JP2023519347A - 少なくとも１つの制御性ｔ細胞活性化エピトープを含むタンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、免疫学の分野、特に、免疫応答の調節、とりわけ、免疫応答の抑制および／または免疫寛容の誘導の分野に関する。本発明は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に由来する配列に基づくＴレジトープ（制御性Ｔ細胞活性化エピトープ）担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を提供し、該ＴＣＰは、３つの特定配列フレームの少なくとも１つ内に位置するヒトＩｇＧとは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含む。本発明は、多目的に、例えば、単量体または二量体形態で、両者が要すれば、例えば、免疫応答が調節または抑制されるべき薬剤に連結されるか、そのような薬剤と共投与されるか、または単独の治療剤として用いるための、そのようなポリペプチドを提供する。本発明のＴＣＰをコード化する核酸、医薬組成物および該ＴＣＰの使用もまた提供する。

Description

本発明は、免疫学の分野、特に免疫応答の調節、とりわけ免疫応答の抑制および／または免疫寛容の誘導の分野に関する。本発明は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に由来する配列に基づくＴレジトープ（制御性Ｔ細胞活性化エピトープ：tregitope）担持ポリペプチドを提供し、ここで、該ＴＣＰは、３つの特定の配列フレームの少なくとも１つ内に位置するヒトＩｇＧとは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含む。本発明は、多目的に、例えば、単量体または二量体形態で、両者が要すれば、例えば、免疫応答が調節または抑制されるべき薬剤に連結されるか、そのような薬剤と共投与されるか、または単独の治療剤として使用するための、そのようなポリペプチドを提供する。本発明のＴＣＰをコード化する核酸、医薬組成物および該ＴＣＰの使用もまた提供する。
背景
制御性Ｔ細胞活性化エピトープ（Ｔレジトープ）は、もともとヒトおよび霊長動物のタイプＧ免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域に見出されたペプチドであり、制御性Ｔ細胞を活性化することができる（L. Cousens, et al, Hum. Immunol. 75, 1139-1146 (2014); Y. Su, R. Rossi, et al. J. Leukoc. Biol. 94, 377-383 (2013); L. Cousens, et al., J. Clin. Immunol. 33 (Suppl 1), S43-S49 (2013))。Ｔレジトープは、複数のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するコンセンサス領域を探索するヒトＩｇ分子のコンピューターによるエピトープマッピングによって同定されている（R. Caspi, Blood 112:3003-3004 (2008)）。Ｔレジトープの提示は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）により制限されており、ここで、Ｔレジトープは複数のＨＬＡにより提示される。Ｔレジトープは、既存の天然（natural）制御性Ｔ細胞に選択的に結合して活性化し、炎症の抑制をもたらすことが記載されている（De Groot et al. Blood 112(8):3303-3311 (2008)）。
Ｔレジトープは、短い（一般に１５～２０アミノ酸）直鎖状ペプチド配列であり、ＨＬＡに結合して制御性Ｔ細胞を活性化する。Ｔレジトープの配列は、類似の自己タンパク質において高度に保存されている。ほぼ全ての同定されたＴレジトープは、単一の９マーの配列を示し、これはEpiMatrixエピトープ予測アルゴリズム（ＷＯ ２００８／０９４５３８Ａ２に開示される）により、少なくとも４種のＨＬＡ ＤＲ対立遺伝子に結合すると予測され得る。かかる同定されたＴレジトープは、ヒト集団において広く認識され得る。Ｔレジトープに応答するＴ細胞は、制御性Ｔ細胞表現型（ＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋）を示す。
Ｔレジトープの免疫抑制効果および免疫調節効果は、最近、Maddur et al. Trend in Immunology 38(11): 789-792 (2017)によってレビューされており、制御性Ｔ細胞に対するＴレジトープの活性化効果が記載されている（L. Cousens, et al, Hum. Immunol. 75, 1139-1146 (2014); Su et al. J. Leukoc. Biol. 94, 377-383 (2013)；L. Cousens, et al., J. Clin. Immunol. 33 (Suppl 1), S43-S49 (2013))。最近の文献では、Ｔレジトープがアレルギーの処置（De Groot et al, Blood 112(8): 3303-3311 (2008))、炎症性大腸炎の処置(Van der Marel et al. World J Gastroenterol. 18(32): 4288-4299 (2012))、１型糖尿病の処置(Su et al. J. Leukoc. Biol. 94, 377-383 (2013)、Cousens et al. Journal of Diabetes Research, Volume 2013, Article ID 621693 (2013)）、多発性硬化症の処置（Elyaman et al., Neurology Research International, Volume 2011, Article ID :256460 (2011)）、および耐性の誘導（Cousens et al., Hum. Immunol. 75, 1139-1146 (2014))に適していることが示されている。
ＷＯ ２００８／０９４５３８ Ａ２は、いくつかの特定のＴレジトープ、ならびにアレルギー、移植、自己免疫、糖尿病、Ｂ型肝炎感染、全身性エリテマトーデス、バセドウ病および自己免疫甲状腺炎の処置におけるこれらの適用を記載している。Ｔレジトープは、例えば、望ましくない免疫応答を伴う病状の処置手段として用いられ得る。
ＷＯ ２００６／０３６８３４ Ａ２には、ループ領域に薬理活性ペプチドを含むヒトＩｇＧ Ｆｃドメインを有する分子が記載されている。
これまで、Ｔレジトープの有利な特性を利用することは困難であった。また、Ｔレジトープまたはそれを含むタンパク質を製造することは、これまで困難であった。そのため、Ｔレジトープまたはそれを含むタンパク質を容易に製造する手段および方法の開発が強く望まれている。
一般に、Ｔレジトープは、ペプチド合成または組換え生産によって提供され得る。しかしながら、化学的なペプチド合成は、必要なペプチドの量を考えると満足のいくものではない。さらに、Ｔレジトープを単独で用いることは、例えば、循環血液中のペプチドの半減期が短いために、治療的投与に適していない。本発明者らの知る限り、２以上のＴレジトープを他のタンパク質に組み込んだり、融合して発現させたりする試みは、あまり成功していない。Cousensら（Albumin Delivery of Tregitope Peptides for Tolerance Induction in Autoimmunity and Inflammatroy Disease, AAPS May 2014）は、異なる数のＴレジトープに結合したヒト血清アルブミンの融合タンパク質を試験し、ここで、２個および４個のＴレジトープを有するタンパク質を詳細に分析した。４個の末端に融合させたＴレジトープを有するバージョンは、大きな分解生成物を生じ、精製が困難であることが記載されている。
さらに、標的特異的な免疫寛容を伝えるために、潜在的に免疫原性のタンパク質またはペプチドにＴレジトープを組み込むことが望ましいため、組換え生産が望ましいと思われる。
しかし、ＴレジトープまたはＴレジトープを含むタンパク質の組換え生産は困難である。Ｔレジトープを細菌発現系（大腸菌）で生産する試みがなされているが、本発明者らの知る限り、ペプチドの高い疎水性のためか、これらの試みはすべて失敗している。また、真核生物でのＴレジトープの発現も同様の問題を有する。Ｔレジトープをアルブミンおよび他のタンパク質と融合させ、発現を向上させる試みがなされてきた。しかし、本発明者らの知る限り、これらのアプローチは満足のいく結果には至っていない。化学合成（ＦＭＯＣなど）によりＴレジトープを製造することは可能であるが、合理的なコストでＴレジトープを大量に製造すること、または組換え法によりＴレジトープを融合タンパク質で常套的に発現させることは、依然として困難である。
したがって、Ｔレジトープの効果的な生産、特に効率的な発現系、例えば標的特異的な免疫寛容を伝えるために複数のＴレジトープを標的タンパク質に連結することを可能にするアプローチに対する当技術分野の強いニーズが存在する。また、Ｔレジトープの治療能力を活用するために、Ｔレジトープを対象に投与することを可能にすることも強く求められている。
本発明
これらの問題は、本明細書に記載される本発明によって、例えば、特許請求の範囲の主題によって解決される。
Ｔレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）
第１の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を提供し、ここで該ＴＣＰは、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。配列番号１は、ヒトＩｇＧ１の重鎖配列の定常領域を表す（詳細は後段でさらに記載する）。従って、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０は、ヒトＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一部を含み、特にＣ１４４におけるジスルフィド架橋を含む。したがって、本発明のＴＣＰは、一般的には、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に由来する配列を含む。
別の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１１４～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を提供し、ここで該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。要すれば、該ＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。
別の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１０４～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を提供し、ここで該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。要すれば、該ＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。要すれば、該ＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。
本発明において、新規のＴレジトープ担持ポリペプチド（“ＴＣＰ”と略す）が開発され、種々の目的および用途のために、Ｔレジトープ（同じものとして、“制御性Ｔ細胞活性化エピトープ”と称される）の発現および投与を特に効率的かつ柔軟な方法で行うことが可能となった。
本発明は、Ｔレジトープが、免疫グロブリンＦｃ部分の（配列番号１に記載のような）鎖（複数可）に組み込まれるとき、驚くほどよく発現され得るという予期せぬ発見に基づいている。さらに、Ｔレジトープのための骨格または担体分子としてのＦｃ部分鎖の使用は、１以上のＴレジトープの組み込みおよび成功裏の発現を可能にし、それにより、顕著に効率的な発現および／または送達ツールを提供することができる。
さらに、本発明者らは、Ｔレジトープの特に効率的な発現を可能にする、該Ｆｃ部分の鎖内の特に有利なフレームを特定した。これらのフレームは、複数のＴレジトープのバリエーションおよびその組合せを組み込むことを可能にするモジュール設計を提供し、したがって、選択した製品を設計するための極めて高度の柔軟性を提供する。
本発明のＴレジトープを担持するポリペプチドは、医薬の分野でも有用であり、特に免疫学的障害を処置するために有用である。例えば、Ｔレジトープ担持ポリペプチドは、例えば過剰な免疫応答を処置するために、単独の治療薬として投与され得る。ＴレジトープがＦｃ部分に組み込まれているという事実は、単離されたＴレジトープと比較してより容易な製造を可能にするだけでなく、単一のＴレジトープの投与と比較して製品の血漿半減期を向上させる役割を果たし得る。このように、Ｔレジトープ担持ポリペプチドは、治療薬または予防薬として顕著に有用である。
Ｔレジトープ担持ポリペプチドはまた、Ｔレジトープを、例えば融合タンパク質の形態で、他のタンパク質に容易に組み入れおよび／または結合させることができる。したがって、本発明は、Ｔレジトープを選択したタンパク質に結合させる柔軟なプラットフォームを提供し、Ｔレジトープを組み込むためのさらなる実験の必要性を低減させる。また、本発明のアプローチは、免疫寛容を伝えたいタンパク質またはペプチドのような特定の物質と組み合わせた、またはそれに連結させたＴレジトープを投与するための新しいツールも提供する。これは、自己免疫、アレルギー、その他の疾患の予防または低減の観点、および治療薬に対する望ましくない免疫応答の予防または低減の観点で特に有用であると考えられる。さらに、例えば、Ｔレジトープを担持するポリペプチドに結合された抗原結合領域によって、該タンパク質は、特定の組織または細胞に標的化され得る。
本発明は、多くの用途に適した担体でＴレジトープを発現させることを可能にする。しかしながら、本発明のアプローチは、ＴレジトープがＴＣＰ内で発現される、単離されたＴレジトープを効果的に製造するために用いられることも可能である。ＴＣＰの発現後、ＴレジトープをＴＣＰ（またはＴＣＰを含むタンパク質）から切り出し、さらに精製してもよい。これにより、単離されたＴレジトープを効率的に製造および利用することができる。
理論はともかく、本発明のアプローチ、すなわち、担体配列として免疫グロブリンのＦｃ部分鎖を用いることにより、Ｔレジトープ同志が互いに結合する傾向を阻止し、効率的に発現させることが可能であると思われる。とりわけ、上記のように、本発明者らの知る限り、複数のＴレジトープをタンパク質に融合させるこれまでの試みはあまり成功していなかった。
したがって、Ｔレジトープを結合させるための骨格としてＦｃ部分鎖を用いることにより、生物学的に、特に真核生物の発現系におけるＴレジトープの効率的なクローニングおよび発現（とりわけ分泌を含む）が可能となる。
Ｔレジトープの担体分子として免疫グロブリンＦｃ部分鎖を用いることにより、１つのポリペプチド内にＴレジトープ、特に２以上のＴレジトープ、有利には異なるＴレジトープでも同一のＴレジトープでもよい３以上のＴレジトープも効率的にクローニングおよび発現させることができる。得られた本発明のＴＣＰは、安定であり、精製が容易である。
本明細書の実施例に示されるように、本発明のＴＣＰは、免疫調節活性に関して良好な結果を示した。これは、９つの主要なＨＬＡ－ＤＲＢ１スーパータイプを代表する広範囲のドナーにわたるエフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖および活性化に対するＴＣＰの免疫抑制能によって示された。
多くのさらなる有用な態様、利点および適用は、本発明の記載から明らかであろう。
本明細書中を通して用いられている用語“配列同一性”は、当業者には知られている。一般的に、アミノ酸配列は、それら２つの整列した配列間の配列同一性が、該他のアミノ酸配列の全長にわたって少なくともｘ％であるとき、他のアミノ酸配列と“少なくともｘ％の同一性”を有する。このようなグローバルアラインメントは、例えば、ＥＭＢＬのホームページ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）で提供されている“EMBOSS”ニードルプログラムのような公に利用可能なコンピュータホモロジープログラムを用いて、提供されている以下の設定を用いて実施することができる：MATRIX：BLOSUM 62；GAP OPEN 20；GAP EXTEND 0.5；OUTPUT FORMAT：pair；END GAP PENALTY：false；END GAP OPEN：10；ENDGAP EXTEND：0.5。アミノ酸配列のセットの配列同一性または配列類似性／配列相同性パーセンテージを計算するさらなる方法は、当技術分野で知られている。
特定の領域、本明細書で定義されたフレームが配列同一性の決定のために考慮されない限り、これは、配列同一性の決定のための比較が行われる前に、フレームのそれぞれの部分配列が、比較が行われる配列および比較される配列の両方において削除されることを意味する。ここで、疑わしい場合には、まず初めに全長配列に対するアライメントを行い、次いで、比較配列中のフレームに対応する配列を削除する。さらに、明確にするために、本明細書中で定義されているように、配列同一性に関連するコア配列の外側のＮ末端およびＣ末端の部分配列は、配列同一性を決定するために考慮されない。したがって、上記第１のアラインメントは、配列同一性の計算のために考慮されないそのようなＮ末端およびＣ末端の部分配列を特定し、そして排除するために用いられ得る。
本発明はさらに、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＰを提供し、ここで、該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。
本発明のＴＣＰはまた、配列番号１（ヒトＩｇＧの完全なＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む配列）のアミノ酸１１４～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、ここで、該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。この態様において、特定領域のアミノ酸配列同一性はまた、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であってもよい。
本発明のＴＣＰはまた、配列番号１（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域の一部を含む配列）のアミノ酸１０４～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、ここで、該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。この態様において、特定領域のアミノ酸配列同一性は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であってもよい。
さらなる態様において、本発明のＴＣＰはまた、配列番号１（ヒトＩｇＧの定常領域の配列）のアミノ酸１～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよく、ここで、該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。この態様において、特定領域のアミノ酸配列同一性はまた、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％であってもよい。
別の態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％の配列同一性を有する、少なくとも１９０アミノ酸の連続配列を含むＴＣＰを提供し、ここで、該ＴＣＰは該Ｆｃ－部分鎖とは非相同の少なくとも２つの制御性Ｔ細胞活性化エピトープを含み、該タンパク質は要すれば抗体のＶＨドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含まなくてもよい。好ましくは、該ＴＣＰのＴレジトープの少なくとも１つ、要すれば少なくとも２つは、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置し、ここで
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応する。
上記態様において、配列同一性の決定のためにフレームの配列が考慮され、これにより、例えば、上記で定義されたＴＣＰと比較して低い配列同一性となる。
本発明はまた、少なくとも１つの、好ましくは２つ、３つ、または４つの非相同性Ｔレジトープの挿入により修飾された免疫グロブリン、例えばＩｇＧ Ｆｃ－部分鎖を含むＴＣＰも提供し、ここで該ＴＣＰは抗体のＶＨドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含まない。
当業者にとって、上記のすべてのＴＣＰについて、可能なまたは好ましいＴレジトープ、Ｆｃ－部分鎖、配列フレーム、ならびに結合および位置に関するルールを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される好ましい特徴が同様に適用されることは明らかである。同様に、ＴＣＰを含む多量体および融合タンパク質を設計および製造することができる。
配列番号１は、ＵＮＩＰＲＯＴ配列Ｐ０１８５７に対応する。これは、ヒトＩｇＧ重鎖の定常領域を表し、以下の特徴を有する（Giuntini et al., 2016. Clin Vaccine Immunol 23:698-706）：
１）ヒンジ領域：位置１０３－１１３
２）ＣＨ２ドメイン：位置１１４－２２３
３）ＣＨ３ドメイン：位置２２４－３３０
４）分子間Ｆｃ部分二量化のためのシステイン残基：位置１０９および１１２
５）分子内ジスルフィド架橋のシステイン残基（ＣＨ２ドメイン）：位置１４４および２０４
６）分子内ジスルフィド架橋のシステイン残基（ＣＨ３ドメイン）：位置２５０および３０８
７）潜在的なグリコシル化部位（抗体のＫａｂａｔ番号付けによるＡｓｎ２９７）：位置１８０。
上記のように、本発明は、免疫グロブリンＦｃ部分またはそのフラグメントの鎖内にＴレジトープを導入するという新規な概念に基づくものである。本明細書中で用いる用語“免疫グロブリンＦｃ－部分鎖”および“免疫グロブリンＦｃ－部分”または単に“Ｆｃ－部分鎖”は、この技術分野の当業者に理解される（例えば、Schroeder, H.W., & Cavacini, L. (2010) Structure and function of Immunoglobulins, J Allergy Clin Immunol vol. 125(2), S41-S52参照のこと）。用語“Ｆｃ部分”は、当業者に知られている。本発明のＦｃ部分鎖とは、免疫グロブリンのＦｃ－フラグメント二量体の１本鎖、またはそのフラグメントを意味する。例えば、かかるフラグメントは、パパインで消化することにより、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、好ましくはヒトＩｇＧとして得ることができる。対応するアミノ酸配列および核酸配列は既知である。Ｆｃ部分鎖の例としては、配列番号１の一部として開示されているヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分鎖が挙げられる。Ｆｃ－部分鎖は、全長のＦｃ部分鎖であってもよく、またはそれより短くてもよい。好ましくは、ＴＣＰに用いられるポリペプチドは、少なくとも、ヒトＩｇＧなどのＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインに対応すべきであり、Ｆｃ－部分鎖のヒンジ領域または該ヒンジ領域の一部を含んでいてもよい。
要求される配列同一性が満たされるとき、本発明のＴＣＰにおける免疫グロブリン配列は、マウスＩｇＧに由来するものでもよい。好ましくは、それらは、ヒトＩｇＧに由来する。
配列番号１のアミノ酸１３５から３３０による免疫グロブリンＦｃ部分鎖は、該免疫グロブリンのヒンジ領域を除くヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの大部分を表す。
用語“ＣＨ２ドメイン”、“ＣＨ３ドメイン”および“ヒンジ領域”は、当業者に知られている（例えば、Schroeder, H.W., & Cavacini, L. (2010) Structure and function of Immunoglobulins, J Allergy Clin Immunol vol. 125(2), S41-52を参照のこと）。上記のように、それぞれのドメインは、配列番号１において、以下のように見出され得る：
(a) ヒンジ領域：位置１０３－１１３
(b) ＣＨ２ドメイン：位置１１４－２２３
(c) ＣＨ３ドメイン：位置２２４－３３０
各ＣＨ領域は、分子内ジスルフィド結合を介して、かなり保存されたループ状のドメインを形成している。ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、エフェクター機能の仲介および抗体の安定性保持に重要な役割を担っている。抗体中では、糖鎖を介した別のＣＨ２ドメインとの弱い相互作用に関与している。Ａｓｎ２９７のＮ－結合型グリコシル化は、哺乳動物ＩｇＧならびに他の抗体アイソタイプの相同領域で保存されている。
抗体またはＦｃ部分鎖の二量体では、ＣＨ２ドメインは糖鎖を介して互いに相互作用するが、ＣＨ３ドメインは互いに直接的に相互作用するため、二量体化にも重要な役割を担っている。これらの定常領域はまた、抗体のエフェクター機能、特にＦｃ受容体との結合にも重要である。
ＴＣＰの生成に用いられるＦｃ部分鎖は、配列番号１に由来する。より具体的には、少なくとも配列番号１のアミノ酸１３５から３３０に由来する。二量体化が望まれるとき、Ｆｃ部分鎖は、配列番号１のアミノ酸１０３から１１３で特定されるようなヒンジ領域（コアヒンジ領域、Giuntini et al., 2016参照）、または二量体化を可能にするその一部を含んでいてもよく、例えばＴＣＰは配列番号１のアミノ酸１０４～３３０に由来し得る。また、配列番号１のアミノ酸４０～３３０、または配列番号１のアミノ酸１～３３０に由来してもよい。“由来”とは、配列に対して１以上の修飾が行われ得ることを意味する。１つの修飾は、配列内に少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープを挿入するまたは結合させることである。
Ｔレジトープ担持ポリペプチドが、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に結合する免疫グロブリンＦｃ部分の能力を保持するとき、これは有利には、ＴＣＰの半減期および安定性の改善をもたらし得る。要すれば、グリコシル化部位は、ＦｃＲｎ相互作用のために維持される。要すれば、本発明のＴＣＰは、Ｆｃ－γＲＩ、Ｆｃ－γＲＩＩおよび／またはＦｃ－γＲＩＩＩにも結合する。この場合、ＩｇＧに由来するＴＣＰは、上記のようにグリコシル化部位を維持することが望ましい。Ｆｃ－γ－受容体への結合は、プロフェッショナルな抗原提示細胞による取り込みを増加させることができ、これは本発明において有利とであり得る。
タンパク質の特定の所望の特性を変更または改善するために、Ｔレジトープ担持ポリペプチドにさらなる変異を導入することができる。ＴＣＰの特定の目的に応じて、それぞれの受容体を介する明確なエフェクター機能を防止または促進するために、例えば、タンパク質の関連アミノ酸に変異を導入することによって、新生児Ｆｃ受容体またはＦｃ－γＲＩ、Ｆｃ－γＲＩＩもしくはＦｃ－γＲＩＩＩへの該タンパク質結合を阻害することが好ましい場合がある。
ＴＣＰは一般的には可溶性タンパク質であるため、有利にはそれを発現する細胞によって分泌され得る。この目的のために、ＴＣＰはシグナル配列を含んでいてもよい。用語“シグナル配列”は、当業者には一般的に知られている。より具体的には、この用語は、一般的にはＮ末端でＴＣＰに結合され、ＴＣＰの細胞内輸送および／または分泌を促進するペプチドに関する。シグナル配列は、タンパク質の輸送および分泌の間に切断されてもよく、あるいは、例えば、別の酵素処理によって除去されてもよい。シグナル配列の例としては、配列番号２２が挙げられる。
要すれば、ＴＣＰは、精製タグを含む。用語“精製タグ”も当業者には理解される。より具体的には、この用語は、一般的にはＮ末端またはＣ末端でＴＣＰに融合し、合成されたＴＣＰの精製を容易にするペプチドに関する。一般例としては、Ｈｉｓ－Ｔａｇ、ＦＬＡＧ－ＴａｇまたはＭｙｃ－Ｔａｇである。
さらに、ＴＣＰは、グリコシル化、リン酸化またはＰＥＧ化のような翻訳後修飾を含んでいてもよい。好ましくは、ＴＣＰは、配列番号１の位置１８０に対応するＡｓｎ２９７（抗体のＫａｂａｔ番号付けによる）にグリコシル化部位を維持する。
免疫グロブリンＦｃ部分に基づくＴＣＰの１つの利点は、免疫グロブリンＦｃ部分鎖に由来する構造によって伝えられる長い血漿中半減期である。しかしながら、ＴＣＰはまた、半減期延長部分、例えばアルブミン、アルブミン結合ドメイン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでいてもよい。
Ｔレジトープ
本明細書中で用いられる用語“Ｔレジトープ”（または“制御性Ｔ細胞活性化エピトープ”）は、当業者にはよく知られている。Ｔレジトープは、一般に約１０から２５アミノ酸長、例えば約１５から２０アミノ酸長を有する小さな直鎖状ペプチドであり、これは制御性Ｔ細胞を活性化することができる。それらはもともと、ヒトおよび霊長動物のＩｇＧ免疫グロブリンの定常領域において同定された（L. Cousens, et al., Hum. Immunol. 75, 1139-1146 (2014); Y. Su, R. Rossi, et al. J. Leukoc. Biol. 94, 377-383 (2013); L. Cousens, et al., J. Clin. Immunol. 33 (Suppl 1), S43-S49 (2013))。これらの短鎖ペプチドは、特に樹状細胞などの抗原提示細胞上のＨＬＡ複合体のＭＨＣ ＩＩポケットに結合することにより、制御性Ｔ細胞を活性化することができる。抗原提示細胞および制御性Ｔ細胞の間のＨＬＡ－Ｔレジトープ複合体を含む受容体ベースの相互作用は、後者の細胞タイプの活性化をもたらす。本発明によるＴ細胞活性化エピトープの例は、本明細書中に記載される。一般に、Ｔレジトープを表す配列は、類似の自己のタンパク質において高度に保存されている。ほぼ全ての同定されたＴレジトープが単一の９マーのコア配列を有し、ＥｐｉＭａｔｒｉｘエピトープ予測アルゴリズムにより、少なくとも４種のＨＬＡ ＤＲ対立遺伝子に結合することが予測され得る。このような同定されたＴレジトープは、ヒト集団において広く認識される可能性がある。この選択は、ＨＬＡスーパータイプにわたるＥｐｉＭａｔｒｉｘスコア、ＨＬＡ結合アッセイにおける予測されたヒットの検証、バリデーションおよび裏付けとなる証拠、インビトロアッセイおよびインビボモデル、および本明細書中の考察に基づいて行われる。
