KR20230154311A - Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체 - Google Patents
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Abstract
신규한 GPC3 결합 도메인, 및 그러한 GPC3 결합 도메인(예를 들어, 항-GPC3 x 항-CD3)을 포함하는 항체가 본원에 제공된다. 또한, GPC3-관련 암의 치료를 위해 그러한 항체를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
Description
우선권 주장
본 출원은 2021년 3월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제63/159,058호 및 2021년 4월 9일자로 출원된 제63/173,127호의 이익을 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
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요약
신규한 GPC3 결합 도메인, 및 그러한 GPC3 결합 도메인(예를 들어, 항-GPC3 x 항-CD3)을 포함하는 항체가 본원에 제공된다. 또한, GPC3-관련 암의 치료를 위해 그러한 항체를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
제1 태양에서는, GPC3 항원 결합 도메인(ABD: antigen binding domain)을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH)/가변 경쇄 도메인(VL) 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 포함한다.
일부 실시 형태에서, ABD는 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는다.
일부 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 실시 형태에서, 조성물은 단클론 항체이다.
다른 태양에서는, a) 제1 단량체, b) 제2 단량체, 및 c) 경쇄를 포함하는 이종이량체 항체가 본원에 제공된다. 제1 단량체는 i) 제1 가변 경쇄 도메인, scFv 링커, 및 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv; 및 ii) 제1 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 scFv는 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 N-말단에 공유적으로 부착된다. 제2 단량체는 VH2-CH1-힌지-CH2-CH3 단량체를 포함하며, 여기서 VH는 제2 가변 중쇄 도메인이고, CH2-CH3은 제2 Fc 도메인이다. 이 실시 형태에서, 제2 가변 중쇄 도메인 및 제2 가변 경쇄 도메인은 GPC3 항원 결합 도메인(ABD)을 형성한다.
일부 실시 형태에서, GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 포함한다.
예시적인 실시 형태에서, GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL쌍을 포함한다.
예시적인 실시 형태에서, GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함한다.
이종이량체 항체의 일부 실시 형태에서, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인은 변이형 Fc 도메인이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 도 1a 내지 도 1e에 도시된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이량체화 변이체의 세트를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선택된 이종이량체화 변이체의 세트는 S364K/E357Q : L368D/K370S; S364K : L368D/K370S; S364K : L368E/K370S; D401K: T411E/K360E/Q362E; 및 T366W : T366S/L368A/Y407V로 이루어진 군으로부터의 것이며, 여기서 넘버링(numbering)은 EU 넘버링에 따른다.
일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 단량체는 하나 이상의 절제 변이체(ablation variant)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 절제 변이체는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K이고, 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
예시적인 실시 형태에서, 제1 또는 제2 단량체 중 하나는 하나 이상의 pI 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 pI 변이체는 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D이고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
이종이량체 항체의 예시적인 실시 형태에서, 제1 단량체는 아미노산 변이체 S364K/E357Q/ E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고, 제2 단량체는 아미노산 변이체 L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 단량체는 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
다른 태양에서, 본원에는 a) N-말단에서 C-말단으로, scFv-링커-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 scFv는 항-CD3 scFv이고, CH2-CH3은 제1 Fc 도메인인 제1 단량체; b) N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인인 제2 단량체; 및 c) VL-CL을 포함하는 경쇄를 포함하는 이종이량체 항체가 제공된다. 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 S364K/E357Q를 포함하고, 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 L368D/K370S를 포함하고, 제1 변이체 Fc 도메인 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고, 제2 단량체의 CH1-힌지-CH2-CH3은 아미노산 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(EU 넘버링)를 포함한다. 추가로, VH 및 VL은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로부터 선택된 GPC3 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 각각 포함하는 GPC3 결합 도메인을 형성하며; 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로부터 선택된 CD3 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 제1 변이형 Fc 도메인과 제2 변이형 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
다른 태양에서는, a) 제1 단량체, b) 제2 단량체, 및 c) 공통 경쇄를 포함하는 이종이량체 항체가 본원에 제공된다. 제1 단량체는 N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-링커 1-scFv-링커 2-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 VH1은 제1 가변 중쇄 도메인이고, scFv는 항-CD3 scFV이고, 링커 1 및 링커 2는, 각각, 제1 도메인 링커 및 제2 도메인 링커이고, CH2-CH3은 제1 Fc 도메인이다. 제2 단량체는, N-말단에서 C-말단으로, VH2-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 VH2는 제2 가변 중쇄 도메인이고 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인이며; c) 공통 경쇄는 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제1 CLDN6 ABD를 형성하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제2 CLDN6 ABD를 형성한다.
다른 태양에서는, a) 제1 단량체, b) 제2 단량체, 및 c) 공통 경쇄를 포함하는 이종이량체 항체가 본원에 제공된다. 제1 단량체는 N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-링커 1-scFv-링커 2-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 VH1은 제1 가변 중쇄 도메인이고, scFv는 항-CD3 scFV이고, 링커 1 및 링커 2는, 각각, 제1 도메인 링커 및 제2 도메인 링커이고, CH2-CH3은 제1 Fc 도메인이다. 제2 단량체는, N-말단에서 C-말단으로, VH2-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 VH2는 제2 가변 중쇄 도메인이고 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인이며; c) 공통 경쇄는 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 제1 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제1 GPC3 ABD를 형성하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제2 GPC3 ABD를 형성한다.
일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 각각 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 GPC3 결합 도메인 각각은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는다. 일부 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 하기 CD3 결합 도메인 중 임의의 것의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다: H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31.
이종이량체 항체의 일부 실시 형태에서, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이다. 일부 실시 형태에서, scFv 링커는 아미노산 서열(GKPGS)4(서열 번호 1)를 갖는 하전된 scFv 링커이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 Fc 도메인과 제2 Fc 도메인은 변이형 Fc 도메인이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 도 1a 내지 도 1e에 도시된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이량체화 변이체의 세트를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선택된 이종이량체화 변이체의 세트는 S364K/E357Q : L368D/K370S; S364K : L368D/K370S; S364K : L368E/K370S; D401K: T411E/K360E/Q362E; 및 T366W : T366S/L368A/Y407V로 이루어진 군으로부터의 것이며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 단량체는 하나 이상의 절제 변이체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 절제 변이체는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K이고, 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
일부 실시 형태에서, 제1 또는 제2 단량체 중 하나는 하나 이상의 pI 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 pI 변이체는 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D이고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
이종이량체 항체의 예시적인 실시 형태에서, 제1 단량체는 아미노산 변이체 S364K/E357Q/ E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고, 제2 단량체는 아미노산 변이체 L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 단량체는 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다.
45.
제44항에 있어서, 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
다른 태양에서는, a) 제1 단량체, b) 제2 단량체, 및 c) 공통 경쇄를 포함하는 이종이량체 항체가 본원에 제공된다. 제1 단량체는, N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-링커 1-scFv-링커 2-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 scFv는 항-CD3 scFv이고 CH2-CH3은 제1 Fc 도메인이다. 제2 단량체는, N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인이다. 공통 경쇄는 VL-CL을 포함한다. 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 S364K/E357Q를 포함하고, 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 L368D/K370S를 포함하고, 제1 변이체 Fc 도메인 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고, 제2 단량체의 CH1-힌지-CH2-CH3은 아미노산 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D(EU 넘버링)를 포함한다. VH 및 VL은 H1.9_L1.187, H1.24_L1.187, H2.91_L1.187, 및 H1.9_L1.187로부터 선택된 GPC3 ABD의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하고; 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로부터 선택된 CD3 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 조성물, 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 조성물, 발현 벡터 조성물을 포함하는 항체를 제조하기 위한 숙주 세포, 및 항체의 제조 방법이 또한 본원에 제공된다.
항체 기반 치료제는 암을 비롯한 다양한 질환을 치료하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 점점 더 널리 탐구되고 있는 방법은 2가지 상이한 항원에 공동으로 결합하는 단일 면역글로불린 분자의 조작이다. 2가지 상이한 항원에 결합하는 이러한 교대 항체 형식은 종종 이중특이적 항체로 지칭된다. 항체 가변 영역(Fv)의 상당한 다양성으로 인해 사실상 모든 분자를 인식하는 Fv를 생성할 수 있기 때문에, 이중특이적 항체 생성에 대한 전형적인 접근법은 항체에 새로운 가변 영역을 도입하는 것이다.
이중특이적 항체에 특히 유용한 접근법은, 이중특이적 항체가 CD3+ T세포를 방향전환시켜 암세포를 파괴하도록, CD3과 결합하는 제1 결합 도메인 및 암세포와 관련되거나 암세포에서 상향조절되는 항원과 결합하는 제2 결합 도메인을 조작하는 것이다. 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 패밀리 구성원 글리피칸 3(GPC3)은 간세포 암종(특히 간의)에서 고도로 발현되고 건강한 조직에서는 최소한으로 발현되는 것으로 이전에 보고되었다. 이러한 관점에서, 항-GPC3 항체는, 예를 들어 항종양 치료제(예를 들어, 화학요법제 및 T세포)를 이러한 GPC3 발현 종양에 국소화시키는 데 유용한 것으로 여겨진다. CD3 이중특이적 항체 및 CAR-T 요법과 같이 GPC3을 표적화하는 이전의 시도는 일부 성공을 나타냈지만, 전임상 또는 임상 환경에서 사이토카인 방출 증후군과 같은 유해 사례를 입증하였다. 본 발명은, 개선된 치료 프로파일을 갖는, CD3+ 이펙터 T 세포를 GPC3 발현 종양에 국소화시킬 수 있는, CD3 및 GPC3에 대한 신규한 이중특이적 항체를 제공한다
도 1a 내지 도 1e는, Fc 이종이량체화로 이어지는, 유용한 Fc 이종이량체화 변이체 세트(비대칭 변이체 및 pI 변이체를 포함함)의 쌍을 도시한다. 상응하는 "단량체 2" 변이체가 없는 변이체가 존재하며; 이들은 어느 하나의 단량체에 단독으로 사용될 수 있는 pI 변이체이다.
도 2는 등입체성의 변이체 항체 불변 영역 및 이들 각각의 치환의 목록을 도시한다. pI_(-)는 더 낮은 pI 변이체를 표시하는 반면에, pI_(+)는 더 높은 pI 변이체를 표시한다. 이는 본 발명의 다른 이종이량체화 변이체(및 또한 본원에 개괄된 바와 같은 다른 변이체 유형)와 임의로 및 독립적으로 조합될 수 있다.
도 3은, FcγR 결합을 절제하는 유용한 절제 변이체(간혹 "녹아웃(knock out)" 또는 "KO" 변이체로 지칭됨)를 도시한다. 일반적으로, 절제 변이체는 둘 모두의 단량체에 대해 발견되지만, 일부 경우에 이들은 하나만의 단량체에 대한 것일 수 있다.
도 4는, 본 발명의 "비-Fv" 구성요소의 특히 유용한 실시 형태를 도시한다.
도 5는, 본원에 기재된 바와 같이 구성요소로서 하나 이상의 scFv를 이용하는 대상 이종이량체 bsAb의 pI를 증가시키거나 감소시키는 데 사용되는 다수의 하전된 scFv 링커를 도시한 것이다. (+H) 양전하 링커가, 특히 본원에 제시된 항-CD3 VL 및 VH 서열과 함께, 특히 본원에서 사용된다. 단일 전하를 갖는 단일 선행 기술 scFv 링커는, 문헌[Whitlow et al., Protein Engineering 6(8): 989-995 (1993)]에 "휘트로우(Whitlow)"로서 언급되어 있다. 이러한 링커가 scFv에서 응집을 감소시키고 단백질분해 안정성을 향상시키기 위해 사용되었다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이 하전된 scFv 링커는 scFv를 포함하는 본원에 개시된 임의의 대상 항체 형식(예를 들어, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식)에 사용될 수 있다.
도 6은, 다수의 예시적인 도메인 링커를 도시한 것이다. 일부 실시 형태에서, 이러한 링커는 단일-사슬 Fv를 Fc 사슬에 연결하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 조합될 수 있다. 예를 들어, GGGGS 링커(서열 번호 2)는 "하프 힌지(half hinge)" 링커와 조합될 수 있다.
도 7a 내지 도 7d는, Fv 서열 없이, 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇몇 유용한 1 + 1 Fab-scFv-Fc 이중특이적 항체 형식 중쇄 백본(예를 들어, Fab 측에 대한 scFv 및 VH)의 서열을 도시한다. 백본 1은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 2는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 3은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368E/K370S 비대칭 변이체, S364K 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368E/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 4는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, D401K : K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체, D401K 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 5는 인간 IgG1(356D/358L 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 6은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐 아니라, 양쪽 사슬 상에 N297A 변이체를 포함한다. 백본 7은, 돌연변이가 N297S인 점을 제외하고는, 백본 6과 동일하다. 백본 8은 인간 IgG4를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 S228P(EU 넘버링, 이는 Kabat에서 S241P임) 변이체(이는 당업계에 공지된 바와 같이 Fab 아암(arm) 교환을 제거함)를 포함한다. 백본 9는 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, 및 L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체를 포함한다. 백본 10은 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 S267K 변이체를 포함한다. 백본 11은, 그것이 M428L/N434S Xtend 돌연변이를 포함하는 점을 제외하고는, 백본 1과 동일하다. 백본 12는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S 및 P217R/P229R/N276K pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 이들 백본 각각 내에는 (본원에 정의된 바와 같이) 언급된 서열과 90, 95, 98, 및 99% 동일하고/하거나, (당업자가 이해할 바와 같이 모 인간 IgG1(또는 백본에 따라, IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 이미 다수의 아미노산 변형을 함유하는, 도면의 "모"와 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 부가적인 아미노산 치환을 함유하는 서열이 포함된다. 즉, 언급된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 함유된 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체에 더하여, 부가적인 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 함유할 수 있다.
도 8a 내지 도 8c는, Fv 서열 없이, 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇몇 유용한 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 이중특이적 항체 형식 중쇄 백본(예를 들어, Fab 측에 대한 scFv 및 VH)의 서열을 도시한다. 백본 1은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 2는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 3은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368E/K370S 비대칭 변이체, L368E/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 4는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, D401K : K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체, K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 5는 인간 IgG1(356D/358L 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 6은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐 아니라, 양쪽 사슬 상에 N297A 변이체를 포함한다. 백본 7은, 돌연변이가 N297S인 점을 제외하고는, 백본 6과 동일하다. 백본 8은, M428L/N434S Xtend 돌연변이를 포함하는 점을 제외하고는, 백본 1과 동일하다. 백본 9는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 P217R/P229R/N276K pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 이들 백본 각각 내에는 (본원에 정의된 바와 같이) 언급된 서열과 90, 95, 98, 및 99% 동일하고/하거나, (당업자가 이해할 바와 같이 모 인간 IgG1(또는 백본에 따라, IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 이미 다수의 아미노산 변형을 함유하는, 도면의 "모"와 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 부가적인 아미노산 치환을 함유하는 서열이 포함된다. 즉, 언급된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 함유된 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체에 더하여, 부가적인 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 함유할 수 있다.
도 9는, Fv 서열 없이, 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇 가지 유용한 불변 경쇄 도메인 백본(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 서열을 도시한 것이다. 여기에는, (본원에 정의된 바와 같이) 인용된 서열과 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 추가 아미노산 변형을 함유하는 불변 경쇄 백본 서열이 포함되어 있다.
도 10a 내지 도 10f는, 본 발명의 이중특이적 항체에 사용하기에 적합한 예시적인 항-CD3 scFv에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, scFv 링커에는 이중 밑줄이 그어져 있으며(당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 링커는 하전되지 않거나 음성으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있지만, 서열 내에서 scFv 링커는 양성으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커이며(서열번호 15), 이들 중 일부는 도 5에 도시되어 있음), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 표시한다. 또한, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 보여준다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 도면 내의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다.
도 11a 및 도 11b는, 임상 개발의 용이성을 위해 둘 모두에 결합하는 항원 결합 도메인의 개발을 용이하게 하는, 인간 및 사이노 둘 모두를 포함하는 본 발명에 유용한 다수의 항원에 대한 항원 서열을 도시한다.
도 12는 인간화 GPC3-A 변이체에 대한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 불변 도메인 사이의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 나아가, 도면의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 도시된 가변 중쇄 도메인 각각은 임의의 다른 αGPC3-A 가변 경쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있으며; 본원에 도시된 가변 경쇄 도메인 각각은 임의의 다른 αGPC3-A 가변 중쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있다.
도 13a 내지 도 13g는 감소된 분해(예를 들어, 아스파르트산 이성질화 및 탈아미드화) 취약성(liability), 조절되는 GPC3 결합 친화도, 및/또는 높은 GPC3 발현 세포주에 대한 선택성을 위해 조작된 GPC3-A 변이체에 대한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 불변 도메인 사이의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 도면의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 나아가, 본원에 도시된 가변 중쇄 도메인은 각각 임의의 다른 αGPC3 가변 경쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있으며; 본원에 도시된 가변 경쇄 도메인은 각각 임의의 다른 αGPC3 가변 중쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있다.
도 14a 내지 도 14e는 2가 항-GPC3 mAb 및 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 갖는 IgG1 백본으로서 형식화된 예시적인 GPC3-A 변이체를 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 불변 도메인 사이의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 도면 내의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 2가지 형식을 도시한다. 도 15a는 "1 + 1 Fab-scFv-Fc" 형식을 도시하며, 제1 Fab 아암은 GPC3에 결합하고 제2 scFv 아암은 CD3에 결합한다. 도 15b는 GPC3에 결합하는 제1 Fab 아암 및 제2 Fab-scFv 아암을 갖는 "2 + 1 Fab2-scFv-Fc" 형식을 도시하며, 여기서 Fab는 GPC3에 결합하고 scFv는 CD3에 결합한다.
도 16a 내지 도 16c는 CD3 고 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.30_L1.47)를 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 17a 내지 도 17g는 CD3 고-Int #1 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.32_L1.47)를 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 18a 및 도 18b는 CD3 고 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.30_L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 19a 내지 도 19h는 CD3 고-Int#1 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.32_L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 둘 모두의 Fc 도메인 내에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도20a 내지 도 20e는 CD3 고-Int#2 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.89_ L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 21은 CD3 중간 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.33_L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3-A x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3-A x αCD3 bsAb는 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90, 95, 98, 및 99% 동일하고/하거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있음에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 22는 WO 2016/047722호에 개시된 바와 같은 비교기 αGPC3 x αCD3 이중특이적 항체를 기반으로 하는 서열을 도시한다.
도 23은 인간 및 사이노몰거스 GPC3 항원에 대한 5개의 GPC-A 친화도 변이체 H1.1_L1.6, H1.1_L1.29, H1.1_L1.16, H1.1_L1.23, 및 H1.1_L1.31(CD3 고-Int#1 scFv를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc로서 형식화됨)의 결합 친화도를 도시한다. 친화도 변이체는 광범위한 결합(4 내지 400 nM Kd)을 입증했으며, 사이노몰거스 GPC3에 대해 교차 반응성이었다.
도 24는 HepG2(GPC3고) 세포에 대한 3개의 GPC-A 친화도 변이체 H1.1_L1.29, H1.1_L1.16, 및 H1.1_L1.31(CD3 고-Int#1 scFv를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc로서 형식화됨)의 결합을 도시한다.
도 25는 인간 GPC3-A에 대한 분해 취약성을 제거하도록 조작된 GPC3-A 변이체의 결합을 도시한다. 변이체 중 몇몇은 GPC3에 대한 감소된 결합 친화도를 입증했다.
도 26은 인간 및 사이노몰거스 GPC3-A에 대한 분해 취약성을 제거하도록 조작된 GPC3-A 변이체의 결합을 도시한다. 변이체 중 몇몇은 GPC3에 대한 감소된, 이상성(biphasic), 또는 제거된 결합을 입증했다.
도 27은 αGPC3 x αCD3 bsAb 비교기 XENP31308에 의한 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포의 활성화(IFNγ 분비에 의해 표시되는 바와 같음)를 도시한다. XENP31308은 GPC3고 HepG2, GPC3중간 Huh7, 및 GPC3저 HEK293 세포 각각의 존재 하에 강력한 RTCC 및 T 세포의 활성화를 유도한다(10:1의 이펙터:표적 비).
도 28은 1:1의 이펙터:표적 비에서 αGPC3 x αCD3 bsAb 비교기 XENP31308에 의한 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포의 활성화(IFNγ 분비에 의해 표시되는 바와 같음)를 도시한다.
도 29는 HepG2(GPC3고) 세포의 존재 하에 CD3 고-Int#1을 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc bsAb로서 형식화된 상이한 GPC3 에피토프에 결합하는 GPC3 결합 도메인에 의한 T 세포의 활성화(IFNγ 방출에 의해 표시되는 바와 같음)를 도시한다. GPC3-A 이외의 GPC3 결합 도메인을 갖는 bsAb 각각은 GPC3-A 결합 도메인을 갖는 bsAb보다 덜 강력하게 T 세포를 활성화하였다.
도 30은 1 + 1 Fab-scFv-Fc bsAb, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc bsAb, 및 2가 단일특이적 mAb의 맥락에서 HepG2(GPC3고)에 대한 A) GPC3-A H1.1_L1.16(100 nM) 및 B) GPC3-A H1.1_L1.31(400 nM) 변이체의 결합을 도시한다. 2 + 1 형식의 BsAb는 1 + 1 형식의 bsAb와 비교하여 더 강력한 결합 (및 2가 단일특이적 mAb에 대한 유사한 결합)을 입증했다. 1 + 1 형식으로부터 2 + 1 형식으로의 효력 시프트는 더 낮은 결합 친화도 GPC3-A_H1.1_L1.31(400 nM) 변이체에 대해 더 현저했다.
도 31은 HepG2(GPC3고) 세포와T 세포(10:1의 이펙터:표적 비) 및 상이한 CD3 결합 친화도를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 αGPC3 x αCD3 bsAb의 인큐베이션 후에 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포에 의한 사이토카인 방출을 도시한다. CD3 고로부터 CD3 고-Int#1로의 CD3 결합 친화도의 이조(detuning)는 RTCC의 효력, 및 더욱 중요하게는, 사이토카인 방출 증후군을 잠재적으로 완화시키기 위한 IFNγ 방출의 실질적인 감소를 제공한다.
도 32는 HepG2(GPC3고) 세포와T 세포(10:1의 이펙터:표적 비) 및 상이한 CD3 결합 친화도를 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 αGPC3 x αCD3 bsAb의 인큐베이션 후에 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포에 의한 사이토카인 방출을 도시한다. CD3 고로부터 CD3 고-Int#1로의 CD3 결합 친화도의 이조는 효력의 실질적인 감소를 제공하지 않았지만, CD3 고-Int#2로의 추가의 감소는 효력의 실질적인 감소를 제공하였다.
도 33은 HepG2(GPC3고) 세포의 존재 하에 CD3 고-Int#2[VLVH] scFv를 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc로서 형식화된 3개의 GPC3-A 친화도 변이체에 의한 A) RTCC의 유도 및 B) 사이토카인 분비를 도시한다. bsAb는 이들의 감소된 친화도와 상관되는 방식으로 RTCC를 유도하였으며, 70 nm GPC3 친화도 변이체를 갖는 XENP37625가 가장 강력한 효력을 입증하였고, 400 nm GPC3 친화도 변이체를 갖는 XENP37626이 가장 약한 효력을 입증하였다. 의외로, H1.1_L1.23 200 nm 친화도 변이체는 400 nm 친화도 변이체로부터 유의하게 구별되는 것으로 보이지 않았다.
도 34는 1:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 부가적인 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP34364, XENP34920, XENP35843, XENP36939, 및 XENP37433)에 의한 A) HepG2 및 B) HEK293 세포에 대한 RTCC의 유도를 도시한다.
도 35는 1:1의 이펙터:표적 비에서 A) HepG2 및 B) HEK293 세포 및 본 발명의 부가적인 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP34364, XENP34920, XENP35843, XENP36939, 및 XENP37433)의 존재 하에 T 세포에 의한 IFNγ 방출의 유도를 도시한다. XENP37430 및 XENP34920은 HepG2에 대한 가장 높은 효력을 입증한 반면에, XENP36939는 가장 낮은 효력을 가졌다. 각각의 bsAb에 의한 IFNγ 방출을 유도함에 있어서의 효력은 RTCC 유도에 있어서의 이들의 효력에 비례하였다. HEK293(GPC저)에 비해 HepG2(GPC고)의 존재 하에 대부분의 bsAb 선택성은 사멸화(및 사이토카인 방출)를 유도하였다.
도 36은 10:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP37625, XENP35843, XENP34920, XENP37624, XENP36939, XENP37433, 및 XENP37626) 및 비교기 bsAb XENP31308에 의한 HepG2에 대한 RTCC의 유도를 도시한다. BsAb XENP34920, XENP37430, XENP37625, 및 XENP37624는 비교기 XENP31308과 유사한 효력(100 ng/ml의 EC50 미만)을 입증했다. 다른 bsAb XENP35843, XENP36935, XENP37433, 및 XENP37626은 훨씬 덜 강력했지만 더 높은 농도에서는 효과적인 사멸화를 달성할 수 있었다. XENP36939는 어떠한 사멸화도 입증하지 않았다.
도 37은 1:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP37625, XENP35843, XENP34920, XENP37624, XENP36939, XENP37433, 및 XENP37626) 및 비교기 bsAb XENP31308에 의한 HepG2에 대한 RTCC의 유도를 도시한다.
도 38은 10:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP37625, XENP35843, XENP34920, XENP37624, XENP36939, XENP37433, 및 XENP37626) 및 비교기 bsAb XENP31308에 의한 Huh7에 대한 RTCC의 유도를 도시한다.
도 39는 2D Incucyte 모델에서 시간경과에 따른 GPC3고 HepG2 종양의 성장을 도시한다. 각각의 시험 물품의 10 ug/ml 처리 농도 및 10:1의 E:T 비를 사용하였다. 다른 Incucyte 연구에서 볼 수 있는 바와 같이, XENP36939는 임의의 유의한 활성을 나타내지 않았으며, 효능은 PBS 대조군과 유사하였다. 그러나, XENP34920, XENP37430, XENP36935, XENP37624, 및 XENP37625를 포함하는 대부분의 다른 시험은 비교기 XENP31308과 유사한 효능을 나타냈다.
도 40은 2D Incucyte 모델에서 시간경과에 따른 GPC3중간 Huh7 종양 세포의 성장을 도시한다. 각각의 시험 물품의 10 ug/ml 처리 농도를 사용하였다. 400 nM GPC3 결합제(XENP36939, XENP37433, 또는 XENP37626)를 갖는 bsAb는 세포 성장을 유의하게 억제할 수 없었다. 그러나, 70 nM 또는 100 nM GPC3 결합제를 갖는 2 + 1 bsAb는 모두 비교기와 유사한 효능으로 성장을 방지할 수 있었다.
도 41은 Incucyte를 사용하는 3D 스페로이드 RTCC 모델의 결과를 도시한다. 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 웰에 시딩하고, 72 내지 96 시간 성장시킨 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 각각의 신호(종양 또는 면역 세포)의 강도를 각각의 웰에 걸쳐 적분하였다. XENP37625가 XENP36935(고-In#1)와 비교하여 더 낮은 친화도 CD3 아암(고-Int#2)을 가짐을 고려하면, XENP34920 및 XENP37624에 대한 곡선은 예상된 것보다 더 유사하였다. 144 시간 후에, XENP36939를 제외한 모든 bsAb는 100% 효능을 나타낸다.
도 42는 Incucyte를 사용하는 3D 스페로이드 RTCC 모델의 결과를 도시한다. 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 웰에 시딩하고, 72 내지 96 시간 성장시킨 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 각각의 신호(종양 또는 면역 세포)의 강도를 각각의 웰에 걸쳐 적분하였다. 흥미롭게, 더 약한 친화도 400 nM GPC3 결합제 중 하나는 최고 수준의 증식을 나타냈다. 1+1 작제물 XENP35843 및 XENP36939를 제외하고, 나머지 bsAb는 비교기 XENP31308과 유사하거나 이보다 더 높은 수준의 면역 세포 증식을 나타냈다.
도 43은 Incucyte를 사용하는 3D 스페로이드 RTCC 모델의 결과의 촬영된 사진을 도시한다. 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 웰에 시딩하고, 72 내지 96 시간 성장시킨 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 표적 종양 세포 스페로이드는 PBS 대조군 컬럼에서 가장 명확하게 볼 수 있으며, 여기서 PBMC는 스페로이드 주위에 클러스터링되고 시간경과에 따라 변화하지 않고 유지된다. PBS 대조군 컬럼을 XENP31308, XENP37625, XENP34920, 및 XENP36935에 의해 처리된 컬럼과 비교하는 단계에서, 면역 세포가 종양 세포를 사멸시킴에 따른 PBMC의 확장이 시각화될 수 있다.
도 44a 내지 도 44j는 본 발명의 몇몇 형식을 도시한다. 첫째는 제1 및 제2 항-항원 결합 도메인을 갖는 1+1 Fab-scFv-Fc 형식이다. 또한, mAb-Fv, mAb-scFv, 중앙-scFv, 중앙-Fv, 1-아암 중앙-scFv, 하나의 scFv-mAb, scFv-mAb, 및 이중 scFv 형식을 모두 나타낸다. 도시된 모든 scFv 도메인에 대해, 이들은 N 말단에서 C 말단으로 가변 중쇄-(선택적 링커)-가변 경쇄 또는 그 반대일 수 있다. 또한, 1-아암 scFv-mAb의 경우, scFv는 중쇄 단량체의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 부착될 수 있다.
도 2는 등입체성의 변이체 항체 불변 영역 및 이들 각각의 치환의 목록을 도시한다. pI_(-)는 더 낮은 pI 변이체를 표시하는 반면에, pI_(+)는 더 높은 pI 변이체를 표시한다. 이는 본 발명의 다른 이종이량체화 변이체(및 또한 본원에 개괄된 바와 같은 다른 변이체 유형)와 임의로 및 독립적으로 조합될 수 있다.
도 3은, FcγR 결합을 절제하는 유용한 절제 변이체(간혹 "녹아웃(knock out)" 또는 "KO" 변이체로 지칭됨)를 도시한다. 일반적으로, 절제 변이체는 둘 모두의 단량체에 대해 발견되지만, 일부 경우에 이들은 하나만의 단량체에 대한 것일 수 있다.
도 4는, 본 발명의 "비-Fv" 구성요소의 특히 유용한 실시 형태를 도시한다.
도 5는, 본원에 기재된 바와 같이 구성요소로서 하나 이상의 scFv를 이용하는 대상 이종이량체 bsAb의 pI를 증가시키거나 감소시키는 데 사용되는 다수의 하전된 scFv 링커를 도시한 것이다. (+H) 양전하 링커가, 특히 본원에 제시된 항-CD3 VL 및 VH 서열과 함께, 특히 본원에서 사용된다. 단일 전하를 갖는 단일 선행 기술 scFv 링커는, 문헌[Whitlow et al., Protein Engineering 6(8): 989-995 (1993)]에 "휘트로우(Whitlow)"로서 언급되어 있다. 이러한 링커가 scFv에서 응집을 감소시키고 단백질분해 안정성을 향상시키기 위해 사용되었다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이 하전된 scFv 링커는 scFv를 포함하는 본원에 개시된 임의의 대상 항체 형식(예를 들어, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식)에 사용될 수 있다.
도 6은, 다수의 예시적인 도메인 링커를 도시한 것이다. 일부 실시 형태에서, 이러한 링커는 단일-사슬 Fv를 Fc 사슬에 연결하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 조합될 수 있다. 예를 들어, GGGGS 링커(서열 번호 2)는 "하프 힌지(half hinge)" 링커와 조합될 수 있다.
