CN107207596A - Cd3/cd38 t 细胞重靶向异源二聚体免疫球蛋白及其生产方法 - Google Patents

Cd3/cd38 t 细胞重靶向异源二聚体免疫球蛋白及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向人CD3抗原组分和人CD38抗原组分的异源二聚体免疫球蛋白及其制备方法。本发明还涉及结合人CD38抗原的抗体及其衍生物用作治疗剂或诊断剂及其制备方法。

Description

CD3/CD38 T细胞重靶向异源二聚体免疫球蛋白及其生产方法
发明领域
本发明涉及靶向人CD3抗原组分和人CD38抗原组分的异源二聚体免疫球蛋白，及其制备方法。本发明还涉及用作治疗剂或诊断剂的结合人CD38抗原的抗体及其衍生物，及其制备方法。
发明背景
体内使用单克隆抗体(mAb)已经成为各种人类疾病治疗中的常规临床实践的支柱，并且使用mAb的靶向免疫疗法对于许多形式的癌症的成功治疗已经变得非常重要。例如利妥昔单抗(rituximab)——嵌合CD20抗体，其在几种B细胞恶性疾病(如滤泡性淋巴瘤)的治疗中带来了变革。然而，B细胞在终末分化成浆细胞后失去CD20表达，并且因此在其他癌症中，利妥昔单抗对多发性骨髓瘤的治疗具有非常有限的益处。
CD38分子因为其表达模式及其作为受体和胞外酶的双重作用，是有吸引力的靶标。特别提出了CD38的靶向作为治疗多发性骨髓瘤和慢性淋巴性白血病(CLL)的手段。
T细胞重定向杀伤是许多治疗领域中期望的作用模式。在临床前和临床研究中已经证实多种双特异性抗体形式可以介导T细胞重定向(May C等,(2012)BiochemPharmacol,84(9):1105-12；Frankel SR&Baeuerle PA,(2013)Curr Opin Chem Biol,17(3):385-92)。所有的T细胞重靶向性双特异性抗体或其片段，经工程化而具有至少两个抗原结合位点，其中一个位点结合靶细胞上表面抗原，而另一位点结合T细胞表面抗原。在T细胞表面抗原中，TCR蛋白复合物中的人CD3ε亚基是最常被靶向以实现T细胞杀伤重定向的抗原。
许多双特异性抗体形式已经用于重定向T细胞杀伤，主要包括串联的scFv片段和基于双抗体(diabody)的形式，仅有少数基于Fc的双特异性抗体形式的例子被报道(MoorePA等,(2011)Blood,117(17):4542-51；May C等,(2012)同上引文；Frankel SR&BaeuerlePA,(2013)同上引文)。包含人Fc区的双特异性形式将具有更长的循环半衰期，这可以导致增强的功效和/或更低频率的给药方案。在可能的基于Fc的双特异性形式中，用于重定向T细胞杀伤的一个优选形式是所谓的重链异源二聚体形式。该形式是尤其有意义的，因为它不允许多个拷贝的人CD3分子聚集在T细胞表面，从而防止了任何的T细胞失活(Klein C etal.,(2012)MAbs,4(6):653-63)。
第一个描述的用于工程化构建重链异源二聚体的方法是称作“杵臼”(knob-into-hole)法的方法(PCT公布号WO199627011；Merchant AM等(1998)Nat Biotechnol,16(7):677-81)。近来报道了一种称作FAB-臂交换法的化学方法，其中两个抗体通过还原和半免疫球蛋白的体外改组而组合成一个双特异性抗体(PCT公布号WO2008119353(Schuurman J等)和WO2013060867(Gramer M等)；Labrijn AF等,(2013)Proc Natl Acad Sci USA,110(13):5145-50)。
发明概述
本发明提供结合人CD38的抗体或其片段，其包含：
包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:208的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:209的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:210的氨基酸序列的重链CDR3；
和/或包含：
包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:212的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:213的氨基酸序列的轻链CDR3；或
其中结合CD38蛋白复合物的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:33的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据本发明此方面，抗CD38抗体或其片段是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。
特别地，抗体或其片段包含重链可变区序列，所述重链可变区序列包含SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60的氨基酸序列、或与任一所述重链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列；和/或其中抗体或其片段包含轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61的氨基酸序列、或与任一所述轻链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列。
特别地，抗体或其片段包含重链序列，所述重链序列包含SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149的氨基酸序列、或与任一所述重链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列；和/或其中抗体或其片段包含轻链序列，所述轻链序列包含SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:146、SEQ IDNO:148、SEQ ID NO:150的氨基酸序列、或与任一所述轻链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列。
特别地，抗体或片段包含人重链和/或轻链恒定区和其中人重链恒定区选自由IGHG1、非岩藻糖基化IGHG1和IGHG4组成的人免疫球蛋白组。
本发明还提供新的抗人CD3/CD38双特异性抗体。
根据本发明，抗人CD3结合臂的靶结合部分优选包含SP34或OKT3的单链可变片段(scFv)。特别地，当抗人CD3结合臂是SP34时，其与包含SEQ ID NO:1和2编码的重链和轻链可变区的scFv-Fc相比，具有更好的表达谱，同时保持其CD3结合特性。
特别地，当表达为scFv-Fc时，与包含SEQ ID NO:1和2编码的重链和轻链可变区的scFv-Fc形式的SP34嵌合体相比，表达提高至少两倍。优选，该改良的SP34scFv与包含SEQID NO:1和2编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，表达提高至少六倍，并且最优选，与包含SEQ ID NO:1和2编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，表达提高至少十二倍。
根据本发明的另一个方面，当在BEAT形式的包含FAB臂的双特异性抗体中作为scFv表达时，与包含SEQ ID NO:1和2编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，表达提高至少两倍。优选，作为BEAT双特异性抗体组分的该改进SP34scFV，与作为BEAT双特异性抗体组分的包含SEQ ID NO:1和2编码的重链和轻链可变区的scFv形式的SP34嵌合体相比，表达提高至少五倍。
根据本发明，抗人CD3双特异性抗体的两条结合臂各自包含免疫球蛋白恒定区，并且其中第一臂或多肽结合蛋白A，而第二臂或多肽不结合蛋白A。
根据本发明的再一个方面，结合CD3蛋白复合物的多肽的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3；或
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的重链CDR1，和包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的轻链CDR1，和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据本发明的再一个方面，结合CD38蛋白的多肽的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR3；或
其中结合CD38蛋白复合物的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链CDR3；或
结合CD38蛋白的多肽的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR3；或
结合CD38蛋白复合物的表位结合区包含：
包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链CDR3。
这些新的抗人CD3/CD38双特异性抗体的用途包括但不限于，各种人癌症、自身免疫病和炎性疾病的治疗。癌细胞超过健康细胞和组织的特异性破坏是肿瘤学的主要目标。可以安全地将T细胞杀伤重定向于肿瘤相关细胞表面抗原的治疗剂可以提供改善的临床功效。肿瘤学中临床未满足需求的已知领域包括但不限于乳腺癌、转移性乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第二多肽的恒定区，包含IgG3CH3区。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第二多肽的恒定区，包含非来自IgG的CH3区，并且该非IgG3CH3区包含至少一个取代以降低/消除蛋白A结合。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段的第二多肽的表位结合区包含VH3区，该VH3区包含至少一个降低蛋白A结合的修饰。
本发明还提供，从重组哺乳动物宿主细胞系生产抗人CD3/CD38双特异性重链异源二聚体的方法，所述抗人CD3/CD38双特异性重链异源二聚体具有至少一个基于VH3的抗原结合位点，其中该双特异性抗体产物可以容易地在单个蛋白A色谱步骤之后以高纯度分离。
特别地，该修饰的VH3区包含选自以下的氨基酸取代：57,65,81,82a和组合19/57/59(Kabat编号)；甚至更优选地，该修饰的VH3区包含选自以下的氨基酸取代：57A,57E,65S,81E,82aS和组合19G/57A/59A(Kabat编号)。
根据本发明的再一方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段，可以包含其它取代，其中重链可变框架区包含选自以下的氨基酸取代：I34M,V48I,A49G,R58N/Y,I69L,A71T和T73K(Kabat编号)，轻链可变框架区包含选自以下的氨基酸取代：M4L,V33M,A34N,L46R,L47W,T51A,R66G,F71Y和P96F(Kabat编号)；或者其中重链可变框架区包含氨基酸取代I34M,A49G和A71T(Kabat编号)，且轻链可变框架区包含氨基酸取代M4L,L46R,L47W和F71Y(Kabat编号)。
在另一个实施方案中，结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含重链可变框架区，其是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类。优选地，重链可变框架区是人IGHV3-23的产物或衍生自人IGHV3-23。更优选地，重链可变框架区是人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：37)的产物或衍生自人IGHV3-23*04(SEQ ID NO：37)。该重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：1的相应鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
在一个优选的实施方案中，结合CD3蛋白复合物的第一多肽的表位结合区包含轻链可变框架区，其是人VK1亚类或人VK3亚类的产物或衍生自人VK1亚类或人VK3亚类。优选地，轻链可变框架区是人VK1-39或VK3-20的产物或衍生自人VK1-39或VK3-20。更优选，轻链可变框架区是人IGKV1-39*01(SEQ ID NO：39)或IGKV3-20*01(SEQ ID NO：40)的产物或衍生自人IGKV1-39*01(SEQ ID NO:39)或IGKV3-20*01(SEQ ID NO:40)。该轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:2的相应鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
在一个优选实施方案中，结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含具有选自以下的回复突变的人源化重链可变结构域：I34M,V48I,A49G,R58N/Y,I69L,A71T和T73K(Kabat编号)，和具有选自以下的回复突变的人源化轻链可变结构域：M4L,V33M,A34N,L46R,L47W,R66G,F71Y和P96F(Kabat编号)。更优选地，结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含具有回复突变I34M,A49G和A71T(Kabat编号)的人源化重链可变结构域，和具有回复突变M4L,L46R,L47W和F71Y(Kabat编号)的人源化轻链可变结构域。
根据本发明的再一个方面，异源二聚体免疫球蛋白或其片段中结合CD3蛋白复合物的表位结合区，
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链可变区；或
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区；或
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区；或
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区；或
其中结合CD3蛋白复合物的表位结合区包含：包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区。
CD3蛋白复合物包含多个亚基，例如δ、ε和γ。在一个优选实施方案中，结合CD3蛋白复合物的表位结合区结合CD3的ε亚基。
本文描述的表位结合区包括一个或多个重链可变结构域和一个或多个互补轻链可变结构域的组合，其一起形成允许异源二聚体免疫球蛋白或其片段特异性结合一个或多个表位的结合位点。在本发明的一个实施方案中，第一多肽的表位结合区包含FAB，第二多肽的表位结合区包含scFv。或者，第一多肽的表位结合区包含scFv，第二多肽的表位结合区包含FAB。
结合CD38的表位结合区可以包含重链可变框架区，所述重链可变框架区可以是人VH3亚类的产物或衍生自人VH3亚类，所述VH3亚类优选人VH-23，更优选人IGHV3-23*04(SEQID NO:37)。该重链可变框架区可以包含至少一个来自包含SEQ ID NO:50或51或52的氨基酸序列的相应小鼠抗体的重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。表位结合区还可以包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区可以是人VK1亚类的产物或衍生自人VK1亚类，所述VK1亚类优选人VK1-39，更优选人IGVK1-39*01(SEQ ID NO 39)。该轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含SEQ ID NO:53或54或55的氨基酸序列的相应小鼠抗体的轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。
特别地，CD38结合多肽包含由SEQ ID NO:56/57、58/59、60/61和62/63编码的可变重链结构域和可变轻链结构域对。
已经发现，抗CD3抗体可以通过直接和间接制剂触发毒性。间接机制由CD3抗体的Fc区介导，其与表达Fc受体的免疫细胞作用，导致瞬时T细胞活化和细胞因子释放。因此，为了改善本文所述异源二聚体免疫球蛋白或其片段的安全性，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区对效应免疫细胞和/或补体C1q具有降低的结合或没有结合。优选地，工程化免疫球蛋白恒定区，以消除下铰链区(lower hinge region)中的Fc受体结合。更优选地，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区包含取代L234A和/或L235A(EU编号)。最优选地，第一和/或第二多肽的免疫球蛋白恒定区包含取代L234A和L235A(EU编号)。
在另一方面，本发明的公开还描述了异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中表位结合区结合CD3蛋白复合物的CD3ε亚基并且包含FAB，如通过差示扫描量热法(DSC)所测量(如表1)，该FAB具有的FAB热稳定性优于SP34嵌合体的FAB热稳定性，其中所述SP34嵌合体包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变结构域和氨基酸序列SEQ ID NO：2的轻链可变结构域。这种增加的热稳定性意味着，这些改进的SP34结合臂将具有增加的体内和体外稳定性，意味着作为治疗剂以及在稳定性/储存期限/保存期限方面更好的性能。
在一个优选实施方案中，本发明提供异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其结合：
i)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列并且与SEQ ID NO:66的氨基酸序列的关联(cognate)轻链装配并结合CD38，和其中第二多肽具有SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列并结合CD3ε；
ii)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列并且与SEQ ID NO:72的氨基酸序列的关联轻链装配并结合CD38，和其中第二多肽具有SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列并结合CD3ε；
