MX2011006621A

MX2011006621A - Polipeptidos solubles para uso en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios.

Info

Publication number: MX2011006621A
Application number: MX2011006621A
Authority: MX
Inventors: Maximilian Woisetschlaeger; Marianne Raymond; Marie Sarfati; Karl Welzenbach
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-07-12
Also published as: KR20110112299A; WO2010070047A1; AU2009327058A1; US20110237498A1; EP2379584A1; CA2747678A1; JP2012512640A; BRPI0923442A2; EA201100947A1; CN102257001A

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos de unión a CD47 solubles, para su uso como un medicamento, en particular para la prevención o tratamiento de trastornos autoinmunes o inflamatorios, por ejemplo asma alérgico y enfermedades inflamatorias del intestino La invención se refiere de manera más especifica a un polipéptido de unión a CD47 soluble para su uso como un medicamento que comprende un dominio extracelular de SIRPa (CD172a) o derivados funcionales los cuales se unen a CD47 de humano.

Description

POLIPÉPTIDOS SOLUBLES PARA USO EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS AUTOINMUNES E INFLAMATORIOS La presente invención se refiere a polipéptidos de unión a CD47 solubles, para uso como un medicamento, en particular para la prevención o tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios, por ejemplo asma alérgica y enfermedades inflamatorias del intestino. La invención de manera más específica se refiere a un polipéptido de unión a CD47 soluble para uso como un medicamento, que comprende un dominio extracelular de SIRPa (CD172a) o derivados funcionales que se unan a CD47 de humano.

CD47 es una glucoproteína de superficie celular que se une a SIRPa (alias SHPS-1) y SIRPy en células opositoras. Esta interacción conduce a la regulación negativa de la función celular inmune o puede servir para mediar la adhesión y migración celular. CD47 fue sugerido para uso como un producto biológico en el tratamiento de trastornos autoinmunes (W01999/040940). En contraste, existe muy poca evidencia de un uso potencial de los ligandos de CD47, tales como SIRPa para propósitos terapéuticos similares. Una explicación es la expresión ubicua de CD47 que podría evitar utilizar polipéptidos para unión a CD47 como fármacos potenciales. Los datos mostrados por Yu et al 2006 (J Invest Dermatol, 126, 797-807) sugieren que una proteína de fusión elaborada a partir de los dominios extracelulares de SIRPa fusionados a un dominio Fe de inmunoglobulina puede evitar la migración de células dendríticas obtenidas de la piel (DCs) hacia los nodos linfáticos de drenado en ratones y de esta manera atenuar (por lo menos parcialmente) la respuesta de hipersensibilidad por contacto en ratones. La migración y función de las DCs es esencial para respuestas inmunes o inflamatorias. Bajo condiciones patológicas estas respuestas exacerbadas de las DCs pueden conducir a la perpetuación de la enfermedad. Interferir con la migración de las DCs patógenas desde tejido hacia órganos linfoides podría ser una oportunidad atractiva para detener el ciclo vicioso que lleva a enfermedades autoinmunes o auto-inflamatorias. La presente invención provee por primera vez evidencia in vivo que la construcción SIRPa-Fc es apropiada para prevenir o detener enfermedades impulsadas por Th1/Th17 y Th2 en modelos animales de enfermedad. Estos datos proveen las bases para esta invención y apoyan el carácter de fármaco de agentes terapéuticos proteínicos derivados de SIRPa. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la manipulación de la ruta de CD47/SIRPa suprime la patogénesis impulsada por células dendríticas CD103" inmunógenas de Th1 /Th17-(artritis y colitis) así como de enfermedades impulsadas por Th2 (asma alérgica). Estos nuevos descubrimientos ofrecen mecanismos comunes previamente desconocidos sobre las causas subyacentes de la enfermedad y representan perspectivas terapéuticas para trastornos autoinmunes e inflamatorios múltiples. Además, la evidencia reciente en reportes publicados indica que la ligación de CD47 podría ser benéfica para el tratamiento de varios cánceres (Majeti et al Cell 2009). Aunque los reportes indican el uso de anticuerpos de CD47, la invención en este caso se refiere al uso de polipéptidos derivados de SIRPa para tratamiento de dichas enfermedades.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención provee polipéptidos para unión a CD47 solubles, para uso como un medicamento, que comprende polipéptidos derivados de SIRPa que se seleccionan de entre el grupo que consiste de a) un dominio extracelular de SIRPa (SEQ ID NO: 3); b) un fragmento de SEQ ID NO: 1, y, c) un polipéptido variante de SEQ ID NO: 1 que tiene por lo menos 75% de identidad con SEQ ID NO: 3; en donde dicho polipéptido derivado de SIRPa se une a CD47 de humano (SEQ ID NO: 24). En algunas modalidades, el polipéptido variante de SEQ ID NO: 3 es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idéntico a SEQ ID NO: 3.

Para facilidad de lectura, los polipéptidos de unión a CD47 solubles de conformidad con la presente invención son designados de aquí en adelante en la presente solicitud como los "Polipéptidos Solubles de la Invención".

En una modalidad, dicho polipéptido derivado de SIRPa se selecciona de entre antagonista de CD47, es decir, un polipéptido que inhibe en forma competitiva la unión de un ligando de CD47 a CD47. Los ligandos de CD47 incluyen, sin limitación, SIRPa, SIRy o TSP1.

En otra modalidad, dicho polipéptido derivado de SIRPa se selecciona de entre agonista de CD47, es decir, un polipéptido que pueda inducir la actividad de señalización de CD47.

En una modalidad, dicho polipéptido de unión a CD47 soluble se selecciona de entre aquellos que se unen a CD47 de humano con una KD de 2 µ? o menor y/o inhibe la secreción de citocina inducida según se mide en una prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune.

En otra modalidad, dicho polipéptido derivado de SIRPa es un dominio extracelular de SIRPa que comprende por lo menos la región V de SIRPa (SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, el Polipéptido Soluble de la Invención es un polipéptido de fusión que comprende un primer componente que consiste de un polipéptido derivado de SIRPa fusionado a un segundo polipéptido heterólogo. En una modalidad, el Polipéptido Soluble también comprende un espaciador entre el segundo polipéptido heterólogo y el polipéptido derivado de SIRPa. En una modalidad específica, el polipéptido derivado de SIRPa está fusionado a un dominio Fe de IgG. En una modalidad preferida, dicho dominio Fe es un fragmento Fe silencioso del isotipo lgG1 de humano. En una modalidad, dicho dominio Fe es una variante muíante aglucosilada del isotipo I g G 1 de humano.

En otra modalidad relacionada, los Polipéptidos Solubles de la Invención se utilizan como fármacos en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios. Las indicaciones preferidas se seleccionan de entre el grupo que consiste de inflamación de vías respiratorias mediadas por Th2, trastornos alérgicos , asma , enfermedades inflamatorias del intestino y trastornos isquémicos . Además, los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden utiliza r como fármacos en el tratamiento de leucemias o cáncer.

Con el fin de que la presente invención se pueda entender más fácilmente , primero se definen alg u nos términos. Las definiciones adicionales se indican a través de toda la descripción detallada .

El término C D47 se refiere a C D47 de humano . CD47 de humano incluye SEQ I D NO : 24 pero también cualquier polimórfico natural, por ejemplo, que comprenda polimorfismos de nucleótido ind ividual (S N Ps por sus siglas en inglés) , o variantes de empalme de CD47 de h u mano. Los ejemplos de variantes de empalme o SN Ps en la secuencia de n ucleótido de CD47 encontrados en h umanos se describen en la Tabla 1 .

TABLA 1 Variantes de la proteína CD47 Tipo de variante ID de variante Descripción Variante de empalme NP_001768.1 referencia; variante más larga; secuencia NO:2 NP_942088.1 diferente, extremo C terminal más corto NP_001020250.1 diferente, extremo C terminal más corto ENSP00000381308 diferente, extremo C terminal más corto TABLA 1 (cont.) El término SIRPa se refiere a la Proteína Alfa Reguladora de Señal (también denominada CD172a o SHPS-1) la cual muestra adhesión a la proteína asociada a integrina CD47. En alguna modalidad, el término SIRPa se refiere a SIRPa de humano como se define en SEQ ID NO: 23. SIRPa de humano contiene un dominio extracelular de aminoácidos (SEQ ID NO: 3), con un dominio tipo V (SEQ ID NO: 2), y dos dominios de Ig tipo C1 y tres sitios potenciales de N-glucosilación. Esta tiene una secuencia citoplasmática de 110 aminoácidos con motivos ITIM que recluían las tirosina fosfatases SHP-1 y SHP-2 cuando se fosforila. El término SIRPa de humano también incluye, sin limitación, cualquier polimórfico natural, por ejemplo, que comprenda polimorfismos de nucleótido individual (SNPs), o variantes de empalme de SIRPa de humano. Los ejemplos de variantes de empalme o SNP en la secuencia de nucleótido de SIRPa encontrados en humanos se describen en la Tabla 2.