도 7a 내지 도 7d는, Fv 서열 없이, 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇몇 유용한 1 + 1 Fab-scFv-Fc 이중특이적 항체 형식 중쇄 백본(예를 들어, Fab 측에 대한 scFv 및 VH)의 서열을 도시한다. 백본 1은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 2는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 3은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368E/K370S 비대칭 변이체, S364K 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368E/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 4는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, D401K : K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체, D401K 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 5는 인간 IgG1(356D/358L 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 6은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐 아니라, 양쪽 사슬 상에 N297A 변이체를 포함한다. 백본 7은, 돌연변이가 N297S인 점을 제외하고는, 백본 6과 동일하다. 백본 8은 인간 IgG4를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 S228P(EU 넘버링, 이는 Kabat에서 S241P임) 변이체(이는 당업계에 공지된 바와 같이 Fab 아암(arm) 교환을 제거함)를 포함한다. 백본 9는 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, 및 L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체를 포함한다. 백본 10은 인간 IgG2를 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 S267K 변이체를 포함한다. 백본 11은, 그것이 M428L/N434S Xtend 돌연변이를 포함하는 점을 제외하고는, 백본 1과 동일하다. 백본 12는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 C220S 및 P217R/P229R/N276K pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 이들 백본 각각 내에는 (본원에 정의된 바와 같이) 언급된 서열과 90, 95, 98, 및 99% 동일하고/하거나, (당업자가 이해할 바와 같이 모 인간 IgG1(또는 백본에 따라, IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 이미 다수의 아미노산 변형을 함유하는, 도면의 "모"와 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 부가적인 아미노산 치환을 함유하는 서열이 포함된다. 즉, 언급된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 함유된 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체에 더하여, 부가적인 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 함유할 수 있다.
도 8a 내지 도 8c는, Fv 서열 없이, 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇몇 유용한 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 이중특이적 항체 형식 중쇄 백본(예를 들어, Fab 측에 대한 scFv 및 VH)의 서열을 도시한다. 백본 1은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 2는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 3은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K : L368E/K370S 비대칭 변이체, L368E/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 4는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, D401K : K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체, K360E/Q362E/T411E 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 5는 인간 IgG1(356D/358L 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 6은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, L368D/K370S 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐 아니라, 양쪽 사슬 상에 N297A 변이체를 포함한다. 백본 7은, 돌연변이가 N297S인 점을 제외하고는, 백본 6과 동일하다. 백본 8은, M428L/N434S Xtend 돌연변이를 포함하는 점을 제외하고는, 백본 1과 동일하다. 백본 9는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)을 기반으로 하며, S364K/E357Q : L368D/K370S 비대칭 변이체, S364K/E357Q 비대칭 변이체를 갖는 사슬 상에 P217R/P229R/N276K pI 변이체, 및 양쪽 사슬 상에 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 이들 백본 각각 내에는 (본원에 정의된 바와 같이) 언급된 서열과 90, 95, 98, 및 99% 동일하고/하거나, (당업자가 이해할 바와 같이 모 인간 IgG1(또는 백본에 따라, IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 이미 다수의 아미노산 변형을 함유하는, 도면의 "모"와 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 부가적인 아미노산 치환을 함유하는 서열이 포함된다. 즉, 언급된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 함유된 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체에 더하여, 부가적인 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 함유할 수 있다.
도 9는, Fv 서열 없이, 인간 IgG1을 기반으로 하는 몇 가지 유용한 불변 경쇄 도메인 백본(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 서열을 도시한 것이다. 여기에는, (본원에 정의된 바와 같이) 인용된 서열과 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 추가 아미노산 변형을 함유하는 불변 경쇄 백본 서열이 포함되어 있다.
도 10a 내지 도 10f는, 본 발명의 이중특이적 항체에 사용하기에 적합한 예시적인 항-CD3 scFv에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, scFv 링커에는 이중 밑줄이 그어져 있으며(당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 링커는 하전되지 않거나 음성으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있지만, 서열 내에서 scFv 링커는 양성으로 하전된 scFv (GKPGS)4 링커이며(서열번호 15), 이들 중 일부는 도 5에 도시되어 있음), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)를 표시한다. 또한, 명명 규칙은 N-말단에서 C-말단으로 scFv의 배향을 보여준다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 도면 내의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다.
도 11a 및 도 11b는, 임상 개발의 용이성을 위해 둘 모두에 결합하는 항원 결합 도메인의 개발을 용이하게 하는, 인간 및 사이노 둘 모두를 포함하는 본 발명에 유용한 다수의 항원에 대한 항원 서열을 도시한다.
도 12는 인간화 GPC3-A 변이체에 대한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 불변 도메인 사이의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 나아가, 도면의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 추가로, 본원에 도시된 가변 중쇄 도메인 각각은 임의의 다른 αGPC3-A 가변 경쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있으며; 본원에 도시된 가변 경쇄 도메인 각각은 임의의 다른 αGPC3-A 가변 중쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있다.
도 13a 내지 도 13g는 감소된 분해(예를 들어, 아스파르트산 이성질화 및 탈아미드화) 취약성(liability), 조절되는 GPC3 결합 친화도, 및/또는 높은 GPC3 발현 세포주에 대한 선택성을 위해 조작된 GPC3-A 변이체에 대한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 불변 도메인 사이의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 도면의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 나아가, 본원에 도시된 가변 중쇄 도메인은 각각 임의의 다른 αGPC3 가변 경쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있으며; 본원에 도시된 가변 경쇄 도메인은 각각 임의의 다른 αGPC3 가변 중쇄 도메인과 쌍을 이룰 수 있다.
도 14a 내지 도 14e는 2가 항-GPC3 mAb 및 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 갖는 IgG1 백본으로서 형식화된 예시적인 GPC3-A 변이체를 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 불변 도메인 사이의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 언급되고, CDR을 함유하는 본원의 모든 서열에 대하여 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 2에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있으며, 따라서 밑줄 그어진 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 추가로, 도면 내의 모든 서열에 대하여, 이러한 VH 및 VL 서열은 scFv 형식 또는 Fab 형식 중 어느 하나로 사용될 수 있다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 2가지 형식을 도시한다. 도 15a는 "1 + 1 Fab-scFv-Fc" 형식을 도시하며, 제1 Fab 아암은 GPC3에 결합하고 제2 scFv 아암은 CD3에 결합한다. 도 15b는 GPC3에 결합하는 제1 Fab 아암 및 제2 Fab-scFv 아암을 갖는 "2 + 1 Fab2-scFv-Fc" 형식을 도시하며, 여기서 Fab는 GPC3에 결합하고 scFv는 CD3에 결합한다.
도 16a 내지 도 16c는 CD3 고 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.30_L1.47)를 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 17a 내지 도 17g는 CD3 고-Int #1 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.32_L1.47)를 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 18a 및 도 18b는 CD3 고 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.30_L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 19a 내지 도 19h는 CD3 고-Int#1 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.32_L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 둘 모두의 Fc 도메인 내에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도20a 내지 도 20e는 CD3 고-Int#2 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.89_ L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3 x αCD3 bsAb가 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90%, 95%, 98% 및 99% 동일하고/하거나 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 21은 CD3 중간 scFv(VHVL 배향 또는 VLVH 배향 중 어느 하나인 H1.33_L1.47)를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3-A x αCD3 bsAb에 대한 서열을 도시한다. CDR에는 밑줄이 그어져 있고, 슬래시는 가변 영역과 다른 사슬 구성요소(예를 들어, 불변 영역 및 도메인 링커) 사이의 경계(들)을 나타낸다. αGPC3-A x αCD3 bsAb는 가변 영역, Fc 영역, 및 (본원에 정의된 바와) 90, 95, 98, 및 99% 동일하고/하거나 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 함유하는 불변 도메인 서열을 이용할 수 있음에 유의해야 한다. 또한, 본원에 개괄된 각각의 서열은 한쪽 또는 바람직하게는 양쪽 Fc 도메인에 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청 내 반감기를 연장시킨다.
도 22는 WO 2016/047722호에 개시된 바와 같은 비교기 αGPC3 x αCD3 이중특이적 항체를 기반으로 하는 서열을 도시한다.
도 23은 인간 및 사이노몰거스 GPC3 항원에 대한 5개의 GPC-A 친화도 변이체 H1.1_L1.6, H1.1_L1.29, H1.1_L1.16, H1.1_L1.23, 및 H1.1_L1.31(CD3 고-Int#1 scFv를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc로서 형식화됨)의 결합 친화도를 도시한다. 친화도 변이체는 광범위한 결합(4 내지 400 nM Kd)을 입증했으며, 사이노몰거스 GPC3에 대해 교차 반응성이었다.
도 24는 HepG2(GPC3고) 세포에 대한 3개의 GPC-A 친화도 변이체 H1.1_L1.29, H1.1_L1.16, 및 H1.1_L1.31(CD3 고-Int#1 scFv를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc로서 형식화됨)의 결합을 도시한다.
도 25는 인간 GPC3-A에 대한 분해 취약성을 제거하도록 조작된 GPC3-A 변이체의 결합을 도시한다. 변이체 중 몇몇은 GPC3에 대한 감소된 결합 친화도를 입증했다.
도 26은 인간 및 사이노몰거스 GPC3-A에 대한 분해 취약성을 제거하도록 조작된 GPC3-A 변이체의 결합을 도시한다. 변이체 중 몇몇은 GPC3에 대한 감소된, 이상성(biphasic), 또는 제거된 결합을 입증했다.
도 27은 αGPC3 x αCD3 bsAb 비교기 XENP31308에 의한 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포의 활성화(IFNγ 분비에 의해 표시되는 바와 같음)를 도시한다. XENP31308은 GPC3고 HepG2, GPC3중간 Huh7, 및 GPC3저 HEK293 세포 각각의 존재 하에 강력한 RTCC 및 T 세포의 활성화를 유도한다(10:1의 이펙터:표적 비).
도 28은 1:1의 이펙터:표적 비에서 αGPC3 x αCD3 bsAb 비교기 XENP31308에 의한 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포의 활성화(IFNγ 분비에 의해 표시되는 바와 같음)를 도시한다.
도 29는 HepG2(GPC3고) 세포의 존재 하에 CD3 고-Int#1을 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc bsAb로서 형식화된 상이한 GPC3 에피토프에 결합하는 GPC3 결합 도메인에 의한 T 세포의 활성화(IFNγ 방출에 의해 표시되는 바와 같음)를 도시한다. GPC3-A 이외의 GPC3 결합 도메인을 갖는 bsAb 각각은 GPC3-A 결합 도메인을 갖는 bsAb보다 덜 강력하게 T 세포를 활성화하였다.
도 30은 1 + 1 Fab-scFv-Fc bsAb, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc bsAb, 및 2가 단일특이적 mAb의 맥락에서 HepG2(GPC3고)에 대한 A) GPC3-A H1.1_L1.16(100 nM) 및 B) GPC3-A H1.1_L1.31(400 nM) 변이체의 결합을 도시한다. 2 + 1 형식의 BsAb는 1 + 1 형식의 bsAb와 비교하여 더 강력한 결합 (및 2가 단일특이적 mAb에 대한 유사한 결합)을 입증했다. 1 + 1 형식으로부터 2 + 1 형식으로의 효력 시프트는 더 낮은 결합 친화도 GPC3-A_H1.1_L1.31(400 nM) 변이체에 대해 더 현저했다.
도 31은 HepG2(GPC3고) 세포와T 세포(10:1의 이펙터:표적 비) 및 상이한 CD3 결합 친화도를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 αGPC3 x αCD3 bsAb의 인큐베이션 후에 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포에 의한 사이토카인 방출을 도시한다. CD3 고로부터 CD3 고-Int#1로의 CD3 결합 친화도의 이조(detuning)는 RTCC의 효력, 및 더욱 중요하게는, 사이토카인 방출 증후군을 잠재적으로 완화시키기 위한 IFNγ 방출의 실질적인 감소를 제공한다.
도 32는 HepG2(GPC3고) 세포와T 세포(10:1의 이펙터:표적 비) 및 상이한 CD3 결합 친화도를 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 αGPC3 x αCD3 bsAb의 인큐베이션 후에 A) RTCC의 유도 및 B) T 세포에 의한 사이토카인 방출을 도시한다. CD3 고로부터 CD3 고-Int#1로의 CD3 결합 친화도의 이조는 효력의 실질적인 감소를 제공하지 않았지만, CD3 고-Int#2로의 추가의 감소는 효력의 실질적인 감소를 제공하였다.
도 33은 HepG2(GPC3고) 세포의 존재 하에 CD3 고-Int#2[VLVH] scFv를 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc로서 형식화된 3개의 GPC3-A 친화도 변이체에 의한 A) RTCC의 유도 및 B) 사이토카인 분비를 도시한다. bsAb는 이들의 감소된 친화도와 상관되는 방식으로 RTCC를 유도하였으며, 70 nm GPC3 친화도 변이체를 갖는 XENP37625가 가장 강력한 효력을 입증하였고, 400 nm GPC3 친화도 변이체를 갖는 XENP37626이 가장 약한 효력을 입증하였다. 의외로, H1.1_L1.23 200 nm 친화도 변이체는 400 nm 친화도 변이체로부터 유의하게 구별되는 것으로 보이지 않았다.
도 34는 1:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 부가적인 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP34364, XENP34920, XENP35843, XENP36939, 및 XENP37433)에 의한 A) HepG2 및 B) HEK293 세포에 대한 RTCC의 유도를 도시한다.
도 35는 1:1의 이펙터:표적 비에서 A) HepG2 및 B) HEK293 세포 및 본 발명의 부가적인 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP34364, XENP34920, XENP35843, XENP36939, 및 XENP37433)의 존재 하에 T 세포에 의한 IFNγ 방출의 유도를 도시한다. XENP37430 및 XENP34920은 HepG2에 대한 가장 높은 효력을 입증한 반면에, XENP36939는 가장 낮은 효력을 가졌다. 각각의 bsAb에 의한 IFNγ 방출을 유도함에 있어서의 효력은 RTCC 유도에 있어서의 이들의 효력에 비례하였다. HEK293(GPC저)에 비해 HepG2(GPC고)의 존재 하에 대부분의 bsAb 선택성은 사멸화(및 사이토카인 방출)를 유도하였다.
도 36은 10:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP37625, XENP35843, XENP34920, XENP37624, XENP36939, XENP37433, 및 XENP37626) 및 비교기 bsAb XENP31308에 의한 HepG2에 대한 RTCC의 유도를 도시한다. BsAb XENP34920, XENP37430, XENP37625, 및 XENP37624는 비교기 XENP31308과 유사한 효력(100 ng/ml의 EC50 미만)을 입증했다. 다른 bsAb XENP35843, XENP36935, XENP37433, 및 XENP37626은 훨씬 덜 강력했지만 더 높은 농도에서는 효과적인 사멸화를 달성할 수 있었다. XENP36939는 어떠한 사멸화도 입증하지 않았다.
도 37은 1:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP37625, XENP35843, XENP34920, XENP37624, XENP36939, XENP37433, 및 XENP37626) 및 비교기 bsAb XENP31308에 의한 HepG2에 대한 RTCC의 유도를 도시한다.
도 38은 10:1의 이펙터:표적 비에서 본 발명의 αGPC3 x αCD3 bsAb(XENP36935, XENP37430, XENP37625, XENP35843, XENP34920, XENP37624, XENP36939, XENP37433, 및 XENP37626) 및 비교기 bsAb XENP31308에 의한 Huh7에 대한 RTCC의 유도를 도시한다.
도 39는 2D Incucyte 모델에서 시간경과에 따른 GPC3고 HepG2 종양의 성장을 도시한다. 각각의 시험 물품의 10 ug/ml 처리 농도 및 10:1의 E:T 비를 사용하였다. 다른 Incucyte 연구에서 볼 수 있는 바와 같이, XENP36939는 임의의 유의한 활성을 나타내지 않았으며, 효능은 PBS 대조군과 유사하였다. 그러나, XENP34920, XENP37430, XENP36935, XENP37624, 및 XENP37625를 포함하는 대부분의 다른 시험은 비교기 XENP31308과 유사한 효능을 나타냈다.
도 40은 2D Incucyte 모델에서 시간경과에 따른 GPC3중간 Huh7 종양 세포의 성장을 도시한다. 각각의 시험 물품의 10 ug/ml 처리 농도를 사용하였다. 400 nM GPC3 결합제(XENP36939, XENP37433, 또는 XENP37626)를 갖는 bsAb는 세포 성장을 유의하게 억제할 수 없었다. 그러나, 70 nM 또는 100 nM GPC3 결합제를 갖는 2 + 1 bsAb는 모두 비교기와 유사한 효능으로 성장을 방지할 수 있었다.
도 41은 Incucyte를 사용하는 3D 스페로이드 RTCC 모델의 결과를 도시한다. 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 웰에 시딩하고, 72 내지 96 시간 성장시킨 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 각각의 신호(종양 또는 면역 세포)의 강도를 각각의 웰에 걸쳐 적분하였다. XENP37625가 XENP36935(고-In#1)와 비교하여 더 낮은 친화도 CD3 아암(고-Int#2)을 가짐을 고려하면, XENP34920 및 XENP37624에 대한 곡선은 예상된 것보다 더 유사하였다. 144 시간 후에, XENP36939를 제외한 모든 bsAb는 100% 효능을 나타낸다.
도 42는 Incucyte를 사용하는 3D 스페로이드 RTCC 모델의 결과를 도시한다. 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 웰에 시딩하고, 72 내지 96 시간 성장시킨 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 각각의 신호(종양 또는 면역 세포)의 강도를 각각의 웰에 걸쳐 적분하였다. 흥미롭게, 더 약한 친화도 400 nM GPC3 결합제 중 하나는 최고 수준의 증식을 나타냈다. 1+1 작제물 XENP35843 및 XENP36939를 제외하고, 나머지 bsAb는 비교기 XENP31308과 유사하거나 이보다 더 높은 수준의 면역 세포 증식을 나타냈다.
도 43은 Incucyte를 사용하는 3D 스페로이드 RTCC 모델의 결과의 촬영된 사진을 도시한다. 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 웰에 시딩하고, 72 내지 96 시간 성장시킨 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 표적 종양 세포 스페로이드는 PBS 대조군 컬럼에서 가장 명확하게 볼 수 있으며, 여기서 PBMC는 스페로이드 주위에 클러스터링되고 시간경과에 따라 변화하지 않고 유지된다. PBS 대조군 컬럼을 XENP31308, XENP37625, XENP34920, 및 XENP36935에 의해 처리된 컬럼과 비교하는 단계에서, 면역 세포가 종양 세포를 사멸시킴에 따른 PBMC의 확장이 시각화될 수 있다.
도 44a 내지 도 44j는 본 발명의 몇몇 형식을 도시한다. 첫째는 제1 및 제2 항-항원 결합 도메인을 갖는 1+1 Fab-scFv-Fc 형식이다. 또한, mAb-Fv, mAb-scFv, 중앙-scFv, 중앙-Fv, 1-아암 중앙-scFv, 하나의 scFv-mAb, scFv-mAb, 및 이중 scFv 형식을 모두 나타낸다. 도시된 모든 scFv 도메인에 대해, 이들은 N 말단에서 C 말단으로 가변 중쇄-(선택적 링커)-가변 경쇄 또는 그 반대일 수 있다. 또한, 1-아암 scFv-mAb의 경우, scFv는 중쇄 단량체의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 부착될 수 있다.
본 발명은 인간 CD3ε 및 인간 GPC3에 결합하는 이종이량체 이중특이적 항체를 제공한다.
A.
개요
CD3과 종양 항원 표적에 공동으로 결합하는 항-이중특이적 항체는 표적화된 종양세포를 공격하고 용해시키도록 T세포의 방향을 전환시키는 데 사용된다. 예에는, CD3과 종양 항원에 1가로 결합하는 BiTE® 및 DART 형식이 포함된다. CD3 표적화 접근법은 상당한 가능성을 보여주었지만, 이러한 요법의 일반적인 부작용은 사이토카인의 생산과 관련이 있으며, 종종 독성 사이토카인 방출 증후군으로 이어진다. 이중특이적 항체의 항-CD3 결합 도메인은 모든 T세포와 결합하기 때문에, 높은 사이토카인 생성 CD4 T세포 서브세트가 동원된다. 나아가, CD4 T세포 서브세트는 조절 T세포를 포함하며, 이의 동원 및 확장은 잠재적으로 면역억제로 이어질 수 있고, 장기 종양 억제에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 또한, 이러한 형식은Fc 도메인을 함유하지 않고, 환자에서 매우 짧은 혈청 반감기를 나타낸다.
신규한 항-CD3 x 항-GPC3(항-GPC3 x 항-CD3, αCD3 x αGPC3, αGPC3 x αCD3, 또는 간혹 단지 GPC3 X CD3으로도 지칭됨) 이종이량체 이중특이적 항체, 및 암의 치료를 위한 그러한 항체의 사용 방법이 본원에 제공된다. 특히, 다양한 형식의 항-CD3, 항-GPC3 이중특이적 항체가 본원에 제공된다. 이러한 이중특이적 항체는, 특히 신세포암종과 같이 GPC3 발현이 증가된 암의 치료에 유용하다. 이러한 항체는 CD3+ 이펙터 T세포를 GPC3+ 종양으로 유도하여, CD3+ 이펙터 T세포가 GPC3+ 종양을 공격하고 용해시키도록 하는 데 사용된다.
또한, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 항-CD3 요법의 잠재적인 부작용을 변경시키거나 감소시킬 수 있는, 인간 CD3에 대해 상이한 결합 친화성을 갖는 이중특이적 항체를 제공한다. 즉, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 CD3에 대한 "강력한" 또는 "고친화성" 결합제이며(예를 들어, 하나의 예는 H1.30_L1.47로 도시된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인임(선택적으로, 적절한 경우 하전된 링커를 포함함)), GPC3에도 결합하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 구조체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 CD3에 대한 "약한" 또는 "저친화성" 결합제인 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 구조체를 제공한다. 추가의 구현예는 CD3에 대해 중급의 또는 "중간" 친화성을 갖고 GPC3에도 결합하는 항-CD3 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 구조체를 제공한다. 매우 다수의 항-CD3 항원 결합 도메인(ABD)이 사용될 수 있지만, 특히 유용한 구현예는 6개의 상이한 항-CD3 ABD를 사용하며, 본원에 논의된 바와 같은 2가지 scFv 배향으로 사용될 수 있다. 친화성은 일반적으로 Biacore 검정을 사용하여 측정된다.
본원에 제공된 "고, 중간, 저" 항-CD3 서열은 본원에 논의된 바와 같이 다양한 이종이량체화 형식으로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 일반적으로, T 세포 동원의 잠재적인 부작용으로 인해, 예시적인 실시 형태는 도 15a 및 도 15b에 도시된 바와 같이 CD3에 1가로만 결합하는 형식을 이용하며, 본원에 도시된 형식에서 본원에 더욱 완전하게 기재된 바와 같은 scFv는 CD3 ABD이다. 대조적으로, 대상 이중특이적 항체는 GPC3에 1가(예를 들어 도 15a) 또는 2가(예를 들어 도 15b)로 결합할 수 있다.
그러한 GPC3 결합 도메인을 갖는 항체(예를 들어, GPC3 x CD3 이중특이적 항체)를 포함하여, GPC3 결합 도메인을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 GPC3 결합 도메인을 포함하는 대상 항체는, 유리하게는 사용되는 특정 GPC3 결합 도메인에 따라, 다양한 상이한 면역 반응을 이끌어낸다. 예를 들어, 대상 항체는 GPC3 발현이 상이한 세포에 대한 선택성, GPC3 발현 세포에 대한 역가, 사이토카인 방출을 이끌어내는 능력, 및 가용성 GPC3에 대한 민감성의 차이를 나타낸다. 이러한 GPC3 결합 도메인 및 관련 항체는, 예를 들어 GPC3 관련 암의 치료에 사용된다.
따라서, 하나의 양태에서, 2가지 상이한 항원에 결합하는, 예를 들어 항체가 2가지 상이한 표적 항원, 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 GPC3 및 CD3에 결합한다는 점에서 "이중특이적"인 이종이량체 항체가 본원에 제공된다. 이러한 이종이량체 항체는 이러한 표적 항원에 1가(예를 들어, 가변 중쇄 도메인과 가변 경쇄 도메인의 쌍과 같은 단일 항원 결합 도메인이 존재함) 또는 2가(항원에 각각 독립적으로 결합하는 2개의 항원 결합 도메인이 존재함)로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 이종이량체 항체는 하나의 CD3 결합 도메인과 하나의 GPC3 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 본원에 기재된 "1 + 1 Fab-scFv-Fc" 형식의 이종이량체 항체). 다른 구현예에서, 본원에 제공된 이종이량체 항체는 하나의 CD3 결합 도메인과 2개의 GPC3 결합 도메인을 포함한다(예를 들어, 본원에 기재된 "2 + 1 Fab2-scFv-Fc" 형식의 이종이량체 항체). 본원에 제공된 이종이량체 항체는, 하기에 유사하게 개괄된 바와 같이 동종이량체로부터 이종이량체의 간단한 정제를 가능하게 하는 "pI 변이체"와 결합된, 하기에 보다 상세하게 개괄된 바와 같이 동종이량체보다 이종이량체의 형성으로 "편향되게 하는" 아미노산 치환을 함유하는 상이한 단량체를 사용하는 것을 기반으로 한다. 본원에 제공된 이종이량체성 이중특이적 항체는 일반적으로 이종이량체 단백질을 생산하기 위해 생산 세포에서 자가 조립될 수 있는 조작된 또는 변이형 Fc 도메인의 사용, 및 이러한 이종이량체 단백질을 생성 및 정제하는 방법에 따라 달라진다.
B.
명명법
본원에 제공된 항체는 몇 가지 상이한 형식으로 열거되어 있다. 일부 예에서, 특정 항체의 각 단량체는 고유한 "XENP" 번호로 제시되지만, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 더 긴 서열은 더 짧은 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 항체의 "scFv-Fc" 단량체는 첫 번째 XENP 번호를 가질 수 있지만, scFv 도메인 자체는 상이한 XENP 번호를 가질 것이다. 일부 분자는 3개의 폴리펩티드를 가지므로, 구성요소와 함께 XENP 번호가 명칭으로 사용된다. 따라서, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식인 분자 XENP33744는 3개의 서열(도 18 참조), "Fab-Fc 중쇄" 단량체; 2) "Fab-scFv-Fc 중쇄 "단량체; 및 3) "경쇄" 단량체 또는 등가물을 포함하지만, 당업자는 서열 정렬을 통해 이들을 용이하게 식별할 수 있을 것이다. 이러한 XENP 번호는 서열 목록뿐만 아니라 식별자에 있으며, 이는 도면에서 사용된다. 또한, 3개의 구성요소를 포함하는 하나의 분자는 다중 서열 식별자를 생성시킨다. 예를 들어, Fab의 목록은, 전장 중쇄 서열, 가변 중쇄 도메인 서열 및 가변 중쇄 도메인 서열의 3개의 CDR, 전장 경쇄 서열, 가변 경쇄 도메인 서열 및 가변 경쇄 도메인 서열의 3개의 CDR을 포함한다. Fab-scFv-Fc 단량체는 전장 서열, 가변 중쇄 도메인 서열, 3개의 중쇄 CDR 서열 및 scFv 서열(scFv 가변 중쇄 도메인 서열, scFv 가변 경쇄 도메인 서열 및 scFv 링커를 포함함)을 포함한다. scFv 도메인을 갖는 본원의 일부 분자는 단일 하전된 scFv 링커(+H)를 사용하지만, 다른 것들이 사용될 수도 있다는 점에 유의해야 한다. 또한, 특정 항원 결합 도메인(예를 들어, GPC3 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인)의 명명법은 "Hx.xx_Ly.yy" 유형의 형식을 사용하며, 여기서 숫자는 특정 가변 사슬 서열에 대한 고유한 식별자이다. 따라서, 항원 결합 도메인의 Fv 도메인은 "H1 L1"이며, 이는 가변 중쇄 도메인 H1이 경쇄 도메인 L1과 조합되었음을 표시한다. 이러한 서열이 scFv로 사용되는 경우, "H1 L1"이라는 지정은, 가변 중쇄 도메인 H1이 경쇄 도메인 L1과 조합되어 있고, N-말단에서 C-말단으로, VH-링커-VL 배향으로 존재함을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 서열이 동일하지만, 역순(N-말단에서 C-말단으로, VL-링커-VH 배향)인 이러한 분자는 "L1_H1.1"로 지정될 수 있다. 유사하게, 상이한 구조체는 서열목록 및 도면으로부터 명백해지는 바와 같이 중쇄와 경쇄를 "혼합 및 매칭"할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 항체는 본원에서"항-CD3 x 항-GPC3", "αCD3 x αGPC3", "αGPC3 x αCD3", 또는 간혹 단지 "GPC3 X CD3"으로 지칭된다. 항원의 순서는 하기 논의되는 바와 같이 결정적이지 않지만, scFv로서 이용하는 형식의 대부분은 scFv로서 항-CD3 ABD를 갖는다.
C.
정의
본원을 더 완전하게 이해할 수 있도록 몇몇 정의를 하기 설명한다. 그러한 정의는 문법적 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 "GPC3"은 클라우딘 패밀리에 속하는 단백질을 의미한다. GPC3 서열은, 예를 들어, 도 11에 도시되어 있다. 본 발명의 ABD는 인간 GPC3에 결합한다.
본원에서 "절제"는 활성의 감소 또는 제거를 의미한다. 따라서, 예를 들어, "FcγR 결합의 절제"는, Fc 영역 아미노산 변이체가 특이적 변이체를 함유하지 않는 Fc 영역과 비교하여 50% 미만의 출발 결합을 갖는 것을 의미하며, 70-80-90-95-98% 초과의 활성 손실이 바람직하고, 일반적으로 활성은 Biacore, SPR, 또는 BLI 검정에서 검출 가능한 결합 수준 미만이다. 도 3에 나타낸 것들이 FcγR 결합의 절제에 특히 유용하며, 이는 일반적으로 둘 모두의 단량체에 첨가된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "ADCC" 또는 "항체 의존적 세포-매개 세포독성"은, FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC는 FcγRIIIa에 대한 결합과 상관관계가 있고; FcγRIIIa에 대한 증가된 결합은 ADCC 활성의 증가로 이어진다.
본원에 사용되는 바와 같이 "ADCP" 또는 항체 의존적 세포-매개 포식작용(phagocytosis)은, FcγR을 발현하는 비특이적 포식세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 포식작용을 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어가 일반적으로 사용된다. 본원에 기재된 항체는 전통적인 항체뿐 아니라, 본원에 기재된 다수의 이중특이적 형식을 포함하는, 항체 유도체, 단편, 및 모방체를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 다수의 형식을 취할 수 있다.
전형적인 면역글로불린(Ig) 항체는 "Y" 모양의 사량체이다. 각각의 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬의 쌍으로 구성되어 있으며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄" 단량체(전형적으로 분자량이 약 25 kDa임)와 하나의 "중쇄" 단량체(전형적으로 분자량이 약 50 kDa 내지 70 kDa임)를 갖는다.
