JP2022542964A - 抗ms4a4a抗体、及びその使用方法 - Google Patents

抗ms4a4a抗体、及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、一般的に、MS4A4Aポリペプチド、例えば、哺乳動物MS4A4AまたはヒトMS4A4Aに特異的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、及び抗体フラグメントを含む組成物、ならびにそれを必要とする個体での予防、リスクの抑制、または、治療におけるそのような組成物の使用に関する。【選択図】なし

Description

ASCIIテキストファイルでの配列表の提出
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の全内容を、参照により、本明細書で援用する:コンピューターで読み取り可能な(CRF)配列表(ファイル名称:4503_008PC06_Seqlisting_ST25.TXT、作成日:2020年7月28日、サイズ:289,448バイト)。
本開示の技術分野
本開示は、抗MS4A4A抗体、及び、そのような抗体の治療的使用に関する。
本開示の背景
4回膜貫通ドメインサブファミリーA(MS4A)遺伝子クラスターは、染色体11q12に存在しており、また、18個の遺伝子を含む。このMS4A遺伝子ファミリーは、一般的には、テトラ貫通トポロジーを有する膜タンパク質をコードする(Ishibashi et al,2001,Gene,265:87-93;Liang and Tedder,2001,Genomics,72:119-127;Efthymiou and Goate,2017,Molecular Neurodegeneration,12:43)。これらの膜貫通ドメインは、1つの細胞内ループと、2つの細胞外ループで相互に接続されており、N末端とC末端の両方が細胞質の内部にある。大部分のMS4Aタンパク質は、MS4A1(CD20)とアミノ酸配列の相同性(20~30%の類似性)を共有しており、最初の3つの膜貫通ドメインで、最も高い配列同一性が認められる。異なるMS4Aタンパク質にまで及んで、これらの膜貫通領域内において高度に保存されたモチーフは、当該膜貫通ドメインが、MS4Aタンパク質の機能において重要な一般的な役割を果たすことを示唆している。MS4Aタンパク質の間での最大の変動領域が、N末端とC末端の細胞質ドメイン、及び第2の推定細胞外ループで認められており(Ishibashi et al,2001,Gene,265:87-93)、これらの領域が、独特の機能特性を付与することが示唆されている。
この多様性にもかかわらず、MS4Aドメインには、幾つかの共有要素がある。例えば、MS4Aタンパク質(MS4A8B、及び、MS4A12を除く)で保存されている注目に値する機能の1つは、ジスルフィド架橋を形成し得る第2の推定細胞外ループでの2つのシステイン残基の保存である。MS4Aタンパク質のN末端ドメインとC末端ドメインも、プロリン残基が豊富であるが、この機能的な重要性は未だ解明されていない(Hulett et al,2001,Genomics,72:119-127)。しかしながら、プロリンに富む領域は、一般的に、細胞骨格の再構成、転写の開始、シグナル伝達カスケード、及び、タンパク質間相互作用を促すアダプターシステムの一部としてSH3ドメインと関連するなど、様々な細胞プロセスに関与している(Kay et al,2000,FASEB J,14:231-241)。
MS4Aタンパク質ファミリーは、一部の重要な例外:MS4A1(CD20)は、Bリンパ球においてのみ発現し、当該タンパク質が、B細胞抗原受容体、及び、カルシウム流入によるシグナル伝達機能を有することを除いて、機能面では特徴決定があまり進んでいない。CD20は、慢性リンパ性白血病、リンパ腫、自己免疫疾患、及び、固形臓器移植での病原性B細胞を枯渇させるために使用する免疫療法抗体の標的である。MS4A2(FcεRβ)は、肥満細胞に関する高親和性IgE受容体(FcεRI)、及び、低親和性IgG受容体(FcεRIII)のシグナル伝達サブユニットであり、過敏症とアレルギー反応において重要な役割を果たす。MS4A2は、4つのタンパク質の高親和性IgE受容体複合体を介してシグナルを増幅するITAMドメインのタンパク質である。MS4A3(Htm4)は、リンパ系、及び、骨髄細胞の細胞内膜に発現し、そして、細胞周期調節のアダプタータンパク質として機能する。
MS4Aファミリーのメンバーの大部分は特徴決定されていないが、MS4Aタンパク質が、脂肪酸、ペプチド、及び、硫酸化ステロイドなどの様々な外因性、及び、内因性リガンドの化学センサー、及び、化学受容体として機能しており、そして、カルシウム流入の媒介、エンドサイトーシスの調節、輸送に関与しており、また、シグナル伝達複合体のアダプターとして機能し得ることを示唆する報告がある(Cruse et al,2015,Mol Biol Cell,26:1711-1727;Greer et al,2016,Cell,165:1734-1748;Eon Kuek et al,2016,Cell,165:1734-1748;Koslowski et al,2008,Cancer Res,68:3458-3466;Bubien et al,1993;J Cell Biol,121:1121-1132)。
特定のMS4A遺伝子は、様々な障害や疾患、特に、神経変性障害と遺伝的に関連している。例えば、ゲノムワイド有意性関連分析は、染色体11q12にあるMS4A遺伝子クラスターを、最も重要なアルツハイマー病の遺伝子座の1つとして特定した。特に興味深い同定された遺伝子の1つは、MS4A4Aである(Lambert et al,2013,Nat Genet,45:1452-1458;Hollingworth et al,2011,Nat Genet,43:429-435;Naj et al,2011,Nat Genet,43:436-441)。
したがって、MS4A4A活性に関連する様々な疾患、障害、及び病態を治療するために、MS4A4Aに特異的に結合する抗体など、MS4A4Aを標的とする治療法、及び/または、例えば、MS4A4Aタンパク質レベルまたは活性を抑制してまたは大きくして、MS4A4Aの活性を調節する(例えば、阻害するまたは抑制する、活性化するまたは高める)ことができる治療法が必要とされている。
特許出願、及び、刊行物を含む、本明細書で引用するすべての文献を、参照により、それらの全内容を本明細書で援用する。
Ishibashi et al,2001,Gene,265:87-93 Liang and Tedder,2001,Genomics,72:119-127 Efthymiou and Goate,2017,Molecular Neurodegeneration,12:43 Hulett et al,2001,Genomics,72:119-127 Kay et al,2000,FASEB J,14:231-241 Cruse et al,2015,Mol Biol Cell,26:1711-1727 Greer et al,2016,Cell,165:1734-1748 Eon Kuek et al,2016,Cell,165:1734-1748 Koslowski et al,2008,Cancer Res,68:3458-3466 Bubien et al,1993;J Cell Biol,121:1121-1132 Lambert et al,2013,Nat Genet,45:1452-1458 Hollingworth et al,2011,Nat Genet,43:429-435 Naj et al,2011,Nat Genet,43:436-441
本開示の概要
本開示は、一般的に、抗MS4A4A抗体、及び、そのような抗体を使用する方法に関する。本明細書で提供する方法は、神経変性疾患、障害、または、病態の予防、そのリスクの抑制、またはそれを有する個体の治療における用途を見出す。一部の実施形態では、本開示は、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、認知症、及び、認知障害から選択する神経変性疾患、障害、または、病態を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、本開示は、MS4A4Aの発現または活性の高まりに関連する疾患、障害、または、病態を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。
ある態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域が:配列番号:94、108、116、146、147、308、及び311から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309、及び312から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310、及び313から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が;配列番号103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314、及び317から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号105、106、114、139、140、141、142、143、159、160、161、315、及び318から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号107、115、144、145、163、316、及び319配列番号から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域が;配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号96~99から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び、配列番号100~102から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が:配列番号103~104から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号105~106から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域が:配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号310のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が:配列番号314のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号315のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び、配列番号316のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域が:配列番号311のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号312のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び、配列番号313のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が:配列番号317のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号318のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び、配列番号319のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域が:配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号110~111から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号112のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が:配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は:配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号118~122から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号123~129から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が:配列番号130~138から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号139~143から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号144~145から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域が:配列番号146~147から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号149~153から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域が:配列番号156~158から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号159~161から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号5~15、304、及び306から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号24~30から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号40~53から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号76~84から選択するアミノ酸配列を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、配列番号17~22、305、及び307から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、配列番号32~36から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、配列番号55~74から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、配列番号86~93から選択するアミノ酸配列を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号5~15、304、及び306から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号17~22、305、及び307から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号24~30から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号32~36から選択するアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号40~53から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号55~74から選択するアミノ酸配列を含む。実施形態のいずれかと組み合わせることができる一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号76~84から選択したアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号86~93から選択するアミノ酸配列を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、当該重鎖は、配列番号320~343から選択するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該重鎖は、配列番号336~343から選択するアミノ酸配列を含む(任意に、当該軽鎖は、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、さらに任意に、当該軽鎖は、配列番号344のアミノ酸配列を含む定常領域を含む)。一部の実施形態では、当該重鎖は、配列番号320~327から選択するアミノ酸配列を含む(任意に、当該軽鎖は、配列番号304のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、さらに任意に、当該軽鎖は、配列番号344のアミノ酸配列を含む定常領域を含む)。一部の実施形態では、当該重鎖は、配列番号328~335から選択するアミノ酸配列を含む(任意に、軽鎖は、配列番号305のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、さらに任意に、当該軽鎖は、配列番号344のアミノ酸配列を含む定常領域を含む)。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号14のアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号22のアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、当該重鎖は、配列番号359または360のアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖は、配列番号365のアミノ酸配列を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は:配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号310のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域は:配列番号314のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号315のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号316のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号304のアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は配列番号305のアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、当該重鎖は、配列番号324または325のアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖は、配列番号363のアミノ酸配列を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は:配列番号311のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号312のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号313のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、当該軽鎖可変領域は:配列番号317のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号318のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号319のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、配列番号306のアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖可変領域は、配列番号307のアミノ酸配列を含む。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、当該重鎖は、配列番号332または333のアミノ酸配列を含み、かつ、当該軽鎖は配列番号364のアミノ酸配列を含む。
ある態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に結合する単離した抗体に関し、当該抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、本明細書のいずれかの実施形態の1つ以上の抗体との結合を競合的に阻害する。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体に関し、当該抗体は、本明細書のいずれかの実施形態の抗体と本質的に同じである、または重複しているMS4A4Aのエピトープに結合する。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、ヒトMS4A4Aの細胞外ドメイン1に結合する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、配列番号1のアミノ酸配列CMASNTYGSNPIS(配列番号177)での1つ以上のアミノ酸残基に結合する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、ヒトMS4A4Aの細胞外ドメイン2に結合する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、配列番号1のアミノ酸配列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(配列番号178)での1つ以上のアミノ酸残基に結合する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、配列番号1のアミノ酸配列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(配列番号178)での1つ以上のアミノ酸残基に結合し、さらに当該抗体は、配列番号1のアミノ酸残基プロリン163(P163)に結合しない。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、ヒト抗MS4A4A抗体またはヒト化抗MS4A4A抗体である。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であり、当該抗体は、MS4A4Aの細胞表面レベルを下げる、またはMS4A4Aの細胞内レベルを下げる。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質は、哺乳動物タンパク質、またはヒトタンパク質である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質は、野生型タンパク質である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質は、天然に存在するバリアントである。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞において、可溶性TREM2レベルを引き上げる、膜TREM2レベルを引き上げる、または可溶性TREM2を増やし、膜TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、可溶性TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、膜TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、可溶性TREM2レベル、及び膜TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで、可溶性TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで、血清での可溶性TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで、脳脊髄液(CSF)での可溶性TREM2レベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで、血清及びCSFでの可溶性TREM2レベルを引き上げる。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞でのM2細胞表面マーカー(例えば、受容体)の発現を抑制する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞、例えば、マクロファージにおけるM2細胞表面マーカーのレベルを下げる、または抑制する。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞でのCD200R、Dectin-1、またはCD163の発現を抑制する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞、例えば、マクロファージでのCD200R、Dectin-1、及び/またはCD163の細胞表面レベルを下げる、または抑制する。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞でのゲルゾリン及び/またはオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質の発現を高める。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞でのIL1RNのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞でのCSF1RのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞でのプリン作動性受容体P2RY12及び/またはCX3Cケモカイン受容体1(CX3CR1)のmRNA及び/またはタンパク質のレベルを下げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞での1-ホスホチジルイノシトール-4,5-二リン酸ホスホジエステラーゼガンマ-2(PLCG2)、C-タイプレクチンドメインファミリー7メンバーA(CLEC7A)、イノシトール1,4、5-三リン酸受容体2(ITPR2)、及び/または抗原KI-67(MK167)のmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞での膜貫通糖タンパク質NMB(GPNMB)のmRNA及び/またはタンパク質のレベルを下げる。
ある態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に結合する単離した抗体に関し、当該抗体は、骨髄細胞でのゲルゾリン及び/またはオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質の発現を高める。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該骨髄細胞は、ヒトマクロファージである。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体は、ヒトのもの、またはヒト化したものである。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、モノクローナル抗体、多価抗体、コンジュゲート抗体、またはキメラ抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体は、4A-18、4A-25、4A-214、4A-21、及び4A-202から選択する抗体と同じエピトープに結合する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体は、骨髄細胞でのM2マーカーの発現を抑制する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、当該骨髄細胞は、ヒトマクロファージである。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、当該M2マーカーは、CD200R、Dectin-1、及び/またはCD163である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体は、ヒトマクロファージでの原形質膜または細胞表面TREM2を、少なくとも50%、90%、100%、150%、200%、または250%増やす。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体は、ヒトマクロファージ上清での可溶性TREM2を、少なくとも15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、または70%増やす。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、第1の抗原と、第2の抗原とを認識する二重特異性抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、第1の抗原は、MS4A4Aであり、かつ、第2の抗原は、血液脳関門を通過する輸送を促す抗原である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、当該第2の抗原を、MS4A4A、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様成長因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマシングルドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリ-アルギニンペプチド、angiopepペプチド、ベイシジン、Glut1、及びCD98hc、及びANG1005から選択する。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、モノクローナル抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該抗体は、ヒト抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該抗体は、ヒト化抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該抗体は、二重特異性抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該抗体は、多価抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該抗体は、キメラ抗体である。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、IgGクラス、IgMクラス、またはIgAクラスに属する。一部の実施形態では、当該抗体は、IgGクラスに属し、かつ、IgG1、IgG2、またはIgG4アイソタイプを有する。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、当該抗体は、抗体フラグメントである。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、当該抗体は、ヒトMS4A4Aまたは哺乳動物MS4A4Aタンパク質のアミノ酸残基を含むエピトープに対して結合する抗体フラグメントである。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、当該抗体フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、またはscFvフラグメントである。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該抗体は、第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である。本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る一部の実施形態では、当該第1の抗原は、MS4A4Aであり、かつ、当該第2の抗原は:
(a)血液脳関門を通過する輸送を促す抗原;
(b)トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様成長因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマシングルドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、アンジオペプチド、及び、ANG1005から選択する、血液脳関門を通過する輸送を促す抗原;
(c)病原ペプチドまたはタンパク質、または、病原核酸から選択する病原作用物質であって、当該病原核酸は、アンチセンスGGCCCC(G2C4)反復拡張RNAであり、当該病原タンパク質は、アミロイドベータ、オリゴマーアミロイドベータ、アミロイドベータプラーク、アミロイド前駆体タンパク質、または、そのフラグメント、Tau、IAPP、アルファ-シヌクレイン、TDP-43、FUSタンパク質、C9orf72(第9番染色体オープンリーディングフレーム72)、c9RANタンパク質、プリオンタンパク質、PrPSc、ハンチンチン、カルシトニン、スーパーオキシドジスムターゼ、アタキシン、アタキシン1、アタキシン2、アタキシン3、アタキシン7、アタキシン8、アタキシン10、レビー小体、心房性ナトリウム利尿因子、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、アポリポタンパク質AI、血清アミロイドA、メジン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、ベータ2ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖AL、S-IBMタンパク質、反復関連非ATG(RAN)翻訳産物、ジペプチド反復(DiPeptide repeat)(DPR)ペプチド、グリシン-アラニン(GA)反復ペプチド、グリシン-プロリン(GP)反復ペプチド、グリシン-アルギニン(GR)反復ペプチド、プロリン-アラニン(PA)反復ペプチド、ユビキチン、及び、プロリン-アルギニン(PR)反復ペプチドから選択する、当該病原作用物質;
(d)免疫細胞で発現するリガンド、及び/またはタンパク質であって、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3、及び、ホスファチジルセリンから選択する、当該リガンド、及び/または、タンパク質;または、
(e)1つ以上の腫瘍細胞で発現するタンパク質、脂質、多糖、または、糖脂質である。
別の態様では、本開示は、先行実施形態のいずれかの抗体をコードする核酸配列を含む単離した核酸に関する。一部の実施形態では、本開示は、先行実施形態のいずれかの核酸を含むベクターに関する。一部の実施形態では、本開示は、先行実施形態のいずれかのベクターを含む単離した宿主細胞に関する。
別の態様では、本開示は、抗MS4A4A抗体を製造するために、先行実施形態のいずれかの宿主細胞を培養することを含む、ヒトMS4A4A抗体に対して結合する抗体を製造する方法に関する。特定の実施形態では、この方法は、細胞が産生した抗MS4A4A抗体を回収することをさらに含む。
別の態様では、本開示は、先行実施形態のいずれか1つの抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
ある態様では、本開示は、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び認知障害から選択する、疾患、障害、または損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、先行実施形態のいずれか1つの抗体の治療有効量を投与することを含む、当該方法に関する。別の態様では、本開示は、MS4A4Aの過剰発現または活性の増大が引き起こす、またはそのことに関連する疾患、障害、病態、または損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、先行実施形態のいずれか1つの抗体の治療有効量を投与することを含む、当該方法に関する。本開示の一部の実施形態では、当該方法は、当該抗体の投与の前及び/または後でのオステオポンチン、ゲルゾリン、原形質膜または細胞表面のTREM2、及び/または可溶性TREM2のレベルを検出することをさらに含む。
ある態様では、本開示は、CSF1R欠損疾患または障害を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、先行実施形態のいずれか1つの抗体の治療有効量を投与することを含む、当該方法に関する。一部の実施形態では、当該CSF1R欠損疾患または障害は、軸索スフェロイド及び色素性グリアを伴う成人発症性白質脳症(ALSP)または遺伝性びまん性白質脳症(HDLS)である。
本開示のその他の態様は、先行実施形態のいずれかの方法で製造した単離した抗MS4A4A抗体に関する。本開示のその他の態様は、先行実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、(表1、表5、表30、及び表31に示した)抗体4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、または4A-450のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、(表1、表5、表30、及び表31に示した)抗体4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、または4A-450のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、当該抗体は、(表1、表5、表30、及び表31に示した)抗体4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、または4A-450のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、(表2及び表6に示した)抗体4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、または4A-331のHVR-H1、HVR-H2、及びのHVR-H3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、(表2及び表6に示した)抗体4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、または4A-331のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、当該抗体は、(表2及び表6に示した)抗体4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、または4A-331のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、(表3及び表7に示した)抗体4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、または4A-381のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、(表3及び表7に示した)抗体4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、または4A-381のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、当該抗体は、(表3及び表7に示した)抗体4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、または4A-381のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該重鎖可変領域は、(表4及び表8に示した)抗体4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390のHVR-H1、HVR-H2、及び抗HVR-H3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、(表4及び表8に示した)抗体4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
別の態様では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、当該抗体は、(表4及び表8に示した)抗体4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、本開示は、MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体に関し、当該抗体は、骨髄細胞でのゲルゾリン及び/またはオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質の発現を高める。一部の実施形態では、当該骨髄細胞は、マクロファージである。
本明細書のいずれかの実施形態と組み合わせ得る特定の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、ヒトMS4A4A、マウスMS4A4A、カニクイザルMS4A4A、またはそれらの組み合わせに対して特異的に結合する。
本明細書に記載した様々な実施形態の1つ、一部、または全部の特性を組み合わせて、本開示のその他の実施形態を形成し得ることを理解されたい。本開示のこれらの態様、及びその他の態様は、当業者には自明である。本開示のこれらの実施形態、及びその他の実施形態を、以下にさらに詳細に説明する。
特許または出願書類は、カラーで出力した少なくとも1枚の図面を含む。カラーで出力した図面を具備した特許公報、または、特許出願公報公開のコピーは、所定の請求を行い、かつ、所定の手数料を支払うことで、庁から提供を受ける。
ヒトMS4A4Aの一次アミノ酸配列を示す。細胞内ドメインはイタリック体で示し、膜貫通ドメインには下線を付けて示し、細胞外ループは太字のイタリック体で示す。 Aは、RCSB Protein Data Bankから得た可溶性の4ヘリックスバンドルスキャホールド(PDB_ID:1P68)の構造概略図を示しており、螺旋状のリボンとして認められる4つの膜貫通ドメインを構造内に有する。B及びCは、それぞれ、可溶性の4ヘリックスバンドルスキャホールドPDB-ID:1P68及びPDB_ID:1M6Tの一次アミノ酸配列を示す;4つの膜貫通ドメインは、アミノ酸配列に下線を付した。 Aは、ヒトMS4A4Aの2つの細胞外ループ(太い下線を付した)を加えた可溶性の4ヘリックスバンドルスキャホールドJS1、JS5、及びJS6の一次アミノ酸配列を示す。 Bは、ネガティブコントロールバリアントとして使用する可溶性の4ヘリックスバンドルスキャホールドJS4及びJS10の一次アミノ酸配列を示す。 ELISAによって、組換えMS4A4A可溶性ループグラフト化ポリペプチドJS1、JS4、JS5、JS6、及びJS10に対して結合する本開示の特定の抗MS4A4A抗体を示す。 組換えMS4A4A可溶性ループグラフト化ポリペプチドJS1に対して結合するマウス抗MS4A4A抗体4A-21の特定のヒト化した抗MS4A4A抗体バリアントを示す。 組換えMS4A4A可溶性ループグラフト化ポリペプチドJS1に対して結合するマウス抗MS4A4A抗体4A-202の特定のヒト化した抗MS4A4A抗体バリアントを示す。 組換えMS4A4A可溶性ループグラフト化ポリペプチドJS5に対して結合するマウス抗MS4A4A抗体4A-202のヒト化した、及び親和性成熟した特定の抗MS4A4A抗体バリアントを示す。 組換えMS4A4A可溶性ループグラフト化ポリペプチドJS5に対して結合するマウス抗MS4A4A抗体4A-21のヒト化した、及び親和性成熟した特定の抗MS4A4A抗体バリアントを示す。 組換えMS4A4A可溶性ループグラフト化ポリペプチドJS5に対して結合するマウス抗MS4A4A抗体4A-21のヒト化した、及び親和性成熟した特定の抗MS4A4A抗体バリアントを示す。 カニクイザルの血清でのsTREM2のレベルに関する抗MS4A4A抗体4A-202の効果を示す。抗MS4A4A抗体4A-202またはアイソタイプコントロール抗体(huIgG1)を、いずれも80mg/kgの用量で投与して、提示した時間(時間)が経過した時点でのカニクイザルの血清でのsTREM2のレベル(ng/mL)を示す。 カニクイザルの血清でのsTREM2のレベルに関する抗MS4A4A抗体4A-202の効果を示す。抗MS4A4A抗体4A-202またはアイソタイプコントロール抗体(huIgG1)を、いずれも80mg/kgの用量で投与して、提示した時間(時間)が経過した時点でのカニクイザルの血清でのsTREM2のレベル(ベースラインのパーセント)を示す。 カニクイザルの脳脊髄液(CSF)でのsTREM2のレベルに関する抗MS4A4A抗体4A-202の効果を示す。抗MS4A4A抗体4A-202またはアイソタイプコントロール抗体(huIgG1)を、いずれも80mg/kgの用量で投与して、提示した時間(時間)が経過した時点でのカニクイザルのCSFでのsTREM2のレベル(ng/mL)を示す。 カニクイザルの脳脊髄液(CSF)でのsTREM2のレベルに関する抗MS4A4A抗体4A-202の効果を示す。抗MS4A4A抗体4A-202またはアイソタイプコントロール抗体(huIgG1)を、いずれも80mg/kgの用量で投与して、提示した時間(時間)が経過した時点でのカニクイザルのCSFでのsTREM2のレベル(ベースラインのパーセント)を示す。 組換えヒトMS4A4Aを発現するU937細胞に対する抗MS4A4A抗体4A-313野生型(WT)huIgG1及び4A-450 WT huIgG1の結合曲線を表すデータを示す。 抗MS4A4A抗体4A-450 WT huIgG1、4A-450 NSLF huIgG1、及び4A-450 K322A huIgG1で処理した初代ヒトマクロファージでの膜TREM2レベルを表すデータを示す。 抗MS4A4A抗体4A-313 WT huIgG1、4A-313 NSLF huIgG1、及び4A-313 K322A huIgG1で処理した初代ヒトマクロファージでの膜TREM2レベルを表すデータを示す。 抗MS4A4A抗体4A-450 huIgG1で処理した初代ヒトマクロファージの上清での可溶性TREM2レベルの増大を表すデータを示す。 抗MS4A4A抗体4A-313 huIgG1で処理した初代ヒトマクロファージの上清での可溶性TREM2レベルの増大を表すデータを示す。 抗MS4A4A抗体4S-313 NSLF huIgG1、4A-313 PS huIgG1、4A-450.NSLF huIgG1、及び4A-450 PS hu IgG1で処理した初代ヒトマクロファージでのATPレベルの増大を表すデータを示す。 A~Cは、抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1及び4A-419 WT huIgG1で処理した初代ヒトマクロファージでのCD14、CD163、及びCD200Rのレベルの変化を表すデータを(それぞれ)示す。 ヨウ化プロピジウム取り込みで測定した、組換えヒトMS4A4Aを発現するU937細胞における抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 K322A huIgG1及び4A-313 WT huIgG1の補体依存性細胞傷害性(CDC)活性を表すデータを示す。 FcyRIIIa活性化で測定した、初代ヒトマクロファージにおける抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 K322A huIgG1、及び4A-313 WT huIgG1のADCP活性を表すデータを示す。 FcyRIIIa活性化で測定した、初代ヒトマクロファージにおける抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 K322A huIgG1、及び4A-313 WT huIgG1のADCC活性を表すデータを示す。 A~Bは、初代ヒトマクロファージにおける膜TREM2(A)及び可溶性TREM2(B)に関するMS4A4Aノックアウトの効果を表すデータを示す。 A~Cは、それぞれ、本開示の抗MS4A4A抗体で処理したヒトマクロファージでの可溶性TREM2タンパク質のレベル、膜TREM2タンパク質のレベル、及びTREM2 mRNAレベルの変化の動態を表すデータを示す。 A~Cは、それぞれ、本開示の抗MS4A4A抗体で処理したヒトマクロファージでの可溶性TREM2タンパク質のレベル、膜TREM2タンパク質のレベル、及びTREM2 mRNAレベルの変化の動態を表すデータを示す。 A~Cは、それぞれ、本開示の抗MS4A4A抗体で処理したヒトマクロファージでの可溶性TREM2タンパク質のレベル、膜TREM2タンパク質のレベル、及びTREM2 mRNAレベルの変化の動態を表すデータを示す。 A~Bは、MS4A4AのsiRNAノックダウンが、ヒトマクロファージにおける膜TREM2及び可溶性TREM2レベルを引き上げたことを表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおける膜TREM2レベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおける膜TREM2レベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおける膜TREM2レベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおける可溶性TREM2レベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおける可溶性TREM2レベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおける可溶性TREM2レベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおけるATPレベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおけるATPレベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の3名の異なるドナーに由来する初代ヒトマクロファージにおけるATPレベルの用量依存的増加を表すデータを示す。 A~Bは、本開示の抗MS4A4A抗体が、CSF1R阻害が誘導する細胞死を救済する上で有効であることを表すデータを示す。 本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルCSFでのプロテオームワイドの効果のボルケーノプロットを示す。 本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザル血清でのsTREM2レベルの増大を表すデータを示す。 A~Dは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルCSFでのオステオポンチンレベルの増大を表すデータを示す。 A~Dは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルCSFでのオステオポンチンレベルの増大を表すデータを示す。 A~Dは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルCSFでのオステオポンチンレベルの増大を表すデータを示す。 A~Dは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルCSFでのオステオポンチンレベルの増大を表すデータを示す。 A~Bは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルの脳の前頭葉及び海馬のそれぞれでのオステオポンチンレベルの増大を表すデータを示す。 A~Bは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルの脳の前頭葉及び海馬のそれぞれでのオステオポンチンレベルの増大を表すデータを示す。 A~Bは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルの脳の前頭葉及び海馬のそれぞれでのCSF1Rレベルの増大を表すデータを示す。 A~Bは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルの脳の前頭葉及び海馬のそれぞれでのCSF1Rレベルの増大を表すデータを示す。 A~Bは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のカニクイザルの脳の前頭葉及び海馬のそれぞれでの総TREM2タンパク質のレベルの増大を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与したカニクイザルの脳から単離したミクログリアにおけるミクログリア活性化、遊走、及び増殖のマーカーでのmRNAレベルの変化を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与したカニクイザルの脳から単離したミクログリアにおけるミクログリア活性化、遊走、及び増殖のマーカーでのmRNAレベルの変化を表すデータを示す。 A~Cは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与したカニクイザルの脳から単離したミクログリアにおけるミクログリア活性化、遊走、及び増殖のマーカーでのmRNAレベルの変化を表すデータを示す。 本開示の抗MS4A4A抗体が、U937細胞において組換え的に発現したHA-シュノーケルタグを付けたMS4A4Aタンパク質の細胞表面発現を抑制することを表すデータを示す。 本開示の抗MS4A4A抗体が、初代ヒトマクロファージにおいて、GPNMB細胞表面発現を抑制したことを表すデータを示す。
本開示は、抗MS4A4A抗体(例えば、モノクローナル抗体);それらの抗体を作り出す、及び、使用する方法;それらの抗体を含む医薬組成物;それらの抗体をコードする核酸;及び、それらの抗体をコードする核酸を含む宿主細胞に関する。
本明細書で説明または参照した技術や手順は、一般的に、よく理解がされており、そして、当業者であれば、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003);Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)に記載されている方法論など、広く利用がされている方法論である従来の方法論を進んで使用している。
I.定義
本明細書では、用語「MS4A4A」または「MS4A4Aポリペプチド」を、互換的に使用しており、特に断りがない限り、霊長類(例えば、ヒト、及び、カニクイザル)、及び、齧歯類(例えば、マウス、及び、ラット)などの哺乳類を含む、あらゆる脊椎動物起源の天然のあらゆるMS4A4Aのことを指す。一部の実施形態では、この用語は、野生型配列、及び、天然に存在する変異配列、例えば、スプライスバリアント、または、対立遺伝子バリアントの両方を含む。一部の実施形態では、この用語は、「全長」の未処理MS4A4A、ならびに、細胞内での処理が関与するあらゆる形態のMS4A4Aを含む。一部の実施形態では、当該MS4A4Aは、ヒトMS4A4Aである。一部の実施形態では、例示的なMS4A4Aのアミノ酸配列は、2001年12月1日現在でのUniprot受託番号:Q96JQ5である。一部の実施形態では、例示的なヒトMS4A4Aのアミノ酸配列は、配列番号1である。
用語「抗MS4A4A抗体」、「MS4A4Aに対して結合する抗体」、及び、「MS4A4Aに特異的に結合する抗体」は、MS4A4Aを標的にする診断薬、及び/または、治療薬として有用な抗体であり、MS4A4Aに対して十分な親和性で結合することができる抗体のことを指す。ある実施形態では、無関係の非MS4A4Aポリペプチドに対する抗MS4A4A抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)で決定したように、MS4A4Aに対する抗体の結合の約10%未満である。特定の実施形態では、MS4A4Aに対して結合する抗体は、<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM、または、<0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10-13M)の解離定数(KD)を有する。特定の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、異なる種に由来するMS4A4Aの間で保存されているMS4A4Aのエピトープに対して結合する。
標的分子に対する抗体の結合に関して、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」、または、特定のポリペプチド、または、特定のポリペプチド標的に関するエピトープに「特異的」であるとは、非特異的相互作用とは異なる測定可能な結合を意味する。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して、分子の結合を決定して測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰の非標識標的に類似するコントロール分子と競合させて決定することができる。この事例では、プローブに対する標識した標的の結合を、過剰な非標識標的が競合的に阻害していれば、特異的結合を示す。本明細書で使用する用語「特異的結合」または「特異的に結合する」、または、特定のポリペプチド、または、特定のポリペプチド標的に関するエピトープに「特異的」であるとは、例えば、概ね、10-4M以下、10-5M以下、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下のいずれかの標的に関するKD、または、10-4M~10-6M、または、10-6M~10-10M、または、10-7M~10-9Mの範囲のKDを有する分子として示すことができる。当業者であれば、親和性とKD値とが反比例することを理解する。抗原に対する高い親和性は、低いKD値として表れる。ある実施形態では、用語「特異的結合」とは、分子が、あらゆるその他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに対して実質的に結合せずに、特定のポリペプチド、または、特定のポリペプチドに関するエピトープに対して結合する結合のことを指す。
本明細書では、用語「免疫グロブリン」(Ig)を、「抗体」と互換的に使用する。本明細書において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用しており、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つのインタクトな抗体から形成した多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び、所望の生物学的活性を示す限りは、抗体フラグメントを含む。
「ネイティブ抗体」は、通常、2つの同一の軽(「L」)鎖、及び、2つの同一の重(「H」)鎖から構成されている約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、1つのジスルフィド共有結合で重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。それぞれの重鎖、及び、それぞれの軽鎖は、規則的な間隔を設けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一端に、可変ドメイン(V)を有しており、これに、幾つかの定常ドメインが続く。それぞれの軽鎖は、一端に、可変ドメイン(V)を有しており、他端に、定常ドメインを有しており;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインと整列しており、そして、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられる。
異なる抗体クラスの構造及び特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology,8th Ed.,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994,page 71 and Chapter 6を参照されたい。
あらゆる脊椎動物種に由来する軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(「κ」)、及び、ラムダ(「λ」)と称する2つの明確に異なる種類のうちの一方に割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメイン(CH)のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには;IgA、IgD、IgE、IgG、及び、IgMの5つのクラスがあり、それぞれ、アルファ(「α」)、デルタ(「δ」)、イプシロン(「ε」)、ガンマ(「γ」)、及び、ミュー(「μ」)と表記される重鎖を有する。γ及びαのクラスは、CH配列及び機能での相対的にわずかな相違に基づいて、サブクラス(アイソタイプ)にさらに分類され、例えば、ヒトでは、以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及び、IgA2を発現する。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造、及び、三次元構成は公知であり、例えば、Abbas et al,Cellular and Molecular Immunology,4th ed.(W.B.Saunders Co.,2000)で概説されている。
本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインのことを指す。当該重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、それぞれ、「V」及び「V」と称し得る。これらのドメインは、一般的に、(同じクラスのその他の抗体と比較して)最も変化しやすい抗体の箇所であり、そして、抗原結合部位を含む。
用語「可変」とは、可変ドメインの特定のセグメントが、本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体の間で配列が大きく異なるという事実のことを指す。当該可変ドメインは、抗原結合を媒介し、そして、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、当該可変性は、当該可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。むしろ、それは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインの超可変領域(HVR)と呼ばれている3つのセグメントに集中している。可変ドメインにおいて高度に保存されている部分を、フレームワーク領域(FR)と称する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、3つのHVRで接続した、ベータシート立体配置を主体とする4つのFR領域を含み、それらは、当該ベータシート構造に接続するループ、及び、一部の事例では、当該ベータシート構造の一部を形成するループを形成する。それぞれの鎖でのHVRは、FR領域に非常に近接して一緒に保持され、他方の鎖に由来するHVRとともに、それらの抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991)を参照されたい)。当該定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得た抗体、例えば、本開示のモノクローナル抗MS4A4A抗体などの抗体のことを指し、すなわち、当該集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る自然発生の変異、及び/または、翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化など)を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、1つ以上の抗原部位に指向する。一般的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、当該抗原の単一の決定基に指向する。それらの特異性に加えて、当該モノクローナル抗体は、その他の免疫グロブリンによる汚染を受けていないハイブリドーマ培養で合成するという点で有利である。修飾語「モノクローナル」とは、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、あらゆる特定の方法で抗体を生産する必要があると解釈すべきではない。例えば、本開示にしたがって使用するモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、及び、ヒト免疫グロブリン遺伝子座、または、ヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部またはすべてを有する動物において、ヒトまたはヒト様抗体を生産する技術などの様々な技術によって生産し得る。
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」、または、「全抗体」とは、抗体フラグメントとは対照的に、その実質的にインタクトな形態にある本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体を指すために、互換的に使用している。具体的には、全抗体は、Fc領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。当該定常ドメインは、ネイティブ配列の定常ドメイン(例えば、ヒトネイティブ配列の定常ドメイン)、または、そのアミノ酸配列変異体とし得る。一部の事例では、当該インタクト抗体は、1つ以上のエフェクター機能を有し得る。
「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体が結合する抗原に対して結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子のことを指す。抗体フラグメントの例として、Fab、Fab’、F(ab’)、及びFvフラグメント;ダイアボディ;線状抗体(米国特許第5641870号、実施例2;Zapata et al,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)を参照されたい);一本鎖抗体分子、及び、抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体がある。