TABLA 2 Variantes de la proteína SIRPa Tipo de ID de variante Descripción variante Variante de NP_542970.1 referencia; variante corta; empalme secuencia NO:2 variante larga, inserción de cuatro ENSP00000382941 aminoácidos cercanos al extremo C terminal Polimorfismo rs17855609 ADN: A o T; proteína: T o S posición de 50 de NP_542970.1) nucleótido individual rs17855610 ADN: C o T; proteína: T o I posición 52 de NP_542970.1) rs17855611 ADN: G o A; proteína: R o H (posición 54 de NP_542970.1) rs17855612 ADN: C o T; proteína: A 0 V (posición 57 de NP_542970.1) rs1057114 ADN: G o C; proteína: G o A (posición 75 de NP_542970.1) rs1z35200 ADN: C o G; proteína: D 0 E (posición 95 de NP_542970.1) rs17855613 ADN: A o G; proteína: N o D (posición 100 de NP_542970 • 1) rs17855614 ADN: C o A; proteína: N o K (posición 100 de NP_542970 ¦1) rs17855615 ADN: C o A; proteína: R o S (posición 107 de NP_542970 ¦1) rs1135202 ADN: G o A; proteína: G o S (posición 109 de NP_542970 ¦ 1) rs17855616 ADN: G o A; proteína: G o S (posición 109 de NP_542970 1) rs2422666 ADN: G o C; proteína: V o L (posición 302 de NP_542970•1) rs12624995 ADN: T o G; proteína: V o G (posición 379 de NP_542970 1) rs41278990 ADN: C o T; proteína: P o S (posición 482 de NP_542970 ¦1) Tal como se utiliza en la presente solicitud, un polipéptido es "soluble" cuando éste carece de cualquier dominio de transmembrana o dominio de proteína que ancle o integre el polipéptido en la membrana de una célula que expresa a dicho polipéptido. En particular, los Polipéptidos Solubles de la Invención pueden, de igual manera, excluir dominios transmembrana e intracelulares de SIRPa.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, un polipéptido que "se une a CD47" pretende hacer referencia a un polipéptido que se une a CD47 de humano con una KD de una 20 µ? o menor, 2 µ? o menor, 0.2 µ? o menor. En alguna modalidad, un polipéptido que se une a CD47 también se une a la proteína tensoactiva A (SP-A) y/o la proteína tensoactiva D (SP-D).

Tal como se utiliza en la presente solicitud, un polipéptido que inhibe la secreción de citocina inducida según se mide en una prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune es un polipéptido que inhibe la liberación de citocina (por ejemplo, IL-6, IL- 0, IL-12p70, IL-23, IL-8 y/o TNF-a) a partir de monocitos de sangre periférica, células dendríticas convencionales (DCs) así como DCs derivadas de monocito estimuladas con Cowan 1 de Staphylococcus aureus (Pansorbin) o CD40L e IFN-?. Un ejemplo de una prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune se describe con mayor detalle en los ejemplos más adelante. En algunas modalidades, los Polipéptidos Solubles de la Invención inhiben la secreción de citocina según se mide en una prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune a una Cl50 de 1 µ? o menos, 100 nM o menos, o 10 nM o menos.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, un polipéptido que inhibe la proliferación de célula T se puede medir en una prueba de reacción de linfocito mixta como se describe en el Ejemplo.

El término "Kas0c" o "Ka", tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la velocidad de asociación de una interacción proteína-proteína particular, mientras que el término "Kdis" o "Kd", tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la velocidad de disociación de una interacción proteína-proteína particular. El término KD, tal como se utiliza en la presente solicitud, pretende hacer referencia a la constante de disociación, la cual se obtiene a partir de la relación de Kd a Ka (es decir Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para la interacción proteína-proteína se pueden determinar utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la KD de una interacción proteína/proteína es mediante el uso de resonancia de plasmón de superficie, o utilizando un sistema de biosensor tal como el sistema Biacore®.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de la interacción entre el polipéptido y su objetivo en un sitio individual. Dentro de cada sitio, la región de unión del polipéptido ínteractúa a través de fuerzas no covalentes débiles con su objetivo en sitios numerosos; mientras más interacciones, más fuerte es la afinidad.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "alta afinidad" para un polipéptido de unión se refiere a un polipéptido que tiene una KD de 10 nM o menos, por ejemplo, 1 nM o menos, para su objetivo.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "individuo" incluye cualquier animal humano o no humano.

El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, borregos, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "optimizado(a)" significa que una secuencia de nucleotido ha sido alterada para que codifique para una secuencia de aminoácidos utilizando codones que son preferidos en la célula u organismo de producción, ya sea una célula eucariota, por ejemplo, una célula de Pichia o Saccharomyces, una célula de Trichoderma, una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) o una célula de humano, o una célula procariota, por ejemplo una cepa de Escherichia coli.

La secuencia de nucleotido optimizada está diseñada para conservar completamente o tanto como sea posible la secuencia de aminoácido originalmente codificada por la secuencia de nucleotido de partida, la cual también es conocida como la secuencia "progenitora". Las secuencias optimizadas en la presente solicitud han sido diseñadas para que tengan codones que son preferidos en la célula u organismo de producción correspondiente, por ejemplo una célula de mamífero, sin embargo también se contempla en la presente solicitud la expresión optimizada de dichas secuencias en otras células procariotas o eucariotas. Las secuencias de aminoácido codificadas por secuencias de nucleotido optimizadas también son referidas como optimizadas.

Varios aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones.

Las pruebas para evaluar los efectos de los Polipéptidos Solubles de la Invención sobre las propiedades funcionales de CD47 se describen con mayor detalle en los Ejemplos.

Polipéptidos derivados de SIRPa Los Polipéptidos Solubles de la Invención comprenden polipéptidos derivados de SIRPa que se seleccionan de entre el grupo que consiste de a) un dominio extraceiular de SIRPa (SEQ ID NO: 3); b) un fragmento de SEQ ID NO: 3, y, c) un polipéptido variante de SEQ ID NO: 3; en donde dicho polipéptido derivado de SIRPa se une a CD47 de humano (SEQ ID NO: 24).

Los Polipéptidos Solubles de la Invención y sus fragmentos derivados de SIRPa deben conservar la capacidad de unirse a CD47. Por lo tanto, los fragmentos de SEQ ID NO: 3 se pueden seleccionar de entre aquellos fragmentos que comprenden el dominio de unión a CD47 de SIRPa. Dichos fragmentos por lo general no comprenden los dominios de transmembrana e intracelular de SIRPa. En modalidades ilustrativas no limitativas, el polipéptido derivado de SIRPa consiste esencialmente de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos derivados de SIRPa también incluyen, sin limitación, polipéptidos variantes de SEQ ID NO: 3 en los cuales se han mutado residuos de aminoácidos mediante deleción, inserción o sustitución de aminoácido, y no obstante tienen por lo menos 60, 70, 80, 90 o 95 por ciento de identidad con SEQ ID NO: 3; en tanto que los cambios a la secuencia original no afecten sustancialmente la actividad biológica de la molécula, en particular su unión a CD47. En algunas modalidades, éste incluye secuencias de aminoácido mutantes en las cuales no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos han sido mutados mediante deleción, inserción o sustitución de aminoácido en el polipéptido derivado de SIRPa cuando se compara con SEQ ID NO: 2. Los ejemplos de secuencias de aminoácido mutantes son aquellas secuencias obtenidas a partir de polimorfismos de nucleótido individual (véase Tabla 2).

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), tomando en consideración el número de espacios, y la longitud de cada espacio, lo cual necesita ser introducido para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del por ciento de identidad entre las dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático, como se describe a continuación.

El por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácido se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de residuo de ponderación PAM120, un castigo por longitud de espacio de 12 y un castigo por espacio de 4. Además, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácido se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970) el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

En una modalidad específica, el polipéptido derivado de SIRPa incluye cambios a SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 2 que contienen sustituciones de aminoácido conservadoras.

Las sustituciones de aminoácido conservadoras son aquellas en las cuales el residuo de aminoácido es remplazado con un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, se pueden reemplazar uno o más residuos de aminoácido dentro de la región de unión a CD47 del polipéptido derivado de SIRPa con otros residuos de aminoácido provenientes de la misma familia de cadena lateral, y la nueva variante de polipéptido se puede analizar respecto a función retenida utilizando las pruebas de unión o funcionales descritas en la presente solicitud.

En algunas modalidades, los polipéptidos derivados de SIRPa se seleccionan de entre aquellos que conservan la capacidad para inhibir la secreción de citocina según se mide en una prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune por lo menos hasta el mismo grado que el polipéptido de SEQ ID NO: 3 que comprende el dominio extracelular de SIRPa de humano.

En algunas modalidades, los polipéptidos derivados de SIRPa se seleccionan de entre aquellos que conservan la capacidad para inhibir la proliferación de célula T según se mide en una prueba de reacción de linfocito mixta.

En otra modalidad, los polipéptidos derivados de SIRPa se seleccionan de entre aquellos que presentan reacción cruzada con CD47 de primate no humano.

Polipéptidos de fusión En un aspecto, los Polipéptidos Solubles de la Invención son polipéptidos de fusión que comprenden los polipéptidos derivados de SIRPa.

En una modalidad preferida, los Polipéptidos Solubles de la Invención son polipéptidos de fusión que comprenden los polipéptidos derivados de SIRPa y una segunda secuencia de aminoácido heteróloga, por ejemplo, una porción de una o más proteínas diferentes de SIRPa, unida covalentemente al polipéptido derivado de SIRPa en el extremo N-terminal y/o C-terminal de este último, y opcionalmente comprende también un enlazador.

La proteína no derivada de SIRPa puede ser de preferencia un polipéptido de cadena individual soluble, el cual, cuando se fusiona a otra proteína heteróloga, puede incrementar el tiempo de vida media en sangre de la proteína de fusión resultante. De manera alternativa o además, la proteína no derivada de SIRPa comprende un dominio para multimerización del polipéptido de fusión.

La proteína no derivada de SIRPa puede ser, por ejemplo, una inmunoglobulina, seroalbúmina y fragmentos de las mismas. La proteína no derivada de SIRPa también puede ser un polipéptido que se puede unir a proteínas de seroalbúmina para incrementar el tiempo de vida media de la molécula resultante cuando se administra en un individuo. Dicha estrategia se describe, por ejemplo, en Nygren et al., EP O 486525.

En una modalidad específica, la proteína no derivada de SIRPa es un dominio Fe. El uso de la porción Fe para elaborar una construcción soluble con tiempo de vida media in vivo incrementado en humanos es bien conocido en la técnica y se describe por ejemplo en Capón et al (US 5,428,130).

Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "dominio Fe" se refiere a la región constante de una inmunoglobulina. Un dominio Fe comprende por lo menos el dominio CH2 y CH3, opcionalmente, la región de gozne la cual está ubicada entre el dominio CH1 de la cadena pesada y CH2. Los fragmentos de Fe se pueden obtener por ejemplo mediante digestión de una inmunoglobulina con papaína. Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término dominio Fe también incluye variantes de Fe en las cuales se ha introducido una sustitución, deleción o inserción de por lo menos un aminoácido.

En una modalidad, la región de gozne de CH1 se modifica de modo tal que el número de residuos cisteína en la región de gozne esté alterado, por ejemplo, incrementado o disminuido. Este método se describe también en la patente E.U.A. No. 5,677,425 para Bodmer et al. El número de residuos cisteína en la región de gozne de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblado de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o disminuir la estabilidad del polipéptido de fusión.

En otra modalidad, la región de Fe se modifica para incrementar su tiempo de vida media biológico. Son posibles varias estrategias. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente E.U.A. No.6,277,375 para Ward.

Incluso en otras modalidades, la región de Fe se altera remplazado por lo menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras de la porción Fe. Por ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos con un residuo de aminoácido diferente de modo tal que la porción Fe tenga una afinidad alterada para un ligando efector. El ligando efector hacia el cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe del componente C1 del complemento. Este método se describe con mayor detalle en las patentes E.U.A. Nos.5,624,821 y 5,648,260 ambas de Winter et al.

En otra modalidad, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos que se seleccionan a partir de residuos de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente de modo tal que la porción Fe resultante tenga unión alterada a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC por sus siglas en inglés) reducida o eliminada. Este método se describe con mayor detalle en la patente E.U.A. No.6,194,551 de Idusogie et al.

En otra modalidad, se alteran uno o más residuos de aminoácido para de esta manera alterar la capacidad de la región Fe para fijar el complemento. Este método se describe adicionalmente en la publicación WO 94/29351 del PCT de Bodmer et al.

Incluso en otra modalidad, la región Fe se modifica para incrementar la capacidad del polipéptido de fusión para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar o disminuir la afinidad de la región Fe para un receptor Fcy mediante modificación de uno o más aminoácidos. Este método se describe adicionalmente en la publicación del PCT WO 00/42072 de Presta. Asimismo, se han mapeado los sitios de unión en lgG1 de humano para FCYRI, FCYRII, FcyRI 11 y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem.276:6591-6604).

En una modalidad, el dominio Fe es de origen humano y puede provenir de cualquiera de las clases de inmunoglobulina, tales como IgG o IgA y de cualquier subtipo tal como IgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4 de humano. En otras modalidades, el dominio Fe proviene de un animal no humano, por ejemplo, pero sin limitarse a, un ratón, rata, conejo, camello, tiburón, primate no humano o hámster.

En algunas modalidades, se utiliza el dominio Fe del isotipo lgG1. En algunas modalidades especificas, se utiliza una variante mutante del fragmento Fe de lgG1, por ejemplo, Fe de lgG1 silencioso el cual reduce o elimina la capacidad del polipéptido de fusión para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para unirse a un receptor Fcy. Un ejemplo de un mutante silencioso del isotipo lgG1, es el denominado mutante LALA, en el cual el residuo Leucina está remplazado con el residuo Alanina en las posiciones de aminoácido 234 y 235 como lo describen Hezareh et al. en J. Virol Diciembre 2001; 75(24): 12161 -8. En algunas modalidades, el dominio Fe es un mutante que evita la glucosilación en el residuo en la posición 297 del dominio Fe. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido del residuo asparagina en la posición 297 del dominio Fe. Un ejemplo de dicha sustitución de aminoácido es el reemplazo de N297 por una glicina o una alanina.

En una modalidad, el dominio Fe comprende un dominio de dimerización, de preferencia a través de cisteína que pueda formar un puente de disulfuro covalente entre dos polipéptidos de fusión que comprenden dicho dominio Fe.

El polipéptido derivado de SIRPa se puede fusionar directamente en cuadro con la proteína no derivada de SIRPa o a través de un enlazador polipeptídico (espaciador). Dicho espaciador puede ser un aminoácido individual (tal como por ejemplo, un residuo glicina) o entre 5-100 aminoácidos, por ejemplo entre 5-20 aminoácidos. El enlazador debe permitir que el dominio derivado de SIRPa asuma la orientación espacial apropiada para formar un sitio de unión con CD47. Los enlazadores polipeptídicos apropiados se pueden seleccionar de entre aquellos que adoptan una conformación flexible. Los ejemplos de dichos enlazadores son (sin limitación) aquellos enlazadores que comprenden residuos glicina y serina, por ejemplo, (Gly4Ser)n en el cual n= 1-12.

Modificaciones por glucosilación Incluso en otra modalidad, se puede alterar el patrón de glucosilación del Polipéptido Soluble de la Invención en comparación con el patrón de glucosilación mamífero típico tal como aquellos obtenidos en líneas de células CHO o de humano. Por ejemplo, se puede elaborar polipéptidos aglucosilados utilizando líneas de células procariotas como células hospederas o células de mamífero que hayan sido diseñadas para que carezcan de glucosilación. Las modificaciones de carbohidrato también se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro del polipéptido soluble.

De manera adicional o como alternativa, se puede preparar un polipéptido glucosilado que tenga un tipo de glucosilación alterando. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden lograr, por ejemplo, expresando los polipéptidos solubles en una célula hospedera con maquinaria de glucosilación alterada, es decir el patrón de glucosilación del polipéptido soluble está alterado en comparación con el patrón de glucosilación observado en células de tipo silvestre correspondientes. Las células con maquinaria de glucosilación alterada han sido descritas en la técnica y se pueden utilizar como células hospederas en las cuales se expresan los polipéptidos solubles recombinantes de la invención para de esta manera producir dichos polipéptidos solubles con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1,176,195 de Hang et al., describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, el cual codifica para una fucosil transferasa, de modo tal que las glucoproteínas expresadas en dicha línea de células presentan hipofucosilación. La publicación del PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea de célula CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para ligar la fucosa a carbohidratos ligados a Asn(297), lo que también resulta en hipofucosilación de glucoproteínas expresadas en dicha célula hospedera (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Bíol. Chem. 277:26733-26740). De manera alternativa, los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden producir en levadura, por ejemplo, Pichia pastoris, u hongos filamentosos, por ejemplo, Trichoderma reesei diseñados para patrón de giucosilacion tipo mamífero (véase por ejemplo el documento EP1297172B1 ). Las ventajas de dichas células hospederas gluco-diseñadas son, entre otras, la provisión de composiciones de polipéptido con patrón de giucosilacion homogéneo y/o rendimiento más alto.

Polipéptidos solubles conjugados con PEG y otros conjugados Otra modalidad de los polipéptidos solubles de la presente solicitud contemplada por la invención es la conjugación con PEG. Los Polipéptidos Solubles de la Invención, por ejemplo, que consisten esencialmente de polipéptidos derivados de SIRPa se pueden conjugar con PEG. La conjugación con PEG es una tecnología bien conocida para incrementar el tiempo de vida media biológico (por ejemplo, en suero) de los productos biológicos resultantes en comparación con los mismos productos biológicos sin conjugación con PEG. Para conjugar un polipéptido con PEG, el polipéptido típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se unan a los polipéptidos. La conjugación con PEG se puede efectuar mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para convertir en derivados otras proteínas, tales como monoalcoxi(C1 -C10)-polietilenglicol o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. Los métodos para conjugar proteínas con PEG son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los Polipéptidos Solubles de la Invención. Véase por ejemplo, los documentos EP 0154316 de Nishimura et al. y EP 0401 384 de Ishikawa et al.

Se pueden utilizar conjugados o vehículo polimérico alternativos, en particular para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los conjugados resultantes. El vehículo polimérico puede comprender por lo menos un polímero lineal o dendrítico, ramificado, natural o sintético. El vehículo polimérico de preferencia es soluble en agua y fluidos corporales y de preferencia es un polímero farmacéuticamente aceptable. Las porciones de polímero soluble en agua incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, polialquilenglicol y derivados del mismo, incluyendo PEG, homopolímeros de PEG, mPEG, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de etilenglicol con propilenglicol, en los cuales dichos homopolímeros y copolímeros no están sustituidos o están sustituidos en un extremo por ejemplo con un grupo acilo; poliglicerinas o ácido polisiálico; carbohidratos, polisacáridos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa; almidones (por ejemplo hidroxialquil-almidón (HAS), en especial h id roxieti I-almidón (HES) y dextrinas, y derivados de los mismos; dextrano y derivados de dextrano, incluyendo dextransulfat, dextrina entrelazada, y carboximetil-dextrina; quitosana (un polisacárido lineal), heparina y fragmentos de heparina; alcohol polivinílico y éteres etílicos de polivinilo; polivinilpirrolidon; alfa, beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida; y polioles polioxi- etilados.

Uso de los polipéptidos solubles como un medicamento Los Polipéptidos Solubles de la Invención han demostrado proteger contra trastornos inflamatorios tales como asma alérgica o enfermedades inflamatorias del intestino en modelos animales y por lo tanto se pueden utilizar como un medicamento, en particular para disminuir o suprimir (en una manera estadísticamente o biológicamente significativa) la respuesta inflamatoria y/o autoinmune, en particular, una respuesta mediada por células SIRPa+ en un individuo.