다른 유용한 항체 형식은, 본원에 기재되고 도 15에 도시된 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 및 2 + 1 Fab-scFv-Fc 항체 형식뿐 아니라, 하기 논의되고 도 44에 나타낸 바와 같은 "mAb-Fv", "mAb-scFv", "중앙-Fv", "1-아암 scFv-mAb", "scFv-mAb", "이중 scFv", 및 "트라이던트" 형식 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
항체 중쇄는 전형적으로 vhCDR1-3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 도메인과, CH2-CH3 단량체를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 중쇄는 힌지 및 CH1 도메인을 포함한다. 전형적인 항체 중쇄는, N-말단에서 C-말단으로, VH-CH1-힌지-CH2-CH3으로 구성된 단량체이다. CH1-힌지-CH2-CH3은 종합적으로 항체의 중쇄 "불변 도메인" 또는 "불변 영역"으로 지칭되며, 이에는 5개의 상이한 카테고리 또는 "아이소타입(isotype)"인 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM이 존재한다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이 "아이소타입"은 이들의 불변 영역의 화학적 및 항원적 특징에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 서브클래스 중 임의의 것을 의미한다. 치료용 항체가 아이소타입 및/또는 서브클래스의 혼성체를 또한 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2009/0163699호(본원에 참조로서 인용됨)에 제시된 바와 같이, 본원에 기재된 항체는 인간 IgG1/G2 혼성체의 사용을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 제공된 항체는 IgG 아이소타입 불변 도메인을 포함하며, 이는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하지만 이로 제한되지 않는 몇몇 서브클래스를 갖는다. 면역글로불린의 IgG 서브클래스에서는, 중쇄 내에 몇몇 면역글로불린 도메인이 존재한다. 본원에서 "면역글로불린(Ig) 도메인"은 별개의 3차 구조를 갖는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 본원에 기재된 항체에서 관심있는 것은 불변 중쇄(CH) 도메인 및 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이다. IgG 항체의 맥락에서, IgG 아이소타입은 각각 3개의 CH 영역을 갖는다. 따라서, IgG의 맥락에서 "CH" 도메인은 하기와 같다: "CH1"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 118번 내지 220번의 위치를 지칭한다. "CH2"는 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 237번 내지 340번의 위치를 지칭하고, "CH3"은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따라 341번 내지 447번 위치를 지칭한다. 본원에 제시되고 하기에 기재되는 바와 같이, pI 변이체는 하기 논의되는 힌지 영역뿐 아니라 하나 이상의 CH 영역에 있을 수 있다.
IgG1이 356(D 또는 E) 및 358(L 또는 M)에서 다형성을 갖는 상이한 알로타입을 갖는다는 점에 유의해야 한다. 본원에 도시된 서열은 356D/358M 알로타입을 사용하지만, 다른 알로타입도 본원에 포함된다. 즉, 본원에 포함된 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356D/358M 알로타입을 대체하는 356E/358L을 가질 수 있다. 치료용 항체가 아이소타입 및/또는 서브클래스의 혼성체를 또한 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2009/0163699호(본원에 참조로서 인용됨)에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항체는, 일부 구현예에서, IgG1/IgG2 혼성체를 포함한다.
본원에 사용된 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"이란, 항체의 불변 영역을 포함하는, 일부 경우에는 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(예를 들어, CH1)의 전부 또는 이의 일부를 제외한, 일부 경우에는 선택적으로 힌지의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3(Cγ2 및 Cγ3), 및 선택적으로 CH1(Cγ1)과 CH2(Cγ2) 사이의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 따라서, 일부 경우에, Fc 도메인은, N-말단에서 C-말단으로, CH2-CH3 및 힌지-CH2-CH3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 것이며, 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 및 IgG4 힌지-CH2-CH3이 다수의 실시 형태에서 특히 유용하다. 또한, 인간 IgG1 Fc 도메인의 경우, 흔히 힌지는 C220S 아미노산 치환을 포함한다. 나아가, 인간 IgG4 Fc 도메인의 경우, 흔히 힌지는 S228P 아미노산 치환을 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 이의 카르복실 말단에 잔기 E216, C226 또는 A231을 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시 형태에서, 하기 더욱 완전하게 기재되는 바와 같이, 예를 들어 하나 이상의 FcγR 또는 FcRn에 대한 결합을 변경하기 위해 Fc 영역에 대한 아미노산 변형이 이루어진다.
본원에서 "중쇄 불변 영역"은, 가변 중쇄 도메인을 배제한 항체(또는 이의 단편)의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분을 의미하며; 인간 IgG1의 EU 넘버링에서, 이는 118번 내지 447번 아미노산이다. 본원에서 "중쇄 불변 영역 단편"은, N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두로부터 더 적은 아미노산을 함유하지만, 여전히 다른 중쇄 불변 영역과 이량체를 형성하는 능력을 보유하는 중쇄 불변 영역을 의미한다.
중쇄의 또 다른 유형의 Ig 도메인은 힌지 영역이다. 본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"이란, 항체의 제1 불변 도메인과 제2 불변 도메인 사이에 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩타이드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 215번 위치에서 종결되고, IgG CH2 도메인은 EU 231번 위치 잔기에서 시작된다. 따라서, IgG의 경우, 항체 힌지는 본원에서 216번(IgG1에서 E216) 내지 230번(IgG1에서 P230) 위치를 포함하도록 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 경우에는, 힌지 도메인의 N-말단 및 C-말단 중 어느 하나 또는 둘 모두에 더 적은 아미노산을 함유하는 "힌지 단편"이 사용된다. 본원에 언급된 바와 같이, pI 변이체는 또한 힌지 영역에 만들어질 수 있다. 본원의 다수의 항체는 EU 넘버링에 따른 220번 위치(힌지 영역)에서 적어도 하나의 시스테인이 세린으로 대체되어 있다. 일반적으로, 이러한 변형은 본원에 도시된 서열의 대부분의 경우 "scFv 단량체" 측에 있지만, 이는 또한 다이설파이드 형성을 감소시키도록 "Fab 단량체" 측 또는 양측에 있을 수 있다. 대체된 이러한 시스테인(C220S) 중 하나 또는 둘 모두가 구체적으로 본원의 서열 내에 포함되어 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 중쇄 불변 영역 도메인의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템들 간에 상이할 수 있다. EU 및 Kabat에 따른 중쇄 불변 영역 넘버링의 유용한 비교는 하기와 같으며, 전체적으로 참고로 포함된 문헌[Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85], 및 문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda]을 참조한다.
[표 1]
항체 경쇄는 일반적으로 2개의 도메인, 즉 경쇄 CDR vlCDR1-3을 포함하는 가변 경쇄 도메인(VL)과 불변 경쇄 영역(종종 CL 또는 Cκ로 지칭됨)을 포함한다. 항체 경쇄는 전형적으로, N-말단에서 C-말단으로, VL-CL로 구성되어 있다.
본원에서 "항원 결합 도메인" 또는 "ABD"란, 폴리펩타이드 서열의 일부로 존재할 때, 본원에 논의된 바와 같이 표적 항원(예를 들어, GPC3 또는 CD3)에 특이적으로 결합하는 6개 상보성 결정 영역(CDR)의 세트를 의미한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이러한 CDR은 일반적으로, 각각이 3개의 CDR(가변 중쇄 CDR의 경우 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, 및 가변 경쇄 CDR의 경우 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3 vhCDR3)을 포함하는, 제1 가변 중쇄 CDR 세트(vhCDR 또는 VHCDR) 및 제2 가변 경쇄 CDR 세트(vlCDR 또는 VLCDR)로 존재한다. CDR은 가변 중쇄 도메인(vhCDR1-3)과 가변 경쇄 도메인(vlCDR1-3)에 존재한다. 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 Fv 영역을 형성한다.
본원에 기재된 항체는 다수의 상이한 CDR 세트를 제공한다. 이러한 경우, "완전 CDR 세트"는 3개의 가변 경쇄 CDR과 3개의 가변 중쇄 CDR, 예를 들어 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함한다. 이들은 각각 더 큰 가변 경쇄 도메인 또는 가변 중쇄 도메인의 일부일 수 있다. 또한, 본원에 보다 충분히 개괄된 바와 같이, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 중쇄 및 경쇄가 사용되는 경우(예를 들어, Fab이 사용되는 경우) 별개의 폴리펩타이드 사슬에 존재하거나, scFv 서열의 경우에는 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템들 간에 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 서열 및/또는 가변 경쇄 서열의 개시내용이 관련된 (고유한) CDR의 개시내용을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 개시내용은 vhCDR(예를 들어, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시내용이며, 각각의 가변 경쇄 영역의 개시내용은 vlCDR(예를 들어, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시내용이다. CDR 넘버링의 유용한 비교는 하기와 같으며, 문헌[Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003)]을 참조한다:
[표 2]
본 명세서 전반에 걸쳐, Kabat 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기(대략, 경쇄 가변 영역의 1번 내지 107번 잔기 및 중쇄 가변 영역의 1번 내지 113번 잔기)를 지칭할 때 사용되고, EU 넘버링 시스템은 Fc 영역에 사용된다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., 상기문헌(1991)]).
CDR은 항원 결합, 또는 보다 구체적으로, 항원 결합 도메인 및 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다. "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역 내의 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 결정기(determinant)를 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 분류이며 일반적으로 특이적 구조 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 단일 항원은 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다.
에피토프는 결합에 직접 관여하는 아미노산 잔기(에피토프의 면역우세 성분으로도 불림) 및 특이적 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같이 결합에 직접 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 다시 말해서, 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있다.
에피토프는 입체배좌 또는 선형일 수 있다. 입체배좌 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 세그먼트로부터의 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 입체배좌 및 비입체배좌 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에 후자가 아닌 전자에 대한 결합이 손실된다는 점에서 구별될 수 있다.
에피토프는 전형적으로 고유한 공간적 입체배좌에서 3개 이상, 더욱 일반적으로는 5개 이상, 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체는, 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순한 면역검정, 예를 들어 "비닝(binning)"에서 확인될 수 있다. 하기에 개괄되는 바와 같이, 본 개시내용은 본원에 열거된 항원 결합 도메인 및 항체를 포함할 뿐 아니라, 열거된 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프와의 결합에서 경쟁하는 것들을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항원 결합 도메인의 6개의 CDR은 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인에 의해 제공된다. "Fab" 형식에서, 6개 CDR의 세트는 2개의 상이한 폴리펩티드 서열, 가변 중쇄 도메인(vh 또는 VH; vhCDR1, vhCDR2, 및 vhCDR3을 함유함) 및 가변 경쇄 도메인(vl 또는 VL; vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3을 함유함)에 의해 제공되며, vh 도메인의 C-말단은 중쇄의 CH1 도메인의 N-말단에 부착되고, vl 도메인의 C-말단은 불변 경쇄 도메인의 N-말단에 부착된다(그리고 따라서 경쇄를 형성함). scFv 형식에서, vh 및 vl 도메인은 일반적으로 본원에 개괄된 바와 같은 링커("scFv 링커")의 사용을 통해 단일 폴리펩티드 서열에 공유적으로 부착되고, 이는 (N-말단에서 시작하여) vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh일 수 있으며, 일반적으로 전자가 바람직하다(사용되는 형식에 따라(예를 들어, 도 44로부터), 각각의 측면 상에 임의의 도메인 링커를 포함함)). 일반적으로, scFv 도메인의 C-말단은 제2 단량체 내의 힌지의 N-말단에 부착된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은, 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 각각 구성하는 Vκ, Vλ, 및/또는 VH 유전자 중 임의의 것에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하고, 항원 특이성을 부여하는 CDR을 함유하는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 따라서, "가변 중쇄 도메인"은 "가변 경쇄 도메인"과 쌍을 이루어 항원 결합 도메인("ABD")을 형성한다. 또한, 각각의 가변 도메인은 하기 순서로 아미노 말단에서 카복시 말단으로 배열된 3개의 초가변 영역("상보성 결정 영역", "CDR")(가변 중쇄 도메인에 대한 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 및 가변 경쇄 도메인에 대한 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3) 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 잔기 약 24번 내지 34번(LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50번 내지 56번(LCDR2), 및 89번 내지 97번(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역 내의 약 31번 내지 35B번(HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50번 내지 65번(HCDR2), 및 95번 내지 102번(HCDR3) 부근으로부터의 아미노산 잔기 (문헌[Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 초가변 루프를 형성하는 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 영역 내의 잔기 26번 내지 32번(LCDR1), 50번 내지 52번(LCDR2), 및 91번 내지 96번(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역 내의 26번 내지 32번(HCDR1), 53번 내지 55번(HCDR2), 및 96번 내지 101번(HCDR3)) (문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917])를 포함한다. 본 발명의 특정 CDR은 표 2에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "Fab" 또는 "Fab 영역"은, 일반적으로 2개의 상이한 폴리펩티드 사슬 상에 VH, CH1, VL, 및 CL 면역글로불린 도메인(예를 들어, 하나의 사슬 상에 VH-CH1 및 다른 사슬 상에 VL-CL)을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fab은 단리된 이러한 영역, 또는 본원에 기재된 이중특이적 항체의 맥락에서의 이러한 영역을 나타낼 수 있다. Fab의 맥락에서, Fab는 CH1 도메인 및 CL 도메인에 더하여 Fv 영역을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "Fv 영역"은, ABD의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fv 영역은 Fab(상기 논의된 바와 같이, 일반적으로 상기 개괄된 바와 같은 불변 영역을 또한 포함하는 2개의 상이한 폴리펩타이드) 및 scFv 두 가지 형식을 모두 취할 수 있으며, 여기서 VL 도메인과 VH 도메인은 조합되어(일반적으로 본원에 논의된 바와 같은 링커를 이용하여) scFv를 형성한다.
본원에서 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는, 일반적으로 본원에 논의된 바와 같은 scFv 링커를 사용하여 가변 경쇄 도메인에 공유적으로 부착되어, scFv 또는 scFv 도메인을 형성하는 가변 중쇄 도메인을 의미한다. scFv 도메인은, N-말단에서 C-말단으로, 어느 배향으로든 존재할 수 있다(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH). 서열목록 및 도면에 도시된 서열에서, VH 도메인과 VL 도메인의 순서는 명칭에 표시되어 있으며, 예를 들어 H.X_L.Y는, N-말단에서 C-말단으로, VH-링커-VL이고, L.Y_H.X는 VL-링커-VH이다. 그러나, 임의의 "H_L" 쌍의 개시내용은 이들을 어느 순서로든 포함하는 것을 의미한다.
본원에 제공된 대상 항체의 일부 실시 형태는, 자연 발생하는 것은 아니지만, scFv 링커에 의해 함께 연결되는, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 일반적으로 포함하는, 하나 이상의 scFv 도메인을 포함한다. 본원에 개괄된 바와 같이, scFv 도메인은 일반적으로 N-말단에서 C-말단으로 VH-scFv 링커-VL로 배향되지만, 이는 임의의 scFv 도메인(또는 Fab로부터의 vh 서열 및 vl 서열을 사용하여 구조화된 도메인)의 경우 VL-scFv 링커-VH로 역전될 수 있으며, 여기서 선택적 링커는 형식에 따라 한쪽 또는 양쪽 말단에 있다.
본원에서 "변형"은, 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실, 또는 단백질에 화학적으로 연결된 모이어티에 대한 변경을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착된 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조일 수 있다. 본원에서 "아미노산 변형"은, 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 의미한다. 명확성을 위해, 달리 언급되지 않는 한, 아미노산 변형은 항상 DNA에 의해 코딩되는 아미노산, 예를 들어 DNA 및 RNA에 코돈을 갖는 20개의 아미노산에 대한 것이다.
본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은, 모 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치에서 아미노산을 상이한 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 특히, 일부 실시 형태에서, 치환은 특정 위치에서 자연적으로 발생하지 않는(유기체 내에서 또는 임의의 유기체 내에서 자연적으로 발생하지 않는) 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, 치환 E272Y는 272번 위치에서 글루탐산이 티로신으로 대체된 변이체 폴리펩티드, 이 경우에는 Fc 변이체를 지칭한다. 명확성을 위해, 핵산 코딩 서열을 변화시키지만 출발 아미노산은 변화시키지 않는 단백질(예를 들어, 숙주 유기체 발현 수준을 증가시키기 위해 CGG(아르기닌을 인코딩함)를 CGA(여전히 아르기닌을 인코딩함)로 교환함)은 "아미노산 치환"이 아니며; 즉, 단백질이 그것이 시작되는 특정 위치에 동일한 아미노산을 갖는 경우, 동일한 단백질을 인코딩하는 새로운 유전자의 생성에도 불구하고, 그것은 아미노산 치환이 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은, 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 아미노산 서열을 부가하는 것을 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 233번 위치 이후 및 234번 위치 이전에 글루탐산의 삽입을 나타낸다. 또한, -233ADE 또는 A233ADE는 233번 위치 이후 및 234번 위치 이전에 AlaAspGlu의 삽입을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이 "아미노산 결실" 또는 "결실"은, 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열을 제거하는 것을 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233#, E233(), 또는 E233del은 233번 위치에서의 글루탐산의 결실을 나타낸다. 또한, EDA233- 또는 EDA233#은 233번 위치에서 시작하는 서열 GluAspAla의 결실을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이 "변이체 단백질", "단백질 변이체", 또는 "변이체"는, 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 모 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 갖지만, 변이체 단백질이 하기 기재되는 바와 같은 정렬 프로그램을 사용하여 모 단백질과 정렬되지 않을 정도로 많지는 않다. 일반적으로, 본원에 개괄된 변이체 단백질(예컨대, 변이체 Fc 도메인 등)은, BLAST와 같은 하기 기재된 정렬 프로그램을 사용하여, 일반적으로 모 단백질과 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상 동일하다. 본원에 사용된 "변이체"란, 또한 특정 기능을 부여하는 특정 아미노산 변형(예를 들어, "이종이량체화 변이체", "pI 변이체", "절제 변이체" 등)을 나타낸다.
하기에 기재되는 바와 같이, 일부 실시 형태에서, 모 폴리펩티드, 예를 들어 Fc 모 폴리펩티드는, 중쇄 불변 도메인, 또는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 Fc 영역과 같은 인간 야생형 서열이지만, 변이체를 갖는 인간 서열이 또한 "모 폴리펩티드"로서 작용할 수 있으며, 예를 들어 미국 출원 공개 제2006/0134105호의 IgG1/2 혼성체가 포함될 수 있다. 본원의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 약 80% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 95-98-99% 이상의 동일성을 보유할 것이다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는, 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 항체와 상이한 항체를 의미하고, 본원에 사용되는 바와 같이 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는, 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 IgG(다시 말해서, 다수의 경우에, 인간 IgG 서열로부터의)와 상이한 항체를 의미하고, 본원에 사용되는 바와 같이 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은, 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 모 면역글로불린 서열과 상이한 면역글로불린 서열을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는, Fc 도메인 내에 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 변형은 부가, 결실, 또는 치환일 수 있다. Fc 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어, N434S 또는 434S는 모 Fc 폴리펩티드와 비교하여 434번 위치에 세린에 대한 치환을 갖는 Fc 변이체이며, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 마찬가지로, M428L/N434S는 모 Fc 폴리펩티드와 비교하여 M428L 및 N434S의 치환을 갖는 Fc 변이체를 정의한다. WT 아미노산의 정체가 명시되지 않을 수 있으며, 이 경우에 전술한 변이체는 428L/434S로 지칭된다. 치환이 제공되는 순서는 임의적이며, 즉, 예를 들어, 428L/434S는 434S/428L 등과 동일한 Fc 변이체라는 점에 유의한다. 항체, 또는 이의 유도체 및 단편(예를 들어, Fc 도메인)과 관련하여 본 발명에서 논의된 모든 위치에 대하여, 달리 언급되지 않는 한, 아미노산 위치 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. "EU 인덱스" 또는 "Kabat에서와 같은 EU 인덱스" 또는 "EU 넘버링" 체계는 EU 항체의 넘버링을 나타낸다(문헌[Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)).
일반적으로, 변이체 Fc 도메인은 상응하는 모 인간 IgG Fc 도메인에 대해 약 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는다(하기 논의되는 동일성 알고리즘을 사용하며, 일 실시 형태에서는 디폴트 매개변수를 사용하여 당업계에 알려진 바와 같이 BLAST 알고리즘을 이용함). 대안적으로, 변이형 Fc 도메인은 모 Fc 도메인과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 아미노산 변형이 있을 수 있다. 대안적으로, 변이형 Fc 도메인은 모 Fc 도메인과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이하의 아미노산 변형이 있을 수 있다. 또한, 본원에 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 변이형 Fc 도메인은 미변성 겔 전기영동과 같은 본원에 기재된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 측정 시, 또 다른 Fc 도메인과 이량체를 형성하는 능력을 여전히 보유한다.
본원에서 "단백질"은, 2개 이상의 공유적으로 부착된 아미노산을 의미하며, 이는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 및 펩티드를 포함한다. 또한, 본원에 기재된 항체를 구성하는 폴리펩타이드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, PEG화(PEGylation), 순환 치환, 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에의 융합, 및 펩타이드 태그 또는 표지의 부가를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "잔기"는, 단백질 내에서의 위치 및 그의 관련 아미노산 정체를 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297(Asn297 또는 N297로도 지칭됨)은 인간 항체 IgG1 내의 297번 위치의 잔기이다.
본원에 사용되는 바와 같이 "IgG 서브클래스 변형" 또는 "아이소타입 변형"은, 하나의 IgG 아이소타입의 하나의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 아이소타입의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, EU 296번 위치에 IgG1은 티로신을 포함하고 IgG2는 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 서브클래스 변형으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "비-자연 발생 변형"은, 아이소타입이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, 인간 IgG 중 어느 것도 434번 위치에 세린을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4(또는 이들의 혼성체)에서의 치환 434S는 비-자연 발생 변형으로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "아미노산" 및 "아미노산 정체"는, DNA 및 RNA에 의해 코딩되는 20개의 자연 발생 아미노산 중 하나를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "이펙터 기능"은, 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 유발되는 생화학적 사건을 의미한다. 이펙터 기능은 ADCC, ADCP, 및 CDC를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이 "IgG Fc 리간드"는, IgG 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노오스 수용체, 포도상구균 단백질 A, 연쇄상구균 단백질 G, 및 바이러스 FcγR을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. Fc 리간드는 또한 FcγR과 상동성인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)를 포함한다(전체적으로 참고로 포함된 문헌[Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136]). Fc 리간드는 Fc에 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 특정 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본원에 사용되는 바와 같이 "Fc 리간드"는, 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "Fc 감마 수용체", "FcγR", 또는 "Fc감마R"은, IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcγR 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서 이 패밀리는 동형 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 동형 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함함), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 동형 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIb-NA1 및 FcγRIIb-NA2를 포함함)를 포함하는 FcγRIII(CD16)(전체적으로 참고로 포함된 문헌[Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65])뿐만 아니라, 임의의 발견되지 않은 인간 FcγR 또는 FcγR 동형 또는 알로타입을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. FcγR은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 마우스 FcγR은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), 및 FcγRIII-2(CD16-2)뿐만 아니라 임의의 발견되지 않은 마우스 FcγR 또는 FcγR 동형 또는 알로타입을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이 "FcRn" 또는 "신생아 Fc 수용체"는, IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. FcRn은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 유기체로부터의 것일 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 기능성 FcRn 단백질은 종종 중쇄 및 경쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 여기서 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 지칭한다. FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키기 위해, 그리고 일부 경우에는, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 다양한 FcRn 변이체가 사용된다. "FcRn 변이체"는 FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키는 변이체이며, 적합한 FcRn 변이체는 하기에 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같이 "모 폴리펩티드"는, 변이체를 생성하기 위해 후속으로 변형되는 출발 폴리펩티드를 의미한다. 모 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드, 또는 자연 발생 폴리펩티드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이 "모 면역글로불린"은, 변이체를 생성하기 위해 변형되는 변형되지 않은 면역글로불린 폴리펩티드를 의미하고, 본원에 사용되는 바와 같이 "모 항체"는, 변이체 항체를 생성하기 위해 변형되는 변형되지 않은 항체를 의미한다. "모 항체"가 하기에 개괄되는 바와 같이 알려진 상업적인 재조합적으로 제조된 항체를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 이러한 맥락에서, "모 Fc 도메인"은 언급된 변이체에 비교한 것일 것이며; 따라서, "변이체 인간 IgG1 Fc 도메인"은 인간 IgG1의 모 Fc 도메인과 비교되고, "변이체 인간 IgG4 Fc 도메인"은 모 Fc 도메인 인간 IgG4와 비교된다.
본원에 사용되는 바와 같이 "위치"는, 단백질 서열 내의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 형식, 예를 들어 항체 넘버링에 대한 EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "표적 항원"은, 주어진 항체의 가변 영역을 포함하는 항원 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 분자를 의미한다.
본원에 기재된 이종이량체 항체의 단량체의 맥락에서 "가닥 배열(strandedness)"이란, "매칭"되는 DNA의 2개의 가닥과 유사하게, 이종이량체화 변이체가 이종이량체를 형성하기 위해 "매칭"되는 능력을 보존하도록 각각의 단량체에 혼입됨을 의미한다. 예를 들어, 일부 pI 변이체가 단량체 A로 조작되는 경우(예를 들어, pI를 더 높게 만드는 경우), 또한 이용될 수 있는 "전하 쌍"인 입체 변이체는 pI 변이체를 방해하지 않으며, 예를 들어 pI를 더 높게 만드는 전하 변이체는 둘 모두의 기능을 보존하기 위해 동일한 "가닥" 또는 "단량체" 상에 배치된다. 유사하게, 하기 더욱 완전하게 개괄되는 바와 같이 세트의 쌍으로 된 "비대칭" 변이체의 경우, 비대칭체의 pI를 또한 사용하여 pI 분리가 최대화되도록, 하나의 쌍의 세트가 어느 가닥 또는 단량체에 들어갈 것인지를 결정함에 있어서, 당업자는 pI를 고려할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이 "표적 세포"는, 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.
본원에 기재된 항체에 따른 이중특이적 항체를 제조하는 맥락에서 "숙주세포"란, 이중특이적 항체의 구성요소를 인코딩하는 외인성 핵산을 함유하고, 적합한 조건 하에서 이중특이적 항체의 발현을 가능하게 하는 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 하기 논의되어 있다.
본원에서 "야생형 또는 WT"는, 대립유전자 변이를 포함하는, 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
인간 항체 도메인과 동일한 서열을 갖는 다수의 항체 도메인이 본원에 제공된다. 2개의 유사한 서열(예를 들어, 항체 가변 도메인) 사이의 서열 동일성은 문헌[Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Comparison Of Biosequences," Adv. Appl. Math. 2:482 [local homology algorithm]]; 문헌[Needleman, S.B. & Wunsch, CD. (1970) "A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins," J. Mol. Biol.48:443 [homology alignment algorithm]], 문헌[Pearson, W.R. & Lipman, D.J. (1988) "Improved Tools For Biological Sequence Comparison," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [search for similarity method]]; 또는 문헌[Altschul, S.F. et al, (1990) "Basic Local Alignment Search Tool," J. Mol. Biol. 215:403-10], "BLAST" 알고리즘(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 참조)의 것과 같은 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 전술한 알고리즘 중 임의의 것을 사용할 때, (윈도우 길이, 갭 패널티 등에 대한) 디폴트 매개변수가 사용된다. 일 실시 형태에서, 서열 동일성은 디폴트 매개변수를 사용하는 BLAST 알고리즘을 사용하여 실행된다.
본원에 기재된 항체는 일반적으로 단리된 것이거나 재조합된 것이다. 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기재하기 위해 사용될 때, "단리된"은 그것이 발현된 세포 또는 세포 배양물로부터 식별되고 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. "재조합"은, 항체가 외인성 숙주 세포에서 재조합 핵산 기술을 사용하여 생성되며, 이들이 또한 단리될 수 있다는 것을 의미한다.
특정 항원 또는 에피토프에 대해 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적인"은, 비-특이적 상호작용과는 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어, 항체가 항원 또는 에피토프에 대하여, 약 10-4 M 이상, 약 10-5 M 이상, 약 10-6 M 이상, 약 10-7 M 이상, 약 10-8 M 이상, 약 10-9 M 이상, 대안적으로 약 10-10 M 이상, 약 10-11 M 이상, 약 10-12 M 이상, 또는 그 이상의 KD를 갖는 것으로 나타날 수 있으며, 여기서 KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 비해 대조군 분자에 대하여 20-배, 50-배, 100-배, 500-배, 1000-배, 5,000-배, 10,000-배 이상 더 큰 KD를 가질 것이다.
또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어, 항체가 대조군에 비해 에피토프에 대하여 20-배, 50-배, 100-배, 500-배, 1000-배, 5,000-배, 10,000-배 이상 더 큰 항원 또는 에피토프에 대한 KA 또는 Ka를 갖는 것으로 나타날 수 있으며, 여기서 KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 결합 친화도는 일반적으로 Biacore, SPR, 또는 BLI 검정을 사용하여 측정된다.
D.
본 발명의 항체
본 발명은 인간 GPC3에 결합하는 단클론 항체 및 이중특이적 항체를 포함하는 항체를 제공한다(전임상 시험의 용이함을 위해 예시된 항체 중 다수(대부분은 아니라도)가 또한 사이노 GPC3에 결합하지만, 이것이 모든 실시 형태에서 필요하지는 않다는 점에 유의해야 함). 특히, 하기 더욱 완전히 기재된 바와 같이 다양한 형식을 취하는 CD3 및 GPC3에 결합하는 이중특이적 항체가 제공된다.
1.
항체
본원에 제공된 항체는 하기 더욱 완전히 기재된 바와 같이 상이한 항체 도메인을 포함한다. 본원에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같이, 본원에 기재된 항체는 중쇄 및 경쇄 내에 상이한 도메인을 포함하며, 이들은 또한 중첩될 수 있다. 이러한 도메인은 Fc 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 도메인, 중쇄 불변 도메인(CH1-힌지-Fc 도메인 또는 CH1-힌지-CH2-CH3), 가변 중쇄 도메인, 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, Fab 도메인, 및 scFv 도메인을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
특히, 도 15a 및 도 15b에 도시된 형식은 통상적으로 "이종이량체 항체"로 지칭되는 항체이며, 이는 단백질이 이종이량체 Fc 도메인으로 자가 조립되는 적어도 2개의 회합된 Fc 서열, 및 Fab 또는 scFv로서의 적어도 2개의 Fv 영역을 갖는다는 것을 의미한다.
a.
키메라 및 인간화 항체
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 그러한 항체는 특정 생식계열 서열의 "생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는, 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하는 단계, 및 (본원에 개괄된 방법을 사용하여) 인간 항체의 서열에 서열이 가장 가까운(즉, 최대 % 동일성) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택하는 단계에 의해 그렇게 식별될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어, 자연-발생 체세포 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해, 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, 인간화 항체는 전형적으로 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 아미노산 서열이 90% 이상 동일하며, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 뮤린 생식계열 서열)과 비교할 때 항체가 인간 서열로부터 유래된 것으로 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 소정의 경우에, 인간화 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 95, 96, 97, 98, 또는 99% 이상, 또는 심지어 96, 97, 98, 또는 99% 이상 아미노산 서열이 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래된 인간화 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로부터 10 내지 20개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다(본원의 임의의 비대칭, pI, 및 절제 변이체의 도입 전에; 즉, 본원에 기재된 변이체의 도입 전에, 변이체의 수는 일반적으로 낮음). 소정의 경우에서, 인간화 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로부터 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다(다시 말하면, 본원의 임의의 비대칭, pI, 및 절제 변이체의 도입 전에; 즉, 본원에 기재된 변이체의 도입 전에, 변이체의 수는 일반적으로 낮음).
