JP2021519758A - Ｌｆａ３バリアントならびにその組成物および使用法 - Google Patents

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Abstract

本発明はLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3融合ポリペプチド分子を提供する。本発明は、該LFA3ポリペプチド分子の使用、および該LFA3ポリペプチド分子を使用する関連した方法を包含する。

Description

関連出願
本願は、2018年3月29日に出願された米国特許出願第62/650,022号および2018年12月21日に出願された米国特許出願第62/783,986号に基づく優先権を主張し、これらの特許出願のそれぞれの内容は参照によりそのすべてが本明細書に組み入れられる。
配列表の参照
本願は電子出願されており、電子提出された.txtフォーマットの配列表を含む。この.txtファイルには、2019年3月21日に作成された、サイズが127,715バイトである、「PC72432A_Seq_Listing_ST25.txt」というファイル名の配列表が含まれている。この.txtファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりそのすべてが本明細書に組み入れられる。
共同研究の当事者に関する陳述
本願に係る発明は、以下に列挙する共同研究契約の当事者によって、またはそれらの当事者を代表してなされた。共同研究契約は本願に係る発明がなされた日またはそれ以前に発効しており、本願に係る発明は、共同研究契約の範囲内で着手された活動の結果としてなされた。共同研究契約の当事者は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校を代表するカリフォルニア大学理事会（THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA）およびPFIZER INC.である。
分野
本発明はリンパ球機能関連抗原3（LFA3）ドメインを含むポリペプチド分子、ならびにその組成物、方法、および使用に関する。
背景
CD58としても公知であるリンパ球機能関連抗原3（LFA3）はCD2のリガンドであり、抗原提示細胞（APC）を含む多くの細胞タイプ上に発現する（Miller et al.,J.Exp.Med.1993 178（1）:211-22（非特許文献1）、Krueger et al.,Expert Opin.Biol.Ther.2002 2（4）:431-41（非特許文献2）、Haider et al.,J.Immunol.2007 393:411-20（非特許文献3）、Punch et al.,Transplantation 1999 67（5）:741-8（非特許文献4）、Leitner et al.,J.Immunol.2015 195（2）:477-87（非特許文献5））。CD2はすべてのT細胞上に発現するが、ナイーブT細胞または制御性T細胞と比べるとメモリーT細胞の方がその発現量は多い（Chamian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2005 102（6）:2075-80（非特許文献6）、Rigby et al.,J.Clin.Invest.2015 125（8）:3285-96（非特許文献7））。ヒトの場合、CD2はNK細胞上および一部の樹状細胞集団上にも発現する。T細胞上またはNK細胞上のCD2とアクセサリー細胞上のLFA3との相互作用は、ナイーブリンパ球にも、以前に活性化されたリンパ球またはメモリーリンパ球にも、共刺激シグナルを送達することができる。この共刺激シグナルは、潜在的に、細胞間相互作用のアビディティーの増大および/またはCD2を介した直接的共刺激シグナルの送達を伴う（Kaizuka et al.J.Cell Biol.2009 185（3）:521-34（非特許文献8）、Skanland et al.,Biochem.J.2014 460（3）:399-410（非特許文献9））。このように、例えば可溶性LFA3分子を使用するなどしてCD2を標的とすることは、1型糖尿病（T1D）および/または乾癬性関節炎などの自己免疫疾患の処置にとって、治療的利益を有しうる。したがって、免疫応答の媒介におけるCD2とLFA3との突出した役割を考えると、CD2を発現する免疫エフェクター細胞を枯渇させると共に、CD2の活性を調節するための戦略を開発する必要がある。
Miller et al.,J.Exp.Med.1993 178（1）:211-22 Krueger et al.,Expert Opin.Biol.Ther.2002 2（4）:431-41 Haider et al.,J.Immunol.2007 393:411-20 Punch et al.,Transplantation 1999 67（5）:741-8 Leitner et al.,J.Immunol.2015 195（2）:477-87 Chamian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2005 102（6）:2075-80 Rigby et al.,J.Clin.Invest.2015 125（8）:3285-96 Kaizuka et al.J.Cell Biol.2009 185（3）:521-34 Skanland et al.,Biochem.J.2014 460（3）:399-410
本開示は、1つには、ある特定のLFA3-Fc融合ポリペプチドが、CD2発現細胞を枯渇させると共に、CD2の活性を調節するという発見を提供する。CD2発現細胞の調節は、糖尿病および/または乾癬性関節炎などの自己免疫疾患の処置において有益な効果を有しうる。本願は、LFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3融合ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子を開示する。ある特定の局面において、LFA3ポリペプチド分子はCD2に結合し、CD2-LFA3相互作用を調節し、CD2を発現するメモリーT細胞を選択的に枯渇させる。
理論に束縛されることは望まないが、本明細書に開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1（本明細書ではM1-d1、LFA3-Fc M1d1、およびLFA3-Fc M1-d1ともいう）は、CD2＋TEM細胞の機能と選択的枯渇を調節することで、制御性/TEM細胞数を再バランスする。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、病原性Tエフェクター細胞の排除および/または抑制を促進する。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、CD2とLFA3の間の相互作用を調節し、それによって、CD2が媒介するT細胞共刺激を妨げる。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、FcRが媒介する抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）によって、CD2＋T細胞を枯渇させる。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、アポトーシスによってCD2＋T細胞を枯渇させる。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、制御性T細胞（Treg）を保ちつつ、CD2high Tメモリー細胞（Tmem）の数、例えばセントラルメモリーT細胞（TCM）およびエフェクターメモリーT細胞（TEM）の数を減少させる。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、制御性Tナイーブ細胞を保ちつつ、CD2high Tmem細胞の数、例えばセントラルメモリーT細胞（TCM）およびエフェクターメモリーT細胞（TEM）の数を減少させる。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、例えばCD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞におけるTreg/TEM比またはTreg/TCM比を増加させる。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、PD-1および/またはTIGITを発現するCD4＋TEM細胞の比率を増加させる。
理論に束縛されることは望まないが、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1は、1型糖尿病（T1D）におけるβ細胞破壊の主たる原因となる細胞であるCD4＋およびCD8＋TEM（Tエフェクターメモリー）細胞上に最も顕著に発現する細胞表面タンパク質CD2に結合する。本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子、例えばM1d1の投与は、T1D患者における内因性インスリン産生の長期間にわたる保全、インスリン必要量の低減、重度低血糖（major hypoglycemia）の率の減少、およびβ細胞の回復につながりうる。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3ポリペプチド分子は、それらの安定性および製造性を野生型LFA3配列と比べて向上させるために、操作されている。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3ポリペプチド分子は、CD2に対するそれらの結合アフィニティーを野生型LFA3配列と比べて増大させるために、操作されている。
一局面において、本開示は、第2のドメインに融合されたLFA3ドメインを含むLFA3融合ポリペプチド分子を提供する。理論に束縛されることは望まないが、LFA3融合ポリペプチド分子中のLFA3ドメインのC末端境界を延長すると、LFA3融合ポリペプチド分子の1つまたは複数の活性が向上する。例えば、野生型LFA3の93番目（例えばSEQ ID NO:2の93番目）に対応するLeuであるアミノ酸残基、または野生型LFA3の93〜98番目（例えばSEQ ID NO:2の93〜98番目）に対応するLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）を含むようにLFA3ドメインのC末端境界を延長すると、例えば図6B〜図6Dに示されるように、熱安定性の増大および/または凝集の低減など、LFA3融合ポリペプチド分子の1つまたは複数の活性が向上する。
当業者は、本明細書に記載する本発明の具体的態様の数多くの等価物を、認識するかまたは日常的程度の実験を使用して確かめることができるであろう。そのような等価物は以下の実施形態（E）によって包含されるものとする。
E1.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子（例えば融合ポリペプチド分子）であって、LFA3ドメインを含み（例えば本明細書に記載のバリアントLFA3-Fc融合体）、かつ以下の特性のうちの1つまたは複数を有する、単離されたポリペプチド分子:
i.例えばサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）および/または図3Aに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約98、または約99％を上回る単量体のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された単量体発現、
ii.例えばSECおよび/または図6Cに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約75、約80、約85、約90、約95、約98、もしくは約99％を上回る単量体のパーセンテージ、約10、約8、約6、約4、もしくは約2％未満である低分子量種（LMWS）のパーセンテージ、および/または約5、約2、もしくは約1％未満である高分子量種（HMWS）のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された単量体発現および低減した多量体発現、
iii.例えばSECおよび/または図3Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、37.4℃で24時間インキュベートした後に約90、約92、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージを示しかつ/または40℃で24時間インキュベートした後に約75、約80、もしくは約85％を上回る単量体のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向、
iv.例えばSECおよび/または表4に関連して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、40℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、もしくは約20％以下の増加および/または50℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、約20、もしくは約25％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向、
v.例えばSECおよび/または表4に関連して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、低pH、5時間でのHMWSにおける約6、約7、約8、または約9％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、低pH下での凝集傾向、
vi.キャピラリーゲル電気泳動（CGE）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）および/または図30A〜図30Cもしくは図31A〜図31Dに関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、40℃で2週間または4週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、約2、約3、約4、もしくは約5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
vii.SE-HPLCおよび/または図32A〜図32Dに関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、25℃で2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
viii.SE-HPLCおよび/または図33A〜図33Dに関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、5℃で2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
ix.例えばSECおよび/または表4に関連して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、5サイクルの凍結融解後にHMWSにおける約0.5、約1、または約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された凍結融解安定性、
x.例えば図3Bに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、Expi293培養物20mLあたり約5.5、約6、約6.5、または約7mgを上回る収量を有する、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加した収量、
xi.例えば示差走査蛍光光度法（DSF）によっておよび/または図3Cに関して実施例1に述べる方法を使用して測定した場合に、例えば、約38、約40、約42、または約45℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xii.例えばDSFによっておよび/または図5Bに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約40、約45、約50、約55、または約60℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xiii.例えばDSFによっておよび/または図6Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約40、約45、または約50℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xiv.例えばDSFによっておよび/または図7Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約45、約50、または約55℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xv.例えば示差走査熱量測定法（DSC）によっておよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約50℃または約60℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xvi.例えばDSCによっておよび/または表13に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、pH7.5において約55、約58、約60、約62、約64、もしくは約66℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;pH5.8において約55、約58、約60、約62、もしくは約64℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;またはpH4.5において55、58、もしくは60℃を上回るTm1および約75、約78、もしくは約80℃を上回るTm2、
xvii.例えばDSCによっておよび/または表14に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、pH7.5またはpH4.5において約50℃または約60℃を上回るTmを有し;pH5.8において約50℃または約62℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xviii.例えばDSCおよびFabRICATOR IdeSによってならびに/または表15に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約50℃または約60℃を上回るTmを有する、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xix.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、例えばSPRによっておよび/または図5Aに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、ヒトCD2に対して約1.2、約1、約0.8、約0.6、約0.4、約0.2、約0.1、または約0.08μM未満のKD、
xx.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、例えばSPRによっておよび/または図7Cに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、ヒトCD2に対して約1.3、約1.2、約1.1、もしくは約1μM未満のKDおよび/またはカニクイザルCD2に対して約1.4、約1.3、約1.2、約1.1、もしくは約1μM未満のKD、
xxi.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えば表6に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4 Tメモリー（Tmem）細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKd、
xxii.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えばSPRならびに/または表10および図11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4メモリーT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、もしくは約1500pM以下であるIC50計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約150、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、もしくは約800pM以下であるIC50計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、もしくは約500pM以下であるIC50計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、もしくは約600pM以下であるIC50計算値;ならびに/またはCD8ネイティブT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、約1500、約1600、もしくは約1700pM以下であるIC50計算値、
xxiii.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えばSPRならびに/または表10および図11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、または約600pM以下であるKd計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKd計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、または約300pM以下であるKd計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約50、約100、または約150pM以下であるKd計算値;CD8ナイーブT細胞への結合に関して約50、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値、
xxiv.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えばSPRならびに/または図18Aおよび図18Bに関して実施例3に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、カニクイザルCD4＋TEM細胞への結合に関するEC50、
xxv.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイならびに/または表17および図12Aおよび図12Bに関して実施例5に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4 Tmem細胞の殺滅に関して約400、約600、約800、約1000、約1200、約1400pM以下、または約1500pM以下であるEC50、
xxvi.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイならびに/または表17および図12Dに関して実施例5に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD8 Tmem細胞の死滅に関して約1、約5、約10、約20、約30、約40、約50nM以下であるEC50、
xxvii.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖およびサイトカイン産生などの同種異系T細胞応答の阻害、例えば混合リンパ球反応（MLR）アッセイならびに/または表6および図14Aおよび図14Bに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約400、約800、約1200、約1600、約2000、または約2400pM以下であるIC50、
xxviii.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖およびサイトカイン産生などの同種異系T細胞応答の阻害、例えば混合リンパ球反応（MLR）アッセイならびに/または図15Bおよび図15Cに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、NK細胞非存在下での混合リンパ球反応（MLR）アッセイに関して約300、約400、約500、約600、約800、約1000、約1500、または約2000pM以下であるIC50、
xxix.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、破傷風トキソイドリコール応答の阻害、例えば破傷風トキソイドリコール（TTR）アッセイならびに/または表6および図16Aおよび図16Bに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4 Tmem IFNγ産生に関して約1、約2、約5、約10、約15、約20、または約25nM以下であるIC50、
xxx.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて遅い、インビボでのクリアランス、例えば表11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約0.14、約0.16、約0.18、約0.2、または約0.22mL/hr/kgを超えない中枢からのクリアランス、
xxxi.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された純度、例えばキャピラリーゲル電気泳動および/または実施例1もしくは実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、少なくとも約98％または少なくとも約99％の純度、あるいは
xxxii.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減したシアル酸修飾、例えばキャピラリーゲル電気泳動および/または実施例1もしくは実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、約20、約18、約16、約14、約12、約10、約9、約8、または約7nmolシアル酸/nmolポリペプチドを超えない純度。
E2.例えばSECおよび/または図3Aに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約70、約75、約80、約85、約90、または約95％を上回る単量体のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された単量体発現を有する、E1に記載の単離されたポリペプチド分子。
E3.例えばSECおよび/または図6Cに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約75、約80、約85、約90、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージ、約10、約8、約6、約4、もしくは約2％未満である低分子量種（LMWS）のパーセンテージ、および/または約5、約2、もしくは約1％未満である高分子量種（HMWS）のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された単量体発現および低減した多量体発現を有する、E1またはE2に記載の単離されたポリペプチド分子。
E4.例えばSECおよび/または図3Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、37.4℃で24時間インキュベートした後に約90、約92、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージを示しかつ/または40℃で24時間インキュベートした後に約75、約80、もしくは約85％を上回る単量体のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて、低減した、熱ストレス下での凝集傾向を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E5.例えばSECおよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、40℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、もしくは約20％以下の増加および/または50℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、約20、もしくは25％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E6.例えばSECおよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、低pH、5時間でのHMWSにおける約6、約7、約8、または約9％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、低pH下での凝集傾向を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E7.例えばSECおよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、5サイクルの凍結融解後にHMWSにおける約0.5、約1、または約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて、増強された凍結融解安定性を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E8.キャピラリーゲル電気泳動（CGE）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）および/または図30A〜図30Cもしくは図31A〜図31Dに関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、40℃で2週間または4週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、約2、約3、約4、もしくは約5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E9.SE-HPLCおよび/または図32A〜図32Dに関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、25℃で2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E10.SE-HPLCおよび/または図33A〜図33Dに関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、5℃で2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E11.SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加した収量を有し、例えば図3Bに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、Expi293培養物20mLあたり約5.5、約6、約6.5、または約7mgを上回る収量を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E12.SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、例えば約38、約40、約42、または約45℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E13.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えば約40、約45、約50、約55、または約60℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E14.SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えばDSFによっておよび/または図6Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約40、約45、または約50℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E15.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えばDSFによっておよび/または図7Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約45、約50、または約55℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E16.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えば示差走査熱量測定法（DSC）によっておよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約50℃または約60℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E17.例えばDSCによっておよび/または表13に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、pH7.5において約55、約58、約60、約62、約64、もしくは約66℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;pH5.8において約55、約58、約60、約62、もしくは約64℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;またはpH4.5において約55、約58、もしくは約60℃を上回るTm1および約75、約78、もしくは約80℃を上回るTm2を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E18.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えばDSCによっておよび/または表14に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、pH7.5またはpH4.5において約50℃または約60℃を上回るTmを有し;pH5.8において約50℃または約62℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E19.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えばDSCおよびFabRICATOR IdeSによってならびに/または表15に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約50℃または約60℃を上回るTmを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E20.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、例えばSPRによっておよび/または図5Aに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、ヒトCD2に対して約1.2、約1、約0.8、約0.6、約0.4、約0.2、約0.1、または約0.08μM未満であるKDを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E21.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、例えばSPRによっておよび/または図7Cに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、ヒトCD2に対して約1.3、約1.2、約1.1、もしくは約1μM未満であるKDおよび/またはカニクイザルCD2に対して約1.4、約1.3、約1.2、約1.1、もしくは約1μM未満であるKDを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E22.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えば表6に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4 Tmem細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKdを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E23.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えばSPRならびに/または表10および図11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4メモリーT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、もしくは約1500pM以下であるIC50計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約150、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、もしくは約800pM以下であるIC50計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、もしくは約500pM以下であるIC50計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、もしくは約600pM以下であるIC50計算値;ならびに/またはCD8ネイティブT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、約1500、約1600、もしくは約1700pM以下であるIC50計算値を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E24.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えばSPRならびに/または表10および図11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、または約600pM以下であるKd計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKd計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、または約300pM以下であるKd計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約50、約100、または約150pM以下であるKd計算値;CD8ナイーブT細胞への結合に関して約50、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E25.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、例えばSPRならびに/または図18Aおよび図18Bに関して実施例3に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、カニクイザルCD4＋TEM細胞への結合に関してSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減したEC50を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E26.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、例えばADCCアッセイならびに/または表17および図12Aおよび図12Bに関して実施例5に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4 Tmem細胞の死滅に関して約400、約600、約800、約1000、約1200、または約1400pM以下であるEC50を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E27.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイならびに/または表17および図12Dに関して実施例5に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD8 Tmem細胞の死滅に関して約1、約5、約10、約20、約30、約40、または約50nM以下であるEC50を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E28.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖およびサイトカイン産生などの同種異系T細胞応答の阻害、例えばMLRアッセイならびに/または表6および図14Aおよび図14Bに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約400、約800、約1200、約1600、約2000、または約2400pM以下であるIC50を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E29.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖およびサイトカイン産生などの同種異系T細胞応答の阻害、例えばMLRアッセイおよび/または図15Bおよび図15Cに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約300、約400、約500、約600、約800、約1000、約1500、または約2000pM以下であるNK細胞非存在下でのIC50を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E30.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、破傷風トキソイドリコール応答の阻害、例えばTTRアッセイならびに/または表6および図16Aおよび図16Bに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、CD4 Tmem IFNγ産生に関して約1、約2、約5、約10、約15、約20、または約25nM以下であるIC50を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E31.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて遅い、インビボでのクリアランス、例えば表11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、約0.14、約0.16、約0.18、約0.2、または約0.22mL/hr/kgを超えない中枢からのクリアランスを有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E32.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された純度、例えばキャピラリーゲル電気泳動および/または実施例1もしくは実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、少なくとも約98％または少なくとも約99％の純度を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E33.SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減したシアル酸修飾、例えばキャピラリーゲル電気泳動および/または実施例1もしくは実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、約20、約18、約16、約14、約12、約10、約9、約8、または約7nmolシアル酸/nmolポリペプチドを超えない純度を有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E34.以下の特性のうちの1つまたは複数をさらに有する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子:
i.CD2high TEM細胞、例えばCD4＋および/またはCD8＋TEM細胞に、例えばインビボで、優先的に結合すること、
ii.例えば図13Aに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、NK細胞の存在下でCD2発現細胞（例えばCD4＋もしくはCD8＋TCM細胞、またはCD4＋もしくはCD8＋TEM細胞）を殺滅すること、
iii.例えば図20Aに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、CD4＋および/またはCD8＋TEM細胞、例えば末梢CD4＋TEM細胞を、インビボで減少させること、
iv.例えば図20Bに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えばCD4＋T細胞における、Treg/TEM比をインビボで増加させること、あるいは
v.例えばCD4＋および/またはCD8＋T細胞における、Treg/TCM比を増加させること。
E35.CD2high TEM細胞、例えばCD4＋および/またはCD8＋TEM細胞に、例えばインビボで、優先的に結合する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E36.例えば図13Aに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、NK細胞の存在下でCD2発現細胞（例えばCD4＋もしくはCD8＋TCM細胞、またはCD4＋もしくはCD8＋TEM細胞）を殺滅する、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E37.例えば図20Aに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、CD4＋および/またはCD8＋TEM細胞、例えば末梢CD4＋TEM細胞をインビボで減少させる、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E38.例えば図20Bに関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、例えばCD4＋T細胞における、Treg/TEM比をインビボで増加させる、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E39.例えばCD4＋および/またはCD8＋T細胞における、Treg/TCM比を増加させる、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
代替的にまたは本明細書において提供される態様（例えばE1〜E39）のいずれかと組み合わせて、ポリペプチド分子は、以下の特徴および態様のうちの1つまたは複数を有する。
E40.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:73のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:73の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E41.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:74）またはSEQ ID NO:74の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、F、I、L、V、A、またはYであり、
X2が、F、I、L、V、M、A、またはNleであり、
X3が、F、I、L、V、Nle、M、またはAであり、
X4が、F、I、L、V、M、A、またはNleであり、
X5が、W、F、L、C、またはYであり、
X6が、F、I、L、V、M、A、またはNleであり、
X7が、A、V、S、L、またはIであり、
X8が、F、I、L、V、Nle、M、またはAであり、
X9が、F、I、L、V、A、またはYであり、
X10が、A、V、S、L、またはIであり、
X11が、F、I、L、V、Nle、M、またはAであり、
X12が、S、T、A、またはGであり、
X13が、F、I、L、V、Nle、M、またはAであり、
X14が、M、L、I、またはFであり、
X15が、M、L、I、またはFであり、
X16が、F、I、L、V、A、またはYであり、かつ
X17が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E42.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:75）またはSEQ ID NO:75の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、F、I、L、またはVであり、
X2が、F、I、L、またはVであり、
X3が、F、I、L、またはVであり、
X4が、F、I、L、またはVであり、
X5が、W、F、L、またはCであり、
X6が、F、I、L、またはVであり、
X7が、A、V、S、またはLであり、
X8が、F、I、L、またはVであり、
X9が、F、I、L、またはVであり、
X10が、A、V、S、またはLであり、
X11が、F、I、L、またはVであり、
X12が、S、T、A、またはGであり、
X13が、F、I、L、またはVであり、
X14が、M、L、I、またはFであり、
X15が、M、L、I、またはFであり、
X16が、F、I、L、またはVであり、かつ
X17が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E43.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:3と比べて残基15、17、23、26、28、35、36、38、43、45、55、60、62、77、86、または88に、1つまたは複数の変異（例えば置換、欠失、または付加）を含む、単離されたポリペプチド分子。
E44.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E43に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.F15I、F15L、F15V、F15A、またはF15Yから選択される置換、
ii.V17F、V17I、V17L、V17M、V17A、またはV17Nleから選択される置換、
iii.L23F、L23I、L23V、L23Nle、L23M、またはL23Aから選択される置換、
iv.V26F、V26I、V26L、V26M、V26A、またはV26Nleから選択される置換、
v.W28F、W28L、W28C、またはW28Yから選択される置換、
vi.V35F、V35I、V35L、V35M、V35A、またはV35Nleから選択される置換、
vii.A36V、A36S、A36L、またはA36Iから選択される置換、
viii.L38F、L38I、L38V、L38Nle、L38M、またはL38Aから選択される置換、
ix.F43I、F43L、F43V、F43A、またはF43Yから選択される置換、
x.A45V、A45S、A45L、またはA45Iから選択される置換、
xi.L55F、L55I、L55V、L55Nle、L55M、またはL55Aから選択される置換、
xii.G60S、G60T、またはG60Aから選択される置換、
xiii.L62F、L62I、L62V、L62Nle、L62M、またはL62Aから選択される置換、
xiv.M77L、M77I、またはM77Fから選択される置換、
xv.M86L、M86I、またはM86Fから選択される置換、あるいは
xvi.F88I、F88L、F88V、F88A、またはF88Yから選択される置換。
E45.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含むE43に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.F15I、F15L、またはF15Vから選択される置換、
ii.V17F、V17I、またはV17Lから選択される置換、
iii.L23F、L23I、またはL23Vから選択される置換、
iv.V26F、V26I、またはV26Lから選択される置換、
v.W28F、W28L、またはW28Cから選択される置換、
vi.V35F、V35I、またはV35Lから選択される置換、
vii.A36V、A36S、またはA36Lから選択される置換、
viii.L38F、L38I、またはL38Vから選択される置換、
ix.F43I、F43L、またはF43Vから選択される置換、
x.A45V、A45S、またはA45Lから選択される置換、
xi.L55F、L55I、またはL55Vから選択される置換、
xii.G60S、G60T、またはG60Aから選択される置換、
xiii.L62F、L62I、L62Vから選択される置換、
xiv.M77L、M77I、またはM77Fから選択される置換、
xv.M86L、M86I、またはM86Fから選択される置換、あるいは
xvi.F88I、F88L、またはF88Vから選択される置換。
E46.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:76）のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:76の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E47.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:77）またはSEQ ID NO:77の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、A、V、S、L、またはIであり、
X2が、F、I、L、V、Nle、M、またはAであり、
X3が、F、I、L、V、A、またはYであり、
X4が、A、V、S、L、またはIであり、
X5が、M、L、I、またはFであり、
X6が、M、L、I、またはFであり、かつ
X7が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E48.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:78）またはSEQ ID NO:78の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、A、V、S、またはLであり、
X2が、F、I、L、またはVであり、
X3が、F、I、L、またはVであり、
X4が、A、V、S、またはLであり、
X5が、M、L、I、またはFであり、
X6が、M、L、I、またはFであり、かつ
X7が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E49.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:79）またはSEQ ID NO:79の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、V、L、またはAであり、
X2が、FまたはLであり、
X3が、V、I、L、またはFであり、
X4が、A、V、またはSであり、
X5が、M、F、I、またはLであり、
X6が、F、M、I、またはLであり、かつ
X7が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E50.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:80）またはSEQ ID NO:80の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、VまたはLであり、
X2が、V、IまたはLであり、
X3が、AまたはVであり、
X4が、MまたはFであり、
X5が、FまたはMであり、かつ
X6が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E51.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:80）を含み、ここで、
X1が、VまたはLであり、
X2が、V、I、またはLであり、
X3が、AまたはVであり、
X4が、MまたはFであり、
X5が、FまたはMであり、かつ
X6が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
E52.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:81）またはSEQ ID NO:81の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、VまたはLであり、
X2が、V、IまたはLであり、
X3が、AまたはVであり、
X4が、MまたはFであり、かつ
X5が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E53.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:81）を含み、ここで、
X1が、VまたはLであり、
X2が、V、I、またはLであり、
X3が、AまたはVであり、
X4が、MまたはFであり、かつ
X5が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
E54.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:82）またはSEQ ID NO:82の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、VまたはIであり、
X2が、AまたはVであり、
X3が、MまたはFであり、かつ
X4が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E55.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:82）を含み、ここで、
X1が、VまたはIであり、
X2が、AまたはVであり、
X3が、MまたはFであり、かつ
X4が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
E56.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:17〜23から選択されるアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E57.Leuであるアミノ酸残基またはLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）をさらに含む、E56に記載の単離されたポリペプチド分子。
E58.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:26〜29から選択されるアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E59.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:17のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E60.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E61.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:18のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E62.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E63.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:19のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E64.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E65.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:20のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E66.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E67.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:21のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E68.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E69.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E70.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E71.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E72.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E73.Leuであるアミノ酸残基またはLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）をさらに含む、E59〜E72に記載の単離されたポリペプチド分子。
E74.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:26のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E75.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E76.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:27のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E77.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E78.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:28のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E79.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E80.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:29のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E81.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E82.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:24もしくはSEQ ID NO:25から選択されるアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E83.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:24のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E84.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E85.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:25のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E86.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E87.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:30〜41から選択されるアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
E88.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:30〜41から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
E89.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:3と比べて、SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基36、38、43、45、77、または86に1つまたは複数の変異（例えば置換、欠失、または付加）を含む、単離されたポリペプチド分子。
E90.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36V、A36S、A36L、またはA36Iから選択される置換、
ii.L38F、L38I、L38V、L38Nle、L38M、またはL38Aから選択される置換、
iii.F43I、F43L、F43V、F43A、またはF43Yから選択される置換、
iv.A45V、A45S、A45L、またはA45Iから選択される置換、
v.M77L、M77I、またはM77Fから選択される置換、あるいは
vi.M86L、M86I、またはM86Fから選択される置換。
E91.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36V、A36S、またはA36Lから選択される置換、
ii.L38F、L38I、またはL38Vから選択される置換、
iii.F43I、F43L、またはF43Vから選択される置換、
iv.A45V、A45S、またはA45Lから選択される置換、
v.M77L、M77I、またはM77Fから選択される置換、あるいは
vi.M86L、M86I、またはM86Fから選択される置換。
E92.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36VまたはA36Lから選択される置換、
ii.L38Fの置換、
iii.F43V、F43I、またはF43Lから選択される置換、
iv.A45VまたはA45Sから選択される置換、
v.M77L、M77I、またはM77Fから選択される置換、あるいは
vi.M86L、M86I、またはM86Fから選択される置換。
E93.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36VまたはA36Lから選択される置換、
ii.L38Fの置換、
iii.F43V、F43I、またはF43Lから選択される置換、
iv.A45Vの置換、
v.M77Fの置換、あるいは
vi.M86Fの置換。
E94.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36Vの置換、
ii.L38Fの置換、
iii.F43VまたはF43Iから選択される置換、
iv.A45Vの置換、
v.M77Fの置換、あるいは
vi.M86Fの置換。
E95.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36Vの置換、
ii.L38Fの置換、
iii.F43Vの置換、または
iv.M86Fの置換。
E96.変異が、以下の置換を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:A36V、L38F、F43V、およびM86F。
E97.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36Vの置換、
ii.L38Fの置換、
iii.F43Vの置換、
iv.A45Vの置換、
v.M77Fの置換、または
vi.M86Fの置換。
E98.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、E89に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.A36Vの置換、
ii.L38Fの置換、
iii.F43Iの置換、
iv.A45Vの置換、
v.M77Fの置換、または
vi.M86Fの置換。
E99.SEQ ID NO:2の細胞外ドメイン由来の、例えばSEQ ID NO:2のアミノ酸残基93〜187由来の、1〜10個、例えば1〜6個のアミノ酸残基をさらに含む、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E100.
