KR20220058540A - 항-ms4a4a 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-ms4a4a 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

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아난야 미트라
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산티아고 비베로스 살라자르
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Abstract

본 개시내용은 일반적으로, MS4A4A 폴리펩타이드, 예를 들어, 포유류 MS4A4A 또는 인간 MS4A4A에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, 단클론성 항체, 인간화된 항체 및 항체 단편을 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물을 필요로 하는 개체의 예방, 위험 감소 또는 치료에서의 이러한 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

항-MS4A4A 항체 및 이의 사용 방법
ASCII 텍스트 파일 상의 서열목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 상의 다음의 제출 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)(파일명: 4503_008PC06_Seqlisting_ST25.TXT; 생성일: 2020년 7월 28일; 용량: 289,448 바이트).
본 개시내용의 기술분야
본 개시내용은 항-MS4A4A 항체 및 이러한 항체의 치료적 용도에 관한 것이다.
막-스패닝 4-도메인 슈퍼패밀리 A(MS4A) 유전자 클러스터는 염색체 11q12 상에 존재하고, 18개의 유전자를 포함한다. MS4A 유전자 패밀리는 전형적으로 테트라-스패닝 위상을 갖는 막 단백질을 암호화한다(Ishibashi et al, 2001, Gene, 265:87-93; Liang and Tedder, 2001, Genomics, 72:119-127; Efthymiou and Goate, 2017, Molecular Neurodegeneration, 12:43). 막 스패닝 도메인은 1개의 세포내 루프 및 2개의 세포외 루프에 의해 상호 연결되며 N-말단과 C-말단이 둘 다 사이토졸 내에 있다. 대부분의 MS4A 단백질은 MS4A1(CD20)에 대해 아미노산 서열 상동성(20 내지 30%의 유사성)을 공유하며, 가장 높은 정도의 서열 동일성은 처음 3개의 막관통 도메인에서 생긴다. 상이한 MS4A 단백질에 걸친 이들 막 영역 내에서 크게 보존된 모티프는 막 스패닝 도메인이 MS4A 단백질 기능에서 중요한 일반적 역할을 갖는다는 것을 시사한다. MS4A 단백질 사이의 가장 큰 변이 영역은 이들의 N- 및 C-말단의 세포질 도메인 및 추정적 제2 세포외 루프 내에 생기는데(Ishibashi et al, 2001, Gene, 265:87-93), 이는 이들 영역이 독특한 기능적 특성을 전한다는 것을 시사한다.
이런 다양성에도 불구하고, MS4A 도메인은 일부 공유된 요소를 갖는다. 예를 들어, MS4A 단백질(MS4A8B 및 MS4A12를 제외함)에 보존된 한 가지 주목할 만한 특징은 이황화 브리지를 형성할 수 있는 추정적 제2 세포외 루프에서의 2개의 시스테인 잔기의 보존이다. MS4A 단백질의 N- 및 C-말단 도메인은 또한 프롤린 잔기가 풍부하지만, 이의 기능적 유효성은 밝혀지지 않고 있다(Hulett et al, 2001, Genomics, 72:119-127). 그러나, 프롤린 풍부 영역은 다양한 세포 과정, 예컨대, 세포골격 재배열, 전사 개시, 신호전달 캐스케이드 및 단백질-단백질 상호작용을 용이하게 하기 위한 어댑터 시스템의 부분으로서 SH3 도메인과의 결합에 공통으로 관련된다(Kay et al, 2000, FASEB J, 14:231-241).
MS4A 단백질 패밀리는 상대적으로 기능적으로 특성규명되지 않고 있으며, 일부 중요한 예외가 있다: MS4A1(CD20)은 B 림프구에서 배타적으로 발현되며, 단백질은 B 세포 항원 수용체 및 칼슘 유입에 의해 신호전달에서 기능을 가진다. CD20은 만성 림프성 백혈병, 림프종, 자가면역 질환에서, 그리고 고형 장기 이식에서 병원성 B 세포를 고갈시키기 위해 사용되는 면역치료적 항체의 표적이다. MS4A2(FcεRβ)는 비만 세포 상의 고친화도 IgE 수용체(FcεRI) 및 저친화도 IgG 수용체(FcεRIII)의 신호전달 서브유닛이며, 과민증 및 알레르기 반응에서 중요한 역할을 한다. MS4A2는 4-단백질 고친화도 IgE 수용체 복합체를 통해 신호를 증폭시키는 ITAM-도메인 단백질이다. MS4A3(Htm4)은 림프구 및 골수성 세포의 세포내 막 상에서 발현되고, 세포 주기 조절에서 어댑터 단백질로서 작용한다.
대다수의 MS4A 패밀리 구성원은 특성규명되지 않지만, 보고는 MS4A 단백질이 다양한 외인성 및 내인성 리간드에 대해 지방산, 펩타이드 및 황산화 스테로이드를 포함하는 화학센서 및 화학수용체로서 작용하며, 칼슘 유입 매개, 내포 작용 조절, 수송에 연루되고, 신호전달 복합체에 대한 어댑터로서 작용할 수 있다는 것을 시사한다(Cruse et al, 2015, Mol Biol Cell, 26:1711-1727; Greer et al, 2016, Cell, 165:1734-1748; Eon Kuek et al, 2016, Cell, 165:1734-1748; Koslowski et al, 2008, Cancer Res, 68:3458-3466; Bubien et al, 1993; J Cell Biol, 121:1121-1132).
특정 MS4A 유전자는 다양한 장애 및 질환, 특히 신경퇴행성 장애에 유전적으로 연결되었다. 예를 들어, 게놈-와이드 유의성 연관 분석은 가장 유의미한 알츠하이머병 좌위 중 하나로서 염색체 11q12 상에 위치된 MS4A 유전자 클러스터를 확인하였다. 확인된 특정 관심 중 하나의 유전자는 MS4A4A이다(Lambert et al, 2013, Nat Genet, 45:1452-1458; Hollingworth et al, 2011, Nat Genet, 43:429-435; Naj et al, 2011, Nat Genet, 43:436-441).
따라서, MS4A4A 활성과 관련된 다양한 질환, 장애 및 병태를 치료하기 위해, 예컨대 MS4A4A 단백질 수준 또는 활성을 감소 또는 증가시킴으로써, MS4A4A에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 MS4A4A를 표적화하는 요법 및/또는 MS4A4A 활성을 조절할 수 있는(예를 들어, 저해 또는 감소; 활성화 또는 향상시킴) 요법에 대한 필요가 있다.
특허 출원 및 간행물을 포함하는 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 포함된다.
본 개시내용은 일반적으로 항-MS4A4A 항체 및 이러한 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 제공된 방법은 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 알츠하이머병, 후발성 알츠하이머병, 치매 및 인지기능장애로부터 선택된 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 질환, 장애 또는 병태의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 MS4A4A의 증가된 발현 또는 활성과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 질환, 장애 또는 병태의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 94, 108, 116, 146, 147, 308 및 311로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 96, 97, 98, 99, 110, 111, 118, 119, 120, 121, 122, 149, 150, 151, 152, 153, 309 및 312로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 100, 101, 102, 112, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 154, 310 및 313으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 경쇄 가변 영역은 서열번호 103, 104, 113, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 156, 157, 158, 314 및 317로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 105, 106, 114, 139, 140, 141, 142, 143, 159, 160, 161, 315 및 318로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 107, 115, 144, 145, 163, 316 및 319로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 96 내지 99로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 100 내지 102로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 경쇄 가변 영역은 서열번호 103 내지 104로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 105 내지 106으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 312의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 317의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 318의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 319의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 110 내지 111로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 118 내지 122로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 123 내지 129로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 경쇄 가변 영역은 서열번호 130 내지 138로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 139 내지 143으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 144 내지 145로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 146 내지 147의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 149 내지 153으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 154로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 경쇄 가변 영역은 서열번호 156 내지 158로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 159 내지 161로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 내지 15, 304 및 306으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 24 내지 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 53으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 76 내지 84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 17 내지 22, 305 및 307로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 32 내지 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 55 내지 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 86 내지 93으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 내지 15, 304 및 306으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 17 내지 22, 305 및 307로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 24 내지 30으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 32 내지 36로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 53으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 55 내지 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 76 내지 84로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 86 내지 93으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 320 내지 343으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중쇄는 서열번호 336 내지 343으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(선택적으로 경쇄는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 추가로 선택적으로 경쇄는 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 추가로 포함한다). 일부 실시형태에서, 중쇄는 서열번호 320 내지 327로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(선택적으로 경쇄는 서열번호 304의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 추가로 선택적으로 경쇄는 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 추가로 포함한다). 일부 실시형태에서, 중쇄는 서열번호 328 내지 335로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(선택적으로 경쇄는 서열번호 305의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 추가로 선택적으로 경쇄는 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 추가로 포함한다).
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역은 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 서열번호 359 또는 360의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호 365의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역은 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 304의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 305의 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 서열번호 324 또는 325의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호 363의 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 312의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 그리고 경쇄 가변 영역은 서열번호 317의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 318의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 319의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열번호 307의 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄는 서열번호 332 또는 333의 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄는 서열번호 364의 아미노산 서열을 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이되, 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해 본 명세서의 임의의 실시형태의 항체 중 하나 이상과의 결합을 경쟁적으로 저해한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이되, 항체는 MS4A4A 상에서 본 명세서의 임의의 실시형태의 항체와 동일한 또는 중복되는 에피토프에 본질적으로 결합한다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 인간 MS4A4A의 세포외 도메인 1에 결합한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 CMASNTYGSNPIS(서열번호 177) 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 인간 MS4A4A의 세포외 도메인 2에 결합한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(서열번호 178) 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합한다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(서열번호 178) 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하고, 추가로 항체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 프롤린 163(P163)에 결합하지 않는다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 인간 항-MS4A4A 항체 또는 인간화된 항-MS4A4A 항체이다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체이되, 항체는 MS4A4A의 세포 표면 수준을 감소시키거나, MS4A4A의 세포내 수준을 감소시킨다.
본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질은 포유류 단백질 또는 인간 단백질이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질은 야생형 단백질이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질은 천연 유래 변이체이다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포에서 가용성 TREM2 수준을 증가시키거나, 막 TREM2 수준을 증가시키거나, 또는 가용성 TREM2를 증가시키고, 막 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 막 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 가용성 TREM2 수준 및 막 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내 뇌척수액(CSF) 중 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내 혈청 중 및 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 M2 세포 표면 마커(예를 들어, 수용체)의 발현을 감소시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포, 예를 들어, 대식세포에서 M2 세포 표면 마커 수준을 줄이거나 감소시킨다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 CD200R, Dectin-1 또는 CD163의 발현을 감소시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포, 예를 들어, 대식세포에서 CD200R, Dectin-1 및/또는 CD163의 세포 표면 수준을 줄이거나 감소시킨다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 겔솔린 및/또는 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 발현을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 IL1RN의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 CSF1R의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 퓨린 수용체 P2RY12 및/또는 CX3C 케모카인 수용체 1(CX3CR1)의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 감소시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 1-포스포티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 포스포다이에스터라제 감마-2(PLCG2), C-형 렉틴 도메인 패밀리 7 구성원 A(CLEC7A), 이노시톨 1,4,5-트라이포스페이트 수용체 2(ITPR2) 및/또는 항원 KI-67(MK167)의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 감소시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포 상에서 막관통 당단백질 NMB(GPNMB)의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 감소시킨다.
일 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이되, 항체는 골수성 세포 상에서 겔솔린 및/또는 오스테오폰틴 mRNA 및/또는 단백질 발현을 증가시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 골수성 세포는 인간 대식세포이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체는 인간 또는 인간화된다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 이중특이성 항체, 단클론성 항체, 다가 항체, 접합 항체 또는 키메라 항체이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체는 4A-18, 4A-25, 4A-214, 4A-21 및 4A-202로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체는 골수성 세포 상에서 M2 마커의 발현을 감소시킨다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 골수성 세포는 인간 대식세포이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, M2 마커는 CD200R, Dectin-1 및/또는 CD163이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체는 인간 대식세포 상에서 혈장-막 또는 세포 표면 TREM2를 적어도 50%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 250%만큼 증가시킨다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체는 인간 대식세포 상청액 중 가용성 TREM2를 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70%만큼 증가시킨다.
본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 제1 항원 및 제2 항원을 인식하는 이중특이성 항체이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 제1 항원은 MS4A4A이고, 제2 항원은 혈액-뇌-장벽에 걸쳐 수송을 용이하게 하는 항원이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 제2 항원은 MS4A4A, 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 형질도입 도메인, TAT, Syn-B, 페네트라틴(penetratin), 폴리-알기닌 펩타이드, 안지오펩타이드, 바시긴(basigin), Glut1, 및 CD98hc, 및 ANG1005로부터 선택된다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 단클론성 항체이다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항체는 인간 항체이다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항체는 이중특이성 항체이다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항체는 다가 항체이다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항체는 키메라 항체이다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 IgG 부류, IgM 부류 또는 IgA 부류를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 부류를 가지며, IgG1, IgG2 또는 IgG4 아이소타입을 가진다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 항체는 항체 단편이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 항체는 인간 MS4A4A 또는 포유류 MS4A4A 단백질 상에서 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체 단편이다. 본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편이다.
본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 항체는 제1 항원 및 제2 항원을 인식하는 이중특이성 항체이다. 본 명세서의 임의의 실시형태와 조합될 수 있는 일부 실시형태에서, 제1 항원은 MS4A4A이고, 제2 항원은 하기와 같다:
(a) 상기 혈액-뇌-장벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하는 항원;
(b) 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 저밀도 지방단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 형질도입 도메인, TAT, Syn-B, 페너트라틴, 폴리-알기닌 펩타이드, 안지오펩타이드 및 ANG1005로부터 선택된 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하는 항원;
(c) 질환-원인 펩타이드 또는 단백질 또는 질환-원인 핵산으로부터 선택된 질환-원인 제제로서, 상기 질환-원인 핵산은 안티센스 GGCCCC(G2C4) 반복부-확장 RNA이고, 상기 질환-원인 단백질은 아밀로이드 베타, 올리고머 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타 플라크, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 이의 단편, 타우, IAPP, 알파-시뉴클레인, TDP-43, FUS 단백질, C9orf72(염색체 9 오픈 리딩 프레임 72), c9RAN 단백질, 프리온 단백질, PrPSc, 헌팅턴, 칼시토닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 아탁신, 아탁신 1, 아탁신 2, 아탁신 3, 아탁신 7, 아탁신 8, 아탁신 10, 루이소체, 심방나트륨이뇨인자, 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드, 인슐린, 아포지방단백질 AI, 혈청 아밀로이드 A, 메딘, 프로락틴, 트랜스타이레틴, 라이소자임, 베타 2 마이크로글로불린, 겔솔린, 케라토에피텔린, 시스타틴, 면역글로불린 경쇄 AL, S-IBM 단백질, 반복부-관련 비-ATG(RAN) 번역 산물, 다이펩타이드 반복부(DPR) 펩타이드, 글리신-알라닌(GA) 반복부 펩타이드, 글리신-프롤린(GP) 반복부 펩타이드, 글리신-알기닌(GR) 반복부 펩타이드, 프롤린-알라닌(PA) 반복부 펩타이드, 유비퀴틴 및 프롤린-알기닌(PR) 반복부 펩타이드로부터 선택된, 질환-원인 제제;
(d) 면역 세포 상에서 발현된 리간드 및/또는 단백질로서, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA-4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 및 포스파티딜세린으로부터 선택된, 리간드 및/또는 단백질; 또는
(e) 하나 이상의 종양 세포 상에서 발현된 단백질, 지질, 다당류, 또는 당지질.
다른 양상에서, 본 개시내용은 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항체를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 임의의 앞의 실시형태의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 선행하는 실시형태 중 어느 것의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 항-MS4A4A 항체가 생성되도록 선행하는 실시형태 중 어느 것의 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 인간 MS4A4A 항체에 결합하는 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 세포에 의해 생성된 항-MS4A4A 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 양상에서, 본 개시내용은 알츠하이머병, 후발성 알츠하이머병 및 인지기능장애로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 질환, 장애 또는 손상의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A의 과발현 또는 증가된 활성에 의해 야기되거나 이와 관련된 질환, 장애, 병태를 갖는 개체에서의 질환, 장애, 병태의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 질환, 장애 또는 손상의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체의 투여 전 및/또는 후에 오스테오폰틴, 겔솔린, 혈장-막 또는 세포 표면 TREM2 및/또는 가용성 TREM2의 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 CSF1R-결핍 질환 또는 장애를 갖는 개체에서의 질환 또는 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 질환 또는 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 선행하는 실시형태 중 어느 하나의 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, CSF1R-결핍 질환 또는 장애는 축삭 회전타원체 및 색소침착된 아교세포(axonal spheroids and pigmented glia: ALSP) 또는 유전성 미만성 백질뇌병증(hereditary diffuse leukoencephalopath: HDLS)을 수반한 성인-발병 백질뇌병증이다.
본 개시내용의 다른 양상은 임의의 앞의 실시형태의 방법에 의해 생성된 단리된 항-MS4A4A 항체에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 임의의 앞의 실시형태의 항-MS4A4A 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 항체 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 또는 4A-450의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함한다(표 1, 표 5, 표 30 및 표 31에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 항체 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 또는 4A-450의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 1, 표 5, 표 30 및 표 31에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체는 항체 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 또는 4A-450의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 1, 표 5, 표 30 및 표 31에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 항체 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 또는 4A-331의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함한다(표 2 및 표 6에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 항체 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 또는 4A-331의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 2 및 표 6에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체는 항체 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 또는 4A-331의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 2 및 표 6에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 항체 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 또는 4A-381의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함한다(표 3 및 표 7에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 항체 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 또는 4A-381의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 3 및 표 7에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체는 항체 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 또는 4A-381의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 3 및 표 7에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 항체 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 또는 4A-390의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함한다(표 4 및 표 8에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 항체 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 또는 4A-390의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 4 및 표 8에 나타낸 바와 같음).
다른 양상에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항체는 항체 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 또는 4A-390의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함한다(표 4 및 표 8에 나타낸 바와 같음).
본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 MS4A4A 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이되, 항체는 골수성 세포 상에서 겔솔린 및/또는 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 골수성 세포는 대식세포이다.
본 명세서의 실시형태와 조합될 수 있는 특정 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 인간 MS4A4A, 마우스 MS4A4A, cyno MS4A4A 또는 이들의 조합물에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 기재된 다양한 실시형태의 특성 중 하나, 일부 또는 모두는 본 개시내용의 다른 실시형태를 형성하기 위해 조합될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 개시내용의 이들 및 다른 양상은 당업자에게 분명할 것이다. 본 개시내용의 이들 및 다른 실시형태는 다음의 상세한 설명에 의해 추가로 기재된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 수행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 있는 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 시 필요한 요금을 지불하고 특허청에 의해 제공받을 것이다.
도 1은 인간 MS4A4A의 1차 아미노산 서열을 나타내는 도면. 세포내 도메인은 이탤릭체이며, 막관통 도메인은 밑줄 표시되어 있고, 세포외 루프는 볼드 이탤릭체이다.
도 2A는 구조에서 나선 리본으로서 나타내는 4개의 막관통 도메인을 갖는 RCSB Protein Data Bank로부터 얻은 가용성인 4개의 나선 다발 스캐폴드(PDB_ID:1P68)의 구조 개략도를 나타내는 도면. 도 2B 및 도 2C는 각각 가용성인 4개의 나선 다발 스캐폴드 PDB-ID:1P68 및 PDB_ID:1M6T의 1차 아미노산 서열을 나타내고; 4개의 막관통 도메인은 아미노산 서열에 밑줄 표시되어 있다.
도 3A는 인간 MS4A4A의 2개의 세포외 루프가 더해진(볼드 밑줄 표시로 나타냄) 가용성인 4개의 나선 다발 스캐폴드 JS1, JS5 및 JS6의 1차 아미노산 서열을 나타낸 도면. 도 3B는 음성 대조군 변이체로서 사용되는 가용성인 4개의 나선 다발 스캐폴드 JS4 및 JS10의 1차 아미노산 서열을 나타낸 도면.
도 4는 ELISA에 의해 재조합 MS4A4A 가용성 루프 접합된 폴리펩타이드 JS1, JS4, JS5, JS6 및 JS10에 결합하는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 나타낸 도면.
도 5는 재조합 MS4A4A 가용성 루프 접합된 폴리펩타이드 JS1에 결합하는 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-21의 특정 인간화된 항-MS4A4A 항체 변이체를 나타낸 도면.
도 6은 재조합 MS4A4A 가용성 루프 접합된 폴리펩타이드 JS1에 결합하는 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-202의 특정 인간화된 항-MS4A4A 항체 변이체를 나타낸 도면.
도 7은 재조합 MS4A4A 가용성 루프 접합된 폴리펩타이드 JS5에 결합하는 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-202의 특정 인간화 및 친화도 성숙된 항-MS4A4A 항체 변이체를 나타낸 도면.
도 8은 재조합 MS4A4A 가용성 루프 접합된 폴리펩타이드 JS5에 결합하는 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-21의 특정 인간화 및 친화도 성숙된 항-MS4A4A 항체 변이체를 나타낸 도면.
도 9는 재조합 MS4A4A 가용성 루프 접합된 폴리펩타이드 JS5에 결합하는 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-21의 특정 인간화 및 친화도 성숙된 항-MS4A4A 항체 변이체를 나타낸 도면.
도 10A 내지 도 10B는 사이노몰거스 원숭이 혈청에서 sTREM2 수준에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-202의 효과를 나타낸 도면. 도 10A는 항-MS4A4A 항체 4A-202 또는 아이소타입 대조군 항체(huIgG1)를 둘 다 80㎎/㎏ 용량으로 투여 후 표시된 시간(hr)에 사이노몰거스 원숭이 혈청 중 sTREM2 수준(ng/㎖)을 제공하는 도면. 도 10B는 항-MS4A4A 항체 4A-202 또는 아이소타입 대조군 항체(huIgG1)를 둘 다 80㎎/㎏ 용량으로 투여 후 표시된 시간(hr)에 사이노몰거스 원숭이의 혈청 중 sTREM2 수준(기준선의 백분율)을 제공하는 도면.
도 11A 내지 도 11B는 사이노몰거스 원숭이의 뇌척수액(CSF)에서 sTREM2 수준에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-202의 효과를 나타낸 도면. 도 11A는 항-MS4A4A 항체 4A-202 또는 아이소타입 대조군 항체(huIgG1)를 둘 다 80㎎/㎏ 용량으로 투여 후 표시된 시간(hr)에 사이노몰거스 원숭이의 CSF 중 sTREM2 수준(ng/㎖)을 제공하는 도면. 도 11B는 항-MS4A4A 항체 4A-202 또는 아이소타입 대조군 항체(huIgG1)를 둘 다 80㎎/㎏ 용량으로 투여 후 표시된 시간(hr)에 사이노몰거스 원숭이의 CSF 중 sTREM2 수준(기준선의 백분율)을 제공하는 도면.
도 12는 재조합 인간 MS4A4A를 발현시키는 U937 세포에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-313 야생형(WT) huIgG1 및 4A-450 WT huIgG1의 결합 곡선을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 13은 항-MS4A4A 항체 4A-450 WT huIgG1, 4A-450 NSLF huIgG1 및 4A-450 K322A huIgG1로 처리된 1차 인간 대식세포에서 막 TREM2 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 14는 항-MS4A4A 항체 4A-313 WT huIgG1, 4A-313 NSLF huIgG1 및 4A-313 K322A huIgG1로 처리된 1차 인간 대식세포에서 막 TREM2 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 15는 항-MS4A4A 항체 4A-450 huIgG1로 처리된 1차 인간 대식세포의 상청액 중 증가된 가용성 TREM2 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 16은 항-MS4A4A 항체 4A-313 huIgG1로 처리된 1차 인간 대식세포의 상청액 중 증가된 가용성 TREM2 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 17은 항-MS4A4A 항체 4S-313 NSLF huIgG1, 4A-313 PS huIgG1, 4A-450.NSLF huIgG1 및 4A-450.PS hu IgG1로 처리된 1차 인간 대식세포에서 증가된 ATP 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 18A, 18B 및 18C는 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1 및 4A-419 WT huIgG1로 처리된 1차 인간 대식세포에서 CD14, CD163 및 CD200R(각각)의 수준 변화를 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 19는 프로피디움 아이오딘화물 흡수에 의해 측정된 바와 같은 재조합 인간 MS4A4A를 발현시키는 U937 세포에서의 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1, 4A-313 K322A huIgG1 및 4A-313 WT huIgG1의 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 20은 FcyRIIIa 활성화에 의해 측정된 바와 같은 1차 인간 대식세포에서 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1, 4A-313 K322A huIgG1 및 4A-313 WT huIgG1의 ADCP 활성을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 21은 FcyRIIIa 활성화에 의해 측정된 바와 같은 1차 인간 대식세포에서 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1, 4A-313 K322A huIgG1 및 4A-313 WT huIgG1의 ADCC 활성을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 22A 및 도 22B는 1차 인간 대식세포에서 막 TREM2(도 22A) 및 가용성 TREM2(도 22B) 상의 MS4A4A 넉아웃(knockout)의 효과를 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 23A, 도 23B 및 도 23C는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체로 처리된 인간 대식세포에서 각각 가용성 TREM2 단백질 수준, 막 TREM2 단백질 수준 및 TREM2 mRNA 수준에서의 변화의 동력학을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 24A 및 도 24B는 인간 대식세포에서 MS4A4A 증가된 막 TREM2 및 가용성 TREM2 수준의 siRNA 넉아웃을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 25A, 도 25B 및 도 25C는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 첨가 후 3가지 상이한 공여자로부터의 1차 인간 대식세포에서의 막 TREM2 수준의 용량-의존적 증가를 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 26A, 도 26B 및 도 26C는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 첨가 후 3가지 상이한 공여자로부터의 1차 인간 대식세포에서의 가용성 TREM2 수준의 용량-의존적 증가를 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 27A, 도 27B 및 도 27C는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 첨가 후 3가지 상이한 공여자로부터의 1차 인간 대식세포에서의 ATP 수준의 용량-의존적 증가를 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 28A 및 도 28B는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 CSF1R 저해-유도 세포사 구제(rescuing)에서 효과적이라는 것을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 29는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 사이노몰거스 원숭이 CSF에서 프로테옴-와이드(proteome-wide) 효과의 화산 도표(volcano plot)를 나타내는 도면.
도 30은 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 사이노몰거스 원숭이 혈청에서 증가된 sTREM2 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 31A, 도 31B, 도 31C 및 도 31D는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 사이노몰거스 원숭이 CSF에서 증가된 오스테오폰틴 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 32A 및 도 32B는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 사이노몰거스 원숭이 뇌에서 전두엽 피질 및 해마에서의 증가된 오스테오폰틴 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 33A 및 도 33B는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 사이노몰거스 원숭이 뇌에서 전두엽 피질 및 해마에서의 증가된 CSF1R 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 34A 및 도 34B는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 사이노몰거스 원숭이 뇌에서 전두엽 피질 및 해마에서의 증가된 총 TREM2 단백질 수준을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 35A, 도 35B 및 도 35C는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 투여된 사이노몰거스 원숭이의 뇌로부터 단리된 미세아교세포에서의 미세아교세포 활성화, 이동 및 증식 마커에서 mRNA 수준의 변화를 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
도 36은 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 U937 세포에서 재조합적으로 발현된 HA-Snorkel-태그된 MS4A4A 단백질의 세포 표면 발현을 감소시킨다는 것을 나타내는 ㅔㄷ이터를 제시하는 도면.
도 37은 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 1차 인간 대식세포에서 GPNMB 세포 표면 발현을 감소시킨다는 것을 나타내는 데이터를 제시하는 도면.
본 개시내용은 항-MS4A4A 항체(예를 들어, 단클론성 항체); 이러한 항체의 제조 및 이용 방법; 이러한 항체를 포함하는 약제학적 조성물; 이러한 항체를 암호화하는 핵산; 및 이러한 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 명세서에 기재되거나 언급된 기법 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고, 당업자에 의한 통상적인 방법, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]에 기재된 것과 같은 널리 이용되는 방법을 이용하여 통상적으로 사용된다.
I. 정의
용어 "MS4A4A" 또는 "MS4A4A 폴리펩타이드"는 달리 표시되지 않는 한, 포유류, 예컨대, 영장류(예를 들어, 인간 및 cynos) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 MS4A4A를 본 명세서에서 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 용어는 야생형 서열과 천연 유래 변이체 서열(예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체)을 둘 다 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 용어는 "전장", 비가공 MS4A4A뿐만 아니라 세포에서의 가공으로부터 초래되는 MS4A4A의 임의의 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 인간 MS4A4A이다. 일부 실시형태에서, 예시적인 MS4A4A의 아미노산 서열은 2001년 12월 1일자의 Uniprot 수탁 번호 Q96JQ5이다. 일부 실시형태에서, 예시적인 인간 MS4A4A의 아미노산 서열은 서열번호 1이다.
용어 "항-MS4A4A 항체", "MS4A4A에 결합하는 항체" 및 "MS4A4A에 특이적으로 결합하는 항체"는 MS4A4A를 표적화하는 데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 MS4A4A에 결합할 수 있는 항체이다. 일 실시형태에서, 관련 없는, 비-MS4A4A 폴리펩타이드에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역측정법(RIA)에 의해 측정될 때 MS4A4A에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시형태에서, MS4A4A에 결합하는 항체는 < 1μM, < 100nM, < 10nM, < 1nM, < 0.1nM, < 0.01nM, 또는 < 0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 특정 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 상이한 종으로부터의 MS4A4A 중에서 보존된 MS4A4A의 에피토프에 결합한다.
표적 분자에 대한 항체의 결합에 관해, 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적 상의 에피토프에 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 또는"~에 특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 대조군 분자의 결합과 비교되는 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어, 과량의 비표지 표적과의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 특이적 결합은, 표지된 표적의 프로브에 대한 결합이 과량의 비표지 표적에 의해 경쟁적으로 저해되는 경우에 나타난다. 용어 "특이적 결합" 또는 "에 특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 표적 상의 에피토프가, 예를 들어, 약 10-4M 이하, 10-5M 이하, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 10-12M 이하 중 어느 것의 표적에 대한 KD 또는 10-4M 내지 10-6M 또는 10-6M 내지 10-10M 또는 10-7M 내지 10-9M 범위의 KD를 갖는 분자에 의해 나타날 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 친화도 및 KD 값은 반비례 관계이다. 항원에 대한 고친화도는 낮은 KD 값에 의해 측정된다. 일 실시형태에서, 용어 "특이적 결합"은 임의의 다른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프에 실질적으로 결합하는 일 없이 분자가 특정 폴리펩타이드 또는 특정 폴리펩타이드 상의 에피토프에 결합하는 경우의 결합을 지칭한다.
용어 "면역글로불린"(Ig)은 본 명세서의 "항체"와 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 적어도 2개의 무손상 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 것을 포함하는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체)를 특이적으로 아우른다.
"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경("L") 쇄 및 2개의 동일한 중("H") 쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이형사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 중에서 변한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규치적으로 간격을 둔 쇄내의 이황화 브리지를 가진다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 도메인(VH) 다음에 다수의 불변 도메인을 가진다. 각각의 경쇄는 하나의 말단(VL)에서 가변 도메인 및 그의 말단에서 불변 도메인을 가지고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 맞추어 조정되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 맞추어 조정된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해, 예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 페이지 71 및 Chapter 6] 참조.
임의의 척추동물 종으로부터의 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 카파("κ") 및 람다("λ")로 불리는 2개의 분명하게 별개인 유형 중 하나가 부여될 수 있다. 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 아이소타입이 부여될 수 있다. 5가지 부류의 면역글로불린이 있다: 알파("α"), 델타("δ"), 엡실론("ε"), 감마 ("γ") 및 뮤("μ")로 각각 표기되는 중쇄를 갖는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능의 상대적으로 약간의 차이에 기반하여 하위분류(아이소타입)으로 추가로 나뉘어지며, 예를 들어, 인간은 다음의 하위분류를 발현시킨다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2. 상이한 분류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders Co., 2000)]에서 일반적으로 기재된다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인", 예컨대 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일한 부류의 다른 항체에 비해) 항체의 대부분의 가변 부분이며, 항원 결합 부위를 포함한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 세그먼트가 항체, 예컨대 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체 중의 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. 가변 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 폭에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신에, 이는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역(HVR)으로 불리는 3개의 세그먼트에서 집중된다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 베타-시트 구조를 연결하고 그리고 일부 경우에 부분을 형성하는 루프를 형성하는 3개의 HVR에 의해 연결되는 베타-시트 입체배치를 대체로 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 HVR은 FR 영역에 의해 그리고 다른 쇄로부터의 HVR에 의해 근접하게 함께 보유되고, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에서 직접적으로 수반되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적-세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻은 항체, 예컨대 본 개시내용의 단클론성 항-MS4A4A 항체를 지칭하며, 즉, 집단을 포함하는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 유래 돌연변이 및/또는 번역후 변형(예를 들어, 이성질체화, 아마이드화 등)을 제외하고 동일하다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위로 향한다. 상이한 결정소(에피토프)로 향하는 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론성 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정소로 향한다. 이들의 특이성에 추가로, 단클론성 항체는 이들이 하이브리도마 배양물에 의해 합성되고, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용될 단클론성 항체는, 예를 들어, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 및 인간 면역글로불린 좌위의 일부 또는 모두 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하기 위한 기술을 포함하는, 다양한 기법에 의해 생성될 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 또는 "전체 항체"는 항체 단편과 대조적으로 실질적으로 무손상 형태로 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체와 같은 항체를 지칭하기 위해 상호 호환적으로 사용된다. 구체적으로 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것을 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 무손상 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는 무손상 항체가 아닌 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 다이어바디; 선형 항체(미국 특허 제5641870호, 실시예 2; 문헌[Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)] 참조); 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
항체, 예컨대 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 항원 결합 단편, 및 잔여 "Fc" 단편을 생성하며, 표기는 용이하게 결정화하는 능력을 반영한다. Fab 단편은 중쇄(VH)의 가변 영역 도메인, 및 하나의 중쇄(CH1)의 제1 불변 도메인과 함께 전체 경쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이고, 즉, 이는 단일 항원-결합 부위를 가진다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 갖는 2개의 이황화 연결된 Fab 단편에 거의 대응하고 여전히 항원을 가교할 수 있는 단일의 거대한 F(ab')2 단편을 수득한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에서 소수의 추가적인 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본 명세서의 표기이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되는데, 이 단편의 쌍 사이에 사이에 시스테인 힌지를 가진다. 항체 단편의 다른 화학적 결합이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 이황화물에 의해 함께 보유되는 중쇄 둘 다의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역에서 서열에 의해 결정되는데, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식된다.
항체, 예컨대, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 "기능성 단편"은 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역 또는 변형된 FcR 결합 능력을 보유하거나 또는 갖는 항체의 Fc 영역을 일반적으로 포함하는, 무손상 항체의 부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 선형 항체, 단일쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
용어 "다이어바디"는 가변 도메인의 쇄간이지만 쇄내 짝짓기가 달성되지 않음으로써, 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 초래하도록 VH와 VL 도메인 사이의 짧은 링커(약 5 내지 10개) 잔기를 갖는 sFv 단편(앞 단락을 참조)을 구성함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이성 다이어바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩타이드 쇄 상에 존재하는 2개의 "크로스오버(crossover)" sFv 단편의 이형이량체이다.
본 명세서에서 사용되는 "키메라 항체"는 그들이 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 반면, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류뿐만 아니라 이러한 항체의 단편에 속하는 항체에서의 대응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 항체(면역글로불린), 예컨대 본 개시내용의 키메라 항-MS4A4A 항체를 지칭한다. 본 명세서의 관심 대상의 키메라 항체는 PRIMATIZED® 항체를 포함하되, 항체의 항원-결합 영역은, 예를 들어, 관심 대상의 항원을 이용하여 마카크 원숭이를 면역화함으로써 생성된 항체로부터 유래된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "인간화된 항체"는 "키메라 항체"의 서브세트로 사용된다.
비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태, 예컨대, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체이다. 특정 실시형태에서, 인간화된 항체는 각각의 HVR(예를 들어, CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두가 비-인간 항체의 그것에 대응하고, 각각의 FR의 모두 또는 실질적으로 모두가 인간 항체의 그것에 대응하는, 적어도 1개, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 항체, 예컨대, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체이고, 인간에 의해 생성된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본 명세서에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조를 위한 임의의 기법을 이용하여 생성되었다. 인간 항체의 이런 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 구체적으로 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리 및 효모-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되지만, 이의 내인성 좌위가 망가진 유전자이식 동물, 예컨대, 면역화된 제노마우스(xenomice)에 대해 항원을 투여함으로써 제조될 뿐만 아니라 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체-가변 도메인의 영역, 예컨대 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 항체 가변 도메인 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에서 3개(H1, H2, H3), 및 VL에서 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR의 최고의 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체의 미세한 특이성을 부여함에 있어서 고유한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 중쇄만으로 이루어진 천연 유래 낙타 항체는 경쇄의 부재 하에서 작용성이고 안정하다.
다수의 HVR 정의를 사용 중이며, 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, HVR은 서열 가변성에 기반하는 EU 또는 Kabat 상보성-결정 영역(CDR)일 수 있으며, 가장 통상적으로 사용된다(Kabat et al., 상기 참조). 일부 실시형태에서, HVR은 Chothia CDR일 수 있다. 대신에 Chothia는 구조적 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 일부 실시형태에서, HVR은 AbM HVR일 수 있다. AbM HVR은 카바트 CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 절충을 나타내고, 옥스포드 몰레큘러 AbM 항체-모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody-modeling software)에 의해 사용된다. 일부 실시형태에서, HVR은 "컨택트(contact)" HVR일 수 있다. "접촉" HVR은 이용 가능한 복합 결정 구조의 분석에 기반한다. 각각의 이들 HVR로부터의 잔기를 이하에서 주목한다.
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HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34(L1), 46-56 또는 50-56(L2), 및 89-97 또는 89-96(L3), 및 VH에서 26-35(H1), 50-65 또는 49-65(바람직한 실시형태) (H2), 및 93-102, 94-102 또는 95-102(H3). 가변-도메인 잔기는 각각의 이들 연장된-HVR 정의에 대해 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 HVR 잔기 이외의 해당 가변 도메인 잔기이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "억셉터(acceptor) 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 억셉터 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 사전 존재하는 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사전 존재하는 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하 또는, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하이다. 사전 존재하는 아미노산 변화가 VH에 존재하는 경우, 바람직한 해당 변화는 위치 71H, 73H 및 78H 중 단지 3, 2 또는 1개에서 생기며; 예를 들어, 해당 위치에서 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 일 실시형태에서, VL 억셉터 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열에 대한 서열에서 동일하다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에서와 같은 하위그룹이다. 예는 VL을 포함하며, 하위 그룹은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 하위그룹 카파 I, 카파 II, 카파 III 또는 카파 IV일 수 있다. 추가적으로, VH에 대해, 하위그룹은 문헌[Kabat et al., 상기 참조]에서와 같은 하위그룹 I, 하위그룹 II 또는 하위그룹 III일 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 구체화된 위치에서 "아미노산 변형"은 구체화된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 구체화된 잔기에 인접한 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 구체화된 잔기에 "인접한"은 이의 1 내지 2개의 잔기 내의 삽입을 의미한다. 삽입은 구체화된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 본 명세서의 바람직한 아미노산 변형은 치환이다.
