JP5017116B2 - 修飾Ｆｃ分子 - Google Patents

Description

薬物Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）の成功によって、抗体の定常ドメインを用いて改変された治療薬の期待が結実した。抗体は、機能上独立した２個の部分、すなわち、抗原に結合する「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体活性化及び食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に結びつく「Ｆｃ」として知られる定常ドメインとを含む。Ｆｃは血清半減期が長いのに対して、Ｆａｂは短命である。Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）， Ｎａｔｕｒｅ ３３７： ５２５−３１。Ｆｃドメインは、治療タンパク質と一緒に構築すると、半減期を延長することができ、又はＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合、さらにはおそらく胎盤通過のような機能をもたらすことができる。前記。表１に、当分野で公知のＦｃ融合タンパク質の使用について要約する。

治療薬を開発する極めて異なる手法はペプチドライブラリースクリーニングである。タンパク質リガンドとその受容体との相互作用は、比較的大きな界面で起こることが多い。しかし、ヒト成長ホルモンとその受容体で示された通り、界面におけるほんの少数の重要な残基が結合エネルギーの大部分に寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７： ３８３−６。タンパク質リガンドのバルクは、単に正しい形態の結合エピトープを示し、又は結合に無関係な機能を果たすだけに過ぎない。従って、「ペプチド」長（２から４０個のアミノ酸）のみの分子は、所与の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。かかるペプチドは、大きいタンパク質リガンドの生理活性を模倣することができ（「ペプチドアゴニスト」）、又は大きいタンパク質リガンドの生理活性を競合的結合を介して阻害することができる（「ペプチドアンタゴニスト」）。

ファージディスプレイペプチドライブラリーは、かかるペプチドアゴニスト及びアンタゴニストの特定における強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ３８６、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ４０４、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、１９９８年３月３１日に発行された米国特許第５，７３３，７３１号、１９９６年３月１２日に発行された米国特許第５，４９８，５３０号、１９９５年７月１１日に発行された米国特許第５，４３２，０１８号、１９９４年８月１６日に発行された米国特許第５，３３８，６６５号、１９９９年７月１３日に発行された米国特許第５，９２２，５４５号、１９９６年１２月１９日に公開された国際公開第９６／４０９８７号及び１９９８年４月１６日に公開された国際公開第９８／１５８３３号を参照されたい（これらの各々を参照により本明細書に組み入れる。）。かかるライブラリーにおいては、ランダムペプチド配列は、繊維状ファージのコートタンパク質と融合することによって示される。典型的には、示されたペプチドは、抗体に固定された、受容体の細胞外ドメインに対して親和溶出される。保持されたファージは、親和精製及び再増殖（ｒｅｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を繰り返すことによって濃縮することができる。最適な結合ペプチドの配列を決定して、構造的に関係する１つ以上のペプチドファミリー内の重要な残基を特定することができる。例えば、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １６９６−９を参照されたい。ここでは、２つの異なるファミリーが特定された。アラニンスキャンニングによって、又はＤＮＡレベルでの変異誘発によって、その残基を安全に置換することができるペプチド配列も示唆することができる。変異誘発ライブラリーを作製し、スクリーニングして、最適なバインダーの配列をさらに最適化することができる。Ｌｏｗｍａｎ （１９９７）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６： ４０１−２４。

他の方法は、ペプチド研究においてファージディスプレイと競合する。ペプチドライブラリーは、ｌａｃリプレッサーのカルボキシ末端と融合し、Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）中で発現させることができる。Ｅ．コリを用いる別の方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって細胞外膜上でのディスプレイが可能である。以下、これらの方法及び関係する方法を「Ｅ．コリディスプレイ」と総称する。可溶ペプチド混合物をスクリーニングする別の生物学的手法は、発現及び分泌に酵母を使用する。Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４３： ７４１−８を参照されたい。以下、Ｓｍｉｔｈ等の方法及び関係する方法を「酵母スクリーニング」と称する。別の方法においては、ランダムＲＮＡの翻訳は、リボソームから放出される前に停止し、その関連ＲＮＡを含むポリペプチドライブラリーは依然として結合したままである。以下、この方法及び関係する方法を「リボソームディスプレイ」と総称する。他の方法は、ペプチドとＲＮＡの化学的連結を使用する。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＆ Ｓｚｏｓｔａｋ （１９９７）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： １２２９７−３０３を参照されたい。以下、この方法及び関係する方法を「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と総称する。ペプチドがポリエチレンロッド、溶媒透過性樹脂などの安定な非生物学的材料上に固定された、化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発された。別の化学的に誘導されたペプチドライブラリーは、フォトリソグラフィーを用いて、ガラススライド上に固定されたペプチドをスキャンする。以下、これらの方法及び関係する方法を「化学−ペプチドスクリーニング」と総称する。化学−ペプチドスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及び他の異常アナログ並びに非ペプチド要素を使用することができる点で有利である。生物学的方法と化学的方法のどちらもＷｅｌｌｓ ＆ Ｌｏｗｍａｎ（１９９２）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３： ３５５−６２に概説されている。

公知の生理活性ペプチドの場合には、治療上好都合な諸特性を有するペプチドリガンドの合理的設計を完了することができる。かかる手法においては、ペプチド配列に段階的変化を加え、ペプチドの生理活性又は予測される生物物理学的性質（例えば、溶液構造）に対する置換の効果を確認する。以下、これらの技術を「合理的設計」と総称する。かかる一技術においては、単一残基をアラニンと一度に交換して一連のペプチドを調製する。この技術を「アラニンウォーク（ａｌａｎｉｎｅ ｗａｌｋ）」又は「アラニンスキャン」と一般に記述する。（隣接する又は相隔たる）２個の残基を置換するときには、「ダブルアラニンウォーク」と記述する。生じるアミノ酸置換を単独で、又は組み合わせて使用して、治療上好都合な諸特性を有する新しいペプチド体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｅｎｔｉｔｙ）を得ることができる。

タンパク質−タンパク質相互作用の構造解析を使用して、大きいタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆することもできる。かかる分析においては、結晶構造によって、大きいタンパク質リガンドの重要な残基の同一性及び相対的配向を示唆することができ、それからペプチドを設計することができる。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５： １２６６−７０を参照されたい。以下、これらの方法及び関係する方法を「タンパク質構造解析」と記述する。これらの分析方法を使用して、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択されるペプチドとの相互作用を検討することもできる。これによって、結合親和性を増大させるためのペプチドのさらなる修飾を示唆することができる。

概念的には、ファージディスプレイ及び上述した他の方法を用いてあらゆるタンパク質のペプチド模倣物を発見することができる。これらの方法は、エピトープマッピングに、タンパク質−タンパク質相互作用における重要なアミノ酸の確認に、また、新しい治療薬の発見の手がかりとして、使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ７： ６１６−２１。ペプチドライブラリーは、現在、エピトープマッピングなどの免疫学的研究において最も頻繁に使用されている。Ｋｒｅｅｇｅｒ（１９９６）， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １０（１３）： １９−２０。

ここで特に興味深いのは、薬理学的に活性なペプチドの発見におけるペプチドライブラリー及び他の技術の使用である。当分野で確認された幾つかのかかるペプチドを表２に要約する。各ペプチドは列挙した刊行物に記載されている。その各々を参照により本明細書に組み入れる。ペプチドの薬理活性を記載する。多くの場合、括弧内にこれに対する略記号を後に続ける。これらのペプチドの一部は（例えば、Ｃ末端で架橋した２量体を形成するために）修飾されている。典型的には、薬理学的に活性なタンパク質の受容体（例えば、ＥＰＯ受容体）に結合するかどうかによってペプチドライブラリーをスクリーニングした。少なくとも１つ（ＣＴＬ Ａ４）においては、ペプチドライブラリーをモノクローナル抗体に結合するかどうかによってスクリーニングした。

ペプチドライブラリースクリーニングによって特定されたペプチドは、治療薬自体としてではなく、治療薬開発における単なる「手がかり」と長期間見なされていた。他のタンパク質及びペプチド同様、これらのペプチドも、腎臓ろ過、細網内皮系における細胞クリアランス機構又はタンパク質分解によってインビボで迅速に除去される。Ｆｒａｎｃｉｓ （１９９２）， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３： ４−１１。その結果、当該技術は、特定されたペプチドを用いて薬物標的を確認することに、又は特定されたペプチドを、化学ライブラリースクリーニングによって容易に若しくは素早く特定されない恐れがある有機化合物の設計の足場として用いた。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６： ４０１−２４、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｔｏｄａｙ ３： ３７０−８。

より最近の開発は、ランダムに生成されたペプチドとＦｃドメインとを融合するものである。２００３年１２月９日に発行されたＦｅｉｇｅ他の米国特許第６，６６０，８４３号を参照されたい（参照によりその全体を本明細書に組み入れる。）。かかる分子は、「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）」として知られるようになった。ペプチボディは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸側鎖又はこれらの部位の２つ以上に連結された１個以上のペプチドを含む。ペプチボディ技術によって、１個以上のリガンド又は受容体、腫ようホーミングペプチド、膜輸送ペプチドなどを標的とするペプチドを組み入れた治療薬を設計することができる。ペプチボディ技術は、ジスルフィドによって拘束された線状ペプチド、「直列ペプチド多量体」（すなわち、Ｆｃドメインの単鎖上の１個を超えるペプチド）を含めて、幾つかのかかる分子の設計において有用であることが証明された。例えば、米国特許第６，６６０，８４３号、（２００２年１１月２１日に公開された国際公開第０２／０９２６２０号に対応する）２００３年１０月１６日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１９５１５６号、（２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１５８９号に対応する）２００３年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１７６３５２号、（２０００年５月４日に公開された国際公開第００／２４７７０号に対応する）１９９９年１０月２２日に出願された米国特許出願第０９／４２２，８３８号、２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２２９０２３号、２００３年７月１７日に公開された国際公開第０３／０５７１３４号、（２００４年４月８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／０１０９８９号に対応する）２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号、（２００４年４月１日に公開された国際公開第０４／０２６３２９号に対応する）２００３年９月１８日に出願された米国特許出願第１０／６６６，４８０号を参照されたい。これらの各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる。当該技術は、ポリペプチド治療薬のかかる合理的設計を可能にするさらなる技術からの利益を得るものである。

本発明は、少なくとも１種類の生物活性ペプチドが内部配列としてＦｃドメイン中に組み込まれる方法に関する。かかる内部配列は、（すなわち、既存のＦｃドメイン中のアミノ酸間への）挿入によって、又は既存のＦｃドメイン中のアミノ酸の置換（すなわち、既存のＦｃドメイン中のアミノ酸の除去とペプチドアミノ酸の付加）によって、付加することができる。後者の場合、付加されるペプチドアミノ酸の数は、既存のＦｃドメインから除去されるアミノ酸の数に対応する必要はない。例えば、本発明は、１０個のアミノ酸が除去され、１５個のアミノ酸が付加される分子に関する。本発明においては、薬理学的に活性な物質は、
ａ） 目的タンパク質の活性を調節する少なくとも１種類のペプチドを選択すること、及び
ｂ） Ｆｃドメインの内部配列として選択ペプチドのアミノ酸配列を含む薬剤を調製すること
を含む方法によって調製される。

この方法を用いて、ポリペプチド（例えば、エタネルセプト）に、又は（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９５１５６号、同２００３／０１７６３５２号、同２００３／０２２９０２３号及び同２００３／０２３６１９３号；国際公開第００／２４７７０号；国際公開第０４／０２６３２９号に記載の）ペプチドに、Ｎ末端、Ｃ末端又は側鎖を介してすでに連結されているＦｃドメインを修飾することができる。全体を通して記述する本方法は、抗体の一部であるＦｃドメインの修飾に使用することもできる（例えば、アダリムマブ、エピラツズマブ、インフリキシマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）など）。このようにして、異なるエピトープへの結合ドメイン、前駆体分子の既存のエピトープへの追加の結合ドメインなどの追加の官能性を有する様々な分子を作成することができる。ペプチドは、例えば、（好ましくは）ファージディスプレイ、Ｅ．コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、酵母スクリーニング、化学−ペプチドスクリーニング、合理的設計若しくはタンパク質構造解析によって選択することができ、又は天然のペプチド（例えばＰＴＨ、ＧＬＰ−１）とすることができる。

本発明は、さらに、Ｆｃドメインの内部配列として（好ましくはループ領域中に）ペプチドを含むように修飾されたＦｃドメインを含む分子に関係する。内部ペプチド配列を含む分子は、全体を通して「Ｆｃ内部ペプチボディ」又は「Ｆｃ内部ペプチド分子」と記述する。これらの分子を以下にさらに記述する。

Ｆｃ内部ペプチド分子は、特定の内部領域中に１個を超える直列のペプチド配列を含むことができ、他の内部領域中にさらなるペプチドを含むことができる。推定ループ領域が好ましいものの、Ｆｃの任意の他の非末端ドメイン中の挿入も本発明の一部と考えられる。（以下に記述する）上記化合物の変異体及び誘導体も本発明に包含される。

本発明の化合物は、標準合成方法、組換えＤＮＡ技術、又はペプチド及び融合タンパク質を調製する任意の他の方法によって調製することができる。

Ｆｃ内部ペプチド分子について企図される主要な用途は治療薬又は予防薬である。選択ペプチドは、ペプチドによって模倣される天然リガンドと類似の活性、さらにはそれを超える活性を有することができる。また、ある種の天然リガンド系治療薬は、患者自身の内因性リガンドに対する抗体を誘導することがある。これに対し、ビヒクルに連結されたペプチドの独特の配列は、天然リガンドと配列同一性を殆ど持たない、又は典型的にはまったく持たないことによってこの落とし穴を回避する。また、Ｆｃ内部ペプチボディは、Ｎ又はＣ末端連結Ｆｃ分子を上回るリフォールディング及び精製の利点を有し得る。さらに、Ｆｃ内部ペプチボディは、キメラドメインの安定化のために熱力学的にも、また、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼ由来のタンパク質分解に対する高い抵抗性のために化学的にもより安定となり得る。Ｆｃ内部ペプチボディは、薬物動態学的諸特性も改善され得る。

本発明の化合物は、大部分は治療薬として企図されるが、かかる薬剤のスクリーニングにおいても有用となり得る。例えば、抗Ｆｃ被覆プレートを用いるアッセイにおいてＦｃ内部ペプチボディ（例えば、Ｆｃループ−ＳＨ２ドメインペプチド）を使用することができる。Ｆｃ内部ペプチボディは、不溶性ペプチドを可溶性にすることができ、従って幾つかのアッセイにおいて有用となり得る。

本発明の化合物は、適切な薬剤担体材料と一緒に処方し、治療又は予防の必要なヒト（又は他の哺乳動物）などの患者に有効量を投与することによって、治療又は予防の目的に使用することができる。他の関係する態様も本発明に含まれる。

本発明の多数の追加の態様及び利点も、本発明の図及び詳細な説明を考慮することによって明らかになるはずである。

図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、この発明の方法により修飾し得るＦｃドメインのループ領域を示す。ＦｃのＣＨ２およびＣＨ３ドメインのこれら構造表示において、これらループ領域は、示されていない、βシート（平板矢印）またはαシート（円筒）のモデルの何れの部分でも良いと考えられる。

（図面の簡単な説明）
図１Ａは、単量体のラットＩｇＧ２ａ Ｆｃドメイン（タンパク質データベースファイル＃１Ｉ１Ｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）を示す。この図は、ｘ線回折結晶構造から得られた、ラットＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインモノマーの３次元モデルを示す（ｐｄｂ ＃１Ｉ１Ｃ）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方の可能なＦｃループ挿入部位を示す。好ましいＣＨ３ドメインＦｃループ挿入部位を特に区別して示す。

図１Ｂは、単量体ネズミＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（タンパク質データベースファイル＃１ＩＧＹ）を示す。この図は、ｘ線回折結晶構造から得られた、ネズミＩｇＧ１ Ｆｃドメインモノマーの３次元モデルを示す（ｐｄｂ ＃１ＩＧＹ）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方の可能なＦｃループ挿入部位を示す。好ましいＣＨ３ドメインＦｃループ挿入部位を特に区別して示す。

図１Ｃは、単量体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（タンパク質データベースファイル＃１Ｈ３Ｔ）を示す。この図は、ｘ線回折結晶構造から得られた、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインモノマーの３次元モデルを示す（ｐｄｂ ＃１Ｈ３Ｔ）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方の可能なＦｃループ挿入部位を示す。好ましいＣＨ３ドメインＦｃループ挿入部位を特に区別して示す。

これら構造は、異なるＩｇＧサブタイプ内においておよび種間で、二次および三次立体構造において、高度の相同性があることを示している。これら構造についてのｘ−線結晶構造座標は、ＰＲＣＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に見出すことができる。

図２Ａは、太字の予測ループ配列とのペプチボディ融合体に使用する一連のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（配列番号５９９）を示す図である。図２Ａは、本発明に使用するヒトＩｇＧ１配列に関連して、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す構造によって示唆される、太字のＦｃループ領域（配列番号６２１、６２２、６２４、６２５、６２７、６２８、６３０、６３２、６３４及び６３６）を示す。太字で示す部位のいずれか又は全ては、ペプチド配列による完全若しくは部分的な置換に、又はペプチド配列の挿入に適切となり得、本発明の一部と見なされる。特に好ましい内部部位に下線を引く（配列番号６２３、６２６、６２９、６３１、６３３、６３５及び６３７）。好ましい一部位は、ＤＥＬＴＫ（配列番号６３０）ループ中のＬｅｕ_１３９とＴｈｒ_１４０の間の配列番号６３１である。他のＩｇサブタイプにおける可能なループ部位は、当該技術においては、図２Ｂ及び２Ｃに示すアラインメントに基づいて理解される。

図２Ｂ及び２Ｃは、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブクラス由来のヒトＦｃドメインの配列アラインメントを示す図である。図２Ｂ及び２Ｃは、本発明において有用であり得るＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブタイプ由来のヒトＦｃ領域の例示的アミノ酸配列（配列番号６００から６０７）を示す。図２Ｂ及び２Ｃは、コンセンサス配列（配列番号６０８）も示す。

図２Ｂ及び２Ｃはまた、図２Ａに示すＦｃ配列の内部部位に対応する、ペプチド付加のための好ましい内部部位を太字で示す（配列番号５９９）。特に、図２Ｂ及び２Ｃは、以下の好ましい部位を示す。
・ 配列番号６０３から６０８内の太字で示す配列番号６２１、
・ 配列番号６０３から６０６及び６０８内の配列番号６２２、
・ 配列番号６０７内の配列番号６３８、
・ 配列番号６０３から６０８内の配列番号６２４、
・ 配列番号６０３及び６０４内の配列番号６２５、
・ 配列番号６０５から６０８内の配列番号６３９、
・ 配列番号６０３から６０５、６０７及び６０８内の配列番号６２７、
・ 配列番号６０６内の配列番号６４０、
・ 配列番号６０３、６０４及び６０８内の配列番号６２８、
・ 配列番号６０５内の配列番号６４１、
・ 配列番号６０６内の配列番号６４２、
・ 配列番号６０７内の配列番号６４３、
・ 配列番号６０３内の配列番号６３０、
・ 配列番号６０４から６０８内の配列番号６４４、
・ 配列番号６０３、６０４、６０６、６０７及び６０８内の配列番号６３２、
・ 配列番号６０５内の配列番号６４５、
・ 配列番号６０３、６０４及び６０７内の配列番号６３４、
・ 配列番号６０５、６０６及び６０８内の配列番号６４６、
・ 配列番号６０３、６０４、６０６及び６０８内の配列番号６３６、
・ 配列番号６０５内の配列番号６１４、並びに
・ 配列番号６０７内の配列番号６２０。

図２Ｂ及び２Ｃの配列アラインメントは、（図２Ａ中の配列番号５９９の付番を用いて）Ｑ_１６７／Ｐ_１６８及び／又はＧ_１８３／Ｓ_１８４におけるさらに可能な２個の挿入部位を示唆する。これらの位置は、並べられたＩｇＡとＩｇＭの配列中に存在する２及び３個の挿入残基があるＩｇＧ配列中のギャップに相当する。他の好ましい挿入部位は図２Ａ中の配列に対応する。好ましい挿入部位は図２Ｂ及び２Ｃの下線部であり、以下の通りである。
・ 配列番号６０３及び６０４中のＨ_５３／Ｅ_５４、
・ 配列番号６０５中のＨ_１００／Ｅ_１０１、
・ 配列番号６０６中のＨ_４９／Ｅ_５０、
・ 配列番号６０７中のＱ_５０／Ｅ_５１、
・ 配列番号６０８中のＨ _６５ ／Ｅ _６６ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＹ_８１／Ｎ_８２、
・ 配列番号６０５中のＦ_１２８／Ｎ_１２９、
・ 配列番号６０６中のＦ_７７／Ｎ_７８、
・ 配列番号６０７中のＦ_７８／Ｎ_７９、
・ 配列番号６０８中のＦ _９３ ／Ｎ _９４ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＮ_１１０／Ｋ_１１１、
・ 配列番号６０５中のＮ_１５７／Ｋ_１５８、
・ 配列番号６０６中のＮ_１０６／Ｋ_１０７、
・ 配列番号６０７中のＮ_１０７／Ｋ_１０８、
・ 配列番号６０８中のＮ _１２２ ／Ｋ _１２３ 、
・ 配列番号６０３及び６０４各中の、Ｌ_１４３／Ｔ_１４４ 及びＭ _１４３ ／Ｔ _１４４ 、
・ 配列番号６０５中のＭ_１９０／Ｔ_１９１、
・ 配列番号６０６中のＭ_１３９／Ｔ_１４０、
・ 配列番号６０７中のＭ_１４０／Ｔ_１４１、
・ 配列番号６０８中のＭ _１５７ ／Ｔ _１５８ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＱ_１７１／Ｐ_１７２、
・ 配列番号６０５中のＱ_２１８／Ｐ_２１９、
・ 配列番号６０６中のＱ_１６７／Ｐ_１６８、
・ 配列番号６０７中のＱ_１６８／Ｐ_１６９、
・ 配列番号６０８中のＱ _１８５ ／Ｐ _１８８ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＥ_１７３Ｎ_１７４、
・ 配列番号６０５中のＥ_２２０／Ｎ_２２１、
・ 配列番号６０６中のＥ_１６９／Ｎ_１７０、
・ 配列番号６０７中のＥ_１７０／Ｎ_１７１、
・ 配列番号６０８中のＥ _１８９ ／Ｎ _１９０ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＳ _１８５ ／Ｄ _１８６ 、
・ 配列番号６０５中のＳ_２３２／Ｄ_２３３、
・ 配列番号６０６中のＳ_１８１／Ｄ_１８２、
・ 配列番号６０７中のＳ_１８２／Ｄ_１８３、
・ 配列番号６０８中のＳ _２０１ ／Ｄ _２０２ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＧ _１８７ ／Ｓ _１８８ 、
・ 配列番号６０５中のＧ_２３４／Ｓ_２３５、
・ 配列番号６０６中のＧ_１８３／Ｓ_１８４、
・ 配列番号６０７中のＧ_１８４／Ｓ_１８５、
・ 配列番号６０８中のＧ _２０３ ／Ｓ _２０７ 、
・ 配列番号６０３及び６０４中のＧ_２０５／Ｎ_２０６、
・ 配列番号６０５中のＧ_２５２／Ｎ_２５３、
・ 配列番号６０６中のＧ_２０１／Ｎ_２０２、
・ 配列番号６０７中のＧ_２０２／Ｎ_２０３、並びに
・ 配列番号６０８中のＧ _２２４ ／Ｎ _２２５ 。