Figure 2021519758
のうちの1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基をさらに含む、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E101.LESLPS（SEQ ID NO:118）のうちの1、2、3、4、もしくは5個またはすべてのアミノ酸残基をさらに含む、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E102.第2のドメインをさらに含み、例えば融合タンパク質分子である、前記態様のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E103.LFA3ドメインが、第2のドメインに、例えばリンカーを介してまたはリンカーなしで、連結されており、例えば、LFA3ドメインのC末端が第2のドメインのN末端に連結されているか、またはLFA3ドメインのN末端が第2のドメインのC末端に連結されており、任意でLFA3ドメインのC末端が、第2のドメインのN末端にリンカーなしで連結されている、E102に記載の単離されたポリペプチド分子。
E104.第2のドメインが、分子間ジスルフィド結合などによって別の第2のドメインとの二量体を形成する能力を有する、E102またはE103に記載の単離されたポリペプチド分子。
E105.i.第2のドメインが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を媒介する能力を有するか、または
ii.第2のドメインが、CD16発現細胞、例えばCD16発現NK細胞もしくはCD16発現マクロファージに結合しかつそれらを活性化する能力を有する、
E102〜E104のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E106.第2のドメインが、免疫グロブリンタンパク質、例えば重鎖定常領域、例えばヒト重鎖定常領域、またはその機能的バリアントである、E102〜E105のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E107.第2のドメインが、重鎖（例えばIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4重鎖、例えばヒトIgG1重鎖）のFc領域、またはその機能的バリアントを含み、例えば第2のドメインが、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、またはそれらの機能的バリアントを含む、E102〜E106のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E108.第2のドメインが、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、例えば第2のドメインが、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む、E102〜E107のいずれかに記載の単離されたポリペプチド分子。
E109.CD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチドまたはそのフラグメントであって、第1のドメインと第2のドメインとを含み、
第1のドメインが、SEQ ID NO:26に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつポリペプチドがSEQ ID NO:3のアミノ酸を含まず、かつ
第2のドメインが、SEQ ID NO:16に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、
単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
E110.SEQ ID NO:69のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含まない、CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子。
E111.SEQ ID NO:69のアミノ酸配列を含む、CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子。
E112.前記態様のいずれかに記載のポリペプチド分子を2つまたはそれ以上含む、単離された多量体型（例えば二量体型）タンパク質分子。
E113.SEQ ID NO:26のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含むポリペプチド分子を2つまたはそれ以上含む、単離された多量体型（例えば二量体型）タンパク質分子であって、ポリペプチド分子がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離された多量体型タンパク質分子。
E114.SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を2つまたはそれ以上含む、単離された多量体型（例えば二量体型）タンパク質分子。
E115.SEQ ID NO:69のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含むポリペプチド分子を2つまたはそれ以上含む、単離された多量体型（例えば二量体型）タンパク質分子であって、ポリペプチド分子がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含まない、単離された多量体型タンパク質分子。
E116.SEQ ID NO:69のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を2つまたはそれ以上含む、単離された多量体型（例えば二量体型）タンパク質分子。
E117.E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子またはE112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子をコードする核酸分子。
E118.SEQ ID NO:44〜50、53〜56、122、もしくは123から選択されるヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含まない、核酸分子。
E119.SEQ ID NO:44〜50、53〜56、122、または123から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
E120.SEQ ID NO:53のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含まず、任意でSEQ ID NO:53のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
E121.SEQ ID NO:123のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含まず、任意でSEQ ID NO:123のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
E122.E117〜E121のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
E123.E117〜E121のいずれかに記載の核酸分子またはE122に記載のベクターを含む、宿主細胞。
E124.哺乳動物細胞である、E123に記載の宿主細胞。
E125.CHO細胞、COS細胞、HEK-293細胞、NS0細胞、PER.C6（登録商標）細胞、またはSp2.0細胞である、E124に記載の宿主細胞。
E126.E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子またはE112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
E127.HEPES緩衝食塩水をさらに含む、E126に記載の薬学的組成物。
E128.E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子またはE112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子が、約0.015、約0.15、または約1.5mg/mLの濃度で製剤化されている、E126に記載の薬学的組成物。
E129.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子を作製する方法であって、E123〜E125のいずれかに記載の宿主細胞を、ポリペプチド分子が宿主細胞によって発現される条件下で培養する工程を含む、方法。
E130.ポリペプチド分子を単離する工程をさらに含む、E129に記載の方法。
E131.E129またはE130に記載の方法を使用して生成されるポリペプチド分子。
E132.それを必要とする対象においてCD2の活性を低減する方法、例えばCD2シグナリングを低減する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
E133.それを必要とする対象において、CD2発現細胞、例えばCD2発現メモリーT細胞、例えばCD2発現TEM細胞、例えばCD2発現CD4＋TEM細胞またはCD2発現CD8＋TEM細胞の数を低減する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
E134.それを必要とする対象において、例えばCD4＋および/またはCD8＋T細胞におけるTreg/TEM比またはTreg/TCM比を増加させる方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
E135.それを必要とする対象において、CD2と天然に存在するLFA3分子との間の相互作用を妨害する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。
E136.それを必要とする対象において、炎症性の疾患、障害、または状態を処置する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。
E137.それを必要とする対象において、自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態を処置する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。
E138.免疫抑制を必要とする対象を処置する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。
E139.それを必要とする対象において、異常なメモリーT細胞応答に関連するまたは異常なメモリーT細胞応答によって媒介される疾患、障害、または状態を処置する方法であって、治療有効量の、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を、対象に投与する工程を含む、方法。
E140.前記対象がヒトである、E132〜E139のいずれかに記載の方法。
E141.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物を皮下、筋肉内、または静脈内に投与する工程を含む、E132〜E140のいずれかに記載の方法。
E142.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物を皮下に投与する工程を含む、E141に記載の方法。
E143.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物を筋肉内に投与する工程を含む、E141に記載の方法。
E144.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物を静脈内に投与する工程を含む、E141に記載の方法。
E145.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物の投与が、以下の特性のうちの1つまたは複数を有し、任意で、ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、週に1回約15mg/週の用量で皮下投与され、例えば多量体型タンパク質分子または薬学的組成物が1クールまたは複数クールにわたって投与され、各クールが12週からなり、2つの相接するクールが12週間の間隔で隔てられている、E132〜E144のいずれかに記載の方法:
i.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、週に2回、週に1回、2週間毎に1回、または3週間毎に1回、例えば週に1回投与されること、
ii.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、約5〜20mg/週（例えば5、6、7、8、9、10、12、15、17、または20mg/週）、例えば約7.5mg/週の用量で投与されること、
iii.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、注射1回あたり約0.2〜8mg（例えば注射1回あたり0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、または8mg）、例えば注射1回あたり0.22〜7.5mgまたは注射1回あたり7.5mgの用量で投与されること、
iv.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、注射1回あたり約0.5〜2.0mlの溶液（例えば注射1回あたり0.5、1、または1.5mlの溶液）、例えば注射1回あたり約1mlの溶液で投与されること、あるいは
v.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、1クールまたは複数クールにわたって投与され、例えば各クールが、10〜14週（例えば10、11、12、13、または14週）、例えば12週からなり、例えば相接する2つのクールが、10〜14週間の間隔（例えば10、11、12、13、または14週間の間隔）、例えば12週間の間隔で隔てられていること。
E146.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が、約0.03、約0.3、約3、または約100mg/kgの用量で投与される、E132〜E144のいずれかに記載の方法。
E147.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が約2mL/kgの投与体積で投与される、E132〜E144のいずれかに記載の方法。
E148.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が約7.5mg/週の用量で皮下投与される、E132〜E144のいずれかに記載の方法。
E149.ポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物が毎週投与される、E132〜E144のいずれかに記載の方法。
E150.医薬として使用するための、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物。
E151.対象におけるCD2活性の低減に使用するための、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物。
E152.免疫抑制を必要とする対象の処置に使用するための、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物。
E153.対象における自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態の処置に使用するための、E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物。
E154.前記対象が、以下の疾患、障害、または状態のうちの1つまたは複数を有する、E132〜E153のいずれかに記載の方法または使用:1型糖尿病、乾癬、尋常性乾癬、手掌足底膿疱症（palmoplantaris pustulosis）、手掌足底膿疱性乾癬、掌蹠膿疱症（pustulosis palmaris et plantaris）、手掌足底の膿疱症（pustulosis of palm and sole）、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、移植片対宿主病（GVHD）、白斑、毛孔性紅色粃糠疹、移植（例えば臓器移植、例えば腎臓移植）、乾癬性関節炎、同種異系造血幹細胞移植を必要とする疾患、障害、または状態、サラセミア、鎌形血球症、グランツマン血小板無力症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、重症先天性好中球減少症、白血球接着不全症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、先天性角化異常症、チェディアック・東症候群、再生不良性貧血、円形脱毛症、ならびにT細胞リンパ腫（例えば皮膚T細胞リンパ腫または末梢T細胞非ホジキンリンパ腫）。
E155.前記対象が、以下の疾患、障害、または状態のうちの1つまたは複数を有する、E132〜E153のいずれかに記載の方法または使用:真性糖尿病（例えばI型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）;若年発症型糖尿病;乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患などの炎症応答;皮膚筋炎;全身性強皮症および全身性硬化症;炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）に関連する応答;呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群、ARDSを含む）;皮膚炎;髄膜炎;脳炎;ブドウ膜炎;大腸炎;胃炎;糸球体腎炎;湿疹および喘息などのアレルギー状態ならびにT細胞の浸潤および慢性炎症性応答が関与する他の状態;アテローム性動脈硬化;白血球接着不全症;関節リウマチ;全身性エリテマトーデス（SLE）;多発性硬化症;レイノー症候群;自己免疫性甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;ならびに結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎において典型的に見出されるサイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答;ウェゲナー病;悪性貧血（アジソン病）;白血球血管外漏出を伴う疾患;中枢神経系（CNS）炎症性障害;多臓器損傷症候群;溶血性貧血（クリオグロビン血症（cryoglobinemia）またはクームス試験陽性貧血を含むが、それらに限定されるわけではない）;重症筋無力症;抗原-抗体複合体媒介性疾患;抗糸球体基底膜抗体病;抗リン脂質症候群;アレルギー性神経炎;グレーブス病;ランバート・イートン筋無力症候群;水疱性類天疱瘡;天疱瘡;自己免疫性多腺性内分泌障害;白斑;ライテル病;全身硬直症候群;ベーチェット病;巨細胞性動脈炎;免疫複合体腎炎;IgA腎症;IgMポリニューロパチー;免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）または自己免疫性血小板減少症および自己免疫性溶血性疾患;橋本甲状腺炎;自己免疫性肝炎;自己免疫性血友病;自己免疫性リンパ球増殖症候群（ALPS）;自己免疫性網膜ブドウ膜炎;ギラン・バレー症候群;グッドパスチャー症候群;混合結合組織病;自己免疫関連不妊;結節性多発動脈炎;円形脱毛症;特発性粘液水腫;移植片対宿主病;筋ジストロフィー（デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位型、エメリ・ドレフュス型）;ならびに炎症性非免疫疾患、例えば心臓疾患または脳疾患。
E156.i.対象が糖尿病を有するか、
ii.対象が1型糖尿病（T1D）を有するか、
iii.対象が新規発症T1Dを有するか、
iv.対象が、β細胞機能が残存している新規発症T1Dを有するか、
v.対象が新規発症T1Dと診断されてから100日未満であるか、
vi.対象が前糖尿病段階のT1D患者であるか、
vii.対象がステージ2のT1Dを有し、例えば、対象が血糖代謝異常を呈し、前症候性疾患を有し、かつ/または少なくとも2種類のT1D関連自己抗体に関して陽性であるか、
viii.対象がステージ3のT1Dを有し、例えば、対象が高血糖を呈し、症候性疾患を有し、かつ/または少なくとも2種類のT1D関連自己抗体に関して陽性であるか、あるいは
ix.対象が1種類または複数種類のT1D関連自己抗体に関して陽性である、
E132〜E153のいずれかに記載の方法または使用。
E157.第2の治療を対象に実施する工程をさらに含み、任意で第2の治療がTregの活性を高めるかまたはTregの数を増加させ、任意で第2の治療がIL-2を含む、E132〜E156のいずれかに記載の方法または使用。
E158.前記対象が、糖尿病、例えば1型糖尿病、例えば新規発症1型糖尿病を有し、第2の治療がインスリンを含む、E156に記載の方法または使用。
E159.E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を使用して、試料中、組織中、または細胞中のCD2を検出する方法であって、試料、組織、または細胞をポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物と接触させる工程、およびポリペプチド分子、多量体型タンパク質分子、または薬学的組成物を検出する工程を含む、方法。
E160.E1〜E111のいずれかに記載のポリペプチド分子、E112〜E116のいずれかに記載の多量体型タンパク質分子、またはE126〜E128のいずれかに記載の薬学的組成物を含むキット。
E161.CD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチド分子またはその機能的バリアントであって、
ポリペプチド分子が、SEQ ID NO:69のアミノ酸配列に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
ポリペプチド分子がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含まない、
単離されたポリペプチド分子またはその機能的バリアント。
E162.前記ポリペプチド分子が、SEQ ID NO:69のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
ポリペプチド分子がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含まない、
E161に記載の単離されたポリペプチド分子またはその機能的バリアント。
E163.SEQ ID NO:69のアミノ酸配列を含む、E161またはE162に記載の単離されたポリペプチド分子。
E164.CD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントであって、
SEQ ID NO:17〜41からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むLFA3ドメインを含み、かつLFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E165.前記アミノ酸配列がSEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、または23であり、かつ前記LFA3ドメインが、Leuであるアミノ酸残基、またはLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）をさらに含む、E164に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E166.前記LFA3ドメインが、SEQ ID NO:26に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつLFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、E164に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E167.前記LFA3ドメインがSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む、E164またはE166に記載の単離されたポリペプチド。
E168.LFA3ドメインを含む、単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントであって、
LFA3ドメインが、SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基36、38、43、および86に1つまたは複数の変異を有するSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E169.前記LFA3ドメインが、Leuであるアミノ酸残基、またはLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）をさらに含む、E168に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E170.SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基36、38、43、および86における前記1つまたは複数の変異がA36V、L38F、F43V、およびM86Fである、E168またはE169に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E171.第2のドメインをさらに含み、
第2のドメインが、免疫グロブリンタンパク質、例えば重鎖定常領域、例えばヒト重鎖定常領域、もしくはその機能的バリアントを含むか、
第2のドメインが、重鎖（例えばヒトIgG1重鎖）のFc領域、もしくはその機能的バリアントを含むか、または
第2のドメインが、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、もしくはそれらの機能的バリアントを含む、
E164〜E170のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E172.第2のドメインをさらに含み、第2のドメインが、SEQ ID NO:16に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むFcドメインを含む、E164〜E171のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E173.前記第2のドメインが、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むFcドメインを含む、E172に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E174.前記第2のドメインのN末端を前記LFA3ドメインのC末端に連結するリンカーをさらに含む、E171〜E173のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E175.iii.第2のドメインが、分子間ジスルフィド結合などによって別の第2のドメインとの二量体を形成する能力を有し、かつ/または
iv.第2のドメインが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を媒介する能力を有する、
E171〜E174のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E176.前記LFA3ドメインが、SEQ ID NO:26に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつポリペプチドがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まず、かつ
前記Fcドメインが、SEQ ID NO:16に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、
E171〜E175のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E177.前記ポリペプチドまたはその機能的バリアントがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み、かつ
アミノ酸配列が、SEQ ID NO:4に準じてナンバリングされた残基36、38、43、86、92、228、および230に1つまたは複数の変異を含む、
E171〜E175のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
E178.SEQ ID NO:4に準じてナンバリングされた残基36、38、43、86、92、228、および230における前記1つまたは複数の変異が、A36V、L38F、F43V、M86F、V92_D93insL、D228E、およびL230Mである、E177に記載の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
E179.CD2に結合する、例えばCD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、かつ以下の特性のうちの1つまたは複数を有する、単離されたポリペプチド分子:
i.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて約70、約75、約80、約85、約90、または約95％高い単量体のパーセンテージによって示される、増強された単量体発現、
ii.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、約75、約80、約85、約90、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージ、約10、約8、約6、約4、もしくは約2％未満である低分子量種（LMWS）のパーセンテージ、および/または5、2、もしくは1％未満である高分子量種（HMWS）のパーセンテージによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された単量体発現および低減した多量体発現、
iii.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、37.4℃で24時間インキュベートした後に約90、約92、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージによって示されかつ/または40℃で24時間インキュベートした後に約75、約80、もしくは約85％を上回る単量体のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向、
iv.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、40℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、もしくは約20％以下の増加、および/または50℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、約20、もしくは約25％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向、
v.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、低pH、5時間でのHMWSにおける約6、7、約8、または約9％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、低pH下での凝集傾向、
vi.キャピラリーゲル電気泳動（CGE）またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）を使用して測定した場合に、40℃で2週間または4週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、約2、約3、約4、もしくは約5％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
vii.SE-HPLCを使用して測定した場合に、例えば、25℃で2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
viii.SE-HPLCを使用して測定した場合に、例えば、5℃における2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
ix.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、5サイクルの凍結融解後にHMWSにおける約0.5、約1、または約1.5％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された凍結融解安定性、
x.Expi293培養物20mLあたり約5.5、約6、約6.5、または約7mgを上回る収量によって示される、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加した収量、
xi.示差走査蛍光光度法（DSF）によって測定した場合に、約38、約40、約42、約45、または約50℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xii.DSFによって測定した場合に、約40、約45、約50、約55、または約60℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xiii.示差走査熱量測定法（DSC）によって測定した場合に、約50または約60℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xiv.DSCによって測定した場合に、pH7.5において約55、約58、約60、約62、約64、もしくは約66℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;pH5.8において約55、約58、約60、約62、もしくは約64℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;またはpH4.5において約55、約58、もしくは約60℃を上回るTm1および約75、約78、もしくは約80℃を上回るTm2、
xv.DSCによって測定した場合に、pH7.5もしくはpH4.5において約50もしくは約60℃を上回るTmまたはpH5.8において約50もしくは約62℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xvi.DSCおよびFabRICATOR IdeSによって測定した場合に、約50または約60℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
xvii.SPRによって測定した場合に、ヒトCD2に対する約1.2、約1、約0.8、約0.6、約0.4、約0.2、約0.1、または約0.08μM未満のKDによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、
xviii.SPRによって測定した場合に、ヒトCD2に対する約1.3、約1.2、約1.1、もしくは約1μM未満のKDおよび/またはカニクイザルCD2に対する1.4、1.3、1.2、1.1、もしくは1μM未満のKDによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、
xix.SPRを使用して測定した場合に、CD4 Tmem細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKdによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
xx.例えばSPRならびに/または表10および図11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、CD4メモリーT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、もしくは約1500pM以下であるIC50計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約150、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、もしくは約800pM以下であるIC50計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約200、300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、もしくは約500pM以下であるIC50計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、もしくは約600pM以下であるIC50計算値;ならびに/またはCD8ネイティブT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、約1500、約1600、もしくは約1700pM以下であるIC50計算値によって示される、SPRによって測定した場合にSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
xxi.SPRによって測定した場合に、CD4メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、または約600pM以下であるKd計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKd計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、または約300pM以下であるKd計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約50、約100、または約150pM以下であるKd計算値;CD8ナイーブT細胞への結合に関して約50、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
xxii.SPRによって測定した場合に、カニクイザルCD4＋TEM細胞への結合に関する低減したEC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
xxiii.抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイを使用して測定した場合に、CD4 Tmem細胞の死滅に関して約400、約600、約800、約1000、約1200、または約1400pM以下であるEC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、
xxiv.抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイを使用して測定した場合に、CD8 Tmem細胞の死滅に関して約1、約5、約10、約20、約30、約40、または約50nM以下であるEC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、
xxv.混合リンパ球反応（MLR）アッセイに関して約400、約800、約1200、約1600、約2000、または約2400pM以下であるIC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖および/またはサイトカイン産生である同種異系T細胞応答の阻害、
xxvi.NK細胞非存在下での混合リンパ球反応（MLR）アッセイに関して約330、約400、約500、約600、約800、約1000、約1500、または約2000pM以下であるIC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖および/またはサイトカイン産生である同種異系T細胞応答の阻害、
xxvii.破傷風トキソイドリコール（TTR）アッセイにおいて測定した場合に、CD4 Tmem IFNγ産生に関して約1、約2、約5、約10、約15、約20、または約25nM以下であるIC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、破傷風トキソイドリコール応答の阻害、
xxviii.PK/PD研究によって測定した場合に、約0.14、約0.16、約0.18、約0.2、または約0.22mL/hr/kgを超えない中枢からのクリアランスによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて遅いインビボでのクリアランス、ならびに/あるいは
xxix.キャピラリーゲル電気泳動を使用して測定した場合に、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、少なくとも約98％または少なくとも約99％の純度。
E180. E161〜E179のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードする、単離された核酸。
E181.SEQ ID NO:43、53、および/または123に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％の同一性を有する核酸配列を含む、E180に記載の単離された核酸。
E182.SEQ ID NO:43、53、および/または123の核酸配列を含む、E180またはE181に記載の単離された核酸。
E183. E180〜E182のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
E184. E180〜E182のいずれかに記載の核酸またはE183に記載のベクターを含む、宿主細胞。
E185.Expi293細胞、ExpiCHO細胞、CHO細胞、COS細胞、HEL-293細胞、NSO細胞、PER.C6細胞、またはSP2.0細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、E184に記載の宿主細胞。
E186.Expi293細胞またはExpiCHO細胞である、E184またはE185に記載の宿主細胞。
E187. E161〜E179のいずれかに記載のポリペプチド分子と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
E188. E161〜E179のいずれかに記載のポリペプチド分子7.5mgとHEPES緩衝食塩水とを含む、E187に記載の薬学的組成物。
E189.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子を作製する方法であって、E184〜E186のいずれかに記載の宿主細胞を、ポリペプチド分子が宿主細胞によって発現される条件下で培養する工程を含む、方法。
E190.前記ポリペプチド分子を単離する工程をさらに含む、E189に記載の方法。
E191.免疫抑制を必要とする対象の処置に使用するための、E161〜E179のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはE187もしくはE188に記載の薬学的組成物。
E192.免疫疾患、免疫障害、または免疫状態を処置するための、E161〜E179のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはE187もしくはE188に記載の薬学的組成物の使用。
E193.それを必要とするヒト対象において、CD2によって媒介される免疫疾患、免疫障害、または免疫状態を処置または防止するための方法であって、
対象にE187またはE188に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を含み、疾患、障害、または状態が、1型糖尿病、乾癬、尋常性乾癬、手掌足底膿疱症、手掌足底膿疱性乾癬、掌蹠膿疱症、手掌足底の膿疱症、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、移植片対宿主病（GVHD）、白斑、毛孔性紅色粃糠疹、移植（例えば臓器移植、例えば腎臓移植）、乾癬性関節炎、同種異系造血幹細胞移植を必要とする疾患、障害、または状態、サラセミア、鎌形血球症、グランツマン血小板無力症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、重症先天性好中球減少症、白血球接着不全症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、先天性角化異常症、チェディアック・東症候群、再生不良性貧血、円形脱毛症、およびT細胞リンパ腫（例えば皮膚T細胞リンパ腫または末梢T細胞非ホジキンリンパ腫）からなる群より選択される、方法。
E194.前記疾患が、糖尿病、例えば1型糖尿病（T1D）、例えば新規発症T1D、例えば、β細胞機能が残存している（例えば、前記対象が診断後100日未満である）新規発症T1D、例えばステージ2またはステージ3のT1Dである、E193に記載の方法。
E195.免疫疾患、免疫障害、または免疫状態を処置するための医薬の製造における、E161〜E179のいずれかに記載の単離されたポリペプチドの使用。
E196. E161〜E179のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントを使用して試料中、組織中、または細胞中のCD2を検出する方法であって、試料、組織、または細胞をポリペプチドまたはその機能的バリアントと接触させる工程、およびポリペプチドまたはその機能的バリアントを検出する工程を含む、方法。
E197.対象が乾癬性関節炎を有する、E132〜E153に記載の方法または使用。
上述した本発明の概要および後述する本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば、よりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的で図面には態様が示されている。しかし本発明は表示した装置および手段そのものに限定されるわけではないと理解すべきである。
第1世代の安定性（S）酵母ディスプレイライブラリーおよびアフィニティー＋安定性（AS）酵母ディスプレイライブラリーのための構造ベースのライブラリー設計。16個のコア残基（SライブラリーおよびASライブラリー）および15個のコンタクト残基（ASライブラリー）を化学的に類似する4〜6種類の残基に変異させた。図1に示す残基はSEQ ID NO:2に準じてナンバリングされている。 図2A〜図2D:酵母ディスプレイライブラリーから同定されたクローンにおけるアミノ酸変化の頻度により、6つのホットスポット位置が同定された。図2Aは同定された6つのホットスポット残基を示す図である。これら6つの残基はSEQ ID NO:2に準じてナンバリングされている。図2Bでは、ライブラリーにおいて標的とされたLFA3残基が太字で示されており、6つのホットスポット残基は下線付きの太字で示されている。図2Cは、6つのホットスポット位置におけるアミノ酸変化の頻度を示すグラフである。図2Dは、6種類の組換えバリアントM1〜M6の設計を示す表である。ホットスポット位置におけるアミノ酸残基が各バリアントについて指定されている。 図3A〜図3D:野生型LFA3（LFA3 WT）融合タンパク質およびM1〜M6バリアントFc融合タンパク質の分子的評価を図示する例示的グラフ。「LFA3 WT-Pfe」および「WT-Pfe」はWT LFA3-Pfeを指す。 結合アフィニティーが増大しているクローンを同定するためのFGループライブラリーの構造ベースの設計。図4の表には、第2世代のライブラリーにおいて変異誘発の標的とした残基が示されている。残基の位置はSEQ ID NO:2に準じてナンバリングされている。 図5Aおよび図5B:高アフィニティーLFA3バリアントの例示的特性解析。クローンを、Biacoreアッセイ（SPR）において組換えCD2に対する結合アフィニティーについて評価し（図5A）、DSFで熱安定性について評価した（図5B）。「LFA3-WT」はLFA3-Fc WTを指す。「LFA3-Pfe」はWT LFA3-Pfeを指す。 図6A〜図6D:ドメイン境界バリアントd1の合理的設計。追加の内因性ロイシン残基（d1）を野生型LFA3配列（LFA3-Fc d1）または安定性Mバリアント（M1-d1（「M1d1」ともいう）およびM4-d1（「M4d1」ともいう））のどちらかと共に含有するLFA3-Fcタンパク質の例示的特性解析。図6Cにおける「WT」はLFA3-Fc WTを指す。図6Dにおける「Pfe」はWT LFA3-Pfeを指す。 図7A〜図7D:ドメイン境界バリアントM1-d1（「M1d1」ともいう）およびM1-d3（「M1d3」ともいう）の、ヒトCD2およびカニクイザル（cyno）CD2に対するアフィニティーおよび熱安定性（DSF）。 図8A〜図8D:M7-d1の設計および特性解析。図8B、図8Cおよび図8Dには、それぞれSEC解析、熱安定性解析およびアフィニティー解析からの例示的結果が示されている。図8Cにおける「LFA3-WT」および図8Dにおける「WT」はLFA3-Fc WTを指す。図8Cにおける「LFA3-Pfe」はWT LFA3-Pfeを指す。 休止状態のヒトPBMC上でのCD2レベルを図示する例示的グラフ。図9には4人のドナー由来の平均±SEMを示す。NK＝ナチュラルキラー;eff mem＝エフェクターメモリー;cen mem＝セントラルメモリー;Treg＝制御性T。 抗CD3/CD28ビーズによるTCR活性化後のヒトPBMC上でのCD2レベルを図示する例示的グラフ。図10には1人のドナーを示す。データを1細胞あたりの平均分子数（±SD）として表す。NK＝ナチュラルキラー;eff mem＝エフェクターメモリー;cen mem＝セントラルメモリー;Treg＝制御性T。 抗CD2抗体との競合結合アッセイを使用した初代ヒトT細胞集団への例示的LFA3-Fc結合。アッセイは三つ組で行った。平均±標準偏差がプロットされている。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 図12A〜図12E:例示的ヒトPBMC ADCCアッセイ。PBMCを一連の量のLFA3-Fcタンパク質（LFA3-Fc M1d1またはLFA3-Fc WT）と共に培養した。メモリーCD4（例えばCD4 CD45RO＋）細胞の細胞傷害を図12Aにプロットする。ドナー全体にわたるEC50を図12Bに示す。LFA3-Fcタンパク質によるCD4非メモリー細胞（例えばCD4 CD45RO-）、CD8メモリー細胞（例えばCD8 CD45 RO＋）およびCD8非メモリー細胞（例えばCD8 CD45RO-）の例示的な濃度依存的細胞傷害を図12C〜図12Eに図示する。データポイントは平均（n＝5）±SEMを表す。 図13A〜図13C:固定された量のLFA3-Fc M1d1またはLFA3-Fc WTの下で標的細胞と共培養された精製NK細胞による細胞傷害性アッセイを図示する例示的グラフ。図13A:標的細胞（CD4メモリー細胞）を250nMのタンパク質と共にインキュベートした。5人のドナーのうちの1人に関する三つ組のウェルの平均±標準偏差。標的細胞（CD4ナイーブ細胞、CD4メモリー細胞またはB細胞）を、100nM LFA3-Fc WT（図13B）またはLFA3-Fc M1d1（図13C）およびNK細胞（エフェクター細胞）と共に、さまざまなエフェクター対標的細胞比でインキュベートした。1人のドナーについて三つ組のウェルの平均±標準偏差を示す。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 図14Aおよび図14B:同種異系刺激に応答して起きるCD4＋T細胞増殖（expansion）（MLR）の、LFA3-Fc M1d1（「M1d1」）による完全な阻害を図示する例示的グラフ。1人のドナーに関する三つ組のウェルの平均±標準偏差を図14Aに示す。複数のドナー全体にわたるIC50を図14Bに示す。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 図15A〜図15C:NK細胞非存在下でのMLRの、LFA3-Fc M1d1（「M1d1」）による阻害を図示する例示的グラフ。NK細胞を、そのままにしておくか（図15A）、磁気単離法を使用して枯渇させた（図15B）。1人のドナーに関する三つ組のウェルの平均±標準偏差を図15Aおよび図15Bに示す。反復実験全体にわたるIC50を図15Cに示す。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 図16Aおよび図16B:抗原・破傷風トキソイド（TT）に対するCD4メモリーリコール応答の、LFA3-Fc M1d1（「M1-d1」）による阻害を図示する例示的グラフ。1人のドナーに関する三つ組のウェルの平均±標準偏差を図16Aに示す。複数のドナー全体にわたるIC50を図16Bに示す。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 例示的なカニクイザルPBMC上でのCD2発現。N＝6;データを1細胞あたりの平均分子数（±SD）として表す。NK＝ナチュラルキラー;eff mem＝エフェクターメモリー;cen mem＝セントラルメモリー;Treg＝制御性T。 図18Aおよび図18B:例示的なカニクイザルPBMC ADCCアッセイ。カニクイザルPBMCを一連の量のLFA3-Fcポリペプチド（M1d1またはWT）と共培養した。CD4＋TEM細胞の細胞傷害をプロットする。単一ドナーに関する三つ組のウェルの平均±標準偏差を図18Aに示す。3匹のドナーに関するEC50を図18Bに示す。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 カニクイザル反復投与PK/PD研究17MA057の実験設計。 図20Aおよび図20B:LFA3-Fc M1d1は、反復投与後（黒い矢印）に、CD4＋TEMを減少させ、Treg/CD4＋TEMの比を増加させる。例示的データを投与前の細胞数と比較した変化倍率としてプロットする。4匹の平均±SEMを示す。 LFA3-Fc M1d1処置はメモリーT細胞に、より大きな影響を有する。例示的データを投与前の細胞数と比較した変化倍率としてプロットする。4匹の平均±SEMを示す。 図22Aおよび図22B:LFA3-Fc WTは、反復投与後に、CD4＋TEMを減少させ、Treg/CD4＋TEMの比を増加させた。例示的データを投与前の細胞数と比較した変化倍率としてプロットする。4匹の平均±SEMを示す。「WT」はLFA3-Fc WTを指す。 図23Aおよび図23B:試験17MA057からのカニクイザルにおけるM1d1およびLFA3-Fc WTの例示的PKプロファイル。用量は0.03〜3mg/kgで比例している。 LFA3-Fcの作用機序の提案。 図25A〜図25B:quantibriteビーズおよびフローサイトメトリーを使用した、ヒトKLRG1＋対KLRG1-TIGIT＋PD1＋Tヘルパー細胞サブセット上でのCD2発現の例示的定量。図25Aは、CD4エフェクターメモリー（「EM」）細胞におけるCD2発現を図示している。図25Bは、CD4セントラルメモリー（「CM」）細胞におけるCD2発現を図示している。データをn＝2ドナーの幾何平均蛍光強度（gMFI）±SDとして表す。KLRG1＝キラー細胞レクチン様受容体G1;TIGIT＝IgドメインおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain）。 図26A〜図26B:quantibriteビーズおよびフローサイトメトリーを使用した、ヒトTヘルパー細胞サブセット上でのCD2発現の例示的定量。図26Aおよび図26Bは別々の2日に解析された2人のドナーを表している。データを幾何平均蛍光強度（gMFI）±SDとして表す。CCR7＝C-Cケモカイン受容体7型;PD1＝プログラム細胞死タンパク質1;TH＝Tヘルパー;Tfh＝T濾胞性ヘルパー;Treg＝制御性T細胞。 Tris緩衝液pH7.5、ヒスチジン緩衝液pH5.8またはグルタミン酸緩衝液pH4.5中に製剤化されたLFA3-Fc M1d1の例示的示差走査熱量測定法（DSC）プロファイル。 Fabricator-IdeSによる消化後のLFA3-Fc M1d1の例示的示差走査熱量測定法（DSC）プロファイル。 図29A〜図29C:20mM Tris緩衝液pH7.5（図29A）、20mMヒスチジン緩衝液pH5.8（図29B）または20mMグルタミン酸緩衝液pH4.5（図29C）中に製剤化されたLFA3-Fc M1-d1（LFA3-Fc M1d1ともいう）およびWT LFA3-Fc（LFA3-Fc WTともいう）の例示的な電荷不均一性解析。 図30A〜図30C:時刻0における、および40℃で2週間または4週間貯蔵した後の、Tris緩衝液pH7.5（図30A）、ヒスチジン緩衝液pH5.8（図30B）またはグルタミン酸緩衝液pH4.5（図30C）中に製剤化されたLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの例示的な非還元（NR）キャピラリーゲル電気泳動（CGE）解析。低分子質量種（LMMS）のパーセンテージを定量した。 図31A〜図31D:時刻0における、および40℃で2週間または4週間貯蔵した後の、Tris緩衝液pH7.5（図31A）、ヒスチジン緩衝液pH5.8（図31B）またはグルタミン酸緩衝液pH4.5（図31C）中に製剤化されたLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの例示的サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）解析。低分子質量種（LMMS）（図31D）および高分子質量種（HMMS）（図31A〜図31C）のパーセンテージを定量した。 図32A〜図32D:時刻0における、および25℃で2、4、または6週間貯蔵した後の、Tris緩衝液pH7.5（図32A）、ヒスチジン緩衝液pH5.8（図32B）またはグルタミン酸緩衝液pH4.5（図32C）中に製剤化されたLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの例示的サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）解析。低分子質量種（LMMS）（図32D）および高分子質量種（HMMS）（図32A〜図32C）のパーセンテージを定量した。 図33A〜図33D:時刻0における、および5℃で2、4、または6週間貯蔵した後の、トリス/スクロース緩衝液pH7.5（図33A）、ヒスチジン/スクロース緩衝液pH5.8（図33B）またはグルタミン酸/トレハロース緩衝液pH4.5（図33C）中に製剤化されたLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの例示的サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）解析。低分子質量種（LMMS）（図33D）および高分子質量種（HMMS）（図33A〜図33C）のパーセンテージを定量した。 図34A〜図34B:LFA3-Fc M1d1は、反復投与後に、CD4＋TEMを減少させ、Treg/CD4＋TEMの比を増加させた。例示的データを投与前の細胞数と比較した変化倍率としてプロットする。4匹の平均±SEMを示す。 図35A〜図35B:LFA3-Fc WTは、反復投与後に、CD4＋TEMを減少させ、Treg/CD4＋TEMの比を増加させた。例示的データを投与前の細胞数と比較した変化倍率としてプロットする。4匹の平均±SEMを示す。