iii)CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列并且与SEQ ID NO:74的氨基酸序列的关联轻链装配并结合CD38，和其中第二多肽具有SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列并结合CD3ε；
在进一步的实施方案中，本发明提供异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其结合：
CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO:75或76的氨基酸序列并且与SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链装配并结合CD38，和其中第二多肽具有选自SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列并结合CD3ε；
CD3蛋白复合物和CD38，其中第一多肽具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列并且与SEQID NO:66的氨基酸序列的轻链装配并结合CD38，和其中第二多肽具有选自SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列并结合CD3ε；
根据本发明的再一个方面，提供异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其包含：(a)包含具有CH2结构域和第一工程化CH3结构域的免疫球蛋白恒定区的第一多肽；(b)包含具有CH2结构域和第二工程化CH3结构域的免疫球蛋白恒定区的第二多肽，其中两个多肽通过其工程化的CH3结构域异源二聚体化；和其中第一多肽不结合蛋白A或蛋白G，而第二多肽只通过其免疫球蛋白恒定区结合蛋白A和/或蛋白G；其中第一工程化CH3结构域在残基20、22、26、79、85.1、86、88、90中的一个或多个具有置换和第二工程化CH3结构域在选自3、5、20、22、26、27、81、84、85.1、86、88的至少一个残基具有置换和其中所述第二链还包含根据IMGT编号的残基84.4的置换。
根据本发明的再一个方面，位置84.4的置换选自84.4Q、84.4V、84.4A、84.4S、84.4T、84.4N、84.4G、84.4L、84.4L、84.4Y、84.4F、84.4M。
根据本发明的再一个方面，根据IMGT编号，第一工程化CH3结构域至少在残基22、86、88具有置换，和第二工程化CH3结构域至少在残基7、84.4、85.1、86具有置换。
根据本发明的再一个方面，根据IMGT编号，第一工程化CH3结构域至少在残基20、22、79、86、88具有置换，和第二工程化CH3结构域至少在残基7、26、84、84.4、85.1、86具有置换。
根据本发明的再一个方面，第一工程化CH3结构域至少在残基20、22、26、79、85.1、86、88、90具有置换，和第二工程化CH3结构域至少在残基3、5、7、20、26、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88、90具有置换。
根据本发明的再一个方面，第一工程化CH3结构域至少在残基3、20、22、26、79、85.1、86、88、90具有置换，和第二工程化CH3结构域至少在残基3、5、7、20、22、26、81、84、84.2、84.4、85.1、86、88、90具有置换。
根据本发明的再一个方面，提供异源二聚体免疫球蛋白，其具有包括IgG3同种型的Fc区的第一链和结合蛋白A的第二链，所述第一链包括BTA CH3结构域和非-VH3可变结构域或消除了蛋白A结合的基于VH3的可变结构域(例如，使用G65S或N82aS置换)、或无可变结构域并且因此不结合蛋白A，所述第二链包括BTB D401Q CH3结构域(例如，源自人IgG1同种型)以及非-VH3可变结构域或消除了蛋白A结合的VH3可变结构域(例如，使用G65S或N82aS置换)、或无可变结构域。
附图简述
图1A-F：这些图都与在稳定的人框架上的OKT3人源化有关。图1A-C：人IgG1抗体形式的人源化候选物的总结。相对于嵌合OKT3抗体的HPB-ALL染色：(-)表示没有结合，(+)表示较弱的结合，(++)表示中度结合，(+++)表示相似的结合。图1D：选择的候选抗体的DSC谱。图1E：scFv-Fc融合形式的人源化候选物的总结。相对于嵌合OKT3抗体的HPB-ALL染色：(-)表示没有结合，(+)表示较弱的结合，(++)表示中度结合，(+++)表示相似的结合。图1F：选择的scFv-Fc候选物的DSC谱。
图2A-B：这些图都与在稳定的人框架上的SP34人源化有关。图2A：人IgG1抗体形式的人源化候选物的总结。图2B：scFv-Fc融合蛋白形式的人源化候选物的总结(人IgG1同种型的Fc)。对于人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白，相对于嵌合SP34抗体的SPR数据：(-)表示没有结合，(+)表示较弱的结合，(++)表示中度结合，(+++)表示强但不相似的结合，(++++)表示相似的结合。
图3显示，对于SP34嵌合体以及SP34H1L21，从IgG1重新格式化成scFv-Fc后的相对表达水平，其中观察到了表达的剧烈损失。
图4显示，以下位置的丙氨酸扫描对SP34H1L21ScFv-Fc的表达水平的影响：T27、G27a、V27c、T28、T29、S30、N31、Y32、N52、K53、R54、P56、L90、Y92、S93、N94和L95。
图5A显示，位置29的随机突变对SP34H3L23ScFv-Fc的表达水平的影响；图5B显示，位置30的随机突变对SP34H3L23ScFv-Fc的表达水平的影响；图5C显示，位置95的随机突变对SP34H5L23ScFv-Fc的表达水平的影响。
图6显示几种人源化SP34的归一化的表达水平。
图7A：嵌合HB-7抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的嵌合HB-7抗体。以125、31、7.8、3.9、1.9、1和0.5nM、以30μl/min的流速在HBS-P中注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图7B：人源化HB-7最适配(best-fit)抗体与人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的人源化HB-7最适配抗体。在HBS-P中以50、25、12.5、6.25和0.39nM、以30μl/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图7C：人源化9G7最适配抗体与人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的人源化9G7最适配抗体。在HBS-P中以25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19和0.1nM、以30μl/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图7D：人源化9G7最佳框架抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获了200RU的人源化9G7最佳框架抗体。在HBS-P中以50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.19,和0.1nM、以30μL/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。图7E：人767抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片与蛋白G共价偶联，捕获200RU的人767抗体。在HBS-P中以500、250、125、62.5、31.25和15.6nM、30μl/min的流速注射人CD38蛋白(具有多组氨酸标签的人CD38胞外结构域)。根据以下公式从平衡反应(Req)vs.分析物浓度(C)曲线获得亲和力：Req＝KA*C*Rmax/(KA*C*n+1)，KD为50％饱和的浓度。所有SPR数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。图7F：嵌合HB-7和人源化HB-7最适配抗体的DSC谱。图7G：嵌合9G7和人源化9G7最适配抗体的DSC谱。图7H：人源化9G7最佳框架抗体的DSC谱。图7I：人克隆767抗体的DSC谱。图7J：9G7人源化抗体的总结表。
图8：BEAT CD38-HB7最适配/CD3(形式A)和BEAT CD38-767/CD3(形式B)抗体的示意图。[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。[(A-)]表示非功能性蛋白A结合位点。
图9A：BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体和人CD38抗原之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价偶联蛋白G，捕获200U的BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体。在HBS-P中以50、25、12.5、6.25和0.39nM、以30μl/min的流速注射人CD38蛋白(多组氨酸标记的蛋白)。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。图9B：BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体DSC谱。
图10：通过BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体的T细胞重定向杀伤实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：纯化的人T细胞。效应细胞与靶细胞的比为10:1。两个供体的平均值，48h孵育。靶细胞：RPMI 8226。抗体浓度以nM表示。
图11：通过BEAT CD38-767/CD3(SP34)抗体的T细胞重定向杀伤实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均值，24小时孵育。靶细胞：Daudi。抗体浓度以nM表示。
图12：BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)(形式A)和BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)(形式B)抗体的示意图。[(A+)]表示功能性蛋白A结合位点。
图13：通过BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体的T细胞重定向杀伤的实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均值，24小时孵育。靶细胞：Daudi细胞。抗体浓度以nM表示。
图14：BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体与人CD3ε1-26_Fc融合蛋白之间通过SPR测量的抗体-抗原相互作用。CM5传感器芯片共价偶联500RU的人CD3ε1-26_Fc融合蛋白。在HBS-P中以50、25、12.5、6.2、3.1、0.8和0.4nM、以30μl/min的流速注射BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体。数据表示为响应单位数(缩写为RU；Y轴)vs.时间(X轴)。
图15：通过BEAT CD38/CD3(SP34-κ2)抗体的T细胞重定向杀伤实例。读取：RDL-FACS方法。效应细胞：人PBMC。效应细胞与靶细胞的比为10：1。三个供体的平均值,24小时孵育。靶细胞：Daudi细胞。抗体浓度以nM表示。
图16显示，在RDL测定中几个CD38/CD3双特异性抗体的性能，其中CD3结合臂包含重新格式化为scFv的初始小鼠SP34(SEQ ID NO:137)、或包含修饰的人源化SP34scFv，所述修饰的人源化SP34scFv包含重链/轻链组合H1/L21(SEQ ID NO:67)、H5/L32(SEQ ID NO:68)、H5/L65(SEQ ID NO:69)和H5/L67(SEQ ID NO:70)。
图17：具有蛋白A结合(泳道组1)和不具有蛋白A结合的scFv部分(泳道组2)的BTB同源二聚体的非还原SDS-PAGE分析。使用亲和色谱纯化：蛋白A色谱(A)或蛋白G色谱(G)后，分析了洗脱的和中和的级分。对于组2，收集流通物或未结合的级分，其显示不结合蛋白A或G(分别缩写为A ft和G ft)。在pH3.0进行洗脱。[(A+)]表示蛋白A结合位点。分子量标记如所示(kDa)。
图18A：在携带D401Q置换的BTB链中只含有单个蛋白A位点的BEAT同源二聚体的非还原SDS-PAGE分析。使用亲和色谱纯化：蛋白A色谱(A)或蛋白G色谱(G)后，分析了洗脱的和中和的级分。在pH3.0进行洗脱。[(A+)]表示蛋白A结合位点。分子量标记如所示(kDa)；18B：在缺少D401Q置换的BTB链中含有单个蛋白A位点的BEAT异源二聚体体的SDS-PAGE分析。使用亲和色谱纯化：蛋白A色谱(A)或蛋白G色谱(G)后，分析了洗脱的和中和的级分。在pH3.0进行洗脱。[(A+)]表示蛋白A结合位点。分子量标记如所示(kDa)。
图19：显示，对于注射了CD3/CD38 BEAT的动物，针对CD4+群(实线)和CD8+群(虚线)，每μl血液的计数。上图显示对给药1μg/kg的动物的计数。下图显示对给药10μg/kg的动物的计数。在零时间点的计数对应于给药前1天收获的样品。
图20：显示，对于注射了CD3/CD38 BEAT的动物，针对CD4+CD38+单核细胞群，每μl血液的计数。上图显示对给药1μg/kg的动物的计数。下图显示对给药10μg/kg的动物的计数。在零时间点的计数对应于给药前1天收集的样品。
图21：显示，作为以秒计的时间的函数，fluo-4染料的平均荧光强度(MFI)。每个图中包括同种型对照条件。在40s基线获取后，将所示抗体加入样品中并重新开始获取。同种型对照是人IgG1抗体。MFI的提高表示钙动员至细胞的细胞质中。
图22：使用衍生自人CD38胞外结构域的肽-Fc融合体，通过SPR进行的人源化9G7抗体的表位作图。数据表示为响应单位数(缩写RU；Y轴)vs.时间(X轴)。
图23：人CD38的胞外结构域的3D绘制。F6肽序列涂成灰色，位置M110和T148涂成黑色。
图24：使用人和猕猴CD38的胞外结构域，通过SPR进行的人源化9G7和SAR650984抗体的表位作图。数据表示为响应单位数(缩写RU；Y轴)vs.时间(X轴)。
图25：使用源自人CD38胞外结构域的肽-Fc融合体，通过SPR进行的人767抗体的表位作图。数据表示为响应单位数(缩写RU；Y轴)vs.时间(X轴)。
图26：人CD38的胞外结构域的3D绘制。F3肽序列涂成灰色，位置E76和H79涂成黑色。
图27：使用源自人CD38胞外结构域的肽-Fc融合体，通过SPR进行的人源化SAR650984抗体的表位作图。数据表示为响应单位数(缩写RU；Y轴)vs.时间(X轴)。
发明详述
本发明一般涉及结合CD3蛋白复合物和CD38抗原的新型异源二聚体免疫球蛋白。
而且，这些异源二聚体免疫球蛋白可以具有降低的或消除的蛋白A结合，并因此可以使用亲和色谱纯化至非常高的纯度。
为解释本说明书的目的，应用以下定义，并且在适用时，以单数使用的术语也涵盖其复数形式且反之亦然。应当理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案，而不旨在构成限制。
术语“多肽”和“蛋白”是指，氨基酸残基聚合物，其中氨基酸通过肽键组合形成氨基酸链，在该链中氨基酸已经通过脱水合成而连接在一起。多肽和蛋白可以通过化学合成或重组表达方式合成，并且没有最小氨基酸长度的限制。
根据本发明，当蛋白质由单个多肽链组成时，多肽涵盖“蛋白质”。多肽还可以形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即，由一个以上多肽分子组成。形成二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不同。相应地，这些多聚体的对应高级结构被称为同源-或异源-二聚体、同源-或异源-三聚体等等。异源多聚体的一个例子是抗体分子，其天然形式由两个相同的轻链多肽和两个相同的重链多肽组成。术语“多肽”和“蛋白”也指天然修饰的多肽/蛋白，其中所述修饰可以通过例如翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等实现。这些修饰是本领域已知的。此外，出于本发明目的，“多肽”可以指相对于天然序列包括修饰的蛋白质，例如缺失、添加和取代(在性质上可以是保守的)。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变引起，或可以是偶然的，例如由于产生蛋白的宿主的突变或由于PCR扩增错误引起。
本文中，术语“CD3复合物”指称作CD3(分化簇3)T细胞共受体的蛋白质复合物(Wucherpfennig KW等,(2010)Cold Spring Harb Perspect Biol,2(4):a005140)。CD3蛋白复合物由四条分开的链组成。在哺乳动物中，该复合物含有CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。这些链与称作T细胞受体(TCR)的分子及ζ-链缔合，在T淋巴细胞中产生活化信号(vander Merwe PA&Dushek O(2011)Nat Rev Immunol,11(1):47-55)。TCR、ζ-链和CD3分子一起组成TCR复合物。CD3γ,CD3δ,和CD3ε链是免疫球蛋白超家族中高度相关的细胞表面蛋白，含有单个细胞外免疫球蛋白结构域。CD3分子的胞内尾含有一个保守基序，称作免疫受体酪氨酸激活基序或缩写为ITAM，其是TCR的信号传导能力所必需的。由于CD3是T细胞活化所必需的，故靶向CD3的药物(常常是单克隆抗体)一直以来以及目前都被作为免疫抑制剂疗法进行研究。
