JP2019214582A - Ｃｄ３／ｃｄ３８ ｔ細胞再標的化ヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明は、ヒトＣＤ３抗原の成分とヒトＣＤ３８抗原の成分の両方を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法に関する。本発明はまた、治療用又は診断用試薬としての使用のための、ヒトＣＤ３８抗原及びその誘導体に結合する抗体並びにその製造方法に関する。【解決手段】ある特定のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３８に結合する抗体又はその断片を提供する。さらに、ある特定のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３に結合する抗体又はその断片を含む二重特異性抗体を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＣＤ３抗原の成分とヒトＣＤ３８抗原の成分の両方を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリン及びその製造方法に関する。本発明はまた、治療用又は診断用試薬としての使用のための、ヒトＣＤ３８抗原及びその誘導体に結合する抗体並びにその製造方法に関する。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のインビボでの使用は、様々なヒト疾患の治療における日常的な診療の主軸となっており、ｍＡｂを用いた標的化免疫療法は、多くの形態のがんの治療の成功にとって非常に重要になってきている。これは、濾胞性リンパ腫などのいくつかのＢ細胞悪性腫瘍の治療に革命をもたらしたキメラＣＤ２０抗体であるリツキシマブによって示されている。しかしながら、Ｂ細胞は、形質細胞への最終分化時にＣＤ２０発現を失い、その結果としてリツキシマブは、他のがんの中で特に多発性骨髄腫の治療に非常に限られた利益をもたらしている。
ＣＤ３８分子は、その発現パターンと、受容体及び細胞外酵素としての二重の役割のために、魅力的な標的である。ＣＤ３８の標的化は、多発性骨髄腫及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の治療手段として特に提案されている。
Ｔ細胞リダイレクトキリング(T cell redirected killing)は、多くの治療分野において望ましい作用機序である。様々な二重特異性抗体フォーマットがＴ細胞リダイレクトを媒介することが、前臨床及び臨床研究の両方において、示されている(May C et al., (2012) Biochem Pharmacol, 84(9): 1105-12; Frankel SR & Baeuerle PA, (2013) Curr Opin Chem Biol, 17(3): 385-92)。すべてのＴ細胞再標的化二重特異性抗体又はその断片は、少なくとも二の抗原結合部位を有するように操作されており、この場合、一方の部位が標的細胞上の表面抗原に結合し、他方の部位はＴ細胞表面抗原に結合する。Ｔ細胞表面抗原の中でも、ＴＣＲタンパク質複合体に由来するヒトＣＤ３イプシロンサブユニットは、主にＴ細胞キリングをリダイレクトすることを目的とするものである。
多くの二重特異性抗体フォーマットがＴ細胞キリングをリダイレクトするのに用いられているが、これらには、主にタンデム型のｓｃＦｖ断片及びダイアボディベースのフォーマットが含まれ、Ｆｃベースの二重特異性抗体フォーマットについてはごく数例しか報告されていない(Moore PA et al., (2011) Blood, 117(17): 4542-51; 上掲May C et al., (2012); 上掲Frankel SR & Baeuerle PA, (2013))。ヒトＦｃ領域を包含する二重特異性フォーマットは、比較的長い循環半減期を有し、その結果、有効性の向上及び／又は比較的低頻度の投与計画を実現し得る。考え得るＦｃベースの二重特異性フォーマットの中でも、Ｔ細胞キリングをリダイレクトする一の好ましいフォーマットとして、いわゆる重鎖ヘテロ二量体フォーマットがある。本フォーマットは、Ｔ細胞表面においてヒトＣＤ３分子の複数のコピーが凝集するのを可能にせず、それによりＴ細胞の不活性化をすべて阻止するので、特に興味深い(Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6): (653-63)。
重鎖ヘテロ二量体を操作するための最初に記載された方法は、「ノブ・イントゥー・ホール」法として知られている（ＰＣＴ公開番号：国際公開第１９９６２７０１１号； Merchant AM et al., (1998) Nat Biotechnol, 16(7): (677-81）。昨今、半免疫グロブリン（half-immunoglobulin）の還元及びインビトロでの再シャッフリングにより二の抗体を一の二重特異性抗体に結合する、ＦＡＢアーム交換法(FAB-arm exchange method)として知られている化学的方法が報告されている（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９３５３号（Schuurman Jら）及び国際公開第２０１３０６０８６７号（Gramer Mら）；Labrijn AF et al., (2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): (5145-50）。
本発明は、配列番号２５若しくは配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号２６若しくは配列番号２０９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号２７若しくは配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；並びに／あるいは配列番号２８若しくは配列番号２１１若しくは配列番号２１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号２９若しくは配列番号２１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号３０若しくは配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＣＤ３８に結合する抗体若しくはその断片を提供し、又は
ＣＤ３８タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
本発明のこの態様によれば、抗ＣＤ３８抗体又はその断片は、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。
特に、抗体又はその断片は、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６０からなるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含み、かつ／あるいは抗体又はその断片は、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列か、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含む。
特に、抗体又はその断片は、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９からなるアミノ酸配列を含む重鎖配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含み、かつ／あるいは抗体又はその断片は、配列番号７４、配列番号７７、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む軽鎖配列か、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含む。
特に、抗体又は断片は、ヒト重及び／又は軽鎖定常領域を含み、かつヒト重定常領域は、ＩＧＨＧ１、非フコシル化ＩＧＨＧ１、及びＩＧＨＧ４からなるヒト免疫グロブリンの群から選択される。
本発明はまた、新規抗ヒトＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体も提供する。
本発明に従えば、抗ヒトＣＤ３結合アームの標的結合部分は、ＳＰ３４又はＯＫＴ３の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を好ましくは含む。特に抗ヒトＣＤ３結合アームがＳＰ３４の場合、ｓｃＦｖは、ＣＤ３結合特性を維持しながら配列番号１及び２によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖ−Ｆｃと比較して、より良好な発現プロファイルを有する。
特に、ｓｃＦｖ−Ｆｃとして発現される場合、それは、配列番号１及び２によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖ−ＦｃとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも２倍の発現の改善を有する。好ましくは、改善されたＳＰ３４ ｓｃＦｖは、配列番号１及び２によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも６倍の発現の改善を有し、最も好ましくは配列番号１及び２によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、１２倍の発現の改善を有する。
本発明の別の態様に従えば、ＢＥＡＴフォーマットの、ＦＡＢアームを含む二重特異性抗体中のｓｃＦｖとして発現される場合、それは、配列番号１及び２によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも２倍の発現の改善を有する。好ましくは、ＢＥＡＴ二重特異性抗体の成分としての改善されたＳＰ３４ ｓｃＦｖは、ＢＥＡＴ二重特異性抗体の成分としての配列番号１及び２によってコードされる重並びに軽可変領域を含むｓｃＦｖとしてフォーマットされたＳＰ３４キメラと比較して、少なくとも５倍の発現の改善を有する。
本発明に従えば、抗ヒトＣＤ３二重特異性抗体の二の結合アームは各々、免疫グロブリン定常領域を含み、第一のアーム又はポリペプチドはプロテインＡに結合し、第二のアーム又はポリペプチドはプロテインＡに結合しない。
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３タンパク質複合体に結合する、ポリペプチドのエピトープ結合領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５又は配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、又は
ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１６６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む。
本発明のさらなる態様によれば、ＣＤ３８タンパク質複合体に結合する、ポリペプチドのエピトープ結合領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、又は
ＣＤ３８タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、又は
ＣＤ３８タンパク質複合体に結合する、ポリペプチドのエピトープ結合領域は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、又は
ＣＤ３８タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、並びに配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
これらの新規の抗ヒトＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性抗体の使用は、様々なヒトのがん、自己免疫及び炎症性疾患の治療を含むがこれらに限定されない。正常な細胞及び組織の中からがん細胞を特異的に破壊することは、腫瘍学における主要な目的に相当する。腫瘍関連細胞表面抗原に対して安全にＴ細胞キリングをリダイレクトすることができる治療法は、臨床効果の改善をもたらし得る。腫瘍学における臨床上満たされていないニーズの既知の分野には、乳がん、転移性乳がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のさらなる態様に従えば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第二のポリペプチドの定常領域は、ＩｇＧ３ ＣＨ３領域を含む。
本発明のさらなる態様に従えば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第二のポリペプチドの定常領域は、ＩｇＧからのもの以外のＣＨ３領域を含み、非ＩｇＧ３ Ｃｈ３領域は、プロテインＡ結合を減少／消失させるように少なくとも一の置換を含む。
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の第二のポリペプチドのエピトープ結合領域は、プロテインＡ結合を減少させる少なくとも一の修飾を含むＶＨ３領域を含む。
本発明はまた、組換え哺乳動物宿主細胞株由来の少なくとも一のＶＨ３ベースの抗原結合部位を有する抗ヒトＣＤ３／ＣＤ３８二重特異性重鎖ヘテロ二量体を製造するための方法であって、二重特異性抗体生成物が一工程のプロテインＡクロマトグラフィー後に高純度で容易に単離される方法を提供する。
特に、修飾ＶＨ３領域は、５７、６５、８１、８２ａ、及び１９／５７／５９（Ｋａｂａｔ番号付け）の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、さらにより好ましくは、修飾ＶＨ３領域は５７Ａ、５７Ｅ、６５Ｓ、８１Ｅ、８２ａＳ、及び１９Ｇ／５７Ａ／５９Ａ（Ｋａｂａｔ番号付け）の組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む。
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片は、重鎖可変フレームワーク領域がＩ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含み、軽鎖可変フレームワーク領域がＭ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｔ５１Ａ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択されるアミノ酸置換を含むか；又は重鎖可変フレームワーク領域がアミノ酸置換Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含み、軽鎖可変フレームワーク領域がアミノ酸置換Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含む。
さらなる実施態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラスの産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。好ましくは、重鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＶ３−２３の産物であるか又はそれに由来する。より好ましくは、重鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号３７）の産物であるか又はそれに由来する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号３８又は配列番号１のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
好ましい実施態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合する、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス若しくはヒトＶＫ３サブクラスの産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。好ましくは、軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＶＫ１−３９又はＶＫ３−２０の産物であるか又はそれに由来する。より好ましくは、軽鎖可変フレームワーク領域は、ヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号３９）又はＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号４０）の産物であるか又はそれに由来する。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号４１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
好ましい実施態様では、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ／Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択される逆突然変異を有するヒト化重鎖可変ドメインと、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）からなる群より選択される逆突然変異を有するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。さらに好ましくは、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、逆突然変異Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有するヒト化重鎖可変ドメインと、逆突然変異Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付け）を有するヒト化軽鎖可変ドメインとを含む。
本発明のさらなる態様によれば、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片のＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、
配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか；又は
配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
ＣＤ３タンパク質複合体は、いくつかのサブユニット、例えばデルタ、イプシロン、及びガンマを含む。好ましい実施態様において、ＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域は、ＣＤ３イプシロンサブユニットに結合する。
本明細書に記載のエピトープ結合領域は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の、一又は複数のエピトープへの特異的結合を可能にする結合部位を共に形成する一又は複数の重鎖可変ドメイン及び一又は複数の相補的軽鎖可変ドメインを含む。本発明の一実施態様において、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域はＦＡＢを含み、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域はｓｃＦｖを含む。あるいは、第一のポリペプチドのエピトープ結合領域がｓｃＦｖを含み、第二のポリペプチドのエピトープ結合領域がＦＡＢを含む。
ＣＤ３８に結合するエピトープ結合領域は、ヒトＶＨ３サブクラス、好ましくはヒトＶＨ３−２３、より好ましくはヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号３７）の産物であるか又はそれに由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号５０又は５１又は５２のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。エピトープ結合領域は、ヒトＶＫ１サブクラス、好ましくはヒトＶＫ１−３９、より好ましくはヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号３９）の産物であるか又はそれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域をさらに含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号５３又は５４又は５５のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。
特に、ＣＤ３８結合ポリペプチドは、配列番号５６／５７、５８／５９、６０／６１、及び６２／６３によってコードされる可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとの対を含む。
抗ＣＤ３抗体は、直接的及び間接的機序の両方によって毒性を誘発することが判明している。間接的機序は、免疫細胞を発現するＦｃ受容体と相互作用し、かつ一過性のＴ細胞活性化及びサイトカイン放出をもたらすＣＤ３抗体のＦｃ領域によって媒介される。したがって、本明細書に記載のヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片の安全性を向上させるために、第一及び／又は第二のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、エフェクター免疫細胞及び／又は補体Ｃ１ｑｂに対する結合が低下しているか又は全く結合していない。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、下部ヒンジ領域におけるＦｃ受容体結合を排除するように操作される。より好ましくは、第一及び／又は第二のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、Ｌ２３４Ａ及び／又はＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）の置換（単数又は複数）を含む。最も好ましくは、第一及び／又は第二のポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）の置換を含む。
別の態様では、本発明の開示はまた、エピトープ結合領域がＣＤ３タンパク質複合体のＣＤ３イプシロンサブユニットに結合し、配列番号１のアミノ酸配列の重鎖可変ドメイン及び配列番号２のアミノ酸配列の軽鎖可変ドメインを含むＳＰ３４キメラのＦＡＢ熱安定性よりも優れたＦＡＢ熱安定性を有する（表１のように示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定した場合）ＦＡＢを含む、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を記載している。この熱安定性の増大は、これらの改善されたＳＰ３４結合アームが、治療剤として、またその安定性／保管／貯蔵寿命の点でより優れた性能を意味する、インビボ及びインビトロでの安定性を高めたことを意味する。
好ましい実施態様では、本発明は、以下のものに結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供する：
ｉ） 第一のポリペプチドが配列番号６５のアミノ酸配列を有し、配列番号６６のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
ｉｉ） 第一のポリペプチドが配列番号７１のアミノ酸配列を有し、配列番号７２のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
ｉｉｉ） 第一のポリペプチドが配列番号７３のアミノ酸配列を有し、配列番号７４のアミノ酸配列の同族軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０のアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８。
さらなる実施態様では、本発明は、以下のものに結合するヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供する：
第一のポリペプチドが配列番号７５又は７６のアミノ酸配列を有し、配列番号７７のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８；
第一のポリペプチドが配列番号７８のアミノ酸配列を有し、配列番号６６のアミノ酸配列の軽鎖と共に組み立てられ、ＣＤ３８に結合し、かつ第二のポリペプチドが配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ３イプシロンに結合する、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８。
本発明のさらなる態様によれば、（ａ）ＣＨ２ドメイン及び第一の操作されたＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常領域を含む第一のポリペプチド；
（ｂ）ＣＨ２ドメイン及び第二の操作されたＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリン定常領域を含む第二のポリペプチド
を含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片が提供され、この場合前記二つのポリペプチドは操作されたそれらのＣＨ３ドメインを介してヘテロ二量体化し、第一のポリペプチドはプロテインＡ又はプロテインＧに結合せず、第二のポリペプチドはその免疫グロブリン定常領域を介してプロテインＡ及び／又はプロテインＧにのみ結合し、この場合第一の操作されたＣＨ３ドメインは次の残基：２０、２２、２６、７９、８５．１、８６、８８、９０の一又は複数における置換を有し、第二の操作されたＣＨ３ドメインは３、５、２０、２２、２６、２７、８１、８４、８５．１、８６、８８からなる群から選択される少なくとも一の残基における置換を有し、この場合前記第二鎖もＩＭＧＴ番号付けによる残基８４．４における置換を含む。
本発明のさらなる態様によれば、８４．４位における置換は、８４．４Ｑ、８４．４Ｖ、８４．４Ａ、８４．４Ｓ、８４．４Ｔ、８４．４Ｎ、８４．４Ｇ、８４．４Ｌ、８４．４Ｌ、８４．４Ｙ、８４．４Ｆ、８４．４Ｍの群から選択される。
本発明のさらなる態様によれば、第一の操作されたＣＨ３ドメインは、少なくとも次の残基：２２、８６、８８における置換を有し、第二の操作されたＣＨ３ドメインは、ＩＭＧＴの番号付けによる少なくとも次の残基：７、８４．４、８５．１、８６における置換を有する。
本発明のさらなる態様によれば、第一の操作されたＣＨ３ドメインは、少なくとも次の残基：２０、２２、７９、８６、８８における置換を有し、第二の操作されたＣＨ３ドメインは、ＩＭＧＴの番号付けによる少なくとも次の残基：７、２６、８４、８４．４、８５．１、８６における置換を有する。
本発明のさらなる態様によれば、第一の操作されたＣＨ３ドメインは、少なくとも次の残基：２０、２２、２６、７９、８５．１、８６、８８、９０における置換を有し、第二の操作されたＣＨ３ドメインは、少なくとも次の残基：３、５、７、２０、２２、２６、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、９０における置換を有する。
本発明のさらなる態様によれば、第一の操作されたＣＨ３ドメインは、少なくとも次の残基：３、２０、２２、２６、７９、８５．１、８６、８８、９０における置換を有し、第二の操作されたＣＨ３ドメインは、少なくとも次の残基：３、５、７、２０、２２、２６、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、９０における置換を有する。
本発明のさらなる態様によれば、ＢＴＡ ＣＨ３ドメイン及び非ＶＨ３可変ドメイン又は（例えばＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて）プロテインＡ結合を除去したＶＨ３ベースの可変ドメイン又は非可変ドメインを含み、ゆえにプロテインＡ結合を有しないＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を包含する第一の鎖と、（例えばヒトＩｇＧ１アイソタイプに由来する）ＢＴＢ Ｄ４０１Ｑ ＣＨ３ドメイン）及び非ＶＨ３可変ドメインか（例えばＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて）プロテインＡ結合を除去したＶＨ３可変ドメインのいずれか、又は非可変ドメインを包含する、プロテインＡに結合する第二の鎖とを有するヘテロ二量体免疫グロブリンが提供される。
これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図１Ａ−Ｃ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＰＢ−ＡＬＬ染色：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は同程度の結合を示す。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図１Ａ−Ｃ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＰＢ−ＡＬＬ染色：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は同程度の結合を示す。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図１Ａ−Ｃ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＰＢ−ＡＬＬ染色：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は同程度の結合を示す。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図１Ｄ：候補から選択された抗体のＤＳＣプロファイル。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図１Ｅ：ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＰＢ−ＡＬＬ染色：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は同程度の結合を示す。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＯＫＴ３ヒト化に関するものである。図１Ｆ：選択されたｓｃＦｖ−Ｆｃ候補のＤＳＣプロファイル。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＳＰ３４ヒト化に関するものである。図２Ａ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。図２Ｂ：ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ）としてフォーマットされたヒト化候補の概要。ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６Ｆｃ融合タンパク質についてキメラＳＰ３４抗体と比較したＳＰＲデータ：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は強いが同程度ではない結合、（＋＋＋＋）は同程度の結合を示す。 これらの図はすべて、安定したヒトフレームワーク上のＳＰ３４ヒト化に関するものである。図２Ａ：ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされたヒト化候補の概要。図２Ｂ：ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃ）としてフォーマットされたヒト化候補の概要。ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６Ｆｃ融合タンパク質についてキメラＳＰ３４抗体と比較したＳＰＲデータ：（−）は結合なし、（＋）はより弱い結合、（＋＋）は中程度の結合、（＋＋＋）は強いが同程度ではない結合、（＋＋＋＋）は同程度の結合を示す。 ＳＰ３４キメラ及びＳＰ３４ Ｈ１Ｌ２１について、ＩｇＧ１からｓｃＦｖ−Ｆｃへの再フォーマット後の相対的発現レベルを示す。ここで劇的な発現の喪失が観察された。 Ｔ２７、Ｇ２７ａ、Ｖ２７ｃ、Ｔ２８、Ｔ２９、Ｓ３０、Ｎ３１、Ｙ３２、Ｎ５２、Ｋ５３、Ｒ５４、Ｐ５６、Ｌ９０、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｎ９４、及びＬ９５の位置でのアラニンスキャンによるＳＰ３４ Ｈ１Ｌ２１ ＳｃＦｖ−Ｆｃの発現レベルに対する効果を示す。 図５Ａは、ＳＰ３４ Ｈ３Ｌ２３ ＳｃＦｖ−Ｆｃの２９位でのランダム突然変異の発現レベルに対する効果を示す；図５Ｂは、ＳＰ３４ Ｈ３Ｌ２３ ＳｃＦｖ−Ｆｃの３０位でのランダム突然変異の発現レベルに対する効果を示す；図５Ｃは、ＳＰ３４ Ｈ５Ｌ２３ ＳｃＦｖ−Ｆｃの９５位でのランダム突然変異の発現レベルに対する効果を示す。 複数のヒト化ＳＰ３４についての正規化された発現レベルを示す。 キメラＨＢ−７抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのキメラＨＢ−７抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、１２５、３１、７．８、３．９、１．９、１、及び０．５ｎＭでヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。 ヒト化ＨＢ−７ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。 ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。 ヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク（ｂｅｓｔ−ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト化９Ｇ７ｂベストフレームワーク抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９、０．１９、及び０．１ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。 ヒト７６７抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのヒト７６７抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、及び１５．６ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグを有するヒトＣＤ３８細胞外ドメイン）をＨＢＳ−Ｐに注入した。親和性は、次の式：Ｒｅｑ＝ＫＡ＊Ｃ＊Ｒｍａｘ／（ＫＡ＊Ｃ＊ｎ＋１）に従って平衡応答（Ｒｅｑ）対分析物濃度（Ｃ）のプロットから得られた。５０％飽和時の濃度はＫＤである。すべてのＳＰＲデータは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。 キメラＨＢ−７及びヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体のＤＳＣプロファイル。 キメラ９Ｇ７及びヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体のＤＳＣプロファイル。 ヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク抗体のＤＳＣプロファイル。 ヒト化クローン７６７抗体のＤＳＣプロファイル。 ９Ｇ７ヒト化抗体の要約表。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（フォーマットＡ）及びＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（フォーマットＢ）抗体の模式図。［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。［（Ａ−）］は非機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体とヒトＣＤ３８抗原間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、２００ＲＵのＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２５、及び０．３９ｎＭで、ヒトＣＤ３８タンパク質（ポリヒスチジンタグ付きタンパク質）をＨＢＳ−Ｐに注入した。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体ＤＳＣプロファイル。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：精製ヒトＴ細胞。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。４８時間インキュベーションした２ドナーの平均。標的細胞：ＲＰＭＩ ８２２６。抗体濃度をｎＭで示す。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ。抗体濃度をｎＭで示す。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）（フォーマットＡ）とＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）（フォーマットＢ）抗体の模式図。［（Ａ＋）］は機能的なプロテインＡ結合部位を意味する。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度をｎＭで示す。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度をｎＭで示す。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体とヒトＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質間のＳＰＲによって測定された抗体−抗原相互作用。ＣＭ５センサーチップを、ヒトＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質の５００ＲＵと共有結合させた。３０μｌ／分の流速、５０、２５、１２．５、６．２、３．１、０．８、及び０．４ｎＭで、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体をＨＢＳ−Ｐに注入した。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。 ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体によるＴ細胞リダイレクトキリングの例。読み取り：ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法。エフェクター細胞：ヒトＰＢＭＣ。１０：１のエフェクター細胞対標的細胞比。２４時間インキュベーションした３ドナーの平均。標的細胞：Ｄａｕｄｉ細胞。抗体濃度をｎＭで示す。 複数のＣＤ３８／ＣＤ３二重特異性抗体のＲＤＬアッセイにおける性能を示す。ここでＣＤ３結合アームは、ｓｃＦｖ（配列番号１３７）として再フォーマットされた元のマウスＳＰ３４、又は重／軽鎖組み合わせＨ１／Ｌ２１（配列番号６７）、Ｈ５／Ｌ３２（配列番号６８）、Ｈ５／Ｌ６５（配列番号６９）、及びＨ５／Ｌ６７（配列番号７０）を含む修飾ヒト化ＳＰ３４のｓｃＦｖを含む、 プロテインＡ結合ｓｃＦｖ部分を有するＢＴＢホモ二量体（群１のレーン）及びプロテインＡ結合ｓｃＦｖ部分を有しないＢＴＢホモ二量体（群２のレーン）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。アフィニティークロマトグラフィーを用いる精製：溶出画分及び中和画分を、プロテインＡクロマトグラフィー（Ａ）又はプロテインＧクロマトグラフィー（Ｇ）の後に分析した。群２では、フロースルー又は非結合画分が集まり、プロテインＡ又はＧ（それぞれＡ ｆｔ及びＧ ｆｔと略記）に結合しないことを示した。溶出は、ｐＨ３．０で行った。［（Ａ＋）］は、プロテインＡ結合部位を意味する。分子量マーカーは、示された通りである（ｋＤａ）。 Ａ：Ｄ４０１Ｑ置換を有するＢＴＢ鎖中に単一のタンパク質Ａ部位のみを含有するＢＥＡＴヘテロ二量体の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。アフィニティークロマトグラフィーを用いる精製：溶出画分及び中和画分を、プロテインＡクロマトグラフィー（Ａ）又はプロテインＧクロマトグラフィー（Ｇ）の後に分析した。溶出は、ｐＨ３．０で行った。［（Ａ＋）］は、プロテインＡ結合部位を意味する。分子量マーカーは、示された通りである（ｋＤａ）；Ｂ：Ｄ４０１Ｑ置換を欠くＢＴＢ鎖中に単一のタンパク質Ａ部位を含有するＢＥＡＴヘテロ二量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。アフィニティークロマトグラフィーを用いる精製：溶出画分及び中和画分を、プロテインＡクロマトグラフィー（Ａ）又はプロテインＧクロマトグラフィー（Ｇ）の後に分析した。溶出は、ｐＨ３．０で行った。［（Ａ＋）］は、プロテインＡ結合部位を意味する。分子量マーカーは、示された通りである（ｋＤａ）。 グラフは、ＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴを注入した両方の動物について、ＣＤ４＋集団（実線）及びＣＤ８＋集団（点線）についての血液１μｌ当たりのカウントを示す。上のグラフは、１μｇ／ｋｇを投与した動物でのカウントを示す。下のグラフは、１０μｇ／ｋｇを投与した動物でのカウントを示す。ゼロ時点でのカウントは、投薬の１日前に採取した試料に対応する。 グラフは、ＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴを注入した両方の動物について、ＣＤ１４＋ＣＤ３８＋単球集団の血液１μｌ当たりのカウントを示す。上のグラフは、１μｇ／ｋｇを投与した動物のカウントを示す。下のグラフは、１０μｇ／ｋｇを投与した動物のカウントを示す。ゼロ時点でのカウントは、投薬の１日前に採取した試料に対応する。 グラフは、時間（秒）の関数としてのフルオ４色素の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。アイソタイプコントロール条件は、各グラフに含まれている。４０秒間のベースライン取得後、表示の抗体を試料に加え、取得を再開した。アイソタイプコントロールは、ヒトＩｇＧ１抗体であった。ＭＦＩの増加は、細胞の細胞質へのカルシウム動員を示す。 ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに由来するペプチド−Ｆｃ融合物を用いたＳＰＲによるヒト化９Ｇ７抗体のエピトープマッピング。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。 ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインの３Ｄレンダリング。Ｆ６ペプチド配列は灰色に着色され、Ｍ１１０及びＴ１４８の位置は黒色に着色されている。 ヒト及びカニクイザルＣＤ３８の細胞外ドメインを用いたＳＰＲによるヒト化９Ｇ７及びＳＡＲ６５０９８４抗体のエピトープマッピング。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。 ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに由来するペプチド−Ｆｃ融合物を用いたＳＰＲによるヒト７６７抗体のエピトープマッピング。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。 ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインの３Ｄレンダリング。Ｆ３ペプチド配列は灰色に着色され、Ｅ７６及びＨ７９の位置は黒色に着色されている。 ヒトＣＤ３８の細胞外ドメインに由来するペプチド−Ｆｃ融合物を用いたＳＰＲによるヒト化ＳＡＲ６５０９８４抗体のエピトープマッピング。データは、応答単位（ＲＵと略記；Ｙ軸）の数対時間（Ｘ軸）として表される。
本発明は、一般に、ＣＤ３タンパク質複合体及びＣＤ３８抗原に結合する新規のヘテロ二量体免疫グロブリンに関する。
さらに、これらのヘテロ二量体免疫グロブリンは、プロテインＡへの結合を低減又は排除しているため、アフィニティークロマトグラフィーを用いて非常に高い純度まで精製することができる。
本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆も同じである。本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことを理解すべきである。
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸がペプチド結合を介して結合されて、脱水合成によって一緒に連結されたアミノ酸の鎖を形成するアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチド及びタンパク質は、化学合成又は組換え発現によって合成することができ、最小アミノ酸長に限定されない。
本発明によれば、ポリペプチド群は、タンパク質が単一のポリペプチド鎖からなる限り、「タンパク質」を含む。ポリペプチドは、例えば二量体、三量体、及びより高次のオリゴマー、すなわち一より多いポリペプチド分子からなる多量体をさらに形成することができる。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一でも異なっていてもよい。したがって、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の例は、天然に存在する形態の、二の同一軽ポリペプチド鎖と二の同一重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」はまた、天然に修飾されたポリペプチド／タンパク質を指し、この場合修飾は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等の翻訳後修飾によりなされる。そのような修飾は、当該技術分野でよく知られている。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、天然配列に対して欠失、付加、及び置換等の修飾（本質的に保存的であり得る）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるなど計画的であってもよく、又はタンパク質を生成する宿主の突然変異若しくはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるものなど、偶発的であってもよい。
本明細書で使用する用語「ＣＤ３複合体」は、ＣＤ３（分化クラスター３）Ｔ細胞共受容体として知られているタンパク質複合体を指す(Wucherpfennig KW et al., (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(4): a005140）。ＣＤ３タンパク質複合体は、４の異なる鎖からなる。哺乳動物では、該複合体は、ＣＤ３ｇ鎖、ＣＤ３ｄ鎖、及び二のＣＤ３ｅ鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子及びｚ鎖と会合して、Ｔリンパ球に活性化シグナルを生成する(van der Merwe PA & Dushek O (2011) Nat Rev Immunol, 11(1): (47-55)。ＴＣＲ、ｚ鎖、及びＣＤ３分子は、共にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３ｇ、ＣＤ３ｄ、及びＣＤ３ｅ鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの、関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内テールは、ＴＣＲのシグナル伝達能力に不可欠な免疫受容活性化チロシンモチーフ又は略してＩＴＡＭとして知られている単一の保存モチーフを含有する。ＣＤ３はＴ細胞活性化に必要であるため、ＣＤ３を標的とする薬物（通常はモノクローナル抗体）が免疫抑制療法として研究されてきており、今なお継続されている。
本明細書でいう用語「免疫グロブリン」は、用語「抗体」と互換的に使用することができる。免疫グロブリンは、完全長抗体及び任意の抗原結合断片又はその一本鎖を含む。免疫グロブリンは、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得る。免疫グロブリン、特に天然抗体は、４のポリペプチド鎖から構成されるＹ字型ユニットの一又は複数のコピーとして存在する糖タンパク質である。各「Ｙ」字型は、重（Ｈ）鎖の二の同一コピーと軽（Ｌ）鎖の二の同一コピーとを含有し、それらの相対分子量によって命名される。各軽鎖は重鎖と対をなし、各重鎖はもう一つの重鎖と対をなす。共有結合鎖間ジスルフィド結合及び非共有結合相互作用は、これらの鎖をつなぎ合わせる。免疫グロブリン、特に天然抗体は、抗原結合部位の二のコピーである可変領域を含有する。タンパク質分解酵素であるパパイン(Papain)は、「Ｙ」字型を三の別個の分子、二のいわゆる「Ｆａｂ」又は「ＦＡＢ」断片（Ｆａｂ＝抗原結合断片(fragment antigen binding））及び一のいわゆる「Ｆｃ」断片又は「Ｆｃ領域」（Ｆｃ＝結晶化可能な断片）に分割する。Ｆａｂ断片は、軽鎖全体及び重鎖の一部からなる。重鎖は、一の可変領域（ＶＨ）及び３又は４の定常領域（抗体クラス又はアイソタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含有する。ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間の領域はヒンジ領域と呼ばれ、Ｙ字型抗体分子の二のＦａｂアーム間の可動性を付与し、一定の距離で隔てられた二の抗原決定基にうまく結合するように、二のアームが開閉できるようにする。本明細書でいう「ヒンジ領域」は、長さが６−６２アミノ酸の配列領域であり、二の重鎖を架橋するシステイン残基を包含するＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧにのみ存在する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの重鎖は、４の領域、すなわち一の可変領域（ＶＨ）及び三の定常領域（ＣＨ１−３）を各々有する。ＩｇＥ及びＩｇＭは、重鎖上に一の可変領域及び４の定常領域（ＣＨ１−４）を有する。免疫グロブリンの定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び補体系古典経路の第一の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への結合を媒介し得る。各軽鎖は、通常、一の共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結される。各軽鎖は、一の可変領域（ＶＬ）及び一の軽鎖定常領域を含有する。軽鎖定常領域は、本明細書でＩＧＫＣと称されるカッパ軽鎖定常領域であるか、又は本明細書でＩＧＬＣと称されるラムダ軽鎖定常領域である。ＩＧＫＣは、本明細書ではＣｋ又はＣＫと等しく使用され、同じ意味を有する。ＩＧＬＣは、本明細書ではＣｌ又はＣＬと等しく使用され、同じ意味を有する。本明細書で使用する用語「ＩＧＬＣ領域」は、すべてのラムダ軽鎖定常領域、例えばＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７からなる群より選択されるすべてのラムダ軽鎖定常領域を指す。ＶＨ及びＶＬ領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ又はＦＷ）という領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）という超可変領域にさらに細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３のＣＤＲ及び４のＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用するエピトープ結合領域を含有する。操作された免疫グロブリンは、ｓｃＦｖ、ＦＡＢ又はｄＡｂ断片などの異なるエピトープ結合領域フォーマットを包含し得る。これらの断片は、通常、ＩｇＧ Ｆｃ領域との遺伝的融合によって抗体様構造に組み立てられる。操作された免疫グロブリンは、ヘテロ二量体化増強技術の使用の有無にかかわらず、ホモ又はヘテロ二量体として構築することができ、単一又は二重特異性結合特性を有し得る。
本明細書で使用される用語「完全長抗体」は、可変及び定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を含む。例えば、ヒト及びマウスを含むほとんどの哺乳動物において、ＩｇＧクラスの完全長抗体は四量体であり、二の免疫グロブリン鎖の二の同一の対からなり、各対は一の軽鎖と一の重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリン領域ＶＬと軽鎖定常領域を含み、各重鎖は免疫グロブリン領域ＶＨ、抗体クラス又はアイソタイプに応じてＣＨ１（Ｃｇ１）、ＣＨ２（Ｃｇ２）、ＣＨ３（Ｃｇ３）、ＣＨ４（Ｃｇ４）を含む。いくつかの哺乳動物、例えばラクダ及びラマでは、ＩｇＧ抗体は、二の重鎖のみからなり、各重鎖はＦｃ領域に結合した可変領域を含む。
抗体は、定常領域によって遺伝子学的に決定された、アイソタイプとも呼ばれるクラスに分類される。ヒト定常軽鎖は、カッパ（Ｃｋ）及びラムダ（Ｃｌ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（ｍ）、デルタ（ｄ）、ガンマ（ｇ）、アルファ（ａ）又はイプシロン（ｅ）に分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。したがって、本明細書において使用される「アイソタイプ」は、定常領域の化学及び抗原特性により定義される免疫グロブリンのクラス及び／又はサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩＧＨＧ１（ＩｇＧ１）、ＩＧＨＧ２（ＩｇＧ２）、ＩＧＨＧ３（ＩｇＧ３）、ＩＧＨＧ４（ＩｇＧ４）、ＩＧＨＡ１（ＩｇＡ１）、ＩＧＨＡ２（ＩｇＡ２）、ＩＧＨＭ（ＩｇＭ）、ＩＧＨＤ（ＩｇＤ）、及びＩＧＨＥ（ＩｇＥ）である。いわゆるヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、配列決定されているが改変されたスイッチ領域のためにタンパク質をコードしないさらなるヒト免疫グロブリン重定常領域遺伝子である(Bensmana M et al., (1988) Nucleic Acids Res, 16(7): 3108)。改変されたスイッチ領域を有するにも関わらず、ヒト免疫グロブリン偽ガンマＩＧＨＧＰ遺伝子は、すべての重鎖定常領域（ＣＨ１−ＣＨ３）及びヒンジについてオープンリーディングフレームを有する。その重定常領域についてのすべてのオープンリーディングフレームは、予測される構造的特徴を有するすべてのヒト免疫グロブリン定常領域と良好に整列するタンパク質領域をコードする。このさらなる偽ガンマアイソタイプは、本明細書においてＩｇＧＰ又はＩＧＨＧＰという。ヒト免疫グロブリン重定常領域イプシロンＰ１及びＰ２偽遺伝子（ＩＧＨＥＰ１及びＩＧＨＥＰ２）などの他の偽免疫グロブリン遺伝子が、報告されている。ＩｇＧクラスは、治療目的のために最も一般的に用いられる。ヒトにおいてこのクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスにおいてこのクラスは、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＧ３を含む。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン断片」には、（ｉ）例えばＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３領域を含む領域、（ｉｉ）Ｆａｂ′及びＦａｂ′−ＳＨを含む、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ又はＣＫ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１領域からなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一の可変領域からなるｄＡｂ断片(Ward ES et al., (1989) Nature, 341(6242): 544-6)、（ｉｖ）二の連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖ）ＶＨ領域及びＶＬ領域がペプチドリンカーにより連結されており、二の領域が会合して抗原結合部位を形成するのを可能にしている単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）(Bird RE et al., (1988) Science, 242(4877): 423-6; Huston JS et al., (1988) Proc Natl Acad Sci U S A, 85(16): 5879-83)、（ｖｉ）遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性断片である「ダイアボディ」又は「トリアボディ」(Holliger P et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A, 90(14): 6444-8; Tomlinson I & Holliger P, (2000) Methods Enzymol, 326:461-79)、（ｖｉｉ）Ｆｃ領域と融合したｓｃＦｖ、ダイアボディ又は領域抗体、及び（ｖｉｉｉ）同じか又は異なる抗体と融合したｓｃＦｖが含まれる。