ＥｐｉＭａｔｒｉｘは、１以上のＭＨＣ対立遺伝子に結合すると予測される９から１０アミノ酸長のペプチドセグメントについて、タンパク質配列をスクリーニングするＴ細胞エピトープマッピングアルゴリズムである（例えば、De Groot, AS, Jesdale, BM, Szu, E, Schafer, JR.の、 An interactive web site providing MHC ligand predictions: application to HIV research to HIV research. AIDS Res. and Human Retroviruses. 1997;13: 539-541;および、Schafer JA, Jesdale BM, George JA, Kouttab NM, De Groot, AS.の、Prediction of well-conserved HIV-1 ligands using a Matrix-based Algorithm, EpiMatrix. Vaccine. 1998;16(19):1880-1884. など参照）。ＥｐｉＭａｔｒｉｘは、１９９９年にSturnioloおよびHammerによって初めて記載された、エピトープ予測のためのポケットプロファイル法を用いている。効率および簡略化の理由から、予測は８つの最も一般的なＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子および６つの“スーパータイプ”ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に限定されている。ＥｐｉＭａｔｒｉｘの生スコアは、無作為に生成されたペプチド配列の非常に大きなセットから得られたスコア分布に関して正規化されている。ＥｐｉＭａｔｒｉｘの“Ｚ”スケールで１．６４以上のスコア（何れかのペプチドセットの上位５％程度）を有するペプチドは、それが予測されたＭＨＣ分子に結合する可能性がかなり高い。スケールで２．３２以上のスコアのペプチド（上位１％）は、結合する可能性が顕著に高く、ほとんどのよく知られたＴ細胞エピトープのスコアは、このスコアの範囲内に入る。ＥｐｉＭａｔｒｉｘは、例えばｉＶＡＸ Ｔｏｏｌｋｉｔ（ｉＶＡＸのウェブサイト、www. http://i-cubed.org/tools/ivax/ivax-tool-kit/）を通じて、i-cubesのウェブサイトで一般に公開されており、そこでもさらなる情報が入手可能である。Ｔレジトープの同定は、引用により本明細書中に包含させるＷＯ ２００８／０９４５３８ Ａ２の３６ページ、４行目から４４ページ、３０行目および実施例１、２および３に例示されており、ＷＯ ２００８／０９４５３８ Ａ２の１４ページ、８行から２３行も参照のこと。
本発明のＴレジトープの主な機能的特徴は以下の通りである：
(i) Ｔレジトープは、樹状細胞のような抗原提示細胞によって提示される。
(ii) Ｔレジトープは、該抗原提示細胞のＨＬＡ複合体のＭＨＣ ＩＩポケットに結合する。
(iii) Ｔレジトープが提示されると、制御性Ｔ細胞が活性化される。
(iv) Ｔレジトープの提示は、有効なＴ細胞を活性化しない。
Ｔレジトープによって作用する過程および機序は複雑であるが、Ｔレジトープであるペプチドの性質を、適切なアッセイ、例えば、後段の実施例に記載のいわゆるＴＴ（Tetanus Toxoid）アッセイによって、さらに確認することができる。このアッセイは、破傷風トキソイドを抗原として用いたＰＢＭＣにおけるＣＤ４ Ｔ細胞リコール応答のＴレジトープを介する抑制に基づく。
適切なＴレジトープの例を以下に記載する。さらなるＴレジトープは、ＷＯ２００８／０９４５３８ Ａ２の表２およびＷＯ２０１６／０５４１１４ Ａ１に開示された配列に記載されており、これらは本発明で用いることもできる。好適なＴレジトープの例としては、以下が挙げられる：
配列番号１０（Ｔｒｅｇ２８９）：ＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ、
配列番号７（Ｔｒｅｇ０８４）：ＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤ、
配列番号２（Ｔｒｅｇ００９Ａ）：ＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦ、
配列番号９（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）：ＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨＹＣＡ、
配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）：ＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ、
配列番号３（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）：ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ、
配列番号４（Ｔｒｅｇ０８８）：ＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ、
配列番号５（Ｔｒｅｇ１６７）：ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ、
配列番号６（Ｔｒｅｇ２８９ｎ－天然）：ＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ。
天然Ｔレジトープの配列内には軽微な修飾があってもよい。例えば、生理学的ｐＨで帯電しているアミノ酸を組み込むことによってＴレジトープの疎水性を変更し、とりわけ低減するために、修飾（複数可）、とりわけ単一アミノ酸の置換を含むことが有利であり得る。ＷＯ２００８／０９４５３８の表２は、Ｔレジトープの可能な改変に関する例を示している。天然Ｔレジトープの修飾配列の２つの好ましい例は、Ｔｒｅｇ０８８ｘおよびＴｒｅｇ２８９であり、ここで配列内の修飾を下線で示す：
配列番号９（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）：ＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨＹＣＡ
配列番号１０（Ｔｒｅｇ２８９）：ＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ。
さらに、トリミングされた配列を用いてもよく、すなわち、Ｔ細胞結合エピトープの機能を維持しながら、Ｔレジトープを表す配列の末端の１以上のアミノ酸、とりわけ末端の２個または３個のアミノ酸が欠失されてもよい。一般に、Ｔレジトープの９アミノ酸のコア配列（core motive）は、その自然免疫学的プロセス中にペプチドを提示するために重要である。好ましくは、該コア配列は、好ましいＴレジトープの配列中に存在する。以下にＴレジトープのいくつかの好ましいトリミングされた配列を示す：
配列番号１１（トリミングされたＴｒｅｇ００９Ａ）：ＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ、
配列番号１２（トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ１）：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬ、
配列番号１３（トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ２）：ＶＲＱＡＰＧＫＧＬ、
配列番号１４（トリミングされたＴｒｅｇ０８８）：ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹ、
配列番号１５（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１）：ＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨ、
配列番号１６（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ２）：ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨ、
配列番号１７（トリミングされたＴｒｅｇ１６７）：ＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬ、
配列番号１８（トリミングされたＴｒｅｇ２８９ｎ）：ＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ、
配列番号１９（トリミングされたＴｒｅｇ２８９）：ＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ、
配列番号２０（トリミングされたＴｒｅｇ０８４）：ＦＴＬＴＩＳＳＬＱ、および
配列番号２１（トリミングされたＴｒｅｇ１３４）：ＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ。
Ｔｒｅｇ２８９、Ｔｒｅｇ０８４、Ｔｒｅｇ００９Ａ、Ｔｒｅｇ０８８ｘおよびＴｒｅｇ１３４（トリミングされていないバージョンおよびトリミングされたバージョンの両方）は、本発明のＴＣＰに関して、発現において特に良好な結果を示している。
要すれば、本発明のＴＣＰにおいて、ＴＣＰの２つ、３つまたは全てのＴレジトープは、配列番号２－２１のＴレジトープ、好ましくは、配列番号２、７、８、９、１０、１１、１５、１６、１９および２０のＴレジトープである。
好ましくは、１つのＴＣＰ鎖中のすべての非相同性Ｔレジトープは、異なる配列を有していてもよい。異なるＴレジトープを使用することにより、異なるＨＬＡハプロタイプおよび異なる認識、プロセシングまたは提示能を有する対象の制御性Ｔ細胞を標的化し活性化する可能性が向上する。あるいは、１つのＴＣＰモノマー(単量体)中の一部またはすべての非相同性Ｔレジトープは、例えば、適切なＨＬＡハプロタイプまたはハプロタイプセットにおける提示を標的として、同じ配列を有する。
非相同性Ｔレジトープ
本明細書中で用いる用語“非相同性Ｔレジトープ”とは、Ｔレジトープがそれぞれの免疫グロブリンＦｃ－部分鎖の同じ位置に同一に生じないことを意味する。したがって、より具体的には、用語“非相同性Ｔレジトープ”とは、Ｔレジトープが、
(i）免疫グロブリンＦｃ部分鎖に天然に存在しない、および／または
(ii）免疫グロブリンＦｃ部分鎖のその天然の位置に存在しない
ことを意味する。
本明細書中の用語“天然に存在しない”とは、Ｔレジトープ配列が天然Ｔレジトープと類似しているが、未修飾天然抗体、特に天然ヒトＩｇＧ抗体の対応するＦｃ部分に存在する何れかのＴレジトープと異なる１以上の修飾を有する場合を包含する。そのような修飾は、例えば、欠失、挿入、逆位または置換であってよく、好ましくは、置換である。
配列番号１について、本明細書中で用いる用語“非相同性”とは、Ｔレジトープが配列番号１のＦｃ部分鎖の同じ位置に同一に存在しないこと、より具体的には配列番号１の位置１３５から位置３３０までのアミノ酸配列に存在しないことを意味する。好ましくは、それはまた、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列、例えば、天然配列において、同じ位置で同一に生じることはない。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ－部分鎖、より具体的には配列番号１のアミノ酸１３５－３３０の該免疫グロブリンＦｃ－部分鎖において、１つの天然Ｔレジトープが存在することが特記される。これはＴレジトープ２８９（配列番号１０）であり、配列番号１の野生型ＩｇＧでは、配列フレームＡに位置する。別の位置、例えば配列フレームＢまたはＣに位置するとき、それは非相同性Ｔレジトープとみなされる。また、本明細書中、Ｔレジトープ２８９の配列変異体（Ｔレジトープ２８９ｘ）が言及されており、これも天然Ｔレジトープとは異なるため、本発明の目的では非相同性Ｔレジトープと見なされる。これは、該Ｔレジトープが配列番号１のＴレジトープ２８９と同じ位置にあるときにも適用される。したがって、配列番号２－９および１１－２１のＴレジトープは、配列番号１におけるそれらの位置に関係なく、非相同性Ｔレジトープである。
少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープに加えて、本発明のＴＣＰは、少なくとも１つの“相同” Ｔレジトープ、すなわち配列番号１のＦｃ－部分鎖に天然に存在するＴレジトープまたはそれに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するＴレジトープ、例えば配列番号１のＦｃ－部分に天然に存在するＴレジトープ２８９などをさらに含んでいてもよい。
例えば、本発明のＴＣＰが、本発明において好ましい、フレームＢまたはＣに少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープを含むとき、ＴＣＰは、フレームＡに相同Ｔレジトープ、特にＴレジトープ２８９をさらに含み得る。したがって、そのようなＴＣＰは、少なくとも２つのＴレジトープを含むか、またはフレームＢおよびＣの各々に非相同性Ｔレジトープがあるときは、少なくとも３つのＴレジトープを含む。
好ましくは、本発明のＴＣＰは、少なくとも２つの非相同性Ｔレジトープを含み、より好ましくは少なくとも３つ、要すれば４つの非相同性Ｔレジトープを含む。要すれば、ＴＣＰは、２から４個のＴレジトープを含む。
Ｔレジトープの挿入
原則として、当業者は、Ｔレジトープ（複数可）が挿入されるべきＴＣＰ内または免疫グロブリンのＦｃ部分鎖内の位置を適切に選択することができる。しかしながら、好ましい位置は、得られるタンパク質の三次構造または四次構造の形成に関与するＴＣＰの部分の外側である。免疫グロブリンのＦｃ部分の構造に匹敵する三次構造または四次構造の形成に関与するＴＣＰの部分は、例えば、ジスルフィド結合を形成するシステインのようなアミノ酸、またはグリコシル化に関与するアミノ酸であってもよい。したがって、好ましい態様において、Ｔレジトープを表す配列は、三次構造を安定化する分子内ジスルフィド結合が維持されるように、および／またはグリコシル化が維持されるようにＴＣＰ中に配置される。特定の態様において、二量体化を可能にするために、ヒンジ領域またはその一部を維持することも望まれ得る。この場合、Ｔレジトープは、四次構造を安定化する分子間ジスルフィド結合が維持されるように、ＴＣＰに配置されるべきである。
本発明において同定された、特に有利なフレーム、Ｔレジトープの挿入に適した領域は、本明細書において詳細に説明される。
特に、ＩｇＧ１などのＩｇＧに由来するＴＣＰについて、本発明者らは、１以上の非相同性Ｔレジトープが配列フレームＡ、ＢまたはＣ内にあるとき、例えば、ＴＣＰの発現および安定性のために有利であることを見出し、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応する。
好ましくは、（a）配列フレームＡは、配列番号１の位置１７０から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７５から位置３０６に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１４から位置２４９に対応する。
要すれば、（a）配列フレームＡは、配列番号１の位置１７３から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７７から位置３０４に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１７から位置２４８に対応する。
各フレームは、ＴＣＰにＴレジトープを挿入することを可能にし、一方、ＴＣＰの発現は依然として許容される方法で可能である。より具体的には、Ｆｃ部分鎖の三次構造は、許容できない方法で影響されることはない。例えば、有利には、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを安定化する分子内ジスルフィド結合が維持される。また、所望により、二量体形成も可能である。本発明者らによるこれらのフレームの定義により、Ｔレジトープを挿入するための顕著に柔軟なプラットフォームがもたらされる。フレームＢおよびＣは、特に同定が困難であった。
当業者は、挿入されたＴレジトープの外側のＴＣＰ配列もまた、本発明の実質的な利点を根本的に損なうことなく、一定の改変を受け得ることを理解し得る。例えば、配列番号１の対立遺伝子変異体、すなわち、他のＦｃ－部分鎖が用いられてもよい。当業者は、Ｆｃ－部分鎖の多くの変異体、例えば哺乳動物Ｆｃ－部分鎖またはヒトおよび非ヒトＦｃ－部分鎖を認識している。ヒトの治療用途の場合、ヒトＦｃ－部分鎖、例えばヒトＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ由来のＦｃ－部分鎖が好ましく、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、より好ましくはＩｇＧ１およびＩｇＧ４が好ましい。最も好ましいのは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ－部分鎖である。
本発明のＴＣＰは、ＩｇＧ以外の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤに由来し、好ましくは、そのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに由来してもよく、ここで、ＴＣＰは要すれば、さらなる定常ドメイン、特に、ＣＨ４ドメイン、および／または結合鎖などのさらなる領域を、該免疫グロブリンに通常存在すれば含んでいてもよい。このようなＴＣＰについては、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープを挿入するための適切なフレームも、それぞれのＴレジトープの配列と比較的高い配列類似性を示す、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列類似性を示すＦｃ－部分鎖の位置で同定することができる。これは、実施例部分に記載されているような配列アライメントによって分析することができる（例えば、図４、図５および図６参照）。本明細書中“類似性（similarity）”とは、配列の類似性を損なうことなく、整列させたアミノ酸が同一であるか、または類似の特性を示すことを意味し、例えば、極性アミノ酸は他の極性アミノ酸と置換されてもよく、非極性アミノ酸は他の非極性アミノ酸と置換されてもよく、塩基性アミノ酸は他の塩基性アミノ酸と置換されてもよく、酸性アミノ酸は他の酸性アミノ酸と置換されてもよい。一態様において、該類似性は配列同一性である。そのようなＴＣＰは、一般的には、それらが由来するＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤの定常ドメイン（特に、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の全体の配列の同一性を示す。要すれば、そのようなＴＣＰが由来するＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤが１以上の相同Ｔレジトープ（複数可）を含むとき、該相同Ｔレジトープは非相同性Ｔレジトープに対して置換されてもよい。しかしながら、好ましくは、そのようなＴＣＰは、異なる位置に少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープを含む。ＩｇＧに由来する本発明のＴＣＰにおけるフレームＡ、ＢまたはＣの位置は、他のＩｇに由来するＴＣＰにおける適切なフレームを特定する際のガイダンスとして機能し得る。分子内ジスルフィド結合に重要なアミノ酸の位置は、一般的に維持される。また、Ｆｃ部分のグリコシル化は維持されていてもよいが、存在しなくてもよい。ＩｇＧ以外のＩｇでは、受容体結合などの一部のエフェクター機能にはグリコシル化が必要ないことが示されている。特定の態様において、二量体化を可能にするために、それぞれのＩｇまたはその一部のヒンジ領域を維持することも望まれ得る。この場合、Ｔレジトープは、四次構造を安定化する分子間ジスルフィド結合も維持されるように、ＴＣＰに配置されるべきである。
Ｔレジトープが挿入されたＴＣＰは、切断、付加、欠失、挿入、逆位または置換などの、適切または有用と考えられるさらなる改変を含んでいてもよい。このような修飾は、例えば、所望により、（例えば、ヒンジ領域内のシステイン残基を介して）ジスルフィド架橋の形成を排除または促進するのに役立ち得る。他の修飾は、意図された目的に応じて所望されるように、Ｆｃ受容体への結合を改善または低減するために導入されてもよい。好ましくは、修飾は、ＴＣＰの製造（組換え発現および／または分泌など）を損なわないようにすべきである。グリコシル化、リン酸化、ＰＥＧ化またはＨＥＳ化などのさらなる修飾が企図される。例えば、ＰＥＧ化は、ＴＣＰの半減期をさらに増加させるのに有用であり得る。当業者は、そのような修飾を導入する方法を知っている。
しかしながら、当業者は、発現レベルに対する配列修飾のある種の負の影響を受け入れることができるが、いかなる配列修飾も、それらが許容できない様式でＴＣＰの発現に影響を与えないように選択されるべきである。好ましくは、発現レベルは、同じ条件下で発現させたとき、配列番号５４、構築物Ｖ３２のポリペプチドの発現レベルの５％、１０％、２０％、５０％、好ましくは、８０％以上であるべきであり、後段の実施例に記載されている通りである。
本発明のＴＣＰにおいては、以下のことが好ましい：
(a）配列フレームＡが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３と少なくとも８５％の配列同一性を有し、
(b）配列フレームＢが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７と少なくとも８５％の配列同一性を有し、および
(c）配列フレームＣが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９と少なくとも８５％の配列同一性を有する。もちろん、非相同性Ｔレジトープを含まないそれらのフレームのそれぞれの位置との配列同一性も、より高くてもよく、好ましくは、少なくとも９０％、要すれば少なくとも９９％または１００％であってもよい。
非相同性Ｔレジトープが配列フレーム内に“位置する”と記載されているとき、これは、当該非相同性Ｔレジトープの配列全体が、例えばそれぞれの野生型配列の置換、または部分置換によって、対応する配列フレーム内に挿入されていることを意味する。好ましくは、本発明のＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープ（またはフレームＡ、ＢまたはＣに存在する全ての非相同性Ｔレジトープ）は、該Ｔレジトープと同じ長さを有するか、またはＴレジトープの長さに１もしくは２個のアミノ酸を加えたまたは引いた長さを有する、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０にわたる領域内の配列に置換される。非相同性Ｔレジトープが該Ｔレジトープと同じ長さを有する配列を置換するとき、三次構造および四次構造の破壊は一般的に最小化される。当業者は、適切とみなされるように、配列フレームにさらなる配列変化を導入することを考慮してもよい。しかしながら、一般的には、配列フレームのうち非相同性Ｔレジトープ（複数可）によって置換されていない部分は、さらに変更される必要はない。したがって、好ましくは、配列番号１のそれぞれの位置と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する。
あるいは、または、好ましくは、フレームＡ、ＢおよびＣの１以上内に位置する非相同性Ｔレジトープに加えて、本発明のＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端のＴレジトープも含んでいてもよい。該Ｃ末端Ｔレジトープは、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列に対して直接的Ｃ末端であるか、またはリンカー、例えば、１８個未満のアミノ酸、要すれば１２個未満のアミノ酸または５個未満のアミノ酸のリンカーを介して、該配列に連結されてもよい。好ましくは、３－１８個のアミノ酸のリンカーが用いられる。
該Ｃ末端の非相同性Ｔレジトープは、ＴＣＰのＣ末端に存在してもよく、要すれば３－１８個のアミノ酸のリンカーを介して該配列に連結されていてもよい。あるいは、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端の非相同性Ｔレジトープは、ＴＣＰのＣ末端にはなく、この場合、好ましくは、ＴＣＰは融合タンパク質である。
リンカーは、例えば、当技術分野で知られているようなＧＳリンカーであってもよい。例えば、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号１１０）のようなリンカーが用いられてもよく、ここで、“ｎ”は該配列の１以上（例えば、２、３または４個）の繰り返しを意味する。
リンカーのさらに好ましい例としては、
リンカー１：Ala Gly Pro Gly Pro Ser Gly (配列番号１０７)
リンカー２：Pro Thr Gly Ser Gly (配列番号１０８)
リンカー３：Gly Gly Ser Thr Gly (配列番号１０９)
が挙げられる。
本発明者らは、リンカー２の使用が、得られるＴＣＰ二量体の結合エネルギー、すなわちタンパク質の安定性を特に改善することを示した。
配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に含めるための好ましいＴレジトープは、Ｔｒｅｇ１３４、Ｔｒｅｇ０８８ｘおよびＴｒｅｇ０８８である。
後段の実施例に示すように、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端の非相同性Ｔレジトープは、特に、リンカー２（配列番号１０８）などのリンカーと共に用いるために、Ｔｒｅｇ０２９Ｂであってもよい。
また、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＮ末端、好ましくは、タンパク質のＮ末端に１以上のＴレジトープを付加してもよいことが企図される。
本発明は、第１の非相同性ＴレジトープがフレームＡ、ＢまたはＣの１つに位置し、少なくとも第２のＴレジトープがフレームＡ、Ｂ、Ｃの異なるフレームに位置するか、または配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５%の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に位置し、要すれば例えば３－１８個のアミノ酸のリンカーを介して該配列と連結されるＴＣＰを提供する。
例えば、ＴＣＰが２つの非相同性Ｔレジトープを含むとき、これらはフレームＡおよびＢ、フレームＡおよびＣ、または好ましくはフレームＢおよびＣに位置してもよく、その場合、フレームＡが相同ＴレジトープＴｒｅｇ２８９（配列番号１の位置１７６－１９６）を含むことが好ましい。非相同性Ｔレジトープはまた、フレームＡおよび配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端、またはフレームＢおよび配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端、あるいはフレームＣおよび配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に位置していてもよい。
ＴＣＰが３つの非相同性Ｔレジトープを含むとき、これらはフレームＡ、ＢおよびＣ内、またはフレームＡ、Ｂおよび配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端内、またはフレームＡ、Ｃおよび配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端内、またはフレームＢ、Ｃおよび配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端内に位置していてもよい。４つの非相同性Ｔレジトープがあるとき、これらはフレームＡ、ＢおよびＣ、ならびに配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に位置していてもよい。
特定の好ましいＴレジトープの好ましい位置は、以下の表に示され、位置の番号付けは配列番号１を参照する。他のＦｃ－部分鎖における対応する有利な位置は、当業者に知られているように配列アラインメントによって見出すことができる。
Figure 2023519347000002
好ましいＴＣＰ
本発明者らは、特定のフレームにおける特定のＴレジトープのために特に有利な位置を特定した。好ましい態様において、本発明のＴＣＰにおいて、
(a）フレームＡは、位置１７６－１９６（すなわち、配列番号１のそれぞれの位置に対応する位置）に配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）を、位置１７４－１９９に配列番号５のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１６７）、位置１８０－２００に配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、位置１７８－１９２に配列番号３のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、位置１８６－２００に配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、位置１７９－２０２に配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、または位置１７３－１９０に配列番号１５のＴレジトープ（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１）を含み；および／または、
(b）フレームＢは、位置２８０－３００に配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、位置２７８－３０３に配列番号５のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１６７）、位置２７８－２９８に配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、位置２８７－３０１に配列番号３のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、位置２８４－２９８に配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、位置２７７－３００に配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、または位置２８７－３０４に配列番号１５のＴレジトープ（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１）を含み；および／または、