本文中使用的术语“免疫球蛋白”可以与“抗体”互换使用。免疫球蛋白包括全长抗体、及其任何抗原结合片段或单链。免疫球蛋白可以是同源二聚体或异源二聚体。免疫球蛋白，特别是天然存在的抗体，是以一或多拷贝的Y形单元存在的糖蛋白，所述单元由四条多肽链组成。每个“Y”形含有2个相同的重链(H)拷贝和2个相同的轻链(L)拷贝，其中重链和轻链因其相对分子量而得名。每条轻链与重链配对，而每条重链与另一条重链配对。共价的链间二硫键和非共价相互作用将这些链连接在一起。免疫球蛋白，特别是天然存在的抗体，含有可变区，其是两个拷贝的抗原结合位点。木瓜蛋白酶(一种蛋白水解酶)将“Y”形切割成3个独立的分子，2个被称为“Fab”或“FAB”片段(Fab＝抗原结合片段)，一个被称为“Fc”片段或“Fc区”(Fc＝可结晶的片段)。Fab片段由完整的轻链和部分重链组成。重链含有1个可变区(VH)和3或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4，取决于抗体类型或同种型)。在CH1和CH2区之间的区域被称为铰链区，其使得Y形抗体分子的2个Fab臂之间具有柔性，允许其打开和闭合以适应于结合相隔固定距离的2个抗原决定簇。本文中提及的“铰链区”是长度为6-62个氨基酸的序列区，仅存在于IgA、IgD和IgG中，涵盖了桥接2条重链的半胱氨酸残基。IgA、IgD和IgG的重链都具有4个区，即，1个可变区(VH)和3个恒定区(CH1-3)。IgE和IgM的重链具有1个可变区和4个恒定区(CH1-4)。免疫球蛋白的恒定区可以介导与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和补体系统经典通路的第一成分(C1q)。每条轻链通常通过1个共价二硫键与重链连接。每条轻链含有1个可变区(VL)和1个轻链恒定区。轻链恒定区是κ轻链恒定区，在本文中称为IGKC，或者是λ轻链恒定区，在本文中称为IGLC。IGKC在本文中与Cκ或CK等价使用，具有相同的含义。IGLC在本文中与Cλ或CL等价使用，具有相同的含义。本文中使用的术语“IGLC区”指所有的λ轻链恒定区，例如，选自IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7的所有λ轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为命名为互补决定区(CDR)的超变区，其间散布了更保守的、命名为框架区(FR或FW)的区域。每个VH和VL都包括3个CDR和4个FR，按下列顺序从氨基端至羧基端排列：FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的表位结合区。工程化的免疫球蛋白可以包含不同的表位结合区形式，例如scFv、FAB或dAb片段。这些片段通常通过与IgG Fc区遗传融合而组装在抗体样结构中。工程化的免疫球蛋白可以通过使用或不使用异源二聚体化增强技术而构建为同源或异源二聚体，并可以具有单或双特异性结合性质。
本文中使用的术语“全长抗体”包括构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。例如，在大多数哺乳动物(包括人和小鼠)中，IgG类的全长抗体是四聚体，由相同的2对组成，每对两条免疫球蛋白链，每一对具有1条轻链和1条重链，每条轻链包含免疫球蛋白区VL和轻链恒定区，每条重链包含免疫球蛋白区VH、CH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)、CH3(Cγ3)和CH4(Cγ4，取决于抗体类型或同种型)。在一些哺乳动物中，例如骆驼和羊驼，IgG抗体可以仅由2条重链组成，每条重链包含与Fc区连接的可变区。
由恒定区的基因决定，抗体被分成类，也称为同种型。人恒定轻链分为κ(CK)和λ(Cλ)轻链。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)，分别定义了抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。因此，本文中使用的“同种型”意指通过恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白类别和/或亚类。已知的人免疫球蛋白同种型有IGHG1(IgGl)、IGHG2(IgG2)、IGHG3(IgG3)、IGHG4(IgG4)、IGHA1(IgA1)、IGHA2(IgA2)、IGHM(IgM)、IGHD(IgD)和IGHE(IgE)。所谓的人免疫球蛋白假-γIGHGP基因代表了另外的人免疫球蛋白重链恒定区基因，该基因已被测序，但由于改变的转换区(switch region)而不编码蛋白质(Bensmana M等人，(1988)Nucleic Acids Res.16(7):3108)。尽管具有改变的转换区，人免疫球蛋白假-γIGHGP基因仍具有所有的重链恒定区(CH1-CH3)和铰链的可读框。其重链恒定区的所有可读框编码与具有预测结构特征的所有人免疫球蛋白恒定区良好对齐的蛋白质区域。该另外的假-γ同种型在本文中被称为IgGP或IGHGP。还报道了其他的假免疫球蛋白基因，如人免疫球蛋白重链恒定区P1和P2假基因(IGHEP1和IGHEP2)。IgG类是最常用于治疗目的的。在人中，该类别包括亚类IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，该类别包括亚类IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3。
本文使用的术语“免疫球蛋白片段”包括但不限于(i)区域，包括例如CH1、CH2或CH3区，(ii)由VL、VH、CL或CK、和CH1区组成的Fab片段，包括Fab′和Fab′-SH，(ii)由VH和CH1区组成的Fd片段，(iii)由单可变区组成的dAb片段(Ward ES等人，(1989)Nature,341(6242):544-6)，(iv)F(ab')2片段，一种包含2个相连的Fab片段的二价片段，(v)单链Fv分子(scFv)，其中VH区和VL区通过肽接头相连，所述接头允许2个区缔合形成抗原结合位点(Bird RE等人(1988)，Science、242(4877):423-6；Huston JS等人，(1988)Proc Natl AcadSci U S A,85(16):5879-83)，(vi)“双抗体(diabody)”或“三抗体(triabodies)”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Holliger P等人，(1993)Proc Natl Acad Sci U S A、90(14):6444-8；Tomlinson I和Holliger P,(2000)Methods Enzymol,326:461-79)，(vii)scFv，与Fc区融合的双抗体或区域抗体，和(viii)与相同或不同抗体融合的scFv。
术语“可变区”是指介导抗原结合并定义特定抗体对特定抗原的特异性的区域或结构域。在天然抗体中，抗原结合位点由定义特异性的两个可变区组成：一个位于重链中，在本文中称作重链可变区(VH)，另一个位于轻链中，在本文中称作轻链可变区(VL)。在人类中，重链可变区(VH)可以分为7个亚组或亚类：VH1,VH2,VH3,VH4,VH5,VH6和VH7。一些情况下，特异性可以仅存在于两个区域的仅一个中，例如在来自驼科动物(camelids)的重链抗体的单域抗体中。这些V区通常大约110个氨基酸长度，由称作框架区(FR或“非CDR区”)的15-30个氨基酸的相对不变氨基酸序列链和称作“高变区”的7-17个氨基酸长度的极度可变的较短区域组成，其中框架区被高变区分隔开。天然重链和轻链的可变结构域包含4个FR,这些FR大部分采取β片层构型，通过形成环的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR而紧靠在一起，与来自另一链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat EA等，同上引文)。本文中术语“高变区”是指，负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，后者具有最大的序列变异性和/或参与抗原识别。对于所有可变区，根据Kabat(Kabat EA等，同上引文)进行编号。
有多种CDR定义在使用，并包括在本文中。Kabat定义基于序列的变异性，是最常使用的CDR定义(Kabat EA等，同上引文)。Chothia则是指结构环的位置(Chothia&Lesk J.(1987)Mol Biol,196:901-917)。AbM定义是Kabat和Chothia定义的折中，用于OxfordMolecular的AbM抗体模建软件(Martin ACR等,(1989)Proc Natl Acad Sci USA86:9268–9272；Martin ACR等,(1991)Methods Enzymol,203:121–153；Pedersen JT等,(1992)Immunomethods,1:126–136；Rees AR等,(1996)In Sternberg M.J.E.(ed.),ProteinStructure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141–172)。近来引入了接触定义(MacCallum RM等,(1996)J Mol Biol,262:732-745)，其基于对蛋白数据库中可得的复合物结构的分析。(国际ImMunoGeneTics)的CDR定义(http://www.imgt.org)基于对所有物种的所有免疫球蛋白和T细胞受体V-REGIONs的IMGT编号(国际ImMunoGeneTicsLefranc MP等,(1999)Nucleic Acids Res,27(1):209-12；Ruiz M等,(2000)Nucleic Acids Res,28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res,29(1):207-9；Lefranc MP(2003)Nucleic Acids Res,31(1):307-10；Lefranc MP等,(2005)Dev Comp Immunol,29(3):185-203；Kaas Q等,(2007)Briefings inFunctional Genomics&Proteomics,6(4):253-64)。在本发明中提及的所有互补决定区(CDR)优选按如下进行定义(根据Kabat EA等人的编号，同上引文)：
LCDR1:24-34,LCDR2:50-56,LCDR3:89-98,HCDR1:26-35,HCDR2:50-65,HCDR3:95-102。
可变结构域的“非CDR区”称作框架区(FR)。在本文中VL区的“非CDR区”包含氨基酸序列：1-23(FRl),35-49(FR2),57-88(FR3)和99-107(FR4)。在本文中VH区的“非CDR区”包含氨基酸序列：1-25(FRl),36-49(FR2),66-94(FR3)和103-113(FR4)。
本发明CDR可以包含基于上述定义的“延长的CDR”，具有如下可变结构域残基：LCDR1:24-36,LCDR2:46-56,LCDR3:89-97,HCDR1:26-35,HCDR2:47-65,HCDR3:93-102。这些延长的CDR也根据Kabat等人(同上引文)编号。本文中VL区的“非延长CDR区”包含氨基酸序列：1-23(FR1),37-45(FR2),57-88(FR3)和98-大约107(FR4)。本文中VH区的“非延长CDR区”包含氨基酸序列：1-25(FR1),37-46(FR2),66-92(FR3)和103-大约113(FR4)。
本文使用的术语“Fab”或“FAB”或“Fab区”或“FAB区”包括包含VH、CH1、VL和轻链恒定免疫球蛋白区的多肽。Fab可以指分离的这一区域，或位于全长抗体或抗体片段中的这一区域。
本文使用的术语“Fc”或“Fc区”包括这样的多肽，所述多肽包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体重链恒定区。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后2个恒定区免疫球蛋白区域，或IgE和IgM的最后3个恒定区免疫球蛋白区域，和这些结构域N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白区域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)，和Cgammal(Cγl)和Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为包括残基C226或P230至其羧基端，其中根据EU索引编号。Fc可以指分离的这一区域，或位于Fc多肽(例如抗体)环境中的这一区域。
术语“免疫球蛋白恒定区”在本文中指，来自人或动物物种的免疫球蛋白或抗体重链恒定区，涵盖所有同种型。优选地，免疫球蛋白恒定区是人源的，选自但不限于：IGHG1CH1,IGHG2 CH1,IGHG3 CH1,IGHG4 CH1,IGHA1 CH1,IGHA2 CH1,IGHE CH1,IGHEP1 CH1,IGHM CH1,IGHD CH1,IGHGP CH1,IGHG1 CH2,IGHG2 CH2,IGHG3 CH2,IGHG4 CH2,IGHA1CH2,IGHA2 CH2,IGHE CH2,IGHEP1 CH2,IGHM CH2,IGHD CH2,IGHGP CH2,IGHG1 CH3,IGHG2CH3,IGHG3 CH3,IGHG4 CH3,IGHA1 CH3,IGHA2 CH3,IGHE CH3,IGHEP1 CH3,IGHM CH3,IGHDCH3,IGHGP CH3,IGHE CH4和IGHM CH4。优选的“免疫球蛋白恒定区”选自：人IGHE CH2,IGHMCH2,IGHG1 CH3,IGHG2 CH3,IGHG3 CH3,IGHG4 CH3,IGHA1 CH3,IGHA2 CH3,IGHE CH3,IGHMCH3,IGHD CH3和IGHGP CH3。更优选的“免疫球蛋白恒定区”选自：人IGHG1 CH3,IGHG2 CH3,IGHG3 CH3,IGHG4 CH3,IGHA1 CH3,IGHA2 CH3,IGHE CH3,IGHM CH3,IGHD CH3和IGHGPCH3。
术语“表位结合区”包括具有允许免疫球蛋白分子与一个或多个表位特异性结合的最小氨基酸序列的多肽或其片段。天然抗体具有两个表位结合区，也称作抗原结合位点或抗原结合部位或抗原互补位。天然抗体中的表位结合区局限于VH和/或VL结构域的CDR区内，其中存在介导表位结合的氨基酸。除了天然抗体外，可以工程化构建人工VH结构域或VL结构域或其片段及其组合，以提供表位结合区(Holt LJ et al.,(2003)TrendsBiotechnol,21(11):484-490；Polonelli L et al.,(2008)PLoS ONE,3(6):e2371)。基于非免疫球蛋白的表位结合区的实例可以见于作为“支架”用于工程化表位结合区的人工蛋白结构域(Binz HK et al.,(2005)Nat Biotechnol,23(10):1257-1268)或肽模拟物(Murali R&Greene MI(2012)Pharmaceuticals,5(2):209-235)。优选地，术语“表位结合区”包括一个或多个重链可变结构域和一个或多个互补轻链可变结构域的组合，其一起形成允许免疫球蛋白分子与一个或多个表位特异性结合的结合位点。在本发明中示例的表位结合区实例包括scFv和FAB。
本文中，术语“表位”包括多肽或蛋白或非蛋白分子的片段，其在动物中，优选在哺乳动物中且最优选地在人类中，具有抗原性或免疫原性活性。具有免疫原性活性的表位是可以在动物中引起抗体应答的多肽或蛋白的片段。具有抗原性活性的表位是，通过本领域技术人员熟知的任何方法测定，例如通过免疫测定法测定，可以与抗体或多肽特异性结合的多肽或蛋白的片段。抗原性表位无需一定是免疫原性的。优选地，术语“表位”在本文中指至少约3-5，优选约5-10或15至不超过约1,000(或之间的任何整数)个氨基酸的多肽序列，这些氨基酸定义的序列，自身或作为更大序列的一部分，可以与响应于该序列而产生的抗体结合。对于该片段的长度，没有关键性的上限，其可以包含近乎全长的蛋白序列，或甚至包含一个或多个表位的融合蛋白。用于本发明的表位不限于这样的多肽，所述多肽具有其所源自的亲本蛋白的该部分的确切序列。因此，术语“表位”涵盖与天然序列相同的序列、以及对天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常在性质上保守)。蛋白抗原的表位，基于其结构和与表位结合位点的相互作用，可以分为两类，构象表位和线性表位(Goldsby R etal.,(2003)“抗原(第3章)”Immunology(第5版),New York:W.H.Freeman andCompany.pp.57-75,ISBN 0-7167-4947-5)。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成。这些表位基于抗原的3-D表面特征和形状或三级结构，与互补位相互作用。大多数表位是构象表位。相对地，线性表位基于其一级结构与互补位相互作用。线性表位由来自抗原的一段连续氨基酸序列形成。
本文使用的术语“异源二聚体免疫球蛋白”或“异源二聚体片段”或“异源二聚体”或“重链异源二聚体”包括，至少包含第一和第二多肽(如第一和第二区)的免疫球蛋白分子或其部分，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽不同。优选的，异源二聚体免疫球蛋白包含2条多肽链，其中第一链与第二链具有至少一个不同的区域，且其中两条链通过其不同区域组装，即，相互作用。更优选地，异源二聚体免疫球蛋白对至少2个不同配体、抗原或结合位点具有结合特异性，即，是双特异性的。本文使用的异源二聚体免疫球蛋白包括但不限于全长双特异性抗体、双特异性Fab、双特异性F(ab’)2、与Fc区融合的双特异性scFv、与Fc区融合的双抗体和与Fc区融合的结构域抗体。
本文使用的术语“同源二聚体免疫球蛋白”或“同源二聚体片段”或“同源二聚体”或“重链同源二聚体”包括，至少包含第一和第二多肽(如第一和第二区)的免疫球蛋白分子或其部分，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽相同。优选的，同源二聚体免疫球蛋白包括2条多肽链，其中第一链与第二链具有至少一个相同的区域，且其中两条链通过其相同区域组装，即，相互作用。优选的，同源二聚体免疫球蛋白片段包含至少2个区域，其中第一区与第二区相同，且其中两个区通过其蛋白质-蛋白质界面组装，即相互作用。
对于本发明中包括的所有免疫球蛋白恒定区，可以根据(同上引文)编号。
对于选自IGHG1、IGHG2、IGHG3和IGHG4的所有的人CH1、CH2、CH3免疫球蛋白重链恒定结构域，可以根据“EU编号体系”编号(Edelman GM等人，(1969)Proc Natl Acad Sci U SA,63(1):78-85)。对于IGHG1的人CH1、铰链、CH2和CH3恒定区，完整的对应性可见于IMGT数据库(同上引文)。
对于人κ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGKC)，可以根据“EU编号体系”编号(Edelman GM等人，同上引文)。人CK区的完整对应性可见于IMGT数据库(同上引文)。
对于人λ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7)，可以根据“Kabat编号体系”编号(Kabat EA等人，同上引文)。人IGLC区的完整对应性可见于IMGT数据库(同上引文)。