図２Ｄは、ペプチボディプラットフォームに使用するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（Ａｍｇｅｎ Ｆｃ、配列番号６０９）と、ＦｃＲｎ／Ｆｃ複合体の結晶構造由来のラットＩｇＧ２Ａ（１Ｉ１Ａ．ｐｄｂ、配列番号６１０とのアラインメントを示す図である。得られたコンセンサス配列（配列番号６１１）も示す。

図３Ａは、ミオスタチン結合ペプチド（配列番号３６５）が挿入されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号６１２）を示す図である。以下、この分子を「ミオスタチンループペプチボディ」又は「Ｆｃループ−ｍｙｏ７」と記述する。挿入ペプチドを太字で示し、グリシンリンカーをイタリック体で示す。

図３Ｂは、ＴＮ８−１９−０７と記述されるＣ末端連結ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１３）を示す図である。このペプチボディは、Ｆｃループ−ｍｙｏ７と同じペプチド配列を含む（配列番号３６５）。ＴＮ８−１９−０７ペプチドを太字で示し、グリシン及びアラニンの各リンカーをイタリック体で示す。

図３Ｃは、Ｆｃループ−ＥＭＰと以下で記述するＦｃ内部ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１５）を示す図である。このペプチボディはＥＰＯ様ペプチド（配列番号２）を含む。挿入ペプチドを太字で示し、グリシンリンカーをイタリック体で示す。ジスルフィド結合を形成するシステインには下線が引かれている。

図３Ｄは、Ｆｃループ−Ａｍｐ２と以下で記述するＦｃ内部ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１６）を示す図である。生理活性ペプチド（配列番号２８）を太字で強調表示し、グリシンリンカーをイタリック体で強調表示する。ＡＭＰ−２ペプチド挿入におけるジスルフィド拘束はない。

図３Ｅは、Ｆｃループ−ＡＭＰ２−２量体と以下で記述するＣ末端連結ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１７）を示す図である。この直列治療ペプチド２量体は、治療ペプチド配列（配列番号２８）を太字で示し、リンカーをイタリック体で示す。この分子は、Ｆｃループ−ＡＭＰ−２中に存在するものと同じペプチド配列の直列ペプチド２量体を含む。

図４Ａ及び４Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％）によってＦｃループ−ｍｙｏ７及びＴＮ８−１９−０７のＥ．コリ中での発現を示す図である。Ｆｃループ−Ｍｙｏ７（＃６９５１）とＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の両方の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性（ｓｏｌ）画分の還元ゲル中の各試料を示す。ＳｅｅＢｌｕｅ及び分子量マーカー（レーン１）、全細胞溶解物（レーン２）、不溶性画分（レーン３）及び不溶性画分（レーン４）。

図５は、Ｆｃループ−Ｍｙｏ７（＃６９５１）及びＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各未精製再折り畳み反応物の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を比較したグラフである。ペプチボディ約１０μｇを再折り畳み反応からＶｙｄａｋ Ｃ４カラム（５μＭ、３００オングストローム、４．６×２５０ｍｍ）に直接充填し、線状４０−５０％ＡＣＮ勾配で０．５％／ｍｉｎで溶出させた。

図６は、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）とカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各最終精製プールの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を比較したグラフである。精製ペプチボディ１０μｇをＶｙｄａｋ Ｃ４カラム（５μＭ、３００オングストローム、４．６×２５０ｍｍ）に充填し、線状４０−５０％ＡＣＮ勾配で０．５％／ｍｉｎで溶出させた。

図７は、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）及びカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各最終精製プールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％ゲル）による分析結果を示す図である。各試料５μｇを以下の通り充填した：＃６９５１（レーン１）、＃６８２６（レーン２）、ＳｅｅＢｌｕｅ＋マーカー（レーンＭ）、還元＃６９５１（レーン３）、還元＃６８２６（レーン４）。

図８は、ミオスタチン抑制性化合物を測定するインビトロ細胞系バイオアッセイを示すグラフである。ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）は、カルボキシ末端ＴＮ８−１９−０７ペプチボディ（＃６８２６）と比較して十分な抑制活性を保持する。

図９は、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）及びカルボキシ末端ＴＮ８−１９−０７ペプチボディ（＃６８２６）に対するインビボ安定性試験のウエスタンブロット分析結果を示す図である。５匹のマウスから得た血清プールを各時点（０、４、２４及び４８時間）で評価した。レーン１−３はそれぞれ２ｎｇ、５ｎｇ及び１０ｎｇのＦｃループＴＮ８−１９−０７標準である。レーン４と５は４時間におけるそれぞれＦｃループペプチボディ対カルボキシ末端ペプチボディである。レーン６と７は２４時間におけるそれぞれＦｃループペプチボディ対カルボキシ末端ペプチボディである。レーン８と９は４８時間におけるそれぞれＦｃループペプチボディ対カルボキシ末端ペプチボディである。レーン１０−１２は、それぞれ２ｎｇ、５ｎｇ及び１０ｎｇのカルボキシ末端ペプチボディ標準である。ゲルは、ＭＥＳ還元緩衝剤中で実施した１ｍｍ ４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ウエスタンブロットをヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＨＲＰ複合体を用いて展開した。

図１０Ａは、Ａｎｇ２結合ペプチド（配列番号１４７）が挿入されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号６１８）を示す図である。以下、この分子を「Ａｎｇ２ループペプチボディ」又は「Ｆｃループ−Ａｎｇ２」と記述する。生理活性ペプチドを太字で強調表示し、グリシンリンカーをイタリック体で強調表示する。

図１０Ｂは、本明細書ではＴＮ８−Ｃｏｎ４と記述するＣ末端連結ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１９）を示す図である。この分子は、Ｆｃループ−ａｎｇ２と同じペプチド配列を含む（配列番号１４７）。生理活性ペプチドを太字で強調表示し、グリシン及びアラニンの各リンカーをイタリック体で強調表示する。

図１１は、ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）及びカルボキシ末端ＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の各ペプチボディのＥ．コリ中での発現及び分布をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示す図である。Ｆｃループ−Ｔｎ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）とＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の両方の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性（ｓｏｌ）画分の還元ゲル中の各試料を示す。

図１２は、ＦｃループＡｎｇ２（＃６８８８）とカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃５５６４）の各再折り畳み反応物のＲＰ−ＨＰＬＣを比較したグラフである。再折り畳み反応物２０μｌをＶｙｄａｋ Ｃ４カラム（５μＭ、３００オングストローム、４．６×２５０ｍｍ）に充填し、線状４０−５０％ＡＣＮ勾配で０．５％／ｍｉｎで溶出させた。

図１３は、ＦｃループＡｎｇ２（＃６８８８）とカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の各最終精製プールのＲＰ−ＨＰＬＣを比較したグラフである。精製ペプチボディ１０μｇをＶｙｄａｋ Ｃ４カラム（５μＭ、３００オングストローム、４．６×２５０ｍｍ）に充填し、線状４０−５０％ＡＣＮ勾配で０．５％／ｍｉｎで溶出させた。

図１４は精製Ｆｃループ−ｍｙｏ７及びＴＮ８−１９−７を示す図である。

図１５はＦｃループ−ａｎｇ２及びＦｃ−ａｎｇ２−直列のＢｉａｃｏｒｅ結合分析結果を示すグラフである。

図１６は、Ｆｃループ−ａｎｇ２、ＴＮ８−Ｃｏｎ４及びＦｃ−ａｎｇ２−直列のインビトロ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図である。

図１７は、Ｆｃループ−ＥＭＰのＵＴ７エリスロポイエチン増殖アッセイの結果を示す図である。このアッセイでは、２個の異なるＦｃループ−ＥＭＰ分子の活性をエポエチンアルファの活性と比較する。

図１８は、ＦｃループＴＮ８−Ａｍｐ２（＃６８７５）ペプチボディのＥ．コリ中での発現及び分布をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示す図である。Ｆｃループ−Ａｍｐ２（＃６８８８）の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性（ｓｏｌ）画分の還元ゲル中の各試料を示す。

図１９は、ＦｃループＡＭＰ ２（＃６８７５）の最終精製プールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％ゲル）による分析結果を示す図である。レーン２にＦｃループＡＭＰ ２ペプチボディ５μｇを充填した。レーン４に還元ＦｃループＡＭＰ ２ペプチボディ５μｇを充填した。レーン１及び３にＳｅｅＢｌｕｅ及び２種類の分子量マーカーを充填した。

図２０は、ＦｃループＡＭＰ ２（＃６８７５）の最終精製プールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。精製ペプチボディ１０μｇをＶｙｄａｋ Ｃ４カラム（５μＭ、３００オングストローム、４．６×２５０ｍｍ）に充填し、線状４０−５０％ＡＣＮ勾配で０．５％／ｍｉｎで溶出させた。

図２１は、ＦｃループＡＭＰ ２及びＡＭＧ ５３１の各ペプチボディのネズミインビボバイオアッセイ結果を示すグラフである。５０μｇ／ｋｇペプチボディ又は担体のみを単回皮下注射したマウス。アッセイ方法については実施例９を参照されたい。

図２２は、２個の生理活性ペプチドをＦｃループペプチボディに組み込む幾つかの戦略を示す図である。

図２３は、精製Ｆｃループ構築体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。試料（２ｕｇ／レーン）を４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で＋／−還元緩衝剤泳動させた。

図２４はＦｃループ構築体のＲＰ−ＨＰＬＣを示すグラフである。

用語の定義
具体例において特に限定しない限り、本明細書を通して使用する用語を以下の通り定義する。

アミノ酸配列に関連して使用する「含む」という用語は、化合物が所与の配列のＮ末端、Ｃ末端又はその両方に追加のアミノ酸を含むことができることを意味する。

「抗体」又は「抗体ペプチド」とは、無傷の抗体、又は特異的結合に対して無傷の抗体と競合するその結合性フラグメントを指し、キメラ抗体、ヒト化抗体、全ヒト抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。ある実施形態においては、結合性フラグメントを組換えＤＮＡ技術によって生成させる。別の実施形態においては、結合性フラグメントを無傷の抗体の酵素切断又は化学切断によって生成させる。結合性フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖抗体などが挙げられるが、これらだけに限定されない。

「ネイティブＦｃ」という用語は、単量体でも多量体でも、抗体全体を消化して得られ、ループ領域への挿入又はループ領域の置換によってその中にペプチド配列を付加することができる、非抗原結合性フラグメントの配列を含む分子又は配列を指す。ネイティブＦｃの本来の免疫グロブリン源は好ましくはヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれでもよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。ネイティブＦｃは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）及び非共有結合によって２量体又は多量体中に連結させることができる単量体ポリペプチドで構成されている。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて１から４の範囲である。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合２量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０： ４０７１−９を参照されたい。）。本明細書では「ネイティブＦｃ」という用語は、単量体、２量体及び多量体の総称である。

「Ｆｃ変異体」という用語は、ネイティブＦｃから改変されたがサルベージ受容体ＦｃＲｎに対する結合部位を依然として含む分子又は配列を指す。（１９９７年９月２５日に公開された）国際公開第９７／３４６３１号及び国際公開第９６／３２４７８号は、例示的Ｆｃ変異体、及びサルベージ受容体との相互作用を記載している。これらの国際公開を参照により本明細書に組み入れる。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化された分子又は配列を含む。また、ネイティブＦｃは、本発明の融合分子に不要である構造的特徴又は生物活性をもたらすので除去することができる部位を含む。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択宿主細胞との不適合性（３）選択宿主細胞中での発現時のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼす、又はこれらに関与する、１個以上のネイティブＦｃ部位又は残基を欠く、分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体を以下でさらに詳細に述べる。

「Ｆｃドメイン」という用語は、上記ネイティブＦｃ及びＦｃ変異分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及びネイティブＦｃ同様、「Ｆｃドメイン」という用語は、抗体全体から消化されていようと、又は他の手段によって生成されていようと、単量体又は多量体の分子を含む。

Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用する「多量体」という用語は、共有結合した、非共有結合した、又は共有結合性と非共有結合性の両方の相互作用によって結合した、２本以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。ＩｇＧ分子は典型的には２量体を形成し、ＩｇＭは５量体、ＩｇＤは２量体、ＩｇＡは単量体、２量体、３量体又は４量体を形成する。多量体は、ＦｃのネイティブＩｇ源の配列及び生じる活性を活用することによって、又はかかるネイティブＦｃを（以下に定義するように）誘導体化することによって、形成することができる。

Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用する「２量体」という用語は、共有結合又は非共有結合した２本のポリペプチド鎖を有する分子を指す。本発明の範囲内の例示的２量体は米国特許第６，６６０，８４３号、図２に示されている。この特許を参照により本明細書に組み入れる。

「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、それぞれ（１）化合物が環式部分、例えば、化合物内のシステイニル残基間の架橋を有する、（２）化合物が架橋されている、又は架橋部位を有する；例えば、化合物がシステイニル残基を有し、従って培養又はインビボで架橋２量体を形成する、（３）１個以上のペプチジル連結が非ペプチジル連結で置換されている、（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ^１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換若しくは非置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−で置換されている（式中、Ｒ及びＲ^１及び環置換基は以下に定義する通りである。）、（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２又は−ＮＲ^３Ｒ^４で置換されている（式中、Ｒ^２、Ｒ^３及びＲ^４は以下に定義する通りである。）、（６）化合物が個々のアミノ酸部分が選択した側鎖又は末端残基と反応することができる薬剤で処理することによって修飾されている、方法及びこの方法によってもたらされた化合物を含む。誘導体については以下でさらに述べる。

「ポリペプチド」という用語は、かかる分子が膜結合性でない限り、天然に存在してもしなくても、４０個を超えるアミノ酸の分子を指す。例示的なポリペプチドとしては、ＩＬ−１ｒａ、レプチン、可溶性１型及び２型ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ１、ｓＴＮＦ−Ｒ２）、ＫＧＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ダーベポエチン（ｄａｒｂｅｐｏｉｅｔｉｎ）、Ｆａｂ断片などが挙げられる。

「ペプチド」という用語は、２から４０個のアミノ酸の分子を指す。３から２０個のアミノ酸の分子が好ましく、６から１５個のアミノ酸の分子が最も好ましい。例示的なペプチドは、ペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）において実施する上記方法のいずれかによってランダムに生成することができ、又はタンパク質を消化して誘導することができる。

ペプチド配列に関連して用いる「ランダム化」という用語は、（例えば、ファージディスプレイ方法によって選択される）完全なランダム配列、及び天然の分子の１個以上の残基が、天然の分子中のその位置には存在しないアミノ酸残基で置換された配列を指す。ペプチド配列を特定する例示的な方法としては、ファージディスプレイ、Ｅ．コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母スクリーニング、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造解析などが挙げられる。

「薬理学的に活性な」という用語は、そのように記述した物質が、医学的パラメータ（例えば、血圧、血球数、コレステロールレベル）又は病態（例えば、癌、自己免疫異常）に影響を及ぼす活性を有すると判定されることを意味する。従って、薬理学的に活性なペプチドは、以下のアゴニストペプチド又は様ペプチド及びアンタゴニストペプチドを含む。

「様ペプチド」及び「アゴニストペプチド」という用語は、目的タンパク質と相互作用するタンパク質（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ）に類似した生物活性を有するペプチドを指す。これらの用語は、さらに、目的タンパク質の天然リガンドの効果の増強などによって目的タンパク質の活性を間接的に模倣するペプチドも含む。例えば、本明細書の表２及び参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，６６０，８４３号の表７に示すＧ−ＣＳＦ様ペプチドを参照されたい。従って、「ＥＰＯ様ペプチド」という用語は、Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３： ４５８−６３， Ｎａｒａｎｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： ７５６９−７４又はＥＰＯ様対象を含むと認定された表２中の任意の他の参考文献に記載のように特定することができるペプチド、又は誘導することができる任意のペプチドを含む。当業者は、これらの参考文献の各々によって、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従って、その中で実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することができることを理解されたい。

「アンタゴニストペプチド」又は「阻害ペプチド」という用語は、関連する目的タンパク質の生物活性を遮断するペプチド、何らかの方法で妨害するペプチド、又は関連する目的タンパク質の公知アンタゴニスト若しくは阻害剤と類似の生物活性を有するペプチドを指す。従って、「ＴＮＦアンタゴニストペプチド」という用語は、Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５： １２６６−７０又はＴＮＦアンタゴニスト対象を含むと認定された表２中の参考文献のいずれかに記載のように特定することができるペプチド、又は誘導することができるペプチドを含む。当業者は、これらの参考文献の各々によって、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従って、その中で実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することができることを理解されたい。

「ＴＰＯ様ペプチド」という用語は、２０００年５月４日に公開された国際公開第００／２４７７０号に加えて、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １６９６−９、米国特許第５，８６９，４５１号及び同５，９３２，９４６号、２００３年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１７６３５２号、２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１５８９号及びＴＰＯ様対象を含むと認定された表２中の任意の他の参考文献に記載のように特定することができるペプチド、又は誘導することができるペプチドを含む。これらの文献を参照により本明細書に組み入れる。当業者は、これらの参考文献の各々によって、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従って、その中で実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することができることを理解されたい。

「ａｎｇ−２結合ペプチド」という用語は、２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２２９０２３号、７／１７／０３に公開された国際公開第０３／０５７１３４号、２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号及びａｎｇ−２に関係する対象を含むと認定された表２中の任意の他の参考文献に記載のように特定することができるペプチド、又は誘導することができるペプチドを含む。当業者は、これらの参考文献の各々によって、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従って、その中で実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することができることを理解されたい。

「ＮＧＦ結合ペプチド」という用語は、２００４年４月１日に公開された国際公開第０４／０２６３２９号及びＮＧＦに関係する対象を含むと認定された表２中の任意の他の参考文献に記載のように特定することができるペプチド、又は誘導することができるペプチドを含む。当業者は、これらの参考文献の各々によって、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従って、その中で実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することができることを理解されたい。

「ミオスタチン結合ペプチド」という用語は、２００３年１２月１９日に出願された米国特許出願第１０／７４２，３７９号及びミオスタチンに関係する対象を含むと認定された表２中の任意の他の参考文献に記載のように特定することができるペプチド、又は誘導することができるペプチドを含む。当業者は、これらの参考文献の各々によって、異なるペプチドライブラリーを用いて、開示された手順に従って、その中で実際に開示されたものとは異なるペプチドを選択することができることを理解されたい。

また、本発明の化合物の生理学的に許容される塩も本発明に包含される。「生理学的に許容される塩」とは、薬剤として許容されることが知られている、又は将来発見される、あらゆる塩を意味する。幾つかの具体例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩、臭化水素酸塩などのヒドロハロゲン化物（ｈｙｄｒｏｈａｌｉｄｅ）；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩及びシュウ酸塩である。

化合物の構造
一般
本発明に従って調製する構成物においては、ペプチドは、ペプチドのＮ末端又はＣ末端を介してビヒクルに結合することができる。従って、本発明のビヒクル−ペプチド分子は、以下の式Ｉによって記述することができる。

式中、
Ｆ^１はループ領域中に少なくとも１個のＸ^３を含むように修飾されたＦｃドメインであり、
Ｘ^１及びＸ^２は−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３及び−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３−（Ｌ^４）_ｆ−Ｐ^４から各々独立に選択され、
Ｘ^３は−（Ｌ^５）_ｃ−Ｐ^５、−（Ｌ^５）_ｃ−Ｐ^５−（Ｌ^６）_ｄ−Ｐ^６、−（Ｌ^５）_ｃ−Ｐ^５−（Ｌ^６）_ｄ−Ｐ^６−（Ｌ^７）_ｅ−Ｐ^７及び−（Ｌ^５）_ｃ−Ｐ^５−（Ｌ^６）_ｄ−Ｐ^６−（Ｌ^７）_ｅ−Ｐ^７−（Ｌ^８）_ｆ−Ｐ^８から独立に選択され、
Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３及びＰ^４は各々独立に薬理学的に活性なポリペプチド又は薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
Ｐ^５、Ｐ^６、Ｐ^７及びＰ^８は各々独立に薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｌ^５、Ｌ^６、Ｌ^７及びＬ^８は各々独立にリンカーであり、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各々独立に０又は１である。

好ましい実施形態においては、ａとｂはどちらも０である。すなわち、Ｘ^１基とＸ^２基のどちらもＦｃドメインのＮ末端にもＣ末端にも存在しない。

当業者は、１個を超えるＸ^３置換基がＦｃドメイン中に存在することができ、複数のＸ^３置換基が異なることができ、例えば、異なるＰ^５ペプチド、同じペプチド配列に結合した異なるリンカーなどを含むことができることを理解されたい。同様に、Ｘ^１とＸ^２は同じでも異なっていてもよく、整数ｃからｆはＸ^１、Ｘ^２及びＸ^３で異なっていてもよい。

