TW202120547A - 抗ms4a4a抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示案概言之係關於包括特異性地結合MS4A4A多肽例如哺乳動物MS4A4A或人類MS4A4A之抗體例如單株抗體、人類化抗體及抗體片段之組合物，及此等組合物在預防、降低風險或治療有需要之個體中之用途。

Description

抗MS4A4A抗體及其使用方法
本揭示案係關於抗MS4A4A抗體及此等抗體之治療用途。
跨膜4結構域亞家族A (MS4A)基因簇存在於染色體11q12上且包括18個基因。MS4A基因家族編碼通常具有四跨拓撲結構之膜蛋白質(Ishibashi等人，2001, Gene, 265:87-93；Liang及Tedder, 2001, Genomics, 72:119-127；Efthymiou及Goate, 2017, Molecular Neurodegeneration, 12:43)。跨膜結構域由一個細胞內環及兩個細胞外環互連，其中N及C末端二者均位於胞質液內。大多數MS4A蛋白與MS4A1 (CD20)共有胺基酸序列同源性(20-30%相似度)，其中最高程度之序列一致性存在於前三個跨膜結構域中。該等跨膜區域內跨越不同MS4A蛋白高度保守之基元提示跨膜結構域在MS4A蛋白功能中具有重要的一般性作用。MS4A蛋白之間變化最大之區域存在於其N及C末端細胞質結構域及推定的第二細胞外環內(Ishibashi等人，2001, Gene, 265:87-93)，此表明該等區域賦予獨特之功能性質。
儘管存在此多樣性，但MS4A結構域具有一些共有元件。舉例而言，在MS4A蛋白(MS4A8B及MS4A12除外)中保守之一個顯著特徵係在推定的第二細胞外環中之可形成二硫橋之兩個半胱胺酸殘基之保守性。MS4A蛋白之N及C末端結構域亦富含脯胺酸殘基，但其功能意義仍待闡明(Hulett等人，2001, Genomics, 72:119-127)。然而，富含脯胺酸之區域通常參與各種細胞過程，諸如細胞骨架重排、轉錄起始、信號傳導級聯及與SH3結構域締合作為轉接系統之一部分以促進蛋白質-蛋白質相互作用(Kay等人，2000, FASEB J, 14:231-241)。
MS4A蛋白家族在功能上相對未表徵，一些重要的例外：MS4A1 (CD20)僅在B淋巴球中表現，在此該蛋白質藉由B細胞抗原受體及鈣流入具有信號傳導功能。CD20係用以使慢性淋巴球性白血病、淋巴瘤、自體免疫疾病及實體器官移植中之致病性B細胞耗竭之免疫治療抗體之靶標。MS4A2 (FcεRβ)係肥胖細胞上之高親和力IgE受體(FcεRI)及低親和力IgG受體(FcεRIII)之信號傳導亞單元，其在過敏性及過敏反應中具有關鍵作用。MS4A2係ITAM結構域蛋白質，其經由4蛋白質高親和力IgE受體複合物放大信號。MS4A3 (Htm4)在淋巴樣及骨髓樣細胞之細胞內膜上表現，且在細胞週期調控中起轉接蛋白之作用。
儘管大多數MS4A家族成員未表徵，但有報導表明MS4A蛋白用作多種外源性及內源性配位體(包括脂肪酸、肽及硫酸化類固醇)之化學感測器及化學受體，且參與調介鈣流入、調控胞吞作用、輸送，且可用作信號轉導複合物之轉接子(Cruse等人，2015, Mol Biol Cell, 26:1711-1727；Greer等人，2016, Cell, 165:1734-1748；Eon Kuek等人，2016, Cell, 165:1734-1748；Koslowski等人，2008, Cancer Res, 68:3458-3466；Bubien等人，1993；J Cell Biol, 121:1121-1132)。
某些MS4A基因已在遺傳學上與各種病症及疾病、尤其神經退化性病症相關。舉例而言，全基因體顯著性關聯分析已鑑別出位於染色體11q12上之MS4A基因簇，其為最顯著之阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)基因座之一。一個所鑑別出之尤為受關注基因係MS4A4A (Lambert等人，2013, Nat Genet, 45:1452-1458；Hollingworth等人，2011, Nat Genet, 43:429-435；Naj等人，2011, Nat Genet, 43:436-441)。
因此，業內需要靶向MS4A4A之療法，包括特異性地結合至MS4A4A之抗體，及/或能夠調節(例如抑制或降低；活化或增強) MS4A4A活性之療法，諸如藉由降低或提高MS4A4A蛋白水準或活性，以便治療與MS4A4A活性相關之各種疾病、病症及疾患。
本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案及公開案)均係以全文引用的方式併入本文中。
本揭示案概言之係關於抗MS4A4A抗體及使用此等抗體之方法。本文所提供之方法可用於預防、降低風險或治療患有神經退化性疾病、病症或疾患之個體。在一些實施例中，本揭示案提供預防、降低風險或治療患有選自阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、失智症及認知損害之神經退化性疾病、病症或疾患之個體之方法，該方法包括向有需要之該個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。在一些實施例中，本揭示案提供預防、降低風險或治療患有與MS4A4A之表現或活性增加相關之疾病、病症或疾患之個體之方法，該方法包括向有需要之該個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。
在一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括選自SEQ ID NO:94、108、116、146、147、308及311之胺基酸序列；HVR-H2，其包括選自SEQ ID NO:96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309及312之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括選自SEQ ID NO:100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310及313之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括選自SEQ ID NO:103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314及317之胺基酸序列；HVR-L2，其包括選自SEQ ID NO:105、106、114、139、140、141、142、143、159、160、161、315及318之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括選自SEQ ID NO:107、115、144、145、163、316及319之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括SEQ ID NO:94之胺基酸序列；HVR-H2，其包括選自SEQ ID NO:96-99之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括選自SEQ ID NO:100-102之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括選自SEQ ID NO:103-104之胺基酸序列；HVR-L2，其包括選自SEQ ID NO:105-106之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括SEQ ID NO:107之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括SEQ ID NO:308之胺基酸序列；HVR-H2，其包括SEQ ID NO:309之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括SEQ ID NO:310之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括SEQ ID NO:314之胺基酸序列；HVR-L2，其包括SEQ ID NO:315之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括SEQ ID NO:316之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括SEQ ID NO:311之胺基酸序列；HVR-H2，其包括SEQ ID NO:312之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括SEQ ID NO:313之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括SEQ ID NO:317之胺基酸序列；HVR-L2，其包括SEQ ID NO:318之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括SEQ ID NO:319之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括SEQ ID NO:108之胺基酸序列；HVR-H2，其包括選自SEQ ID NO:110-111之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括SEQ ID NO:112之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括SEQ ID NO:113之胺基酸序列；HVR-L2，其包括SEQ ID NO:114之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括SEQ ID NO:115之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括SEQ ID NO:116之胺基酸序列；HVR-H2，其包括選自SEQ ID NO:118-122之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括選自SEQ ID NO:123-129之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括選自SEQ ID NO:130-138之胺基酸序列；HVR-L2，其包括選自SEQ ID NO:139-143之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括選自SEQ ID NO:144-145之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括：HVR-H1，其包括選自SEQ ID NO:146-147之胺基酸序列；HVR-H2，其包括選自SEQ ID NO:149-153之胺基酸序列；及HVR-H3，其包括SEQ ID NO:154之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包括：HVR-L1，其包括選自SEQ ID NO:156-158之胺基酸序列；HVR-L2，其包括選自SEQ ID NO:159-161之胺基酸序列；及HVR-L3，其包括SEQ ID NO:163之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO:5-15、304及306之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO:24-30之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO:40-53之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO:76-84之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO:17-22、305及307之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO:32-36之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO:55-74之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO:86-93之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 5-15、304及306之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 17-22、305及307之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 24-30之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 32-36之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 40-53之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 55-74之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 76-84之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包括選自SEQ ID NO: 86-93之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包括重鏈及輕鏈，其中該重鏈包括選自SEQ ID NO: 320-343之胺基酸序列。在一些實施例中，該重鏈包括選自SEQ ID NO:336-343之胺基酸序列(視情況其中該輕鏈包含有包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之輕鏈可變區，此外視情況其中該輕鏈進一步包含有包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列之恆定區)。在一些實施例中，該重鏈包括選自SEQ ID NO:320-327之胺基酸序列(視情況其中該輕鏈包含有包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列之輕鏈可變區，此外視情況其中該輕鏈進一步包含有包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列之恆定區)。在一些實施例中，該重鏈包括選自SEQ ID NO:328-335之胺基酸序列(視情況其中該輕鏈包含有包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列之輕鏈可變區，此外視情況其中該輕鏈進一步包含有包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列之恆定區)。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列之HVR-H3；且該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列之HVR-L3。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 359或360之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:365之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO:315之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 324或325之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:363之胺基酸序列。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO:317之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 332或333之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:364之胺基酸序列。
在一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體競爭性地抑制本文中之任一實施例之抗體中之一或多者針對結合至MS4A4A之結合。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體與本文中之任一實施例之抗體結合MS4A4A上之基本上相同或重疊之抗原決定基。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體結合至人類MS4A4A之細胞外結構域1。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列CMASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:177)內之一或多個胺基酸殘基。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體結合至人類MS4A4A之細胞外結構域2。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:178)內之一或多個胺基酸殘基。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:178)內之一或多個胺基酸殘基，且此外其中該抗體不結合至SEQ ID NO:1之胺基酸殘基脯胺酸163 (P163)。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，抗MS4A4A抗體係人類抗MS4A4A抗體或人類化抗MS4A4A抗體。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體降低MS4A4A之細胞表面水準或降低MS4A4A之細胞內水準。
在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，MS4A4A蛋白係哺乳動物蛋白質或人類蛋白質。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，MS4A4A蛋白係野生型蛋白質。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，MS4A4A蛋白係天然變異體。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加骨髓樣細胞中之可溶性TREM2水準、增加膜TREM2水準或增加可溶性TREM2且增加膜TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加可溶性TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加膜TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加可溶性TREM2水準及膜TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內增加可溶性TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內增加血清中之可溶性TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內增加腦脊髓液(CSF)中之可溶性TREM2水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內增加血清及CSF中之可溶性TREM2水準。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低骨髓樣細胞上M2細胞表面標記物(例如受體)之表現。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體減少或降低骨髓樣細胞(例如巨噬細胞)中之M2細胞表面標記物之水準。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低骨髓樣細胞上CD200R、Dectin-1或CD163之表現。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體減少或降低骨髓樣細胞(例如巨噬細胞)中之CD200R、Dectin-1及/或CD163之細胞表面水準。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加骨髓樣細胞上凝溶膠蛋白及/或骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質表現。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加骨髓樣細胞上IL1RN之mRNA及/或蛋白質水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加骨髓樣細胞上CSF1R之mRNA及/或蛋白質水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低骨髓樣細胞上嘌呤能受體P2RY12及/或CX3C趨化介素受體1 (CX3CR1)之mRNA及/或蛋白質水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加骨髓樣細胞上1-磷脂醯肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶γ-2 (PLCG2)、C型凝集素結構域家族7膜A (CLEC7A)、肌醇1,4,5-三磷酸受體2 (ITPR2)及/或抗原KI-67 (MK167)之mRNA及/或蛋白質水準。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低骨髓樣細胞上跨膜糖蛋白NMB (GPNMB)之mRNA及/或蛋白質水準。
在一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體增加骨髓樣細胞上凝溶膠蛋白及/或骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質表現。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，骨髓樣細胞係人類巨噬細胞。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體係人類或人類化的。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體係人類抗體、人類化抗體、雙特異性抗體、單株抗體、多價抗體、結合抗體或嵌合抗體。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體與選自4A-18、4A-25、4A-214、4A-21及4A-202之抗體結合至相同的抗原決定基。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體降低骨髓樣細胞上M2標記物之表現。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，骨髓樣細胞係人類巨噬細胞。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，M2標記物係CD200R、Dectin-1及/或CD163。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體使人類巨噬細胞上之漿膜或細胞表面TREM2增加至少50%、90%、100%、150%、200%或250%。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體使人類巨噬細胞上清液中之可溶性TREM2增加至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%或70%。
在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，抗MS4A4A抗體係識別第一抗原及第二抗原之雙特異性抗體。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，該第一抗原係MS4A4A且該第二抗原係促進跨血腦障壁轉運之抗原。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，該第二抗原係選自MS4A4A；運鐵蛋白受體(TR)；胰島素受體(HIR)；胰島素樣生長因子受體(IGFR)；低密度脂蛋白受體相關蛋白質1及2 (LPR-1及LPR-2)；白喉毒素受體CRM197；駱馬單一結構域抗體TMEM 30(A)；蛋白質轉導結構域TAT、Syn-B、穿膜肽；多精胺酸肽；血管肽基礎免疫球蛋白、Glut1及CD98hc；以及ANG1005。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體係單株抗體。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該抗體係人類抗體。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該抗體係人類化抗體。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該抗體係雙特異性抗體。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該抗體係多價抗體。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該抗體係嵌合抗體。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體為IgG類、IgM類或IgA類。在一些實施例中，該抗體為IgG類且具有IgG1、IgG2或IgG4同型。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，該抗體係抗體片段。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，抗體係結合至包括人類MS4A4A或哺乳動物MS4A4A蛋白上之胺基酸殘基的抗原決定基之抗體片段。在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，該抗體片段係Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv或scFv片段。
在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該抗體係識別第一抗原及第二抗原之雙特異性抗體。在可與本文中之任一實施例組合之一些實施例中，該第一抗原係MS4A4A且該第二抗原係： (a)      促進跨血腦障壁轉運之抗原； (b)     選自以下之促進跨血腦障壁轉運之抗原：運鐵蛋白受體(TR)；胰島素受體(HIR)；胰島素樣生長因子受體(IGFR)；低密度脂蛋白受體相關蛋白質1及2 (LPR-1及LPR-2)；白喉毒素受體CRM197；駱馬單一結構域抗體TMEM 30(A)；蛋白質轉導結構域TAT、Syn-B、穿膜肽；多精胺酸肽；血管肽；及ANG1005； (c)      選自致病性肽或蛋白質或致病性核酸之致病劑，其中該等致病性核酸係反義GGCCCC (G2C4)重複序列擴增RNA，該等致病性蛋白質係選自澱粉樣β、寡聚澱粉樣β、澱粉樣β斑塊、澱粉樣前體蛋白質或其片段、Tau、IAPP、α-突觸核蛋白、TDP-43、FUS蛋白、C9orf72 (染色體9開放閱讀框72)、c9RAN蛋白、普里昂蛋白(prion protein)、PrPSc、亨庭頓蛋白(huntingtin)、降血鈣素、超氧化物歧化酶、共濟失調蛋白、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、共濟失調蛋白7、共濟失調蛋白8、共濟失調蛋白10、路易氏體(Lewy body)、心房利鈉因子、胰島澱粉樣多肽、胰島素、載脂蛋白AI、血清澱粉樣A、medin、泌乳素、轉甲狀腺素、溶菌酶、β 2微球蛋白、凝溶膠蛋白、角膜上皮蛋白、胱抑素、免疫球蛋白輕鏈AL、S-IBM蛋白、重複序列相關之非ATG (RAN)轉譯產物、二肽重複序列(DPR)肽、甘胺酸-丙胺酸(GA)重複序列肽、甘胺酸-脯胺酸(GP)重複序列肽、甘胺酸-精胺酸(GR)重複序列肽、脯胺酸-丙胺酸(PA)重複序列肽、泛素及脯胺酸-精胺酸(PR)重複序列肽； (d)     在免疫細胞上表現之配位體及/或蛋白質，其中該等配位體及/或蛋白質係選自CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3及磷酯醯絲胺酸；或 (e)      在一或多種腫瘤細胞上表現之蛋白質、脂質、多糖或糖酯。
在另一態樣中，本揭示案係關於經分離核酸，其包括編碼任一前述實施例之抗體之核酸序列。在一些實施例中，本揭示案係關於載體，其包括任一前述實施例之核酸。在一些實施例中，本揭示案係關於經分離之宿主細胞，其包括任一前述實施例之載體。
在另一態樣中，本揭示案係關於產生結合至人類MS4A4A之抗體之方法，其包括培養任一前述實施例之宿主細胞，使得產生抗MS4A4A抗體。在某些實施例中，該方法進一步包括回收由細胞產生之抗MS4A4A抗體。
在另一態樣中，本揭示案係關於醫藥組合物，其包括任一前述實施例之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在一態樣中，本揭示案係關於預防、降低風險或治療患有選自阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病及認知損害之疾病、病症或損傷之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之任一前述實施例之抗體。在另一態樣中，本揭示案係關於預防、降低風險或治療患有由MS4A4A之過表現或活性增加引起或與其相關之疾病、病症、疾患或損傷之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之任一前述實施例之抗體。在本揭示案之一些實施例中，該方法進一步包括在投與抗體之前及/或之後偵測骨橋蛋白、凝溶膠蛋白、漿膜或細胞表面TREM2及/或可溶性TREM2之水準。
在一態樣中，本揭示案係關於預防、降低風險或治療患有CSF1R缺乏疾病或病症之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之任一前述實施例之抗體。在一些實施例中，CSF1R缺乏疾病或病症係成人發作型腦白質病變伴軸突球樣變及膠質著色(ALSP)或遺傳性瀰漫性腦白質病變(HDLS)。
本揭示案之其他態樣係關於由任一前述實施例之方法所產生的經分離之抗MS4A4A抗體。本揭示案之其他態樣係關於醫藥組合物，其包括任一前述實施例之抗MS4A4A抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括抗體4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419或4A-450之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3 (如表 1 、表 5 、表 30 及表 31 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括抗體4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419或4A-450之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 1 、表 5 、表 30 及表 31 中所示)。
在另一方面，本公開涉及與MS4A4A蛋白結合之抗體，其中該抗體包括含有HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3之重鏈可變區和含有HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包括抗體4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419或4A-450之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 1 、表 5 、表 30 及表 31 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括抗體4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330或4A-331之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3 (如表 2 及表 6 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括抗體4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330或4A-331之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 2 及表 6 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括有包括HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包括HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包括抗體4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330或4A-331之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 2 及表 6 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括抗體4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380或4A-381之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3 (如表 3 及表 7 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括抗體4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380或4A-381之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 3 及表 7 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括有包括HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包括HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包括抗體4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380或4A-381之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 3 及表 7 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包括抗體4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3 (如表 4 及表 8 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包括抗體4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 4 及表 8 中所示)。
在另一態樣中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包括有包括HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包括HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包括抗體4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3 (如表 4 及表 8 中所示)。
在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，本揭示案係關於結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體增加骨髓樣細胞上凝溶膠蛋白及/或骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質表現。在一些實施例中，骨髓樣細胞係巨噬細胞。
在可與本文中之任一實施例組合之某些實施例中，抗MS4A4A抗體特異性地結合至人類MS4A4A、小鼠MS4A4A、食蟹猴MS4A4A或其組合。
應理解，本文所闡述各實施例之性質中之一者、一些或全部可組合以形成本揭示案之其他實施例。本揭示案之該等及其他態樣對熟習此項技術者將變得顯而易見。本揭示案之該等及其他實施例藉由下列詳細說明進一步闡述。
以 ASCII 文本檔案提交序列表
以ASCII文本檔案提交之以下內容係以全文引用的方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：4503_008PC06_Seqlisting_ST25.TXT；創建日期：2020年7月28日；大小：289,448個位元組)。
本揭示案係關於抗MS4A4A抗體(例如單株抗體)；製備及使用此等抗體之方法；包含此等抗體之醫藥組合物；編碼此等抗體之核酸；及包含編碼此等抗體之核酸之宿主細胞。
熟習此項技術者通常充分理解本文所闡述或提及之技術及程序且常使用習用方法對其加以採用，該等方法係諸如所廣泛利用之方法，諸如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編輯(2003)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編輯，Oxford University Press, 2000)。 I. 定義
除非另有指示，否則術語「MS4A4A」或「MS4A4A多肽」在本文中可互換使用，在本文中係指來自任何脊椎動物來源之任何天然MS4A4A，該脊椎動物來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹猴)及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在一些實施例中，該術語涵蓋野生型序列及天然變異體序列(例如剪接變異體或等位基因變異體)二者。在一些實施例中，該術語涵蓋未經處理之「全長」MS4A4A以及自處理細胞產生之MS4A4A之任何形式。在一些實施例中，MS4A4A係人類MS4A4A。在一些實施例中，例示性MS4A4A之胺基酸序列係截至2001年12月1日之Uniprot登錄號Q96JQ5。在一些實施例中，例示性人類MS4A4A之胺基酸序列係SEQ ID NO: 1。
術語「抗MS4A4A抗體」、「結合至MS4A4A之抗體」及「特異性地結合MS4A4A之抗體」係指能夠以足夠親和力結合MS4A4A，使得該抗體可用作靶向MS4A4A之診斷及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，如(例如)藉由放射性免疫分析(RIA)所量測，抗MS4A4A抗體與無關非MS4A4A多肽之結合程度小於該抗體與MS4A4A之結合的約10%。在某些實施例中，結合至MS4A4A之抗體具有＜ 1 μΜ、＜ 100 nM、＜ 10 nM、＜ 1 nM、＜ 0.1 nM、＜ 0.01 nM或＜ 0.001 nM (例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(KD)。在某些實施例中，抗MS4A4A抗體結合至在來自不同物種之MS4A4A中保守的MS4A4A之抗原決定基。
關於抗體與靶分子之結合，術語「特異性結合」或「特異性地結合」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基意指可量測地不同於非特異性相互作用之結合。特異性結合可(例如)藉由測定與對照分子之結合相比分子之結合來量測。舉例而言，特異性結合可藉由與類似於靶標(例如過量之未標記靶標)之對照分子進行競爭來測定。在此情形中，若經標記靶標與探針之結合被過量未經標記之靶標競爭性地抑制，則指示特異性結合。如本文所用之術語「特異性結合」或「特異性地結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽靶標上之抗原決定基可藉由(例如)對靶標之KD為約10-4 M或更低、10-5 M或更低、10-6 M或更低、10-7 M或更低、10-8 M或更低、10-9 M或更低、10-10 M或更低、10-11 M或更低、10-12 M或更低中之任一者或KD在10-4 M至10-6 M或10-6 M至10-10 M或10-7 M至10-9 M範圍內之分子來展現。如熟習此項技術者將瞭解，親和力及KD值係逆相關的。對於抗原之高親和力係藉由低KD值來量測。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指其中分子結合至特定多肽或特定多肽上之抗原決定基而實質上不與任何其他多肽或多肽抗原決定基結合之結合。
術語「免疫球蛋白 」(Ig)在本文中可與「抗體 」互換使用。本文中之術語「抗體」係以最廣泛意義使用且具體而言涵蓋單株抗體、多珠抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體) (包括自至少兩種完整抗體形成之彼等多特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望生物學活性即可。
「天然抗體 」通常為約150,000道耳頓(Dalton)之異四聚體糖蛋白，其由兩條相同輕(「L」)鏈及兩條相同重(「H」)鏈構成。每一輕鏈係由一個共價二硫鍵連接至重鏈，而在不同免疫球蛋白同型之重鏈中二硫鍵聯之數目各不相同。每一重鏈及輕鏈亦具有規則地間隔開之鏈內二硫橋。每一重鏈在一端具有可變結構域(VH )，之後為多個恆定結構域。每一輕鏈在一端具有可變結構域(VL )且在其另一端具有恆定結構域；輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對齊，且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對齊。據信，特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變結構域之間形成介面。
關於不同類別抗體之結構及性質，參見(例如)Basic and Clinical Immunology ，第8版，Daniel P. Stites、Abba I. Terr及Tristram G. Parslow (編輯)，Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994，第71頁及第6章。
基於來自任何脊椎動物物種之輕鏈恆定結構域之胺基酸序列，可將輕鏈指派為兩種明顯不同類型(稱為卡帕(「κ」)及拉姆達(「λ」))中之一者。端視免疫球蛋白重鏈(CH)恆定結構域之胺基酸序列，可將其指派為不同類別或同型。存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其重鏈分別指定為阿爾法(「α」)、德爾塔(「δ」)、伊蒲賽龍(「ε」)、伽馬(「γ」)及繆(「μ」)。基於CH序列及功能之相對較小差異將γ及α類別進一步劃分成亞類(同型)，例如，人類表現以下亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。不同類別之免疫球蛋白之亞單元結構及三維構形眾所周知，且通常闡述於(例如) Abbas等人，Cellular and Molecular Immunology，第4版(W.B. Saunders Co., 2000)中。
抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)之「可變區 」或「可變結構域 」係指該抗體之重鏈或輕鏈之胺基末端結構域。重鏈及輕鏈之可變結構域可分別稱為「VH 」及「VL 」。該等結構域通常係抗體之最可變部分(相對於相同類別之其他抗體)且含有抗原結合位點。
術語「可變 」係指如下事實：抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)之間可變結構域之某些區段的序列差異極大。可變結構域調介抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性在整個可變結構域跨度中並非均勻分佈。相反，其在輕鏈及重鏈可變結構域二者中均集中於三個稱為超變區(HVR)之區段中。可變結構域之更高度保守之部分稱為框架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含4個由三個HVR連結之FR區，其主要採用β摺疊構形，該等HVR形成連結β摺疊結構之環且在一些情形中形成β摺疊結構之一部分。每一鏈中之HVR藉由FR區保持緊密靠近在一起，且與來自另一鏈之HVR一起促進形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Immunological Interest ，第5版，National Institute of Health, Bethesda, MD (1991))。恆定結構域並不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞毒性。
如本文所用之術語「單株抗體 」係指自實質上同源之抗體群體獲得的抗體(諸如本揭示案之單株抗MS4A4A抗體)，亦即，除可以極少量存在之可能的天然突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化、醯胺化等)以外，構成該群體之個別抗體均相同。單株抗體具有高度特異性，其針對單一抗原位點。與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相比，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除特異性以外，單株抗體之優勢亦在於其係藉由雜交瘤培養物合成，不受其他免疫球蛋白之污染。修飾詞「單株」指示抗體之特徵在於自實質上同源之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任一特定方法來產生該抗體。舉例而言，根據本揭示案使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(例如)雜交瘤方法、重組DNA方法及用於在具有部分或全部人類免疫球蛋白基因座或編碼人類免疫球蛋白序列之基因的動物中產生人類或人類樣抗體之技術。
術語「全長抗體 」、「完整抗體 」或「全抗體 」可互換使用以指與抗體片段相對之呈其實質上完整形式之抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)。具體而言，全抗體包括具有重鏈及輕鏈且包括Fc區之彼等抗體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如，人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。在一些情形中，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段 」係指與完整抗體不同之包含完整抗體之一部分之分子，該部分結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙價抗體；直鏈抗體(參見美國專利5641870，實例2；Zapata等人，Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995))；單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)之木瓜酶消化產生兩個相同抗原結合片段(稱為「Fab 」片段)及一個殘餘「Fc 」片段，其命名反映容易結晶之能力。Fab片段係由整個輕鏈以及重鏈之可變區結構域(VH )及一條重鏈之第一恆定結構域(CH 1)組成。每一Fab片段關於抗原結合均係單價的，亦即其具有單一抗原結合位點。抗體經胃蛋白酶處理產生單一大F(ab')2 片段，該片段大致對應於兩個經二硫鍵連接之具有不同抗原結合活性之Fab片段，且仍然能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在CH 1結構域之羧基末端具有幾個額外殘基，該等殘基包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。在本文中，Fab'-SH係恆定結構域之一或多個半胱胺酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'之命名。F(ab')2 抗體片段最初係作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對產生。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
Fc片段包含藉由二硫鍵保持在一起的兩條重鏈之羧基末端部分。抗體之效應功能由Fc區中之序列決定，該區亦被某些類型之細胞上發現的Fc受體(FcR)識別。
抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)之「功能片段 」包含完整抗體之一部分，該部分通常包括完整抗體之抗原結合區或可變區或抗體中保留或具有經改質之FcR結合能力之Fc區。抗體片段之實例包括直鏈抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「雙價抗體 」係指藉由以下方式製備之小抗體片段：用VH 與VL 結構域之間的短連接體(約5-10個殘基)構築sFv片段(參見前述段落)，使得達成可變結構域之鏈間而非鏈內配對，藉此產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙價抗體係兩個「交叉」sFv片段之異二聚體，其中兩種抗體之VH 及VL 結構域存在於不同多肽鏈上。
如本文所用，「嵌合抗體 」係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源之抗體(免疫球蛋白)(諸如本揭示案之嵌合抗MS4A4A抗體)，以及此等抗體之片段，只要其展現期望生物學活性即可。本文所關注之嵌合抗體包括PRIMATIZED® 抗體，其中抗體之抗原結合區係源自藉由(例如)用所關注抗原對獼猴實施免疫所產生之抗體。如本文所用，「人類化抗體」係作為「嵌合抗體」之子集使用。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化 」形式(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體之人類化形式)係包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之每一HVR (例如CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR (例如CDR)，且全部或實質上全部之每一FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
「人類抗體 」係具有對應於由人類產生之抗體的胺基酸序列之胺基酸序列及/或使用如本文所揭示之用於製備人類抗體之任一技術製備之抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)。人類抗體之此定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生，該等技術包括噬菌體展示文庫及酵母展示文庫。人類抗體可藉由將抗原投與給基因轉殖動物來製備，該動物已經修飾以因應抗原攻擊產生此等抗體，但其內源性基因座已失能，例如經免疫異種小鼠(xenomice)，以及經由人類B細胞雜交瘤技術來產生。
術語「超變區 」、「HVR 」或「HV 」在本文中使用時係指抗體可變結構域(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體之可變結構域)中在序列上超變及/或在結構上形成所定義環之區。通常，抗體包含6個HVR；3個在VH 中(H1、H2、H3)，且3個在VL 中(L1、L2、L3)。在天然抗體中，H3及L3展示6個HVR之大部分多樣性，且據信尤其H3在賦予抗體良好特異性方面具有獨特作用。僅由重鏈組成之天然駱駝科動物抗體在不存在輕鏈之情形下具有功能性且穩定。
本文使用且涵蓋諸多對HVR之描述。在一些實施例中，HVR可為基於序列可變性之Kabat互補決定區(CDR)且最為常用(Kabat等人，上文文獻)。在一些實施例中，HVR可為Chothia CDR。而Chothia係指結構性環之位置(Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。在一些實施例中，HVR可為AbM HVR。AbM HVR代表Kabat CDR與Chothia結構性環之間的折衷，且用於Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體中。在一些實施例中，HVR可為「接觸」HVR。「接觸」HVR係基於對可獲得之複雜晶體結構之分析。來自該等HVR中之每一者之殘基係如下所述。
環 Kabat AbM Chothia 接觸
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat編號)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
HVR可包含如下「經延伸HVR」：VL中之24-36或24-34 (L1)、46-56或50-56 (L2)及89-97或89-96 (L3)以及VH中之26-35 (H1)、50-65或49-65 (較佳實施例) (H2)及93-102、94-102或95-102 (H3)。對於該等經延伸HVR定義中之每一者，根據Kabat等人(上文文獻)對可變結構域殘基進行編號。
「框架 」或「FR 」殘基係除如本文所定義之HVR殘基以外之彼等可變結構域殘基。
如本文所用之「接受體人類框架 」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類一致框架之VL 或VH 框架之胺基酸序列的框架。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類一致框架之接受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可包含先前存在之胺基酸序列變化。在一些實施例中，先前存在之胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在VH中存在先前存在之胺基酸變化之情形下，彼等變化較佳僅發生在位置71H、73H及78H中之三者、兩者或一者處；舉例而言，彼等位置處之胺基酸殘基可為71A、73T及/或78A。在一個實施例中，VL接受體人類框架之序列與VL 人類免疫球蛋白框架序列或人類一致框架序列一致。
「人類一致框架 」係代表在人類免疫球蛋白VL 或VH 框架序列之選擇中最常見胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL 或VH 框架序列之選擇係來自可變結構域序列之亞組。通常，序列之亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)中之亞組。實例包括，對於VL 而言，亞組可為如Kabat等人，上文文獻中之亞組κI、κII、κIII或κIV。另外，對於VH 而言，亞組可為如Kabat等人，上文文獻中之亞組I、亞組II或亞組III。
在(例如)本揭示案之抗MS4A4A抗體之指定位置處的「胺基酸修飾 」係指指定殘基之取代或缺失，或毗鄰指定殘基之至少一個胺基酸殘基之插入。「毗鄰」指定殘基意指在其一至兩個殘基內插入。插入可在指定殘基之N末端或C端進行。本文之較佳胺基酸修飾係取代。
「親和力成熟 」抗體(諸如本揭示案之親和力成熟之抗MS4A4A抗體)係在其一或多個HVR中具有一或多個改變之抗體，與不具有彼等改變之親代抗體相比，該等改變使得該抗體對抗原之親和力有所改良。在一個實施例中，親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳級或甚至皮莫耳級親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序來產生。舉例而言，Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992)闡述藉由VH 及VL 結構域改組之親和力成熟。HVR及/或框架殘基之隨機誘變闡述於(例如)：Barbas等人，Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)；Schier等人，Gene 169:147-155 (1995)；Yelton等人，J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995)；Jackson等人，J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)；及Hawkins等人，J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)。
「Fv 」係包含完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段係由一個重鏈可變區結構域與一個輕鏈可變區結構域呈緊密非共價締合形式之二聚體組成。自該兩個結構域之摺疊產生6個超變環(自H鏈及L鏈各自產生3個環)，該等超變環貢獻用於抗原結合之胺基酸殘基且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或Fv之一半，其僅包含三個對抗原具有特異性之HVR)具有識別並結合抗原之能力，但其親和力低於完整結合位點。
「單鏈 Fv 」 亦縮寫為「sFv 」或「scFv 」，其係包含連結成單一多肽鏈之VH及VL抗體結構域之抗體片段。較佳地，sFv多肽進一步包含在VH 與VL 結構域之間的多肽連接體，其使sFv能夠形成所期望之抗原結合結構。
抗體「效應功能 」係指可歸因於抗體Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)之彼等生物學活性，且其隨抗體同型而變化。
術語「Fc 區 」在本文中用於界定免疫球蛋白重鏈之C末端區域，其包括天然序列Fc區及變異體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈Fc區之邊界可能有所變化，但通常將人類IgG重鏈Fc區界定為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可在(例如)抗體之產生或純化期間或藉由重組工程改造編碼抗體重鏈之核酸來去除。因此，完整抗體之組成可包含去除全部K447殘基之抗體群體、未去除K447殘基之抗體群體及具有含有及不含K447殘基之抗體混合物之抗體群體。用於本揭示案之抗體中之適宜天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
「天然序列 Fc 區 」包含與自然界中所發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然變異體。
「變異體 Fc 區 」包含因至少一個胺基酸修飾、較佳地一或多個胺基酸取代而與天然序列Fc區不同之胺基酸序列。較佳地，變異體Fc區與天然序列Fc區相比或與親代多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如天然序列Fc區或親代多肽之Fc區中之約1個至約10個胺基酸取代，且較佳地約1個至約5個胺基酸取代。本文中之變異體Fc區較佳將與天然序列Fc區及/或與親代多肽之Fc區具有至少約80%同源性，且最佳與其具有至少約90%同源性，更佳與其具有至少約95%同源性。
「Fc 受體 」或「FcR 」描述結合至抗體Fc區之受體。較佳之FcR係天然序列人類FcR。此外，較佳之FcR係結合IgG抗體之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，其包括該等受體之等位基因變異體及選擇性剪接形式，FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化性受體」)及FcγRIIB (「抑制性受體」)，兩者具有主要在其細胞質結構域上有所不同的類似胺基酸序列。活化性受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(「ITAM」)。抑制性受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(「ITIM」)。本文之術語「FcR」涵蓋其他FcR，包括欲在將來鑑別之彼等FcR。FcR亦可延長抗體之血清半衰期。
如本文所用，關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比 (%) 」及「同源性 」係指在比對序列且引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，且不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括此項技術中已知之在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。
術語「競爭 」在競爭相同抗原決定基之抗體(例如中和性抗體)之背景中使用時意指如藉由分析所測定之抗體之間的競爭，在該分析中所測試抗體防止或抑制(例如降低)參考分子(例如配位體或參考抗體)與常見抗原(例如MS4A4A或其片段)之特異性結合。可使用多種類型之競爭性結合分析來確定抗體是否彼此競爭，例如：固相直接或間接放射性免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心式競爭分析(例如，參見Stahli等人，1983, Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (例如，參見Kirkland等人，1986, J. Immunol. 137:3614-3619)；固相直接標記之分析、固相直接標記之夾心式分析(例如，參見Harlow及Lane，1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA (例如，參見Morel等人，1988, Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (例如，參見Cheung等人，1990, Virology 176:546-552)；及直接標記之RIA (Moldenhauer等人，1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。通常，此一分析涉及使用結合至載有該等未經標記之測試抗體及經標記之參考抗體中之任一者的固體表面或細胞之經純化抗原。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測競爭性抑制。通常，測試抗體過量存在。藉由競爭分析鑑別之抗體(競爭性抗體)包括與參考抗體結合至相同的抗原決定基之抗體及因出現立體阻礙而結合至與參考抗體所結合抗原決定基足夠接近的毗鄰抗原決定基之抗體。關於測定競爭性結合之方法的其他細節提供於本文實例中。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將使參考抗體與常見抗原之特異性結合抑制(例如降低)至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97.5%及/或接近100%。
如本文所用，MS4A4A多肽與第二多肽之間的「相互作用 」涵蓋(但不限於)蛋白質-蛋白質相互作用、物理相互作用、化學相互作用、結合、共價結合及離子結合。如本文所用，當抗體破壞、降低或完全消除兩種多肽之間的相互作用時，該抗體「抑制該兩種多肽之間的相互作用」。當本揭示案之抗體結合至兩種多肽中之一者時，該抗體「抑制該兩種多肽之間的相互作用」。在一些實施例中，可使相互作用抑制至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97.5%及/或接近100%中之任一者。