本文所述的人IGHG1免疫球蛋白重链恒定区的区边界如下：CH1区[EU编号：118-215]、铰链γ1[EU编号：216-230]、CH2区[EU编号：231-340]和CH3区[EU编号：341-447]。本文所述的人CK区跨残基108至214(EU编号)。本文所述的人IGLC1、IGLC2、IGLC3、IGLC6和IGLC7区跨残基108-215(Kabat编号)。
本文使用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然氨基酸和非天然氨基酸。优选包括天然氨基酸。
本文中的术语“修饰”或“氨基酸修饰”包括多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中术语“氨基酸取代”或“取代”或“氨基酸残基取代”意指，一个氨基酸序列中第一氨基酸残基被第二氨基酸残基替代，其中第一氨基酸残基与第二氨基酸残基不同，即，替代氨基酸残基与被替代的氨基酸不同。例如，取代R94K指这样的变体多肽，其中第94位的精氨酸被赖氨酸替代。例如，94K表示第94位被赖氨酸取代。出于本文的目的，通常用斜线或逗号分开多个取代。例如，“R94K/L78V”或“R94K，L78V”指包含取代R94K和L78V的双重变体。本文使用的术语“氨基酸插入”或“插入”意指在亲代多肽序列的特定位置添加氨基酸。例如，插入-94表示在第94位的插入。本文使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲代多肽序列的特定位置上的氨基酸。例如，R94-表示缺失第94位的精氨酸。
在一些实施方案中，在蛋白A结合中术语“减少”、“降低”或“下降”是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合，总体减少了至少25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％,97％,或99％至多达100％(消除)。在一些实施方案中，这些术语备选地可以指总体减少10倍(即，1log),100倍(2logs),1,000倍(或3logs),10,000倍(或4logs),或100,000倍(或5logs)。
术语“消除”或“废除”蛋白A结合是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合，总体下降100％，即修饰的免疫球蛋白或其片段与蛋白A的结合完全丧失。
类似地，在与亲和试剂的结合中术语“减少”、“降低”或“下降”是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合，总体减少了至少25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％,97％,或99％至多达100％(消除)。在一些实施方案中，这些术语备选地可以指总体减少10倍(即，1log),100倍(2logs),1,000倍(或3logs),10,000倍(或4logs),或100,000倍(或5logs)。
术语“消除”或“废除”与亲和试剂的结合是指，通过标准本领域已知方法例如本文所述方法检测，与亲本，即未修饰的免疫球蛋白或野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比，修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合，总体下降100％，即修饰的免疫球蛋白或其片段与亲和试剂的结合完全丧失。
“双特异性抗体”是对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是，相对于亲本抗体，在VH区中具有一个或多个氨基酸修饰的双特异性抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体可以是人或人源化抗体。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达靶抗原的细胞。这些抗体具有靶-抗原结合臂和结合细胞毒性剂的臂，细胞毒性剂是例如皂草素(saporin)、抗干扰素α、长春花生物碱(vincaalkaloid)、蓖麻毒蛋白A链、氯甲蝶呤或放射性同位素半抗原。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产基于的是共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello,(1983)Nature,305:537-40)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机组配，这些杂交瘤(四重瘤)产生不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和色谱步骤进行，十分繁琐且低产率。相似的程序公开在WO1993/08829和Traunecker et al.,(1991)EMBO J,10:3655-9中。根据不同方法，具有期望结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合部位)与免疫球蛋白恒定区序列融合。例如融合包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。在一些实施方案中，含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)，存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物、以及如果期望的话，免疫球蛋白轻链的DNA，插入分开的表达载体，共转染合适的宿主生物。在不等比率的三个多肽片段用于构建可以提供最佳产率的实施方案中，这使得可以灵活地调整三个多肽片段的相互比例。然而，当至少两个多肽链的等比率表达可以导致高产率或当比率不是特别重要时，可以将两个或全部三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
双特异性抗体包括交联抗体或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中抗体之一可以与亲和素偶联，而另一可以与生物素偶联。这样的抗体已经例如被提出用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(US4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO1991/00360,WO1992/00373和EP03089)。异源缀合物抗体可以使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂是本领域熟知的(参见US4,676,980)，多种交联技术也是已知的。也考虑具有二价以上效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(参见Tutt A et al.(1991)J.Immunol.147:60-9)。
蛋白A：蛋白A是细胞壁成分，由几个金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株产生，为单个多肽链。蛋白A基因产物由5个同源重复组成，其以串联方式附着到该病原体的细胞壁上。这5个结构域大约58个氨基酸长，命名为EDABC，每一个都显示出免疫球蛋白结合活性(Tashiro M&Montelione GT(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.,5(4):471-481)。这5个同源免疫球蛋白结合结构域折叠成三螺旋捆。每个结构域都能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白质，最显著的是IgG(Hober S et al.,(2007)J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.Life Sci.,848(1):40-47)。蛋白A与大多数免疫球蛋白的重链在Fc区中结合，但在人VH3家族的情况中也可以在Fab区中结合(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)。蛋白A结合来自各种物种，包括人、小鼠、兔和豚鼠的IgG，但不结合人IgG3(Hober S et al.,(2007)同上引文)。人IgG3不能结合蛋白A，可以由人IgG3Fc区中H435R和Y436F替代来解释(EU编号,Jendeberg等,(1997)J.Immunol.Methods,201(1):25-34)。除了IgG外，蛋白A还与IgM和IgA相互作用。
在人VH亚类中，VH3是唯一结合蛋白A的亚类(Graille M et al.,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(10):5399-5404)，蛋白A的所有5个结构域已知都结合该可变结构域亚类(Jansson B et al,(1998)FEMS Immunol.Med.Microbiol.,20(1):69-78)。基于VH3的免疫球蛋白或其片段对生物技术行业至关重要。由于其结合蛋白A的能力有利于其功能性预筛选，故基于VH3的分子已经被广泛地开发，并且由此用于抗体开发的许多合成的或基于供体的噬菌体展示文库或转基因动物技术都基于VH3亚类。此外，由于其良好的表达和稳定性，基于VH3的抗体常优于其他已知的重链可变结构域亚类而被选择。
蛋白A以高亲合力结合抗体的能力是其在生物制药中工业规模应用的驱动力。用于在生物制药中生产抗体的蛋白A通常在大肠杆菌中重组生产，并具有与天然蛋白A基于上相同的功能(Liu HF et al.,(2010)MAbs,2(5):480-499)。最通常的，重组蛋白A与固定相色谱树脂结合用于纯化抗体。最佳结合发生在pH8.2，但在中性或生理条件(pH 7.0-7.6)也发生良好的结合。洗脱通常通过将pH迁移至酸性pH(甘氨酸-HCl,pH2.5-3.0)实现。这可以有效地解离大多数蛋白-蛋白和抗体-抗原结合相互作用，而不会永久地影响蛋白质的结构。然而，一些抗体和蛋白会因低pH而被破坏，最好在回收后通过加入十分之一体积的碱性缓冲液例如1M Tris-HCl,pH 8.0进行立即中和，以最小化在低pH条件中的持续时间。
有多种商业可得的蛋白A色谱树脂。这些介质之间的主要差别在于支持基质的类型、蛋白A配体修饰、孔径和粒径。这些因素的差异造成在可压缩性、化学和物理稳健性、扩散阻力和吸附剂结合能力方面的差别(Hober S et al.,(2007),同上引文)。蛋白A色谱树脂的实例包括但不限于用于实施例中的MabSelect SuReTM蛋白A树脂和MabSelectTM蛋白A树脂(来自GE Healthcare)。
术语“色谱”是指蛋白液相色谱，包括快速蛋白液相色谱(FPLC)——常用于分析或纯化蛋白混合物的一种液相色谱形式。如在其它形式的色谱中一样，由于混合物的不同成分对两个物质——流动液体(流动相)及其通过的多孔相(固定相)——具有不同亲合力，分离是可能的。在FPLC中，流动相是水性溶液或“缓冲液”。缓冲液流速可以在重力流下运行，或通过正排量泵(通常保持在恒定速度)控制，而缓冲液的组成可以通过从两个或两个以上外在贮库抽取不同比率的液体来改变。固定相可以是由珠子组成的树脂，通常为交联琼脂糖，装填在圆柱形玻璃或塑料柱中。取决于应用，可以获得宽范围的珠子大小和表面配体的FPLC树脂。
“亲和色谱”方法涉及使用亲和试剂作为配体，其与固定相交联，对特定的分子或一类分子具有结合亲合力。配体可以是生物分子，如蛋白配体，或可以是合成的分子。两类配体都倾向于具有良好的特异性。生产中最常用的蛋白配体是亲和试剂蛋白A。在亲和色谱中，当溶液(例如含有目的蛋白的粗制细胞上清液)上样到柱上后，通常靶蛋白被吸附，而允许杂质(其它蛋白、脂质、碳水化合物、DNA、色素等)通过柱子。吸附剂本身通常被装填在色谱柱中；但吸附阶段也可以通过以搅拌浆的形式使用吸附剂以分批结合模式进行。吸附后的下一阶段是洗涤阶段，其中洗涤吸附剂以去除残余杂质。然后以半纯或纯形式洗脱结合的蛋白质。洗脱通常通过如下方式进行：改变缓冲液或盐组成，以便蛋白质不再与固定化的配体相互作用并被释放。在一些情况中，目的蛋白可以不结合亲和树脂，亲和色谱定向于结合不需要的杂质，由此可以收集未结合的级分以分离目的蛋白。亲和色谱可以在固定床或流化床中进行。
术语“梯度模式色谱”是指这样的色谱方法，其中“洗脱”缓冲液(缓冲液B)的比例以逐步或逐渐升高的方式从0％增加到100％。
术语“捕获-洗脱模式色谱”或“捕获-洗脱纯化模式”或“捕获-洗脱纯化”是指这样的色谱方法，其中“洗脱”缓冲液(缓冲液B)的比例不是以逐步或逐渐升高的方式从0％增加到100％，而是在捕获和任选地以运行缓冲液(缓冲液A)洗涤步骤后直接地以100％施加。
靶向CD3和CD38的异源二聚体免疫球蛋白的开发
本发明提供结合CD3蛋白复合物的表位结合区，其包含如上所述的重链和轻链CDR，并且还包含重链可变框架区，所述重链可变框架区是人基因IGHV3-23*04(SEQ ID NO：37)的产物或衍生自人基因IGHV3-23*04(SEQ ID NO：37)。重链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：38的相应鼠抗体OKT3重链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是氨基酸取代。通常，在框架区内进行不超过7个、优选不超过6个、优选不超过5个、优选不超过4个、更优选不超过3个、甚至更优选不超过2个、最优选不超过1个氨基酸修饰。在一些实施方案中，本公开提供结合CD3蛋白复合物的表位结合区，其中重链可变区的框架区的氨基酸修饰包括在选自以下组的氨基酸位置的氨基酸取代：34、48、49、58、69、71和73，并且其中每个组成员的氨基酸位置根据Kabat编号来指示。优选地，重链可变区的框架区的氨基酸取代选自：I34M、V48I、A49G、R58N、R58Y、I69L、A71T和T73K。重链可变区的框架区的优选氨基酸取代位于选自34、49和71的氨基酸位置。重链可变区的框架区的更优选氨基酸取代选自I34M、A49G和A71T。
在另一方面，结合CD3蛋白复合物的第一多肽的表位结合区包含轻链可变框架区，所述轻链可变框架区是选自以下的人基因的产物或衍生自选自以下的人基因：IGKV1-39*01(SEQ ID NO：39)和IGKV3-20*01(SEQ ID NO：40)。轻链可变框架区可以包含至少一个来自包含氨基酸序列SEQ ID NO：41的相应鼠抗体OKT3轻链可变区的相应框架区的氨基酸修饰。优选地，氨基酸修饰是氨基酸酸取代。通常，在框架区内进行不超过8个、优选不超过7个、优选不超过6个、优选不超过5个、优选不超过4个、更优选不超过3个、甚至更优选不超过2个、最优选不超过1个的氨基酸修饰。在一些实施方案中，本公开提供结合CD3蛋白复合物的表位结合区，其中轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰包括在选自以下氨基酸位置的氨基酸取代：4、33、34、46、47、66、71和96。优选地，轻链可变区的框架区的氨基酸取代选自：M4L、V33M、A34N、L46R、L47W、R66G、F71Y和P96F。轻链可变区的框架区的优选氨基酸取代位于选自4、46和47的氨基酸位置。轻链可变区的框架区的更优选氨基酸取代选自M4L、L46R、L47W和F71Y。在一些实施方案中，结合CD3蛋白复合物的第一多肽的表位结合区可以包含如上所述的重链可变区序列的框架区的氨基酸修饰和如上所述的轻链可变区序列的框架区的氨基酸修饰。
本公开还提供了结合CD3蛋白复合物的抗体或其片段，其包含选自SEQ ID NO：79至90、91-95和64的重链序列，优选选自SEQ ID NO：64的重链序列。本公开还提供了结合CD3蛋白复合物的抗体或其片段，其包含选自SEQ ID NO：96至104、105至126、127、128和129的轻链序列，优选SEQ ID NO：127的轻链序列。
鉴于这些重链和轻链可变区序列每一个都结合CD3蛋白复合物，故可以将这些重链和轻链可变区序列进行“混配”以产生本发明的抗CD3结合分子。可以使用例如实施例中描述的结合测定法，测试该“混配”抗体的CD3结合。
工程化改造免疫球蛋白恒定区以促进异源二聚体形成超过同源二聚体形成
本领域已知产生异源二聚体免疫球蛋白的方法，最简单的一个方法依赖于在一个细胞中表达两个不同的免疫球蛋白链(WO95/33844,Lindhofer H&Thierfelder S)。不经工程化改造，该直接方法存在同源二聚体的形成超过目的异源二聚体形成的局限性(Kufer Pet al.,(2004)Trends Biotechnol.,22(5):238-244)。当使用增强重链异源二聚体化的互补技术(Merchant AM et al.,(1998)Nat.Biotechnol.,16(7):677-681)时，可以实现较多的异源二聚体产生，但仍有显著量的不期望的同源二聚体生成(Jackman J et al.,(2010)J Biol Chem.,285(27):20850-9,Klein C et al.,(2012)MAbs,4(6):653-63)。因此，本发明利用技术方法(PCT公布号WO2012/131555)，该方法基于生物模拟的独特概念，其在异源二聚体化方面显示出优于现有技术方法。BEAT技术基于在天然的同源或异源二聚体免疫球蛋白结构域对之间的界面交换来产生新的异源二聚体，该新的异源二聚体可以用作基于Fc的双特异性抗体的构件。
一方面，本发明提供包含第一和第二多肽的异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在选自以下位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,85.1,86,88和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置84.4和在选自以下位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,85.1,86,88和90(编号)。
在再一实施方案中，本发明提供异源二聚体免疫球蛋白或其片段，其中第一和第二多肽包含具有修饰的CH3结构域的工程化免疫球蛋白恒定区，所述修饰的CH3结构域具有蛋白-蛋白界面，其中第一多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置88和在选自下组的位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,85.1,86和90(编号)，并且其中第二多肽的蛋白-蛋白界面包含在位置85.1和/或86以及在选自下组的位置的氨基酸取代：3,5,7,20,22,26,27,79,81,84,84.2,84.4,88和90(编号)，其中第一工程化免疫球蛋白恒定区中位置88的取代氨基酸残基与第二工程化免疫球蛋白恒定区中位置85.1和/或86的取代氨基酸残基相互作用，其中每个组成员的氨基酸位置根据编号表示。