従って、化合物Ｉは、式ＩＩの化合物

及びその多量体（式中、Ｆ^１はＸ^１のＣ末端で結合している。）、
式ＩＩＩの化合物

及びその多量体（式中、Ｆ^１はＸ^２のＮ末端で結合している。）、
式ＩＶの化合物

及びその多量体（式中、Ｆ^１は−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１のＮ末端で結合している。）、
並びに式Ｖの化合物

及びその多量体（式中、Ｆ^１は−Ｌ^１−Ｐ^１−Ｌ^２−Ｐ^２のＮ末端で結合している。）
を含む。

ペプチド
任意の数のペプチドを本発明に関連して使用することができる。好ましいペプチドは、アンジオポエチン−２（ａｎｇ−２）、ミオスタチン、神経成長因子（ＮＧＦ）、腫よう壊死因子（ＴＮＦ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、ＴＡＬＬ−Ｉとも称される。）に結合し、又はＥＰＯ、ＴＰＯ若しくはＧ−ＣＳＦの活性を模倣する。腫ようホーミングペプチド、膜輸送ペプチドなどを含めて、ターゲティングペプチドも興味深い。これらのクラスのペプチドの全てを、本明細書で引用する参考文献及び他の参考文献に記載の方法によって発見することができる。

特にファージディスプレイは、本発明に使用するペプチドの生成に有用である。ランダムペプチドライブラリーからの親和性選択は、任意の遺伝子産物の任意の部位に対するペプチドリガンドの特定に使用することができると述べられてきた。Ｄｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ２３０２５−３０。ファージディスプレイは、細胞表面受容体又は線状エピトープを有するタンパク質のような目的タンパク質に結合するペプチドを特定するのに特に適している。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４： ３１３−２９； Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｔｏｄａｙ ３： ３７０−８。かかるタンパク質は、参照により本明細書に組み入れるＨｅｒｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）， Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＆ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｒｅｓ． １７（５）： ６７１−７７６に広範に概説されている。かかる当該タンパク質は本発明に使用するのに好ましい。

特に好ましいペプチド群は、サイトカイン受容体に結合する群である。サイトカインは、最近、その受容体コードによって分類された。参照により本明細書に組み入れるＩｎｇｌｏｔ （１９９７）， Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ４５： ３５３−７を参照されたい。これらの受容体のうち、最も好ましいのはＣＫＲ（表３のファミリーＩ）である。受容体分類を表３に示す。

本発明におけるペプチド産生用標的としての特定の目的タンパク質としては以下が挙げられる。

αｖβ３
αＶβ１
Ａｎｇ−２
ＢＡＦＦ／ＴＡＬＬ−１
Ｂ７
Ｂ７ＲＰ１
ＣＲＰ１
カルシトニン
ＣＤ２８
ＣＥＴＰ
ｃＭｅｔ
補体因子Ｂ
Ｃ４ｂ
ＣＴＬＡ４
グルカゴン
グルカゴン受容体
ＬＩＰＧ
ＭＰＬ
ミオスタチン
腫よう細胞上で優先的に発現される分子のスプライスバリアント、例えば、ＣＤ４４、ＣＤ３０
ムチン及びＬｅｗｉｓ Ｙ表面糖タンパク質の非グリコシル化変異体
ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４５
前立腺特異的膜抗原及び前立腺特異的細胞抗原
分泌及び膜結合性のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰ−９）
カテプシン
アンジオポエチン−２
ＴＩＥ−２受容体
ヘパラナーゼ
ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ＵＰＡ）、ＵＰＡ受容体
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨ−ＲＩ、ＰＴＨ−ＲＩＩ
Ｈｅｒ２
Ｈｅｒ３
インスリン

本発明の例示的ペプチドは、参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，６６０，８４３号の表４から２０にある。追加の好ましいペプチドは、２００３年１２月１１日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２２９０２３号、２００３年７月１７日に公開された国際公開第０３／０５７１３４号、２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号、２０００年５月４日に公開された国際公開第００／２４７７０号、２００３年９月１８日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１７６３５２号、２００３年４月１７日に公開された国際公開第０３／０３１５８９号、２００３年９月１８日に出願された米国特許出願第１０／６６６，４８０号、２００４年４月１日に公開された国際公開第０４／０２６３２９号、２００３年１２月１９日に出願された米国特許出願第１０／７４２，３７９号、２００３年１２月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０３／４０７８１号にある。これらの各々を参照により本明細書に組み入れる。かかるペプチドは、当分野で開示される方法によって調製することができる。

特に好ましいペプチドを下表に示す。単一文字のアミノ酸略語を使用する。これらのペプチドのいずれも、リンカーを用いて、又はリンカーを用いないで、直列に（すなわち、逐次的に）連結することができる。システイニル残基を含むペプチドは、別のＣｙｓ含有ペプチド又はタンパク質と架橋することができる。１個を超えるＣｙｓ残基を有するペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合も形成することができる。これらのペプチドのいずれも本明細書に記載されたように誘導体化することができる。全てのペプチドは、他に断らない限り、ペプチド結合を介して連結されている。

Ｆｃドメイン
本発明は、ペプチド配列を含むように修飾された少なくとも１個のＦｃドメインが存在する必要がある。

上述したように、ネイティブＦｃとＦｃ変異体のどちらも本発明の範囲内で使用するのに適切なＦｃドメインである。ネイティブＦｃは、サルベージ受容体との結合が維持される限り、本発明によるＦｃ変異体を形成するように大幅に修飾することができる。例えば国際公開第９７／３４６３１号及び国際公開第９６／３２４７８号を参照されたい。かかるＦｃ変異体においては、本発明の融合分子によって必要とされない構造的特徴又は機能的活性をもたらすネイティブＦｃの１個以上の部位を除去することができる。これらの部位は、例えば、残基の置換若しくは除去、部位への残基の挿入、又は部位を含む部分の切断によって除去することができる。挿入又は置換された残基は、ペプチド模倣物、Ｄ−アミノ酸などの変化したアミノ酸とすることもできる。Ｆｃ変異体は、幾つかの理由のために望ましい場合がある。そのうち幾つかを以下に記述する。例示的なＦｃ変異体としては、以下の分子及び配列が挙げられる。

１． ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。かかる除去によって、本発明の分子を生成するのに使用する宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。このために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを切断することができ、又はシステイン残基を欠失させ、若しくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換することができる。特に、Ｎ末端の配列番号５９９の２０アミノ酸セグメントを切断することができ、又は配列番号５９９の７位及び１０位のシステイン残基を欠失させ、若しくは置換することができる。システイン残基を除去するときでも、単鎖Ｆｃドメインは、非共有結合した２量体Ｆｃドメインを依然として形成することができる。

２． ネイティブＦｃは、選択宿主細胞にさらに適合するように修飾される。例えば、典型的なネイティブＦｃのＮ末端近くのＰＡ配列を除去することができる。ＰＡ配列は、プロリンイミノペプチダーゼなどのＥ．コリ中の消化酵素によって認識することができる。分子がＥ．コリなどの細菌細胞中で組換え発現されるときには特に、Ｎ末端メチオニン残基を付加することもできる。配列番号５９９のＦｃドメイン（図２Ａ）はかかる１つのＦｃ変異体である。

３． ネイティブＦｃのＮ末端部分は、選択宿主細胞中で発現されるときには、Ｎ末端の不均一性を防止するために除去される。このために、Ｎ末端の第１の２０アミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４及び５位のアミノ酸残基を欠失させることができる。

４． １個以上のグリコシル化部位は除去される。典型的にはグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解性応答を与える恐れがある。かかる残基は、欠失させることができ、又は非グリコシル化残基（例えば、アラニン）で置換することができる。

５． Ｃ１ｑ結合部位など補体との相互作用に関与する部位は除去される。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させることができ、又は置換することができる。補体動員は、本発明の分子では有利でない場合もあり、かかるＦｃ変異体を用いて回避することができる。

６． サルベージ受容体以外のＦｃ受容体との結合に影響を及ぼす部位は除去される。ネイティブＦｃは、ある種の白血球との相互作用部位を有し得る。この部位は、本発明の融合分子には不要であり、従って除去することができる。

７． ＡＤＣＣ部位は除去される。ＡＤＣＣ部位は当分野で公知である。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関してはＭｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９（５）： ６３３−９（１９９２）を参照されたい。これらの部位も、本発明の融合分子には不要であり、従って除去することができる。

８． ネイティブＦｃが非ヒト抗体に由来するときには、ネイティブＦｃをヒト化することができる。典型的には、ネイティブＦｃをヒト化するために、非ヒトネイティブＦｃ中の選択残基をヒトネイティブＦｃ中に通常存在する残基で置換する。抗体のヒト化技術は当分野で周知である。

好ましいＦｃ変異体は以下を含む。配列番号５９９（図２Ａ）においては、１５位のロイシンをグルタミン酸で置換することができ、９９位のグルタミン酸をアラニンで置換することができ、１０１位及び１０３位のリジンをアラニンで置換することができる。また、１個以上のチロシン残基をフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）残基で置換することができる。

追加のビヒクル
米国特許第４，６４０，８３５号、同４，４９６，６８９号、同４，３０１，１４４号、同４，６７０，４１７号、同４，７９１，１９２号及び同４，１７９，３３７号に記載のように、本発明は、さらに、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどの１個以上の水溶性ポリマー付加物を含むように共有結合的に修飾された分子も包含する。当分野で公知のさらに別の有用なポリマーとしては、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物系ポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、これらのポリマーの混合物などが挙げられる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットを用いて共有結合的に修飾されたペプチボディである。水溶性ポリマーは、特定の位置、例えばペプチボディのアミノ末端に結合させることができ、又はポリペプチドの１個以上の側鎖にランダムに結合させることができる。特定の結合剤、例えばペプチボディ、特にヒト化抗体の治療能力を向上させるためにＰＥＧを使用することは、２０００年１０月１７日に発行されたＧｏｎｚａｌｅｓ他の米国特許第６，１３３，４２６号に記載されている。

現在、ビヒクルとして有用である化学成分を結合させる様々な手段が利用可能である。例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開第９６／１１９５３号”Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ”を参照されたい。このＰＣＴ刊行物は、なかでも、タンパク質Ｎ末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示している。

好ましいポリマービヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、任意の好都合な分子量とすることができ、線状でも分枝状でもよい。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤ、より好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤから約２０ｋＤの範囲である。ＰＥＧ基は、一般に、本発明の化合物に、アシル化又は還元的アルキル化によって、ＰＥＧ部分の反応性基（例えば、アルデヒド、マレイミド、アミノ、チオール又はエステル基）を介して、本発明の化合物の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）に結合する。

合成ペプチドのＰＥＧ化に有用な戦略は、溶液中で共役連結を形成することによって、相互に反応する特別な官能基を各々が有するペプチドとＰＥＧ部分とを結合させることからなる。ペプチドは、従来の固相合成によって容易に調製することができる（例えば、図５及び６並びに本明細書中の付随する文章を参照されたい。）。ペプチドは、特定の部位の適切な官能基を用いて「予備活性化される（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ）」。前駆体を精製し、ＰＥＧ部分と反応させる前に十分分析する。ペプチドとＰＥＧの連結は、通常、水相で起こり、分析用逆相ＨＰＬＣによって容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取用ＨＰＬＣによって容易に精製することができ、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって分析することができる。

多糖ポリマーは、タンパク質修飾に使用することができる水溶性ポリマーの別のタイプである。デキストランは、主にα１−６連結によって連結されたグルコースの個々のサブユニットで構成された多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多数の分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、ビヒクルとして、単独で、又は別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて、本発明での使用に適切な水溶性ポリマーである。例えば、国際公開第９６／１１９５３号及び国際公開第９６／０５３０９号を参照されたい。治療又は診断用免疫グロブリンと複合化されたデキストランの使用は、すでに報告されている。例えば、参照により本明細書に組み入れる欧州特許公報第０ ３１５ ４５６号を参照されたい。デキストランを本発明によるビヒクルとして使用するときには、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。

追加のビヒクルは、サルベージ受容体と結合可能である、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又は小分子（例えば、ペプチド模倣化合物）とすることもできる。例えば、１９９８年４月１４日に発行されたＰｒｅｓｔａ他の米国特許第５，７３９，２７７号に記載のポリペプチドをビヒクルとして使用することができる。ペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体との結合についてファージディスプレイによって選択することもできる。かかるサルベージ受容体結合化合物も、本発明における「ビヒクル」の範ちゅうに含まれる。かかるビヒクルは、（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによって）半減期が延長されるかどうかによって、また、（例えば、抗体のヒト化において発見される、非免疫原性配列を優先することによって）免疫原性が減少するかどうかによって、選択すべきである。

リンカー
「リンカー」基は必須でない。存在するときには、主にスペーサーとして働くので、その化学構造は重要ではない。リンカーは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸で構成されることが好ましい。従って、好ましい実施形態においては、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１から２０個のアミノ酸で構成される。アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸から選択される。当業者によって十分理解されるように、これらのアミノ酸の一部はグリコシル化することができる。より好ましい一実施形態においては、１から２０個のアミノ酸をグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択する。さらにより好ましくは、リンカーは、グリシン、アラニンなどの立体障害のないアミノ酸の大多数で構成される。従って、好ましいリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）_４、（Ｇｌｙ）_５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。リンカーの他の具体例は、
（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号５９５）、
（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号５９６）、
（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号５９７）及び
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号５９８）である。

上記命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａの組み合わせも好ましい。本明細書に示すリンカーは例示である。本発明の範囲内のリンカーは、これらよりはるかに長くすることができ、他の残基を含むことができる。

非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２−２０）などのアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えば、Ｃ_１−Ｃ_６） 低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどの非立体障害基で置換することもできる。例示的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーである。

式中、ｎは、リンカーが１００から５０００ｋＤ、好ましくは１００から５００ｋＤの分子量を有するようなものである。ペプチドリンカーは、上述と同様に、改変して誘導体を形成することができる。

誘導体
本発明は、アミノ酸残基の挿入、欠失若しくは置換以外の修飾、又はこれらに加えた修飾を有する分子を含む「誘導体」も提供する。好ましくは、修飾は、本質的に共有結合性であり、例えば、ポリマー、脂質、他の有機成分及び無機成分との化学結合が挙げられる。本発明の誘導体は、分子の循環半減期を延長するように、所望の細胞、組織若しくは器官に対する分子のターゲティング能力を改善するように、分子の溶解性若しくは吸収を改善するように、又は分子の望ましくない副作用を除去若しくは減弱するように、調製することができる。例示的な誘導体としては、以下の化合物が挙げられる。

１． 化合物又はその一部が環式である。例えば、ジスルフィド結合の形成によって環化することができる２個以上のＣｙｓ残基を（例えば、リンカー中に）含むようにペプチド部分を修飾することができる。環化誘導体の調製に関する参考文献の引用については表２を参照されたい。

２． 化合物は架橋され、又は分子間架橋可能にされる。例えば、ペプチド部分は、１個のＣｙｓ残基を含み、それによって類似分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾することができる。化合物は、下記分子のように、そのＣ末端を介して架橋することもできる。

３． １個以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）は、非ペプチジル連結で置換される。例示的な非ペプチジル結合は、−ＣＨ_２−カルバメート［−ＣＨ_２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホナート、−ＣＨ_２−スルホンアミド［−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ_２−第二級アミン及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６−（式中、Ｒ^６は低級アルキルである。）］である。

４． Ｎ末端は誘導体化される。典型的には、Ｎ末端は、アシル化することができ、又は置換アミンに改変することができる。例示的なＮ末端の誘導体基としては、（−ＮＨ_２以外の）−ＮＲＲ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、コハク酸イミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）が挙げられる。式中、Ｒ及びＲ^１は各々独立に水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１から３個の置換基で置換することができる。

５． 自由Ｃ末端は誘導体化される。典型的には、Ｃ末端はエステル化又はアミド化される。例えば、当分野で記述されている方法を用いて（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）_２を本発明の化合物に付加することができる。同様に、当分野で記述されている方法を用いて−ＮＨ_２を本発明の化合物に付加することができる。例示的なＣ末端誘導基としては、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２（式中、Ｒ^２は低級アルコキシである。）又は−ＮＲ^３Ｒ^４（式中、Ｒ^３及びＲ^４は独立に水素又はＣ_１−Ｃ_８アルキル（好ましくはＣ_１−Ｃ_４アルキル）である。）が挙げられる。

６． ジスルフィド結合は、別の、好ましくはより安定な、架橋成分（例えば、アルキレン）で置換される。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９： ３８１４−９； Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ． Ｐｅｐ． Ｓｙｍｐ．， ３５７−９を参照されたい。

７． １個以上の個々のアミノ酸残基が修飾される。以下に詳述するように、選択側鎖又は末端残基と特異的に反応する様々な誘導体化剤（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が知られている。

リシニル残基及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させることができる。これによって、リシニル残基の電荷は逆転する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬としては、メチルピコリンイミダートなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオン、グリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応などが挙げられる。

アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンを含めて、幾つかの従来の試薬のいずれか１種類又は組み合わせと反応させることによって修飾することができる。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いので、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。また、これらの試薬は、リジン基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応させることができる。

チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチロシル残基に導入することに特に関心を集めて、広範に研究されてきた。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）及びテトラニトロメタンを用いて、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。

カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾することができる。また、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、脱アミドして、対応するグルタミル及びアスパルチル残基にすることができる。或いは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲内である。

システイニル残基は、ジスルフィド結合を除去するために、又は逆に架橋を安定化するために、アミノ酸残基又は他の成分で置換することができる。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９： ３８１４−９を参照されたい。

二官能性薬剤を用いた誘導体化は、ペプチド又はその機能的誘導体を水不溶性支持マトリックス又は他の巨大分子ビヒクルに架橋させるのに有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）などのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。或いは、米国特許第３，９６９，２８７号、同３，６９１，０１６号、同４，１９５，１２８号、同４，２４７，６４２号、同４，２２９，５３７号及び同４，３３０，４４０号に記載の臭化シアン活性化炭水化物、反応性基質などの反応性水不溶性マトリックスをタンパク質の固定に使用する。

炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に好都合には結合させることができる。一般に、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸とすることができる。）の一部であるときには、Ｏ連結オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合しているのに対して、Ｎ連結オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合している。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の１９種類の天然アミノ酸の１つである。各タイプにおいて存在するＮ連結及びＯ連結オリゴ糖並びに糖残基の構造は異なる。両方で一般に存在する糖の１タイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と記述する。）である。シアル酸は、通常、Ｎ連結とＯ連結の両方のオリゴ糖の末端残基であり、その負電荷のために、グリコシル化化合物に酸性の諸性質を付与することができる。かかる部位は、本発明の化合物のリンカーに組み込むことができ、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞中で）ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によってグリコシル化される。しかし、かかる部位は、さらに、当分野で公知の合成又は半合成手順によってもグリコシル化することができる。

他の可能な修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化などが挙げられる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）， ｐｐ．７９−８６（１９８３）。

かかる誘導体化成分は、好ましくは、化合物の抗血管形成活性、溶解性、吸収、生物学的半減期などを含めて、１つ以上の特性を改善する。或いは、誘導体化成分は、誘導体化しない化合物の同じ又は本質的に同じ諸特性及び／又は諸性質を有する化合物をもたらすことができる。或いは、誘導体化成分は、化合物などの望ましくない副作用を除去又は減弱することができる。

本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変えることができる。化合物の任意の部分のＤＮＡ配列は、選択した宿主細胞にさらに適合するコドンに変えることができる。好ましい宿主細胞であるＥ．コリの場合、最適化コドンは当分野で公知である。コドンは、制限酵素切断部位を除去するように、又は選択宿主細胞中のＤＮＡのプロセシングに役立ち得るサイレントな制限酵素切断部位を含むように、置換することができる。ビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は、上記配列変化のいずれかを含むように修飾することができる。

同位体複合誘導体及び毒素複合誘導体有用な誘導体の別のセットは、毒素、トレーサー又は放射性同位体と複合化された上記分子である。かかる複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、腫よう細胞又は病原体に結合するペプチド配列を含む分子に特に有用である。かかる分子は、治療薬として、又は手術（例えば、免疫ＲＩガイド手術又はＲＩＧＳ）の補助として、又は診断薬（例えば、放射免疫診断又はＲＩＤ）として使用することができる。

治療薬として、これらの複合誘導体は幾つかの利点を有する。これらの複合誘導体は、ペプチド配列によってもたらされる特異的結合なしで投与すると毒性がある、毒素及び放射性同位体の使用を容易にする。これらの複合誘導体は、複合相手の有効量を低減することによって、放射及び化学療法の使用に付随する副作用を軽減することができる。

有用である複合相手としては、
・ ^９０イットリウム、^１３１ヨウ素、^２２５アクチニウム、^２１３ビスマスなどの放射性同位体、
・ リシンＡ毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素（例えば、ＰＥ３８、ＰＥ４０）などの微生物由来の毒素など、
・ キャプチャーシステムにおけるパートナー分子（下記参照）、
・ （キャプチャーシステムにおけるパートナー分子又は特に診断用のトレーサーとして有用である）ビオチン、ストレプトアビジン及び
・ 細胞毒性薬（例えば、ドキソルビシン）などが挙げられる。

これらの複合誘導体の１つの有用な適応はキャプチャーシステムにおける使用である。かかるシステムにおいては、本発明の分子は、良性のキャプチャー分子を含む。このキャプチャー分子は、例えば毒素又は放射性同位体を含む、別個のエフェクター分子に特異的に結合することができる。ビヒクル複合分子とエフェクター分子の両方を患者に投与する。かかるシステムにおいては、エフェクター分子は、ビヒクル複合キャプチャー分子に結合したときを除いて、半減期が短く、従って毒性副作用が最小限に抑えられる。ビヒクル複合分子は、比較的長い半減期を有するが、良性で無毒である。両方の分子の特異的結合部分は、公知の特異的結合対の一部（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン）とすることができ、又は本明細書に記載の方法などのペプチド産生方法から得ることができる。