術語「抗原決定基 」包括能夠由抗體結合之任一決定子。抗原決定基係抗原中由靶向該抗原之抗體結合之區域，且當抗原為多肽時，其包括直接接觸抗體之特定胺基酸。大多數情況下，抗原決定基位於多肽上，但在一些情況下可位於其他種類之分子(諸如核酸)上。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。通常，對特定靶抗原具有特異性之抗體將優先識別多肽及/或大分子之複雜混合物中之靶抗原上之抗原決定基。
「促效劑 」抗體或「活化性 」抗體係如下抗體：在該抗體結合抗原後誘導(例如增加)抗原之一或多種活性或功能。
「拮抗劑 」抗體或「阻斷性 」抗體或「抑制性 」抗體係如下抗體：在該抗體結合抗原後降低、抑制及/或消除(例如減少)抗原與一或多種配位體之結合及/或在該抗體結合抗原後降低、抑制及/或消除(例如減少)抗原之一或多種活性或功能。在一些實施例中，拮抗劑抗體或阻斷性抗體或抑制性抗體實質上或完全抑制抗原與一或多種配位體之結合及/或抗原之一或多種活性或功能。
「經分離 」抗體(諸如本揭示案之經分離之抗MS4A4A抗體)係已自其產生環境之組分(例如天然或重組)鑑別、分離及/或回收之抗體。較佳地，經分離抗體不與來自其產生環境之所有其他污染性組分締合。來自經分離抗體產生環境之污染性組分(諸如源自重組轉染細胞之彼等組分)係通常將干擾抗體之研究、診斷或治療用途之材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，將抗體純化至以下程度：(1)如藉由(例如) Lowry方法所測定大於95重量%之抗體，且在一些實施例中大於99重量%；(2)藉由使用旋杯式測序儀足以獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列殘基之程度，或(3)藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色之均質性。經分離抗體包括重組T細胞內之原位抗體，此乃因抗體天然環境之至少一種組分將不存在。然而，經分離多肽或抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
編碼抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)之「經分離 」核酸分子係自其產生環境中通常與其締合之至少一種污染性核酸分子鑑別並分離之核酸分子。較佳地，經分離核酸不與同產生環境相關之所有組分締合。編碼本文多肽及抗體之經分離核酸分子之形式不為其在自然界中所發現之形式或設置。因此，經分離核酸分子區別於天然存在於細胞中之編碼本文多肽及抗體之核酸。
如本文所用之術語「載體 」意欲指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。一類載體為「質體」，其係指其中可連接額外DNA區段之環形雙股DNA。另一類載體為噬菌體載體。另一類載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段連接至病毒基因體中。某些載體能夠在已引入其之宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入至宿主細胞中時整合至該宿主細胞之基因體中，且藉此隨宿主基因體一同複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作連接之基因之表現。此等載體在本文中稱為「重組表現載體」或簡稱「表現載體」。一般而言，在重組DNA技術中可用之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用，此乃因質體係載體之最常用形式。
如本文中可互換使用之「多核苷酸 」或「核酸 」係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物或任一可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入至聚合物中之受質。
「宿主細胞 」包括可成為或已成為載體接受者之個別細胞或細胞培養物，該(等)載體用於併入多核苷酸插入物。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代，且子代可因天然、偶然或特意突變而未必與原始親代細胞完全相同(在形態上或在基因體DNA互補上)。宿主細胞包括在活體內經本揭示案之多核苷酸轉染之細胞。
如本文所用之術語「膜 TREM2 」、「漿膜 TREM2 」及「細胞表面 TREM2 」可互換使用。
如本文所用之「載劑 」包括在所採用劑量及濃度下對所暴露細胞或哺乳動物無毒之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。
如本文所用，術語「預防 」包括提供關於個體之特定疾病、病症或疾患之發生或復發之預防。個體可能傾向於、易於患特定疾病、病症或疾患，或處於發生此一疾病、病症或疾患之風險下，但尚未診斷出患有該疾病、病症或疾患。
如本文所用，處於發生特定疾病、病症或疾患「風險下 」之個體可能患有或可不患有可偵測到之疾病或疾病症狀，且可在本文所闡述之治療方法之前已展示或可能尚未展示可偵測到之疾病或疾病症狀。如此項技術中所已知，「處於風險下」表示個體具有一或多種風險因素，該等風險因素係與特定疾病、病症或疾患之發展相關之可量測參數。具有該等風險因素中之一或多者之個體發生特定疾病、病症或疾患之機率高於不具有該等風險因素中之一或多者之個體。
如本文所用，術語「治療 」係指經設計以改變所治療個體在臨床病理學進程期間之天然進程之臨床干預。期望治療效應包括降低特定疾病、病症或疾患之進展速率、改善或減輕其病理狀態及緩解或改良其預後。舉例而言，若一或多種與特定疾病、病症或疾患相關之症狀緩和或消除，則個體成功地「治療」。
「有效量 」係指至少在所需劑量下及在所需時間段內有效達成期望治療或預防結果之量。有效量可以一或多次投與來提供。本文之有效量可根據諸如以下等因素而有所變化：疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及治療在個體內引發期望反應之能力。有效量亦為治療有益效應勝過治療之任何毒性或有害效應之量。對於預防性應用而言，有益或期望結果包括諸如消除或降低疾病之風險、減輕其嚴重程度或延遲其發作之結果，該疾病包括疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀、在疾病發展期間呈現之其併發症及中間病理學表型。對於治療性應用而言，有益或期望結果包括諸如以下等臨床結果：諸如經由靶向、延遲疾病之進展及/或延長存活來減少自疾病引起之一或多種症狀、提高患有疾病者之生活品質、減少治療疾病所需之其他藥劑之劑量、增強另一藥劑之效應。藥物、化合物或醫藥組合物之有效量係足以直接或間接地實現預防性或治療性治療之量。如在臨床背景中所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效量可與另一藥物、化合物或醫藥組合物聯合達成或可不與其聯合達成。因此，可認為「有效量」係在投與一或多種治療劑之背景下進行，且若聯合一或多種其他劑可達成或達成期望結果，則可認為單一劑係以有效量給予。
用於治療、預防或降低風險目的之「個體 」係指分類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家養及農場動物以及動物園動物、運動型動物或寵物，諸如狗、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓及諸如此類。在一些實施例中，個體係人類。
如本文所用，與另一化合物或組合物「聯合 」投與包括同時投與及/或在不同時間投與。聯合投與亦涵蓋作為共調配物投與或作為分開之組合物投與，包括以不同投用頻率或間隔及使用相同投與途徑或不同投與途徑投與。在一些實施例中，聯合投與係作為相同治療方案之一部分之投與。
如本文所用之術語「約 」係指為熟習本技術領域者容易知曉之各別值之一般誤差範圍。在本文中提及「約 」一值或參數包括(且描述)關於該值或參數本身之實施例。
除非上下文另外明確地指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包括複數個指示物。舉例而言，對「抗體」之提及係對一至許多個抗體之提及，諸如莫耳量，且包括為熟習此項技術者已知之其等效物等。
應理解，本文所闡述之本揭示案之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由其組成」及「基本上由其組成」。 II. 抗 MS4A4A 抗體
本文提供抗MS4A4A抗體。本文所提供之抗體可用於(例如)診斷或治療MS4A4A相關之病症。
在一態樣中，本揭示案提供結合至本揭示案之MS4A4A蛋白內的抗原決定基之經分離(例如單株)抗體。本揭示案之MS4A4A蛋白包括(但不限於)哺乳動物MS4A4A蛋白、人類MS4A4A蛋白、小鼠MS4A4A蛋白及食蟹猴MS4A4A蛋白。本揭示案之MS4A4A蛋白包括MS4A4A之天然變異體。
人類MS4A4A係編碼膜糖蛋白之239個胺基酸之蛋白質。人類MS4A4A之胺基酸序列示於SEQ ID NO:1中： MHQTYSRHCRPEESTFSAAMTTMQGMEQAMPGAGPGVPQLGNMAVIHSHLWKGLQEKFLKGEPKVLGVVQILTALMSLSMGITMMCMASNTYGSNPISVYIGYTIWGSVMFIISGSLSIAAGIRTTKGLVRGSLGMNITSSVLAASGILINTFSLAFYSFHHPYCNYYGNSNNCHGTMSILMGLDGMVLLLSVLEFCIAVSLSAFGCKVLCCTPGGVVLILPSHSHMAETASPTPLNEV
另外，小鼠MS4A4A之胺基酸序列示於SEQ ID NO:2中： MLVIQGTEQSALEAGYGAQQNGQPLYVNSHSWKRMTEKFLKGEPKILGIVQIVIAIMNLSIGIMMIIATVSTGEIPPSSVYIGYPIWGSLMFIISGSFSIVAGRRTTKGLVRSSLGLNITSSVFAFSGIVISSLSPGIYSFHVYYCTYRGSSEGCHMTLSILMGLDIVVVVLSVLEFCIGVSLSAFGCRVMCCNPGGVMIIMPSNPTKAETANPVTLQSGLMPPEHQERNVPENMH
另外，食蟹猴(cynomolgus、cyno) MS4A4A之胺基酸序列示於SEQ ID NO:3中： HQTYRRHCRPEESTFSAAMTTMQGMEQATPGAGPGVPQLGNMAVVHSHLWKGLQEKFLKGEPKVLGVVQILIALMSLSMGITMMCVAFSAYGHYPISVYIGYTIWGSVMFIISGSLSIAAGIRTTKGLVRGSLGMNITSSVLAVSAILINTISLTIYSFYHRYCNYYGNPNNCHGTVSILMGMDGMVLLLSVLEFCIAVSLSAFGCKAICCTPGGVVLIIPSNSHMAEAAPLTPLNEV
在一些實施例中，MS4A4A在細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在骨髓樣細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在腦細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在星狀細胞、包括(但不限於)成熟星狀細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在寡突膠質細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在小神經膠質細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在免疫細胞中表現，該等免疫細胞包括(但不限於)巨噬細胞、嗜酸性球、肥胖細胞、樹突細胞、天然殺手細胞、嗜中性球及T細胞。在一些實施例中，MS4A4A在嗅覺細胞中表現。在一些實施例中，MS4A4A在細胞表面上表現。
本揭示案之MS4A4A蛋白包括若干個結構域，包括(但不限於)細胞質結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基1-64；參見SEQ ID NO:1)；跨膜結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基65-85)；細胞外結構域(細胞外結構域1；ECL1)，其對應於人類MS4A4A之胺基酸殘基86-98；跨膜結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基99-119)；細胞質結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基120-137)；跨膜結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基138-158)；細胞外結構域(細胞外結構域2；ECL2)，其對應於胺基酸殘基159-179；跨膜結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基180-200)；及細胞質結構域(人類MS4A4A之胺基酸殘基201-239)。另外，本揭示案之MS4A4A蛋白在多種組織及細胞中表現，包括(但不限於)腦、神經元、神經膠質細胞、內皮細胞、血管周細胞、外被細胞等。 MS4A4A 在巨噬細胞及小神經膠質細胞功能中之作用
中樞神經系統(CNS)之巨噬細胞及骨髓樣細胞(諸如小神經膠質細胞)在其表型及功能中具有固有之可塑性。可將活體外巨噬細胞劃分成M1巨噬細胞及M2巨噬細胞，其具有不同的吞噬及發炎潛能、表型及活性。舉例而言，在外周器官中，認為具有M1表型之巨噬細胞具有促發炎性及抗微生物表型及功能，而認為具有M2表型之巨噬細胞處於更穩定之狀態，具有抗發炎性表型及功能。
與M1標記物(例如CD16、II類MHC、CD86)相比，與健康穩態狀況相關之小神經膠質細胞在其細胞表面表現更多之M2標記物(例如CD200R、CD163及CD115) (Ginhoux及Prinz，2015, Cold Spring Harb Perspect Biol, 7:a020537)。然而，在阿茲海默氏病小鼠模型及人類阿茲海默氏病二者中，疾病相關之小神經膠質細胞(DAM)均處於促炎性或活化狀態。處於促炎性或活化狀態之疾病相關之小神經膠質細胞由於在減少與阿茲海默氏病及其他神經退化性病症相關之病理中發揮積極作用而視為有益的。
MS4A4A表現在活體外M2巨噬細胞中升高，且已表明MS4A4A係M2巨噬細胞之新穎細胞表面標記物。另外，亦已顯示MS4A4A在肥胖細胞上調控cKit之細胞表面轉運，此表明MS4A4A在調節肥胖細胞脫粒及存活中之作用(Cruse等人，2015, Molecular Biol Cell, 26:1711-1727)。綜上所述，該等所報導之發現表明，靶向MS4A4A可影響與M1及M2巨噬細胞表型相關之各種巨噬細胞表面受體之再循環、表現及/或降解，由此影響其功能及活性。
本揭示案之抗MS4A4A抗體影響M2巨噬細胞表面標記物之表現。特定而言，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低巨噬細胞中CD200R、Dectin-1及CD163之細胞表面表現，此表明抗MS4A4A抗體藉由降低M2巨噬細胞表面受體之表現而調節巨噬細胞極化、功能及/或活性。本揭示案之抗MS4A4A抗體減少M2巨噬細胞表面受體，此表明本揭示案之抗MS4A4A抗體有效地將小神經膠質細胞之生理狀態改變成更具保護性表型之生理狀態，諸如改變成更具促炎性或更活化之狀態(例如改變成更偏M1之表型)。因此，本揭示案之抗MS4A4A抗體部分地藉由將巨噬細胞及小神經膠質細胞之表型改變成促炎性及活化狀態而可用於治療阿茲海默氏病及其他神經退化性病症。
本揭示案之抗MS4A4A抗體影響小神經膠質細胞之活化狀態。本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內增加與小神經膠質細胞活化(例如C型凝集素結構域家族7成員A (CLEC7A))、小神經膠質細胞遷移(例如肌醇1,4,5-三磷酸受體2 (ITPR2))及小神經膠質細胞增殖(例如抗原KI-67 (MKI67))相關之蛋白質之mRNA水準。另外，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加小神經膠質細胞活化標記物IL1RN、SPP1及PLCG2之mRNA水準。本揭示案之抗MS4A4A抗體亦減少穩態小神經膠質細胞標記物嘌呤能受體P2RY12及CX3C趨化介素受體1 (CX3CR1)之mRNA水準。因此，如藉由與小神經膠質細胞活化、遷移及增殖相關的蛋白質之各種mRNA水準增加及與小神經膠質細胞穩態相關的蛋白質之各種mRNA水準降低所證明，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內有效地使小神經膠質細胞活化。 MS4A4A 及 TREM2 表現
神經退化性疾病之特徵部分地在於中樞神經系統(CNS)中之免疫功能缺陷。舉例而言，認為CNS骨髓樣細胞區室(包括但不限於小神經膠質細胞)之存活率及功能之降低導致對諸如阿茲海默氏病等神經退化性病症之易感性。提高骨髓樣細胞之存活率及/或功能之藥理學介入將提供有效治療以改善此等神經退化性疾病及病症之發作、嚴重程度或進展。
在骨髓樣細胞上表現之觸發受體-2 (TREM2)係主要在骨髓樣細胞上表現之免疫球蛋白樣受體，該等骨髓樣細胞係諸如巨噬細胞、樹突細胞、單核球、皮膚之朗格漢斯細胞(Langerhans cell)、庫弗氏細胞(Kupffer cell)、破骨細胞及小神經膠質細胞。TREM2在小神經膠質細胞上高度表現且在實驗性自體免疫腦脊髓炎及阿茲海默氏病期間浸潤CNS中之巨噬細胞(Piccio等人，2007, Eur J Immunol, 37:1290-1301；Wang, 2015, Cell, 160:1061-1071)。TREM2路徑視為CNS骨髓樣細胞存活率及功能之關鍵調節劑。
來自人類遺傳學研究之資料已提示MS4A4A與TREM2之間及與阿茲海默氏病易感性之密切遺傳關聯(Piccio等人，2016, Acta Neuropathol, 131:925-9330)。特定而言，對於阿茲海默氏病有保護性之MS4A4A等位基因與患者腦脊髓液中之sTREM2水準增加相關。
本發明之抗MS4A4A抗體增加巨噬細胞中之細胞ATP水準，此指示抗MA4A4A抗體有效增加、維持或增強細胞(例如巨噬細胞、骨髓樣細胞、小神經膠質細胞)存活率及功能。另外，與先前報導之市售抗MS4A4A抗體5C12降低所培養人類巨噬細胞上清液中之sTREM2水準相比，本發明之抗MS4A4A抗體增加巨噬細胞中之sTREM2及mTREM2水準(Deming等人，2018, bioRxiv, doi: dx doi org / 10.1101/352179)。由於針對阿茲海默氏病之MS4A4A保護性等位基因與增加之sTREM2水準相關，故本文所提供之結果指示，本發明之抗MS4A4A抗體藉由增加sTREM2及mTREM2水準在諸如阿茲海默氏病等神經退化性疾病及病症中模擬或複製保護性表型。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中TREM2之細胞表面表現增加至少10%、至少20%、至少25%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%或至少250%。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中之可溶性TREM2水準增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體以約0.028 µg/ml至約0.039 µg/ml之EC50增加骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中之mTREM蛋白水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體以約0.025 µg/ml至約0.069 µg/ml之EC50增加骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中之sTREM蛋白水準。在其他實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體以約0.010 µg/ml至約0.021 µg/ml之EC50增加骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中之ATP水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中之ATP水準增加至為在抗MS4A4A抗體不存在下此等細胞中之ATP水準之約1.2倍、約1.4倍或約1.7倍。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內(例如在非人類靈長類動物中或人類中)增加可溶性TREM2水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準自在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之基線可溶性TREM2水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%、至少125%或至少150%。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準自在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之基線可溶性TREM2水準增加約50%。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準增加至為在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之可溶性TREM2水準之至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準增加至為在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之可溶性TREM2水準之約1.5倍。
在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12 天、至少13天、至少14天、至少15、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天或至少20天。在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少20天。在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少24小時、至少48小時、至少72小時、至少96小時、至少120小時、至少144小時、至少168小時、至少192小時、至少216小時、至少240小時、至少264小時、至少288小時、至少312小時、至少336小時、至少360小時、至少384小時、至少408小時、至少432小時、至少456小時或至少480小時。在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內血清中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內血清中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少480小時。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準自在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之基線可溶性TREM2水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%、至少225%、至少250%、至少275%、至少300%、至少325%、至少350%、至少375%或至少400%。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準自在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之基線可溶性TREM2水準增加約300%。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準增加至為在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之可溶性TREM2水準之至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、至少2.0倍、至少2.2倍、至少2.4倍、至少2.6倍、至少2.8倍、至少3.0倍、至少3.2倍、至少3.4倍、至少3.6倍、至少3.8倍或至少4.0倍。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準增加至為在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之可溶性TREM2水準之約2倍至約4倍。
在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少1天、至少2天、至少3天或至少4天。在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少4天。在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少24小時、至少48小時、至少72小時或至少96小時。在一些實施例中，與在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體之前活體內CSF中之可溶性TREM2水準相比，本揭示案之抗MS4A4A抗體使活體內CSF中之可溶性TREM2水準增加並且持續至少96小時。
本文所提供之證據展示，本揭示案之抗MS4A4A抗體影響TREM2，但不排除經由其他路徑起作用之抗體。拮抗劑抗體
在一些實施例中，結合MS4A4A蛋白之抗體可包括結合MS4A4A且藉由防止MS4A4A與其配位體之間的相互作用或藉由防止MS4A4A之信號在配位體存在下轉導至細胞質中而抑制一或多種MS4A4A活性之拮抗劑抗體。在一些實施例中，本揭示案之拮抗劑抗體可具有本揭示案之促效劑抗體之抗原決定基特異性，但具有不能夠結合Fcg受體之Fc結構域，且因此無法(例如)使MS4A4A受體聚集。
在一些實施例中，本揭示案之抗體係拮抗劑抗體。在一些實施例中，拮抗劑抗體抑制一或多種MS4A4A活性。在一些實施例中，拮抗劑抗體降低一或多種MS4A4A依賴性基因之活性。在一些實施例中，拮抗劑抗體抑制MS4A4A與一或多種MS4A4A配位體之間的相互作用。在一些實施例中，拮抗劑抗體抑制MS4A4A信號轉導。在一些實施例中，拮抗劑抗體抑制MS4A4A與一或多種MS4A4A配位體之間的相互作用且抑制MS4A4A信號轉導。
在一些實施例中，藉由下調或降低細胞中之MS4A4A蛋白水準之抗MS4A4A抗體實現MS4A4A蛋白水準之下調或降低MS4A4A活性。在一些實施例中，使用熟習此項技術者已知且可獲得之方法，藉由下調MS4A4A核酸表現或水準(例如藉由使用反義方法、基因療法等)實現MS4A4A蛋白水準之下調或降低MS4A4A活性。因此，在一些實施例中，利用本揭示案之抗MS4A4A抗體或藉由降低MS4A4A核酸(例如mRNA)表現或水準實現降低MS4A4A蛋白水準或活性。
在一些實施例中，促效劑抗體功能需要抗體交聯。抗體交聯可經由在活體外結合至二級抗體或經由在活體內結合至Fc受體而發生。舉例而言，拮抗性抗體可在活體外經由生物素/鏈黴抗生物素蛋白交聯或二級抗體結合轉化成促效性抗體(例如，參見Gravestein等人，1996, J. Exp.  Med. 184:675-685；Gravestein等人，1994, International Immunol, 7:551-557)。促效性抗體可藉由模擬受體配位體之生物學活性或藉由增強受體聚集來發揮其活性，藉此使受體信號傳導活化。在一些實施例中，拮抗活性需要不存在抗體交聯。拮抗性抗體可藉由阻斷受體-配位體相互作用來發揮其活性。凝溶膠蛋白、骨橋蛋白及表型模擬阿茲海默氏病保護性等位基因
MS4A基因簇中有三個SNP與遲發型阿茲海默氏病之風險增加相關。該等SNP包括MS4A4A中之rs4938933、MS4A4E中之rs670139及MS4A6A中之rs610932 (Hollingworth等人，2011, Nat Genetics, 43:429-435；Naj等人，2011, Nature Genetics, 43:436-441；Antunez等人，2011, Genome Medicine, 3，文章33)。另外，MS4A4A基因座SNP (rs2304933及rs2304935)與較高水準之MS4A4A及增加之阿茲海默氏病風險、包括遲發型阿茲海默氏病(LOAD)相關(Allen等人，2012, Neurology, 79:221-228)。
已鑑別出與MS4A基因簇相關之阿茲海默氏病相關遺傳變異體(SNP)。彼等變異體等位基因中之一者係rs1582763，其與CSF sTREM2水準升高及阿茲海默氏病風險降低以及發病年齡延遲相關，且因此視為保護性等位基因。(Deming等人，2018, bioRxiv, doi: dx doi org / 10.1101/352179)。rs1582763保護性等位基因與血液中MS4A4A mRNA水準降低相關。該等發現進一步表明，rs1582763等位基因藉由降低MS4A4A水準及降低阿茲海默氏病風險或嚴重程度起保護性作用。保護性rs1582763亦與骨橋蛋白之表現水準增加及凝溶膠蛋白之水準增加相關。本發明之抗MS4A4A抗體至少就減少MS4A4A表現、增加骨橋蛋白表現、增加凝溶膠蛋白表現及/或增加sTREM水準而言有效地表型模擬保護性等位基因之該等態樣。在本揭示案之一些態樣中，提供抗MS4A4A抗體，其中該等抗體表型模擬與阿茲海默氏病風險降低及/或阿茲海默氏病之發病年齡延遲相關的MS4A之一或多個等位基因。
本揭示案之抗MS4A4A抗體增加人類外周血單核細胞源性巨噬細胞中之骨橋蛋白(SPP1)之mRNA水準且增加凝溶膠蛋白(GSN)之mRNA水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加凝溶膠蛋白之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%或至少250%。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中凝溶膠蛋白之mRNA及/或蛋白質水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%或至少250%。
本揭示案之抗MS4A4A抗體增加非人類靈長類動物中之骨橋蛋白(SSP1)水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內(例如在非人類靈長類動物中或人類中)增加骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加血清中及/或CSF中骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使血清中及/或CSF中骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%或至少250%。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加腦中骨橋蛋白之蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加額葉皮質中及/或海馬體中骨橋蛋白之蛋白質水準。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體就增加骨橋蛋白及凝溶膠蛋白之表現而言表型模擬保護性rs1582763等位基因。在其他態樣中，本揭示案之抗MS4A4A抗體有效地增加骨橋蛋白、凝溶膠蛋白及/或sTREM2之表現且在降低阿茲海默氏病風險及/或嚴重程度方面具有生物學活性，此與保護性rs1582763等位基因類似。該等資料指示，SPP1及GSN係與rs158273等位基因相關之保護性生物學活性之藥效學標記物。CSFR1 及 IL1RN 表現
本揭示案之抗MS4A4A抗體增加非人類靈長類動物中之CSF1R水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內(例如在非人類靈長類動物中或人類中)增加CSF1R之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加血清中及/或CSF中CSF1R之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使血清中及/或CSF中CSF1R之mRNA及/或蛋白質水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%或至少250%。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加腦中CSF1R之蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加額葉皮質中及/或海馬體中CSF1R之蛋白質水準。
CSF1R缺乏會對腦中小神經膠質細胞之發育產生負面影響(Swerdlow等人(2000) Neurology, 111:300-311；Baba等人(2006) Acta Neuropath, 111:300-311)，且最近研究已將CSF1R基因中之突變與各種病症相關聯，包括成人發作型腦白質病變伴軸突球樣變及膠質著色(ALSP)及遺傳性瀰漫性腦白質病變伴球樣變(HDLS) (Oosterhof等人(2019) Am J Hum Genet, 104:936-947；Rademaker等人(2011) Nat Genet, 44:200-205；Nicholson等人(2013) Neurology, 80:1033-1040)。本揭示案之抗MS4A4A抗體降低細胞死亡且在CSF1R抑制後維持人類巨噬細胞之存活。因此，在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體可用於治療患有諸如ALSP或HDLS等CSF1R缺乏疾病或病症之個體。
本揭示案之抗MS4A4A抗體增加人類外周血單核細胞源性巨噬細胞中之IL1RN水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加IL1RN之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加IL1RN之mRNA及/或蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中IL1RN之mRNA及/或蛋白質水準增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少100%、至少125%、至少150%、至少200%或至少250%。GPNMB 表現
GPNMB (糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白質B)係在多種細胞類型(包括組織巨噬細胞及小神經膠質細胞)中表現之表面糖蛋白。若干種遺傳變異體與帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)風險相關。PD患者黑質中之GPNMB蛋白質水準升高，且在溶酶體應激後GPNMB水準增加(Moloney等人，2018, Neurobio Dis. 120: 1-11)。另外，GPNMB之表現增加與SNP rs199347相關，此風險SNP位於GPNMB基因內(Murthy等人，Neurogenetics, 2017, 18:121-133)。
本揭示案之抗MS4A4A抗體降低人類原代巨噬細胞中之GPNMB細胞表面蛋白質水準。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體使骨髓樣細胞(例如巨噬細胞、人類巨噬細胞、小神經膠質細胞)中之GPNMB細胞表面蛋白質水準降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%。由於GPNMB水準之增加與PD之風險等位基因相關，因此添加抗MS4A4A抗體後GPNMB之減少可提供治療PD之方式。 A. 例示性抗體及某些其他抗體實施例
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:94、108、116、146、147、308及311組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:94、108、116、146、147、308及311組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309及312組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309及312組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310及313組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310及313組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(d) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314及317組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314及317組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(e) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:105、106、114、139、140、141、142、143、160、161、315及318組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 105、106、114、139、140、141、142、143、160、161、315及318組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；及(f) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:107、115、144、145、163、316及319組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:107、115、144、145、163、316及319組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:94及308組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:94及308組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:96、97、98、99及309組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 96、97、98、99及309組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:100、101、102及310組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 100、101、102及310組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(d) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:103、104及314組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 103、104及314組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(e) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:105、106及315組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 105、106及315組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；及(f) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:107及316組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:107及316組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 108之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:110及111組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:110及111組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 112之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:113之胺基酸序列或與SEQ ID NO:113之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:114之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 114之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列或與SEQ ID NO:115之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列或與SEQ ID NO:116之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 118、119、120、121及122組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(d) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(e) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:139、140、141、142及143組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；及(f) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:144及145組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:144及145組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:146及147組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:146及147組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 154之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(d) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:156、157及158組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；(e) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:159、160及161組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 159、160及161組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸；及(f) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:163組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:163組成之群之胺基酸具有至少約95%同源性之胺基酸。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:103之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:103之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:98之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:103之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:101之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:103之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:106之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列；或(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:99之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:315之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列；或(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:317之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:110之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:113之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:114之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列；或(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:111之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:113之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:114之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:141之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:142之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:141之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:143之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:143之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:142之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:141之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:141之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:156之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:160之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列； (a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:150之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:156之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:160之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:157之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:159之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:151之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:156之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:160之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:151之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:158之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:159之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:152之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:156之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:161之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列；(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:153之胺基酸序列；(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；(d) HVR-L1，其包含SEQ ID NO:158之胺基酸序列；(e) HVR-L2，其包含SEQ ID NO:159之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列或與SEQ ID NO:94之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:96、97、98及99組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:96、97、98及99組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 100、101及102組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 100、101及102組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列或與SEQ ID NO:308之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列或與SEQ ID NO:309之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列或與SEQ ID NO:310之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列或與SEQ ID NO:311之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列或與SEQ ID No:312之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列或與SEQ ID NO:313之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:103及104組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 103及104組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 105及106組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:105及106組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列或與SEQ ID NO:107之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a) HVR-L1，其包含選自SEQ ID NO:314之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO:314之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 315之胺基酸序列或與SEQ ID NO:315之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列或與SEQ ID NO:316之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a) HVR-L1，其包含選自SEQ ID NO:317之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO:317之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列或與SEQ ID NO:318之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列或與SEQ ID NO:319之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列或與SEQ ID NO:94之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 96、97、98及99組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 96、97、98及99組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 100、101及102組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 100、101及102組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 103及104組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 103及104組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 105及106組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 105及106組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列或與SEQ ID NO:107之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列或與SEQ ID NO:308之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含SEQ ID NO: 309之胺基酸或與SEQ ID NO: 309之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 310之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 310之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i) HVR-L1，其包含SEQ ID NO: 314之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 314之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 315之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 315之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 316之胺基酸序列或與SEQ ID NO:316之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列或與SEQ ID NO:311之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含SEQ ID NO: 312之胺基酸或與SEQ ID NO: 312之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 313之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 313之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i) HVR-L1，其包含SEQ ID NO: 317之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 317之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 318之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 318之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 316之胺基酸序列或與SEQ ID NO:316之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:24、25、26、27、28、29及30組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29及30組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:110及111組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 110及111組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 112之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a) HVR-L1，其包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 113之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列或與SEQ ID NO:114之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列或與SEQ ID NO:115之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列或與SEQ ID NO:108之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 110及111組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 110及111組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 112之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i) HVR-L1，其包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 113之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 114之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列或與SEQ ID NO:115之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列或與SEQ ID NO:116之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 118、119、120 121及122組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:144及145組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:144及145組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列或與SEQ ID NO:116之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 144及145組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 144及145組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:146及147組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:146及147組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(a) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:160及161組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:160及161組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列或與SEQ ID NO:163之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VH HVR序列：(i) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:146及147組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO:146及147組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 154之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下之VL HVR序列：(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 160及161組成之群之胺基酸序列或與選自由SEQ ID NO: 160及161組成之群之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 163之胺基酸序列具有至少約95%同源性之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304及306組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH )序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304及306組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304或306中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304或306中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、24、25、26、27、28、29、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、76、77、78、79、80、81、82、83、84、304或306之VH 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:94、108、116、146、147及308以及311組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309及312組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310及313組成之群之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含與選自由SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305及307組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL )。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305及307組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在一些實施例中，在SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305或307中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305或307中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、32、33、34、35、36、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、86、87、88、89、90、91、92、93、305或307之VL 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-Ll，其包含選自由SEQ ID NO: 103、104、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314及317組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 105、106、114、139、140、141、142、143、160、161、315及318組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 107、115、144、145、163、316及319組成之群之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH 及如上文所提供任一實施例中之VL 。在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH 及如上文所提供任一實施例中之VL 。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:5-15及SEQ ID NO:17-22中之VH 及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:24-30及SEQ ID NO:32-36中之VH 及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:40-53及SEQ ID NO:55-74中之VH 及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:76-84及SEQ ID NO:86-93中之VH 及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:304及SEQ ID NO:305中之VH 及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:306及SEQ ID NO:307中之VH 及VL 序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含重鏈可變結構域(VH )及輕鏈可變結構域(VL )，其中該VH 及該VL 係選自由以下組成之群：包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列之VL ；以及包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列之VL 。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含重鏈可變結構域(VH )及輕鏈可變結構域(VL )，其中該VH 及該VL 係選自由以下組成之群：包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之VL ；以及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之VL 。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含重鏈可變結構域(VH )及輕鏈可變結構域(VL )，其中該VH 及該VL 係選自由以下組成之群：包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:56之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:58之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:59之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:61之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:68之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:70之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:72之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:69之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:49之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:51之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:52之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:62之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:63之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:64之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列之VL ；以及包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:67之胺基酸序列之VL 。
