JP7449390B2 - 抗ｅ－セレクチン抗体、組成物および使用の方法 - Google Patents

抗ｅ－セレクチン抗体、組成物および使用の方法 Download PDF

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Description

ATCC PTA-126529 ATCC PTA-126530
関連出願との相互参照
本出願は、そのそれぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０２０年１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／９６５，６８８号、２０２０年１０月２２日出願の米国仮特許出願第６３／１０４，２１３号、および２０２０年１２月４日出願の米国仮特許出願第６３／１２１，４６７号の優先権を主張するものである。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０２１年１月６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＣ０７２４９８Ａ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、サイズは１，０４８，５７６バイトである。
発明の分野
本発明は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性断片、ならびにＳＣＤに関連する血管閉塞クリーゼ（ＶＯＣ）の処置および予防を含めた鎌状赤血球症（ＳＣＤ）を処置するための本開示の抗体の使用を含む、組成物、方法およびその使用に関する。
背景
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、米国（ＵＳ）だけで１００，０００人を超える人に影響を与えている、重症の稀な遺伝障害である（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）。ＳＣＤは、集団における実質的な罹患率および死亡率を伴う慢性の状態であり、大きなまだ対処されていない医学的必要性を有する。ＳＣＤを有する個体は、進行性の臓器損傷を受け、平均余命が著しく短縮し、生存期間中央値はおよそ５６年である（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ２０１６；１２８（１０）１４３６～３８）。
ＳＣＤは、異常な形態のヘモグロビン（Ｈｂ）－鎌状ヘモグロビン（ＨｂＳ）の存在を特徴とする。β－グロビン遺伝子（ＨＢＢ）の一塩基置換の結果、残基６における１つのアミノ酸置換（グルタミン酸の代わりにバリン）がもたらされる（ＨＢＳ対立遺伝子）。ＨＢＳについてホモ接合性の個体は、最も一般的かつ最も重症の形態の鎌状赤血球症（ＳＣＤ－ＳＳ）を有する。ＳＣＤのバリアント形態は、個体が１コピーのＨＢＳおよび１コピーの別のＨＢＢ遺伝子の変異を有する場合に生じる。１コピーのＨＢＳ対立遺伝子および１コピーのヘモグロビンＣ対立遺伝子（ＨＢＣ）を有する個体は、ＳＣ症（ＳＣＤ－ＳＣ）を有する。個体が１コピーのＨＢＳおよび１コピーのβ－サラセミア対立遺伝子を有する場合、ＳＣＤの重症度は、Ｈｂβ＋－サラセミア対立遺伝子（ＳＣＤ－Ｓβ＋－ｔｈａｌ）または別の相互作用するＨＢバリアント（ＳＣＤ－ＳＶａｒｉａｎｔ）よりも重症であることも多いＨｂβ°－サラセミア欠失（ＳＣＤ－Ｓβ°－ｔｈａｌ）を伴うβ－サラセミア対立遺伝子の重症度に依存する（Ｆｒｅｎｅｔｔ＆Ａｔｗｅｈ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７；１１７：８５０～８５８）。
ＳＣＤの分子病理発生における主な事象は、低酸素圧の条件下でＨｂＳが重合し、赤血球（ＲＢＣ）が固く鎌状になる傾向である（Ｆａｂｒｙ＆Ｎａｇｅｌ Ｂｌｏｏｄ １９８２；６０（６）１３７０～７７）。微小毛細血管静脈床における低酸素により、内皮の炎症および好中球の接着、ならびに好中球のローリングおよび流速の低下が導かれる。これらの細胞凝集体は、内皮細胞との相互作用によって脈管構造内に捕捉される。鎌状ＲＢＣ、白血球、および内皮細胞の接着性相互作用により脈管構造が妨害され、それにより血管閉塞（vaso-occlusion）が導かれる（Ｚｈａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ２０１６：１２７：８０１～８０９；Ｏｋｐａｌａ、２００６；Ｆｒｅｎｅｔｔｅ＆Ａｔｗｅｈ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００７；１１７：８５０～８５８）。一酸化窒素恒常性の調節不全がＳＣＤにおける血管機能障害に寄与する（Ａｓｌａｎ＆Ｆｒｅｅｍａｎ、２００７）。血液細胞凝集体により、臨床的には重度の疼痛のエピソードとして顕在化する血管閉塞（vascular obstruction）、臓器梗塞および虚血のエピソードが導かれる。貧血は、血管内皮と鎌状ＲＢＣ、白血球および血小板の相互作用によって誘発される溶血および血管閉塞（vascular occlusion）に起因する赤血球寿命の短縮の結果として生じる（Ｒｅｅｓら、Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７６：２０１８～３１）。
血管閉塞クリーゼ（ＶＯＣ）がＳＣＤの最も一般的な臨床所見であり、ＳＣＤの罹患率の主要な原因であり、日常機能を妨害する（Ｂａｌｌａｓ＆Ｌｕｓａｒｄｉ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５；７９：１７～２５；Ｐｉｅｌら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１７；３７６：１５６１～１５７３；Ｄａｒｂａｒｉら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ２０１３；８（１１）：ｅ７９９２３）。ＶＯＣは、鎌状ＲＢＣとその酸素圧が最低になる後毛細管小静脈内の血管内皮との相互作用によって開始される（Ｍａｎｗａｎｉ＆Ｆｒｅｎｅｔｔｅ、Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２（２４）：３８９２～８）。これにより、炎症反応を誘発する内皮損傷が導かれ、白血球、血小板およびさらなるＲＢＣの炎症部位への動員が引き起こされる（Ｚｈａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ２０１６；１２７（７）：８０１）。これらの細胞の凝集体により血管閉塞（vascular obstruction）（Ｔｕｒｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２；９９（５）：３０４７～５１）および後毛細管小静脈内の血流の緩徐化が導かれ、それにより局所的な組織低酸素症、およびさらなる組織炎症が引き起こされる。これにより、ＲＢＣのより多くの脱酸素および鎌状赤血球化、ならびに、時には鎌状細胞の二次動員と呼ばれる閉塞の伝播および血管の閉塞が生じる（Ｓｔｕａｒｔ＆Ｎａｇｅｌ、Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６４（９９４２）：１３４３～６０）。
ＶＯＣは、ＳＣＤを有する患者において早ければ６カ月齢で顕在化し得るが、年少乳児では年長の小児や成人よりもはるかに稀である（Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ａｍｅｒ．Ｐａｉｎ Ｓｏｃ．１９９４；１巻、９４頁）。ホモ接合性ＳＣＤを有する患者のおよそ６０％が重症ＶＯＣエピソードを１年当たり少なくとも１件有するが、一部の患者ははるかに多くのエピソードを有する（Ｐｌａｔｔら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９１；３２５（１）；１１～６）。この同じ試験において、ＳＣＤ遺伝子型を有する患者の５．２％が重症ＶＯＣエピソードを１年当たり３～１０件有し、低い割合（＞１％）の患者がエピソードを１年当たり１０件以上有した。
疼痛は、最初のおよび継続している血管閉塞（vascular occlusion）および虚血の臨床所見であり（Ｂａｌｌａｓ、Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．２００５；１９（５）：７８５～８０２）、ＳＣＤ－ＳＳ遺伝子型を有する患者で特に重度であり得、当該患者は他の遺伝子型よりも高い死亡率にさらされることも観察されている（Ｐｌａｔｔら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９４；３３０（２３）；１６３９～４４）。
血管内皮損傷の領域への白血球の動員には、セレクチンファミリーの接着分子：Ｅ－セレクチン（ＣＤ６２Ｅとしても公知）；Ｐ－セレクチン（ＣＤ６２Ｐとしても公知）；およびＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌとしても公知）が関与し、これらは全て、炎症反応の一部として完全に調節される（Ｅｒｎｓｔ＆Ｍａｇｎａｎｉ Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２００９；８（８）：６６１～７７；Ｍｏｒｉｋｉｓら、Ｂｌｏｏｄ ２０１７；１３０（１９）：２１０１～１０）。構造は類似しているが、各セレクチンは異なる分布、リガンド結合キネティクスならびに病理学的および生理機能の両方の多様性を示す。
セレクチンファミリーの接着分子およびそれらのリガンドは、鎌状赤血球の変更および活性化された内皮細胞によって促進される、ＳＣＤにおける炎症促進性応答の一部である。セレクチンはまた、細胞間接着の最初の接触、内皮上の白血球ローリングおよびインテグリン活性化および細胞遊出の調節においても重大な役割を果たす。炎症を起こした内皮および循環している細胞の凝集体への白血球の接着は、ＳＣＤにおける特質事象である。
セレクチンファミリーの炭水化物結合性タンパク質は、類似の構造を共有し、各々が、Ｃａ２＋依存性（Ｃ型）レクチンに特徴的なＮ末端炭水化物認識ドメイン、続いて、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、補体調節ドメインとの相同性を有する一連の短いコンセンサスリピート、膜貫通ドメイン、および短い細胞質尾部を有する（ＭｃＥｖｅｒ＆Ｚｈｕ、２０１０）。セレクチンおよびそれらのリガンドは、血液から血管内皮への血小板および白血球の動員を媒介し、それによって、慢性炎症促進性環境の創出に寄与する。
ＳＣＤの病態生理は複雑かつ不均一である。症状としては、疼痛発作、慢性貧血、急性胸部症候群、脳卒中、脾臓血球貯留、血管閉塞性急性疼痛事象または発作、腎機能障害、および細菌感染に対する易罹患性が挙げられる（Ａｓｈｌｅｙ－Ｋｏｃｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０００；１５１：８３９～８４５；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９９；３４０：１０２１～１０３０；Ｐｉｅｌら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１７；３７６：１５６１～１５７３）。ＳＣＤに伴う急性終末器官合併症には、急性胸部症候群、急性脳卒中、持続勃起症、肝胆道合併症、脾臓血球貯留および急性腎不全が含まれ得る。ＳＣＤの累積的侵襲による慢性合併症には、無血管性壊死、肺高血圧症、腎臓の合併症、眼科の合併症、下腿潰瘍および再発性持続勃起症が含まれる（Ｙａｗｎら、ＪＡＭＡ ２０１４；３１２：１０３３～４８）。
ヒドロキシウレアは、ＳＣＤの予防的治療に関して承認を受けている。機構的に、ヒドロキシウレアは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）濃度を増加させ、疼痛発作の数を減少させる（Ｃｈａｒａｃｈｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９５；３３２：１３１７～１３２２）。ヒドロキシウレアはＶＯＣの予防における標準治療とみなされているが、失敗率が約３０～３５％であり、急性ＶＯＣの間の症状の処置に関しては効果がない。ＥＮＤＡＲＩ（Ｌ－グルタミン）は予防的ＳＣＤ処置について最近承認されたが、作用機序が不確実であり、臨床的有用性は大きくない（Ｑｕｉｎｎ、Ｂｌｏｏｄ ２０１８；１３２：６８９～６９３）。急性ＶＯＣエピソードに対する現行の処置は、オピオイド鎮痛薬、水和、酸素、および輸血を用いた主に支持的なものである。さらに、大多数の患者がＶＯＣの処置を自宅で行い、直接の医療介入を求めない（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２００８；１４８：９４～１０１；Ｃａｌｌａｇｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ ２０１７；１３０：９７３）。
ＳＣＤの予防および処置、特に、患者における再発性および衰弱性のＶＯＣの基礎をなす病態生理に対処する（例えば、炎症および細胞凝集を低減させる）ことの著しい必要が存在したままである。本発明は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、Ｅ－セレクチンの機能活性を中和し得る新規の治療用抗体を提供する。これらの抗体がＳＣＤに対する予防的処置として利用される場合には、ＶＯＣの発生を防止するまたは低減させるために、ならびにＳＣＤを有する患者における急性ＶＯＣを、ＶＯＣの持続時間（例えば、ＶＯＣの消散までの時間の短縮）、強度および／または重症度を低減させることによって処置するために、有利に使用され得る。
概要
本発明は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する抗体およびその抗原結合性断片、ならびに使用、および関連の方法を提供する。当業者は、慣用的に過ぎない実験を使用して、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識する、またはそれを確認することができる。かかる等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含される意図である。
Ｅ１．Ｅ－セレクチン（例えば、ヒトおよび／またはカニクイザルＥ－セレクチン）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２．配列番号８、２３、５２、６３、７７、９２、１１１、１２５、９、２４、２９、３８、４１、４４、５３、６４、７８、９３、１１２、１２６、１０、５４、６５、７９、９４、１１３および１２７からなる群から選択されるＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２およびＨＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３．配列番号２、１８、４７、６８、８２、９７、１０６、９、２４、２９、３８、４１、４４、５３、６４、７８、９３、１１２、１２６、１０、５４、６５、７９、９４、１１３および１２７からなる群から選択されるＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２およびＬＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４．（ａ）～（ｆ）
（ａ）配列番号２、１８、４７、６８、８２、９７および１０６の配列からなる群から選択されるＬＣＤＲ－１アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３、１９、４８、６９、８３、９８、１０７および１２０の配列からなる群から選択されるＬＣＤＲ－２アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号４、２０、４９、７０、８４、９９、１０８および１２１の配列からなる群から選択されるＬＣＤＲ－３アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号８、２３、５２、６３、７７、９２、１１１および１２５の配列からなる群から選択されるＨＣＤＲ－１アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号９、２４、２９、３８、４１、４４、５３、６４、７８、９３、１１２および１２６の配列からなる群から選択されるＨＣＤＲ－２アミノ酸配列；ならびに
（ｆ）配列番号１０、５４、６５、７９、９４、１１３および１２７の配列からなる群から選択されるＨＣＤＲ－３アミノ酸配列
のうち１つ以上を含む、Ｅ１からＥ３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５．以下：
配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－１、
配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－２、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－３、
配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－１、
配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２、および
配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－３
のうち１つ以上を含む、Ｅ１からＥ４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６．配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８、および１２８からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７．配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６、および１２２からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８．配列番号７、１３、２２、２８、３４、３７、４０、４３、５１、５９、６２、７４、７６、８９、９１、１０３、１１０、１１７および１２４からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２およびＨＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９．配列番号１、１７、２６、３１、４６、５６、６７、７２、８１、８６、９６、１０１、１０５、１１５および１１９からなる群から選択される少なくとも１つの配列のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２およびＬＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０．配列番号１１のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２およびＨＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１．配列番号５のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２およびＬＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ１０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２．配列番号７または１３のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２およびＨＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ１１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１３．配列番号１のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３配列を含む、Ｅ１からＥ１２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１４．配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－２、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－３、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－３、を含む、Ｅ１からＥ１３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１５．配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－２、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－３を含む、Ｅ１からＥ４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１６．配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２、および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－３を含む、Ｅ１からＥ１５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１７．ＩＧＫＶ１－１２＊０１、ＩＧＫＶ１－１３＊０２、ＩＧＫＶ１－３３＊０１、ＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＩＧＫＶ１－５＊０１、ＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＩＧＫＶ３－１５＊０１、ＩＧＫＶ３－２０＊０１、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０＊０２、およびＩＧＫＶ４－１＊０１からなる群から選択されるヒト生殖系列ＶＬ配列に由来するＶＬフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ１６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１８．ＩＧＨＶ１－２＊０２、ＩＧＨＶ１－３＊０１、ＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＩＧＨＶ１－６９＊０１、ＩＧＨＶ１－６９＊０２、ＩＧＨＶ１－８＊０１、ＩＧＨＶ３－７＊０１、ＩＧＨＶ３－１３＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０４、ＩＧＨＶ３－３０＊０１、ＩＧＨＶ３－３０＊１８、ＩＧＨＶ５－１０－１＊０１、ＩＧＨＶ５－１０－１＊０４およびＩＧＨＶ５－５１＊０１からなる群から選択されるヒト生殖系列ＶＨ配列に由来するＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ１７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１９．ＩＧＨＶ１－３９＊０１ ＶＬフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ１８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２０．ＩＧＨＶ３－０７＊０１ ＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ１９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２１．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ２０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、ＶＬフレームワーク配列が、それが由来したヒト生殖系列配列に対して少なくとも７２％同一である、抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２２．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ２１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、ＶＬフレームワーク配列が、それが由来したヒト生殖系列配列に対して少なくとも７２％、７４％、７５％、７７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である、抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２３．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ２２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、ＶＨフレームワーク配列が、それが由来したヒト生殖系列配列に対して少なくとも５３％同一である、抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２４．ＶＬフレームワーク配列およびＶＨフレームワーク配列を含む、Ｅ１からＥ２３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、ＶＨフレームワーク配列が、それが由来したヒト生殖系列配列に対して少なくとも５３％、５８％、６０％、６３％、７１％、７２％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２５．配列番号１１に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、Ｅ１からＥ２４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２６．配列番号１１に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、Ｅ１からＥ２５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２７．配列番号１１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＨドメインを含む、Ｅ１からＥ２６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２８．配列番号５に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、Ｅ１からＥ２７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ２９．配列番号５に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、Ｅ１からＥ２８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３０．配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むまたはそれからなる、Ｅ１からＥ２９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３１．配列番号１１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＬドメインを含む、Ｅ１からＥ３０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３２．Ｆｃドメインを含む、Ｅ１からＥ３１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３３．Ｆｃドメインが、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃドメインである、Ｅ３２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３４．Ｆｃドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、Ｅ３３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３５．ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択される、Ｅ３４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３６．ＩｇＧがＩｇＧ１である、Ｅ３５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３７．配列番号７または配列番号１３に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む重鎖を含む、Ｅ１からＥ３６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３８．配列番号７または配列番号１３に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含む重鎖を含む、Ｅ１からＥ３７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ３９．配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる重鎖を含む、Ｅ１からＥ３８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４０．配列番号２２、２８、３４、３７、４０、４３、５１、５９、６２、７４、７６、８９、９１、１０３、１１０、１１７および１２４のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含む重鎖を含む、Ｅ１からＥ３９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４１．配列番号１に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む、Ｅ１からＥ４０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４２．配列番号１に対して少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含む、Ｅ１からＥ４１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４３．配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬＣを含む、Ｅ１からＥ４２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４４．配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、Ｅ１からＥ４３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４５．配列番号１、１７、２６、３１、４６、５６、６７、７２、８１、８６、９６、１０１、１０５、１１５および１１９のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、Ｅ１からＥ４５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４６．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物によってコードされるＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２およびＨＣＤＲ－３を含む、Ｅ１からＥ４５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４７．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物によってコードされるＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２およびＬＣＤＲ－３を含む、Ｅ１からＥ４６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４８．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミド中の挿入物によってコードされるＶＨドメインを含む、Ｅ１からＥ４７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ４９．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミド中の挿入物によってコードされるＶＬドメインを含む、Ｅ１からＥ４８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５０．ＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミド中の挿入物によってコードされるＨＣアミノ酸配列、およびＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミド中の挿入物によってコードされるＬＣアミノ酸配列を含む、Ｅ１からＥ４９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５１．Ｆｃ融合タンパク質、モノボディ（monobody）、マキシボディ（maxibody）、二機能性抗体、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、ペプチボディである、Ｅ１からＥ５０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５２．約８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１７５ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭおよび５００ｐＭからなる群から選択されるおよその値のＫＤまたはその値未満のＫＤで、ヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５３．約８００ｎＭ、７００ｎＭ、６００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１７５ｎＭ、１５０ｎＭ、１２５ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭおよび５００ｐＭからなる群から選択されるおよその値のＫＤまたはその値未満のＫＤで、カニクイザルＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５４．約１０ｎＭ～約２００ｎＭのＫＤでヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５５．約６８．４＋／－３．１８ｎＭのＫＤでヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５６．約１０ｎＭ～約２００ｎＭのＫＤでカニクイザルＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５７．約６４．９＋／－１．１３ｎＭのＫＤでカニクイザルＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５８．約９２．８５ｎＭ、約７０．３ｎＭ、約６５．２ｎＭ、約６１．８ｎＭ、約６０．５ｎＭ、約６８．０ｎＭ、約２１．６ｎＭ、約３２４ｎＭ、約５４．４ｎＭ、約６２８．５ｎＭおよび２９４０ｎＭからなる群から選択されるＫＤでヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ５９．約１３８．５ｎＭ、約７８．３ｎＭ、約７６．５ｎＭ、約８１．５ｎＭ、約６７．８ｎＭ、約４５．８ｎＭ、約２４３．５ｎＭ、約４５．４ｎＭ、約４９２ｎＭおよび３１４５ｎＭの群から選択されるＫＤでカニクイザルＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ５８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６０．カニクイザルにおける平均半減期が、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後、少なくとも約１４．４日間（３４５時間）である、Ｅ１からＥ５９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６１．