Moléculas de ácido nucleico que codifican para los Polipéptidos Solubles de la Invención Otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácido nucleico que codifican para los Polipéptidos Solubles de la Invención o por lo menos para polipéptidos derivados de SIRPa, incluyendo sin limitación, las modalidades relacionadas con polipéptidos de fusión. Los ejemplos de secuencias de nucleótido que codifican para los Polipéptidos Solubles de la Invención comprenden SEQ ID NOs: 26 o 27.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células intactas, en un lisado celular, o pueden ser ácidos nucleicos en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se hace sustancialmente puro" cuando se purifica de los otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, utilizando técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas con CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede o puede no contener secuencias intrónicas. En una modalidad, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. El ácido nucleico puede estar presente en un vector tal como un vector para despliegue en fago, o en un vector de plásmido recombinante.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican para los Polipéptidos Solubles de la Invención, por ejemplo, el polipéptido de fusión que comprende los polipéptidos derivados de SIRPa como se describió anteriormente, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo para incluir cualquier secuencia de señal para secreción apropiada en el sistema de expresión, cualquier marca para purificación y marca susceptible de corte para pasos de purificación adicionales. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN se liga en forma operativa a otra molécula de ADN, o a un fragmento que codifica para otra proteína, tal como una marca de purificación/secreción o un enlazador flexible. El término "ligado en forma operativa", tal como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN están unidos en una manera funcional, por ejemplo, de modo tal que las secuencias de aminoácido codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en cuadro, o de modo tal que la proteína se exprese bajo control de un promotor deseado.

Generación de transfectomas que producen el polipéptido derivado de SIRPa o los polipéptidos solubles Los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden producir en un transfectoma de célula hospedera utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de gen como es bien sabido en la técnica.

Por ejemplo, para expresar los Pol ipéptidos Solubles de la I nvención o intermediarios de los mismos, tal como los polipéptidos derivados de SI RPa , las moléculas de ADN q ue cod ifican para los polipéptidos correspondientes, se pueden obtener media nte técn icas estándar de biolog ía molecular (por ejemplo, amplificación con PC R o clonación de ADNc utilizando u n hibridoma que exprese los polipéptidos de interés) y las molécu las de AD N se pueden insertar en vectores de expresión de modo tal que el gen correspondiente esté ligado en forma operativa a las secuencias de control de transcripción y traducción . En este contexto, el término "ligado en forma operativa" q uiere decir que u n gen está ligado en u n vector de modo tal q ue las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector cumplan su fu nción pretend ida de regula r la transcripción y trad ucción del gen . El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen de modo q ue sean compatibles con la célula hospedera para expresión utilizada . El gen que cod ifica para los polipéptidos solubles o intermediarios se inserta en el vector de expresión utilizando métodos estánda r (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementa rios en el fragmento de gen y vector, o ligación del extremo despuntado si no está n presentes sitios de restricción) . De manera adicional o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede cod ificar para un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de polipéptido a partir de una célula hospedera. El gen se puede clona r en el vector de modo tal que el péptido de señal esté ligado en cuad ro al extremo amino terminal de la cadena de polipéptido. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de S I RPa o u n péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal no asociado naturalmente con la secuencia de SI RPa) .

Además de la secuencia codificadora del polipéptido, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión del gen en una célula hospedera. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores , incrementadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o trad ucción de los genes de la cadena de polipéptido. Dichas secuencias reg uladoras se describen , por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Tech nology. ethods in Enzymology 1 85 , Academic Press , San Diego, CA 1 990) . Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión , incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que se va a transformar, el n ivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras para expresión en cél u la hospedera de mamífero incluyen elementos virales que dirigen niveles elevados de expresión de proteína en células de mam ífero , tales como los promotores y/o incrementadores obtenidos a parti r de citomegalovirus (C MV) , Virus 40 de Simio (SV40) , adenovirus (por ejemplo, el promotor tard ío mayor de adenovirus (Ad MLP)) , y polioma . De manera alternativa , se pueden utilizar secuencias reg uladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de globina P. Además, elementos reguladores constituidos por secuencias provenientes de fuentes diferentes, tales como el sistema de promotor de SRa, el cual contiene secuencias provenientes del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus tipo 1 de leucemia de célula T de humano (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol.8:466-472).

Además de esto, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en células hospederas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes de marcador seleccionable. El gen de marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas en las cuales se ha introducido el vector (véase por ejemplo, patentes E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas para Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen del marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual se ha introducido el vector. Los genes del marcador seleccionable incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospederas dhfr- con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Para expresión del polipéptido, el vector o vectores de expresión que codifican para el Polipéptido Soluble o intermediarios tales como el polipéptido derivado de SIRPa se transfectan en una célula hospedera utilizando técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedera procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Teóricamente es posible expresar los Polipéptidos Solubles de la Invención ya sea en células hospederas procariotas o en células hospederas eucariotas. Se discute la expresión de glucoproteína en células eucariotas, en particular células hospederas de mamífero, debido a que dichas células eucariotas, y en particular células de mamífero, tienen mayor probabilidad que las células procariotas de ensamblarse y secretar una glucoproteína plegada adecuadamente y biológicamente activa tal como los Polipéptidos Solubles de la Invención.

Las células hospederas de mamífero para expresar los polipéptidos solubles e intermediarios tales como los polipéptidos derivados de SIRPa de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 utilizadas con un marcador seleccionable para DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621, células de mieloma NSO, células COS y células SP2) o líneas de células de humano (incluyendo líneas de células PER-C6, Crucell). En particular, para uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión es el sistema de expresión del gen GS mostrado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican para polipéptidos en células hospederas de humano, los polipéptidos solubles o intermediarios tales como los polipéptidos derivados de SIRP se producen cultivando las células hospederas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión de los polipéptidos recombinantes en las células hospederas o la secreción de los polipéptidos recombinantes hacia el medio de cultivo en el cual se cultivan las células hospederas. Los polipéptidos después se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteína.

Proteínas multivalentes En otro aspecto, la presente invención provee proteínas multivalentes que comprenden por lo menos dos Polipéptidos Solubles de la Invención idénticos o diferentes que se unen a CD47. En una modalidad, las proteínas multivalentes comprenden por lo menos dos, tres o cuatro Polipéptidos Solubles de la Invención. Los polipéptidos para unión a CD47 solubles se pueden ligar entre sí mediante fusión de proteína o enlazamiento covalente o no covalente. Las proteínas multivalentes de la presente invención se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constituyentes, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la proteína multivalente se puede generar por separado y después conjugar una con la otra.

Se puede utilizar una variedad de agentes para copulación o entrelazamiento para conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de entrelazamiento incluyen proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)-ciclohaxan-1 -carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase por ejemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), y Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). El enlazamiento covalente se puede obtener mediante puente de disulfuro entre dos cisteínas, por ejemplo puente de disulfuro de la cisteína de un dominio Fe.

En una modalidad particular, la región de gozne de un dominio Fe fusionado a un polipéptido derivado de SIRPa se modifica para que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, por ejemplo uno, antes de la conjugación. De manera alternativa, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula hospedera.

Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención provee una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de los Polipéptidos Solubles de la presente Invención, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las formulaciones farmacéuticas que comprenden un Polipéptido Soluble de la Invención se pueden preparar para almacenamiento mezclando el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edición (2000)), en forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras formulaciones secas. Por lo tanto, la invención también se refiere a una composición liofilizada que comprende por lo menos el Polipéptido Soluble de la Invención.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un Polipéptido Soluble de la presente invención combinado con por lo menos otro agente anti-inflamatorio u otro agente quimioterapéutico. Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden utilizar en terapia de combinación se describen con mayor detalle más adelante en la sección sobre usos de los Polipéptidos Solubles de la Invención.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retraso de absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. El vehículo debe ser apropiado para administración por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo se puede aplicar como recubrimiento en un material para proteger al compuesto contra la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pudieran inactivar al compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparte ningún efecto toxicológico indeseado (véase por ejemplo, Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales ácidas de adición y sales básicas de adición. Las sales ácidas de adición incluyen aquellas obtenidas a partir de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como los ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos monocarboxílicos y di-carboxílicos, ácidos alcanóicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxi-alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales básicas de adición incluyen aquellas que se obtienen a partir de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como ?,?'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y agentes quelantes de metal, tales como ácidos cítrico, ácido etilendiamintetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos apropiados que se puede utilizar en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de agentes tensoactivos.

Estas composiciones también pueden contener coadyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emuisificantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, y mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol-sórbico, y similares. También podría ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede lograr mediante la inclusión de agentes que retrasen la absorción tales como, monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, rhicroemulsión, liposomas, u otra estructura ordenada apropiada para concentración alta de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensoactivos. En muchos casos se puede incluir en la composición, agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización mediante microfiltración. En términos generales, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos provenientes de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una forma de dosificación individual puede variar en función del individuo que está siendo tratado, y del modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material de vehículo para producir una forma de dosificación individual generalmente es aquella cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En términos generales, de un cien por ciento, esta cantidad puede variar desde aproximadamente 0.01 por ciento hasta aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, desde aproximadamente 0.1 por ciento hasta aproximadamente 70 por ciento, o desde aproximadamente 1 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proveer la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo individual, se pueden administrar varias dosis divididas a través del tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. Forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en la presente solicitud se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitaria para los individuos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención quedan dictadas por y dependen directamente de las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a ser logrado, y las limitaciones inherentes en la técnica de mezclar dicho compuesto activo para tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para administración de los Polipéptidos Solubles de la Invención, la dosis varía desde aproximadamente 0.0001 hasta 100 mg/kg, y de manera más usual de 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación para un Polipéptido Soluble de la Invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración por vía intravenosa, en el que el polipéptido se administra utilizando uno de los siguientes programas de dosificación: cada cuatro semanas para seis dosis, después cada tres meses; cada tres semanas; 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

El Polipéptido Soluble usualmente se administra en ocasiones múltiples. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanales, mensuales, cada tres meses o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares según se indique mediante medición de los niveles en sangre del Polipéptido Soluble en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración del polipéptido en plasma de aproximadamente 1-1000 g/ml y en algunos métodos de aproximadamente 25-300 g/ml.

De manera alternativa, el Polipéptido Soluble se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere de administración menos frecuente. La dosis y frecuencia varían dependiendo del tiempo de vida media del Polipéptido Soluble en el paciente. La dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes a través de un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere de una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o elimina el avance de la enfermedad o hasta que el paciente muestra mejoramiento parcial o completo de los síntomas de la enfermedad. Después de esto, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado puede depender de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que está siendo utilizado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, género, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las artes médicas.