用語「可変領域」は、抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する領域又はドメインを指す。天然抗体では、抗原結合部位は、特異性を規定する二の可変領域、すなわち一方は重鎖に位置するものであり（本明細書では重鎖可変領域（ＶＨ）という）、他方は軽鎖に位置するもの（本明細書では軽鎖可変領域（ＶＬ）という）からなる。ヒトにおいて、重鎖可変領域（ＶＨ）は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、及びＶＨ７の７のサブグループ又はサブクラスに分けることができる。場合によっては、特異性は、ラクダ科に見られる重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体のように、二の領域のうちの一にのみ排他的に存在し得る。Ｖ領域は、通常約１１０アミノ酸長であり、７−１７アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端に可変的な短領域によって隔てられた１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ又は「非ＣＤＲ領域」）と呼ばれるアミノ酸配列の比較的不変のストレッチからなる。天然の重及び軽鎖の可変ドメインは、主にベータシート立体配置を採る４のＦＲを含み、三の超可変領域により連結され、この超可変領域はループを形成する。各鎖において超可変領域は、ＦＲによって緊密に結合され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（上掲のKabat EAら参照）。本明細書において使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、かつ／又は抗原認識に関与する。すべての可変領域について、番号付けは、Ｋａｂａｔによる（上掲のKabat EAら）。
複数のＣＤＲの定義が使用されているが、これらは本明細書に包含される。Ｋａｂａｔの定義は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（上掲のKabat EAら）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置を参照する(Chothia & Lesk J. (1987) Mol Biol, 196: 901-917）。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの定義の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されている(Martin ACR et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin ACR et al., (1991) Methods Enzymol, 203: 121-153; Pedersen JT et al., (1992) Immunomethods, 1: 126-136; Rees AR et al., (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172)。接触定義は、最近導入されたものであり(MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol, 262: 732-745)、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｎｋから入手できる利用可能な複合体構造の分析に基づく。ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）（http://www.imgt.org）によるＣＤＲの定義は、すべての種のすべての免疫グロブリン及びＴ細胞受容体Ｖ領域についてのＩＭＧＴ番号付けに基づいている（ＩＭＧＴ（登録商標）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標）；Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res, 27(1): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res, 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res, 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res, 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev Comp Immunol, 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64)。本発明でいうすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）は、好ましくは次のように定義される（上掲のKabat EAらによる番号付け）：ＬＣＤＲ１：２４−３４、ＬＣＤＲ２：５０−５６、ＬＣＤＲ３：８９−９８、ＨＣＤＲ１：２６−３５、ＨＣＤＲ２：５０−６５、ＨＣＤＲ３：９５−１０２。
可変ドメインの「非ＣＤＲ領域」は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られている。本明細書で使用するＶＬ領域の「非ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２３（ＦＲ１）、３５−４９（ＦＲ２）、５７−８８（ＦＲ３）、及び９９−１０７（ＦＲ４）を含む。本明細書で使用するＶＨ領域の「非ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２５（ＦＲ１）、３６−４９（ＦＲ２）、６６−９４（ＦＲ３）、及び１０３−１１３（ＦＲ４）を含む。
本発明のＣＤＲは、上記の定義に基づき、次の可変ドメイン残基：ＬＣＤＲ１：２４−３６、ＬＣＤＲ２：４６−５６、ＬＣＤＲ３：８９−９７、ＨＣＤＲ１：２６−３５、ＨＣＤＲ２：４７−６５、ＨＣＤＲ３：９３−１０２を有する「拡張ＣＤＲ」を含み得る。これらの拡張ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔらにより同様に番号付けされる。本明細書で使用するＶＬ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２３（ＦＲ１）、３７−４５（ＦＲ２）、５７−８８（ＦＲ３）、及び９８−およそ１０７（ＦＲ４）を含む。本明細書で使用するＶＨ領域の「非拡張ＣＤＲ領域」は、アミノ酸配列：１−２５（ＦＲ１）、３７−４６（ＦＲ２）、６６−９２（ＦＲ３）、及び１０３−およそ１１３（ＦＲ４）を含む。
本明細書で使用する用語「Ｆａｂ」若しくは「ＦＡＢ」又は「Ｆａｂ領域」若しくは「ＦＡＢ領域」には、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及び軽鎖定常免疫グロブリン領域を含むポリペプチドが含まれる。Ｆａｂは、この領域単独を指すか、又は完全長抗体若しくは抗体断片におけるこの領域を指す。
用語「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、本明細書で用いる場合、抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを含むが、第一の定常領域免疫グロブリン領域は除く。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の二の定常領域免疫グロブリン領域、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後の三の定常領域免疫グロブリン領域、及びこれらの領域に対してＮ末端側の可撓性ヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリン領域Ｃガンマ２及びＣガンマ３（Ｃｇ２及びＣｇ３）並びにＣガンマ１（Ｃｇｌ）とＣガンマ２（Ｃｇ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の接触は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、そのカルボキシル末端に対する残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むように通常定義され、この場合の番号付けはＥＵインデックスによる。Ｆｃは、この領域単独を指すか、又はＦｃポリペプチド（例えば抗体）におけるこの領域を指す。
本明細書で用いる用語「免疫グロブリン定常領域」は、ヒト又は動物種由来の免疫グロブリン又は抗体重鎖定常領域を指し、またすべてのアイソタイプを包含する。好ましくは、免疫グロブリン定常領域は、ヒト由来であり、限定されないが、ＩＧＨＧ１ ＣＨ１、ＩＧＨＧ２ ＣＨ１、ＩＧＨＧ３ ＣＨ１、ＩＧＨＧ４ ＣＨ１、ＩＧＨＡ１ ＣＨ１、ＩＧＨＡ２ ＣＨ１、ＩＧＨＥ ＣＨ１、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ１、ＩＧＨＭ ＣＨ１、ＩＧＨＤ ＣＨ１、ＩＧＨＧＰ ＣＨ１、ＩＧＨＧ１ ＣＨ２、ＩＧＨＧ２ ＣＨ２、ＩＧＨＧ３ ＣＨ２、ＩＧＨＧ４ ＣＨ２、ＩＧＨＡ１ ＣＨ２、ＩＧＨＡ２ ＣＨ２、ＩＧＨＥ ＣＨ２、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ２、ＩＧＨＭ ＣＨ２、ＩＧＨＤ ＣＨ２、ＩＧＨＧＰ ＣＨ２、ＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＥＰ１ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３、ＩＧＨＧＰ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ４、及びＩＧＨＭ ＣＨ４からなる群より選択される。好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのＩＧＨＥ ＣＨ２、ＩＧＨＭ ＣＨ２、ＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３、及び ＩＧＨＧＰ ＣＨ３からなる群より選択される。より好ましい「免疫グロブリン定常領域」は、ヒトのＩＧＨＧ１ ＣＨ３、ＩＧＨＧ２ ＣＨ３、ＩＧＨＧ３ ＣＨ３、ＩＧＨＧ４ ＣＨ３、ＩＧＨＡ１ ＣＨ３、ＩＧＨＡ２ ＣＨ３、ＩＧＨＥ ＣＨ３、ＩＧＨＭ ＣＨ３、ＩＧＨＤ ＣＨ３、及びＩＧＨＧＰ ＣＨ３からなる群より選択される。
用語「エピトープ結合領域」は、一又は複数のエピトープへの免疫グロブリン分子の特異的結合を可能にする最低限のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその断片を含む。天然抗体は、抗原結合部位又はパラトープとしても知られている、二のエピトープ結合領域を有する。天然抗体中のエピトープ結合領域は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインのＣＤＲ領域内に限られ、そこでアミノ酸媒介性のエピトープ結合が見出される。天然抗体の他に、合成ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン又はそれらの断片及びそれらの組み合わせを操作して、エピトープ結合領域を提供することができる(Holt LJ et al., (2003) Trends Biotechnol, 21(11): 484-490; Polonelli Let al.,(2008) PLoS ONE, 3(6): e2371)。非免疫グロブリンに基づくエピトープ結合領域の例は、エピトープ結合領域を操作するための「スカフォールド」として用いられる合成タンパク質ドメイン(Binz HKet al., (2005) Nat Biotechnol, 23(10): 1257-1268)又はペプチド模倣体(Murali R & Greene MI (2012) Pharmaceuticals, 5(2): 209-235)に見出すことができる。好ましくは、用語「エピトープ結合領域」は、一又は複数のエピトープへの免疫グロブリン分子の特異的結合を可能にする結合部位を共に形成する、一又は複数の重鎖可変ドメインと一又は複数の相補的な軽鎖可変ドメインとの組み合わせを含む。本発明に示されるエピトープ結合領域の例は、ｓｃＦｖ及びＦＡＢを含む。
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」は、動物において、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性又は免疫原性活性を有するポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子の断片を含む。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチド又はタンパク質の断片である。免疫原性活性を有するエピトープは、当業者にとって周知の任意の方法、例えばイムノアッセイにより決定されるような、抗体又はポリペプチドが特異的に結合するポリペプチド又はタンパク質の断片である。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。好ましくは、本明細書で用いる用語「エピトープ」は、少なくとも約３から５個、好ましくは約５から１０個又は１５個であって約１０００個以下（又はその間の任意の整数）のアミノ酸のポリペプチド配列を指し、それだけで又はより長い配列の一部として、かかる配列に応答して生成された抗体に結合する配列を定義する。断片の長さについて上限臨界値は存在せず、ほぼ完全長のタンパク質配列、又は一若しくは複数のエピトープを含む融合タンパク質さえも含み得る。主題発明における使用のためのエピトープは、由来元の親タンパク質の部分配列と完全に一致する配列を有するポリペプチドに限定されない。したがって、用語「エピトープ」は、天然配列と同一の配列の他、天然配列に対する修飾、例えば欠失、付加、及び置換（一般的に天然では保存的）を包含する。タンパク質抗原のエピトープは、その構造及びエピトープ結合部位との相互作用に基づき、立体構造エピトープ(conformational epitope）と直線状エピトープ(linear epitope)の二のカテゴリーに分けられる(Goldsby R et al., (2003) “Antigens (Chapter 3)” Immunology (Fifth edition ed.), New York: W. H. Freeman and Company. pp. 57-75, ISBN 0-7167-4947-5)。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションから構成される。このエピトープは、抗原の３Ｄ表面特性及び形状又は三次構造に基づき、パラトープと相互作用する。ほとんどのエピトープは、立体構造エピトープである。対照的に、直線状エピトープは、その一次構造に基づき、パラトープと相互作用する。直線状エピトープは、抗原由来の連続的なアミノ酸配列により形成される。
本明細書で用いる用語「ヘテロ二量体免疫グロブリン」又は「ヘテロ二量体断片」又は「ヘテロ二量体」又は「重鎖のヘテロ二量体」は、第一及び第二の領域のような少なくとも第一及び第二のポリペプチドを含む免疫グロブリン分子又はその部分を含み、この場合第二のポリペプチドは第一のポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、二のポリペプチド鎖を含み、第一の鎖は第二の鎖と少なくとも一の非同一領域を有し、両方の鎖はそれらの非同一領域を介して会合、すなわち相互作用する。より好ましくは、ヘテロ二量体免疫グロブリンは、少なくとも二の異なるリガンド、抗原又は結合部位に対して結合特異性を有する、すなわち二重特異性である。本明細書で用いるヘテロ二量体免疫グロブリンは、限定されないが、完全長二重特異性抗体、二重特異性Ｆａｂ、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ領域と融合した二重特異性ｓｃＦｖ、Ｆｃ領域と融合したダイアボディ、及びＦｃ領域と融合したドメイン抗体を含む。
本明細書で用いる用語「ホモ二量体免疫グロブリン」又は「ホモ二量体断片」又は「ホモ二量体」又は「重鎖のホモ二量体」は、第一及び第二の領域のような少なくとも第一及び第二のポリペプチドを含む免疫グロブリン分子又はその部分を含み、この場合第二のポリペプチドは第一のポリペプチドとアミノ酸配列が同一である。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリンは、二のポリペプチド鎖を含み、第一の鎖は第二の鎖と少なくとも一の同一領域を有し、両方の鎖はそれらの同一領域を介して会合、すなわち相互作用する。好ましくは、ホモ二量体免疫グロブリン断片は、少なくとも二の領域を含み、第一の領域は、第二の領域と同一であり、また両方の領域は、そのタンパク質−タンパク質界面(protein-protein interfaces)を介して会合、すなわち相互作用する。
本発明に含まれるすべての免疫グロブリン定常領域に関して、番号付けは、ＩＭＧＴ（登録商標）（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に従って行うことができる。
ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、及びＩＧＨＧ４からなる群より選択されるすべてのヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常領域に関して、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」(Edelman GM et al., (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85)に従って行うことができる。ＩＧＨＧ１のヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３定常領域の完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に見出すことができる。
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＫＣ）に関して、番号付けは、「ＥＵ番号付けシステム」（上掲のEdelman GMら）に従って行うことができる。ヒトＣＫ領域の完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に見出すことができる。
ヒトラムダ免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７）に関して、番号付けは、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」（上掲のKabat EAら）に従って行うことができる。ヒトＩＧＬＣ領域の完全な対応は、ＩＭＧＴデータベース（上掲のＩＭＧＴ（登録商標））に見出すことができる。
本明細書でいうヒトＩＧＨＧ１免疫グロブリン重鎖定常領域は、次の領域接触を有する：ＣＨ１領域（ＥＵ番号付け：１１８−２１５）、ヒンジｇ１領域（ＥＵ番号付け：２１６−２３０）、ＣＨ２領域（ＥＵ番号付け：２３１−３４０）、及びＣＨ３領域（ＥＵ番号付け：３４１−４４７）。本明細書でいうヒトＣＫ領域は、残基１０８から２１４（ＥＵ番号付け）に及ぶ。本明細書でいうヒトＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、及びＩＧＬＣ７領域は、残基１０８−２１５（Ｋａｂａｔ番号付け）に及ぶ。
本明細書で用いる用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含む。好ましくは、天然アミノ酸が含まれる。
本明細書における用語「修飾」又は「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含む。本明細書で用いる用語「置換」又は「アミノ酸置換」又は「アミノ酸残基置換」は、アミノ酸配列内の第一のアミノ酸残基の第二のアミノ酸残基での置換を指し、この場合、第一のアミノ酸残基は第二のアミノ酸残基とは異なる（すなわち置換アミノ酸残基は置換されたアミノ酸とは異なる）。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、９４位のアルギニンがリジンで置換されているバリアントポリペプチドを意味する。例えば、９４Ｋは、９４位のリジンでの置換を表す。本明細書の場合、多重置換は、スラッシュ又は読点により通常区別される。例えば、「Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖ」又は「Ｒ９４Ｋ、Ｌ７８Ｖ」は、置換Ｒ９４ＫとＬ７８Ｖとを含む二重バリアントを指す。本明細書で用いる「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入−９４は、９４位における挿入を表す。本明細書で用いる「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列内の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位におけるアルギニンの欠失を表す。
特定の実施態様において、プロテインＡへの結合が「減少する」、「低下する」又はその「低下」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のプロテインＡへの結合が全体として少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％、最大１００％（排除）減少することを意味する。ある特定の実施態様において、これらの用語は、代わりに１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１０００倍（すなわち３ｌｏｇ）、１００００倍（すなわち４ｌｏｇ）又は１０００００倍（すなわち５ｌｏｇ）の全体的な減少を意味し得る。
プロテインＡへの結合を「排除する」、「取り除く」、その「排除」又は「除去」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のプロテインＡへの結合が全体として１００％減少することを意味する。
同様に、アフィニティー試薬への結合が「減少する」、「低下する」又はその「低下」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のアフィニティー試薬への結合が全体として少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％、最大１００％（排除）減少することを意味する。ある特定の実施態様において、これらの用語は、代わりに１０倍（すなわち１ｌｏｇ）、１００倍（２ｌｏｇ）、１０００倍（すなわち３ｌｏｇ）、１００００倍（すなわち４ｌｏｇ）又は１０００００倍（すなわち５ｌｏｇ）の全体的な減少を意味し得る。
アフィニティー試薬への結合を「排除する」、「取り除く」、その「排除」又は「除去」という用語は、親、すなわち非修飾免疫グロブリン又は野生型ＩｇＧ、又は野生型ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有するＩｇＧと比較して、標準的な技術の既知の方法（例えば本明細書に記載の方法）により検出される修飾免疫グロブリン又はその断片のアフィニティー試薬への結合が全体として１００％減少することを意味する。
「二重特異性抗体」は、少なくとも二の異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、二重特異性抗体は、親抗体と比較して、ＶＨ領域内に一又は複数のアミノ酸修飾を有する二重特異性抗体である。特定の実施態様において、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。二重特異性抗体はまた、標的抗原を発現する細胞に細胞傷害性剤を局在化させるためにも用いられ得る。このような抗体は、標的抗原結合アームと、細胞傷害性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−ａ、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン等）に結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え製造は、二対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現に基づき、この場合二の重鎖は異なる特異性を有する(Milstein and Cuello, (1983) Nature, 305: 537-40)。免疫グロブリン重及び軽鎖がランダムな取り合わせゆえに、そのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なる抗体分子の混合物を生成する可能性があり、そのうちの一のみが正しい二重特異性構造を有する。アフィニティークロマトグラフィー工程により通常行われる正しい分子の精製は面倒であり、生成物収率は低い。類似の手順が、国際公開第９３／０８８２９号及びTrauneckerらの(1991) EMBO J, 10: 3655-9に開示されている。異なるアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変領域（抗体−抗原結合部位）が免疫グロブリン定常領域配列と融合している。融合は例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とである。特定の実施態様において、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、少なくとも一の融合体中に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体及び（所望の場合には）免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、異なる発現ベクターに挿入され、適する宿主生物内にコトランスフェクトされる。こうすれば、構築で用いられる三のポリペプチド鎖の比率が等しくなく、そのような比が最適な収率を実現するような実施態様においては、三のポリペプチド断片の相互の割合を調整する際に柔軟性が得られる。しかし、少なくとも二のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することで収率が高くなるとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、二又は三すべてのポリペプチド鎖のコード配列を一の発現ベクターに挿入することが可能である。
二重特異性抗体は、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方はアビジンに、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的とするために（米国特許第４６７６９８０号）、またＨＩＶ感染症の治療用に（国際公開第１９９１／００３６０号、国際公開第１９９２／００３７３号、及びＥＰ第０３０８９号）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は、いくつかの架橋法と共に当該技術分野において周知である（米国特許第４６７６９８０号を参照）。二価より多い抗体も企図されている。例えば、三重特異性抗体を調製することできる（Tutt A et al.,(1991)J. Immunol. 147: 60-9を参照）。
プロテインＡ：プロテインＡは、いくつかの系統の黄色ブドウ球菌により産生される細胞壁成分であり、単一のポリペプチド鎖から構成される。プロテインＡ遺伝子産物は、病原体の細胞壁と縦列に並んで連結した５の相同的リピート(homologous repeat)から構成される。５のドメインは、長さ約５８のアミノ酸であり、ＥＤＡＢＣで表され、各々は免疫グロブリン結合活性を示す(Tashiro M & Montelione GT (1995) Curr. Opin. Struct. Biol., 5(4): 471-481)。５の相同的免疫グロブリン結合ドメインは、３ヘリックス束状に折り畳まれている。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質、とりわけＩｇＧに結合することができる(Hober S et al., (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 848(1): 40-47)。プロテインＡは、Ｆｃ領域内でほとんどの免疫グロブリンの重鎖に結合するだけでなく、ヒトＶＨ３ファミリーの場合にはＦａｂ領域内でも結合する(Jansson B et al, (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78)。プロテインＡは、ヒト、マウス、ウサギ、及びモルモットを含む様々な種に由来するＩｇＧに結合するが、ヒトＩｇＧ３には結合しない（上掲のHober Sら(2007)）。ヒトＩｇＧ３がプロテインＡに結合できないのは、ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域内のＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ置換により説明可能である（ＥＵ番号付け、Jendeberg et al., (1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34）。プロテインＡは、ＩｇＧの他に、ＩｇＭ及びＩｇＡとも相互作用する。