カニクイザルにおける平均半減期が、３ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後、少なくとも約１２日間（２８７時間）である、Ｅ１からＥ６０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６２．カニクイザルにおける平均半減期が、３ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＣ投与後、約２１．５日間（５１８時間）である、Ｅ１からＥ６１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６３．抗薬物抗体を誘導しない、Ｅ１からＥ６２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６４．ｔ－レジトープ（t-regitope）（Ｔ－Ｒｅｇ）調整済スコアによって示される、抗体の予測される免疫原性潜在力が、約－３０未満である、Ｅ１からＥ６３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６５．ｔ－レジトープ（Ｔ－Ｒｅｇ）調整済スコアによって示される、抗体の予測される免疫原性潜在力が、約－４５未満であり、０個の非生殖系列Ｔ細胞エピトープが存在する、Ｅ１からＥ６４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６６．Ｔ－Ｒｅｇ調整済スコアによって示される、抗体の予測される免疫原性潜在力が、約－２４、－２６、－２７、－３０、－３２、－３３、－３４、－３５、－３６、－３７、－３８、－３９、－４０、－４１、－４２、－４３、－４４、－４５、－４６、－４７および－４８からなる群から選択されるＴ－Ｒｅｇ調整済スコア未満である、Ｅ１からＥ６５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６７．Ｔ－Ｒｅｇ調整済スコアによって示される、抗体の予測される免疫原性潜在力が、約－４５または－４６である、Ｅ１からＥ６６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６８．例えばＡＣ－ＳＩＮＳアッセイ、ＤＮＡ結合アッセイおよび／またはインスリン結合アッセイによって測定した場合に、多反応性のリスクが低い、Ｅ１からＥ６７のいずれか１つに記載の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ６９．２５℃で、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合に、約２３ｍｇ／ｍＬの濃度で約７．９７＋／－１．８３ｃＰ、約４８ｍｇ／ｍＬの濃度で約１２．３８＋／－５．２８ｃＰ、約９０ｍｇ／ｍＬの濃度で約４．２６＋／－０．６ｃＰ、約１０２ｍｇ／ｍＬの濃度で約５．５８＋／－０．９９ｃＰ、約１２１ｍｇ／ｍＬの濃度で約８．４４＋／－１．５４ｃＰ、約１４０ｍｇ／ｍＬの濃度で約９．７８＋／－２．３２ｃＰ、約１５８ｍｇ／ｍＬの濃度で約１７．４７＋／－３．２４ｃＰおよび約１８８ｍｇ／ｍＬの濃度で約３７．９９＋／－７．０３ｃＰからなる群から選択される粘度を有する、Ｅ１からＥ６８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７０．２５℃で、例えばＤＬＳによって測定した場合に、約１５０ｍｇ／ｍＬ～約１９０ｍｇ／ｍＬの濃度で約１５ｃＰ～４０ｃＰの粘度を有する、Ｅ１からＥ６９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７１．２５℃で、例えばＡｎｔｏｎ Ｐａｒｒ法によって測定した場合に、１８５．７ｍｇ／ｍＬで３３．４ｃＰの粘度を有する、Ｅ１からＥ７０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７２．例えば競合アッセイによって、例えばＯｃｔｅｔバイオセンサーを使用して決定した場合に、ヒトＥ－セレクチンの３つのエピトープのうち少なくとも１つに結合する、Ｅ１からＥ７１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７３．エピトープのうち少なくとも２つが重複している、Ｅ７２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７４．Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｍ１０、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１１３、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用する、Ｅ１からＥ７３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７５．３．８Å以内の、Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用する、Ｅ１からＥ７４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７６．埋没表面積（Å２）が＞５Å２である、Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１１３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用する、Ｅ１からＥ７５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７７．Ｅ８、Ｓ４７、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と水素結合によって相互作用する、Ｅ１からＥ７６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７８．Ｋ１１１、Ｋ１１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と塩橋によって相互作用する、Ｅ１からＥ７７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ７９．Ｒ９７、Ｋ１１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と水を介した水素結合によって相互作用する、Ｅ１からＥ７８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８０．３．８Å以内のｓＬｅｘアミノ酸残基とも相互作用する、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と相互作用する、Ｅ１からＥ７９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８１．２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２０ｍＭヒスチジンｐＨ５．８、および２０ｍＭグルタミン酸ｐＨ４．５からなる群から選択される溶液中、４０℃で４週間の保管後、ＨＭＭＳのパーセンテージおよび／またはパーセンテージＬＭＭＳが５％未満であり、任意選択により、分析がａＳＥＣによって実施される、Ｅ１からＥ８０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８２．２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８．５％スクロースｐＨ７．５、２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロース、０．００５％ＥＤＴＡ ｐＨ５．８および２０ｍＭグルタミン酸、８．５％トレハロースｐＨ４．５からなる群から選択される溶液中、４℃または２５℃で最大６週間の保管後、ＨＭＭＳのパーセンテージが５％未満であり、抗体の濃度が約１５０ｍｇ／ｍｌであり、任意選択により、分析がａＳＥＣによって実施される、Ｅ１からＥ８１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８３．示差走査熱量測定によって測定した場合に、約６５℃以上の、融解温度（Ｔｍ１）または抗体のＣＨ２が５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８４．示差走査熱量測定によって測定した場合に、６５℃と７２℃との間の、融解温度（Ｔｍ１）または抗体のＣＨ２が５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８５．示差走査熱量測定によって測定した場合に、約７１．７℃の、融解温度（Ｔｍ１）または抗体のＣＨ２が５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８６．示差走査熱量測定によって測定した場合に、約７４℃以上の、融解温度（Ｔｍ２）または抗体のＦａｂが５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８７．示差走査熱量測定によって測定した場合に、７４℃と７８℃との間の、融解温度（Ｔｍ２）または抗体のＦａｂが５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８８．示差走査熱量測定によって測定した場合に、約７８．２℃の、融解温度（Ｔｍ２）または抗体のＦａｂが５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ８９．示差走査熱量測定によって測定した場合に、約８２℃以上の、融解温度（Ｔｍ３）または抗体のＣＨ３が５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９０．示差走査熱量測定によって測定した場合に、８２℃と８６℃との間の、融解温度（Ｔｍ３）または抗体のＣＨ３が５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ８９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９１．示差走査熱量測定によって測定した場合に、約８４．３℃の、融解温度（Ｔｍ３）または抗体のＣＨ３が５０％折り畳まれていない温度で、熱安定性を有する、Ｅ１からＥ９０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９２．細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、５０ｎＭ以下、例えば、４８ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２５ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下である、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する、Ｅ１からＥ９１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９３．細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、約０．６６ｎＭである、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する、Ｅ１からＥ９２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９４．細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、５０ｎＭ以下、例えば、４８ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２５ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下である、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する、Ｅ１からＥ９３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９５．細胞表面に発現されるヒトＰ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、３５０ｎＭ以上、例えば、４００ｎＭ以上、４５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、５５０ｎＭ以上、６００ｎＭ以上、６５０ｎＭ以上である、またはそれよりも大きい、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する、Ｅ１からＥ９４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９６．可溶性ラット、マウスもしくはウサギＥ－セレクチン、または可溶性ヒトＬ－もしくはＰ－セレクチンに対して、弱い結合を有するまたは結合を有さない、Ｅ１からＥ９５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９７．細胞表面に発現されるヒトＰ－セレクチンに対して、弱い結合を有するまたは結合を有さない、Ｅ１からＥ９６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９８．ラット、マウスもしくはウサギＥ－セレクチン、または可溶性ヒトＬ－もしくはＰ－セレクチンに対して、例えば、ＳＰＲによって測定した場合に、４０５ｎＭまで、結合が実証されない、Ｅ１からＥ９７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ９９．可溶性マウスまたはラットＥ－セレクチンに対して、例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンに対する結合の約＞１００分の１である弱い非飽和性結合が実証される、Ｅ１からＥ９８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１００．可溶性マウスまたはラットＥ－セレクチンに対して、例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１３３．３ｎＭまでの弱い非飽和性結合が実証される、Ｅ１からＥ９９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０１．２ｎＭ以下、例えば、０．０１０ｎＭ以下、０．０１５ｎＭ以下、０．０２０ｎＭ以下、０．０２５ｎＭ以下、０．０３０ｎＭ以下、０．０３５ｎＭ以下、０．０４０ｎＭ以下、０．０４５ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０５５ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０６５ｎＭ以下、０．０７０ｎＭ以下、０．０７５ｎＭ以下、０．０８０ｎＭ以下、０．０８５ｎＭ以下、０．０９０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．１２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．９５ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１．８ｎＭ以下または１．９ｎＭ以下のＥＣ５０で可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ１００のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０２．例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約０．０８５ｎＭ～約０．１２ｎＭのＥＣ５０で可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ１０１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０３．１ｎＭ以下、例えば、０．０１０ｎＭ以下、０．０１５ｎＭ以下、０．０２０ｎＭ以下、０．０２５ｎＭ以下、０．０３０ｎＭ以下、０．０３５ｎＭ以下、０．０４０ｎＭ以下、０．０４５ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０５５ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０６５ｎＭ以下、０．０７０ｎＭ以下、０．０７５ｎＭ以下、０．０８０ｎＭ以下、０．０８５ｎＭ以下、０．０９０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．１２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下または０．９５ｎＭ以下のＥＣ５０で可溶性カニクイザルＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ１０２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０４．例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、０．０７１ｎＭ～０．０９３ｎＭのＥＣ５０で可溶性カニクイザルＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ１０３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０５．約１ｎＭ～約３ｎＭのＩＣ５０、好ましくは約１．２ｎＭのＩＣ５０で、ヒト血清中の遊離可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合する、Ｅ１からＥ１０４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０６．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１０５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０７．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約２．８７ｎＭ～約３．０１ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１０６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０８．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性カニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１０７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１０９．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約２．３９ｎＭ～約２．９１ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性カニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１０８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１０．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１０９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１１．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約１．８８ｎＭ～約２．８９ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１１０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１２．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１１１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１３．例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約１．４７ｎＭ～約２．６５ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する、Ｅ１からＥ１１２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１４．例えば、静置条件下で測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１５．例えば、静置条件下で測定した場合に、約３．３６ｎＭ～約４．７ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１６．例えば、静置条件下で測定した場合に、約３．８４ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１７．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下または２ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１８．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約４．２５ｎＭ～約４．５６ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１１９．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約４．３２ｎＭ～約４．３５ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２０．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、３００ｎＭ以下、例えば、２９０ｎＭ以下、２８０ｎＭ以下、２７０ｎＭ以下、２６０ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１１９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２１．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約１３．２８ｎＭ～約１５．９４ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１２０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２２．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約９．４５ｎＭ～約１６．３３ｎＭのＩＣ５０で、活性化されたヒト好中球（例えば、ＴＮＦ－αで活性化された）の、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１２１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２３．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約２．８７ｎＭ～約４．６５ｎＭのＩＣ５０で、活性化されたヒト好中球（例えば、ＴＮＦ－αで活性化された）の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１２２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２４．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約６．１７ｎＭ～約１８．６６ｎＭのＩＣ５０で、ＳＣＤ患者からの血液細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１２３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２５．例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約１２．４ｎＭのＩＣ５０で、ＳＣＤ患者からの血液細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する、Ｅ１からＥ１２４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
Ｅ１２６．Ｅ１からＥ１２５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１２７．Ｅ１からＥ１２５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１２８．ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片の、ＶＬ、ＶＨ、またはそれら両方をコードする単離された核酸分子であって、配列番号１３６の核酸配列、配列番号１３７の核酸配列、またはそれら両方を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１２９．配列番号１３６の核酸配列、配列番号１３７の核酸配列、またはそれら両方を含むまたはそれからなる、単離された核酸分子。
Ｅ１３０．配列番号１３６として示される核酸配列を含むまたはそれからなる、単離された核酸分子。
Ｅ１３１．配列番号１３７として示される核酸配列を含むまたはそれからなる、単離された核酸分子。
Ｅ１３２．配列番号１３６、１４４、１４６、１４８、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１および１７３からなる群から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む、ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片のＶＨをコードする、単離された核酸分子。
Ｅ１３３．配列番号１３６、１４４、１４６、１４８、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１および１７３からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸を含む、ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片のＶＨをコードする、単離された核酸分子。
Ｅ１３４．配列番号１３７、１４５、１４７、１４９、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４からなる群から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む、ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片のＶＬをコードする、単離された核酸分子。
Ｅ１３５．配列番号１３７、１４５、１４７、１４９、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４からなる群から選択される核酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸を含む、ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片のＶＬをコードする、単離された核酸分子。
Ｅ１３６．ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖、重鎖、またはそれら両方をコードする、単離された核酸分子であって、配列番号２０６もしくは１３８の核酸配列；配列番号１３９の核酸配列；またはそれら両方を含む、核酸分子。
Ｅ１３７．配列番号２０６もしくは１３８の核酸配列、配列番号１３９の核酸配列、またはそれら両方を含むまたはそれからなる、単離された核酸分子。
Ｅ１３８．配列番号２０６または１３８の核酸配列を含むまたはそれからなる、単離された核酸分子。
Ｅ１３９．配列番号１３９の核酸配列を含むまたはそれからなる、単離された核酸分子。
Ｅ１４０．ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子であって、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１４１．ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子であって、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１４２．ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子であって、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列、およびＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１４３．ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１４４．ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１４５．ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列、およびＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含む、単離された核酸分子。
Ｅ１４６．Ｅ１２６からＥ１４５のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、ベクター。
Ｅ１４７．Ｅ１２６からＥ１４５のいずれか１つに記載の核酸分子またはＥ１４６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
Ｅ１４８．哺乳動物細胞である、Ｅ１４７に記載の宿主細胞。
Ｅ１４９．ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞またはＳｐ２．０細胞である、Ｅ１４７またはＥ１４８に記載の宿主細胞。
Ｅ１５０．抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、Ｅ１４７からＥ１４９のいずれか１つに記載の宿主細胞を、前記抗体または抗原結合性断片が前記宿主細胞によって発現される条件下で培養するステップを含む、方法。
Ｅ１５１．抗体またはその抗原結合性断片を単離するステップをさらに含む、Ｅ１５０に記載の方法。
Ｅ１５２．Ｅ１からＥ１２５およびＥ２２１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片、ならびに薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
Ｅ１５３．１．１２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ヒスチジン、２．６７ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、８５ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０５ｍｇ／ｍＬエデト酸二ナトリウム二水和物、０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０ ｐＨ５．８を含む、Ｅ１５２に記載の医薬組成物。
Ｅ１５４．２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロース、および０．０２％ポリソルベート８０、０．００５％ＥＤＴＡ ｐＨ５．８を含む、Ｅ１５２またはＥ１５３に記載の医薬組成物。
Ｅ１５５．約２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍｌの抗体またはその抗原結合性断片を含む、Ｅ１５２からＥ１５４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１５６．約１００ｍｇ／ｍＬの抗体またはその抗原結合性断片を含む、Ｅ１５５に記載の医薬組成物。
Ｅ１５７．用量が、１ｍＬ用量である、Ｅ１５２からＥ１５６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１５８．ＳＣおよび／またはＩＶ投与に適切である、Ｅ１５２からＥ１５７に記載の医薬組成物。
Ｅ１５９．ｉ）配列番号１１のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３配列ならびに配列番号５のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３配列；ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；またはｉｉｉ）配列番号７もしくは１３のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗体またはその抗原結合性断片を含む、Ｅ１５２からＥ１５８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１６０．Ｌ－グルタミン（例えば、ＥＮＤＡＲＩ）、抗Ｐ－セレクチン抗体（例えば、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ））、ＨｂＳをそのＲ状態（即ち、酸素化状態）に維持するようにモジュレートする化合物、例えば、２－アミノキノリンおよびＷＯ２０２０／１０９９９４（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、ＨｂＳの酸素親和性をモジュレートする化合物（例えば、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ））、２，３－ジスホスホグリセリン酸の生成をモジュレートすることによってＨｂＳ重合を標的とする化合物、胎児ヘモグロビンの発現を誘導することによってＨｂＳ重合を標的とする化合物（例えば、ヒドロキシウレア、例えば、ＤＲＯＸＩＡ、ＨＹＤＲＥＡ）、機能障害性細胞接着、血管機能障害および／または炎症を標的とする化合物（例えば、ホスホジエステラーゼ－９阻害剤）、血液中の一酸化窒素のレベルを増加させる化合物（例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、例えば、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ））、静脈内ＩＧ、過凝固状態を標的とする化合物（例えば、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ））、ＮＭＤＡ受容体結合を遮断する化合物（例えば、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ））およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、さらなる治療的に活性な化合物を含む、Ｅ１５２からＥ１５９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１６１．肺炎球菌感染症を予防するためのペニシリン系予防薬、ヒドロキシウレア（例えば、ＤＲＯＸＩＡ、ＨＹＤＲＥＡ）、Ｌ－グルタミン（例えば、ＥＮＤＡＲＩ）、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ）、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ）、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛薬、一般に、オピオイド鎮痛薬、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ）、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、さらなる治療的に活性な化合物を含む、Ｅ１５２からＥ１５９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ１６２．Ｅ－セレクチン活性を低減させるまたは阻害する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＥ１からＥ１２５、Ｅ２２１のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片またはＥ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップ、および抗体の投与前のＥ－セレクチンの活性を、投与後のＥ－セレクチン活性のレベルと比較するステップを含み、それによって、Ｅ－セレクチンの活性を低減させる、方法。
Ｅ１６３．Ｅ－セレクチンの活性を低減させるまたは阻害することにより、Ｅ－セレクチン活性の除去、阻害または低減によって改善、寛解、阻害または予防される疾患、障害または状態を処置する、Ｅ１６２に記載の方法。