本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体をパパイン消化すると、「Fab」フラグメントと称する2つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映した名称を有する残留「Fc」フラグメントとを生成する。当該Fabフラグメントは、軽鎖全体に加えて、重鎖の可変領域ドメイン(V)と、1つの重鎖の第1の定常ドメイン(C1)とからなる。それぞれのFabフラグメントは、抗原結合に関しては一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシン処理すると、単一の大きなF(ab’)フラグメントが得られ、これは、異なる抗原結合活性を有するジスルフィド結合した2つのFabフラグメントに概ね対応しており、また、依然として抗原を架橋することができる。Fab’フラグメントは、C1ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域に由来する1つ以上のシステインを含んだ幾つかのさらなる残基を有する点で、Fabフラグメントと異なる。Fab’-SHとは、定常ドメインのシステイン残基(複数可)が遊離チオール基を持つFab’に関する本明細書での表記である。F(ab’)抗体フラグメントは、本来は、そのフラグメント間にヒンジシステインを有するFab’フラグメントのペアとして生産した。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
当該Fcフラグメントは、ジスルフィドとともに保持された両方の重鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域の配列によって決定され、この領域は、特定の細胞型で認められるFc受容体(FcR)でも認識される。
本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体の「機能性フラグメント」は、インタクト抗体の一部分を含み、一般的には、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域、または、FcR結合能力を保持する、または、改変したFcR結合能力を有する抗体のFc領域を含む。抗体フラグメントの例として、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び、抗体フラグメントから形成した多重特異性抗体がある。
用語「ダイアボディ」とは、可変ドメインの鎖内ではなく、鎖間のペアリングを達成し、それにより、二価フラグメント、すなわち、2つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られるように、VドメインとVドメインとの間に短いリンカー(約5~10個)の残基)を用いてsFvフラグメント(前出の段落を参照されたい)を構築して調製した小さな抗体フラグメントのことを指す。二重特異性ダイアボディは、2つの抗体のVドメイン及びVドメインが、異なるポリペプチド鎖に存在している、2つの「交差」sFvフラグメントのヘテロ二量体である。
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、本開示のキメラ抗MS4A4A抗体などの抗体(免疫グロブリン)であって、重鎖及び/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または、特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体での対応する配列と同一または相同であり、かつ、その(それらの)鎖(複数可)の残部が、別の種に由来する抗体、または、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体での対応する配列と同一または相同である抗体、ならびに、所望の生物活性を奏する限りは、それら抗体のフラグメントのことを指す。本明細書で対象とするキメラ抗体として、PRIMATIZED(登録商標)抗体があり、当該抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを目的の抗原で免疫処置して生産した抗体に由来する。本明細書で使用する、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用する。
本開示の抗MS4A4A抗体のヒト化など、非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基、及び、ヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、及び、一般的には、2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、それぞれのHVR(例えば、CDR)のすべて、または、実質的にすべてが、非ヒト抗体のHVRに対応しており、そして、それぞれのFRのすべて、または、実質的にすべてが、ヒト抗体のFRに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体とは、ヒト化を受けた抗体のことを指す。
「ヒト抗体」は、本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体であり、ヒトで生産した抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を持つ及び/または本明細書に開示したヒト抗体を作り出すためのいずれかの技術を使用して生産されている。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して生産することができる。ヒト抗体は、かかる抗体を抗原接種に応答して生産するように修飾しているが、例えば、免疫処置したゼノマウス、ならびに、ヒトB細胞ハイブリドーマを介して生成させて、その内因性遺伝子座を無効化したトランスジェニック動物に対して当該抗原を投与して、調製することができる。
本明細書で使用する用語「超可変領域」、「HVR」または「HV」とは、配列が超可変性であり、及び/または、構造的に定義したループを形成する、本開示の抗MS4A4A抗体の抗体可変ドメインの領域などの抗体可変ドメインの領域のことを指す。一般的に、抗体には、6つのHVRがあり;3つが、V(H1、H2、H3)にあり、そして、3つが、V(L1、L2、L3)にある。ネイティブ抗体では、H3及びL3が、6つのHVRのうちで最も多様性に富んでおり、そして、特に、H3が、抗体に対して優れた特異性を与える上で独特の役割を果たすものと考えられている。重鎖のみからなる天然ラクダ抗体は、軽鎖がなくとも機能的であり、かつ、安定している。
数多くのHVRの記載を、本明細書で使用しており、かつ、本明細書に含んでいる。一部の実施形態では、これらのHVRは、配列変動性に基づいたKabat相補性決定領域(CDR)とし得るものであり、そして、最も一般的に使用している(Kabat et al,上掲)。一部の実施形態では、それらのHVRは、Chothia CDRとし得る。Chothiaは、どちらかと言えば、構造的ループの位置を指す(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。一部の実施形態では、これらのHVRを、AbM HVRとし得る。これらのAbM HVRは、Kabat CDRと、Chothia構造的ループとの間の折衷案を示しており、そして、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアで使用されている。一部の実施形態では、これらのHVRを、「接触」HVRとし得る。当該「接触」HVRは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づくものである。これらのHVRのそれぞれの残基を、以下に示す。
Figure 2022542964000001
HVRは、次の「伸長HVR」を含み得る:VLでの24~36または24~34(L1)、46~56または50~56(L2)、及び、89~97または89~96(L3)、及び、VHでの26~35(H1)、50~65または49~65(好ましい実施形態)(H2)、及び、93~102、94~102または95~102(H3)。当該可変ドメイン残基を、これらの伸長HVR定義のそれぞれに対して、Kabat et al,上掲に従って付番する。
「フレームワーク」または「FR」残基は、本明細書で定義するHVR残基以外の可変ドメイン残基である。
本明細書で使用する「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワーク、または、ヒトコンセンサスフレームワークに由来するVまたはVフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク、または、ヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、当該フレームワークと同じアミノ酸配列を含み得る、または、既存のアミノ酸配列変化を含み得る。一部の実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、10個以下、9つ以下、8つ以下、7つ以下、6つ以下、5つ以下、4つ以下、3つ以下、または、2つ以下である。既存のアミノ酸変化がVHに存在する場合、好ましいアミノ酸変化は、位置71H、73H、及び、78Hのうちの3つ、2つ、または、1つのみに生じ;例えば、当該位置のアミノ酸残基は、71A、73T、及び/または、78Aとし得る。ある実施形態では、VLアクセプターヒトフレームワークは、配列において、Vヒト免役グロブリンフレームワーク配列、または、ヒトコンセンサスフレームワーク配列と同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免役グロブリンのVまたはVフレームワーク配列の選択において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免役グロブリンのVまたはVフレームワーク配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)などのサブグループである。例として、Vに関するものとして、サブグループは、Kabat et al,上掲などのサブグループカッパI、カッパII、カッパIII、または、カッパIVとし得る。さらに、Vに関するものとして、サブグループは、Kabat et al,上掲などのサブグループI、サブグループII、または、サブグループIIIとし得る。
例えば、本開示の抗MS4A4A抗体のアミノ酸修飾など、指定した位置での「アミノ酸修飾」とは、指定した残基の置換もしくは欠失、または、少なくとも1つのアミノ酸残基を、指定した残基に隣接するように挿入することを指す。指定した残基に「隣接する」とは、そこから1個~2個の残基までに挿入することを意味する。当該挿入は、指定した残基のN末端側またはC末端側で行い得る。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
例えば、本開示の親和性成熟抗MS4A4A抗体などの「親和性成熟した」抗体とは、当該抗体の1つ以上のHVRが、1つ以上の改変を有し、その結果、抗原に対する抗体の親和性が、当該改変(複数可)を有しない親抗体と比較して改善した抗体である。ある実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対して、ナノモル、または、ひいてはピコモルの親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当該技術分野で公知の手法で生産する。例えば、Marks et al,Bio/Technology 10:779~783(1992)は、V-及びV-ドメインのシャッフリングを用いた親和性成熟について記載している。HVR、及び/または、フレームワーク残基のランダム変異導入については、例えば、Barbas et al.Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809~3813(1994);Schier et al.Gene 169:147~155(1995);Yelton et al.J.Immunol.155:1994~2004(1995);Jackson et al,J.Immunol.154(7):3310~9(1995);及び、Hawkins et al,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)に記載されている。
「Fv」は、完全な抗原認識部位、及び、抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、1つの重鎖可変領域ドメインと、1つの軽鎖可変領域ドメインが、非共有結合で緊密に結合した二量体からなる。これらの2つのドメインの折り畳みが、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供して、この抗体に抗原結合特異性を与える、6つの超可変ループ(H及びL鎖からそれぞれ3つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン(または、抗原に特異的なHVRを3つしか含まない半分のFv)であっても、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力を有する。
「sFv」または「scFv」とも略称される「一本鎖Fv」は、単一のポリペプチド鎖の状態で接続したV及びV抗体ドメインを含む、抗体フラグメントである。好ましくは、当該sFvポリペプチドは、VとVドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーは、sFvが抗原結合のための所望の構造を形成する、ことを可能にする。
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のFc領域(ネイティブ配列Fc領域、または、アミノ酸配列バリアントFc領域)が関与する生物活性のことを指しており、また、抗体のアイソタイプに応じて異なる。
本明細書で使用する用語「Fc領域」とは、ネイティブ配列Fc領域、及び、バリアントFc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用する。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は様々であるが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、アミノ酸残基の位置Cys226、または、Pro230から、そのカルボキシル末端にまで及ぶものと定義される。当該Fc領域のC末端リジン(EU付番システムでの残基447)は、例えば、抗体の生産もしくは精製の間に、または、抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することで除去し得る。したがって、インタクト抗体の組成は、すべてのK447残基を除去した抗体集団、K447残基を除去していない抗体集団、及び、K447残基を持つ抗体と持たない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。本開示の抗体における使用に好適なネイティブ配列Fc領域として、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、及び、IgG4がある。
「ネイティブ配列Fc領域」は、自然界で認められるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブ配列のヒトFc領域として、ネイティブ配列のヒトIgG1 Fc領域(非A、及び、Aアロタイプ)、ネイティブ配列ヒトIgG2 Fc領域、ネイティブ配列ヒトIgG3 Fc領域、及び、ネイティブ配列ヒトIgG4 Fc領域、ならびに、それらの天然バリアントがある。
「バリアントFc領域」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾、好ましくは、1つ以上のアミノ酸置換(複数可)によって、ネイティブ配列Fc領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、当該バリアントFc領域は、ネイティブ配列Fc領域、または、親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を有しており、例えば、ネイティブ配列Fc領域、または、親ポリペプチドのFc領域に、約1~約10個のアミノ酸置換、好ましくは、約1~約5個のアミノ酸置換を有する。本明細書でのバリアントFc領域は、好ましくは、ネイティブ配列Fc領域、及び/または、親ポリペプチドのFc領域に対して、少なくとも約80%の相同性、及び、最も好ましくは、それらに対して少なくとも約90%の相同性、より好ましくは、それらに対して少なくとも約95%の相同性を有する。
「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことを表す。好ましいFcRは、ネイティブ配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRは、IgG抗体(ガンマ受容体)と結合する抗体であり、そして、FcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIのサブクラスの受容体があり、これらの受容体の対立遺伝子バリアント、及び、選択的スプライシング形態を含み、FcγRII受容体として、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なるFcγRIIA(「活性化受容体」)と、FcγRIIB(「阻害性受容体」)とを含む。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(「ITAM」)を含む。阻害性受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ(「ITIM」)を含む。その他のFcRは、今後同定されるものを含めて、本明細書での用語「FcR」に含まれる。また、FcRは、抗体の血清での半減期を長くすることができる。
ペプチド、ポリペプチド、または、抗体配列に関して本明細書で使用する、「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」及び「相同性」は、配列を整列させ、必要に応じて、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮しない、指定のペプチド、または、ポリペプチド配列でのアミノ酸残基と同一である候補配列でのアミノ酸残基のパーセンテージのことを指す。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術範囲に属する様々な方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、または、MEGALIGN(商標)(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要とされる当該技術分野において公知のあらゆるアルゴリズムなど、アラインメントを評価するための適切なパラメーターを決定することができる。
同じエピトープに関して競合する抗体(例えば、中和抗体)の文脈で使用する用語「競合する」とは、試験する抗体が、共通の抗原(例えば、MS4A4A、または、そのフラグメント)に対するリファレンス分子(例えば、リガンド、または、リファレンス抗体)の特異的結合を予防または阻害(例えば、抑制)するアッセイによって決定する抗体間の競合のことを意味する。無数のタイプの競合結合アッセイを使用して、抗体が、別の抗体と競合するか否かを判断することができ、例えば;固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相直接または間接酵素イムノアッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(例えば、Stahli et al,1983,Methods in Enzymology 9:242-253を参照されたい);固相直接ビオチン-アビジンEIA(例えば、Kirkland et al,1986,J.Immunol.137:3614-3619)固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(例えば、Harlow and Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Pressを参照されたい);1-125ラベルを使用した固相直接ラベルRIA(例えば、Morel et al,1988,Molec.Immunol.25:7-15);固相直接ビオチン-アビジンEIA(例えば、Cheung,et al,1990,Virology 176:546-552を参照されたい);及び、直接標識RIA(Moldenhauer et al,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)がある。一般的には、そのようなアッセイは、非標識試験抗体、及び、標識リファレンス抗体のいずれかを担持する固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用を含む。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定して測定する。通常、当該試験抗体は、過剰に存在する。競合アッセイ(競合抗体)で同定した抗体として、リファレンス抗体と同じエピトープに対して結合する抗体と、立体障害を招くリファレンス抗体が結合するエピトープに対して十分近位の隣接エピトープに対して結合する抗体がある。競合結合を決定するための方法に関するさらなる詳細を、本明細書の実施例において説明する。通常、競合する抗体が過剰に存在すると、共通抗原に対するリファレンス抗体の特異的結合は、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97.5%、及び/または、ほぼ100%を阻害(例えば、抑制)する。
本明細書で使用するMS4A4Aポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の「相互作用」として、タンパク質間相互作用、物理的相互作用、化学的相互作用、結合、共有結合、及び、イオン結合があるが、これらに限定されない。本明細書において、抗体が、2つのポリペプチドの間の相互作用を、攪乱、抑制、または、完全に解消する場合、当該抗体は、2つのポリペプチドの間の「相互作用を阻害する」。その抗体が、2つのポリペプチドのうちの一方に結合する場合、本開示の抗体は、2つのポリペプチドの間の「相互作用を阻害する」。一部の実施形態では、当該相互作用は、少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97.5%、及び/または、ほぼ100%のいずれかで阻害することができる。
用語「エピトープ」として、抗体が結合することができる、あらゆる決定基がある。エピトープは、その抗原を標的とする抗体が結合する抗原の領域であり、また、抗原がポリペプチドである場合、当該抗体と直接に接触する特定のアミノ酸を含む。大抵の場合、エピトープは、ポリペプチドに存在するが、一部の事例では、核酸などのその他の種類の分子に存在することができる。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基などの分子に属する化学的に活性な表面を含み、そして、特定の三次元構造特性、及び/または、特定の電荷特性を有することができる。一般的に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、ポリペプチド、及び/または、高分子の複雑な混合物での標的抗原に関するエピトープを優先的に認識する。
「アゴニスト」抗体、または、「活性化」抗体は、抗体が抗原と結合した後に、当該抗原の1つ以上の活性または機能を誘導する(例えば、強める)抗体である。
「アンタゴニスト」抗体、または、「ブロッキング」抗体、または、「阻害」抗体とは、当該抗体が、抗原と結合した後に、1つ以上のリガンドに対する抗原結合を抑制し、阻害し、及び/または、解消する(例えば、弱める)抗体、及び/または、当該抗体が抗原と結合した後に、当該抗原の1つ以上の活性または機能を抑制し、阻害し、及び/または、解消する(例えば、弱める)抗体である。一部の実施形態では、アンタゴニスト抗体、または、ブロッキング抗体、または、阻害抗体は、1つ以上のリガンドへの抗原結合、及び/または、当該抗原の1つ以上の活性または機能を、実質的または完全に阻害する。
本開示の単離した抗MS4A4A抗体などの「単離した」抗体は、その生産環境の成分から(例えば、自然に、または、組換えて)同定、分離、及び/または、回収したものである。好ましくは、当該単離した抗体は、その生産環境に由来するその他のすべての汚染成分とは関連がない。組換えトランスフェクト細胞から得られるものなど、その生産環境に由来する汚染成分は、一般的には、抗体の研究、診断、または、治療への使用を妨げる物質であり、そして、酵素、ホルモン、及び、その他のタンパク質性、または、非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体を:(1)例えば、ローリー法で決定した抗体の95重量%を超えるまで、そして、一部の実施形態では、99重量%を超えるまで;(2)スピニングカップシーケンサーを使用して、N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または、(3)クマシーブルー、または、好ましくは、銀染色を使用する非還元または還元条件下でのSDS-PAGEで均一になるまで精製する。単離した抗体は、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換えT細胞内の元の位置に抗体を含む。しかしながら、通常、単離したポリペプチドまたは抗体は、少なくとも1つの精製工程で調製する。
本開示の抗MS4A4A抗体などの抗体をコードする「単離した」核酸分子とは、それが生産された環境において通常会合している少なくとも1つの汚染核酸分子から同定及び分離した核酸分子である。好ましくは、当該単離した核酸は、その生産環境に関連するすべての構成成分とは会合しない。本明細書のポリペプチド、及び、抗体をコードする単離した核酸分子は、自然界で認められる形態または状況とは異なる形態で存在する。したがって、単離した核酸分子は、細胞内に自然に存在する本明細書のポリペプチド、及び、抗体をコードする核酸とは区別される。
本明細書で使用する用語「ベクター」とは、それに結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子のことを指す。「プラスミド」は、ベクターの一種であり、さらなるDNAセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖DNAのことを指す。ファージベクターは、別の種類のベクターである。別の種類のベクターとして、ウイルスベクターがあり、さらなるDNAセグメントを、ウイルスゲノムに対してライゲーションすることができる。特定のベクター(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、及び、エピソーム哺乳動物ベクター)は、導入した宿主細胞で自己複製が可能である。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞に導入すると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結した遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では、「組換え発現ベクター」、または、簡略して「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えDNA技法で利用する発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが、ベクターのうちで最も一般的に使用される形態であるため、互換的に使用し得る。
本明細書で互換的に使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体のことを指すものであり、そして、DNA及びRNAを含む。当該ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、及び/または、それらの類似体、または、DNAもしくはRNAポリメラーゼにより、または、合成反応により重合体に組み込まれ得るあらゆる基質とすることができる。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクター(複数可)のレシピエントになることができる、または、レシピエントになっている個々の細胞、または、細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そして、その子孫は、自然発生的、偶発的、または、意図的な変異により、起源の親細胞と必ずしも完全に(形態学的に、または、ゲノムDNA相補鎖において)同一でなくともよい。宿主細胞は、本開示のポリヌクレオチド(複数可)をインビボでトランスフェクションした細胞を含む。
本明細書で使用する用語「膜TREM2」、「原形質膜TREM2」、及び「細胞表面TREM2」は、互換可能に使用する。
本明細書で使用する「担体」は、使用する用量、及び、濃度で、そこに曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒であり、医薬として許容可能な担体、賦形剤、または、安定剤を含む。
本細書で使用する用語「予防する」とは、個体における特定の疾患、障害、または、病態の発生または再発に関して予防を提供することを含む。個体は、特定の疾患、障害、または、病態にかかりやすく、影響を受けやすく、または、そのような疾患、障害、または、病態を発症するリスクがあるが、未だに、当該疾患、障害、または、病態であると診断されていない。
本明細書で使用する、特定の疾患、障害、または、病態を発症する「リスクのある」個体は、検出可能な疾患または疾患の症状を有し得る、または、有し得ず、そして、本明細書に記載した治療法を行う前に、検出可能な疾患または疾患の症状を示し得る、または、示し得ない。「リスクがある」とは、個体が、特定の疾患、障害、または、病態の発症と相関する測定可能なパラメーターである当該技術分野で公知の1つ以上のリスク因子を有することを示す。これらのリスク因子の1つ以上を有する個体は、これらのリスク因子の1つ以上を持たない個体よりも、特定の疾患、障害、または、病態を発症する可能性が高くなる。
本明細書で使用する用語「治療」とは、臨床病理の経過期間で治療を受けている個体の自然な経過を変えるようにデザインした臨床介入のことを指す。治療の望ましい効果として、進行速度の低下、病的状態の改善または緩和、及び、特定の疾患、障害、または、病態の寛解または予後の改善がある。例えば、特定の疾患、障害、または、病態に関連する1つ以上の症状が緩和または解消した場合、個体の「治療」は成功している。
「有効量」とは、所望の治療的または予防的結果を達成するために必要な投薬量及び期間での少なくとも有効な量のことを指す。有効量は、1回以上の投与で提供することができる。本明細書に記載の有効量は、個体の病状、年齢、性別、及び、体重、ならびに、個体において所望の応答を誘発する治療の能力などの要因によって変化し得る。有効量は、治療でのあらゆる毒性または有害な効果よりも、治療的に有益な効果が勝る量でもある。予防的使用の場合、有益または望ましい結果として、疾患の生化学的、組織学的、及び/または、行動的症状、その合併症、及び、疾患の進行過程での中間的病理学的表現型など、疾患のリスクの排除または軽減、重症度の軽減、または、発症の遅延などの結果がある。治療的使用の場合、有益または望ましい結果として、疾患が関与する1つ以上の症状の抑制、疾患を煩った方々の生活の質の向上、疾患の治療に必要なその他の薬物の投与量の抑制、標的化などを介した別の薬物の効果の改善、疾患の進行の遅延、及び/または、生存期間の延長などがある。薬物、化合物、または、医薬組成物の有効量は、直接的または間接的のいずれかで予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床の関連での理解では、薬物、化合物、または、医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または、医薬組成物と組み合わせて達成し得る、または、達成し得ない。したがって、「有効量」は、1つ以上の治療薬を投与する状況で考慮し得るものであり、そして、単一の薬剤が、1つ以上のその他の薬剤と組み合わせて、所望の結果を達成し得る、または、達成するのであれば、有効量で与えられると考え得る。
治療、予防、または、リスクの軽減を目的とする「個体」とは、ヒト、飼育動物、及び、家畜、ならびに、動物園展示用動物、競技用または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含む、哺乳動物に分類されるあらゆる動物のことを指す。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
本明細書で使用する、別の化合物または組成物との「併用」投与とは、同時投与、及び/または、異なる時点での投与を含む。また、併用投与は、合剤としての投与、または、別個の組成物としての投与を含み、異なる投与頻度または間隔で、かつ、同じ投与経路、または、異なる投与経路を使用することを含む。一部の実施形態では、併用投与は、同じ治療レジメンの一部としての投与である。
本明細書で使用する用語「約」とは、それぞれの数値の通常の誤差範囲のことを指しており、当該技術分野の当業者は容易に理解する。本明細書において「約」を付した値またはパラメーターへの言及は、その数値、または、パラメーターそれ自体を対象にした実施形態を含む(及び、説明する)。
本明細書、及び、添付した特許請求の範囲で使用する単数形「a」、「an」、及び、「the」は、特に断りのない限り、複数形を含む。例えば、「抗体」への言及は、1つの抗体から、モル量の数多くの抗体までを指しており、そして、当業者に公知のそれらの等価物なども含む。
本明細書で説明する本開示の態様及び実施形態は、態様、及び、実施形態を「含む(comprising)」、「からなる(consisting)」、及び、「から本質的になる(consisting essentially of)」を含む、ことを理解されたい。
II.抗MS4A4A抗体
本明細書では、抗MS4A4A抗体を提供する。本明細書で提供する抗体は、例えば、MS4A4A関連障害の診断または治療に有用である。
ある態様では、本開示は、本開示のMS4A4Aタンパク質のエピトープに結合する単離した(例えば、モノクローナル)抗体を提供する。本開示のMS4A4Aタンパク質として、哺乳動物MS4A4Aタンパク質、ヒトMS4A4Aタンパク質、マウスMS4A4Aタンパク質、及び、カニクイザルMS4A4Aタンパク質があるが、これらに限定されない。本開示のMS4A4Aタンパク質は、天然に存在するMS4A4Aのバリアントを含む。
ヒトMS4A4Aは、膜糖タンパク質をコードする239アミノ酸のタンパク質である。ヒトMS4A4Aのアミノ酸配列を、配列番号1に示す:
MHQTYSRHCRPEESTFSAAMTTMQGMEQAMPGAGPGVPQLGNMAVIHSHLWKGLQEKFLKGEPKVLGVVQILTALMSLSMGITMMCMASNTYGSNPISVYIGYTIWGSVMFIISGSLSIAAGIRTTKGLVRGSLGMNITSSVLAASGILINTFSLAFYSFHHPYCNYYGNSNNCHGTMSILMGLDGMVLLLSVLEFCIAVSLSAFGCKVLCCTPGGVVLILPSHSHMAETASPTPLNEV
加えて、マウスMS4A4Aのアミノ酸配列を、配列番号2に示す:
MLVIQGTEQSALEAGYGAQQNGQPLYVNSHSWKRMTEKFLKGEPKILGIVQIVIAIMNLSIGIMMIIATVSTGEIPPSSVYIGYPIWGSLMFIISGSFSIVAGRRTTKGLVRSSLGLNITSSVFAFSGIVISSLSPGIYSFHVYYCTYRGSSEGCHMTLSILMGLDIVVVVLSVLEFCIGVSLSAFGCRVMCCNPGGVMIIMPSNPTKAETANPVTLQSGLMPPEHQERNVPENMH
加えて、カニクイザル(cyno)MS4A4Aのアミノ酸配列を、配列番号3に示す:
HQTYRRHCRPEESTFSAAMTTMQGMEQATPGAGPGVPQLGNMAVVHSHLWKGLQEKFLKGEPKVLGVVQILIALMSLSMGITMMCVAFSAYGHYPISVYIGYTIWGSVMFIISGSLSIAAGIRTTKGLVRGSLGMNITSSVLAVSAILINTISLTIYSFYHRYCNYYGNPNNCHGTVSILMGMDGMVLLLSVLEFCIAVSLSAFGCKAICCTPGGVVLIIPSNSHMAEAAPLTPLNEV
一部の実施形態では、MS4A4Aを、細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、骨髄細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、脳細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、成熟星状細胞など、これに限定されない星状細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、乏突起膠細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、ミクログリア細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、及び、T細胞などであるが、これらに限定されない免疫細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、嗅覚細胞で発現する。一部の実施形態では、MS4A4Aを、細胞表面で発現する。
本開示のMS4A4Aタンパク質は、細胞質ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基1~64;配列番号1を参照されたい);膜貫通ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基65~85);ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基86~98に対応する細胞外ドメイン(細胞外ドメイン1;ECL1);膜貫通ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基99~119);細胞質ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基120~137);膜貫通ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基138~158);アミノ酸残基159~179に対応する細胞外ドメイン(細胞外ドメイン2;ECL2);膜貫通ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基180~200);及び、細胞質ドメイン(ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基201~239)などの幾つかのドメインがあるが、これらに限定されない。加えて、本開示のMS4A4Aタンパク質は、脳、ニューロン、グリア細胞、内皮細胞、血管周囲細胞、周皮細胞などであるが、これらに限定されない、数多くの組織、及び、細胞で発現する。
マクロファージ及びミクログリア細胞機能でのMS4A4A
ミクログリアなどの中枢神経系(CNS)のマクロファージ及び骨髄細胞は、本質的に多様な表現型及び機能を有する。マクロファージは、インビトロで、食細胞性、及び、潜在的炎症性、表現型、及び、活性が異なる、M1マクロファージ及びM2マクロファージに分けることができる。例えば、末梢器官では、M1表現型を有するマクロファージは、炎症誘発性及び抗菌性の表現型及び機能を有するものと考えられており、一方で、M2表現型を有するマクロファージは、抗炎症性表現型及び機能を有しており、さらに恒常的な状態にあると考えられている。
健康で恒常性状態に関連するミクログリアは、M1マーカー(例えば、CD16、MHCクラスII、CD86)の発現と比較して、それらの細胞表面で、より多くのM2マーカー(例えば、CD200R、CD163、及び、CD115など)を発現する(Ginhoux and Prinz,2015,Cold Spring Harb Perspect Biol,7:a020537)。しかしながら、アルツハイマー病のマウスモデルと、ヒトアルツハイマー病との両方の疾患関連ミクログリア(DAM)は、炎症性または活性化状態にある。炎症性または活性化状態の疾患関連ミクログリアは、アルツハイマー病、及び、その他の神経変性疾患に関連する病理の抑制に積極的な役割を果たしており、有益であると考えられている。
MS4A4Aの発現は、インビトロで、M2マクロファージにおいて高まっており、また、MS4A4Aは、M2マクロファージの新規の細胞表面マーカーであることが示唆されている。加えて、MS4A4Aは、肥満細胞でのcKitの細胞表面輸送を調節することも示されており、肥満細胞の脱顆粒と生存調節におけるMS4A4Aの役割を示唆している(Cruse et al,2015,Molecular Biol Cell,26:1711-1727)。まとめると、これらの報告での知見は、MS4A4Aを標的にすると、M1及びM2マクロファージ表現型に関連する様々なマクロファージ細胞表面受容体の再利用、発現、及び/または、分解に影響を与え、それが故に、機能と活動に影響を与える可能性があることを示唆している。
本開示の抗MS4A4A抗体は、M2マクロファージ細胞表面マーカーの発現に影響を与える。特に、本開示の抗MS4A4A抗体は、マクロファージにおけるCD200R、Dectin-1、及び、CD163の細胞表面発現を抑制しており、このことは、抗MS4A4A抗体が、M2マクロファージ細胞表面受容体の発現を抑制することで、マクロファージの分極、機能、及び/または、活性を調節することを示唆している。本開示の抗MS4A4A抗体は、M2マクロファージ細胞表面受容体を抑制しており、このことは、本開示の抗MS4A4A抗体が、ミクログリア細胞の生理学的状態を、例えば、炎症性または活性化状態が高まった、より保護的な表現型へと(例えば、M1表現型が多くなるように)改変する上で有効であることを示唆している。したがって、本開示の抗MS4A4A抗体は、一部では、マクロファージ及びミクログリアの表現型を、炎症誘発性及び活性化状態に改変することで、アルツハイマー病、及び、その他の神経変性障害の治療において有用になる。
本開示の抗MS4A4A抗体は、ミクログリアの活性化状態に影響を与える。本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで、ミクログリア活性化(例えば、C型レクチンドメインファミリー7メンバーA(CLEC7A))、ミクログリア遊走(例えば、イノシトール1,4,5-三リン酸受容体2(ITPR2))、及びミクログリア増殖(例えば、抗原KI-67(MKI67))に関連するタンパク質のmRNAレベルを引き上げた。加えて、本開示の抗MS4A4A抗体は、ミクログリア活性化マーカーIL1RN、SPP1、及びPLCG2のmRNAレベルを高めた。また、本開示の抗MS4A4A抗体は、恒常性ミクログリアマーカーであるプリン作動性受容体P2RY12及びCX3Cケモカイン受容体1(CX3CR1)のmRNAレベルを低下させた。したがって、本開示の抗MS4A4A抗体は、ミクログリアの活性化、遊走、及び増殖に関連するタンパク質の様々なmRNAレベルを引き上げること;及び、ミクログリアの恒常性に関連するタンパク質の様々なmRNAレベルを下げることにより証明されているように、インビボで、ミクログリアを活性化する上で有効である。
MS4A4A及びTREM2の発現
神経変性疾患は、一部では、中枢神経系(CNS)の欠陥免疫機能によって特徴決定される。例えば、CNS骨髄細胞の一部の生存能力と機能の低下は、ミクログリアに限ったものではなく、アルツハイマー病などの神経変性疾患に対する感受性に寄与するものと考えられている。骨髄細胞の生存能力、及び/または、機能を高める薬理学的介入は、そのような神経変性疾患、及び、障害の発症、重症度、または、進行を改善するための効果的な治療を提供する。
骨髄細胞2(TREM2)で発現するトリガー受容体は、マクロファージ、樹状細胞、単球、皮膚のランゲルハンス細胞、クッパー細胞、破骨細胞、ミクログリアなどの骨髄細胞で主に発現する免疫グロブリン様受容体である。TREM2は、実験的自己免疫性脳脊髄炎、及び、アルツハイマー病の間に、CNSのミクログリア及び浸潤性マクロファージで高度に発現する(Piccio et al,2007,Eur J Immunol,37:1290-1301;Wang,2015,Cell,160:1061-1071)。当該TREM2経路は、CNS骨髄細胞の生存能力と機能の重要な調節因子と考えられている。
ヒトの遺伝学研究のデータは、MS4A4AとTREM2との間に強い遺伝的関連があり、かつ、アルツハイマー病に罹患しやすいことを示唆している(Piccio et al,2016,Acta Neuropathol,131:925-9330)。特に、アルツハイマー病の予防のためのMS4A4A対立遺伝子は、患者の脳脊髄液でのsTREM2レベルの増大に関連している。
本発明の抗MS4A4A抗体は、マクロファージにおける細胞ATPレベルを引き上げており、このことは、抗MA4A4A抗体が、細胞(例えば、マクロファージ、骨髄細胞、ミクログリア)の生存能力及び機能の増大、維持、または増強に有効であることを示している。加えて、本発明の抗MS4A4A抗体は、市販の抗MS4A4A抗体5C12が、培養したヒトマクロファージの上清でのsTREM2レベルを抑制したことを報告した従前の報告とは対照的に、マクロファージでのsTREM2、及び、mTREM2レベルを引き上げた(Deming et al,2018,bioRxiv,doi:dxdoiorg/10.1101/352179)。アルツハイマー病に関するMS4A4A保護対立遺伝子は、sTREM2レベルの増大と関連しているので、本明細書で提供した結果は、本発明の抗MS4A4A抗体が、sTREM2、及び、mTREM2レベルの増大を受けて、アルツハイマー病などの神経変性疾患、及び、障害での保護的表現型を、模倣または複製することを示すものである。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)におけるTREM2の細胞表面発現を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%。少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも250%増やす。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)における可溶性TREM2レベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%。少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも100%引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)でのmTREMタンパク質のレベルを引き上げ、EC50は約0.028μg/mlから約0.039μg/mlとなる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)でのsTREMタンパク質のレベルを引き上げ、EC50は約0.025μg/mlから約0.069μg/mlとなる。なおもその他の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)でのATPレベルを引き上げ、EC50は約0.010μg/mlから約0.021μg/mlとなる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)でのATPレベルを、抗MS4A4A抗体の非存在下でそれら細胞でのATPのレベルの約1.2倍、約1.4倍、または約1.7倍引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで(例えば、非ヒト霊長類、またはヒトにおいて)、可溶性TREM2レベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清におけるベースライン可溶性TREM2レベルよりも、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、または少なくとも150%引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清におけるベースライン可溶性TREM2レベルよりも、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、約50%引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清における可溶性TREM2レベルと比較して、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、少なくとも1.1倍、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、または少なくとも2倍引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清における可溶性TREM2レベルと比較して、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、約1.5倍引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清における可溶性TREM2レベルと比較して、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、少なくとも7日間、少なくとも8日間、少なくとも9日間、少なくとも10日間、少なくとも11日間、少なくとも12日間、少なくとも13日間、少なくとも14日間、少なくとも15日間、少なくとも16日間、少なくとも17日間、少なくとも18日間、少なくとも19日間、または少なくとも20日間引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清における可溶性TREM2レベルと比較して、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、少なくとも20日間引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清における可溶性TREM2レベルと比較して、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも144時間、少なくとも168時間、少なくとも192時間、少なくとも216時間、少なくとも240時間、少なくとも264時間、少なくとも288時間、少なくとも312時間、少なくとも336時間、少なくとも360時間、少なくとも384時間、少なくとも408時間、432時間、少なくとも456時間、または少なくとも480時間引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでの血清における可溶性TREM2レベルと比較して、インビボで血清での可溶性TREM2レベルを、少なくとも480時間引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおけるベースライン可溶性TREM2レベルから、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも225%、少なくとも250%、少なくとも275%、少なくとも300%、少なくとも325%、少なくとも350%、少なくとも375%、または少なくとも400%引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおけるベースライン可溶性TREM2レベルから、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、約300%引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおける可溶性TREM2レベルと比較して、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、少なくとも1.4倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.8倍、少なくとも2.0倍、少なくとも2.2倍、少なくとも2.4倍、少なくとも2.6倍、少なくとも2.8倍、少なくとも3.0倍、少なくとも3.2倍、少なくとも3.4倍、少なくとも3.6倍、少なくとも3.8倍、または少なくとも4.0倍増やす。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおける可溶性TREM2レベルと比較して、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、約2倍から約4倍増やす。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおける可溶性TREM2レベルと比較して、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、または少なくとも4日間引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおける可溶性TREM2レベルと比較して、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、少なくとも4日間引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおける可溶性TREM2レベルと比較して、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、または少なくとも96時間は引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、本開示の抗MS4A4A抗体を投与する前のインビボでのCSFにおける可溶性TREM2レベルと比較して、インビボでCSFでの可溶性TREM2レベルを、少なくとも96時間は引き上げる。
本明細書で提供する証拠は、本開示の抗MS4A4A抗体が、TREM2に影響を与えることを実証しているが、その他の経路を介して作用する抗体は除外しない。
アンタゴニスト抗体
一部の実施形態では、MS4A4Aタンパク質に結合する抗体として、MS4A4Aとそのリガンド(複数可)との間の相互作用を妨げる、あるいは、リガンドの存在下で、MS4A4Aのシグナルを細胞質へ伝達することを妨げることで、MS4A4Aに結合して、1つ以上のMS4A4A活性を阻害するアンタゴニスト抗体があり得る。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト抗体は、本開示のアゴニスト抗体のエピトープ特異性を有し得るが、Fcg受容体に結合することができず、したがって、例えば、MS4A4A受容体のクラスターを形成することができないFcドメインを有する。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、アンタゴニスト抗体である。一部の実施形態では、当該アンタゴニスト抗体は、1つ以上のMS4A4A活性を阻害する。一部の実施形態では、当該アンタゴニスト抗体は、1つ以上のMS4A4A依存性遺伝子の活性を抑制する。一部の実施形態では、当該アンタゴニスト抗体は、MS4A4Aと、1つ以上のMS4A4Aリガンドとの間の相互作用を阻害する。一部の実施形態では、当該アンタゴニスト抗体は、MS4A4Aシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、当該アンタゴニスト抗体は、MS4A4Aと、1つ以上のMS4A4Aリガンドとの間の相互作用を阻害し、そして、MS4A4Aシグナル伝達を阻害する。
一部の実施形態では、MS4A4Aタンパク質のレベルのダウンレギュレーションまたはMS4A4A活性の抑制は、細胞内のMS4A4Aタンパク質のレベルをダウンレギュレーションするまたは抑制する抗MS4A4A抗体で達成する。一部の実施形態では、MS4A4Aタンパク質のレベルのダウンレギュレーションまたはMS4A4A活性の抑制は、当業者に公知で、かつ利用可能な方法を使用して、例えば、アンチセンス方法論、遺伝子治療などを使用して、MS4A4A核酸発現またはレベルをダウンレギュレーションして達成する。したがって、一部の実施形態では、MS4A4Aタンパク質のレベルまたは活性の抑制は、本開示の抗MS4A4A抗体を使用して、またはMS4A4A核酸(例えば、mRNA)の発現またはレベルを下げることで達成する。
一部の実施形態では、アゴニスト抗体機能のために、抗体架橋が必要である。抗体架橋は、インビトロでの二次抗体への結合を介して、または、インビボでのFc受容体への結合を介して作り出すことができる。例えば、アンタゴニスト抗体は、インビトロでのビオチン/ストレプトアビジン架橋、または、二次抗体結合を介して、アゴニスト抗体へと変換することができる(例えば、Gravestein et al,1996、J.Exp.Med.184:675-685;Gravestein et al,1994、International Immunol,7:551-557を参照されたい)。アゴニスト抗体は、受容体リガンドの生物学的活性を模倣する、または、受容体凝集を増強することで、それらの活性を発揮し、それにより、受容体シグナル伝達を活性化し得る。一部の実施形態では、抗体架橋を存在させないことが、アンタゴニスト活性のために必要となる。アンタゴニスト抗体は、受容体-リガンド相互作用をブロックすることで、それらの活性を発揮し得る。
ゲルゾリン、オステオポンチン、及びアルツハイマー病保護対立遺伝子の表現型模写
MS4A遺伝子クラスターには3つのSNPがあり、それらは、遅発性アルツハイマー病のリスク増大に関連している。これらには、MS4A4Aのrs4938933、MS4A4Eのrs670139、そして、MS4A6Aのrs610932がある(Hollingworth et al, 2011,Nat Genetics,43:429-435;Naj et al,2011,Nature Genetics,43:436-441;Antunez et al,2011,Genome Medicine,3,article 33)。加えて、MS4A4A遺伝子座SNP(rs2304933、及びrs2304935)は、MS4A4Aのレベルの増加、及び遅発性アルツハイマー病(LOAD)を含むアルツハイマー病のリスクの増加と関連している(Allen et al,2012,Neurology,79:221-228)。
MS4A遺伝子クラスターに関連するアルツハイマー病に関連する遺伝的変異(SNP)が特定されている。それらのバリアント対立遺伝子の1つが、rs1582763であり、これは、CSF sTREM2レベルの増大、アルツハイマー病のリスクの低下、そして、発症年齢の遅延に関連しているので、保護対立遺伝子とみなされている(Deming et al,2018,bioRxiv,doi:dx doi org/10.1101/352179)。このrs1582763保護対立遺伝子は、血中でのMS4A4A mRNAレベルの低下に関連している。さらに、これらの知見は、rs1582763対立遺伝子が、MS4A4Aレベルを低下させ、アルツハイマー病のリスクまたは重症度を抑制することで、保護的な役割を果たすことを示唆している。この保護rs1582763は、オステオポンチンの発現レベルの増大、及びゲルゾリンのレベルの増大にも関連している。本発明の抗MS4A4A抗体は、少なくともMS4A4A発現の抑制、オステオポンチン発現の増大、ゲルゾリン発現の増大、及び/またはsTREMレベルの増大に関して、保護対立遺伝子でのこれらの態様を表現型模写する上で有効である。本開示の一部の態様では、抗MS4A4A抗体を提供し、当該抗体は、アルツハイマー病のリスクの低下、及び/またはアルツハイマー病の発症年齢の遅延に関連するMS4Aの1つ以上の対立遺伝子を表現型模写する。
本開示の抗MS4A4A抗体は、ヒト末梢血単核細胞由来マクロファージにおいて、オステオポンチン(SPP1)のmRNAレベルを高め、また、ゲルゾリン(GSN)のmRNAレベルを高めた。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、オステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、ゲルゾリンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)におけるオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも250%引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)におけるゲルゾリンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも250%引き上げる。
本開示の抗MS4A4A抗体は、非ヒト霊長類においてオステオポンチン(SSP1)レベルを高めた。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで(例えば、非ヒト霊長類またはヒトにおいて)、オステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、血清及び/またはCSFにおけるオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、血清及び/またはCSFでのオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも250%引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、脳内のオステオポンチンのタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、前頭葉及び/または海馬におけるオステオポンチンのタンパク質のレベルを引き上げる。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、オステオポンチン及びゲルゾリンの発現の増加に関して、保護rs1582763対立遺伝子を表現型模写する。その他の態様では、本開示の抗MS4A4A抗体は、オステオポンチン、ゲルゾリン、及び/またはsTREM2の発現を高める上で有効であり、保護rs1582763対立遺伝子と同様に、アルツハイマー病のリスク及び/または重症度の抑制において生物学的に活性である。このデータは、SPP1とGSNが、rs158273対立遺伝子に関連する保護生物活性の薬力学的マーカーであることを示した。
CSFR1及びIL1RNの発現
本開示の抗MS4A4A抗体は、非ヒト霊長類においてCSF1Rレベルを高めた。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、インビボで(例えば、非ヒト霊長類またはヒトにおいて)、CSF1RのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、血清及び/またはCSFにおけるCSF1RのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、血清及び/またはCSFでのCSF1RのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも250%引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、脳内のCSF1Rのタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、前頭葉及び/または海馬におけるCSF1Rのタンパク質のレベルを引き上げる。
CSF1R欠損症は、脳内のミクログリアの発達に悪影響を及ぼし(Swerdlow et al(2000)Neurology,111:300-311;Baba et al(2006)Acta Neuropath,111:300-311)、そして、最近の研究は、CSF1R遺伝子の変異と、軸索スフェロイド及び色素性グリアを伴う成人発症性白質脳症(ALSP)、及びスフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症(HDLS)などの様々な障害との関連を突き止めている(Oosterhof et al(2019)Am J Hum Genet,104:936-947;Rademaker et al(2011)Nat Genet,44:200-205;Nicholson et al(2013)Neurology,80:1033-1040)。本開示の抗MS4A4A抗体は、CSF1R阻害後のヒトマクロファージの細胞死を抑制し、その生存を持続させた。したがって、一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、ALSPまたはHDLSなどのCSF1R欠損疾患または障害を有する個体を治療する上で有用である。
本開示の抗MS4A4A抗体は、ヒト末梢血単核細胞由来マクロファージにおいてIL1RNレベルを高めた。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、IL1RNのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、IL1RNのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを引き上げる。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)におけるIL1RNのmRNA及び/またはタンパク質のレベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも200%、または少なくとも250%引き上げる。
GPNMB発現
GPNMB(糖タンパク質非転移性黒色腫タンパク質B);は、組織マクロファージやミクログリアなどの複数の細胞型で発現する表面糖タンパク質である。幾つかの遺伝的バリアントが、パーキンソン病(PD)のリスクに関連している。GPNMBタンパク質のレベルは、PD患者の黒質で上昇しており、また、GPNMBレベルは、リソソームストレス後に高まる(Moloney et.al.,2018,Neurobio Dis.120:1-11)。加えて、GPNMB発現の増大は、SNP rs199347に関連しており、このリスクSNPは、GPNMB遺伝子内に位置している(Murthy et al,Neurogenetics,2017,18:121-133)。
本開示の抗MS4A4A抗体は、ヒト初代マクロファージにおけるGPNMB細胞表面タンパク質のレベルを低下させた。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞(例えば、マクロファージ、ヒトマクロファージ、ミクログリア)におけるGPNMB細胞表面タンパク質のレベルを、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%引き下げる。GPNMBレベルの増大は、PDのリスク対立遺伝子に関連しているので、抗MS4A4A抗体を加えた後のGPNMBの低下は、PDの治療手段を提供し得る。
A.例示的な抗体、及び特定のその他の抗体の実施形態