ヒトＶＨサブクラスの中でも、ＶＨ３は、プロテインＡに結合する唯一のサブクラスであり(Graille M et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10):5399-5404)、プロテインＡの５のドメインはすべて、この可変ドメインサブクラスに結合することが知られている(Jansson B et al, (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78.)。ＶＨ３ベースの免疫グロブリン又はその断片は、バイオテクノロジー産業にとって多大な重要性を有する。ＶＨ３ベースの分子がプロテインＡに結合する能力は該分子の機能的な事前スクリーニングをし易くするので、ＶＨ３ベースの分子は幅広く開発されており、したがって抗体探索のために用いられる多くの合成若しくはドナーベースのファージディスプレイライブラリー又はトランスジェニック動物技術は、ＶＨ３サブクラスに基づく。さらに、ＶＨ３ベースの分子は、他の既知の重鎖可変ドメインサブクラスよりも良好な発現及び安定性のためにしばしば選択される。
そのように高い親和性で抗体に結合するプロテインＡの能力は、バイオ医薬品においてそれを工業的規模で使用する強い動機付けとなる。バイオ医薬品における抗体の製造のために使用されるプロテインＡは、大腸菌内での組換えにより通常製造され、天然のプロテインＡと実質的に同様に機能する(Liu HFet al., (2010) MAbs, 2(5):480-499)。
最も一般的には、組換えプロテインＡは、抗体精製用の固定相クロマトグラフィー樹脂に結合される。最適な結合はｐＨ８．２で生ずるが、中性又は生理学的状態（ｐＨ７．０−７．６）においても結合は良好である。溶出は、酸性ｐＨ（グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５−３．０）に対してｐＨを変化させることにより通常達成される。この溶出法は、タンパク質構造に永久的な影響を及ぼすことなく、ほとんどのタンパク質−タンパク質及び抗体−抗原結合相互作用を効率的に解離させる。それにもかかわらず、一部の抗体及びタンパク質は、低ｐＨにより損傷を受けることもあり、低ｐＨ条件に置かれる時間を最低限に抑えるために、回収直後に１／１０容量のアルカリ性バッファー、例えば１Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより中和するのが最善である。
様々なプロテインＡクロマトグラフィー樹脂が市販されている。このような媒体間の主な差異は、支持マトリックスのタイプ、プロテインＡのリガンド修飾、ポアサイズ、及び粒子サイズである。このような因子の差異は、吸着剤の圧縮性、化学的及び物理的ロバスト性、拡散抵抗、及び結合能力の差異の原因となる（上掲Hober Sら(2007)）。プロテインＡクロマトグラフィー樹脂の例は、実施例で用いられている、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭプロテインＡ樹脂及びＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭプロテインＡ樹脂を含む（但しこれらに限定されない）。
用語「クロマトグラフィー」は、タンパク質液体クロマトグラフィーを指し、タンパク質の混合物を分析又は精製するのに多くの場合用いられる液体クロマトグラフィーの形態の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含む。その他の形態のクロマトグラフィーと同様に、分離は、混合物の異なる成分が二の物質、多孔性の固体（固定相）とそれを通過する移動流体（移動相）に対して異なる親和性を有するので、可能である。ＦＰＬＣでは、移動相は、水溶液又は「バッファー」である。バッファーの流速は、自然流下で操作可能であるか、又は一定速度に通常保たれる容量型ポンプにより制御可能であり、一方バッファーの組成は、二以上の外部リザーバーから異なる割合で液体を出すことにより変えることができる。固定相は、ビーズから、通常は架橋アガロースから構成される樹脂であり、円筒形のガラス又はプラスチック製のカラムに充填される。ＦＰＬＣ樹脂は、用途に応じて、幅広い範囲のビーズサイズ及び表面リガンドが利用可能である。
「アフィニティークロマトグラフィー」のプロセスは、固定相に架橋していて、かつ特定の分子又は分子のクラスに対して結合親和性を有するリガンドであるアフィニティー試薬の使用を伴う。リガンドは、タンパク質リガンドのような生体分子か又は合成分子であり得る。いずれの種類のリガンドも、良好な特異性を有する傾向がある。製造において最も一般的に用いられるタンパク質リガンドは、アフィニティー試薬のプロテインＡである。アフィニティークロマトグラフィーでは、溶液（例えば目的のタンパク質を含有する粗製細胞上清）をカラム上に充填すると、標的タンパク質は通常吸着される一方で、夾雑物（その他のタンパク質、脂質、炭水化物、ＤＮＡ、色素等）はカラムを通過することができる。吸着剤自体はクロマトグラフィーカラムに通常充填されるが、吸着段階は、バッチ結合モードで撹拌したスラリーとして吸着剤を用いることにより実施可能である。吸着後の次の段階は洗浄段階であり、この段階では、残留夾雑物質を除去するために吸着剤を洗浄する。次いで、結合したタンパク質を半純粋又は純粋な形態で溶出する。溶出は、タンパク質が固定リガンドともはや相互作用できず、遊離するように、バッファー又は塩組成を変更することにより通常達成される。いくつかの例では、目的のタンパク質はアフィニティー樹脂に結合しないこともあり得、アフィニティークロマトグラフィーは望ましくない夾雑物を結合させることに向けられる。そのため、非結合画分を回収して目的のタンパク質を単離する。アフィニティークロマトグラフィーは、固定床又は流動床内でも実施可能である。
用語「勾配モードクロマトグラフィー」は、「溶出」バッファー（バッファーＢ）の割合が漸進的又は段階的に０％から１００％増加するクロマトグラフィー法を指す。
用語「捕捉溶出モード(capture−elution mode)クロマトグラフィー」又は「捕捉溶出精製モード」又は「捕捉溶出精製」は、「溶出」バッファー（バッファーＢ）の割合が漸進的又は段階的に０％から１００％増加するのではなく、捕捉後に１００％でそのまま適用され、任意選択的にランニングバッファー（バッファーＡ）による洗浄工程を伴うクロマトグラフィー法を指す。
ＣＤ３及びＣＤ３８を標的とするヘテロ二量体免疫グロブリンの開発
本発明は、上記のような重及び軽鎖ＣＤＲを含み、かつヒト遺伝子ＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号３７）の産物であるか又はこれに由来する重鎖可変フレームワーク領域をさらに含むＣＤ３タンパク質複合体に結合するエピトープ結合領域を提供する。重鎖可変フレームワーク領域は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体ＯＫＴ３の重鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、７以下、好ましくは６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、なお一層好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施態様において、本開示は、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供するが、この場合重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は３４、４８、４９、５８、６９、７１、及び７３からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、各群メンバーのアミノ酸位置はＫａｂａｔ番号付けに基づいて示される。好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｉ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ、Ｒ５８Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋからなる群より選択される。重鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、３４、４９、及び７１からなる群より選択されるアミノ酸位置にある。重鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔからなる群より選択される。
さらなる態様において、ＣＤ３タンパク質複合体に結合する第一のポリペプチドのエピトープ結合領域は、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号３９）及びＩＧＫＶ３−２０＊０１（配列番号４０）からなる群より選択されるヒト遺伝子の産物であるか又はこれに由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。軽鎖可変フレームワーク領域は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む、対応するマウス抗体ＯＫＴ３の軽鎖可変領域の対応するフレームワーク領域からの少なくとも一のアミノ酸修飾を含む。好ましくは、アミノ酸修飾は、アミノ酸置換である。一般的に、８以下、好ましくは７以下、好ましくは６以下、好ましくは５以下、好ましくは４以下、より好ましくは３以下、なお一層好ましくは２以下、最も好ましくは１以下のアミノ酸修飾が、フレームワーク領域内で実施される。いくつかの実施態様において、本開示は、ＣＤ３タンパク質複合体と結合するエピトープ結合領域を提供するが、この場合軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾は４、３３、３４、４６、４７、６６、７１、及び９６からなる群より選択されるアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。好ましくは、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸置換は、Ｍ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆからなる群より選択される。軽鎖可変領域のフレームワーク領域の好ましいアミノ酸置換は、４、４６、及び４７からなる群より選択されるアミノ酸位置にある。軽鎖可変領域のフレームワーク領域のより好ましいアミノ酸置換は、Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、及びＦ７１Ｙ．からなる群より選択される。いくつかの実施態様において、ＣＤ３タンパク質複合体と結合する第一のポリペプチドのエピトープ結合領域は、上記のような重鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾、及び上記のような軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域のアミノ酸修飾を含み得る。
本開示はまた、配列番号７９から９０、９１−９５、及び６４からなる群より選択され、好ましくは配列番号６４からなる選択される重鎖配列を含むＣＤ３タンパク質複合体に結合する抗体又はその断片も提供する。本開示はまた、配列番号９６から１０４、１０５から１２６、１２７、１２８、及び１２９からなる、好ましくは配列番号１２７からなる群より選択される軽鎖配列を含むＣＤ３タンパク質複合体に結合する抗体又はその断片も提供する。
このような重及び軽鎖可変領域配列の各々がＣＤ３タンパク質複合体に結合可能であることを踏まえれば、重及び軽鎖可変領域配列を「混合してマッチさせ」て、本発明の抗ＣＤ３結合分子を作り出すことができる。かかる「混合してマッチさせ」た抗体のＣＤ３結合は、例えば実施例に記載のような結合アッセイを用いて試験可能である。
ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を促進する免疫グロブリン定常領域の操作
ヘテロ二量体免疫グロブリンを製造する方法は、当該技術分野において知られており、最も単純な方法の一つは、単一細胞内での二の異なる免疫グロブリン鎖の発現を利用することである（国際公開第９５／３３８４４号、Lindhofer H & Thierfelder S）。操作を用いないこの単純な方法は、目的のヘテロ二量体よりもホモ二量体種が形成されることにより制限される(Kufer P et al., (2004) Trends Biotechnol., 22(5): 238-244)。重鎖のヘテロ二量化を強化する補完的な技術(Merchant AM et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16(7): 677-681)を用いると、より多くのヘテロ二量体の製造が実現し得るが、なおも顕著な量の望ましくないホモ二量体の製造を引き起こす(Jackman J et al., (2010) J Biol Chem., 285(27):20850-9, Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6):653-63)。それゆえ本発明は、ＢＥＡＴ（登録商標）法に記載されている方法を利用するが（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２／１３１５５５号）、同方法は先行技術の方法よりも優れたヘテロ二量体化を示すバイオミミクリーという独自の概念に基づく。ＢＥＡＴ法は、天然ホモ又はヘテロ二量体免疫グロブリンドメイン対間の界面交換に基づき、Ｆｃベースの二重特異性抗体の構成要素として利用可能な新規のヘテロ二量体を作り出す。
一態様において、本発明は、第一及び第二のポリペプチドを含むヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は、３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、また第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８４．４位に、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む。
さらなる実施態様において、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ、操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８８位、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、また第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は８５．１位及び／又は８６位、並びに３、５、７、２０、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８８、及び９０（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域の８８位で置換されたアミノ酸残基は第二の操作された免疫グロブリン定常領域の８５．１位及び／又は８６位で置換されたアミノ酸残基と相互作用しており、ここで各群メンバーのアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で８８位において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗ及びその保存的なアミノ酸置換であり、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。より好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で８８位において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗであり、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２０Ｖ、２０Ｔ、２０Ａ、２０Ｎ、２０Ｑ、２０Ｅ、２０Ｓ、２０Ｋ、２０Ｗ、２２Ａ、２２Ｇ、２２Ｔ、２２Ｌ、２２Ｉ、２２Ｖ、２６Ｒ、２６Ｑ、２６Ｔ、２６Ｋ、２６Ｖ、２６Ｓ、２６Ｎ、２６Ｅ、７９Ｙ、８５．１Ｔ、８５．１Ｍ、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｒ、８５．１Ｈ、８５．１Ｋ、８５．１Ｆ、８５．１Ｃ、８５．１Ｎ、８５．１Ｗ、８６Ｓ、８６Ｉ、８６Ｔ、８６Ｈ、８６Ｑ、８６Ｖ、８６Ｗ、８６Ｙ、８６Ｆ、及び９０Ｎからなる群より選択され、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
好ましくは、第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で８５位及び８６位において置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｃ、及び８６Ｓ並びにそれらの保存的なアミノ酸置換からなる群より選択される（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。より好ましくは、第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｃ、及び８６Ｓからなる群より選択され、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、２６Ｔ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８８Ｒ、及び９０Ｒ並びにそれらの保存的なアミノ酸置換からなる群より選択される（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。
好ましい実施態様において、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８８位において置換されるアミノ酸残基は、８８Ｗであり、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２０Ｋ、２２Ｖ、２６Ｔ、７９Ｙ、８５．１Ｓ、８６Ｖ、及び９０Ｎであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、８５．１位及び８６位において置換されるアミノ酸残基は、８５．１Ａ、８５．１Ｓ又は８５．１Ａ、及び８６Ｓであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、２６Ｔ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８４．４Ｑ、８８Ｒ、及び９０Ｒである（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。
代替的実施態様において、本発明は、ヘテロ二量体免疫グロブリン又はその断片を提供するが、その第一及び第二のポリペプチドはタンパク質−タンパク質界面を有する修飾ＣＨ３ドメインを持つ、操作された免疫グロブリン定常領域を含み、この場合第一のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は２０位に、並びに３、５、７、２２、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第二のポリペプチドのタンパク質−タンパク質界面は２６位に、並びに３、２２、２７、７９、８１、８４、８５．１、８６、及び８８からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含み、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域内の２０位で置換されるアミノ酸残基は、第二の操作された免疫グロブリン定常領域内の２６位で置換されるアミノ酸残基と相互作用しており、
ここで各群メンバーのアミノ酸位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２０位及び２２位にアミノ酸残基を、また任意選択的に３、５、７、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にさらなるアミノ酸残基を含み、この場合第二の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２６位に、並びに３、５、７、２０、２２、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択されるさらなる位置にアミノ酸残基を含み、ここで各群メンバーのアミノ酸位置は、ＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２０位及び２２位にアミノ酸残基を、また任意選択的に３、５、７、２６、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択される位置にさらなるアミノ酸残基を含み、この場合第二の操作された免疫グロブリン鎖のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるアミノ酸残基は、２６位及び８６位に、また任意選択的に３、５、７、２０、２２、２７、７９、８１、８４、８４．２、８４．４、８５．１、８６、８８、及び９０からなる群より選択されるさらなる位置にアミノ酸残基を含み、ここで各群メンバーのアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
より好ましくは、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で２０位において置換されるアミノ酸残基は、２０Ｖ、２０Ｔ、２０Ａ、２０Ｎ、２０Ｑ、２０Ｋ、２０Ｓ、２０Ｗ、及び２０Ｅからなる群より選択され、この場合第一の操作されたグロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２２Ａ、２２Ｇ、２２Ｌ、２２Ｉ、２２Ｖ、２２Ｔ、２６Ｋ、２６Ｒ、２６Ｑ、２６Ｔ、２６Ｖ、２６Ｓ、２６Ｎ、２６Ｅ、７９Ｙ、８５．１Ｗ、８５．１Ｆ、８５．１Ｔ、８５．１Ｍ、８５．１Ａ、８５．１Ｓ、８５．１Ｒ、８５．１Ｈ、８５．１Ｋ、８５．１Ｃ、８５．１Ｎ、８６Ｗ、８６Ｙ、８６Ｓ、８６Ｉ、８６Ｈ、８６Ｑ、８６Ｖ、８６Ｔ、８６Ｆ、８８Ｑ、８８Ｌ、８８Ｖ、８８Ｒ、８８Ｅ、８８Ｔ、８８Ｉ、８８Ｙ、８８Ｋ、８８Ｗ、及び９０Ｎからなる群より選択され、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で２６位において置換されるアミノ酸残基は、２６Ｔ及び２６Ｅ並びにそれらの保存的アミノ酸置換からなる群より選択され、ここでアミノ酸位置はＩＭＧＴ（登録商標）番号付けに従って示される。
最も好ましい実施態様において、第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２０位において置換されるアミノ酸残基は、２０Ｋであり、この場合第一の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は３Ａ、２２Ｖ、２６Ｔ、７９Ｙ、８５．１Ｓ、８６Ｖ、８８Ｗ、及び９０Ｎであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で、２６位において置換されるアミノ酸残基は、２６Ｔであり、この場合第二の操作された免疫グロブリン定常領域のタンパク質−タンパク質界面内で置換されるさらなるアミノ酸残基は、３Ｅ、５Ａ、７Ｆ、２０Ｔ、２２Ｖ、８１Ｄ、８４Ｌ、８４．２Ｅ、８４．４Ｑ、８５．１Ｃ／Ｓ／Ａ、８６Ｓ、８８Ｒ、及び９０Ｒである（ＩＭＧＴ（登録商標）番号付け）。
実施例１． 材料及び方法
哺乳動物細胞の一過性発現のための発現ベクターの構築
異なるポリペプチド鎖を一部又は全部コードするｃＤＮＡをＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）によって最初に遺伝子合成し、これを標準的な分子生物学技法を用いて修飾した。ＰＣＲ産物を、適切なＤＮＡ制限酵素で消化し、精製し、同じＤＮＡ制限酵素で予め消化しておいたウシホルモンポリアデニル化物(bovine hormone poly-adenylation)（ポリ（Ａ））とＣＭＶプロモーターとを有する修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（スイス、ツークのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）にライゲートした。すべてのポリペプチド鎖を、この発現ベクターに独立にライゲートした。この場合、分泌は、マウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドによって引き起こされた。
組換えタンパク質の発現
抗体、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、ＢＥＡＴ抗体、及び抗原は、別途明示しない限り、以下に記載のように発現した。一過性発現の場合、操作された各鎖と等量のベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；スイス、ブーフスのＳｉｇｍａ）を用いて、懸濁適合ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞（英国、テディントンのＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）にコトランスフェクトした。一般的に、１ｍｌ当たり細胞０．８−１．２百万個の密度で懸濁状態の細胞１００ｍｌを、ＤＮＡ−ＰＥＩ混合物と共にトランスフェクトする。操作された各鎖の遺伝子をコードする組換え発現ベクターを宿主細胞に導入すると、該細胞を４から５日間さらに培養することにより免疫グロブリン構築物が生成されて、培地（０．１％プルロニック酸、４ｍＭ グルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌジェネテシンを補充した、ＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地（Ｓｉｇｍａ））中への分泌が可能となる。分泌された免疫グロブリンを含有する無細胞培養上清を、遠心分離とその後の滅菌濾過により調製し、さらなる分析で用いた。
ディファレンシャルプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
生成後、０．２Ｍ リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で事前に平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐＴＭ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅＴＭプロテインＡカラム上に無細胞上清を充填し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒＴＭクロマトグラフィーシステム（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ製；カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）で、流速１ｍｌ／分で稼働させた。ランニングバッファーは、０．２Ｍ リン酸クエン酸バッファー（ｐＨ６）であった。目的のヘテロ二量体の溶出を、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４）を用いて実施する一方、ホモ二量体種を０．１Ｍ グリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。
溶出後、２８０ｎｍでのＯＤ読み取りを行い、目的のヘテロ二量体を含有する画分をプールし、０．１容量の１Ｍ トリス（ｐＨ８．０）（Ｓｉｇｍａ）で中和した。
上清、通過画分、及び溶出分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４−１２％アクリルアミド、スイス、バーセルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）により非還元条件下で分析した。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