詳細な説明
本明細書では、CD2に結合し、CD2の活性を阻害し、かつ/またはCD2発現細胞を枯渇させる、LFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3融合ポリペプチド分子、例えばバリアントLFA3-Fc融合ポリペプチド分子が開示される。LFA3ポリペプチド分子を作製する方法、それらのLFA3ポリペプチド分子を含む組成物、それらのLFA3ポリペプチド分子を使用する方法が提供される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子は、野生型LFA3ポリペプチド分子と比べて増強された安定性および製造特性を有する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えばバリアントLFA3-Fc融合タンパク質）は、野生型LFA3ポリペプチド分子（例えば野生型LFA3-Fc融合タンパク質）と比べて増大した、CD2に対する結合アフィニティーを有する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えばバリアントLFA3-Fc融合タンパク質）は、野生型LFA3ポリペプチド分子（例えば野生型LFA3-Fc融合タンパク質）と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性を示す。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えばバリアントLFA3-Fc融合タンパク質）は、野生型LFA3ポリペプチド分子（例えば野生型LFA3-Fc融合タンパク質）と比べて増強された、同種異系T細胞応答の阻害を呈する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えばバリアントLFA3-Fc融合タンパク質）は、野生型LFA3ポリペプチド分子（例えば野生型LFA3-Fc融合タンパク質）と比べて遅い、インビボでのクリアランスを示す。
LFA3ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドが提供される。LFA3ポリペプチド分子を発現する宿主細胞が提供される。LFA3ポリペプチド分子を使用する処置方法が提供される。一態様において、そのような方法は、炎症性の疾患、障害、または状態を処置する方法を包含する。一態様において、そのような方法は、免疫抑制を必要とする疾患、例えば限定するわけではないが自己免疫疾患などを処置する方法を包含する。一態様において、そのような方法は、心臓疾患または脳疾患などの炎症性非免疫疾患を処置する方法を包含する。
本明細書において使用されるセクション見出しには構成上の目的しかなく、記載されている主題を限定すると解釈してはならない。
本明細書において言及される参照文献は、特許出願、特許公報、およびGenBankアクセッション番号を含めてすべて、あたかも個々の参照文献が参照によりその全体が本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において記載または言及する技術および手法は一般によく理解されており、これらは、当業者により、従来の方法論を使用して、例えばSambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd.edition（2001）Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（F.M.Ausubel,et al.eds.,（2003））;METHODS IN ENZYMOLOGYシリーズ（Academic Press,Inc.）:PCR 2:A PRACTICAL APPROACH（M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.（1995））;Harlow and Lane,eds.（1988）ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL、およびANIMAL CELL CULTURE（R.I.Freshney,ed.（1987））;Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait,ed.,1984）;Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook（J.E.Cellis,ed.,1998）Academic Press;Animal Cell Culture（R.I.Freshney）,ed.,1987）;Introduction to Cell and Tissue Culture（J.P.Mather and P.E.Roberts,1998）Plenum Press;Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures（A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8）J.Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology（D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds）;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987）;PCR:The Polymerase Chain Reaction,（Mullis et al,eds.,1994）;Current Protocols in Immunology（J.E.Coligan et al,eds.,1991）;Short Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons,1999）;Immunobiology（C.A.Janeway and P.Travers,1997）;Antibodies（P.Finch,1997）;Antibodies:A Practical Approach（D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989）;Monoclonal Antibodies:A Practical Approach（P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000）;Using Antibodies:A Laboratory Manual（E.Harlow and D.Lane（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999））;The Antibodies（M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995）;およびCancer:Principles and Practice of Oncology（V.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993）;ならびにそれらの更新版に記載の広く用いられている方法論などを使用して、よく使用されている。
LFA3ポリペプチド分子（例えばバリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えば限定するわけではないが、1型糖尿病、乾癬、尋常性乾癬、手掌足底膿疱症、手掌足底膿疱性乾癬、掌蹠膿疱症、手掌足底の膿疱症、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、移植片対宿主病（GVHD）、白斑、毛孔性紅色粃糠疹、移植（例えば臓器移植、例えば腎臓移植）、乾癬性関節炎、同種異系造血幹細胞移植を必要とする疾患、障害、または状態、サラセミア、鎌形血球症、グランツマン血小板無力症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、重症先天性好中球減少症、白血球接着不全症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、先天性角化異常症、チェディアック・東症候群、再生不良性貧血、円形脱毛症、およびT細胞リンパ腫（例えば皮膚T細胞リンパ腫または末梢T細胞非ホジキンリンパ腫）などといった疾患、障害、または状態の防止、処置、および/または寛解に使用することができる。他の例示的な疾患、障害、または状態は、真性糖尿病（例えばI型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）;若年発症型糖尿病;乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患などの炎症応答;皮膚筋炎;全身性強皮症および全身性硬化症;炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）に関連する応答;呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群、ARDSを含む）;皮膚炎;髄膜炎;脳炎;ブドウ膜炎;大腸炎;胃炎;糸球体腎炎;湿疹および喘息などのアレルギー状態ならびにT細胞の浸潤および慢性炎症性応答が関与する他の状態;アテローム性動脈硬化;白血球接着不全症;関節リウマチ;全身性エリテマトーデス（SLE）;多発性硬化症;レイノー症候群;自己免疫性甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;ならびに結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎において典型的に見出されるサイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答;ウェゲナー病;悪性貧血（アジソン病）;白血球血管外漏出を伴う疾患;中枢神経系（CNS）炎症性障害;多臓器損傷症候群;溶血性貧血（クリオグロビン血症またはクームス試験陽性貧血を含むが、それらに限定されるわけではない）;重症筋無力症;抗原-抗体複合体媒介性疾患;抗糸球体基底膜抗体病;抗リン脂質症候群;アレルギー性神経炎;グレーブス病;ランバート・イートン筋無力症候群;水疱性類天疱瘡;天疱瘡;自己免疫性多腺性内分泌障害;白斑;ライテル病;全身硬直症候群;ベーチェット病;巨細胞性動脈炎;免疫複合体腎炎;IgA腎症;IgMポリニューロパチー;免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）または自己免疫性血小板減少症および自己免疫性溶血性疾患;橋本甲状腺炎;自己免疫性肝炎;自己免疫性血友病;自己免疫性リンパ球増殖症候群（ALPS）;自己免疫性網膜ブドウ膜炎;ギラン・バレー症候群;グッドパスチャー症候群;混合結合組織病;自己免疫関連不妊;結節性多発動脈炎;円形脱毛症;特発性粘液水腫;移植片対宿主病;筋ジストロフィー（デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位型、エメリ・ドレフュス型）;ならびに炎症性非免疫疾患、例えば心臓疾患または脳疾患である。
I. 定義
本発明は、以下に述べる本発明の例示的態様の詳細な説明とそこに含まれる実施例を参照すれば、より容易に理解しうる。
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先される。
さらに、文脈上別段の必要がある場合または明示されている場合を除き、単数形は複数を包含するものとし、複数形は単数を包含するものとする。
本明細書に記載する本発明の局面および態様は、局面および態様「からなる」および/または「から本質的になる」を包含すると理解される。本明細書において使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、別段の表示がある場合を除き、複数の指示対象を包含する。
本願において、「または」の使用は、言明される場合または当業者によってはっきりと理解される場合を除き、「および/または」を意味する。多項従属請求項の場合、「または」の使用は、2つ以上の先行する独立請求項または従属請求項に戻って参照する。
「約」または「およそ」は、測定可能な数値変量に関して使用される場合には、その変量の表示された値および表示された値の実験誤差内（例えば平均に関して95％信頼区間内）またはどちらが大きくても表示された値の10パーセント以内にあるその変量のすべての値を指す。数値範囲はその範囲を画定する数字を含む。
本発明の広い範囲を説明する数値範囲および数値パラメーターは近似値であるが、具体的実施例に示す数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしどの数値も、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差に必然的に起因するある特定の誤差を、本質的に含む。さらにまた、本明細書に開示する範囲はすべて、そこに包摂されるありとあらゆる部分範囲を包含すると理解すべきである。例えば、「1〜10」と言明された範囲は、最小値1と最大値10の間（最小値と最大値を含む）のありとあらゆる部分範囲、すなわち1またはそれ以上の最小値、例えば1〜6.1で始まり、10またはそれ未満の最大値、例えば5.5〜10で終わるすべての部分範囲を包含するとみなされるべきである。
本明細書と特許請求の範囲の全体を通して、「を含む（comprise）」という単語または「を含む（comprises）」もしくは「を含む（comprising）」などの変形は、言明された完全体（integer）または完全体の群の包含を含意するが、他の任意の完全体または完全体の群の除外を含意しないと理解されるであろう。文脈上別段の必要がある場合を除き、単数形は複数を包含するものとし、複数形は単数を包含するものとする。「例えば（e.g.）」または「例えば（for example）」に続く例はいずれも、網羅的であることまたは限定であることを意味しない。
本明細書において態様が「を含む」という言い回しで記載されている場合は常に、「からなる」および/または「から本質的になる」という用語で記載されその他の点では同様である態様も提供されると理解される。
本発明の局面または態様がマーカッシュ群または他の選択肢の群で記載される場合、本発明は、列挙された群全体を丸ごと包含するだけでなく、その群の各成員および主群の考えうるすべての部分群も個別に包含し、群の成員のうちの1つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明では、請求項に係る発明における群の成員のいずれかのうちの1つまたは複数の明示的除外も想定される。
本明細書において使用する術語には、特定の態様を説明する目的しかなく、限定を意図していないことを理解すべきである。本明細書および後述の特許請求の範囲ではいくつかの用語に言及するが、それらは以下の意味を有すると定義されるものとする。
「単離された分子」という用語（分子が例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチドである場合）は、その起源または派生源に基づいて、（1）そのネイティブ状態においてそれに随伴している天然に付随する構成要素を付随しない分子、（2）同じ種由来の他の分子を実質的に含まない分子、（3）異なる種由来の細胞によって発現される分子、または（4）天然に存在しない分子である。したがって、化学合成された分子または天然に生じる細胞とは異なる細胞系において発現される分子は、それに天然に付随する構成要素から「単離されている」ことになる。分子は、当技術分野において周知の精製技術を使用した単離によって、天然に付随する構成要素を実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度および均一性は、当技術分野において周知のいくつかの手段によってアッセイしうる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し、当技術分野において周知の技術を使用してそのゲルを染色してポリペプチドを可視化することによってアッセイしうる。ある特定の目的には、HPLCを使用することによって、または当技術分野において周知の他の精製手段を使用することによって、さらに高い分解能を得ることもできる。
本明細書で使用する場合の「実質的に純粋」とは、目的の種が、存在する主要な種であること（すなわち、モルベースで、組成物中の他のどの個々の種よりも豊富であること）を意味し、好ましくは、実質的に精製された画分とは、存在する全高分子種の（モルベースで）少なくとも約50パーセントを目的の種（例えば糖タンパク質）が占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約80パーセント超、より好ましくは約85％超、約90％超、約95％超、および約99％超を占めると考えられる。最も好ましくは、目的の種は基本的に均一にまで精製され（従来の検出方法では夾雑種を組成物中に検出することができない）、ここでは組成物が本質的に単一の高分子種からなる。ある特定の態様において、実質的に純粋な材料は、少なくとも50％純粋（すなわち夾雑物を含まない）、より好ましくは少なくとも90％純粋、より好ましくは、少なくとも95％純粋、さらに好ましくは、少なくとも98％純粋、最も好ましくは少なくとも99％純粋である。
当技術分野において公知の用語「同一性」は、配列を比較することによって決定される、2つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または2つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当技術分野において「同一性」とは、場合に応じて、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチド分子配列間または核酸分子配列間の関連度も意味する。「同一性」では、コンピュータプログラムの特定数学モデル（すなわち「アルゴリズム」）によって処理されたギャップアラインメントでの、2つまたはそれ以上の配列間の同一マッチのパーセントを測定する。
「類似性」という用語は関連する概念であるが、「同一性」とは異なり、これは、同一マッチと保存的置換マッチの両方を包含する類似性の尺度を指す。保存的置換はポリペプチドに当てはまり、核酸分子には当てはまらないので、類似性はポリペプチド配列比較だけを扱う。2つのポリペプチドが例えば20個のうち10個の同一アミノ酸を有し、残りはすべて非保存的置換であるとすると、パーセント同一性およびパーセント類似性はどちらも50％になる。同じ例で、さらに5つの位置に保存的置換があるとすると、パーセント同一性は50％のままだが、パーセント類似性は75％（20個のうち15個）になる。したがって、保存的置換がある場合、2つのポリペプチド配列間の類似度はそれら2つの配列間のパーセント同一性よりも高くなる。
本発明のポリペプチド「フラグメント」またはポリペプチド「部分」は、トランケーションによって、例えばポリペプチドのN末端および/またはC末端からの1つまたは複数のアミノ酸の除去によって、作製することができる。10個まで、20個まで、30個まで、40個まで、またはそれ以上のアミノ酸を、このようにしてN末端および/またはC末端から除去しうる。フラグメントは1つまたは複数の内部欠失によって生成させてもよい。
バリアント分子は、上で論じた具体的配列およびフラグメントから、1個、2個、3個、4個、5個、10個まで、20個まで、30個まで、またはそれ以上のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入を含みうる。「欠失」バリアントは、個々のアミノ酸の欠失、小さなアミノ酸の群、例えば2個、3個、4個、または5個のアミノ酸の欠失、またはさらに大きなアミノ酸領域の欠失、例えば特定アミノ酸ドメインまたは他の特徴の欠失を含みうる。「挿入」バリアントは、個々のアミノ酸の挿入、小さなアミノ酸の群、例えば2個、3個、4個、または5個のアミノ酸の挿入、またはさらに大きなアミノ酸領域の挿入、例えば特定アミノ酸ドメインまたは他の特徴の挿入を含みうる。「置換」バリアントは、好ましくは、同じ数のアミノ酸による、そして保存的アミノ酸置換を生じる、1つまたは複数のアミノ酸の置き換えを伴う。例えば、あるアミノ酸は、類似する特性を有する代替的アミノ酸で、例えば別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸または別の脂肪族アミノ酸で、置換されうる。適切な置換基を選択するために使用することができる20種類の主要アミノ酸のいくつかの特性は以下のとおりである。
置換バリアントは、その分子中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。表1では例示的な保存的置換を「保存的置換」という見出しの下に示す。以下に例示的置換と名付ける、またはアミノ酸クラスに関してさらに後述する、追加の置換を導入して、生成物をスクリーニングしてもよい。
（表１）アミノ酸および置換
Figure 2021519758
分子の生物学的特性の実質的改変は、（a）置換領域における例えばβシートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーションなどとしてのポリペプチド主鎖の構造の維持、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性の維持、または（c）側鎖の嵩高さの維持に及ぼすその効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。天然の残基は、共通する側鎖の特性に基づいてグループ分けされる:
i.非極性残基:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
ii.電荷を有さない極性残基:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
iii.酸性（負荷電）残基:Asp、Glu;
iv.塩基性（正荷電）残基:Lys、Arg;
v.鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および
vi.芳香族:Trp、Tyr、Phe、His。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することによってなされる。
例えば、行うことができる置換の1つのタイプは、化学反応性でありうる分子中の1つまたは複数のシステインを、別の残基、例えば限定するわけではないが、アラニンまたはセリンに変えることである。例えば非カノニカルシステインの置換を行うことができる。いくつかの態様において、システインはカノニカルである。分子の適正なコンフォメーションの維持に関与していないシステイン残基はいずれも、分子の酸化安定性を向上させ異常な架橋を防ぐために、一般的にはセリンで、置換することができる。逆に、分子の安定性を向上させるためにシステイン結合を分子に付加してもよい。
「抗体」は、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも1つの抗原認識部位によって特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子である。本明細書において使用されるこの用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、別段の指定がない限り、特異的結合に関してインタクト抗体と競合するその抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および免疫グロブリン分子の他の任意の改変されたコンフィギュレーションであって抗原認識部位を含むものも包含する。抗原結合部分としては、例えばFab、Fab'、F（ab'）2、Fd、Fvドメイン抗体（dAb、例えばサメ抗体およびラクダ科抗体）、相補性決定領域（CDR）を含むフラグメント、一本鎖可変フラグメント抗体（scFv）、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（minibody）、イントラボディ（intrabody）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、v-NARおよびbis-scFv、ならびにポリペプチドへの特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの一部分を少なくとも含有するポリペプチドが挙げられる。ダイアボディは、小さなペプチドリンカーによってつながれた重鎖可変（VH）領域および軽鎖可変（VL）領域からなる一本鎖Fv（scFv）フラグメントの非共有結合的二量体を含みうる。別の態様において、ダイアボディは、2つのscFvフラグメントが互いに共有結合で連結されている一本鎖（Fv）2である。トリアボディは、例えば、3つのscFvフラグメントが互いに共有結合で連結されている一本鎖（Fv）2である。
抗体はIgG、IgA、またはIgM（またはそのサブクラス）など、任意のクラスの抗体を含み、抗体がいずれか特定クラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主要クラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2に分類されうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。さまざまなクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元コンフィギュレーションは周知である。
標的に「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書では相互可換的に使用される）分子とは、当技術分野ではよく理解されている用語であり、そのような特異的結合または優先的結合を決定するための方法も、当技術分野では周知である。分子は、それが特定の細胞または基質と、他の細胞または基質との反応または会合よりも、高頻度に、迅速に、長い持続時間にわたって、かつ/または強いアフィニティーで、反応または会合するのであれば、「特異的結合」または「優先的結合」を呈するという。分子は、それが他の物質への結合よりも、強いアフィニティーで、強いアビディティーで、容易に、かつ/または長い持続時間にわたって結合するのであれば、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。また、分子は、それが試料中に存在する他の物質への結合よりも、強いアフィニティーで、強いアビディティーで、容易に、かつ/または長い持続時間にわたって試料中の標的に結合するのであれば、該標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、CD2に特異的または優先的に結合する分子は、非CD2タンパク質への結合よりも、強いアフィニティーで、強いアビディティーで、容易に、かつ/または長い持続時間にわたってCD2に結合する分子である。また、この定義を読むことにより、例えば、第1の標的に特異的または優先的に結合する分子は、第2の標的に特異的または優先的に結合する場合もしない場合もあることが、理解される。したがって「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただしそれを包含することもできる）。必ずというわけではないが、一般的には、結合への言及は優先的結合を意味する。「特異的結合」または「優先的結合」は、特異的分子を認識しそれに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず、それに結合もしない化合物、例えばタンパク質、核酸などを包含する。例えば、試料中のコグネイトリガンドまたは結合パートナーを認識しそれに結合するが（例えばCD2に結合するLFA3ポリペプチド分子）、試料中の他の分子を実質的に認識せずそれに結合もしない分子は、該コグネイトリガンドまたは結合パートナーに特異的に結合する。このように、指定のアッセイ条件下で、指定された結合部分は、特定の標的分子に結合し、試験試料中に存在する他の構成要素には、有意な量では結合しない。
関心対象の標的に特異的に結合する分子を選択するには、さまざまなアッセイフォーマットを使用しうる。コグネイトリガンドまたは結合パートナーと特異的に結合する抗原もしくは受容体またはそのリガンド結合部分と特異的に反応する分子を同定するために使用しうる数多くのアッセイには、例えば固相ELISAイムノアッセイ、免疫沈降、Biacore（商標）（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、KinExA、蛍光活性化細胞選別（FACS）、Octet（商標）（ForteBio,Inc.、カリフォルニア州メンローパーク）およびウェスタンブロット解析などがある。典型的には、特異的反応または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍、例えばバックグラウンドの10倍超、例えばバックグラウンドの50倍超、例えばバックグラウンドの100倍超、例えばバックグラウンドの500倍超、例えばバックグラウンドの1000倍超、例えばバックグラウンドの10,000倍超であると考えられる。
「結合アフィニティー」という用語は、本明細書では、2つの分子の間の、例えばポリペプチド分子とその標的との間の、非共有結合的相互作用の強さの尺度として使用される。「結合アフィニティー」という用語は一価相互作用（固有活性）を記述するために使用される。
加えて、CD2発現細胞へのLFA3ポリペプチド分子の結合アフィニティーを決定するために、細胞結合実験を行って見かけのアフィニティーを決定することもできる。標的を発現する細胞へのポリペプチド分子結合の見かけのアフィニティーは、標的結合集団の幾何平均蛍光強度（gMFI）がフローサイトメトリーによって定量される平衡結合タイトレーション曲線のEC50として算出することができる。
2つの分子の間の、例えばポリペプチド分子とその標的の間の、一価相互作用による結合アフィニティーは、解離定数（KD）の決定によって定量されうる。そしてそのKDは、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）法（Biacore）などを使用した複合体形成および複合体解離の速度論の測定によって決定することができる。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数を、それぞれ会合速度定数ka（またはkon）および解離速度定数kd（またはkoff）という。KDとkaおよびkdとの間には式KD＝kd/kaという関係がある。解離定数の値は周知の方法によって直接決定することができ、例えばCaceci et al.（1984,Byte 9:340-362）に記載されている方法などによって複雑な混合物についても、計算することができる。例えばKDは、二重フィルタニトロセルロースフィルタ結合アッセイ、例えばWong＆Lohman（1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5428-5432）に開示されているものを使用して確定されうる。当技術分野では、例えばELISA、ウェスタンブロット、RIAおよびフローサイトメトリー解析、ならびに本明細書の他の項で例示される他のアッセイなど、標的抗原に対するリガンドの結合能力を評価するための他の標準的アッセイも公知である。分子の速度論および結合アフィニティーは、表面プラズモン共鳴（SPR）、例えばBiacore（商標）システムを使用するもの、またはKinExAなど、当技術分野において公知の標準的アッセイによって評価することもできる。
標的への分子の結合を、その標的の別のリガンド、例えば本来であればその標的に結合する抗体または可溶性受容体による標的の結合と比較する、競合結合アッセイを行うことができる。50％阻害が起きる濃度はKiとして公知である。理想的条件下ではKiはKDに等しい。Ki値はKD未満には決してならないので、KDの上限を得るためにKiの測定を都合よく代用することができる。
上記の定義によれば、異なる分子相互作用に関連する結合アフィニティー、例えば所与の標的に対する異なる分子の結合アフィニティーの比較は、個々の分子/標的複合体についてのKD値の比較によって比較されうる。結合パートナーに関するKD値は、当技術分野において十分に確立された方法を使用して決定することができる。KDを決定するための方法の1つは、典型的にはBiacore（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する、表面プラズモン共鳴を使用することによる。
同様に、相互作用の特異性は、関心対象の相互作用、分子と標的との間の特異的相互作用に関するKD値を、関心対象ではない相互作用、例えば標的に結合しないことが公知の対照分子に関するKDと共に決定し、それらを比較することによって評価することができる。
本明細書の他の項で言明したように、特異的結合は、標的ではない対照分子への分子の結合との関連において評価しうる。この比較は、標的に結合する分子の能力と対照分子に結合する分子の能力とを比較することによってなされうる。この比較は上述のようにKDまたはKiの評価においてなされうる。そのような比較において使用される対照分子は標的ではない任意の分子であることができる。好ましくは対照分子は標的と同一ではない。好ましくは対照分子は標的のフラグメントではない。特異的結合を決定するために使用される対照分子は、構造面および機能面で標的とは無関係でありうる。例えば対照分子は無関係な材料または環境において随伴する材料でありうる。特異的結合を決定するために使用される対照分子は、標的、すなわちCD2と同じインビボ経路に関与する分子である。本発明の分子が別のそのような分子と比べてCD2に対する特異性を有することを保証することにより、不要なインビボ交差反応性を回避しうる。
本発明の分子は標的に関連するいくつかの分子に結合する能力を保ちうる。
あるいは本発明の分子は特定標的分子に対する特異性を有しうる。例えば、それは、本明細書に記載するある標的分子には結合しうるが、本明細書に記載する異なる標的分子には結合しえないか、著しく低減したアフィニティーでしか結合しえない。例えば、成熟ヒトCD2は標的として使用されうるが、その標的に結合する分子は、他の種由来の他のCD2タンパク質、例えば他の哺乳類CD2には結合できないか、または弱いアフィニティーでしか結合しえない。いくつかの態様において、分子はヒトCD2とカニクイザルCD2の両方に結合する。
「融合」タンパク質または「融合」分子は、第1のポリペプチドが、例えば直接的または間接的に、第2のポリペプチドに機能的に連結されているタンパク質である。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子は、第2のポリペプチドに機能的に連結されたLFA3ドメインを含む融合タンパク質である。
「Fc融合体」タンパク質または「Fc融合体」分子は、1つまたは複数のポリペプチドが例えば直接的または間接的に、Fcポリペプチドに機能的に連結されているタンパク質である。Fc融合体は免疫グロブリンのFc領域を融合パートナーと共に含む。いくつかの態様において、本明細書において開示するLFA3ポリペプチド分子は、Fcポリペプチドに機能的に連結されたLFA3ドメインを含むFc融合タンパク質である。
「ネイティブ配列Fc領域」は天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。「バリアントFc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸改変ゆえにネイティブ配列Fc領域とは異なるアミノ酸配列を含むが、それでもなお、ネイティブ配列Fc領域のエフェクター機能を少なくとも1つは保持している。好ましくは、バリアントFc領域は、ネイティブ配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域と比べて少なくとも1つのアミノ酸置換、例えば約1〜約10個のアミノ酸置換、好ましくはネイティブ配列Fc領域または親ポリペプチドFc領域中に約1〜約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書においてバリアントFc領域は、好ましくは、ネイティブ配列Fc領域および/または親ポリペプチドのFc領域に対して、少なくとも約80％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約90％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％の配列同一性を保持すると考えられる。
当技術分野では公知であるとおり、抗体の「定常領域」とは、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域のどちらかを単独で指すか、またはそれらの組合せを指す。
「IgG Fc領域」、「Fc領域」、「Fcドメイン」、および「Fc」という用語は、本明細書では相互可換的に使用され、IgG分子のうち、IgG分子のパパイン消化によって得られる結晶化可能フラグメントに関連する部分を指す。本明細書において使用される場合、この用語は、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除外した抗体の定常領域に関し、さらに、その領域の一部分に関する。したがってFcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのN末端側にあるフレキシブルなヒンジ、またはそれらの一部を指す。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含みうる。IgGの場合、Fcは、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3（Cガンマ2およびCガンマ3）ならびにCγ1（Cガンマ1）とCγ2（Cガンマ2）の間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変動しうるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は通常、残基C226またはP230をそのカルボキシル末端に含むように定義される。ここで、ナンバリングは、Kabat et al.,1991に記載されているEdelman et al.,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63（1）:78-85のEUインデックスに従う。典型的には、Fcドメインは、ヒトIgG1定常ドメインのアミノ酸残基236前後から447前後までを含む。例示的なヒト野生型IgG1 Fcドメインアミノ酸配列をSEQ ID NO:31に示す。Fcポリペプチドとは、孤立したこの領域を指す場合も、抗体もしくはその抗原結合部位またはFc融合タンパク質との関連におけるこの領域を指す場合もある。
重鎖定常ドメインはFc領域を含み、IgG重鎖のCH2およびCH3（任意でIgAおよびIgEのCH4）ドメインに加えてCH1ドメインおよびヒンジをさらに含む。
「機能的Fc領域」は、ネイティブ配列Fc領域のエフェクター機能を少なくとも1つは保持する。例示的「抗体エフェクター機能」として、C1q結合、補体依存性細胞傷害、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、貪食、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。そのようなエフェクター機能は一般にFc領域が結合ドメインと組み合わされることを必要とし、そのようなエフェクター機能を評価するための当技術分野において公知のさまざまなアッセイを使用して評価することができる。
「ネイティブ配列Fc領域」は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列ヒトFc領域としては、ネイティブ配列ヒトIgG1Fc領域（非AおよびAアロタイプ）、ネイティブ配列ヒトIgG2Fc領域、ネイティブ配列ヒトIgG3Fc領域、およびネイティブ配列ヒトIgG4Fc領域、ならびにそれらの天然バリアントが挙げられる。
「バリアントFc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸改変ゆえにネイティブ配列Fc領域とは異なるアミノ酸配列を含む。
「Fc受容体」または「FcR」とは抗体のFc領域に結合する受容体を表す。いくつかの態様において、FcγRはネイティブヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（γ受容体）であり、FcγRIサブクラス、FcγRIIサブクラスおよびFcγRIIIサブクラスの受容体を、それら受容体のアレルバリアントおよび選択的スプライス型を含めて包含する。FcγRII受容体には、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）があり、これらは、主としてその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含有する。阻害受容体FcγRIIBはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ITIM）を含有する（例えばDaeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234（1997）参照）。FcRについては、例えばRavetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92（1991）、Capel et ah,Immunomethods 4:25-34（1994）およびde Haas et ah,J.Lab.Clin.Med.126:330-41（1995）に総説がある。他のFcRも、今後同定されるものを含めて、本明細書における用語「FcR」に包含される。
「Fc受容体」または「FcR」という用語は、胎児への母性IgGの移行（Guyer et ah,J.Immunol.117:587（1976）およびKim et ah,J.Immunol.24:249（1994））ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調整を担う新生児受容体FcRnも包含する。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えばGhetie and Ward.,Immunol.Today 18（12）:592-598（1997）、Ghetie et ah,Nature Biotechnology,15（7）:637-640（1997）;Hinton et ah,J.Biol.Chem.279（8）:6213-6216（2004）;WO 2004/92219（Hinton et al）を参照されたい）。
「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域に帰することができる生物学的活性を指し、それらは抗体アイソタイプによってさまざまである。抗体エフェクター機能の例として、Clq結合および補体依存性細胞傷害（CDC）、Fc受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、貪食、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション、ならびにB細胞活性化が挙げられる。
「ヒトエフェクター細胞」は、1つまたは複数のFcRを発現してエフェクター機能を履行する白血球である。ある特定の態様において、これらの細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、ADCCエフェクター機能を履行する。ADCCを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、マクロファージ、細胞傷害性T細胞および好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、ネイティブな供給源、例えば血液から単離することができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ADCC」とは、細胞傷害の一形態であり、ここでは、ある特定の細胞傷害性細胞（例えばNK細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するFc受容体（FcR）に結合した分泌型Igが、それら細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒で標的細胞を殺すことを可能にする。ADCCを媒介するための主要な細胞であるNK細胞がFcγRIIIしか発現しないのに対し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現は、Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92（1991）の464頁のTable 3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するには、米国特許出願第5,500,362号または同5,821,337号または米国特許出願第6,737,056号（Presta）に記載されているようなインビトロADCCアッセイを行いうる。そのようなアッセイに役立つエフェクター細胞としてPBMCおよびNK細胞が挙げられる。代替的に、またはその上、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes et al.Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）95:652-656（1998）に開示されているような動物モデルで、評価することもできる。Fc領域アミノ酸が変更されていてADCC活性が増大または減少しているさらなる抗体は、例えば米国特許出願第7,923,538号および米国特許出願第7,994,290号に記載されている。
「増強されたADCC活性」を有する分子（例えばFc融合体）とは、アッセイにおいて使用されるこのような分子とリファレンス分子の量が本質的に同じ場合には、リファレンス分子よりも効果的にインビトロまたはインビボでADCCを媒介する分子を指し、ここで該分子とリファレンス分子とは少なくとも1つの構造的側面において相違する。いくつかの態様において、ADCC活性は本明細書において開示するインビトロADCCアッセイを使用して決定されうるが、例えば動物モデルなどにおいてADCC活性を決定するための他のアッセイまたは他の方法も考えられる。いくつかの態様において、増強されたADCC活性を有する分子は、FcγRIIIAに対して増強されたアフィニティーを有する。いくつかの態様において、増強されたADCC活性を有する分子はFcγRIIIA（V158）に対して増強されたアフィニティーを有する。いくつかの態様において、増強されたADCC活性を有する分子は、FcγRIIIA（F158）に対して増強されたアフィニティーを有する。
「変更された」FcR結合アフィニティーまたはADCC活性を有する分子（例えばFc融合体）は、リファレンス分子と比較して増強されたまたは減少したFcR結合活性および/またはADCC活性を有するものであり、ここで該分子とリファレンス分子とは少なくとも1つの構造的側面において相違する。FcRに対して「増大した結合を呈する」分子は、少なくとも1つのFcRに、リファレンス分子よりも良いアフィニティーで結合する。FcRに対して「減少した結合を呈する」分子は、少なくとも1つのFcRに、リファレンス分子よりも低いアフィニティーで結合する。FcRに対して減少した結合を呈するそのような分子は、例えばネイティブ配列IgG Fc領域と比べて、FcRに対して0〜20パーセントの結合を保持するなど、FcRに対する結合をほとんど保持しないか、または明らかな結合を保持しない。
「FcγRIIIAに対する増強されたアフィニティー」とは、分子（例えばFc融合体）を指す。FcγRIIIA（場合によってはCD16aとも呼ばれる）に対してリファレンス分子よりも強いアフィニティーを有する分子を指し、ここで該分子とリファレンス分子とは少なくとも1つの構造的側面において相違する。FcγRIIIAに対するアフィニティーを決定するのに適した任意の方法を使用しうる。いくつかの態様において、FcγRIIIAに対するアフィニティーは、本明細書に記載の方法によって決定される。いくつかの態様において、FcγRIIIAに対する増強されたアフィニティーは増強されたADCC活性を有する。いくつかの態様において、FcγRIIIAに対して増強されたアフィニティーを有する分子は、FcγRIIIA（V158）に対して増強されたアフィニティーを有する。いくつかの態様において、FcγRIIIAに対して増強されたアフィニティーを有する分子は、FcγRIIIA（F158）に対して増強されたアフィニティーを有する。
L-フコースは、6-デオキシ-L-ガラクトースとも呼ばれ、動物におけるN結合型およびO結合型グリカンならびに糖脂質の一構成要素である単糖である。Becker and Lowe,Glycobiology 13:41R-51R（2003）を参照されたい。フコースは典型的には、血液型抗原、セレクチンおよび抗体に取り付けられるグリカンなどといったグリカンに、末端修飾として付加される。フコースは、特異的フコシルトランスフェラーゼによって、α（1,2）結合、α（1,3）結合、α（1,4）結合およびα（1,6）結合を介してグリカンに取り付けることができる。α（1,2）-フコース結合は、典型的には、H血液型抗原と関連する。α（1,3）-およびα（1,4）-フコース結合はルイスX抗原の修飾と関連する。α（1,6）-フコース結合は抗体上にあるようなN結合型GlcNAc分子に関連する。
本発明の糖質部分は、オリゴ糖の記述に一般に使用される命名法を参照して記述される。この命名法を使用する糖質化学の総説はHubbard and Ivatt（1981）Ann.Rev.Biochem.50:555-583に見出される。この命名法には、例えば、マンノースを表すMan、2-N-アセチルグルコサミンを表すGIcNAc、ガラクトースを表すGal、フコースのFuc、およびグルコースを表すGlcが含まれる。シアル酸は、5-N-アセチルノイラミン酸についてはNeuNAcという略号で記述され、5-グリコリルノイラミン酸についてはNeuNGcで記述される（IUB-IUPAC合同生化学命名委員会,1982,J.Biol.Chem.257:3347-3351;（1982）J.Biol.Chem.257:3352）。
本発明の糖質構造は、発現したタンパク質上に、N結合型オリゴ糖として存在する。「N結合型グリコシル化」は、ポリペプチド鎖中のアスパラギン残基への、GlcNAcを介した糖質部分の取付けを指す。N結合型糖質はすべて共通のMan1-6（Man1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-Rコア構造を含有する。したがって、記載のコア構造では、Rが、産生された糖タンパク質のアスパラギン残基を表す。産生されたタンパク質の配列は、アスパラギン-X-セリン、アスパラギン-X-スレオニンおよびアスパラギン-X-システインを含有すると考えられる。ここで、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である（Asn-Xaa-Ser/Thr）。これに対し、「O結合型」糖質は、スレオニンまたはセリンのヒドロキシル基に取り付けられたGalNAcである共通のコア構造を特徴とするが、コンセンサス配列は要求されない。N結合型糖質のうち、最も重要なのは、本明細書に記載する「バイアンテナ型」構造などの「複合型」N結合型糖質である。
糖タンパク質免疫グロブリンG（IgG）が、ガラクトース残基を0個、1個、または2個含有する3タイプの複合型バイアンテナ構造（Wormland et al.、1997、Biochemistry 36:1370-1380）と関連し、それらが一般にそれぞれG0、G1、およびG2として公知であることが、当業者は認識するであろう。IgGクラスのヒト抗体分子の場合、各抗体分子は、Fc領域のCH2ドメインの内面のβ-4ベンドのAsn297のアミド側鎖に取り付けられたN結合型オリゴ糖を有する（Beale and Feinstein,1976,Q.Rev.Biophys.9:253-259、Jefferis et al.,1995,Immunol.Letts.44:111-117）。IgG CH2ドメインのAsn297に取り付けられるオリゴ糖部分は、同定された六糖コア構造とさまざまな外側糖残基とを有する複合型バイアンテナタイプである（Jefferis et al,1997,前掲書、Wyss and Wagner,1996,Current Opinions in Biotech.7:409-416参照）。コア構造（GIcNAc2Man3GIcNAc）はバイアンテナ型オリゴ糖に特有であり、図1に模式的に示されている。