"친화도-성숙" 항체, 예컨대 본 개시내용의 친화도 성숙 항-MS4A4A 항체는 해당 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체 친화도의 개선을 초래하는 하나 이상의 HVR에서 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 일 실시형태에서, 친화도-성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가진다. 친화도-성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성된다. 예를 들어, 문헌[Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH- 및 VL-도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재한다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은, 예를 들어: 문헌[Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al. J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 의해 기재된다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 단단한, 비공유 회합에서 하나의 중쇄- 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합에 대한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 대해 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(각각 H쇄 및 L쇄로부터3개의 루프)가 나온다. 그러나, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에도 불구하고, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 단지 3개의 HVR을 포함하는 Fv의 절반)조차도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
또한 "sFv" 또는 "scFv"로 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩타이드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 sFv가 항원 결합에 대해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 해당 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 아이소타입에 따라 다르다.
본 명세서의 용어 "Fc 영역"은 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단의 영역을 정하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 위치 Cys226에서 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 이의 카복실 말단까지 신장하는 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단의 라이신(EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 항체의 생성 또는 정제 동안, 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기가 있거나 또는 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 항체에서 사용하기 위한 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이의 천연 유래 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들) 때문에 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역에 비해 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역에서 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 가진다. 본 명세서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역과 그리고/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 가장 바람직하게는 그와 적어도 약 90% 상동성, 더 바람직하게는 그와 적어도 약 95% 상동성을 가질 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체(이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함)를 포함하는 것이며, FcγRII 수용체는 주로 이의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프("ITAM")를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에서 면역수용체 타이로신-기반 저해 모티프("ITIM")를 포함한다. 장래에 확인되는 것을 포함하는 다른 FcR은 본 명세서의 용어 "FcR"에 의해 포함된다. FcR은 또한 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열에 대해 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)" 및 "상동성"은, 필요하다면, 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 서열 및 도입 갭을 정렬시킨 후에, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율을 지칭한다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당업계의 기술 내의 다양한 방법, 예를 들어, 공공연하게 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어로 달성될 수 있다. 당업자는 비교 중인 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 당업계에 공지된 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
동일한 에피토프와 경쟁하는 항체(예를 들어, 중화 항체)와 관련하여 사용될 때 "경쟁하다"라는 용어는 시험 중인 항체가 공통 항원(예를 들어, MS4A4A 또는 이의 단편)에 대한 기준 분자(예를 들어, 리간드 또는 기준 항체)의 특이적 결합을 방지하거나 또는 저해하는(예를 들어, 감소시키는) 분석에 의해 결정되는 바와 같은 항체 간의 경쟁을 의미한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석, 예를 들어, 고체상 직접 또는 간접 방사면역측정법(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어, 문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조) 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 이용하는 고체상 직접 표지 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지 RIA(문헌[Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82])은 항체가 다른 것과 경쟁하는지의 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 분석은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 이들 중 하나를 보유하는 세포, 비표지 시험 항체 및 표지된 기준 항체의 사용을 수반한다. 경쟁 저해는 시험 항체의 존재 하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 보통 시험 항체는 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장해가 일어나는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 경쟁 결합을 결정하기 위한 방법에 관한 추가적인 상세한 설명은 본 명세서의 실시예에 제공된다. 보통, 경쟁 항체가 과량으로 존재할 때, 이는 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5% 및/또는 거의 100%만큼 저해할 것이다(예를 들어, 감소시킬 것이다).
본 명세서에서 사용되는 MS4A4A 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이의 "상호작용"은, 제한 없이, 단백질-단백질 상호작용, 물리적 상호작용, 화학적 상호작용, 결합, 공유 결합 및 이온 결합을 포함한다. 항체가 두 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 파괴하거나, 감소시키거나 또는 완전히 제거할 때 두 폴리펩타이드 사이에서 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 항체가 "상호작용을 저해한다". 본 개시내용의 항체 또는 이의 단편은 항체가 두 폴리펩타이드 중 하나에 결합할 때 두 폴리펩타이드 사이의 "상호작용을 저해한다". 일부 실시형태에서, 상호작용은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 및/또는 거의 100% 중 어느 것만큼 저해될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 결정소를 포함한다. 에피토프는 해당 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이고, 항원이 폴리펩타이드일 때, 항체와 직접 접촉하는 특정 아미노산을 포함한다. 가장 흔하게는, 에피토프는 폴리펩타이드 상에 존재하지만, 일부 예에서, 다른 종류의 분자, 예컨대, 핵산 상에 존재할 수 있다. 에피토프 결정소는 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화, 예컨대, 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설폰일기를 포함할 수 있고, 특정 3차원 구조 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 폴리펩타이드 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
"작용제" 항체 또는 "활성화" 항체는 항체가 항원에 결합한 후에 항원의 하나 이상의 활성 또는 기능을 유도하는(예를 들어, 증가시키는) 항체이다.
"길항제" 항체 또는 "차단하는" 항체 또는 "저해" 항체는 항체가 항원에 결합한 후에 하나 이상의 리간드에 결합하는 항원을 감소, 저해 및/또는 제거하고(예를 들어, 줄이고), 그리고/또는 항체가 항원에 결합한 후에 항원의 하나 이상의 활성 또는 기능을 감소, 저해 및/또는 제거하는(예를 들어, 줄이는) 항체이다. 일부 실시형태에서, 길항제 항체 또는 차단 항체, 또는 저해 항체는 하나 이상의 리간드에 대한 항원 결합 및/또는 항원의 하나 이상의 활성 또는 작용을 실질적으로 또는 완전히 저해한다.
"단리된" 항체, 예컨대 본 개시내용의 단리된 항-MS4A4A 항체는 그의 생성 환경의 성분으로부터 (예를 들어, 자연적으로 또는 재조합적으로) 확인되고/되거나, 분리되고/되거나 회수된 것이다. 바람직하게는, 단리된 항체는 그의 생성 환경으로부터의 모든 다른 오염 성분과의 회합이 없다. 그의 생성환경으로부터의 오염 성분, 예컨대 재조합 형질감염 세포로부터 초래된 것은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 방해하지 않는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체는: (1) 예를 들어, 로리법(Lowry method)에 의해 결정하여 항체의 95중량% 초과까지, 그리고 일부 실시형태에서, 99중량% 초과까지; (2) 스피닝 컵 시퀀서의 사용에 의해 N-말단의 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마씨 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하는 비-환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의한 균질성에 대해 정제될 것이다. 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 제시되지 않을 것이기 때문에 단리된 항체는 재조합 T-세포 내에서 인시추로 항체를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 폴리펩타이드 또는 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
항체, 예컨대 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 암호화하는 "단리된" 핵산 분자는 그것이 생성된 환경에서 그것이 본래 관련된 적어도 하나의 오염 핵산으로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 생성 환경과 관련된 모든 성분과 관련이 없다. 본 명세서의 폴리펩타이드 및 항체를 암호화하는 단리된 핵산 분자는 그것이 자연에서 발견되는 형태 또는 상황이 아닌 형태이다. 따라서 단리된 핵산 분자는 세포에서 자연적으로 존재하는 본 명세서의 폴리펩타이드 및 항체를 암호화하는 핵산과 구별된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 가지 유형의 벡터는 "플라스미드"인데, 이는 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이되, 추가적인 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제를 할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점 및 에피솜 포유류 벡터를 갖는 박테리아 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 그들이 조작 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순하게, "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 효용의 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)에 대한 수용자일 수 있거나 또는 수용자인 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 천연, 우연적 또는 의도적인 돌연변이에 기인하여 본래의 모 세포와 (형태 또는 게놈 DNA 상보체가) 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주 세포는 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드(들)에 의해 생체내에서 형질감염된 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "막 TREM2", "원형질막 TREM2" 및 "세포 표면 TREM2"는 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "담체"는 사용되는 투약량 및 농도에서 그것이 노출되는 세포 또는 포유류에 대해 비독성인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "방지하는"은 개체에서 특정 질환, 장애 또는 병태의 발생 또는 재발에 대해 예방을 제공하는 것을 포함한다. 개체는 특정 질환, 장애 또는 병태의 성향이 있거나 또는 의심의 여지가 있거나 또는 이러한 질환, 장애 또는 병태가 발생할 위험에 있을 수 있지만, 질환, 장애 또는 병태로 아직 진단되지 않았다.
본 명세서에서 사용되는 특정 질환, 장애 또는 병태가 발생할 "위험에 있는" 개체는 검출 가능한 질환 또는 질환 증상을 가질 수도 있거나 또는 갖지 않을 수도 있고, 본 명세서에 기재된 치료 방법 전에 검출 가능한 질환 또는 질환 증상을 나타낼 수도 있거나 또는 나타내지 않을 수도 있다. "위험에 있는"은 개체가 당업계에 공지된 바와 같은 특정 질환, 장애 또는 병태의 발생과 상관관계가 있는 측정 가능한 매개변수인 하나 이상의 위험 인자를 가진다는 것을 나타낸다. 이들 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 개체는 이들 위험 인자 중 하나 이상 없이 개체보다 특정 질환, 장애 또는 병태가 발생할 더 높은 확률을 가진다.
본 명세서에 기재된 용어 "치료"는 임상 병리 과정 동안 처리 중인 개체의 자연적 과정을 변경시키도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 바람직한 치료 효과는 병리학적 상태의 진행 속도의 감소, 개선 또는 완화, 및 특정 질환, 장애 또는 병태의 관해 또는 개선된 예후를 포함한다. 예를 들어, 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상이 완화되거나 또는 제거된다면, 개체는 성공적으로 "치료된다".
"유효량"은 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투약량으로 그리고 시간 기간 동안 적어도 유효한 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여로 제공될 수 있다. 본 명세서의 유효량은 질환 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하기 위한 치료 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 유효량은 또한 임의의 독성 또는 유해한 치료 효과가 치료적으로 유리한 효과보다 더 큰 양이다. 예방적 용도를 위해, 유리한 또는 목적하는 결과는 질환의 발생 동안 제시되는 질환, 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상을 포함하는, 질환의 위험의 제거 또는 감소, 질환의 중증도의 감소 또는 질환 개시의 지연과 같은 결과를 포함한다. 치료적 용도를 위해, 유리한 또는 목적하는 결과는 질환으로부터 초래되는 하나 이상의 증상의 감소, 질환으로 고통받는 것의 삶의 질 증가, 질환을 치료하는 데 필요한 다른 의약 용량의 감소, 예컨대 질환을 표적화, 진행의 지연 및/또는 생존 연장을 통해 다른 의약 효과의 향상과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효량의 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물은 직접적으로 또는 간접적으로 예방 또는 치료적 처치를 달성하는 데 충분한 양이다. 임상 관련하여 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효량은 다른 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수도 있거나 또는 달성되지 않을 수도 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 치료제를 투여하는 것과 관련하여 고려될 수 있고, 단일 제제는 하나 이상의 다른 제제와 함께, 목적하는 결과가 달성될 수 있다면 유효량으로 주어지도록 고려될 수 있다.
위험의 치료, 예방 또는 감소의 목적을 위한 "개체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원, 스포츠 또는 반려 동물, 예컨대 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 게르빌루스, 마우스, 페릿, 랫트, 고양이 등을 포함하는 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 개체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 다른 화합물 또는 조성물과 "함께" 투여는 동시 투여 및/또는 상이한 시간에 투여를 포함한다. 함께 투여는 또한 상이한 투약 빈도 또는 간격에서, 그리고 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 이용하는 것을 포함하는 공동 제형으로서의 투여 또는 별개의 조성물로서의 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 함께 투여는 동일한 치료 요법의 부분으로서의 투여이다.
본 명세서에 사용된 용어 "약"은 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 보통의 오차 범위를 지칭한다. 본 명세서의 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 특정 값 또는 매개변수에 관한 실시형태를 포함한다(그리고 기재한다).
본 명세서에서 사용되고 첨부하는 청구 범위에서, 단수의 형태는 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 하나 내지 다수의 항체, 예컨대 몰량에 대한 언급이며, 당업자에게 공지된 동등물 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 개시내용의 양상 및 실시형태는 "포함하는", "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진" 양상 및 실시형태를 포함한다는 것이 이해된다.
II. 항-MS4A4A 항체
본 명세서에 항-MS4A4A 항체가 제공된다. 본 명세서에 제공된 항체는, 예를 들어, MS4A4A-관련 장애의 진단 또는 치료에 유용하다.
일 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 MS4A4A 단백질 내의 에피토프에 결합하는 단리된(예를 들어, 단클론성) 항체를 제공한다. 본 개시내용의 MS4A4A 단백질은 포유류 MS4A4A 단백질, 인간 MS4A4A 단백질, 마우스 MS4A4A 단백질, 및 cyno MS4A4A 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 MS4A4A 단백질은 MS4A4A의 천연 유래 변이체를 포함한다.
인간 MS4A4A는 막 당단백질을 암호화하는 239-아미노산 단백질이다. 인간 MS4A4A의 아미노산 서열은 서열번호 1에서 제시된다:
Figure pct00002
추가적으로, 마우스 MS4A4A의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다:
Figure pct00003
추가적으로, 사이노몰거스(cyno) MS4A4A의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시된다:
Figure pct00004
일부 실시형태에서, MS4A4A는 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 골수성 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 뇌세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 성숙 성상세포를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 성상세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 희돌기교세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 미세아교세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 호중구 및 T 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 면역 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 후세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A는 세포 표면 상에서 발현된다.
본 개시내용의 MS4A4A 단백질은 세포질 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 1 내지 64; 서열번호 1 참조); 막관통 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 65 내지 85); 인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 86 내지 98에 대응하는 세포외 도메인(세포외 도메인 1; ECL1); 막관통 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 99 내지 119); 세포질 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 120 내지 137); 막관통 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 138 내지 158); 아미노산 잔기 159 내지 179에 대응하는 세포외 도메인(세포외 도메인 2; ECL2); 막관통 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 180 내지 200); 및 세포질 도메인(인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 201 내지 239)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 몇몇 도메인을 포함한다. 추가적으로, 본 개시내용의 MS4A4A 단백질은 뇌, 뉴런, 신경아교세포, 내피세포, 혈관주위세포, 주피세포 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 다수의 조직 및 세포에서 발현된다.
대식세포 및 미세아교세포의 세포 기능에서의 MS4A4A
중추 신경계(CNS)의 대식세포 및 골수성 세포, 예컨대, 미세아교세포는 이들의 표현형 및 기능에 본질적으로 가소성이 있다. 시험관내 대식세포는 상이한 식세포 및 염증 가능성, 표현형 및 활성을 갖는 M1 대식세포 및 M2 대식세포로 분할될 수 있다. 예를 들어, 말초 기관에서, M1 표현형을 갖는 대식세포는 전염증 및 항-미생물 표현형 및 기능을 갖는 것으로 간주되는 한편, M2 표현형을 갖는 대식세포는 항-염증 표현형 및 기능을 갖는 더 항상성인 상태인 것으로 간주된다.
건강한, 항상성 조건과 관련된 미세아교세포는 M1 마커(예를 들어, CD16, MHC 클래스 II, CD86)와 비교할 때 이들의 세포 표면(예를 들어, CD200R, CD163 및 CD115) 상에서 더 많은 M2 마커를 발현시킨다(Ginhoux and Prinz, 2015, Cold Spring Harb Perspect Biol, 7:a020537). 그러나, 알츠하이머병의 마우스 모델과 인간 알츠하이머병에서 질환 관련 미세아교세포(DAM)는 전염증 또는 활성화된 상태이다. 전염증 또는 활성화 상태의 질환 관련 미세아교세포는 알츠하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애와 관련된 병리를 감소시킴에 있어서 적극적인 역할을 함으로써 유익한 것으로 간주된다.
MS4A4A 발현은 시험관내 M2 대식세포에서 상승되고, 이는 MS4A4A가 M2 대식세포에 대한 신규한 세포 표면 마커라는 것을 시사하였다. 추가적으로, MS4A4A는 비만 세포 상의 cKit의 세포 표면 수송을 조절하는 것으로 나타났는데, 이는 비만 세포 탈과립 및 생존을 조절함에 있어서 MS4A4A의 역할을 시사한다(Cruse et al, 2015, Molecular Biol Cell, 26:1711-1727). 종합하면, 이들 보고된 발견은 표적화 MS4A4A가 M1 및 M2 대식세포 표현형과 관련된 다양한 대식세포의 세포 표면 수용체의 재순환, 발현 및/또는 분화에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 이들의 기능 및 활성에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 M2 대식세포의 세포 표면 마커의 발현에 영향을 미친다. 특히, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 대식세포에서 CD200R, Dectin-1 및 CD163의 세포 표면 발현을 감소시키며, 이는 항-MS4A4A 항체는 M2 대식세포의 세포 표면 수용체의 발현을 감소시킴으로써 대식세포 편극화, 기능 및/또는 활성을 조절한다는 것을 시사한다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 M2 대식세포의 세포 표면 수용체를 감소시키며, 이는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 미세아교세포의 생리적 상태를 더 보호적인 표현형의 생리적 상태로, 예컨대, 더 많은 전염증 또는 활성화된 상태로(예를 들어, 더 많은 M1 표현형으로) 변경시키는 데 효과적이라는 것을 시사한다. 따라서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는, 부분적으로, 대식세포 및 미세아교세포의 표현형을 전염증 및 활성화 상태로 변경시킴으로써, 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 장애를 치료하는 데 유용하다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 미세아교세포의 활성화 상태에 영향을 미친다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내 미세아교세포 활성화(예를 들어, C-형 렉틴 도메인 패밀리 7 구성원 A(CLEC7A)), 미세아교세포 이동(예를 들어, 이노시톨 1,4,5-트라이포스페이트 수용체 2(ITPR2)) 및 미세아교세포 증식(예를 들어, 항원 KI-67(MKI67))과 관련된 단백질의 mRNA 수준을 증가시켰다. 추가적으로, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 미세아교세포 활성화 마커 IL1RN, SPP1 및 PLCG2의 mRNA 수준을 증가시켰다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 또한 항상성 미세아교세포 마커 퓨린 수용체 P2RY12 및 CX3C 케모카인 수용체 1(CX3CR1)의 mRNA 수준을 감소시켰다. 따라서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 미세아교세포 활성화, 이동 및 증식과 관련된 단백질의 다양한 mRNA 수준을 증가시킴으로써; 그리고 미세아교세포 항상성과 관련된 단백질의 다양한 mRNA 수준을 감소시킴으로써 입증된 바와 같이 미세아교세포를 활성화시키는 데 효과적이다.
MS4A4A 및 TREM2 발현
신경퇴행성 질환은 부분적으로 중추 신경계(CNS)에서의 결함있는 면역 기능을 특징으로 한다. 예를 들어, 미세아교세포를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 CNS 골수성 세포구획의 생존도 및 기능 감소는 신경퇴행성 장애, 예컨대, 알츠하이머병에 대한 감수성에 기여하는 것으로 여겨진다. 골수성 세포의 생존도 및/또는 기능을 향상시키는 약학적 개입은 이러한 신경퇴행성 질환 및 장애의 발병, 중증도 또는 진행을 개선사힉 위한 효과적인 치료를 제공할 것이다.
골수성 세포-2(TREM2) 상에서 발현된 촉발 수용체는 골수성 세포, 예컨대, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, 피부의 랑게르한스 세포, 쿠퍼 세포, 파골세포 및 미세아교세포 상에서 주로 발현된 면역글로불린-유사 수용체이다. TREM2는 미세아교세포 상에서 고도로 발현되고, 실험적 자가면역 뇌척수염 및 알츠하이머병 동안에 CNS에서 대식세포를 침윤한다(Piccio et al, 2007, Eur J Immunol, 37:1290-1301; Wang, 2015, Cell, 160:1061-1071). TREM2 경로는 CNS 골수성 세포 생존도 및 기능의 중요한 조절자로 간주된다.
인간 유전자 연구로부터의 데이터는 MS4A4A와 TREM2 사이의 강한 유전적 연결 및 알츠하이머병에 대한 감수성을 시사하였다(Piccio et al., 2016, Acta Neuropathol, 131:925-9330). 특히, 알츠하이머병에 대해 보호적인 MS4A4A 대립유전자는 환자의 뇌척수액에서의 증가된 sTREM2 수준과 연관된다.
본 발명의 항-MS4A4A 항체는 대식세포에서의 세포 ATP 수준을 증가시키는데, 이는 항-MA4A4A 항체가 세포(예를 들어, 대식세포, 골수성 세포, 미세아교세포) 생존도 및 기능을 증가, 유지 또는 향상시키는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 추가적으로, 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 5C12가 배양된 인간 대식세포의 상청액에서 sTREM2 수준을 감소시켰다는 이전의 보고와 대조적으로, 본 발명의 항-MS4A4A 항체는 대식세포에서 sTREM2 및 mTREM2 수준을 증가시켰다(Deming et al, 2018, bioRxiv, doi: dx doi org / 10.1101/352179). 알츠하이머병에 대한 MS4A4A 보호적 대립유전자는 증가된 sTREM2 수준과 연결되기 때문에, 본 명세서에 제공된 결과는 본 발명의 항-MS4A4A 항체는 sTREM2 및 mTREM2 수준을 증가시킴으로써 신경퇴행성 질환 및 장애, 예컨대, 알츠하이머병에서 보호적 표현형을 모방 또는 복제한다는 것을 나타내었다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 TREM2의 세포표면 발현을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200% 만큼 또는 적어도 250%만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 가용성 TREM2 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90%만큼 또는 적어도 100%만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 mTREM 단백질 수준을 약 0.028㎍/㎖ 내지 약 0.039㎍/㎖의 EC50으로 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 sTREM 단백질 수준을 약 0.025㎍/㎖ 내지 약 0.069㎍/㎖의 EC50으로 증가시킨다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 ATP 수준을 약 0.010㎍/㎖ 내지 약 0.021㎍/㎖의 EC50으로 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 ATP 수준을 항-MS4A4A 항체의 부재 하에 이러한 세포에서의 ATP 수준보다 약 1.2배, 약 1.4배 또는 약 1.7배로 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 (예를 들어, 비-인간 영장류에서 또는 인간에서) 생체내 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 기준선 가용성 TREM2 수준으로부터 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125%만큼 또는 적어도 150%만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 기준선 가용성 TREM2 수준으로부터 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 약 50%만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준에 대해 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 1.1배만큼, 적어도 1.2배만큼, 적어도 1.3배만큼, 적어도 1.4배만큼, 적어도 1.5배만큼, 적어도 1.6배만큼, 적어도 1.7배만큼, 적어도 1.8배만큼, 적어도 1.9배만큼 또는 적어도 2배만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준에 대해 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 약 1.5배만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12 일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일 또는 적어도 20일 동안 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체 내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 20일 동안 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 168시간, 적어도 192시간, 적어도 216시간, 적어도 240시간, 적어도 264시간, 적어도 288시간, 적어도 312시간, 적어도 336시간, 적어도 360시간, 적어도 384시간, 적어도 408시간, 적어도 432시간, 적어도 456시간 또는 적어도 480시간 동안 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 혈청 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체 내 혈청 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 480시간 동안 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 기준선 가용성 TREM2 수준으로부터 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200% 만큼, 적어도 225% 만큼, 적어도 250% 만큼, 적어도 275% 만큼, 적어도 300% 만큼, 적어도 325% 만큼, 적어도 350% 만큼, 적어도 375%만큼 또는 적어도 400%만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 기준선 가용성 TREM2 수준으로부터 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 약 300%만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준에 대해 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 1.4배만큼, 적어도 1.6배만큼, 적어도 1.8배만큼, 적어도 2.0배만큼, 적어도 2.2배만큼, 적어도 2.4배만큼, 적어도 2.6배만큼, 적어도 2.8배만큼, 적어도 3.0배만큼, 적어도 3.2배만큼, 적어도 3.4배만큼, 적어도 3.6배만큼, 적어도 3.8배만큼 또는 적어도 4.0배만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준으로부터 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 약 2배 내지 약 4배만큼 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체 내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일 또는 적어도 4일 동안 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때, 생체 내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 4일 동안 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체 내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간 또는 적어도 96시간 동안 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 전 생체내 CSF 중 가용성 TREM2 수준과 비교할 때 생체 내 CSF 중 가용성 TREM2 수준을 적어도 96시간 동안 증가시킨다.
본 명세서에 제공된 증거는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 affect TREM2에 영향을 미치지만, 다른 경로를 통해 작용하는 항체를 제외하지 않는다는 것을 입증한다.
길항제 항체
일부 실시형태에서, MS4A4A 단백질에 결합하는 항체는 MS4A4A에 결합하는 길항체 항체를 포함할 수 있고, MS4A4A와 이의 리간드(들) 사이의 상호작용을 방지함으로써, 또는 리간드의 존재 하에 세포질에 MS4A4A의 신호 전달을 방지함으로써, 하나 이상의 MS4A4A 활성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 길항제 항체는 본 개시내용의 작용제 항체의 작용제 항체의 에피토프 특이성을 가질 수 있지만, Fcg 수용체에 결합할 수 없고, 따라서, 예를 들어, 클러스터 MS4A4A 수용체에 결합할 수 없는 Fc 도메인을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 길항제 항체이다. 일부 실시형태에서, 길항제 항체는 하나 이상의 MS4A4A 활성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 길항제 항체는 하나 이상의 MS4A4A-의존적 유전자의 활성을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 길항제 항체는 MS4A4A와 하나 이상의 MS4A4A 리간드 사이의 상호작용을 저해한다. 일부 실시형태에서, 길항제 항체는 MS4A4A 신호전달을 저해한다. 일부 실시형태에서, 길항제 항체는 MS4A4A와 하나 이상의 MS4A4A 리간드 사이의 상호작용을 저해하고, MS4A4A 신호전달을 저해한다.
일부 실시형태에서, MS4A4A 단백질 수준의 하향 조절 또는 MS4A4A 활성의 감소는 세포에서 MS4A4A 단백질 수준을 하향조절 또는 감소시키는 항-MS4A4A 항체에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, MS4A4A 단백질 수준의 하향조절 또는 MS4A4A 활성의 감소는 공지되어 있고 당업자에게 이용 가능한 방법을 이용하여, 예를 들어, 안티센스 방법, 유전자 요법 등의 사용에 의해, MS4A4A 핵산 발현 또는 수준의 하향 조절에 의해 달성된다. 따라서, 일부 실시형태에서, MS4A4A 단백질 수준 또는 활성 감소는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체에 의해 또는 MS4A4A 핵산(예를 들어, mRNA) 발현 또는 수준을 감소시킴으로써 달성된다.
일부 실시형태에서, 항체 가교는 작용제 항체 기능에 필요하다. 항체 가교는 시험관내 2차 항체에 대한 결합을 통해 또는 생체내 Fc 수용체에 대한 결합을 통해 생길 수 있다. 예를 들어, 길항제 항체는 시험관내 바이오틴/스트렙타비딘 가교 또는 2차 항체 결합을 통해 작용제 항체로 전환될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gravestein et al., 1996, J. Exp. Med. 184:675-685; Gravestein et al., 1994, International Immunol, 7:551-557] 참조). 작용제 항체는 수용체 리간드의 생물학적 활성을 모방하거나 또는 수용체 응집을 향상시켜, 수용체 신호전달을 활성화시킴으로써 이들의 활성을 발휘할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 가교의 부재는 길항제 활성에 필요하다. 길항제 항체는 수용체-리간드 상호작용을 차단시킴으로써 이들의 활성을 발휘할 수 있다.
겔솔린, 오스테오폰틴 및 알츠하이머병 보호 대립유전자의 표현형모사
후기-발병 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 MS4A 유전자 클러스터에 3개의 SNP가 있다. 이들은 MS4A4A에서 rs4938933, MS4A4E에서 rs670139 및 MS4A6A에서 rs610932를 포함한다(Hollingworth et al, 2011, Nat Genetics, 43:429-435; Naj et al, 2011, Nature Genetics, 43:436-441; Antunez et al, 2011, Genome Medicine, 3, article 33). 추가적으로, MS4A4A 좌위 SNP(rs2304933 및 rs2304935)는 보다 고수준의 MS4A4A 및 후기-발병 알츠하이머병(LOAD)을 포함하는 증가된 알츠하이머병 위험과 관련된다(Allen et al, 2012, Neurology, 79:221-228).
MS4A 유전자 클러스터와 관련된 알츠하이머병-관련 유전자 변이체(SNP)가 확인되었다. 해당 변이체 대립유전자 중 하나는 rs1582763이며, 이는 상승된 CSF sTREM2 수준과 관련되고, 감소된 알츠하이머병 위험 및 지연된 발병 연령과 관련되며, 따라서 보호 대립유전자로 간주된다. (Deming et al, 2018, bioRxiv, doi: dx doi org / 10.1101/352179). rs1582763 보호 대립유전자는 혈액 중 감소된 MS4A4A mRNA 수준과 관련된다. 이들 발견은 rs1582763 대립유전자가 MS4A4A 수준을 감소시키고, 알츠하이머병 위험 또는 중증도를 감소시킴으로써 보호적 역할을 수행한다는 것을 추가로 시사한다. 보호적 rs1582763은 또한 오스테오폰틴의 증가된 발현 수준 및 겔솔린의 증가된 수준과 관련된다. 본 발명의 항-MS4A4A 항체는 적어도 MS4A4A 발현 감소, 오스테오폰틴 발현 증가, 겔솔린 발현 증가 및/또는 sTREM 수준 증가에 대해 보호적 대립유전자의 이들 양상의 표현형 모사에서 효과적이다. 본 개시내용의 일부 양상에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 감소된 알츠하이머병 위험 및/또는 알츠하이머병의 지연된 발병 시 연령과 관련된 MS4A의 하나 이상의 대립유전자를 표현형모사한다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 오스테오폰틴(SPP1)의 mRNA 수준을 증가시키고, 인간 말초 혈액 단핵 세포-유래 대식세포에서 겔솔린(GSN)의 mRNA 수준을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 겔솔린의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200%만큼 또는 적어도 250%만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 겔솔린의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200%만큼 또는 적어도 250%만큼 증가시킨다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 비-인간 영장류에서 오스테오폰틴(SSP1) 수준을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내(예를 들어, 비-인간 영장류에서 또는 인간에서) 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 혈청 중 및/또는 CSF 중 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 혈청 및/또는 CSF에서 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200%만큼 또는 적어도 250%만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 뇌에서 오스테오폰틴의 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 전두엽 피질 및/또는 해마에서 오스테오폰틴의 단백질 수준을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 오스테오폰틴 및 겔솔린의 발현 증가에 대해 보호적 rs1582763 대립유전자를 표현형 모사한다. 다른 양상에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 오스테오폰틴, 겔솔린 및/또는 sTREM2의 발현 증가에 효과적이고, 보호적 rs1582763 대립유전자와 유사하게 알츠하이머병 위험 및/또는 중증도 감소에서 생물학적으로 활성이다. 데이터는 SPP1 및 GSN이 rs158273 대립유전자와 관련된 보호적 생물학적 활성에 대한 약력학적 마커라는 것을 나타내었다.
CSFR1 및 IL1RN 발현
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 비-인간 영장류에서 CSF1R 수준을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 생체내(예를 들어, 비-인간 영장류에서 또는 인간에서) CSF1R의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 혈청 중 및/또는 CSF 중 CSF1R의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 혈청 및/또는 CSF에서 CSF1R의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200%만큼 또는 적어도 250%만큼 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 뇌에서 CSF1R의 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 전두엽 피질 및/또는 해마에서 CSF1R의 단백질 수준을 증가시킨다.
CSF1R 결핍증은 뇌에서 미세아교세포의 발생에 부정적으로 영향을 미치며(Swerdlow et al (2000) Neurology, 111:300-311; Baba et al (2006) Acta Neuropath, 111:300-311), 최근의 연구는 축삭 회전타원체 및 색소침착된 아교세포(ALSP)를 갖는 성인-발병 백질뇌병증 및 회전 타원체(HDLS)를 갖는 유전성 미만성 백질뇌병증을 포함하는 다양한 장애에 대해 CSF1R 유전자에서의 돌연변이와 연관되었다(Oosterhof et al (2019) Am J Hum Genet, 104:936-947; Rademaker et al (2011) Nat Genet, 44:200-205; Nicholson et al (2013) Neurology, 80:1033-1040). 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 CSF1R 저해 후 인간 대식세포의 세포사 및 지속된 생존을 감소시켰다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 CSF1R-결핍 질환 또는 장애, 예컨대, ALSP 또는 HDLS를 갖는 개체를 치료하는 데 유용하다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 인간 말초 혈액 단핵 세포-유래 대식세포에서 IL1RN 수준을 증가시켰다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 IL1RN의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 IL1RN의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 IL1RN의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 25% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40% 만큼, 적어도 50% 만큼, 적어도 60% 만큼, 적어도 70% 만큼, 적어도 75% 만큼, 적어도 80% 만큼, 적어도 90% 만큼, 적어도 100% 만큼, 적어도 125% 만큼, 적어도 150% 만큼, 적어도 200%만큼 또는 적어도 250%만큼 증가시킨다.
GPNMB 발현
GPNMB(당단백질 비전이성 흑색종 단백질 B)는 조직 대식세포 및 미세아교세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서 발현되는 표면 당단백질이다. 몇몇 유전자 변이체는 파킨슨병(PD) 위험과 관련되었다. GPNMB 단백질 수준는 PD 환자의 흑질에서 상승되며, GPNMB 수준은 라이소좀 스트레스 후에 증가된다(Moloney et.al., 2018, Neurobio Dis. 120: 1-11). 추가적으로, GPNMB의 증가된 발현은 SNP rs199347과 연관되며, 이 위험 SNP는 GPNMB 유전자 내에 위치된다(Murthy et al, Neurogenetics, 2017, 18:121-133).
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 인간 1차 대식세포에서 GPNMB 세포 표면 단백질 수준을 감소시켰다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 골수성 세포(예를 들어, 대식세포, 인간 대식세포, 미세아교세포)에서 GPNMB 세포 표면 단백질 수준을 적어도 10% 만큼, 적어도 20% 만큼, 적어도 30% 만큼, 적어도 40%만큼 또는 적어도 50%만큼 감소시킨다. 증가된 GPNMB 수준은 PD에 대해 위험 대립유전자와 관련되기 때문에, 항-MS4A4A 항체 첨가 후 GPNMB의 감소는 PD의 치료를 위한 수단을 제공할 수 있다.
A. 예시적인 항체 및 특정 다른 항체 실시형태
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 94, 108, 116, 146, 147, 308 및 311로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 94, 108, 116, 146, 147, 308 및 311로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 96, 97, 98, 99, 110, 111, 118, 119, 120, 121, 122, 149, 150, 151, 152, 153, 309 및 312로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 96, 97, 98, 99, 110, 111, 118, 119, 120, 121, 122, 149, 150, 151, 152, 153, 309 및 312로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 100, 101, 102, 112, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 154, 310 및 313로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 100, 101, 102, 112, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 154, 310 및 313으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 103, 104, 113, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 156, 157, 158, 314 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 103, 104, 113, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 156, 157, 158, 314 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105, 106, 114, 139, 140, 141, 142, 143, 160, 161, 315 및 318로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 105, 106, 114, 139, 140, 141, 142, 143, 160, 161, 315 및 318로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107, 115, 144, 145, 163, 316 및 319로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 107, 115, 144, 145, 163, 316 및 319로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 94 및 308로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 94 및 308로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 96, 97, 98, 99 및 309로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 96, 97, 98, 99 및 309로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 100, 101, 102 및 310으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 100, 101, 102 및 310으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 103 104 및 314로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 103, 104 및 314로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105, 106 및 315로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 105, 106 및 315로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107 및 316으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 107 및 316으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 108의 아미노산 서열, 또는 서열번호 108의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 112의 아미노산 서열, 또는 서열번호 112의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 113의 아미노산 서열, 또는 서열번호 113의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열, 또는 서열번호 114의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열, 또는 서열번호 115의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 116의 아미노산 서열, 또는 서열번호 116의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열, 또는 서열번호 154의 아미노산에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 159, 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 159, 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 163으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95% 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;(a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 312의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 317의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 318의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 319의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (a) 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (d) 서열번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (a) 서열번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 94의 아미노산 서열, 또는 서열번호 94의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 96, 97, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 96, 97, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 100, 101 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 100, 101 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 308의 아미노산 서열, 또는 서열번호 308의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 309의 아미노산 서열, 또는 서열번호 309의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 310의 아미노산 서열, 또는 서열번호 310의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 311의 아미노산 서열, 또는 서열번호 311의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 312의 아미노산 서열, 또는 서열번호 312의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 313의 아미노산 서열, 또는 서열번호 313의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 103 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 103 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 105 및 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 105 및 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 107의 아미노산 서열, 또는 서열번호 107의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 314의 아미노산 서열, 또는 서열번호 314의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 315의 아미노산 서열, 또는 서열번호 315의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 316의 아미노산 서열, 또는 서열번호 316의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 317의 아미노산 서열, 또는 서열번호 317의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 318의 아미노산 서열, 또는 서열번호 318의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 319의 아미노산 서열, 또는 서열번호 319의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) (i) 서열번호 94의 아미노산 서열, 또는 서열번호 94의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 96, 97, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 96, 97, 98 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 100, 101 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 100, 101 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 103 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 103 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 105 및 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 105 및 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 107의 아미노산 서열, 또는 서열번호 107의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는, VL 도메인을 포함하는, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) (i) 서열번호 308의 아미노산 서열, 또는 서열번호 308의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 309의 아미노산 서열, 또는 서열번호 309의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 310의 아미노산 서열, 또는 서열번호 310의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 314의 아미노산 서열, 또는 서열번호 314의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 315의 아미노산 서열, 또는 서열번호 315의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 316의 아미노산 서열, 또는 서열번호 316의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는, VL 도메인을 포함하는, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) (i) 서열번호 311의 아미노산 서열, 또는 서열번호 311의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 312의 아미노산 서열, 또는 서열번호 312의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 313의 아미노산 서열, 또는 서열번호 313의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 317의 아미노산 서열, 또는 서열번호 317의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 318의 아미노산 서열, 또는 서열번호 318의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 316의 아미노산 서열, 또는 서열번호 316의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는, VL 도메인을 포함하는, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 112의 아미노산 서열, 또는 서열번호 112의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 113의 아미노산 서열, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 114의 아미노산 서열, 또는 서열번호 114의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 115의 아미노산 서열, 또는 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) (i) 서열번호 108의 아미노산 서열, 또는 서열번호 108의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 112 아미노산 서열, 또는 서열번호 112의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 113의 아미노산 서열, 또는 서열번호 113의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 114의 아미노산 서열, 또는 서열번호 114의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 115의 아미노산 서열, 또는 서열번호 115의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는, VL 도메인을 포함하는, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 116의 아미노산 서열, 또는 서열번호 116의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) (i) 서열번호 116의 아미노산 서열, 또는 서열번호 116의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열번호 154의 아미노산 서열, 또는 서열번호 154의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열번호 163의 아미노산 서열, 또는 서열번호 163의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, (a) (i) 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (iii) 서열번호 154의 아미노산 서열, 또는 서열번호 154의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2 또는 모두 3개의 VH HVR 서열을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열번호 163의 아미노산 서열, 또는 서열번호 163의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모두 3개의 VL HVR 서열을 포함하는, VL 도메인을 포함하는, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 304 및 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 304 및 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 304 또는 306에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 304 또는 306에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 304 또는 306의 VH 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 94, 108, 116, 146, 147 및 308 및 311로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 96, 97, 98, 99, 110, 111, 118, 119, 120, 121, 122, 149, 150, 151, 152, 153, 309 및 312로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 100, 101, 102, 112, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 154, 310 및 313으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 305 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 305 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 305, 또는 307에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 305, 또는 307에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 35, 36, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 305 또는 307의 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 103, 104, 113, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 156, 157, 158, 314 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 105, 106, 114, 139, 140, 141, 142, 143, 160, 161, 315 및 318로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 107, 115, 144, 145, 163, 316 및 319로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 상기 제공된 실시형태 중 어느 것에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 실시형태 중 어느 것에서와 같은 VL을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공되되, 항체는 상기 제공된 실시형태 중 어느 것에서와 같은 VH, 및 상기 제공된 실시형태 중 어느 것에서와 같은 VL을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 5 내지 15 및 서열번호 17 내지 22에서 VH 및 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 32 내지 36에서 VH 및 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 40 내지 53 및 서열번호 55 내지 74에서 VH 및 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 76 내지 84 및 서열번호 86 내지 93에서 VH 및 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 304 및 서열번호 305에서 VH 및 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 306 및 서열번호 307에서 VH 및 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공되되, VH 및 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 304의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 305의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 및 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 307의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공되되, VH 및 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공되되, VH 및 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
일부 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공되되, VH 및 VL은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 및 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 304 및 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 304 및 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 304 또는 306에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 304 또는 306에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 304 또는 306의 VH 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 94 및 308로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 96, 97, 98, 99 및 309로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 100, 101, 102 및 310으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 305 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 305 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 305 또는 307에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 305 또는 307에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 305 또는 307의 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 103, 104 및 314로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 105, 106 및 315로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 107 및 316로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 VH 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 서열번호 32, 33, 34, 35 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 32, 33, 34, 35 및 36로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 32, 33, 34, 35 또는 36에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 32, 33, 34, 35 또는 36에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 32, 33, 34, 35 또는 36의 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 또는 53의 VH 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74의 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 및 84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84의 VH 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH는 (a) 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체가 제공되되, 항체는 서열번호 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 또는 93에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 또는 93에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다. 선택적으로, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 또는 93의 VL 서열을 포함하며, 해당 서열의 번역 후 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, VL은 (a) 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 320 내지 335 및 355 내지 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 서열번호 320 내지 335 및 355 내지 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 320 내지 335 및 355 내지 362에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 320 내지 335 및 355 내지 362에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다.