在一些實施例中，本文提供抗MS4A4A抗體，其包含重鏈可變結構域(VH )及輕鏈可變結構域(VL )，其中該VH 及該VL 係選自由以下組成之群：包含SEQ ID NO:76之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:90之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:81之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:91之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:91之胺基酸序列之VL ；包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列之VL ；以及包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列之VH 及包含SEQ ID NO:93之胺基酸序列之VL 。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304及306組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH )序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304及306組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304或306中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304或306中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、304或306之VH 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO: 94及308組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 96、97、98、99及309組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:100、101、102及310組成之群之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含與選自由SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、305及307組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL )。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、305及307組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在一些實施例中，在SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、 22、305或307中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、305或307中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 17、18、19、20、21、22、305或307之VL 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-Ll，其包含選自由SEQ ID NO: 103、104及314組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 105、106及315組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 107及316組成之群之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29及30組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH )序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29及30組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29或30中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29或30中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 24、25、26、27、28、29或30之VH 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列，(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 110及111組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含與選自由SEQ ID NO:32、33、34、35及36組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL )。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 32、33、34、35及36組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在一些實施例中，在SEQ ID NO: 32、33、34、35或36中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 32、33、34、35或36中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 32、33、34、35或36之VL 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-Ll，其包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列，(b) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列，及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52及53組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH )序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52及53組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53之VH 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含與選自由SEQ ID NO:55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL )。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在一些實施例中，在SEQ ID NO: 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73或74之VL 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-Ll，其包含選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 144及145組成之群之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO: 76、77、78、79、80、81、82、83及84組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之重鏈可變結構域(VH )序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 76、77、78、79、80、81、82、83及84組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 76、77、78、79、80、81、82、83或84中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 76、77、78、79、80、81、82、83或84中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 76、77、78、79、80、81、82、83或84之VH 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VH 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO: 146及147組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供抗MS4A4A抗體，其中該抗體包含與選自由SEQ ID NO:86、87、88、89、90、91、92及93組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL )。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 86、87、88、89、90、91、92及93組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL 序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在一些實施例中，在SEQ ID NO: 86、87、88、89、90、91、92或93中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 86、87、88、89、90、91、92或93中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。視情況，該抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO: 86、87、88、89、90、91、92或93之VL 序列，包括該序列之轉譯後修飾。在特定實施例中，VL 包含1個、2個或3個選自以下之HVR：(a) HVR-Ll，其包含選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸序列，(b) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 160及161組成之群之胺基酸序列，及(c) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO: 320-335及355-362組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之全長重鏈胺基酸序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 320-335及355-362組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之全長重鏈胺基酸序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 320-335及355-362中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 320-335及355-362中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(亦即在FR中)。
在另一態樣中，抗MS4A4A抗體包含與選自由SEQ ID NO: 363-365組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之全長輕鏈胺基酸序列。在某些實施例中，與選自由SEQ ID NO: 363-365組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之全長重鏈胺基酸序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗MS4A4A抗體保留結合至MS4A4A之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 363-365中，總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，在SEQ ID NO: 363-365中，總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在LVR以外之區域中(亦即在FR中)。
在一些實施例中，抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO:355-362之全長重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:365之全長輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO:320-327之全長重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:363之全長輕鏈胺基酸序列。在一些實施例中，抗MS4A4A抗體包含SEQ ID NO:328-335之全長重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO:364之全長輕鏈胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制選自以下之至少一種參考抗體之結合：4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419及4A-450。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制選自以下之至少一種參考抗體之結合：4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330及4A-331。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制選自以下之至少一種參考抗體之結合：4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380及4A-381。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制選自以下之至少一種參考抗體之結合：4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、4A-390。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體結合至人類MS4A4A之抗原決定基，該抗原決定基與至少一種選自以下之參考抗體所結合之MS4A4A抗原決定基相同或重疊：4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、4A-331、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、4A-381、4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、4A-390、4A-419及4A-450。用於定位抗體所結合之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology ，第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。
在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制至少一種選自以下之參考抗體之結合：4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419及4A-450以及其任一組合。在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制至少一種選自以下之參考抗體之結合：4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330及4A-331以及其任一組合。在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制至少一種選自以下之參考抗體之結合：4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380及4A-381以及其任一組合。在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體競爭性地抑制至少一種選自以下之參考抗體之結合：4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390及其任一組合。
在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體具有MS4A4A上與至少一種選自以下之參考抗體相同或重疊之抗原決定基：4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419及4A-450以及其任一組合。在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體具有MS4A4A上與至少一種選自以下之參考抗體相同或重疊之抗原決定基：4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330及4A-331以及其任一組合。在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體具有MS4A4A上與至少一種選自以下之參考抗體相同或重疊之抗原決定基：4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380及4A-381以及其任一組合。在一些實施例中，針對與MS4A4A之結合，本揭示案之抗MS4A4A抗體具有MS4A4A上與至少一種選自以下之參考抗體相同或重疊之抗原決定基：4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389及4A-390以及其任一組合。
在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體結合至MS4A4A之細胞外結構域1 (ECL1)。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列CMASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:177)內之一或多個胺基酸。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體結合至MS4A4A之細胞外結構域2 (ECL2)。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:178)內之一或多個胺基酸。
可利用此項技術中已知之任何適宜競爭分析或MS4A4A結合分析(諸如BIAcore分析、ELISA分析或流式細胞術)來測定抗MS4A4A抗體是否與一或多種選自以下之參考抗體競爭與MS4A4A之結合(或競爭性地抑制其結合)：4A-202、4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-18、4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330、4A-331、4A-21、4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-361、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380、4A-381、4A-25、4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389、4A-390、4A-419及4A-450以及其任一組合。在例示性競爭分析中，將經固定之MS4A4A或在細胞表面上表現MS4A4A之細胞於包含第一經標記抗體(其結合至MS4A4A (例如人類或非人類靈長類動物))及第二未經標記之抗體(正在測試其與第一抗體競爭結合至MS4A4A之能力)之溶液中培育。該第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，將經固定之MS4A4A或表現MS4A4A之細胞於包含第一經標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育。在允許第一抗體與MS4A4A結合之條件下培育後，去除過量未結合抗體，且量測與經固定之MS4A4A或表現MS4A4A之細胞締合之標記的量。若與經固定之MS4A4A或表現MS4A4A之細胞締合之標記的量在測試樣品中相對於對照樣品中實質上減少，則此指示第二抗體與第一抗體競爭與MS4A4A之結合。參見Harlow及Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual 第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
本文進一步提供競爭性地抑制抗MS4A4A抗體之結合及/或與抗MS4A4A抗體競爭結合之抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:94及308組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 96、97、98、99及309組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 100、101、102及310組成之群之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 103、104及314組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 105、106及315組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 107及316組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:5-15及304以及SEQ ID NO:17-22及305中之VH 及VL 序列。
本文提供抗結合至與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同或重疊的人類MS4A4A之抗原決定基之MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:94及308組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 96、97、98、99及309組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 100、101、102及310組成之群之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 103、104及314組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 105、106及315組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 107及316組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:5-15及304以及SEQ ID NO:17-22及305中之VH 及VL 序列。在一些實施例中，人類MS4A4A之抗原決定基與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同。
本文進一步提供競爭性地抑制抗MS4A4A抗體之結合及/或與抗MS4A4A抗體競爭結合之抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 110及111組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:24-30及SEQ ID NO:32-36中之VH 及VL 序列。
本文提供抗結合至與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同或重疊的人類MS4A4A之抗原決定基之MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 110及111組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:24-30及SEQ ID NO:32-36中之VH 及VL 序列。在一些實施例中，人類MS4A4A之抗原決定基與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同。
本文進一步提供競爭性地抑制抗MS4A4A抗體之結合及/或與抗MS4A4A抗體競爭結合之抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 144及145組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:40-53及SEQ ID NO:55-74中之VH 及VL 序列。
本文提供抗結合至與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同或重疊的人類MS4A4A之抗原決定基之MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:118、119、120、121及122組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO: 123、124、125、126、127、128及129組成之群之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 130、131、132、133、134、135、136、137及138組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 139、140、141、142及143組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO: 144及145組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:40-53及SEQ ID NO:55-74中之VH 及VL 序列。在一些實施例中，人類MS4A4A之抗原決定基與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同。
本文進一步提供競爭性地抑制抗MS4A4A抗體之結合及/或與抗MS4A4A抗體競爭結合之抗MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO: 146及147組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO: 156、157及158組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 160及161組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:76-84及SEQ ID NO:86-93中之VH 及VL 序列。
本文提供抗結合至與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同或重疊的人類MS4A4A之抗原決定基之MS4A4A抗體，其包含(a) VH 結構域，該結構域包含(i) HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO: 146及147組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO: 149、150、151、152及153組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-H3，其包含SEQ ID NO: 154之胺基酸序列；及(b) VL 結構域，該結構域包含(i) HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:156、157及158組成之群之胺基酸序列，(ii) HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO: 160及161組成之群之胺基酸序列，及(iii) HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 163之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO:76-84及SEQ ID NO:86-93中之VH 及VL 序列。在一些實施例中，人類MS4A4A之抗原決定基與抗MS4A4A抗體所結合之抗原決定基相同。
在一些實施例中，根據上文實施例中之任一者之抗MS4A4A抗體係單株抗體，包括人類化及/或人類抗體。在一些實施例中，抗MS4A4A抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙價抗體或F(ab')2片段。在一些實施例中，抗MS4A4A抗體係實質上全長抗體，例如IgGl抗體、IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在一些實施例中，根據上文實施例中之任一者之抗MS4A4A抗體可單一地或組合地併入如下文部分1至7中所闡述之任一特徵：(1) 抗 MS4A4A 抗體結合親和力
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體具有如下解離常數(Kd)：＜ 1 μM、＜ 100 nM、＜ 10 nM、＜ 1 nM、＜ 0.1 nM、＜ 0.01 nM或＜ 0.001 nM (例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。解離常數可經由任何分析技術來測定，包括任何生物化學或生物物理學技術，諸如ELISA、表面電漿子共振(SPR)、生物層干涉(例如，參見Octet系統(ForteBio))、等溫滴定量熱法(ITC)、差示掃描量熱法(DSC)、圓二色性(CD)、停流分析及比色或螢光蛋白熔融分析。在一個實施例中，藉由經放射性標記之抗原結合分析(RIA)量測Kd。在一些實施例中，利用所關注抗體之Fab形式及其抗原實施RIA，例如如Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)中所闡述。在一些實施例中，使用BIACORE表面電漿子共振分析來量測Kd，舉例而言，在25℃下利用經固定抗原CM5晶片以約10個反應單位(RU)實施使用BIACORE -2000或BIACORE -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)之分析。在一些實施例中，使用單價抗體(例如Fab)或全長抗體來測定KD 。在一些實施例中，使用呈單價形式之全長抗體來測定KD 。(2) 抗體片段
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv及scFv片段以及下文所闡述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，例如參見WO 93/16185；及美國專利第5571894號及第5587458號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段之論述，參見美國專利第5869046號。
雙價抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP404097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。Hudson等人，Nat. Med . 9:129-134 (2003)中亦闡述三價抗體及四價抗體。單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分之抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(例如，參見美國專利第6248516號)。
如本文所闡述，抗體片段可藉由各種技術製得，該等技術包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )或噬菌體)產生。(3) 嵌合及人類化抗體
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4816567號中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係其中類別或亞類已自親代抗體之類別或亞類發生變化之「類別切換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體係人類化抗體。通常，使非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。在某些實施例中，人類化抗體在人類中為實質上非免疫原性的。在某些實施例中，人類化抗體與該人類化抗體所源自之來自另一物種之抗體對靶標具有實質上相同之親和力。例如，參見美國專利第5530101號；第5693761號；第5693762號；及第5585089號。在某些實施例中，鑑別抗體可變結構域中可經修飾而不會減小抗原結合結構域之天然親和力同時降低其免疫原性之胺基酸。例如，參見美國專利第5766886號及第5869619號。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR (或其部分)係源自非人類抗體，且FR (或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，HVR殘基所源自之抗體)之相應殘基取代，以例如恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro等人，Front. Biosci. 13:161 9-1633 (2008)中，且進一步闡述於(例如)美國專利第5821337號、第7527791號、第6982321號及第7087409號中。可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims等人，J. Immunol. 151:2296 (1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體一致序列之框架區(例如，參見Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)；及Presta等人，J. Immunol . 151: 2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類生殖系框架區(例如，參見Almagro及Fransson，Front.  Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及源自篩選FR文庫之框架區(例如，參見Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，J. Biol. Chem . 271:22611-22618 (1996))。(4) 人類抗體
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體係人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術來產生。人類抗體概述於van Dijk等人，Curr. Opin. Pharmacol . 5:368-74 (2001)及LonbergCurr. Opin. Immunol . 20:450-459 (2008)中。
可藉由向基因轉殖動物投與免疫原來製備人類抗體，該基因轉殖動物已經改良以因應抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體。可利用人類Ig基因座之較大片段對小鼠抗體產生有缺陷之小鼠品系進行工程改造，預期此等小鼠在不存在小鼠抗體之情形下將產生人類抗體。較大人類Ig片段可保持較大可變基因多樣性以及對抗體產生及表現之適當調控。藉由利用用於抗體多樣化及選擇之小鼠機構以及對人類蛋白質之免疫耐受性之缺乏，在該等小鼠品系中複製之人類抗體譜可產生針對任何所關注抗原(包括人類抗原)之高親和力全人類抗體。使用雜交瘤技術，可產生並選擇具有期望特異性之抗原特異性人類MAb。某些例示性方法闡述於美國專利第5545807號、EP 546073及EP 546073中。例如，亦參見闡述XENOMOUSE™技術之美國專利第6075181號及第6150584號；闡述HUMAB®技術之美國專利第5770429號；闡述K-M MOUSE®技術之美國專利第7041870號及闡述VELOCIMOUSE®技術之美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。可(例如)藉由與不同人類恆定區進行組合來進一步修飾來自由此等動物產生之完整抗體之人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製得。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。(例如，參見Kozbor J. Immunol. 133:3001 (1984)及Boerner等人，J. Immunol. 147:86 (1991))。經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 03:3557-3562 (2006)中。其他方法包括(例如)闡述於美國專利第7189826號(闡述自雜交瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)中之彼等方法。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers等人，Histology and Histopathology 20(3) :927-937 (2005)及Vollmers等人，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-91 (2005)中。亦可藉由分離選自人類源性噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。接著可將此等可變結構域序列與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體係藉由活體外方法及/或在組合文庫中篩選具有一或多種期望活性之抗體而分離出之人類抗體。適宜實例包括(但不限於)噬菌體展示(CAT、Morphosys、Dyax、Biosite/Medarex、Xoma、Symphogen、Alexion (舊稱Proliferon)、Affimed)、核糖體展示(CAT)、酵母展示(Adimab)及諸如此類。在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)來單獨選殖VH及VL基因之譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，接著可如Winter等人，Ann. Rev. Immunol . 12: 433-455 (1994)中所闡述篩選抗原結合噬菌體。舉例而言，此項技術中已知多種用於產生噬菌體展示文庫及在此等文庫中篩選具有期望結合特徵之抗體之方法。亦參見Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310, 2004；Lee 等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093, 2004；FellouseProc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(-2):1 19-132 (2004)。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段之形式展示抗體片段。來自免疫化源之文庫無需構築雜交瘤即可提供針對免疫原之高親和力抗體。或者，如Griffiths等人，EMBO J . 12: 725-734 (1993)中所闡述，可對天然譜進行選殖(例如自人類)以不經任何免疫即提供針對眾多種非自體抗原以及自體抗原之單一抗體源。最後，亦可如Hoogenboom等人，J. Mol. Biol ., 227: 381-388, 1992中所闡述藉由以下方式合成製備天然文庫：自幹細胞選殖未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變HVR3區並在活體外完成重排。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5750373號及美國專利公開案第2007/0292936號及第2009/0002360號。自人類抗體文庫分離之抗體在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。(5) 包括 Fc 區之恆定區
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體包含Fc。在一些實施例中，該Fc係人類IgG1、IgG2、IgG3及/或IgG4同型。在一些實施例中，抗體為IgG類、IgM類或IgA類。
在本文所提供之任一抗體之某些實施例中，抗體具有IgG2同型。在一些實施例中，抗體含有人類IgG2恆定區。在一些實施例中，人類IgG2恆定區包括Fc區。在一些實施例中，抗體誘導一或多種MS4A4A活性或獨立地結合至Fc受體。在一些實施例中，抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體係抑制性Fc-γ受體IIB (FcγIIB)。
在本文所提供之任一抗體之某些實施例中，抗體具有IgG1同型。在一些實施例中，抗體含有小鼠IgG1恆定區。在一些實施例中，抗體含有人類IgG1恆定區。在一些實施例中，人類IgG1恆定區包括Fc區。在一些實施例中，人類IgG1輕鏈恆定區包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體係抑制性Fc-γ受體IIB (FcγIIB)。
在本文所提供之任一抗體之某些實施例中，抗體具有IgG4同型。在一些實施例中，抗體含有人類IgG4恆定區。在一些實施例中，人類IgG4恆定區包括Fc區。在一些實施例中，抗體結合抑制性Fc受體。在某些實施例中，抑制性Fc受體係抑制性Fc-γ受體IIB (FcγIIB)。
在本文所提供之任一抗體之某些實施例中，抗體具有雜合IgG2/4同型。在一些實施例中，抗體包括包含根據人類IgG2之EU編號胺基酸118至260及根據人類IgG4之EU編號胺基酸261至447之胺基酸序列(WO 1997/11971；WO 2007/106585)。
在一些實施例中，與包含有不包含胺基酸取代之Fc區之相應抗體相比，Fc區使聚集增加而不使補體活化。在一些實施例中，抗體誘導該抗體所特異性結合之靶標之一或多種活性。在一些實施例中，抗體結合至MS4A4A。
亦可期望修飾本揭示案之抗MS4A4A抗體以改良效應功能及/或延長該抗體之血清半衰期。舉例而言，恆定區上之Fc受體結合位點可經修飾或突變以去除或降低與某些Fc受體(諸如FcγRI、FcγRII及/或FcγRIII)之結合親和力，以降低抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。在一些實施例中，藉由去除抗體Fc區(例如在IgG之CH2結構域中)之N-糖基化來削弱效應功能。在一些實施例中，如WO 99/58572及Armour等人，Molecular Immunology 40:585-593 (2003)；Reddy等人，J. Immunology 164:1925-1933 (2000)中所闡述，藉由修飾諸如人類IgG之233-236、297及/或327-331等區來削弱效應功能。在其他實施例中，亦可期望修飾本揭示案之抗MS4A4A抗體以改良效應功能，從而增加對含有ITIM之FcgRIIb (CD32b)之發現選擇性以增加MS4A4A抗體在毗鄰細胞上之聚集而不使體液反應(包括抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及抗體依賴性細胞吞噬作用)活化。
為延長抗體之血清半衰期，如(例如)美國專利5739277中所闡述，可將補救受體結合抗原決定基併入至抗體(尤其抗體片段)中。如本文所用，術語「補救受體結合抗原決定基 」係指IgG分子(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 或IgG4 )之Fc區之抗原決定基，其負責延長IgG分子之活體內血清半衰期。其他胺基酸序列修飾。(6) 多特異性抗體
多特異性抗體係對至少兩種不同的抗原決定基具有結合特異性之抗體，該等抗原決定基包括在同一或另一多肽(例如本揭示案之一或多種MS4A4A多肽)上之彼等抗原決定基。在一些實施例中，多特異性抗體可為雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體可為三特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體可為四特異性抗體。此等抗體可源自全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2 雙特異性抗體)。在一些實施例中，多特異性抗體包含結合至MS4A4A上之第一位點之第一抗原結合區且包含結合至MS4A4A上之第二位點之第二抗原結合區。在一些實施例中，多特異性抗體包含結合至MS4A4A之第一抗原結合區及結合至第二多肽之第二抗原結合區。
本文提供多特異性抗體，其包含結合至MS4A4A之第一抗原結合區，其中該第一抗原結合區包含本文所闡述抗體之6個HVR；及結合至第二多肽之第二抗原結合區。在一些實施例中，第一抗原結合區包含本文所闡述抗體之VH 或VL 。
在任一多特異性抗體之一些實施例中，第二多肽係a)促進跨血腦障壁轉運之抗原；(b)選自以下之促進跨血腦障壁轉運之抗原：運鐵蛋白受體(TR)；胰島素受體(HIR)；胰島素樣生長因子受體(IGFR)；低密度脂蛋白受體相關蛋白質1及2 (LPR-1及LPR-2)；白喉毒素受體CRM197；駱馬單一結構域抗體TMEM 30(A)；蛋白質轉導結構域TAT、Syn-B、穿膜肽；多精胺酸肽；血管肽及ANG1005；(c)致病性蛋白質，其選自澱粉樣β、寡聚澱粉樣β、澱粉樣β斑塊、澱粉樣前體蛋白質或其片段、Tau、IAPP、α-突觸核蛋白、TDP-43、FUS蛋白、C9orf72 (染色體9開放閱讀框72)、c9RAN蛋白、普里昂蛋白、PrPSc、亨庭頓蛋白、降血鈣素、超氧化物歧化酶、共濟失調蛋白、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、共濟失調蛋白7、共濟失調蛋白8、共濟失調蛋白10、路易氏體、心房利鈉因子、胰島澱粉樣多肽、胰島素、載脂蛋白AI、血清澱粉樣A、medin、泌乳素、轉甲狀腺素、溶菌酶、β 2微球蛋白、凝溶膠蛋白、角膜上皮蛋白、胱抑素、免疫球蛋白輕鏈AL、S-IBM蛋白、重複序列相關之非ATG (RAN)轉譯產物、二肽重複序列(DPR)肽、甘胺酸-丙胺酸(GA)重複序列肽、甘胺酸-脯胺酸(GP)重複序列肽、甘胺酸-精胺酸(GR)重複序列肽、脯胺酸-丙胺酸(PA)重複序列肽、泛素及脯胺酸-精胺酸(PR)重複序列肽；(d)在免疫細胞上表現之配位體及/或蛋白質，其中該等配位體及/或蛋白質係選自CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27 、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3及磷酯醯絲胺酸；及/或(e)在一或多種腫瘤細胞上表現之蛋白質、脂質、多糖或糖酯及其任一組合。
此項技術中已知多種促進跨血腦障壁轉運之抗原(例如，參見Gabathuler R.Neurobiol.  Dis. 37:48-57 (2010))。此等第二抗原包括(但不限於)運鐵蛋白受體(TR)、胰島素受體(HIR)、胰島素樣生長因子受體(IGFR)、低密度脂蛋白受體相關蛋白質1及2 (LPR-1及LPR-2)、白喉毒素受體(包括CRM197 (白喉毒素之無毒突變異體))、駱馬單一結構域抗體(諸如TMEM 30(A) (翻轉酶(Flippase)))、蛋白質轉導結構域(諸如TAT、Syn-B或穿膜肽)、多精胺酸或通常帶正電之肽、血管肽(諸如ANG1005) (例如，參見Gabathuler，2010)及在血腦障壁內皮細胞上富集之其他細胞表面蛋白質(例如，參見Daneman等人，PLoS One 5(10):e13741 (2010))。
多價抗體可識別MS4A4A抗原以及不限於以下之其他抗原：Aβ肽、抗原或α-突觸核蛋白抗原或Tau蛋白抗原或TDP-43蛋白抗原或普里昂蛋白抗原或亨庭頓蛋白抗原或RAN、轉譯產物抗原，包括由甘胺酸-丙胺酸(GA)、甘胺酸-脯胺酸(GP)、甘胺酸-精胺酸(GR)、脯胺酸-丙胺酸(PA)或脯胺酸-精胺酸(PR)構成之二肽重複序列(DPR肽)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體。運鐵蛋白受體或促進抗體跨血腦障壁轉移之任何其他抗原。在一些實施例中，第二多肽係運鐵蛋白。在一些實施例中，第二多肽係Tau。在一些實施例中，第二多肽係Aβ。在一些實施例中，第二多肽係TREM2。在一些實施例中，第二多肽係α-突觸核蛋白。
多價抗體含有至少一條多肽鏈(且較佳兩條多肽鏈)，其中該(等)多肽鏈包含兩個或更多個可變結構域。舉例而言，該(等)多肽鏈可包含VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc，其中VD1係第一可變結構域，VD2係第二可變結構域，Fc係Fc區之一條多肽鏈，X1及X2代表胺基酸或多肽，且n係0或1。類似地，該(等)多肽鏈可包含VH -CH 1-撓性連接體-VH -CH 1-Fc區鏈；或VH -CH 1-VH -CH 1-Fc區鏈。本文之多價抗體較佳地進一步包含至少兩種(且較佳四種)輕鏈可變結構域多肽。本文之多價抗體可(例如)包含約2種至約8種輕鏈可變結構域多肽。本文所審慎考慮之輕鏈可變結構域多肽包含輕鏈可變結構域且視情況進一步包含CL結構域。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello，Nature 305:537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J. 10:3655 (1991))及「隆凸於孔洞中」工程改造(例如，參見美國專利第5731168號)。亦參見WO 2013/026833 (CrossMab)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：工程改造靜電牽引效應以供製備抗體Fc-異二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體交聯(例如，參見美國專利第4676980號)；使用白胺酸；使用「雙價抗體」技術以供製備雙特異性抗體片段(例如，參見Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (scFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J. Immunol. 152:5368 (1994))；及如(例如) Tutt等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)中所闡述製備三特異性抗體。
本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」(例如，參見US 2006/0025576)。本文抗體亦包括「雙重作用之FAb」或「DAF」，其包含結合至多個MS4A4A之抗原結合位點(例如，參見US 2008/0069820)。(7) 抗體變異體
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，審慎考慮抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。(i) 取代、插入及缺失變異體
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入至編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。表 A ：胺基酸取代
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
對抗體生物學性質之實質性修飾係藉由選擇在維持以下性質之效應方面顯著不同的取代來實現：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如呈摺疊或螺旋構形，(b)靶位點處分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之體積(bulk of the side chain)。基於常見側鏈性質將天然殘基分為以下各組： (1)     疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)     中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)     酸性：Asp、Glu； (4)     鹼性：His、Lys、Arg； (5)     影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及 (6)     芳香族：Trp、Tyr、Phe。
舉例而言，非保守性取代可涉及將該等類別中之一者之成員換成另一類別之成員。可將此等經取代殘基引入至(例如)與非人類抗體同源之人類抗體之區中，或引入至分子之非同源區中。
根據某些實施例，在對本文所闡述之多肽或抗體進行改變時，可考慮胺基酸之親疏水性指數(hydropathic index)。已基於每一胺基酸之疏水性及電荷特徵為其指派親疏水性指數。該等親疏水性指數為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(−0.4)；蘇胺酸(−0.7)；絲胺酸(−0.8)；色胺酸(−0.9)；酪胺酸(−1.3)；脯胺酸(−1.6)；組胺酸(−3.2)；麩胺酸鹽(−3.5)；麩醯胺酸(−3.5)；天冬胺酸鹽(−3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(−3.9)；及精胺酸(−4.5)。
此項技術中理解親疏水性胺基酸指數在賦予蛋白質交互生物學功能中之重要性。Kyte等人，J. Mol. Biol ., 157:105-131 (1982)。已知某些胺基酸可取代具有類似親疏水性指數或評分之其他胺基酸且仍保留類似生物學活性。在基於親疏水性指數進行改變時，在某些實施例中，包括親疏水性指數在±2以內之胺基酸之取代。在某些實施例中，包括在±1以內之彼等胺基酸之取代，且在某些實施例中，包括在±0.5以內之彼等胺基酸之取代。
此項技術中亦理解，可基於親水性有效地進行相似胺基酸之取代，尤其是在藉此產生之生物功能性蛋白質或肽意欲用於免疫實施例之情形中，如本發明之情形。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如由其毗鄰胺基酸之親水性管控)與其免疫原性及抗原性(亦即，蛋白質之生物學性質)相關。
已將以下親水性值指派給該等胺基酸殘基：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0±1)；天冬胺酸鹽(+3.0±1)；麩胺酸鹽(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(−0.4)；脯胺酸(−0.5±1)；丙胺酸(−0.5)；組胺酸(−0.5)；半胱胺酸(−1.0)；甲硫胺酸(−1.3)；纈胺酸(−1.5)；白胺酸(−1.8)；異白胺酸(−1.8)；酪胺酸(−2.3)；苯丙胺酸(−2.5)及色胺酸(−3.4)。在基於類似親水性值進行改變時，在某些實施例中，包括親水性值在±2以內之胺基酸之取代，在某些實施例中，包括在±1以內之彼等胺基酸之取代，且在某些實施例中，包括在±0.5以內之彼等胺基酸之取代。亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。該等區亦稱為「抗原決定基核心區」。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可對HVR作出不會實質上降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供之保守性取代)。此等改變可(例如)在HVR中之抗原接觸殘基外部。在上文所提供之變異體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