各コア構造はバイセクティングN-アセチルグルコースアミン、コアフコース、およびガラクトースまたはシアル酸外側糖類を有しうるので、Asn 297部位を占めうる構造上ユニークなオリゴ糖は36種類存在する（Jefferis and Lund、前掲書）。特定CH2ドメイン内ではAsn297におけるグリコシル化が、2本鎖Fcドメイン内のどちらかのAsn297残基に取り付けられた異なるオリゴ糖鎖ゆえに、非対称でありうることも、認識されるであろう。例えば、単一抗体分泌細胞内で合成される重鎖はそのアミノ酸配列が均一でありうるが、それは、一般的には異なるグリコシル化を受けて、多数の構造上ユニークなIgグリコフォームをもたらす。
IgGのCH2ドメインに見出される複合型オリゴ糖構造の主要タイプは「グリコフォーム」とも呼ばれ、国際特許公報番号WO 99/22764の7頁目に示されている。
本発明によれば、G0とは、末端シアル酸（NeuAc）も末端Galも存在しないバイアンテナ型構造を指し、G1とは1つのGalを有しNeuAcを有しないバイアンテナ型構造を指し、G2とは、2つの末端Galを有しNeuAcを有さないバイアンテナ型構造を指す。例えば、G0、G1、G-1、およびG2の例示的構造を図示する図2を参照されたい。
「アフコシル化」分子（例えばFc融合体）または「フコースを欠く」分子（例えばFc融合体）とは、その定常領域グリコシル化中にフコースを欠くIgG1またはIgG3アイソタイプ分子（例えばFc融合体）を指す。ヒトIgG1またはIgG3のグリコシル化は、Asn297において、2個までのGal残基を末端に持つコアフコシル化バイアンテナ複合型オリゴ糖グリコシル化として起こる。いくつかの態様において、アフコシル化抗体はAsn297にフコースを欠く。これらの構造は末端Gal残基の量に応じてG0、G1（1,6または1,3）またはG2グリカン残基と指定される。例えばRaju,T.S.,BioProcess Int.1:44-53（2003）参照。抗体FcのCHO型グリコシル化は、例えばRoutier,F.FL,Glycoconjugate J.14:201-207（1997）に記載されている。
いくつかの態様において、本明細書において相互可換的に使用される「フコシル」または「アフコシル化」分子（例えばFc融合体）とは、コアフコースを欠くように糖鎖工学的に操作された分子（例えばFc融合体）を指す。グリコース部分中のフコース含量が低減している分子（例えばFc融合体）は、FcγRIIIa（CD16）に対して増大したアフィニティーを有し、結果として、増強された活性依存性細胞性細胞傷害（activity-dependent cellular cytotoxicity）（ADCC）活性を保持する。アフコシル分子（例えばFc融合体）は、フコース付加を担う遺伝子（α1,6-フコシルトランスフェラーゼ）をどちらのアレルも欠くPotelligent（登録商標）CHOK1SV細胞株（Lonza Biologics）を使用して産生させることができる。アフコシル分子またはフコース低減分子（例えばFc融合体）は、オリゴ糖生合成活性をさまざまな方法で改変することによっても生成させることができる。例えば産生細胞株のゴルジ装置におけるN-アセチルグルコサミン-トランスフェラーゼIII（GnTIII）の過剰発現は、分子のFc定常領域に付随するバイセクト型オリゴ糖構造を生成させ、フコシル化を抑制する。そのような発現系では、GnTIII発現のレベルが、アフコシル化IgG1グリコフォームの生成およびその結果としての増強されたADCC活性と相関する。フコシル化は、糖類似体、例えば限定するわけではないが、WO 2012/019165に記載のフコース類似体などの使用によっても、細胞培養において減少させることができる。したがってアフコシル化分子またはフコース低減分子（例えばFc融合体）は、当技術分野において周知の多種多様な方法を使用して産生させることができる。
いくつかの態様において、アフコシル化分子（例えばFc融合体）はFcγRIIIAに対して増強されたアフィニティーを有する。いくつかの態様において、アフコシル化分子（例えばFc融合体）はFcγRIIIA（V158）に対して増強されたアフィニティーを有する。いくつかの態様において、アフコシル化分子（例えばFc融合体）はFcγRIIIA（F158）に対して増強されたアフィニティーを有する。
「グリコフォーム」とは、さまざまな糖質単位の連結を含む複雑なオリゴ糖構造を指す。そのような構造は、例えばEssentials of Glycobiology Varki et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY（1999）に記載されており、この文献には標準的な糖生物学的命名法の総説も記載されている。そのようなグリコフォームとして、G2、G1、G0、G-1、およびG-2が挙げられるが、それらに限定されるわけではない（例えば国際特許公報番号WO 99/22764を参照されたい）。
「グリコシル化パターン」とは、タンパク質に共有結合される糖質単位のパターン（例えばグリコフォーム）およびグリコフォームがタンパク質の、より具体的には免疫グロブリンタンパク質の、ペプチドバックボーンに共有結合される部位と定義される。
「補体依存性細胞傷害」または「CDC」とは、補体存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それぞれのコグネイト抗原に結合している抗体（適切なサブクラスのもの）への補体系の第1の成分（Clq）の結合によって開始される。補体活性化を評価するには、例えばGazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163（1996）に記載されているようなCDCアッセイを行いうる。変更されたFc領域アミノ酸配列を有し、Clq結合能が増大または減少している抗体は、例えば米国特許出願第6,194,551号B1、米国特許出願第7,923,538号、米国特許出願第7,994,290号およびWO 1999/51642に記載されている。例えばIdusogie et al,J.も参照されたい。
本明細書において使用される「野生型アミノ酸」および「野生型配列」という用語は、ある特定の集団（例えばヒト、マウス、ラット、細胞など）内に天然に存在するアミノ酸または核酸の配列を指す。
本明細書において相互可換的に使用される「リンパ球機能関連抗原3」または「LFA3」は、当技術分野では「CD58」とも呼ばれ、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。LFA3という用語には、とりわけヒト、カニクイザル、ラット、ウサギ、およびマウスを含む、LFA3ホモログおよびLFA3オルソログが包含される。本明細書で使用する場合の「LFA3」は、哺乳動物のLFA3、例えばヒト、ラットまたはマウスのLFA3および非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、またはブタのLFA3を指す。LFA3の非限定的な例はヒトLFA3である（例えばUniProtKBアクセッション番号P19256、SEQ ID NO:2）。「LFA3」という用語は、上述のLFA3分子のフラグメント、バリアント、アイソフォームおよび他のホモログも包含する。バリアントLFA3分子は、一般に、天然のLFA3と同じタイプの活性、例えばCD2への結合能を有することを特徴とすると考えられる。
「LFA3ドメイン」は、LFA3のフラグメントまたはそのバリアントを指す。いくつかの態様において、LFA3ドメインは、100、110、120、130、140、150、160、170、または180アミノ酸長以下である。いくつかの態様において、LFA3ドメインはLFA3の第1の細胞外ドメインに由来する。いくつかの態様において、LFA3ドメインは、野生型LFA3配列と比べて6、10、15、20、または30個以下のアミノ酸変異（例えば置換、付加または欠失）を含む。
「CD2」は、当技術分野では「赤血球受容体」、「LFA-3受容体」、「ロゼット受容体」または「T細胞表面抗原T11/Leu-5」とも呼ばれ、T細胞およびNK細胞などの細胞上に発現する分子である。CD2という用語には、とりわけヒト、カニクイザル、ラット、ウサギ、およびマウスを含む、CD2ホモログおよびCD2オルソログが包含される。本明細書で使用する場合の「CD2」は、哺乳動物のCD2、例えばヒト、ラット、またはマウスのCD2および非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、またはブタのCD2を指す。CD2の非限定的な例はヒトCD2である（例えばUniProtKBアクセッション番号P06729、SEQ ID NO:121）。「CD2」という用語は、上述のCD2分子のフラグメント、バリアント、アイソフォームおよび他のホモログも包含する。バリアントCD2分子は、一般に、天然のCD2と同じタイプの活性を有することを特徴とすると考えられる。
Figure 2021519758
本明細書の他の項で概説するように、ポリペプチド分子のある特定の位置には変更を加えることができる。本明細書で使用する場合の「位置」とはタンパク質の配列中の場所を意味する。位置には通し番号をつけるか、確立されたフォーマットに従ってナンバリングすることができ、例えば抗体のアミノ酸残基にはEUインデックスおよびKabatインデックスを使用してナンバリングすることができる。
当技術分野では公知であるとおり、本明細書において相互可換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、DNAおよびRNAを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによって鎖に組み込まれうる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチド構造の改変が存在する場合、その改変は、鎖の組み立ての前または後に加えうる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成要素で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは重合後に、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって、さらに修飾されうる。他のタイプの修飾として、無修飾型のポリヌクレオチドに加えて、例えば「キャップ」、天然ヌクレオチドのうちの1つまたは複数の、類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合によるもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）および荷電結合によるもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）など、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）など、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を有するもの（例えばαアノマー核酸など）が挙げられる。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホン酸基、リン酸基で置き換えるか、標準的保護基で保護するか、または活性化することで追加のヌクレオチドへの追加の結合を準備するか、または固体支持体にコンジュゲートしてもよい。5'および3'末端OHは、リン酸化するか、アミンもしくは1〜20炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルを標準的保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野において一般に公知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似体、例えば2'-O-メチル-、2'-O-アリル、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-またはβ-アノマー糖、アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体およびメチルリボシドなどの無塩基ヌクレオシド類似体なども含有することができる。1つまたは複数のホスホジエステル結合を代替的連結基で置き換えうる。これらの代替的連結基としては、ホスフェートがP（O）S（「チオエート」）、P（S）S（「ジチオエート」）、（O）NR2（「アミデート」）、P（O）R、P（O）OR'、COまたはCH2（「ホルムアセタール」）で置き換えられている態様が挙げられるが、それらに限定されるわけではなく、ここで、各RまたはR'は、独立してH、またはエーテル（-O-）結合を含有してもよい置換もしくは無置換アルキル（1〜20C）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（araldyl）である。ポリヌクレオチドの連結部はすべてが同一である必要はない。上述の説明は、RNAおよびDNAを含めて、本明細書において言及するすべてのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書で使用する場合の「ベクター」とは、関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を宿主細胞に送達し、好ましくはそこで発現させる能力を有するコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性凝縮剤と会合したDNAまたはRNA発現ベクター、リポソームに封入されたDNAまたはRNA発現ベクター、およびある特定の真核細胞、例えば産生細胞が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクターのレシピエントであることができるかまたはレシピエントとなった、個々の細胞または細胞培養を包含する。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を包含し、子孫は、天然の偶発的な変異または故意の変異ゆえに、元の親細胞と（形態またはゲノムDNAコンプリメント（complement）が）必ずしも完全には同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトおよび/または形質転換された細胞を包含する。
宿主細胞は原核細胞または真核細胞でありうる。例示的真核細胞として、哺乳動物細胞、例えば霊長類または非霊長類の動物細胞、真菌細胞、例えば酵母、植物細胞、および昆虫細胞が挙げられる。
本発明では、細胞培養が可能でありタンパク質またはポリペプチドを発現させることができる任意の宿主細胞を、用いることができる。ある特定の態様において、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞である。発現用の宿主として使用することができる哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、American Type Culture Collection（ATCC）から入手できる多くの不死化細胞株が、これに含まれる。非限定的な例示的哺乳動物細胞として、NS0細胞、HEK293細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにそれらの派生株、例えば293-6E細胞およびCHO DG44細胞、CHO DXB11、ならびにPotelligent（登録商標）CHOK1SV細胞（BioWa/Lonza、ニュージャージー州アレンデール）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。哺乳動物宿主細胞には、ヒト子宮頸癌細胞（HeLa、ATCC CCL 2）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）、サル腎臓細胞（COS）およびヒト肝細胞癌細胞（例えばHep G2）も包含されるが、それらに限定されるわけではない。本発明に従って使用されうる哺乳動物細胞の他の非限定的な例としては、ヒト網膜が細胞（PER.C6（登録商標）、CruCell、オランダ、ライデン）;SV40で形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7、ATCC CRL 1651）;ヒト胎児腎臓株293（HEK 293）または浮遊培養で成長するようにサブクローニングされた293細胞（Graham et al,1977,J.Gen Virol.36:59）;マウスセルトリ細胞（TM4,Mather,1980,Biol.Reprod.23:243-251）;サル腎臓細胞（CV1 ATCC CCL 70）;アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL-1 587）;イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）;バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）;ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）;ヒト肝臓細胞（Hep G2、HB 8065）;マウス乳房腫瘍（MMT 060562、ATCC CCL51）;TR1細胞（Mather et al.,1982,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68）;MRC5細胞;FS4細胞;ヒトヘパトーマ株（Hep G2）;および数多くの骨髄腫細胞株、例えば限定するわけではないが、BALB/cマウス骨髄腫株（NS0/1、ECACC No:85110503）、NS0細胞およびSp2/0細胞が挙げられる。
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する多くの市販細胞株および非市販細胞株を、本発明に用いうる。さまざまな細胞株が異なる栄養要求性を有しうることならびに/または最適な成長およびポリペプチド発現またはタンパク質発現のために異なる培養条件を要求しうることは当業者には理解されるであろうし、当業者は必要に応じて条件を改変することができるであろう。
本発明は、関心対象のタンパク質を産生させるための、例えば昆虫細胞系、酵母発現系、または限定するわけではないがCHO細胞などの哺乳動物細胞系における発現のための、当技術分野において公知の、または本明細書に開示する、任意の真核発現系を包含する。
本明細書で使用する場合の「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであることができる。発現制御配列は、転写されるべき核酸配列に機能的に連結される。
本明細書では相互可換的に使用される「リーダーペプチド」または「リーダー配列」という用語は、核酸分子の5'端および/またはポリペプチドのN末端もしくはその近傍に存在しえ、それが存在する場合には限定するわけではないが細胞からのポリペプチドの分泌を含む送り先の細胞小器官へのポリペプチドの輸送を媒介しうる、任意の核酸配列またはそれによってコードされるアミノ酸配列を意味する。そのようなリーダー配列として、例えば、
Figure 2021519758
および
Figure 2021519758
を含む核酸配列、ならびに、それによってコードされるアミノ酸配列、例えば、限定するわけではないが
Figure 2021519758
および
Figure 2021519758
が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本発明は、所望の細胞小器官への、例えば小胞体への、ポリペプチドの輸送をもたらすことができる、および/または細胞から分泌される、当技術分野において公知の、または今後同定される、これらの、および他の任意のリーダーシグナル（核酸配列およびアミノ酸配列）を包含する。一般に、シグナルペプチドは、成熟ポリペプチドからは除去される。
本明細書で使用する場合の「処置」は、有益なまたは所望する臨床結果を得るためのアプローチである。本発明に関して、有益なまたは所望する臨床結果としては、以下のうちの1つまたは複数が挙げられるが、それらに限定されるわけではない:生存率の向上（死亡率の低減）、疾患に対する炎症応答の低減、組織線維症の量の低減、疾患病巣の外見の改善、病理学的病巣の局所的部位への限定、疾患による損傷の程度の減少、疾患の持続時間の減少、および/または疾患に関係する症状の数、程度もしくは持続時間の低減。この用語は、疾患の症状、合併症、もしくは生化学的徴候の発生を防止するもしくは遅延させるか、症状を軽減するか、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる発達を停止もしくは阻害するための、本発明の化合物または作用物質の投与を包含する。処置は、予防的（発病を防止または遅延させること、またはその臨床症状もしくは前臨床症状の発現を防止すること）であってもよいか、または疾患の症状発現後の症状の治療的抑止もしくは緩和であってもよい。
「寛解」とは、LFA3ポリペプチド分子を投与しない場合と比較して、1つまたは複数の症状の減弱または改善を意味する。「寛解」には、症状の持続時間の短縮または低減も包含される。
本明細書で使用する場合の薬物、化合物、または薬学的組成物の「有効投薬量」または「有効量」とは、任意の1つまたは複数の有益なまたは所望する結果に影響を及ぼすのに十分な量である。より具体的な局面において、有効量は、疾患または感染の症状を防止し、緩和し、もしくは寛解し、かつ/または処置対象を延命する。予防的使用の場合、有益なまたは所望する結果としては、リスクの排除または低減、重症度の減弱、または、疾患の生化学的症状、組織学的症状および/もしくは行動症状、その合併症、ならびに疾患の発生中に提示される中間病理学的表現型を含む疾患の発生の遅延が挙げられる。治療的使用の場合、有益なまたは所望する結果としては、疾患、障害、または状態の1つまたは複数の症状を低減すること、その疾患を処置するために必要な他の薬物治療の用量を減少させること、他の薬物治療の効果を増強すること、および/または患者の疾患の進行を遅延させることなどの臨床結果が挙げられる。有効投薬量は、1回または複数回で投与することができる。本発明に関して、薬物、化合物または薬学的組成物の有効投薬量とは、予防的処置または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床的状況において理解されるように、薬物、化合物または薬学的組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物、もしくは薬学的組成物と一緒に達成されてもよいかままたはそうでなくてもよい。したがって、「有効投薬量」は、1つまたは複数の治療用物質を投与する状況において考慮することができ、単剤は、1つまたは複数の他の作用物質と一緒に、望ましい結果が達成されうるか、達成されるのであれば、有効量で与えられるとみなされうる。
「個体」または「対象」とは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、農用動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットも包含されるが、それらに限定されるわけではない。ある特定の態様において、対象は自己免疫疾患、自己免疫障害、または自己免疫状態、例えば1型糖尿病または乾癬性関節炎を有する。ある特定の態様において対象は免疫抑制治療を必要としている。
本明細書で使用する場合の「薬学的に許容される担体」または「許容される薬学的賦形剤」には、活性成分と組み合わされた時に、その成分が生物学的活性を保つことを可能にし、対象の免疫系と非反応性である、任意の材料が包含される。例としては、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、油/水型エマルションなどのエマルション、およびさまざまなタイプの湿潤剤など、任意の標準的な薬学的担体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。エアロゾル投与または非経口投与のための好ましい希釈剤はリン酸緩衝食塩水（PBS）または生理（0.9％）食塩水である。そのような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化される（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990およびRemington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000参照）。
本明細書には例示的な方法および材料を記載するが、本発明の実施または試験では、本明細書に記載するものと類似するか等価な方法および材料を使用することができる。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定を意図していない。
II. LFA3バリアント
本発明はLFA3バリアント、例えばヒトCD2に結合するヒトLFA3バリアントに関する。いくつかの態様において、LFA3バリアントは、その安定性および製造特性を増強する1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様において、LFA3バリアントは、CD2に対するその結合アフィニティーを増大させる1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様において、LFA3バリアント（例えばバリアントLFA3-Fc融合タンパク質）は、CD2発現細胞に対する細胞毒性を増強する1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様において、LFA3バリアント（例えばバリアントLFA3-Fc融合タンパク質）は、同種異系T細胞応答の阻害を増強する1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様において、LFA3バリアントは、その分子のインビボでの遅いクリアランスにつながる1つまたは複数の変異を含有する。野生型LFA3およびLFA3バリアントの例示的配列を、LFA3-Fc融合タンパク質を含めて、表2および表3に提供する。
操作されたFcポリペプチドがC末端リジン（K）アミノ酸残基を含む（例えばヒトIgG1重鎖が末端リジンを含む）別の態様では、リジン残基を切り取ってC末端リジン残基を欠く融合タンパク質をもたらしうることは、当業者には理解されるであろう。したがっていくつかの態様において、操作されたFcポリペプチドを含むFc融合タンパク質は、本来なら存在する末端リジンが存在しないポリペプチドを含む。
（表２）野生型LFA3およびLFA3バリアントの例示的アミノ酸配列
Figure 2021519758
Figure 2021519758
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Figure 2021519758
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Figure 2021519758
（表３）野生型LFA3およびLFA3バリアントの例示的ヌクレオチド配列
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
M1d1 LFA3-Fc融合タンパク質のアミノ酸配列をSEQ ID NO:69として提供する。4つの非ネイティブアミノ酸置換（A36V、L38F、F43V、およびM86F）は太字で示し、下線を付す。LFA3ドメインのC末端残基（L93）には二重下線で印をつける。4つの予想N結合型グリコシル化部位（N12、N66、N81、およびN170）には点線の下線で印をつける。
Figure 2021519758
一局面において、追加のポリペプチド分子は、以下の態様のうちの1つまたは複数を包含する。
A1.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:70のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:70の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A2.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:71）またはSEQ ID NO:71の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X2が、F、I、L、V、Nle、M、またはAであり、
X3が、K、R、M、T、Q、またはNであり、
X4が、K、R、M、T、Q、またはNであり、
X5が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X6が、K、R、M、T、Q、またはNであり、
X7が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X8が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X9が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X10が、K、R、M、T、Q、またはNであり、
X11が、F、Y、L、H、I、N、V、D、A、またはYであり、
X12が、S、T、A、またはGであり、
X13が、P、L、H、R、またはAであり、
X14が、F、I、L、V、M、A、またはNleであり、
X15が、D、E、N、K、Q、またはHであり、かつ
X16が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A3.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:72）またはSEQ ID NO:72の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X2が、F、I、L、またはVであり、
X3が、K、R、M、またはTであり、
X4が、K、R、M、またはTであり、
X5が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X6が、K、R、M、またはTであり、
X7が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X8が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X9が、D、E、N、K、Q、またはHであり、
X10が、K、R、M、またはTであり、
X11が、F、Y、L、H、I、N、V、またはDであり、
X12が、S、T、A、またはGであり、
X13が、P、L、H、またはRであり、
X14が、F、I、L、またはVであり、
X15が、D、E、N、K、Q、またはHであり、かつ
X16が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A4.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:3と比べて、SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基25、27、29、32、33、34、37、39、42、44、46、47、80、82、または84に1つまたは複数の変異（例えば置換、欠失、または付加）を含み、例えばLFA3ドメインが、SEQ ID NO:3と比べて残基25、27、29、32、33、34、37、39、42、44、46、47、80、82、または84に1つまたは複数の変異（例えば置換、欠失、または付加）を有するSEQ ID NO:3を含む、単離されたポリペプチド分子。
A5.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、A4に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.E25D、E25N、E25K、E25Q、またはE25Hから選択される置換、
ii.L27F、L27I、L27V、L27Nle、L27M、またはL27Aから選択される置換、
iii.K29R、K29M、K29T、K29Q、またはK29Nから選択される置換、
iv.K32R、K32M、K32T、K32Q、またはK32Nから選択される置換、
v.D33E、D33N、D33K、D33Q、またはD33Hから選択される置換、
vi.K34R、K34M、K34T、K34Q、またはK34Nから選択される置換、
vii.E37D、E37N、E37K、E37Q、またはE37Hから選択される置換、
viii.E39D、E39N、E39K、E39Q、またはE39Hから選択される置換、
ix.E42D、E42N、E42K、E42Q、またはE42Hから選択される置換、
x.R44K、R44M、R44T、R44Q、またはR44Nから選択される置換、
xi.F46Y、F46L、F46H、F46I、F46N、F46V、F46D、F46A、またはF46Yから選択される置換、
xii.S47T、S47A、またはS47Gから選択される置換、
xiii.P80L、P80H、P80R、またはP80Aから選択される置換、
xiv.I82F、I82L、I82V、I82M、I82A、またはI82Nleから選択される置換、あるいは
xv.D84E、D84N、D84K、D84Q、またはD84Hから選択される置換。
A6.前記1つまたは複数の変異が、以下の置換のうちの1つまたは複数を含む、A4に記載の単離されたポリペプチド分子:
i.E25D、E25N、E25K、E25Q、またはE25Hから選択される置換、
ii.L27F、L27I、またはL27Vから選択される置換、
iii.K29R、K29M、またはK29Tから選択される置換、
iv.K32R、K32M、またはK32Tから選択される置換、
v.D33E、D33N、D33K、D33Q、またはD33Hから選択される置換、
vi.K34R、K34M、またはK34Tから選択される置換、
vii.E37D、E37N、E37K、E37Q、またはE37Hから選択される置換、
viii.E39D、E39N、E39K、E39Q、またはE39Hから選択される置換、
ix.E42D、E42N、E42K、E42Q、またはE42Hから選択される置換、
x.R44K、R44M、またはR44Tから選択される置換、
xi.F46Y、F46L、F46H、F46I、F46N、F46V、またはF46Dから選択される置換、
xii.S47T、S47A、またはS47Gから選択される置換、
xiii.P80L、P80H、またはP80Rから選択される置換、
xiv.I82F、I82L、またはI82Vから選択される置換、あるいは
xv.D84E、D84N、D84K、D84Q、またはD84Hから選択される置換。
A7.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:84）またはSEQ ID NO:84の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、M、またはTであり、
X2が、R、W、P、またはAであり、
X3が、N、Y、S、E、D、Q、H、K、またはRであり、
X4が、P、G、I、L、V、M、A、F、またはNleであり、
X5が、Y、G、T、またはSであり、
X6が、R、E、K、P、D、またはNであり、かつ
X7が、R、D、S、Q、A、E、T、またはSであり、
LFA3ドメインがSPNITDTのアミノ酸配列（SEQ ID NO:83）を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A8.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:85）またはSEQ ID NO:85の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、またはMであり、
X2が、R、W、またはPであり、
X3が、N、Y、S、E、またはDであり、
X4が、P、G、またはIであり、
X5が、Y、G、またはTであり、
X6が、R、E、K、P、またはDであり、かつ
X7が、R、D、S、Q、A、E、またはTであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A9.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:86）またはSEQ ID NO:86の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、またはMであり、
X2が、RまたはWであり、
X3が、N、Y、S、E、またはDであり、
X4が、PまたはGであり、
X5が、YまたはGであり、
X6が、R、E、K、またはPであり、かつ
X7が、R、D、S、Q、A、またはEであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A10.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7のアミノ酸配列（SEQ ID NO:86）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、またはMであり、
X2が、RまたはWであり、
X3が、N、Y、S、E、またはDであり、
X4が、PまたはGであり、
X5が、YまたはGであり、
X6が、R、E、K、またはPであり、かつ
X7が、R、D、S、Q、A、またはEである、
単離されたポリペプチド分子。
A11.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SX1NX2X3X4X5
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:87）またはSEQ ID NO:87の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、R、W、P、またはAであり、
X2が、P、G、I、L、V、M、A、F、またはNleであり、
X3が、Y、G、T、またはSであり、
X4が、R、P、D、またはNであり、かつ
X5が、R、D、T、またはSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A12.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SX1NX2X3X4X5
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:88）またはSEQ ID NO:88の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、R、W、またはPであり、
X2が、P、G、またはIであり、
X3が、Y、G、またはTであり、
X4が、R、P、またはDであり、かつ
X5が、R、D、またはTであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A13.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SX1NX2X3X4X5
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:89）またはSEQ ID NO:89の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、RまたはWであり、
X2が、PまたはGであり、
X3が、YまたはGであり、
X4が、RまたはPであり、かつ
X5が、RまたはDであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A14.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SX1NX2X3X4X5
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:89）を含み、ここで
X1が、RまたはWであり、
X2が、PまたはGであり、
X3が、YまたはGであり、
X4が、RまたはPであり、かつ
X5が、RまたはDである、
単離されたポリペプチド分子。
A15.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:90）またはSEQ ID NO:90の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、M、またはTであり、
X2が、R、W、P、またはAであり、
X3が、N、Y、S、E、D、Q、H、K、またはRであり、
X4が、P、G、I、L、V、M、A、F、またはNleであり、
X5が、Y、G、T、またはSであり、
X6が、R、E、K、P、D、またはNであり、かつ
X7が、D、S、Q、A、E、T、またはSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A16.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:91）またはSEQ ID NO:91の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、またはMであり、
X2が、R、W、またはPであり、
X3が、N、Y、S、E、またはDであり、
X4が、P、G、またはIであり、
X5が、Y、G、またはTであり、
X6が、R、E、K、P、またはDであり、かつ
X7が、D、S、Q、A、E、またはTであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A17.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:92）またはSEQ ID NO:92の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、またはMであり、
X2が、RまたはWであり、
X3が、N、Y、S、E、またはDであり、
X4が、PまたはGであり、
X5が、YまたはGであり、
X6が、R、E、K、またはPであり、かつ
X7が、D、S、Q、A、またはEであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A18.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、X1X2X3X4X5X6X7
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:92）を含み、ここで、
X1が、S、G、A、またはMであり、
X2が、RまたはWであり、
X3が、N、Y、S、E、またはDであり、
X4が、PまたはGであり、
X5が、YまたはGであり、
X6が、R、E、K、またはPであり、かつ
X7が、D、S、Q、A、またはEである、
単離されたポリペプチド分子。
A19.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:93）またはSEQ ID NO:93の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、V、L、またはAであり、
X2が、FまたはLであり、
X3が、V、I、L、またはFであり、
X4が、A、V、またはSであり、
X5が、M、F、I、またはLであり、
X6が、S、G、A、またはMであり、
X7が、RまたはWであり、
X8が、N、Y、S、E、またはDであり、
X9が、PまたはGであり、
X10が、YまたはGであり、
X11が、R、E、K、またはPであり、
X12が、R、D、S、Q、A、またはEであり、
X13が、F、M、I、またはLであり、かつ
X14が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A20.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:93）を含む、ここで、
X1が、V、L、またはAであり、
X2が、FまたはLであり、
X3が、V、I、L、またはFであり、
X4が、A、V、またはSであり、
X5が、M、F、I、またはLであり、
X6が、S、G、A、またはMであり、
X7が、RまたはWであり、
X8が、N、Y、S、E、またはDであり、
X9が、PまたはGであり、
X10が、YまたはGであり、
X11が、R、E、K、またはPであり、
X12が、R、D、S、Q、A、またはEであり、
X13が、F、M、I、またはLであり、かつ
X14が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
A21.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:94）またはSEQ ID NO:94の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、VまたはAであり、
X2が、FまたはLであり、
X3が、V、I、またはFであり、
X4が、AまたはVであり、
X5が、MまたはFであり、
X6が、S、G、A、またはMであり、
X7が、RまたはWであり、
X8が、N、Y、S、E、またはDであり、
X9が、PまたはGであり、
X10が、YまたはGであり、
X11が、R、E、K、またはPであり、
X12が、R、D、S、Q、A、またはEであり、
X13が、FまたはMであり、かつ
X14が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A22.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:94）を含み、ここで、
X1が、VまたはAであり、
X2が、FまたはLであり、
X3が、V、I、またはFであり、
X4が、AまたはVであり、
X5が、MまたはFであり、
X6が、S、G、A、またはMであり、
X7が、RまたはWであり、
X8が、N、Y、S、E、またはDであり、
X9が、PまたはGであり、
X10が、YまたはGであり、
X11が、R、E、K、またはPであり、
X12が、R、D、S、Q、A、またはEであり、
X13が、FまたはMであり、かつ
X14が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
A23.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:95のアミノ酸配列またはSEQ ID NO:95の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A24.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:96）またはSEQ ID NO:96の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、A、V、L、またはIであり、
X2が、M、F、L、またはIであり、
X3が、S、G、A、M、またはTであり、
X4が、R、W、P、またはAであり、
X5が、N、Y、S、E、D、Q、H、K、またはRであり、
X6が、P、G、I、L、V、M、A、F、またはNleであり、
X7が、Y、G、T、またはSであり、
X8が、R、E、K、P、D、またはNであり、
X9が、R、D、S、Q、A、E、T、またはSであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A25.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:97）またはSEQ ID NO:97の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、AまたはVであり、
X2が、MまたはFであり、
X3が、S、G、A、またはMであり、
X4が、R、W、またはPであり、
X5が、N、Y、S、E、またはDであり、
X6が、P、G、またはIであり、
X7が、Y、G、またはTであり、
X8が、R、E、K、P、またはDであり、
X9が、R、D、S、Q、A、E、またはTであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A26.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:98）またはSEQ ID NO:98の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、AまたはVであり、
X2が、MまたはFであり、
X3が、S、G、A、またはMであり、
X4が、RまたはWであり、
X5が、N、Y、S、E、またはDであり、
X6が、PまたはGであり、
X7が、YまたはGであり、
X8が、R、E、K、またはPであり、
X9が、R、D、S、Q、A、またはEであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A27.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:98）を含む、ここで、
X1が、AまたはVであり、
X2が、MまたはFであり、
X3が、S、G、A、またはMであり、
X4が、RまたはWであり、
X5が、N、Y、S、E、またはDであり、
X6が、PまたはGであり、
X7が、YまたはGであり、
X8が、R、E、K、またはPであり、
X9が、R、D、S、Q、A、またはEであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
A28.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:99）またはSEQ ID NO:99の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が任意のアミノ酸であり、
X2が任意のアミノ酸であり、
X3が任意のアミノ酸であり、
X4が任意のアミノ酸であり、
X5が任意のアミノ酸であり、かつ
X6が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A29.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:100）またはSEQ ID NO:100の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、R、W、P、またはAであり、
X2が、P、G、I、L、V、M、A、F、またはNleであり、
X3が、Y、G、T、またはSであり、
X4が、R、P、D、またはNであり、
X5が、R、D、T、またはSであり、かつ
X6が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A30.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:101）またはSEQ ID NO:101の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、R、W、またはPであり、
X2が、P、G、またはIであり、
X3が、Y、G、またはTであり、
X4が、R、P、またはDであり、
X5が、R、D、またはTであり、かつ
X6が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A31.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:102）またはSEQ ID NO:102の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、RまたはWであり、
X2が、PまたはGであり、
X3が、YまたはGであり、
X4が、RまたはPであり、
X5が、RまたはDであり、かつ
X6が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A32.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:102）を含み、ここで、
X1が、RまたはWであり、
X2が、PまたはGであり、
X3が、YまたはGであり、
X4が、RまたはPであり、
X5が、RまたはDであり、かつ
X6が、存在しないか、LまたはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
A33.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:103）またはSEQ ID NO:103の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、A、V、L、またはIであり、
X2が、M、F、L、またはIであり、
X3が、S、G、A、M、またはTであり、
X4が、R、W、P、またはAであり、
X5が、N、Y、S、E、D、Q、H、K、またはRであり、
X6が、P、G、I、L、V、M、A、F、またはNleであり、
X7が、Y、G、T、またはSであり、
X8が、R、E、K、P、D、またはNであり、
X9が、D、S、Q、A、E、T、またはSであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A34.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:104）またはSEQ ID NO:104の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、AまたはVであり、
X2が、MまたはFであり、
X3が、S、G、A、またはMであり、
X4が、R、W、またはPであり、
X5が、N、Y、S、E、またはDであり、
X6が、P、G、またはIであり、
X7が、Y、G、またはTであり、
X8が、R、E、K、P、またはDであり、
X9が、D、S、Q、A、E、またはTであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A35.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:105）またはSEQ ID NO:104の機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、ここで、
X1が、AまたはVであり、
X2が、MまたはFであり、
X3が、S、G、A、またはMであり、
X4が、RまたはWであり、
X5が、N、Y、S、E、またはDであり、
X6が、PまたはGであり、
X7が、YまたはGであり、
X8が、R、E、K、またはPであり、
X9が、D、S、Q、A、またはEであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSであり、
LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A36.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、
Figure 2021519758
のアミノ酸配列（SEQ ID NO:105）を含む、ここで、
X1が、AまたはVであり、
X2が、MまたはFであり、
X3が、S、G、A、またはMであり、
X4が、RまたはWであり、
X5が、N、Y、S、E、またはDであり、
X6が、PまたはGであり、
X7が、YまたはGであり、
X8が、R、E、K、またはPであり、
X9が、D、S、Q、A、またはEであり、かつ
X10が、存在しないか、Lであるか、またはLESLPSである、
単離されたポリペプチド分子。