优选地，第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置88的取代氨基酸残基是88W及其保守氨基酸取代，其中氨基酸位置根据编号给出。更优选地，第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中位置88的取代氨基酸残基是88W，且其中第一工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中另外的取代氨基酸残基选自：3A,20V,20T,20A,20N,20Q,20E,20S,20K,20W,22A,22G,22T,22L,22I,22V,26R,26Q,26T,26K,26V,26S,26N,26E,79Y,85.1T,85.1M,85.1A,85.1S,85.1R,85.1H,85.1K,85.1F,85.1C,85.1N,85.1W,86S,86I,86T,86H,86Q,86V,86W,86Y,86F和90N,其中氨基酸位置根据编号表示。
优选地，在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中在位置85和86进行取代的氨基酸残基选自：85.1A,85.1S,85.1C和86S及其保守氨基酸取代(编号)。更优选地，在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中进行取代的氨基酸残基选自：85.1A,85.1S,85.1C和86S，且其中在第二工程化免疫球蛋白恒定区的蛋白-蛋白界面中进行取代的其他氨基酸残基选自：3E,5A,7F,20T,22V,26T,81D,84L,84.2E,88R和90R及其保守氨基酸取代(编号)。
实施例
实施例1.材料和方法
构建用于瞬时哺乳动物细胞表达的表达载体
首先编码不同多肽链的cDNA部分或全部由GENEART AG(Regensburg,Germany)合成，并使用标准分子生物学技术修饰。用合适的DNA限制酶消化PCR产物，纯化，连接入之前已经用相同的DNA限制酶消化的修饰的pcDNA3.1质粒(Invitrogen AG,Zug,瑞士)中，所述质粒带有CMV启动子和牛激素多聚腺苷酸化序列(poly(A))。所有的多肽链独立地连接入该表达载体中，其中由鼠源VJ2C前导肽驱动多肽链的分泌。
重组蛋白的表达
抗体、ScFv-Fc融合蛋白、BEAT抗体和抗原，除非另行说明，否则如下述进行表达。对于瞬时表达，使用聚乙烯亚胺(PEI；Sigma,Buchs,瑞士)，将各工程化链载体以等量共转染至悬浮适应化的HEK293-EBNA细胞(ATCC-LGL标准,Teddington,UK；Cat.No:CRL-10852)中。典型地，100ml悬浮细胞(密度0.8-1.2百万个细胞/ml)用DNA-PEI混合物转染。在将编码各工程化链基因的重组表达载体引入宿主细胞中后，进一步培养细胞4至5天以允许免疫球蛋白构建体分泌到培养基(EX-CELL 293,HEK293-无血清培养基(Sigma),补充了0.1％pluronic acid,4mM谷氨酰胺和0.25μg/ml遗传霉素)中，产生免疫球蛋白构建体。通过离心制备含有分泌的免疫球蛋白的无细胞培养物上清液，之后无菌过滤并用于进一步的分析。
差异蛋白A亲和色谱
产生后，将无细胞上清液加载到在0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH 6.0中预平衡的1ml HiTrapTMMabSelect SuReTM蛋白A柱上，并在色谱系统上(两者均来自GE Healthcare Europe GmbH；柱目录号:11-0034-93)以1ml/min流速运行。运行缓冲液是0.2M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液pH6。使用20mM柠檬酸钠缓冲液pH4洗脱目的异源二聚体，而使用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱同源二聚体物质。
通过280nm的OD读数，跟踪洗脱；合并含有目的异源二聚体的级分，用0.1体积的1MTris pH 8.0(Sigma)中和。
通过SDS-PAGE(NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺，Invitrogen AG，Basel，瑞士)在非还原条件下分析上清液、流通液和洗脱级分。
差示扫描量热法(DSC)
使用量热测量，比较抗体的热稳定性。在VP-DSC差式扫描微量热仪(MicroCal-GEHealthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上，进行量热测量。细胞体积是0.128ml，加热速度是1℃/min，保持过压在64p.s.i.。所有蛋白片段均以浓度1-0.5mg/ml在PBS(pH 7.4)中使用。通过与含有相同缓冲液但已经省去了蛋白的重复样品进行比较，估计每个蛋白的摩尔热容。使用标准程序分析了偏摩尔热容和熔解曲线。温谱图进行了基线校正和浓度标化后，使用非二态模型(Non-Two State model)在软件Origin v7.0中进一步分析。
人IgG亚类的预期熔解曲线是已知的(Garber E&Demarest SJ(2007)BiochemBiophys Res Commun,355(3):751-7)，并且所有曲线均显示出含有三个解折叠过渡，相应于CH2、CH3和FAB结构域的独立解折叠。在4个人IgG亚类中，IGHG1具有最稳定的CH3结构域(～85℃)；而其它亚类CH3结构域较不稳定，但已知无一在70℃以下熔解。类似地，已知所有亚类的CH2结构域具有～70℃的熔解温度。
通过毛细管凝胶电泳进行的纯度评估
非还原样品制备
将40μg脱盐的蛋白样品缓冲在含有5mM碘乙酰胺(Sigma)的SDS样品缓冲液(Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士；IgG Purity Kit,Cat.No:A10663)中。在样品中加入10-kDa内标。样品混合物在70℃加热10分钟。
毛细管凝胶电泳
样品制备后，在配备有设定在220nm的光电二极管阵列检测器(DAD)的ProteomeLab PA 800(Beckman Coulter International S.A.,Nyon,瑞士)上，运行样品。使用裸露的熔融石英毛细管50μm ID×30.2cm(至检测器的20.2cm有效长度)作为分离介质。样品注射和分离分别在5和15kV恒压进行，在SDS分子量凝胶缓冲液中反转极性。以2Hz的速度记录数据，在分离过程中电流稳定。毛细管和样品被恒温调节在25℃。
通过SPR的亲和性测量
使用SPR分析测量不同抗体(鼠源和人源化抗体)结合动力学的结合和解离速度常数。在BIAcore 2000仪器(BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH,Glattbrugg,瑞士)上室温测量抗体的结合动力学，用BiaEvaluation软件(4.1版,BIAcore-GE Healthcare EuropeGmbH)分析。
在CM5传感器芯片(GE Healthcare Europe GmbH,Cat.No:BR-1000-14)上进行测量，所述芯片使用商业胺偶联试剂盒(GE Healthcare Europe GmbH,Cat.No:BR-1000-50)分别偶联了目的配体。蛋白G配体来自Pierce(Thermo Fisher Scientific-PerbioScience S.A.,Lausanne,瑞士,Cat.No:21193)。
数据(传感图：fc2-fc1)拟合1:1Langmuir模型(如所示的，有或无传质)。在捕获实验中，为了解决在每次测量开始时的实验变异性，在所有拟合中将Rmax值设置为局部的(local)。解离时间为至少350秒。一式三份进行测量，测量包括零浓度样品作为参照。使用Chi2和残差值来评估实验数据和各结合模型之间的拟合质量。
通过FACS在HPB-ALL细胞上的亲合力测量
HPB-ALL细胞(DSMZ,Braunschweig,德国,Cat.No:ACC483)作为CD3阳性细胞系用于FACS染色。HPB-ALL维持在补充了10％FCS和100U/ml青霉素及100ug/ml链霉素的RPMI1640中。将嵌合OKT3抗体和人源化变体的100μl系列稀释物与4x105HPB-all细胞在补充了1％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS(称作FACS缓冲液)中于冰上孵育45分钟。无关人IgG1用作同种型对照，嵌合OKT3抗体用作阳性对照。洗涤后，细胞与1/200稀释的抗人Fc-PE(EBioscience,Vienna,Austria)在冰上孵育45分钟。然后再次洗涤细胞并重悬在200ulFACS缓冲液中。在FACSCalibur(BD Biosciences,Allschwil,瑞士)上测量了每个样品的相对平均荧光。结果总结在图9中，表示为与嵌合OKT3抗体相比，HBP-ALL的相对染色。
用于体外测试的细胞系
人CD38阳性细胞系
表达CD38抗原的人细胞描述在PCT公布号WO2005103083,WO2008047242,WO2011154453和WO2012092612中。在此使用的CD38阳性人细胞系如下：
稳定的重组CHO[CD38]细胞
在Source Biosciences(Berlin,Germany,Cat.-No.:IRAU37D11,4309086)订购了编码人CD38的基因。人CD38使用引物扩增，在5’端添加kozak序列、起始密码子、及随后的信号肽(鼠V前导序列)，并在3’端添加NheI限制性位点。使用NheI和HindIII切割扩增子，克隆至pT1(内部开发的pcDNA3.1(Invitrogen AG)衍生载体)的表达盒中。pT1的表达盒使用两个IRES(内部核糖体进入位点)将目的基因的表达和GFP和PAC(嘌呤霉素抗性基因)的表达连接在一个多顺反子mRNA上。制备质粒的小量制备物，通过DNA测序验证了克隆的CD38开发阅读框。在50ml生物反应器(TubeSpin 50生物反应器,TPP,Trasadingen,瑞士)中，使用聚乙烯亚胺(Polyplus-transfection,Illkirch,法国)转染悬浮CHO-S细胞(Invitrogen AG)。为此目的，将指数生长的细胞接种在OptiMEM培养基(Invitrogen AG,Cat.No.:31985-047)中。向细胞中加入DNA复合物。细胞和DNA复合物在37℃振摇(200RPM)孵育5h进行内吞后，向细胞悬浮液中加入一体积补充了4mM Gln的培养基PowerCHO2(Lonza,distributor RUWAG Lifescience,Bettlach,瑞士,Cat.No:BE12-771Q)。然后，将细胞在摇床上在37℃、5％CO2和80％湿度下孵育。转染后一天，将细胞以不同浓度接种在96孔板中于含有嘌呤霉素的选择培养基(Sigma,Cat.No:P8833-25mg)中。在静止条件下选择大约14天后，使用TubeSpin 50生物反应器，以悬浮培养物形式扩增46个高GFP表达细胞合并物。一旦成功地适应悬浮后，通过FACS分析细胞的CD38。选择具有同质CD38染色谱的稳定CHO[CD38]克隆，并用于本文中。
其它CD38阳性细胞系包括：
NCI-H929(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CRL-9068).
Namalwa(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CRL-1432)
U266(ATCC-LGL标准品；Cat.No:TIB-196)
RPMI 8226(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CCL-155)
培养条件:RPMI 1640培养基，补充10％热灭活的FBS,1％青霉素-链霉素(Invitrogen AG)和1％GlutaMAX-1(Invitrogen AG)
Raji(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CCL-86)
Daudi(ATCC-LGL标准品；Cat.No:CCL-213)
重组靶抗原
人CD3γ-ε-Fc融合蛋白
首先由GENEART AG(德国雷根斯堡)合成cDNA，其编码通过26个残基肽接头(序列：GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS；SEQ ID NO:169)与人CD3ε胞外区(UniProt登录号：P07766，残基22-118(SEQ ID NO：185))融合的人CD3γ胞外区(UniProt登录号：P09693残基23-103(SEQ ID NO：184)；UniProt Consortium(2013)Nucleic Acids Res.,41(Databaseissue):D43-7；http://www.uniprot.org/)。使用标准重叠PCR技术以及从Geneart AG得到的人IgG1Fc cDNA模板，将该合成基因与人IgG1Fc部分融合。将得到的cDNA克隆到上述修饰的pcDNA3.1质粒中。
对于CD3γ-ε-Fc蛋白(SEQ ID NO：170)的瞬时表达，如上所述，使用聚乙烯亚胺(PEI)将重组载体转染到悬浮适应化的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)中。然后使用重组Streamline rProtein A培养基(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)，从无细胞上清液中纯化CD3γ-ε-Fc构建体，并用于进一步分析。
人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白
分别从获自GENEART AG的人和猕猴CD3ε胞外区的合成cDNA，PCR扩增编码人CD3ε肽1-26(UniProt登录号：P07766，氨基酸23-48，SEQ ID NO：171)的cDNA和编码猕猴CD3ε肽1-26(UniProt登录号：Q95LI5，氨基酸22-47，SEQ ID NO：172)的cDNA。随后使用标准重叠PCR技术，将扩增产物与人IgG1Fc部分融合。人IgG1Fc cDNA模板获自Geneart AG。将得到的cDNA克隆到上述修饰的pcDNA3.1质粒中。
对于人和猕猴CD3ε构建体(分别为SEQ ID NO：173和174)的瞬时表达，如上所述使用聚乙烯亚胺(PEI)将重组载体转染入悬浮适应化的HEK-EBNA细胞(ATCC-CRL-10852)。然后使用重组Streamline rProtein A培养基(GE Healthcare Europe GmbH，Glattbrugg，瑞士)从无细胞上清液中纯化CD3ε融合构建体，并用于进一步分析。这两种融合蛋白在本文中被称为人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白。
人和猕猴CD38胞外区
人CD38的cDNA获自Source Biosciences(Erwin-Negelein-Haus，Germany，目录号：IRAU37D11，4309086)，PCR扩增其胞外区(UniProt登录号：P28907残基43-300)并克隆到源自pcDNA3.1(Invitrogen AG)的内部表达载体中。该表达载体在其多克隆位点5'端包含kozak序列和起始密码子及随后的鼠VJ2C前导肽，在3'端包含6-His标签。融合至6-His-标签的人CD38可溶性胞外区(SEQ ID NO：175)如下表达和纯化：在摇瓶中在37℃、5％CO2和80％湿度下孵育1体积的含有HEK细胞、0.1％pluronic acid(Invitrogen AG)、表达载体和聚乙烯亚胺(Polyplus-transfection，Illkirch，France)的RPMI 1640培养基(PAA实验室，目录号：E15-039)。4小时后，将1体积的补充有6mM谷氨酰胺的ExCell293培养基加入到混合物中，并进一步孵育共5天。生产后，通过离心并使用0.2μm过滤器过滤，制备无细胞上清液，使用Tris 1M pH8.7将pH调节至7.4(4℃)。将Ni-Sepharose Excell珠(GEHealthcare，目录号：17-3712-03)加入到溶液中并在4℃下搅拌过夜。将溶液装载至Econo-Column(Bio-Rad Laboratories AG，Reinach，瑞士，目录号737-4252)上用于重力流纯化。将珠子在PBS(2x)、20mM咪唑中洗涤，蛋白质在PBS、500mM咪唑中洗脱。合并洗脱的级分并在4℃下用两个透析步骤将缓冲液交换为PBS。使用0.22μm注射过滤器过滤纯化的人CD38胞外区。
使用如上所述的方法，克隆、表达和纯化融合至6-His标签(SEQ ID NO：176)的猕猴CD38抗原的可溶性胞外区。
体外T细胞重定向杀伤试验
制备外周血单核细胞
为了制备外周血单核细胞(PBMCs)，从瑞士La Chaux-de-Fonds的血液采集中心(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Sérologie,rue Sophie-Mairet29,CH-2300)，收集了含有人白细胞的血液过滤物。用含有10U/ml肝素(liquemin)(Drossapharm AG,Lucern,瑞士)的60ml PBS反洗，从过滤物分离细胞。然后用50mL Blood-Sep-Filter管(Brunschwig,Basel,瑞士)，按照生产商的说明书，纯化PBMCs。800g室温离心(无制动)管子20分钟，从界面收集细胞。用Roswell Park Memorial Institute(RPMI,PAALaboratories,Pasching,Austria)培养基(无FBS或磷酸缓冲盐水PBS)，洗涤细胞3次。以10e6细胞/mL将PBMCs重悬在RDL培养基(补充了10％热灭活胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的RPMI)中，37℃在5％CO2温箱中培养过夜，之后用于试验。
T细胞制备
直接在PBMC分离后，使用pan-T细胞分离试剂盒II(Myltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,Germany,Cat.No:130-091-156)，按照生产商的说明书，纯化T细胞。纯化后，以10e6细胞/mL将T细胞重悬在RDL培养基中，37℃在5％CO2温箱中培养过夜，之后用于试验。
试验读出
使用给出高度相当结果的两个不同读出数值来定量重定向的杀伤。