Ｅ１６４．Ｅ－セレクチンの活性が、
（ａ）内皮細胞への白血球テザリング；
（ｂ）内皮細胞への安定な接着の活性化；
（ｃ）白血球を停止させる緩徐なローリング；
（ｄ）白血球の効率的な経内皮遊走；
（ｅ）ＣＤ１８インテグリンの親和性および結合力；
（ｆ）急性炎症の部位への白血球の輸送；
（ｇ）細胞質カルシウムの増加；
（ｈ）ｐ３８ ＭＡＰキナーゼおよびＳｙｋキナーゼを活性化するチロシンリン酸化の増加；
（ｉ）血液から血管内皮への血小板および白血球の動員；ならびに
（ｊ）炎症促進性環境の創出
からなる群から選択される、Ｅ１６２からＥ１６３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６５．遊離Ｅ－セレクチンのレベルの低減を必要とする対象において、遊離Ｅ－セレクチンのレベルを低減させる方法であって、対象に、治療有効量のＥ１からＥ１２５のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片またはＥ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ１６６．Ｅ－セレクチンの発現および／もしくはＥ－セレクチンのリガンドへの結合と関連するまたはそれによって媒介される疾患、障害および／もしくは状態を処置および／または予防する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量のＥ１からＥ１２５のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片またはＥ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
Ｅ１６７．疾患、障害および／または状態が、ＳＣＤ、血管閉塞クリーゼ（ＶＯＣ）、疼痛、臓器梗塞、虚血、脳卒中、終末器官機能障害、急性胸部および血管閉塞（vascular obstruction）、皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）および糖尿病の合併症からなる群から選択される少なくとも１つである、Ｅ１６６の方法。
Ｅ１６８．ＶＯＣが、ＳＣＤと関連する、Ｅ１６７に記載の方法。
Ｅ１６９．ＶＯＣの発生を予防するまたは低減させることによるＳＣＤに対する予防的処置を含む、Ｅ１６６からＥ１６８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７０．ＶＯＣの持続時間（例えば、ＶＯＣが消散するまでの時間の低減）および強度を低減させることによるＳＣＤに対する急性処置を含む、Ｅ１６７からＥ１６９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７１．処置が、予防的処置である、Ｅ１６６からＥ１７０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７２．ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状、例えば、心臓胸部系に影響を及ぼすもの（例えば、慢性拘束性肺疾患、左心室拡張疾患、肺高血圧症、急性胸部症候群、調律異常、突然死、血管閉塞クリーゼ）、神経系に影響を及ぼすもの（例えば、出血性卒中、静脈洞血栓症、無症候性脳梗塞、慢性疼痛、急性虚血性脳卒中、増殖性網膜症、眼窩梗塞、認知障害）、細網内皮系に影響を及ぼすもの（例えば、脾臓血球貯留、機能性脾機能低下症、貧血、溶血）、筋骨格系に影響を及ぼすもの（例えば、無血管性壊死、皮膚潰瘍）、泌尿生殖器系に影響を及ぼすもの（例えば、乳頭壊死、タンパク尿、腎不全、血尿、夜尿症、持続勃起症）および胃腸系に影響を及ぼすもの（例えば、胆石症、胆管症、肝障害、腸間膜血管閉塞症（mesenteric vaso-occlusion））を処置する、予防する、および／または寛解させる、Ｅ１６６からＥ１７１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７３．対象が、ヒトである、Ｅ１６６からＥ１７２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７４．対象が、ＳＣＤを有する患者である、Ｅ１６６からＥ１７３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７５．対象が、ＨＢＳＳ、ＨＢＳＣ、ＨＢＳ／β°ｔｈａｌ、ＨＢＳ／β＋ｔｈａｌまたはＨＢＳ－バリアント遺伝子型を有する、Ｅ１６６からＥ１７４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７６．抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、皮下投与される、Ｅ１６６からＥ１７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７７．抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、静脈内投与される、Ｅ１６６からＥ１７５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７８．抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、約１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、８週間毎に１回、９週間毎に１回、１０週間毎に１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に１回、２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、７ヶ月毎に１回、８ヶ月毎に１回、９ヶ月毎に１回、１０ヶ月毎に１回、１１ヶ月毎に１回または１２ヶ月毎に１回投与される、Ｅ１６６からＥ１７７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１７９．抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、１ヶ月に１回投与される、Ｅ１６６からＥ１７７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８０．抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、１週間に１回投与される、Ｅ１６６からＥ１７９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８１．治療有効量が、約１ｍｇ～約８００ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の用量を含む、Ｅ６６からＥ１８０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８２．用量が、初期固定用量である、Ｅ１８１に記載の方法。
Ｅ１８３．用量が、約１ｍｇ～約１０ｍｇ、約１０ｍｇ～約２０ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約３０ｍｇ～約４０ｍｇ、約４０ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約６０ｍｇ、約６０ｍｇ～約７０ｍｇ、約７０ｍｇ～約８０ｍｇ、約８０ｍｇ～約９０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約６００ｍｇ～約７００ｍｇまたは約７００ｍｇ～約８００ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片である、Ｅ１８１からＥ１８２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８４．用量が、約１５ｍｇ、４０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇまたは６００ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片である、Ｅ１８１からＥ１８３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８５．用量が、約１５０ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片である、Ｅ１８１からＥ１８４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８６．用量を、１週間に１回、２週間毎に１回、１カ月に１回、２カ月毎に１回、またはこれらの組み合わせで投与するステップを含む、Ｅ１８１からＥ１８５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８７．抗体が抗体１４４４であり、抗原結合性断片が抗体１４４４の断片である、Ｅ１６２からＥ１８６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８８．投与が、皮下または静脈内投与である、Ｅ１６２からＥ１８７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１８９．ｉ）配列番号１１のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３配列ならびに配列番号５のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３配列；ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；またはｉｉｉ）配列番号７もしくは１３のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗体またはその抗原結合性断片を投与するステップを含む、Ｅ１６２からＥ１８８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９０．ｉ）配列番号１１のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３配列ならびに配列番号５のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３配列；ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；またはｉｉｉ）配列番号７もしくは１３のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、Ｅ１６２からＥ１８８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９１．対象が、ＳＣＤを有する患者である、Ｅ１６２からＥ１９０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９２．ＳＣＤを処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、ｉ）配列番号１１のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３配列ならびに配列番号５のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３配列；ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；またはｉｉｉ）配列番号７もしくは１３のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を投与するステップを含む、方法。
Ｅ１９３．ＳＣＤの処置が、ＶＯＣを含めたＳＣＤの少なくとも１つの症状を処置することを含む、Ｅ１９２に記載の方法。
Ｅ１９４．対象が、ＳＣＤを有する患者である、Ｅ１９２からＥ１９３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９５．抗体またはその抗原結合性断片を皮下および／または静脈内投与するステップを含む、Ｅ１９２からＥ１９４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９６．前記抗体またはその抗原結合性断片が、約１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、８週間毎に１回、９週間毎に１回、１０週間毎に１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月毎に１回、３カ月に１回、４カ月毎に１回、５カ月毎に１回、６カ月毎に１回、７カ月毎に１回、８カ月毎に１回、９カ月毎に１回、１０カ月毎に１回、１１カ月毎に１回または１２カ月毎に１回投与される、Ｅ１９２からＥ１９５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９７．抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月に１回、またはこれらの組み合わせで投与される、Ｅ１９２からＥ１９６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９８．抗体またはその抗原結合性断片が、約１ｍｇから約８００ｍｇの間の用量で、投与される、Ｅ１９２からＥ１９７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９９．前記抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が、約１５ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約５００ｍｇ、および約６００ｍｇからなる群から選択される用量で投与される、Ｅ１９２からＥ１９８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２００．抗体またはその抗原結合性断片が、治療有効量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である、１つ以上のさらなる治療的に活性な化合物または処置モダリティと組み合わせて投与される、Ｅ１９２からＥ１９９のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０１．抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の量、ならびにＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティの量が、一緒になって、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において相乗的効果を達成する量で投与される、Ｅ１９２からＥ２００のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０２．抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片の量、ならびに／またはＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／もしくは症状の処置および／もしくは予防において有効である治療的に活性な化合物もしくは処置モダリティの量が、各々、組み合わせない場合に投与される投薬量よりも少ない投薬量で投与される、Ｅ１９２からＥ２０１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０３．さらなる治療的に活性な化合物が、肺炎球菌感染症を予防するためのペニシリン系予防薬、ヒドロキシウレア（例えば、ＤＲＯＸＩＡ、ＨＹＤＲＥＡ）、Ｌ－グルタミン（例えば、ＥＮＤＡＲＩ）、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ）、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ）、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛薬、一般に、オピオイド鎮痛薬、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ）、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、Ｅ１９２からＥ２０２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０４．さらなる治療的に活性な化合物が、Ｌ－グルタミン（例えば、ＥＮＤＡＲＩ）、抗Ｐ－セレクチン抗体（例えば、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ））、ＨｂＳをそのＲ状態（即ち、酸素化状態）に維持するようにモジュレートする化合物、例えば、２－アミノキノリンおよびＷＯ２０２０／１０９９９４（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、ＨｂＳの酸素親和性をモジュレートする化合物（例えば、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ））、２，３－ジホスホグリセリン酸の生成をモジュレートすることによってＨｂＳ重合を標的とする化合物、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を誘導することによってＨｂＳ重合を標的とする化合物（例えば、ヒドロキシウレア、例えば、ＤＲＯＸＩＡ、ＨＹＤＲＥＡ）、機能障害性細胞接着、血管機能障害および／または炎症を標的とする化合物（例えば、ホスホジエステラーゼ－９阻害剤）、血液中の一酸化窒素のレベルを増加させる化合物（例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、例えば、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ））、静脈内ＩＧ、過凝固状態を標的とする化合物（例えば、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ））、ＮＭＤＡ受容体結合を遮断する化合物（例えば、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ））およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、Ｅ１９２からＥ２０３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０５．ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防に有用である治療的に活性な処置モダリティが、酸素補給、任意選択により鉄キレート化を伴う輸血、骨髄移植、遺伝子治療（例えば、ＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ（登録商標））、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＴＸ００１）またはジンクフィンガー技術による遺伝子編集治療およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、Ｅ１９２からＥ２０４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０６．抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片と、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティが、同時投与される、Ｅ２００からＥ２０５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０７．組み合わせ治療が、同じ投薬レジメンに従って投与される（例えば、両方の治療が毎日投与される）または異なる投薬レジメンに従って投与される（例えば、１つの治療が毎日投与され、他の治療が毎週投与される）、Ｅ２００からＥ２０６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０８．組み合わせ治療が、対象に同じまたは異なる経路の投与によって投与される、Ｅ２００からＥ２０７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２０９．Ｅ－セレクチンによって媒介される疾患、障害または状態（例えば、ＳＣＤ）を処置するための医薬の製造における、Ｅ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
Ｅ２１０．Ｅ－セレクチンの発現および／またはＥ－セレクチンのリガンドへの結合と関連するまたはそれによって媒介される疾患、障害または状態を処置および／または予防するための医薬の製造における、Ｅ１からＥ１２５またはＥ２２１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
Ｅ２１１．Ｅ－セレクチンの発現および／またはＥ－セレクチンのリガンドへの結合と関連するまたはそれによって媒介される疾患、障害または状態を処置および／または予防するための医薬の製造における、Ｅ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。
Ｅ２１２．医薬としての使用のための、Ｅ１からＥ１２５もしくはＥ２２１のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片またはＥ１５２からＥ１６１に記載の医薬組成物。
Ｅ２１３．ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防における使用のための、Ｅ１からＥ１２５もしくはＥ２２１のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片またはＥ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ２１４．ＳＣＤの症状がＶＯＣである、Ｅ２１３に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物。
Ｅ２１５．処置および／または予防が、例えば、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である少なくとも１つの他の治療的に活性な化合物または処置モダリティであるがこれらに限定されないさらなる治療剤をさらに含む、Ｅ２１３からＥ２１４のいずれか１つに記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物。
Ｅ２１６．さらなる治療剤が、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の予防および／または処置のための標準治療である薬剤（例えば、Ｌ－グルタミン、ヒドロキシウレア、輸血および当該分野で公知の任意の他の治療）である、Ｅ２１５に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物。
Ｅ２１７．処置および／または予防が、ｉ）相乗的治療有効量の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、およびｉｉ）相乗的治療有効量のさらなる治療剤を含む、Ｅ２１５から２１６に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物。
Ｅ２１８．処置および／または予防が、ｉ）相乗的治療有効量の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、およびｉｉ）相乗的治療有効量の処置モダリティを含む、Ｅ２１５またはＥ２１６に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物。
Ｅ２１９．ＳＣＤを有する患者に投与するために組み合わせにおいて使用される、各化合物の適切な量が、年齢、体重、総体的な健康、投与される化合物、投与の経路、ＳＣＤの処置の性質および進行、ならびに他の薬物療法の存在からなる群から選択される少なくとも１つの因子を考慮に入れることによって決定される、Ｅ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ２２０．Ｅ－セレクチンによって媒介される疾患、障害または状態（例えば、ＳＣＤ）を処置するための医薬としての使用のために製剤化された、Ｅ１５２からＥ１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｅ２２１．抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１７０、０１８０、０８４１、１２８２、１２８４、１４４４または１４４８である、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体。
図１は、短縮型ヒトＥ－セレクチンと共結晶化した抗Ｅ－セレクチン抗体０１６４のＦａｂの例示的な結晶構造を示す。Ｅ－セレクチンは、灰色の表面として示される（右側の分子）。０１６４ Ｆａｂ（左側の分子）は、リボンとして示され、ＶＬは薄い灰色、ＶＨは濃い灰色である。 図２は、時間０（Ｔ０）における、およびＴｒｉｓ緩衝液（ＴｒｉｓＴ４）、ヒスチジン緩衝液（ＨｉｓＴ４）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ４）緩衝液中での４０℃で４週間にわたる貯蔵後の、最適化抗Ｅ－セレクチン抗体０８４１の３部の質量分析による分析からの例示的なデータを示す。 図３は、強制的分解後の抗体８４１（０８４１としても公知）の例示的な競合ＥＬＩＳＡ分析を示す。抗体８４１を、時間０（０ｗｋ）において、およびＴｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中での４０℃で２週間（２ｗｋ）または４週間（４ｗｋ）にわたるインキュベーション後に、分析した。 図４は、ヒト化抗体０８４１のＶＨおよびＶＬ領域についての予測された非生殖系列Ｔ細胞エピトープを示す。ヒト生殖系列中には見出されないＴ細胞エピトープを包含することがＥｐｉｖａｘ／ＩＳＰＲＩまたはＩＥＤＢによって予測されたアミノ酸残基は、下線付きである。 図５は、ヒトＥ－セレクチンを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞へのシアリルルイスＡリガンド接着の例示的な中和を示す。試験した抗体は、抗Ｅ－セレクチン抗体１６４（０１６４としても公知）、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８ならびにＩｇＧアイソタイプ対照を含んだ。 図６は、カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのシアリルルイスＸリガンド接着の例示的な中和を示す。試験した抗体は、抗Ｅ－セレクチン抗体１６４（０１６４としても公知）、１２８２、１２８４、１４４４、１４４８およびＩｇＧアイソタイプ対照を含んだ。 図７は、抗体１２８２、１２８４、１４４４、１４４８および１６４（０１６４としても公知）による、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０細胞接着の例示的な中和を示す。 図８は、時間０（上のパネル）における、およびＴｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中での４０℃で４週間にわたる貯蔵後の、最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４の３部の質量分析による分析からの例示的なデータを示す。 図９Ａは、強制的分解後の、抗体１２８２の例示的な競合ＥＬＩＳＡ分析を示す。抗体を、時間０（Ｔ０）において、およびＴｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中での４０℃で２週間（Ｔ２）または４週間（Ｔ４）にわたるインキュベーション後に、分析した。 図９Ｂは、強制的分解後の、抗体１２８４の例示的な競合ＥＬＩＳＡ分析を示す。抗体を、時間０（Ｔ０）において、およびＴｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中での４０℃で２週間（Ｔ２）または４週間（Ｔ４）にわたるインキュベーション後に、分析した。 図９Ｃは、強制的分解後の、抗体１４４４の例示的な競合ＥＬＩＳＡ分析を示す。抗体を、時間０（Ｔ０）において、およびＴｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中での４０℃で２週間（Ｔ２）または４週間（Ｔ４）にわたるインキュベーション後に、分析した。 図９Ｄは、強制的分解後の、抗体１４４８の例示的な競合ＥＬＩＳＡ分析を示す。抗体を、時間０（Ｔ０）において、およびＴｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中での４０℃で２週間（Ｔ２）または４週間（Ｔ４）にわたるインキュベーション後に、分析した。 図１０Ａ～１０Ｄは、最適化抗Ｅ－セレクチン抗体サンプルの高濃度サンプルのａＳＥＣ分析を示す。１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗体を、時間０（０）において、ならびにＴｒｉｓ／Ｓｕｃ、Ｈｉｓ／ＳｕｃまたはＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中での４℃または２５℃で１、２、４、６および７週間にわたる貯蔵後に、分析した。高分子量種のパーセンテージ（％ＨＭＭＳ）を定量化した。図１０Ａは、抗体１２８２についての結果を示す。 図１０Ｂは、抗体１２８４についての結果を示す。 図１０Ｃは、抗体１４４４についての結果を示す。 図１０Ｄは、抗体１４４８についての結果を示す。 図１１は、最適化抗Ｅ－セレクチン抗体の例示的な粘度曲線を示す。最適化抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の粘度を、ＤＬＳビーズベースの方法を使用して測定した。さらなる単一のデータポイントが、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒコーンプレート法を使用して、各々について提供される。 図１２は、ヒトＥ－セレクチン（ｒｈＥ－セレクチン）、ホモログＰ－セレクチンおよびＬ－セレクチン、ならびにウサギ、ラット、マウス（ｍｕＥ－セレクチン）およびカニクイザル（ｒｃｙＥ－セレクチン）の種ホモログへの最適化抗体１４４４結合の例示的なＳＰＲ分析を示す。 図１３は、固定化されたヒトＬ－セレクチンおよびヒトＰ－セレクチンへの抗Ｅ－セレクチン抗体（０８４１、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８）の例示的な結合を示す。抗Ｌ－セレクチン対照抗体および抗Ｐ－セレクチン対照抗体は、それぞれ、ヒトＬ－セレクチンおよびヒトＰ－セレクチンに結合した。 図１４は、生理学的流動下での組換えＥ－セレクチンへのＳＣＤ患者細胞（ドナー１１２５３およびドナー２２３５８）の接着の例示的な中和を示す。
詳細な説明
本開示は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、糖タンパク質または糖脂質上にシアリルルイス（ｓＬｅｘ）決定因子を有する炭水化物構造を含むリガンドと相互作用する（例えば、結合する）Ｅ－セレクチンの能力が含まれるがこれらに限定されない、Ｅ－セレクチンの活性を低減させるまたは阻害する、抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本開示は、抗Ｅ－セレクチン抗体を作製、調製または産生するためのプロセスもまた提供する。本開示の抗体は、ＳＣＤ、血管閉塞クリーゼ、疼痛、臓器梗塞、虚血、脳卒中および血管閉塞（vascular obstruction）が含まれるがこれらに限定されない、Ｅ－セレクチンの活性（例えば、結合）によって媒介されるまたはそれと関連する障害または状態の診断、予防および／または処置において有用である。本開示は、抗体の発現、ならびに本開示の抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物、例えば、抗体の使用のための医薬の調製および製造をさらに包含する。
Ｅ－セレクチンに結合する抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。抗体重鎖もしくは軽鎖、またはそれら両方をコードするポリヌクレオチドもまた提供される。抗Ｅ－セレクチン抗体を発現する宿主細胞が提供される。Ｅ－セレクチンに対する抗体を使用する処置の方法が提供される。かかる方法には、ＳＣＤ、血管閉塞クリーゼ、疼痛、臓器梗塞、虚血、脳卒中、終末器官機能障害、急性胸部および血管閉塞（vascular obstruction）が含まれるがこれらに限定されない、Ｅ－セレクチンの発現および／またはｓＬｅｘリガンドへのＥ－セレクチンの結合と関連するまたはそれによって媒介される疾患を処置および／または予防する方法が含まれるがこれらに限定されない。
いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、セレクチンファミリーの接着分子（例えば、Ｅ－セレクチン）およびそれらのリガンドは、全てが、重度の疼痛または血管閉塞クリーゼ（例えば、血管閉塞（vascular obstruction）、臓器梗塞および虚血が含まれる）のエピソードとして臨床的に顕在化するＳＣＤにおける炎症促進性応答の一部である、細胞間接着の最初の接触、内皮上の白血球ローリング、インテグリン活性化および細胞遊出の調節において重大な役割を果たす。したがって、本開示の抗体およびその抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチン活性に対する選択的な拮抗作用および脈管系における結合を可能にし、したがって、対象における血管閉塞（vaso-occlusion）を低減させるものである。本明細書の実施例に開示されている一部の実施形態では、Ｅ－セレクチンに対する抗体およびその抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチンが溶液中に存在するかまたは細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＣＤを有する患者由来の好中球および／または血液細胞）上に発現されており、そのリガンドが溶液中に存在するかまたは細胞（例えば、ＨＬ－６０細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、カニクイザル肺微小血管内皮細胞（ＣＬＭＥＣ））上に発現されている場合に、Ｅ－セレクチンのそのリガンドへの結合を阻害する、中和するまたは低減させることが示されている。
ヒト化抗体が含まれる抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、血管閉塞クリーゼ、疼痛、臓器梗塞、虚血、脳卒中および血管閉塞（vascular obstruction）が含まれるＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の予防、処置、および／または寛解において、単独でまたは第２の治療と組み合わせて使用され得る。
本明細書で使用されるセクション見出しは、構成のみを目的としており、記載される主題を限定すると解釈すべきではない。
特許出願、特許公開、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献がその全体が参照によって組み込まれると具体的かつ個々に示されるかのように、本明細書で参照によって組み込まれる。
本明細書に記載されるまたは本明細書で言及される技術および手順は、一般に、十分に理解され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第３版（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ． ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（２００３））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，ａｎｄ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９））；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；ならびにそれらの最新版に記載される広く利用される方法論などの、当業者による従来の方法論を使用して、一般に使用される。
本開示は、本発明の例示的な実施形態およびその中に含まれる実施例に関する以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。
