KR20110112299A - 자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 가용성 폴리펩티드 - Google Patents

자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 가용성 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히 자가면역 및 염증성 장애, 예를 들어 알레르기성 천식 및 염증성 장 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약으로 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 SIRPα의 세포외 도메인 (CD172a) 또는 인간 CD47에 결합하는 기능적 유도체를 포함하는, 의약으로 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

자가면역 및 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한 가용성 폴리펩티드 {SOLUBLE POLYPEPTIDES FOR USE IN TREATING AUTOIMMUNE AND INFLAMMATORY DISORDERS}
본 발명은 특히 자가면역 및 염증성 장애, 예를 들어 알레르기성 천식 및 염증성 장 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약으로 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 SIRPα의 세포외 도메인 (CD172a) 또는 인간 CD47에 결합하는 기능적 유도체를 포함하는, 의약으로 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드에 관한 것이다.
CD47은 대향하는 세포상의 SIRPα (일명, SHPS-1) 및 SIRPγ에 결합하는 세포 표면 당단백질이다. 이러한 상호작용은 면역 세포 기능의 음성 조절을 유도하거나, 또는 세포의 접착 및 이동을 매개하는 기능을 할 수 있다. CD47은 자가면역 장애의 치료시에 생물학적 작용제로서 사용될 것이 제안되었다 (WO 1999/040940). 반대로, 유사한 치료 목적을 위한 CD47 리간드, 예컨대 SIRPα의 잠재적인 용도에 관한 증거는 거의 없다. 이에 관한 설명 중 하나는 CD47의 발현이 편재되어 있어서 CD47 결합 폴리펩티드를 잠재적인 약물로서 사용하는 것을 저해한다는 것이다. 문헌 [Yu et al., 2006 (J Invest Dermatol, 126, 797-807)]에 나타난 데이터는, 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 융합된 SIRPα의 세포외 도메인으로 제조된 융합 단백질이 마우스에서 피부 유래의 수지상 세포 (DC)가 인접 림프절로 이동되는 것을 저해하여 마우스에서의 접촉 과민증 반응을 (적어도 부분적으로) 감쇠시킬 수 있음을 시사한다. DC의 이동 및 기능은 면역 또는 염증성 반응에 필수적이다. 질환 상태하에서, DC의 이러한 악화된 반응은 질환의 영구화를 야기할 수 있다. 병원성 DC가 조직에서 림프양 장기로 이동하는 것을 저해하는 것은 자가면역 또는 염증성 질환을 구동하는 악순환을 중단시키는 매력적인 기회일 것이다. 본 발명은 SIRPα-Fc 구축물이 질환의 동물 모델에서 Th1/Th17- 및 Th2-구동된 질환을 예방하거나 중단시키는데 적합하다는 최초의 생체내 증거를 제공한다. 이러한 데이터는 본 발명의 기초를 제공하고, SIRPα-유래 단백질 치료제가 약물로서 작용하는 능력을 뒷받침한다. 본 발명은, 부분적으로는, CD47/SIRPα 경로의 조작이 Th1/Th17-구동된 질환 (관절염 및 결장염) 및 또한 Th2-구동된 질환 (알레르기성 천식)의 면역원성 CD103- 수지상 세포-구동된 발병을 저해한다는 발견을 기초로 한다. 이러한 새로운 발견은 질환의 근본적인 원인에 대해 이전에 알려지지 않은 공통적인 메카니즘을 제공하고 다양한 자가면역 및 염증성 장애에 대한 치료 관점을 제공한다. 또한, 공개된 보고에서의 최근 증거는 CD47의 라이게이션이 여러가지 암의 치료에 유익할 수 있음을 나타낸다 ([Majeti et al., Cell 2009]). 상기 보고가 CD47 항체의 용도를 나타내긴 하지만, 본원에서의 본 발명은 이러한 질환의 치료에 있어서 SIRPα-유래 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 a) SIRPα의 세포외 도메인 (서열 3), b) 서열 1의 단편, 및 c) 서열 3에 적어도 75% 동일성을 갖는 서열 1의 변이체 폴리펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 SIRPα-유래 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드는 인간 CD47 (서열 24)에 결합하는, 의약으로 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 서열 3의 변이체 폴리펩티드는 서열 3에 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하다.
읽기 편하도록, 본 발명에 따른 가용성 CD47 결합 폴리펩티드를 이하 "본 발명의 가용성 폴리펩티드"라 칭한다.
한 실시양태에서, 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드는 CD47의 길항제, 즉, CD47에 대한 CD47 리간드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 폴리펩티드로부터 선택된다. CD47 리간드는 SIRPα, SIRPγ 또는 TSP1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드는 CD47의 효능제, 즉, CD47 신호전달 활성을 유도할 수 있는 폴리펩티드로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 상기 가용성 CD47 결합 폴리펩티드는 2 μM 이하의 KD로 인간 CD47에 결합하고/하거나 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정으로 측정시에 유도된 시토카인 분비를 억제하는 것들로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드는 SIRPα의 적어도 V-영역 (서열 2)을 포함하는 SIRPα의 세포외 도메인이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 제2 이종 폴리펩티드에 융합된 SIRPα-유래 폴리펩티드로 이루어진 제1 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 가용성 폴리펩티드는 제2 이종 폴리펩티드 및 SIRPα-유래 폴리펩티드 사이에 스페이서를 추가로 포함한다. 한 구체적인 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드는 IgG Fc 도메인에 융합된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 이소형의 침묵(silent) Fc 단편이다. 한 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 이소형의 글리코실화되지 않은 돌연변이 변이체이다.
또 다른 관련 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 자가면역 및 염증성 장애의 치료시에 약물로서 사용된다. 바람직한 적응증은 Th2-매개 기도 염증, 알레르기성 장애, 천식, 염증성 장 질환 및 허혈성 장애로 이루어진 군 중에서 선택된다. 또한, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 백혈병 또는 암의 치료시에 약물로서 사용될 수 있다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 기재되어 있다.
용어 CD47은 인간 CD47을 지칭한다. 인간 CD47은 서열 24를 포함하지만, 또한 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 인간 CD47의 임의의 천연 다형체 또는 스플라이싱 변이체를 포함한다. 인간에서 발견되는 CD47 뉴클레오티드 서열의 스플라이싱 변이체 또는 SNP의 예는 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00001
용어 SIRPα는 신호 조절 단백질 알파 (또한, CD172a 또는 SHPS-1이라고도 지칭됨)를 지칭하며, CD47 인테그린 결합 단백질에 대한 접착을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 용어 SIRPα는 서열 23에서 정의된 바와 같은 인간 SIRPα를 지칭한다. 인간 SIRPα는 1개의 V-유형 도메인 (서열 2) 및 2개의 C1-유형 Ig 도메인 및 3개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 갖는 아미노산 세포외 도메인 (서열 3)을 함유한다. 이것은 인산화될 때 티로신 포스파타제 SHP-1 및 SHP-2를 동원하는 ITIM 모티프를 갖는 110개 아미노산의 세포질 서열을 갖는다. 용어 인간 SIRPα는 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함하는 인간 SIRPα의 임의의 천연 다형체 또는 스플라이싱 변이체를 추가로 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간에서 발견되는 SIRPα 뉴클레오티드 서열의 스플라이싱 변이체 또는 SNP의 예는 표 2에 기재되어 있다.
Figure pct00002
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드는 그 폴리펩티드를 이러한 폴리펩티드를 발현하는 세포의 막에 고정시키거나 통합하는 임의의 막횡단 도메인 또는 단백질 도메인이 결여된 경우에 "가용성"이다. 특히, 본 발명의 가용성 폴리펩티드에는 SIRPα의 막횡단 및 세포내 도메인이 마찬가지로 없을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "CD47에 결합"하는 폴리펩티드는 20 μM 이하, 2 μM 이하, 0.2 μM 이하의 KD로 인간 CD47에 결합하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD47에 결합하는 폴리펩티드는 계면활성제 단백질 A (SP-A) 및/또는 계면활성제 단백질 D (SP-D)에 추가로 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정으로 측정시에 유도된 시토카인 분비를 억제하는 폴리펩티드는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus Aureus) 코완(Cowan) 1 (판소르빈(Pansorbin)) 또는 가용성 CD40L 및 IFN-γ로 자극된 말초혈 단핵구, 통상적인 수지상 세포 (DC) 및 또한 단핵구-유래 DC로부터의 시토카인 (예를 들어, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-23, IL-8 및/또는 TNF-α) 방출을 억제하는 폴리펩티드이다. 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정의 일례는 하기 실시예에서 보다 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정으로 측정시에 시토카인 분비를 1 μM 이하, 100 nM 이하 또는 10 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, T 세포 증식을 억제하는 폴리펩티드는 실시예에 기재된 바와 같이 혼합 림프구 반응 검정으로 결정할 수 있다.