流式细胞术，在此处称作RDL-FACS法，基于Schlereth B等((2005)Cancer Res,65:2882-2889),Moore PA等((2011)Blood,117(17):4542-51)和Friedrich M等((2012)Mol Cancer Ther,11:2664-2673)中描述的荧光-细胞计数。收获靶细胞，计数，洗涤一次，以5x10e6细胞/mL重悬在PBS+1μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,Sigma)中。细胞在37℃孵育15分钟，每5分钟轻柔振荡一次。用RDL培养基3x洗涤CFSE加载的细胞，并以2x10e5细胞/mL重悬在RDL培养基中。收获PBMCs，计数并以2x10e6细胞/mL重悬在RDL培养基中。在RDL培养基中制备抗体系列稀释物(3x溶液)。将靶细胞(50μl/孔),T细胞(50μl/孔)和3x抗体溶液(50μl/孔)分配到平底96孔板(TPP,Trasadingen,瑞士)中。效应物:靶比率是10:1。平板在5％CO2温箱中37℃孵育48h。孵育后，300g离心平板3分钟，通过轻敲平板，弃去上清液。用200μl PBS洗涤平板一次，再次离心，并弃去PBS。加入预温的accutase(Invitrogen AG)溶液，37℃孵育平板10分钟。加入100μL RDL培养基后，通过上下抽吸将脱壁的贴壁细胞重悬。将溶液转移到U形底96孔板(TPP)中。300g离心U形底板3分钟。弃去上清液，细胞以1/40稀释度重悬于补充有7-AAD(Becton Dickinson AG,Allschwil,瑞士)的200μl冷FACS缓冲液(PBS+2％FBS+10％Versene)中。立即在Guava easyCyteTM流式细胞计数器(Millipore AG,Zug,瑞士)上读取平板。对于每孔，通过门控CFSE阳性7ADD阴性群，使用软件(Miltenyi Biotec GmbH,Bergisch Gladbach,Germany)，确定活靶细胞的绝对数量。使用仅孵育靶细胞的条件作为基线，确定每个样品的比细胞毒性的百分数。使用非线性变斜率回归方法和Prism软件(GraphPad software,La Jolla,CA,USA)，确定EC50值。通过从加有测试抗体的条件下的比细胞毒性百分数中扣除无抗体条件下的比细胞毒性百分数，计算比重定向裂解(RDL)的百分数。
细胞存活力方法，在此为RDL-MTS法，基于比色法来评估细胞存活力，参见BühlerP等((2008)Cancer Immunol Immunother,57:43–52,Labrijn AF等((2013)Proc NatlAcad Sci USA,110(13):5145-50)和PCT公布号WO2012143524中的描述。收获靶细胞，计数，洗涤一次，并以2x10e5细胞/ml重悬在RDL培养基中。收获PBMC，计数，并以2x10e6细胞/mL重悬在RDL培养基中。在RDL培养基中制备抗体系列稀释物(3x溶液)。将靶细胞(50μl/孔),T细胞(50μl/孔)和3x抗体溶液(50μl/孔)分配到平底96孔板(TPP)中。效应物:靶比率是10:1。平板在5％CO2温箱中37℃孵育48h。孵育后，弃去上清液，用200μl PBS洗涤平板3次以移出PBMC，然后每孔加入100μl RDL培养基。使用CellTiter试剂盒(Promega AG,Dübendorf,瑞士)，根据厂商说明书，进行读数。简言之，向每孔加入10-20μl MTS试剂，平板在5％CO2温箱中37℃孵育2-6h。然后在BioTek synergy平板读取器(BioTek AG,Luzern,瑞士)上，读取490nm吸光度。使用下面公式计算比杀伤百分数：比杀伤＝100x[(SD-Sp)/(SD-MD)]。SD是在孵育单独靶细胞的自发死亡条件下测量的吸光度。Sp是在每个测试条件(靶细胞+PBMCs+抗体)下测量的吸光度。MD是在以3个冻融循环裂解靶细胞的最大死亡条件下测量的吸光度。通过从加入测试抗体的条件下的比细胞毒性百分数中扣除无抗体条件下的比细胞毒性百分数，计算了比重定向裂解(RDL)百分数。使用非线性变斜率回归法和Prism软件(GraphPad software)，确定EC50值。
实施例2：靶向人CD3抗原和CD38抗原的抗原结合位点
2.1抗人CD3抗原的抗原结合位点
选择人CD3ε亚基，以通过双特异性结合来驱动T细胞重定向杀伤。
2.1A小鼠OKT3抗体的人源化变体
本文使用的抗人CD3ε抗原结合位点来源于小鼠OKT3抗体(Muromonab-CD3，商品名为Orthoclone OKT3，由Janssen-Cilag销售并随后停销；鼠可变重链和轻链结构域分别具有SEQ ID NO：38和41)。将OKT3鼠可变结构域人源化并形成为scFv和FAB片段。
人源化遵循Jung S&PlückthunA(1997，Protein Eng，10(8)：959-66)描述的方法，以产生适合于FAB和scFv形式的高度稳定的人源化变体。该方法利用抗体(rhuMAbHER2、huMAB4D5-8、曲妥珠单抗或商品名美国专利公开号5,821,337；分别具有SEQ ID NO：20和21的可变重链和轻链结构域)中的高度稳定的VH/VL结构域对，并遵循在固定的框架区上的人源化过程的工作流程(Almagro JC&Fransson J(2008),FrontBiosci,13:1619-33)。由于抗体最初来源于高度稳定的人种系框架VH3和VK1家族，所以来自这两个家族的种系框架可以同等地用作固定框架的来源。或者，可以使用人VK3种系轻链框架家族替代VK1，因为它也具有良好的稳定性(Ewert S等人,(2003)J MolBiol,325:531-553)。除了小鼠抗体之外，可以使用该固定框架方法来设计人抗体以改善稳定性。优选使用分别具有SEQ ID NO：37、39和40的人种系框架IGHV3-23*04、IGKV1-39*01和IGKV3-20*01(根据(国际ImMunoGeneTics信息系统述及)(Lefranc MP等人(1999)Nucleic Acids Res,27(1):209-12；Ruiz M等人(2000)Nucleic Acids Res,28(1):219-21；Lefranc MP(2001)Nucleic Acids Res,29(1):207-9；Lefranc MP(2003)NucleicAcids Res,31(1):307-10；Lefranc MP等人,(2005)Dev Comp Immunol,29(3):185-203；Kaas Q等人,(2007)Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64；http://www.imgt.org)。
为此目的，构建了第一人源化抗体，其中抗体的可变结构域中的CDR分别被来自小鼠OKT3抗体的CDR替代，并以小鼠OKT3抗体的嵌合体(具有SEQ ID NO：130和131的可变重链和轻链，并且在本文中称为嵌合OKT3抗体)作为参照基准。
原型抗体(具有SEQ ID NO：79和96的可变重链和轻链，缩写为VH/VL)在瞬时表达测试中具有增加的生产水平并具有增加的FAB稳定性(如通过差示扫描量热法所测量)，但是不结合HPB-ALL细胞(人CD3ε阳性T细胞肿瘤细胞系)(通过FACS实验中的中值荧光强度评估，参见材料和方法部分)(图1A)。
基于该第一对原型可变结构域的3D模型，选择并测试了一组回复突变(从CDR嫁接的原型至小鼠OKT3序列)：可变重链结构域中I34M,V48I,A49G,R58N,R58Y,I69L,A71T和T73K；和可变轻链中M4L,V33M,A34N,L46R,L47W,R66G,F71Y和P96F(Kabat编号)。注意，R58N取代相应于CDR嫁接的原型至小鼠OKT3的突变，而R58Y取代相应于CDR嫁接的原型至人IGHV3-23*04种系的替代。有关组合取代的工程化策略，基于不同取代在如下方面的互补性：不同取代对CDR区和/或可变结构域组装和/或免疫原性的推定影响。
在第一个方法中，所有候选物制备为人IgG1抗体形式。根据表达水平、FAB片段的热稳定性、和结合HPB-ALL细胞的能力(通过FACS),选择了最佳变体。使用G65S或N82aS取代，消除最佳人源化变体在其VH结构域中存在的蛋白A结合位点。需要该工程化步骤以进一步产生无抗CD3同源二聚体的安全的T细胞重定向BEAT抗体。
在VH中的回复突变I34M、A49G和A71T以及在VL中的回复突变M4L、L46R、L47W和F71Y使亲和力恢复。可变结构域的最佳组合是VH8/VL4、VH8/VL8、VH11/VL4和VH11/VL8，因为其保留了大部分的亲本细胞结合(图1A-C)。此外，组合VH8/VL8(分别具有SEQ ID NO：131和132的可变结构域)和VH11/VL8(分别具有SEQ ID NO：133和132的可变结构域)具有增强的FAB稳定性(分别为+2.8℃和+1.6℃，图1D)。
最后，也将最佳人源化变体重新形成为scFv-Fc融合物形式，并瞬时表达。根据在该形式中的相对亲和力、稳定性、瞬时转染的表达水平，排序变体(图1E)。scFv-Fc融合形式中可变结构域的最佳组合与在抗体形式中鉴定的组合类似：VH8-VL4(具有SEQ ID NO：135的scFv片段)和VH8-VL8(具有SEQ ID NO：136的scFv片段)。两种scFv片段以该scFv-Fc融合形式具有良好的热稳定性(图1F)。
2.1B小鼠SP34抗体的人源化变体
小鼠抗体SP34首先在1985年被描述(Pessano S等人,(1985)EMBO J,4(2):337-44)。它由杂交瘤产生，所述杂交瘤从使用来自HPB-ALL细胞的变性蛋白提取物免疫的小鼠获得，该抗体具有人特异性和对猕猴的交叉反应性。
按照以上实施例所述的方法和程序，通过将CDR嫁接到VH3-23和VK3种系框架上，工程化构建了鼠SP34抗体的人源化VH和VL结构域(SEQ ID NO：1的VH结构域和SEQ ID NO：2的VL结构域)。根据其在BEAT抗体形式中的用途，可以使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)，进一步消除所得的基于VH3的可变结构域对蛋白A的结合。
为此目的，构建了第一人源化抗体，其中具有种系VH3重链结构域和种系VK3轻链结构域的人抗体可变结构域中的CDR分别被来自小鼠SP34抗体的CDR替代。使用所得的人源化抗体作为起点进一步改善亲和力，并以SP34抗体的嵌合体(分别具有SEQ ID NO：137和138的重链和轻链，在本文中称为嵌合SP34抗体)作为参照基准。
原型抗体(具有SEQ ID NO：91和105的可变重链和轻链，缩写为VH1/VL1)对人CD3ε1-26_Fc融合蛋白具有低的结合(通过SPR评估，参见材料和方法部分和图2A)。
基于该第一对原型可变结构域的3D模型，选择了一组取代，所述取代对应于CDR嫁接的人种系VH3/VK3原型和小鼠SP34序列之间的回复突变(人至小鼠或小鼠至人取代)或对应于合理设计的氨基酸变化。以各种组合进行并测试了以下改变：可变重链结构域中的W100eF和W100eY；以及可变轻链中的A2I、S25A、T27A、G27aA、V27cA、T28A、T29A、S30A、N31A、Y32A、E38Q、F44P、G46L、T51A、N52A、K53A、R54A、P56A、L66G、D69T、F87Y、Q89A、W91F、Y92A、S93A、N94A和Q100G(Kabat编号；参见图2A)。关于组合取代的工程化策略，基于不同取代在如下方面的互补性：对CDR区和/或可变结构域组装和/或免疫原性的推定影响、和/或对哺乳动物细胞中瞬时表达的影响。
在第一种方法中，所有候选物形成为人IgG1抗体，并且随后以scFv-Fc融合蛋白形式(图2B)进一步测试，其中一些变体使用G65S消除了在其VH结构域中存在的蛋白A结合位点。根据表达水平和通过SPR测定的与人和猕猴CD3ε1-26_Fc融合蛋白结合的能力，选择了最佳人源化候选物。
令人惊讶的是，当重新形成为scFv时，与IgG1形式相比，SP34嵌合体和H1L21导致了表达的显著丧失(图3)。然而，通过VH中取代W100eY和VL中W91F的组合，增强了scFv-Fc表达(图2B)。
为了进一步改善基于CD3的双特异性的可制造性，进一步设计了人源化SP34scFv。为了鉴定影响SP34scFv-Fc表达的关键位置，在VL21CDR中进行丙氨酸扫描。进行以下改变：T27A、G27aA、V27cA、T28A、T29A、S30A、N31A、Y32A、N52A、K53A、R54A、P56A、L90A、Y92A、S93A、N94A和L95A。有趣的是，只有位置29、30(VH1/VL26SEQ ID NO：139)和95(VH1/VL34SEQ IDNO：140)的取代导致了scFv-Fc表达的显著增加(图4)，而且这些突变体是保持与人和猕猴CD3ε完全结合的仅有那些突变体。
基于这些结果，在轻链中在位置29、30和95测试了更多的取代。
由于位置29和30在所有这些不同的可变轻链家族中显示出高变异性，故通过定点PCR随机突变这两个位置。在产生的所有突变体中，只有取代T29A、T29E、T29S、S30A和S30D在维持与人CD3ε结合的同时，显著改善了瞬时表达水平，图5a和5b。
在一个不同的方法中，L95(本领域中已知的规范结构残基)被取代为在可变λ家族中在该相同位置处最常见的残基。进行以下变化：L95A、L95G、L95T、L95S、L95D和L95N。意外的是，只有L95G和L95T在维持与靶标结合的同时显著改善表达(图5c)。
基于这项工作，设计了几种基于人源化SP34的BEAT，并测试了其表达和与CD3ε的结合。在所有这些构建体中，含有H5L65(SEQ ID NO：69)和H5L67(SEQ ID NO：70)scFv的双特异性显示出，比基于H5L32scFv的BEAT对照，增加2倍的表达(图6)。
通过DSC进一步表征了IgG1或scFv-Fc形式的H5L65和H5L67，并与H5L32、H1L21和SP34嵌合体进行比较。H5L65以IgG1形式显示出优异的热稳定性，但更有意义的是，在scFv-Fc形式中与其他人源化变体相比，显示出5至2℃的增加(表1)。由此，这些改良抗体的体内稳定性增加，体外稳定性也增加。
表1
就抗原结合和重组表达而言，重链和轻链可变结构域的优选组合如下：VH1(SEQID NO:42)或VH2(SEQ ID NO:43)或VH3(SEQ ID NO:44)或VH5(SEQ ID NO:45)，与轻链结构域VL21(SEQ ID NO:46)、VL32(SEQ ID NO:47)、VL65(SEQ ID NO:48)和VL67(SEQ ID NO:49)配对。
2.2抗人CD38抗原的抗原结合位点
CD38是II类跨膜糖蛋白，其正常存在于造血细胞上和实体组织中。CD38也在各种恶性血液学疾病中表达。重定向T细胞以杀伤CD3阳性癌细胞的双特异性抗体可以用于治疗各种恶性血液学疾病，包括多发性骨髓瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞急性淋巴细胞性白血病、氏巨球蛋白血症、原发性系统性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、前淋巴细胞/髓细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、滤泡性淋巴瘤、NK细胞白血病和浆细胞白血病。几种抗CD38抗体已经被描述为研究试剂或治疗剂候选物(PCT公布号:WO2006099875)。OKT-10和HB-7小鼠杂交瘤是表征最好的抗人CD38抗体(Hoshino S etal.,(1997)J Immunol,158(2):741-7)。
在第一种方法中，抗人CD38抗原结合位点可来自小鼠杂交瘤OKT10(分别具有SEQID NO：50和53的可变重链和轻链)或HB-7(分别具有SEQ ID NO：51和54的可变重链和轻链)和其人源化版本，其可进一步制备为FAB或scFv片段形式。按照实施例2.1中描述的方法和程序，通过将CDR嫁接到VH3-23和VK1种系框架上，可以工程化构建HB-7杂交瘤的人源化VH和VL结构域。
在第二种方法中，根据Almagro JC&Fransson J(Front Biosci,(2008)13:1619-33)描述的所谓最适配人源化方法(best-fit humanization method)，通过将CDR嫁接到人IGHV4-59*03和IGKV1-NL1*01种系框架(根据上述述及)上，工程化构建了HB-7杂交瘤的最适配人源化VH和VL结构域。在计算机上(in silico)研究了具有不同程度的回复突变的人源化VH和VL变体，将一个优选选择的人源化VH和VL瞬时表达为人IgG1形式，并且在本文中称为人源化HB-7最适配VH(SEQ ID NO：56)和VL(SEQ ID NO：57)结构域。引入了以下小鼠回复突变：(VH)S35H、I37V、I48L、V67L、V71K、T73N、F78V、Y91F和(VL):M4L、L48I、Y49S、T69K(Kabat编号)。
通过FACS，人源化HB-7最适配抗体(具有SEQ ID NO：141的重链和具有SEQ ID NO：142的轻链)染色CHO[CD38]重组细胞(数据未显示)。当通过SPR分析时，人源化HB-7最适配抗体具有与嵌合HB-7抗体(具有SEQ ID NO：143的重链和具有SEQ ID NO：144的轻链)类似的CD38胞外区结合亲和力(KD分别为3.6和2.5nM；图7A(嵌合)和图7B(人源化))。令人吃惊的是，如从量热谱确定的，人源化HB-7最适配抗体与嵌合HB-7抗体相比，显示出了显著增强的FAB片段稳定性(+14.6℃)(76.4℃(嵌合)vs.91.0℃(人源化)，图7F)。
在第三种方法中，以人CD38胞外结构域和人CD38+细胞免疫小鼠，用于产生针对人CD38的新杂交瘤候选物。产生杂交瘤的方法是已知的，本文使用的方法类似于PCT公开号：WO2013008171中公开的方法。9G7小鼠抗体候选物(分别具有SEQ ID NO：52和55的可变重链和轻链)对人和猕猴CD38两者具有高亲和力。该小鼠抗体首先按照以上实施例所述的方法人源化。使用最适配方法，选择种系VH框架IGHV2-5*09和VK框架IGKV1-33*01(根据上述述及)作为人源化过程的起点。CDR嫁接后，第一抗体原型(人IgG1同种型形式，重链SEQ ID NO：145和轻链SEQ ID NO：146)显示出与人CD38的强结合，如通过SPR确定的，比小鼠亲本抗体仅低三倍(嵌合9G7抗体具有重链SEQ ID NO：147和轻链SEQ ID NO：148；嵌合9G7抗体(数据未显示)和第一人源化原型(数据未显示)的KD分别为0.3nM和1nM)。在抗体可变轻链中引入F36Y回复突变(Kabat编号)后，亲和力提高了两倍(所得抗体在本文中称为人源化9G7最适配抗体，其具有重链SEQ ID NO:145和轻链SEQ ID NO:74；对人CD38的KD为0.5nM，图7C)。人源化9G7最适配抗体还显示对猕猴CD38抗原的高亲和力(KD为3.2nM，数据未显示)，以及比嵌合9G7抗体增强的FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)(对于人源化9G7最适配抗体和嵌合9G7抗体分别为94℃与82.2℃；参见图7G)。人源化9G7最适配抗体具有SEQ ID NO：58的重链可变结构域和SEQ ID NO：59的轻链可变结构域。