胺基酸序列插入包括胺基末端及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至包含上百或更多個殘基之多肽範圍內)以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如用於ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽之融合物。
不參與維持抗體之適當構形之任一半胱胺酸殘基通常亦可經絲胺酸取代，以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反，可將一或多個半胱胺酸鍵添加至抗體以改良其穩定性(尤其是在抗體係抗體片段(諸如Fv片段)之情形下)。(ii) 糖基化變異體
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，改變抗體以增加或減少該抗體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列使得產生或去除一或多個糖基化位點便捷地實現抗體中糖基化位點之增加或缺失。
抗體之糖基化通常為N連接或O連接的。N連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X係除脯胺酸外之任一胺基酸)係碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在該等三肽序列中之任一者均可產生潛在糖基化位點。O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸(最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸)之連接。
將糖基化位點添加至抗體可藉由改變胺基酸序列使得其含有上述三肽序列中之一或多者便捷地實現(對於N連接之糖基化位點而言)。亦可藉由向原始抗體之序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基進行取代來達成該改變(對於O連接之糖基化位點而言)。
倘若抗體包含Fc區，則可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈二分枝寡糖，其通常藉由N鍵聯連接至Fc區之CH2結構域之Asn297 (根據Kabat編號)。該寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及連接至二分枝寡糖結構之「主幹」中的GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可對本揭示案抗體中之寡糖進行修飾以產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺少(直接或間接地)連接至Fc區之岩藻糖的碳水化合物結構之抗體變異體。例如，參見美國專利公開案第2003/0157108號及第2004/0093621號。與「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體相關之出版物之實例包括：US 2003/0157108；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng . 87:614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Led 3 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986)；US 2003/0157108)，及剔除細胞株(諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞) (例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)及Kanda等人，Biotechnol. Bioeng . 94(4):680-688 (2006))。(iii) 經修飾之恆定區
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，抗體Fc係抗體Fc同型及/或修飾形式。在一些實施例中，抗體Fc同型及/或修飾形式能夠結合至Fc γ受體。
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，經修飾之抗體Fc係IgG1修飾之Fc。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含一或多種修飾。舉例而言，在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含一或多個胺基酸取代(例如相對於相同同型之野生型Fc區)。在一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自N297A (Bolt S 等人，(1993)Eur J Immunol 23:403-411)、D265A (Shields等人，(2001)R. J. Biol. Chem. 276, 6591-6604)、L234A、L235A (Hutchins等人，(1995)Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984；Alegre等人，(1994)Transplantation 57:1537-1543. 31；Xu等人，(2000)Cell Immunol , 200:16-26)、G237A (Alegre等人，(1994)Transplantation 57:1537-1543. 31；Xu等人，(2000)Cell Immunol , 200:16-26)、C226S、C229S、E233P、L234V、L234F、L235E (McEarchern等人，(2007)Blood , 109:1185-1192)、P331S (Sazinsky等人，(2008)Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:20167-20172)、S267E、L328F、A330L、M252Y、S254T及/或T256E，其中胺基酸位置係根據EU編號慣例。
在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之N297A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之D265A及N297A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之N297A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之K322A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之N297A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P331S突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之D270A突變。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號之L234A及L235A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L234A及G237A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L234A、L235A及G237A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、L328E、E233、G237D、H268D、P271G及A330R突變中之一或多者(包括全部)。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E/L328F突變中之一或多者。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之N325S及L328F突變(N325S/L328F)。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、L328E、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、S267E、L328E、E233D、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之P238D、S267E、L328E、G237D、H268D、P271G及A330R突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之C226S、C229S、E233P、L234V及L235A突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L234F、L235E及P331S突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E及L328F突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E突變。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含用具有κ輕鏈之IgG2之恆定重鏈1 (CH1)及鉸鏈區(根據EU編號，IgG2之胺基酸118-230)取代IgG1之CH1及鉸鏈區。
在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，與具有不包括兩個或更多個胺基酸取代之Fc區之相應抗體相比，該Fc包括兩個或更多個使抗體聚集增加而不使補體活化之胺基酸取代。因此，在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，IgG1修飾之Fc係包含Fc區之抗體，其中該抗體包含根據EU編號在位置E430G處之胺基酸取代及一或多個選自以下之Fc區中殘基位置處之胺基酸取代：L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S及其任一組合。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G、L234A、L235A及P331S處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置L234A、L235A及P331S處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G及P331S處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G及K322A處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G、A330S及P331S處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G、K322A、A330S及P331S處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G、K322A及A330S處之胺基酸取代。在一些實施例中，IgG1修飾之Fc包含根據EU編號在位置E430G、K322A及P331S處之胺基酸取代。
在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，IgG1修飾之Fc可在本文中進一步包含根據EU編號慣例之A330L突變(Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA , 103:4005-4010 (2006))，或L234F、L235E及/或P331S突變中之一或多者(Sazinsky等人，Proc Natl Acad Sci USA , 105:20167-20172 (2008))，以消除補體活化。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，IgG1修飾之Fc可進一步包含根據EU編號之A330L、A330S、L234F、L235E及/或P331S中之一或多者。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，IgG1修飾之Fc可進一步包含一或多個突變以延長人類血清中之抗體半衰期(例如根據EU編號慣例，M252Y、S254T及T256E突變中之一或多者(包括全部))。在任一IgG1修飾之Fc之一些實施例中，IgG1修飾之Fc可進一步包含根據EU編號之E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y及/或S440W中之一或多者。
本揭示案之其他態樣係關於具有經修飾恆定區(亦即Fc區)之抗體。若對依賴於結合至FcgR受體以使靶向受體活化之抗體進行工程改造以消除FcgR結合，則其可喪失促效劑活性(例如，參見Wilson等人，Cancer Cell 19:101-113 (2011)；Armour等人，Immunology 40:585-593 (2003)；及White等人，Cancer Cell 27:138-148 (2015))。因此，當具有正確抗原決定基特異性之本揭示案之抗MS4A4A抗體具有來自人類IgG2同型之Fc結構域(CH1及鉸鏈區)或能夠優先結合抑制性FcgRIIB r受體之另一類Fc結構域或其變化形式時，認為該抗體可使靶抗原活化且不良效應最低。
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，經修飾之抗體Fc係IgG2修飾之Fc。在一些實施例中，IgG2修飾之Fc包含一或多種修飾。舉例而言，在一些實施例中，IgG2修飾之Fc包含一或多個胺基酸取代(例如相對於相同同型之野生型Fc區)。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自根據EU編號慣例之V234A (Alegre等人，Transplantation 57:1537-1543 (1994)；Xu等人，Cell Immunol , 200:16-26 (2000))；G237A (Cole等人，Transplantation , 68:563-571 (1999))；H268Q、V309L、A330S、P331S (US 2007/0148167；Armour等人，Eur J Immunol 29: 2613-2624 (1999)；Armour等人，The Haematology Journal 1 (增刊1):27 (2000)；Armour等人，The Haematology Journal 1 (增刊1):27 (2000))、C219S及/或C220S (White等人，Cancer Cell 27, 138-148 (2015))；S267E、L328F (Chu等人，Mol Immunol , 45:3926-3933 (2008))；及M252Y、S254T及/或T256E。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置V234A及G237A處之胺基酸取代。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置C219S或C220S處之胺基酸取代。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置A330S及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置S267E及L328F處之胺基酸取代。
在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號慣例之C127S胺基酸取代(White等人，(2015)Cancer Cell 27, 138-148；Lightle等人，Protein Sci. 19:753-762 (2010)；及WO 2008/079246)。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，抗體具有κ輕鏈恆定結構域包含根據EU編號慣例之C214S胺基酸取代之IgG2同型(White等人，Cancer Cell 27:138-148 (2015)；Lightle等人，Protein Sci. 19:753-762 (2010)；及WO 2008/079246)。
在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號慣例之C220S胺基酸取代。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，抗體具有κ輕鏈恆定結構域包含根據EU編號慣例之C214S胺基酸取代之IgG2同型。
在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號慣例之C219S胺基酸取代。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，抗體具有κ輕鏈恆定結構域包含根據EU編號慣例之C214S胺基酸取代之IgG2同型。
在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包括IgG2同型重鏈恆定結構域1(CH1)及鉸鏈區(White等人，Cancer Cell 27:138-148 (2015))。在任一IgG2修飾之Fc之某些實施例中，IgG2同型CH1及鉸鏈區包含根據EU編號118-230之胺基酸序列。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，抗體Fc區包含根據EU編號慣例之S267E胺基酸取代、L328F胺基酸取代或該兩者及/或N297A或N297Q胺基酸取代。
在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc進一步包含根據EU編號在以下位置處之一或多個胺基酸取代：E430G、E430S、E430F、E430T、E345K、E345Q、E345R、E345Y、S440Y及S440W。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc可進一步包含一或多個突變以延長人類血清中之抗體半衰期(例如根據EU編號慣例，M252Y、S254T及T256E突變中之一或多者(包括全部))。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc可進一步包含A330S及P331S。
在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc係IgG2/4雜合Fc。在一些實施例中，IgG2/4雜合Fc包含IgG2 aa 118至260及IgG4 aa 261至447。在任一IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置H268Q、V309L、A330S及P331S處之一或多個胺基酸取代。
在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含一或多個選自根據EU編號A330L、L234F、L235E或P331S及其任一組合之額外胺基酸取代。
在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之某些實施例中，Fc包含根據EU編號在選自以下殘基位置處之一或多個胺基酸取代：C127S、L234A、L234F、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、A330S、P331S、E345R、E430G、S440Y及其任一組合。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G、L243A、L235A及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G及K322A處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G、A330S及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G、K322A、A330S及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G、K322A及A330S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G、K322A及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置S267E及L328F處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置C127S處之胺基酸取代。在任一IgG1及/或IgG2修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E345R、E430G及S440Y處之胺基酸取代。
在本文所提供之任一抗體之一些實施例中，經修飾之抗體Fc係IgG4修飾之Fc。在一些實施例中，IgG4修飾之Fc包含一或多種修飾。舉例而言，在一些實施例中，IgG4修飾之Fc包含一或多個胺基酸取代(例如相對於相同同型之野生型Fc區)。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，該一或多個胺基酸取代係選自根據EU編號慣例之L235A、G237A、S229P、L236E (Reddy等人，J Immunol 164:1925-1933(2000))、S267E、E318A、L328F、M252Y、S254T及/或T256E。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc可進一步包含根據EU編號慣例之L235A、G237A及E318A。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc可進一步包含根據EU編號慣例之S228P及L235E。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，IgG4修飾之Fc可進一步包含根據EU編號慣例之S267E及L328F。
在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，IgG4修飾之Fc可與根據EU編號慣例之S228P突變組合(Angal等人，Mol Immunol. 30:105-108 (1993))及/或與(Peters等人，J Biol Chem. 287(29):24525-33 (2012))中所闡述之一或多個突變組合以增強抗體穩定。
在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，IgG4修飾之Fc可進一步包含一或多個突變以延長人類血清中之抗體半衰期(例如根據EU編號慣例，M252Y、S254T及T256E突變中之一或多者(包括全部))。
在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之L235E。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S228P突變。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號之S267E及L328F突變。在任一IgG4修飾之Fc之某些實施例中，Fc包含根據EU編號在選自以下殘基位置處之一或多個胺基酸取代：C127S、F234A、L235A、L235E、S267E、K322A、L328F、E345R、E430G、S440Y及其任一組合。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G、L243A、L235A及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G及P331S處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430G及K322A處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E430處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc區包含根據EU編號在位置E430G及K322A處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置S267E及L328F處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置C127S處之胺基酸取代。在任一IgG4修飾之Fc之一些實施例中，Fc包含根據EU編號在位置E345R、E430G及S440Y處之胺基酸取代。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:336之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:328之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:320之胺基酸序列之重鏈。
在一些實施例中，抗體具有不含C末端離胺酸之人類IgG1重鏈。在一些實施例中，抗體具有含有P331S突變之人類IgG1重鏈。在一些實施例中，抗體具有含有P331S突變且不含C末端離胺酸之人類IgG1重鏈。在一些實施例中，抗體具有含有N325S及L328F突變(N325S/L328F)之人類IgG1重鏈。在一些實施例中，抗體具有含有N325S/L328F突變且不含C末端離胺酸之人類IgG1重鏈。在一些實施例中，抗體具有含有K322A突變之人類IgG1重鏈。在一些實施例中，抗體具有含有K322A突變且不含C末端離胺酸之人類IgG1重鏈。在前述實施例中，突變係根據EU編號指示。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:337之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:338之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:339之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:340之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:341之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:342之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:343之胺基酸序列之重鏈。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:329之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:330之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:331之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:332之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:333之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:334之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:335之胺基酸序列之重鏈。
在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:321之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:322之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:323之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:324之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:325之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:326之胺基酸序列之重鏈。在一些實施例中，抗體包含有包含SEQ ID NO:327之胺基酸序列之重鏈。(8) 其他抗體修飾
在任一抗體之一些實施例中，抗體係衍生物。術語「衍生物」係指包括除胺基酸(或核酸)之插入、缺失或取代以外之化學修飾之分子。在某些實施例中，衍生物包含共價修飾，包括(但不限於)與聚合物、脂質或其他有機或無機部分之化學鍵結。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合蛋白可較未經化學修飾之抗原結合蛋白具有更長之循環半衰期。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合蛋白可具有改良之對期望細胞、組織及/或器官之靶向能力。在一些實施例中，衍生物抗原結合蛋白經共價修飾以包括一或多種水溶性聚合物連接物，包括(但不限於)聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。例如，參見美國專利第4640835號、第4496689號、第4301144號、第4670417號、第4791192號及第4179337號。在某些實施例中，衍生物抗原結合蛋白包含一或多種聚合物，包括(但不限於)單甲氧基-聚乙二醇、聚葡萄糖、纖維素、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)、聚-(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇以及此等聚合物之混合物。
在某些實施例中，衍生物經聚乙二醇(PEG)亞單元共價修飾。在某些實施例中，一或多種水溶性聚合物在衍生物之一或多個特定位置處(例如在胺基末端處)鍵結。在某些實施例中，一或多種水溶性聚合物隨機連接至衍生物之一或多條側鏈。在某些實施例中，使用PEG來改良抗原結合蛋白之治療能力。在某些實施例中，使用PEG來改良人類化抗體之治療能力。某些此等方法論述於(例如)美國專利第6133426號中，其出於任何目的係以引用的方式併入本文中。
肽類似物在醫藥行業中常用作非肽藥物，其性質類似於模板肽之彼等性質。該等類型之非肽化合物稱作「肽模擬物(peptide mimetic或peptidomimetic)」。Fauchere,J. Adv. Drug Res ., 15:29 (1986)；及Evans等人，J. Med. Chem ., 30:1229 (1987)，其出於任何目的係以引用的方式併入本文中。此等化合物通常係在電腦化分子建模之幫助下開發出的。可使用在結構上類似於治療可用肽之肽模擬物來產生類似之治療性或預防性效應。通常，肽模擬物在結構上類似於範例多肽(亦即具有生物化學性質或藥理學活性之多肽)，諸如人類抗體，但其一或多個肽鍵聯視情況藉由此項技術中熟知之方法由選自以下之鍵聯替代：-CH2 NH-、-CH2 S-、-CH2 -CH2 -、-CH═CH-(順式及反式)、-COCH2 -、-CH(OH)CH2 -及-CH2 SO-。在某些實施例中，用相同類型之D-胺基酸系統性取代一致序列之一或多個胺基酸(例如D-離胺酸替代L-離胺酸)可用以產生更穩定之肽。另外，包含一致序列或實質上相同之一致序列變化形式之限制性肽可藉由此項技術中已知之方法來產生(Rizo及Gierasch，Ann. Rev. Biochem ., 61:387 (1992)，其出於任何目的係以引用的方式併入本文中)；舉例而言，藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋之內部半胱胺酸殘基來實施。
藥物結合涉及使生物活性細胞毒性(抗癌)有效載荷或藥物與特異性靶向某一腫瘤標記物(例如理想地僅發現於腫瘤細胞中或腫瘤細胞上之多肽)之抗體偶合。抗體在體內追蹤該等蛋白質且將自身附著至癌細胞表面。抗體與靶蛋白(抗原)之間的生物化學反應在腫瘤細胞中觸發信號，接著該腫瘤細胞將抗體與細胞毒素一起吸收或內化。在ADC內化後，釋放細胞毒性藥物且殺傷癌症。由於此靶向，因此藥物理想地具有較低之副作用且給出較其他化學治療劑更寬之治療窗。結合如所揭示抗體之技術為此項技術中所已知(例如，參見Jane de Lartigue，OncLive 2012年7月5日；ADC Review on antibody-drug conjugates；及Ducry等人，Bioconjugate Chemistry 21 (1):5-13 (2010)。 III. 核酸、載體及宿主細胞
本揭示案之抗MS4A4A抗體可使用(例如)如美國專利第4816567號中所闡述之重組方法及組合物來產生。在一些實施例中，提供經分離核酸，其具有編碼本揭示案之任一抗MS4A4A抗體之核苷酸序列。此等核酸可編碼構成抗MS4A4A抗體之VL 之胺基酸序列及/或構成抗MS4A4A抗體之VH 之胺基酸序列(例如該抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一些實施例中，提供一或多個包含此等核酸之載體(例如表現載體)。在一些實施例中，亦提供包含此核酸之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞包含如下載體(例如已經如下載體轉型)：(1)包含如下核酸之載體：其編碼構成抗體之VL 之胺基酸序列及構成抗體之VH 之胺基酸序列，或(2)第一載體，其包含編碼構成抗體之VL 之胺基酸序列的核酸，及第二載體，其包含編碼構成抗體之VH 之胺基酸序列的核酸。在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。本揭示案之宿主細胞亦包括(但不限於)經分離細胞、活體外培養細胞及離體培養細胞。
提供製備本揭示案之抗MS4A4A抗體之方法。在一些實施例中，該方法包括在適於表現抗MS4A4A抗體之條件下培養包含編碼該抗體之核酸的本揭示案之宿主細胞。在一些實施例中，該抗體隨後自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收。
為重組產生本揭示案之抗MS4A4A抗體，將編碼該抗MS4A4A抗體之核酸分離且插入至一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此核酸可使用習用程序容易地分離並測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)。
包含編碼本揭示案之任一抗MS4A4A抗體或本文所闡述多肽(包括抗體)之細胞表面表現片段或多肽之核酸序列之適宜載體包括(但不限於)選殖載體及表現載體。適宜選殖載體可根據標準技術來構築，或可選自此項技術中可獲得之大量選殖載體。雖然所選擇之選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而有所變化，但可用之選殖載體通常具有自複製之能力，可具有特定限制性核酸內切酶之單一靶標，及/或可攜帶可用於選擇包含該載體之純系之標記物的基因。適宜實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript (例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。該等及許多其他選殖載體可自商業供應商獲得，諸如BioRad、Strategene及Invitrogen。
用於選殖或表現抗體編碼載體之適宜宿主細胞包括原核或真核細胞。舉例而言，本揭示案之抗MS4A4A抗體可在細菌中產生，尤其是在不需要糖基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現(例如美國專利第5648237號、第5789199號及第5840523號)。表現後，可自細菌細胞團以可溶性部分形式分離出抗體且可進一步純化。
除原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)亦係適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株(例如，Gerngross，Nat. Biotech . 22:1409-1414 (2004)；及Li等人，Nat. Biotech. 24:210-215 (2006))。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦可源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可聯合昆蟲細胞使用、尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞之多種桿狀病毒株。亦可利用植物細胞培養物作為宿主(例如美國專利第5959177號、第6040498號、第6420548號、第7125978號及第6417429號，其闡述用於在基因轉殖植物中產生抗體之PLANTIBODIES™技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。可用哺乳動物宿主細胞株之其他實例係經SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293細胞，如(例如) Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所闡述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠支援細胞(TM4細胞，如(例如) Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中所闡述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如) Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所闡述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他可用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見(例如) Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology ，第 248 卷 (B.K.C. Lo編輯，Humana Press, Totowa, NJ)，第255-268頁(2003)。 IV. 醫藥組合物 / 調配物
本文提供包含本揭示案之抗MS4A4A抗體及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物及/或醫藥調配物。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下較佳對接受者無毒。可將本文所闡述之抗體調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑。此等調配物之實例包括(但不限於)錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、注射液、吸入劑、凝膠、微球及氣溶膠。端視於期望之調配物而定，醫藥學上可接受之載劑可包括醫藥學上可接受、無毒之稀釋劑載劑，其係常用於調配用於動物或人類投與之醫藥組合物之媒劑。在某些實施例中，醫藥組合物可包含用於修改、維持或保持(例如) pH、滲透性、黏度、澄清度、色彩、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶離或釋放速率、組合物之吸附或滲透之調配物材料。
在某些實施例中，醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；複合劑(諸如咖啡因、聚乙烯基吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單糖；二糖；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、矯味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯基吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、柳酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(諸如普郎尼克(pluronic)、PEG、山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、曲拉通(triton)、胺丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapol))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物、較佳氯化鈉或氯化鉀、甘露醇、山梨醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。適於各種投與類型之調配物之其他實例可參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy , Pharmaceutical Press，第22版 (2013)。關於藥物遞送方法之簡短綜述，參見Langer,Science 249:1527-1533 (1990)。
適於非經腸投與之調配物包括水性及非水性等滲無菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及可使調配物與預期接受者之血液等滲之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。
調配物可經最佳化以在腦或中樞神經系統中保留且穩定。當將劑投與至顱腔室中時，期望該劑保留在該腔室中，且不擴散或以其他方式穿過血腦障壁。穩定技術包括交聯、多聚化或連接至諸如聚乙二醇、聚丙烯醯胺、中性蛋白質載劑等基團以達成分子量之增加。
用於延長保留之其他策略包括將抗體(諸如本揭示案之抗MS4A4A抗體)包埋在可生物降解或可生物蝕解之植入物中。治療活性劑之釋放速率受穿過聚合基質之轉運速率及植入物之生物降解控制。植入物可為顆粒、薄片、貼片、斑塊、纖維、微膠囊及諸如此類，且可具有與所選插入位點相容之任何大小或形狀。可採用之可生物降解之聚合組合物可為有機酯或醚，其在降解時產生生理學上可接受之降解產物，包括單體。可使用酸酐、醯胺、原酸酯或諸如此類自身或與其他單體之組合。聚合物將為縮合聚合物。聚合物可交聯或不交聯。尤受關注者係羥基脂肪族羧酸之聚合物(均聚物或共聚物)及多糖。所關注之聚酯包括D-乳酸、L-乳酸、外消旋乳酸、乙醇酸、聚己內酯及其組合之聚合物。所關注之多糖為海藻酸鈣及官能化纖維素、具體而言特徵在於水不溶性、分子量為約5 kD至500 kD等之羧甲基纖維素酯。本揭示案之植入物中亦可採用可生物降解之水凝膠。水凝膠通常係特徵在於能夠吸收液體之共聚物材料。 V. 治療用途
如本文所揭示，本揭示案之抗MS4A4A抗體可用於預防疾病及病症、降低其風險或對其進行治療。在一些實施例中，本揭示案之抗MS4A4A抗體有效預防阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病及認知損害、降低其風險或對其進行治療。作為疾病靶標之 MS4A4A
全基因體關聯研究已鑑別出MS4A家族中與阿茲海默氏病相關之各個成員。該等成員係MS4A2、MS4A3、MS4A4A、MS4A4E、MS4A6A及MS4A6E。相關之SNP在MS4A6A之3′ UTR (rs610932)及MS4A4E與MS4A6A之間的基因間隔區(rs670139)中發現。MS4A基因簇中有三個SNP與遲發型阿茲海默氏病之風險增加相關。該等SNP包括MS4A4A中之rs4938933、MS4A4E中之rs670139及MS4A6A中之rs610932 (Hollingworth等人，2011, Nat Genetics, 43:429-435；Naj等人，2011, Nature Genetics, 43:436-441；Antunez等人，2011, Genome Medicine, 3，文章33)。另外，MS4A4A基因座SNP (rs2304933及rs2304935)與較高之MS4A4A水準及阿茲海默氏病、包括遲發型阿茲海默氏病(LOAD)風險增加相關(Allen等人，2012, Neurology, 79:221-228)。
本文所提供之方法可用於預防、降低風險或治療患有神經退化性疾病、病症或疾患之個體。在一些實施例中，本揭示案提供用於預防、降低風險或治療患有神經退化性病症之個體之方法，該方法包括向有需要之該個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。
在一些實施例中，本揭示案提供用於預防、降低風險或治療患有阿茲海默氏病之個體之方法，該方法包括向有需要之該個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。
在一些實施例中，本揭示案提供用於預防、降低風險或治療患有遲發型阿茲海默氏病之個體之方法，該方法包括向有需要之該個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。
在一些實施例中，本揭示案提供用於預防、降低風險或治療患有輕度認知損害之個體之方法，該方法包括向有需要之該個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。
在一些實施例中，本揭示案提供用於預防、降低風險或治療患有與MS4A4A之過表現或活性增加相關的疾病、病症或疾患之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。
在一些實施例中，本揭示案提供用於預防、降低風險或治療患有CSF1R缺乏疾病或病症之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之抗MS4A4A抗體。在一些實施例中，CSF1R缺乏疾病或病症係成人發作型腦白質病變伴軸突球樣變及膠質著色(ALSP)或遺傳性瀰漫性腦白質病變伴球樣變(HDLS)。
本揭示案之其他態樣係關於預防、降低風險或治療患有選自由以下組成之群的疾病、病症或損傷之個體之方法：額顳葉失智症、阿茲海默氏病、輕度認知損害、血管型失智症、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、創傷性腦損傷、脊髓損傷、長期抑鬱、動脈粥樣硬化血管疾病、正常衰老之不期望症狀、失智症、混合型失智症、庫賈二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、常壓性水腦症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨庭頓氏病(Huntington’s disease)、tau蛋白病變病、中風、急性創傷、慢性創傷、狼瘡、急性及慢性結腸炎、克隆氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、瘧疾、自發性震顫、中樞神經系統狼瘡、貝賽特氏病(Behcet's disease)、帕金森氏病、路易氏體型失智症(dementia with Lewy bodies)、多系統萎縮、椎間盤退化性疾病、夏伊-德雷格症候群(Shy-Drager syndrome)、進行性核上性麻痺、皮質基底神經節退化、急性瀰漫性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老疾病、年齡相關性黃斑退化、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜退化、呼吸道感染、敗血症、眼部感染、全身性感染、發炎性病症、關節炎、多發性硬化、代謝失調、肥胖症、胰島素抗性、2型糖尿病、組織或血管損傷、損傷、發炎性細胞碎片或蛋白質聚集體、異常循環骨髓樣細胞、不健康衰老、年齡相關性認知損害、年齡相關性腦萎縮、年齡相關性特質(包括(但不限於)發炎、神經元丟失及認知缺陷，諸如在不存在已知腦病情形下之認知缺陷，包括年老個體之額葉大腦皮質之認知缺陷及正常衰老之一或多種不期望症狀)，該方法包括向該個體投與治療有效量之任一前述實施例之抗MS4A4A抗體。本揭示案之其他態樣係關於任一前述實施例之抗MS4A4A抗體，其用於預防、降低風險或治療患有選自由以下組成之群的疾病、病症或損傷之個體：額顳葉失智症、阿茲海默氏病、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、創傷性腦損傷、脊髓損傷、長期抑鬱、動脈粥樣硬化血管疾病、正常衰老之不期望症狀、失智症、混合型失智症、庫賈二氏病、常壓性水腦症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨庭頓氏病、tau蛋白病變病、中風、急性創傷、慢性創傷、狼瘡、急性及慢性結腸炎、克隆氏病、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、瘧疾、自發性震顫、中樞神經系統狼瘡、貝賽特氏病、帕金森氏病、路易氏體型失智症、多系統萎縮、椎間盤退化性疾病、夏伊-德雷格症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底神經節退化、急性瀰漫性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老疾病、年齡相關性黃斑退化、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜退化、呼吸道感染、敗血症、眼部感染、全身性感染、發炎性病症、關節炎、多發性硬化、代謝失調、肥胖症、胰島素抗性、2型糖尿病、組織或血管損傷、損傷、發炎性細胞碎片或蛋白質聚集體、異常循環骨髓樣細胞、不健康衰老、年齡相關性認知損害、年齡相關性腦萎縮、年齡相關性特質(包括(但不限於)發炎、神經元丟失及認知缺陷，諸如在不存在已知腦病情形下之認知缺陷，包括年老個體之額葉大腦皮質之認知缺陷及正常衰老之一或多種不期望症狀)。本揭示案之其他態樣係關於任一前述實施例之抗MS4A4A抗體，其用於預防或降低轉移。本揭示案之其他態樣係關於任一前述實施例之抗MS4A4A抗體，其用於預防、降低風險或治療患有癌症之個體。
本揭示案之其他態樣係關於任一前述實施例之抗MS4A4A抗體之用途，其用於製造用於預防、降低風險或治療患有選自由以下組成之群的疾病、病症或損傷之個體之藥劑：額顳葉失智症、阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、輕度認知損害、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、創傷性腦損傷、脊髓損傷、長期抑鬱、動脈粥樣硬化血管疾病、正常衰老之不期望症狀、失智症、混合型失智症、庫賈二氏病、常壓性水腦症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨庭頓氏病、tau蛋白病變病、中風、急性創傷、慢性創傷、狼瘡、急性及慢性結腸炎、克隆氏病、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、瘧疾、自發性震顫、中樞神經系統狼瘡、貝賽特氏病、帕金森氏病、路易氏體型失智症、多系統萎縮、椎間盤退化性疾病、夏伊-德雷格症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底神經節退化、急性瀰漫性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老疾病、年齡相關性黃斑退化、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜退化、呼吸道感染、敗血症、眼部感染、全身性感染、發炎性病症、關節炎、多發性硬化、代謝失調、肥胖症、胰島素抗性、2型糖尿病、組織或血管損傷、損傷、發炎性細胞碎片或蛋白質聚集體、異常循環骨髓樣細胞、不健康衰老、年齡相關性認知損害、年齡相關性腦萎縮、年齡相關性特質(包括(但不限於)發炎、神經元丟失及認知缺陷，諸如在不存在已知腦病情形下之認知缺陷，包括年老個體之額葉大腦皮質之認知缺陷及正常衰老之一或多種不期望症狀)。本揭示案之其他態樣係關於預防、降低風險或治療患有選自由以下組成之群的疾病、病症或損傷之個體之方法：額顳葉失智症、進行性核上性麻痺、阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、輕度認知損害、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、創傷性腦損傷、脊髓損傷、失智症、中風、帕金森氏病、急性瀰漫性腦脊髓炎、視網膜退化、年齡相關性黃斑退化、青光眼、多發性硬化、敗血性休克、細菌感染、關節炎及骨關節炎，該方法包括向該個體投與治療有效量之任一前述實施例之抗MS4A4A抗體。本揭示案之其他態樣係關於任一前述實施例之抗MS4A4A抗體，其用於預防、降低風險或治療患有選自由以下組成之群的疾病、病症或損傷之個體：額顳葉失智症、進行性核上性麻痺、阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、輕度認知損害、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、創傷性腦損傷、脊髓損傷、失智症、中風、帕金森氏病、急性瀰漫性腦脊髓炎、視網膜退化、年齡相關性黃斑退化、青光眼、多發性硬化、敗血性休克、細菌感染、關節炎及骨關節炎。本揭示案之其他態樣係關於任一前述實施例之抗MS4A4A抗體之用途，其用於製造用於預防、降低風險或治療患有選自由以下組成之群的疾病、病症或損傷之個體之藥劑：額顳葉失智症、進行性核上性麻痺、阿茲海默氏病、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、創傷性腦損傷、脊髓損傷、失智症、中風、帕金森氏病、急性瀰漫性腦脊髓炎、視網膜退化、年齡相關性黃斑退化、青光眼、多發性硬化、敗血性休克、細菌感染、關節炎及骨關節炎。
在一些實施例中，個體(subject或individual)係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在一些實施例中，個體(subject或individual)係人類。
本文所提供之抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式來投與，包括非經腸、肺內、鼻內、病灶內投與、腦脊髓內、顱內、脊椎內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑。非經腸輸注包括肌內、以濃注形式或藉由在一段時間內連續輸注靜脈內投與、動脈內、關節內、腹膜內或皮下投與。在一些實施例中，投與係靜脈內投與。在一些實施例中，投與係皮下的。可藉由任何適宜途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)進行投藥，此部分地取決於投與為短期抑或長期的。本文審慎考慮各種投藥時間表，包括(但不限於)在各個時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本文所提供之抗體將以符合良好醫學實踐之方式經調配、投藥及投與。本文中需考慮之因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個別患者之臨床狀況、病症原因、劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及開業醫師所知之其他因素。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所論述病症之劑一起調配。此等其他劑之有效量取決於調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所討論之其他因素。該等劑通常以相同劑量及如本文所闡述之投與途徑來使用，或以本文所闡述劑量之約1%至99%來使用，或以憑經驗/臨床確定為適當之任一劑量及任一途徑來使用。
對於疾病之預防或治療，本揭示案抗體之適當劑量(在單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。將抗體適宜地一次性或經一系列治療投與給患者。
端視疾病之類型及嚴重程度，不論(例如)藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注，約1 μg/kg至100 mg/kg之抗體可為投與給患者之初始候選劑量。端視上文所提及之因素而定，一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高範圍內。對於經若干天或更久之重複投與而言，端視疾患而定，通常將持續治療直至出現對疾病症狀之期望阻抑為止。一個例示性抗體劑量將在約0.05 mg/kg至約150 mg/kg範圍內，其可間歇性地投與給患者，例如每週或每三週(例如使得患者接受約2個至約20個或例如約6個劑量之抗體)。在某些實施例中，投藥頻率係每天三次、每天兩次、每天一次、每隔一天一次、每週一次、每兩週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次或每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或更久。可在開始時投與較高負荷劑量，之後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。藉由習用技術及分析容易地監測此療法之進展。 VI. 診斷用途
在任一抗體之一些實施例中，本文所提供之任一抗MS4A4A抗體可用於偵測樣品或個體中MS4A4A之存在。如本文所用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。本文提供使用本揭示案之抗體用於診斷性目的之方法，諸如偵測個體中或源自個體之組織樣品中之MS4A4A。在一些實施例中，個體係人類。
偵測方法可涉及對抗原結合抗體之定量。生物樣品中之抗體偵測可利用此項技術中已知之任何方法來進行，包括免疫螢光顯微術、免疫細胞化學、免疫組織化學、ELISA、FACS分析、免疫沈澱或微型正電子發射斷層攝影術。在某些實施例中，抗體經放射性標記(例如用18 F)，且隨後利用微型正電子發射斷層攝影術分析進行偵測。抗體結合亦可藉由非侵入性技術在患者中進行定量，該等技術係諸如正電子發射斷層攝影術(PET)、X射線電腦斷層攝影術、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、電腦斷層攝影術(CT)及電腦軸向斷層攝影術(CAT)。 VII. 製品
本文提供包含本文所闡述抗MS4A4A抗體之製品(例如套組)。製品可包括一或多個包含本文所闡述抗體之容器。容器可為任何適宜包裝，包括(但不限於)小瓶、瓶、廣口瓶、撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及諸如此類。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如多劑量包裝)或亞單位劑量。
在一些實施例中，套組可進一步包括第二劑。在一些實施例中，第二劑係醫藥學上可接受之緩衝劑或稀釋劑，包括(但不限於)諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格式溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。在一些實施例中，第二劑係醫藥活性劑。
在任一製品之一些實施例中，製品進一步包括根據本揭示案之方法使用之說明書。說明書通常包括關於用於預期治療之劑量、投藥時間表及投與途徑之資訊。在一些實施例中，該等說明書包含對投與本揭示案之經分離抗體(例如本文所闡述之抗MS4A4A抗體)以預防、降低風險或治療患有選自以下之疾病、病症或損傷之個體的說明：額顳葉失智症、阿茲海默氏病、遲發型阿茲海默氏病、認知衰退或受損、輕度認知損害、血管型失智症、血管型失智症、癲癇發作、視網膜營養不良、創傷性腦損傷、脊髓損傷、長期抑鬱、動脈粥樣硬化血管疾病、正常衰老之不期望症狀、失智症、混合型失智症、庫賈二氏病、常壓性水腦症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、亨庭頓氏病、tau蛋白病變病、中風、急性創傷、慢性創傷、狼瘡、急性及慢性結腸炎、克隆氏病、發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、瘧疾、自發性震顫、中樞神經系統狼瘡、貝賽特氏病、帕金森氏病、路易氏體型失智症、多系統萎縮、椎間盤退化性疾病、夏伊-德雷格症候群、進行性核上性麻痺、皮質基底神經節退化、急性瀰漫性腦脊髓炎、肉芽腫病症、類肉瘤病、衰老疾病、年齡相關性黃斑退化、青光眼、色素性視網膜炎、視網膜退化、呼吸道感染、敗血症、眼部感染、全身性感染、發炎性病症、關節炎、多發性硬化、代謝失調、肥胖症、胰島素抗性、2型糖尿病、組織或血管損傷、損傷、發炎性細胞碎片或蛋白質聚集體、異常循環骨髓樣細胞、不健康衰老、年齡相關性認知損害、年齡相關性腦萎縮、年齡相關性特質(包括(但不限於)發炎、神經元丟失及認知缺陷，諸如在不存在已知腦病情形下之認知缺陷，包括年老個體之額葉大腦皮質之認知缺陷及正常衰老之一或多種不期望症狀)，其包含向該個體投與治療有效量之任一前述實施例之抗MS4A4A抗體。
在一些實施例中，說明書包括抗MS4A4A抗體及第二劑(例如第二醫藥活性劑)之使用說明。
藉由參考以下實例將更全面地理解本揭示案。然而，不應將該等實例解釋為限制本揭示案之範圍。整個本揭示案中之所有引用均係以引用的方式明確併入本文中。實例 實例 1 ：鼠類抗 MS4A4A 小鼠抗體之人類化
此實例之目的係產生國際專利申請案第PCT/US2019/016156號中所揭示之某些親代小鼠抗MS4A4A抗體之人類化變異體。
親代小鼠抗MS4A4A抗體4A-202含有包含以下胺基酸序列之重鏈可變區：QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQWVKQRPGQGLEWIGATHPGHGDTRYTQKFKGKATLSADKSSSTAYMQLSNLASEDSAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDVWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO:164)，及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGVSFMNWFQQKPGQPPKLLIYGASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:165)。
親代小鼠抗MS4A4A 4A-18含有包含以下胺基酸序列之重鏈可變區：QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGNINPTNGGTNYNERFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAYYYGSSLFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:166)，及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區：DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVAWSQQKPGQSPKLLIYSASYRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSTYPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:167)。
親代小鼠抗MS4A4A抗體4A-21含有包含以下胺基酸序列之重鏈可變區：QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTSYGLSWVKQTPGKGLKWMGWINTYSGVPTYANDFKGRFAFSLETSASTTYLRINNLKNDDTATYFCARSLVDYWGQGTPLTVSS (SEQ ID NO:168)，及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區：DVVMTQTPFTLSVTIGQSASISCKSSQSLLYSDGKTYLSWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGIDFHQTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:169)。