용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 본원에서 사용된 바와 같이 특정 단백질-단백질 상호작용의 결합 속도를 지칭하며, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 본원에서 사용된 바와 같이 특정 단백질-단백질 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하고, Ka에 대한 Kd의 비율 (즉, Kd/Ka)로부터 구하며 몰 농도 (M)로 표시된다. 단백질-단백질 상호작용에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 단백질/단백질 상호작용의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라스몬 공명을 이용하거나 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)® 시스템을 이용하는 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화도"는 단일 부위에서 폴리펩티드와 그의 표적 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 부위 내에서 폴리펩티드의 결합 영역은 그의 표적과 수많은 부위에서 약한 비-공유 힘을 통해 상호작용하고, 상호작용이 많을수록 친화도가 더 강하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 결합 폴리펩티드에 대한 용어 "고친화도"는 그의 표적에 대한 KD가 10 nM 이하, 예를 들어 1 nM 이하인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다.
용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "최적화된"은 뉴클레오티드 서열이 진핵 세포, 예를 들어 피치아(Pichia) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces)의 세포, 트리코데르마(Trichoderma)의 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포, 또는 원핵 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 균주인 생성 세포 또는 유기체에서 바람직한 코돈으로 아미노산 서열을 코딩하도록 변경된 것을 의미한다.
최적화된 뉴클레오티드 서열은 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 코딩되는 아미노산 서열 ("모" 서열이라고도 공지됨)을 완전하게 또는 가능한 만큼 많이 보유하도록 조작된다. 본원에서의 최적화된 서열은 상응하는 생성 세포 또는 유기체, 예를 들어 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었지만, 본원에서는 다른 원핵 또는 진핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현 또한 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 역시 최적화된 것으로 지칭된다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 하위섹션에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
CD47의 기능적 특성에 대한 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 효과를 평가하는 검정은 실시예에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
SIRP α-유래 폴리펩티드
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 a) SIRPα의 세포외 도메인 (서열 3), b) 서열 3의 단편, 및 c) 서열 3의 변이체 폴리펩티드로 이루어진 군 중에서 선택된 SIRPα-유래 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드는 인간 CD47 (서열 24)에 결합한다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드 및 이것의 SIRPα-유래 단편은 CD47에 결합하는 능력을 보유해야 한다. 따라서, 서열 3의 단편은 SIRPα의 CD47 결합 도메인을 포함하는 단편에서 선택될 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 SIRPα의 막횡단 및 세포내 도메인을 포함하지 않는다. 비-제한적인 예시적인 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 2로 본질적으로 이루어진다. SIRPα-유래 폴리펩티드는, 천연 서열에 대한 변화가 상기 분자의 생물학적 활성, 특히 CD47에 대한 결합에 실질적으로 영향을 주지 않는다면 아미노산 잔기가 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이되고 서열 3에 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 서열 3의 변이체 폴리펩티드를 추가로 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 이것은 서열 2와 비교할 때 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이하의 아미노산이 SIRPα-유래 폴리펩티드에서의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환에 의해 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다. 돌연변이체 아미노산 서열의 예는 단일 뉴클레오티드 다형성으로부터 유래된 서열이다 (표 2 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 동일성 백분율(%)은, 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하면서 그 서열들이 공유하는 동일한 위치의 수에 대한 함수이다 (즉, 동일성(%) = 동일 위치의 수/위치의 전체 수×100). 2개 서열들 사이의 서열 비교 및 동일성(%) 결정은 하기 기재되는 바와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성(%)은 PAM120 가중 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하고 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열들 사이의 동일성 백분율(%)은 블로썸(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하고 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능함)에 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드는 보존적 아미노산 치환을 함유하는 서열 3 또는 서열 2에 대한 변화를 포함한다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 당업계에 규정되어 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, SIRPα-유래 폴리펩티드의 CD47 결합 영역 내 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일 측쇄 부류의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 새로운 폴리펩티드 변이체는 본원에 기재된 결합 또는 기능적 검정을 이용하여 보유하는 기능에 대해 시험될 수 있다.
일부 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드는 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정으로 측정시에 인간 SIRPα의 세포외 도메인을 포함하는 서열 3의 폴리펩티드와 적어도 동일한 정도로 시토카인 분비를 억제하는 능력을 보유하는 것들로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드는 혼합 림프구 반응 검정으로 측정시에 T 세포 증식을 억제하는 능력을 보유하는 것들로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드는 비-인간 영장류 CD47과 교차반응하는 것들로부터 선택된다.
융합 폴리펩티드
한 측면에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 SIRPα-유래 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 SIRPα-유래 폴리펩티드, 및 SIRPα-유래 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단에서 SIRPα-유래 폴리펩티드에 공유 결합된 제2 이종 아미노산 서열, 예를 들어 SIRPα 이외의 1종 이상의 단백질의 일부를 포함하고, 임의로는 링커를 추가로 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
비-SIRPα-유래 단백질은, 바람직하게는 또 다른 이종 단백질에 융합되는 경우에 생성된 융합 단백질의 혈중 반감기를 증가시킬 수 있는 가용성 단일 쇄 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 비-SIRPα-유래 단백질은 융합 폴리펩티드의 다량체화를 위한 도메인을 포함한다.
비-SIRPα-유래 단백질은 예를 들어 이뮤노글로불린, 혈청 알부민 및 그의 단편일 수 있다. 비-SIRPα-유래 단백질은 또한 혈청 알부민 단백질에 결합하여 생성된 분자의 대상체 투여시 반감기를 증가시킬 수 있는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 EP 0 486 525 (Nygren et al.)에 기재되어 있다.
한 구체적인 실시양태에서, 비-SIRPα-유래 단백질은 Fc 도메인이다. 인간에서의 생체내 반감기가 증가된 가용성 구축물 제조를 위한 Fc 잔기의 용도는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 US 5,428,130 (Capon et al.)에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인"은 이뮤노글로불린의 불변 영역을 지칭한다. Fc 도메인은 적어도 CH2 및 CH3 도메인, 및 임의로는 중쇄 CH1 도메인 및 CH2 사이에 위치한 힌지 영역을 포함한다. Fc 단편은 예를 들어 이뮤노글로불린의 파파인 소화로 수득될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 Fc 도메인은 적어도 1개의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입이 도입된 Fc 변이체를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 융합 폴리펩티드의 안정성이 증가 또는 감소되도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 이것의 생물학적 반감기가 증가되도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같이, 1종 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F.
다른 실시양태에서, Fc 영역을 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 변경시켜서 Fc 부분의 이펙터 기능을 변경시킨다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산은 Fc 부분이 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖도록 하는 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기에서 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 생성된 Fc 부분에서 C1q 결합이 변경되고/되거나 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 감소되거나 없어지게 할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시켜서 보체를 고정시키는 Fc 영역의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 융합 폴리펩티드가 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 능력이 증가되고/되거나 Fcγ 수용체에 대한 Fc 영역의 친화도가 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 추가로, FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1의 결합 부위가 맵핑되어 있고, 결합이 개선된 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조).
한 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 기원의 것이고, 임의의 이뮤노글로불린 클래스, 예컨대 IgG 또는 IgA, 및 임의의 아형, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4일 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 비-인간 동물, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 마우스, 래트, 토끼, 낙타, 상어, 비-인간 영장류 또는 햄스터의 것이다.
특정 실시양태에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 구체적인 실시양태에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어 융합 폴리펩티드가 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하고/하거나 Fcγ 수용체에 결합하는 능력을 감소시키거나 없앤 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 예는 문헌 [J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 (Hezareh et al.)]에 기재된 바와 같이 아미노산 위치 234 및 235에서 류신 잔기가 알라닌 잔기로 대체된, 소위 LALA 돌연변이체이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297의 잔기에서의 글리코실화를 저해하는 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인 위치 297의 아스파라진 잔기의 아미노산 치환이다. 이러한 아미노산 치환의 예는 N297의 글리신 또는 알라닌으로의 대체이다.
한 실시양태에서, Fc 도메인은 바람직하게는 이러한 Fc 도메인을 포함하는 2개의 융합 폴리펩티드 사이에서 공유 디술피드 브릿지를 형성할 수 있는 시스테인에 의한 이량체화 도메인을 포함한다.
SIRPα-유래 폴리펩티드는 비-SIRPα-유래 단백질과 프레임에 맞게 직접 융합될 수도 있고, 또는 폴리펩티드 링커 (스페이서)를 통해 융합될 수도 있다. 이러한 스페이서는 단일 아미노산 (예를 들어, 글리신 잔기) 또는 5개 내지 100개의 아미노산, 예를 들어 5개 내지 20개의 아미노산일 수 있다. 링커는, SIRPα-유래 도메인이 적당한 공간적 배향을 가져서 CD47과의 결합 부위를 형성하도록 해야 한다. 적합한 폴리펩티드 링커는 가요성 형태를 갖는 것들로부터 선택될 수 있다. 이러한 링커의 예는 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 링커, 예를 들어 (Gly4Ser)n (여기서, n = 1 내지 12)이다 (이에 제한되지 않음).