일 실시 형태에서, 모 항체는 당업계에 알려진 바와 같이 친화도 성숙되어 있다. 예를 들어 USSN 11/004,590호에 기재된 바와 같이 인간화 및 친화도 성숙을 위해 구조-기반 방법이 사용될 수 있다. 모두 전체적으로 참고로 포함된 문헌[Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162]; 문헌[Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684]; 문헌[Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618]; 문헌[Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915]; 문헌[Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759]에 기재된 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 선택 기반의 방법을 사용하여 항체 가변 영역을 인간화하고/하거나 친화도 성숙시킬 수 있다. 모두 전체적으로 참고로 포함된 USSN 09/810,510호; 문헌[Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125]; 문헌[De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084]에 기재된 방법을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다른 인간화 방법은 CDR의 일부만의 이식을 포함할 수 있다.
2.
이종이합체성 항체
예시적인 구현예에서, 본원에 제공된 이중특이적 항체는 2개의 변이형 Fc 도메인 서열을 포함하는 이종이량체성 이중특이적 항체이다. 이러한 변이형 Fc 도메인은 이종이량체 항체의 자가 조립 및/또는 정제를 용이하게 하는 아미노산 변형을 포함한다.
항체 기술에서 현재 진행 중인 문제는, 2개의 상이한 항원에 동시에 결합하는, 따라서 일반적으로 상이한 항원들을 근접하게 하고 새로운 기능 및 새로운 요법을 유발하는 "이중특이적" 항체에 대한 바람이다. 일반적으로, 이러한 항체는 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 숙주 세포에 포함시킴으로써 제조된다. 이는, 일반적으로 원하는 이종이량체(A-B)뿐 아니라, 2개의 동종이량체(A-A 및 B-B(경쇄 이종이량체 문제는 포함하지 않음))의 형성을 유발한다. 하지만, 이중특이적 항체의 형성에서 주요 장애물은, 동종이량체의 형성보다 목적하는 이종이량체 항체의 형성으로 편향시키고/시키거나 동종이량체에서 이종이량체 항체를 정제하는 것이 어렵다는 점이다.
대상 이종이량체 항체를 생성하는 데 사용될 수 있는 다수의 메커니즘이 존재한다. 또한, 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 상이한 메커니즘은 높은 이종이량체화를 보장하도록 조합될 수 있다. 이종이량체의 생성 및 정제를 용이하게 하는 아미노산 변형은 일반적으로 "이종이량체화 변이체"로 총칭된다. 하기에 논의되는 바와 같이, 이종이량체화 변이체는 "비대칭" 변이체(예를 들어, 하기에 기재되는 "놉 앤 홀(knobs and holes)" 및 "전하 쌍" 변이체) 뿐 아니라, 동종이량체로부터 이종이량체의 정제를 가능하게 하는 "pI 변이체"를 포함한다. 그 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 US 9,605,084호에 일반적으로 기재되고, 이종이량체화 변이체의 논의에 대하여 하기 구체적으로 기재된 바와 같이, 이종이량체화에 유용한 메커니즘은, 미국 특허 US 9,605,084호에 기재된 바와 같은 "놉 앤 홀"("KIH"), 미국 특허 US 9,605,084호에 기재된 바와 같은 "정전기 스티어링(electrostatic steering)" 또는 "전하 쌍", 미국 특허 US 9,605,084호에 기재된 바와 같은 pI 변이체, 및 미국 특허 US 9,605,084호 및 하기에 개괄된 바와 같은 일반적인 부가적인 Fc 변이체를 포함한다.
대상 이종이량체 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)의 형성 및 정제에 유용한 이종이량체화 변이체가 하기에 상세하게 추가로 논의된다.
a.
비대칭 변이체
일부 실시 형태에서, 이종이량체 항체는 Fc 동종이량체(제1 Fc 도메인 중 2개 또는 제2 Fc 도메인 중 2개를 포함하는 Fc 이량체; A-A 또는 B-B)에 비해 Fc 이종이량체(제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인을 포함하는 Fc 이량체; A-B)의 형성을 선호하는, 제1 Fc 도메인(A) 및/또는 제2 Fc 도메인(B) 내의 하나 이상의 아미노산 변형인 비대칭 변이체를 포함한다. 적합한 비대칭 변이체는, 그 전문이, 그리고 구체적으로 비대칭 변이체의 그의 개시내용에 대해 본원에 참고로 포함된 미국 출원 공개 제2016/0355608호의 도 29뿐만 아니라, 도 1에 포함된다.
따라서, 이종이량체 Fc 영역의 형성을 허용할 적합한 Fc 이종이량체화 변이체 쌍을 도 1에 나타낸다. 따라서, 제1 Fc 도메인은 제1 Fc 이종이량체화 변이체를 갖고, 제2 Fc 도메인은 도 1의 쌍으로부터 선택된 제2 Fc 이종이량체화 변이체를 갖는다.
이종이량체 형성을 선호하고 동종이량체 형성을 선호하지 않도록 입체 영향을 생성하는 아미노산 조작을 지칭하는, 일반적으로 당업계에서 "놉 앤 홀"로 지칭되는 일 메커니즘이 또한 임의로 사용될 수 있으며; 이는 간혹 USSN 61/596,846호, 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996)]; 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26]; 미국 특허 제8,216,805호에 기재된 바와 같이 "놉 앤 홀"로 지칭되며, 이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 도면은 "놉 앤 홀"에 의존하는 다수의 "단량체 A - 단량체 B" 쌍을 식별한다. 또한, 문헌[Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)]에 기재된 바와 같이, 이러한 "놉 앤 홀" 돌연변이는 다이설파이드 결합과 조합되어 이종이량체화 형성으로 편향되게 할 수 있다.
이종이량체의 생성에 유용한 부가적인 메커니즘은 간혹 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)]에 기재된 바와 같이 "정전기 스티어링"으로 지칭되며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이는 때때로 본원에서 "전하 쌍"으로 지칭된다. 이 실시 형태에서는, 정전기를 사용하여 이종이량체화 형성으로 편향되게 한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이는 또한 pI, 및 이에 따른 정제에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 일부 경우에 이는 또한 pI 변이체로 간주될 수 있다. 그러나, 이들은 이종이량체화를 강제하기 위해 생성되었고 정제 도구로서 사용되지 않았으므로, 이들은 "입체 변이체"로 분류된다. 이들은 D221R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 D221E/P228E/L368E(예를 들어, 이들은 "단량체" 상응 세트임) 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 C220E/P228E/368E를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 비대칭 변이체는 유리하게 및 동시에 "놉 앤 홀" 메커니즘뿐만 아니라 "정전기 스티어링" 메커니즘 둘 모두에 기반하여 이종이량체화를 선호한다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체 항체는 그러한 이종이량체화 비대칭 변이체의 하나 이상의 세트를 포함한다. 이러한 변이체는 "세트"의 "쌍"으로 이루어진다. 즉, 한 세트의 쌍은 제1 단량체에 혼입되고, 다른 한 세트의 쌍은 제2 단량체에 혼입된다. 이러한 세트가 반드시 하나의 단량체 상의 잔기와 다른 하나의 단량체 상의 잔기 사이에서 일대일 상응성을 갖는 "놉 인 홀" 변이체로서 거동하지는 않는다는 점에 유의해야 한다. 즉, 이러한 세트의 쌍은 대신에 이종이량체 형성을 유리하게 하고 동종이량체 형성을 불리하게 하는 2개의 단량체 사이의 계면을 형성함으로써, 생물학적 조건 하에 자발적으로 형성되는 이종이량체의 백분율이 예상되는 50%(25%의 동종이량체 A/A: 50%의 이종이량체 A/B: 25%의 동종이량체 B/B)가 아니라 90%가 초과되게 할 수 있다. 예시적인 이종이량체화 "비대칭" 변이체는 도 1에 도시되어 있다. 예시적인 실시 형태에서, 이종이량체 항체는 Fc 이종이량체화 변이체를 하기 세트로서 포함한다: S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L; K370S : S364K/E357Q; 또는 T366S/L368A/Y407V : T366W(임의로 가교화 다이설파이드, T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C를 포함함)는 모두 Fc 이종이량체화 변이체의 "비대칭" 변이체 아미노산 치환 세트이다. 예시적인 실시 형태에서, 이종이량체 항체는 "S364K/E357Q : L368D/K370S" 아미노산 치환 세트를 포함한다. 명명법에 관하여, 쌍 "S364K/E357Q : L368D/K370S"는 단량체 중 하나가 아미노산 치환 S364K 및 E357Q를 포함하는 Fc 도메인을 포함하고, 다른 하나의 단량체가 아미노산 치환 L368D 및 K370S를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다는 것을 의미하며; 상기와 같이, 이러한 쌍의 "가닥 배열"은 출발 pI에 따라 달라진다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 비대칭 변이체는 선택적으로 및 독립적으로, 비제한적으로, 다른 비대칭 변이체(예를 들어, 미국 특허출원공개 제2012/0149876호의 도 37 참조(특히 비대칭 변이체의 그의 개시내용에 대해 본원에 참고로 포함됨)), pI 변이체, 아이소타입 변이체, FcRn 변이체, 절제 변이체 등을 포함하는 임의의 다른 변형과 함께, 이종이량체 항체의 제1 및 제2 Fc 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 혼입될 수 있다. 나아가, 개별 변형은 또한 독립적으로 및 선택적으로 대상 이종이량체 항체에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있다.
부가적인 단량체 A 및 단량체 B 변이체는 본원에 개괄된 pI 변이체 또는 US 2012/0149876호(이의 도면 및 범례 및 서열 번호는 명백하게 본원에 참고로 포함됨)의 도 37에 나타낸 다른 입체 변이체와 같은 다른 변이체와, 임의로 그리고 독립적으로 임의의 양으로 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개괄된 입체 변이체는 선택적으로 및 독립적으로 임의의 pI 변이체(또는 Fc 변이체, FcRn 변이체 등과 같은 다른 변이체)와 함께 한쪽 또는 양쪽 단량체에 혼입될 수 있으며, 이는 독립적으로 및 선택적으로 본원에 기재된 항체의 단백질에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있다.
적합한 비대칭 변이체의 목록은 다수의 실시 형태에서 특히 유용한 일부 쌍을 나타내는 도 1에서 확인된다. S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, 및 K370S : S364K/E357Q를 포함하지만 이로 제한되지 않는 세트의 쌍이 다수의 실시 형태에서 특히 유용하다. 명명법에 관하여, 쌍 "S364K/E357Q : L368D/K370S"는 단량체 중 하나가 이중 변이체 세트 S364K/E357Q를 갖고, 다른 하나가 이중 변이체 세트 L368D/K370S를 갖는 것을 의미한다.
b.
이종이량체를 위한 pI(등전점) 변이체
일부 구현예에서, 이종이량체 항체는 동종이량체 단백질로부터 이종이량체 항체(예를 들어, 항-GPC3 x 항-CD3 이중특이적 항체)의 분리를 유리하게 가능하게 하는 정제 변이체를 포함한다.
이종이량체 항체의 정제를 용이하게 할 수 있는 몇 가지 기본 메커니즘이 존재한다. 예를 들어, 각각의 단량체가 상이한 pI를 갖도록 하는 항체 중쇄 단량체 A 및 B 중 하나 또는 둘 모두에 대한 변형은, 단량체 A-A 및 B-B 단백질로부터 이종이량체 A-B 항체의 등전위 정제를 가능하게 한다. 대안적으로, "1 + 1 Fab-scFv-Fc" 형식 및 "2 + 1 Fab2-scFv-Fc" 형식과 같은 일부 스캐폴드 형식은 또한 크기를 기반으로 한 분리를 가능하게 한다. 상기 기재된 바와 같이, 이는 또한 비대칭 변이체를 사용하여 동종이량체보다 이종이량체의 형성으로 "편향되게" 할 수 있다. 따라서, 특히 이종이량체화 비대칭 변이체와 pI 변이체의 조합이 본원에 제공된 이종이량체 항체에 사용된다.
또한, 하기에 보다 충분히 개괄되는 바와 같이, 이종이량체 항체의 형식에 따라, pI 변이체가 단량체의 불변 영역 및/또는 Fc 도메인 내에 함유될 수 있고/있거나, 도메인 링커가 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체 항체는 Fc, FcRn, 및 KO 변이체와 같이 pI 변화를 또한 생성할 수 있는 대안적인 기능을 위한 부가적인 변형을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본원에 제공된 대상 이종이량체 항체는 단량체의 pI를 변경하는 하나 이상의 변형을 갖는 하나 이상의 단량체(즉, "pI 변이체")를 포함한다. 일반적으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 하기 2가지의 일반적인 범주의 pI 변이체가 존재한다: 단백질의 pI를 증가시키는(염기성 변화) 것들 및 단백질의 pI를 감소시키는(산성 변화) 것들. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 변이체의 모든 조합이 이루어질 수 있으며, 하나의 단량체는 야생형, 또는 야생형과 유의하게 상이한 pI를 나타내지 않는 변이체일 수 있고, 다른 하나의 단량체는 더 염기성이거나 더 산성일 수 있다. 대안적으로, 하나는 더 염기성으로, 그리고 하나는 더 산성으로 각각의 단량체가 변경된다.
이종이량체 항체의 형식에 따라, pI 변이체가 단량체의 불변 및/또는 Fc 도메인 내에 함유될 수 있고/있거나, 하전된 링커(도메인 링커 또는 scFv 링커)가 사용될 수 있다. 즉, "1 + 1 Fab-scFv-Fc" 형식과 같이 scFv(들)을 이용하는 항체 형식은 정제 목적으로 추가의 pI 부스트를 제공하는 하전된 scFv 링커(양전하 또는 음전하)를 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 일부 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식은 추가 pI 조정 없이 하전된 scFv 링커만으로 유용하지만, 본원에 기재된 항체는 단량체의 한쪽 또는 양쪽에 있는 pI 변이체, 및/또는 하전된 도메인 링커도 제공한다. 또한, 대안적인 기능을 위한 추가의 아미노산 조작은 또한 Fc 변이체, FcRn 변이체 및 KO 변이체와 같은 pI 변경을 부여할 수 있다.
이종이량체 단백질의 정제를 가능하게 하는 분리 메커니즘으로서 pI를 이용하는 대상 이종이량체 항체에서, 아미노산 변이체는 단량체 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두에 도입된다. 즉, 하나의 단량체(본원에서 간단히 "단량체 A"로 지칭됨)의 pI가 단량체 B로부터 멀어지게 조작될 수 있거나, 단량체 A의 pI는 증가하고 단량체 B의 pI는 감소하도록 단량체 A와 단량체 B 둘 모두가 변경될 수 있다. 하기 더욱 완전하게 개괄되는 바와 같이, 하전된 잔기를 제거 또는 부가하거나(예를 들어, 중성 아미노산이 양성 또는 음성으로 하전된 아미노산 잔기로, 예를 들어 글리신이 글루탐산으로 대체됨), 하전된 잔기를 양성 또는 음성으로부터 반대 전하로 변경하거나(아스파르트산을 리신으로), 하전된 잔기를 중성 잔기로 변경함으로써(예를 들어, 전하의 손실, 리신을 세린으로) 한쪽 또는 양쪽 단량체의 pI 변경을 실행할 수 있다. 다수의 이러한 변이체를 도 1 및 도 2에 나타낸다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 대상 이종이량체 항체는 아미노산 치환("pI 변이체" 또는 "pI 치환")을 단량체 중 하나 또는 둘 모두에 혼입시킴으로써 "pI 항체"를 형성하기 위해 이량체 단백질의 단량체 중 하나 이상(둘 모두는 아니라도)의 등전점(pI)을 변경하는 불변 영역 내의 아미노산 변형을 포함한다. 본원에 제시된 바와 같이, 2개의 동종이량체로부터 이종이량체를 분리시키는 것은, 2개의 단량체의 pI가 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 또는 그 이상으로 0.1 pH 단위만큼 차이가 나는 경우에 달성될 수 있으며, 이들은 모두 본원에 기재된 항체에 사용된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 양호한 분리를 얻기 위해 각각의 또는 양쪽 단량체(들)에 포함되는 pI 변이체의 수는 부분적으로, 예를 들어 1 + 1 Fab-scFv-Fc 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식에서의 구성요소의 출발 pI, 관심 scFv 및 Fab(들)의 출발 pI에 따라 달라질 것이다. 즉, 조작하고자 하는 단량체 또는 이의 "방향"(예를 들어, 더 양으로 또는 더 음으로)을 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열이 계산되고, 이로부터 결정이 이루어진다. 당업계에 공지된 바와 같이, 상이한 Fv는 본원에 기재된 항체에서 채용되는 상이한 출발 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 개괄된 바와 같이, pI는 각각의 단량체의 총 pI 차이가 약 0.1 로그 이상(본원에 개괄된 바와 같이 0.2 내지 0.5가 바람직함)이 되도록 조작된다.
중쇄(들)의 불변 영역(들)을 사용하여 이종이량체화를 달성하기 위해 pI 변이체가 사용되는 경우, 이중특이적 단백질(항체 포함)을 설계하고 정제하는 더 모듈화된 접근법이 제공된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 이종이량체화 변이체(비대칭 이종이량체화 변이체 및 pI 이종이량체화 변이체를 포함함)는 가변 영역 내에 포함되지 않기 때문에, 각각의 개별 항체가 조작되어야 한다. 또한, 일부 실시 형태에서, pI 변이체로부터 유발되는 면역원성의 가능성은, 유의한 면역원성의 도입 없이 pI가 변경되도록 상이한 IgG 아이소타입으로부터의 pI 변이체를 이입함으로써 유의하게 감소된다. 따라서, 해결하고자 하는 추가적인 문제는 높은 인간 서열 함량을 갖는 낮은 pI 불변 도메인의 규명, 예를 들어 임의의 특정한 위치에서의 비(非)인간 잔기의 최소화 또는 회피이다. 아이소타입 치환에 대안적으로 또는 이에 더하여, pI 변이체로부터 유발되는 면역원성의 가능성은 등입체성 치환(예를 들어, Asn에서 Asp로; 그리고 Gln에서 Glu로)을 이용하여 유의하게 감소된다.
하기 논의되는 바와 같이, 이러한 pI 조작으로 발생할 수 있는 부수적 이점은 또한 혈청 반감기의 연장 및 FcRn 결합의 증가이다. 즉, 미국 출원 공개 US 2012/0028304호(그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 항체 불변 도메인(항체 및 Fc 융합체에서 발견되는 것들을 포함함)의 pI를 낮추는 것은, 더 긴 생체내 혈청 체류로 이어질 수 있다. 혈청 반감기 증가를 위한 이러한 pI 변이체는 또한 정제를 위한 pI 변경을 가능하게 한다.
또한, 동종이량체가 존재하는 경우에는 제거, 최소화 및 구별하는 능력이 중요하기 때문에, pI 변이체가 이중특이적 항체의 분석 및 품질 관리 과정에 추가적인 이점을 제공한다는 점에 유의해야 한다. 유사하게, 이종이량체 항체 생산의 재현성을 신뢰성 있게 시험하는 능력이 중요하다.
일반적으로, 특정 용도의 실시 형태는, 동종이량체로부터 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위해 2개 단량체 사이의 pI 차이를 증가시키는, pI 변이체와 커플링된, 동종이량체화 형성에 비해 이종이량체화 형성을 유리하게 하는, 비대칭 변이체를 포함하는 변이체 세트에 의존한다.
pI 변이체의 예시적인 조합은 미국 출원 공개 제2016/0355608호의 도 1 및 도 2, 및 도 30에 제시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이, 구체적으로 pI 변이체의 개시내용이 본원에 참조로서 인용된다. pI 변이체의 바람직한 조합은 도 1 및 도 2에 제시되어 있다. 본원에 개괄되고 도면에 나타낸 바와 같이, 이러한 변경은 IgG1과 비교하여 나타내지만, 모든 아이소타입뿐 아니라 아이소타입 혼성체도 이러한 방식으로 변경될 수 있다. 중쇄 불변 도메인이 IgG2 내지 IgG4로부터의 것인 경우, R133E 및 R133Q가 또한 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 하나의 단량체는 도 2로부터의 치환의 세트를 갖고, 다른 단량체는 하전된 링커를 갖는다(단량체가 scFv를 포함하므로 하전된 scFv 링커의 형태로, 또는 도 5 및 도 6에 도시된 것들로부터 선택될 수 있는, 형식이 지시하는 바와 같은, 하전된 도메인 링커의 형태로).
일부 실시 형태에서, 변형은 EU 넘버링을 기반으로 하여 216번, 217번, 218번, 219번, 220번, 221번, 222번, 223번, 224번, 225번, 226번, 227번, 228번, 229번, 및 230번의 위치를 포함하는 Fc 도메인의 힌지에서 실행된다. 따라서, pI 돌연변이, 특히 치환은 216번 내지 230번의 위치 중 하나 이상에서 만들어질 수 있으며, 여기서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 돌연변이가 사용된다. 다시 말하면, 모든 가능한 조합이, 단독으로 또는 다른 도메인의 다른 pI 변이체와 함께, 고려된다.
힌지 도메인의 pI를 저하시키는 데 사용되는 특정한 치환에는, 비제한적으로, 221번 위치에서의 결실, 222번 위치에서의 비(非)천연 발린 또는 트레오닌, 223번 위치에서의 결실, 224번 위치에서의 비천연 글루탐산, 225번 위치에서의 결실, 235번 위치에서의 결실, 및 236번 위치에서의 결실 또는 비천연 알라닌이 포함된다. 일부 경우에, 힌지 도메인에는 pI 치환만이 일어나고, 다른 것들의 경우에는, 이러한 치환(들)이 다른 도메인의 다른 pI 변이체에 임의의 조합으로 부가된다.
일부 실시 형태에서, 돌연변이는 EU 넘버링을 기반으로 하여 233번, 234번, 235번, 236번, 274번, 296번, 300번, 309번, 320번, 322번, 326번, 327번, 334번, 및 339번 위치를 포함하는 CH2 영역 내에서 실행될 수 있다. IgG2 백본에서 (327A와 함께) 이펙터 기능을 증가시키기 위해 233번 내지 236번에서 변경이 실행될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 다시 말해서, 이들 14개 위치의 모든 가능한 조합들이 실행될 수 있고; 예를 들어, =는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 CH2 pI 치환을 갖는 변이체 Fc 도메인을 포함할 수 있다.
CH2 도메인의 pI를 저하시키는 데 사용되는 특정한 치환에는, 비제한적으로, 274번 위치에서의 비천연 글루타민 또는 글루탐산, 296번 위치에서의 비천연 페닐알라닌, 300번 위치에서의 비천연 페닐알라닌, 309번 위치에서의 비천연 발린, 320번 위치에서의 비천연 글루탐산, 322번 위치에서의 비천연 글루탐산, 326번 위치에서의 비천연 글루탐산, 327번 위치에서의 비천연 글리신, 334번 위치에서의 비천연 글루탐산, 339번 위치에서의 비천연 트레오닌, 및 CH2 내 및 다른 도메인과의 모든 가능한 조합이 포함된다.
이 실시 형태에서, 변형은 독립적으로 그리고 임의로 CH3 영역의 355번, 359번, 362번, 384번, 389번, 392번, 397번, 418번, 419번, 444번, 및 447번 위치(EU 넘버링)로부터 선택될 수 있다. CH3 도메인의 pI를 저하시키는 데 사용되는 특정한 치환에는, 비제한적으로, 355번 위치에서의 비천연 글루타민 또는 글루탐산, 384번 위치에서의 비천연 세린, 392번 위치에서의 비천연 아스파라긴 또는 글루탐산, 397번 위치에서의 비천연 메티오닌, 419번 위치에서의 비천연 글루탐산, 359번 위치에서의 비천연 글루탐산, 362번 위치에서의 비천연 글루탐산, 389번 위치에서의 비천연 글루탐산, 418번 위치에서의 비천연 글루탐산, 444번 위치에서의 비천연 글루탐산, 및 447번 위치에서의 결실 또는 비천연 아스파르트산이 포함된다.
일반적으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 하기 2가지의 일반적인 범주의 pI 변이체가 존재한다: 단백질의 pI를 증가시키는(염기성 변화) 것들 및 단백질의 pI를 감소시키는(산성 변화) 것들. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 변이체의 모든 조합이 이루어질 수 있으며, 하나의 단량체는 야생형, 또는 야생형과 유의하게 상이한 pI를 나타내지 않는 변이체일 수 있고, 다른 하나의 단량체는 더 염기성이거나 더 산성일 수 있다. 대안적으로, 하나는 더 염기성으로, 그리고 하나는 더 산성으로 각각의 단량체가 변경된다.
pI 변이체의 바람직한 조합을 도 2에 나타낸다. 본원에 개괄되고 도면에 나타낸 바와 같이, 이러한 변경은 IgG1과 비교하여 나타내지만, 모든 아이소타입뿐 아니라 아이소타입 혼성체도 이러한 방식으로 변경될 수 있다. 중쇄 불변 도메인이 IgG2 내지 IgG4로부터의 것인 경우, R133E 및 R133Q가 또한 사용될 수 있다.
일 실시 형태에서, 예를 들어 도 15 및 도 44 형식으로, pI 변이체의 바람직한 조합은 208D/295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1과 비교하여 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함하는 하나의 단량체(음성 Fab 측) 및 (GKPGS)4(서열번호 15)를 포함하는 양성으로 하전된 scFv 링커를 포함하는 제2 단량체(양성 scFv 측)를 갖는다. 그러나, 당업자가 이해하는 바와 같이, 제1 단량체는 208번 위치를 포함하는 CH1 도메인을 포함한다. 따라서, CH1 도메인을 포함하지 않는 작제물에서(예를 들어, 도메인 중 하나 상의 CH1 도메인을 이용하지 않는 항체의 경우, 예를 들어 도 44c 또는 도 44d에 도시된 것들과 같은 이중 scFv 형식 또는 "1-아암" 형식으로), 바람직한 음성 pI 변이체 Fc 세트는 295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1과 비교하여 Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 하나의 단량체는 도 4로부터의 치환의 세트를 갖고, 다른 단량체는 하전된 링커를 갖는다(그 단량체가 scFv를 포함하므로 하전된 scFv 링커의 형태로, 또는 도 5 및 도 6에 도시된 것들로부터 선택될 수 있는, 형식이 지시하는 바와 같은, 하전된 도메인 링커의 형태로).
c.
아이소타입 변이체
또한, 본원에 기재된 항체의 다수의 구현예는 특정 위치에서 하나의 IgG 아이소타입으로부터 또 다른 IgG 아이소타입으로의 pI 아미노산의 "이입"에 의존하기 때문에, 원치 않는 면역원성이 변이체에 도입될 가능성이 감소되거나 제거된다. 다수의 이러한 것들이, 본원에 참고로 포함된 미국 출원 공개 제2014/0370013호의 도 21에 제시되어 있다. 즉, IgG1은 높은 이펙터 기능을 포함하는 다양한 이유로 치료용 항체를 위한 통상의 아이소타입이다. 하지만, IgG1의 중쇄 불변 영역은 IgG2보다 높은 pI를 갖는다(8.10 대 7.31). 특정 위치에서 IgG2 잔기를 IgG1 백본에 도입함으로써, 생성되는 단량체의 pI는 저하되고(또는 증가되고), 부가적으로 더 긴 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들어, IgG1은 137번 위치에 글리신(pI 5.97)을 갖고, IgG2는 글루탐산(pI 3.22)을 가지며; 글루탐산을 이입하는 것은 생성되는 단백질의 pI에 영향을 미칠 것이다. 하기 기재되는 바와 같이, 일반적으로 변이체 항체의 pI에 유의한 영향을 미치기 위해서는 다수의 아미노산 치환이 필요하다. 그러나, 하기 논의되는 바와 같이, 심지어 IgG2 분자 내의 변경도 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다는 점에 유의해야 한다.
다른 실시 형태에서, 하기 추가로 기재되는 바와 같이, 생성되는 단백질의 전반적인 전하 상태를 감소시키거나(예를 들어, 더 높은 pI의 아미노산을 더 낮은 pI의 아미노산으로 변경함으로써), 안정성 등을 위해 구조의 조정을 가능하게 하도록 비-아이소타입 아미노산 변경이 실행된다.
또한, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 둘 모두를 pI 조작함으로써, 이종이량체의 각각의 단량체에서 유의한 변화를 관찰할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 2개의 단량체의 pI를 0.5 이상만큼 상이하게 하는 것은, 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동, 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 가능하게 할 수 있다.
d.
pI 계산
각각의 단량체의 pI는 변이체 중쇄 불변 도메인의 pI, 및 변이체 중쇄 불변 도메인 및 융합 파트너를 포함하는 총 단량체의 pI에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, pI의 변경은 다음의 미국 특허출원공개의 도 19에서의 도표를 사용하여 변이형 중쇄 불변 도메인을 기준으로 계산된다. 2014/0370013. 본원에 논의된 바와 같이, 어느 단량체를 조작할 것인지는 일반적으로 Fv 및 스캐폴드 영역의 고유 pI에 의해 결정된다. 대안적으로, 각각의 단량체의 pI가 비교될 수 있다.
e.
더 양호한 FcRn 생체내 결합을 또한 부여하는 pI 변이체
pI 변이체가 단량체의 pI를 감소시키는 경우, 이들은 생체내 혈청 체류를 개선하는 추가의 이익을 가질 수 있다.
아직 연구 중이지만, Fc 영역은 엔도솜에서 pH 6에서 FcRn에 결합하여 Fc를 격리시키기 때문에, 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는 것으로 여겨진다(문헌[Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598, 전체적으로 참고로 포함됨). 이어서, 엔도솜 구획은 Fc를 세포 표면으로 재순환시킨다. 일단 구획이 세포외 공간에 대해 개방되면, 약 7.4의 더 높은 pH는 Fc가 다시 혈액 내로 방출되도록 유도한다. Dall' Acqua 등은, 마우스에서, pH 6 및 pH 7.4에서 FcRn 결합이 증가된 Fc 돌연변이체가 실제로 감소된 혈청 농도 및 야생형 Fc와 동일한 반감기를 갖는다는 것을 보여주었다(문헌[Dall' Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)). pH 7.4에서 FcRn에 대한 Fc의 증가된 친화도는 Fc가 다시 혈액 내로 방출되는 것을 방지하는 것으로 생각된다. 따라서, 생체내 Fc의 반감기를 증가시키는 Fc 돌연변이는 더 높은 pH에서 여전히 Fc의 방출을 허용하면서 더 낮은 pH에서 FcRn 결합을 이상적으로 증가시킬 것이다. 아미노산 히스티딘은 6.0 내지 7.4의 pH 범위에서 그의 전하 상태를 변경한다. 따라서, Fc/FcRn 복합체의 중요한 위치에서 His 잔기를 발견하는 것은 의외의 일이 아니다.
최근에는, 등전점이 더 낮은 가변 영역을 갖는 항체가 또한 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있다고 시사되었다(문헌[Igawa et al., 2010 PEDS. 23(5): 385-392, 전체적으로 참고로 포함됨). 그러나, 이의 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있다. 추가로, 가변 영역은 항체마다 상이하다. pI가 감소되고 반감기가 연장된 불변 영역 변이체는 본원에 기재된 바와 같이 항체의 약동학적 특성을 개선하기 위한 더 모듈화된 접근법을 제공할 것이다.
f.
부가적인 기능을 위한 부가적인 Fc 변이체
상기 논의된 이종이량체화 변이체에 더하여, 하기 논의되는 바와 같이, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합의 변경, FcRn 수용체에 대한 결합의 변경 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 이유로 실행될 수 있는 다수의 유용한 Fc 아미노산 변형이 존재한다.