熱量測定法を用い、抗体の熱安定性を比較した。熱量測定を、ＶＰ−ＤＳＣ示差走査式マイクロカロリメーター(differential scanning microcalorimeter)（スイス、グラットブルックのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）で実施した。細胞容積は０．１２８ｍｌであり、加熱速度は１℃／分であった。また、過剰圧力は６４ｐ．ｓ．ｉに保った。タンパク質断片はすべて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１−０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で用いた。各タンパク質のモル熱容量を、同一のバッファーを含有するがタンパク質が省略された重複試料との比較により見積もった。部分的なモル熱容量及び融解曲線を、標準手順を用いて分析した。サーモグラムは、ベースライン補正し、濃度を正規化した後、Ｏｒｉｇｉｎ ｖ７．０ソフトウェア内の非二状態モデル(Non-Two State model)を用いてさらに分析した。
ヒトＩｇＧサブクラスについて予測される融解プロファイルは、既知であり(Garber E & Demarest SJ (2007) Biochem Biophys Res Commun, 355(3): 751-7)、またすべてのプロファイルは、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＦＡＢドメインの独立したアンフォールディングに対応する三のアンフォールディング転移(unfolding transition)を含有することが示されている。４のヒトＩｇＧサブクラスのうち、ＩＧＨＧ１は、最も安定なＣＨ３ドメインを有し（〜８５ｏＣ）、一方、その他のサブクラスのＣＨ３ドメインは、いずれも７０℃未満で融解するかは不明であるが、それほど安定ではない。同様に、すべてのサブクラスは、ＣＨ２ドメインについて〜７０ｏＣの融解温度を有することが知られている。
キャピラリーゲル電気泳動による精製評価
非還元試料調製
４０μｇの脱塩したタンパク質試料を、５ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を含有するＳＤＳ試料バッファー（スイス、ニヨンのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ．Ａ．；ＩｇＧ Ｐｕｒｉｔｙ Ｋｉｔ、カタログ番号Ａ１０６６３）中で緩衝した。１０ｋＤａの内部標準をこの試料に添加した。試料混合物を、７０℃で１０分間加熱した。
キャピラリーゲル電気泳動
試料調製後、２２０ｎｍに設定したフォトダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）が取り付けられたＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＡ ８００（スイス、ニヨンのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓ．Ａ．）で、試料を測定した。ＩＤ５０μｍ×３０．２ｃｍ（検出器までの有効長さ２０．２ｃｍ）のベア溶融シリカキャピラリー(bare-fused silica capillary)を分離メディウムとして用いた。試料注入及び分離を、ＳＤＳ−分子量ゲルバッファー中にて、逆極性で、それぞれ５及び１５ｋＶの定電圧で実施した。２Ｈｚの速度でデータを記録し、電流は分離の間中、安定であった。キャピラリー及び試料を２５℃にサーモスタット制御した。
ＳＰＲによる親和性測定
ＳＰＲ分析を用いて、異なる抗体（マウス及びヒト化抗体）の結合反応速度に関する結合及び解離速度定数を測定した。抗体の結合反応速度は、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置（スイス、グラットブルックのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）で室温で測定し、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１、ＢＩＡｃｏｒｅ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いて分析した。
測定は、市販のアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、カタログ番号：ＢＲ−１０００−５０）を使用して、目的のリガンドと個々に結合したＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、カタログ番号：ＢＲ−１０００−１４）で実施した。プロテインＧリガンドは、Ｐｉｅｒｃｅ（スイス、ローザンヌのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ、カタログ番号：２１１９３）からのものであった。
示されている通り、データ（センサーグラム：ＦＣ２−ＦＣ１）は、物質移動の有無にかかわらず１：１ラングミュアモデルを用いてフィットさせた。捕捉実験では、各測定の開始時に、実験変動を考慮して、すべてのフィッティングにおいてＲｍａｘ値をローカルに設定した。解離時間は、少なくとも３５０秒であった。測定は３連で実施し、参照のためにゼロ濃度試料を含めた。カイ２及び残差の値をともに用いて、実験データと個別の結合モデルとの間のフィッティングの質を評価した。
ＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞の親和性測定
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（ドイツ、ブラウンシュワイクのＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ４８３）を、ＦＡＣＳ染色用のＣＤ３陽性細胞株として用いた。ＨＰＢ−ＡＬＬを、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０中で維持した。キメラＯＫＴ３抗体及びヒト化バリアントの１００μｌ希釈系列を、氷上で４５分間（ＦＡＣＳバッファとしてで参照）、１％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳバッファーという）を補充したＰＢＳ中の４×１０５ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞とともにインキュベートした。無関係のヒトＩｇＧ１をアイソタイプコントロールとして、またキメラＯＫＴ３抗体をポジティブコントロールとして使用した。洗浄後、細胞を氷上で４５分間、抗ヒトＦｃ−ＰＥ（オーストリア、ウィーンのＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の１／２００希釈物とともにインキュベートした。次いで、細胞を再び洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。各試料の相対平均蛍光発光を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（スイス、アルシュヴィルのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。結果を、キメラＯＫＴ３抗体と比較したＨＢＰ−ＡＬＬの相対的染色として、図１に要約する。
インビトロアッセイ用の細胞株
ヒトＣＤ３８陽性細胞株
ＣＤ３８抗原を発現するヒト細胞は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００５１０３０８３号、国際公開第２００８０４７２４２号、国際公開第２０１１１５４４５３号、及び国際公開第２０１２０９２６１２号に記載されている。本明細書で使用されるＣＤ３８陽性ヒト細胞株は以下の通りであった。
安定な組換えＣＨＯ［ＣＤ３８］細胞
Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツのベルリン、カタログ番号：ＩＲＡＵ３７Ｄ１１、４３０９０８６）で注文したヒトＣＤ３８をコードする遺伝子。ヒトＣＤ３８は、コザック配列、開始コドン、それに続いてシグナルペプチド（マウスのＶリーダー）を５’末端に、ＮｈｅＩ制限部位３’末端に付加したプライマーを用いて増幅させた。アンプリコンを、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、自社で開発したｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）由来のベクターであるｐＴ１の発現カセットにクローニングした。ｐＴ１の発現カセットは、多シストロン性ｍＲＮＡ上の二のＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を用い、目的の遺伝子の発現をＧＦＰ及びＰＡＣ（ピューロマイシン耐性のための遺伝子）の発現と結び付ける。プラスミドのミディプレップを調製した。また、クローンＣＤ３８のオープンリーディングフレームをＤＮＡ配列決定により確認した。懸濁ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）を、５０ｍＬバイオリアクター式（ＴｕｂｅＳｐｉｎ５０バイオリアクター、スイス、トラザーディンゲンのＴＰＰ）中でポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、フランス、イルキーチュのＰｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を用いてトランスフェクトした。この目的のために、指数増殖細胞をＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ、カタログ番号：３１９８５−０４７）に播種した。これらの細胞にＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体を添加した。エキソサイトーシスのために振とう（２００ ＲＰＭ）下３７℃でＪｅｔＰＥＩ（登録商標）：ＤＮＡ複合体とともに５時間インキュベートした後、４ｍＭ Ｇｌｎを補充した１容量の培地ＰｏｗｅｒＣＨＯ２（スイス、ベットラッハのＬｏｎｚａ、販売店ＲＵＷＡＧ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：ＢＥ１２−７７１Ｑ）を細胞懸濁液に添加した。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２及び８０％湿度の振とうプラットフォーム上でインキュベートした。トランスフェクションの１日後、ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ８８３３−２５ｍｇ）を含有する選択培地中に異なる濃度で、細胞を９６ウェルプレートに播種した。静状態で約１４日間の選択後、ＴｕｂｅＳｐｉｎ ５０バイオリアクターを用いて、４６個の高ＧＦＰ発現細胞プールを懸濁培養物として増やした。懸濁液にうまく適合したら、細胞のＣＤ３８についての分析をＦＡＣＳにより行った。均一なＣＤ３８染色プロフィールを有する安定なＣＨＯ［ＣＤ３８］クローンを選択し、ここで使用した。
その他のＣＤ３８陽性細胞株は以下を含む。
ＮＣＩ−Ｈ９２９（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−９０６８）。
Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＲＬ−１４３２）。
Ｕ２６６（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＴＩＢ−１９６）
ＲＰＭＩ ８２２６（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−１５５）。
培養条件：１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）、及び１％ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地
Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−８６）
Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準品；カタログ番号：ＣＣＬ−２１３）
組換え標的抗原
ヒトＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃ融合タンパク質
２６残基ペプチドリンカー（配列：ＧＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＳ；配列番号１６９）によりヒトＣＤ３イプシロン細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０７７６６、残基２２−１１８（配列番号１８５））と融合した、ヒトＣＤ３ガンマ細胞外領域をコードするｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０９６９３ 残基２３−１０３（配列番号１８４）；UniProt Consortium (2013) Nucleic Acids Res., 41（データべース特集号(Database issue）):D43-7；http://www.uniprot.org/）を、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧ（ドイツ、レーゲンスブルク）により最初に合成した。この合成遺伝子を、標準的なオーバーラップＰＣＲ法を用いてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分と融合させ、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ｃＤＮＡテンプレートもＧｅｎｅａｒｔ ＡＧから入手した。得られたｃＤＮＡを上記修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングした。
ＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃタンパク質（配列番号１７０）の一過性発現のために、組換えベクターを上記のようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて懸濁液適合ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。次いで、組換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ培地（スイス、グラットブルックのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いて、ＣＤ３ガンマ−イプシロン−Ｆｃ構築物を無細胞上清から精製し、さらなる分析に使用した。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン １−２６＿Ｆｃ融合タンパク質
ヒトＣＤ３イプシロンペプチド１−２６をコードするｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０７７６６、アミノ酸２３−４８、配列番号１７１）及びカニクイザルＣＤ３イプシロンペプチド１−２６（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９５ＬＩ５、アミノ酸２２−４７、配列番号１７２）をコードするｃＤＮＡを、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン細胞外領域それぞれについて、ＧＥＮＥＡＲＴ ＡＧから入手した合成ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。続いて、増幅された産物を、標準的なオーバーラップＰＣＲ法を用いてヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分と融合させた。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ ｃＤＮＡテンプレートは、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧから入手した。得られたｃＤＮＡを上記修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングした。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン構築物（それぞれ、配列番号１７３及び１７４）の一過性発現のために、組換えベクターを上記のようにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて懸濁液適合ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。次いで、組換えＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ培地（スイス、グラットブルックのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いて、ＣＤ３イプシロン融合構築物を無細胞上清から精製し、さらなる分析に使用した。これらの二の融合タンパク質は、本明細書において、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質と称される。
ヒト及びカニクイザルＣＤ３８細胞外領域
ヒトＣＤ３８のｃＤＮＡをＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツのＥｒｗｉｎ−Ｎｅｇｅｌｅｉｎ−Ｈａｕｓ、カタログ番号：ＩＲＡＵ３７Ｄ１１、４３０９０８６）から得、その細胞外領域（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２８９０７ 残基４３−３００）をＰＣＲ増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｇ）由来の自社製発現ベクターにクローニングした。この発現ベクターは、コザック配列及び開始コドン、それに続いて、多重クローニング部位の５’末端に対するマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチド及び３’末端に対する６−Ｈｉｓ−タグを包含した。６−Ｈｉｓ−タグと融合したヒトＣＤ３８の可溶性細胞外領域（配列番号１７５）は、次のように発現させ、精製した：ＨＥＫ細胞、０．１％プルロニック酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）、発現ベクター、及びポリエチレンイミン（ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）、フランス、イルキーチュのＰｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を含有する１容量のＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｅ１５−０３９）を３７℃、５％ＣＯ２及び８０％湿度の振とうフラスコ中でインキュベートした。６ｍＭのグルタミンを補充した１容量のＥｘＣｅｌｌ２９３培地を４時間後に混合物に添加し、さらに５日間インキュベーションを続けた。ポストプロダクション、無細胞上清を遠心分離により調製し、０．２μｍフィルターを用いて濾過し、１Ｍトリス（ｐＨ８．７）を用いてｐＨを７．４（４℃）に調整した。Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｅｘｃｅｌｌビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７−３７１２−０３）を溶液に添加し、撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。自然流下による精製(gravity-flow purification)のために、その溶液をＥｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ（スイス、ライナハのＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＡＧ、カタログ番号：７３７−４２５２）に充填した。ビーズをＰＢＳ（２×）、２０ｍＭイミダゾールで洗浄し、タンパク質をＰＢＳ、５００ｍＭイミダゾール中で溶出させた。溶出画分をプールし、４℃で２回の透析工程によりバッファーをＰＢＳと交換した。精製したヒトＣＤ３８細胞外領域を、０．２２μｍシリンジフィルターを用いて濾過した。
上記の方法を用いて、６−Ｈｉｓ−ｔａｇ（配列番号１７６）と融合したカニクイザルＣＤ３８抗原の可溶性細胞外領域をクローニングし、発現させ、精製した。
インビトロＴ細胞リダイレクトキリングアッセイ(redirection killing assay)
末梢血単核細胞の調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を製造するために、ヒト白血球含有血液フィルターをスイス、Ｌａ Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓの血液採集センター(Blood Collection Centre)（Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ ｅｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｄｅ Ｓｅｒｏｌｏｇｉｅ，ｒｕｅ Ｓｏｐｈｉｅ−Ｍａｉｒｅｔ ２９，ＣＨ−２３００）から集めた。１０Ｕ／ｍｌのリケミン(liquemin)（スイス、ルツェルンのＤｒｏｓｓａｐｈａｒｍ ＡＧ）を含有する６０ｍｌのＰＢＳとともにバックフラッシングすることにより、細胞をフィルターから除去した。次いで、５０ｍＬのＢｌｏｏｄ−Ｓｅｐ−Ｆｉｌｔｅｒ Ｔｕｂｅ（スイス、バーゼルのＢｒｕｎｓｃｈｗｉｇ）を用い、製造者の指示通りにＰＢＭＣを精製した。室温で８００ｇで２０分間、管を遠心分離し（ブレーキなし）、細胞を界面から回収した。ＦＢＳ又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含まないロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ、オーストリア、パッシングのＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）培地で細胞を３回洗浄した。ＲＤＬ培地（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ）中に１０ｅ６細胞／ｍＬでＰＢＭＣを再懸濁させ、アッセイ前に５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で一晩培養した。
Ｔ細胞調製
Ｔ細胞精製は、ｐａｎ−Ｔ細胞単離キットＩＩ（ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのＭｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、カタログ番号１３０−０９１−１５６）を使用し、製造業者の支持通りにＰＢＭＣ単離後すぐに行った。精製後、Ｔ細胞をＲＤＬ培地中に１０ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁させ、アッセイ前に５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で一晩培養した。
アッセイ読み取り
かなり類似した結果の二の異なる読み取りを使用して、リダイレクトキリングを定量化した。
フローサイトメトリー法は、本明細書ではＲＤＬ−ＦＡＣＳ法と称され、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈ Ｂら（(2005) Cancer Res, 65: 2882-2889), Moore PA et al. ((2011) Blood, 117(17): 4542-51)及びFriedrich M et al. ((2012) Mol Cancer Ther, 11: 2664-2673)に記載されるように蛍光サイトメトリーに基づく。標的細胞を回収し、計数し、１回洗浄し、ＰＢＳ＋１μＭのカルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｓｉｇｍａ）に５×１０ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁させた。細胞を、５分毎に穏やかに攪拌しながら３７℃で１５分間インキュベートした。ＣＦＳＥ負荷細胞をＲＤＬ培地で３回洗浄し、ＲＤＬ培地に２×１０ｅ５細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＰＢＭＣを回収し、計数し、２×１０ｅ６細胞／ｍＬ ＲＤＬ培地に再懸濁させた。抗体の段階希釈液（３×溶液）をＲＤＬ培地中で調製した。標的細胞（５０μＬ／ウェル）、Ｔ細胞（５０μＬ／ウェル）、及び３×抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を平底９６ウェルプレート（スイス、トラザーディンゲンのＴＰＰ）に分配した。エフェクター：標的比は、１０：１であった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００ｇで３分間遠心分離し、プレートをフリックすることにより上清を捨てた。プレートを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、再び遠心分離し、ＰＢＳは捨てた。予め加温したＡｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＧ）を添加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。１００μｌのＲＤＬ培地の添加後に上下にピペッティングすることにより、剥離、接着細胞を再懸濁させた。溶液をＵ字底型９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に移した。Ｕ字底型プレートを３００ｇで３分間遠心分離し、上清を捨て、１／４０希釈で７−ＡＡＤ（スイス、アルシュヴィルのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＡＧ）を補充した冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１０％バーゼン液）２００μｌに細胞を再懸濁させた。プレートは、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（スイス、ツークのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＧ）ですぐに得られた。各ウェルについて、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）ソフトウェア（ドイツ、ベルギッヒグラヂバッハのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を用いてＣＦＳＥ陽性７ＡＤＤ陰性集団をゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベートした条件を用いて、各試料の特異的細胞傷害性のパーセンテージを決定した。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（米国、カリフォルニア州ラホヤのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形変動傾き回帰法(nonlinear variable slope regression method)を用いて決定した。特定のリダイレクト溶解（ＲＤＬ）のパーセンテージは、試験抗体が添加された状態に対する抗体のない状態の特異的細胞傷害性のパーセンテージを差し引くことによって計算した。
ＲＤＬ−ＭＴＳ法と本明細書で称される細胞生存率法は、Ｂｕｈｌｅｒ Ｐら((2008) Cancer Immunol Immunother, 57: 43-52)、Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦら((2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): 5145-50)、及びＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１２１４３５２４号に記載されているような、細胞生存率を評価するための比色法に基づく。標的細胞を回収し、計数し、１回洗浄し、ＲＤＬ培地に２×１０ｅ５細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＰＢＭＣを回収し、計数し、２×１０ｅ６細胞／ｍＬ ＲＤＬ培地に再懸濁させた。抗体の段階希釈液（３×溶液）をＲＤＬ培地中で調製した。標的細胞（５０μＬ／ウェル）、Ｔ細胞（５０μＬ／ウェル）、及び３×抗体溶液（５０μｌ／ウェル）を平底９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に分配した。エフェクター：標的比は、１０：１であった。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を捨て、プレートを２００μＬのＰＢＳで３回洗浄してＰＢＭＣを除去し、次いで１００μｌのＲＤＬ培地を各ウェルに添加した。読み取りは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）キット（ドイツ、ジューベンドルフのＰｒｏｍｅｇａ ＡＧ）を用い、製造者の指示に従って行った。簡潔には、１０−２０μｌのＭＴＳ試薬を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター内で２−６時間インキュベートした。次いで、４９０ｎｍの吸光度をＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ プレートリーダー（スイス、ルツェルンのＢｉｏＴｅｋ ＡＧ）で読み取った。式：特異的殺傷率＝１００×［（ＳＤ−Ｓｐ）／（ＳＤ−ＭＤ）］を用いて特異的殺傷率を算出した。ＳＤは、標的細胞を単独でインキュベートした自然死状態で測定した吸光度である。Ｓｐは、各試験条件（標的細胞＋ＰＢＭＣ＋抗体）で測定された吸光度である。ＭＤは、標的細胞を３回の凍結及び融解サイクルにより溶解させた最大死状態で測定した吸光度である。特定のリダイレクト溶解（ＲＤＬ）のパーセンテージは、試験抗体が添加された状態に対する抗体のない状態の特異的細胞傷害性パーセンテージを差し引くことによって計算した。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形変動傾き回帰法を用いて決定した。