A37.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:106〜117から選択されるアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A38.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:106のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A39.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:106のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A40.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:107のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A41.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:107のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A42.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:108のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A43.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:108のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A44.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:109のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A45.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:109のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A46.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:110のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A47.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:110のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A48.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:111のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A49.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:111のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A50.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:112のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A51.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:112のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A52.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:113のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A53.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:113のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A54.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:114のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A55.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:114のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A56.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:115のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A57.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:115のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A58.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:116のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A59.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:116のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A60.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:117のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A61.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:117のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A62.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:30〜41から選択されるアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A63.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:30のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A64.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A65.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:31のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A66.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A67.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:32のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A68.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A69.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:33のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A70.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:33のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A71.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:34のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A72.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A73.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:35のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A74.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A75.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:36のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A76.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A77.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A78.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A79.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:38のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A80.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A81.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A82.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A83.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:40のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A84.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:40のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A85.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:41のアミノ酸配列またはその機能的バリアント（例えばそれに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、もしくは少なくとも99％の同一性を有する配列）を含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:83のアミノ酸配列を含まない、単離されたポリペプチド分子。
A86.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインがSEQ ID NO:41のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド分子。
A87.CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、LFA3ドメインが、SEQ ID NO:3と比べて、SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基79、80、81、82、83、84、または85に1つまたは複数の変異（例えば置換、欠失、または付加）を含み、例えばLFA3ドメインが、SEQ ID NO:3と比べて、SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基79、80、81、82、83、84、または85に1つまたは複数の変異（例えば置換、欠失、または付加）を有するSEQ ID NO:3を含む、単離されたポリペプチド分子。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子はLFA3ドメインを含み、LFA3ドメインは、本明細書に開示する任意のLFA3バリアント配列（例えば、表2に開示する任意のLFA3バリアント配列）である。いくつかの態様において、LFA3ドメインは、100、110、120、130、140、150、160、170、または180アミノ酸長以下である。いくつかの態様において、LFA3ドメインは92アミノ酸長である。いくつかの態様において、LFA3ドメインは93アミノ酸長である。いくつかの態様において、LFA3ドメインは98アミノ酸長である。いくつかの態様において、LFA3ドメインはLFA3の第1の細胞外ドメインに由来する。いくつかの態様において、LFA3ドメインは、野生型LFA3配列と比べて6、10、15、20、または30個以下のアミノ酸変異（例えば置換、付加または欠失）を含む。いくつかの態様において、LFA3ドメインは、野生型LFA3配列と比べて5個のアミノ酸置換を含む。
本発明のLFA3ポリペプチド分子は、当技術分野において公知の任意の方法により製造されてもよい。組換えタンパク質の製造のための一般的な技術は当技術分野において公知でありかつ/または本明細書に記載されている。
初期同定後、候補LFA3ポリペプチド分子の活性は、標的とした生物学的活性を試験するために公知のバイオアッセイによりさらに確認および精密化することができる。いくつかの態様において、候補LFA3ポリペプチド分子をさらに特徴決定するためにインビトロの細胞アッセイが使用される。例えば、直接的に候補をスクリーニングするためにバイオアッセイを使用することができる。LFA3ポリペプチド分子を同定および特徴決定するための方法のいくつかは実施例に詳細に記載される。
ある特定の態様において、本明細書に記載するLFA3ポリペプチド分子はFcドメインを含む。Fcドメインは、IgA（例えば、IgA1もしくはIgA2）、IgG、IgE、またはIgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4）に由来することができる。いくつかの態様において、FcドメインはIgG1 Fcドメインである。いくつかの態様において、IgG1 FcドメインはSEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む。
一局面において、本発明は、以下の性質のうちの1つまたは複数を有するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を開示する:（a）野生型LFA3配列と比べて増強された単量体発現、（b）野生型LFA3配列と比べて低減した多量体発現、（c）野生型LFA3配列と比べて低減した熱ストレス下での凝集傾向、（d）野生型LFA3配列と比べて低減した低pH下での凝集傾向、（e）野生型LFA3配列と比べて増強された凍結融解安定性、（f）野生型LFA3配列と比べて増加した収率、（g）野生型LFA3配列と比べて増加した融解温度（Tm）。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）および/または図3Aに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約98、または約99％より高い単量体のパーセンテージを示す。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばSECおよび/または図6Cに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約75、約80、約85、約90、約95、約98、もしくは約99％を上回る単量体のパーセンテージ、約10、約8、約6、約4、もしくは約2％未満である低分子量種（LMWS）のパーセンテージ、および/または約5、約2、もしくは約1％未満である高分子量種（HMWS）のパーセンテージを示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばSECおよび/または図3Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、37.4℃で24時間インキュベートした後に約90、約92、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージ、および/または40℃で24時間インキュベートした後に約75、約80、もしくは約85％を上回る単量体のパーセンテージを示す。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばSECおよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、40℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、もしくは約20％以下の増加、および/または50℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、約20、もしくは約25％以下の増加を示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばSECおよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、低pH、5時間でのHMWSにおける約6、約7、約8、または約9％以下の増加を示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばSECおよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、5サイクルの凍結融解後にHMWSにおける約0.5、約1、または約1.5％以下の増加を示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子は、例えば、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE_HPLC）、ならびに/または図30A〜30Cおよび/もしくは図31A〜31Dに関して実施例3に記載する方法を使用して測定した場合に、40℃で2週間または4週間の貯蔵後に約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下のHMMSにおける増加および/または約0.5、約1、約2、約3、約4、もしくは約5％以下のLMMSにおける増加を示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子は、例えば図32A〜32Dに関して実施例3に記載するSE-HPLC方法を使用して測定した場合に、25℃で2、4、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子は、例えば図33A〜33Dに関して実施例3に記載するSE-HPLC方法を使用して測定した場合に、5℃で2、4、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えば図3Bに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、20mLのExpi293培養物あたり約5.5、約6、約6.5、または約7mgを上回る収率を有する。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えば示差走査蛍光光度（DSF）によっておよび/または図3Cに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約38、約40、約42、または約45℃を上回るTmを有する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばDSFによっておよび/または図5Bに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約40、約45、約50、約55、または約60℃を上回るTmを有する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばDSFによっておよび/または図6Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約40、約45、または約50℃を上回るTmを有する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばDSFによっておよび/または図7Dに関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約45、約50、または約55℃を上回るTmを有する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えば示差走査熱量測定（DSC）によっておよび/または表4に関して実施例1に記載する方法を使用して測定した場合に、約50または約60℃を上回るTmを有する。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えばDSCによっておよび/または表13に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、pH7.5において約55、約58、約60、約62、約64、もしくは約66℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;pH5.8において約55、約58、約60、約62、もしくは約64℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;またはpH4.5において55、58、もしくは60℃を上回るTm1および約75、約78、もしくは約80℃を上回るTm2を有する。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えばDSCによっておよび/または表14に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、例えば、pH7.5またはpH4.5において約50℃または約60℃を上回るTmを有し;pH5.8において約50℃または約62℃を上回るTmを有する。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）のLFA3ドメインは、例えばDSCおよびFabRICATOR IdeSによってならびに/または表15に関して実施例4に記載する方法を使用して測定した場合に、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTmを有し、例えば、約50または約60℃を上回るTmを有する。
本発明は、CD2に結合し、かつ、以下から選択される少なくとも1つの検出可能な活性を媒介する、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を開示する:（a）CD2＋細胞、例えば、CD2発現CD4 Tmem細胞またはCD2発現CD8 Tmem細胞に結合すること、（b）CD2と天然に存在するLFA3との相互作用を低減すること、（c）例えばNK細胞の存在下で、CD2発現細胞、例えば、CD2発現CD4 Tmem細胞またはCD2発現CD8 Tmem細胞に対する細胞傷害性を媒介すること、（d）CD4＋および/またはCD8＋TEM細胞を減少させること、（e）例えばCD4＋および/またはCD8＋T細胞における、Treg/TEM比を増加させること、（f）例えばCD4＋および/またはCD8＋T細胞における、Treg/TCM比を増加させること、（g）同種異系T細胞応答、例えば、T細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害すること、ならびに（h）破傷風トキソイドリコール応答を阻害すること。Tmem細胞として、例えば、セントラルメモリー（TCM）およびエフェクターメモリー（TEM）T細胞が挙げられる。
一局面において、本発明は、ヒトまたはカニクイザルCD2を発現する細胞に、高い見かけのアフィニティーで結合するが、齧歯動物CD2を発現する細胞には結合しない、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を含む。見かけのアフィニティー結合は、フローサイトメトリーを使用して標的タンパク質（例えば、CD2）を発現する細胞への結合を検出することにより評価することができる。細胞にCD2をコードする核酸を一過的または安定的にトランスフェクトすることができる。あるいは、細胞は、表面上にCD2を天然に発現する細胞でありうる。CD2＋細胞の供給源にかかわらず、細胞へのLFA3ポリペプチド分子の結合は、当技術分野において認識されるさまざまな方法を使用して容易に評価することができる。LFA3ポリペプチド分子はヒトまたはカニクイザルCD2に結合するが、齧歯動物CD2に検出可能に結合しない、またははるかに低い程度で結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えば実施例に記載するSPRによって測定した場合に、1.3、1.2、1.1、または1μM未満であるアフィニティーで組換えヒトCD2に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約1.08μMのアフィニティーで組換えヒトCD2に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、例えば実施例に記載するSPRによって測定した場合に、1.4、1.3、1.2、1.1、または1μM未満であるアフィニティーで組換えカニクイザルCD2に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約1.06μMのアフィニティーで組換えカニクイザルCD2に結合する。
一局面において、100、200、300、または400pM以下であるKdでCD2発現細胞、例えば、CD4 Tmem細胞に結合するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）が本明細書に開示される。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約94pMのKdでCD2発現細胞、例えば、CD4 Tmem細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約300、約400、約500、約500、約700、約800、約1000、約1200、または約1500pM以下であるIC50計算値でCD4メモリーT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約1.18E-10MのIC50計算値でCD4メモリーT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約307pMの平均IC50計算値でCD4メモリーT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約150、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、または約1200pM以下であるIC50計算値でCD4＋TEM細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約150pMのIC50計算値でCD4＋TEM細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、または約800pM以下であるIC50計算値でCD4＋TCM細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約110pMのIC50計算値でCD4＋TCM細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、または約1200pM以下であるIC50計算値でCD4ナイーブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約1.44E-10MのIC50計算値でCD4ナイーブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約180pMの平均IC50計算値でCD4ナイーブT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるIC50計算値で増大したCD4 Treg細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約8.54E-11MのIC50計算値で増大したCD4 Treg細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約90pMのIC50計算値で増大したCD4 Treg細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、約400、約500、または約600pM以下であるIC50計算値でCD8メモリーT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約120pMのIC50計算値でCD8メモリーT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、約1500、約1600、または約1700pM以下であるIC50計算値でCD8ネイティブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約9.49E-11MのIC50計算値でCD8ネイティブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約300pMの平均IC50計算値でCD8ネイティブT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値でCD4メモリーT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約67pMのKd計算値でCD4メモリーT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約94pMの平均Kd計算値でCD4メモリーT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、約400、約500、または約600pM以下であるKd計算値でCD4＋TEM細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約79pMのKd計算値でCD4＋TEM細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値でCD4＋TCM細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約64pMのKd計算値でCD4＋TCM細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、約300、または約400pM以下であるKd計算値でCD4ナイーブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約61pMのKd計算値でCD4ナイーブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約54pMの平均Kd計算値でCD4ナイーブT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約100、約200、または約300pM以下であるKd計算値で増大したCD4 Treg細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約58pMのKd計算値で増大したCD4 Treg細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約50、約100、または約150pM以下であるKd計算値でCD8メモリーT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約31pMのKd計算値でCD8メモリーT細胞に結合する。
一局面において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約50、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値でCD8ネイティブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約30pMのKd計算値でCD8ネイティブT細胞に結合する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約98pMのKd計算値でCD8ネイティブT細胞に結合する。
一局面において、本発明は、約400、約600、約800、約1000、約1200、約1400、または約1500pM以下であるEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD4 Tmem細胞に対する細胞傷害性を媒介するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約348pMのEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD4 Tmem細胞に対する細胞傷害性を媒介する。
一局面において、本発明は、約1、約5、約10、約20、約30、約40、または約50nM以下であるEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD8 Tmem細胞に対する細胞傷害性を媒介するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約0.716nMのEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD8 Tmem細胞に対する細胞傷害性を媒介する。
一局面において、本発明は、約1200、約1500、約1800、約2000、約2500、約3000、約3500、約4000pM以下であるEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD4 T非mem細胞に対する細胞傷害性を媒介するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約1256pMのEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD4 T非mem細胞に対する細胞傷害性を媒介する。
一局面において、本発明は、約1、約5、約10、約20、約30、約40、または約50nM以下であるEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD8 T非mem細胞に対する細胞傷害性を媒介するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約0.787nMのEC50で、CD2発現細胞、例えば、CD8 T非mem細胞に対する細胞傷害性を媒介する。
本発明は、CD2に結合し、免疫応答、例えば、T細胞媒介性免疫応答を抑制するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を含む。免疫応答、例えば、T細胞媒介性免疫応答の阻害を決定するための当技術分野において公知の多くのアッセイがある。1つのそのようなアッセイは、実施例に記載する混合リンパ球反応（MLR）アッセイである。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約400、約800、約1200、約1600、約2000、または約2400pM以下であるIC50で同種異系応答を阻害することができる。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約302pMのIC50で同種異系応答を阻害することができる。別のアッセイは、実施例に記載する破傷風トキソイドリコール応答アッセイである。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、破傷風トキソイドリコール応答アッセイにおいて約5、約10、約15、約20、または約25nM以下であるIC50でCD4メモリーT細胞のIFNγ産生を阻害することができる。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、破傷風トキソイドリコール応答アッセイにおいて約1.342nMのIC50でCD4メモリーT細胞のIFNγ産生を阻害することができる。
一局面において、本発明は、例えば表11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、0.14、0.16、0.18、0.2、または0.22mL/hr/kgを超えない中枢からのクリアランスを示すLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、約0.11mL/hr/kgである中枢からのクリアランスを示す。
一局面において、本発明は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された純度、例えば、キャピラリーゲル電気泳動を使用して測定した場合に少なくとも約98％または少なくとも約99％の純度を示すLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は約99％純粋である。
一局面において、本発明は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減したシアル酸修飾、例えば、キャピラリーゲル電気泳動を使用して測定した場合に1nmolのポリペプチドあたり約20、約18、約16、約14、約12、約10、約9、約8、または約7nmol以下のシアル酸の純度を示すLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を提供する。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、1nmolのポリペプチドあたり約14nmolのシアル酸を含む。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）は、1nmolのポリペプチドあたり約9nmolのシアル酸を含む。
本発明は、上記の生物学的活性の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、またはそれ以上、例えば、すべてを呈するLFA3ポリペプチド分子（例えば、バリアントLFA3融合ポリペプチド分子）を包含する。
III. LFA3ポリペプチド分子の発現および生成
LFA3ポリペプチド分子をコードする核酸
本発明はまた、本明細書に記載する任意のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本明細書に記載する任意のポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の手法によって作製しおよび発現させることができる。
所望のポリペプチド分子、およびそのようなポリペプチド分子をコードする核酸、またはこれらの部分の配列は、標準的なシークエンシング技術を使用して決定することができる。所望のポリペプチド分子をコードする核酸配列は、組換え生成および特徴決定のためにさまざまなベクター（例えば、クローニングおよび発現ベクター）に挿入されてもよい。
一局面において、本発明は、本明細書に開示する以下のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する:ヒトLFA3アイソフォーム1、ヒトLFA3アイソフォーム1ドメイン1、LFA3-Fc WT、LFA3-Pfe WT、ヒトIgG2 Fc、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、d1、d3、M1d1、M1d3、M4d1、M7d1、CM1d1、CM2d1、CM3d1、CM4d1、CM5d1、CM6d1、ML1d1、ML2d1、ML3d1、ML4d1、ML5d1、ML6d1、およびLFA3-Fc M1d1。いくつかの態様において、上記のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示するポリペプチド分子のアミノ酸配列と少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％、より好ましくは同一であるアミノ酸配列をコードする。
本発明は、SEQ ID NO:15〜41、69、120、および128からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:26またはSEQ ID NO:16および69のアミノ酸配列と少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％、より好ましくは同一であるアミノ酸配列をコードする。
本発明は、SEQ ID NO:42〜68および122〜127からなる群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、SEQ ID NO:44に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、SEQ ID NO:53に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、SEQ ID NO:122に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、SEQ ID NO:123に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、SEQ ID NO:43に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、SEQ ID NO:43および53に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、SEQ ID NO:42〜68および122〜127からなる群より選択される1つまたは複数の核酸分子を含む細胞を提供する。本発明は、SEQ ID NO:44に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。本発明は、SEQ ID NO:53に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。本発明は、SEQ ID NO:122に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。本発明は、SEQ ID NO:123に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。本発明は、SEQ ID NO:43に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。本発明は、SEQ ID NO:43および53に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。
別の局面において、本発明は、LFA3ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドおよびそのバリアントであって、そのようなバリアントポリヌクレオチドが、本明細書に開示する特定の核酸配列のいずれかと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を共有する、ポリヌクレオチドおよびそのバリアントを提供する。いくつかの態様において、本発明は、LFA3ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドおよびそのバリアントであって、そのようなバリアントポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:123またはSEQ ID NO:43および53と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも87％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を共有する、ポリヌクレオチドおよびそのバリアントを提供する。これらの量は限定的であることを意図せず、記載したパーセンテージの間の増分は本開示の部分として特に想定される。
本発明は、本明細書に記載する核酸分子によってコードされるポリペプチドを提供する。
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドもまた本開示によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングもしくはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、DNA（ゲノム、cDNA、もしくは合成）またはRNA分子であってもよい。RNA分子は、イントロンを含有しかつ1対1の方式でDNA分子に対応するHnRNA分子、およびイントロンを含有しないmRNA分子を含む。その必要はないが、追加のコーディングまたは非コーディング配列が本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよく、その必要はないが、ポリヌクレオチドは他の分子および/または支持体材料に連結していてもよい。
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、ポリペプチド分子をコードする内因性配列）を含んでもよく、またはそのような配列のバリアントを含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性が天然の免疫反応性分子と比べて減少しないように1つまたは複数の置換、付加、欠失および/または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に本明細書に記載されるように評価されてもよい。いくつかの態様において、バリアントは、天然ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約70％の同一性、いくつかの態様において、少なくとも約80％の同一性、いくつかの態様において、少なくとも約90％の同一性、いくつかの態様において、少なくとも約95％の同一性を呈する。これらの量は限定的であることを意図せず、記載したパーセンテージの間の増分は本開示の部分として特に想定される。
2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、以下に記載するように最大の一致のためにアラインメントされた時に2つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じである場合に「同一」であるといわれる。2つの配列間の比較は、典型的には、比較ウインドウにわたって配列を比較して配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。本明細書で使用する場合の「比較ウインドウ」は、少なくとも約20個、通常は30〜約75個、または40〜約50個の連続した位置のセグメントであって、そのセグメント内で、配列が、同数の連続した位置の数のリファレンス配列と、それら2つの配列を最適にアラインメントした後に比較されうる、セグメントを指す。
比較用の配列の最適アラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergene（登録商標）スイート（DNASTAR（登録商標）,Inc.、Madison、WI）におけるMegAlign（登録商標）プログラムを使用してデフォルトのパラメーターを使用して実行されてもよい。このプログラムは、以下の参照文献:Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.,Dayhoff,M.O.（ed.）,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358;Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645 Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA;Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153;Myers,E.W.and Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17;Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105;Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA;Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730に記載されるいくつかのアラインメントスキームを実装する。
いくつかの態様において、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも20個の位置の比較のウインドウにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適アラインメントのためにリファレンス配列（付加も欠失も含まない）と比べて20パーセントもしくはそれ未満、通常は5〜15パーセント、または10〜12パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、両配列中に同一核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定することで一致位置の数を得て、一致位置の数をリファレンス配列内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り、その結果に100を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。
バリアントはまたまたは代替的に、天然遺伝子、またはその部分もしくは相補体に実質的に相同的であってもよい。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、天然ポリペプチド分子をコードする天然に存在するDNA配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、5×のSSC、0.5％のSDS、1.0mMのEDTAの溶液（pH8.0）中での予備洗浄;50℃〜65℃、5×のSSCでの終夜のハイブリダイズ;続いて0.1％のSDSを含有する2×、0.5×、および0.2×のSSCのそれぞれを用いた65℃で20分間の2回の洗浄を含む。
本明細書で使用する場合の「高ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（1）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、50℃での0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウムを用い;（2）ハイブリダイゼーションの間に変性剤、例えば、42℃での750mMの塩化ナトリウム、75mMのクエン酸ナトリウムを含むpH6.5の0.1％のウシ血清アルブミン/0.1％のフィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのリン酸ナトリウム緩衝剤を含むホルムアミド、例えば、50％（v/v）のホルムアミドを用い;または（3）42℃での50％のホルムアミド、5×のSSC（0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム、5×のデンハルト溶液、超音波処理したサケ精子DNA（50μg/mL）、0.1％のSDS、および10％の硫酸デキストランを、0.2×のSSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム）中での42℃および50％のホルムアミド中での55℃での洗浄と共に用い、続いて55℃でのEDTAを含有する0.1×のSSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いる条件である。当業者は、プローブの長さなどの因子を適合させるために必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整するべきかを認識する。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載するようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることが当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン用法の差異に起因して変化するポリヌクレオチドが本発明により特に想定される。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルは本開示の範囲内である。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加および/または置換などの、1つまたは複数の突然変異の結果として変化した内因性遺伝子である。結果として生じるmRNAおよびタンパク質は、その必要はないが、変化した構造または機能を有してもよい。アレルは、標準技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および/またはデータベース配列比較）を使用して同定されてもよい。
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはPCRを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載される必要はない。当業者は、所望のDNA配列を生成するために本明細書に提供する配列および商用のDNA合成装置を使用することができる。
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することができ、次いでベクターを、本明細書にさらに議論するような、複製および増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の手段によって宿主細胞に挿入されてもよい。細胞は、直接的な取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、F接合（F-mating）またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。外因性ポリヌクレオチドが導入されると、それは非組込み型ベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持され、または宿主細胞ゲノムに組み込まれうる。そのようにして増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Sambrook et al.,1989を参照。
あるいは、PCRはDNA配列の複製を可能とする。PCR技術は当技術分野において周知であり、米国特許第4,683,195号、同第4,800,159号、同第4,754,065号および同第4,683,202号の他に、PCR:The Polymerase Chain Reaction,Mullis et al.eds.,Birkauswer Press,Boston,1994に記載されている。
RNAは、適切なベクター中の単離されたDNAを使用し、それを適切な宿主細胞に挿入することによって得ることができる。細胞が複製されかつDNAがRNAに転写されると、RNAは次に、例えばSambrook et al.,1989に記載されるような当業者に周知の方法を使用して単離されうる。