글리코실화 변형
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 글리코실화 패턴은 전형적인 포유동물 글리코실화 패턴, 예컨대 CHO 또는 인간 세포주에서의 패턴과 비교할 때 변경될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화되지 않은 폴리펩티드는 숙주 세포 또는 포유동물 세포로서 글리코실화가 결여되도록 조작된 원핵 세포주를 사용하여 제조될 수 있다. 탄수화물 변형은 예를 들어 가용성 폴리펩티드 내 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수도 있다.
추가로 또는 대안적으로, 글리코실화된 폴리펩티드는 변경된 유형의 글리코실화를 갖도록 제조될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 가용성 폴리펩티드를 변경된 글리코실화 기구를 갖는, 즉, 가용성 폴리펩티드의 글리코실화 패턴이 상응하는 야생형 세포에서 관찰되는 글리코실화 패턴과 비교할 때 변경된 숙주 세포에서 발현시켜서 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 가용성 폴리펩티드를 발현시켜서 변경된 글리코실화를 갖는 이러한 가용성 폴리펩티드가 생성되도록 하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴된 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 당단백질은 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주인 Lecl3 세포를 기재하고, 상기 숙주 세포에서 발현된 당단백질에서는 역시 저푸코실화가 일어난다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). 대안적으로, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는, 포유동물-유사 글리코실화 패턴에 대해 조작된 효모, 예를 들어 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 또는 필라멘트형 진균, 예를 들어 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)에서 생성될 수 있다 (예를 들어, EP1297172B1 참조). 당조작된 숙주 세포의 이점은 특히 균일한 글리코실화 패턴 및/또는 더 높은 수율을 갖는 폴리펩티드 조성물을 제공한다는 점이다.
PEG 화 가용성 폴리펩티드 및 기타 접합체
본 발명에서 고려되는 본원에서의 가용성 폴리펩티드의 또 다른 실시양태는 PEG화된다. 예를 들어 SIRPα-유래 폴리펩티드로 본질적으로 이루어진 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 PEG화될 수 있다. PEG화는, PEG화가 없는 동일 생물학적 작용제에 비해 생성된 생물학적 작용제의 생물학적 반감기 (예를 들어, 혈청 반감기)를 증가시키는 공지의 기술이다. 폴리펩티드를 PEG화하기 위해서는, 이러한 폴리펩티드를 전형적으로 1개 이상의 PEG기가 상기 폴리펩티드에 부착되는 조건하에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응으로 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하는데 사용되는 임의의 형태의 PEG를 포함한다. 단백질을 PEG화하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 가용성 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
특히, 생성된 접합체의 약동학 특성을 개선시키기 위해서, 대안적인 접합체 또는 중합체 담체가 사용될 수 있다. 중합체 담체는 적어도 1종의 천연 또는 합성의 분지형, 선형 또는 수지상 중합체를 포함할 수 있다. 중합체 담체는 바람직하게는 물 및 체액 중에 가용성이고, 바람직하게는 제약상 허용되는 중합체이다. 수용성 중합체 잔기는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 예컨대 PEG, PEG 단독중합체, mPEG, 폴리프로필렌글리콜 단독중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체 (여기서, 상기 단독중합체 및 공중합체는 치환되지 않거나, 또는 한쪽 말단에서 예를 들어 아실기로 치환됨); 폴리글리세린 또는 폴리시알산; 탄수화물, 폴리사카라이드, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 예를 들어 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스; 전분 (예를 들어, 히드록시알킬 전분 (HAS), 특히 히드록시에틸 전분 (HES) 및 덱스트린, 및 그의 유도체; 덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어 덱스트란술페이트, 가교된 덱스트린, 및 카르복시메틸 덱스트린; 키토산 (선형 폴리사카라이드), 헤파린 및 헤파린의 단편; 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르; 폴리비닐피롤리돈; 알파,베타-폴리[(2-히드록시에틸)-DL-아스파르트아미드; 및 폴리옥시-에틸화 폴리올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
의약으로서의 가용성 폴리펩티드의 용도
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 동물 모델에서 염증성 장애, 예컨대 알레르기성 천식 또는 염증성 장 질환에 대한 보호를 제공하는 것으로 나타났고, 따라서 의약, 염증성 및/또는 자가면역 반응, 특히, 대상체에서 SIRPα+ 세포에 의해 매개되는 반응을 (통계적으로 또는 생물학적으로 유의한 방식으로) 특히 감소시키거나 저해하기 위한 의약으로 사용될 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 가용성 폴리펩티드 또는 적어도 SIRPα-유래 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 융합 폴리펩티드와 관련된 실시양태에 관한 것이다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예는 서열 26 또는 27을 포함한다.
핵산은 온전한 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수도 있고, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태의 핵산일 수도 있다. 핵산은 표준 기술, 예를 들어 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계 공지의 기타 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 세포의 다른 핵산 또는 단백질로부터 정제된 경우에 "단리"되거나 "실질적으로 순수해진" 상태이다. 문헌 [F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York]을 참조한다. 본 발명의 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있고, 인트론 서열을 함유할 수도 있고 함유하지 않을 수도 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다. 핵산은 벡터, 예컨대 파지 디스플레이 벡터 또는 재조합 플라스미드 벡터에 존재할 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 SIRPα-유래 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편이 일단 수득되면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해서, 예를 들어 발현 시스템에서의 적절한 분비를 위한 임의의 신호 서열, 임의의 정제 태그 및 추가의 정제 단계를 위한 절단가능한 태그를 포함하도록 추가로 조작될 수 있다. 이러한 조작시에, DNA 단편은 또 다른 DNA 분자에 또는 또 다른 단백질, 예컨대 정제/분비 태그 또는 가요성 링커를 코딩하는 단편에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편이 기능적 방식으로, 예를 들어 2개의 DNA 단편에 의해 코딩되는 아미노산 서열이 프레임에 맞게 유지되도록, 또는 상기 단백질이 원하는 프로모터의 제어하에 발현되도록 연결된 것을 의미한다.
SIRP α-유래 폴리펩티드 또는 가용성 폴리펩티드를 생성하는 트랜스펙토마의 생성
당업계에 공지된 바와 같이, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 예를 들어 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생성될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 가용성 폴리펩티드 또는 그의 중간체, 예컨대 SIRPα-유래 폴리펩티드를 발현시키기 위해서, 상응하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어, 관심 폴리펩티드를 발현하는 하이브리도마를 사용한 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)로 수득할 수 있고, 상기 DNA를 상응하는 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이것들의 의도된 기능을 수행하도록 유전자가 벡터 내로 라이게이션된 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용가능한 것을 선택한다. 가용성 폴리펩티드 또는 중간체를 코딩하는 유전자를 표준 방법 (예를 들어, 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 효소 부위의 라이게이션 또는 제한 효소 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)에 의해 발현 벡터로 삽입한다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 폴리펩티드 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 상기 유전자는 신호 펩티드가 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단에 프레임에 맞게 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 SIRPα 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, SIRPα 서열과 천연적으로 결합되어 있지 않은 신호 펩티드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 폴리펩티드 코딩 서열에 추가하여 숙주 세포에서의 유전자 발현을 제어하는 조절 서열을 갖는다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서, 및 폴리펩티드 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 디자인이 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포 내 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비-바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 추가로, 상이한 공급원들로부터의 서열로 이루어진 조절 요소, 예컨대 SRa 프로모터 시스템은 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 장쇄 말단 반복부의 서열을 함유한다 ([Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472]).
이에 추가하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선별가능한 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두가 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 선별가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위함)를 포함한다.
폴리펩티드의 발현을 위해, 가용성 폴리펩티드 또는 중간체, 예컨대 SIRPα-유래 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터(들)을 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함한다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론상 가능하다. 진핵 세포, 특히 포유동물 숙주 세포에서의 당단백질의 발현이 논의되며, 이는 이러한 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 적당하게 폴딩되고 생물학적으로 활성인 당단백질, 예컨대 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 조립하고 분비하는데 있어서 원핵 세포보다 더 적합하기 때문이다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드 및 중간체, 예컨대 SIRPα-유래 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, 문헌 [Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 dhfr- CHO 세포 - 예를 들어 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용됨, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포) 또는 인간 세포주 (예를 들어, PER-C6 세포주, 크루셀(Crucell))을 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 사용하는 경우의 또 다른 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 제시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 가용성 폴리펩티드 또는 중간체, 예컨대 SIRPα-유래 폴리펩티드는, 숙주 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 발현 또는 숙주 세포가 성장하고 있는 배양 배지로의 재조합 폴리펩티드의 분비를 허용하기에 충분한 기간의 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 생성된다. 이후, 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 폴리펩티드를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
다가 단백질
또 다른 측면에서, 본 발명은 CD47에 결합하는 적어도 2개의 동일하거나 상이한 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함하는 다가 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 다가 단백질은 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 적어도 2개, 3개 또는 4개 포함한다. 가용성 CD47-결합 폴리펩티드는 단백질 융합 또는 공유 또는 비-공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 본 발명의 다가 단백질은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 성분 결합 특이체들을 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 다가 단백질의 각 결합 특이체를 별도로 생성시킨 후에 서로 접합시킬 수 있다.