다른 양상에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 363 내지 365로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 서열번호 363 내지 365로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 전장 중쇄 아미노산 서열은 기준 서열에 대해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 포함하지만, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 결합하는 능력을 보유하는 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서열번호 363 내지 365에서 총 1 내지 10개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 서열번호 363 내지 365에서 총 1 내지 5개의 아미노산이 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 LVR 외부의 영역에서(즉, FR에서) 일어난다.
일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 355 내지 362의 전장 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 365의 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 320 내지 327의 전장 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 363의 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 서열번호 328 내지 335의 전장 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 364의 전장 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 4A-202, 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 및 4A-450으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 4A-18, 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 및 4A-331로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 4A-21, 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 및 4A-381로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 4A-25, 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389, 4A-390으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 4A-202, 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-18, 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330, 4A-331, 4A-21, 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380, 4A-381, 4A-25, 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389, 4A-390, 4A-419 및 4A-450으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체에 의해 결합된 MS4A4A 에피토프와 동일하거나 중복되는 인간 MS4A4A의 에피토프에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하기 위한 상세한 예시적인 방법은 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에서 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-202, 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 및 4A-450, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-18, 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 및 4A-331, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-21, 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 및 4A-381, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-25, 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389, 4A-390, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-202, 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 및 4A-450, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체와 동일하거나 중복되는 에피토프를 MS4A4A 상에 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-18, 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 및 4A-331, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체와 동일하거나 중복되는 에피토프를 MS4A4A 상에 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-21, 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 및 4A-381, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체와 동일하거나 중복되는 에피토프를 MS4A4A 상에 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해, 4A-25, 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 및 4A-390 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 기준 항체와 동일하거나 중복되는 에피토프를 MS4A4A 상에 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A의 세포외 도메인 1(ECL1)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 CMASNTYGSNPIS(서열번호 177) 내에서 하나 이상의 아미노산에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A의 세포외 도메인 2(ECL2)에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(서열번호 178) 내에서 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 경쟁 분석 또는 MS4A4A 결합 분석, 예컨대, BIAcore 분석, ELISA 분석 또는 유세포분석은 MS4A4A에 대한 결합에 대해 항-MS4A4A 항체가 4A-202, 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-18, 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330, 4A-331, 4A-21, 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-361, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380, 4A-381, 4A-25, 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389, 4A-390, 4A-419 및 4A-450, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 기준 항체와 경쟁하는지(기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는지)의 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 예시적인 경쟁 분석에서, 세포 표면 상에서 고정된 MS4A4A 또는 MS4A4A를 발현시키는 세포는 MS4A4A에 결합하는 제1 표지 항체(예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류) 및 MS4A4A에 대한 결합을 위해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험 중인 제2 비표지 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 MS4A4A 또는MS4A4A를 발현시키는 세포는 제1 표지 항체를 포함하지만, 제2 비표지 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션된다. MS4A4A에 대한 제1 항체의 결합에 허용적인 조건 하에서 인큐베이션 후에, 과량의 비결합 항체가 제거되고, 고정된 MS4A4A 또는 MS4A4A를 발현시키는 세포와 관련된 표지의 양이 측정된다. 고정된 MS4A4A 또는 MS4A4A를 발현시키는 세포와 관련된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된다면, 제2 항체는 MS4A4A에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] 참조.
추가로 (a) (i) 서열번호 94 및 308로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 96, 97, 98, 99 및 309로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 100, 101, 102 및 310로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 103, 104 및 314로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 105, 106 및 315로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 107 및 316으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체와의 결합을 경쟁적으로 저해하고/하거나 상기 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 5 내지 15 및 304, 및 서열번호 17 내지 22 및 305에서 VH 및 VL 서열을 포함한다.
(a) (i) 서열번호 94 및 308로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 96, 97, 98, 99 및 309로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 100, 101, 102 및 310로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 103, 104 및 314로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 105, 106 및 315로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 107 및 316으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일하거나 중복되는 인간 MS4A4A의 에피토프에 결합하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 5 내지 15 및 304, 및 서열번호 17 내지 22 및 305에서 VH 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 MS4A4A의 에피토프는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프이다.
추가로 (a) (i) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체와의 결합을 경쟁적으로 저해하고/하거나 상기 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 32 내지 36에서 VH 및 VL 서열을 포함한다.
(a) (i) 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 110 및 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일하거나 중복되는 인간 MS4A4A의 에피토프에 결합하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 24 내지 30 및 서열번호 32 내지 36에서 VH 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 MS4A4A의 에피토프는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프이다.
추가로 (a) (i) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체와의 결합을 경쟁적으로 저해하고/하거나 상기 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 40 내지 53 및 서열번호 55 내지 74에서 VH 및 VL 서열을 포함한다.
(a) (i) 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 118, 119, 120, 121 및 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 123, 124, 125, 126, 127, 128 및 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 139, 140, 141, 142 및 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 144 및 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일하거나 중복되는 인간 MS4A4A의 에피토프에 결합하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 40 내지 53 및 서열번호 55 내지 74에서 VH 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 MS4A4A의 에피토프는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프이다.
추가로 (a) (i) 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체와의 결합을 경쟁적으로 저해하고/하거나 상기 항체와의 결합에 대해 경쟁하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 76 내지 84 및 서열번호 86 내지 93에서 VH 및 VL 서열을 포함한다.
(a) (i) 서열번호 146 및 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열번호 149, 150, 151, 152 및 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열번호 154로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는, VH 도메인, 및 (b) (i) 서열번호 156, 157 및 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열번호 160 및 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 (iii) 서열번호 163으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, VL 도메인을 포함하는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일하거나 중복되는 인간 MS4A4A의 에피토프에 결합하는 항-MS4A4A 항체가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 항체는 각각 서열번호 76 내지 84 및 서열번호 86 내지 93에서 VH 및 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 MS4A4A의 에피토프는 항-MS4A4A 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프이다.
일부 실시형태에서, 상기 실시형태 중 어느 것에 따른 항-MS4A4A 항체는 인간화된 및/또는 인간 항체를 포함하는 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이어바디 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 실시형태에서, 항-MS4A4A 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어, IgGl 항체, IgG2a 항체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다.
일부 실시형태에서, 상기 실시형태 중 어느 것에 따른 항-MS4A4A 항체는 이하의 부문 1 내지 7에 기재된 바와 같이, 임의의 특징을 개별적으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
(1) 항-MS4A4A 항체 결합 친화도
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 < 1μM, < 100nM, < 10nM, < 1nM, < 0.1nM, < 0.01nM, 또는 < 0.001 nM(예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8M 내지 10-13M, 예를 들어, 10-9M 내지 10-13M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다. 해리 상수는 임의의 생화학적 또는 생물리학적 기법, 예컨대 ELISA, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계법(예를 들어, 문헌[Octet System by ForteBio] 참조), 등온 적정형 열량계(ITC), 시차주사 열량측정법(DSC), 원이색성(CD), 유동 정지 분석, 및 표색 또는 형광 단백질 용융 분석을 포함하는 임의의 분석 기법을 통해 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, Kd는 방사성표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, RIA는, 예를 들어, 문헌[Chen et al. J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))]에 기재된 바와 같이 관심 대상의 항체 및 이의 항원의 Fab 형태에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, Kd는 BIACORE 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용하여 측정되고, 예를 들어, BIACORE -2000 또는 BIACORE -3000(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재)를 이용하는 분석은 대략 10 반응 단위(RU)에서 고정 항원 CM5 칩에 의해 25℃에서 수행된다. 일부 실시형태에서, KD는 1가 항체(예를 들어, Fab) 또는 전장 항체를 이용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, KD는 1가 형태로 전장 항체를 이용하여 결정된다.
(2) 항체 단편
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 이하에 기재되는 다른 단편을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)] 참조. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, WO 93/16185; 및 미국 특허 제5571894호 및 제5587458호를 참조. 회수(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 제5869046호 참조.
다이어바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, 유럽 특허 제404097호; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)] 참조. 트라이어바디 및 테트라바디는 또한 문헌[Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 중쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 모두 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시형태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(예를 들어, 미국 특허 제6248516호 참조).
본 명세서에 기재된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질 분해뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어, 이콜라이 또는 파지)의 생산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 기법에 의해 항체 단편이 생성될 수 있다.
(3) 키메라 및 인간화된 항체
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4816567호에 기재되어 있다. 일례에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대, 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류로부터 변화된 "부류가 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화된 반면, 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 특정 실시형태에서, 인간화된 항체는 인간에서 실질적으로 비면역원성이다. 특정 실시형태에서, 인간화된 항체는 인간화된 항체가 유래된 다른 종으로부터의 항체와 실질적으로 동일하게 표적에 대한 친화도를 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 제5530101호, 제5693761호; 제5693762호; 및 제5585089호 참조. 특정 실시형태에서, 항원 결합 도메인의 본래의 친화도를 감소시키지 않는 한편, 이의 면역원성을 감소시키는 일 없이, 변형될 수 있는 항체 가변 도메인의 아미노산이 확인된다. 예를 들어, 미국 특허 제5766886호 및 제5869619호 참조. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR(또는 이의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR(또는 이의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항체에서 일부 FR 잔기는 비-인간 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선시킨다.
인간화된 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 문헌[Almagro et al. Front. Biosci. 13:161 9-1633 (2008)]에서 검토되고, 예를 들어, 미국 특허 제5821337호, 제7527791호, 제6982321호 및 제7087409호에 추가로 기재된다. 인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "베스트-핏(best-fit)" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol. 151 :2623 (1993)] 참조); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]); 및 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어, 문헌[Baca et al. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al. J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
(4) 인간 항체
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌[van Dijk et al. Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) 및 Lonberg Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 생성하도록 변형된 유전자이식 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 마우스가 마우스 항체의 부재 하에 인간 항체를 생성한다는 예상에서 인간 Ig의 거대 단편을 이용하여 마우스 항체 생성에서 결핍된 마우스 균주를 조작할 수 있다. 거대 인간 Ig 단편은 거대 가분 유전자 다양성뿐만 아니라 항체 생성 및 발현의 적절한 조절을 보존할 수 있다. 항체 다양성 및 선택에 대한 마우스 기작 및 인간 단백질에 대한 면역학적 관용의 결여를 이용함으로써, 이들 마우스 균주에서 복제된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 포함하는 관심 대상의 임의의 항원에 대해 고친화도 완전 인간 항체를 수득할 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여, 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 MAb가 생성 및 선택될 수 있다. 특정 예시적인 방법은 미국 특허 제5545807호, 유럽 특허 제546073호 및 유럽 특허 제546073호에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어, XENOMOUSE™ 기술을 기재하는 미국 특허 제6075181호 및 제6150584호; HUMAB® 기술을 기재하는 미국 특허 제5770429호; K-M MOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 제7041870호, 및 VELOCIMOUSE® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 제2007/0061900호. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 생성될 수 있다. 인간 단클론성 항체의 생성을 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 이형골수종 세포주가 기재되었다(예를 들어, 문헌[Kozbor J. Immunol. 133:3001 (1984) 및 Boerner et al. J. Immunol. 147:86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 문헌[Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 03:3557-3562(2006)]에 기재되어 있다. 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7189826호에 기재된 것을 포함한다(하이브리도마 세포주로부터의 단클론성 인간 IgM 항체의 생성을 기재). 인간 하이브리도마 기술(Trioma 기술)은 또한 문헌[Vollmers et al. Histology and Histopathology 20(3) :927-937 (2005) 및 Vollmers et al. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다. 인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리시킴으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기법은 이하에 기재한다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 시험관내 방법에 의해 그리고/또는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리된 인간 항체이다. 적합한 예는 파지 디스플레이(CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (formerly Proliferon), Affimed) 리보솜 디스플레이(CAT), 효모 디스플레이(Adimab) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 별개로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이어서, 문헌[Winter et al. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별될 수 있다. 예를 들어, 다양한 방법은 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특징을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 선별하기 위해 당업계에 공지되어 있다. 또한 문헌[Sidhu et al. J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004; Lee et al. J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004; Fellouse Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472(2004); 및 Lee et al. J. Immunol. Methods 284( -2):1 19-132(2004)] 참조. 파지는 전형적으로 단일쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 작제하는 하이드리도마의 필요조건 없이 면역원에 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 미경험(naive) 레퍼토리는 문헌[Griffiths et al. EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 의해 기재되는 바와 같은 임의의 면역화 없이 매우 다양한 비-자기 및 자기-항원에 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한 줄기 세포로부터 비배열 V-유전자 세그먼트를 클로닝함으로써, 그리고 문헌[Hoogenboom et al. J. Mol. Biol., 227: 381-388, 1992]에 의해 기재된 바와 같이 고도로 가변적인 HVR3 영역을 암호화하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하여 합성에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는, 예를 들어, 미국 특허 제5750373호 및 미국 특허 공개 제2007/0292936호 및 제2009/0002360호를 포함한다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체는 본 명세서의 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
(5) Fc 영역을 포함하는 불변 영역
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 Fc를 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 아이소타입이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG 부류, IgM 부류 또는 IgA 부류이다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 IgG2 아이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG2 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG2 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 하나 이상의 MS4A4A 활성 또는 독립적으로 Fc 수용체에 대한 결합을 유도한다. 일부 실시형태에서, 항체는 저해 Fc 수용체에 결합한다. 특정 실시형태에서, 저해 Fc 수용체는 저해 Fc-감마 수용체 IIB(FcγIIB)이다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 IgG1 아이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 마우스 IgG1 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG1 경쇄 불변 영역은 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 저해 Fc 수용체에 결합한다. 특정 실시형태에서, 저해 Fc 수용체는 저해 Fc-감마 수용체 IIB(FcγIIB)이다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 IgG4 아이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG4 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 IgG4 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 저해 Fc 수용체에 결합한다. 특정 실시형태에서, 저해 Fc 수용체는 저해 Fc-감마 수용체 IIB(FcγIIB)이다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 혼성 IgG2/4 아이소타입을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 IgG2의 EU 넘버링에 따른 아미노산 118 내지 260 및 인간 IgG4의 EU 넘버링에 따른 아미노산 261 내지 447(WO 1997/11971; WO 2007/106585)을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 아미노산 치환을 포함하지 않는 Fc 영역을 포함하는 대응하는 항체와 비교할 때 보체 활성화 없이 클러스터링을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 항체는 항체에 특이적으로 결합된 표적의 하나 이상의 활성을 유도한다. 일부 실시형태에서, 항체는 MS4A4A에 결합한다.
또한 효과기 작용을 변형시키기 위해 그리고/또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위는 항체-의존적 세포-매개 세포독성을 감소시키기 위해 특정 Fc 수용체, 예컨대 FcRI, FcRII 및/또는 FcRIII에 대한 결합 친화도를 제거하거나 또는 감소시키도록 변형되거나 또는 돌연변이될 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과기 작용은 항체의 (예를 들어, IgG의 CH2 도메인에서) Fc 영역의 N-글리코실화를 제거함으로써 손상된다. 일부 실시형태에서, 효과기 작용은 WO 99/58572 및 문헌[Armour et al. Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al. J. Immunology 164:1925-1933 (2000)]에 기재된 바와 같은 인간 IgG의 영역, 예컨대 233-236, 297, 및/또는 327-331을 변형시킴으로써 손상된다. 다른 실시형태에서, 또한 항체-의존적 세포-매개 세포독성 및 항체-의존적 세포의 식세포작용을 포함하는 체액성 반응을 활성화시키는 일 없이 인접한 세포 상에서 MS4A4A 항체를 증가시키기 위해 ITIM-함유 FcgRIIb(CD32b)로 향하는 선택성 발견을 증가시키도록 효과기 기능을 변경시키기 위해 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 변형하는 것이 바람직할 수 있다.
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5739277호에 기재된 바와 같은 항체(특히, 항체 단편) 내로 회수 수용체 결합 에피토프를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 용어 "구조 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기 증가를 초래하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다. 기타 아미노산 서열 변형.
(6) 다중특이성 항체
다중 특이성은 동일한 또는 다른 폴리펩타이드(예를 들어, 하나 이상의 본 개시내용의 MS4A4A 폴리펩타이드) 상의 항체를 포함하여, 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 삼중특이성 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 사중특이성 항체일 수 있다. 이러한 항체는 전장-항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2 이중 특이성 항체)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 MS4A4A 상의 제1 부위에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 MS4A4A 상의 제2 부위에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다중특이성 항체는 MS4A4A에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 제2 폴리펩타이드에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함한다.
MS4A4A에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 제2 폴리펩타이드에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이성 항체가 본 명세서에 제공되되, 제1 항원 결합 영역은 본 명세서에 기재된 항체의 6개의 HVR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 항원 결합 영역은 본 명세서에 기재된 항체의 VH 또는 VL을 포함한다.
임의의 다중특이성 항체의 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 a) 혈액-뇌-장벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하는 항원; (b) 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 저밀도 지방단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 형질도입 도메인, TAT, Syn-B, 페너트라틴, 폴리-알기닌 펩타이드, 안지오펩 펩타이드 및 ANG1005로부터 선택된 혈액-뇌-장벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하는 항원; (c) 아밀로이드 베타, 올리고머 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타 플라크, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 이의 단편, 타우, IAPP, 알파-시뉴클레인, TDP-43, FUS 단백질, C9orf72(염색체 9 오픈 리딩 프레임 72), c9RAN 단백질, 프리온 단백질, PrPSc, 헌팅턴, 칼시토닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 아탁신, 아탁신 1, 아탁신 2, 아탁신 3, 아탁신 7, 아탁신 8, 아탁신 10, 루이소체, 심방나트륨이뇨인자, 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드, 인슐린, 아포지방단백질 AI, 혈청 아밀로이드 A, 메딘, 프로락틴, 트랜스타이레틴, 라이소자임, 베타 2 마이크로글로불린, 겔솔린, 케라토에피텔린, 시스타틴, 면역글로불린 경쇄 AL, S-IBM 단백질, 반복부-관련 비-ATG(RAN) 번역 산물, 다이펩타이드 반복부(DPR) 펩타이드, 글리신-알라닌(GA) 반복부 펩타이드, 글리신-프롤린(GP) 반복부 펩타이드, 글리신-알기닌(GR) 반복부 펩타이드, 프롤린-알라닌(PA) 반복부 펩타이드, 유비퀴틴 및 프롤린-알기닌(PR) 반복부 펩타이드로부터 선택되는, 질환-원인 제제; (d) 면역 세포 상에서 발현된 리간드 및/또는 단백질로서, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA-4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 및 포스파티딜세린으로부터 선택된, 리간드 및/또는 단백질; 및/또는 (e) 하나 이상의 종양 세포 상에서 발현된 단백질, 지질, 다당류 또는 당지질, 및 이들의 임의의 조합이다.
혈액-뇌 장벽에 걸쳐 수송을 용이하게 하는 수많은 항원이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Gabathuler R. Neurobiol. Dis. 37:48-57 (2010)] 참조). 이러한 제2 항원은 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체(예를 들어, CRM197(디프테리아 독소의 비독성 돌연변이체)), llama 단일 도메인 항체, 예컨대, TMEM 30(A) (Flippase), 단백질 형질도입 도메인, 예컨대 TAT, Syn-B, 또는 페네트라틴, 폴리-알기닌 또는 일반적으로 양으로 하전된 펩타이드, Angiopep 펩타이드, 예컨대, ANG1005(예를 들언, 문헌[Gabathuler, 2010]), 및 혈액-뇌 장벽 내피세포 상에 풍부한 기타 세포 표면(예를 들어, 문헌[Daneman et al. PLoS One 5(10):e13741 (2010)] 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다가 항체는 MS4A4A 항원뿐만 아니라, 제한 없이, 추가적인 항원 Aβ 펩타이드, 항원 또는 α-시뉴클레인 단백질 항원 또는, 타우 단백질 항원 또는, TDP-43 단백질 항원 또는, 프리온 단백질 항원 또는, 헌팅턴 단백질 항원, 또는 RAN, 번역 산물 항원(글리신-알라닌(GA), 글리신-프롤린(GP), 글리신-알기닌(GR), 프롤린-알라닌(PA) 또는 프롤린-알기닌(PR), 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체, 트랜스페린 수용체 또는 혈액 뇌 장벽에 걸쳐 항체 전달을 용이하게 하는 임의의 다른 항원으로 구성된 다이펩타이드 반복부(DPR 펩타이드)를 포함)을 인식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 트랜스페린이다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 Tau이다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 Aβ이다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 TREM2이다. 일부 실시형태에서, 제2 폴리펩타이드는 α-시뉴클레인이다.
다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄(및 바람직하게는 2개의 폴리펩타이드 쇄)를 포함하되, 폴리펩타이드 쇄 또는 쇄는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 쇄 또는 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있되, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 영역의 하나의 폴리펩타이드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내며, n은 0 또는 1이다. 유사하게, 폴리펩타이드 쇄 또는 쇄는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서의 다가 항체는 바람직하게는 추가로 적어도 2개의(바람직하게는 4개의) 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 상정된 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 선택적으로, 추가로 CL 도메인을 포함한다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍의 재조합 공동-발현(문헌[Milstein and Cuello Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker et al. EMBO J. 10:3655 (1991)]), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작(예를 들어, 미국 특허 제5731168 참조)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 WO 2013/026833(CrossMab) 참조. 다중-특이성 항체는 또한 항체 Fc-이형이량체 분자의 제조를 위한 정전기적 스티어링 효과를 조작하고(WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체를 가교하고(예를 들어, 미국 특허 제4676980호 참조); 류신을 이용하고; 이중특이성 항체 단편의 제조를 위해 "다이어바디" 기술을 이용하고(예를 들어, 문헌[Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)] 참조); 단일쇄 Fv(scFv) 이량체를 이용하고(예를 들어, 문헌[Gruber et al. J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조); 예를 들어, 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이성 항체를 제조함으로써 생성될 수 있다.
"팔중(Octopus) 항체"를 포함하는 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2006/0025576호 참조). 본 명세서의 항체는 또한 다중 MS4A4A에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용성 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2008/0069820호).
(7) 항체 변이체
　본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체의 아미노산 서열 변이체가 상정된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다.
(i) 치환, 삽입 및 결실 변이체
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체가 제공된다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기 내로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다.
[표 A]
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항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체배좌로서, 치환 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지함에 있어서 그들의 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 유래 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 기반하여 그룹들로 나뉘어진다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는, 예를 들어, 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체의 영역 내로, 또는 분자의 비상동성 영역 내로 도입될 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 또는 항체에 대한 변화를 만드는데 있어서, 특정 실시형태에 따르면, 아미노산의 수치 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특징에 기반하여 수치 지수가 부여되었다. 이들은 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 알기닌(-4.5)이다.
단백질 상에서 상호적 생물학적 기능을 부여함에 있어서 수치 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 이해되고 있다. 문헌[Kyte et al. J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982)]. 특정 아미노산은 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산을 치환할 수 있고, 유사한 생물학적 활성을 여전히 보유한다는 것이 알려져 있다. 수치 지수에 기반하여 변화를 생성함에 있어서, 특정 실시형태에서, 수치 치수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 실시형태에서, ±1 이내인 것이 포함되고, 특정 실시형태에서, ±0.5 이내인 것이 포함된다.
또한 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기반하여 효과적으로 이루어질 수 있으며, 특히, 생물학적으로 기능성인 단백질 또는 펩타이드가 이에 의해 생성되는 경우는 본 경우에서와 같이 면역학적 실시형태에서 사용에 대해 의도된다는 것이 당업계에서 이해된다. 특정 실시형태에서, 인접한 아미노산의 친수성에 의해 좌우되는 바와 같은 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수성은 이의 면역원성 및 항원성과, 즉, 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다.
다음의 친수성 값이 이들 아미노산 잔기: 알기닌(+3.0); 라이신(+3.0±1); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4)에 부여되었다. 유사한 친수성 값에 기반하여 변화를 만드는 데 있어서, 특정 실시형태에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함되며, 특정 실시형태에서, ±1 이내인 것이 포함되고, 특정 실시형태에서, ±0.5 이내인 것이 포함된다. 또한 친수성에 기반하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이들 영역은 또한 "에피토프 코어 영역"으로서 지칭된다.
특정 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)은 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은, 예를 들어, HVR에서 항원 접촉 잔기 밖에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시형태에서, 각 HVR 중 하나는 변경되지 않거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기로부터 1백개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드의 범위로 아미노- 및/또는 카복시- 말단의 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단의 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소에 대한(예를 들어, ADEPT에 대한) 또는 폴리펩타이드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
분자의 산화적 안정성을 개선시키기 위해 그리고 비정상 가교를 방지하기 위해 항체의 적절한 입체배좌를 유지하는 데 수반되지 않는 임의의 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 대조적으로, 시스테인 결합(들)은 그의 안정성을 개선시키기 위해 항체에 첨가될 수 있다(특히, 여기서 항체는 항체 단편, 예컨대 Fv 단편임).
(ii) 글리코실화 변이체
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체가 글리코실화된 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 항체가 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 수행될 수 있다.
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소 부착에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 트라이펩타이드 서열 중 하나의 존재는 잠재적 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있지만, 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 부착을 지칭한다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 그것이 (N-연결 글리코실화 부위에 대해) 상기 기재한 트라이펩타이드 서열을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 변경은 또한 (O-연결 글리코실화 부위에 대해) 본래의 항체의 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 카바트 넘버링에 따라 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 2안테나 올리고당을 포함한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 2안테나 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2003/0157108호 및 제2004/0093621호 참조. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예는 하기를 포함한다: 미국 특허 공개 제2003/0157108호; 미국 특허 공개 제2003/0115614호; 미국 특허 공개 제2002/0164328호; 미국 특허 공개 제2004/0093621호; 미국 특허 공개 제2004/0132140호; 미국 특허 공개 제2004/0110704호; 미국 특허 공개 제2004/0110282호; 미국 특허 공개 제2004/0109865호; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)] 참조. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Led 3 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 공개 제2003/0157108호), 및 넉아웃 세포주, 예컨대, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)] 및 문헌[Kanda et al. Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)] 참조)를 포함한다.
(iii) 변형된 불변 영역
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체 Fc는 항체 Fc 아이소타입 및/또는 변형이다. 일부 실시형태에서, 항체 Fc 아이소타입 및/또는 변형은 Fc 감마 수용체에 결합할 수 있다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 변형된 항체 Fc는 IgG1 변형 Fc이다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 (예를 들어, 동일한 아이소타입의 야생형 Fc 영역에 대해) 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 N297A(Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A (Shields et al. (2001) R. J. Biol. Chem. 276, 6591-6604), L234A, L235A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984; Alegre et al., (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al., (2000) Cell Immunol, 200:16-26), G237A (Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537-1543. 31; Xu et al. (2000) Cell Immunol, 200:16-26), C226S, C229S, E233P, L234V, L234F, L235E(McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P331S(Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20167-20172), S267E, L328F, A330L, M252Y, S254T 및/또는 T256E로부터 선택되며, 여기서, 아미노산 위치는 EU 넘버링 체계에 따른다.
IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 N297A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 D265A 및 N297A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 N297A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 K322A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 N297A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 P331S 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 D270A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 L234A 및 G237A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 P238D, L328E, E233, G237D, H268D, P271G 및 A330R 돌연변이 중 하나 이상(모두를 포함)을 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 S267E/L328F 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 N325S 및 L328F 돌연변이(N325S/L328F)를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 P238D, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 P238D, L328E, G237D, H268D, P271G 및 A330R 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 P238D, S267E, L328E, E233D, G237D, H268D, P271G 및 A330R 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 P238D, S267E, L328E, G237D, H268D, P271G 및 A330R 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 C226S, C229S, E233P, L234V 및 L235A 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 L234F, L235E 및 P331S 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 S267E 및 L328F 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 S267E 돌연변이를 포함한다. IgG1 변형 Fc의 임의의 일부 실시형태에서, Fc는 불변 중쇄 1(CH1)의 대체물 및 CH1을 갖는 IgG1의 힌지 영역 및 카파 경쇄를 갖는 IgG2의 힌지 영역(EU 넘버링에 따른 IgG2의 아미노산 118 내지 230)을 포함한다.
IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 둘 이상의 아미노산 치환을 포함하지 않는 Fc 영역을 갖는 대응하는 항체와 비교할 때 보체를 활성화시키는 일 없이 항체 클러스터링을 증가시키는 둘 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 따라서, IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 Fc 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 항체는 위치 E430G에서 아미노산 치환 및 하기로부터 선택되는 잔기 위치에서 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다: EU 넘버링에 따른 L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, 및 이들의 임의의 조합. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, L234A, L235A 및 P331S에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 L234A, L235A 및 P331S에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 P331S에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 K322A에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, A330S 및 P331S에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, K322A, A330S 및 P331S에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, K322A 및 A330S에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, K322A 및 P331S에서 아미노산 치환을 포함한다.
IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 추가로, 보체 활성화를 제거하기 위해 EU 넘버링 체계에 따른, A330L 돌연변이(Lazar et al. Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010 (2006)), 또는 L234F, L235E, 및/또는 P331S 돌연변이 중 하나 이상(Sazinsky et al. Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167-20172(2008))과 조합될 수 있다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 추가로 EU 넘버링에 따른 A330L, A330S, L234F, L235E 및/또는 P331S 중 하나 이상을 포함할 수 있다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 추가로 인간 혈청에서 항체 반감기를 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, EU 넘버링 체계에 따른 M252Y, S254T 및 T256E 돌연변이 중 하나 이상(모두를 포함))를 포함할 수 있다. IgG1 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG1 변형 Fc는 추가로 EU 넘버링에 따른 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y 및/또는 S440W 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양상은 변형된 불변 영역(즉, Fc 영역)을 갖는 항체에 관한 것이다. 표적화된 수용체를 활성화시키기 위해 FcgR 수용체에 대한 결합에 의존하는 항체는 FcgR 결합을 제거하기 위해 조작되는 경우에 이의 작용제 활성을 상실할 수 있다(예를 들어, 문헌[Wilson et al. Cancer Cell 19:101-113 (2011); Armour at al. Immunology 40:585-593 (2003); 및 White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015)] 참조). 이렇게 해서, 항체가 인간 IgG2 아이소타입(CH1 및 힌지 영역)으로부터의 Fc 도메인 또는 저해 FcgRIIB r 수용체에 우선적으로 결합할 수 있는 Fc 도메인의 다른 유형, 또는 이의 변이체를 가질 때, 정확한 에피토프 특이성을 갖는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 최소 유해 효과로 표적 항원을 활성화시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 변형된 항체 Fc는 IgG2 변형 Fc이다. 일부 실시형태에서, IgG2 변형 Fc는 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IgG2 변형 Fc는 (예를 들어, 동일한 아이소타입의 야생형 Fc 영역에 대해) 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 EU 넘버링 체계에 따른 V234A(Alegre et al. Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al. Cell Immunol, 200:16-26 (2000)); G237A(Cole et al. Transplantation, 68:563-571 (1999)); H268Q, V309L, A330S, P331S(US 2007/0148167; Armour et al. Eur J Immunol 29: 2613-2624 (1999); Armour et al. The Haematology Journal 1(Suppl.1):27 (2000); Armour et al. The Haematology Journal 1(Suppl.1):27 (2000)), C219S 및/또는 C220S(White et al. Cancer Cell 27, 138-148 (2015)); S267E, L328F(Chu et al. Mol Immunol, 45:3926-3933 (2008)); 및 M252Y, S254T 및/또는 T256E로부터 선택된다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 V234A 및 G237A에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 C219S 또는 C220S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 A330S 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 S267E 및 L328F에 따른 아미노산 치환을 포함한다.
IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링 체계에 따른 C127S 아미노산 치환을 포함한다(White et al., (2015) Cancer Cell 27, 138-148; Lightle et al. Protein Sci. 19:753-762(2010); 및 WO 2008/079246). IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 항체는 EU 넘버링 체계에 따른 C214S 아미노산 치환을 포함하는 Kappa 경쇄 불변 도메인을 갖는 IgG2 아이소타입을 갖는다(White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015); Lightle et al. Protein Sci. 19:753-762(2010); 및 WO 2008/079246).
IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링 체계에 따른 C220S 아미노산 치환을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 항체는 EU 넘버링 체계에 따른 C214S 아미노산 치환을 포함하는 Kappa 경쇄 불변 도메인을 갖는 IgG2 아이소타입을 갖는다.
IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링 체계에 따른 C219S 아미노산 치환을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 항체는 EU 넘버링 체계에 따른 C214S 아미노산 치환을 포함하는 Kappa 경쇄 불변 도메인을 갖는 IgG2 아이소타입을 갖는다.
IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 IgG2 아이소타입 중쇄 불변 도메인 1(CH1) 및 힌지 영역을 포함한다(White et al. Cancer Cell 27:138-148 (2015)). IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 특정 실시형태에서, IgG2 아이소타입 CH1 및 힌지 영역은 EU 넘버링에 따른 118 내지 230의 아미노산 서열을 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 항체 Fc 영역은 S267E 아미노산 치환, L328F 아미노산 치환, 또는 둘 다, 및/또는 EU 넘버링 체계에 따른 N297A 또는 N297Q 아미노산 치환을 포함한다.
IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, E430S, E430F, E430T, E345K, E345Q, E345R, E345Y, S440Y 및 S440W에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 추가로 인간 혈청에서 항체 반감기를 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, EU 넘버링 체계에 따른 M252Y, S254T 및 T256E 돌연변이 중 하나 이상(모두를 포함))를 포함할 수 있다. IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 A330S 및 P331S를 추가로 포함할 수 있다.
IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 IgG2/4 혼성 Fc이다. 일부 실시형태에서, IgG2/4 혼성 Fc는 IgG2 aa 118 내지 260 및 IgG4 aa 261 내지 447을 포함한다. IgG2 변형 Fc의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 H268Q, V309L, A330S 및 P331S에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 A330L, L234F; L235E 또는 P331S로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환; 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 특정 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 C127S, L234A, L234F, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, A330S, P331S, E345R, E430G, S440Y으로부터 선택된 잔기 위치 및 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, L243A, L235A 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 K322A에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, A330S 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, K322A, A330S 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, K322A 및 A330S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, K322A 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 S267E 및 L328F에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 C127S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG1 및/또는 IgG2 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E345R, E430G 및 S440Y에 따른 아미노산 치환을 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 항체의 일부 실시형태에서, 변형된 항체 Fc는 IgG4 변형 Fc이다. 일부 실시형태에서, IgG4 변형 Fc는 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, IgG4 변형 Fc는 (예를 들어, 동일한 아이소타입의 야생형 Fc 영역에 대해) 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 EU 넘버링 체계에 따른 L235A, G237A, S229P, L236E(Reddy et al. J Immunol 164:1925-1933(2000)), S267E, E318A, L328F, M252Y, S254T 및/또는 T256E로부터 선택된다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링 체계에 따른 L235A, G237A 및 E318A를 추가로 포함할 수 있다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링 체계에 따른 S228P 및 L235E를 추가로 포함할 수 있다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG4 변형 Fc는 EU 넘버링 체계에 따른 S267E 및 L328F를 추가로 포함할 수 있다.
IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG4 변형 Fc는 항체 안정화를 향상시키기 위해 EU 넘버링 체계에 따른 S228P 돌연변이(Angal et al. Mol Immunol. 30:105-108 (1993)) 및/또는 (Peters et al. J Biol Chem. 287(29):24525-33 (2012))에 기재된 하나 이상의 돌연변이와 조합될 수 있다.
IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, IgG4 변형 Fc는 추가로 인간 혈청에서 항체 반감기를 향상시키는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, EU 넘버링 체계에 따른 M252Y, S254T 및 T256E 돌연변이 중 하나 이상(모두를 포함))를 포함할 수 있다.
IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 L235E 돌연변이를 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 S228P 돌연변이를 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 S267E 및 L328F 돌연변이를 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 특정 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 C127S, F234A, L235A, L235E, S267E, K322A, L328F, E345R, E430G, S440Y로부터 선택된 잔기 위치 및 이들의 임의의 조합에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G, L243A, L235A 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 P331S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 K322A에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E430에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc 영역은 EU 넘버링에 따른 위치 E430G 및 K322A에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 S267E 및 L328F에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 C127S에 따른 아미노산 치환을 포함한다. IgG4 변형 Fc 중 어느 것의 일부 실시형태에서, Fc는 EU 넘버링에 따른 위치 E345R, E430G 및 S440Y에 따른 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 336의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 328의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 320의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 C-말단의 라이신 없이 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 P331S 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 P331S 돌연변이를 갖고 C-말단의 라이신이 없는 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 N325S 및 L328F 돌연변이(N325S/L328F)를 갖는 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 N325S/L328F 돌연변이를 갖고 C-말단의 라이신이 없는 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 K322A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 K322A 돌연변이를 갖고 C-말단의 라이신이 없는 인간 IgG1 중쇄를 갖는다. 앞서 언급한 실시형태에서, 돌연변이는 EU 넘버링에 따라 표시된다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 아미노를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 339의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 340의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 343의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 아미노를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 331의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 332의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 335의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 아미노를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호 327의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
(8) 다른 항체 변형
임의의 항체의 일부 실시형태에서, 항체는 유도체이다. 용어 "유도체"는 아미노산(또는 핵산)의 삽입, 결실 또는 치환이 아닌 화학적 변형을 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 유도체는 중합체, 지질 또는 기타 유기 또는 무기 모이어티와의 화학적 결합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 공유 변형을 포함한다. 특정 실시형태에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 화학적으로 변형되지 않은 항원 결합 단백질보다 더 큰 순환 반감기를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 화학적으로 변형된 항원 결합 단백질은 목적하는 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 개선된 표적화 능력을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도체 항원 결합 단백질은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 수용성 중합체 부착을 포함하도록 공유적으로 변형된다. 예를 들어, 미국 특허 제4640835호, 제4496689호, 제4301144호, 제4670417호, 제4791192호 및 제4179337호 참조. 특정 실시형태에서, 유도체 항원 결합 단백질은 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체 중 하나), 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동중중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 중합체(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올뿐만 아니라 이러한 중합체의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 하나 이상의 중합체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 유도체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 서브유닛에 의해 공유적으로 변형된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 유도체의 하나 이상의 특정 위치에서, 예를 들어, 아미노 말단에서 결합된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 유도체의 하나 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 특정 실시형태에서, PEG는 항원 결합 단백질에 대한 치료 능력을 개선시키는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, PEG는 인간화된 항체에 대한 치료 능력을 개선시키는 데 사용된다. 특정 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서에 임의의 목적을 위해 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제6133426호에서 논의된다.
펩타이드 유사체는 주형 펩타이드와 유사한 특성을 갖는 비-펩타이드 약물로서 약제 산업에서 통상적으로 사용된다. 이들 유형의 비-펩타이드 화합물은 "펩타이드 모방체" 또는 "펩티도모방체"를 지칭한다. 임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29 (1986); 및 Evans et al. J. Med. Chem., 30:1229 (1987)]. 이러한 화합물은 종종 컴퓨터 분자 모델링의 도움에 의해 개발된다. 치료적으로 유용한 펩타이드와 구조적으로 유사한 펩타이드 모방체는 유사한 치료적 또는 예방적 효과를 생성하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모방체는 패러다임 폴리펩타이드(즉, 생물학적 특성 또는 약학적 활성을 갖는 폴리펩타이드), 예컨대, 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로부터 선택된 연결에 의해 선택적으로 대체되는 하나 이상의 펩타이드 결합을 갖는다. 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 동일한 유형의 D-아미노산으로의 체계적 치환(예를 들어, L-라이신 대신 D-라이신)은 더 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 특정 실시형태에서 사용될 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 제한된 펩타이드는 당업계에 공지된 방법(임의의 목적을 위해 본 명세서에 참조에 의해 원용된 문헌[Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)])에 의해; 예를 들어, 펩타이드를 고리화하는 분자내 이황화 브리지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.
약물 접합은 생물학적 활성 세포독성(항암) 페이로드 또는 약물의 특정 종양 마커(예를 들어, 이상적으로는 종양 세포에서 또는 종양 세포 상에서만 발견되는 폴리펩타이드)를 특이적으로 표적화하는 항체에 대한 결합을 수반한다. 항체는 신체에서 이들 단백질 하향을 추적하고, 그들 자체를 암세포의 표면에 부착한다. 항체와 표적 단백질(항원) 사이의 생화학적 반응은 신호 종양에서 세포를 촉발하는데, 이는 세포독소와 함께 항체를 흡수하거나 또는 내재화한다. ADC가 내재화된 후에, 세포독성 약물이 방출되고, 암을 사멸한다. 이런 표적화에 기인하여, 이상적으로 약물은 더 낮은 부작용을 가지며, 다른 화학치료제보다 더 넓은 치료적 창을 제공한다. 항체에 접합하기 위한 기법은 개시되어 있고, 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Jane de Lartigue OncLive July 5, 2012; ADC Review on antibody-drug conjugates; 및 Ducry et al. Bioconjugate Chemistry 21 (1):5-13 (2010)] 참조.
III. 핵산, 벡터 및 숙주 세포
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4816567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 이용하여 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 임의의 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항-MS4A4A 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일부 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다(예를 들어, 하기에 의해 형질도입되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프구 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 본 개시내용의 숙주 세포는 또한 단리된 세포, 시험관내 배양 세포 및 생체외 배양 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 제조 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 항-MS4A4A 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 개시내용의 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 후속적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수된다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 재조합 생성에 대해, 항-MS4A4A 항체를 암호화하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서 추가적인 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에게 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리되며, 서열분석된다.
본 명세서에 기재된 임의의 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체, 또는 세포 표면 발현된 단편 또는 이의 폴리펩타이드(항체를 포함)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적합한 벡터는, 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라 구성될 수 있거나, 또는 당업계에서 입수 가능한 매우 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용될 것으로 의도되는 숙주 세포에 따라 다를 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가복제되는 능력을 가지고, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나 벡터를 포함하는 클로닝을 선택함에 있어서 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 운반할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, Bluescript(예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 다수의 다른 클로닝 벡터는 상업적 공급업자, 예컨대 BioRad, Strategene 및 Invitrogen으로부터 입수 가능하다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 작용이 필요하지 않을 때 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해, (예를 들어, 미국 특허 제5648237호, 제5789199호 및 제5840523호. 발현 후에, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 추가로, 진핵 미생물, 예컨대 섬질 진균 또는 효모는 또한 부분적으로 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생성을 초래하는 글리코실화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모 균주를 포함하는 항체-암호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다(예를 들어, 문헌[Gerngross Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); 및 Li et al. Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]).
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주가 확인되었다. 식물 세포 배양물은 또한 숙주(예를 들어, 미국 특허 공개 제5959177호, 제6040498호, 제6420548호, 제7125978호 및 제6417429호, 유전자이식 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술)로서 이용될 수 있다.
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하는 데 적합한 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어, 문헌[Graham et al. J. Gen Virol. 36:59 (1977))]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포; 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에서 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어, 문헌[Mather et al. Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에서 기재되는 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(Urlaub et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함하는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다. 항체 생성에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)] 참조.
IV. 약제학적 조성물/제형
약제학적 조성물 및/또는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 제형이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 바람직하게는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이다. 본 명세서에 기재된 항체는 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 제형의 예는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 미소구체 및 에어로졸을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 목적하는 제형에 따라서 동물 또는 인간 투여를 위한 약제학적 조성물을 제형화하기 위해 통상적으로 사용되는 비히클인, 약제학적으로 허용 가능한, 비-독성 담체의 희석제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, pH, 삼투압 농도, 점성도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 멸균, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 조성물의 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 알기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예컨대, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 시트르산염, 인산염 또는 기타 유기산); 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체(예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염-형성 반대이온(예컨대, 나트륨); 보존제(예컨대, 염화 벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 솔브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 솔비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대, 플루로닉스, PEG, 솔비탄 에스터, 폴리솔베이트, 예컨대, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제(예컨대, 수크로스 또는 솔비톨); 등장성 향상제(예컨대, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 솔비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 보조제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다양한 유형의 투여에 적합한 제형의 추가적인 예는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press 22nd ed. (2013)]에서 찾을 수 있다. 약물 전달을 위한 방법의 간략한 검토를 위해, 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참조한다.
비경구 투여에 적합한 제형은 수성 및 비수성, 등장성 멸균 주사용액을 포함하는데, 이는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 현탁액을 함유할 수 있다.
제형은 뇌 또는 중추신경계에서 체류 및 안정화를 위해 최적화될 수 있다. 제제가 두개골 구획 내로 투여될 때, 제제는 구획 내에 보유되며, 확산되지 않거나 또는 다르게는 혈액 뇌 장벽을 가로지르지 않는 것이 바람직하다. 안정화 기법은 분자량의 증가를 달성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아마이드, 중성 단백질 담체 등과 같은 기에 대한 가교, 다량체화 또는 연결을 포함한다.
체류를 증가시키기 위한 다른 전략은 생분해성 또는 생부식성 이식물에서 항체, 예컨대 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 제제의 폐색을 포함한다. 치료적 활성제의 방출 속도는 중합체 기질을 통한 수송 속도, 및 이식물의 생분해에 의해 제어된다. 이식물은 입자, 시트, 패치, 플라크, 섬유, 마이크로캡슐 등일 수 있고, 삽입의 선택 부위에 적합한 임의의 크기 또는 형상을 가질 수 있다. 사용될 수 있는 생분해성 중합체 조성물은 분해될 때 단량체를 포함하는 생리적으로 허용 가능한 분해 생성물을 초래하는 유기 에스터 또는 에터일 수 있다. 무수물, 아마이드, 오쏘에스터 등은 단독으로 또는 다른 단량체와 조합하여 용도를 발견할 수 있다. 중합체는 축합 중합체일 것이다. 중합체는 가교되거나 또는 비가교될 수 있다. 하이드록시지방족 카복실산, 동종- 또는 공중합체 및 다당류의 중합체에 특히 관심이 있다. 관심 대상의 폴리에스터 중에 D-락트산, L-락트산, 라세미 락트산, 글리콜산, 폴리카프로락톤 및 조합물의 중합체가 포함된다. 관심 대상의 다당류 중에 알긴산칼슘, 작용화된 셀룰로스가 있으며, 특히 카복시메틸셀룰로스 에스터는 수용성이며, 분자량이 약 5kD 내지 500kD 등인 것을 특징으로 한다. 생분해성 하이드로겔이 또한 본 개시내용의 이식물에서 사용될 수 있다. 하이드로겔은 전형적으로 공중합체 물질이며, 액체를 흡수하는 능력을 특징으로 한다.
V. 치료적 용도
본 명세서에 개시된 바와 같은, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 질환 및 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 알츠하이머병, 후발성 알츠하이머병 및 인지기능장애의 예방, 위험 감소 또는 치료에서 효과적이다.
질환 표적으로서의 MS4A4A
게놈 와이드 연관 연구는 MS4A 패밀리의 다양한 구성원이 알츠하이머병과 관련된다는 것을 확인하였다. 이들은 MS4A2, MS4A3, MS4A4A, MS4A4E, MS4A6A 및 MS4A6E이다. 관련된 SNP는 MS4A6A의 3' UTR(rs610932) 및 MS4A4E와 MS4A6A 사이의 유전자간변화(intergenic) 영역(rs670139)에서 발견된다. 후기-발병 알츠하이머병의 증가된 위험과 관련된 MS4A 유전자 클러스터에 3개의 SNP가 있다. 이들은 MS4A4A에서 rs4938933, MS4A4E에서 rs670139 및 MS4A6A에서 rs610932를 포함한다(Hollingworth et al, 2011, Nat Genetics, 43:429-435; Naj et al, 2011, Nature Genetics, 43:436-441; Antunez et al, 2011, Genome Medicine, 3, article 33). 추가적으로, MS4A4A 좌위 SNP(rs2304933 및 rs2304935)는 보다 고수준의 MS4A4A 및 후기-발병 알츠하이머병(LOAD)을 포함하는 증가된 알츠하이머병 위험과 관련된다(Allen et al, 2012, Neurology, 79:221-228).
본 명세서에 제공된 방법은 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 신경퇴행성 장애를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 신경퇴행성 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 알츠하이머병을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 알츠하이머병의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 후발성 알츠하이머병을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 후발성 알츠하이머병의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 경증 인지기능장애를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 경증 인지기능장애의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 MS4A4A의 과발현 또는 증가된 활성과 관련된 질환, 장애 또는 병태를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 질환, 장애 또는 병태의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 CSF1R-결핍 질환 또는 장애를 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환 또는 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, CSF1R-결핍 질환 또는 장애는 축삭 회전타원체 및 색소침착된 아교세포(ALSP) 또는 회전 타원체를 갖는 유전성 미만성 백질뇌병증(HDLS)을 수반한 성인-발병 백질뇌병증이다.
본 개시내용의 다른 양상은 치료적 유효량의 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 경증 인지기능장애, 혈관성 치매, 혈관성 치매, 발작, 망막이영양증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 장기 억압, 죽상 경화증 혈관성 질환, 바람직하지 않은 정상 노화 증상, 치매, 혼합형 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 정상뇌압수두증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 타우병증, 뇌졸중, 급성 외상, 만성 외상, 루푸스, 급성 및 만성 대장염, 크론병, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 말라리아, 본태성 진전, 중추 신경계 루푸스, 베체트병, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 퇴행성 추간판 질환, 샤이-드래거 증후군, 진행성 핵상안근 마비, 대뇌 피질 기저핵 변성, 급성 파종 뇌척수염, 육아종성 장애, 사르코이드증, 노화 질환, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 망막색소변성증, 망막 퇴화, 호흡기 감염, 패혈증, 눈 감염, 전신 감염, 염증성 장애, 관절염, 다발성 경화증, 대사 장애, 비만, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 조직 또는 혈관성 손상, 손상, 염증성 세포 파편 또는 단백질 응집물, 비정상적 순환 골수성 세포, 건강하지 않은 노화, 나이 관련 인지기능장애, 나이 관련 뇌 위축증, 염증, 신경손실, 및 인지결함을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 나이 관련 속성, 예컨대, 노인의 전두 대뇌 피질의 인지결함을 포함하는 공지된 뇌 질환이 존재하지 않을 때의 인지결함 및, 하나 이상의 바람직하지 않은 정상 노화 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 발작, 망막이영양증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 장기 억압, 죽상 경화증 혈관성 질환, 바람직하지 않은 정상 노화 증상, 치매, 혼합형 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 정상뇌압수두증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 타우병증, 뇌졸중, 급성 외상, 만성 외상, 루푸스, 급성 및 만성 대장염, 크론병, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 말라리아, 본태성 진전, 중추 신경계 루푸스, 베체트병, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 퇴행성 추간판 질환, 샤이-드래거 증후군, 진행성 핵상안근 마비, 대뇌 피질 기저핵 변성, 급성 파종 뇌척수염, 육아종성 장애, 사르코이드증, 노화 질환, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 망막색소변성증, 망막 퇴화, 호흡기 감염, 패혈증, 눈 감염, 전신 감염, 염증성 장애, 관절염, 다발성 경화증, 대사 장애, 비만, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 조직 또는 혈관성 손상, 손상, 염증성 세포 파편 또는 단백질 응집물, 비정상적 순환 골수성 세포s, 건강하지 않은 노화, 나이 관련 인지기능장애, 나이 관련 뇌 위축증, 염증, 신경손실 및 인지결함을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 나이 관련 속성, 예컨대, 노인의 전두 대뇌 피질의 인지결함을 포함하는 공지된 뇌 질환이 존재하지 않을 때의 인지결함, 및 하나 이상의 바람직하지 않은 정상 노화 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료에서 사용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 전이의 예방 또는 감소에서 사용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 암을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료에서 사용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 양상은 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 후기-발병 알츠하이머병, 경증 인지기능장애, 혈관성 치매, 발작, 망막이영양증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 장기 억압, 죽상 경화증 혈관성 질환, 바람직하지 않은 정상 노화 증상, 치매, 혼합형 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 정상뇌압수두증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 타우병증, 뇌졸중, 급성 외상, 만성 외상, 루푸스, 급성 및 만성 대장염, 크론병, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 말라리아, 본태성 진전, 중추 신경계 루푸스, 베체트병, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 퇴행성 추간판 질환, 샤이-드래거 증후군, 진행성 핵상안근 마비, 대뇌 피질 기저핵 변성, 급성 파종 뇌척수염, 육아종성 장애, 사르코이드증, 노화 질환, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 망막색소변성증, 망막 퇴화, 호흡기 감염, 패혈증, 눈 감염, 전신 감염, 염증성 장애, 관절염, 다발성 경화증, 대사 장애, 비만, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 조직 또는 혈관성 손상, 손상, 염증성 세포 파편 또는 단백질 응집물, 비정상적 순환 골수성 세포, 건강하지 않은 노화, 나이 관련 인지기능장애, 나이 관련 뇌 위축증, 염증, 신경손실 및 인지결함을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 나이 관련 속성, 예컨대, 노인의 전두 대뇌 피질의 인지결함을 포함하는 알려진 뇌 질환이 존재하지 않을 때의 인지결함 및 하나 이상의 바람직하지 않은 정상 노화 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료에서 사용하기 위한 의약의 제조에서의 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 개체에게 치료적 유효량의 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 알츠하이머병, 후기-발병 알츠하이머병, 경증 인지기능장애, 혈관성 치매, 발작, 망막이영양증, 근위축성 측삭 경화증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 치매, 뇌졸중, 파킨슨병, 급성 파종 뇌척수염, 망막 퇴화, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 다발성 경화증, 패혈증, 박테리아 감염, 관절염, 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 알츠하이머병, 후기-발병 알츠하이머병, 경증 인지기능장애, 혈관성 치매, 발작s, 망막이영양증, 근위축성 측삭 경화증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 치매, 뇌졸중, 파킨슨병, 급성 파종 뇌척수염, 망막 퇴화, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 다발성 경화증, 패혈증, 박테리아 감염, 관절염 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료에서 사용하기 위한 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 양상은 전두측두엽 치매, 진행성 핵상 마비, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 발작, 망막이영양증, 근위축성 측삭 경화증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 치매, 뇌졸중, 파킨슨병, 급성 파종 뇌척수염, 망막 퇴화, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 다발성 경화증, 패혈증, 박테리아 감염, 관절염 및 골관절염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료를 위한 의약의 제조에서의 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체의 용도에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체 또는 개체는 포유류이다. 포유류는 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 랫트)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체 또는 개체는 인간이다.
본 명세서에 제공된 항체(및 임의의 추가적인 치료제)는 비경구, 폐내, 비강내, 병변내 투여, 뇌척수내, 두개내, 척주내, 활액내, 척추강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 볼루스로서 또는 장기간에 걸친 지속적 주입에 의한 근육내, 정맥내 투여, 동맥내, 관절내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내 투여이다. 일부 실시형태에서, 투여는 피하이다. 투약은 투여가 잠깐인가 또는 만성인가에 부분적으로 의존하여, 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 투약 스케줄이 본 명세서에 상정된다.
본 명세서에 제공된 항체는 양호한 의학적 실행과 일치되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려되는 인자는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유류, 개개 환자의 임상 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 종사자에게 공지되어 있는 다른 인자를 포함한다. 항체는 문제가 되는 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화될 필요는 없지만, 선택적으로 함께 제형화된다. 유효량의 이러한 다른 제제는 제형에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료 유형 및 상기 논의한 다른 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기재된 것과 동일한 투약량 및 투여 경로에서, 또는 본 명세서에 기재된 투약량의 약 1 내지 99%로, 또는 적절한 것으로 경험적/임상적으로 결정되는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 개시내용의 항체의 적절한 투약량은 (단독으로 또는 1종 이상의 다른 추가적인 치료제와 병용하여 사용될 때) 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당 의사의 재량에 따라 다를 것이다. 항체는 1회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.
질환의 유형 및 중증도에 따라서, 항체의 약 1㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏은, 예를 들어, 1회 이상의 별개의 투여에 의하든, 또는 지속적 주입에 의하든, 환자에 대한 투여를 위한 개시 후보 투약량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투약량은 상기 언급한 인자에 따라서 약 1㎍/㎏ 내지 100㎎/㎏ 이상의 범위일 것이다. 병태에 따라 며칠 또는 더 장기간에 걸쳐 반복된 투여를 위해, 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 항체의 한 가지 예시적인 투약량은 (예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어, 약 6용량의 항체를 받도록) 환자에게 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있는 약 0.05㎎/㎏ 내지 약 150㎎/㎏의 범위일 것이다. 특정 실시형태에서, 투약 빈도는 1일당 3회, 1일당 2회, 1일당 1회, 격일에 1회, 1주 1회, 2주에 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회 또는 1개월에 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회 또는 더 길다. 초기에 보다 높은 부하 용량 다음에 1회 이상의 보다 저용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
VI. 진단 용도
임의의 항체의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 임의의 항-MS4A4A 항체는 샘플 또는 개체에서 MS4A4A의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. 진단 목적을 위해 본 개시내용의 항체를 이용하는 방법, 예컨대, 개체에서의 또는 개체로부터 유래된 조직 샘플에서의 MS4A4A의 검출이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 개체는 인간이다.
검출 방법은 항원-결합 항체의 정량화를 수반할 수 있다. 생물학적 샘플에서 항체 검출은 면역형광 현미경, 면역세포화학, 면역조직화학, ELISA, FACS 분석, 면역침전, 또는 마이크로-양전자 방출 단층촬영술을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 일어날 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는, 예를 들어 18F로 방사성표지되고, 후속적으로 마이크로-양전자 방출 단층촬영술 분석을 이용하여 검출된다. 항체-결합은 또한 비-침습적 기법, 예컨대 양전자 방출 단층촬영술(PET), X-선 컴퓨터 단층촬영술, 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영술(SPECT), 컴퓨터 단층촬영술(CT), 및 컴퓨터 축 단층촬영술(CAT)에 의해 환자에서 정량화될 수 있다.
VII. 제조 물품
본 명세서에 기재된 항-MS4A4A 항체를 포함하는 제조 물품(예를 들어, 키트)이 본 명세서에 제공된다. 제조 물품은 본 명세서에 기재된 항체를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 용기는 바이알, 보틀, 병, 가요성 패키징(예를 들어, 밀봉된 Mylar 또는 비닐백) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 적합한 패키징일 수 있다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회 용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 제2 제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 제제는 이하로 제한되는 것은 아니지만, 주사용 정균수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는, 약제학적으로 허용 가능한 완충제 또는 희석제이다. 일부 실시형태에서, 제2 제제는 약제학적 활성제이다.
임의의 제조물품의 일부 실시형태에서, 제조물품은 본 개시내용의 방법에 따른 사용을 위한 설명서를 추가로 포함한다. 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투약량, 투약 스케줄 및 투여 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 설명서는 개체에게 치료적 유효량의 선행하는 실시형태 중 어느 것의 항-MS4A4A 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 후발성 알츠하이머병, 인지저하 또는 인지장애, 경증 인지기능장애, 혈관성 치매, 혈관성 치매, 발작, 망막이영양증, 외상성 뇌손상, 척수손상, 장기 억압, 죽상 경화증 혈관성 질환, 바람직하지 않은 정상 노화 증상, 치매, 혼합형 치매, 크로이츠펠트-야콥병, 정상뇌압수두증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴병, 타우병증, 뇌졸중, 급성 외상, 만성 외상, 루푸스, 급성 및 만성 대장염, 크론병, 염증성 장질환, 궤양성 대장염, 말라리아, 본태성 진전, 중추 신경계 루푸스, 베체트병, 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 퇴행성 추간판 질환, 샤이-드래거 증후군, 진행성 핵상안근 마비, 대뇌 피질 기저핵 변성, 급성 파종 뇌척수염, 육아종성 장애, 사르코이드증, 노화 질환, 나이 관련 황반변성, 녹내장, 망막색소변성증, 망막 퇴화, 호흡기 감염, 패혈증, 눈 감염, 전신 감염, 염증성 장애, 관절염, 다발성 경화증, 대사 장애, 비만, 인슐린 내성, 2형 당뇨병, 조직 또는 혈관성 손상, 손상, 염증성 세포 파편 또는 단백질 응집물, 비정상적 순환 골수성 세포, 건강하지 않은 노화, 나이 관련 인지기능장애, 나이 관련 뇌 위축증, 염증, 신경손실, 및 인지결함을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 나이 관련 속성, 예컨대, 노인의 전두 대뇌 피질의 인지결함을 포함하는 공지된 뇌 질환이 존재하지 않을 때의 인지결함 및, 하나 이상의 바람직하지 않은 정상 노화 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료를 위한 본 개시내용의 단리된 항체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 항-MS4A4A 항체) 투여의 설명을 포함한다.
일부 실시형태에서, 설명서는 항-MS4A4A 항체 및 제2 제제(예를 들어, 제2 약제학적 활성제)의 사용을 위한 설명서를 포함한다.
본 개시내용은 다음의 실시예를 참고로 하여 더 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 그들은 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용 전체적으로 모든 인용은 본 명세서에 명확하게 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: 뮤린 항-MS4A4A 마우스 항체의 인간화
본 실시예의 목적은 국제 특허 출원 일련 번호 PCT/US2019/016156에 개시된 특정 모 마우스 항-MS4A4A 항체의 인간화된 변이체를 생성하는 것이다.
모 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-202는 아미노산 서열: QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGATHPGHGDTRYTQKFKGKATLSADKSSSTAYMQLSNLASEDSAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDVWGRGTLVTVSS(서열번호 164)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPPTFGGGTKLEIK(서열번호 165)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
모 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-18은 아미노산 서열: QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPTNGGTNYNERFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAYYYGSSLFAYWGQGTLVTVSS(서열번호 166)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열: DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWSQQKPGQSPKLLIYSASYRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSTYPWTFGGGTKLEIK(서열번호 167)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
모 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-21은 아미노산 서열: QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTSYGLSWVKQTPGKGLKWMGWINTYSGVPTYANDFKGRFAFSLETSASTTYLRINNLKNDDTATYFCARSLVDYWGQGTPLTVSS(서열번호 168)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열: DVVMTQTPFTLSVTIGQSASISCKSSQSLLYSDGKTYLSWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGIDFHQTFGGGTKLEIK(서열번호 169)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
모 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-25는 아미노산 서열: QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSDMGVGWVRQPSGEGLEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRANYGNLFDYWGQGTAVTVSS(서열번호 170)을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열: DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYLTFGSGTKLEIK(서열번호 171)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
비-인간 항체를 인간화하는 한 가지 방법은 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 CDR을 인간 항체 억셉터 프레임워크에 이식하는 것이다. 이러한 CDR 이식은 프레임워크에서의 동요로 인해 인간화된 항체가 이의 표적에 대해 친화도가 약화되거나 완전히 상실되는 것을 초래할 수 있다. 그 결과, 인간 프레임워크에서 특정 아미노산 잔기는 약화 또는 상실된 친화도를 회복하기 위해 뮤린 항체 프레임워크의 대응하는 위치로부터 아미노산 잔기에 의해 대체될 필요가 있을 수 있다(역 돌연변이). 따라서, 선택된 인간 항체 생식계열 억셉터 프레임워크와 관련하여 대체될 아미노산 잔기는, 인간화된 항체가 기능 및 파라토프를 실질적으로 보유하도록 결정되어야 한다. 또한, 보유 또는 개선된 열적 안정성 및 용해도는 양호한 제조능력 및 후속 개발을 위해 요망된다.
따라서, 구조-기반 항체 모델링은 MOE(Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, 캐나다 몬드리올에 소재)의 BioMOE 모듈을 이용하는 인간화 마우스 항-MS4A4A 단클론성 항체 4A-202, 4A-18, 4A-21 및 4A-25의 공정에 적용한다. 간략하게, 인간화될 마우스 단클론성 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열을 IMGT(http://www.imgt.org/)로부터 취한 인간 VL, VH, LJ, HJ 기능성 생식계열 아미노산 서열과 비교하였다. 유사-유전자 및 ORF는 분석으로부터 제외하였다. 하나의 마우스 단클론성 항체(질의)마다, 5개의 가장 유사한 VL 및 5개의 가장 유사한 VH 생식계열 아미노산 서열을 선택하고, 가장 유사한 VJ 및 HJ 유전자와 조합하여, 25개의 인간화된 아미노산 서열을 생성하였다. 인간 프레임워크 상에 이식될 CDR을 AbM 정의에 따라 정하였다(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef).
MOE(Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, 캐나다 몬드리올에 소재)의 BioMOE 모듈 또는 Antibody Modeler 모듈을 이용하여 Fv 상동성 모델을 생성하기 위해 질의 및 25개의 인간화된 아미노산 서열을 사용하였다. 전체 항체 상동성 모델링 과정을 통한 에너지 최소화를 위해 AMBER10:EHT 역장 분석을 사용하였다. 얻은 Fv 상동성 모델에 기반하여, 분자 기술어, 예컨대, VL과 VH 사이의 상호작용 에너지, 좌표-기반 등전점(3D pI), 소수성 패치, 및 하전된 표면적을 계산하고, 분석하고, MOE에 의해 제공되는 분류 매트릭스에 의해 정렬하였다. 단백질 발현, 정제, 결합 친화도 연구 및 기능성 분석을 포함하는 후속 실험 절차를 위한 인간화된 단클론성 항체를 우선적으로 처리하기 위해 이들 분자 기술어를 이용하였다.
MOE의 BioMOE 모듈은 역돌연변이를 위한 잠재적 잔기를 시각화 및 분류하기 위한 도구인 Mutation Site Properties을 제공한다. 이와 관련하여, 역돌연변이는 인간화된 아미노산 서열을 대체하는 본래의 질의 아미노산 서열로 복귀되는 아미노산 치환으로서 정의된다. 이 도구를 이용하여, 본래의 질의(기준)를 1차 아미노산 서열과 3D Fv 상동성 모델의 3D 구조 둘 다에 대해 선택된 인간화된 변이체와 개별적으로 비교하였다.
기준(즉, 모) 항체와 인간화된 변이체 사이의 변화를 아미노산 유형 차이, CDR 잔기를 갖는 상호작용 잠재력, VL/VH 짝짓기에 잠재적인 영향 및 CDR에서 및 근처에서 소수성 및 하전된 표면적의 잠재적 변화에 기반하여 분류하였다.
유의미한 전하 차이를 갖거나 또는 강한 H-결합 상호작용을 포함하는 CDR 또는 VL/VH 계면 근처의 돌연변이를 개별적으로 평가하고, 유의미하게 붕괴성인 돌연변이를 본래의 질의 잔귀로 복귀시켰다. 그 결과, 인간화된 아미노산 서열은 최대 5개의 역 돌연변이를 포함할 수 있다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄 질의 마우스 단클론성 항체(마우스 항-MS4A4A 항체 4A-202, 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-18, 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-21, 및 마우스 항-MS4A4A 항체 4A-25) 및 역돌연변이가 있거나 또는 역돌연변이가 없는 인간화된 단클론성 항체에 대한 아미노산 서열을 이하의 표 1 내지 표 4에 제공한다. 표 1 내지 표 4에서, CDR 서열(Kabat)을 밑줄 표시한다.
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본 개시내용의 항-MS4A4A 항체에 대해 Kabat에 따른 CDR 서열을 이하의 표 5 내지 표 8에 제공한다.
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실시예 2: 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드의 제조
인간 MS4A4A의 1차 아미노산 서열(서열번호 1)을 분석하여 이의 2차 및 3차 구조에 관한 정보를 제공하였다. 인간 MS4A4A 단백질은 4개의 막관통 도메인(TMD)을 갖고, 각각의 TMD는 21개의 아미노산으로 구성된다. 아미노산 조성, 잔기 수 및 지질 이중층의 두께로부터 예측하면, MS4A4A는 N-말단에서 C-말단까지 각각 TMD1과 TMD2, 및 TMD3 및 TMD4를 연결하는 2개의 여분의 세포 루프(ECL)와 함께 4개의 나선 다발(4HB)을 포함하는 것으로 예측된다(도 1 참조). 도 1은 인간 MS4A4A의 1차 아미노산 서열을 나타내고; 세포내 도메인은 이탤릭체이며, 막관통 도메인은 밑줄표시되고, 2개의 세포외 루프는 볼드 이탤릭체이다.
RCSB Protein Data Bank(http://www(dot)rcsb(dot)org/)를 이용하여 가용성인 4HB 스캐폴드 단백질의 2개의 주형 구조(MS4A4A의 기하학 및 입체배치를 모방하기 위해 예측됨)를 확인하였다. 이들 단백질 스캐폴드의 PDB_ID는 1P68 및 1M6T이다. 도 2A, 도 2B 및 도 2C는 2개의 가용성 4-나선형 다발 스캐폴드의 구조 및 1차 아미노산 서열을 나타낸다(PDB_ID:1P68 및 PDB_ID:1M6T). 도 2A에서, 막관통 도메인은 구조에서 나선으로서 제공되고; 도 2B 및 도 2C에서, 막관통 도메인은 1P68 및 1M6T의 대응하는 아미노산 서열에서 밑줄표시된다.
인간 MS4A4A의 2개의 ECL의 아미노산 서열을 1P68에 재조합적으로 위치시켜, 폴리펩타이드 JS1 및 폴리펩타이드 JS4(폴리펩타이드 JS1에 대한 음성 대조군)를 초래하고, 1M6T 내로 위치시켜, 폴리펩타이드 JS5, 폴리펩타이드 JS6; 및 폴리펩타이드 JS10(폴리펩타이드 JS5 및 폴리펩타이드 JS6에 대한 음성 대조군으로서 작용함)을 초래한다. (도 3 참조) 도 3A는 폴리펩타이드 JS1, 폴리펩타이드 JS5, 및 폴리펩타이드 JS6의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 3B는 음성 대조군 폴리펩타이드 JS4 및 음성 대조군 폴리펩타이드 JS10의 아미노산 서열을 나타낸다. 이들 단백질/폴리펩타이드 스캐폴드를 암호화하는 핵산을 각각 3' his-태그 및 Avi-태그를 갖는 pcDNA3.4 발현 벡터에 삽입하였다.　얻어진 클론을 Expi293 세포에서 발현시키고, 제조업자의 프로토콜을 이용하여 Ni-NTA 아가로스(QIAGEN 카탈로그 번호 30230)에 의해 정제하였다. 항체 결합 특징에 대한 가용성 시약으로서 사용하기 위해 MS4A4A의 2개의 ECL의 구조 및 기능을 모방하는 가용성 단백질을 얻기 위하여 이들 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드(또한 루프 접합 항원으로서 지칭됨)를 생성하였다.
실시예 3: 펩타이드 결합에 의한 항-MS4A4A 항체의 에피토프 결정
항-MS4A4A 항체 4A-21의 에피토프 결합 특징을 다음과 같이 결정하였다. 인간 MS4A4A(서열번호 1)의 세포외 루프(ECL)로부터 유래된 중복 펩타이드의 패널을 JPT 펩타이드(독일 베를린에 소재)에 의해 합성하였다. 이들 펩타이드는 길이가 15개의 아미노산이고, 각각은 2개의 아미노산만큼 상쇄된다. 펩타이드를 N-말단 상에서 바이오틴일화하였다. 펩타이드 4A.1 내지 4A.4는 인간 MS4A4A ECL1 및 주변 영역으로부터 유래되었다. 펩타이드 4A.5 내지 4A.12는 인간 MS4A4A ECL2 및 주변 영역으로부터 유래되었다.
Continuous Flow Microspotter(CFM)를 이용하여 스트렙타비딘-코팅 칩(Xantec SAD50M, 독일 뒤셀도르프에 소재) 상에 펩타이드 라이브러리를 인쇄하였다. 먼저, 칩을 100mM MES, pH 5.5, 100㎕ EDC(최종 133mM), 100㎕의 S-NHS(최종 33.3mM)로 활성화시켰다. 펩타이드 라이브러리를 1㎎/㎖ BSA 및 1㎍/㎖ 마우스 IgG-바이오틴을 이용하여 HBS-EP+ 완충제(Teknova 카탈로그 번호 H8022)에 희석시킨 펩타이드당 250nM로 칩 상에 고정시켰다. 고정 후에, 칩 표면을 1M 에탄올아민을 이용하여 10분 동안 pH 8.5에서 탈활성화시켰다. 하이브리도마 상청액 및 정제된 항-MS4A4A 항체를 1㎎/㎖ BSA를 이용하여 HBS-EP+ 완충제에서 희석시키고, 칩 상에 주사하였다. 각 항-MS4A4A 항체에 대한 중복 측정으로 재현 가능성을 보장하였다. 각 펩타이드-항체 조합에 대해 결합 특징을 결정하여, 각 항체와 상호작용하는 선형 펩타이드 영역의 맵핑을 허용하였다.
항-MS4A4A 항체 4A-21 및 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 5C12는 이하의 표 9에 나타내는 바와 같이 인간 MS4A4A ECL2에서의 영역에 대응하는 펩타이드에 대해 강한 결합을 나타내었다. 항-MS4A4A 항체 4A-21은 인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 155 내지 177에 걸쳐 펩타이드 4A.5 내지 4A.9에 결합한다. 항-MS4A4A 항체 5C12는 인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 157 내지 177에 걸쳐 펩타이드 4A.6 내지 4A.9에 결합한다. 이들 두 항체의 결합 영역은 중복되지만, 동일하지는 않은데, 이는 이들이 인간 MS4A4A의 ECL2 내에서 상이한 잔기와 상호작용한다는 것을 나타낸다. 이들 두 항체 중 어느 것도 상기 기재한 방법을 이용하여 인간 MS4A4A ECL1에 대한 결합을 나타내지 않았다.
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실시예 4: 인간 MS4A4A 세포외 도메인에 대응하는 펩타이드에 대한 항-MS4A4A 항체 결합
효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하여 ECL1(서열번호 1의 인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 86 내지 98) 및 ECL2(서열번호 1의 인간 MS4A4A의 아미노산 잔기 159 내지 179)에 대응하는 인간 MS4A4A 펩타이드에 대한 결합에 대해 항-MS4A4A 하이브리도마 상청액(순수) 또는 정제된 mIgG(5㎍/㎖)를 시험하였다. 간략하게, 96-웰 폴리스타이렌 플레이트를 밤새 4℃에서 코팅 완충제(0.05M 탄산염 완충제, pH9.6, Millipore Sigma 카탈로그 번호 C3041)에서 2 또는 10㎍/㎖의 무합성 또는 BSA-접합 펩타이드로 코팅하였다. 이어서, 코팅 플레이트를 ELISA 희석제(PBS + 0.5% BSA + 0.05% Tween20)로 1시간 동안 차단시키고, PBST(PBS + 0.05% Tween20, Thermo 카탈로그 번호 28352)에서 3×300㎕로 세척하고, 이어서, 항체를 플레이트(50㎕/웰)에 첨가하였다. 30분의 인큐베이션(실온, 진탕) 후에, 플레이트를 PBST 중에서 3×300㎕로 세척하였다. 2차 항-마우스 HRP 항체(Jackson Immunoresearch 카탈로그 번호 115-035-003)를 ELISA 희석제(50㎕/웰)에 1:1000의 희석으로 첨가하고, 실온에서 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최종 세척 세트(PBST 중 3×300㎕) 후에, 50㎕의 TMB 기질(BioFx 카탈로그 번호 TMBW-1000-01)을 첨가하고, 이어서, 50㎕의 중단 용액(BioFx 카탈로그 번호 BSTP-1000-01)에 의해 5 내지 10분 후에 반응을 중단시켰다. 중단시킨 반응 웰을 GEN5 2.04 소프트웨어를 이용하는 BioTek Synergy 마이크로플레이트 판독기에 의해 650㎚에서 흡광도에 대해 검출하였다.