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号94、108、116、146、147、308、及び311からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号94、108、116、146、147、308、及び311からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H1;(b)配列番号96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309、及び312からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309、及び312からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H2;(c)配列番号100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310、及び313からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310、及び313からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H3;(d)配列番号103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314、及び317からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314、及び317からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L1;(e)配列番号105、106、114、139、140、141、142、143、160、161、315、及び318からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号105、106、114、139、140、141、142、143、160、161、315、及び318からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107、115、144、145、163、316、及び319からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号107、115、144、145、163、316、及び319からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L3、から選択する少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号94及び308からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号94及び308からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H1;(b)配列番号96、97、98、99、及び309からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号96、97、98、99、及び309からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H2;(c)配列番号100、101、102、及び310からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号100、101、102、及び310からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H3;(d)配列番号103、104、及び314からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号103、104、及び314からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L1;(e)配列番号105、106、及び315からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号105、106、及び315からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L2:及び(f)配列番号107及び316からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号107及び316からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L3、から選択する少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号108のアミノ酸配列、または配列番号108のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H1;(b)配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H2;(c)配列番号112のアミノ酸配列、または配列番号112のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H3;(d)配列番号113のアミノ酸配列、または配列番号113のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L1;(e)配列番号114のアミノ酸配列、または配列番号114のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L2;及び(f)配列番号115のアミノ酸配列、または配列番号115のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L3、から選択する少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号116のアミノ酸配列、または配列番号116のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H1;(b)配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H2;(c)配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H3;(d)配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L1;(e)配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L3、から選択する少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H1;(b)配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列、または配列番号154のアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-H3;(d)配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L1;(e)配列番号159、160、及び161からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号159、160、及び161からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号163からなる群から選択するアミノ酸と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸を含むHVR-L3、から選択する少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号100のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号103のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号97のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号100のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号103のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号98のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号100のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号103のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号101のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号103のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号106のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3;または、(a)配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号99のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号100のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号310のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号314のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号315のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号316のアミノ酸配列を含むHVR-L3;または、(a)配列番号311のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号312のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号313のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号317のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号318のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号319のアミノ酸配列を含むHVR-L3、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号110のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号112のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3;または、(a)配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号111のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号112のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号123のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号119のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号123のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号120のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号123のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号121のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号123のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号131のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号132のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号133のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号134のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号135のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号136のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号140のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号145のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号137のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号138のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号141のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号142のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号141のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号124のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号143のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号125のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号137のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号125のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号143のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号125のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号131のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号125のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号125のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号142のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号125のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号145のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号126のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号138のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号141のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号126のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号126のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号130のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号141のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号127のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号131のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号122のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号127のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号131のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号128のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号131のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号129のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号131のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含

むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号129のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号132のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号129のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号133のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号129のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号134のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号129のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号135のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号129のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号136のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号139のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号144のアミノ酸配列を含むHVR-L3、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号147のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号149のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号156のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号160のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号146のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号150のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号156のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号160のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号147のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号149のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号157のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号159のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号147のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号151のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号156のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号160のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号147のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号151のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号158のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号159のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号146のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号152のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号156のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号161のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3;(a)配列番号146のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号153のアミノ酸配列を含むHVR-H2;(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3;(d)配列番号158のアミノ酸配列を含むHVR-L1;(e)配列番号159のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(f)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では、(a)配列番号94のアミノ酸配列、または配列番号94のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号96、97、98、及び99からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号96、97、98、及び99からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(c)配列番号100、101、及び102からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号100、101、及び102からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では、(a)配列番号308のアミノ酸配列、または配列番号308のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号309のアミノ酸配列、または配列番号309のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(c)配列番号310のアミノ酸配列、または配列番号310のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では、(a)配列番号311のアミノ酸配列、または配列番号311のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号312のアミノ酸配列、または配列番号312のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(c)配列番号313のアミノ酸配列、または配列番号313のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では、(a)配列番号103及び104からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号103及び104からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(b)配列番号105及び106からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号105及び106からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(c)配列番号107のアミノ酸配列、または配列番号107のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では、(a)配列番号314のアミノ酸配列、または配列番号314のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(b)配列番号315のアミノ酸配列、または配列番号315のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(c)配列番号316のアミノ酸配列、または配列番号316のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では、(a)配列番号317のアミノ酸配列、または配列番号317のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(b)配列番号318のアミノ酸配列、または配列番号318のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(c)配列番号319のアミノ酸配列、または配列番号319のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)(i)配列番号94のアミノ酸配列、または配列番号94のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(ii)配列番号96、97、98、及び99からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号96、97、98、及び99からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(iii)配列番号100、101、及び102からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号100、101、及び102からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号103及び104からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号103及び104からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(ii)配列番号105及び106からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号105及び106からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(iii)配列番号107のアミノ酸配列、または配列番号107のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)(i)配列番号308のアミノ酸配列、または配列番号308のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(ii)配列番号309のアミノ酸配列、または配列番号309のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(iii)配列番号310のアミノ酸配列、または配列番号310のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号314のアミノ酸配列、または配列番号314のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(ii)配列番号315のアミノ酸配列、または配列番号315のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(iii)配列番号316のアミノ酸配列、または配列番号316のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)(i)配列番号311のアミノ酸配列、または配列番号311のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(ii)配列番号312のアミノ酸配列、または配列番号312のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(iii)配列番号313のアミノ酸配列、または配列番号313のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号317のアミノ酸配列、または配列番号317のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(ii)配列番号318のアミノ酸配列、または配列番号318のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(iii)配列番号316のアミノ酸配列、または配列番号316のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号24、25、26、27、28、29、及び30からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号24、25、26、27、28、29、及び30からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(c)配列番号112のアミノ酸配列、または配列番号112のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号113のアミノ酸配列、または配列番号113のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(b)配列番号114のアミノ酸配列、または配列番号114のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(c)配列番号115のアミノ酸配列、または配列番号115のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)(i)配列番号108のアミノ酸配列、または配列番号108のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(ii)配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列、または、配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(iii)配列番号112のアミノ酸配列、または配列番号112のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号113のアミノ酸配列、または配列番号113のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(ii)配列番号114のアミノ酸配列、または配列番号114のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(iii)配列番号115のアミノ酸配列、または配列番号115のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号116のアミノ酸配列、または配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(c)配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(b)配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(c)配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)(i)配列番号116のアミノ酸配列、または配列番号116のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(ii)配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(iii)配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(ii)配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(iii)配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(c)配列番号154のアミノ酸配列、または配列番号154のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(b)配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(c)配列番号163のアミノ酸配列、または配列番号163のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
一部の実施形態では、本明細書では:(a)(i)配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H1;(ii)配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び(iii)配列番号154のアミノ酸配列、または配列番号154のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L1;(ii)配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列、または配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び(iii)配列番号163のアミノ酸配列、または配列番号163のアミノ酸配列と少なくとも約95%の相同性を有するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのV HVR配列を含むVドメイン、を含む抗MS4A4A抗体を提供する。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304、及び306からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(V)配列を含む。特定の実施形態では、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304、及び306からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304、または306において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304、または306において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304、または306のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号94、108、116、146、147、及び308、及び311からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309、及び312からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(c)配列番号100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310、及び313からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3、から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体を提供し、当該抗体は、配列番号17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305、及び307からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(V)を含む。特定の実施形態では、配列番号17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305、及び307からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。一部の実施形態では、配列番号17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305、または307において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305、または307において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305、または307のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314、及び317からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)配列番号105、106、114、139、140、141、142、143、160、161、315、及び318からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(c)配列番号107、115、144、145、163、316、及び319からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3、から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
一部の実施形態では、抗MS4A4A抗体を提供し、当該抗体は、先に提供した実施形態のいずれかでのVと、先に提供した実施形態のいずれかでのVとを含む。一部の実施形態では、本明細書では抗MS4A4A抗体を提供しており、当該抗体は、先に提供した実施形態のいずれかでのVと、先に提供した実施形態のいずれかでのVとを含む。ある実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それらの配列は、それぞれ、配列番号5~15及び配列番号17~22であり、これらの配列の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それらの配列は、それぞれ、配列番号24~30及び配列番号32~36であり、これらの配列の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それらの配列は、それぞれ、配列番号40~53及び配列番号55~74であり、これらの配列の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それらの配列は、それぞれ、配列番号76~84及び配列番号86~93であり、これらの配列の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それらの配列は、それぞれ、配列番号304及び配列番号305であり、これらの配列の翻訳後修飾を含む。ある実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それらの配列は、それぞれ、配列番号306及び配列番号307であり、これらの配列の翻訳後修飾を含む。
一部の実施形態では、本明細書では、重鎖可変ドメイン(V)、及び軽鎖可変ドメイン(V)を含む抗MS4A4A抗体を提供し、当該V及びVを:配列番号5のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号5のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むV;配列番号6のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号5のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号19のアミノ酸配列を含むV;配列番号7のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号5のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号20のアミノ酸配列を含むV;配列番号8のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号9のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号10のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号18のアミノ酸配列を含むV;配列番号11のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号12のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むV;配列番号13のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号21のアミノ酸配列を含むV;配列番号14のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むV;配列番号15のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号122のアミノ酸配列を含むV;配列番号304のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号305のアミノ酸配列を含むV;及び配列番号306のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号307のアミノ酸配列を含むVからなる群から選択する。
一部の実施形態では、本明細書では、重鎖可変ドメイン(V)、及び軽鎖可変ドメイン(V)を含む抗MS4A4A抗体を提供し、当該V及びVを:配列番号24のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号25のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むV;配列番号25のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号26のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むV;配列番号26のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号27のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号27のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むV;配列番号28のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号33のアミノ酸配列を含むV;配列番号28のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号28のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むV;配列番号28のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号34のアミノ酸配列を含むV;配列番号29のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号29のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むV;配列番号30のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号37のアミノ酸配列を含むV;配列番号30のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号32のアミノ酸配列を含むV;配列番号30のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号38のアミノ酸配列を含むV;配列番号30のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号36のアミノ酸配列を含むVからなる群から選択する。
一部の実施形態では、本明細書では、重鎖可変ドメイン(V)、及び軽鎖可変ドメイン(V)を含む抗MS4A4A抗体を提供し、当該V及びVを:配列番号40のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号55のアミノ酸配列を含むV;配列番号41のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号55のアミノ酸配列を含むV;配列番号40のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号56のアミノ酸配列を含むV;配列番号40のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むV;配列番号40アミノ酸配列を含むV、及び配列番号58のアミノ酸配列を含むV;配列番号41のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号56のアミノ酸配列を含むV;配列番号41のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号57のアミノ酸配列を含むV;配列番号41のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号58のアミノ酸配列を含むV;配列番号42のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号59のアミノ酸配列を含むV;配列番号43のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号59のアミノ酸配列を含むV;配列番号44のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むV;配列番号45のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むV;配列番号46のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号60のアミノ酸配列を含むV;配列番号43のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号61のアミノ酸配列を含むV;配列番号46のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号61のアミノ酸配列を含むV;配列番号42のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号61のアミノ酸配列を含むV;配列番号44のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号61のアミノ酸配列を含むV;配列番号45のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号61のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号55のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号62のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号63のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号64のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号66のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号67のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号68のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号69のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号70のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号72のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号73のアミノ酸配列を含むV;配列番号47のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むV;配列番号48のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号70のアミノ酸配列を含むV;配列番号48のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号74のアミノ酸配列を含むV;配列番号48のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号62のアミノ酸配列を含むV;配列番号48のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号55のアミノ酸配列を含むV;配列番号48のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号72のアミノ酸配列を含むV;配列番号48のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号69のアミノ酸配列を含むV;配列番号49のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号71のアミノ酸配列を含むV;配列番号49のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号55のアミノ酸配列を含むV;配列番号49のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号73のアミノ酸配列を含むV;配列番号50のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号62のアミノ酸配列を含むV;配列番号51のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号62のアミノ酸配列を含むV;配列番号52のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号62のアミノ酸配列を含むV;配列番号53のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号62のアミノ酸配列を含むV;配列番号53のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号63のアミノ酸配列を含むV;配列番号53のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号64のアミノ酸配列を含むV;配列番号53のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号65のアミノ酸配列を含むV;配列番号53のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号66のアミノ酸配列を含むV;及び配列番号53のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号67のアミノ酸配列を含むVからなる群から選択する。
一部の実施形態では、本明細書では、重鎖可変ドメイン(V)、及び軽鎖可変ドメイン(V)を含む抗MS4A4A抗体を提供し、当該V及びVを:配列番号76のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号86のアミノ酸配列を含むV;配列番号77のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号87のアミノ酸配列を含むV;配列番号78のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号88のアミノ酸配列を含むV;配列番号79のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号89のアミノ酸配列を含むV;配列番号80のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号90のアミノ酸配列を含むV;配列番号81のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むV;配列番号82のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号91のアミノ酸配列を含むV;配列番号83のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号92のアミノ酸配列を含むV;及び配列番号84のアミノ酸配列を含むV、及び配列番号93のアミノ酸配列を含むVからなる群から選択する。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304、及び306からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(V)配列を含む。特定の実施形態では、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304、及び306からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304、または306において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304、または306において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304、または306のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号94及び308からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号96、97、98、99、及び309からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(c)配列番号100、101、102、及び310からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3、から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体が提供され、当該抗体は、配列番号17、18、19、20、21、22、305、及び307からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(V)配列を含む。特定の実施形態では、配列番号17、18、19、20、21、22、305、及び307からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。一部の実施形態では、配列番号17、18、19、20、21、22、305、または307において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号17、18、19、20、21、22、305、または307において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号17、18、19、20、21、22、305、または307のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号103、104、及び314からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)配列番号105、106、及び315からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(c)配列番号107及び316からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3、から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号24、25、26、27、28、29、及び30からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(V)配列を含む。特定の実施形態では、配列番号24、25、26、27、28、29、及び30からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号24、25、26、27、28、29、または30において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号24、25、26、27、28、29、または30において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号24、25、26、27、28、29、または30のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(c)配列番号112のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体を提供し、当該抗体は、配列番号32、33、34、35、及び36からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(V)を含む。特定の実施形態では、配列番号32、33、34、35、及び36からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。一部の実施形態では、配列番号32、33、34、35、または36において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号32、33、34、35、または36において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号32、33、34、35、または36のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(c)配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、及び53からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(V)配列を含む。特定の実施形態では、配列番号40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、及び53からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、または53において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、または53において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、または53のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(c)配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体が提供され、当該抗体は、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、及び74からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(V)を含む。特定の実施形態では、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、及び74からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。一部の実施形態では、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、または74において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、または74において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、または74のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(c)配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、及び84からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(V)配列を含む。特定の実施形態では、配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、及び84からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、または84において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、または84において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号76、77、78、79、80、81、82、83、または84のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1、(b)配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(c)配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体が提供され、当該抗体は、配列番号86、87、88、89、90、91、92、及び93からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(V)を含む。特定の実施形態では、配列番号86、87、88、89、90、91、92、及び93からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するV配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。一部の実施形態では、配列番号86、87、88、89、90、91、92、または93において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号86、87、88、89、90、91、92、または93において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。任意に、抗MS4A4A抗体は、配列番号86、87、88、89、90、91、92、または93のV配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、Vは:(a)配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1、(b)配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(c)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択する1つ、2つ、または3つのHVRを含む。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号320~335及び355~362からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号320~335及び355~362からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号320~335及び355~362において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号320~335及び355~362において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、HVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。
別の態様では、抗MS4A4A抗体は、配列番号363~365からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する全長軽鎖アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、配列番号363~365からなる群から選択するアミノ酸配列に対して、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する全長重鎖アミノ酸配列は、リファレンス配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含むが、その配列を含む抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対して結合する能力を保持している。特定の実施形態では、配列番号363~365において、合計で1~10個のアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、配列番号363~365において、合計で1~5つのアミノ酸を、置換、挿入、及び/または欠失している。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、LVRの外側の領域(すなわち、FR)で起こる。