(c）フレームＣは、位置２２５－２４５（または配列番号１のそれぞれの位置に対応する位置）に配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、位置２２３－２４８に配列番号５のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１６７）、位置２２３－２４３に配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、位置２２３－２３７に配列番号３のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、位置２２４－２３８に配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、位置２２２から２４５に配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、または位置２１７－２３４に配列番号１５のＴレジトープ（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ － ｖ１）を含み；および／または、
(d）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に位置する少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）、配列番号１４（トリミングされたＴｒｅｇ０８８）または配列番号９（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）を有し、ここで、該Ｔレジトープは、ＧＳリンカーまたは配列番号１０７－１１０の何れかリンカーなどの３－１８個のアミノ酸のリンカーを介して配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有する該配列に連結されていてよい。
特定のＴレジトープの好適な組合せを有する本発明のＴＣＰの例としては、以下のものが挙げられる：
(I)(a）フレームＡに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
(b）フレームＢに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
(c）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(d) 配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に、要すればＧＳリンカー（Ｖ３２）のような３～１８アミノ酸のリンカーを介して位置する、配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、
を含むＴＣＰ（Ｖ３２）；
(II) (a）フレームＢに位置する配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、および
(b）フレームＣに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）
を含むＴＣＰ（Ｖ２０）；
(III) (a）フレームＢに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、および
(b）配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に、要すればＧＳリンカーなどの３～１８アミノ酸のリンカーを介して位置する、配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）
を含むＴＣＰ（Ｖ３４）；
(IV) (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
(b）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(c）配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に、要すればＧＳリンカーなどの３～１８アミノ酸のリンカーを介して位置する、配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）
を含むＴＣＰ（Ｖ１）；
(V) (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
(b）フレームＢに位置する配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、および
(c）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）
を含むＴＣＰ（Ｖ３）；
(VI) (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
(b）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(c) 配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に、要すればＧＳリンカーなどの３～１８アミノ酸のリンカーを介して位置する、配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）
を含むＴＣＰ（Ｖ１３）；
(VII) (a）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、
(b）配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に、要すればＧＳリンカーなどの３～１８アミノ酸のリンカーを介して位置する配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）
を含むＴＣＰ（Ｖ１４）。
本明細書において、本発明者らは、配列番号２３から４４（Ｖ１～Ｖ２２）および４６から５８（Ｖ２４～Ｖ３６）のアミノ酸配列を含む特定のＴＣＰを提供した。Ｖ３２、Ｖ２０、Ｖ３４、Ｖ１、Ｖ３、Ｖ１３およびＶ１４は特に高い発現を示し、したがって本発明の好ましいＴＣＰである。Ｖ３２は、最も多くのＴレジトープを含む構築物である。
配列番号５４のＶ３２の代替物は、配列番号１１１のＶ３２_変異体であり、これはフレームＣにおいて配列番号１のアミノ酸Ｒ２３８の欠失を有する。
種々のＴＣＰフォーマット
本発明のＴＣＰは、種々のフォーマットで使用することができる。
・単剤としてのＴＣＰ
例えば、ＴＣＰが他の薬剤または部位に連結されていない、特に、他の、例えば、治療用ポリペプチドとの融合タンパク質として発現されていない、単剤、例えば、単独の治療薬として用いることができる。本明細書中、ＴＰＣは、単量体として、または多量体として、例えば二量体として用いられ得る。
従って、本発明は、１９５から３５０のアミノ酸を含むＴＣＰを提供する。本発明はまた、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるＴＣＰを提供し、ここで該ＴＣＰは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは配列同一性を決定するために考慮されず、ＴＣＰは、要すれば、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にＴレジトープをさらに含み、これは例えば、３～１８アミノ酸からなるリンカーで配列と連結されてもよい。該ＴＣＰは、１９５～３５０アミノ酸、好ましくは、２００～３３０アミノ酸、例えば、２０５～３００アミノ酸、２１０～２５１アミノ酸、または２２０～２３０アミノ酸から構成されてもよい。このフォーマットで用いられ得る好ましいＴＣＰは、本明細書に、例えば上に記載されている。
本明細書中、“本質的に～からなる”とは、配列番号１の位置９９～３３０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するさらなる配列、特に、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域（組込みＴレジトープを有する）ならびに、要すれば、ヒンジ領域に対応する配列の存在を排除しない。ＴＣＰはまた、シグナル配列を含んでいてもよい。しかしながら、好ましくは、該ＴＣＰは、抗体のＶＨドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含んでいない。
特定のさらなる態様において、ＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチド配列からなるか、またはそれから本質的になり、ここで、該ＴＣＰは、要すれば、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端のＴレジトープをさらに含み、これは例えば、３～１８アミノ酸からなるリンカーを介して配列と結合されていてもよい。
特定のさらなる態様において、ＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸９９～３３０と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列からなるか、またはそれから本質的になり、ここで、該ＴＣＰは、要すれば、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端のＴレジトープをさらに含み、これは、例えば、３～１８アミノ酸からなるリンカーを介して該配列と結合されていてもよい。
特定のさらなる態様において、ＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸８０～３３０と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列からなるか、またはそれから本質的になり、ここで、該ＴＣＰは、要すれば、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端のＴレジトープをさらに含み、これは、例えば、３～１８アミノ酸からなるリンカーを介して該配列と結合されてもいてもよい。
本明細書中“本質的に～からなる”とは、ＴＣＰが精製のための親和性タグのようなｓらなる成分を含んでいてもよいことも意味するが、一般に本発明のＴＣＰは、それ自体がアレルゲンのように治療的効果または生理的効果を有する融合タンパク質またはペプチドを含んでいない。
好ましくは、本発明のＴＣＰは、配列番号１の位置９９～３３０に対して５０％未満、より具体的には７５％未満、８５％未満、９０％未満の配列同一性を有する１００以上、好ましくは５０以上、より好ましくは２０以上の連続アミノ酸のアミノ酸配列またはＴレジトープ配列、より具体的には本明細書に記載のＴレジトープ配列を含まない。
そのようなＴＣＰはモノマーであってもよく、ここでＴＣＰは一般的には二量体形成を可能にする部分を含まず、すなわち免疫グロブリンのヒンジ領域または二量体化を可能にするその部分を含まない。さらに、モノマーはまた、ＣＨ３ドメインにおいて、例えば、配列番号１においてＫ２９２Ｒ置換を導入することによって、二量体化を低減するように修飾されてもよい。
あるいは、そのようなＴＣＰは、多量体、例えば、二量体であってもよい。ＴＣＰは、要すれば、例えばＣＨ３ドメインにおいて、多量体化、例えば、二量体形成を増加させるように修飾されてもよい。ＴＣＰはまた、三量体、四量体、五量体または六量体であってもよい。多量体は、後段でさらに特徴付けられる。好ましくは、単独使用形式のＴＣＰは、多量体、特に、二量体を形成する。
したがって、特定の態様において、本発明のＴＣＰは、好ましくは、配列番号１の位置１３５－３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の、記載された配列フレームおよび／またはＣ末端に位置する、１以上の非相同性Ｔレジトープを含むＦｃ部分鎖のモノマー、二量体または多量体に本質的に対応し、またはそれからなり、ここでＣ末端Ｔレジトープは例えば３～１８アミノ酸からなるリンカーを介して該配列と結合されていてもよい。
・さらなる抗体ドメインを含むＴＣＰ
本発明のＴＣＰは、Ｆｃ部分鎖およびＴレジトープ配列に対応する配列とは別に、さらなるペプチドまたはポリペプチド配列を含んでいてもよい。本発明はまた、本発明のＴＣＰを提供し、ここで、該ＴＣＰは、さらなる免疫グロブリンスーパーファミリドメインを含む。
例えば、本発明のＴＣＰは、少なくとも抗体のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、好ましくは、抗体（一般的には、ＩｇＧ）の抗原結合部分を含んでいてもよい。抗体の抗原結合部の異なる構造は当技術分野で知られており、例えば、本発明のＴＣＰは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬおよびＣＬドメインを有する軽鎖と会合していてよく、ここで、ＶＨドメインおよびＣＨドメインは、抗原結合部分の抗原結合部位を形成している。あるいは、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであってもよく、ここで、好ましくは、ｓｃＦｖは、ＴＣＰとの融合タンパク質として発現される。
あるいは、またはさらに、該ＴＣＰは、ＩｇＡのＣＨ３ドメイン、および要すればＩｇＡの結合領域をさらに含んでいてもよく、これにより、４つのＴＣＰモノマーを含む４量体タンパク質の形成が可能となる。例えば、該ＴＣＰは、ＩｇＭのＣＨ３およびＣＨ４ドメインをさらに含んでいてもよく、これにより、１０個のＴＣＰモノマーを有する多量体の形成が可能となる。
・さらなる薬剤に結合されたＴＣＰ
本発明のＴＣＰは、１以上のさらなる薬剤に結合されていてもよい。かかる薬剤は、治療以外の機能、例えば、発現または精製を増加または促進するための機能を有していてもよい。例えば、ＴＣＰは、親和性タグ、例えば、アルブミン、アルブミン結合ドメインまたはＨｉｓ－タグをさらに含んでいてもよい。また、本発明のＴＣＰは、リンカー、例えば、ＧＳリンカーまたは配列番号１０７－１１０の何れかのリンカーをさらに含んでいてもよい。
本発明のＴＣＰは、さらにまたはあるいは、治療または予防機能を有する１以上の薬剤に結合されていてもよい。
本発明のＴＣＰは、例えば、薬剤に共有結合的または非共有結合的に連結されていてもよく、ここで、該薬剤は、好ましくは、望ましくない免疫応答が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき薬剤である。“免疫応答の抑制”とは、本明細書中、免疫応答が低減されるか、または完全に消失することを意味する。これは、免疫応答の望ましくない効果、例えば、炎症および／または抗体の形成を回避または低減する方法で、免疫応答の性質が変更される場合も含む。さらに、免疫応答は、免疫応答の抑制によっても防止することができる。このような免疫応答の抑制および／または免疫原性寛容の誘導は、制御性Ｔ細胞の活性化に介在し得る。
好ましくは、ＴＣＰは、目的の薬剤に共有結合している。それは、単量体、または多量体（例えば、二量体）として結合され得る。ＴＣＰは、他の薬剤との結合が特に容易である。ポリペプチドとして、ＴＣＰは、組換え技術によって他のタンパク質またはペプチドと特に容易な方法で結合され、ＴＣＰ融合タンパク質をもたらし得る。したがって、本発明は、ＴＣＰ、および望ましくない免疫応答を抑制し、免疫原性寛容を付与する薬剤を含むＴＣＰ融合タンパク質にも関する。
融合タンパク質において、薬剤は、好ましくはＮ末端に、例えば、ＣＨ１ドメインまたは該ＴＣＰに存在しない場合にはヒンジ領域の代わりに、結合される（ここで、一般的には、二量体化が意図されるとき、ヒンジ領域は存在し、二量体化が意図されないとき、ヒンジ領域は存在しない）。融合タンパク質は、リンカー、例えば、ＧＳリンカーまたは配列番号１０７－１１０の何れかのリンカーを介して結合されていてもよい。
ヒンジ領域がＴＣＰに含まれるとき、ＴＣＰは１以上のジスルフィド架橋を介して薬剤に結合されることもできる。化学的カップリング、例えば、ＴＣＰ中のリジン残基へのカップリングも可能である。あるいは、ＴＣＰは、該薬剤に非共有結合していてもよく、例えば、ファンデルワールス相互作用、イオン相互作用または疎水性相互作用、極性相互作用（双極子、四極子以上）、および芳香族相互作用（四極極／四極極またはπ／π）経由で薬剤に結合されていてもよい。しかしながら、好ましくは、ＴＣＰおよび薬剤の密接な結合を維持するために、結合は生理的条件下で十分に安定である。
ＴＣＰとペプチドまたはポリペプチドとの結合は、例えば組換え手段および方法によって、特に容易である。さらに、ペプチドおよびポリペプチドは、自己抗原または外来抗原のような多くの望ましくない免疫応答において役割を果たす。したがって、ある好ましい態様において、薬剤はペプチドまたはポリペプチドの部分である。
“望ましくない免疫応答”とは、例えば、アレルギー、自己免疫または移植に対する免疫応答、例えば、移植片拒絶反応であってよい。望ましくない免疫応答は、主に抗体によって介在される場合もあれば、細胞傷害性Ｔ細胞のような細胞性メカニズムによって介在される場合もある。それは、例えば、ＴＨ１応答またはＴＨ２応答であってもよい。
薬剤は、例えば、（a）アレルゲン、（b）不耐性誘導剤（intolerance inducing agent）、（c）自己免疫応答の標的タンパク質、例えば自己抗体、（d）自己免疫応答の標的エピトープ、例えば自己抗体、または（e）治療薬であり得る。
用語“アレルゲン”は、当業者には一般的に知られている。アレルゲンは、アレルゲンに曝露された対象において、望ましくないまたは異常に活発な免疫応答を引き起こす能力を有する非自己の物質である。より具体的には、アレルゲンは、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）応答を介してアトピー個体のＩ型過敏性反応を刺激することができる抗原である。
アレルゲンの例としては、以下が挙げられる：
(a) セロリ（複数可）、トウモロコシ（複数可）、卵（一般的には白身）、豆類（例えば、豆、エンドウ、ピーナッツ、大豆）、牛乳、魚介類、ゴマ、大豆、木の実（例えば、ペカン、アーモンド）などの食物アレルゲン、
(b) 昆虫毒（例えば、ハチ毒、スズメバチ毒、蚊毒）、
(c) 植物花粉（枯草熱）、例えば、草の花粉（例えば、ライグラス、チモシーグラス）、雑草の花粉（例えば、ブタクサ、プランタゴ、イラクサ、ヨモギ、シロザ（Chenopodium album）、スイバ）、木の花粉（例えば、カバ、ハンノキ、ヘーゼル、シデ、セイヨウトチノキ（Aesculus）、柳、ポプラ、プラタナス（Platanus）、シナノキ（Tilia）、オレア、アッシュジュニパー（Ashe juniper）、シチヨウジュ（Alstonia scholaris）など）；
(d) 薬物（例えば、ペニシリン、スルホンアミド、サリチル酸塩（多数の果実にも天然に存在する））；
(e) 動物性食品（例えば、Fel d 1（猫アレルギー）、毛皮およびふけ、ゴキブリの鱗屑、羊毛、ダニの排泄物。
一般的に、このようなアレルゲンの関連エピトープを含むフラグメントを用いるだけで十分であり得る。したがって、例えば、本発明は、ハチ毒のエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰ、スズメバチ毒のエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰ、蚊毒のエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰ、植物花粉のエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰを提供する。
免疫学的“不耐性誘導剤”とは、免疫学的不耐性反応、すなわち、免疫系が特定の物質を異物として認識する、非ＩｇＥ免疫グロブリンを介した望ましくない免疫学的応答を引き起こすことができる非自己の物質である。アレルギーとは対照的に、この反応は一般的に長期間にわたって起こる。不耐性誘導剤の例としては、グルテン、サリチレート（後者はアレルギーを引き起こすこともある）などが挙げられる。例えば、アルファ－／ベータ－、ガンマ－またはオメガ－グリアジンから選択されるタンパク質またはペプチドあるいはそれらの原因となるエピトープなどのグルテンの１以上の成分が、本明細書中で考慮され得る。したがって、本発明は、アルファ－グリアジンのエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰ、および／またはベータ－グリアジンのエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰ、および／またはガンマ－グリアジンのエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と結合したＴＣＰ、および／またはオメガ－グリアジンのエピトープ、フラグメントまたは完全なペプチド／タンパク質と連結したＴＣＰ、ならびに／あるいはサリチレートと結合したＴＣＰをも提供する。
自己免疫応答、例えば自己抗体の“標的タンパク質”または“標的エピトープ”は、当業者には知られており、例えば、自己抗原およびその関連疾患のリストを閲覧、検索およびダウンロードできるＡＡｇＡｔｌａｓデータベースのようなデータベースから既知である。このデータベースは、http://biokb.ncpsb.org/aagatlas にて自由にアクセス可能である。融合タンパク質またはＴＣＰと自己抗原との組合せは、リウマチ性疾患、橋本甲状腺炎、またはＩｇＧ４を介する自己免疫疾患において好適に適用され得る。例えば、標的タンパク質は、セリアック病に関して組織トランスグルタミナーゼであってもよく、Ｉ型糖尿病に関してインスリンまたはインスリン受容体または膵島細胞抗原であってもよい。他の標的タンパク質はバセドウ病に関して甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）または他のバセドウ病抗原、あるいは自己免疫甲状腺炎に関して甲状腺過酸化酵素および／またはサイログロブリンＴＳＨＲであり得る。標的エピトープは、例えば、これらの標的タンパク質の何れか由来のエピトープ、特に、処置されるべき対象によってＭＨＣ上に提示される該タンパク質由来のエピトープであってよい。
用語“治療薬”とは、障害または疾患を予防または処置するために用いられ得る何れかの薬物、医薬品または他の薬剤を含み、ここで、該薬剤は医薬品として承認され得る。かなりの数の治療薬が、望ましくない免疫応答を誘発することができる。それらの反応は、アレルギー反応（上記）または他の望ましくない反応である。例えば、多くの治療薬は、免疫系によって異物として認識される。このため、抗薬物抗体（ＡＤＡとも呼ばれる）が形成されることがある。しばしば、これらの抗体は中和性であり、すなわち、薬剤が意図された治療標的（例えば、特定の受容体）と相互作用するのを阻害することによって、または治療薬の分解を促進することによって、薬剤の治療効果を阻害する。このことは、患者がある内因性タンパク質または因子を遺伝的に欠いているため、免疫系が当該内因性タンパク質または因子に対する耐性を獲得していない場合のある種の置換療法に関連して特に関連性がある。したがって、このような治療薬に対する免疫学的寛容を伝えること、および／または望ましくない免疫応答を抑制することが強く必要とされている。これは、特定のホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、凝固因子、融合タンパク質またはモノクローナル抗体のような治療用タンパク質またはペプチドに関する特別な問題である。さらなる例は、一般に、望ましくない免疫応答が治療用タンパク質またはペプチドによって、例えば置き換え療法の過程で誘発されるか、または取り消される可能性のある、そのような障害である。そのような治療剤には、ｒｈＥＰＯ、ｒｈＭＧＤＦ／ＴＰＯ、グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病）、α－グルコシダーゼ（ポンペ病）、α－ガラクトシダーゼＡ（ファブリ病）、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、第２因子、Ｖ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＸＩ因子、ＸＩＩＩ因子が含まれる。治療薬に対する免疫応答は、望ましくない炎症、あるいは敗血症性ショックを引き起こすこともある。
もちろん、アレルゲン、不耐性誘導剤、自己免疫応答の標的タンパク質、例えば自己抗体の標的タンパク質または治療剤の全体が、ＴＣＰに結合されていることは必要ない。ＴＣＰが投与される対象のＭＨＣに提示されるＴ細胞エピトープが知られているとき、該Ｔ細胞エピトープの１以上をＴＣＰに結合することも可能である。
好ましくは、該アレルゲン、不耐性誘導剤、自己免疫応答の標的タンパク質もしくは標的エピトープまたは治療薬およびＴＣＰは、融合タンパク質を形成する。
本発明はまた、２つのＴＣＰモノマーがヒンジ領域において１つまたは２つのジスルフィド架橋を介して互いに共有結合しているＴＣＰ二量体を含むＴＣＰ融合タンパク質に関し、ここで、該融合タンパク質は各モノマーにおいて、望ましくない免疫応答が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき薬剤を含んでいてよく、すなわち、二量体が２種のそのような薬剤を含んでいてもよい。
特定の態様において、薬剤は、免疫グロブリンの完全な可変ドメインを含まない。さらに、特定の態様において、融合タンパク質は、全長免疫グロブリンをもたらさない。
しかしながら、一般に、結合された薬剤は、いかなる方法においても限定されない。実際、同定されたフレームの１つの利点は、上記のフレームＡ、ＢおよびＣに対応する位置で、１以上の非相同性Ｔレジトープをかかる抗体のＦｃ部分に挿入することによって、ほとんどすべての抗体の免疫原性を容易に低減することができる。
したがって、特定の態様において、ＴＣＰは、抗体またはＦｃ融合タンパク質の一部であってもよい。好ましくは、抗体は、治療用抗体であり、Ｆｃ融合タンパク質は、治療用Ｆｃ融合タンパク質である。これは、そのような抗体の抗原性および／または中和抗薬物抗体の形成を減少させる可能性を有し得る。したがって、該抗体またはＦｃ融合タンパク質の有効性の低下および／またはクリアランスの加速を回避することができる。例えば、治療用抗体の抗原結合領域またはＦａｂフラグメントをＴＣＰと融合させることができる。あるいは、上記のアプローチに従って、１以上の非相同性Ｔレジトープを治療用抗体のＦｃ部分に直接、好ましくはフレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に組み込むこともできる。しかしながら、ＴＣＰを該抗体と、好ましくは重鎖のＣ末端に融合させてもよい。
治療用抗体および治療用Ｆｃ融合タンパク質の好適な例は、当業者に知られている。そのような治療用抗体の例としては、アブシキシマブ、アブリルマブ（Abrilumab）、アダリムマブ、アデュカヌマブ、アファセビクマブ、アフェリモマブ、アレムツズマブ、アニフロルマブ、アンルキンズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ（Bertilimumab）、ベバシズマブ、ブレゼルマブ（Bleselumab）、ブロソズマブ、ブラジクマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ（Catumaxomab）、セデリズマブ（Cedelizumab）、セルトリズマブ、セツキシマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ（Clenoliximab）、クロツマブ（Crotedumab）、ダクリズマブ、デノスマブ、デュピルマブ、エクリズマブ、エルデルマブ（Eldelumab）、エミシズマブ、エノキズマブ、ファシヌマブ、フェザキヌマブ、フレチクマブ、フルラヌマブ、ガビリモマブ（Gavilimomab）、ギムシルマブ（Gimsilumab）、ゴリムマブ、グゼルクマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ（Inolimomab）、イピリムマブ、イトリスマブ、イキセキズマブ、レブリキズマブ、レトリズマブ（Letolizumab）、ルリズマブペゴル（Lulizumab pegol）、マブリリムマブ（Mavrilimumab）、ミリキズマブ、ムロモナブ－ＣＤ３、ナタリズマブ、ネモリズマブ、オデュリムマブ（Odulimomab）、オファツムマブ、オレンダリズマブ（Olendalizumab）、オロキズマブ、オマリズマブ、オピシヌマブ、オテリキシズマブ、オチリマブ、オクセルマブ（Oxelumab）、オゾラリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パスコリズマブ（Pascolizumab）、ペムブロリズマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、プラクルマブ、プリリキシマブ（Priliximab）、ラニビズマブ、リサンキズマブ、リツキシマブ、ロンタリズマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シファリムマブ（Sifalimumab）、シプリズマブ、シルクマブ、タリズマブ、タネズマブ、テプリズマブ、テゼペルマブ、チブリズマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ウブリツキシマブ（Ublituximab）、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、およびザノルマブ（Zanolimumab）などが挙げられる。治療用Ｆｃ融合タンパク質の例としては、アバタセプト、アレファセプト、ベラタセプト、エタネルセプト、および第ＶＩＩＩ因子－Ｆｃ融合タンパク質および第ＩＸ因子－Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。
したがって、本発明はまた、本発明のＴＣＰを含む人工抗体またはＦｃ融合タンパク質に関し、好ましくは、ＴＣＰは該抗体またはＦｃ融合タンパク質のＦｃ部分を置換するか、または本質的に置換するものである。より具体的には、本発明はまた、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を含む人工抗体またはＦｃ－融合タンパク質に関し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。本発明はまた、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を含む人工抗体またはＦｃ－融合タンパク質に関し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置し、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。該ＴＣＰは、上でさらに定義されるようなＴＣＰであってもよい。本発明はまた、配列番号１のアミノ酸１０４～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を含む人工抗体またはＦｃ－融合タンパク質に関し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。該ＴＣＰは、上でさらに定義されるようなＴＣＰであってもよい。本発明はまた、配列番号１のアミノ酸１～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を含む人工抗体またはＦｃ－融合タンパク質に関し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。該ＴＣＰは、上でさらに定義されるようなＴＣＰであってもよい。
好ましくは、そのような治療用抗体の必要なエフェクター機能は、保持されるべきである。例えば、グリコシル化部位が重要であるとき、該グリコシル化部位は維持されるべきであり、および／または受容体への結合が重要であるとき、それは維持されるべきである。
・多量体