いくつかの態様において、第1のベクターは、LFA3ポリペプチド、例えばM1d1をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、第2のベクターは、例えばIgG1由来の、重鎖Fc領域をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第1のベクターおよび第2のベクターは、類似した量（例えば、類似したモル量または類似した質量）で宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの態様において、5:1〜1:5のモルまたは質量比の第1のベクターおよび第2のベクターが宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばM1d1をコードするベクター、および、例えばIgG1由来の、重鎖Fcドメインをコードするベクターについて1:1〜1:5の質量比が使用される。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばM1d1をコードするベクター、および、例えばIgG1由来の、重鎖Fcをコードするベクターについて1:2の質量比が使用される。
ベクター
いくつかの態様において、CHO細胞中もしくはCHO由来細胞中、またはNSO細胞中でのポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Running Deer et al,Biotechnol.Prog.20:880-889（2004）に記載されている。
適切なクローニングおよび発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節配列などのさまざまな成分を含むことができる。ベクターはまた、異なるベクターへの抗体可変ドメインのその後のクローニングを可能とするように構築されてもよい。適切なクローニングベクターは標準技術に従って構築されてもよく、または当技術分野において使用可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されるクローニングベクターは使用が意図される宿主細胞に従って異なりうるが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有してもよく、かつ/またはベクターを含有するクローンの選択において使用することができるマーカー用の遺伝子を有してもよい。適切な例として、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、pUC18、pUC19、Bluescript（例えば、pBS SK＋）およびその誘導体、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、ならびにシャトルベクター、例えば、pSA3およびpAT28が挙げられる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、BioRad、Strategene、およびInvitrogenなどの商業ベンダーから入手可能である。発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは、一般に、本開示によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとしてまたは染色体DNAの組み込まれた部分として宿主細胞中で複製可能でなければならないことが含意される。適切な発現ベクターとして、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびPCT公報番号WO 87/04462において開示される発現ベクターが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ベクター成分は、一般に、以下:シグナル配列;複製起点;1つまたは複数のマーカー遺伝子;適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）の1つまたは複数を含んでもよいがそれらに限定されるわけではない。発現（すなわち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどの1つまたは複数の翻訳制御エレメントもまた通常必要とされる。
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは、多数の適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができ、該手段として、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション;微粒子銃;リポフェクション;および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）が挙げられる。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入の選択は、多くの場合に、宿主細胞の特徴に依存する。
宿主細胞
LFA3ポリペプチド分子は、適切な宿主細胞を使用して組換えにより作製されてもよい。LFA3ポリペプチド分子をコードする核酸を発現ベクターにクローニングすることができ、それを次に宿主細胞、例えば、大腸菌（E.coli）細胞、酵母細胞、昆虫細胞、シミアンCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または細胞が他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞に導入して組換え宿主細胞中でのLFA3ポリペプチド分子の合成を得ることができる。好ましい宿主細胞として、当技術分野において周知の多くの細胞の中でも、CHO細胞、ヒト胎児腎臓HEK-293細胞、またはSp2.0細胞が挙げられる。タンパク質およびペプチドの化学合成の方法は当技術分野において公知であり、商業的に使用可能である。
さまざまな態様において、LFA3ポリペプチド分子は、細菌細胞などの原核細胞中;または真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの真核細胞中で発現されてもよい。そのような発現は、例えば、当技術分野において公知の手法に従って実行されてもよい。ポリペプチドを発現するために使用されてもよい例示的な真核細胞として、COS7細胞を含むCOS細胞;293-6EおよびExpi293細胞を含む293細胞;CHO-S、DG44.Lecl3 CHO細胞、ExpiCHOおよびFUT8 CHO細胞を含むCHO細胞;PER.C6（登録商標）細胞（Crucell）;ならびにNSO細胞が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子は、酵母中で発現されてもよい。例えば、米国特許出願公開第US 2006/0270045 Al号を参照。いくつかの態様において、特定の真核宿主細胞は、LFA3ポリペプチド分子に対して所望の翻訳後修飾を行う能力に基づいて選択される。例えば、いくつかの態様において、CHO細胞は、293細胞中で産生される同じポリペプチドより高いシアリル化のレベルを有するポリペプチドを産生する。
所望の宿主細胞への1つまたは複数の核酸の導入は、任意の方法によって達成されてもよく、該方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。非限定的な例示的な方法は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過的または安定的にトランスフェクトされてもよい。
LFA3ポリペプチド分子は、任意の適切な方法によって精製されてもよい。そのような方法として、アフィニティーマトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、プロテインA、プロテインG、またはプロテインA/Gの使用が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルまたはフェニルカラムもまた、いくつかのポリペプチドを精製するために適切なことがある。ポリペプチドを精製する多くの方法が当技術分野において公知である。
いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド分子は無細胞システムで生成される。非限定的な例示的な無細胞システムは、例えば、Sitaraman et al.,Methods Mol.Biol.498:229-44（2009）;Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45（2004）;Endo et al,Biotechnol.Adv.21:695-713（2003）に記載されている。
IV. 使用および医学的療法
いくつかの局面において、本発明は、LFA3ポリペプチド分子を使用する治療方法であって、LFA3ポリペプチド分子を含む薬学的組成物の治療有効量を投与する工程を含む、方法を提供する。
適用可能な疾患、障害、または状態として、1型糖尿病、乾癬、尋常性乾癬、手掌足底膿疱症、手掌足底膿疱性乾癬、掌蹠膿疱症、手掌足底の膿疱症、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、移植片対宿主病（GVHD）、白斑、毛孔性紅色粃糠疹、移植（例えば臓器移植、例えば腎臓移植）、乾癬性関節炎、同種異系造血幹細胞移植を必要とする疾患、障害、または状態、サラセミア、鎌形血球症、グランツマン血小板無力症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、重症先天性好中球減少症、白血球接着不全症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、先天性角化異常症、チェディアック・東症候群、再生不良性貧血、円形脱毛症、およびT細胞リンパ腫（例えば皮膚T細胞リンパ腫または末梢T細胞非ホジキンリンパ腫）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
追加の疾患、障害、または状態として、真性糖尿病（例えばI型真性糖尿病またはインスリン依存性真性糖尿病）;若年発症型糖尿病;乾癬および皮膚炎（例えばアトピー性皮膚炎）を含む炎症性皮膚疾患などの炎症応答;皮膚筋炎;全身性強皮症および全身性硬化症;炎症性腸疾患（例えばクローン病および潰瘍性大腸炎）に関連する応答;呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群、ARDSを含む）;皮膚炎;髄膜炎;脳炎;ブドウ膜炎;大腸炎;胃炎;糸球体腎炎;湿疹および喘息などのアレルギー状態ならびにT細胞の浸潤および慢性炎症性応答が関与する他の状態;アテローム性動脈硬化;白血球接着不全症;関節リウマチ;全身性エリテマトーデス（SLE）;多発性硬化症;レイノー症候群;自己免疫性甲状腺炎;アレルギー性脳脊髄炎;シェーグレン症候群;ならびに結核、サルコイドーシス、多発性筋炎、肉芽腫症、および血管炎において典型的に見出されるサイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答;ウェゲナー病;悪性貧血（アジソン病）;白血球血管外漏出を伴う疾患;中枢神経系（CNS）炎症性障害;多臓器損傷症候群;溶血性貧血（クリオグロビン血症またはクームス試験陽性貧血を含むが、それらに限定されるわけではない）;重症筋無力症;抗原-抗体複合体媒介性疾患;抗糸球体基底膜抗体病;抗リン脂質症候群;アレルギー性神経炎;グレーブス病;ランバート・イートン筋無力症候群;水疱性類天疱瘡;天疱瘡;自己免疫性多腺性内分泌障害;白斑;ライテル病;全身硬直症候群;ベーチェット病;巨細胞性動脈炎;免疫複合体腎炎;IgA腎症;IgMポリニューロパチー;免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）または自己免疫性血小板減少症および自己免疫性溶血性疾患;橋本甲状腺炎;自己免疫性肝炎;自己免疫性血友病;自己免疫性リンパ球増殖症候群（ALPS）;自己免疫性網膜ブドウ膜炎;ギラン・バレー症候群;グッドパスチャー症候群;混合結合組織病;自己免疫関連不妊;結節性多発動脈炎;円形脱毛症;特発性粘液水腫;移植片対宿主病;筋ジストロフィー（デュシェンヌ型、ベッカー型、筋緊張型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位型、エメリ・ドレフュス型）;ならびに炎症性非免疫疾患、例えば心臓疾患または脳疾患が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本発明のLFA3ポリペプチド分子はまた、例えば診断目的のために、試料中のCD2、またはCD2発現細胞を検出および/または測定するために使用されてもよい。例えば、LFA3ポリペプチド分子は、CD2の異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現の欠如など）によって特徴付けられる状態または疾患を診断するために使用されてもよい。CD2の例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明のLFA3ポリペプチド分子と接触させることを含んでもよく、LFA3ポリペプチド分子は検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。
本明細書で使用する場合の「薬学的に許容される担体」または「許容される薬学的賦形剤」には、活性成分と組み合わされた時に、その成分が生物学的活性を保つことを可能にし、対象の免疫系と非反応性である、任意の材料が包含される。例として、例えばリン酸緩衝食塩溶液、HEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝食塩溶液、水、油/水型エマルションなどのエマルション、およびさまざまなタイプの湿潤剤など、任意の標準的薬学的担体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。エアロゾル投与または非経口投与のための好ましい希釈剤はリン酸緩衝食塩水（PBS）または生理（0.9％）食塩水である。そのような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化される（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990およびRemington,The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing,2000）。
V. 組成物
本開示はまた、本明細書に記載するLFA3ポリペプチド分子の有効量を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物の例の他に、製剤化方法もまた本明細書に記載される。いくつかの態様において、組成物は、1つまたは複数のLFA3ポリペプチド分子を含む。
本開示において使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含むことができる（Remington:The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.,2000,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、かつホスフェート、シトレート、HEPESおよび他の有機酸などの緩衝剤を含んでもよい。いくつかの態様において、本明細書において提供されるLFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1を含む組成物は、HEPES緩衝食塩溶液を含む。いくつかの態様において、HEPES緩衝剤の濃度は、約10mM、約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mMである。いくつかの態様において、HEPES緩衝剤の濃度は20mMである。追加の許容される担体、賦形剤または安定化剤として、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシル-ジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;単糖、二糖および他の糖質、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（PEG）などが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。薬学的に許容される賦形剤は本明細書においてさらに記載される。
LFA3ポリペプチド分子およびその組成物はまた、剤の有効性を増強および/または補完するために働く他の剤と組み合わせて使用することができる。
本開示はまた、本開示の任意のポリヌクレオチドを含む、薬学的組成物を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本明細書に記載するようなLFA3ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の態様において、組成物は、本明細書に記載するような任意のLFA3ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
本開示の薬学的組成物はまた、他の剤との組合せなどの併用療法において投与されうる。例えば、併用療法は、少なくとも1つの他の療法と組み合わせて本開示のLFA3ポリペプチド分子を含むことができ、療法は、手術、免疫療法、または薬物療法であってもよい。
本開示の薬学的化合物は、1つまたは複数の薬学的に許容される塩を含んでもよい。そのような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩として、非毒性の無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、および亜リン酸などの他に、非毒性の有機酸、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、ならびに脂肪族および芳香族スルホン酸などに由来するものが挙げられる。塩基付加塩として、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどの他に、非毒性の有機アミン、例えば、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどに由来するものが挙げられる。
本開示の薬学的組成物はまた、薬学的に許容される酸化防止剤を含んでもよい。薬学的に許容される酸化防止剤として、（1）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（2）油溶性酸化防止剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど、および（3）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
本開示の薬学的組成物において用いられてもよい適切な水性または非水性の担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散体の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの佐剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌処理ならびにさまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸などを含めることの両方によって確実にすることができる。等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることも望ましいことがある。さらに、注射可能な薬学的形態の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって生じさせることができる。
薬学的組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度にとって適切な他の秩序だった構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびに適切なこれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが適切である。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって生じさせることができる。
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上記に列記した成分の1つまたは組合せと共に適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を組み込み、続いて滅菌精密濾過を行うことによって調製することができる。
一般に、分散体は、基本的な分散媒体と上記に列記したもの由来の必要とされる他の成分とを含有する無菌のビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分と、以前に無菌濾過された溶液由来の任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
本開示の薬学的組成物は、眼投与のために適切な製剤として調製、包装、または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、例えば水性または油性液体担体中の0.1％〜1.0％（w/w）の活性成分の溶液または懸濁液を含む点眼剤の形態であってもよい。そのような点眼剤は、緩衝化剤、塩、または本明細書に記載する1つもしくは複数の他の追加の成分をさらに含んでもよい。有用な他の眼投与可能な製剤としては、微晶性形態でまたはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが挙げられる。
本明細書で使用する場合の「追加の成分」として、以下:賦形剤;表面活性剤;分散剤;不活性希釈剤;顆粒化剤および崩壊剤;結合剤;潤滑剤;甘味剤;香味剤;着色剤;防腐剤;ゼラチンなどの生理学的に分解性の組成物;水性ビヒクルおよび溶媒;油性ビヒクルおよび溶媒;懸濁化剤;分散剤または湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩;増粘剤;充填剤;乳化剤;酸化防止剤;抗生物質;抗真菌剤;安定化剤;ならびに薬学的に許容されるポリマー性または疎水性の材料の1つまたは複数が挙げられるが、それらに限定されない。本開示の薬学的組成物中に含まれてもよい他の「追加の成分」は当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences,Genaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA（1985）に記載されている。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子は、皮下注射のために製剤化されうる。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子は、筋肉内注射のために製剤化されうる。
いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1は、約0.01〜2.0mg/mLの濃度で製剤化される。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1は、約0.01、約0.02、約0.05、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.2、約1.5、約1.8、または約2.0mg/mLの濃度の製剤である。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1は、約0.015mg/mLの濃度で製剤化される。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1は、約0.15mg/mLの濃度で製剤化される。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1は、約1.5mg/mLの濃度で製剤化される。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えばLFA3-Fc M1d1は、約10、約20、約30、約40、または約50mg/mLの濃度で製剤化される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子は、注射1回あたり約0.2〜8mg（例えば、注射1回あたり0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、または8mg）、例えば、注射1回あたり0.22〜7.5mgの用量として製剤化することができる。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子は、注射1回あたり約0.5〜1.5mlの溶液（例えば、注射1回あたり0.5、1、または1.5mlの溶液）、例えば、注射1回あたり約1mlの溶液中に製剤化することができる。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬学分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されうる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を担体または1種類もしくは複数種類の他の補助成分と混合し、次に必要であればまたは所望であれば、製品を所望の単回投与単位または複数回投与単位に成形またはパッケージングする工程を含む。
一態様において、本開示の組成物は、エンドトキシンおよび/または関連する発熱性物質を実質的に含まない発熱物質非含有製剤である。エンドトキシンは、微生物内部に限局し、微生物が破壊または死亡した場合にのみ放出される毒素を含む。発熱性物質としてはまた、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘導性の熱安定性物質（糖タンパク質）が挙げられる。これらの物質の両方は、ヒトに投与された場合に発熱、低血圧およびショックを引き起こしうる。潜在的な有害効果に起因して、少量のエンドトキシンであっても、静脈内に投与される薬学的薬物溶液から除去することが有利である。The Food and Drug Administration（「FDA」）は、静脈内薬物適用のために単一の1時間の期間において体重1キログラムあたり5エンドトキシン単位（EU）/用量の上限を設定した（The United States Pharmacopeial Convention,Pharmacopeial Forum 26（1）:223（2000））。治療用タンパク質が体重1キログラムあたり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、微量のエンドトキシンであっても除去することが有利である。一態様において、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質レベルは、10EU/mg未満であり、または5EU/mg未満であり、または1EU/mg未満であり、または0.1EU/mg未満であり、または0.01EU/mg未満であり、または0.001EU/mg未満である。別の態様において、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質レベルは、約10EU/mg未満であり、または約5EU/mg未満であり、または約1EU/mg未満であり、または約0.1EU/mg未満であり、または約0.01EU/mg未満であり、または約0.001EU/mg未満である。
一態様において、本開示は、前記投与が、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、膣、直腸、舌、舌下、頬側、頬内、静脈内、皮膚、皮下、または経皮投与である組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、LFA3ポリペプチド、例えば、LFA3-Fc M1d1を含む組成物は静脈内に投与される。別の態様において、本開示は、他の療法、例えば、手術、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法または放射線療法と組み合わせて組成物を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、他の療法は、造血幹細胞移植、例えば、同種異系造血幹細胞移植である。
VI. 投与量/投与
本開示のLFA3ポリペプチド分子を含む薬学的または無菌組成物を調製するために、LFA3ポリペプチド分子は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合される。治療用物質および診断用物質の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形態で生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することによって調製することができる（例えば、Hardman,et al.（2001）Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.;Gennaro（2000）Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.;Avis,et al.（eds.）（1993）Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.（eds.）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.（eds.）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY;Weiner and Kotkoskie（2000）Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.を参照）。
治療剤のための投与レジメンの選択はいくつかの要因に依存し、該要因としては、実体の血清または組織代謝速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中での標的細胞のアクセス可能性が挙げられる。ある特定の態様において、投与レジメンは、副作用の許容されるレベルと合致して患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物学的製剤の量は、部分的に、特定の実体および治療されている状態の重篤度に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量の選択におけるガイダンスが使用可能である（例えば、Wawrzynczak,1996,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK;Kresina（ed.）,1991,Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.;Bach（ed.）,1993,Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.;Baert,et al.,2003,New Engl.J.Med.348:601-608;Milgrom,et al.,1999,New Engl.J.Med.341:1966-1973;Slamon,et al.,2001,New Engl.J.Med.344:783-792;Beniaminovitz,et al.,2000,New Engl.J.Med.342:613-619;Ghosh,et al.,2003,New Engl.J.Med.348:24-32;Lipsky,et al.,2000,New Engl.J.Med.343:1594-1602を参照）。
適切な用量の決定は、例えば、治療に影響することが当技術分野において公知であるもしくは疑われるまたは治療に影響することが予測されるパラメーターまたは要因を使用して、臨床医によってなされる。一般に、用量は、最適条件よりいくぶん少ない量で開始され、その後に任意の負の副作用と比べて所望のまたは最適な条件が達成されるまで小さい増分で増加される。重要な診断的指標としては、例えば、炎症の症状の指標または産生される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。
本開示の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者にとっての毒性を伴わずに、特定の患者、組成物および投与様式に関して所望の治療的応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように、変動させうる。選択される投薬量レベルは、使用される本開示の特定組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定化合物の排泄率、処置の継続時間、使用される特定化合物と併用される他の薬物、化合物および/または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態、および既往歴など、医学分野において周知の因子を含む、さまざまな薬物動態因子に依存すると考えられる。
本開示のLFA3ポリペプチド分子を含む組成物は、週に2回、週に1回、2週毎に1回、または3週毎に1回投与することができる。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、週に1回投与される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、約5〜20mg/週（例えば、5、6、7、8、9、10、12、15、17、または20mg/週）の用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、約15mg/週の用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、約7.5mg/週の用量で投与される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、約0.2〜8mg/注射（例えば、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、または8mg/注射）の用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、0.22〜7.5mg/注射の用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、例えばLFA3-Fc M1d1、またはその薬学的組成物は、約7.5mg/注射の用量で投与される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約0.01〜10mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約0.01、約0.02、約0.03、約0.04、約0.05、約0.06、約0.07、約0.08、約0.09、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約2.0、約3.0、約4.0、約5.0、約6.0、約7.0、約8.0、約9.0、または約10.0mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFAポリペプチド（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約0.03mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFAポリペプチド（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約0.3mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFAポリペプチド（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約3.0mg/kgの用量で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFAポリペプチド（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約25、約50、約75、または約100mg/kgの用量で投与される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、注射1回あたり約0.5〜1.5mlの溶液（例えば、注射1回あたり0.5、1、または1.5mlの溶液）中で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、注射1回あたり約1mLの溶液中で投与される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約0.5〜5mL/kgの用量体積で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、または約5.0mL/kgの用量体積で投与される。いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子（例えば、LFA3-Fc M1d1）、またはその薬学的組成物は、約2.0mL/kgの用量体積で投与される。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、またはそれ以上）の過程にわたり投与され、例えば、各過程は10〜14週（例えば、10、11、12、13、または14週）、例えば、12週からなり、例えば、2つの相接する過程は、10〜14週間の間隔（例えば、10、11、12、13、または14週間の間隔）、例えば、12週間の間隔で分離されている。
いくつかの態様において、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、週に1回約15mg/週の用量で皮下に投与され、例えば、本発明のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、またはそれ以上）の過程にわたり投与され、各過程は12週からなり、かつ、2つの相接する過程は12週間の間隔で分離されている。
特定の患者のための有効量は、治療されている状態、患者の全般的健康状態、投与の方法経路および用量、ならびに副作用の重篤度などの要因に依存して変化しうる（例えば、Maynard,et al.,1996,A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,FIa.;Dent,2001,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ,London,UKを参照）。
投与の経路は、例えば、外用もしくは皮膚塗布によるもの、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内による注射もしくは注入によるもの、または持続放出システムもしくはインプラントによるものであってもよい（例えば、Sidman et al.,1983,Biopolymers 22:547-556;Langer,et al.,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277;Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105;Epstein,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688-3692;Hwang,et al.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4030-4034;米国特許第6,350466号および同第6,316,024号を参照）。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位において痛みを緩和するためのリドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。加えて、例えば吸入器またはネブライザーおよびエアロゾル化剤を含む製剤の使用によって、経肺投与を使用することもできる。例えば、米国特許第6,019,968号、同第5,985,320号、同第5,985,309号、同第5,934,272号、同第5,874,064号、同第5,855,913号、同第5,290,540号、および同第4,880,078号;ならびにPCT公報番号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、およびWO 99/66903を参照されたく、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み入れられる。一態様において、本開示のLFA3ポリペプチド分子、またはその薬学的組成物は、Alkermes AIR（商標）肺薬物送達技術（Alkermes,Inc.、Cambridge、Mass.）を使用して投与される。
本開示の組成物はまた、当技術分野において公知のさまざまな方法の1つまたは複数を使用して1つまたは複数の投与経路を介して投与されてもよい。当業者によって理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望の結果に依存して変化する。本開示のポリペプチド分子のために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口の投与経路、例えば、注射または注入によるものが挙げられる。非経口投与は、通常は注射による、経腸および外用投与以外の投与の様式を表すことができ、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、本開示の組成物は、外用、表皮または粘膜の投与経路などの非経口ではない経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸内、舌下、または外用を介して投与されうる。
本開示のLFA3ポリペプチド分子が制御放出または持続放出システムにおいて投与される場合、制御または持続放出を達成するためにポンプが使用されてもよい（上掲のLanger;Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:20;Buchwald et al.,1980,Surgery 88:501;Saudek et al.,1989,N.Engl.J.Med.321:514を参照）。
本開示の療法の制御または持続放出を達成するためにポリマー材料を使用することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise（eds.）,CRC Pres.,Boca Raton,FIa.（1974）;Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball（eds.）,Wiley,New York（1984）;Ranger and Peppas,1983,J.,Macromol.ScL Rev.Macromol.Chem.23:61を参照;Levy et al,1985,Science 11 225:190;During et al.,19Z9,Ann.Neurol.25:351;Howard et al,1989,J.Neurosurg.71:105）;米国特許第号5,679,377号;米国特許第5,916,597号;米国特許第5,912,015号;米国特許第5,989,463号;米国特許第5,128,326号;PCT公報番号WO 99/15154;およびPCT公報番号WO 99/20253も参照）。持続放出製剤において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン-コ-ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（PLG）、ポリ無水物、ポリ（N-ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール）、ポリラクチド（PLA）、ポリラクチド（polyoeactide）-コ-グリコリド）（PLGA）、およびポリオルトエステルが挙げられるが、それらに限定されない。一態様において、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性であり、浸出可能な不純物を含まず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、かつ生分解性である。制御または持続放出システムは、予防または治療標的と近接して置くことができ、そのため全身用量のほんの一部を必要とする（例えば、Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,上掲,vol.2,pp.115-138（1984）を参照）。
制御放出システムは、Langer,1990,Science 249:1527-1533による総説において議論されている。本開示の1つもしくは複数のポリペプチド分子またはそのコンジュゲートを含む持続放出製剤を作製するために当業者に公知の任意の技術を使用することができる。例えば、米国特許第4,526,938号、国際特許公報番号WO 91/05548、WO 96/20698、Ning et al.,1996,“Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy and Oncology 59:179-189,Song et al.,1995,“Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397,Cleek et ah,1997,“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro.Ml.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854、およびLam et al.,1997,“Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc.Ml.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-160を参照されたく、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み入れられる。
本開示のLFA3ポリペプチド分子が外用で投与される場合、それは、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルションの形態、または当業者に周知の他の形態に製剤化されうる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,19th ed.,Mack Pub.Co.,Easton,Pa.（1995）を参照。非スプレー式外用投与形態について、外用塗布と適合性でありかついくつかの事例において水より高い動粘度を有する担体または1つもしくは複数の賦形剤を含む粘性〜半固体または固体形態が典型的には使用される。適切な製剤としては、溶液、懸濁液、エマルション、クリーム、軟膏（ointment）、粉末、リニメント、および軟膏（salve）などが挙げられるが、それらに限定されず、これらは、所望の場合、滅菌され、または、例えば浸透圧などのさまざまな性質に影響を及ぼすために助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、もしくは塩）と混合される。他の適切な外用投与形態としては、いくつかの事例において固体または液体不活性担体と組み合わせて、活性成分が加圧式揮発剤（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物でまたはスクイズボトル中にパッケージされたスプレー式エアロゾル調製物が挙げられる。モイスチャライザーまたは湿潤剤もまた、所望の場合、薬学的組成物および投与形態に加えることができる。そのような追加の成分の例は当技術分野において周知である。
LFA3ポリペプチド分子を含む組成物が鼻腔内に投与される場合、それは、エアロゾル形態、スプレー、ミストにまたは点鼻剤（drop）の形態に製剤化されうる。特に、本開示に従って使用するための予防用物質または治療用物質は、適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して、加圧パックまたはネブライザーから、エアロゾルスプレー提示の形態で好都合に送達されうる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量済みの量を送達するためのバルブを設けることによって決定しうる。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有する、吸入器または吹送器に使用するための、カプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製）を製剤化しうる。
第2の治療用物質、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線を用いる併用投与または治療のための方法は当技術分野において周知である（例えば、Hardman,et al.（eds.）（2001）Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill,New York,N.Y.;Poole and Peterson（eds.）（2001）Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.;Chabner and Longo（eds.）（2001）Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,Williams and Wilkins,Phila.,Pa.を参照）。有効量の治療剤は、少なくとも10パーセント;少なくとも20パーセント;少なくとも約30パーセント;少なくとも40パーセント、または少なくとも50パーセント症状を減少させるものであってもよい。
一態様において、本開示のLFA3ポリペプチド分子は、自己免疫疾患および障害を治療するための組成物と併用投与することができ、該組成物としては、アドリアマイシン、アザチオプリン（azathiopurine）、ブスルファン、シクロホスファミド、サイクロスポリンA、シトキサン、フルダラビン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、6-メルカプトプリン、コルチコステロイド、非ステロイド抗炎症剤、シロリムス（ラパマイシン）、およびタクロリムス（FK-506）が挙げられるが、それらに限定されない。代替的な態様において、免疫調節剤または免疫抑制剤は、ムロモナブ-CD3、アレムツズマブ（Campath（登録商標））、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ムロモナブ（OKT3（登録商標））、リツキシマブ、抗胸腺細胞グロブリンおよびIVIg、ならびに当業者に公知のその他のものからなる群より選択される抗体である。
一態様において、本開示のLFA3ポリペプチド分子は、糖尿病を治療するための組成物と併用投与することができ、該組成物としては、ビグアニド（例えば、ブホルミン、メトホルミン、およびフェンホルミン（phenform））、ホルモンおよびそのアナログ（アミリン、インスリン、インスリンアスパルト、インスリンデテミル、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリンリスプロ、リラグルチド、およびプラムリンチド）、スルホニル尿素誘導体（アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリボルヌリド、グリクラジド、グリメピリド、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリブリド、グリブチアゾール、グリブゾール、グリヘキサミド、グリミジン、トラザミド、トルブタミド、およびトルシクラミド）、チアゾリジンジオン（ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、およびトログリタゾン）、アカルボース、エキセナチド、ミグリトール、ミチグリニド、ムラグリタザル、ナテグリニド、レパグリニド、シタグリプチン、テサグリタザル、ビルダグリプチン、およびボグリボースが挙げられるが、それらに限定されない。
ある特定の態様において、本開示のLFA3ポリペプチド分子は、インビボでの適切な分布を確実にするように製剤化されうる。例えば、血液脳関門（BBB）は、多くの高親水性化合物を排除する。本開示の治療用化合物が（所望の場合に）BBBを越えることを確実にするために、それらは、例えばリポソーム中に製剤化されうる。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許第4,522,811号;同第5,374,548号;および同第5,399,331号を参照。リポソームは、標的化薬物送達を増強するように特定の細胞または臓器に選択的に輸送される1つまたは複数の部分を含んでもよい（例えば、V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685を参照）。例示的なターゲティング部分としては、葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第5,416,016号を参照）;マンノシド（Umezawa et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038）;抗体（P.G.Bloeman et al.,1995,FEBS Lett.357:140;M.Owais et al.,1995,Antimicrob.Agents Chemother.39:180）;サーファクタントプロテインA受容体（Briscoe et al.（1995）Am.J.Physiol.1233:134）;pl20（Schreier et al.（1994）J.Biol.Chem.269:9090）が挙げられる。K.Keinanen;M.L.Laukkanen,1994,FEBS Lett.346:123;Killion;Fidler,1994;Immunomethods 4:273も参照。
本開示は、それを必要とする対象に単独でまたは他の療法と組み合わせて本開示のLFA3ポリペプチド分子を含む薬学的組成物を投与するためのプロトコールを提供する。本開示の併用療法の療法（例えば、予防用物質または治療用物質）は、対象に同時または逐次的に投与されうる。本開示の併用療法の療法（例えば、予防用物質または治療用物質）はまた、周期的に投与されうる。周期的療法は、療法（例えば、剤）の1つに対する抵抗性の発生を低減し、療法（例えば、剤）の1つの副作用を回避もしくは低減し、かつ/または療法の有効性を向上させるために、ある期間にわたる第1の療法（例えば、第1の予防用物質または治療用物質）の投与、続いてある期間にわたる第2の療法（例えば、第2の予防用物質または治療用物質）の投与およびこの逐次投与、すなわち、サイクルを繰り返すことを伴う。
本開示の併用療法の療法（例えば、予防用物質または治療用物質）は、対象に同時に投与されうる。「同時」という用語は、正確に同じ時間での療法（例えば、予防用物質または治療用物質）の投与に限定されず、むしろ、本開示のLFA3ポリペプチド分子を含む薬学的組成物が、本開示のLFA3ポリペプチド分子が他の療法と共に作用して、それらがそうではなく投与された場合よりも増大した利益を提供できるような配列でおよび時間的間隔内に対象に投与されることを意味する。例えば、各療法は、同時にまたは任意の順序で異なる時点において逐次的に対象に投与されてもよいが、同時に投与されない場合、それらは、所望の治療または予防効果を提供するように十分に近接した時間内に投与されるべきである。各療法は、任意の適切な形態でおよび任意の適切な経路により別々に対象に投与されうる。さまざまな態様において、療法（例えば、予防用物質または治療用物質）は、15分未満、30分未満、1時間未満の間隔、約1時間の間隔、約1時間〜約2時間の間隔、約2時間〜約3時間の間隔、約3時間〜約4時間の間隔、約4時間〜約5時間の間隔、約5時間〜約6時間の間隔、約6時間〜約7時間の間隔、約7時間〜約8時間の間隔、約8時間〜約9時間の間隔、約9時間〜約10時間の間隔、約10時間〜約11時間の間隔、約11時間〜約12時間の間隔、24時間の間隔、48時間の間隔、72時間の間隔、または1週間の間隔で対象に投与される。他の態様において、2つまたはそれ以上の療法（例えば、予防用物質または治療用物質）は、同じ患者外来内に投与される。