かかる複合誘導体は、当分野で公知の方法によって調製することができる。タンパク質エフェクター分子（例えば、シュードモナス内毒素）の場合には、かかる分子は、相応するＤＮＡ構築体から融合タンパク質として発現させることができる。放射性同位体複合誘導体は、例えばＢＥＸＡ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ）に対して記述されたように、調製することができる。細胞毒性薬又は微生物毒素を含む誘導体は、例えばＢＲ９６抗体（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）に対して記述されたように、調製することができる。キャプチャーシステムに用いる分子は、例えばＮｅｏＲｘの特許、特許出願及び刊行物によって記述されたように、調製することができる。ＲＩＧＳ及びＲＩＤに用いる分子は、例えばＮｅｏＰｒｏｂｅの特許、特許出願及び刊行物によって記述されたように、調製することができる。

複合誘導体を調製する方法も企図される。例えば、腫よう細胞は、その正常な対応細胞上に存在しないエピトープを提示する。かかるエピトープは、例えば、その急速な増殖に起因する異なる翻訳後修飾を含む。従って、本発明の一態様は、
ａ）標的エピトープに特異的に結合する少なくとも１種類のランダムペプチドを選択すること、及び
ｂ）（ｉ）少なくとも１種類のビヒクル（Ｆｃドメインが好ましい。）と、（ｉｉ）選択ペプチド又はペプチドの少なくとも１個のアミノ酸配列と、（ｉｉｉ）エフェクター分子とを含む薬剤を調製すること
を含む方法である。

標的エピトープは、好ましくは、腫よう特異的エピトープ又は病原体に特異的なエピトープである。エフェクター分子は、上記複合相手のいずれかとすることができ、好ましくは放射性同位体である。

変異体
変異体も本発明の範囲に含まれる。変異体に含まれるのは、挿入、欠失及び置換の変異体である。本発明の特定の分子は、１種類、２種類又は全３種類の変異体を含むことができると理解される。挿入及び置換変異体は、天然アミノ酸、（下記の）特殊なアミノ酸又はその両方を含むことができる。

一例において、天然アミノ酸又は特殊アミノ酸の１個以上のアミノ酸残基がペプチド又はペプチボディアミノ酸配列を補う挿入変異体を提供する。挿入は、タンパク質の一方若しくは両方の末端に位置することができ、又はペプチボディアミノ酸配列の内部領域内に位置することができる。一方若しくは両方の末端に追加の残基を有する挿入変異体としては、例えば、融合タンパク質及びアミノ酸タグ又は標識を含むタンパク質が挙げられる。挿入変異体としては、１個以上のアミノ酸残基がペプチド又はペプチボディアミノ酸配列又はそれらの断片に付加したペプチド及びペプチボディなどが挙げられる。

本発明の変異体は、リーダー又はシグナル配列が除去された、成熟ペプチド及びペプチボディも含む。生成したタンパク質は追加のアミノ末端残基を有する。このアミノ酸は天然でも非天然でもよい。２位及び１位に追加のメチオニン及びリジン残基を有する具体的な結合剤（Ｍｅｔ^２−Ｌｙｓ^−１−）と同様に、アミノ酸位置１に追加のメチオニル残基を有する（ペプチボディなどの）本発明の分子（Ｍｅｔ１−ペプチボディ）が企図される。追加のＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（又は一般に１個以上の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞中での組換えタンパク質産生を増加させるのに特に有用である。

本発明は、特定の発現系を使用して生じる、追加のアミノ酸残基を有する変異体も包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する市販ベクターは、所望のポリペプチドからＧＳＴ成分を切断した後、アミノ酸位置１に追加のグリシン残基を有する所望のポリペプチドを与える。ポリヒスチジンタグがアミノ酸配列の一般にカルボキシ及び／又はアミノ末端においてアミノ酸配列に組み込まれた変異体を含めて、他のベクター系における発現から得られる変異体も企図される。

挿入変異体は、ペプチド又はペプチボディのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端が別のポリペプチドと、その断片と又は特定のタンパク質配列の一部であるとは一般に認識されないアミノ酸と融合した、融合タンパク質も含む。かかる融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域などの循環半減期の長いタンパク質、マーカータンパク質、所望のペプチド又はペプチボディの精製を容易にするタンパク質又はポリペプチド、及び（２量体形成／安定性に有用であるロイシンジッパーモチーフなどの）多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列である。

このタイプの挿入変異体は、一般に、第２のポリペプチドの全部又は部分にＮ又はＣ末端で連結された、ネイティブ分子の全部又はかなりの部分を有する。例えば、融合タンパク質は、典型的には他の種由来のリーダー配列を用いて、異種宿主中でタンパク質を組換え発現させる。別の有用な融合タンパク質としては、融合タンパク質の精製を容易にする、抗体エピトープなどの免疫学的に活性なドメインの付加などが挙げられる。融合部に、又は融合部の近くに切断部位を介在させると、精製後の異質ポリペプチドの除去が容易になる。他の有用な融合としては、酵素由来の活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル又は膜貫通領域などの機能的ドメインの連結が挙げられる。

本発明に使用することができる様々な市販融合タンパク質発現系がある。特に有用な系としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの系は、ペプチド又はペプチボディの活性に大きな影響を及ぼしそうにない少数の追加のアミノ酸のみを有する組換えペプチド及び／又はペプチボディを産生することができる。例えば、ＦＬＡＧ系と６ｘＨｉｓ系のどちらも短配列しかその天然の高次構造に付加しない。この短配列のどちらも抗原性が低いことが知られており、ポリペプチドの折り畳みに悪影響を及ぼさない。有用であると予想される別のＮ末端融合は、タンパク質又はペプチドのＮ末端領域におけるＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。かかる融合は、タンパク質発現又は活性における有利な増加をもたらし得る。

他の融合系は、所望のペプチド又はペプチボディから融合相手を切除することが望ましいものであるポリペプチドハイブリッドを産生する。一実施形態においては、融合相手は、特定のプロテアーゼ認識配列を含むペプチド配列によって組換えペプチボディに連結される。適切な配列の例は、タバコエッチ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ）ウイルスプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）又は第Ｘ因子ａ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）によって認識される配列である。

本発明はまた、切断型組織因子（ｔＴＦ）と組み合わせて本発明のペプチボディ又はペプチドの全部又は一部を含む融合ポリペプチドを提供する。ｔＴＦは、腫よう血管凝固剤として働くヒト凝固誘導タンパク質の切断型からなる血管ターゲティング剤であり、米国特許第５，８７７，２８９号、同６，００４，５５５号、同６，１３２，７２９号、同６，１３２，７３０号、同６，１５６，３２１号及び欧州特許第０９８８０５６号に記載されている。抗Ａｎｇ−２ペプチボディ若しくはペプチド又はその断片とｔＴＦの融合によって標的細胞への抗Ａｎｇ−２の送達が容易になる。

別の態様においては、本発明は、ペプチド又はペプチボディ中の１個以上のアミノ酸残基が除去された欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチボディの一端若しくは両末端において、又はペプチボディアミノ酸配列中の１個以上の残基の除去から、生じさせることができる。欠失変異体は、ペプチド又はペプチボディの全ての断片を必ず含む。

さらに別の態様においては、本発明は、本発明のペプチド及びペプチボディの置換変異体を提供する。置換変異体としては、１個以上のアミノ酸残基が除去され、１個以上の天然でも非天然でもよい代替アミノ酸で置換されたペプチド及びペプチボディが挙げられる。置換変異体は、２個の分子が同一アミノ酸をある割合で含む点で元のペプチド又はペプチボディと「類似」したペプチド又はペプチボディを産生する。置換変異体は、ペプチド又はペプチボディ内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個のアミノ酸の置換を含む。置換数は、ペプチド又はペプチボディのアミノ酸の１０パーセント以上までとすることができる。一態様においては、置換は本質的に保存的であるが、本発明は、非保存的である置換及び特殊なアミノ酸を含む置換も包含する。

関係するペプチド及びペプチボディの同一性及び類似度は、公知の方法によって容易に計算することができる。かかる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９８８）に記載の方法などが挙げられるが、これらだけに限定されない。

２個のペプチド若しくはポリペプチド又はポリペプチドとペプチドの関連性又は同一割合を求める好ましい方法は、試験配列間の最大一致を生じるように設計される。同一性を求める方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記述されている。２個の配列間の同一性を求めるのに好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １２：３８７（１９８４）； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０（１９９０））を含めて、ＧＣＧプログラムパッケージなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他の出所（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， 同上（１９９０））から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて同一性を求めることもできる。

２個のアミノ酸配列を整列させるある種のアラインメントスキームは、２個の配列の短い領域のみの一致を生じる場合がある。この小さな整列領域は、２個の完全長配列間に重要な関係が存在しない場合でも極めて高い配列同一性を有する場合がある。従って、ある実施形態においては、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、比較する標的ポリペプチドの完全長の少なくとも１０パーセント、すなわち、少なくとも４００個からなるアミノ酸の配列を比較する場合には少なくとも４０個の隣接アミノ酸、少なくとも３００から約４００個からなるアミノ酸の配列を比較する場合には少なくとも３０個の隣接アミノ酸、２００から約３００個からなるアミノ酸の配列を比較する場合には少なくとも２０個の隣接アミノ酸、及び約１００から２００個からなるアミノ酸の配列を比較する場合には少なくとも１０個の隣接アミノ酸にわたるアラインメントを生じる。

例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、配列同一性割合を求めようとする２個のポリペプチドをそれぞれのアミノ酸が最適一致するように整列させる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン（ｍａｔｃｈｅｄ ｓｐａｎ）」）。ある実施形態において、ギャップ開始ペナルティ（典型的には平均対角線の３倍として計算される。「平均対角線」は使用する比較マトリックスの対角線の平均である。「対角線」は、特定の比較マトリックスによって各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数値である。）及びギャップ伸長ペナルティ（通常はギャップ開始ペナルティの１／１０である。）並びにＰＡＭ ２５０、ＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスをアルゴリズムと併せて使用する。ある実施形態においては、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ５（３）（１９７８）を参照されたい。ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照されたい。）もアルゴリズムによって使用される。

ある実施形態において、ポリペプチド配列比較のパラメータとして以下のものが挙げられる。

アルゴリズム： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８：４４３−４５３（１９７０）、
比較マトリックス： Ηｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，同上（１９９２）のＢＬＯＳＵＭ ６２、
ギャップペナルティ： １２
ギャップ長ペナルティ： ４
類似度のしきい値： ０
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いると有用となり得る。ある実施形態においては、上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較のデフォルトパラメータ（末端ギャップに対するペナルティなし。）である。

ある実施形態においては、（アミノ酸配列に対して）ポリヌクレオチド分子配列の比較のパラメータとして以下のものが挙げられる。

アルゴリズム： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，同上（１９７０）、
比較マトリックス： 一致＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ： ５０
ギャップ長ペナルティ： ３
ＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いても有用となり得る。上記パラメータは、ポリヌクレオチド分子比較のデフォルトパラメータである。

Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ９， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ， １９９７に記載のものを含めて、他の例示的アルゴリズム、ギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似度のしきい値などを使用することができる。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、ＤＮＡとＤＮＡ、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡなど、さらには、比較が（ＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが一般に好ましい）所与の配列対間でも、（ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）一配列と大きい配列データベースとの間でも、なされる具体的比較に応じて決まる。

本明細書では、２０種類の従来のアミノ酸及びその略語は、従来の用法に従う。参照により本明細書に組み入れる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｅ．Ｓ． Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ． Ｇｒｅｎ， Ｅｄｓ．， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。

アミノ酸は、Ｌ配置でもＤ配置でもよく（ＬでもＤでもないＧｌｙを除く。）、本発明のポリペプチド及び構成物は、立体配置の組み合わせを含むことができる。しかし、Ｌ配置が好ましい。本発明は、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端までの配列が逆である逆分子も提供する。例えば、通常の配列がＸ_１−Ｘ_２−Ｘ_３である分子の逆はＸ_３−Ｘ_２−Ｘ_１である。本発明は、上記のように、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端までの配列が逆であり、通常「Ｌ」鏡像異性体である残基が「Ｄ」立体異性体に変わった、レトロ逆分子（ｒｅｔｒｏ−ｒｅｖｅｒｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）も提供する。

２０種類の従来のアミノ酸、α−，α−二置換アミノ酸などの異常アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の特殊なアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドに適切な成分とすることができる。特殊アミノ酸の例としては、アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、ベータ−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ ａｃｉｄ）、アミノヘプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン（ｅｔｈｙｌａｓｐａｒｇｉｎｅ）、ヒドロキシリジン（ｈｙｒｏｘｙｌｙｓｉｎｅ）、アロヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン（ｏｒｉｔｈｉｎｅ）、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、他の類似のアミノ酸及びアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。

同様に、別段の記載がないかぎり、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を５’方向と記述する。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’の付加方向を転写方向と記述する。ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流の配列」と記述する。ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流の配列」と記述する。

アミノ酸残基は、その共通側鎖の諸特性に基づくクラスに分類できることを理解されたい。

１． 中性疎水性：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）及びメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）。

２． 中性極性：グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｕ；Ｑ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）及びノルロイシン。

３． 酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；
４） 塩基性：リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）。

Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）， ｐ．１１を参照されたい。

保存的アミノ酸置換は、特殊アミノ酸残基を包含することができる。特殊アミノ酸残基は、典型的には、生体系における合成ではなく、化学ペプチド合成によって組み込まれる。特殊アミノ酸残基としては、ペプチド模倣物、アミノ酸成分の他の逆又は裏返しの形などが挙げられるが、これらだけに限定されない。非保存的置換は、これらのクラスの１つのアミノ酸残基と別のクラスのアミノ酸残基との交換を含むことができる。

かかる変化を起こす際には、ある実施形態によれば、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている。疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。

相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は当分野では理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸を置換することができ、それでもなお類似の生物活性を保持することが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、ある実施形態においては、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換を含む。ある実施形態においては±１以内であるアミノ酸の置換を含み、ある実施形態においては±０．５以内であるアミノ酸の置換を含む。

類似アミノ酸の置換は、本例のように、特にそれによって産生される生物学的に機能的であるペプチボディ又はペプチドを免疫学的実施形態に用いようとする場合には、親水性に基づいて効果的に実施することができることも当分野では理解されている。ある実施形態においては、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の局所的な最大平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関がある。

以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化させる際には、ある実施形態においては、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換を含み、ある実施形態においては±１以内であるアミノ酸の置換を含み、ある実施形態においては±０．５以内であるアミノ酸の置換を含む。親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも記述される。

例示的なアミノ酸置換を下記表１０に示す。

当業者は、周知技術を用いて、本明細書に記載のポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。ある実施形態において、当業者は、活性に重要ではないと考えられる領域を標的にすることによって活性を損なわずに変化させることができる適切な分子域を特定することができる。ある実施形態においては、類似のペプチド又はポリペプチド間で保存されている、残基及び分子の一部を特定することができる。ある実施形態において、生物活性又は構造に重要であり得る領域でも、生物活性を損なわずに、又はポリペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換に供することができる。

また、当業者は、活性又は構造に重要である類似のポリペプチド中の残基を特定する構造−機能研究を再検討することができる。かかる比較を考慮して、類似のタンパク質中の活性又は構造に重要であるアミノ酸残基に対応するタンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、予測されたかかる重要なアミノ酸残基を化学的に類似したアミノ酸で置換することを選択することができる。

当業者は、類似のポリペプチドにおいて、その構造に関連して３次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。かかる情報を考慮して、当業者は、その３次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。ある実施形態において、当業者は、タンパク質表面に存在すると予測されたアミノ酸残基に過激な変化を起こさないように選択することができる。というのは、かかる残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において単一のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成させることができる。次いで、当業者に公知の活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることができる。かかる変異体は、適切な変異体についての情報収集に使用することができる。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、損なわれた活性、望ましくない低活性又は不適当な活性をもたらすことを発見した場合には、かかる変化を含む変異体を回避することができる。換言すれば、かかる定常的な実験から収集した情報に基づいて、当業者は、さらなる置換を単独で又は他の変異と組み合わせて回避すべきアミノ酸を容易に決定することができる。

幾つかの科学関係の出版物が二次構造の予測に注力している。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７（４）：４２２−４２７（１９９６）， Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３（２）：２２２−２４５（１９７４）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １１３（２）：２１１−２２２（１９７４）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌａｔ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４７：４５−１４８（１９７８）； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， ２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造予測の支援にコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づくものである。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似度を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、類似の構造形態を有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の進展によって、ポリペプチド又はタンパク質の構造中の可能な折り畳み数を含めて、二次構造の予測性が向上した。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中には限定数の折り畳みが存在し、臨界数の構造が解明されると、構造予測は劇的により正確になることが示唆された（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３６９−３７６（１９９７））。

二次構造を予測するさらに別の方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３７７−８７（１９９７）； Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３：１６４−１７０（１９９１）； Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ．， １８３：１４６−１５９（１９９０）； Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、「進化連鎖」（Ｈｏｌｍ、同上（１９９９）及びＢｒｅｎｎｅｒ、同上（１９９７））などが挙げられる。

ある実施形態においては、ペプチボディ変異体は、Ｎ連結グリコシル化部位などの１個以上のグリコシル化部位がペプチボディに付加したグリコシル化変異体を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とする。ここで、Ｘで示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基とすることができる。この配列を生じるアミノ酸残基の置換又は付加によって、Ｎ連結糖鎖の付加が可能な新しい部位がもたらされる。或いは、この配列を除去する置換によって、既存のＮ連結糖鎖が除去される。１個以上のＮ連結グリコシル化部位（典型的には天然のＮ連結グリコシル化部位）が除去され、１個以上の新しいＮ連結部位が生成する、Ｎ連結糖鎖の再配列ももたらされる。

本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変えることができる。化合物の任意の部分のＤＮＡ配列は、選択した宿主細胞にさらに適合するコドンに変えることができる。好ましい宿主細胞であるＥ．コリの場合、最適化コドンは当分野で公知である。コドンは、制限酵素切断部位を除去するように、又は選択宿主細胞中のＤＮＡのプロセシングに役立ち得るサイレントな制限酵素切断部位を含むように、置換することができる。ビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は、上記配列変化のいずれかを含むように修飾することができる。従って、本明細書において考察する全ての修飾、置換、誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎ）などは、ペプチド、ペプチド２量体及び多量体、リンカー並びにビヒクルを含めて、本発明の全態様に等しく適用される。

親和性成熟
本発明の一実施形態は「親和性成熟」ペプチド及びペプチボディを含む。この手順は、ファージディスプレイ又は他の選択技術を用いて、本発明のペプチド及びペプチボディの親和性又は生理活性を高めることを企図する。（関連ペプチドの集団に対して生成される）コンセンサス配列に基づいて、（コンセンサス配列から決定される）「コア」アミノ酸が一定である、又はその出現度数が偏った、誘導二次ファージディスプレイライブラリー（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を作製することができる。或いは、個々のペプチド配列を用いて、偏った誘導ファージディスプレイライブラリーを作製することができる。かかるライブラリーのパニングによって、標的と強く結合した、又は生理活性の高い、（ペプチボディに転化することができる）ペプチドを得ることができる。

非ペプチド類似体／タンパク質模倣物
また、構造を安定化する、又は生分解を減少させる、ペプチドの非ペプチド類似体も企図される。ペプチド模倣類似体は、選択した抑制性ペプチドに基づいて、１個以上の残基を非ペプチド部分で置換することによって調製することができる。好ましくは、非ペプチド部分によって、ペプチドはその天然の確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を保持することができ、又はＡｎｇ−２を認識し、それに結合する能力を保持する好ましい確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）、例えば生理活性な確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を安定化することができる。一態様においては、生成した類似体／模倣物は、Ａｎｇ−２に対する結合親和性が増加する。非ペプチド模倣類似体をペプチドから調製する方法の一例は、Ｎａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔ． ５７：３５９−３７０（１９９５）に記載されている。必要に応じて、本発明のペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化若しくはリン酸化によって、又は本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル及びＮ−アシル誘導体を生成することによって、修飾することができる。ペプチボディは、他の成分と共有結合性又は非共有結合性複合体を形成することによってペプチド誘導体を生成するように改変することもできる。共有結合複合体は、ペプチボディを構成するアミノ酸の側鎖上の、又はＮ若しくはＣ末端の、官能基に化学成分を連結することによって調製することができる。

特に、ペプチドは、放射性標識、蛍光標識、（例えば、比色定量又は蛍光定量的な反応を触媒する）酵素、基質、固体マトリックス又は担体（例えば、ビオチン又はアビジン）を含めて、但しこれらだけに限定されないレポーター基と複合化することができると予測される。従って、本発明は、ペプチボディ分子を含む分子を提供する。この分子は、好ましくは、さらに、放射性標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス及び担体からなる群から選択されるレポーター基を含む。かかる標識は当業者に周知であり、例えば、ビオチン標識が特に企図される。かかる標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同３，８５０，７５２号、同３，９９６，３４５号及び同４，２７７，４３７号に記載されている。他の有用な標識としては、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識などが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる標識の使用に関する米国特許としては、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同３，８５０，７５２号、同３，９３９，３５０号及び同３，９９６，３４５号が挙げられる。本発明のペプチボディのいずれも、これらの標識のいずれか１つ、２つ又は３つ以上を含むことができる。

製造方法
本発明の化合物は、主として、形質転換宿主細胞中で組換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。このために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。かかるＤＮＡ分子の調製方法は、当分野で周知である。例えば、ペプチドをコードする配列を、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切除することができる。或いは、ＤＮＡ分子をホスホロアミデート法などの化学合成技術によって合成することができる。また、これらの技術を併用することもできる。

本発明は、適切な宿主中でペプチドを発現することができるベクターも含む。ベクターは、適切な発現調節配列に作用可能に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前又は挿入した後に、この作用連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｉｎｇ）をもたらす方法は周知である。発現調節配列としては、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニレーションシグナル、転写又は翻訳の制御に関係する他のシグナルなどが挙げられる。