本発明はまた、少なくとも２つのＴＣＰモノマーを含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）多量体、好ましくはＴＣＰ二量体に関し、各ＴＣＰモノマーは配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸１～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、各ＴＣＰモノマーは配列番号１とは非相同のＴレジトープを少なくとも１つ含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置し、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。好ましくは、該ＴＣＰは、ヒトＦｃ－部分鎖に由来する配列を含む。
本発明はまた、少なくとも２つのＴＣＰモノマーを含むＴＣＰ多量体、好ましくはＴＣＰ二量体を提供し、各ＴＣＰモノマーは、配列番号１のアミノ酸１１４～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸１～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、各ＴＣＰモノマーは配列番号１とは非相同のＴレジトープを少なくとも１つ含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置し、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されず、例えば、上でさらに定義されるように、考慮されない。本発明はまた、少なくとも２つのＴＣＰモノマーを含むＴＣＰ多量体、好ましくはＴＣＰ二量体を提供し、各ＴＣＰモノマーは、配列番号１のアミノ酸１０４～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸１～３３０と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、各ＴＣＰモノマーは配列番号１とは非相同のＴレジトープを少なくとも１つ含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置し、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されず、例えば、上でさらに定義されるように、考慮されない。
多量体は、単量体（モノマー）、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体であってもよく、または６個以上のＴＣＰ単量体を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のＴＣＰ多量体は、２から１０個、より好ましくは２から６個の単量体を含む。ＴＣＰの二量体または多量体を得るために、免疫グロブリンＦｃ－部分鎖のヒンジ領域を介して形成されるジスルフィド結合を利用することができる。
当業者は、このようなＴＣＰ多量体におけるＴＣＰモノマーは、完全に同一である必要はないことを理解する。しかしながら、本発明のＴＣＰ多量体において、モノマーは実質的に類似の構造を有するべきである。好ましくは、多量体中の各モノマーは、多量体中に含まれる他の各モノマーに対して少なくとも６０％、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、より好ましくは９０％、９５％の配列同一性を有することが望ましい。モノマーが（実質的に）同一である（例えば、９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する、より具体的には９７％以上のアミノ酸配列同一性を有する）とき、それらは接頭辞“ホモ”（ホモダイマーのように）で識別され得る。多量体中の異なるモノマーが関連する差異を示すとき（例えば、ＴＣＰモノマーは少なくとも１つの異なるＴレジトープを含むとき）、それらは接頭辞“ヘテロ”（ヘテロ二量体のように）で識別され得る。
特に好ましいのは、ＴＣＰ二量体である。従って、本発明はまた、本明細書に記載のＴＣＰに関し、該ＴＣＰは、本明細書に記載の少なくとも２つのＴＣＰモノマーを含む二量体を形成している。したがって、本発明は、２つのＴＣＰモノマーを含むＴＣＰ二量体も提供する。例えば、該ＴＣＰモノマーは、少なくとも１つのジスルフィド架橋、好ましくは２つのジスルフィド架橋を介して共有結合をしていてもよい。好ましくは、該ＴＣＰモノマーは、それぞれ、二量体形成を可能にする免疫グロブリンまたはその一部に由来するヒンジ領域を含む。より具体的には、該ＴＣＰモノマーはそれぞれ、要すれば、配列番号１のアミノ酸位置１０３～１１３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する、二量体形成を可能にする少なくとも一部を含み、好ましくは、配列番号１のアミノ酸位置１０９および１１２のシステイン残基が保持されている。二量体化を可能にする部分ヒンジ領域は、配列番号１のアミノ酸１０４～１１３と少なくとも８５％、好ましくは１００％の配列同一性を有する。
ＴＣＰは、１以上（例えば、２つ）のジスルフィド架橋を介して二量体化した二量体（２つのＴＣＰモノマーを含む）を形成してもよく、好ましくは、ＴＣＰは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して二量体化した２つのＴＣＰモノマーを含む二量体を形成する。当業者によって知られているように、免疫グロブリンのパパイン消化によって得られるＦｃフラグメントは、一般的には二量体である。同様に、Ｆｃ部分鎖のヒンジ領域がＴＣＰに含まれるとき、ＴＣＰは、それぞれのヒンジ領域を介して自発的に二量体化する可能性が高い。二量体化は、さらに、非共有結合のＣＨ３－ＣＨ３－相互作用によって支持されていてもよい。
あるいは、該ＴＣＰ多量体において、ＴＣＰモノマーは、例えば融合タンパク質として、または可撓性もしくは非可撓性リンカーを介して、互いに共有結合していてもよく、非共有結合していてもよい。二量体化はまた、例えば、ロイシンジッパーを介して行われてもよい。
このようなＴＣＰ二量体は、一般的に、対応する単量体と比較して、安定性および半減期が改善される傾向にある。ＴＣＰ二量体は、ホモ二量体であってもヘテロ二量体であってもよい。ホモダイマーは、細胞またはタンパク質を含まない発現系を用いて、信頼性の高い方法で製造することがより容易であり得る。一方、ヘテロ二量体は、より異なるＴレジトープ、例えば最大８個の異なるＴレジトープ（各モノマーにおいてフレームＡ，Ｂ，Ｃのそれぞれにおける１個のＴレジトープ、および１個のＣ末端Ｔレジトープ）を挿入することができるという利点を有し得る。
ヘテロ二量体を生成する技術は、当業者には一般に知られている。種々のＴＣＰモノマーの共発現に加えて、該ヘテロ二量体の形成は、ＴＣＰの特定の修飾によって誘導され得る。そのような修飾は、例えば二重特異性抗体フォーマットの重鎖－重鎖対合から知られている、例えば、（I）免疫グロブリンＦｃ－部分鎖のＣＨ３ドメインに対応するＴＣＰの領域へのシステイン対の導入によるジスルフィド結合対合、（II）種々のＴＣＰモノマーに対して反対荷電残基による塩架橋（salt bridge）を促進する荷電残基の導入、（III）種々のＴＣＰモノマーにおける小さいアミノ酸またはそれぞれより大きいアミノ酸の置換に基づくノブ－イン－ホール（knobs-into-holes；ＫｉＨ）戦略などである。特に、ＫｉＨ戦略は非常に効率的である。
ＴＣＰ六量体も形成することができる。人工の六価Ｆｃタンパク質は、当技術分野で知られている（Rowley et al. 2018. Communications Biology 1:146）。
本明細書に記載されるように、ＴＣＰ多量体は、Ｔレジトープおよび配列番号１の特定の領域に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する配列以外の配列を本質的に含まないＴＣＰタンパク質、またはそれらは他の免疫グロブリンドメイン、例えば抗体の抗原結合部分、もしくは他のポリペプチド、例えば免疫応答が調節されるべきポリペプチドをさらに含むＴＣＰタンパク質、を含み得る。もちろん、混合型多量体を生成することも可能である。
・単量体
しかしながら、二量体または多量体の形成が好ましくない用途もある。二量体または多量体形成を防止することは、例えば、ＴＣＰ配列が、本明細書中の他の場所により詳細に概説されているように、他の薬剤と結合および／または融合されるときに望ましい場合がある。例えば、ヒンジ領域のシステイン残基は、ＴＣＰを含む融合タンパク質において融合パートナーと望ましくない相互作用をする場合がある。
そのような場合、ヒンジ領域を介した二量体形成または他の望ましくないジスルフィド架橋を回避することが望ましい。例えば、そのような場合、ＴＣＰはヒンジ領域を含まないことが望ましい。あるいは、二量体形成に関与するシステイン残基は、当技術分野で知られているように、欠失または置換されてもよい。例えば、それぞれのシステイン残基の１以上は、セリンまたは他のアミノ酸で置換され、それによって、得られる分子の二量体形成が防止され得る。あるいは、二量体または多量体の形成は、化学反応、例えば還元およびその後のアルキル化によって、発現および精製後に排除されてもよい。例えば、ヒンジ領域のシステインに基づくジスルフィド結合は、還元反応、例えば還元型グルタチオン、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトールまたはトリス－２－カルボキシエチルホスフィン塩酸塩などの還元剤を用いて壊すことが可能である。その後、ヨードアセトアミドなどの試薬を用いてアルキル化することで、システイン間のジスルフィド結合の再結合を防ぐことができる。
核酸、宿主細胞およびトランスジェニック動物
本発明はまた、本明細書に記載される、本発明のＴＣＰをコードする核酸、例えば、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）をコードする核酸を提供し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。ＴＣＰは、ヒトＦｃ部分鎖に由来する配列を含んでいてもよい。本発明はまた、本明細書に記載の、本発明のＴＣＰをコードする核酸、例えば、配列番号１のアミノ酸１１４～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）をコードする核酸を提供し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、例えば、上記で定義されるように、配列同一性を決定するために考慮されない。本発明はまた、本明細書に記載の、本発明のＴＣＰをコードする核酸、例えば、配列番号１のアミノ酸１０４～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）をコードする核酸を提供し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、例えば、上記で定義されるように、配列同一性を決定するために考慮されない。本発明はまた、本明細書に記載の、本発明のＴＣＰをコードする核酸、例えば、配列番号１のアミノ酸１～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）をコードする核酸を提供し、ここで、該ＴＣＰは配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、該非相同性Ｔレジトープは配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置しており、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、例えば、上記で定義されるように、配列同一性の決定には考慮されない。
核酸によってコード化されるは、例えば、融合タンパク質であってもよい。好ましくは、核酸は、発現されたタンパク質の分泌を可能にし、それに応じて、精製を容易にするために、シグナルペプチドを含むＴＣＰをコード化する。好ましい態様において、ＴＣＰをコード化する配列は、真核生物のシグナルペプチド、例えば、配列番号２２に示されるようなアミノ酸配列（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ）を有するＮ末端のシグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結される。
核酸は、原核生物または真核生物の宿主細胞、好ましくは真核生物の宿主細胞における相同組換えに適したベクターであってもよい。例えば、ベクターは、ＣＲＩＰＲ／Ｃａｓに基づく組換えに適したものであってもよい。
核酸はまた、発現ベクターであってもよい。したがって、本発明は、ＴＣＰをコード化する核酸を含む発現ベクターにも関する。より具体的には、発現ベクターは、真核生物または原核生物の宿主細胞においてＴＣＰを発現させるのに適したものである。すなわち、該発現ベクターは、ＴＣＰ融合タンパク質としてなど、本明細書中に記載される態様のいずれかにおいて、ＴＣＰをコード化する核酸を含んでいてもよいことが理解されるべきである。
このような発現構築物を作成するのに適した発現ベクターは、当業者によく知られている。それぞれの発現系およびそれぞれの細胞に依存して、発現構築物をコドン最適化すること、および／またはそれを適切なベクターにクローン化することが好ましい場合がある。
好ましくは、発現ベクターにおいて、核酸は、適切なプロモーターに機能的に連結される。このようなプロモーターは一般に知られている。プロモーターは、構成的であっても誘導的であってもよい。好ましくは、プロモーターは、宿主細胞、特に、真核生物宿主細胞におけるＴＣＰの発現に介在するのに適している。また、トランスジェニック動物、例えば、ヒトにおける発現に適していてもよい。例えば、プロモーターは、組織特異的なプロモーターであってもよい。例えば、鳥類の卵での発現に適したプロモーターが選択されてもよい。また、プロモーターは、乳生産動物（milk-producing animal）、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなどにおいて、乳汁中への分泌をもたらす細胞での発現に介在することができるものであってもよい。また、プロモーターは、自己免疫応答がある抗原を発現するヒト細胞、および／または樹状細胞、マクロファージおよび／またはＢ細胞などの抗原提示細胞での発現に介在することができる組織特異的プロモーターであってもよい。
本発明はまた、本発明のＴＣＰをコード化する核酸、例えば発現ベクターを含む、真核生物または原核生物の宿主細胞を提供し、ここで宿主細胞は、好ましくは該ＴＣＰを発現することができる。
好ましくは、該細胞は真核生物細胞である。細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。例えば、治療用途では、生産されるＴＣＰが、例えばグリコシル化のような翻訳後修飾の観点から、ヒトタンパク質により類似している可能性があるため、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞を用いることが有利である。好適な宿主細胞は既知である。例えば、上皮細胞、単球由来細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、膵島細胞または線維芽細胞であってもよい。より具体的な例は、ＨＥＫ ２９３、ＣＡＰ－Ｔ細胞、ＣＡＰ－Ｇｏ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－１またはＣＯＳ－７）、ＢＨＫ－２１、Ｊｕｒｋａｔ、ピア（Peer）、ＣＭＬ Ｔ１、ＥＬ４、Ｔ２、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫＩＩ、およびＶｅｒｏなどである。特定の好ましい態様において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＰ Ｇｏ細胞である。
本発明はさらに、本発明の核酸を含むトランスジェニック動物、好ましくは非ヒト動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、チンパンジー（an ape）、ブタ、イヌ(a do)、ネコ、ラクダ、牛、羊、ヤギまたは鶏のような鳥類を提供する。トランスジェニック動物は、好ましくは、１以上の細胞または組織において該ＴＣＰを発現することができる。例えば、雌のトランスジェニック動物、例えば、ラクダ、ウシ、ヒツジまたはヤギは、その乳中にＴＣＰを分泌することが可能である。トランスジェニック鳥類はまた、本発明のＴＣＰを含む卵を産むことが可能である。したがって、このようなトランスジェニック動物は、本発明のＴＣＰを製造するために用いられ得る。また、例えば、研究のために用いられてもよい。
製造方法
本発明は、本発明のＴＣＰをコード化する核酸を製造する方法を提供する。方法は、
(a）免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、好ましくは、ＩｇＧ１）Ｆｃ部分鎖またはその一部、例えば、ｗｔ Ｆｃ部分鎖をコード化する核酸配列を提供する工程、
(b）好ましくは工程（a）の核酸配列に、本明細書に記載の配列番号１の免疫グロブリンＦｃ部分鎖のフレームＡ、ＢまたはＣの１以上に対応する位置に１以上、例えば、２個、３個または４個の非相同性Ｔレジトープの核酸配列を導入する工程、
(c）工程（b）の配列を有する核酸を作成する工程
を含み得る。
本発明はまた、ＴＣＰをコード化する核酸または該ＴＣＰを含むタンパク質をコード化する核酸を製造するための免疫グロブリンＦｃ－部分鎖の核酸配列の使用を提供する。
該ＴＣＰをコード化する核酸配列は、手動的にまたはコンピューターを用いて（in silicoで）設計することができ、要すれば、その後、該ＴＣＰまたはタンパク質をコード化する核酸の組換えまたは化学合成を行うことができる。適切な方法は既知であり、当業者には利用可能である。
本発明は、本発明のＴＣＰを製造する方法を提供する。本発明のＴＣＰは、人工的または組換え（artificial or engineered）タンパク質であり、自然界には存在しない。ＴＣＰは、組換え技術であっても非組換え技術であっても、当業者が適切と考える何れかのタンパク質合成方法によって製造することができる。例えば、ＴＣＰは、細胞培養における発現または化学的タンパク質合成によって製造されてもよい。しかしながら、細胞系または無細胞系での組換え発現が、確立された方法であり、かつ比較的安価であることから、好ましい。組換え発現において、本発明のＴＣＰで達成可能な良好な発現レベルは、特に利点である。
ＴＣＰのクローニング、発現および精製のための適切な方法は、例えば、J. Sambrook and D. Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3。Edition、Cold Spring Harbour Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY (2001)のような実験室マニュアルを利用することができる。
本発明はまた、本明細書に記載のＴＣＰを製造する方法であって、例えば、（a）ＴＣＰをコード化する核酸を含む適切な発現ベクターを作成する工程、（b）該発現ベクターを用いて適切な宿主細胞をトランスフェクトする工程、（c）該宿主細胞を該ＴＣＰの発現を可能にする条件下で培養する工程、（d）該ＴＣＰを単離する工程を含む方法を提供する。
特に、本発明は、
(a）ＴＣＰの発現に適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養する工程；
(b）工程（a）で発現されたＴＣＰを含む細胞または培地を集める工程；
(c）該ＴＣＰを単離する工程；
(d)要すれば、工程(c)のＴＣＰを薬学的に許容される組成物中に配合する工程
を含む、ＴＣＰを製造する方法を提供する。
さらに、要すれば、工程ｃ）のタンパク質または工程ｄ）の組成物は、適切な容器、例えばシリンジに充填されてもよい。
本発明のＴＣＰは、特に、ＴＣＰがシグナル配列なしで発現されるとき、細胞から単離され得る。また、特に、ＴＣＰが細胞外分泌のためのシグナル配列を含んで発現されるとき、培地から単離されてもよい。
単離は、本明細書中、様々な純度への精製を意味し得る。単離は、細胞または培地から少なくとも１つの非ＴＣＰ成分を除去または減少させる。例えば、ＴＣＰの純度は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、小なくとも９９％、または少なくとも９９．５％であってよく、ここでパーセントは、ｗ／ｗに関する。
適用可能な単離または精製の方法および工程は、当業者に知られており、適切とみなされるように適用することができる。例としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ろ過、ナノろ過、沈殿（例えば、エタノール沈殿）、限外ろ過、および／または透析ろ過が挙げられる。必要とされる純度に応じて、一次精製、中間精製および仕上げ(polishing)など、異なる単離工程を組み合わせてもよい。さらに、精製されたＴＣＰは、その後、例えば限外ろ過および／または透析ろ過を用いて、適切な緩衝液または医薬組成物に濃縮および製剤されてもよい。本方法はまた、特に治療用途のために、例えば放射線または滅菌濾過による滅菌を含んでいてもよい。
例えば、ＴＣＰがプロテインＡまたはプロテインＧに結合するとき、親和性クロマトグラフィーはプロテインＡまたはプロテインＧに基づくものであってよい。
本発明のＴＣＰに含まれる免疫グロブリンＦｃ部分鎖配列に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いることを含む親和性に基づく単離方法は、特に単離に有用であることが見いだされた。したがって、例えば、工程（c）は、ＴＣＰを親和性材料に吸着させることを含んでいてもよく、該親和性材料は、好ましくは、ヒトＩｇのＦｃ－部分に対するポリクローナル抗体を含み、ここで、工程（c）は、要すれば、親和性クロマトグラフィーを含んでいてもよい。モノクローナル抗体は、通常、ポリクローナル抗体よりも制御性に優れている。一方、ポリクローナル抗体は、特定の配列に関係なく、種々のＴＣＰを認識することができるという利点を有している。したがって、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかが、本発明のＴＣＰを単離するために有用であり得る。
あるいは、ＴＣＰが親和性タグを含むとき、該親和性に基づいて、例えば、Ｈｉｓ－タグに対する金属キレート親和性マトリックス、例えば、Ｎｉ２＋親和性マトリックスを介して単離することができる。ＴＣＰ上の親和性タグ、例えば、ＦＬＡＧタグに対して向けられた抗体も、単離のために用いられてもよい。親和性に基づく単離は、親和性クロマトグラフィーを含み得る。親和性吸着は、カラムまたはバッチ形式で実施されてもよい。
当業者にとって、上記のこれらすべての用途および方法について、可能なまたは好ましいＴレジトープ、Ｆｃ部分鎖、配列フレーム、ならびに挿入および位置のルールを含むがこれらに限定されない、本明細書中に記載された好ましいＴＣＰおよびその特徴が類推的に適用されることは明らかである。同様に、ＴＣＰを含む多量体および融合タンパク質を設計および製造することができる。
ＴＣＰの使用
本発明のＴＣＰは、
１）例えば、酵素的切断およびそれに続く、生成したＴＣＰからのＴレジトープの精製による、単離されたＴレジトープの発現および製造のため、
２）例えばＴＣＰ単量体または多量体、特にＴＣＰ二量体として、独立した治療薬として使用するため、
３）免疫応答が抑制されるべきおよび／または寛容が誘導されるべき薬剤との共投与における使用のため、ここで共投与は、ＴＣＰが薬剤に連結されていない形態またはＴＣＰが薬剤に非共有結合または共有結合している形態であり得る、例えば、ＴＣＰを含む融合タンパク質における使用のため、特にその融合タンパク質における非ＴＣＰ融合パートナーに対する免疫応答の抑制および／または該融合パートナーに対する免疫寛容の誘導のためのもの、
４）インビトロの方法のため、例えば、インビトロで制御性Ｔ細胞を活性化するためのもの、または
５）研究に使用するため、
を含む複数の方法において有用である。
第一の用途において、ＴＣＰは、Ｔレジトープを製造するために用いることができる。有利なことに、本発明のＴＣＰは、Ｔレジトープの生産、特に組換え生産を容易にする。したがって、本発明は、１以上のＴレジトープを含むか、またはそれらからなるポリペプチドまたはペプチドの製造方法であって、
a) 本発明のＴＣＰを提供する工程、
b) ＴＣＰから１以上のＴレジトープを含むペプチドまたはポリペプチドを切断する工程、
c) 要すれば、工程b)からのペプチドまたはポリペプチドを精製する工程、
を含む方法を提供する。
工程a)は、本明細書に記載の本発明のＴＣＰを製造する工程を含んでいてもよい。工程b)は、何れかの手段または方法、例えば化学的または酵素的切断によって実施されてもよい。有利には、ＴＣＰに含まれるＴレジトープ（複数可）は、Ｔレジトープ（複数可）を含む、またはＴレジトープ（複数可）からなるポリペプチド（複数可）またはペプチド（複数可）の定められた切断を可能にする酵素的切断部位によって挟まれていてもよい。好ましくは、本明細書中の“挟まれた”とは、酵素切断部位がＴレジトープに近接して位置し、より好ましくはＴレジトープの最も近位端から２０個未満、１５個未満、または１０個未満のアミノ酸残基離れたところに位置することを意味する。
当業者には、Ｔレジトープのみからなるペプチドを必ずしも提供する必要はないことが理解され得る。さらなるアミノ酸を含むペプチドまたはポリペプチドを提供することは、全く十分であるか、または有利でさえある可能性がある。したがって、例えば酵素認識および／または切断部位は、例えばＴレジトープ（複数可）に隣接する領域において、より柔軟に選択され、含まれ得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、さらなる有用なアミノ酸残基、例えば、本明細書中で言及されたような精製タグを含んでいてもよい。好ましくは、酵素認識および／または切断部位は、本明細書中でより詳細に記載されているように、ＴＣＰの該配列フレームＡ、ＢまたはＣのうちの１つ内に位置する。好ましくは、Ｔレジトープに連結された何れかのタグもまた、該配列フレームＡ、ＢまたはＣのうちの１つ内に位置する。
その結果、本発明はまた、本発明により得られる１以上のＴレジトープを含むか、またはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドを提供する。
１以上のＴレジトープを含む、またはそれから構成されるペプチドまたはポリペプチドは、適切と考えられる何れかの方法によって精製することができる。適切な方法は知られており、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ろ過、ナノろ過、沈殿（例えば、エタノール沈殿）、限外ろ過、ダイアフィルトレーションを含む。Ｔレジトープの精製のための好適な方法は、ＷＯ ２００８／０９４５３８Ａ２にも記載されている。
後段の実施例に示すように、本発明のＴＣＰの発現レベルは、単一のＴレジトープの発現よりもはるかに高い。したがって、ＴＣＰからＴレジトープを調製する本明細書に記載のルートは、有利である。
単独の治療薬としての医学的用途、または免疫応答が抑制されるべきおよび／または寛容が誘導されるべき薬剤との共投与での使用については、後段でさらに詳細に記載する。
本発明のＴＣＰはまた、インビトロで用いることができる。例えば、本発明は、免疫応答を調節するための、好ましくは、免疫応答を抑制するための、または寛容を誘導するための、例えばインビトロで、抗原提示細胞などの免疫細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージおよび／またはＢ細胞）および／またはＴ細胞を、本発明のＴＣＰ、本発明の核酸または本発明の宿主細胞と接触させることを含み、個々で、要すれば、該免疫応答は、ＴＣＰが共有結合または非共有結合で結合している薬剤に対する免疫応答、またはＴＣＰ、核酸もしくは宿主細胞が実質的に同時に混合もしくは接触している薬剤に対する免疫応答である、を含む、方法を提供する。
例えば、本発明は、患者から単離された制御性Ｔ細胞を活性化する方法を提供する。この方法で活性化された制御性Ｔ細胞は、該患者への投与に用いるため、例えば、望ましくない免疫応答の抑制および／または免疫原性寛容の付与に用いるためであってもよい。例えば、このような制御性Ｔ細胞は、ＴＣＰに提供されるＴレジトープ（複数可）および／または該ＴＣＰに連結された薬剤、例えば、望ましくない免疫応答が抑制されるべきおよび／または免疫原性寛容が付与されるべきタンパク質に含まれるエピトープを認識し得る。したがって、本発明はまた、望ましくない免疫応答を抑制し、および／または薬剤に対する免疫原性寛容を付与する方法であって、対象からＴ細胞を単離すること（何れかの純度まで、例えば、Ｔ細胞はまた、対象由来の樹状細胞、マクロファージおよび／またはＢ細胞などの抗原提示細胞を含む組成物中にあってもよい、例えば、ＰＢＭＣの文脈において）、該Ｔ細胞を活性化するのに適した条件下で本発明のＴＣＰと接触させること、要すれば、活性化された制御性Ｔ細胞を単離すること、および該Ｔ細胞、好ましくは該制御性Ｔ細胞を該対象に投与すること、を含む方法を提供する。Ｔ細胞を活性化するのに適する条件は、一般的には、抗原提示細胞、好ましくは、樹状細胞、マクロファージおよび／またはＢ細胞などのプロフェッショナルな抗原提示細胞が存在することを必要とする。抗原提示細胞はまた、本発明の宿主細胞であってもよい。一般的には、適当な時間、例えば１２～３６時間、要すれば１６～２４時間、共培養する。Ｔ細胞を対象に再投与する前に、Ｔ細胞の特性、例えばサイトカイン産生および／または免疫特異的マーカータンパク質（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７）が、例えばＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡを用いて分析されてもよい。好ましくは、調節性表現型、例えばＣＤ２５、ＣＤ１２７,ＦｏｘＰ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７および／またはＩＬ－１０を発現するＴ細胞が投与される。
本発明のＴＣＰはまた、研究、例えば動物モデルにおいて、および／または毒性試験のために、および／または細胞培養に基づく実験のための単離初代細胞の刺激のために、用いられ得る。
組成物およびキット
本明細書に記載のように、本発明のＴＣＰは、薬剤と共投与されてもよく、ここで、薬剤は、要すれば、望ましくない免疫応答が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき薬剤である。したがって、本発明は、単量体または多量体（例えば、二量体）であってよい本発明のＴＣＰを含む組成物を提供し、ここで、該組成物は、薬剤をさらに含み、かつ該薬剤は、望ましくない免疫応答を抑制することおよび／または免疫原性寛容を付与することが望ましい薬剤であり得る。
薬剤は、例えば、アレルゲン、不耐性誘導剤、自己免疫応答の標的タンパク質、特に自己抗体の標的エピトープ、またはＴ細胞介在自己免疫応答の標的エピトープ、または治療薬であってよい。
本発明は、種々の共投与に適した組成物を提供する。
最初に、本発明は、本発明のＴＣＰを含む組成物を提供し、ここで、該ＴＣＰは薬剤に連結されていない。従って、ＴＣＰおよび薬剤は単に混合されるだけであり、互いに関連付けられることはない。例えば、組成物は、溶液であってもよく、好ましくは、均一な溶液であり得る。ＴＣＰは、多量体のＴＣＰ、例えば二量体であってもよい。あるいは、単量体の形態であってもよい。