併用療法の予防用物質または治療用物質は、同じ薬学的組成物中で対象に投与されうる。あるいは、併用療法の予防用物質または治療用物質は、別々の薬学的組成物中で対象に同時に投与されうる。予防用物質または治療用物質は、同じまたは異なる投与経路により対象に投与されてもよい。
VII. キット
本開示はまた、本明細書に記載するポリペプチド分子のいずれかまたはすべてを含むキットを提供する。本開示のキットは、本明細書に記載するLFA3ポリペプチド分子を含む1つまたは複数の容器および本明細書に記載する開示の任意の方法に従って使用するための説明書を含む。一般に、これらの説明書は、上記の治療的処置のためのポリペプチド分子の投与に関する記載を含む。いくつかの態様において、キットは、単回用量投与単位を作製するために提供される。ある特定の態様において、キットは、乾燥タンパク質を有する第1の容器および水性製剤を有する第2の容器の両方を含有することができる。ある特定の態様において、アプリケーター、例えば、単一および複数チャンバー事前充填シリンジ（例えば、液体シリンジおよび凍結乾燥シリンジ（lyosyringe））を含有するキットが含まれる。
LFA3ポリペプチド分子の使用に関する説明書は、一般に、意図する治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）または部分単位用量であってもよい。本開示のキットにおいて供給される説明書は、典型的には、ラベルまたはパッケージ挿入物（例えば、キットに含まれる紙シート）上の書面説明書であるが、機械読取り可能な説明書（例えば、磁気または光学ストレージディスク上の説明書）もまた許容される。
本開示のキットは、適切なパッケージング中にある。適切なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、および柔軟性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチックバック）などが挙げられるが、それらに限定されない。特定のデバイス、例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）または注入デバイス、例えば、ミニポンプと組み合わせて使用するためのパッケージもまた想定される。キットは滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静注用バッグであるか、または皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってもよい）。容器もまた、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は静注用バッグであるか、または皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本開示のLFA3ポリペプチド分子である。容器は、第2の薬学的活性剤をさらに含んでもよい。
キットは、任意で、緩衝液および説明情報などの追加の成分を提供してもよい。通常、キットは、容器、および容器上のまたは容器に付属するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。
本開示はまた、本明細書に記載するポリペプチド分子のいずれかまたはすべてを含む診断キットを提供する。診断キットは、例えば、試料中のCD2の存在を検出するために有用である。いくつかの態様において、診断キットは、CD2媒介性疾患、障害、もしくは状態またはCD2欠損性疾患、障害、もしくは状態を発生するリスクに個体をさらしうる潜在性の疾患、障害、または状態を有する個体を同定するために使用されうる。いくつかの態様において、診断キットは、CD2媒介性疾患またはCD2欠損性疾患、障害、もしくは状態を有することが疑われる個体においてCD2の存在および/またはレベルを検出するために使用されうる。
本開示の診断キットは、本明細書に記載するLFA3ポリペプチド分子を含む1つまたは複数の容器および本明細書に記載する開示の任意の方法に従って使用するための説明書を含む。一般に、これらの説明書は、CD2媒介性疾患またはCD2欠損性疾患、障害、もしくは状態のリスクがある個体、またはそれらを有することが疑われる個体においてCD2の存在を検出するためのLFA3ポリペプチド分子の使用の記載を含む。いくつかの態様において、例示的な診断キットは、例えば、LFA3ポリペプチド分子などの試薬、陰性対照試料、陽性対照試料、およびキットを使用するための指示を含有するように構成されうる。
VIII. 等価物
以上の記載および以下の実施例は、本開示のある特定の具体的な態様を詳述し、本発明者らによって想定される最良の態様を記載する。しかしながら、以上が文書中にどれほど詳細に書かれていたとしても、本開示は、多くのやり方で実施されてもよく、本開示は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
開示する教示をさまざまな適用、方法、キット、および組成物に関して記載したが、本明細書の教示および以下の請求項に係る開示から離れることなくさまざまな変更および改変を行うことができることが理解されるであろう。以下の実施例は、開示する教示をよりよく説明するために提供され、本明細書に提供する教示の範囲を限定することは意図されない。本教示をこれらの例示的な態様に関して記載したが、これらの例示的な態様の多数のバリエーションおよび改変が過度の実験なしに可能であることを当業者は容易に理解するであろう。すべてのそのようなバリエーションおよび改変は本教示の範囲内である。
特許、特許出願、文書、および教本を含む、本明細書において言及されるすべての参照文献、ならびに、まだ含まれていない程度に本明細書において言及される参照文献は、参照により全体が本明細書に組み入れられる。組み入れられる文献および類似の材料の1つまたは複数が、用語の定義、用語の用法、または記載する技術が挙げられるが、それらに限定されない本出願と異なるまたは矛盾する場合、本出願が優先される。
IX. 一般的教示
本発明は、特定の合成的作製方法に限定されず、それは当然ながらさまざまでありうることが理解されるべきである。本明細書において別段の定義がある場合を除き、本発明との関連で使用される科学用語および技術用語は、本技術分野の通常の技能を有する者に一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がある場合を除き、単数形は複数を包含するものとし、複数形は単数を包含するものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技術との関連で使われる学術用語は当技術分野において周知であり、一般的に使われている。
本発明の実施は、他に指し示されなければ、当技術分野の技術的範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition（Sambrook et al.,1989）Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait,ed.,1984）;Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook（J.E.Cellis,ed.,1998）Academic Press;Animal Cell Culture（R.I.Freshney,ed.,1987）;Introduction to Cell and Tissue Culture（J.P.Mather and P.E.Roberts,1998）Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures（A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998）J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology（Academic Press,Inc.）;Handbook of Experimental Immunology（D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.）;Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987）;Current Protocols in Molecular Biology（F.M.Ausubel et al.,eds.,1987）;PCR:The Polymerase Chain Reaction,（Mullis et al.,eds.,1994）;Current Protocols in Immunology（J.E.Coligan et al.,eds.,1991）;Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY（2001）;Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,NY（2002）;Harlow and Lane Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY（1998）;Coligan et al.,Short Protocols in Protein Science,John Wiley＆Sons,NY（2003）;Short Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons,1999）;Immunobiology（C.A.Janeway and P.Travers,1997）;Antibodies（P.Finch,1997）;Antibodies:a practical approach（D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989）;Monoclonal antibodies:a practical approach（P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000）;Using antibodies:a laboratory manual（E.Harlow and D.Lane（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999）;The Antibodies（M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995）などの文献中に十分に説明されている。
酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、当技術分野においてよく行われているとおりに、または本明細書に記載するとおりに行われる。本明細書に記載する分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、合成有機化学、ならびに医薬および薬化学の実験室手法および技術との関連で使われる学術用語は当技術分野において周知であり、一般的に使われている。標準技術が、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、および患者の治療のために使われる。
以下に実験例を挙げて、本開示をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、別段の明示がある場合を除き、例示のために提供されるに過ぎず、限定を意図していない。従って本開示は、決して、以下の例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として自明になるありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
実施例1: 酵母ディスプレイによるLFA3の安定性およびアフィニティー成熟
方法:
タンパク質の発現および精製
C末端ヒンジ-Pfe Fcを有するヒトLFA3バリアントを哺乳動物発現ベクターpRY19にクローニングし、それを使用して、製造者の説明書に従ってExpiFectamine 293 Transfection Kit（ThermoFisher＃A14525）およびExpiCHO Expression System Kit（ThermoFisher＃A29133）をそれぞれ使用しExpi293（ThermoFisher）およびExpiCHO（ThermoFisher）細胞に一過的にトランスフェクトした。発現の4〜7日後、タンパク質を回収し、MabSelectSuRe resin（GE Healthcare＃17-5438-01）を使用したプロテインAアフィニティーカラムによって、続いてSuperdex200 13100 Increase column（GE Healthcare）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって精製した。
大規模発現のために、CHO SSIプール安定細胞株を生成した。LFA3-Fc M1-d1およびM1-d3含有上清を濾過し、MabSelect SuRe LX resinに捕捉させた。溶出したタンパク質を中和し、最終精製工程としてフロースルーモードでSPカラムに通した。野生型（WT）LFA3-Fcタンパク質について、SECを使用して単量体画分を精製した。残留プロテインA、宿主細胞タンパク質（HCP）、およびDNA用の商用のアッセイキットを使用して処理不純物を測定した。
ヒトLFA3の酵母表面ディスプレイ
ヒトLFA3（残基1〜93）、例えば、SEQ ID NO:24のポリペプチドのN末端Igドメインを、pRNYD2またはpRNYDGベクター（Pfizer）を使用してS.セレビシアエ（S.cerevisiae）株BJ5465の表面に提示させた。両方のベクターはN末端V5エピトープタグを有するLFA3を提示し、LFA3のC末端はMuc3および膜アンカー領域に融合している。pRNYD2ベクターは酵母の表面にLFA3をアンカーするためにAxl2の膜貫通領域を使用する一方、pRNYDGはGPIリンカーを用いる。活性LFA3の表面ディスプレイは、V5エピトープ染色およびフローサイトメトリーを介するCD2結合によって確認した（データ示さず）。pRNYDGシステムは、pRNYD2システムと比較して酵母表面上にはるかにより効率的におよびはるかにより高い発現レベルでLFA3を提示することが見出された。
第1世代ライブラリーの設計および構築
野生型ヒトLFA3:CD2複合体の結晶構造に基づいて（Wang,et al（1999）Cell 97,791-803）、LFA3の15のコンタクト残基および16の内向き疎水性「コア」残基を選択して、オーバーラップ伸長PCRおよび縮重コドンを有する以下のPCRプライマーを使用して無作為化した。2つのライブラリーを構築した:1 - 「コア」残基のみの無作為化を含有するS（安定性ライブラリー）;ならびに2 - コンタクト残基および「コア」残基の両方の無作為化を含有するAS（アフィニティーおよび安定性ライブラリー）。酵母上（on-yeast）発現レベルは組換えタンパク質の熱安定性と相関することが報告されている（Shusta,et al（1999）Journal of molecular biology 292,949-956）。従って、向上させることができるLFA3の熱安定性の範囲を増大させるためにより低い表面発現を有するpRNYD2ディスプレイプラットフォームにおいてこれらの第1世代ライブラリーを構築した。
コンタクト残基用のPCRプライマー:
Figure 2021519758
「コア」残基用のPCRプライマー:
Figure 2021519758
ASライブラリーを構築するために、コンタクトおよび「コア」残基の無作為化を含有するLFA3遺伝子断片を別々に増幅し、ApaI/NcoI二重消化pRNYD2ベクターと共に混合した後にエレクトロポレーションを行った。酵母ライブラリーのエレクトロポレーション、レスキュー、および増大は、以前に記載されたように行った（Chao,et al（2006）Nature protocols 1,755-768）。最終のASおよびSライブラリーはそれぞれ約1.5×108個および約1.3×108個の形質転換体を含有した。
第1世代の選択
選択のすべてのラウンドについて20℃でLFA3バリアントの酵母上発現を誘導し、2つの選択的なパラメーターを変更することによってライブラリー選択を実行した:1 - 酵母上熱変性を適用して熱安定性を向上させた;および2 - CD2の濃度を維持するかまたは低下させてアフィニティーを保持するかまたは向上させた。計4ラウンドの選択を各ライブラリーについて行った。
Sライブラリーの選択:
Sライブラリーの選択のために、リガンド（hCD2-ビオチン）を1μMの一定濃度に保った一方、選択ラウンドを通じて熱曝露の増大を適用して、CD2に対する野生型様アフィニティーを維持しながら最も熱安定なクローンを濃縮した。選択戦略は、酵母上でのタンパク質安定性を進化させるための以前に報告されたアプローチから適合させた（Shusta,et al（2000）Nature biotechnology 18,754-759）。ラウンド1について、追加の熱曝露なしに、約2.0×109個の細胞を4℃で1時間hCD2-ビオチンとインキュベートし、PBE（PBS、pH7.4＋0.5％（w/v）のBSA＋2mMのEDTA、pH8.0）を用いて2回洗浄した。ライブラリーをその後に1:50のStreptavidin-PE（SA-PE、Life Technologies＃S21388）を用いて15分間染色し、2回洗浄し、そして最後に、1:10の常磁性抗PEマイクロビーズ（Miltenyi＃130-048-801）を用いて20分間標識し、これらはすべて4℃で行った。製造者の説明書に従ってMACS LSカラム（Miltenyi＃130-042-401）およびQuadroMACS Separator（Miltenyi＃130-090-976）を使用してライブラリーを選択した。ラウンド2〜4について、熱ブロック（Eppendorf）を使用してPBE中の1.0×108個の細胞を［46℃で20分間］、［46℃で30分間］および［46℃で20分間＋50℃で10分間］にそれぞれ曝露した。熱変性後、1μMのhCD2-ビオチンを用いてライブラリーを4℃で1時間染色し、2回洗浄し、SA-PE（hCD2結合を検出するため）および抗V5-FITC（LFA3バリアント発現を検出するため）を用いて4℃で10分間共標識した。2色FACS、SH800選別装置（Sony）を使用したCD2＋V5＋二重陽性集団の選別によってライブラリー選択を行った。
ASライブラリーの選択:
ASライブラリーの選択のために、hCD2-ビオチン濃度を低下させ、選択ラウンドを通じて熱曝露の増大を適用して、最も高いアフィニティーと共に最も熱安定なクローンを濃縮した。ASライブラリーのための選択ラウンドの基準およびモダリティーは、上記のSライブラリーについてのものと本質的に同じであったが、ラウンド2〜4について、1μMのリガンドを用いてライブラリーを染色する代わりに、40nMのhCD2-ビオチンを用いてASライブラリーを4℃で1時間染色するという1つの改変を伴った。
選択の終了時に、100μlのラウンド4後のSおよびASライブラリーを使用し、製造者の説明書に従ってZymoprep（商標）Yeast Plasmid Miniprep II Kit（Zymo Research＃D2004）を使用してライブラリーDNAを抽出した。抽出したDNAで化学コンピテントTOP10大腸菌を形質転換し、プレーティングして個々のクローンをシークエンシングした。
第2世代「ループ」ライブラリーの設計および構築
LFA3バリアントのアフィニティーをさらに向上させるために、オーバーラップ伸長PCRのための鋳型としてWTならびに第1世代バリアントの3つ（M1、M4、およびM5）を使用し、かつ以下の縮重プライマーを用いてFGループを無作為化することによって第2世代ライブラリーを構築した。FGループは最小の電荷/表面相補性を有するLFA3:CD2境界面の領域であるので、この設計の根拠は、結合エネルギー論を最適化するためにループを完全に無作為化することである。必ずしも高アフィニティーではない高発現クローンの優先的な選択を回避するために、最適な表面発現のためのpRNYDGディスプレイプラットフォームにおいて「ループ」ライブラリーを構築した。
ループ残基用のPCRプライマー:
Figure 2021519758
酵母ライブラリーのエレクトロポレーション、レスキュー、および増大は、以前に記載されたように行った（Chao,et al（2006）Nature protocols 1,755-768）。最終のライブラリーは約2.9×108個の形質転換体を含有した。
第2世代の選択
安定性に対してではなくアフィニティーに対する選択圧力の増大を伴う計6ラウンドの選択をループライブラリーに対して行って、最も高いアフィニティーのLFA3バリアントを濃縮した。初期ラウンドの選択のために、第1世代ライブラリーのラウンド1について記載したものと類似の手法を使用してMACSを介して50nMの単量体hCD2-ビオチンを用いて3×109個の細胞を選択した。その後のラウンドでは速度論的選択戦略（Boder,et al（1997）Nature biotechnology 15,553-557）を用いて最も遅いオフレートを有するクローンを濃縮した。簡潔に述べれば、速度論的選択戦略は、250nMの単量体hCD2-ビオチンを用いた室温で1時間の1×108個の酵母の染色、PBEを用いた2回の洗浄、増加する時間にわたる室温での1μMの単量体非ビオチン化hCD2との競合、PBEを用いた2回の洗浄、および最後に、MACSまたは2色FACSのいずれかを用いた濃縮を伴った。ラウンド2〜6の競合の長さは、それぞれ10、20、40、80、および80分間であった。選択モダリティーはラウンド2〜3についてMACS、ラウンド4〜6についてFACSであった。
選択の終了時に、第1世代の選択について上記したように個々のクローンをシークエンシングした。
酵母上のタイトレーション
酵母上のCD2に対するアフィニティーを評価するために、hCD2-ビオチンの段階希釈液をLFA3発現酵母と4℃で1時間撹拌と共にインキュベートした。200μlのPBEを用いて2回洗浄することによって未結合のhCD2-ビオチンを除去した。hCD2-ビオチン標識した酵母を1:100のSA-PEと4℃で15分間撹拌と共にインキュベートし、再びPBEを用いて2回洗浄した。試料をAccuri C6フローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。データは平均蛍光強度を表し、Prism 6（Graphpad）を使用して点をシグモイド用量応答曲線にフィッティングした。
いくつかの改変と共に以前に報告されたアプローチを使用して酵母上タンパク質熱安定性を評価した（Orr,et al（2003）Biotechnology progress 19,631-638）。簡潔に述べれば、Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler（BioRad）を使用してPBE中のLFA3発現酵母を30〜70℃の指し示す温度において15分間加熱し、次に4℃に冷却した。酵母を500nMのhCD2-ビオチンと1時間インキュベートし、PBEを用いて2回洗浄し、次に1:100のSA-PEを用いて4℃で15分間染色した。試料をAccuri C6フローサイトメーターで分析した。データは、各LFA3バリアントについての最大結合に対して正規化した平均蛍光強度を表し、Prism 6を使用して点をシグモイド用量応答曲線にフィッティングした。
安定性の評価
示差走査蛍光光度（DSF）
製造者の説明書に従ってViiA 7 Real-Time PCR system（Thermo Fisher）およびProtein Thermal Shift Dye Kit（Thermo Fisher ＃4461146）を用いて実験を実行した。簡潔に述べれば、0.8〜1mg/mlのLFA3バリアントをPBS中の色素の1:1000希釈液と混合した。試料（20μlの反応体積）を、MicroAmp Optical 96-well reaction plate（Applied Biosystems＃N8010560）にわたってプレートの側部を回避して分布させ、光学粘着カバー（Applied Biosystems＃4360954）を用いて密閉した。0.05℃/秒の速度で25℃から99℃まで温度を増加させるようにViia 7 Real-Time PCR systemをプログラムした。ViiA 7ソフトウェアにおいて融解曲線の第1の転移に対応する温度を測定することによってLFA3-Pfeバリアントの融解温度を定量化し、Prism 6を使用して点をプロットした。
熱強制凝集
Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler（BioRad）を使用してpH7.2のPBS中の1mg/mlのLFA3-Pfeバリアントを指し示す温度において24時間加熱した（20μl/反応）。熱誘導性凝集のレベルを評価するために、15μl/試料をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析のためにYMC-Pack Diol-200（YMC）カラムにロードした。結果として得られたクロマトグラムを使用して、温度の関数として高分子量種（HMMS）％、二量体％、および単量体％を定量化した。
低pH保持
pH7.2のPBS中の1.5mg/mlのLFA3-Pfeバリアントを10％（v/v）の0.4Mのグリシン（pH2.7）またはPBS（pH7.2）のいずれかと混合し（すなわち、5μlのグリシンまたはPBSを50μlのタンパク質に加えた）、室温で5時間インキュベートした。4.55％（v/v）の0.25MのTris Base（pH7.4）またはPBSのいずれかを用いて試料を中和した（すなわち、2.5μlの中和緩衝液を55μlの試料に加えた）。低pH誘導性凝集のレベルを評価するために、25μl/試料をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析のためにYMC-Pack Diol-200（YMC）カラムにロードした。結果として得られたクロマトグラムを使用して、温度の関数として高分子量種（HMMS）％、二量体％、および単量体％を定量化した。
凍結融解および振とうの安定性
材料を-80℃または-20℃で≧30分間凍結し、5℃で≧30分間融解し、ボルテックスすることによって凍結融解安定性を評価した。処理を5サイクルにわたって繰り返し、試料を分析的SECによって評価した。振とう安定性のために、試料を300rpm（PS80ありおよびなし）で24時間の振とうに供し、可溶性の凝集および沈殿について調べた。
熱安定性（示差走査熱量測定）
MicroCal VP-Capillary DSCを使用して60℃/時の速度で10〜110℃で走査して、DSCによる熱安定性を評価した。試料を緩衝液中で1mg/mlに希釈した。
タンパク質分析
キャピラリーゲル電気泳動（cGE）
試料を1mg/mlに希釈した。非還元試料をヨードアセトアミド（IAM）で処理し、還元試料をDTTで処理した。cGE LabChip HT Antibody Express 200法（Perkin Elmer）を使用して分析を行った。
分析的SEC
YMC-Pack Diol-200クロマトグラフィー（YMC America）カラムを使用してSEC-HPLC分析を行った。
粘度
RheoSense m-VROC粘度計を使用して粘度を測定した。タンパク質をpH5.8のヒスチジンスクロースEDTA緩衝液中に配合し、150mg/mlまでの濃度において粘度を測定した。
タンパク質特徴決定
アフィニティー捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（AC-SINS）
抗ヒトIgGでコーティングしたコーティング金ナノ粒子を使用してAC-SINSアッセイを行った。PBS中の50μg/mlの試料をコーティングナノ粒子と混合し、2時間インキュベートした。試料をUV透明プレートに移し、450〜650nmで吸光度を測定した。
FcRnクロマトグラフィー
ビオチン化ヒトFcRnをストレプトアビジン樹脂に捕捉させ、カラムに充填した。50μgの試料をカラムに注入し、pH5.5〜8.8の線形溶出勾配を適用した。対照mAbと比較した相対溶出時間および50％のピーク高さでのピーク幅を記録した。
多反応性ELISA
ELISAプレートを10μg/mlのdsDNAまたは5μg/mlのインスリンで終夜コーティングした。プレートをELISA緩衝液（PBS、0.05％のTween-20、1mMのEDTA）でブロッキングし、1μg/mlから開始する4倍段階希釈液を使用して試験タンパク質をアプライした。HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgGを使用して結合を検出した。
インシリコ免疫原性
EpiVax ISPRIウェブベーススクリーニングツールキットを使用してインシリコ免疫原性を評価した。
結合アフィニティー解析
Biacore T200機器（GE Healthcare、Piscataway、NJ）を使用して表面プラズモン共鳴によって組換えCD2に結合するLFA3-Fcバリアントのアフィニティーを決定した。ビオチン化CD2タンパク質を低連結密度でストレプトアビジン（SA）コーティングBiacoreセンサーチップ（Series S Sensor Chip SA、BR100531、GE Healthcare）に捕捉させた。実験は、0.01MのHEPES（pH7.4）、0.15MのNaClおよび0.005％ v/vの界面活性剤P20（HBS-P）緩衝液中で30μl/分の流速を使用して25℃で行った。LFA3-Fcバリアントを表面に2分間注入し、解離をさらに5分間、またはより高アフィニティーのクローンについて10分間モニターした。再生は必要とされなかった。Biacore T200 Evaluationソフトウェアを使用してデータを解析し、ストレプトアビジンのみが固定化された隣接する対照フローセルからのシグナルを各抗体について緩衝液のみの注入と共にバックグラウンドサブトラクションした。平衡結合モデルを使用してアフィニティー定数（Kd）を算出した。
結果
構造ベースの設計を使用して、ヒトLFA3の第1の細胞外ドメインに基づく酵母ディスプレイライブラリーを構築した（図1）。ASおよびSライブラリーは、それぞれ約1.5×108個および約1.3×108個の形質転換体を含有すると推定された。ナイーブライブラリーの配列解析により各ライブラリー中にクローンあたり約6〜7の突然変異が確認された。
ライブラリーを誘導後に増加する量の熱曝露、およびASライブラリーについて減少性濃度のCD2リガンドに曝露した。4ラウンドの選択後、個々のクローンをシークエンシングし、6つのホットスポット残基を同定した:A36、L38、F43、A45、M77、およびM86（図2Aおよび図2B）。これらの6つの位置において観察された最も頻繁な残基に基づいて（図2C）、6つの組換えバリアントを設計し（M1-＞M6）（図2D）、哺乳動物細胞中でFc融合タンパク質として発現させた。M1〜M6のFc融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:16）と融合したバリアントLFA3細胞外ドメイン（それぞれSEQ ID NO:17〜22）を含む（表2）。図面中および本出願の全体を通じてヒトIgG1 Fc領域SEQ ID NO:16を「Pfe」とも称する。対応するヌクレオチド配列を表3に提供する。
実施例1および実施例2に記載の研究において、M1〜M6のFc融合タンパク質および他のバリアントLFA3-Fc融合タンパク質を野生型LFA3-Fc融合タンパク質と比較した。2つの参照野生型LFA3-Fc融合タンパク質を研究において使用し、これらの両方は、ヒトIgG1 Fc領域に融合したヒトLFA3の野生型の第1の細胞外ドメインを含む。第1の参照分子を「WT LFA3-Fc」または「LFA3-Fc WT」（SEQ ID NO:4）と称し、これはアレファセプトの報告された配列に基づいて生成された。この参照分子は参照により全体が本明細書に組み入れられるUS5547853に開示されている。第2の参照分子を「WT LFA3-Pfe」（SEQ ID NO:120）と称し、これはWT LFA3-Fcと同じヒトLFA3の野生型の第1の細胞外ドメインを含むが、わずかに異なるヒトIgG1 Fc領域を有する。いくつかの態様において、LFA3-Fc WT（SEQ ID NO:4）および/またはWT LFA3-Pfe（SEQ ID NO:120）はカルボキシ末端リジン残基を含む。いくつかの態様において、SEQ ID NO:4および/またはSEQ ID NO:120はカルボキシ末端リジン残基を含まない。いくつかの態様において、SEQ ID NO:128はカルボキシ末端リジン残基を含まない。
LFA3バリアントFc融合タンパク質を特徴決定して、組換えタンパク質の安定性および潜在的な製造可能性を評価した。単量体発現、全体的収率、熱安定性、および熱ストレス下での凝集傾向に基づいてバリアントを順位付けした（図3A〜3D）。バリアントM1、M4、およびM5は、この解析に基づいて最も望ましい特性を有することが同定された。
CD2に対する増大した結合アフィニティーを有するクローンを同定するために第2世代ライブラリーを設計した。このライブラリーは、野生型、M1、M4、およびM5バリアントを鋳型として使用してLFA3のFGループ上の7つの残基を変異させた（図4）。配列解析に基づいて、12個のバリアントLFA3-Fc融合タンパク質を設計し、さらなる解析のために哺乳動物細胞中で発現させた（CM1d1-＞CM6d1およびML1d1-＞ML6d1）。CM1d1〜CM6d1のFc融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:16）と融合したバリアントLFA3細胞外ドメイン（それぞれSEQ ID NO:30〜35）（表2）。同様に、ML1d1〜ML6d1のFc融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:16）と融合したバリアントLFA3細胞外ドメイン（それぞれSEQ ID NO:36〜41）を含む（表2）。対応するヌクレオチド配列を表3に提供する。
第2世代ループライブラリーから同定されたクローンをFc融合タンパク質として発現させ、示差走査蛍光光度（DSF）を使用して熱安定性（図5B）およびBiacore結合アッセイを使用してSPRによって組換えCD2タンパク質に対する結合アフィニティー（図5A）を評価した。評価した最も高いアフィニティーのクローンは60〜100nMの範囲内の見かけのアフィニティーを有した（図5A）。評価した最も高いアフィニティーのクローンは、親WT LFA3-Fcタンパク質と比較して約20倍ならびにM1d1-Pfe（「LFA3-Fc M1d1」とも称する）およびM4d1-Pfeバリアントに対して10倍のアフィニティーの増加を有した（図5A）。バリアントCM2d1-Pfe、CM5d1-Pfe、およびML3d1-Pfeは、野生型構築物（WT LFA3-FcおよびWT LFA3-Pfe）の他に親バリアント構築物（M1d1-PfeおよびM4d1-Pfe）と比較して増大したDSFによる熱安定性を有する（図5B）。
構造解析に基づく合理的設計を使用して、発現構築物に含まれるLFA3ドメインのc末端境界を拡張した（図6A）。野生型LFA3ドメイン（LFA3-Fc d1）またはMバリアント（M1-d1およびM4-d1）上の追加のc末端ロイシン残基をコードする構築物を発現させ、精製した。LFA3-Fc d1、M1-d1（「M1d1」とも称する）、およびM4-d1（「M4d1」とも称する）Fc融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:16）に融合したLFA3ドメイン（それぞれSEQ ID NO:24、26、および28）を含む（表2）。対応するヌクレオチド配列を表3に提供する。d1バリアントは、LFA3 Fc融合タンパク質について以前に報告されたドメイン境界を有して発現されたタンパク質と比較して減少した凝集物形成、および増大した熱安定性を有することが見出された（図6Bおよび図6D）。M1またはM4バックグラウンドへのドメイン境界改変（d1）の追加は、細胞培養物からのタンパク質の単量体比率（図6C）およびDSFによって測定した場合の熱安定性（図6D）をさらに増大させた。
追加の1つ（d1、＋L）（図7A）または6つ（d3、＋LESLPS）（図7B）の内因性アミノ酸を含むバリアントをFc融合タンパク質として生成し、安定性および結合アフィニティーについて特徴決定した。M1-d1およびM1-d3（「M1d3」とも称する）Fc融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:16）に融合したLFA3ドメイン（それぞれSEQ ID NO:26および27）を含む（表2）。対応するヌクレオチド配列を表3に提供する。2つのバリアント、M1-d1およびM1-d3は、類似したCD2結合アフィニティーおよびインビトロ熱安定性を実証する（図7Cおよび図7D）。
M1と比べて位置86において1つの追加の野生型残基を含有するように追加のLFA3バリアントM7を設計した（図8A）。M7-d1（「M7d1」とも称する）Fc融合タンパク質は、ヒトIgG1 Fc領域（SEQ ID NO:16）に融合したLFA3ドメイン（SEQ ID NO:29）を含む（表2）。対応するヌクレオチド配列を表3に開示する。M7-d1を特徴決定して、単量体比率（図8B）、熱安定性（図8C）、および組換えCD2に対する結合アフィニティー（図8D）を評価した。
バリアントLFA3-FcおよびWT LFA3-Fcを安定性および潜在的な製造可能性について特徴決定した（表4および表5）。これらのアッセイにより、M1-d1（「M1d1」としても知られる）バリアントは、単量体タンパク質発現、熱安定性、凝集傾向、低pH保持に対する感受性、および凍結解凍サイクルに関して野生型Fc融合体より有意に安定であることが見出された（表4）。
（表４）LFA3-Fcバリアントの新規かつ有用な分子特性
Figure 2021519758
HMWSは高分子量種を指し、LMWSは低分子量種を指す。
＊本明細書に開示するLFA3-Fcバリアントのすべてを包含する例示的な態様。
（表５）LFA3-Fc M1-d1の操作されたバリアントの分子特性の概要
Figure 2021519758
実施例2: M1D1のさらなるインビトロおよびインビボ特徴決定
序論
LFA3-Fcは、一旦最適化されると、これまで疾患修飾的介入に対して概ね難治性であり、従って特に子供において大きい満たされていない医学的必要性を表す疾患である1型糖尿病（T1D）において免疫学的寛容を回復させる可能性を有する重要な治療経路を標的とする。
M1d1（「M1-d1」、「LFA3-Fc M1d1」、および「LFA3-Fc M1-d1」とも称する）は、IgG1 Fc領域に融合したLFA3の第1の細胞外ドメインを含む二量体LFA3-Fc融合タンパク質である。M1d1は、安定性および製造可能性を向上させるためにLFA3細胞外ドメイン中に4つの非内因性アミノ酸を含有するように操作された。理論によって縛られることを望まないが、M1d1は、TregおよびTナイーブ細胞を比較的温存しながらADCC/細胞傷害性を通じてメモリーCD4およびCD8 T細胞の数を低減し、かつCD2/LFA3相互作用をモジュレートする可能性があり、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の両方におけるTreg/TEMおよびTreg/TCM比の向上につながりうる。M1d1は、提案される作用機序（MOA）および治療的仮説と合致してカニクイザルにおける免疫表現型のモジュレーションを実証した。M1d1を用いた非臨床研究は、PKは線形であり、用量は比例的であることを示唆し、非GLP TK研究は、リンパ球における予期される低減以外のいかなる安全性の発見も明らかにしなかった。薬理学的特性の要約を、標的CD4メモリー細胞集団についてのデータと共に以下の表6に含める。
（表６）LFA3-Fcバリアントの新規かつ有用な薬理学的特性の要約
Figure 2021519758
＊本明細書に開示するLFA3-Fcバリアントのすべてを包含する例示的な態様。
方法
CD2発現解析
リンパ球サブセットのために、Lymphoprep（Stemcell Technologies＃07851）を使用してヒト末梢血単核細胞（PBMC）を単離した。PBS中の90％ Lymphoprep（Corning＃21-040-CM）を使用してマカクからPBMCを単離し、蛍光活性化細胞選別（FAC）緩衝液（PBS＋0.2％のBSA（Jackson Immuno Research＃001-000-173））に再懸濁した。Human TruStain FcX（BioLegend＃422302）を使用してヒト細胞を遮断した。試料あたり200万個のPBMCを染色した。Tヘルパー細胞サブセットのために、製造者の説明書を使用してEasy Sep kit（Stem Cell Technology＃19052）を使用してCD4細胞を単離し、次に試料あたり100万個の細胞を染色した。表面染色のために、細胞をintracellular（IC）Fixation buffer（Ebioscience＃00-8222-49）に固定した後に解析を行った。FoxP3の染色のために、human FoxP3 Buffer set（BD Pharmingen＃560098）を製造者の説明書に基づいて使用した。ヒトPBMCのために、細胞を以下の抗体で染色した:CD4 BUV395、CD3 PerCp-e710、CD2 PE、CD45RO PeCy7、CD8 FITC、CCR7 BV421、TIGIT APC、PD1 BV650、近赤外バイアビリティー（near IR viability）（パネル1）;またはCD4 BUV 395、CD3 Percp-e710、CD2 PE、CD8 BUV 496、CD20 FITC、CD159a A647、CD25 BV421、CD127 BV605、および近赤外バイアビリティー。カニクイザルPBMCのために、細胞を以下のように染色した:CD95 BUV 395、CD4 PerCP-e710、CD2 PE、CD28 PeCy7、CD8 BUV496、CD3 FITC、CD20 V450、CD159a APC、PD1 BV650、近赤外バイアビリティー（パネル1）;またはCD4 Percpe710、CD3 FITC、CD25 BV421、CD2 PE、FoxP3 APC、および近赤外バイアビリティー。細胞をLSR Fortessaに流し、Quantibriteビーズを試料収集の時点で流した（製造者の説明書による）。近赤外（IR）蛍光反応性生死判定色素（Invitrogen＃L34976）を使用して生存細胞を識別した。データを幾何平均蛍光強度（gMFI）として表した。
LFA3-Fc競合結合アッセイ
PBMCおよびサブセットの単離
Trimaアフェレーシス収集物からのかつPBMCについて濃縮された、健常ドナー由来のTrima残留物を、Blood Centers of the Pacific（San Francisco、CA）から得た。密度勾配遠心分離によってPBMCを単離した。精製したCD4/CD8ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクターメモリー集団を陰性選択キット（StemCell Technologies）によってPBMCから単離した。
CD4 Enrichment RosetteSep（商標）カクテル（STEMCELL Technologies）を使用して、次にマーカーCD4-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）CD127-PE、およびCD25-APCを使用した蛍光活性化細胞選別によって制御性T細胞を全血から単離した。制御性T細胞は、CD4hiCD127loCD25hiによって同定される。単離された制御性T細胞を2週間までDynaBead Human Treg Expander beads（Invitrogen）の存在下でX-VIVO培地（Lonza）中で培養して増大させた。
細胞結合アッセイ
単離後、CD4およびCD8サブセットを細胞5×104個/ウェルの密度でプレーティングした。プレートを遠心沈降し、ヒト結晶化断片Fcブロック（2μl/ウェル）、LFA3-Fc M1d1またはLFA3-Fc WTの段階希釈液および競合物商用抗CD2-FITC（クローンRPA2.10）を含有するFACS緩衝液（2％のBSAを含有するPBS）に再懸濁してKdを決定した。競合物抗体を依然として検出できるが競合除去できるようにEC50より低い値において競合物濃度を一定（3.23×10-8M）に保持した。細胞を氷上で2時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、生体染色色素を含有する100μlのFACS緩衝液に再懸濁した。CD4エフェクターおよびセントラルメモリーの区別のために、CCR7-BV421を含めた。15分間のインキュベーション後、細胞をFACS緩衝液で洗浄し、50μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
データ解析
Cheng Prusoff式
Figure 2021519758
を使用してLFA3-FcのKdを算出した。
LFA3-Fc抗体濃度のlogに対して競合物結合の幾何平均蛍光強度（gMFI）をプロットすることによって細胞結合曲線を生成した。最大結合を競合なしの試料の平均とし、最小値を競合物CD2-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）なしの試料として値を正規化した。各PBMC細胞サブセットについて細胞結合曲線を生成した（図11）。GraphPad Prism（登録商標）（Version 6.0、GraphPad Software,Inc、San Diego、CA）の非線形回帰曲線フィットおよびアンタゴニスト用量応答モデルのシグモイドlogを使用して競合物のIC50値（最大応答の50％の阻害における有効濃度）を決定した。
MLRアッセイ
HLA遺伝子型の完全なミスマッチに基づいてドナーを凍結PBMCのバンクから選択した。CD3およびCD56陽性選択キットを使用して「スティミュレーター」ドナー由来のPBMCからT細胞およびNK細胞を枯渇させた。すべてのNK枯渇アッセイについて、CD56陽性選択キットを使用してNK細胞を「レスポンダー」ドナーからも枯渇させた。112500の細胞、または75μlの、スティミュレーターおよびレスポンダーの各集団を96ウェルU底プレートのウェルに加えた。LFA3-Fcタンパク質の段階希釈液を3×で調製し、75μlのタンパク質を各ウェルに加えた。プレートを37℃で5日間インキュベートした。細胞を遠心沈降し、蛍光活性化細胞選別（FACS）緩衝液（2％のBSAを含有するPBS）中で洗浄し、次に免疫フェノタイピング抗体で15分間染色した。以下の抗体を使用した:CD3（BUV496）、CD4（BUV395）、CD8 PerCp-e710、CD45RO PeCy7、CD45RA FITC、CD25 PE-CF594、CD56 BV421、CD2-PE、および近赤外バイアビリティー。フローサイトメトリー分析の直前に10μlのCountBrightビーズを各ウェルに加えた。
CD4メモリー、CD4ナイーブ、CD8メモリー、CD8ナイーブ、およびCD56 NK細胞の絶対数を算出した。
Figure 2021519758
としてCD4メモリー集団についてのパーセント応答を報告および算出した。
同種異系応答のパーセント阻害を、100 - パーセント応答として算出した。値をLFA3-Fc抗体濃度のlogに対してプロットした。アッセイ応答をメモリー細胞の絶対数の関数として決定した。GraphPad Prism（登録商標）（Version 6.0、GraphPad Software,Inc、San Diego、CA）の非線形回帰曲線フィットおよびアゴニスト用量応答モデルのシグモイドlogを使用してEC50値を決定した。
TTリコールアッセイ
Trima残留物から単離したPBMCを破傷風トキソイド（Astarte Biologics）に対する反応性についてスクリーニングした。強い陽性レスポンダーをTTRアッセイにおいて使用するためにバンクした。96ウェルU底プレート中、ウェルあたり200000個のPBMCを100μl中でプレーティングした。LFA3-Fcポリペプチドを4×で調製し、50μlの各LFA3タンパク質を各ウェルに加えた。50μlの破傷風トキソイドタンパク質（1μg/mL）を各ウェルに加え、37℃で5日間インキュベートした。プレートを16000rpmで5分間遠心分離した。125μlの上清を収集し、ELISAを介してIFNγ産生を解析した。細胞を遠心沈降し、FACS緩衝液（2％のBSAを含有するPBS）中で洗浄し、次に免疫フェノタイピング抗体で15分間染色した。以下の抗体を使用した:CD3（BUV496）、CD4（BUV395）、CD8 PerCp-e710、CD45RO PeCy7、CD45RA FITC、CD25 PE-CF594、CD56 BV421、CD2-PE、および近赤外バイアビリティー。フローサイトメトリー分析の直前に10μlのCountBrightビーズを各ウェルに加えた。
IFNγの濃度を使用してパーセント応答を決定した。MLRアッセイについて上記したようにパーセント応答を算出した。メモリーリコール応答のパーセント阻害を、100 - パーセント応答として算出した。値をLFA3-Fc抗体濃度のlogに対してプロットした。GraphPad Prism（登録商標）（Version 6.0、GraphPad Software,Inc、San Diego、CA）の非線形回帰曲線フィットおよびアゴニスト用量応答モデルのシグモイドlogを使用してEC50値を決定した。
PKアッセイ
標準物質および品質管理物質（QC）をカニクイザル血清中で調製し、次にMRDのためにアッセイ緩衝液（0.5MのNaClを含むScytek Superblock）中で20倍に希釈した。試料をまた、MRDに従ってアッセイ緩衝液中で希釈した。試料の任意の追加の希釈を5％のサル血清を含有するアッセイ緩衝液中で行い、96ウェルPCRプレートにロードした。ビオチン化捕捉抗体（抗LFA3、Invitrogen、MA1-19503）およびAF647標識検出抗体（ロバ抗ヒトIgG H＋L、Jackson ImmunoResearch、709-005-149）をそれぞれ50μg/mLおよび1μg/mLで調製し、別々の96ウェルPCRプレートにロードした。プレート、Gyros 1000 CD、および洗浄緩衝液を処理および解析のためにGyrolab機器にセットした。
結果
インビトロ解析
T1Dにおける組織破壊および病理の鍵となるドライバーはCD4＋TEM細胞である。CD2はすべてのT細胞上に発現されるが、CD2はTEM細胞上に最も高いレベルで発現される。CD2発現はTCR活性化後にさらに5倍増加する。ヒト細胞上でのCD2レベル（細胞あたりの分子）を図9および図10に示す。M1d1結合（最大gMFI）はT細胞上でのCD2発現のレベルと相関する。M1d1は、FcR結合エフェクター機能を有するIgG1 Fcを有する。インビトロでの薬理学を、i）細胞結合アッセイ、ii）一次ADCCアッセイ、iii）精製NK細胞細胞傷害性アッセイ、iv）混合リンパ球反応（MLR）における同種異系刺激からのCD4およびCD8増殖の阻害、ならびにv）破傷風トキソイドを使用した抗原リコールアッセイにおけるCD4mem IFNγ産生の阻害を通じて特徴決定した。さらに、M1d1は、非ADCC依存性の作用機序を有する可能性がある。インビトロで、MLRアッセイからのNK細胞の枯渇の他に、Fc-エフェクター機能バリアント分子の使用を通じてこれを実証した。すべてのインビトロアッセイにおいて、M1d1をベンチマークとしてのWT LFA3-Fc分子と比較した。追加の対照は、アイソタイプ対照（mAb陰性対照、無Fc突然変異）、および以下のアッセイのいずれにおいても活性/阻害を有しなかった（データ示さず）M1d1-Fcのエフェクター機能バリアント（eff null）を含んだ。理論によって縛られることを望まないが、これらのインビトロアッセイでは、CD2hiメモリーT細胞の優先的なターゲティング、およびメモリー細胞応答のその後の阻害を含む、M1d1の作用機序を評価した。
CD2発現解析
すべてのT細胞はCD2を発現する。しかしながら、絶対的な発現は細胞サブセット毎に異なり、メモリーT細胞はナイーブT細胞より高いレベルのCD2を発現する（図9）。B細胞はCD2を発現せず、NK細胞は不均質の低いレベルのCD2を発現する。活性化後、CD2発現は約5倍増加し、次に1週以内に基礎レベルに戻った（図10）。この発現プロファイルは、TregおよびTナイーブ細胞を温存しながらCD2hi TEM細胞をターゲティングしうるウインドウを提供する。
ヒトPBMCにおいて、CD2分子の定量化は、CD4およびCD8メモリー細胞上で最大数の分子を実証し、具体的には、CD4セントラルメモリー（「cen mem」）は平均で9220個の分子を発現し;ヒトCD4エフェクターメモリー（「eff mem」）は平均で11,000個の分子を発現し;ヒトCD8セントラルメモリーは平均で11,800個の分子を発現し;ヒトCD8エフェクターメモリーは平均で10,000個の分子を発現した（表7、図9）。ヒトCD8メモリー細胞内で、セントラルメモリーはエフェクターメモリーよりも多数の分子を有した（p＝＜0.05）。ヒトCD4細胞内で、エフェクターメモリーはセントラルメモリーよりも多くのCD2分子を有した（p＝＜0.05）。
（表７）ヒトPBMC中のリンパ球サブセット上でのCD2定量化
Figure 2021519758
cenメモリー＝セントラルメモリー;effメモリー＝エフェクターメモリー;Treg＝制御性T。
Quantibrite解析を使用してCD2発現を定量化した（図17）。ヒトと同様、カニクイザルメモリーT細胞は、細胞あたりでナイーブ細胞よりも多くの数のCD2分子を発現する。ヒトではそうではないがカニクイザルにおいて、CD8＋細胞は二峰性のCD2発現を有し、約10〜20％はCD2陰性であった。CD2分子の定量化は、CD4およびCD8メモリー細胞上で最大数の分子を実証し、CD4セントラルメモリー細胞は8,570個の分子を発現し、CD4エフェクターメモリーは8,140個の分子を発現し、CD8セントラルメモリーは7,100個の分子を発現し、CD8エフェクターメモリーは5,880個の分子を発現する（図17、表8）。
（表８）カニクイザルPBMC中のリンパ球サブセット上でのCD2定量化
Figure 2021519758
CD2のごくわずかな発現がヒトおよびカニクイザルの両方のB細胞において認められ、それぞれ28.6および42.1個の分子であった。ヒトナイーブCD8およびCD4細胞ならびにTregはそれぞれ6,510、5,280、および6,720個の分子を有するため、ヒトPBMC中のTリンパ球サブセット内での最低数のCD2分子を表す。カニクイザルナイーブCD8およびCD4はそれぞれ4,510および5,200個の分子を発現するため、カニクイザルT細胞サブセット内で最低数を有する。
ヒトCD4メモリー細胞内で、CD2発現は、Klrg1＋細胞での17,000と比べてKlrg1-Tigit＋PD1＋細胞において11,800 gMFIであった（図25A〜25B）。Klrg1-Tigit＋PD1＋の発現は、表現型においてアネルギー性であるT細胞を同定することが示唆された。
Tヘルパー細胞サブセット内で、CD2発現は、TregおよびTh2細胞と比べて炎症性Th17/Th1およびTh22細胞において最も高かった（図26A〜26B）。
（表９）ヒトTヘルパーサブセット上でのCD2発現
Figure 2021519758
CCR7＝C-Cケモカイン受容体7型;PD1＝プログラム細胞死タンパク質1;TH＝Tヘルパー;Tfh＝T濾胞性ヘルパー;Treg＝制御性T。
