BR112020019368A2 - variantes de lfa3 e composições e usos das mesmas - Google Patents

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BR112020019368A2
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Natasha Kay CRELLIN
Lauren Kate ELY
Jason Robles REYES
Chia Chi Ho
Jeffrey A. Bluestone
Eleonora Trotta
Qizhi Tang
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Pfizer Inc.
The Regents Of The University Of California
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Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas de polipeptídeo LFA3, por exemplo, moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3 variante. A invenção inclui usos, e métodos associados de usar as moléculas de polipeptídeo LFA3.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARI- ANTES DE LFA3 E COMPOSIÇÕES E USOS DAS MESMAS".
APLICAÇÕES RELACIONADAS
[001] Este pedido reivindica prioridade para Pedido dos EUA Nº. de Série 62/650.022, depositado em 29 de março de 2018, e Pedido dos EUA Nº. de Série 62/783.986, depositado em 21 de dezembro de 2018, o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Este pedido está sendo depositado eletronicamente e inclui uma listagem de sequência submetida eletronicamente em formato .txt. O arquivo .txt contém uma listagem de sequência intitulado "PC72432A_Seq_Listing_ST25.txt" criado em 21 de março de 2019 e tendo um tamanho de 127,715 bytes. A listagem de sequência contida nesse arquivo .txt é parte da especificação e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
PARTES DE DECLARAÇÃO DE PESQUISA CONJUNTA
[003] A invenção aqui reivindicada foi feita por ou em nome das partes listadas abaixo em um acordo de pesquisa conjunta. O acordo de pesquisa conjunta estava em vigor em ou antes da data em que a invenção reivindicada foi feita e a invenção reivindicada foi feita como resultado de atividades realizadas no escopo do acordo de pesquisa conjunta. As partes do acordo de pesquisa conjunta são OS REGEN- TES DA UNIVERSIDADE DA CALIFÓRNIA em nome de seu CAM- PUS DE SÃO FRANCISCO e PFIZER INC.
CAMPO
[004] A presente invenção refere-se a moléculas de polipeptídeo que compreendem um domínio de antígeno associado a função linfoci- tária 3 (LFA3), e composições, métodos e usos dos mesmos.
ANTECEDENTES
[005] Antígeno associado a função linfocitária3 (LFA3), também conhecido como CD58, é um ligando de CD2 e é expresso em muitos tipos de célula, incluindo células de apresentação de antígeno (APCs) (Miller et al., J. Exp. Med. 1993 178(1):211-22; Krueger et al., Expert Opin. Biol. Ther. 2002 2(4):431-41; Haider et al., J. Immunol. 2007 393:411-20; Punch et al., Transplante 1999 67(5):741-8; Leitner et al., J. Immunol. 2015 195(2):477-87). CD2 é expresso em todas células T, mas a expressão é maior em células T de memória em comparação com células T virgens ou reguladoras (Chamian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2005 102(6):2075-80; Rigby et al., J. Clin. Invest. 2015 125(8):3285-96). Em seres humanos, CD2 é também expresso em cé- lulas NK e algumas populações de células dendríticas. A interação de CD2 em células T ou células NK e LFA3 em células acessórias pode entregar um sinal coestimulador tanto para linfócitos virgens e linfóci- tos de memória ou previamente ativados. Esse sinal coestimulador po- tencialmente envolve aumentar a avidez de interação célula-célula e/ou entregar um sinal coestimulador direto através de CD2 (Kaizuka et al. J. Cell Biol. 2009 185(3):521-34; Skanland et al., Biochem. J. 2014 460(3):399-410). Dessa forma, direcionamento de CD2, por exemplo, usando moléculas de LFA3 solúveis, pode ter benefício tera- pêutico para tratar doenças autoimunes, tais como Diabetes tipo 1 (T1D) e/ou artrite psoriática. Por conseguinte, em vista do papel notá- vel de CD2 e LFA3 na mediação de respostas imunes, existe a neces- sidade de desenvolver estratégias para modular a atividade de CD2, bem como depletar células efetoras imunes que expressam CD2.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente divulgação fornece, em parte, a descoberta de que determinados polipeptídeos de fusão LFA3-Fc modulam a ativida- de de CD2, bem como depletam células que expressam CD2. A modu- lação de células que expressam CD2 pode ter efeitos benéficos no tra-
tamento de doença autoimune, tal como diabetes e ou artrite psoriáti- ca. Este pedido divulga moléculas de polipeptídeo LFA3, por exemplo, moléculas de polipeptídeo LFA3 variante, por exemplo, moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3 variante, por exemplo, moléculas de poli- peptídeo de fusão LFA3-Fc variante. Em determinados aspectos, as moléculas de polipeptídeo LFA3 se ligam a CD2, modulam a interação de CD2-LFA3, e seletivamente depleta células T de memória que ex- pressam CD2.
[007] Sem desejar estar vinculado à teoria, as moléculas de poli- peptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as molécu- las de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1 (também referidas aqui como M1-d1, LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc M1- d1), modulam a função de e depleção seletiva de células TEM CD2+ para reequilibrar o número de células reguladoras/TEM. Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste do- cumento, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3- Fc variante, por exemplo, M1d1, promovem a eliminação e/ou supres- são de células efetoras T patogênicas. Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, modulam a interação entre CD2 e LFA3, interrompen- do assim coestimulação de célula T mediada por CD2. Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste do- cumento, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3- Fc variante, por exemplo, M1d1, depletam células T CD2+ através de citotoxicidade celular dependente de anticorpo mediada por FcR (ADCC). Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as moléculas de po- lipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, depletam células T CD2+ através de apoptose. Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, reduzem o número de células de memória T CD2high (Tmem), por exemplo, células T de memória centrais (TCM) e de memó- ria efetoras (TEM), enquanto preservam células T reguladoras (Tregs). Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 divul- gadas neste documento, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, reduzem o número de células Tmem CD2high, por exemplo, células T de memória central (TCM) e de memória efetora (TEM) células T, enquanto preservam células vir- gens T reguladoras. Em algumas modalidades, as moléculas de poli- peptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as molécu- las de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, aumentam a razão de Treg/TEM ou a razão de Treg/TCM, por exemplo, em células T CD4+ e/ou CD8+. Em algumas modalidades, as molécu- las de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, aumentam a proporção de células TEM CD4+ expressando PD-1 e/ou TIGIT.
[008] Sem desejar estar vinculado à teoria, as moléculas de poli- peptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as molécu- las de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, se ligam a CD2, uma proteína de superfície celular expressa mais predo- minantemente em células TEM (T memória efetora) CD4+ e CD8+, as células principalmente responsáveis por destruição de células beta em diabetes tipo 1 (T1D). A administração das moléculas de polipeptídeo LFA3 divulgadas neste documento, por exemplo, as moléculas de po- lipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, por exemplo, M1d1, podem levar a extensa conservação de produção de insulina endógena, redução de requisitos de insulina, redução na taxa de hipoglicemia major, e restau-
ração de células β em pacientes com T1D.
[009] Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo LFA3 variante, desta invenção foram projetadas para melhorar sua estabilidade e capacida- de de fabricação em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3, por exemplo, as moléculas de polipeptídeo LFA3 variante, desta invenção foram projetadas para aumentar sua afinidade de ligação a CD2 em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem.
[0010] Em um aspecto, a divulgação fornece uma molécula de po- lipeptídeo de fusão de LFA3 compreendendo um domínio de LFA3 fundido a um segundo domínio. Sem desejar estar vinculado à teoria, estender o limite de C-terminal do domínio de LFA3 na molécula de polipeptídeo de fusão de LFA3 melhora uma ou mais atividades da molécula de polipeptídeo de fusão de LFA3. Por exemplo, estender o limite de C-terminal do domínio de LFA3 para incluir o resíduo de ami- noácido de Leu, que corresponde a posição 93 de LFA3 de tipo selva- gem (por exemplo, posição 93 de SEQ ID NO: 2) ou a sequência de aminoácido de LESLPS (SEQ ID NO: 118), que corresponde a posi- ções 93-98 de LFA3 de tipo selvagem (por exemplo, posições 93-98 de SEQ ID NO: 2) melhora uma ou mais atividades da molécula de polipeptídeo de fusão de LFA3, por exemplo, maior estabilidade térmi- ca e/ou agregação reduzida, por exemplo, conforme mostrado nas Fi- guras 6B-6D.
[0011] Os versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita neste documento. Tais equivalentes devem ser englobados pelas seguintes modalidades (E).
[0012] E1. Uma molécula de polipeptídeo isolado (por exemplo,
uma molécula de polipeptídeo de fusão) que especificamente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3 (por exemplo, uma fusão de variante LFA3-Fc conforme descrito neste documento) e tem uma ou mais das seguintes propriedades: i.
Expressão monomérica aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99%, por exemplo, conforme medido usando cromatografia por exclu- são de tamanho (SEC) e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com re- lação à Figura 3A, ii.
Expressão monomérica aprimorada e expressão multi- mérica reduzida em relação a uma molécula de polipeptídeo compre- endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cer- ca de 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99%, uma porcentagem de espécies de baixo peso molecular (LMWS) que é inferior a cerca de 10, 8, 6, 4 ou 2%, e/ou uma porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) que é inferior a cerca de 5, 2 ou 1%, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com rela- ção à Figura 6C, iii.
Propensão à agregação reduzida sob estresse térmico em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, apresentan- do uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 90, 92 ou 95% após incubação a 37,4ºC por 24 horas, e/ou apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 75, 80 ou 85% após incubação a 40ºC por 24 horas, por exemplo, conforme me- dido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3D,
iv.
Propensão à agregação reduzida sob estresse térmico em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 5, 10, 15 ou 20% de aumento em HMWS a 40ºC, e/ou não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% de aumento em HMWS a 50ºC, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4, v.
Propensão à agregação reduzida sob baixo pH em rela- ção a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 6, 7, 8 ou 9% de aumento em HMWS a baixo pH por 5 horas, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos des- critos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4, vi.
Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5% de aumento em LMMS após 2 ou 4 semanas de armazenamento a 40°C conforme medido usando eletroforese em gel capilar (CGE), cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC), e/ou métodos descritos no Exemplo 4 com relação às Fi- guras 30A-30C ou Figuras 31A-31D, vii.
Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 25°C conforme medido usando SE-HPLC, e/ou métodos descritos no Exemplo 4 com relação às Figuras 32A-32D, viii.
Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 5°C confor- me medido usando SE-HPLC, e/ou métodos descritos no Exemplo 4 com relação às Figuras 33A-33D, ix.
Estabilidade a congelamento-descongelamento aprimo- rada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentan- do não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMWS após 5 ciclos de congelamento-descongelamento, por exemplo, con- forme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4, x.
Rendimento elevado em relação a uma molécula de po- lipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, tendo um rendimento que é superior a cerca de 5,5, 6, 6,5 ou 7 mg por 20ml de cultura Expi293, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3B, xi.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 38, 40, 42 ou 45ºC, por exemplo, conforme medido por fluorometria de varredura diferen- cial (DSF) e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3C, xii.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 40, 45, 50, 55 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 5B,
xiii.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 40, 45 ou 50ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 6D, xiv.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 45, 50 ou 55ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 7D, xv.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por calorimetria de varredura diferencial (DSC) e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4, xvi.
A Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62, 64 ou 66ºC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 7,5; uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62 ou 64oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 5,8; ou uma Tm1 que é superior a 55, 58 ou 60ºC e uma Tm2 que é superior a cer- ca de 75, 78 ou 80ºC a pH 4,5, por exemplo, conforme medido por DSC e/ou usando métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Ta- bela 13, xvii.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC a pH 7,5 ou pH 4,5; tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 62ºC a pH 5,8, por exemplo, conforme medido por DSC e/ou usando méto- dos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 14,
xviii.
Tm elevada em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por DSC e FabRICATOR IdeS e/ou usan- do métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 15, xix.
Afinidade de ligação aprimorada a CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1 ou 0,08 µM, por exem- plo, conforme medido por SPR e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 5A, xx.
Afinidade de ligação aprimorada a CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, e/ou uma kD para CD2 de ci- nomolgo que é inferior a cerca de 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, por exem- plo, conforme medido por SPR e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 7C, xxi.
Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kD para ligação a Células de memória T (Tmem) CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400pM, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 6, xxii.
Afinidade de ligação aprimorada a células que ex- pressam CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200 ou 1500 pM; um IC50 calculado para ligação a células TEM CD4+ que não é su-
perior a cerca de 150, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 pM; um IC50 cal- culado para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cer- ca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células Treg CD4 expandidas que não é su- perior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; e/ou um IC50 calculado para ligação a células T nativas CD8 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, 1500, 1600 ou 1700 pM, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 10 e Figura 11, xxiii.
Afinidade de ligação aprimorada a células que ex- pressam CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kd calculada para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; uma kd calculada para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; uma kd calculada para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400 pM; uma kd calculada para ligação a células Treg CD4 expandidas que não é superior a cerca de 100, 200 ou 300 pM; uma kd calculada para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 50, 100 ou 150 pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD8 que não é superior a cerca de 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 pM, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com rela- ção à Tabela 10 e Figura 11,
xxiv.
Afinidade de ligação aprimorada a células que ex- pressam CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um EC50 reduzido para ligação a células TEM CD4+ de cinomolgo em rela- ção a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 3 com relação às Figuras 18A e 18B, xxv.
Citotoxicidade aprimorada contra células que ex- pressam CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um EC50 para exterminar células Tmem CD4 que não é superior a cerca de 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400pM ou 1500pM por exemplo, confor- me medido usando um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou métodos descritos no Exemplo 5 com relação à Tabela 17 e Figuras 12A e 12B, xxvi.
Citotoxicidade aprimorada contra células que ex- pressam CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um EC50 para exterminar células Tmem CD8 que não é superior a cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 nM por exemplo, conforme medido usando um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou métodos descritos no Exemplo 5 com relação à Tabela 17 e Figuras 12D, xxvii.
Inibição aprimorada de resposta alogênica de célu- las T, por exemplo, proliferação de células T e produção de citocina, em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 que não é superior a cerca de 400, 800, 1200, 1600, 2000 ou 2400 pM, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de reação mista linfoci-
tária (MLR) e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabe- la 6 e Figuras 14A e 14B, xxviii.
Inibição aprimorada de resposta alogênica de célu- las T, por exemplo, proliferação de células T e produção de citocina, em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 para um ensaio de reação mista linfocitária (MLR) na ausência de células NK que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500 ou 2000 pM, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de re- ação mista linfocitária (MLR) e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação às Figuras 15B e 15C, xxix.
Inibição aprimorada de resposta de recuperação (recall response) de toxoide tetânico em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 para produção de IFNγ Tmem CD4 que não é superior a cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25 nM, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de memória de toxoide tetânico (TTR) e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 6 e Figuras 16A e 16B, xxx.
Depuração mais lenta in vivo em relação a uma mo- lécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma depuração a partir do centro que não é superior a cerca de 0,14, 0,16, 0,18, 0,2 ou 0,22 ml/h/kg, por exem- plo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 11, xxxi.
Pureza aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma pureza de pelo menos cerca de 98% ou 99% conforme medido usando eletroforese em gel capilar e/ou métodos descritos no Exemplo 1 ou 4, ou xxxii. Modificação de ácido siálico reduzida em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma pureza não superior a cer- ca de 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8 ou 7 nmoles de ácido siálico/nmol de polipeptídeo conforme medido usando eletroforese em gel capilar e/ou método descrito no Exemplo 1 ou 4.
[0013] E2. A molécula de polipeptídeo isolado de E1, em que a molécula de polipeptídeo tem expressão monomérica aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 70, 75, 80, 85, 90 ou 95%, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3A.
[0014] E3. A molécula de polipeptídeo isolado de E1 ou E2, em que a molécula de polipeptídeo tem expressão monomérica aprimora- da e expressão multimérica reduzida em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 75, 80, 85, 90 ou 95%, uma porcentagem de espécies de baixo peso molecular (LMWS) que é inferior a cerca de 10, 8, 6, 4 ou 2%, e/ou uma porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) que é inferior a cerca de 5, 2 ou 1%, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 6C.
[0015] E4. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem propensão à agregação reduzida sob estresse térmico em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, apresentando uma porcenta- gem de monômeros que é superior a cerca de 90, 92 ou 95% após in-
cubação a 37,4ºC por 24 horas, e/ou apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 75, 80 ou 85% após incuba- ção a 40ºC por 24 horas, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3D.
[0016] E5. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem propensão à agregação reduzida sob estresse térmico em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 5, 10, 15 ou 20% de aumento em HMWS a 40ºC, e/ou não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% de aumento em HMWS a 50ºC, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos des- critos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4.
[0017] E6. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem propensão à agregação reduzida sob baixo pH em relação a uma mo- lécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 6, 7, 8 ou 9% de aumento em HMWS a baixo pH por 5 horas, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4.
[0018] E7. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem estabilidade a congelamento-descongelamento aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMWS após 5 ciclos de congelamento-descongelamento, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Ta- bela 4.
[0019] E8. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5% de aumento em LMMS após 2 ou 4 semanas de armazenamento a 40°C conforme medido usando eletroforese em gel capilar (CGE), cromatografia líqui- da de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC), e/ou métodos descritos no Exemplo 4 com relação às Figuras 30A-30C ou Figuras 31A-31D.
[0020] E9. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 25°C conforme medido usando SE-HPLC, e/ou métodos descritos no Exemplo 4 com relação às Figuras 32A-32D.
[0021] E10. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 5°C conforme medido usando SE-HPLC, e/ou métodos descritos no Exemplo 4 com relação às Figuras 33A-33D.
[0022] E11. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem rendimento elevado em relação a uma molécula de polipeptídeo com- preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, tendo um rendimento que é superior a cerca de 5,5, 6, 6,5 ou 7 mg por 20 ml de cultura Expi293, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3B.
[0023] E12. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 38, 40, 42 ou 45oC.
[0024] E13. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 40, 45, 50, 55 ou 60ºC.
[0025] E14. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 40, 45 ou 50ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 6D.
[0026] E15. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 45, 50 ou 55ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 7D.
[0027] E16. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por calorimetria de varredura diferencial (DSC) e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4.
[0028] E17. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62, 64 ou 66ºC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 7,5; uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62 ou 64oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 5,8; ou uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58 ou 60ºC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78 ou 80ºC a pH 4,5, por exemplo, conforme medido por DSC e/ou usan- do métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 13.
[0029] E18. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem uma Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compre- endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC a pH 7,5 ou pH 4,5; tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 62ºC a pH 5,8, por exemplo, conforme medido por DSC e/ou usando métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 14.
[0030] E19. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem uma Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compre- endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por DSC e FabRICATOR IdeS e/ou usando métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 15.
[0031] E20. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem afinidade de ligação aprimorada a CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1 ou 0,08 µM, por exemplo, conforme medido por SPR e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 5A.
[0032] E21. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem afinidade de ligação aprimorada a CD2 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, e/ou uma kD para CD2 de cinomolgo que é inferior a cerca de 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, por exemplo, conforme medido por SPR e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 7C.
[0033] E22. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem afinidade de ligação aprimorada a células que expressam CD2 em re- lação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kd para ligação a cé- lulas Tmem CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400pM, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 6.
[0034] E23. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem afinidade de ligação aprimorada a células que expressam CD2 em re- lação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200 ou 1500 pM; um IC50 calcu- lado para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 150, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calcu- lado para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 pM; um IC50 calculado para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células Treg CD4 expandidas que não é superior a cer- ca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; e/ou um IC50 calculado para ligação a célu- las T nativas CD8 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, 1500, 1600 ou 1700 pM, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com rela- ção à Tabela 10 e Figura 11.
[0035] E24. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem afinidade de ligação aprimorada a células que expressam CD2 em re- lação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma kd calculada para li- gação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500pM; uma kd calculada para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; uma kd calculada para ligação a células TCM CD4+ que não é supe- rior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400 pM; uma kd calculada para ligação a células Treg CD4 expandidas que não é superior a cerca de 100, 200 ou 300 pM; uma kd calculada para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 50, 100 ou 150 pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD8 que não é superior a cerca de 50, 100, 200, 300, 400 ou 500pM, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 10 e Figura 11.
[0036] E25. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem afinidade de ligação aprimorada a células que expressam CD2 em re- lação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um EC50 reduzido para ligação a células TEM CD4+ de cinomolgo em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 3 com relação às Figuras 18A e 18B.
[0037] E26. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem citotoxicidade aprimorada contra células que expressam CD2 em rela- ção a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um EC50 para exterminar células Tmem CD4 que não é superior a cerca de 400, 600, 800, 1000, 1200 ou 1400 pM, por exemplo, conforme medido usando um ensaio ADCC e/ou métodos descritos no Exemplo 5 com relação à Tabela 17 e Figuras 12A e 12B.
[0038] E27. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem citotoxicidade aprimorada contra células que expressam CD2 em rela- ção a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um EC50 para exterminar células Tmem CD8 que não é superior a cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 nM por exemplo, conforme medido usando um ensaio de citotoxici-
dade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou métodos descritos no Exemplo 5 com relação à Tabela 17 e Figuras 12D.
[0039] E28. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem inibição aprimorada de resposta alogênica de células T, por exemplo, proliferação de células T e produção de citocina, em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 que não é superior a cerca de 400, 800, 1200, 1600, 2000 ou 2400pM, por exemplo, conforme medido usando um ensaio MLR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 6 e Figuras 14A e 14B.
[0040] E29. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem inibição aprimorada de resposta alogênica de células T, por exemplo, proliferação de células T e produção de citocina, em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 na ausência de células NK que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500 ou 2000 pM, por exemplo, conforme medido usando e ensaio MLR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação às Figuras 15B e 15C.
[0041] E30. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem inibição aprimorada de resposta de recuperação de toxoide tetânico em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, um IC50 para produção de IFNγ Tmem CD4 que não é superior a cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25 nM, por exemplo, conforme medido usando um ensaio TTR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 6 e Figuras 16A e 16B.
[0042] E31. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem depuração mais lenta in vivo em relação a uma molécula de polipeptí- deo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma depuração a partir do centro que não é superior a cerca de 0,14, 0,16, 0,18, 0,2 ou 0,22 ml/h/kg, por exemplo, conforme medi- do usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Tabela 11.
[0043] E32. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem pureza aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo com- preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exem- plo, uma pureza de pelo menos cerca de 98% ou 99% conforme medi- do usando eletroforese em gel capilar e/ou métodos descritos no Exemplo 1 ou 4.
[0044] E33. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo tem modificação de ácido siálico reduzida em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma pureza não superior a cerca de 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8 ou 7 nmoles de ácido siálico/nmol de polipeptídeo con- forme medido usando eletroforese em gel capilar e/ou método descrito no Exemplo 1 ou 4.
[0045] E34. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo ainda tem uma ou mais das seguintes propriedades: i. Ligação preferencial a células TEM CD2high, por exemplo, células TEM CD4+ e/ou CD8+, por exemplo, in vivo, ii. Exterminar células que expressam CD2 (por exemplo, células TCM CD4+ ou CD8+ ou células TEM CD4+ ou CD8+) na presen- ça de células NK, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Figura 13A,
iii. Reduzir células TEM CD4+ e/ou CD8+, por exemplo, cé- lulas TEM CD4+ periféricas, in vivo, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Figura 20A, iv. Aumentar a razão de Treg/TEM, por exemplo, em células T CD4+, in vivo, por exemplo, conforme medido usando métodos des- critos no Exemplo 2 com relação à Figura 20B, ou v. Aumentar a razão de Treg/TCM, por exemplo, em células T CD4+ e/ou CD8+.
[0046] E35. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo pre- ferencialmente se liga a células TEM CD2high, por exemplo, células TEM CD4+ e/ou CD8+, por exemplo, in vivo.
[0047] E36. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo ex- termina células que expressam CD2 (por exemplo, células TCM CD4+ ou CD8+ ou células TEM CD4+ ou CD8+) na presença de células NK, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Figura 13A.
[0048] E37. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo di- minui células TEM CD4+ e/ou CD8+, por exemplo, células TEM CD4+ periféricas, in vivo, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Figura 20A.
[0049] E38. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo aumenta a razão de Treg/TEM, por exemplo, em células T CD4+, in vi- vo, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Figura 20B.
[0050] E39. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo aumenta a razão de Treg/TCM, por exemplo, em células T CD4+ e/ou CD8+.
[0051] Alternativamente ou em combinação com qualquer uma das modalidades providas neste documento (por exemplo, E1-E39), a mo- lécula de polipeptídeo tem uma ou mais das seguintes características e modalidades.
[0052] E40. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 73 ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 73 (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0053] E41. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNVPX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8ENSE X9RX10FSSFKNRVYX11DTVSX12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ESPNITD TX15KX16FLYVX17, em que: X1 é F, I, L, V, A ou Y, X2 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X3 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X4 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X5 é W, F, L, C ou Y, X6 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X7 é A, V, S, L ou I, X8 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X9 é F, I, L, V, A ou Y,
X10 é A, V, S, L ou I, X11 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X12 é S, T, A ou G, X13 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X14 é M, L, I ou F, X15 é M, L, I ou F, X16 é F, I, L, V, A ou Y, e X17 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 74), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 74 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0054] E42. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNVPX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8ENSE X9RX10FSSFKNRVYX11DTVSX12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ESPNITD TX15KX16FLYVX17, em que: X1 é F, I, L ou V, X2 é F, I, L ou V, X3 é F, I, L ou V, X4 é F, I, L ou V, X5 é W, F, L ou C, X6 é F, I, L ou V, X7 é A, V, S ou L, X8 é F, I, L ou V, X9 é F, I, L ou V, X10 é A, V, S ou L, X11 é F, I, L ou V,
X12 é S, T, A ou G, X13 é F, I, L ou V, X14 é M, L, I ou F, X15 é M, L, I ou F, X16 é F, I, L ou V, e X17 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 75), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 75 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0055] E43. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma ou mais mutações (por exemplo, uma substituição, uma exclusão ou uma adição) nos resíduos 15, 17, 23, 26, 28, 35, 36, 38, 43, 45, 55, 60, 62, 77, 86 ou 88 em relação a SEQ ID NO: 3.
[0056] E44. A molécula de polipeptídeo isolado de E43, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de F15I, F15L, F15V, F15A ou F15Y, ii. uma substituição escolhida de V17F, V17I, V17L, V17M, V17A ou V17Nle, iii. uma substituição escolhida de L23F, L23I, L23V, L23Nle, L23M ou L23A, iv. uma substituição escolhida de V26F, V26I, V26L, V26M, V26A ou V26Nle, v. uma substituição escolhida de W28F, W28L, W28C ou W28Y, vi. uma substituição escolhida de V35F, V35I, V35L, V35M,
V35A ou V35Nle, vii. uma substituição escolhida de A36V, A36S, A36L ou A36I, viii. uma substituição escolhida de L38F, L38I, L38V, L38Nle, L38M ou L38A, ix. uma substituição escolhida de F43I, F43L, F43V, F43A ou F43Y, x. uma substituição escolhida de A45V, A45S, A45L ou A45I, xi. uma substituição escolhida de L55F, L55I, L55V, L55Nle, L55M ou L55A, xii. uma substituição escolhida de G60S, G60T ou G60A, xiii. uma substituição escolhida de L62F, L62I, L62V, L62Nle, L62M ou L62A, xiv. uma substituição escolhida de M77L, M77I ou M77F, xv. uma substituição escolhida de M86L, M86I ou M86F, ou xvi. uma substituição escolhida de F88I, F88L, F88V, F88A ou F88Y.
[0057] E45. A molécula de polipeptídeo isolado de E43, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de F15I, F15L ou F15V, ii. uma substituição escolhida de V17F, V17I ou V17L, iii. uma substituição escolhida de L23F, L23I ou L23V, iv. uma substituição escolhida de V26F, V26I ou V26L, v. uma substituição escolhida de W28F, W28L ou W28C, vi. uma substituição escolhida de V35F, V35I ou V35L, vii. uma substituição escolhida de A36V, A36S ou A36L, viii. uma substituição escolhida de L38F, L38I ou L38V, ix. uma substituição escolhida de F43I, F43L ou F43V,
x. uma substituição escolhida de A45V, A45S ou A45L, xi. uma substituição escolhida de L55F, L55I ou L55V, xii. uma substituição escolhida de G60S, G60T ou G60A, xiii. uma substituição escolhida de L62F, L62I, L62V, xiv. uma substituição escolhida de M77L, M77I ou M77F, xv. uma substituição escolhida de M86L, M86I ou M86F, ou xvi. uma substituição escolhida de F88I, F88L ou F88V.
[0058] E46. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 76) ou uma variante funcio- nal de SEQ ID NO: 76 (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0059] E47. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6KFFLYV X7, em que: X1 é A, V, S, L ou I, X2 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X3 é F, I, L, V, A ou Y, X4 é A, V, S, L ou I, X5 é M, L, I ou F, X6 é M, L, I ou F, e X7 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 77), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 77 (por exemplo, uma se-
quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0060] E48. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6KFFLYV X7, em que: X1 é A, V, S ou L, X2 é F, I, L ou V, X3 é F, I, L ou V, X4 é A, V, S ou L, X5 é M, L, I ou F, X6 é M, L, I ou F, e X7 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 78), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 78 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0061] E49. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6KFFLYV X7, em que: X1 é V, L ou A, X2 é F ou L,
X3 é V, I, L ou F, X4 é A, V ou S, X5 é M, F, I ou L, X6 é F, M, I ou L, e X7 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 79), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 79 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0062] E50. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3 FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTX5KFFLYVX 6, em que: X1 é V ou L, X2 é V, I ou L, X3 é A ou V, X4 é M ou F, X5 é F ou M, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 80), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 80 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0063] E51. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de:
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3 FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTX5KFFLYVX 6, em que: X1 é V ou L, X2 é V, I ou L, X3 é A ou V, X4 é M ou F, X5 é F ou M, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 80).
[0064] E52. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3 FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTFKFFLYVX5, em que: X1 é V ou L, X2 é V, I ou L, X3 é A ou V, X4 é M ou F, e X5 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 81), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 81 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0065] E53. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2RX3
FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX4ESPNITDTFKFFLYVX5, em que: X1 é V ou L, X2 é V, I ou L, X3 é A ou V, X4 é M ou F, e X5 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 81).
[0066] E54. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEX1RX2F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX3ESPNITDTFKFFLYVX4, em que: X1 é V ou I, X2 é A ou V, X3 é M ou F, e X4 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 82), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 82 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[0067] E55. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEX1RX2 FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX3ESPNITDTFKFFLYVX4 , em que: X1 é V ou I,
X2 é A ou V, X3 é M ou F, e X4 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 82).
[0068] E56. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NOs: 17-23 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 3.
[0069] E57. A molécula de polipeptídeo isolado de E56, ainda compreendendo o resíduo de aminoácido de Leu ou a sequência de aminoácido de LESLPS (SEQ ID NO: 118).
[0070] E58. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NOs: 26-29 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 3.
[0071] E59. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0072] E60. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17.
[0073] E61. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0074] E62. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18.
[0075] E63. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0076] E64. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19.
[0077] E65. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen-
de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0078] E66. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20.
[0079] E67. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0080] E68. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21.
[0081] E69. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0082] E70. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22.
[0083] E71. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0084] E72. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23.
[0085] E73. A molécula de polipeptídeo isolado de E59-E72, ainda compreendendo o resíduo de aminoácido de Leu ou a sequência de aminoácido de LESLPS (SEQ ID NO: 118).
[0086] E74. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0087] E75. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26.
[0088] E76. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0089] E77. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27.
[0090] E78. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0091] E79. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28.
[0092] E80. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%,
85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0093] E81. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29.
[0094] E82. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NO: 24 ou 25 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 3.
[0095] E83. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0096] E84. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24.
[0097] E85. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
3.
[0098] E86. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25.
[0099] E87. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NOs: 30-41 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 3.
[00100] E88. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NOs: 30-41.
[00101] E89. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma ou mais mutações (por exemplo, uma substituição, uma exclusão ou uma adição) nos resíduos 36, 38, 43, 45, 77 ou 86 em relação a SEQ ID NO: 3, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3.
[00102] E90. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições:
i. uma substituição escolhida de A36V, A36S, A36L ou A36I, ii. uma substituição escolhida de L38F, L38I, L38V, L38Nle, L38M ou L38A, iii. uma substituição escolhida de F43I, F43L, F43V, F43A ou F43Y, iv. uma substituição escolhida de A45V, A45S, A45L ou A45I, v. uma substituição escolhida de M77L, M77I ou M77F, ou vi. uma substituição escolhida de M86L, M86I ou M86F.
[00103] E91. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de A36V, A36S ou A36L, ii. uma substituição escolhida de L38F, L38I ou L38V, iii. uma substituição escolhida de F43I, F43L ou F43V, iv. uma substituição escolhida de A45V, A45S ou A45L, v. uma substituição escolhida de M77L, M77I ou M77F, ou vi. uma substituição escolhida de M86L, M86I ou M86F.
[00104] E92. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de A36V ou A36L, ii. uma substituição de L38F, iii. uma substituição escolhida de F43V, F43I ou F43L, iv. uma substituição escolhida de A45V ou A45S, v. uma substituição escolhida de M77L, M77I ou M77F, ou vi. uma substituição escolhida de M86L, M86I ou M86F.
[00105] E93. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de A36V ou A36L, ii. uma substituição de L38F, iii. uma substituição escolhida de F43V, F43I ou F43L, iv. uma substituição de A45V, v. uma substituição de M77F, ou vi. uma substituição de M86F.
[00106] E94. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição de A36V, ii. uma substituição de L38F, iii. uma substituição escolhida de F43V ou F43I, iv. uma substituição de A45V, v. uma substituição de M77F, ou vi. uma substituição de M86F.
[00107] E95. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição de A36V, ii. uma substituição de L38F, iii. uma substituição de F43V ou iv. uma substituição de M86F.
[00108] E96. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as mutações compreendem as seguintes substituições: A36V, L38F, F43V e M86F.
[00109] E97. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição de A36V,
ii. uma substituição de L38F, iii. uma substituição de F43V, iv. uma substituição de A45V, v. uma substituição de M77F, ou vi. uma substituição de M86F.
[00110] E98. A molécula de polipeptídeo isolado de E89, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição de A36V, ii. uma substituição de L38F, iii. uma substituição de F43I, iv. uma substituição de A45V, v. uma substituição de M77F, ou vi. uma substituição de M86F.
[00111] E99. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo ainda compreende 1 a 10, por exemplo, 1 a 6, resíduos de aminoácido do domínio extracelular de SEQ ID NO: 2, por exemplo, resíduos de aminoácido 93-187 de SEQ ID NO: 2.
[00112] E100. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo ainda compreende um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos de aminoácido de LESLPSPTLTCALTNGSIEV (SEQ ID NO: 119).
[00113] E101. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, em que a molécula de polipeptídeo ainda compreende um, dois, três, quatro, cinco ou todos os resíduos de aminoácido de LESLPS (SEQ ID NO: 118).
[00114] E102. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma das modalidades precedentes, ainda compreendendo um segundo domínio, por exemplo, a molécula de polipeptídeo é uma molécula de proteína de fusão.
[00115] E103. A molécula de polipeptídeo isolado de E102, em que o domínio de LFA3 é ligado ao segundo domínio, por exemplo, através de um ligante ou sem um ligante, por exemplo, o C-terminal do domí- nio de LFA3 é ligado ao N-terminal do segundo domínio ou o N- terminal do domínio de LFA3 é ligado ao C-terminal do segundo domí- nio, opcionalmente em que o C-terminal do domínio de LFA3 é ligado ao N-terminal do segundo domínio sem um ligante.
[00116] E104. A molécula de polipeptídeo isolado de E102 ou E103, em que o segundo domínio é capaz de formar um dímero com outro segundo domínio, por exemplo, através de uma ligação dissulfeto in- termolecular.
[00117] E105. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma de E102-E104, em que: i. o segundo domínio é capaz de mediar citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), ou ii. o segundo domínio é capaz de se ligar a e ativar células expressando CD16, por exemplo, células NK expressando CD16 ou macrófagos expressando CD16.
[00118] E106. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma de E102-E105, em que o segundo domínio é uma proteína de imuno- globulina, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada humana ou uma va- riante funcional da mesma.
[00119] E107. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma de E102-E106, em que o segundo domínio compreende uma região Fc de uma cadeia pesada (por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1 huma- na) ou uma variante funcional da mesma, por exemplo, em que o se-
gundo domínio compreende uma região de dobradiça, uma região de CH2, e uma região de CH3 ou uma variante funcional da mesma.
[00120] E108. A molécula de polipeptídeo isolado de qualquer uma de E102-E107, em que o segundo domínio compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 ou uma variante funcional da mes- ma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), por exemplo, em que o segundo domínio compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[00121] E109. Um polipeptídeo isolado ou fragmento do mesmo, que especificamente se liga a CD2 compreendendo um primeiro domí- nio e um segundo domínio em que o primeiro domínio compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26 e em que o polipeptídeo não compreende o aminoácido de SEQ ID NO:3; e em que o segundo domínio compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO:
16.
[00122] E110. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que a molécula de polipeptídeo não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 4.
[00123] E111. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen-
de a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
[00124] E112. Uma molécula de proteína multimética (por exemplo, dimérica) isolada compreendendo duas ou mais moléculas de polipep- tídeo de qualquer uma das modalidades precedentes.
[00125] E113. Uma molécula de proteína multimética (por exemplo, dimérica) isolada compreendendo duas ou mais moléculas de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que a molécula de polipeptídeo não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00126] E114. Uma molécula de proteína multimética (por exemplo, dimérica) isolada compreendendo duas ou mais moléculas de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26.
[00127] E115. Uma molécula de proteína multimética (por exemplo, dimérica) isolada compreendendo duas ou mais moléculas de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que a molécula de polipeptídeo não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.
[00128] E116. Uma molécula de proteína multimética (por exemplo, dimérica) isolada compreendendo duas ou mais moléculas de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
[00129] E117. Uma molécula de ácido nucleico que codifica a molé- cula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111 ou a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116.
[00130] E118. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo escolhida de SEQ ID NOs: 44-50, 53- 56, 122 ou 123 ou uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos
75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma, em que a molécula de ácido nucleico não compreende uma sequência de nu- cleotídeo codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00131] E119. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo escolhida de SEQ ID NOs: 44-50, 53- 56, 122 ou 123.
[00132] E120. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 53 ou uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma, em que a molécula de ácido nucleico não com- preende uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, opcionalmente em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 53.
[00133] E121. Uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 123 ou uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma, em que a molécula de ácido nucleico não com- preende uma sequência de nucleotídeo codificando a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, opcionalmente em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 123.
[00134] E122. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nu- cleico de qualquer uma de E117-E121.
[00135] E123. Uma célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma de E117-E121 ou o vetor de E122.
[00136] E124. A célula hospedeira de E123, em que a célula hos- pedeira é uma célula de mamífero.
[00137] E125. A célula hospedeira de E124, em que a célula hos- pedeira é uma célula CHO, uma célula COS, uma célula HEK-293,
uma célula NS0, uma célula PER.C6® ou uma célula Sp2.0.
[00138] E126. Uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111 ou a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00139] E127. A composição farmacêutica de E126, ainda compre- endendo solução salina tamponada com HEPES.
[00140] E128. A composição farmacêutica de E126, em que a mo- lécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111 ou a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116 é formulada em uma concentração de cerca de 0,015, cerca de 0,15 ou cerca de 1,5 mg/ml.
[00141] E129. Um método de produzir uma molécula de polipeptí- deo isolado que especificamente se liga a CD2, compreendendo culti- var a célula hospedeira de qualquer uma de E123-E125, sob condi- ções em que a molécula de polipeptídeo é expressa pela célula hos- pedeira.
[00142] E130. O método de E129, ainda compreendendo isolar a molécula de polipeptídeo.
[00143] E131. A molécula de polipeptídeo produzida usando o mé- todo de E129 ou E130.
[00144] E132. Um método de reduzir uma atividade de CD2, por exemplo, reduzir sinalização de CD2, em um indivíduo em necessida- de do mesmo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qual- quer uma de E126-E128.
[00145] E133. Um método de reduzir o número de células que ex- pressam CD2, por exemplo, células T de memória que expressam
CD2, por exemplo, células TEM expressando CD2, por exemplo, células TEM CD4+ ou células TEM CD8+ expressando CD2 em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao in- divíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de poli- peptídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multi- mérica de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128.
[00146] E134. Um método de aumentar a razão de Treg/TEM ou a razão de Treg/TCM, por exemplo, em células T CD4+ e/ou CD8+, em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128.
[00147] E135. Um método de interromper a interação entre CD2 e uma molécula de LFA3 de existência natural em um indivíduo em ne- cessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao indiví- duo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de polipep- tídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multiméri- ca de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128.
[00148] E136. Um método de tratar uma doença, distúrbio ou con- dição inflamatória em um indivíduo em necessidade do mesmo, o mé- todo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade tera- peuticamente eficaz da molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126- E128.
[00149] E137. Um método de tratar uma doença, distúrbio ou con- dição autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo, o mé-
todo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade tera- peuticamente eficaz da molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126- E128.
[00150] E138. Um método de tratar um indivíduo em necessidade de imunossupressão, o método compreendendo administrar ao indiví- duo uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de polipep- tídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multiméri- ca de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128.
[00151] E139. Um método de tratar uma doença, distúrbio ou con- dição associada com ou mediada por resposta de célula T de memória aberrante em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuti- camente eficaz da molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1- E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112- E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128.
[00152] E140. O método de qualquer uma de E132-E139, em que o indivíduo é um ser humano.
[00153] E141. O método de qualquer uma de E132-E140, compre- endendo administrar a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteí- na multimérica ou a composição farmacêutica subcutaneamente, in- tramuscularmente ou intravenosamente.
[00154] E142. O método de E141, compreendendo administrar a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica subcutaneamente.
[00155] E143. O método de E141, compreendendo administrar a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica intramuscularmente.
[00156] E144. O método de E141, compreendendo administrar a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica intravenosamente.
[00157] E145. O método de qualquer uma de E132-E144, em que a administração da molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica tem uma ou mais das se- guintes propriedades: i. a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína mul- timérica ou a composição farmacêutica é administrada duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez a cada três semanas, por exemplo, uma vez por semana, ii. a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína mul- timérica ou a composição farmacêutica é administrada em uma dose de cerca de 5-20 mg/semana (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17 ou 20 mg/semana), por exemplo, cerca de 7,5 mg/semana, iii. a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína mul- timérica ou a composição farmacêutica é administrada em uma dose de cerca de 0,2-8 mg por injeção (por exemplo, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ou 8 mg por injeção), por exemplo, entre 0,22-7,5 mg por injeção ou 7,5 mg por injeção, iv. a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína mul- timérica ou a composição farmacêutica é administrada em cerca de 0,5-2,0 ml de solução por injeção (por exemplo, 0,5, 1 ou 1,5 ml de so- lução por injeção), por exemplo, cerca de 1 ml de solução por injeção, ou v. a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína mul- timérica ou a composição farmacêutica é administrada por um ou mais cursos, por exemplo, em que cada curso consiste em 10-14 semanas (por exemplo, 10, 11, 12, 13 ou 14 semanas), por exemplo, 12 sema- nas, por exemplo, em que dois cursos adjacentes são separados por um intervalo de 10 a 14 semanas (por exemplo, um intervalo de 10, 11, 12, 13 ou 14 semanas), por exemplo, um intervalo de 12 semanas, opcionalmente em que: a molécula de polipeptídeo, a molécula de pro- teína multimérica ou a composição farmacêutica é administrada subcu- taneamente em uma dose de cerca de 15 mg/semana uma vez por semana, por exemplo, em que a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica é administrada por um ou mais cursos, em que cada curso consiste em 12 semanas e dois cursos adjacentes são separados por um intervalo de 12 semanas.
[00158] E146. O método de qualquer uma de E132-E144, em que a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica é administrada em uma dose de cerca de 0,03, cerca de 0,3, cerca de 3 ou cerca de 100 mg/kg.
[00159] E147. O método de qualquer uma de E132-E144, em que a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica é administrada em um volume de dose de cerca de 2 ml/kg.
[00160] E148. O método de qualquer uma de E132-E144, em que a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica é administrada subcutaneamente em uma dose de cerca de 7,5 mg/semana.
[00161] E149. O método de qualquer uma de E132-E144, em que a molécula de polipeptídeo, a molécula de proteína multimérica ou a composição farmacêutica, é administrada semanalmente.
[00162] E150. A molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1- E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112- E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128, para uso como um medicamento.
[00163] E151. A molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1- E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-
E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128, para uso na redução da atividade de CD2 em um indivíduo.
[00164] E152. A molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1- E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112- E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128, para uso no tratamento de um indivíduo em necessidade de imunos- supressão.
[00165] E153. A molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1- E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112- E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128, para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição autoi- mune em um indivíduo.