一部の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、配列番号355~362の全長重鎖アミノ酸配列と、配列番号365の全長軽鎖アミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、配列番号320~327の全長重鎖アミノ酸配列と、配列番号363の全長軽鎖アミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、抗MS4A4A抗体は、配列番号328~335の全長重鎖アミノ酸配列と、配列番号364の全長軽鎖アミノ酸配列とを含む。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、4A-202、4A-301、4A-302、4A-330、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、及び4A-450から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体の結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、及び4A-331から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体の結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、及び4A-381から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体の結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、4A-390から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体の結合を競合的に阻害する。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、4A-331、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、4A-381、4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、4A-390、4A-419、及び4A-450から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体が結合するMS4A4Aエピトープと同一である、または重複するヒトMS4A4Aのエピトープに対して結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングする例示的な方法の詳細は、Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)に記載されている。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、A-419、4A-450から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせの結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、4A-331から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせの結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、及び4A-381から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせの結合を競合的に阻害する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせの結合を競合的に阻害する。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、及び4A-450から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせと同じである、または重複する、MS4A4Aでのエピトープを有する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、及び4A-331から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせと同じである、または重複する、MS4A4Aでのエピトープを有する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、及び4A-381から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせと同じである、または重複する、MS4A4Aでのエピトープを有する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-25、A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、及び4A-390、から選択する少なくとも1つのリファレンス抗体、及びそれらのあらゆる組み合わせと同じである、または重複する、MS4A4Aでのエピトープを有する。
一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aの細胞外ドメイン1(ECL1)に対して結合する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、配列番号1のアミノ酸配列CMASNTYGSNPIS(配列番号177)での1つ以上のアミノ酸に対して結合する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aの細胞外ドメイン2(ECL2)に対して結合する。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、配列番号1のアミノ酸配列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(配列番号178)での1つ以上のアミノ酸に対して結合する。
当該技術分野で公知のあらゆる適切な競合アッセイまたはMS4A4A結合アッセイ、例えば、BIAcore分析、ELISAアッセイ、またはフローサイトメトリーなどを利用して、抗MS4A4A抗体が、MS4A4Aに対する結合に関して、4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、4A-331、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、4A-381、4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、4A-390、4A-419、及び4A-450、及びそれらのあらゆる組み合わせから選択する1つ以上のリファレンス抗体と競合する(または、競合的にその結合を阻害する)か否かを決定し得る。例示的な競合アッセイでは、固定化したMS4A4A、または細胞表面にMS4A4Aを発現する細胞を、MS4A4Aに対して結合する第1の標識抗体(例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類)と、MS4A4Aに対する結合に関して第1の抗体と競合する能力について試験する第2の非標識抗体とを含む溶液でインキュベーションする。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清に存在し得る。コントロールとして、固定化したMS4A4A、またはMS4A4Aを発現する細胞を、第2の非標識抗体ではなく、第1の標識抗体を含む溶液においてインキュベーションする。MS4A4Aに対する第1の抗体の結合を許容する条件下でインキュベーションした後に、過剰な非結合抗体を除去し、そして、固定化したMS4A4A、またはMS4A4Aを発現する細胞に関連する標識の量を測定する。固定化したMS4A4A、またはMS4A4Aを発現する細胞に関連する標識の量が、コントロール試料と比較して、試験試料において実質的に減っていれば、このことは、MS4A4Aに対する結合について、第2の抗体が、第1の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)を参照されたい。
本明細書では、抗MS4A4A抗体の結合を競合的に阻害する、及び/または当該抗体への結合について競合する抗MS4A4A抗体をさらに提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号94及び308からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号96、97、98、99、及び309からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号100、101、102、及び310からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号103、104、及び314からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号105、106、及び315からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号107及び316からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号5~15及び304、及び配列番号17~22及び305である。
本明細書では、抗MS4A4A抗体が結合するエピトープと同じである、または重複するヒトMS4A4Aのエピトープに対して結合する抗MS4A4A抗体を提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号94及び308からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号96、97、98、99、及び309からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号100、101、102、及び310からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号103、104、及び314からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号105、106、及び315からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号107及び316からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号5~15及び304、ならびに配列番号17~22及び305である。一部の実施形態では、ヒトMS4A4Aのエピトープは、抗MS4A4A抗体が結合するものと同じエピトープである。
本明細書では、抗MS4A4A抗体の結合を競合的に阻害する、及び/または当該抗体への結合について競合する抗MS4A4A抗体をさらに提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号112のアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号24~30、及び配列番号32~36である。
本明細書では、抗MS4A4A抗体が結合するエピトープと同じである、または重複するヒトMS4A4Aのエピトープに対して結合する抗MS4A4A抗体を提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号110及び111からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号112のアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号24~30、及び配列番号32~36である。一部の実施形態では、ヒトMS4A4Aのエピトープは、抗MS4A4A抗体が結合するものと同じエピトープである。
本明細書では、抗MS4A4A抗体の結合を競合的に阻害する、及び/または当該抗体への結合について競合する抗MS4A4A抗体をさらに提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号40~53、及び配列番号55~74である。
本明細書では、抗MS4A4A抗体が結合するエピトープと同じである、または重複するヒトMS4A4Aのエピトープに対して結合する抗MS4A4A抗体を提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号118、119、120、121、及び122からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号123、124、125、126、127、128、及び129からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号130、131、132、133、134、135、136、137、及び138からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号139、140、141、142、及び143からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号144及び145からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号40~53、及び配列番号55~74である。一部の実施形態では、ヒトMS4A4Aのエピトープは、抗MS4A4A抗体が結合するものと同じエピトープである。
本明細書では、抗MS4A4A抗体の結合を競合的に阻害する、及び/または当該抗体への結合について競合する抗MS4A4A抗体をさらに提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号154のアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号76~84、及び配列番号86~93である。
本明細書では、抗MS4A4A抗体が結合するエピトープと同じである、または重複するヒトMS4A4Aのエピトープに対して結合する抗MS4A4A抗体を提供しており、これらの抗体は、(a)(i)配列番号146及び147からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-H1、(ii)配列番号149、150、151、152、及び153からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び(iii)配列番号154のアミノ配列を含むHVR-H3を含むVドメイン、及び(b)(i)配列番号156、157、及び158からなる群から選択するアミノ配列を含むHVR-L1、(ii)配列番号160及び161からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び(iii)配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含むVドメインを含む。一部の実施形態では、当該抗体は、V及びV配列を含み、それぞれ、配列番号76~84、及び配列番号86~93である。一部の実施形態では、ヒトMS4A4Aのエピトープは、抗MS4A4A抗体が結合するものと同じエピトープである。
一部の実施形態では、前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体は、ヒト化、及び/または、ヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、当該抗MS4A4A抗体は、抗体フラグメント、例えば、Fv、Fab、Fab’、scFv、ダイアボディ、または、F(ab’)2フラグメントである。一部の実施形態では、当該抗MS4A4A抗体は、実質的な全長抗体、例えば、本明細書で定義するIgG1抗体、IgG2a抗体、または、その他の抗体クラス、または、アイソタイプである。
一部の実施形態では、前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体を、以下の第1~7節に記載したように、あらゆる特徴を、単独で、または、組み合わせて取り込み得る。
(1)抗MS4A4A抗体結合親和性
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM、または、<0.001nM(例えば、10-8M以下、例えば、10-8M~10-13M、例えば、10-9M~10-13M)の解離定数(Kd)を有する。解離定数は、ELISA、表面プラズモン共鳴(SPR)、バイオレイヤー干渉法(例えば、ForteBioのOctet Systemを参照されたい)、等温滴定カロリメトリー(ITC)、示差走査熱量測定法(DSC)、円偏光二色性(CD)、ストップト-フロー分析、及び、比色分析、または、蛍光タンパク質融解分析などのあらゆる生化学的または生物物理学的技法など、あらゆる解析技法で決定することができる。ある実施形態では、Kdを、放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)で測定する。一部の実施形態では、RIAを、例えば、Chen et al.J.Mol.Biol.293:865-881(1999))に記載された、目的の抗体のFabバージョン、または、その抗原を用いて実施する。一部の実施形態では、BIACORE表面プラズモン共鳴アッセイ、例えば、BIACORE-2000、または、BIACORE-3000(BIAcore,Inc.、Piscataway,NJ)を使用するアッセイを使って、約10反応単位(RU)の固定化した抗原CM5チップを用いて、25℃で、Kdの測定を行う。一部の実施形態では、当該Kを、一価抗体(例えば、Fab)、または、全長抗体を使用して決定する。一部の実施形態では、当該Kを、一価形態の全長抗体を使用して決定する。
(2)抗体フラグメント
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントとして、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)、Fv、及び、scFvフラグメント、及び、後述するその他のフラグメントがあるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの概説については、Hudson et al.Nat.Med.9:129-134(2003)を参照されたい。scFvフラグメントの概説については、例えば、WO93/16185;及び、米国特許第5571894号、及び、第5587458号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ、インビボでの半減期が延びたFab、及びF(ab’)フラグメントの考察については、米国特許第5869046号を参照されたい。
ダイアボディは、二価、または、二重特異性であり得る2つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、EP404097;WO1993/01161;Hudson et al.Nat.Med.9:129-134(2003)を参照されたい。トリアボディ、及び、テトラボディも、Hudson et al.Nat.Med.9:129-134(2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部、または、軽鎖可変ドメインの全部または一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である(例えば、米国特許第6248516号を参照されたい)。
抗体フラグメントは、本明細書に記載した通り、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに、組換え宿主細胞(例えば、E.coli、または、ファージ)による生産などであるが、これらに限定されない様々な技術で生産することができる。
(3)キメラ、及び、ヒト化抗体
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号に記載されている。ある例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または、サルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)、及び、ヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のものから変更した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、ヒト化抗体である。一般的に、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性と親和性とを保持しながら、ヒトに対する免疫原性を抑制するためにヒト化する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、標的に対して、ヒト化抗体が由来する別の種に由来する抗体と実質的に同じ親和性を有する。例えば、米国特許第5530101号、第5693761号;第5693762号;及び、第5585089号を参照されたい。特定の実施形態では、免疫原性を低下させながら、抗原結合ドメインの本来の親和性を抑制せずに修飾することができる抗体可変ドメインのアミノ酸を同定する。例えば、米国特許第5766886号、及び、第5869619号を参照されたい。一般的に、ヒト化抗体は、HVR(またはその一部)が、非ヒト抗体に由来し、かつ、FR(またはその一部)が、ヒト抗体配列に由来する1つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体での一部のFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体(例えば、HVR残基が由来する抗体)に由来する対応する残基で置換する。
ヒト化抗体、及び、それらを生産する方法は、例えば、Almagro et al.Front.Biosci.13:1619-1633(2008)で概説されており、また、例えば、米国特許第5821337号、第7527791号、第6982321号、及び、第7087409号に記載されている。ヒト化に使用し得るヒトフレームワーク領域として、「ベストフィット」法を使用して選択したフレームワーク領域(例えば、Sims et al.J.Immunol.151:2296(1993)を参照されたい);軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域(例えば、Carter et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);及び、Presta et al,J.Immunol.151:2623(1993)を参照されたい);ヒトの成熟した(体細胞変異)フレームワーク領域、または、ヒトの生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro and Fransson Front.Biosci.13:1619-1633(2008)を参照されたい)、及びFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域(例えば、Baca et al.J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)、及び、Rosok et al.J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996)を参照されたい)があるが、これらに限定されない。
(4)ヒト抗体
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して生産することができる。ヒト抗体は、一般的には、van Dijk et al.Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)、及び、Lonberg Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)で説明されている。
ヒト抗体は、抗原接種に応答して、ヒト可変領域を有する、インタクトなヒト抗体、または、インタクトな抗体を生産するように修飾したトランスジェニック動物に対して免疫原を投与して調製することができる。そのようなマウスが、マウス抗体の非存在下でヒト抗体を生産するものとして予想して、ヒトIg遺伝子座の大きなフラグメントを有するマウス抗体生産を欠損しているマウス系統を遺伝子操作することができる。大きなヒトIgフラグメントは、大きな可変遺伝子の多様性、ならびに、抗体の生産と発現の適切な調節を続けることができる。抗体の多様化と選択、及び、ヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠如のためのマウス機構を利用することで、これらのマウス系統において再現したヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原などの目的の抗原に対する高親和性完全ヒト抗体を生み出すことができる。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を、生産及び選択することができる。特定の例示的な方法は、米国特許第5545807号、EP546073、及び、EP546073で説明されている。また、例えば、XENOMOUSE(商標)技術を記載している米国特許第6075181号、及び、第6150584号;HUMAB(登録商標)技術を記載している米国特許第5770429号;K-M MOUSE(登録商標)技術を記載している米国特許番号7041870号、及び、VELOCIMOUSE(登録商標)技術を記載している米国特許出願公開第US2007/0061900号を参照されたい。そのような動物が生成したインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせて、さらに改変し得る。
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法で生産することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫、及び、マウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J.Immunol.133:3001(1984)、及び、Boerner et al.J.Immunol.147:86(1991))。ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成したヒト抗体は、Li et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1 03:3557-3562(2006)に記載されている。さらなる方法として、例えば、(ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトIgM抗体の生産を説明している)米国特許第7189826号に記載されている方法がある。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers et al.Histology and Histopathology 20(3):927-937(2005)、及び、Vollmers et al.Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91(2005)に記載されている。また、ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したFvクローン可変ドメイン配列を単離することで生成し得る。次に、そのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせ得る。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を、以下に説明する。
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、インビトロ法、及び/または、所望の1つ以上の活性を有する抗体に関するコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして単離したヒト抗体である。適切な例として、ファージディスプレイ(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion(かつてのProliferon)、Affimed)リボソームディスプレイ(CAT)、酵母ディスプレイ(Adimab)などがあるが、これらに限定されない。特定のファージディスプレイ法では、VH、及び、VL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で別々にクローニングし、次いで、Winter et al.Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)に記載されているファージライブラリーでランダムに再結合する。例えば、当該技術分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、そして、所望の結合特性を保有する抗体に関する当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が公知である。Sidhu et al.J.Mol.Biol.338(2):299-310、2004;Lee et al,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093,2004;Fellouse Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及び、Lee et al.J.Immunol.Methods 284(-2):119-132(2004)も参照されたい。一般的に、ファージは、一本鎖Fv(scFv)フラグメント、または、Fabフラグメントのいずれかで抗体フラグメントを表す。免疫源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要がなく、免疫原に対して高親和性の抗体を提供する。あるいは、未処理のレパートリーを、(例えば、ヒトから)クローニングして、Griffiths et al.EMBO J.12:725-734(1993)に記載されているようにして、免疫化処置をせずに、広範囲の非自己抗原、それに、自己抗原に対する単一の抗体源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリーは、幹細胞から再配置していないV遺伝子セグメントをクローニングし、そして、ランダム配列を含むPCRプライマーを使用して可変性に富んだHVR3領域をコードし、そして、Hoogenboom et al.J.Mol.Biol.,227:381-388、1992に記載されているようにして、インビトロでの再配置を達成した。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許文献として、例えば:米国特許第5750373号、ならびに、米国特許公開第2007/0292936号、及び、第2009/0002360号がある。ヒト抗体ライブラリーから単離した抗体は、本明細書では、ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと見なす。
(5)Fc領域を含む定常領域
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、Fcを含む。一部の実施形態では、当該Fcは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、及び/または、IgG4アイソタイプである。一部の実施形態では、当該抗体は、IgGクラス、IgMクラス、または、IgAクラスの抗体である。
本明細書で提供するあらゆる抗体の特定の実施形態では、当該抗体は、IgG2アイソタイプを有する。一部の実施形態では、当該抗体は、ヒトIgG2定常領域を含む。一部の実施形態では、当該ヒトIgG2定常領域は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、当該抗体は、1つ以上のMS4A4A活性を誘導し、または、Fc受容体に対する結合とは無関係に誘導する。一部の実施形態では、当該抗体は、阻害性Fc受容体に対して結合する。特定の実施形態では、当該阻害性Fc受容体は、阻害性Fc-ガンマ受容体IIB(FcγIIB)である。
本明細書で提供するあらゆる抗体の特定の実施形態では、当該抗体は、IgG1アイソタイプを有する。一部の実施形態では、当該抗体は、マウスIgG1定常領域を含む。一部の実施形態では、当該抗体は、ヒトIgG1定常領域を含む。一部の実施形態では、当該ヒトIgG1定常領域は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、ヒトIgG1軽鎖定常領域は、配列番号344のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、当該抗体は、阻害性Fc受容体に対して結合する。特定の実施形態では、当該阻害性Fc受容体は、阻害性Fc-ガンマ受容体IIB(FcγIIB)である。
本明細書で提供するあらゆる抗体の特定の実施形態では、当該抗体は、IgG4アイソタイプを有する。一部の実施形態では、当該抗体は、ヒトIgG4定常領域を含む。一部の実施形態では、当該ヒトIgG4定常領域は、Fc領域を含む。一部の実施形態では、当該抗体は、阻害性Fc受容体に対して結合する。特定の実施形態では、当該阻害性Fc受容体は、阻害性Fc-ガンマ受容体IIB(FcγIIB)である。
本明細書で提供するあらゆる抗体の特定の実施形態では、当該抗体は、ハイブリッドIgG2/4アイソタイプを有する。一部の実施形態では、当該抗体は、EU付番法で定めたヒトIgG2のアミノ酸118~260、及び、EU付番法で定めたヒトIgG4のアミノ酸261~447を含む、アミノ酸配列を含む(WO1997/11971;WO2007/106585)。
一部の実施形態では、当該Fc領域は、アミノ酸置換を含まないFc領域を含む対応する抗体と比較して、補体を活性化せずに、クラスター形成を高める。一部の実施形態では、当該抗体は、当該抗体が特異的に結合する標的の1つ以上の活性を誘導する。一部の実施形態では、当該抗体は、MS4A4Aに対して結合する。
本開示の抗MS4A4A抗体を修飾して、エフェクター機能を修飾すること、及び/または、抗体の血清半減期を長くすることも望ましい。例えば、当該定常領域のFc受容体結合部位を修飾または変異させて、FcγRI、FcγRII、及び/または、FcγRIIIなどの特定のFc受容体に対する結合親和性を除去または抑制して、抗体依存性細胞性細胞毒性を抑制し得る。一部の実施形態では、当該抗体の(例えば、IgGのCH2ドメインにおける)Fc領域のN-グリコシル化を除去すると、当該エフェクター機能は低下する。一部の実施形態では、WO99/58572、及び、Armour et al.Molecular Immunology 40:585-593(2003);Reddy et al.J.Immunology164:1925-1933(2000)に記載されているようなヒトIgGの233~236、297、及び/または、327~331などの領域を修飾すると、当該エフェクター機能は低下する。その他の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体を修飾してエフェクター機能を修飾すると、ITIM含有FcgRIIb(CD32b)に対する発見選択性を高めて、抗体依存性細胞媒介細胞毒性、及び、抗体依存性細胞食作用などの体液性応答を活性化せずに、隣接細胞でのMS4A4A抗体のクラスター形成を高めることも望ましい。
当該抗体の血清半減期を長くするために、例えば、米国特許第5739277号に記載されているようにして、サルベージ受容体結合エピトープを、当該抗体(特に、抗体フラグメント)に組み込み得る。本明細書で使用する用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、インビボでのIgG分子の血清半減期の延長に関与するIgG分子(例えば、IgG、IgG、IgG、または、IgG)のFc領域のエピトープのことを指す。その他のアミノ酸配列の修飾。
(6)多重特異性抗体
多重特異性抗体とは、同じまたは別のポリペプチド(例えば、本開示の1つ以上のMS4A4Aポリペプチド)のエピトープなど、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体のことである。一部の実施形態では、当該多重特異性抗体を、二重特異性抗体とすることができる。一部の実施形態では、当該多重特異性抗体を、三重特異性抗体とすることができる。一部の実施形態では、当該多重特異性抗体を、四重特異性抗体とすることができる。そのような抗体を、全長抗体、または、抗体フラグメント(例えば、F(ab’)二重特異性抗体)に由来する抗体とすることができる。一部の実施形態では、当該多重特異性抗体は、MS4A4Aでの第1の部位に対して結合する第1の抗原結合領域を含み、かつ、MS4A4Aでの第2の部位に対して結合する第2の抗原結合領域を含む。一部の実施形態では、当該多重特異性抗体は、MS4A4Aに対して結合する第1の抗原結合領域、及び、第2のポリペプチドに対して結合する第2の抗原結合領域を含む。
本明細書では、第1の抗原結合領域を含む多重特異性抗体を提供しており、当該第1の抗原結合領域は、MS4A4Aに対して結合する本明細書に記載の抗体の6つのHVR、及び、第2のポリペプチドに対して結合する第2の抗原結合領域を含む。一部の実施形態では、当該第1の抗原結合領域は、本明細書に記載している抗体のVまたはVを含む。
当該多重特異性抗体のいずれかの一部の実施形態では、当該第2のポリペプチドは、a)血液脳関門を通る輸送を促す抗原;(b)トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様成長因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマシングルドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、angiopepペプチド、及び、ANG1005から選択した血液脳関門を通る輸送を促す抗原;(c)アミロイドベータ、オリゴマーアミロイドベータ、アミロイドベータプラーク、アミロイド前駆体タンパク質、または、そのフラグメント、Tau、IAPP、アルファ-シヌクレイン、TDP-43、FUSタンパク質、C9orf72(第9染色体オープンリーディングフレーム72)、c9RANタンパク質、プリオンタンパク質、PrPSc、ハンチンチン、カルシトニン、スーパーオキシドジスムターゼ、アタキシン、アタキシン1、アタキシン2、アタキシン3、アタキシン7、アタキシン8、アタキシン10、レビー小体、心房性ナトリウム利尿因子、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、アポリポタンパク質AI、血清アミロイドA、メジン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、ベータ2ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖AL、S-IBMタンパク質、反復関連非ATG(RAN)翻訳産物、ジペプチド反復(DiPeptide repeat)(DPR)ペプチド、グリシン-アラニン(GA)反復ペプチド、グリシン-プロリン(GP)反復ペプチド、グリシン-アルギニン(GR)反復ペプチド、プロリン-アラニン(PA)反復ペプチド、ユビキチン、及び、プロリン-アルギニン(PR)反復ペプチドから選択した疾患原因タンパク質;(d)免疫細胞で発現するリガンド、及び/または、タンパク質であって、当該リガンド、及び/または、タンパク質を、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3、及び、ホスファチジルセリンから選択する;及び/または、(e)1つ以上の腫瘍細胞、及び、それらのあらゆる組み合わせで発現するタンパク質、脂質、多糖、または糖脂質である。
血液脳関門を通る輸送を促す多数の抗原は、当該技術分野で公知である(例えば、Gabathuler R.Neurobiol.Dis.37:48-57(2010))。そのような第2の抗原として、トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様成長因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、CRM197(ジフテリア毒素の非毒性変異体)などのジフテリア毒素、TMEM30(A)(Flippase)などのラマ単一ドメイン抗体、TAT、Syn-B、または、ペネトラチンなどのタンパク質形質導入ドメイン、ポリアルギニン、または、一般的に正電荷を有するペプチド、ANG1005などのAngiopepペプチド(例えば、Gabathuler、2010を参照されたい)、及び、血液脳関門内皮細胞で濃縮を受けるその他の細胞表面タンパク質(例えば、Daneman et al.PLoS One 5(10):e13741(2010)を参照されたい)があるが、これらに限定されない。
当該多価抗体は、MS4A4A抗原、ならびに、さらなる抗原Aβペプチド、抗原またはα-シヌクレインタンパク質抗原、または、Tau-タンパク質抗原、または、TDP-43タンパク質抗原、または、プリオンタンパク質抗原、または、ハンチンチンタンパク質抗原、または、RAN、グリシン-アラニン(GA)、グリシン-プロリン(GP)、グリシン-アルギニン(GR)、プロリン-アラニン(PA)、または、プロリン-アルギニン(PR)、からなるジペプチド反復(DiPeptide Repeats)、(DPRペプチド)を含む翻訳産物抗原、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体などを認識し得るが、これらに限定されない。トランスフェリン受容体、または、抗体の移動を促すその他の抗原は、血液脳関門を通る。一部の実施形態では、当該第2のポリペプチドは、トランスフェリンである。一部の実施形態では、当該第2のポリペプチドは、Tauである。一部の実施形態では、当該第2のポリペプチドは、Aβである。一部の実施形態では、当該第2のポリペプチドは、TREM2である。一部の実施形態では、当該第2のポリペプチドは、α-シヌクレインである。
当該多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(及び、好ましくは、2つのポリペプチド鎖)を含み、1つ以上の当該ポリペプチド鎖は、2つ以上の可変ドメインを含む。例えば、1つ以上のポリペプチド鎖は、VD1-(X1)-VD2-(X2)-Fcを含み得るものであり、VD1は、第1の可変ドメインであり、VD2は、第2の可変ドメインであり、Fcは、Fc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1及びX2は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、そして、nは、0または1である。同様に、1つ以上のポリペプチド鎖は、V-C1可撓性リンカー-V-C1-Fc領域鎖;または、V-C1-V-C1-Fc領域鎖を含む。本明細書の多価抗体は、好ましくは、少なくとも2つ(及び、好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書の多価抗体は、例えば、約2~約8個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書で企図する軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、また、任意に、CLドメインをさらに含む。
多重特異性抗体を作り出す技術として、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペアの組換え共発現があるが、これらに限定されない(Milstein and Cuello Nature 305:537(1983)、WO93/08829、及び、Traunecker et al.EMBO J.10:3655(1991))、及び、「ノブ-イン-ホール」遺伝子操作(例えば、米国特許第5731168号を参照されたい)を参照されたい)。また、WO2013/026833(CrossMab)も参照されたい。また、多特異性抗体は、抗体Fc-ヘテロ二量体分子を作り出す静電ステアリング効果を操作して(WO2009/089004A1);2つ以上の抗体を架橋して(例えば、米国特許第4676980号を参照されたい);ロイシンを使用して;二重特異性抗体フラグメントを作り出す「ダイアボディ」技術を使用して(例えば、Hollinger et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)を参照されたい);そして、一本鎖Fv(scFv)二量体を使用して(例えば、Gruber et al,J.Immunol.152:5368(1994)を参照されたい);及び、例えば、Tutt et al.J.Immunol.147:60(1991)に記載されているようにして三重特異性抗体を調製して、作り出し得る。
本明細書は、「オクトパス抗体」などの3つ以上の機能的な抗原結合部位を有する遺伝子操作した抗体も含む(例えば、US2006/0025576を参照されたい)。また、本明細書の抗体は、複数のMS4A4Aに対して結合する抗原結合部位を含む「二重作用FAb」または「DAF」を含む(例えば、US2008/0069820を参照されたい)。
(7)抗体バリアント
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体のアミノ酸配列のバリアントを企図している。例えば、抗体の結合親和性、及び/または、その他の生物学的特性を改善することが望ましい。
(i)置換、挿入、及び、欠失バリアント
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供する。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することで、または、ペプチド合成により調製し得る。そのような修飾として、例えば、当該抗体のアミノ酸配列での残基の欠失、及び/または、挿入、及び/または、残基の置換がある。
Figure 2022542964000002
当該抗体の生物特性の実質的な修飾は、(a)置換領域内のポリペプチド主鎖の構造、例えば、シートまたはヘリックス構造、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、または、(c)側鎖の嵩を維持することに対する作用が著しく異なる置換を選択することで達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖特性に基づいて:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
(6)芳香族性:Trp、Tyr、Phe、に分けられる。
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを、別のクラスのものと交換することに関係する。そのような置換した残基は、例えば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域、または、当該分子の非相同領域に導入することができる。
本明細書に記載のポリペプチドまたは抗体に変更を加える場合、特定の実施形態では、アミノ酸の疎水性指標を考慮することができる。それぞれのアミノ酸には、その疎水性と電荷特性に基づいて、疎水性指標を割り当てている。それらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/システイン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(-0.4);スレオニン(-0.7);セリン(-0.8);トリプトファン(-0.9);チロシン(-1.3);プロリン(-1.6);ヒスチジン(-3.2);グルタミン酸塩(-3.5);グルタミン(-3.5);アスパラギン酸塩(-3.5);アスパラギン(-3.5);リジン(-3.9);及び、アルギニン(-4.5)である。
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性アミノ酸指標の重要性は、当該技術分野で理解されている。Kyte et al.J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)。特定のアミノ酸では、類似の疎水性指標、または、スコアを有するその他のアミノ酸の代わりに使用することができ、かつ、なおも類似の生物活性を保持することができる、ことは公知である。疎水性指標に基づいて変更を加える場合、特定の実施形態では、疎水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換を含む。特定の実施形態では、±1以内の事例を含み、そして、特定の実施形態では、±0.5以内の事例を含む。
また、類似のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて効果的に行うことができ、特に、そうして生成した生物学的機能性タンパク質またはペプチドは、本事例のように免疫学的実施形態での使用を意図している、ことも理解されたい。特定の実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性が支配するタンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性、及び、抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関する。
これらのアミノ酸残基には:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0±1);アスパラギン酸塩(+3.0±1);グルタミン酸塩(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(-0.4);プロリン(-0.5±1);アラニン(-0.5);ヒスチジン(-0.5);システイン(-1.0);メチオニン(-1.3);バリン(-1.5);ロイシン(-1.8);イソロイシン(-1.8);チロシン(-2.3);フェニルアラニン(-2.5)、及び、トリプトファン(-3.4)の親水性値を割り当てている。類似の親水性値に基づいて変更を加える場合、特定の実施形態では、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換を含み、特定の実施形態では、±1以内のアミノ酸の置換を含み、特定の実施形態では、±0.5以内のアミノ酸の置換を含む。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域を、「エピトープコア領域」とも称する。
特定の実施形態において、置換、挿入、または、欠失は、そのような改変が、抗体が抗原に対して結合する能力を実質的に低下させない限り、1つ以上のHVRで起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変(例えば、本明細書で提供する保存的置換)は、HVRで行い得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側で行い得る。前出の変異VH、及び、VL配列の特定の実施形態では、それぞれのHVRは改変されておらず、または、1つ、2つ、または、3つ以下のアミノ酸置換を含む。
アミノ酸配列挿入として、1残基~100以上の残基の長さのポリペプチドまでの範囲のアミノ末端、及び/または、カルボキシル末端での融合、ならびに、1つ以上のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例として、N末端メチオニル残基を有する抗体がある。抗体分子のその他の挿入バリアントとして、(例えば、ADEPTに関しては)抗体のN-またはC-末端、または、当該抗体の血清半減期を長くするポリペプチドへの融合がある。
抗体の適切な立体構造の維持に関与しないシステイン残基も、一般的に、セリンで置換することができ、分子の酸化安定性を改善し、そして、異常な架橋を阻止することができる。逆に、システイン結合(複数可)を抗体に付加すると、その安定性を改善することができる(特に、当該抗体が、Fvフラグメントなどの抗体フラグメントである場合)。
(ii)グリコシル化バリアント
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体を改変して、当該抗体がグリコシル化する程度を増大または抑制する。抗体に対するグリコシル化部位の追加または欠失は、1つ以上のグリコシル化部位を、生成または除去するように当該アミノ酸配列を改変することで好都合に達成し得る。
抗体のグリコシル化は、一般的に、N結合またはO結合のいずれかである。N-結合とは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の付着のことを指す。トリペプチド配列であるアスパラギン-X-セリン、及び、アスパラギン-X-スレオニンがあり、式中、Xは、プロリン以外のあらゆるアミノ酸であり、これらの配列は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。O結合型グリコシル化とは、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、または、キシロースの1つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリン、または、スレオニンに対して付着することを指すが、5-ヒドロキシプロリン、または、5-ヒドロキシリジンも使用し得る。
抗体に対するグリコシル化部位の付加は、(N-結合グリコシル化部位に関する)上記したトリペプチド配列の1つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することを、好都合に達成する。また、当該改変は、(O-結合型グリコシル化部位に関しては)当初の抗体の配列に対して、1つ以上のセリン、または、スレオニン残基を追加または置換しても達成し得る。
当該抗体が、Fc領域を含む場合、そこに付着した炭水化物を改変し得る。哺乳動物細胞が生成するネイティブ抗体は、一般的に、Fc領域のCH2ドメインのKabat付番法でのAsn297に対するN結合で一般的に付着している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。このオリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、及び、シアル酸、ならびに、二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてGlcNAcに付着したフコースを含み得る。一部の実施形態では、本開示の抗体でのオリゴ糖の修飾を、特定の改善した特性を有する抗体変異体を作り出すために行い得る。
ある実施形態では、Fc領域に(直接的に、または、間接的に)付着したフコースを欠いた炭水化物構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、米国特許公開第2003/0157108号、及び、第2004/0093621号を参照されたい。「脱フコシル化」または「フチコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例として:US2003/0157108;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;Okazaki et al,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki et al,Biotech.Bioeng.87:614(2004)がある。脱フコシル化抗体を生産することができる細胞株の例として、タンパク質フコシル化を欠損したLed 3 CHO細胞がある(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);US2003/0157108)、及び、アルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8、ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株(例えば、Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)、及び、Kanda et al,Biotechnol.Bioeng.94(4):680-688(2006)を参照されたい)がある。
(iii)修飾した定常領域
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体Fcとは、抗体Fcアイソタイプ、及び/または、修飾である。一部の実施形態では、当該抗体Fcアイソタイプ、及び/または、修飾は、Fcガンマ受容体に対して結合することができる。
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該修飾した抗体Fcは、IgG1修飾Fcである。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、1つ以上の修飾を含む。例えば、一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、(例えば、同じアイソタイプの野生型Fc領域に関連して)1つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、1つ以上の当該アミノ酸置換を、そのアミノ酸位置をEU付番法で定めている、N297A(Bolt S et al.(1993)Eur J Immunol23:403-411)、D265A(Shields et al.(2001)R.J.Biol.Chem.276,6591-6604)、L234A、L235A(Hutchins et al.(1995)Proc Natl Acad Sci USA,92:11980-11984;Alegreet al,(1994)Transplantation 57:1537-1543.31;Xu et al,(2000)Cell Immunol,200:16-26)、G237A(Alegre et al.(1994)Transplantation 57:1537-1543.31;Xu et al.(2000)Cell Immunol,200:16-26)、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E(McEarchern et al,(2007)Blood,109:1185-1192)、P331S(Sazinsky et al,(2008)Proc Natl Acad Sci USA2008,105:20167-20172)、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T、及び/または、T256Eから選択する。
あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのN297A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのD265A、及び、N297A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのN297A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのK322A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのN297A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのP331S変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのD270A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのL234A、及び、L235A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのL234A、及び、G237A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのL234A、L235A、及び、G237A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのP238D、L328E、E233、G237D、H268D、P271G、及び、A330R変異の(すべてを含む)1つ以上を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での1つ以上のS267E/L328F変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのN325S及びL328F変異(N325S/L328F)を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのP238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G、及び、A330R変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのP238D、L328E、G237D、H268D、P271G、及び、A330R変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのP238D、S267E、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G、及び、A330R変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのP238D、S267E、L328E、G237D、H268D、P271G、及び、A330R変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、Fcは、EU付番法によるC226S、C229S、E233P、L234V、及び、L235A変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのL234F、L235E、及び、P331S変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのS267E、及び、L328F変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのS267E変異を含む。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、IgG1の定常重鎖1(CH1)及びヒンジ領域を、CH1で置換すること、及び、IgG2のヒンジ領域(EU付番法によるIgG2のアミノ酸118~230)を、カッパ軽鎖で置換することを含む。
あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、2つ以上のアミノ酸置換を含まないFc領域を有する対応する抗体と比較して、補体を活性化せずに、抗体クラスター形成を高める2つ以上のアミノ酸置換を含む。したがって、あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、Fc領域を含む抗体であり、当該抗体は、位置E430Gでのアミノ酸置換、及び、EU付番法でのL234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、及び、これらのあらゆる組み合わせから選択した残基位置でのFc領域における1つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、L234A、L235A、及び、P331Sにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置L234A、L235A、及びP331Sにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、及び、P331Sにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、及び、K322Aにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、A330S、及び、P331Sにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、K322A、A330S、及び、P331Sにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、K322A、及び、A330Sにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法での位置E430G、K322A、及び、P331Sにアミノ酸置換を含む。
あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、本明細書では、当該IgG1修飾Fcをさらに含み、かつ、補体の活性化を回避するために、EU付番規定でのA330L変異(Lazar et al.Proc Natl Acad Sci USA,103:4005-4010(2006))、または、L234F、L235E、及び/または、P331S変異の1つ以上(Sazinsky et al.Proc Natl Acad Sci USA,105:20167-20172(2008))と組み合わせ得る。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番法でのA330L、A330S、L234F、L235E、及び/または、P331Sの1つ以上をさらに含み得る。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、ヒト血清での抗体半減期を長くする1つ以上の変異(例えば、EU付番規定でのM252Y、S254T、及び、T256E変異の(すべてを含む)1つ以上)をさらに含み得る。あらゆるIgG1修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG1修飾Fcは、EU付番でのE430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y、及び/または、S440Wの1つ以上をさらに含み得る。
本開示のその他の態様は、修飾した定常領域(すなわち、Fc領域)を有する抗体に関する。FcgR受容体に対する結合に依存して標的化受容体を活性化させる抗体を、FcgR結合を解消するように遺伝子操作すると、そのアゴニスト活性を喪失し得る(例えば、Wilson et al.Cancer Cell 19:101-113(2011);Armour at al.Immunology 40:585-593(2003);及び、White et al,Cancer Cell 27:138-148(2015)を参照されたい)。したがって、当該抗体が、ヒトIgG2アイソタイプ(CH1、及び、ヒンジ領域)由来のFcドメイン、または、阻害性FcgRIIBr受容体、または、その変異体を優先的に結合することができる別のタイプのFcドメインを有していれば、適正なエピトープ特異性を有する本開示の抗MS4A4A抗体は、最小限の副作用で、標的抗原を活性化できると考えられる。