親代小鼠抗MS4A4A抗體4A-25含有包含以下胺基酸序列之重鏈可變區：QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSDMGVGWVRQPSGEGLEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRANYGNLFDYWGQGTAVTVSS (SEQ ID NO:170)，及包含以下胺基酸序列之輕鏈可變區：DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAWYQQKPGQSPKVLIYWASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:171)。
一種使非人類抗體人類化之方法係將來自非人類(例如鼠類)抗體之CDR移植至人類抗體受體框架上。此CDR移植可能由於人類化抗體框架之擾動而導致該抗體對其靶標之親和力減弱或完全喪失。因此，人類框架中之某些胺基酸殘基可能需要用來自鼠類抗體框架之相應位置之胺基酸殘基替代(回復突變)以恢復減弱或喪失之親和力。因此，必須確定在所選人類抗體生殖系受體框架之背景中欲替代之胺基酸殘基，使得人類化抗體實質上保留功能及互補位。另外，對於良好可製造性及下游開發，期望保留或改良之熱穩定性及溶解性。
因此，在使小鼠抗MS4A4A單株抗體4A-202、4A-18、4A-21及4A-25人類化之製程中，利用MOE (Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, Montreal, Canada)之BioMOE模組，應用基於結構之抗體建模。簡言之，將欲人類化之小鼠單株抗體之VH及VL胺基酸序列與自IMGT (http://www.imgt.org/)獲取之人類VL、VH、LJ、HJ功能性生殖系胺基酸序列進行比較。分析中不包括假基因及ORF。每一種小鼠單株抗體(詢問)，選擇5個最類似之VL及5個最類似之VH生殖系胺基酸序列且將其與最類似之VJ及HJ基因組合，從而產生25個人類化胺基酸序列。根據AbM定義(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef)對欲移植至人類框架上之CDR進行定義。
使用MOE (Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, Montreal, Canada)之BioMOE模組或Antibody Modeler模組，使用詢問及25個人類化胺基酸序列來創建Fv同源性模型。在整個抗體同源性建模過程中，使用AMBER10:EHT力場分析以達到能量最小化。基於所獲得之Fv同源性模型，藉由MOE所提供之評分度量對諸如VL與VH之間的相互作用能、基於座標之等電點(3D pI)、疏水性區片及帶電表面區域等分子描述符進行計算、分析及分類。利用該等分子描述符對人類化單株抗體進行優先順序排序以用於下游實驗程序，包括蛋白質表現、純化、結合親和力研究及功能性分析。
MOE之BioMOE模組提供工具Mutation Site Properties，以使回復突變之潛在殘基可視化並對其進行分類。在本文中，回復突變定義為回復至原始詢問胺基酸序列從而替代人類化胺基酸序列之胺基酸取代。使用此工具，針對一級胺基酸序列及3D Fv同源性模型之3D結構二者，對原始詢問(參考)與所選人類化變異體進行個別比較。
基於胺基酸類型差異、與CDR殘基之相互作用電勢、VL/VH配對之衝擊電勢以及CDR中及CDR附近之疏水性且帶電表面區域之電勢變化，對參考(亦即親代)抗體與人類化變異體之間的變化進行分類。
對具有顯著電荷差異或含有強H鍵相互作用之CDR或VL/VH介面附近之突變進行個別評估，且使顯著破壞性突變回復至原始詢問殘基。因此，人類化胺基酸序列可含有至多5個回復突變。下文表 1 至表 4 中提供可變重鏈及可變輕鏈詢問小鼠單株抗體(小鼠抗MS4A4A抗體4A-202、小鼠抗MS4A4A抗體4A-18、小鼠抗MS4A4A抗體4A-21及小鼠抗MS4A4A抗體4A-25)及具有或不具回復突變之人類化單株抗體之胺基酸序列。在表 1 至表 4 中，CDR序列(Kabat)加下劃線。表 1
抗體 可變重鏈 SEQ ID NO: 可變輕鏈 SEQ ID NO:
4A-202 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQ WVKQRPGQGLEWIGATHPGHGDTRYTQKFKG KATLSADKSSSTAYMQLSNLASEDSAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 4 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGVSFMN WFQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPPT FGGGTKLEIK 16
4A-301 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 5 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-302 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 5 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQAPRLLIYGASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 18
4A-303 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYWMQ WVRQMPGKGLEWMGATHPGHGDTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 6 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-304 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 5 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQAPRLLIYGASNQGS GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 19
4A-305 EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNYWMQ WVQQAPGKGLEWMGATHPGHGDTRYAEKFQG RVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 7 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-306 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGKAPKLLIYGASNQGS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 20
4A-307 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 8 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-308    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 9 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-309    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTLTADKSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 10 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQAPRLLIYGASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 18
4A-310 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYTFTNYWMQ WVRQMPGKGLEWMGATHPGHGDTRYSPSFQG QVTISADKSSSTAYLQWSSLKASDTAMYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 11 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-311 EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTNYWMQ WVQQAPGKGLEWMGATHPGHGDTRYAEKFQG RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 12 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQPPKLLIYGASNQGS GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 17
4A-312    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVDYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 13 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSFMN WYQQKPGQAPRLLIYGASNQQS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 21
4A-313    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL WGRGTLVTVSS 14 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSRMN WYQQKPGQAPRLLIYGASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 22
4A-314 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGTTLPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDV WGRGTLVTVSS 15 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSRMN WYQQKPGQAPRLLIYGASNQGS GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPPT FGGGTKVEIK 22
表 2
抗體 可變重鏈 SEQ ID NO: 可變輕鏈 SEQ ID NO:
4A-18 QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIH WVKQRPGQGLEWIGNINPTNGGTNYNERFKS KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 23 DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGTAVA WSQQKPGQSPKLLIYSASYRHT GVPDRFTGSGSGTDFTLTITNMQSEDLADYFCQQYSTYPWT FGGGTKLEIK 31
4A-315 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 24 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-316 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 25 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIKR 33
4A-317 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 25 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-318 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 26 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIKR 33
4A-319 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 26 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-320 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTSTRDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 27 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-321 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTSTRDTSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 27 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPEKAPKSLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 34
4A-322 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTSTVDKSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 28 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIKR 33
4A-323 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTSTVDKSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 28 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-324 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTSTVDKSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 28 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPEKAPKSLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 35
4A-325 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQGLEWMGNINPTNGGTNYAQKFQG RVTSTVDKSISTAYMELSRLRSDDTVVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 28 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPEKAPKSLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 34
4A-326 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQRLEWMGNINPTNGGTNYSQKFQG RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 29 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-327 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQRLEWMGNINPTNGGTNYSQKFQG RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 29 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 36
4A-328 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQRLEWMGNINPTNGGTNYSQKFQG RVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 30 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 37
4A-329 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQRLEWMGNINPTNGGTNYSQKFQG RVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 30 DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 32
4A-330 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQRLEWMGNINPTNGGTNYSQKFQG RVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 30 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 38
4A-331 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIH WVRQAPGQRLEWMGNINPTNGGTNYSQKFQG RVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAYYYGSSLFAY WGQGTLVTVSS 30 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTAVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRHT GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPWT FGGGTKVEIK 36
表 3
抗體 可變重鏈 SEQ ID NO: 可變輕鏈 SEQ ID NO:
4A-21 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTSYGLS WVKQTPGKGLKWMGWINTYSGVPTYANDFKG RFAFSLETSASTTYLRINNLKNDDTATYFCARSLVDY WGQGTPLTVSS 39 DVVMTQTPFTLSVTIGQSASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDS GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKLEIK 54
4A-332 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 40 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 55
4A-333 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTTYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 41 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 55
4A-334 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 40 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLQQRPGQPPRLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 56
4A-335 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 40 DVVMTQTPLSSPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLQQRPGQPPRLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 57
4A-336 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 40 DVVMTQTPLSSPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLQQRPGQPPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 58
4A-337 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTTYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 41 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLQQRPGQPPRLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 56
4A-338 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTTYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 41 DVVMTQTPLSSPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLQQRPGQPPRLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 57
4A-339 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTTYLQISSLKAEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 41 DVVMTQTPLSSPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WLQQRPGQPPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 58
4A-340 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQRLEWMGWINTYSGVPTYSQKFQG RVTITLDTSASTTYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 42 DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 59
4A-341 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQRLEWMGWINTYSGVPTYSQKFQG RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 43 DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 59
4A-342 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 44 DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQTF GGGTKVEIK 60
4A-343 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQKFQG RVTMTLDTSTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 45 DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 60
4A-344 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 46 DVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 60
4A-345 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQRLEWMGWINTYSGVPTYSQKFQG RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 43 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 61
4A-346 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 46 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 61
4A-347 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQRLEWMGWINTYSGVPTYSQKFQG RVTITLDTSASTTYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 42 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 61
4A-348 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 44 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 61
4A-349 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQKFQG RVTMTLDTSTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCARSLVDY WGQGTLVTVSS 45 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WYLQKPGQPPQLLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 61
4A-350 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 55
4A-351 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 62
4A-352 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSGGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 63
4A-353 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSEGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 64
4A-354 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSAGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 65
4A-355 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSSGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 66
4A-356 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSQGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 67
4A-357 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYEVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 68
4A-358 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIRFHQT FGGGTKVEIK 69
4A-359 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKASQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 70
4A-360 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSGQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSRLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 71
4A-361 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLES GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 72
4A-362 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSRLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 73
4A-363 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLADY WGQGTLVTVSS 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLSS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 74
4A-364 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLS WIRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMVDY WGQGTLVTVSS 48 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKASQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 70
4A-365 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLS WIRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMVDY WGQGTLVTVSS 48 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLSS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 74
4A-366 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLS WIRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMVDY WGQGTLVTVSS 48 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 62
4A-367 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLS WIRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMVDY WGQGTLVTVSS 48 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 55
4A-368 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLS WIRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMVDY WGQGTLVTVSS 48 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLES GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 72
4A-369 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLS WIRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMVDY WGQGTLVTVSS 48 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIRFHQT FGGGTKVEIK 69
4A-370 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLGDY WGQGTLVTVSS 49 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSGQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSRLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 71
4A-371 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLGDY WGQGTLVTVSS 49 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 55
4A-372 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLGDY WGQGTLVTVSS 49 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSRLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 73
4A-373 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLVDY WGQGTLVTVSS 50 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 62
4A-374 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFAG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTLVDY WGQGTLVTVSS 51 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 62
4A-375 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSLADY WGQGTLVTVSS 52 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 62
4A-376 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSMADY WGQGTLVTVSS 53 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSDGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 62
4A-377 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSMADY WGQGTLVTVSS 53 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSGGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 63
4A-378 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSMADY WGQGTLVTVSS 53 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSEGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 64
4A-379 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSMADY WGQGTLVTVSS 53 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSAGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 65
4A-380 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSMADY WGQGTLVTVSS 53 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSSGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 66
4A-381 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARSMADY WGQGTLVTVSS 53 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSQGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK 67
表 4
抗體 可變重鏈 SEQ ID NO: 可變輕鏈 SEQ ID NO:
4A-25 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTSDMGVG WVRQPSGEGLEWLADIWWDDNKYYNPSLKS RLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTAVTVSS 75 DIVMTQSLKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVA WYQQKPGQSPKVLIYWASNRHT GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYLT FGSGTKLEIK 85
4A-382 QVTLKESGPALVQPTQTLTLTCTFSGFSLRTSDMGVS WIRQPPGEALEWLALIWWDDNKYYSTSLKT RLTISKDTSSNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTAVTVSS 76 DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVRSALA WYQQKPGQAPKVLIYWASNRHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 86
4A-383 QVTLKESGPTLVQPTQTLTLTCTFSGFSLRTSDMGVG WIRQPPGKALEWLALIWWDDNKYYSPSLKS RLTISKDTSSNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 77 DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVRSALA WYQQKPGQAPKLLIYWASNRHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 87
4A-384 QVTLRESGPALVQPTQTLTLTCTFSGFSLRTSDMGVS WIRQPPGEALEWLALIWWDDNKYYSTSLKT RLTISKDTSSNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 78 DIVMTQSPSSMSASVGDRVTITCQASQNVRSAVA WYQQKPGKAPKLLIYWASNRHT GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 88
4A-385 QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLRTSDMGVG WIRQPPGKALEWLALIWWDDNKYYSPSLKS RLTITKDTSSNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 79 DIVMTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQNVRSALA WYQQKPEKAPKSLIYWASNRHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 89
4A-386 QVTLKESGPGLVQPTETLTLTCTFSGFSLRTSDMGVS WIRQPPGKALEWLAHIWWDDNKSYSTSLKS RLTISKDTSSNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 80 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVRSALA WYQQKPEQAPKSLIYWASNRHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 90
4A-387 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGFSLRTSDMGVS WIRQPSGKALEWLAHIWWDDNKSYSTSLKS RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 81 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNVRSALN WYQQKPGKAPKLLIYWASNRHT GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQSEDIATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 91
4A-388 QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGFSLRTSDMGVS WIRQPSGEGLEWLAHIWWDDNKSYSTSLKS RLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 82 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNVRSALN WYQQKPGKAPKLLIYWASNRHT GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQSEDIATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 91
4A-389 QVTLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGFSLRTSDMGVG WIRQPPGEGLEWIGSIWWDDNKYYNPSLKS RVTISKDTSKNQVSLKLSSVDAADTAVYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 83 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVRSALA WYQQKPEQAPKSLIYWASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISNRHPEDFATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 92
4A-390 QVQLQESGPGLVQPSETLSLTCAVSGFSLRTSDMGVG WIRQPPGKGLEWIGSIWYDDNKYYNPSLKS RVTISKDTSSNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRANYGNLFDY WGQGTLVTVSS 84 DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTITCQASQNVRSALN WYQQKPGKAPKLLIYWASNRHT GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQSEDIATYYCQQHWNYLT FGGGTKVEIK 93
本揭示案之抗 MS4A4A 抗體之根據 Kabat 之 CDR 序列提供於表 5-8 中。 表 5
抗體 CDR-H1 SEQ ID NO: CDR-H2 SEQ ID NO: CDR-H3 SEQ ID NO: CDR-L1 SEQ ID NO: CDR-L2 SEQ ID NO: CDR-L3 SEQ ID NO:
4A-202 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYTQKFKG 95 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-301 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-302 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-303 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYSPSFQG 97 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-304 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-305 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAEKFQG 98 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-306 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-307 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-308 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN    103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-309 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS    105 QQSKEVPPT 107
4A-310 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYSPSFQG 97 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-311 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAEKFQG 98 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-312 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVDYGFRSYWYFDV 101 RASESVDNYGVSFMN 103 GASNQQS 106 QQSKEVPPT 107
4A-313 NYWMQ 94 ATHPGHGDTRYAQKFQG 96 EEVYYGFRSYWYFDL 102 RASESVDNYGVSRMN 104 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
4A-314    NYWMQ 94 TTLPGHGDTRYAQKFQG 99 EEVYYGFRSYWYFDV 100 RASESVDNYGVSRMN 104 GASNQGS 105 QQSKEVPPT 107
表 6
抗體 CDR-H1 SEQ ID NO: CDR-H2 SEQ ID NO: CDR-H3 SEQ ID NO: CDR-L1 SEQ ID NO: CDR-L2 SEQ ID NO: CDR-L3 SEQ ID NO:
4A-18 SYWIH 108 NINPTNGGTNYNERFKS 109 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-315 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-316 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-317 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-318 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-319 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-320 SYWIH            108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-321 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-322 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-323 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-324 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-325 SYWIH 108 NINPTNGGTNYAQKFQG 110 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-326 SYWIH 108 NINPTNGGTNYSQKFQG 111 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-327 SYWIH 108 NINPTNGGTNYSQKFQG             111 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT    115
4A-328 SYWIH 108 NINPTNGGTNYSQKFQG 111 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-329 SYWIH 108 NINPTNGGTNYSQKFQG 111 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-330 SYWIH 108 NINPTNGGTNYSQKFQG 111 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
4A-331 SYWIH 108 NINPTNGGTNYSQKFQG 111 AYYYGSSLFAY 112 KASQNVGTAVA 113 SASYRHT 114 QQYSTYPWT 115
表 7
抗體 CDR-H1 SEQ ID NO: CDR-H2 SEQ ID NO: CDR-H3 SEQ ID NO: CDR-L1 SEQ ID NO: CDR-L2 SEQ ID NO: CDR-L3 SEQ ID NO:
4A-21 SYGLS 116 WINTYSGVPTYANDFKG 117 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-332 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-333 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-334 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT             144
4A-335 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-336 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-337 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-338 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-339 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-340 SYGLS 116 WINTYSGVPTYSQKFQG 119 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-341 SYGLS 116 WINTYSGVPTYSQKFQG 119 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS            130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-342 SYGLS            116 INTYSGVPTYAQKFQG 120 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-343 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQKFQG 121 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-344 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQKFQG 121 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-345 SYGLS 116 WINTYSGVPTYSQKFQG 119 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-346 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQKFQG 121 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-347 SYGLS 116 WINTYSGVPTYSQKFQG 119 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-348 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQKFQG 121 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-349 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQKFQG 121 SLVDY 123 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-350 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-351 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSRSLLYSDGKTYLS 131 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-352 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSRSLLYSGGKTYLS 132 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-353 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSRSLLYSEGKTYLS 133 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-354 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSRSLLYSAGKTYLS 134 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-355 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSRSLLYSSGKTYLS 135 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-356 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSRSLLYSQGKTYLS 136 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-357 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 EVSKLDS 140 WQGIDFHQT 144
4A-358 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIRFHQT 145
4A-359 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KASQSLLYSDGKTYLS 137 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-360 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSGQSLLYSDGKTYLS 138 LVSRLDS 141 WQGIDFHQT 144
4A-361 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLES 142 WQGIDFHQT 144
4A-362 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSRLDS 141 WQGIDFHQT 144
4A-363 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLADY 124 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLSS 143 WQGIDFHQT 144
4A-364 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TMVDY 125 KASQSLLYSDGKTYLS 137 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-365 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TMVDY 125 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLSS 143 WQGIDFHQT 144
4A-366 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TMVDY 125 KSSRSLLYSDGKTYLS 131 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-367 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TMVDY 125 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-368 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TMVDY 125 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLES 142 WQGIDFHQT 144
4A-369 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TMVDY 125 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIRFHQT 145
4A-370 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLGDY 126 KSGQSLLYSDGKTYLS 138 LVSRLDS 141 WQGIDFHQT 144
4A-371 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLGDY 126 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-372 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLGDY 126 KSSQSLLYSDGKTYLS 130 LVSRLDS 141 WQGIDFHQT 144
4A-373 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 TLVDY 127 KSSRSLLYSDGKTYLS 131 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-374 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFAG 122 TLVDY 127 KSSRSLLYSDGKTYLS 131 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-375 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SLADY 128 KSSRSLLYSDGKTYLS 131 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-376 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SMADY 129 KSSRSLLYSDGKTYLS 131 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-377 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SMADY 129 KSSRSLLYSGGKTYLS 132 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-378 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SMADY 129 KSSRSLLYSEGKTYLS 133 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-379 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SMADY 129 KSSRSLLYSAGKTYLS 134 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-380 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SMADY 129 KSSRSLLYSSGKTYLS 135 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