第二に、本発明は、本発明のＴＣＰを含む組成物を提供し、ここで、該ＴＣＰは、薬剤に非共有結合している。このような非共有結合は、例えば、疎水性相互作用、ファン－デル－ワールス－相互作用または極性相互作用を介した、非特異的相互作用であってもよい。また、特異的相互作用であってもよく、例えば、ＴＣＰが抗体の抗原結合部分を含む抗体であるとき、該抗原結合部分は、抗原が薬剤である該抗原に特異的に結合することができる。これは、薬剤がアレルゲンまたは自己免疫応答の標的、特に自己抗体の標的であるタンパク質である場合に、特に有用であり得る。ＴＣＰは、多量体ＴＣＰ、例えば、二量体であってもよい。あるいは、単量体の形態であってもよい。
第三に、本発明は、本発明のＴＣＰを含む組成物を提供し、ここでＴＣＰは、例えば融合タンパク質の形態で薬剤に共有結合されている。ＴＣＰは、多量体ＴＣＰ、例えば、二量体であってもよい。あるいは、単量体の形態であってもよい。
第四の態様において、本発明の組成物は、別の活性剤、例えば、望ましくない免疫応答が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき薬剤を含んでいない。すなわち、該ＴＣＰは、多量体ＴＣＰ、例えば二量体であってもよい。あるいは、単量体の形態であってもよい。
これらの形態の何れにおいても、組成物は、後段でさらに説明するように、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。
本発明はまた、別個に、本発明のＴＣＰ、および薬剤、要すれば、望ましくない免疫応答が抑制されるべきおよび／または免疫原性寛容が付与されるべき薬剤を含むキットを提供する。該薬剤は、例えば、アレルゲン、不耐性誘導剤、自己免疫応答の標的タンパク質、特に自己抗体の標的エピトープ、または治療薬であってもよい。このようなキットは、医薬組成物を製剤するための適切な賦形剤をさらに含んでいてもよい。それは、医学的使用のための説明書を含んでいてもよい。キットはまた、ＴＣＰまたは医薬組成物および説明書を含む１以上の容器を含む外包を有していてよく、要すれば、例えば本発明のタンパク質（複数可）の再構成および／または投与のための１以上のデバイスをさらに含んでいてもよい。
本発明のキットは、代替的にまたはさらに、例えば化学的結合を介して、ＴＣＰおよび薬剤を結合させるための手段を含んでいてもよい。そのような形態では、それはまた一般的には、ＴＣＰおよび薬剤を結合させるための説明書を含む。本発明のキットはまた、ＴＣＰ、およびＴＣＰとキットに提供されていない薬剤とを、例えば化学的結合によって連結するための手段を含み、要すれば、ＴＣＰおよび薬剤を結合させるための説明書を含んでいてもよい。適切なリンカーは、当技術分野で知られている。
医薬組成物
本発明は、本発明のＴＣＰ、本発明の核酸、または本発明の宿主細胞（特に、ヒト細胞における発現に適した宿主細胞）を含む、医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、本発明のＴＣＰを含む。
医薬組成物は、要すれば、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。要すれば、１～１０個の薬学的に許容される賦形剤、より好ましくは１～５個の薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。用語“賦形剤”はまた、担体および／または希釈剤を含む。適切な賦形剤は、当業者には一般に知られている。例としては、塩、緩衝剤、防腐剤および浸透圧活性物質が挙げられる。担体の例としては、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。組成物は、該組成物を等張にするために、適当な量の薬学的に許容される塩をさらに含んでいてもよい。好ましくは、許容される賦形剤、担体または安定化剤は、用いられる投与量および濃度において無毒である。これらには、クエン酸塩、リン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；ナトリウムおよびカリウムなどの塩形成対イオン；低分子量ポリペプチド（例えば、１０個以上のアミノ酸残基）；タンパク質、例えば、血清アルブミンまたはゼラチン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；ヒスチジン、グルタミン、リシン、アスパラギン、アルギニンまたはグリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの炭水化物；単糖類；二糖類；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどのその他糖類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；Ｔｗｅｅｎ、プルロニック系またはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤；メチオニン、アスコルビン酸およびトコフェロールなどの抗酸化剤；および／または、防腐剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；および、ｍ－クレゾールが挙げられる。さらに、医薬組成物は、１以上の安定化剤を含んでいてもよい。一般的な例は、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸またはヒスチジンなど）、糖または糖アルコール（トレハロース、ソルビトール、マンニトールなど）、界面活性剤（ポリソルベートまたはポロキサマーなど）である。適切な賦形剤および製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co.に、より詳細に記載されている。賦形剤および／または担体および／または希釈剤の選択は、投与経路および活性剤（複数可）の濃度、好ましくは、本発明のＴＣＰおよび要すれば、本明細書に記載するように、共投与され得るさらなる薬剤に依存して変わり得る。医薬組成物は、適切とみなされる何れかの形態であってよく、特に、液体または凍結乾燥であってよい。医薬組成物は、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、坐剤、懸濁液、ロゼンジ、粉末、液体、水溶液、または可溶化のための凍結乾燥組成物などに形成されてもよく、好ましくは、水溶液または凍結乾燥組成物である。
本発明の医薬組成物は、非経腸、例えば、静脈内、皮下、経口、局所、経直腸、鼻腔内投与または何れかの他の投与経路用に製剤することができる。静脈内または皮下投与が好ましい。臨床環境では、静脈内投与が好ましい場合がある。皮下投与は、家庭でより容易に実施することができる。当業者は、症例の実態に対応して投与様式を選択することができる。好ましい投与様式はまた、例えば、ＴＣＰの皮下利用可能性に依存して変わり得る。
例えば、特に、医薬組成物が単独の薬剤としてＴＣＰを含むとき、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む医薬組成物、特に静脈内または皮下免疫グロブリン製剤などの免疫グロブリン製剤に通常用いられる何れかの賦形剤、希釈剤および担体はまた、ＴＣＰを含む医薬製剤に適しているものである。例えば、医薬製剤は、１～５０ｇ/ｌの濃度のＴＣＰ、アミノ酸（１５０～５００ｍＭグリシンなど）、要すれば界面活性剤（２０ｍＭポリソルベートなど）、および緩衝液を含み、ｐＨは４．３から６．５とすることができる。
投与のために製剤されるＴＣＰの投与量は、処置されるべき特定の障害および投与経路に応じて選択され得る。当業者は、適切な安全かつ有効な投与量を見出すための手段および方法を知っている。
ガイダンスとして、投与量は、例えば、２ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｇ／ｋｇ体重までの範囲、特に、２００ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｇ／ｋｇ体重までの範囲であってよい。
さらなるガイダンスとして：ＴＣＰが単独治療薬として、例えば自己免疫疾患との関連で投与されるとき、投与量は、それぞれの障害の処置に用いられるポリクローナル静脈内または皮下免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の投与量に相当する範囲であり得る。ＴＣＰが、免疫応答を抑制すべき薬剤と共投与されるとき、投与量は、むしろ、該薬剤の投与量に対してモル過剰となり得る。ＴＣＰが治療薬と連結されるとき、例えば、治療タンパク質との融合タンパク質を形成するとき、投与量は、殆どが、当該治療薬に適した有効量によって決定され得る。
処置または予防すべき障害に応じて、ＴＣＰは、単回用量または複数回投与で適用され得る。例えば、投与は、毎日、２日毎に１回、週１回、２週間毎に１回、または月１回であってもよい。投与はまた、例えば、適切なポンプを介して、連続的に行われてもよい。有利なことに、ＴＣＰは、一般的には、そのＦｃ－部分由来の骨格配列によって、良好な血漿半減期を有する。したがって、好ましくは、ＴＣＰを週１回、２週間毎に１回、またはさらに月１回投与することで十分である。二量体などの多量体は、特に長い血漿中半減期を有し、週１回、２週間に１回、あるいは月１回の投与を可能にし得る。特定のＴＣＰの正確な血漿中半減期は、当業者であれば、当技術分野で知られている方法、例えば、適切な薬物動態試験によって決定することができる。血漿半減期は、新生児Ｆｃ－受容体（ＦｃＲｎ）へのＴＣＰの結合が保持されるか否かにも依存して変化し得る。これは、当業者によって試験され得る。同様に、血漿半減期は、当業者によって延長または短縮することができる。例えば、上記のように、血漿中半減期を延長するために、ＴＣＰをＰＥＧ化することができる。
ＴＣＰを含む医薬組成物は、本明細書に記載の治療用途の何れにも適用可能である。
好ましくは、医薬組成物は安定な組成物であり、すなわち、ＴＣＰは、２～８℃、より好ましくは室温（１８℃～２５℃）で保存したとき、少なくとも３ヶ月、より好ましくは少なくとも６ヶ月、患者への投与への適性を維持し得る。
ＴＣＰまたは医薬組成物は、適切な容器、例えば、フラスコ、ボトル、バッグまたは注射器内に構成されてもよい。医薬として用いるとき、ＴＣＰを含む医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容される容器に充填される。
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるすべての形態において、望ましくない免疫応答が抑制され、および／または免疫寛容が付与されるべき薬剤などのさらなる薬剤の不存在下または存在下で、本発明のＴＣＰを含む組成物であってもよい。本発明はまた、本発明のＴＣＰおよび望ましくない免疫応答を誘発することができる薬剤を含む複合体化された組成物を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明のＴＣＰ（多量体、例えば二量体、または単量体であってもよい）、および別個に、望ましくない免疫応答を抑制すべき薬剤を含む医薬キットに関する。該キットは、例えば、本明細書中に記載された投与量および投与経路の指示を伴う、該キットの医学的使用のための説明書も含んでいてもよい。
該キットは、これらの成分の共投与に用いるためのものであってもよく、共投与は、該キットで処置される対象の同一または近傍の部位または近傍の区画への投与であってもよい。例えば、共投与は、例えば、各種静脈への両成分の静脈内投与であってもよい。好ましくは、共投与は同じ部位で行われる。
共投与はまた、同時または実質的に同時に、例えば１日以内、好ましくは１時間以内、例えば１０分以内、５分以内または１分以内に行われ得る。共投与は、有利には、キットの成分、すなわち、ＴＣＰおよび薬剤が実質的に同時にＴ細胞に提示されることにより、薬剤のエピトープに反応するＴ細胞が、ＴＣＰ由来のＴレジトープによって活性化された制御性Ｔ細胞の影響を受け、薬剤に対する免疫応答が抑制され、および／または薬剤に対して免疫が付与されるという効果を奏する。
医学的適応
本発明のＴＣＰは、医療において有用である。Ｔレジトープの存在により、ＴＣＰは、免疫調節および免疫抑制特性を有し、複数の方法で医学において有益に用いられ得る。
特に、本発明は、対象における免疫応答を調節するのに用いるための本発明の医薬組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする対象における免疫応答を調節するための方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与することを含む方法を開示している。免疫応答の調節は、免疫応答を抑制すること、または免疫寛容を誘導すること（すなわち、免疫寛容を付与すること）であり得る。
本発明はまた、免疫応答の抑制または免疫寛容の誘導に用いるための本発明の医薬組成物を提供する。本発明はまた、それを必要とする対象において免疫応答を抑制する、または免疫寛容を誘導するための方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与することを含む方法を開示する。
本発明はまた、自己免疫関連障害、アレルギー、ウイルス感染または移植関連免疫応答もしくは障害の予防または処置、好ましくは、処置に用いるための本発明の医薬組成物を提供する。同様に、本発明はさらに、自己免疫関連障害、アレルギー、ウイルス感染または移植関連免疫応答もしくは障害の予防または処置のための医薬品の製造のための、本発明のTＣＰの使用に関する。本発明はまた、それを必要とする対象における自己免疫関連障害、アレルギー、ウイルス感染または移植関連免疫応答もしくは障害を予防または処置する方法であって、本発明の医薬組成物を該対象に投与することを含む方法を提供する。
本明細書中の“処置”とは、疾患の少なくとも１つの症状が改善されることを意味し、好ましくは、１以上、最も好ましくは、疾患の全ての症状が改善されるか、または症状がそれ以上発生しなくなることを意味する。処置は、所望により、繰り返し行うことができる。“予防”とは、疾患の発生のリスクまたは発生率の低減を含む。
本明細書で用いる用語“対象”とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、好ましくはヒト対象に関する。対象は、例えば、本明細書で言及されるような疾患または障害の１以上に罹患している、患者であってもよい。非ヒト哺乳動物という用語は、特に限定されず、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ラクダ、モルモット、ブタ、ウサギ、マウスまたはラットが含まれる。治療用途の場合、ＴＣＰに用いられるＦｃ部分鎖および／またはＴレジトープは、好ましくは、処置されるべき種に由来するものである。
“自己免疫関連障害”とは、神経性自己免疫障害、皮膚性自己免疫障害、リウマチ性障害、代謝障害、甲状腺疾患、移植関連免疫応答および障害、ならびに他の自己免疫障害を包含する。
神経系自己免疫疾患の例は、脱髄疾患、例えば、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、多巣性運動神経障害（ＭＭＮ）、ギランバレー症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、重症筋無力症、ランバート－イートン症候群、抗ＮＭＤＡＲ脳炎、スティッフ・パーソン症候群、神経変性中枢系疾患、ＩｇＭ関連多発神経炎、筋炎、自己免疫性多発筋炎、封入体筋炎、免疫性神経筋炎、慢性局所脳炎、溶連菌感染に伴う小児自己免疫性神経精神障害（ＰＡＮＤＡＳ）などである。
皮膚自己免疫疾患の例としては、水疱性皮膚疾患、例えば、天疱瘡（例えば、尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡）、自己免疫性皮膚筋炎、壊疽性膿皮症、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、スティーブンス－ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、アトピー性皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹および強膜水腫が挙げられる。
リウマチ性疾患の例としては、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、若年性リウマチ性関節炎、乾癬および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などが挙げられる。
代謝性自己免疫疾患としては、例えば、Ｉ型糖尿病が挙げられる。
甲状腺疾患型の自己免疫関連疾患としては、例えば、バセドウ病および自己免疫性甲状腺炎が挙げられる。
他の自己免疫疾患としては、例えば、川崎症候群、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群、ＩｇＡ関連血管炎、結節性多発動脈炎、リブド血管症、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、新生物随伴症候群および免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）などの、一次および二次血管炎がある。さらに考えられるのは、自己免疫性血友病（自己免疫性溶血性貧血など）、自己免疫性肝炎、自己免疫性喘息および神経皮膚炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、および慢性疼痛などの処置または予防である。
自己免疫障害の処置において、ＴＣＰが薬剤、一般的には標的または自己免疫応答であることが知られているタンパク質と共投与（例えば、融合タンパク質の形態などの共有結合）されると有利であり得る。しかしながら、本明細書で説明するように、それは必須ではない。
同様に、食物不耐性のようなアレルギーまたは不耐性も、本発明のこの面にしたがって処置され得る。例えば、この態様において、ＴＣＰが、不耐性の原因となるアレルゲンまたはその一部、あるいは物質または化合物（これらが知られている場合）と共投与（例えば、融合タンパク質の形態などの共有結合）されることが有利であり得る。しかしながら、本明細書で説明するように、それは必須ではない。
本発明の医薬組成物が標的とし得るウイルス感染症の例としては、Ｂ型肝炎感染症およびＣ型肝炎感染症が挙げられる。例えば、慢性Ｂ型肝炎の急性増悪は、Ｂ型肝炎コア抗原およびｅ抗原（ＨＢｃＡｇ／ＨＢｅＡｇ）に対する細胞障害性Ｔ細胞応答の増加を伴う場合があり、増悪時にはＨＢｃＡｇペプチド特異的細胞障害性Ｔ細胞の増加を伴い、ＨＢｃＡｇに特異的な制御性Ｔ細胞は減少する。ＷＯ ２００８／０９４５３８ Ａ２も参照のこと。したがって、本発明の処置によって仲介される制御性Ｔ細胞の活性化の増加は、そのような増悪またはその症状の軽減に役立ち得ると考えられる。この態様において、ＴＣＰが、増加した応答が見られる抗原またはその部分（これらが知られている場合）と共投与される（例えば、融合タンパク質の形態などの共有結合）ことが有利であり得る。しかしながら、本明細書で説明するように、それは必須ではない。
“移植関連免疫応答および障害”とは、例えば、移植拒絶反応、宿主対移植片病、および移植片対宿主病などである。該免疫応答の少なくとも一部に関与する標的タンパク質またはＴ細胞エピトープが知られているとき、該標的タンパク質またはＴ細胞エピトープを本発明のＴＣＰと、例えば、融合タンパク質の形態のように共有結合した形態で共投与することが可能である。しかしながら、それは必須ではない。
投与時に、免疫応答は、対象に存在し得るか（例えば、患者に存在する自己免疫疾患またはアレルギー疾患、または治療剤、例えば置換治療タンパク質に対する免疫応答）、または免疫応答は、対象を処置しないとき、将来起こり得る（例えば、将来投与される薬剤、例えば、置換治療タンパク質などの治療剤に反応する免疫応答）。免疫応答が向けられる薬剤が知られているとき、ＴＣＰは、免疫応答が向けられる薬剤と共投与することができる。例えば、ＴＣＰは、アレルゲン、または自己免疫応答の標的タンパク質もしくは標的エピトープ、例えば、抗体と共投与することができる。
Ｔレジトープの存在により、ＴＣＰは、例えば、ＴＣＰを単独の治療剤として、特に、薬剤が別の活性剤と共投与されない場合に用いることにより、既に有益に利用することができる免疫調節および免疫抑制特性を有する。従って、本発明のタンパク質は、免疫抑制剤または免疫調節剤として用いることができる。例えば、自己免疫関連障害、アレルギー、ウイルス感染、または移植関連免疫応答もしくは障害などの本明細書に記載の障害の予防または処置に好適に適用できる。
したがって、ＴＣＰは、本明細書で定義されるように、単独の治療薬として投与に用いるためのものであってもよい。しかしながら、用語“単独（“stand-alone）の”治療法は、ＴＣＰが特定の障害を処置するのに有用な他の薬物と共投与されることを排除するものではない。単独用途の場合、ＴＣＰまたはＴＣＰ組成物は、アレルゲンのような望ましくない免疫反応を調節すべき薬剤、例えば融合タンパク質またはペプチドなどを含んでいない。好ましくは、そのような単独の用途のために、ＴＣＰは二量体または多量体として投与される。
好ましくは、単独の治療薬の形態の本発明のＴＣＰは、血漿由来の静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）または皮下血漿由来の免疫グロブリンＧで有利に処置されることが知られている適応症で用いるためのものである。例えば、単独治療薬としての本発明のＴＣＰ、特に、本明細書で定義する二量体化または多量体化ＴＣＰからなるまたは本質的にそれからなるタンパク質は、アレルギー、免疫血小板減少症、川崎病、ギランバレー症候群などの自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、肝炎、多巣性運動神経障害、スティッフ・パーソン症候群、多発性硬化症および重症筋無力症などの神経疾患、筋炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、自己免疫甲状腺炎、宿主対移植片病、移植片対宿主病ならびに慢性疼痛などの処置において有利に適用できる。この態様において、処置によって調節されるべき免疫応答の標的が既知であることは必要ではない。
あるいは、対象における免疫応答の調節、免疫応答の抑制または耐性の誘導に用いるためのＴＣＰは、別の薬剤と共投与される。その場合、該免疫応答は、一般的には、ＴＣＰが共投与される薬剤に対する免疫応答である。本明細書に記載されるように、一態様において、薬剤およびＴＣＰは結合されていない。あるいは、医薬組成物は、ＴＣＰと非共有結合または共有結合した薬剤に対する望ましくない免疫応答の抑制または阻害、好ましくは、ＴＣＰと共有結合した、例えば、融合タンパク質の形態での使用のためのものであってもよい。目的の薬剤に共有結合または非共有結合しているとき、ＴＣＰは、結合のない単純な共投与の場合よりも、その耐性誘導特性を付与するのにさらに適している。
態様リスト
第１の態様（態様１）において、本発明は、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８5％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を提供し、ここで、該ＴＣＰは、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。
第２の態様において、態様１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０との配列同一性は、少なくとも９０％である。第３の態様において、態様１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０との配列同一性は、少なくとも９５％である。第４の態様において、態様１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０との配列同一性は、少なくとも９９％である。第５の態様において、態様１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０との配列同一性は１００％である。
第６の態様において、本発明は、態様１～５の何れかのＴＣＰであってよく、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該ＴＣＰが、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない、
ＴＣＰを提供する。
第７の態様において、態様６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０との配列同一性は、少なくとも９０％である。第８の態様において、態様６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０との配列同一性は、少なくとも９５％である。第９の態様において、態様６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０との配列同一性は、少なくとも９９％である。第１０の態様において、態様６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１１４から３３０との配列同一性は１００％である。
第１１の態様において、本発明は、態様１～１０の何れかのＴＣＰであってよく、配列番号１のアミノ酸１０４から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該ＴＣＰが、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない、
ＴＣＰを提供する。
第１２の態様において、態様１１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１０４から３３０との配列同一性は、少なくとも９０％である。第１３の態様において、態様１１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１０４から３３０との配列同一性は、少なくとも９５％である。第１４の態様において、態様１１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１０４から３３０との配列同一性は、少なくとも９９％である。第１５の態様において、態様１１のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１０４から３３０との配列同一性は１００％である。
第１６の態様において、本発明は、態様１～１５の何れかのＴＣＰであってよく、配列番号１のアミノ酸１から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該ＴＣＰが、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない、
ＴＣＰを提供する。
第１７の態様において、態様１６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１から３３０との配列同一性は、少なくとも９０％である。第１８の態様において、態様１６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１から３３０との配列同一性は、少なくとも９５％である。第１９の態様において、態様１６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１から３３０との配列同一性は、少なくとも９９％である。第２０の態様において、態様１６のＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１から３３０との配列同一性は１００％である。
第２１の態様において、本発明は、態様１～２０の何れかのＴＣＰであってよく、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも１９０アミノ酸の連続配列を含み、ここで、該ＴＣＰが、該Ｆｃ－部分鎖とは非相同の少なくとも２つの制御性Ｔ細胞活性化エピトープを含み、該タンパク質が要すれば抗体のＶＨドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含んでいなくてもよい、ＴＣＰを提供する。第２２の態様において、態様２１に記載のＴＣＰのＴレジトープの少なくとも１つ、要すれば少なくとも２つは、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置し、ここで、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応する。
態様２１および２２において、配列同一性の決定にフレームの配列が考慮されるため、例えば態様１と比較して配列同一性が低くなる。
第２３の態様において、態様１～２２の何れかのＴＣＰは、少なくとも２つの非相同性Ｔレジトープ、好ましくは少なくとも３つ、要すれば４つの非相同性Ｔレジトープを含む。第２４の態様において、態様１～２３の何れかのＴＣＰは、２～４個のＴレジトープを含む。
第２５の態様において、態様１～２４の何れかのＴＣＰにおいて、第１の非相同性Ｔレジトープは、フレームＡ、ＢまたはＣのいずれか１つに位置し、ここで、少なくとも第２のＴレジトープは、フレームＡ、Ｂ、Ｃ、または配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端の異なるフレームに位置し、要すれば３－１８アミノ酸のリンカーを介して該配列と連結される。
第２６の態様において、態様１～２５の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープが配列フレームＡに位置する。第２７の態様において、態様１～２６の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープが配列フレームＢに位置する。第２８の態様において、態様１～２７の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列フレームＣに位置する。第２９の態様において、態様１～２８の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列フレームＡおよびＢに位置する。第３０の態様において、態様１～２９の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列フレームＡおよびＣのそれぞれに位置する。第３１の態様において、態様１～３０の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列フレームＢおよびＣのそれぞれに位置する。第３２の態様において、態様１～３１の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列フレームＢまたはＣのいずれかに位置する。
第３３の態様において、態様１～３２の何れかに記載のＴＣＰにおいて、
(a）配列フレームＡが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３と少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ
(b）配列フレームＢが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７と少なくとも８５％の配列同一性を有し、かつ
(c）配列フレームＣが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