Una "dosis terapéuticamente efectiva" del Polipéptido Soluble de la Invención puede dar como resultado un decremento en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duración de períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención de debilitamiento o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad.

Una composición de la presente invención se puede administrar mediante una o más vías de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como el experto en la técnica apreciará, la vía y/o modo de administración puede variar dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración para los Polipéptidos Solubles de la Invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo medíante inyección o infusión. La frase "administración por vía parenteral" tal como se utiliza en la presente solicitud significa modos de administración diferentes a la administración por vía entérica y tópica, usualmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, trans-tráquea, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e ¡ntraesternón.

De manera alternativa, un Polipéptido Soluble de la Invención se puede administrar mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o en mucosas, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protejan al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglucólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o son conocidos en forma general por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo para inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos mostrados en las patentes E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851, 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 o 4,596,556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: patentes E.U.A. No. 4,487,603, la cual muestra una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicamento a una velocidad controlada; patente E.U.A. No. 4,486,194, la cual muestra un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; patente E.U.A. No. 4,447,233, la cual muestra una bomba para infusión de medicamento para suministrar medicamento a una velocidad de infusión precisa; patente E.U.A. No. 4,447,224, la cual muestra un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro continuo de fármacos; patente E.U.A. No. 4,439,196, la cual muestra un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámaras múltiples; y la patente E.U.A. No.4,475,196, la cual muestra un sistema para suministro de fármaco osmótico. Muchos otros de dichos implantes, sistemas de suministro, y módulos son conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden formular para asegurar la distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hemato-encefálica (BBB por sus siglas en inglés) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la barrera hemato-encefálica (si se desea), éstos se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, patentes E.U.A. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que sean transportadas selectivamente hacía células u órganos específicos, por lo tanto incrementan el suministro dirigido de fármaco (véase, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685). Los ejemplos de porciones para selección de blanco incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, patente E.U.A. 5,416,016 para Low et al.); manósidos (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); receptor de proteína A tensoactiva (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233: 134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273.

Usos y métodos de la invención Los Polipéptidos Solubles de la Invención tienen utilidad diagnóstica y terapéutica in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo in vitro o in vivo, o en un individuo, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de trastornos.

El término "individuo" tal como se utiliza en la presente solicitud pretende incluir animales humanos y no humanos. Animales no humanos incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios, y reptiles.

Los métodos son particularmente apropiados para tratar, prevenir o diagnosticar trastornos autoinmunes e inflamatorios mediados por células SIRPa + , por ejemplo, asma alérgica o colitis ulcerante. Estos incluyen condiciones inflamatorias, alergias y condiciones alérgicas, enfermedades autoinmunes, trastornos isquémicos, infecciones severas, y rechazo de trasplante de células, órgano o tejido, incluyendo xenotrasplante (es decir transplante proveniente de especies diferentes, por ejemplo de una especie no humana a humano) de células, tejidos u órganos.

Los ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, sin limitación, artritis (por ejemplo artritis reumatoide, artritis crónica progresiva y artritis deformante) y enfermedades reumáticas, incluyendo condiciones inflamatorias y enfermedades reumáticas que implican pérdida de hueso, dolor inflamatorio, espondiloartropatías incluyendo espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis reactiva, artritis psoriática, y artritis enterophathis, hipersensibilidad (incluyendo tanto hipersensibilidad de vías respiratorias como hipersensibilidad dérmica) y alergias. Las enfermedades autoinmunes incluyen trastornos hematológicos autoinmunes (incluyendo por ejemplo anemia hemolítica, anemia aplásica, anemia de glóbulo rojo pura y trombocitopenia idiopática), lupus eritematoso sistémico, trastornos inflamatorios del músculo, p.olicondritis, esclerodoma, granulomatosis de Wegener, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, miastenia grave, psoriasis, síndrome de Steven-Johnson, psilosis idiopática, oftalmopatía endocrina, enfermedad de Graves, sarcoidosis, esclerosis múltiple, cirrosis biliar hepática, diabetes juvenil (diabetes mellitus tipo I), uveitis (anterior y posterior), queratoconjuntivitis seca y queratoconjuntivitis primaveral, fibrosis pulmonar intersticial, artritis psoriática y glomerulonefritis (con y sin síndrome nefrótico, incluyendo por ejemplo síndrome nefrótico idiopático o nefropatía de cambio mínimo), tumores, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria de la piel y córnea, miositis, aflojamiento de implantes óseos, trastornos metabólicos, tales como ateroesclerosis, diabetes, y dislipidemia.

Los Polipéptidos Solubles de la Invención también son útiles para el tratamiento, prevención, o mejoramiento de asma, bronquitis, pneumoconiosis, enfisema pulmonar, y otras enfermedades obstructivas o inflamatorias de las vías respiratorias.

Los Polipéptidos Solubles de la Invención también son útiles para el tratamiento de trastornos mediados por IgE. Trastornos mediados por IgE incluyen trastornos atópicos, los cuales se caracterizan por una propensión heredada a responder inmunológicamente a muchos antígenos inhalados e ingeridos comunes que ocurren en la Naturaleza y la producción continua de anticuerpos de IgE. Los trastornos atópicos específicos incluyen asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica gastroenteropatía alérgica.

Sin embargo, los trastornos asociados con niveles elevados de IgE no están limitados a aquellos con una etiología heredada (atópica). Otros trastornos asociados con niveles elevados de IgE, que parecen ser mediados por IgE y que se pueden tratar con las formulaciones de esta presente invención incluyen hipersensibilidad (por ejemplo, hipersensibilidad anafiláctica), eczema, urticaria, aspergilosis alérgica bronquiopulmonar, enfermedades parasitarias, síndrome de hiper-lgE, ataxia-telangiectasia, síndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia del timo, mieloma de IgE y reacción de injerto contra hospedero.

Los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden administrar como el único ingrediente activo o en conjunto con, por ejemplo como un coadyuvante para o en combinación con, otros fármacos por ejemplo agentes inmunosupresores o inmunomoduladores u otros agentes anti-inflamatorios, por ejemplo para el tratamiento o prevención de las enfermedades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden utilizar en combinación con DMARD, por ejemplo sales de oro, sulfasalazina, agentes anti-malaria, metotrexato, D-penicilamina, azatioprina, ácido micofenólico, ciclosporina A, tacrolimus, sirolimus, minociclina, leflunomida, glococorticoides; un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina A o FK 506; un modulador de recirculación de linfocitos, por ejemplo FTY720 y análogos de FTY720; un inhibidor de mTOR, por ejemplo rapamicina, 40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, CCI779, ABT578, AP23573 o TAFA-93; una ascomicina que tenga propiedades ¡nmunosupresoras, por ejemplo ABT-281, ASM981, etc.; corticosteroides; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; mofetil micofenolato; 15-desoxiaspergualina o un homólogo, análogo o derivado inmunosupresor del mismo; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocito, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40. CD45, CD58, CD80, CD86 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo una molécula recombinante para unión que tenga por lo menos una porción del dominio extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma, por ejemplo una porción por lo menos extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma unida a una secuencia de proteína de tipo no CTLA4, por ejemplo CTLA4lg (designada por ejemplo ATCC 68629) o un mutante de la misma, por ejemplo LEA29Y; inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo antagonistas de LFA-1, antagonistas de ICAM-1 o ICAM-3, antagonistas de VCAM-4 o antagonistas de VLA-4; o un agente quimioterapéutico, por ejemplo paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, doxorrubicina o 5-fluorouracilo; agentes anti-TNF, por ejemplo anticuerpos monoclonales para TNF, por ejemplo infliximab, adalimumab, CDP870, o construcciones de receptor para TNF-RI o TNF-RII, por ejemplo Etanercept, PEG-TNF-Rl; bloqueadores de citocinas pro-inflamatorias, bloqueadores de IL-1, por ejemplo Anakinra o trampa de IL-1, AAL160, ACZ 885, bloqueadores de IL-6; bloqueadores de quimiocinas, por ejemplo inhibidores o activadores de proteasas, por ejemplo metaloproteasas, anticuerpos anti-IL-15, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-CD22, anticuerpos anti-l L17, NSAIDs, tales como aspirina o un agente anti-infeccioso (la lista no está limitada al agente mencionado).

Los Polipéptidos Solubles de la Invención también son útiles como co-agentes terapéuticos para uso en conjunto con fármacos anti-inflamatorios o broncodilatadores, particularmente en el tratamiento de enfermedades obstructivas o inflamatorias de vías respiratorias tales como aquellas mencionadas anteriormente en la presente solicitud, por ejemplo como potenciadores de la actividad terapéutica de dichos fármacos o como medios para reducir la dosificación requerida o los efectos secundarios potenciales de dichos fármacos. Se puede mezclar un agente de la invención con el fármaco anti-inflamatorio o broncodilatador en una composición farmacéutica fija o éste se puede administrar por separado, antes, simultáneamente con o después del fármaco anti-inflamatorio o broncodilatador. Dichos fármacos anti-inflamatorios incluyen esferoides, en particular glucocorticosteroides tales como budesonida , beclametasona, fluticasona o mometasona , y agonistas del receptor de dopamina tales como cabergolina , bromocriptina o ropinirol . Dichos fármacos broncodilatadores incluyen agentes anticolinérgicos o antimuscarínicos, en particu lar brom uro de ipratropio , bromu ro de oxitropio y bromuro de tiotropio.

Se pueden utilizar combinaciones de agentes de la invención y esteroides por ejemplo, en el tratamiento de EPOC o, particu larmente , asma . Se pueden utilizar combinaciones de los agentes de la invención y agentes anticolinérgicos o antim uscarínicos o agonistas del receptor de dopamina , por ejemplo, en el tratamiento de asma o, en pa rticular, EPOC .