정제된 항-MS4A4A 뮤린 항체 및 3가지의 상업적으로 입수 가능한 뮤린 항-MS4A4A 항체(5C12, 3F2 및 4H2)를 시험하였다. 뮤린 항-MS4A4A 항체(4A-21, 4A-25, 4A-202 및 4A-214)는 부적절한 음성 펩타이드 대조군인 BSA 마우스 DAP12에 대해 관찰된 것과 비교할 때 huMS4A4A-ELC2 유리 펩타이드에 대한 강한 결합을 나타내었다. 3가지의 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체는 인간 MS4A4A ECL1 및 ECL2 펩타이드에 대해 결합을 나타내지 않았다.
실시예 5: 항-MS4A4A 항체의 에피토프 결정
MS4A4A의 1차 아미노산 서열은 이의 2차 및 3차 구조에 관한 중요한 정보를 제공한다. MS4A4A 단백질은 4개의 막관통 도메인(TMD)을 갖고, 각각의 TMD는 21개의 아미노산으로 구성된다. 전형적인 TMD는 두께가 대략 40Å인 포스포다이에스터 지질 이중층으로 구성된다. 인산염 헤드 모이어티는 세포외 또는 사이토졸 공간 중 하나에서 친수성 환경과 상호작용하는 친수성 층을 생성하고, 지질 꼬리는 TMD의 친유성 잔기와 상호작용하는 내부 지질 이중층을 생성한다. TMD 지질 이중층의 두께는 대략 32 내지 34Å이다. 아미노산 조성, 잔기 수 및 지질 이중층의 두께로부터 예측하면, MS4A4A는 N-말단에서 C-말단까지 각각 TMD1과 TMD2, 및 TMD3 및 TMD4를 연결하는 2개의 여분의 세포 루프(ECL)와 함께 4개의 나선 다발(4HB)을 포함하는 것으로 예측된다. 4-나선 다발은 나선-지질 이중층 상호작용 및 나선-나선 상호작용으로부터 얻은 유의미한 엔탈피 획득에 의해 막에서 MS4A4A를 안정화시킨다.
MS4A4A ECL의 1차 아미노산 서열 및 조성은 에피토프 및 역학 특성과 관련된 중요한 특징을 나타낸다. ECL1은 1개의 시스테인, 1개의 메티오닌, 1개의 알라닌, 3개의 세린, 1개의 트레오닌, 2개의 아스파라긴, 1개의 타이로신, 1개의 프롤린, 1개의 아이소류신, 및 단지 1개의 글리신 잔기(들)를 포함하는 13개의 아미노산으로 구성된다. ECL2는 8개의 아미노산으로 분리되는 2개의 시스테인 잔기, 3개의 세린, 1개의 트레오닌, 1개의 페닐알라닌, 3개의 히스티딘, 1개의 프롤린, 3개의 타이로신, 4개의 아스파라긴, 1개의 메티오닌, 및 단지 2개의 글리신 잔기를 포함하는, 21개의 아미노산으로 구성된다. 몇몇 거대 베타-분지형 아미노산 잔기 및 프롤린 잔기를 제외한 매우 소수의 글리신 잔기가 ECL1 및 ECL2에서 발견된다. 게다가, ECL2는 입체구조 엔트로피를 추가로 감소시키는 루프내 이황화 결합을 생성하는 것으로 예측되는 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 그 결과, ECL1 및 ECL2는 강성-바디 유형 내부 움직임에서 서로 상호작용하는 유의미하게 감소된 수의 입체구조 이성질체를 사용하는 경향이 있다.
C-말단의 GFP 태그를 포함하는 인간 MS4A4A(NM_024021)를 암호화하는 발현 플라스미드를 Origene(카탈로그 번호 RG223557)로부터 구입하고, 인간 MS4A4A의 세포외 루프 1(ECL1)의 암호화 영역에서(이하의 표 10에서 4A.Ala1-Ala13; ECL1에 대응하는 서열번호 1의 C67 내지 S79; CMASNTYGSNPIS; 인간 MS4A4A의 세포외 루프 2(ECL2)의 암호화 영역에서(이하의 표 10에서 4A.Ala14-Ala34; ECL2에 대응하는 서열번호 1의 S140 내지 S160; SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS; 및 ECL2 결실 돌연변이(이하의 표 11에서 4A.Ala35(ECL2 내에서 서열번호 1의 아미노산 잔기 150 내지 152의 결실) 및 4A.Ala36(ECL2 내에서 서열번호 1의 아미노산 잔기 148 내지 152의 결실)) 단일 알라닌 스캐닝 돌연변이를 생성하기 위해 주형으로서 사용하였다. 당업계에서의 중복 중합효소 연쇄 반응 기법 표준을 이용하여 돌연변이를 수행하였다. 각 중합효소 연쇄 반응 폴리핵산 단편을 정제하고, MluI 및 AsiSI 제한 부위를 이용하여 발현 벡터에 다시 서브클로닝시켰다.
알라닌-스캐닝 기법을 이용하는 에피토프 결정을 수행하기 전에, 항-MS4A4A 항체의 상대적 EC50을 HEK293T 세포에서 상기 기재한 발현 작제물의 일시적 형질감염을 이용하여 다음과 같이 결정하였다. HEK293T 세포를 6개의 웰 플레이트에 파종하고, 밤새 성장시켰다. 다음 날에, 제조업자의 프로토콜에 따라 Fugene 대 DNA의 4:1 비 또는 리포펙타민 대 DNA의 3:1 비로 Fugene HD(Promega) 또는 Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 세포를 형질감염시켰다. 형질감염의 대략 24시간 후에, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 채취하고, FACS 염색을 위해 진행하였다.
FACS 염색을 위해, 150,000개의 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 항-MS4A4A 항체의 적정을 FACS 완충제(PBS + 2% FBS)에 첨가하고, 60분 동안 얼음에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 원심분리시키고(1,400rpm, 3분), 상청액을 비우고 나서, 세포를 200㎕ FACS 완충제로 3회 세척한 후에, 각각 교반 및 디캔팅 단계가 이어졌다. 항체를 msIgG1 또는 huIgG1 키메라로서 시험하였고, 염소 항-인간 PE(Southern Biotech, 카탈로그 번호 2040-09, 1:200) 또는 염소 항-마우스 APC(BD Biosciences, 카탈로그 번호 550826, 1:100) 중 하나를 얼음 상에서 30분 동안 FACS 완충제 중에 첨가하였다. 세포를 후속적으로 200㎕ FACS 완충제로 2회 세척하고, iQue 세포계산기 상에서 영상화하였다. 중위 형광 강도(MFI)를 MS4A4A를 발현시키는 세포를 나타내는 GFP 양성 집단 상에서 측정하였다.
처음에 시험한 항-MS4A4A 항체 중 여섯은 야생형(WT) MS4A4A-GFP를 발현시키는 HEK293T 세포에 결합하고: 이들은 항-MS4A4A 항체 4A-18, 4A-21, 4A-202뿐만 아니라 공개된 뮤린 단클론성 항-MS4A4A 항체 4H2(Kerafast), 5C12(Biolegend), 3F2(Millipore)를 포함하였다. 후속적 에피토프 맵핑 연구에 대한 최적의 항-MS4A4A 항체 농도를 확립하기 위해 각 항체에 대한 적정 곡선을 결정하였다.
에피토프 맵핑 실험을 위해, HEK293T 세포를 상이한 인간 MS4A4A 발현 작제물(상기 기재한 바와 같음; 이하의 표 10 참조)로 형질감염시키고, 6개의 상이한 항-MS4A4A 항체: 4A-21, 4A-18, 4A-202, 4H2, 5C12 및 3F5를 이용하여 항체 결합을 결정하였다. 야생형 인간 MS4A4A 발현 작제물로 형질감염시킨 세포에 대한 결합으로부터의 MFI%로서 항-MS4A4A 항체 결합을 계산하였다. MS4A4A 폴리펩타이드에서 아미노산 돌연변이가 야생형 MS4A4A에 대한 결합의 20% 미만으로 감소된 항체 결합을 초래한다면, 돌연변이된 아미노산을 MS4A4A 단백질에 대한 항-MS4A4A 항체 결합에 필요한 중요한 아미노산으로 간주하였다. MS4A4A 단백질에서 일부 아미노산 돌연변이는 (야생형 MS4A4A에 대한 결합과 비교할 때) 항-MS4A4A 항체 결합의 감소를 51% 미만이지만 20% 초과로 야기하였고; 이러한 아미노산을 MS4A4A 단백질에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합에 기여하는 아미노산으로서 정하였다.
MS4A4A에서 일부 아미노산은 모든 시험 항체, 예컨대, MS4-유형 단백질에서 시스테인 브리지를 형성하는 것으로 생각되는 2개의 시스테인, 즉, C165 및 C174의 결합에 영향을 미쳤다. 이러한 아미노산을 구조적 아미노산으로 간주하였다.
이들 실험의 결과를 이하의 표 10에 제공한다. 상기 언급한 바와 같이, Ala.1 내지 Ala.13은 ECL1에서 MS4A4A 돌연변이를 지칭하고; Ala.14 내지 Ala.36은 ECL2에서 MS4A4A 돌연변이를 지칭한다. 데이터를 야생형 MS4A4A 단백질에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합과 비교할 때 다양한 알라닌-스캐닝 돌연변이에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합%로서 나타낸다. 맵핑 실험을 독립적으로 2회 반복하였고, 매우 유사한 결과를 가졌다. 항-MS4A4A 항체 4A-21 및 4A-18을 두 가지 농도에서 huIgG1로 1회, msIgG1로서 두 번째로 시험하였다는 한 가지 차이가 있다. 이하의 표 11은 이들 항체에 대한 msIgG1 시험으로부터의 결과를 나타낸다. 모든 다른 항체에 대해, 표 10은 실험 둘 다에 걸친 평균 항체 결합을 나타낸다. 야생형 MS4A4A에 대한 결합에 대해 측정함 것의 20% 미만으로 MS4A4A 단백질에 대한 항-MS4A4A 항체 결합을 나타내는 값은 이하의 표 10에서 볼드체이다.
모든 돌연변이는 대략 22 내지 33%의 동등한 형질감염 효율을 나타내었다(데이터 미제시). 세포에서 평균 항체 결합과 GFP 수준 사이에 상관관계가 없다는 것이 관찰되었고, 이는 GFP 수준이 MS4A4A 세포 표면 발현에 대한 예측자로서 사용될 수 없다는 것을 시사한다.
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Figure pct00034
상기 나타낸 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 MS4A4A 내에서 별개의 선형 및/또는 3D 구조적 에피토프를 인식한다는 것을 시사한다.
이들 실험으로부터 얻은 항-MS4A4A 항체 결합 데이터에 기반하여, 인간 MS4A4A 내의 다음의 루프 아미노산 잔기는, 이들 중 각각의 돌연변이가 시험한 항-MS4A4A 항체: M87, C165, Y167, Y168, C174(인간 MS4A4A 단백질에 기반; 서열번호 1)의 결합에 영향을 미치기 때문에 MS4A4A 단백질 내의 구조적 아미노산으로 간주하였다. 아미노산 잔기 C165 및 C174는 ECL2에서 루프를 형성하는 시스테인 브리지를 확립하는 것으로 예측된다. 이 시스테인 브리지의 부재 하에, 항-MS4A4A 항체는 MS4A4A 단백질에 결합하지 않았는데, MS4A4A의 ECL2 내의 루프 구조는 항체 결합에 중요하다는 것을 시사한다. 루프 구조가 중요하다는 더 많은 증거는 또한 항체의 결합에 강하게 영향을 미치는 2개의 루프 결실 돌연변이체(Ala.35 및 Ala.36)로부터 유래된다.
결과는 추가로 아미노산 잔기 Y167 및 Y168이 항-MS4A4A 항체 4A-21, 4A-18, 4H2, 5C12 및 3F2의 결합에 강하게 영향을 미쳤다는 것을 나타내었다. 이들 아미노산 잔기는 또한 항-MS4A4A 항체 4A-202의 결합에 더 적은 정도로 영향을 미쳤다. 추가적으로, ECL1에서 아미노산 잔기 P96, I97 및 S98은 시험한 모든 항-MS4A4A 항체에 어느 정도로 결합을 감소시켰다. 이들 결과는 이들 5개의 아미노산 잔기 중 어느 것에서의 돌연변이가 항체 인식 및 결합에 중요한 세포외 도메인의 구조를 변경시키거나, 또는 이들 아미노산 잔기가 열거한 6개의 항-MS4A4A 항체 각각의 상호작용 및 결합에 중요하다는 것을 시사하였다. 프롤린은 폴리펩타이드의 2차 및 3차 구조에 중요한 가장 억제된 아미노산 잔기이다. 예를 들어, 프롤린은 알파 나선 및 베타 시트를 포함하는 규칙적 2차 구조의 중간에서 파괴자(disrupter)로서 작용하지만; 그러나, 프롤린은 알파 나선의 제1 아미노산 잔기로서 그리고 베타 시트의 각 가닥에서 통상적으로 발견된다. 타이로신, 아이소류신 및 세린 잔기는, 예를 들어, 반데르 발스 상호작용(들), 파이-파이 적층 및 파이-직면(facial) 수소 결합 상호작용 및/또는 수소 결합을 포함하는 다양한 항원-항체 상호작용을 제공한다. 따라서, 타이로신, 프롤린, 아이소류신 또는 세린 잔기 중 하나는 잘 정의된 구조적 에피토프를 생성할 수 있다. 이들 4개의 아미노산 잔기에서의 임의의 미묘한 변화는 항체 결합 친화도를 유의미하게 붕괴시키는 가능성을 가진다.
MS4A4A의 아미노산 잔기 M87A에서의 돌연변이는 시험한 모든 항-MS4A4A 항체의 결합을 크게 감소시키거나 또는 없앴다. ECL1 및 ECL2가 잘 정의된 강성의 바디 구조를 사용하고 서로 상호작용할 수 있다는 예측에 기반하여, 나타낸 M87A 결합 결과는 M87의 측쇄가 골격-측쇄 및/또는 골격-골격 상호작용을 통해 반데르 발스 접촉 및 수소 결합에 의해 ECL1 및/또는 ECL2에서 하나 이상의 베타-분지 아미노산과 상호작용할 수 있기 때문에, M87 아미노산 잔기가 MS4A4A의 강성 루프 구조를 유지함에 있어서 가장 중요한 잔기 중 하나인 것으로 예측된다는 것을 나타내었다.
이하의 표 11은 본 명세서에 개시된 항-MS4A4A 항체에 대한 독특한 결합 아미노산 잔기를 열거한다. 항-MS4A4A 항체 4A-21은 인간 MS4A4A에 대한 결합에 대해 ECL2에서 N166을 필요로 한다. 데이터는 항-MS4A4A 항체 4A-18 및 5C12가 인간 MS4A4A의 ECL1뿐만 아니라 ECL2에 결합한다는 것을 나타내었다. 항-MS4A4A 항체 4A-202는 아미노산 잔기 Y164에 의한 일부 결합 기여를 가졌다.
모두 3개의 상업적 항-MS4A4A 항체는 P163에 결합하는 반면, 본 본 명세서에 개시되고 본 연구에서 시험한 항-MS4A4A 항체 중 어느 것도 결합하지 않았다. 사이노몰거스 MS4A4A 단백질에서 인간 MS4A4A의 이 프롤린 P163을 알기닌으로 대체한다. 이러한 관찰은 상업적 MS4A4A 항체의 결합 특징에 의해 나타내는 바와 같이, 이 프롤린의 알기닌으로의 변화가 cyno 교차 반응성, 또는 이의 결여를 결정하는 데 중요하다는 것을 시사한다. 프롤린은 가장 구조적으로 제한된 아미노산 잔기이며, 알기닌(cyno MS4A4A에서) 생리적 pH에서 양으로 하전된 아미노산이다. 인간 대 cyno MS4A4A에서 알기닌에 대한 프롤린 차이는 MS4A4A 단백질의 입체구조에 엄청나게 영향을 미칠 수 있고, 따라서, 상업적 MS4A4A 항체가 결합하는 것을 방지한다. 항-MS4A4A 항체 4A-18, 4A-21 및 4A-202는 결합에 대해 이 아미노산에 의존하지 않는 것으로 나타났고, 따라서, 사이노몰거스 단백질에 대한 결합은 영향받지 않았다.
요약하면, 항-MS4A4A 항체 4A-21, 4A-18 및 4A-202는 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체와는 별개인 MS4A4A 상의 에피토프에 결합하였다(이하의 표 11). 상업적 항-MS4A4A 항체 4H2 및 3F2는 동일한 에피토프를 나타내었고, 이는 항-MS4A4A 항체 5C12와 유의미하게 중복되었다. 대조적으로, 항-MS4A4A 항체 4A-18, 4A-21 및 4A-202는 각각 서로 별개이며, 상업적 항-MS4A4A 항체와 별개인 독특한 에피토프 결합 특징을 나타내었다. 결합 특성에서의 이들 차이를 표 10에 나타낸다. 추가적으로, 결과는 시험한 2개의 항-MS4A4A 항체 중 어느 것도 인간 MS4A4A 내에서 동일한 에피토프에 결합하지 않았지만; 그러나, 일부 또는 모든 항체에 걸쳐 아미노산 결합 잔기(예를 들어, 아미노산 잔기 Y167 및 Y168, Y164, N170, T177)를 공유하였다는 것을 나타내었다.
Figure pct00035
실시예 6: 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 다음과 같이 실시예 2에 기재하는 바와 같이 상이한 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드에 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 본 개시내용의 인간화된 항-MS4A4A 항체의 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 핵산을 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 또는 인간 카파 불변 도메인 중 하나를 포함하는 pcDNA3.4 벡터에 클로닝시켰다. 인간화된 항-MS4A4A 항체를 Expi293 세포에서 발현시키고, 제조업자의 프로토콜에 따라 Mab 선택 항체 정제 수지(GE Healthcare Life Science, 카탈로그 번호 17519902)에 의해 정제하였다. 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 결합을 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 1㎍/㎖ 바이오틴일화된 항원을 1시간 동안 스트렙타비딘-코팅 ELISA 플레이트(Thermo Scientific, 카탈로그 번호 PI15120) 상에서 사전인큐베이션시켰다. 플레이트를 3회 세척한 후에, 항체(1㎍/㎖, 0.33㎍/㎖, 및 0.11㎍/㎖의 항체의 첨가가 이어졌다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰고, 3회 세척하고, 이어서, HRP 접합체의 1/2500 희석물을 염소 항 인간 카파 항체에 첨가하였다(SigmaAldrich 카탈로그 번호 A7164-1ML).
도 4는 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS1, JS4, JS5, JS6 및 JS10에 대한 특정 인간화된 항-MS4A4A 항체 결합의 ELISA 결합 결과를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 특정 항-MS4A4A 항체(4A-18.hFc, 4A-21.hFc, 4A-202.hFc, 4A-220.mFc, 4A-214.mFc, 4A-204.mFc' hFc는 인간 Fc를 지칭하고; mFc는 뮤린 Fc를 지칭함))는 인간 MS4A4A의 2개의 ECL을 포함하는 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS1, JS5 및 JS6에 대해 ELISA에 의한 결합을 나타내었다. 본 발명의 항-MS4A4A 항체는 음성 대조군 폴리펩타이드이며, MS4A4A ECL 영역 서열을 포함하지 않는 재조합 가용성 폴리펩타이드 JS4 및 JS10에 결합하지 않았다. 2개의 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체, 즉, 5C12 및 4H2는 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 중 어느 것에 대해 결합을 나타내지 않았다(도 4 참조). 도 4에서, 항-MS4A4A 항체 4A-214는 국제 특허 출원 번호 PCT/US2019/016156에서 이전에 개시되었고, EVKLEESGGGLVQPGRSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCSSMIIVDYWGQGTTVTVSS(서열번호 179)의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSSSTYSYLHWYQQRPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTVFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPLTFGAGTKLEMK(서열번호 180)의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
도 4에 제시한 결과는 이하의 표 12에 나타낸 데이터로부터 도출되었다:
Figure pct00036
도 5는 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS1에 대한 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-21의 인간화된 형태의 ELISA 결합 결과를 나타낸다. 항체를 1㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-21의 인간화된 형태 중 다수는 본 재조합 폴리펩타이드에 결합하는 이들의 능력을 보유하였다. 항-MS4A4A 항체 4A-21의 특정 인간화된 형태는 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS1에 대해 감소된 결합을 나타내었다.
도 5에 제시한 결과는 이하의 표 13에 나타낸 데이터로부터 도출되었다:
Figure pct00037
도 6은 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS1에 대한 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-202의 인간화된 형태의 ELISA 결합 결과를 나타낸다. 항체를 1㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-202의 인간화된 형태는 본 재조합 폴리펩타이드에 결합하는 이들의 능력을 보유하였다.
도 6에 제시한 결과는 이하의 표 14에 나타낸 데이터로부터 도출되었다:
Figure pct00038
뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-202 및 뮤린 항-MS4A4A 항체 4A-21의 다양한 인간화된 형태를 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드에 결합하는 이들의 능력에 대해 추가로 시험하였다. 인간화된 항-MS4A4A 항체 4A-332 및 인간화된 항-MS4A4A 항체 4A-302는 합리적인 결합을 나타내었고, 다음과 같이 추가적인 친화도 개선을 위해 선택하였따.　중복 PCR 기법을 이용하여 항-MS4A4A 항체 4A-322 및 항-MS4A4A 항체 4A-302의 6개의 CDR에서의 무작위 돌연변이를 도입하였다. 이들 항체 변이체의 파지 디스플레이 패닝에 대해 바이오틴일화된 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS5를 사용하였다. 3라운드의 패닝 후에, 대략 190개의 돌연변이체 항-MS4A4A 항체 변이체를 선택하고, TG1 세포에서 발현시키고, 이의 용해물을 ELISA에 의해 선별하였다. 22개의 인간화된 항-MS4A4A 항체 4A-21 변이체 및 15개의 인간화된 항-MS4A4A 항체 4A-202 변이체를 선택하고, 완전한 인간 IgG로 재조합적으로 전환하고, Expi293 세포에서 발현시켰다.　항-MS4A4A 항체를 제조업자의 프로토콜에서 나타낸 바와 같이 MabSelect　항체 정제 수지(GE Healthcare Life Science, 카탈로그 번호 17519902)에 의해 정제하였다. ELISA 및 유세포분석 실험을 후속적으로 반복하였다.
인간화 및 친화도 성숙된 항-MS4A4A 항체 4A-312, 4A-313 및 4A-314는 다양한 항체 농도(1㎍/㎖, 0.33㎍/㎖ 및 0.11㎍/㎖)에서　ELISA에 의해 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS5에 대한 결합을 나타내었고(도 7 참조), 추가적인 기능성 분석을 위해 선택하였다.
도 7에 제시한 결과는 이하의 표 15에 나타낸 데이터로부터 도출되었다:
Figure pct00039
인간화 및 친화도 성숙 항-MS4A4A 항체 4A-351 및 4A-376(0.4㎍/㎖)은 ELISA에 의해 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS5에 대한 양호한 결합을 나타내었다(도 8 참조). 이어서, 아미노산 치환이 CDR-L1에서 아미노산 D28로 생성된 주형으로서 이들　항-MS4A4A 항체를 선택하였고; 이러한 아미노산 치환은 D28G, D28E, D28S, D28A　및　D28Q를 포함하였다.
도 8에 제시한 결과는 이하의 표 16에 나타낸 데이터로부터 도출되었다:
Figure pct00040
이들 추가적인 항-MS4A4A 항체는 항-MS4A4A 항체 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 및 4A-381을 포함하였고, 3가지의 상이한 항체 농도(1㎍/㎖, 0.33㎍/㎖ 및 0.11㎍/㎖)에서 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS5에 대한 결합에 대해 ELISA에 의해 시험하였다. 이들 연구 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9에 나타내는 바와 같이, 이들 추가적인 항-MS4A4A 항체는 재조합 MS4A4A 가용성 폴리펩타이드 JS5에 대한 결합을 나타내었다.
도 9에 제시한 결과는 이하의 표 17에 나타낸 데이터로부터 도출되었다:
Figure pct00041
실시예 7: 인간 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포에 대한 인간화된 및 친화도 성숙된 항-MS4A4A 항체의 결합
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 인간화 및 친화도 성숙 형태를 다음과 같이 인간 MS4A4A-발현 U937 세포에 대한 이들의 결합에 대해 평가하였다.
시험한 항-MS4A4A 항체는 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 마우스 IgG 또는 Expi293 세포에서 재조합적으로 생성된 인간 IgG1 Fc 키메라였다. 세포에 대한 친화도 결합을 다음과 같이 결정하였다. 간단히 말해서, 세포를 채취하고, 세척하고 나서, 생존도 차이에 대해 Aqua Live/Dead로 표지하였다. PBS로 세척한 후에, 2×10^4개의 세포를 96-웰 U-바닥 플라스크에서 웰마다 분취시키고, FACS 완충제(PBS + 2% FBS + 1mM EDTA) 중 다양한 농도에서(10㎍/㎖에서 시작해서 3× 희석) 50㎕의 정제된 항-MS4A4A 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이런 1차 인큐베이션 후에, 원심분리를 통해 상청액을 제거하고, 150㎕의 빙랭 FACS 완충제로 2× 세척하고, 15분 동안 얼음 상에서 적절한 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 2차 항체 인큐베이션 후에, 세포를 빙랭 FACS 완충제로 2× 다시 세척하고, 200㎕의 FACS 완충제의 최종 용적으로 재현탁시켰다. FACSCanto 시스템(BD Biosciences) 상에서 유세포분석을 수행하였다. 결합 데이터를 중위 형광 강도(Median Fluorescent Intensity: MFI)로서 표현하였다.
이들 결합 실험의 결과를 이하의 표 18 및 표 19에 나타낸다. 표 18은 재조합 인간 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포에 본 개시내용의 특정 항-MS4A4A 항체의 결합을 나타낸다. 5㎍/㎖의 농도로 항-MS4A4A 항체를 이용하여 이들 실험을 수행하였고, 세포 결합에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다.
Figure pct00042
표 19는 재조합 인간 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포에 본 개시내용의 특정 항-MS4A4A 항체의 결합을 나타낸다. 5㎍/㎖의 농도로 항-MS4A4A 항체를 이용하여 이들 실험을 수행하였고, 세포 결합에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다. 본 분석에서, 2차 항체 단독으로 염색한 세포의 MFI 값은 대략 200이었다.
Figure pct00043
실시예 8: 항-MS4A4A 항체는 1차 인간 골수성 세포에서 TREM2 단백질을 조절한다
MS4A 좌위에서 SNP는 인간에서 가용성 TREM2(sTREM2) 수준, 일반적으로 TREM2 경로, 및 알츠하이머병 감수성에 영향을 미친다는 것이 보고되었다. 알츠하이머병 보호적 MS4A4A 대립유전자는 뇌척수액에서 증가된 sTREM2 수준과 연관된다. 종합하면, 이들 경로는 알츠하이머병 또는 다른 신경퇴행성 질환의 예방에서 어떤 역할을 할 수 있다. 추가적으로, 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체에 의한 배양물 중 인간 대식세포의 처리는 sTREM2 수준을 감소시켰다(Piccio et.al. Acta Neuropathol 2016, 131:925-933). 대식세포에서 sTREM2 및 혈장-막/세포 표면 TREM2(mTREM2) 수준을 조절하는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
1차 인간 대식세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 완전한 RPMI에서 항-MS4A4A 항체(10㎍/㎖)의 패널로 처리하였다. 48시간의 인큐베이션 후에, 상청액을 수집하고, Meso Scale Discovery(MSD)를 이용하여 sTREM2 수준을 결정하였다. 간단히 말해서, MSD 플레이트(카탈로그 번호 L15XA-3)의 웰을 500 RPM으로 4℃에서 오비탈 진탕기 상에서 밤새 1㎍/㎖에서 포획 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 웰을 세척하고, 이어서, 500 RPM으로 20℃에서 오비탈 진탕기 상에서 1시간 동안 PBS 중 결합 완충제(1% 열-비활성화된 고등급 BSA)에서 차단시켰다. 적절한 농도에서 표준(재조합 인간 Trem2 Fc 1828-T2(R&D Systems)) 및 미지의 샘플을 결합 완충제에서 준비하고, 웰에 첨가하고, 이어서, 500RPM으로 20℃에서 오비탈 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 세척하고, 이어서, 500RPM으로 20℃에서 오비탈 진탕기 상에서 1시간 동안 100ng/㎖에서 2차 항체(바이오틴일화된 염소 항-인간 TREM2(R&D Systems 카탈로그 번호 BAF1828))와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 이어서, 결합 완충제 중 0.2㎍/㎖에서 검출 시약(설포 태그-스트렙타비딘; MSD 카탈로그 번호 R32AD)과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 웰을 세척하고, 150 ㎕의 판독 완충제(1×, MSD)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 Sector Imager 상에서 판독하였다.
별도로, 항-MS4A4A 항체 처리 세포(상기)를 수집하고, 알로피코사이아닌 또는 유사한 형광단에 접합된 항-TREM2 항체(Alector)를 이용하여 mTREM2 수준을 결정하기 위해 유세포분석을 실시하였다.
표 20에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체는 다양한 공여자로부터 얻은 배양된 인간 1차 대식세포의 상청액에서 sTREM2 수준을 증가시켰다. 본 명세서에 기재된 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 인간 1차 대식세포의 상청액에서 sTREM2 수준을 증가 또는 상향조절한다는 것을 나타내었다. 표 20에서 보고된 수는 100으로 설정한 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 얻은 수에 대한 것이다.
Figure pct00044
이하의 표 21에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체는 다양한 공여자로부터 얻은 배양된 인간 1차 대식세포에 대한 혈장-막/세포 표면 TREM2(mTREM2)의 수준을 증가시켰다. 이들 결과는 표 20에서 상기 나타낸 바와 같이, 이들 세포의 상청액에서 관찰된 sTREM2의 대응하는 증가와 일치되었다. 표 21에서 보고된 수는 100으로 설정한 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 얻은 수에 대한 것이다.
Figure pct00045
이들 데이터는 본 발명의 항-MS4A4A 항체에 의한 인간 1차 대식세포의 처리가 골수 계통의 이들 세포에서 sTREM2와 mTREM2 수준을 둘 다 증가시켰다는 것을 나타내었다. 이들 결과는 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 5C12가 배양된 인간 대식세포의 상청액 중 sTREM2 수준을 감소시켰다는 것을 나타내는 이전의 보고와 대조적이다(Deming et al, 상기 참조).
낮은 내독소 수준을 갖도록 제조한 항-MS4A4A 항체를 이용하여 가용성 및 막 TREM2에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하는 상기 실험을 반복하였다. 배양 상청액에서 측정한 바와 같은 sTREM2 수준을 이하의 표 22에 나타낸다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체 대부분은, 고도로 정제되고 내독소가 본질적으로 없을 때, 다른 정도로 증가된 sTREM2 수준을 유도하였다. 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 3F2, 4H2 및 5C12는 또한 sTREM2 수준을 증가시켰지만, 더 적은 정도였다. 이들 결과는 이들 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체가 배양물에서 sTREM2 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸 이전의 공개된 데이터와 대조적이며; 이는 상업적 제제에 존재하는 오염 내독소, 불순물 및 응집물로 인한 것일 가능성이 있다. 표 22의 데이터는ng/㎖로 표현되는 sTREM2 수준을 나타내며, 아이소타입 대조군 항체에 의해 관찰된 것에 정규화한다.
관찰된 sTREM2의 증가는 항-MS4A4A 항체 처리 후에 막 결합된 TREM2(mTREM2) 수준의 증가와 병행되었다(이하의 표 23). 공여자의 반응성의 변화에도 불구하고, 대부분의 항-MS4A4A 항체는 시험한 3명의 공여자 중 2 또는 3에서 mTREM2의 수준을 증가시켰다. 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체(3F2, 4H2 및 5C12)와 비교할 때, 본 개시내용에서 다수의 항체는 동등한 또는 우수한 활성을 나타낸다. 이하의 표 23에 나타낸 수준은 유세포분석에 의해 결정한 바와 같은 평균 형광 강도로서 표현하며, 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 관찰된 것에 정규화한다.
Figure pct00046
Figure pct00047
유전적 연구는 알츠하이머병 환자에서 sTREM2의 증가된 수준과 함께 알츠하이머병 보호적 MS4A4A 대립유전자와 연관되기 때문에, 이들 결과는 항-MS4A4A 항체가 TREM2 활성 및 기능을 조절함으로써(즉, 증가시킴으로써) 알츠하이머병 및 기타 신경퇴행성 장애의 효과적인 치료가 된다는 것을 시사한다.
sTREM2 및 막 결합된 TREM2(mTREM2)에 대한 본 개시내용의 인간화된 항-MS4A4A 항체의 효과를 또한 결정하였다. 이를 시험하기 위해, 두 공여자로부터의 인간 1차 대식세포를 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체로 48시간 동안 처리하였다. 배양 상청액을 수집하였고, Mesoscale Discovery 분석을 이용하여 가용성 TREM2 수준에 대해 분석하였다. 형광단과 접합된 항-TREM2 항체에 의한 염색 후에 유세포분석에 의해 별개로 처리한 세포에서 세포 표면 TREM2를 측정하였다. Mesoscale Discovery 시스템(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌에 소재)을 이용하여 대식세포의 배양물 상청액에서 가용성 TREM2를 측정하였다.
이하의 표 24는 가용성 TREM2 수준의 변화에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과 결과를 나타낸다. 표 24에서, 가용성 TREM2 수준을ng/㎖로서 열거한다. 표 24에 나타낸 바와 같이, 대부분의 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 인간 1차 대식세포에서 가용성 TREM2 수준을 증가시켰다. 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 5C12, 4H2 및 3F2는 본 개시내용의 다수의 항-MS4A4A 항체에 의해 관찰된 것과 비교할 때 가용성 TREM2 수준을 임의의 유의미한 정도로 증가를 나타내지 않았고, 5C12, 4H2 및 3F2의 효과는 아이소타입 대조군과 비슷하였다.
Figure pct00048
이하의 표 25는 세포 표면(예를 들어, 막) TREM2 수준의 변화에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과 결과를 나타낸다. 표 25에서, 세포 표면 TREM2 수준은 유세포분석 절차에서 측정한 바와 같이 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 표 25에 나타낸 바와 같이, 대부분의 본 발명의 항-MS4A4A 항체는 인간 1차 대식세포에서 세포 표면 TREM2 수준을 증가시켰다. 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 5C12, 4H2 및 3F2는 본 개시내용의 다수의 항-MS4A4A 항체에 의해 관찰된 것과 비교할 때 세포 표면 TREM2 수준을 임의의 유의미한 정도로 증가를 나타내지 않았고, 5C12, 4H2 및 3F2의 효과는 아이소타입 대조군과 비슷하였다.
Figure pct00049
표 24 및 표 25에 나타낸 바와 같이, 막 TREM2 수준과 가용성 TREM2 수준은 둘 다 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체에 의한 처리 시 상향조절되었다. 상업적으로 입수 가능한 항-MS4A4A 항체 5C12, 4H2 및 3F2는 임의의 유의미한 정도로 TREM2 발현을 유도하지 않았다.
실시예 9: 대식세포의 세포 표면 마커에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
다양한 M1 및 M2 대식세포의 세포 표면 마커에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과를 다음과 같이 시험하였다. 인간 1차 대식세포를 완전 RPMI1640에서 다양한 항-MS4A4A 항체(10㎍/㎖)로 48시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 채취하고, M1 마커(CD16, MHC Class II, CD86), M2 마커(CD200R, Dectin-1, CD163) 및 pan-대식세포 마커 CD14에 특이적인 항체를 이용하여 유세포분석을 실시하였다.
이들 연구 결과를 이하의 표 26에 나타낸다. 세포 표면 마커 발현 수준을 유세포분석에 의해 분석하였고, 100%로 설정한 아이소타입 대조군 항체로 처리한 세포에서 얻은 것에 정규화시켰다. CD86 및 MHC-II를 포함하는 특정 M1 마커의 세포 표면 발현은 변경되지 않았거나, 항-MS4A4A 항체 처리에 의해서 보통으로만 영향받았다. 대조적으로, CD200R, CD163 및 Dectin-1을 포함하는 특정 M2 마커의 세포 표면 발현은 항-MS4A4A 항체 처리에 의해 유의미하게 감소되었다.
Figure pct00050
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 대식세포 편극화에 영향을 미쳐서, M2 표현형으로부터 떨어진 세포에 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 이들 결과는 CNS 내에서, 항-MS4A4A 항체 처리가 신경퇴행성 질환 및 장애와 관련하여 이들의 신경보호 기능을 강화, 증가 또는 회복시킴으로써 미세아교세포 활성의 유리한 향상을 제공할 수 있다는 것을 시사하였다. 건강한 조건에서 항상성 미세아교세포는 더 많은 M2 마커, 예컨대, CD200R, CD163 및 CD115를 발현시키기 때문에, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 미세아교세포의 생리적 상태를, 보다 전염증 또는 활성화된 상태를 포함하는 더 보호적인 표현형으로 변경시키는 데 효과적이라는 것을 시사하였다. 알츠하이머병 마우스 모델에서 그리고 인간 알츠하이머병에서 질환 관련 미세아교세포(DAM)는 알츠하이머병에서 유리한 것으로 간주되는 전염증 및 활성화 상태이기 때문에, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 알츠하이머병 및 다른 신경퇴행성 장애를 치료하는 데 유리하다.
실시예 10: 항-MS4A4A 항체는 오스테오폰틴 및 겔솔린의 발현을 증가시킨다
MS4A 유전자 클러스터와 관련된 알츠하이머병-관련 유전자 변이체(SNP)가 확인되었다. 해당 변이체 대립유전자 중 하나는 rs1582763이며, 이는 상승된 CSF sTREM2 수준과 관련되고, 감소된 알츠하이머병 위험 및 지연된 발병 연령과 관련된다. (Deming et al, 2018, bioRxiv, doi: dx doi org/10.1101/352179). rs1582763 대립유전자는 혈액 중 MS4A4A mRNA 수준을 감소시킨다. 이들 발견은 rs1582763 대립유전자가 MS4A4A 수준을 감소시키고, 알츠하이머병 위험 또는 중증도를 잠재적으로 감소시킴으로써 보호적 역할을 수행한다는 것을 시사한다.
인간 대식세포 중 이런 보호적 대립유전자 효과를 나타내는 RNA 발현 프로파일은 공개된 RNA 발현 데이터로부터 도출되었다. SPP1(오스테오폰틴) 및 GSN(겔솔린)에 대한 mRNA는, 증가된 발현을 나타내는 다른 마커(제시하지 않음)와 비교할 때 배수 변화("FC") 및 p-값(표 27에서 "rs1582763" 하의 열 및 이하의 표 28에서 중복되는 열)에 의해 나타내는 바와 같이, 발현의 가장 유의미한 증가를 나타내었다. 데이터는 SPP1 및 GSN이 rs158273 대립유전자와 관련된 보호적 생물학적 활성에 대한 약력학적 마커라는 것을 나타내었다.