ＤＮＡ分子を有する生成ベクターを使用して、適切な宿主を形質転換する。この形質転換は、当分野で周知の方法によって実施することができる。

本発明の実施には、多数の利用可能な周知の宿主細胞のいずれかを使用することができる。特定の宿主は、当該技術によって認められる幾つかの要因に応じて選択される。これらの要因としては、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチド回収の容易さ、発現特性、バイオセーフティ及びコストが挙げられる。全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効であり得るとは限らないことを理解した上で、これらの要因のバランスをとらなければならない。これらの一般的指針内で、有用な微生物の宿主としては、（Ｅ．コリ種などの）細菌、（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種などの）酵母及び他の真菌、昆虫、植物、（ヒトを含めた）哺乳動物の培養細胞、当分野で公知の他の宿主などが挙げられる。

次に、形質転換宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように従来の発酵条件下で培養することができる。かかる発酵条件は当分野で周知である。最後に、ペプチドを当分野で周知の方法によって培養物から精製する。

化合物は、合成方法によって製造することもできる。例えば、固相合成技術を使用することができる。適切な技術は当分野で周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９７３）， Ｃｈｅｍ． Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．）； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９６３）， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． １０： ３９４−４１４； Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ （１９６９）， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号； Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｒｄ ｅｄ．） ２： １０５−２５３及びＥｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｒｄ ｅｄ．） ２： ２５７−５２７に記載の技術などが挙げられる。固相合成は、少量のペプチドを製造する最も費用効果の高い方法であるので、個々のペプチドを製造する好ましい技術である。

誘導体化ペプチドを含む化合物又は非ペプチド基を含む化合物は、周知の有機化学反応技術によって合成することができる。

化合物の使用
一般。本発明の化合物は、目的タンパク質の天然リガンドのアゴニスト、模倣物又はアンタゴニストとして、かかる目的タンパク質に結合する能力に起因する薬理活性を有する。具体的化合物の有用性を表２に示す。これらの化合物の活性は、当分野で公知のアッセイによって測定することができる。ＴＰＯ様及びＥＰＯ様化合物の場合、インビボでのアッセイを本明細書の実施例の項でさらに説明する。

治療上の使用に加えて、本発明の化合物は、対象となるその関連タンパク質の機能不全を特徴とする疾患の診断に有用である。一実施形態において、生物学的試料中の活性化可能な目的タンパク質（例えば、受容体）を検出する方法は、（ａ）試料を本発明の化合物と接触させる段階及び（ｂ）化合物による目的タンパク質の活性化を検出する段階を含む。生物学的試料としては、組織標本、無傷細胞、その抽出物などが挙げられる。本発明の化合物は、生物学的試料中の対象となるその関連タンパク質の存在を検出する診断キットの一部として使用することができる。かかるキットは、検出を可能にする結合標識を有する本発明の化合物を用いる。本化合物は、正常又は異常な目的タンパク質の特定に有用である。ＥＰＯ様化合物の場合、例えば、生物学的試料中の対象となる異常タンパク質の存在は、ＥＰＯ受容体の機能不全であると考えられるダイアモンド−ブラックファン貧血のような障害を示している場合がある。

ＥＰＯ様分子の治療上の使用
本発明のＥＰＯ様化合物は、低赤血球レベルを特徴とする障害の治療に有用である。哺乳動物におけるＥＰＯ受容体の内因的活性を調節する方法、好ましくはＥＰＯ受容体の活性を増加させる方法は、本発明に含まれる。一般に、貧血などエリスロポイエチンによって治療可能な症状は、本発明のＥＰＯ様化合物によっても治療することができる。これらの化合物は、治療する症状の性質及び重症度に適切であり、当業者によって確認することができる、量及び送達経路で投与される。投与は、皮下、筋肉内又は静脈内の注射によることが好ましい。

ＴＰＯ様化合物の治療上の使用
ＴＰＯ様化合物の場合、国際公開第９５／２６７４６号「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」に記載のアッセイのような標準アッセイを利用することができる。インビボアッセイも以下の実施例に示す。

治療する症状は、一般に、既存の巨核球／血小板欠乏又は（例えば、計画手術又は血小板供与による）予想される巨核球／血小板欠乏を含む症状である。かかる症状は、通常、活性Ｍｐｌリガンドのインビボでの（一時的又は恒常的）欠乏の結果である。血小板欠乏の一般的用語は血小板減少症であり、従って本発明の方法及び構成物は、一般に、治療が必要な患者における血小板減少症の治療に利用可能である。

血小板減少症（血小板欠乏）は、化学療法及び様々な薬物を用いた他の治療、放射線療法、手術、偶発的な失血、他の具体的症状を含めて、様々な理由によって起こり得る。血小板減少症を含み、本発明に従って治療することができる例示的な具体的症状は、再生不良性貧血、特発性血小板減少症、血小板減少症をもたらす転移性腫よう、全身性エリテマトーデス、ひ腫、ファンコニー症候群、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、メイ−ヘグリン異常、ウィスコット−オールドリッチ症候群及び発作性夜間血色素尿症である。また、ある種のＡＩＤＳ治療も血小板減少症をもたらす（例えば、ＡＺＴ）。ある種の創傷治癒障害も、血小板数の増加による利点を得ることがある。

例えば将来の手術による、予測される血小板欠乏に関しては、本発明の化合物を血小板の必要な数日から数時間前に投与することができる。急性の状況、例えば、偶発的な多量の失血に関しては、本発明の化合物を血液又は精製血小板と一緒に投与することができる。

本発明のＴＰＯ様化合物は、巨核球以外のある種の細胞タイプがＭｐｌ受容体を発現することが判明した場合には、かかる細胞の刺激にも有用であり得る。Ｍｐｌリガンドによる刺激に応答するＭｐｌ受容体を発現する細胞に関連した症状も本発明の範囲内である。

本発明のＴＰＯ様化合物は、血小板若しくは血小板前駆細胞の産生が望まれる、又はｃ−Ｍｐｌ受容体の刺激が望まれる、あらゆる状況において使用することができる。従って、例えば、本発明の化合物は、哺乳動物において血小板、巨核球などを必要とする症状の治療に使用することができる。かかる症状は、以下の例示的な出典、すなわち、国際公開第９５／２６７４６号、同９５／２１９１９号、同９５／１８８５８号、同９５／２１９２０号に詳述されている。これらを本明細書に組み込む。

本発明のＴＰＯ様化合物は、血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の生存度又は貯蔵寿命を維持するのにも有用であり得る。従って、かかる細胞を含む組成物中に１種類以上のかかる化合物の有効量を含めることが有用であり得る。

Ａｎｇ−２結合分子の治療上の使用
Ａｎｇ−２結合活性又は他の細胞活性を調節する薬剤を他の治療薬と併用して、その治療効果を高め、又は起こり得る副作用を減少させることができる。

一態様においては、本発明は、細胞におけるＡｎｇ−２活性の望ましくない又は異常なレベルを特徴とする疾患及び症状の治療に有用である試薬及び方法を提供する。これらの疾患としては、癌、過形成などの他の過剰増殖症状、乾せん、接触性皮膚炎、免疫障害、不妊などが挙げられる。

本発明は、Ａｎｇ−２活性を阻害又は抑制する、ペプチボディなどの特定の結合剤の有効量を動物に投与することを含む、ヒトを含めた動物における癌を治療する方法も提供する。本発明は、さらに、生体系における細胞増殖、侵襲性及び転移の各プロセスを含めて、癌細胞の増殖を阻止する方法も対象とする。方法は、癌細胞増殖の阻害剤として本発明の化合物を使用することを含む。本方法は、哺乳動物などの生きている動物における癌細胞増殖、侵襲性、転移又は腫よう発生の阻害又は抑制に使用することが好ましい。本発明の方法は、アッセイシステムにおける使用、例えば、癌細胞増殖及びその諸性質の分析並びに癌細胞増殖に影響を及ぼす化合物の特定にも容易に適合する。

本発明の方法によって治療可能な癌は、好ましくは哺乳動物において発生する。哺乳動物としては、例えば、ヒト及び他の霊長目、イヌ、ネコなどのペット又は伴侶動物、ラット、マウス、ウサギなどの実験動物並びにウマ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの家畜が挙げられる。

腫よう又は新生物としては、細胞の増殖が抑制されず、進行性である組織細胞の腫ようなどが挙げられる。一部のかかる腫ようは良性であるが、他の腫ようは悪性と称され、生物の死をもたらし得る。悪性新生物又は癌は、攻撃的な細胞増殖を示すことに加えて、周囲組織に侵入し、転移し得る点で、良性腫ようと区別される。さらに、悪性新生物は、分化のより大きな喪失（より大きな脱分化）を示し、相互及びその周囲組織に対するその組織化のより大きな減少を示すことを特徴とする。この特性は「退形成」とも呼ばれる。

本発明によって治療可能な新生物としては、固形腫よう、すなわち、癌腫及び肉腫なども挙げられる。癌腫としては、周囲組織に浸潤（侵入）し、転移する、上皮細胞由来の悪性新生物などが挙げられる。腺癌は、腺組織由来の癌腫、又は認識可能な腺構造を形成する癌腫である。別の癌の広範なカテゴリーとしては、肉腫などが挙げられる。肉腫は、その細胞が胎生結合組織のような原線維物質又は均一物質中に埋め込まれた腫ようである。本発明は、白血病、リンパ腫及び典型的には腫りゅうとして存在しないが、血管又はリンパ細網系中に分布する他の癌を含めて、骨髄系又はリンパ系の癌の治療も可能にする。

従って、発明のａｎｇ−２結合本分子は、固形腫よう及び白血病を含めて、多種多様な癌の治療に有用である。本発明による治療の対象となる癌又は腫よう細胞のタイプとしては、例えば、ＡＣＴＨ産生腫よう；急性リンパ球性白血病；急性非リンパ性白血病；腺腫；副腎皮質癌；乳房、前立腺及び結腸の腺癌；エナメル上皮腫；アプドーマ；ぼうこう癌；脳腫よう；さい腫；乳癌；気管支原性肺癌の全ての形態；カルチノイド心疾患；癌腫（例えば、ウォーカー癌、基底細胞癌、基底へん平細胞癌、ブラウン−ピアス腫よう、腺管癌、エールリッヒ癌、Ｋｒｅｂｓ ２、メルケル細胞腫、粘液癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支癌、へん平上皮癌及び移行上皮癌）；悪性カルチノイド症候群；免疫増生性小細胞肺癌；セメント質腫；子宮頚癌；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；分離腫；慢性リンパ性白血病；慢性骨髄性白血病；結腸直腸癌；脊索腫；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；未分化胚細胞腫；子宮体癌；食道癌；ユーイング肉腫；線維腫；線維肉腫；胆嚢癌；巨細胞腫；神経こう腫；有毛細胞白血病；過誤腫；頭頚部癌；肝細胞癌；組織球性障害；組織球増殖症；ホジキンリンパ腫；カポジ肉腫；腎癌；脂肪腫；脂肪肉腫；肝臓癌；肺癌（小細胞及び非小細胞）；悪性腹水；悪性胸水；黒色腫；間葉細胞腫；中腎腫；中皮腫；多発性骨髄腫；筋肉腫；粘液腫；粘液肉腫；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；歯牙腫；骨腫；骨肉腫；卵巣癌；卵巣（胚細胞）癌；すい癌；乳頭腫；陰茎癌；プラズマ細胞腫；前立腺癌；細網内皮症；網膜芽細胞腫；皮膚癌；軟部組織肉腫；へん平上皮癌；胃癌；奇形腫；精巣癌；胸腺腫；甲状腺癌；絨毛性新生物；子宮癌；膣癌；外陰癌；ウィルムス腫ようが挙げられる。

さらに、以下のタイプの癌も治療することができる。胆管癌；胆脂腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫よう；男女性胚細胞腫；汗腺腫；島細胞腫よう；ライディッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣細胞腫；神経節神経腫；神経こう腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫；角化血管腫；好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫（ａｎｇｉｏｍａ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ）；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫症；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症（ｎｅｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）及び子宮頚部異形成。

ＮＧＦ結合分子の治療上の使用
ＮＧＦ結合分子は、ＮＧＦ関連疾患及び障害の予防又は治療に使用することができる。かかる適応症としては、（炎症性とう痛並びに付随する痛覚過敏及び異痛症、神経因性とう痛並びに付随する痛覚過敏及び異痛症、糖尿病性神経障害とう痛、灼熱痛、交感神経依存性とう痛、求心路遮断症候群、急性痛、緊張性頭痛、片頭痛、歯痛、外傷由来のとう痛、手術に起因するとう痛、切断術又は膿ように起因するとう痛、灼熱痛、脱髄疾患及び三叉神経痛を含めて、但しこれらだけに限定されない）とう痛などが挙げられるが、これらだけに限定されない。本発明のペプチド及び修飾ペプチドは、ぜん息、切迫尿失禁（すなわち、過活動ぼうこう）、乾せん、癌（特に、すい癌及び黒色腫）、慢性アルコール依存症、卒中、視床症候群、糖尿病、後天性免疫不全症候群（「ＡＩＤＳ」）、毒素及び化学療法、一般的頭痛、片頭痛、群発性頭痛、血管及び非血管混合症候群（ｍｉｘｅｄ−ｖａｓｃｕｌａｒ ａｎｄ ｎｏｎ−ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、一般的炎症、関節炎、リウマチ性疾患、ループス、骨関節炎、炎症性腸疾患、炎症性眼疾患、炎症性若しくは不安定ぼうこう障害、乾せん、炎症性成分を伴う皮膚病、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋炎、神経炎、こう原血管病、慢性炎症性症状、ぜん息、上皮組織損傷若しくは機能不全、単純ヘルペス、呼吸器、尿生殖器、胃腸若しくは血管領域における内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻よう症（ｐｒｕｒｉｔｉｓ）、白斑、一般的胃腸疾患、結腸炎、胃潰よう、十二指腸潰よう、血管運動神経性鼻炎、アレルギー性鼻炎又は気管支疾患を含めて、但しこれらだけに限定されない、原因因子としてＮＧＦに関連した他の疾患の予防又は治療に対する治療学的価値を有する。

ミオスタチン結合分子の治療上の使用
本発明のミオスタチン結合剤は、ミオスタチンに結合し、標的細胞内のミオスタチンシグナル伝達を遮断又は阻害する。本発明は、１種類以上のミオスタチン結合剤の有効投与量を動物に投与することによって、動物におけるミオスタチンの量又は活性を減少させる方法及び試薬を提供する。一態様においては、本発明は、１種類以上の結合剤の有効投与量を動物に投与することを含む、動物におけるミオスタチン関連障害を治療する方法及び試薬を提供する。これらのミオスタチン関連障害としては、筋肉疲労の様々な形態、糖尿病及び関連障害などの代謝障害、骨粗しょう症などの骨変性疾患などが挙げられるが、これらだけに限定されない。

米国特許出願第１０／７４２，３７９号の実施例８に示されるように、本発明の例示的なペプチボディは、ＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスモデルにおいて除脂肪筋肉量を劇的に増加させる。このインビボでの活性は、同じペプチボディについて以下に記述するインビトロでの結合及び抑制活性と相関がある。

筋肉疲労障害としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリン−ランドゥジー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィー、乳児型神経軸索ジストロフィーなどのジストロフィーなどが挙げられる。例えば、抗体をインビボで使用してミオスタチンを遮断すると、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのｍｄｘマウスモデルのジストロフィー表現型が改善された（Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｎａｔｕｒｅ ４２０： ２８）。例示的ペプチボディを使用すると、下記実施例９に記載のように、ｍｄｘマウスモデルにおいて除脂肪筋肉量が増加し、除脂肪筋肉と脂肪の比が増加する。

さらなる筋肉疲労障害は、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、癌、ＡＩＤＳ、腎不全、リウマチ様関節炎などの慢性疾患から生じる。例えば、悪液質又は筋肉疲労及び体重減少が、胸腺欠損ヌードマウスにおいて全身投与されたミオスタチンによって誘発された（Ｚｉｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、同上）。他の例においては、ミオスタチン免疫反応性タンパク質の血清及び筋肉内濃度が、ＡＩＤＳ関連筋肉疲労を示す男性において増加し、除脂肪体重に反比例することが判明した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５： １４９３８−１４９４３）。筋肉疲労を生じるさらなる条件は、車椅子での拘束など身体障害のための不活動、卒中、疾病、骨折又は外傷のための長期床上安静及び微小重力環境（宇宙飛行）における筋萎縮症から生じ得る。例えば、血しょうミオスタチン免疫反応性タンパク質は、長期床上安静後に増加することが判明した（Ｚａｃｈｗｉｅｊａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｇｒａｖｉｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ６（２）：１１（１９９９）。スペースシャトル飛行中に微小重力環境に曝されたラットの筋肉は、曝されなかったラットの筋肉よりも多量のミオスタチンを発現することも判明した（Ｌａｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）， Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． １６７（３）：４１７−２８）。

また、脂肪と筋肉の比の年齢関連性の増加及び年齢関連性の筋萎縮症は、ミオスタチンと関係していると考えられる。例えば、平均血清ミオスタチン免疫反応性タンパク質は、若年群（１９−３５歳）、中年群（３６−７５歳）及び高齢者群（７６−９２歳）の男性及び女性において年齢とともに増加したが、平均筋肉量及び除脂肪体重は、これらの群において年齢とともに減少した（Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｕｔｒ Ａｇｉｎｇ ６（５）：３４３−８（２００２））。マウスにおけるミオスタチン遺伝子ノックアウトによって筋形成が増加し、脂肪生成が減少し（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９１（３）：７０１−６、成体の筋肉量が増加し、脂肪蓄積及びレプチン分泌が減少した。例示的な分子は、以下に示すように、加齢ｍｄｘマウスにおいて除脂肪筋肉量と脂肪の比を改善する。

また、ミオスタチンは、心筋において低レベルで発現されることが現在見出されており、発現は梗塞後の心筋細胞後に増加する（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １８０（１）：１−９）。従って、心筋中のミオスタチンレベルを低下させると、梗塞後の心筋の回復が改善され得る。

ミオスタチンは、２型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、高血糖及び肥満を含めて、代謝障害にも影響を及ぼすと考えられる。例えば、ミオスタチンの欠乏によって、２つのマウスモデルの肥満及び糖尿病表現型が改善することが判明した（Ｙｅｎ ｅｔ ａｌ． 同上）。また、ミオスタチンレベルを低下させて筋肉量を増加させると、骨強度が改善され、骨粗しょう症及び他の変性骨疾患が減少し得る。例えば、ミオスタチン欠乏マウスは、マウス上腕骨のミネラル含有量及び密度が増加し、海綿骨と皮質骨の両方の筋肉が付着している領域におけるミネラル含有量が増加し、筋肉量が増加することも判明している（Ｈａｍｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）， Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ７１（１）：６３−８）。本発明においては、例示的ペプチボディは、以下に示すように、ｍｄｘマウスモデルにおいて除脂肪筋肉量と脂肪の比を増加させる。

本発明は、ミオスタチン結合剤の有効投与量を食用動物に投与することによって、食用動物における筋肉量を増加させる方法及び試薬も提供する。成熟Ｃ末端ミオスタチンポリペプチドは、試験した全ての種で同一であるので、ミオスタチン結合剤は、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ及びブタを含めて農業に重要なあらゆる種における筋肉量を増加させ、脂肪を減少させるのに有効であると予想される。

本発明のミオスタチン結合分子は、その治療効果を高め、又は起こり得る副作用を減少させるのに単独で又は他の治療薬と組み合わせて使用することができる。本発明の分子は、薬剤の治療学的価値を向上させる諸特性の望ましいが予想外である１つ以上の組み合わせを有する。これらの諸特性としては、高活性、高溶解性、低分解、長い半減期、低毒性、低免疫原性などが挙げられる。従って、本発明の分子は長期治療計画に有用である。また、本発明の化合物の親水性と疎水性はバランスが良好であり、それによってインビトロと特にインビボの両方での使用にその有用性が高くなる。具体的には、本発明の化合物は、体内での吸収及び生物学的利用能を可能にする、水性媒体への適切な溶解度を有する一方で、化合物が特定の筋肉などの推定作用部位に向かって細胞膜を通り抜けることができる、脂質への溶解度も有する。

本発明のミオスタチン結合分子は、適切な組成物中で有効投与量で投与すると、「対象」又はヒトを含めた任意の動物の治療に有用である。

また、本発明のミオスタチン結合分子は、幾つかのアッセイにおいてミオスタチンの検出及び定量に有用である。これらのアッセイは、米国特許出願第１０／７４２，３７９号に詳述されている。

一般に、本発明のミオスタチン結合分子は、例えば、Ａｓａｉ， ｅｄ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３７， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に記載のアッセイと同様に、様々なアッセイにおいてミオスタチンに結合し、固定する捕捉剤として有用である。ミオスタチン結合分子は、何らかの方法で標識することができ、又はミオスタチンの検出及び定量を可能にするように標識された抗結合分子抗体などの第３の分子と反応させることができる。例えば、ミオスタチン結合分子又は第３の分子は、ビオチンなどの検出可能成分で修飾することができ、次いで酵素標識ストレプトアビジンなどの第４の分子又は他のタンパク質と結合させることができる。（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５）， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：２５８９； Ｃｈａｕｂｅｒｔ（１９９７）， Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ １０：５８５）。

任意の特定のアッセイを通して、試薬の各組み合わせ後にインキュベーション及び／又は洗浄段階が必要になり得る。インキュベーション段階は約５秒から数時間、好ましくは約５分間から約２４時間とすることができる。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、溶液の体積、濃度などに応じて決まる。通常、アッセイは、周囲温度で実施するが、ある温度範囲にわたって実施することができる。

ＢＡＦＦ結合分子の治療上の使用
本発明のＢＡＦＦ結合分子は、Ｂ細胞によって媒介される自己免疫疾患の治療に特に有用であり得る。特に、本発明のＢＡＦＦ結合分子は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含めたループス並びにループス関連疾患及び症状の治療、予防、寛解、診断又は予知に有用であり得る。他の好ましい適応症としては、Ｂ細胞リンパ腫を含めて、Ｂ細胞によって媒介される癌などが挙げられる。