De conformidad con lo anterior, la presente invención también provee un método para el tratamiento de una enfermedad obstructiva o inflamatoria de las vías respiratorias que comprende administrar a un individuo, particularmente u n individ uo h umano, en necesidad de lo mismo un Polipéptido Soluble , como el descrito anteriormente en la presente solicitud. En otro aspecto , la invención provee un Polipéptido Soluble , como el descrito anteriormente pa ra uso en la prepa ración de un medicamento pa ra el tratamiento de u na enfermedad obstructiva o inflamatoria de las vías respi ratorias.

Los Polipéptidos Solubles de la I nvención también son particularmente útiles para el tratamiento, prevención o mejoramiento de i nflamación gastrointesti nal crónica , tal como enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerante.

"Inflamación gastrointestinal crónica" se refiere a inflamación de las mucosas del tracto gastrointestinal y se caracteriza por un periodo relativamente largo de inicio, es perdurable (por ejemplo, desde varios días, semanas, meses, o años y hasta por toda la vida del individuo), y está asociada con infiltración o influjo de células mononucleares y puede también estar asociada con periodos de remisión espontánea y ocurrencia espontánea. Por lo tanto, se podría esperar que los individuos con inflamación gastrointestinal crónica requieran de un periodo largo de supervisión, observación, o cuidado. "Condiciones inflamatorias gastrointestinales crónicas" (también referidas como "enfermedades inflamatorias gastrointestinales crónicas") que tienen dicha inflamación crónica incluyen, pero no necesariamente se limitan a, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD por sus siglas en inglés), colitis inducida por ataques ambientales (por ejemplo, inflamación gastrointestinal (por ejemplo, colitis) causada por o asociada con (por ejemplo, como un efecto secundario) un régimen terapéutico, tal como la administración de quimioterapia, terapia de radiación, y similares), colitis en condiciones tales como enfermedad granulomatosa crónica (Schappi et al. Arch Dis Child. 2001 Febrero;1984(2):147-151) enfermedad celíaca, psilosis celíaca (una enfermedad heredable en la cual el descubrimiento intestinal se inflama en respuesta a la ingestión de una proteína conocida como gluten), alergias por alimento, gastritis, gastritis infecciosa o enterocolitis (por ejemplo, gastritis activa crónica infectada con Helicobacter pylori) y otras formas de inflamación gastrointestinal ocasionadas por un agente infeccioso, y otras condiciones similares.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "enfermedad inflamatoria del intestino" o "IBD" se refiere a cualquiera de una variedad de enfermedades caracterizadas por inflamación de todo o una parte de los intestinos. Los ejemplos de enfermedad inflamatoria del intestino incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante. La referencia a IBD a través de toda la descripción con frecuencia es referida en la descripción como ejemplo de condiciones inflamatorias gastrointestinales, y no pretende ser limitativa.

De conformidad con lo anterior, la presente invención también provee un método para el tratamiento de inflamación gastrointestinal crónica o enfermedades inflamatorias del intestino, tales como colitis ulcerante, el cual comprende administrar a un individuo, particularmente un individuo humano, en necesidad de lo mismo, un Polipéptido Soluble, como el descrito anteriormente en la presente solicitud. En otro aspecto, la invención provee un Polipéptido Soluble, como el descrito anteriormente en la presente solicitud descrito para uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de inflamación gastrointestinal crónica o enfermedades inflamatorias del intestino.

La presente invención también es útil en el tratamiento, prevención o mejoramiento de leucemias y otros trastornos de cáncer.

También queda abarcado dentro del alcance de la presente invención un método como el definido anteriormente que comprende la co-administración, por ejemplo, en forma concomitante o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido soluble, y por lo menos un segundo fármaco, dicho segundo fármaco es un fármaco inmunosupresor/inmunomodulador, anti-inflamatorio quimioterapéutico o anti-infeccioso, por ejemplo como se indicó anteriormente O, una combinación terapéutica, por ejemplo un estuche, constituido por una cantidad terapéuticamente efectiva de a) un Polipéptido Soluble de la Invención y b) por lo menos una segunda sustancia que se selecciona a partir de un fármaco inmunosupresor/inmunomodulador, anti-inflamatorio quimioterapéutico o anti-infeccioso, por ejemplo como se indicó anteriormente. El estuche puede comprender instrucciones para su administración.

En casos en los que los Polipéptidos Solubles de la Invención se administran en conjunto con otra terapia inmunosupresora/inmunomoduladora, anti-inflamatoria quimioterapéutica o anti-infecciosa, las dosis del compuesto de la combinación co-administrada puede, desde luego, variar dependiendo del tipo de co-fármaco utilizado, de la condición que está siendo tratada, etc.

En una modalidad, los Polipéptidos Solubles de la Invención se pueden utilizar para detectar niveles de células dendríticas CD47+, o niveles de células que contienen CD47. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra (tal como una muestra in vitro) y una muestra de control con un Polipéptido Soluble de la Invención bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre los Polipéptidos Solubles y las células que expresan CD47. Cualesquiera complejos formados se detectan y se comparan en la muestra y el control. Por ejemplo, se pueden efectuar métodos estándar de detección, bien conocidos en la técnica, tales como pruebas citométricas de flujo, utilizando las composiciones de la invención.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención también provee métodos para detectar la presencia de CD47 (por ejemplo, CD47 de humano) en una muestra, o medir la cantidad de CD47, que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un Polipéptido Soluble de la Invención, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el Polipéptido Soluble y CD47. La formación de un complejo se detecta después, en el cual una diferencia en formación de complejo entre la muestra comparada con la muestra de control es indicativa de la presencia de CD47 en la muestra.

También dentro del alcance de la invención están estuches que consisten de las composiciones de la invención e instrucciones para uso. El estuche también puede contener por lo menos un reactivo adicional. Los estuches típicamente incluyen un marbete que indica el uso pretendido del contenido del estuche. El término marbete incluye cualquier material escrito o grabado suministrado en o con el estuche, o que de alguna otra manera acompaña al estuche. El estuche también puede comprender herramientas para diagnosticar si un paciente pertenece o no a un grupo que pueda responder a un tratamiento, como se definió anteriormente.

Habiendo descrito completamente la invención, ésta se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y reivindicaciones, los cuales son ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. SIRPa-Fc de múrido se une a células CD47+/+ (WT) pero no a células CD47-/- (KO). La unión de SIRPa-Fc de múrido a esplenocitos CD47+/+ (WT) o CD47-/- (KO) de múrido se detecta mediante citometría de flujo como se describe. La fluorescencia que resulta de la unión de SIRPa-Fc (SIRP) se gráfica como gráfica de puntos contra FL3.

Figura 2. SIRPa-Fc de humano se une a células T Jurkat que expresan CD47+/+ (Jin8CD47) pero no a células T Jurkat deficientes de CD47 (Jin8). La unión de SIRPa-Fc se cuantifica mediante citometría de flujo como se describió. La fluorescencia que resulta de la unión de SIRPa-Fc (SIRP) se gráfica como histograma en líneas oscuras. La línea oscura indica la unión en presencia de 10ug/mL del clon B6H12 anti-CD47.

Figuras 3(a-h). El bloqueo de CD47/SIRPa en el cebado evita el desarrollo de enfermedad alérgica en ratones BALB/c (Figura 3a) Los ratones se sensibilizan con OV por vía intraperitoneal en los días 0 y 5 en presencia o ausencia de moléculas de fusión SIRPa-Fc, y reciben desafíos de aerosol de OVA en los días 12, 16 y 20 y se sacrifican el día 21 (n=4 a 7 ratones por grupo). (Figura 3b) Las secciones de pulmón de ratones no afectados por tratamiento (PBS), ratones inmunizados con OVA, ratones tratados con OVA más SIRPa-Fe se tiñen con H&E y PAS. Los datos son representativos de 3 pulmones analizados en forma individual. (Figura 3c) Los números de célula BALF diferencial se analizan mediante citometría de flujo. (Figura 3d) Los niveles en suero de IgE específica de OVA se miden en el día 21. (Figura 3e) Se analizan los niveles de IL-4, IL-5 e IL- 3 en los sobrenadantes de cultivos de célula mLN después de 3 días de re-estimulación in vitro con OVA. (Figura 3f) En el día 21, se evalúa el % de células T CD4+ y células T CD4+ productoras de IL-13 mediante citometría de flujo en células aisladas ex vivo. Se muestra un experimento representativo de los 3. (Figura 3g) liberación de IL-4, IL-5, IL-13 y (Figura 3h) eotaxina en explantes de pulmón. Los datos son la media ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

Figuras 4(a-c). Mecanismos de protección contra enfermedad en ratones BALB/c tratados con SIRPa-Fc. Los ratones se sensibilizan con OVA en los días 0 y 5 en presencia o ausencia de la molécula de fusión SIRPa-Fc, reciben desafíos de aerosol de OVA en los días 12, 16 y 20 y se sacrifican en el día 21. (Figura 4a) Subpoblaciones de células dendríticas (DC) CD1 blowCD 03+ y CD11 bhighCD103 (controladas en CD11c+) en células mLN. Los datos representan como % de subconjuntos de DC (n = 3 a 4 ratones por grupo). (Figura 4b) Se transfieren pasivamente ratones BALB/c con células T CD47+/+CD4+Tg marcadas con CFSE un día antes de la inmunización por vía intraperitoneal con OVA-alumn en ausencia (PBS) o presencia de SIRPa-Fc y la dilución celular de CFSE se examina en células mLN después de 2 días. Los datos son de uno de los experimentos representativos efectuados en 4 ratones por grupo. (Figura 4c) En el día 21, se analizan los números absolutos de eosinófilos (CCR3+) mediante citometría de flujo en mLNs aisladas ex vivo. Los datos son la media ± SEM (n= 3 a 4 ratones por grupo).

Figura 5. Protección de colitis por TNBS-colitis mediante administración de SIRPa-Fc Se induce colitis y se analiza como se describió. Se aplican 100 ug /animal de SIRPa-Fc de múrido en el día 0 y 24 horas después por vía intraperitoneal. De manera alternativa se inyecta PBS por vía intraperitoneal. El peso corporal de los animales se analiza hasta el día 4 después de la inyección de TNBS.