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該修飾抗体Fcは、IgG2修飾Fcである。一部の実施形態では、当該IgG2修飾Fcは、1つ以上の修飾を含む。例えば、一部の実施形態では、当該IgG2修飾Fcは、(例えば、同じアイソタイプの野生型Fc領域に関連して)1つ以上のアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、1つ以上の当該アミノ酸置換を、EU付番規定でのV234A(Alegre et al.Transplantation 57:1537-1543(1994);Xu et al.Cell Immunol,200:16-26(2000));G237A(Cole et al.Transplantation,68:563-571(1999));H268Q、V309L、A330S、P331S(US2007/0148167;Armour et al.Eur J Immunol 29:2613-2624(1999);Armour et al.The Haematology Journal 1(Suppl.1):27(2000);Armour et al.The Heamatology Journal 1(Suppl.1):27(2000))、C219S、及び/または、C220S(White et al.Cancer Cell 27,138-148(2015));S267E、L328F(Chu et al.Mol Immunol,45:3926-3933(2008));及び、M252Y、S254T、及び/または、T256Eから選択する。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置V234A、及び、G237Aでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置C219S、または、C220Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置A330S、及び、P331Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置S267E、及び、L328Fでのアミノ酸置換を含む。
あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番規定でのC127Sアミノ酸置換を含む(White et al,(2015)Cancer Cell 27、138-148;Lightle et al.ProteinSci.19:753-762(2010);及び、WO2008/079246)。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該抗体は、EU付番規定でのC214Sアミノ酸置換を含むカッパ軽鎖定常ドメインを持ったIgG2アイソタイプを有する(White et al.Cancer Cell 27:138-148(2015);Lightle et al.Protein Sci.19:753-762(2010);及び、WO2008/079246)。
あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番規定でのC220Sアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該抗体は、EU付番規定でのC214Sアミノ酸置換を含むカッパ軽鎖定常ドメインを持ったIgG2アイソタイプを有する。
あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番規定でのC219Sアミノ酸置換を含む。あらゆるIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該抗体は、EU付番規定でのC214Sアミノ酸置換を含むカッパ軽鎖定常ドメインを持ったIgG2アイソタイプを有する。
あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、IgG2アイソタイプ重鎖定常ドメイン1(CH1)と、ヒンジ領域とを含む(White et al.Cancer Cell 27:138-148(2015))。あらゆる当該IgG2修飾Fcの特定の実施形態では、当該IgG2アイソタイプCH1、及び、ヒンジ領域は、EU付番法での118~230のアミノ酸配列を含む。あらゆるIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該抗体Fc領域は、EU付番法でのS267Eアミノ酸置換、L328Fアミノ酸置換、または、その両方、及び/または、N297AまたはN297Qアミノ酸置換を含む。
あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y、及び、S440Wに1つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。あらゆるIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、ヒト血清での抗体半減期を長くする1つ以上の変異(例えば、EU付番規定でのM252Y、S254T、及び、T256E変異の(すべてを含む)1つ以上)をさらに含み得る。あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、A330S、及び、P331Sをさらに含み得る。
あらゆる当該IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、IgG2/4ハイブリッドFcである。一部の実施形態では、当該IgG2/4ハイブリッドFcは、IgG2アミノ酸118~260、及び、IgG4アミノ酸261~447を含む。あらゆるIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置H268Q、V309L、A330S、及び、P331Sに1つ以上のアミノ酸置換を含む。
あらゆる当該IgG1、及び/または、IgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのA330L、L234F;L235E、または、P331S;及び、それらのあらゆる組み合わせから選択した1つ以上のさらなるアミノ酸置換を含む。
あらゆる当該IgG1、及び/または、IgG2修飾Fcの特定の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのC127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y、及びそれらのあらゆる組み合わせから選択する残基位置に1つ以上のアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、L243A、L235A、及びP331Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、Fcは、EU付番法での位置E430G及びP331Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G及びK322Aでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、A330S、及びP331Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、K322A、A330S、及びP331Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、K322A、及びA330Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、K322A、及びP331Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置S267E及びL328Fでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置C127Sでのアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG1及び/またはIgG2修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E345R、E430G、及びS440Yでのアミノ酸置換を含む。
本明細書で提供するあらゆる抗体の一部の実施形態では、当該修飾抗体Fcは、IgG4修飾Fcである。一部の実施形態では、当該IgG4修飾Fcは、1つ以上の修飾を含む。例えば、一部の実施形態では、当該IgG4修飾Fcは、(例えば、同じアイソタイプの野生型Fc領域に関連して)1つ以上のアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、1つ以上の当該アミノ酸置換は、EU付番規定でのL235A、G237A、S229P、L236E(Reddy et al.J Immunol 164:1925-1933(2000))、S267E、E318A、L328F、M252Y、S254T、及び/または、T256Eから選択する。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番規定でのL235A、G237A、及び、E318Aをさらに含み得る。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番規定でのS228P、及び、L235Eをさらに含み得る。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG4修飾Fcは、EU付番規定でのS267E、及び、L328Fをさらに含み得る。
あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG4修飾Fcは、EU付番規定でのS228P変異(Angal et al.Mol Immunol.30:105-108(1993))、及び/または、(Peters et al.J Biol Chem.287(29):24525-33(2012))に記載されている1つ以上の変異と組み合わせて、抗体安定性を高め得る。
あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該IgG4修飾Fcは、ヒト血清での抗体半減期を長くする1つ以上の変異(例えば、EU付番規定でのM252Y、S254T、及び、T256E変異の(すべてを含む)1つ以上)をさらに含み得る。
あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのL235Eを含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのS228P変異を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのS267E及びL328F変異を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの特定の実施形態では、当該Fcは、EU付番法でのC127S、F234A、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、E345R、E430G、S440Y、及び、それらのあらゆる組み合わせから選択した残基位置に1つ以上のアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G、L243A、L235A、及び、P331Sにアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G及びP331Sにアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G及びK322Aにアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430にアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E430G及びK322Aにアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置S267E及びL328Fにアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置C127Sにアミノ酸置換を含む。あらゆる当該IgG4修飾Fcの一部の実施形態では、当該Fcは、EU付番法での位置E345R、E430G、及び、S440Yにアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号336のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号328のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号320のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態では、抗体は、C末端リジンを持たないヒトIgG1重鎖を有する。一部の実施形態では、抗体は、P331S変異を有するヒトIgG1重鎖を有する。一部の実施形態では、抗体は、P331S変異を有し、C末端リジンを持たないヒトIgG1重鎖を有する。一部の実施形態では、抗体は、N325S及びL328F変異(N325S/L328F)を有するヒトIgG1重鎖を有する。一部の実施形態では、抗体は、N325S/L328F変異を有し、C末端リジンを持たないヒトIgG1重鎖を有する。一部の実施形態では、抗体は、K322A変異を有するヒトIgG1重鎖を有する。一部の実施形態では、抗体は、K322A変異を有し、C末端リジンを持たないヒトIgG1重鎖を有する。前出の実施形態では、変異を、EU付番法に従って示す。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号337のアミノ酸配列を含む重鎖アミノを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号338のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号339のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号340のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号341のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号342のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号343のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号329のアミノ酸配列を含む重鎖アミノを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号330のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号331のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号332のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号333のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号334のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号335のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号321のアミノ酸配列を含む重鎖アミノを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号322のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号323のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号324のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号325のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号326のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号327のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
(8)その他の抗体修飾
あらゆる抗体の一部の実施形態では、当該抗体は、誘導体である。用語「誘導体」とは、アミノ酸(または、核酸)の挿入、欠失、または、置換以外の化学修飾を含む分子のことを指す。特定の実施形態では、誘導体は、ポリマー、脂質、または、その他の有機もしくは無機部分を有する化学結合などであるが、これらに限定されない共有結合修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾した抗原結合タンパク質は、化学修飾を受けていない抗原結合タンパク質よりも循環半減期を長くすることができる。特定の実施形態では、化学修飾した抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織、及び/または、臓器に対する標的化能力を改善することができる。一部の実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、または、ポリプロピレングリコールなどであるが、これらに限定されない1つ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有結合的に修飾する。例えば、米国特許第4640835号、第4496689号、第4301144号、第4670417号、第4791192号、及び、第4179337号を参照されたい。特定の実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー、または、ランダムコポリマーのいずれか)、ポリ-(N-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、及び、ポリビニルアルコール、ならびに、そのようなポリマーの混合物などであるが、これらに限定されない1つ以上のポリマーを含む。
特定の実施形態では、誘導体は、ポリエチレングリコール(PEG)サブユニットで共有結合的に修飾する。特定の実施形態では、1つ以上の水溶性ポリマーを、誘導体の1つ以上の特定の位置、例えば、アミノ末端に対して結合する。特定の実施形態では、1つ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の1つ以上の側鎖に対してランダムに結合する。特定の実施形態では、PEGを、抗原結合タンパク質の治療能力を改善するために使用する。特定の実施形態では、PEGを、ヒト化抗体の治療能力を改善するために使用する。このような特定の方法は、例えば、米国特許第6133426号で論じられており、本明細書の一部を構成するものとして、同文献を、あらゆる目的のために援用する。
ペプチド類似体は、製薬業界では、テンプレートペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬として一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物(peptide mimetics)」または「ペプチド模倣物(peptidomimetics)」と称されている。本明細書の一部を構成するものとして、あらゆる目的のために援用する、Fauchere,J.Adv.DrugRes.,15:29(1986);及び、Evans et al,J.Med.Chem.,30:1229(1987)。このような化合物は、コンピューター化した分子モデリングを利用して、開発されることが多い。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物を使用して、類似の治療効果、または、予防効果を得ることができる。一般的に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド(すなわち、生化学的特性、または、薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に似ているが、当該技術分野で周知の方法で:-CHNH-、-CHS-、-CH-CH-、-CH=CH-(シス、及び、トランス)、-COCH-、-CH(OH)CH-、及び、-CHSOから選択する結合で任意に置換した1つ以上のペプチド結合を有する。特定の実施形態では、コンセンサス配列の1つ以上のアミノ酸を、同じタイプのD-アミノ酸(例えば、L-リジンの代わりにD-リジン)で体系的に置換すると、安定性が高まったペプチドを生成することができる。加えて、コンセンサス配列、または、実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む固定化したペプチドは、当該技術分野で公知の方法(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.,61:387(1992)、本明細書の一部を構成するものとして、あらゆる目的のために援用する)、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることで、生成することができる。
薬物コンジュゲーションは、生物学的活性細胞毒性(抗がん)ペイロード、または、特定の腫瘍マーカーを特異的に標的とする抗体(例えば、理想的には、腫瘍細胞内、または、腫瘍細胞上にだけ認められるポリペプチド)に対する薬物のカップリングに関与する。抗体は、これらのタンパク質を体内で追跡し、そして、がん細胞の表面に付着する。当該抗体と標的タンパク質(抗原)との間の生化学的反応は、当該腫瘍細胞においてシグナルを発生させ、次いで、当該抗体を、細胞毒素とともに、吸収し、または、内部に取り込む。ADCを内部に取り込んだ後に、細胞毒性薬を放出して、がんを死滅させる。この標的作用により、理想的には、当該薬物の副作用が小さくなり、かつ、その他の化学療法剤よりも治療ウィンドウが広くなる。抗体をコンジュゲートする技術は、当該技術分野で公知である(例えば、Jane de Lartigue OncLive July 5,2012;ADC Review on antibody-drug conjugates;及び、Ducry et al.Bioconjugate Chemistry 21(1):5-13(2010)を参照されたい。
III.核酸、ベクター、及び、宿主細胞
本開示の抗MS4A4A抗体は、例えば、米国特許第4816567号に記載の組換え方法、及び、組成物を使用して生産し得る。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離した核酸を提供する。かかる核酸は、抗MS4A4A抗体のVを含むアミノ酸配列、及び/または、Vを含むアミノ酸配列(例えば、当該抗体の軽鎖、及び/または、重鎖)をコードし得る。一部の実施形態では、かかる核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)を提供する。一部の実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、(1)当該抗体のVを含むアミノ酸配列、及び、当該抗体のVを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)当該抗体のVを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、及び、当該抗体のVを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、形質導入している)。一部の実施形態では、当該宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または、リンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。また、本開示の宿主細胞として、単離した細胞、インビトロで培養した細胞、及び、エクスビボで培養した細胞があるが、これらに限定されない。
本開示の抗MS4A4A抗体を作り出す方法を提供する。一部の実施形態では、当該方法は、抗MS4A4A抗体をコードする核酸を含有する本開示の宿主細胞を、当該抗体の発現に好適な条件下で培養することを含む。一部の実施形態では、当該抗体を、その後に、宿主細胞(または、宿主細胞培養培地)から回収する。
本開示の抗MS4A4A抗体を組換え生産するために、抗MS4A4A抗体をコードする核酸を単離し、そして、宿主細胞でのさらなるクローニング、及び/または、発現のために、1つ以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、当該抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離を行い、そして、配列決定し得る。
本開示の抗MS4A4A抗体、または、細胞表面で発現したそのフラグメント、または、ポリペプチド、本明細書に記載したポリペプチド(抗体を含む)のいずれかをコードする核酸配列を含有する好適なベクターとして、クローニングベクター、及び、発現ベクターがあるが、これらに限定されない。好適なクローニングベクターは、標準的技法に従って構築することができ、または、当該技術分野において入手可能な数多くのクローニングベクターから選択し得る。選択するクローニングベクターは、使用予定の宿主細胞に応じて変わり得るが、有用なクローニングベクターは、一般的に、自己複製能を有しており、特定の制限エンドヌクレアーゼのための単一の標的を有することができ、及び/または、当該ベクターを含むクローンの選択に用いることができるマーカーの遺伝子を保持し得る。好適な例として、プラスミド、及び、細菌ウイルス、例えば、pUC18、pUC19、Bluescript(例えば、pBS SK+)、及び、その誘導体、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、ファージDNA、ならびに、pSA3、及び、pAT28などのシャトルベクターがある。これらのクローニングベクター、及び、数多くのその他のクローニングベクターは、BioRad、Strategene、及び、Invitrogenなどの業者から入手可能である。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞として、原核細胞または真核細胞がある。例えば、本開示の抗MS4A4A抗体は、特に、グリコシル化、及びFcエフェクター機能を必要としない場合には、細菌において生産し得る。細菌での抗体フラグメント、及び、ポリペプチドの発現については、(例えば、米国特許第5648237号、第5789199号、及び、第5840523号。発現の後に、当該抗体を、可溶性画分での細菌細胞ペーストから単離し、そして、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主であり、このようなものとして、グリコシル化経路を「ヒト化」して、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体を生産する真菌株及び酵母株がある(例えば、Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004);及び、Li et al,Nat.Biotech.24:210-215(2006))。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物、及び、脊椎動物)から得ることもできる。無脊椎動物細胞の例として、植物細胞、及び、昆虫細胞がある。昆虫細胞とともに、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションに使用することができる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。また、植物細胞培養物も、宿主として利用することができる(例えば、トランスジェニック植物で抗体を生産するためのPLANTIBODIES(商標)技術について記載している米国特許第5959177号、第6040498号、第6420548号、第7125978号、及び、第6417429号)。
また、脊椎動物細胞も、宿主として使用し得る。例えば、懸濁液で成長するように適合させた哺乳動物細胞株が有用である。有用な宿主哺乳動物細胞株のその他の例として、SV40で形質転換したサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胚性腎臓株(293細胞、または、例えば、Graham et al,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載されているような293細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)に記載されたTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);イヌ科腎臓細胞(MDCK;バッファローラット肝細胞(BRL 3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝細胞(Hep G2);マウス乳腺腫瘍(MMT 060562);例えば、Mather et al,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)に記載のTRI細胞;MRC5細胞;及びFS4細胞がある。その他の有用な宿主哺乳動物細胞株として、DHFR-CHO細胞(Urlaub et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))などのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;ならびに、Y0,NS0、及び、Sp2/0などの骨髄腫細胞株がある。抗体生産に好適な特定の宿主哺乳動物細胞株の総説については、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)を参照されたい。
IV.医薬組成物/製剤
本明細書では、本開示の抗MS4A4A抗体、及び、医薬として許容可能な担体を含む医薬組成物、及び/または、医薬製剤を提供する。
一部の実施形態では、医薬として許容可能な担体は、好ましくは、使用する用量、及び、濃度でレシピエントに対して無毒である。本明細書に記載の抗体は、固体、半固体、液体、または、気体の形態の調製物に製剤し得る。このような製剤の例として、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、及び、エアロゾル剤があるが、これらに限定されない。医薬として許容可能な担体は、所望の製剤に応じて、動物またはヒト投与のための医薬組成物を製剤するために一般的に使用するビヒクルである、医薬として許容可能な非毒性の希釈剤の担体を含み得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のpH、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着または浸透を改変、維持、または、保存するための製剤材料を含むことができる。
特定の実施形態では、医薬として許容可能な担体として、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、または、リジンなど);抗菌剤;酸化防止剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または、亜硫酸水素ナトリウム);緩衝剤(ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩、または、その他の有機酸など);増量剤(マンニトール、または、グリシンなど);キレート剤(エチレンジアミン四酢酸(EDTA)など);錯化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリン、または、ヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリンなど);増量剤;単糖類;二糖類;及び、その他の炭水化物(グルコース、マンノース、または、デキストリンなど);タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、または、免疫グロブリンなど);着色剤、矯味矯臭剤、及び、希釈剤;乳化剤;親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンなど);低分子量ポリペプチド;塩を形成する対イオン(ナトリウムなど);防腐剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または、過酸化水素など);溶媒(グリセリン、プロピレングリコール、または、ポリエチレングリコールなど);糖アルコール(マンニトール、または、ソルビトールなど);懸濁剤;界面活性剤、または、湿潤剤(プルロニック(登録商標)、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど);安定性増強剤(スクロース、または、ソルビトールなど);等張化増強剤(アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど);送達媒体;希釈剤;賦形剤、及び/または、医薬用アジュバントがあるが、これらに限定されない。様々な種類の投与に適した製剤のさらななる例は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press 22nd ed.(2013)に認められる。薬物送達法の簡潔な総説については、Langer,Science 249:1527-1533(1990)を参照されたい。
非経口投与に好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び、製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性及び非水性の等張性無菌注射液剤と、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び、防腐剤を含むことができる水性及び非水性の無菌懸濁剤とがある。
製剤を、脳または中枢神経系で保持し、そして、安定させるように最適化し得る。作用物質を頭蓋区画に投与すると、その作用物質が、その区画内に保持され、拡散せず、または、拡散しても血液脳関門を通過しないことが望ましい。安定化技法として、分子量の増大を達成するために、架橋、多量体化、または、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、中性タンパク質担体などの基への結合などがある。
保持を確実ならしめるためのその他の方策として、生分解性または生体侵食性インプラントへの本開示の抗MS4A4A抗体の封じ込めがある。治療的活性物質の放出速度は、ポリマーマトリックスを介した輸送速度、及び、インプラントの生分解速度によって制御される。インプラントは、粒子、シート、パッチ、プラーク、繊維、マイクロカプセルなどとし得るものであり、また、選択した挿入部位に適合するあらゆるサイズまたは形状とし得る。使用し得る生分解性ポリマー組成物は、分解したときにモノマーなど、生理学的に許容可能な分解生成物を生成する有機エステルまたはエーテルとし得る。無水物、アミド、オルトエステルなどを、単独で、または、その他のモノマーと組み合わせて使用し得る。これらのポリマーを、縮合ポリマーとし得る。これらのポリマーは、架橋したもの、または、未架橋のものとし得る。特に対象となるものは、ホモポリマーまたはコポリマーのいずれかであるヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、それに、多糖である。対象となるポリエステルとして、D-乳酸、L-乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、ポリカプロラクトン、及び、これらの組み合わせのポリマーがある。対象となる多糖として、アルギン酸カルシウム、及び、官能化セルロース、特に、非水溶性であり、分子量が約5kD~500kDであることを特徴とするカルボキシメチルセルロースエステルなどがある。生分解性ヒドロゲルも、本開示のインプラントに採用し得る。ヒドロゲルとは、一般的に、液体を吸収する能力を特徴とするコポリマー材料である。
V.治療用途
本明細書で開示したように、本開示の抗MS4A4A抗体は、疾患及び障害を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを治療するために使用し得る。一部の実施形態では、本開示の抗MS4A4A抗体は、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び認知障害を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれらを治療する上で有効である。
疾患標的としてのMS4A4A
ゲノムワイド関連研究は、MS4Aファミリーの様々なメンバーが、アルツハイマー病に関連していることを確認している。これらは、MS4A2、MS4A3、MS4A4A、MS4A4E、MS4A6A、及び、MS4A6Eである。関連するSNPは、MS4A6Aの3’UTR(rs610932)、及び、MS4A4EとMS4A6Aとの間の遺伝子間領域(rs670139)で認められる。MS4A遺伝子クラスターの3つのSNPは、遅発性アルツハイマー病のリスクの高まりと関連している。これらには、MS4A4Aのrs4938933、MS4A4Eのrs670139、及び、MS4A6Aのrs610932などがある(Hollingworth et al,2011,Nat Genetics,43:429-435;Naj et al,2011,Nature Genetics,43:436-441;Antunez et al,2011,Genome Medicine,3、article 33)。加えて、MS4A4A遺伝子座のSNP(rs2304933、及び、rs2304935)は、MS4A4Aのレベルが高くまること、また、遅発性アルツハイマー病(LOAD)などのアルツハイマー病のリスクが高くなることと関連していた(Allen et al,2012,Neurology,79:221-228)。
本明細書で提供する方法は、神経変性疾患、障害、または、病態の予防、そのリスクの抑制、またはそれを有する個体の治療における用途を見出す。一部の実施形態では、本開示は、神経変性障害を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、アルツハイマー病を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、遅発性アルツハイマー病を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、軽度認知機能障害を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、MS4A4Aの過剰発現または活性の増大に関連する疾患、障害、または、病態を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、CSF1R欠損疾患または障害を予防する、そのリスクを抑制する、または、それを有する個体を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、それを必要とする個体に対して、治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。一部の実施形態では、CSF1R欠損疾患または障害は、軸索スフェロイド及び色素性グリアを伴う成人発症性白質脳症(ALSP)またはスフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症(HDLS)である。
本開示のその他の態様は、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、血管性認知症、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、外傷性脳損傷、脊髄損傷、長期鬱病、動脈硬化性血管疾患、正常な老化の望ましくない症状、認知症、混合型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、正常圧水頭症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、タウパチー病、脳卒中、急性外傷、慢性外傷、狼瘡、急性及び慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、マラリア、本態性振戦、中枢神経系ループス、ベーチェット病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、変性椎間板疾患、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核神経節変性症、急性播種性脳脊髄炎、肉芽腫性障害、サルコイドーシス、加齢性疾患、加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、網膜変性、気道感染症、敗血症、眼感染症、全身感染症、炎症性障害、関節炎、多発性硬化症、代謝障害、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、組織または血管の損傷、外傷、炎症性細胞の破片またはタンパク質凝集体、異常な循環骨髄細胞、不健康な老化、加齢性認識機能障害、加齢性脳萎縮、炎症やニューロン脱落などであるが、これらに限定されない加齢関連形質、及び、高齢者の前頭大脳皮質の認知障害など、公知の脳疾患が認められない認知障害などの認知障害、及び、正常な老化の1つ以上の望ましくない症状からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、当該個体に対して、前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体の治療有効量を投与することを含む、当該方法に関する。本開示のその他の態様は、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、外傷性脳損傷、脊髄損傷、長期鬱病、動脈硬化性血管疾患、正常な老化の望ましくない症状、認知症、混合型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、正常圧水頭症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、タウパチー病、脳卒中、急性外傷、慢性外傷、狼瘡、急性及び慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、マラリア、本態性振戦、中枢神経系ループス、ベーチェット病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、変性椎間板疾患、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核神経節変性症、急性播種性脳脊髄炎、肉芽腫性障害、サルコイドーシス、加齢性疾患、加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、網膜変性、気道感染症、敗血症、眼感染症、全身感染症、炎症性障害、関節炎、多発性硬化症、代謝障害、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、組織または血管の損傷、外傷、炎症性細胞の破片またはタンパク質凝集体、異常な循環骨髄細胞、不健康な老化、加齢性認識機能障害、加齢性脳萎縮、炎症やニューロン脱落などであるが、これらに限定されない加齢関連形質、及び、高齢者の前頭大脳皮質の認知障害など、公知の脳疾患が認められない認知障害などの認知障害、及び、正常な老化の1つ以上の望ましくない症状からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷の予防、そのリスクの抑制、またはそれを有する個体の治療における使用のための前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体に関する。本開示のその他の態様は、転移の予防または抑制のために使用するための前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体に関する。本開示のその他の態様は、がんの予防、そのリスクの抑制、またはそれを有する個体の治療に使用するための前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体に関する。
本開示のその他の態様は、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、軽度認知機能障害、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、外傷性脳損傷、脊髄損傷、長期鬱病、動脈硬化性血管疾患、正常な老化の望ましくない症状、認知症、混合型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、正常圧水頭症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、タウパチー病、脳卒中、急性外傷、慢性外傷、狼瘡、急性及び慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、マラリア、本態性振戦、中枢神経系ループス、ベーチェット病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、変性椎間板疾患、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核神経節変性症、急性播種性脳脊髄炎、肉芽腫性障害、サルコイドーシス、加齢性疾患、加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、網膜変性、気道感染症、敗血症、眼感染症、全身感染症、炎症性障害、関節炎、多発性硬化症、代謝障害、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、組織または血管の損傷、外傷、炎症性細胞の破片またはタンパク質凝集体、異常な循環骨髄細胞、不健康な老化、加齢性認識機能障害、加齢性脳萎縮、炎症やニューロン脱落などであるが、これらに限定されない加齢関連形質、及び、高齢者の前頭大脳皮質の認知障害など、公知の脳疾患が認められない認知障害などの認知障害、及び、正常な老化の1つ以上の望ましくない症状からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療するための医薬の製造における、前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体の使用に関する。本開示のその他の態様は、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、軽度認知機能障害、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、認知症、脳卒中、パーキンソン病、急性播種性脳脊髄炎、網膜変性、加齢性黄斑変性症、緑内障、多発性硬化症、敗血症ショック、細菌感染、関節炎、及び、変形性関節症からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法に関に関するものであり、当該方法は、個体に対して、前出の実施形態のいずれか治療有効量の抗MS4A4A抗体を投与することを含む。本開示のその他の態様は、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、軽度認知機能障害、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、認知症、脳卒中、パーキンソン病、急性播種性脳脊髄炎、網膜変性、加齢性黄斑変性症、緑内障、多発性硬化症、敗血症ショック、細菌感染、関節炎、及び、変形性関節症からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷の予防、そのリスクの抑制、またはそれを有する個体の治療のために使用する前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体に関する。本開示のその他の態様は、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、アルツハイマー病、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷、認知症、脳卒中、パーキンソン病、急性播種性脳脊髄炎、網膜変性、加齢性黄斑変性症、緑内障、多発性硬化症、敗血症ショック、細菌感染、関節炎、及び、変形性関節症からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する医薬の製造における、前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体の使用に関する。
一部の実施形態では、対象または個体は、哺乳動物である。哺乳動物として、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及び、ウマ)、霊長類(例えば、ヒト、そして、サルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、齧歯類(例えば、マウス、及び、ラット)があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、当該対象または個体は、ヒトである。
本明細書で提供する抗体(及び、あらゆるさらなる治療薬)を、非経口、肺内、鼻腔内、病巣内投与、脳脊髄内、頭蓋内、髄腔内、滑膜内、髄腔内、経口、局所、または、吸入経路などのあらゆる適切な手段で投与することができる。非経口注入として、ボーラスとしての筋肉内、静脈内投与、または、一定期間にわたる持続注入、動脈内、関節内、腹腔内、または、皮下投与がある。一部の実施形態では、当該投与は、静脈内投与である。一部の実施形態では、当該投与を、皮下にする。投与時間の長短をも加味して、投与は、適切な経路、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射で実施できる。本明細書では、単回投与、または、様々な時点に及ぶ複数回投与、ボーラス投与、及び、パルス注入などであるが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールを企図している。
本明細書で提供する抗体は、優れた医療行為と一致する方法で、製剤、投薬、及び、投与する。この関連で考慮すべき要素として、治療する特定の障害、治療を受ける特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び、開業医に公知のその他の要素がある。当該抗体は、必須ではないが、問題の障害の予防または治療のために現在利用されている1つ以上の作用物質を用いて、任意に製剤する。そのようなその他の作用物質の有効量は、製剤に存在する抗体の量、障害または治療の種類、及び、先述した考察でのその他の要素によって定まる。これらは、一般的には、本明細書に記載したのと同じ用量、及び、投与経路で、または、本明細書に記載した用量の約1~99%、または、あらゆる用量で、かつ、経験的/臨床的に適切であると決定したあらゆる経路で使用する。
疾患の予防または治療のための(単独で、または、1つ以上のその他のさらなる治療剤と組み合わせて使用する場合の)本開示の抗体の適切な用量は、治療する疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度と経過、当該抗体を予防または治療のいずれの目的で投与するのかの区別、従前の治療、患者の病歴と抗体に対する反応、及び、主治医の裁量によって定まる。当該抗体を、一度に、または、一連の治療において、適切に患者に対して投与する。
疾患の種類、及び、重症度に応じて、約1μg/kg~100mg/kgの抗体を、例えば、1回以上の別々の投与、または、持続注入のいずれかで、当該患者に対して投与する最初の候補用量とすることができる。上記した要素に応じて、ある一般的な1日用量を、約1μg/kg~100mg/kg以上の範囲とし得る。病態に応じて、数日以上の反復投与に関しては、一般的に、治療は、疾患症状に所望の抑制が認められるまで続ける。当該抗体のある例示的な用量は、約0.05mg/kg~約150mg/kgの範囲であり、そのような用量を、断続的に、例えば、毎週、または、3週間ごと(例えば、当該患者が、約2~約20用量、または、例えば、約6用量の抗体の投与を受けるよう)に投与し得る。特定の実施形態では、投薬頻度は、1日3回、1日2回、1日1回、隔日1回、週1回、2週間に1回、4週間に1回、5週間に1回、6週間に1回、7週間に1回、8週間に1回、9週間に1回、10週間に1回、または、月1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、または、それ以上である。最初に高負荷用量を、続いて、1回以上の低用量を投与し得る。しかしながら、その他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進行状況は、従来の技術とアッセイで容易にモニターできる。
VI.診断用途
あらゆる抗体の一部の実施形態では、本明細書で提供するあらゆる抗MS4A4A抗体は、試料または個体でのMS4A4Aの存在を検出する上で有用である。本明細書で使用する用語「検出する」とは、定量的または定性的検出を含む。本明細書では、個体、または、個体に由来する組織試料でのMS4A4Aの検出など、診断目的で本開示の抗体を使用する方法を提供する。一部の実施形態では、当該個体は、ヒトである。
当該検出方法は、抗原に結合した抗体の定量が関与し得る。生物学的試料での抗体検出は、免疫蛍光顕微鏡、免疫細胞化学、免疫組織化学、ELISA、FACS分析、免疫沈降、または、マイクロ陽電子放射断層撮影など、当該技術分野で公知のあらゆる方法で行い得る。特定の実施形態では、当該抗体を、例えば、18Fで放射性標識し、次いで、マイクロ陽電子放出断層撮影分析を利用して検出する。また、抗体結合も、陽電子放出断層撮影(PET)、X線コンピューター断層撮影、単一光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)、コンピューター断層撮影(CT)、及び、コンピューター断層撮影(CAT)などの非侵襲的手法で、患者において定量し得る。
VII.製造物
本明細書では、本明細書で説明した抗MS4A4A抗体を含む製造物(例えば、キット)を提供する。製造物は、本明細書に記載した抗体を含む1つ以上の容器を含み得る。容器は、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装(例えば、密封したMylar、または、プラスチックバッグ)などであるが、これらに限定されない、あらゆる適切な包装とし得る。これらの容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば、複数用量パッケージ)、または、サブユニット用量とし得る。
一部の実施形態では、これらのキットは、第2の作用物質をさらに含み得る。一部の実施形態では、当該第2の作用物質は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及び、デキストロース溶液などであるが、これらに限定されない、医薬として許容可能な緩衝剤または希釈剤である。一部の実施形態では、当該第2の作用物質は、医薬として活性な作用物質である。
あらゆる製造物の一部の実施形態では、当該製造物は、本開示の方法に従って使用するための指示書をさらに含む。一般的に、当該指示書は、意図した治療のための用量、投薬スケジュール、及び、投与経路に関する情報を含む。一部の実施形態では、これらの指示書は、本開示のあらゆる方法に従って、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、認知障害または認識機能障害、軽度認知機能障害、血管性認知症、血管性認知症、発作、網膜ジストロフィー、外傷性脳損傷、脊髄損傷、長期鬱病、動脈硬化性血管疾患、正常な老化の望ましくない症状、認知症、混合型認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、正常圧水頭症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、タウパチー病、脳卒中、急性外傷、慢性外傷、狼瘡、急性及び慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、マラリア、本態性振戦、中枢神経系ループス、ベーチェット病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、変性椎間板疾患、シャイ・ドレーガー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核神経節変性症、急性播種性脳脊髄炎、肉芽腫性障害、サルコイドーシス、加齢性疾患、加齢性黄斑変性症、緑内障、網膜色素変性症、網膜変性、気道感染症、敗血症、眼感染症、全身感染症、炎症性障害、関節炎、多発性硬化症、代謝障害、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病、組織または血管の損傷、外傷、炎症性細胞の破片またはタンパク質凝集体、異常な循環骨髄細胞、不健康な老化、加齢性認識機能障害、加齢性脳萎縮、炎症やニューロン脱落などであるが、これらに限定されない加齢関連形質、及び、高齢者の前頭大脳皮質の認知障害など、公知の脳疾患が認められない認知障害などの認知障害、及び、正常な老化の1つ以上の望ましくない症状から選択する疾患、障害、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療するための、本開示の単離した抗体(例えば、本明細書で説明した抗MS4A4A抗体)の投与であって、当該個体に対して、前出の実施形態のいずれかの抗MS4A4A抗体の治療有効量を投与することを含む、当該投与に関する説明を含む。
一部の実施形態では、当該指示書は、抗MS4A4A抗体、及び、第2の作用物質(例えば、医薬として活性な第2の作用物質)の使用に関する説明を含む。
以下の実施例を参照することで、本開示の理解は十分に深まる。しかしながら、それらを、本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本開示全体でのすべての引用を、本明細書の一部を構成するものとして、明示的に援用する。
実施例1:マウス抗MS4A4Aマウス抗体のヒト化
本実施例の目的は、国際特許出願第PCT/US2019/016156号で開示されている特定の親マウス抗MS4A4A抗体のヒト化バリアントの生成であった。
親マウス抗MS4A4A抗体4A-202は:
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGATHPGHGDTRYTQKFKGKATLSADKSSSTAYMQLSNLASEDSAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDVWGRGTLVTVSS(配列番号164)
のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPPTFGGGTKLEIK(配列番号165)
のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
親マウス抗MS4A4A4A-18は:
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPTNGGTNYNERFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAYYYGSSLFAYWGQGTLVTVSS(配列番号166)
のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWSQQKPGQSPKLLIYSASYRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSTYPWTFGGGTKLEIK(配列番号167)
のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
親マウス抗MS4A4A抗体4A-21は:
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTSYGLSWVKQTPGKGLKWMGWINTYSGVPTYANDFKGRFAFSLETSASTTYLRINNLKNDDTATYFCARSLVDYWGQGTPLTVSS(配列番号168)
のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
DVVMTQTPFTLSVTIGQSASISCKSSQSLLYSDGKTYLSWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGIDFHQTFGGGTKLEIK(配列番号169)
のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
親マウス抗MS4A4A抗体4A-25は:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSDMGVGWVRQPSGEGLEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRANYGNLFDYWGQGTAVTVSS(配列番号170)
のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYLTFGSGTKLEIK(配列番号171)
のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
非ヒト抗体をヒト化する1つの方法は、非ヒト(例えば、マウス)抗体由来のCDRを、ヒト抗体アクセプターフレームワークに移植することである。そのようなCDR移植を行うと、そのフレームワークの変動に起因して、その標的に対するヒト化抗体の親和性の減弱または完全な喪失を招き得る。結果として、ヒトフレームワークでの特定のアミノ酸残基を、マウス抗体フレームワークの対応する位置のアミノ酸残基で置換(逆変異)して、低下または喪失した親和性を回復させる必要があり得る。したがって、選択したヒト抗体生殖細胞系列アクセプターフレームワークの関連で置換するアミノ酸残基は、ヒト化抗体が機能及びパラトープを実質的に保持しておくように決定しなければならない。加えて、良好な製造可能性及び下流発達のための、熱安定性及び溶解性の保持または改善が望まれる。
したがって、MOE(Molecular Operating Environment,Chemical Computing Group,Montreal,Canada)のBioMOEモジュールを使用して、構造ベースの抗体モデリングを、マウス抗MS4A4Aモノクローナル抗体4A-202、4A-18、4A-21、及び4A-25をヒト化するプロセスに適用した。簡潔に説明すると、ヒト化するマウスモノクローナル抗体のVH及びVLアミノ酸配列を、IMGT(http://www.imgt.org/)から取得したヒトVL、VH、LJ、HJ機能性生殖細胞系列アミノ酸配列と比較した。偽遺伝子とORFは分析から除外した。1つのマウスモノクローナル抗体(クエリー)ごとに、最も類似した5つのVLと、最も類似した5つのVH生殖細胞系列アミノ酸配列を選択し、そして、最も類似したVJ及びHJ遺伝子を組み合わせると、25個のヒト化アミノ酸配列が生成された。ヒトのフレームワークに移植するCDRは、AbMの定義(http://www.bioinf.org。Uk/abs/#cdrdef)に従って定義した。
このクエリーと、25個のヒト化アミノ酸配列を使用して、BioMOEモジュールまたはMOEのAntibody Modelerモジュール(Molecular Operating Environment,Chemical Computing Group,Montreal,Canada)を利用して、Fv相同性モデルを作成した。AMBER10:EHT力場分析は、抗体相同性モデリングプロセスを介したエネルギー最小化のために使用した。得たFv相同性モデルに基づいて、VLとVHとの間の相互作用エネルギー、座標をベースとした等電点(3Dpi)、疎水性パッチ、及び帯電表面積などの分子記述子を、MOEが提供するスコアリングメトリクスによって計算、分析、及び選別した。これらの分子記述子を利用して、タンパク質発現、精製、結合親和性研究、及び機能アッセイなどの下流の実験手順に向けてヒト化モノクローナル抗体に優先順位を付けた。
MOEのBioMOEモジュールは、逆変異の可能性のある残基を視覚化及び分類するためのツールであるMutation Site Propertiesを提供する。これに関連して、逆変異を、ヒト化したアミノ酸配列を置き換える当初のクエリーアミノ酸配列に戻すアミノ酸置換として定義する。このツールを使用して、当初のクエリー(リファレンス)を、3D Fv相同性モデルの1次アミノ酸配列と3D構造の両方について選択したヒト化バリアントと個別に比較した。
リファレンス(すなわち、親)抗体とヒト化バリアントとの間の変化を、アミノ酸タイプの差異、CDR残基との相互作用ポテンシャル、VL/VHペアリングについての影響ポテンシャル、ならびにCDRの内部及び近傍での疎水性及び荷電表面積の潜在的な変化に基づいて分類した。
有意な電荷の差異を有する、または強いH結合相互作用を含むCDRまたはVL/VH界面の近傍での変異を個別に評価し、そして、有意に攪乱を示す変異を、当初のクエリー残基に戻した。その結果、ヒト化アミノ酸配列は、最大で5つの逆変異を含み得る。可変重鎖及び可変軽鎖クエリーマウスモノクローナル抗体(マウス抗MS4A4A抗体4A-202、マウス抗MS4A4A抗体4A-18、マウス抗MS4A4A抗体4A-21、及びマウス抗MS4A4A抗体4A-25)、ならびに逆変異を有する、または有していないヒト化モノクローナル抗体のアミノ酸配列を、以下の表1~4に示す。表1~4では、CDR配列(Kabat)に、下線を付けている。
Figure 2022542964000003
Figure 2022542964000004
Figure 2022542964000005
Figure 2022542964000006
Figure 2022542964000007
Figure 2022542964000008
Figure 2022542964000009
Figure 2022542964000010
Figure 2022542964000011
Figure 2022542964000012
Figure 2022542964000013
Figure 2022542964000014
Figure 2022542964000015
Figure 2022542964000016