ヒトおよび非ヒト霊長動物PBMCにおいて、すべてのT細胞サブセットはCD2を発現する。T細胞区画内で、非制御性メモリーT細胞は細胞あたりで最も多くのCD2分子、細胞あたりでナイーブT細胞より約1.5〜2倍多くのCD2分子を発現する。これらの結果は、重要な細胞集団（例えば、T細胞）はLFA3-Fc M1d1治療用ペプチドの標的を発現することを指し示す。これらのデータはまた、LFA3-Fcポリペプチドを用いた治療のための患者を層化するために免疫表現型解析を使用することができる可能性を指し示す。
LFA3-Fc競合結合解析
CD2へのLFA3-Fcの結合は、SPRによって測定した場合に比較的低いアフィニティーの相互作用である（1μM）。洗浄ストリンジェンシーがデータに顕著に影響しうるので、LFA3-Fcの飽和した初代T細胞結合を達成することは困難である。従って、競合結合アッセイを抗CD2抗体と共に使用して、T細胞サブセットに対するM1d1の見かけのアフィニティーを確認した（表10および図11）。LFA3-Fc WTは、CD4メモリー細胞およびCD4ナイーブ細胞に対して平均でそれぞれ0.501および0.391nMの見かけのアフィニティーを呈した（表10）。LFA3-Fc M1d1は、CD4メモリー細胞およびCD4ナイーブ細胞に対して平均でそれぞれ0.094および0.054nMの見かけのアフィニティーを呈した（表10）。これらの研究は、LFA3-Fc WTおよびLFA3-Fc M1d1はCD2＋細胞（例えば、CD4メモリー細胞およびCD4ナイーブ細胞）に結合することならびにLFA3-Fc M1d1は細胞表面CD2に対してLFA3-Fc WTよりも約5倍高いアフィニティーを呈することを実証する。そのため、これらの研究は、治療用ポリペプチドLFA3-Fc M1d1は標的表面マーカーCD2に対する増大したアフィニティーを呈することを実証する。
（表１０）抗CD2抗体との競合結合アッセイを使用した初代ヒトT細胞へのLFA3-Fc結合
Figure 2021519758
EM＝エフェクターメモリー;CM＝セントラルメモリー。
MLRアッセイ
混合リンパ球反応（MLR）応答は、同種異系刺激に対するCD4＋およびCD8＋T細胞応答（例えば、増大）を評価し、刺激時にナイーブであった細胞による応答を含む。それはより複雑な機能的応答であり、ADCC以外の機序の評価を可能とする。M1d1は、同種異系刺激に応答してCD4＋T細胞（図14A）およびCD8＋T細胞（データ示さず）の増大を完全に阻害し、WT LFA3-Fcより強力であった（図14Aおよび図14B）。
M1d1がNK媒介性細胞殺傷に加えた作用機序を有するかどうかをインビトロで評価するために、NK細胞をMLRアッセイから枯渇させた。M1d1は、IC50が増加したが、NK細胞の非存在下でさえもMLRにおいてCD4＋T細胞の増大を阻害した（図15A〜15C）。CD16結合（ADCCと関連付けられるFcR）を欠いたLFA3-Fcエフェクター機能バリアントもまた同種異系応答を阻害できたことを示す追加の裏付けデータが生成された（データ示さず）。これは、LFA3-Fcと関連付けられる非NK細胞依存性の作用機序と合致する。
これらの研究は、治療用ポリペプチドLFA3-Fc M1d1は同種異系MLRアッセイにおいてT細胞応答を阻害することおよびLFA3-Fc M1d1はLFA3-Fc WTに対して向上したインビトロ有効性を有することを実証する。
TTRアッセイ
既存のメモリー細胞応答の阻害を評価するために、エクスビボにおいて破傷風トキソイド（TT）反応性ドナーPBMCをTTで刺激した。M1d1は、エクスビボでTTトキソイドに応答した抗原特異的メモリー細胞増大およびサイトカイン分泌（IFNγ）を完全に阻害した（図16Aおよび図16B）。WT LFA3-Fcは、この応答の阻害においてM1d1より強力でなかった（図16Aおよび図16B）。これらの研究は、治療用ポリペプチドLFA3-Fc M1d1はTTRアッセイにおいてT細胞応答を阻害することおよびLFA3-Fc M1d1はLFA3-Fc WTに対して向上したインビトロ有効性を有することを実証する。
実施例3: インビボ解析
ヒトLFA3は齧歯動物CD2に結合しないが非ヒト霊長動物CD2に結合する。非ヒト霊長動物は、アレファセプト治療からの免疫調節およびメモリーT細胞枯渇を評価するために使用されてきた（Weaver,et al（2009）Nat Med.15（7）:746-749）。
カニクイザルにおいてM1d1を用いた2つの研究が実行された。1つ目は単回用量調査研究である（17-MA005）。第2の研究、17MA057は、用量応答の関係性、単回および反復用量の効果、ならびに罹患した細胞の回復の理解をサポートするために大規模な免疫表現型解析を用いて設計された、反復用量PK/PD研究である。WT LFA3-Fcを用いた並行用量応答が含まれた。雌サルを用いて目立った差異は観察されなかったので、雄および雌からのデータを解析のために組み合わせる。
8週間の観察期を伴う単回用量IV試験毒性研究（17MA005）
1日目に1回のIVボーラス注射を介して0.3mg/kgまたは100mg/kgの用量でビヒクル対照またはLFA3-Fc M1d1をカニクイザルに投与した。試験物関連死および臨床徴候は観察されなかった。0.3mg/kgのLFA3-Fc M1d1を投与された動物において評価したいかなる細胞タイプにおいても試験物に関連する変化はなかった。100mg/kgのLFA3-Fc M1d1を投与された雄サルおよび雌サルの両方においていくつかのリンパ球サブセットにおいて試験物に関連する変化が見られたが（表12）、すべての細胞サブセットは57日目またはその前までにベースライン値に戻った。全体として、100mg/kgでのCmaxおよびAUClast（1〜1368時間）値はそれぞれ3590μg/mLおよび23,800μg＊h/mLであった。抗薬物抗体誘導の発生率は、0.3mg/kgでLFA3-Fc M1d1を投与された動物について66％（2/3）、100mg/kgでLFA3-Fc M1d1を投与された動物について50％（1/2）であった。
末梢血試料を-14、1（投与前）、2、4、8、15、29、43、および57日目に収集した。各リンパ球サブセットのパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。100mg/kgのLFA3-Fc M1d1の投与は、少なくとも1匹の動物の末梢血における総T細胞、ヘルパーT細胞、および細胞傷害性T細胞の数においてベースラインからの試験物に関連する一過性の減少を結果としてもたらした。Tヘルパー細胞およびT細胞傷害性細胞のナイーブ、セントラル、およびエフェクターメモリーサブセットの数における減少もあった。減少はまた、CD25 Foxp3 Tヘルパー（制御性T）細胞の数ならびにPD-1＋T細胞傷害性細胞の数およびパーセンテージの両方において観察された。すべてのサブセットについてのこれらの減少の範囲は0.01〜0.37×であった。これらの減少のほとんどは15日目および/または29日目に観察された。すべての細胞サブセットは、57日目またはその前までにベースライン値に戻った。B細胞およびNK細胞の数、またはPD-1＋Tヘルパー細胞、もしくはPD-1＋エフェクターもしくはセントラルメモリーTヘルパーおよびT細胞傷害性細胞のパーセンテージにおいて試験物に関連する変化はなかった。0.3mg/kgのLFA3-Fc M1d1を投与された動物において評価したいかなる細胞タイプにおいても試験物に関連する変化はなかった。
カニクイザルPBMCをエクスビボでM1d1またはWT LFA3-Fcタンパク質とインキュベートし、フローサイトメトリーを使用して細胞傷害性を評価した。M1d1は、インビトロで用量依存的なCD4＋TEM細胞傷害性を誘導した。M1d1はWT LFA3-Fcと同等の最大細胞傷害性を達成し、WT LFA3-Fc分子より強力であった（図18Aおよび図18B）。全体として、カニクイザル細胞についてのEC50はヒトPBMCについてより高かった。
6週間の観察期を伴う4週間のIVボーラスPK/PD研究（17MA057）
17MA057の実験の設計を図19に示す。1、8、15、および22日目（すなわち、4週間にわたり週に1回）のIVボーラス注射を介して0.03、0.3、または3mg/kg/用量のLFA3-Fc M1d1またはLFA3-Fc WTをカニクイザルに投与し、続いて6週間の観察期とした。投与の開始前、投与日ならびに観察期の間の36、43、50、57、64、および71日目にすべての動物から血液試料を収集した。各リンパ球サブセットのパーセンテージをフローサイトメトリーによって決定した。LFA3-Fc M1d1またはLFA3-Fc WTの投与後のリンパ球サブセットにおける変化の決定は、総T細胞、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、NK細胞、B細胞、CD4＋およびCD8＋ナイーブ、セントラルおよびエフェクターメモリーT細胞ならびに制御性T細胞に限定した。変化は、絶対的な細胞数およびベースライン値に対する比を使用して決定した。
ベースラインと比較したB細胞およびNK細胞の数における変化を、LFA3-Fc M1d1を投与された動物について観察した。1つまたは複数の投与日において主に投与の6時間後に、B細胞は0.3（1.37×〜1.94×ベースライン）、0.3（1.41×ベースライン）または3（1.50×〜2.92×ベースライン）mg/kg/用量を投与された動物について増大し、NK細胞は≧0.03mg/kg/用量（0.27×〜0.44×ベースライン）で減少した。B細胞およびNK細胞における変化は、ほとんどの動物について投与後24時間までにベースライン値に戻る傾向があった。
M1d1の反復投与は末梢CD4＋TEM細胞を減少させた（図20Aおよび図34A）。TregはM1d1によって比較的温存され、Treg/TEMの比の増加を結果としてもたらした（図20Bおよび図34B）。CD8＋TEM細胞もまた減少した。Tナイーブに対して最小の効果であった。回復期を完了したところ、回復に向けた傾向または新たなベースラインの確立は57日目までに顕著であった。
総T細胞数に対するM1d1の全体的な影響力は比較的小さく（3mg/kgにおいて＜50％の減少）、免疫抑制と関連付けられる閾値を満たさない（図21）。B細胞は治療によって減少しなかった（図示せず）。M1d1は、インビボでCD2hi TEM細胞を優先的に標的とする（図21）。
上述したように、ベンチマークとして使用するためにWT LFA3-Fcを用いる並行用量応答を研究17MA057に含めた。カニクイザルにおけるWT LFA3-Fcの反復投与はCD4 EM細胞を減少させ、Treg/CD4＋TEMの比を増加させた（図22Aおよび図22Bならびに図35Aおよび図35B）。
NHP反復用量研究データ（4週間にわたる0.03、0.3、または3mg/kgの週毎の投与、続いて6週間の回復期間）（図23Aおよび図23B）を2コンパートメントPKモデルにフィッティングすることによってM1d1およびWT LFA3-FcについてのNHP PKパラメーターを決定した。アレファセプトについてのヒトPKパラメーターは、文献からの臨床的平均データ（0.04、0.15、および0.2mg/kgの単回用量（IV/IM/SC））をデジタル化し、それらを2コンパートメントPKモデルにフィッティングすることによって導出した。これらのPKパラメーターを以下の表11に示す。M1d1のクリアランスはWT LFA3-Fcより2倍遅かった。
LFA3-Fc M1d1有効用量推定値を評価した。筋肉内に投与されたアレファセプトに対して皮下経路を介したLFA3-Fc M1d1の類似した吸収、およびアレファセプトと比較してLFA3-Fc M1d1の2×低いクリアランス推定値を仮定して、7.5mgのLFA3-FC M1d1の週毎のsc用量はヒトにおいて有効であろう。
（表１１）M1d1およびWT LFA3-FcのPKパラメーター
Figure 2021519758
＊報告されたデータに基づく;＊＊予測。
M1d1関連有害事象は、サルにおける単回用量調査毒性研究において観察されなかった。Tリンパ球における減少は、100mg/kgでM1d1を投与された動物における唯一の試験物に関連する変化であり、その後57日目までに回復した。アレファセプトでの報告されたデータに基づいて、毒性の標的は、CD2陽性リンパ球の中〜顕著な枯渇、および関連する免疫抑制と関連付けられることが予測されるもののみである。M1d1毒物学研究の概要を表12に提供する。
（表１２）M1d1毒物学研究の概要
Figure 2021519758
a限度は、PK/PD研究（17MA057）から予測される有効な曝露に基づく推定値である。
M1d1についての有効用量におけるAUCssについての予測される範囲は16〜550μg＊日/mLであり、用量範囲は0.22〜7.5mgである。
bCmax＝血清中に観察される最大薬物濃度;AUC168＝投与後0〜168時間の時間-薬物濃度曲線下の面積。
実施例4: LFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの生物物理学的特徴決定および安定性研究
比較での製造可能特性を予測するためにLFA3-Fc M1d1（「LFA3-Fc M1-d1」、「M1d1」、「M1-d1」または「M1d1-Pfe」としても知られる）およびLFA3-Fc WT（「WT LFA3-Fc」としても知られる）を生物物理学的特性および安定性について特徴決定した。
熱安定性評価
Tris緩衝液（pH7.5）、ヒスチジン緩衝液（pH5.8）、およびグルタミン酸緩衝液（pH4.5）中でのDSC（示差走査熱量測定）によってLFA3-Fc M1d1の熱安定性を評価した。タンパク質は、ヒスチジンおよびTris緩衝液中で65℃より高い転移温度（TM1）を呈した（表13および図27）。
（表１３）LFA3-Fc M1d1の熱転移温度
Figure 2021519758
LFA3ドメインおよびFcドメイン（CH2およびCH3）の別々の解析のために、試料をFabRICATOR IdeS（Genovis AB、Cambridge、MA）を用いて37℃で30分間処理した。LFA3ドメイン（「LFA3断片」とも称される）は、Fc断片のCH2ドメインの熱転移温度に近い熱転移温度を呈した（図28）。
DSCを使用してLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの熱安定性を比較した。LFA3-Fc WTは、LFA3-Fc M1d1と比べてすべての条件下でより低い熱アンフォールディング安定性を有した。LFA3-Fc WTの熱アンフォールディング安定性は、抗体の標的温度より有意に低かった（例えば、TM1≧65℃）（表14）。
（表１４）LFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの熱転移温度
Figure 2021519758
上記のようにDSC、続いてFabRICATOR IdeSを使用してLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの熱安定性を比較した。消化したLFA3ドメインおよびFcドメイン（すなわち、CH2およびCH3）もまた別々に解析した。M1d1 LFA3ドメイン/CH2ドメインは、WT LFA3ドメイン/CH2ドメインより有意に高い熱アンフォールディング安定性を有した（それぞれ64.8℃対52.2℃）（表15）。
（表１５）LFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTドメインの熱転移温度
Figure 2021519758
電荷不均質性
3つの条件:20mMのTris（pH7.5）、20mMのヒスチジン（pH5.8）、および20mMのグルタミン酸（pH4.5）下で等電点キャピラリー電気泳動によってLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの電荷不均質性を評価した。両方の分子は、15〜18の異なる種を含む複雑な電荷プロファイルを呈した（図29A〜29C）。LFA3-Fc WTおよびM1d1の両方（＞20のpI種）は、6つのLFA3-Fc N結合型グリカン部位における酸性シアル酸修飾を反映する。LFA3-Fc M1d1と比較してLFA3-Fc WT化合物のより低い分解が観察された。
安定性
2、4、または6週間にわたる時間経過研究においてLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTの安定性を評価した。30Kの分子量カットオフの再生セルロースフィルタ（Amicon）を使用した遠心限外濾過/ダイアフィルトレーションに試料を供した。25μlまたは100μlの各ポリペプチド製剤（表16）を500μlのクライオバイアルに充填した。研究条件を表16に提供する。
（表１６）安定性研究条件
Figure 2021519758
キャピラリーゲル電気泳動
低分子量種（LMMS）のパーセンテージにおける増加によって示されるような断片化について、非還元条件（NR）下でのキャピラリーゲル電気泳動（CGE）によって2、4、および6週時ポリペプチドを分析した。LFA3-Fc M1d1と比較して40℃においてLFA3-Fc WTの断片化の有意な増大があった（図30A〜30C）。25℃において、LMMSのパーセンテージの増加に向かう傾向がLFA3-Fc WT試料において見られたが、LFA3-Fc M1d1試料においてLMMSのパーセンテージにおける増加はなかった（データ示さず）。LFA3-Fc WTまたはM1d1のいずれについても5℃においてLMMSのパーセンテージにおける有意な変化はなかった（データ示さず）。各緩衝液製剤におけるLFA3-Fc M1d1の安定性は類似していた。しかしながら、LFA3-Fc WTは、ヒスチジンまたはグルタミン酸と比較してTris中に製剤化された場合に有意により安定であった。
LFA3-Fc WT調製物は還元および非還元条件下で約97％純粋であった。LFA3-Fc M1d1調製物は還元および非還元条件下で約99％純粋であった。
サイズ排除クロマトグラフィー
40℃で2または4週間の貯蔵後にサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）によってポリペプチドを分析した（図31A〜31D）。0週目と比較して、およびグルタミン酸緩衝液中に製剤化されたLFA3-Fc M1d1と比較して2週目および4週目におけるLFA3-Fc WTグルタミン酸製剤において、高分子量種（HMMS）のパーセンテージにおける増加によって示されるような凝集の有意な増大があった（図31C）。グルタミン酸またはヒスチジン緩衝液中に製剤化されたLFA3-Fc WTにおいてLMMS形成の著しい増加もあった（図31D）。LMMSにおける2〜3％の増加が、LFA3-Fc M1d1ヒスチジンおよびグルタミン酸製剤において4週時観察された（図31D）。
25℃での2、4、または6週間の貯蔵後にSE-HPLCによってポリペプチドを分析した（図32A〜32D）。LFA3-Fc M1d1製剤と比較してLFA3-Fc WT製剤においてHMMSのより高い開始パーセンテージが検出された。HMMSにおける1〜2％の増加がLFA3-Fc M1d1製剤において検出された一方、HMMSはLFA3-Fc WT製剤において2〜10％増加した。HMMSのパーセンテージにおける最も顕著な増加（約10％）が、グルタミン酸/トレハロース緩衝液中に製剤化されたLFA3-Fc WTにおいて検出された（図32C）。LFA3-Fc M1d1のいずれの製剤においてもLMMSにおける有意な増加は観察されなかった一方、LMMSにおける約7％の増加がヒスチジン/スクロース緩衝液およびグルタミン酸/トレハロース緩衝液中に製剤化されたLFA3-Fc WTにおいて6週時検出された（図32D）。
5℃での2、4、または6週間の貯蔵後にSE-HPLCによってポリペプチドを分析した（図33A〜33D）。LFA3-Fc M1d1製剤と比較してLFA3-Fc WT製剤においてHMMSのより高い開始パーセンテージが検出された（図33A〜33C）。HMMSのパーセンテージにおける最も顕著な増加が、6週間の貯蔵後のグルタミン酸/トレハロース緩衝液中に製剤化されたLFA3-Fc WTにおいて検出された（約2.8％の増加）（図33C）。
全体として、LFA3-Fc M1d1は、試験したすべての条件下でLFA3-Fc WTと比較して断片化に対して優れた安定性を示した。特に、LFA3-Fc WTは、試験した製剤において低pHで有意な不安定性を呈した。LFA3-Fc WT凝集速度はTrisおよびヒスチジン緩衝液中で40℃と比較して25℃においてより高く、これは濃度依存性または賦形剤不適合性を指し示す可能性がある。
溶解性
pH4.5のグルタミン酸、トレハロースおよびEDTAを含む緩衝液中で165mg/mLまでのLFA3-Fc WTの溶解性を試験した。pH4.5のグルタミン酸、トレハロースおよびEDTAを含む緩衝液中で148mg/mLまでのLFA3-Fc M1d1の溶解性を試験した。
グリカン分析
LFA3-Fc WTおよびLFA3-Fc M1d1ポリペプチドの両方は、抗体Fcドメインに特徴的なN-グリカンを含んでいた。WTポリペプチドのLFA3ドメインは、高分岐グリカンおよびLFA3-Fc WTポリペプチド1nmolあたり約22nmolのシアル酸を含んでいた。M1d1ポリペプチドのLFA3ドメインもまた、高分岐グリカンおよびLFA3-Fc M1d1ポリペプチド1nmolあたり約14nmolのシアル酸を含んでいた。
実施例5: LFA3-Fc M1d1の抗体依存性細胞傷害性（ADCC）
ヒトT細胞に対するLFA3-Fc M1d1およびLFA3-Fc WTのインビトロADCCをこの研究において特徴決定した。CD2はすべてのT細胞上に発現され、ナイーブまたは制御性T細胞と比較してメモリーT細胞上で最大の発現を有する。LFA3-FcはCD2に結合し、主要な作用機序はADCCである。
この研究は、LFA3-Fc M1d1はメモリーCD4細胞のADCCの誘導においてLFA3-Fc WTよりも3〜4倍強力であることを実証した。また、LFA3-Fc M1d1は、ナイーブT細胞と比較してメモリーCD4＋T細胞を優先的に標的とした。
方法
PBMCのADCCアッセイおよびフローサイトメトリー
製造者の説明書（STEMCELL Technologies、Tukwila、WA）に従ってSepMate（商標）チューブおよびLymphoprep（商標）を使用して密度勾配遠心分離によって健常ヒトドナーからPBMCを単離した。単離後、PBMCを丸底の96ウェルプレート中に細胞2.0×105個/ウェルの密度で完全RPMI培地中にプレーティングした。このアッセイにおいて、PMBCはナチュラルキラー（NK）エフェクター細胞ならびに標的T細胞（CD4メモリーおよび非メモリー、CD8メモリーおよび非メモリー）の供給源である。メモリーおよび非メモリー細胞はCD45RO発現に基づいて区別した（メモリー細胞はCD45RO＋であり;非メモリー細胞はCD45RO-である）。LFA3-Fc融合タンパク質の段階希釈液をウェルに加え、細胞を37℃、5％のCO2で約20時間インキュベートした。
プレートを室温（RT）で5分間300×g（重力）で遠心分離した。PBMCを氷冷した蛍光活性化細胞選別（FACS）緩衝液で洗浄し、リンパ球サブセットの染色用の蛍光コンジュゲート抗体を含有する50μLの氷冷したFACS緩衝液に再懸濁した。染色パネルは、CD3（BUV496）、CD4（BUV395）、CD8（PerCP-e710）、CD45RO（PeCy7）、CD45RA（FITC）、CD25（PE-CF594）、CD56（BV421）、CD2（PE）、および近赤外（IR）バイアビリティーを含んだ。
4℃で15〜30分間のインキュベーション後、氷冷したFACS緩衝液でPBMCを2回洗浄し、100μLのPBS中の0.5％のパラホルムアルデヒド（PFA）に再懸濁した。CountBright（商標）Absolute Counting Beads（Thermo Fisher Scientific）を各ウェルに加えた（10μL）。フローサイトメトリー（BD LSRFortessas（商標）Cell Analyzer）によってプレートを分析した。
NKタイトレーション細胞傷害性アッセイ
新たに単離したPBMCを完全RPMI＋10％のFBS中細胞5×106個/mlで終夜静置した。翌日、STEMCELL Technologiesの単離キットを使用して標的細胞（CD4メモリー、CD4ナイーブ、またはB細胞）を単離した。同じドナー由来の対応するナチュラルキラー（NK）細胞も単離した。50μLの体積の標的細胞を96ウェルV底プレート中に細胞30,000個/ウェルでプレーティングした。NK細胞を2倍段階希釈液中に調製し、50μLを標的細胞に加えた。LFA3-Fcポリペプチドを100nMの最終作用濃度のために10×で調製した。11μLの体積のポリペプチドを適切なウェルに加え、プレートを37℃で4時間インキュベートした。プレートを洗浄し、Annexin V Alexa Fluor 488、7-AAD、CD56 BV421、およびCD4 APH-H7を含有する染色緩衝液を用いて30分間染色した。細胞をAnnexin V結合緩衝液で洗浄し、PBS中の2％のPFAを用いて10分間固定し、洗浄し、次にフローサイトメトリーによって分析した。絶対数を決定するためにCountBrightビーズを各ウェルに含めた。
データ解析
LFA3-Fcポリペプチド濃度のlogに対して抗原結合集団の細胞傷害性のパーセンテージをプロットすることによって細胞傷害性タイトレーション曲線を生成した。細胞傷害性のパーセンテージは、非処理対象と実験試料との生細胞の絶対数の差異を非処理対照で割り、100を掛けることで算出した。特異的細胞傷害性のパーセントは、非処理対象と実験試料との生細胞の絶対数の差異を、非処理対照とアイソタイプ対照との差異で割り、100を掛けることで算出した。最大応答の50％における有効濃度（EC50）値は、GraphPad Prism（登録商標）（version 6.0、GraphPad Software,Inc、San Diego、CA）の非線形回帰曲線フィットおよびアゴニスト用量応答モデルのシグモイドlogを使用して決定した。
結果
LFA3-Fc WTおよびLFA3-Fc M1d1は、試験したすべての細胞タイプにおいてADCCを誘導した。LFA3-Fc M1d1は、LFA3-Fc WTと比較してメモリーおよび非メモリー細胞においてADCC力価の増大を実証した（表17、図12A〜12E）。
（表１７）LFA3-FcポリペプチドによるADCCの誘導
Figure 2021519758
各細胞タイプについてn＝5。
LFA3-Fc WTおよびLFA3-Fc M1d1は、ナイーブ細胞またはB細胞と比較して、高いレベルのCD2を発現する単離されたメモリー細胞の優先的な殺傷を誘導した。
（表１８）NK細胞傷害性
Figure 2021519758
ND＝未決定。
NK媒介性細胞傷害性を評価する代替的なアッセイでは、増加する比で標的細胞とともに培養された精製NK細胞を使用する。複数のドナーにわたってより濃縮されたポリペプチドを使用するNKタイトレーション細胞傷害性アッセイは、単離されたメモリー細胞の優先的な殺傷を実証した。精製された標的細胞集団（CD4メモリー、CD4ナイーブおよびB細胞）を、さまざまなエフェクター対標的比のNK細胞および100nMのLFA3-Fc WTまたはLFA3-Fc M1d1と培養した（図13B〜13C）。10:1のエフェクター対標的比（E:T）、および100nMのタンパク質濃度において、LFA3-Fc WTおよびLFA3-Fc M1d1はCD4メモリー細胞およびナイーブ細胞において細胞傷害性を誘導した（表19）。
（表１９）NK細胞傷害性
Figure 2021519758
各細胞タイプについてn＝3。
この研究は、ヒトPBMCを使用したインビトロアッセイにおいてCD2＋T細胞のADCCのLFA3-Fcタンパク質による誘導を例示した。LFA3-Fc M1d1は、メモリーCD4細胞のADCCの誘導においてLFA3-Fc WTよりも3〜4倍強力であった。LFA3-Fc M1d1は、ナイーブCD4 T細胞と比較してより高レベルのCD2タンパク質を発現することが公知であるメモリーCD4＋T細胞を優先的に標的とする。そのため、これらの研究は、治療用ポリペプチドLFA3-Fc M1d1は標的CD2＋T細胞のADCCを誘導することを実証する。
（表２０）LFA3-Fcバリアントの新規かつ有用な特徴
Figure 2021519758
Figure 2021519758
Figure 2021519758
＊本明細書に開示するLFA3-Fcバリアントのすべてを包含する例示的な態様。
開示する教示をさまざまな適用、方法、キット、および組成物に関して記載したが、本明細書の教示および添付の請求項に係る発明から離れることなくさまざまな変更および改変を行うことができることが理解されるであろう。以上の実施例は、開示する教示をよりよく説明するために提供され、本明細書に提供する教示の範囲を限定することは意図されない。本教示をこれらの例示的な態様に関して記載したが、これらの例示的な態様の多数のバリエーションおよび改変が過度の実験なしに可能であることを当業者は容易に理解するであろう。すべてのそのようなバリエーションおよび改変は本教示の範囲内である。
特許、特許出願、文書、および教本を含む、本明細書において言及されるすべての参照文献、ならびにまだ言及されていない程度に本明細書において言及される参照文献は、参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み入れられる。組み入れられる文献および類似の材料の1つまたは複数が、用語の定義、用語の用法、または記載する技術が挙げられるが、それらに限定されない本出願と異なるまたは矛盾する場合、本出願が優先される。
本発明の範囲または精神から離れることなくさまざまな改変およびバリエーションが本発明においてなされうることが当業者に明らかである。本発明の他の態様は、本明細書の考慮および本明細書に開示される発明の実施から当業者に明らかとなる。本明細書および実施例は、例示としてのみ考慮され、本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって指し示されることが意図される。

Claims (36)

  1. CD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチド分子またはその機能的バリアントであって、
    該ポリペプチド分子が、SEQ ID NO:69のアミノ酸配列に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または少なくとも約99％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
    該ポリペプチド分子がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含まない、
    該単離されたポリペプチド分子またはその機能的バリアント。
  2. 前記ポリペプチド分子が、SEQ ID NO:69のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
    該ポリペプチド分子がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含まない、
    請求項1に記載の単離されたポリペプチド分子またはその機能的バリアント。
  3. SEQ ID NO:69のアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の単離されたポリペプチド分子。
  4. CD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントであって、
    SEQ ID NO:17〜41からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むLFA3ドメインを含み、かつ該LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、該単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  5. 前記アミノ酸配列がSEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、または23であり、かつ前記LFA3ドメインが、Leuであるアミノ酸残基、またはLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）をさらに含む、請求項4に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  6. 前記LFA3ドメインが、SEQ ID NO:26に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ該LFA3ドメインがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まない、請求項4に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  7. 前記LFA3ドメインがSEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む、請求項4または請求項6に記載の単離されたポリペプチド。
  8. LFA3ドメインを含む、単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントであって、
    該LFA3ドメインが、SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基36、38、43、および86に1つまたは複数の変異を有するSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、該単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  9. 前記LFA3ドメインが、Leuであるアミノ酸残基、またはLESLPSであるアミノ酸配列（SEQ ID NO:118）をさらに含む、請求項8に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  10. SEQ ID NO:3に準じてナンバリングされた残基36、38、43、および86における前記1つまたは複数の変異がA36V、L38F、F43V、およびM86Fである、請求項8または請求項9に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  11. 第2のドメインをさらに含み、
    第2のドメインが、免疫グロブリンタンパク質、例えば重鎖定常領域、例えばヒト重鎖定常領域、もしくはその機能的バリアントを含むか、
    第2のドメインが、重鎖（例えばヒトIgG1重鎖）のFc領域、もしくはその機能的バリアントを含むか、または
    第2のドメインが、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域、もしくはそれらの機能的バリアントを含む、
    請求項4〜10のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  12. 第2のドメインをさらに含み、該第2のドメインが、SEQ ID NO:16に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％の同一性を有するアミノ酸配列を含むFcドメインを含む、請求項4〜11のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  13. 前記第2のドメインが、SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含むFcドメインを含む、請求項12に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  14. 前記第2のドメインのN末端を前記LFA3ドメインのC末端に連結するリンカーをさらに含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  15. iii.第2のドメインが、分子間ジスルフィド結合などによって別の第2のドメインとの二量体を形成する能力を有し、かつ/または
    iv.第2のドメインが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を媒介する能力を有する、
    請求項11〜14のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  16. 前記LFA3ドメインが、SEQ ID NO:26に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、かつ該ポリペプチドがSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含まず、かつ
    前記Fcドメインが、SEQ ID NO:16に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、
    請求項11〜15のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  17. 前記ポリペプチドまたはその機能的バリアントがSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含み、かつ
    該アミノ酸配列が、SEQ ID NO:4に準じてナンバリングされた残基36、38、43、86、92、228、および230に1つまたは複数の変異を含む、
    請求項11〜15のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアント。
  18. SEQ ID NO:4に準じてナンバリングされた残基36、38、43、86、92、228、および230における前記1つまたは複数の変異が、A36V、L38F、F43V、M86F、V92_D93insL、D228E、およびL230Mである、請求項17に記載の単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
  19. CD2に結合する、例えばCD2に特異的に結合する、単離されたポリペプチド分子であって、LFA3ドメインを含み、かつ以下の特性のうちの1つまたは複数を有する、該単離されたポリペプチド分子:
    i.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて約70、約75、約80、約85、約90、または約95％高い単量体のパーセンテージによって示される、増強された単量体発現、
    ii.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、約75、約80、約85、約90、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージ、約10、約8、約6、約4、もしくは約2％未満である低分子量種（LMWS）のパーセンテージ、および/または5、2、もしくは1％未満である高分子量種（HMWS）のパーセンテージによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された単量体発現および低減した多量体発現、
    iii.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、37.4℃で24時間インキュベートした後に約90、約92、もしくは約95％を上回る単量体のパーセンテージによって示されかつ/または40℃で24時間インキュベートした後に約75、約80、もしくは約85％を上回る単量体のパーセンテージを示す、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向、
    iv.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、40℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、もしくは約20％以下の増加、および/または50℃でのHMWSにおける約5、約10、約15、約20、もしくは約25％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、熱ストレス下での凝集傾向、
    v.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、低pH、5時間でのHMWSにおける約6、7、約8、または約9％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて低減した、低pH下での凝集傾向、
    vi.キャピラリーゲル電気泳動（CGE）またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SE-HPLC）を使用して測定した場合に、40℃で2週間または4週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、約2、約3、約4、もしくは約5％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
    vii.SE-HPLCを使用して測定した場合に、例えば、25℃で2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、約1.5、もしくは約2％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
    viii.SE-HPLCを使用して測定した場合に、例えば、5℃における2週間、4週間、または6週間の貯蔵後にHMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加および/またはLMMSにおける約0.5、約1、もしくは約1.5％以下の増加を示す、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された安定性、
    ix.サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した場合に、5サイクルの凍結融解後にHMWSにおける約0.5、約1、または約1.5％以下の増加によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された凍結融解安定性、
    x.Expi293培養物20mLあたり約5.5、約6、約6.5、または約7mgを上回る収量によって示される、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加した収量、
    xi.示差走査蛍光光度法（DSF）によって測定した場合に、約38、約40、約42、約45、または約50℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:120のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
    xii.DSFによって測定した場合に、約40、約45、約50、約55、または約60℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
    xiii.示差走査熱量測定法（DSC）によって測定した場合に、約50または約60℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
    xiv.DSCによって測定した場合に、pH7.5において約55、約58、約60、約62、約64、もしくは約66℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;pH5.8において約55、約58、約60、約62、もしくは約64℃を上回るTm1および約75、約78、約80、もしくは約82℃を上回るTm2;またはpH4.5において約55、約58、もしくは約60℃を上回るTm1および約75、約78、もしくは約80℃を上回るTm2、
    xv.DSCによって測定した場合に、pH7.5もしくはpH4.5において約50もしくは約60℃を上回るTmまたはpH5.8において約50もしくは約62℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
    xvi.DSCおよびFabRICATOR IdeSによって測定した場合に、約50または約60℃を上回るTmによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増加したTm、
    xvii.SPRによって測定した場合に、ヒトCD2に対する約1.2、約1、約0.8、約0.6、約0.4、約0.2、約0.1、または約0.08μM未満のKDによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、
    xviii.SPRによって測定した場合に、ヒトCD2に対する約1.3、約1.2、約1.1、もしくは約1μM未満のKDおよび/またはカニクイザルCD2に対する1.4、1.3、1.2、1.1、もしくは1μM未満のKDによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2に対する結合アフィニティー、
    xix.SPRを使用して測定した場合に、CD4 Tmem細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKdによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
    xx.例えばSPRならびに/または表10および図11に関して実施例2に記載する方法を使用して測定した場合に、CD4メモリーT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、もしくは約1500pM以下であるIC50計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約150、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、もしくは約800pM以下であるIC50計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約200、300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、もしくは約1200pM以下であるIC50計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、もしくは約500pM以下であるIC50計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、もしくは約600pM以下であるIC50計算値;ならびに/またはCD8ネイティブT細胞への結合に関して約300、約400、約500、約600、約700、約800、約1000、約1200、約1500、約1600、もしくは約1700pM以下であるIC50計算値によって示される、SPRによって測定した場合にSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
    xxi.SPRによって測定した場合に、CD4メモリーT細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4＋TEM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、約500、または約600pM以下であるKd計算値;CD4＋TCM細胞への結合に関して約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値;CD4ナイーブT細胞への結合に関して約100、約200、約300、または約400pM以下であるKd計算値;増大したCD4 Treg細胞への結合に関して約100、約200、または約300pM以下であるKd計算値;CD8メモリーT細胞への結合に関して約50、約100、または約150pM以下であるKd計算値;CD8ナイーブT細胞への結合に関して約50、約100、約200、約300、約400、または約500pM以下であるKd計算値によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
    xxii.SPRによって測定した場合に、カニクイザルCD4＋TEM細胞への結合に関する低減したEC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する結合アフィニティー、
    xxiii.抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイを使用して測定した場合に、CD4 Tmem細胞の死滅に関して約400、約600、約800、約1000、約1200、または約1400pM以下であるEC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、
    xxiv.抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）アッセイを使用して測定した場合に、CD8 Tmem細胞の死滅に関して約1、約5、約10、約20、約30、約40、または約50nM以下であるEC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、CD2発現細胞に対する細胞毒性、
    xxv.混合リンパ球反応（MLR）アッセイに関して約400、約800、約1200、約1600、約2000、または約2400pM以下であるIC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖および/またはサイトカイン産生である同種異系T細胞応答の阻害、
    xxvi.NK細胞非存在下での混合リンパ球反応（MLR）アッセイに関して約330、約400、約500、約600、約800、約1000、約1500、または約2000pM以下であるIC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、T細胞増殖および/またはサイトカイン産生である同種異系T細胞応答の阻害、
    xxvii.破傷風トキソイドリコール（TTR）アッセイにおいて測定した場合に、CD4 Tmem IFNγ産生に関して約1、約2、約5、約10、約15、約20、または約25nM以下であるIC50によって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、破傷風トキソイドリコール応答の阻害、
    xxviii.PK/PD研究によって測定した場合に、約0.14、約0.16、約0.18、約0.2、または約0.22mL/hr/kgを超えない中枢からのクリアランスによって示される、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて遅いインビボでのクリアランス、ならびに/あるいは
    xxix.キャピラリーゲル電気泳動を使用して測定した場合に、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子と比べて増強された、少なくとも約98％または少なくとも約99％の純度。
  20. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントをコードする、単離された核酸。
  21. SEQ ID NO:43、53、および/または123に対して少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項20に記載の単離された核酸。
  22. SEQ ID NO:43、53、および/または123の核酸配列を含む、請求項20または請求項21に記載の単離された核酸。
  23. 請求項20〜22のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
  24. 請求項20〜22のいずれか一項に記載の核酸または請求項23に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  25. Expi293細胞、ExpiCHO細胞、CHO細胞、COS細胞、HEL-293細胞、NSO細胞、PER.C6細胞、またはSP2.0細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、請求項24に記載の宿主細胞。
  26. Expi293細胞またはExpiCHO細胞である、請求項24または請求項25に記載の宿主細胞。
  27. 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド分子と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
  28. 請求項1〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド分子7.5mgとHEPES緩衝食塩水とを含む、請求項27に記載の薬学的組成物。
  29. CD2に特異的に結合する単離されたポリペプチド分子を作製する方法であって、請求項24〜26のいずれか一項に記載の宿主細胞を、該ポリペプチド分子が該宿主細胞によって発現される条件下で培養する工程を含む、該方法。
  30. 前記ポリペプチド分子を単離する工程をさらに含む、請求項29に記載の方法。
  31. 免疫抑制を必要とする対象の処置に使用するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたは請求項27もしくは請求項28に記載の薬学的組成物。
  32. 免疫疾患、免疫障害、または免疫状態を処置するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたは請求項27もしくは請求項28に記載の薬学的組成物の使用。
  33. それを必要とするヒト対象において、CD2によって媒介される免疫疾患、免疫障害、または免疫状態を処置または防止するための方法であって、
    該対象に請求項27または請求項28に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を含み、該疾患、障害、または状態が、1型糖尿病、乾癬、尋常性乾癬、手掌足底膿疱症（palmoplantaris pustulosis）、手掌足底膿疱性乾癬、掌蹠膿疱症（pustulosis palmaris et plantaris）、手掌足底の膿疱症（pustulosis of palm and sole）、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、移植片対宿主病（GVHD）、白斑、毛孔性紅色粃糠疹、移植（例えば臓器移植、例えば腎臓移植）、乾癬性関節炎、同種異系造血幹細胞移植を必要とする疾患、障害、または状態、サラセミア、鎌形血球症、グランツマン血小板無力症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、慢性肉芽腫性疾患、重症先天性好中球減少症、白血球接着不全症、シュワッハマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、ファンコーニ貧血、先天性角化異常症、チェディアック・東症候群、再生不良性貧血、円形脱毛症、およびT細胞リンパ腫（例えば皮膚T細胞リンパ腫または末梢T細胞非ホジキンリンパ腫）からなる群より選択される、該方法。
  34. 前記疾患が、糖尿病、例えば1型糖尿病（T1D）、例えば新規発症T1D、例えば、β細胞機能が残存している（例えば、前記対象が診断後100日未満である）新規発症T1D、例えばステージ2またはステージ3のT1Dである、請求項33に記載の方法。
  35. 免疫疾患、免疫障害、または免疫状態を処置するための医薬の製造における、請求項1〜19のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドの使用。
  36. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドまたはその機能的バリアントを使用して試料中、組織中、または細胞中のCD2を検出する方法であって、該試料、組織、または細胞を該ポリペプチドまたはその機能的バリアントと接触させる工程、および該ポリペプチドまたはその機能的バリアントを検出する工程を含む、該方法。
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