第３４の態様において、態様１～３３のいずれかのＴＣＰは、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープを含む。第３５の態様では、態様３４のＴＣＰにおいて、非相同性Ｔレジトープは、該アミノ酸配列の直接Ｃ末端である。第３６の態様において、態様３４のＴＣＰにおいて、非相同性Ｔレジトープは、３－１８個のアミノ酸のリンカーを介して該配列に連結されている。第３７の態様において、態様３６のＴＣＰにおいて、リンカーは、ＧＳリンカーまたは配列番号１０７、１０８、１０９もしくは１１０の何れかのリンカーからなる群より選択される。第３８の態様では、態様３４～３７のいずれかのＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８5％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端の非相同性Ｔレジトープは、Ｔｒｅｇ１３４、Ｔｒｅｇ０８８ｘおよびＴｒｅｇ０８８からなる群より選択される。第３９の態様において、態様３４および３６－３７のいずれかのＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列の非相同性ＴレジトープＣ末端はＴｒｅｇ０２９Ｂであり、リンカーは配列番号１０８である。
第４０の態様では、態様３４～３９の何れかのＴＣＰにおいて、ＴＣＰのＣ末端に非相同性Ｔレジトープがあり、要すれば、３－１８個のアミノ酸のリンカーを介して該配列に連結されている。あるいは、第４１の態様において、態様３４～３９の何れかのＴＣＰにおいて、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端非相同性Ｔレジトープは、ＴＣＰのＣ末端にはなく、好ましくは、ＴＣＰは融合タンパク質である。
第４２の態様では、上記の何れかの態様のＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、該Ｔレジトープと同じ長さを有する、またはＴレジトープの長さに１または２アミノ酸を加えた長さを有する配列番号１のアミノ酸１３５から３３０の配列に置換しているが、好ましくは、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは該Ｔレジトープと同じ長さを有する配列番号１のアミノ酸１３５から３３０の配列に置換している。
第４３の態様では、上記の態様の何れかに記載のＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、以下からなる群より選択される：
配列番号１０（Ｔｒｅｇ２８９）：ＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ、
配列番号７（Ｔｒｅｇ０８４）：ＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤ、
配列番号２（Ｔｒｅｇ００９Ａ）：ＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦ、
配列番号９（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）：ＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨＹＣＡ、
配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）：ＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ、
配列番号３（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）：ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ、
配列番号４（Ｔｒｅｇ０８８）：ＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ、
配列番号５（Ｔｒｅｇ１６７）：ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ、
配列番号６（Ｔｒｅｇ２８９ｎ－天然）：ＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ、
配列番号１１（トリミングされたＴｒｅｇ００９Ａ）：ＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ、
配列番号１２（トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ１）：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬ、
配列番号１３（トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ２）：ＶＲＱＡＰＧＫＧＬ、
配列番号１４（トリミングされたＴｒｅｇ０８８）：ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹ、
配列番号１５（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１）：ＫＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨ、
配列番号１６（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ２）：ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＫＨ、
配列番号１７（トリミングされたＴｒｅｇ１６７）：ＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬ、
配列番号１８（トリミングされたＴｒｅｇ２８９ｎ）：ＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ、
配列番号１９（トリミングされたＴｒｅｇ２８９）：ＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ、
配列番号２０（トリミングされたＴｒｅｇ０８４）：ＦＴＬＴＩＳＳＬＱ、ａｎｄ
配列番号２１（トリミングされたＴｒｅｇ１３４）：ＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳ、
ここで、要すれば、全てのＴレジトープが該群から選択される。
第４４の態様では、上記の態様の何れかに記載のＴＣＰにおいて、Ｔレジトープは、配列番号１０、７、２、９および８からなる群より選択される。第４５の態様において、態様１～４４のいずれかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープが配列番号１０を有する。第４６の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープが配列番号７を有する。第４７の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは配列番号２を有する。第４８の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは配列番号９を有する。第４９の態様において、態様１～４４のいずれかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは配列番号８を有する。
第５０の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも1つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号３を有する。第５１の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号４を有する。第５２の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号５を有する。第５３の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号６を有する。第５４の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１１を有する。第５５の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１２を有する。第５６の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１３を有する。第５７の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１４を有する。第５８の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは配列番号１５を有する。第５９の態様では、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは配列番号１６を有する。第６０の態様では、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは配列番号１７を有する。第６１の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１８を有する。第６２の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１９を有する。第６３の態様では、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号２０を有する。第６４の態様において、態様１～４４の何れかのＴＣＰにおいて、少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号２１を有する。
第６５の態様では、態様１～６５の何れかのＴＣＰにおいて、１つのＴＣＰモノマー中のすべてのＴレジトープは、異なる配列を有する。第６６の態様において、態様１～６５の何れかのＴＣＰにおいて、１つのＴＣＰモノマー中の全てのＴレジトープは、同じ配列を有する。
第６７の態様において、本発明は、態様１～６６の何れかのＴＣＰにおいて、配列フレームＡが、配列番号１の位置１７０から位置２０３に対応し、好ましくは、配列番号１の位置１７３から位置２０３に対応する、ＴＣＰを提供する。第６８の態様において、本発明は、配列フレームＢが、配列番号１の位置２７５から位置３０６、好ましくは、配列番号１の位置２７７から位置３０４に対応する、態様１～６７のいずれかに記載のＴＣＰを提供する。第６９の態様において、本発明は、配列フレームＣが、配列番号１の位置２１２から位置２４９、好ましくは、配列番号１の位置２１７から位置２４８に対応する、態様１～６８のいずれかのＴＣＰを提供する。
第７０の態様では、態様１～６９のいずれかのＴＣＰにおいて、
(a）フレームＡは、配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）を位置１７６から位置１９６に（すなわち、配列番号１のそれぞれの位置に対応する位置で）、位置１７４から位置１９９に配列番号５（Ｔｒｅｇ１６７）、位置１８０から位置２００に配列番号２（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、位置１７８から位置１９２に配列番号３（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、位置１８６から位置２００に配列番号７（Ｔｒｅｇ０８４）、位置１７９から位置２０２に配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）、または位置１７３から位置１９０に配列番号１５（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ～ｖ１）を含み；および／または
(b）フレームＢは、位置２８０から位置３００に配列番号１０（Ｔｒｅｇ２８９）、位置２７８から位置３０３に配列番号５（Ｔｒｅｇ１６７）、位置２７８から位置２９８に配列番号２（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、位置２８７から位置３０１に配列番号３（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、位置２８４から位置２９８に配列番号７（Ｔｒｅｇ０８４）、位置２７７から位置３００に配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）、または位置２８７から位置３０４に配列番号１５（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ～ｖ１）を含み；および／または
(c）フレームＣは、位置２２５から位置２４５（または、配列番号１のそれぞれの位置に対応する位置）に配列番号１０（Ｔｒｅｇ２８９）、位置２２３から位置２４８に配列番号５（Ｔｒｅｇ１６７）、位置２２３から位置２４３に配列番号２（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、位置２２３から位置２３７に配列番号３（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、位置２２４から位置２３８に配列番号７（Ｔｒｅｇ０８４）、位置２２２から位置２４５に配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）、または位置２１７から位置２３４に配列番号１５（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ～ｖ１）を含み；および／または
(d）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に位置する少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープは、配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）、配列番号１４（トリミングされたＴｒｅｇ０８８）または配列番号９（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）を有し、ここで、該Ｔレジトープは、要すれば、ＧＳリンカーまたは配列番号１０７～１１０の何れかのリンカーなどの３－１８アミノ酸のリンカーを介して配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有する該配列に連結され得る。
第７１の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(I） (a）フレームＡに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
(b）フレームＢに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
(c）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(d）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にあり、要すればＧＳリンカーなどの３－１８アミノ酸のリンカーを介して該配列に連結されている配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）であって、該ＴレジトープはＴＣＰのＣ末端に存在してもよい
を含むＴＣＰである。
第７２の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(II） (a）フレームＢに位置する配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、および
(b）フレームＣに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
を含むＴＣＰである。
第７３の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(III） (a）フレームＢに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、および
(b）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すればＧＳリンカーなどの３－１８アミノ酸のリンカーを介して該配列に連結された配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、ここで該ＴレジトープはＴＣＰのＣ末端に存在してもよい
を含むＴＣＰである。
第７４の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(IV） (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
(b）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(c）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すればＧＳリンカーなどの３－１８アミノ酸のリンカーを介して該配列に連結された配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）であって、該ＴレジトープはＴＣＰのＣ末端に存在してもよい
を含むＴＣＰである。
第７５の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(V） (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
(b）フレームＢに位置する配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、および
(c）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）
を含むＴＣＰである。
第７６の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(VI）(a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
(b）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(c）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すればＧＳリンカーなどの３－１８アミノ酸のリンカーを介して該配列に連結された配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）であって、該ＴレジトープはＴＣＰのＣ末端に存在してもよい
を含むＴＣＰである。
第７７の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、
(VII） (a）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
(b）配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すればＧＳリンカーなどの３－１８アミノ酸のリンカーを介して該配列に連結された配列番号８によるＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、であって、該ＴレジトープはＴＣＰのＣ末端に位置していてもよい
を含むＴＣＰである。
第７８の態様において、態様１～７０のいずれかのＴＣＰは、配列番号２３～４４および４６～５８および１１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
第７９の態様において、本発明は、態様１～７８のいずれかのＴＣＰを提供し、ここで、ＴＣＰは、二量体形成を可能にする少なくとも部分、要すれば、免疫グロブリンの完全なヒンジ領域を含んでいてもよい。
第８０の態様において、本発明は、ＴＣＰが１９５～３５０個のアミノ酸を含む、態様１～７９のいずれかのＴＣＰを提供する。
第８１の態様において、態様８０のＴＣＰは、本質的に、配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になり、ここで、該ＴＣＰは、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、
(a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
(b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
(c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない。
第８２の態様において、本発明は、該ＴＣＰが、抗体のＶＨドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含まない、態様１～８１のいずれかのＴＣＰを提供する。
第８３の態様において、本発明は、該ＴＣＰが、さらなる免疫グロブリンスーパーファミリドメインを含み、好ましくは、ＴＣＰが、少なくとも抗体のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、好ましくは、抗体の抗原結合部をさらに含む、態様１～７９のいずれかのＴＣＰを提供する。
第８４の態様において、態様１～８０および８１～８３のいずれかのＴＣＰは、ＩｇＡのＣＨ３ドメインを含み、および、要すればＩｇＡの接合領域をさらに含んでいてもよい。
第８５の態様において、態様１～８０および８２～８３のいずれかのＴＣＰは、ＩｇＭのＣＨ３およびＣＨ４ドメインをさらに含む。
第８６の態様において、態様１～８５のいずれかのＴＣＰは、アルブミンまたはアルブミン結合ドメインからなる群より選択される親和性タグをさらに含む。第８７の態様において、態様１～８６のいずれかのＴＣＰは、リンカー、例えば、ＧＳリンカーまたは配列番号１０７～１１０のいずれかのリンカーをさらに含む。第８８の態様において、態様１～８７のいずれかのＴＣＰは、シグナルペプチド、例えば、配列番号２２を有するシグナルペプチドをさらに含む。
第８９の態様では、態様１～８８のいずれかのＴＣＰは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上のＴＣＰモノマーを含む多量体を形成する。第９０の態様において、態様８９のＴＣＰは、態様１～８８のいずれか１つの、少なくとも２つのＴＣＰモノマーを含む二量体を形成する。第９１の態様において、態様９０のＴＣＰにおいて、該ＴＣＰモノマーは、少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して共有結合しており、要すれば、該ＴＣＰモノマーは、少なくとも部分的に免疫グロブリンヒンジ領域を介して共有結合している。第９２の態様において、態様９１のＴＣＰにおいて、部分ヒンジ領域は、配列番号１のアミノ酸１０４から１１３と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有する。第９３の態様では、態様９１または９２のいずれかのＴＣＰにおいて、ヒンジ領域は、配列番号１のアミノ酸９９から１１３と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の配列同一性を有している。
第９４の態様において、態様８９～９３のいずれかのＴＣＰは、態様８０～８２のいずれかのＴＣＰモノマーからなる。
第９５の態様において、態様８９～９３のいずれかのＴＣＰは、態様８３～８５のいずれかの少なくとも１つ、好ましくは、２つのＴＣＰモノマーを含む。
第９６の態様において、態様１～８０、８２～９３および９５のいずれかのＴＣＰは、薬剤に共有結合または非共有結合しており、ここで、薬剤は、好ましくは、望ましくない免疫反応が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき、薬剤である。第９７の態様において、態様９６のＴＣＰにおいて、該ＴＣＰは、該薬剤と共有結合している。第９８の態様において、態様９６のＴＣＰにおいて、ＴＣＰは、該薬剤に非共有結合的に連結されている。
第９９の態様では、態様９６～９８のいずれかのＴＣＰにおいて、該薬剤はアレルゲンである。第１００の態様では、態様９６～９８のいずれかのＴＣＰにおいて、該薬剤は、不耐性誘導剤である。第１０１の態様において、態様９６～９８のいずれかのＴＣＰにおいて、該薬剤は、自己免疫反応の標的タンパク質、例えば、自己抗体の標的タンパク質である。第１０２の態様において、態様９６～９９のいずれかのＴＣＰにおいて、該薬剤は、自己免疫反応の標的エピトープ、例えば、自己抗体の標的エピトープである。また、自己免疫応答の標的エピトープであるＴ細胞エピトープであってもよい。第１０３の態様において、第９６～９９のいずれかのＴＣＰにおいて、該薬剤は、治療用薬剤である。第１０４の態様において、態様９６～１０３のいずれかのＴＣＰにおいて、該ＴＣＰおよび該薬剤は、融合タンパク質を形成する。
第１０５の態様において、本発明は、態様１～１０４のいずれか１つのＴＣＰをコード化する核酸を提供する。第１０６の態様において、態様１０５の核酸は、原核生物または真核生物宿主細胞においてＴＣＰを発現させるのに適した発現ベクターおよび／または原核生物または真核生物宿主細胞における相同組換え用ベクターであり、宿主細胞は、好ましくは真核生物宿主細胞である。
第１０７の態様において、本発明は、ＴＣＰをコード化する核酸、好ましくは態様１０５～１０６のいずれかの核酸を製造する方法であって、
(a）免疫グロブリンＦｃ部分鎖をコードする核酸配列を提供する工程、
(b）本明細書で定義される配列番号１による免疫グロブリンＦｃ部分鎖のフレームＡ、ＢまたはＣの１以上に対応する位置で、工程（a）の核酸配列に１以上の非相同性Ｔレジトープの核酸配列を導入する工程、
(c）工程（b）の配列を有する核酸を生成する工程
を含む、方法を提供する。
第１０８の態様において、本発明は、態様１０５～１０６のいずれかの核酸を含む、真核生物または原核生物、好ましくは、真核生物宿主細胞を提供し、ここで、要すれば、宿主細胞はＴＣＰを発現するのに適したものである。
第１０９の態様において、本発明は、
(a）ＴＣＰの発現に適した条件下で、態様１０８の宿主細胞を培養する工程；
(b）工程（a）で発現されたＴＣＰを含む細胞または培地を収集する工程；
(c）該ＴＣＰを単離する工程；
(d）要すれば、工程（c）のＴＣＰを薬学的に許容される組成物中に製剤する工程
を含む、ＴＣＰを製造する方法を提供する。
第１１０の態様において、態様１０９の方法において、工程（c）は、ＴＣＰを親和性材料に吸着させることを含み、ここで、該親和性材料は、好ましくはヒトＩｇのＦｃ－部分に対するポリクローナル抗体を含み、工程（c）は、要すれば、親和性クロマトグラフィーを含む。
第１１１の態様において、本発明は、態様１０５～１０６のいずれか１つの核酸を含むトランスジェニック動物、好ましくは非ヒト動物、例えばマウスを提供する。
第１１２の態様において、本発明は、態様１～１０４のいずれか、好ましくは、態様８０～８２または９４のＴＣＰを含む組成物を提供し、ここで、該組成物は、薬剤をさらに含み、ここで、該薬剤は、要すれば、望ましくない免疫反応が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき、薬剤である。第１１３の態様において、態様１１２の組成物において、該薬剤はアレルゲンである。第１１４の態様において、態様１１２の組成物において、該薬剤は不耐性誘導剤である。第１１５の態様において、態様１１２の組成物において、該薬剤は自己免疫反応の標的タンパク質、例えば自己抗体の標的タンパク質である。第１１６の態様において、態様１１２の組成物において、該薬剤は自己免疫応答の標的エピトープ、例えば自己抗体の標的エピトープである。また、Ｔ細胞ベースの自己免疫応答の標的エピトープであってもよい。第１１７の態様において、態様１１２の組成物において、該薬剤は治療薬である。
第１１８の態様において、本発明は、態様１～１０４のいずれかのＴＣＰ、好ましくは、態様８０～８２または９４のＴＣＰ、および薬剤、要すれば望ましくない免疫反応が抑制されるべき、および／または免疫原性寛容が付与されるべき薬剤を、別個に含むキットを提供する。第１１９の態様において、態様１１８のキットにおいて、該薬剤はアレルゲンである。第１２０の態様において、態様１１８のキットにおいて、該薬剤は不耐性誘導剤である。第１２１の態様において、態様１１８のキットにおいて、該薬剤は、自己免疫反応の標的タンパク質、例えば自己抗体の標的タンパク質である。第１２２の態様において、態様１１８のキットにおいて、該薬剤は、自己免疫反応の標的エピトープ、例えば自己抗体の標的エピトープである。また、自己免疫応答の標的エピトープであるT細胞エピトープであってもよい。第１２３の態様において、態様１１８のキットにおいて、該薬剤は治療薬である。
第１２４の態様において、本発明は、態様１～１０４のいずれかのＴＣＰ、態様１０５～１０６のいずれかの核酸、または態様１０８の宿主細胞、および要すれば、薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい、医薬組成物を提供する。好ましくは、該医薬組成物はＴＣＰを含む。
第１２５の態様において、態様１２４の医薬組成物は、態様１１２～１１７のいずれかの組成物を含むか、または態様１１８～１２３のいずれかのキットである。
第１２６の態様において、本発明は、対象における免疫応答を調節する際に用いるための、態様１２４～１２５のいずれかの医薬組成物を提供する。第１２７の態様において、態様１２６の使用のための医薬組成物は、免疫応答を抑制するため、または免疫寛容を誘導するためであり、要すれば、該免疫応答は、例えば共有結合形態で、ＴＣＰが共投与されている薬剤に対する免疫応答である。第１２８の態様において、態様１２６または１２７のいずれかの使用のための医薬組成物は、別の薬剤に対する望ましくない免疫応答の抑制または阻害における使用のためのものであり、ＴＣＰは、該薬剤と共投与される。第１２９の態様において、態様１２６の使用のための医薬組成物は、ＴＣＰに共有結合された薬剤に対する望ましくない免疫応答の抑制または阻害における使用のためのものである。
第１３０の態様において、本発明は、自己免疫関連障害、アレルギー、ウイルス感染、または移植関連免疫反応もしくは障害の予防または処置における使用のための、好ましくは、自己免疫障害の処置における使用のための、態様１２４～１２９のいずれかの医薬組成物を提供する。第１３１の態様において、態様１３０の医薬組成物は、自己免疫関連障害の予防に用いるためのものである。第１３２の態様において、態様１３０の医薬組成物は、自己免疫関連障害の処置に用いるためのものである。第１３３の態様において、態様１３０の医薬組成物は、アレルギーの予防に用いるためのものである。第１３４の態様において、態様１３０の医薬組成物は、アレルギーの治療に用いるためのものである。第１３５の態様において、態様１３０の医薬組成物は、ウイルス感染症の処置に用いるためのものである。第１３６の態様において、態様１３０の医薬組成物は、移植関連免疫反応または障害の予防に用いるためのものである。第１３７の態様において、態様１３０の医薬組成物は、移植関連免疫反応または障害の処置に用いるためのものである。第１３８の態様において、本発明は、治療用タンパク質に対する自己免疫反応の予防に使用するための、態様１２４～１２９のいずれかの医薬組成物を提供する。