4A-381 SYGLS 116 WINTYSGVPTYAQGFTG 118 SMADY 129 KSSRSLLYSQGKTYLS 136 LVSKLDS 139 WQGIDFHQT 144
表 8
抗體 CDR-H1 SEQ ID NO: CDR-H2 SEQ ID NO: CDR-H3 SEQ ID NO: CDR-L1 SEQ ID NO: CDR-L2 SEQ ID NO: CDR-L3 SEQ ID NO:
4A-25 TSDMGVG 146 DIWWDDNKYYNPSLKS 148 RANYGNLFDY 154 KASQNVRSAVA 155 WASNRHT 159 QHWNYLT 162
4A-382 TSDMGVS 147 LIWWDDNKYYSTSLKT 149 RANYGNLFDY 154 RASQNVRSALA 156 WASNRHS 160 QQHWNYLT 163
4A-383 TSDMGVG 146 LIWWDDNKYYSPSLKS 150 RANYGNLFDY 154 RASQNVRSALA 156 WASNRHS 160 QQHWNYLT 163
4A-384 TSDMGVS 147 LIWWDDNKYYSTSLKT 149 RANYGNLFDY 154 QASQNVRSAVA 157 WASNRHT 159 QQHWNYLT 163
4A-385 TSDMGVG 146 LIWWDDNKYYSPSLKS 150 RANYGNLFDY 154 RASQNVRSALA 156 WASNRHS 160 QQHWNYLT 163
4A-386 TSDMGVS 147 HIWWDDNKSYSTSLKS 151 RANYGNLFDY 154 RASQNVRSALA 156 WASNRHS 160 QQHWNYLT 163
4A-387 TSDMGVS 147 HIWWDDNKSYSTSLKS 151 RANYGNLFDY 154 QASQNVRSALN 158 WASNRHT 159 QQHWNYLT 163
4A-388 TSDMGVS 147 HIWWDDNKSYSTSLKS 151 RANYGNLFDY 154 QASQNVRSALN 158 WASNRHT 159 QQHWNYLT 163
4A-389 TSDMGVG 146 SIWWDDNKYYNPSLKS 152 RANYGNLFDY 154 RASQNVRSALA 156 WASSLQS 161 QQHWNYLT 163
4A-390 TSDMGVG 146 SIWYDDNKYYNPSLKS 153 RANYGNLFDY 154 QASQNVRSALN 158 WASNRHT 159 QQHWNYLT 163
實例 2 ：重組 MS4A4A 可溶性多肽之製備
對人類MS4A4A之一級胺基酸序列(SEQ ID NO:1)進行分析以提供關於其二級及三級結構之資訊。人類MS4A4A蛋白具有四個跨膜結構域(TMD)，且每一TMD係由21個胺基酸構成。根據胺基酸組成、殘基數量及脂質雙層之厚度預測，預測MS4A4A包含四螺旋束(4HB)及兩個細胞外環(ECL)，該兩個環自N末端至C末端分別連接TMD1及TMD2及TMD3及TMD4 (參見圖 1 )。圖 1 顯示人類MS4A4A之一級胺基酸序列；細胞內結構域為斜體，跨膜結構域加下劃線，且該兩個細胞外環為粗斜體。
使用RCSB蛋白質資料庫(http://www(dot)rcsb(dot)org/)鑑別出可溶性4HB支架蛋白質(預測其模擬MS4A4A之幾何學及構形)之兩種模板結構。該等蛋白質支架之PDB_ID為1P68及1M6T。圖 2A 、圖 2B 及圖 2C 顯示兩種可溶性四螺旋束支架之結構及一級胺基酸序列(PDB_ID:1P68及PDB_ID:1M6T)。在圖 2A 中，跨膜結構域在結構中呈現為螺旋；在圖 2B 及圖 2C 中，跨膜結構域在1P68及1M6T之相應胺基酸序列中加下劃線。
將人類MS4A4A之該兩個ECL之胺基酸序列重組置於1P68中，產生多肽JS1及多肽JS4 (多肽JS1之陰性對照)，且將其重組置於1M6T中，產生多肽JS5、多肽JS6；及多肽JS10 (其用作多肽JS5及多肽JS6之陰性對照)。(參見圖 3 。)圖 3A 顯示多肽JS1、多肽JS5及多肽JS6之胺基酸序列。圖 3B 顯示陰性對照多肽JS4及陰性對照多肽JS10之胺基酸序列。將編碼該等蛋白質/多肽支架之核酸分別插入至具有3’ his標籤及Avi標籤之pcDNA3.4表現載體中。使所得純系在Expi293細胞中表現且藉由Ni-NTA瓊脂糖(QIAGEN目錄號30230)使用製造商之方案進行純化。產生該等重組MS4A4A可溶性多肽(亦稱為打環接枝抗原)以獲得模擬MS4A4A之該兩個ECL之結構及功能之可溶性蛋白質，其用作用於抗體結合表徵之可溶性試劑。實例 3 ：藉由肽結合對抗 MS4A4A 抗體之抗原決定基確定
如下測定抗MS4A4A抗體4A-21之抗原決定基結合特徵。JPT peptides (Berlin, Germany)合成一組源自人類MS4A4A (SEQ ID NO:1)之細胞外環(ECL)之重疊肽。該等肽之長度為15個胺基酸，其各自偏移2個胺基酸。在N末端上使該等肽生物素化。肽4A.1至4A.4係源自人類MS4A4A ECL1及周圍區。肽4A.5至4A.12係源自人類MS4A4A ECL2及周圍區。
使用連續流動微量點樣器(CFM)將肽文庫印刷至鏈黴抗生物素蛋白包被之晶片(Xantec SAD50M, Dusseldorf, Germany)上。首先，利用100 mM MES，pH 5.5、100 μL EDC (133 mM最終)、100 μL S-NHS (33.3 mM最終)使晶片活化。將肽文庫以每個肽250 nM固定至晶片上，該等肽稀釋至含有1 mg/ml BSA及1 µg/ml小鼠IgG-生物素之HBS-EP+緩衝液(Teknova目錄號H8022)中。固定後，利用1 M乙醇胺(pH 8.5)使晶片表面去活化10分鐘。將雜交瘤上清液及經純化之抗MS4A4A抗體稀釋於含有1 mg/ml BSA之HBS-EP+緩衝液中且注射至晶片上。對每一抗MS4A4A抗體進行雙重量測以確保再現性。測定每一肽-抗體組合之結合特徵，此容許定位每一抗體與之相互作用之線性肽區。
如下表 9 中以粗體所指示，抗MS4A4A抗體4A-21及市售抗MS4A4A抗體5C12展示與對應於人類MS4A4A ECL2中之區之肽的強勁結合。抗MS4A4A抗體4A-21結合肽4A.5至4A.9，跨越人類MS4A4A之胺基酸殘基155至177。抗MS4A4A抗體5C12結合肽4A.6至4A.9，跨越人類MS4A4A之胺基酸殘基157至177。該兩種抗體之結合區重疊但並不一致，此指示其與人類MS4A4A之ECL2內之不同殘基相互作用。使用上文所闡述之方法，該兩種抗體均不顯示結合至人類MS4A4A ECL1。表 9
肽 序列 4A-21 5C12
4A.1 ITMMCMASNTYGSNP (SEQ ID NO:292) -11.16 -1.49
4A.2 MMCMASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:293) -11.53 -0.19
4A.3 CMASNTYGSNPISVY (SEQ ID NO:294) -10.55 -1.54
4A.4 ASNTYGSNPISVYIG (SEQ ID NO:295) -7.90 -0.46
4A.5 LAFYSFHHPYCNYYG (SEQ ID NO:296) 382.80 1.60
4A.6 FYSFHHPYCNYYGNS (SEQ ID NO:297) 485.67 44.38
4A.7 SFHHPYCNYYGNSNN (SEQ ID NO:298) 446.10 17.75
4A.8 HHPYCNYYGNSNNCH (SEQ ID NO:299) 308.63 22.30
4A.9 PYCNYYGNSNNCHGT (SEQ ID NO:300) 225.21 30.86
4A.10 CNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:301) -4.50 1.13
4A.11 YYGNSNNCHGTMSIL (SEQ ID NO:302) -6.50 -2.73
4A.12 GNSNNCHGTMSILMG (SEQ ID NO:303) -5.20 -4.08
實例 4 ：抗 MS4A4A 抗體與對應於人類 MS4A4A 細胞外結構域之肽之結合
使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)測試抗MS4A4A雜交瘤上清液(純淨)或經純化之mIgG (5 μg/ml)與對應於ECL1 (SEQ ID NO:1之人類MS4A4A之胺基酸殘基86-98)及ECL2 (SEQ ID NO:1之人類MS4A4A之胺基酸殘基159-179)之人類MS4A4A肽之結合。簡言之，利用於包被緩衝液(0.05 M碳酸鹽緩衝液，pH 9.6，Millipore Sigma目錄號C3041)中之2 μg/ml或10 μg/ml合成游離肽或BSA結合肽將96孔聚苯乙烯板在4℃下包被隔夜。接著將經包被板用ELISA稀釋液(PBS + 0.5% BSA + 0.05% Tween 20)封閉1小時，於PBST (PBS + 0.05% Tween 20，Thermo目錄號28352)中以3×300 μL洗滌，且接著將抗體添加至板(50 μl/孔)。30 min培育(室溫，振盪)後，於PBST中以3×300 μL洗滌板。添加於ELISA稀釋液中以1:1000稀釋度得到之二級抗小鼠HRP抗體(Jackson Immunoresearch目錄號115-035-003) (50 μl/孔)，且在室溫下振盪培育30分鐘。在最後一組洗滌(3×300 μL，於PBST中)後，添加50 μL TMB受質(BioFx目錄號TMBW-1000-01)，且接著在5-10 min後利用50 μL終止溶液(BioFx目錄號BSTP-1000-01)使反應淬滅。利用BioTek Synergy微量板讀數儀，使用GEN5 2.04軟體偵測淬滅反應孔在650 nm下之吸光度。
測試經純化之抗MS4A4A鼠類抗體及3種市售鼠類抗MS4A4A抗體(5C12、3F2及4H2)。與針對BSA小鼠DAP12 (不相關之陰性肽對照)所觀察到之結合相比，鼠類抗MS4A4A抗體(4A-21、4A-25、4A-202及4A-214)展示與huMS4A4A-ELC2游離肽之強結合。該三種市售抗MS4A4A抗體不展示與人類MS4A4A ECL1及ECL2肽之結合。實例 5 ：抗 MS4A4A 抗體之抗原決定基確定
MS4A4A之一級胺基酸序列提供關於其二級及三級結構之重要資訊。MS4A4A蛋白具有四個跨膜結構域(TMD)，且每一TMD係由21個胺基酸構成。典型TMD係由厚度為大約40 Å之磷酸二酯脂質雙層構成。磷酸頭部分產生親水層，其與細胞外或胞質空間中之親水性環境相互作用，且脂質尾產生內部脂質雙層，其與TMD之親脂性殘基相互作用。TMD脂質雙層之厚度為大約32 Å至34 Å。根據胺基酸組成、殘基數量及脂質雙層之厚度預測，預測MS4A4A包含四螺旋束(4HB)及兩個細胞外環(ECL)，該兩個環自N末端至C末端分別連接TMD1及TMD2及TMD3及TMD4。該4螺旋束藉由自螺旋-脂質雙層相互作用及螺旋-螺旋相互作用獲得之顯著焓增使膜中之MS4A4A穩定。
MS4A4A ECL之一級胺基酸序列及組成指示與抗原決定基相關之重要特徵及動力學性質。ECL1係由13個胺基酸構成，包括1個半胱胺酸、1個甲硫胺酸、1個丙胺酸、3個絲胺酸、1個蘇胺酸、2個天冬醯胺、1個酪胺酸、1個脯胺酸、1個異白胺酸及僅1個甘胺酸殘基。ECL2係由21個胺基酸構成，包括2個半胱胺酸殘基(其由8個胺基酸隔開)、3個絲胺酸、1個蘇胺酸、1個苯丙胺酸、3個組胺酸、1個脯胺酸、3個酪胺酸、4個天冬醯胺、1個甲硫胺酸及僅2個甘胺酸殘基。在ECL1及ECL2中發現極少之甘胺酸殘基，但發現若干個大的β-支鏈胺基酸殘基及脯胺酸殘基。此外，ECL2含有兩個半胱胺酸殘基，預測該兩個殘基產生環內二硫鍵，其進一步降低構形熵。因此，ECL1及ECL2傾向於採用顯著降低數目之在剛體型內部運動中彼此相互作用之構形異構物。
自Origene購得編碼人類MS4A4A且含有C末端GFP標籤之表現質體(NM_024021) (目錄號RG223557)，且使用其作為模板以在人類MS4A4A之細胞外環1 (ECL1)之編碼區中(下表 10 中之4A.Ala1-Ala13；SEQ ID NO:1中對應於ECL1之C67至S79；CMASNTYGSNPIS)、人類MS4A4A之細胞外環2 (ECL2)之編碼區中(下表 10 中之4A.Ala14-Ala34；SEQ ID NO:1中對應於ECL2之S140至S160；SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS)產生單一丙胺酸掃描突變；及ECL2缺失突變(下表 11 中之4A.Ala35 (缺失SEQ ID NO:1中在ECL2內之胺基酸殘基150-152)及4A.Ala36 (缺失SEQ ID NO:1中在ECL2內之胺基酸殘基148-152))。使用此項技術中標準之重疊聚合酶鏈式反應技術實施突變。對每一聚合酶鏈式反應多核酸片段進行純化，且使用MluI及AsiSI限制位點將其亞選殖回至表現載體中。
在使用丙胺酸掃描技術實施抗原決定基確定之前，使用HEK293T細胞中上述表現構築體之暫態轉染，如下測定抗MS4A4A抗體之相對EC50。將HEK293T細胞接種於6孔板中且使其生長隔夜。次日，遵循製造商之方案，以4:1之Fugene對DNA比率或3:1之Lipofectamine對DNA比率，利用Fugene HD (Promega)或Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific)轉染細胞。在轉染後大約24小時，使用胰蛋白酶-EDTA收穫細胞並處理該等細胞以進行FACS染色。
對於FACS染色，將150,000個細胞添加至96孔板之每一孔且添加於FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)中之滴定抗MS4A4A抗體並在冰上培育60分鐘。將板離心(1,400 rpm，3分鐘)，傾析出上清液，且用200 μl FACS緩衝液將細胞洗滌三次，每次洗滌之後進行旋轉及傾析步驟。抗體以msIgG1或huIgG1嵌合體形式進行測試，且在冰上添加於FACS緩衝液中之山羊抗人類PE (Southern Biotech，目錄號2040-09，1:200)或山羊抗小鼠APC (BD Biosciences，目錄號550826，1:100)達30分鐘。隨後用200 μl FACS緩衝液將細胞洗滌兩次且在iQue細胞計數器上成像。對GFP陽性群體(代表表現MS4A4A之細胞)量測中值螢光強度(MFI)。
最初測試之抗MS4A4A抗體中有6種結合至表現野生型(WT) MS4A4A-GFP之HEK293T細胞：該等抗體包括抗MS4A4A抗體4A-18、4A-21、4A-202以及已公佈之鼠類單株抗MS4A4A抗體4H2 (Kerafast)、5C12 (Biolegend)、3F2 (Millipore)。測定每一抗體之滴定曲線以確立用於後續抗原決定基定位研究之最佳抗MS4A4A抗體濃度。
對於抗原決定基定位實驗，利用不同的人類MS4A4A表現構築體(如上文所闡述；參見下表 10 )轉染HEK293T細胞，且使用6種不同的抗MS4A4A抗體測定抗體結合：4A-21、4A-18、4A-202、4H2、5C12及3F5。將抗MS4A4A抗體結合計算為與經野生型人類MS4A4A表現構築體轉染之細胞結合的MFI之%。若MS4A4A多肽中之胺基酸突變導致抗體結合降低至與野生型MS4A4A結合之20%以下，則將該突變之胺基酸視為抗MS4A4A抗體結合至MS4A4A蛋白所必需之關鍵胺基酸。MS4A4A蛋白中之一些胺基酸突變導致抗MS4A4A抗體結合降低至51%以下但在20%以上(與結合至野生型MS4A4A相比)；將此等胺基酸定義為有助於抗MS4A4A抗體結合至MS4A4A蛋白之胺基酸。
MS4A4A中之一些胺基酸影響所有所測試抗體之結合，諸如兩個半胱胺酸C165及C174，認為該兩個半胱胺酸在MS4型蛋白質中形成半胱胺酸橋。將此等胺基酸視為結構性胺基酸。
該等實驗之結果提供於下表 10 中。如上所述，Ala.1至Ala.13係指ECL1中之MS4A4A突變；Ala.14至Ala.36係指ECL2中之MS4A4A突變。數據顯示為與抗MS4A4A抗體與野生型MS4A4A蛋白之結合相比，抗MS4A4A抗體與各種丙胺酸掃描突變之結合%。獨立地重複兩次定位實驗，結果非常類似。一個不同之處在於，抗MS4A4A抗體4A-21及4A-18在兩種濃度下以huIgG1形式測試一次且以msIgG1形式測試第二次。下表 11 顯示來自該等抗體之msIgG1測試之結果。對於所有其他抗體，表 10 顯示跨越兩個實驗之平均抗體結合。在下表 10 中，顯示抗MS4A4A抗體與MS4A4A蛋白之結合在與野生型MS4A4A之所量測結合之20%以下之值為粗體。
所有突變均顯示在大約22%-33%之間的等效轉染效率(數據未示出)。在細胞中未觀察到平均抗體結合與GFP水準之間的相關性，此表明GFP水準不能用作MS4A4A細胞表面表現之預測因子。表 10
構築體 環序列 4A-21 4A-18 4A-202* 4H2 5C12 3F2
WT ECL1 CMASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:289) 100
4A.Ala.1 S MASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:255) 84.1 96.6 86.99 72.80 82.36 79.58
4A.Ala.2 C A ASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:256) 12.5 19.1 9.93 7.42 11.04 7.33
4A.Ala.3 CM S SNTYGSNPIS (SEQ ID NO:257) 90.7 116.6 99.12 87.76 94.47 87.46
4A.Ala.4 CMA A NTYGSNPIS (SEQ ID NO:258) 91.2 85.8 92.48 77.90 88.62 82.49
4A.Ala.5 CMAS A TYGSNPIS (SEQ ID NO:259) 93.1 65.6 81.64 75.95 80.92 83.89
4A.Ala.6 CMASN A YGSNPIS (SEQ ID NO:260) 100.4 87.5 83.22 77.29 78.57 78.38
4A.Ala.7 CMASNT A GSNPIS (SEQ ID NO:261) 114.5 15.8 98.41 93.36 94.96 92.91
4A.Ala.8 CMASNTY A SNPIS (SEQ ID NO:262) 94.6 70.4 83.82 74.41 17.39 84.41
4A.Ala.9 CMASNTYG A NPIS (SEQ ID NO:263) 99.6 106.0 102.06 85.83 89.83 94.67
4A.Ala.10 CMASNTYGS A PIS (SEQ ID NO:264) 102.3 103.2 124.27 91.27 93.95 89.57
4A.Ala.11 CMASNTYGSN A IS (SEQ ID NO:265) 28.7 14.8 35.06 20.53 32.79 25.29
4A.Ala.12 CMASNTYGSNP A S (SEQ ID NO:266) 66.4 91.4 57.21 48.93 56.33 49.19
4A.Ala.13 CMASNTYGSNPI A (SEQ ID NO:267) 38.4 41.8 32.34 27.38 36.36 28.92
WT ECL2 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:290) 100
4A.Ala.14 A FHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:268) 94.3 87.8 78.14 83.99 81.28 85.27
4A.Ala.15 S A HHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:269) 118.7 116.9 111.77 84.71 98.51 87.20
4A.Ala.16 SF A HPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:270) 71.0 48.1 76.87 58.00 71.46 64.58
4A.Ala.17 SFH A PYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:271) 102.8 99.4 125.37 77.01 82.95 85.21
4A.Ala.18 SFHH A YCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:) 101.4 103.7 89.39 36.92 46.13 42.33
4A.Ala.19 SFHHP A CNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:272) 83.8 16.3 26.68 1.66 42.27 1.08
4A.Ala.20 SFHHPY S NYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:273) 5.0 2.8 8.66 1.94 1.74 1.60
4A.Ala.21 SFHHPYC A YYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:274) 1.8 73.3 93.33 70.08 73.76 80.30
4A.Ala.22 SFHHPYCN A YGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:275) 1.8 3.0 31.23 1.10 0.99 0.88
4A.Ala.23 SFHHPYCNY A GNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:276) 1.4 2.7 50.05 1.19 0.96 0.95
4A.Ala.24 SFHHPYCNYY A NSNNCHGTMS (SEQ ID NO:277) 57.5 63.0 75.76 27.67 18.20 33.76
4A.Ala.25 SFHHPYCNYYG A SNNCHGTMS (SEQ ID NO:278) 69.2 40.0 100.54 37.09 25.55 45.60
4A.Ala.26 SFHHPYCNYYGN A NNCHGTMS (SEQ ID NO:279) 89.3 96.5 90.84 68.48 81.73 68.38
4A.Ala.27 SFHHPYCNYYGNS A NCHGTMS (SEQ ID NO:) 98.3 118.6 98.39 99.46 91.60 94.25
4A.Ala.28 SFHHPYCNYYGNSN A CHGTMS (SEQ ID NO:280) 87.3 116.4 98.61 86.22 85.94 83.37
4A.Ala.29 SFHHPYCNYYGNSNN S HGTMS (SEQ ID NO:281) 8.4 2.7 4.54 1.09 1.01 0.91
4A.Ala.30 SFHHPYCNYYGNSNNC A GTMS (SEQ ID NO:282) 87.5 62.6 92.83 72.87 80.56 82.45
4A.Ala.31 SFHHPYCNYYGNSNNCH A TMS (SEQ ID NO:283) 147.8 158.6 142.81 123.13 124.19 135.58
4A.Ala.32 SFHHPYCNYYGNSNNCHG A MS (SEQ ID NO:284) 61.6 42.9 63.28 44.61 56.19 45.14
4A.Ala.33 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTA S (SEQ ID NO:285) 81.8 36.1 73.09 62.83 59.85 60.45
4A.Ala.34 SFHHPYCNYYGNSNNCHGTM A (SEQ ID NO:286) 113.4 91.0 117.02 102.44 99.15 103.80
4A.Ala.35 SFHHPYCNYY---NNCHGTMS (SEQ ID NO:287) 107.3 2.7 73.14 1.08 1.00 0.88
4A.Ala.36 SFHHPYCN-----NNCHGTMS (SEQ ID NO:288) 1.3 2.6 0.07 0.99 0.93 0.83
*抗體作為huIgG1嵌合體來測試
上文所示之結果表明，本揭示案之抗MS4A4A抗體識別MS4A4A內之獨特線性及/或3D結構性抗原決定基。
基於自該等實驗獲得之抗MS4A4A抗體結合資料，人類MS4A4A內之以下環胺基酸殘基視為MS4A4A蛋白內之結構性胺基酸，此乃因該等殘基中之每一者之突變均影響所測試抗MS4A4A抗體之結合：M87、C165、Y167、Y168、C174 (基於人類MS4A4A蛋白；SEQ ID NO:1)。預測胺基酸殘基C165及C174建立半胱胺酸橋，其在ECL2中形成環。在不存在此半胱胺酸橋之情形下，抗MS4A4A抗體不結合MS4A4A蛋白，此表明MS4A4A之ECL2內之該環結構對於抗體結合係重要的。環結構重要之更多證據來自兩種環缺失突變體(Ala.35及Ala.36)，其亦強烈地影響抗體結合。
結果進一步顯示，胺基酸殘基Y167及Y168強烈地影響抗MS4A4A抗體4A-21、4A-18、4H2、5C12及3F2之結合。該等胺基酸殘基亦較小程度地影響抗MS4A4A抗體4A-202之結合。另外，ECL1中之胺基酸殘基P96、I97及S98在某種程度上降低所測試之所有抗MS4A4A抗體之結合。該等結果表明，該五個胺基酸殘基中之任一者之突變均改變對於抗體識別及結合重要的細胞外結構域之結構，或該等胺基酸殘基對於所列示之六種抗MS4A4A抗體中之每一者之相互作用及結合均係重要的。脯胺酸係最受限制之胺基酸殘基，其對於多肽之二級及三級結構至關重要。舉例而言，脯胺酸在規則二級結構元件(包括α螺旋及β摺疊)之中間起破壞作用；然而，常發現脯胺酸作為α螺旋之第一個胺基酸殘基且在β摺疊之邊緣鏈中。酪胺酸、異白胺酸及絲胺酸殘基提供多種抗原-抗體相互作用，包括(例如)凡得瓦相互作用(Van der Waals interaction)、π-π堆疊及π面氫鍵結相互作用及/或氫鍵。因此，酪胺酸、脯胺酸、異白胺酸或絲胺酸殘基均可產生明確定義之結構性抗原決定基。該四種胺基酸殘基中之任何細微變化均可能顯著地破壞抗體結合親和力。
MS4A4A中胺基酸殘基M87A處之突變極大地降低或消除所測試之所有抗MS4A4A抗體之結合。基於ECL1及ECL2採用明確定義之剛體結構且可能彼此相互作用之預測，所示之M87A結合結果指示，預測M87胺基酸殘基為維持MS4A4A之剛性環結構之最關鍵殘基之一，此乃因M87之側鏈可藉由凡得瓦接觸及氫鍵經由主鏈-側鏈及/或主鏈-主鏈相互作用與ECL1及/或ECL2中之一或多個β-分支胺基酸相互作用。
下表 11 列示本文所揭示之抗MS4A4A抗體之獨特結合胺基酸殘基。抗MS4A4A抗體4A-21在ECL2中需要N166以供結合至人類MS4A4A。資料顯示，抗MS4A4A抗體4A-18及5C12結合人類MS4A4A之ECL1以及ECL2。抗MS4A4A抗體4A-202因胺基酸殘基Y164而具有一定結合作用。
所有三種市售抗MS4A4A抗體均結合P163，而本文所揭示且在本研究中測試之抗MS4A4A抗體均不結合P163。人類MS4A4A之此脯胺酸P163在食蟹猴MS4A4A蛋白中由精胺酸替代。此觀察結果表明，如市售MS4A4A抗體之結合特徵所展示，此脯胺酸至精胺酸之變化對於決定食蟹猴交叉反應性或缺乏該交叉反應性係重要的。脯胺酸係在結構上最受限之胺基酸殘基且精胺酸(食蟹猴MS4A4A中)在生理pH下係帶正電之胺基酸。人類對食蟹猴MS4A4A中脯胺酸與精胺酸之差異可顯著地影響MS4A4A蛋白之構形，故而阻止市售MS4A4A抗體結合。抗MS4A4A抗體4A-18、4A-21及4A-202似乎不依賴於此胺基酸進行結合，且因此其與食蟹猴蛋白質之結合未受影響。
總之，抗MS4A4A抗體4A-21、4A-18及4A-202在MS4A4A上所結合之抗原決定基不同於市售抗MS4A4A抗體(下表 11 )。市售抗MS4A4A抗體4H2及3F2展現相同之抗原決定基，該等抗原決定基與抗MS4A4A抗體5C12之抗原決定基大幅重疊。相比之下，抗MS4A4A抗體4A-18、4A-21及4A-202各自展現彼此不同且與市售抗MS4A4A抗體不同之獨特的抗原決定基結合特徵。該等結合性質差異示於表 10 中。另外，結果顯示，在所測試之抗MS4A4A抗體中沒有兩種抗體結合人類MS4A4A內之相同抗原決定基；然而，跨越一些或全部抗體存在共有胺基酸結合殘基(例如胺基酸殘基Y167及Y168、Y164、N170、T177)。 表 11
抗體 ECL1 殘基 ECL2 殘基
4A-21    N166 (關鍵)
4A-18 Y92 (關鍵) Y164 (關鍵) H161、N170、T177、M178 (有作用)
4A-202    Y164 (有作用)
4H2    Y164 (關鍵) P163、G169、N170、T177 (有作用)
5C12 G93 (關鍵) G169 (關鍵) P163、Y164、N170 (有作用)
3F2    Y164 (關鍵) P163、G169、N170、T177 (有作用)
實例 6 ：抗 MS4A4A 抗體與重組 MS4A4A 可溶性多肽之結合
如下文實例2中所闡述，測試本揭示案之抗MS4A4A抗體與不同重組MS4A4A可溶性多肽結合之能力。將編碼本揭示案之人類化抗MS4A4A抗體之VH及VL結構域之核酸選殖至pcDNA3.4載體中，該載體含有人類IgG1重鏈恆定結構域或人類κ恆定結構域。在Expi293細胞中表現該等人類化抗MS4A4A抗體且遵循製造商之方案藉由Mab select抗體純化樹脂(GE Healthcare Life Science，目錄號17519902)進行純化。實施ELISA以量測本揭示案之抗MS4A4A抗體與重組MS4A4A可溶性多肽之結合。使1 μg/ml生物素化抗原在鏈黴抗生物素蛋白包被之ELISA板(Thermo Scientific，目錄號PI15120)上預培育1小時。將板洗滌3次，之後添加抗體(1 μg/ml、0.33 μg/ml及0.11 μg/ml抗體)。使板在室溫下振盪培育1小時，洗滌3次，接著添加以1/2500稀釋度得到之HRP結合之山羊抗人類κ抗體(SigmaAldrich目錄號A7164-1ML)。
圖 4 顯示某些人類化抗MS4A4A抗體與重組MS4A4A可溶性多肽JS1、JS4、JS5、JS6及JS10結合之ELISA結合結果。如圖 4 中所示，藉由ELISA，某些抗MS4A4A抗體(4A-18.hFc、4A-21.hFc、4A-202.hFc、4A-220.mFc、4A-214.mFc、4A-204.mFc’ hFc係指人類Fc；mFc係指鼠類Fc))顯示與含有人類MS4A4A之兩個ECL之重組MS4A4A可溶性多肽JS1、JS5及JS6結合。本發明之抗MS4A4A抗體不結合至重組可溶性多肽JS4及JS10，該二者係陰性對照多肽且不含MS4A4A ECL區序列。兩種市售抗MS4A4A抗體5C12及4H2不顯示與任一重組MS4A4A可溶性多肽之結合(參見圖 4 )。在圖 4 中，抗MS4A4A抗體4A-214先前揭示於國際專利申請案第PCT/US2019/016156號中，且具有EVKLEESGGGLVQPGRSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCSSMIIVDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:179)之重鏈可變區胺基酸序列及DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSSSTYSYLHWYQQRPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTVFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPLTFGAGTKLEMK (SEQ ID NO:180)之輕鏈可變區胺基酸序列。
圖 4 中所呈現之結果係源自下表 12 中所示之數據：表 12
Figure 02_image001
圖 5 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-21之人類化形式與重組MS4A4A可溶性多肽JS1之ELISA結合結果。抗體以1 μg/ml之濃度使用。如圖 5 中所示，抗MS4A4A抗體4A-21之許多人類化形式保留其與此重組多肽結合之能力。抗MS4A4A抗體4A-21之某些人類化形式顯示與重組MS4A4A可溶性多肽JS1之結合降低。
圖 5 中所呈現之結果係源自下表 13 中所示之數據：表 13
Figure 02_image002
圖 6 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-202之人類化形式與重組MS4A4A可溶性多肽JS1之ELISA結合結果。抗體以1 μg/ml之濃度使用。如圖 6 中所示，抗MS4A4A抗體4A-202之人類化形式能夠結合至此重組多肽。
圖 6 中所呈現之結果係源自下表 14 中所示之數據：表 14
Figure 02_image003
進一步測試鼠類抗MS4A4A抗體4A-202及鼠類抗MS4A4A抗體4A-21之各種人類化形式與重組MS4A4A可溶性多肽結合之能力。人類化抗MS4A4A抗體4A-332及人類化抗MS4A4A抗體4A-302顯示合理之結合且選擇其用於如下進行進一步親和力改良。使用重疊PCR技術在抗MS4A4A抗體4A-322及抗MS4A4A抗體4A-302之6個CDR中引入隨機突變。使用生物素化重組MS4A4A可溶性多肽JS5對該等抗體變異體進行噬菌體展示淘選。在3輪淘選後，選擇出大約190種突變抗MS4A4A抗體變異體且使其在TG1細胞中表現，藉由ELISA對該等細胞之溶解物進行篩選。選擇出22種人類化抗MS4A4A抗體4A-21變異體及15種人類化抗MS4A4A抗體4A-202變異體，將其重組轉化成全人類IgG並在Expi293細胞中表現。如製造商之方案中所指示，藉由MabSelect抗體純化樹脂(GE Healthcare Life Science，目錄號17519902)純化抗MS4A4A抗體。隨後重複ELISA及流式細胞術實驗。
藉由ELISA，人類化且親和力成熟之抗MS4A4A抗體4A-312、4A-313及4A-314在各種抗體濃度(1 μg/ml、0.33 μg/ml及0.11 μg/ml)下顯示與重組MS4A4A可溶性多肽JS5結合(參見圖 7 )，且選擇該等抗體用於進一步功能分析。
圖 7 中所呈現之結果係源自下表 15 中所示之數據：表 15
Figure 02_image004
藉由ELISA，人類化且親和力成熟之抗MS4A4A抗體4A-351及4A-376 (0.4 μg/ml)顯示與重組MS4A4A可溶性多肽JS5結合良好(參見圖 8 )。接著選擇該等抗MS4A4A抗體用作模板以對其CDR-L1中之胺基酸D28進行胺基酸取代；此等胺基酸取代包括D28G、D28E、D28S、D28A及D28Q。
圖 8 中所呈現之結果係源自下表 16 中所示之數據：表 16
抗體 OD450
4A-350 0.939
4A-351 0.99
4A-357 0.892
4A-358 0.901
4A-359 0.892
4A-360 0.797
4A-361 0.79
4A-362 0.908
4A-363 0.833
4A-364 0.959
4A-365 0.845
4A-366 0.875
4A-367 0.961
4A-368 0.901
4A-369 0.852
4A-370 0.822
4A-371 0.955
4A-372 0.873
4A-373 0.907
4A-374 0.833
4A-375 0.996
4A-376 0.977
4A-332 0.821
4A-21 0.925
該等其他抗MS4A4A抗體包括抗MS4A4A抗體4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380及4A-381，且藉由ELISA測試其在三種不同的抗體濃度(1 μg/ml、0.33 μg/ml及0.11 μg/ml)下與重組MS4A4A可溶性多肽JS5之結合。該等研究之結果示於圖 9 中。如圖 9 中所示，該等其他抗MS4A4A抗體顯示與重組MS4A4A可溶性多肽JS5結合。
圖 9 中所呈現之結果係源自下表 17 中所示之數據：表 17
Figure 02_image005
實例 7 ：人類化且親和力成熟之抗 MS4A4A 抗體與過表現人類 MS4A4A 之 U937 細胞之結合
如下評估本揭示案之抗MS4A4A抗體之人類化且親和力成熟形式與表現人類MS4A4A之U937細胞之結合。
所測試之抗MS4A4A抗體係自雜交瘤上清液純化之小鼠IgG或在Expi293細胞中重組產生之人類IgG1 Fc嵌合體。如下測定與細胞結合之親和力。簡言之，收穫細胞，洗滌，且用Aqua Live/Dead標記以用於活力辨別。在用PBS洗滌後，於96孔U形底板中每孔等分2×10^ 4個細胞且使其與50 μL各種濃度(自10 μg/mL開始3倍稀釋)之經純化之抗MS4A4A抗體一起於FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA)中培育。在此初次培育後，經由離心去除上清液，用150 μL冰冷FACS緩衝液洗滌2次，且與適當二級抗體一起在冰上培育15分鐘。在二級抗體培育後，用冰冷FACS緩衝液將細胞再洗滌2次且重新懸浮於200 μL最終體積之FACS緩衝液中。在FACSCanto系統(BD Biosciences)上實施流式細胞術分析。結合數據表示為中值螢光強度(MFI)。
該等結合實驗之結果示於下文表 18 及表 19 中。表 18 顯示本揭示案之某些抗MS4A4A抗體與過表現重組人類MS4A4A之U937細胞之結合。使用5 μg/ml濃度之抗MS4A4A抗體實施該等實驗且藉由流式細胞術對細胞結合進行分析。表 18
抗體 MFI
4A-18 382
4A-202 216
4A-21 670
4A-25 648
4A-301 89.7
4A-302 113
4A-303 94.7
4A-304 112
4A-305 69.6
4A-306 71.3
4A-307 68.8
4A-308 97.2
4A-309 131
4A-310 75.4
4A-311 68.8
4A-332 324
4A-333 350
4A-334 296
4A-335 286
4A-336 309
4A-337 218
4A-338 222
4A-339 284
4A-340 41.8
4A-341 65.3
4A-342 538
4A-343 513
4A-344 427
4A-345 54.4
4A-346 56.1
4A-347 50.2
4A-348 47.8
4A-349 142
同型對照 33.4
表 19 顯示本揭示案之某些抗MS4A4A抗體與過表現重組人類MS4A4A之U937細胞之結合。使用5 μg/ml濃度之抗MS4A4A抗體實施該等實驗且藉由流式細胞術對細胞結合進行分析。在此分析中，僅經二級抗體染色之細胞之MFI值為大約200。表 19
抗體 MFI
4A-21 18779
4A-332 8821
4A-350 11581
4A-351 12175
4A-358 12107
4A-360 10277
4A-362 10023
4A-369 10079
4A-373 11874
4A-376 16664
4A-352 10955
4A-353 10363
4A-354 13682
4A-355 13418
4A-356 11974
4A-377 12243
4A-378 9913
4A-379 10567
4A-380 11809
4A-381 12588
4A-202 31745
4A-302 24450
4A-312 17715
4A-313 41794
4A-314 15289
實例 8 ：抗 MS4A4A 抗體調節原代人類骨髓樣細胞中之 TREM2 蛋白
已報導，MS4A基因座中之SNP影響人類中之可溶性TREM2 (sTREM2)水準、通常TREM2路徑及阿茲海默氏病易感性。阿茲海默氏病保護性MS4A4A等位基因與腦脊髓液中之sTREM2水準增加相關。總而言之，該等路徑可在阿茲海默氏病或其他神經退化性疾病之預防中起作用。另外，利用市售抗MS4A4A抗體處理培養之人類巨噬細胞降低sTREM2水準(Piccio等人，Acta Neuropathol 2016, 131:925-933)。為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體調節巨噬細胞中之sTREM2及漿膜/細胞表面TREM2 (mTREM2)水準之效應，實施以下研究。
將原代人類巨噬細胞平鋪於96孔板中並利用抗MS4A4A抗體組(10 μg/ml)於完全RPMI中進行處理。在培育48小時後，收集上清液且使用Meso Scale Discovery (MSD)測定sTREM2水準。簡言之，在4℃下使MSD板(目錄號L15XA-3)之孔與1 μg/ml之捕獲抗體以500 RPM於定軌振盪器上一起培育隔夜。洗滌各孔，且接著在20℃下於結合緩衝液(於PBS中之1%熱不活化高等級BSA)中以500 RPM於定軌振盪器上封閉1小時。於結合緩衝液中製備標準品(重組人類Trem2 Fc 1828-T2 (R&D Systems))及適當濃度之未知樣品，添加至孔中，接著在20℃下以500 RPM於定軌振盪器上培育1小時。洗滌各孔，且接著在20℃下與100 ng/ml之二級抗體(生物素化山羊抗人類TREM2 (R&D Systems目錄號BAF1828))一起以500 RPM於定軌振盪器上培育1小時。洗滌各孔，且接著與於結合緩衝液中之0.2 μg/ml偵測試劑(磺基標籤-鏈黴抗生物素蛋白；MSD目錄號R32AD)一起培育。接著洗滌各孔，將150 μl讀取緩衝液(1×，MSD)添加至每一孔，且在Sector成像儀上讀板。
單獨地，收集抗MS4A4A抗體處理之細胞(上文)，且使用結合至別藻藍蛋白或類似螢光團之抗TREM2抗體(Alector)進行流式細胞術以測定mTREM2水準。
如表 20 中所示，抗MS4A4A抗體使自各個供體獲得的所培養人類原代巨噬細胞上清液中之sTREM2水準增加。本文所闡述之結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加或上調人類原代巨噬細胞上清液中之sTREM2水準。表 20 中所報告之數字係相對於使用同型對照抗體獲得之彼等數字(其設置為100)。表 20
抗體 供體
686 687 688
4A-202 249.7 208.9 431.2
4A-214 142.8 168.3 137.7
4A-18 151.2 152.4 181.0
4A-21 340.0 230.4 489.7
huIgG1 100 100 100
如下表 21 中所示，抗MS4A4A抗體使自各個供體獲得的所培養人類原代巨噬細胞上之漿膜/細胞表面TREM2 (mTREM2)水準增加。該等結果與如上表 20 中所示之在該等細胞之上清液中所觀察到的sTREM2之相應增加一致。表 21 中所報告之數字係相對於使用同型對照抗體獲得之彼等數字(其設置為100)。 表 21
抗體 供體
695 696 697
4A-202 319.2 374.5 373.2
4A-214 178.3 124.6 65.7
4A-18 273.0 286.1 313.6
4A-21 209.1 356.4 546.1
hIgG1 100.0 100.0 100.0
該等數據顯示，利用本發明之抗MS4A4A抗體處理人類原代巨噬細胞增加該等骨髓樣譜系細胞中之sTREM2及mTREM2水準二者。該等結果與先前報導相反，該先前報導顯示市售抗MS4A4A抗體5C12降低所培養人類巨噬細胞之上清液中之sTREM2水準(Deming等人，上文文獻)。
使用經製備以具有低內毒素水準之抗MS4A4A抗體重複上述檢查抗MS4A4A抗體對可溶性及膜TREM2之效應之實驗。在培養上清液中所量測之sTREM2水準示於下表 22 中。當高度純化且基本上不含內毒素時，本揭示案之大多數抗MS4A4A抗體在不同程度上誘導sTREM2水準之增加。市售抗MS4A4A抗體3F2、4H2及5C12亦使sTREM2水準增加，但程度較低。該等結果與先前公佈之資料相反，該等先前公佈之資料顯示該等市售抗MS4A4A抗體降低培養物中之sTREM2水準；此有可能係由於市售製劑中所存在之污染性內毒素、雜質及聚集體所致。表 22 中之數據顯示以ng/ml表示之sTREM2水準，且其針對同型對照抗體所觀察到之水準進行正規化。
在抗MS4A4A抗體處理後，所觀察到的sTREM2之增加與膜結合TREM2 (mTREM2)水準之增加平行(下表 23 )。儘管供體反應有所不同，但大多數抗MS4A4A抗體使所測試之三個供體中之2者或3者之mTREM2水準增加。當與市售抗MS4A4A抗體(3F2、4H2及5C12)相比時，本揭示案中之多種抗體展示等效或更優活性。下表 23 中所示之水準係以如藉由流式細胞術所測定之平均螢光強度表示，且針對使用同型對照抗體所觀察到之強度進行正規化。表 22
供體
抗體 753 754 755
4A-202 50.5 15.1 16.1
4A-18 54.9 -2.4 -0.3
4A-21 108.3 36.5 65.5
4A-25 21.5 12.0 33.8
4A-214 43.9 15.1 28.5
3F2 14.1 5.0 17.4
4H2 -1.0 7.5 -5.1
5C12 -0.4 5.5 35.2
表 23
TREM2 MFI ，相對於對照之差量
抗體 供體 753 供體 754 供體 755
4A-202 5258 1171 6591
4A-18 3531 -76 4289
4A-21 5585 2097 6334
4A-25 687 888 2528
4A-214 6017 1774 6009
3F2 2176 103 2423
4H2 1625 207 2444
5C12 926 499 1803
由於遺傳學研究已將阿茲海默氏病保護性MS4A4A等位基因與阿茲海默氏病患者中之sTREM2水準增加相關聯，故該等結果表明，抗MS4A4A抗體藉由調節(亦即增加) TREM2活性及功能有效治療阿茲海默氏病及其他神經退化性病症。
亦測定本揭示案之人類化抗MS4A4A抗體對sTREM2及膜結合TREM2 (mTREM2)之效應。為檢查此效應，將來自兩名供體之人類原代巨噬細胞用本揭示案之抗MS4A4A抗體處理48小時。收集培養上清液且使用Mesoscale Discovery分析對可溶性TREM2之水準進行分析。在用結合有螢光團之抗TREM2抗體染色後，藉由流式細胞術在單獨處理之細胞中量測細胞表面TREM2。使用Mesoscale Discovery系統(MSD, Rockville, MD, USA)量測巨噬細胞之培養上清液中之可溶性TREM2。
下表 24 顯示抗MS4A4A抗體對可溶性TREM2水準變化之效應之結果。在表 24 中，可溶性TREM2水準係以ng/ml列示。如表 24 中所示，本揭示案之大多數抗MS4A4A抗體使人類原代巨噬細胞中之可溶性TREM2水準增加。與本揭示案之許多抗MS4A4A抗體所觀察到之結果相比，市售抗MS4A4A抗體5C12、4H2及3F2未顯示出可溶性TREM2水準之任何顯著程度的增加，且5C12、4H2及3F2之效應與同型對照相當。表 24
抗體 供體888 供體904
hIgG1同型 24.1 25.0
4A-202 46.5 38.4
4A-21 47.2 39.7
4A-25 41.3 41.2
4A-302 49.3 41.3
4A-312 41.4 36.2
4A-313 53.7 40.4
4A-314 47.9 37.2
4A-332 44.6 37.3
4A-350 51.4 44.0
4A-351 45.4 42.2
4A-352 41.2 41.0
4A-353 32.3 34.7
4A-354 41.4 38.0
4A-355 35.5 23.2
4A-356 40.4 38.0
4A-358 55.0 45.8
4A-360 45.3 38.4
4A-362 56.0 45.7
4A-369 54.4 41.6
4A-373 54.2 44.5
4A-376 54.2 51.1
4A-377 34.4 37.0
4A-378 32.7 35.1
4A-379 31.9 31.2
4A-380 38.1 33.0
4A-381 33.7 33.1
4A-382 26.9 31.3
4A-383 29.0 30.5
4A-384 23.2 24.1
4A-385 27.4 27.2
4A-386 25.4 28.3
4A-387 26.0 30.6
4A-388 28.7 31.1
4A-390 26.8 31.5
mIgG1同型 25.9 28.8
5C12 29.7 30.0
4H2 28.9 30.6
3F2 29.4 28.8
下表 25 顯示抗MS4A4A抗體對細胞表面(例如膜) TREM2水準變化之效應之結果。在表 25 中，細胞表面TREM2水準係以如在流式細胞術程序中所量測之平均螢光強度(MFI)示出。如表 25 中所示，本發明之大多數抗MS4A4A抗體使人類原代巨噬細胞中之細胞表面TREM2水準增加。與本揭示案之許多抗MS4A4A抗體所觀察到之結果相比，市售抗MS4A4A抗體5C12、4H2及3F2未顯示出細胞表面TREM2水準之任何顯著程度的增加，且5C12、4H2及3F2之效應與同型對照相當。表 25
抗體 供體888 供體904
hIgG1同型 2566.5 2637.5
4A-202 4045.5 4100
4A-21 3329 3325
4A-25 2967.5 3191
4A-302 5336 4741.5
4A-312 5492 4672
4A-313 3645.5 3345.5
4A-314 4335 4070
4A-332 3257 3061
4A-350 3552 3192.5
4A-351 3464 3235.5
4A-352 3247.5 3227.5
4A-353 2835 3133
4A-354 2940 3092.5
4A-355 3319 3891.5
4A-356 2971.5 3328.5
4A-358 3659 3273.5
4A-360 3421.5 3154.5
4A-362 3759.5 3240
4A-369 3558.5 3256
4A-373 3430 3313
4A-376 3521 3398.5
4A-377 3376.5 3553.5
4A-378 3920.5 3804.5
4A-379 3847.5 3745
4A-380 4070 3754
4A-381 4070.5 3952.5
4A-382 2618.5 2621.5
4A-383 2611.5 2812.5
4A-384 2524.5 2601
4A-385 2576.5 2560.5
4A-386 2546 2614
4A-387 2534 2601
4A-388 2589.5 2624.5
4A-390 2561 2639.5
mIgG1同型 2459.5 2690.5
5C12 2596 2683.5
4H2 2611.5 2780
3F2 2629 2629.5
如表 24 及表 25 中所示，在用本揭示案之抗MS4A4A抗體處理後，膜TREM2水準及可溶性TREM2水準二者均上調。市售抗MS4A4A抗體5C12、4H2及3F2不以任何顯著程度誘導TREM2表現。實例 9 ：抗 MS4A4A 抗體對巨噬細胞表面標記物之效應
如下檢查抗MS4A4A抗體對各種M1及M2巨噬細胞表面標記物之效應。於完全RPMI1640中利用各種抗MS4A4A抗體(10 μg/ml)將人類原代巨噬細胞處理48小時。接著收穫該等細胞且使用對M1標記物(CD16、MHC II類、CD86)、M2標記物(CD200R、Dectin-1、CD163)及泛巨噬細胞標記物CD14具有特異性之抗體進行流式細胞術。
該等研究之結果示於下表 26 中。藉由流式細胞術對細胞表面標記物表現水準進行分析且針對在利用同型對照抗體處理之細胞中所獲得之水準(其設置為100%)進行正規化。某些M1標記物(包括CD86及MHC-II)之細胞表面表現未因抗MS4A4A抗體處理而改變或其僅受輕微影響。相比之下，某些M2標記物(包括CD200R、CD163及Dectin-1)之細胞表面表現因抗MS4A4A抗體處理而顯著降低。表 26
抗體 CD200R (M2) CD14 (泛) Dectin-1 (M2) CD16 (M1) CD163 (M2) MHC-II (M1) CD86 (M1)
huIgG1 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
4A-202 35.2 60.2 47.3 171.0 39.1 73.6 121.8
4A-214 89.5 98.1 108.3 106.5 112.8 144.2 131.6
4A-18 29.0 56.6 46.6 239.3 33.6 45.6 112.3
4A-21 67.9 39.4 22.9 75.5 65.0 81.3 177.0
總而言之，該等結果指示，本揭示案之抗MS4A4A抗體影響巨噬細胞極化，從而影響細胞遠離M2表型。該等結果表明，在CNS內，抗MS4A4A抗體治療可在神經退化性疾病及病症之背景中藉由增強、提高或恢復小神經膠質細胞之神經保護性功能而提供對小神經膠質細胞活性之有益增強。由於健康條件下之穩態小神經膠質細胞表現更多之M2標記物(諸如CD200R、CD163及CD115)，因此該等結果表明，本揭示案之抗MS4A4A抗體將小神經膠質細胞之生理狀態有效地改變成更具保護性之表型，包括改變成更具促炎性或活化狀態。由於阿茲海默氏病小鼠模型及人類阿茲海默氏病中之疾病相關之小神經膠質細胞(DAM)處於促炎性或活化狀態(此在阿茲海默氏病中視為有益的)，因此本揭示案之抗MS4A4A抗體可用於治療阿茲海默氏病及其他神經退化性病症。實例 10 ：抗 MS4A4A 抗體增加骨橋蛋白及凝溶膠蛋白之表現
已鑑別出與MS4A基因簇相關之阿茲海默氏病相關遺傳變異體(SNP)。彼等變異等位基因中之一者係rs1582763，其與CSF sTREM2水準升高以及阿茲海默氏病風險降低及發病年齡延遲相關。(Deming等人，2018, bioRxiv, doi: dx doi org / 10.1101/352179)。rs1582763等位基因使血液中之MS4A4A mRNA水準降低。該等發現表明，rs1582763等位基因藉由降低MS4A4A水準而起保護性作用，潛在性地降低阿茲海默氏病風險或嚴重程度。
顯示此保護性等位基因在人類巨噬細胞中之效應之RNA表現譜係源自已公佈之RNA表現數據。與顯示表現增加之其他標記物(未示出)相比，如藉由倍數變化(「FC」)及p值所指示，SPP1 (骨橋蛋白)及GSN (凝溶膠蛋白)之mRNA顯示最為顯著之表現增加(參見表 27 中「rs1582763」下方之欄且在下表 28 中重複)。該等數據指示，SPP1及GSN係與rs158273等位基因相關之保護性生物學活性之藥效學標記物。
測試親代MS4A4A抗體表型模擬保護性等位基因之能力。利用如表 27 及表 28 中所指示之抗MS4A4A抗體將人類PBMC源性巨噬細胞處理24小時(高達三次重複)。提取RNA並製備RNA文庫且測序，之後進行基因體圖譜分析及定量。結果指示，就增加SPP1及GSN之表現而言，所有所指示之親代抗MS4A4A抗體(4A-220除外)均表型模擬保護性rs1582763等位基因(表 27 及表 28 )。該等結果表明，與保護性等位基因類似，有效增加SPP1及GSN之表現的本揭示案之MS4A4A抗體在降低阿茲海默氏病風險及/或嚴重程度方面具有生物學活性。表 27
   rs1582763 4A-18 4A-18+4A-21 4A-25 4A-214
基因 FC p FC p FC p FC p FC p
SPP1 0.82 4.E-06 0.73 1.E-08 0.25 4.E-02 0.37 3.E-03 0.29 1.E-02
GSN 0.34 6.E-06 1.28 1.E-17 0.85 2.E-09 0.65 3.E-06 0.56 8.E-06
表 28
   rs1582763 4A-220 4A-21 4A-202
基因 FC p FC p FC p FC p
SPP1 0.82 4.E-06 -0.13 3.E-01 0.56 7.E-06 0.49 2.E-03
GSN 0.34 6.E-06 -0.11 4.E-01 0.94 5.E-11 0.82 2.E-06
實例 11 ：利用抗 MS4A4A 抗體衍生並刺激 iPSC 源性小神經膠質細胞
經由引入與幹細胞相關之轉錄因子混合物，可將任何組織起源之成人細胞轉化成誘導型多潛能幹細胞(iPSC) (在https://www(dot)cell(dot)com/iPSC中深入綜述)。iPSC可無限期維持，且在給予適當生長因子時，可驅動其分化成各種成熟細胞類型。自iPSC衍生神經元之方法早已確立(Salimi等人，Mol. Bio.  Rep. 2014; 41: 1717-1721；Engle等人，Neuron 2018; 100: 783-797)。最近，iPSC已用於衍生星狀細胞(Julia等人，Stem Cell Report 2017；9:600-614)及小神經膠質細胞(於Pocock及Piers，Nat. Rev. Neurosci. 2018; 19: 445-452中綜述)。該等培養系統容許在受控環境中研究該等細胞之生物學及功能，否則可能無法實現。此外，可藉由各種方法(諸如藉由CRISPR基因編輯)對iPSC進行遺傳操縱，以容許進一步剖析該等細胞類型中所關注基因之功能相關性。
在自iPSC衍生後，在活體外單獨培養小神經膠質細胞，使其經受本揭示案中之抗MS4A4A抗體之刺激。在刺激後，藉由對細胞內ATP水準進行定量來評價細胞存活率。如上文所闡述量測對細胞表面TREM2表現變化或對可溶性TREM2水準變化之效應。使用諸如ELISA、Mesoscale Discovery分析(MSD, Rockville, MD, USA)、Legendplex (BioLegend, San Diego, CA, USA)或CBA (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)等方法，針對各種細胞介素及趨化介素之表現或水準因抗MS4A4A抗體處理而發生的變化對來自該等培養物之上清液進行分析。使用包括流式細胞術、西方墨點法(western blotting)、固定及即時成像以及RNAseq分析在內之各種方法對該等iPSC-小神經膠質細胞因抗MS4A4A抗體處理而發生的吞噬能力、自體吞噬率、表面標記物表現及基因表現譜之變化進行量測，且與自經抗MS4A4A抗體處理之單核球源性巨噬細胞所獲得的變化進行比較。實例 12 ：抗 MS4A4A 抗體對巨噬細胞表面標記物之效應
CNS及外周器官二者中之骨髓樣細胞在其表型及功能上具有固有之可塑性。此可由活體外巨噬細胞來建模，可將巨噬細胞劃分成M1及M2型巨噬細胞，其顯示不同的吞噬及發炎性潛力、表型及活性。在外周器官中，認為與M1表型相關之巨噬細胞更具促發炎性及抗微生物性，而M2樣巨噬細胞則更具穩態性及抗發炎性。在CNS內，處於穩態條件下之小神經膠質細胞亦表現M2標記物，諸如CD200R、CD163，此表明此細胞類型具有調控功能。在活體外M2巨噬細胞中，MS4A4A表現升高。
如下檢查抗MS4A4A抗體對各種M1及M2巨噬細胞表面標記物之效應。於完全RPMI1640中利用各種抗MS4A4A抗體(例如10 μg/ml)將人類原代巨噬細胞處理48小時。接著收穫該等細胞且使用對M1標記物(諸如CD16、MHC II類、CD86)、M2標記物(諸如CD200R、Dectin-1、CD163)及泛巨噬細胞標記物(包括CD14及其他)具有特異性之抗體進行流式細胞術。實例 13 ：抗 MS4A4A 抗體之動力學表徵
如下由Carterra (South San Francisco, CA)使用專利性陣列表面電漿子共振(SPR)儀器(MX-96)對經純化抗體與MS4A4A ECL1及ECL2肽之結合動力學實施表徵。使用連續流動微量點樣器(CFM)將抗體印刷至CMD500D晶片(Xantec編號SPMX CMD500D批號SC CMD500D0117.a Exp. 31.12.18)上。首先，利用100 mM MES pH 5.5、100 µL EDC (133 mM最終)、100 µL S-NHS (33.3 mM最終)使晶片活化7分鐘。注射一平面之抗小鼠IgG-Fc (Jackson ImmunoResearch目錄號115-005-071)達15分鐘以建立10000-12000 RU之表面密度，之後利用1 M乙醇胺(pH 8.5)使晶片表面去活化10分鐘。將所討論之抗MS4A4A抗體以2:1用HBS-EP+緩衝液(Teknova目錄號H8022)稀釋，且接著自相同樣品溶液以20分鐘及5分鐘印刷進行一式兩份印刷。將對照抗體稀釋至20 μg/ml以供印刷。
為實施動力學分析，於含有1 mg/ml BSA之HBS-EP+緩衝液中製備所討論之肽，其最終分析濃度為2000 nM、400 nM、80 nM、16 nm及3.2 nM。接著將該等肽在晶片上注射5分鐘，之後在非再生動力學系列中以8 uL/秒進行7分鐘解離期。對每一抗MS4A4A抗體進行雙重量測以確保再現性。實例 14 ： MS4A4A 抗體對暫態及天然表現細胞株之親和力量測
評估經純化之抗MS4A4A抗體與各種MS4A4A表現細胞株之結合親和力。該等表現細胞包括如上文實例8中所闡述之轉染細胞，以及內源性地表現MS4A4A之骨髓樣細胞株及原代細胞。所測試之抗MS4A4A抗體係自雜交瘤上清液純化之小鼠IgG或在Expi293細胞中重組產生之人類IgG1 Fc嵌合體。如下測定與細胞之親和結合。簡言之，收穫細胞，洗滌，且用Aqua Live/Dead標記以用於活力辨別。在用PBS洗滌後，於96孔U形底板中每孔等分2×10^ 5個細胞且使其與50 μL各種濃度(自10 μg/mL開始3倍稀釋)之經純化之抗MS4A4A抗體一起於FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA)中培育。在初次培育後，經由離心去除上清液，用150 μL冰冷FACS緩衝液洗滌2次，且與適當二級抗體一起在冰上培育30分鐘。在二級抗體培育後，用冰冷FACS緩衝液將細胞再洗滌2次且重新懸浮於200 μL最終體積之FACS緩衝液中。在FACSCanto系統(BD Biosciences)上實施流式細胞術分析。使用中值螢光強度來分析結合數據且在Prism中擬合曲線(非線性回歸：四參數log抑制劑對劑量反應)以確定EC50值。實例 15 ：下調 MS4A4A 蛋白
評估抗MS4A4A抗體降低各種細胞株及原代細胞中MS4A4A之細胞表面及總細胞蛋白質水準之能力。任一區室中MS4A4A蛋白之減少指示細胞中MS4A4A活性之降低。
使細胞與本揭示案之抗MS4A4A抗體一起培育不同時間段且接著藉由FACS (細胞表面)或西方墨點(總細胞蛋白質水準)分析與細胞締合之剩餘MS4A4A蛋白之水準。對於FACS分析，利用直接別藻藍蛋白(APC)結合之非競爭性抗體偵測剩餘MS4A4A。對於西方墨點偵測，藉由添加50 μL溶解緩衝液(RIPA溶解緩衝液(ThermoFischerScientific目錄號89900) + 1:100 HALT蛋白酶抑制劑混合劑(ThermoFischerScientific目錄號87786))使細胞溶解，且藉由以14,000×g離心15分鐘清除不溶性碎片。利用二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑分析可溶性部分以進行蛋白定量。將來自每一樣品之等量蛋白質載入於4-12% Bis-Tris Plus聚丙烯醯胺凝膠(ThermoFisher Scientific NW04120)上且進行電泳分離，之後使用iBlot2 (ThermoFisher Scientific IM21001)及Transfer Stacks (ThermoFisher Scientific IB24002)將凝膠中之蛋白質轉移至聚二氟亞乙烯(PVDF)膜上。將膜用1%牛血清白蛋白或5%脫脂乳封閉以防止非特異性結合。接著使該膜與內部或市售偵測抗體一起培育，洗滌，且與HRP結合之二級抗體(兔，Abcam編號205718；小鼠，Abcam編號205719)一起培育。藉由利用SuperSignal West Pico Plus化學發光受質(ThermoFisher Scientific編號34577)顯影使結合可視化且利用iBright FL1000 (ThermoFisher Scientific A32752)或其他相容性系統進行數位記錄。
MS4A4A蛋白水準之下調亦可藉由使用熟習此項技術者已知且可獲得之方法下調MS4A4A核酸表現或水準來實現，例如藉由使用反義方法、基因療法等。實例 16 ：利用衰老、癲癇發作、脊髓損傷、視網膜營養不良、額顳葉失智症及阿茲海默氏病之動物模型表徵抗 MS4A4A 抗體之活性