本発明の態様または実施形態がマルクーシュ群または他の代替の群分けに関して記載されている場合、本発明は、全体として、しかし群の各メンバーが個別に、および主要群の全ての可能性のある亜群が列挙されている群全体を包含するだけでなく、群のメンバーのうち１つ以上が存在しない主要群もまた包含する。本発明では、特許請求された発明における群のメンバーのいずれか１つ以上の明確な除外も想定される。
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が支配する。
さらに、文脈が他を要求しない限りまたは明白に示されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。
広範囲の本発明を記載する数値範囲および数値パラメーターは概数であるにもかかわらず、特定の実施例において記載されている数値はできる限り正確に報告される。しかし、あらゆる数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必ず生じるある特定の誤差を本質的に含有する。さらに、本明細書に開示される範囲は全て、その中に包含されるありとあらゆる部分範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、「１～１０」と述べられた範囲は、最小値である１と最大値である１０の間（両端を含む）のありとあらゆる部分範囲；即ち、最小値である１以上から始まる部分範囲、例えば、１～６．１、および最大値である１０以下で終わる部分範囲、例えば、５．５～１０の全てを含むものとみなされるべきである。
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」には、他が示されない限り、複数の参照対象が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「および／または」は、付随する列挙された項目のうち１つ以上のありとあらゆる可能性のある組み合わせ、ならびに、選択肢「または（ｏｒ）」として解釈される場合には組み合わせの欠如を指し、包含する。
本明細書で使用する場合、用語「約」または「およそ」は、例えば、生物学的活性の量、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、ＧおよびＣヌクレオチドの含量、コドン適応指標、ＣｐＧジヌクレオチドの数、用量、時間、温度などの測定可能な値を指し、他の指定のない限り、文脈から他が明らかでない限り、またはかかる数が可能性のある値の１００％を超える場合を除き、特定された量のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％またはさらには０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「寛解させる」は、対象の疾患、障害もしくは状態（例えば、ＳＣＤ）またはその症状（例えば、血管閉塞クリーゼ）、または基礎をなす細胞応答の検出可能なまたは測定可能な改善を意味する。検出可能なまたは測定可能な改善には、疾患、障害もしくは状態の発生、頻度、重症度、進行もしくは持続時間の主観的もしくは客観的な減少、低減、阻害、抑制、限定もしくは制御、疾患、障害もしくは状態によって引き起こされるまたはそれと関連する合併症の発生、頻度、重症度、進行もしくは持続時間の主観的もしくは客観的な減少、低減、阻害、抑制、限定もしくは制御、疾患、障害もしくは状態の症状の改善、または、疾患、障害もしくは状態の逆転が含まれる。
本明細書で使用する場合、「別の」は、少なくとも第２のものまたはそれ以上を意味し得る。本明細書で他に定義されない限り、本発明と併せて使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
本明細書で使用する場合、用語「と関連する」は、存在する場合、互いに、一方のレベルおよび／または形態が他方のレベルおよび／または形態と相関することを指す。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝産物、微生物など）は、その存在、レベルおよび／または形態が特定の疾患、障害、または状態の発生率および／またはそれに対する易罹患性と相関する場合、その疾患、障害、または状態と関連するとみなされる（例えば、関連性のある集団にわたって）。一部の実施形態では、２つ以上の実体が直接または間接的に相互作用し、その結果、それらの実体が互いに物理的近傍にあるおよび／または物理的近傍のままである場合、それらの実体は互いに物理的に「関連する」。一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合により連結している；一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合による連結はしていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、およびこれらの組み合わせによって非共有結合により関連している。
本明細書で使用する場合、用語「コード配列」は、特定のタンパク質をコードする配列を指す、または、「コード核酸」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、適切な調節配列の制御下に置かれた（それに作動可能に連結された）場合に、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列を意味する。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物または真核生物ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るがこれらに限定されない。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変形および単語「有する（having）／含む（including）」は、述べられた整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群の除外を意味するものではないと理解されたい。文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。用語「例えば（e.g.）」または「例えば（for example）」の後ろに続く任意の例は、網羅するものでも限定するものでもない。本明細書において実施形態が語「含む（comprising）」と共に記載されている場合はいつでも、「からなる（consisting
of）」および／または「から本質的になる（consisting essentially of）の点で記載される他の類似の実施形態も提供されることが理解される。
本明細書で使用する場合、用語「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、生物学的、化学的または構造的に類似した残基による置き換えを指す。生物学的に類似したとは、置換により生物学的活性が破壊されないことを意味する。構造的に類似したとは、アミノ酸が、例えば、アラニン、グリシンおよびセリンなど、類似の長さの側鎖を有する、または類似のサイズを有することを意味する。化学的類似性は、残基が同じ電荷を有するまたはどちらも親水性であるもしくは疎水性であることを意味する。特定の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの疎水性残基の別の疎水性残基での置換、または１つの極性残基の別の極性残基での置換、例えば、アルギニンでのリジンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、またはグルタミンでのアスパラギンの置換、セリンでのトレオニンなの置換などが含まれる。保存的置換の特定の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基での互いの置換、極性残基での別の極性残基の置換、例えば、アルギニンでのリジンの置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、またはグルタミンでのアスパラギンの置換などが含まれる。典型的には、保存的アミノ酸置換には、例えば、以下の群内での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。「保存的置換」には、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「発現制御配列」は、核酸の転写を方向づける核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結される。
本明細書で使用する場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投薬量」または「有効量」という用語は、任意の１つ以上の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。より具体的な態様では、有効量は、疾患、例えばＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を予防する、軽減する、および／または寛解させる量である。予防的使用について、有益なまたは所望の結果には、リスクを排除もしくは低減させること、重症度を低下させること、または疾患、その合併症、および疾患の発達の間に存在する中間の病理学的表現型の生化学的、組織学的および／もしくは行動学的症状を含む、疾患の開始を遅延させることが含まれる。治療的使用について、有益なまたは所望の結果には、臨床結果、例えば、Ｅ－セレクチンに媒介される疾患、障害または状態の少なくとも１つの徴候および／または症状を低減させること、疾患を処置するために要求される他の薬物療法の用量を減少させること、別の薬物療法の効果を増強すること、および／または患者の疾患の進行を遅延させることが含まれる。有効投薬量は、１つ以上の投与で投与され得る。本発明の目的のために、薬物、化合物または医薬組成物の有効投薬量は、予防的処置または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬物、化合物または医薬組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物または医薬組成物と併せて達成されてもされなくてもよい。したがって、「有効投薬量」は、１つ以上の治療剤を投与する観点から検討され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合に、有効量で与えられたとみなされ得る。
本明細書で使用する場合、用語「機能的」は、生体分子が、それを特徴付ける特性および／または活性を示す形態にあることを指す。生体分子は、２つの機能を有し得る（即ち、二機能性）または多くの機能を有し得る（即ち、多機能性）。
本明細書で使用する場合、用語「グリコシル化パターン」は、タンパク質に共有結合により付着した炭水化物単位のパターン（例えば、グリコフォーム）ならびにグリコフォームがタンパク質、より詳細には免疫グロブリンタンパク質のペプチド骨格に共有結合により付着する部位を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「相同な」または「相同性」は、所与の領域または断片にわたって少なくとも部分的な同一性を共有する、２つ以上の参照実体（例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列）を指す。例えば、２つのペプチド内のあるアミノ酸位置が同一なアミノ酸によって占有されている場合、これらのペプチドはその位置において相同である。とりわけ、相同なペプチドは、改変されていないまたは参照ペプチドと関連する活性または機能を保持し、改変されたペプチドは、一般に、改変されていない配列のアミノ酸配列と「実質的に相同な」アミノ酸配列を有する。ポリペプチド、核酸またはその断片について言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、別のポリペプチド、核酸（またはその相補鎖）またはその断片と適切な挿入または欠失を伴って最適にアラインメントした場合に、配列の少なくとも約９５％～９９％に配列同一性が存在することを意味する。２つの配列間の相同性（同一性）の程度は、コンピュータープログラムまたは数理アルゴリズムを使用して確認され得る。パーセント配列相同性（または同一性）を計算するかかるアルゴリズムでは、一般に、比較領域またはエリアにわたって配列ギャップおよびミスマッチを説明する。例示的なプログラムおよびアルゴリズムを以下に提示する。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、ポリヌクレオチド挿入物の取り込みのためのベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を意味する。宿主細胞には、「形質転換体」、「形質転換された細胞」、および「形質導入された細胞」が含まれ、これらには、初代の形質転換または形質導入された細胞、および継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。宿主細胞の子孫は、天然の、偶然のまたは意図的な変異に起因して（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ相補性において）元の親細胞とは必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）でｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトおよび／または形質転換された細胞が含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「同一性」または「に対して同一」は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／もしくはＲＮＡ分子）間ならびに／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。「同一性」は、特定の数理モデルのコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって扱われるギャップアラインメントを用いて、２つ以上の配列間の同一な一致のパーセントを測定する。
一部の実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。
２つの核酸またはポリペプチド配列のパーセント同一性の計算は、例えば、２つの配列を最適に比較するためにアラインメントすることによって実施され得る（例えば、最適なアラインメントのために第１と第２の配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較のために、同一でない配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較のためにアラインメントされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列内のある位置が第２の配列内の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）に占有されている場合、その結果これらの分子は、その位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一な位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数理アルゴリズムを使用して達成され得る。
パーセント同一性を決定するために、配列のアラインメントを、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を通じて入手可能なＢＬＡＳＴを含めた方法およびコンピュータープログラムを使用して行うことができる。他のアラインメントプログラムには、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ内のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が含まれる。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージとして入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６巻：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃに記載されている。配列内のギャップが許容されるアラインメントプログラムが特に興味深い。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメント内にギャップが許容されるアルゴリズムの型の１つである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０： １７３～１８７（１９９７）を参照のこと。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムを使用して配列をアラインメントすることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８： ４４３～４５３（１９７０）を参照のこと。
また、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２： ４８２～４８９）の局所相同性アルゴリズムを使用して配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムも興味深い。ギャップ生成ペナルティは、一般に１～５まで、通常は２～４までにわたり、一部の実施形態では３になる。ギャップ伸長ペナルティは、一般に約０．０１から０．２０までにわたり、一部の場合では０．１０になる。このプログラムは、比較のためにインプットされる配列によって決定されるデフォルトパラメーターを有する。プログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用して配列同一性を決定することが好ましい。このプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージでも入手可能である。
興味深い別のプログラムはＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１２７～１４９頁、１９８８、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃに記載されている。パーセント配列同一性はＦａｓｔＤＢによって以下のパラメーターに基づいて計算される：ミスマッチペナルティ：１．００；ギャップペナルティ（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）：１．００；ギャップサイズペナルティ（Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ）：０．３３；およびジョイニングペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）：３０．０。
本明細書で使用する場合、用語「増加させる」、「改善する」、「減少させる」または「低減させる」は、ベースライン測定値、例えば、本明細書に記載される処置を開始する前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下での対照個体（もしくは複数の対照個体）における測定値などと比較した値を示す。一部の実施形態では、「対照個体」は、処置される個体と同じ形態の疾患または傷害を患っている個体である。一部の実施形態では、「対照個体」は、処置される個体と同じ形態の疾患または傷害を患っていない個体である。
本明細書で使用する場合、用語「単離された分子」（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体もしくはその抗原結合性断片の場合）は、それが引き出された起源または供給源に基づいて、（１）そのネイティブ状態では付随する天然に関連する構成要素と関連していない、（２）同じ種に由来する他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）天然に存在しない、分子を意味する。したがって、化学的に合成される、またはそれが天然に起源とする細胞とは異なる細胞の系で発現される分子は、その天然には関連する構成要素から「単離された」ものになる。分子を、当該分野で周知の精製技術を使用して単離することにより、天然には関連する構成要素を実質的に含まないものにすることもできる。分子の純度または均一性は、当該分野で周知の多数の手段によってアッセイされ得る。例えば、ポリペプチドサンプルの純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および当該分野で周知の技術を使用してゲルを染色してポリペプチドを可視化することを使用してアッセイされ得る。ある特定の目的に関しては、ＨＰＬＣまたは精製のための当該分野で周知の他の手段を使用することによって、より高い分解能が提供され得る。
本明細書で使用する場合、用語「リーダーペプチド」または「リーダー配列」または「リーダーシグナル配列」または「シグナル配列」（本明細書では互換的に使用される）は、核酸分子の５’末端および／またはポリペプチドのＮ末端もしくはその付近に存在し得、存在する場合には、細胞からのポリペプチドの分泌が含まれるがこれらに限定されない、ポリペプチドの目的地の細胞小器官への輸送を媒介し得る、任意の核酸配列、またはそれによってコードされるアミノ酸配列を意味する。かかるリーダー配列には、例えば、ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣ（配列番号１４０）を含む核酸配列およびＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＣＧＴＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号１４１）を含む核酸配列、ならびに、例えば、これらに限定されないが、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号１２９）およびＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１３０）などの、それによってコードされるアミノ酸配列、または、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ（配列番号１３１）などの他のリーダー配列が含まれるがこれらに限定されない。本発明は、ポリペプチドの、所望の細胞小器官、例えば小胞体への輸送、および／または細胞からの分泌をもたらし得る、これらのおよび当該分野で公知のまたは同定される任意の他のリーダーシグナル（核酸およびアミノ酸配列）を包含する。一般に、シグナルペプチドは成熟ポリペプチドから除去され、および／または成熟ポリペプチドには存在しない。
本明細書で使用する場合、用語「残基」は、タンパク質内の位置およびそれの関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７とも呼ばれ、Ｎ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１内の残基である。
用語「類似性」は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一の一致および保存的置換一致の両方を含む類似性の尺度を指す。保存的置換は、ポリペプチドには当てはまり、核酸分子には当てはまらないので、類似性は、ポリペプチド配列比較のみに当てはまる。２つのポリペプチド配列が、例えば、２０個のうち１０個の同一なアミノ酸を有し、残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、共に５０％である。同じ例において、保存的置換が存在する５つのさらなる位置が存在する場合、パーセント同一性は、５０％のままであるが、パーセント類似性は、７５％（２０個のうち１５個）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド配列間の類似性の程度は、その２つの配列間のパーセント同一性よりも高い。
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、哺乳動物、より好ましくは、ヒトを意味する。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットもまた含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、対象は患者である。一部の実施形態では、対象は、Ｅ－セレクチンのそのリガンドへの結合によって媒介されるまたはそれと関連する疾患、障害または状態のリスクがある。一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載される疾患、障害または状態、例えばＳＣＤを有する患者である。一部の実施形態では、対象（例えば、患者）は、ＳＣＤ、ＳＣＤのバリアントまたはＳＣ症を有する。一部の実施形態では、対象（例えば、患者）は、ＨＢＳＳ、ＨＢＳＣ、ＨＢＳ／β°ｔｈａｌ、ＨＢＳ／β＋ｔｈａｌ、ＨＢＳ／ＨＰＨＰ、ＨＢＳＥまたはＨＢＳ－バリアント遺伝子型を有する。
本明細書で使用する場合、用語「実質的に純粋」は、目的の種が、存在する優勢な種である（即ち、モル濃度に基づいて、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）こと、および、好ましくは、実質的に精製された画分が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル濃度に基づいて）を目的の種（例えば、抗体または受容体を含めた糖タンパク質）が構成する組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種を約８０パーセントよりも多く、より好ましくは約８５％よりも多く、約９０％よりも多く、約９５％よりも多く、および約９９％よりも多く構成する。最も好ましくは、目的の種は必須の均一性まで精製され（従来の検出方法によって組成物中に夾雑種を検出することができない）、組成物は単一の高分子種から本質的になる。ある特定の実施形態では、実質的に純粋な材料は、少なくとも５０％純粋である（即ち、夾雑物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋である、より好ましくは、少なくとも９５％純粋である、さらにより好ましくは、少なくとも９８％純粋である、および最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である。
本発明によるポリペプチドまたは抗体「断片」または「部分」は、短縮によって、例えば、ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を除去することによって作製され得る。１個、２個、３個、４個、５個、最大で１０個、最大で２０個、最大で３０個、最大で４０個またはそれよりも多くのアミノ酸を、このようにＮおよび／またはＣ末端から除去することができる。断片は、１つ以上の内部の欠失によっても生成され得る。
本明細書で使用する場合、用語「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に、モノマー性ヌクレオチドで構成されるまたはモノマー性ヌクレオチドを含む任意の分子を指す。核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）であり得る。ヌクレオチド配列は、化学修飾されたものまたは人工的なものであり得る。ヌクレオチド配列には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノおよびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が含まれる。これらの配列は各々、分子の骨格に対する変化により、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡから識別される。また、ホスホロチオエートヌクレオチドが使用され得る。他のデオキシヌクレオチド類似体には、本開示のヌクレオチド配列に使用され得るメチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロジチオエート、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホラミデート、およびオリゴリボヌクレオチド
ホスホロチオエートおよびそれらの２’－０－アリル類似体および２’－０－メチルリボヌクレオチドメチルホスホネートが含まれる。
本明細書で使用する場合、用語「核酸構築物」は、組換えＤＮＡ技術の使用の結果生じた天然に存在しない核酸分子（例えば、組換え核酸）を指す。核酸構築物は、核酸配列のセグメントを含有するように改変されており、天然に見出されない様式で組み合わされ、配置される、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子である。核酸構築物は、「ベクター」（例えば、プラスミド）、即ち、外因的に創出されたＤＮＡを宿主細胞内に送達するように設計された核酸分子である。
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチド（またはポリペプチド）エレメントの機能的関連性での連結を指す。核酸が別の核酸配列との機能的関連性に置かれている場合、その核酸は作動可能に連結されている。例えば、プロモーターまたは他の転写調節配列（例えば、エンハンサー）は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、作動可能に連結されたとは、連結された核酸配列が連続していることを意味する。一部の実施形態では、作動可能に連結されたとは、核酸配列が連続して連結されていることを意味するのではなく、連結されているそれらの核酸配列の間に介在配列が存在することを意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」（本明細書では「核酸分子」とも呼ばれる）は、リン酸ジエステル連結によって接続されたヌクレオチドの配列を指す。ポリヌクレオチドは、本明細書では、５’から３’への方向で示されている。本開示のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得、二本鎖分子、一本鎖分子、低分子（small or short）ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子（small
or short）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス－スプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどの、核酸の全形態を指す。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ、アンチセンス分子または前述の分子のいずれかの断片であり得る。ヌクレオチド塩基は、本明細書では１文字コード：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）で示される。本開示のポリヌクレオチドは、当業者に周知の標準の技術を使用して調製され得る。
本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（核酸配列またはヌクレオチド配列）によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質と同様に全長のネイティブ配列、ならびに、部分配列、改変形態またはバリアントがネイティブ全長タンパク質の機能性をある程度保持する限りは、機能的な部分配列、改変形態または配列バリアントを指す。本開示の方法および使用では、ポリヌクレオチド配列によってコードされるかかるポリペプチド、タンパク質およびペプチドは、遺伝子治療を用いた処置を受ける対象において欠陥があるまたはその発現が不十分である、または欠損している内因性タンパク質に対して同一であり得るが、そうである必要はない。
本明細書で使用する場合、用語「予防する」または「予防」は、特定の疾患、障害または状態（例えば、ＳＣＤ）の少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、血管閉塞クリーゼ、疼痛）の発症の遅延、ならびに／または頻度および／もしくは重症度の低減を指す。一部の実施形態では、予防は集団に基づいて評価され、したがって、疾患、障害または状態にかかりやすい集団において、疾患、障害または状態の１つ以上の症状の発達、頻度および／または強度の統計的に有意な減少が観察された場合、薬剤は、特定の疾患、障害または状態を「予防する」とみなされる。予防は、疾患、障害または状態の発症が予め定義された期間にわたって遅延した場合、完了したとみなされ得る。
本明細書で使用する場合、用語「組換え」は、クローニング、制限またはライゲーションステップ（例えば、その中に含まれるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する）、および／または天然に見出される産物とは別個の構築物を生じさせる他の手順の、種々の組み合わせの産物であるベクター、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞を指す。
本明細書で使用する場合、用語「処置する」または「処置」は、特定の疾患、障害および／または状態（例えば、ＳＣＤ）の１つ以上の症状、特色および原因を部分的にもしくは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、阻害する、その発症を遅延させる、その重症度を低減させる、および／またはその発生率を低減させる、治療を投与することを意味する。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、以下のうち１つ以上が含まれるがこれらに限定されない：生存率の改善（死亡率の低減）、組織線維症の量の低減、疾患による損傷の程度の減少、疾患の持続時間の減少、および／または疾患に関連する症状の数、程度、もしくは持続時間の低減。この用語には、疾患の症状、合併症、もしくは生化学的徴候の発症を予防するもしくは遅延させる、症状を軽減する、または疾患、状態もしくは障害のさらなる発達を停止もしくは阻害するために、本発明の化合物または薬剤を投与することが包含される。処置は、予防的なもの（疾患の発症を予防するもしくは遅延させるためまたはその臨床的もしくは無症候性の症状の顕在化を防止するため）または疾患が顕在化した後の症状の治療的抑制もしくは軽減であり得る。一部の実施形態では、疾患、状態または障害はＳＣＤである。
抗体
「抗体」または「Ａｂ」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、特異的標的または抗原（Ａｇ）、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどを認識しそれに結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、所与の抗原（例えば、Ｅ－セレクチン）に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、インタクトな抗体の抗原結合性断片（または部分）および任意の他の改変された立体配置の、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子が含まれるがこれらに限定されない、任意の型の抗体を包含し得る。
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどの任意のクラス（またはそのサブクラス）の抗体が含まれ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、その重鎖（ＨＣ）の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、およびこれらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類される。一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体は、ＩｇＧ１抗体である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置は周知である。
抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット（例えば、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット）などが含まれるがこれらに限定されない任意の哺乳動物、または他の動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）、魚類（例えば、サメ）およびラクダ科の動物（例えば、ラマ）などに由来し得る。