모 MS4A4A 항체는 보호적 대립유전자를 표현형모사하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 인간 PBMC-유래 대식세포를 24시간 동안 표 27 및 표 28에서 나타낸 바와 같이 항-MS4A4A 항체로 처리하였다(최대 3회 복제물). RNA를 추출하고, RNA 라이브러리를 준비 및 서열분석한 후에, 게놈 맵핑 및 정량화한다. 결과는 표시된 모 항-MS4A4A 항체 중 하나(4A-220)를 제외하고 모두는 SPP1 및 GSN의 발현 증가에 대해 보호적 rs1582763 대립유전자를 표현형 모사한다는 것을 나타내었다(표 27 및 표 28). 이들 결과는 SPP1 및 GSN의 발현 증가에서 효과적인 본 개시내용의 MS4A4A 항체는 보호적 대립유전자와 유사하게, 알츠하이머병 위험 및/또는 중증도를 감소시킴에 있어서 생물학적으로 활성이라는 것을 시사하였다.
Figure pct00051
Figure pct00052
실시예 11: 항-MS4A4A 항체에 의한 iPSC-유래 미세아교세포의 유도 및 자극
임의의 조직-유래의 성체 세포는 줄기 세포와 연관된 전사 인자의 혼합물의 토입을 통해 유도만능 줄기 세포(iPSC)로 전환될 수 있다(https://www(dot)cell(dot)com/iPSC에서 광범위하게 검토됨). iPSC는 무기한으로 유지될 수 있고, 적절한 성장 인자가 주어질 때, 다양한 성숙 세포 유형으로 분화되도록 유도될 수 있다. iPSC로부터 뉴런을 유도하기 위한 방법은 오랫동안 확립되어 왔다(Salimi et.al., Mol. Bio. Rep. 2014; 41: 1717-1721; Engle et.al., Neuron 2018; 100: 783-797). 보다 최근에, iPSC는 성상세포(Julia et.al., Stem Cell Report 2017; 9:600-614) 및 미세아교세포(문헌[Pocock and Piers, Nat. Rev. Neurosci. 2018; 19: 445-452]에 의해 검토됨)를 유도하는 데 사용되었다. 이들 배양 시스템은 달리 가능하지 않을 수 있는 제어된 환경에서 이들 세포의 생물학 및 기능의 연구를 가능하게 한다. 더 나아가, iPSC는 이들 세포 유형에서 관심 대상의 유전자의 기능적 적절성의 추가적인 조사를 가능하게 하기 위해 다양한 방법에 의해, 예컨대, CRISPR 유전자 편집에 의해 유전자 조작될 수 있다.
iPSC로부터의 유도 후에, 미세아교세포를 시험관내에서 단독으로 배양시키고, 여기서, 이들에 본 개시내용에서 항-MS4A4A 항체에 의한 자극으로 처리한다. 자극 후에, 세포내 ATP 수준의 정량화에 의해 세포 생존도를 평가한다. 세포 표면 TREM2 발현의 변화 또는 가용성 TREM2 수준의 변화에 대한 효과를 상기 기재한 바와 같이 측정한다. 이들 배양물로부터의 상청액을, ELISA, Mesoscale Discovery 분석(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌에 소재), Legendplex(BioLegend, 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재) 또는 CBA(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 새너제이에 소재)와 같은 방법을 이용하여, 항-MS4A4A 항체 처리의 결과로서 다양한 사이토카인 및 케모카인의 발현 또는 수준 변화에 대해 분석한다. 항-MS4A4A 항체 처리로부터 초래되는 이들 iPSC-미세아교세포에서 식세포작용 능력, 자가소화작용률, 표면 마커 발현 및 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하고, 유세포분석, 웨스턴 블롯팅, 고정- 및 실시간 영상화 및 RNAseq 분석을 포함하는 다양한 방법을 이용하여, 항-MS4A4A 항체로 처리한 단핵구-유래 대식세포로부터 얻은 것과 비교하였다.
실시예 12: 대식세포의 세포 표면 마커에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
CNS에서 그리고 말초 기관에서 골수 세포는 이들의 표현형 및 기능에 본질적으로 가소성이 있다. 이는 M1 및 M2 유형 대식세포로 나눌 수 있는 시험관내 대식세포에 의해 모델링할 수 있으며, 상이한 식세포 및 염증 가능성, 표현형 및 활동을 나타낸다. 말초 기관에서, M1 표현형과 관련된 대식세포는 보다 전염증 및 항미생물인 것으로 생각되는 반면, M2-유사 대식세포는 보다 항상성 및 항-염증성이다. CNS 내에서, 항상성 조건에서 미세아교세포는 또한 M2 마커, 예컨대, CD200R, CD163을 발현시키는데, 이는 본 세포 유형에서의 조절 기능을 시사한다. MS4A4A 발현은 시험관내 M2 대식세포에서 상승된다.
다양한 M1 및 M2 대식세포의 세포 표면 마커에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과를 다음과 같이 시험한다. 인간 1차 대식세포를 완전 RPMI1640에서 다양한 항-MS4A4A 항체(예를 들어, 10㎍/㎖)로 48시간 동안 처리한다. 이어서, 세포를 채취하고, M1 마커(예컨대, CD16, MHC 클래스 II, CD86), M2 마커(예컨대, CD200R, Dectin-1, CD163), 및 CD14 및 기타를 포함하는 pan-대식세포 마커에 특이적인 항체를 이용하여 유세포분석을 실시한다.
실시예 13: 항-MS4A4A 항체의 동력학 특성규명
MS4A4A ECL1 및 ECL2 펩타이드에 대한 정제된 항체의 결합 동력학 특성규명을 다음과 같은 사유(proprietary) 어레이 표면 플라즈만 공명(SPR) 기기(MX-96)를 이용하여 Carterra(캘리포니아주 사우스 샌프란시스코에 소재)에 의해 수행한다. 항체를 지속적 유동 마이크로스포터(Continous Flow Microspotter: CFM)를 이용하여 CMD500D 칩(Xantec # SPMX CMD500D 로트 번호 SC CMD500D0117.a Exp. 31.12.18) 상에 인쇄한다. 먼저, 칩을 7분 동안 100mM MES, pH 5.5, 100㎕ EDC(최종 133mM), 100㎕의 S-NHS(최종 33.3mM)로 활성화시킨다. 항-마우스 IgG-Fc(Jackson ImmunoResearch 카탈로그 번호 115-005-071)의 론(lawn)을 15분 동안 주사하여 10000 내지 12000 RU의 표면 밀도를 확립하고, 이후에, 칩 표면을 1M 에탄올아민을 이용하여 10분 동안 pH 8.5에서 탈활성화시킨다. 당해 항-MS4A4A 항체를 HBS-EP+ 완충제(Teknova 카탈로그 번호 H8022)를 이용하여 2:1로 희석시키고, 이어서, 동일한 샘플 용액으로부터 20분 및 5분 인쇄로 중복하여 인쇄하였다. 대조군 항체를 인쇄를 위해 20㎍/㎖로 희석시킨다.
동력학 분석을 수행하기 위해, 당해 펩타이드를 1㎎/㎖ BSA를 이용하여 2000nM, 400nM, 80nM, 16nm 및 3.2nM의 최종 분석 농도로 HBS-EP+ 완충제에서 제조한다. 이어서, 이들을 5분 동안 칩 상에 주사한 후에, 비-재생 동력학 계열에서 초당 8㎕로 7분 해리 기간이 이어졌다. 각 항-MS4A4A 항체에 대한 중복 측정으로 재현 가능성을 보장한다.
실시예 14: 일시적 및 천연적 발현 세포주에 대한 MS4A4A 항체의 친화도 측정
정제된 항-MS4A4A 항체를 다양한 MS4A4A-발현 세포주에 대한 이들의 결합 친화도에 대해 평가한다. 이들은 실시예 8에서 상기 기재한 바와 같은 형질감염 세포뿐만 아니라 MS4A4A를 내인성으로 발현시키는 골수성 세포주 및 1차 세포를 포함한다. 시험한 항-MS4A4A 항체는 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 마우스 IgG 또는 Expi293 세포에서 재조합적으로 생성된 인간 IgG1 Fc 키메라이다. 세포에 대한 친화도 결합을 다음과 같이 결정한다. 간단히 말해서, 세포를 채취하고, 세척하고 나서, 생존도 차이에 대해 Aqua Live/Dead로 표지한다. PBS로 세척한 후에, 2×10^5개의 세포를 96-웰 U-바닥 플라스크에서 웰마다 분취시키고, FACS 완충제(PBS + 2% FBS + 1mM EDTA) 중 다양한 농도에서(10㎍/㎖에서 시작해서 3× 희석) 50㎕의 정제된 항-MS4A4A 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 1차 인큐베이션 후에, 원심분리를 통해 상청액을 제거하고, 150㎕의 빙랭 FACS 완충제로 2× 세척하고, 30분 동안 얼음 상에서 적절한 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 2차 인큐베이션 후에, 세포를 빙랭 FACS 완충제로 2× 다시 세척하고, 200㎕의 FACS 완충제의 최종 용적으로 재현탁시킨다. FACSCanto 시스템(BD Biosciences) 상에서 유세포분석을 수행한다. 중위 형광 강도를 이용하여 결합 데이터를 분석하고, EC50 값을 결정하기 위해 곡선을 Prism에 적합화시켰다(비선형 회귀: log 저해제 대 4개 파라미터에 의한 용량 반응).
실시예 15: MS4A4A 단백질의 하향조절
다양한 세포주 및 1차 세포에서 MS4A4A의 세포 표면 및 총 세포 단백질 수준을 감소시키는 항-MS4A4A 항체의 능력을 평가한다. 구획 중 하나에서 MS4A4A 단백질의 감소는 세포에서 MS4A4A 활성의 감소를 나타낸다.
세포를 다양한 시간 기간 동안 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체와 함께 인큐베이션시키고, 이어서, 세포와 관련된 남아있는 MS4A4A 단백질의 수준을 FACS(세포 표면) 또는 웨스턴 블롯(총 세포 단백질 수준) 중 하나에 의해 분석한다. FACS 분석을 위해, 직접-알로피코사이아닌(APC) 접합, 비-경쟁 항체에 의해 남아있는 MS4A4A의 검출을 수행한다. 웨스턴 블롯 검출을 위해, 50㎕ 용해 완충제(RIPA 용해 완충제(ThermoFischerScientific 카탈로그 번호 89900) + 1:100 HALT 프로테아제 저해제 칵테일(ThermoFischerScientific 카탈로그 번호 87786)의 첨가에 의해 세포를 용해시키고, 15분 동안 14,000×g에서 원심분리에 의해 불용성 파편을 제거하였다. 단백질 정량화를 위해 비신콜닌산(BCA)을 이용하여 가용성 분획을 분석한다. 각 샘플로부터 동일한 양의 단백질을 4-12% Bis-Tris Plus 폴리아크릴아마이드 겔(ThermoFisher Scientific NW04120) 상에 부하하고, 전기영동 분리 처리하고, 이후에 겔의 단백질을 iBlot2(ThermoFisher Scientific IM21001) 및 Transfer Stacks (ThermoFisher Scientific IB24002)을 이용하여 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF) 막 상에 전달한다. 1% 소 혈청 알부민 또는 5% 탈지유 중 하나로 막을 차단하여 비-특이적 결합을 방지한다. 이어서, 이를 사내(in-house) 또는 상업적 검출 항체와 함께 인큐베이션시키고, 세척한 후에, HRP-접합 2차 항체(토끼, Abcam #205718; 마우스, Abcam #205719)와 함께 인큐베이션시켰다. 결합을 SuperSignal West Pico Plus 화학발광 기질(ThermoFisher Scientific #34577)로 전개함으로써 시각화하고, iBright FL1000 (ThermoFisher Scientific A32752) 또는 다른 적합한 시스템으로 디지털 기록하였다.
MS4A4A 단백질 수준의 하향조절은 또한 공지되어 있고 당업자에게 이용 가능한 방법을 이용하여, 예를 들어, 안티센스 방법, 유전자 요법 등의 사용에 의해, MS4A4A 핵산 발현 또는 수준의 하향 조절에 의해 달성될 수 있다.
실시예 16: 노화, 발작, 척수손상, 망막이영양증, 전두측두엽 치매 및 알츠하이머병에 대해 동물 모델을 이용하는 항-MS4A4A 항체의 특성규명
앞서 기재한 바와 같이, 노화, 발작, 척수손상, 망막이영양증, 전두측두엽 치매 및 알츠하이머병에 대한 동물 모델에서 항-MS4A4A 항체의 치료적 유용성을 시험할 수 있다(예를 들어, 문헌[Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al., (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Nykjaer, A et al., (2004) Nature 427, 843-848; Harrington, AW et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 6226-6230; Teng, HK et al., (2005) J. Neurosci. 25, 5455-5463; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fan, YJ et al., (2008) Eur. J. Neurosci. 27, 2380-2390; Al-Shawi, R et al., (2008) Eur. J. Neurosci. 27, 2103-2114; 및 Yano, H et al., (2009) J. Neurosci. 29, 14790-14802] 참조).
실시예 17: 종양학에 대해 동물 모델을 이용하는 항-MS4A4A 항체의 특성규명
골수 세포는 대부분의 고형 종양에 존재하는 면역 세포의 대부분의 성분을 나타낸다. 종양 생물학에서 이들의 역할은 문맥 의존적이며 - 한편으로 이러한 세포는 종양 근절에서 중요한 역할을 할 가능성을 갖고, 이들은 가장 흔하게는 종양전 표현형을 제공하는 데 도움을 주는 숙주 종양이 끌어들인다. 이는 M2-표현형으로 향하는 골수성 세포의 편극화를 통해 주로 달성되며, 이는 전형적으로 면역억제성이고, 따라서, 면역계가 종양을 근절하는 것을 차단한다. 골수성 세포의 재편극화를 통해 항-MS4A4A 항체는 이런 면역억제성 표현형을 반전시키고, 항-종양 면역 반응을 촉진시킬 수 있다.
수많은 동물 종양 모델이 존재한다. 적절한 동물 모델의 예는 NSG 마우스(Jackson Laboratory, 미국 메인주 바하버에 소재)에 의해 대표되는 바와 같은 인간화된 마우스 모델을 포함하며, 여기서, 마우스 면역계는 유전자 결실된다. 이들 마우스는 인간 면역 세포에 대한 수용 숙주로서 작용하여, 인간 적응 면역 및 선천성 면역 세포의 생착을 야기한다. 이어서, 이들 동물을 보통 옆구리 피부 하에 종양 세포로 접종한다. 시간에 따른 종양 크기는 종양 세포의 성장과 숙주 면역계에 의한 이들의 근절 사이의 균형을 나타낸다. 시간 과정 내내, 동물을 아이소타입-처리 동물과 비교할 때 종양 진행을 변형시키는 항-MS4A4A 항체로 처리하였다. 처리 기간의 종료 시, 종양을 추출하고, 다양한 분석을 실시하여 종양 세포 및 침윤성 면역 세포에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과를 결정한다. 종양을 절개하고, 슬라이드 상에 장착하고, 조직학적 변화에 대해 현미경 하에 분석할 수 있다. 유전자 발현에서 변화를 결정하기 위해 RT-PCR, RNASeq 또는 마이크로어레이에 의해 mRNA를 분석할 수 있다. 종양 및 침윤성 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하고, 다양한 세포 표면 마커에 대해 항체로 염색하고, 유세포분석에 의해 분석하여, 세포 표면 표현형에서, 특히 면역 세포, 예컨대, 대식세포 및 T 세포에서의 변화를 기술할 수 있다. 이들 분석 중 어느 것에서 항-MS4A4A 처리의 결과로서 관찰된 변화는 이들 항체에 대해 면역 조절 기능을 나타낼 것이다.
실시예 18: TREM2 전사 및 mRNA에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
TREM2 전사 수준 및 mRNA에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과를 다음과 같이 평가한다. 배양 세포를 다양한 기간 동안 다양한 농도의 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체로 처리한다. 이후에, 당업자에게 공지된 mRNA 수준을 측정 및/또는 정량화하기 위해 표준 방법을 이용하여 세포 내에서의 TREM2 mRNA 수준의 변화를 결정한다.
실시예 19: TREM2 재순환 및 분해에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
증가된 수준의 sTREM2 및 mTREM2에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과를 더 양호하게 이해하기 위해, TREM2 재순환 및/또는 분해를 시험하는 다음의 연구를 수행한다. 이들 연구에서, 항-MS4A4A 항체 처리와 관련된 추가적인 새로운 TREM2 합성을 방지하기 위해 세포의 사이클로헥시마이드 처리를 사용한다. 항-MS4A4A 항체로 처리한 세포와 비교할 때 대조군 세포에서 TREM2 세포의 재순환 및 분해를 시험하기 위해 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용 가능하다.
실시예 20: 추가적인 항-MS4A4A 항체
상기 실시예 1에 기재한 바와 같이, 2개의 추가적인 항-MS4A4A 항체를 인간화시키고, 모 항체 4A-21로부터 친화도 성숙시켜, 항-MS4A4A 항체 4A-450 및 항-MS4A4A 항체 4A-419를 생성하였다. 이들 항체 각각의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 이하의 표 29에 나타내며, 이들의 대응하는 CDR(Kabat에 따름)은 밑줄 표시된다. 중쇄 CDR 서열을 표 30에 나타내며; 경쇄 CDR 서열을 표 31에 나타낸다.
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
실시예 21: 생체내 sTREM 수준에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
생체내 혈청 및 뇌척수액(CSF) 중 sTREM 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 정맥내 주입에 의해 단일 용량의 80 ㎎/㎖로 항-MS4A4A 항체 4A-202 또는 아이소타입 대조군(huIgG1)을 투여하였다. 혈청 샘플을 투약 전, 항체 투여 후 0.5, 4, 10, 24, 48, 96, 192, 312, 480 및 648시간에 동물로부터 수집하고; CSF 샘플을 투약 전, 항체의 투여 후 48, 96, 192 및 336시간에 동물로부터 수집하였다.
혈청 및 CSF 중 sTREM 수준을 다음과 같이 측정하였다. 단일 스팟 Meso Scale Discovery(MSD) 플레이트(메릴랜드주 록빌에 소재)를 4℃에서 밤새 PBS 중 포획 항체로 코팅하였다. 원숭이 혈청 및 CSF 샘플(뿐만 아니라 원숭이 TREM2-Fc 표준)을 결합 완충제에서 희석시키고, 1시간 동안 실온에서 웰에 첨가하였다. 바이오틴일화된 염소 항-인간 TREM2 다클론성 항체(R&D Systems)를 결합 완충제에서 1:2,000 희석으로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에, 설포 태그 스트렙타비딘(MSD)으로 검출하였다. 150　㎕의 1× 판독 완충제를 플레이트에 첨가하고, 이어서, 플레이트를 Sector Imager(MSD) 상에서 분석하였다.
혈청에서, 항-MS4A4A 항체 4A-202의 투여 후 sTREM2 수준은 기준선으로부터 대략 1.5배로 증가되었다(기준선으로부터 대략 50% 증가)(도 10A 내지 도 10B). 혈청 sTREM2 수준은 사이노몰거스 원숭이에서 단일용량의 항-MS4A4A 항체 4A-202 후에 적어도 480시간(20일) 동안 상승된 채로 남아있었다(기준선 수준 초과).
CSF에서, 항-MS4A4A 항체 4A-202의 투여 후 sTREM2 수준은 기준선으로부터 대략 2 내지 4배 초과로 증가되었다(기준선으로부터 대략 300% 증가)(도 11A 내지 도 11B). CSF sTREM2 수준은 사이노몰거스 원숭이에서 단일용량의 항-MS4A4A 항체 4A-202 후에 적어도 96시간(4일) 동안 상승된 채로 남아있었다(기준선 수준 초과).
이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 생체내 혈청 및 CSF에서의 sTREM2 수준 증가에서 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 22: 재조합 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 인간 재조합 MS4A4A-발현 U937 세포(이들 세포의 생성을 상기 기재함)에 대한 이들의 결합 친화도에 대해 평가하였다. 세포에 대한 항-MS4A4A 항체의 결합 친화도를 다음과 같이 결정하였다. 간단히 말해서, 재조합 인간 MS4A4A를 발현시키는 U937 세포를 채취하고, 세척하고 나서, 생존도 차이에 대해 Aqua Live/Dead로 표지하였다. PBS로 세포를 세척한 후에, 2×10^4개의 세포를 96-웰 U-바닥 플라스크에서 웰마다 분취시키고, FACS 완충제(PBS + 2% FBS + 1mM EDTA) 중 다양한 농도에서 50㎕의 정제된 항-MS4A4A 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이런 1차 인큐베이션 후에, 원심분리를 통해 상청액을 제거하고, 세포를 150㎕의 빙랭 FACS 완충제로 2× 세척하고, 이어서, 15분 동안 얼음 상에서 적절한 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 2차 항체 인큐베이션 후에, 세포를 빙랭 FACS 완충제로 2× 다시 세척하고, 200㎕의 FACS 완충제의 최종 용적으로 재현탁시켰다. 이어서, FACSCanto 시스템(BD Biosciences)을 이용하여 유세포분석을 수행하였다. 결합 데이터를 평균 형광 강도(MFI)로서 표현하였다. 유세포측정기에 의해 측정한 MFI 값을 문헌[Kuek, et al, 2016, Immunology and Cell Biology. 94:11-23]에 기반하여 다음의 식(또는 유사한 4-모수 적합을 사용할 수 있음)을 이용하여 Prism(Graphpad) 소프트웨어 상에서 분석하였다:
Figure pct00056
이들 분석에서, 실험 조건에 따라 다음의 값을 제한하였다: C = 웰당 세포 수(20,000); V =염색의 총 용적(마이크로리터); n = 세포 표면 상의 수용체 수, 세포당 100,000개의 수용체가 있는 것으로 추정됨. 이들 결합 연구 결과를 도 12에 나타낸다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313 WT huIgG1은 대략 2.8e-10의 U937 세포 상에서 발현된 재조합 인간 MS4A4A에 대한 결합 친화도를 나타낸 반면, 항-MS4A4A 항체 4A-450 WT huIgG1은 본 분석에서 3.8e-09의 결합 친화도를 나타내었다.
실시예 23: MS4A4A 과발현 세포주의 생성
재조합 인간 MS4A4A를 발현시키는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포주를 생성하기 위한 어려움을 고려하여, 다른 DNA 벡터 및 세포주가 재조합 인간 MS4A4A의 발현에 더 적합한지에 여부를 결정하기 위해 이들을 시험하였다. 안정한 형질감염을 위해, MS4A4A 암호화 서열을 발현 벡터 pD2533-G418 또는 pD3539-puro(Atum, 미국 캘리포니아주 뉴어크에 소재)에 도입하였다.
MS4A4A를 생체내에서 골수성 세포에서 천연으로 발현시킨다. 따라서, 상기 기재한 세포를 이용하여 관찰한 독성을 극복하기 위해, 몇몇 골수-유래 세포주를 관찰된 독성이 최소이거나 전혀 없는 재조합 인간 MS4A4A를 발현시키는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 이들 연구에서 사용한 골수-유래 세포주의 패널은 THP-1 세포(ATCC TIB202), U937 세포(ATCC CRL-1593.2), K562 세포(ATCC CCL243), HL60 세포(ATCC CCL240) 및 Kasumi-1 세포(ATCC CRL-2724)를 포함하였다. 300.19 세포(Tufts University T000710), 마우스 프레-B 세포주를 또한 시험하였는데, 이들 세포가 재조합 단백질 발현 목적을 위해 통상적으로 사용되었기 때문이다. 선택 및 형질감염 효율을 위한 G418 또는 퓨로마이신의 적합한 용량을 결정하기 위해 이들 세포주 각각을 항생제 감수성에 대해 선별하였다. MS4A4A 발현 플라스미드 형질감염 및 항생제 선택을 암호화하는 재조합 인간 다음에 U937 세포, K562 세포 및 300.19 세포로부터의 형질감염체가 생존 가능한 것을 발견하였다. 희석을 제한함으로써 이들 세포를 클로닝한 후에, 개개 클론을 생성하고, 후속적으로 유세포측정을 이용하는 인간 MS4A4A 단백질 세포 표면 발현에 대해 선별하였다.
실시예 24: 인간화 및 친화도 성숙 항-MS4A4A 항체는 1차 인간 골수성 세포에서 TREM2 단백질을 조절한다
인간 유전자 연구로부터의 데이터는 MS4A4A, TREM2 경로와 알츠하이머병(AD) 감수성 사이의 연관을 확인하였다(Piccio et al., 2016, Acta Neuropathol, 131:925-933; doi: https://dx.doi.org/10.1101/352179). 예를 들어, AD-보호적 MS4A4A 대립유전자는 뇌척수액에서의 증가된 sTREM2 수준과 연관된다. 이들 보호 경로에 대한 통찰을 얻기 위해, 다음의 연구를 수행하였다. 인간 1차 대식세포를 48시간 동안 다양한 농도의 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체로 처리하였다. 이들 연구에서, 다음의 항-MS4A4A 항체를 시험하였다: 야생형 huIgG1 Fc(WT)를 갖는 4A-450, huIgG1 Fc N325S 및 L328F(NSLF)를 갖는 4A-450, huIgG1 Fc K322A를 갖는 4A-450, 4A-313 WT huIgG1, 4A-313 NSLF huIgG1 및 4A-313 K322A huIgG1. 이어서, 후속적으로 세포를 형광단과 접합된 항-TREM2 항체로 염색한 후에, TREM2의 세포 표면(막 결합된) 발현을 유세포분석에 의해 측정하였다. Mesoscale Discovery 시스템(MSD, 미국 메릴랜드주 록빌에 소재)을 이용하여 세포의 배양 상청액에서 가용성 TREM2 수준을 측정하였다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 막 TREM2 수준은 항-MS4A4A 항체의 세포에 첨가 후 인간 1차 대식세포에서 용량 의존적 방식으로 증가되었다. 상이한 huIgG1 Fc 서열에 대한 항-MS4A4A 항체 - 야생형 huIgG1, huIgG1에서 N325S/L328F 아미노산 치환, 및 huIgG1에서 K322A 아미노산 치환은 모두 막 TREM2 발현 수준을 증가시킬 수 있었다. 이하의 표 32 및 표 33은 막 결합된 TREM2 수준의 변화에 대해 항-MS4A4A 처리 세포에서 얻은 MFI의 비에 대한 수치적 값을 도 13 및 도 14로부터 각각 얻은 비처리 대조군 세포에서 얻은 것과 비교하여 제시한다.
도 15 및 도 16은 야생형 huIgG1 Fc 골격 상의 항-MS4A4A 항체 4A-450 및 4A-313이(각각) 용량-의존적 방식으로 1차 인간 대식세포의 상청액에서 가용성 TREM2 수준을 증가시켰다는 것을 나타낸다. 이하의 표 34 및 표 35는 각각 도 15 및 도 16으로부터 얻은 플레이트 기준선 수준으로서 측정한 것 이상으로 항-MS4A4A 세포에서 관찰된 가용성 TREM2의 배수 증가의 수치적 값을 제시한다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
이들 결과는 항-MS4A4A 항체 4A-450 WT huIgG1(2.5㎍/㎖)이 1차 인간 대식세포에서의 sTREM 수준을 비처리 세포에 비해 약 1.4배만큼 증가시켰다는 것을 나타내었다. 이들 결과는 또한 항-MS4A4A 항체 4A-313 WT huIgG1이 1차 인간 대식세포에서의 sTREM 수준을 비처리 세포에 비해 약 1.5 내지 약 1.7배만큼 증가시켰다는 것을 나타내었다. 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 시험관내 sTREM 수준 증가에 효과적이며, 따라서, 생체내 혈장 및 CSF에서 sTREM 수준의 효과적인 수단을 제공할 수 있고, 알츠하이머병 발생에 보호적인 MS4A4A 대립유전자의 효과를 모방한다는 것을 나타내었다.
실시예 25: 세포 ATP 수준에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
제조업자의 프로토콜에 따라 RosetteSep 인간 단핵구 풍부 칵테일(Stemcell technologies) 및 Ficoll 원심분리를 이용하여 전혈로부터 인간 단핵구를 단리시켰다. ACK 용리 완충제를 이용하는 적혈구의 용리 후에, 단핵구를 완전 배지(RPMI, 10% FBS, Pen/Strep, L-글루타민, HEPES, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨)에서 재현탁시켰다. 이들 단리된 단핵구로부터 대식세포를 얻기 위해, 100　ng/㎖의 인간 M-CSF 및 8% v/v 인간 혈청을 5 내지 7일 동안 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포를 완전 RPMI-1640에서 50,000개의 세포/웰로 플레이팅하고, 48시간 동안 용액 중 다양한 농도의 항-MS4A4A 항체(4A-313 NSLF, 4A-313 PS, 4A-450 NSLF 및 4A-450 PS) 또는 다양한 농도의 아이소타입 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 2일 동안 배양시켰다. 이어서, 제조업자의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존도 키트(Promega, 카탈로그 번호 G7571)를 이용하여 세포 내의 ATP 함량을 정량화하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1, 4A-313 PS huIgG1, 4A-450 NSLF huIgG1 및 4A-450 PS huIgG1은 1차 인간 대식세포에서 ATP 수준을 용량-의존적 방식으로 증가시켰다. FcγRIIIa 결합(Journal of Biological Chemistry 2014, 289: 15309-15318)을 없앤 N325S/L328F 아미노산 치환을 포함하는 huIgG1 Fc를 갖거나, 또는 C1q 결합을 없앤 P331S 아미노산 치환을 포함하는 huIgG1 Fc를 갖는 항-MS4A4A 항체(Journal of Immunology 2000, 164: 4178-4184)는 둘 다 인간 대식세포에서의 ATP 수준 증가에서 효과적이었다. ATP 수준의 증가는 인간 대식세포의 증가된 생존도를 나타낸다.
이하의 표 36은 이들 연구에서 결정된 ATP 수준의 수치적 값을 제시하며(도 17과 연관됨), 이를 비처리 대식세포에서 관찰된 것에 정규화시켰다. 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 용량-의존적 방식으로 인간 대식세포에서 ATP 수준을 증가시키는 데 효과적이라는 것을 나타내었다. ATP 수준은 항-MS4A4A 항체 4A-450을 이용하여 비처리 세포에서 관찰된 것 보다 약 1.2배(0.016㎍/㎖ 항-MS4A4A 항체에 의함) 내지 약 1.4배(1.0㎍/㎖ 항-MS4A4A 항체에 의함) 초과만큼 증가되었다. ATP 수준은 항-MS4A4A 항체 4A-313을 이용하여 비처리 세포에서 관찰된 것 보다 약 1.3배(0.008㎍/㎖ 항-MS4A4A 항체에 의함) 내지 약 1.7배(1.0㎍/㎖ 항-MS4A4A 항체에 의함) 초과만큼 증가되었다.
Figure pct00061
실시예 26: 대식세포의 세포 표면 마커에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
CNS에서 그리고 말초 기관에서 골수 세포는 이들의 표현형 및 기능에 본질적으로 가소성이 있다. 말초 기관에서, M1-유사 표현형을 갖는 대식세포는 보다 전염증 및 항미생물인 것으로 생각되는 반면, M2-유사 표현형을 갖는 대식세포는 보다 항상성 및 항-염증성이다. CNS 내에서, 항상성 조건에서 미세아교세포는 또한 M2-유사 마커, 예를 들어, CD200R 및 CD163을 발현시킨다. MS4A4A 발현은 시험관내 M2-유사 대식세포에서 상승되고, 이는 MS4A4A가 M2-유사 대식세포에 대한 신규한 세포 표면 마커라는 것을 시사하였다(Immunology and Cell Biology 2017, 95: 611-619).
다양한 대식세포의 세포 표면 마커에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 다음과 같이 시험하였다. 인간 1차 대식세포를 48시간 동안 완전 RPMI1640에서 다양한 농도(10㎍/㎖, 1.0㎍/㎖, 0.1㎍/㎖)의 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1 또는 4A-419 야생형 (WT) huIgG1로 처리하였다. 이어서, 세포를 채취하고, M1-유사 마커(예를 들어, CD16, MHC 클래스 II, CD86), M2-유사 마커(예를 들어, CD200R, Dectin-1, CD163) 및 pan-대식세포 마커 CD14에 특이적인 항체를 이용하여 유세포분석을 실시하였다.
도 18A, 도 18B 및 도 18C에 나타낸 바와 같이, 1차 인간 대식세포에 대한 항-MS4A4A 항체의 첨가는 비처리 세포(항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF huIgG1 Fc(각 쌍에서 우측 상의 막대), 항-MS4A4A 항체 4A-419 야생형 huIgG1 Fc(WT)(각 쌍의 좌측 상의 막대)에서 관찰된 것과 비슷한 용량 의존적 방식으로 CD14 및 CD163 세포 표면 마커의 감소를 초래하였다. 1차 인간 대식세포에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF의 첨가는 CD200R 세포 표면 마커 수준을 비처리 세포에서 관찰된 것 미만으로 야기하였다. 대조적으로, 1차 인간 대식세포에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-419의 첨가는 비처리 세포에서 관찰된 것에 비해 CD200R 세포 표면 마커의 증가를 초래하였다. 이 결과는 상기 항-MS4A4A 항체 4A-313 NSLF에 의해 얻은 결과에 비추어, 그리고 M2-유사 세포 표면 마커, 예컨대, CD200R를 감소시킨 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체에 의해 얻은 결과에 비추어 본 구체적 실험에 대해 이례적인 것으로 간주한다(상기 실시예 9 및 표 26 참조). 이하의 표 37은 도 18A, 도 18B 및 도 18C에서 그래프로부터 얻은 세포 표면 마커에서 배수 변화(상기 비처리 세포)에 대한 수치적 값을 제시한다. 데이터를 두 공여자로부터 웰을 3회 중복에 걸쳐 평균을 낸다.
Figure pct00062
이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 M2-유사 대식세포의 세포 표면 마커 감소에서 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 27: 보체 의존적 세포독성(CDC) 분석에서 인간 IgG1 Fc 변이체
인간 IgG1 항체의 Fc 도메인은 다중 하류 효과기 분자, 예를 들어, C1q, Fc 감마 수용체 및 신생아 Fc 수용체와의 상호작용에 의해 효과기 기능에 영향을 미친다. 다음과 같이 C3b 침착/세포 사멸 분석을 이용하여 보체 침착(complement deposition)에 영향을 미치는 변이체 huIgG1 Fc 영역을 갖는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 능력을 측정하였다.
상기 기재한 바와 같이 생성한 재조합 인간 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포를 이들 연구에서 표적 세포로서 사용하였다. 세포를 채취하고, PBS에서 1× 세척하고, RPMI 1640 배지에서 2×106개의 세포/㎖로 희석시켰다. 50㎕의 표적 세포를 둥근 바닥 96 웰 플레이트(Falcon #351177)에서 웰마다 분취시켰다(웰당 1×105개의 세포). 이들 세포에 사전 결정된 농도의 4배로 동일한 배지에서 제조한 25㎕의 항-MS4A4A 항체를 첨가하였다. 세포-항체 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 25㎕의 풀링된 보체 인간 혈청(Innovative Research, IPLA-CSER)을 보체 공급원으로서 웰마다 첨가하고, 플레이트를 추가 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 FACS 완충제(PBS + 2% FBS + 1mM EDTA)로 2× 세척하고, 100㎕의 1:50 희석된 항-C3b-APC 항체(Biolegend 846106)를 웰마다 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충제로 2× 세척하고, iQue 유세포 분석기(IntelliCyt) 상에서 분석 전에 80㎕의 FACS 완충제 + 0.25㎕/웰의 프로피디움 아이오딘화물(Fischer Scientific, BD 556463)에서 재현탁시켰다. 보체 활성을 2가지 방법, 즉, CDC-매개 세포 사멸의 정도를 확인하기 위해 PI-high 세포의 백분율에 의해, 또는 C3b 침착을 측정하기 위해 APC 통로에서 세포의 MFI에 의해 측정하였다.
도 19는 다양한 huIgG1 Fc 변이체와 함께 항-MS4A4A 항체 4A-313으로 처리한 재조합 인간 MS4A4A를 발현시키는 U937 세포에서의 PI%(프로피디움 아이오딘화물) 흡수를 나타낸다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 야생형 huIgG1과 함께 항-MS4A4A 항체 4A-313은 세포에 의해 PI 흡수에서의 증가로서 관찰되는, 보체 침착의 유도 및 표적-발현 세포의 사멸을 상당히 가능하게 한다. 이 효과는 용량 의존적이었다. Fc 영역에서 huIgG1 N325S/L328F 아미노산 치환(이는 C1q 결합을 유의미하게 감소시킴)을 갖는 항-MS4A4A 항체 4A-313은 본 분석에서 CDC를 거의 완전히 없앴다. 추가적으로, Fc 영역에서 huIgG1 K322A 아미노산 치환을 갖는 항-MS4A4A 항체 4A-313은 본 분석에서 CDC 활성이 없는 것과 유사한 효과를 가졌다.
이하의 표 38은 도 19에 나타낸 그래프와 관련된 수치적 값을 나타낸다.
Figure pct00063
이들 결과는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 항-MS4A4A 항체가 보체 의존적 세포독성에서 효과적인 반면, N325S/L328F 아미노산 치환 또는 K322A 아미노산 치환 중 하나의 인간 IgG1 Fc 변이체를 갖는 항-MS4A4A 항체는 보체 의존적 세포독성에서 효과적이지 않다는 것을 나타내었다.
실시예 28: 항체 의존적 세포의 식세포작용(ADCP)에서의 인간 IgG1 Fc 변이체
항체-의존적 세포의 식세포 작용(ADCP)을 매개하는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 능력을 ADCH Reporter Bioassay 시스템(Promega #G9901)을 이용하여 평가하였다. 본 시스템은 FcγRIIa 수용체를 안정하게 발현시키는 조작된 Jurkat T 세포주(H131 변이체) 및 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 이용한다. 본 분석에서 활성은 효과기 세포(이 경우에, 골수성 세포)에 의해 ADCP 활성과 상호 연관된다. 본 명세서에서 사용한 표적 세포는 재조합 인간 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포 또는 단핵구로부터 유래되고 hIL-4(20ng/㎖) 및 덱사메타손(20nM)에 의해 편극화된 1차 인간 대식세포 중 하나였다.
세포를 ㎖당 1.2×106개의 농도로 분석 완충제(RPMI + 4% 낮은 IgG 혈청)에서 희석시켰고, 25㎕의 세포(웰당 30,000개)를 96-웰 백색 분석 플레이트(Costar 3922)의 내부 웰에 분취시켰다. 플레이트의 외부 웰을 세포 또는 항체 없이 75㎕의 분석 완충제로 채웠다. 세포를 함유하는 웰에, 또한 분석 완충제에서 희석시킨 목적하는 최종 농도의 3배 농도의 25㎕의 항-MS4A4A 항체를 첨가하였다. 표적 세포에 대한 항체의 첨가 후에, 분석 시스템에 제공한 효과기 세포(㎖당 2×107개로 냉동)를 37℃에서 해동시켰고, 630㎕를 3.6㎖의 사전 가온시킨(37℃) 분석 완충제에 첨가하고, 부드럽게 혼합하였다. 25㎕의 효과기 세포(2.5의 E:T 비에 대해 웰당 75,000개)를 표적 세포 및 항체를 함유하는 웰에 직접 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켜 수용체 세포 활성화 및 루시퍼라제 발현을 가능하게 하였다. 이 인큐베이션 후에, 플레이트를 실온(15분)으로 평형상태로 만들고, 이후에 75㎕의 루시퍼라제 분석 시약을 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 플레이트 진탕제 상에서 20분 동안 인큐베이션시키고, BioTek 플레이트 판독기 상에서 발광을 측정하였다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 야생형 huIgG1(Iso Ctrl IgG1)을 본 분석에서 루시퍼라제 활성을 유도하는 데 강력하였고, 이는 FcγRIIa-H131 활성화를 나타낸다. N325S/L328F 아미노산 치환이 있는 huIgG1 Fc를 갖는 항-MS4A4A 항체 4A-313은 Iso Ctlr IgG1에 의해 관찰된 것과 비교할 때 FcγRIIa-H131 활성화의 상당한 손실을 나타내었고; K322A 아미노산 치환이 있는 huIgG1 Fc를 갖는 항-MS4A4A 항체 4A-313은 본 분석에서 유사한 효과를 가졌다.