따라서, 본원에 제공된 항체(이종이량체 및 동종이량체)는 본원에 개괄된 이종이량체화 변이체(예를 들어, pI 변이체 및 입체 변이체)를 포함하거나 포함하지 않는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 각각의 변이체 세트는 독립적으로 및 선택적으로 임의의 특정한 이종이량체 단백질에 포함되거나 이로부터 배제될 수 있다.
(i)
FcγR 변이체
따라서, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합을 변경하기 위해 이루어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 치환이 존재한다. 소정의 실시 형태에서, 대상 항체는 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합을 변경하는 변형(즉, "FcγR 변이체")을 포함한다. 증가된 결합뿐만 아니라 감소된 결합을 유발하는 치환이 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa에 대한 증가된 결합은 일반적으로 증가된 ADCC(항체 의존적 세포-매개 세포독성; FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응)를 유발한다는 것이 알려져 있다. 유사하게, 일부 상황에서 FcγRIIb(억제 수용체)에 대한 감소된 결합도 유익할 수 있다. 본원에 기재된 항체에 유용한 아미노산 치환은, 미국 특허 제8,188,321호(특히 도 41) 및 제8,084,582호, 및 미국 출원 공개 제20060235208호 및 제20070148170호(이들 모두는 그 전문이, 그리고 구체적으로 그 안에 개시된 변이체에 대해 본원에 명백하게 참고로 포함됨)에 열거된 것들을 포함한다. 사용되는 특정 변이체에는, 비제한적으로, 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D/332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V 및 299T가 포함된다.
또한, 434S, 434A, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 428L/434A, 259I/308F, 436I/428L, 436I or V/434S, 436V/428L, 및 259I/308F/428L을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 그 전문이 본원에 참고로 포함된 USSN 12/341,769호에 구체적으로 개시된 바와 같이, FcRn 수용체에 대한 증가된 결합 및 증가된 혈청 반감기에 유용한 부가적인 Fc 치환이 존재한다. 이러한 변형은 대상 항체의 Fc 도메인 중 하나 또는 둘 모두에 포함될 수 있다.
(ii)
절제 변이체
유사하게, 기능성 변이체의 다른 범주는 "FcγR 절제 변이체" 또는 "Fc 녹아웃(FcKO 또는 KO)" 변이체이다. 이들 실시 형태에서, 일부 치료적 응용을 위해, Fcγ 수용체(예를 들어, FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 등) 중 하나 이상 또는 전부에 대한 Fc 도메인의 정상적인 결합을 감소시키거나 제거하여, 부가적인 작용 메커니즘을 회피하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어, 다수의 구현예에서, 특히 CD3에 1가로 결합하는 이중특이적 항체의 사용에 있어서, 일반적으로 Fc 도메인 중 하나가 하나 이상의 Fcγ 수용체 절제 변이체를 포함하도록 ADCC 활성을 제거하거나 유의하게 감소시키기 위해 FcγRIIIa 결합을 절제하는 것이 바람직하다. 이러한 절제 변이체는 도 14에 도시되어 있고, 이들 각각은 독립적으로 및 임의로 포함되거나 배제될 수 있으며, 절제 변이체를 이용하는 바람직한 태양은 G236R/L328R, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G, 및 E233P/L234V/L235A/G236del로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 언급된 절제 변이체는 FcγR 결합을 절제하지만, 일반적으로 FcRn 결합은 절제하지 않는다는 점에 유의해야 한다.
당업계에 알려진 바와 같이, 인간 IgG1의 Fc 도메인은 Fcγ 수용체에 대한 최고 결합을 가지며, 따라서 이종이량체 항체 백본 내의 불변 도메인(또는 Fc 도메인)이 IgG1인 경우에 절제 변이체가 사용될 수 있다. IgG1 배경에서 절제 변이체에 대안적으로 또는 부가적으로, 297번 글리코실화 위치에서의 돌연변이(일반적으로, A 또는 S로)는, 예를 들어 FcγRIIIa에 대한 결합을 유의하게 절제할 수 있다. 인간 IgG2 및 IgG4는 Fcγ 수용체에 대한 자연적으로 감소된 결합을 가지며, 따라서 그러한 백본은 절제 변이체의 존재 또는 부재 하에 사용될 수 있다.
E.
이종이량체 및 Fc 변이체의 조합
당업자가 이해하는 바와 같이, 모든 언급된 이종이량체화 변이체(비대칭 변이체 및/또는 pI 변이체를 포함함)는, 이들이 "가닥 배열" 또는 "단량체 분할"을 유지하는 한, 선택적으로 및 독립적으로 임의의 방식으로 조합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본원에 제공된 이종이량체 항체는 도 4에 도시된 바와 같은 이종이량체화 비대칭 변이체, 등입체성 pI 치환, 및 FcKO 변이체의 조합을 포함한다. 또한, 이러한 변이체 모두는 이종이량체화 형식 중 임의의 것으로 조합될 수 있다.
pI 변이체의 경우에, 특히 사용되는 구현예가 도면에 도시되어 있지만, 정제를 용이하게 하기 위해 2개의 단량체 사이의 pI 차이를 변경하는 기본 규칙에 따라 다른 조합이 생성될 수 있다.
또한, 이종이량체화 변이체, 비대칭 변이체, 및 pI 변이체 중 임의의 것은 또한 본원에 일반적으로 개괄된 바와 같이 Fc 절제 변이체, Fc 변이체, FcRn 변이체와 독립적으로 및 임의로 조합된다.
이종이량체 1+1 Fab-scFv-Fc 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체의 일부 구현예에 포함되는 변이체의 예시적인 조합은, 도 4에 포함되어 있다. 특정 구현예에서, 항체는 도 15a 및 도 15b에 제시된 바와 같은 이종이량체 1+1 Fab-scFv-Fc 또는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체이다.
F.
항-GPC3 x 항-CD3 이중특이적 항체
다른 태양에서는, 항-GPC3 x 항-CD3(본원에서 "αGPC3 x αCD3" 또는 간혹 단지 "GPC3 X CD3"으로도 지칭됨) 이중특이적 항체가 본원에 제공된다. 이러한 항체는 적어도 하나의 GPC3 결합 도메인과 적어도 하나의 CD3 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 이중특이적 αGPC3 x αCD3은 GPC3을 발현하는 종양 부위에 선택적으로 면역 반응을 일으킨다.
본원에 명시되지 않는 한, 명칭에서 항원 목록의 순서는 구조를 부여하지 않으며; 즉, GPC3 X CD3 1 + 1 Fab-scFv-Fc 항체는 GPC3 또는 CD3에 결합하는 scFv를 가질 수 있지만, 일부 경우에는, 표시된 바와 같이 순서가 구조를 명시한다는 것에 유의한다.
본원에 더욱 완전하게 개괄된 바와 같이, ABD의 이러한 조합은 하기 개괄된 바와 같은 다양한 형식으로, 일반적으로는 하나의 ABD가 Fab 형식이고 다른 하나가 scFv 형식인 조합으로 존재할 수 있다. 본원에 제공된 이중특이적 항체에 사용되는 예시적인 형식에는, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fv 형식(예를 들어, 도 15a 및 도 15b 참조)이 포함된다. 다른 유용한 항체 형식은, 도 44에 도시되고 하기 더욱 완전하게 기재된 바와 같이, "mAb-Fv", "mAb-scFv", "중앙-Fv", "1-아암 scFv-mAb", "scFv-mAb", "이중 scFv", 및 "트라이던트" 형식 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
또한, 일반적으로, ABD 중 하나는, N-말단에서 C-말단으로, VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 배향으로 본원에 개괄된 바와 같은 scFv를 포함한다. 상기 형식에 따르는 다른 ABD 중 하나 또는 둘 모두는, 일반적으로 하나의 단백질 사슬 상에 VH 도메인(일반적으로, 중쇄의 구성요소)을 포함하고 또 다른 단백질 사슬 상에 VL(일반적으로, 경쇄의 구성요소)을 포함하는 Fab이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 6개 CDR의 세트, 또는 VH 도메인과 VL 도메인은 scFv 형식 또는 Fab 형식으로 존재할 수 있고, 이는 이어서 중쇄 불변 도메인과 경쇄 불변 도메인에 부가되며, 여기서 중쇄 불변 도메인은 변이체(CH1 도메인 및 Fc 도메인 내에 포함됨)를 포함한다. 서열목록에 포함된 scFv 서열은 특정 하전된 링커를 이용하지만, 본원에 개괄된 바와 같이 도 5 및 도 6에 도시된 것들을 포함하는 하전되지 않은 또는 달리 하전된 링커가 사용될 수 있다.
또한, 상기 논의된 바와 같이, CDR의 식별을 위해 서열 목록에 사용된 넘버링은 Kabat이지만, 표 2에 나타낸 바와 같이 CDR의 아미노산 서열을 변화시킬 상이한 넘버링이 사용될 수 있다.
본원에 열거된 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 모두에 대해, 추가의 변이체가 만들어질 수 있다. 본원에 개괄된 바와 같이, 프레임워크(CDR 제외)가 미국 특허 제7,657,380호의 도 1(도면 및 범례는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 열거된 것들로부터 선택된 인간 생식계열 서열에 대해 약 80, 85, 또는 90% 이상의 동일성을 유지하는 한, 일부 실시 형태에서, 6개 CDR의 세트는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형(특히 유용한 아미노산 치환을 가짐)뿐만 아니라, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 프레임워크 영역 내의 변경을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역이 미국 특허 제7,657,380호의 도 1에 열거된 것들로부터 선택된 인간 생식계열 서열에 대해 80, 85, 또는 90% 이상의 동일성을 유지하는 한, 본원에 기재된 바와 동일한 CDR은 인간 생식계열 서열로부터의 상이한 프레임워크 서열과 조합될 수 있다. 대안적으로, 프레임워크 영역이 미국 특허 제7,657,380호의 도 1에 열거된 것들로부터 선택된 인간 생식계열 서열에 대해 80, 85, 또는 90% 이상의 동일성을 유지하는 한, CDR은 아미노산 변형(예를 들어, CDR의 세트에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형으로부터(즉, 6개 CDR의 세트에서 변화의 총 수가 6개 미만의 아미노산 변형인 한 CDR이 변형될 수 있고, CDR의 임의의 조합은 변화되고; 예를 들어, vlCDR1 내의 1개의 변화, vhCDR2 내의 2개의 변화, vhCDR3 내의 무변화 등이 있을 수 있음))뿐만 아니라, 프레임워크 영역 변화를 가질 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 대상 이종이량체 항체는 2개의 항원 결합 도메인(ABD)을 포함하며, 이들은 각각 GPC3 또는 CD3에 결합한다. 본원에 개괄된 바와 같이, 이러한 이종이량체 항체는 이중특이적이며 2가(각각의 항원은, 예를 들어 도 15a에 도시된 형식으로 단일 ABD에 의해 결합됨)일 수 있거나, 이중특이적이며 3가(예를 들어 도 15b에 도시된 바와 같이, 하나의 항원은 단일 ABD에 의해 결합되고, 다른 하나는 2개의 ABD에 의해 결합됨)일 수 있다.
또한, 일반적으로, ABD 중 하나는, N-말단에서 C-말단으로, VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 배향으로 본원에 개괄된 바와 같은 scFv를 포함한다. 상기 형식에 따르는 다른 ABD 중 하나 또는 둘 모두는, 일반적으로 하나의 단백질 사슬 상에 VH 도메인(일반적으로, 중쇄의 구성요소)을 포함하고 또 다른 단백질 사슬 상에 VL(일반적으로, 경쇄의 구성요소)을 포함하는 Fab이다.
본 개시내용은 하기 개괄된 바와 같은 다수의 ABD를 제공한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 6개 CDR의 세트, 또는 VH 도메인과 VL 도메인은 scFv 형식 또는 Fab 형식으로 존재할 수 있고, 이는 이어서 중쇄 불변 도메인과 경쇄 불변 도메인에 부가되며, 여기서 중쇄 불변 도메인은 변이체(CH1 도메인 및 Fc 도메인 내에 포함됨)를 포함한다. 서열 목록에 포함된 scFv 서열은 특정 하전된 링커를 이용하지만, 본원에 개괄된 바와 같이 도 5에 도시된 것들을 포함하는 하전되지 않거나 달리 하전된 링커가 사용될 수 있다.
또한, 상기 논의된 바와 같이, CDR의 식별을 위해 서열 목록에 사용된 넘버링은 Kabat이지만, 표 2에 나타낸 바와 같이 CDR의 아미노산 서열을 변화시킬 상이한 넘버링이 사용될 수 있다.
본원에 열거된 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 모두에 대해, 추가의 변이체가 만들어질 수 있다. 본원에 개괄된 바와 같이, 프레임워크(CDR 제외)가 미국 특허 제7,657,380호의 도 1(도면 및 범례는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 열거된 것들로부터 선택된 인간 생식계열 서열에 대해 약 80, 85, 또는 90% 이상의 동일성을 유지하는 한, 일부 실시 형태에서, 6개 CDR의 세트는 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형(특히 유용한 아미노산 치환을 가짐)뿐만 아니라, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 프레임워크 영역 내의 변경을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프레임워크 영역이 미국 특허 제7,657,380호의 도 1에 열거된 것들로부터 선택된 인간 생식계열 서열에 대해 80, 85, 또는 90% 이상의 동일성을 유지하는 한, 본원에 기재된 바와 동일한 CDR은 인간 생식계열 서열로부터 상이한 프레임워크 서열과 조합될 수 있다. 대안적으로, 프레임워크 영역이 미국 특허 제7,657,380호의 도 1에 열거된 것들로부터 선택된 인간 생식계열 서열에 대해 80, 85, 또는 90% 이상의 동일성을 유지하는 한, CDR은 아미노산 변형(예를 들어, CDR의 세트에서 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 아미노산 변형으로부터(즉, 6개 CDR의 세트에서 변화의 총 수가 6개 미만의 아미노산 변형인 한 CDR이 변형될 수 있고, CDR의 임의의 조합은 변화되고; 예를 들어, VLCDR1 내의 1개의 변화, VHCDR2 내의 2개의 변화, VHCDR3 내의 무변화 등이 있을 수 있음))뿐만 아니라, 프레임워크 영역 변화를 가질 수 있다.
1.
GPC3 항원 결합 도메인
인간 GPC3에 결합하는 항원 결합 도메인을 함유하는 단클론 및 이중특이적 항체가 본원에 제공된다. 적합한 6개 CDR의 세트 및/또는 VH 및 VL 도메인은 도 12 및 도 13에 도시되어 있다. 일부 실시 형태에서, 이종이량체 항체는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 또는 2 + 1 Fab2-scFv-Fv 형식 항체이지만(예를 들어, 도 15a 및 도 15b 참조) 하기 개괄된 형식 중 임의의 것이 이용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 ABD는 H1, H1, H1.1, H1.2, H1.3, 및 H1.4로 이루어진 군으로부터 선택된 VH로부터의 vhCDR1, vhCDR2, 및 vhCDR3 서열로부터 선택된 vhCDR의 세트를 가지며, 이들의 서열은 도 12 및 도 13에 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 ABD의 VH 도메인은 H1, H1, H1.1, H1.2, H1.3, 및 H1.4로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들의 서열은 도 12 및 도 13에 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 ABD는 L1, L1.1, L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L1.6, L1.7, L1.8, L1.9, L1.10, L1.16, L1.23, L1.29, L1.31. L1.65, L1.66, L1.68, L1.69, L1.70, L1.71, L1.72, 및 L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL로부터의 vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3 서열로부터 선택된 vlCDR의 세트를 가지며, 이들의 서열은 도 12 및 도 13에 나타낸다.
일부 실시 형태에서, GPC3 ABD의 VL은 L1, L1.1, L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L1.6, L1.7, L1.8, L1.9, L1.10, L1.16, L1.23, L1.29, L1.31. L1.65, L1.66, L1.68, L1.69, L1.70, L1.71, L1.72, 및 L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들의 서열은 도 12 및 도 13에 나타낸다.
따라서, [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 갖는 GPC3 ABD가 본원에 포함된다.
또한, [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는 GPC3 ABD가 본원에 포함된다.
특정 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 Fab이고 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 적합한 GPC3 결합 도메인은 도면에 도시된 바와 같은 6개 CDR의 세트를 포함할 수 있으며, 이에는 밑줄이 그어져 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 그리고 표 2에 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에는, CDR은 도 12 및 도 13에 도시된 것들의 VH 및 VL 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된다. scFv 또는 Fab으로 사용되는 적합한 ABD는 또한 이러한 서열 및 도면에 도시된 바와 같은 전체 VH 서열 및 VL 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 GPC3에 대한 Fv를 함유하는 다수의 구현예에서, GPC3에 결합하는 것은 Fab 단량체이다.
GPC3에 대한 ABD를 형성하는 도면 및 서열 목록에 개시된 모 CDR 세트에 더하여, 본원에 개시된 GPC3 ABD CDR의 하나 이상의 변형을 포함하는 CDR을 갖는 변이체 GPC3 ABD가 본원에 제공된다(예를 들어, 도 12 및 도 13 및 서열 목록). 일 실시 형태에서, 대상 이종이량체 항체의 GPC3 ABD는 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 GPC3 결합 도메인 VH/VL 쌍의 6개 CDR과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 변형을 갖는 6개 CDR의 세트를 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, 대상 이종이량체 항체의 GPC3 ABD는 하기 GPC3 결합 도메인 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69 중 하나의 6개 CDR과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 변형을 갖는 6개 CDR의 세트를 포함한다. 소정의 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), BLI(생물층 간섭계, 예를 들어, Octet 검정) 검정, 및/또는 유세포 분석법 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이(다수의 실시 형태에서 후자가 특히 유용함), 대상 항체의 GPC3 ABD는 GPC3에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에서, GPC3 ABD는 인간 GPC3에 결합할 수 있다(도 11 참조). 일부 경우에, 각각의 변이체 CDR은 1 또는 2개 이하의 아미노산 변화를 가지며, CDR당 1개 이하가 특히 유용하다.
일부 실시 형태에서, 대상 항체의 GPC3 ABD는 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 바와 같이 GPC3 ABD의 6개 CDR과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 6개의 CDR을 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, 대상 항체의 GPC3 ABD는 하기 GPC3 결합 도메인 VH/VL 쌍 중 하나의 6개의 CDR과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 6개의 CDR을 포함한다: GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69. 특정 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), BLI(생물층 간섭계, 예를 들어, Octet 검정) 검정, 및/또는 유세포 분석법 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이, 대상 항체의 GPC3 ABD는 GPC3에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에서, GPC3 ABD는 인간 GPC3 항원에 결합할 수 있다(도 11 참조).
다른 예시적인 실시 형태에서, 대상 항체의 GPC3 ABD는 도면 및 서열 목록(예를 들어, 도 12 및 도 13)을 포함하는 본원에 기재된 GPC3 결합 도메인 VH/VL 쌍 중 어느 하나의 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 대상 항체는 본원에 개시된 GPC3 ABD VH 및 VL 도메인의 변이체인 가변 중쇄 도메인 및/또는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 GPC3 ABD를 포함한다. 일 실시 형태에서, 변이체 VH 도메인 및/또는 변이체 VL 도메인은 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 GPC3 ABD의 VH 및/또는 VL 도메인으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는다. 예시적인 실시 형태에서, 변이체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 하기 GPC3 결합 도메인 VH/VL 쌍 중 하나의 VH 및/또는 VL 도메인으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는다: GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69. 일부 실시 형태에서, 변화는 도 12 및 도 13에 도시된 VH 도메인 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 변화는 도 12 및 도 13에 도시된 VL 도메인 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 변화는 도 12 및 도 13에 도시된 VH 및 VL 도메인 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 변화는 VH 및/또는 VL 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4) 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 변화는 하나 이상의 CDR 내에 존재한다. 특정 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), BLI(생물층 간섭계, 예를 들어, Octet 검정) 검정, 및/또는 유세포 분석법 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이, 대상 항체의 GPC3 ABD는 GPC3에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에서, GPC3 ABD는 인간 GPC3 항원에 결합할 수 있다(도 11 참조).
일 실시 형태에서, 변이체 VH 및/또는 VL 도메인은 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 GPC3 ABD의 VH 및/또는 VL과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일하다. 예시적인 실시 형태에서, 변이체 VH 및/또는 VL 도메인은 하기 GPC3 결합 도메인 VH/VL 쌍 중 하나의 VH 및/또는 VL과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일하다: GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69. 일부 실시 형태에서, GPC3 ABD는 도 12 및 도 13에 도시된 VH 도메인과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 VH를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3 ABD는 도 12 및 도 13에 도시된 VL 도메인과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3 ABD는 도 12 및 도 13에 도시된 VH 도메인 및 VL 도메인과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 VH 및 VL을 포함한다. 특정 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), BLI(생물층 간섭계, 예를 들어, Octet 검정) 검정, 및/또는 유세포 분석법 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이, 대상 항체의 GPC3 ABD는 GPC3에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에서, GPC3 ABD는 인간 GPC3 항원에 결합할 수 있다(도 11 참조).
2.
CD3 항원 결합 도메인
본 발명의 이종이량체 이중특이적 항체(예를 들어, 항-GPC3 x 항-CD3 항체)는 또한 인간 엡실론 CD3(CD3ε)에 결합하는 ABD를 포함한다.
적합한 6개 CDR의 세트 및/또는 VH 및 VL 도메인뿐만 아니라 scFv 서열은, 도 10에 도시되어 있다. 특히 유용한 CD3 결합 도메인 서열은 도 10에 도시된 바와 같은 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 항-CD3 ABD가 scFv 도메인일 때, VH 및 VL 도메인은 어느 하나의 배향일 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 적합한 CD3 결합 도메인은 도 10에 도시된 바와 같은 6개 CDR의 세트를 포함할 수 있으며, 이에는 밑줄이 그어져 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 그리고 표 2에 나타낸 바와 같이 상이한 넘버링 체계가 사용되는 경우에는, CDR은 도 10a 내지 도 10f에 도시된 것들의 VH 및 VL 서열 내에서 다른 정렬을 사용하여 식별된다. scFv 또는 Fab으로 사용되는 적합한 ABD는 또한 이러한 서열 및 도면에 도시된 바와 같은 전체 VH 서열 및 VL 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 CD3에 대한 Fv를 함유하는 다수의 구현예에서, CD3에 결합하는 것은 scFv 단량체이다.
CD3에 대한 ABD를 형성하는 도면 및 서열 목록에 개시된 모 CDR 세트에 더하여, 본원에 개시된 CD3 ABD CDR의 하나 이상의 변형을 포함하는 CDR을 갖는 변이체 CD3 ABD가 본원에 제공된다(예를 들어, 도 10 및 서열 목록). 일 실시 형태에서, 대상 이종이량체 항체의 CD3 ABD(예를 들어, 항-GPC3 x 항-CD3 항체)는 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 CD3 ABD의 6개 CDR과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 변형을 갖는 6개 CDR의 세트를 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, 대상 이종이량체 항체의 CD3 ABD는 하기 CD3 결합 도메인 중 하나의 6개의 CDR과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 변형을 갖는 6개 CDR의 세트를 포함한다: 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31(도 10) 소정의 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 유세포 분석법, 및/또는 BLI(생물층 간섭계, 예를 들어 Octet 검정) 검정 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이(다수의 실시 형태에서 후자가 특히 유용함), 대상 항체의 CD3 ABD는 CD3 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에서, CD3ABD는 인간 CD3에 결합할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 대상 항체의 CD3 ABD는 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 바와 같이 CD3 ABD의 6개 CDR과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 6개의 CDR을 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, 대상 항체의 CD3 ABD는 하기 CD3 결합 도메인 중 하나의 6개의 CDR과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 6개의 CDR을 포함한다: 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31(도 10). 소정의 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 유세포 분석법, 및/또는 BLI(생물층 간섭계, 예를 들어 Octet 검정) 검정 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이(다수의 실시 형태에서 후자가 특히 유용함), CD3 ABD는 CD3에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, CD3 ABD는 인간 CD3 항원에 결합할 수 있다.
다른 예시적인 실시 형태에서, 대상 항체의 CD3 ABD는 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 CD3 결합 도메인 중 어느 하나의 가변 중쇄(VH) 도메인 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 대상 항체는 본원에 개시된 CD3 ABD VH 및 VL 도메인의 변이체인 가변 중쇄 도메인 및/또는 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CD3 ABD를 포함한다. 일 실시 형태에서, 변이체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 CD3 ABD의 VH 및/또는 VL 도메인으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는다. 예시적인 실시 형태에서, 변이체 VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 하기 CD3 결합 도메인 중 하나의 VH 및/또는 VL 도메인으로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 변화를 갖는다: 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31(도 10). 일부 실시 형태에서, 변화는 도 10에 도시된 VH 도메인 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 변화는 도 10에 도시된 VL 도메인 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 변화는 도 10에 도시된 VH 및 VL 도메인 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 변화는 VH 및/또는 VL 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4) 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 변화는 하나 이상의 CDR 내에 존재한다. 소정의 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 유세포 분석법, 및/또는 BLI(생물층 간섭계, 예를 들어 Octet 검정) 검정 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이(다수의 실시 형태에서 후자가 특히 유용함), 대상 항체의 CD3 ABD는 CD3에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, CD3 ABD는 인간 CD3 항원에 결합할 수 있다.
일 실시 형태에서, 변이체 VH 및/또는 VL 도메인은 도면 및 서열 목록을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 CD3 ABD의 VH 및/또는 VL과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일하다. 예시적인 실시 형태에서, 변이체 VH 및/또는 VL 도메인은 하기 CD3 결합 도메인 중 하나의 VH 및/또는 VL과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일하다: 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31(도 10). 일부 실시 형태에서, CD3 ABD는 도 10에 도시된 VH 도메인과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 VH를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD3 ABD는 도 10에 도시된 VL 도메인과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD3 ABD는 도 10에 도시된 VH 도메인 및 VL 도메인과 90, 95, 97, 98, 또는 99% 이상 동일한 VH 및 VL을 포함한다. 소정의 실시 형태에서, Biacore, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 유세포 분석법, 및/또는 BLI(생물층 간섭계, 예를 들어 Octet 검정) 검정 중 하나 이상에 의해 측정되는 바와 같이(다수의 실시 형태에서 후자가 특히 유용함), CD3 ABD는 CD3에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, CD3 ABD는 인간 CD3 항원에 결합할 수 있다.
도 10의 αCD3 ABD에 더하여, 본 발명에 유용한 부가적인 ABD는, 도면 및 그 안의 범례를 포함하여 명백하게 그 전문이 본원에 포함된 WO2014/145806호의 도 14 및 도 15에 도시된 것들을 포함한다.
3.
링커
본원에 제시된 바와 같이, 재조합 기법에 의해 생성되는 전형적인 펩타이드 결합을 포함하여 언급된 도메인(예를 들어, scFv, Fab, Fc 도메인 등)을 공유결합으로 부착시키는 데 사용될 수 있는 (도메인 링커 또는 scFv 링커로 사용하기 위한) 다수의 적합한 링커가 존재한다. 대상 항체의 도메인을 서로 부착시키기 위한 예시적인 링커는 도 6에 도시되어 있다. 일부 실시 형태에서, 링커 펩티드는 주로 하기 아미노산 잔기를 포함할 수 있다: Gly, Ser, Ala, 또는 Thr. 링커 펩티드는 이들이 원하는 활성을 유지하도록 서로에 대해 정확한 입체배좌를 취하는 방식으로 2개의 분자를 연결하기에 적절한 길이를 가져야 한다. 일 실시 형태에서, 링커는 약 1 내지 50개 아미노산 길이, 바람직하게는 약 1 내지 30개 아미노산 길이이다. 일 실시 형태에서, 1 내지 20개 아미노산 길이의 링커가 사용될 수 있으며, 일부 실시 형태에서는 약 5 내지 약 10개 아미노산이 유용하다. 유용한 링커는, 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n(서열 번호 3), (GGGGS)n(서열 번호 2), 및 (GGGS)n(서열 번호 4)(여기서 n은 1 이상(일반적으로 3 내지 4)의 정수임)을 포함하는 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 다른 가요성 링커를 포함하며, 이들 중 일부는 도 5 및 도 6에 나타낸다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 비단백질성 중합체가 링커로서 유용할 수 있다.
다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 모든 잔기가 아니라 CL/CH1 도메인의 임의의 길이의 임의의 서열; 예를 들어, CL/CH1 도메인의 최초 5 내지 12개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 링커는 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 Cκ 또는 Cλ로부터 유래될 수 있다. 링커는 예를 들어 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε 및 Cμ를 포함하여 임의의 아이소타입의 면역글로불린 중쇄로부터 유래될 수 있다. 링커 서열은 또한 다른 단백질, 예컨대 Ig-유사 단백질(예를 들어, TCR, FcR, KIR), 힌지 영역-유래 서열, 및 다른 단백질로부터의 다른 천연 서열로부터 유래될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 링커는 본원에 개괄된 바와 같이 임의의 2개의 도메인을 함께 연결하기 위해 사용되는 "도메인 링커"이다. 예를 들어, 도 15b에서, Fab의 CH1 도메인의 C-말단을 scFv의 N-말단에 부착시키는 도메인 링커가 존재할 수 있으며, (다수의 구현예에서 힌지가 이러한 도메인 링커로서 사용되지만) scFv의 C-말단을 CH2 도메인에 부착시키는 또 다른 선택적 도메인 링커가 존재할 수 있다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있는 한편, 다수의 실시 형태는 도메인 링커로서 예를 들어 (GS)n, (GSGGS)n(서열 번호 3), (GGGGS)n(서열 번호 2), 및 (GGGS)n(서열 번호 4)(여기서, n은 1 이상(일반적으로 3 내지 4 내지 5)의 정수임)을 포함하는 글리신-세린 중합체뿐만 아니라, 각각의 도메인이 그의 생물학적 기능을 유지하도록 충분한 길이 및 가요성을 갖는 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩티드 서열을 이용한다. 일부 경우에, 하기 개괄되는 바와 같이 "가닥 배열"에 주목하면, scFv 링커의 일부 실시 형태에서 사용된 바와 같은 하전된 도메인 링커가 사용될 수 있다. 예시적인 유용한 도메인 링커는 도 6에 도시되어 있다.
특히 scFv 도메인을 "2+1" 형식으로 Fc 도메인에 부착하기 위해 사용되는 도메인 링커에 관하여, 도 6에 나타낸 바와 같은 "전장 힌지(full hinge) C220S 변이체", "플렉스 하프 힌지(flex half hinge)", "하전된 하프 힌지 1", 및 "하전된 하프 힌지 2"를 포함하는, 특히 유용한 몇몇 도메인 링커가 존재한다.
일부 구현예에서, 링커는 본원에 논의된 바와 같이 VH 도메인과 VL 도메인을 공유결합으로 부착시키는 데 사용되는 "scFv 링커"이다. 다수의 경우, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이며, 이들 중 다수는 도 5에 제시되어 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 제1 단량체와 제2 단량체 사이의 pI 분리를 용이하게 하기 위해 하전된 scFv 링커를 추가로 제공한다. 즉, 양성 또는 음성 중 어느 하나(또는 상이한 단량체 상의 scFv를 사용하는 스캐폴드의 경우에는 둘 모두)인 하전된 scFv 링커를 혼입시킴으로써, 이는 하전된 링커를 포함하는 단량체가 Fc 도메인에서 추가의 변화를 만들지 않으면서 pI를 변경할 수 있게 한다. 이러한 하전된 링커는 임의의 scFv 함유 표준 링커로 치환될 수 있다. 다시 말하면, 당업자가 이해하는 바와 같이, 하전된 scFv 링커는 목적하는 pI 변화에 따라 정확한 "가닥" 또는 단량체에서 사용된다. 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같이, 1+1 Fab-scFv-Fc 형식 이종이량체 항체를 만들기 위해, 목적하는 항원 결합 도메인 각각에 대한 Fv 영역의 본래의 pI가 계산되고, 하나가 scFv를 만들기 위해 선택되며, pI에 따라 양전하 또는 음전하 링커 중 어느 하나가 선택된다.