用語「抗原」は、抗原を認識する抗体を産生するため、または発現ライブラリー（例えば、とりわけ、ファージ、酵母またはリボソームディスプレイライブラリー）をスクリーニングするために、免疫適格性脊椎動物の免疫化のために使用される分子実体を指す。本明細書で、抗原は、より広い用語であり、抗体によって特異的に認識される標的分子を含むこと、したがって、抗体を生じさせるための免疫化プロセスにおいて、または抗体を選択するためのライブラリースクリーニングにおいて使用される分子の断片または模倣物を含むことを一般に意図する。したがって、Ｅ－セレクチンに結合する本発明の抗体について、そのモノマーおよびマルチマー、例えば、ダイマー、トリマーなどを含む、哺乳動物種（例えば、ヒト、サル（カニクイザルを含む）、マウス、ウサギおよびラット）由来の全長Ｅ－セレクチン、Ｅ－セレクチンの短縮型および他のバリアント（例えば、細胞外ドメイン）、ならびに可溶性Ｅ－セレクチンおよび細胞表面に発現されるＥ－セレクチンが、本明細書において抗原と呼ばれる。
抗体の「抗原結合性断片」は、抗原に（好ましくは、実質的に同じ結合親和性で）特異的に結合する能力を保持する、全長の抗体の１つ以上の断片を指す。全長の抗体の断片によって、抗体の抗原結合機能が発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合性断片」という用語の範囲内に包含される結合性断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３４１：５４４～５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ジスルフィド連結されたＦｖｓ（ｄｓＦｖ）、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体および細胞内抗体が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても公知）を形成している単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されるのを可能にする合成リンカーによって、接合され得る；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２４２：４２３～４２６およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８８ ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３を参照のこと。他の形態の単鎖抗体、例えば、ダイアボディ（diabody）もまた包含される。かかる単鎖抗体もまた抗体の「抗原結合性断片」という用語の範囲内に包含されることが意図される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、これらのドメインをもう一方の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３；９０：６４４４～６４４８；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １９９４；２：１１２１～１１２３を参照のこと）。
抗体「可変ドメイン」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域（ＶＬ）または抗体重鎖の可変領域（ＶＨ）を指す。当該分野で公知のように、重鎖および軽鎖の可変領域は各々、３つの「相補性決定領域」（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。対象可変領域のバリアント、特に、ＣＤＲ領域の外側（即ち、フレームワーク領域内）のアミノ酸残基に置換を有するものが望まれる場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは、保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を、対象可変領域と同じカノニカルなクラス内のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定され得る（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６（４）：９０１～９１７）。
可変ドメイン内の残基は、典型的には、抗体のコンパイルの重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付け体系を提供するＫａｂａｔに従って番号付けされる。Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照のこと。この番号付け体系を使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲを短くすること、または可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲへの挿入に対応して、より少ないまたはさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）、ならびに重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃ）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、抗体の配列の相同性領域を「標準の」Ｋａｂａｔにより番号付けされた配列とアラインメントすることによって決定され得る。Ｋａｂａｔ番号付けを割り当てるための種々のアルゴリズムが入手可能である。例えば、Ａｂｙｓｉｓ（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ）のバージョン２．３．３リリースでインプリメントされるアルゴリズムを使用して、Ｋａｂａｔ番号付けを可変領域ＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３に割り当てることができ、次いで、ＡｂＭ定義をＨＣＤＲ－１に対して使用することができる。
ある特定の実施形態では、ＣＤＲの最終的な線引きおよび抗体の結合性部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解明することおよび／または抗体－リガンド複合体の構造を解明することによって実現される。ある特定の実施形態では、これは、Ｘ線結晶構造解析などの当業者に公知の様々な技術のいずれかによって実現され得る。ある特定の実施形態では、様々な解析方法を使用してＣＤＲ領域を同定または推定することができる。かかる方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、接触定義、およびコンフォメーション定義が含まれるがこれらに限定されない。
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ、接触、Ｎｏｒｔｈおよび／もしくはコンフォメーション定義または当該分野で周知のＣＤＲ決定の任意の方法の定義に従って同定され得る。例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版（超可変領域）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ １９８９；３４２：８７７～８８３（構造的ループ構造）を参照のこと。特定の抗体中のＣＤＲを構成するアミノ酸残基の同一性は、当該分野で周知の方法を使用して決定され得る。ＣＤＲのＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの間の妥協であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用する。
ＣＤＲの「接触」定義は、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６；２６２：７３２～７４５に示される、観察された抗原接触に基づく。ＣＤＲの「コンフォメーション」定義は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基に基づく（例えば、Ｍａｋａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８；２８３：１１５６～１１６６を参照のこと）。Ｎｏｒｔｈは、異なる好ましいセットのＣＤＲ定義を使用して、カノニカルなＣＤＲコンフォメーションを同定している（Ｎｏｒｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１；４０６：２２８～２５６）。ＣＤＲの「コンフォメーション定義」と本明細書で呼ばれる別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として同定され得る（Ｍａｋａｂｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８、２８３：１１５６～１１６６）。なお他のＣＤＲ境界定義は、上記アプローチのうちの１つに厳密に従わなくてもよいが、それにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部分と重複するが、これらは、特定の残基もしくは残基の群またはさらにはＣＤＲ全体であっても抗原結合に顕著には影響しないという予測または実験的知見に照らして、短縮または延長され得る。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含む、当該分野で公知の任意のアプローチによって定義されるＣＤＲを指し得る。本明細書で使用される方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用し得る。１つよりも多くのＣＤＲを含む任意の所与の実施形態について、ＣＤＲ（または抗体の他の残基）は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｎｏｒｔｈ、拡張型（extended）、ＡｂＭ、接触および／またはコンフォメーション定義のいずれかに従って定義され得る。
「接触残基」は、抗体またはそれが特異的に結合する抗原に関して本明細書で使用する場合、同族抗体／抗原上に存在するアミノ酸残基の重原子に対して４Å以下である、少なくとも１つの重原子（即ち、水素ではない）を含む抗体／抗原上に存在するアミノ酸残基を指す。
「フレームワーク」（ＦＲ）残基は、ＣＤＲ残基以外の抗体可変ドメイン残基である。ＶＨまたはＶＬドメインフレームワークは、以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４でＣＤＲが散在する４つのフレームワークサブ領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む。
当該分野で公知のように、抗体の「定常領域」は、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
用語「ＩｇＧ Ｆｃ領域」、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」および「Ｆｃ」は、本明細書で相互交換可能に使用される場合、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のパパイン消化によって得られる結晶化可能な断片と相関する、Ｉｇ分子の部分を指す。本明細書で使用する場合、これらの用語は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除外する抗体の定常領域に関し、その領域の部分にさらに関する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインに対してＮ末端側の可動性ヒンジ、またはそれらの部分を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。
ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃガンマ２およびＣガンマ３）ならびにＣγ１（Ｃガンマ１）とＣγ２（Ｃガンマ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、この番号付けは、Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９６９；６３（１）：７８～８５のＥＵインデックスに従い、Ｋａｂａｔら、１９９１に記載される通りである。典型的には、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常ドメインのアミノ酸残基約２３６～約４４７を含む。例示的なヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインアミノ酸配列は、配列番号１６および配列番号１５に示される（任意選択の末端リジン（Ｋ）残基を含む）。Ｆｃポリペプチドは、単離状態にあるこの領域、または抗体もしくはその抗原結合性断片、またはＦｃ融合タンパク質と関連したこの領域を指し得る。
重鎖定常ドメインは、Ｆｃ領域を含み、ＩｇＧ重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジならびにＣＨ２およびＣＨ３（ならびに、任意選択により、ＩｇＡおよびＩｇＥのＣＨ４）ドメインをさらに含む。
「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列のＦｃ領域のエフェクター機能を少なくとも１つ有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、Ｂ細胞活性化などが含まれる。かかるエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が結合性ドメイン（例えば、抗体可変ドメインまたはその抗原結合性断片）と組み合わされることを必要とし、また、かかる抗体エフェクター機能を評価するための当該分野で公知の様々なアッセイを使用して評価され得る。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。一部の実施形態では、ＦｃγＲは、ネイティブヒトＦｃＲである。一部の実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的スプライシングを受けた形態が含まれるものである。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；１５：２０３～２３４を参照のこと）。ＦｃＲは、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１；９：４５７～９２；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １９９４；４：２５～３４；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１９９５；１２６：３３０～４１に総説されている。今後同定されるものを含めた他のＦｃＲも本明細書の用語「ＦｃＲ」に包含される。
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」にはまた、母系ＩｇＧの胎児への移行（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；１１７：５８７およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；２４：２４９）および免疫グロブリンの恒常性の調節を担う胎児性受容体ＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １９９７；１８（１２）：５９２～５９８；Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７；１５（７）：６３７～６４０；Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４；２７９（８）：６２１３～６２１６；ＷＯ２００４／９２２１９を参照のこと）。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。ある特定の実施形態では、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、および好中球が含まれる。エフェクター細胞は、ネイティブ供給源から、例えば血液から単離され得る。
本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、分泌されたＩｇがある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞に特異的に結合することが可能になり、引き続いて、標的細胞が細胞毒で死滅する、細胞傷害性の形態を指す。ＡＤＣＣの媒介のための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号、同第５，８２１，３３７号または同第６，７３７，０５６号に記載されているものなどを実施することができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１９９８；９５：６５２～６５６に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列を有し、ＡＤＣＣ活性が増加または減少したさらなる抗体は、例えば、米国特許第７，９２３，５３８号、および米国特許第７，９９４，２９０号に記載されている。
「増強されたＡＤＣＣ活性」を有する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＡＤＣＣの媒介に関して親抗体と比較してより有効である抗体を指し、ここで、抗体と親抗体は少なくとも１つの構造的側面が異なり、また、アッセイに使用された場合、かかる抗体と親抗体の量は基本的に同じである。一部の実施形態では、抗体と親抗体は同じアミノ酸配列を有するが、抗体は脱フコシル化されており、一方、親抗体はフコシル化されている。一部の実施形態では、ＡＤＣＣ活性は、本明細書において開示されているｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを使用して決定されるが、ＡＤＣＣ活性を決定するための他のアッセイまたは方法、例えば、動物モデルにおけるものなどが意図されている。一部の実施形態では、増強されたＡＤＣＣ活性を有する抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＩＡに対する増強された親和性を有する。
「変更された」ＦｃＲ結合親和性またはＡＤＣＣ活性を有する抗体は、親抗体と比較して増強されたかまたは減弱したＦｃＲ結合力および／またはＡＤＣＣ活性を有するものであり、ここで、抗体と親抗体は少なくとも１つの構造的側面が異なる。ＦｃＲに対する「結合の増大を示す」抗体は、少なくとも１つのＦｃＲに親抗体よりも良好な親和性で結合する。ＦｃＲに対する「結合の減少を示す」抗体は、少なくとも１つのＦｃＲに親抗体よりも低い親和性で結合する。ＦｃＲに対する結合の減少を示す、かかる抗体は、ＦｃＲに対してはっきりと認められる結合をほとんどまたは全く有さないものであり得、例えば、ネイティブ配列ＩｇＧ Ｆｃ領域と比較してＦｃＲへの結合が０～２０パーセントである。
「ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増強された親和性」は、抗体がＦｃγＲＩＩＩＡに対して親抗体よりも高い親和性を有することを指し、ここで、抗体と親抗体は少なくとも１つの構造的側面が異なる。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的細胞が溶解することを指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の構成要素（Ｃｌｑ）が、それらの同族抗原に結合している抗体（適切なサブクラスのもの）に結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９６；２０２：１６３に記載されているＣＤＣアッセイを実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変更され、Ｃｌｑ結合能が増大または減少した抗体は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、米国特許第７，９２３，５３８号、米国特許第７，９９４，２９０号およびＷＯ１９９９／５１６４２に記載されている。
重鎖定常ドメインは、Ｆｃ領域を含み、ＩｇＧ重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジならびにＣＨ２およびＣＨ３（ならびに任意選択により、ＩｇＡおよびＩｇＥのＣＨ４）ドメインをさらに含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体が重鎖ポリペプチド上にＣ末端リジン（Ｋ）アミノ酸残基を含む（例えば、ヒトＩｇＧ１重鎖は末端リジンを含む）場合、リジン残基を切り取り、それにより、Ｃ末端リジン残基を欠く重鎖を有する抗体を生じさせることができることが、当業者によって理解される。さらに、抗体重鎖は、リジンをコードしない核酸を使用して作出され得る。したがって、一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体は、そうでなければ存在する末端リジンが存在しない重鎖を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）に由来し得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体はＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）はＩｇＧ１抗体である。
「Ｆｃ融合」タンパク質は、１つ以上のポリペプチドがＦｃポリペプチドに作動可能に連結されたタンパク質である。Ｆｃ融合は、免疫グロブリンのＦｃ領域を融合パートナーと組み合わせる。
「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に対して同一なアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域のものと少なくとも１つのアミノ酸の改変によって異なるが、それでもなおネイティブ配列Ｆｃ領域のエフェクター機能を少なくとも１つ保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、例えば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における約１個から約１０個までのアミノ酸の置換、好ましくは、約１個から約５個までのアミノ酸の置換を有する。本明細書のバリアントＦｃ領域は、好ましくはネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域に対して少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、それらに対して少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、それらに対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有することになる。
「エピトープ」は、当該分野で周知の任意の方法によって、例えば、従来のイムノアッセイによってまたは本開示の実施例９および１０に記載されるように決定される、抗体が特異的に結合する抗原のエリアまたは領域、例えば、抗体と相互作用する残基を含むエリアまたは領域を指す。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９の第１１章に記載されるように、抗体－抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイが含まれる、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングするためおよび特徴付けるための当該分野で公知の方法が多く存在する。さらなる例では、エピトープマッピングを使用して、抗Ｅ－セレクチン抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは種々の供給源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ １５、８２１９ ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から市販されている。あるいは、発見プロセスの間に、抗体の生成および特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報を解明することができる。次いで、この情報から、抗体を同じエピトープへの結合について競合的にスクリーニングすることができる。これを達成するための手法は、競合および交差競合試験を行って、Ｅ－セレクチンへの結合について互いに競合するまたは交差競合する抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見つけることである。
さらに、抗Ｅ－セレクチン抗体が結合するエピトープは、系統的なスクリーニングにおいて、Ｅ－セレクチン（例えば、ヒトＥ－セレクチン配列）に由来する重複するペプチドを使用し、抗体の結合を決定することによって決定され得る。遺伝子断片発現アッセイに従って、Ｅ－セレクチンをコードするオープンリーディングフレームを無作為にまたは特定の遺伝子構築物によって断片化することができ、Ｅ－セレクチンの発現された断片の試験される抗体との反応性を決定する。遺伝子断片を、例えばＰＣＲによって作出し、次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、放射性アミノ酸の存在下で転写し、タンパク質に翻訳することができる。次いで、抗体の、放射標識したＥ－セレクチン断片への結合を免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定する。
また、ある特定のエピトープを、ファージ粒子（ファージライブラリー）または酵母（酵母ディスプレイ）の表面上にディスプレイされた無作為なペプチド配列の大きなライブラリーを使用して同定することもできる。あるいは、重複するペプチド断片の定義されたライブラリーを試験抗体への結合について単純な結合アッセイで試験することができる。さらなる例では、抗原の変異誘発、ドメインスワッピング実験およびアラニンスキャニング変異誘発を実施して、エピトープ結合のために要求される、十分である、および／または必要である残基を同定することができる。
その最も詳細なレベルでは、抗原と抗体との間の相互作用のためのエピトープは、抗原－抗体相互作用中に存在する原子接触を定義する空間座標、ならびに結合熱力学へのそれらの相対的寄与についての情報によって、定義され得る。あまり詳細でないレベルでは、エピトープは、抗原と抗体との間の原子接触を定義する空間座標によって特徴付けられ得る。さらにあまり詳細でないレベルでは、エピトープは、具体的な基準によって、例えば、抗体および抗原中の原子（例えば、重原子、即ち、非水素原子）間の距離によって定義される、それが含むアミノ酸残基によって特徴付けられ得る。さらにあまり詳細でないレベルでは、エピトープは、機能を介して、例えば、他の抗体との競合結合によって、特徴付けられ得る。エピトープはまた、別のアミノ酸による置換（例えば、アラニンスキャニングを使用する）が抗体と抗原との間の相互作用の特徴を変更するアミノ酸残基を含むものとして、より一般に定義され得る。
使用されるエピトープマッピング法に依存するエピトープの説明および定義が、異なるレベルの詳細さで得られるという事実から、同じ抗原上の、異なる抗体に対するエピトープの比較は、異なるレベルの詳細さで同様に実施することができるということになる。
アミノ酸レベルで記載される、例えば、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素／重水素交換質量分析（Ｈ／Ｄ－ＭＳ）によって決定されるエピトープは、それらが同じアミノ酸残基のセットを含有する場合、同一であると言える。エピトープは、少なくとも１つのアミノ酸がそれらのエピトープによって共有される場合、重複すると言われる。エピトープは、アミノ酸残基がそれらのエピトープによって共有されない場合、別々（独自）であると言われる。
抗Ｅ－セレクチン抗体を特徴付けるために使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原に結合することが分かっている他の抗体を用いた競合アッセイ（例えば、本開示の実施例９に記載されるように）を使用して、抗Ｅ－セレクチン抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定することである。競合アッセイは当業者には周知である。競合結合によって特徴付けられるエピトープは、対応する抗体の結合が相互に排他的である場合、即ち、１つの抗体の結合が、他の抗体の同時のまたは連続的な結合を排除する場合、重複していると言われる。エピトープは、抗原が、両方の対応する抗体の結合を同時に受け入れることが可能である場合、別々（独自）であると言われる。
エピトープは、線状またはコンフォメーションであり得る。線状エピトープでは、タンパク質と、相互作用する分子（例えば、抗体など）との間の相互作用点は全て、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。「非線状エピトープ」または「コンフォメーションエピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原性タンパク質内の連続していないポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。
抗体の結合親和性は、特定の抗原－抗体相互作用の解離速度を指すＫＤ値として表され得る。ＫＤは、「オフレート（ｋｏｆｆ）」または「ｋｄ」とも呼ばれる解離の速度の、「オンレート（ｋｏｎ）」または「ｋａ」とも呼ばれる会合速度に対する比である。したがって、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（またはｋｄ／ｋａ）と等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、ＫＤが小さいほど、結合の親和性はより強い。抗体についてのＫＤ値は、当該分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。ＫＤを測定するための１つの例示的な方法は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを典型的には使用する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、それらの表面上に固定化された分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）を有するチップからの、抗原の結合および解離を分析することを含む。抗体のＫＤを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを使用すること、典型的には、ＯＣＴＥＴテクノロジー（Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用することによる。あるいは、またはさらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイもまた使用され得る。
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書で相互交換可能に使用される）抗体は、当該分野で十分に理解された用語であり、かかる特異的または優先的結合を決定するための方法もまた、当該分野で周知である。分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）は、それが代替的な細胞または物質と反応または会合するよりも、特定の細胞または物質と、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、および／またはより高い親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。抗体が他の物質に結合する場合よりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、抗体は、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、Ｅ－セレクチンエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、それがＰ－セレクチンおよび／またはＬ－セレクチンエピトープを含む他のＥ－セレクチンエピトープまたは非Ｅ－セレクチンエピトープに結合する場合よりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続時間で特定のエピトープに結合する抗体である。したがって、指定されたアッセイ条件下で、特定された結合部分（例えば、抗体もしくはその抗原結合性断片または受容体もしくはそのリガンド結合性断片）は、特定の標的分子に優先的に結合し、試験サンプル中に存在する他の構成要素には、顕著な量では結合しない。一般に、必ずではないが、結合に対する言及は、優先的結合を意味する。
種々のアッセイフォーマットが、目的の分子に特異的に結合する抗体またはペプチドを選択するために使用され得る。抗原と特異的に反応する抗体、または、同族リガンドもしくは結合パートナーに特異的に結合する受容体もしくはそのリガンド結合性断片を同定するために使用され得る多くのアッセイの中では、例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ（競合結合ＥＬＩＡが含まれる）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）イムノアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）およびウエスタンブロット分析である。典型的には、特異的または選択的反応は、背景シグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、背景の１０倍を超える、背景の５０を超える、背景の１０００倍を超える、またはそれを超える。抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭまたは≦１００ｐＭである場合、抗原に「特異的に結合する」と言われる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体は、＜７０ｎＭ（例えば、６８．４＋／－３．１８ｎＭ）のＫＤでＥ－セレクチン（例えば、ヒトＥ－セレクチン）に結合する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体は、＜６８ｎＭ（例えば、６４．９＋／－１．１３ｎＭ）のＫＤでＥ－セレクチン（例えば、カニクイザルＥ－セレクチン）に結合する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体は、約９２．８５ｎＭ、約７０．３ｎＭ、約６５．２ｎＭ、約６１．８ｎＭ、約６０．５ｎＭ、約６８．０ｎＭ、約２１．６ｎＭ、約３２４ｎＭ、約５４．４ｎＭ、約６２８．５ｎＭおよび２９４０ｎＭからなる群から選択されるＫＤでヒトＥ－セレクチンに結合する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体は、約１３８．５ｎＭ、約７８．３ｎＭ、約７６．５ｎＭ、約８１．５ｎＭ、約６７．８ｎＭ、約４５．８ｎＭ、約２４３．５ｎＭ、約４５．４ｎＭ、約４９２ｎＭおよび３１４５ｎＭの群から選択されるＫＤでカニクイザルＥ－セレクチンに結合する。
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用する場合、抗原への第１の抗体またはその抗原結合性断片の結合が、第２の抗体またはその抗原結合性断片による同じ抗原の引き続く結合を低減させることを意味する。代替的に、抗原への第２の抗体の結合もまた第１の抗体の存在下で検出可能に減少する場合もあり得るが、そうである必要はない。即ち、第１の抗体は抗原への第２の抗体の結合を阻害し得、その第２の抗体によるそのそれぞれのエピトープへの第１の抗体の結合の阻害は伴わない。しかし、各抗体が他の抗体とその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、程度が同じであるかより大きいかより小さいかにかかわらず検出可能に阻害する場合、抗体は、それらのそれぞれのエピトープの結合について互いに「交差競合する」と言える。競合および交差競合抗体のどちらも本発明に包含される。かかる競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、または共通のエピトープもしくはその断片への結合）にかかわらず、本明細書で提供される教示に基づいて、かかる競合および／または交差競合抗体が本明細書に開示される方法に包含され、有用であり得ることが、当業者によって理解される。