Figure 2022542964000017
Figure 2022542964000018
Figure 2022542964000019
Figure 2022542964000020
Figure 2022542964000021
Figure 2022542964000022
本開示の抗MS4A4A抗体に関して、KabatによるCDR配列を、以下の表5~8に提供する。
Figure 2022542964000023
Figure 2022542964000024
Figure 2022542964000025
Figure 2022542964000026
Figure 2022542964000027
Figure 2022542964000028
Figure 2022542964000029
Figure 2022542964000030
Figure 2022542964000031
Figure 2022542964000032
Figure 2022542964000033
Figure 2022542964000034
Figure 2022542964000035
実施例2:組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドの調製
ヒトMS4A4Aの一次アミノ酸配列(配列番号1)を分析して、その二次及び三次構造に関する情報を提供した。ヒトMS4A4Aタンパク質には4つの膜貫通ドメイン(TMD)があり、それぞれのTMDは、21個のアミノ酸で構成されている。アミノ酸組成、残基数、及び脂質二重層の厚みから考えて、MS4A4Aは、N末端からC末端に向けて、TMD1とTMD2、及びTMD3とTMD4のそれぞれを接続する2つの余分な細胞ループ(ECL)を備えた4ヘリックスバンドル(4HB)を含むものと予測される(図1を参照されたい)。図1は、ヒトMS4A4Aの一次アミノ酸配列を示しており。細胞内ドメインをイタリック体で記載しており、膜貫通ドメインには下線を付けており、また、2つの細胞外ループは、太字のイタリック体で記載している。
可溶性4HBスキャホールドタンパク質(これらは、MS4A4Aの形状と構成を模倣すると考えられている)の2つのテンプレート構造を、RCSB Protein Data Bank(http://www(dot)rcsb(dot)org/)を使用して識別した。これらのタンパク質スキャホールドのPDB_IDは、1P68と1M6Tである。図2A、図2B、及び図2Cは、2つの可溶性4ヘリックスバンドルスキャホールド(PDB_ID:1P68及びPDB_ID:1M6T)の構造と一次アミノ酸配列を示す。図2Aでは、膜貫通ドメインは、螺旋状の構造になっている;図2B及び図2Cでは、膜貫通ドメインは、1P68及び1M6Tの対応するアミノ酸配列において下線を付けている。
ヒトMS4A4Aの2つのECLのアミノ酸配列を、1P68に組換え的に配置して、ポリペプチドJS1及びポリペプチドJS4(ポリペプチドJS1のネガティブコントロール)をもたらし、また、1M6Tに配置して、ポリペプチドJS5、ポリペプチドJS6;及び、ポリペプチドJS10(ポリペプチドJS5及びポリペプチドJS6のネガティブコントロールとして機能する)をもたらした。(図3を参照されたい。)図3Aは、ポリペプチドJS1、ポリペプチドJS5、及びポリペプチドJS6のアミノ酸配列を示す。図3Bは、ネガティブコントロールポリペプチドJS4及びネガティブコントロールポリペプチドJS10のアミノ酸配列を示す。これらのタンパク質/ポリペプチドスキャホールドをコードする核酸を、それぞれ、3’hisタグとAviタグを備えたpcDNA3.4発現ベクターに挿入した。得たクローンをExpi293細胞で発現させ、そして、製造業者のプロトコルを使用して、Ni-NTAアガロース(QIAGENカタログ番号30230)で精製した。抗体結合の特徴決定のための可溶性試薬として使用するためのMS4A4Aの2つのECLの構造と機能を模倣する可溶性タンパク質を得るために、これらの組換えMS4A4A可溶性ポリペプチド(別名、ループグラフト抗原)を製造した。
実施例3:ペプチド結合による抗MS4A4A抗体のエピトープ決定
抗MS4A4A抗体4A-21のエピトープ結合の特徴を、次のようにして決定した。まず、ヒトMS4A4A(配列番号1)の細胞外ループ(ECL)に由来する重複ペプチドのパネルを、JPTペプチド(Berlin,Germany)で合成した。これらのペプチドは、15アミノ酸長であり、それぞれに、2個のアミノ酸を補った。これらのペプチドを、N末端でビオチン化した。ペプチド4A.1~4A.4は、ヒトMS4A4A ECL1と、その周辺領域に由来するものであった。ペプチド4A.5~4A.12は、ヒトMS4A4A ECL2と、その周辺領域に由来するものであった。
当該ペプチドライブラリーを、Continuous Flow Microspotter(CFM)を使用して、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ(Xantec SAD50M,Dusseldorf,Germany)に印刷した。まず、このチップを、100mM MES、pH5.5、100μL EDC(最終濃度133mM)、100μLのS-NHS(最終濃度33.3mM)を用いて活性化した。当該ペプチドライブラリーを、1mg/ml BSA、及び、1μg/mlマウスIgG-ビオチンを含むHBS-EP+緩衝剤(Teknovaカタログ番号H8022)で希釈した250nM/ペプチドで、チップに固定化した。固定化の後に、当該チップの表面を、1Mエタノールアミンで、pH8.5で、10分間かけて不活性化した。ハイブリドーマ上清、及び、精製した抗MS4A4A抗体を、1mg/ml BSAを含むHBS-EP+緩衝剤で希釈し、そして、チップに注入した。再現性を確保するために、それぞれの抗MS4A4A抗体の重複測定を行った。それぞれのペプチド-抗体の組み合わせに対して結合の特徴決定を行い、それぞれの抗体が相互作用する線形ペプチド領域のマッピングを可能にする。
抗MS4A4A抗体4A-21、及び、市販の抗MS4A4A抗体5C12は、以下の表9において太字で示したように、ヒトMS4A4A ECL2の領域に対応するペプチドに対して強固な結合を示した。抗MS4A4A抗体4A-21は、ペプチド4A.5~4A.9に結合し、ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基155~177に及ぶ。抗MS4A4A抗体5C12は、ペプチド4A.6~4A.9に結合し、ヒトMS4A4Aのアミノ酸残基157~177に及ぶ。これら2つの抗体の結合領域は、重複しているが同一ではなく、このことは、ヒトMS4A4AのECL2内での異なる残基と相互作用することを示している。これらの2つの抗体のいずれも、上記した方法論を使用しても、ヒトMS4A4A ECL1に対する結合を示さなかった。
Figure 2022542964000036
実施例4:ヒトMS4A4A細胞外ドメインに対応するペプチドに対して結合する抗MS4A4A抗体
抗MS4A4Aハイブリドーマ上清(原体)、または、精製したmIgG(5μg/ml)を、ECL1(配列番号1のヒトMS4A4Aのアミノ酸残基86~98)、及び、ECL2(配列番号1のヒトMS4A4Aのアミノ酸残基159~179)に対応するヒトMS4A4Aペプチドに対する結合に関して、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を使用して試験した。簡潔に説明すると、96ウェルポリスチレンプレートを、2または10μg/mlの合成物不含ペプチド、または、BSAコンジュゲートペプチドを含むコーティング緩衝剤(0.05M炭酸塩緩衝剤、pH9.6,Millipore Sigmaカタログ番号C3041)で、4℃で、一晩、コーティングした。次いで、コーティングしたプレートを、ELISA希釈剤(PBS+0.5% BSA+0.05% Tween(登録商標)20)で、1時間、ブロックし、PBST(PBS+0.05% Tween20、Thermoカタログ番号28352)の3×300μLで洗浄した後に、これらの抗体を、プレートに加えた(50μl/ウェル)。30分間インキュベーション(室温、震盪)した後に、これらのプレートを、PBSTの3×300μLで洗浄した。二次抗マウスHRP抗体(Jackson Immunoresearchカタログ番号115-035-003)を、ELISA希釈剤(50μl/ウェル)で、1:1000希釈で、そして、震盪しながら、室温で、30分間、インキュベーションした。最後の洗浄セット(PBSTで3×300μL)の後に、50μLのTMB基質(BioFxカタログ番号TMBW-1000-01)を加え、そして、5~10分後に、50μLの反応停止液(BioFxカタログ番号BSTP-1000-01)で反応を停止させた。反応停止させた反応ウェルを、GEN5 2.04ソフトウェアを使用して、BioTek Synergyマイクロプレートリーダーで、650nmの吸光度で検出した。
精製した抗MS4A4Aマウス抗体、及び3つの市販のマウス抗MS4A4A抗体(5C12、3F2、及び、4H2)を試験した。マウス抗MS4A4A抗体(4A-21、4A-25、4A-202、及び、4A-214)は、無関係のネガティブペプチドコントロールであるBSAマウスDAP12で認められたものと比較して、huMS4A4A-ELC2不含ペプチドに対して強力に結合した。3つの市販の抗MS4A4A抗体は、ヒトMS4A4A ECL1、及びECL2ペプチドに対する結合を示さなかった。
実施例5:抗MS4A4A抗体のエピトープ決定
MS4A4Aの一次アミノ酸配列は、その二次及び三次構造に関する重要な情報を提供する。当該MS4A4Aタンパク質は、4回膜貫通ドメイン(TMD)を有しており、それぞれのTMDは、21個のアミノ酸から構成されている。一般的なTMDは、厚さが約40Åのホスホジエステル脂質二重層からなる。当該リン酸の頭部は、細胞外、または、細胞質スペースのいずれかで、親水性環境と相互作用する親水性層を作り出しており、また、当該脂質の尾部は、TMDの親油性残基と相互作用する内部脂質二重層を作り出す。当該TMD脂質二重層の厚さは、約32~34Åである。アミノ酸組成、残基数、及び、脂質二重層の厚みから予測すると、MS4A4Aは、N末端からC末端にかけて、それぞれ、TMD1とTMD2、そして、TMD3とTMD4とを接続している2つの余分な細胞ループ(ECL)を有する4ヘリックスバンドル(4HB)を含むものと考えられる。4ヘリックスバンドルは、ヘリックス-脂質二重層相互作用と、ヘリックス-ヘリックス相互作用から得られる有意なエンタルピーゲインによって、膜内のMS4A4Aを安定させる。
MS4A4A ECLの主要なアミノ酸配列と組成は、エピトープと動的特性に関連する重要な特徴を示す。ECL1は、1つのシステイン、1つのメチオニン、1つのアラニン、3つのセリン、1つのスレオニン、2つのアスパラギン、1つのチロシン、1つのプロリン、1つのイソロイシン、及び、唯一のグリシン残基(複数可)を含む、13個のアミノ酸からなる。ECL2は、2つのシステイン残基を含む21個のアミノ酸で構成されており、それらは、3つのセリン、1つのスレオニン、1つのフェニルアラニン、3つのヒスチジン、1つのプロリン、3つのチロシン、4つのアスパラギン、1つのメチオニンの8種のアミノ酸と、2つだけのグリシン残基で分けられる。ECL1及びECL2には、グリシン残基はほとんどなく、幾つかの大きなベータ分岐アミノ酸残基と、プロリン残基が認められる。さらに、ECL2は、構造内エントロピーをさらに減少させるループ内ジスルフィド結合を生成すると考えられる2つのシステイン残基を含む。その結果、ECL1及びECL2は、剛体タイプの内部運動で互いに相互作用する立体配座異性体の個数が大幅に減少する傾向がある。
C末端GFPタグを含むヒトMS4A4A(NM_024021)をコードする発現プラスミドを、Origene(カタログ番号RG223557)から購入し、そして、ヒトMS4A4Aの細胞外ループ1(ECL1)のコード領域に単一のアラニンスキャン変異を生成するためのテンプレートとして使用した(以下の表10での4A.Ala1-Ala13;ECL1に対応する配列番号1のC67~S79;CMASNTYGSNPIS;ヒトMS4A4Aの細胞外ループ2(ECL2)のコード領域内(以下の表10での4A.Ala14-Ala34;ECL2に対応する配列番号1のS140~S160;SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS;及び、以下の表11でのECL2欠失変異(4A.Ala35(ECL2での配列番号1のアミノ酸残基150~152の欠失)、及び、4A.Ala36(ECL2での配列番号1のアミノ酸残基148~152の欠失))。これらの突然変異は、当該技術分野で標準的な重複ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して行った。それぞれのポリメラーゼ連鎖反応ポリ核酸フラグメントを精製し、そして、MluIとAsiSI制限部位を使用して、発現ベクターにサブクローニングした。
アラニンスキャニング技術を使用してエピトープ決定を行う前に、HEK293T細胞での上記した発現構築物の一時的トランスフェクションを使用して、以下のようにして、当該抗MS4A4A抗体の相対的EC50を決定した。HEK293T細胞を、6ウェルプレートに播種し、そして、一晩、増殖させた。翌日、製造業者のプロトコルに従って、Fugene HD(Promega)、または、Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)を使用して、4:1の比率のFugeneとDNA、または3:1の比率のLipofectamineとDNAで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの約24時間後に、トリプシン-EDTAを使用して細胞を回収し、そして、FACS染色のために処理した。
FACS染色については、150,000個の細胞を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに加え、次いで、抗MS4A4A抗体の滴定を、FACS緩衝剤(PBS+2% FBS)に対して加え、そして、氷上で、60分間、インキュベーションした。プレートを遠心分離し(1,400rpm、3分間)、上清をデカントして、細胞を、200μlのFACS緩衝剤で3回洗浄した後に、それぞれを、遠心分離とデカントの工程に供した。抗体を、msIgG1、または、huIgG1キメラとして試験し、そして、ヤギ抗ヒトPE(Southern Biotech、カタログ番号2040-09、1:200)、または、ヤギ抗マウスAPC(BD Biosciences、カタログ番号550826、1:100)のいずれかを、氷上で、30分間、FACS緩衝剤に加えた。続いて、細胞を、200μlのFACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、iQueサイトメーターで画像化した。蛍光強度の中央値(MFI)を、MS4A4Aを発現する細胞を表すGFPポジティブ集団で測定した。
最初に試験した抗MS4A4A抗体のうちの6つは、野生型(WT)MS4A4A-GFPを発現するHEK293T細胞に結合する;このようなものとして、抗MS4A4A抗体4A-18、4A-21、4A-202、ならびに、公開されたマウスモノクローナル抗MS4A4A抗体4H2(Kerafast)、5C12(Biolegend)、3F2(Millipore)がある。それぞれの抗体の滴定曲線を決定して、その後のエピトープマッピング研究に最適な抗MS4A4A抗体濃度を確立した。
エピトープマッピング実験については、HEK293T細胞を、異なるヒトMS4A4A発現構築物(上記した通り、以下の表10を参照されたい)でトランスフェクトし、そして、6つの異なる抗MS4A4A抗体:4A-21、4A-18、4A-202、4H2、5C12、及び、3F5を使用して、抗体結合を測定した。抗MS4A4A抗体結合は、野生型ヒトMS4A4A発現構築物でトランスフェクトした細胞に対する結合でのMFIの%として計算した。当該MS4A4Aポリペプチドでのアミノ酸変異が、抗体結合を、野生型MS4A4Aに対する結合の20%未満にまで低下させていれば、当該変異したアミノ酸は、MS4A4Aタンパク質に対する抗MS4A4A抗体の結合に必要な重要なアミノ酸と考えられる。当該MS4A4Aタンパク質の一部のアミノ酸変異が、抗MS4A4A抗体結合を、(野生型MS4A4Aに対する結合と比較して)51%未満から20%を超えるまで抑制していれば、そのようなアミノ酸を、MS4A4Aタンパク質に対する抗MS4A4A抗体の結合に寄与するアミノ酸として定義した。
MS4A4Aの一部のアミノ酸は、MS4タイプのタンパク質でシステイン架橋を形成すると考えられている2つのシステイン、C165及びC174など、試験したすべての抗体の結合に影響を及ぼした。そのようなアミノ酸は、構造アミノ酸であると考えられた。
これらの実験の結果を、以下の表10に示す。上記したように、Ala.1~Ala.13とは、ECL1でのMS4A4A変異のことを指す;Ala.14~Ala.36とは、ECL2でのMS4A4A変異のことを指す。データは、野生型MS4A4Aタンパク質に対する抗MS4A4A抗体の結合と比較して、様々なアラニンスキャン変異に対する抗MS4A4A抗体の%結合として示している。これらのマッピング実験は、独立して、2回繰り返しており、非常に類似した結果が得られた。1つの差異は、抗MS4A4A抗体4A-21及び4A-18が、2つの濃度で、huIgG1として1度目の試験を、そして、msIgG1として2度目の試験をしたことであった。以下の表11は、これらの抗体のmsIgG1試験の結果を示している。その他のすべての抗体について、表10は、両方の実験における平均抗体結合を示している。MS4A4Aタンパク質に対する抗MS4A4A抗体の結合を示す数値の内、野生型MS4A4Aに対する結合についての測定値の20%未満のものを、以下の表10では、太字で示している。
すべての変異は、約22~33%の同等のトランスフェクション効率を示した(データは示さず)。細胞内の平均抗体結合とGFPレベルとの間に相関関係は認められず、このことは、GFPレベルが、MS4A4A細胞表面発現の予測因子として使用できないことを示唆している。
Figure 2022542964000037
Figure 2022542964000038
上記した結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、MS4A4Aでの別個の線形エピトープ、及び/または、3D構造エピトープを認識することを示唆している。
これらの実験から得た抗MS4A4A抗体結合データに基づいて、ヒトMS4A4Aでの次のループアミノ酸残基を、MS4A4Aタンパク質での構造アミノ酸とみなしたが、これは、それらのそれぞれを変異させると、試験した抗MS4A4A抗体:M87、C165、Y167、Y168、C174(ヒトMS4A4Aタンパク質に基づく;配列番号1)の結合に影響を及ぼしたためである。アミノ酸残基C165及びC174は、ECL2にてループを形成するシステイン架橋を確立すると考えられた。このシステイン架橋がないと、抗MS4A4A抗体は、MS4A4Aタンパク質に対して結合せず、このことは、MS4A4AのECL2でのループ構造が、抗体結合に重要であることを示唆している。ループ構造が重要であるとのさらなる証拠は、これらの抗体の結合にも強く影響する2つのループ欠失変異体(Ala.35、及び、Ala.36)から得られる。
これらの結果は、アミノ酸残基Y167及びY168が、抗MS4A4A抗体4A-21、4A-18、4H2、5C12、及び、3F2の結合に強く影響することをさらに示した。これらのアミノ酸残基は、抗MS4A4A抗体4A-202の結合には、あまり影響しなかった。加えて、ECL1でのアミノ酸残基P96、I97、及び、S98は、試験したすべての抗MS4A4A抗体の結合を、ある程度は抑制した。これらの結果は、これらの5つのアミノ酸残基のいずれかの変異が、抗体の認識と結合において重要な細胞外ドメインの構造を改変すること、あるいは、これらのアミノ酸残基が、列挙した6つの抗MS4A4A抗体のそれぞれの相互作用と結合において重要であることを示唆した。プロリンは、最も抑制を受けたアミノ酸残基であり、ポリペプチドの二次、及び、三次構造において重要である。例えば、プロリンは、アルファヘリックスやベータシートのものなど、通常の二次構造要素の中央で攪乱物質として機能する;しかしながら、通常、プロリンは、アルファヘリックスの最初のアミノ酸残基として、かつ、ベータシートの端において認められる。チロシン、イソロイシン、及び、セリン残基は、例えば、ファンデルワールス相互作用(複数可)、パイ-パイスタッキング、及び、パイ-フェイシアル水素結合相互作用、及び/または、水素結合など、複数の抗原抗体相互作用を提供する。したがって、チロシン、プロリン、イソロイシン、または、セリン残基のいずれかは、明確に定義した構造エピトープを作り出すことができる。これらの4つのアミノ酸残基の微妙な変化は、抗体の結合親和性を著しく損ないかねない。
MS4A4Aでのアミノ酸残基M87Aの変異は、試験したすべての抗MS4A4A抗体の結合を、大幅に抑制または解消した。ECL1とECL2は、明確に定義した堅牢な構造を使用しており、また、互いに相互作用し得るという予測に基づいて、M87A結合結果は、M87の側鎖が、主鎖-側鎖、及び/または、主鎖-主鎖相互作用を介して、ファンデワールス接触と水素結合によって、ECL1、及び/または、ECL2の1つ以上のベータ分岐アミノ酸と相互作用できるので、M87アミノ酸残基が、MS4A4Aの堅牢なループ構造を維持する上で最も重要な残基の1つであると考えられることを示した。
以下の表11は、本明細書に開示した抗MS4A4A抗体の独特の結合アミノ酸残基を列挙している。抗MS4A4A抗体4A-21は、ヒトMS4A4Aに対して結合するにあたって、ECL2にN166を必要とする。このデータは、抗MS4A4A抗体4A-18及び5C12が、ヒトMS4A4AのECL1ならびにECL2に結合することを示した。抗MS4A4A抗体4A-202では、アミノ酸残基Y164が、結合において多少なりとも寄与した。
3つの市販の抗MS4A4A抗体は、すべてP163に結合するが、ここで開示し、かつ、この研究で試験した抗MS4A4A抗体は、いずれも結合しなかった。ヒトMS4A4AのこのプロリンP163は、カニクイザルMS4A4Aタンパク質では、アルギニンに置換されている。そのような知見は、このプロリンからアルギニンへの変化が、市販のMS4A4A抗体の結合特性が示すように、カニクイザルの交差反応性、または、その欠如を決定する上で重要である、ことを示唆している。プロリンは、構造的に最も抑制を受けたアミノ酸残基であり、そして、(カニクイザルMS4A4Aでの)アルギニンは、生理的pHで、正に帯電したアミノ酸である。ヒトとカニクイザルのMS4A4Aにおけるプロリンとアルギニンの差異は、MS4A4Aタンパク質の立体配座に大きな影響を与え得るものであり、したがって、市販のMS4A4A抗体との結合を妨げる。抗MS4A4A抗体4A-18、4A-21、及び、4A-202は、結合については、このアミノ酸に依存しておらず、したがって、カニクイザルタンパク質に対する結合には影響がなかったと考えられた。
まとめると、抗MS4A4A抗体4A-21、4A-18、及び、4A-202は、市販の抗MS4A4A抗体のものとは異なるMS4A4Aでのエピトープに結合した(下記の表11)。市販の抗MS4A4A抗体4H2及び3F2は、抗MS4A4A抗体5C12のエピトープと大半が重複している同一のエピトープを示した。対照的に、抗MS4A4A抗体4A-18、4A-21、及び、4A-202は、それぞれが、互いに相違しており、市販の抗MS4A4A抗体とは異なる独自のエピトープ結合特性を示した。結合特性でのこれらの差異を、表10に示す。加えて、これらの結果は、試験した2つの抗MS4A4A抗体が、ヒトMS4A4Aでの同一のエピトープに結合しないことを示した;しかしながら、一部の、または、すべての抗体で、アミノ酸結合残基(例えば、アミノ酸残基Y167、及び、Y168、Y164、N170、T177)が共有されている。
Figure 2022542964000039
実施例6:組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドに対する抗MS4A4A抗体の結合
本開示の抗MS4A4A抗体を、実施例2に記載したようにして、異なる組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドに対して結合するそれら抗体の能力について、次のようにして試験した。本開示のヒト化抗MS4A4A抗体のVH及びVLドメインをコードする核酸を、ヒトIgG1重鎖定常ドメイン、またはヒトカッパ定常ドメインのいずれかを含むpcDNA3.4ベクターにクローニングした。ヒト化抗MS4A4A抗体を、Expi293細胞で発現し、そして、Mab選択抗体精製樹脂(GE Healthcare Life Science、カタログ番号17519902)によって、製造業者のプロトコルに従って精製した。ELISAで実施して、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドに対する本開示の抗MS4A4A抗体の結合を測定した。1μg/mlのビオチン化抗原を、ストレプトアビジンでコーティングしたELISAプレート(Thermo Scientific、カタログ番号PI15120)で、1時間、プレインキュベーションした。プレートを3回洗浄した後に、抗体(1μg/ml、0.33μg/ml、及び0.11μg/ml抗体)を加えた。プレートを、室温で、1時間振とうしながらインキュベーションを行い、3回洗浄した後に、HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトカッパ抗体の1/2500希釈液を加えた(Sigma Aldrichカタログ番号A7164-1ML)。
図4は、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS1、JS4、JS5、JS6、及びJS10に対して結合する特定のヒト化抗MS4A4A抗体のELISAでの結合の結果を示す。図4に示したように、特定の抗MS4A4A抗体(4A-18.hFc、4A-21.hFc、4A-202.hFc、4A-220.mFc、4A-214.mFc、4A-204.mFc’hFcは、ヒトFcのことを指し;mFcは、マウスFcのことを指す))は、ELISAで、ヒトMS4A4Aの2つのECLを含む組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS1、JS5、及びJS6に対する結合を示した。本発明の抗MS4A4A抗体は、ネガティブコントロールポリペプチドであり、かつ、MS4A4A ECL領域配列を含まない組換え可溶性ポリペプチドJS4及びJS10には結合しなかった。2つの市販の抗MS4A4A抗体、5C12及び4H2は、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドのいずれにも結合を示さなかった(図4を参照されたい)。図4において、抗MS4A4A抗体4A-214は、すでに国際特許出願第PCT/US2019/016156号に開示されており、また、
EVKLEESGGGLVQPGRSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCSSMIIVDYWGQGTTVTVSS(配列番号179)
の重鎖可変領域アミノ酸配列と、
DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSSSTYSYLHWYQQRPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTVFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPLTFGAGTKLEMK(配列番号180)
の軽鎖可変領域アミノ酸配列とを有する。
図4に提示した結果は、表12に示すデータから導き出した:
Figure 2022542964000040
図5は、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS1に対するマウス抗MS4A4A抗体4A-21のヒト化バージョンのELISAでの結合の結果を示す。これらの抗体は、1μg/mlの濃度で使用した。図5に示したように、抗MS4A4A抗体4A-21のヒト化バージョンの多くは、この組換えポリペプチドに対して結合する能力を保持していた。抗MS4A4A抗体4A-21の特定のヒト化バージョンでは、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS1に対する結合が低下したことが示された。
図5に提示した結果は、表13に示すデータから導き出した:
Figure 2022542964000041
図6は、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS1に対するマウス抗MS4A4A抗体4A-202のヒト化バージョンのELISAでの結合の結果を示す。これらの抗体は、1μg/mlの濃度で使用した。図6に示したように、抗MS4A4A抗体4A-202のヒト化バージョンは、この組換えポリペプチドに対して結合することができた。
図6に提示した結果は、表14に示すデータから導き出した:
Figure 2022542964000042
マウス抗MS4A4A抗体4A-202、及びマウス抗MS4A4A抗体4A-21の様々なヒト化バージョンを、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドに対して結合するそれら抗体の能力について、さらに試験した。ヒト化抗MS4A4A抗体4A-332、及びヒト化抗MS4A4A抗体4A-302は、妥当な結合を示しており、そして、以下のように、さらなる親和性の改善のために選択した。抗MS4A4A抗体4A-322、及び抗MS4A4A抗体4A-302の6つのCDRに対して、オーバーラップPCR法を使用して、無作為に変異を導入した。ビオチン化組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS5を、これらの抗体バリアントのファージディスプレイパニングに使用した。3ラウンドのパニングの後に、約190の変異型抗MS4A4A抗体バリアントを選択し、そして、TGI細胞で発現させて、それらの溶解物を、ELISAでスクリーニングした。22個のヒト化抗MS4A4A抗体4A-21バリアントと、15個のヒト化抗MS4A4A抗体4A-202バリアントを選択し、組換えにより完全ヒトIgGに変換し、そして、Expi293細胞で発現させた。抗MS4A4A抗体を、MabSelect Antibody Purification Resin(GE Healthcare Life Science,カタログ番号17519902)によって、製造業者のプロトコルに示されるように精製した。続けて、ELISAとフローサイトメトリー実験を反復した。
ヒト化した、及び親和性成熟した抗MS4A4A抗体4A-312、4A-313、及び4A-314は、ELISAによって、様々な抗体濃度(1μg/ml、0.33μg/ml、及び0.11μg/ml)で、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS5に対する結合を示し(図7を参照されたい)、そして、さらなる機能分析のために選択した。
図7に提示した結果は、表15に示すデータから導き出した:
Figure 2022542964000043
ヒト化した、及び親和性成熟した抗MS4A4A抗体4A-351及び4A-376(0.4μg/ml)は、ELISAによって、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS5に対して良好な結合を示した(図8を参照されたい)。次いで、これらの抗MS4A4A抗体を、CDR-L1でのアミノ酸D28にアミノ酸置換を行うためのテンプレートとして使用するために選択した;そのようなアミノ酸置換として、D28G、D28E、D28S、D28A、及びD28Qが含まれた。
図8に提示した結果は、表16に示すデータから導き出した:
Figure 2022542964000044
これらのさらなる抗MS4A4A抗体として、抗MS4A4A抗体4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、及び4A-381が含まれ、そして、ELISAによって、3つの異なる抗体濃度(1μg/ml、0.33μg/ml、及び0.11μg/ml)で、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS5に対するそれらの結合について試験した。これらの研究の結果を、図9に示す。図9に示したように、これらのさらなる抗MS4A4A抗体は、組換えMS4A4A可溶性ポリペプチドJS5に対して結合したことを示した。
図9に提示した結果は、表17に示すデータから導き出した:
Figure 2022542964000045
実施例7:ヒトMS4A4Aを過剰発現するU937細胞に対するヒト化した、及び親和性成熟した抗MS4A4A抗体の結合
本開示の抗MS4A4A抗体のヒト化した、及び親和性成熟したバージョンを、次のようにして、ヒトMS4A4Aを発現するU937細胞に対するそれらの結合について評価した。
試験した抗MS4A4A抗体は、ハイブリドーマ上清から精製したマウスIgG、またはExpi293細胞で組換え産生したヒトIgG1Fcキメラのいずれかであった。細胞に対する親和性結合は、次のようにして決定した。簡潔に説明すると、細胞を回収し、洗浄し、そして、生死判別のためにAqua Live/Deadで標識した。PBSで洗浄した後に、2×104個の細胞を、96ウェルU底プレートでウェルごとに分注し、そして、様々な濃度(10μg/mLから開始する3倍希釈)の精製した抗MS4A4A抗体を含む50μLのFACS緩衝剤(PBS+2%FBS+1mM EDTA)とともにインキュベーションした。この一次インキュベーションを行った後に、上清を遠心分離で除去し、150μLの氷冷FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、氷上で、適切な二次抗体とともに15分間インキュベーションした。二次抗体のインキュベーションの後に、これらの細胞を、再び氷冷FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、最終体積が200μLであるFACS緩衝剤に再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、FACSCantoシステム(BD Biosciences)で行った。結合データを、蛍光強度の中央値(Median Fluorescent Intensity)(MFI)として表した。
これらの結合実験の結果を、以下の表18及び表19に示す。表18は、組換えヒトMS4A4Aを過剰発現するU937細胞に対する本開示の特定の抗MS4A4A抗体の結合を示す。これらの実験は、5μg/mlの濃度の抗MS4A4A抗体を使用して行っており、また、細胞結合に関しては、フローサイトメトリーでアッセイした。
Figure 2022542964000046
表19は、組換えヒトMS4A4Aを過剰発現するU937細胞に対する本開示の特定の抗MS4A4A抗体の結合を示す。これらの実験は、5μg/mlの濃度の抗MS4A4A抗体を使用して行っており、また、細胞結合に関しては、フローサイトメトリーでアッセイした。このアッセイでは、二次抗体だけで染色した細胞のMFI値は、約200であった。
Figure 2022542964000047
実施例8:抗MS4A4A抗体は、初代ヒト骨髄細胞のTREM2タンパク質を調節する
MS4A遺伝子座でのSNPが、ヒトの可溶性TREM2(sTREM2)レベル、一般的には、TREM2経路、そして、アルツハイマー病の感受性に対して影響を及ぼすことが報告されている。アルツハイマー病保護MS4A4A対立遺伝子は、脳脊髄液でのsTREM2レベルの増大に関連している。これらの経路が合わさると、アルツハイマー病や、その他の神経変性疾患の予防において役割を果たし得る。加えて、ヒトマクロファージの培養物を、市販の抗MS4A4A抗体で処理すると、sTREM2レベルが低下することが報告されている(Piccio et.al.Acta Neuropathol 2016、131:925-933)。マクロファージでのsTREM2及び原形質膜/細胞表面TREM2(mTREM2)レベルを調節する本開示の抗MS4A4A抗体の効果を調べるために、以下の研究を行った。
初代ヒトマクロファージを、96ウェルプレートに播種し、そして、抗MS4A4A抗体のパネル(10μg/ml)を含む完全RPMIで処理した。48時間のインキュベーションの後に、上清を回収し、そして、Meso Scale Discovery(MSD)を使用して、sTREM2レベルを測定した。簡潔に説明すると、MSDプレート(カタログ番号LI5XA-3)のウェルを、オービタルシェーカーで、4℃で、500RPMで、一晩、1μg/mlの捕捉抗体とインキュベーションした。ウェルを洗浄した後に、オービタルシェーカーで、500RPMで、20℃で、1時間、結合緩衝剤(1%熱不活性化高品質BSA)を含むPBS)でブロックした。標準(Recombinant Human Trem2 Fc 1828-T2(R&D Systems))、及び、未知の試料を、適切な濃度で、結合緩衝剤で調製し、ウェルに加え、次いで、オービタルシェーカーで、500RPMで、20℃で、1時間、インキュベーションした。これらのウェルを洗浄した後に、オービタルシェーカーで、500RPMで、20℃で、1時間、100ng/mlの二次抗体(ビオチン化ヤギ抗ヒトTREM2(R&D Systemsカタログ番号BAF1828))とインキュベーションした。ウェルを洗浄し、次いで、0.2μg/mlの検出試薬(Sulfo Tag-Streptavidin;MSDカタログ番号R32AD)を含む結合緩衝剤でインキュベーションした。次いで、ウェルを洗浄し、150μlの読取り緩衝剤(read buffer)(1×、MSD)をそれぞれのウェルに加え、そして、それらのプレートを、Sector Imagerで読み取った。
これとは別に、抗MS4A4A抗体で処理した細胞(前出)を回収し、そして、フローサイトメトリーに供して、アロフィコシアニンまたは類似のフルオロフォアとコンジュゲートした抗TREM2抗体(Alector)を使用して、mTREM2レベルを決定した。
表20に示すように、抗MS4A4A抗体は、様々なドナーから得た培養ヒト初代マクロファージの上清でのsTREM2のレベルを引き上げた。本明細書に記載した結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、ヒト初代マクロファージの上清でのsTREM2レベルを引き上げる、またはアップレギュレーションすることを示した。表20で報告している数値は、100に設定したアイソタイプコントロール抗体を使用して得た数値に関連するものである。
Figure 2022542964000048
以下の表21に示すように、抗MS4A4A抗体は、様々なドナーから得た培養ヒト初代マクロファージの原形質膜/細胞表面TREM2(mTREM2)のレベルを引き上げた。これらの結果は、上記した表20に示すように、これらの細胞の上清で認められたsTREM2の対応する増大と一致していた。表21で報告している数値は、100に設定したアイソタイプコントロール抗体を使用して得た数値に関連するものである。
Figure 2022542964000049
これらのデータは、本発明の抗MS4A4A抗体でヒト初代マクロファージを処理することで、骨髄細胞系列でのこれらの細胞でのsTREM2及びmTREM2レベルの双方が増大したことを示した。これらの結果は、市販の抗MS4A4A抗体5C12が、培養したヒトマクロファージの上清でのsTREM2レベルを抑制したことを示す従前の報告とは符合しない(Deming et al、前掲)。
可溶性TREM2及び膜TREM2に関する抗MS4A4A抗体の効果を調べる前出の実験は、低レベルのエンドトキシンを有するように調製した抗MS4A4A抗体を使用して反復して行った。培養上清で測定したsTREM2のレベルを、以下の表22に示す。本開示の大抵の抗MS4A4A抗体は、高度に精製しており、かつ、本質的にエンドトキシンを含んでいなければ、sTREM2レベルを様々な程度にまで引き上げた。市販の抗MS4A4A抗体3F2、4H2、及び5C12も、sTREM2レベルを引き上げたが、低レベルのものでしかなかった。これらの結果は、これらの市販の抗MS4A4A抗体が、培養物においてsTREM2レベルを下げることを示した従前に公開されたデータとは対照的である。このことは、市販の製剤に存在するエンドトキシン、不純物、及び凝集体による汚染が原因であると考えられる。表22のデータは、ng/mlを単位とするsTREM2のレベルを示しており、また、アイソタイプコントロール抗体で認められたものに正規化している。
認められたsTREM2の増加は、抗MS4A4A抗体で処理した後の膜結合TREM2(mTREM2)レベルの増加と平行していた(以下の表23)。ドナー間の反応性のばらつきがあるにもかかわらず、ほとんどの抗MS4A4A抗体は、試験した3名のドナーのうち2名または3名で、mTREM2のレベルを引き上げた。市販の抗MS4A4A抗体(3F2、4H2及び5C12)と比較した場合、本開示の多くの抗体は、同等または優れた活性を示している。以下の表23に示すレベルは、フローサイトメトリーによって決定した平均蛍光強度(Mean Fluorescence Intensity)として表しており、また、アイソタイプコントロール抗体を使用して認められたものに正規化されている。
Figure 2022542964000050
Figure 2022542964000051
遺伝学的研究は、アルツハイマー病保護MS4A4A対立遺伝子とアルツハイマー病患者でのsTREM2のレベルの増加とを関連付けているので、これらの結果は、抗MS4A4A抗体が、TREM2活性と機能を調節する(すなわち、高める)ことによる、アルツハイマー病、及びその他の神経変性障害の効果的な治療法であることを示唆した。
sTREM2及び膜結合TREM2(mTREM2)に関する本開示のヒト化抗MS4A4A抗体の効果も決定した。このことを調べるために、2名のドナーに由来するヒト初代マクロファージを、本開示の抗MS4A4A抗体で、48時間処理した。培養上清を回収し、そして、Mesoscale Discoveryアッセイを使用して、可溶性TREM2のレベルをアッセイした。細胞表面のTREM2は、フルオロフォアとコンジュケートした抗TREM2抗体で染色した後に、フローサイトメトリーで別々に処理した細胞で測定した。Mesoscale Discoveryシステム(MSD,Rockville,MD,USA)を使用して、マクロファージの培養上清での可溶性TREM2を測定した。
以下の表24は、可溶性TREM2レベルの変化に関する抗MS4A4A抗体の効果の結果を示す。表24では、可溶性TREM2レベルを、ng/mlの単位で示す。表24に示したように、本開示の大抵の抗MS4A4A抗体は、ヒト初代マクロファージでの可溶性TREM2レベルを引き上げた。市販の抗MS4A4A抗体5C12、4H2、及び3F2では、本開示の多くの抗MS4A4A抗体で認められたレベルと比較して、可溶性TREM2レベルの有意な増大は認められず、また、5C12、4H2、及び3F2の効果は、アイソタイプコントロールと同等であった。
Figure 2022542964000052
Figure 2022542964000053
以下の表25は、細胞表面(例えば、膜)でのTREM2レベルの変化に関する抗MS4A4A抗体の効果の結果を示す。表25では、細胞表面TREM2レベルを、フローサイトメトリー手順で測定した平均蛍光強度(MFI)として示す。表25に示したように、本発明の大抵の抗MS4A4A抗体は、ヒト初代マクロファージでの細胞表面TREM2レベルを引き上げた。市販の抗MS4A4A抗体5C12、4H2、及び3F2では、本開示の多くの抗MS4A4A抗体で認められたレベルと比較して、細胞表面TREM2レベルの有意な増大は認められず、また、5C12、4H2、及び3F2の効果は、アイソタイプコントロールと同等であった。
Figure 2022542964000054
表24及び表25に示したように、膜TREM2レベル、及び可溶性TREM2レベルの双方が、本開示の抗MS4A4A抗体で処理するとアップレギュレーションされた。市販の抗MS4A4A抗体5C12、4H2、及び3F2は、TREM2の発現を、有意な程度にまで誘導しなかった。
実施例9:マクロファージ細胞表面マーカーに関する抗MS4A4A抗体の効果
様々なM1及びM2マクロファージ細胞表面マーカーに関する抗MS4A4A抗体の効果を、以下のようにして調べた。ヒト初代マクロファージを、様々な抗MS4A4A抗体(10μg/ml)を含む完全RPMI1640で、48時間、処理した。次いで、これらの細胞を回収し、そして、M1マーカー(CD16、MHCクラスII、CD86)、M2マーカー(CD200R、Dectin-1、CD163)、及び、汎マクロファージマーカーCD14に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーに供した。
これらの研究の結果を、以下の表26に示す。細胞表面マーカーの発現レベルを、フローサイトメトリーでアッセイし、そして、100%に設定したアイソタイプコントロール抗体で処理した細胞で得たレベルに正規化した。CD86やMHC-IIなどの特定のM1マーカーの細胞表面発現は変化しておらず、あるいは、抗MS4A4A抗体処理の影響をわずかに受けていた。対照的に、CD200R、CD163、及びDectin-1などの特定のM2マーカーの細胞表面発現は、抗MS4A4A抗体で処理すると顕著に抑制された。
Figure 2022542964000055
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、マクロファージ分極に影響を及ぼしており、M2表現型から離れた細胞に影響を及ぼすことを示した。これらの結果は、CNSにおいて、抗MS4A4A抗体治療が、神経変性疾患及び障害に関連する神経保護機能を強化、増大、または、回復することで、ミクログリア活性の有益な改善を提供し得ることを示唆した。健康状態での恒常性ミクログリアは、CD200R、CD163、及び、CD115などのM2マーカーをさらに発現するので、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、ミクログリア細胞の生理学的状態を、進行した炎症状態または活性化状態など、より保護的な表現型の状態への改変に影響を及ぼすことを示唆した。アルツハイマー病マウスモデル、及びヒトアルツハイマー病における疾患関連ミクログリア(DAM)は、炎症誘発性または活性化状態にあり、アルツハイマー病において有益であると考えられており、本開示の抗MS4A4A抗体は、アルツハイマー病及びその他の神経変性障害の治療において有用である。
実施例10:抗MS4A4A抗体は、オステオポンチン及びゲルゾリンの発現を高める
MS4A遺伝子クラスターが関係するアルツハイマー病に関連する遺伝的バリアント(SNP)が特定されている。それらのバリアント対立遺伝子の1つは、rs1582763であり、これはは、CSF sTREM2レベルの増大、アルツハイマー病のリスクの低下、及び発症年齢の遅延に関連している。(Deming et al,2018,bioRxiv,doi:dxdoiorg/10.1101/352179)。このrs1582763対立遺伝子は、血中MS4A4AmRNAレベルを低下させる。これらの知見は、rs1582763対立遺伝子が、MS4A4Aレベルを低下させ、アルツハイマー病のリスクまたは重症度を潜在的に抑制することで、保護的な役割を果たしていることを示唆している。
ヒトマクロファージでのこの保護対立遺伝子の効果を示すRNA発現プロファイルは、公開されたRNA発現データから導き出した。SPP1(オステオポンチン)及びGSN(ゲルゾリン)のmRNAは、倍率変化(「FC」)及びp値(表27の「rs1582763」の下方にある列を参照されたい。また、表28にも同様に記載した)で示したように、発現の増加を示すその他のマーカー(図示せず)と比較して、最も有意な発現の高まりを示した。このデータは、SPP1とGSNが、rs158273対立遺伝子に関連する保護的生物活性の薬力学的マーカーであることを示した。
親のMS4A4A抗体を、保護対立遺伝子を表現型模写する能力について試験した。ヒトPBMC由来のマクロファージを、表27及び表28に示したように、抗MS4A4A抗体で、24時間処理した(最大で3回の反復)。RNAを抽出し、そして、RNAライブラリーを調製して配列を決定した後に、ゲノムマッピングと定量を行った。結果は、示したすべての親の抗MS4A4A抗体が、1つ(4A-220)を除いて、SPP1及びGSNの発現の増大に関して、保護rs1582763対立遺伝子を表現型模写することを示した(表27及び表28)。これらの結果は、SPP1及びGSNの発現を高める上で有効な本開示のMS4A4A抗体が、保護対立遺伝子と同様に、アルツハイマー病のリスク及び/または重症度を抑制する点に関して、生物学的に活性であることを示唆した。
Figure 2022542964000056
Figure 2022542964000057
実施例11:抗MS4A4A抗体によるiPSC由来ミクログリア細胞の誘導及び刺激
あらゆる組織に由来する成体細胞を、幹細胞に関連する転写因子の混合物を導入することで、人工多能性幹細胞(iPSC)に変換できる(https://www(dot)cell(dot)com/iPSCで入念に検討が行われている)。iPSCはいつまでも維持することができ、そして、適切な成長因子が与えられると、様々な成熟細胞型に向けて分化するように駆動することができる。iPSCからニューロンを誘導する方法は、かねてより確立されていた(Salimi et.al.,Mol.Bio.Rep.2014;41:1717-1721;Engle et.al.,Neuron 2018;100:783-797)。最近では、iPSCを使用して、星状細胞(Julia et.al.,Stem Cell Report 2017;9:600-614)、及びミクログリア(Pocock and Piers,Nat.Rev.Neurosci.2018;19:445-452で検討されている)を誘導している。これらの培養システムは、その他の方法では実現し得ない制御環境下において、これらの細胞の生物学的研究と機能面での研究を可能にする。さらに、iPSCは、CRISPR遺伝子編集などの様々な方法で遺伝子操作することができ、それにより、これらの細胞型で目的の遺伝子の機能的関連性をさらに詳しく分析することができる。
iPSCから誘導した後に、ミクログリアをインビトロで単独で培養を行い、そこで、本開示の抗MS4A4A抗体で刺激を与える。刺激を与えた後に、細胞生存率を、細胞内ATPレベルを定量して評価する。細胞表面でのTREM2発現の変化、または可溶性TREM2レベルの変化に関する効果は、上記したようにして測定する。これらの培養物から得た上清を、ELISA、Mesoscale Discoveryアッセイ(MSD,Rockville,MD,USA)、Legendplex(BioLegend,San Diego,CA,USA)、またはCBA(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)などの方法を使用して、抗MS4A4A抗体で処理して得られる、様々なサイトカインまたはケモカインの発現またはレベルの変化について分析する。抗MS4A4A抗体処理に起因するこれらのiPSCミクログリアでの食作用能力、オートファジー率、表面マーカー発現、及び遺伝子発現プロファイルの変化を測定し、そして、様々な方法、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、定時イメージング及びリアルタイムイメージング、及びRNAseq分析を使用して、抗MS4A4A抗体で処理した単球由来マクロファージで認められた変化と比較する。
実施例12:マクロファージ細胞表面マーカーに関する抗MS4A4A抗体の効果
CNS及び末梢器官の双方での骨髄細胞は、表現型と機能が本質的に一定していない。このことは、M1型とM2型のマクロファージに分けることができるマクロファージによって、インビトロでモデル化することができ、多様な食作用と炎症の潜在性、表現型、及び活性を示す。末梢器官では、M1表現型に関連するマクロファージは、炎症誘発性が大きく、抗菌性であると考えられるが、M2様マクロファージは、恒常性が大きく、抗炎症性である。CNS内では、恒常性状態のミクログリアは、CD200R、CD163などのM2マーカーも発現しており、このことは、この細胞型での調節機能を示唆している。MS4A4Aの発現は、インビトロで、M2マクロファージにおいて上昇している。
様々なM1及びM2マクロファージ細胞表面マーカーに関する抗MS4A4A抗体の効果を、以下のようにして調べる。ヒト初代マクロファージを、完全RPMI1640において、様々な抗MS4A4A抗体(例えば、10μg/ml)で48時間処理する。次に、これらの細胞を回収し、そして、M1マーカー(CD16、MHCクラスII、CD86など)、M2マーカー(CD200R、Dectin-1、CD163など)、及び汎マクロファージマーカー、例えば、CD14などに対して特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーに供する。
実施例13:抗MS4A4A抗体の動態特徴決定
MS4A4A ECL1及びECL2ペプチドに対する精製した抗体の結合動態の特徴を、以下のようにして、独自のアレイ表面プラズモン共鳴(SPR)装置(MX-96)を使用して、Carterra(South San Francisco,CA)で決定した。Continuous Flow Microspotter(CFM)を使用して、抗体を、CMD500Dチップ(Xantec #SPMX CMD500D ロット番号SC CMD500D0117.a Exp31.12.18)に印刷した。まず、このチップを、100mM MES、pH5.5、100μL EDC(最終濃度133mM)、100μLのS-NHS(最終濃度33.3mM)を用いて、7分間かけて活性化した。抗マウスIgG-Fcのローン(Jackson ImmunoResearchカタログ番号115-005-071)を、15分間かけて注射して、10000~12000RUの表面密度を確立した後に、チップ表面を、1Mエタノールアミン、pH8.5で、10分間かけて不活性化した。対象となる抗MS4A4A抗体を、HBS-EP+緩衝剤(Teknovaカタログ番号H8022)で2:1に希釈し、次いで20分間と5分間かけて印刷して、同じ試料溶液から2つ組を印刷した。コントロール抗体は、印刷のために20μg/mlに希釈した。
動態分析を実行するために、対象となるペプチドを、2000nM、400nM、80nM、16nmM、及び、3.2nMの最終アッセイ濃度で、1mg/mlのBSAを含むHBS-EP+緩衝剤で調製した。次に、これらを、チップに5分間かけて注入した後に、非再生的な動態シリーズで、毎秒8uLで、7分間の解離時間を設けた。再現性を確保するために、それぞれの抗MS4A4A抗体の2つ組を測定した。
実施例14:一過性かつネイティブに発現する細胞株に対するMS4A4A抗体の親和性測定
精製した抗MS4A4A抗体を、様々なMS4A4A発現細胞株に対する結合親和性について評価する。この細胞として、上記した実施例8に記載したトランスフェクト細胞、そして、MS4A4Aを内因的に発現する骨髄細胞株及び初代細胞がある。試験する抗MS4A4A抗体は、ハイブリドーマ上清から精製したマウスIgG、または、Expi293細胞で組換え産生したヒトIgG1 Fcキメラのいずれかである。細胞に対する親和性結合は、以下のようにして決定する。簡潔に説明すると、細胞を回収し、洗浄し、そして、Aqua Live/Deadで標識して、生死を識別する。PBSで洗浄した後に、2×105個の細胞を、96ウェルU底プレートのウェルごとに等分に分注し、そして、様々な濃度(10μg/mLから始める3倍希釈)の50μLの精製した抗MS4A4A抗体を含むFACS緩衝剤(PBS+2%FBS+1mM EDTA)で、インキュベーションする。一次インキュベーションの後に、遠心分離で上清を除去し、150μLの氷冷FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、適切な二次抗体と、氷上で、30分間、インキュベーションした。二次インキュベーションの後に、これらの細胞を、再び氷冷FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、最終体積が200μLであるFACS緩衝剤に再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、FACSCantoシステム(BD Biosciences)で行う。結合データを、蛍光強度の中央値を使用して分析し、そして、曲線を、Prism(非線形回帰:4つのパラメーターを使用したlog阻害剤対用量反応)にあてはめて、EC50値を決定した。
実施例15:MS4A4Aタンパク質のダウンレギュレーション
抗MS4A4A抗体が、様々な細胞株及び初代細胞におけるMS4A4Aの細胞表面及び総細胞タンパク質のレベルを下げる能力を評価する。いずれかのコンパートメントでのMS4A4Aタンパク質の減少は、それら細胞でのMS4A4A活性の低下を示す。
細胞を、本開示の抗MS4A4A抗体と一緒に、様々な時間をかけてインキュベーションを行い、次いで、それら細胞に関連して残存しているMS4A4Aタンパク質のレベルを、FACS(細胞表面)、または、ウェスタンブロット(総タンパク質のレベル)のいずれかを使用してアッセイする。FACSアッセイについては、残存するMS4A4Aの検出を、直接にアロフィコシアニン(APC)をコンジュケートした非競合抗体を使用して実行する。ウェスタンブロット検出については、50μLの溶解緩衝剤(RIPA溶解緩衝剤(ThermoFischerScientificカタログ番号89900)+1:100 HALTプロテアーゼ阻害剤カクテル(ThermoFischerScientificカタログ番号87786)を加えて細胞を溶解し、14,000×gで、15分間の遠心分離を行って、不溶性の細胞片を除去した。可溶性画分を、タンパク質定量のために、ビシンコニン酸(BCA)試薬でアッセイする。それぞれの試料から得た等量のタンパク質を、4~12% Bis-Tris Plusポリアクリルアミドゲル(ThermoFisher Scientific NW04120)にロードし、電気泳動分離を行った後に、当該ゲルでのタンパク質を、iBlot2(ThermoFisher Scientific IM21001)、及びTransfer Stacks(ThermoFisher Scientific IB24002)を使用して、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に転写する。この膜を、1%ウシ血清アルブミン、または5%脱脂乳のいずれかでブロックして、非特異的結合を防ぐ。次に、この膜を、独自のまたは市販の検出抗体とインキュベーションし、洗浄し、HRP結合二次抗体(ウサギ、Abcam#205718、マウス、Abcam#205719)とインキュベーションする。SuperSignal West Pico Plus化学発光基質(ThermoFisher Scientific #34577)で現像して結合を視覚化し、そして、iBright FL1000(ThermoFisher A32752)、または、その他の互換システムでデジタル記録する。
MS4A4Aタンパク質のレベルのダウンレギュレーションは、例えば、アンチセンス方法論、遺伝子治療など、当業者に公知で、かつ利用可能な方法を使用して、MS4A4A核酸発現またはレベルのダウンレギュレーションでも達成し得る。
実施例16:老化、発作、脊髄損傷、網膜ジストロフィー、前頭側頭型認知症、及びアルツハイマー病の動物モデルを用いる抗MS4A4A抗体の活性の特徴決定
前出の説明の通り、老化、発作、脊髄損傷、網膜ジストロフィー、前頭側頭型認知症、及びアルツハイマー病の動物モデルにおいて、抗MS4A4A抗体の治療上の有用性も試験することができる(例えば、Beattie,MS et al.,(2002)Neuron 36,375-386;Volosin,M et al.,(2006)J.Neurosci.26,7756-7766;Nykjaer,A et al.,(2005)Curr.Opin.Neurobiol.15,49-57;Jansen,P et al.,(2007)Nat.Neurosci.10,1449-1457;Volosin,M et al.,(2008)J.Neurosci.28,9870-9879;Fahnestock,M et al.,(2001)Mol.Cell Neurosci.18,210-220;Nakamura,K et al.,(2007)Cell Death.Differ.14,1552-1554;Yune,T et al.,(2007)Brain Res.1183,32-42;Wei,Y et al.,(2007)Neurosci.Lett.429,169-174;Provenzano,MJ et al.,(2008)Laryngoscope 118,87-93;Nykjaer,A et al.,(2004)Nature 427,843-848;Harrington,AW et al.,(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101,6226-6230;Teng,HK et al.,(2005)J.Neurosci.25,5455-5463;Jansen,P et al.,(2007)Nat.Neurosci.10,1449-1457;Volosin,M et al.,(2008)J.Neurosci.28,9870-9879;Fan,YJ et al.,(2008)Eur.J.Neurosci.27,2380-2390;Al-Shawi,R et al.,(2008)Eur.J.Neurosci.27,2103-2114;及び、Yano,H et al.,(2009)J.Neurosci.29,14790-14802)。
実施例17:腫瘍学用動物モデルを用いる抗MS4A4A抗体の効果の特徴決定
骨髄細胞は、大抵の固形腫瘍に存在する免疫細胞の主成分である。腫瘍生物学におけるそれらの役割は、状況に依存する。つまり、それらは、腫瘍の根絶において重要な役割を果たす可能性があるが、それらは、大抵の場合、宿主腫瘍により吸収されて、腫瘍促進性の表現型の提供を補助する。このことは、例えば、骨髄細胞が、M2表現型へ分極することで達成される場合があり、これは、一般的には、免疫抑制性であるので、当該免疫系が、当該腫瘍を根絶することをブロックする。抗MS4A4A抗体は、骨髄細胞の再分極を介して、この免疫抑制表現型を逆転させ、そして、抗腫瘍免疫応答を促し得る。
数多くの動物腫瘍モデルが存在する。関連する動物モデルの例には、NSGマウス(Jackson Laboratory,Bar Harbor,Maine)など、マウスの免疫系を遺伝的に欠失したヒト化マウスモデルがある。これらのマウスは、ヒト免疫細胞の受容宿主として機能し、ヒトの適応性及び自然免疫細胞の生着をもたらす。次いで、これらの動物に対して、通常は、脇腹の皮下に腫瘍細胞を接種する。経時的な腫瘍サイズは、腫瘍細胞の成長と、宿主免疫系によるそれらの根絶との間のバランスを表す。期間全体を通して、これらの動物を抗MS4A4A抗体で処理すると、アイソタイプ処理動物と比較して、腫瘍の進行が修正される。処理期間の終わりに、腫瘍を抽出し、そして、様々な分析を行って、腫瘍細胞及び浸潤免疫細胞に対する抗MS4A4A抗体の効果を決定する。腫瘍を、切片にし、スライドに載置すると、顕微鏡下で組織学的変化を分析することができる。mRNAを、RT-PCR、RNASeq、またはマイクロアレイで分析して、遺伝子発現の変化を決定することができる。腫瘍及び浸潤性免疫細胞の単一細胞懸濁液を調製し、様々な細胞表面マーカーに対する抗体で染色し、そして、フローサイトメトリーで分析すると、特に、マクロファージ及びT細胞などの免疫細胞における細胞表面表現型の変化を表すことができる。これらの分析のいずれかにおいて、抗MS4A4A処理の結果として認められた変化は、これらの抗体の免疫調節機能を示す。
実施例18:TREM2転写及びmRNAに関する抗MS4A4A抗体の効果
TREM2転写レベルとmRNAに関する抗MS4A4A抗体の効果は、以下のようにして評価する。培養細胞を、様々な濃度の本開示の抗MS4A4A抗体で、様々な時間をかけて処理する。その後、細胞内のTREM2 mRNAレベルの変化を、mRNAレベルを測定及び/または定量するための当業者に周知の標準的な方法論を使用して決定する。
実施例19:TREM2の再利用及び分解に関する抗MS4A4A抗体の効果
増大したsTREM2及びmTREM2のレベルに関する抗MS4A4A抗体の効果の理解をさらに深めるために、TREM2の再利用及び/または分解を調べる以下の研究を行う。これらの研究では、抗MS4A4A抗体処理に関連する新たなTREM2合成をさらに防ぐために、細胞のシクロヘキシミド処理を使用する。抗MS4A4A抗体で処理した細胞と比較して、コントロール細胞におけるTRME2の再利用と分解を調べるために、当該技術分野で公知の様々な方法が利用可能である。
実施例20:さらなる抗MS4A4A抗体
前出の実施例1に記載した通り、親抗体4A-21から2つのさらなる抗MS4A4A抗体をヒト化及び親和性成熟させて、抗MS4A4A抗体4A-450、及び抗MS4A4A抗体4A-419を得た。これらの抗体のそれぞれの可変重鎖及び可変軽鎖配列を、以下の表29に示しており、それらの対応するCDR(Kabatによる)に下線を付けた。重鎖CDR配列を、表30に示す;軽鎖CDR配列を、表31に示す。
Figure 2022542964000058
Figure 2022542964000059
Figure 2022542964000060
実施例21:sTREMレベルに関するインビボでの抗MS4A4A抗体の効果
血清及び脳脊髄液(CSF)でのsTREMレベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体のインビボでの効果を調べるために、次のようにして研究を行った。
カニクイザルに対して、抗MS4A4A抗体4A-202またはアイソタイプコントロール(huIgG1)を、80mg/mlの単回静脈内注入により投与した。血清試料は、抗体の投与前、投与から0.5、4、10、24、48、96、192、312、480、及び648時間後に動物から回収した。CSF試料は、抗体の投与前、投与から48、96、192、及び336時間後に動物から回収した。
血清及びCSFでのsTREMレベルは、次のようにして測定した。シングルスポットMeso Scale Discovery(MSD)プレート(Rockville,MD)を、捕捉抗体を含むPBSで、4℃で、一晩コーティングした。サルの血清及びCSF試料(ならびに、サルのTREM2-Fc標準)を結合緩衝剤で希釈し、室温で1時間かけてウェルに加えた。ビオチン化ヤギ抗ヒトTREM2ポリクローナル抗体(R&D Systems)を、結合緩衝剤で1:2,000に希釈して加え、室温で1時間インキュベーションした後に、スルホタグストレプトアビジン(MSD)で検出した。150μLの1×読取り緩衝剤(Read Buffer)をプレートに加え、そして、これらのプレートを、Sector Imager(MSD)で分析した。
血清では、抗MS4A4A抗体4A-202を投与した後に、sTREM2レベルが、ベースラインの約1.5倍高まっていた(ベースラインから約50%増えた)(図10A~10B)。カニクイザルに対して抗MS4A4A抗体4A-202を単回投与した後の血清sTREM2レベルは、少なくとも480時間(20日間)は上昇したレベルを維持していた(ベースラインレベルを上回っている)。