다양한 커플링제 또는 가교제가 공유 접합에 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686], [Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132], [Brennan et al., 1985 Science 229:81-83] 및 [Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것들을 포함한다. 공유 연결부는 2개의 시스테인 사이의 디술피드 브릿지, 예를 들어 Fc 도메인의 시스테인으로부터의 디술피드 브릿지에 의해 형성될 수 있다.
특정 실시양태에서, SIRPα-유래 폴리펩티드에 융합된 Fc 도메인의 힌지 영역은 접합 전에 홀수개, 예를 들어 1개의 술피드릴 잔기를 함유하도록 변형된다. 대안적으로, 2개의 결합 특이체 모두가 동일 벡터에서 코딩되어 동일 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 가용성 폴리펩티드 중 1종 또는 이것들의 조합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함하는 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 임의의 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)])와 혼합하여 수용액제, 동결건조 또는 기타 건조 제제의 형태로 저장되도록 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 적어도 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함하는 동결건조된 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 조합 요법으로, 즉, 다른 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 1종의 다른 항염증제 또는 또 다른 화학요법제와 조합된 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료제의 예는 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 용도에 관한 아래 섹션에서 더 상세하게 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하여야 한다 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함). 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 이러한 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 기타 천연 조건으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
본 발명의 제약 화합물은 1종 이상의 제약상 허용되는 염을 포함할 수 있다. "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고, 임의의 원치않는 독성 효과는 제공하지 않는 염을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등, 및 또한 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리성 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등 및 또한 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 제약상 허용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 항산화제의 예는 다음을 포함한다: 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨 등; 지용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이것들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적당한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액제의 경우에는 필요한 입도의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 상기한 멸균 절차 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 도입 둘다에 의해 확실해질 수 있다. 또한, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사가능한 제약 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 유도될 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 멸균 주사가능한 용액제 또는 분산액제의 즉각투여용(extemporaneous) 제제를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 제약 조성물에서 이것들을 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액제, 마이크로에멀젼제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이것들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액제의 경우에는 필요한 입도의 유지, 및 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 중에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시켜 유도될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액제는 필요량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 기재된 성분들 중 1종 또는 이것들의 조합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후에 멸균 마이크로여과를 수행하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시켜 제조된다. 멸균 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 대상체, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합되는 활성 성분 (100% 기준)의 약 0.01% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30%의 범위일 것이다.
투약법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 정해지는 바에 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여량 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 관한 상세사항은, 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 개체에서의 감수성 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존적이다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 투여하는 경우의 투여량은 숙주 체중 1 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg, 더욱 통상적으로는 0.01 내지 5 mg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중일 수도 있고, 또는 1 내지 10 mg/kg의 범위일 수도 있다. 예시적인 치료법은 1주 1회 투여, 2주 당 1회 투여, 3주 당 1회 투여, 4주 당 1회 투여, 1개월 당 1회 투여, 3개월 당 1회 투여, 또는 3개월 내지 6개월 당 1회 투여를 포함한다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 위한 투약법은 정맥내 투여의 경우에 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 하기하는 투여 스케줄 중 한 가지를 이용하여 제공된다: 6회 투여를 4주마다 실시한 후에 3개월 마다 투여함, 3주마다 투여함, 3 mg/kg 체중으로 1회 투여한 후에 1 mg/kg 체중으로 3주마다 투여함.
가용성 폴리펩티드는 통상적으로 여러 번에 나누어 투여된다. 단일 투여량들 사이의 간격은, 예를 들어 1주일, 1개월, 3개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 가용성 폴리펩티드의 혈중 수준을 측정하여 나타나는 바에 따라 불규칙할 수도 있다. 일부 방법에서의 투여량은 약 1 내지 1000 ㎍/mL, 일부 방법에서는 약 25 내지 300 ㎍/mL의 혈장 폴리펩티드 농도가 달성되도록 조정된다.
대안적으로, 덜 빈번한 투여가 요구되는 경우에는 가용성 폴리펩티드를 지속 방출 제제로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 가용성 폴리펩티드의 반감기에 따라 달라진다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방을 위한 것인지 치료를 위한 것인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방을 위해 적용하는 경우에는 비교적 낮은 투여량이 비교적 빈번하지 않은 간격으로 장기간의 시간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 일생 동안 계속 처치를 받는다. 치료를 위해 적용하는 경우에는 질환의 진행이 저하되거나 종결될 때까지, 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지 비교적 높은 투여량을 비교적 짧은 간격으로 투여하는 것이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방적 요법제를 투여할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 처치 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 처치를 받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 약동학 인자에 따라 달라될 것이다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드의 "치료 유효 투여량"은 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도와 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 활동제한의 예방을 유도할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법 중 하나 이상을 이용하여 하나 이상의 투여 경로로 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드에 대한 투여 경로는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척추 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "비경구 투여"는 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 투여를 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대안적으로, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 비경구가 아닌 경로에 의해, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로, 예를 들어 비내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 투여될 수 있다.
활성 화합물은 예를 들어 제어 방출 제제, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 미세캡슐화 전달 시스템과 같이 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 무침 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 또는 4,596,556에 기재된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 제어된 속도로 약제를 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 약제를 투여하는 치료 장치를 제시하는 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 약제를 전달하는 약물 주입 펌프를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동식 이식가능 주입 기기를 제시하는 미국 특허 번호 4,447,224; 다중 챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투 약물 전달 시스템을 제시하는 미국 특허 번호 4,475,196. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 생체내에서 적당하게 분포되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 확실히 횡단하도록 하기 위해서는, 이것들을 예를 들어 리포좀 내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대해서는 예를 들어 미국 특허 4,522,811, 5,374,548 및 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되어 표적화된 약물 전달을 증진시키는 1개 이상의 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685] 참조). 예시적인 표적화 잔기는 폴레이트 또는 비오틴 (예를 들어, 미국 특허 5,416,016 (Low et al.) 참조); 만노시드 ([Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 ([P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140], [M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 ([Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134]); p120 ([Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090])를 포함하며, 또한 문헌 [K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123], [J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273]을 참조한다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 배양된 세포, 예를 들어 시험관내 또는 생체내 세포에게 투여될 수도 있고, 또는 대상체에게 예를 들어 생체내 투여하여 각종 장애를 치료, 예방 또는 진단할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다.
상기 방법은 SIRPα+ 세포에 의해 매개되는 자가면역 및 염증성 장애, 예를 들어 알레르기성 천식 또는 궤양성 대장염의 치료, 예방 또는 진단에 특히 적합하다. 이것들은 염증성 상태, 알레르기 및 알레르기성 상태, 자가면역 질환, 허혈성 장애, 중증 감염, 및 세포, 장기 또는 조직 이식 거부, 예를 들어 세포, 조직 또는 장기의 이종이식 (즉, 상이한 종으로부터의 이식, 예를 들어 비-인간 종에서 인간으로의 이식)을 포함한다.
자가면역 질환의 예는 관절염 (예를 들어, 류마티스 관절염, 만성 진행성 관절염 및 변형 관절염) 및 류마티스병, 예를 들어 염증성 상태, 및 골 소실을 수반하는 류마티스병, 염증성 통증, 척추관절병증, 예를 들어 강직성 척추염, 라이터 증후군, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 및 장병증성 관절염, 과민증 (예를 들어, 기도 과민증 및 피부 과민증 둘다) 및 알레르기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 자가면역 질환은 자가면역 혈액계 장애 (예를 들어, 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 전신 홍반성 루푸스, 염증성 근육 장애, 다발연골염, 경피증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증근무력증, 건선, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 내분비 눈병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 연소성 당뇨병 (진성 당뇨병 유형 I), 포도막염 (전포도막염 및 후포도막염), 건성 각결막염 및 춘계 각결막염, 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염 및 사구체신염 (신 증후군을 수반하는 것 및 수반하지 않는 것 - 예를 들어, 특발성 신 증후군 또는 미소 변화형 신장병증), 종양, 다발성 경화증, 피부 및 각막의 염증성 질환, 근염, 뼈 이식물의 해리, 대사 장애, 예컨대 아테롬성동맥경화증, 당뇨병 및 이상지혈증을 포함한다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 또한 천식, 기관지염, 진폐증, 폐 기종, 및 기도의 기타 폐쇄성 또는 염증성 질환의 치료, 예방 또는 호전에도 유용하다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 또한 IgE 매개 장애의 치료에도 유용하다. IgE 매개 장애는 많은 통상적인 천연 발생 흡입 및 섭취 항원에 대해 면역학적으로 반응하는 유전적 성향 및 IgE 항체의 지속적인 생성을 특징으로 하는 아토피성 장애를 포함한다. 특정 아토피성 장애는 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 및 알레르기성 위장병증을 포함한다.