此外，通过将CDR嫁接至VH3-23和VK1种系框架上，按照最佳框架方法(best-framework approach)，对9G7小鼠抗体进行了人源化。在计算机上研究了具有不同程度回复突变的人源化VH和VL变体，并且将一个优选选择的人源化VH和VL组合瞬时表达为人IgG1抗体(所得抗体在本文中称为人源化9G7最佳框架抗体，其具有重链SEQ ID NO：149和轻链SEQ ID NO：150)。引入以下小鼠回复突变：(VH)A24F、V37I、V48L、S49A、F67L、R71K、N73T、L78V和K94R；和(VL)F36Y(Kabat编号)。该抗体表现出与人CD38和猕猴CD38的强结合，亲和力常数与人源化9G7最适配抗体相似(对人和猕猴CD38，KD分别为0.4和1nM；图7D)。FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)也非常类似于9G7最适配F36Y人源化变体(89.2℃，参见图7H)。图7J总结了上述不同的人源化9G7抗体。人源化9G7最佳框架抗体具有SEQ ID NO：60的重链可变结构域和SEQ ID NO：61的轻链可变结构域。
在第四种方法中，筛选抗体噬菌体文库以产生针对人CD38的另外scFv片段。该文库具有基于天然人V基因的多样性。该供体衍生的抗体噬菌体展示文库使用从48位人供体的血液淋巴细胞扩增的cDNA，48位人供体中70％具有自身免疫性疾病(血管炎、系统性红斑狼疮、脊椎关节病、类风湿性关节炎和硬皮病)。文库构建遵循Schofield等人(2007,GenomeBiol.,8(11):R254)描述的方案，其中总多样性为2.53×10e10克隆。如下从该供体衍生的噬菌体展示文库中分离了识别人和/或猕猴CD38的ScFv片段。在一系列重复选择循环中在重组来源的人和/或猕猴CD38抗原上分离了ScFv片段(参见材料和方法部分)。筛选抗体噬菌体展示文库的方法是已知的(Viti F等人，(2000)Methods Enzymol,326:480-505)。简言之，在与文库孵育后，回收与固定化的抗原结合的噬菌体，而洗去未结合的噬菌体，其中所述固定化抗原之前已经包被在塑料免疫管上(以20μg/ml浓度在PBS中过夜)或捕获在链霉亲和素珠上(当使用抗原的生物素标记形式时，在整个选择过程中以50nM的浓度捕获抗原)。如Marks等人(Marks JD等人，(1991)J Mol Biol,222(3):581-97)所述，拯救结合的噬菌体，选择过程重复三次。表达来自第二和第三轮淘选的一千多个克隆，并针对人和猕猴CD38抗原通过ELISA进行分析。对阳性克隆进行DNA测序，并进一步分析一些独特克隆结合人CD38表达细胞系的能力。使用固定在链霉亲和素珠上的人CD38抗原的生物素标记版本进行第一轮淘选和使用固定在链霉亲和素珠上的猕猴CD38抗原的生物素标记版本进行第二轮淘选之后，基于结合人和猕猴CD38两者的能力，选择了一个优选的scFv片段(克隆号767)，其具有SEQ ID NO：62的可变重链序列和SEQ ID NO：63的可变轻链。当形成为人IgG1抗体形式时，克隆767对人CD38的KD为约300nM(图7E)，对猕猴CD38的KD为约1.2μM(数据未显示)(克隆767IgG1抗体在本文中称为人767抗体，其具有重链SEQ ID NO：151和轻链SEQID NO：152)。FAB热稳定性(来自DSC扫描的FAB Tm)为70.2℃(图7I)。克隆767VH结构域属于VH3结构域亚类。
实施例3：CD38/CD3靶向BEAT抗体
抗CD38和抗CD3ε臂可以形成为由融合至BEAT链的scFv片段组成的scFv-Fc型重链，或由融合至BEAT链的FAB片段组成的重链(与天然抗体相似)。基于FAB的重链需要与其关联轻链缔合以组装成功能性抗原结合位点。
在CH2区引入L234A和L235A取代，并且酌情地使用G65S或N82aS取代(Kabat编号)消除残留的蛋白A结合。靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：
使用人源化HB7最适配VH和VL序列，按如下形成靶向人CD38抗原和人CD3ε的第一BEAT抗体实例：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建了BEAT CD38/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联的轻链(SEQ ID NO:72)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：153)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：153)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：154)组成。该重链包含人IgG3Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括N82aS取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体(图8的形式A)。
瞬时表达BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体，纯化并在体外测试其对CD38和CD3ε抗原的亲和力、其稳定性及其重定向T细胞杀伤的能力。对人CD38抗原，KD值为3.2nM(通过SPR测量；图9A)。该双特异性抗体的DSC谱显示了良好的热稳定谱，scFv部分的Tm约68℃。FAB部分具有约91℃的Tm(图9B)。
在测定法中使用表达CD38的细胞系(参见材料和方法部分)来评估重定向的T细胞杀伤。图10显示了使用BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体对RPMI 8226骨髓瘤细胞的T细胞重定向杀伤。注意，该测定法使用纯化的T细胞作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1。当用RDL-FACS方法测量时，BEAT CD38-HB7最适配/CD3抗体具有2.2pM的EC50(2个供体的平均值，孵育48小时)。
使用人克隆767VH和VL序列的、靶向人CD38抗原和人CD3ε的第二BEAT抗体实例如下形成：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建BEAT CD38/CD3抗体。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:138)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：65)组成，所述BEAT重链(SEQ IDNO：65)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEATCH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：155)组成。该重链包含人IgG3Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-767/CD3抗体(图8的形式B)。
瞬时表达BEAT CD38-767/CD3抗体，纯化并在体外测试其对CD38和CD3ε抗原的亲和力、其稳定性及其重定向T细胞杀伤的能力。在类似实施例3.2.1所述的测定法中使用表达CD38的细胞系(参见材料和方法部分)来评估重定向的T细胞杀伤。图11显示了使用BEATCD38-767/CD3抗体对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。注意，测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1。当用RDL-FACS方法测量时，BEAT CD38-767/CD3抗体具有244pM的EC50(3个供体的平均值，孵育24小时)。
使用人源化的9G7最佳框架VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD38/CD3抗体。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联的轻链(SEQ ID NO:77)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：75或155)组成，所述BEAT重链包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：68)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-9G7最佳框架/CD3(SP34-κ2)抗体。
使用人克隆767VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的另一个实例如下形成：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38抗原结合位点)，工程化构建BEAT CD38/CD3。
该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:66)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：78)组成，所述BEAT重链包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区、和基于γ3的BEAT CH3结构域。该重链包含人IgG3Fc区的一部分，因此不与蛋白A结合，但是由于此处所用的重链具有源自VH3框架的重链可变结构域，所以突变该VH结构域以包括G65S取代，从而除去重链内的任何其他蛋白A结合位点。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、和基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQID NO：68)组成。该双特异性抗体在本文中称为BEAT CD38-767/CD3(SP34-κ2)抗体。
在第一组实验中，与PBMC组合时，BEAT 9G7/SP34显示出激活T细胞，而分离时则不显示。
实施例4：只包括一个VH3结构域的CD3/CD38BEAT抗体
使用人源化的HB7/最适配VH和VL序列的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的实例如下形成：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建BEAT CD38/CD3。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：72)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：71)组成，所述BEAT重链(SEQ IDNO：71)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以该重链不与蛋白A结合。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：157)组成。该重链和轻链组装物包含如PCT公开号WO2008119565中描述的抗人CD3ε抗体(SP34)的人源化版本。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体(图12的形式A)。
在体外研究了BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体重定向T细胞杀伤CD38+细胞的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定中。图13显示了BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体引起的对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1，并在24小时孵育期后使用RDL-FACS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT CD38-HB7最适配/CD3(SP34)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi CD38+细胞系方面具有高功效，其中EC50为1.8pM(3个供体的平均值)。
使用人源化的9G7最适配VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:58和59)的靶向人CD38抗原和人CD3ε的BEAT抗体的第二个实例如下形成：使用实施例2.1和2.2中描述的抗原结合位点的组合(分别用于抗人CD3ε和抗人CD38臂)，工程化构建BEAT CD38/CD3。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO：74)组装的BEAT重链(SEQ ID NO：73)组成，所述BEAT重链(SEQ ID NO：73)包含可变重链区、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ3CH2区和基于γ3的BEAT CH3结构域。因为该重链包含人IgG3Fc区的一部分并且具有源自非VH3结构域亚类的重链可变结构域，所以其不与蛋白A结合。该异源二聚体免疫球蛋白的抗人CD3ε臂由包含scFv片段、CH1γ1区、γ1铰链区、具有L234A和L235A取代(EU编号)的γ1CH2区、基于γ1的BEAT CH3结构域的BEAT重链(SEQ ID NO：158)组成。该双特异性抗体的臂包含实施例2.1中描述的人源化的SP34VH5/VL32抗体的可变结构域。该BEAT抗体形式在本文中称为BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体(图12的形式B)。CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体具有针对人CD3 1-26_Fc融合蛋白的18nM KD值(图14)。
在体外研究了BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体重定向T细胞杀伤CD38+细胞的能力。CD38+B淋巴母细胞系Daudi用于杀伤测定中。图15显示了BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体引起的对Daudi细胞的T细胞重定向杀伤。测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10比1，以及24小时孵育期后使用RDL-FACS读取方法(参见材料和方法部分)。结果表明，BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)抗体在重定向T细胞杀伤Daudi CD38+细胞系方面具有高度的功效，其中EC50为2pM(3个供体的平均值)。
实施例5：scFv形式中改进的SP34的功能性等同物
为了确定为改善表达而对各种SP34scFv进行的修饰是否也影响其功能性质，即与CD3的结合，在CD38xCD3双特异性背景中测试了这些修饰。作为FAB存在的CD38结合臂包含由SEQ ID NO：60编码的重链可变区和由SEQ ID NO：61编码的轻链可变区。CD3结合臂包含重新格式化为scFv的原始小鼠SP34(SEQ ID NO：207)、或修饰的人源化SP34scFv(包含重链/轻链组合H1/L21(SEQ ID NO：67)、H5/L32(SEQ ID NO：68)、H5/L65(SEQ ID NO：69)和H5/L67(SEQ ID NO：70))。
瞬时表达和纯化使用不同SP34版本的CD3/CD38 BEAT。在体外测试，以比较其重定向T细胞杀伤的能力。Raji CD38表达细胞系(参见材料和方法部分)用于评估重定向的T细胞杀伤。该测定法使用人PBMC作为效应细胞，其中效应细胞与靶细胞的比例为10:1。
当用RDL-FACS方法测量时，所有BEAT显示6至10pM的相当EC50(2个供体的平均值，孵育24小时)图16。
实施例6：D401Q取代消除两种同源二聚体之一中的蛋白A和G结合
为了分析的目的，我们产生了FAB×scFv BEAT抗体的BTA和BTB同源二聚体，其中FAB臂(BTA同源二聚体)不结合蛋白A，因为与上述相似，其包括非-VH3可变结构域和部分人IgG3Fc区；其中scFv臂(BTB同源二聚体)使用其基于VH3的可变结构域及其人IgG1Fc区，结合蛋白A。表达和纯化后(如上所述)，我们发现，通过蛋白G可以容易地纯化BTA同源二聚体(重链SEQ ID NO:156和轻链SEQ ID NO:74)，但BTB同源二聚体只可以通过蛋白A分离，其不结合蛋白G，表明例如在携带BTB CH3结构域(SEQ ID NO:159)的Fc区中蛋白G结合位点的错误折叠或构象变化。考虑到蛋白G与蛋白A结合几乎相同的Fc区部分(在CH2-CH3界面)，这是令人就惊讶的——BTB同源二聚体结合蛋白A但不结合蛋白G。随后假设，BTB同源二聚体的蛋白A结合仅由位于scFv部分中的蛋白A结合位点介导，所述scFv部分如上所述包括基于VH3的可变结构域。为了评价scFv对于结合蛋白A所起的作用，产生了缺乏基于VH3的scFv的构建体，并发现不再结合蛋白A(SEQ ID NO:160，参见图17)。由此得出结论，在BTB同源二聚体中，Fc区中的蛋白A和G结合位点都是非功能性的。
这后一结果表明，BTB同源二聚体确实在蛋白A/G结合区中是错误折叠的或结构改变了的。然而，将BTB CH3结构域用于异源二聚体免疫球蛋白时的先前数据给出了相反的提示。为了进一步研究异源二聚体中就蛋白A结合而言BTB CH3结构域的功能性，我们产生了由FAB臂(BTA臂)和scFv臂(BTB臂)组成的FAB×scFv BEAT抗体，该FAB臂因包括非VH3可变结构域、人IgG1铰链、人IgG3CH2结构域和源自人IgG3同种型的工程化BTA CH3结构域而不结合蛋白A(FAB臂重链SEQ ID NO:156和轻链SEQ ID NO:74)，该scFv臂包括消除了蛋白A结合的基于VH3的scFv片段、人IgG1铰链、人IgG1CH2结构域和源自人IgG1同种型的工程化BTBCH3结构域(scFv臂重链具有SEQ ID NO:161)——因此预期异源二聚体仅在scFv臂的Fc区中结合蛋白A。表达和纯化后(如上所述)，发现确实该分子结合蛋白A和G(图18A)并且没有BTB同源二聚体的痕迹。因此，得出结论，蛋白A和G位点在异源二聚体免疫球蛋白中是完好的，并且只有在BTA和BTB链结合时才形成功能性蛋白A/G结合位点。