第１３９の態様において、本発明は、免疫応答を調節するための、好ましくは、免疫応答を抑制するための、または免疫寛容を誘導するための、例えば、インビトロでの、免疫細胞を態様１～１０４のいずれかのＴＣＰ、態様１０５～１０６のいずれかの核酸、または宿主細胞もしくは態様１０８に接触させることを含み、ここで、要すれば、該免疫応答はＴＣＰが共有結合または非共有結合で結合した薬剤に対する免疫応答である、方法を提供する。
第１４０の態様において、態様１～１３９のいずれかの非相同性Ｔレジトープは、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列において同じ位置に同一に発生せず、例えば、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有する天然アミノ酸配列において同じ位置に同一に発生することはない。
Kuby, Immunology, Seventh Edition, W. H. Freeman & Co., New York, 2013によるＩｇドメイン構造であり、Ｔレジトープ配列の起源（origin）を示す図である。 ヒトＩｇＧ重鎖の定常部分（P01857；配列番号１）および担体分子配列として配列番号１の位置１０４から位置３３０の好ましいＦｃ部分サブ配列（配列番号６０）の配列構造である。多重配列アライメントによって同定されたＴレジトープ置換フレームを強調表示している。 分子内ジスルフィド結合、ドメイン境界および局所残基番号を有する置換フレームを有する、Ｆｃ－部分サブ配列（配列番号６０）を示す。 Ｔレジトープ配列Ｔｒｅｇ２８９、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ００９Ａ、Ｔｒｅｇ０２９Ｂ、Ｔｒｅｇ０８４およびＴｒｅｇ１３４（配列番号１０、５、２、３、７および８）と完全担体分子配列（P01857、配列番号１の位置１５０から２２０が示される、配列番号１０４）とのＣｌｕｓｔａｌＸアライメントの一部分したものである。P01857、位置１０４から３３０に対するトリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１のさらなるアライメントを行い、追加した。完全な担体分子配列との全体的なアラインメントは、３０残基のフレームＡを規定する。 Ｔレジトープ配列Ｔｒｅｇ２８９、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ００９Ａ、Ｔｒｅｇ０２９Ｂ、Ｔｒｅｇ０８４およびＴｒｅｇ１３４（配列番号１０、５、２、３、７および８）と部分担体分子配列（P01857、配列番号１の位置２４１－３１０が示されている、配列番号１０５）とのＣｌｕｓｔａｌＸアラインメントの一部分を示したものである。さらに、P01857に対するトリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１（配列番号１５）のアラインメントを行い、追加した。この部分的な担体分子配列との全体的なアラインメントは、２８残基のフレームＢを規定する。 Ｔレジトープ配列Ｔｒｅｇ２８９、Ｔｒｅｇ１６７、Ｔｒｅｇ００９Ａ、Ｔｒｅｇ０２９Ｂ、Ｔｒｅｇ０８４およびＴｒｅｇ１３４（配列番号１０、５、２、３、７および８）と部分担体分子配列（P01857、配列番号１の位置２０５～２５０が示され、配列番号１０６）とのＣｌｕｓｔａｌＸアラインメントの一部分を示したものである。なお、近傍のシステインはアライメント対象に含めていない。さらに、P01857に対するトリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１（配列番号１５）のアラインメントを行い、追加した。この部分的な担体分子配列との全体的なアラインメントは、３２残基のフレームＣを規定する。 フレームＡ（左バー、黒）、フレームＢ（中バー、グレー）、またはフレームＣ（右バー、淡色）への一置換Ｆｃホモ二量体の予測される結合エネルギー。分子間ジスルフィド結合による共有結合の寄与は無視した。 三重置換Ｆｃホモ二量体の予測結合エネルギー。１：ｔｇｐ００８４ｆａ、ｔｇｐ０１６７ｆｂ、ｔｇｐ００９Ａｆｃ；２：ｔｇｐ０１３４ｆａ、ｔｇｐ０２９Ｂｆｂ、ｔｇｐ０１６７ｆｃ；３：ｔｇｐ０２９Ｂｆａ、ｔｇｐ０２８９ｆｂ、ｔｇｐ０１３４ｆｃ；４：ｔｇｐ０１６７ｆａ、ｔｇｐ００９Ａｆｂ、ｔｇｐ００８４ｆｃ；５：ｔｇｐ０２８９ｆａ、ｔｇｐ０１３４ｆｂ、ｔｇｐ００８４ｆｃ；６：ｔｇｐ００８４ｆａ、ｔｇｐ０１６７ｆｂ、ｔｇｐ００９Ａｆｃ；７：Ｐ０１８５７ 位置１０４－３３０、非置換担体（ｔｇｐ：Ｔレジトープ, ｆａ：フレームＡ, ｆｂ：フレームＢ, ｆｃ：フレームＣ。分子間ジスルフィド結合による共有結合の寄与は無視した。単一のＴレジトープは、ｔｇｐ００８４などと記載する。 選択したヘテロダイマーの結合エネルギー。１：Ｐ０１８５７＃１０４－３３０（グリコシル化）、非置換担体２：ｔｇｐ０２８９ｆａ－ｔｇｐ０１３４ｆｂ－ｔｇｐ００８４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０２９Ｂ－ｔｇｐ０２８９ｆｂ－ｔｇｐ０１３４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０３：ｔｇｐ０２８９ｆａ－ｔｇｐ０１３４ｆｂ－ｔｇｐ００８４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ００９Ａｆａ－ｔｇｐ０２９Ｂｆｂ－ｔｇｐ０１６７ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０４：ｔｇｐ００８４ｆａ－ｔｇｐ０１３４ｆｂ－ｔｇｐ０２９Ｂｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０１６７ｆａ－ｔｇｐ０２８９ｆｂ－ｔｇｐ００９Ａｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０５：ｔｇｐ０２８９ｆａ－ｔｇｐ０１３４ｆｂ－ｔｇｐ００８４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０２９Ｂｆａ－ｔｇｐ０１６７ｆｂ－ｔｇｐ００９Ａｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０６：ｔｇｐ０２９Ｂｆａ－ｔｇｐ０２８９ｆｂ－ｔｇｐ０１３４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０２８９ｆａ－ｔｇｐ０１３４ｆｂ－ｔｇｐ００８４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０７：ｔｇｐ０１３４ｆａ－ｔｇｐ０２８９ｆｂ－ｔｇｐ００８４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０１６７ｆａ－ｔｇｐ００９Ａｆｂ－ｔｇｐ０２９Ｂｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０８：ｔｇｐ００９Ａｆａ－ｔｇｐ００８４ｆｂ－ｔｇｐ０２８９ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０１３４ｆａ－ｔｇｐ０２９Ｂｆｂ－ｔｇｐ０１６７ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０９：ｔｇｐ０１３４ｆａ－ｔｇｐ０１６７ｆｂ－ｔｇｐ００９Ａｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ０２９Ｂｆａ－ｔｇｐ００８４ｆｂ－ｔｇｐ０２８９ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０１０：ｔｇｐ０２９Ｂｆａ－ｔｇｐ００９Ａｆｂ－ｔｇｐ０１６７ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ００８４ｆａ－ｔｇｐ０１３４ｆｂ－ｔｇｐ０２８９ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０１１：ｔｇｐ００８４ｆａ－ｔｇｐ０１６７ｆｂ－ｔｇｐ０１３４ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０およびｔｇｐ００９Ａｆａ－ｔｇｐ０２９Ｂｆｂ－ｔｇｐ０２８９ｆｃを含むＰ０１８５７＃１０４－３３０。 本発明のタンパク質であるＴレジトープ担持ポリペプチド分子としてのＦｃ二量体。ヘテロ二量体複合体［E（A：B）］（下のグラフ）および単量体［E（A）、E（B）］（上のグラフ）の全エネルギーと結合エネルギーとの相関を示す。 構築物Ｖ３２および３つの直接的Ｔレジトープ（Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ）の発現解析を示す。構築物Ｖ３２またはＤｉｒ－Ｔｒｅｇ－０１－ＦＬＡＧもしくはＤｉｒ－Ｔｒｅｇ－０２－ＦＬＡＧもしくはＤｉｒ－Ｔｒｅｇ－０３－ＦＬＡＧ（配列番号１０１～１０３）のいずれかの配列情報を有するプラスミドＤＮＡ（一方、各Ｄｉｒ－ＴｒｅｇはＣ末端にＦＬＡＧ－タグが続く３つの連続的にクローニングしたＴレジトープ配列を記載する）は、同一条件下でＣＡＰ－Ｔ細胞に核感染させて、４日間タンパク質発現を行った。細胞上清を遠心分離により集めた。構築物Ｖ３２を１：１０に希釈し、Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ－０ｘ－ＦＬＡＧ上清を１：２に希釈し、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に添加した。カルボキシ末端ＦＬＡＧ－ＢＡＰ融合タンパク質（Sigma-Aldrich、P7457-.1MG）を、対照として連続希釈に用いた。サイズ識別には、Precision Plus Protein All Blue Standard (Bio-Rad, 161-0373)を用いた。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ実行後、ゲルからタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロットし、抗ＦＬＡＧ抗体および抗Ｆｃ抗体を用いて蛍光検出を行った。構築物Ｖ３２の発現は、Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ－０ｘ－ＦＬＡＧ変異体と比較して、顕著に高いタンパク質量となった。 ＦｃＴｒｅｇＶ１、Ｖ３、Ｖ１３、Ｖ１４、Ｖ２０、Ｖ２３、Ｖ３２およびＶ３４と対応する非修飾Ｆｃ－部分（配列番号６０）のウェスタンブロット分析を示す。ＣＡＰ－Ｔ細胞を、それぞれの構築物をコード化するプラスミドを用いて一過性にトランスフェクトし、４日間の細胞培養上清を添加し、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ウェスタンブロット解析は、AffiniPure マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的一次抗体およびIRDye 800CW ラクダ抗マウス二次抗体を用いて行った。すべてのＴレジトープを担持するポリペプチドは、よく発現し、分泌されている。Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standardsを適用して得られたタンパク質のサイズが表示される。
配列リスト
配列番号１： ヒト野生型ＩｇＧ定常領域
配列番号２： Ｔｒｅｇ００９Ａ
配列番号３： Ｔｒｅｇ０２９Ｂ
配列番号４： Ｔｒｅｇ０８８
配列番号５： Ｔｒｅｇ１６７
配列番号６： Ｔｒｅｇ２８９ｎ－天然
配列番号７： Ｔｒｅｇ０８４
配列番号８： Ｔｒｅｇ１３４
配列番号９： Ｔｒｅｇ０８８ｘ
配列番号１０： Ｔｒｅｇ２８９
配列番号１１： トリミングされたＴｒｅｇ００９Ａ
配列番号１２： トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ１
配列番号１３： トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ２
配列番号１４： トリミングされたＴｒｅｇ０８８
配列番号１５： トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１
配列番号１６： トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ２
配列番号１７： トリミングされたＴｒｅｇ１６７
配列番号１８： トリミングされたＴｒｅｇ２８９ｎ
配列番号１９： トリミングされたＴｒｅｇ２８９
配列番号２０： トリミングされたＴｒｅｇ０８４
配列番号２１： トリミングされたＴｒｅｇ１３４
配列番号２２： シグナルペプチド
配列番号２３－４４および４６－５８： ＦｃＴｒｅｇＶ１－Ｖ２２およびＶ２４－Ｖ３６
配列番号５９： na コード化シグナルペプチド
配列番号６０： Ｆｃ－部分サブ配列
配列番号６１－９６： na コード化ＦｃＴｒｅｇＶ１－Ｖ２２およびＶ２４－Ｖ３６
配列番号９７： Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ０１－ＦＬＡＧ
配列番号９８： Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ０２－ＦＬＡＧ
配列番号９９： Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ０３－ＦＬＡＧ
配列番号１００： ＦＬＡＧ配列
配列番号１０１： Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ０１－ＦＬＡＧ ＤＮＡ
配列番号１０２： Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ０２－ＦＬＡＧ ＤＮＡ
配列番号１０３： Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ０３－ＦＬＡＧ ＤＮＡ
配列番号１０４： 図４に示す配列番号１の部分配列
配列番号１０５： 図５に示す配列番号１の部分配列
配列番号１０６： 図６に示す配列番号１の部分配列
配列番号１０７： リンカー１
配列番号１０８： リンカー２
配列番号１０９： リンカー３
配列番号１１０： ＧＳリンカーの配列または部分配列
配列番号１１１： ＦｃＴｒｅｇＶ３２_変異体
実施例
分子モデリング研究によるＴレジトープ用担体プラットフォームの検討
Ｔレジトープは、もともとヒトおよび霊長動物のＧ型免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常領域に存在するペプチドであり、制御性Ｔ細胞を活性化させることができるものである。しかしながら、これらのペプチドの組換え生産は非常に困難である。その天然起源に従って、ヒトＩｇＧのＦｃ部分が、一連の異なるＴレジトープ（配列番号２、３、５、６、７、８）用のクローニングフレームワーク候補として選択された。これらの配列は、図１に示すように、もともと免疫グロブリンの異なるドメインに由来するものであった。本試験の目的は、Ｔレジトープのクローニングおよび発現に適した配列フレームを同定することであった。本試験で用いた正確な基本配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ配列Ｐ０１８５７（配列番号１）、位置１０４から３３０（図２）であり、これはヒンジ領域の一部から開始して、ヒトＩｇＧ1の重鎖の定常領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。配列の詳細は図３に示す。
担体分子の配列内の置換候補フレームは、ＣＬＵＳＴＡＬＸによる多重配列アライメントで同定した。Ｔレジトープのエピトープ特性を維持するために、Ｔレジトープ配列にギャップのないアライメントを作成した。これは、可能な限り高いギャップペナルティ値（＝１００）を用いることで達成された。図４、５および６に、Ｔレジトープ配列と担体分子配列とのアラインメントを示す。完全な担体分子配列に対して、フレームＡ（図４）のアラインメントが得られる。分子内のジスルフィド結合を乱さないようにするため、全配列をシステイン残基を含まないセクションに分割した。これらのセクションは、さらにＴレジトープとアライメントされた。その結果、図５（フレームＢ）および図６（フレームＣ）に示すアラインメントが得られた。これらの他の２つのセクションの相同性は、全配列よりもかなり低いことが特記される。
その生物学的に活性な形態では、Ｆｃ部分はＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むホモダイマーであり、ヒンジ領域で分子間ジスルフィド結合により共有結合している（図１）。ＹＡＳＡＲＡソフトウェアスイートを用いたホモロジーモデリングと呼ばれるコンピューター手法により、類似配列との相同性に基づいたモデルが構築された。その結果、エネルギー的に最も好ましい構造がモデル構造として選択された。ソフトウェアが予測した収束性の悪さおよび二量体を形成しないことは、現実の折りたたみ問題の指標とされ、不安定性の予測として解釈された。計算された構造モデルに基づいて、フレームＡは完全にドメインＣＨ２に属し、フレームＢはドメインＣＨ３のほぼ中央にあることを示された。フレームＣはドメインＣＨ２と重複し、ＣＨ２とＣＨ３の間のドメイン境界を含む。その結果、フレームＡはＴレジトープ置換の重要性が最も低く、フレームＢおよびＣはモノマーの構造、二量体の構造、二量体の結合エネルギーにより顕著な影響を及ぼし得る。
置換フレームの折り畳み（fold）は常にβ鎖およびループまたは短いヘリックスのどちらか一方または両方の末端を含むと予測された。いずれの場合も、β鎖は同じドメイン内の他の鎖と対になっており、担体の他の二次構造要素との密接な結合が強調された。しかしながら、どのフレームも他のＦｃ分子鎖との分子間相互作用には直接関与していない。正しく折りたたまれた担体は、既存の担体構造と同程度の結合エネルギーを示すはずである（Ｐ０１８５７）。ヒンジ領域での分子間ジスルフィド結合の形成は、安定な二量体構造が形成されたときにのみ期待できる。この二量体形成には、ＣＨ３ドメイン間の相互作用が優先的に寄与していることが示されている。したがって、モデルのＣＨ３－ＣＨ３相互作用エネルギーは、予測された構造の最初の検証のための有用な基準である。アニーリングおよび最小化の予測には、水分子を用いなかった。その代わりに、結晶構造を可能な限り再現するようにパラメトリック化された特殊な力場であるＹＡＳＡＲＡ ＮＯＶＡ力場が、二量体エネルギー評価において計算量および精度で妥当な妥協点となることが判明した。
実際、Ｆｃ－部分の変異体（約７５００原子）の場合、ホモロジーモデリングプロセスに続く３６サイクルのシミュレーションアニーリングおよび最急降下法による最小化が、構造、全エネルギー、モノマーエネルギーおよび結合エネルギーの収束に有用であることが見いだされた。しかしながら、古典的な力場に基づくモデルはその精度に限界があり、類似した構造の比較およびそこから傾向を定性的に推測するためにのみ解釈されるべきものである。結果の信頼性を高めるために、信頼できる実験データを参照した。
以下の構造変異体を分析した：
a) １つのＴレジトープを備えるＦｃホモ二量体（各フレームのＦｃ分子につき１つのＴレジトープ）
b) ３つのＴレジトープを備えるＦｃホモ二量体（Ｆｃ分子あたり３つのＴレジトープ、各フレームで１つのＴレジトープ）
c) ６つのＴレジトープを備えるＦｃヘテロ二量体（Ｆｃ分子あたり３つのＴレジトープ、各フレームに１つのＴレジトープ、各Ｆｃモノマーに異なるＴレジトープ）
d) ＴレジトープのＣ末端への付着
e) a)、b)およびd)の組合せ。
図７は、ＴＣＰの二量体結合エネルギーである（ケースａの場合）。これらの結果および他のすべての結果は、ヒンジ領域の２つのジスルフィド結合からの共有結合の寄与を無視していることに注意する必要がある。これらの寄与は、すべてのＴレジトープ挿入変異体で同一であると仮定している。予想されるように、基本配列をＴレジトープで置換すると、結合エネルギーが減少する。修飾された、あるいは欠失したグリコシル化がこの差に大きく寄与していると考えられる。注目すべきは、モデル化されたどの変異体もオリジナルのＦｃフラグメントと同じグリコシル化パターンを有していないことである。担体モデル構造は、その主要なテンプレートであるＰＤＢ結晶構造３ＳＧＫのグリコシル化パターンを有する。この構造は、配列番号６０のＡｓｎ７７でグリコシル化されている（図３参照）。これは、配列番号１のＡｓｎ１８０の位置である（図４参照）。このことは、ｔｇｐ０８４、ｔｇｐ０１３４およびｔｇｐ０８８ｘでグリコシル化がせいぜい期待される程度であり、これらもまさにこの位置にＡｓｎを有していることが明らかである。フレームＡに他のすべてのＴレジトープを挿入すると、このグリコシル化部位は失われる。このデータから、グリコシル化が二量体結合エネルギーにどの程度影響するかは明らかではない。一方、Ｎ１８０Ｑの置換によってのみ元のＦｃ配列と異なるｔｇｐ０２８９（図４参照）は、Ｆｃ二量体に最も近いが、１３５ ｋＪ／ｍｏｌの結合エネルギーの差は驚くべきものである。これは主に、二面体（dihedral）および静電エネルギーの違いに由来する。特に静電エネルギーの差は溶媒和現象へのヒントであり、用いた力ファイルでは明示的に考慮されていない。そのため、結合エネルギーの差は、力場によって過大評価されている可能性がある。この図は、二量体の結合エネルギーに直接影響するフレームＢの重要な役割を確認するものである。Ｔｇｐ００９ＡはフレームＡに有利に導入されるはずである。
図８はケースb)の結果であり、三重に置換されたＦｃ－部分変異体をホモ二量体とした場合の結果である。まず、図７のデータと比較すると、Ｔレジトープの３つの置換による結合エネルギーに一定の相乗効果がある。エラーバーは、最適化過程での結合エネルギーの標準偏差（揺らぎ）を示す。
図９にケースc)の置換の例を示す。これらはもはやホモ二量体ではなくヘテロ二量体であり、本質的な対称性を有していない。変異体２を除いて、すべてのヘテロ二量体変異体は、非置換Ｆｃ二量体よりも著しく安定性が低い。しかし、図８のホモ二量体と比較して、図９では、変異体１１のみがそれらのホモ二量体よりも有意に安定性が低いことが示されている。原理的には、６つの異なるＴレジトープを含むヘテロ二量体を実験的に生成することができる。また、変異体７、８および９は、少なくとも１つのグリコシル化モノマーを有し得る。
図１０は、ヘテロ二量体のエネルギー状況の概要を示す。大部分の変異体は、－２５０ ｋＪ／ｍｏｌおよび－３２０ ｋＪ／ｍｏｌ間の結合エネルギーを示し、全複合体エネルギーは－８７４０ ｋＪ／ｍｏｌおよび－１１０００ ｋＪ／ｍｏｌの間である。この表現における例外は、図９で定義されるように、非常に弱い結合エネルギーを有する変異体１１（－１５４ ｋＪ／ｍｏｌ結合エネルギー；－８２１４ ｋＪ／ｍｏｌ総複合エネルギー）、非常に安定な変異体２（－４２４ ｋＪ／ｍｏｌ結合エネルギー；－１１４８１ ｋＪ／ｍｏｌ総複合エネルギー）および非置換担体変異体１（－５１５ ｋＪ／ｍｏｌ結合エネルギー；－１０１２３ｋＪ／ｍｏｌ総複合エネルギー）である。変異体２は、Ｔレジトープによる安定性の問題が偶然にキャンセルされたという点でユニークであると思われる。全エネルギーおよび結合エネルギー間に弱い相関が見られるのは、一貫性を示すものである。さらに、原子数（７２００－７６００個）に大きな違いがないため、エネルギーの垂直方向の広がりから、力場の精度およびエントロピーの寄与の両方の大きさの順序がわかる。
Ｆｃ部分のＣ末端へのＴレジトープの直接結合の予備的分析では、それぞれの二量体が不安定化することが明らかになった（データは示さず）。その理由は、Ｃ末端アルギニンのカルボキシ基が表面からアクセスできず、二量体構造の内部に隠されていることに関係し得る。Ｃ末端の位置が変わるような修飾は、ＣＨ３ドメインの変形につながり、二量体結合エネルギーを低下させる可能性がある。３つのリンカーバージョン（配列番号１０７－１０９）が、フレームＢ置換のない３つの異なるＴレジトープ構築物と共に分析された。リンカーの１つであるリンカー３（配列番号１０９）はまた、正常なＣ末端リシン残基を欠く切断型Ｆｃ分子と共に用いられている。リンカー２（ＰＴＧＳＧ；配列番号１０８）が結合エネルギーの改善を与えることが明らかとなり、これはＣ末端付着としてｔｇｐ０２９Ｂ（例えば、変異体３；担体配列にｔｇｐ００９Ａｆａ（フレームａのＴｒｅｇ００９Ａ）、ｆｂなし（フレームＢ中のＴレジトープなし）、ｔｇｐ００８４ｆｃ（フレームＣ中のＴｒｅｇ０８４、およびｔｇｐ０２９Ｂ（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）Ｃ末端付着－ ホモ二量体）で、ｔｇｐ０２８９（変異体１；担体配列にｔｇｐ００９Ａｆａ、ｆｂなし、ｔｇｐ００８４ｆｃ、およびｔｇｐ０２８９ Ｃ末端付着－ホモ二量体）より顕著である。
種々のＴＣＰの発現
ＴＣＰ（本明細書中、FcTregとも称する）用の３６種の異なる発現構築物である、構築物ＦｃＴｒｅｇＶ１～ＦｃＴｒｅｇＶ２２、ＦｃＴｒｅｇＶ２４～ＦｃＴｒｅｇＶ３６を調製した。ＦｃＴｒｅｇＶ２３も調製した（配列番号４５）。それぞれのＴＣＰ変異体のアミノ酸配列（配列番号２３～４４および４６～５８）および核酸配列（配列番号６１～８２および８４～９６）は、本明細書の配列表に記載されている。全ての構築物の分泌のために、Ｆｃシグナルペプチド、例えば、Ｆｃ－シグナル＿ＡＡ（配列番号２２）：ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧを用いた。
このシグナル配列は、Ｆｃ－シグナル_ＤＮＡ（配列番号５９）によりコードされた：ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣ。
シグナル配列は、ＤＮＡの５’末端、それぞれタンパク質のＮ末端に付加された。シグナルペプチドは、タンパク質の輸送および分泌中に切断される。
発現および二量体形成の分析のため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞およびＣＡＰ－Ｔ細胞を用いて、構築物を一過性に発現させた。ＣＡＰ－Ｔ細胞は、初代ヒト羊膜細胞をベースにした不死化細胞株であり、４ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕを添加したＰＥＭ培地（Life Technologies）中で浮遊増殖させる。ＣＡＰ Ｇｏ細胞と比較して、ＣＡＰ－Ｔ細胞はさらにシミアンウイルス４０のラージＴ抗原を発現している。ＨＥＫ ２９３－ｆ細胞株は、オリジナルのＨＥＫ ２９３細胞株に由来し、無血清培地での懸濁増殖に適合している。一過性のトランスフェクションは、市販のNucleofector(商標)システムを用いたエレクトロポレーションによって行われた。
培養の指数増殖期中に、ＣＡＰ－Ｔ細胞をCedex XS（Roche Applied Science, Innovatis）により計数し、生細胞密度および生存率を測定した。各ヌクレオフェクション反応について、１×１０７個のＣＡＰ－Ｔ細胞を遠心分離（１５０×ｇ、５分間）により集めた。この細胞を１００μＬの完全ヌクレオファクター溶液ＳＥ（Lonza、スイス）中に再懸濁させ、それぞれのＦｃ－Ｔｒｅｇ構築物（Ｔレジトープ担体分子をコードするプラスミド）と混合させた。ＤＮＡ／細胞懸濁液をキュベットに移し、Nucleofector IIのＸ００１プログラムを用いてヌクレオフェクションを実施した。パルス後、５００μＬの予熱した完全ＰＥＭ培地（＝４ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンを添加）をキュベットに加えて細胞を回収し、１２５ｍＬの振盪フラスコ中の１１．５ｍＬ完全ＰＥＭ培地に静かに移した。残留細胞を回収するため、キュベットを５００μＬの新鮮な培地で１回洗浄した。最終的な培養量は１２．５ｍｌであった。エレクトロポレーションを、７×１０６ ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞および７μｇプラスミドを用いて同様に行った。トランスフェクション後、細胞を４日間インキュベートした。細胞ペレットおよび上清を、その後ウェスタンブロットによって試験した。対照（Reference）はＦｃモノマーによるトランスフェクションであった。試験したすべての構築物はペレットで発現を示したが、分泌には違いが観察された。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞およびＣＡＰ－Ｔ細胞で観察された発現間には、良好な相関があった。
分子Ｖ１、Ｖ３、Ｖ１３およびＶ１４は、ＨＥＫ２９３Ｆでの分泌および発現において良好な結果を示した。Ｖ７、Ｖ９およびＶ１２は、やや劣るものの、分泌および発現の結果が得られた。これらの面で最も良好な結果を示したＴＣＰは、Ｖ１、Ｖ３、Ｖ１３およびＶ１４であった（Ｖ１３およびＶ１４はＣＡＰ－Ｔ細胞でのみ試験された）。ＣＡＰ－Ｔ細胞におけるＶ１５－Ｖ３６の上清を用いたさらなる試験では、Ｖ２０、Ｖ２３、Ｖ３２およびＶ３４について特に良好な結果を示した。
したがって、本発明の好ましいＴＣＰは、以下の構造を有し、ここで、特記しないフレームは、非相同性Ｔレジトープを含まない：
(a）フレームＡのＴｒｅｇ２８９、フレームＣのＴｒｅｇ０８４、Ｔｒｅｇ１３４ Ｃ末端、例えば、Ｖ１
(b）フレームＡのＴｒｅｇ２８９、フレームＣのＴｒｅｇ０８４、フレームＢのＴｒｅｇ１３４、例えば、Ｖ３
(c）フレームＡのＴｒｅｇ２８９、フレームＣのＴｒｅｇ０８４、Ｔｒｅｇ８８ Ｃ末端、例えば、Ｖ１３
(d）フレームＣのＴｒｅｇ０８４、Ｔｒｅｇ１３４ Ｃ末端、例えば、Ｖ１４
(e）フレームＣのＴｒｅｇ００９Ａ、フレームＢのＴｒｅｇ０８８ｘ、例えば、Ｖ２０
(f）AフレームのTreg084、例えば、V23
(g）フレームＡのＴｒｅｇ００９Ａ、フレームＣのＴｒｅｇ０８４、フレームＢのＴｒｅｇ００９Ａ、Ｔｒｅｇ０８８ｘ Ｃ末端、例えば、Ｖ３２
(h）フレームＢのＴｒｅｇ２８９、Ｔｒｅｇ０８８ｘ Ｃ末端、例えばＶ３４。
Figure 2023519347000003
ＦｃＴｒｅｇｓＶ１、Ｖ３、Ｖ１３、Ｖ１４、Ｖ２０、Ｖ２３、Ｖ３２およびＶ３４ならびに対応する非修飾Ｆｃ部分（配列番号６０）の例示的ウェスタンブロットを図１２に示す。上記のように一過性にトランスフェクトしたＣＡＰ－Ｔ細胞の細胞培養上清を、それぞれの上清２０μＬと１０μＬ NuPage LDS サンプルバッファー（４ｘ、Thermo Fisher）、４μＬ NuPage サンプル還元剤（１０ｘ、Thermo Fisher）および６μＬ Aqua Dest. (B. Braun, Germany)を混合して調製した。サンプルを７０℃にて１０分間変性させ、調製したサンプル１０μＬをNuPAGE 勾配 ４－１２％ ＢｉｓＴｒｉｓゲルに添加した。サイズマーカーとしてPrecision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards (Bio-Rad)を適用した。還元ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を２００Ｖで行い、ＭＯＰＳバッファー（４０ｍＬ NuPAGE MOPS SDS 泳動バッファー ＋ ７６０ｍＬ Aqua dest.＋５００μＬ NuPAGE Antioxidant）を用いて行った。その後のウェスタンブロッティングを、転写バッファー（５０ｍＬ NuPAGE トランスファーバッファー (２０ｘ, Thermo Fisher) ＋１ｍＬ NuPAGE 抗酸化剤 ＋ １００ｍＬ メタノール＋８４９ｍＬ Aqua Dest.）を用いて、３０Ｖで６０分間ニトロセルロース膜上にて行った。検出のための非特異的な抗体結合をブロックするために、まず膜をＯｄｙｓｓｅｙのブロッキングバッファー（ＰＢＳ）で４℃にて一晩かけてブロッキングした。その後、一次抗体としてAffiniPure マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的 (Jackson ImmunoResearch, 209-005-098) を用いて、３０ｍＬのブロッキングバッファー＋０．０５％ Tween 20を混合して調製した溶液で１：１００に希釈して、穏やかに振り混ぜながら室温にて１時間インキュベートした。二次抗体IRDye 800CW ロバ抗マウス（１：１５０００希釈、Li-Cor）を、４℃にて１時間インキュベートした。一次抗体と二次抗体のインキュベーション工程間および工程後に、膜を約２５ｍＬのＰＢＳ－Ｔ（５００ｍＬのＰＢＳ＋０．１％の１０％Tween 20溶液）でそれぞれ４回洗浄した。膜をＰＢＳで５分間２回濯いだ後、光から保護して一晩乾燥させた。膜をOdyssey CLx Imager (Li-Cor)を用いてスキャンし、抗体標識タンパク質バンドを検出した。