EJEMPLOS 1. Ejemplos de Polipéptidos Solubles de la Invención La siguiente tabla 3 provee ejemplos de polipéptidos solubles de la invención se pueden prod ucir mediante métodos recombinantes utilizando ADN q ue codifica para las secuencias de aminoácido descritas.

TABLA 3 2. Determinación de afinidad 2.1 Afinidad hacia CD47 La afinidad de SI RPa-Fc de humano hacía C D47 monomérica o la prote ína CD47-Fc divalente se puede evaluar mediante Biacore. La interacción monovalente del dominio V de CD47 con SIRPa se reporta alrededor de 1 µ? (Heatherley et al Mol Cell. 2008).

Por ejemplo, una proteína del dominio V de CD47 marcada con APP se expresa en células HEK293 y se compara con una proteína CD47-Fc divalente como ligando. La interacción monovalente con SIRPa-Fc se mide como KD de 0.8 µ? mientras que la fuerza de unión (avidez) de una proteína CD47-Fc divalente se incrementa por un factor de 10 hasta KD < 60 nM. En contraste no se puede observar la unión de una proteína de fusión CD47-Fc de múrido lo que indica la especificidad de la interacción analizada.

TABLA 4 Afinidades de unión determinadas mediante análisis Biacore Peso Mol KD [uM] a SIRPa-Fc Da CD47-huFc de (control) 80805 > 10 (unión no detectable) huCD47-huFc 81317 0.06 (divalente) huCD47-APP 16916 0.8 (monovalente) 2.2 Unión de célula a CD47 celular de múrido Se vuelven a suspender 5 x 105 esplenocitos CD47* y CD47" de múrido provenientes de ratones de tipo silvestre o con expresión suprimida (knock out) de CD47 en 50 µ? de solución reguladora para FACS (PBS 2% de FCS 2mM de EDTA ) que contiene 200 pg/ml de IgG de humano y 5 g/ml de SIRPa-Fc de múrido durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar, las células se tiñen con estreptavidina marcada con FITC (1/1000) durante 30 minutos a 4°C. Los resultados muestran que SIRPa-Fc se une a los linfocitos de ratones knockout CD47+/+ pero no a los linfocitos de ratones knockout CD47-'- (Figura 1). 2.3 Unión de célula a CD47 celular de humano Se vuelven a suspender 5 x 105 líneas de célula T Jurkat CD47+ y CD47' en 50 µ? de solución reguladora para FACS (PBS 2% de FCS 2mM de EDTA ) que contiene 200 Mg/ml de IgG de humano y 5 pg/ml de SIRPa-Fc durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar, las células se tiñen con estreptavidina marcada con FITC (1/1000) durante 30 minutos a 4°C.

Los resultados muestran que SIRPa-Fc se une a linfocitos de células Jurkat CD47+/+ (Jin8CD47) pero no a las células Jurkat que no expresan CD47 (Jin8) (Figura 2). La unión a las células es específica como se indica mediante bloqueo completo con un anticuerpo B6H12 anti-CD47. 2.4 Estudios de inhibición/bloqueo de la unión de SIRPa-Fc conjugada con biotina a líneas de célula CHO CD47 De manera alternativa, se pueden efectuar estudios de inhibición/bloqueo de la unión de SIRPa-Fc biotinilada a líneas de célula CHO CD47 utilizando mAbs anti-CD47 dirigidos contra diferentes epítopes (es decir clones B6H12, 2D3, BRIC 126, IF7 y 10G2, mAbs anti-SIRPa de humano (CD172a) diferentes, Tromboespondina-1 (TSP-1) recombinante de humano o TSP-1 c-terminal (4N1K) y péptidos de control (4NGG). 2.5 Estudios de bloqueo/inhibición de la unión de mAb anti-CD47 marcado directamente a líneas de célula CHO CD47 Como una estrategia complementaria, se pueden efectuar estudios de bloqueo/inhibición de la unión de mAb directamente marcado anti-CD47 a líneas de célula CHO CD47 utilizando SIRPa-Fc de humano no conjugada con biotina.

También se pueden analizar estudios de inhibición/bloqueo de la unión de CD47-Fc conjugada con biotina a células L transfectadas con SIRPa-Fc de humano utilizando SIRPa-Fe. 3. Pruebas funcionales de SIRPct-Fc 3.1 Prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune Se preparan monocitos de sangre periférica (CD14+ CD16-) así como células dendríticas derivadas de monocito (DCs) en la forma descrita (Latour et al, J of Immunol, 2001: 167:2547). Las células dendríticas convencionales (DCs) se aislan como CD11c+, linaje-, mediante un aparato FACS Aria (BD Biosciences) utilizando anti-CD11c marcado con aloficocianina (APC) (B-ly6), una mezcla de mAbs marcados con FITC contra los marcadores de linaje, CD3, CD14, CD15, CD16, CD19 y CD56 y CD4 marcado con APC-Cy7 (RPA-T4) hasta alcanzar >99% de pureza. Las APCs se estimulan con Cowan 1 de Staphylococcus aureus a 1/40,000 (Pansorbin) o CD40L soluble (1 pg/ml) e IFNy (500 U/ml) en presencia de varias concentraciones de SIRPa-Fc de humano (1 a 20 pg/ml) en medio HB101 libre de suero. Se evalúa la liberación de citocina (IL-1, IL-6, IL- 0, IL-12p70, IL-23, IL-8 y TNFa) mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo de 24 horas o 48 horas. 3.2 Prueba de reacciones de linfocito mixtas (MLR) Se cocultivan células dendríticas maduras tratadas con mitomicina c (estimuladas con SAC o LPS) con células T CD4+ alogenéicas no fraccionadas, no afectadas por tratamiento (CD45RA+ CD62LHigh) o de memoria (CD45RO+ CD62Llow) de adulto (106/ml) a diferentes relaciones de estimuladores (DCs)/respondedores (células T) en presencia o ausencia de los Polipéptidos Solubles de la Invención (5 a 50 g/ml). La proliferación de célula T (captación de 3H timidina) y liberación de IFNy se analizan en los sobrenadantes de cultivo de cultivos primarios de 5 a 8 días. 4. Datos in vivo con modelos animales de múrido para uso de SIRPa-Fc en el tratamiento de asma Se sensibilizan ratones BALB/c mediante inyección intraperitoneal de 10 pg de OVA (Sigma, Grade V) adsorbida en 1 mg de Imject Alum (Pierce) en los días 0 y 5. En los días 12, 16 y 20, los ratones se desafían durante 30 minutos con un aerosol de OVA al 0.5% (Sigma, Grado V) suministrado mediante un sistema de nebulizador de malla vibratoria (Omron). 24 horas después del último desafío, los ratones se sacrifican con sobredosis de 75 mg/kg de pentobarbital sódico y se sangran. BAL se recolecta 3 veces con 0.5 mi de solución salina fisiológica y se aislan el pulmón y ml_N. Un tercio de los pulmones se enjuaga en PBS complementada con antibióticos, se corta en piezas pequeñas y se pone en cultivo en placas de 24 cavidades de fondo redondo durante 24 horas en 1 mi de RPMI1640 (Wisent Inc.) complementado con 10% de suero fetal de bovino, 500 U/ml de penicilina, 500 pg/ml de estreptomicina, solución amortiguadora HEPES 10 mM y 2-ME 1 mM. Las células MLN (4x106 células/ml) se cultivan en placas de 96 cavidades de fondo redondo y se vuelven a estimular con OVA (100 µ/ml) durante 72 horas. Las células BAL totales se lavan, se cuentan y se tiñen durante 30 minutos con PE anti-CCR3 (R&D systems), anti-CD3 FITC (clon 145-2C11) y anti-B220 FITC (R&D systems). Como se describe en Van Rijt L.S. et al (Immunol Methods. 2004 Mayo;288(1 -2):111-21), se encuentra que los granulocitos son granulares, no auto-fluorescentes, carecen de la expresión de CD3 y B220. Los eosinófilos se distinguen de los neutrófilos por la expresión de CCR3. Los linfocitos son pequeños, no granulares, no auto-fluorescentes, expresan CD3 o B220 y las otras células mononucleadas, incluyendo macrófagos y DCs, están carentes de CD3, B220 y CCR3. Para identificar los subconjuntos de DC, las mLN y los pulmones se tratan primero con liberasa, se cortan en trozos y se cuentan las células. Las suspensiones de célula de pulmón se tratan con NH4CI para la lisis de los glóbulos rojos y se lavan antes de teñir. Las células se tiñen con anti-CD11c FITC (BD Biosciences) o anti-CD11c APC (clon N418), anti-CD11b PE (Caltag), anti-l-Ad/l-Ed PE (BD Biosciences), anti-GR1, anti-B220 FITC (R&D systems), 120G8 FITC y anti-CD103-biotinilado seguido por SA-APC o CD103 PE (BD Biosciences) anti-CD47 y mAbs anti-SIRPa. En los pulmones, los macrófagos alveolares, autofluorescentes se excluyen de las compuertas del análisis. Para identificar células T reguladoras, se utilizan anti-CD4 FITC o APC (BD Biosciences), anti-CD25 PE (Caltag) o FITC (BD Biosciences), anti-CD44 APC (clon IM7 8.1). Para medir la producción de IL-13 ex vivo, primero se identifican mastocitos y basófilos con anti-lgE-biotinilado extracelular y anti-CD117 (c-Kit, BioLegend) y las células T CD4 se tiñen con anti-CD4 APC. Las células se fijan, se permeabilizan y se tiñen con anti-IL-13 PE (eBioscience). Las células se tiñen primero para marcadores extracelulares (anti-CD4 APC y anti-CD25 FITC), se fijan, se permeabilizan y se tiñen con anti-FoxP3 PE (estuche de eBioscience). Tinción de mastocitos y basófilos + IL-13 intracitoplasmática. Todos los datos se adquieren en un citómetro de flujo FACSCalibur o Cantoll (BD Biosciences) y se analizan con el software Cellquest o DIVA (BD Biosciences).