[00166] E154. O método ou uso de qualquer uma de E132-E153, em que o indivíduo tem uma ou mais das seguintes doenças, distúr- bios ou condições: diabetes tipo 1, psoríase, psoríase em placas, pus- tulose palmoplantar, psoríase pustulosa de palmas e solas, pustulose palmar e plantar, pustulose de palmas e solas, dermatite atópica, lí- quen plano, doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), vitiligo, Pi- tiríase Rubra Pilar, transplante (por exemplo, transplante de órgão, por exemplo, transplante de rim), artrite psoriática, uma doença, distúrbio ou condição que requer transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas, talassemia, anemia falciforme, trombastenia de Glanz- mann, síndrome de Wiskott-Aldrich, doença granulomatosa crônica, neutropenia congênita grave, deficiência de adesão de leucócitos, sín- drome de Schwachman-Diamond, anemia de Diamond-Blackfan, ane- mia Fanconi, disceratose congênita, síndrome de Chediak-Higashi, anemia aplástica, alopecia areata, e linfoma de células T (por exemplo, linfoma de células T cutâneas ou linfoma não Hodgkin de células T pe- riféricas).
[00167] E155. O método ou uso de qualquer uma de E132-E153,
em que o indivíduo tem uma ou mais das seguintes doenças, distúr- bios ou condições: diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus tipo 1 ou diabetes mellitus dependente de insulinaa); diabetes juvenil; respostas inflamatórias, tais como doenças de pele inflamatórias inclu- indo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); dermato- miosite; esclerodermia sistêmica e esclerose; respostas associadas a doença inflamatória intestinal (tais como doença de Crohn e colite ul- cerativa); síndrome da dificuldade respiratória (incluindo síndrome da dificuldade respiratória no adulto; ARDS); dermatite; meningite; ence- falite; uveíte; colite; gastrite; glomerulonefrite; condições alérgicas, tais como eczema e asma e outras condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatoide; lúpus eritematoso sistêmi- co (SLE); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tireoidite autoimu- ne; encefalomielite alérgica; síndroms de Sjogren; e respostas imunes associadas a hipersensibilidade aguda e tardia mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontrados em tuberculose, sarcoidose, po- limiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia per- niciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diapedese leucoci- tária; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (CNS); síndro- me de disfunção de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas sem limitação, crioglobinemia ou anemia Coombs-positivo); mias- tenia grave; doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo; do- ença antimembrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neuri- te alérgica; doença de Grave; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; pênfigo; poliendocrinopatias autoimunea; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; arte- rite de células gigantes; nefrite do complexo imune; nefropatia de IgA; polineuropatias de IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombocitopenia imune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoidite de
Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfo- proliferativa autoimune (ALPS); uveoretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barre; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade autoimune; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopática; doença do enxerto versus hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cintura-membro, Facioscapu- lohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss); e uma doença não imune inflamatória, tal como uma doença cardíaca ou uma doença cerebral.
[00168] E156. O método ou uso de qualquer uma de E132-E153, em que: i. o indivíduo tem diabetes, ii. o indivíduo tem diabetes tipo 1 (T1D), iii. o indivíduo tem T1D de novo-início, iv. o indivíduo tem T1D de novo-início com função de célu- la β residual, v. o indivíduo é diagnosticado com T1D de novo-início em menos de 100 dias), vi. o indivíduo é um paciente com T1D no estágio de pré- diabetes, vii. o indivíduo tem T1D estágio 2, por exemplo, o indivíduo apresenta disglicemia, tem uma doença pré-sintomática, e/ou é positi- vo para pelo menos dois autoanticorpos associados a T1D, viii. o indivíduo tem T1D estágio 3, por exemplo, o indivíduo apresenta hiperglicemia, tem uma doença sintomática, e/ou é positivo para pelo menos dois autoanticorpos associados a T1D, ou ix. o indivíduo é positivo para um ou mais autoanticorpos associados a T1D.
[00169] E157. O método ou uso de qualquer uma de E132-E156, ainda compreendendo administrar ao indivíduo uma segunda terapia,
opcionalmente em que a segunda terapia promotes a atividade de Tregs ou aumenta o número de Tregs, opcionalmente em que a se- gunda terapia compreende IL-2.
[00170] E158. O método ou uso de E156, em que o indivíduo tem diabetes, por exemplo, diabetes tipo 1, por exemplo, diabetes de novo- início tipo 1, e a segunda terapia compreende insulina.
[00171] E159. Um método de detectar CD2 em uma amostra, tecido ou célula usando a molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1- E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112- E116 ou a composição farmacêutica de qualquer uma de E126-E128, compreendendo contactar a amostra, tecido ou célula com a molécula de polipeptídeo, molécula de proteína multimérica ou composição far- macêutica, e detectar a molécula de polipeptídeo, molécula de proteí- na multimérica ou composição farmacêutica.
[00172] E160. Um kit compreendendo a molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E1-E111, a molécula de proteína multimérica de qualquer uma de E112-E116 ou a composição farmacêutica de qual- quer uma de E126-E128.
[00173] E161. Uma molécula de polipeptídeo isolado ou variante funcional da mesma, que especificamente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende uma se- quência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 69, e em que a molécula de polipeptídeo não compreende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.
[00174] E162. A molécula de polipeptídeo isolado ou variante funci- onal da mesma, de E161, em que a molécula de polipeptídeo compreende uma se- quência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69, e em que a molécula de polipeptídeo não compreende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.
[00175] E163. A molécula de polipeptídeo isolado de E161 ou E162, em que a molécula de polipeptídeo compreende a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 69.
[00176] E164. Um polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, que especificamente se liga a CD2, compreendendo um do- mínio de LFA3 compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identida- de com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 17-41, e em que o domínio de LFA3 não com- preende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00177] E165. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de E164, em que a sequência de aminoácido é SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 e em que o domínio de LFA3 ainda com- preende o resíduo de aminoácido de Leu ou a sequência de aminoáci- do de LESLPS (SEQ ID NO: 118).
[00178] E166. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de E164, em que o domínio de LFA3 compreende uma se- quência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 26, e em que o domínio de LFA3 não compreende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00179] E167. O polipeptídeo isolado de E164 ou E166, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26.
[00180] E168. Um polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, compreendendo um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 com uma ou mais mutações nos resí-
duos 36, 38, 43 e 86, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3.
[00181] E169. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de E168, em que o domínio de LFA3 ainda compreende o re- síduo de aminoácido de Leu ou a sequência de aminoácido de LES- LPS (SEQ ID NO: 118).
[00182] E170. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de E168 ou E169, em que as uma ou mais mutações nos re- síduos 36, 38, 43 e 86 numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3 são A36V, L38F, F43V e M86F.
[00183] E171. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E164-E170, ainda compreendendo um segundo domínio, em que o segundo domínio compreende uma proteína de imunoglobulina, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada humana ou uma variante funcional da mesma; em que o segundo domínio compreende uma região Fc de uma cadeia pesada (por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1 huma- na) ou uma variante funcional da mesma; ou em que o segundo domínio compreende uma região de do- bradiça, uma região de CH2, e uma região de CH3 ou uma variante funcional da mesma.
[00184] E172. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E164-E171, ainda compreendendo um segundo domínio em que o segundo domínio compreende um domínio Fc compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 16.
[00185] E173. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de E172, em que o segundo domínio compreende um domínio
Fc compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[00186] E174. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E171-E173, ainda compreendendo um ligante, em que o ligante liga o N-terminal do segundo domínio ao C- terminal do domínio de LFA3.
[00187] E175. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E171-E174, em que: i. o segundo domínio é capaz de formar um dímero com outro segundo domínio, por exemplo, através de uma ligação dissulfe- to intermolecular, e/ou ii. o segundo domínio é capaz de mediar citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[00188] E176. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E171-E175, em que o domínio de LFA3 compreende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 26, e em que o polipeptídeo não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e em que o domínio Fc compreende um polipeptídeo com- preendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 16.
[00189] E177. O polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E171-E175, em que o polipeptídeo ou variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, e em que a sequência de aminoácido compreende uma ou mais mutações nos resíduos 36, 38, 43, 86, 92, 228 e 230 numerados de acordo com a SEQ ID NO: 4.
[00190] E178. O polipeptídeo isolado ou fragmento do mesmo, de E177, em que as uma ou mais mutações nos resíduos 36, 38, 43, 86,
92, 228 e 230 numerados de acordo com a SEQ ID NO: 4 são A36V, L38F, F43V, M86F, V92_D93insL, D228E e L230M.
[00191] E179. Uma molécula de polipeptídeo isolado que se liga, por exemplo, especificamente se liga, a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3 e tem uma ou mais das seguintes propriedades: i. Expressão monomérica aprimorada demonstrada por uma porcentagem de monômero que é cerca de 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% superior em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 conforme me- dido usando cromatografia por exclusão de tamanho, ii. Expressão monomérica aprimorada e expressão mul- timérica reduzida demonstradas por uma porcentagem de monômero que é superior a cerca de 75, 80, 85, 90 ou 95%, uma porcentagem de espécies de baixo peso molecular (LMWS) que é inferior a cerca de 10, 8, 6, 4 ou 2%, e/ou uma porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) que é inferior a 5, 2 ou 1% em relação a uma mo- lécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, iii. Propensão à agregação reduzida sob estresse térmico demonstrada por uma porcentagem de monômero que é superior a cerca de 90, 92 ou 95% após incubação a 37,4ºC por 24 horas, e/ou apresentando uma porcentagem de monômero que é superior a cerca de 75, 80 ou 85% após incubação a 40ºC por 24 horas em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 120, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, iv. Propensão à agregação reduzida sob estresse térmico demonstrada por não mais do que cerca de 5, 10, 15 ou 20% de au-
mento em HMWS a 40ºC, e/ou não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% de aumento em HMWS a 50ºC em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tama- nho, v.
Propensão à agregação reduzida sob baixo pH de- monstrada por não mais do que cerca de 6, 7, 8 ou 9% de aumento em HMWS a baixo pH por 5 horas em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, vi.
Estabilidade aprimorada conforme demonstrado por não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5% de aumento em LMMS após 2 ou 4 semanas de armazenamento a 40°C em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando eletroforese em gel capilar (CGE) ou cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC), vii.
Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 25°C conforme medido usando SE-HPLC, viii.
Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de au- mento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 5°C conforme medido usando SE-HPLC,
ix.
Estabilidade a congelamento-descongelamento apri- morada demonstrada por não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMWS após 5 ciclos de congelamento-descongelamento em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, x.
Rendimento elevado conforme demonstrado por um rendimento que é superior a cerca de 5,5, 6, 6,5 ou 7 mg por 20ml de cultura Expi293 em relação a uma molécula de polipeptídeo compre- endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, xi.
Tm elevada demonstrada por uma Tm que é superior a cerca de 38, 40, 42, 45 ou 50ºC em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, conforme medido por fluorometria de varredura diferencial (DSF), xii.
Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 40, 45, 50, 55 ou 60ºC em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por DSF, xiii.
Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por calorimetria de varredura diferencial (DSC), xiv.
Uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62, 64 ou 66 oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 7,5; uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62 ou 64 oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 5,8; ou uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58 ou 60ºC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78 ou 80ºC a pH 4,5 conforme medido por DSC, xv.
Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC a pH 7,5 ou pH 4,5 ou uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 62ºC a pH 5,8 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por DSC, xvi.
Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 conforme medido por DSC e FabRICATOR IdeS, xvii.
Afinidade de ligação aprimorada a CD2 conforme de- monstrado por uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1 ou 0,08 µM em relação a uma molécula de po- lipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xviii.
Afinidade de ligação aprimorada a CD2 conforme de- monstrado por uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, e/ou uma kD para CD2 de cinomolgo que é infe- rior a 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xix.
Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por uma kD para ligação a células Tmem CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando SPR, xx.
Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200 ou 1500 pM; um IC50 calculado para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 150, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 pM; um IC50 calculado para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células Treg CD4 expandidas que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; e/ou um IC50 calculado para ligação a células T nati- vas CD8 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, 1500, 1600 ou 1700 pM, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Ta- bela 10 e Figura 11, em relação a uma molécula de polipeptídeo com- preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xxi.
Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por uma kd calculada para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500pM; uma kd calculada para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; uma kd calculada para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400 pM; uma kd calculada para ligação a células Treg CD4 expan- didas que não é superior a cerca de 100, 200 ou 300 pM; uma kd cal- culada para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 50, 100 ou 150 pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD8 que não é superior a cerca de 50, 100, 200, 300, 400 ou 500pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR,
xxii.
Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um EC50 reduzido para ligação a células TEM CD4+ de cinomolgo em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xxiii.
Citotoxicidade aprimorada contra células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um EC50 para exterminar células Tmem CD4 que não é superior a cerca de 400, 600, 800, 1000, 1200 ou 1400pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usan- do um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), xxiv.
Citotoxicidade aprimorada contra células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um EC50 para exterminar células Tmem CD8 que não é superior a cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 nM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), xxv.
Inibição aprimorada de resposta alogênica de células T, em que a resposta alogênica de células T é proliferação de células T e/ou produção de citocina, conforme demonstrado por um IC50 para um ensaio de reação mista linfocitária (MLR) que não é superior a cer- ca de 400, 800, 1200, 1600, 2000 ou 2400 pM em relação a uma mo- lécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, xxvi.
Inibição aprimorada de resposta alogênica de células T, em que a resposta alogênica de células T é proliferação de células T e/ou produção de citocina, conforme demonstrado por um IC50 para um ensaio de reação mista linfocitária (MLR) na ausência de células NK que não é superior a cerca de 330, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500 ou 2000 pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, xxvii. Inibição aprimorada de resposta de recuperação de toxoide tetânico conforme demonstrado por um IC50 para produção de IFNγ Tmem CD4 que não é superior a cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25nM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido em um ensaio de memória de toxoide tetânico (TTR), xxviii. Depuração mais lenta in vivo conforme demonstrado por uma depuração a partir do centro que não é superior a cerca de 0,14, 0,16, 0,18, 0,2 ou 0,22 ml/h/kg em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por estudos PK/PD, e/ou xxix. Pureza aprimorada de pelo menos cerca de 98% ou 99% em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando eletroforese em gel capilar.
[00192] E180. Um ácido nucleico isolado codificando o polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de qualquer uma de E161- E179.
[00193] E181. O ácido nucleico isolado de E180, compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% de identidade com a SEQ ID NO: 43, 53 e/ou 123.
[00194] E182. O ácido nucleico isolado de E180 ou E181, compre- endendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 43, 53 e/ou
123.
[00195] E183. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de qual- quer uma de E180-E182.
[00196] E184. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nu-
cleico de qualquer uma de E180-E182 ou o vetor de E183.
[00197] E185. A célula hospedeira de E184, em que a célula hos- pedeira é uma célula de mamífero selecionada do grupo que consiste em uma célula Expi293, uma célula ExpiCHO, uma célula CHO, uma célula COS, uma célula HEL-293, uma célula NSO, uma célula PER.C6 ou uma célula Sp2.0.
[00198] E186. A célula hospedeira de E184 ou E185, em que a cé- lula hospedeira é uma célula Expi293 ou uma célula ExpiCHO.
[00199] E187. Uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E161-E179 e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00200] E188. A composição farmacêutica de E187, compreenden- do 7,5 mg da molécula de polipeptídeo de qualquer uma de E161- E179 e solução salina tamponada com HEPES.
[00201] E189. Um método de produzir uma molécula de polipeptí- deo isolado que especificamente se liga a CD2, compreendendo culti- var a célula hospedeira de qualquer uma de E184-E186, sob condi- ções em que a molécula de polipeptídeo é expressa pela célula hos- pedeira.
[00202] E190. O método de E189, ainda compreendendo isolar a molécula de polipeptídeo.
[00203] E191. O polipeptídeo isolado de qualquer uma de E161- E179 ou a composição farmacêutica de E187 ou E188, para uso no tratamento de um indivíduo em necessidade de imunossupressão.
[00204] E192. Uso do polipeptídeo isolado de qualquer uma de E161-E179 ou a composição farmacêutica de E187 ou E188, para tra- tar uma doença, distúrbio ou condição imune.
[00205] E193. Um método para tratar ou prevenir uma doença, dis- túrbio ou condição imune mediada por CD2 em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, o referido método compreendendo admi-
nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêuti- ca de E187 ou E188, em que a referida doença, distúrbio ou condição é selecionada do grupo que consiste em: diabetes tipo 1, psoríase, psoríase em placas, pustulose palmoplantar, psoríase pustulosa de palmas e solas, pustulose palmar e plantar, pustulose de palmas e so- las, dermatite atópica, líquen plano, doença do enxerto versus hospe- deiro (GVHD), vitiligo, Pitiríase Rubra Pilar, transplante (por exemplo, transplante de órgão, por exemplo, transplante de rim), artrite psoriáti- ca, uma doença, distúrbio ou condição que requer transplante de célu- las-tronco hematopoiéticas alogênicas, talassemia, anemia falciforme, trombastenia de Glanzmann, síndrome de Wiskott-Aldrich, doença granulomatosa crônica, neutropenia congênita grave, deficiência de adesão de leucócitos, Síndrome de Schwachman-Diamond, anemia de Diamond-Blackfan, anemia Fanconi, disceratose congênita, síndrome de Chediak-Higashi, anemia aplástica, alopecia areata, e linfoma de células T (por exemplo, linfoma de células T cutâneas ou linfoma não Hodgkin de células T periféricas).
[00206] E194. O método de E193, em que a referida doença é dia- betes, por exemplo, diabetes tipo 1 (T1D), por exemplo, T1D de novo- início, por exemplo, T1D de novo-início com função de célula β residu- al (por exemplo, o indivíduo é diagnosticado com menos de 100 dias), por exemplo, T1D de estágio 2 ou estágio 3.
[00207] E195. Uso do polipeptídeo isolado de qualquer uma de E161-E179 na fabricação de um medicamento para tratar uma doença, distúrbio ou condição imune.
[00208] E196. Um método de detectar CD2 em uma amostra, tecido ou célula usando o polipeptídeo isolado ou variante funcional da mes- ma, de qualquer uma de E161-E179, compreendendo contactar a amostra, tecido ou célula com o polipeptídeo ou variante funcional da mesma, e detectar o polipeptídeo ou variante funcional da mesma.
[00209] E197. O método ou uso de E132-E153, em que o indivíduo tem artrite psoriática.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00210] O sumário acima, bem como a descrição detalhada a seguir da invenção, será mais bem compreendida quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Com o propósito de ilustrar a invenção, são mostradas nas modalidades dos desenhos. Deve ser entendido, no entanto, que a invenção não é limitada aos arranjos e instrumentalida- des precisas mostradas.
[00211] Figura 1: Projeto de biblioteca baseado em estrutura para bibliotecas de exibição de levedura de estabilidade (S) e afinidade + estabilidade (AS) de primeira geração. 16 resíduos de núcleo (bibliote- ca S e AS) e 15 resíduos de contato (biblioteca AS) foram mutados para 4-6 resíduos quimicamente semelhantes. Os resíduos mostrados na Figura 1 são numerados de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00212] Figuras 2A-2D: Frequência de variação de aminoácido em clones identificados a partir de bibliotecas de exibição de levedura identificou 6 posições de hotspot. A Figura 2A é um gráfico mostrando seis resíduos de hotspot identificados. Esses seis resíduos são nume- rados de acordo com a SEQ ID NO: 2. Na Figura 2B, os resíduos de LFA3 direcionados nas bibliotecas são mostrados em negrito, e os seis resíduos do hotspot são mostrados em negrito e sublinhados. A Figura 2C é um gráfico mostrando a frequência de variação de aminoácido nas seis posições de hotspot. A Figura 2D é uma tabela mostrando o desenho das 6 variantes recombinantes M1-M6. Os resíduos de ami- noácido nas posições de hotspot são especificados para cada varian- te.
[00213] Figuras 3A-3D: Gráficos exemplificativos que representam a avaliação molecular de LFA3 de tipo selvagem (LFA3 WT) e proteí- nas de fusão Fc variante M1-M6. "LFA3 WT-Pfe" e "WT-Pfe" referem-
se a WT LFA3-Pfe.
[00214] Figura 4: Projeto baseado em estrutura da biblioteca de loop FG para identificar clones com afinidade de ligação aumentada. São mostrados na tabela da Figura 4 resíduos direcionados à mutagê- nese na biblioteca de segunda geração. As posições de resíduo são numeradas de acordo com a SEQ ID NO: 2.
[00215] Figuras 5A e 5B: Caracterização exemplificativa de varian- tes de LFA3 de alta afinidade. Os clones foram avaliados quanto à afi- nidade de ligação a CD2 recombinante em um ensaio Biacore (SPR) (Figura 5A) e estabilidade térmica por DSF (Figura 5B). "LFA3-WT" refere-se a LFA3-Fc WT. "LFA3-Pfe" refere-se a WT LFA3-Pfe.
[00216] Figuras 6A-6D: Projeto racional de variante de limite de domínio d1. Caracterização exemplificativa de proteínas LFA3-Fc con- tendo resíduo de leucina endógena adicional (d1) para expressão mo- nomérica e estabilidade térmica com sequência de LFA3 de tipo sel- vagem (LFA3-Fc d1) ou variantes M de estabilidade (M1-d1 (também referida como "M1d1") e M4-d1 (também referida como "M4d1")). "WT" na Figura 6C refere-se a LFA3-Fc WT. "Pfe" na Figura 6D refere-se a WT LFA3-Pfe.
[00217] Figuras 7A-7D: Afinidade de variantes de limite de domínio M1-d1 (também referida como "M1d1") e M1-d3 (também referida co- mo "M1d3") para CD2 humano e de cino e estabilidade térmica (DSF).
[00218] Figuras 8A-8D: Projeto e caracterização de M7-d1. São mostrados nas Figuras 8B, 8C e 8D resultados exemplificativos de análise SEC, análise de estabilidade térmica e análise de afinidade, respectivamente. "LFA3-WT" na Figura 8C e "WT" na Figura 8D refe- rem-se a LFA3-Fc WT. "LFA3-Pfe" na Figura 8C refere-se a WT LFA3- Pfe.
[00219] Figuras 9 e 10: Gráficos exemplificativos representando os níveis de CD2 em PBMC humana em repouso (Figura 9) e após ativa-
ção de TCR com esferas anti-CD3/CD28 (Figura 10). A média ± SEM de 4 doadores é mostrada na Figura 9, e um único doador é mostrado na Figura 10. Os dados são expressos como o número médio (+/- SD) de moléculas por célula. NK = exterminadora natural; eff mem = me- mória efetora; cen mem = memória central; Tregs = T reguladora.
[00220] Figura 11: Ligação de LFA3-Fc exemplificativa a popula- ções de células T humanas primárias usando ensaio de ligação com- petitivo com um anticorpo anti-CD2. O ensaio foi executado em triplica- ta e média ± st. dev. é representada graficamente. "WT" refere-se a LFA3-Fc WT.
[00221] Figuras 12A-12E: Ensaio ADCC de PBMC humana exem- plificativa. PBMCs foram cocultivadas com quantidades elevadas de proteína LFA3-Fc (LFA3-Fc M1d1 ou LFA3-Fc WT), e a citotoxicidade de células CD4 de memória (por exemplo, CD4 CD45RO+) é repre- sentada graficamente na Figura 12A. EC50 entre doadores é mostrado na Figura 12B. Citotoxicidade dependente da concentração exemplifi- cativa de células CD4 não memória (por exemplo, CD4 CD45RO-), células de memória CD8 (por exemplo, CD8 CD45 RO+) e células não memória CD8 (por exemplo, CD8 CD45RO-) por proteínas LFA3-Fc é representada na Figura 12C-12E. Os pontos de dados representam a média (n=5) +/- SEM.
[00222] Figuras 13A-13C: Gráficos exemplificativos representando ensaios de citotoxicidade com células NK purificadas cocultivadas com células alvo em uma quantidade fixa de LFA3-Fc M1d1 ou LFA3-Fc WT. Figura 13A: Células alvo (células de memória CD4) foram incuba- das com 250 nM de proteína. A média de cavidades triplicadas ± st. dev. para 1 de 5 doadores é mostrada. As células alvo (CD4 virgens, CD4 de memória ou células B) foram incubadas com 100 nM de LFA3- Fc WT (Figura 13B) ou LFA3-Fc M1d1 (Figura 13C) e células NK (cé- lulas efetoras) em várias razões de células alvo x efetoras. A média de cavidades triplicadas ± st. dev. para 1 doador é mostrada. "WT" refere- se a LFA3-Fc WT.
[00223] Figuras 14A e 14B: Gráficos exemplificativos representando inibição completa de LFA3-Fc M1d1 ("M1d1") de expansão de células T CD4+ em resposta à estimulação alogênica (MLR). A média de cavi- dades triplicadas +/- st. dev. para um único doador é mostrada na Fi- gura 14A. IC50 em vários doadores é mostrado na Figura 14B. "WT" refere-se a LFA3-Fc WT.
[00224] Figuras 15A-15C: Gráficos exemplificativos representando a inibição de LFA3-Fc M1d1 ("M1d1") de MLR na ausência de células NK. As células NK estavam intocadas (Figura 15A) ou depletadas (Fi- gura 15B) usando isolamento magnético. A média de cavidades tripli- cadas +/- st. dev. para um único doador é mostrada nas Figuras 15A e 15B. IC50 em experimentos repetidos é mostrado na Figura 15C. "WT" refere-se a LFA3-Fc WT.
[00225] Figuras 16A e 16B: Gráficos exemplificativos representando inibição de LFA3-Fc M1d1 ("M1-d1") de resposta de recuperação de CD4 a toxoide tetânico (TT) de antígeno. A média cavidades triplica- das +/- st. dev. para um único doador é mostrada na Figura 16A. IC50 em vários doadores é mostrado na Figura 16B. "WT" refere-se a LFA3- Fc WT.
[00226] Figura 17: Expressão de CD2 exemplificativa em PBMCs de macaco cinomolgo. N=6; dados são expressos como o número mé- dio (+/- SD) de moléculas por célula. NK = exterminadora natural; eff mem = memória efetora; cen mem = memória central; Tregs = T regu- ladora.
[00227] Figuras 18A e 18B: Ensaio ADCC de PBMC de cino exem- plificativo. PBMCs de macaco cinomolgo foram cocultivadas com quantidades elevadas de polipeptídeos LFA3-Fc (M1d1 ou WT), e a citotoxicidade de células TEM CD4+ é representada graficamente. A média de cavidades triplicadas +/- st. dev. para um único doador é mostrada na Figura 18A. EC50 para 3 doadores é mostrado na Figura 18B. "WT" refere-se a LFA3-Fc WT.
[00228] Figura 19: Projeto experimental de estudo PK/PD de dose de repetição em macaco cinomolgo 17MA057.
[00229] Figuras 20A e 20B: LFA3-Fc M1d1 reduziu CD4+ TEM, e aumentou a razão de Tregs/CD4+ TEM após a dosagem de repetição (setas pretas). Dados exemplificativos são representados graficamente como alteração de dobra em comparação com as contagens de célu- las pré-dose. A média +/- SEM de 4 animais é mostrada.
[00230] Figura 21: Tratamento com LFA3-Fc M1d1 tem maior im- pacto em células T de memória. Os dados exemplificativos são repre- sentados graficamente como alteração de dobra em comparação com as contagens de células pré-dose. A média +/- SEM de 4 animais é mostrada.
[00231] Figuras 22A e 22B: LFA3-Fc WT reduziu CD4+ TEM e au- mentou a razão de Tregs/CD4+ TEM após a dosagem de repetição. Os dados exemplificativos são representados graficamente como altera- ção de dobra em comparação com as contagens de células pré-dose. A média +/- SEM de 4 animais é mostrada. "WT" refere-se a LFA3-Fc WT.
[00232] Figuras 23A e 23B: Perfil PK exemplificativo de M1d1 e LFA3-Fc WT em macaco cinomolgo do estudo 17MA057. A dose é proporcional entre 0,03-3 mg/kg.
[00233] Figura 24: Mecanismos de ação propostos de LFA3-Fc.
[00234] Figuras 25A-25B: Quantificação exemplificativa da expres- são de CD2 em KLRG1+ humano versus subconjuntos de células T auxiliares KLRG1-TIGIT+PD1+ usando esferas Quantibrite e citometria de fluxo. A Figura 25A representa a expressão de CD2 em células de memória efetora ("EM") CD4. A Figura 25B representa a expressão de
CD2 em células de memória central ("CM") CD4. Os dados são ex- pressos como a intensidade de fluorescência média geométrica (gMFI) de n = 2 doadores +/- SD. KLRG1 = receptor G1 do tipo lectina de cé- lulas exterminadoras; TIGIT = imunorreceptor de células T com domí- nios Ig e ITIM.
[00235] Figuras 26A-26B: Quantificação exemplificativa de expres- são de CD2 em subconjuntos de células T auxiliares humanas usando esferas Quantibrite e citometria de fluxo. A Figura 26A e a Figura 26B representam dois doadores analisados em dois dias diferentes. Os da- dos são expressos como intensidade de fluorescência média geomé- trica (gMFI) +/- SD. CCR7 = receptor de quimiocina C-C tipo 7; PD1 = proteína 1 de morte celular programada; TH = auxiliar T; Tfh = auxiliar folicular T; Tregs = células T reguladoras.
[00236] Figura 27: Perfil de calorimetria de varredura diferencial (DSC) exemplificativa de LFA3-Fc M1d1 formulada em tampão Tris pH 7,5, tampão de histidina pH 5,8 ou tampão de glutamato pH 4,5.
[00237] Figura 28: Perfil de calorimetria de varredura diferencial (DSC) exemplificativo de LFA3-Fc M1d1 após digestão com Fabrica- tor-IdeS.
[00238] Figuras 29A-29C: Análise de heterogeneidade de carga exemplificativa de LFA3-Fc M1-d1 (também referida como LFA3-Fc M1d1) e WT LFA3-Fc (também referida como LFA3-Fc WT) formulada em 20 mM de tampão Tris pH 7,5 (Figura 29A), 20 mM de tampão de histidina, pH 5,8 (Figura 29B) ou 20 mM de tampão de glutamato, pH 4,5 (Figura 29C).
[00239] Figuras 30A-30C: Análise de eletroforese em gel capilar (CGE) não reduzida (NR) exemplificativa de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT formulada em tampão Tris pH 7,5 (Figura 30A), tampão de histidi- na pH 5,8 (Figura 30B) ou tampão de glutamato pH 4,5 (Figura 30C) no tempo 0 e após armazenamento a 40°C por 2 ou 4 semanas. A porcentagem de espécies de baixa massa molecular (LMMS) foi quan- tificada.
[00240] Figuras 31A-31D: Análise de cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC) exemplificativa de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT formulada em tampão Tris pH 7,5 (Figu- ra 31A), tampão de histidina pH 5,8 (Figura 31B) ou tampão de gluta- mato pH 4,5 (Figura 31C) no tempo 0 e após armazenamento a 40°C por 2 ou 4 semanas. A porcentagem de espécies de baixa massa mo- lecular (LMMS) (Figura 31D) e espécies de alta massa molecular (HMMS) (Figura 31A-31C) foi quantificada.
[00241] Figuras 32A-32D: Análise de cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC) exemplificativa de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT formulada em tampão Tris pH 7,5 (Figu- ra 32A), tampão de histidina pH 5,8 (Figura 32B) ou tampão de gluta- mato pH 4,5 (Figura 32C) no tempo 0 e após armazenamento a 25°C por 2, 4 ou 6 semanas. A porcentagem de espécies de baixa massa molecular (LMMS) (Figura 32D) e espécies de alta massa molecular (HMMS) (Figura 32A-32C) foi quantificada.
[00242] Figuras 33A-33D: Análise de cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC) exemplificativa de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT formulada em tampão Tris/sacarose pH 7,5 (Figura 33A), tampão de histidina/sacarose pH 5,8 (Figura 33B) ou tampão de glutamato/trealose pH 4,5 (Figura 33C) no tempo 0 e após armazenamento a 5°C por 2, 4 ou 6 semanas. A porcentagem de es- pécies de baixa massa molecular (LMMS) (Figura 33D) e espécies de alta massa molecular (HMMS) (Figuras 33A-33C) foi quantificada.
[00243] Figuras 34A-34B: LFA3-Fc M1d1 reduziu CD4+ TEM, e au- mentou a razão de Tregs/CD4+ TEM após a dosagem de repetição. Os dados exemplificativos são representados graficamente como altera- ção de dobra em comparação com as contagens de células pré-dose.
A média +/- SEM de 4 animais é mostrada.
[00244] Figuras 35A-35B: LFA3-Fc WT reduziu CD4+ TEM e aumen- tou a razão de Tregs/CD4+ TEM após a dosagem de repetição. Os da- dos exemplificativos são representados graficamente como alteração de dobra em comparação com as contagens de células pré-dose. Mé- dia +/- SEM de 4 animais é mostrada.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00245] São divulgada neste documento moléculas de polipeptídeo LFA3, por exemplo, moléculas de polipeptídeo LFA3 variante, por exemplo, moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3 variante, por exemplo, moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3-Fc variante, que se ligam a CD2, inibem uma atividade de CD2, e/ou depletam células que expressam CD2. Métodos de produzir moléculas de polipeptídeo LFA3, composições compreendendo essas moléculas de polipeptídeo LFA3, e métodos de uso dessas moléculas de polipeptídeo LFA3 são providos.
[00246] Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 da invenção têm propriedades de fabricação e estabilidade aprimoradas em relação a moléculas de polipeptídeo LFA3 de tipo sel- vagem. Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc variantes) da invenção têm elevada afinidade de ligação a CD2 em relação a moléculas de poli- peptídeo LFA3 de tipo selvagem (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc de tipo selvagem). Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc vari- antes) da invenção apresentam citotoxicidade aprimorada contra célu- las que expressam CD2 em relação a moléculas de polipeptídeo LFA3 de tipo selvagem (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc de tipo selvagem). Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc variantes) da inven-
ção exibem inibição aprimorada de resposta alogênica de células T em relação a moléculas de polipeptídeo LFA3 de tipo selvagem (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc de tipo selvagem). Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, prote- ínas de fusão LFA3-Fc variantes) da invenção apresentam uma depu- ração mais lenta in vivo em relação a moléculas de polipeptídeo LFA3 de tipo selvagem (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc de tipo selvagem).
[00247] Polinucleotídeos codificando moléculas de polipeptídeo LFA3 são providos. Células hospedeiras que expressam moléculas de polipeptídeo LFA3 são providos. Métodos de tratamento usando molé- culas de polipeptídeo LFA3 são providos. Em uma modalidade, tais métodos incluem métodos de tratar uma doença, distúrbio ou condição inflamatória. Em uma modalidade, tais métodos incluem métodos de tratar doenças em necessidade de imunossupressão, incluindo, mas sem limitação, doenças autoimunes. Em uma modalidade, tais méto- dos incluem métodos de tratar uma doença não imune inflamatória, tal como uma doença cardíaca ou uma doença cerebral.
[00248] Os títulos das seções usados neste documento são apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitan- tes do objeto descrito.
[00249] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de pa- tentes, publicações de patentes e números de Acesso Genbank são aqui incorporados por referência, como se cada referência individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência em sua totalidade.
[00250] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados neste documento são geralmente bem compreendidos e comumente empregados usando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, os métodos amplamente utilizados descritas em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. Ma- cPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, e ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthe- sis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Human Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); In- troduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather e P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, e D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds); Gene Transfer Vectors for Mammalian células (J. M. Miller e M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Anti- bodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Com- pany, 1993); e versões atualizadas dos mesmos.
[00251] Moléculas de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, moléculas de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) podem ser usadas na preven-
ção, tratamento e/ou melhoria de doenças, distúrbios ou condições incluindo, mas sem limitação, diabetes tipo 1, psoríase, psoríase em placas, pustulose palmoplantar, psoríase pustulosa de palmas e solas, pustulose palmar e plantar, pustulose de palmas e solas, dermatite atópica, líquen plano, doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), vitiligo, Pitiríase Rubra Pilar, transplante (por exemplo, transplante de órgão, por exemplo, transplante de rim), artrite psoriática, uma doença, distúrbio ou condição que requer transplante de células-tronco hema- topoiéticas alogênicas, talassemia, anemia falciforme, trombastenia de Glanzmann, síndrome de Wiskott-Aldrich, doença granulomatosa crô- nica, neutropenia congênita grave, deficiência de adesão de leucóci- tos, Síndrome de Schwachman-Diamond, anemia de Diamond- Blackfan, anemia Fanconi, disceratose congênita, síndrome de Chedi- ak-Higashi, anemia aplástica, alopecia areata, e linfoma de células T (por exemplo, linfoma de células T cutâneas ou linfoma não Hodgkin de células T periféricas). Doenças, distúrbios ou condições exemplifi- cativas adicionais são: diabetes mellitus (por exemplo, diabetes melli- tus tipo 1 ou diabetes mellitus dependente de insulinaa); diabetes ju- venil; respostas inflamatórias, tais como doenças de pele inflamatórias incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); der- matomiosite; esclerodermia sistêmica e esclerose; respostas associa- das a doença inflamatória intestinal (tais como doença de Crohn e coli- te ulcerativa); síndrome da dificuldade respiratória (incluindo síndrome da dificuldade respiratória no adulto; ARDS); dermatite; meningite; en- cefalite; uveíte; colite; gastrite; glomerulonefrite; condições alérgicas, tais como eczema e asma e outras condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; defici- ência de adesão de leucócitos; artrite reumatoide; lúpus eritematoso sistêmico (SLE); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tireoidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndroms de Sjogren; e respostas imunes associadas a hipersensibilidade aguda e tardia mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontrados em tuberculose, sar- coidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diape- dese leucocitária; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (CNS); síndrome de disfunção de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas sem limitação, crioglobinemia ou anemia Coombs- positivo); miastenia grave; doenças mediadas por complexo antígeno- anticorpo; doença antimembrana basal glomerular; síndrome antifosfo- lipídica; neurite alérgica; doença de Grave; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; pênfigo; poliendocrinopatias au- toimunea; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doen- ça de Bechet; arterite de células gigantes; nefrite do complexo imune; nefropatia de IgA; polineuropatias de IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombocitopenia imune e doenças hemolíticas autoi- munes; tireoidite de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoi- mune; síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS); uveoretinite au- toimune; síndrome de Guillain-Barre; síndrome de Goodpasture; do- ença mista do tecido conjuntivo; infertilidade autoimune; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopática; doença do enxerto ver- sus hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cin- tura-membro, Facioscapulohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss); e uma doença não imune inflamatória, tais como uma doença cardíaca ou uma doença cerebral. I. Definições
[00252] A presente invenção pode ser entendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada de modalidades exem- plificativas da invenção e os exemplos nela incluídos.
[00253] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação, in- cluindo definições, prevalecerá.
[00254] Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo con- texto ou expressamente indicado, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.
[00255] É entendido que os aspectos e modalidades da invenção descrita neste documento incluem "consistindo" e/ou "consistindo es- sencialmente em" aspectos e modalidades. Conforme usado neste do- cumento, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referên- cias no plural, a menos que indicado de outra forma.
[00256] Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", a menos que expressamente declarado ou compreendido por alguém versado na técnica. No contexto de uma reivindicação dependente múltipla, o uso de "ou" se refere a mais de uma reivindicação independente ou de- pendente anterior.
[00257] "Cerca de" ou "aproximadamente", quando usado em cone- xão com uma variável numérica mensurável, refere-se ao valor indica- do da variável e a todos os valores da variável que estão dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro do intervalo de confiança de 95% para a média) ou dentro de 10 por cento do valor indicado, o que for maior. Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo.
[00258] Não obstante as faixas numéricas e parâmetros que esta- belecem o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados com a maior precisão possível. Qualquer valor numérico, entretanto, con- tém inerentemente certos erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste. Além dis- so, todas os intervalos divulgados neste documento devem ser enten-
didos como abrangendo todos os subintervalos neles incluídos. Por exemplo, um intervalo declarado de "1 a 10" deve ser considerado pa- ra incluir qualquer e todos os subintervalos entre (e inclusive) o valor mínimo de 1 e o valor máximo de 10; isto é, todos os subintervalos começando com um valor mínimo de 1 ou mais, por exemplo, 1 a 6,1, e terminando com um valor máximo de 10 ou menos, por exemplo, 5,5 a 10.
[00259] Em toda esta especificação e reivindicações, a palavra "compreendem" ou variações, tais como "compreende" ou "compreen- dendo", será entendida como implicando a inclusão de um número in- teiro ou grupo de números inteiros declarado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. A menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Qual- quer exemplo que siga o termo "por exemplo" não pretende ser exaus- tivo ou limitante.
[00260] É entendido que, sempre que as modalidades forem descri- tas neste documento com a linguagem "compreendendo", modalidades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" também são fornecidas.
[00261] Onde os aspectos ou modalidades da invenção são descri- tos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alterna- tivas, a presente invenção abrange não apenas todo o grupo listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, mas também o grupo principal com ausência de um ou mais de seus membros. A presente invenção também prevê a exclusão explícita de um ou mais de quaisquer mem- bros do grupo na invenção reivindicada.
[00262] Deve ser entendido que a terminologia usada neste docu- mento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante. Nesta especificação e nas reivindica- ções que seguem, será feita referência a uma série de termos que de- vem ser definidos como tendo os seguintes significados.
[00263] O termo "molécula isolada" (onde a molécula é, por exem- plo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo) é uma molécula que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, (1) não é associada a componentes naturalmente associados que a acompanham em seu estado nativo, (2) é substancialmente livre de outras moléculas da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie dife- rente ou (4) não ocorre na natureza. Assim, uma molécula que seja sintetizada quimicamente ou expressa em um sistema celular diferente da célula da qual naturalmente se origina, será "isolada" de seus com- ponentes naturalmente associados. Uma molécula também pode se tornar substancialmente livre de componentes naturalmente associa- dos por isolamento, usando técnicas de purificação bem conhecidas na técnica. A pureza ou homogeneidade da molécula pode ser avalia- da por vários meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a pure- za de uma amostra de polipeptídeo pode ser avaliada utilizando eletro- forese em gel de poliacrilamida e coloração do gel para visualização do polipeptídeo utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Para certos fins, resolução mais alta pode ser fornecida usando HPLC ou outros meios bem conhecidos na técnica para purificação.
[00264] Como aqui utilizado, "substancialmente puro" significa que uma espécie de objeto é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição), e preferencialmente uma fração substanci- almente purificada é uma composição em que a espécie de objeto (por exemplo, uma glicoproteína) compreende pelo menos cerca de 50 por cento (em base molar) de todas as espécies macromoleculares pre- sentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compre-
enderá mais do que cerca de 80 por cento de todas as espécies ma- cromoleculares presentes na composição, mais preferencialmente mais do que cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Mais preferencialmente, a espécie de objeto é purificada até a homogeneidade essencial (es- pécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Em certas modalidades, um material substancialmente puro é pelo menos 50% puro (ou seja, livre de contaminantes), mais preferencialmente, pelo menos 90% puro, mais preferencialmente, pelo menos 95% puro, ain- da mais preferencialmente, pelo menos 98% puro, e mais preferenci- almente, pelo menos 99% puro.
[00265] O termo "identidade", como conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de po- lipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, determinada pela comparação das sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de parentesco entre sequências de polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico, conforme o caso, como determinado pela correspondência entre cadeias de nucleotídeo ou sequências de ami- noácido. "Identidade" mede a porcentagem de correspondências idên- ticas entre duas ou mais sequências com alinhamentos de lacunas endereçadas por um modelo matemático específico de programa de computador (isto é, "algoritmos").
[00266] O termo "similaridade" é um conceito relacionado, mas em contraste com "identidade", refere-se a uma medida de similaridade que inclui correspondências idênticas e correspondências de substitui- ção conservadora. Uma vez que as substituições conservadoras se aplicam a polipeptídeos e não a moléculas de ácido nucleico, a simila- ridade trata apenas de comparações de sequências de polipeptídeo. Se duas sequências de polipeptídeo tiverem, por exemplo, 10 de 20 aminoácidos idênticos, e o restante tiver substituições não conserva- doras, então a identidade percentual e similaridade seriam ambas de 50%. Se no mesmo exemplo houver mais 5 posições onde há substi- tuições conservadoras, então a identidade percentual permanece 50%, mas a similaridade percentual seria de 75% (15 de 20). Portanto, nos casos em que há substituições conservadoras, o grau de similaridade entre duas sequências de polipeptídeo será maior do que a porcenta- gem de identidade entre essas duas sequências.
[00267] Os "fragmentos" ou "porções" de polipeptídeo de acordo com a invenção podem ser feitos por truncamento, por exemplo, por remoção de um ou mais aminoácidos das extremidades de terminais N e/ou C de um polipeptídeo. Até 10, até 20, até 30, até 40 ou mais ami- noácidos podem ser removidos do N-terminal e/ou C dessa forma. Fragmentos também podem ser gerados por uma ou mais exclusões internas.