本発明の化合物は、関節の炎症性症状の治療に使用することもできる。関節の炎症性症状は、世界中で数百万人が様々な程度で苦しみ、身体障害者になっている慢性関節疾患である。リウマチ様関節炎は、滑膜から誘導されるパンヌスと呼ばれる増殖性浸潤性結合組織によって軟骨及び骨が徐々に侵食されて無くなる関節疾患である。この疾患には、包、腱鞘、腱などの関節周囲構造及び皮下組織、心血管系、肺、ひ臓、リンパ節、骨格筋、（中枢及び末梢）神経系、眼などの関節外組織が関与し得る（Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ（１９８５）， Ａｎｄｅｒｓｏｎ’ｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｋｉｓｓａｎｅ （ｅｄ．）， ＩＩ：１８２８）。骨関節炎は、関節軟骨における変性並びに関節周囲の骨及び軟骨の反応性増殖を特徴とする一般的関節疾患である。骨関節炎は、異化及び同化刺激に対する軟骨細胞の不適当な応答に起因し得る細胞媒介性の活性なプロセスである。関節軟骨の一部のマトリックス分子の変化が初期の骨関節炎において発生するとされている（Ｔｈｏｎａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）， Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ （ｅｄ．）， １９：６３５−６５７ ａｎｄ Ｓｈｉｎｍｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．， ３５：１３０４−１３０８）。ＴＡＬＬ−Ｉ、ＴＡＬＬ−ＩＲ及びその調節物質は、これらの症状及び関係する症状の治療において有用であると考えられる。

ＢＡＦＦ結合分子は、急性すい炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；ぜん息；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性溶血性貧血；癌、特にＢ細胞に関係する癌；悪液質／食欲不振症；慢性疲労症候群；硬変（例えば、原発性胆汁性肝硬変）；糖尿病（例えば、インスリン糖尿病）；発熱；ＩｇＡ糸球体腎炎及び原発性糸球体腎炎を含めた糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；ギランバレー症候群；移植片対宿主病；橋本甲状腺腫；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；骨関節炎、乾せん性関節炎及びリウマチ様関節炎を含めた関節の炎症性症状；挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科、感染又は他の疾患過程に起因する炎症性症状；インスリン依存性糖尿病；脳虚血（例えば、各々が神経変性をもたらし得る、外傷、てんかん、出血又は卒中の結果としての脳傷害）を含めた虚血性傷害；学習障害；肺疾患（例えば、ＡＲＤＳ）；ループス、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；多発性骨髄腫；多発性硬化症；重症筋無力症；骨髄性（例えば、ＡＭＬ及びＣＭＬ）及び他の白血病；筋疾患（例えば、筋タンパク質代謝、特に敗血症）；（例えば、ＨＩＶによって誘導される）神経毒性；骨粗しょう症；とう痛；パーキンソン病；天ほうそう；多発性筋炎／皮膚筋炎；自己免疫肺炎症を含めた肺炎症；早産；乾せん；ライター病；再かん流傷害；敗血症ショック；放射線療法による副作用；シェーグレン症候群；睡眠障害；顎関節疾患；特発性血小板減少症及び自己免疫性新生児血小板減少症を含めた血小板減少症；腫よう転移；ブドウ膜炎及び血管炎を含めて、幾つかのさらなる疾患及び障害の治療においても有用であり得る。

併用療法
本発明の治療方法、構成物及び化合物は、血小板欠乏に加えて他の症候を特徴とする病態の治療において、単独で又は他のサイトカイン、可溶性Ｍｐｌ受容体、造血因子、インターロイキン、増殖因子若しくは抗体と組み合わせて使用することもできる。本発明の化合物は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦなど血球新生の一般的刺激物質と組み合わせて、血小板減少症の一部の形態を治療するのに有用であることが判明すると予測される。他の巨核球刺激因子、すなわち、ｍｅｇ−ＣＳＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）又は巨核球刺激活性を有する他の分子をＭｐｌリガンドと一緒に使用することもできる。かかる同時投与用のさらなる例示的サイトカイン又は造血因子としては、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ又はＩＦＮ−ガンマが挙げられる。さらに、巨核球が成熟型になった後に巨核球を血小板に断片化する効果を有すると考えられる可溶性哺乳動物Ｍｐｌ受容体の有効量を同時に又は逐次的に投与することが有用であり得る。従って、（成熟巨核球数を増加させるための）本発明の化合物の投与とそれに続く（リガンドを不活性化し、成熟巨核球が血小板を産生できるようにするための）可溶性Ｍｐｌ受容体の投与は、血小板産生を刺激する特に有効な手段であると予想される。上記投与量は、治療組成物中のかかる追加の成分を補うように調節される。治療した患者の経過は従来の方法によってモニターすることができる。

本発明の化合物を血小板及び／又は巨核球及び関連細胞の組成物に添加する場合には、添加量は、一般に、当分野で公知の技術及びアッセイによって実験的に確認される。例示的な量の範囲は、細胞１０^６個当たり本発明の化合物０．１μｇ−１ｍｇである。

薬剤組成物
一般
本発明は、本発明の化合物の薬剤組成物を用いる方法も提供する。かかる薬剤組成物は、注射投与用又は経口、肺、経鼻、経皮若しくは他の投与形態の投与用とすることができる。一般に、本発明は、薬剤として許容される希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と一緒に本発明の化合物の有効量を含む薬剤組成物を包含する。かかる組成物としては、様々な緩衝剤含有量（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；洗浄剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、充填物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの重合体化合物の粒子調製物中への又はリポソーム中への材料の混合などが挙げられる。ヒアルロン酸も使用することができる。ヒアルロン酸は、循環中の持続期間を延長する効果を有し得る。かかる組成物は、本タンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、参照により本明細書に組み入れるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．（１９９０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ １８０４２） １４３５−１７１２ページを参照されたい。本組成物は、液体の形で調製することができ、又は凍結乾燥体などの乾燥粉末として調製することができる。経皮製剤同様、移植可能な徐放性製剤も企図される。

経口剤形
本発明の使用に企図されるのは経口固体剤形である。経口固体剤形は、一般に、参照により本明細書に組み入れるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ １８０４２の８９章に記載されている。固体剤形としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤又は舐剤、カシェ剤又はペレット剤などが挙げられる。また、（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテイノイドミクロスフェアのような）リポソーム又はプロテイノイド封入を利用して本組成物を処方することができる。リポソーム封入を利用することができ、リポソームは、様々なポリマーを用いて誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の考えられる固体剤形の記述は、参照により本明細書に組み入れるＭａｒｓｈａｌｌ， Ｋ．， Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９）， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇ．Ｓ． Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃ．Ｔ． Ｒｈｏｄｅｓの１０章にある。一般に、本製剤は、本発明の化合物と、胃環境に対して保護し、生物活性材料を腸において放出できるようにする不活性成分とを含む。

また具体的に企図されるのは、上記本発明の化合物の経口剤形である。必要に応じて、本化合物は、経口送達が効果的になるように化学修飾することができる。一般に、企図される化学修飾は、少なくとも１種類の成分を化合物分子自体に付加させるものである。前記成分によって、（ａ）タンパク質分解を抑制することができ、（ｂ）胃又は腸から血流中に吸収することができる。化合物全体の安定性の増加及び体内循環時間の延長も望まれる。本発明において共有結合ビヒクルとして有用である成分をこの目的に使用することもできる。かかる成分の例としては、ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが挙げられる。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ Ａｄｄｕｃｔｓ， Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇｓ（１９８１）， Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ， ｅｄｓ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，， ｐｐ ３６７−８３； Ｎｅｗｍａｒｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８２）， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４：１８５−９を参照されたい。使用することができる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−トリオキソカン（ｔｉｏｘｏｃａｎｅ）である。薬剤の使用に好ましいのは、上述したように、ＰＥＧ成分である。

経口送達剤形の場合には、本発明の治療化合物の吸収を促進する担体としてＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）などの改変脂肪族アミノ酸の塩を使用することもできる。ＳＮＡＣを用いたヘパリン製剤の臨床効果は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって実施された第二相試験において実証された。米国特許第５，７９２，４５１号「Ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。

本発明の化合物は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の微小多粒子として製剤中に含めることができる。カプセル剤投与用材料の剤形は、粉末、軽く圧縮した詰め物（ｐｌｕｇ）、さらには錠剤とすることもできる。治療薬は圧縮によって調製することができる。

着色剤及び香味料は全て含めることができる。例えば、（リポソーム又はミクロスフェア封入などによって）タンパク質（又は誘導体）を処方し、次いで着色剤及び香味料を含む冷蔵飲料などの可食生成物内にさらに含有させることができる。

本発明の化合物を不活性材料で希釈し、又はその体積を増加させることができる。これらの希釈剤としては、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、改変デキストラン、デンプンなどが挙げられる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含めて、ある種の無機塩も充填剤として使用することができる。幾つかの市販されている希釈剤はＦａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌである。

治療薬の処方において崩壊剤を固体剤形に含めることができる。崩壊剤として使用される材料としては、デンプンを主成分とする市販の崩壊剤Ｅｘｐｌｏｔａｂを含めたデンプンなどが挙げられるが、これだけに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジの皮、酸カルボキシメチルセルロース（ａｃｉｄ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、天然海綿及びベントナイトは全て使用することができる。崩壊剤の別の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。ゴム粉末は崩壊剤及びバインダーとして使用することができる。ゴム粉末としては寒天、カラヤゴム、トラガカントゴムなどのゴム粉末が挙げられる。アルギン酸及びそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。

バインダーは治療薬を結合して硬い錠剤を形成するのに使用することができる。バインダーとしては、アラビアゴム、トラガカントゴム、デンプン、ゼラチンなどの天然物由来の材料などが挙げられる。他のバインダーとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などが挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）はどちらもアルコール溶液として治療薬を顆粒化するのに使用することができる。

減摩剤は、製剤プロセス中の粘着を防止するために、治療薬の処方に含めることができる。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用することができる。潤滑剤としては、そのマグネシウム塩及びカルシウム塩を含めたステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油、ワックスなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス４０００及び６０００などの可溶性潤滑剤も使用することができる。

製剤中の薬物の流動性を改善することができ、圧縮中の再配列を助ける流動化剤を添加することもできる。流動化剤としては、デンプン、タルク、熱分解法シリカ、水和アルミノケイ酸塩などが挙げられる。

水溶液環境への本発明の化合物の溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として添加することができる。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、スルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン洗剤などが挙げられる。陽イオン洗剤も使用することができる。陽イオン洗剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどが挙げられる。界面活性剤として製剤に含めることができる非イオン洗剤候補のリストは、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で又は異なる比の混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在することができる。

添加剤も、本化合物の吸収を促進するために製剤に含めることができる。この特性を潜在的に有する添加剤は、例えば、脂肪酸 オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。

制御放出製剤が望ましい場合もある。本発明の化合物は、拡散又は浸出機序による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばゴム中に混合することができる。徐々に劣化するマトリックス、例えば、アルギナート、多糖を製剤中に混合することもできる。本発明の化合物の制御放出の別の形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．）に基づく方法によるものである。すなわち、薬物は、浸透圧効果のために単一の小さな開口を通って水が入り、薬物を押し出す半透膜に封入されている。一部の腸溶コーティングは、遅延放出効果も有する。

他のコーティングも製剤に使用することができる。他のコーティングとしては、コーティングパンに適用することができる様々な糖などが挙げられる。治療薬はフィルムコート錠とすることもできる。この場合に使用される材料は２つのグループに分類される。第１のグループは非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポビドン（ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ）及びポリエチレングリコールが含まれる。第２のグループは、一般にフタル酸エステルである腸溶材料からなる。

最適なフィルムコーティングを提供するために材料の混合物を使用することができる。フィルムコーティングは、パンコーター若しくは流動層を用いて、又は圧縮コーティングによって実施することができる。

肺送達形態
本タンパク質（又はその誘導体）の肺送達も本発明では企図される。タンパク質（又は誘導体）は、吸入中に哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｎｉｎｇ）を通り抜けて血流に入る。（肺送達の他の報告としては、Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａ． Ｒｅｓ． （１９９０） ７： ５６５−９； Ａｄｊｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）， Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ６３： １３５−４４（酢酸ロイプロリド）； Ｂｒａｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）， Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １３ （ｓｕｐｐｌ．５）： ｓ．１４３−１４６ （エンドセリン−１）； Ｈｕｂｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）， Ａｎｎａｌｓ Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． ３： ２０６−１２ （α１−抗トリプシン）； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８４： １１４５−６ （α１−プロテイナーゼ）； Ｏｓｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｒｃｈ １９９０）， ”Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”， Ｐｒｏｃ． Ｓｙｍｐ． Ｒｅｓｐ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ＩＩ， Ｋｅｙｓｔｏｎｅ， Ｃｏｌｏｒａｄｏ （組換えヒト成長ホルモン）； Ｄｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０： ３４８２−８ （インターフェロン−γ及び腫よう壊死因子α）、Ｐｌａｔｚ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）などが挙げられる。）。

本発明の実施において使用が企図されるのは、全て当業者によく知られた、ネブライザー、定量吸入器及び粉末吸入器を含めて、但しこれらだけに限定されない、治療薬の肺送達用に設計された様々な機械装置である。本発明の実施に適切な市販装置の幾つかの具体例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ， Ｉｎｃ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉによって製造されているＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー、Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏによって製造されているＡｃｏｒｎ ＩＩネブライザー、Ｇｌａｘｏ Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａによって製造されているＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器及びＦｉｓｏｎｓ Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓによって製造されているＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。

かかる装置は全て、本発明の化合物の投与に適切な製剤を使用する必要がある。典型的には、各製剤は、使用する装置のタイプに特異的であり、治療に有用な希釈剤、アジュバント及び／又は担体に加えて、適切な噴霧材料を使用する必要がある場合がある。

本発明の化合物は、末端の肺に最も効果的に送達するために、平均粒径１０μＭ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５から５μＭの粒子形態で最も有利には調製すべきである。

薬剤として許容される担体としては、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトールなどの炭水化物などが挙げられる。製剤に使用する他の成分としては、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣなどを挙げることができる。天然又は合成界面活性剤を使用することができる。（タンパク質又は類似体の誘導体化におけるその使用を別にしても）ＰＥＧを使用することができる。シクロデキストランなどのデキストランを使用することができる。胆汁酸塩及び他の関係する賦活薬を使用することができる。セルロース及びセルロース誘導体を使用することができる。緩衝製剤中での使用など、アミノ酸を使用することができる。

また、リポソーム、マイクロカプセル若しくはミクロスフェア、包接化合物又は他のタイプの担体が企図される。

噴射又は超音波のネブライザーと一緒に使用するのに適切な製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物活性タンパク質約０．１から２５ｍｇの濃度で水に溶解させた本発明の化合物を含む。製剤は、（例えば、タンパク質安定化及び浸透圧調節用の）緩衝剤及び単糖を含むこともできる。ネブライザー製剤は、エアゾールを形成する際の溶液の微粒化によって引き起こされる、表面でのタンパク質凝集を抑制又は防止するために、界面活性剤を含むこともできる。

定量吸入装置と一緒に使用される製剤は、一般に、界面活性剤を用いて噴霧剤中に懸濁された、本発明の化合物を含む微粉を含む。噴霧剤は、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含めて、クロロフルオロ炭素、ヒドロクロロフルオロ炭素、ヒドロフルオロ炭素若しくは炭化水素又はこれらの組み合わせなどこの目的で使用される従来の材料とすることができる。適切な界面活性剤としては、トリオレイン酸ソルビタン、ダイズレシチンなどが挙げられる。オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。

粉末吸入装置投与用製剤は、本発明の化合物を含む乾燥微粉を含み、装置からの粉末の分散を容易にする量、例えば、製剤の５０から９０重量％のラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、キシリトールなどの充填剤を含むこともできる。

他の送達形態
本発明の化合物の経鼻送達も企図される。経鼻送達によって、肺中で治療薬が沈着する必要なしに、治療薬を鼻に投与した直後にタンパク質が血流に入ることができる。経鼻送達用製剤としては、デキストラン又はシクロデキストランを含む製剤などが挙げられる。他の粘膜を通過する送達も企図される。

本発明の化合物の頬送達も企図される。ペプチドを併用する頬送達製剤は当分野で公知である。

投与量
上記症状の治療方法に関わる投与計画は、薬物の作用を加減する様々な要因、例えば患者の年齢、症状、体重、性別及び食事、感染の重症度、投与時間及び他の臨床上の要因を考慮して、主治医によって決定される。一般に、毎日の投薬計画は、体重１キログラム当たり本発明の化合物０．１−１０００マイクログラム、好ましくは０．１−１５０マイクログラム／キログラムの範囲とすべきである。

好ましい具体的実施形態
本発明者らは、多種多様な活性を有する分子の好ましいペプチド配列を決定した。本発明者らは、さらに、好ましいリンカー及びビヒクルと結合したこれらの好ましいペプチドの好ましい構造を決定した。これらの好ましいペプチドの好ましい構造を下表１１に示した。リンカー配列を太字で示す。活性なペプチド配列を太字で示し、下線を引く。

実施例
上記化合物は以下に示すように調製することができる。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を構成し、限定するものではなく説明のためのものである。

Ｆｃループ−ａｎｇ２の調製
本発明のこの実施例においては、ジスルフィドによって拘束されたペプチドＴＮ８−Ｃｏｎ４を、配列Ｄ_１３７Ｅ_１３８Ｌ_１３９Ｔ_１４０Ｋ_１４１（図２Ａ）で定義されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃループドメインに挿入した。

ＴＮ８−Ｃｏｎ４ ＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭ（配列番号１４７）
ペプチド挿入はＦｃ残基Ｌｅｕ_１３９とＴｈｒ_１４０の間であり、挿入ペプチドの両側に隣接したリンカーとして２個のＧｌｙ残基を含む（図１０Ａ）。ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４構築体はＡｍｇｅｎクローン＃６８８８で標識されている。カルボキシ末端ＴＮ８−Ｃｏｎ４融合ペプチボディ（図１０Ｂ）は、５個のＧｌｙリンカーを含み、Ａｍｇｅｎクローン＃５５６４で標識されている。

クローン＃６８８８と＃５５６４のどちらも、当業者に公知の従来法によってＥ．コリに形質転換された。両方のクローンは、もっぱら不溶性封入体部分で高レベルで発現することが判明した（図１１）。単離封入体部分（１ｇ）を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ９（１０ｍｌ）に室温で混合しながら１時間溶解させた。変性し、還元したペプチボディを、２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミンからなる再折り畳み緩衝剤ｐＨ８．５中に１：２５（ｖ／ｖ）希釈することによって、可溶化封入体から再び折り畳んだ。可溶化ペプチボディを再折り畳み緩衝剤に４℃で撹拌しながら滴下した。再折り畳み反応物を４８時間撹拌し、次いで一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相ＨＰＬＣによって評価した。ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（図１２）によって示されるように、再折り畳み反応において、カルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−Ｃｏｎ４ペプチボディ（＃５５６４）よりもかなり均一である。

再折り畳みＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４及びカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−Ｃｏｎ４を２カラムプロセスによって精製した。まず、組換えＰｒｏｔｅｉｎ−Ａカラムを２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で平衡にし、ろ過ペプチボディ再折り畳み反応物を充填した。次いで、カラムを平衡緩衝剤２カラム体積、続いてＰＢＳ ２カラム体積で洗浄した。ペプチボディ画分を５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ３で溶出させ、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中に１：４希釈することによって素早く中和した。希釈Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ溶出物を再度ろ過し、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５で平衡にしたＳＰセファロースＨＰ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。次いで、ペプチボディ画分を線状５０−５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出させ、プールし、約２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）及びカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の各最終プールをＲＰ−ＨＰＬＣ（図１３）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１４）によって評価した。ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、生成物の均一性は、比較のカルボキシ末端融合ペプチボディ（＃５５６４）よりもＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）で改善される。

ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４とカルボキシ末端融合ＴＮ８−Ｃｏｎ４ペプチボディのどちらも、アンジオポエチン２受容体の競合阻害についてインビトロＥＬＩＳＡによってさらに評価した。この形式では、ペプチボディは、固定化アンジオポエチン２への結合について、アンジオポエチン２受容体−Ｆｃ融合体と競合する。アンジオポエチン２受容体−Ｆｃ融合体の結合は、酵素結合免疫検出方法を用いた蛍光によってモニターされ、５０％阻害における阻害定数（ＩＣ_５０）として記録される。この実験によれば、ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４は、カルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−Ｃｏｎ４よりも十分に活性である（図１５）。

マウスにおいてＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４ペプチボディのインビボでの安定性をカルボキシ末端ＴＮ８−Ｃｏｎ４ペプチボディと比較した。この試験では、１５匹のマウスからなる群にペプチボディ構築体を５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。注射から４時間後に５匹のマウスを屠殺し、血清を収集した。２４時間で別の５匹のマウスから収集し、４８時間も同様であった。検出可能なヒトＩｇＧ−Ｆｃペプチボディについて個々の血清試料をウエスタンブロットによって評価した。各５匹のマウス群内の血清は全て極めて類似していたので、各群をプールして、代表試料を単一のゲル／ブロット上で一緒に泳動させた。分析結果（図１６）によれば、ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４ペプチボディとカルボキシ末端ＴＮ８−Ｃｏｎ４ペプチボディのどちらも、プールしたマウス血清中に明白な損失なしに４８時間存続することが明らかである。この結果は、Ｆｃループ設計ペプチボディが、ペプチド挿入によってインビボで不安定化されないことを示している。

Ｆｃループ−ｍｙｏ７の調製
本発明の別の実施形態においては、配列
ＴＮ８−１９−０７ ＬＡＤＨＧＱＣＩＲＷＰＷＭＣＰＰＥＧＷＥ（配列番号３６５）
の、ジスルフィドによって拘束された新規ペプチドＴＮ８−１９−７（参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開２００４−０１８１０３３−Ａ１号）をＩｇＧ１ Ｆｃ配列の推定Ｆｃループ配列ＤＥＬＴＫ中の内部融合体としてＬｅｕ１３９とＴｈｒ１４０の間に挿入した（図２Ａ）。追加の２個のＧｌｙ残基もフランキングリンカーとしてＴＮ８−１９−０７ペプチドの各末端に付加した。最終ＦｃループＴＮ８−１９−０７配列を図３Ａに示す。最終ＦｃループＴＮ８−１９−０７配列は標識クローン＃６９５１である。或いは、同じＩｇＧ１ Ｆｃ配列とのＴＮ８−１９−０７のカルボキシ末端融合体を調製し、対象（図３Ｂ）及び標識クローン＃６８２６とした。カルボキシ末端融合体は、ＦｃとＴＮ８−１９−０７の間にリンカーとして働く５個のＧｌｙ残基を含んだ。