이하의 표 39는 도 20에 제시한 그래프와 관련된 수치적 값을 제공한다.
Figure pct00064
이들 결과는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 항-MS4A4A 항체가 항체 의존적 세포의 식세포작용에서 효과적이라는 것을 나타내었다. 추가적으로, 이들 결과는 N325S/L328F 아미노산 치환 또는 K322A 아미노산 치환 중 하나의 인간 IgG1 Fc 변이체를 갖는 항-MS4A4A 항체는 또한 보다 적은 정도이긴 하지만 항체 의존적 세포의 식세포작용에 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 29: 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)에서의 인간 IgG1 Fc 변이체
표적 세포에 결합된 항체는 자연 살해 세포 상에서 FcγRIIIa 활성화에 의해 주로 유발되는 것으로 생각되는 활성인 ADCC를 매개할 수 있다. 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC)을 야기하는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 능력을 ADCC Reporter Bioassay 시스템(Promega #G7010)을 이용하여 평가하였다. 본 분석 시스템은 FcγRIIIa 수용체를 안정하게 발현시키는 조작된 Jurkat T 세포주(V158 변이체) 및 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 NFAT 반응 요소를 이용한다. 본 명세서에서 사용한 표적 세포는 재조합 인간 MS4A4A를 과발현시키는 U937 세포 또는 단핵구로부터 유래되고 hIL-4(20ng/㎖) 및 덱사메타손(20nM)에 의해 편극화된 1차 인간 대식세포 중 하나였다. 표적 세포를 ㎖당 1.2×106개의 농도로 분석 완충제(RPMI + 4% 낮은 IgG 혈청)에서 희석시켰고, 25㎕의 세포(웰당 30,000개)를 96-웰 백색 분석 플레이트(Costar 3922)의 내부 웰에 분취시켰다. 플레이트의 외부 웰을 세포 또는 항체 없이 75㎕의 분석 완충제로 채웠다. 세포를 함유하는 웰에, 또한 분석 완충제에서 희석시킨 목적하는 최종 농도의 3배 농도의 25㎕의 항체를 첨가하였다. 표적 세포에 대한 항체의 첨가 후에, 분석 시스템에 제공한 효과기 세포(㎖당 2×107개로 냉동)를 37℃에서 해동시켰고, 630㎕를 3.6㎖의 가온시킨(37℃) 분석 완충제에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고 나서, 표적 세포 및 항체를 함유하는 웰에 25㎕의 효과기 세포(2.5의 E:T 비에 대해 웰당 75,000개)를 즉시 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 6시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켜 수용체 세포 활성화 및 루시퍼라제 발현을 가능하게 하였다. 이 인큐베이션 후에, 플레이트를 실온(15분)으로 평형상태로 만들고, 이후에 75㎕의 루시퍼라제 분석 시약을 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 플레이트 진탕제 상에서 20분 동안 인큐베이션시키고, BioTek 플레이트 판독기 상에서 발광을 측정하였다.
도 21에 나타낸 바와 같이, 야생형 huIgG1(Iso Ctrl IgG1)은 본 분석에서 루시퍼라제 활성을 유도하는 데 강력하였고, 이는 FcγRIIIa-V158 활성화를 나타낸다. N325S/L328F 아미노산 치환이 있는 huIgG1 Fc를 갖는 항-MS4A4A 항체 4A-313은 Iso Ctlr IgG1에 의해 관찰된 것과 비교할 때 FcγRIIa-H131 활성화의 상당한 손실을 나타내었고; K322A 아미노산 치환이 있는 huIgG1 Fc를 갖는 항-MS4A4A 항체 4A-313은 본 분석에서 유사한 효과를 가졌다.
이하의 표 40은 도 21에 제시한 그래프와 관련된 수치적 값을 제공한다.
Figure pct00065
이들 결과는 야생형 hu IgG1 Fc 영역을 갖는 항-MS4A4A 항체가 항체 의존적 세포의 세포독성에서 효과적인 반면, N325S/L328F 아미노산 치환 또는 K322A 아미노산 치환 중 하나의 인간 IgG1 Fc 변이체를 갖는 항-MS4A4A 항체는 항체 의존적 세포의 세포독성에서 효과적이지 않다는 것을 나타내었다.
실시예 30: 1차 인간 대식세포에서 막 및 가용성 TREM2 수준에 대한 MS4A4A 넉아웃의 효과
대식세포에서 막 및 가용성 TREM2 수준에 대한 MS4A4A 넉아웃의 효과를 다음과 같이 시험하였다. 1차 인간 대식세포에서 MS4A4A의 발현을 넉아웃시키기 위해 CRISPR 기술을 사용하였다. 간단히 말해서, tracrRNA(IDT)로 어닐링되는 비-표적(NT), 또는 좌위-특이적 crRNA(IDT; NT1, IDT 음성 대조군 crRNA #1 및 #2; NT2, GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC(서열번호 345) 및 AACCCCTGATTGTATCCGCA(서열번호 346); MS4A4A #1, AATTGTGTACCCGATATACA(서열번호 347); MS4A4A #2, AACCATGCAAGGAATGGAAC(서열번호 348); MS4A4A #3, TATTCATTCCTAGACTACCT(서열번호 349); MS4A4A #4, GCTCTGTACTGGCTGCATCA(서열번호 350))로 이루어진 MS4A4A-특이적 gRNA와 복합체화되는 Cas9 단백질(IDT)을 이용하는 전기천공법에 의해 넉아웃 대식세포를 생성하였다. MS4A4A 넉아웃 효율을 유세포측정 분석에 의해 평가하였고, 90% 초과였다(데이터 미제시).
도 22A 및 도 22B는 막 TREM2(mTREM2) 수준 및 가용성 TREM2(sTREM2) 수준에 대한 MS4A4A 넉아웃 효과를 나타낸다. 도 22A 및 도 22B에서, NT1 및 NT2는 비-표적화 CRISPR 대조군이며; gRNA 2+3 및 gRNA 1+4는 MS4A4A를 넉아웃시키기 위해 사용되는 상이한 가이드를 지칭한다.
도 22A 및 도 22B에 나타낸 바와 같이, 1차 인간 대식세포에서 MS4A4A의 넉아웃은 mTREM2 및 sTREM2 수준의 증가를 초래하였다. MS4A4A 넉아웃 시 관찰된 mTREM2 및 sTREM2의 증가된 수준은 NT1 및 NT2 대조군 세포에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-313의 첨가 시 mTREM2 및 sTREM2 수준의 증가와 비슷하였다. MS4A4A 넉아웃 1차 인간 대식세포의 항-MS4A4A 항체 처리 시, mTREM2 또는 sTREM2 수준의 추가적인 증가는 관찰되지 않았고, 이는 인간 대식세포에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 첨가 시 관찰된 mTREM2 및 sTREM2 수준의 증가가 세포 상에서 MS4A4A에 대한 항-MS4A4A 항체 결합의 결과라는 것을 시사한다.
실시예 31: 항-MS4A4A 항체에 의한 막 및 가용성 TREM2 조절의 동력학
TREM2 단백질의 세포 표면 발현은 원형질막에 그리고 원형질막으로부터의 TREM2의 내포작용/세포외배출에 의해 그리고 막 결합된 프로테아제에 의한 TREM2의 조절된 절단에 의해 조절된다(Thornton et al., 2017, EMBO Mol. Med. 9: 1366-1378; doi: 10.15252/emmm.201707673). 상기 실시예에 기재한 바와 같이, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체에 의한 인간 대식세포의 처리는 막과 가용성 TREM2 수준을 둘 다 증가시켰다. 막 및 가용성 TREM2 수준 변화의 동력학을 추가로 이해하기 위해 다음의 연구를 수행하였다.
가용성 TREM2(sTREM2) 수준 변화를 평가하기 위해, 1차 인간 대식세포를 24-웰 또는 96-웰 플레이트 중 하나에 플레이팅한 후에, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 4A-450.NSLF 또는 아이소타입 대조군 항체(모두 1㎍/㎖)의 첨가가 이어졌다. 항체의 존재 하에 0.5, 1, 4, 24 및 48시간의 세포 배양 후에, 상청액을 수집하고, Meso Scale Discovery를 이용하여 sTREM2 수준을 결정하였다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 첨가 후에 1차 인간 대식세포에서 막 TREM2(mTREM2) 수준 증가의 동력학을 다음과 같이 평가하였다. 1차 인간 대식세포를 분석 3일 전(T - 72시간)에 96-웰 U-바닥 플레이트에서 100,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 다양한 시점(T - 48시간, T - 24시간, T - 4시간, T - 1시간)에, 항체를 플레이팅된 세포에 첨가하였고, 이는 아이소타입 대조군 항체(IsoControl.NSLF) 및 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF를 포함하였다. 플레이팅 후 72시간에, 형광단-접합 항-TREM2 항체를 이용하는 세포의 염색 후에 TREM2의 세포 표면(막 결합된) 발현 수준을 유세포분석에 의해 측정하였다.
도 23A에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 다양한 공여자로부터 얻은 배양된 1차 인간 대식세포의 상청액 중 sTREM2 수준을 급격히 증가시켰다. 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 세포에서 sTREM2 수준을 대략 0.5배 초과로 증가시켰다(대략 50% 증가). 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 세포에서 sTREM2 수준을 대략 2.5배 초과로 증가시켰다(대략 250% 증가).
도 23B에 나타낸 바와 같이, 1차 인간 대식세포에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 첨가 후 1시간 및 4시간에, 막 TREM2 수준은 아이소타입 대조군 항체의 첨가 후 관찰된 것에 비해 감소되었다. 도 23B에서, 점선은 아이소타입 대조군 항체 처리 세포에서 mTREM2 수준을 나타낸다. 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 첨가 후 24시간 및 48시간 시점에, mTREM2 수준은 아이소타입 대조군 항체로 처리된 세포에서 관찰된 것 초과로 증가되었다. 막 TREM2에서의 조기 감소는 도 23A에 나타낸 바와 같이, 시험한 모든 시점에 TREM2 쉐딩(shedding)의 증가와 일치된다.
본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 1차 인간 대식세포에서 TREM2 단백질 수준을 증가시켰기 때문에, 항-MS4A4A 항체 첨가 후 TREM2 mRNA 수준에 대한 효과를 시험하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 1차 인간 대식세포를 24 또는 96-웰 플레이트에서 플레이팅하고, 완전 RPMI에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 아이소타입(1㎍/㎖)으로 처리하였다. 0.5, 1, 4, 24 및 48시간의 인큐베이션 후에, 세포 펠릿을 수집하고, 정량적 PCR 분석(qPCR)을 이용하여 TREM2 mRNA 수준을 결정하였다. 간단히 말해서, RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 이용하여 RNA를 추출하고, QuantiNova 역전사 키트(Qiagen)를 이용하여 총 RNA롤부터 cDNA를 제조하였다. TREM2(Hs00219132_m1) 및 GAPDH(Hs027886624_g1)에 대한 TaqMan 분석을 이용하여 실시간 PCR에 의해 유전자 발현 수준을 분석하였다. 각 샘플에 대한 CT 값을 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대한 CT 값에 대해 정규화시켰다.
도 23C에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF는 다양한 공여자로부터 얻은 배양된 인간 1차 대식세포에서 TREM2 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았고; mRNA 수준에서 일부 부수적 변동이 관찰되었다(아이소타입 대조군에서 관찰된 것보다 0.5배보다 더 적게 초과됨). 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 배양된 인간 1차 대식세포에서 TREM2 mRNA 수준에 영향을 미치는 일 없이 TREM2 단백질 수준을 증가시켰다는 것을 나타내었다.
실시예 32: 항-MS4A4A 항체는 1차 인간 대식세포에서 SPP1 및 IL1RN 분비를 증가시킨다
1차 인간 대식세포에서 오스테오폰틴(SSP1) 및 인터류킨-1 수용체 길항제(IL1RN)의 분비 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하고, 다음과 같이 넉아웃 MS4A4A 발현에 대해 유전자 변형된 1차 인간 대식세포에서 관찰된 것과 비교하였다.
1차 인간 대식세포에서 MS4A4A 유전자 넉아웃을, 단일 gRNA 분자, 또는 표준 절차를 이용하여 tracrRNA로 어닐링되는 crRNA: 비-표적화 NT1(IDT 음성 대조군 RNA #1 및 #2); NT2(GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC[서열번호 345] 및 AACCCCTGATTGTATCCGCA [서열번호 346]); MS4A4A #1(AATTGTGTACCCGATATACA [서열번호 347]); MS4A4A #2(AACCATGCAAGGAATGGAAC[서열번호 348]); MS4A4A #3(TATTCATTCCTAGACTACCT[서열번호 349]); MS4A4A #4, GCTCTGTACTGGCTGCATCA[서열번호 350])(모두 IDT제, 미국 아이오와주 코럴빌에 소재)로 이루어진 gRNA 이중가닥 중 하나의 형태로 가이드 RNA(gRNA)와 복합체화되는 Cas9 단백질을 이용하는 전기천공법에 의해 생성하였다. 이어서, 세포를 완전 RPMI-1640에서 50,000개의 세포/웰로 플레이팅하고, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF(0.1㎍/㎖), 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF(0.1㎍/㎖) 또는 아이소타입 대조군 항체의 존재 하에 48시간 동안 배양시켰다. 세포로부터의 상청액을 수집하고, R&D DuoSet ELISA 키트(IL1RN 카탈로그 번호 DY280, SPP1 카탈로그 번호 DY1433)를 이용하여 IL1RN 및 SPP1 수준을 분석하였다.
항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 또는 4A-450.NSLF 중 하나에 의한 NT 대조군 세포의 처리는 분비된 SPP1 수준의 증가를 초래하였다. 이들 세포에서 MS4A4A의 유전자 넉아웃은 또한 MS4A4A 항체 처리에 의해 보이는 것과 비슷하게 분비된 SPP1 수준의 증가를 초래하였다. 이들 연구에서 SPP1의 수준은 NT 대조군 세포에서 아이소타입 대조군 항체의 첨가 후 대략 100ng/㎖; NT 대조군 세포에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 첨가 후 대략 200ng/㎖; NT 대조군 세포에서 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 첨가 후 대략 275ng/㎖; 및 MS4A4A 넉아웃 세포에서 대략 225ng/㎖였다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체 중 하나의 첨가 후 분비된 SPP1 수준의 증가는 MS4A4A 발현이 유전자 넉아웃된 세포에서 관찰된 것과 비슷하였다.
항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 또는 4A-450.NSLF 중 하나에 의한 NT 대조군 세포의 처리는 분비된 IL1RN 수준의 증가를 초래하였다. 이들 세포에서 MS4A4A의 유전자 넉아웃은 또한 MS4A4A 항체 처리에 의해 보이는 것과 비슷하게 분비된 IL1RN 수준의 증가를 초래하였다. 이들 연구에서 IL1RN의 수준은 NT 대조군 세포에서 아이소타입 대조군 항체의 첨가 후 대략 8ng/㎖; NT 대조군 세포에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 첨가 후 대략 12ng/㎖; NT 대조군 세포에서 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 첨가 후 대략 16ng/㎖; 및 MS4A4A 넉아웃 세포에서 대략 14ng/㎖였다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체 중 하나의 첨가 후 분비된 IL1RN 수준의 증가는 MS4A4A 발현이 유전자 넉아웃된 세포에서 관찰된 것과 비슷하였다.
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 1차 인간 대식세포에서 SPP1 및 IL1RN의 증가된 분비 수준에서 효과적이라는 것을 나타내었다. 추가적으로, 이들 결과는 SPP1 및 IL1RN 수준을 증가시키는 것에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과가 MS4A4A의 발현이 유전적으로 넉아웃될 때 관찰된 것과 유사하다는 것을 나타내었고, 이는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 이들 세포에서 MS4A4A의 활성을 감소 또는 차단시켜, SPP1 및 IL1RN 수준의 관찰된 증가를 초래하였다는 것을 시사한다.
실시예 33: 인간 대식세포에서 항-MS4A4A 항체-유도된 생존도는 TREM2-독립적이다
상기 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 항-MS4A4A 항체 첨가 후 1차 인간 대식세포 생존도 증가에서(총 세포 ATP 증가에 의해 측정되는 바와 같음) 효과적이었다. 추가적으로, 상기 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 세포에서 막 TREM2 수준을 증가시켰다. 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 막 TREM2 수준을 증가시키고, 항-MS4A4A 항체는 세포 생존도를 증가시켰기 때문에, 항-MS4A4A 항체 첨가에 반응하여 관찰된 세포 생존도의 증가가, 적어도 부분적으로, TREM2-의존적인지의 여부를 시험하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 이를 연구하기 위해, TREM2 발현을 유전적으로 결여하는 1차 인간 대식세포에서 세포 생존도에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해 CRISPR 기술을 이용하여 인간 1차 대식세포에서 TREM2를 유전자 넉아웃시켰다.
TREM2 넉아웃 대식세포를, 단일 gRNA 분자, 또는 tracrRNA로 어닐링되는 crRNA: 비-표적화 1(NT1)(IDT 음성 대조군 crRNA #1 및 #2); NT2(GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC[서열번호 345] 및 AACCCCTGATTGTATCCGCA[서열번호 346]); TREM2 #1(GCCATCACAGACGATACCCT[서열번호 351]); TREM2 #2(ATAGGGGCAAGACACCTGCA[서열번호 352]); TREM2 #3(CAGCATCCCGGTGATCCAGG[서열번호 353]); TREM2 #4,　TGGAGATCTCTGGTTCCCCG[서열번호 354])(모두 IDT제, 미국 아이오와주 코럴빌에 소재)로 이루어진 gRNA 이중가닥 중 하나의 형태로 가이드 RNA(gRNA)와 복합체화되는 Cas9 단백질을 이용하는 천기천공법에 의해 생성하였다.
이어서, 세포를 완전 RPMI-1640에서 50,000개의 세포/웰로 플레이팅하고, 48시간 동안 용액 중 항-MS4A4A 항체(4A-313 NSLF, 4A-450 NSLF), 또는 아이소타입 대조군 항체(모두 0.1㎍/㎖)의 존재 하에 배양시켰다. 이어서, 제조업자의 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존도 키트(Promega, 카탈로그 번호 G7571)를 이용하여 세포 내의 ATP 함량을 정량화하였다.
항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLFor 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 첨가는 아이소타입 대조군 항체에 의해 관찰된 것과 비교할 때 NT 대조군 세포에서의 ATP 수준을 대략 20%만큼 증가시켰다. 추가적으로, TREM2 넉아웃 세포에 대한 항-MS4A4A 항체 첨가는 아이소타입 대조군 항체에 의해 관찰된 것보다 대략 15% 내지 20% 초과만큼 증가된 ATP 수준을 초래하였다. 종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 세포의 ATP 수준(및 그에 따른 세포 생존도)을, 적어도 부분적으로, TREM2-독립적 방식으로 증가시킨다는 것을 나타내었다.
실시예 34: MS4A4A의 siRNA 넉아웃은 1차 인간 대식세포에서 막 및 가용성 TREM2 수준을 증가시킨다
상기 나타낸 바와 같이, CRISPR 기술을 이용하는 MS4A4A 발현의 유전자 제거(genetic ablation)는 인간 대식세포에서 증가된 막 및 가용성 TREM2 수준을 초래하였다. 이들 결과를 추가로 뒷받침하기 위해, 독립적 실험 접근을 이용하여 TREM2 수준에 대한 MS4A4A 발현의 상실 효과를 평가하였다. 이들 연구에서, 1차 인간 대식세포에서 MS4A4A의 siRNA 넉다운을 수행하였고, 막 및 가용성 TREM2 수준에 대한 이의 효과를 측정하였다.
N-TER 나노입자 siRNA 형질감염 시스템(Millipore Sigma)을 이용하여 대조군(Millipore Sigma, SIC001) 및 MS4A4A-표적화 siRNA(Millipore Sigma, SASI_Hs01_00150955)를 형질감염시킴으로써 MS4A4A 넉다운 대식세포를 생성하였다. MS4A4A 넉아웃 효율을 유세포측정 분석에 의해 평가하였다(데이터 미제시). 형광단-접합 항-TREM2 항체를 이용하는 세포의 염색 후에 TREM2의 세포 표면(막 결합된) 발현을 유세포분석에 의해 측정하였다.
도 24A 및 도 24B에 나타낸 바와 같이, MS4A4A 발현의 siRNA 넉다운은 각각 막 TREM2 수준 및 가용성 TREM2 수준의 증가를 야기하였다. 도 24A 및 도 24B에서, 연결된 도트의 각 세트는 (총 6명의 공여자에 대해) siRNA 넉다운이 있는 그리고 이것이 없는 한 명의 개개 공여자로부터의 평균 결과를 나타낸다. 이들 데이터는 상기 기재한 유전자 조작된 MS4A4A 넉아웃 세포에서 증가된 mTREM2 및 sTREM2 수준을 나타내는 유사한 결과와 일치된다. 종합하면, 이들 결과는 MS4A4A 발현 또는 활성의 상실이 1차 인간 대식세포에서 가용성 TREM2 수준과 막 TREM2 수준을 둘 다 증가시켰다는 것을 나타내었다.
실시예 35: 시험관내 mTREM2, sTREM2 및 ATP 수준 증가에서의 항-MS4A4A 항체 효능
(실시예 24 및 25에서 앞서 상기 기재한 바와 같은) mTREM2, sTREM2 및 ATP 수준 증가에서 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 3명의 개별 공여자로부터 얻은 1차 인간 대식세포에서 추가로 시험하였다. 1차 인간 대식세포를 다양한 농도의 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 4A-450.NSLF로 48시간 동안 처리하였다. 이어서, mTREM2, sTREM2 및 ATP 수준의 변화를 측정하였다.
도 25A, 도 25B 및 도 25C에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF는 각각 3명의 상이한 공여자로부터 얻은 1차 인간 대식세포에서 용량 의존적 방식으로 mTREM2 수준을 증가시켰다. 도 25A, 도 25B 및 도 25C의 데이터는 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 관찰된 것 이상으로 mTREM2 수준의 배수-증가를 제공한다(x-축은 항체 농도(㎍/㎖)를 나타내고, y-축은 1.0으로 설정한 대조군 이상으로 배수-증가를 나타낸다). EC50 값 및 최대 반응을 결정하기 위해 이들 그래프로부터의 데이터를 분석하였고; 이들 결과를 이하의 표 41에 나타낸다(평균 +/- SEM으로 나타냄).
Figure pct00066
도 26A, 도 26B 및 도 26C에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF는 각각 3명의 상이한 공여자로부터 얻은 1차 인간 대식세포에서 용량 의존적 방식으로 sTREM2 수준을 증가시켰다. 도 26A, 도 26B 및 도 26C의 데이터는 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 관찰된 것 이상으로 sTREM2 수준의 배수-증가를 제공한다(x-축은 항체 농도(㎍/㎖)를 나타내고, y-축은 1.0으로 설정한 대조군 이상으로 배수-증가를 나타낸다). EC50 값 및 최대 반응을 결정하기 위해 이들 그래프로부터의 데이터를 분석하였고; 이들 결과를 이하의 표 42에 나타낸다(평균 +/- SEM으로 나타냄).
Figure pct00067
도 27A, 도 27B 및 도 27C에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF는 각각 3명의 상이한 공여자로부터 얻은 1차 인간 대식세포에서 용량 의존적 방식으로 세포 ATP 수준을 증가시켰다. 도 27A, 도 27B 및 도 27C의 데이터는 아이소타입 대조군 항체를 이용하여 관찰된 것 이상으로 세포 ATP 수준의 배수-증가를 제공한다(x-축은 항체 농도(㎍/㎖)를 나타내고, y-축은 1.0으로 설정한 대조군 이상으로 배수-증가를 나타낸다). EC50 값 및 최대 반응을 결정하기 위해 이들 그래프로부터의 데이터를 분석하였고; 이들 결과를 이하의 표 43에 나타낸다(평균 +/- SEM으로 나타냄).
Figure pct00068
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 항체 첨가 후 mTREM2, sTREM2 및 세포 ATP의 증가된 수준에 의해 입증되는 바와 같이 1차 인간 대식세포에서의 기능적 변화를 유도하였다는 것을 나타내었다.
실시예 36: 항-MS4A4A 항체는 CSF1R 저해 유도 세포사를 구제한다
CSF1R 저해 후 인간 대식세포의 생존을 지속하는 MS4A4A의 능력을 평가하기 위해, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체를 CSF1R 저해제인 PLX3397의 존재 하에 세포 생존을 향상시키는 이들의 연구에 대해 연구하였다(문헌[DeNardo et al., Cancer Discov (2011) 1(1):54-67. 22039576); Peng, et al., J. of Exp Canc Res (2019) 38(1):372. PMID: 31438996] 참조).
RosetteSep 인간 단핵구 풍부 프로토콜(Stem Cell Technologies)을 이용하여 전혈로부터 인간 단핵구를 단리시켰다. 인간 단핵구 유래 대식세포를 제조하기 위해, 단핵구를 계수하고, 완전 RPMI 배지(Glutamax, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨 및 10% 열 비활성화된 소태아 혈청으로 보충한 RPMI) 및 50ng/㎖ MCSF(Peprotech)에서 플레이팅하였다. 6일 후에, 분화된 단핵구(대식세포)를 채취하고, 50ng/㎖ M-CSF를 갖는 완전 RPMI 배지에서 0.1×106개 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 대식세포를 밤새 회수하였다. 제7일에, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 4A-450.NSLF를 PLX3397(1μM)와 함께 및 이것 없이 배양된 대식세포에 첨가하였다. 모든 항체를 1㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 사멸 세포를 표지하는 DNA 염료인 cytotox red 시약(Essen Bioscience)을 이용하여 세포 생존도를 결정하였다. IncuCyte Live Cell 영상화 시스템(Essen Bioscience)을 이용하여 며칠에 걸쳐 형광 신호를 측정함으로써 cytotox red 시약 수준을 결정하였다.
도 28A에 나타낸 바와 같이, PLX3397 및 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF로 처리한 인간 대식세포는 PLX3397 + 아이소타입 대조군 항체로 처리한 세포에서 관찰된 것과 비교할 때 cytotox red 계수의 감소를 나타내었다. 도 28A의 데이터를 평균 ± SEM으로서 그래프화한다; 3명의 인간 공여자로부터 N = 3.
도 28B에 나타낸 바와 같이, PLX3397 및 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF로 처리한 인간 대식세포는 PLX3397 + 아이소타입 대조군 항체로 처리한 세포에서 관찰된 것과 비교할 때 cytotox red 계수의 감소를 나타내었다. 도 28B의 데이터를 평균 ± SEM으로서 그래프화한다; 3명의 인간 공여자로부터 N = 3.
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 CSF1R 저해 후 인간 대식세포의 세포사 및 지속된 생존을 감소시켰다는 것을 나타내었다. 따라서, 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체는 CSF1R-결핍 질환 또는 장애, 예컨대, ALSP 또는 HDLS를 갖는 개체를 치료하는 데 유용하다.
실시예 37: 사이노몰거스 원숭이 혈청에서 항-MS4A4A 항체의 약물동태학
생체내 혈청 중 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 약물동태학(PK)을 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이(cyno)에 정맥내 볼루스 주사에 의해 80㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT, 4A-25.WT, 4A-18.WT 또는 아이소타입 대조군(huIgG1)을 투여하였다. 각 동물 그룹에 총 5회 용량을 투여하였고; 제1 용량과 제2 용량을 28일 간격만큼 분리하며, 남아있는 4회 용량은 각 용량 사이에 7일 간격만큼 분리하였다.
투약 전, 항체 투여 후 0.5, 4, 6, 10, 12, 24, 48, 96, 168, 192, 264, 312, 336, 480, 504, 648, 672, 672.5, 684, 720, 840, 840.5, 852, 888, 1008, 1008.5, 1014, 1020, 1032, 1056, 1104, 1176, 1188 및 1224시간에 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였다.
포획 시약으로서 바이오틴 표지 염소 항-인간 IgG(카탈로그 번호 NBP1-74983; Novus Biologicals) 및 검출 시약으로서 Alexa fluor® 647 표지 항-인간 IgG(카탈로그 번호 2049-31; Southern Biotech)를 갖는 단계별 샌드위치 형식에 기반하는 맞춤 Gyrolab 분석을 이용하여 사이노몰거스 원숭이 혈청 중 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT, 4A-25.WT 및 4A-18.WT 수준을 측정하였다. Rexxip HN 완충제(카탈로그 번호 P0004996, Gyrolab)에서 표준, 품질 관리 및 샘플을 희석시켰다. gyrolab bioaffy 200 CD의 스트렙타비딘 코팅 친화도 칼럼에 결합된 바이오틴일화된 항-인간 IgG에 의해 샘플에 존재하는 항-MS4A4A 항체를 포획하였다. 형광 표지된 항-인간 IgG 항체에 의해 포획한 항-MS4A4A 항체를 검출하였다. 생성된 형광 신호 강도는 샘플에 존재하는 항-MS4A4A 항체의 양에 비례하였다. Gyrolab xP 및 Excel을 이용하여 데이터를 분석하였다.
동물에 대한 80㎎/㎏ 용량의 투여 후에, 혈청 중 항-MS4A4A 항체 농도는 평균 최대 관찰 농도(Cmax)에 도달된 후 지속적으로 감소되었고, 평균 반감기(t1/2) 값(평균 ± SD)은 제1일(제1 투약일) 투여 후 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT에 대해 140 ± 54.5시간, 항-MS4A4A 항체 4A-25.WT에 대해 269 ± 114시간, 및 항-MS4A4A 항체 4A-18.WT에 대해 193 ± 26.8시간이었다. 클리어런스(CL)는 t1/2에 반비례하며, 평균 CL(평균 ± SD)은 제1일에 항체 4A-21.WT에 대해 0.625　±　0.107㎖/hr/㎏, 항체 4A-25.WT에 대해 0.124 ± 0.025㎖/hr/㎏ 및 항체 4A-18.WT에 대해 0.402 ± 0.09㎖/hr/㎏이었다. 제1일에 정상 상태 분포 용적(Vss) 값은 항체 4A-21.WT, 4A-25.WT, 4A-18.WT 그룹 각각에 대해 30.8 내지 51.4㎖/㎏, 22.6 내지 41.7㎖/㎏, 및 24.9 내지 41.3㎖/㎏의 범위였다.
Cmax 및 투약 후 0 내지 168시간에 농도-시간 곡선하 면적(AUC0-168)에 의해 노출을 평가하였다. 제1일에, 항체 4A-25.WT는 가장 큰 평균 Cmax(6.26×106ng/㎖) 다음에, 항체 4A-18.WT(4.81×106ng/㎖)를 가졌다. 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT(3.53 ×106ng/㎖)는 시험 항목 중에서 가장 큰 Cmax를 가졌다.
항-MS4A4A 항체 4A-25.WT 및 4A-18.WT는 유사한 AUC0-168(각각 3.47×108 ng*hr/㎖ 및 3.35×108ng*hr/㎖)를 가졌고, 이는 항체 4A-21(1.15×108ng*hr/㎖)보다 유의미하게 더 높았다.
실시예 38: 항-MS4A4A 항체는 생체내 혈청 및 CSF sTREM2 수준을 증가시킨다
생체내 혈청 및 뇌척수액(CSF) 중 sTREM2 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 정맥내 볼루스 주사에 의해 80㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT, 4A-25.WT, 4A-18.WT 또는 아이소타입 대조군(huIgG1)을 투여하였다. 각 그룹에 총 5회 용량을 투여하였고; 제1 용량과 제2 용량을 28일 간격만큼 분리하며, 남아있는 4회 용량은 각 용량 사이에 7일 간격만큼 분리하였다.
투약 전, 항체 투여 후 0.5, 4, 6, 10, 12, 24, 48, 96, 168, 192, 264, 312, 336, 480, 504, 648, 672, 672.5, 684, 720, 840, 840.5, 852, 888, 1008, 1008.5, 1014, 1020, 1032, 1056, 1104, 1176, 1188 및 1224시간에 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 투약 전, 항체 투여 후 0.5, 4, 6, 10, 12, 24, 48, 96, 168, 192, 264, 312, 336, 480, 504, 648, 672, 672.5, 684, 720, 840, 840.5, 852, 888, 1008, 1008.5, 1014, 1020, 1032, 1056, 1104, 1176, 1188 및 1224시간에 동물로부터 CSF 샘플을 또한 수집하였다.
혈청에서, 항-MS4A4A 항체 4A-25.WT, 4A-18.WT 및 4A-21.WT의 투여 후, sTREM2 수준은 이들의 투약 전 기준선 수준, 제1 항체 용량의 투여 후 48 내지 96시간의 232%, 261% 및 287%의 피크 수준으로 각각 기준선으로부터 2배 초과로 증가되었다. 더 나아가, 혈청 중 sTREM2 수준은 제29일, 제36일, 제43일 및 제50일에 항-MS4A4A 항체의 반복된 매주 투약에 의해 상승된 채로 남아있었고, 평균 sTREM2 수준은 투약 전 기준선 수준에서 관찰된 것의 대략 2배(214%, 4A-25.WT; 226%, 4A-18.WT; 199%, 4A-21.WT) 초과였다. 아이소타입 대조군은 투약 기간 내내 투약 전 수준(기준선의 107%)에 가깝게 남아있었다.
CSF에서, sTREM2 수준은 아이소타입 대조군 처리 동물에서 관찰된 것과 비교할 때, 항-MS4A4A 항체 4A.21.WT(p=0.0008, 2-원 ANOVA) 및 4A-25.WT(p=0.004, 2-원 ANOVA) 각각의 투여 후에, 24 및 96시간에 유의미하게 증가되었다. 4A-18.WT 처리군에서 sTREM2 수준은 아이소타입 대조군에서 관찰된 것과 유사하게 남아있었다.
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 생체내 혈청과 CSF 둘 다의 sTREM2 수준 증가에서 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 39: 항-MS4A4A 항체는 생체내 CSF 오스테오폰틴 수준을 증가시킨다
생체내 CSF 중 오스테오폰틴 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 정맥내 볼루스 주사에 의해 80㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT, 4A-25.WT, 4A-18.WT 또는 아이소타입 대조군(huIgG1)을 투여하였다. 각 그룹에 총 5회 용량을 투여하였고; 제1 용량과 제2 용량을 28일 간격만큼 분리하며, 남아있는 4회 용량은 각 용량 사이에 7일 간격만큼 분리하였다. 투약 전, 항체 투여 후 0.5, 4, 6, 10, 12, 24, 48, 96, 168, 192, 264, 312, 336, 480, 504, 648, 672, 672.5, 684, 720, 840, 840.5, 852, 888, 1008, 1008.5, 1014, 1020, 1032, 1056, 1104, 1176, 1188 및 1224시간에 동물로부터 CSF 샘플을 수집하였다.
항-MS4A4A 항체 4A-25.WT, 4A-18.WT 및 4A-21.WT는 아이소타입 대조군 항체에 의해 관찰되는 것과 비교할 때 CSF 중 오스테오폰틴 수준을 유의미하게 증가시켰다.
항-MS4A4A 항체 4A-21.WT의 반복 투여는 아이소타입 대조군에 비교할 때 제1 투약 후 12시간에 대략 280ng/㎖(p< 0.0001, 2-원 ANOVA)까지 최고가 되고 후속 투약 후 12 내지 24시간에 계속해서 최고 수준을 나타내는 유의미하게 증가된 CSF 오스테오폰틴 수준을 초래하였다. 항-MS4A4A 항체 4A-25.WT 및 항체 4A-18.WT의 반복 투여는 아이소타입 대조군과 비교할 때 각 투약 후 12 내지 24시간에 (대략 50 내지 80ng/㎖ 수준까지) 증가된 CSF 오스테오폰틴 수준의 경향을 나타내었다.
이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 생체내 CSF에서의 오스테오폰틴 수준 증가에서 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 40: 항-MS4A4A 항체는 생체내 다양한 뇌 영역에서 오스테오폰틴 수준을 증가시킨다
생체내 사이노몰거스 원숭이의 전두엽 피질 및 해마 중 오스테오폰틴 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 정맥내 볼루스 주사에 의해 80㎎/㎖의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT, 4A-25.WT, 4A-18.WT 또는 아이소타입 대조군(huIgG1)을 투여하였다. 각 그룹에 총 5회 용량을 투여하였고; 제1 용량과 제2 용량을 각 용량 사이에 28일 간격만큼 분리하며, 남아있는 4회 용량은 각 용량 사이에 7일 간격만큼 분리하였다. 제5 투약 후 48시간에 동물을 안락사시키고, 전두엽 피질 및 해마를 제거하고, 냉동시켰다.
뇌 조직 내 오스테오폰틴 수준을 다음과 같이 측정하였다. N-Per Neuronal 단백질 추출 시약(카탈로그 번호 87792, Thermo Scientific) 및 Halt 프로테아제 저해제(카탈로그 번호 1861278)를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 20분 동안 얼음 상에서 냉동된 뇌 샘플을 용해시켰다. 샘플을 원심분리시키고, 상청액을 새로운 관에 옮기고, 추가 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 각 샘플에서 총 단백질 농도를 제조업자의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트(카탈로그 번호 23225, Thermo Scientific)에 의해 측정하였다. 단백질 농도값을 뇌 조직에서 측정한 분석물 농도를 정규화하는 데 사용하였다.