CSFでは、抗MS4A4A抗体4A-202を投与した後に、sTREM2レベルが、ベースラインの約2~4倍高まっていた(ベースラインから約300%増えた)(図11A~11B)。カニクイザルに対して抗MS4A4A抗体4A-202を単回投与した後のCSF sTREM2レベルは、少なくとも96時間(4日間)上昇したレベルを維持していた(ベースラインレベルを上回っている)。
これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、インビボで、血清及びCSFにおいて、sTREM2レベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例22:組換えMS4A4Aを過剰発現するU937細胞に対する抗MS4A4A抗体の結合
ヒト組換えMS4A4Aを発現するU937細胞に対する本開示の抗MS4A4A抗体の結合親和性について、評価を行った(これらの細胞の生成については、すでに説明している)。これらの細胞に対する抗MS4A4A抗体の結合親和性を、以下のようにして決定した。簡潔に説明すると、組換えヒトMS4A4Aを発現するU937細胞を回収し、洗浄し、そして、Aqua Live/Deadで標識して、生死を識別した。2×104個の細胞を、PBSで洗浄した後に、96ウェルU底プレートのウェルごとに分注し、そして、様々な濃度の50μLの精製した抗MS4A4A抗体を含むFACS緩衝剤(PBS+2%FBS+1mM EDTA)で、インキュベーションした。この一次インキュベーションの後に、遠心分離で上清を除去し、150μLの氷冷FACS緩衝剤で細胞を2回洗浄し、そして、適切な二次抗体と、氷上で、15分間、インキュベーションした。この抗体の二次インキュベーションの後に、これらの細胞を、再び氷冷FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、最終体積が200μLであるFACS緩衝剤に再懸濁した。次いで、フローサイトメトリー分析を、FACSCantoシステム(BD Biosciences)で行った。結合データを、平均蛍光強度(Mean Fluorescent Intensity)(MFI)として表した。フローサイトメーターで測定したMFI値を、Kuek,et al,2016,Immunology and Cell Biology.94:11-23に基づいた次の方程式(または、同様の4パラメーターフィットを使用することができる)を使用して、Prism(Graphpad)ソフトウェアで測定した:
Y=((Fmax-B)/(n(C/6.02e23)/(V1e-6)))[[(aptKD+X+n((C/6.02e23)/(V1e-6)))-SQRT{((aptKD+X+n((C/6.02e23)/(V1e-6)))2)-4(n((C/6.02e23)/(V1e-6))X)}]/2]+B)
これらの分析では、以下の数値を、実験条件に従って制約した:C=細胞数/ウェル(20,000);V=マイクロリットル単位の染色する総体積;n=細胞表面の受容体の数、細胞につき100,000個の受容体を推定している。これらの結合研究の結果を、図12に示す。
図12に示したように、抗MS4A4A抗体4A-313 WT huIgG1は、U937細胞で発現した組換えヒトMS4A4Aに対して、約2.8e-10の結合親和性を示しており、一方で、抗MS4A4A抗体4A-450 WT huIgG1は、このアッセイで、3.8e-09の結合親和性を示した。
実施例23:MS4A4A過剰発現細胞株の生成
組換えヒトMS4A4Aを発現する、安定的にトランスフェクトしたHEK293細胞株を生成することの困難性を考慮して、その他のDNAベクター及び細胞株を調べて、組換えヒトMS4A4Aの発現により適合性があるかどうかを判定した。安定したトランスフェクションのために、MS4A4Aコード配列を、発現ベクターpD2533-G418またはpD3539-puro(Atum,Newark,CA,USA)に導入した。
MS4A4Aは、インビボでは骨髄細胞にネイティブに発現している。したがって、上記した細胞を使用して認められた毒性を克服するために、幾つかの骨髄由来細胞株を、最小限の毒性を有する、または毒性が認められない組換えヒトMS4A4Aを発現する能力について試験した。これらの研究で使用した骨髄由来細胞株のパネルには、THP-1細胞(ATCC TIB202)、U937細胞(ATCC CRL-1593.2)、K562細胞(ATCC CCL243)、HL60細胞(ATCC CCL240)、及びKasumi-1細胞(ATCC CRL-2724)が含まれた。マウスpre-B細胞株である300.19細胞(Tufts University T000710)は、組換えタンパク質の発現目的で一般的に使用されているので、これらの細胞も試験した。選択効率及びトランスフェクション効率に関して、G418またはピューロマイシンの適切な用量を決定するために、これらの細胞株のそれぞれを、抗生物質感受性についてスクリーニングした。U937細胞、K562細胞、及び300.19細胞からのトランスフェクタントが、組換えヒトコードMS4A4A発現プラスミドトランスフェクション及び抗生物質選択の後も生存していることが認められた。限界希釈でこれらの細胞をクローニングした後に、個々のクローンが生成し、続いて、フローサイトメトリーを使用してヒトMS4A4Aタンパク質細胞表面発現についてスクリーニングした。
実施例24:ヒト化した、及び親和性成熟した抗MS4A4A抗体は、初代ヒト骨髄細胞においてTREM2タンパク質を調節する
ヒト遺伝学研究でのデータは、MS4A4A、TREM2経路、及びアルツハイマー病(AD)感受性の間の関連性を特定している(Piccio et al.,2016,Acta Neuropathol,131:925-933;doi:https://dx.doi.org/10.1101/352179)。例えば、AD保護MS4A4A対立遺伝子は、脳脊髄液でのsTREM2レベルの増大に関連している。これらの保護経路に関する理解を得るために、以下の研究を行った。ヒト初代マクロファージを、様々な濃度の本開示の抗MS4A4A抗体で、48時間処理した。これらの研究では、次の抗MS4A4A抗体を試験した:野生型huIgG1 Fc(WT)を有する4A-450、huIgG1 Fc N325S及びL328F(NSLF)を有する4A-450、huIgG1 Fc K322Aを有する4A-450、4A-313 WT huIgG1、4A-313 NSLF huIgG1、及び4A-313 K322A huIgG1。次いで、細胞を、フルオロフォアとコンジュケートした抗TREM2抗体で染色した後に、TREM2の細胞表面(膜結合)発現を、フローサイトメトリーで測定した。Mesoscale Discoveryシステム(MSD,Rockville,MD,USA)を使用して、細胞の培養上清での可溶性TREM2レベルを測定した。
図13及び14に示したように、膜TREM2レベルは、細胞に対して抗MS4A4A抗体を加えた後に、ヒト初代マクロファージにおいて用量依存的に高まった。異なるhuIgG1 Fc配列に関する抗MS4A4A抗体-野生型huIgG1、huIgG1でのN325S/L328Fアミノ酸置換、及びhuIgG1でのK322Aアミノ酸置換はすべて、膜TREM2発現レベルを引き上げることができた。以下の表32及び33は、膜結合TREM2レベルの変化について、抗MS4A4A処理細胞で認められたMFIの比率に関する数値を示しており、それぞれ、図13及び14から得た未処理のコントロール細胞で認められたものと比較している。
図15及び16は、野生型huIgG1 Fc主鎖における抗MS4A4A抗体4A-450及び4A-313が(それぞれ)、初代ヒトマクロファージの上清において、可溶性TREM2レベルを用量依存的に高めたことを示す。以下の表34及び35は、抗MS4A4A処理細胞で認められた可溶性TREM2の倍数を示しており、それぞれ、図15及び16から得たプレートベースラインレベルとして測定したものと比べている。
Figure 2022542964000061
Figure 2022542964000062
Figure 2022542964000063
Figure 2022542964000064
これらの結果は、抗MS4A4A抗体4A-450 WT huIgG1(2.5μg/ml)が、未処理の細胞と比較して、初代ヒトマクロファージのsTREMレベルを約1.4倍引き上げたことを示した。また、これらの結果は、抗MS4A4A抗体4A-313 WT huIgG1が、未処理の細胞と比較して、初代ヒトマクロファージのsTREMレベルを約1.5倍~約1.7倍引き上げたことを示した。これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、インビトロで、sTREMレベルを引き上げる上で有効であり、したがって、アルツハイマー病の発症を防御するMS4A4A対立遺伝子の効果を模倣して、インビボで、血漿及びCSFでのsTREMレベルを引き上げる効果的な手段を提供し得ることを示した。
実施例25:細胞ATPレベルに関する抗MS4A4A抗体の効果
ヒト単球を、製造業者のプロトコルに従って、RosetteSepヒト単球濃縮カクテル(Stemcell Technologies)、及びFicoll遠心分離を使用して全血から分離した。ACK溶解緩衝剤で赤血球を溶解した後に、単球を完全培地(RPMI、10%FBS、Pen/Strep、L-グルタミン、HEPES、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム)に再懸濁した。これらの単離した単球からマクロファージを得るために、100ng/mlのヒトM-CSF、及び8%v/vのヒト血清を、5~7日間かけて細胞に加えた。次いで、細胞を、50,000個の細胞/ウェルを含む完全RPMI-1640でプレートに播種し、そして、様々な濃度の抗MS4A4A抗体(4A-313NSLF、4A-313PS、4A-450NSLF、及び4A-450PS)の存在下または非存在下で2日間培養した、または様々な濃度のアイソタイプコントロール抗体を含む溶液で48時間培養した。次いで、製造業者のプロトコルに従って、CellTiter-Glo Luminescent細胞生死判別キット(Promega、カタログ番号G7571)を使用して、細胞内のATP含有量を定量した。
図17に示したように、抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 PS huIgG1、4A-450 NSLF huIgG1、及び4A-450 PS huIgG1は、初代ヒトマクロファージのATPレベルを、用量依存的に高めた。FcγRIIIa結合を無効にするN325S/L328Fアミノ酸置換を含むhuIgG1 Fcを有する抗MS4A4A抗体(Journal of Biological Chemistry 2014,289:15309-15318)、または、C1q結合を無効にするP331Sアミノ酸置換を含むhuIgG1 Fcを有する抗MS4A4A抗体(Journal of Immunology 2000,164:4178-4184)は、両方とも、ヒトマクロファージのATPレベルを引き上げる上で効果的であった。ATPレベルが増大は、ヒトマクロファージの生存率の増大を示した。
以下の表36は、これらの研究で決定した(図17に関連する)ATPレベルの数値を示しており、これらの数値は、未処理のマクロファージで認められた数値に正規化している。これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、用量依存的にヒトマクロファージのATPレベルを引き上げる上で有効であることを示した。ATPレベルは、抗MS4A4A抗体4A-450を使用した未処理細胞で認められたレベルの約1.2倍(0.016μg/mlの抗MS4A4A抗体を使用)から約1.4倍(1.0μg/mlの抗MS4A4A抗体を使用)引き上げられた。ATPレベルは、抗MS4A4A抗体4A-313を使用した未処理細胞で認められたレベルの約1.3倍(0.008μg/mlの抗MS4A4A抗体を使用)から約1.7倍(1.0μg/mlの抗MS4A4A抗体を使用)引き上げられた。
Figure 2022542964000065
実施例26:マクロファージ細胞表面マーカーに関する抗MS4A4A抗体の効果
CNS及び末梢器官の双方での骨髄細胞は、表現型と機能は本質的に一定していない。末梢器官では、M1様の表現型を有するマクロファージは、より炎症誘発性で、抗菌性があり、M2様の表現型を有するマクロファージは、恒常性が大きく、抗炎症性である。CNS内では、恒常性状態のミクログリアは、CD200R、CD163などのM2様マーカーも発現する。MS4A4Aの発現は、インビトロで、M2様マクロファージにおいて上昇しており、このことは、MS4A4Aが、M2様マクロファージの新規の細胞表面マーカーであることを示唆している(Immunology and Cell Biology 2017,95:611-619)。
様々なマクロファージ細胞表面マーカーに関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果を、以下のようにして調べた。ヒト初代マクロファージを、様々な濃度(10μg/ml、1.0μg/ml、0.1μg/ml)の抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1または4A-419野生型(WT)huIgG1を含む完全RPMI1640で、48時間処理した。次に、これらの細胞を回収し、そして、M1様マーカー(例えば、CD16、MHCクラスII、CD86)、M2様マーカー(例えば、CD200R、Dectin-1、CD163)、及び汎マクロファージマーカーCD14に対して特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーに供した。
図18A、18B、及び18Cに示したように、初代ヒトマクロファージに対して抗MS4A4A抗体を加えると、未処理細胞で認められたものと比較して、用量依存的に、CD14及びCD163細胞表面マーカーが抑制された(抗MS4A4A抗体4A-313 NSLF huIgG1 Fc(それぞれのペアのグラフの右側の棒)、抗MS4A4A抗体4A-419野生型huIgG1 Fc(WT)(それぞれのペアのグラフの左側の棒)。初代ヒトマクロファージに対して抗MS4A4A抗体4A-313 NSLFを加えると、未処理細胞で認められたレベルよりも低いレベルのCD200R細胞表面マーカーが認められた。対照的に、初代ヒトマクロファージに対して抗MS4A4A抗体4A-419を加えると、未処理細胞で認められたレベルよりも高いレベルのCD200R細胞表面マーカーが認められた。この結果は、上記した抗MS4A4A抗体4A-313 NSLFで得た結果、及びCD200RなどのM2様細胞表面マーカーを抑制する本開示のその他の抗MS4A4A抗体で得た結果を考慮すると、この特定の実験にあっては例外的なものと考えられる(上記実施例9及び表26を参照されたい)。以下の表37は、図18A、18B、及び18Cのグラフから得た細胞表面マーカーの倍数変化の(未処理細胞を超える)数値を示す。データは、2名のドナーからのもので、3つのウェルで平均化している。
Figure 2022542964000066
これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、M2様マクロファージ細胞表面マーカーを抑制する上で有効であることを示した。
実施例27:補体依存性細胞傷害性(CDC)アッセイでのヒトIgG1 Fcバリアント
ヒトIgG1抗体のFcドメインは、例えば、C1q、Fcガンマ受容体、及び新生児Fc受容体など、複数の下流エフェクター分子との相互作用によってエフェクター機能に影響を与える。補体沈着に影響を与えるバリアントhuIgG1 Fc領域を有する本開示の抗MS4A4A抗体の能力を、以下のようにして、C3b沈着/細胞死滅アッセイを使用して測定した。
上記したようにして生成した組換えヒトMS4A4Aを過剰発現するU937細胞を、これらの研究の標的細胞として使用した。細胞を回収し、PBSで1回洗浄し、RPMI 1640培地で2×10個の細胞/mLに希釈した。丸底96ウェルプレート(Falcon #351177)に、ウェルあたり50μLの標的細胞(1×10個の細胞/ウェル)を分注した。これらの細胞に対して、同じ培地で調製した25μLの抗MS4A4A抗体を、所定の濃度の4倍で加えた。細胞-抗体混合物を、37℃で、15分間インキュベーションし、次いで、プールした補体ヒト血清(Innovative Research,IPLA-CSER)の25μLを、補体供給源としてそれぞれのウェルに加え、そして、それらのプレートを、37℃で、さらに2時間インキュベーションした。その後、細胞を、FACS緩衝剤(PBS+2%FBS+1mM EDTA)で2回洗浄し、次いで、それぞれのウェルに、100μLの1:50で希釈した抗C3b-APC抗体(Biolegend 846106)を加え、そして、氷上で30分間インキュベーションした。細胞を、FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、80μLのFACS緩衝剤+0.25μL/ウェルのヨウ化プロピジウム(Fischer Scientific,BD556463)に再懸濁してから、iQueフローサイトメーター(IntelliCyt)で分析した。補体活性は、CDCで媒介した細胞死の程度を特定する高PI(PI-high)細胞のパーセンテージ、またはC3b沈着を測定するAPCチャネル内の細胞のMFIの2つの方法で測定した。
図19は、様々なhuIgG1 Fcバリアントを有する抗MS4A4A抗体4A-313で処理した組換えヒトMS4A4Aを発現するU937細胞でのPI(ヨウ化プロピジウム)取り込み%を示す。図19に示したように、野生型huIgG1を有する抗MS4A4A抗体4A-313は、細胞によるPI取り込みの増加として認められる、補体沈着及び標的発現細胞の死滅を促す能力に優れている。この効果は、用量依存的であった。Fc領域にhuIgG1 N325S/L328Fアミノ酸置換(C1q結合を大幅に弱める)を有する抗MS4A4A抗体4A-313、このアッセイでは、CDCはほぼ完全になくなっていた。加えて、Fc領域にhuIgG1 K322Aアミノ酸置換を有する抗MS4A4A抗体4A-313は、このアッセイでは、CDC活性が認められないとの同様の効果を示した。
以下の表38は、図19に示すグラフに関連した数値を示す。
Figure 2022542964000067
これらの結果は、野生型ヒトIgG1 Fc領域を有する抗MS4A4A抗体が、補体依存性細胞傷害性については有効であるのに対して、N325S/L328Fアミノ酸置換またはK322Aアミノ酸置換のいずれかのヒトIgG1 Fcバリアントを有する抗MS4A4A抗体が、補体依存性細胞傷害性については有効ではないことを示した。
実施例28:抗体依存性細胞食作用(ADCP)におけるヒトIgG1 Fcバリアント
抗体依存性細胞食作用(ADCP)を媒介する本開示の抗MS4A4A抗体の能力を、ADCH Reporter Bioassayシステム(Promega #G9901)を使用して評価した。このシステムは、FcγRIIa受容体(H131バリアント)を安定して発現する遺伝子操作したJurkat T細胞株、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを利用している。このアッセイの活性は、エフェクター細胞(この事例では、骨髄細胞)によるADCP活性と相関している。本明細書で使用した標的細胞は、組換えヒトMS4A4Aを過剰発現するU937細胞、または単球に由来しており、かつ、hIL-4(20ng/ml)及びデキサメタゾン(20nM)で極性化した初代ヒトマクロファージのいずれかであった。
細胞を、アッセイ緩衝剤(RPMI+4%低IgG血清)で、1.2×10/mLの濃度に希釈し、そして、25μLの細胞(30,000個/ウェル)を、96ウェルホワイトアッセイプレート(Costar 3922)の内部ウェルに分注した。プレートの外側のウェルを、細胞や抗体を含まない75μLのアッセイ緩衝剤で満たした。細胞を含むウェルに対して、アッセイ緩衝剤で希釈も行った所望の最終濃度の3倍の濃度の25μLの抗MS4A4A抗体を加えた。標的細胞に抗体を加えた後に、このアッセイシステムで提供したエフェクター細胞(2×10/mLで凍結したもの)を、37℃で解凍し、そして、630μLを、3.6mLの予め温めておいた(37℃)アッセイ緩衝剤に加え、そして、ゆっくりと混合した。25μLのエフェクター細胞(75,000個/ウェル、2.5のE:T比)を、標的細胞と抗体を含むウェルに直ちに加えた。次いで、このプレートを、37℃及び5%COで、6時間インキュベーションして、受容体細胞の活性化と、ルシフェラーゼの発現を可能にした。このインキュベーションの後に、このプレートを、室温に平衡化させ(15分)、その後、75μLのルシフェラーゼアッセイ試薬を、それぞれのウェルに加えた。次いで、このプレートを、プレートシェーカーで、20分間、インキュベーションし、そして、BioTekプレートリーダーで発光を測定した。
図20に示したように、野生型huIgG1(Iso Ctrl IgG1)は、このアッセイで、ルシフェラーゼ活性を強力に駆動しており、これは、FcγRIIa-H131の活性化を示している。N325S/L328Fアミノ酸置換を有するhuIgG1 Fcを含む抗MS4A4A抗体4A-313は、Iso Ctlr IgG1で認められたものと比較して、FcγRIIa-H131活性化の実質的な喪失を示した;K322Aアミノ酸置換を有するhuIgG1 Fcを含む抗MS4A4A抗体4A-313は、このアッセイにおいて、同様の効果を有した。
以下の表39は、図20に示すグラフに関連した数値を示す。
Figure 2022542964000068
これらの結果は、野生型ヒトIgG1 Fc領域を有する抗MS4A4A抗体が、抗体依存性細胞食作用に有効であることを示した。加えて、これらの結果は、N325S/L328Fアミノ酸置換、またはK322Aアミノ酸置換のいずれかのヒトIgG1 Fcバリアントを有する抗MS4A4A抗体も、程度は低くなるものの、抗体依存性細胞食作用において有効であることを示した。
実施例29:抗体依存性細胞傷害(ADCC)でのヒトIgG1 Fcバリアント
標的細胞に結合した抗体は、主に、ナチュラルキラー細胞に関するFcγRIIIaの活性化により駆動すると考えられている活性であるADCCを媒介することができる。本開示の抗MS4A4A抗体が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を引き起こす能力を、ADCC Reporter Bioassayシステム(Promega #G7010)を使用して評価した。このアッセイシステムは、FcγRIIIa受容体(V158バリアント)を安定して発現する遺伝子操作したJurkat T細胞株、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答エレメントを利用している。本明細書で使用した標的細胞は、組換えヒトMS4A4Aを過剰発現するU937細胞、または単球に由来しており、かつ、hIL-4(20ng/ml)及びデキサメタゾン(20nM)で極性化した初代ヒトマクロファージのいずれかであった。標的細胞を、アッセイ緩衝剤(RPMI+4%低IgG血清)で、1.2×10/mLの濃度に希釈し、そして、25μLの細胞(30,000個/ウェル)を、96ウェルホワイトアッセイプレート(Costar 3922)の内部ウェルに分注した。プレートの外側のウェルを、細胞や抗体を含まない75μLのアッセイ緩衝剤で満たした。細胞を含むウェルに対して、アッセイ緩衝剤で希釈も行った、所望の最終濃度の3倍の濃度の25μLの抗体を加えた。標的細胞に抗体を加えた後に、提供したエフェクター細胞(2×10/mLで凍結したもの)を、37℃で解凍し、そして、630μLを、3.6mLの予め温めておいた(37℃)アッセイ緩衝剤に加え、ゆっくりと混合を行い、そして、25μLのエフェクター細胞(75,000個/ウェル、2.5のE:T比)を、標的細胞と抗体を含むウェルに直ちに加えた。次いで、このプレートを、37℃及び5%COで、6時間インキュベーションして、受容体細胞の活性化と、ルシフェラーゼの発現を可能にした。このインキュベーションの後に、このプレートを、室温に平衡化させ(15分)、その後、75μLのルシフェラーゼアッセイ試薬を、それぞれのウェルに加えた。次いで、このプレートを、プレートシェーカーで20分間インキュベーションし、そして、BioTekプレートリーダーで発光を測定した。
図21に示したように、野生型hu IgG1(Iso Ctrl IgG1)は、このアッセイで、ルシフェラーゼ活性を強力に駆動しており、このことは、FcγRIIIa-V158の活性化を示している。N325S/L328Fアミノ酸置換を有するhuIgG1 Fcを含む抗MS4A4A抗体4A-313は、Iso Ctlr IgG1で認められたものと比較して、FcγRIIa-H131活性化の実質的な喪失を示した;K322Aアミノ酸置換を有するhuIgG1 Fcを含む抗MS4A4A抗体4A-313は、このアッセイにおいて、同様の効果を有した。
以下の表40は、図21に示すグラフに関連した数値を示す。
Figure 2022542964000069
これらの結果は、野生型ヒトIgG1 Fc領域を有する抗MS4A4A抗体が、抗体依存性細胞傷害に有効であるが、その一方で、N325S/L328Fアミノ酸置換、またはK322Aアミノ酸置換のいずれかのヒトIgG1 Fcバリアントを有する抗MS4A4A抗体は、抗体依存性細胞傷害において有効でないことを示した。
実施例30:初代ヒトマクロファージでの膜及び可溶性TREM2レベルに関するMS4A4Aノックアウトの効果
マクロファージにおけるMS4A4Aノックアウトが膜及び可溶性TREM2レベルに及ぼす効果を、次のようにして調べた。CRISPR技術を使用して、初代ヒトマクロファージにおけるMS4A4Aの発現をノックアウトした。簡潔に説明すると、ノックアウトマクロファージを、Cas9タンパク質(IDT)を用いたエレクトロポレーションで生成しており、当該タンパク質は、tracrRNA(IDT)にアニーリングした遺伝子座特異的crRNA(IDT;NT1、IDTネガティブコントロールcrRNA#1及び#2;NT2,GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC(配列番号345)及びAACCCCTGATTGTATCCGCA(配列番号346);MS4A4A#1,AATTGTGTACCCGATATACA(配列番号347);MS4A4A#2,AACCATGCAAGGAATGGAAC(配列番号348);MS4A4A#3,TATTCATTCCTAGACTACCT(配列番号349);MS4A4A#4,GCTCTGTACTGGCTGCATCA(配列番号350))からなる非標的(NT)またはMS4A4A特異的gRNAと複合体を形成した。MS4A4Aノックアウト効率を、フローサイトメトリー分析で評価を行ったところ、90%超であった(データは示さず)。
図22A及び22Bは、膜TREM2(mTREM2)レベル、及び可溶性TREM2(sTREM2)レベルに関するMS4A4Aノックアウトの効果を示す。図22A及び22Bでは、NT1及びNT2は、非標的CRISPRコントロールである;gRNA2+3とgRNA1+4とは、MS4A4Aをノックアウトするために使用する異なるガイドのことを指す。
図22A及び22Bに示したように、初代ヒトマクロファージにおけるMS4A4Aのノックアウトは、mTREM2及びsTREM2レベルを引き上げた。MS4A4Aノックアウトの際に認められたmTREM2及びsTREM2のレベルの増大は、NT1及びNT2コントロール細胞に対して抗MS4A4A抗体4A-313を加えた時のmTREM2及びsTREM2レベルの増大に匹敵していた。MS4A4Aノックアウト初代ヒトマクロファージを抗MS4A4A抗体で処理しても、mTREM2またはsTREM2レベルのさらなる増大は認められず、このことは、ヒトマクロファージに対して本開示の抗MS4A4A抗体を加えた際に認められたmTREM2及びsTREM2レベルの増大が、細胞のMS4A4Aに対して結合する抗MS4A4A抗体によるものであることを示唆している。
実施例31:抗MS4A4A抗体による膜及び可溶性TREM2調節の動態
TREM2タンパク質の細胞表面発現は、原形質膜に対する、及び原形質膜からのTREM2のエンドサイトーシス/エキソサイトーシスで調節しており、また、膜結合プロテアーゼによるTREM2の調節された開裂で調節している(Thornton et al.,2017,EMBO Mol.Med.9:1366-1378;doi:10.15252/emmm.201707673)。先の実施例で説明したように、本開示の抗MS4A4A抗体で、ヒトマクロファージを処理すると、膜及び可溶性TREM2レベルの両方が増大した。以下の研究は、膜及び可溶性TREM2のレベルの変化の動態の理解をさらに深めるために実施した。
可溶性TREM2(sTREM2)レベルの変化を評価するために、初代ヒトマクロファージを、24ウェルまたは96ウェルプレートのいずれかに播種し、続いて、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、4A-450.NSLF、またはアイソタイプコントロール抗体(すべて、1μg/ml)を加えた。抗体の存在下、細胞培養の0.5、1、4、24、及び48時間後に上清を回収し、そして、Meso Scale Discoveryを使用して、sTREM2レベルを決定した。
本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後の初代ヒトマクロファージでの膜TREM2(mTREM2)レベルの増加の動態は、以下のようにして評価した。初代ヒトマクロファージを、分析の3日前(Tマイナス72時間)に、96ウェルU底プレートに、100,000個の細胞/ウェルで播種した。様々な時点(Tマイナス48時間、Tマイナス24時間、Tマイナス4時間、Tマイナス1時間)で、アイソタイプコントロール抗体(IsoControl.NSLF)、及び抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFなどの抗体を、播種した細胞に対して加えた。播種して72時間後に、TREM2の細胞表面(膜結合)発現レベルを、フルオロフォアとコンジュケートした抗TREM2抗体で細胞を染色した後に、フローサイトメトリーで測定した。
図23Aに示したように、本開示の抗MS4A4A抗体は、様々なドナーから得た培養した初代ヒトマクロファージの上清でのsTREM2のレベルを急速に引き上げた。抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFは、アイソタイプコントロール抗体で処理した細胞で認められたレベルの約0.5倍、sTREM2レベルを引き上げた(約50%の増加)。抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFは、アイソタイプコントロール抗体で処理した細胞で認められたレベルの約2.5倍、sTREM2レベルを引き上げた(約250%の増加)。
図23Bに示したように、初代ヒトマクロファージに対して抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを加えて1時間及び4時間後の膜TREM2レベルは、アイソタイプコントロール抗体を加えた後に認められたレベルと比較して低下していた。図23Bにおいて、点線は、アイソタイプコントロール抗体で処理した細胞でのmTREM2のレベルを表す。抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを加えて24時間及び48時間後のmTREM2のレベルは、アイソタイプコントロール抗体で処理した細胞で認められたレベルを超えて増大していた。膜TREM2の初期の減少は、図23Aに示したように、試験した全時点でのTREM2のシェディングの拡大と一致している。
本開示の抗MS4A4A抗体は、初代ヒトマクロファージにおけるTREM2タンパク質のレベルを引き上げたので、以下の実験を実施して、抗MS4A4A抗体を加えた後のTREM2 mRNAレベルに及ぶ影響について調べた。初代ヒトマクロファージを、24ウェルプレートまたは96ウェルプレートのいずれかに播種し、そして、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及びアイソタイプ(1μg/ml)を含む完全RPMIで処理した。0.5、1、4、24、及び48時間のインキュベーション後に、細胞ペレットを回収し、そして、定量PCR分析(qPCR)を使用して、TREM2 mRNAレベルを決定した。簡潔に説明すると、RNAを、RNease Mini Kit(Qiagen)を使用して抽出し、cDNAを、QuantiNova Reverse Transcription Kit(Qiagen)を使用して全RNAから調製した。遺伝子発現レベルは、TREM2(Hs00219132_m1)及びGAPDH(Hs027886624_g1)のTaqManアッセイを使用して、リアルタイムPCRで分析した。それぞれの試料のCT値を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHのCT値に対して正規化した。
図23Cに示したように、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFは、様々なドナーから得た培養ヒト初代マクロファージのTREM2 mRNAレベルに影響を与えなかった;mRNAレベルのわずかな変化が認められた(アイソタイプコントロールで認められたレベルの0.5倍未満)。これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、培養ヒト初代マクロファージでのTREM2 mRNAレベルに影響を与えずに、TREM2タンパク質のレベルを高めたことを示した。
実施例32:抗MS4A4A抗体は、初代ヒトマクロファージでのSPP1及びIL1RN分泌を増やす
初代ヒトマクロファージでのオステオポンチン(SSP1)、及びインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL1RN)の分泌レベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果を調べ、そして、以下のようにして、MS4A4A発現をノックアウトするように遺伝子操作して改変した初代ヒトマクロファージで認められたものと比較した。
初代ヒトマクロファージでのMS4A4A遺伝子ノックアウトを、Cas9タンパク質を用いたエレクトロポレーションで生成した。このタンパク質は、単一のgRNA分子またはgRNA二重鎖のいずれかの形態のガイドRNA(gRNA)と複合体を形成しており、当該ガイドRNAは、標準的な方法を使用して、tracrRNAにアニーリングしたcrRNA:非標的NT1(IDTネガティブコントロールRNA#1及び#2);NT2(GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC[配列番号345]及びAACCCCTGATTGTATCCGCA[配列番号346]);MS4A4A#1(AATTGTGTACCCGATATACA[配列番号347]);MS4A4A#2(AACCATGCAAGGAATGGAAC[配列番号348]);MS4A4A#3(TATTCATTCCTAGACTACCT[配列番号349]);MS4A4A#4(GCTCTGTACTGGCTGCATCA[配列番号350])(すべて、IDT,Coralville,Iowa,USAから得た)からなる。次に、細胞を、50,000個の細胞/ウェルで、完全RPMI-1640に播種し、そして、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF(0.1μg/ml)、抗MS4A4A抗体4A-450.NSLF(0.1μg/ml)、またはアイソタイプコントロール抗体の存在下で、48時間培養した。細胞から上清を回収し、そして、IL1RN及びSPP1のレベルを、R&D DuoSet ELISAキット(IL1RNカタログ番号DY280、SPP1カタログ番号DY1433)を使用して分析した。
NTコントロール細胞を、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFまたは4A-450.NSLFのいずれかで処理すると、分泌したSPP1のレベルが高まった。これらの細胞でのMS4A4Aの遺伝子ノックアウトも、MS4A4A抗体治療で認められるものに匹敵する分泌SPP1レベルの増大をもたらした。これらの研究でのSPP1のレベルは:NTコントロール細胞にアイソタイプコントロール抗体を加えた後での約100ng/ml;NTコントロール細胞に抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを加えた後での約200ng/ml;NTコントロール細胞に抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを加えた後での約275ng/ml;及びMS4A4Aノックアウト細胞での約225ng/mlであった。本開示のいずれかの抗MS4A4A抗体を加えた後での分泌したSPP1レベルの増大は、MS4A4A発現を遺伝的にノックアウトした細胞で認められたものと同等であった。
NTコントロール細胞を、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFまたは4A-450.NSLFのいずれかで処理すると、分泌したIL1RNのレベルが高まった。これらの細胞でのMS4A4Aの遺伝子ノックアウトも、MS4A4A抗体治療で認められるものに匹敵する分泌IL1RNレベルの増大をもたらした。これらの研究でのIL1RNのレベルは:NTコントロール細胞にアイソタイプコントロール抗体を加えた後での約8ng/ml;NTコントロール細胞に抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを加えた後での約12ng/ml;NTコントロール細胞に抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを加えた後での約16ng/ml;及びMS4A4Aノックアウト細胞での約14ng/mlであった。本開示のいずれかの抗MS4A4A抗体を加えた後での分泌したIL1RNレベルの増大は、MS4A4A発現を遺伝的にノックアウトした細胞で認められたものと同等であった。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、初代ヒトマクロファージにおけるSPP1及びIL1RNの分泌レベルを引き上げる上で有効であることを示した。加えて、これらの結果は、分泌したSPP1及びIL1RNのレベルの増大に関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果が、MS4A4Aの発現を遺伝的にノックアウトしたときに認められたものと類似していることを示しており、このことは、本開示の抗MS4A4A抗体が、これらの細胞におけるMS4A4Aの活性を抑制またはブロックし、その結果、SPP1及びIL1RNレベルの増大が認められたことを示唆している。
実施例33:ヒトマクロファージでの抗MS4A4A抗体誘導性生存率は、TREM2非依存性である
上記したように、本開示の抗MS4A4A抗体は、抗MS4A4A抗体を加えた後の初代ヒトマクロファージの生存率(総細胞ATPの増加について測定する)を高める上で有効であった。加えて、上記したように、本開示の抗MS4A4A抗体は、細胞での膜TREM2レベルを引き上げた。本開示の抗MS4A4A抗体が、膜TREM2レベルを高め、そして、抗MS4A4A抗体が、細胞生存率を高めたので、一連の実験を実施して、抗MS4A4A抗体添加に応答して認められた細胞生存率の増大が、少なくとも部分的には、TREM2に依存しているかどうかを調べた。このことを調査するために、CRISPR技術を使用して、ヒト初代マクロファージでTREM2を遺伝的にノックアウトして、TREM2発現を遺伝的に欠失している初代ヒトマクロファージの細胞生存率に関する、本開示の抗MS4A4A抗体の効果を調べた。
TREM2ノックアウトマクロファージは、Cas9タンパク質を利用したエレクトロポレーションによって生成した。このタンパク質は、単一のgRNA分子またはgRNA二重鎖のいずれかの形態のガイドRNA(gRNA)と複合体を形成しており、当該ガイドRNAは、tracrRNAにアニーリングしたcrRNA:非標的NT1(NT1)(IDTネガティブコントロールcrRNA#1及び#2);NT2(GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC[配列番号345]及びAACCCCTGATTGTATCCGCA[配列番号346]);TREM2#1(GCCATCACAGACGATACCCT[配列番号351]);TREM2#2(ATAGGGGCAAGACACCTGCA[配列番号352]);TREM2#3(CAGCATCCCGGTGATCCAGG[配列番号353]);TREM2#4,TGGAGATCTCTGGTTCCCCG[配列番号354])(すべて、IDT,Coralville,Iowa,USAから得た)からなる。
次に、細胞を、50,000個の細胞/ウェルで、完全RPMI-1640に播種し、そして、抗MS4A4A抗体(4A-313NSLF、4A-450NSLF)、またはアイソタイプコントロール抗体(すべて、0.1μg/ml)を含む溶液の存在下で、48時間培養した。次いで、製造業者のプロトコルに従って、CellTiter-Glo Luminescent細胞生死判別キット(Promega,カタログ番号G7571)を使用して、細胞内のATP含有量を定量した。
抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFまたは抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを加えると、アイソタイプコントロール抗体で認められたレベルと比較して、NTコントロール細胞のATPレベルを約20%引き上げた。加えて、TREM2ノックアウト細胞に対して抗MS4A4A抗体を加えると、アイソタイプコントロール抗体で認められたレベルよりもATPレベルが約15%~20%引き上げた。まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体は、少なくとも部分的には、TREM2に依存せずに、細胞ATPレベル(したがって、細胞生存率)を高めることを示した。
実施例34:MS4A4AのsiRNAノックダウンは、初代ヒトマクロファージでの膜及び可溶性TREM2レベルを引き上げる
上記したように、CRISPR技術を使用してMS4A4A発現の遺伝子を除去すると、ヒトマクロファージでの膜及び可溶性TREM2レベルが増大した。これらの知見をさらに裏付けるために、独立した実験的手法を使用して、TREM2レベルに関してMS4A4A発現の喪失が及ぼす影響を評価した。これらの研究では、初代ヒトマクロファージでのMS4A4AのsiRNAノックダウンを実施して、膜及び可溶性TREM2レベルに及ぼすその影響を測定した。
MS4A4Aノックダウンマクロファージを、N-TER Nanoparticle siRNA Transfection System(Millipore Sigma)を使用して、コントロール(Millipore Sigma,SIC001)、及びMS4A4A標的siRNA(Millipore Sigma,SASI_Hs01_00150955)をトランスフェクトして生成した。MS4A4Aノックアウト効率は、フローサイトメトリー分析で評価した(データ示さず)。TREM2の細胞表面(膜結合)発現は、フルオロフォアとコンジュゲートした抗TREM2抗体で細胞を染色した後に、フローサイトメトリーで測定した。
図24A及び図24Bに示したように、MS4A4A発現のsiRNAノックダウンは、膜TREM2レベル及び可溶性TREM2レベルをそれぞれを引き上げた。図24A及び図24Bでは、つなぎ合わせたドットのそれぞれのセットは、siRNAノックダウンが有る場合とない場合での1名の個々のドナー(合計で6名のドナー)での平均結果を表す。これらのデータは、上記した遺伝子操作したMS4A4Aノックアウト細胞でのmTREM2及びsTREM2レベルの増大を示す同様の結果と一致している。まとめると、これらの結果は、MS4A4Aの発現または活性を欠失させると、初代ヒトマクロファージでの可溶性TREM2レベルと膜TREM2レベルの両方を引き上げることを示した。
実施例35:mTREM2、sTREM2、及びATPレベルの増大に関する抗MS4A4A抗体のインビトロでの効力
mTREM2、sTREM2、及びATPレベルの増大に関する本開示の抗MS4A4A抗体の(上記した実施例24及び25で説明した)効果を、3名の別々のドナーから得た初代ヒトマクロファージでさらに調べた。初代ヒトマクロファージを、様々な濃度の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及び4A-450.NSLFで、48時間処理した。次いで、mTREM2、sTREM2、及びATPのレベルの変化を測定した。
図25A、図25B、及び図25Cに示したように、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及び抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFは、それぞれ3名の異なるドナーから得た初代ヒトマクロファージにおいて、用量依存的にmTREM2のレベルを引き上げた。図25A、図25B、及び図25Cのデータは、アイソタイプコントロール抗体を使用して認められたレベルに対するmTREM2のレベルの増加倍数として表されている(x軸は、抗体濃度(μg/ml)を示しており、y軸は、1.0に設定したコントロールを超える増加倍数を示す)。これらのグラフのデータを分析して、EC50値と最大応答を決定した;これらの結果を、以下の表41に示す(平均+/-SEMとして示した)。
Figure 2022542964000070
図26A、図26B、及び図26Cに示したように、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及び抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFは、それぞれ3名の異なるドナーから得た初代ヒトマクロファージにおいて、用量依存的にsTREM2のレベルを引き上げた。図26A、図26B、及び図26Cのデータは、アイソタイプコントロール抗体を使用して認められたレベルに対するsTREM2のレベルの増加倍数として表されている(x軸は、抗体濃度(μg/ml)を示しており、y軸は、1.0に設定したコントロールを超える増加倍数を示す)。これらのグラフのデータを分析して、EC50値と最大応答を決定した;これらの結果を、以下の表42に示す(平均+/-SEMとして示した)。
Figure 2022542964000071
図27A、図27B、及び図27Cに示したように、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及び抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFは、それぞれ3名の異なるドナーから得た初代ヒトマクロファージにおいて、用量依存的に細胞ATPのレベルを引き上げた。図27A、図27B、及び図27Cのデータは、アイソタイプコントロール抗体を使用して認められたレベルに対する細胞ATPのレベルの増加倍数として表されている(x軸は、抗体濃度(μg/ml)を示しており、y軸は、1.0に設定したコントロールを超える増加倍数を示す)。これらのグラフのデータを分析して、EC50値と最大応答を決定した;これらの結果を、以下の表43に示す(平均+/-SEMとして示した)。
Figure 2022542964000072
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体を加えた後のmTREM2、sTREM2、及び細胞ATPのレベルが増大していることから明らかなように、当該抗体が、初代ヒトマクロファージの機能的変化を誘発したことを示した。
実施例36:抗MS4A4A抗体は、CSF1R阻害によって誘導する細胞死を救済する
CSF1R阻害後のヒトマクロファージの生存を維持するMS4A4Aの能力を評価するために、本開示の抗MS4A4A抗体を、CSF1R阻害剤、PLX3397の存在下で細胞生存を高める当該抗体の能力について研究した(DeNardo et al.,Cancer Discov(2011)1(1):54-67.22039576);Peng,et al.,J.of Exp Canc Res(2019)38(1):372.PMID:31438996を参照されたい)。
RosetteSep Human Monocyte Enrichment Protocol(Stem Cell Technologies)を使用して、全血からヒト単球を分離した。ヒト単球由来のマクロファージを調製するために、単球を計数し、そして、完全RPMI培地(Glutamax、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及び10%熱不活化ウシ胎児血清を補充したRPMI)、及び50ng/mlのMCSF(Peprotech)に接種した。6日後に、分化した単球(マクロファージ)を回収し、そして、50ng/mlのM-CSFを含む完全RPMI培地において、0.1×10個の細胞/ウェルの密度で、96ウェルプレートに播種した。マクロファージを、一晩かけて、回復させた。7日目に、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及び4A-450.NSLFを、PLX3397(1μM)を含む、または含まない培養マクロファージに対して加えた。すべての抗体を、1μg/mlの最終濃度で加えた。細胞生存率を、死滅細胞を標識するDNA色素であるCytotox red試薬(Essen Bioscience)を使用して決定した。Cytotox red試薬のレベルを、IncuCyte Live Cellイメージングシステム(Essen Bioscience)を使用して、数日間にわたって蛍光シグナルを測定して決定した。
図28Aに示したように、PLX3397及び抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFで処理したヒトマクロファージのCytotox red計数は、PLX3397とアイソタイプコントロール抗体とで処理した細胞で認められた計数よりも少なかった。図28Aのデータは、平均±SEMとしてグラフ化している;N=3名のヒトドナーの3。
図28Bに示したように、PLX3397及び抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFで処理したヒトマクロファージのCytotox red計数は、PLX3397とアイソタイプコントロール抗体とで処理した細胞で認められた計数よりも少なかった。図28Bのデータは、平均±SEMとしてグラフ化している;N=3名のヒトドナーの3。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、CSF1R阻害後のヒトマクロファージの細胞死を抑制し、その生存を持続させることを示した。したがって、本開示の抗MS4A4A抗体は、ALSPまたはHDLSなどのCSF1R欠損疾患または障害を有する個体を治療する上で有用である。
実施例37:カニクイザル血清での抗MS4A4A抗体の薬物動態
血清での本開示の抗MS4A4A抗体の薬物動態(PK)をインビボで調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザル(cyno)に対して、抗MS4A4A抗体4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT、またはアイソタイプコントロール(huIgG1)を、80mg/kgの用量で、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの動物群に、合計で5回の投与を行った:1回目と2回目の投与は28日の間隔を設け、残りの4回の投与は、それぞれの投与間隔を7日間とした。
血清試料は、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188、及び1224時間後に動物から回収した。
カニクイザル血清での抗MS4A4A抗体4A-21.WT、4A-25.WT、及び4A-18.WTのレベルを、捕捉試薬であるビオチン標識ヤギ抗ヒトIgG(カタログ番号NBP1-74983;Novus Biologicals)、及び検出試薬であるAlexa fluor(登録商標)647標識抗ヒトIgG(カタログ番号2049-31;Southern Biotech)を用いた段階的サンドウィッチ方式に基づいたカスタムGyrolabアッセイを使用して測定した。標準、品質コントロール、及び試料を、Rexxip HN緩衝剤(カタログ番号P0004996,Gyrolab)で希釈した。試料に存在する抗MS4A4A抗体を、gyrolab bioaffy 200CDのストレプトアビジンでコーティングしたアフィニティーカラムに結合したビオチン化抗ヒトIgGで捕捉した。捕捉した抗MS4A4A抗体を、蛍光標識した抗ヒトIgG抗体で検出した。生成した蛍光シグナルの強度は、試料に存在する抗MS4A4A抗体の量に比例していた。Gyrolab xPとExcelを使用してデータを分析した。
動物に対して80mg/kgの用量を投与した後に、血清での抗MS4A4A抗体濃度は、認められた平均最大濃度(Cmax)に達した後に着実に低下しており、投与1日目(初回投与日)の後での平均半減期(t1/2)値(平均±SD)は、抗MS4A4A抗体4A-21.WTでは140±54.5時間、抗MS4A4A抗体4A-25.WTでは269±114時間、そして、抗MS4A4A抗体4A-18.WTでは193±26.8時間であった。クリアランス(CL)はt1/2に反比例しており、1日目の平均CL(平均±SD)は、抗体4A-21.WTでは0.625±0.107mL/時間/kg、抗体4A-25.WTでは0.124±0.025mL/時間/kg、そして、抗体4A-18.WTでは0.402±0.09mL/時間/kgであった。1日目の定常状態の分布体積(Vss)値は、抗体4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT群では、それぞれ、30.8~51.4mL/kg、22.6~41.7mL/kg、及び24.9~41.3mL/kgの範囲であった。
曝露を、Cmaxと、投与後0~168時間の濃度-時間曲線下の面積(AUC0-168)で評価した。1日目に、抗体4A-25.WTの平均Cmaxが最も高く(6.26×10ng/mL)、次いで、抗体4A-18.WT(4.81×10ng/mL)が続いた。抗MS4A4A抗体4A-21.WT(3.53×10ng/mL)は、試験対象の中で最も低いCmaxを示した。
抗MS4A4A抗体4A-25.WT、及び4A-18.WTは、同様のAUC0-168(それぞれ、3.47×10ng時間/mL、及び3.35×10ng時間/mL)を示しており、この数値は、抗体4A-21のもの(1.15×10ng時間/mL)よりも有意に大きかった。
実施例38:抗MS4A4A抗体は、インビボで、血清及びCSF sTREM2レベルを引き上げる
血清及び脳脊髄液(CSF)でのsTREM2レベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果をインビボで調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザルに対して、抗MS4A4A抗体4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT、またはアイソタイプコントロール(huIgG1)を、80mg/kgの用量で、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で5回の投与を行った:1回目と2回目の投与は28日の間隔を設け、残りの4回の投与は、それぞれの投与間隔を7日間とした。
血清試料は、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188、及び1224時間後に動物から回収した。CSF試料も、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188、及び1224時間後に動物から回収した。
血清では、抗MS4A4A抗体4A-25.WT、4A-18.WT、及び4A-21.WTを投与すると、sTREM2レベルは、ベースラインの2倍超引き上げられており、第1の抗体を投与して48~96時間後に、それぞれ、投与前のベースラインレベルの232%、261%、及び287%のピークレベルを示した。さらに、29、36、43、及び50日目に抗MS4A4A抗体を、毎週反復投与すると、血清でのsTREM2のレベルは上昇を続け、平均sTREM2レベルは、投与前のベースラインレベルで認められたレベルの約2倍であった(214%、4A-25.WT;226%、4A-18.WT;199%、4A-21.WT)。アイソタイプコントロールは、投与期間を通して投与前のレベル(ベースラインの107%)をほぼ保っていた。
CSFでは、アイソタイプコントロール処理動物で認められたレベルと比較して、それぞれ抗MS4A4A抗体4A.21.WT(p=0.0008、二元配置分散分析)及び4A-25.WT(p=0.004、二元配置分散分析)の投与から24時間及び96時間後でのsTREM2レベルが有意に上昇した。4A-18.WTで処理した群でのsTREM2レベルは、アイソタイプコントロール群で認められたレベルと同様のままであった。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、インビボで、血清及びCSFの両方において、sTREM2レベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例39:抗MS4A4A抗体は、インビボで、CSFオステオポンチンレベルを引き上げる
CSFでのオステオポンチンレベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果をインビボで調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザルに対して、抗MS4A4A抗体4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT、またはアイソタイプコントロール(huIgG1)を、80mg/kgの用量で、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で5回の投与を行った:1回目と2回目の投与は28日の間隔を設け、残りの4回の投与は、それぞれの投与間隔を7日間とした。CSF試料を、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188、及び1224時間後に動物から回収した。
抗MS4A4A抗体4A-25.WT、4A-18.WT、及び4A-21.WTは、アイソタイプコントロール抗体で認められたレベルと比較して、CSFでのオステオポンチンレベルを有意に高めた。抗MS4A4A抗体4A-21.WTを反復投与すると、アイソタイプコントロールと比較して、初回投与の12時間後にピークに達したCSFオステオポンチンレベルを、約280ng/ml(p<0.0001、二元配置分散分析)にまで大きく引き上げ、続く投与後の12~24時間、ピークレベルを示し続けた。抗MS4A4A抗体4A25.WT及び抗体4A-18.WTを反復投与すると、アイソタイプコントロールと比較して、各投与の12~24時間後、CSFオステオポンチンレベルが(約50~80ng/mlのレベルまで)上昇する傾向が示された。
これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、インビボで、CSFでのオステオポンチンレベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例40:抗MS4A4A抗体は、インビボで、様々な脳領域のオステオポンチンレベルを引き上げる
カニクイザルの前頭葉及び海馬でのオステオポンチンレベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果をインビボで調べるために、以下の研究を行った
カニクイザルに対して、抗MS4A4A抗体4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT、またはアイソタイプコントロール(huIgG1)を、80mg/mlの用量で、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で5回の投与を行った:1回目と2回目の投与は28日の間隔を設け、残りの4回の投与は、それぞれの投与間隔を7日間とした。これらの動物を、5回目の投与の48時間後に安楽死させ、そして、前頭葉と海馬を取り出して凍結した。
脳組織でのオステオポンチンレベルを、次のようにして測定した。凍結した脳試料を、N-Per Neuronal Protein Extraction Reagent(カタログ番号87792、Thermo Scientific)、及びHalt Protease阻害剤(カタログ番号1861278)を使用して、製造業者の指示に従って、氷上で、20分間かけて溶解した。試料を遠心分離し、そして、上清を新しいチューブに移し、さらなる分析に供するまで-80℃で保存した。それぞれの試料の総タンパク質濃度を、製造業者の指示に従って、BCAタンパク質分析キット(カタログ番号23225、Thermo Scientific)で測定した。タンパク質濃度値は、脳組織で測定した分析物濃度を正規化するために使用した。
カニクイザルの脳組織でのオステオポンチンレベルは、抗MS4A4A抗体4A-21.WTで処理した後に上昇していた。抗MS4A4A抗体4A-21.WTを、カニクイザルに対して反復投与すると、アイソタイプコントロール抗体で認められたレベルと比較して、カニクイザルの前頭葉でのオステオポンチンレベルが有意に上昇した(それぞれ、p<0.035及びp=0.0003;一元配置分散分析)。特に、抗体を投与した後の前頭葉で測定した平均オステオポンチンレベルは次の通りであった:約0.6ng/mg(アイソタイプコントロール抗体);約1.2ng/mg(4A-21.WT);約0.7ng/mg(4A-25.WT及び4A-18.WT)。抗MS4A4A抗体を反復投与すると、アイソタイプコントロール抗体で認められたレベルと比較して、カニクイザルの海馬でのオステオポンチンレベルが上昇する傾向が認められた。特に、抗体を投与した後に海馬で測定した平均オステオポンチンレベルは次の通りであった:約1.3ng/mg(アイソタイプコントロール抗体);約1.8ng/mg(4A-21.WT及び4A-18.WT);及び約2.4ng/mg(4A-25.WT)。これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類の前頭葉及び海馬でのオステオポンチンレベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例41:CSFタンパク質バイオマーカーに関する抗MS4A4A抗体の効果
抗MS4A4A抗体4A-21.WT(80mg/kg)を末梢注射で投与したカニクイザルから得た脳脊髄液を、タンパク質バイオマーカー発現の変化について、インビボで、さらに分析した。これらの研究では、抗体注射の24時間後に動物から得たCSF試料に対してSomalogic Somascan 1.3kアッセイを用いて、CSFでのタンパク質発現レベルの変化の測定を行った。
抗MS4A4A抗体4A-21.WTをカニクイザルに投与した後に、CSFでのタンパク質変化が認められた。図29は、抗MS4A4A抗体4A-21.WT(80mg/kg)を末梢注射した後のカニクイザルから得た3つのCSF試料でのプロテオームワイドの効果を示すボルケーノプロットである。このボルケーノプロットでのそれぞれのドットは、1つのタンパク質を表している。測定したそれぞれのタンパク質について、x軸の値は、抗体処理動物とコントロール動物との間のCSFでのタンパク質のレベルの倍率変化の差を表している;y軸の値は、認められたこれらの差異の有意性を表しており、分散分析(ANOVA)で評価した差次的発現のp値のマイナスlog10として表している。図29のタンパク質記号は、p値が、<1E-3である抗体処理動物とコントロール動物において差次的に発現するタンパク質を示す。
図29に示したように、オステオポンチン(SSP1)及びIL1RN(2つのミクログリアマーカー)のCSFレベルの増大が、抗MS4A4A抗体を投与した動物で認められた。まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類のCSF及び血清の両方において、IL1RN及びオステオポンチンタンパク質のレベルを高めたことを示した。
実施例42:抗MS4A4A抗体は、インビボで、血清sTREM2レベルを引き上げる
血清及び脳脊髄液(CSF)でのsTREM2レベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体のインビボでの効果を、非ヒト霊長類で実施した別の一連の実験でさらに調べた。
カニクイザルに対して、80mg/mlの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、4A-313.WT、及び4A-450.NSLF、250mg/mlの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、またはビヒクルコントロールを、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で4回の投与を行った:1回目と2回目の投与は7日の間隔を設け、2回目と3回目の投与は14日の間隔を設け、そして、3回目と4回目の投与は28日の間隔を設けた。
血清試料は、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、2、6、10、24、34、48、72、96、168、168.5、170、174、178、192、216、240、264、336、408、504、504.5、506、510、514、528、552、576、600、672、744、840、912、1008、1176、1186、1200、及び1224時間後に動物から回収した;CSF試料も、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、2、6、10、24、34、48、72、96、168、168.5、170、174、178、192、216、240、264、336、408、504、504.5、506、510、514、528、552、576、600、672、744、840、912、1008、1176、1186、1200、及び1224時間後に動物から回収した。
血清でのsTREMレベルを、次のようにして測定した。Single spot Meso Scale Discovery(MSD)プレート(Rockville,MD)を、捕捉抗体を含むPBSで、4℃で、一晩コーティングした。サル血清試料(ならびに、サルTREM2-Fc標準)を、結合緩衝剤で希釈し、そして、室温で、1時間かけて、ウェルに加えた。ビオチン化ヤギ抗ヒトTREM2ポリクローナル抗体(R&D Systems)を、結合緩衝剤で1:2,000に希釈したものを加え、そして、室温で1時間インキュベーションした後に、スルホタグストレプトアビジン(MSD)で検出した。150μlの1×読取り緩衝剤(Read Buffer)をプレートに加え、そして、プレートを分析した。
これらの研究の結果を図30に示す。血清でのsTREM2レベルは、80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを投与して24時間後に、ベースラインで認められたレベルの約1.5倍(投与前のベースラインレベルの約150%)上昇した。sTREM2のレベルは、時間の経過とともに上昇を続け、80mg/kgで複数回投与した後では、ベースラインで認められたレベルの3倍の最大レベル(投与前のベースラインレベルの約300%)に達した。