[00268] Uma molécula variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, até 10, até 20, até 30 ou mais substituições e/ou exclusões e/ou inserções de de aminoácido das sequências e fragmentos específicos discutidos acima. Variantes de "exclusão" podem compreender uma exclusão de aminoácidos individuais, exclusão de pequenos grupos de aminoáci- dos, tais como 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou exclusão de regiões de aminoácido maiores, tais como exclusão de domínios de aminoácido específicos ou outros recursos. Variantes de "inserção" podem com- preender a inserção de aminoácidos individuais, inserção de pequenos grupos de aminoácidos, tais como 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou inser- ção de regiões de aminoácido maiores, tais como a inserção de domí- nios de aminoácido específicos ou outros recursos. As variantes de "substituição" envolvem preferencialmente a substituição de um ou mais aminoácidos pelo mesmo número de aminoácidos e produzir substituições de aminoácido conservadoras. Por exemplo, um aminoá-
cido pode ser substituído por um aminoácido alternativo com proprie- dades semelhantes, por exemplo, outro aminoácido básico, outro ami- noácido ácido, outro aminoácido neutro, outro aminoácido carregado, outro aminoácido hidrofílico, outro aminoácido hidrofóbico, outro ami- noácido polar, outro aminoácido aromático ou outro aminoácido alifáti- co. Algumas propriedades dos 20 aminoácidos principais que podem ser usadas para selecionar substituintes adequados são as seguintes.
[00269] As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Substituições conservadoras exemplificativas são mostra- das na Tabela 1 sob o título de "substituições conservadoras". Substi- tuições adicionais denominadas "substituições exemplificativas" abaixo ou como ainda descrito abaixo em referência às classes de aminoáci- do, podem ser introduzidas e os produtos, analisados. Tabela 1. Aminoácidos e Substituições Resíduo original Substituições Substituições exemplifi- conservadoras cativas alanina Ala (A) Val (V) Val (V); Leu (L); Ile (I) arginina Arg (R) Lys (K) Lys (K); Gln (Q); Asn (N) asparagina Asn (N) Gln (Q) Gln (Q); His (H); Asp (D), Lys (K); Arg (R) ácido aspárticoAsp (D) Glu (E) Glu (E); Asn (N) cisteína Cys (C) Ser (S) Ser (S); Ala (A) glutamina Gln (Q) Asn (N) Asn (N); Glu (E) glutâmico Glu (E) Asp (D) Asp (D); Gln (Q) glicina Gly (G) Ala (A) Ala (A) histidina His (H) Arg (R) Asn (N); Gln (Q); Lys (K); Arg (R) isoleucina Ile (I) Leu (L) Leu (L); Val (V); Met (M); Ala (A); Phe (F); Norleu- cina (Nle)
Resíduo original Substituições Substituições exemplifi- conservadoras cativas leucina Leu (L) Ile (I) Norleucina (Nle); Ile (I); Val (V); Met (M); Ala (A); Phe (F) lisina Lys (K) Arg (R) Arg (R); Gln (Q); Asn (N) metionina Met (M) Leu (L) Leu (L); Phe (F); Ile (I) fenilalanina Phe (F) Tyr (Y) Leu (L); Val (V); Ile (I); Ala (A); Tyr (Y) prolina Pro (P) Ala (A) Ala (A) serina Ser (S) Thr (T) Thr (T) treonina Thr (T) Ser (S) Ser (S) triptofano Trp (W) Tyr (Y) Tyr (Y); Phe (F) tirosina Tyr (Y) Phe (F) Trp (W); Phe (F); Thr (T); Ser (S) valina Val (V) Leu (L) Ile (I); Leu (L); Met (M); Phe (F); Ala (A); Norleu- cina (Nle)
[00270] Modificações substanciais nas propriedades biológicas da molécula são realizadas pela seleção de substituições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura do es- queleto de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação helicoidal ou beta-folha, (b) da carga ou hidrofobici- dade da molécula no sítio alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns de cadeia lateral: i. Não polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; ii. Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; iii. Ácida (negativamente carregada): Asp, Glu; iv. Básica (positivamente carregada): Lys, Arg; v. Resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; e vi. Aromática: Trp, Tyr, Phe, His.
[00271] Substituições não conservadoras são feitas por meio de troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[00272] Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feita é a troca de uma ou mais cisteínas na molécula, que podem ser quimica- mente reativas, por outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Por exemplo, pode haver uma substituição de uma cisteína não canônica. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada da molécula também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir reticulações aberrantes. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína po- dem ser adicionadas à molécula para melhorar sua estabilidade.
[00273] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobu- lina. Como usado neste documento, o termo abrange não apenas anti- corpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também, a menos que especificado de outra forma, qualquer porção de ligação a antíge- no dos mesmos que compete com o anticorpo intacto por ligação es- pecífica, proteínas de fusão compreendendo uma porção de ligação a antígeno e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antí- geno. As porções de ligação a antígeno incluem, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, anticorpos de domínio (dAbs, por exemplo, anti- corpos de tubarão e camelídeo), fragmentos incluindo regiões de de- terminação de complementaridade (CDRs), anticorpos de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv, e polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que é su-
ficiente para conferir a ligação de antígeno específica ao polipeptídeo. Um diacorpo pode incluir um dímero não covalente de Fv de fragmento de cadeia simples (scFv) que consiste nas regiões variável de cadeia pesada (VH) e variável de cadeia leve (VL) conectadas por um pequeno ligante de peptídeo. Em outra modalidade, um diacorpo é uma cadeia simples (Fv)2 em que dois fragmentos de scFv são covalentemente li- gados um ao outro. Um triacorpo é, por exemplo, uma cadeia simples (Fv)2 em que três fragmentos de scFv são covalentemente ligados en- tre si.
[00274] Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe particular. Dependendo da sequência de ami- noácido de anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias delas podem ainda ser divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglo- bulinas são denominadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectiva- mente. As estruturas de subunidades e as configurações tridimensio- nais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[00275] Uma molécula que "preferencialmente se liga" ou "especifi- camente se liga" (aqui usada indistintamente) a um alvo é um termo bem compreendido na técnica, e os métodos para determinar tal liga- ção específica ou preferencial também são bem conhecidos na técni- ca. Uma molécula é dita exibir "ligação específica" ou "ligação prefe- rencial" se ela reage ou se associa mais frequentemente, mais rapi- damente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célu- la ou substância particular do que com células ou substâncias alterna- tivas. Uma molécula "especificamente se liga" ou "preferencialmente se liga" a um alvo se ela se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substân- cias. Além disso, uma molécula "especificamente se liga" ou "prefe- rencialmente se liga" a um alvo se ela se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração àquele alvo em uma amostra do que se liga a outras substâncias presentes na amos- tra. Por exemplo, uma molécula que especificamente ou preferencial- mente se liga a CD2 é uma molécula que se liga a CD2 com maior afi- nidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a uma proteína não CD2. É também entendido pela leitura desta definição, por exemplo, que uma molécula que especificamente ou preferencialmente se liga a um primeiro alvo pode ou não se ligar es- pecificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Assim, "liga- ção específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não neces- sariamente, referência à ligação significa ligação preferencial. "Ligação específica" ou "ligação preferencial" inclui um composto, por exemplo, uma proteína, um ácido nucleico e semelhantes, que reconhece e se liga a uma molécula específica, mas não substancialmente reconhece ou se liga a outras moléculas em uma amostra. Por exemplo, uma mo- lécula que reconhece e se liga a um ligando cognato ou parceiro de ligação (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo LFA3 que se liga a CD2) em uma amostra, mas não substancialmente reconhece ou se liga a outras moléculas na amostra, especificamente se liga àquele ligando cognato ou parceiro de ligação. Assim, sob condições de en- saio designadas, a porção de ligação especificada se liga preferenci- almente a uma molécula alvo particular e não se liga em uma quanti- dade significativa a outros componentes presentes em uma amostra de teste.
[00276] Uma variedade de formatos de ensaio pode ser usada para selecionar uma molécula que especificamente se liga a um alvo de in- teresse. Por exemplo, imunoensaio ELISA de fase sólida, imunopreci- pitação, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ), KinExA, classifi- cação de células ativadas por fluorescência (FACS), Octet™ (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA) e análise de Western blot estão entre muitos en- saios que podem ser usados para identificar uma molécula que especi- ficamente reage com um antígeno ou um receptor ou sua porção de ligação a ligando, que especificamente se liga a um ligando cognato ou parceiro de ligação. Tipicamente, uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal ou ruído de fundo, por exemplo, mais de 10 vezes o fundo, por exemplo, mais de 50 vezes o fundo, por exemplo, mais de 100 vezes o fundo, por exemplo, mais de 500 vezes o fundo, por exemplo, mais de 1000 vezes o fundo, por exemplo, mais de 10.000 vezes o fundo.
[00277] O termo "afinidade de ligação" é aqui utilizado como uma medida da força de uma interação não covalente entre duas molécu- las, por exemplo, uma molécula de polipeptídeo, e seu alvo. O termo "afinidade de ligação" é usado para descrever interações monovalen- tes (atividade intrínseca).
[00278] Adicionalmente, para determinar a afinidade de ligação de moléculas de polipeptídeo LFA3 a células que expressam CD2, expe- rimentos de ligação celular podem ser realizados para determinar a afinidade aparente. A afinidade aparente de ligação da molécula de polipeptídeo a células que expressam o alvo pode ser calculada como o EC50 de curvas de titulação de ligação de equilíbrio, em que a inten- sidade de fluorescência média geométrica (gMFI) da população de li- gação alvo é quantificada por citometria de fluxo.
[00279] A afinidade de ligação entre duas moléculas, por exemplo, uma molécula de polipeptídeo e seu alvo, através de uma interação monovalente, pode ser quantificada por determinação da constante de dissociação (KD). Por sua vez, a KD pode ser determinado por medição da cinética de formação e dissociação de complexo usando, por exemplo, o método de ressonância de plásmons de superfície (SPR) (Biacore). As constantes de taxa correspondentes à associação e dis- sociação de um complexo monovalente são referidas como constantes de taxa de associação ka (ou kon) e constante de taxa de dissociação kd (ou koff), respectivamente. KD refere-se a ka e kd através da equação KD = kd/ka. O valor da constante de dissociação pode ser determinado diretamente por métodos bem conhecidos e pode ser calculado mes- mo para misturas complexas por métodos, tais como aqueles, por exemplo, apresentados em Caceci et al. (1984, Byte 9: 340-362). Por exemplo, a KD pode ser estabelecida usando um ensaio de ligação de filtro de nitrocelulose de filtro duplo, como o divulgado por Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432). Outros en- saios padrão para avaliar a capacidade de ligação de ligandos a antí- genos alvo são conhecidos na técnica, incluindo por exemplo, ELISAs, Western blots, RIAs, e análise de citometria de fluxo e outros ensaios exemplificados em outro lugar neste documento. A cinética de ligação e a afinidade de ligação da molécula também podem ser avaliadas por ensaios padrão conhecidos na técnica, tais como Ressonância de Su- perfície de Plásmons (SPR), por exemplo, usando um sistema Biaco- re™ ou KinExA.
[00280] Um ensaio de ligação competitiva pode ser conduzido em que a ligação da molécula ao alvo é comparada à ligação do alvo por outro ligando daquele alvo, tal como um anticorpo ou um receptor so- lúvel que de outra forma se liga ao alvo. A concentração na qual ocor- re inibição de 50% é conhecida como Ki. Sob condições ideais, a Ki é equivalente à KD. O valor de Ki nunca será inferior ao da KD, então a medição de Ki pode ser convenientemente substituída para fornecer um limite superior para KD.
[00281] Seguindo a definição acima, as afinidades de ligação asso- ciadas com diferentes interações moleculares, por exemplo, compara- ção da afinidade de ligação de diferentes moléculas para um determi- nado alvo, podem ser comparadas por comparação dos valores de KD para os complexos individuais de molécula/alvo. Os valores de KD para parceiros de ligação podem ser determinados usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para determinar a KD é o uso de ressonância de plásmons de superfície, usando um sistema biossen- sor, tal como um sistema Biacore®.
[00282] Da mesma forma, a especificidade de uma interação pode ser avaliada por determinação e comparação do valor de KD para a interação de interesse, por exemplo, uma interação específica entre uma molécula e um alvo, com o valor de KD de uma interação não de interesse, por exemplo, uma molécula de controle conhecida por não se ligar ao alvo.
[00283] Como afirmado anteriormente em outro lugar neste docu- mento, a ligação específica pode ser avaliada com referência à ligação da molécula a uma molécula de controle que não é o alvo. Essa com- paração pode ser feita comparando a capacidade da molécula de se ligar ao alvo e a uma molécula de controle. Essa comparação pode ser feita conforme descrito acima em uma avaliação de KD ou Ki. A molé- cula de controle usada em tal comparação pode ser qualquer molécula que não seja o alvo. De preferência, a molécula de controle não é idêntica ao alvo. De preferência, a molécula de controle não é um fra- gmento do alvo. A molécula de controle usada para determinar a liga- ção específica pode não estar relacionada em estrutura ou função ao alvo. Por exemplo, a molécula de controle pode ser um material não relacionado ou material acompanhante no ambiente. A molécula de controle usada para determinar a ligação específica pode ser uma mo- lécula envolvida na mesma via in vivo que o alvo, isto é, CD2. Ao ga-
rantir que a molécula da invenção tenha especificidade para CD2 em relação a outra molécula, a reatividade cruzada in vivo indesejada po- de ser evitada.
[00284] A molécula da invenção pode reter a capacidade de se ligar a algumas moléculas que são relacionadas ao alvo.
[00285] Alternativamente, a molécula da invenção pode ter especifi- cidade para uma molécula alvo particular. Por exemplo, pode se ligar a uma molécula alvo como descrito neste documento, mas não pode se ligar ou pode se ligar com afinidade significativamente reduzida a uma molécula alvo diferente, como descrito neste documento. Por exemplo, um CD2 humano maduro pode ser usado como o alvo, mas a molécu- la que se liga ao alvo pode ser incapaz de se ligar a ou pode se ligar com menor afinidade a, por exemplo, outras proteínas CD2 de outras espécies, tais como outra CD2 de mamífero. Em algumas modalida- des, a molécula se liga a um CD2 humano e cinomolgo.
[00286] Uma proteína de "fusão" ou molécula de "fusão" é uma pro- teína em que um primeiro polipeptídeo é operacionalmente ligado, por exemplo, direta ou indiretamente, a um segundo polipeptídeo. Em al- gumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 aqui divulgada é uma proteína de fusão compreendendo um domínio de LFA3 opera- cionalmente ligado a um segundo polipeptídeo.
[00287] Uma proteína de "fusão Fc" ou molécula de "fusão Fc" é uma proteína em que um ou mais polipeptídeos são operacionalmente ligados, por exemplo, direta ou indiretamente, a um polipeptídeo Fc. Uma fusão Fc compreende a região Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão. Em algumas modalidades, a molécula de poli- peptídeo LFA3 aqui divulgada é uma proteína de fusão Fc compreen- dendo um domínio de LFA3 operativamente ligado a um polipeptídeo Fc.
[00288] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma se-
quência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compre- ende uma sequência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, mas retém pelo menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. De preferência, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma re- gião Fc de sequência nativa à região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoá- cido, e de preferência, de cerca de um a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc variante neste documento pre- ferencialmente possuirá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma re- gião Fc de um polipeptídeo de origem, e mais preferencialmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com o mesmo, mais preferencialmente, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo me- nos cerca de 99% de identidade de sequência com o mesmo.
[00289] Como é conhecido na técnica, uma "região constante" de um anticorpo refere-se à região constante da cadeia leve de anticorpo ou à região constante da cadeia pesada de anticorpo, sozinha ou em combinação.
[00290] Os termos "região Fc de IgG", "região Fc", "domínio Fc" e "Fc", conforme usado indistintamente neste documento, referem-se à porção de uma molécula de IgG que se correlaciona a um fragmento cristalizável obtido por digestão com papaína de uma molécula de IgG. Como usado neste documento, os termos referem-se à região cons- tante de um anticorpo excluindo o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante e ainda se referem a porções daquela região. As-
sim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina de regi- ão constante de IgA, IgD e IgG, e os últimos três domínios de imuno- globulina de região constante de IgE e IgM, e o N-terminal de dobradi- ça flexível desses domínios ou porções dos mesmos. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cγ2 e Cγ3 (C gama 2 e C gama 3) e a dobradiça entre Cγ1 (C gama 1) e Cγ2 (C gama 2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é geral- mente definida para compreender os resíduos C226 ou P230 ao seu C-terminalarboxil, em que a numeração é de acordo com o índice EU de Edelman et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85, con- forme descrito em Kabat et al., 1991. Tipicamente, o domínio Fc com- preende de cerca do resíduo de aminoácido 236 a cerca de 447 do domínio constante de IgG1 humana. Um exemplo de sequência de aminoácido de domínio Fc de IgG1 de tipo selvagem é estabelecido na SEQ ID NO: 31. O polipeptídeo Fc pode se referir a essa região isola- damente ou essa região no contexto de um anticorpo ou uma porção de ligação a antígeno do mesmo ou proteína de fusão Fc.
[00291] O domínio constante da cadeia pesada compreende a regi- ão Fc e ainda compreende o domínio CH1 e a dobradiça bem como os domínios CH2 e CH3 (e, opcionalmente, CH4 de IgA e IgE) da cadeia pesada de IgG.
[00292] Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exemplificativas incluem ligação a C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célu- la dependente de anticorpo; fagocitose; regulação negativa de recepto- res de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combina- da com um domínio de ligação e pode ser avaliada usando vários en-
saios conhecidos na técnica para avaliar tais funções efetoras.
[00293] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma se- quência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. As regiões Fc humanas de sequên- cia nativa incluem uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alótipos não A e A); região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc de IgG4 humana de sequência nativa, bem como suas variantes de ocorrência natural.
[00294] Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido.
[00295] "Receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcγR é um FcR humano nativo. Em algumas modalidades, um FcR é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcγRI, FcγRII e FcγRIII, incluindo variantes alélicas e for- mas alternativamente emendadas desses receptores. Os receptores FcγRII incluem FcγRIIA (um "receptor de ativação") e FcγRIIB (um "re- ceptor de inibição"), que têm sequências de aminoácido semelhante que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O re- ceptor de ativação FcγRIIA contém um motivo de ativação baseado em tirosina de imunorreceptor (IT AM) em seu domínio citoplasmático O receptor de inibição FcγRIIB contém um motivo de inibição baseado em imunorreceptor tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático, (ver, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são revistos, por exemplo, em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et ah, Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Ha- as et ah, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo
"FcR" neste documento.
[00296] O termo "receptor Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs mater- nas para o feto (Guyer et ah, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et ah, J. Immunol. 24:249 (1994)) e regulação de homeostase de imunoglo- bulinas. Métodos de medir a ligação a FcRn são conhecidos (ver, por exemplo, Ghetie e Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et ah, Nature Biotechnology, 15(7):637- 640 (1997); Hinton et ah, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al).
[00297] "Funções efetoras" referem-se a atividades biológicas atri- buíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isótipo de anti- corpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação de Clq e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação a re- ceptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação de células B.
[00298] "Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Em certas moda- lidades, as células expressam pelo menos FcγRIII e executam fun- ção(ões) efetora(s) de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células exterminadoras naturais (NK), monócitos, macrófa- gos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.
[00299] "Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticor- po" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig se- cretada ligada a receptores Fc (FcRs) presentes em certas células ci- totóxicas (por exemplo, células NK, neutrófilos e macrófagos) permi- tem que essas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula-alvo portadora de antígeno e, subsequentemente, matem a célula-alvo com citotoxinas. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam apenas FcγRIII, enquanto os monócitos ex- pressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR em células he- matopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito nas Patentes dos EUA Nºs. 5.500.362 ou
5.821.337 ou na Patente dos EUA Nº. 6,737.056 (Presta), pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem PBMC e células NK. Alternativamente ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como os divulgados em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Anticorpos adicionais com se- quências de aminoácido de região Fc alteradas e atividade de ADCC aumentada ou diminuída são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA Nº. 7.923.538 e Patente dos EUA Nº. 7.994.290.
[00300] Uma molécula (por exemplo, uma fusão Fc) tendo uma "ati- vidade de ADCC aumentada" refere-se a uma molécula que é mais eficaz na mediação de ADCC in vitro ou in vivo em comparação com uma molécula de referência, em que a molécula e a molécula de refe- rência diferem em pelo menos um aspecto estrutural, e quando as quantidades dessa molécula e da molécula de referência utilizadas no ensaio são essencialmente as mesmas. Em algumas modalidades, a atividade de ADCC será determinada usando o ensaio de ADCC in vitro como aqui divulgado, mas outros ensaios ou métodos para de- terminar a atividade de ADCC, por exemplo, em um modelo animal etc. são contemplados. Em algumas modalidades, uma molécula com atividade de ADCC aprimorada tem afinidade aprimorada para Fc ga- ma RIIIA. Em algumas modalidades, uma molécula com atividade de
ADCC aumentada tem afinidade aumentada para Fc gama RIIIA (V158). Em algumas modalidades, uma molécula com atividade de ADCC aprimorada tem afinidade aprimorada para Fc gama RIIIA (F158).
[00301] Uma molécula (por exemplo, uma fusão Fc) com afinidade de ligação FcR "alterada" ou atividade de ADCC é aquela que aumen- tou ou reduziu a atividade de ligação FcR e/ou atividade de ADCC em comparação com uma molécula de referência, em que a molécula e a molécula de referência diferem em pelo menos um aspecto estrutural. Uma molécula que "exibe ligação aumentada" a um FcR liga pelo me- nos um FcR com melhor afinidade do que a molécula de referência. Uma molécula que "exibe ligação reduzida" a um FcR, liga pelo menos um FcR com afinidade menor do que a molécula de referência. Tais moléculas que exibem ligação reduzida a um FcR podem possuir pou- ca ou nenhuma ligação apreciável a um FcR, por exemplo, 0-20 por cento de ligação ao FcR em comparação com uma região Fc de IgG de sequência nativa.
[00302] "Afinidade aumentada para Fc gama RIIIA" refere-se a uma molécula (por exemplo, uma fusão Fc) que tem maior afinidade para Fc gama RIIIA (também referida, em alguns casos, como CD 16a) do que uma molécula de referência, em que a molécula e a molécula de referência diferem em pelo menos um aspecto estrutural. Qualquer método adequado para determinar a afinidade para Fc gama RIIIA po- de ser usado. Em algumas modalidades, a afinidade para Fc gama RIIIA é determinada por um método descrito neste documento. Em al- gumas modalidades, uma molécula com afinidade aumentada para Fc gama RIIIA tem atividade de ADCC aumentada. Em algumas modali- dades, uma molécula com afinidade aumentada para Fc gama RIIIA tem afinidade aumentada para Fc gama RIIIA (V158). Em algumas modalidades, uma molécula com afinidade aumentada para Fc gama
RIIIA tem afinidade aumentada para Fc gama RIIIA (F158).
[00303] L-fucose, também referida como 6-desóxi-L-galactose, é um monossacarídeo que é um componente de alguns glicanos e glico- lipídíos ligados a N- e O- em animais. Ver Becker e Lowe, Glycobio- logy 13:41R-51R (2003). A fucose é tipicamente adicionada como uma modificação terminal a glicanos, incluindo glicanos anexados a antíge- nos de grupos sanguíneos, selectinas e anticorpos. A fucose pode ser ligada a glicanos através de ligações α(1,2)-, α(1,3)-, α(1,4)- e α(1,6) por fucosiltransferases específicas. As ligações α(1,2)-fucose são tipi- camente associadas aos antígenos do grupo sanguíneo H. Ligações α(1,3)- e α(1,4)-fucose são associadas a modificação de antígenos de LewisX. Ligações α(1,6)-fucose são associadas com moléculas de GlcNAc ligadas a N, tais como aquelas em anticorpos.
[00304] As porções de carboidrato da presente invenção serão des- critas com referência à nomenclatura comumente usada para a descri- ção de oligossacarídeos. Uma revisão da química dos carboidratos que usa essa nomenclatura é encontrada em Hubbard e Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. Essa nomenclatura inclui, por exem- plo, Man, que representa manose; GIcNAc, que representa 2-N- acetilglucosamina; Gal que representa galactose; Fuc para fucose; e Glc, que representa glicose. Ácidos siálicos são descritos pela notação abreviada NeuNAc, para ácido 5-N-acetilneuramínico, e NeuNGc para ácido 5-glicolilneuramínico (IUB-IUPAC Joint Commission on Bioche- mical Nomenclature, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3347-3351; (1982) J. Biol. Chem. 257: 3352).
[00305] As estruturas de carboidrato da presente invenção ocorrem na proteína expressa como oligossacarídeos ligados a N. "Glicosilação ligada a N" refere-se à fixação da porção carboidrato via GlcNAc a um resíduo de asparagina em uma cadeia de polipeptídeo. Todos os car- boidratos ligados a N contêm uma estrutura central comum Man 1-
6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R. Portanto, na estrutura cen- tral descrita, R representa um resíduo de asparagina da glicoproteína produzida. A sequência da proteína produzida conterá uma asparagi- na-X-serina, asparagina-X-treonina, e asparagina-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina (Asn-Xaa-Ser/Thr). Os carboi- dratos "ligados a O", ao contrário, são caracterizados por uma estrutu- ra central comum, que é o GalNAc ligado ao grupo hidroxil de uma tre- onina ou serina, mas nenhuma sequência de consenso é necessária. Dos carboidratos ligados a N, os mais importantes são os carboidratos ligados a N "complexos", tais como as estruturas "biantenárias" descri- tas neste documento.
[00306] Os versados na técnica reconhecerão que a imunoglobulina de glicoproteína G (IgG) é associada a três tipos de estruturas biante- nárias complexas contendo zero, um ou dois resíduos de galactose (Wormland et al., 1997, Biochemistry 36:1370-1380) comumente co- nhecido como G0, G1 e G2, respectivamente. Em relação às molécu- las de anticorpo humano da classe de IgG, cada uma tem um oligos- sacarídeo ligado a N anexado à cadeia lateral de amida de Asn 297 da curva β-4 da face interna do domínio CH2 da região Fc (Beale e Feins- tein, 1976, Q. Rev. Biophys. 9:253-259; Jefferis et al., 1995, Immunol. Letts. 44:111-117). A porção de oligossacarídeo ligada a Asn 297 do domínio CH2 de IgG é do tipo biantenário complexo tendo a estrutura central de hexassacarídeo identificada e resíduos de açúcar externos variáveis (ver Jefferis et al., 1997, supra; Wyss e Wagner, 1996, Cur- rent Opinions in Biotech. 7:409-416). A estrutura central (GIc- NAc2Man3GIcNAc) é típica de oligossacarídeos biantenários e é re- presentada esquematicamente na Figura 1.
[00307] Uma vez que cada estrutura núcleo pode ter uma bissetriz N-acetilglucoseamina, fucose de núcleo e sacarídeos externos de ga- lactose ou ácido siálico, há um total de 36 oligossacarídeos estrutu-
ralmente únicos que podem ocupar o sítio Asn 297 (Jefferis e Lund, supra). Também será reconhecido que, dentro de um domínio CH2 particular, a glicosilação em Asn 297 pode ser assimétrica devido a diferentes cadeias de oligossacarídeo ligadas a qualquer resíduo Asn 297 dentro do domínio Fc de cadeia dupla. Por exemplo, enquanto a cadeia pesada sintetizada dentro de uma única célula secretora de an- ticorpos pode ser homogênea em sua sequência de aminoácido, ela é geralmente glicosilada diferencialmente resultando em um grande nú- mero de glicoformas de Ig estruturalmente únicas.
[00308] Os principais tipos de estruturas de oligossacarídeo com- plexas, também denominados "glicoformas", encontrados no domínio CH2 da IgG são descritos na Publicação de Patente Internacional Nº. WO 99/22764 na página 7.
[00309] De acordo com a presente invenção, G0 refere-se a uma estrutura biantenária em que nenhum ácido siálico terminal (NeuAcs) ou Gales está presente, G1 refere-se a uma estrutura biantenária ten- do um Gal e nenhum NeuAcs, e G2 refere-se a uma estrutura biante- nária com dois Gals terminais e nenhum NeuAcs. Ver, por exemplo, a Figura 2, representando estruturas exemplificativas de G0, G1, G-1 e G2.
[00310] Molécula "afucosilada" (por exemplo, uma fusão Fc) ou uma molécula (por exemplo, uma fusão Fc) "sem fucose" refere-se a uma molécula de isótipo de IgGl ou IgG3 (por exemplo, uma fusão Fc) que carece de fucose em sua glicosilação de região constante. A gli- cosilação de IgGl ou IgG3 humana ocorre em Asn297 como o glicosi- lação de oligossacarídeo de complexo biantenário fucosilado central terminado com até 2 resíduos Gal. Em algumas modalidades, um anti- corpo fucosilado carece de fucose em Asn297. Essas estruturas são designadas como G0, G1 (a 1,6 ou a 1,3) ou resíduos de G2 glicano, dependendo da quantidade de resíduos Gal terminais. Ver, por exem-
plo, Raju, T. S., BioProcess Int. 1:44-53 (2003). A glicosilação do tipo CHO de anticorpo Fc é descrita, por exemplo, em Routier, F. FL, Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997).
[00311] Em algumas modalidades, a molécula "fucosil" ou "afucosi- lada", como aqui utilizado indistintamente (por exemplo, uma fusão Fc), se refere a uma molécula (por exemplo, uma fusão Fc) que foi gli- coprojetada para não ter fucose central. A molécula (por exemplo, fu- sões Fc) com teor de fucose reduzido em porções de glicano têm afi- nidade aumentada para FcγRIIIa (CD16) e, como resultado, possuem citotoxicidade celular dependente de atividade aumentada (ADCC). Moléculas de afucosil (por exemplo, fusões Fc) podem ser produzidas usando a linhagem celular Potelligent® CHOK1SV (Lonza Biologics), que não possui os dois alelos do gene responsável pela adição de fu- cose (α1,6-fucosiltransferase). As moléculas de afucosil ou fucose re- duzida (por exemplo, fusões Fc) também podem ser geradas modifi- cando as atividades de biossíntese de oligossacarídeo de várias ma- neiras. Por exemplo, a superexpressão de N-acetilglucosamina- transferase III (GnTIII) no aparelho de Golgi da linhagem celular de produção gera estruturas oligossacarídicas bissetadas associadas à região constante Fc da molécula e suprime a fucosilação. Em tais sis- temas de expressão, o nível de expressão de GnTIII se correlaciona com a geração de glicoformas de IgG1 afucosiladas e atividade de ADCC aumentada resultante. A fucosilação também pode ser diminuí- da em cultura celular pelo uso de análogos de açúcar, tais como, mas sem limitação, análogos de fucose, conforme descrito no WO 2012/019165. Assim, moléculas afucosiladas ou de fucose reduzida (por exemplo, fusões Fc) podem ser produzidas usando uma ampla variedade de métodos bem conhecidos na técnica.
[00312] Em algumas modalidades, uma molécula afucosilada (por exemplo, uma fusão Fc) tem afinidade aumentada para Fc gama RIIIA.
Em algumas modalidades, uma molécula afucosilada (por exemplo, uma fusão Fc) tem afinidade aumentada para Fc gama RIIIA (V158). Em algumas modalidades, uma molécula afucosilada (por exemplo, uma fusão Fc) tem afinidade aumentada para Fc gama RIIIA (F158).
[00313] "Glicoforma" refere-se a uma estrutura de oligossacarídeo complexa compreendendo ligações de várias unidades de carboidrato. Tais estruturas são descritas, por exemplo, em Essentials of Glycobio- logy Varki et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999), que também fornece uma revisão da no- menclatura glicobiológica padrão. Essas glicoformas incluem, mas sem limitação, G2, G1, G0, G-1, e G-2 (ver, por exemplo, Publicação de Patente Internacional Nº. WO 99/22764).
[00314] "Padrão de glicosilação" é definido como o padrão de uni- dades de carboidrato que são covalentemente ligadas a uma proteína (por exemplo, a glicoforma), bem como ao(s) sítio(is) em que a(s) gli- coforma(s) é(são) covalentemente ligada(s) ao esqueleto de peptídeo de uma proteína, mais especificamente a uma proteína de imunoglo- bulina.
[00315] "Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" re- fere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ati- vação da via clássica de complemento é iniciada pela ligação do pri- meiro componente do sistema do complemento (Clq) a anticorpos (da subclasse apropriada), que são ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), podem ser realizados. Anticorpos com sequências de aminoácido de região Fc alterada e capacidade de ligação de Clq au- mentada ou reduzida são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA Nº. 6.194.551 B1, Patente dos EUA Nº. 7.923.538, Patente dos EUA Nº. 7.994.290 e WO 1999/51642. Veja também, por exemplo, Idusogie et al, J.
[00316] Como aqui utilizado, os termos "aminoácido de tipo selva- gem" e "sequência de tipo selvagem" referem-se a uma sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos que ocorre naturalmente dentro de uma determinada população (por exemplo, seres humanos, camun- dongos, ratos, células etc.).
[00317] "Antígeno associado a função linfocitária 3" ou "LFA3", usado indistintamente neste documento, também referido na técnica como "CD58", é um membro da superfamília de imunoglobulinas. O termo LFA3 inclui homólogos e ortólogos de LFA3, incluindo humanos, de macaco cinomolgo, rato, coelho e camundongo, entre outros. Como aqui utilizado, "LFA3" refere-se a um LFA3 de mamífero, tal como hu- mano, de rato ou camundongo, bem como LFA3 de primata não hu- mano, bovino, ovino ou porcino. Um exemplo não limitante de LFA3 é LFA3 humano (ver, por exemplo, UniProtKB Número de Acesso P19256, SEQ ID NO: 2). O termo "LFA3" também abrange fragmentos, variantes, isoformas e outros homólogos de tais moléculas de LFA3. As moléculas de LFA3 variantes serão geralmente caracterizadas por terem o mesmo tipo de atividade que o LFA3 de ocorrência natural, tal como a capacidade de se ligar a CD2.
[00318] Um "domínio de LFA3" refere-se a um fragmento de LFA3 ou uma variante deste. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 não tem mais do que 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 ou 180 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 é derivado do primeiro domínio extracelular de LFA3. Em algu- mas modalidades, o domínio de LFA3 compreende não mais do que 6, 10, 15, 20 ou 30 mutações de aminoácido (por exemplo, substituições, adições ou exclusões) em relação à sequência LFA3 de tipo selvagem.
[00319] "CD2", também referido na técnica como "receptor de eri- trócitos", "receptor de LFA-3", "receptor de roseta" ou "antígeno de su-
perfície de célula T T11/Leu-5" é uma molécula expressa em células, tais como células T e células NK. O termo CD2 inclui homólogos e or- tólogos de CD2, incluindo humano, macaco cinomolgo, rato, coelho e camundongo, entre outros. Como usado neste documento, "CD2" refe- re-se a um CD2 de mamífero, tal como CD2 humano, rato ou camun- dongo, bem como primata não humano, bovino, ovino ou porcino. Um exemplo não limitante de CD2 é CD2 humano (ver, por exemplo, Uni- ProtKB Número de Acesso P06729, SEQ ID NO: 121). O termo "CD2" também abrange fragmentos, variantes, isoformas e outros homólogos de tais moléculas de CD2. As moléculas de CD2 variantes geralmente serão caracterizadas por terem o mesmo tipo de atividade que CD2 de ocorrência natural.
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRK EKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIF DLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQR VITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLDIYLIIGICGG GSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPH
QIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKR PPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN (SEQ ID NO: 121).
[00320] Conforme descrito em outro lugar neste documento, certas posições de uma molécula de polipeptídeo podem ser alteradas. "Po- sição", conforme usado neste documento, significa um local na se- quência de uma proteína. As posições podem ser numeradas sequen- cialmente ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo, o índice EU e o índice Kabat podem ser usados para numerar resíduos de aminoácido de um anticorpo.
[00321] Como conhecido na técnica, "polinucleotídeo" ou "ácido nu- cleico", conforme usados indistintamente aqui, referem-se a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nu- cleotídeos ou bases modificadas, e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado em uma cadeia por DNA ou RNA polimerase.
Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modi- ficados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos.
Se presen- te, a modificação na estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida an- tes ou após a montagem da cadeia.
A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos.
Um polinucleotí- deo pode ser ainda modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
Outros tipos de modifi- cações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações in- ternucleotídicas, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamida- tos, carbamatos etc.) e ligações carregadas (por exemplo, fosforotioa- tos, fosforoditioatos etc.), aqueles contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anti- corpos, peptídeos sinal, poli-L-lisina etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno etc.), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxil normalmente presentes nos açúcares pode ser substi- tuído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão ou ativados para preparar ligações adi- cionais a nucleotídeos adicionais ou podem ser conjugados a suportes sólidos.
O terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou porções de grupo de cobertura orgânicas de 1 a 20 átomos de carbono.
Outros hidroxis também podem ser derivatizados em gru-
pos de proteção padrão. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são ge- ralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'- O-alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclicos, açúcares alfa ou beta-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de fura- nose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tais como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses gru- pos de ligação alternativos incluem, mas sem limitação, modalidades em que fosfato é substituído por P(O)S("tioato"), P(S)S("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquil substituído ou não substituído (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.
[00322] Como aqui utilizado, "vetor" significa um constructo, que é capaz de entregar, e, de preferência, expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de ve- tores incluem, mas sem limitação, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, vetores de plasmídeo, cosmídeo ou fago, veto- res de expressão de DNA ou RNA associados a agentes de conden- sação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produ- toras.
[00323] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cul- tura celular que pode ser ou ter sido receptora de vetor(es) para incor- poração de inserções de polinucleotídeo. Células hospedeiras incluem progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ne- cessariamente ser completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula-mãe original devido a muta- ção natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui cé- lulas transfectadas e/ou transformadas in vivo com um polinucleotídeo desta invenção.
[00324] As células hospedeiras podem ser células procarióticas ou células eucarióticas. Células eucarióticas exemplificativas incluem cé- lulas de mamífero, tais como células de animais primatas ou não pri- matas; células fúngicas, tais como levedura; células de plantas; células de inseto.
[00325] Qualquer célula hospedeira suscetível à cultura celular e à expressão de proteínas ou polipeptídeos pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, a célula hospedeira é de mamífero. As linhagens celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC). Células de mamíferos exemplificati- vas não limitantes incluem, mas sem limitação, células NS0, células HEK 293 e de ovário de hamster chinês (CHO), e seus derivados, tais como células 293-6E e CHO DG44, CHO DXB11, e células Potelli- gent® CHOK1SV (BioWa/Lonza, Allendale, NJ). As células hospedei- ras de mamíferos também incluem, mas sem limitação, células de car- cinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2), células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10), células de rim de macaco (COS) e células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2). Outros exemplos não limitantes de células de mamífero que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem retinoblastos humanos (PER.C6®; CruCell, Leiden, Holanda); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha-
gem 293 de rim embrionário humano (HEK 293) ou células 293 sub- clonadas para crescimento em cultura em suspensão (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36:59); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23: 243-251); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO- 76, ATCC CRL-1 587); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); células MRC 5; células FS4; uma linhagem de hepa- toma humano (Hep G2); e várias linhagens celulares de mieloma, in- cluindo, mas sem limitação, linhagem de mieloma de camundongo BALB/c (NS0/1, ECACC No: 85110503), células NS0 e células Sp2/0.
[00326] Adicionalmente, qualquer número de linhagens celulares comercialmente e não comercialmente disponíveis que expressam po- lipeptídeos ou proteínas podem ser utilizadas de acordo com a presen- te invenção. Um versado na técnica apreciará que diferentes linhagens celulares podem ter diferentes requisitos de nutrição e/ou podem exigir diferentes condições de cultura para um crescimento ideal e expressão de polipeptídeo ou proteína, e será capaz de modificar as condições conforme necessário.
[00327] A invenção inclui qualquer sistema de expressão eucarióti- ca conhecido na técnica ou divulgado aqui para a produção de proteí- nas de interesse, tais como expressão em um sistema de células de inseto, um sistema de expressão de levedura ou um sistema de célu- las de mamífero, tal como, mas sem limitação, células CHO.
[00328] Como aqui utilizado, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível ou um intensificador. A sequência de controle de expressão é operativamente ligada à sequência de ácido nucleico a ser transcrita.
[00329] O termo "peptídeo líder" ou "sequência líder" ou "sequência sinal líder", conforme usado indistintamente aqui, significa qualquer sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácido assim codifi- cada, que pode estar presente na extremidade 5' de uma molécula de ácido nucleico e/ou em ou próximo ao N-terminal de um polipeptídeo, que, quando presente, pode mediar o transporte do polipeptídeo para uma organela de destino, incluindo, mas sem limitação, a secreção do polipeptídeo de uma célula. Essas sequências líderes incluem, mas sem limitação, sequências de ácido nucleico compreendendo, por exemplo,
ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTCTTTCTGGTGGCCACAGCTACC GGAGTGCATAGC (SEQ ID NO: 42), e
ATGGTTGCTGGGAGCGACGCGGGGCGGGCCCTGGGGGTCCTCA GCGTGGTCTGCCTGCTGCACTGCTTTGGTTTCATCAGCTGT (SEQ ID NO: 130), e sequências de aminoácido codificada desse modo, tais como, mas sem limitação, mgwsciilflvatatgvhs (SEQ ID NO: 15), e mvagsdagral- gvlsvvcllhcfgfisc (SEQ ID NO: 129). A invenção abrange estes e quaisquer outros sinais líderes (sequências de aminoácido e ácido nu- cleico) conhecidos na técnica ou a serem identificados que possam resultar no transporte de um polipeptídeo até a organela desejada, por exemplo, o retículo endoplasmático, e/ou secretado da célula. Geral- mente, o peptídeo sinal é removido do polipeptídeo maduro.
[00330] Conforme usado neste documento, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Pa- ra os fins desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: melhora da taxa de sobrevivência (redução da mortalidade), redução da resposta inflamatória à doença, redução da quantidade de fibrose tecidual, me- lhora no aparecimento das lesões de doença, limitação das lesões pa- tológicas a locais focais, diminuição da extensão dos danos da doen- ça, diminuição da duração da doença, e/ou redução do número, exten- são ou duração dos sintomas relacionados à doença . O termo inclui a administração dos compostos ou agentes da presente invenção para prevenir ou retardar o início dos sintomas, complicações ou indícios bioquímicos de uma doença, aliviando os sintomas ou interrompendo ou inibindo ainda o desenvolvimento da doença, condição ou distúrbio. O tratamento pode ser profilático (para prevenir ou retardar o apareci- mento da doença ou prevenir a manifestação de sintomas clínicos ou subclínicos) ou supressão terapêutica ou alívio dos sintomas após a manifestação da doença.
[00331] "Melhorar" significa a diminuição ou melhoria de um ou mais sintomas em comparação com a não administração de uma mo- lécula de polipeptídeo LFA3. "Melhorar" também inclui encurtamento ou redução da duração de um sintoma.
[00332] Como aqui utilizado, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para afetar qualquer um ou mais resultados be- néficos ou desejados. Em aspectos mais específicos, a quantidade eficaz previne, alivia ou melhora os sintomas da doença ou infecção, e/ou prolonga a sobrevida do indivíduo em tratamento. Para uso profi- lático, os resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou redu- zir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da doença, incluin- do sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doen- ça, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêu- tico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos,
tais como reduzir um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição, reduzir a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, aumentar o efeito de outro medicamento, e/ou retardar a progressão da doença de pacientes. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta in- venção, uma dosagem eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar um tratamento profilático ou terapêutico, direta ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um agente único pode ser con- siderado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável possa ser for alcançado.
[00333] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero, mais preferen- cialmente, um ser humano. Os mamíferos também incluem, mas sem limitação, animais de fazenda (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, galinhas etc.), animais de esporte, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos. Em certas modalidades, o indivíduo tem uma doença, distúrbio ou condição autoimune, tal como diabetes tipo 1 ou artrite psoriática. Em certas modalidades, o indiví- duo está em necessidade de terapia de imunossupressão.
[00334] Conforme usado neste documento, "veículo farmaceutica- mente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha a atividade biológica e seja não rea- tivo com o sistema imune do indivíduo. Os exemplos incluem, mas sem limitação, quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais co-
mo uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões, tais como emulsão de óleo/água e vários tipos de agentes umectantes. Os diluentes preferidos para aerossol ou administração parenteral são so- lução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina normal (0,9%). Composições compreendendo tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (ver, por exemplo, Re- mington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ª Ed. Mack Publishing, 2000).