하전된 도메인 링커는 마찬가지로 본원에 기재된 항체의 단량체의 pI 분리를 증가시키는 데 사용될 수 있고, 따라서 도 5에 포함된 링커는 본원에서 링커가 사용되는 임의의 구현예에서 사용될 수 있다.
G.
본 발명의 유용한 형식
당업자가 이해하고 하기 더욱 완전하게 논의되는 바와 같이, 본원에 제공된 이종이량체 이중특이적 항체는 일반적으로 도 15뿐만 아니라 도 44에 도시된 바와 같이 매우 다양한 구성을 취할 수 있다. 일부 도면은 "단일 말단화" 구성을 도시하며, 여기서 분자의 하나의 "아암" 상에 하나의 유형의 특이성이 존재하고, 다른 하나의 "아암" 상에 상이한 특이성이 존재한다. 다른 도면은 "이중 말단화" 구성을 도시하며, 여기서 분자의 "상단"에 하나 이상의 유형의 특이성이 존재하고, 분자의 "하단"에 하나 이상의 상이한 특이성이 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 상이한 제1 항원과 제2 항원에 공동으로 결합하는 신규한 면역글로불린에 관한 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 기재된 항체의 이종이량체 형식은 상이한 원자가를 가질뿐 아니라, 이중특이적일 수 있다. 즉, 본원에 기재된 항체의 이종이량체 항체는 2가이고 이중특이적일 수 있으며, 여기서 하나의 표적 종양 항원(예를 들어 CD3)은 하나의 결합 도메인에 의해 결합되고, 다른 하나의 표적 종양 항원(예를 들어 GPC3)은 제2 결합 도메인에 의해 결합된다. 이종이량체 항체는 또한 3가이고 이중특이적일 수 있으며, 여기서 제1 항원은 2개의 결합 도메인에 의해 결합되고, 제2 항원은 제2 결합 도메인에 의해 결합된다. 본원에 개괄된 바와 같이, CD3이 표적 항원 중 하나인 경우, 잠재적인 부작용을 감소시키기 위해 CD3이 1가로만 결합되는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 항체는 항-CD3 항원 결합 도메인을 항-GPC3 결합 도메인과 조합으로 이용한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 도면에 도시된 바와 같은 항-CD3 CDR, 항-CD3 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인, Fab 및 scFv의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 유사하게, 도면 중 임의의 것에 도시된 바와 같은 CDR, 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인, Fab 및 scFv이 임의의 조합으로 임의로 및 독립적으로 조합되어 사용될 수 있는 지 여부에 관계없이, 항-GPC3 항원 결합 도메인 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
1.
1+1 Fab-scFv-Fc 형식
본원에 기재된 항체에 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는, CD3 결합 도메인과 종양 표적 항원(GPC3) 결합 도메인의 예시적인 조합을 포함하는, 도 15a에 제시된 바와 같은 "1+1 Fab-scFv-Fc" 또는 "병 오프너" 형식이다. 이러한 구현예에서, 항체 중 하나의 중쇄 단량체는 단일 사슬 Fv(하기에 정의되는 바와 같은 "scFv")와 Fc 도메인을 함유한다. scFv는 가변 중쇄 도메인(VH1)과 가변 경쇄 도메인(VL1)을 포함하며, 여기서 VH1은 하전될 수 있는 scFv 링커를 사용하여 VL1에 부착되어 있다(예를 들어, 도 5 참조). scFv는 도메인 링커를 사용하여 중쇄에 부착되어 있다(예를 들어, 도 6 참조). 다른 하나의 중쇄 단량체는 "일반(regular)" 중쇄(VH-CH1-힌지-CH2-CH3)이다. 1 + 1 Fab-scFv-Fc는 또한 VH-CH1과 상호작용하여 Fab을 형성하는 경쇄를 포함한다. 이러한 구조는 종종 병 오프너와 대략적인 시각적 유사성으로 인해 "병 오프너" 형식으로 지칭된다. 2개의 중쇄 단량체는, 하기에 보다 충분히 기재되는 바와 같이, 이종이량체 항체의 형성을 촉진시키는 불변 영역(예를 들어, Fc 도메인, CH1 도메인 및/또는 힌지 영역)에서의 아미노산 변이체(예를 들어, 상기 논의된 이종이량체화 변이체)의 사용을 통해 함께 결합된다.
이러한 "1+1 Fab-scFv-Fc" 형식에는 몇 가지 뚜렷한 이점이 존재한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 2개의 scFv 구조체에 의존하는 항체 유사체에는 종종 안정성 및 응집 문제가 있으며, 이는 "일반" 중쇄와 경쇄의 쌍을 추가하는 방식으로 본원에 기재된 항체에서 완화될 수 있다. 또한, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 형식과는 반대로, 중쇄와 경쇄의 부정확한 쌍(예를 들어, 중쇄 1과 경쇄 2의 쌍 등)에 대한 문제가 없다.
본원에 개괄된 다수의 실시 형태는 일반적으로, scFv를 포함하고, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하며, scFv 링커(모든 경우는 아니지만, 다수의 경우에 하전됨)를 사용하여 공유적으로 부착된 제1 단량체를 포함하는 1+1 Fab-scFv-Fc 또는 "병 오프너" 형식 항체에 의존하며, 여기서 scFv는 통상적으로 도메인 링커를 통해 제1 Fc 도메인의 N-말단에 공유적으로 부착된다. 도메인 링커는 하전되거나 하전되지 않을 수 있고 외인성이거나 내인성일 수 있다(예를 들어, 천연 힌지 도메인의 전부 또는 일부). 임의의 적합한 링커를 사용하여 scFv를 제1 Fc 도메인의 N-말단에 부착시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 도메인 링커는 도 6의 도메인 링커에서 선택된다. 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 또는 "병 오프너" 형식의 제2 단량체는 중쇄이고, 조성물은 경쇄를 추가로 포함한다.
일반적으로, 다수의 바람직한 구현예에서, scFv는 CD3에 결합하는 도메인이고, Fab은 GPC3 결합 도메인을 형성한다. 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식의 예시적인 항-GPC3 x 항-CD3 이중특이적 항체는 도 15a에 도시되어 있다. 1+1 Fab-scFv-Fc 형식의 예시적인 항-GPC3 x 항-CD3 이중특이적 항체는 도 16 및 도 17에 도시되어 있다.
또한, 본원에 기재된 항체의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L; K370S : S364K/E357Q; T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
특정 구현예에서, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 스캐폴드 형식은 scFv-도메인 링커-CH2-CH3 단량체를 포함하는 제1 단량체, 제1 가변 중쇄 도메인-CH1-힌지-CH2-CH3 단량체를 포함하는 제2 단량체, 및 제1 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제3 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 단량체의 CH2-CH3은 제1 변이형 Fc 도메인이고, 제2 단량체의 CH2-CH3은 제2 변이형 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, scFv는 scFv 가변 중쇄 도메인과, CD3 결합 모이어티를 형성하는 scFv 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 소정의 실시 형태에서, scFv 가변 중쇄 도메인 및 scFv 가변 경쇄 도메인은 scFv 링커(모든 경우는 아니지만 다수의 경우에 하전됨, 예를 들어 도 5 참조)를 사용하여 공유적으로 부착된다. 일부 구현예에서, 제1 가변 중쇄 도메인과 제1 가변 경쇄 도메인은 GPC3 결합 도메인을 형성한다.
일부 구현예에서, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는, a) 본원에 개괄된 바와 같이 CD3에 결합하는, 하전된 scFv 링커(일부 실시 형태에서 도 5의 +H 서열을 갖는 것이 바람직함), 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 scFv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"), 및 c) 가변 경쇄 도메인 경쇄 도메인(VL) 및 불변 경쇄 도메인(CL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식을 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 가변 중쇄 도메인과 가변 경쇄 도메인은 GPC3 결합 모이어티를 구성한다.
본원에 제공된 것들을 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 항체에 임의의 적합한 CD3 ABD가 포함될 수 있다. 이들 실시 형태에 특히 유용한 CD3 결합 도메인 서열은 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31 또는 이들의 변이체뿐만 아니라, 도 10에 도시된 것들 및 범례를 포함하여 본원에 참고로 포함된 WO2014/145806호의 도 14 및 도 15에 도시된 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에 제공된 것들을 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 항체에 임의의 적합한 GPC3 ABD가 포함될 수 있다. 이들 실시 형태에 특히 유용한 GPC3 ABD는 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는 것들로부터 선택된 VH 및 VL 도메인을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
특정 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는, a) 본원에 개괄된 바와 같이 CD3에 결합하는, 하전된 scFv 링커(일부 실시 형태에서 도 5의 +H 서열을 갖는 것이 바람직함), 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 scFv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/ G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"), 및 c) 가변 경쇄 도메인(VL) 및 불변 경쇄 도메인(CL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식을 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 가변 중쇄 도메인과 가변 경쇄 도메인은 GPC3 결합 도메인을 구성한다. 이들 실시 형태에 특히 유용한 CD3 결합 도메인 서열은 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31 또는 이들의 변이체뿐만 아니라, 도 10에 도시된 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 이들 실시 형태에 특히 유용한 GPC3 결합 도메인 서열은, VH/VL 쌍이 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택되는 αGPC3 ABD를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
1 + 1 형식 항체와 함께 사용하기 위한 특히 유용한 GPC3 및 CD3 서열 조합은, 예를 들어 도 16 및 도 17에 개시되어 있다.
도 7a 내지 도 7d는, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 항체에 유용한 일부 예시적인 Fc 도메인 서열을 보여준다. 도 7a 내지 도 7d에 도시된 "단량체 1" 서열은 전형적으로 "Fab-Fc 중쇄"의 Fc 도메인을 나타내고, "단량체 2" 서열은 "scFv-Fc 중쇄"의 Fc 도메인을 나타낸다. 추가로, 도 9는 이러한 형식으로 사용될 수 있는 유용한 CL 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 도시된 임의의 VH 및 VL 서열(GPC3에 관한 것을 포함하여, 도면 및 서열목록에 도시된 모든 VH 및 VL 서열을 포함함)은, 도면 및 서열목록에 제시된 임의의 항-CD3 scFv 서열을 사용하여 도 7a 내지 도 7d의 병 오프너 백본 형식에 "Fab 측"으로 부가될 수 있다.
도 7a로부터의 병 오프너 백본 1(임의로 428L/434S 변이체를 포함함)의 경우, 이들 실시 형태에 특히 유용한 CD 결합 도메인 서열은 도 7에 나타낸 백본의 scFv 측으로서 부착된 CD3 결합 도메인 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 및 항-CD3 H1.31_L1.47을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
2.
mAb-Fv
본원에 기재된 항체에 특히 유용한 하나의 이종이량체 스캐폴드는 mAb-Fv 형식이다(도 44g). 이러한 구현예에서, 상기 형식은 하나의 단량체에 대한 "추가" 가변 중쇄 도메인의 C-말단 부착 및 다른 하나의 단량체에 대한 "추가" 가변 경쇄 도메인의 C-말단 부착의 사용에 의존하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 GPC3에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 CD3에 결합한다.
이러한 구현예에서, 제1 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인과, 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 C-말단에 공유결합으로 부착되어 있다(VH1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-VL2). 제2 단량체는 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인의 제2 가변 중쇄 도메인과, 도메인 링커를 사용하여 제2 Fc 도메인의 C-말단에 공유결합으로 부착된 제3 가변 중쇄 도메인을 포함한다(vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-VH2). 2개의 C-말단으로 부착된 가변 도메인은 CD3에 결합하는 Fv를 구성한다(2가 CD3 결합을 갖는 것이 덜 바람직하기 때문에). 이러한 구현예는 GPC3에 결합하는 2개의 동일한 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인과 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 이용한다. 본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, CD3 결합 도메인 서열이 도 10에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 mAb-Fv 형식을 제공한다. 본원에 기재된 항체는, GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 또는 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 mAb-Fv 형식을 제공한다.
또한, mAb-Fv 형식의 Fc 도메인은 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, mAb-Fv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제2 가변 중쇄 도메인과 함께 CD3에 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 mAb-Fv 형식을 포함한다.
일부 실시 형태에서, mAb-Fv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 및 제1 단량체의 제2 가변 중쇄 도메인과 함께 CD3에 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하는 mAb-Fv 형식을 포함한다.
3.
mAb-scFv
본원에 기재된 항체에 특히 유용한 하나의 이종이량체 스캐폴드는 mAb-scFv 형식이다(도 44h). 이러한 구현예에서, 상기 형식은 단량체 중 하나에 대한 scFv의 C-말단 부착의 사용에 의존하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 GPC3에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 CD3에 결합한다. 따라서, 제1 단량체는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv가 어느 배향으로든 C-말단에 공유결합으로 부착되어 있는 제1 중쇄(가변 중쇄 도메인과 불변 도메인을 포함함)를 포함한다(VH1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-VH2-scFv 링커-VL2 또는 VH1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-VL2-scFv 링커-VH2). 이러한 구현예는 GPC3에 결합하는 2개의 동일한 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인과 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 이용한다. 본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, CD 결합 도메인 서열이 도 10a 내지 도 10f에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체이고, GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 mAb-scFv 형식을 제공한다.
또한, mAb-scFv 형식의 Fc 도메인은 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, mAb-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 mAb-scFv 형식을 포함한다.
일부 실시 형태에서, mAb-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 mAb-scFv 형식을 포함한다.
4.
2+1 Fab2-scFv-Fc 형식
본원에 기재된 항체에 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는, CD3 결합 도메인과 2개의 종양 표적 항원(GPC3) 결합 도메인의 예시적인 조합을 포함하는, 도 15b에 제시된 "2+1 Fab2-scFv-Fc" 형식(이전의 관련 출원에서는 "중앙-scFv 형식"으로도 지칭됨)이다. 이러한 구현예에서, 상기 형식은 삽입된 scFv 도메인의 사용에 의존하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 GPC3에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 CD3에 결합한다. scFv 도메인은 단량체 중 하나의 Fc 도메인과 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되어, 제3 항원 결합 도메인을 제공한다. 기재된 바와 같이, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식을 갖는 GPC3 x CD3 이중특이적 항체는 GPC3을 낮은 수준으로 발현하는 세포 환경에서 방향전환된 T세포 세포독성을 유도하는 데 강력하다. 나아가, 예에 제시된 바와 같이, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식을 갖는 GPC3 x CD3 이중특이적 항체는, 이러한 항체가 사용되는 GPC3 및/또는 CD3 결합 도메인에 따라 매우 다양한 상이한 특성을 나타내기 때문에 면역 반응의 "미세 조정"을 가능하게 한다. 예를 들어, 이러한 항체는 GPC3 발현이 상이한 세포에 대한 선택성, GPC3 발현 세포에 대한 역가, 사이토카인 방출을 이끌어내는 능력, 및 가용성 GPC3에 대한 민감성의 차이를 나타낸다. 이러한 GPC3 항체는, 예를 들어 GPC3 관련 암의 치료에 사용된다.
이 실시 형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인(및 임의의 힌지), 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄와 함께, scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커, 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv를 포함한다. scFv는 선택적 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합으로 부착되어 있다(VH1-CH1-[선택적 링커]-VH2-scFv 링커-VL2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3, 또는scFv에 대해 반대 배향으로, VH1-CH1-[선택적 링커]-VL2-scFv 링커-VH2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3). 선택적 링커는, 예를 들어 도 6에 포함된 도메인 링커를 포함하는 임의의 적합한 펩타이드 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 선택적 링커는 힌지 또는 이의 단편이다. 다른 하나의 단량체는 표준 Fab 측이다(즉, VH1-CH1-힌지-CH2-CH3). 이러한 구현예는 GPC3에 결합하는 2개의 동일한 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인과 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 이용한다. 본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
일 실시 형태에서, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체는 도 10에 도시된 CD3 결합 도메인 서열의 VH 및 VL을 갖는 scFv를 포함한다. 일 실시 형태에서, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체는 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같은 GPC3 결합 도메인의 VH 및 VL을 갖는 2개의 Fab을 포함한다.
예시적인 실시 형태에서, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc GPC3 x CD3 이중특이적 항체의 GPC3 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하며, 이들 실시 형태에 특히 유용한 CD3 결합 도메인 서열은 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31 또는 이들의 변이체뿐만 아니라, 도 10에 도시된 것들 및 범례를 포함하여 본원에 참고로 포함된 WO2014/145806호의 도 14 및 도 15에 도시된 것들을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
임의의 적합한 GPC3 ABD는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체에 포함될 수 있으며, 본원에 제공된 것들을 포함하였다. 이들 실시 형태에 특히 유용한 GPC3 ABD는 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 도메인을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
특정 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 Fc 도메인은 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체는 비대칭 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체(Fab-scFv-Fc 측); b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체(Fab-Fc 측); 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식을 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시 형태에서, αGPC3 VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체는 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체(Fab-scFv-Fc 측); b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체(Fab-Fc 측); 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식을 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 실시 형태에서, αGPC3 VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 실시 형태에 특히 유용한 CD3 결합 도메인 서열은 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31 또는 이들의 변이체를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
도 8a 내지 도 8c는, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식에 유용한 일부 예시적인 Fc 도메인 서열을 나타낸다. 도 8a 내지 도 8c에 도시된 "단량체 1" 서열은 전형적으로 "Fab-Fc 중쇄"의 Fc 도메인을 나타내고, "단량체 2" 서열은 "Fab-scFv-Fc 중쇄"의 Fc 도메인을 나타낸다. 추가로, 도 9는 이러한 형식으로 사용될 수 있는 유용한 CL 서열을 제공한다.
예시적인 항-GPC3 x 항-CD3 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식 항체가 도 18 내지 도 21에 도시되어 있다.
5.
중앙-Fv
본원에 기재된 항체에 특히 유용한 하나의 이종이량체 스캐폴드는 중앙-Fv 형식이다(도 44i). 이러한 구현예에서, 상기 형식은 삽입된 Fv 도메인(즉, 중앙 Fv 도메인)의 사용에 의존하여 "추가" 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 GPC3에 결합하고, "추가" 중앙 Fv 도메인은 CD3에 결합한다. "추가" 중앙 Fv 도메인은 단량체의 Fc 도메인과 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되어, 제3 항원 결합 도메인(즉, "추가" 중앙 Fv 도메인)을 제공하며, 여기서 각각의 단량체는 "추가" 중앙 Fv 도메인의 구성요소를 함유한다(즉, 하나의 단량체는 가변 중쇄 도메인을 포함하고, 다른 하나는 "추가" 중앙 Fv 도메인의 가변 경쇄 도메인을 포함함).
이 실시 형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄 및 부가적인 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합으로 부착되어 있다(VH1-CH1-[선택적 링커]-VL2-힌지-CH2-CH3). 다른 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄와, 추가의 가변 중쇄 도메인을 포함한다(VH1-CH1-[선택적 링커]-VH2-힌지-CH2-CH3). 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유적으로 부착된다.
이러한 구현예는 각각 GPC3에 결합하는 2개의 동일한 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인과 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 이용한다. 본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, CD3 결합 도메인 서열이 도 10에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체이고, GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 중앙-Fv 형식을 제공한다.
6.
1-아암 중앙-scFv
본원에 기재된 항체에 특히 유용한 하나의 이종이량체 스캐폴드는 1-아암 중앙-scFv 형식이다(도 44c). 이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 Fc 도메인만 포함하지만, 다른 하나의 단량체는 Fab 도메인(제1 항원 결합 도메인), scFv 도메인(제2 항원 결합 도메인) 및 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 scFv 도메인은 Fc 도메인과 Fc 도메인 사이에 삽입된다. 이러한 형식에서, Fab 부분은 하나의 수용체 표적에 결합하고, scFv는 또 다른 수용체 표적에 결합한다. 이러한 형식에서, Fab 부분 중 어느 하나는 GPC3에 결합하고, scFv는 CD3에 결합하거나, 그 반대이다.
이 실시 형태에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인, 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄와, scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커, 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv를 포함한다. scFv는, 어느 배향으로든, 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합으로 부착되어 있다: VH1-CH1-[선택적 도메인 링커]-VH2-scFv 링커-VL2-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3 또는 VH1-CH1-[선택적 도메인 링커]-VL2-scFv 링커-VH2-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3. 제2 단량체는 Fc 도메인(CH2-CH3)을 포함한다. 이러한 구현예는 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인과 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 추가로 이용한다.
본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, CD3 결합 도메인 서열이 도 10에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체이고, GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 중앙-Fv 형식을 제공한다.
또한, 1-아암 중앙-scFv 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 1-아암 중앙-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 중앙-scFv 형식의 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 1-아암 중앙-scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 중앙-scFv 형식의 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/ E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 FcRn 변이체 M428L/N434S를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
7.
1-아암 scFv-mAb
본원에 기재된 항체에 특히 유용한 하나의 이종이량체 스캐폴드는 1-아암 scFv-mAb 형식이다(도 44d). 이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 Fc 도메인만 포함하지만, 다른 하나의 단량체는 일반적으로 링커의 사용을 통해, 중쇄의 N-말단에 부착된 scFv 도메인을 사용한다: VH-scFv 링커-VL-[선택적 도메인 링커]-CH1-힌지-CH2-CH3 또는 (반대 배향으로) VL-scFv 링커-VH-[선택적 도메인 링커]-CH1-힌지-CH2-CH3. 이러한 형식에서, Fab 부분은 각각 GPC3에 결합하고, scFv는 CD3에 결합한다. 이 실시 형태는 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 추가로 이용한다. 본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, CD3 결합 도메인 서열이 도 10에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체이고, 여기서 GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 1-아암 scFv-mAb 형식을 제공한다.
또한, 1-아암 scFv-mAb 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 1-아암 scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 scFv-mAb 형식의 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 1-아암 scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 1-아암 scFv-mAb 형식의 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/ E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 FcRn 변이체 M428L/N434S를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함한다.
8.
scFv-mAb
본원에 기재된 항체에 특히 유용한 하나의 이종이량체 스캐폴드는 mAb-scFv 형식이다(도 44e). 이러한 구현예에서, 상기 형식은 단량체 중 하나에 대한 scFv의 N-말단 부착의 사용에 의존하여 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 GPC3에 결합하고, "추가" scFv 도메인은 CD3에 결합한다.
이러한 구현예에서, 제1 단량체는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv가 어느 배향으로든 N-말단에 공유결합으로 부착되어 있는, 제1 중쇄(가변 중쇄 도메인과 불변 도메인을 포함함)를 포함한다((VH1-scFv 링커-VL1-[선택적 도메인 링커]- VH2-CH1-힌지-CH2-CH3) 또는 (scFv가 반대 배향인 경우) (VL1-scFv 링커-VH1-[선택적 도메인 링커]-VH2-CH1-힌지-CH2-CH3)). 이러한 구현예는 GPC3에 결합하는 2개의 동일한 Fab을 형성하기 위해 중쇄와 회합하는, 가변 경쇄 도메인과 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 추가로 이용한다. 본원의 실시 형태 중 다수에 있어서, 본원에 기재되고 원하는 바와 같이, 이들 작제물은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 부가적인 Fc 변이체 등을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, CD3 결합 도메인 서열이 도 10에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체이고, 여기서 GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 scFv-mAb 형식을 제공한다.
또한, scFv-mAb 형식의 Fc 도메인은 일반적으로 비대칭 변이체(예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 치환의 세트, 특히 유용한 비대칭 변이체는 S364K/E357Q : L368D/K370S; L368D/K370S : S364K; L368E/K370S : S364K; T411T/E360E/Q362E : D401K; L368D/K370S : S364K/E357L, K370S : S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V : T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C로 이루어진 군으로부터 선택됨), 임의로 절제 변이체(도 3에 나타낸 것들을 포함함), 임의로 하전된 scFv 링커(도 5에 나타낸 것들을 포함함)를 포함하며, 중쇄는 pI 변이체(도 2에 나타낸 것들을 포함함)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 scFv-mAb 형식을 포함한다.
일부 실시 형태에서, scFv-mAb 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는 a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인, 및 CD3에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/ Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 공통 경쇄의 가변 경쇄 도메인과 함께 본원에 개괄된 바와 같이 GPC3에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하는 scFv-mAb 형식을 포함한다.
9.
이중 scFv 형식
본원에 기재된 항체는 또한 당업계에 알려진 바와 같은 이중 scFv 형식을 제공한다(도 44b). 이러한 구현예에서, GPC3 x CD3 이종이량체성 이중특이적 항체는 2개의 scFv-Fc 단량체로 구성되어 있다(둘 모두 (VH-scFv 링커-VL-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3) 형식 또는 (VL-scFv 링커-VH-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3) 형식으로, 또는 하나의 단량체는 하나의 배향으로, 다른 하나의 단량체는 다른 하나의 배향으로).
본원에 기재된 항체는, CD3 결합 도메인 서열이 도 10에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체이고, 여기서 GPC3 결합 도메인 서열이 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같거나 이들의 변이체인 이중 scFv 형식을 제공한다.
일부 실시 형태에서, 이중 scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태는, a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 CD3 또는 GPC3에 결합하는 제1 scFv를 포함하는 제1 단량체; 및 b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체
E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 CD3 또는 GPC3에 결합하는 제2 scFv를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이중 scFv 형식을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중 scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 및 FcRn 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이중 scFv 형식은 비대칭 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는, a) 비대칭 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 CD3 또는 GPC3에 결합하는 제1 scFv를 포함하는 제1 단량체; 및 b) 비대칭 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S, 및 CD3 또는 GPC3에 결합하는 제2 scFv를 포함하는 제2 단량체를 포함하는 이중 scFv 형식을 포함한다.
10.
비-이종이량체 이중특이적 항체
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 제공된 항-GPC3 x 항-CD3 항체는 또한 비-이종이량체 이중특이적 형식에 포함될 수 있다(도 44j 참조). 이 형식에서, 항-GPC3 x 항-CD3은 1) VH1-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 제1 단량체; 2) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하는 제2 단량체; 3) VL1-CL을 포함하는 제1 경쇄; 및 4) VL2-CL을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 그러한 실시 형태에서, VH1 및 VL1은 제1 항원 결합 도메인을 형성하고 VH2 및 VL2는 제2 항원 결합 도메인을 형성한다. 제1 또는 제2 항원 결합 도메인 중 하나는 GPC3에 결합하고 다른 하나의 항원 결합 도메인은 CD3에 결합한다.
임의의 적합한 GPC3 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인은 본원에 제공된 GPC3 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인 및 관련 VH 및 VL 중 임의의 것 또는 이들의 변이체를 포함하는 비-이종이량체 이중특이적 항체 형식으로 항-GPC3 x 항-CD3 항체에 포함될 수 있다(예를 들어, 도 10, 도 12, 및 도 13 참조).
11.
트라이던트 형식
일부 구현예에서, 본원에 기재된 이중특이적 항체는 일반적으로 WO2015/184203(이는 그 전문이, 특히 "이종이량체 촉진 도메인(Heterodimer-Promoting Domain)" 또는 "HPD"의 도면, 범례, 정의 및 서열("K-coil" 및 "E-coil" 서열 포함)이 본원에 명백하게 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같은 "트라이던트" 형식으로 존재한다. 트라이던트는 구조의 구성요소로서 이종이량체 구조를 형성하기 위해 회합하는 2개의 상이한 HPD의 사용에 의존한다. 이러한 구현예에서, 트라이던트 형식은 "전형적인" 중쇄 및 경쇄(예를 들어, VH1-CH1-힌지-CH2-CH3 및 VL1-CL), 제1 "디아바디형 결합 도메인" 또는 "DART®", VH2-(링커)-VL3-HPD1을 포함하는 제3 사슬, 및 제2 DART®, VH3-(링커)-(링커)-VL2-HPD2를 포함하는 제4 사슬을 포함한다. VH1과 VL1은 제1 ABD를 형성하고, VH2와 VL2는 제2 ABD를 형성하고, VH3과 VL3은 제3 ABD를 형성한다. 일부 경우에, 도 1k에 제시된 바와 같이, 제2 ABD와 제3 ABD는 동일한 항원에 결합하고(이러한 경우, 일반적으로 GPC3에, 예를 들어 2가로 결합함), 제1 ABD는 CD3에 1가로 결합한다.
임의의 적합한 GPC3 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인은 본원에 제공된 GPC3 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인 및 관련 VH 및 VL 중 임의의 것 또는 이들의 변이체를 포함하는 트라이던트 이중특이적 항체 형식으로 항-GPC3 x 항-CD3 항체에 포함될 수 있다(예를 들어, 도 10, 도 12, 및 도 13 참조).
12.
단일특이적 단클론 항체
당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 개괄된 신규한 Fv 서열은 또한 단일특이적 항체(예를 들어, "전형적인 단클론 항체") 또는 비이종이량체성 이중특이적 형식에 모두 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 도면으로부터의 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 서열을 포함하고, 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역을 갖고, 일부 구현예에서는 특히 IgG1, IgG2 및 IgG4(S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 불변 영역 포함)가 사용되는 단클론(단일특이적) 항체를 제공한다. 즉, "H_L" 지정을 갖는 임의의 서열은 인간 IgG1 항체의 불변 영역에 연결될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 단일특이적 항체는 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는 GPC3 단일특이적 항체이다.
특정 실시 형태에서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
H.
본 발명의 특정 실시 형태
본 발명은 구체적으로 CD3 및 GPC3에 결합하는 1+1 및 2+1 형식을 제공한다. 소정의 실시 형태는 XENP38086(XENP34920에 대한 Xtend 유사체, Xtend 유사체가 각각의 Fc 도메인 상에 428L/434S를 포함한다는 점을 제외하고는 이들이 동일한 서열을 갖는다는 것을 의미함), XENP38087(XENP36935에 대한 Xtend 유사체, 상동), 및 XENP38232(XENP37625에 대한 Xtend 유사체, 상동)를 포함한다.
1.
1 + 1 형식
특정 1+1 형식 실시 형태에서, αGPC3 ABD는 Fab이고 VH/VL 쌍 [GPC3]H1.1_L1.16을 가지며 αCD3 ABD는 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv이다.
특정 1+1 형식 실시 형태에서, αGPC3 ABD는 Fab이고 VH/VL 쌍 [GPC3]H1.1_L1.69를 가지며, αCD3 ABD는 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv이다.
다수의 응용에 유용한 특정 실시 형태는, XENP21971, XENP34364, XENP34365, XENP34367, XENP34368, XENP35843, XENP36140, XENP36931, XENP36932 XENP36933, XENP36934, XENP36935, XENP36936, XENP36937, XENP36938, XENP36939, XENP36941, 및 XENP38087을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 도 16 및 도 17에 열거된 것들을 포함한다.
2.
2 + 1 형식
특정 2+1 형식 실시 형태에서, αGPC3 ABD는 Fab이고 VH/VL 쌍 [GPC3]H1.1_L1.16을 가지며 αCD3 ABD는 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv이다.
특정 2+1 형식 실시 형태에서, αGPC3 ABD는 Fab이고 VH/VL 쌍 [GPC3]H1.1_L1.69를 가지며, αCD3 ABD는 항-CD3 H1.30_L1.47, 항-CD3 H1.32_L1.47, 항-CD3 H1.89_L1.47, 항-CD3 H1.90_L1.47, 항-CD3 H1.33_L1.47, 항-CD3 H1.31_L1.47, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.30, 항-CD3 L1.47_H1.32, 항-CD3 L1.47_H1.89, 항-CD3 L1.47_H1.90, 항-CD3 L1.47_H1.33, 및 항-CD3 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv이다.