그러나, 증가된 IgE 수준과 관련이 있는 장애는 유전적 (아토피) 병인을 갖는 것으로 제한되지 않는다. IgE에 의해 매개된다고 여겨지고 본 발명의 제제로 치료가능한, 증가된 IgE 수준과 관련이 있는 다른 장애는 과민증 (예를 들어, 아나필락시성 과민증), 습진, 두드러기, 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스종, 기생충 질환, 과다-IgE 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 비스코트-알드리치 증후군, 흉선성 림프형성부전증, IgE 골수종 및 이식편-대-숙주 반응을 포함한다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 예를 들어 상기 언급된 질환의 치료 또는 예방을 위해서 단독 활성 성분으로서 투여될 수도 있고, 또는 예를 들어 다른 약물, 예컨대 면역억제제 또는 면역조절제, 또는 기타 항염증제에 대한 보조제로서 함께 투여되거나 그와 조합하여 투여될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 DMARD, 예를 들어 골드(Gold) 염, 술파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 미코페놀산, 시클로스포린 A, 타크롤리무스, 시롤리무스, 미노시클린, 레플루노미드, 글루코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환의 조절제, 예를 들어 FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역-저해 특성을 갖는 아스코마이신, 예를 들어 ABT-281, ASM981 등; 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 그의 면역억제제 동족체, 유사체 또는 유도체; 면역억제성 모노클로날 항체, 예를 들어 백혈구 수용체, 예를 들어 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 그의 리간드에 대한 모노클로날 항체; 기타 면역조절 화합물, 예를 들어 CTLA4 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 그의 돌연변이체를 갖는 재조합 결합 분자, 예를 들어 비-CTLA4 단백질 서열에 연결된 CTLA4의 적어도 세포외 부분 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 CTLA4Ig (예를 들어, ATCC 68629로 지정된 것) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 LEA29Y; 접착 분자 억제제, 예를 들어 LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제; 또는 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀, 겜시타빈, 시스플라티늄, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항-TNF 작용제, 예를 들어 TNF에 대한 모노클로날 항체, 예를 들어 인플릭시맙, 아달리무맙, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구축물, 예를 들어 에타네르셉트(Etanercept), PEG-TNF-RI; 염증전 시토카인의 차단제, IL-1 차단제, 예를 들어 아나킨라(Anakinra) 또는 IL-1 트랩, AAL160, ACZ 885, IL-6 차단제; 케모카인 차단제, 예를 들어 프로테아제, 예컨대 메탈로프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-IL17 항체, NSAID, 예컨대 아스피린 또는 항감염성 작용제 (이것의 목록은 상기 언급된 작용제로 제한되지 않음)와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 또한 특히 폐쇄성 또는 염증성 기도 질환, 예컨대 앞서 언급된 질환의 치료에 있어서 항염증성 또는 기관지확장성 약물 물질과 함께 예를 들어 이러한 약물의 치료 활성 강화제로서 또는 이러한 약물의 필요 투여량을 감소시키거나 이것의 잠재적 부작용을 감소시키기 위한 수단으로서 사용되는 보조치료제로서 유용하다. 본 발명의 작용제는 고정된 제약 조성물에서 항염증성 또는 기관지확장성 약물과 혼합될 수도 있고, 또는 항염증성 또는 기관지확장성 약물의 투여 이전, 이것의 투여와 동시에 또는 이것의 투여 이후에 따로 투여될 수도 있다. 이러한 항염증성 약물은 스테로이드, 특히 글루코코르티코스테로이드, 예컨대 부데소니드, 베클라메타손, 플루티카손 또는 모메타손, 및 도파민 수용체 효능제, 예컨대 카베르골린, 브로모크립틴 또는 로피니롤을 포함한다. 이러한 기관지확장성 약물은 항콜린제 또는 항무스카린제, 특히 이프라트로퓸 브로마이드, 옥시트로퓸 브로마이드 및 티오트로퓸 브로마이드를 포함한다.
본 발명의 작용제와 스테로이드의 조합물은 예를 들어 COPD 또는 특히 천식의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 작용제 및 항콜린제 또는 항무스카린제 또는 도파민 수용체 효능제의 조합물은 예를 들어 천식 또는 특히 COPD의 치료에 사용될 수 있다.
전술한 기재에 따라, 본 발명은 또한 폐쇄성 또는 염증성 기도 질환의 치료가 필요한 대상체, 특히 인간 대상체에게 앞서 기재된 바와 같은 가용성 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 폐쇄성 또는 염증성 기도 질환의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 폐쇄성 또는 염증성 기도 질환의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한, 앞서 기재된 바와 같은 가용성 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 또한 만성 위장 염증, 예컨대 염증성 장 질환, 예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염의 치료, 예방 또는 호전에 특히 유용하다.
"만성 위장 염증"은 비교적 더 오랜 발병 기간을 특징으로 하고 오래 지속되고 (예를 들어, 수일, 수주, 수개월 또는 수년 및 최대로는 대상체의 생애) 단핵 세포의 침윤 또는 유입과 관련이 있는 위장관 점막의 염증을 지칭하고, 자발적인 차도 및 자발적인 발생 기간과 추가로 관련이 있을 수 있다. 따라서, 만성 위장 염증을 갖는 대상체는 오랜 기간의 감독, 관찰 또는 관리가 필요하다고 예상될 수 있다. 이러한 만성 염증을 갖는 "만성 위장 염증성 상태" (또한, "만성 위장 염증성 질환"이라 지칭되기도 함)는 염증성 장 질환 (IBD), 환경적 손상에 의해 유발된 결장염 (예를 들어, 치료 처치, 예컨대 화학요법제의 투여, 방사선 요법 등에 의해 야기되거나 이와 관련이 있는 (예를 들어, 부작용) 위장 염증 (예를 들어, 결장염)), 만성 육아종성 질환과 같은 상태에서의 결장염 ([Schappi et al., Arch Dis Child. 2001 February;1984(2):147-151]), 셀리아크병, 비열대 스프루 (글루텐으로 공지된 단백질의 섭취에 반응하여 내장 내막에 염증이 생기는 유전 질환), 식품 알레르기, 위염, 감염성 위염 또는 소장결장염 (예를 들어, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)-감염된 만성 활성 위염) 및 감염원에 의해 야기된 다른 형태의 위장 염증, 및 기타 유사 상태를 포함하지만 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, "염증성 장 질환" 또는 "IBD"는 장 전체 또는 일부의 염증을 특징으로 하는 임의의 다양한 질환을 지칭한다. 염증성 장 질환의 예는 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서 전반에 걸쳐 IBD에 관한 언급은 종종 본 명세서에서 위장 염증성 상태의 예로서 언급되고, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 기재에 따라, 본 발명은 또한 만성 위장 염증 또는 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 대장염의 치료가 필요한 대상체, 특히 인간 대상체에게 앞서 기재된 바와 같은 가용성 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 만성 위장 염증 또는 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 대장염의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 만성 위장 염증 또는 염증성 장 질환의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한, 앞서 기재된 바와 같은 가용성 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 백혈병 또는 기타 암 장애의 치료, 예방 또는 호전에 유용하다.
또한, 본 발명의 범위에는 치료 유효량의 가용성 폴리펩티드 및 적어도 1종의 제2 약물 물질을 공동 투여하는 것, 예를 들어 동시에 투여하거나 순차적으로 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 제2 약물 물질은 면역억제/면역조절성, 항염증성 화학요법 또는 항감염성 약물, 예를 들어 상기한 바와 같은 것일 수 있는, 상기 정의된 바와 같은 방법이 포함된다.
또는, 치료 유효량의 a) 본 발명의 가용성 폴리펩티드 및 b) 면역억제/면역조절, 항염증성 화학요법 또는 항감염성 약물, 예를 들어 상기한 바와 같은 것들에서 선택된 적어도 1종의 제2 물질을 포함하는 치료 조합물, 예를 들어 키트가 제공된다. 키트는 투여 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드가 다른 면역억제/면역조절, 항염증성 화학요법 또는 항감염성 요법과 함께 투여되는 경우, 공동 투여되는 조합 화합물의 투여량은 사용되는 공동 약물의 유형, 치료할 상태 등에 따라 달라질 것이 당연하다.
한 실시양태에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 CD47+ 수지상 세포의 수준 또는 CD47을 함유하는 세포의 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어 샘플 (예를 들어, 시험관내 샘플) 및 대조군 샘플을, 본 발명의 가용성 폴리펩티드와 CD47 발현 세포 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건하에 상기 가용성 폴리펩티드와 접촉시켜서 달성될 수 있다. 형성된 임의의 복합체를 검출하여 샘플 및 대조군의 경우와 비교한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 사용하여 당업계에 공지된 표준 검출 방법, 예컨대 유동 세포계측 검정을 수행할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 샘플 및 대조군 샘플을, 본 발명의 가용성 폴리펩티드와 CD47 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건하에 상기 가용성 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 중 CD47 (예를 들어, 인간 CD47)의 존재를 검출하거나 CD47의 양을 결정하는 방법을 추가로 제공한다. 이후, 복합체의 형성을 검출하고, 이때 대조군 샘플과 비교하여 이것과 샘플 사이의 복합체 형성의 차이는 샘플 중 CD47의 존재를 나타낸다.