사이노몰거스 원숭이의 뇌 조직에서 오스테오폰틴 수준은 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT에 의한 처리 후에 증가되었다. 사이노몰거스 원숭이에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT의 반복 투여는 아이소타입 대조군 항체에 의해 관찰된 것과 비교할 때 사이노몰거스 원숭이의 전두엽 피질에서 유의미하게 증가된(각각 p < 0.035 및 p = 0.0003; 1원 ANOVA) 오스테오폰틴 수준을 초래하였다. 특히, 항체 투여 후 전두엽 피질에서 측정된 평균 오스테오폰틴 수준은 다음과 같ㅌ다: 대략 0.6ng/㎎(아이소타입 대조군 항체); 대략 1.2ng/㎎(4A-21.WT); 대략 0.7ng/㎎(4A-25.WT 및 4A-18.WT). 항-MS4A4A 항체의 반복 투여는 아이소타입 대조군 항체에 의해 관찰된 것과 비교할 때 사이노몰거스 원숭이의 해마에서 증가된 오스테오폰틴 수준의 경향을 초래하였다. 특히, 항체 투여 후 해마에서 측정된 평균 오스테오폰틴 수준은 다음과 같았다: 대략 1.3ng/㎎(아이소타입 대조군 항체); 대략 1.8ng/㎎(4A-21.WT 및 4A-18.WT); 및 대략 2.4ng/㎎(4A-25.WT). 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류의 전두엽 피질 및 해마에서 오스테오폰틴 수준 증가에 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 41: CSF 단백질 바이오마커에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
항-MS4A4A 항체 4A-21.WT(80㎎/㎏)의 말초 주사를 투여한 사이노몰거스 원숭이로부터 얻은 뇌척수액을 생체내 단백질 바이오마커 발현의 변화에 대해 추가로 분석하였다. 이들 연구에서, 항체 주사 후 24시간에 동물로부터 얻은 CSF 샘플 상에서 수행한 Somalogic Somascan 1.3k 분석을 이용하여 CSF 중 단백질 발현 수준의 변화를 측정하였다.
사이노몰거스 원숭이에 대한 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT의 투여 후 CSF 중 단백질 변화를 관찰하였다. 도 29는 항-MS4A4A 항체 4A-21.WT(80㎎/㎏)의 말초 주사 후 사이노몰거스 원숭이로부터 취한 3개의 CSF 샘플로부터의 프로테옴-와이드 효과를 제시하는 화산 도표이다. 화산 도표에서 각각의 점은 1개의 단백질을 나타낸다. 각 측정 단백질에 대해, x-축 상의 값은 항체 처리 동물과 대조군 동물 사이의 CSF 중 단백질 수준에서의 배수변화 차이를 나타내고; y축 상의 값은 이들 관찰된 차이의 유의도를 나타내며, 이를 ANOVA에 의해 평가되는 차등 발현에 대한 p-값의 마이너스 log10로서 표현한다. 도 29의 단백질 기호는 1E-3 미만의 p-값을 갖는 대조군 동물에 비해 항체-처리된 동물에서 차등 발현된 단백질에 대해 제공된다.
도 29에 나타내는 바와 같이, 항-MS4A4A 항체를 투여한 동물에서 오스테오폰틴(SSP1) 및 IL1RN(2개의 미세아교세포 마커)에서 CSF 수준의 증가가 관찰되었다. 종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류의 CSF와 혈청 둘 다에서 IL1RN 및 오스테오폰틴 단백질 수준을 증가시켰다는 것을 나타내었다.
실시예 42: 항-MS4A4A 항체는 생체내 혈청 sTREM2 수준을 증가시킨다
비-인간 영장류에서 수행한 다른 일련의 실험에서 생체내 혈청 및 뇌척수액(CSF) 중 sTREM2 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 추가로 시험하였다.
사이노몰거스 원숭이에 80㎎/㎖의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 4A-313.WT 및 4A-450.NSLF; 250㎎/㎖의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 또는 정맥내 볼루스 주사에 의해 비히클 대조군을 투여하였다. 각 그룹에 총 4회의 용량을 투여하였으며; 제1 용량과 제2 용량은 7일의 간격만큼 분리하고, 제2 용량과 제3 용량을 14일의 간격만큼 분리하며, 제3 용량과 제4 용량은 28일의 간격만큼 분리하였다.
투약 전, 항체 투여 후 0.5, 2, 6, 10, 24, 34, 48, 72, 96, 168, 168.5, 170, 174, 178, 192, 216, 240, 264, 336, 408, 504, 504.5, 506, 510, 514, 528, 552, 576, 600, 672, 744, 840, 912, 1008, 1176, 1186, 1200 및 1224시간에 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였고; 또한 투약 전, 항체 투여 후 0.5, 2, 6, 10, 24, 34, 48, 72, 96, 168, 168.5, 170, 174, 178, 192, 216, 240, 264, 336, 408, 504, 504.5, 506, 510, 514, 528, 552, 576, 600, 672, 744, 840, 912, 1008, 1176, 1186, 1200 및 1224시간에 동물로부터 CSF 샘플을 수집하였다.
혈청 중 sTREM 수준을 다음과 같이 측정하였다. 단일 스팟 Meso Scale Discovery(MSD) 플레이트(메릴랜드주 록빌에 소재)를 4℃에서 밤새 PBS 중 포획 항체로 코팅하였다. 원숭이 혈청 샘플(뿐만 아니라 원숭이 TREM2-Fc 표준)을 결합 완충제에서 희석시키고, 1시간 동안 실온에서 웰에 첨가하였다. 바이오틴일화된 염소 항-인간 TREM2 다클론성 항체(R&D Systems)을 결합 완충제에서 1:2,000 희석으로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에, 설포 태그 스트렙타비딘(MSD)으로 검출하였다. 150　㎕의 1× 판독 완충제를 플레이트에 첨가하고, 이어서, 플레이트를 분석하였다.
이들 연구 결과를 도 30에 나타낸다. 혈청에서, sTREM2 수준은 투약 후 24시간에 80㎎/㎏으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 투여 후 기준선(투약 전 기준선 수준의 대략 150%)에서 관찰된 것의 대략 1.5배 초과로 증가되었다. sTREM2 수준은 시간에 따라 계속해서 증가되어, 80㎎/㎏으로 다중 투약 후 기준선(투약 전 기준선 수준의 대략 300%)에서 관찰된 것의 최대 3배 초과 수준에 도달되었다.
250㎎/㎏의 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 용량에서, 혈청 sTREM2 수준은 투약 후 24시간에 기준선에서 관찰된 것의 대략 1.5배로 증가되었고, 시간에 따라 계속해서 증가되어, 250㎎/㎏의 다회 투약 후 기준선에서 관찰된 것의 최대 4.8배 수준에 도달되었다.
80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.WT의 투여 후, 혈청 sTREM2 수준은 투약 후 24시간에 시작해서 기준선에서 관찰된 것의 대략 1.5배로 증가되었다. 80㎎/㎏에서 4A-313.WT의 반복 용량에 의해, 혈청 sTREM2 수준은 기준선에서 관찰된 것의 최대 3배까지 증가되었다.
80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 투여 후, 혈청 sTREM2 수준은 투약 후 24시간에 기준선에서 관찰된 것의 대략 2배로 증가되어, 80㎎/㎏에서 4A-450.NSLF의 다중 투약 후 기준선에서 관찰된 것의 최대 3배 수준에 도달되었다.
종합하면, 이들 결과는 본 발명의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류 중 혈청 중 sTREM2 수준의 증가에서 효과적이었다는 것을 나타내었다.
실시예 43: 항-MS4A4A 항체는 생체내 CSF 오스테오폰틴 수준을 증가시킨다
생체내 뇌척수액(CSF) 중 오스테오폰틴 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 80㎎/㎖의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 4A-313.WT 4A-450.NSLF; 250㎎/㎖의 용량으로 4A-313.NSLF, 또는 정맥내 볼루스 주사에 의해 비히클 대조군을 투여하였다. 각 그룹에 총 4회의 용량을 투여하였으며; 제1 용량과 제2 용량은 7일의 간격만큼 분리하고, 제2 용량과 제3 용량을 14일의 간격만큼 분리하며, 제3 용량과 제4 용량은 28일의 간격만큼 분리하였다.
투약 전, 항체 투여 후 0.5, 2, 6, 10, 24, 34, 48, 72, 96, 168, 168.5, 170, 174, 178, 192, 216, 240, 264, 336, 408, 504, 504.5, 506, 510, 514, 528, 552, 576, 600, 672, 744, 840, 912, 1008, 1176, 1186, 1200 및 1224시간에 동물로부터 CSF 샘플을 수집하였다.
CSF 중 오스테오폰틴 수준을 다음과 같이 측정하였다. 단일 스팟 Meso Scale Discovery(MSD) 플레이트(메릴랜드주 록빌에 소재)를 4℃에서 밤새 PBS 중 포획 항체로 코팅하였다. 원숭이 CSF 샘플을 결합 완충제에서 희석시키고, 1시간 동안 실온에서 웰에 첨가하였다. 바이오틴일화된 염소 항-인간 오스테오폰틴 다클론성 항체(R&D Systems)을 결합 완충제에서 1:2,000 희석으로 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에, 설포 태그 스트렙타비딘(MSD)으로 검출하였다. 150　㎕의 1× 판독 완충제를 플레이트에 첨가하고, 이어서, 플레이트를 Sector Imager(MSD) 상에서 분석하였다.
사이노몰거스 원숭이의 CSF 중 오스테오폰틴 수준은 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 증가되었다. 80㎎/㎏ 및 250㎎/㎏ 용량에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 투여 후, CSF 오스테오폰틴 수준은 평균적으로 각각 기준선에서 관찰된 대략 13배 및 6배에서 최고로 되었고, 제1 투약 후 24시간 다음에, 기준선 수준의 1.5배로 감소되었다(도 31A 및 도 31B). 80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF의 반복 용량에 의해, CSF 오스테오폰틴 수준은 각 투약 후 10 내지 24시간에 최고로 되었고, 기준선 수준에서 관찰된 것의 3배 내지 5배의 피크 수준에 도달되었다(도 31A). 250㎎/㎏의 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF에서 반복 용량에 의해, CSF 오스테오폰틴 수준은 증가되었고, 제2 투약 후 기준선 168시간까지 관찰된 것의 14배의 피크 수준(도 31B) 및 후속 투약 후 기준선 24 내지 48시간에 관찰된 것의 4배 내지 5배의 피크 수준에 도달되었다(도 31B).
80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 투여 후, CSF 오스테오폰틴 수준은 기준선에 관찰된 것의 대략 13배로 최고가 되었고, 제1 투약 후 24시간 다음에 기준선 수준까지 감소되었다(도 31C 및 도 31D). 80㎎/㎏에서 4A-450.NSLF의 반복된 용량에 의해, CSF 오스테오폰틴 수준은 각 투약 후 24시간에 최고로 되었고, 기준선 수준에서 관찰된 것의 6배 내지 9배의 피크 수준에 도달되었다(도 31C).
80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-313.WT의 반복 투여 후, CSF 오스테오폰틴 수준은 기준선에서 관찰된 것의 대략 1.5배로 최고가 되었고, 각 투약 후 24시간 후에 기준선 수준으로 감소되었다(도 31D).
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류에서 CSF 중 오스테오폰틴 수준 증가에서 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 44: 항-MS4A4A 항체는 생체내 다양한 뇌 영역에서 오스테오폰틴 수준을 증가시킨다
생체내 전두엽 피질 및 해마 중 오스테오폰틴 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 80㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 4A-313.WT 및 4A-450.NSLF, 250㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 또는 정맥내 볼루스 주사에 의해 비히클 대조군을 투여하였다. 각 그룹에 총 4회의 용량을 투여하였으며; 제1 용량과 제2 용량은 7일의 간격만큼 분리하고, 제2 용량과 제3 용량을 14일의 간격만큼 분리하며, 제3 용량과 제4 용량은 28일의 간격만큼 분리하였다. 제4 투약 후 48시간에 동물을 안락사시키고, 전두엽 피질 및 해마를 제거하고, 냉동시켰다.
뇌 조직 내 오스테오폰틴 수준을 다음과 같이 측정하였다. N-Per Neuronal 단백질 추출 시약(카탈로그 번호 87792, Thermo Scientific) 및 Halt 프로테아제 저해제(카탈로그 번호 1861278)를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 20분 동안 얼음 상에서 냉동된 뇌 샘플을 용해시켰다. 샘플을 원심분리시키고, 상청액을 새로운 관에 옮기고, 추가 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 각 샘플에서 총 단백질 농도를 제조업자의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트(카탈로그 번호 23225, Thermo Scientific)에 의해 측정하였다. 단백질 농도값을 뇌 조직에서 측정한 분석물 농도를 정규화하는 데 사용하였다.
사이노몰거스 원숭이의 뇌 조직에서 오스테오폰틴 수준은 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 투여 후에 증가되었다. 80㎎/㎏에서 항체 4A-450.NSLF의 반복 투여는 대조군 동물에서 관찰된 것과 비교할 때, 사이노몰거스 원숭이의 전두엽 피질에서 유의미하게 증가된 오스테오폰틴 수준(p = 0.027, t-검정)을 초래하였다(도 32A). 유사하게, 80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 반복 투여는 대조군 처리 동물에서 관찰된 것과 비교할 때, 사이노몰거스 원숭이의 해마에서 유의미하게 증가된 오스테오폰틴 수준(p = 0.027, t-검정)을 초래하였다(도 32B).
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류의 뇌조직(예를 들어, 전두엽 피질 및 해마)에서 오스테오폰틴 수준 증가에 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 45: 항-MS4A4A 항체는 생체내 다양한 뇌 영역에서 CSF1R 수준을 증가시킨다
생체내 전두엽 피질 및 해마 중 집락 자극 인자 1 수용체(CSF1R) 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 80㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 4A-313.WT 및 4A-450.NSLF, 250㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 또는 정맥내 주입에 의해 비히클 대조군을 투여하였다. 각 그룹에 총 4회의 용량을 투여하였으며; 제1 용량과 제2 용량은 7일의 간격만큼 분리하고, 제2 용량과 제3 용량을 14일의 간격만큼 분리하며, 제3 용량과 제4 용량은 28일의 간격만큼 분리하였다. 제4 투약 후 48시간에 동물을 안락사시키고, 전두엽 피질 및 해마를 제거하고, 냉동시켰다.
뇌 조직 내 CSF1R 수준을 다음과 같이 측정하였다. N-Per Neuronal 단백질 추출 시약(카탈로그 번호 87792, Thermo Scientific) 및 Halt 프로테아제 저해제(카탈로그 번호 1861278)를 이용하여 제조업자의 지침에 따라 20분 동안 얼음 상에서 냉동된 뇌 샘플을 용해시켰다. 샘플을 원심분리시키고, 상청액을 새로운 관에 옮기고, 추가 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 각 샘플에서 총 단백질 농도를 제조업자의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트(카탈로그 번호 23225, Thermo Scientific)에 의해 측정하였다. 단백질 농도값을 뇌 조직에서 측정한 분석물 농도를 정규화하는 데 사용하였다.
사이노몰거스 원숭이의 뇌 조직에서 CSF1R 수준은 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF와 함께 투여 후에 증가되었다. 250㎎/㎏에서 항체 4A-313.NSLF의 반복 투여는 대조군 처리 동물에서 관찰된 것과 비교할 때, 사이노몰거스 원숭이의 전두엽 피질에서 유의미하게 증가된(p = 0.046, t-검정) CSF1R 수준을 초래하였다(도 33A). 유사하게, 80㎎/㎏에서 항-MS4A4A 항체 4A-450.NSLF의 반복 투여는 대조군 동물에서 관찰된 것과 비교할 때, 사이노몰거스 원숭이의 해마에서 유의미하게 증가된(p = 0.013, t-검정) CSF1R 수준을 초래하였다(도 33B).
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류의 뇌조직(예를 들어, 전두엽 피질 및 해마)에서 CSF1R 수준 증가에 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 46: 항-MS4A4A 항체는 생체내 다양한 뇌 영역에서 총 TREM2 수준을 증가시킨다
생체내 전두엽 피질 및 해마 중 가용성 TREM2 및 막 TREM2(총 TREM2) 수준에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 시험하기 위해, 다음의 연구를 수행하였다.
사이노몰거스 원숭이에 80㎎/㎏의 용량으로 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, 4A-313.WT, 4A-450.NSLF, 250㎎/㎏의 용량으로 4A-313.NSLF, 또는 정맥내 볼루스 주사에 의해 비히클 대조군을 투여하였다. 각 그룹에 총 4회의 용량을 투여하였으며; 제1 용량과 제2 용량은 7일의 간격만큼 분리하고, 제2 용량과 제3 용량을 14일의 간격만큼 분리하며, 제3 용량과 제4 용량은 28일의 간격만큼 분리하였다. 제4 투약 후 48시간에 동물을 안락사시키고, 전두엽 피질 및 해마를 제거하고, 냉동시켰다. 이들 뇌 영역에서 총 TREM2 수준을 측정하였다.
사이노몰거스 원숭이의 뇌 조직에서 총 TREM2 수준은 항-MS4A4A 항체, 4A-313.NSLF, 4A-313.WT 및 4A-450.NSLF에 의한 처리 후에 증가되었다. 250㎎/㎏에서 항체 4A-313.NSLF의 반복 투여는 대조군 처리 동물에서 관찰된 것과 비교할 때 사이노몰거스 원숭이의 해마에서 총 TREM2 수준의 통계적으로 유의미한 증가(p=0.014, 1원 ANOVA)를 초래하였다(도 34A). 250㎎/㎏의 항체 4A-313.NSLF 및 80㎎/㎏의 항체 4A-313.WT의 반복 투여는 대조군 처리 동물에서 관찰된 것과 비교할 때, 사이노몰거스 원숭이의 전두엽 피질에서 증가된 TREM2 수준의 경향을 초래하였다(도 34B).
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 비-인간 영장류의 뇌조직(예를 들어, 전두엽 피질 및 해마)에서 TREM2 수준 증가에 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 47: 생체내 미세아교세포에서 유전자 발현 프로파일에 대한 항-MS4A4A 항체의 효과
상기 기재한 바와 같은 사이노몰거스 원숭이에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 투여 후 미세아교세포 RNAseq 분석에 의해 측정된 바와 같은 유전자 발현의 변화를 다음과 같이 수행하였다. 항-MS4A4A 항체는 항체 4A-313.WT(80㎎/㎏), 4A-313.NSLF(80㎎/㎏ 및 250㎎/㎏) 및 4A-450.NSLF(80㎎/㎏)를 포함하였다. 동물을 최종적으로 죽인 후에, 파편을 제거하기 위해 가벼운 수동 해리 프로토콜 후에 Percoll 구배 분리를 이용하여 전두엽 피질 샘플을 해리시켰다. 세포 펠릿을 20분 동안 Cd11b 항체로 염색하고, 세척 후, DAPI로 표지하고, 미세아교세포의 FACS 단리를 위해 처리하였다. DAPI-:CD11b+ 세포를 350㎕ 또는 RLT plus 완충제(Qiagen)에 직접 분류하였고, RNA 단리를 위해 세포를 직접 처리하였다. 테이프 장치를 이용하여 RNA 품질을 결정하고, Lexogen QuantSeq에 대한 낮은 입력 프로토콜을 약간 변형해서 이용하여 라이브러리를 생성하였다. 테이프 장치를 이용하여 라이브러리를 정량화하고, Next Seq를 이용하여 서열분석하였다. Lexogen 다중 오류 수정 툴을 이용하여 서열분석 데이터를 탈다중복합화하고, 분석하였다.
도 35A, 도 35B 및 도 35C에 나타낸 바와 같이, 사이노몰거스 원숭이에서 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 말초 주사는 이들 비-인간 영장류로부터 단리한 FACS-분류 미세아교세포에서 RNAseq 분석에 의해 측정된 바와 같이 미세아교세포의 유전자 발현 변화를 초래하였다. 미세아교세포에서 항-MS4A4A 항체 처리에 의한 강한 유도를 나타내는 유전자 중에 미세아교세포 활성화(C-형 렉틴 도메인 패밀리 7 구성원 A, CLEC7A), 미세아교세포 이동(이노시톨 1,4,5-트라이포스페이트 수용체 2, ITPR2) 및 미세아교세포 증식(항원 KI-67(MKI67))의 마커가 있다(도 35A). 미세아교세포 활성화의 추가적인 마커의 변화를 또한 관찰하였고, 도 35B에 나타낸 바와 같이 미세아교세포 활성화 마커 IL1RN, SPP1 및 1-포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트 포스포다이에스터라제 감마-2(PLCG2)를 포함하였다. 도 35C. 2개의 항상성 미세아교세포 마커(퓨린 수용체 P2RY12 및 CX3C 케모카인 수용체 1(CX3CR1))에 대한 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체의 효과를 도 35C에 나타내고, 여기서 이들 2개의 항상성 미세아교세포 마커의 발현 수준은 다음의 항-MS4A4A 항체 처리를 감소시켰다. 도 35A, 도 35B 및 도 35C의 데이터는 log2 척도로 평균으로서 제시하고, 오차 막대는 SEM이며, 실험군당 및 시간당 N=5이다.
종합하면, 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 미세아교세포 활성화, 이동 및 증식과 관련된 단백질의 다양한 mRNA 수준을 증가시킴으로써; 그리고 미세아교세포 항상성과 관련된 단백질의 다양한 mRNA 수준을 감소시킴으로써 입증된 바와 같이 미세아교세포를 활성화시키는 데 효과적이라는 것을 나타내었다.
실시예 48: 항-MS4A4A 항체는 U937 세포 상에서 HA-Snorkel-태그된 MS4A4A의 표면 발현을 감소시킨다
U937 세포(ATCC CRL-1593.2)를 snorkel 태그로 태그된 인간 MS4A4A를 암호화하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다(막관통 도메인 다음에 HA-태그를 인간 MS4A4A의 세포질 C-말단에 부착하였다). 이 방법에서, 태그는 세포외에서 나타나지만, 막 단백질과 구조적으로 별개이다. 플라스미드 형질감염 및 항생제 선택 후에 형질감염된 U937 세포는 생존 가능하였다. 이어서, 세포를 유세포분석을 이용하여 인간 MS4A4A 단백질 세포 표면 발현에 대해 선별하고, 다음의 연구에서 사용하기 위해 단지 5%의 가장 양성인 세포를 수집하였다.
상기 기재한 바와 같이 생성한 재조합 인간 MS4A4A-snorkel를 과발현시키는 U937 세포를 이들 연구에서 표적 세포로서 사용하였다. 세포를 PMA(25ng/㎖)로 24시간 동안 전처리하고, 이어서, 채취하고, 0.01, 0.1 및 1㎍/㎖의 최종 농도로 PMA 및 항-MS4A4A 항체 및 아이소타입 대조군과 함께 RPMI 1640 완전 배지 내 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 100,000개의 세포/웰로 파종하였다. 세포를 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 차가운 FACS 완충제(PBS + 2% FBS)로 세척하고, 50 ㎕의 1:200 희석 항-HA 태그 단클론성 항체(ThermoFisher, A-21287)를 웰마다 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시키고, 세포를 또한 생존도 식별을 위해 Aqua Live/Dead로 표지하였다. 세포를 차가운 FACS 완충제로 2× 세척하고, 200㎕의 FACS 완충제 중에서 재현탁시켰다. FACSCanto 시스템(BD Biosciences) 상에서 유세포분석을 수행하였다. 중위 형광 강도를 이용하여 결합 데이터를 분석하였다.
도 36에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF, d4A-450.NSLF는 용량 관련 방식으로 인간 MS4A4A-snorkel-태그된 단백질을 발현시키는 U937 세포에서 원형질막 MS4A4A의 수준을 감소시켰다. 1㎍/㎖의 가장 높은 항-MS4A4A 항체 농도에서, 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF 및 4A-450.NSLF는 아이소타입 대조군 항체로 처리된 세포에서 관찰된 것과 비교할 때 표면 MS4A4A 수준을 대략 50%만큼 감소시켰다. 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 재조합 인간 MS4A4A-snorkel을 발현시키는 U937 세포에서 세포 표면 MS4A4A 수준을 감소 또는 하향조절하였다는 것을 나타내었다.
실시예 49: 항-MS4A4A 항체는 1차 인간 골수성 세포에서 당단백질 비전이성 흑색종 단백질 B (GPNMB) 단백질 수준을 조절한다
GPNMB는 조직 대식세포 및 미세아교세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서 발현되는 표면 당단백질이다. 몇몇 유전자 변이체는 파킨슨병(PD) 위험과 관련되었다. GPNMB 단백질 수준는 PD 환자의 흑질에서 상승되며, GPNMB 수준은 라이소좀 스트레스 후에 증가된다(Moloney et.al., 2018, Neurobio Dis. 120: 1-11). 추가적으로, GPNMB의 증가된 발현은 SNP rs199347과 연관되며, 이 위험 SNP는 GPNMB 유전자 내에 위치된다(Murthy et al, 2017, 18:121-133). MS4A4A가 GPNMB의 발현 수준을 조절할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 2명의 공여자(공여자 #1117 및 #1118)로부터의 인간 1차 대식세포를 48시간 동안 다양한 농도의 항-MS4A4A 항체 4A-313.NSLF로 처리하였다. 세포를 형광단과 접합된 항-GPNMB 항체로 염색한 후에 유세포 분석에 의해 세포 표면(막 결합된) GPNMB를 측정하였다.
도 37에 나타낸 바와 같이, 항-MS4A4A 항체 4A.313.NSLF의 세포에 대한 첨가 후 인간 1차 대식세포에서 막 GPNMB 수준이 감소되었다. 항-MS4A4A 항체 처리에 반응한 GPNMB 수준의 감소는 용량-의존적 방식이었다. 이들 결과는 본 개시내용의 항-MS4A4A 항체가 골수성 세포, 예를 들어, 대식세포에서 GPNMB의 세포 표면 발현 수준 감소에서 효과적이라는 것을 나타내었다.
야생형 huIgG1의 야생형 huIgG1 또는 Fc 변이체를 갖는 예시적인 항-MS4A4A 항체 중쇄 아미노산 서열:
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
SEQUENCE LISTING <110> ALECTOR LLC <120> ANTI-MS4A4A ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF <130> WO/2021/022083 <140> PCT/US2020/044335 <141> 2020-07-30 <150> US 63/057,142 <151> 2020-07-27 <150> US 62/960,606 <151> 2020-01-13 <150> US 62/947,449 <151> 2019-12-12 <150> US 62/892,467 <151> 2019-08-27 <150> US 62/881,187 <151> 2019-07-31 <160> 365 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Gln Thr Tyr Ser Arg His Cys Arg Pro Glu Glu Ser Thr Phe 1 5 10 15 Ser Ala Ala Met Thr Thr Met Gln Gly Met Glu Gln Ala Met Pro Gly 20 25 30 Ala Gly Pro Gly Val Pro Gln Leu Gly Asn Met Ala Val Ile His Ser 35 40 45 His Leu Trp Lys Gly Leu Gln Glu Lys Phe Leu Lys Gly Glu Pro Lys 50 55 60 Val Leu Gly Val Val Gln Ile Leu Thr Ala Leu Met Ser Leu Ser Met 65 70 75 80 Gly Ile Thr Met Met Cys Met Ala Ser Asn Thr Tyr Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Ile Ser Val Tyr Ile Gly Tyr Thr Ile Trp Gly Ser Val Met Phe Ile 100 105 110 Ile Ser Gly Ser Leu Ser Ile Ala Ala Gly Ile Arg Thr 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Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ile Asp Phe His Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 364 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A-419 - full length light chain <400> 364 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Arg Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ala Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ile Asp Phe His Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 365 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4A-313 - full length light chain <400> 365 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Arg Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (85)

  1. MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 94, 108, 116, 146, 147, 308 및 311로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 96, 97, 98, 99, 110, 111, 118, 119, 120, 121, 122, 149, 150, 151, 152, 153, 309 및 312로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 102, 100, 101, 102, 112, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 154, 310 및 313으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 104, 103, 113, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 156, 157, 158, 314 및 317로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 105, 106, 114, 139, 140, 141, 142, 143, 159, 160, 161, 315 및 318로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 107, 115, 144, 145, 163, 316 및 319로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 96 내지 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 102, 100 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 104 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 105 내지 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 110 내지 111로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 118 내지 122로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 123 내지 129로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 130 내지 138로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 139 내지 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 144 내지 145로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 146 내지 147로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 149 내지 153으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 156 내지 158로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 159 내지 161로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열번호 312의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며; 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 317의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열번호 318의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열번호 319의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  9. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 항체 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 또는 4A-450의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는, 항체.
  10. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 항체 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 또는 4A-450의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  11. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 항체는 항체 4A-301, 4A-302, 4A-303, 4A-304, 4A-305, 4A-306, 4A-307, 4A-308, 4A-309, 4A-310, 4A-311, 4A-312, 4A-313, 4A-314, 4A-419 또는 4A-450의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  12. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 항체 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 또는 4A-331의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는, 항체.
  13. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 항체 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 또는 4A-331의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  14. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 항체는 항체 4A-315, 4A-316, 4A-317, 4A-318, 4A-319, 4A-320, 4A-321, 4A-322, 4A-323, 4A-324, 4A-325, 4A-326, 4A-327, 4A-328, 4A-329, 4A-330 또는 4A-331의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  15. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 항체 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-362, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 또는 4A-381의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는, 항체.
  16. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 항체 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-362, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 또는 4A-381의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  17. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 항체는 항체 4A-332, 4A-333, 4A-334, 4A-335, 4A-336, 4A-337, 4A-338, 4A-339, 4A-340, 4A-341, 4A-342, 4A-343, 4A-344, 4A-345, 4A-346, 4A-347, 4A-348, 4A-349, 4A-350, 4A-351, 4A-352, 4A-353, 4A-354, 4A-355, 4A-356, 4A-357, 4A-358, 4A-359, 4A-360, 4A-361, 4A-362, 4A-363, 4A-364, 4A-365, 4A-366, 4A-367, 4A-368, 4A-369, 4A-370, 4A-371, 4A-372, 4A-373, 4A-374, 4A-375, 4A-376, 4A-377, 4A-378, 4A-379, 4A-380 또는 4A-381의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  18. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 항체 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 또는 4A-390의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는, 항체.
  19. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 항체 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 또는 4A-390의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  20. MS4A4A 단백질에 결합하는 항체로서, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 항체는 항체 4A-382, 4A-383, 4A-384, 4A-385, 4A-386, 4A-387, 4A-388, 4A-389 또는 4A-390의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는, 항체.
  21. 제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 내지 15, 304 및 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  22. 제1항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 24 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  23. 제1항 또는 제15항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  24. 제1항 또는 제18항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 76 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  25. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 17 내지 22, 305 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  26. 제1항 또는 제13항에 있어서, 상기 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 32 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  27. 제1항 또는 제16항에 있어서, 상기 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 55 내지 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  28. 제1항 또는 제19항에 있어서, 상기 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 86 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  29. 제1항 또는 제11항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 5 내지 15, 304 및 306으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 17 내지 22, 305 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  30. 제1항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 24 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 32 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  31. 제1항 또는 제17항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 40 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 55 내지 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  32. 제1항 또는 제20항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 76 내지 84로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 86 내지 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  33. 제1항, 제2항, 제4항, 제6항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 320 내지 343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  34. 제1항, 제2항, 제6항, 제9항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 336 내지 343으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 선택적으로 상기 경쇄는 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 더 포함하는, 항체.
  35. 제1항, 제7항, 제9항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 320 내지 327로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 305의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 선택적으로 상기 경쇄는 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 더 포함하는, 항체.
  36. 제1항, 제8항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 328 내지 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 307의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 선택적으로 상기 경쇄는 서열번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 더 포함하는, 항체.
  37. 제1항, 제2항, 제6항, 제9항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 355 내지 362로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 365의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  38. 제1항, 제7항, 제9항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 320 내지 327로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 363의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  39. 제1항, 제8항 내지 제11항, 제21항, 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하되, 상기 중쇄는 서열번호 328 내지 335로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 364의 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  40. 제2항에 있어서, 상기 항체는:
    a. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며, 그리고 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2 및 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역;
    b. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는
    c. 중쇄 및 경쇄로서, 상기 중쇄는 서열번호 359 또는 360의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 365의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 중쇄 및 경쇄
    를 포함하는, 항체.
  41. 제7항에 있어서, 상기 항체는:
    a. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 304의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 305의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는
    b. 중쇄 및 경쇄로서, 상기 중쇄는 서열번호 324 또는 325의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 363의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 중쇄 및 경쇄
    를 포함하는, 항체.
  42. 제8항에 있어서, 상기 항체는:
    a. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 306의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 307의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역; 또는
    b. 중쇄 및 경쇄로서, 상기 중쇄는 서열번호 332 또는 333의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 364의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 중쇄 및 경쇄
    를 포함하는, 항체.
  43. MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체로서, MS4A4A에 대한 결합에 대해 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체 중 하나 이상과의 결합을 경쟁적으로 저해하는, 단리된 항체.
  44. MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체로서, MS4A4A 상에서 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 항체와 동일한 또는 중복되는 에피토프에 본질적으로 결합하는, 단리된 항체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(서열번호 178) 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하되, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 잔기 프롤린 163에 결합하지 않는, 항체.
  46. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 MS4A4A의 세포외 도메인 1에 결합하는, 항체.
  47. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 CMASNTYGSNPIS(서열번호 177) 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는, 항체.
  48. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 MS4A4A의 세포외 도메인 2에 결합하는, 항체.
  49. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS(서열번호 178) 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는, 항체.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 또는 인간화된, 항체.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 MS4A4A의 세포 표면 수준을 감소시키거나, MS4A4A의 세포내 수준을 감소시키는, 항체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 골수성 세포에서 가용성 TREM2 수준을 증가시키거나, 막 TREM2 수준을 증가시키거나, 또는 가용성 TREM2를 증가시키고, 막 TREM2 수준을 증가시키는, 항체.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 골수성 세포 상에서 M2 세포 표면 마커의 발현을 감소시키는, 항체.
  54. 제53항에 있어서, 상기 항체는 골수성 세포 상에서 CD200R, Dectin-1 또는 CD163의 발현을 감소시키는, 항체.
  55. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 골수성 세포 상에서 겔솔린(gelsolin) 및/또는 오스테오폰틴(osteopontin)의 mRNA 및/또는 단백질 발현을 증가시키는, 항체.
  56. MS4A4A 단백질에 결합하는 단리된 항체로서, 골수성 세포 상에서 겔솔린 및/또는 오스테오폰틴의 mRNA 및/또는 단백질 발현을 증가시키는, 단리된 항체.
  57. 제56항에 있어서, 상기 골수성 세포는 인간 대식세포인, 항체.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 항체는 인간 또는 인간화된, 항체.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 4A-18, 4A-25, 4A-214, 4A-21 및 4A-202로 이루어진 군으로부터 선택된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 항체.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 골수성 세포 상에서 M2 마커의 발현을 감소시키는, 항체.
  61. 제60항에 있어서, 상기 골수성 세포는 인간 대식세포인, 항체.
  62. 제61항에 있어서, 상기 M2 마커는 CD200R, Dectin-1 및/또는 CD163인, 항체.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 대식세포 상의 막 TREM2를 적어도 50%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 250%만큼 증가시키는, 항체.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간 대식세포 상청액 중 가용성 TREM2를 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70%만큼 증가시키는, 항체.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인, 항체.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 인간 MS4A4A에 결합하는, 항체.
  67. 제66항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 3의 사이노몰거스 원숭이 MS4A4A에 추가로 결합하는, 항체.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG 부류를 갖고, IgG1, IgG2 또는 IgG4 아이소타입을 갖는, 항체.
  69. 제68항에 있어서, 상기 항체는 IgG1 아이소타입을 갖는, 항체.
  70. 제69항에 있어서, 상기 항체는 EU 넘버링에 따른 N325S 및 L328F 돌연변이를 포함하는 변형된 Fc를 포함하는, 항체.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체 단편인, 항체.
  72. 제71항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편인, 항체.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 제1 항원 및 제2 항원을 인식하는 이중특이성 항체인, 항체.
  74. 제73항에 있어서, 상기 제1 항원은 MS4A4A이고, 상기 제2 항원은 하기 (a) 내지 (e)인, 항체:
    (a) 혈액-뇌-장벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하는 항원;
    (b) 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 저밀도 지방단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 형질도입 도메인, TAT, Syn-B, 페너트라틴, 폴리-알기닌 펩타이드, 안지오펩타이드 및 ANG1005로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 수송을 용이하게 하는 항원;
    (c) 질환-원인 펩타이드 또는 단백질 또는 질환-원인 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환-원인 제제로서, 상기 질환-원인 핵산은 안티센스 GGCCCC(G2C4) 반복부-확장 RNA이고, 상기 질환-원인 단백질은 아밀로이드 베타, 올리고머 아밀로이드 베타, 아밀로이드 베타 플라크, 아밀로이드 전구체 단백질 또는 이의 단편, 타우, IAPP, 알파-시뉴클레인, TDP-43, FUS 단백질, C9orf72(염색체 9 오픈 리딩 프레임 72), c9RAN 단백질, 프리온 단백질, PrPSc, 헌팅턴, 칼시토닌, 슈퍼옥사이드 디스무타제, 아탁신, 아탁신 1, 아탁신 2, 아탁신 3, 아탁신 7, 아탁신 8, 아탁신 10, 루이소체, 심방나트륨이뇨인자, 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드, 인슐린, 아포지방단백질 AI, 혈청 아밀로이드 A, 메딘, 프로락틴, 트랜스타이레틴, 라이소자임, 베타 2 마이크로글로불린, 겔솔린, 케라토에피텔린, 시스타틴, 면역글로불린 경쇄 AL, S-IBM 단백질, 반복부-관련 비-ATG(RAN) 번역 산물, 다이펩타이드 반복부(DPR) 펩타이드, 글리신-알라닌(GA) 반복부 펩타이드, 글리신-프롤린(GP) 반복부 펩타이드, 글리신-알기닌(GR) 반복부 펩타이드, 프롤린-알라닌(PA) 반복부 펩타이드, 유비퀴틴 및 프롤린-알기닌(PR) 반복부 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된, 상기 질환-원인 제제;
    (d) 면역 세포 상에서 발현된 리간드 및/또는 단백질로서, CD40, OX40, ICOS, CD28, CD137/4-1BB, CD27, GITR, PD-L1, CTLA-4, PD-L2, PD-1, B7-H3, B7-H4, HVEM, BTLA, KIR, GAL9, TIM3, A2AR, LAG-3 및 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택된, 상기 리간드 및/또는 단백질; 또는
    (e) 하나 이상의 종양 세포 상에서 발현된 단백질, 지질, 다당류, 또는 당지질.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는, 단리된 핵산.
  76. 제75항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  77. 제75항의 핵산 또는 제76항의 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  78. 인간 MS4A4A에 결합하는 항체의 생성 방법으로서, 상기 항체가 생성되도록 제77항의 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 세포에 의해 생성된 상기 항체를 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  80. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  81. 알츠하이머병, 후발성 알츠하이머병 및 인지기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환, 장애 또는 손상을 갖는 개체에서의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법으로서, 상기 질환, 장애 또는 손상의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  82. MS4A4A의 과발현 또는 증가된 활성에 의해 야기되거나 또는 이와 관련된 질환, 장애, 병태를 갖는 개체에서의 질환, 장애, 병태의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법으로서, 상기 질환, 장애 또는 손상의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. CSF1R-결핍 질환 또는 장애를 갖는 개체에서의 질환 또는 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료 방법으로서, 상기 질환 또는 장애의 예방, 위험 감소 또는 치료가 필요한 개체에게 치료적 유효량의 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 CSF1R-결핍 질환 또는 장애는 축삭 회전타원체 및 색소침착된 아교세포(axonal spheroids and pigmented glia: ALSP) 또는 유전성 미만성 백질뇌병증(hereditary diffuse leukoencephalopath: HDLS)을 수반한 성인-발병 백질뇌병증인, 방법.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 투여 전 및/또는 투여 후에 오스테오폰틴, 겔솔린, 막 TREM2 및/또는 가용성 TREM2의 수준을 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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