Mediciones de citocina IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-? (BD Biosciences), IL-13 (R&D Systems) se miden en sobrenadantes de cultivo de mLNs y en explantes de pulmón mediante ELISA.

Las células LN del mediastino provenientes de ratones sensibilizados y desafiados con OVA se vuelven a estimular in vitro durante 3 días con la proteína OVA (1 mg/ml) y la producción de IL-4, IL-5 e IL-13 se cuantifica mediante ELISA en los sobrenadantes de cultivo. Los explantes de pulmones se cultivan durante la noche en medio completo y se recolectan los sobrenadantes de cultivo para medir la liberación de citocina.

Resultados Datos in vivo con modelos animales de múrido para uso de SIRPa-Fc en el tratamiento de asma alérgica CD47 y SIRPa parecen ser moléculas importantes en el inicio y perpetuación de inmunidad tipo Th2 impulsada por DC SIRPa + CD103-. De esta manera, por lo tanto, éstas se pueden utilizar terapéuticamente para reducir la inflamación del pulmón y mejorar la enfermedad de vías respiratorias. Se evalúa la eficacia de SIRPa más la región Fe de IgG de humano (SIRPa-Fc) sobre el desarrollo de inflamación alérgica de las vías respiratorias. Ratones BALB/c a los que se les administra ya sea SIRPa-Fc en los días 0 y 5 de la inmunización con OVA (Figura 3a) tienen muy poca o nada de infiltración celular inflamatoria de los tejidos pulmonares después del desafío con aerosol de OVA (Figura 3b). Una fuerte reducción o una ausencia de eosinófilos, neutrófitos y linfocitos en el BALF (Figura 3c) ocurre junto con una caída en IgE específica e OVA en suero (Figura 3d), una reducción de 50% en la celularidad del nodulo linfático y una inhibición drástica de la producción de IL-4, IL-5 e IL-13 en las mLN (Figuras 3e y 3f). La protección contra desarrollo de enfermedad de vías respiratorias no se correlaciona con un incremento en la liberación de IL-10 o de IFNy, la cual de hecho también está suprimida en los ratones tratados (datos no mostrados). Después se examina la liberación de citocina y quimiocina en los sobrenadantes de cultivo de los explantes de pulmón de ratones tratados con CD47 y SIRPa-Fc y se encuentra que se inhibieron las liberaciones de IL-5, IL-13 y eotaxina mientras que la expresión de IL-4 permanece sin cambio (Figuras 3 g y 3h).

Después se exploran los mecanismos potenciales que gobiernan está inhibición y dan como resultado protección contra enfermedad de las vías aéreas. Se encontró una disminución en la acumulación de células dendríticas SIRPa + CD103- en las mLN de ratones tratados con CD47-Fc (Figura 4a). La administración de SIRPa-Fc también lleva a una reducción en la proporción de células T Tg marcadas con CFSE en las mLNs de ratones inmunizados con OVA tratados con CD47-Fc (Figura 4b). Por último, se observa un decremento en la proporción y acumulación de eosinófilos en las mLn de ratones tratados con SIRPa-Fc (Figura 4c).

Estos datos demuestran que la interrupción de CD47/SIRPa en la sensibilización con Ag primario reduce drásticamente las respuestas tipo 2 en las mLN y pulmones así como la inflamación de vías respiratorias independiente de IgE. 5. Datos in vivo con modelos animales de múrido para uso de SIRPa-Fc en el tratamiento de colitis Se disuelve ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) (2 o 3 mg) en etanol al 50% y se instila en el colon de ratones Balb/c machos (WT y CD47 KO) mediante un catéter 3.5 F. Los ratones de control reciben etanol sólo. Los ratones se pesan cada 24 horas y se sacrifican en el día 2 (punto de tiempo temprano) o en el día 4. En el modelo de colitis crónica por TNBS, se instilan 1.5 mg de TNBS por vía intra-rectal en el día 0 y de nuevo en el día 7, y los ratones se sacrifican en el día 12. El suero, nodos linfáticos mesentéricos y el colon se recolectan para análisis posterior. El colon se califica macroscópicamente utilizando los criterios de Wallace los cuales toman en consideración la presencia de diarrea, adhesiones, engrosamiento de la pared intestinal y ulceración. Estos también se evalúan 'respecto a marcadores microscópicos de inflamación utilizando los criterios de Ameho, un sistema de calificación basado en el engrosamiento de la submucosa, infiltración de la submucosa y lamina propria con células mononucleares, depleción de moco, pérdida de la arquitectura de la cripta, y edema (no mostrado). Se adiminstra una proteína de fusión SIRPa-Fc recombinante de ratón por vía intraperitoneal (100 ug/ratón) justo antes de la inducción de colitis con TNBS y 24 después de esto. Los ratones de control reciben solución salina sola. La inyección de SIRPa-Fc de múrido 100 pg/animal en el día 0, 30 minutos antes de la inducción con TNBS y en el día 1 bloquea en forma estadísticamente significativa el desarrollo de la enfermedad según se evalúa mediante pérdida de peso corporal. 6. Modelos animales de múrido in vivo para uso de SIRPa-Fc en el tratamiento de artritis Modelo de artritis inducida por colágena Se mezcla Mycobacterium tuberculosis con coadyuvante completo de Freund y se agita minuciosamente (= solución A). Alícuotas de solución de colágena de bovino se mezclan bien sobre hielo con PBS estéril (= solución B). La solución A y la solución B se inyectan como emulsión en ratones DBA/1 machos no afectados por tratamiento. Los ratones se anestesian mediante inyección subcutánea de una mezcla de ketamina esterilizada por filtración. Después de la narcosis, se afeita la raíz de la cola de cada ratón y posteriormente se inyectan por vía intradérmica, 0.1 mi de la emulsión de colágena por ratón (que contiene 100 pg de colágena) en la base de la cola. En el día 22 se administra una segunda inyección por vía intraperitoneal de 100 µ? de colágena/PBS (dilución 1:5) después de la primera inmunización (= refuerzo). La hinchazón y calificación del enfermedad se evalúa como se describe en Nat Protoc. 2007;2(5):1269-75 por Brand et al. 7.- Secuencias de aminoácido y nucleótido útiles para practicar la invención TABLA 3 SEQ ID SECUENCIA Secuencia líder de Sirpa de tipo silvestre SEQ ID NO:1 Secuencia de dominio D1 de Sirpa de tipo silvestre SEQ ID NO:2 Secuencia de dominio D1-D2-D3 de Sirpa de tipo SEQ ID NO:3 silvestre SEQ ID NO:4 Secuencia polimórfica T50S de dominio D1 de Sirpa SEQ ID NO:5 Secuencia polimórfica D95E de dominio D1 de Sirpa Secuencia polimórfica V302L de dominio D1-D2-D3 de SEQ ID NO:6 Sirpa de tipo silvestre SEQ ID NO:7 Secuencia enlazadora de FC de tipo silvestre de lqG1 Secuencia mutada enlazadora de FC de lqG1 (Cvs SEQ ID NO:8 remplazado con Ser) SEQ ID NO:9 Secuencia enlazadora de FC de tipo silvestre de lqG1 SEQ ID NO:10 Secuencia mutada enlazadora de FC de lqG1 (Cvs remplazado con Ser) SEQ ID NO:11 Secuencia enlazadora de tipo no silvestre SEQ ID NO:12 Secuencia enlazadora de tipo no silvestre SEQ ID NO:13 Secuencia de FC silenciosa de lqG1 TABLA 3 ícont.)

Claims

REIVINDICACIONES

1 - Un polipéptido de unión a CD47 soluble para su uso como un medicamento, que comprende un polipéptido derivado de SIRPa que se selecciona de entre el grupo que consiste de: a) un dominio extracelular de SIRPa (SEQ ID NO:3); b) un fragmento de SEQ ID NO:3, y, c) un polipéptido variante de SEQ ID NO:3 que tiene por lo menos 75% de identidad para SEQ ID NO:2; en donde dicho polipéptido derivado de SIRPa se une a CD47 de humano (SEQ ID NO:24).

2. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido de unión a CD47 soluble se une a CD47 de humano con una KD de 2 µ? o menor, e inhibe la secreción de citocina inducida como se mide en una prueba de liberación de citocina de célula dendrítica estimulada por complejo inmune.

3. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho polipéptido derivado de SIRPa está fusionado a un fragmento Fe de IgG.

4. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicho fragmento Fe de IgG es un fragmento Fe mutante aglucosilado.

5. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho dominio extracelular de SIRPa comprende por lo menos la región V de SIRPa (SEQ ID NO:2).

6. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso como un fármaco en el tratamiento de trastornos autoinmunes e inflamatorios.

7. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso como un fármaco en el tratamiento de a) inflamación de vías aéreas mediadas por Th2; b) trastornos alérgicos; c) asma; d) enfermedades inflamatorias del intestino; e) artritis; f) trastornos isquémicos; o, g) leucemias o cáncer.

8. - El polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho polipéptido consiste esencialmente de un dominio extracelular de SIRPa fusionado al fragmento Fe de un IgG de humano.

9. - Una proteína que comprende por lo menos dos polipéptidos de unión a CD47 solubles de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. - Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la proteína de conformidad con la reivindicación 9. - 11.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. 12. - Un ácido nucleico aislado que codifica para el polipéptido de unión a CD47 soluble de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 13. - Un vector de clonación o expresión que comprende uno o más ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 12. 14. - Un vector de clonación o expresión de conformidad con la reivindicación 13, el cual comprende por lo menos un ácido nucleico de SEQ ID NO:25 o 26. 15. - Una célula hospedera que comprende uno o más vectores de clonación o expresión de conformidad con la reivindicación 13 o 14. 16. - La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicha célula hospedera es una célula de mamífero, por ejemplo, célula CHO.