実施例２： ヒトＣＤ３抗原及びＣＤ３８抗原を標的とする抗原結合部位
２．１ ヒトＣＤ３抗原に対する抗原結合部位
ヒトＣＤ３イプシロンサブユニットは、二重特異性の関与を介してＴ細胞リダイレクトキリングを引き起こすように選択された。
２．１Ａ マウスＯＫＴ３抗体のヒト化バリアント
本明細書で使用される抗ヒトＣＤ３イプシロン抗原結合部位は、マウスＯＫＴ３抗体（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇにより市販され、その後販売中止されたＭｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３；それぞれ配列番号３８及び４１を有するマウス可変重鎖及び軽鎖ドメイン）。ＯＫＴ３マウス可変ドメインをヒト化し、ｓｃＦｖ及びＦＡＢ断片トとしてフォーマットした。
ヒト化は、ＦＡＢ及びｓｃＦｖフォーマットの両方に適した非常に安定なヒト化バリアントを製造するためにＪｕｎｇ Ｓ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ(1997, Protein Eng, 10(8): 959-66)によって記載された方法に従った。この方法は、ハーセプチン（登録商標）抗体（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２、ｈｕＭＡＢ４Ｄ５−８、トラスツズマブ又は商品名ハーセプチン（登録商標）；米国特許公開第５８２１３３７号；それぞれ配列番号２０及び２１を有する可変重鎖及び軽鎖ドメイン）に見出され、固定フレームワーク上へのヒト化プロセスのワークフローに従う(Almagro JC & Fransson J (2008), Front Biosci, 13: 1619-33)。ハーセプチン（登録商標）抗体はもともと生殖系列フレームワークＶＨ３及びＶＫ１の非常に安定したヒトのファミリーに由来するので、これらの二のファミリーに由来する生殖系列フレームワークは、固定フレームワークの供給源として同等に使用することができる。あるいは、ヒトＶＫ３生殖系列軽鎖フレームワークファミリーは、ＶＫ１の代わりに使用することができる。なぜなら、それも良好な安定性を有するからである(Ewert S et al., (2003) J Mol Biol, 325: (531-553)。マウス抗体に加えて、安定性を改善するために、この固定フレームワーク法を用いてヒト抗体を操作することができる。好ましいのは、それぞれ配列番号３７、３９、及び４０（ＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム(Lefranc MP et al. (1999) Nucleic Acids Res, 27(1): 209-12; Ruiz M et al. (2000) Nucleic Acids Res, 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res, 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res, 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev Comp Immunol, 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64; http://www.imgt.org)に基づく）を有するヒト生殖系列フレームワーク ＩＧＨＶ３−２３＊０４、ＩＧＫＶ１−３９＊０１、及びＩＧＫＶ３−２０＊０１の使用である。
この目的のために、ハーセプチン（登録商標）抗体の可変ドメイン内のＣＤＲをマウスＯＫＴ３抗体由来のＣＤＲでそれぞれ置換し、マウスＯＫＴ３抗体のキメラに対してベンチマークした第一のヒト化抗体を構築した（可変重鎖及び軽鎖は配列番号１３０及び１３１を有し、本明細書ではキメラＯＫＴ３抗体と称する）。
プロトタイプ抗体（配列番号７９及び９６を有する可変重鎖及び軽鎖、ＶＨ／ＶＬと略記される）は、一過性発現試験で産生レベルが増加し、示差走査熱量測定によって測定されたＦＡＢ安定性が増加したが、ヒトＣＤ３イプシロン陽性Ｔ細胞腫瘍株であるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合はなかった（ＦＡＣＳ実験での蛍光強度中央値による評価、材料及び方法のセクションを参照）（図１Ａ）。
可変ドメインの第一のプロトタイプ対の３Ｄモデルに基づいて、次の逆突然変異（ＣＤＲ移植ハーセプチン（登録商標）プロトタイプからマウスＯＫＴ３配列へ）：可変重鎖ドメインのＩ３４Ｍ、Ｖ４８Ｉ、Ａ４９Ｇ、Ｒ５８Ｎ、Ｒ５８Ｙ、Ｉ６９Ｌ、Ａ７１Ｔ、及びＴ７３Ｋ、並びに可変軽鎖ドメインのＭ４Ｌ、Ｖ３３Ｍ、Ａ３４Ｎ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、Ｒ６６Ｇ、Ｆ７１Ｙ、及びＰ９６Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付け）のサブセットを選択し、試験した。Ｒ５８Ｎ置換は、ＣＤＲ移植ハーセプチン（登録商標）プロトタイプからマウスＯＫＴ３への変異に対応する一方、Ｒ５８Ｙ置換は、ＣＤＲ移植ハーセプチン（登録商標）プロトタイプからヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４生殖系列置換に対応することに留意されたい。置換の組み合わせに関する操作の方法は、ＣＤＲ領域への推定上の影響及び／又は可変ドメインのパッキング及び／又は免疫原性の観点から種々な置換の相補性に基づいたものであった。
第一の手法では、すべての候補をヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットした。最良のバリアントは、発現レベル、ＦＡＢ断片の熱安定性、及びＦＡＣＳによるＨＰＢ−ＡＬＬ細胞への結合能に従って選択された。最良のヒト化バリアントは、そのＶＨドメイン内に存在するプロテインＡ結合部位がＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて除去されていた。この操作工程は、抗ＣＤ３ホモ二量体を含まない安全なＴ細胞再標的化ＢＥＡＴ抗体をさらに産生するために必要であった。
ＶＨの逆変異：Ｉ３４Ｍ、Ａ４９Ｇ、及びＡ７１Ｔ、並びにＶＬの逆変異：Ｍ４Ｌ、Ｌ４６Ｒ、Ｌ４７Ｗ、ＩｇＧ４、Ｆ７１Ｙ、及びＩｇＡ２は、親和性を取り戻した。可変ドメインの最良の組み合わせは、親細胞結合の大部分を保持している（図１Ａ−Ｃ）ことから、ＶＨ８／ＶＬ４、ＶＨ８／ＶＬ８、ＶＨ１１／ＶＬ４、及びＶＨ１１／ＶＬ８であった。さらに、ＶＨ８／ＶＬ８（それぞれ配列番号１３１及び１３２を有する可変ドメイン）及びＶＨ１１／ＶＬ８（それぞれ配列番号１３３及び１３２を有する可変ドメイン）のｊ組み合わせは、ＦＡＢ安定性を向上させた（それぞれ＋２．８℃及び＋１．６℃、図１Ｄ）。
最後に、最良のヒト化バリアントもｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体として再フォーマットし、一過性発現させた。バリアントは、このフォーマットでの一過性トランスフェクションにおける相対親和性、安定性、発現レベルの観点からランク付けされた（図１Ｅ）。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合体フォーマットでの可変ドメインの最良の組み合わせは、ＶＨ８−ＶＬ４（配列番号１３５を有するｓｃＦｖ断片）及びＶＨ８−ＶＬ８（配列番号１３６を有するｓｃＦｖ断片）であり、抗体フォーマットで確認された組み合わせに類似していた。両方のｓｃＦｖ断片は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合フォーマットで良好な熱安定性を有した（図１Ｆ）。
２．１Ｂ マウスＳＰ３４抗体のヒト化バリアント
マウス抗体ＳＰ３４は、１９８５年に最初に記述された(Pessano S et al., (1985) EMBO J, 4(2):337-44)。それは、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞からの変性タンパク質抽出物で免疫したマウスから得られたハイブリドーマによって産生され、該抗体はヒト特異性及びカニクイザルに対する交差反応性を有する。
上記の実施例に記載された方法及びワークフローに従って、配列番号１を有するＶＨドメインと、配列番号２を有するＶＬドメインとを有するマウスＳＰ３４抗体のヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ３生殖細胞系フレームワークへのＣＤＲ移植を介して操作した。得られたＶＨ３ベースの可変ドメインは、ＢＥＡＴ抗体フォーマットにおけるその用途に応じて、Ｇ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を用いてプロテインＡに対する結合をさらに除去することができる。
この目的のために、生殖系列ＶＨ３重鎖ドメイン及び生殖系列ＶＫ３軽鎖ドメインを有するヒト抗体の可変ドメイン内のＣＤＲをそれぞれマウスＳＰ３４抗体由来のＣＤＲで置換した第一のヒト化抗体を構築した。得られたヒト化抗体は、さらなる親和性の改善のための開始点として使用され、ＳＰ３４抗体のキメラ（それぞれ配列番号１３７及び１３８を有する重鎖及び軽鎖、本明細書ではキメラＳＰ３４抗体と称される）に対してベンチマークされた。
プロトタイプの抗体（配列番号９１及び１０５を有する可変重鎖及び軽鎖、ＶＨ１／ＶＬ１と略記される）は、ヒトＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対する低結合性を有した（ＳＰＲによる評価、材料及び方法のセクション並びに図２Ａ参照）。
可変ドメインの第一のプロトタイプ対の３Ｄモデルに基づいて、ＣＤＲ移植ヒト生殖系列ＶＨ３／ＶＫ３プロトタイプとマウスＳＰ３４配列（ヒト対マウスまたはマウス対ヒト）間の逆突然変異か、合理的に設計されたアミノ酸変化のいずれかに対応する置換のサブセットが選択された。次の変更を行い、様々な組み合わせで試験した：可変重鎖ドメインにおけるＷ１００ｅＦ及びＷ１００ｅＹ、並びに可変軽鎖におけるＡ２Ｉ、Ｓ２５Ａ、Ｔ２７Ａ、Ｇ２７ａＡ、Ｖ２７ｃＡ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｅ３８Ｑ、Ｆ４４Ｐ、Ｇ４６Ｌ、Ｔ５１Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｒ５４Ａ、Ｐ５６Ａ、Ｌ６６Ｇ、Ｄ６９Ｔ、Ｆ８７Ｙ、Ｑ８９Ａ、Ｗ９１Ｆ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９４Ａ、及びＱ１００Ｇ（Ｋａｂａｔ番号付け；図２Ａ参照）。置換の組み合わせに関する操作の方法は、ＣＤＲ領域への推定上の影響及び／又は可変ドメインのパッキング及び／又は免疫原性及び／又は哺乳動物細胞における一過性発現への影響の観点から種々な置換の相補性に基づいたものであった。
第一の手法では、すべての候補は、ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットされ、さらにｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質フォーマット（図２Ｂ）で、ＶＨドメイン内に存在するプロテインＡ結合部位がＧ６５Ｓにより除去されたいくつかのバリアントを用いて試験された。最良のヒト化候補は、発現レベル並びにＳＰＲによるヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロン１−２６＿Ｆｃ融合タンパク質への結合能に従って選択された。
意外なことに、ｓｃＦｖとして再フォーマットした場合、ＳＰ３４キメラ及びＨ１Ｌ２１は、ＩｇＧ１フォーマットと比較して、発現の劇的な消失をもたらす（図３）。しかし、ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現は、ＶＨにおける置換Ｗ１００ｅＹとＶＬにおける置換Ｗ９１Ｆとの組み合わせによって増強された（図２Ｂ）。
したがって、ＣＤ３ベースの二重特異性抗体の製造可能性をさらに改善するために、ヒト化ＳＰ３４ ｓｃＦｖをさらに操作した。ＳＰ３４ ｓｃＦｖ−Ｆｃ発現に影響を及ぼす重要な位置を同定するために、アラニンスキャンをＶＬ２１ ＣＤＲにおいて実施した。Ｔ２７Ａ、Ｇ２７ａＡ、Ｖ２７ｃＡ、Ｔ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３０Ａ、Ｎ３１Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｎ５２Ａ、Ｋ５３Ａ、Ｒ５４Ａ、Ｐ５６Ａ、Ｌ９０Ａ、Ｙ９２Ａ、Ｓ９３Ａ、Ｎ９４Ａ、及びＬ９５Ａの改変がなされた。興味深いことに、２９位、３０位（ＶＨ１／ＶＬ２６ 配列番号１３９）及び９５位（ＶＨ１／ＶＬ３４ 配列番号１４０）における置換のみがｓｃＦｖ−Ｆｃ発現を有意に増加させ（図４）、さらにこれらの変異体は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３イプシロンに対する完全な結合を保持する唯一のものであった。
これらの結果に基づいて、軽鎖の２９位、３０位、及び９５位においてより多くの置換を試験した。
２９位及び３０位はすべての異なる可変軽鎖ファミリーにおいて超可変性を示すため、これらの二つの位置を、部位特異的ＰＣＲによってランダムに突然変異させた。製造したすべての突然変異体から、置換Ｔ２９Ａ、Ｔ２９Ｅ、Ｔ２９Ｓ、Ｓ３０Ａ、及びＳ３０Ｄのみが、ヒトＣＤ３イプシロンへの結合を維持しながら、図５ａ及び５ｂの一過性発現レベルを有意に改善した。
別の手法で、当該技術分野において標準構造残基として知られているＬ９５を、可変ラムダファミリーのこのまさに同じ位置で最も頻繁に見出される残基で置換した。Ｌ９５Ａ、Ｌ９５Ｇ、Ｌ９５Ｔ、Ｌ９５Ｓ、Ｌ９５Ｄ、及びＬ９５Ｎの変更がなされた。意外なことに、Ｌ９５Ｇ及びＬ９５Ｔのみが、標的への結合を維持しながら発現を有意に改善した（図５ｃ）。
この研究から、いくつかのヒト化ＳＰ３４ベースのＢＥＡＴを設計し、発現及びＣＤ３イプシロンへの結合について試験した。これらすべての構築物の中で、Ｈ５Ｌ６５（配列番号６９）及びＨ５Ｌ６７（配列番号７０）ｓｃＦｖを含有する二重特異性抗体が、Ｈ５Ｌ３２ ｓｃＦｖベースのＢＥＡＴコントロールと比較して２倍の発現増加を示した（図６）。
Ｈ５Ｌ６５及びＨ５Ｌ６７を、ＩｇＧ１かｓｃＦｖ−ＦｃのいずれかとしてＤＳＣによってさらに特徴付け、Ｈ５Ｌ３２、Ｈ１Ｌ２１、及びＳＰ３４キメラと比較した。Ｈ５Ｌ６５は、ＩｇＧ１と同じくらい優れた熱安定性を示したが、興味深いことにｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの他のヒト化バリアントと比較して５から２℃の増加を示した。（表１）したがって、改善された抗体のインビボ安定性は、インビトロでもそうであるため、増加する。
Figure 2019214582
抗原結合及び組換え発現に関して、重鎖及び軽鎖可変ドメインの好ましい組み合わせは次の通りであった：軽鎖ドメインＶＬ２１（配列番号４６）、ＶＬ３２（配列番号４７）、ＶＬ６５（配列番号４８）、及びＶＬ６７（配列番号４９）と対のＶＨ１（配列番号４２）又はＶＨ２（配列番号４３）又はＶＨ３（配列番号４４）又はＶＨ５（配列番号４５）。
２．２ ヒトＣＤ３８抗原に対する抗原結合部位
ＣＤ３８は、造血細胞及び固形組織に通常見られるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ３８は、様々な悪性血液病においても発現する。Ｔ細胞をリダイレクトしてＣＤ３８陽性がん細胞を殺傷させる二重特異性抗体は、多発性骨髄腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む様々な悪性血液病を治療するのに有用であろう。いくつかの抗ＣＤ３８抗体は、研究試薬又は治療薬候補として記述されている（ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００６０９９８７５号）。最もよく特徴がわかっている抗ヒトＣＤ３８抗体の中には、ＯＫＴ−１０及びＨＢ−７マウスハイブリドーマがある(Hoshino S et al., (1997) J Immunol, 158(2): 741-7)。
第一の手法では、抗ヒトＣＤ３８抗原結合部位は、マウスハイブリドーマＯＫＴ１０（それぞれ配列番号５０及び５３の可変重鎖及び軽鎖）又はＨＢ−７（それぞれ配列番号５１及び５４の可変重鎖及び軽鎖）及びＦＡＢ又はｓｃＦｖ断片としてさらにフォーマット化することができるそれらのヒト化バージョンに由来し得る。実施例２．１に記載の方法及びワークフローに従って、ＨＢ−７ハイブリドーマのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークにＣＤＲ移植することによって操作される。
第二の手法では、Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣ ＆ Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ(Front Biosci, (2008) 13: 1619-33)によって記載されたいわゆるベストフィットヒト化法に従って、ＨＢ−７ハイブリドーマのベストフィットヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを、それぞれヒトＩＧＨＶ４−５９＊０３及びＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１生殖細胞系フレームワーク（上掲のＩＭＧＴ（登録商標）に基づく）上へのＣＤＲ移植を介して操作した。異なる程度の逆突然変異を有するヒト化ＶＨ及びＶＬバリアントをインシリコで調べ、ヒト化ＶＨ及びＶＬの好ましい選択の一をヒトＩｇＧ１フォーマットとして一過性発現させ、本明細書ではヒト化ＨＢ−７ベストフィットＶＨ（配列番号５６）及びＶＬ（配列番号５７）ドメインと呼ぶ。次のマウス逆突然変異を導入した：（ＶＨ）Ｓ３５Ｈ、Ｉ３７Ｖ、Ｉ４８Ｌ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｆ７８Ｖ、Ｙ９１Ｆ、及び（ＶＬ）：Ｍ４Ｌ、Ｌ４８Ｉ、Ｙ４９Ｓ、Ｔ６９Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）。
ヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体（配列番号１４１を有する重鎖及び配列番号１４２を有する軽鎖）は、ＦＡＣＳによってＣＨＯ［ＣＤ３８］組換え細胞を染色した（データは示さず）。ヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体は、ＳＰＲによりアッセイした場合、キメラＨＢ−７抗体（配列番号１４３を有する重鎖及び配列番号１４４を有する軽鎖）と同様のＣＤ３８細胞外領域に対する結合親和性を有した（それぞれ３．６及び２．５ｎＭのＫＤ；図７Ａ（キメラ）及び図７Ｂ（ヒト化））。意外なことに、ヒト化ＨＢ−７ベストフィット抗体は、熱量測定プロファイルから判断した場合、ＦＡＢ断片安定性においてキメラＨＢ−７抗体と比較して有意な増強（＋１４．６℃）をしめした（７６．４℃（キメラ）対９１．０℃（ヒト化）、図７Ｆ）。
第三の手法では、ヒトＣＤ３８細胞外ドメイン及びヒトＣＤ３８＋細胞で免疫したマウスを用いて、ヒトＣＤ３８に対する新規ハイブリドーマ候補を生成した。ハイブリドーマを生成する方法は既知であり、本明細書で使用する方法は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２０１３００８１７１号に開示の方法と同様であった。９Ｇ７マウス抗体候補は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８（それぞれ配列番号５２及び５５を有する可変重鎖及び軽鎖）に対して高い親和性を有した。上掲の実施例に記載の方法に従って、このマウス抗体を最初にヒト化した。ベストフィット法を使用して、生殖系列ＶＨフレームワークＩＧＨＶ２−５＊０９及びＶＫフレームワークＩＩＧＫＶ１−３３＊０１（上掲のＩＭＧＴ（登録商標）に基づく）をヒト化プロセスの開始点として選択した。ＣＤＲ移植後、第一の抗体プロトタイプ（ヒトＩｇＧ１アイソタイプとしてフォーマット、配列番号１４５を有する重鎖及び配列番号１４６を有する軽鎖）は、ＳＰＲにより判断した場合、マウスの親抗体よりわずかに３分の１だけ低い、ヒトＣＤ３８への強力な結合を示した（配列番号１４７を有する重鎖と配列番号１４８を有する軽鎖とを有するキメラ９Ｇ７抗体；キメラ９Ｇ７抗体（データは示していない）及び第一のヒト化プロトタイプ（データは示していない）に対してそれぞれ０．３ｎＭ及び１ｎＭのＫＤ）。親和性は、抗体の可変軽鎖にＦ３６Ｙ逆突然変異（Ｋａｂａｔ番号付け）を導入すると、２倍改善した（得られた抗体は、本明細書では配列番号１４５を有する重鎖と配列番号７４を有する軽鎖とを有するヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体という；ヒトＣＤ３８に対して０．５ｎＭのＫＤ、図７Ｃ）。また、ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体は、キメラ９Ｇ７抗体と比較して、カニクイザルＣＤ３８抗原に対する高い親和性（３．２ｎＭのＫＤ、データは示していない）及び高いＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンからのＦＡＢ Ｔｍ）を示した（ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体及びキメラ９Ｇ７抗体について、それぞれ９４ｏＣ ｖｓ． ８２．２ｏＣ；図７Ｇ参照）。ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体は、配列番号５８を有する重鎖可変ドメインと、配列番号５９を有する軽鎖可変ドメインとを有する。
加えて、９Ｇ７マウス抗体は、ＶＨ３−２３及びＶＫ１生殖系列フレームワークへのＣＤＲ移植を介したベストフレームワーク手法（best-framework approach）に従ってヒト化された。異なる程度の逆突然変異を有するヒト化ＶＨ及びＶＬバリアントをインシリコで調べ、ヒト化ＶＨ及びＶＬの組み合わせの一の好ましい選択をヒトＩｇＧ１抗体として一過性発現させ（得られた抗体は、本明細書では、配列番号１４９を有する重鎖と配列番号１５０を有する軽鎖とを有するヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク抗体と呼ぶ）。次のマウス逆突然変異を導入した：（ＶＨ）Ａ２４Ｆ、Ｖ３７Ｉ、Ｖ４８Ｌ、Ｓ４９Ａ、Ｆ６７Ｌ、Ｒ７１Ｋ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ｖ、及びＫ９４Ｒ、並びに（ＶＬ）Ｆ３６Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付け）。この抗体は、ヒト化９Ｇ７ベストフィット抗体と類似の親和定数を有するヒトＣＤ３８及びカニクイザルＣＤ３８に対する強い結合を示した（ヒト及びカニクイザルＣＤ３８に対して、それぞれ０．４及び１ｎＭのＫＤ；図７Ｄ）。ＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンからのＦＡＢ Ｔｍ）もまた、９Ｇ７ベストフィットＦ３６Ｙヒト化バリアントと非常に類似していた（８９．２℃、図７Ｈ参照）。図７Ｊは、上記の様々なヒト化９Ｇ７抗体を要約している。ヒト化９Ｇ７ベストフレームワーク抗体は、配列番号６０を有する重鎖可変ドメインと、配列番号６１を有する軽鎖可変ドメインとを有する。
第四の手法では、抗体ファージライブラリーをスクリーニングして、ヒトＣＤ３８に対するさらなるｓｃＦｖ断片を生成した。ライブラリーは、天然ヒトＶ遺伝子に基づく多様性を有した。このドナー由来の抗体ファージディスプレイライブラリーは、７０％が自己免疫疾患（脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、脊椎関節症、関節リウマチ、及び強皮症）を有する４８名のヒトドナー由来の血液リンパ球から増幅されたｃＤＮＡを使用した。ライブラリー構築は、Schofieldら(2007, Genome Biol., 8(11): R254)によって記載されたプロトコール従い、合計２．５３×１０ｅ１０クローンの多様性を有した。ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３８を認識するＳｃＦｖ断片を、このドナー由来のファージディスプレイライブラリーから以下のように単離した。組換えに由来するヒト及び／又はカニクイザルＣＤ３８抗原についての一連の選択サイクルの繰り返しにより、ＳｃＦｖ断片を単離した（材料及び方法のセクションを参照のこと）。抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングする方法は、既知である(Viti F et al., (2000) Methods Enzymol, 326: 480-505)。簡潔には、ライブラリーとのインキュベーションの後、予めプラスチックイムノチューブにコーティング（２０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に一晩）又はストレプトアビジンビーズ上に捕捉しておいた固定化抗原（ビオチン標識形態の抗原を使用する場合、選択プロセスを通して５０ｎＭの濃度で捕捉した抗原）に結合したファージを回収し、結合しなかったファージを洗い流した。Marksら(Marks JD et al., (1991) J Mol Biol, 222(3): 581-97)によって記載されているように、結合したファージをレスキューし、選択プロセスを３回繰り返した。２回目及び３回目のパニングから１０００以上のクローンを発現させ、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８抗原に対するＥＬＩＳＡによって分析した。陽性クローンをＤＮＡ配列決定に付し、固有のクローンのいくつかを、ヒトＣＤ３８を発現する細胞株に結合する能力についてさらに分析した。ストレプトアビジンビーズ上に固定されたヒトＣＤ３８抗原のビオチン標識バージョンに対する１回目のパニング及びストレプトアビジンビーズ上に固定されたニクイザルのＣＤ３８抗原ビオチン標識バージョンに対する２回目のパニングに続いて、配列番号６２の可変重鎖配列と配列番号６３を有する可変軽鎖とを有する一の好ましいｓｃＦｖ断片（クローン番号７６７）を、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８の両方に結合する能力のために選択した。ヒトＩｇＧ１抗体としてフォーマットした場合、クローン７６７は、ヒトＣＤ３８に対しては約３００ｎＭ（図７Ｅ）、カニクイザルＣＤ３８に対しては約１．２μＭ（データは示していない）のＫＤを有した（クローン７６７ ＩｇＧ１抗体は、本明細書では、配列番号１５１を有する重鎖と配列番号１５２を有する軽鎖とを有するヒト７６７抗体と称する）。ＦＡＢ熱安定性（ＤＳＣスキャンからのＦＡＢ Ｔｍ）は、７０．２℃であった（図７Ｉ）。クローン７６７ ＶＨドメインは、ＶＨ３ドメインサブクラスに属する。
実施例３： ＣＤ３８／ＣＤ３標的化ＢＥＡＴ抗体
抗ＣＤ３８及び抗ＣＤ３イプシロンアームは、ＢＥＡＴ鎖と融合したｓｃＦｖ断片からなるｓｃＦｖ−Ｆｃ型の重鎖としてか、又は天然抗体のものと類似のＢＥＡＴ鎖と融合したＦＡＢ断片からなる重鎖としてフォーマットすることができる。ＦＡＢベースの重鎖は、機能的抗原結合部位へと組み立てられるために、その同族の軽鎖との会合が必要である。
Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換をＣＨ２領域に導入し、また適切な場合にはＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換（Ｋａｂａｔ番号付け）を使用して、残留プロテインＡ結合を除去した。ヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例を以下のようにフォーマットした。