[00335] Métodos e materiais exemplificativos são descritos neste documento, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento também possam ser utilizados na prá- tica ou teste da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. II. Variantes LFA3
[00336] A presente invenção refere-se a variantes de LFA3, por exemplo, variantes de LFA3 humano que se ligam a CD2 humano. Em algumas modalidades, as variantes de LFA3 contêm uma ou mais mu- tações que aumentam suas propriedades de estabilidade e capacida- de de fabricação. Em algumas modalidades, as variantes de LFA3 contêm uma ou mais mutações que aumentam sua afinidade de liga- ção a CD2. Em algumas modalidades, as variantes LFA3 (por exem- plo, proteínas de fusão LFA3-Fc variante) contêm uma ou mais muta- ções que aumentam a citotoxicidade contra células que expressam CD2. Em algumas modalidades, as variantes de LFA3 (por exemplo, proteínas de fusão LFA3-Fc variantes) contêm uma ou mais mutações que aumentam a inibição de resposta alogênica de células T. Em al- gumas modalidades, as variantes de LFA3 contêm uma ou mais muta- ções que levam a uma depuração mais lenta das moléculas in vivo. Sequências exemplificativas de LFA3 de tipo selvagem e variantes de
LFA3, incluindo proteínas de fusão LFA3-Fc, são fornecidas na Tabela 2 e Tabela 3.
[00337] Em outras modalidades, onde o polipeptídeo Fc projetado compreende um resíduo de aminoácido de lisina (K) de C-terminal (por exemplo, cadeia pesada de IgG1 humana compreende uma lisina ter- minal), um versado na técnica compreenderia que o resíduo de lisina pode ser cortado resultando em uma proteína de fusão sem o resíduo de lisina de C-terminal. Assim, em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc compreendendo um polipeptídeo Fc projetado compreen- de um polipeptídeo onde a lisina terminal de outra forma presente não está presente. Tabela 2. Sequências de aminoácido exemplificativas de LFA3 de tipo selvagem e variantes de LFA3. SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 1 Isoforma de mvagsdagralgvlsvvcllhcfgfiscFSQ LFA3 humano1 QIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKE (P19256) com VLWKKQKDKVAELENSEFRAFS peptídeo sinal SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSS (sublinhado, DEDEYEMESPNITDTMKFFLYVL itálico) ESLPSPTLTCALTNGSIEVQCMI
PEHYNSHRGLIMYSWDCPMEQ CKRNSTSIYFKMENDLPQKIQCT LSNPLFNTTSSIILTTCIPSSGHS RHRYALIPIPLAVITTCIVLYMNGI LKCDRKPDRTNSN
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 2 Isoforma de FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP LFA3 humano1 LKEVLWKKQKDKVAELENSEFR (P19256) sem AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL peptídeo sinal TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL
YVLESLPSPTLTCALTNGSIEVQ CMIPEHYNSHRGLIMYSWDCPM EQCKRNSTSIYFKMENDLPQKIQ CTLSNPLFNTTSSIILTTCIPSSG HSRHRYALIPIPLAVITTCIVLYMN
GILKCDRKPDRTNSN SEQ ID NO: 3 Isoforma de FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP LFA3 humano1 LKEVLWKKQKDKVAELENSEFR domínio 1 AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL
TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL
YV SEQ ID NO: 4 WT LFA3-Fc FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP (também LKEVLWKKQKDKVAELENSEFR referido como AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL "LFA3-Fc WT" TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL YVdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvd gvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqd wlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqp repqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdi avewesngqpennykttppvldsdgsfflys kltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytq kslslspgk
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 120 WT LFA3-Pfe FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVAELENSEFR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL
TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL YVdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkd tlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvd gvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqd wlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqp repqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyps diavewesngqpennykttppvldsdgsffl yskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhy tqkslslspg SEQ ID NO: 15 Sequência líder mgwsciilflvatatgvhs de proteínas de fusão LFA3-Fc SEQ ID NO: 16 Dobradiça-Pfe dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmi (IgG1 Fc srtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgve humana) vhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwln gkeykckvsnkalpapiektiskakgqprep qvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdia vewesngqpennykttppvldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqk slslspg SEQ ID NO: 17 M1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTFKFFL
YV SEQ ID NO: 18 M2 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEFESPNITDTFKFFL YV
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 19 M3 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR VFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTFKFFL
YV SEQ ID NO: 20 M4 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR VFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEFESPNITDTFKFFL
YV SEQ ID NO: 21 M5 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEIR VFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEFESPNITDTFKFFL
YV SEQ ID NO: 22 M6 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVLEFENSELR VFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEFESPNITDTFKFFL
YV SEQ ID NO: 23 M7 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL
YV SEQ ID NO: 24 d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVAELENSEFR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL
YVL SEQ ID NO: 25 d3 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVAELENSEFR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL YVLESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 26 M1d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTFKFFL
YVL SEQ ID NO: 27 M1d3 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTFKFFL
YVLESLPS SEQ ID NO: 28 M4d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR VFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEFESPNITDTFKFFL
YVL SEQ ID NO: 29 M7d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESPNITDTMKFFL
YVL SEQ ID NO: 30 CM1d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESRNGGPDFKFF
LYVL SEQ ID NO: 31 CM2d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESRNPYRRFKFF
LYVL SEQ ID NO: 32 CM3d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESRNPYRDFKFF LYVL
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 33 CM4d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESWNGGPDFKF
FLYVL SEQ ID NO: 34 CM5d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESWNPYRRFKFF
LYVL SEQ ID NO: 35 CM6d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESWNPYRDFKFF
LYVL SEQ ID NO: 36 ML1d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMEGRYPYESFKFF
LYVL SEQ ID NO: 37 ML2d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR VFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEFESWEPGREFKFF
LYVL SEQ ID NO: 38 ML3d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMEARYPYRQFKFF
LYVL SEQ ID NO: 39 ML4d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMEMRNGGPDFKF FLYVL
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 40 ML5d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMEARDGGPDFKFF
LYVL SEQ ID NO: 41 ML6d1 FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP
LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESWSPYKAFKFF
LYVL SEQ ID NO: 69 Proteína de FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP fusão LFA3-Fc LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR M1d1 (também AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL referido como TSSDEDEYEMESPNITDTFKFFL "LFA3-Fc YVLdkthtcppcpapellggpsvflfppkpk M1d1", "M1d1", dtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyv "M1-d1" ou dgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq "M1d1-Pfe") dwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgq prepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyp sdiavewesngqpennykttppvldsdgsff lyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnh ytqkslslspg
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 70 Biblioteca de FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP contato LKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8N consenso #1 SX9FX10AX11X12SFKNRVYLDTVS GSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13N X14TX15TMKFFLYVX16, em que: X1 é qualquer aminoácido, X2 é qualquer aminoácido, X3 é qualquer aminoácido, X4 é qualquer aminoácido, X5 é qualquer aminoácido, X6 é qualquer aminoácido, X7 é qualquer aminoácido, X8 é qualquer aminoácido, X9 é qualquer aminoácido, X10 é qualquer aminoácido, X11 é qualquer aminoácido, X12 é qualquer aminoácido, X13 é qualquer aminoácido, X14 é qualquer aminoácido, X15 é qualquer aminoácido, e X16 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 71 Biblioteca de FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP contato LKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8N consenso #2 SX9FX10AX11X12SFKNRVYLDTVS GSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13N X14TX15TMKFFLYVX16, em que: X1 é D, E, N, K, Q ou H, X2 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X3 é K, R, M, T, Q ou N, X4 é K, R, M, T, Q ou N, X5 é D, E, N, K, Q ou H, X6 é K, R, M, T, Q ou N, X7 é D, E, N, K, Q ou H, X8 é D, E, N, K, Q ou H, X9 é D, E, N, K, Q ou H, X10 é K, R, M, T, Q ou N, X11 é F, Y, L, H, I, N, V, D, A ou Y, X12 é S, T, A ou G, X13 é P, L, H, R ou A, X14 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X15 é D, E, N, K, Q ou H, e X16 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 72 Biblioteca de FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP contato LKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8N consenso #3 SX9FX10AX11X12SFKNRVYLDTVS GSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13N X14TX15TMKFFLYVX16, em que: X1 é D, E, N, K, Q ou H, X2 é F, I, L ou V, X3 é K, R, M ou T, X4 é K, R, M ou T, X5 é D, E, N, K, Q ou H, X6 é K, R, M ou T, X7 é D, E, N, K, Q ou H, X8 é D, E, N, K, Q ou H, X9 é D, E, N, K, Q ou H, X10 é K, R, M ou T, X11 é F, Y, L, H, I, N, V ou D, X12 é S, T, A ou G, X13 é P, L, H ou R, X14 é F, I, L ou V, X15 é D, E, N, K, Q ou H, e X16 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 73 Biblioteca de FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNV núcleo PX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8EN consenso #1 SEX9RX10FSSFKNRVYX11DTVS X12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ES PNITDTX15KX16FLYVX17, em que: X1 é qualquer aminoácido, X2 é qualquer aminoácido, X3 é qualquer aminoácido, X4 é qualquer aminoácido, X5 é qualquer aminoácido, X6 é qualquer aminoácido, X7 é qualquer aminoácido, X8 é qualquer aminoácido, X9 é qualquer aminoácido, X10 é qualquer aminoácido, X11 é qualquer aminoácido, X12 é qualquer aminoácido, X13 é qualquer aminoácido, X14 é qualquer aminoácido, X15 é qualquer aminoácido, X16 é qualquer aminoácido, e X17 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 74 Biblioteca de FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNV núcleo PX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8EN consenso #2 SEX9RX10FSSFKNRVYX11DTVS X12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ES PNITDTX15KX16FLYVX17, em que: X1 é F, I, L, V, A ou Y, X2 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X3 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X4 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X5 é W, F, L, C ou Y, X6 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X7 é A, V, S, L ou I, X8 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X9 é F, I, L, V, A ou Y, X10 é A, V, S, L ou I, X11 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X12 é S, T, A ou G, X13 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X14 é M, L, I ou F, X15 é M, L, I ou F, X16 é F, I, L, V, A ou Y, e X17 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 75 Biblioteca de FSQQIYGVVYGNVTX1HX2PSNV núcleo PX3KEX4LX5KKQKDKX6X7EX8EN consenso #3 SEX9RX10FSSFKNRVYX11DTVS X12SX13TIYNLTSSDEDEYEX14ES PNITDTX15KX16FLYVX17, em que: X1 é F, I, L ou V, X2 é F, I, L ou V, X3 é F, I, L ou V, X4 é F, I, L ou V, X5 é W, F, L ou C, X6 é F, I, L ou V, X7 é A, V, S ou L, X8 é F, I, L ou V, X9 é F, I, L ou V, X10 é A, V, S ou L, X11 é F, I, L ou V, X12 é S, T, A ou G, X13 é F, I, L ou V, X14 é M, L, I ou F, X15 é M, L, I ou F, X16 é F, I, L ou V, e X17 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 76 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #1 LKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX 3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6K FFLYVX7, em que: X1 é qualquer aminoácido, X2 é qualquer aminoácido, X3 é qualquer aminoácido, X4 é qualquer aminoácido, X5 é qualquer aminoácido, X6 é qualquer aminoácido, e X7 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 77 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #2 LKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX 3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6K FFLYVX7, em que: X1 é A, V, S, L ou I, X2 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X3 é F, I, L, V, A ou Y, X4 é A, V, S, L ou I, X5 é M, L, I ou F, X6 é M, L, I ou F, e X7 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 78 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #3 LKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX 3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6K FFLYVX7, em que: X1 é A, V, S ou L, X2 é F, I, L ou V, X3 é F, I, L ou V, X4 é A, V, S ou L, X5 é M, L, I ou F, X6 é M, L, I ou F, e X7 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 79 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #4 LKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX 3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX5ESPNITDTX6K FFLYVX7, em que: X1 é V, L ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I, L ou F, X4 é A, V ou S, X5 é M, F, I ou L, X6 é F, M, I ou L, e X7 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 80 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #5 LKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2 RX3FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX4ESPNITDTX5K FFLYVX6, em que: X1 é V ou L, X2 é V, I ou L, X3 é A ou V, X4 é M ou F, X5 é F ou M, e X6 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 81 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #6 LKEVLWKKQKDKVX1EFENSEX2 RX3FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX4ESPNITDTFKF FLYVX5, em que: X1 é V ou L, X2 é V, I ou L, X3 é A ou V, X4 é M ou F, e X5 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 82 Hotspot FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP consenso #7 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEX1 RX2FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX3ESPNITDTFKF FLYVX4, em que: X1 é V ou I, X2 é A ou V, X3 é M ou F, e X4 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 83 Região de loop SPNITDT de LFA3 de tipo selvagem SEQ ID NO: 84 Loop consenso X1X2X3X4X5X6X7, em que: #1 X1 é S, G, A, M ou T, X2 é R, W, P ou A, X3 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R X4 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X5 é Y, G, T ou S, X6 é R, E, K, P, D ou N, e X7 é R, D, S, Q, A, E, T ou S SEQ ID NO: 85 Loop consenso X1X2X3X4X5X6X7, em que: #2 X1 é S, G, A ou M, X2 é R, W ou P, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P, G ou I, X5 é Y, G ou T, X6 é R, E, K, P ou D, e X7 é R, D, S, Q, A, E ou T
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 86 Loop consenso X1X2X3X4X5X6X7, em que: #3 X1 é S, G, A ou M, X2 é R ou W, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P ou G, X5 é Y ou G, X6 é R, E, K ou P, e X7 é R, D, S, Q, A ou E SEQ ID NO: 87 Loop consenso SX1NX2X3X4X5, em que: #4 X1 é R, W, P ou A, X2 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X3 é Y, G, T ou S, X4 é R, P, D ou N, e X5 é R, D, T ou S SEQ ID NO: 88 Loop consenso SX1NX2X3X4X5, em que: #5 X1 é R, W ou P, X2 é P, G ou I, X3 é Y, G ou T, X4 é R, P ou D, e X5 é R, D ou T SEQ ID NO: 89 Loop consenso SX1NX2X3X4X5, em que: #6 X1 é R ou W, X2 é P ou G, X3 é Y ou G, X4 é R ou P, e X5 é R ou D
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 90 Loop consenso X1X2X3X4X5X6X7, em que: #7 X1 é S, G, A, M ou T, X2 é R, W, P ou A, X3 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R X4 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X5 é Y, G, T ou S, X6 é R, E, K, P, D ou N, e X7 é D, S, Q, A, E, T ou S SEQ ID NO: 91 Loop consenso X1X2X3X4X5X6X7, em que: #8 X1 é S, G, A ou M, X2 é R, W ou P, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P, G ou I, X5 é Y, G ou T, X6 é R, E, K, P ou D, e X7 é D, S, Q, A, E ou T SEQ ID NO: 92 Loop consenso X1X2X3X4X5X6X7, em que: #9 X1 é S, G, A ou M, X2 é R ou W, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P ou G, X5 é Y ou G, X6 é R, E, K ou P, e X7 é D, S, Q, A ou E
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 93 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #10 LKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX 3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10 X11X12X13KFFLYVX14, em que: X1 é V, L ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I, L ou F, X4 é A, V ou S, X5 é M, F, I ou L, X6 é S, G, A ou M, X7 é R ou W, X8 é N, Y, S, E ou D, X9 é P ou G, X10 é Y ou G, X11 é R, E, K ou P, X12 é R, D, S, Q, A ou E, X13 é F, M, I ou L, e X14 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 94 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #11 LKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX 3RX4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIY NLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10 X11X12X13KFFLYVX14, em que: X1 é V ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I ou F, X4 é A ou V, X5 é M ou F, X6 é S, G, A ou M, X7 é R ou W, X8 é N, Y, S, E ou D, X9 é P ou G, X10 é Y ou G, X11 é R, E, K ou P, X12 é R, D, S, Q, A ou E, X13 é F ou M, e X14 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 95 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #12 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é qualquer aminoácido, X2 é qualquer aminoácido, X3 é qualquer aminoácido, X4 é qualquer aminoácido, X5 é qualquer aminoácido, X6 é qualquer aminoácido, X7 é qualquer aminoácido, X8 é qualquer aminoácido, X9 é qualquer aminoácido, e X10 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 96 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #13 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A, V, L ou I, X2 é M, F, L ou I, X3 é S, G, A, M ou T, X4 é R, W, P ou A, X5 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R, X6 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X7 é Y, G, T ou S, X8 é R, E, K, P, D ou N, X9 é R, D, S, Q, A, E, T ou S X10 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 97 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #14 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R, W ou P, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P, G ou I, X7 é Y, G ou T, X8 é R, E, K, P ou D, X9 é R, D, S, Q, A, E ou T, e X10 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 98 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #15 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R ou W, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P ou G, X7 é Y ou G, X8 é R, E, K ou P, X9 é R, D, S, Q, A ou E, e X10 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 99 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #16 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR
AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5F KFFLYVX6, em que: X1 é qualquer aminoácido, X2 é qualquer aminoácido, X3 é qualquer aminoácido, X4 é qualquer aminoácido, X5 é qualquer aminoácido, e X6 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 100 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #17 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR
AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5F KFFLYVX6, em que: X1 é R, W, P ou A, X2 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X3 é Y, G, T ou S, X4 é R, P, D ou N, X5 é R, D, T ou S, e X6 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 101 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #18 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR
AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5F KFFLYVX6, em que: X1 é R, W ou P, X2 é P, G ou I, X3 é Y, G ou T, X4 é R, P ou D, X5 é R, D ou T, e X6 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 102 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #19 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR
AFSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5F KFFLYVX6, em que: X1 é R ou W, X2 é P ou G, X3 é Y ou G, X4 é R ou P, X5 é R ou D, e X6 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 103 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #20 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A, V, L ou I, X2 é M, F, L ou I, X3 é S, G, A, M ou T, X4 é R, W, P ou A, X5 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R, X6 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X7 é Y, G, T ou S, X8 é R, E, K, P, D ou N, X9 é D, S, Q, A, E, T ou S, e X10 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 104 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #21 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R, W ou P, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P, G ou I, X7 é Y, G ou T, X8 é R, E, K, P ou D, X9 é D, S, Q, A, E ou T, e X10 é ausente, L ou LESLPS
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 105 Loop consenso FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVP #22 LKEVLWKKQKDKVVEFENSEVR X1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNL TSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R ou W, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P ou G, X7 é Y ou G, X8 é R, E, K ou P, X9 é D, S, Q, A ou E, e X10 é ausente, L ou LESLPS SEQ ID NO: 106 loop CM1d1 SRNGGPD SEQ ID NO: 107 loop CM2d1 SRNPYRR SEQ ID NO: 108 loop CM3d1 SRNPYRD SEQ ID NO: 109 loop CM4d1 SWNGGPD SEQ ID NO: 110 loop CM5d1 SWNPYRR SEQ ID NO: 111 loop CM6d1 SWNPYRD SEQ ID NO: 112 loop ML1d1 GRYPYES SEQ ID NO: 113 loop ML2d1 SWEPGRE SEQ ID NO: 114 loop ML3d1 ARYPYRQ SEQ ID NO: 115 loop ML4d1 MRNGGPD SEQ ID NO: 116 loop ML5d1 ARDGGPD SEQ ID NO: 117 loop ML6d1 SWSPYKA SEQ ID NO: 118 Limite do C- LESLPS terminal SEQ ID NO: 119 Limite do C- LESLPSPTLTCALTNGSIEV terminal
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 128 Domínio Fc de dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmi IgG1 srtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgve vhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwln gkeykckvsnkalpapiektiskakgqprep qvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiav ewesngqpennykttppvldsdgsfflysklt vdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksl slspgk SEQ ID NO: 129 líder mvagsdagralgvlsvvcllhcfgfisc Tabela 3. Sequências de nucleotídeo exemplificativas de LFA3 de tipo selvagem e variantes de LFA3. SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 42 Sequência líder ATGGGCTGGTCCTGTATCATC de proteínas de CTCTTTCTGGTGGCCACAGCT fusão LFA3-Fc ACCGGAGTGCATAGC SEQ ID NO: 43 Dobradiça-Pfe GACAAAACTCACACATGCCCA
CCGTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGAAGAGATGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGA
SEQ ID NO Descrição Sequência
GAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGTTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG CTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAG GCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT
CCGGGT SEQ ID NO: 44 M1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCCCTA ATATTACAGACACATTCAAGTT
TTTTTTGTACGTT SEQ ID NO: 45 M2 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAATTCGAGTCCCCTAA TATTACAGACACATTCAAGTTT
TTTTTGTACGTT SEQ ID NO: 46 M3 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GTATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT
SEQ ID NO Descrição Sequência
TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCCCTA ATATTACAGACACATTCAAGTT
TTTTTTGTACGTT SEQ ID NO: 47 M4 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GTATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAATTCGAGTCCCCTAA TATTACAGACACATTCAAGTTT
TTTTTGTACGTT SEQ ID NO: 48 M5 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGATTAGG GTATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAATTCGAGTCCCCTAA TATTACAGACACATTCAAGTTT
TTTTTGTACGTT SEQ ID NO: 49 M6 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTTTAGA ATTTGAGAATAGTGAGCTTAGG GTATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAATTCGAGTCCCCTAA TATTACAGACACATTCAAGTTT TTTTTGTACGTT
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 50 M7 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCCCTA ATATTACAGACACAATGAAGTT
TTTTTTGTACGTT SEQ ID NO: 51 d1 TTTTCCCAACAAATATATGGTG
TTGTGTATGGGAATGTAACTTT CCATGTACCAAGCAATGTGCC TTTAAAAGAGGTCCTATGGAAA AAACAAAAGGATAAAGTTGCAG AACTGGAAAATTCTGAATTCAG AGCTTTCTCATCTTTTAAAAATA GGGTTTATTTAGACACTGTGTC AGGTAGCCTCACTATCTACAAC TTAACATCATCAGATGAAGATG AGTATGAAATGGAATCGCCAAA TATTACTGATACCATGAAGTTC
TTTCTTTATGTCCTC SEQ ID NO: 52 d3 TTTTCCCAACAAATATATGGTG
TTGTGTATGGGAATGTAACTTT CCATGTACCAAGCAATGTGCC TTTAAAAGAGGTCCTATGGAAA AAACAAAAGGATAAAGTTGCAG AACTGGAAAATTCTGAATTCAG AGCTTTCTCATCTTTTAAAAATA GGGTTTATTTAGACACTGTGTC AGGTAGCCTCACTATCTACAAC TTAACATCATCAGATGAAGATG AGTATGAAATGGAATCGCCAAA TATTACTGATACCATGAAGTTC TTTCTTTATGTCCTTGAGAGTC
TGCCCAGC SEQ ID NO: 53 M1d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA
SEQ ID NO Descrição Sequência
AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCCCTA ATATTACAGACACATTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTCTC SEQ ID NO: 54 M1d3 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCCCTA ATATTACAGACACATTCAAGTT TTTTTTGTACGTTCTTGAGAGT
CTGCCCAGC SEQ ID NO: 55 M4d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GTATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAATTCGAGTCCCCTAA TATTACAGACACATTCAAGTTT
TTTTTGTACGTTCTC SEQ ID NO: 56 M7d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC
SEQ ID NO Descrição Sequência
CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCCCTA ATATTACAGACACAATGAAGTT
TTTTTTGTACGTTCTC SEQ ID NO: 57 CM1d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCAGGA ATGGTGGACCTGATTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 58 CM2d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCAGGA ATCCTTATAGAAGGTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 59 CM3d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCAGGA ATCCTTATAGAGACTTCAAGTT TTTTTTGTACGTTTTG
SEQ ID NO Descrição Sequência SEQ ID NO: 60 CM4d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCTGGA ATGGTGGACCTGATTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 61 CM5d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCTGGA ATCCTTATAGAAGGTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 62 CM6d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCCTGGA ATCCTTATAGAGACTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 63 ML1d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA
SEQ ID NO Descrição Sequência
ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGGGTCGGT ATCCGTATGAGTCGTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 64 ML2d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GTATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAATTCGAGAGTTGGG AGCCTGGGAGGGAGTTCAAGT
TTTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 65 ML3d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGGCTCGGT ATCCTTATCGGCAGTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 66 ML4d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG
SEQ ID NO Descrição Sequência
AGTACGAAATGGAGATGCGGA ATGGTGGTCCTGATTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 67 ML5d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGGCGCGGG ATGGGGGTCCTGATTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 68 ML6d1 TTTTCACAGCAGATTTACGGTG
TTGTTTACGGTAATGTGACTTT TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG GCATTTAGTTCATTTAAGAATA GGGTCTATTTGGATACTGTATC CGGTTCTTTGACCATTTATAAT TTAACAAGTAGTGATGAAGACG AGTACGAAATGGAGTCGTGGT CTCCTTATAAGGCGTTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTTTG SEQ ID NO: 122 Nucleotídeo ATGGGCTGGTCCTGTATCATC M1-d1 de CTCTTTCTGGTGGCCACAGCT LFA3-Fc ACCGGAGTGCATAGCTTTTCA (incluindo CAGCAGATTTACGGTGTTGTTT sequência ACGGTAATGTGACTTTTCACGT líder, TCCGAGTAACGTTCCTTTGAAG sublinhado e GAAGTCTTATGGAAAAAACAAA itálico) AAGATAAAGTTGTAGAATTTGA
GAATAGTGAGGTTAGGGCATT TAGTTCATTTAAGAATAGGGTC TATTTGGATACTGTATCCGGTT CTTTGACCATTTATAATTTAACA AGTAGTGATGAAGACGAGTAC GAAATGGAGTCCCCTAATATTA CAGACACATTCAAGTTTTTTTT
SEQ ID NO Descrição Sequência
GTACGTTCTCGACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCA CCTGAACTCCTGGGGGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAA AACCCAAGGACACCCTCATGA TCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCA AGTTCAACTGGTACGTGGACG GCGTGGAGGTGCATAATGCCA AGACAAAGCCGCGGGAGGAG CAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTC CTGCACCAGGACTGGCTGAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC CGAGAACCACAGGTGTACACC CTGCCCCCATCCCGGGAAGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGC CTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGTTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCC
TCTCCCTGTCTCCGGGT SEQ ID NO: 123 Nucleotídeo TTTTCACAGCAGATTTACGGTG M1-d1 de TTGTTTACGGTAATGTGACTTT LFA3-Fc TCACGTTCCGAGTAACGTTCCT (também TTGAAGGAAGTCTTATGGAAAA referido como AACAAAAAGATAAAGTTGTAGA "LFA3-Fc ATTTGAGAATAGTGAGGTTAGG M1d1", "M1d1", GCATTTAGTTCATTTAAGAATA "M1-d1" ou GGGTCTATTTGGATACTGTATC "M1d1-Pfe") CGGTTCTTTGACCATTTATAAT (sem TTAACAAGTAGTGATGAAGACG sequência AGTACGAAATGGAGTCCCCTA
SEQ ID NO Descrição Sequência líder) ATATTACAGACACATTCAAGTT
TTTTTTGTACGTTCTCGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGG CTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCC CTCCCAGCCCCCATCGAGAAA ACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCGG GAAGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTC AAAGGCTTCTATCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAAC TACAAGACCACGCCTCCCGTG TTGGACTCCGACGGCTCCTTC TTCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAG
AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT SEQ ID NO: 124 LFA3-Fc WT ATGGTTGCTGGGAGCGACGCG (incluindo líder, GGGCGGGCCCTGGGGGTCCT sublinhado) CAGCGTGGTCTGCCTGCTGCA
CTGCTTTGGTTTCATCAGCTGT TTTTCCCAACAAATATATGGTG TTGTGTATGGGAATGTAACTTT CCATGTACCAAGCAATGTGCC TTTAAAAGAGGTCCTATGGAAA AAACAAAAGGATAAAGTTGCAG AACTGGAAAATTCTGAATTCAG
SEQ ID NO Descrição Sequência
AGCTTTCTCATCTTTTAAAAATA GGGTTTATTTAGACACTGTGTC AGGTAGCCTCACTATCTACAAC TTAACATCATCAGATGAAGATG AGTATGAAATGGAATCGCCAAA TATTACTGATACCATGAAGTTC TTTCTTTATGTCGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACGT GAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGT CCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCC AGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGTTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCC
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 125 LFA3-Fc WT TTTTCCCAACAAATATATGGTG (no líder) TTGTGTATGGGAATGTAACTTT
CCATGTACCAAGCAATGTGCC TTTAAAAGAGGTCCTATGGAAA AAACAAAAGGATAAAGTTGCAG
SEQ ID NO Descrição Sequência
AACTGGAAAATTCTGAATTCAG AGCTTTCTCATCTTTTAAAAATA GGGTTTATTTAGACACTGTGTC AGGTAGCCTCACTATCTACAAC TTAACATCATCAGATGAAGATG AGTATGAAATGGAATCGCCAAA TATTACTGATACCATGAAGTTC TTTCTTTATGTCGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAG CACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACGT GAGCCACGAAGACCCTGAGGT CAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACAACAGCACGTACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGT CCTGCACCAGGACTGGCTGAA TGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCC AGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGATGA GCTGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGTTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCC
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 126 LFA3 WT TTTTCCCAACAAATATATGGTG domain TTGTGTATGGGAATGTAACTTT
CCATGTACCAAGCAATGTGCC TTTAAAAGAGGTCCTATGGAAA
SEQ ID NO Descrição Sequência
AAACAAAAGGATAAAGTTGCAG AACTGGAAAATTCTGAATTCAG AGCTTTCTCATCTTTTAAAAATA GGGTTTATTTAGACACTGTGTC AGGTAGCCTCACTATCTACAAC TTAACATCATCAGATGAAGATG AGTATGAAATGGAATCGCCAAA TATTACTGATACCATGAAGTTC
TTTCTTTATGTC SEQ ID NO: 127 Domínio Fc de GACAAAACTCACACATGCCCA IgG1 CCGTGCCCAGCACCTGAACTC
CTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAG TACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCA CAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGA GAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGTTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAG CTCACCGTGGACAAGAGCAGG TGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAG GCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT
CCGGGTAAA SEQ ID NO: 130 líder ATGGTTGCTGGGAGCGACGCG
GGGCGGGCCCTGGGGGTCCT
SEQ ID NO Descrição Sequência
CAGCGTGGTCTGCCTGCTGCA CTGCTTTGGTTTCATCAGCTGT
[00338] A sequência de aminoácido de proteína de fusão LFA3-Fc M1d1 é provida como SEQ ID NO: 69. As quatro substituições de ami- noácido não nativo (A36V, L38F, F43V, e M86F) estão em negrito e sublinhado. O resíduo de C-terminal do domínio de LFA3 (L93) é mar- cado por sublinhado duplo. Os quatro sítios de glicosilação ligados em N previstos (N12, N66, N81, e N170) são marcados por sublinhado pontilhado.
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFS SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESPNITDTFKFFLYVLDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 69)
[00339] Em um aspecto, molécula de polipeptídeo adicional inclui uma ou mais das seguintes modalidades.
[00340] A1. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 70 ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 70 (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00341] A2. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a se-
quência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8NSX9 FX10AX11X12SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13NX14TX1 5TMKFFLYVX16, em que: X1 é D, E, N, K, Q ou H, X2 é F, I, L, V, Nle, M ou A, X3 é K, R, M, T, Q ou N, X4 é K, R, M, T, Q ou N, X5 é D, E, N, K, Q ou H, X6 é K, R, M, T, Q ou N, X7 é D, E, N, K, Q ou H, X8 é D, E, N, K, Q ou H, X9 é D, E, N, K, Q ou H, X10 é K, R, M, T, Q ou N, X11 é F, Y, L, H, I, N, V, D, A ou Y, X12 é S, T, A ou G, X13 é P, L, H, R ou A, X14 é F, I, L, V, M, A ou Nle, X15 é D, E, N, K, Q ou H, e X16 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 71), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 71 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00342] A3. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a se- quência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKX1VX2WX3KQX4X5X6VAX7LX8NSX9 FX10AX11X12SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX13NX14TX1
5TMKFFLYVX16, em que: X1 é D, E, N, K, Q ou H, X2 é F, I, L ou V, X3 é K, R, M ou T, X4 é K, R, M ou T, X5 é D, E, N, K, Q ou H, X6 é K, R, M ou T, X7 é D, E, N, K, Q ou H, X8 é D, E, N, K, Q ou H, X9 é D, E, N, K, Q ou H, X10 é K, R, M ou T, X11 é F, Y, L, H, I, N, V ou D, X12 é S, T, A ou G, X13 é P, L, H ou R, X14 é F, I, L ou V, X15 é D, E, N, K, Q ou H, e X16 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 72), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 72 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00343] A4. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma ou mais mutações (por exemplo, uma substituição, uma exclusão ou uma adição) nos resíduos 25, 27, 29, 32, 33, 34, 37, 39, 42, 44, 46, 47, 80, 82 ou 84 em relação a SEQ ID NO: 3, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3, por exemplo, em que o domínio de LFA3 compreende SEQ ID NO: 3 com uma ou mais mutações (por exemplo, uma substi- tuição, uma exclusão ou uma adição) nos resíduos 25, 27, 29, 32, 33,
34, 37, 39, 42, 44, 46, 47, 80, 82 ou 84 em relação a SEQ ID NO: 3.
[00344] A5. A molécula de polipeptídeo isolado de A4, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de E25D, E25N, E25K, E25Q ou E25H, ii. uma substituição escolhida de L27F, L27I, L27V, L27Nle, L27M ou L27A, iii. uma substituição escolhida de K29R, K29M, K29T, K29Q ou K29N, iv. uma substituição escolhida de K32R, K32M, K32T, K32Q ou K32N, v. uma substituição escolhida de D33E, D33N, D33K, D33Q ou D33H, vi. uma substituição escolhida de K34R, K34M, K34T, K34Q ou K34N, vii. uma substituição escolhida de E37D, E37N, E37K, E37Q ou E37H, viii. uma substituição escolhida de E39D, E39N, E39K, E39Q ou E39H, ix. uma substituição escolhida de E42D, E42N, E42K, E42Q ou E42H, x. uma substituição escolhida de R44K, R44M, R44T, R44Q ou R44N, xi. uma substituição escolhida de F46Y, F46L, F46H, F46I, F46N, F46V, F46D, F46A ou F46Y, xii. uma substituição escolhida de S47T, S47A ou S47G, xiii. uma substituição escolhida de P80L, P80H, P80R ou P80A, xiv. uma substituição escolhida de I82F, I82L, I82V, I82M,
I82A ou I82Nle, ou xv. uma substituição escolhida de D84E, D84N, D84K, D84Q ou D84H.
[00345] A6. A molécula de polipeptídeo isolado de A4, em que as uma ou mais mutações compreendem uma ou mais das seguintes substituições: i. uma substituição escolhida de E25D, E25N, E25K, E25Q ou E25H, ii. uma substituição escolhida de L27F, L27I ou L27V, iii. uma substituição escolhida de K29R, K29M ou K29T, iv. uma substituição escolhida de K32R, K32M ou K32T, v. uma substituição escolhida de D33E, D33N, D33K, D33Q ou D33H, vi. uma substituição escolhida de K34R, K34M ou K34T, vii. uma substituição escolhida de E37D, E37N, E37K, E37Q ou E37H, viii. uma substituição escolhida de E39D, E39N, E39K, E39Q ou E39H, ix. uma substituição escolhida de E42D, E42N, E42K, E42Q ou E42H, x. uma substituição escolhida de R44K, R44M ou R44T, xi. uma substituição escolhida de F46Y, F46L, F46H, F46I, F46N, F46V ou F46D, xii. uma substituição escolhida de S47T, S47A ou S47G, xiii. uma substituição escolhida de P80L, P80H ou P80R, xiv. uma substituição escolhida de I82F, I82L ou I82V, ou xv. uma substituição escolhida de D84E, D84N, D84K, D84Q ou D84H.
[00346] A7. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a se- quência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A, M ou T, X2 é R, W, P ou A, X3 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R X4 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X5 é Y, G, T ou S, X6 é R, E, K, P, D ou N, e X7 é R, D, S, Q, A, E, T ou S (SEQ ID NO: 84), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 84 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SPNITDT (SEQ ID NO: 83).
[00347] A8. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a se- quência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A ou M, X2 é R, W ou P, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P, G ou I, X5 é Y, G ou T, X6 é R, E, K, P ou D, e X7 é R, D, S, Q, A, E ou T (SEQ ID NO: 85), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 85 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00348] A9. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifica- mente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a se- quência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A ou M, X2 é R ou W, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P ou G, X5 é Y ou G, X6 é R, E, K ou P, e X7 é R, D, S, Q, A ou E (SEQ ID NO: 86), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 86 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00349] A10. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A ou M, X2 é R ou W, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P ou G, X5 é Y ou G, X6 é R, E, K ou P, e X7 é R, D, S, Q, A ou E (SEQ ID NO: 86).
[00350] A11. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: SX1NX2X3X4X5, em que: X1 é R, W, P ou A, X2 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle,
X3 é Y, G, T ou S, X4 é R, P, D ou N, e X5 é R, D, T ou S (SEQ ID NO: 87), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 87 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00351] A12. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: SX1NX2X3X4X5, em que: X1 é R, W ou P, X2 é P, G ou I, X3 é Y, G ou T, X4 é R, P ou D, e X5 é R, D ou T (SEQ ID NO: 88), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 88 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00352] A13. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: SX1NX2X3X4X5, em que: X1 é R ou W, X2 é P ou G, X3 é Y ou G, X4 é R ou P, e X5 é R ou D (SEQ ID NO: 89), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 89 (por exemplo, uma se-
quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00353] A14. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: SX1NX2X3X4X5, em que: X1 é R ou W, X2 é P ou G, X3 é Y ou G, X4 é R ou P, e X5 é R ou D (SEQ ID NO: 89).
[00354] A15. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A, M ou T, X2 é R, W, P ou A, X3 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R X4 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X5 é Y, G, T ou S, X6 é R, E, K, P, D ou N, e X7 é D, S, Q, A, E, T ou S (SEQ ID NO: 90), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 90 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00355] A16. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A ou M, X2 é R, W ou P, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P, G ou I, X5 é Y, G ou T, X6 é R, E, K, P ou D, e X7 é D, S, Q, A, E ou T (SEQ ID NO: 91), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 91 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00356] A17. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A ou M, X2 é R ou W, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P ou G, X5 é Y ou G, X6 é R, E, K ou P, e X7 é D, S, Q, A ou E (SEQ ID NO: 92), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 92 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00357] A18. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: X1X2X3X4X5X6X7, em que: X1 é S, G, A ou M, X2 é R ou W, X3 é N, Y, S, E ou D, X4 é P ou G, X5 é Y ou G, X6 é R, E, K ou P, e X7 é D, S, Q, A ou E (SEQ ID NO: 92).
[00358] A19. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X1 3KFFLYVX14, em que: X1 é V, L ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I, L ou F, X4 é A, V ou S, X5 é M, F, I ou L, X6 é S, G, A ou M, X7 é R ou W, X8 é N, Y, S, E ou D, X9 é P ou G, X10 é Y ou G, X11 é R, E, K ou P, X12 é R, D, S, Q, A ou E, X13 é F, M, I ou L, e X14 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 93), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 93 (por exemplo, uma se-
quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00359] A20. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X1 3KFFLYVX14, em que: X1 é V, L ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I, L ou F, X4 é A, V ou S, X5 é M, F, I ou L, X6 é S, G, A ou M, X7 é R ou W, X8 é N, Y, S, E ou D, X9 é P ou G, X10 é Y ou G, X11 é R, E, K ou P, X12 é R, D, S, Q, A ou E, X13 é F, M, I ou L, e X14 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 93).
[00360] A21. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X1
3KFFLYVX14, em que: X1 é V ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I ou F, X4 é A ou V, X5 é M ou F, X6 é S, G, A ou M, X7 é R ou W, X8 é N, Y, S, E ou D, X9 é P ou G, X10 é Y ou G, X11 é R, E, K ou P, X12 é R, D, S, Q, A ou E, X13 é F ou M, e X14 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 94), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 94 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00361] A22. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVX1EX2ENSEX3RX 4FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX5EX6X7X8X9X10X11X12X1 3KFFLYVX14, em que: X1 é V ou A, X2 é F ou L, X3 é V, I ou F, X4 é A ou V,
X5 é M ou F, X6 é S, G, A ou M, X7 é R ou W, X8 é N, Y, S, E ou D, X9 é P ou G, X10 é Y ou G, X11 é R, E, K ou P, X12 é R, D, S, Q, A ou E, X13 é F ou M, e X14 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 94).
[00362] A23. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 95 ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 95 (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00363] A24. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A, V, L ou I, X2 é M, F, L ou I, X3 é S, G, A, M ou T, X4 é R, W, P ou A, X5 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R,
X6 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X7 é Y, G, T ou S, X8 é R, E, K, P, D ou N, X9 é R, D, S, Q, A, E, T ou S X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 96), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 96 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00364] A25. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R, W ou P, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P, G ou I, X7 é Y, G ou T, X8 é R, E, K, P ou D, X9 é R, D, S, Q, A, E ou T, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 97), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 97 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00365] A26. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R ou W, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P ou G, X7 é Y ou G, X8 é R, E, K ou P, X9 é R, D, S, Q, A ou E, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 98), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 98 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00366] A27. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4X5X6X7X8X9FKFFL YVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F,
X3 é S, G, A ou M, X4 é R ou W, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P ou G, X7 é Y ou G, X8 é R, E, K ou P, X9 é R, D, S, Q, A ou E, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 98).
[00367] A28. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de:
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFS SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYV X6, em que: X1 é qualquer aminoácido, X2 é qualquer aminoácido, X3 é qualquer aminoácido, X4 é qualquer aminoácido, X5 é qualquer aminoácido, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 99), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 99 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00368] A29. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de:
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFS
SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYV X6, em que: X1 é R, W, P ou A, X2 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X3 é Y, G, T ou S, X4 é R, P, D ou N, X5 é R, D, T ou S, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 100), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 100 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00369] A30. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de:
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFS SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYV X6, em que: X1 é R, W ou P, X2 é P, G ou I, X3 é Y, G ou T, X4 é R, P ou D, X5 é R, D ou T, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 101), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 101 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00370] A31. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de:
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFS SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYV X6, em que: X1 é R ou W, X2 é P ou G, X3 é Y ou G, X4 é R ou P, X5 é R ou D, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 102), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 102 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00371] A32. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de:
FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRAFS SFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEMESX1NX2X3X4X5FKFFLYV X6, em que: X1 é R ou W, X2 é P ou G, X3 é Y ou G, X4 é R ou P, X5 é R ou D, e X6 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 102).
[00372] A33. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A, V, L ou I, X2 é M, F, L ou I, X3 é S, G, A, M ou T, X4 é R, W, P ou A, X5 é N, Y, S, E, D, Q, H, K ou R, X6 é P, G, I, L, V, M, A, F ou Nle, X7 é Y, G, T ou S, X8 é R, E, K, P, D ou N, X9 é D, S, Q, A, E, T ou S, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 103), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 103 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00373] A34. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSEVRX1F SSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M,
X4 é R, W ou P, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P, G ou I, X7 é Y, G ou T, X8 é R, E, K, P ou D, X9 é D, S, Q, A, E ou T, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 104), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 104 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00374] A35. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSE- VRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R ou W, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P ou G, X7 é Y ou G, X8 é R, E, K ou P, X9 é D, S, Q, A ou E, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 105), ou uma variante funcional de SEQ ID NO: 104 (por exemplo, uma se- quência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
[00375] A36. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de: FSQQIYGVVYGNVTFHVPSNVPLKEVLWKKQKDKVVEFENSE- VRX1FSSFKNRVYLDTVSGSLTIYNLTSSDEDEYEX2EX3X4 X5X6X7X8X9FKFFLYVX10, em que: X1 é A ou V, X2 é M ou F, X3 é S, G, A ou M, X4 é R ou W, X5 é N, Y, S, E ou D, X6 é P ou G, X7 é Y ou G, X8 é R, E, K ou P, X9 é D, S, Q, A ou E, e X10 é ausente, L ou LESLPS (SEQ ID NO: 105).
[00376] A37. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NOs: 106-117 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 83.
[00377] A38. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 106 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00378] A39. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 106.
[00379] A40. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 107 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00380] A41. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 107.
[00381] A42. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 108 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00382] A43. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 108.
[00383] A44. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 109 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00384] A45. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 109.
[00385] A46. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 110 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00386] A47. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 110.
[00387] A48. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 111 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00388] A49. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 111.
[00389] A50. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00390] A51. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 112.
[00391] A52. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 113 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00392] A53. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 113.
[00393] A54. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 114 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00394] A55. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 114.
[00395] A56. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 115 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00396] A57. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 115.
[00397] A58. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 116 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00398] A59. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 116.
[00399] A60. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 117 ou uma variante funcio- nal da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 83.
[00400] A61. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 117.
[00401] A62. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido escolhida de SEQ ID NOs: 30-41 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 3.
[00402] A63. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00403] A64. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30.
[00404] A65. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00405] A66. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31.
[00406] A67. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00407] A68. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32.
[00408] A69. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00409] A70. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33.