標準的な競合アッセイが、２つの抗体が互いに競合するかどうかを決定するために使用され得る。抗体競合についての１つの適切なアッセイには、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーを使用して、典型的には、バイオセンサーシステム（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム）を使用して相互作用の程度を測定することができる、Ｂｉａｃｏｒｅテクノロジーの使用が関与する。例えば、ＳＰＲは、第２の抗体の結合を阻害する１つの抗体の能力を決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合的結合阻害アッセイにおいて使用され得る。抗体競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用する。
さらに、それらの競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスが、国際特許出願公開ＷＯ２００３／４８７３１に記載されている。競合は、１つの抗体（または断片）がＥ－セレクチンへの別の抗体（または断片）の結合を低減させる場合に存在する。例えば、逐次的な結合競合アッセイが使用され得、異なる抗体は逐次的に添加される。第１の抗体は、飽和に近い結合に到達するまで添加され得る。次いで、第２の抗体が添加される。Ｅ－セレクチンへの第２の抗体の結合が検出されない場合、または第１の抗体の非存在下での並行アッセイ（その値が１００％と設定され得る）と比較して、顕著に低減される（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の低減）場合、これら２つの抗体は、互いに競合するとみなされる。
用語「パラトープ」の定義は、上記の「エピトープ」の定義から視点を逆転させることによって引き出される。したがって、用語「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する、抗体のエリアまたは領域、即ち、抗原（Ｅ－セレクチンまたはその断片）と接触する抗体のアミノ酸残基を指し、「接触」は本明細書の他の場所で定義されている通りである。所与の抗体／抗原対のパラトープは、常套的な方法によって同定され得る。例えば、抗体と標的分子を組み合わせることができ、抗体／抗原複合体を結晶化することができる。複合体の結晶構造を決定し、抗体とその標的との間の相互作用の特定の部位を同定するために使用することができる。
一部の実施形態では、抗体は、「バリアント抗体」である。バリアント抗体は、本明細書、特に表２に開示される特定の配列および断片からの、１、２、３、４、５、最大で１０、最大で２０、最大で３０またはそれよりも多くのアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含み得る。「欠失」バリアントは、個々のアミノ酸の欠失、アミノ酸の小さい群、例えば、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の欠失、またはより大きいアミノ酸領域の欠失、例えば、特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特色の欠失を含み得る。「挿入」バリアントは、個々のアミノ酸の挿入、アミノ酸の小さい群、例えば、１、２、３、４もしくは５アミノ酸の挿入、またはより大きいアミノ酸領域の挿入、例えば、特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特色の挿入を含み得る。「置換」バリアントには、好ましくは、１つ以上のアミノ酸の、同じ数のアミノ酸による置き換え、および保存的アミノ酸置換を行うことが関与する。例えば、アミノ酸は、類似の特性を有する代替的アミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸または別の脂肪族アミノ酸で置換され得る。
置換バリアントは、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換変異誘発のために最も目的とされる部位には、超可変領域が含まれるが、フレームワーク変更もまた企図される。保存的置換は、表１中に示される。かかる置換が生物学的活性における変化を生じる場合、以下に示される「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される、より実質的な変化が導入され得、産物がスクリーニングされ得る。
Figure 0007449390000001
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えば、ベータ－シートもしくはらせんコンフォメーションとしての、置換のエリアにおけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに対するそれらの効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、以下の群へと分けられる：
ｉ．非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
ｉｉ．電荷なし極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
ｉｉｉ．酸性（負に荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
ｉｖ．塩基性（正に荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
ｖ．鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
ｖｉ．芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーを、別のクラスと交換することによって行われる。
例えば、行われ得る１つの型の置換は、抗体中の化学的に反応性であり得る１つ以上のシステインを、別の残基、例えば、限定なしに、アラニンまたはセリンに変化させることである。例えば、非カノニカルなシステインの置換が存在し得る。置換は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中、または定常領域中で行われ得る。一部の実施形態では、システインは、カノニカルである。抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化安定性を改善するためおよび異常な架橋結合を防止するために、一般にはセリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、その安定性を改善するために抗体に付加され得る。
「生殖系列化（germlining）」として公知のプロセスでは、ＶＨおよびＶＬ配列中の特定のアミノ酸が、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列中に天然に見出されるアミノ酸と一致するように変異され得る。特に、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、抗体が投与された場合の免疫原性のリスクを低減させるために、生殖系列配列と一致するように変異され得る。本明細書で使用する場合、用語「生殖系列」は、それらが生殖細胞を介して親から子孫に受け継がれるときの、抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。この生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟化の過程の間の組換えおよび超変異事象によって変更された、成熟Ｂ細胞中の抗体をコードするヌクレオチド配列から識別される。特定の生殖系列を「利用する」抗体は、その生殖系列ヌクレオチド配列またはそれが特定するアミノ酸配列と最も密接にアラインするヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。かかる抗体は、生殖系列配列と比較して、頻繁に変異される。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、当該分野で公知である（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照のこと；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２；２２７：７７６～７９８；およびＣｏｘら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；２４：８２７～８３６もまた参照のこと）。
Ｅ－セレクチンに対する抗体
本開示は、Ｅ－セレクチンに結合する抗体およびその抗原結合性断片を提供する。Ｅ－セレクチンは、ＣＤ６２抗原様ファミリーメンバーＥ（ＣＤ６２Ｅ）、内皮－白血球接着分子１（ＥＬＡＭ－１）または白血球－内皮細胞接着分子２（ＬＥＣＡＭ２）としても公知である。
本明細書で使用する場合、用語「Ｅ－セレクチン」には、ヒトＥ－セレクチンのバリアント、アイソフォーム、ホモログ、オルソログおよびパラログが含まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト以外の種からのＥ－セレクチン、例えば、カニクイザルのＥ－セレクチン、ならびに異なる形態のＥ－セレクチンと交差反応する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＥ－セレクチンに対して完全に特異的であり得、種交差反応性を示さなくてもよく（例えば、マウスＥ－セレクチンには結合しない）、他の型の交差反応性を示さなくてもよい（例えば、Ｐ－セレクチンおよび／もしくはＬ－セレクチンには結合しない）。本明細書で使用する場合、用語Ｅ－セレクチンは、文脈上他のように定められない限り、天然に存在するヒトＥ－セレクチンを指す。したがって、「Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片」、「抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片」または他の類似の指定は、Ｅ－セレクチン、そのアイソフォーム、断片または誘導体と特異的におよび／または優先的に会合、結合または反応する任意の抗体またはその抗原結合性断片（本明細書で定義される）を意味する。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１６５８１（アミノ酸２２～６１０）によって示される全長成熟形態のヒトＥ－セレクチンは、本明細書で配列番号１３２として提供される。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ００６９０（アミノ酸２２～６１２）によって示される全長成熟形態のマウスＥ－セレクチンは、本明細書で配列番号１３４として提供される。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｇ８Ｆ３７０（アミノ酸２２～６１０）によって示される全長成熟形態のカニクイザルＥ－セレクチンは、本明細書で配列番号２０１として提供される。
Ｅ－セレクチンは内皮細胞上に発現され、Ｌ－セレクチンは白血球微絨毛上に構成的に発現され、Ｐ－セレクチンは血小板のα－顆粒および内皮細胞のバイベルパラーデ小体に貯蔵される（Ｔｅｄｄｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５；９：８６６～８７３；Ｋａｎａｓら、Ｂｌｏｏｄ １９９６；８８：３２５９～３２８７）。これらのセレクチンは全て、糖タンパク質または糖脂質上にシアリルルイス（ｓＬｅｘ）決定因子を有する炭水化物構造に結合する（Ｃｈａｓｅら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２０１２；４０（４）：８４９～８８５）。Ｐ－およびＬ－セレクチンは最適な結合のためにリガンド上の硫酸化もまた要求するが、一方、リガンドに結合するＥ－セレクチン
は、より許容的であり、シアリルルイス決定因子のみを要求する。Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１（ＰＳＧＬ－１）は白血球上に発現され、全てのセレクチンに結合する。Ｅ－セレクチンは、Ｌ－セレクチンリガンド、ＣＤ４４およびＥ－セレクチンリガンド－１（ＥＳＬ－１）を含めたリガンドとも相互作用する（Ｃｈａｓｅら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２０１２；４０（４）：８４９～８８５；Ｈｉｄａｌｇｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００７；２６（４）：４７７～４８９）。
内皮細胞によるＥ－セレクチンの発現には、低酸素または炎症性の刺激に応答した新しいタンパク質合成が要求される。Ｅ－セレクチンは、内皮への好中球の接着、および、活性化されたαＭβ２インテグリンの極性化された発現を生じさせる内皮における活性化シグナルの波の生成に、極めて重要である（Ｈｉｄａｌｇｏら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００９；１５：３８４～３９１；Ｐｒｕｅｎｓｔｅｒら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；６：６９１５；Ｍａｎｗａｎｉ、＆ Ｆｒｅｎｅｔｔｅ、Ｂｌｏｏｄ ２０１４；１２２：３８９２～３８９８）。Ｅ－セレクチン欠損マウスは、野生型マウスから識別可能な明白な表現型を示さない（Ｌａｂｏｗら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４；１：７０９～７２０）。
内皮細胞Ｅ－セレクチンに加えて、可溶性Ｅ－セレクチン（ｓＥ－セレクチン）が循環中に見出される。循環中へのｓＥ－セレクチン放出の機構は、酵素による切断、または、損傷を受けたもしくは活性化された内皮細胞の排出の結果であり得るが、正確な機構は分かっていない（Ｒｏｌｄａｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３；９０：１００７～１０２０）。ｓＥ－セレクチンの濃度は内皮細胞の表面上でのその発現と相関すると思われ、したがって、血漿中Ｅ－セレクチン濃度は内皮細胞の損傷または活性化のマーカーになり得る（Ｌｅｅｕｗｅｎｂｅｒｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９２；７７（４）：５４３～５４９；Ｒｏｌｄａｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３；９０：１００７～１０２０）。循環可溶性Ｅ－セレクチンレベルのレベルの増加が、高血圧症、糖尿病および高脂血症を含む多数の病態において見出されている（Ｒｏｌｄａｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３；９０：１００７～１０２０）。Ｋａｔｏらは、１６０名のＳＣＤ患者および４１名の対照対象に対する試験を行い、ＳＣＤ患者の血漿中では対照と比較して可溶性Ｅ－セレクチンが有意に上昇していることを見出した（中央値７４．６．４１．５ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．００１）（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈａｅｍ．２００５；１３０：９４３～９５３）。軽度および中等度のレベルの肺高血圧症がｓＥ－セレクチンの直線的濃度と有意に関連し、ＳＣＤ患者の早期死亡率の相対的なリスクが増加した（ＲＲ４．２；９５％ＣＩ２．０、８．９）（Ｋａｔｏら）。
好ましくは、本開示の抗体およびその抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチンに結合するが、他のセレクチン（例えば、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン）には結合しない、またはより低い親和性で結合する。一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、より好ましくは、ヒトおよび／またはカニクイザルＥ－セレクチンに特異的に結合する。本開示は、かかる抗体およびその抗原結合性断片を含む組成物、ならびに、治療的および医薬としての使用を含む、かかる抗体の使用もまた提供する。
抗Ｅ－セレクチン抗体、好ましくは、高親和性抗体（例えば、特異的な抗体）は、Ｅ－セレクチンが内皮細胞の表面上に発現されるかまたは可溶性の形態で見出され、Ｅ－セレクチンリガンドを発現する標的細胞（例えば、好中球、単球、好酸球、メモリーエフェクターＴ様リンパ球、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞）と相互作用すると考えられる、脈管系および複数の組織区画において有効であり得る。本開示の抗体およびその抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチンの、例えば、シアリルルイス（ｓＬｅｘ）決定因子を有する糖タンパク質または糖脂質（例えば、α２，３シアリル化およびα１，３またはα１，４フコシル化四糖シアリルルイスｘ）、シアリルルイスＡ決定因子、Ｅ－セレクチンリガンド－１（ＥＳＬ－１）、Ｌ－セレクチン、ＣＤ４４、Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１（ＰＳＧＬ－１）、リソソーム膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、リソソーム膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）、細胞死受容体－３（ＤＲ３）およびαＭβ２インテグリン（ＣＤ１１b／ＣＤ１８；Ｍａｃ－１）が含まれるリガンドへの結合を阻害する潜在力を有する（Ｃｈａｓｅら、Ａｎｎａｌｓ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇｉｎ．２０１２；４０（４）：８４９～８５９）。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、Ｅ－セレクチン細胞性リガンド相互作用の遮断により、内皮への白血球（例えば、好中球）接着が阻害され、それにより、細胞性凝集体により血流が遮断され、ＶＯＣが導かれることが予防される。
中和または「遮断」抗体は、Ｅ－セレクチンへのその結合が、（ｉ）Ｅ－セレクチンもしくはＥ－セレクチン断片とＥ－セレクチンリガンド、例えばｓＬｅｘ決定因子との間の相互作用を妨害、制限もしくは阻害する；および／または（ｉｉ）Ｅ－セレクチン結合の少なくとも１つの生物学的機能の阻害を生じる、抗体を指す。本開示の抗体による中和を決定するためのアッセイは、本明細書の他の場所に記載されおり、当該分野で周知である。
Ｅ－セレクチンの「生物学的機能」または「生物学的活性」は、白血球テザリング、緩徐なローリングおよび内皮細胞への白血球の安定な接着の活性化、炎症の部位における選択的かつ効率的な血管外遊出シグナル伝達を含む意味である。Ｅ－セレクチンの「生物学的機能」または「生物学的活性」には、とりわけ、当該分野で現在公知のまたは後に同定される、ＰＭＮの減速および急性炎症の部位への輸送を支持するＣＤ１８インテグリンの親和性および結合力、細胞質カルシウム、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼおよびＳｙｋキナーゼを活性化するチロシンリン酸化の増加を媒介することが含まれる。Ｅ－セレクチンの生物学的機能または生物学的活性は、Ｅ－セレクチンとそのリガンドとの間の相互作用によって媒介され得るが、その必要はない。
本開示は、Ｅ－セレクチンの生物学的活性をモジュレートし得る抗体またはその抗原結合性断片を含む。即ち、本発明は、その抗体が、（ａ）内皮細胞への白血球テザリングを減少させる；（ｂ）内皮細胞への安定な接着の活性化を減少させる；（ｃ）白血球を停止させる緩徐なローリングを低減させる；（ｄ）白血球の効率的な経内皮遊走を低減させる；（ｅ）ＣＤ１８インテグリンの親和性および結合力を減少させる；（ｆ）急性炎症の部位への白血球の輸送を低減させる；（ｇ）細胞質カルシウムを減少させる；（ｈ）ｐ３８ ＭＡＰキナーゼおよびＳｙｋキナーゼを活性化するチロシンリン酸化を減少させる；（ｉ）血液から血管内皮への血小板および白血球の動員を低減させる；ならびに／または（ｊ）炎症促進性環境を創出しないような、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、少なくとも１つの検出可能なＥ－セレクチン活性をモジュレートする単離された抗体またはその抗原結合性断片を含む。
Ｅ－セレクチンの生物学的活性は、Ｅ－セレクチン（例えば、可溶性Ｅ－セレクチンまたはＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞）およびリガンド（例えば、可溶性シアリルルイスリガンドまたは細胞表面に発現されるリガンド（例えば、ＨＬ－６０細胞上の））を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ静的中和結合アッセイにおいて評価され得る。Ｅ－セレクチンの結合はまた、可溶性または細胞表面に発現されるタンパク質を使用し、当該分野で公知であり、本開示の実施例の節に示される生理的流動アッセイで評価され得る。Ｅ－セレクチン結合を防止する中和抗体の能力は、漸増濃度の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の非存在下または存在下で、Ｅ－セレクチン（例えば、ヒト、カニクイザル）を発現する細胞を可溶性Ｅ－セレクチンリガンド（シアリルルイス抗原）または細胞表面に発現される（例えば、ＨＬ－６０細胞、ＨＵＶＥＣ、ＣＬＭＥＣ上）Ｅ－セレクチンリガンドと共にインキュベートすることによっても評価され得る。
一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体は、配列番号１１として示される重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号５として示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性断片と、ヒトＥ－セレクチンへの結合について競合する、および／またはそれと同じエピトープに結合する、抗体を包含する。
一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、少なくとも１つのＥ－セレクチンリガンド（例えば、シアリルルイス（ｓＬｅｘ）決定因子を有する糖タンパク質または糖脂質（例えば、α２，３シアリル化およびα１，３またはα１，４フコシル化四糖シアリルルイスｘ）、シアリルルイスＡ決定因子、ＥＳＬ－１、Ｌ－セレクチン、ＣＤ４４、ＰＳＧＬ－１、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＲ３およびαＭβ２インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８；Ｍａｃ－１））とのＥ－セレクチンの結合を阻害するまたは低減させる抗体またはその抗原結合性断片を包含する。
一部の実施形態では、本開示は、リガンドとのＥ－セレクチンの結合を阻害するにあたり、配列番号１１として示される重鎖可変領域のアミノ酸配列および配列番号５として示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体またはその抗原結合性断片を包含する。
一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、例えば、配列番号７または配列番号１３（Ｃ末端リジンを有さない）として示される抗Ｅ－セレクチン重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、カッパ軽鎖定常領域、例えば、配列番号１として示される抗Ｅ－セレクチン軽鎖を含む。
本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体断片（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合により改変された抗体を含む、任意の他の改変された立体配置の、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子を包含し得る。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源もの（キメラまたはヒト化抗体を含む）であり得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体はヒトまたはヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体はキメラ抗体である。
表２は、本明細書に記載されるキメラおよびヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体のアミノ酸およびヌクレオチド配列を提供する。一般に、具体的に示されない限り、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体は、１つ以上のＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体は、表２に示される１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列と表３の配列番号によって定義される特定の抗体の任意の組み合わせを含み得る。抗Ｅ－セレクチンＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、拡張型Ｈ１を伴うＫａｂａｔ定義を使用して定義した。ＨＣＤＲ－１については、最後の残基は、Ｈ３６位の前の任意の挿入物（即ち、Ｈ３５ａ、Ｈ３５ｂ、Ｈ３５ｃなど）を含む。ＣＤＲを以下の通り定義した：ＨＣＤＲ－１（Ｈ２６～Ｈ３５ｃ）、ＨＣＤＲ－２（Ｈ５０～Ｈ６５）、ＨＣＤＲ－３（Ｈ９５～Ｈ１０２）、ＬＣＤＲ－１（Ｌ２４～Ｌ３４）、ＬＣＤＲ－２（Ｌ５０～Ｌ５６）、およびＬＣＤＲ－３（Ｌ８９～Ｌ８７）。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、表２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一なアミノ酸配列を含むＨＣ、ＬＣ、ＶＬドメイン、および／またはＶＨドメインを含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、表２の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な核酸配列によってコードされるＨＣ、ＬＣ、ＶＬドメイン、および／またはＶＨドメインを含む。
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一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１のアミノ酸を含むまたはそれからなるＶＨドメインを含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８および１２８のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み得るＶＨドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８および１２８のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得るＶＨドメインを含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＶＬドメインを含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６および１２２のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み得るＶＬドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６および１２２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るまたはそれからなり得るＶＬドメインを含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号３９、４２または４５のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号６０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７１のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号８０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号９５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよび配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６および１２２のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬドメインならびに配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８および１２８のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６および１２２の少なくとも１つのアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８および１２８の少なくとも１つのアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３をさらに含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、ＬＣＤＲ－３、ならびに配列番号１１のアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２のアミノ酸を含むＬＣＤＲ－１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－２および配列番号４のアミノ酸を含むＬＣＤＲ－３を含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８のアミノ酸を含むＨＣＤＲ－１、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２および配列番号１０のアミノ酸を含むＨＣＤＲ－３を含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－１、配列番号３８、４１または４４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－３を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２、１８、４７、６８、８２、９７または１０６のうちいずれか１つのアミノ酸を含むＬＣＤＲ－１、配列番号３、１９、４８、６９、８３、９８、１０７または１２０のうちいずれか１つのアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－２、および配列番号４、２０、４９、７０、８４、９９、１０８または１２１のアミノ酸を含むＬＣＤＲ－３を含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８、２３、５２、６３、７７、９２、１１１または１２５のアミノ酸を含むＨＣＤＲ－１、配列番号９、２４、２９、３８、４１、４４、５３、６４、７８、９３、１１２または１２６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２、および配列番号１０、５４、６５、７９、９４、１１３または１２７のアミノ酸を含むＨＣＤＲ－３を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２、およびＬＣＤＲ－３アミノ酸配列、ならびにアクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２、およびＨＣＤＲ－３アミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有する、ＡＴＣＣに寄託されたプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＬＣを含み得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
ＬＣは、配列番号１、１７、２６、３１、４６、５６、６７、７２、８１、８６、９６、１０１、１０５、１１５、または１１９のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、抗体ＬＣは、配列番号１、１７、２６、３１、４６、５６、６７、７２、８１、８６、９６、１０１、１０５、１１５、または１１９のうちいずれか１つを含むまたはそれからなるアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７または１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＨＣを含み得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７または１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＨＣを含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７、１３、２２、２８、３４、３７、４０、４３、５１、５９、６２、７４、７６、８９、９１、１０３、１１０、１１７または１２４のうちいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。一部の実施形態では、抗体ＨＣは、配列番号７、１３、２２、２８、３４、３７、４０、４３、５１、５９、６２、７４、７６、８９、９１、１０３、１１０、１１７または１２４のうちいずれか１つを含むまたはそれからなるアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬＣおよび配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＨＣを含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片はエフェクター機能を欠く（即ち、エフェクターヌルである）。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８および１２８のうちいずれか１つのアミノ酸配列（例えば、配列番号１１）を含み、ＩｇＧ１定常ドメイン（例えば、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１定常ドメイン）をさらに含むＶＨドメインを含む重鎖を含み得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１定常ドメインをさらに含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＶＨドメインを含み、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列からなるＩｇＧ１定常ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体はエフェクター機能を欠く。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、（例えば、ヒト）カッパ軽鎖定常領域（例えば、配列番号１４のアミノ酸配列によってコードされる）またはラムダ軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６および１２２のうちいずれか１つのアミノ酸配列（例えば、配列番号５）を含むＶＬドメインを含み、配列番号１４のアミノ酸配列を含むカッパ定常ドメインをさらに含む軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号５のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含み、配列番号１４のアミノ酸配列からなるカッパ定常ドメインをさらに含む軽鎖を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の定常領域を変更、例えば、変異させて、抗体の特性を改変すること（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、および／または補体機能のうち１つ以上を増加または減少させること）ができる。