血清sTREM2レベルは、250mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを投与して24時間後に、ベースラインで認められたレベルの約1.5倍上昇し、また、時間の経過とともに上昇を続け、250mg/kgで複数回投与した後では、ベースラインで認められたレベルの4.8倍の最大レベルに達した。
80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-313.WTを投与して24時間後から、血清sTREM2レベルは、ベースラインで認められたレベルの約1.5倍上昇した。80mg/kgの4A-313.WTの反復投与では、血清sTREM2レベルは、ベースラインで認められたレベルの最大3倍にまで引き上げられた。
80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを投与して24時間後に、血清sTREM2レベルは、ベースラインで認められたレベルの約2倍上昇し、また、時間の経過とともに上昇を続け、80mg/kgの4A-450.NSLFで複数回投与した後では、ベースラインで認められたレベルの3倍の最大レベルに達した。
まとめると、これらの結果は、本発明の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類の血清でのsTREM2レベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例43:抗MS4A4A抗体は、インビボで、CSFオステオポンチンレベルを引き上げる
脳脊髄液(CSF)でのオステオポンチンレベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体のインビボでの効果を調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザルに対して、80mg/mlの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、4A-313.WT、4A-450.NSLF、250mg/mlの用量の4A-313.NSLF、またはビヒクルコントロールを、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で4回の投与を行った:1回目と2回目の投与は7日の間隔を設け、2回目と3回目の投与は14日の間隔を設け、そして、3回目と4回目の投与は28日の間隔を設けた。
CSF試料を、抗体の投与前、抗体を投与して0.5、2、6、10、24、34、48、72、96、168、168.5、170、174、178、192、216、240、264、336、408、504、504.5、506、510、514、528、552、576、600、672、744、840、912、1008、1176、1186、1200、及び1224時間後に動物から回収した。
CSFでのオステオポンチンレベルを、次のようにして測定した。Single spot Meso Scale Discovery(MSD)プレート(Rockville,MD)を、捕捉抗体を含むPBSで、4℃で、一晩コーティングした。サルCSF試料を、結合緩衝剤で希釈し、そして、室温で、1時間かけて、ウェルに加えた。ビオチン化ヤギ抗ヒトオステオポンチンポリクローナル抗体(R&D Systems)を、結合緩衝剤で1:2,000に希釈したものを加え、そして、室温で1時間インキュベーションした後に、スルホタグストレプトアビジン(MSD)で検出した。150μlの1×読取り緩衝剤(Read Buffer)をプレートに加え、そして、プレートを、Sector Imager(MSD)で分析した。
カニクイザルのCSFでのオステオポンチンレベルは、本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後に増大した。80mg/kg及び250mg/kgの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを投与した後に、CSFオステオポンチンレベルは、初回投与の24時間後に、それぞれ、平均で、ベースラインで認められたものの約13倍及び6倍のピークに達しており、その後に、ベースラインレベルの1.5倍にまで低下した(図31A及び31B)。80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを反復投与すると、CSFオステオポンチンレベルは、各投与の10~24時間後にピークに達しており、ベースラインレベルで認められたものの3倍~5倍のピークレベルに達した(図31A)。250mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFを反復投与すると、CSFオステオポンチンレベルは増加して、2回目の投与の168時間後には、ベースラインで認められたものの14倍のピークレベルに達しており(図31B)、続く投与の24~48時間後には、ベースラインで認められたものの4倍~5倍のピークレベルに達した(図31B)。
80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを投与した後に、CSFオステオポンチンレベルは、初回投与の24時間後に、ベースラインで認められたものの約13倍のピークに達し、その後、ベースラインレベルにまで低下した(図31C及び31D)。80mg/kgの4A-450.NSLFを反復投与すると、CSFオステオポンチンレベルは、各投与の24時間後にピークに達し、ベースラインレベルで認められたものの6倍~9倍のピークレベルに達した(図31C)。
80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-313.WTを反復投与した後に、CSFオステオポンチンレベルは、各投与の24時間後に、ベースラインで認められたものの約1.5倍のピークに達し、その後、ベースラインレベルにまで低下した(図31D)。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類のCSFでのオステオポンチンレベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例44:抗MS4A4A抗体は、インビボで、様々な脳領域のオステオポンチンレベルを引き上げる
前頭葉及び海馬でのオステオポンチンレベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体のインビボでの効果を調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザルに対して、80mg/kgの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、4A-313.WT、及び4A-450.NSLF、ならびに250mg/kgの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、またはビヒクルコントロールを、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で4回の投与を行った:1回目と2回目の投与は7日の間隔を設け、2回目と3回目の投与は14日の間隔を設け、そして、3回目と4回目の投与は28日の間隔を設けた。これらの動物を、4回目の投与の48時間後に安楽死させ、そして、前頭葉と海馬を取り出して凍結した。
脳組織でのオステオポンチンレベルを、次のようにして測定した。凍結した脳試料を、N-Per Neuronal Protein Extraction Reagent(カタログ番号87792、Thermo Scientific)、及びHalt Protease阻害剤(カタログ番号1861278)を使用して、製造業者の指示に従って、氷上で、20分間かけて溶解した。試料を遠心分離し、そして、上清を新しいチューブに移し、さらなる分析に供するまで-80℃で保存した。それぞれの試料の総タンパク質濃度を、製造業者の指示に従って、BCAタンパク質分析キット(カタログ番号23225、Thermo Scientific)で測定した。タンパク質濃度値は、脳組織で測定した分析物濃度を正規化するために使用した。
カニクイザルの脳組織でのオステオポンチンレベルは、抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFの投与後に上昇した。80mg/kgの抗体4A-450.NSLFを反復投与すると、コントロール動物で認められたレベルと比較して、カニクイザルの前頭葉でのオステオポンチンレベルが有意に上昇した(p=0.027;t-検定)(図32A)。同様に、80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを反復投与すると、コントロール処理動物で認められたレベルと比較して、カニクイザルの海馬でのオステオポンチンレベルが有意に上昇した(p=0.027;t-検定)(図32B)。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類の脳組織(例えば、前頭葉及び海馬)でのオステオポンチンレベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例45:抗MS4A4A抗体は、インビボで、様々な脳領域のCSF1Rレベルを引き上げる
前頭葉及び海馬でのコロニー刺激因子1受容体(CSF1R)レベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体のインビボでの効果を調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザルに対して、80mg/kgの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、4A-313.WT、及び4A-450.NSLF、250mg/kgの用量の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、またはビヒクルコントロールを、静脈内注射して投与した。それぞれの群に、合計で4回の投与を行った:1回目と2回目の投与は7日の間隔を設け、2回目と3回目の投与は14日の間隔を設け、そして、3回目と4回目の投与は28日の間隔を設けた。これらの動物を、4回目の投与の48時間後に安楽死させ、そして、前頭葉と海馬を取り出して凍結した。
脳組織でのCSF1Rレベルを、次のようにして測定した。凍結した脳試料を、N-Per Neuronal Protein Extraction Reagent(カタログ番号87792、Thermo Scientific)、及びHalt Protease阻害剤(カタログ番号1861278)を使用して、製造業者の指示に従って、氷上で、20分間かけて溶解した。試料を遠心分離し、そして、上清を新しいチューブに移し、さらなる分析に供するまで-80℃で保存した。それぞれの試料の総タンパク質濃度を、製造業者の指示に従って、BCAタンパク質分析キット(カタログ番号23225、Thermo Scientific)で測定した。タンパク質濃度値は、脳組織で測定した分析物濃度を正規化するために使用した。
カニクイザルの脳組織でのCSF1Rレベルは、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFの投与後に上昇した。250mg/kgの抗体4A-313.NSLFを反復投与すると、コントロール処理動物で認められたレベルと比較して、カニクイザルの前頭葉でのCSF1Rレベルが有意に上昇した(p=0.046;t-検定)(図33A)。同様に、80mg/kgの抗MS4A4A抗体4A-450.NSLFを反復投与すると、コントロール動物で認められたレベルと比較して、カニクイザルの海馬でのCSF1Rレベルが有意に上昇した(p=0.013;t-検定)(図33B)。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類の脳組織(例えば、前頭葉及び海馬)でのCSF1Rレベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例46:抗MS4A4A抗体は、インビボで、様々な脳領域の総TREM2レベルを引き上げる
前頭葉及び海馬での可溶性TREM2及び膜TREM2(総TREM2)レベルに関する本開示の抗MS4A4A抗体のインビボでの効果を調べるために、以下の研究を行った。
カニクイザルに対して、80mg/kgの用量の抗MS4A4A抗体、4A-313.NSLF、4A-313.WT、4A-450.NSLF、250mg/kgの用量の4A-313.NSLF、またはビヒクルコントロールを、静脈内ボーラス注射して投与した。それぞれの群に、合計で4回の投与を行った:1回目と2回目の投与は7日の間隔を設け、2回目と3回目の投与は14日の間隔を設け、そして、3回目と4回目の投与は28日の間隔を設けた。これらの動物を、4回目の投与の48時間後に安楽死させ、そして、前頭葉と海馬を取り出して凍結した。総TREM2レベルを、これらの脳領域で測定した。
カニクイザルの脳組織での総TREM2レベルは、抗MS4A4A抗体、4A-313.NSLF、4A-313.WT、及び4A-450.NSLFで処理した後に上昇した。250mg/kgの抗体4A-313.NSLFを反復投与すると、コントロール処理動物で認められたレベルと比較して、カニクイザルの海馬での総TREM2レベルが統計的に有意に上昇した(p=0.014;一元配置分散分析)(図34A)。250mg/kgの抗体4A-313.NSLF、及び80mg/kgの抗体4A-313.WTを反復投与すると、コントロール処理動物で認められたレベルと比較して、カニクイザルの前頭葉でのTREM2レベルが上昇する傾向が示された(図34B)。
まとめると、これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、非ヒト霊長類の脳組織(例えば、前頭葉及び海馬)でのTREM2レベルを引き上げる上で有効であることを示した。
実施例47:ミクログリアでの遺伝子発現プロファイルに関する抗MS4A4A抗体のインビボでの効果
上記したようにして、カニクイザルに対して本開示の抗MS4A4A抗体を投与した後のミクログリアRNAseq分析で測定する遺伝子発現の変化を、以下のように行った。抗MS4A4A抗体には、抗体4A-313.WT(80mg/kg)、4A-313.NSLF(80mg/kg及び250mg/kg)、及び4A-450.NSLF(80mg/kg)が含まれた。動物に終末期処置(terminal take down)を施した後に、容易な手作業の解離プロトコルに沿って前頭葉試料を解離させ、続いて、Percoll勾配分離を行って細片を除去した。細胞ペレットを、Cd11b抗体で20分間染色し、洗浄し、DAPIで標識し、そして、ミクログリアのFACS分離のために処理した。DAPI:Cd11b細胞を、350ulまたはRLTプラス緩衝剤(Qiagen)に直接選別し、そして、RNA分離のために細胞を直ちに処理した。RNAの品質を、テープステーションを使用して決定し、そして、Lexogen QuantSeqの低入力プロトコルに若干の変更を加えたものを使用してライブラリーを作成した。ライブラリーを、テープステーションを使用して定量し、そして、Next Seqを使用して配列決定した。配列決定したデータを、Lexogen多重エラー訂正ツールを使用して逆多重化し、分析した。
図35A、35B、及び35Cに示したように、カニクイザルに本開示の抗MS4A4A抗体を末梢注射すると、これらの非ヒト霊長類の前頭葉から単離したFACS選別ミクログリアでのRNAseq分析で測定したミクログリアでの遺伝子発現の変化がもたらされた。ミクログリアにおける抗MS4A4A抗体処置による強力な誘導を示す遺伝子として、ミクログリア活性化のマーカー(C型レクチンドメインファミリー7メンバーA、CLEC7A)、ミクログリア遊走(イノシトール1,4,5-三リン酸受容体2、ITPR2)、及びミクログリア増殖(抗原KI-67(MKI67))がある(図35A)。ミクログリア活性化のさらなるマーカーの変化も認められており、図35B、図35Cに示したように、ミクログリア活性化マーカーIL1RN、SPP1、及び1-ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェートホスホジエステラーゼガンマ-2(PLCG2)がある。2つの恒常性ミクログリアマーカー(プリン作動性受容体P2RY12、及びCX3Cケモカイン受容体1(CX3CR1))に関する本開示の抗MS4A4A抗体の効果を、図35Cに示しており、それによると、これら2つの恒常性ミクログリアマーカーの発現レベルは、抗MS4A4A抗体処理の後に低下した。図35A、35B、及び35Cのデータは、log2スケールの平均として示しており、エラーバーはSEMであり、そして、実験グループ及び時点あたりN=5である。
まとめると、これらの結果は、ミクログリアの活性化、遊走、及び増殖に関連するタンパク質の様々なmRNAレベルの増大;及びミクログリアの恒常性に関連するタンパク質の様々なmRNAレベルの低下により証明されるように、本開示の抗MS4A4A抗体が、ミクログリアをインビボで活性化する上で有効であることを示した。
実施例48:抗MS4A4A抗体は、U937細胞でのHA-シュノーケル(Snorkel)タグが付いたMS4A4Aの表面発現を抑制する
U937細胞(ATCC CRL-1593.2)を、シュノーケルタグ(膜貫通ドメインと、それに続いて、HAタグを、ヒトMS4A4Aの細胞質C末端に結合させたもの)でタグ付けしたヒトMS4A4Aをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。このようにして、タグを、細胞外に出現させるが、膜タンパク質から構造的に分離されている。トランスフェクトしたU937細胞は、プラスミドトランスフェクションと抗生物質の選択を経ても生存していた。次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞をヒトMS4A4Aタンパク質細胞表面発現に関してスクリーニングし、そして、次の研究で使用するために、最も陽性度が顕著な5%の細胞だけを回収した。
上記したようにして生成した組換えヒトMS4A4A-シュノーケルを過剰発現するU937細胞を、これらの研究での標的細胞として使用した。細胞を、PMA(25ng/ml)で24時間前処理した後に、回収し、そして、PMA及び抗MS4A4A抗体、ならびにアイソタイプコントロール抗体を、0.01、0.1、及び1ug/mlの最終濃度で含むRPMI1640完全培地が入った丸底96ウェルプレートに、100,000個の細胞/ウェルで播種した。細胞を、48時間インキュベーションした。細胞を、冷FACS緩衝剤(PBS+2%FBS)で洗浄し、そして、1ウェルあたり50μLの1:200に希釈した抗HAタグモノクローナル抗体(ThermoFisher、A-21287)を加え、そして、氷上で30分間インキュベーションし、生死判別のためにAqua Live/Deadで標識した。細胞を、冷FACS緩衝剤で2回洗浄し、そして、200μLのFACS緩衝剤に再懸濁した。フローサイトメトリー分析は、FACSCantoシステム(BD Biosciences)で行った。結合データを、蛍光強度の中央値を使用して分析した。
図36に示したように、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF、及び4A-450.NSLFは、ヒトMS4A4A-シュノーケルタグが付いたタンパク質を用量に関連した方法で発現するU937細胞での原形質膜MS4A4Aのレベルを抑制した。1μg/mlの最大の抗MS4A4A抗体濃度では、抗MS4A4A抗体4A-313.NSLF及び4A-450.NSLFは、アイソタイプコントロール抗体で処理した細胞で認められたレベルと比較して、表面MS4A4Aレベルを約50%減少させた。これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、組換えヒトMS4A4A-シュノーケルを発現するU937細胞での細胞表面MS4A4Aレベルを抑制またはダウンレギュレーションしたことを示した。
実施例49:抗MS4A4A抗体は、初代ヒト骨髄細胞での糖タンパク質非転移性黒色腫タンパク質B(GPNMB)タンパク質のレベルを調節する
GPNMBは、組織マクロファージやミクログリアなどの複数の細胞型で発現する表面糖タンパク質である。幾つかの遺伝的バリアントが、パーキンソン病(PD)のリスクに関連している。GPNMBタンパク質のレベルは、PD患者の黒質で上昇しており、また、GPNMBレベルは、リソソームストレスを受けた後に上昇する(Moloney et.al.,2018,Neurobio Dis.120:1-11)。加えて、GPNMBの発現の増大は、SNP rs199347に関連しており、このリスクSNPは、GPNMB遺伝子内に位置している(Murthy et al,2017,18:121-133)。MS4A4Aが、GPNMBの発現レベルを調節し得るか否かを決定するために、2名のドナー(ドナー#1117及び#1118)から得たヒト初代マクロファージを、様々な濃度の抗MS4A4A抗体4A-313.NSLFで、48時間処理した。細胞表面(膜結合)GPNMBは、細胞をフルオロフォアとコンジュケートした抗GPNMB抗体で染色した後に、フローサイトメトリーで測定した。
図37に示したように、抗MS4A4A抗体4A.313.NSLFを細胞に加えた後に、膜GPNMBレベルは、ヒト初代マクロファージにおいて低下した。抗MS4A4A抗体処理に応答したGPNMBレベルの低下は、用量依存的であった。これらの結果は、本開示の抗MS4A4A抗体が、骨髄細胞、例えば、マクロファージでのGPNMBの細胞表面発現レベルを下げる上で有効であることを示した。
野生型huIgG1、または野生型huIgG1のFcバリアントを有する例示的な抗MS4A4A抗体重鎖アミノ酸配列:
4A-450(huIgG1重鎖)(配列番号320)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-450(C末端Kを持たないhuIgG1重鎖)(配列番号321)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-450(hIgG1重鎖;P331S)(配列番号322)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-450(C末端Kを持たないhIgG1重鎖P331S)(配列番号323)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-450(huIgG1重鎖N325S/L328F)(配列番号324)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-450(C末端Kを持たないhIgG1重鎖N325S/L328F)(配列番号325)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-450(huIgG1重鎖K322A)(配列番号326)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-450(C末端Kを持たないhuIgG1重鎖K322A)(配列番号327)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

********
4A-419(huIgG1重鎖)(配列番号328)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-419(C末端Kを持たないhuIgG1重鎖)(配列番号329)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-419(hIgG1重鎖P331S)(配列番号330)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-419(C末端Kを持たないhIgG1重鎖P331S)(配列番号331)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-419(huIgG1重鎖N325S/L328F)(配列番号332)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-419(C末端Kを持たないhIgG1重鎖N325S/L328F)(配列番号333)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-419(huIgG1重鎖K322A)(配列番号334)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-419(C末端Kを持たないhuIgG1重鎖K322A)(配列番号335)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

********
4A-313(huIgG1重鎖定常領域)(配列番号336)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-313(C末端Kを持たないhuIgG1重鎖定常領域)(配列番号337)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-313(hIgG1重鎖定常領域P331S)(配列番号338)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-313(C末端Kを持たないhIgG1重鎖定常領域P331S)(配列番号339)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-313(huIgG1重鎖定常領域N325S/L328F)(配列番号340)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-313(C末端Kを持たないhIgG1重鎖定常領域N325S/L328F)(配列番号341)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
4A-313(huIgG1重鎖定常領域K322A)(配列番号342)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
4A-313(C末端Kを持たないhuIgG1重鎖定常領域K322A)(配列番号343)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

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ヒトIgG1軽鎖定常領域(配列番号344)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

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Figure 2022542964000073
Figure 2022542964000074
Figure 2022542964000075
Figure 2022542964000076
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Figure 2022542964000078
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Figure 2022542964000081
Figure 2022542964000082
Figure 2022542964000083

Claims (85)

  1. MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号:94、108、116、146、147、308、及び311からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309、及び312からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号102、100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310、及び313からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が:配列番号104、103、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314、及び317からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号105、106、114、139、140、141、142、143、159、160、161、315、及び318からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号107、115、144、145、163、316、及び319配列番号からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、前記抗体。
  2. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号96~99からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号102、100、及び101からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が:配列番号104及び103からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号105~106からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  3. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号108のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号110~111からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号112のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が;配列番号113のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号114のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号115のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  4. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号116のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号118~122からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号123~129からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H3を含む、かつ、前記軽鎖可変領域が;配列番号130~138からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号139~143からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号144~145からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号146~147からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号149~153からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号154のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が;配列番号156~158からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号159~161からなる群から選択するアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号163のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  6. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び、配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が;配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  7. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号308のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号309のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号310のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が;配列番号314のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号315のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号316のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が:配列番号311のアミノ酸配列を含むHVR-H1;配列番号312のアミノ酸配列を含むHVR-H2;及び配列番号313のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み、かつ、前記軽鎖可変領域が;配列番号317のアミノ酸配列を含むHVR-L1;配列番号318のアミノ酸配列を含むHVR-L2;及び配列番号319のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、請求項1に記載の抗体。
  9. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、抗体4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、または4A-450のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む、前記抗体。
  10. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、また、前記軽鎖可変領域は、抗体4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、または4A-450のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  11. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、前記抗体は、抗体4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419、または4A-450のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  12. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、抗体4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、または4A-331のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む、前記抗体。
  13. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、抗体4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、または4A-331のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  14. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、前記抗体は、抗体4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、または4A-331のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  15. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、抗体4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-362、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、または4A-381のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む、前記抗体。
  16. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、抗体4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-362、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、または4A-381のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  17. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、前記抗体は、抗体4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-362、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、または4A-381のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  18. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、抗体4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390のHVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む、前記抗体。
  19. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、また、前記軽鎖可変領域は、抗体4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390のHVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  20. MS4A4Aタンパク質に対して結合する抗体であって、前記抗体は、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3を含む重鎖可変領域と、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む軽鎖可変領域とを含み、前記抗体は、抗体4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、または4A-390のHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、及びHVR-L3を含む、前記抗体。
  21. 前記抗体は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号5~15、304、及び306からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項9に記載の抗体。
  22. 前記抗体は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号24~30からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項12に記載の抗体。
  23. 前記抗体は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号40~53からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項15に記載の抗体。
  24. 前記抗体は、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号76~84からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項18に記載の抗体。
  25. 前記抗体は、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号17~22、305、及び307からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項10に記載の抗体。
  26. 前記抗体は、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号32~36からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項13に記載の抗体。
  27. 前記抗体は、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号55~74からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項16に記載の抗体。
  28. 前記抗体は、軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号86~93からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項19に記載の抗体。
  29. 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号5~15、304、及び306からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号17~22、305、及び307からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項11に記載の抗体。
  30. 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号24~30からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号32~36からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項14に記載の抗体。
  31. 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号40~53からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号55~74からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項17に記載の抗体。
  32. 前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号76~84からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号86~93からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項20に記載の抗体。
  33. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号320~343からなる群から選択するアミノ酸配列を含む、請求項1、2、4、6~11、21、25、及び29のいずれか1項に記載の抗体。
  34. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号336~343からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意に、前記軽鎖は、配列番号344のアミノ酸配列を含む定常領域をさらに含む、請求項1、2、6、9~11、21、25、29のいずれか1項に記載の抗体。
  35. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号320~327からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号305のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意に、前記軽鎖は、配列番号344のアミノ酸配列を含む定常領域をさらに含む、請求項1、7、9~11、21、25、及び29のいずれか1項に記載の抗体。
  36. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号328~335からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号307のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、任意に、前記軽鎖は、配列番号344のアミノ酸配列を含む定常領域をさらに含む、請求項1、8~11、21、25、及び29のいずれか1項に記載の抗体。
  37. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号355~362からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号365のアミノ酸配列を含む、請求項1、2、6、9~11、21、25、及び29のいずれか1項に記載の抗体。
  38. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号320~327からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号363のアミノ酸配列を含む、請求項1、7、9~11、21、25、及び29のいずれか1項に記載の抗体。
  39. 前記抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、前記重鎖は、配列番号328~335からなる群から選択するアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号364のアミノ酸配列を含む、請求項1、8~11、21、25、及び29のいずれか1項に記載の抗体。
  40. 前記抗体が:
    a.重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、配列番号94のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号96のアミノ酸配列を含むHVR-H2、及び配列番号102のアミノ酸配列を含むHVR-H3を含み;かつ、前記軽鎖可変領域は、配列番号104のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号105のアミノ酸配列を含むHVR-L2、及び配列番号107のアミノ酸配列を含むHVR-L3を含む、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域;
    b.重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、配列番号14のアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖可変領域は、配列番号22のアミノ酸配列を含む、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域;または
    c.重鎖及び軽鎖であって、前記重鎖は、配列番号359または360のアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号365のアミノ酸配列を含む、前記重鎖及び軽鎖、
    を含む、請求項2に記載の抗体。
  41. 前記抗体が:
    a.重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、配列番号304のアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖可変領域は、配列番号305のアミノ酸配列を含む、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域;または
    b.重鎖及び軽鎖であって、前記重鎖は、配列番号324または325のアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号363のアミノ酸配列を含む、前記重鎖及び軽鎖、
    を含む、請求項7に記載の抗体。
  42. 前記抗体が:
    a.重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域は、配列番号306のアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖可変領域は、配列番号307のアミノ酸配列を含む、前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域;または
    b.重鎖及び軽鎖であって、前記重鎖は、配列番号332または333のアミノ酸配列を含み、かつ、前記軽鎖は、配列番号364のアミノ酸配列を含む、前記重鎖及び軽鎖、
    を含む、請求項8に記載の抗体。
  43. MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であって、前記抗体は、MS4A4Aに対する結合に関して、請求項1~42のいずれか1項に記載の1つ以上の抗体との結合を競合的に阻害する、前記抗体。
  44. MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であって、前記抗体は、請求項1~42のいずれか1項に記載の抗体と本質的に同じである、または重複するMS4A4Aのエピトープに対して結合する、前記抗体。
  45. 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(配列番号178)の1つ以上のアミノ酸残基に対して結合し、前記抗体は、配列番号1のアミノ酸残基プロリン163に結合しない、請求項44に記載の抗体。
  46. 前記抗体が、ヒトMS4A4Aの細胞外ドメイン1に対して結合する、請求項1~42のいずれか1項に記載の抗体。
  47. 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列CMASNTYGSNPIS(配列番号177)の1つ以上のアミノ酸残基に対して結合する、請求項1~42のいずれか1項に記載の抗体。
  48. 前記抗体が、ヒトMS4A4Aの細胞外ドメイン2に対して結合する、請求項1~42のいずれか1項に記載の抗体。
  49. 前記抗体が、配列番号1のアミノ酸配列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(配列番号178)の1つ以上のアミノ酸残基に対して結合する、請求項1~42のいずれか1項に記載の抗体。
  50. 前記抗体が、ヒトのもの、またはヒト化したものである、請求項1~49のいずれか1項に記載の抗体。
  51. 前記抗体が、MS4A4Aの細胞表面レベルを下げる、またはMS4A4Aの細胞内レベルを下げる、請求項1~50のいずれか1項に記載の抗体。
  52. 前記抗体が、骨髄細胞において、可溶性TREM2レベルを引き上げる、膜TREM2レベルを引き上げる、または可溶性TREM2を増やし、膜TREM2レベルを引き上げる、請求項1~51のいずれか1項に記載の抗体。
  53. 前記抗体が、骨髄細胞でのM2細胞表面マーカーの発現を抑制する、請求項1~52のいずれか1項に記載の抗体。
  54. 前記抗体が、骨髄細胞でのCD200R、Dectin-1、またはCD163の発現を抑制する、請求項53に記載の抗体。
  55. 前記抗体が、骨髄細胞でのゲルゾリン及び/またはオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質の発現を高める、請求項1~50のいずれか1項に記載の抗体。
  56. MS4A4Aタンパク質に対して結合する単離した抗体であって、前記抗体は、骨髄細胞でのゲルゾリン及び/またはオステオポンチンのmRNA及び/またはタンパク質の発現を高める、前記抗体。
  57. 前記骨髄細胞が、ヒトマクロファージである、請求項56に記載の抗体。
  58. 前記抗体が、ヒトのもの、またはヒト化したものである、請求項56または57に記載の抗体。
  59. 前記抗体は、4A-18、4A-25、4A-214、4A-21、及び4A-202からなる群から選択する抗体と同じエピトープに対して結合する、請求項56~58のいずれか1項に記載の抗体。
  60. 前記抗体が、骨髄細胞でのM2マーカーの発現を抑制する、請求項56~59のいずれか1項に記載の抗体。
  61. 前記骨髄細胞が、ヒトマクロファージである、請求項60に記載の抗体。
  62. 前記M2マーカーが、CD200R、Dectin-1、及び/またはCD163である、請求項61に記載の抗体。
  63. 前記抗体が、ヒトマクロファージでの膜TREM2を、少なくとも50%、90%、100%、150%、200%、または250%増やす、請求項56~62のいずれか1項に記載の抗体。
  64. 前記抗体が、ヒトマクロファージ上清での可溶性TREM2を、少なくとも15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、または70%増やす、請求項56~63のいずれか1項に記載の抗体。
  65. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項1~64のいずれか1項に記載の抗体。
  66. 前記抗体が、配列番号1のヒトMS4A4Aに対して結合する、請求項1~65のいずれか1項に記載の抗体。
  67. 前記抗体が、配列番号3のカニクイザルMS4A4Aに対してさらに結合する、請求項66に記載の抗体。
  68. 前記抗体が、IgGクラスに属し、かつ、IgG1、IgG2、またはIgG4アイソタイプを有する、請求項1~67のいずれか1項に記載の抗体。
  69. 前記抗体が、IgG1アイソタイプを有する、請求項68に記載の抗体。
  70. 前記抗体が、EU付番法で定めたN325S及びL328F変異を含む改変したFcを含む、請求項69に記載の抗体。
  71. 前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項1~70のいずれか1項に記載の抗体。
  72. 前記抗体フラグメントが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、またはscFvフラグメントである、請求項71に記載の抗体。
  73. 前記抗体が、第1の抗原及び第2の抗原を認識する二重特異性抗体である、請求項1~72のいずれか1項に記載の抗体。
  74. 前記第1の抗原がMS4A4Aであり、かつ、前記第2の抗原が:
    (a)血液脳関門を通過する輸送を促す抗原;
    (b)トランスフェリン受容体(TR)、インスリン受容体(HIR)、インスリン様成長因子受容体(IGFR)、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1及び2(LPR-1及び2)、ジフテリア毒素受容体、CRM197、ラマシングルドメイン抗体、TMEM30(A)、タンパク質形質導入ドメイン、TAT、Syn-B、ペネトラチン、ポリアルギニンペプチド、アンジオペプチド、及び、ANG1005からなる群から選択する、血液脳関門を通過する輸送を促す抗原;
    (c)病原ペプチドまたはタンパク質、または、病原核酸からなる群から選択する病原作用物質であって、前記病原核酸は、アンチセンスGGCCCC(G2C4)反復拡張RNAであり、前記病原タンパク質は、アミロイドベータ、オリゴマーアミロイドベータ、アミロイドベータプラーク、アミロイド前駆体タンパク質、または、そのフラグメント、Tau、IAPP、アルファ-シヌクレイン、TDP-43、FUSタンパク質、C9orf72(第9番染色体オープンリーディングフレーム72)、c9RANタンパク質、プリオンタンパク質、PrPSc、ハンチンチン、カルシトニン、スーパーオキシドジスムターゼ、アタキシン、アタキシン1、アタキシン2、アタキシン3、アタキシン7、アタキシン8、アタキシン10、レビー小体、心房性ナトリウム利尿因子、膵島アミロイドポリペプチド、インスリン、アポリポタンパク質AI、血清アミロイドA、メジン、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、ベータ2ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピセリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖AL、S-IBMタンパク質、反復関連非ATG(RAN)翻訳産物、ジペプチド反復(DiPeptide repeat)(DPR)ペプチド、グリシン-アラニン(GA)反復ペプチド、グリシン-プロリン(GP)反復ペプチド、グリシン-アルギニン(GR)反復ペプチド、プロリン-アラニン(PA)反復ペプチド、ユビキチン、及び、プロリン-アルギニン(PR)反復ペプチドからなる群から選択する、前記病原作用物質;
    (d)免疫細胞で発現するリガンド、及び/または、タンパク質であって、CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3、及び、ホスファチジルセリンからなる群から選択する、前記リガンド、及び/または、タンパク質;または
    (e)1つ以上の腫瘍細胞で発現するタンパク質、脂質、多糖、または、糖脂質、
    である、請求項73に記載の抗体。
  75. 先行請求項のいずれか1項に記載の抗体をコードする核酸配列を含む単離した核酸。
  76. 請求項75に記載の核酸を含むベクター。
  77. 請求項75に記載の核酸、または請求項76に記載のベクターを含む単離した宿主細胞。
  78. ヒトMS4A4Aに対して結合する抗体を製造する方法であって、前記抗体を製造するために、請求項77に記載の細胞を培養することを含む、前記方法。
  79. 細胞が産生した抗体を回収することをさらに含む、請求項78に記載の方法。
  80. 請求項1~74のいずれか1項に記載の抗体と、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
  81. アルツハイマー病、遅発性アルツハイマー病、及び、認知障害からなる群から選択する疾患、障害、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、治療有効量の請求項1~74のいずれか1項に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
  82. MS4A4Aの過剰発現、または、高まった活性に起因する、または、それらと関連する疾患、障害、病態、または、損傷を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、治療有効量の請求項1~74のいずれか1項に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
  83. CSF1R欠損疾患または障害を予防する、そのリスクを抑制する、またはそれを有する個体を治療する方法であって、それを必要とする個体に対して、請求項1~74のいずれか1項に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
  84. 前記CSF1R欠損疾患または障害が、軸索スフェロイド及び色素性グリアを伴う成人発症性白質脳症(ALSP)または遺伝性びまん性白質脳症(HDLS)である、請求項83に記載の方法。
  85. 前記抗体の投与の前及び/または後でのオステオポンチン、ゲルゾリン、膜TREM2、及び/または可溶性TREM2のレベルを検出することをさらに含む、請求項81~84のいずれか1項に記載の方法。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019152715A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies and methods of use thereof
CN114341181A (zh) 2019-07-31 2022-04-12 艾莱克特有限责任公司 抗ms4a4a抗体及其使用方法
TW202415679A (zh) * 2022-07-29 2024-04-16 美商阿列克特有限責任公司 抗gpnmb抗體及其使用方法
WO2024026472A2 (en) * 2022-07-29 2024-02-01 Alector Llc Transferrin receptor antigen-binding domains and uses therefor
WO2024086796A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies with amyloid-beta therapies

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992022653A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU7378096A (en) 1995-09-28 1997-04-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Porcine cell interaction proteins
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
PT1222292E (pt) 1999-10-04 2005-11-30 Medicago Inc Metodo para regulacao da transcricao de genes exogenos na presenca de azoto
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
AU2002251692A1 (en) 2000-12-08 2002-08-19 Duke University Identification of novel ms4a gene family members expressed by hematopoietic cells
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
WO2003085107A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cellules à génome modifié
AU2003236017B2 (en) 2002-04-09 2009-03-26 Kyowa Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
GB0324888D0 (en) * 2003-10-24 2003-11-26 Novartis Ag Organic compounds
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック, インコーポレイテッド ヒト化抗TGF−β抗体
JP2008506637A (ja) 2004-06-14 2008-03-06 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 胎児起源の細胞に対する抗体
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
HUE066795T2 (hu) 2006-03-15 2024-09-28 Alexion Pharmaceuticals Inc Paroxysmalis nocturnalis haemoglobinuriában szenvedõ betegek kezelése egy komplement inhibitorral
JP2009536527A (ja) 2006-05-09 2009-10-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 最適化されたスキャフォールドを備えた結合ポリペプチド
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
GB0624500D0 (en) * 2006-12-07 2007-01-17 Istituto Superiore Di Sanito A novel passive vaccine for candida infections
UY30776A1 (es) 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
EP2108701A1 (en) * 2008-04-10 2009-10-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Methods involving MS4A12 and agents targeting MS4A12 for therapy, diagnosis and testing
PE20141521A1 (es) 2011-08-23 2014-10-25 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
CN104774264B (zh) 2014-01-15 2018-09-14 上海易乐生物技术有限公司 抗人proBDNF单克隆抗体及其在疼痛中的作用
CA2874083C (en) * 2014-12-05 2024-01-02 Universite Laval Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
US20190321443A1 (en) 2016-02-16 2019-10-24 President And Fellows Of Harvard College Modulators of MS4A activity
CN105759057A (zh) 2016-04-12 2016-07-13 上海凯璟生物科技有限公司 一种检测阿尔兹海默综合症ms4a6a的干式免疫荧光试剂盒和制备方法
WO2019152715A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Alector Llc Anti-ms4a4a antibodies and methods of use thereof
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