[00410] A71. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00411] A72. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 34.
[00412] A73. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00413] A74. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35.
[00414] A75. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00415] A76. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 36.
[00416] A77. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00417] A78. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 37.
[00418] A79. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00419] A80. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 38.
[00420] A81. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00421] A82. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 39.
[00422] A83. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi-
camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00423] A84. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 40.
[00424] A85. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 41 ou uma variante funcional da mesma (por exemplo, uma sequência tendo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade da mesma), em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
83.
[00425] A86. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 41.
[00426] A87. Uma molécula de polipeptídeo isolado que especifi- camente se liga a CD2, em que a molécula de polipeptídeo compreen- de um domínio de LFA3, em que o domínio de LFA3 compreende uma ou mais mutações (por exemplo, uma substituição, uma exclusão ou uma adição) nos resíduos 79, 80, 81, 82, 83, 84 ou 85 em relação a SEQ ID NO: 3, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3, por exem- plo, em que o domínio de LFA3 compreende SEQ ID NO: 3 com uma ou mais mutações (por exemplo, uma substituição, uma exclusão ou uma adição) nos resíduos 79, 80, 81, 82, 83, 84 ou 85 em relação a SEQ ID NO: 3, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3.
[00427] Em algumas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 da invenção compreendem um domínio de LFA3, em que o do- mínio de LFA3 é qualquer sequência variante de LFA3 divulgada neste documento (por exemplo, qualquer sequência variante de LFA3 divul- gada na Tabela 2). Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 tem não mais do que 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 ou 180 ami- noácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 tem 92 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 tem 93 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 tem 98 aminoácidos de comprimen- to. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 é derivado do primei- ro domínio extracelular de LFA3. Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 compreende não mais do que 6, 10, 15, 20 ou 30 mutações de aminoácido (por exemplo, substituições, adições ou exclusões) em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem. Em algumas modali- dades, o domínio de LFA3 compreende 5 substituições de aminoácido em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem.
[00428] As moléculas de polipeptídeo LFA3 da invenção podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica. Técnicas ge- rais para produção de proteínas recombinantes são conhecidas na técnica e/ou são descritas neste documento.
[00429] Após a identificação inicial, a atividade de uma molécula de polipeptídeo LFA3 candidata pode ser ainda confirmada e refinada by bioensaios, conhecidos por testarem as atividades biológicas alvo. Em algumas modalidades, um ensaio celular in vitro é usado para ainda caracterizar uma molécula de polipeptídeo LFA3 candidata. Por exem- plo, bioensaios podem ser usados para analisar candidatos diretamen-
te. Alguns dos métodos para identificar e caracterizar moléculas de polipeptídeo LFA3 são descritos em detalhes nos Exemplos.
[00430] Em certas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 descrita neste documento compreende um domínio Fc. O domínio Fc pode ser derivado de IgA (por exemplo, IgA1 ou IgA2), IgG, IgE ou IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4). Em algumas modalidades, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG1. Em algumas modalidades, um domínio Fc de IgG1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16.
[00431] Em um aspecto, a invenção divulga uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) tendo uma ou mais das seguintes propriedades: (a) ex- pressão monomérica aprimorada em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem, (b) expressão multimérica reduzida em relação à se- quência de LFA3 de tipo selvagem, (c) propensão à agregação reduzi- da sob estresse térmico em relação à sequência de LFA3 de tipo sel- vagem, (d) propensão à agregação reduzida sob baixo pH em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem, (e) estabilidade a congelamen- to-descongelamento aprimorada em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem, (f) rendimento elevado em relação à sequência de LFA3 de tipo selvagem, (g) temperatura de fusão elevada (Tm) em re- lação à sequência de LFA3 de tipo selvagem.
[00432] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção apresenta uma porcentagem de monômeros que é supe- rior a cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99%, por exemplo, con- forme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3A. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção apresenta uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99%, uma porcentagem de espécies de baixo peso molecular (LMWS) que é inferior a cerca de 10, 8, 6, 4 ou 2%, e/ou uma porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) que é inferior a cerca de 5, 2 ou 1%, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Fi- gura 6C.
[00433] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção apresenta uma porcentagem de monômeros que é supe- rior a cerca de 90, 92 ou 95% após incubação a 37,4ºC por 24 horas, e/ou apresentando uma porcentagem de monômeros que é superior a cerca de 75, 80 ou 85% após incubação a 40ºC por 24 horas, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3D. Em algumas modalidades, a mo- lécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptí- deo de fusão LFA3 variante) da invenção apresenta não mais do que cerca de 5, 10, 15 ou 20% de aumento em HMWS a 40ºC, e/ou não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% de aumento em HMWS a 50ºC, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos des- critos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4.
[00434] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção apresenta não mais do que cerca de 6, 7, 8 ou 9% de aumento em HMWS a baixo pH por 5 horas, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com rela- ção à Tabela 4.
[00435] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção apresenta não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMWS após 5 ciclos de congelamento-descongelamento, por exemplo, conforme medido usando SEC e/ou métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4.
[00436] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante da invenção apresenta não mais do que a cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5% de aumento em LMMS após 2 ou 4 semanas de armazenamento a 40°C, por exemplo, conforme medido usando eletroforese em gel capilar (CGE), cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE_HPLC), e/ou métodos descritos no Exemplo 3 com relação às Fi- guras 30A-30C e/ou Figuras 31A-31D.
[00437] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante da invenção apresenta não mais do que a cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 25°C, por exem- plo, conforme medido usando SE-HPLC métodos descritos no Exem- plo 3 com relação às Figuras 32A-32D.
[00438] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante da invenção apresenta não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 5°C, por exem- plo, conforme medido usando SE-HPLC métodos descritos no Exem- plo 3 com relação às Figuras 33A-33D.
[00439] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem um rendimento que é superior a cerca de 5,5, 6, 6,5 ou 7 mg por 20ml de cultura Expi293, por exemplo, conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3B.
[00440] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm que é superior a cerca de 38, 40, 42 ou 45ºC, por exemplo, conforme medido por fluorometria de varredura diferencial (DSF) e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 3C. Em algumas modalidades, a molécula de polipep- tídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm que é superior a cerca de 40, 45, 50, 55 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 5B. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm que é superior a cerca de 40, 45 ou 50ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 6D. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fu- são LFA3 variante) da invenção tem uma Tm que é superior a cerca de 45, 50 ou 55ºC, por exemplo, conforme medido por DSF e/ou usan- do métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Figura 7D. Em al- gumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC, por exemplo, con- forme medido por calorimetria de varredura diferencial (DSC) e/ou usando métodos descritos no Exemplo 1 com relação à Tabela 4.
[00441] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62, 64 ou 66 oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 7,5; uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62 ou 64 oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 5,8; ou uma Tm1 que é superior a 55, 58 ou 60ºC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78 ou 80ºC a pH 4,5, por exemplo, conforme medido por DSC e/ou usando métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Ta- bela 13.
[00442] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm elevada em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC a pH 7,5 ou pH 4,5; tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 62ºC a pH 5,8, por exemplo, conforme medido por DSC e/ou usando méto- dos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 14.
[00443] Em algumas modalidades, o domínio de LFA3 da molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção tem uma Tm elevada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, tendo uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC, por exemplo, conforme medido por DSC e Fa- bRICATOR IdeS e/ou usando métodos descritos no Exemplo 4 com relação à Tabela 15.
[00444] A invenção divulga uma molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que se liga a CD2 e medeia pelo menos uma atividade detectável se- lecionada do que segue: (a) se liga a Células CD2+, por exemplo, cé- lulas Tmem CD4 que expressam CD2 ou células Tmem CD8 que expres- sam CD2, (b) reduz a interação entre CD2 e um LFA3 de ocorrência natural, (c) medeia a citotoxicidade contra células que expressam CD2, por exemplo, células Tmem CD4 que expressam CD2 ou células Tmem CD8 que expressam CD2, por exemplo, na presença de células
NK, (d) diminui células TEM CD4+ e/ou CD8+, (e) aumenta a razão de Treg/TEM, por exemplo, em células T CD4+ e/ou CD8+, (f) aumenta a razão de Treg/TCM, por exemplo, em células T CD4+ e/ou CD8+, (g) inibe resposta alogênica de células T, por exemplo, proliferação de cé- lulas T e produção de citocina, e (h) inibe resposta de recuperação de toxoide tetânico. Células Tmem incluem, por exemplo, células T de me- mória centrais (TCM) e memória efetoras (TEM).
[00445] Em um aspecto, a invenção inclui uma molécula de polipep- tídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que se liga a células expressando CD2 humano ou de macaco cinomolgo com alta afinidade aparente, mas não liga células expressando CD2 de roedor. Ligação de afinidade aparente pode ser avaliada usando citometria de fluxo para detectar a ligação a células expressando a proteína alvo (por exemplo, CD2). As células podem ser transientemente ou estavelmente transfectadas com um ácido nu- cleico codificando CD2. Alternativamente, as células podem ser célu- las que naturalmente expressam CD2 em sua superfície. Independen- temente das fontes de células CD2+, a ligação da molécula de polipep- tídeo LFA3 às células pode ser facilmente avaliada usando uma varie- dade de métodos conhecidos na técnica. A molécula de polipeptídeo LFA3 liga CD2 humano ou de cino, mas não detectavelmente liga ou liga em extensão muito menor, CD2 de roedor.
[00446] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a CD2 humano recombinante com uma afinidade que é inferior a 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, por exemplo, conforme medido por SPR descrito nos Exemplos. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fu- são LFA3 variante) da invenção se liga a CD2 humano recombinante com uma afinidade de cerca de 1,08 µM.
[00447] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a CD2 de cinomolgo recombinante com uma afinidade que é inferior a 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, por exemplo, conforme me- dido por SPR descrito nos Exemplos. Em algumas modalidades, a mo- lécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptí- deo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a CD2 de cinomolgo recombinante com uma afinidade de cerca de 1,06 µM.
[00448] Em um aspecto, é divulgada neste documento uma molécu- la de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que se liga a células que expressam CD2, por exemplo, células Tmem CD4, com uma kD que é não mais do que 100, 200, 300 ou 400 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipep- tídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) se liga a células que expressam CD2, por exemplo, cé- lulas Tmem CD4, com uma kD de cerca de 94 pM.
[00449] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD4 com um IC50 calculado que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 500, 700, 800, 1000, 1200 ou 1500 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptí- deo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD4 com um IC50 calculado de cerca de 1,18E-10 M. Em algumas modalidades, a molé- cula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptí- deo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memó- ria CD4 com um IC50 calculado médio de cerca de 307 pM.
[00450] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TEM CD4+ com um IC50 calculado que não é superior a cerca de 150, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TEM CD4+ com um IC50 calculado de cerca de 150 pM.
[00451] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TCM CD4+ com um IC50 calculado que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TCM CD4+ com um IC50 calculado de cerca de 110 pM.
[00452] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T virgens CD4 com um IC50 calculado que não é superior a cerca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T virgens CD4 com um IC50 calculado de cerca de 1,44E-10M. Em algumas modalidades, a molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T virgens CD4 com um IC50 calculado médio de cerca de 180 pM.
[00453] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células Treg CD4 expandidas com um IC50 calcula- do que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células Treg CD4 expandidas com um IC50 calculado de cerca de 8,54E-11M. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 va- riante) da invenção se liga a células Treg CD4 expandidas com um IC50 calculado de cerca de 90 pM.
[00454] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD8 com um IC50 calculado que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD8 com um IC50 calculado de cerca de 120 pM.
[00455] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T nativas CD8 com um IC50 calculado que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, 1500, 1600 ou 1700 pM. Em algumas modalidades, a molécula de po- lipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T nativas CD8 com um IC50 calculado de cerca de 9,49E-11M. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de poli- peptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T nati- vas CD8 com um IC50 calculado médio de cerca de 300 pM.
[00456] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD4 com uma kd calculada que não é superior a cerca de100, 200, 300, 400 ou 500pM. Em algu- mas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD4 com uma kd calculada de cerca de 67 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD4 com uma Kd média cal- culada de cerca de 94 pM.
[00457] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TEM CD4+ com uma kd calculada que não é superior a cerca de100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma mo- lécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TEM CD4+ com uma kd calculada de cerca de 79 pM.
[00458] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TCM CD4+ com uma kd calculada que não é superior a cerca de100, 200, 300, 400 ou 500pM. Em algumas modali- dades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células TCM CD4+ com uma kd calculada de cerca de 64 pM.
[00459] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T virgens CD4 com uma kd calculada que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400 pM. Em algumas mo- dalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molé- cula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a cé- lulas T virgens CD4 com uma kd calculada de cerca de 61 pM. Em al- gumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T virgens CD4 com uma Kd média calculada de cerca de 54 pM.
[00460] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células Treg CD4 expandidas com uma kd calculada que não é superior a cerca de 100, 200 ou 300 pM. Em algumas mo- dalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molé- cula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a cé- lulas Treg CD4 expandidas com uma kd calculada de cerca de 58 pM.
[00461] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD8 com uma kd calculada que não é superior a cerca de50, 100 ou 150 pM. Em algumas modali- dades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T de memória CD8 com uma kd calculada de cerca de 31 pM.
[00462] Em um aspecto, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T nativas CD8 com uma kd calculada que não é superior a cerca de50, 100, 200, 300, 400 ou 500 pM. Em algu- mas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T nativas CD8 com uma kd calculada de cerca de 30 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) da invenção se liga a células T nativas CD8 com uma kd calculada de cer- ca de 98 pM.
[00463] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que medeia citotoxicidade contra células que expres- sam CD2, por exemplo, células Tmem CD4, com um EC50 que não é superior a cerca de 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400 ou 1500 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo,
uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção medeia citotoxicidade contra células que expressam CD2, por exem- plo, células Tmem CD4, com um EC50 de cerca de 348 pM.
[00464] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que medeia citotoxicidade contra células que expres- sam CD2, por exemplo, células Tmem CD8, com um EC50 que não é superior a cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 nM. Em algumas modali- dades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção medeia citoto- xicidade contra células que expressam CD2, por exemplo, células Tmem CD8, com um EC50 de cerca de 0,716 nM.
[00465] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que medeia citotoxicidade contra células que expres- sam CD2, por exemplo, células Tnão-mem CD4, com um EC50 que não é superior a cerca de 1200, 1500, 1800, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000 pM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção medeia citotoxicidade contra células que expressam CD2, por exemplo, células Tnão-mem CD4, com um EC50 de cerca de 1256 pM.
[00466] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que medeia citotoxicidade contra células que expres- sam CD2, por exemplo, células Tnão-mem CD8, com um EC50 que não é superior a cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 nM. Em algumas modali- dades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção medeia citoto- xicidade contra células que expressam CD2, por exemplo, células Tnão-
mem CD8, com um EC50 de cerca de 0,787 nM.
[00467] A invenção inclui uma molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que se liga a CD2 e suprime uma resposta imune, por exemplo, uma res- posta imune mediada por célula T. Existem muitos ensaios conhecidos na técnica para determinar a inibição de uma resposta imune, por exemplo, uma resposta imune mediada por célula T. Tal ensaio é en- saio de reação mista linfocitária (MLR) descrito nos Exemplos. Em al- gumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção pode inibir a resposta alogênica com um IC50 que não é superior a cerca de 400, 800, 1200, 1600, 2000 ou 2400pM. Em algumas modali- dades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção pode inibir a resposta alogênica com um IC50 de cerca de 302pM. Outro ensaio é ensaio de resposta de recuperação de toxoide tetânico descrito nos Exemplos. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 va- riante) desta invenção pode inibir a produção de IFNγ de células T de memória CD4 em um ensaio de resposta de recuperação de toxoide tetânico com um IC50 que não é superior a cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25nM. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) desta invenção pode inibir a produção de IFNγ de células T de memó- ria CD4 em um ensaio de resposta de recuperação de toxoide tetânico com um IC50 de cerca de 1,342 nM.
[00468] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que apresenta uma depuração a partir do centro que é não mais do que 0,14, 0,16, 0,18, 0,2 ou 0,22 ml/h/kg, por exemplo,
conforme medido usando métodos descritos no Exemplo 2 com rela- ção à Tabela 11. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptí- deo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) apresenta uma depuração a partir do centro que é cerca de 0,11 ml/h/kg.
[00469] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que apresenta pureza aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma pureza de pelo menos cerca de 98% ou 99% conforme medido usando eletroforese em gel capilar. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) é cerca de 99% pura.
[00470] Em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de poli- peptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que apresenta modificação de ácido siálico reduzida em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, uma pureza não superior a cerca de 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8 ou 7 nmoles de ácido siálico/nmol de polipeptídeo conforme medido usando eletrofore- se em gel capilar. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptí- deo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) compreende cerca de 14 nmoles de ácido siálico/nmol de po- lipeptídeo. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) compreende cerca de 9 nmoles de ácido siálico/nmol de polipeptídeo.
[00471] A invenção engloba uma molécula de polipeptídeo LFA3 (por exemplo, uma molécula de polipeptídeo de fusão LFA3 variante) que apresenta pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, por exemplo, todas, das atividades biológicas discutidas acima. III. Expressão e produção de molécula de polipeptídeo LFA3 Ácidos nucleicos codificando moléculas de polipeptídeo LFA3
[00472] A invenção também fornece polinucleotídeos codificando qualquer uma das moléculas de polipeptídeo descritas neste docu- mento. A invenção também fornece um método de produzir qualquer um dos polinucleotídeos descritos neste documento. Os polinucleotí- deos podem ser produzidos e expressos por procedimentos conheci- dos na técnica.
[00473] A sequência de uma molécula de polipeptídeo desejada, e ácido nucleico codificando tal molécula de polipeptídeo ou porção do mesmo, pode ser determinada usando técnicas de sequenciamento padrão. Uma sequência de ácido nucleico codificando uma molécula de polipeptídeo desejada pode ser inserida em vários vetores (tais como vetores de clonagem e expressão) para produção e caracteriza- ção recombinante.
[00474] Em um aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos codifi- cando qualquer um dos seguintes polipeptídeos divulgados neste do- cumento: isoforma de LFA3 humano1, isoforma de LFA3 humano1 domínio 1, LFA3-Fc WT, LFA3-Pfe WT, IgG2 Fc humana, M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, d1, d3, M1d1, M1d3, M4d1, M7d1, CM1d1, CM2d1, CM3d1, CM4d1, CM5d1, CM6d1, ML1d1, ML2d1, ML3d1, ML4d1, ML5d1, ML6d1 e LFA3-Fc M1d1. Em algumas modalidades, um poli- nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido acima codifica uma sequência de aminoácido pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e mais preferencialmente idêntica a, a sequência de aminoácido de uma molécula de polipeptídeo divulgada neste documento.
[00475] A invenção fornece polinucleotídeos codificando uma ou mais proteínas compreendendo uma sequência de aminoácido seleci-
onada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15-41, 69, 120 e 128. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo codificando uma se- quência de aminoácido codifica uma sequência de aminoácido pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e mais preferencialmente idêntica a, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID Nos: 16 e 69.
[00476] A invenção fornece polinucleotídeos compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42-68 e 122-127. A invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 44. A invenção fornece um polinucleotídeo compreen- dendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 53. A invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO:
122. A invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo a se- quência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 123. A invenção fornece um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 43. A inven- ção fornece um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NOs: 43 e 53.
[00477] A invenção fornece células compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 42-68 e 122-127. A invenção fornece células compreen- dendo um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nu- cleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 44. A invenção fornece células compreendendo um polinucleotídeo compreendendo a se- quência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 53. A invenção fornece células compreendendo um polinucleotídeo com- preendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 122. A invenção fornece células compreendendo um poli-
nucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 123. A invenção fornece células com- preendendo um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NO: 43. A invenção forne- ce células compreendendo um polinucleotídeo compreendendo a se- quência de ácido nucleico conforme estabelecida em SEQ ID NOs: 43 e 53.
[00478] Em outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos e variantes dos mesmos codificando moléculas de polipeptídeo LFA3, em que tais polinucleotídeos variantes compartilham pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 87%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de áci- do nucleico divulgadasneste documento. Em algumas modalidades, a invenção fornece polinucleotídeos e variantes dos mesmos, codifican- do moléculas de polipeptídeo LFA3, em que tais polinucleotídeos vari- antes compartilham pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 87%, pelo menos 89%, pelo me- nos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 123 ou SEQ ID NOs: 43 e 53. Essas quantidades não pretendem ser limitantes, e incrementos entre as porcentagens citadas são especificamente previstos como parte da divulgação.
[00479] A invenção fornece polipeptídeos codificados pelas molécu- las de ácido nucleico descritas neste documento.
[00480] Polinucleotídeos complementares a qualquer uma dessas sequências são também englobados pela presente divulgação. Os po-
linucleotídeos podem ser de filamento simples (codificação ou antis- sentido) ou filamento duplo, e podem ser moléculas de DNA (genômi- co, cDNA ou sintético) ou RNA. As moléculas de RNA incluem molécu- las de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de maneira um-para-um, e moléculas de mRNA, que não con- têm íntrons. Sequências de codificação ou não codificação adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotí- deo da presente divulgação, e um polinucleotídeo pode, mas não pre- cisa, ser ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.
[00481] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (ou seja, uma sequência endógena que codifica uma molécula de polipeptídeo) ou podem compreender uma variante dessa sequên- cia. Variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, exclusões e/ou inserções, tal que a imunorreatividade do po- lipeptídeo codificado não seja reduzida, em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado conforme descrito neste do- cumento. Em algumas modalidades, as variantes exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 80% de identidade, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 90% de identidade, e em algumas modalidades, pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma molécula de polipeptídeo nativa. Essas quantidades não pretendem ser limitantes e incrementos entre as porcentagens ci- tadas são especificamente previstos como parte da divulgação.
[00482] Duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são ditas "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para máxima corres- pondência conforme descrito abaixo. Comparações entre duas se- quências são tipicamente realizadas através da comparação das se-
quências por uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de compara- ção", como aqui utilizado, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 a cerca de 75 ou 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma se- quência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas.
[00483] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa MegAlign® na suíte Lasergene® de software de bioinformática (DNASTAR®, Inc., Madison, WI), usando parâmetros padrão. Esse programa incorpora vários esquemas de ali- nhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting dis- tant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. e Muller W., 1988, CA- BIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Nume- rical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
[00484] Em algumas modalidades, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada pela comparação de duas sequências idealmente alinhadas por uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou po- lipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou ex- clusões (ou seja, lacunas) de 20 por cento ou menos, normalmente 5 a
15 por cento ou 10 a 12 por cento, em comparação com as sequências de referência (que não compreendem adições ou exclusões) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições em que o resíduo de aminoácido ou bases de ácido nucleico idênticos ocorrem em ambas as sequên- cias para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (ou seja, o tamanho da janela) e multipli- cando os resultados por 100 para obter a percentagem de identidade de sequência.
[00485] As variantes também podem ou alternativamente, ser subs- tancialmente homólogas a um gene nativo ou a uma porção ou com- plemento deste. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hi- bridizar sob condições moderadamente rigorosas a uma sequência de DNA de ocorrência natural codificando uma molécula de polipeptídeo nativa.
[00486] "Condições moderadamente rigorosas" adequadas incluem pré-lavagem em solução de 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); hibridização a 50ºC-65ºC, 5X SSC, durante a noite; seguida de duas lavagens a 65ºC por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo 0,1% de SDS.
[00487] Conforme usado neste documento, "condições altamente rigorosas" ou "condições de alto rigor" são aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de do- decilsulfato de sódio a 50ºC; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão de fosfato de sódio a pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42ºC; ou
(3) empregam 50% de formamida, 5X SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de piro- fosfato de sódio, 5X solução de Denhardt, DNA de espermatozoide de salmão sonicado (50 µg/ml), 0,1% SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, lavagens a 42ºC em 0,2X SSC (cloreto de sódio/citrato de só- dio) e 50% de formamida a 55ºC, seguido por uma lavagem de alto rigor que consiste em 0,1X SSC contendo EDTA a 55ºC. O versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica etc. con- forme necessário para acomodar fatores, tais como comprimento da sonda e similares.
[00488] Será apreciado pelos versados na técnica que, em conse- quência da degenerescência do código genético, existem muitas se- quências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo conforme des- crito neste documento. Alguns desses polinucleotídeos apresentam homologia mínima à sequência de nucleotídeo de qualquer gene nati- vo. No entanto, polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso de códons são especificamente contemplados pela presente di- vulgação. Além disso, alelos dos genes compreendendo as sequên- cias de polinucleotídeo fornecidos neste documento estão dentro do escopo da presente divulgação. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, tais como exclu- sões, adições e/ou substituições de nucleotídeos. A proteína e mRNA resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados utilizando técnicas padrão (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de base de dados).
[00489] Os polinucleotídeos desta divulgação podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes neste documento. Um versado na técnica pode usar as sequências fornecidas neste documento e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[00490] Para a preparação de polinucleotídeos usando métodos recombinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, o vetor por sua vez pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, como ainda discutido neste documento. Po- linucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por qual- quer meio conhecido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por captação direta, endoci- tose, transfecção, F-conjugação ou eletroporação. Uma vez introduzi- do, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido no interior da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989.
[00491] Alternativamente, a PCR permite a reprodução de sequên- cias de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita nas Patentes dos EUA Nºs. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e
4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
[00492] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quan- do a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado usando métodos bem conhecidos dos versados na técnica, conforme preferência em Sambrook et al., 1989, por exemplo.
[00493] Em algumas modalidades, um primeiro vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo LFA3, por exemplo, M1d1, e um segundo vetor compreende um polinucleotídeo que codifi-
ca uma região Fc de cadeia pesada, por exemplo, IgG1. Em algumas modalidades, o primeiro vetor e o segundo vetor são transfectados em células hospedeiras em quantidades similares (tais como quantidades molares similares ou quantidades de massa similares). Em algumas modalidades, uma relação de massa molar entre 5:1 e 1:5 do primeiro vetor e do segundo vetor é transfectada em células hospedeiras. Em algumas modalidades, uma razão de massa entre 1:1 e 1:5 para o ve- tor codificando o polipeptídeo LFA3, por exemplo, M1d1, e o vetor co- dificando o domínio Fc de cadeia pesada de, por exemplo, IgG1, é usado. Em algumas modalidades, uma razão de massa de 1:2 para o vetor codificando o polipeptídeo LFA3, por exemplo, M1d1, e o vetor codificando Fc de cadeia pesada, por exemplo, IgG1, é usado. Vetores
[00494] Em algumas modalidades, um vetor é selecionado que é otimizado para expressão de polipeptídeos em células CHO ou deriva- das de CHO ou em células NSO. Exemplos de tais vetores são descri- tos, por exemplo, em Running Deer et al, Biotechnol. Prog. 20: 880- 889 (2004).
[00495] Vectores adequados de clonagem e expressão podem in- cluir uma variedade de componentes, tais como promotor, potenciador e outras sequências reguladoras transcricionais. O vetor também pode ser construído para permitir clonagem subsequente de um domínio variável de anticorpo em vetores diferentes. Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem seleci- onado possa variar de acordo com a célula hospedeira que se preten- de usar, vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma determinada endonuclease de restrição, e/ou podem transportar genes para um marcador que podem ser usados na seleção de clones contendo o ve- tor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago, vetores de transporte, tais como pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis em fornecedores co- merciais, tais como BioRad, Strategene, e Invitrogen. Vetores de ex- pressão são ainda fornecidos. Os vetores de expressão geralmente são constructos de polinucleotídeo replicáveis que contêm um polinu- cleotídeo de acordo com a divulgação. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras tanto como epissomas quanto como parte integrante do DNA cromossômico. Veto- res de expressão adequados incluem, mas serm limitação, plasmí- deos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adenoassociados, re- trovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão divulgados na Publica- ção PCT Nº WO 87/04462. Os componentes de vetor podem geral- mente incluir, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: uma se- quência sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcado- res; elementos de controle da transcrição adequados (tais como pro- motores, intensificadores e terminadores). Para expressão (ou seja, tradução), um ou mais elementos de controle de tradução também são geralmente necessários, tais como sítios de ligação do ribossomo, sí- tios de iniciação de tradução, e códons de parada.
[00496] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse e/ou os próprios polinucleotídeos, podem ser introduzidos na célula hospe- deira por qualquer de uma variedade de meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bom- bardeio de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como vírus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira. Células Hospedeiras
[00497] A molécula de polipeptídeo LFA3 pode ser produzida de forma recombinante usando uma célula hospedeira adequada. Um ácido nucleico codificando uma molécula de polipeptídeo LFA3 pode ser clonado em um vetor de expressão, que pode então ser introduzi- do em uma célula hospedeira, tal como célula de E. coli, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula COS de símio, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula de mieloma, em que a célula não produz proteína de imunoglobulina, para a obtenção da síntese da molécula de polipeptídeo LFA3 na célula hospedeira re- combinante. As células hospedeiras preferidas incluem uma célula CHO, uma célula HEK-293 de rim embrionário humano ou uma célula Sp2.0, entre muitas células bem conhecidas na técnica. Métodos de síntese química de proteínas e peptídeos são conhecidos na técnica e comercialmente disponíveis.
[00498] Em várias modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 pode ser expressa em células procarióticas, tais como células bacteri- anas; ou em células eucarióticas, tais como células fúngicas (tais co- mo levedura), células de plantas, células de inseto e células de mamí- feros. Tal expressão pode ser realizada, por exemplo, de acordo com procedimentos conhecidos na técnica. Células eucarióticas exemplifi- cativas que podem ser utilizadas para expressar polipeptídeos inclu- em, mas sem limitação, células COS, incluindo células COS 7; célu- las293, incluindo células293-6E e Expi293; células CHO, incluindo CHO-S, DG44. Células CHO Lecl3, ExpiCHO e células CHO FUT8; células PER.C6® (Crucell); e células NSO. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 pode ser expressa em levedura. Ver, por exemplo, Publicação dos EUA Nº US 2006/0270045 A1. Em algu-
mas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica particular é sele- cionada com base em sua capacidade de fazer as modificações pós- translacionais desejadas na molécula de polipeptídeo LFA3. Por exemplo, em algumas modalidades, as células CHO produzem poli- peptídeos que possuem um nível de sialilação mais alto do que o mesmo polipeptídeo em células 293.
[00499] A introdução de um ou mais ácidos nucleicos em uma célu- la hospedeira desejada pode ser realizada por qualquer método, inclu- indo mas sem limitação, transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídio catiôni- co, eletroporação, transdução, infecção etc. Métodos exemplificativos não limitantes são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Mole- cular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª ed. Cold Spring Harbor Labora- tory Press (2001). Ácidos nucleicos podem ser transfectados de forma transitória ou estável nas células hospedeiras desejadas, de acordo com qualquer método adequado.
[00500] As moléculas de polipeptídeo LFA3 podem ser purificadas por qualquer método adequado. Tais métodos incluem, mas sem limi- tação, o uso de matrizes de afinidade ou cromatografia de interação hidrofóbica, por exemplo, uma Proteína A, Proteína G ou Proteína A/G. A cromatografia hidrofóbica interativa, por exemplo, uma coluna butil ou fenil, pode também ser adequada para purificar alguns polipeptí- deos. Muitos métodos de purificar polipeptídeos são conhecidos na técnica.
[00501] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 é produzida em um sistema livre de células. Sistemas livres de células exemplificativos não limitantes são descritos, por exemplo, em Sitara- man et al., Methods Mol. Biol. 498:229-44 (2009); Spirin, Trends Bio- technol. 22: 538-45 (2004); Endo et al, Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).
IV. Usos e Terapias Médicas
[00502] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos terapêu- ticos usando uma molécula de polipeptídeo LFA3, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo a mo- lécula de polipeptídeo LFA3.
[00503] As doenças, distúrbios ou condições aplicáveis incluem, mas sem limitação, diabetes tipo 1, psoríase, psoríase em placas, pus- tulose palmoplantar, psoríase pustulosa de palmas e solas, pustulose palmar e plantar, pustulose de palmas e solas, dermatite atópica, lí- quen plano, doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD), vitiligo, Pi- tiríase Rubra Pilar, transplante (por exemplo, transplante de órgão, por exemplo, transplante de rim), artrite psoriática, uma doença, distúrbio ou condição que requer transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas, talassemia, anemia falciforme, trombastenia de Glanz- mann, síndrome de Wiskott-Aldrich, doença granulomatosa crônica, neutropenia congênita grave, deficiência de adesão de leucócitos, Síndrome de Schwachman-Diamond, anemia de Diamond-Blackfan, anemia Fanconi, disceratose congênita, síndrome de Chediak-Higashi, anemia aplástica, alopecia areata, e linfoma de células T (por exemplo, linfoma de células T cutâneas ou linfoma não Hodgkin de células T pe- riféricas).
[00504] Doenças, distúrbios ou condições adicionais incluem, mas sem limitação, diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus tipo 1 ou diabetes mellitus dependente de insulinaa); diabetes juvenil; res- postas inflamatórias, tais como doenças de pele inflamatórias incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); dermatomiosite; esclerodermia sistêmica e esclerose; respostas associadas a doença inflamatória intestinal (tais como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome da dificuldade respiratória (incluindo síndrome da dificuldade respiratória no adulto; ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; gastrite; glomerulonefrite; condições alérgicas, tais como ecze- ma e asma e outras condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatoide; lúpus eritematoso sistêmico (SLE); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tireoidite autoimune; encefa- lomielite alérgica; síndroms de Sjogren; e respostas imunes associa- das a hipersensibilidade aguda e tardia mediada por citocinas e linfóci- tos T tipicamente encontrados em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diapedese leucocitária; dis- túrbio inflamatório do sistema nervoso central (CNS); síndrome de dis- função de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas sem limitação, crioglobinemia ou anemia Coombs-positivo); miastenia gra- ve; doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo; doença anti- membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgi- ca; doença de Grave; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfi- goide bolhoso; pênfigo; poliendocrinopatias autoimunea; vitiligo; doen- ça de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; arterite de células gigantes; nefrite do complexo imune; nefropatia de IgA; poli- neuropatias de IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombo- citopenia imune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoidite de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfo- proliferativa autoimune (ALPS); uveoretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barre; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade autoimune; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopática; doença do enxerto versus hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cintura-membro, Facioscapu- lohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss); e uma doença não imune inflamatória, tais como uma doença cardíaca ou uma doença cerebral.
[00505] As moléculas de polipeptídeo LFA3 da presente invenção podem também ser usadas para detectar e/ou medir CD2 ou células que expressam CD2 em uma amostra, por exemplo, para fins de diag- nóstico. Por exemplo, uma molécula de polipeptídeo LFA3 pode ser usada para diagnosticar uma condição ou doença caracterizado por expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão etc.) de CD2. Ensaios diagnósticos exemplificativos para CD2 podem compreender, por exemplo, contactar uma amostra, obtida de um paciente, com uma molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção, em que a molécula de polipeptídeo LFA3 é marcada com um marcador detectável ou molécula repórter.
[00506] Como usado neste documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente mantenha a atividade biológica e seja não reativo com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, mas sem limita- ção, quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão, tais como solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico), água, emulsões, tais como emulsão de óleo/água, e vários tipos de agentes umectan- tes. Diluentes preferidos para administração por aerossol ou parenteral são solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina normal (0,9%). Composições compreendendo tais veículos são formu- ladas por métodos convencionais bem conhecidos (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Ed., Mack Publishing, 2000). V. Composições
[00507] A divulgação também fornece composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz da LFA3 molécula de polipep- tídeo descrita neste documento. Exemplos de tais composições, e também de como formular, são também descritos neste documento. Em algumas modalidades, a composição compreende uma ou mais moléculas de polipeptídeo LFA3.
[00508] A composição usada na presente divulgação pode ainda compreender veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamen- te aceitáveis (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20ª Ed., 2000, Lippincott Williams e Wilkins, Ed. K.E. Hoover), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosa- gens e concentrações, podendo compreender tampões, tais como fos- fato, citrato, HEPES e outros ácidos orgânicos. Em algumas modalida- des, composições compreendendo polipeptídeos LFA3 providos neste documento, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, incluem solução salina tam- ponada com HEPES. Em algumas modalidades, uma concentração de um tampão HEPES é cerca de 10 mM, cerca de 20 mM, cerca de 30 mM, cerca de 40 mM, cerca de 50 mM, cerca de 60 mM, cerca de 70 mM, cerca de 80 mM, cerca de 90 mM, cerca de 100 mM. Em algumas modalidades, uma concentração de tampão HEPES é 20 mM. Veícu- los, excipientes ou estabilizantes aceitáveis adicionais incluem antioxi- dantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; clo- reto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzí- lico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; re- sorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutami- na, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissa-
carídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextranos; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são ainda descritos neste documento.
[00509] As moléculas de polipeptídeo LFA3 e composições das mesmas também podem ser utilizadas em conjunto com outros agen- tes que servem para potencializar e/ou complementar a eficácia dos agentes.
[00510] A divulgação também provê composições, incluindo com- posições farmacêuticas, compreendendo qualquer um dos polinucleo- tídeos da divulgação. Em algumas modalidades, a composição com- preende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica a molécula de polipeptídeo LFA3 conforme descrito neste documento. Em outras modalidades, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica qualquer uma das moléculas de polipeptídeo LFA3 descritas neste do- cumento.
[00511] Composições farmacêuticas da divulgação também podem ser administradas em terapia de combinação, tal como combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode in- cluir a molécula de polipeptídeo LFA3 da presente divulgação combi- nada com pelo menos uma outra terapia, em que a terapia pode ser cirurgia, imunoterapia ou terapia medicamentosa.
[00512] Os compostos farmacêuticos da divulgação podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos al- canoicos substituídos por fenil, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aro- máticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.
[00513] Uma composição farmacêutica da divulgação também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de an- tioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbil, hi- droxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, pro- pil galato, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sor- bitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.
[00514] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da divul- gação incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis, tais como etil oleato. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
[00515] Essas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização como pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açú- cares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser ocasio- nada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[00516] As composições farmacêuticas tipicamente devem ser esté- reis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como solução, microemulsão, lipos- soma ou outra estrutura ordenada adequada a altas concentrações de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão con- tendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propile- noglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares) e suas misturas ade- quadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será adequado para incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições in- jetáveis pode ser ocasionada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00517] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um sol- vente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enu- merados acima, conforme necessário, seguido por microfiltração de esterilização.
[00518] Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorpora- ção do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enu- merados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de solu- ções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são se- cagem a vácuo e criodessecação (liofilização) que geram um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente esterilizada filtrada deste.
[00519] Uma composição farmacêutica da presente divulgação po- de ser preparada, embalada ou vendida em uma formulação adequada para administração oftálmica. Tais formulações podem, por exemplo, estar na forma de colírios incluindo, por exemplo, uma solução ou sus- pensão a 0,1%-1,0% (p/p) do ingrediente ativo em um veículo aquoso ou líquido oleoso. Esses colírios podem compreender ainda agentes tamponantes, sais ou um ou mais outros dos ingredientes adicionais descritos neste documento. Outras formulações oftalmicamente admi- nistráveis que são úteis incluem aquelas que compreendem o ingredi- ente ativo na forma microcristalina ou em uma preparação lipossomal.
[00520] Como usado neste documento, "ingredientes adicionais" incluem, mas sem limitação, um ou mais dos seguintes: excipientes; agentes tensoativos; agentes dispersantes; diluentes inertes; agentes de granulação e desintegração; agentes de ligação; agentes lubrifican- tes; agentes adoçantes; agentes aromatizantes; agentes corantes; conservantes; composições fisiologicamente degradáveis, tais como gelatina; veículos aquosos e solventes; veículos oleosos e solventes; agentes de suspensão; agentes dispersantes ou umectantes; agentes emulsificantes, demulcentes; tampões; sais; agentes espessantes; en- chimentos; agentes emulsificantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos; agentes estabilizantes; e materiais poliméricos ou hidro- fóbicos farmaceuticamente aceitáveis. Outros "ingredientes adicionais"
que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas da divulga- ção são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Reming- ton's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985), que é incorporado neste documento por referência.
[00521] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 desta invenção pode ser formulada para injeção subcutânea. Em al- gumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 desta invenção pode ser formulada para injeção intramuscular.
[00522] Em algumas modalidades, o polipeptídeo LFA3, por exem- plo, LFA3-Fc M1d1, é formulado em uma concentração de cerca de 0,01 – 2,0 mg/ml. Em algumas modalidades, o polipeptídeo LFA3, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, é formulado em uma concentração de cerca de 0,01, cerca de 0,02, cerca de 0,05, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cer- ca de 0,3, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 1,8 ou cerca de 2,0 mg/ml. Em algumas modalidades, o polipeptídeo LFA3, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, é formulado em uma concentra- ção de cerca de 0,015 mg/ml. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo LFA3, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, é formulado em uma concen- tração de cerca de 0,15 mg/ml. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo LFA3, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, é formulado em uma concen- tração de cerca de 1,5 mg/ml. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo LFA3, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, é formulado em uma concen- tração de cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40 ou cerca de 50 mg/ml.
[00523] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 desta invenção pode ser formulada como uma dose de cerca de 0,2-8 mg por injeção (por exemplo, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ou 8 mg por injeção), por exemplo, entre 0,22-7,5 mg por injeção. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo
LFA3 desta invenção pode ser formulada em cerca de 0,5-1,5 ml de solução por injeção (por exemplo, 0,5, 1 ou 1,5 ml de solução por inje- ção), por exemplo, cerca de 1 ml de solução por injeção.
[00524] As formulações das composições farmacêuticas descritas neste documento podem ser preparadas por qualquer método conhe- cido ou doravante desenvolvido na técnica de farmacologia. Em geral, tais métodos preparatórios incluem a etapa de colocar o ingrediente ativo em associação com um veículo ou um ou mais outros ingredien- tes acessórios e, então, se necessário ou desejável, moldar ou emba- lar o produto em uma unidade de dose única ou múltipla desejada.
[00525] Em uma modalidade, as composições da divulgação são formulações apirogênicas as quais são substancialmente livres de en- dotoxinas e/ou substâncias pirogênicas relacionadas. Endotoxinas in- cluem toxinas que são confinadas dentro de um microrganismo e são liberadas quando os microrganismos são decompostos ou morrem. As substâncias pirogênicas também incluem substâncias termoestáveis indutoras de febre (glicoproteínas) da membrana externa de bactérias e outros microrganismos. Ambas as substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se administradas em seres humanos. Devido aos potenciais efeitos nocivos, é vantajoso remover até mesmo pequenas quantidades de endotoxinas de soluções de drogas farmacêuticas ad- ministradas intravenosamente. A Food and Drug Administration ("FDA") definiu um limite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dose por quilograma de peso corporal em um único período de uma hora para aplicações de drogas intravenosas (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Quando as proteínas terapêuticas são administradas em quantidades de várias centenas ou milhares de miligramas por quilograma de peso corporal, é vantajoso remover até mesmo vestígios de endotoxina. Em uma modalidade, níveis de endotoxina e pirogênio na composição são inferiores a 10 EU/mg ou inferiores a 5 EU/mg ou inferiores a 1 EU/mg ou inferiores a 0,1 EU/mg ou inferiores a 0,01 EU/mg ou inferiores a 0,001 EU/mg. Em outra modalidade, os níveis de endotoxina e pirogê- nio na composição são inferiores a cerca de 10 EU/mg ou inferiores a cerca de 5 EU/mg ou inferiores a cerca de 1 EU/mg ou inferiores a cerca de 0,1 EU/mg ou inferiores a cerca de 0,01 EU/mg ou inferiores a cerca de 0,001 EU/mg.
[00526] Em uma modalidade, a divulgação compreende administrar uma composição em que a referida administração é oral, parenteral, intramuscular, intranasal, vaginal, retal, lingual, sublingual, bucal, in- trabucal, intravenosa, cutânea, subcutânea ou transdérmica. Em al- gumas modalidades, uma composição compreendendo um polipeptí- deo LFA3, por exemplo, LFA3-Fc M1d1, é administrada intravenosa- mente. Em outra modalidade, a divulgação ainda compreende admi- nistrar uma composição em combinação com outras terapias, tais co- mo cirurgia, quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica, imuno- terapia ou radioterapia. Em algumas modalidades, a outra terapia é o transplante de células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, transplan- te de células-tronco hematopoiéticas alogênicas. VI. Dosagem/Administração
[00527] Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis inclu- indo uma molécula de polipeptídeo LFA3 da divulgação, a molécula de polipeptídeo LFA3 é misturada com um veículo ou excipiente farma- ceuticamente aceitável. As formulações de agentes terapêuticos e de diagnóstico podem ser preparadas através da mistura de veículos, ex- cipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis na forma de, por exemplo, pós liofilizados, pastas fluidas, soluções aquosas, loções ou suspensões (ver, por exemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, e Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medica- tions, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceuti- cal Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Mar- cel Dekker, NY; Weiner e Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Sa- fety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.).