ヒト化ＨＢ７ベストフィットＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第一の例を次のようにフォーマットした：
抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組合せを用いて、ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１ ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号７２）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５３）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３ ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５４）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＮ８２ａＳ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体という（図８ フォーマットＡ）。
ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体を一過性発現させ、精製し、ＣＤ３８及びＣＤ３イプシロン抗原に対するその親和性、その安定性、及びＴ細胞キリングをリダイレクトするその能力についてインビトロで試験した。ヒトＣＤ３８抗原のＫＤ値は、３．２ｎＭであった（ＳＰＲにより測定；図９Ａ）。二重特異性抗体のＤＳＣプロファイルは、ｓｃＦｖ部分について約６８℃のＴｍを有する良好な熱安定性プロフィールを示した。ＦＡＢ部分のＴｍは、約９１℃であった（図９Ｂ）。
ＣＤ３８発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照）を用いて、リダイレクトＴ細胞キリングを評価した。図１０は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体を用いた、ＲＰＭＩ ８２２６骨髄腫細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。本アッセイでは、エフェクター細胞として精製Ｔ細胞を、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用いたことに留意されたい。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３抗体は、２．２ｐＭのＥＣ５０を有した（２ドナーの平均、インキュベーション４８時間）。
ヒトクローン７６７ ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第二の例は、次のようにフォーマットされた：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３抗体を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１ ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号１３８）と組み立てられた、ｇ１ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号６５）から構成された。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３ ＣＨ２領域、並びにｇ３ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５５）から構成された。この重鎖はヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しなかったが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有したため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去した。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体という（図８ フォーマットＢ）。
ＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体を一過性発現させ、精製し、ＣＤ３８及びＣＤ３イプシロン抗原に対するその親和性、その安定性、及びＴ細胞キリングをリダイレクトするその能力についてインビトロで試験した。ＣＤ３８発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照のこと）を使用し、実施例３．２．１に記載のものと同様のアッセイにおいてリダイレクトＴ細胞キリングを評価した。図１１は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体を用いた、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。本アッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用いたことに留意されたい。ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３抗体は、２４４ｐＭのＥＣ５０を有した（３ドナーの平均、インキュベーション２４時間）。
ヒト化９Ｇ７ベストフレームワークＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３ ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号７７）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号７５又は１５５）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１ ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号６８）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフレームワーク／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
ヒトクローン７６７ ＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の別の例は、次のようにフォーマットされる：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８抗に対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３を操作する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３ ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号６６）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号７８）から構成される。この重鎖はヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含し、したがってプロテインＡとの結合を有しないが、本明細書で使用する重鎖はＶＨ３フレームワークに由来する重鎖可変ドメインを有するため、ＶＨドメインをＧ６５Ｓ置換を含むように突然変異させ、それにより重鎖内のいかなるさらなるプロテインＡ結合部位も除去する。
ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１ ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号６８）から構成される。この二重特異性抗体は、本明細書ではＢＥＡＴ ＣＤ３８−７６７／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という。
実験の第１セットでは、ＢＥＡＴ ９Ｇ７／ＳＰ３４は、ＰＢＭＣと組み合わせた場合にＴ細胞の活性化を示したが、単離された場合はＴ細胞の活性化を示さなかった。
実施例４： 一のＶＨ３ドメインのみを包含するＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴ抗体
ヒト化ＨＢ７／ベストフィットＶＨ及びＶＬ配列を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の例は、次のようにフォーマットされた：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３ ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号７２）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号７１）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインＡへの結合を有しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１ ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５７）から構成された。この重鎖及び軽会合体は、ＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８１１９５６５号に記載されているような抗ヒトＣＤ３イプシロン抗体（ＳＰ３４）のヒト化バージョンを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書ではＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体という（図１２ フォーマットＡ）。
このＢＥＡＴ ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体の、ＣＤ３８＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞株Ｄａｕｄｉをキリングアッセイに用いた。図１３は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体による、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また２４時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＨＢ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４）抗体が、１．８ｐＭのＥＣ５０（３ドナーの平均）を有するＤａｕｄｉ ＣＤ３８＋細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
ヒト化９Ｇ７ベストフィットＶＨ及びＶＬ配列（それぞれ、配列番号５８及び５９）を用いてヒトＣＤ３８抗原及びヒトＣＤ３イプシロンの両方を標的とするＢＥＡＴ抗体の第二の例は、次のようにフォーマットされた：抗ヒトＣＤ３イプシロン及び抗ヒトＣＤ３８アームに対する抗原結合部位（それぞれ実施例２．１及び２．２に記載）の組み合わせを用いて、ＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３を操作した。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３８アームは、可変重鎖領域、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ３ ＣＨ２領域、並びにその同族軽鎖（配列番号７４）と組み立てられた、ｇ３ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号７３）から構成された。この重鎖は、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含し、非ＶＨ３ドメインサブクラスに由来する重鎖可変ドメインを有したため、プロテインＡへの結合を有しなかった。ヘテロ二量体免疫グロブリンの抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、ｓｃＦｖ断片、ＣＨ１ ｇ１領域、ｇ１ヒンジ領域、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換（ＥＵ番号付け）を有するｇ１ ＣＨ２領域、並びにｇ１ベースのＢＥＡＴ ＣＨ３ドメインを包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１５８）から構成された。この二重特異性抗体のアームは、実施例２．１に記載のヒト化ＳＰ３４ ＶＨ５／ＶＬ３２抗体の可変ドメインを包含した。このＢＥＡＴ抗体フォーマットは、本明細書ではＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体という（図１２ フォーマットＢ）。ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体は、ヒトＣＤ３ １−２６＿Ｆｃ融合タンパク質に対して１８ｎＭのＫＤ値を有した（図１４）。
このＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体の、ＣＤ３８＋細胞に対してＴ細胞キリングをリダイレクトする能力をインビトロで調べた。ＣＤ３８＋Ｂリンパ芽球細胞株Ｄａｕｄｉをキリングアッセイに用いた。図１５は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体による、Ｄａｕｄｉ細胞のＴ細胞リダイレクトキリングを示す。このアッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で使用し、また２４時間のインキュベーション後にＲＤＬ−ＦＡＣＳ読み取り法を用いた（材料及び方法のセクションを参照）。結果は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体が、２ｐＭのＥＣ５０（３ドナーの平均）を有するＤａｕｄｉ ＣＤ３８＋細胞株に対するリダイレクトＴ細胞キリングにおいて非常に強力であったことを示す。
実施例５： ｓｃＦｖフォーマットでの改良型ＳＰ３４の機能的同等性
種々のＳＰ３４ ｓｃＦｖを、その発現を改善するように行った修飾が機能的特性、すなわちＣＤ３の結合にも影響を与えたかどうかを決定するために、ＣＤ３８×ＣＤ３二重特異性に関して試験した。ＦＡＢとして存在するＣＤ３８結合アームは、配列番号６０によってコードされる重鎖可変領域と、配列番号６１によってコードされる軽鎖可変領域とを含む。ＣＤ３結合アームは、ｓｃＦｖ（配列番号２０７）として再フォーマットされた元のマウスＳＰ３４、又は重／軽鎖組み合わせＨ１／Ｌ２１（配列番号６７）、Ｈ５／Ｌ３２（配列番号６８）、Ｈ５／Ｌ６５（配列番号６９）、及びＨ５／Ｌ６７（配列番号７０）を含む修飾ヒト化ＳＰ３４ ｓｃＦｖを含む。
異なるバージョンのＳＰ３４を使用するＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴのそれぞれを一過性発現させ、精製した。Ｔ細胞キリングをリダイレクトする能力を比較するために、それらをインビトロで試験した。Ｒａｊｉ ＣＤ３８発現細胞株（材料及び方法のセクションを参照）を用いて、リダイレクトＴ細胞キリングを評価した。本アッセイでは、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを、１０対１のエフェクター細胞対標的細胞比で用いた。
ＲＤＬ−ＦＡＣＳ法で測定した場合、すべてのＢＥＡＴは、６から１０ｐＭの間（２ドナーの平均、インキュベーション２４時間、図１６）に相当するＥＣ５０を示した。
実施例６： Ｄ４０１Ｑ置換は、二つのホモ二量体種のうちの一つにおいてプロテインＡ及びＧ結合を除去する
分析の目的で本発明者らは、ＦＡＢ×ｓｃＦｖ ＢＥＡＴ抗体のＢＴＡ及びＢＴＢホモ二量体を製造したが、この場合ＦＡＢアーム（ＢＴＡホモ二量体）は、上記と同様に、非ＶＨ３可変ドメイン及びヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域の一部を包含したことからプロテインＡに結合せず、そのＶＨ３ベースの可変ドメイン及びそのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の両方を用いて、ｓｃＦｖアーム（ＢＴＢホモ二量体）がプロテインＡに結合した。（上記のような）発現及び精製時に、本発明者らは、ＢＴＡホモ二量体はプロテインＧ（重鎖配列番号１５６及び軽鎖配列番号７４）によって容易に精製され得る。一方、ＢＴＢホモ二量体は、プロテインＡによってしか単離することができず、プロテインＧには結合しなかったことを見出した。これは、例えばＢＴＢ ＣＨ３ドメイン（配列番号１５９）を有するＦｃ領域内のプロテインＧ結合部位におけるミスフォールディング又は立体構造の変化を示唆する。（ＣＨ２−ＣＨ３界面において）プロテインＧはプロテインＡが結合するのとほぼ同じＦｃ領域の部分に結合することを考慮すると、ＢＴＢホモ二量体がプロテインＡに結合するがプロテインＧには結合しないことは、驚くべきことである。それで、ＢＴＢホモ二量体によるプロテインＡ結合は、上記のようにＶＨ３ベースの可変ドメインを包含するｓｃＦｖ部分に位置するプロテインＡ結合部位によってのみ媒介されると仮定された。プロテインＡへの結合に対するｓｃＦｖの関与を評価するために、ＶＨ３ベースのｓｃＦｖを欠く構築物を製造し、プロテインＡに結合しないことが分かった（配列番号１６０、図１７参照）。ＢＴＢホモ二量体において、Ｆｃ領域内のプロテインＡ及びＧ結合部位は、両方とも非機能的であると結論づけられた。
この後の結果は、ＢＴＢホモ二量体が実際にプロテインＡ／Ｇ結合領域においてミスフォールディングされたか又は構造的に変化したことを示唆した。しかし、ＢＴＢ ＣＨ３ドメインがヘテロ二量体免疫グロブリンの文脈で使用されていたこれまでのデータは、別のことを示唆していた。プロテインＡ結合に関してヘテロ二量体という文脈におけるＢＴＢ ＣＨ３ドメインの機能性をさらに調べるために、本発明者らは、非ＶＨ３可変ドメイン、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメイン、及びヒトＩｇＧ３アイソタイプに由来する操作されたＢＴＡ ＣＨ３ドメインとを包含することからプロテインＡ結合を有しないＦＡＢアーム（ＢＴＡアーム）（配列番号１５６を有するＦＡＢアームの重鎖及び配列番号７４を有するＦＡＢアームの軽鎖）と、プロテインＡ結合が除去されたＶＨ３ベースのｓｃＦｖ断片、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ由来の操作されたＢＴＢ ＣＨ３ドメインを包含するｓｃＦｖアーム（ＢＴＢアーム）、（配列番号１６１を有するｓｃＦｖアームの重鎖）とからなり、したがってｓｃＦｖアームのＦｃ領域においてのみプロテインＡにのみ結合することが予想されるヘテロ二量体であるＦＡＢ×ｓｃＦｖ ＢＥＡＴ抗体を製造した。（上記のような）発現及び精製時に、実際にこの分子はプロテインＡ及びＧに結合し（図１８Ａ）、ＢＴＢホモ二量体の痕跡がないことが見出された。したがって、プロテインＡ及びＧ部位は、ヘテロ二量体免疫グロブリンという文脈においてインタクトであり、ＢＴＡ及びＢＴＢ鎖が会合した場合にのみ、機能的なプロテインＡ／Ｇ結合部位が形成されると結論づけられた。
ＢＴＢホモ二量体内のプロテインＡ／Ｇ除去の分子基盤を理解するために、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ由来の、これまでに操作されたＢＴＢ ＣＨ３ドメインを調べた。ＥＵとＩＭＧＴ番号付け間の比較は、http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.htmlで提供されており、ＢＴＢ ＣＨ３ドメイン内の置換Ｄ４０１Ｑ（ＥＵ番号付け）は、モデリング研究から同定され、ＢＴＢホモ二量体の第一の鎖のＡｒｇ４１１とＢＴＢホモ二量体の第二の鎖のＡｓｐ４０１との間の推定上の静電気的接触を、この相互作用がホモ二量体複合体を安定化させ得るという見解から、除去するように操作された。この置換はＢＴＢ ＣＨ３ドメイン操作の最後の工程でのみ実施されたため、上記のＦＡＢ×ｓｃＦｖ ＢＥＡＴ抗体は、ＢＴＢ ＣＨ３ドメインにおける前記Ｄ４０１Ｑ置換を伴わずに製造された（それぞれ配列番号１５６及び７４を有する重鎖及び軽鎖を有するＦＡＢアーム；配列番号１６２の重鎖を有するｓｃＦｖアーム）。（上記のように）発現及び精製時に、この分子はプロテインＡ及びＧに結合するが（図１８Ｂ）、ＢＴＢホモ二量体の存在を示し、ゆえにＤ４０１Ｑ置換がＢＴＢホモ二量体で観察されたプロテインＡ／Ｇ結合の欠損の原因であることが示され、それにより前記ＢＴＢ夾雑物を還元する際のヘテロ二量体免疫グロブリン内で有意な関与をすることが見出された。重要なこととして、残基４０１自体は、プロテインＡ／Ｇ結合部位の一部ではない。ただし、ＣＨ３−ＣＨ３界面の反対側に位置する。したがって、プロテインＡ／Ｇ除去は、プロテインＡ／ＧとＦｃ領域との間の相互作用を直接中断させることの結果ではない。むしろ、意外にもＤ４０１Ｑは、ＢＴＢ鎖の互いに劣った対形成能力の結果として、ＣＨ２−ＣＨ３界面での長距離にわたる立体構造変化をもたらすことが示唆される。ヘテロ二量体の場合、界面は、互いに完全に一致し、したがってＣＨ２／ＣＨ３界面における適切な立体構造がタンパク質Ａ／Ｇ結合部位を機能的にする。
この驚くべき結果は、以下の特定の設計を使用して、ホモ二量体夾雑物を含まないヘテロ二量体免疫グロブリンを効率的に単離するための新しい方法を設計するために利用することができる：ヘテロ二量体免疫グロブリンが、ＢＴＡ ＣＨ３ドメイン及び非ＶＨ３可変ドメイン又は（例えばＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて）プロテインＡ結合を除去したＶＨ３ベースの可変ドメイン又は非可変ドメインを含み、ゆえにプロテインＡとの結合を有しないＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を包含する第一の鎖と、（例えばヒトＩｇＧ１アイソタイプに由来する）ＢＴＢ Ｄ４０１Ｑ ＣＨ３ドメイン及び非ＶＨ３可変ドメインか（例えばＧ６５Ｓ又はＮ８２ａＳ置換を用いて）プロテインＡ結合を除去したＶＨ３可変ドメインのいずれか、又は非可変ドメインを包含するプロテインＡに結合する第二の鎖とを有する。この設定では、ホモ二量体のいずれもプロテインＡ結合部位を含有しない。第一のホモ二量体は、第一の鎖の二量体であり、プロテインＡ結合部位がないためプロテインＡに結合しないが、一方、第二のホモ二量体は、非機能的なプロテインＡ結合部位を有する第二の鎖の二量体である。得られたヘテロ二量体は、第二の鎖に存在する唯一のプロテインＡ結合部位を有する（ＢＴＢ鎖のプロテインＡ結合部位は、ＢＴＡ鎖と対合した場合にのみ機能する）。したがって、ヘテロ二量体は、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂に結合する唯一の種であり、一方、ＢＴＡ及びＢＴＢ鎖の望ましくないホモ二量体は洗い流されるであろう。
実施例７： カニクイザルにおけるインビボでのＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴ活性
カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、１用量当たりオス１匹、メス１匹）に、本実施例ではＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴという、ＣＤ３／ＣＤ３８（ｓｃＦｖ配列番号６９としてフォーマットされた、ＣＤ３重鎖／軽鎖の組合せＳＰ３４ Ｈ５／Ｌ６５と、ＦＡＢとしてフォーマットされた、配列番号６０によりコードされるＣＤ３８重鎖可変領域及び配列番号６１によりコードされる軽鎖可変領域とを含む）を静脈内ボーラス注入によりを投与した。
全動物について、治療前及びＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴの各投与後の異なる時点で採取された血液試料（ＥＤＴＡ）の免疫表現型検査を実施した。リンパ球サブセットの評価は、次のマーカー：全Ｔリンパ球（ＣＤ４及びＣＤ８）、単球（ＣＤ１４）及びＣＤ３８を用いたフローサイトメトリーにより実施した。試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩフローサイトメーターで取得した。データは、ＦＡＣＳＤｉｖａＴＭ分析ソフトウェアを用いて次のように分析した：最初に、リンパ球又は単球集団（母集団）を選択するために、前方及び側方散乱特性に基づいて電子ゲートを描画した。Ｔリンパ球集団（ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞）及びＣＤ３８陽性単球集団（ＣＤ１４＋ＣＤ３８＋）の全血μＬ当たりの絶対的カウントを、式：集団の絶対的カウント（×１０３／μＬ）＝（集団相対％×母集団総カウント）／１００に従って、母集団ゲートから得られる相対百分率及びバリデーションされた血液分析装置からの母集団総カウントから算出した。
１及び１０μｇ／ｋｇの投与後、Ｔ細胞数（ＣＤ４及びＣＤ８陽性の両方）の明らかな早期減少があった（図１９）。投与１日前に得られた細胞数と比較して、ＣＤ４ Ｔ細胞数は、１μｇ／ｋｇの投与後に４８及び７８％減少し、１０μｇ／ｋｇ投与後４時間の時点で９０％超減少した。ＣＤ８ Ｔ細胞数はさらに劇的に影響され、１μｇ／ｋｇ投与後に８６％減少した。４８時間後、ＣＤ４ Ｔ細胞数は急速に回復し、投与前と概ね同様の数となった。しかし、ＣＤ８ Ｔ細胞数は、より回復が遅く、１週間後に投与前と同様のレベルに達した。末梢血Ｔ細胞のこの一過性の減少は、予想されたことであり、ＣＤ３／ＣＤ３８ ＢＥＡＴによるこの集団の活性化を表す。これらの所見は、Ｔリンパ球及び特に細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞が組織における殺傷活性に関与していることを示唆している。
また、循環しているＣＤ３８＋単球集団の明らかな減少もあった（図２０）。非常に速い消失が観察され、続いて２４から４８時間の間に回復が観察された。概して、ＣＤ３８＋単球数は、この回復の後に第二の実質的減少が続き、この集団がＴリンパ球の細胞傷害作用によって標的化され、無くなる可能性が高いことが示された。
実施例８： ９Ｇ７ベースのＢＥＡＴ抗体は、ＯＫＴ１０×ＯＫＴ３ ＢＥＡＴよりも増強されたキリング活性を示す。
二の異なる９Ｇ７ベースのＢＥＡＴ抗体対ＯＫＴ１０ベースのＢＥＡＴ抗体の力価をＲＤＬアッセイで調べた。
本明細書でＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７マウス／ＣＤ３と呼ばれる二重特異性抗体は、実施例２に記載の抗原結合部位の組合せ（抗ヒトＣＤ３イプシロンアームについてはＯＫＴ３ ＶＨ１１／ＶＬ８ ｓｃＦｖ、抗ヒトＣＤ３８アームについてはマウス−ヒトキメラ９Ｇ７ ＦＡＢ）に基づくＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３抗体である。二重特異性抗体の抗ヒトＣＤ３８アームは、その同族軽鎖（配列番号１７８）と組み立てられたＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７７）からなっていた。二重特異性抗体の抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、抗ヒトＣＤ３イプシロンｓｃＦｖ断片を包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７９）からなっていた。二重特異性抗体を一過的に発現させ、上記のように精製した。
本明細書でＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＯＫＴ１０マウス／ＣＤ３と呼ばれる二重特異性抗体は、実施例２に記載の抗原結合部位の組合せ（抗ヒトＣＤ３イプシロンアームについてはＯＫＴ３ ＶＨ１１／ＶＬ８ ｓｃＦｖ、抗ヒトＣＤ３８アームについてはマウス−ヒトキメラＯＫＴ１０ ＦＡＢ）に基づくＢＥＡＴ ＣＤ３８／ＣＤ３抗体である。二重特異性抗体の抗ヒトＣＤ３８アームは、その同族軽鎖（配列番号１８１）と組み立てられたＢＥＡＴ重鎖（配列番号１８０）からなっていた。二重特異性抗体の抗ヒトＣＤ３イプシロンアームは、抗ヒトＣＤ３イプシロンｓｃＦｖ断片を包含するＢＥＡＴ重鎖（配列番号１７９）からなっていた。二重特異性抗体を一過的に発現させ、上記のように精製した。
本明細書でＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）抗体と呼ばれるＢＥＡＴ抗体は、上記の実施例４に記載した。
９Ｇ７又はＯＫＴ１０抗ＣＤ３８ ｍＡｂに基づく異なるＢＥＡＴ抗体の細胞傷害性潜在能力を、ＣＤ３８＋標的Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ）に対するキリングアッセイで評価した。標的細胞死を定量化するために、フローサイトメトリーに基づく読み取りを行った。同様のフローサイトメトリーに基づく読み取りは、Moore et al.