또한, 본 발명의 범위 내에는 본 발명의 조성물 및 사용 지침서로 이루어진 키트가 포함된다. 키트는 1종 이상의 추가의 시약을 추가로 함유할 수 있다. 전형적으로, 키트는 키트 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트상에 또는 키트와 함께 제공되는 임의의 기입물 또는 기록물 또는 기타 방식으로 키트에 수반되는 물질을 포함한다. 키트는 환자가 상기 정의된 바와 같은 처치에 반응할 군에 속하는지 여부를 진단하는 도구를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명이 상세히 기재되긴 하였지만, 하기하는 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적인 것이지 추가의 제한을 의미하는 것이 아니다.
<도면의 간단한 설명>
도 1. 뮤린 SIRPα-Fc는 CD47+/+ (WT) 세포에는 결합하지만 CD47-/- (KO) 세포에는 결합하지 않는다. CD47+/+ (WT) 또는 CD47-/- (KO) 뮤린 비장세포에 대한 뮤린 SIRPα-Fc 결합은 기재된 바와 같이 유동 세포계측으로 검출하였다. SIRPα-Fc 결합 (SIRP)으로 인한 형광을 FL3에 대한 도트 플롯으로 플롯팅하였다.
도 2. 인간 SIRPα-Fc는 CD47+/+ 발현 주캐트(Jurkat) T 세포 (Jin8CD47)에는 결합하지만 CD47 결핍 주캐트 T 세포 (Jin8)에는 결합하지 않는다. SIRPα-Fc 결합은 기재된 바와 같이 유동 세포계측으로 정량화하였다. SIRPα-Fc 결합 (SIRP)으로 인한 형광을 굵은 선의 히스토그램으로 플롯팅하였다. 굵은 선은 10 ㎍/mL 항-CD47 클론 B6H12의 존재하의 결합을 나타낸다.
도 3. 프라이밍시의 CD47/SIRPα 차단이 BALB/c 마우스에서의 알레르기성 질환 발생을 예방한다. (3a) 제0일 및 제5일에 SIRPα-Fc 융합 분자의 존재 또는 부재하에 마우스에게 OVA-감작화를 i.p.로 실시하였고, 제12일, 제16일 및 제20일에는 OVA-에어로졸 시험감염을 실시하고 제21일에 안락사시켰다 (군 당 n = 4 내지 7마리 마우스). (3b) H&E 및 PAS로 염색한, 나이브(naive) (PBS), OVA 면역화, OVA 및 SIRPα-Fc-처치된 마우스의 폐 절편. 데이터는 3개의 개별적으로 분석된 폐를 대표한다. (3c) 차별적인 BALF 세포 수를 유동 세포계측으로 분석하였다. (3d) 제21일에 측정된, OVA-특이적 IgE의 혈청 수준. (3e) OVA를 사용한 시험관내 재자극 3일 후 mLN 세포 배양물의 상등액 중 IL-4, IL-5 및 IL-13 수준. (3f) 제21일에, CD4+ T 세포 및 IL-13 생성 CD4+ T 세포의 백분율(%)을 생체외 단리된 mLN 중에서 유동 세포계측으로 평가하였다. 3회의 실험 중 1개의 대표적인 실험값을 나타냈다. (3g) IL-4, IL-5, IL-13, 및 (h) 폐 추출물 중 에오탁신 방출. 데이터는 평균±SEM이다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
도 4. SIRPα-Fc 처치된 BALB/c 마우스에서의 질환 보호 메카니즘. 제0일 및 제5일에 SIRPα-Fc 융합 분자의 존재 또는 부재하에 마우스에게 OVA-감작화를 실시하였고, 제12일, 제16일 및 제20일에는 OVA-에어로졸 시험감염을 실시하고 제21일에 안락사시켰다. (4a) mLN 중 CD11b저수준CD103+ 및 CD11b고수준CD103- DC (CD11c+에서 게이팅)의 하위집단. 데이터는 DC 하위세트의 백분율(%)로서 나타냈다 (n = 군 당 3마리 내지 4마리 마우스). (4b) BALB/c 마우스에게 i.p. 하루 전에 CFSE-표지된 CD47+/+CD4+ Tg T 세포를 수동 전달시켰다. SIRPα-Fc의 부재 (PBS) 또는 존재하에 OVA-알룸(Alum) 면역화를 실시하고, 2일 후에 mLN 중 CFSE 세포 희석물을 조사하였다. 데이터는 군 당 4마리 마우스에 대해 수행된 하나의 대표적인 실험값이다. (4c) 제21일에, 호산구 (CCR3+)의 절대 수를 생체외 단리된 mLN 중에서 유동 세포계측으로 평가하였다. 데이터는 평균±SEM이다 (n = 군 당 3마리 내지 4마리 마우스).
도 5. SIRPα-Fc 투여에 의한 TNBS-결장염의 보호.
기재된 바와 같이 결장염을 유도하고 평가하였다. 동물 1마리 당 100 ㎍의 뮤린 SIRPα-Fc를 제0일 및 i.p. 24시간 후에 적용하였다. 대안적으로, PBS를 i.p. 주사하였다. 동물의 체중을 TNBS 주사후 제4일까지 평가하였다.
실시예
1. 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 예
하기 표 3은 본원에 개시된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 사용한 재조합 방법에 의해 생성될 수 있는 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 예를 제공한다.
Figure pct00003
2. 친화도 결정
2.1. CD47 에 대한 친화도
단량체성 CD47 또는 2가 CD47-Fc 단백질에 대한 인간 SIRPα-Fc의 친화도는 비아코어에 의해 평가될 수 있다. SIRPα를 갖는 CD47 V-도메인의 1가 상호작용은 약 1 μM인 것으로 보고되었다 ([Heatherley et al., Mol Cell. 2008]).
예를 들어, APP-태그가 부착된 CD47 V 도메인 단백질을 HEK293 세포에서 발현시키고, 리간드로서의 2가-CD47-Fc 단백질과 비교하였다. SIRPα-Fc와의 1가 상호작용은 KD 0.8 μM인 것으로 결정되었고, 2가 CD47-Fc 단백질의 결합 강도 (화합력)는 KD < 60 nM까지 10배 증가하였다. 반대로, 뮤린 CD47-Fc 융합 단백질의 결합은 관찰되지 않았고, 이는 평가된 상호작용의 특이성을 나타낸다.
Figure pct00004
2.2. 뮤린 세포 CD47 에 대한 세포 결합
야생형 또는 CD47 넉아웃 마우스로부터의 5×105개의 CD47+ 및 CD47- 뮤린 비장세포를 200 ㎍/mL 인간 IgG 및 5 ㎍/mL 뮤린 SIRPα-Fc를 함유하는 FACS 완충제 (PBS 2% FCS 2 mM EDTA) 50 ㎕ 중에 30분 동안 4℃에서 재현탁하였다. 세척 후, 세포를 FITC-표지된 스트렙타비딘 (1/1000)으로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 이 결과는, SIRPα-Fc가 CD47+/+ 마우스의 림프구에는 결합하지만 CD47-/- 넉아웃 마우스로부터의 림프구에는 결합하지 않음을 보여준다 (도 1).
2.3. 인간 세포 CD47 에 대한 세포 결합
5×105개의 CD47+ 및 CD47- 주캐트 T 세포주를 200 ㎍/mL 인간 IgG 및 5 ㎍/mL SIRPα-Fc를 함유하는 FACS 완충제 (PBS 2% FCS 2 mM EDTA) 50 ㎕ 중에 30분 동안 4℃에서 재현탁하였다. 세척 후, 세포를 FITC-표지된 스트렙타비딘 (1/1000)으로 30분 동안 4℃에서 염색하였다.
이 결과는, SIRPα-Fc가 CD47+/+ 주캐트 세포 (Jin8CD47)의 림프구에는 결합하지만 CD47을 발현하지 않는 주캐트 세포 (Jin8)의 림프구에는 결합하지 않음을 보여준다 (도 2). 항-CD47 항체 B6H12 사용시의 완벽한 차단으로 나타나는 바와 같이, 세포에 대한 결합은 특이적이었다.
2.4. CHO CD47 세포주에 대한 비오티닐화 SIRP α- Fc 결합의 억제/차단 연구
대안적으로, CHO CD47 세포주에 대한 비오티닐화 SIRPα-Fc 결합의 억제/차단 연구를 상이한 에피토프에 대한 항-CD47 mAb (즉, B6H12, 2D3, BRIC 126, IF7 및 10G2 클론), 상이한 항-인간 SIRPα (CD172a) mAb, 재조합 인간 트롬보스폰딘-1 (TSP-1) 또는 TSP-1 c-말단 (4N1K) 및 대조군 (4NGG) 펩티드를 사용하여 수행할 수 있다.
2.5. CHO CD47 세포주에 대한 직접 표지된 항- CD47 mAb 결합의 차단/억제 연구
상보적인 접근법으로서, CHO CD47 세포주에 대한 직접 표지된 항-CD47 mAb 결합의 차단/억제 연구를 비오티닐화되지 않은 인간 SIRPα-Fc를 사용하여 수행할 수 있다.
SIRPα-Fc를 사용한 인간 SIRPα-Fc로 형질감염된 L 세포에 대한 비오티닐화 CD47-Fc 결합의 억제/차단 연구도 평가할 수 있다.