図１２に示すような還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに基づくウェスタンブロットの結果は、ＦｃＴｒｅｇＶ１、Ｖ３、Ｖ１３、Ｖ１４、Ｖ２０、Ｖ２３、Ｖ３２およびＶ３４の特に良好な発現および分泌を明確に示している。ＴＣＰはほとんどが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ実行中の還元条件により、約２６～３６ｋＤａのサイズ範囲のモノマー（単量体）として見える。このサイズ範囲内の個々のＦｃＴｒｅｇ変異体内の複数のバンドは、クローン発現からではなく、一過性のトランスフェクトされたプール（集団）から得られたタンパク質のため、異なる翻訳後修飾種（例えば、グリコシル化）であり得る。二量体化したＴＣＰ分子のごく一部は、約５５ｋＤａから７０ｋＤａのバンドとして残っていることが確認されている。
これらの結果は、本発明のアプローチに従って、免疫グロブリンＦｃ部分に組み込むことによって、Ｔレジトープを効果的に発現させ、製造することが可能であることを示している。
このようにして、分子Ｖ１、Ｖ３、Ｖ１３、Ｖ１４、Ｖ２０、Ｖ２３、Ｖ３２およびＶ３４が、組換えタンパク質を安定に発現するＣＡＰ Ｇｏ基本細胞株を作製するために選択された。ＣＡＰ Ｇｏ細胞のトランスフェクションは、ＣＡＰ－Ｔ細胞について上記のように行ったが、溶液ＳＥの代わりに溶液Ｖを用い、Nucleofector II上でトランスフェクションプログラムＸ００１を実行した。さらに、ヌクレオフェクションの７２時間後にブラストサイジンによる選択を開始した。
プロテインＡ／ＧまたはThermo ScientificのＦｃＸＬカラムを介した一般的な親和性精製プロトコルによって細胞培養上清から組換えＴＣＰ変異体を精製するいくつかの試みは、失敗した。ＴＣＰは樹脂に適切に結合せず、フロースルーで検出された。そこで、ウェスタンブロットで組換えタンパク質の変異体と結合することが示されているマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ－γフラグメント特異的ポリクローナル抗体を用いて、特異的親和性精製戦略を開発した。この抗体（AffiniPure マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ－γフラグメント特異的ポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch, Cat 209-005-098)）を親和性クロマトグラフィー用の捕捉抗体として用いた。
市販のAffiniPureマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ－γフラグメント特異的ポリクローナル抗体（Jackson ImmunoResearch、Cat 209-005-098）を、ＮＨＳ活性化セファロース４ファストフロー樹脂（GE Healthcare、カタログ番号１７－０９０６）に以下の工程で適用して共有結合させた：
(a) 抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ－γフラグメント特異的抗体バッファー（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３, ０．５Ｍ ＮａＣｌ, ｐＨ８．３）をカップリングバッファーに交換した。
(b) ＮＨＳ活性化セファロース４ファストフローマトリックスを、１ｘマトリックス容量の１ｍＭ ＨＣｌで６回、１ｘマトリックス容量のカップリングバッファーで１回洗浄した。
(c) １２．５ｍＬの抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ－γフラグメント特異的抗体（約１ｍｇ／ｍＬ）を２５ｍＬの調製したＮＨＳ活性化セファロース４ファストフロー樹脂に添加した。ローテーターを用いて２－８℃にて一晩、コンジュゲーションした。
(d) マトリックスの非反応基を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ, ｐＨ 約８．５で４時間インキュベートすることによりブロッキングした。
(e) ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ｐＨ８～９、および０．１Ｍ 酢酸バッファー、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４～５を用いて樹脂の洗浄を行った。洗浄手順は、１マトリックス体積のＴｒｉｓバッファーで３回洗浄後に、１マトリックス体積の酢酸バッファーで３回洗浄した。このサイクルを３～６回繰り返した。最後に、樹脂を２０％エタノール中に保存した。
(f) 樹脂をＸＫ １６／４０またはＴｒｉｃｏｒｎ １０／３００カラムに充填した。
分子発現調製物の細胞培養上清から組換えタンパク質変異体を精製するために、細胞培養上清をまずｐＨ７．４に調整した。この上清を、流速２－６ｍｌ／分、圧力０．１５－０．２ ＭＰａで、調製した親和性カラムに添加した。その後、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）でカラムを洗浄した。組換えタンパク質変異体を、１００ｍＭ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７を用いて溶出させた。流速および圧力は、ローディング工程と同じにした。最終画分の約１０％を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．８での中和に用いた。組換えタンパク質変異体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に再緩衝させて、Pierce Protein Concentrators（Thermo, カタログ番号８８５３５）を用いて濃縮（約３０倍）した。要すれば、Amicon限外ろ過フィルター（Merck、カタログ番号ｕｆｃ９０１０２４）をさらなる濃縮に用いた。
バイスタンダー抑制（Bystander suppression）アッセイ
健康なドナーのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、破傷風トキソイドによる増殖反応をもたらす対応する抗原でエクスビボ刺激することに基づくバイスタンダー抑制アッセイ（ＴＴアッセイ）を、エフェクターＣＤ４細胞の増殖／活性化に対するそれらの阻害能力に関して分子構築物を評価するために用いた。ドナーを選択する際に、ヒト集団における対立遺伝子変異の９５％以上をカバーする、可能な限り広い範囲のヒト集団（主要なＨＬＡ－ＤＲ Ｂ１スーパータイプをカバーする）を得ることが考慮された。インキュベートされた細胞の分析は、細胞内および細胞表面のマーカーによる免疫染色で行われ、フローサイトメトリーで分析した。分子集合体の阻害効果は、エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞の増殖および活性化の低下として観察された。統計学的解析により、特に有効な分子構築物を同定した。
アッセイは、０日目に９６ウェルプレートに３×１０５ 細胞／ウェルを播種し、各データポイントをデュプリケートで実施した。刺激、Ｔレジトープ、免疫染色用抗体の添加およびフローサイトメトリーのセットアップを含むその後のすべての操作は、プレートから細胞を除去することなく行った。ＰＢＭＣの刺激は、１日目に、０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬまたは８０μｇ／ｍＬのＴＣＰ構築物のいずれかの存在下で、０．５μｇ／ｍＬの破傷風トキソイド（ＴＴ）で行った。ＴＣＰ構築物のみ、またはＴＴのみを投与した対照、およびこれらのいずれも投与しなかった対照も同様に含んだ。エフェクター（増殖、ＣＤ２５）Ｔ細胞マーカー、メモリー（ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ）Ｔ細胞マーカーおよび制御性（ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５）Ｔ細胞マーカーに従って、７日目に読み出しを行った。
ＴＣＰ変異体Ｖ２０（Ｔレジトープ００９Ａおよび０８８ｘを含む）を、ＴＴ抑制アッセイ（上記参照）を用いて２名の健康なドナーのＰＢＭＣにおいて試験した。天然Ｆｃを対照として用いた。抑制反応はドナーによって、また測定された刺激パラメータによって変化した。マイクロモル以下から低マイクロモル濃度のＶ２０は、ＣＤ６９（両ドナー）またはＨＬＡ－ＤＲ（１名のドナー）を評価する際のＴＴエフェクター反応を７５％以上抑制した（バックグラウンドが差し引かれた後）。ＴＴによる刺激に対する反応として測定されたパラメータの抑制に対する感受性の順序は、ＣＤ６９＞ＨＬＡ－ＤＲ＞増殖＞ＣＤ２５であった。ドナーの１名（ＥＶ０１５６）では、Ｖ２０はこの試験でテストした４つの刺激パラメータのすべてを抑制した；ＣＤ６９およびＨＬＡ－ＤＲに関しては強く、増殖およびＣＤ２５に関してはより弱く抑制した。２番目のドナー（ＥＶ０１５９）では、Ｖ２０はＣＤ６９に強い影響を与え、ＨＬＡ－ＤＲには弱い影響を与え、そして増殖およびＣＤ２５には顕著な影響を与えなかった。
本発明の組換えタンパク質と直接融合したＴレジトープペプチドの発現の比較
この実験の目的は、本発明のＴＣＰの発現を、マウスＩｇＧ１シグナルペプチドにＮ末端融合させ、検出または潜在的精製のためにＦＬＡＧ－タグにＣ末端融合させた３つの連続クローニングされたＴレジトープ（直接Ｔレジトープ、Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ－ＦＬＡＧ）の発現と比較することであった（以下の表および示した配列番号を参照のこと）。
Figure 2023519347000004
ＣＡＰ－Ｔ細胞を、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Thermo Fisher Scientific、35050038）および５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Thermo Fisher Scientific、R21001；完全ＰＥＭ培地）を添加したＰＥＭ培地で培養した。細胞を解凍するために、必要量の凍結バイアルを３７℃の水浴に移した。解凍後、各バイアルを１０ｍＬの冷やした完全ＰＥＭ培地に移した。この細胞懸濁液を１５０ × ｇで５分間遠心分離した。この洗浄工程中、ＤＭＳＯを除去した。ペレットを１５ｍＬの暖かい完全ＰＥＭ培地に再懸濁させ、１２５ｍＬ振とうフラスコに移した。細胞を、５％ ＣＯ２を含む雰囲気の加湿インキュベーター内で３７℃にてインキュベートした。フラスコを振盪台にセットし、１８５ｒｐｍで回転させ、５０ｍｍの軌道で振盪させた。
細胞の継代培養は３から４日毎に行った。必要量の培養細胞懸濁液を新しいフラスコに移し、完全ＰＥＭ培地を添加して、新鮮培養を０．５×１０６細胞／ｍｌに設定した。移した細胞懸濁液が全容量の２０％を超えるような場合には、懸濁液を１５０ × ｇで５分間遠心分離し、ペレットを新鮮な完全ＰＥＭ培地に再懸濁させた。振盪フラスコ１本当たりの細胞懸濁液の量は、フラスコ全容積の２０％であった。トランスフェクション実験を行う前に、解凍後、最低３回の継代培養を行った。
ＣＡＰ－Ｔ細胞を、４Ｄ－ヌクレオフェクターを用いてトランスフェクションした。各トランスフェクションについて、１０×１０６個のＣＡＰ－Ｔ細胞を、１５ｍｌのコニカルチューブ中で１５０×ｇで５分間遠心分離させた。この細胞を、ペレットの体積およびプラスミド溶液の体積を考慮して、９５μＬの補充したＳＥ緩衝液に再懸濁させた。その後、５μgのそれぞれのプラスミドを細胞懸濁液に加え、穏やかに撹拌した。この溶液を１００μＬのヌクレオキュベットに移した。用いたトランスフェクションプログラムはＥＤ－１００である。トランスフェクション後、１つのヌクレオキュベットから細胞を、１２．５ｍＬの完全ＰＥＭ培地を含む１２５ｍＬの振とうフラスコに移した。この細胞を上記のように４日間培養した。４日目に、１５０ × ｇで５分間遠心分離することにより、細胞を回収した。
本発明のタンパク質の上清を１：１０に希釈し、Ｄｉｒ－Ｔｒｅｇ－ＦＬＡＧの上清を還元サンプルバッファーで１：２に希釈した。カルボキシ末端ＦＬＡＧ－ＢＡＰ融合タンパク質（Sigma-Aldrich、P7457-1MG）を対照として連続希釈（ゲルへの最終添加量：６４０ｎｇ、３２０ｎｇ、１６０ｎｇ、８０ｎｇ、４０ｎｇ、２０ｎｇ）して用いた。ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（４ｘ, Thermo Fisher Scientific, NP0007）２．５部に、ｕＰＡＧＥサンプル還元剤（１０ｘ, Thermo Fisher Scientific, NP0004）１部を加えて還元サンプルバッファーを作製した。各サンプル２０μＬを１．５ｍＬバイアル中で還元サンプルバッファーと混合し、サーモシェーカー（Eppendorf）を用いて７０℃にて１０分間加熱した。ＮｕＰＡＧＥ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ タンパク質ゲル（Thermo Fisher Scientific）をＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ ミニセル電気泳動システム（Thermo Fisher Scientific）に挿入し、内側および外側チャンバーに１× ＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳ泳動バッファー（Thermo Fisher Scientific, NP000202）を満たした。５００μＬのＮｕＰＡＧＥ 抗酸化剤（Thermo Fisher Scientific）を内側チャンバーに添加した。調製した各サンプル１０μＬおよび１× ＬＤＳ サンプルバッファーで１／１０に希釈したプレシジョン Plus プロテインブルースタンダード（Bio-Rad, 161-0373）４μＬをゲルに添加した。２００Ｖの定電圧で５０－６０分間ゲルを泳動させることにより、サンプルの分離を行った。
分離したタンパク質を免疫蛍光検出法で調べるために、セミウェットタンパク質転写用XCell II Blotモジュール（GE Healthcare Life Sciences社製）を用いて、Amersham Hybond 低蛍光 ０．２μｍ ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（GE Healthcare Life Sciences）上に転写した。ＰＶＤＦ膜をＳＤＳゲルに直接適用し、製造元の指示に従ってNuPAGE トランスファーバッファー（２０Ｘ, Thermo Fisher Scientfic）をシステムに充填した。タンパク質ブロッティングを３０Ｖで１時間行った。タンパク質転写後、膜をOdysseyのブロッキングバッファー（Licor）で４℃にて一晩ブロッキングし、その後、２μｇ／ｍＬ モノクローナル 抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（Sigma Aldrich, F1804-200UG）および０．０５％ Tween 20を含むOdyssey ブロッキングバッファーで希釈した１７μｇ／ｍＬのAffiniPure マウス抗ヒトＩｇＧ， Ｆｃγフラグメント特異的抗体（Jackson Immuno Research, 209-005-098）を用いて同時に１時間室温にてインキュベーションした。インキュベーション後、ＰＶＤＦ膜を０．１％ＰＢＳＴで５分間４回洗浄した。タンパク質の検出のために膜を２つに切り分け、ＦＬＡＧ検出用の膜部分を０．０６７μｇ／ｍｌのIRDye 800CW ロバ抗マウス抗体（Licor）と共に１時間インキュベートした。本発明のタンパク質を含む膜の他の部分は、IRDye 680RD ロバ抗マウス抗体（Licor）と共にインキュベートした。最後に、ＰＶＤＦ膜を０．１％ ＰＢＳＴで５分間４回、ＰＢＳで５分間２回洗浄し、水で濯いだ。Licor Odyssey Imagerを用いて膜を可視化した。Phoretix 1Dソフトウェアを用いてバンド強度を定量し、本発明のタンパク質とDir-Treg-FLAGとの発現率を比較した。
後者の対照タンパク質の濃度依存的な免疫蛍光シグナルが観察され、抗ＦＬＡＧ抗体の検出の質の高さが示された（図１１）。Dir-Treg-01-FLAGはほとんど発現していなかった。Dir-Treg-03-FLAGは最小の量で発現し、Dir-Treg-02-FLAGは連続したＴレジトープペプチドの中で最も良好な発現を示した。しかし、本発明のタンパク質（構築物Ｖ３２）の発現量は、Dir-Treg-02-FLAGと比較して９倍、Dir-Treg-03-FLAGと比較して２０倍高かった。
この試験は、ＦＬＡＧ－タグに融合した３つの連続したＴレジトープペプチドの異なるバージョンの発現と比較して、本発明のＴＣＰの有利な発現を明確に示した。

Claims (19)

  1. 配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）であって、ここで、該ＴＣＰは、配列フレームＡ、ＢまたはＣの少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
    (a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
    (b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
    (c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
    ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されない、
    ＴＣＰ。
  2. 非相同性Ｔレジトープが、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列中の同じ位置に同一に存在しない、請求項１に記載のＴＣＰ。
  3. 少なくとも２つの非相同性Ｔレジトープ、好ましくは、少なくとも３つまたは４つの非相同性Ｔレジトープを含み、
    ここで、要すれば、第１の非相同性ＴレジトープはフレームＡ、ＢまたはＣのうち１つに位置し、少なくとも第２のＴレジトープはフレームＡ、Ｂ、Ｃ、または配列番号１のアミノ酸１３５から３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端の異なるフレームに位置する、
    請求項１または２に記載のＴＣＰ。
  4. (a) 配列フレームＡが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３と少なくとも８５％の配列同一性を有し、
    (b） 配列フレームＢが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７と少なくとも８５％の配列同一性を有し、そして
    (c) 配列フレームＣが非相同性Ｔレジトープを含まないとき、該フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９と少なくとも８５％の配列同一性を有する、
    請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  5. 少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープが、該Ｔレジトープと同じ長さを有する、またはＴレジトープに１個または２個のアミノ酸を加えたまたは差し引いた長さを有する、フレームＡ、ＢまたはＣのいずれか内の配列を置換している、請求項１から４のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  6. 少なくとも１つの非相同性Ｔレジトープが、
    配列番号１０（Ｔｒｅｇ２８９）、
    配列番号７（Ｔｒｅｇ０８４）、
    配列番号２（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
    配列番号９（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、
    配列番号８（Ｔｒｅｇ１３４）、
    配列番号３（Ｔｒｅｇ０２９Ｂ）、
    配列番号４（Ｔｒｅｇ０８８）、
    配列番号５（Ｔｒｅｇ１６７）、
    配列番号６（Ｔｒｅｇ２８９ｎ－天然）、
    配列番号１１（トリミングされたＴｒｅｇ００９Ａ）、
    配列番号１２（トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ１）、
    配列番号１３（トリミングされたＴｒｅｇ０２９Ｂ－ｖ２）、
    配列番号１４（トリミングされたＴｒｅｇ０８８）、
    配列番号１５（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ１）、
    配列番号１６（トリミングされたＴｒｅｇ０８８ｘ－ｖ２）、
    配列番号１７（トリミングされたＴｒｅｇ１６７）、
    配列番号１８（トリミングされたＴｒｅｇ２８９ｎ）、
    配列番号１９（トリミングされたＴｒｅｇ２８９）、
    配列番号２０（トリミングされたＴｒｅｇ０８４）、および
    配列番号２１（トリミングされたＴｒｅｇ１３４）
    からなる群より選択され、ここで、好ましくは、全てのＴレジトープが上記の群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  7. ＴＣＰが以下からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
    (I) (a）フレームＡに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
    (b）フレームＢに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）、
    (c）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
    (d）配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すれば３～１８個のアミノ酸のリンカーを介してこの配列に連結された配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）
    を含むＴＣＰ；
    (II) (a）フレームＢに位置する配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、および
    (b）フレームＣに位置する配列番号２のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ００９Ａ）
    を含むＴＣＰ；
    (III) (a）フレームＢに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、および
    (b）配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すれば３～１８個のアミノ酸のリンカーを介してこの配列に連結された配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）
    を含むＴＣＰ；
    (IV） (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
    (b) フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
    (c) 配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すれば３～１８個のアミノ酸のリンカーを介してこの配列に連結された配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）
    を含むＴＣＰ；
    (V) (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
    (b）フレームＢに位置する配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）、および
    (c）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）
    を含むＴＣＰ；
    (VI） (a）フレームＡに位置する配列番号１０のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ２８９）、
    (b）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
    (c）配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すれば３～１８個のアミノ酸のリンカーを介してこの配列に連結された配列番号９のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８８ｘ）、
    を含むＴＣＰ；ならびに
    (VII) (a）フレームＣに位置する配列番号７のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ０８４）、および
    (b) 配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端にある、要すれば３～１８個のアミノ酸のリンカーを介してこの配列に連結された配列番号８のＴレジトープ（Ｔｒｅｇ１３４）
    を含むＴＣＰ。
  8. 配列番号２３～４４および４６～５８および１１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい、要すれば配列番号５４のアミノ酸配列を含んでいてもよい、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  9. ＴＣＰが１９５～３５０個のアミノ酸からなる、請求項１から８のいずれか一項に記載のＴＣＰであって、ここで、ＴＣＰが、本質的に、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなっていてよく、かつ該ＴＣＰが、配列フレームＡ、ＢまたはＣのうち少なくとも１つ内に位置する配列番号１とは非相同の少なくとも１つのＴレジトープを含み、ここで、
    (a) 配列フレームＡは、配列番号１の位置１６８から位置２０３に対応し、
    (b) 配列フレームＢは、配列番号１の位置２７２から位置３０７に対応し、および
    (c) 配列フレームＣは、配列番号１の位置２１２から位置２４９に対応し、
    ここで、配列フレームＡ、ＢおよびＣは、配列同一性を決定するために考慮されず、
    要すれば、３－１８個のアミノ酸のリンカーを介してこの配列に連結され得る、配列番号１のアミノ酸１３５～３３０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＣ末端に１つのさらなるＴレジトープを有していてよい、
    ＴＣＲ。
  10. ＴＣＰが、抗体のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン、好ましくは、抗体の抗原結合部をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  11. 該ＴＣＰが、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上のＴＣＰモノマーを含む多量体を形成しており、
    好ましくは、少なくとも２個のＴＣＰモノマーを含む二量体であり、
    要すれば、該ＴＣＰモノマーは、少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して共有結合している、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  12. ＴＣＰが、（a）アレルゲン、（b）不耐性誘導剤、（c）自己免疫応答の標的タンパク質、例えば自己抗体、（d）自己免疫応答の標的エピトープ、または（e）治療剤、を含む群から選択される薬剤に共有結合または非共有結合されており、
    要すれば、ＴＣＰおよびこれらの薬剤は、融合タンパク質を形成している、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載のＴＣＰ。
  13. 請求項１から１２のいずれか一項に記載のＴＣＰをコードする核酸であって、ここで、該核酸は、要すれば、真核生物宿主細胞においてＴＣＰを発現させるのに適した発現ベクターである、核酸。
  14. 請求項１３に記載の核酸を含む宿主細胞。
  15. Ｔレジトープ担持ポリペプチド（ＴＣＰ）を製造する方法であって、
    (a）ＴＣＰの発現に適した条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養する工程、
    (b）工程（a）で発現されたＴＣＰを含む細胞または培地を集める工程、
    (c）該ＴＣＰを単離する工程、
    (d）要すれば、工程（c）のＴＣＰを薬学的に許容される組成物として製剤する工程
    を含む、製造方法。
  16. 請求項１３に記載の核酸を含むトランスジェニック動物であって、好ましくは、非ヒト動物である、トランスジェニック動物。
  17. 請求項１から１２のいずれか一項に記載のＴＣＰ、請求項１３に記載の核酸または請求項１４に記載の宿主細胞、および要すれば、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
  18. 免疫応答を調節するために使用するための、好ましくは、対象において免疫応答を抑制するため、または免疫寛容を誘導するための、医薬組成物であって、
    ここで、要すれば、該免疫応答は、ＴＣＰが例えば共有結合された形態で共投与される薬剤に対する免疫応答である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  19. 対象における自己免疫関連障害、アレルギー、ウイルス感染または移植関連免疫応答または障害の予防あるいは処置に用いるための、医薬組成物であって、
    好ましくは、自己免疫疾患の処置における使用のための、請求項１７に記載の医薬組成物。
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