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2011 Apr 28;117(17):4542-51; Friedrich et al. Mol Cancer Ther 2012;11:2664-2673; Schlereth et al. Cancer Res 2005;65:2882-2889において用いられいた。エフェクター細胞は、健康なドナーからの非刺激ＰＢＭＣであった。エフェクター：標的比は典型的には１０：１であり、インキュベーション時間は４８時間であった。簡潔に述べると、標的細胞（Ｄａｕｄｉ）をＣＦＳＥなどの蛍光細胞質色素で標識し、９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に分配した。抗体段階希釈液（３×溶液）及びＰＢＭＣ（５０μＬ／ウェル）を分配し、次いで対応するウェルに分配した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で４８時間インキュベートした。細胞をピペッティングにより再懸濁させ、Ｕ底９６ウェルプレート（ＴＰＰ）に移した。Ｕ底プレートを３００ｇで３分間遠心分離し、上清を捨て、１／４０希釈で７−ＡＡＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を補充した冷ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１０％バーゼン液）２００μｌに細胞を再懸濁させた。プレートは、ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅＴＭ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ですぐに得られた。各ウェルについて、ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を用いて色素（ＣＦＳＥ）陽性７ＡＤＤ陰性集団についてゲーティングすることにより、生存標的細胞の絶対数を決定した。標的細胞のみをベースラインとしてインキュベートした条件又は標的細胞をＰＢＭＣと混合した条件（抗体なし条件）を用いて、各試料の特異的細胞傷害性の％を決定した。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いた非線形変動傾き回帰法を用いて決定した。
表２のデータは、異なるＢＥＡＴ構築物で得られたＥＣ５０値を示す。９Ｇ７ベースのＢＥＡＴ抗体（ＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７マウス／ＣＤ３及びＢＥＡＴ ＣＤ３８−９Ｇ７ベストフィット／ＣＤ３（ＳＰ３４−カッパ２）は、ＢＥＡＴ ＣＤ３８−ＯＫＴ１０マウス／ＣＤ３抗体よりも明らかに低いＥＣ５０を特徴とする殺傷活性を示した（９Ｇ７ベースのＢＥＡＴ抗体の３．２及び１．９ｐＭに対し、ＯＫＴ１０ベースのＢＥＡＴ抗体は１２５．６ｐＭ）。これは、９Ｇ７ベースの抗ＣＤ３８／ＣＤ３ ＢＥＡＴ抗体のより高い細胞傷害性潜在能力を示す。
Figure 2019214582
実施例９： ９Ｇ７及び７６７結合剤は、ＨＢ７抗体とは対照的に、アゴニズムを示さない。
ＣＤ３８にはシグナル伝達能力があることから、９Ｇ７及び７６７抗体のアゴニスト特性を、ＣＤ３８を本来発現するＪｕｒｋａｔヒトＴ細胞リンパ腫細胞株のカルシウムフラックスアッセイにおいて、ＨＢ７クローンと比較して試験した。Ｊｕｒｋａｔ細胞に２μＭのＦｌｕｏ−４色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で１時間かけて負荷した。細胞を洗浄し、１ｍＭのＣａ２＋及び１ｍＭのＭｇ２＋を補充したＰＢＳ ＰＢＳに再懸濁させた。ベースラインについて試料を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で４０秒間測定した。次いで、試験抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で試料に添加し、再び７分まで測定を続けた。図Ｇは、Ｆｌｕｏ−４色素（ＦＬ−１チャネル）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、時間の関数として、細胞の細胞質へのカルシウム動員の読み取りである。アイソタイプコントロール（ＩｇＧ１ヒト抗体）は、カルシウムフラックスを誘発しなかったが、ＨＢ７抗ＣＤ３８抗体は強いシグナルを誘導した。驚くべきことに、９Ｇ７抗体も７６７抗体も、ＨＢ７抗体とは対照的に、これらの抗体がＣＤ３８アゴニスト特性を有していないことを示すカルシウム動員シグナルを誘発することができなかった。
同じ一連の実験の間に、９Ｇ７及び７６７について、それらが特異的にＣＤ３８を発現する細胞に特異的に結合することが示された。
実施例１０： エピトープマッピング
ｈ９Ｇ７エピトープマッピング
線状ペプチドマッピングを使用して、ヒト化９Ｇ７（ベストフィットバージョン）のエピトープを決定した。ヒトＣＤ３８の細胞外ドメイン（残基４３−３００）を１３アミノ酸長の１９連続ペプチド、及び１１アミノ酸長の最終ペプチドに分けた。Ｆｃ配列とペプチド配列との間に２アミノ酸リンカー（Ａｌａ−Ｓｅｒ）を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（ＣＨ２−ＣＨ３）にペプチドを融合させた。このような構築物をＦ１−Ｆ２０（配列番号１８２−２０１）と命名し、それらの結合をＳＰＲにより分析した。ヒト化９Ｇ７抗体（重鎖配列番号１４５及び軽鎖配列番号１４６）をＣＭ５センサーチップに共有結合的に固定化した（約１８００ＲＵ）。ペプチドＦｃ融合物を１５ｎＭで２４０秒間注入した。ヒトＣＤ３８細胞外ドメインをコントロールとして注入した。Ｆ６及びコントロールのみが結合シグナル発した（図２２）。すべての断片を２００ｎＭで再注入したところ、Ｆ６はより強いシグナルを発したが（図２３）、残りの断片は依然として結合を示さなかった（データは示さず）。Ｆ６はＰＣＴ公開番号：国際公開第２００８０４７２４２号に開示のＳＡＲ６５０９８４抗体（配列番号２０２を有する重鎖及び配列番号２０３を有する軽鎖）のエピトープの一部であるため、それらの相互作用はＳＰＲによって、実証され、確認された（データは示さず）。したがって、ｈ９Ｇ７及びＳＡＲ６５０９８４は、ヒトＣＤ３８に対する結合について競合する。さらに、Ｆ６配列をヒトＣＤ３８の細胞外ドメインの３Ｄ表面上にマッピングすると、ＳＡＲ６５０９８４エピトープと重複する。ただし、ＳＡＲ６５０９８４はカニクイザルＣＤ３８と交差反応性ではないことが示されていながら、一方、ヒト化９Ｇ７は、カニクイザルＣＤ３８に高親和性で結合する（図２４）。このことは、この二の抗体が重複するが異なるエピトープを有することを示唆する。
Ｆ６配列内の残基Ｍ１１０は、カニクイザルＣＤ３８中のバリンである。したがって、ヒトＣＤ３８の細胞外ドメイン全体という文脈において、本発明者らは、Ｍ１１０をバリン（配列番号２０４）に変異させ、ｈ９Ｇ７及びＳＡＲ６５０９８４の結合を比較した。ＳＡＲ６５０９８４は、野生型ヒトＣＤ３８に対するその結合と比較して低下した結合を示したが、ヒト化９Ｇ７の結合は影響を受けなかった（データは示さず）。ヒトＣＤ３８細胞外ドメイン（ＰＤＢアクセッションコード４ＣＭＨ、Deckert et al., 2014 Clin.Cancer Res. 20: 4574）と複合体化したＳＡＲ６５０９８４の結晶構造に基づいて、本発明者らは、ＳＡＲ６５０９８４結合にとって潜在的に重要であり、かつヒトとカニクイザルＣＤ３８との間では異なっている、さらなる残基を同定した。この残基はＴ１４８であった。これは、カニクイザルＣＤ３８中のメチオニンである。ヒトＣＤ３８（配列番号２０５）の細胞外ドメインにおけるＴ１４８のメチオニンへの突然変異は、ＳＡＲ６５０９８４の結合を有意に減少させたが、ヒト化９Ｇ７結合は影響を受けなかった（データは示さず）。突然変異Ｍ１１０Ｖ及びＴ１４８Ｍ（配列番号２０６、図２３参照）を含有するヒトＣＤ３８の細胞外ドメインの二重突然変異体はＳＡＲ６５０９８４の結合を消失させが、ヒト化９Ｇ７結合は、影響を受けなかった（図２４）。したがって、ヒト化９Ｇ７とＳＡＲ６５０９８４はヒトＣＤ３８に対する結合について競合するが、これらの抗体によって結合される残基は同一ではないと結論づけることができる。
７６７エピトープマッピング
７６７抗体のエピトープは、上記のエピトープマッピング実験に用いた線状ペプチド−Ｆｃ融合体の同じセットを用いてマッピングされた。７６７抗体（重鎖配列番号１５１及び軽鎖配列番号１５２）をＣＭ５センサーチップに共有結合的に固定化した（約１８００ＲＵ）。ペプチドＦｃ融合体（Ｆ１−Ｆ２０、配列番号１８２−２０１）を１０００ｎＭで２４０秒間注入した。ヒトＣＤ３８細胞外の細胞外ドメインをコントロールとして注入した。Ｆ３及びコントロールのみが結合シグナル発した（図２５）。Ｆ３配列をヒトＣＤ３８の細胞外ドメインの３Ｄ表面上にマッピングすると（図２６）、ＳＡＲ６５０９８４エピトープと、より具体的には二つの残基：Ｅ７６及びＨ７９と部分的に重複する。しかしながら、７６７はカニクイザルＣＤ３８に対して交差反応性である（親和性はより低い）一方、ＳＡＲ６５０９８４はそうではない。このことは、この二の抗体が重複しているが異なるエピトープを有することを示唆している。さらに、ＳＡＲ６５０９８４は、ＳＰＲによってＦ３構築物に結合しなかった（図２７）。したがって、７６７とＳＡＲ６５０９８４はヒトＣＤ３８に対する結合について競合するが、これらの抗体によって結合される残基は同一ではないと結論づけることができる。
７６７エピトープマッピング
７６７抗体のエピトープは、上記のエピトープマッピング実験に用いた線状ペプチド−Ｆｃ融合体の同じセットを用いてマッピングされた。７６７抗体（重鎖配列番号１５１及び軽鎖配列番号１５２）をＣＭ５センサーチップに共有結合的に固定化した（約１８００ＲＵ）。ペプチドＦｃ融合体（Ｆ１−Ｆ２０、配列番号１８２−２０１）を１０００ｎＭで２４０秒間注入した。ヒトＣＤ３８細胞外の細胞外ドメインをコントロールとして注入した。Ｆ３及びコントロールのみが結合シグナル発した（図２５）。Ｆ３配列をヒトＣＤ３８の細胞外ドメインの３Ｄ表面上にマッピングすると（図２６）、ＳＡＲ６５０９８４エピトープと、より具体的には二つの残基：Ｅ７６及びＨ７９と部分的に重複する。しかしながら、７６７はカニクイザルＣＤ３８に対して交差反応性である（親和性はより低い）一方、ＳＡＲ６５０９８４はそうではない。このことは、この二の抗体が重複しているが異なるエピトープを有することを示唆している。さらに、ＳＡＲ６５０９８４は、ＳＰＲによってＦ３構築物に結合しなかった（図２７）。したがって、７６７とＳＡＲ６５０９８４はヒトＣＤ３８に対する結合について競合するが、これらの抗体によって結合される残基は同一ではないと結論づけることができる。
＜本発明のさらなる実施態様＞
［実施態様１］配列番号２５若しくは配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号２６若しくは配列番号２０９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号２７若しくは配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号２８若しくは配列番号２１１若しくは配列番号２１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号２９若しくは配列番号２１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号３０若しくは配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＣＤ３８に結合する抗体又はその断片。
［実施態様２］マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、実施態様１に記載の抗体又はその断片。
［実施態様３］抗体又はその断片が配列番号５２、配列番号５８、配列番号６０からなるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含み、かつ／あるいは抗体又はその断片が配列番号５５、配列番号５９、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含む、実施態様１に記載の抗体又はその断片。
［実施態様４］抗体又はその断片が配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９からなるアミノ酸配列を含む重鎖配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含み、かつ／あるいは抗体又はその断片が配列番号７４、配列番号７７、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列か、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含む、実施態様１又は２に記載の抗体又はその断片。
［実施態様５］前記抗体又は断片がヒト重及び／又は軽鎖定常領域を含み、かつヒト重定常領域がＩＧＨＧ１、非フコシル化ＩＧＨＧ１、及びＩＧＨＧ４からなるヒト免疫グロブリンの群から選択される、実施態様１から３のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
［実施態様６］抗ＣＤ３８抗体断片を含む、実施態様１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
［実施態様７］前記抗ＣＤ３８抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びｓｃＦｖからなる群より選択される、実施態様６に記載の二重特異性抗体。
［実施態様８］Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びｓｃＦｖからなる群より選択される抗ＣＤ３抗体断片をさらに含む、実施態様６又は７に記載の二重特異性抗体。
［実施態様９］前記抗ＣＤ３抗体断片が配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号５又は配列番号９のアミノ酸配列とを含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号７、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含み、又は
前記抗ＣＤ３抗体断片が配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１６６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む、実施態様８に記載の二重特異性抗体。
［実施態様１０］実施態様１から５のいずれか一項に記載の前記抗体又はその断片と同じエピトープか、又は実施態様６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体と同じエピトープに結合する、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８に結合する抗体又はその断片。
［実施態様１１］実施態様１から５のいずれか一項に記載の前記抗体又はその断片によって結合されるか、又は実施態様６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体によって結合される、可溶型ヒトＣＤ３８上のエピトープ。
［実施態様１２］実施態様１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は実施態様６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
［実施態様１３］実施態様１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は実施態様６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体を含む、治療剤と連結されたイムノコンジュゲート。
［実施態様１４］医薬としての使用のための、実施態様１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は実施態様６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体。
［実施態様１５］多発性骨髄腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む悪性血液病からなる群から選択される疾患を治療することにおける医薬としての使用のための、実施態様１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は実施態様６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体。

Claims (15)

  1. 配列番号２５若しくは配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号２６若しくは配列番号２０９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号２７若しくは配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；及び／又は配列番号２８若しくは配列番号２１１若しくは配列番号２１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号２９若しくは配列番号２１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号３０若しくは配列番号２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ヒトＣＤ３８に結合する抗体又はその断片。
  2. マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体又はその断片。
  3. 抗体又はその断片が配列番号５２、配列番号５８、配列番号６０からなるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含み、かつ／あるいは抗体又はその断片が配列番号５５、配列番号５９、配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその断片。
  4. 抗体又はその断片が配列番号７３、配列番号７５、配列番号７６、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９からなるアミノ酸配列を含む重鎖配列か、又は前記重鎖可変領域配列のいずれかの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含み、かつ／あるいは抗体又はその断片が配列番号７４、配列番号７７、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列か、又は前記軽鎖可変領域配列のいずれか一つの非ＣＤＲ領域と少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
  5. 前記抗体又は断片がヒト重及び／又は軽鎖定常領域を含み、かつヒト重定常領域がＩＧＨＧ１、非フコシル化ＩＧＨＧ１、及びＩＧＨＧ４からなるヒト免疫グロブリンの群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体又は断片。
  6. 抗ＣＤ３８抗体断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  7. 前記抗ＣＤ３８抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びｓｃＦｖからなる群より選択される、請求項６に記載の二重特異性抗体。
  8. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びｓｃＦｖからなる群より選択される抗ＣＤ３抗体断片をさらに含む、請求項６又は７に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記抗ＣＤ３抗体断片が配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号５又は配列番号９のアミノ酸配列とを含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号７、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含み、又は
    前記抗ＣＤ３抗体断片が配列番号１６３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号１６６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３とを含む、請求項８に記載の二重特異性抗体。
  10. 請求項１から５のいずれか一項に記載の前記抗体又はその断片と同じエピトープか、又は請求項６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体と同じエピトープに結合する、ヒト及びカニクイザルＣＤ３８に結合する抗体又はその断片。
  11. 請求項１から５のいずれか一項に記載の前記抗体又はその断片によって結合されるか、又は請求項６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体によって結合される、可溶型ヒトＣＤ３８上のエピトープ。
  12. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は請求項６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  13. 請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は請求項６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体を含む、治療剤と連結されたイムノコンジュゲート。
  14. 医薬としての使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は請求項６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体。
  15. 多発性骨髄腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、原発性全身性アミロイドーシス、マントル細胞リンパ腫、前リンパ球性／骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、濾胞性リンパ腫、ＮＫ細胞白血病、及び形質細胞白血病を含む悪性血液病からなる群から選択される疾患を治療することにおける医薬としての使用のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその断片又は請求項６から９のいずれか一項に記載の前記二重特異性抗体。
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