クローン＃６９５１と＃６８２６のどちらも、当業者が用いる従来法によってＥ．コリに形質転換され、もっぱら不溶性封入体部分で高レベルで発現することが判明した（図４Ａ及び４Ｂ）。単離封入体部分（１ｇ）を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ９（１０ｍｌ）に室温で混合しながら１時間溶解させた。変性還元ペプチボディを、２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５中に１：２５（ｖ／ｖ）希釈することによって、可溶化封入体部分から再び折り畳んだ。可溶化ペプチボディを再折り畳み緩衝剤に４℃で撹拌しながら滴下した。再折り畳み反応物を４８時間撹拌し、次いで一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相ＨＰＬＣによって評価した。ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（図５）によって、再折り畳み反応において、カルボキシ末端Ｆｃ−ＴＮ８−１９−０７ペプチボディ（＃６８２６）よりもかなり均一であることが判明した。

精製を２カラムプロセスによって実施した。まず、組換えＰｒｏｔｅｉｎ−Ａカラムを２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で平衡にし、ろ過ペプチボディ再折り畳み反応物を充填した。次いで、カラムを平衡緩衝剤２カラム体積、続いてＰＢＳ ２カラム体積で洗浄した。ペプチボディ画分を５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ３で溶出させ、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中に１：４希釈することによって素早く中和した。希釈Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ溶出物を再度ろ過し、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５で平衡にしたＳＰセファロースＨＰ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。次いで、ペプチボディ画分を線状５０−５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出させ、プールし、約２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）及びカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各最終プールをＲＰ−ＨＰＬＣ（図６）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７）によって評価した。ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、最終生成物の均一性は、比較のカルボキシ末端融合ペプチボディ（＃６８２６）よりもＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）で改善される。

ミオスタチンシグナル伝達活性の阻害を測定するインビトロ細胞アッセイによって、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）の生理活性を求め、カルボキシ末端融合体（＃６８２６）と比較した。このアッセイでは、両方の構築体を４ｎＭミオスタチンで滴定し、そのミオスタチンシグナル伝達活性阻害能力をルシフェラーゼレポーター系によって測定して評価した。相対ペプチボディ活性を５０％阻害有効濃度（ＥＣ_５０）として報告する。この実験によれば、ＦｃループＴＮ８−１９−０７ペプチボディ（＃６９５１）は、十分なインビトロ生理活性を保持する（図８）。

マウスにおいてＦｃループＴＮ８−１９−０７ペプチボディのインビボでの安定性をカルボキシ末端ＴＮ８−１９−０７ペプチボディと比較した。この試験では、１５匹のマウスからなる群にペプチボディ構築体を５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。注射から４時間後に５匹のマウスを屠殺し、血清を収集した。２４時間で別の５匹のマウスから収集し、４８時間も同様であった。検出可能なヒトＩｇＧ−Ｆｃペプチボディについて個々の血清をウエスタンブロットによって評価した。各５匹のマウス群内の血清は全て極めて類似していたので、各群をプールして、代表試料を単一のゲル／ブロット上で一緒に泳動させた。分析結果（図９）によれば、ＦｃループＴＮ８−１９−０７ペプチボディは、プールしたマウス血清中に明白な損失なしに４８時間存続することが明らかである。これに対して、カルボキシ末端ＴＮ８−１９−０７ペプチボディの濃度は、試験期間を通して絶えず減少し、４８時間ではほぼ検出不可能である。この結果は、Ｆｃループ設計手法によって、インビボでのさらなる安定性がＴＮ８−１９−０７ペプチボディに付与できることを示唆している。

ＴＮ８−Ｃｏｎ４の調製
この分子を実施例１及び参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２００３／０２３６１９２号（また、ＰＣＴ／ＵＳ０４／１０９８９）において上述したように調製した。

Ｆｃ−ａｎｇ２−直列の調製
この分子を、参照により本明細書に組み入れる２００３年１２月２５日に公開された米国特許出願公開第２００３／０２３６１９３号（また、２００４年４月８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／１０９８９号）に記載のように調製した。

ＴＮ８−１９−７の調製
この分子を、実施例２及び参照により本明細書に組み入れる２００３年１２月１９日に出願された米国特許出願第１０／７４２，３７９号（また、２００３年１２月１９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０３／４０７８１号）において上述したように調製した。

Ｆｃループ−ＥＭＰの調製
この分子を実施例１で上述したように調製した。

Ｆｃループ−Ａｍｐ２の調製
本発明の別の実施形態においては、線状非拘束ペプチドＡＭＰ ２を、配列Ｄ_１３７Ｅ_１３８Ｌ_１３９Ｔ_１４０Ｋ_１４１（図２Ａ）で定義されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃループドメインに挿入した。

ＡＭＰ−２： ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ（配列番号２８）
Ｆｃ挿入はＬｅｕ_１３９とＴｈｒ_１４０の間であり、挿入ペプチドの両側に隣接したリンカーとして２個のＧｌｙ残基を含む（図３Ｄ）。ＦｃループＡＭＰ ２構築体をＡｍｇｅｎクローン＃６８７５と呼ぶ。

ＦｃループＡＭＰ ２クローン（＃６８７５）は、当業者に公知の従来法によってＥ．コリに形質転換され、もっぱら不溶性封入体部分で高レベルで発現することが判明した（図１７）。単離封入体部分（１ｇ）を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ９（１０ｍｌ）に室温で混合しながら１時間溶解させた。変性還元ペプチボディを、２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４ｍＭシステイン、１ｍＭシスタミン、ｐＨ８．５中に１：２５（ｖ／ｖ）希釈することによって、可溶化封入体部分から再び折り畳んだ。可溶化ペプチボディを再折り畳み緩衝剤に４℃で撹拌しながら滴下した。再折り畳み反応物を４８時間撹拌し、次いで一定分量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び逆相ＨＰＬＣによって評価した。

精製を２カラムプロセスによって実施した。まず、組換えＰｒｏｔｅｉｎ−Ａカラムを２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で平衡にし、ろ過ペプチボディ再折り畳み反応物を充填した。次いで、カラムを平衡緩衝剤２カラム体積、続いてＰＢＳ ２カラム体積で洗浄した。ペプチボディ画分を５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ３で溶出させ、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５中に１：４希釈することによって素早く中和した。希釈Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ溶出物を再度ろ過し、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５で平衡にしたＳＰセファロースＨＰ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。次いで、ペプチボディ画分を線状５０−５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出させ、プールし、約２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＦｃループＡＭＰ ２（＃６８７５）の最終プールをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１９）及びＲＰ−ＨＰＬＣ（図２０）によって評価した。

ＦｃループＡＭＰ ２の最終調製物をインビボでのマウスバイオアッセイにおいて、直列に連結された２個のＡＭＰ ２配列のカルボキシ末端ペプチボディ融合体（Ｆｃ直列ＡＭＰ２）に対して試験した。この比較では、Ｆｃ直列−ＡＭＰ２は、わずか２個のペプチドしか持たないＦｃループＡＭＰ ２と比較して、４個のＡＭＰ ２ペプチドの合計原子価を有する。マウスにどちらかのペプチボディ５０μｇ／ｋｇの単一の皮下注射を投与し、その血小板レベルを１５日間モニターした（図２１）。Ｆｃ直列−ＡＭＰ２はかなりの初期血小板増加を引き起こしたが、全応答は９日までに終了した。これに対して、ＦｃループＡＭＰ ２は、８日目に最大になり、１５日間持続したはるかに小さな応答を誘発した。これらの結果は、ＦｃループＡＭＰ ２ペプチボディの効果的な半減期が、従来のカルボキシ末端融合ペプチボディよりもはるかに大きくなり得ることを示唆している。応答の全体的大きさの相違は、Ｆｃ直列−Ａｍｐ２の原子価が大きい結果であり得る。

Ａｍｐ２の調製
この分子を実施例７及び米国特許第６，６６０，８４３号で上述したように調製した。

インビトロ細胞アッセイ及びミオスタチンシグナル伝達活性の測定（図８）
ミオスタチン活性及びその遮断を定量するために、ｐＭＡＲＥ−Ｌｕｃと称するルシフェラーゼレポーター系を開発した。この系はミオスタチン／アクチビンシグナル伝達強度を検知する。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃベクターは、最小のプロモーター要素（ＴＡＴＡボックス）を含む基本レポータープラスミドｐＬｕｃ−ＭＣＳにＳｍａｄ応答性ＣＡＧＡ直列反復配列をサブクローニングすることによって構築した。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃベクターを骨格筋由来のＣ２Ｃ１２細胞系（ネズミ）に安定に形質移入した。

安定なクローンのミオスタチン応答を分析することによって、ミオスタチンとアクチビンの両方のシグナル伝達活性を検出することができるＣ２Ｃ１２系クローンレポーター細胞系を９６ウェル形式で高い感度と良好な再現性で特定した。

インビトロでのＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）Ａｎｇ−２結合アッセイ（図１５）。

濃度１００ｎＭから開始して、Ｆｃループペプチボディ及び適切な対照を９６ウェルプレート全体にわたりＨＴＲＦ緩衝剤で３倍、９倍に連続希釈した。次いで、希釈物を９６ウェル黒色丸底アッセイプレート上で以下の試薬、すなわちストレプトアビジン−ユウロピウム（１．６ｎＭ）、ビオチン化ヒトアンジオポエチン−２（８．０ｎＭ）、ヒトＴｉｅ２−Ｆｃ−ＡＰＣ（１０ｎＭ）と混合した。。次いで、アッセイプレートを振とうしながら室温で２時間インキュベートした。次に、プレートをＲｕｂｙｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって読み取った。結果を％阻害に変換し、次いで％阻害値をプログラムＧＲＡＦＩＴ ５．０（ＩＣ５０、０−１００％パラメータ）で解析することによってＩＣ５０を計算した。

インビボでのＡＭＰ−２効力アッセイ（図２１）
メスのＢＤＦ１マウスに担体流体（０．１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ）、Ｆｃ直列−ＡＭＰ２ ５０ｍｃｇ／ｋｇ又はＦｃループ−ＡＭＰ２ ５０ｍｃｇ／ｋｇを皮下注射する。注射体積は０．２ｍＬである。眼か後方の洞の穿刺によってヘパリン処置毛管に各マウスから血液を収集し、次いでＥＤＴＡを含むｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒに移す。白血球分画を含めた全血球計算値（ＣＢＣ）を、マウス血液で較正したＡＤＶＩＡ １２０血液分析計（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を用いて得る。標準採血日（ｂｌｅｅｄ ｄａｙ）は０、３、５、７及び１０である。血小板数を注射後の時間の関数としてプロットする。

ＥＭＰ活性のＵＴ−７ ＥＰＯ増殖アッセイ（図１８）
ＵＴ−７Ｅｐｏ増殖アッセイは、ネズミＥＰＯ（ｍＥＰＯ）及びヒトＥＰＯ（ｈｕＥＰＯ）又は成長及び生存のための他のＥＰＯ様分子に応答するヒト巨核芽球性白血病細胞系を使用する。

増殖因子を、９６ウェルプレート全体にわたり１０％ＦＢＳ−Ｉｓｃｏｖｅｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｌｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）１００μｌで１０００ｎｇ／ｍｌから０．４８８ｎｇ／ｍｌに３つ組で連続希釈する。１０％ＦＢＳ ＩＭＤＭ １００μｌ中の１５０００細胞／ウェルを９６ウェルプレートに添加する。ウェル１個当たりの総体積は、１５０００細胞／ウェルを含む培地２００μｌである。細胞及び培地単独がゼロ対照（ｚｅｒｏ ｃｏｎｔｒｏｌ）である。細胞を加湿チャンバ中で３７℃でインキュベートする。

調べようとする増殖因子と一緒に７２時間インキュベーション後、生細胞をＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｐｈｅｎｙｌ））−２−（４−スルホフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩）取り込み（５＋／−１時間、３７℃）によって求め、成長をＯ．Ｄ．（４９０ｎｍ吸光度）、限界４．０Ｏ．Ｄ以下によって測定する。参考文献：Ｙａｓｕｓａｄａ Ｍｉｕｒａ， Ｋｅｉｔａ Ｋｉｒｉｔｏ， ａｎｄ Ｎｏｒｉｏ Ｋｏｍａｔｓｕ （１９９８）， ”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ａｎｄ Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ， ＵＴ−７，” Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，９９：１８０−１８４。

代替Ｆｃループ挿入部位
Ｌ１３９／Ｔ１４０挿入部位を有するＦｃループ挿入型ペプチボディの可能性が幾つかの異なるペプチドを用いて証明されたので、Ｆｃ結晶構造中のさらなるループを調査した。Ｆｃドメイン相同性モデリングを用いて、１２個の異なる挿入部位候補を、溶媒接触表面露出（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）、ＦｃＲｎ結合界面など、ループ内の、Ｆｃ２量体界面に近接し、公知エフェクター機能の部位の近位の立体障害に基づいて選択した。挿入部位候補と特定したＦｃループ部位を詳述し、分類する。図２Ａ及び下表１２を参照されたい。

これらの挿入部位候補のうち、６個は、ＴＮ８−１９−７ペプチド挿入断片を用いて発現され（実施例２）、リフォールディング効率及びインビトロでの活性について評価された。上記最初のループ挿入部位（Ｌ１３９／Ｔ１４０）中に操作された非対称リンカー系Ｇｌｙ４／Ｇｌｙ６を含むさらなる構築体を追加した。合計７個の新しいＦｃループミオスタチン構築体を再折り畳みし、精製し、活性を試験した。

試験した７個の新しいＦｃループＴＮ８−１９−７構築体は、ヒトＩｇＧ１ ＦｃのＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方における挿入を含んだ。具体的には、これらの挿入は、Ｇ２０１／Ｎ２０２（ＣＨ３）、Ｅ１６９／Ｎ１７０（ＣＨ３）、Ｓ１８１／Ｄ１８２（ＣＨ３）、Ｈ４９／Ｅ５０（ＣＨ２）、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）（ＣＨ３）、Ｙ７７／Ｎ７８（ＣＨ２）及びＫ１０７／Ａ１０８（ＣＨ２−ＣＨ３リンカードメイン）であった。これらの構築体は、当分野で公知の従来法によってＥ．コリに形質転換され、もっぱら不溶性封入体部分で発現することが判明した。興味深いことに、Ｈ４９／Ｅ５０、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）及びＹ７７／Ｎ７８構築体は最高レベルの発現を示すと考えられた。Ｅ１６９／Ｎ１７０、Ｓ１８１／Ｄ１８２、Ｋ１０７／１０８は中程度の発現を示し、Ｇ２０１／２０２構築体はある程度の発現を示したが、極めて小さかった。

Ｅ．コリ中で十分に発現されたＦｃループＴＮ８−１９−７構築体を、まず単離封入体部分を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ９．０（封入体１ｇ当たり１０ｍＬ）に混合しながら室温で１時間溶解させることによって精製した。次いで、最適なリフォールディング条件を特定するために、変性還元ＦｃループＴＮ８−１９−７構築体の各々について様々なリフォールディング条件を評価した。Ｇ２０１／Ｎ２０２、Ｅ１６９／Ｎ１７０及びＳ１８１／Ｄ１８２の３個の構築体は、試験した条件のいずれでも十分に再折り畳みされなかった。残りの４個のＦｃループＴＮ８−１９−７構築体のうち、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）が最も良く再折り畳みされ、残りのＨ４９／Ｅ５０、Ｙ７７／Ｎ７８及びＫ１０７／Ａ１０８の３個は十分な収率で再折り畳みされ、さらに精製された。

最適再折り畳み条件を用いて、４Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１６Ｍ Ａｒｇ−ＨＣｌ、２０％グリセリン、３Ｍシスチン、５ｍＭシスタミン ｐＨ８．５に１：２５（ｖ／ｖ）希釈することによって、変性還元ＦｃループＴＮ８−１９−７構築体を可溶化封入体部分から再折り畳みした。可溶化ペプチボディを再折り畳み緩衝剤に４℃で撹拌しながら滴下した。再折り畳み反応物を７２時間撹拌し、続いてクロマトグラフによって精製した。実施例２に記載した通り、最終精製を２カラムクロマトグラフィープロセスによって実施した。

図２３及び２４に示したように、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）、Ｈ４９／Ｅ５０、Ｙ７７／Ｎ７８及びＫ１０７／１０８の各最終プールをＲＰ−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。これら４個の構築体の収率を表１３に示す。

４個の精製類似体のうち、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）挿入部位類似体は、最高純度及び最高収率で生成された。

精製Ｆｃループ挿入類似体を、実施例９に記載のように、機能的ミオスタチン受容体結合活性についてインビトロでの細胞を用いた阻害アッセイによってさらに分析した。結果を表１４に示す。

精製Ｆｃループ挿入類似体をＦｃＲｎ結合についてＢｉａｃｏｒｅアッセイシステムを用いてさらに分析した。試料Ｋ１０７／Ａ１０８は、分析後の残留試料が不十分であったので、試験しなかった。インビトロでの細胞を用いたミオスタチン阻害アッセイによって決定されたＩＣ_５０値は、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）挿入と元のＦｃループ＃６９５１とでは類似していたのに対して、Ｈ４９／Ｅ５０及びＹ７７／Ｎ７８におけるＦｃループ挿入ではミオスタチン阻害能力が低下した（図３０）。Ｂｉａｃｏｒｅ ＦｃＲｎ結合実験によれば、Ｈ４９／Ｅ５０及びＹ７７／Ｎ７８は、対照（Ｆｃループ−１ｘＴＮ８−１９−７、＃６９５１）と同じ程度にＦｃ受容体と結合し、ＥＣ_５０が約６８０ｎＭであったが、Ｌ１３９／Ｔ１４０（Ｇ４−６）はＥＣ_５０がより低く、より好都合な約２２０ｎＭであった。

要約すると、評価した６個の新しい挿入部位のうち、３個は効率的に再折り畳みすることができなかった。回収した３個の新しい挿入部位類似体のうち、Ｋ１０７／Ａ１０８は折り畳みが不十分であり、Ｈ４９／Ｅ５０（ＣＨ２ドメイン）はわずかに良好に再折り畳みされ、Ｙ７７／Ｎ７８（ＣＨ２ドメイン）における残り２個の挿入及び長い非対称リンカーを有する最初の挿入部位Ｌ１３９／Ｔ１４０（ＣＨ３ドメイン）はより高効率で折り畳まれた。興味深いことに、これらの新規挿入部位類似体の全てが、対称Ｇｌｙ２リンカーによって位置Ｌ１３９／Ｔ１４０にＴＮ８−１９−７を有する最初のＦｃループ構築体（＃６９５１）よりもかなり低い収率で再折り畳みされた。

ＦｃＲｎ結合能を保持しているかどうかについて試験すると、全てのＦｃループ分子は、親和性が類似していると考えられた。但し、予想された例外として、長い非対称リンカー構築体はわずかに良好と考えられた。これは、挿入ペプチドとＦｃＲｎ結合界面との立体的相互作用を最小化する設計の理論的枠組と一致していた。

全ての精製Ｆｃループ構築体は、インビトロ細胞機能アッセイ（表１４）によって活性であったが、最初の挿入部位（Ｌ１３９／Ｔ１４０）及び同じ部位における長い非対称リンカー挿入は最も強力であると考えられた。

この研究は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ内の複数のループドメインは、図２３で確認されるように、ペプチドとＦｃＲｎ結合などのＦｃエフェクター機能の両方の活性を保ちつつ、生理活性ペプチドの挿入が可能であることを示している。これらのＦｃループドメインを利用したペプチド挿入類似体は、リフォールディング効率及びペプチド活性がかなり変動し得る。各ペプチド／挿入の組み合わせは、回収率及び効力を最大にするように個々に最適化することができる。

より好ましいのは、図２３において下線を引いたサブドメインを標的としたペプチド挿入である。最も好ましいのは、挿入部位（Ｌ１３９／Ｔ１４０）及びＣＨ_２ドメイン中の２個の追加のループ（Ｈ４９／Ｅ５０及びＹ７７／Ｎ７８）である。