亦可在衰老、癲癇發作、脊髓損傷、視網膜營養不良、額顳葉失智症及阿茲海默氏病之動物模型中測試抗MS4A4A抗體之治療效用，如先前所闡述(例如Beattie, MS等人，(2002) Neuron 36, 375-386；Volosin, M等人，(2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766；Nykjaer, A等人，(2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57；Jansen, P等人，(2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457；Volosin, M等人，(2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879；Fahnestock, M等人，(2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220；Nakamura, K等人，(2007) Cell Death.  Differ. 14, 1552-1554；Yune, T等人，(2007) Brain Res. 1183, 32-42；Wei, Y等人，(2007) Neurosci.  Lett. 429, 169-174；Provenzano, MJ等人，(2008) Laryngoscope 118, 87-93；Nykjaer, A等人，(2004) Nature 427, 843-848；Harrington, AW等人，(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 6226-6230；Teng, HK等人，(2005) J. Neurosci. 25, 5455-5463；Jansen, P等人，(2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457；Volosin, M等人，(2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879；Fan, YJ等人，(2008) Eur.  J. Neurosci. 27, 2380-2390；Al-Shawi, R等人，(2008) Eur.  J. Neurosci. 27, 2103-2114；及Yano, H等人，(2009) J. Neurosci. 29, 14790-14802)。 實例 17 ： 利用腫瘤學動物模型表徵抗 MS4A4A 抗體之效應
骨髓樣細胞代表存在於大多數實體腫瘤中之免疫細胞之主要組分。其在腫瘤生物學中之作用依賴於環境，雖然此等細胞有可能在腫瘤之根除中起關鍵作用，但其最常被宿主腫瘤選擇以協助提供促腫瘤表型。此主要經由使骨髓樣細胞向M2表型極化來達成，該表型通常具有免疫抑制性且因此阻斷免疫系統根除腫瘤。經由使骨髓樣細胞再極化，抗MS4A4A抗體可逆轉此免疫抑制表型且促進抗腫瘤免疫反應。
存在多種動物腫瘤模型。相關動物模型之實例包括人類化小鼠模型，其中小鼠免疫系統遺傳性缺失，以NSG小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)為代表。該等小鼠充當人類免疫細胞之接受性宿主，導致人類適應性及先天性免疫細胞之植入。接著向該等動物接種腫瘤細胞，通常在側腹上之皮膚下。隨時間推移之腫瘤大小代表腫瘤細胞之生長與宿主免疫系統對其之根除之間的平衡。在整個時程中，動物經抗MS4A4A抗體治療，在與經同型治療之動物相比時，該治療改變腫瘤進展。在治療期結束時，提取腫瘤且使其經受各種分析以測定抗MS4A4A抗體對腫瘤細胞及浸潤性免疫細胞之效應。可將腫瘤切片，裝至載玻片上且在顯微鏡下分析組織學變化。可藉由RT-PCR、RNASeq或微陣列對mRNA進行分析以測定基因表現之變化。可製備腫瘤及浸潤性免疫細胞之單細胞懸浮液，用針對各種細胞表面標記物之抗體染色且藉由流式細胞術進行分析，以描繪尤其諸如巨噬細胞及T細胞等免疫細胞中之細胞表面表型之變化。在該等分析中之任一者中所觀察到的源自抗MS4A4A處理之變化將指示該等抗體具有免疫調節功能。實例 18 ：抗 MS4A4A 抗體對 TREM2 轉錄及 mRNA 之效應
如下評估抗MS4A4A抗體對TREM2轉錄水準及mRNA之效應。利用各種濃度之本揭示案之抗MS4A4A抗體將經培養細胞處理不同時間段。之後，接著使用熟習此項技術者已知用於量測及/或定量mRNA水準之標準方法測定細胞內TREM2 mRNA水準之變化。實例 19 ：抗 MS4A4A 抗體對 TREM2 再循環及降解之效應
為更充分地理解抗MS4A4A抗體對sTREM2及mTREM2水準增加之效應，實施以下研究以檢查TREM2再循環及/或降解。在該等研究中，使用環己醯亞胺處理細胞以防止與抗MS4A4A抗體處理相關之進一步的新的TREM2合成。此項技術中已知之各種方法可用於檢查與經抗MS4A4A抗體處理之細胞相比對照細胞中TREM2之再循環及降解。實例 20 ：其他抗 MS4A4A 抗體
如上文實例1中所闡述，使兩種其他抗MS4A4A抗體人類化且自親代抗體4A-21親和力成熟，從而產生抗MS4A4A抗體4A-450及抗MS4A4A抗體4A-419。該等抗體中之每一者之可變重鏈及可變輕鏈序列示於下表 29 中，其中其相應CDR (根據Kabat)加下劃線。重鏈CDR序列示於表 30 中；輕鏈CDR序列示於表 31 中。表 29
抗體 可變重鏈 SEQ ID NO: 可變輕鏈 SEQ ID NO:
4A-450 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADY WGQGTLVTVSS 304 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSAGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK    305
4A-419 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYRFTSYGLS WVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFKG RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADY WGQGTLVTVSS 306 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSRSLLYSAGKTYLS WFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGIDFHQT FGGGTKVEIK    307
表 30
抗體 CDR-H1 SEQ ID NO: CDR-H2 SEQ ID NO: CDR-H3 SEQ ID NO:
4A-450 SYGLS 308 WINTYSGVPTYAQGFTG 309 TMADY 310
4A-419 SYGLS 311 WINTYSGVPTYAQGFKG 312 TMADY 313
表 31
抗體 CDR-L1 SEQ ID NO: CDR-L2 SEQ ID NO: CDR-L3 SEQ ID NO:
4A-450 KSSRSLLYSAGKTYLS 314 LVSKLDS 315 WQGIDFHQT 316
4A-419 KSSRSLLYSAGKTYLS 317 LVSKLDS 318 WQGIDFHQT 319
實例 21 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內對 sTREM 水準之效應
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對血清及腦脊髓液(CSF)中之sTREM水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內輸注向食蟹猴投與80 mg/ml單一劑量之抗MS4A4A抗體4A-202或同型對照(huIgG1)。在投藥前、投與抗體後0.5、4、10、24、48、96、192、312、480及648小時自動物收集血清樣品；在投藥前、投與抗體後48、96、192及336小時自動物收集CSF樣品。
如下量測血清及CSF中之sTREM水準。利用於PBS中之捕獲抗體將單斑點Meso Scale Discovery (MSD)板(Rockville, MD)在4℃下包被隔夜。將猴血清及CSF樣品(以及猴TREM2-Fc標準品)稀釋於結合緩衝液中且在室溫下添加至孔中1小時。將生物素化之山羊抗人類TREM2多株抗體(R&D Systems)以1:2,000稀釋度添加於結合緩衝液中且在室溫下培育1小時，之後利用磺基標籤鏈黴抗生物素蛋白(MSD)進行偵測。將150 μl 1×讀取緩衝液添加至板，且接著在Sector成像儀(MSD)上對板進行分析。
在血清中，在投與抗MS4A4A抗體4A-202後，sTREM2水準自基線增加至為大約1.5倍(自基線增加大約50%) (圖 10A 至圖 10B )。在食蟹猴中單一劑量之抗MS4A4A抗體4A-202後，血清sTREM2水準保持升高(高於基線水準)達至少480小時(20天)。
在CSF中，在投與抗MS4A4A抗體4A-202後，sTREM2水準自基線增加至為大約2至4倍(自基線增加大約300%) (圖 11A 至圖 11B )。在食蟹猴中單一劑量之抗MS4A4A抗體4A-202後，CSF sTREM2水準保持升高(高於基線水準)達至少96小時(4天)。
該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內有效地增加血清及CSF中之sTREM2水準。實例 22 ：抗 MS4A4A 抗體與過表現重組 MS4A4A 之 U937 細胞之結合
評估本揭示案之抗MS4A4A抗體與表現人類重組MS4A4A之U937細胞(該等細胞之產生闡述於上文中)之結合親和力。如下測定抗MS4A4A抗體與該等細胞之結合親和力。簡言之，收穫表現重組人類MS4A4A之U937細胞，洗滌，且用Aqua Live/Dead標記以用於活力辨別。在用PBS洗滌細胞後，於96孔U形底板中每孔等分2×10^ 4個細胞且使其與50 μL各種濃度之經純化之抗MS4A4A抗體一起於FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA)中培育。在此初次培育後，經由離心去除上清液，用150 μL冰冷FACS緩衝液將細胞洗滌2次，且接著與適當二級抗體一起在冰上培育15分鐘。在二級抗體培育後，用冰冷FACS緩衝液將細胞再洗滌2次且重新懸浮於200 μL最終體積之FACS緩衝液中。接著使用FACSCanto系統(BD Biosciences)實施流式細胞術分析。結合數據表示為平均螢光強度(MFI)。使用基於Kuek等人，2016, Immunology and Cell Biology. 94:11-23之以下方程式(或可使用類似4參數擬合)，在Prism (Graphpad)軟體上分析藉由流式細胞儀所量測之MFI值： Y=((F最大-B)/(n*((C/6.02e23)/(V*1e-6)))*[[(aptKD+X+n*((C/6.02e23)/(V*1e-6)))-SQRT{((aptKD+X+n*((C/6.02e23)/(V*1e-6)))^2)-4*(n*((C/6.02e23)/(V*1e-6))*X)}]/2]+B)
在該等分析中，以下值根據實驗條件而受到限制：C=每孔之細胞數量(20,000)；V =以微升計之染色總體積；n =細胞表面上之受體數量，估計為每個細胞100,000個受體。該等結合研究之結果示於圖 12 中。
如圖 12 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313 WT huIgG1展示大約2.8e-10之與在U937細胞上表現之重組人類MS4A4A之結合親和力，而抗MS4A4A抗體4A-450 WT huIgG1在此分析中展示3.8e-09之結合親和力。實例 23 ： MS4A4A 過表現細胞株之產生
鑒於產生穩定轉染之表現重組人類MS4A4A之HEK293細胞株的困難性，檢查其他DNA載體及細胞株以確定其對於表現重組人類MS4A4A是否將更相容。為進行穩定轉染，將MS4A4A編碼序列引入至表現載體pD2533-G418或pD3539-puro (Atum, Newark, CA, USA)中。
MS4A4A在活體內骨髓樣細胞中天然表現。因此，為克服使用上述細胞所觀察到之毒性，測試若干骨髓樣源性細胞株以極低或觀察不到之毒性表現重組人類MS4A4A之能力。該等研究中所使用之骨髓樣源性細胞株組包括THP-1細胞(ATCC TIB202)、U937細胞(ATCC CRL-1593.2)、K562細胞(ATCC CCL243)、HL60細胞(ATCC CCL240)及Kasumi-1細胞(ATCC CRL-2724)。亦測試300.19細胞(Tufts University T000710)，其為小鼠前B細胞株，此乃因該等細胞常用於重組蛋白質表現目的。對該等細胞株中之每一者進行抗生素敏感性篩選，以確定適宜劑量之G418或嘌呤黴素以達到選擇及轉染效率。在重組人類編碼MS4A4A表現質體轉染及抗生素選擇後，發現來自U937細胞、K562細胞及300.19細胞之轉染子具有活力。在藉由有限稀釋選殖該等細胞後，產生個別純系且隨後使用流式細胞術針對人類MS4A4A蛋白細胞表面表現進行篩選。實例 24 ：人類化且親和力成熟之抗 MS4A4A 抗體調節原代人類骨髓樣細胞中之 TREM2 蛋白
來自人類遺傳學研究之資料已鑑別出MS4A4A (TREM2路徑)與阿茲海默氏病(AD)易感性之間的關聯(Piccio等人，2016, Acta Neuropathol, 131:925-933；doi: https://dx.doi.org/10.1101/352179)。舉例而言，AD保護性MS4A4A等位基因與腦脊髓液中之sTREM2水準增加相關。為深入瞭解該等保護性路徑，實施以下研究。將人類原代巨噬細胞用各種濃度之本揭示案之抗MS4A4A抗體處理48小時。在該等研究中，測試以下抗MS4A4A抗體：具有野生型huIgG1 Fc (WT)之4A-450、具有huIgG1 Fc N325S及L328F (NSLF)之4A-450、具有huIgG1 Fc K322A之4A-450、4A-313 WT huIgG1、4A-313 NSLF huIgG1及4A-313 K322A huIgG1。接著在隨後用結合有螢光團之抗TREM2抗體將細胞染色後，藉由流式細胞術量測TREM2之細胞表面(膜結合)表現。使用Mesoscale Discovery系統(MSD, Rockville, MD, USA)量測細胞培養上清液中之可溶性TREM2水準。
如圖 13 及 14 中所示，在向人類原代巨噬細胞添加抗MS4A4A抗體後，該等細胞中之膜TREM2水準以劑量依賴性方式增加。不同huIgG1 Fc序列(野生型huIgG1、huIgG1中之N325S/L328F胺基酸取代及huIgG1中之K322A胺基酸取代)上之抗MS4A4A抗體均能夠增加膜TREM2表現水準。下表 32 及 33 分別呈現自圖 13 及 14 獲得的在經抗MS4A4A處理之細胞中所觀察到的膜結合TREM2水準變化與在未經處理之對照細胞中所觀察到的變化之MFI比率之數值。
圖 15 及 16 顯示野生型huIgG1 Fc主鏈上之抗MS4A4A抗體4A-450及4A-313 (分別)以劑量依賴性方式增加原代人類巨噬細胞上清液中之可溶性TREM2水準。下表 34 及 35 分別呈現自圖 15 及 16 獲得的在經抗MS4A4A處理之細胞中所觀察到的可溶性TREM2相對於量測為板基線水準者之倍數增加之數值。表 32
抗體 (µg/ml) 4A-450 WT 4A-450 NSLF 4A-450 K322A
2.5 1.184 1.174 1.205 1.297 1.176 1.418 1.176 1.180 1.327
0.4 1.236 1.063 1.028 1.276 1.270 1.168 1.163 1.173 1.163
0.064 1.043 1.033 0.897 1.169 1.026 1.093 1.002 1.178 1.023
表 33
抗體 (µg/ml) 4A-313 WT 4A-313 NSLF 4A-313 K322A
1 1.431 1.242 1.475 1.570 1.380 1.542 1.348 1.240 1.405
0.16 1.388 1.210 1.235 1.392 1.262 1.274 1.290 1.155 1.170
0.0256 1.194 1.056 0.978 1.106 1.103 0.974 1.163 1.161 1.068
表 34
4A-450 WT IgG1 (µg/ml) sTREM2 ( 相對於板背景之倍數 )
0.0256 0.250851509
0.064 0.337610359
0.16 0.453324666
0.4 0.60750507
1 0.838142928
2.5 1.452549482
表 35
4A-313 WT IgG1 (µg/ml) sTREM2 ( 相對於板背景之倍數 )
0.0256 0.690304672
0.064 0.942481014
0.16 1.64173901
0.4 1.690748748
1 1.687668894
2.5 1.52381547
該等結果顯示，抗MS4A4A抗體4A-450 WT huIgG1 (2.5 µg/ml)使原代人類巨噬細胞中之sTREM水準增加至為未經處理細胞之約1.4倍。該等結果亦顯示，抗MS4A4A抗體4A-313 WT huIgG1使原代人類巨噬細胞中之sTREM水準增加至為未經處理細胞之約1.5倍至約1.7倍。該等結果指示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體外有效地增加sTREM水準，且因此可提供在活體內增加血漿及CSF中之sTREM水準之有效方式，其模擬保護免於發生阿茲海默氏病之MS4A4A等位基因之效應。實例 25 ：抗 MS4A4A 抗體對細胞 ATP 水準之效應
按照製造商方案，使用RosetteSep人類單核球富集混合劑(Stemcell technologies)及聚蔗糖離心自全血分離出人類單核球。在利用ACK溶解緩衝液將紅血球溶解後，使單核球重新懸浮於完全培養基(RPMI、10% FBS、Pen/Strep、L-麩醯胺酸、HEPES、非必需胺基酸、丙酮酸鈉)中。為自該等經分離之單核球中獲得巨噬細胞，將100 ng/ml人類M-CSF及8% v/v人類血清添加至該等細胞中達5-7天。接著將細胞以50,000個細胞/孔平鋪於完全RPMI-1640中且在於溶液中各種濃度之抗MS4A4A抗體(4A-313 NSLF、4A-313 PS、4A-450 NSLF及4A-450 PS)存在下或不存在下培養2天或在各種濃度之同型對照抗體存在下或不存在下培養48小時。接著使用CellTiter-Glo發光細胞存活率套組(Promega，目錄號G7571)遵循製造商之方案對細胞內之ATP含量進行定量。
如圖 17 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 PS huIgG1、4A-450 NSLF huIgG1及4A-450 PS huIgG1以劑量依賴性方式增加原代人類巨噬細胞中之ATP水準。具有含有N325S/L328F胺基酸取代之huIgG1 Fc且消除FcγRIIIa結合(Journal of Biological Chemistry 2014, 289: 15309-15318)或具有含有P331S胺基酸取代之huIgG1 Fc且消除C1q結合(Journal of Immunology 2000, 164: 4178-4184)之抗MS4A4A抗體二者均有效地增加人類巨噬細胞中之ATP水準。ATP水準之增加指示人類巨噬細胞之活力增加。
下表 36 呈現在該等研究中所測定的ATP水準之數值(與圖 17 相關)，其針對在未經處理之巨噬細胞中所觀察到之數值進行正規化。該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體以劑量依賴性方式有效地增加人類巨噬細胞中之ATP水準。使用抗MS4A4A抗體4A-450，ATP水準增加至為在未經處理之細胞中所觀察到之水準之約1.2倍(0.016µg/ml抗MS4A4A抗體)至約1.4倍(1.0 µg/ml抗MS4A4A抗體)。使用抗MS4A4A抗體4A-313，ATP水準增加至為在未經處理之細胞中所觀察到之水準之約1.3倍(0.008µg/ml抗MS4A4A抗體)至約1.7倍(1.0µg/ml抗MS4A4A抗體)。表 36
抗體 (µg/ml) 4A-450.NSLF 4A-450.PS 4A-313.NSLF 4A-313.PS
1.000 1.431 1.378 1.669 1.739
0.500 1.362 1.355 1.620 1.685
0.250 1.332 1.325 1.670 1.667
0.125 1.298 1.303 1.661 1.711
0.063 1.308 1.317 1.762 1.715
0.031 1.247 1.296 1.704 1.720
0.016 1.258 1.182 1.698 1.652
0.008 1.058 1.000 1.308 1.266
0.004 0.952 0.957 1.079 1.096
實例 26 ：抗 MS4A4A 抗體對巨噬細胞表面標記物之效應
CNS及外周器官二者中之骨髓樣細胞在其表型及功能中具有固有之可塑性。在外周器官中，具有M1樣表型之巨噬細胞更具促發炎性及抗微生物性，而具有M2樣表型之巨噬細胞則更具穩態性及抗發炎性。在CNS內，處於穩態條件下之小神經膠質細胞亦表現M2樣標記物，諸如CD200R及CD163。在活體外M2樣巨噬細胞中，MS4A4A表現升高，且已提出MS4A4A係M2樣巨噬細胞之新穎細胞表面標記物(Immunology and Cell Biology 2017, 95: 611-619)。
如下檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體對各種巨噬細胞表面標記物之效應。於完全RPMI1640中利用各種濃度(10µg/ml、1.0µg/ml、0.1µg/ml)之抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1或4A-419野生型(WT) huIgG1將人類原代巨噬細胞處理48小時。接著收穫該等細胞且使用對M1樣標記物(例如CD16、MHC II類、CD86)、M2樣標記物(例如CD200R、Dectin-1、CD163)及泛巨噬細胞標記物CD14具有特異性之抗體進行流式細胞術。
如圖 18A 、 18B 及 18C 中所示，與在未經處理之細胞(抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1 Fc (每一對中之右側條)、抗MS4A4A抗體4A-419野生型huIgG1 Fc (WT) (每一對中之右側條))中所觀察到之結果相比，向原代人類巨噬細胞中添加抗MS4A4A抗體使得CD14及CD163細胞表面標記物以劑量依賴性方式減少。向原代人類巨噬細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF使得CD200R細胞表面標記物之水準低於在未經處理之細胞中所觀察到之水準。相比之下，與在未經處理之細胞中所觀察到之結果相比，向原代人類巨噬細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-419使得CD200R細胞表面標記物增加。鑑於上文利用抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF所獲得之結果，且鑑於利用本揭示案之其他抗MS4A4A抗體(其減少諸如CD200R等M2樣細胞表面標記物)所獲得之結果(參見上文實例9及表26)，此結果視為此特定實驗之異常。下表 37 呈現自圖 18A 、 18B 及 18C 中之圖表所獲得的細胞表面標記物之倍數變化數值(高於未經處理之細胞)。數據係來自兩名供體之一式三份孔之平均值。表 37
抗體 (µg/ml) 4A-419.WT 4A-313.NSLF
CD14
10 0.40 0.41
1 0.54 0.34
0.1 0.86 0.36
未經處理 1.00 1.08
CD163
10 0.25 0.28
1 0.32 0.30
0.1 0.70 0.36
未經處理 0.63 0.75
CD200R
10 1.17 0.75
1 1.20 0.56
0.1 1.24 0.41
未經處理 0.80 0.96
該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體有效地減少M2樣巨噬細胞表面標記物。實例 27 ：補體依賴性細胞毒性 (CDC) 分析中之人類 IgG1 Fc 變異體
人類IgG1抗體之Fc結構域藉由其與多種下游效應分子(諸如C1q、Fc γ受體及新生Fc受體)之相互作用而影響效應功能。如下使用C3b沈積/細胞殺傷分析量測具有變異體huIgG1 Fc區之本揭示案之抗MS4A4A抗體影響補體沈積之能力。
使用如上文所闡述產生的過表現重組人類MS4A4A之U937細胞作為該等研究中之靶細胞。收穫細胞，於PBS中洗滌1次，且於RPMI 1640培養基中稀釋至2×106 個細胞/mL。於圓底96孔板(Falcon編號351177)中每孔等分50 µL靶細胞(1×105 個細胞/孔)。向該等細胞中添加25 µL於相同培養基中以四倍於預定濃度製備之抗MS4A4A抗體。將細胞-抗體混合物在37℃下培育15 min，接著每孔添加25 µL合併之補體人類血清(Innovative Research, IPLA-CSER)作為補體源且將板在37℃下再培育2 h。之後，將細胞用FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA)洗滌2次且每孔添加100 µL 1:50稀釋之抗C3b-APC抗體(Biolegend 846106)並在冰上培育30分鐘。在iQue流式細胞儀(IntelliCyt)上分析之前，將細胞用FACS緩衝液洗滌2次且重新懸浮於80 µL FACS緩衝液+ 0.25 µL碘化丙啶/孔(Fischer Scientific, BD 556463)中。以兩種方式量測補體活性，一種係藉由高PI細胞百分比來鑑別CDC介導之細胞殺傷程度，另一種係藉由APC通道中細胞之MFI來量測C3b沈積。
圖 19 顯示表現重組人類MS4A4A之U937細胞中之PI (碘化丙啶)攝取%，該等細胞經具有各種huIgG1 Fc變異體之抗MS4A4A抗體4A-313處理。如圖 19 中所示，具有野生型huIgG1之抗MS4A4A抗體4A-313能夠高度驅動補體沈積並殺傷表現靶標之細胞，此觀察為細胞對PI之攝取增加。此效應為劑量依賴性的。在Fc區中具有huIgG1 N325S/L328F胺基酸取代(其顯著地降低C1q結合)之抗MS4A4A抗體4A-313在此分析中之CDC幾乎完全消除。另外，在Fc區中具有huIgG1 K322A胺基酸取代之抗MS4A4A抗體4A-313在此分析中具有無CDC活性之類似效應。
下表 38 顯示與圖 19 中所示之圖表相關之數值。表 38
抗體 (ng/mL) 4A-313.NSLF 4A-313.K322A 4A-313.IgG1 同型對照 IgG1
20,000.0 6.35 4.42 90.93 8.51
6,666.7 9.27 5.96 90.53 8.08
2,222.2 13.48 9.82 92.19 4.38
740.7 24.70 18.79 88.78 5.36
246.9 13.64 16.27 46.49 6.15
82.3 7.39 5.43 11.95 5.08
27.4 7.15 4.72 4.72 7.14
9.1 9.04 3.89 4.38 9.01
3.0 8.96 4.95 3.63 9.13
0.0 7.58 5.49 7.09 9.29
該等結果顯示，具有野生型人類IgG1 Fc區之抗MS4A4A抗體在補體依賴性細胞毒性方面具有效應，而具有含有N325S/L328F胺基酸取代或K322A胺基酸取代之人類IgG1 Fc變異體之抗MS4A4A抗體則在補體依賴性細胞毒性方面沒有效應。實例 28 ：抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP) 中之人類 IgG1 Fc 變異體
使用ADCH報導基因生物分析系統(Promega編號G9901)評估本揭示案之抗MS4A4A抗體介導抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之能力。此系統利用穩定表現FcγRIIa受體(H131變異體)及驅動螢火蟲螢光素酶表現之NFAT反應元件之經工程改造之Jurkat T細胞株。此分析中之活性與效應細胞(在此情形中為骨髓樣細胞)之ADCP活性相關。此處使用之靶細胞為過表現重組人類MS4A4A之U937細胞或源自單核球且用hIL-4 (20 ng/ml)及地塞米松(dexamethasone)(20 nM)極化之原代人類巨噬細胞。
將細胞以1.2×106 個/mL之濃度稀釋於分析緩衝液(RPMI + 4%低IgG血清)中，且將25 µL細胞(30,000個/孔)等分至96孔白色分析板(Costar 3922)之內部孔中。板之外部孔中填充有75 µL無細胞或抗體之分析緩衝液。向含有細胞之孔中添加25 µL亦於分析緩衝液中稀釋之濃度為3倍於期望最終濃度之抗MS4A4A抗體。在將抗體添加至靶細胞後，使分析系統中所提供之效應細胞(以2×107 個/mL冷凍)在37℃下解凍，且將630 µL添加至3.6 mL預溫熱(37℃)之分析緩衝液中並輕輕混合。將25 µL效應細胞(75,000個/孔，E:T比為2.5)立即添加至含有靶細胞及抗體之孔中。接著使板在37℃及5% CO2 下培育6小時以容許受體細胞活化及螢光素酶表現。在此培育後，使板平衡至室溫(15 min)，之後將75 µL螢光素酶分析試劑添加至每一孔。接著使板在板振盪器上培育20 min且在BioTek讀板儀上量測發光。
如圖 20 中所示，野生型huIgG1 (同型對照IgG1)在此分析中強勁地驅動螢光素酶活性，此為FcγRIIa-H131活化之指示。與同型對照IgG1所觀察到之結果相比，具有含有N325S/L328F胺基酸取代之huIgG1 Fc之抗MS4A4A抗體4A-313展示FcγRIIa-H131活化之大量喪失；具有含有K322A胺基酸取代之huIgG1 Fc之抗MS4A4A抗體4A-313在此分析中具有類似效應。
下表 39 提供與圖 20 中所呈現之圖表相關之數值。表 39
抗體 (ng/mL) 4A-313.NSLF 4A-313.K322A 4A-313.IgG1 同型對照 IgG1
20,000 250 154 455 83
6,666.667 227 242 403 49
2,222.222 55 67 128 57
740.7407 61 54 85 60
246.9136 51 60 98 54
82.30453 58 66 64 41
27.43484 39 44 80 42
9.144947 45 46 54 52
3.048316 42 51 48 45
0 50 50 49 64
該等結果顯示，具有野生型人類IgG1 Fc區之抗MS4A4A抗體在抗體依賴性細胞吞噬作用方面有效。另外，該等結果顯示，具有含有N325S/L328F胺基酸取代或K322A胺基酸取代之人類IgG1 Fc變異體之抗MS4A4A抗體在抗體依賴性細胞吞噬作用方面亦有效，但有效程度較低。實例 29 ：抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 中之人類 IgG1 Fc 變異體
與其靶細胞結合之抗體可介導ADCC，此活性被認為主要由天然殺手細胞上之FcγRIIIa活化驅動。使用ADCC報導基因生物分析系統(Promega編號G7010)評估本揭示案之抗MS4A4A抗體引起抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力。此分析系統利用穩定表現FcγRIIIa受體(V158變異體)及驅動螢火蟲螢光素酶表現之NFAT反應元件之經工程改造之Jurkat T細胞株。此處使用之靶細胞為過表現重組人類MS4A4A之U937細胞或源自單核球且用hIL-4 (20 ng/ml)及地塞米松(20 nm)極化之原代人類巨噬細胞。將靶細胞以1.2×106 個/mL之濃度稀釋於分析緩衝液(RPMI + 4%低IgG血清)中，且將25 µL細胞(30,000個/孔)等分至96孔白色分析板(Costar 3922)之內部孔中。板之外部孔中填充有75 µL無細胞或抗體之分析緩衝液。向含有細胞之孔中添加25 µL亦於分析緩衝液中稀釋之濃度為3倍於期望最終濃度之抗體。在將抗體添加至靶細胞後，使所提供之效應細胞(以2×107 個/mL冷凍)在37℃下解凍，且將630 µL添加至3.6 mL預溫熱(37℃)之分析緩衝液中，輕輕混合，且將25 µL效應細胞(75,000個/孔，E:T比為2.5)立即添加至含有靶細胞及抗體之孔中。接著使板在37℃及5% CO2 下培育6小時以容許受體細胞活化及螢光素酶表現。在此培育後，使板平衡至室溫(15 min)，之後將75 µL螢光素酶分析試劑添加至每一孔。接著使板在板振盪器上培育20 min且在BioTek讀板儀上量測發光。
如圖 21 中所示，野生型hu IgG1 (同型對照IgG1)在此分析中強勁地驅動螢光素酶活性，此為FcγRIIIa-V158活化之指示。與同型對照IgG1所觀察到之結果相比，具有含有N325S/L328F胺基酸取代之huIgG1 Fc之抗MS4A4A抗體4A-313展示FcγRIIa-H131活化之大量喪失；具有含有K322A胺基酸取代之huIgG1 Fc之抗MS4A4A抗體4A-313在此分析中具有類似效應。
下表 40 提供與圖 21 中所呈現之圖表相關之數值。表 40
抗體 (ng/mL) 4A-313.NSLF 4A-313.K322A 4A-313.IgG1 同型對照 IgG1
20,000 442 1222 4397 399
6,666.667 415 1182 4891 431
2,222.222 431 1017 5133 373
740.7407 363 623 4346 379
246.9136 332 508 2063 381
82.30453 360 426 839 377
27.43484 347 341 473 340
9.144947 356 338 367 329
3.048316 324 338 346 314
0 328 343 348 368
該等結果顯示，具有野生型hu IgG1 Fc區之抗MS4A4A抗體在抗體依賴性細胞毒性方面具有效應，而具有含有N325S/L328F胺基酸取代或K322A胺基酸取代之人類IgG1 Fc變異體之抗MS4A4A抗體則在抗體依賴性細胞毒性方面沒有效應。實例 30 ： MS4A4A 剔除對原代人類巨噬細胞中之膜及可溶性 TREM2 水準之效應
如下檢查MS4A4A剔除對巨噬細胞中之膜及可溶性TREM2水準之效應。使用CRISPR技術來剔除MS4A4A在原代人類巨噬細胞中之表現。簡言之，藉由用與非靶向性(NT)或MS4A4A特異性gRNA複合之Cas9蛋白(IDT)電穿孔產生剔除巨噬細胞，該等gRNA係由退火至tracrRNA (IDT)之基因座特異性crRNA組成(IDT；NT1，IDT 1號及2號陰性對照crRNA；NT2，GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC (SEQ ID NO:345)及AACCCCTGATTGTATCCGCA (SEQ ID NO:346)；1號MS4A4A，AATTGTGTACCCGATATACA (SEQ ID NO:347)；2號MS4A4A，AACCATGCAAGGAATGGAAC (SEQ ID NO:348)；3號MS4A4A，TATTCATTCCTAGACTACCT (SEQ ID NO:349)；4號MS4A4A，GCTCTGTACTGGCTGCATCA (SEQ ID NO:350))。藉由流式細胞分析評估MS4A4A剔除效率且其大於90% (數據未示出)。
圖 22A 及 22B 顯示MS4A4A剔除對膜TREM2 (mTREM2)水準及可溶性TREM2 (sTREM2)水準之效應。在圖22A及22B中，NT1及NT2為非靶向性CRISPR對照；gRNA 2+3及gRNA 1+4係指用於剔除MS4A4A之不同嚮導物。
如圖 22A 及 22B 中所示，剔除原代人類巨噬細胞中之MS4A4A使得mTREM2及sTREM2水準增加。在MS4A4A剔除後所觀察到的mTREM2及sTREM2水準之增加與在將抗MS4A4A抗體4A-313添加至NT1及NT2對照細胞後mTREM2及sTREM2水準之增加相當。在用抗MS4A4A抗體處理MS4A4A剔除之原代人類巨噬細胞後，未觀察到mTREM2或sTREM2水準之進一步增加，此表明在將本揭示案之抗MS4A4A抗體添加至人類巨噬細胞後所觀察到的mTREM2及sTREM2水準之增加係抗MS4A4A抗體結合至細胞上之MS4A4A之結果。實例 31 ：抗 MS4A4A 抗體調節膜及可溶性 TREM2 之動力學
TREM2蛋白之細胞表面表現受質膜對TREM2之胞吞作用/胞吐作用及膜結合蛋白酶對TREM2之調控裂解調控(Thornton等人，2017, EMBO Mol. Med. 9: 1366-1378; doi: 10.15252/emmm.201707673)。如上文實例中所闡述，利用本揭示案之抗MS4A4A抗體處理人類巨噬細胞增加膜及可溶性TREM2水準二者。實施以下研究以進一步瞭解膜及可溶性TREM2水準變化之動力學。
為評價可溶性TREM2 (sTREM2)水準之變化，將原代人類巨噬細胞平鋪於24孔或96孔板中，之後添加抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-450.NSLF或同型對照抗體(所有均為1 µg/ml)。在抗體存在下0.5、1、4、24及48小時之細胞培養之後，收集上清液且使用Meso Scale Discovery測定sTREM2水準。
如下評價在添加本揭示案之抗MS4A4A抗體後，原代人類巨噬細胞中膜TREM2 (mTREM2)水準之增加之動力學。將原代人類巨噬細胞以100,000個細胞/孔平鋪於96孔U形底板中3天，之後進行分析(T減72小時)。在各個時間點(T減48小時、T減24小時、T減4小時、T減1小時)，將抗體添加至平鋪細胞中，其包括同型對照抗體(同型對照NSLF)及抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF。平鋪後72小時，在用螢光團結合之抗TREM2抗體將細胞染色後藉由流式細胞術量測TREM2之細胞表面(膜結合)表現水準。
如圖 23A 中所示，本揭示案之抗MS4A4A抗體使自各個供體獲得的所培養原代人類巨噬細胞之上清液中sTREM2之水準快速地增加。抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF使sTREM2水準較在經同型對照抗體處理之細胞中所觀察到之水準增加大約0.5倍(增加大約50%)。抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF使sTREM2水準較在經同型對照抗體處理之細胞中所觀察到之水準增加大約2.5倍(增加大約250%)。
如圖 23B 中所示，與在添加同型對照抗體後所觀察之結果相比，在向原代人類巨噬細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後1小時及4小時，膜TREM2水準降低。在圖 23B 中，點線代表同型對照抗體處理細胞中mTREM2之水準。在添加抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後24小時及48小時時間點，mTREM2之水準增加至高於在經同型對照抗體處理之細胞中所觀察到之水準。如圖 23A 中所示，在所檢查之所有時間點，膜TREM2之早期減少與TREM2脫落之增加一致。
由於本揭示案之抗MS4A4A抗體增加原代人類巨噬細胞中之TREM2蛋白水準，故實施以下實驗以檢查在抗MS4A4A抗體添加後對TREM2 mRNA水準之效應。將原代人類巨噬細胞平鋪於24孔或96孔板中，且利用於完全RPMI中之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及同型(1 μg/ml)處理。在0.5、1、4、24及48小時培育後，收集細胞沈澱，且使用定量PCR分析(qPCR)測定TREM2 mRNA水準。簡言之，使用RNeasy Mini套組(Qiagen)提取RNA，使用QuantiNova反轉錄套組(Qiagen)自總RNA製備cDNA。使用TaqMan分析藉由即時PCR分析TREM2 (Hs00219132_m1)及GAPDH (Hs027886624_g1)之基因表現水準。將每一樣品之CT值針對管家基因GAPDH之CT值進行正規化。
如圖 23C 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF不影響自各個供體獲得的所培養人類原代巨噬細胞中之TREM2 mRNA水準；觀察到mRNA水準之一些輕微波動(較在同型對照中所觀察到之水準高不到0.5倍)。該等結果指示，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加所培養人類原代巨噬細胞中之TREM2蛋白水準而不影響TREM2 mRNA水準。實例 32 ：抗 MS4A4A 抗體增加原代人類巨噬細胞中之 SPP1 及 IL1RN 分泌
如下檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體對原代人類巨噬細胞中骨橋蛋白(SSP1)及介白素-1受體拮抗劑(IL1RN)之分泌水準之效應且與在經遺傳修飾以剔除MS4A4A表現之原代人類巨噬細胞中所觀察到之結果進行比較。
使用標準程序，藉由用與嚮導RNA (gRNA)複合之Cas9蛋白電穿孔在原代人類巨噬細胞中產生MS4A4A遺傳剔除，該等嚮導RNA係呈由退火至tracrRNA之crRNA組成之單一gRNA分子或gRNA雙鏈體形式：非靶向性NT1 (IDT 1號及2號陰性對照RNA)；NT2 (GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC [SEQ ID NO:345]及AACCCCTGATTGTATCCGCA [SEQ ID NO:346])；1號MS4A4A (AATTGTGTACCCGATATACA [SEQ ID NO:347])；2號MS4A4A (AACCATGCAAGGAATGGAAC [SEQ ID NO:348])；3號MS4A4A (TATTCATTCCTAGACTACCT [SEQ ID NO:349])；4號MS4A4A，GCTCTGTACTGGCTGCATCA [SEQ ID NO:350]) (所有均來自IDT, Coralville, Iowa, USA)。接著將細胞以50,000個細胞/孔平鋪於完全RPMI-1640中且在抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF (0.1µg/ml)、抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF (0.1µg/ml)或同型對照抗體存在下培養48小時。收集來自細胞之上清液，且使用R&D DuoSet ELISA套組(IL1RN目錄號DY280、SPP1目錄號DY1433)分析IL1RN及SPP1之水準。
利用抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF或4A-450.NSLF處理NT對照細胞使得所分泌SPP1之水準增加。該等細胞中MS4A4A之遺傳剔除亦使得所分泌SPP1之水準增加，其與利用MS4A4A抗體處理所觀察到之水準增加相當。該等研究中SPP1之水準為：在NT對照細胞中添加同型對照抗體後為大約100 ng/ml；在NT對照細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後為大約200 ng/ml；在NT對照細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF後為大約275 ng/ml；且在MS4A4A剔除細胞中為大約225 ng/ml。在添加本揭示案之任一抗MS4A4A抗體後所分泌SPP1水準之增加與在MS4A4A表現遺傳剔除之細胞中所觀察到之水準增加相當。
利用抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF或4A-450.NSLF處理NT對照細胞均使得所分泌IL1RN之水準增加。該等細胞中MS4A4A之遺傳剔除亦使得所分泌之IL1RN水準增加，其與利用MS4A4A抗體處理所觀察到之水準增加相當。該等研究中IL1RN之水準為：在NT對照細胞中添加同型對照抗體後為大約8 ng/ml；在NT對照細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後為大約12 ng/ml；在NT對照細胞中添加抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF後為大約16 ng/ml；且在MS4A4A剔除細胞中為大約14 ng/ml。在添加本揭示案之任一抗MS4A4A抗體後所分泌IL1RN水準之增加與在MS4A4A表現遺傳剔除之細胞中所觀察到之水準增加相當。
綜上所述，該等結果指示，本揭示案之抗MS4A4A抗體有效地增加原代人類巨噬細胞中SPP1及IL1RN之分泌水準。另外，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體對增加所分泌SPP1及IL1RN水準之效應與在MS4A4A之表現遺傳剔除時所觀察到之效應類似，此表明本揭示案之抗MS4A4A抗體降低或阻斷該等細胞中之MS4A4A活性，從而引起所觀察到之SPP1及IL1RN水準之增加。實例 33 ：抗 MS4A4A 抗體誘導之人類巨噬細胞中之存活率與 TREM2 無關
如上文所示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在抗MS4A4A抗體添加後有效地增加原代人類巨噬細胞之存活率(如藉由總細胞ATP之增加所量測)。另外，如上文所示，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加細胞中之膜TREM2水準。由於本揭示案之抗MS4A4A抗體增加膜TREM2水準，且由於抗MS4A4A抗體增加細胞存活率，因此實施一系列實驗以檢查因應於抗MS4A4A抗體添加而觀察到的細胞存活率之增加是否至少部分地為TREM2依賴性的。為對此進行探究，使用CRISPR技術將人類原代巨噬細胞中之TREM2遺傳剔除，以檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體對在遺傳上缺少TREM2表現之原代人類巨噬細胞之細胞存活率之效應。
藉由用與嚮導RNA (gRNA)複合之Cas9蛋白電穿孔產生TREM2剔除巨噬細胞，該等嚮導RNA係呈由退火至tracrRNA之crRNA組成之單一gRNA分子或gRNA雙鏈體形式：非靶向性1 (NT1) (IDT 1號及2號陰性對照crRNA)；NT2 (GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC [SEQ ID NO:345]及AACCCCTGATTGTATCCGCA [SEQ ID NO:346])；1號TREM2 (GCCATCACAGACGATACCCT [SEQ ID NO:351])；2號TREM2 (ATAGGGGCAAGACACCTGCA [SEQ ID NO:352])；3號TREM2 (CAGCATCCCGGTGATCCAGG [SEQ ID NO:353])；4號TREM2，TGGAGATCTCTGGTTCCCCG [SEQ ID NO:354]) (所有均來自IDT, Coralville, Iowa, USA)。
接著將細胞以50,000個細胞/孔平鋪於完全RPMI-1640中且在於溶液中之抗MS4A4A抗體(4A-313 NSLF、4A-450 NSLF)或同型對照抗體(所有均為0.1 µg/ml)存在下培養48小時。接著使用CellTiter-Glo發光細胞存活率套組(Promega，目錄號G7571)遵循製造商之方案對細胞內之ATP含量進行定量。
與同型對照抗體所觀察到之結果相比，添加抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF或抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF使NT對照細胞中之ATP水準增加大約20%。另外，將抗MS4A4A抗體添加至TREM2剔除細胞中使得ATP水準較同型對照抗體所觀察到之ATP水準增加大約15% - 20%。綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體至少部分地以非TREM2依賴性方式增加細胞ATP水準(且由此增加細胞存活率)。實例 34 ： MS4A4A 之 siRNA 減弱增加原代人類巨噬細胞中之膜及可溶性 TREM2 水準
如上文所示，使用CRISPR技術遺傳削弱MS4A4A表現使得人類巨噬細胞中之膜及可溶性TREM2水準增加。為進一步對該等發現提供支援，使用獨立實驗方法評價MS4A4A之表現缺失對TREM2水準之效應。在該等研究中，在原代人類巨噬細胞中實施MS4A4A之siRNA減弱並量測其對膜及可溶性TREM2水準之效應。
藉由使用N-TER奈米粒子siRNA轉染系統(Millipore Sigma)轉染對照(Millipore Sigma, SIC001)及MS4A4A靶向siRNA (Millipore Sigma, SASI_Hs01_00150955)產生MS4A4A減弱之巨噬細胞。藉由流式細胞分析評估MS4A4A剔除效率(數據未示出)。在用螢光團結合之抗TREM2抗體將細胞染色後藉由流式細胞術量測TREM2之細胞表面(膜結合)表現。
如圖 24A 及圖 24B 中所示，MS4A4A表現之siRNA減弱導致膜TREM2水準及可溶性TREM2水準分別增加。在圖 24A 及圖 24B 中，每組連接之點代表來自具有及沒有siRNA減弱之一名個別供體(總計6名供體)之平均結果。該等數據與顯示上文所闡述經遺傳工程改造之MS4A4A剔除細胞中mTREM2及sTREM2水準增加之類似結果一致。綜上所述，該等結果指示，MS4A4A表現或活性之缺失使原代人類巨噬細胞中之可溶性TREM2水準及膜TREM2水準二者增加。實例 35 ：抗 MS4A4A 抗體在活體外增加 mTREM2 、 sTREM2 及 ATP 水準之功效
在自三名單獨供體獲得之原代人類巨噬細胞中進一步檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體增加mTREM2、sTREM2及ATP水準之效應(如先前在上文實例24及25中所闡述)。將原代人類巨噬細胞用各種濃度之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及4A-450.NSLF處理48小時。接著量測mTREM2、sTREM2及ATP水準之變化。
如圖 25A 、圖 25B 及圖 25C 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF分別以劑量依賴性方式使自三名不同供體獲得之原代人類巨噬細胞中mTREM2之水準增加。圖 25A 、圖 25B 及圖 25C 中之數據呈現為mTREM2之水準相對於使用同型對照抗體所觀察到的水準之倍數增加(x軸顯示抗體濃度(µg/ml)且y軸顯示高於對照(其設置為1.0)之倍數增加)。對來自該等圖表之數據進行分析以確定EC50值及最大反應；該等結果示於下表 41 中(顯示為平均值+/- SEM)。表 41
抗體 EC50 (µg/ml) 最大 mTREM2 反應 ( 相對於同型對照之倍數增加 )
4A-313.NSLF 0.028 +/- 0.013 2.45 +/- 0.23
4A-450.NSLF 0.039 +/- 0.014 2.36 +/- 0.27
如圖 26A 、圖 26B 及圖 26C 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF分別以劑量依賴性方式使自三名不同供體獲得之原代人類巨噬細胞中sTREM2之水準增加。圖 26A 、圖 26B 及圖 26C 中之數據呈現為sTREM2之水準相對於使用同型對照抗體所觀察到的水準之倍數增加(x軸顯示抗體濃度(µg/ml)且y軸顯示高於對照(其設置為1.0)之倍數增加)。對來自該等圖表之數據進行分析以確定EC50值及最大反應；該等結果示於下表 42 中(顯示為平均值+/- SEM)。表 42
抗體 EC50 (µg/ml) 最大 sTREM2 反應 ( 相對於同型對照之倍數增加 )
4A-313.NSLF 0.025 +/- 0.007 6.17 +/- 1.90
4A-450.NSLF 0.069 +/- 0.006 5.74 +/- 1.65
如圖 27A 、圖 27B 及圖 27C 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF分別以劑量依賴性方式使自三名不同供體獲得之原代人類巨噬細胞中細胞ATP之水準增加。圖 27A 、圖 27B 及圖 27C 中之數據呈現為細胞ATP之水準相對於使用同型對照抗體所觀察到的水準之倍數增加(x軸顯示抗體濃度(µg/ml)且y軸顯示高於對照(其設置為1.0)之倍數增加)。對來自該等圖表之數據進行分析以確定EC50值及最大反應；該等結果示於下表 43 中(顯示為平均值+/- SEM)。表 43
抗體 EC50 (µg/ml) 最大細胞 ATP 反應 ( 相對於同型對照之倍數增加 )
4A-313.NSLF 0.010 +/- 0.001 1.76 +/- 0.10
4A-450.NSLF 0.021 +/- 0.006 1.43 +/- 0.10
綜上所述，如藉由在抗體添加後mTREM2、sTREM2及細胞ATP之水準增加所證明，該等結果顯示本揭示案之抗MS4A4A抗體誘導原代人類巨噬細胞中之功能性變化。實例 36 ：抗 MS4A4A 抗體挽救 CSF1R 抑制誘導之細胞死亡
為評估MS4A4A在CSF1R抑制後維持人類巨噬細胞存活之能力，研究本揭示案之抗MS4A4A抗體在CSF1R抑制劑PLX3397之存在下增強細胞存活之能力(參見DeNardo等人，Cancer Discov (2011) 1(1):54-67. 22039576)；Peng等人，J. of Exp Canc Res (2019) 38(1):372.  PMID: 31438996)。
使用RosetteSep人類單核球富集方案(Stem Cell Technologies)將人類單核球自全血分離出。為製備人類單核球源性巨噬細胞，對單核球進行計數且平鋪於完全RPMI培養基(補充有Glutamax、青黴素/鏈黴素、非必需胺基酸、丙酮酸鈉及10%熱不活化胎牛血清之RPMI)及50 ng/ml MCSF (Peprotech)中。6天後，收集分化之單核球(巨噬細胞)且以於含有50 ng/ml M-CSF之完全RPMI培養基中0.1×106 個細胞/孔之密度平鋪至96孔板上。使巨噬細胞恢復隔夜。在第7天，將抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及4A-450.NSLF添加至含有及不含PLX3397 (1 µM)之所培養巨噬細胞中。所有抗體均以1µg/ml之最終濃度添加。使用細胞毒性紅(cytotox red)試劑(標記瀕死細胞之DNA染料，Essen Bioscience)測定細胞存活率。藉由使用IncuCyte活細胞成像系統(Essen Bioscience)量測若干天之螢光信號來測定細胞毒性紅試劑之水準。
如圖 28A 中所示，經PLX3397及抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF處理之人類巨噬細胞顯示細胞毒性紅計數與在經PLX3397加同型對照抗體處理之細胞中所觀察到之計數相比減少。圖 28A 中之數據繪製為平均值± SEM；N = 3，來自三名人類供體。
如圖 28B 中所示，經PLX3397及抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF處理之人類巨噬細胞顯示細胞毒性紅計數與在經PLX3397加同型對照抗體處理之細胞中所觀察到之計數相比減少。圖 28B 中之數據繪製為平均值± SEM；N = 3，來自三名人類供體。
綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低細胞死亡且在CSF1R抑制後維持人類巨噬細胞之存活。因此，本揭示案之抗MS4A4A抗體可用於治療患有CSF1R缺乏疾病或病症(諸如ALSP或HDLS)之個體。實例 37 ：抗 MS4A4A 抗體在食蟹猴血清中之藥物動力學
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內血清中之藥物動力學(PK)，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射以80 mg/kg之劑量向食蟹猴(cynomolgus monkey、cyno)投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT或同型對照(huIgG1)。每一動物組投與總計五劑；第一劑與第二劑相隔28天間隔且剩餘四劑中每劑相隔7天間隔。
在投藥前、投與抗體後0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188及1224小時自動物收集血清樣品。
基於利用生物素標記之山羊抗人類IgG (目錄號NBP1-74983；Novus Biologicals)作為捕獲試劑及Alexa fluor® 647標記之抗人類IgG (目錄號2049-31；Southern Biotech)作為偵測試劑之逐步夾心格式，使用定製Gyrolab分析量測食蟹猴血清中之抗MS4A4A抗體4A-21.WT、4A-25.WT及4A-18.WT之水準。將標準品、品質控制品及樣品稀釋於Rexxip HN緩衝液(目錄號P0004996，Gyrolab)中。藉由生物素化之抗人類IgG捕獲樣品中存在的抗MS4A4A抗體，該生物素化之抗人類IgG結合至gyrolab bioaffy 200 CD之鏈黴抗生物素蛋白包被之親和管柱。藉由螢光標記之抗人類IgG抗體偵測所捕獲之抗MS4A4A抗體。所產生之螢光信號之強度與樣品中所存在的抗MS4A4A抗體之量成正比。使用Gyrolab xP及Excel對數據進行分析。
在將80 mg/kg劑量投與給動物後，血清中之抗MS4A4A抗體濃度在達到平均最大觀察濃度(C最大 )後穩定地下降，其中在第1天(第一劑之日)投與後，抗MS4A4A抗體4A-21.WT之平均半衰期(t1/2 )值(平均值± SD)為140 ± 54.5小時，抗MS4A4A抗體4A-25.WT為269 ± 114小時，且抗MS4A4A抗體4A-18.WT為193 ± 26.8小時。清除率(CL)與t1/2 成反比，其中在第1天，抗體4A-21.WT之平均CL (平均值± SD)為0.625 ± 0.107 mL/hr/kg，抗體4A-25.WT為0.124 ± 0.025 mL/hr/kg，且抗體4A-18.WT為0.402 ± 0.09 mL/hr/kg。抗體4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT組在第1天之穩態分佈體積(Vss)值分別在30.8 mL/kg至51.4 mL/kg、22.6 mL/kg至41.7 mL/kg及24.9 mL/kg至41.3 mL/kg範圍內。
藉由C最大 及自0至投藥後168小時之濃度-時間曲線下面積(AUC0-168 )評價暴露。在第1天，抗體4A-25.WT具有最高平均C最大 (6.26×106 ng/mL)，其次為抗體4A-18.WT (4.81×106 ng/mL)。在檢品中，抗MS4A4A抗體4A-21.WT (3.53 ×106 ng/mL)具有最低之C最大 。
抗MS4A4A抗體4A-25.WT及4A-18.WT具有類似之AUC0-168 (分別為3.47×108 ng*hr/mL及3.35×108 ng*hr/mL)，其顯著高於抗體4A-21 (1.15×108 ng*hr/mL)。實例 38 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加血清及 CSF 之 sTREM2 水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對血清及腦脊髓液(CSF)中之sTREM2水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射以80 mg/kg之劑量向食蟹猴投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT或同型對照(huIgG1)。每一組投與總計五劑；第一劑與第二劑相隔28天間隔且剩餘四劑中每劑相隔7天間隔。
在投藥前、投與抗體後0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188及1224小時自動物收集血清樣品。亦在投藥前、投與抗體後0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188及1224小時自動物收集CSF樣品。
在血清中，在投與抗MS4A4A抗體4A-25.WT、4A-18.WT及4A-21.WT之後，sTREM2水準增加至基線之2倍以上，其中在投與第一個抗體劑量後48至96小時達到峰值水準，分別為其投藥前基線水準之232%、261%及287%。此外，在第29天、第36天、第43天及第50天重複每週投用抗MS4A4A抗體之情形下，血清中之sTREM2水準保持升高，其中平均sTREM2水準為在投藥前所觀察到之基線水準之大約2倍(214%，4A-25.WT；226%，4A-18.WT；199%，4A-21.WT)。在整個投藥期，同型對照保持接近投藥前水準(基線之107%)。
在CSF中，與在經同型對照治療之動物中所觀察到之結果相比，在分別投與抗MS4A4A抗體4A.21.WT (p=0.0008，2因子ANOVA)及4A-25.WT (p=0.004，2因子ANOVA)後24及96小時， sTREM2水準顯著地增加。4A-18.WT治療組中之sTREM2水準與在同型對照組中所觀察到之水準相似。
綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內有效地增加血清及CSF二者中之sTREM2水準。實例 39 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加 CSF 骨橋蛋白水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對CSF中之骨橋蛋白水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射以80 mg/kg之劑量向食蟹猴投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT或同型對照(huIgG1)。每一組投與總計五劑；第一劑與第二劑相隔28天間隔且剩餘四劑中每劑相隔7天間隔。在投藥前、投與抗體後0.5、4、6、10、12、24、48、96、168、192、264、312、336、480、504、648、672、672.5、684、720、840、840.5、852、888、1008、1008.5、1014、1020、1032、1056、1104、1176、1188及1224小時自動物收集CSF樣品。
與同型對照抗體所觀察到之結果相比，抗MS4A4A抗體4A-25.WT、4A-18.WT及4A-21.WT顯著地增加CSF中之骨橋蛋白水準。
重複投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT使得CSF骨橋蛋白水準顯著增加，與同型對照相比，其在第一劑量後12小時達到峰值至大約280 ng/ml (p＜ 0.0001，2因子ANOVA)且在後續劑量後12至24小時繼續顯示峰值水準。與同型對照相比，重複投與抗MS4A4A抗體4A-25.WT及抗體4A-18.WT顯示在每一劑量後12至24小時CSF骨橋蛋白水準增加(至大約50-80 ng/ml之水準)之趨勢。
該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內有效地增加CSF中之骨橋蛋白水準。實例 40 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加各個腦區中之骨橋蛋白水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對食蟹猴額葉皮質及海馬體中之骨橋蛋白水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射以80 mg/ml之劑量向食蟹猴投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT、4A-25.WT、4A-18.WT或同型對照(huIgG1)。每一組投與總計五劑；第一劑與第二劑每劑相隔28天間隔，且剩餘四劑中每劑相隔7天間隔。在第五劑後48小時使動物安樂死，且將額葉皮質及海馬體移除並冷凍。