一部の態様では、抗体、または抗原結合性断片、バリアントは、全長重鎖（例えば、配列番号７または１３のアミノ酸配列のＨＣ）および／または全長軽鎖に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５の保存的もしくは非保存的置換、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５の付加および／または欠失を含む。さらなる態様では、バリアント抗体は、全長重鎖に対して、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、ここで、前記抗体または抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する。さらなる態様では、バリアント抗体は、全長軽鎖（例えば、配列番号１のアミノ酸配列のＬＣ）に対して、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、ここで、前記抗体または抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する。
生殖系列置換
多種多様なアクセプターヒト生殖系列配列が入手可能であり、ヒトにおける使用のために非ヒト種抗体を「ヒト化」するプロセスは当該分野で周知であり、本明細書の他の場所でも議論されている。したがって、マウス、ラットなどからの上記のＣＤＲ配列をヒト可変ドメインアミノ酸配列の状況に置くことができることが、当業者によって理解される。そうすることで、元の親（即ち、ドナー）抗体の抗体結合および他の望ましい特徴を保存するためにアクセプターヒト生殖系列配列の変化を一般に行うことができる。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＷ）の両方を以下の通り操作することができる。
ある特定の実施形態では、置換は、（ドナー）ＣＤＲ残基が、例えば、どちらも全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／００７３３９５号およびＴｏｗｎｓｅｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０１５；１１２（５０）：１５３５４～１５３５９に記載されるように、ヒトアミノ酸含量を増加させ、抗体の免疫原性を潜在的に低減させるように、対応するヒト生殖系列（アクセプター）残基で置き換えられる、ヒト生殖系列置換である。
抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト生殖系列ＶＨフレームワーク配列を含むＶＨフレームワークを含み得る。一部の態様では、以下の生殖系列からのＶＨフレームワークが使用され得る：ＩＧＨＶ１－２＊０２、ＩＧＨＶ１－３＊０１、ＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＩＧＨＶ１－６９＊０１、ＩＧＨＶ１－６９＊０２、ＩＧＨＶ１－８＊０１、ＩＧＨＶ３－７＊０１、ＩＧＨＶ３－１３＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０４、ＩＧＨＶ３－３０＊０１、ＩＧＨＶ３－３０＊１８、ＩＧＨＶ５－１０－１＊０１、ＩＧＨＶ５－１０－１＊０４またはＩＧＨＶ５－５１＊０１（生殖系列の名称は、ＩＭＧＴ生殖系列定義に基づく）。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片には、生殖系列ＩＧＨＶ３－７＊０１からのＶＨフレームワーク（配列番号２０２）が使用される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片には、ＣＤＲ領域については生殖系列ＩＧＨＶ３－７＊０１からのＶＨフレームワーク（配列番号２０２）およびフレームワーク領域についてはＩＧＨＪ４＊０１からのＶＨフレームワーク（配列番号２０３）が使用される。
好ましいヒト生殖系列軽鎖フレームワークは、ＶκまたはＶλ生殖系列に由来するフレームワークである。一部の態様では、以下の生殖系列からのＶＬフレームワークが使用され得る：ＩＧＫＶ１－１２＊０１、ＩＧＫＶ１－１３＊０２、ＩＧＫＶ１－３３＊０１、ＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＩＧＫＶ１－５＊０１、ＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＩＧＫＶ３－１５＊０１、ＩＧＫＶ３－２０＊０１、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０＊０２およびＩＧＫＶ４－１＊０１（生殖系列の名称は、ＩＭＧＴ生殖系列定義に基づく）。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片には、生殖系列ＩＧＨＶ１－３９＊０１からのＶＬフレームワーク（配列番号２０４）が使用される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片には、ＣＤＲ領域については生殖系列ＩＧＨＶ１－３９＊０１からのＶＬフレームワーク（配列番号２０４）およびフレームワーク領域についてはＩＧＫＪ１＊０１からのＶＬフレームワーク（配列番号２０５）が使用される。
あるいは、またはさらに、フレームワーク配列は、ヒト生殖系列コンセンサスフレームワーク配列、例えば、ヒトＶλ１コンセンサス配列、Ｖκ１コンセンサス配列、Ｖκ２コンセンサス配列、Ｖκ３コンセンサス配列、ＶＨ３生殖系列コンセンサス配列、ＶＨ１生殖系列コンセンサス配列、ＶＨ５生殖系列コンセンサス配列、またはＶＨ４生殖系列コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列フレームワークの配列は、種々の公的データベース、例えば、Ｖ－ｂａｓｅ、ＩＭＧＴ、ＮＣＢＩまたはＡｂｙｓｉｓから入手可能である。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト生殖系列ＶＬフレームワーク配列を含むＶＬフレームワークを含み得る。ＶＬフレームワークは、それが由来した生殖系列との機能的および構造的類似性をなおも保持しつつ、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含み得る。一部の態様では、ＶＬフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＬフレームワーク配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト生殖系列ＶＬフレームワーク配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換、付加または欠失を含むＶＬフレームワークを含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換、付加または欠失は、フレームワーク領域中のみにある。一部の実施形態では、パーセント同一性は、本明細書でＣＤＲと定義される部分を除いたＶＬドメインとの類似性に基づく。
ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、例えば、ＩＧＫＶ１－３９＊０１のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、例えば、ＩＧＫＶ１－３３＊０１のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＬフレームワークは、Ｖλ、Ｖλ１、Ｖλ３、Ｖκ、Ｖκ１、Ｖκ２またはＶκ３を含むヒトコンセンサス配列のうちいずれか１つのフレームワークであり得る。
一部の実施形態では、ＶＬフレームワークは、ＩＧＫ－３９＊０１＿ＩＧＫＪ１＊０１である。他の類似のフレームワーク領域もまた、配列番号２～４、１８～２０、４７～４９、６８～７０、８２～８４、９７～９９、１０６～１０８、１２０および１２１のＣＤＲ；ならびに、それぞれ、ＩＧＫＶ１－１２＊０１、ＩＧＫＶ１－１３＊０２、ＩＧＫＶ１－３３＊０１、ＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＩＧＫＶ１－５＊０１、ＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＩＧＫＶ３－１５＊０１、ＩＧＫＶ３－２０＊０１、ＩＧＫＶ３Ｄ－２０＊０２、およびＩＧＫＶ４～１＊０１のうちいずれか１つのフレームワーク領域に対して９９％、９７％、９７％、９６％、８０％、７６％、７４％および６６％の同一性を含み得る、以下のＶＬアミノ酸配列によって特定されるＣＤＲ：配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７１、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６、１２２を含む本発明の有利な抗体を送達することが予測される。一部の実施形態では、パーセント同一性は、本明細書においてＣＤＲとして定義されている部分を除いたＶＬとの類似性に基づく。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト生殖系列ＶＨフレームワーク配列を含むＶＨフレームワークを含み得る。ＶＨフレームワークは、それが由来した生殖系列との機能的および構造的類似性をなおも保持しつつ、１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失を含み得る。一部の態様では、ＶＨフレームワークは、ヒト生殖系列ＶＨフレ０ムワーク配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１０％同一である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト生殖系列ＶＨフレームワーク配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換、付加または欠失を含むＶＨフレームワークを含む。一部の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換、付加または欠失は、フレームワーク領域中のみにある。一部の実施形態では、パーセント同一性は、本明細書でＣＤＲと定義される部分を除いたＶＨドメインとの類似性に基づく。
ヒト生殖系列ＶＨフレームワークは、例えば、ＩＧＨＶ３－７＊０１のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＨフレームワークは、例えば、ＩＧＨＶ１－４６＊０１のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＨフレームワークは、例えば、ＩＧＨＶ１－６９＊０１であり得る。ヒト生殖系列ＶＨフレームワークは、ヒトＶＨ生殖系列コンセンサス配列のフレームワークであり得る。ヒト生殖系列ＶＨフレームワークは、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＨ１またはＶＨ４を含むヒト生殖系列コンセンサス配列のフレームワークであり得る。
一部の実施形態では、ＶＨフレームワークは、ＩＧＨＶ３－７＊０１である。他の類似のフレームワーク領域もまた、配列番号８～１０、２３、２４、２９、３８、４１、４４、５２～５４、６３～６５、７７～７９、９２～９４、１１１～１１３、１２５～１２７のＣＤＲ、および以下：それぞれ、ＤＰ－５４のＦＷ領域に対して９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％同一性および共通の構造的特色に１つまたは少数のアミノ酸差異を含み得る（Ｋａｂａｔ番号付け）、ＩＧＨＶ１－２＊０２、ＩＧＨＶ１－３＊０１、ＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＩＧＨＶ１－６９＊０１、ＩＧＨＶ１－６９＊０２、ＩＧＨＶ１－８＊０１、ＩＧＨＶ３－７＊０１、ＩＧＨＶ３－１３＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０１、ＩＧＨＶ３－２３＊０４、ＩＧＨＶ３－３０＊０１、ＩＧＨＶ３－３０＊１８、ＩＧＨＶ５～１０－１＊０１、ＩＧＨＶ５～１０－１＊０４、またはＩＧＨＶ５～５１＊０１を含む、配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８、１２８のＶＨアミノ酸配列のいずれかによって特定されるＣＤＲを含む本発明の有利な抗体を送達することが予測される。一部の態様では、パーセント同一性は、本明細書においてＣＤＲとして定義されている部分を除いたＶＨドメインとの類似性に基づく。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。これらのＶＬおよびＶＨ配列の任意の組み合わせも本発明に包含される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号７もしくは配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＨＣ；および／または（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣを含む。これらのＨＣおよびＬＣ配列の任意の組み合わせも本発明に包含される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）に由来し得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体はＩｇＧ１抗体である。
抗Ｅ－セレクチン抗体の生物学的活性
本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、Ｅ－セレクチン上のエピトープの結合に加えて、生物学的活性を媒介し得る。即ち、本開示は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、以下から選択される少なくとも１つの検出可能な活性を媒介する単離された抗体またはその抗原結合性断片を含む：
（ｉ）ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合すること
（ｉｉ）カニクイザルＥ－セレクチンに特異的に結合すること；
（ｉｉｉ）可溶性Ｅ－セレクチン（例えば、ヒト、カニクイザル）とＥ－セレクチンリガンド（例えば、シアリルルイスＡおよび／またはシアリルルイスＸリガンド）との間の相互作用（例えば、結合）を低減させる、阻害するおよび／または中和すること；
（ｉｖ）細胞表面に発現されるＥ－セレクチン（例えば、ヒト、カニクイザル）とＥ－セレクチンリガンド（例えば、シアリルルイスＡおよび／またはシアリルルイスＸリガンド）との間の相互作用（例えば、結合）を低減させる、阻害するおよび／または中和すること；
（ｖ）細胞表面に発現されるＥ－セレクチン（例えば、ヒト、カニクイザル）と細胞表面に発現されるＥ－セレクチンリガンド（例えば、例えばＨＬ－６０細胞上のシアリルルイスＡおよび／またはシアリルルイスＸリガンド）との間の相互作用（例えば、接着）を低減させる、阻害するおよび／または中和すること；
（ｖｉ）可溶性Ｅ－セレクチンのＥ－セレクチンリガンドを発現する細胞（例えば、ＨＬ－６０）との相互作用（例えば、接着）を低減させる、阻害するおよび／または中和すること；
（ｖｉｉ）静的条件下および生理的流動条件下で、Ｅ－セレクチンリガンドを発現する細胞（例えば、ＨＬ－６０）のＥ－セレクチンを発現する細胞への接着を低減させる、阻害するおよび／または中和すること；
（ｖｉｉｉ）生理的流動条件下で、活性化されたヒト好中球のＥ－セレクチンを発現する細胞（例えば、ヒトおよびカニクイザル）への接着を低減させる、阻害するおよび／または中和すること；
（ｉｘ）ヒトＥ－セレクチンのＴ７、Ｅ８、Ａ９、Ｍ１０、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２およびＫ１１３から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に結合すること；
（ｘ）２５℃で、約１８７ｍｇ／ｍＬの濃度で約３８＋／－７ｃＰの粘度を有すること；
（ｘｉ）３ｍｇ／ｋｇの用量でＳＣ投与した場合に約２１．５日間（５１８時間）の半減期を有すること；
（ｘｉｉ）高濃度における高度の熱安定性および最小限の凝集を含めた、適切な製剤特性を示すこと；ならびに
（ｘｉｉｉ）大規模製造条件で再現性のある発現および純度を示し得ること。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、可溶性ヒトＥ－セレクチンについて、２００ｎＭ以下、例えば、１９５ｎＭ以下、１９０ｎＭ以下、１８０ｎＭ以下、１６０ｎＭ以下、１４０ｎＭ以下、１２０ｎＭ以下、１１０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下である、ＫＤとして表される結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、可溶性ヒトＥ－セレクチンについて、ＳＰＲによって測定した場合に、２００ｎＭ以下である、ＫＤとして表される結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、可溶性ヒトＥ－セレクチンについて、例えば、ＳＰＲによって測定した場合に、約６１．８～約６８．４＋／－３．１８ｎＭである、ＫＤとして表される結合親和性を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、可溶性カニクイザルＥ－セレクチンについて、２００ｎＭ以下、例えば、１９５ｎＭ以下、１９０ｎＭ以下、１８０ｎＭ以下、１６０ｎＭ以下、１４０ｎＭ以下、１２０ｎＭ以下、１１０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下である、ＫＤとして表される結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、可溶性カニクイザルＥ－セレクチンについて、例えば、ＳＰＲによって測定した場合に、約６４．９＋／－１．１３ｎＭ～約８１．５ｎＭである、ＫＤとして表される結合親和性を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、５０ｎＭ以下、例えば、４８ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２５ｎＭ以下または０．１ｎＭ以下である、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、約０．６６ｎＭである、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、５０ｎＭ以下、例えば、４８ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２５ｎＭまたは０．１ｎＭ以下である、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、約０．７５ｎＭである、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、細胞表面に発現されるヒトＰ－セレクチンに対して、例えば、ＦＡＣＳによって測定した場合に、３５０ｎＭ以上、例えば、４００ｎＭ以上、４５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、５５０ｎＭ以上、６００ｎＭ以上、６５０ｎＭ以上またはそれよりも大きい、ＥＣ５０として表される結合親和性を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、可溶性ラット、マウスもしくはウサギＥ－セレクチンまたは可溶性ヒトＬ－もしくはＰ－セレクチンに対して、弱い結合を有するまたは結合を有さない。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、可溶性ラット、マウスもしくはウサギＥ－セレクチンまたは可溶性ヒトＬ－もしくはＰ－セレクチンに対して、例えば、ＳＰＲによって測定した場合に、４０５ｎＭまで、結合が実証されない。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、可溶性マウスまたはラットＥ－セレクチンに対して、例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１３３．３ｎＭまで、弱い非飽和結合（例えば、＞１００分の１）を示す。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、２ｎＭ以下、例えば、０．０１０ｎＭ以下、０．０１５ｎＭ以下、０．０２０ｎＭ以下、０．０２５ｎＭ以下、０．０３０ｎＭ以下、０．０３５ｎＭ以下、０．０４０ｎＭ以下、０．０４５ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０５５ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０６５ｎＭ以下、０．０７０ｎＭ以下、０．０７５ｎＭ以下、０．０８０ｎＭ以下、０．０８５ｎＭ以下、０．０９０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．１２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．９５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１．８ｎＭ以下または１．９ｎＭ以下のＥＣ５０で可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約０．０８５ｎＭ～約０．１２のＥＣ５０で可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を、例えば、ＡｌｐｈａＬｉｓａ同種競合アッセイによって測定した場合に、２ｎＭ以下、例えば、０．０１０ｎＭ以下、０．０１５ｎＭ以下、０．０２０ｎＭ以下、０．０２５ｎＭ以下、０．０３０ｎＭ以下、０．０３５ｎＭ以下、０．０４０ｎＭ以下、０．０４５ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０５５ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０６５ｎＭ以下、０．０７０ｎＭ以下、０．０７５ｎＭ以下、０．０８０ｎＭ以下、０．０８５ｎＭ以下、０．０９０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．１２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．９５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１．８ｎＭ以下または１．９ｎＭ以下のＥＣ５０で中和する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、１ｎＭ以下、例えば、０．０１０ｎＭ以下、０．０１５ｎＭ以下、０．０２０ｎＭ以下、０．０２５ｎＭ以下、０．０３０ｎＭ以下、０．０３５ｎＭ以下、０．０４０ｎＭ以下、０．０４５ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０５５ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、０．０６５ｎＭ以下、０．０７０ｎＭ以下、０．０７５ｎＭ以下、０．０８０ｎＭ以下、０．０８５ｎＭ以下、０．０９０ｎＭ以下、０．１０ｎＭ以下、０．１２ｎＭ以下、０．１５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下または０．９５ｎＭ以下のＥＣ５０で可溶性カニクイザルＥ－セレクチンに結合する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、直接結合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、０．０７１ｎＭ～０．０９３ｎＭのＥＣ５０で可溶性カニクイザルＥ－セレクチンに結合する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、約１ｎＭ～約３ｎＭのＩＣ５０、好ましくは約１．２ｎＭのＩＣ５０で、ヒト血清中の遊離可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約２．８７ｎＭ～約３．０１ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性カニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約２．３９ｎＭ～約２．９１ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性カニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、５０ｎＭ以下、例えば、４８ｎＭ以下、４５ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約１．８８ｎＭ～約２．８９ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの結合を中和する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約１．４７ｎＭ～約２．６５ｎＭのＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの結合を中和する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で測定した場合に、約３．３６ｎＭ～約４．７ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、静置条件下で測定した場合に、約３．８４ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの接着を阻害する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、１００ｎＭ以下、例えば、９５ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約４．２５ｎＭ～約４．５６ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約４．３２ｎＭ～約４．３５ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの接着を阻害する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、３００ｎＭ以下、例えば、２９０ｎＭ以下、２８０ｎＭ以下、２７０ｎＭ以下、２６０ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約１３．２８ｎＭ～約１５．９４ｎＭのＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンド（例えば、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンド）を発現する細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約２．８７ｎＭ～約４．６５ｎＭまたは９．４５ｎＭ～約１６．３３ｎＭのＩＣ５０で、活性化されたヒト好中球の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチン、または細胞表面に発現されるカニクイザルＥ－セレクチンへの接着を阻害する。一部の実施形態では、好中球はＴＮＦ－αによって活性化される。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約６．１７ｎＭ～約１８．６６ｎＭのＩＣ５０で、ＳＣＤ患者からの血液細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、例えば、生理的流動条件下で測定した場合に、約１２．４ｎＭのＩＣ５０で、ＳＣＤ患者からの血液細胞の、可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば競合アッセイによって、例えばＯｃｔｅｔバイオセンサーを使用して決定した場合に、ヒトＥ－セレクチンの３つのエピトープのうち少なくとも１つに結合する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｍ１０、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１１３およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、ヒトＥ－セレクチンの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれよりも多くのアミノ酸残基に結合する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、ヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｍ１０、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２およびＫ１１３と相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、３．８Å以内の、Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれよりも多くのアミノ酸残基と相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、３．８Å以内の、ヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１およびＫ１１２と相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、埋没表面積（Å２）が＞５Å２である、Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２、Ｋ１１３およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれよりも多くのアミノ酸残基と相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、埋没表面積（Å２）が＞５Å２である、ヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２およびＫ１１３と相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、Ｅ８、Ｓ４７、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個またはそれよりも多くのアミノ酸残基と水素結合によって相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、ヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｅ８、Ｓ４７、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０およびＫ１１２と水素結合によって相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、Ｋ１１１、Ｋ１１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と塩橋によって相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、ヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｋ１１１およびＫ１１２と塩橋によって相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、Ｒ９７、Ｋ１１２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つのアミノ酸残基と水を介した水素結合によって相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、ヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｒ９７およびＫ１１２と水を介した水素結合によって相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、３．８Å以内のｓＬｅｘアミノ酸残基接触部とも相互作用する、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるヒトＥ－セレクチンの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、またはそれよりも多くのアミノ酸残基と相互作用する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により、結晶構造に従って、３．８Å以内のｓＬｅｘアミノ酸残基接触部とも相互作用するヒトＥ－セレクチンのアミノ酸残基Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５およびＥ１０７と相互作用する。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の、ヒトＥ－セレクチンの少なくとも１つ、または複数のアミノ酸残基との結合または相互作用は、本明細書の実施例に記載されるように、結合した分子の結晶構造の解析を含めた当該分野で公知の方法に従って決定され得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、ＡＣ－ＳＩＮＳアッセイ、ＤＮＡ結合アッセイおよび／またはインスリン結合アッセイによって測定した場合に、多反応性のリスクが低い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、免疫原性リスクが低く、例えば、約－４４、－４５、－４６または－４７のＴ－ｒｅｇ調整済スコアを有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、ＩＶ投与したところ、以下から選択される少なくとも１つの予測されたヒト薬物動態学的（ＰＫ）パラメーターを示した：（ｉ）全身クリアランスが約０．１５ｍＬ／ｈ／ｋｇ～約０．３９ｍＬ／ｈ／ｋｇ；（ｉｉ）定常状態での見かけの分布容積が２２ｍＬ／ｋｇ～３６ｍＬ／ｋｇ；（ｉｉｉ）平均半減期が約１０２時間～約３４５時間。一部の実施形態では、ＳＣ投与された抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、約２４３～約５１８時間の半減期を示す。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の平均半減期は、０．３ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後、少なくとも約１０２時間（約４．２５日）である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の平均半減期は、０．６ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後、少なくとも約２６４時間（約１１日間）である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の平均半減期は、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後、少なくとも約１８８時間（約７．８日間）である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の平均半減期は、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＩＶ投与後、少なくとも約３４５時間（約１４．４日間）である。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の平均半減期は、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＣ投与後、少なくとも約２４３時間（約１０日間）である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の平均半減期は、３．０ｍｇ／ｋｇの用量でのＳＣ投与後、少なくとも約５１８時間（約２１．５日間）である。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、２５℃で、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合に、約２３ｍｇ／ｍＬの濃度で約７．９７＋／－１．８３ｃＰ、約４８ｍｇ／ｍＬの濃度で約１２．３８＋／－５．２８ｃＰ、約９０ｍｇ／ｍＬの濃度で約４．２６＋／－０．６ｃＰ、約１０２ｍｇ／ｍＬの濃度で約５．５８＋／－０．９９ｃＰ、約１２１ｍｇ／ｍＬの濃度で約８．４４＋／－１．５４ｃＰ、約１４０ｍｇ／ｍＬの濃度で約９．７８＋／－２．３２ｃＰ、約１５８ｍｇ／ｍＬの濃度で約１７．４７＋／－３．２４ｃＰおよび約１８８ｍｇ／ｍＬの濃度で約３７．９９＋／－７．０３ｃＰからなる群から選択される粘度を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、２５℃で、例えばＤＬＳによって測定した場合に、約１５０ｍｇ／ｍＬ～約１９０ｍｇ／ｍＬの濃度で約１５ｃＰ～４０ｃＰの粘度を有する。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、２５℃で、例えばＡｎｔｏｎ Ｐａｒｒ法によって測定した場合に、１８５．７ｍｇ／ｍＬで３３．４ｃＰの粘度を有する。