다수의 응용에 유용한 특정 실시 형태는, XENP33744, XENP33745, XENP27259, XENP33746, XENP34919, XENP34920, XENP34921, XENP34922, XENP34923, XENP35840, XENP35840, XENP37246, XENP37247, XENP38086, XENP33747, XENP35841, XENP37624, XENP37625, XENP37626, XENP38232, XENP37430, XENP37433, 및 XENP33748을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 도 18, 도 19, 도 20, 및 도 21에 열거된 것들을 포함한다.
II.
본 발명의 핵산
본 개시내용은, 비제한적으로, 항-GPC3 x 항-CD3 이중특이적 항체 및 GPC3 단일특이적 항체를 포함하는, 본원에 제공된 항-GPC3 항체를 인코딩하는 핵산 조성물을 추가로 제공한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 핵산 조성물은 이종이량체 단백질의 형식 및 스캐폴드에 따라 달라질 것이다. 따라서, 예를 들어, 해당 형식이 1+1 Fab-scFv-Fc 형식과 같이 3개의 아미노산 서열(예를 들어, Fc 도메인과 scFv를 포함하는 제1 아미노산 단량체, 중쇄를 포함하는 제2 아미노산 단량체 및 경쇄)을 필요로 하는 경우, 3개의 핵산 서열은 발현을 위해 하나 이상의 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 유사하게, 일부 형식(예를 들어, 도 44에 개시된 바와 같은 이중 scFv 형식)은 2개의 핵산만을 필요로 하며; 다시 말하면, 이들은 1 또는 2개의 발현 벡터에 도입될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 본원에 기재된 항체의 구성요소를 인코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이, 및 본원에 기재된 이종이량체 항체를 생산하는 데 사용되는 숙주세포에 따라 발현 벡터에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 임의의 수의 조절 요소(프로모터, 복제 기점, 선택가능한 마커, 리보솜 결합 부위, 유도제 등)에 작동가능하게 연결된다. 발현 벡터는 염색체외 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다.
이어서, 본원에 기재된 항체의 핵산 및/또는 발현 벡터는 포유류 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및/또는 진균 세포를 포함하는 당업계에 널리 공지된 바와 같은 임의의 수의 상이한 유형의 숙주세포로 형질전환되며, 여기서 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)가 다수의 구현예에서 사용된다.
일부 실시 형태에서, 형식에 따라 적용가능한 바와 같이, 각각의 단량체를 인코딩하는 핵산 및 경쇄를 인코딩하는 임의의 핵산은, 일반적으로 상이하거나 동일한 프로모터 제어 하에 단일 발현 벡터 내에 각각 함유된다. 본원에 기재된 항체의 특정 용도의 구현예에서, 이들 2개 또는 3개의 핵산은 각각 상이한 발현 벡터에 함유되어 있다. 본원 및 본원에 참고로 포함된 제62/025,931호에 나타낸 바와 같이, 상이한 벡터 비를 사용하여 이종이량체 형성을 유도할 수 있다. 즉, 의외로, 단백질은 제1 단량체:제2 단량체:경쇄(이종이량체 항체를 포함하는 3개의 폴리펩티드를 갖는 본원의 실시 형태 중 다수의 경우)를 1:1:2의 비로 포함하지만, 이들이 최상의 결과를 제공하는 비는 아니다.
본원에 기재된 이종이량체 항체는 당업계에 널리 공지된 바와 같이 발현 벡터(들)을 포함하는 숙주세포를 배양하는 방식으로 제조된다. 생산되면, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 통상적인 항체 정제 단계가 수행된다. 본원에 논의된 바와 같이, 2개의 단량체의 pI를 0.5 이상만큼 상이하게 하는 것은, 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동, 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 가능하게 할 수 있다. 즉, pI 치환의 포함은 각각의 단량체가 상이한 pI를 갖고 이종이량체가 또한 별개의 pI를 갖도록 각각의 단량체의 등전점(pI)을 변경시키며, 따라서 "1+1 Fab-scFv-Fc " 및 "2+1" 이종이량체의 등전위 정제(예를 들어 음이온 교환 컬럼, 양이온 교환 컬럼)를 용이하게 한다. 이러한 치환은 또한 정제-후 임의의 오염성 이중 scFv-Fc 및 mAb 동종이량체의 결정 및 모니터링에 도움을 준다(예를 들어, IEF 겔, cIEF, 및 분석용 IEX 컬럼).
III.
이종이량체 이중특이적 항체의 생물학적 및 생화학적 기능
일반적으로, 본원에 기재된 이중특이적 GPC3 x CD3 항체가 암을 앓고 있는 환자에게 투여되고, 본원에 기재되는 바와 같은 다수의 방법으로 효능이 평가된다. 따라서, 암 부하, 종양의 크기, 전이의 존재 또는 정도의 평가 등과 같은 효능의 표준 검정이 실행될 수 있으나, 면역-종양학 치료는 또한 면역 상태 평가를 기반으로 하여 평가될 수 있다. 이는 시험관내 및 생체내 검정 둘 모두를 포함하는 다수의 방식으로 실행될 수 있다.
IV.
치료
일단 제조되면, 본원에 기재된 항체의 조성물은 간암과 같은 암을 포함하는 다수의 응용에 유용하므로, 본원에 기재된 항체의 이종이량체 조성물은 그러한 GPC3 양성 암의 치료에 유용하다.
V.
생체내 투여용 항체 조성물
본원에 기재된 항체에 따라 사용되는 항체의 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]])와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 저장을 위해 제조된다.
VI.
투여 방식
본원에 기재된 항체 및 화학요법제는 볼루스로서의 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입과 같은 공지된 방법에 따라 대상에게 투여된다.
VII.
치료 방식
본원에 기재된 방법에서, 요법은 질환 또는 병태에 대하여 긍정적인 치료 반응을 제공하기 위해 사용된다. "긍정적인 치료 반응"은 질환 또는 병태의 개선, 및/또는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선을 의미한다. 예를 들어, 양성 치료 반응은 질환에서 하기 개선 중 하나 이상을 지칭할 것이다: (1) 신생 세포의 수의 감소; (2) 신생 세포 사멸의 증가; (3) 신생 세포 생존의 억제; (5) 종양 성장의 억제(즉, 어느 정도까지 지연시키며, 바람직하게는 중지시킴); (6) 증가된 환자 생존율; 및 (7) 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상으로부터의 일부 완화.
임의의 주어진 질환 또는 병태에서 긍정적인 치료 반응은 해당 질환 또는 병태에 대하여 특정한 표준화된 반응 기준에 따라 결정될 수 있다. 종양 반응은 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, x-선 촬영 영상화, 전산화 단층촬영(CT) 스캔, 뼈 스캔 영상화, 내시경검사, 및 골수 흡인(BMA) 및 순환하는 종양 세포의 계수를 포함하는 종양 생검 샘플링과 같은 스크리닝 기법을 사용하여, 종양 형태(즉, 전체적인 종양 부담, 종양 크기 등)의 변화로 평가될 수 있다.
이러한 긍정적인 치료 반응에 더하여, 요법을 받는 대상은 질환과 관련된 증상의 유익한 개선 효과를 경험할 수 있다.
본 개시내용에 따른 치료는 사용되는 약제의 "치료적 유효량"을 포함한다. "치료적 유효량"은, 필요한 투여량으로 필요한 기간 동안 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 효과적인 양을 지칭한다.
치료적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 이끌어내는 약제의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 치료적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이다.
종양 치료를 위한 "치료적 유효량"은 또한 질환의 진행을 안정화시키는 능력으로 측정될 수 있다. 암을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다.
대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 숙련된 의사에게 알려진 시험관내 검정에 의해 세포 성장을 억제하거나 세포자멸사를 유도하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다. 치료적 유효량의 치료용 화합물은 종양 크기를 감소시키거나, 그 밖에 대상에서의 증상을 개선할 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상의 증상의 중증도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 이러한 요인을 기반으로 이러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
투여 방식은 최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있으며, 몇몇 분할된 용량이 시간경과에 따라 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본 개시내용의 단위 투여 형태에 대한 사양은 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체의 감수성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 컴파운딩하는 기술에 내재된 한계에 의해 결정되고, 이에 직접적으로 의존한다.
본원에 기재된 이중특이적 항체에 대한 효율적인 투여량 및 투여 방식은 치료하고자 하는 질환 또는 병태에 따라 달라지며, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기재된 항체에 사용되는 이중특이적 항체의 치료적 유효량의 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다.
모든 인용된 참고문헌은 그 전문이 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용의 특정 구현예가 예시의 목적으로 상기 기재되었지만, 당업자는 첨부된 청구범위에 기재된 바에서 벗어나지 않는 한 세부사항에 대한 다수의 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예
A.
실시예 1: αGPC3 x αCD3 이중특이적 항체의 조작
αGPC3 x αCD3 이중특이적 항체(bsAb)에 대한 다수의 형식이 고안되었으며, 이에 대한 예시적인 형식은 하기 및 도 15에 개괄되어 있다.
하나의 이러한 형식은 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식으로, 이는 제1 이종이량체 Fc 도메인에 공유결합으로 부착된 단일 사슬 Fv("scFv"), 상보적인 제2 이종이량체 Fc 도메인에 공유결합으로 부착된 중쇄 가변 영역(VH), 및 가변 중쇄 도메인과 함께 Fab 도메인을 형성하도록 별도로 트랜스펙션된 경쇄(LC)를 포함한다.
또 다른 형식은 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식으로, 이는 제1 이종이량체 Fc 도메인에 공유결합으로 부착된 scFv에 공유결합으로 부착된 CH1 도메인에 공유결합으로 부착된 VH 도메인(VH-CH1-scFv-Fc), 상보적인 제2 이종이량체 Fc 도메인에 공유결합으로 부착된 VH 도메인, 및 VH 도메인과 함께 Fab 도메인을 형성하도록 별도로 트랜스펙션된 LC를 포함한다.
표준 유전자 합성에 이어서, 등온 클로닝(깁슨 어셈블리(Gibson assembly)) 또는 융합 파트너(예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같은 도메인 링커 및/또는 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같은 백본)를 함유하는 pTT5 발현 벡터 내로의 서브클로닝에 의해 αGPC3 x αCD3 bsAb의 DNA 인코딩 사슬을 생성하였다. 발현을 위해 DNA를 HEK293E 세포에 트랜스펙션시켰다. 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 예시적인 αGPC3 x αCD3 bsAb에 대한 서열은 도 16 내지 도 21에 각각 도시되어 있다.
B.
실시예 2: GPC3 결합 도메인의 조작
2A: 뮤린 GPC3 결합 도메인의 인간화
세포막에 근접하게 위치한 GPC3 단백질의 GPC3(아미노산 524 내지 563)의 C 말단 펩티드에 결합하는 뮤린 클론을 스트링 함량 최적화를 사용하여 인간화하였다(예를 들어, 2010년 2월 2일자로 등록된 미국 특허 제7,657,380호 참조). 인간화 변이체를 위한 서열은 본원에서 GPC3-A로 지칭되며, 도 12에 도시되어 있다. 변이체는 분해(예를 들어, 아스파르트산 이성질화 및 탈아미드화) 취약성을 감소시켰고, GPC3 결합 친화도, 및/또는 높은 GPC3 발현 세포주에 대한 선택성을 조절하였다. 이러한 변이체의 예시적인 서열은 도 13에 도시되어 있다.
2B: GPC3 결합 친화도의 조정
인간화 후에, GPC3 결합 친화도의 단계를 생성하기 위한 목적으로 가변 경쇄 도메인 내의 단일 점 돌연변이로 GPC3 결합 아암을 조작하였으며, 이에 대한 예시적인 서열은 도 13에 도시되어 있다. 73개의 가변 경쇄 도메인 변이체가 조작되었고 GPC3-A H1.1과 쌍을 이루었다(GPC3-A H1.1 변이체의 설명에 대해서는 실시예 3C 참조). GPC3-A 변이체를 1 + 1 Fab-scFv-Fc bsAb 형식으로 조작하고, GPC3 항원에 대한 결합을 생물층 간섭계(BLI)-기반 방법인 Octet를 사용하여 측정하였다. Octet에 대한 실험 단계는 일반적으로 하기를 포함한다: 고정화(바이오센서에 대한 리간드의 포획); 회합(분석물을 함유하는 웰에 리간드-코팅된 바이오센서를 침지시킴); 및 해리(완충액을 함유하는 웰에 바이오센서를 복귀시킴). 임상 개발의 용이성을 위해(예를 들어, 모델 동물에서 치료제를 조사함으로써), 결합 도메인이 사이노몰거스 항원에 대해 교차-반응성인 것이 유용하며; 따라서, 인간 및 사이노몰거스 GPC3 항원 둘 모두에 대한 결합을 조사하였다. His-태깅된 인간 및 사이노몰거스 GPC3을 HIS1K 센서 상에 포획하고, 이어서 다중 농도의 이중특이적 항체에 침지시켰다. 생성되는 해리 상수(KD)는 도 23에 도시되어 있다. 고 친화도 변이체 H1.1_L1.6(4 nM)으로부터, 중간 친화도 변이체 H1.1_L1.16 및 H1.1_L1.29(각각 100 nM 및 70 nM)까지, 저 친화도 변이체 H1.1_L1.31(400 nM)까지 넓은 범위의 KD 값을 얻었다.
그 다음에, 세포 표면 GPC3에 대한 변이체의 결합을 조사하였다. 예시적인 친화도 변이체 H1.1_L1.29, H1.1_L1.16, 및 H1.1_L1.31을 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식으로 조작하였다. BsAbs XENP36941(L1.29, 70 nM GPC3 친화도), XENP35843(L1.16, 100 nM GPC3 친화도), 및 XENP36140(L1.31, 400 nM GPC3 친화도)을 표시된 농도에서 1 시간 동안 4 oC에서 GPC3고 HepG2 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 1 시간 동안 4 oC에서 2차 항체(전형적으로 항-인간 Fc AlexaFlour647)로 염색하였다. 2회 더 세척한 후에, 세포를 유세포 분석법으로 분석하였다. 도 24에 나타낸 생성된 결합 곡선은 세포 결합이 GPC3 친화도와 상관관계가 있음을 나타내며, XENP36941(70 nM 가변 경쇄 도메인)이 가장 강한 결합을 나타내고, XENP36140(400 nM 가변 경쇄 도메인)이 가장 약한 결합을 나타낸다.
2C: 분해 취약성 잔기를 제거하기 위한 조작
인간화 GPC3-A 항체에 대한 서열을 분해 취약성 잔기에 대해 조사하였다. GPC3-A H1 중쇄 CDR2는 D52/P52a(Kabat 넘버링)를 아스파르트산 이성질화 모티프로서 포함하였다. 추가로, L1 가변 경쇄 도메인은 탈아미드화 모티프로서 N28/G29(Kabat 넘버링)를 함유하였다. 따라서, 이러한 잔기에서의 돌연변이로 라이브러리를 제조하여, GPC3 결합에 영향을 미치지 않으면서 취약성이 제거될 수 있는지 여부를 조사하였으며, 이에 대한 결합 데이터는 도 25에 도시되어 있다. 가변 중쇄 변이체 H1.1에서의 D52E 돌연변이는 유사한 GPC3 결합을 유지하면서(D52N은 결합을 감소시킨 반면에, D52Q 및 D52S는 허용가능하였음) 아스파르트산 이성질화 취약성을 제거하였다(H1에 비해). 가변 경쇄 변이체 L1.6에서의 G29T는 유사한 GPC3 결합을 유지하면서(N28Q, N28Y, N28S, 및 N28H는 결합을 극단적으로 감소시킨 반면에 G29A 및 G29K는 허용가능하였음) 탈아미드화 취약성을 제거하였다(L1에 비해). 친화도 변이체로부터 탈아미드화 취약성을 제거하기 위해서는 상이한 돌연변이가 필요할 수 있음에 유의해야 하며, 예시적인 변이체에 대한 결합 데이터는 도 26에 도시된 바와 같다. L1.29 변이체로부터 탈아미드화 취약성을 제거하기 위해 G29A 돌연변이를 L1.69 변이체에 이용하였고(N28Y 돌연변이는 감소된 결합을 유발한 반면에, G29K는 또한 허용가능하였음); L1.31 변이체로부터 탈아미드화 취약성을 제거하기 위해 G29K 돌연변이를 L1.73 변이체에 이용하였다(N28Y 및 G29A 돌연변이는 낮거나 비정상적인 반응을 유발하였음). 본원에 기재된 변이체에 대한 서열은 도 13에 도시되어 있다.
C.
실시예 3: αGPC3 x αCD3 bsAb의 조정 및 최적화
αGPC3 x αCD3 bsAb를 다양한 친화도-조정된 GPC3 및 CD3 결합 도메인 및 상이한 GPC3 결합 원자가로 조작하고, 실시예 1에 일반적으로 기재된 바와 같이 생성하여 방향전환 T 세포 세포독성(RTCC), 선택성, 및 잠재적인 치료 지수를 최적화하였다.
CD3+ 이펙터 T 세포를 방향전환시켜 GPC3-발현 세포주를 파괴하는 αGPC3 x αCD3 이중특이적 항체(bsAb)의 잠재력을 조사하기 위해 RTCC 검정을 사용하였다. GPC3고 표적 세포로서의 HepG2 세포(간 간세포 암종 세포주), GPC3중간 표적 세포로서의 Huh7 세포(또한 간 간세포 암종 세포주), 및/또는 GPC3저 표적 세포(종양 환경 외부의 세포에 대한 대용물)로서의 HEK293 세포를 사용하여 RTCC 검정을 일반적으로 수행하였다. 유세포 분석법 기반, 및 락테이트 데하이드로게나아제(LDH) 기반의 2가지 방법의 방향전환 T 세포 세포독성(RTCC) 검정을 사용하였다. 유세포 분석법 기반의 RTCC 검정의 경우, 표적 세포를 인간 PBMC 및 시험 물품과 함께 표시된 이펙터 대 표적 세포 비로 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 실온에서 15분 동안 Aqua Zombie 염색으로 염색하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 세포 표면 마커에 대한 항체로 염색하고, 유세포분석으로 분석하였다. CSFE+ 표적세포에서 Zombie Aqua 염색을 사용하여 RTCC의 유도를 측정하고; 림프구에서의 CD107a, CD25 및 CD69 발현으로 T세포의 활성화 및 탈과립화를 측정하였다. LDH-기반 RTCC 검정의 경우, 세포 및 표시된 농도의 시험 물품을 37 oC에서 48 또는 72시간 동안 평면 바닥 96 웰 플레이트에서 200 ul의 총 부피로 인큐베이션할 것이다. 이어서, Promega CytoTox-one 키트를 그의 프로토콜에 따라 사용하여 세포를 용해시키고 기질과 혼합하였다. Wallac 기계를 사용하여 플레이트를 판독하였다. V-PLEX 전염증성 패널 1 인간 키트를 사용하여 사이토카인을 측정하였다. 또한, 몇 가지 조작 접근법이 동시에 탐색되었기 때문에, 데이터 세트 중 일부는 동일한 실험에서 얻은 것이라는 점에 유의해야 한다.
본 섹션 전체에 걸쳐, WO 2016/047722호에 개시된 바와 같은 αGPC3 x αCD3 bsAb를 기반으로 하는 비교기 bsAb XENP31308 및 도 22에 도시된 서열을 또한 본 발명의 신규한 bsAb를 벤치마킹하기 위해 이용하였다. 상기 일반적으로 기재된 바와 같이 RTCC 검정에서 XENP31308을 특성화하였다. 도 27에 도시된 데이터는 10:1의 이펙터:표적 비에서 XENP31308이 높은 GPC3 발현 세포주 및 낮은 GPC3 발현 세포주 둘 모두 상에서 강력한 RTCC 및 사이토카인 분비를 유도하였음을 나타낸다. 도 28에 결과가 도시되어 있는, 1:1 이펙터:표적 비를 이용하는 다른 실험에서,XENP31308은 낮은 GPC3 발현 세포주 HEK293의 존재 하에 RTCC를 거의 유도하지 않지만 사이토카인 분비는 여전히 강력하게 유도한다. GPC3저 세포주는 건강한 조직에 대한 대용물이므로, 낮은 GPC3 발현 세포주의 존재 하에 매우 적거나 없는 사멸화 및 사이토카인 방출을 유지하는 것이 중요한데, 이는 그것이 임상 환경에서 더 적은 독성 및 사이토카인 폭풍으로 이어질 수 있기 때문이다. GPC3저 세포주의 강력한 사멸화는 생체내에서 표적-내 조직-외 사멸화의 가능성을 표시할 것이며, 이는 바람직하지 않은 독성을 야기할 수 있다.
3A: 상이한 GPC3 에피토프에 결합하는 GPC3 결합 도메인의 효과의 조사
GPC3은 막에 결합되며, 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛으로 이루어진다. 알파 서브유닛(잔기 25 내지 358)은 가용성 GPC3으로서 절단되고 방출될 수 있는 반면에, 베타 서브유닛은 세포막에 부착된 상태로 유지된다. 실시예 2A에 기재된 바와 같이, GPC3 결합 도메인 GPC3-A는 베타 서브유닛의 일부인 GPC3의 C-말단 잔기 524 내지 563에 결합한다. 부가적인 GPC3 결합 도메인은 베타 서브유닛 또는 알파 서브유닛의 N-말단 잔기 359 내지 524에 결합하는 것으로 기재되어 있다. 상이한 GPC3 에피토프에 대한 결합의 효과를 조사하기 위해, CD3 고를 갖는 1 + 1 형식 또는 CD3 고-Int#1 scFv를 갖는 2 + 1 형식의 αGPC3 x αCD3 bsAb를 상이한 GPC3 에피토프에 결합하는 상이한 GPC3 결합 도메인으로 조작하였다. bsAb 및 HepG2 세포를 사용하여 RTCC 검정을 수행하였다(10:1 이펙터:표적 비). 도 29의 데이터(IFNγ 방출의 유도에 의해 표시되는 바와 같은 bsAb의 활성을 도시함)는 부가적인 에피토프 각각이 T 세포 활성을 유도함에 있어서 GPC3-A보다 덜 강력했음을 나타낸다. 차이의 일부는 (클론들 사이의) 결합 친화도 또는 (형식들 사이의) 결합력의 차이로 인한 것일 수 있지만, GPC3 에피토프가 감소된 효력에 기여할 가능성이 있다.
3B: GPC3 결합 결합력의 효과의 조사
GPC3에 대한 2가 결합을 갖는 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식의 bsAb는 2개의 결합 도메인으로부터의 개선된 결합력으로 인해 더 낮은 친화도의 결합 도메인으로 더 높은 효력을 달성하는 데 유용할 수 있는 것으로 가정되었다. 이러한 형식의 결합력 이익은 더 높은 표적 발현을 갖는 세포주에 선택성을 부여하여, 생체내에서 표적-내 조직-외(예를 들어, 낮은 수준의 GPC3을 발현하는 건강한 조직) 효과에 대한 잠재력을 감소시킬 수 있다. 또한, GPC3-표적화 약물을 위한 항원 싱크로서 잠재적으로 작용하는, 높은 수준의 가용성 GPC3이 생체내에 존재할 수 있다. 2가 GPC3 결합과 커플링된 더 낮은 GPC3 결합 친화도는 바람직하게는 가용성 항원에 비해 높은 항원 밀도로 세포에 결합함으로써 싱크를 극복하는 데 도움이 될 수 있다. 따라서, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식, 및 전통적인 단일특이적 2가 형식의 αGPC3 x αCD3 이중특이적 항체의 세포 결합을 조사하였다. GPC3-A 가변 경쇄 도메인 L1.16(100 nM의 GPC3 결합 친화도를 가짐) 및 L1.31(400 nM의 GPC3 결합 친화도를 가짐)을 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc(VL/VH), 및 2가 단일특이적 IgG1 형식으로 조작하였다. 시험 물품을 표시된 농도에서 GPC3고 HepG2 세포와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 2차 항체로 염색하고, 다시 세척하고, 상기 기재된 바와 같이 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 도 30에 나타낸 바와 같이, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc(VL/VH) 형식에 의해 부여되는 결합력은 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식과 비교하여 결합을 개선하여, 표준 2가 IgG의 것과 유사한 수준에 도달한다. 또한, 더 낮은 친화도 L1.31 클론은 1 + 1 Fab-scFv-Fc에 비해 이러한 개선을 더 극단적으로 나타내며, 이는 더 낮은 결합 친화도가 결합력 및 결합 원자가에 대한 의존성을 더 많이 생성함을 표시한다.
3C: RTCC에 대한 변이체 CD3 결합 도메인의 효과의 조사
CD3 결합 친화도의 효과를 조사하기 위해, GPC3에 대한 100 nM 또는 400 nM의 결합 친화도를 갖는 CD3 고 scFv, CD3 고-Int#1 scFv, CD3 고-Int#2 scFv, 및 CD3 중간 scFvs 및 GPC3-A 변이체를 갖는 1 + 1 Fab-scFv-Fc 및 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식으로 αGPC3 x αCD3 bsAb를 생성하고 GPC3고 HepG2 표적 세포에 대해 48 시간의 인큐베이션 시간으로 10:1의 E:T 비를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행된 유동-기반 RTCC에서 조사하였다. 도 31a 및 도 32a에 플로팅된 데이터(각각 1 + 1 형식 및 2 + 1 형식의 bsAb에 대해)는 친화도-조작된 αGPC3 x αCD3 bsAb가 GPC3고 HepG2 세포에 대해 고(5 nM CD3 아암 및 2+1 형식을 갖는 XENP33744, 62.63 pg/ml의 EC50 값을 가짐) 내지 저(1+1 형식의 30 nM CD3 아암을 갖는 XENP27259, 19920 pg/ml의 EC50 값을 가짐) 범위의 효력을 입증했음을 나타냈다. 이중특이적 항체는 또한 IFNγ의 방출(도 31b 및 도 32b에 도시된 바와 같음) 및 T 세포 활성화(CD69 및 107a와 같은 활성화 마커의 발현에 의해 표시되는 바와 같음; 데이터는 나타내지 않음)를 이들의 효력과 상관관계가 있는 방식으로 유도하였다. 특히, 1 + 1 Fab-scFv-Fc 형식으로 CD3 고로부터 CD3 고-Int#1로 CD3 결합 친화도를 이조시키는 것은 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식에 비교하여 사이토카인 방출의 유도의 훨씬 더 큰 효력 감소를 제공하였다. 그러나, 2 + 1 Fab2-scFv-Fc 형식에서, CD3 결합 친화도를 CD3 고-Int#2 및 CD3 중간으로 이조시키는 것은 사이토카인 방출의 유도에 있어서의 효력 감소를 여전히 유발하였다.
3D: RTCC에 대한 친화도 이조된 GPC3 결합 도메인의 효과의 조사
다른 실험에서는, 실시예 2에 기재된 바와 같은 αGPC3 x αCD3 bsAb의 세트의 GPC3 결합 도메인에서의 친화도 감소를 조작하는 것의, CD3+ 이펙터 T 세포를 방향전환시키는 능력에 대한 효과를 조사하였다. GPC3중간 Huh7을 표적 세포로 사용하여, 상기 기재된 바와 같이 LDH-기반 RTCC 검정을 수행하고, 10:1의 E:T 비에서 48 시간의 인큐베이션 시간 동안 표시된 농도의 시험 물품 및 PBMC 이펙터와 혼합하였다. 도 33은 XENP37625(가변 경쇄 도메인 L1.69를 가짐, 70 nM GPC3 친화도), XENP37624(가변 경쇄 도메인 L1.16을 가짐, 100 nm GPC3 친화도), 및 XENP37626(가변 경쇄 도메인 L1.73을 가짐, 400 nM GPC3 친화도)이 대략 이들 각각의 친화도에 따라 사멸화 및 IFNγ 분비의 감소된 효력을 각각 입증하였음을 나타낸다.
3E: 상이한 GPC3 발현 수준을 갖는 세포주 상에서 RTCC를 유도하는 αGPC3 x αCD3 bsAb의 능력의 조사
표적-내, 종양-외 독성 및 사이토카인 방출 증후군은 환자에서 중증의 부작용을 유발할 수 있으므로; 낮은 수준의 GPC3을 발현하는 건강한 조직의 존재 하에 사멸화 및 사이토카인 방출의 유도를 피하기 위해 본 발명의 bsAb를 조정하는 것이 중요하다.
따라서, 상기 기재된 다양한 관찰을 기반으로 하여, 부가적인 αGPC3 x αCD3 bsAb를 조작하고, 생성하고, 조사하여 최대 치료 잠재력과 함께 독성에 대한 최소 잠재력을 갖는 bsAb를 식별하였다. 이를 위해, 높은 발현 및 낮은 발현을 갖는 세포주에 대한 이중특이적 항체의 선택성에 대한 GPC3 결합 친화도, GPC3 결합 원자가, 및 CD3 결합 친화도를 조절하는 것의 효과를 조사하였다.
인간 PBMC(1:1의 이펙터 대 표적 세포 비) 및 표시된 농도의 시험 물품과 함께 37℃에서 72 시간 동안 HepG2(GPC3고) 및 HEK293(GPC3저) 세포를 각각 인큐베이션하였다. RTCC 및 사이토카인 분비의 유도를 도시하는 데이터가 도 34 및 도 35에 도시되어 있다. 상기와 일치하게, 이중특이적 항체는 GPC3고 HepG2 세포의 존재 하에 RTCC 및 사이토카인 방출을 유도함에 있어서 소정 범위의 효력을 입증했다. 특히, GPC3저 HEK293 세포의 존재 하에, 이중특이적 항체 각각은 RTCC 및 사이토카인 방출의 유도를 거의 입증하지 않거나 전혀 입증하지 않았다.
3F: Incucyte 상에서 2D RTCC를 사용하는 αGPC3 x αCD3 bsAb의 추가의 특성화
상이한 시스템(Incucyte 상에서의 2D RTCC)을 이용하여 신규한 αGPC3 x αCD3 bsAb 및 비교기 분자 XENP31308을 조사하였다. 표시된 농도의 표시된 시험 물품을 10:1 또는 1:1의 이펙터:표적 비로 HepG2 또는 Huh7 세포 및 T 세포와 함께 인큐베이션하였다. RTCC를 도시하는 데이터는 도 36 내지 도 38에 도시되어 있다. 10:1의 이펙터:표적(HepG2) 비에서bsAbs XENP34920, XENP37430, XENP37625, 및 XENP37624는 비교기 XENP31308과 유사한 효력(100 ng/ml의 EC50 미만)을 입증했고; 다른 bsAb XENP35843, XENP36935, XENP37433, 및 XENP37626은 훨씬 덜 강력했지만 더 높은 농도에서 효과적인 사멸화를 달성할 수 있었고, XENP36939는 임의의 사멸화를 입증하지 않았다. 특히, 더 낮은 밀도의 Huh7 및 더 낮은 이펙터:표적 비에서, 본 발명의 bsAb 중 몇몇(예를 들어, XENP34920, XENP36935, 및 XENP37625)은 XENP31308 비교기와 비교하여 EC50에서 훨씬 더 큰 차이를 나타내며, 이는 향상된 치료 지수에 대한 잠재력을 표시한다. 또한, GPC3고 HepG2 및 GPC3중간 Huh7 표적 세포를 10:1의 E:T 비에서 10 μg/ml의 농도에서 시험 물품으로 처리하고24 내지 144 시간 범위의 상이한 시점에 걸쳐 관찰했을 때, 유사한 결과가 관찰되었다. 도 39 및 도 40에 도시된 바와 같이, XENP34920, XENP37430, XENP36935, XENP37624, 및 XENP37625를 포함하는 친화도 이조된 αGPC3 x αCD3 bsAb는 HepG2 및 Huh7 표적 세포 둘 모두에서 시간경과에 따른 종양 성장을 억제하는 데 효과적이었고, 이들의 효능은 XENP31308의 것과 매우 유사하였다.