如下量測腦組織中之骨橋蛋白水準。根據製造商說明書，將冷凍腦樣品用N-Per神經元蛋白質提取試劑(目錄號87792，Thermo Scientific)及Halt蛋白酶抑制劑(目錄號1861278)在冰上溶解20分鐘。將樣品離心且將上清液轉移至新管並在-80℃下儲存直至進一步分析。根據製造商說明書，藉由BCA蛋白質分析套組(目錄號23225，Thermo Scientific)量測每一樣品中之總蛋白質濃度。使用蛋白質濃度值對腦組織中所量測之分析物濃度進行正規化。
在用抗MS4A4A抗體4A-21.WT治療後，食蟹猴腦組織中之骨橋蛋白水準增加。當與同型對照抗體所觀察到之結果相比時，向食蟹猴重複投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT使得食蟹猴之額葉皮質中之骨橋蛋白水準顯著增加(分別p ＜ 0.035及p = 0.0003；單因子ANOVA)。特定而言，在抗體投與後，在額葉皮質中所量測之平均骨橋蛋白水準如下：大約0.6 ng/mg (同型對照抗體)；大約1.2 ng/mg (4A-21.WT)；大約0.7 ng/mg (4A-25.WT及4A-18.WT)。當與同型對照抗體所觀察到之結果相比時，重複投與抗MS4A4A抗體使得食蟹猴海馬體中之骨橋蛋白水準有增加之趨勢。特定而言，在抗體投與後，在海馬體中所量測之平均骨橋蛋白水準如下：大約1.3 ng/mg (同型對照抗體)；大約1.8 ng/mg (4A-21.WT及4A-18.WT)；及大約2.4 ng/mg (4A-25.WT)。該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體有效增加非人類靈長類動物中額葉皮質及海馬體中之骨橋蛋白水準。實例 41 ：抗 MS4A4A 抗體對 CSF 蛋白質生物標記物之效應
進一步分析自投與抗MS4A4A抗體4A-21.WT (80 mg/kg)之外周注射之食蟹猴所獲得的腦脊液中蛋白質生物標記物活體內表現之變化。在該等研究中，使用對在注射抗體後24小時自動物獲得的CSF樣品實施之Somalogic Somascan 1.3k分析量測CSF中蛋白質表現水準之變化。
在將抗MS4A4A抗體4A-21.WT投與給食蟹猴後觀察到CSF中之蛋白質變化。圖 29 係呈現來自三個CSF樣品之全蛋白質體效應之火山圖，該等樣品係取自外周注射抗MS4A4A抗體4A-21.WT (80 mg/kg)後之食蟹猴。該火山圖中之每一點代表1種蛋白質。對於每一所量測之蛋白質，x軸上之值代表抗體治療動物與對照動物之間CSF中蛋白質水準之倍數變化差異；y軸上之值代表藉由ANOVA所評價之該等所觀察到的差異之顯著性，其表示為差異表現之p值之負log10。圖 29 中之蛋白質符號呈現p值＜1E-3之在抗體治療動物對對照動物中差異表現之蛋白質。
如圖 29 中所示，在投與抗MS4A4A抗體之動物中觀察到骨橋蛋白(SSP1)及IL1RN (2種小神經膠質細胞標記物)之CSF水準之增加。綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體增加非人類靈長類動物之CSF及血清二者中之IL1RN及骨橋蛋白水準。實例 42 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加血清 sTREM2 水準
在非人類靈長類動物中實施之另一系列實驗中進一步檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對血清及腦脊髓液(CSF)中之sTREM2水準之效應。
藉由靜脈內濃注注射向食蟹猴投與80 mg/ml劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-313.WT及4A-450.NSLF；250 mg/ml劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF，或媒劑對照。每一組投與總計四劑；第一劑與第二劑相隔7天間隔，第二劑與第三劑相隔14天間隔，且第三劑與第四劑相隔28天間隔。
在投藥前、投與抗體後0.5、2、6、10、24、34、48、72、96、168、168.5、170、174、178、192、216、240、264、336、408、504、504.5、506、510、514、528、552、576、600、672、744、840、912、1008、1176、1186、1200及1224小時自動物收集血清樣品；亦在投藥前、投與抗體後0.5、2、6、10、24、34、48、72、96、168、168.5、170、174、178、192、216、240、264、336、408、504、504.5、506、510、514、528、552、576、600、672、744、840、912、1008、1176、1186、1200及1224小時自動物收集CSF樣品。
如下量測血清中之sTREM水準。利用於PBS中之捕獲抗體將單斑點Meso Scale Discovery (MSD)板(Rockville, MD)在4℃下包被隔夜。將猴血清樣品(以及猴TREM2-Fc標準品)稀釋於結合緩衝液中且在室溫下添加至孔中1小時。將生物素化之山羊抗人類TREM2多株抗體(R&D Systems)以1:2,000稀釋度添加於結合緩衝液中且在室溫下培育1小時，之後利用磺基標籤鏈黴抗生物素蛋白(MSD)進行偵測。將150 μl 1×讀取緩衝液添加至板，且接著對板進行分析。
該等研究之結果示於圖 30 中。在血清中，在以80 mg/kg投與抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後，在投藥後24小時，sTREM2水準增加至為基線所觀察水準之大約1.5倍(投藥前基線水準之約150%)。sTREM2之水準隨時間推移繼續增加，在80 mg/kg之多次劑量後達到為基線所觀察水準3倍(投藥前基線水準之約300%)之最大水準。
在250 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF下，血清sTREM2水準在投藥後24小時增加至為基線所觀察水準之大約1.5倍且隨時間推移繼續增加，在250 mg/kg之多次劑量後，達到為基線所觀察水準4.8倍之最大水準。
在以80 mg/kg投與抗MS4A4A抗體4A-313.WT後，血清sTREM2水準在投藥後24小時開始增加至為基線所觀察水準之大約1.5倍。在80 mg/kg重複劑量之4A-313.WT之情形下，血清sTREM2水準增加至最大為基線所觀察水準之3倍。
在以80 mg/kg投與抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF後，血清sTREM2水準在投藥後24小時增加至為基線所觀察水準之大約2倍且隨時間推移繼續增加，在80 mg/kg 4A-450.NSLF之多次劑量後，達到為基線所觀察水準3倍之最大水準。
綜上所述，該等結果顯示，本發明之抗MS4A4A抗體在非人類靈長類動物中有效地增加血清中之sTREM2水準。實例 43 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加 CSF 骨橋蛋白水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對腦脊髓液(CSF)中之骨橋蛋白水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射向食蟹猴投與80 mg/ml劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-313.WT、4A-450.NSLF，250 mg/ml劑量之4A-313.NSLF，或媒劑對照。每一組投與總計四劑；第一劑與第二劑相隔7天間隔，第二劑與第三劑相隔14天間隔，且第三劑與第四劑相隔28天間隔。
在投藥前、投與抗體後0.5、2、6、10、24、34、48、72、96、168、168.5、170、174、178、192、216、240、264、336、408、504、504.5、506、510、514、528、552、576、600、672、744、840、912、1008、1176、1186、1200及1224小時自動物收集CSF樣品。
如下量測CSF中之骨橋蛋白水準。利用於PBS中之捕獲抗體將單斑點Meso Scale Discovery (MSD)板(Rockville, MD)在4℃下包被隔夜。將猴CSF樣品稀釋於結合緩衝液中且在室溫下添加至孔中1小時。將生物素化之山羊抗人類骨橋蛋白多株抗體(R&D Systems)以1:2,000稀釋度添加於結合緩衝液中且在室溫下培育1小時，之後利用磺基標籤鏈黴抗生物素蛋白(MSD)進行偵測。將150 μl 1×讀取緩衝液添加至板，且接著在Sector成像儀(MSD)上對板進行分析。
在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴CSF中之骨橋蛋白水準增加。在投與80 mg/kg及250 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後，CSF骨橋蛋白水準在第一劑量後24小時達到峰值，分別為基線所觀察水準之平均大約13倍及6倍，之後下降至基線水準之1.5倍(圖 31A 及 31B )。在重複投用80 mg/kg之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF之情形下，CSF骨橋蛋白水準在每一劑量後10至24小時達到峰值，所達到之峰值水準為在基線水準所觀察結果之3倍至5倍(圖 31A )。在重複投用250 mg/kg之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF之情形下，CSF骨橋蛋白水準增加，且在第二劑量後168小時達到為基線所觀察水準14倍之峰值水準(圖 31B )且在後續劑量後24至48小時達到為基線所觀察水準4倍至5倍之峰值水準(圖 31B )。
在以80 mg/kg投與抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF後，CSF骨橋蛋白水準在第一劑量後24小時達到為基線所觀察水準大約13倍之峰值，之後下降至基線水準(圖 31C 及 31D )。在重複投用80 mg/kg 4A-450.NSLF之情形下，CSF骨橋蛋白水準在每一劑量後24小時達到峰值，所達到之峰值水準為在基線水準所觀察結果之6倍至9倍(圖 31C )。
在重複投與80 mg/kg之抗MS4A4A抗體4A-313.WT後，CSF骨橋蛋白水準在每一劑量後24小時達到為基線所觀察水準大約1.5倍之峰值，之後下降至基線水準(圖 31D )。
綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在非人類靈長類動物中有效地增加CSF中之骨橋蛋白水準。實例 44 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加各個腦區中之骨橋蛋白水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對額葉皮質及海馬體中之骨橋蛋白水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射向食蟹猴投與80 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-313.WT及4A-450.NSLF，及250 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF，或媒劑對照。每一組投與總計四劑；第一劑與第二劑相隔7天間隔，第二劑與第三劑相隔14天間隔，且第三劑與第四劑相隔28天間隔。在第四劑後48小時使動物安樂死，且將額葉皮質及海馬體移除並冷凍。
如下量測腦組織中之骨橋蛋白水準。根據製造商說明書，將冷凍腦樣品用N-Per神經元蛋白質提取試劑(目錄號87792，Thermo Scientific)及Halt蛋白酶抑制劑(目錄號1861278)在冰上溶解20分鐘。將樣品離心且將上清液轉移至新管並在-80℃下儲存直至進一步分析。根據製造商說明書，藉由BCA蛋白質分析套組(目錄號23225，Thermo Scientific)量測每一樣品中之總蛋白質濃度。使用蛋白質濃度值對腦組織中所量測之分析物濃度進行正規化。
在投與抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF後，食蟹猴腦組織中之骨橋蛋白水準增加。當與對照動物中所觀察到之結果相比時，重複投與80 mg/kg之抗體4A-450.NSLF使得食蟹猴額葉皮質中之骨橋蛋白水準顯著增加(p = 0.027，t測試) (圖 32A )。類似地，當與在對照治療動物中所觀察到之結果相比時，重複投與80 mg/kg之抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF使得食蟹猴海馬體中之骨橋蛋白水準顯著增加(p = 0.027，t測試) (圖 32B )。
綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在非人類靈長類動物中有效地增加腦組織(例如額葉皮質及海馬體)中之骨橋蛋白水準。實例 45 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加各個腦區中之 CSF1R 水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對額葉皮質及海馬體中之群落刺激因子1受體(CSF1R)水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內輸注向食蟹猴投與80 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-313.WT及4A-450.NSLF，250 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF，或媒劑對照。每一組投與總計四劑；第一劑與第二劑相隔7天間隔，第二劑與第三劑相隔14天間隔，且第三劑與第四劑相隔28天間隔。在第四劑後48小時使動物安樂死，且將額葉皮質及海馬體移除並冷凍。
如下量測腦組織中之CSF1R水準。根據製造商說明書，將冷凍腦樣品用N-Per神經元蛋白質提取試劑(目錄號87792，Thermo Scientific)及Halt蛋白酶抑制劑(目錄號1861278)在冰上溶解20分鐘。將樣品離心且將上清液轉移至新管並在-80℃下儲存直至進一步分析。根據製造商說明書，藉由BCA蛋白質分析套組(目錄號23225，Thermo Scientific)量測每一樣品中之總蛋白質濃度。使用蛋白質濃度值對腦組織中所量測之分析物濃度進行正規化。
在投與抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF後，食蟹猴腦組織中之CSF1R水準增加。當與在對照治療動物中所觀察到之結果相比時，重複投與250 mg/kg之抗體4A-313.NSLF使得食蟹猴額葉皮質中之CSF1R水準顯著增加(p = 0.046，t測試) (圖 33A )。類似地，當與在對照動物中所觀察到之結果相比時，重複投與80 mg/kg之抗MS4A4A抗體4A-450.NSLF使得食蟹猴海馬體中之CSF1R水準顯著增加(p = 0.013，t測試) (圖 33B )。
綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在非人類靈長類動物中有效地增加腦組織(例如額葉皮質及海馬體)中之CSF1R水準。實例 46 ：抗 MS4A4A 抗體在活體內增加各個腦區中之總 TREM2 水準
為檢查本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內對額葉皮質及海馬體中之可溶性TREM2及膜TREM2 (總TREM2)水準之效應，實施以下研究。
藉由靜脈內濃注注射向食蟹猴投與80 mg/kg劑量之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-313.WT、4A-450.NSLF，250 mg/kg劑量之4A-313.NSLF，或媒劑對照。每一組投與總計四劑；第一劑與第二劑相隔7天間隔，第二劑與第三劑相隔14天間隔，且第三劑與第四劑相隔28天間隔。在第四劑後48小時使動物安樂死，且將額葉皮質及海馬體移除並冷凍。量測該等腦區中之總TREM2水準。
在用抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF、4A-313.WT及4A-450.NSLF治療後，食蟹猴腦組織中之總TREM2水準增加。與在對照治療動物中所觀察到之結果相比，重複投與250 mg/kg之抗體4A-313.NSLF使得食蟹猴海馬體中之總TREM2水準在統計學上顯著增加(p=0.014，單因子ANOVA) (圖 34A )。當與在對照治療動物中所觀察到之結果相比時，重複投與250 mg/kg之抗體4A-313.NSLF及80 mg/kg之抗體4A-313.WT使得食蟹猴額葉皮質中之TREM2水準有增加趨勢(圖 34B )。
綜上所述，該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體在非人類靈長類動物中有效地增加腦組織(例如額葉皮質及海馬體)中之TREM2水準。實例 47 ：抗 MS4A4A 抗體對活體內小神經膠質細胞中之基因表現譜之效應
如上文所闡述在向食蟹猴投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，如下實施藉由小神經膠質細胞RNAseq分析量測基因表現變化。抗MS4A4A抗體包括抗體4A-313.WT (80 mg/kg)、4A-313.NSLF (80 mg/kg及250 mg/kg)及4A-450.NSLF (80 mg/kg)。在將動物最終殺死(take down)後，使用溫和手動解離方案解離出額葉皮質樣品，之後進行Percoll梯度分離以去除碎片。將細胞沈澱用Cd11b抗體染色20分鐘，洗滌，用DAPI標記且予以處理以進行小神經膠質細胞之FACS分離。將DAPI- :CD11b+ 細胞直接分選至350 ul或RLT plus緩衝液(Qiagen)中且立即處理細胞以進行RNA分離。使用tape station測定RNA品質且使用稍作修改之Lexogen QuantSeq之低輸入方案產生文庫。使用tape station對文庫進行定量且使用Next Seq測序。使用Lexogen多重糾錯工具對測序資料進行解複用並進行分析。
如圖 35A 、 35B 及 35C 中所示，在食蟹猴中外周注射本揭示案之抗MS4A4A抗體導致小神經膠質細胞中之基因表現變化，如藉由在自該等非人類靈長類動物之額葉皮質分離的FACS分選之小神經膠質細胞中之RNAseq分析所量測。在小神經膠質細胞中顯示出藉由抗MS4A4A抗體處理強烈誘導之基因係小神經膠質細胞活化(C型凝集素結構域家族7成員A，CLEC7A)、小神經膠質細胞遷移(肌醇1,4,5-三磷酸受體2，ITPR2)及小神經膠質細胞增殖(抗原KI-67 (MKI67))之標記物(圖 35A )。如圖 35B 中所示，亦觀察到小神經膠質細胞活化之其他標記物之變化，且包括小神經膠質細胞活化標記物IL1RN、SPP1及1-磷脂醯肌醇-4,5-二磷酸磷酸二酯酶γ-2 (PLCG2)。圖 35C . 本揭示案之抗MS4A4A抗體對兩種穩態小神經膠質細胞標記物(嘌呤能受體P2RY12及CX3C趨化介素受體1 (CX3CR1))之效應示於圖 35C 中，其中該兩種穩態小神經膠質細胞標記物之表現水準在抗MS4A4A抗體處理後降低。圖 35A 、 35B 及 35C 中之數據呈現為log2標度上之平均值，誤差槓為SEM，且每個實驗組及每個時間點N=5。
綜上所述，該等結果顯示，如藉由與小神經膠質細胞活化、遷移及增殖相關的蛋白質之各種mRNA水準之增加及與小神經膠質細胞穩態相關的蛋白質之各種mRNA水準之降低所證明，本揭示案之抗MS4A4A抗體在活體內有效地使小神經膠質細胞活化。實例 48 ：抗 MS4A4A 抗體減少帶 HA-Snorkel 標籤之 MS4A4A 在 U937 細胞上之表面表現
利用編碼帶有snorkel標籤之人類MS4A4A之表現質體轉染U937細胞(ATCC CRL-1593.2) (將後接HA標籤之跨膜結構域連接至人類MS4A4A之細胞質C末端)。以此方式，標籤展示在細胞外，但在結構上與膜蛋白質分離。經轉染之U937細胞在質體轉染及抗生素選擇後具有活力。接著使用流式細胞術針對人類MS4A4A蛋白細胞表面表現對細胞進行篩選，且僅收集5%之陽性最強細胞用於以下研究中。
使用如上文所闡述產生之過表現重組人類MS4A4A-snorkel之U937細胞作為該等研究中之靶細胞。將細胞用PMA (25 ng/ml)預處理24小時，接著收穫並以100,000個細胞/孔接種於圓底96孔板中之RPMI 1640完全培養基中，其中PMA及抗MS4A4A抗體及同型對照抗體之最終濃度為0.01 ug/ml、0.1 ug/ml及1 ug/ml。將細胞培育48小時。用冷的FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌細胞且每孔添加50 µL 1:200稀釋之抗HA標籤單株抗體(ThermoFisher, A-21287)並在冰上培育30分鐘，亦用Aqua Live/Dead標記細胞以用於活力辨別。用冷的FACS緩衝液將細胞洗滌2次且重新懸浮於200 µL FACS緩衝液中。在FACSCanto系統(BD Biosciences)上實施流式細胞術分析。使用中值螢光強度分析結合數據。
如圖 36 中所示，抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及4A-450.NSLF以劑量相關方式降低表現帶人類MS4A4A-snorkel標籤之蛋白質之U937細胞中的質膜MS4A4A之水準。在1 µg/ml之最高抗MS4A4A抗體濃度下，與在經同型對照抗體處理之細胞中所觀察到之表面MS4A4A水準相比，抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF及4A-450.NSLF使表面MS4A4A水準降低大約50%。該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體降低或下調表現重組人類MS4A4A-snorkel之U937細胞中之細胞表面MS4A4A水準。實例 49 ：抗 MS4A4A 抗體調節原代人類骨髓樣細胞中之糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白質 B (GPNMB) 蛋白質水準
GPNMB係在多種細胞類型(包括組織巨噬細胞及小神經膠質細胞)中表現之表面糖蛋白。若干種遺傳變異體與帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)風險相關。PD患者黑質中之GPNMB蛋白質水準升高，且在溶酶體應激後GPNMB水準增加(Moloney等人，2018, Neurobio Dis. 120: 1-11)。另外，GPNMB之表現增加與SNP rs199347相關，此風險SNP位於GPNMB基因內(Murthy等人，2017, 18:121-133)。為確定MS4A4A是否可調節GPNMB之表現水準，將來自兩名供體(供體1117號及1118號)之人類原代巨噬細胞用各種濃度之抗MS4A4A抗體4A-313.NSLF處理48小時。在將細胞用結合有螢光團之抗GPNMB抗體染色後，藉由流式細胞術量測細胞表面(膜結合) GPNMB。
如圖 37 中所示，在向人類原代巨噬細胞添加抗MS4A4A抗體4A.313.NSLF後，該等細胞中之膜GPNMB水準降低。因應於抗MS4A4A抗體處理之GPNMB水準之降低呈劑量依賴性方式。該等結果顯示，本揭示案之抗MS4A4A抗體有效地降低骨髓樣細胞(例如巨噬細胞)中GPNMB之細胞表面表現水準。
具有野生型 huIgG1 或野生型 huIgG1 之 Fc 變異體之例示性抗 MS4A4A 抗體重鏈胺基酸序列： 4A-450 (huIgG1 重鏈 ) (SEQ ID NO:320) QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYAFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTMADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK4A-450 ( 無 C 末端 K 之 huIgG1 重鏈 ) (SEQ ID NO:321) 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ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG4A-313 (huIgG1 重鏈恆定區 N325S/L328F) (SEQ ID NO:340) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK4A-313 ( 無 C 末端 K 之 hIgG1 重鏈恆定區 N325S/L328F) (SEQ ID NO:341) 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huIgG1 重鏈 ) (SEQ ID NO:356) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL WGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG4A-313 (hIgG1 重鏈 P331S) (SEQ ID NO:357) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL WGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK4A-313 ( 無 C 末端 K 之 hIgG1 重鏈 P331S) (SEQ ID NO:358) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL WGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG4A-313 (huIgG1 重鏈 N325S/L328F) (SEQ ID NO:359) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL WGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK4A-313 ( 無 C 末端 K 之 hIgG1 重鏈 N325S/L328F) (SEQ ID NO:360) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL WGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSSKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG4A-313 (huIgG1 重鏈 K322A) (SEQ ID NO:361) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMQ WVRQAPGQGLEWMGATHPGHGDTRYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEVYYGFRSYWYFDL 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本專利或申請案檔案含有至少一個有色繪製之圖式。在要求並支付必要費用之後，專利事務局將提供本專利或專利申請公開案帶彩圖之複本。
圖 1 顯示人類MS4A4A之一級胺基酸序列。細胞內結構域為斜體，跨膜結構域加下劃線，細胞外環為粗體斜體。圖 2A 顯示自RCSB蛋白質資料庫獲得之可溶性四螺旋束支架(PDB_ID:1P68)之結構示意圖，該支架具有在結構中顯示為螺旋帶之四個跨膜結構域。圖 2B 及圖 2C 分別顯示可溶性四螺旋束支架PDB-ID:1P68及PDB_ID:1M6T之一級胺基酸序列；該四個跨膜結構域在胺基酸序列中加下劃線。圖 3A 顯示可溶性四螺旋束支架JS1、JS5及JS6之一級胺基酸序列，其中添加有人類MS4A4A之兩個細胞外環(顯示為粗體加下劃線)。圖 3B 顯示用作陰性對照變異體之可溶性四螺旋束支架JS4及JS10之一級胺基酸序列。圖 4 顯示藉由ELISA之本揭示案之某些抗MS4A4A抗體與重組MS4A4A可溶性打環接枝多肽JS1、JS4、JS5、JS6及JS10之結合。圖 5 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-21之某些人類化抗MS4A4A抗體變異體與重組MS4A4A可溶性打環接枝多肽JS1之結合。圖 6 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-202之某些人類化抗MS4A4A抗體變異體與重組MS4A4A可溶性打環接枝多肽JS1之結合。圖 7 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-202之某些人類化且親和力成熟之抗MS4A4A抗體變異體與重組MS4A4A可溶性打環接枝多肽JS5之結合。圖 8 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-21之某些人類化且親和力成熟之抗MS4A4A抗體變異體與重組MS4A4A可溶性打環接枝多肽JS5之結合。圖 9 顯示鼠類抗MS4A4A抗體4A-21之某些人類化且親和力成熟之抗MS4A4A抗體變異體與重組MS4A4A可溶性打環接枝多肽JS5之結合。圖 10A 至圖 10B 顯示抗MS4A4A抗體4A-202對食蟹猴血清中之sTREM2水準之效應。圖 10A 提供在均以80 mg/kg之劑量投與抗MS4A4A抗體4A-202或同型對照抗體(huIgG1)後，在指示時間(小時)食蟹猴血清中sTREM2之水準(ng/mL)。圖 10B 提供在均以80 mg/kg之劑量投與抗MS4A4A抗體4A-202或同型對照抗體(huIgG1)後，在指示時間(小時)食蟹猴血清中sTREM2之水準(基線百分比)。圖 11A 至圖 11B 顯示抗MS4A4A抗體4A-202對食蟹猴腦脊髓液(CSF)中之sTREM2水準之效應。圖 11A 提供在均以80 mg/kg之劑量投與抗MS4A4A抗體4A-202或同型對照抗體(huIgG1)後，在指示時間(小時)食蟹猴CSF中sTREM2之水準(ng/mL)。圖 11B 提供在均以80 mg/kg之劑量投與抗MS4A4A抗體4A-202或同型對照抗體(huIgG1)後，在指示時間(小時)食蟹猴CSF中sTREM2之水準(基線百分比)。圖 12 列出顯示抗MS4A4A抗體4A-313野生型(WT) huIgG1及4A-450 WT huIgG1與表現重組人類MS4A4A之U937細胞的結合曲線之資料。圖 13 列出顯示經抗MS4A4A抗體4A-450 WT huIgG1、4A-450 NSLF huIgG1及4A-450 K322A huIgG1處理之原代人類巨噬細胞中的膜TREM2水準之資料。圖 14 列出顯示經抗MS4A4A抗體4A-313 WT huIgG1、4A-313 NSLF huIgG1及4A-313 K322A huIgG1處理之原代人類巨噬細胞中的膜TREM2水準之資料。圖 15 列出顯示在經抗MS4A4A抗體4A-450 huIgG1處理之原代人類巨噬細胞之上清液中可溶性TREM2水準增加之資料。圖 16 列出顯示在經抗MS4A4A抗體4A-313 huIgG1處理之原代人類巨噬細胞之上清液中可溶性TREM2水準增加之資料。圖 17 列出顯示在經抗MS4A4A抗體4S-313 NSLF huIgG1、4A-313 PS huIgG1、4A-450.NSLF huIgG1及4A-450.PS hu IgG1處理之原代人類巨噬細胞中ATP水準增加之資料。圖 18A 、圖 18B 及圖 18C 列出顯示在經抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1及4A-419 WT huIgG1處理之原代人類巨噬細胞中CD14、CD163及CD200R (分別)之水準變化之資料。圖 19 列出顯示如藉由碘化丙啶攝取所量測，抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 K322A huIgG1及4A-313 WT huIgG1在表現重組人類MS4A4A之U937細胞中的補體依賴性細胞毒性(CDC)活性之資料。圖 20 列出顯示如藉由FcyRIIIa活化所量測，抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 K322A huIgG1及4A-313 WT huIgG1在原代人類巨噬細胞中的ADCP活性之資料。圖 21 列出顯示如藉由FcyRIIIa活化所量測，抗MS4A4A抗體4A-313 NSLF huIgG1、4A-313 K322A huIgG1及4A-313 WT huIgG1在原代人類巨噬細胞中的ADCC活性之資料。圖 22A 及圖 22B 列出顯示MS4A4A剔除對原代人類巨噬細胞中之膜TREM2 (圖 22A )及可溶性TREM2 (圖 22B )之效應之資料。圖 23A 、圖 23B 及圖 23C 列出分別顯示在經本揭示案之抗MS4A4A抗體處理之人類巨噬細胞中，可溶性TREM2蛋白水準、膜TREM2蛋白水準及TREM2 mRNA水準變化之動力學之資料。圖 24A 及圖 24B 列出顯示MS4A4A之siRNA減弱增加人類巨噬細胞中之膜TREM2及可溶性TREM2水準之資料。圖 25A 、圖 25B 及圖 25C 列出顯示在添加本揭示案之抗MS4A4A抗體後，來自三名不同供體之原代人類巨噬細胞中膜TREM2水準之劑量依賴性增加之資料。圖 26A 、圖 26B 及圖 26C 列出顯示在添加本揭示案之抗MS4A4A抗體後，來自三名不同供體之原代人類巨噬細胞中可溶性TREM2水準之劑量依賴性增加之資料。圖 27A 、圖 27B 及圖 27C 列出顯示在添加本揭示案之抗MS4A4A抗體後，來自三名不同供體之原代人類巨噬細胞中ATP水準之劑量依賴性增加之資料。圖 28A 及圖 28B 列出顯示本揭示案之抗MS4A4A抗體有效拯救CSF1R抑制誘導之細胞死亡之資料。圖 29 顯示在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴CSF中之全蛋白質體效應之火山圖。圖 30 列出顯示在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴血清中sTREM2水準增加之資料。圖 31A 、圖 31B 、圖 31C 及圖 31D 列出顯示在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴CSF中骨橋蛋白水準增加之資料。圖 32A 及圖 32B 列出顯示在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴腦中之額葉皮質及海馬體中骨橋蛋白水準分別增加之資料。圖 33A 及圖 33B 列出顯示在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴腦中之額葉皮質及海馬體中CSF1R水準分別增加之資料。圖 34A 及圖 34B 列出顯示在投與本揭示案之抗MS4A4A抗體後，食蟹猴腦中之額葉皮質及海馬體中總TREM2蛋白水準分別增加之資料。圖 35A 、圖 35B 及圖 35C 列出顯示在自投與本揭示案之抗MS4A4A抗體的食蟹猴腦分離之小神經膠質細胞中，小神經膠質細胞活化、遷移及增殖之標記物中mRNA水準之變化之資料。圖 36 列出顯示本揭示案之抗MS4A4A抗體減少在U937細胞中重組表現的帶HA-Snorkel標籤之MS4A4A蛋白之細胞表面表現之資料。圖 37 列出顯示本揭示案之抗MS4A4A抗體降低原代人類巨噬細胞中之GPNMB細胞表面表現之資料。
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Claims (85)

  1. 一種結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:94、108、116、146、147、308及311組成之群之胺基酸序列；HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:96、97、98、99、110、111、118、119、120、121、122、149、150、151、152、153、309及312組成之群之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:102、100、101、102、112、123、124、125、126、127、128、129、154、310及313組成之群之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:104、103、113、130、131、132、133、134、135、136、137、138、156、157、158、314及317組成之群之胺基酸序列；HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:105、106、114、139、140、141、142、143、159、160、161、315及318組成之群之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:107、115、144、145、163、316及319組成之群之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:96-99組成之群之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:102、100及101組成之群之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:104及103組成之群之胺基酸序列；HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:105-106組成之群之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:108之胺基酸序列；HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:110-111組成之群之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:112之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO:113之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO:114之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:115之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:118-122組成之群之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含選自由SEQ ID NO:123-129組成之群之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:130-138組成之群之胺基酸序列；HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:139-143組成之群之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含選自由SEQ ID NO:144-145組成之群之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO:146-147組成之群之胺基酸序列；HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO:149-153組成之群之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:154之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO:156-158組成之群之胺基酸序列；HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO:159-161組成之群之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:163之胺基酸序列。
  6. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:308之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO:309之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:310之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO:314之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO:315之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:316之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HVR-H1，其包含SEQ ID NO:311之胺基酸序列；HVR-H2，其包含SEQ ID NO:312之胺基酸序列；及HVR-H3，其包含SEQ ID NO:313之胺基酸序列；且該輕鏈可變區包含：HVR-L1，其包含SEQ ID NO:317之胺基酸序列；HVR-L2，其包含SEQ ID NO:318之胺基酸序列；及HVR-L3，其包含SEQ ID NO:319之胺基酸序列。
  9. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含抗體4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419或4A-450之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。
  10. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含抗體4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419或4A-450之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  11. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含有包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包含抗體4A-301、4A-302、4A-303、4A-304、4A-305、4A-306、4A-307、4A-308、4A-309、4A-310、4A-311、4A-312、4A-313、4A-314、4A-419或4A-450之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  12. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含抗體4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330或4A-331之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。
  13. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含抗體4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330或4A-331之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  14. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含有包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包含抗體4A-315、4A-316、4A-317、4A-318、4A-319、4A-320、4A-321、4A-322、4A-323、4A-324、4A-325、4A-326、4A-327、4A-328、4A-329、4A-330或4A-331之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  15. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含抗體4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-362、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380或4A-381之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。
  16. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含抗體4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-362、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380或4A-381之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  17. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含有包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包含抗體4A-332、4A-333、4A-334、4A-335、4A-336、4A-337、4A-338、4A-339、4A-340、4A-341、4A-342、4A-343、4A-344、4A-345、4A-346、4A-347、4A-348、4A-349、4A-350、4A-351、4A-352、4A-353、4A-354、4A-355、4A-356、4A-357、4A-358、4A-359、4A-360、4A-361、4A-362、4A-363、4A-364、4A-365、4A-366、4A-367、4A-368、4A-369、4A-370、4A-371、4A-372、4A-373、4A-374、4A-375、4A-376、4A-377、4A-378、4A-379、4A-380或4A-381之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  18. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含抗體4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。
  19. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含抗體4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  20. 一種結合至MS4A4A蛋白之抗體，其中該抗體包含有包含HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3之重鏈可變區及包含HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3之輕鏈可變區，其中該抗體包含抗體4A-382、4A-383、4A-384、4A-385、4A-386、4A-387、4A-388、4A-389或4A-390之HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3。
  21. 如請求項1或9之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 5-15、304及306組成之群之胺基酸序列。
  22. 如請求項1或12之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 24-30組成之群之胺基酸序列。
  23. 如請求項1或15之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 40-53組成之群之胺基酸序列。
  24. 如請求項1或18之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO:76-84組成之群之胺基酸序列。
  25. 如請求項1或10之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 17-22、305及307組成之群之胺基酸序列。
  26. 如請求項1或13之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 32-36組成之群之胺基酸序列。
  27. 如請求項1或16之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 55-74組成之群之胺基酸序列。
  28. 如請求項1或19之抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 86-93組成之群之胺基酸序列。
  29. 如請求項1或11之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 5-15、304及306組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 17-22、305及307組成之群之胺基酸序列。
  30. 如請求項1或14之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 24-30組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 32-36組成之群之胺基酸序列。
  31. 如請求項1或17之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 40-53組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 55-74組成之群之胺基酸序列。
  32. 如請求項1或20之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 76-84組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO: 86-93組成之群之胺基酸序列。
  33. 2、4、6至11、21、25及29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO:320-343組成之群之胺基酸序列。
  34. 2、6、9至11、21、25、29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 336-343組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈包含有包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之輕鏈可變區，視情況其中該輕鏈進一步包含有包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列之恆定區。
  35. 7、9至11、21、25及29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 320-327組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈包含有包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列之輕鏈可變區，視情況其中該輕鏈進一步包含有包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列之恆定區。
  36. 8至11、21、25及29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 328-335組成之群之胺基酸序列，且該輕鏈包含有包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列之輕鏈可變區，視情況其中該輕鏈進一步包含有包含SEQ ID NO: 344之胺基酸序列之恆定區。
  37. 2、6、9至11、21、25及29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 355-362組成之群之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO:365之胺基酸序列。
  38. 7、9至11、21、25及29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 320-327組成之群之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO:363之胺基酸序列。
  39. 8至11、21、25及29中任一項之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含選自由SEQ ID NO: 328-335組成之群之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO:364之胺基酸序列。
  40. 如請求項2之抗體，其中該抗體包含： a. 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列之HVR-H3；且該輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO:105之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO:107之胺基酸序列之HVR-L3； b. 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列；或 c. 重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 359或360之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:365之胺基酸序列。
  41. 如請求項7之抗體，其中該抗體包含： a. 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:304之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:305之胺基酸序列；或 b. 重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 324或325之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:363之胺基酸序列。
  42. 如請求項8之抗體，其中該抗體包含： a. 重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:306之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:307之胺基酸序列；或 b. 重鏈及輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO: 332或333之胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO:364之胺基酸序列。
  43. 一種結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體競爭性地抑制如請求項1至42中任一項之抗體中之一或多者針對結合至MS4A4A之結合。
  44. 一種結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體與如請求項1至42中任一項之抗體結合MS4A4A上之基本上相同或重疊之抗原決定基。
  45. 如請求項44之抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:178)內之一或多個胺基酸殘基，其中該抗體不結合SEQ ID NO:1之胺基酸殘基脯胺酸163。
  46. 如請求項1至42中任一項之抗體，其中該抗體結合至人類MS4A4A之細胞外結構域1。
  47. 如請求項1至42中任一項之抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列CMASNTYGSNPIS (SEQ ID NO:177)內之一或多個胺基酸殘基。
  48. 如請求項1至42中任一項之抗體，其中該抗體結合至人類MS4A4A之細胞外結構域2。
  49. 如請求項1至42中任一項之抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之胺基酸序列SFHHPYCNYYGNSNNCHGTMS (SEQ ID NO:178)內之一或多個胺基酸殘基。
  50. 如請求項1至49中任一項之抗體，其中該抗體係人類或人類化的。
  51. 如請求項1至50中任一項之抗體，其中該抗體降低MS4A4A之細胞表面水準或降低MS4A4A之細胞內水準。
  52. 如請求項1至51中任一項之抗體，其中該抗體增加骨髓樣細胞中之可溶性TREM2水準、增加膜TREM2水準或增加可溶性TREM2且增加膜TREM2水準。
  53. 如請求項1至52中任一項之抗體，其中該抗體降低骨髓樣細胞上M2細胞表面標記物之表現。
  54. 如請求項53之抗體，其中該抗體降低骨髓樣細胞上CD200R、Dectin-1或CD163之表現。
  55. 如請求項1至50中任一項之抗體，其中該抗體增加骨髓樣細胞上凝溶膠蛋白及/或骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質表現。
  56. 一種結合至MS4A4A蛋白之經分離抗體，其中該抗體增加骨髓樣細胞上凝溶膠蛋白及/或骨橋蛋白之mRNA及/或蛋白質表現。
  57. 如請求項56之抗體，其中該等骨髓樣細胞係人類巨噬細胞。
  58. 如請求項56或57之抗體，其中該抗體係人類或人類化的。
  59. 如請求項56至58中任一項之抗體，其中該抗體與選自由4A-18、4A-25、4A-214、4A-21及4A-202組成之群之抗體結合至相同的抗原決定基。
  60. 如請求項56至59中任一項之抗體，其中該抗體降低骨髓樣細胞上M2標記物之表現。
  61. 如請求項60之抗體，其中該等骨髓樣細胞係人類巨噬細胞。
  62. 如請求項61之抗體，其中該等M2標記物係CD200R、Dectin-1及/或CD163。
  63. 如請求項56至62中任一項之抗體，其中該抗體使人類巨噬細胞上之膜TREM2增加至少50%、90%、100%、150%、200%或250%。
  64. 如請求項56至63中任一項之抗體，其中該抗體使人類巨噬細胞上清液中之可溶性TREM2增加至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%或70%。
  65. 如請求項1至64中任一項之抗體，其中該抗體係單株抗體。
  66. 如請求項1至65中任一項之抗體，其中該抗體結合至SEQ ID NO:1之人類MS4A4A。
  67. 如請求項66之抗體，其中該抗體進一步結合至SEQ ID NO:3之食蟹猴MS4A4A。
  68. 如請求項1至67中任一項之抗體，其中該抗體為IgG類且具有IgG1、IgG2或IgG4同型。
  69. 如請求項68之抗體，其中該抗體具有IgG1同型。
  70. 如請求項69之抗體，其中該抗體包含經修飾之Fc，該經修飾之Fc包含根據EU編號之N325S及L328F突變。
  71. 如請求項1至70中任一項之抗體，其中該抗體係抗體片段。
  72. 如請求項71之抗體，其中該抗體片段係Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv或scFv片段。
  73. 如請求項1至72中任一項之抗體，其中該抗體係識別第一抗原及第二抗原之雙特異性抗體。
  74. 如請求項73之抗體，其中該第一抗原係MS4A4A且該第二抗原係： (a) 促進跨血腦障壁轉運之抗原； (b) 選自由以下組成之群之促進跨血腦障壁轉運之抗原：運鐵蛋白受體(TR)；胰島素受體(HIR)；胰島素樣生長因子受體(IGFR)；低密度脂蛋白受體相關蛋白質1及2 (LPR-1及LPR-2)；白喉毒素受體CRM197；駱馬單一結構域抗體TMEM 30(A)；蛋白質轉導結構域TAT、Syn-B、穿膜肽；多精胺酸肽；血管肽及ANG1005； (c) 選自由致病性肽或蛋白質或致病性核酸組成之群之致病劑，其中該等致病性核酸係反義GGCCCC (G2C4)重複序列擴增RNA，該等致病性蛋白質係選自由以下組成之群：澱粉樣β、寡聚澱粉樣β、澱粉樣β斑塊、澱粉樣前體蛋白質或其片段、Tau、IAPP、α-突觸核蛋白、TDP-43、FUS蛋白、C9orf72 (染色體9開放閱讀框72)、c9RAN蛋白、普里昂蛋白(prion protein)、PrPSc、亨庭頓蛋白(huntingtin)、降血鈣素、超氧化物歧化酶、共濟失調蛋白、共濟失調蛋白1、共濟失調蛋白2、共濟失調蛋白3、共濟失調蛋白7、共濟失調蛋白8、共濟失調蛋白10、路易氏體(Lewy body)、心房利鈉因子、胰島澱粉樣多肽、胰島素、載脂蛋白AI、血清澱粉樣A、medin、泌乳素、轉甲狀腺素、溶菌酶、β 2微球蛋白、凝溶膠蛋白、角膜上皮蛋白、胱抑素、免疫球蛋白輕鏈AL、S-IBM蛋白、重複序列相關之非ATG (RAN)轉譯產物、二肽重複序列(DPR)肽、甘胺酸-丙胺酸(GA)重複序列肽、甘胺酸-脯胺酸(GP)重複序列肽、甘胺酸-精胺酸(GR)重複序列肽、脯胺酸-丙胺酸(PA)重複序列肽、泛素及脯胺酸-精胺酸(PR)重複序列肽； (d) 在免疫細胞上表現之配位體及/或蛋白質，其中該等配位體及/或蛋白質係選自由以下組成之群：CD40、OX40、ICOS、CD28、CD137/4-1BB、CD27、GITR、PD-L1、CTLA-4、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、GAL9、TIM3、A2AR、LAG-3及磷酯醯絲胺酸；或 (e) 在一或多種腫瘤細胞上表現之蛋白質、脂質、多糖或糖酯。
  75. 一種經分離核酸，其包含編碼如前述請求項中任一項之抗體之核酸序列。
  76. 一種載體，其包含如請求項75之核酸。
  77. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項75之核酸或如請求項76之載體。
  78. 一種產生結合至人類MS4A4A之抗體之方法，其包括培養如請求項77之細胞以使得產生該抗體。
  79. 如請求項78之方法，其進一步包括回收由該細胞所產生之該抗體。
  80. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至74中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  81. 降低風險或治療患有選自由阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)、遲發型阿茲海默氏病及認知損害組成之群的疾病、病症或損傷之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至74中任一項之抗體。
  82. 降低風險或治療患有由MS4A4A之過表現或活性增加引起或與其相關之疾病、病症、疾患或損傷之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至74中任一項之抗體。
  83. 降低風險或治療患有CSF1R缺乏疾病或病症之個體之方法，該方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至74中任一項之抗體。
  84. 如請求項83之方法，其中該CSF1R缺乏疾病或病症係成人發作型腦白質病變伴軸突球樣變及膠質著色(ALSP)或遺傳性瀰漫性腦白質病變(HDLS)。
  85. 如請求項81至84中任一項之方法，其進一步包括在投與該抗體之前及/或之後偵測骨橋蛋白、凝溶膠蛋白、膜TREM2及/或可溶性TREM2之水準。
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