[00528] A seleção de um regime de administração para uma tera- pêutica depende de vários fatores, incluindo a taxa de renovação de soro ou tecido da entidade, o nível de sintomas, a imunogenicidade da entidade e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Em certas modalidades, um regime de administração maximiza a quanti- dade de terapêutica administrada ao paciente consistente com um ní- vel aceitável de efeitos colaterais. Consequentemente, a quantidade de material biológico administrado depende em parte da entidade em particular e da gravidade da condição a ser tratada. Estão disponíveis orientações na seleção de doses adequadas de anticorpos, citocinas e pequenas moléculas (ver, por exemplo, Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.),1993, Monoclonal Antibodies and Peptide The- rapy in Autoimnune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lip- sky, et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602).
[00529] A determinação da dose adequada é feita pelo médico, por exemplo, utilizando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica por afetar o tratamento ou previsto para afetar o tratamento.
Geralmente, a dose começa com uma quantidade um pouco inferior à dose ótima e é aumentada em pequenos incrementos daí em diante até que o efeito desejado ou ótimo seja alcançado em relação a quais- quer efeitos colaterais negativos. Medidas de diagnóstico importantes incluem aqueles sintomas, por exemplo, da inflamação ou nível de ci- tocinas inflamatórias produzidas.
[00530] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser varia- dos de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja efi- caz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente par- ticular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma varie- dade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composi- ções particulares da presente divulgação empregada ou o éster, sal ou amida deste, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser empregado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais usados em com- binação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico prévio do paciente em tratamento, e como fatores bem conhecidos nas técnicas médicas.
[00531] Composições compreendendo moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação pode ser administrada duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas ou uma vez a cada três semanas. Em algumas modalidades, a molécula de polipep- tídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada uma vez por semana.
[00532] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 5-20 mg/semana (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17 ou 20 mg/semana). Em algumas modalidades, a molé-
cula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 15 mg/semana. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da inven- ção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 7,5 mg/semana.
[00533] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 0,2-8 mg por injeção (por exemplo, 0,2, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 ou 8 mg por injeção). Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da inven- ção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose entre 0,22-7,5 mg por injeção. Em algumas modalidades, a mo- lécula de polipeptídeo LFA3 da invenção, por exemplo, LFA3-Fc M1d1 ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 7,5 mg por injeção.
[00534] Em algumas modalidades, o polipeptídeo LFA3 da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 0,01 a 10 mg/kg. Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo LFA3 da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administra- da em uma dose de cerca de 0,01, cerca de 0,02, cerca de 0,03, cerca de 0,04, cerca de 0,05, cerca de 0,06, cerca de 0,07, cerca de 0,08, cerca de 0,09, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,3, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 2,0, cerca de 3,0, cerca de 4,0, cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 8,0, cerca de 9,0 ou cerca de 10,0 mg/kg. Em algumas modalidades, o polipeptídeo LFA da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 0,03 mg/kg. Em algumas mo- dalidades, o polipeptídeo LFA da invenção (por exemplo, LFA3-Fc
M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 0,3 mg/kg. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo LFA da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 3,0 mg/kg. Em algumas modalidades, o polipeptídeo LFA da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em uma dose de cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75 ou cerca de 100 mg/kg.
[00535] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em cerca de 0,5-1,5 ml de solução por injeção (por exemplo, 0,5, 1 ou 1,5 ml de solução por injeção). Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em cerca de 1 ml de solução por injeção.
[00536] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêuti- ca da mesma, é administrada em um volume de dose de cerca de 0,5 to 5 ml/kg. Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêuti- ca da mesma, é administrada em um volume de dose de cerca de 0,5, cerca de 1,0, cerca de 1,5, cerca de 2,0, cerca de 2,5, cerca de 3,0, cerca de 3,5, cerca de 4,0, cerca de 4,5 ou cerca de 5,0 ml/kg. Em al- gumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção (por exemplo, LFA3-Fc M1d1) ou composição farmacêutica da mesma, é administrada em um volume de dose de cerca de 2,0 ml/kg.
[00537] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cursos, por exemplo, em que cada curso consiste em 10-14 semanas (por exemplo, 10, 11, 12, 13 ou 14 semanas), por exemplo, 12 semanas, por exemplo, em que dois cursos adjacentes são separados por um intervalo de 10 a 14 semanas (por exemplo, um intervalo de 10, 11, 12, 13 ou 14 sema- nas), por exemplo, um intervalo de 12 semanas.
[00538] Em algumas modalidades, a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada subcutaneamente em uma dose de cerca de 15 mg/semana uma vez por semana, por exemplo, em que a molécula de polipeptídeo LFA3 da invenção ou composição farmacêutica da mesma, é administrada por um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) cursos, em que cada cur- so consiste em 12 semanas e dois cursos adjacentes são separados por um intervalo de 12 semanas.
[00539] Uma quantidade eficaz para um determinado paciente pode variar dependendo de fatores, tais como a condição a ser tratada, a saúde geral do paciente, a via e dose de administração do método e a gravidade dos efeitos colaterais (ver, por exemplo, Maynard, et al., 1996, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FIa.; Dent, 2001, Good Laboratory and Good Clini- cal Practice, Urch Publ, London, UK).
[00540] A via de administração pode ser, por exemplo, por aplica- ção tópica ou cutânea, injeção ou infusão intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intracerebroespi- nhal, intralesional ou por sistemas de liberação controlada ou um im- plante (ver, por exemplo, Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547- 556; Langer, et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105; Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; Patentes dos EUA Nºs. 6.350.466 e 6.316.024). Quando necessário, a composição pode também incluir um agente so- lubilizante e um anestésico local, tal como lidocaína para aliviar a dor no sítio de injeção. Além disso, administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante. Ver, por exemplo, Paten- te dos EUA Nºs. 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272,
5.874.064, 5.855.913, 5.290.540, e 4.880.078; e Publicação PCT Nº. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, e WO 99/66903, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a molécula de poli- peptídeo LFA3 ou composição farmacêutica da mesma, da divulgação é administrada usando tecnologia de administração de fármaco pul- monar Alkermes AIR™ (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
[00541] Uma composição da presente divulgação pode também ser administrada através de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração irão variar dependendo dos resultados desejados. As vias de administração selecionadas para moléculas de polipeptídeo da divulgação incluem vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias pa- renterais, por exemplo, por injeção ou infusão. A administração paren- teral pode representar modos de administração diferentes da adminis- tração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, peridural e intrasternal. Alternativamente, uma composição da divulgação pode ser administrada por via não pa- renteral, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mu- cosal, por exemplo, intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
[00542] Se como moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação forem administradas em um sistema de liberação controlada ou libera-
ção sustentada, uma bomba pode ser usada para atingir liberação controlada ou sustentada (ver, Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:501; Sau- dek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:514).
[00543] Materiais poliméricos podem ser usados para alcançar libe- ração controlada ou sustentada das terapias da divulgação (ver, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); Controlled Drug Bioavaila- bility, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wi- ley, New York (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver também Levy et al, 1985, Science 11 225:190; During et al., 19Z9, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al, 1989, J. Neurosurg. 71: 105); Patente dos EUA Nº. 5.679.377; Patente dos EUA Nº. 5.916.597; Patente dos EUA Nº. 5.912.015; Patente dos EUA Nº. 5.989.463; Patente dos EUA Nº. 5.128.326; Publicação PCT Nº. WO 99/15154; e Publicação PCT Nº. WO 99/20253. Exemplos de po- límeros usados em formulações de liberação sustentada incluem, mas sem limitação, poli(2-hidroxietil metacrilato), poli(metil metacrilato), po- li(ácido acrílico), poli(etileno-co-vinil acetato), poli (ácido metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolidona), álcool poli- vinílico), poliacrilamida, polietilenoglicol), polilactídeos (PLA), polilactí- deo-co-glicolídeos) (PLGA) e poliortoésteres. Em uma modalidade, o polímero utilizado em uma formulação de liberação sustentada é iner- te, livre de impurezas lixiviáveis, estável no armazenamento, estéril e biodegradável. Um sistema de liberação controlada ou sustentada po- de ser colocado em proximidade do alvo profilático ou terapêutico, re- querendo, portanto, apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
[00544] Os sistemas de liberação controlada são discutidos na revi-
são de Langer, 1990, Science 249:1527-1533. Qualquer técnica co- nhecida por um versado na técnica pode ser usada para produzir for- mulações de liberação sustentada compreendendo uma ou mais mo- léculas de polipeptídeo da divulgação ou conjugados destas. Ver, por exemplo, Patente dos EUA Nº. 4.526.938, Publicações de Patentes Internacionais WO 91/05548, WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intra- tumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy and Oncology 59:179- 189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397, Cleek et ah, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Ml. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, e Lam et al., 1997, "Mi- croencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Ml. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 160, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00545] Se a molécula de polipeptídeo LFA3 da divulgação for ad- ministrada topicamente, ela pode ser formulada na forma de uma po- mada, creme, adesivo transdérmico, loção, gel, xampu, spray, aeros- sol, solução, emulsão ou outra forma bem conhecida por um versado na técnica. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19ª ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para as formas de dosagem farmacêuticas tópicas não pulverizáveis, as formas viscosas a semissólidas ou sólidas com- preendendo um veículo ou um ou mais excipientes compatíveis com a aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica, em alguns casos, superior à da água, são utilizados. As formulações adequadas inclu- em, sem limitação, soluções, suspensões, emulsões, cremes, unguen- tos, pós, linimentos, pomadas e similares, que são, se desejado, este-
rilizados ou misturados com agentes auxiliares (por exemplo, conser- vantes, estabilizantes, agentes umectantes, tampões ou sais) para in- fluenciar várias propriedades, como, por exemplo, pressão osmótica. Outras formas de dosagem tópica adequadas incluem preparações de aerossol pulverizáveis em que o ingrediente ativo, em alguns casos, em combinação com um veículo inerte sólido ou líquido, é embalado em uma mistura com um volátil pressurizado (por exemplo, um prope- lente gasoso, tal como freon) ou em uma garrafa de compressão (squeeze). Hidratantes ou umectantes também podem ser adicionados às composições farmacêuticas e formas de dosagem se desejado. Exemplos de tais ingredientes adicionais são bem conhecidos na téc- nica.
[00546] Se as composições compreendendo as moléculas de poli- peptídeo LFA3 forem administradas por via intranasal, podem ser for- muladas na forma de aerossol, spray, névoa ou na forma de gotas. Em particular, agentes profiláticos ou terapêuticos para uso de acordo com a presente divulgação podem ser convenientemente entregues na forma de uma apresentação em spray aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou nebulizador, com o uso de um propelente adequado (por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetra- fluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determi- nada fornecendo uma válvula para entregar uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos (compostos, por exemplo, de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lac- tose ou amido.
[00547] Métodos de coadministração ou tratamento com um segun- do agente terapêutico, por exemplo, uma citocina, esteroide, agente quimioterápico, antibiótico ou radiação, são bem conhecidos na técni-
ca (ver, por exemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman e Gil- man's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10ª ed., McGraw- Hill, New York, NY; Poole e Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeu- tics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila., Pa.; Chabner e Longo (eds.) (2001) Cancer Chemothe- rapy and Biotherapy, Lippincott, Williams e Wilkins, Phila., Pa.). Uma quantidade eficaz de produto terapêutico pode reduzir os sintomas em pelo menos 10 por cento; em pelo menos 20 por cento; pelo menos cerca de 30 por cento; pelo menos 40 por cento ou pelo menos 50 por cento.
[00548] Em uma modalidade, as moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação podem ser coadministradas com composições para tra- tar doenças e distúrbios autoimunes, incluindo, mas sem limitação, adriamicina, azatiopurina, bussulfano, ciclofosfamida, ciclosporina A, Citoxan, fludarabina, 5-fluorouracil, metotrexato, micofenolato mofetil, 6-mercaptopurina, um corticosteroide, um antiinflamatório não esteroi- de, sirolimus (rapamicina), e tacrolimus (FK-506). Em modalidades al- ternativas, o agente imunomodulador ou imunossupressor é um anti- corpo específico do grupo que consiste em muromonab-CD3, alem- tuzumab (Campath®), basiliximab, daclizumab, muromonab (OKT3®), rituximab, globulina antitimócito e IVIg, e outros, que são conhecidos dos versados na técnica.
[00549] Em uma modalidade, as moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação podem ser coadministradas com composições para tra- tar diabetes, incluindo, mas sem limitação, biguanidas (por exemplo, buformina, metformina e fenorma), hormônios e seus análogos (amili- na, insulina, insulina asparte, insulina detemir, insulina glargina, insuli- na glulisina, insulina lispro, liraglutida, e pramlintida), derivados de sul- fonilureia (acetohexamida, carbutamida, clorpropamida, glibornurida, gliclazida, glimepirida, glipizida, gliquidona, glisoxepida, gliburida, gli-
butiazol, glibuzol, glihexamida, glimidine, tolazamida, tolbutamida e tolciclamida), tiazolidinedionas (pioglitazona, rosiglitazona e troglitazo- na), acarbose, exenatida, miglitol, mitiglinida, muraglitazar, nateglinida, repaglinida, sitagliptina, tesaglitazar, vildagliptina e voglibose.
[00550] Em certas modalidades, as moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação podem ser formuladas para garantir uma distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da divulgação cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para méto- dos de fabricação de lipossomas, ver, por exemplo, Patentes dos EUA
4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreen- der uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, aumentando assim a distribuição direci- onada de fármaco (ver, por exemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porções de direcionamento exemplificativos in- cluem folato ou biotina (ver, por exemplo, Patente dos EUA
5.416.016); manosídeos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P. G. Bloeman et al., 1995, FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A de tensoativo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); pl20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346: 123; Killion; Fidler, 1994; Immunomethods 4:273.
[00551] A divulgação provê protocolos para a administração de composição farmacêutica compreendendo moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação sozinha ou em combinação com outras terapias a um indivíduo em necessidade dos mesmos. As terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) das terapias de combinação da presente divulgação podem ser administradas concomitantemente ou sequencialmente a um indivíduo. A terapia (por exemplo, agentes pro- filáticos ou terapêuticos) das terapias de combinação da presente di- vulgação também pode ser administrada ciclicamente. A terapia de ciclagem envolve a administração de uma primeira terapia (por exem- plo, um primeiro agente profilático ou terapêutico) por um período de tempo, seguido por uma administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profilático ou terapêutico) por um perío- do de tempo e repetir esta administração sequencial ou seja, o ciclo, a fim de reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias (por exemplo, agentes) para evitar ou reduzir os efeitos colaterais de uma das terapias (por exemplo, agentes) e/ou para melhorar a eficácia das terapias.
[00552] As terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuti- cos) da terapia de combinação da divulgação podem ser administra- das a um indivíduo concomitantemente. O termo "concomitantemente" não está limitado à administração de terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) exatamente ao mesmo tempo, mas signifi- ca que uma composição farmacêutica compreendendo moléculas de polipeptídeo LFA3 da divulgação são administradas a um indivíduo em uma sequência e dentro de um intervalo de tempo, tal que as molécu- las de polipeptídeo LFA3 da divulgação podem atuar em conjunto com a(s) outra(s) terapia(s) para proporcionar um benefício maior do que se fossem administradas de outra forma. Por exemplo, cada terapia pode ser administrada a um indivíduo ao mesmo tempo ou sequencialmente em qualquer ordem em momentos diferentes; no entanto, se não fo- rem administradas ao mesmo tempo, devem ser administradas sufici- entemente próximas no tempo para proporcionar o efeito terapêutico ou profilático desejado. Cada terapia pode ser administrada a um indi- víduo separadamente, de qualquer forma adequada e por qualquer via adequada. Em várias modalidades, as terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administradas a um indivíduo em me- nos de 15 minutos, menos de 30 minutos, menos de 1 hora de interva- lo, em cerca de 1 hora de intervalo, em cerca de 1 hora a cerca de 2 horas de intervalo, em cerca de 2 horas a cerca de 3 horas de interva- lo, em cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de intervalo, em cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de intervalo, em cerca de 5 horas a cerca de 6 horas de intervalo, em cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de inter- valo, em cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de intervalo, em cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de intervalo, em cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de intervalo, em cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de intervalo, em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de intervalo, 24 horas de intervalo, 48 horas de intervalo, 72 horas de intervalo ou 1 semana de intervalo. Em outras modalidades, duas ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) são administradas a um paciente na mesma visita do paciente.
[00553] Os agentes profiláticos ou terapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados a um indivíduo na mesma com- posição farmacêutica. Alternativamente, os agentes profiláticos ou te- rapêuticos das terapias de combinação podem ser administrados con- comitantemente a um indivíduo em composições farmacêuticas sepa- radas. Os agentes profiláticos ou terapêuticos podem ser administra- dos a um indivíduo pela mesma ou por diferentes vias de administra- ção. VII. Kits
[00554] A divulgação também fornece kits compreendendo qualquer uma ou todas as moléculas de polipeptídeo descritas neste documen- to. Kits da divulgação incluem um ou mais recipientes compreendendo uma molécula de polipeptídeo LFA3 descrita neste documento e ins- truções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da divulga- ção descrita neste documento. Geralmente, essas instruções compre-
endem uma descrição de administração da molécula de polipeptídeo para os tratamentos terapêuticos descritos acima. Em algumas moda- lidades, os kits são providos para a produção de uma unidade de ad- ministração de dose única. Em certas modalidades, o kit pode conter tanto um primeiro recipiente contendo uma proteína desidratada quan- to um segundo recipiente contendo uma formulação aquosa. Em cer- tas modalidades, kits contendo um aplicador, por exemplo, seringas pré-cheias de uma e várias câmaras (por exemplo, seringas líquidas e liosseringas), estão incluídos.
[00555] As instruções relativas ao uso de uma molécula de polipep- tídeo LFA3 geralmente incluem informações quanto à dosagem, es- quema de dosagem e via de administração para o tratamento preten- dido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidose) ou doses subunitárias. Instru- ções fornecidas nos kits de divulgação são tipicamente instruções es- critas em etiqueta ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas em disco magnético ou óptico de armazenamento) são também aceitáveis.
[00556] Os kits desta divulgação estão em embalagens adequadas. A embalagem adequada inclui, mas sem limitação, frascos, garrafas, potes, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico), e similares. Também contemplados são embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inala- dor, um dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomiza- dor) ou um dispositivo de infusão, tal como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente tam- bém pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma tam- pa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é uma molécula de polipeptídeo LFA3 da divulgação. O recipiente pode compreender ainda um segundo agente farmaceuticamente ativo.
[00557] Os kits podem opcionalmente fornecer componentes adici- onais, tais como tampões e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula(s) sobre ou asso- ciado ao recipiente.
[00558] A divulgação também oferece kits de diagnóstico compre- endendo qualquer uma ou todas as moléculas de polipeptídeo descri- tas neste documento. Os kits de diagnóstico são úteis, por exemplo, para detectar a presença de CD2 em uma amostra. Em algumas mo- dalidades, um kit de diagnóstico pode ser usado para identificar um indivíduo com uma doença latente, distúrbio ou condição que pode co- locá-lo em risco de desenvolver doença, distúrbio ou condição media- da por CD2 ou doença, distúrbio ou condição por deficiência de CD2. Em algumas modalidades, um kit de diagnóstico pode ser usado para detectar a presença e/ou nível de CD2 em um indivíduo suspeito de ter uma doença mediada por CD2 ou doença, distúrbio ou condição por deficiência de CD2.
[00559] Os kits de diagnóstico da divulgação incluem um ou mais recipientes compreendendo uma molécula de polipeptídeo LFA3 des- crita neste documento e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos de divulgação descrita neste documento. Geralmen- te, essas instruções compreendem uma descrição de uso da molécula de polipeptídeo LFA3 para detectar a presença de CD2 em indivíduos em risco de ou com suspeita de ter, uma doença mediada por CD2 ou doença, distúrbio ou condição por deficiência de CD2. Em algumas modalidades, um kit de diagnóstico exemplificativo pode ser configura-
do para conter reagentes como, por exemplo, uma molécula de poli- peptídeo LFA3, uma amostra de controle negativo, uma amostra de controle positivo e instruções de uso do kit. VIII. Equivalentes
[00560] A descrição anterior e os Exemplos a seguir detalham cer- tas modalidades específicas da divulgação e descrevem o melhor mo- do contemplado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa quão detalhado o precedente possa aparecer no texto, a di- vulgação pode ser praticada de muitas maneiras e a divulgação deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.
[00561] Embora os ensinamentos divulgados tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, será apreciado que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar dos ensinamentos neste documento e da divulgação reivin- dicada abaixo. Os exemplos a seguir são providos para melhor ilustrar os ensinamentos divulgados e não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos aqui apresentados. Embora os presentes ensinamentos tenham sido descritos em termos dessas modalidades exemplificati- vas, o versado na técnica compreenderá prontamente que muitas vari- ações e modificações dessas modalidades exemplificativas são possí- veis sem experimentação indevida. Todas essas variações e modifica- ções estão dentro do escopo dos ensinamentos atuais.
[00562] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedi- dos de patentes, artigos, livros de texto, e afins, e as referências aí ci- tadas, na medida em que ainda não o sejam, são aqui incorporados por referência em sua totalidade. No caso de um ou mais da literatura incorporada e materiais similares diferirem ou contradizerem este pe- dido, incluindo, mas sem limitação, termos definidos, termos de uso, técnicas descritas ou similares, este pedido prevalece.
IX. Ensinamentos Gerais
[00563] Deve-se entender que esta invenção não se limita a méto- dos de produção sintéticos específicos que podem, naturalmente, vari- ar. A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos no singular devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular. Geralmente, as nomenclatu- ras utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e te- cidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética, química e hibridização de proteína e ácido nucleico implementadas neste do- cumento são aquelas bem conhecidas e comumente utilizadas na téc- nica.
[00564] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da competência da técnica. Tais técnicas são amplamente explicadas na literatura, tais como, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Métodos in Molecular Biology, Human Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley e Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Mole-
cular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immu- nology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Proto- cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La- boratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Anti- bodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, eds., Harwood Aca- demic Publishers, 1995).
[00565] As reações enzimáticas e técnicas de purificação são reali- zadas de acordo com as especificações do fabricante, conforme co- mumente realizado na técnica ou como descrito neste documento. As nomenclaturas utilizadas em conexão com, e os procedimentos e téc- nicas laboratoriais de, química analítica, bioquímica, imunologia, biolo- gia molecular, química orgânica sintética, e química medicinal e far- macêutica descritas neste documento são aquelas conhecidas e co- mumente utilizadas na técnica. Técnicas padrão são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparações farmacêuticas, formulações, e administração e tratamento de pacientes.
EXEMPLOS
[00566] A divulgação é ainda descrita em detalhes por referência aos seguintes exemplos experimentais. Esses exemplos são providos apenas para fins de ilustração e não têm a intenção de ser limitantes, a menos que especificado de outra forma. Assim, a divulgação não deve, de forma alguma, ser interpretada como sendo limitada aos se- guintes exemplos, mas sim, deve ser interpretada para abranger qual- quer e todas as variações que se tornam evidentes como resultado do ensinamento provido neste documento. Exemplo 1: Estabilidade e maturação de afinidade de LFA3 através de métodos de exibição de levedura Expressão e Purificação de Proteína
[00567] Variantes de LFA3 humano com uma dobradiça-Pfe Fc C- terminal foram clonadas no vetor de expressão de mamífero pRY19 e usadas para transfectar transitoriamente células Expi293 (ThermoFis- her) e ExpiCHO (ThermoFisher) usando o Kit de Transfecção Expi- Fectamine 293 (ThermoFisher #A14525) e o Kit de Sistema de Ex- pressão ExpiCHO (ThermoFisher # A29133), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. Após 4-7 dias de expressão, a proteína foi colhida e purificada pela coluna de afinidade de Proteína A usando a resina MabSelectSuRe (GE Healthcare #17-5438-01) segui- da de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) usando uma co- luna Superdex200 13100 Increase (GE Healthcare).
[00568] Para expressão em larga escala, foram geradas linhagens celulares estáveis agrupadas de CHO SSI. LFA3-Fc M1-d1 e M1-d3 contendo sobrenadante foi filtrado e capturado em resina MabSelect SuRe LX. A proteína eluída foi neutralizada e passada por uma coluna SP em modo de fluxo como etapa de polimento. Para a proteína LFA3- Fc de tipo selvagem (WT), a fração monomérica foi purificada usando SEC. As impurezas do processo foram medidas usando kits de ensaio comerciais para proteína A residual, proteínas de célula hospedeira (HCP) e DNA. Exibição de superfície de levedura de LFA3 humano
[00569] O domínio Ig N-terminal de LFA3 humano (Resíduos 1-93), por exemplo, o polipeptídeo de SEQ ID NO: 24, foi exibido na superfí- cie de cepa BJ5465 de S. cerevisiae usando os vetores pRNYD2 ou pRNYDG (Pfizer). Ambos os vetores exibem LFA3 com uma etiqueta de epítopo N-terminal V5, e o C-terminal de LFA3 é fundido a Muc3 e uma região de ancoragem de membrana. Enquanto o vetor pRNYD2 usa a região transmembranar de Axl2 para ancorar o LFA3 na superfí- cie da levedura, o pRNYDG utiliza o ligante GPI. A exibição de super- fície de LFA3 ativo foi confirmada por coloração de epítopo V5 e liga- ção de CD2 via citometria de fluxo (dados não mostrados). Verificou- se que o sistema pRNYDG exibe LFA3 de forma muito mais eficiente e com níveis de expressão muito mais elevados na superfície de levedu- ra em comparação com o sistema pRNYD2. Projetos e construção de bibliotecas de 1ª geração
[00570] Com base na estrutura cristalina do complexo LFA3:CD2 humano de tipo selvagem (Wang, et al (1999) Cell 97, 791-803), 15 resíduos de contato e 16 resíduos "núcleo" hidrofóbicos voltados para dentro de LFA3 foram escolhidos para serem randomizados usando PCR de extensão de sobreposição e os seguintes iniciadores de PCR com códons degenerados. Duas bibliotecas foram construídas: 1 — S (biblioteca de estabilidade), que continha a randomização de apenas os resíduos "núcleo"; e 2 — AS (biblioteca de afinidade e estabilidade), que continha a randomização tanto dos resíduos de contato quanto "núcleo". Foi relatado que o nível de expressão em levedura se corre- laciona com a estabilidade térmica das proteínas recombinantes (Shusta, et al (1999) Journal of Molecular Biology 292, 949-956). Por- tanto, essas bibliotecas de 1ª geração foram construídas na plataforma de exibição de pRNYD2 com menor expressão de superfície para au- mentar a faixa de estabilidade térmica de LFA3 que pode ser melhora- da.
Iniciadores de PCR para resíduos de contato: Glu25 = VAK, Leu27 = NTT, Lys29 = ANG, Lys32 = ANG, Asp33 = VAM, Lys34 = ANG, Glu37 = VAK, Glu39 = VAM, Glu42 = VAK, Arg44 = ANG, Phe46 = NWT, Ser47 = RST, Pro80 = CNT, Ile82 = NTT, Asp84 = VAM 5'- gagtaacgttcctttgaagVAKgtcNTTtggANGaaacaaANGVAMANGgtggcag aattagagaatag-3' (SEQ ID NO: 5) 5'- gaaaaaacaaaaagataaagtggcaVAKttaVAMaatagtVAKtttANGgctNWTR STtcatttaagaatagggtc-3' (SEQ ID NO: 6) 5'-gtacgaaatggagtccCNTaatNTTacaVAMacaatgaagttttttttgtac-3' (SEQ ID NO: 7)
Iniciadores de PCR para resíduos "núcleo": Phe15 = NTT, Val17 = NTT, Leu23 = NTT, Val26 = NTT, Trp28 = TKS, Val35 = NTT, Ala36 = KYA, Leu38 = NTT, Phe43 = NTT, Ala45 = KYA, Leu55 = NTT, Gly60 = RST, Leu62 = NTT, Met77 = WTS, Met86 = WTS, Phe88 = NTT 5'- gtttacggtaatgtgactNTTcacNTTccgagtaacgttcctNTTaaggaaNTTttaTKSa aaaaacaaaaagataaagtg-3' (SEQ ID NO: 8) 5'- cttatggaaaaaacaaaaagataaaNTTKYAgaaNTTgagaatagtgagNTTaggKY Atttagttcatttaagaatag-3' (SEQ ID NO: 9) 5'- catttaagaatagggtctatNTTgatactgtatccRSTtctNTTaccatttataatttaacaagta g-3' (SEQ ID NO: 10) 5'- gatgaagacgagtacgaaWTSgagtcccctaatattacagacacaWTSaagNTTtttttgt acgttttggg-3' (SEQ ID NO: 11)
[00571] Para a construção da biblioteca AS, fragmentos do gene LFA3 contendo a randomização dos resíduos de contato e "núcleo" foram amplificados separadamente e misturados com o vetor pRNYD2 duplamente digerido ApaI/NcoI antes da eletroporação. Eletroporação, resgate e expansão das bibliotecas de levedura foram realizados con- forme descrito anteriormente (Chao, et al (2006) Nature protocol 1, 755-768). As bibliotecas AS e S finais continham aproximadamente 1,5 x 108 e 1,3 x 108 transformantes, respectivamente. Seleções de 1ª geração
[00572] A expressão de variantes de LFA3 em levedura foi induzida a 20ºC por todas as rodadas de seleção, e as seleções de biblioteca foram conduzidas variando dois parâmetros seletivos: 1 - desnatura- ção por calor em levedura foi aplicada para melhorar a estabilidade térmica; e 2 - a concentração de CD2 foi mantida ou diminuída para manter ou melhorar a afinidade. Um total de 4 rodadas de seleções foram realizadas para cada biblioteca. Seleções de biblioteca S:
[00573] Para as seleções de biblioteca S, o ligando (hCD2-biotina) foi mantido em uma concentração constante de 1 µM, enquanto a ex- posição ao calor foi aplicada através das rodadas de seleção para en- riquecer os clones mais estáveis termicamente, mantendo a afinidade do tipo selvagem para CD2. A estratégia de seleção foi adaptada da abordagem relatada anteriormente para evolução da estabilidade da proteína em levedura (Shusta, et al (2000) Nature biotechnology 18, 754-759). Para a rodada 1, aproximadamente 2,0 x 109 células, sem exposição ao calor adicional, foram incubadas com hCD2-biotina por 1 h a 4ºC e lavadas duas vezes com PBE (PBS, pH 7,4 + 0,5% (p/v) BSA + 2 mM de EDTA, pH 8,0). A biblioteca foi subsequentemente manchada com 1:50 de estreptavidina-PE (SA-PE, Life Technologies
#S21388) por 15 min, lavada duas vezes e, finalmente, marcada com 1:10 de microesferas anti-PE paramagnéticas (Miltenyi #130-048-801) por 20 min, tudo a 4ºC. A biblioteca foi selecionada usando colunas MACS LS (Miltenyi #130-042-401) e Separador QuadroMACS (Miltenyi #130-090-976) de acordo com as instruções do fabricante. Para as ro- dadas 2-4, 1,0 x 108 células em PBE foram expostas a [20 min @46ºC], [30 min @ 46ºC] e [20 min @ 46ºC + 10 min @ 50ºC], respec- tivamente, usando um bloco de calor (Eppendorf). Após desnaturação por calor, as bibliotecas foram manchadas com 1 µM de hCD2-biotina por 1 h a 4ºC, lavadas duas vezes, e comarcadas com SA-PE (para detectar ligação de hCD2) e anti-V5-FITC (para detectar expressão de variante de LFA3) por 10 min a 4ºC. A seleção da biblioteca foi reali- zada por FACS de duas cores, classificando a população duplo- positiva de CD2+V5+ usando um classificador SH800 (Sony). Seleções da biblioteca AS:
[00574] Para as seleções da biblioteca AS, a concentração de hCD2-biotina foi reduzida e maior exposição ao calor foi aplicada atra- vés das rodadas de seleção para enriquecimento as mais estáveis termicamente com os clones de maior afinidade. Os critérios e moda- lidade das rodadas de seleção para a biblioteca AS foram essencial- mente os mesmos da biblioteca S descrita acima com uma modifica- ção: para as rodadas 2-4, em vez de manchar a biblioteca com 1 µM de ligando, a biblioteca AS foi manchada com 40 nM de hCD2-biotina por 1 h a 4ºC.
[00575] Na conclusão das seleções, 100 µl de bibliotecas S e AS pós-rodada-4 foram usadas para extrair o DNA da biblioteca usando o kit Zymoprep™ Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research # D2004), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA extraído foi trans- formado em E. coli TOP10 quimicamente competente e semeado para a sequência dos clones individuais.
Projeto e Construção de Biblioteca "Loop" de 2ª Geração
[00576] Para melhorar ainda mais a afinidade de variantes LFA3, uma biblioteca de 2ª geração foi construída usando WT e 3 das varian- tes de 1ª geração (M1, M4 e M5) como modelos para PCR de exten- são de sobreposição, e randomizando o loop FG com os seguintes ini- ciadores degenerados. Uma vez que o loop FG é a região da interface LFA3:CD2 que tem a menor complementaridade de carga/superfície, a justificativa para este projeto é randomizar completamente o loop a fim de otimizar a energética de ligação. A biblioteca "Loop" foi construída na plataforma de exibição pRNYDG para expressão de superfície ide- al, a fim de evitar a seleção preferencial de clones de alta expressão que não são necessariamente de alta afinidade. Iniciadores de PCR para resíduos de loop: Ser79 = NNK, Pro80 = NNK, Asn81 = NNK, Ile82 = NNK, Thr83 = NNK, Asp84 = NNK, Ser85 = NNK Com base no modelo WT: 5'- gaagacgagtacgaaatggagNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKatgaagtttttttt gtacgttttg-3' (SEQ ID NO: 12) Com base no modelo M1: 5'- gaagacgagtacgaaatggagNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKttcaagtttttttt gtacgttgg-3' (SEQ ID NO: 13) Com base nos modelos M4 ou M5: 5'- gaagacgagtacgaattcgagNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKttcaagttttttttg tacgttg-3' (SEQ ID NO: 14)
[00577] Eletroporação, resgate e expansão das bibliotecas de leve- dura foram realizados conforme descrito anteriormente (Chao, et al (2006) Nature protocol 1, 755-768). A biblioteca final continha aproxi- madamente 2,9 x 108 transformantes. Seleção de 2ª geração
[00578] Um total de 6 rodadas de seleção, com aumento de pres- são seletiva na afinidade, mas não na estabilidade, foram realizadas na biblioteca de Loop para enriquecer as variantes de LFA3 de maior afinidade. Para a rodada de seleção inicial, 3 x 109 células foram sele- cionadas com 50 nM de hCD2 monomérico-biotina via MACS usando um procedimento similar ao descrito para a rodada 1 das bibliotecas de 1ª geração. As rodadas subsequentes utilizaram uma estratégia de seleção cinética (Boder, et al (1997) Nature biotechnology 15, 553- 557) para enriquecer clones com as taxas de desativação mais lentas. Resumidamente, a estratégia de seleção cinética envolveu o man- chamento de 1 x 108 levedura com 250 nM de hCD2 monomérico- biotina por 1 h à temperatura ambiente, lavando duas vezes com PBE, competindo com 1 µM de hCD2 monomérico não biotinilado à tempe- ratura ambiente por uma quantidade maior de tempo, lavando duas vezes com PBE e, finalmente, enriquecimento com MACS ou FACS bicolor. Os comprimentos de competição para as rodadas 2-6 foram de 10, 20, 40, 80 e 80 min, respectivamente. A modalidade de seleção foi MACS para as rodadas 2-3 e FACS para as rodadas 4-6.
[00579] Na conclusão das seleções, clones individuais foram se- quenciados conforme descrito acima para seleções de 1ª geração. Titulações em Levedura
[00580] Para avaliar a afinidade para CD2 em levedura, diluições em série de hCD2-biotina foram incubadas com levedura expressando LFA3 por 1 h a 4ºC com agitação. hCD2-biotina não ligado foi removi-
do por lavagem duas vezes com 200 µl de PBE. A levedura marcada com hCD2-biotina foram incubadas com 1:100 SA-PE por 15 min a 4ºC com agitação e lavadas novamente duas vezes com PBE. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo Accuri C6 (BD Biosciences). Os dados representam a intensidade média de fluores- cência, e os pontos foram ajustados às curvas sigmoidais de resposta à dose usando o Prisma 6 (Graphpad).
[00581] A estabilidade térmica da proteína em levedura foi avaliada usando uma abordagem publicada anteriormente, com algumas modi- ficações (Orr, et al (2003) Biotechnology progress 19, 631-638). Re- sumidamente, a levedura expressando LFA3 em PBE foi aquecida às temperaturas indicadas entre 30-70ºC por 15 min, em seguida, resfria- da a 4ºC usando um termociclador Tetrad 2 Peltier (BioRad). A levedu- ra foi incubada com 500 nM de hCD2-biotina por 1 h, lavada duas ve- zes com PBE e, em seguida, manchada com 1:100 de SA-PE por 15 min a 4ºC. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo Accuri C6. Os dados representam a intensidade média de fluorescên- cia normalizada para a ligação máxima para cada variante de LFA3, e os pontos foram ajustados a curvas de dose-resposta sigmoidais usando Prisma 6. Análises de Estabilidade Fluorometria de Varredura Diferencial (DSF)
[00582] Os experimentos foram conduzidos com um sistema ViiA 7 Real-Time PCR (Thermo Fisher) e kit Protein Thermal Shift Dye (Thermo Fisher # 4461146) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 0,8-1 mg/ml de variantes de LFA3 foram misturadas com diluição 1:1000 do corante em PBS. As amostras (20 µl de volu- me de reação) foram distribuídas em uma placa de reação MicroAmp Optical de 96 cavidades (Applied Biosystems # N8010560), evitando as laterais da placa, e vedadas com uma tampa de adesivo óptico
(Applied Biosystems # 4360954). O sistema Viia 7 Real-Time PCR foi programado para aumentar a temperatura de 25ºC a 99ºC a uma taxa de 0,05ºC/s. As temperaturas de fusão das variantes de LFA3-Pfe fo- ram quantificadas medindo a temperatura correspondente à primeira transição da curva de fusão no software ViiA 7, e os pontos foram re- presentados graficamente usando Prism 6. Agregação Forçada por Calor
[00583] Variantes de LFA3-Pfe a 1 mg/ml em PBS, pH 7,2 foram aquecidas nas temperaturas indicadas (20 µl/reação) por 24 h usando um ciclador térmico Tetrad 2 Peltier (BioRad). Para avaliar o nível de agregação induzida pelo calor, 15 µl/amostra foram carregados em coluna YMC-Pack Diol-200 (YMC) para análise de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Os cromatogramas resultantes foram usados para quantificar a % de espécies de alto peso molecular (HMMS), % de dímero e % de monômero como funções de temperatu- ra. Retenção de pH baixo
[00584] Variantes de LFA3-Pfe a 1,5 mg/ml em PBS, pH 7,2 foram misturadas com 10% (v/v) de 0,4 M de Glicina, pH 2,7 ou PBS, pH 7,2 (isto é, 5 µl de glicina ou PBS foram adicionados a 50 µl de proteína) e incubadas em temperatura ambiente por 5 h. As amostras foram neu- tralizadas com 4,55% (v/v) de 0,25 M de base Tris, pH 7,4 ou PBS (ou seja, 2,5 µl de tampão de neutralização foram adicionados a 55 µl de amostra). Para avaliar o nível de agregação induzida por pH baixo, 25 µl/amostra foram carregados em coluna YMC-Pack Diol-200 (YMC) para análise de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Os cromatogramas resultantes foram usados para quantificar a % espé- cies de alto peso molecular (HMMS), % de dímero e % de monômero como funções de temperatura. Estabilidade ao congelamento-descongelamento e agitação
[00585] A estabilidade ao congelamento-descongelamento foi avali- ada congelando o material a -80ºC ou -20ºC por ≥30 minutos, descon- gelando a 5ºC por ≥30 minutos, e vortexando. O processo é repetido por 5 ciclos e as amostras são avaliadas por SEC analítica. Para esta- bilidade à agitação, as amostras foram submetidas à agitação por 24 horas a 300 rpm (com e sem PS80) e inspecionadas quanto à agrega- ção e precipitação solúvel. Termostabilidade (Calorimetria de Varredura Diferencial)
[00586] A termoestabilidade por DSC foi avaliada usando um Mi- croCal VP-Capillary DSC, varrendo de 10-110ºC a uma taxa de 60ºC/h. As amostras foram diluídas em tampão para 1 mg/ml. Análise de Proteína Eletroforese em Gel Capilar (cGE)
[00587] As amostras foram diluídas para 1 mg/ml. As amostras não reduzidas foram tratadas com iodoacetamida (IAM) e as amostras re- duzidas foram tratadas com DTT. A análise foi realizada usando o mé- todo cGE LabChip HT Antibody Expressa 200 (Perkin Elmer). SEC Analítica
[00588] A análise de SEC-HPLC foi realizada usando uma coluna de cromatografia YMC-Pack Diol-200 (YMC America). Viscosidade
[00589] A viscosidade foi medida usando viscosímetro RheoSense m-VROC. A proteína foi formulada em tampão de histidina sacarose EDTA pH 5,8 e a viscosidade medida em concentrações de até 150 mg/ml. Caracterização de Proteína Espectroscopia de Nanopartículas por Autointeração com Captura de Afinidade (AC-SINS)
[00590] Ensaio AC-SINS foi realizado usando nanopartículas de ouro revestidas com IgG anti-humana. Amostras a 50 µg/ml em PBS foram misturadas com nanopartículas revestidas e incubadas por 2 horas. As amostras são transferidas para uma placa transparente de UV e absorbância medida de 450 a 650 nm. Cromatografia FcRn
[00591] FcRn humano biotinilado foi capturado em resina de estrep- tavidina e empacotado em uma coluna. 50 µg de amostra foram injeta- dos na coluna e um gradiente de eluição linear de pH 5,5 a 8,8 aplica- do. O tempo de eluição relativo em comparação com mAb controle e largura de pico a 50% de altura do pico foi registrado. ELISA de Polirreatividade
[00592] Placas de ELISA foram revestidas com 10 µg/ml de dsDNA ou 5 µg/ml de insulina durante a noite. As placas foram bloqueadas com tampão ELISA (PBS, 0,05% de Tween-20, 1 mM de EDTA), e as proteínas de teste aplicadas usando diluições em série de 4 vezes a partir de 1 µg/ml. A ligação foi detectada usando ums IgG anti-humana de cabra conjugada com HRP. Imunogenicidadfe In Silico
[00593] A imunogenicidade in silico foi avaliada usando o kit de fer- ramentas de triagem baseado na web EpiVax ISPRI. Análise de Afinidade de Ligação
[00594] A afinidade de variantes de LFA3-Fc que se ligam a CD2 recombinante foi fornecida por ressonância de plásmons de superfície usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). A proteína CD2 biotinilada foi capturada em um chip de sensor Biacore revestido com estreptavidina (SA) (Chip de Sensor SA Série S, BR100531, GE Healthcare) em baixas densidades de acoplamento. Os experimentos foram realizados a 25ºC usando uma taxa de fluxo de 30 µl/min em tampão 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl e 0,005% v/v de tensoativo P20 (HBS-P). Variantes LFA3-Fc foram inje- tadas sobre a superfície por 2 minutos e a dissociação foi monitorada por mais 5 minutos ou 10 minutos para os clones de maior afinidade. Nenhuma regeneração foi necessária. Os dados foram analisados utilizando o software de avaliação Biacore T200, o sinal da célula de fluxo de controle adjacente com apenas estreptavidina imobilizada foi subtraído de fundo juntamente com injeções de tampão apenas para cada anticorpo. Um modelo de ligação de equilíbrio foi usado para cal- cular as constantes de afinidade (Kd). Resultados
[00595] O projeto baseado em estrutura foi usado para construir bibliotecas de exibição de levedura com base no primeiro domínio ex- tracelular de LFA3 humano (Figura 1). As bibliotecas AS e S foram es- timadas para conter ~1,5 x 108 e ~1,3 x 108 transformantes, respecti- vamente. A análise da sequência das bibliotecas virgens confirmou aproximadamente 6-7 mutações por clones em cada biblioteca.
[00596] As bibliotecas foram expostas a quantidades elevadas de exposição ao calor pós-indução, e concentrações reduzidas do ligando de CD2 para a biblioteca AS. Após quatro rodadas de seleção, clones individuais foram sequenciados e 6 resíduos de hotspot identificados: A36, L38, F43, A45, M77 e M86 (Figuras 2A e 2B). Com base nos re- síduos mais frequentes observados nessas seis posições (Figura 2C), foram projetadas 6 variantes recombinantes (M1-> M6) (Figura 2D) e expressas como proteínas de fusão Fc em células de mamífero. As proteínas de fusão Fc M1 a M6 compreendem um domínio extracelular de LFA3 variante (SEQ ID NOs: 17-22, respectivamente) fundido a uma região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16) (Tabela 2). A região Fc de IgG1 humana SEQ ID NO: 16 é também referida como "Pfe" nas figuras e ao longo do pedido. As sequências de nucleotídeo corres- pondentes são providas na Tabela 3.