为了了解BTB同源二聚体内蛋白A/G消除的分子基础，研究了之前工程化的源自人IgG1同种型的BTB CH3结构域。从建模研究鉴定了BTB CH3结构域中的取代D401Q(EU编号，在http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGH Gnber.html提供了EU和IMGT编号之间的比较)，并且将其工程化以消除BTB同源二聚体的第一链的Arg411与BTB同源二聚体的第二链的Asp401之间推定的静电接触(鉴于这种相互作用可能稳定该同源二聚体复合物)。由于在BTB CH3结构域工程化的最后步骤中实施仅该取代，产生了如上所述的FAB×scFv BEAT抗体，在BTB CH3结构域中没有所述D401Q取代(FAB臂的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:156和74；scFv臂重链具有SEQ ID NO:162)。表达和纯化后(如上所述)，发现该分子结合蛋白A和G(图18B)，但显示出BTB同源二聚体的存在，因此表明D401Q取代负责在BTB同源二聚体中观察到的蛋白A/G结合的缺失，由此在异源二聚体免疫球蛋白内对减少所述BTB杂质产生显著的贡献。重要的是，残基401自身不是蛋白A/G结合位点的一部分，而是在CH3-CH3界面位于相对位置。因此，蛋白A/G消除不是直接破坏蛋白A/G和Fc区之间的相互作用的结果。相反地，这表明，出乎预料地，D401Q导致在CH2-CH3界面长范围的构象变化，BTB链彼此之间配对能力差。在异源二聚体体的情况中，界面完美地匹配在一起，并且因此CH2/CH3界面的正确构象使得蛋白A/G结合位点是功能性的。
可以利用此令人惊讶的结果设计新策略，以有效分离无同源二聚体杂质的异源二聚体免疫球蛋白，其中使用以下的特定设计：异源二聚体免疫球蛋白具有第一链和第二链，第一链包括包含BTA CH3结构域的IgG3同种型的Fc区、和非-VH3可变结构域或消除了蛋白A结合的基于VH3的可变结构域(例如，使用G65S或N82aS置换)或无可变结构域，并且因此不结合蛋白A；第二链结合蛋白A，包括BTB D401Q CH3结构域(例如源自人IgG1同种型)、和非-VH3可变结构域或消除了蛋白A结合的VH3可变结构域(例如，使用G65S或N82aS置换)或无可变结构域。在这种情况中，两种同源二聚体都不含蛋白A结合位点。第一同源二聚体是第一链的二聚体并且因为不存在蛋白A结合位点而不结合蛋白A；而第二同源二聚体是第二链的二聚体，具有非功能性的蛋白A结合位点。所得到的异源二聚体只具有一个存在于第二链中的蛋白A结合位点(只有与BTA链配对时，BTB链蛋白A结合位点才是功能性的)。因此，异源二聚体将是结合蛋白A色谱树脂的唯一物质，而不合需要的BTA和BTB链的同源二聚体可以被洗掉。
实施例7：猕猴中CD3/CD38 BEAT体内活性
通过静脉内快速浓注CD3/CD38(包含scFv SEQ ID NO:69形式的CD3重链/轻链组合SP34H5/L65，以及FAB形式的由SEQ ID NO:60编码的CD38重链可变区和SEQ ID NO:61编码的轻链可变区，在本实施例中称作CD3/CD38 BEAT)，对猕猴(macaca fascicularis，每个剂量，1雄性，1雌性)给药。
治疗前以及在每次给药CD3/CD38 BEAT后的不同时间点，获取血样(EDTA)，对所有动物进行了免疫表型分型。使用以下标志物，通过流式细胞术进行了淋巴细胞子集的评价：总T淋巴细胞(CD4和CD8)、单核细胞(CD14)和CD38。在FACSCantoTM II流式细胞仪上获取样品。如下使用FACSDivaTM分析软件分析数据：首先，使用基于正和侧散射特征的电子门控，选择淋巴细胞或单核细胞群(亲本群)。每μL全血中T淋巴细胞群(CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)和CD38阳性单核细胞群(CD14+CD38+)的绝对计数，从源自亲本群门控的其相对百分比和来自验证的血液学分析仪的总亲本群计数，根据公式：绝对群计数(×103/μL)＝(群相对％×总亲本群计数)/100，进行了计算。
施用1和10μg/kg剂量后，存在明显的T细胞计数(CD4和CD8阳性两者)的早期降低(图19)。与给药前1天获得的细胞计数相比，在4小时时间点，1μg/kg给药后CD4T细胞计数存在48和78％降低，在10μg/kg给药后超过90％降低。CD8T细胞计数甚至受到更剧烈地影响，1μg/kg给药后降低86％。CD4T细胞计数快速回弹并且在48小时后整体上与给药前计数相似。然而，CD8T细胞计数恢复较慢并且在1周后达到与给药前相似的水平。这种外周血T细胞的瞬时降低是预期的，反映这些群体被CD3/CD38 BEAT激活。这些观察表明，T淋巴细胞，并且特别是细胞毒性CD8T细胞，参与组织中的杀伤活动。
循环CD38+单核细胞群也存在明显降低(图20)。观察到了非常快速的消失，接着在24至48h之间回弹。这种回弹通常接着CD38+单核细胞计数的第二次实质性的降低，表明该群体可能被靶向并通过T淋巴细胞的细胞毒性作用而被耗竭。
实施例8：基于9G7的BEAT抗体呈现出比OKT10×OKT3BEAT增强的杀伤活性
在RDL测试中研究了两种不同的基于9G7的BEAT抗体vs.基于OKT10的BEAT抗体的效力。
在本文中称为BEAT CD38-9G7小鼠/CD3的双特异性抗体是基于实施例2中所述的抗原结合位点组合的BEAT CD38/CD3抗体(OKT3VH11/VL8scFv用于抗人CD3ε臂，小鼠-人嵌合9G7FAB用于抗人CD38臂)。双特异性抗体的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:178)装配的BEAT重链(SEQ ID NO:177)组成。双特异性抗体的抗人CD3ε臂由BEAT重链(SEQ IDNO:179)组成，其包括抗人CD3εscFv片段。如上所述，将双特异性抗体瞬时表达并纯化。
本文中称为BEAT CD38-OKT10小鼠/CD3的双特异性抗体是基于实施例2中所述的抗原结合位点组合的BEAT CD38/CD3抗体(OKT3VH11/VL8scFv用于抗人CD3ε臂，小鼠-人嵌合OKT10FAB用于抗人CD38臂)。双特异性抗体的抗人CD38臂由与其关联轻链(SEQ ID NO:181)装配的BEAT重链(SEQ ID NO:180)组成。双特异性抗体的抗人CD3ε臂由BEAT重链(SEQID NO:179)组成，其包括抗人CD3εscFv片段。如上所述，将双特异性抗体瞬时表达并纯化。
本文中称为BEAT CD38-9G7最佳拟合/CD3(SP34-κ2)的BEAT抗体如以上实施例4中所述。
在对抗CD38+靶Daudi细胞(ATCC)的杀伤试验中，评价了基于9G7或OKT10抗CD38mAb的不同BEAT抗体的细胞毒性潜能。进行了基于流式细胞术的读出，来定量靶细胞死亡。相似的基于流式细胞术的读出用于Moore等，Blood.2011Apr 28；117(17):4542-51；Friedrich等，Mol Cancer Ther 2012；11:2664-2673；Schlereth等，Cancer Res2005；65:2882-2889中。效应细胞是来自健康供体的未刺激的PBMC。效应细胞:靶的比例通常为10:1并且孵育时间为48h。简而言之，用荧光细胞质染料(如CFSE)标记靶细胞(Daudi)，并分配于96-孔平板(TPP)中。随后将抗体连续稀释物(3×溶液)和PBMC(50μL/孔)分配于相应孔中。将平板在37℃在5％CO2培养箱中孵育48h。通过抽吸将细胞重悬浮，并转移至U-底96-孔板(TPP)中。将U-底板在300g离心3min，丢弃上清液并将细胞重悬浮于200μL补充了1/40稀释的7-AAD(Becton Dickinson)的冷FACS缓冲液(PBS+2％FBS+10％Versene)中。在guavaeasy CyteTM流式细胞仪(Millipore)上立即获取平板读数。对于每个孔，通过门控染料(CFSE)阳性7ADD阴性群，使用flowjo软件(Treestar)，测定了活的靶细胞的绝对数量。使用只孵育靶细胞的条件作为基线，或使用靶细胞与PBMC混合的条件(无抗体条件)作为基线，测定了每个样品的比细胞毒性％。使用Prism软件(GraphPad软件)，使用非线性可变斜率回归方法，测定了EC50值。
表2中的数据表明使用不同BEAT构建体获得的EC50值。基于9G7的BEAT抗体(BEATCD38-9G7小鼠/CD3和BEAT CD38-9G7最适配/CD3(SP34-κ2)呈现出特征在于明显低于BEATCD38-OKT10小鼠/CD3抗体的EC50的杀伤活性(基于9G7BEAT抗体的3.2和1.9pM vs.基于OKT10的BEAT抗体的125.6pM)，表明基于9G7的抗-CD38/CD3 BEAT抗体具有更高的细胞毒性潜能。
表2：基于9G7的BEAT抗体呈现出比OKT10×OKT3BEAT增强的杀伤活性
*所示的EC50为使用不同的PBMC供体进行的杀伤测试的平均值。对于9G7×OKT3，N＝8；对于OKT10×OKT3，N＝2；对于9G7×SP34(GV2)，n＝1。
实施例9：与HB7抗体相反，9G7和767结合剂不呈现激动作用
由于CD38能用于信号传输，在天然表达CD38的Jurkat人T细胞淋巴瘤细胞系上，在钙流测试中，与HB7克隆相比，测试了9G7和767抗体的激动剂特性。在37℃，在1小时过程中，给Jurkat细胞加载2μM(Invitrogen)的Fluo-4染料。将细胞洗涤并重悬浮于PBS中，PBS补充了1mM Ca2+和1mM Mg2+。在40s过程中，在FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)上获取样品，用于基线。然后将测试抗体以10μg/ml的浓度加入样品中，并继续获取直至7分钟。图G显示了，作为时间的函数，Fluo-4染料(FL-1通道)的平均荧光强度(MFI)，其是钙动员至细胞的细胞质中的读出。尽管同种型对照(IgG1人抗体)没有引发任何钙流，HB7抗-CD38抗体确实诱导了强烈的信号。引人注意地，9G7和767抗体都不能引发钙动员信号，表明这些抗体与HB7抗体相反，不具有CD38激动剂特性。
在相同系列的实验过程中，对于9G7和767，也显示了它们以特异的方式特异性地结合表达CD38的细胞。
实施例10：表位作图
h9G7表位作图
将线性肽作图用于测定人源化9G7的表位(最适配形式)。将人CD38的胞外结构域(残基43-300)分成19个连续肽，长13个氨基酸和最后一个肽11个氨基酸长。在Fc和肽序列之间用两个氨基酸的衔接物(Ala-Ser)，将肽与人IgG1Fc区(CH2-CH3)融合。将这些构建体称为F1-F20(SEQ ID NO:182-201)，并通过SPR分析其结合。将人源化9G7抗体(重链SEQ IDNO:145和轻链SEQ ID ID:146)共价固定于CM5传感器芯片上(约1800RU)。以15nM注射肽Fc-融合体，持续240秒。作为对照，注射人CD38胞外结构域。只有F6和对照给出了结合信号(图22)。所有片段以200nM重新注射，并且F6给出了更强烈的信号(图23)，而剩余的片段仍然显示出无结合(数据未显示)。因为F6是PCT公开NO：WO2008047242中公开的SAR650984抗体(具有SEQ ID NO:202的重链和具有SEQ ID NO:203的轻链)的表位的一部分，通过SPR验证了它们的相互作用并进行了确认(数据未显示)。因此，h9G7和SAR650984竞争人CD38上的结合。此外，将F6序列作图于人CD38的胞外结构域的3D表面上时，其与SAR650984表位重叠。然而，SAR650984已经被证实不与猕猴CD38交叉反应，而人源化9G7以高亲和性结合猕猴CD38(图24)，表明两个抗体具有重叠但不同的表位。
在F6序列内，残基M110在猕猴CD38中是缬氨酸。因此，在人CD38的整个胞外结构域中，我们将M110突变成缬氨酸(SEQ ID NO:204)，并比较h9G7和SAR650984的结合。SAR650984，与其在野生型人CD38上的结合相比，显示出降低的结合，而人源化9G7的结合未受影响(数据未显示)。基于与人CD38胞外结构域复合的SAR650984的晶体结构(PDB登录码4CMH,Deckert et al.,2014Clin.Cancer Res.20:4574)，我们鉴定了对于SAR650984的结合潜在重要的另一残基，该残基在人CD38和猕猴CD38之间是不同的。该残基是T148，并在猕猴CD38中是甲硫氨酸。在人CD38的胞外域中T148突变为甲硫氨酸显著降低了SAR650984的结合，而人源化9G7的结合不受影响(数据未显示)。含有突变M110V和T148M的人CD38胞外结构域的双重突变体(SEQ ID NO:206，参见图23)破坏了SAR650984的结合，而人源化9G7结合未受影响(图24)。因此，可以得出结论，尽管人源化9G7和SAR650984竞争人CD38上的结合，但这些抗体结合的残基不相同。
767表位作图
使用用于上述表位作图实验的相同组线性肽-Fc融合物，对767抗体的表位进行作图。将767抗体(重链SEQ ID NO:151和轻链SEQ ID NO:152)共价固定于CM5传感器芯片上(约700RU)。将肽Fc-融合物(F1-F20，SEQ ID NO:182-201)以1000nM注射，持续240秒。将人CD38胞外结构域作为对照注射。只有F3和对照给出了结合信号(图25)。将F3序列作图于人CD38胞外结构域的3D表位上时(图26)，其与SAR650984表位部分重叠，更具体地，与两个残基重叠：E76和H79。然而，767与猕猴CD38交叉反应(具有较低亲和性)，而SAR650984没有，表明两个抗体具有重叠但不同的表位。此外，通过SPR，SAR650984不结合F3构建体(图27)。因此，可以得出结论，尽管767和SAR650984竞争人CD38上的结合，但这些抗体结合的残基不相同。

Claims (15)

1.一种结合人CD38的抗体或其片段，其包含：
包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:208的氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:209的氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:210的氨基酸序列的重链CDR3；
和/或包含：
包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:211或SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:212的氨基酸序列的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:213的氨基酸序列的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体或其片段，其中抗体或其片段是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.权利要求1或2的抗体或其片段，
其中抗体或其片段包含：
包含SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链可变区序列或与任一所述重链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列，和/或
其中抗体或其片段包含：
包含SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区序列或与任一所述轻链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列。
4.权利要求1或2的抗体或其片段，
其中抗体或其片段包含：
包含SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149的氨基酸序列的重链序列或与任一所述重链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列，
和/或其中抗体或其片段包含：
包含SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:150的氨基酸序列的轻链可变区序列或与任一所述轻链可变区序列的非CDR区具有至少80％同一性的序列。
5.权利要求1至3的抗体或其片段，其中所述抗体或片段包含人重链和/或轻链恒定区和其中人重链恒定区选自由IGHG1、非岩藻糖基化IGHG1和IGHG4组成的人免疫球蛋白组。
6.包含根据权利要求1至3任一项的抗CD38抗体片段的双特异性抗体。
7.根据权利要求6的双特异性抗体，其中所述抗CD38抗体片段选自Fab、Fab'、Fab'-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三抗体和scFv。
8.根据权利要求6至7任一项的双特异性抗体，进一步包含选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fd、Fv、dAb、F(ab')2、scFv、双特异性单链Fv二聚体、双抗体、三抗体和scFv的抗CD3抗体片段。
9.根据权利要求8的双特异性抗体，
其中所述抗CD3抗体片段包含：
包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR1，和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3；或
其中所述抗CD3抗体片段包含：
包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的重链CDR1，和包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的重链CDR3；和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的轻链CDR1，和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的轻链CDR3。
10.结合人和猕猴CD38的抗体或其片段，其与根据权利要求1至5任一项的抗体或其片段或根据权利要求6至9任一项的双特异性抗体结合相同的表位。
11.可溶性人CD38上的表位，其与根据权利要求1至5任一项的抗体或其片段或根据权利要求6至9任一项的双特异性抗体结合。
12.一种包含根据权利要求1至5任一项的抗体或其片段或根据权利要求6至9任一项的双特异性抗体和药物学上可接受载体的组合物。
13.一种包含与治疗剂连接的权利要求1至5任一项的抗体或其片段或根据权利要求6至9任一项的双特异性抗体的免疫缀合物。
14.根据权利要求1至5任一项的抗体或其片段或根据权利要求6至9任一项的双特异性抗体用作药物。
15.根据权利要求1至5任一项的抗体或其片段或根据权利要求6至9任一项的双特异性抗体用作治疗疾病的药物，所述疾病选自恶性血液学疾病，包括多发性骨髓瘤、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病、B-细胞急性淋巴细胞性白血病、氏巨球蛋白血症、原发性系统性淀粉样变性、套细胞淋巴瘤、前淋巴细胞/髓细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、滤泡性淋巴瘤、NK细胞白血病和浆细胞白血病。
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