略語
本明細書を通して使用する略語は、特定の状況で特に断らない限り、以下に定義する通りである。

Ａｃ （アセチル化残基の記述に用いる）アセチル
ＡｃＢｐａ アセチル化ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡＤＣＣ 抗体依存性細胞傷害
Ａｉｂ アミノイソ酪酸
ｂＡ ベータ−アラニン
Ｂｐａ ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ ブロモアセチル（ＢｒＣＨ_２Ｃ（Ｏ）
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ ベンジル
Ｃａｐ カプロン酸
ＣＴＬ 細胞傷害性Ｔリンパ球
ＣＴＬＡ４ 細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４
ＤＡＲＣ ダッフィ血液型抗原受容体
ＤＣＣ ジシクロ（Ｄｉｃｙｌｃｏ）ヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＭＰ エリスロポイエチン様ペプチド
ＥＳＩ−ＭＳ エレクトロンスプレーイオン化質量分析法
ＥＰＯ エリスロポイエチン
Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル
Ｇ−ＣＳＦ 顆粒球コロニー刺激因子
ＧＨ 成長ホルモン
ＨＣＴ ヘマトクリット
ＨＧＢ ヘモグロビン
ｈＧＨ ヒト成長ホルモン
ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＩＬ インターロイキン
ＩＬ−Ｒ インターロイキン受容体
ＩＬ−１Ｒ インターロイキン−１受容体
ＩＬ−１ｒａ インターロイキン−１受容体アンタゴニスト
Ｌａｕ ラウリン酸
ＬＰＳ リポ多糖
ＬＹＭＰＨ リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法
Ｍｅ メチル
ＭｅＯ メトキシ
ＭＥＳ （２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）
ＭＨＣ 主要組織適合複合体
ＭＭＰ マトリックスメタロプロテイナーゼ
ＭＭＰＩ マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤
ＮａＯＡｃ 酢酸ナトリウム
１−Ｎａｐ １−ナフチル（ｎａｐｔｈｙｌ）アラニン
ＮＥＵＴ 好中球
ＮＧＦ 神経成長因子
Ｎｌｅ ノルロイシン
ＮＭＰ Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
Ｐｂｆ ２，２，４，６，７−ペンタ（ｐｅｎｄａ）メチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応法
Ｐｅｃ ピペコリン酸
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ ピログルタミン酸
Ｐｉｃ ピコリン酸
ＰＬＴ 血小板
ｐＹ ホスホチロシン
ＰＴＦＥ ポリテトラフルオロエチレン
ＲＢＣ 赤血球
ＲＢＳ リボソーム結合部位
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相ＨＰＬＣ
ＲＴ 室温（２５℃）
Ｓａｒ サルコシン
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ セリンスレオニンキナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＧＦ 組織成長因子
ＴＨＦ 胸腺液性因子
ＴＫ チロシンキナーゼ
ＴＭＰ トロンボポイエチン様ペプチド
ＴＮＦ 組織壊死因子
ＴＰＯ トロンボポイエチン
ＴＲＡＩＬ ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド
Ｔｒｔ トリチル
ＵＫ ウロキナーゼ
ＵＫＲ ウロキナーゼ受容体
ＶＥＧＦ 血管内皮細胞増殖因子
ＶＩＰ 血管作動性腸ペプチド
ＷＢＣ 白血球

図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、この発明の方法により修飾し得るＦｃドメインのループ領域を示す。図１Ａは、単量体のラットＩｇＧ２ａ Ｆｃドメイン（タンパク質データベースファイル＃１Ｉ１Ｃ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）を示す。この図は、ｘ線回折結晶構造から得られた、ラットＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインモノマーの３次元モデルを示す（ｐｄｂ ＃１Ｉ１Ｃ）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方の可能なＦｃループ挿入部位を示す。好ましいＣＨ３ドメインＦｃループ挿入部位を特に区別して示す。 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、この発明の方法により修飾し得るＦｃドメインのループ領域を示す。図１Ｂは、単量体ネズミＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（タンパク質データベースファイル＃１ＩＧＹ）を示す。この図は、ｘ線回折結晶構造から得られた、ネズミＩｇＧ１ Ｆｃドメインモノマーの３次元モデルを示す（ｐｄｂ ＃１ＩＧＹ）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方の可能なＦｃループ挿入部位を示す。好ましいＣＨ３ドメインＦｃループ挿入部位を特に区別して示す。 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、この発明の方法により修飾し得るＦｃドメインのループ領域を示す。図１Ｃは、単量体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（タンパク質データベースファイル＃１Ｈ３Ｔ）を示す。この図は、ｘ線回折結晶構造から得られた、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインモノマーの３次元モデルを示す（ｐｄｂ ＃１Ｈ３Ｔ）。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方の可能なＦｃループ挿入部位を示す。好ましいＣＨ３ドメインＦｃループ挿入部位を特に区別して示す。 図２Ａは、太字の予測ループ配列とのペプチボディ融合体に使用する一連のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（配列番号５９９）を示す図である。図２Ａは、本発明に使用するヒトＩｇＧ１配列に関連して、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示す構造によって示唆される、太字のＦｃループ領域（配列番号６２１、６２２、６２４、６２５、６２７、６２８、６３０、６３２、６３４及び６３６）を示す。太字で示す部位のいずれか又は全ては、ペプチド配列による完全若しくは部分的な置換に、又はペプチド配列の挿入に適切となり得、本発明の一部と見なされる。特に好ましい内部部位に下線を引く（配列番号６２３、６２６、６２９、６３１、６３３、６３５及び６３７）。好ましい一部位は、ＤＥＬＴＫ（配列番号６３０）ループ中のＬｅｕ_１３９とＴｈｒ_１４０の間の配列番号６３１である。 図２Ｂ及び２Ｃは、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブクラス由来のヒトＦｃドメインの配列アラインメントを示す図である。図２Ｂ及び２Ｃは、本発明において有用であり得るＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブタイプ由来のヒトＦｃ領域の例示的アミノ酸配列（配列番号６００から６０７）を示す。図２Ｂ及び２Ｃは、コンセンサス配列（配列番号６０８）も示す。図２Ｂ及び２Ｃはまた、図２Ａに示すＦｃ配列の内部部位に対応する、ペプチド付加のための好ましい内部部位を太字で示す（配列番号５９９）。 図２Ｂ及び２Ｃは、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブクラス由来のヒトＦｃドメインの配列アラインメントを示す図である。図２Ｂ及び２Ｃは、本発明において有用であり得るＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＧサブタイプ由来のヒトＦｃ領域の例示的アミノ酸配列（配列番号６００から６０７）を示す。図２Ｂ及び２Ｃは、コンセンサス配列（配列番号６０８）も示す。図２Ｂ及び２Ｃはまた、図２Ａに示すＦｃ配列の内部部位に対応する、ペプチド付加のための好ましい内部部位を太字で示す（配列番号５９９）。 図２Ｄは、ペプチボディプラットフォームに使用するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（Ａｍｇｅｎ Ｆｃ、配列番号６０９）と、ＦｃＲｎ／Ｆｃ複合体の結晶構造由来のラットＩｇＧ２Ａ（１Ｉ１Ａ．ｐｄｂ、配列番号６１０とのアラインメントを示す図である。得られたコンセンサス配列（配列番号６１１）も示す。 図３Ａは、ミオスタチン結合ペプチド（配列番号３６５）が挿入されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号６１２）を示す図である。以下、この分子を「ミオスタチンループペプチボディ」又は「Ｆｃループ−ｍｙｏ７」と記述する。挿入ペプチドを太字で示し、グリシンリンカーをイタリック体で示す。 図３Ｂは、ＴＮ８−１９−０７と記述されるＣ末端連結ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１３）を示す図である。このペプチボディは、Ｆｃループ−ｍｙｏ７と同じペプチド配列を含む（配列番号３６５）。ＴＮ８−１９−０７ペプチドを太字で示し、グリシン及びアラニンの各リンカーをイタリック体で示す。 図３Ｃは、Ｆｃループ−ＥＭＰと以下で記述するＦｃ内部ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１５）を示す図である。このペプチボディはＥＰＯ様ペプチド（配列番号２）を含む。挿入ペプチドを太字で示し、グリシンリンカーをイタリック体で示す。ジスルフィド結合を形成するシステインには下線が引かれている。 図３Ｄは、Ｆｃループ−Ａｍｐ２と以下で記述するＦｃ内部ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１６）を示す図である。生理活性ペプチド（配列番号２８）を太字で強調表示し、グリシンリンカーをイタリック体で強調表示する。ＡＭＰ−２ペプチド挿入におけるジスルフィド拘束はない。 図３Ｅは、Ｆｃループ−ＡＭＰ２−２量体と以下で記述するＣ末端連結ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１７）を示す図である。この直列治療ペプチド２量体は、治療ペプチド配列（配列番号２８）を太字で示し、リンカーをイタリック体で示す。この分子は、Ｆｃループ−ＡＭＰ−２中に存在するものと同じペプチド配列の直列ペプチド２量体を含む。 図４Ａ及び４Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％）によってＦｃループ−ｍｙｏ７及びＴＮ８−１９−０７のＥ．コリ中での発現を示す図である。Ｆｃループ−Ｍｙｏ７（＃６９５１）とＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の両方の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性（ｓｏｌ）画分の還元ゲル中の各試料を示す。ＳｅｅＢｌｕｅ及び分子量マーカー（レーン１）、全細胞溶解物（レーン２）、不溶性画分（レーン３）及び不溶性画分（レーン４）。 図４Ａ及び４Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％）によってＦｃループ−ｍｙｏ７及びＴＮ８−１９−０７のＥ．コリ中での発現を示す図である。Ｆｃループ−Ｍｙｏ７（＃６９５１）とＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の両方の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性（ｓｏｌ）画分の還元ゲル中の各試料を示す。ＳｅｅＢｌｕｅ及び分子量マーカー（レーン１）、全細胞溶解物（レーン２）、不溶性画分（レーン３）及び不溶性画分（レーン４）。 図５は、Ｆｃループ−Ｍｙｏ７（＃６９５１）及びＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各未精製再折り畳み反応物の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を比較したグラフである。 図６は、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）とカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各最終精製プールの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を比較したグラフである。 図７は、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）及びカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃６８２６）の各最終精製プールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％ゲル）による分析結果を示す図である。各試料５μｇを以下の通り充填した：＃６９５１（レーン１）、＃６８２６（レーン２）、ＳｅｅＢｌｕｅ＋マーカー（レーンＭ）、還元＃６９５１（レーン３）、還元＃６８２６（レーン４）。 図８は、ミオスタチン抑制性化合物を測定するインビトロ細胞系バイオアッセイを示すグラフである。ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）は、カルボキシ末端ＴＮ８−１９−０７ペプチボディ（＃６８２６）と比較して十分な抑制活性を保持する。 図９は、ＦｃループＴＮ８−１９−０７（＃６９５１）及びカルボキシ末端ＴＮ８−１９−０７ペプチボディ（＃６８２６）に対するインビボ安定性試験のウエスタンブロット分析結果を示す図である。５匹のマウスから得た血清プールを各時点（０、４、２４及び４８時間）で評価した。レーン１−３はそれぞれ２ｎｇ、５ｎｇ及び１０ｎｇのＦｃループＴＮ８−１９−０７標準である。レーン４と５は４時間におけるそれぞれＦｃループペプチボディ対カルボキシ末端ペプチボディである。レーン６と７は２４時間におけるそれぞれＦｃループペプチボディ対カルボキシ末端ペプチボディである。レーン８と９は４８時間におけるそれぞれＦｃループペプチボディ対カルボキシ末端ペプチボディである。レーン１０−１２は、それぞれ２ｎｇ、５ｎｇ及び１０ｎｇのカルボキシ末端ペプチボディ標準である。 図１０Ａは、Ａｎｇ２結合ペプチド（配列番号１４７）が挿入されたヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号６１８）を示す図である。以下、この分子を「Ａｎｇ２ループペプチボディ」又は「Ｆｃループ−Ａｎｇ２」と記述する。生理活性ペプチドを太字で強調表示し、グリシンリンカーをイタリック体で強調表示する。 図１０Ｂは、本明細書ではＴＮ８−Ｃｏｎ４と記述するＣ末端連結ペプチボディのアミノ酸配列（配列番号６１９）を示す図である。この分子は、Ｆｃループ−ａｎｇ２と同じペプチド配列を含む（配列番号１４７）。生理活性ペプチドを太字で強調表示し、グリシン及びアラニンの各リンカーをイタリック体で強調表示する。 図１１は、ＦｃループＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）及びカルボキシ末端ＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の各ペプチボディのＥ．コリ中での発現及び分布をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示す図である。Ｆｃループ−Ｔｎ８−Ｃｏｎ４（＃６８８８）とＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の両方の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性画分（ｓｏｌ）の還元ゲル中の各試料を示す。 図１２は、ＦｃループＡｎｇ２（＃６８８８）とカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−１９−０７（＃５５６４）の各再折り畳み反応物のＲＰ−ＨＰＬＣを比較したグラフである。 図１３は、ＦｃループＡｎｇ２（＃６８８８）とカルボキシ末端Ｆｃ ＴＮ８−Ｃｏｎ４（＃５５６４）の各最終精製プールのＲＰ−ＨＰＬＣを比較したグラフである。 図１４は精製Ｆｃループ−ｍｙｏ７及びＴＮ８−１９−７を示す図である。 図１５はＦｃループ−ａｎｇ２及びＦｃ−ａｎｇ２−直列のＢｉａｃｏｒｅ結合分析結果を示すグラフである。 図１６は、Ｆｃループ−ａｎｇ２、ＴＮ８−Ｃｏｎ４及びＦｃ−ａｎｇ２−直列のインビトロ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図である。 図１７は、Ｆｃループ−ＥＭＰのＵＴ７エリスロポイエチン増殖アッセイの結果を示す図である。このアッセイでは、２個の異なるＦｃループ−ＥＭＰ分子の活性をエポエチンアルファの活性と比較する。 図１８は、ＦｃループＴＮ８−Ａｍｐ２（＃６８７５）ペプチボディのＥ．コリ中での発現及び分布をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示す図である。Ｆｃループ−Ａｍｐ２（＃６８８８）の粗製細胞溶解物（ｌｙｓ）、不溶性画分（ｉｎｓｏｌ）及び可溶性（ｓｏｌ）画分の還元ゲル中の各試料を示す。 図１９は、ＦｃループＡＭＰ ２（＃６８７５）の最終精製プールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−２０％ゲル）による分析結果を示す図である。レーン２にＦｃループＡＭＰ ２ペプチボディ５μｇを充填した。レーン４に還元ＦｃループＡＭＰ ２ペプチボディ５μｇを充填した。レーン１及び３にＳｅｅＢｌｕｅ及び２種類の分子量マーカーを充填した。 図２０は、ＦｃループＡＭＰ ２（＃６８７５）の最終精製プールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。 図２１は、ＦｃループＡＭＰ ２及びＡＭＧ ５３１の各ペプチボディのネズミインビボバイオアッセイ結果を示すグラフである。 図２２は、２個の生理活性ペプチドをＦｃループペプチボディに組み込む幾つかの戦略を示す図である。 図２３は、精製Ｆｃループ構築体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。試料（２ｕｇ／レーン）を４−２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で＋／−還元緩衝剤泳動させた。 図２４はＦｃループ構築体のＲＰ−ＨＰＬＣを示すグラフである。

Claims (23)

1. 次式の構成物、及びその多量体：
   

   

   ［式中、
   Ｆ^１はループ領域中に１個のＸ^３を含むように修飾されたＩｇＧ Ｆｃドメインであり、前記ループ領域はＩｇＧ Ｆｃドメインの非末端ドメインに存在している、
   Ｘ^３は−（Ｌ^５）_ｃ−Ｐ^５ であり、
   Ｐ^５ は薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
   Ｌ ^５ はリンカーであり、
   ａおよびｂは０であり、
   ｃは０又は１であり、
   前記ＩｇＧ Ｆドメインが配列番号５９９及び配列番号６０３〜６０８から選択される配列を含み、Ｘ^３が、配列番号５９９のＨ_４９／Ｅ_５０，Ｙ_７７／Ｎ_７８，Ｋ_１０７／Ａ_１０８もしくはＬ_１３９／Ｔ_１４０において、又は配列番号６０３のＨ_５３／Ｅ_５４、Ｙ_８１／Ｎ_８２、Ｋ_１１１／Ａ_１１２もしくはＬ_１４３／Ｔ_１４４において、又は配列番号６０４のＨ_５３／Ｅ_５４、Ｙ_８１／Ｎ_８２、Ｋ_１１１／Ａ_１１２もしくはＭ_１４３／Ｔ_１４４において、又は配列番号６０５のＨ_１００／Ｅ_１０１、Ｆ_１２８／Ｎ_１２９、Ｋ_１５８／Ａ_１５９もしくはＭ_１９０／Ｔ_１９１において、又は配列番号６０６のＨ_４９／Ｅ_５０、Ｆ_７７／Ｎ_７８、Ｋ_１０７／Ｇ_１０８もしくはＭ_１３９／Ｔ_１４０において、又は配列番号６０７のＱ_５０／Ｅ_５１、Ｆ_７８／Ｎ_７９、Ｋ_１０８／Ｇ_１０９もしくはＭ_１４０／Ｔ_１４１において、又は配列番号６０８のＨ_６５／Ｅ_６６、Ｆ_９３／Ｎ_９４、Ｋ_１２３／Ａ_１２４もしくはＭ_１５７／Ｔ_１５８において挿入されている］。
2. Ｘ^３がアンジオテンシン−２（ａｎｇ−２）結合ペプチド配列を含む請求項１に記載の構成物。
3. ａｎｇ−２結合ペプチド配列が配列番号１００〜１８９から選択される請求項２に記載の構成物。
4. ａｎｇ−２結合ペプチド配列が配列番号１４７である請求項３に記載の構成物。
5. Ｘ^３がミオスタチン結合ペプチド配列を含む請求項１に記載の構成物。
6. ミオスタチン結合ペプチド配列が配列番号２１８〜５０９から選択される請求項５に記載の構成物。
7. ミオスタチン結合ペプチド配列が配列番号３６５である請求項６に記載の構成物。
8. Ｘ^３がエリスロポイエチン様（ＥＰＯ様）ペプチド配列を含む請求項１に記載の構成物。
9. ＥＰＯ様ペプチド配列が配列番号１〜２７から選択される請求項８に記載の構成物。
10. ＥＰＯ様ペプチド配列が配列番号２である請求項９に記載の構成物。
11. Ｘ^３がトロンボポイエチン様（ＴＰＯ様）ペプチド配列を含む請求項１に記載の構成物。
12. ＴＰＯ様ペプチド配列が配列番号２８〜９９から選択される請求項１１に記載の構成物。
13. ＴＰＯ様ペプチド配列が配列番号２８である請求項１２に記載の構成物。
14. Ｘ^３が神経成長因子（ＮＧＦ）結合ペプチド配列を含む請求項１に記載の構成物。
15. ＮＧＦ結合ペプチド配列が配列番号１９０〜２１８から選択される請求項１４に記載の構成物。
16. Ｘ^３がＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）結合ペプチド配列を含む請求項１に記載の構成物。
17. ＢＡＦＦ結合ペプチド配列が配列番号５１０〜５９４から選択される請求項１６に記載の構成物。
18. 請求項１に記載の構成物をコードするＤＮＡ。
19. 請求項１８に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
20. 請求項１９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
21. 細胞がＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞である請求項２０に記載の細胞。
22. １個のＸ^３をループ領域中に含むように修飾されたＩｇＧ Ｆｃドメインを含む修飾抗体であって、前記ループ領域はＩｇＧ Ｆｃドメインの非末端ドメインに存在しており、
    Ｘ^３が−（Ｌ^５）_ｃ−Ｐ^５ であり、
    Ｐ^５ が薬理学的に活性なペプチドの配列であり、
    Ｌ^５ が各々独立にリンカーであり、
    ｃが０又は１であり、
    前記ＩｇＧ Ｆｃドメインが配列番号５９９及び配列番号６０３〜６０８から選択される配列を含み、Ｘ^３が、配列番号５９９のＨ_４９／Ｅ_５０，Ｙ_７７／Ｎ_７８，Ｋ_１０７／Ａ_１０８もしくはＬ_１３９／Ｔ_１４０において、又は配列番号６０３のＨ_５３／Ｅ_５４、Ｙ_８１／Ｎ_８２、Ｋ_１１１／Ａ_１１２もしくはＬ_１４３／Ｔ_１４４において、又は配列番号６０４のＨ_５３／Ｅ_５４、Ｙ_８１／Ｎ_８２、Ｋ_１１１／Ａ_１１２もしくはＭ_１４３／Ｔ_１４４において、又は配列番号６０５のＨ_１００／Ｅ_１０１、Ｆ_１２８／Ｎ_１２９、Ｋ_１５８／Ａ_１５９もしくはＭ_１９０／Ｔ_１９１において、又は配列番号６０６のＨ_４９／Ｅ_５０、Ｆ_７７／Ｎ_７８、Ｋ_１０７／Ｇ_１０８もしくはＭ_１３９／Ｔ_１４０において、又は配列番号６０７のＱ_５０／Ｅ_５１、Ｆ_７８／Ｎ_７９、Ｋ_１０８／Ｇ_１０９もしくはＭ_１４０／Ｔ_１４１において、又は配列番号６０８のＨ_６５／Ｅ_６６、Ｆ_９３／Ｎ_９４、Ｋ_１２３／Ａ_１２４もしくはＭ_１５７／Ｔ_１５８において挿入されている、
    前記修飾抗体。
23. ａ）目的タンパク質の活性を調節する１個のペプチドを選択すること、及び
    ｂ）ＩｇＧ抗体のＦｃドメインのループ領域中に前記選択ペプチドのアミノ酸配列を含むＩｇＧ抗体を調製すること
    を含む、修飾抗体を調製する方法であって、ここで前記ループ領域は前記Ｆｃドメインの非末端ドメインに存在しており、前記Ｆｃドメインが配列番号５９９及び配列番号６０３〜６０８から選択される配列を含み、前記選択ペプチドが、配列番号５９９のＨ_４９／Ｅ_５０，Ｙ_７７／Ｎ_７８，Ｋ_１０７／Ａ_１０８もしくはＬ_１３９／Ｔ_１４０において、又は配列番号６０３のＨ_５３／Ｅ_５４、Ｙ_８１／Ｎ_８２、Ｋ_１１１／Ａ_１１２もしくはＬ_１４３／Ｔ_１４４において、又は配列番号６０４のＨ_５３／Ｅ_５４、Ｙ_８１／Ｎ_８２、Ｋ_１１１／Ａ_１１２もしくはＭ_１４３／Ｔ_１４４において、又は配列番号６０５のＨ_１００／Ｅ_１０１、Ｆ_１２８／Ｎ_１２９、Ｋ_１５８／Ａ_１５９もしくはＭ_１９０／Ｔ_１９１において、又は配列番号６０６のＨ_４９／Ｅ_５０、Ｆ_７７／Ｎ_７８、Ｋ_１０７／Ｇ_１０８もしくはＭ_１３９／Ｔ_１４０において、又は配列番号６０７のＱ_５０／Ｅ_５１、Ｆ_７８／Ｎ_７９、Ｋ_１０８／Ｇ_１０９もしくはＭ_１４０／Ｔ_１４１において、又は配列番号６０８のＨ_６５／Ｅ_６６、Ｆ_９３／Ｎ_９４、Ｋ_１２３／Ａ_１２４もしくはＭ_１５７／Ｔ_１５８において挿入されている、前記調製方法。

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