[00597] Nos estudos descritos no Exemplo 1 e Exemplo 2, proteí- nas de fusão Fc M1 a M6bem como outras proteínas de fusão LFA3-
Fc variantes foram comparadas com proteínas de fusão LFA3-Fc de tipo selvagem. Duas proteínas de fusão LFA3-Fc de tipo selvagem de referência foram utilizadas nos estudos, ambas compreendendo um primeiro domínio extracelular de tipo selvagem de LFA3 humano fun- dido a uma região Fc de IgG1 humana. A primeira molécula de refe- rência é referida como "WT LFA3-Fc" ou "LFA3-Fc WT" (SEQ ID NO: 4), que foi gerada com base na sequência de alefacept publicada. Es- sa molécula de referência foi divulgada em US5547853, aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade. A segunda molécula de referên- cia é referida como "WT LFA3-Pfe" (SEQ ID NO: 120), que compreen- de o mesmo primeiro domínio extracelular de tipo selvagem de LFA3 humano como WT LFA3-Fc, mas tem uma região Fc de IgG1 humana ligeiramente diferente. Em algumas modalidades, LFA3-Fc WT (SEQ ID NO: 4) e/ou WT LFA3-Pfe (SEQ ID NO: 120) incluem um resíduo de lisina no C-terminal carbóxi. Em algumas modalidades, SEQ ID NO: 4 e/ou SEQ ID NO: 120 não incluem um resíduo de lisina no C- terminalarbóxi. Em algumas modalidades, SEQ ID NO: 128 não inclui um resíduo de lisina no C-terminal carbóxi.
[00598] Proteínas de fusão Fc variantes de LFA3 foram caracteri- zadas para avaliar os atributos de estabilidade e potencial manufatu- rabilidade das proteínas recombinantes. As variantes foram classifica- das com base em sua expressão monomérica, rendimento geral, esta- bilidade térmica e propensão para agregar sob estresse térmico (Figu- ras 3A-3D). As variantes M1, M4 e M5 foram identificadas como tendo as propriedades mais desejáveis com base nessa análise.
[00599] Uma biblioteca de segunda geração foi projetada para iden- tificar clones com afinidade de ligação aumentada para CD2. Esta bi- blioteca sofreu mutação de 7 resíduos no loop FG de LFA3 usando variantes de tipo selvagem, M1, M4 e M5 como o modelo (Figura 4). Com base na análise de sequência, 12 proteínas de fusão LFA3-Fc variantes foram projetadas e expressas em célula de mamíferos para análise posterior (CM1d1-> CM6d1 e ML1d1-> ML6d1). Proteínas de fusão Fc CM1d1 a CM6d1 de domínio extracelular de LFA3 variante (SEQ ID NOs: 30-35, respectivamente) fundido a uma região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16) (Tabela 2). Da mesma forma, as prote- ínas de fusão Fc ML1d1 a ML6d1 compreendem um domínio extrace- lular de LFA3 variante (SEQ ID NOs: 36-41, respectivamente) fundido a uma região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16) (Tabela 2). As se- quências de nucleotídeos correspondentes são providas na Tabela 3.
[00600] Os clones identificados a partir da biblioteca Loop de se- gunda geração foram expressos como proteínas de fusão Fc e avalia- dos quanto à estabilidade térmica usando uma fluorometria de varre- dura diferencial (DSF) (Figura 5B) e afinidade de ligação a proteína CD2 recombinante por SPR usando um ensaio de ligação Biacore (Fi- gura 5A). Os clones de maior afinidade avaliados tinham afinidades aparentes na faixa de 60-100 nM (Figura 5A). Os clones de maior afi- nidade avaliados tinham um aumento de afinidade de ~20 vezes em comparação com a proteína WT LFA3-Fc parental e 10 vezes sobre o M1d1-Pfe (também referido como "LFA3-Fc M1d1") e variantes de M4d1-Pfe (Figura 5A). As variantes CM2d1-Pfe, CM5d1-Pfe, e ML3d1- Pfe aumentaram a termoestabilidade por DSF em comparação com os constructos de tipo selvagem (WT LFA3-Fc e WT LFA3-Pfe), bem co- mo os constructos variantes parentais (M1d1-Pfe e M4d1-Pfe) (Figura 5B).
[00601] O projeto racional com base na análise estrutural foi utiliza- do para estender o limite do C-terminal do domínio de LFA3 incluído no constructo de expressão (Figura 6A). Os construtos codificando um resíduo de leucina c-terminal adicional no domínio de LFA3 de tipo selvagem (LFA3-Fc d1) ou variantes M (M1-d1 e M4-d1) onde expres- sos e purificados. Proteínas de fusão Fc LFA3-Fc d1, M1-d1 (também referido como "M1d1") e M4-d1 (também referido como "M4d1") com- preendem um domínio de LFA3 (SEQ ID NOs: 24, 26 e 28, respecti- vamente) fundido a uma região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16) (Tabela 2). As sequências de nucleotídeo correspondentes são provi- das na Tabela 3. Verificou-se que a variante d1 apresentou formação de agregados reduzida em comparação com a proteína expressa com o limite de domínio publicado anteriormente para uma proteína de fu- são LFA3 Fc, e maior estabilidade térmica (Figuras 6B e 6D) . A adi- ção da modificação de limite do domínio (d1) ao fundo M1 ou M4 ainda aumentou a fração monomérica da proteína fora da cultura celular (Fi- gura 6C) e a estabilidade térmica conforme medido por DSF (Figura 6D).
[00602] Variantes incluindo uma um (d1, +L) (Figura 7A) ou seis (d3, +LESLPS) (Figura 7B) aminoácidos endógenos adicionais foram utilizadas como proteínas de fusão Fc e caracterizadas quanto à esta- bilidade e afinidade de ligação. As proteínas de fusão Fc M1-d1 e M1- d3 (também referidas como "M1d3") compreendem um domínio de LFA3 (SEQ ID NOs: 26 e 27, respectivamente) fundido a uma região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16) (Tabela 2). As sequências de nucleotídeo correspondentes são providas na Tabela 3. As duas vari- antes, M1-d1 e M1-d3, demonstram afinidade de ligação a CD2 e es- tabilidade térmica in vitro similares (Figuras 7C e 7D).
[00603] Uma variante de LFA3 M7 adicional foi projetada para con- ter um resíduo de tipo selvagem adicional na posição 86 em relação a M1 (Figura 8A). A proteína de fusão M7-d1 (também referida como "M7d1") Fc compreende um domínio de LFA3 (SEQ ID NO: 29) fundi- do a uma região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 16) (Tabela 2). A sequência de nucleotídeo correspondente é divulgada na Tabela 3. M7-d1 foi caracterizada para avaliar a fração monomérica (Figura 8B), estabilidade térmica (Figura 8C) e afinidade de ligação a CD2 recom-
binante (Figura 8D).
[00604] As variantes LFA3-Fc e WT LFA3-Fc foram caracterizadas quanto aos atributos de estabilidade e manufaturabilidade potencial (Tabela 4 e Tabela 5). Esses ensaios descobriram que a variante M1- d1 (também conhecida como "M1d1") é significativamente mais estável do que a fusão Fc de tipo selvagem em termos de expressão de prote- ína monomérica, estabilidade térmica, propensão à agregação, sensi- bilidade a manutenção de baixo pH, e ciclos de congelamento- descongelamento (Tabela 4). Tabela 4. Novas e úteis propriedades moleculares de variantes de LFA3-Fc WT LFA3-Fc *variante modificada de M1-d1 Espécies monoméri- 73,9% de monômero >99% cas de proteína A (%) 19% de HMWS, 7,1% de LMWS SEC analítica 99,2% de monômero 99,6% de monômero Estabilidade térmica DSC: Tm1, 47ºCDSF: DSC: Tm1, 65ºC por DSC/DSF Tm1, 40ºC DSF: Tm1, 60ºC Propensão à agrega- 40ºC HMWS aumen- 40ºC nenhum aumento ção forçada to para ~23% em HMWS 50ºC HMWS aumen- 50ºC HMWS aumento to para ~29% para ~3% Manutenção de baixo 11% de HMWS, ne- 4% de HMWS, ne- pH (5 hrs) nhum aumento em nhum aumento em
LMWS LMWS Congelamento- ~2% de aumento em Nenhum aumento em descongelamento (5 HMWS HMWS ciclos) Afinidade por SPR 1,41 - 1,47 µM 0,73 - 1,08 µM para CD2 recombi- nante humano (KD)
WT LFA3-Fc *variante modificada de M1-d1 Afinidade por SPR 1,5 µM 1,06 µM para CD2 recombi- nante de cino (KD) HMWS refere-se a espécies de alto peso molecular, e LMWS refere-se a espécies de baixo peso molecular. *modalidade exemplificativa englobando todas as variantes de LFA3- Fc divulgadas neste documento.
Tabela 5. Visão geral das propriedades moleculares da variante modificada de M1-d1 de LFA3-Fc Propriedades 3 sítios de glicosi- Glicano Contém N-glicanos moleculares lação ligados em N cGE comuns a anticorpo previstos, 1 sítio de Fc desamidação puta- Altamente ramifica- tivo, 2 sítios de do sialilado (9,1 isomerização puta- nmoles de siáli- tivos, 1 metionina co/nmol LFA3-Fc) Expressão Linhagem celular Impurezas rProA 39 ng/mg, agrupada de SSI de Proces- HCP 293 ng/mg, dia 12 rendimento so DNA 27 ng/mg de colheita ~150- 300 mg/l Purificação Processo de purifi- F/T Nenhuma alteração cação de não pla- após cinco ciclos (5 taforma; questões ⁰C/-20 ⁰C) potenciais com procedimento de manutenção de baixo pH e compa- tibilidade com eta- pa de purificação
TMAE
Viscosidade 11 cP a 150 mg/ml Agitação 0,8-1,5% de aumen- em formulação de to de HMMS a 25C. MOD1 ~1% de aumento de HMMS em Glu a 40
C Solubilidade Pelo menos - 175 Atividade Nenhuma alteração mg/ml em todos os em ADCC EC50s tampões testados com amostras de estabilidade SEC Todas as preps Imunogeni- Pontuação de índice >99% de SOI após cidade de imunogenicidade Proteína A. 0,8- de Epivax -13,52; 1,5% de aumento Recomendação de HMMS a 25C. IRAMP moderada- ~1% de aumento alta devido à se- de HMMS em Glu quência endógena a 40 C. DSC Tm1 65 C em AC-SINS Baixa pontuação tampão de histidi- AC-SINS, absor- na pH 5,8. bância Δλ max 1 cGE Alta pureza sob Coluna de Baixo tempo de condições de re- eluição de eluição de coluna de dução e não redu- FcRn FcRn de -0,6 min ção. Nenhuma al- teração a 5ºC e 25ºC. 2-5% de aumento em LMMS por NRCGE a 40ºC iCE Perfil de carga Poliespeci- Pontuação de poli- complicado - 15-18 ficidade especificidade de espécies diferentes DNA e insulina de 1 Exemplo 2: Caracterização in vitro e in vivo adicional de M1d1 Introdução
[00605] LFA3-Fc tem como alvo uma via terapêutica importante que tem o potencial - uma vez otimizado - de restaurar a tolerância imuno- lógica em Diabetes tipo 1 (T1D), uma doença que até agora tem sido amplamente refratária a intervenções modificadoras da doença e, por- tanto, representa uma grande necessidade médica não atendida, es- pecialmente em crianças.
[00606] M1d1 (também referida como "M1-d1," "LFA3-Fc M1d1," e "M1-d1 de LFA3-Fc") é uma proteína de fusão LFA3-Fc dimérica, composta pelo primeiro domínio extracelular de LFA3 fundido a uma região Fc de IgG1. M1d1 foi projetada para conter quatro aminoácidos não endógenos no domínio extracelular de LFA3 para melhorar a es- tabilidade e a manufaturabilidade. Sem desejar estar vinculado à teo- ria, M1d1 pode reduzir o número de células T CD4 e CD8 de memória através de ADCC/citotoxicidade, enquanto relativamente poupando células Treg e Tvirgens, e modulam a interação de CD2/LFA3, levando à melhoria nas razões de Treg/TEM e Treg/TCM em ambas as células T CD4+ e células T CD8+. M1d1 demonstraram a modulação do fenótipo imune em macacos cinomolgo consistente com o mecanismo de ação (MOA) proposto e hipótese terapêutica. Os estudos não clínicos com M1d1 sugerem que PK é linear e a dose é proporcional, e um estudo TK não GLP não revelou quaisquer descobertas de segurança além da redução antecipada de linfócitos. Um resumo das propriedades farma- cológicas está incluído abaixo na Tabela 6, com dados para a popula- ção de células de memória CD4 alvo.
Tabela 6. Sumário de novas e úteis propriedades farmacológicas de variantes de LFA3-Fc Ligação Celular MLR Memória Toxina Tetânica A ligação de IInibição de res- LFA3-Fc se corre- posta de células Inibição de respos- laciona à expres- T alo; Pro- ta de recuperação são de CD2 lif/citocinas TT; CD4 Tmem IFNγ CD4 Tmem Kd CD4 IC50 IFNγ IC50 *M1d1 94 pM (n=3) 0,302 nM (n=8) 1,34 nM (n=3) WT LFA3-Fc 501 pM (n=3) 2,48 nM (n=8) 28,4 nM (n=3) *modalidade exemplificativa englobando todas as variantes de LFA3- Fc divulgadas neste documento. Métodos Análise de expressão de CD2
[00607] Para os subconjuntos de linfócitos, células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs) foram isoladas usando Lym- phoprep (Stemcell Technologies #07851). PBMCs de macacos foram isoladas usando 90% de Lymphoprep em PBS (Corning #21-040-CM) e ressuspensas em tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACs) (PBS mais 0,2% de BSA (Jackson Immuno Re- search # 001-000-173)). Células humanas foram bloqueadas usando Human TruStain FcX (BioLegend #422302). Dois milhões de PBMCs foram manchadas por amostra. Para subconjuntos de células T auxilia- res, células CD4 foram isoladas usando o kit Easy Sep (Stem Cell Technology #19052) usando as instruções do fabricante e, em segui- da, 1 milhão de células foram manchadas por amostra. Para o man- chamento de superfície, as células foram fixadas em tampão de fixa- ção intracelular (IC) (Ebioscience #00-8222-49) antes da análise. Para o manchamento de FoxP3, o conjunto de tampão FoxP3 humano (BD Pharmingen #560098) foi usado com base nas instruções do fabrican- te. Para PBMCs humanas, as células foram manchadas com os se-
guintes anticorpos: CD4 BUV395, CD3 PerCp-e710, CD2 PE, CD45RO PeCy7, CD8 FITC, CCR7 BV421, TIGIT APC, PD1 BV650, viabilidade de infravermelho próximo (painel 1); ou CD4 BUV 395, CD3 Percp-e710, CD2 PE, CD8 BUV 496, CD20 FITC, CD159a A647, CD25 BV421, CD127 BV605 e viabilidade de infravermelho próximo. Para PBMCs de cino, as células foram manchadas da seguinte forma: CD95 BUV 395, CD4 PerCP-e710, CD2 PE, CD28 PeCy7, CD8 BUV496, CD3 FITC, CD20 V450, CD159a APC, PD1 BV650, viabilida- de de infravermelho próximo (painel 1); ou CD4 Percpe710, CD3 FITC, CD25 BV421, CD2 PE, FoxP3 APC, e viabilidade de infravermelho próximo. As células foram executadas em LSR Fortessa, e os grânulos Quantibrite foram executados no momento da coleta da amostra (con- forme instruções do fabricante). Corante de viabilidade reativo fluores- cente de infravermelho próximo (IV) (Invitrogen #L34976) foi usado para discernir células viáveis. Os dados foram expressos como a in- tensidade de fluorescência média geométrica (gMFI). Ensaio de ligação competitiva de LFA3-Fc Isolamento de PBMC e subconjunto
[00608] Resíduos Trima de doadores saudáveis, da coleção de afé- rese Trima e enriquecidos para PBMCs, foram obtidos de Blood Cen- ters of the Pacific (San Francisco, CA). As PBMCs foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade. As populações purificadas de CD4/CD8 virgens, de memória central e de memória efetora foram isoladas de PBMCs por kits de seleção negativa (StemCell Technolo- gies).
[00609] Células T reguladoras foram isoladas de sangue total usan- do um coquetel CD4 Enrichment RosetteSepTM (STEMCELL Techno- logies) e então por Classificação Celular Ativada por Fluorescência usando marcadores CD4-isotiocianato de fluoresceína (FITC) CD127- PE, e CD25-APC. As células reguladoras são identificadas por
CD4hiCD127loCD25hi. As células T reguladoras isoladas foram cultiva- das expandidas em meio X-VIVO (Lonza) na presença de esferas DynaBead Human Treg Expander (Invitrogen) por até duas semanas. Ensaio de Ligação Celular
[00610] Após o isolamento, os subconjuntos de CD4 e CD8 foram semeados a uma densidade de 5x104 células por cavidade. As placas foram centrifugadas e ressuspensas em tampão FACS (PBS contendo 2% de BSA) contendo bloco de fragmento Fc humano cristalizado (2 µl por cavidade), diluições em série de LFA3-Fc M1d1 ou LFA3-Fc WT e competidor comercial anti-CD2-FITC (clone RPA2.10) para determinar Kd. A concentração de competidor foi mantida constante (3,23 x 10-8 M) a um valor menor do que o EC50, de modo que o anticorpo compe- tidor ainda pudesse ser detectado, mas fosse capaz de competir. As células foram incubadas por 2 horas no gelo. As células foram lavadas com tampão FACS três vezes e ressuspensas em 100 µl de tampão FACS contendo corante de viabilidade. Para distinção de memória central e efetora de CD4, CCR7-BV421 foi incluído. Após 15 minutos de incubação, as células foram lavadas com tampão FACS, ressus- pensas em 50 µl de tampão FACS e analisadas por citometria de fluxo. Análise de Dados
[00611] Kd para LFA3-Fc foi calculada usando a equação de Cheng Prusoff. IC50 Kd = [competidor] 1+ Kdcompetidor
[00612] As curvas de ligação celular foram geradas representando graficamente a intensidade de fluorescência média geométrica (gMFI) de ligação do competidor contra o log de concentração de anticorpo LFA3-Fc. Os valores foram normalizados com ligação máxima sendo a média das amostras sem competição e os valores mínimos sendo amostras sem competidor CD2-isotiocianato de fluoresceína (FITC).
As curvas de ligação celular foram geradas para cada um dos subcon- juntos de células PBMC (Figura 11). Os valores de IC50 (concentração efetiva a 50% de inibição da resposta máxima) do competidor foram fornecidos usando ajustes de curva de regressão não linear GraphPad Prism® (Versão 6.0, GraphPad Software, Inc, San Diego, CA) e um log sigmoidal de modelo de resposta à dose antagonista. Ensaio de MLR
[00613] Os doadores foram selecionados de um banco de PBMCs congeladas com base na incompatibilidade completa de genótipos HLA. PBMCs do doador "estimulador" foram depletadas de células T e células NK usando um kit de seleção positiva CD3 e CD56. Para todos os ensaios de depleção de NK, as células NK também foram depleta- das do doador "respondedor" usando o kit de seleção positiva CD56. 112500 células ou 75µl, cada uma das populações de estimulador e respondedor foram adicionadas às cavidades de uma placa de fundo em U de 96 cavidades. Diluições em série de proteína LFA3-Fc foram preparadas a 3x, e 75 µl de proteína foram adicionados a cada cavida- de. As placas foram incubadas a 37ºC durante 5 dias. As células foram centrifugadas, lavadas em tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (PBS contendo 2% de BSA) e, em seguida, manchadas com anticorpos imunofenotípicos por 15 minutos. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD3 (BUV496), CD4 (BUV395), CD8 PerCp-e710, CD45RO PeCy7, CD45RA FITC, CD25 PE-CF594, CD56 BV421, CD2-PE e viabilidade de infravermelho próximo. 10 µl de esferas de CountBright foram adicionados a cada cavidade imediata- mente antes da análise de citometria de fluxo.
[00614] Foram calculadas as contagens absolutas células de me- mória CD4, virgens CD4, de memória CD8, virgens CD8 e NK CD56. A resposta percentual foi relatada para populações de memória CD4 e calculada como:
(reposta - não estimada) % de resposta=100x (estimulada - não estimulada)
[00615] A porcentagem de inibição de resposta alogênica foi calcu- lada como 100 menos a porcentagem de resposta. Os valores foram representados graficamente contra o log de concentração de anticorpo LFA3-Fc. A resposta do ensaio foi determinada como uma função de contagens absolutas de células. Os valores de EC50 foram fornecidos usando ajustes de curva de regressão não linear GraphPad Prism® (Versão 6.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e um log sig- moidal de resposta à dose de agonista. Ensaio de resposta TT
[00616] PBMCs isoladas de resíduos Trima foram avaliados quanto à reatividade a toxoide tetânico (Astarte Biologics). Fortes respostas positivas foram colocadas para uso em ensaios TTRs. Em uma placa de fundo em U de 96 cavidades, 200.000 PBMCs por cavidade foram semeadas em 100 µl. Os polipeptídeos LFA3-Fc foram preparados a 4x e 50 µl de cada proteína LFA3 foram adicionados a cada cavidade. 50 µl de proteína de toxoide tetânico (1 µg/ml) foram adicionados a cada cavidade e incubados a 37ºC durante 5 dias. As placas foram centrifugadas durante 5 min a 16000 rpm. 125 µl do sobrenadante fo- ram coletados para analisar a produção de IFNγ via ELISA. As células foram centrifugadas, lavadas em tampão FACS (PBS contendo 2% de BSA) e manchadas com anticorpos de imunofenotipagem por 15 minu- tos. Foram utilizados os seguintes anticorpos: CD3 (BUV496), CD4 (BUV395), CD8 PerCp-e710, CD45RO PeCy7, CD45RA FITC, CD25 PE-CF594, CD56 BV421, CD2-PE e viabilidade de infravermelho pró- ximo. 10 µl de esferas CountBright foram adicionados a cada cavidade imediatamente antes da análise de citometria de fluxo.
[00617] A concentração de IFNγ foi usada para determinar a por- centagem de resposta. A porcentagem de resposta foi calculada con- forme descrito acima para o ensaio MLR. O percentual de inibição da resposta de recuperação de memória foi calculado como 100 menos o percentual de resposta. Os valores foram representados graficamente contra o log de concentração de anticorpo LFA3-Fc. Os valores de EC50 foram fornecidos usando ajuste de curva de regressão não linear GraphPad Prism® (Versão 6.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e um log sigmoidal de modelo resposta à dose de agonista. Ensaio PK
[00618] Padrões e controles de qualidade (QCs) foram preparados em soro de macaco cinomolgo e então diluídos 20 vezes para MRD em tampão de ensaio (Scytek Superblock com 0,5M de NaCl). As amostras também foram diluídas de acordo com a MRD em tampão de ensaio. Qualquer diluição adicional das amostras foi realizada em tampão de ensaio contendo 5% de soro de macaco e carregado em uma placa de PCR de 96 cavidades. O anticorpo de captura biotinilado (anti-LFA3, Invitrogen, MA1-19503) e o anticorpo de detecção marca- do com AF647 (IgG anti-humano de burro H+L, Jackson ImmunoRe- search, 709-005-149) foram preparados a 50 µg/ml e 1 µg/ml respecti- vamente e carregados em uma placa de PCR de 96 cavidades sepa- rada. Placas, Gyros 1000 CDs, e tampões de lavagem foram configu- rados no instrumento Gyrolab para processamento e análise. Resultados Análises in vitro
[00619] Um fator chave da destruição de tecidos e patologia em T1D são células TEM CD4+. Enquanto CD2 é expresso em todas as células T, CD2 é expresso em níveis mais altos nas células TEM. A ex- pressão de CD2 é aumentada ainda 5 vezes após a ativação de TCR. Os níveis de CD2 (moléculas por célula) nas células humanas são mostrados nas Figuras 9 e 10. A ligação de M1d1 (max gMFI) se cor- relaciona com o nível de expressão de CD2 em células T. M1d1 tem um Fc de IgG1 com função efetora de ligação de FcR. A farmacologia in vitro foi caracterizada através de: i) ensaios de ligação celular, ii) ensaio de ADCC primário, iii) ensaio de citotoxicidade de células NK purificadas, iv) inibição da proliferação de CD4 e CD8 a partir da esti- mulação alogênica em uma reação linfocitária mista (MLR) e, v) inibi- ção de produção de IFNγ de CD4mem em um ensaio de recuperação de antígeno usando toxoide tetânico. Adicionalmente, M1d1 pode ter mecanismos de ação não dependentes de ADCC. In vitro, isso foi de- monstrado através de depleção de células NK a partir de ensaio MLR, bem como o uso de moléculas variantes de função Fc-efetoras. Em todos os ensaios in vitro, M1d1 foi comparado com a molécula de WT LFA3-Fc como referência. Controles adicionais incluíram um controle de isótipo (controle negativo de mAb, sem mutações de Fc) e uma va- riante de função efetora de M1d1-Fc (eff null) que não teve ativida- de/inibição em nenhum dos ensaios abaixo (dados não mostrados). Sem desejar estar vinculado à teoria, esses ensaios in vitro avaliaram os mecanismos de ação de M1d1, que incluem o direcionamento pre- ferencial de células T de memória CD2hi, e subsequente inibição de respostas de células de memória. Análise de expressão de CD2
[00620] Todas as células T expressam CD2. No entanto, a expres- são absoluta difere em diferentes subconjuntos de células, com células T de memória expressando maiores níveis de CD2 do que células T virgens (Figura 9). As células B não expressam CD2, e as células NK expressam níveis baixos heterogêneos de CD2. Após a ativação, a expressão de CD2 aumentou ~5 vezes e, em seguida, voltou aos ní- veis basais em uma semana (Figura 10). Esse perfil de expressão ofe- rece uma janela dentro da qual células TEM CD2hi podem ser direcio- nadas enquanto poupam células Treg e Tvirgens.
[00621] Em PBMCs humanas, a quantificação de moléculas CD2 demonstrou o maior número de moléculas em células de memória
CD4 e CD8 com especificamente memória central CD4 ("cen mem") expressando uma média de 9220 moléculas; memória efetora CD4 humana ("eff mem") expressando em média 11.000 moléculas; memó- ria central CD8 humana expressando uma média de 11.800 moléculas; e memória efetora CD8 humana expressando uma média 10.000 mo- léculas (Tabela 7, Figura 9). Dentro das células de memória CD8 hu- manas, a memória central tinha um número maior de moléculas do que a memória efetora (p = <0,05). Dentro das células CD4 humanas, a memória efetora tinha mais moléculas CD2 do que a memória cen- tral (p = <0,05). Tabela 7. Quantificação de CD2 em subconjuntos de linfócitos em PBMCs humanas Célu- Célu- CD4 Tregs Me- Me- CD8 Me- Me- las B las NK vir- mória mória vir- mória mória gens CD4 CD4 gens CD8 CD8 cen eff cen eff média 28,6 1370 5280 6720 9220 11000 6510 11800 10000 SD 2,34 441 496 668 335 1070 472 912 919 Memória Cen = memória central; Memória eff = memória efetora; Tregs = T reguladora
[00622] A expressão de CD2 foi quantificada usando análise Quan- tibrite (Figura 17). Assim como as células humanas, as células T de memória de cinomolgo expressam números maiores de moléculas CD2 por célula do que as células virgens. Em cino, mas não em seres humanos, as células CD8+ tinham expressão de CD2 bimodal, e ~10- 20% eram CD2 negativas. A quantificação das moléculas de CD2 de- monstrou maior número de moléculas nas células de memória CD4 e CD8, com as células de memória central CD4 expressando 8.570 mo- léculas e a memória efetora CD4 expressando 8.140 moléculas e a memória central CD8 expressando 7.100 moléculas e a memória efe- tora CD8 expressando 5.880 moléculas (Figura 17, Tabela 8).
Tabela 8. Quantificação de CD2 em subconjuntos de linfócitos em PBMCs de cinomolgo. Célu- Célu- CD4 Tregs Me- Me- CD8 Me- Me- las B las NK vir- mória mória vir- mória mória gens CD4 CD4 gens CD8 CD8 cen eff cen eff Média 42,1 374 5200 5730 8570 8140 4510 7100 5880 SD 11 121 1020 1360 2040 2470 945 1690 1890
[00623] Expressão insignificante de CD2 foi observada em ambas as células B humanas e de cino com 28,6 e 42,1 moléculas, respecti- vamente. Células CD8 e CD4 virgens humanas e Tregs têm 6.510,
5.280 e 6.720 moléculas, respectivamente, representando, portanto, o menor número de moléculas CD2 dentro dos subconjuntos de linfóci- tos T em PBMCs humanas. CD8 e CD4 virgens de cino expressam
4.510 e 5.200 moléculas, respectivamente, e, portanto, apresentam o menor número dentro dos subconjuntos de células T de cino.
[00624] Nas células de memória CD4 humanas, a expressão de CD2 foi 11.800 gMFI nas células Klrg1-Tigit+PD1+ em comparação com as células Klrg1+ em 17.000 (Figura 25A-25B). A expressão de Klrg1-Tigit+PD1+ foi sugerida para identificar células T que são anér- gicas em fenótipo.
[00625] Dentro dos subconjuntos de células T auxiliares, a expres- são de CD2 foi mais alta nas células inflamatórias Th17/Th1 e Th22 (Figuras 26A-26B) em comparação com células Tregs e Th2. Tabela 9. Expressão de CD2 em subconjuntos auxiliares T huma- nos TH2 Tfh Tfh Tfh Tregs TH17/ Th1 TH17 TH22 TH9 like CCR7 CCR7 Th1 + + PD1+ média 12500 11800 11900 11600 11600 19800 15000 16000 17500 18200 SD 3360 5740 6060 5260 2720 5310 5170 4120 5920 4600
CCR7 = C-C receptor de quimiocina tipo 7; PD1 = proteína de morte celular programada 1; TH = T auxiliar; Tfh = T auxiliar folicular; Tregs = T reguladora
[00626] Em PBMCs humanos e não humanos primatas, todos os subconjuntos de células T expressam CD2. Dentro do compartimento das células T, as células T de memória não reguladoras expressam a maioria das moléculas de CD2 por célula, aproximadamente 1,5-2 ve- zes mais moléculas de CD2 por célula do que células T virgens. Esses resultados indicam que importantes populações de células (por exem- plo, células T) expressam o alvo do peptídeo terapêutico LFA3-Fc M1d1. Esses dados também indicam que a imunofenotipagem poderia ser usada para estratificar pacientes para tratamento com polipeptí- deos LFA3-Fc. Análise de Ligação Competitiva de LFA3-Fc
[00627] A ligação de LFA3-Fc a CD2 é uma interação de afinidade relativamente baixa conforme medido por SPR (1 µM). É difícil alcan- çar a ligação de células T primárias saturadas de LFA3-Fc, pois a res- trição de lavagem pode afetar significativamente os dados. Portanto, um ensaio de ligação competitiva foi usado com um anticorpo anti-CD2 para determinar a afinidade aparente de M1d1 para subconjuntos de células T (Tabela 10 e Figura 11). LFA3-Fc WT exibiu uma afinidade aparente média para células de memória CD4 e células virgens CD4 de 0,501 e 0,391 nM, respectivamente (Tabela 10). LFA3-Fc M1d1 exibiu uma afinidade aparente média para células de memória CD4 e células virgens CD4 de 0,094 e 0,054 nM respectivamente (Tabela 10). Esses estudos demonstram que LFA3-Fc WT e LFA3-Fc M1d1 se ligam a células CD2+ (por exemplo, células CD4 de memória e células CD4 virgens) e que LFA3-Fc M1d1 apresenta uma afinidade aproxi- madamente 5 vezes maior por CD2 de superfície celular do que LFA3- Fc WT. Assim, esses estudos demonstram que o polipeptídeo terapêu-
tico LFA3-Fc M1d1 apresenta afinidade aumentada pelo CD2 de mar- cador de superfície alvo. Tabela 10. Ligação de LFA3-Fc a células T humanas primárias usando ensaio de ligação competitiva com um anticorpo anti-CD2 IC50 Calculado Kd Calculado (nM) (nM) Subconjunto Kd Calculada pa- WT M1d1 WT M1d1 de Células T ra RPA2,10 (nM) Memória CD4 23,7 2,32 0,55 0,623 0,148 Memória CD4 23,7 1,29 0,25 0,345 0,068 Memória CD4 42,0 0,95 0,12 0,535 0,067 Média de Memória CD4 1,52 0,307 0,501 0,094 CD4 EM 34 1,20 0,15 0,616 0,079 CD4 CM 44,7 0,88 0,11 0,514 0,064 CD4 Virgem 18,2 1,45 0,22 0,319 0,047 CD4 Virgem 23,8 1,09 0,14 0,463 0,061 Média de CD4 Virgem 1,27 0,18 0,391 0,054 CD8 Virgem 14,8 0,71 0,09 0,222 0,030 CD8 Virgem 31,0 2,80 0,51 0,906 0,166 Média de CD8 Virgem 1,76 0,3 0,564 0,098 Memória CD8 11 0,59 0,12 0,151 0,031 CD4 Treg (ex- 67,9 0,50 0,09 0,339 0,058 pnd'd) EM = memória efetora; CM = memória central Esaio MLR
[00628] A resposta de Reação Linfocitária Mista (MLR) avalia a res- posta das células T CD4+ e CD8+ (por exemplo, expansão) à estimu- lação alogênica, e inclui respostas de células que eram virgens no momento da estimulação. É uma resposta funcional mais complexa e permite avaliar mecanismos além de ADCC. M1d1 inibiu completa- mente a expansão de células T CD4+ (Figura 14A) e células T CD8+ (dados não mostrados) em resposta à estimulação alogênica e foi mais potente do que WT LFA3-Fc (Figuras 14A e 14B).
[00629] De modo a avaliar in vitro se M1d1 tem mecanismos de ação na adição à morte celular mediada por NK, as células NK foram depletadas do ensaio MLR. M1d1 inibiu a expansão de células T CD4+ em MLR mesmo na ausência de células NK, embora IC50 tenha sido aumentado (Figuras 15A-15C). Dados de suporte adicionais foram ge- rados mostrando que variantes da função efetora de LFA3-Fc sem li- gação a CD16 (a FcR que é associada com ADCC) poderia também inibir respostas alogênicas (dados não mostrados). Isso é consistente com o mecanismo de ação dependente de células não NK associado com LFA3-Fc.
[00630] Esses estudos demonstram que o polipeptídeo terapêutico LFA3-Fc M1d1 inibe as respostas de células T em ensaios MLR alo- gênicos e que LFA3-Fc M1d1 melhorou a eficácia in vitro em relação a LFA3-Fc WT. Ensaio TTR
[00631] Para avaliar a inibição de respostas de células de memória preexistentes, as PBMCs do doador reativas a toxoide tetânico (TT) foram estimuladas com TT ex vivo. M1d1 inibiu completamente a ex- pansão celular de memória específica de antígeno ex vivo e a secre- ção de citocina (IFNγ) em resposta ao toxoide TT (Figuras 16A e 16B). WT LFA3-Fc foi menos potente do que M1d1 na inibição dessa res- posta (Figuras 16A e 16B). Esses estudos demonstram que o polipep- tídeo terapêutico LFA3-Fc M1d1 inibe as respostas das células T no ensaio de TTRs e que LFA3-Fc M1d1 melhorou a eficácia in vitro em relação ao LFA3-Fc WT. Exemplo 3: Análises In Vivo
[00632] O LFA3 humano não se liga a CD2 de roedor, mas se liga a CD2 de primata não humano. Primata não humano foi usado para ava- liar a depleção de células T de imunomodulação e de memória a partir de tratamento com alefacept (Weaver, et al (2009) Nat Med. 15(7):746–749).
[00633] Dois estudos foram conduzidos com M1d1 em macaco ci- nomolgo: o primeiro foi um estudo investigativo de dose única (17- MA005). O segundo estudo, 17MA057, é um estudo PK/PD de dose de repetição, desenvolvido com extensa análise de imunofenótipo para suportar a compreensão da relação dose-resposta, efeitos de dose única e dose repetida e recuperação das células afetadas. Uma res- posta à dose paralela com WT LFA3-Fc foi incluída. Como não foram observadas diferenças perceptíveis com macacos fêmeas, os dados de machos e fêmeas são combinados para análise. Estudo de toxicidade exploratória de dose única IV com fase observa- cional de 8 semanas (17MA005)
[00634] Macacos cinomolgos foram administrados com veículo con- trole ou LFA3-Fc M1d1 em uma dose de 0,3 mg/kg ou 100 mg/kg via injeção de bolus IV uma vez no Dia 1. Nenhuma mortalidade relacio- nada ao artigo de teste e nenhum sinal clínico foi observado. Não hou- ve alterações relacionadas ao artigo de teste em qualquer tipo de célu- la avaliada em animais administrados com 0,3 mg/kg de LFA3-Fc M1d1. Alterações relacionadas ao artigo de teste em alguns subcon- juntos de linfócitos foram observadas em macacos machos e fêmeas administrados com 100 mg/kg de LFA3-Fc M1d1 (Tabela 12), embora todos os subconjuntos de células retornassem aos valores basais no dia 57 ou antes. No geral, os valores de Cmax e AUClast (de 1-1368 ho- ras) a 100 mg/kg foram de 3590 µg/ml e 238,00 µg*h/ml, respectiva- mente. A incidência de indução de anticorpo antidroga foi de 66% (2/3) para animais administrados com LFA3-Fc M1d1 a 0,3 mg/kg e 50% (1/2) para animais administrados com LFA3-Fc M1d1 em 100 mg/kg.
[00635] Amostras de sangue periférico foram coletadas nos dias - 14, 1 (pré-dose), 2, 4, 8, 15, 29, 43 e 57. A porcentagem de cada sub-
conjunto de linfócitos foi fornecida por citometria de fluxo. A adminis- tração de 100 mg/kg de LFA3-Fc M1d1 resultou em funcionamento transiente relacionado ao artigo de teste a partir da linha de base no número total de células T, células T auxiliares e células T citotóxicas no sangue periférico de pelo menos 1 animal. Houve também redu- ções nos números de subconjuntos de memória virgem, central e efe- tora de células T auxiliares e células T citotóxicas. Reduções foram também observadas no número de células T auxiliares CD25 Foxp3 (T reguladoras) e ambos no número e porcentagem de células citotóxicas T PD-1+. O intervalo dessas reduções para todos os subconjuntos foi de 0,01-0,37x. A maioria dessas reduções foram observadas no Dia 15 e/ou Dia 29. Todos os subconjuntos de células retornaram aos valores de linha de base no Dia 57 ou antes. Não houve alterações relaciona- das ao artigo de teste no número de células B e células NK ou na por- centagem de células T auxiliares PD-1+ ou células T citotóxicas e T auxiliares de memória efetora ou central PD-1+. Não houve alterações relacionadas ao artigo de teste em qualquer tipo de célula avaliada em animais administrados com 0,3 mg/kg de LFA3-Fc M1d1.
[00636] PBMCs de macaco cinomolgo foram incubadas com proteí- nas M1d1 ou WT LFA3-Fc ex vivo, e a citotoxicidade foi avaliada usando citometria de fluxo. M1d1 induziu citotoxicidade de CD4+ TEM dependente de dose in vitro. M1d1 alcançou citotoxicidade máxima comparável a WT LFA3-Fc e foi mais potente do que a molécula WT LFA3-Fc (Figuras 18A e 18B). No geral, os EC50s para células de cino foram maiores do que para PBMCs humanas. Estudo PK/PD de bolus IV de 4 semanas com fase observacional de 6 semanas (17MA057)
[00637] O projeto experimental de 17MA057 é mostrado na Figura
19. Macacos cinomolgo foram administrados com 0,03, 0,3 ou 3 mg/kg/dose de LFA3-Fc M1d1 ou LFA3-Fc WT via injeção de bolus IV nos Dias 1, 8, 15 e 22 (ou seja, uma vez semanalmente por 4 sema- nas) seguido por uma fase de observação de 6 semanas. Amostras de sangue foram coletadas de todos os animais antes do início da dosa- gem, nos dias de dosagem e durante a fase observacional nos dias 36, 43, 50, 57, 64 e 71. A porcentagem de cada subconjunto de linfóci- tos foi fornecida por citometria de fluxo. A determinação das alterações em subconjuntos de linfócitos após a administração de LFA3-Fc M1d1 ou LFA3-Fc WT foi limitada a células T totais, células T CD4+ , células T CD8+, células NK, células B, CD4+ e CD8+ virgem, célula T de memória central e efetora e células T regularas. As alterações foram determinadas usando contagens de células absolutas e a razão para os valores de linha de base.
[00638] Alterações nos números de células e células NK em com- paração com a linha de base foram observadas para animais adminis- trados com LFA3-Fc M1d1. As células B aumentaram para animais administrados com 0,3 (1,37x-1,94x da linha de base), 0,3 (1,41x da linha de base) ou 3 (1,50x-2,92x da linha de base) mg/kg/done e célu- las NK reduziram a ≤ 0,03 mg/kg/dose (0,27x-0,44x da linha de base) predominantemente 6 horas após a dose em 1 ou mais dias de admi- nistração. As alterações nas células B e células NK voltaram aos valo- res de linha de base 24 horas pós-dose para a maioria dos animais.
[00639] A dosagem de repetição de M1d1 reduziu células TEM CD4+ periféricas (Figura 20A e 34A). Tregs foram relativamente poupados por M1d1, resultando em um aumento da razão de Treg/TEM (Figuras 20B e 34B). Células TEM CD8+ reduziram também. O efeito em Tvirgem foi mínimo. A fase de recuperação foi concluída, e as tendências de recuperação ou o estabelecimento de uma nova linha de base eram evidentes no dia 57.
[00640] O impacto geral de M1d1 nas contagens de células T totais é relativamente modesto (<50% de redução a 3 mg/kg) e não atinge o limite associado à imunossupressão (Figura 21). As células B não fo- ram diminuídas pelo tratamento (não mostrado). M1d1 tem como alvo preferencialmente células TEM CD2hi in vivo (Figura 21).
[00641] Como mencionado acima, uma resposta de dose paralela foi incluída no estudo 17MA057 com WT LFA3-Fc para uso como refe- reência. A dosagem de repetição de WT LFA3-Fc em cino reduziu cé- lulas CD4 EM e aumentou a proporção de Tregs/CD4+ TEM (Figuras 22A e 22B e Figuras 35A e 35B).
[00642] Os parâmetros NHP PK para M1d1 e WT LFA3-Fc foram determinados por ajuste dos dados de estudo de dose de repetição de NHP (dosagem semanal de 0,03, 0,3 ou 3 mg/kg por 4 semanas, se- guido por período de 6 semanas de recuperação) (Figuras 23A e 23B) para um modelo PK de 2 compartimentos. Os parâmetros PK huma- nos para alefacept foram derivados digitalizando dados clínicos mé- dios (0,04, 0,15 e 0,2 mg/kg de dose única (IV/IM/SC)) da literatura e ajustando-os a um modelo PK de 2 compartimentos. Esses parâme- tros PK são mostrados abaixo na Tabela 11. A depuração de M1d1 é 2 vezes mais lenta do que a de WT LFA3-Fc.
[00643] As estimativas de dose eficaz de LFA3-Fc M1d1 foram ava- liadas. Assumindo absorção similar de LFA3-Fc M1d1 por via subcutâ- nea versus alefacept administrado intramuscularmente, e a estimativa 2x menor de depuração de LFA3-Fc M1d1 em comparação com alefa- cept, uma dose sc semanalmente de 7,5 mg de LFA3-Fc M1d1 seria eficaz em seres humanos.
Tabela 11. Parâmetros PK de M1d1 e WT LFA3-Fc Parâmetro PK LFA3-Fc LFA3-Fc Alefacept LFA3-Fc WT M1d1 Ser Huma- M1d1 Macaco Macaco no %CV* Ser Huma- (%CV) (%CV) no %CV** Taxa de absorção 0,023 (7) (Ka) (1/hr) Biodisponibilidade 59 (5) (F) (%) Volume Central (V1) 37 (9) 32 (5,0) 49 (6) 32 (5) (ml/kg) Volume Periférico 34(15) 27 (8) 27 (10) 27 (8) (V2) (ml/kg) Depuração de cen- 0,24(4) 0,11 (6) 0,21 (6) 0,11 (6) tral (Cl) (ml/hr*kg) Depuração de distri- 0,67(32) 0,70 (10) 0,85 (45) 0,70 (10) buição (Q) (ml//hr*kg) * com base em dados publicados; ** previsto
[00644] Eventos adversos relacionados a M1d1 não foram observa- dos no estudo de toxicidade investigativa de dose única em macacos. A redução em linfócitos T foi a única alteração relacionada ao artigo de teste em animais administrados com M1d1 a 100 mg/kg, com recupe- ração subsequente até o Dia 57. Com base nos dados publicados com Alefacept, alvos de toxicidade são apenas aqueles que se espera que sejam associados à depleção moderada à marcada de linfócitos CD2 positivos e imunossupressão relacionada. Uma visão geral dos estu- dos de toxicologia de M1d1 é fornecida na Tabela 12.