3. SIRPα- Fc 기능적 검정
3.1. 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정
말초혈 단핵구 (CD14+ CD16-) 및 또한 단핵구-유래 수지상 세포 (DC)를 문헌 [Latour et al., J of Immunol, 2001: 167:2547]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 통상적으로, DC는 알로피코시아닌 (APC)-표지된 항-CD11c (B-ly6), 계통 마커, CD3, CD14, CD15, CD16, CD19 및 CD56에 대한 FITC-표지된 mAb의 혼합물, 및 APC-Cy7-표지된 CD4 (RPA-T4) (> 99% 순도)를 사용하여 FACS Aria (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))로 CD11c+, 계통-로서 단리하였다. APC를 1/40,000의 스타필로코쿠스 아우레우스 코완 1 (판소르빈) 또는 가용성 CD40L (1 ㎍/mL) 및 IFN-γ (500 U/mL)를 사용하여 HB101 혈청 무함유 배지 중 다양한 농도의 인간 SIRPα-Fc (1 내지 20 ㎍/mL)의 존재하에 자극하였다. 시토카인 (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-23, IL-8 및 TNF-α) 방출을 24시간 또는 48시간 배양 상등액에서 ELISA로 평가하였다.
3.2. 혼합 림프구 반응 ( MLR ) 검정
미토마이신 c-처치된 성숙 DC (SAC 또는 LPS 자극)를 동종이계의 미분획화 나이브 (CD45RA+ CD62L고수준) 또는 기억 (CD45RO+ CD62L저수준) 성숙 CD4+ T 세포 (106/mL)와 함께 다양한 자극자 (DC)/반응자 (T 세포) 비율에서 본 발명의 가용성 폴리펩티드 (5 내지 50 ㎍/mL)의 존재 또는 부재하에 공동 배양하였다. T 세포 증식 (3H 티미딘 흡수) 및 IFN-γ 방출을 5일 내지 6일 초대 배양물의 배양 상등액에서 평가하였다.
4. 천식 치료시 SIRP α- Fc 의 사용에 관한 뮤린 동물 모델을 사용한 생체내 데이터
제0일 및 제5일에 1 mg 임젝트 알룸(Imject Alum) (피어스(Pierce))에 흡착시킨 10 ㎍ OVA (시그마(Sigma), 등급 V)의 i.p. 주사로 BALB/c 마우스를 감작화시켰다. 제12일, 제16일 및 제20일에, 마우스를 진동형 메쉬 연무기 시스템 (옴론(Omron))으로 전달되는 0.5% OVA 에어로졸 (시그마, 등급 V)로 30분 동안 시험감염시켰다. 마지막 시험감염으로부터 24시간이 지난 후, 마우스를 75 mg/kg 나트륨 펜토바르비탈 과다투여로 희생시키고 채혈하였다. BAL을 0.5 mL 생리적 염수로 3회 수집하고, 폐 및 mLN을 단리하였다. 폐의 1/3을 항생제가 보충된 PBS로 헹구고, 작은 조각으로 잘라서 평평 바닥 24웰 플레이트에서 24시간 동안 10% 태아 소 혈청, 500 U/mL 페니실린, 500 ㎍/mL 스트렙토마이신, 10 mM HEPES 완충제 및 1 mM 2-ME가 보충된 1 mL RPMI1640 (위센트 인크.(Wisent Inc.)) 중에 배양하였다. mLN 세포 (4×106개 세포/mL)를 평평 바닥 96웰 플레이트에서 배양하고, OVA (100 μ/mL)로 72시간 동안 다시 자극하였다. 전체 BAL 세포를 세척하여 계수하고, 항-CCR3 PE (알앤디 시스템즈(R&D systems)), 항-CD3 FITC (클론 145-2C11) 및 항-B220 FITC (알앤디 시스템즈)로 30분 동안 염색하였다. 문헌 [Van Rijt L.S. et al. (Immunol Methods. 2004 May;288(1-2):111-21)]에 기재된 바와 같이, 과립구는 과립형의 비-자가형광이고 CD3 및 B220을 발현하지 않는 것으로 밝혀졌다. 호산구는 CCR3 발현에 의해 호중구와 구별된다. 림프구는 작고 비-과립형이며 비-자가형광이고 CD3 또는 B220을 발현하며, 대식세포 및 DC를 비롯한 다른 단핵 세포에는 CD3, B220 및 CCR3이 없다. DC 하위세트를 확인하기 위해서, mLN 및 폐를 우선 리버라제로 처리하고 잘게 썰어 세포를 계수하였다. 폐 세포 현탁액을 NH4Cl로 처리하여 적혈구를 용해시키고 세척한 후에 염색하였다. 세포를 항-CD11c FITC (비디 바이오사이언시즈) 또는 항-CD11c APC (클론 N418), 항-CD11b PE (칼타그(Caltag)), 항-I-Ad/I-Ed PE (비디 바이오사이언시즈), 항-GR1, 항-B220 FITC (알앤디 시스템즈), 120G8 FITC 및 항-CD103-비오티닐화 이후 SA-APC 또는 CD103 PE (비디 바이오사이언시즈) 항-CD47 및 항-SIRPα mAb로 염색하였다. 폐에서, 자가형광 폐포 대식세포를 분석 게이트에서 제외시켰다. 조절 T 세포를 확인하기 위해서, 항-CD4 FITC 또는 APC (비디 바이오사이언시즈), 항-CD25 PE (칼타그) 또는 FITC (비디 바이오사이언시즈), 항-CD44 APC (클론 IM7 8.1)를 사용하였다. 생체외 IL-13 생성을 측정하기 위해서, 비만 세포 및 호염기구를 우선 세포외 항-IgE-비오티닐화 및 항-CD117 (c-키트, 바이오레전드(BioLegend))로 확인하고 CD4 T 세포를 항-CD4 APC로 염색하였다. 세포를 고정시키고 투과화하여 항-IL-13 PE (이바이오사이언스(eBioscience))로 염색하였다. 세포를 우선 세포외 마커 (항-CD4 APC 및 항-CD25 FITC)에 대해 염색하고 고정시켜 투과화하고 항-FoxP3 PE (이바이오사이언스의 키트)로 염색하였다. 비만 세포 및 호염기구 + 세포질내 IL-13 염색. 모든 데이터는 FACSCalibur 또는 CantoII 유동 세포계측기 (비디 바이오사이언시즈)에서 획득하였고, 셀퀘스트(Cellquest) 또는 DIVA 소프트웨어 (비디 바이오사이언시즈)로 분석하였다.
시토카인 측정
IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ (비디 바이오사이언시즈), IL-13 (알앤디 시스템즈)을 mLN 배양 상등액 및 폐 추출물에서 ELISA로 측정하였다.
OVA-감작화되고 시험감염된 마우스로부터의 종격 LN 세포를 3일 동안 OVA 단백질 (1 mg/mL)로 시험관내 재자극하고, IL-4, IL-5 및 IL-13 생성을 배양 상등액 중에서 ELISA로 정량화하였다. 폐 추출물을 완전 배지 중에서 밤새 배양하고, 배양 상등액을 수집하여 시토카인 방출을 측정하였다.
결과
알레르기성 천식 치료시 SIRP α- Fc 의 사용에 관한 뮤린 동물 모델을 사용한 생체내 데이터
CD47 및 SIRPα는 SIRPα+CD103- DC-구동된 Th2 면역성의 개시 및 영구화에 있어서 중요한 분자라고 여겨진다. 따라서, 이것들은 폐 염증을 감소시키고 기도 질환을 호전시키기 위해서 치료적으로 이용될 수 있다. 본 발명자들은 본원에서 SIRPα 및 인간 IgG1의 Fc 영역 (SIRPα-Fc)이 알레르기성 기도 염증의 발생에 미치는 효능을 평가하였다. OVA 면역화 제0일 및 제5일에 SIRPα-Fc를 투여한 BALB/c 마우스 (도 3a)에는 OVA 에어로졸 시험감염 후에 폐 조직의 염증성 세포 침윤이 거의 없거나 전혀 없었다 (도 3b). BALF 중 호산구, 호중구 및 림프구의 큰 감소 또는 부재 (도 3c)는, 혈청 OVA-특이적 IgE의 감소 (도 3d), 림프절 세포충실성의 50% 감소 및 mLN 중 IL-4, IL-5 및 IL-13 생성의 급격한 억제 (도 3e 및 3f)와 함께 발생하였다. 기도 질환 발생으로부터의 보호는 IL-10 또는 IFN-γ 방출 어느 것의 증가와도 상관관계가 없었고, 이것은 사실 또한 처치를 받은 마우스에서 저해되었다 (데이터는 제시되지 않음). 다음으로, 본 발명자들은 CD47- 및 SIRPα-Fc-처치된 마우스의 폐 추출물 배양 상등액 중 시토카인 및 케모카인 방출을 조사하였고, IL-5, IL-13 및 에오탁신 방출은 억제된 반면에 IL-4 발현은 변하지 않았음을 알아냈다 (도 3g 및 3h).