3G: 3D 스페로이드 RTCC 모델을 사용하는 αGPC3 x αCD3 bsAb의 추가의 특성화
부가적인 RTCC 시스템을 사용하여 친화도 이조된 αGPC3 x αCD3 bsAb를 추가로 조사하였다. 이 시스템에서, 표적 종양 세포는 3D 스페로이드 형식으로 성장하며, 이는 평평한 표면 상에 단층으로 성장하는 세포와 비교하여 생체내 종양과 생리학적으로 더 유사하다. 이 실험에서는, 1,000개의 HepG2 세포(이는 24 시간의 배가 시간을 가짐)를 시딩하고, 성장시키기 위해 72 내지 96 시간이 주어진 후,10 ug/ml의 농도에서 표시된 bsAb와 함께 40,000개의 PBMC를 첨가하였다(대략 3:1의 E:T 비를 유발함). 상이한 시점에 걸쳐 각각의 신호(종양 또는 면역 세포)의 강도를 각각의 웰에 걸쳐 적분하였으며, 이 데이터는 도 41 및 42에 도시되어 있다. 도 43은 종양 세포 및 PBMC의 사진 영상을 부가적으로 나타낸다. PBS 처리 단독에 의해서는 종양 스페로이드 및 그 주위에 클러스터링된 PBMC가 변화하지 않고 유지되는 반면에, αGPC3 x αCD3 bsAb로 처리할 때에는 PBMC가 극단적으로 증식하고(도 42에 정량적으로 도시된 바와 같음) 종양 세포가 파괴된다(도 41에 정량적으로 도시된 바와 같음). XENP36939를 제외한 모든 αGPC3 x αCD3 bsAb는 144 시간 후에 100% 효능을 나타낸다.
3D 스페로이드 모델은 또한 더 낮은 친화도 고-Int#2 CD3 결합 도메인을 갖는 시험 물품에서 예상치 못한 결과를 생성하였다. 일반적으로, 2D 모델에서 2+1 bsAb의 경우, 고-Int#1 결합 도메인과 고-Int#2 결합 도메인 사이의 CD3 친화도 차이는 도 38에서 관찰할 수 있는 것과 같이 대략 10-배 효력 차이를 유발한다. 그러나, 이러한 3D 모델에서, XENP34920 및 XENP37624(둘 모두 동일한 100 nM GPC3 결합 도메인을 갖지만, XENP34920은 고-Int#1 CD3 결합 도메인을 갖고 XENP34924는 고-Int#2 CD3 결합 도메인을 가짐)는 매우 유사한 효력 곡선을 나타냈다. 도 41에 도시된 바와 같이, 생체내 모델을 더 근접하게 모방해야 하는 이러한 3D 모델의 예상치 못한 결과는 이러한 맥락에서 더 약한 CD3 결합제의 효력에 대한 유용한 고찰을 제공한다.
D.
실시예 4: 최적의 선택성 및 치료적 지수를 갖는 αGPC3 x αCD3 bsAb의 식별
상기 시험관내 실험을 기반으로 하여, 추가의 생체내 분석을 위해 몇몇 bsAb를 선택하였다. 이들 항체를 Xtend Fc(M428L/N434S)로 추가로 조작하여 혈청 반감기를 향상시켰으며, 예시적인 서열은 XENP38086(XENP34920에 대한 Xtend 유사체), XENP38087(XENP36935에 대한 Xtend 유사체), 및 XENP38232(XENP37625에 대한 Xtend 유사체)로서 도 17, 도 19, 및 도 20에 도시한다.
1.
4A: 사이노몰거스에서의 독성에 대한 생체내 조사
시험관내 개선(즉, GPC저 표적 세포에 비해 GPC고에 대한 선택성, 및 GPC저 세포의 존재 하의 감소된 사이토카인 방출)이 생체내 환경에서 개선된 안전성으로 이어지는지 여부를 조사하기 위해 사이노몰거스에서의 연구를 계획한다. 1 상 용량 증가 연구에서, 동물(n = 1)에 1X, 3X, 10X, 30X, 및 60X 용량의 XENP38086, XENP38087, 또는 XENP38232를 정맥내 투여한다. 사이토카인 방출 증후군의 지표로서 IL-6 농도를 결정하기 위해 혈액을 인출하였다. 동물을 희생시켜 부가적인 독성 징후를 조사할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> XENCOR, INC.
<120> HETERODIMERIC ANTIBODIES THAT BIND CD3 AND GPC3
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Glu Gly Glu Ser
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Gly Gly Gly Ser
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<220>
<223> scFv Linker
<400> 28
Pro Arg Gly Ala Ser Lys Ser Gly Ser Ala Ser Gln Thr Gly Ser Ala
1 5 10 15
Pro Gly Ser
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> scFv Linker
<400> 29
Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> scFv Linker
<400> 30
Gly Thr Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 35
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 36
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ala
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
1 5 10 15
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala
20
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
20 25
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 42
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala
20 25 30
<210> 43
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ala
35
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Domain linker 30AA-linker
<400> 44
Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 45
Gly Lys Pro Gly Ser
1 5
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 46
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
20 25
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 47
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
20 25 30
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker
<400> 48
Gly Gly Gly Glu Ser
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker "half hinge"
<400> 49
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker "full hinge C220S variant"
<400> 50
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 51
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker "flex half hinge"
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro
<210> 52
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker "charged half hinge1"
<400> 52
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> Domain linker "charged half hinge2"
<400> 53
Gly Lys Pro Gly Ser Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 54
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 1 Fab-Fc Side
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Asp Val Ser Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 55
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 1 scFv-Fc Side
<400> 55
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gln Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 56
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 2 Fab-Fc Side
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Asp Val Ser Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 57
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 2 scFv-Fc Side
<400> 57
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 58
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 3 Fab-Fc Side
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Ser Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 59
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 3 scFv-Fc Side
<400> 59
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 60
<211> 329
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 4 Fab-Fc Side
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Glu Asn Glu Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Glu Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu Gln Gly Asp Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 61
<211> 231
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> 1 + 1 Fab-scFv-Fc Backbone 4 scFv-Fc Side
<400> 61
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv Variable Heavy (vh)
Domain
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35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 101
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv vhCDR1
<400> 101
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv vhCDR2
<400> 102
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 103
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv vhCDR3
<400> 103
His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 104
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv Variable Light (vl)
Domain
<400> 104
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 105
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv vlCDR1
<400> 105
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
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<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv vlCDR2
<400> 106
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv vlCDR3
<400> 107
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High - [anti-CD3]_H1.30_L1.47_scFv Linker
<400> 108
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 109
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv scFv (VHVL)
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg
180 185 190
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly
210 215 220
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 110
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv scFv (VLVH)
<400> 110
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Lys Pro
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp
225 230 235 240
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 111
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv
Variable Heavy (vh) Domain
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv vhCDR1
<400> 112
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 113
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv vhCDR2
<400> 113
Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv vhCDR3
<400> 114
His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv
Variable Light (vl) Domain
<400> 115
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv vlCDR1
<400> 116
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv vlCDR2
<400> 117
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv vlCDR3
<400> 118
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 119
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #1 - [anti-CD3]_H1.32_L1.47_scFv Linker
<400> 119
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 120
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv scFv (VHVL)
<400> 120
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Glu Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg
180 185 190
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly
210 215 220
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 121
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv scFv (VLVH)
<400> 121
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Lys Pro
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Glu Tyr Val Ser Trp
225 230 235 240
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 122
<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv
Variable Heavy (vh) Domain
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Glu Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv vhCDR1
<400> 123
Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 124
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv vhCDR2
<400> 124
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 125
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv vhCDR3
<400> 125
His Gly Asn Phe Gly Asp Glu Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 126
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv
Variable Light (vl) Domain
<400> 126
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
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100 105
<210> 127
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv vlCDR1
<400> 127
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv vlCDR2
<400> 128
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv vlCDR3
<400> 129
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
<210> 130
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #2 - [anti-CD3]_H1.89_L1.47_scFv Linker
<400> 130
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 131
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #3 - [anti-CD3]_H1.90_L1.47_scFv scFv (VHVL)
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Pro Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro
115 120 125
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg
180 185 190
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly
210 215 220
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 132
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 High-Int #3 - [anti-CD3]_H1.90_L1.47_scFv scFv (VLVH)
<400> 132
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Lys Pro
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Pro Tyr Val Ser Trp
225 230 235 240
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
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Variable Heavy (vh) Domain
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #3 - [anti-CD3]_H1.90_L1.47_scFv vhCDR2
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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peptide
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 High-Int #3 - [anti-CD3]_H1.90_L1.47_scFv Linker
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20
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
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Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp
225 230 235 240
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<223> CD3-Intermediate - [anti-CD3]_H1.33_L1.47_scFv
Variable Heavy (vh) Domain
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3-Intermediate - [anti-CD3]_H1.33_L1.47_scFv vhCDR3
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3-Intermediate - [anti-CD3]_H1.33_L1.47_scFv
Variable Light (vl) Domain
<400> 148
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
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Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
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Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly Ala
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Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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peptide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3-Intermediate - [anti-CD3]_H1.33_L1.47_scFv vlCDR3
<400> 151
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3-Intermediate - [anti-CD3]_H1.33_L1.47_scFv Linker
<400> 152
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 153
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv scFv (VHVL)
<400> 153
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
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Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
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Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
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Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg
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Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
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Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly
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Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 154
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv scFv (VLVH)
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv vhCDR3
<400> 158
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv vlCDR1
<400> 160
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 161
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv vlCDR2
<400> 161
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv vlCDR3
<400> 162
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val
1 5
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> CD3 Low - [anti-CD3]_H1.31_L1.47_scFv Linker
<400> 163
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
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20
<210> 164
<211> 580
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human GPC3 sequence sp|P51654
<400> 164
Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu
1 5 10 15
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130 135 140
Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro
165 170 175
Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
195 200 205
Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln
210 215 220
Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile
225 230 235 240
Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu
245 250 255
Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys
260 265 270
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
275 280 285
Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu
290 295 300
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
325 330 335
Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser
340 345 350
Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile
355 360 365
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370 375 380
Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser
385 390 395 400
Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala
405 410 415
Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr
420 425 430
Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His
435 440 445
Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp
450 455 460
Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys
465 470 475 480
Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe
565 570 575
Phe Leu Val His
580
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<220>
<223> Human GPC3 sequence, alpha subunit sp|P51654|25-358
<400> 165
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50 55 60
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330
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<211> 196
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<213> Homo sapiens
<220>
<223> Human GPC3 sequence, beta subunit sp|P51654|359-554
<400> 166
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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180 185 190
Thr Phe His Asn
195
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<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<220>
<223> Macaca fascicularis GPC3 sequence tr|A0A2K5VK50
<400> 167
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly
275 280 285
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290 295 300
Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu
305 310 315 320
Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys
325 330 335
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340 345 350
Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile
355 360 365
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370 375 380
Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser
385 390 395 400
Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala
405 410 415
Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr
420 425 430
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Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Val Pro Lys
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Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly
485 490 495
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Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser
545 550 555 560
Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe
565 570 575
Phe Leu Val His
580
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<211> 334
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<220>
<223> Macaca fascicularis GPC3 sequence, alpha subunit (predicted)
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<400> 168
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50 55 60
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Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg
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<213> Macaca fascicularis
<220>
<223> Macaca fascicularis GPC3 sequence, beta subunit (predicted)
tr|A0A2K5VK50|359-554
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp
355 360 365
Lys Lys Ile Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser
370 375 380
Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Asn Phe
385 390 395 400
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435 440 445
Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys
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Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Val Pro Lys Gly
465 470 475 480
Lys Val Leu Asp Lys Ser Leu Asp Glu Glu Gly Leu Glu Ser Gly Asp
485 490 495
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500 505 510
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Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Lys Gln His Gly Asn Gln Lys
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Leu Lys Ile Leu Ile Ser Val Ala Ile Tyr Val Ala Cys Phe Phe Phe
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<211> 333
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<213> Mus musculus
<220>
<223> Mouse GPC3 sequence, alpha subunit sp|Q8CFZ4|25-357
<400> 171
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330
<210> 172
<211> 196
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Mouse GPC3 sequence, beta subunit sp|Q8CFZ4|358-553
<400> 172
Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Ile Leu Lys
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Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Pro
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Thr Ser His Ser
195
<210> 173
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1 Variable heavy (vh) domain
<400> 173
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85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 174
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1 vhCDR1
<400> 174
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1 vhCDR2
<400> 175
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 176
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1 vhCDR3
<400> 176
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 177
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_L1 Variable light (vl) domain
<400> 177
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 178
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_L1 vlCDR1
<400> 178
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 179
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_L1 vlCDR2
<400> 179
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_L1 vlCDR3
<400> 180
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 181
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.1 Variable heavy (vh) domain
<400> 181
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Glu Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.1 vhCDR1
<400> 182
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 183
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.1 vhCDR2
<400> 183
Ala Leu Glu Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 184
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.1 vhCDR3
<400> 184
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 185
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.2 Variable heavy (vh) domain
<400> 185
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asn Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 186
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.2 vhCDR1
<400> 186
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 187
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.2 vhCDR2
<400> 187
Ala Leu Asn Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.2 vhCDR3
<400> 188
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 189
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.3 Variable heavy (vh) domain
<400> 189
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Gln Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 190
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.3 vhCDR1
<400> 190
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 191
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.3 vhCDR2
<400> 191
Ala Leu Gln Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 192
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.3 vhCDR3
<400> 192
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 193
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.4 Variable heavy (vh) domain
<400> 193
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Ser Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 194
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.4 vhCDR1
<400> 194
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 195
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.4 vhCDR2
<400> 195
Ala Leu Ser Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_H1.4 vhCDR3
<400> 196
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 197
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.1 Variable light (vl) domain
<400> 197
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 198
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.1 vlCDR1
<400> 198
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 199
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.1 vlCDR2
<400> 199
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.1 vlCDR3
<400> 200
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 201
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.2 Variable light (vl) domain
<400> 201
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 202
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.2 vlCDR1
<400> 202
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 203
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.2 vlCDR2
<400> 203
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.2 vlCDR3
<400> 204
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 205
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.3 Variable light (vl) domain
<400> 205
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 206
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.3 vlCDR1
<400> 206
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 207
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.3 vlCDR2
<400> 207
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 208
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.3 vlCDR3
<400> 208
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 209
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.4 Variable light (vl) domain
<400> 209
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 210
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.4 vlCDR1
<400> 210
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 211
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.4 vlCDR2
<400> 211
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 212
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.4 vlCDR3
<400> 212
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 213
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.5 Variable light (vl) domain
<400> 213
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 214
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.5 vlCDR1
<400> 214
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 215
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.5 vlCDR2
<400> 215
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 216
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.5 vlCDR3
<400> 216
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 217
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.6 Variable light (vl) domain
<400> 217
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 218
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.6 vlCDR1
<400> 218
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 219
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.6 vlCDR2
<400> 219
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.6 vlCDR3
<400> 220
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 221
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.7 Variable light (vl) domain
<400> 221
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 222
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.7 vlCDR1
<400> 222
Asp Tyr Glu Met His
1 5
<210> 223
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.7 vlCDR2
<400> 223
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 224
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.7 vlCDR3
<400> 224
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 225
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.8 Variable light (vl) domain
<400> 225
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
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Asp Tyr Glu Met His
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.8 vlCDR2
<400> 227
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
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<400> 228
Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
1 5
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<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
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<400> 229
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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peptide
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Asp Tyr Glu Met His
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<213> Artificial Sequence
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peptide
<220>
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Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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peptide
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Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
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polypeptide
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<400> 233
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
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Asp Tyr Glu Met His
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peptide
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Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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peptide
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Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr
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polypeptide
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<400> 237
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Ser Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
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Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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peptide
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peptide
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Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Thr
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polypeptide
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<400> 241
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
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35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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peptide
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Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
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<213> Artificial Sequence
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peptide
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Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
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<213> Artificial Sequence
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polypeptide
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide
<220>
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<400> 247
Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.29 vlCDR3
<400> 248
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
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polypeptide
<220>
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<400> 249
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<211> 16
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<213> Artificial Sequence
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peptide
<220>
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<400> 250
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.31 vlCDR2
<400> 251
Tyr Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.31 vlCDR3
<400> 252
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
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<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.65 Variable light (vl) domain
<400> 253
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Trp Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 254
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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peptide
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Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Tyr Gly Asn Thr Trp Leu His
1 5 10 15
<210> 255
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.65 vlCDR2
<400> 255
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.65 vlCDR3
<400> 256
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 257
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.66 Variable light (vl) domain
<400> 257
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Trp Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 258
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.66 vlCDR1
<400> 258
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Trp Leu His
1 5 10 15
<210> 259
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.66 vlCDR2
<400> 259
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 260
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.66 vlCDR3
<400> 260
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 261
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.67 Variable light (vl) domain
<400> 261
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Lys Asn Thr Trp Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 262
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.67 vlCDR1
<400> 262
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Lys Asn Thr Trp Leu His
1 5 10 15
<210> 263
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.67 vlCDR2
<400> 263
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 264
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.67 vlCDR3
<400> 264
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 265
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.68 Variable light (vl) domain
<400> 265
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 266
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.68 vlCDR1
<400> 266
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 267
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.68 vlCDR2
<400> 267
Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 268
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.68 vlCDR3
<400> 268
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 269
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.69 Variable light (vl) domain
<400> 269
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 270
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.69 vlCDR1
<400> 270
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 271
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.69 vlCDR2
<400> 271
Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.69 vlCDR3
<400> 272
Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 273
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> GPC3-A[GPC3]_ L1.70 Variable light (vl) domain
<400> 273
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gln Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
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Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
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Tyr Val Ser Asn Arg Phe Ser
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
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Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
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Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
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Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
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Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
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100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Leu Glu Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> XENP23060 Chain 2-GPC3-A_[GPC3]_L1 Light Chain
<400> 292
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
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Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
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Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<220>
<223> XENP23061 Chain 1-GPC3-A_[GPC3]_H1.2_IgG1_PVA_/S267K Heavy Chain
<400> 293
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35 40 45
Gly Ala Leu Asn Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
340 345 350
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355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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435 440
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> XENP23062 Chain 1-GPC3-A_[GPC3]_H1.3_IgG1_PVA_/S267K Heavy Chain
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
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Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
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Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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370 375 380
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polypeptide
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<223> XENP34364 Chain 1-GPC3-A[GPC3]_H1.1_IgG1_pI(-)_Isosteric_A_/PVA_/
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Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
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145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
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225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
Claims (52)
- GPC3 항원 결합 도메인(ABD: antigen binding domain)을 포함하며, 여기서 GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 도메인(VH)/가변 경쇄 도메인(VL) 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 포함하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, ABD는 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는, 조성물.
- 제2항에 있어서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체인, 조성물.
- a) VH 도메인을 인코딩하는 제1 핵산; 및
b) VL 도메인을 인코딩하는 제2 핵산을 포함하며, 여기서 VH 및 VL은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 쌍인, 핵산 조성물. - a) 제5항의 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터; 및
b) 제5항의 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 각각 포함하는, 발현 벡터 조성물. - 제5항의 제1 및 제2 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
- 제6항의 발현 벡터 조성물 또는 제7항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 항-GPC3 ABD를 제조하는 방법으로서, ABD가 발현되는 조건 하에 제8항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 ABD를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
- a)
i) 제1 가변 경쇄 도메인, scFv 링커, 및 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 항-CD3 scFv; 및
ii) 제1 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 scFv는 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 N-말단에 공유적으로 부착되는 제1 단량체;
b) VH2-CH1-힌지-CH2-CH3 단량체를 포함하며, 여기서 VH는 제2 가변 중쇄 도메인이고 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인인 제2 단량체; 및
c) 제2 가변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며,
여기서 제2 가변 중쇄 도메인 및 제2 가변 경쇄 도메인은 GPC3 항원 결합 도메인(ABD)을 형성하는, 이종이량체 항체. - 제10항에 있어서, GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 및 VL 쌍을 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 링커는 하전된 scFv 링커인, 이종이량체 항체.
- 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 변이체 Fc 도메인인, 이종이량체 항체.
- 제16항에 있어서, 제1 및 제2 단량체는 도 1a 내지 도 1e에 도시된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이량체화 변이체 세트를 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제17항에 있어서, 선택된 이종이량체화 변이체 세트는 S364K/E357Q : L368D/K370S; S364K : L368D/K370S; S364K : L368E/K370S; D401K: T411E/K360E/Q362E; 및 T366W : T366S/L368A/Y407V로 이루어진 군으로부터의 것이며, 여기서 넘버링(numbering)은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 제1 및 제2 단량체는 하나 이상의 절제 변이체(ablation variant)를 추가로 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제19항에 있어서, 하나 이상의 절제 변이체는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K이고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 단량체 중 하나는 하나 이상의 pI 변이체를 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제21항에 있어서, pI 변이체는 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D이며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단량체는 아미노산 변이체 S364K/E357Q/ E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고,
제2 단량체는 아미노산 변이체 L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하며,
여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체. - 제23항에 있어서, 제1 및 제2 단량체는 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하는, 이종이량체 항체.
- a) N-말단에서 C-말단으로, scFv-링커-CH2-CH3을 포함하며,
여기서 scFv는 항-CD3 scFV이고, CH2-CH3은 제1 Fc 도메인인 제1 단량체;
b) N-말단에서 C-말단으로, VH-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인인 제2 단량체; 및
c) VL-CL을 포함하는 경쇄를 포함하며;
여기서 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 S364K/E357Q를 포함하고,
여기서 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 L368D/K370S를 포함하며,
여기서 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고,
여기서 제2 단량체의 CH1-힌지-CH2-CH3은 아미노산 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함하며,
여기서 VH 및 VL은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로부터 선택된 GPC3 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 각각 포함하는 GPC3 결합 도메인을 형성하고,
여기서 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로부터 선택된 CD3 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하며,
여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체. - 제25항에 있어서, 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- a) 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항의 제1 단량체를 인코딩하는 제1 핵산;
b) 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항의 제2 단량체를 인코딩하는 제2 핵산; 및
c) 제10항 내지 제26항 중 어느 한 항의 경쇄를 인코딩하는 제3 핵산을 각각 포함하는, 핵산 조성물. - a) 제26항의 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
b) 제26항의 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
c) 제26항의 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물. - 제28항의 발현 벡터 조성물로 형질전환되는, 숙주 세포.
- 이종이량체 항체를 제조하는 방법으로서, 항체가 발현되는 조건 하에 제29항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
- a) N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-링커 1-scFv-링커 2-CH2-CH3을 포함하며,
여기서 VH1은 제1 가변 중쇄 도메인이고, scFv는 항-CD3 scFV이고, 링커 1 및 링커 2는 각각 제1 도메인 링커 및 제2 도메인 링커이고, CH2-CH3은 제1 Fc 도메인인 제1 단량체;
b) N-말단에서 C-말단으로, VH2-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 VH2는 제2 가변 중쇄 도메인이고 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인인 제2 단량체; 및
c) 가변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 포함하며,
여기서 제1 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제1 GPC3 ABD를 형성하고, 제2 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인은 제2 GPC3 ABD를 형성하는, 이종이량체 항체. - 제31항에 있어서, 제1 및 제2 GPC3 결합 도메인은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 각각 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 제1 및 제2 GPC3 결합 도메인 각각은 [GPC3]H1_L1, [GPC3]H1_L1.1, [GPC3]H1_L1.2, [GPC3]H1_L1.3, [GPC3]H1_L1.4, [GPC3]H1_L1.5, [GPC3]H1_L1.6, [GPC3]H1_L1.7, [GPC3]H1_L1.8, [GPC3]H1_L1.9, [GPC3]H1_L1.10, [GPC3]H1_L1.16, [GPC3]H1_L1.23, [GPC3]H1_L1.29, [GPC3]H1_L1.31, [GPC3]H1_L1.65, [GPC3]H1_L1.66, [GPC3]H1_L1.67, [GPC3]H1_L1.68, [GPC3]H1_L1.70, [GPC3]H1_L1.71, [GPC3]H1_L1.72, [GPC3]H1_L1.73, [GPC3]H1.1_L1, [GPC3]H1.1_L1.1, [GPC3]H1.1_L1.2, [GPC3]H1.1_L1.3, [GPC3]H1.1_L1.4, [GPC3]H1.1_L1.5, [GPC3]H1.1_L1.6, [GPC3]H1.1_L1.7, [GPC3]H1.1_L1.8, [GPC3]H1.1_L1.9, [GPC3]H1.1_L1.10, [GPC3]H1.1_L1.16, [GPC3]H1.1_L1.23, [GPC3]H1.1_L1.29, [GPC3]H1.1_L1.31, [GPC3]H1.1_L1.65, [GPC3]H1.1_L1.66, L1.67, [GPC3]H1.1_L1.68, [GPC3]H1.1_L1.70, [GPC3]H1.1_L1.71, [GPC3]H1.1_L1.72, [GPC3]H1.1_L1.73, [GPC3]H1.2_L1, [GPC3]H1.2_L1.1, [GPC3]H1.2_L1.2, [GPC3]H1.2_L1.3, [GPC3]H1.2_L1.4, [GPC3]H1.2_L1.5, [GPC3]H1.2_L1.6, [GPC3]H1.2_L1.7, [GPC3]H1.2_L1.8, [GPC3]H1.2_L1.9, [GPC3]H1.2_L1.10, [GPC3]H1.2_L1.16, [GPC3]H1.2_L1.23, [GPC3]H1.2_L1.29, [GPC3]H1.2_L1.31, [GPC3]H1.2_L1.65, [GPC3]H1.2_L1.66, [GPC3]H1.2_L1.67, [GPC3]H1.2_L1.68, [GPC3]H1.2_L1.70, [GPC3]H1.2_L1.71, [GPC3]H1.2_L1.72, [GPC3]H1.2_L1.73, [GPC3]H1.3_L1, [GPC3]H1.3_L1.1, [GPC3]H1.3_L1.2, [GPC3]H1.3_L1.3, [GPC3]H1.3_L1.4, [GPC3]H1.3_L1.5, [GPC3]H1.3_L1.6, [GPC3]H1.3_L1.7, [GPC3]H1.3_L1.8, [GPC3]H1.3_L1.9, [GPC3]H1.3_L1.10, [GPC3]H1.3_L1.16, [GPC3]H1.3_L1.23, [GPC3]H1.3_L1.29, [GPC3]H1.3_L1.31, [GPC3]H1.3_L1.65, [GPC3]H1.3_L1.66, [GPC3]H1.3_L1.67, [GPC3]H1.3_L1.68, [GPC3]H1.3_L1.70, [GPC3]H1.3_L1.71, [GPC3]H1.3_L1.72, [GPC3]H1.3_L1.73, [GPC3]H1.4_L1, [GPC3]H1.4_L1.1, [GPC3]H1.4_L1.2, [GPC3]H1.4_L1.3, [GPC3]H1.4_L1.4, [GPC3]H1.4_L1.5, [GPC3]H1.4_L1.6, [GPC3]H1.4_L1.7, [GPC3]H1.4_L1.8, [GPC3]H1.4_L1.9, [GPC3]H1.4_L1.10, [GPC3]H1.4_L1.16, [GPC3]H1.4_L1.23, [GPC3]H1.4_L1.29, [GPC3]H1.4_L1.31, [GPC3]H1.4_L1.65, [GPC3]H1.4_L1.66, [GPC3]H1.4_L1.67, [GPC3]H1.4_L1.68, [GPC3]H1.4_L1.70, [GPC3]H1.4_L1.71, [GPC3]H1.4_L1.72, 및 [GPC3]H1.4_L1.73으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍을 갖는, 이종이량체 항체.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, VH/VL 쌍은 [GPC3]H1.1_L1.16 및 [GPC3]H1.1_L1.69로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이종이량체 항체.
- 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로 이루어진 군으로부터 선택된 VH/VL 쌍으로부터의 6개 CDR(vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2, 및 vlCDR3)의 세트를 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제35항에 있어서, scFv는 하기 CD3 결합 도메인 중 임의의 것의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는, 이종이량체 항체: H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31.
- 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 Fc 도메인은 변이체 Fc 도메인인, 이종이량체 항체.
- 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단량체는 도 1a 내지 도 1e에 도시된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된 이종이량체화 변이체 세트를 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제38항에 있어서, 선택된 이종이량체화 변이체 세트는 S364K/E357Q : L368D/K370S; S364K : L368D/K370S; S364K : L368E/K370S; D401K: T411E/K360E/Q362E; 및 T366W : T366S/L368A/Y407V로 이루어진 군으로부터의 것이며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 단량체는 하나 이상의 절제 변이체를 추가로 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제40항에 있어서, 하나 이상의 절제 변이체는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K이며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 단량체 중 하나는 하나 이상의 pI 변이체를 추가로 포함하는, 이종이량체 항체.
- 제42항에 있어서, pI 변이체는 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D이며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 S364K/E357Q/ E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고,
제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체. - 제44항에 있어서, scFv 링커는 아미노산 서열 (GKPGS)4(서열 번호 15)를 갖는 하전된 scFv 링커인, 이종이량체 항체.
- 제45항에 있어서, 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체.
- a) N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-링커 1-scFv-링커 2-CH2-CH3을 포함하며,
여기서 scFv는 항-CD3 scFV이고 CH2-CH3은 제1 Fc 도메인인 제1 단량체;
b) N-말단에서 C-말단으로, VH1-CH1-힌지-CH2-CH3을 포함하며, 여기서 CH2-CH3은 제2 Fc 도메인인 제2 단량체; 및
c) VL-CL을 포함하는 공통 경쇄를 포함하며;
여기서 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 S364K/E357Q를 포함하고,
여기서 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 변이체 L368D/K370S를 포함하며,
여기서 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고,
여기서 제2 단량체의 CH1-힌지-CH2-CH3은 아미노산 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D를 포함하며,
여기서 VH 및 VL은 H1.9_L1.187, H1.24_L1.187, H2.91_L1.187, 및 H1.9_L1.187로부터 선택된 GPC3 ABD의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하고;
여기서 항-CD3 scFv는 H1.30_L1.47, H1.32_L1.47, H1.89_L1.47, H1.90_L1.47, H1.33_L1.47, H1.31_L1.47, L1.47_H1.30, L1.47_H1.30, L1.47_H1.32, L1.47_H1.89, L1.47_H1.90, L1.47_H1.33, 및 L1.47_H1.31로부터 선택된 CD3 결합 도메인의 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하며,
여기서 넘버링은 EU 넘버링에 따르는, 이종이량체 항체. - 제47항에 있어서, 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 변이체 428/434S를 추가로 포함하는, 이종이량체 항체.
- a) 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항의 제1 단량체를 인코딩하는 제1 핵산;
b) 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항의 제2 단량체를 인코딩하는 제2 핵산; 및
c) 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항의 경쇄를 인코딩하는 제3 핵산을 포함하는, 핵산 조성물. - a) 제49항의 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
b) 제49항의 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
c) 제49항의 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는, 발현 벡터 조성물. - 제50항의 발현 벡터 조성물로 형질전환되는, 숙주 세포.
- 이종이량체 항체를 제조하는 방법으로서, 항체가 발현되는 조건 하에 제51항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
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