Tabela 12. Visão geral dos estudos de toxicologia de M1d1 Estudos Resultados Espécie tox relevan- Homologia de sequência (proteína): macaco te confirmado (94%), cachorro (60%), rato (57%), camun- dongo (52%). Ligação de CD2 Biacore: Nenhuma ligação apreciável a camundongo, rato ou cachorro, li- gação a CD2 humano e de cino: CD2 Hu Kd (M): 1,10E-6; CD2 cino Kd (M): 1,35E-6. Tem uma função efetora de ADCC pretendida como parte do MOA.
Efeitos mínimos de CDC (<10% por cento das células alvo mortas). CRA Humano TNF-α, IFN-γ e IL-6 medidos. (0,1, 1, 10, 100 Nenhuma liberação significativa de citocina em g/ml) CRA de fase solúvel após incubação com amostras de sangue de 8 doadores humanos saudáveis.
Estudo TK de ma- Nenhum sinal clínico relacionado ao artigo de caco teste, peso corporal ou efeito do consumo de (0,3 e 100 mg/kg) alimentos foi observado com 100 mg/kg (> 17MA005 400X margem de segurançaa). Alterações relacionadas ao artigo de teste na imunofenotipagem compararam com os valores de linha de base observados a 100 mg / kg.
Macho: transiente em números absolutos de todos os tipos de células, exceto células B e células NK.
Fêmea: transiente em PD1+ citotóxico T, cé- lulas T reguladoras, células T citotóxicas cen- tral e efetora, células T auxiliares central e efe- tora PD1+, bem como células T citotóxicas cen- tral e efetora PD1+.
Estudos Resultados Estudo PK/PD de Nenhum sinal clínico relacionado ao artigo de macaco teste, peso corporal ou efeitos do consumo de (0,03, 0,3 e 3 mg/kg) alimentos foram observados em todos os níveis 17MA057 de dosagem. Cmax e AUC168 médios de M1d1 a 3 mg/kg/dose foram 181 µg/ml e 16.400 µg*h/ml no Dia 22.b a Margem é uma estimativa baseada na exposição eficaz prevista do estudo PK/PD (17MA057): O intervalo previsto para AUCss com dose eficaz para M1d1 é 16 a 550 µg*dia/ml, intervalo de dose é 0,22 - 7,5 mg. b Cmax = maior concentração de fármaco observada no soro; AUC168 = área sob a curva de concentração de fármaco no tempo de 0-168 horas após a dose.
Exemplo 4: Caracterização Biofísica e Estudos de Estabilidade de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT
[00645] O LFA3-Fc M1d1 (também conhecido como "LFA3-Fc M1- d1" "M1d1" "M1-d1" ou "M1d1-Pfe") e LFA3-Fc WT (também conheci- do como "WT LFA3-Fc") foram caracterizados quanto às propriedades biofísicas e estabilidade, a fim de prever propriedades comparativas de fabricação. Avaliação de Termostabilidade
[00646] A termoestabilidade de LFA3-Fc M1d1 foi avaliada por DSC (calorimetria de varredura diferencial) em tampão Tris, pH 7,5, tampão de histidina, pH 5,8 e tampão de glutamato, pH 4,5. A proteína exibiu uma temperatura de transição (TM1) superior a 65ºC nos tampões de histidina e Tris (Tabela 13 e Figura 27).
Tabela 13. Temperaturas de transição térmica para LFA3-Fc M1d1 Amostra TM1 TM2 LFA3-Fc M1d1 Tris pH 7,5 66,64 83,55 LFA3-Fc M1d1 His pH 5,8 65,08 82,99 LFA3-Fc M1d1 Glu pH 4,5 61,29 80,72
[00647] Para análise separada de domínio de LFA3 e domínio Fc (CH2 e CH3), as amostras foram tratadas com FabRICATOR IdeS (Genovis AB, Cambridge, MA) a 37ºC por 30 minutos. O domínio de LFA3 (também referido como "fragmento de LFA3") exibiu uma tempe- ratura de transição térmica próxima à temperatura de transição térmica do domínio de CH2do fragmento Fc (Figura 28).
[00648] A termoestabilidade de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT foi comparada usando DSC. LFA3-Fc WT apresentou menor estabilidade de desdobramento térmico em todas as condições em relação a LFA3- Fc M1d1. A estabilidade de desdobramento térmico de LFA3-Fc WT foi significativamente menor do que a temperatura alvo para um anticorpo (por exemplo, TM1≥ 65ºC) (Tabela 14). Tabela 14. Temperaturas de transição térmica para LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT Condição Amostra TM1 Tris pH 7,5 LFA3-Fc Md1 66,3 LFA3-Fc WT 59,7 Histidina pH 5,8 LFA3-Fc M1d1 64,01 LFA3-Fc WT 60,9 Glutamato pH 4,5 LFA3-Fc M1d1 61,4 LFA3-Fc WT 56,4
[00649] A termoestabilidade de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT foi comparada usando DSC seguido por FabRICATOR IdeS conforme descrito acima. O domínio de LFA3 digerido e os domínios Fc (isto é, CH2 e CH3) também foram analisados separadamente. O domínio de M1d1 LFA3/domínio de CH2 teve estabilidade de desdobramento tér-
mico significativamente maior do que o domínio de WT LFA3/domínio de CH2 (64,8ºC vs 52,2ºC, respectivamente) (Tabela 15). Tabela 15. Temperaturas de transição térmica para domínios de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT LFA3/CH2 LFA3 CH2 CH3 LFA3-Fc M1d1 66,8 - 82,3 M1d1 Fc - 73,4 80,7 M1d1 LFA3 64,8 - - LFA3-Fc WT 53,2 67 83,2 WT Fc - 73,4 81,7 WT LFA3 52,2 - - Heterogeneidade de Carga
[00650] A heterogeneidade de alteração de LFA3-Fc M1d1 e LFA3- Fc WT foi avaliada por eletroforese capilar isoelétrica sob três condi- ções: 20 mM de Tris pH 7,5, 20 mM de histidina pH 5,8 e 20 mM de glutamato pH 4,5 . Ambas as moléculas exibiram um perfil de carga complicado compreendendo 15-18 espécies diferentes (Figura 29A- 29C). A heterogeneidade de ambos LFA3-Fc WT e M1d1 (>20 espé- cies pI) reflete modificações de ácido siálico nos seis sítios de glicano N-ligados de LFA3-Fc. A resolução mais baixa do composto de LFA3- Fc WT foi observada em comparação com LFA3-Fc M1d1.
[00651] Estabilidade
[00652] A estabilidade de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT foi avaliada em estudos de curso ao longo de 2, 4 ou 6 semanas. As amostras fo- ram submetidas a ultrafiltração/diafiltração centrífuga usando um filtro de celulose regenerada de peso molecular de 30K (Amicon). 25 µl ou 100 µl de cada formulação de polipeptídeo (Tabela 16) foram envasa- dos em um criotubo de 500 µl. As condições do estudo são providas na Tabela 16.
Tabela 16. Condições do Estudo de Estabilidade Concentração Formulação Temperatura Tempo (se- de Polipeptídeo manas) (mg/ml) 150 20 mM de Tris pH 7,5 5°C ou 25°C 2, 4, 6 8,5% de sacarose 0,05 mg/ml de EDTA 150 20 mM de histidina pH 5,8 5°C ou 25°C 2, 4, 6 8,5% de sacarose 0,05 mg/ml de EDTA 150 20 mM de glutamato pH 4,5 5°C ou 25°C 2, 4, 6 8,5% trehalose 0,05 mg/ml de EDTA 5 20 mM de Tris pH 7,5 40°C 2, 4 5 20 mM de histidina pH 5,8 40°C 2, 4 5 20 mM de glutamato pH 4,8 40°C 2, 4 Eletroforese em Gel Capilar.
[00653] Os polipeptídeos foram analisados a 2, 4 e 6 semanas por eletroforese em gel capilar (CGE), sob condições de não redução (NR), para fragmentação conforme mostrado por um aumento na por- centagem de espécies de baixa massa molecular (LMMS). Houve um aumento significativo na fragmentação de LFA3-Fc WT a 40ºC em comparação com o LFA3-Fc M1d1 (Figura 30A-30C). A 25ºC, a ten- dência de aumento da porcentagem de LMMS foi observada nas amostras de LFA3-Fc WT, porém não houve aumento na porcentagem de LMMS nas amostras de LFA3-Fc M1d1 (dados não mostrados). Não houve mudança significativa na porcentagem de LMMS a 5ºC pa- ra LFA3-Fc WT ou M1d1 (dados não mostrados). A estabilidade de LFA3-Fc M1d1 em cada uma das formulações de tampão foi similar. No entanto, LFA3-Fc WT foi significativamente mais estável quando formulado em Tris em comparação com histidina ou glutamato.
[00654] As preparações de LFA3-Fc WT foram ~97% puras sob condições de redução e não redução. As preparações de LFA3-Fc
M1d1 foram ~99% puras sob condições de redução e não redução. Cromatografia por Exclusão de Tamanho
[00655] Os polipeptídeos foram analisados por cromatografia líqui- da de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC) após armazenamento por 2 ou 4 semanas a 40ºC (Figuras 31A-31D). Houve um aumento significativo na agregação, conforme demonstrado por um aumento na porcentagem de espécies de alta massa molecular (HMMS), na formulação de glutamato de LFA3-Fc WT na semana 2 e semana 4 em comparação com a semana 0, e em comparação com LFA3-Fc M1d1 formulado em tampão de glutamato (Figura 31C). Hou- ve também um aumento pronunciado na formação de LMMS no LFA3- Fc WT formulado em tampão de glutamato ou histidina (Figura 31D). Um aumento de 2-3% em LMMS foi observado em 4 semanas nas formulações de histidina e glutamato de LFA3-Fc M1d1 (Figura 31D).
[00656] Os polipeptídeos foram analisados por SE-HPLC após ar- mazenamento por 2, 4 ou 6 semanas a 25ºC (Figuras 32A-32D). Uma maior porcentagem inicial de HMMS foi detectada nas formulações de LFA3-Fc WT em comparação com as formulações de LFA3-Fc M1d1. Um aumento de 1-2% em HMMS foi detectado nas formulações de LFA3-Fc M1d1, enquanto a HMMS aumentou em 2-10% nas formula- ções de LFA3-Fc WT. O aumento mais significativo na porcentagem de HMMS (~10%) foi detectado em LFA3-Fc WT formulado em tampão de glutamato/trealose (Figura 32C). Nenhum aumento significativo em LMMS foi observado em qualquer formulação de LFA3-Fc M1d1, en- quanto um aumento de ~7% em LMMS foi detectado em 6 semanas no LFA3-Fc WT formulado no tampão de histidina/sacarose e no tam- pão de glutamato/trealose (Figura 32D).
[00657] Os polipeptídeos foram analisados por SE-HPLC após ar- mazenamento por 2, 4 ou 6 semanas a 5ºC (Figuras 33A-33D). Uma maior porcentagem inicial de HMMS foi detectada nas formulações de
LFA3-Fc WT em comparação com as formulações de LFA3-Fc M1d1 (Figuras 33A-33C). O aumento mais significativo na percentagem de HMMS foi detectado em LFA3-Fc WT formulado em tampão de gluta- mato/trealose após armazenamento por 6 semanas (aumento de ~2,8%) (Figura 33C).
[00658] No geral, LFA3-Fc M1d1 mostrou estabilidade superior con- tra fragmentação em comparação com LFA3-Fc WT sob todas as con- dições testadas. Em particular, LFA3-Fc WT exibiu instabilidade signi- ficativa em baixo pH nas formulações testadas. A taxa de agregação de LFA3-Fc WT foi maior a 25ºC em comparação com 40ºC em tam- pões Tris e histidina o que pode indicar uma dependência da concen- tração ou incompatibilidade de excipientes. Solubilidade
[00659] A solubilidade de LFA3-Fc WT foi testada até 165 mg/ml em um tampão compreendendo glutamato, trealose e EDTA em pH 4,5. A solubilidade de LFA3-Fc M1d1 foi testada até 148 mg/ml em um tampão compreendendo glutamato, trealose e EDTA em pH 4,5. Análise de Glicano
[00660] Ambos os polipeptídeos LFA3-Fc WT e LFA3-Fc M1d1 compreendem N-glicanos característicos de domínios Fc de anticorpo. O domínio de LFA3 do polipeptídeo WT compreendeu glicanos alta- mente ramificados e aproximadamente 22 nmoles de ácido siáli- co/nmol de polipeptídeo LFA3-Fc WT. O domínio de LFA3 do polipep- tídeo M1d1 também compreendeu glicanos altamente ramificados e aproximadamente 14 nmoles de ácido siálico/nmol de polipeptídeo LFA3-Fc M1d1. Exemplo 5: Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo (ADCC) de LFA3-Fc M1d1
[00661] A ADCC in vitro de LFA3-Fc M1d1 e LFA3-Fc WT contra células T humanas foi caracterizada neste estudo. CD2 é expresso em todas as células T com maior expressão em células T de memória em comparação com células T virgens ou reguladoras. LFA3-Fc se liga a CD2 e um mecanismo de ação principal é a ADCC.
[00662] Este estudo demonstrou que LFA3-Fc M1d1 é 3-4 vezes mais potente na indução de ADCC de células CD4 de memória do que LFA3-Fc WT. Além disso, LFA3-Fc M1d1 preferencialmente teve como alvo células T CD4+ de memória em comparação com células T vir- gens. Métodos Ensaio ADCC de PBMC e Citometria de Fluxo
[00663] PBMCs de doadores humanos saudáveis foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade usando tubos SepMa- te™ e Lymphoprep™ de acordo com as instruções do fabricante (STEMCELL Technologies, Tukwila, WA). Após o isolamento, as PBMCs foram semeadas em meio RPMI completo a uma densidade de 2,0 x 105 células por cavidade em placas de 96 cavidades de fundo redondo. Neste ensaio, as PMBCs são a fonte das células efetoras exterminadoras naturais (NK) e das células T alvo (memória e não memória CD4, memória e não memória CD8). As células de memória e não memória foram diferenciadas com base na expressão de CD45RO (células de memória são CD45RO+; células de não memória são CD45RO). Diluições em série de proteínas de fusão LFA3-Fc fo- ram adicionadas às cavidades e as células foram incubadas a 37ºC, 5% de CO2 por aproximadamente 20 horas.
[00664] As placas foram centrifugadas a 300 x g (gravidade) duran- te 5 minutos à temperatura ambiente (RT). As PBMCs foram lavadas com tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e ressuspensas em 50 µL de tampão FACS gelado contendo anticorpos conjugados por fluorescência para manchamento de sub- conjuntos de linfócitos. O painel de manchamento incluiu: CD3
(BUV496), CD4 (BUV395), CD8 (PerCP-e710), CD45RO (PeCy7), CD45RA (FITC), CD25 (PE-CF594), CD56 (BV421), CD2 (PE), e viabi- lidade de infravermelho próximo (IV).
[00665] Após incubação por 15-30 minutos a 4ºC, as PBMCs foram lavadas com tampão FACS gelado duas vezes e ressuspensas em 100 µL de 0,5% de paraformaldeído (PFA) em PBS. Esferas de Con- tagem Absoluta CountBright (Thermo Fisher Scientific) foram adicio- nadas a cada cavidade (10 µL). As placas foram analisadas por cito- metria de fluxo (BD LSRFortessas™ Cell Analyzer). Ensaio de Citotoxicidade de Titulação NK
[00666] PBMCs recém-isoladas foram deixadas em repouso duran- te a noite em RPMI completo + FBS a 10% a 5x106 células/ml. No dia seguinte, as células alvo (Memória CD4, CD4 Virgem ou células B) foram isoladas utilizando kits de isolamento da STEMCELL Technolo- gies. Células exterminadoras naturais (NK) correspondentes do mes- mo doador também foram isoladas. Um volume de 50 µL de células alvo foi plaqueado a 30.000 células/cavidade em uma placa de fundo em V de 96 cavidades. As células NK foram preparadas em diluições seriadas de 2 vezes e 50 µL foram adicionados às células alvo. Os po- lipeptídeos LFA3-Fc foram preparados a 10x para uma concentração final de trabalho de 100 nM. Um volume de 11 µL de polipeptídeo foi adicionado às cavidades apropriadas e as placas foram incubadas por 4 horas a 37ºC. As placas foram lavadas e manchadas com tampão de manchamento contendo Anexina V Alexa Fluor 488, 7-AAD, CD56 BV421, e CD4 APH-H7 por 30 minutos. As células foram lavadas com tampão de ligação de Anexina V, fixadas por 10 minutos com 2% de PFA em PBS, lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Esferas CountBright foram incluídas em cada cavidade para determinar conta- gens absolutas. Análise de Dados
[00667] As curvas de titulação de citotoxicidade foram geradas tra- çando a porcentagem de citotoxicidade da população de ligação a an- tígeno contra o log de concentração de polipeptídeo LFA3-Fc. A por- centagem de citotoxicidade foi calculada como a diferença nas conta- gens absolutas de células vivas entre os controles não tratados, me- nos a amostra experimental, dividida pelos controles não tratados, multiplicada por 100. A porcentagem de citotoxicidade específica foi calculada como a diferença nas contagens absolutas de células vivas entre os controles não tratados, menos a amostra experimental, dividi- da pela diferença entre os controles não tratados, menos o controle de isótipo, multiplicado por 100. Os valores de concentração efetiva a 50% da resposta máxima (EC50) foram determinados usando ajustes de curva de regressão não linear GraphPad Prism® (versão 6.0, Gra- phPad Software, Inc, San Diego, CA) e um log sigmoidal de modelo de resposta à dose agonista. Resultados
[00668] LFA3-Fc WT e LFA3-Fc M1d1 induziram ADCC em todos os tipos de células testados. LFA3-Fc M1d1 demonstrou aumento da potência de ADCC em células de memória e não memória em compa- ração com LFA3-Fc WT (Tabela 17, Figuras 12A-12E). Tabela 17. Indução de ADCC por Polipeptídeo LFA3-Fc Tipo de Célula LFA3-Fc M1d1 LFA3-Fc WT EC50 (nM) EC50 (nM) Média SEM Média SEM Células de memória 0,348 0,098 1,559 0,425 CD4 CD45RO+ Células de não memó- 1,256 0,446 4,466 2,447 ria CD4 CD45RO- Células de memória 0,716 0,116 57,2 55,2 CD8 CD45RO+ Células de não memó- 0,787 0,279 49,7 47,3 ria CD8 CD45RO- n=5 para cada tipo de célula
[00669] LFA3-Fc WT e LFA3-Fc M1d1 induziram exterminação pre- ferencial de células de memória isoladas, que expressam altos níveis de CD2, em comparação com células virgens ou células B. Tabela 18. Citotoxicidade de NK Tipo de Célula Citotoxicidade Máxima (%) LFA3-Fc M1d1 LFA3-Fc WT Memória CD4 51,39 51,49 CD4 virgem 19,36 28,74 Célula B 4,08 ND ND=não determinada
[00670] Um ensaio alternativo para avaliar a citotoxicidade mediada por NK utiliza células NK purificadas cultivadas em proporções eleva- das com células alvo. Um ensaio de citotoxicidade de titulação NK uti- lizando polipeptídeo mais concentrado sobre múltiplos doadores cor- roborou a exterminação preferencial de células de memória isoladas. Populações de células alvo purificadas (memória CD4, CD4 virgem e células B) foram cultivadas com células NK em várias razões efetoras x alvo e 100 nM de LFA3-Fc WT ou LFA3-Fc M1d1 (Figura 13B-13C). Em uma razão efetora x alvo (E:T) de 10:1, e concentração de proteí- na de 100 nM, LFA3-Fc WT e LFA3-Fc M1d1 induziram citotoxicidade em células de memória CD4 e células virgens (Tabela 19). Tabela 19. Citotoxicidade NK Tipo de Célula LFA3-Fc M1d1 LFA3-Fc WT Citotoxicidade Máxima Citotoxicidade Máxima (%) (%) Média SEM Média SEM Células de me- 22,31 4,23 9,07 2,31 mória CD4 Células virgens 3,98 2,86 0,14 1,99 CD4 n=3 para cada tipo de célula
[00671] Este estudo exemplificou a indução da proteína LFA3-Fc de ADCC de células T CD2+ em ensaios in vitro usando PBMCs huma- nas. LFA3-Fc M1d1 foi 3-4 vezes mais potente na indução de ADCC de células de memória CD4 do que LFA3-Fc WT. LFA3-Fc M1d1 pre- ferencialmente tem como alvo células T de memória CD4+, conheci- das por expressar níveis mais elevados de proteína CD2 em compara- ção com células T CD4 virgens. Assim, esses estudos demonstram que o polipeptídeo terapêutico LFA3-Fc M1d1 induz ADCC de células T CD2+ alvo. Tabela 20. Novas e Úteis Características de Variantes de LFA3-Fc Característica LFA3-Fc WT LFA-Fc M1d1* Sequência de aminoácido Domínio de LFA3 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:26 Alterações em rela- A36V, L38F, F43V, ção a SEQ ID NO:3 M86F, 92insL Domínio Fc SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 16 Alterações em rela- D136E, L138M, ção a SEQ ID NO: 226delK 128 LFA3-Fc SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO:69 Alterações em rela- A36V, L38F, F43V, ção a SEQ ID NO: 4 M86F, V92_D93insL, D228E, L230M, 319delK Sequência de nucleotídeo Domínio de LFA3 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 53 Domínio Fc SEQ ID NO: 127 SEQ ID NO: 43 LFA3-Fc SEQ ID NO: 125 SEQ ID NO: 123
ADCC CD4 Tmem EC50 1,559 +/- 0,425 nM 0,348 +/- 0,098 nM CD4 Tnon-mem EC50 4,466 +/- 2,447 nM 1,256 +/- 0,446 nM CD8 Tmem EC50 57,2 +/- 55,2 nM 0,716 +/- 0,116 nM CD8 Tnon-mem EC50 49,7 +/- 47,3 nM 0,787 +/- 0,279 nM
Estabilidade térmica de LFA3-Fc Tris pH 7,5 59,7° 66,3° Histidina pH 5,8 60,9° 64,01° Glutamato pH 4,5 56,4° 61,4° Estabilidade térmi- ca DSC Tm1, 47°C Tm1, 65°C DSF Tm1, 40°C Tm1 60°C Estabilidade térmica 52,2° 64,8° de domínio de LFA3 Estabilidade no cur- Instabilidade significati- Estabilidade superior so do tempo va em baixo pH; taxa de para fragmentação agregação mais alta a 25°C e 40°C Pureza 97% 99% Solubilidade em 165 mg/ml 148 mg/ml tampão de glutama- to, trehalose e EDTA, pH4,5 Composição de Gli- 22 nmoles de ácido siá- 9-14 nmoles de ácido cano lico/nmol de polipeptí- siálico/nmol de polipep- deo tídeo Rendimento 4,95 mg/20 ml de cultu- 7 mg/20 ml de cultura ra Espécies monomé- 73,9% de monômero; >99% de monômero ricas de proteína A 18% de HMWS; 7,1% (%) de LMWS SEC analítica 99,2% de monômero 99,6% de monômero Estabilidade térmica DSC Tm1, 47°C Tm1, 65°C DSF Tm1, 40°C Tm1 60°C Propensão à agre- 40°C HMWS elevada 40°C nenhum aumento gação forçada para ~23% em HMWS 50°C HMWS elevada 50°C HMWS elevada para ~29% para 3%
Manutenção de bai- 11% de HMWS, ne- 4% de HMWS, nenhum xo pH (5 h) nhum aumento em aumento em LMWS
LMWS Congelamento- ~2% de aumento em Nenhum aumento em descongelamento (5 HMWS HWS ciclos) Afinidade por SPR 1,41-1,47 µM 0,73 – 1,08 µM para CD2 recombi- nante humano (KD) Afinidade por SPR 1,5 µM 1,06 µM para CD2 recombi- nante de cino (KD) Ligação celular 501 pM 94 pM (CD4 Tmem) Kd MLR (IC50) 2,48 nM 0,302 nM TTR (IC50) 28,4 nM 1,34 nM *modalidade exemplificativa englobando todas as variantes de LFA3- Fc divulgada neste documento.
[00672] Embora os ensinamentos divulgados tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, será apreciado que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar dos ensinamentos neste documento e da invenção reivindi- cada abaixo. Os exemplos anteriores são providos para melhor ilustrar os ensinamentos divulgados e não têm a intenção de limitar o escopo dos ensinamentos aqui apresentados. Embora os presentes ensina- mentos tenham sido descritos em termos dessas modalidades exem- plificativas, o versado na técnica compreenderá prontamente que mui- tas variações e modificações dessas modalidades exemplificativas são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas variações e mo- dificações estão dentro do escopo dos ensinamentos atuais.
[00673] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedi- dos de patentes, artigos, livros de texto, e similares, e as referências aí citadas, na medida em que ainda não o sejam, são aqui incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins. No caso de um ou mais da literatura incorporada e materiais similares diferirem ou con- tradizerem este pedido, incluindo mas sem limitação, termos definidos, termos de uso, técnicas descritas ou similares, este pedido prevalece.
[00674] Será evidente para os versados na técnica que várias modi- ficações e variações podem ser feitas na presente invenção sem se afastar do escopo ou do espírito da invenção. Outras modalidades da invenção serão evidentes aos versados na técnica a partir da conside- ração da especificação e prática da invenção divulgada neste docu- mento. Pretende-se que a especificação e os exemplos sejam consi- derados apenas exemplificativos, com um verdadeiro escopo e espírito da invenção sendo indicado pelas reivindicações a seguir.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Molécula de polipeptídeo isolado ou variante funcional da mesma, que especificamente se liga a CD2, caracterizada pelo fato de que a molécula de polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 69 ou em que a molécula de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69, e em que a molécula de polipeptídeo não compreende a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4.
    2. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, que especificamente se liga a CD2, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de LFA3 compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 17-41, e em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
    3. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a se- quência de aminoácido é SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 e em que o domínio de LFA3 ainda compreende o resíduo de aminoáci- do de Leu ou a sequência de aminoácido de LESLPS (SEQ ID NO: 118).
    4. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domí- nio de LFA3 compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 26 ou compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 26, e em que o domínio de LFA3 não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3.
    5. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, compreendendo um domínio de LFA3, caracterizado pelo fato de que o domínio de LFA3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3 com uma ou mais mutações nos resíduos 36, 38, 43 e 86, numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3.
    6. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações nos resíduos 36, 38, 43 e 86 numerados de acordo com a SEQ ID NO: 3 são A36V, L38F, F43V and M86F, e/ou em que o domínio de LFA3 ainda compreende o resíduo de aminoácido de Leu ou a sequência de aminoácido de LESLPS (SEQ ID NO: 118).
    7. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo domínio, em que o segundo domínio compreende uma proteína de imunoglobulina, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada humana ou uma variante funcional da mesma; em que o segundo domínio compreende uma região Fc de uma cadeia pesada (por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1 huma- na) ou uma variante funcional da mesma; ou em que o segundo domínio compreende uma região de do- bradiça, uma região de CH2, e uma região de CH3 ou uma variante funcional da mesma.
    8. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo domínio, em que o segun- do domínio compreende um domínio Fc compreendendo uma sequên- cia de aminoácido tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 16 ou em que o segun-
    do domínio compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
    16.
    9. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ligante, em que o ligante liga o terminal N do segundo domínio ao terminal C do domínio de LFA3, e/ou em que: i. o segundo domínio é capaz de formar um dímero com ou- tro segundo domínio, por exemplo, através de uma ligação dissulfeto intermolecular, e/ou ii. o segundo domínio é capaz de mediar citotoxicidade me- diada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
    10. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de LFA3 compre- ende um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 26, e em que o polipeptídeo não compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 3; e em que o domínio Fc compreende um polipeptídeo com- preendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 16.
    11. Polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo ou variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, e em que a sequência de aminoácido compreende uma ou mais mutações nos resíduos 36, 38, 43, 86, 92, 228 e 230 numerados de acordo com a SEQ ID NO: 4.
    12. Polipeptídeo isolado ou fragmento do mesmo, de acor-
    do com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais mutações nos resíduos 36, 38, 43, 86, 92, 228 e 230 numerados de acordo com a SEQ ID NO: 4 são A36V, L38F, F43V, M86F, V92_D93insL, D228E e L230M.
    13. Molécula de polipeptídeo isolado que se liga, por exem- plo, especificamente se liga, a CD2, caracterizada pelo fato de que a molécula de polipeptídeo compreende um domínio de LFA3 e tem uma ou mais das seguintes propriedades: i. Expressão monomérica aprimorada demonstrada por uma porcentagem de monômero que é cerca de 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% superior em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120 conforme me- dido usando cromatografia por exclusão de tamanho, ii. Expressão monomérica aprimorada e expressão mul- timérica reduzida demonstradas por uma porcentagem de monômero que é superior a cerca de 75, 80, 85, 90 ou 95%, uma porcentagem de espécies de baixo peso molecular (LMWS) que é inferior a cerca de 10, 8, 6, 4 ou 2%, e/ou uma porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMWS) que é inferior a 5, 2 ou 1% em relação a uma mo- lécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, iii. Propensão à agregação reduzida sob estresse térmico demonstrada por uma porcentagem de monômero que é superior a cerca de 90, 92 ou 95% após incubação a 37,4ºC por 24 horas, e/ou apresentando uma porcentagem de monômero que é superior a cerca de 75, 80 ou 85% após incubação a 40ºC por 24 horas em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de amino- ácido de SEQ ID NO: 120, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho,
    iv.
    Propensão à agregação reduzida sob estresse térmico demonstrada por não mais do que cerca de 5, 10, 15 ou 20% de au- mento em HMWS a 40ºC, e/ou não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25% de aumento em HMWS a 50ºC em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tama- nho v.
    Propensão à agregação reduzida sob baixo pH de- monstrada por não mais do que cerca de 6, 7, 8 ou 9% de aumento em HMWS a baixo pH por 5 horas em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, vi.
    Estabilidade aprimorada conforme demonstrado por não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4 ou 5% de aumento em LMMS após 2 ou 4 semanas de armazenamento a 40°C em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando eletroforese em gel capilar (CGE) ou cromatografia líquida de alto desempenho por exclusão de tamanho (SE-HPLC), vii.
    Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1, 1,5 ou 2% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 25°C conforme medido usando SE-HPLC, viii.
    Estabilidade aprimorada em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, por exemplo, apresentando não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMMS e/ou cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de au-
    mento em LMMS após 2, 4 ou 6 semanas de armazenamento a 5°C conforme medido usando SE-HPLC, ix.
    Estabilidade a congelamento-descongelamento apri- morada demonstrada por não mais do que cerca de 0,5, 1 ou 1,5% de aumento em HMWS após 5 ciclos de congelamento-descongelamento em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando cromatografia por exclusão de tamanho, x.
    Rendimento elevado conforme demonstrado por um rendimento que é superior a cerca de 5,5, 6, 6,5 ou 7 mg por 20ml de cultura Expi293 em relação a uma molécula de polipeptídeo compre- endendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, xi.
    Tm elevada demonstrada por uma Tm que é superior a cerca de 38, 40, 42, 45 ou 50ºC em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 120, conforme medido por fluorometria de varredura diferencial (DSF), xii.
    Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 40, 45, 50, 55 ou 60ºC em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por DSF, xiii.
    Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por calorimetria de varredura diferencial (DSC), xiv.
    Uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62, 64 ou 66ºC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 7,5; uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58, 60, 62 ou 64 oC e uma Tm2 que é superior a cerca de 75, 78, 80 ou 82ºC a pH 5,8; ou uma Tm1 que é superior a cerca de 55, 58 ou 60ºC e uma Tm2 que é supe- rior a cerca de 75, 78 ou 80ºC a pH 4,5 conforme medido por DSC,
    xv.
    Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC a pH 7,5 ou pH 4,5 ou uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 62ºC a pH 5,8 em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por DSC, xvi.
    Tm elevada conforme demonstrado por uma Tm que é superior a cerca de 50 ou 60ºC em relação a uma molécula de polipep- tídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 conforme medido por DSC e FabRICATOR IdeS, xvii.
    Afinidade de ligação aprimorada a CD2 conforme de- monstrado por uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1 ou 0,08 µM em relação a uma molécula de po- lipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xviii.
    Afinidade de ligação aprimorada a CD2 conforme de- monstrado por uma kD para CD2 humana que é inferior a cerca de 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM, e/ou uma kD para CD2 de cinomolgo que é inferior a 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 ou 1 µM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, con- forme medido por SPR, xix.
    Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por uma kD para ligação a células Tmem CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando SPR, xx.
    Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200 ou 1500 pM; um IC50 calculado para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 150, 300,
    400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou 800 pM; um IC50 calculado para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000 ou 1200 pM; um IC50 calculado para ligação a células Treg CD4 expandidas que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500 pM; um IC50 calculado para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; e/ou um IC50 calculado para ligação a células T nati- vas CD8 que não é superior a cerca de 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 1200, 1500, 1600 ou 1700 pM, por exemplo, conforme medido usando SPR e/ou métodos descritos no Exemplo 2 com relação à Ta- bela 10 e Figura 11, em relação a uma molécula de polipeptídeo com- preendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xxi.
    Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por uma kd calculada para ligação a células T de memória CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500pM; uma kd calculada para ligação a células TEM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400, 500 ou 600 pM; uma kd calculada para ligação a células TCM CD4+ que não é superior a cerca de 100, 200, 300, 400 ou 500pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD4 que não é superior a cerca de 100, 200, 300 ou 400 pM; uma kd calculada para ligação a células Treg CD4 expan- didas que não é superior a cerca de 100, 200 ou 300 pM; uma kd cal- culada para ligação a células T de memória CD8 que não é superior a cerca de 50, 100 ou 150 pM; uma kd calculada para ligação a células T virgens CD8 que não é superior a cerca de 50, 100, 200, 300, 400 ou 500pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por
    SPR, xxii.
    Afinidade de ligação aprimorada a células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um EC50 reduzido para ligação a células TEM CD4+ de cinomolgo em relação a uma molécula de poli- peptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por SPR, xxiii.
    Citotoxicidade aprimorada contra células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um EC50 para exterminar células Tmem CD4 que não é superior a cerca de 400, 600, 800, 1000, 1200 ou 1400pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usan- do um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), xxiv.
    Citotoxicidade aprimorada contra células que expres- sam CD2 conforme demonstrado por um EC50 para exterminar células Tmem CD8 que não é superior a cerca de 1, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 nM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a se- quência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), xxv.
    Inibição aprimorada de resposta alogênica de células T, em que a resposta alogênica de células T é proliferação de células T e/ou produção de citocina, conforme demonstrado por um IC50 para um ensaio de reação mista linfocitária (MLR) que não é superior a cer- ca de 400, 800, 1200, 1600, 2000 ou 2400 pM em relação a uma mo- lécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, xxvi.
    Inibição aprimorada de resposta alogênica de células T, em que a resposta alogênica de células T é proliferação de células T e/ou produção de citocina, conforme demonstrado por um IC50 para um ensaio de reação mista linfocitária (MLR) na ausência de células
    NK que não é superior a cerca de 330, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500 ou 2000 pM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreen- dendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, xxvii. Inibição aprimorada de resposta de memória de to- xoide tetânico conforme demonstrado por um IC50 para produção de IFNγ Tmem CD4 que não é superior a cerca de 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25nM em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido em um ensaio de memória de toxoide tetânico (TTR), xxviii. Depuração mais lenta in vivo conforme demonstrado por uma depuração a partir do centro que não é superior a cerca de 0,14, 0,16, 0,18, 0,2 ou 0,22 ml/h/kg em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido por estudos PK/PD, e/ou xxix. Pureza aprimorada de pelo menos cerca de 98% ou 99% em relação a uma molécula de polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, conforme medido usando eletroforese em gel capilar.
    14. Ácido nucleico isolado codificando polipeptídeo isolado ou variante funcional do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
    15. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de áci- do nucleico tendo pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% de identidade com a SEQ ID NO: 43, 53 e/ou 123 ou compreen- dendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 43, 53 e/ou 123.
    16. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 14 ou 15.
    17. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico, como definido na reivindicação 14 ou 15 ou o vetor, como definido na reivindicação 16.
    18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de polipeptídeo, como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 13, e um veículo ou excipiente farma- ceuticamente aceitável.
    Biblioteca S (estabilidade) Biblioteca AS (afinidade + estabilidade)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 318/518 1/50
    Biblioteca de contato Diversidade teórica total Biblioteca núcleo Diversidade teórica total Resíduo Posição Mutagênese Códon Diversidade Resíduo Posição Mutagênese Códon Diversidade
    Resíduos de LFA3 direcionados em bibliotecas
    Resíduos de hotspot
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 319/518 Frequência de variação de aminoácido na posição de hotspot 2/50
    Frequência de resíduo (%) Variantes recombinantes
    Perfil de expressão (% de monômero)
    % de monômero
    Capacidade de fabricação (rendimento)
    mg por 20ml de cultura de Expi293
    Estabilidade térmica (DSF)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 323/518 Propensão à agregação: agregação forçada por calor 6/50
    % de monômero Temperatura
    Biblioteca Loop
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 324/518 Diversidade teórica
    Resíduo Posição Códon 7/50
    Loop FG
    Modelos usados: WT, M1, M4 e M5 Tamanho da biblioteca
    Afinidade de ligação a CD2 por SPR
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 325/518 Constructo Afinidade (μm) 8/50
    Estabilidade térmica (DSF)
    Estrutura cristalina de LFA3 Cromatografia por exclusão de tamanho
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 327/518 Absorbância 280nm (mAu) Volume de eluição (ml) 10/50
    Pureza de colheita Estabilidade térmica
    Monômero
    Eluição de ProtA (SEC %) Variante de LFA3-Fc
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 328/518 11/50
    Afinidade por SPR Estabilidade térmica
    Constructo Humano Cino
    Média de medições em triplicata Variante de LFA3-Fc
    Sequência Cromatograma SEC
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 329/518 % de monômero 12/50
    Estabilidade térmica por DSF Afinidade por SPR
    Constructo Afinidade
    D
    C ns e rg Vi Expressão de CD2 4
    D
    C ns e
    K rg
    N Vi as ul él
    B
    C s a ul él
    C Moléculas/célula
    Expressão de CD2 após estimulação por TCR
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 331/518 (memória total)
    (inativada)
    Moléculas/célula 14/50
    Dias 1 de 4 doadores mostrados
    Virgens CD4 Ligada a competidor de fração
    Virgens CD8 Ligada a competidor de fração
    (parte 1)
    Memória efetora CD4 Ligada a competidor de fração
    Memória CD8 Ligada a competidor de fração
    (parte 2)
    Memória central CD Ligada a competidor de fração
    Reguladora T Ligada a competidor de fração
    (parte 3)
    Ensaio PBMC ADCC Memória CD4
    [Proteína]
    % de citotoxicidade
    Memória CD4
    (não memória)
    [Proteína]
    % de citotoxicidade
    [Proteína] % de citotoxicidade
    [Proteína]
    % de citotoxicidade
    Ensaio de citotoxicidade: Titulação de NK Ensaio de citotoxicidade: Titulação de NK Memória CD4
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 339/518 Memória CD4 Virgem CD4 Célula B
    % de citotoxicidade % de citotoxicidade 22/50
    Razão E:T
    Memória CD4 Virgem CD4 Célula B % de citotoxicidade
    Razão E:T
    Reação linfocitária mista Memória ativada por CD4
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 340/518 23/50
    % de inibição de resposta alogênica [Proteína]
    Reação linfocitária mista Inibição de expansão de memória CD4
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 341/518 24/50
    Memória ativada CD4
    [Proteína] NK Normal
    % de inibição de resposta alogênica
    Memória ativada por CD4+ 26/50 Depletada NK
    [Proteína]
    % de inibição de resposta alogênica
    NK depletada NK normal Comparação de depleção NK MLR
    Recuperação Toxoide tetânico Liberação de IFNγ
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 345/518 28/50
    % de inibição resposta de recuperação de memória [Proteína]
    Ensaio de recuperação de toxóide tetânico Inibição da produção de IFNg
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 346/518 29/50
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 347/518 CD2 cino Quantibrite 30/50 Moléculas/célula B K 4 8 as N CD D u l a s C él ul ns ns C él rge rge
    C Vi Vi CD8+ fechadas em Cd2+ (expressão bimodal)
    Isótipo 8.8 μm de composto
    % de citotoxicidade
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 349/518 Objetivo: estabelecer relação de resposta à dose de repetição PK/PD in vivo para depleção de Tmem e razão de Tregs/TEM.
    Inclui WT LFA3-Fc para permitir a comparação com o conjunto de dados Alefacept clínico 32/50
    Análise PK Análise extensiva de fenótipo imune, incluindo subconjuntos de célula T, marcadores de ativação e proliferação, e biomarcadores de exploração nto al me m an anha Ac se omp se do- Horas
    Pré
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 350/518 Alteração de dobra CD4 TEM (escala logarítmica) CD4 TEM de cino
    Dias Alteração de dobra Treg/TEM (escala logarítmica)
    Dias CD4 TEM/Treg de cino 33/50
    CD4+ total Alteração de dobra CD4+ (escala logarítmica)
    Dias Alteração de dobra CD4+ (escala logarítmica)
    CD8+ total
    Dias (parte 1)
    Alteração de dobra Tvirgens (escala logarítmica) Alteração de dobra Tvirgens (escala logarítmica)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 352/518 Dias Dias 35/50
    Virgens CD8+ Virgens CD4
    (parte 2)
    Alteração de dobra CD8 TEM (escala logarítmica) Alteração de dobra CD4 TEM (escala logarítmica)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 353/518 Dias 36/50
    Dias
    (parte 3)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 354/518 Alteração de dobra CD4 TEM (escala logarítmica) Dias Alteração de dobra Treg/TEM (escala logarítmica)
    Dias 37/50
    Tempo (h) Concentração sérica (μg/ml) Tempo (h)
    Concentração sérica (μg/ml)
    Depleção celular – preferencialmente tem como alvo células de memória efetoras T (TEM)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 356/518 TEM ativada Extermínio celular dependente de anticorpo (ADCC)
    Tvirgem
    Proteína CD2 Proteína CD2 basal superior 39/50 aumentada e agrupada
    Modulação de sinais de sobrevivência induzidos por CD2 resultando em exaustão/anergia celular
    PD-1 aumentado Célula T Célula T TIGIT aumentado Estimulação de antígeno Expansão clonal, Exaustão/anergia citocinas aumentadas
    Expressão de CD2 em CD4 CM Expressão de CD2 em CD4 EM
    Expressão de CD2 (Dia 2) Expressão de CD2 (Dia 1)
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 359/518 digerir fragmento 42/50 fragmento
    (kcal/mol/ºC) (kcal/mol/ºC)
    Temperatura (ºC) Temperatura (ºC)
    Histidina
    Absorbância Absorbância
    Histidina
    Absorbância
    Glutamato
    Semanas
    Histidina Semanas
    Semanas
    Estabilidade de LFA3-Fc Tris pH 7,5 40ºC Estabilidade de LFA3-Fc Glutamato pH 4,5 40ºC
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 363/518 % de área
    % de área Semanas Semanas 46/50
    Estabilidade de LFA3-Fc Histidina 5,8 40ºC Estabilidade de LFA3-Fc 40ºC
    % de área
    % de área Semanas Semanas
    Estabilidade de LFA3-c 25ºC Estabilidade de LFA3-c 25ºC
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 364/518 % de área % de área Semanas Semanas 47/50
    Estabilidade de LFA3-c 25ºC Estabilidade de LFA3-c 25ºC
    % de área % de área
    Semanas Semanas
    Estabilidade de LFA3-c 25ºC Estabilidade de LFA3-c 25ºC
    Petição 870200119927, de 24/09/2020, pág. 365/518 % de área % de área Semanas Semanas 48/50
    Estabilidade de LFA3-c 25ºC Estabilidade de LFA3-c 25ºC
    % de área % de área
    Semanas Semanas
    Dia do estudo Alteração de dobra Treg/TEM
    Dia do estudo
    Alteração de dobra CD4 TEM
    Dia do estudo Alteração de dobra Treg/TEM
    Dia do estudo
    Alteração de dobra CD4 TEM
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