다음으로, 본 발명자들은 이러한 억제를 일으키고 기도 질환으로부터의 보호를 달성하는 잠재적 메카니즘을 조사하였다. 본 발명자들은 CD47-Fc-처치된 마우스의 mLN 중 SIRPα+CD103- DC의 축적 감소를 알아냈다 (도 4a). SIRPα-Fc의 투여는 또한 CD47-Fc를 처치한 OVA-면역화 마우스의 mLN 중 CFSE-표지된 Tg T 세포의 비율 감소를 유도하였다 (도 4b). 마지막으로, 본 발명자들은 SIRPα-Fc-처치된 마우스의 mLN 중 호산구의 비율 및 축적의 감소를 관찰하였다 (도 4c).
이러한 데이터는 1차 Ag 감작화시의 CD47/SIRPα 차단이 mLN 및 폐의 유형 2 반응 및 또한 IgE-의존적 기도 염증을 크게 감소시켰음을 입증한다.
5. 결장염 치료시 SIRP α- Fc 의 사용에 관한 뮤린 동물 모델을 사용한 생체내 데이터
트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) (2 또는 3 mg)을 50% 에탄올 중에 용해하고, 수컷 Balb/c 마우스 (WT 및 CD47 KO)의 결장으로 3.5F 카테터를 통해 점적주입하였다. 대조군 마우스에게는 에탄올을 단독으로 제공하였다. 마우스를 24시간마다 칭량하고, 제2일 (초기 시점) 또는 제4일에 희생시켰다. 만성 TNBS 결장염 모델에서, TNBS 1.5 mg을 제0일에 직장내 점적주입하고 제7일에 다시 직장내 점적주입하고, 마우스를 제12일에 희생시켰다. 혈청, 장간막 림프절 및 결장을 추가의 분석을 위해 수확하였다. 결장을 설사, 접착, 장벽의 비후화(thickening) 및 궤양화의 존재를 고려한 월리스(Wallace) 기준을 이용하여 거시적으로 스코어링하였다. 이것을 또한 점막하조직의 비후화, 점막하조직 및 고유판의 단핵 세포 침윤, 점액 고갈, 크립트(crypt) 구조의 손실 및 부종을 기초로 하는 스코어링 시스템인 아메호(Ameho) 기준을 이용하여 염증의 현미경적 마커에 대해 평가하였다 (나타내지 않음). 재조합 마우스 SIRPα-Fc 융합 단백질을 TNBS 결장염 유도 직전 및 이후 24시간 후에 복강내 투여하였다 (100 ㎍/마우스). 대조군 마우스에게는 염수를 단독으로 제공하였다. 제0일, TNBS 유도 30분 전 및 제1일의 뮤린 SIRPα-Fc 100 ㎍/동물 주사는 체중 손실로 평가되는 바와 같이 질환 발생을 통계적으로 유의하게 차단하였다.
6. 관절염 치료시 SIRP α- Fc 의 사용에 대한 생체내 뮤린 동물 모델
콜라겐 유도된 관절염 모델:
미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 프로인트(Freund's) 완전 아주반트와 혼합하고 철저하게 진탕시켰다 (= 용액 A). 소 콜라겐 용액 분취액을 빙상에서 멸균 PBS와 충분히 혼합하였다 (= 용액 B). 용액 A 및 용액 B를 나이브 수컷 DBA/1 마우스에게 에멀젼제로서 주사하였다. 상기 마우스를 케타민의 멸균 여과된 혼합물의 s.c. 주사로 마취시켰다. 혼수상태가 되었을 때, 각 마우스 꼬리의 뿌리 부분을 면도한 후에 마우스 1마리 당 콜라겐-에멀젼 0.1 mL (콜라겐 100 ㎍을 함유함)를 꼬리 아래쪽에 i.d. 주사하였다. 콜라겐/PBS (1:5 희석물) 100 ㎕의 2차 주사를 제1 면역화 후 제22일에 i.p. 제공하였다 (= 부스팅). 부종 및 질환 스코어링을 문헌 [Nat Protoc. 2007;2(5):1269-75 (Brand et al.)]에 기재된 바와 같이 하여 평가하였다.
7. 본 발명의 실시에 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
Figure pct00005
Figure pct00006

SEQUENCE LISTING <110> Novartis Novartis AG <120> Soluble Polypeptide <130> 53202A <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly 20 25 30 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala 115 <210> 3 <211> 343 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 180 185 190 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 210 215 220 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val 260 265 270 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 275 280 285 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 290 295 300 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 305 310 315 320 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 325 330 335 Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr 340 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala 115 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala 115 <210> 6 <211> 343 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala 115 120 125 Arg Ala Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly 130 135 140 Phe Ser Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 145 150 155 160 Leu Ser Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser 165 170 175 Tyr Ser Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val 180 185 190 His Ser Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp 195 200 205 Pro Leu Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro 210 215 220 Thr Leu Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr 245 250 255 Trp Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Leu 260 265 270 Thr Glu Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val 275 280 285 Asn Val Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu 290 295 300 His Asp Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser 305 310 315 320 Ala His Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly 325 330 335 Ser Asn Glu Arg Asn Ile Tyr 340 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 13 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 14 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 130 135 140 Arg Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 145 150 155 160 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 165 170 175 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 180 185 190 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 195 200 205 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 210 215 220 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 225 230 235 240 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 245 250 255 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 260 265 270 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 275 280 285 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 290 295 300 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 325 330 335 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 340 345 350 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 355 360 <210> 15 <211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu 20 25 30 Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly 35 40 45 Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly 50 55 60 Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu 85 90 95 Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr 100 105 110 Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser 115 120 125 Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val 130 135 140 Arg Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 145 150 155 160 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 165 170 175 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 180 185 190 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 195 200 205 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 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115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220 Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240 Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255 Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270 Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285 Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300 Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met 305 310 315 320 Asn Asp Glu <210> 25 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 60 gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt 90 <210> 26 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 60 gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120 ggagctggac caggccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180 acaactgttt cagacctcac aaagagaaac aacatggact tttccatccg catcggtaac 240 atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat 300 gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgcgcc 348 <210> 27 <211> 1029 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 60 gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120 ggagctggac caggccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180 acaactgttt cagacctcac aaagagaaac aacatggact tttccatccg catcggtaac 240 atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat 300 gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc 360 cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc acacctcagc acacagtgag cttcacctgc 420 gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag 480 ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac 540 agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg 600 gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc 660 cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat 720 gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc cagagactac agctgacctg gttggagaat 780 ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca accgttacag agaacaagga tggtacctac 840 aactggatga gctggctcct ggtgaatgta tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc 900 tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca 960 gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc gccgctgaga acactggatc taatgaacgg 1020 aacatctat 1029 <210> 28 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagtca 60 gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120 ggagctggac caggccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180 acaactgttt cagacctcac aaagagaaac aacatggact tttccatccg catcggtaac 240 atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat 300 gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgcgcc 348 <210> 29 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 60 gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120 ggagctggac caggccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180 acaactgttt cagagctcac aaagagaaac aacatggact tttccatccg catcggtaac 240 atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat 300 gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact gagctgtctg tgcgcgcc 348 <210> 30 <211> 1029 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 60 gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120 ggagctggac caggccggga attaatctac 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acactggatc taatgaacgg 1020 aacatctat 1029

Claims (16)

  1. a) SIRPα의 세포외 도메인 (서열 3),
    b) 서열 3의 단편, 및
    c) 서열 2에 적어도 75% 동일성을 갖는 서열 3의 변이체 폴리펩티드
    로 이루어진 군 중에서 선택된 SIRPα-유래 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드는 인간 CD47 (서열 24)에 결합하는, 의약으로 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 2 μM 이하의 KD로 인간 CD47에 결합하고 면역 복합체-자극된 수지상 세포 시토카인 방출 검정으로 측정시에 유도된 시토카인 분비를 억제하는 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 SIRPα-유래 폴리펩티드가 IgG Fc 단편에 융합된 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG Fc 단편이 글리코실화되지 않은 돌연변이체 Fc 단편인 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, SIRPα의 상기 세포외 도메인이 SIRPα의 적어도 V-영역 (서열 2)을 포함하는 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 자가면역 및 염증성 장애의 치료시에 약물로서 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) Th2-매개 기도 염증,
    b) 알레르기성 장애,
    c) 천식,
    d) 염증성 장 질환,
    e) 관절염,
    f) 허혈성 장애, 또는
    g) 백혈병 또는 암
    의 치료시에 약물로서 사용하기 위한 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG의 Fc 단편에 융합된 SIRPα의 세포외 도메인으로 본질적으로 이루어진 가용성 CD47 결합 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 2종 이상의 가용성 CD47 결합 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 가용성 CD47 결합 폴리펩티드 또는 제9항에 따른 단백질을 포함하는 제약 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합된 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 가용성 CD47 결합 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산.
  13. 제12항에 따른 1종 이상의 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 서열 25 또는 26의 1종 이상의 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  15. 제13항 또는 제14항에 따른 1종 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포인 숙주 세포.
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