免疫原性
免疫原性は、抗体およびＦｃ融合タンパク質が含まれるタンパク質治療薬の開発および利用に対する主な障壁である。タンパク質配列、投与の経路および頻度、ならびに患者集団が含まれるがこれらに限定されないいくつかの因子が、タンパク質免疫原性に寄与し得る。免疫応答は、典型的には、マウス抗体などの非ヒトタンパク質に対して最も激しいが、主にまたは完全にヒト配列内容を有する治療薬であっても、免疫原性であり得る。免疫原性は、外来として把握される物質に対する複雑な一連の応答であり、これには、中和および非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、肥満細胞活性化、炎症ならびにアナフィラキシーが含まれ得る。望まれない免疫応答は、抗原認識を直接妨害すること、エフェクター分子との相互作用を変更すること、または治療薬の血清半減期もしくは組織分布を乱すことによって、抗体およびＦｃ融合タンパク質治療薬の効力を低減させ得る。
タンパク質治療薬は、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、Ｒ．Ｉ．のＥｐｉｖａｘ，Ｉｎｃ．によって提供されるような市販のサービスを使用して、潜在的な免疫原性エピトープの存在を予測するために分析され得る。潜在的な免疫原性エピトープはまた、ＩＥＤＢコンセンサス法などの方法を使用しても予測され得る。一部の実施形態では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムが、クラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合するエピトープを予測できる。かかるアルゴリズムを用いたポリペプチドのデータセットの分析は、予測されたエピトープを提供する。予測されたエピトープは、自動ペプチド合成または組換えＤＮＡ技術の標準的な方法によって調製されるペプチドを作製するために使用される。Ｅｐｉｖａｘから提供されたスコアリング情報は、集団中に認識された予測されたエピトープがどのように広がっているかの指標を提供し得る。より低いスコアは、より低い免疫原性潜在力を予測する。
本明細書で使用する場合、「Ｔ－レジトープ」は、天然の調節性Ｔ細胞を活性化し、望まれない免疫応答を低減させることが潜在的にできる、モノクローナル抗体フレームワーク領域内のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、８、７、６、５、４、３、２、１または０の非生殖系列Ｔ細胞エピトープを含む。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、免疫原性リスクが低く、例えば、約－４５．１１、－４５．３２、－４６．１６または－４６．２６のＴ－ｒｅｇ調整済スコアを有する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、約－４５．１１のＴ－ｒｅｇ調整済スコアおよび０の非生殖系列Ｔ細胞エピトープを有する。
抗Ｅ－セレクチン抗体をコードする核酸
本開示は、本明細書に記載される抗体部分および改変抗体を含む本発明の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドもまた提供する。本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法もまた提供する。当該分野で公知の手順によって、ポリヌクレオチドは作製され得、タンパク質は発現され得る。
所望の抗体またはその抗原結合性断片およびかかる抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸の配列は、標準的な配列決定技術を使用して決定され得る。所望の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子は、組換え産生および特徴付けのために、種々のベクター（例えば、クローニングおよび発現ベクター）中に挿入され得る。重鎖または重鎖の抗原結合性断片をコードする核酸分子、および軽鎖または軽鎖の抗原結合性断片をコードする核酸分子は、同じベクターまたは異なるベクター中にクローニングされ得る。
一部の実施形態では、本開示は、以下の抗Ｅ－セレクチン抗体およびその抗原結合性断片のいずれかのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する：抗体１４４４、０８４１、０９７８、０１６４、１４４８、１２８４、１２８２、０５２５、００３９、０２６５＿０２５４、０１５８、０９２９＿５４８、０１５９、０９５５＿０３００、０１７０、０５６４、０１８０および００２７。一実施形態では、本発明は、抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４およびその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号７、１３、２２、２８、３４、３７、４０、４３、５１、５９、６２、７４、７６、８９、９１、１０３、１１０、１１７および１２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の抗Ｅ－セレクチン抗体ＨＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる抗Ｅ－セレクチン抗体ＨＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１、１７、２６、３１、４６、５６、６７、７２、８１、８６、９６、１０１、１０５、１１５および１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の抗Ｅ－セレクチン抗体ＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる抗Ｅ－セレクチン抗体ＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１、２５、３０、３５、３９、４２、４５、５５、６０、６６、７５、８０、９０、９５、１０４、１１４、１１８および１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＨドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＨドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号５、２１、２７、３２、５０、５７、７、７３、８５、８７、１００、１０２、１０９、１１６および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む１つ以上の抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＬドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＬドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、抗体１４４４のＨＣドメインをコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は、抗体１４４４のＬＣをコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた提供する。さらに、本発明は、抗体１４４４のＶＨドメインをコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、抗体１４４４のＶＬドメインをコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドをさらに提供する。
本発明は、抗体１４４４のＨＣＤＲ－１、ＨＣＤＲ－２およびＨＣＤＲ－３をコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列、ならびに抗体１４４４のＬＣＤＲ－１、ＬＣＤＲ－２およびＬＣＤＲ－３をコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列、を含むポリヌクレオチドもまた提供する。
本発明は、抗体１４４４のＶＨドメインをコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列、および、抗体１４４４のＶＬドメインをコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた提供する。
本発明は、抗体１４４４の重鎖をコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドの挿入物の核酸配列、および、抗体１４４４の軽鎖をコードする、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドの挿入物の核酸配列を含むポリヌクレオチドもまた提供する。
一部の実施形態では、本開示は、抗Ｅ－セレクチン抗体をコードするポリヌクレオチドおよびそのバリアントを提供し、かかるバリアントポリヌクレオチドは、表２に開示される核酸配列のいずれかに対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の核酸配列同一性を共有する。これらの量は限定を意味せず、列挙されたパーセンテージ間の増分は、本開示の一部として具体的に想定される。
一実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインもしくはその抗原結合性断片、または全長ＨＣもしくはＬＣは、別々のポリヌクレオチドによってコードされる。あるいは、ＶＨおよびＶＬもしくはその抗原結合性断片、またはＨＣおよびＬＣは共に、単一のポリヌクレオチドによってコードされる。
任意のかかる配列に対して相補的なポリヌクレオチドもまた、本開示によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子には、イントロンを含み、一対一の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が含まれる。さらなるコードまたは非コード配列が、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいがその必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体材料に連結されてもよいがその必要はない。
ポリヌクレオチドは、抗体もしくはその断片をコードする核酸配列を含み得、またはかかる配列のバリアントを含み得る。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの結合特徴がネイティブ抗体分子と比較して減弱されるような、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含む。バリアント核酸配列によってコードされるポリペプチドの結合特徴に対する影響は、一般に、本明細書に記載されるように評価され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、いずれの置換、付加、欠失および／もしくは挿入も含まない元の（親）抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を示す。これらのパーセント同一性は限定を意味せず、列挙されたパーセンテージ間の増分は、本開示の一部として具体的に想定される。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、本明細書に記載されるように、最大の対応を求めてアラインした場合に同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」は、本明細書で使用する場合、少なくとも約２０、通常は３０～約７５または４０～約５０連続する位置のセグメントを指し、ここで、配列は、２つの配列を最適にアラインした後に、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％同一である。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＬドメインは、配列番号１３７、１４５、１４７、１４９、１５４、１６５、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＬドメインは、配列番号１３７、１４５、１４７、１４９、１５４、１６５、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４からなる群から選択される核酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＬドメインは、配列番号１３７の核酸配列に対して少なくとも９０％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＬドメインは、配列番号１３７の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＨドメインは、配列番号１３６、１４４、１４６、１４８、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１および１７３からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＨドメインは、配列番号１３６、１４４、１４６、１４８、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１および１７３からなる群から選択される核酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＨドメインは、配列番号１３６に対して少なくとも９０％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＶＨドメインは、配列番号１３６の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＨＣは、配列番号２０６または２０７に対して少なくとも９０％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＨＣは、配列番号２０６または１３８の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドによってコードされる。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＬＣは、配列番号１３９に対して少なくとも９０％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体ＬＣは、配列番号１３９の核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
ポリヌクレオチドバリアントはまた、またはあるいは、遺伝子、またはその断片もしくは相補体に対して実質的に相同であり得る。かかるポリヌクレオチドバリアントは、抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補的配列）に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能である。
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で事前洗浄すること；約５０℃～６５℃、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）で一晩ハイブリダイズさせること；その後、０．１％ＳＤＳを含む２×、０．５×および０．２×ＳＳＣの各々で、６５℃で２０分間２回洗浄すること、を含む。
本明細書で使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、以下の条件である：（１）洗浄のために、低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間に、変性剤、例えば、ホルムアミド、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５と共に、４２℃で使用する；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃および５０％ホルムアミド中で５５℃での洗浄、その後の、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる５５℃での高ストリンジェンシー洗浄を使用する。当業者は、例えば、プローブ長さなどの因子に適応するために、必要に応じて、温度、イオン強度などを調整する方法を認識する。
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小限の相同性を保有する。即ち、２０種の天然アミノ酸をコードする６４種の異なるコドンが存在し、一部のアミノ酸はそれをコードするコドンを多数有する（例えば、６種の異なるコドンがロイシンをコードする）。したがって、多数の核酸配列が同じタンパク質配列をコードし得、したがって、同じポリペプチドアミノ酸配列をコードする２つの核酸は、非常に低い核酸配列同一性を共有し得る。したがって、コドン使用の差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、本開示によって具体的に企図される。
さらに、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本開示の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの１つ以上の変異、例えば、欠失、付加および／または置換の結果として変更された内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を使用して同定され得る。
本開示のポリヌクレオチドは、化学的合成、組換え法またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当該分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を産生するために、本明細書で提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用することができる。
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドが、適切なベクター中に挿入され得、このベクターは、次に、本明細書でさらに議論されるように、複製および増幅に適切な宿主細胞中に導入され得る。ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞中に挿入され得る。細胞は、直接的取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配（F-mating）またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。いったん導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内で維持され得、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。そうして増幅されたポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法によって、宿主細胞から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。
あるいは、ＰＣＲは、ＤＮＡ配列の再生産を可能にする。ＰＣＲテクノロジーは、当該分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクター中の単離されたＤＮＡを使用し、それを適切な宿主細胞中に挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡへと転写される場合、ＲＮＡは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示される、当業者に周知の方法を使用して単離され得る。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、目的の１つ以上の遺伝子または配列（例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体のＨＣ、ＬＣ、ＶＨ、ＶＬおよび／またはその断片をコードする核酸）を宿主細胞中に送達すること、好ましくは、それを宿主細胞において発現させることが可能な、構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドもしくはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連したＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核生物細胞、例えば、産生細胞が含まれるがこれらに限定されない。
適切なクローニングおよび発現ベクターは、種々の構成要素、例えば、プロモーター、エンハンサーおよび他の転写調節配列を含み得る。ベクターはまた、異なるベクター中への抗体可変ドメインの引き続くクローニングを可能にするように構築され得る。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築され得、または当該分野で入手可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に従って変動し得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を保有し得、および／またはベクターを含むクローンを選択する際に使用され得るマーカーの遺伝子を保有し得る。適切な例には、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が含まれる。これらおよび多くの他のクローニングベクターが、供給業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは、一般に、本開示に従うポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な一部として、宿主細胞中で複製可能でなければならないことが暗示される。適切な発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスが含まれるウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２に開示される発現ベクターが含まれるがこれらに限定されない。ベクター構成要素には、一般に、以下のうち１つ以上が含まれ得るがこれらに限定されない：シグナル配列；複製起点；１つ以上のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）。発現（即ち、翻訳）のために、リボソーム結合部位、翻訳開始部位および停止コドンなどの、１つ以上の翻訳制御エレメントもまた通常は必要とされる。
一部の実施形態では、細胞（例えば、単離されたものまたは生物体内にあるもの）に、異種ポリヌクレオチド（例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体のＨＣ、ＬＣ、ＶＨドメイン、ＶＬドメインまたはその抗原結合性断片）をコードする組換え核酸およびＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を形質導入する。組換え核酸は、形質導入された細胞内で異種ポリヌクレオチドを発現させるための調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、エクソン、ポリＡ）をさらに含み得る。組換え核酸は、ウイルス逆位タンデムリピート（ＩＴＲ）配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、当該分野で公知のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、または任意の他の野生型または組換えＡＡＶカプシドである。ＩＴＲ配列は、当該分野で公知のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、または任意の他の野生型または組換えＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ２）であり得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、抗Ｅ－セレクチン抗体のＨＣ、ＬＣ、ＶＨドメイン、ＶＬドメインまたはその抗原結合性断片をコードする組換え核酸、プロモーター、ＡＡＶ ＩＴＲおよびウイルスカプシドを含む。かかるｒＡＡＶは、対象（例えば、患者）におけるＥ－セレクチンによって媒介される疾患、障害または状態（例えば、ＳＣＤ）を処置または予防するために、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を細胞において発現させるために適している。
目的のポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／またはポリヌクレオチド自体は、エレクトロポレーション、塩化カルシウムもしくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染性因子である場合）が含まれるいくつかの適切な手段のいずれかによって、宿主細胞中に導入され得る。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、宿主細胞の特色に依存する場合が多い。
一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３７、１４５、１４７、１４９、１５４、１６５、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２および１７４からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３７の核酸配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３７の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３６、１４４、１４６、１４８、１５０、１５１、１５２、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１および１７３からなる群から選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３６に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３６の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ｉ）配列番号１３６の核酸配列；ｉｉ）配列番号１３７の核酸；またはｉｉｉ）それら両方を含むポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２０６または１３８に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２０６または１３８の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３９に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号１３９の核酸配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ｉ）配列番号２０６または１３８の核酸配列；ｉｉ）配列番号１３９の核酸；またはｉｉｉ）それら両方を含むポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、ポリヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド挿入物の取り込みのためのベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を意味する。宿主細胞には、「形質転換体」、「形質転換された細胞」、および「形質導入された細胞」が含まれ、これらには、初代の形質転換または形質導入された細胞および継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。宿主細胞の子孫は、天然の、偶然の、または意図的な変異に起因して、（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ相補性において）元の親細胞とは必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）またはそれを含むベクターでｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトおよび／または形質転換された細胞が含まれる。
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例示的な真核細胞には、霊長類または非霊長類動物細胞などの哺乳動物細胞；酵母などの真菌細胞；植物細胞；および昆虫細胞が含まれる。
抗体またはその抗原結合性断片は、適切な宿主細胞を使用して、組換え作製され得る。本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸は、発現ベクター中にクローニングされ得、これは次いで、組換え宿主細胞における抗体の合成を得るために、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞中に導入され得る。細胞培養、およびタンパク質またはポリペプチドの発現を行いやすい任意の宿主細胞が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物である。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞には、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにそれらの誘導体、例えば、２９３－６ＥおよびＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＸＢ１１、およびＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（ＢｉｏＷａ／Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）が含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物宿主細胞には、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、およびヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）もまた含まれるがこれらに限定されない。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の他の非限定的な例には、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）；ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；浮遊培養下で成長させるためにサブクローニングされたヒト胎児由来腎臓株２９３（ＨＥＫ ２９３）または２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９９７；３６：５９）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９８０；２３：２４３～２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８２；３８３：４４～６８）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ Ｇ２）；ならびに、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳ０／１、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）、ＮＳ０細胞およびＳｐ２／０細胞が含まれるがこれらに限定されない、多数の骨髄腫細胞株が含まれる。
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する、任意の数の市販のおよび非商業的に入手可能な細胞株が本発明に従って利用され得る。最適な成長およびポリペプチドまたはタンパク質の発現のために、異なる細胞株は異なる栄養要件を有し得る、および／または異なる培養条件を要求し得、必要に応じて条件を改変することができることが、当業者によって理解されることになる。
使用
処置の方法
一部の実施形態では、本開示は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を使用して、Ｅ－セレクチンの活性を低減させるまたは阻害するための治療方法であって、治療有効量の、抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。処置される障害は、Ｅ－セレクチン活性（例えば、ＳＣＤ）の除去、阻害または低減によって改善、寛解、阻害または予防される任意の疾患または状態である。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を使用する処置の方法には、ＳＣＤ、血管閉塞クリーゼ、疼痛、臓器梗塞、虚血、脳卒中、終末器官機能障害、急性胸部および血管閉塞（vascular obstruction）が含まれるがこれらに限定されない、Ｅ－セレクチンの発現および／またはＥ－セレクチンのリガンド（例えば、ｓＬｅｘＡおよび／またはＸ決定因子）への結合と関連するまたはそれによって媒介される疾患、障害および状態を処置および／または予防する方法が含まれるが、これらに限定されない。本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、他の疾患、障害および状態、例えば、皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）および糖尿病の合併症を処置および／または予防するためにも使用され得る。
本開示は、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、Ｅ－セレクチンの機能活性を中和することが可能な新規の治療用抗体を提供する。これらの抗体は、ＳＣＤに対する予防的処置として利用される場合、ＶＯＣの発生を予防するまたは低減させるために有利に使用され得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの発生は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置されない対象または対象の群（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの発生と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの発生は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片での処置前の同じ対象におけるＶＯＣの発生と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの発生は、ＳＣＤを有さない対象または対象の集団におけるＶＯＣの発生と有意には異ならない。一部の実施形態では、ＶＯＣの発生（例えば、ＶＯＣ事象の数）をある期間にわたって測定する。一部の実施形態では、ＶＯＣの発生（例えば、ＶＯＣ事象の数）を数日間、数週間、数カ月間または数年間にわたって測定する。
一部の実施形態では、本開示の抗体またはその抗体結合性断片は、鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率を低減し得る。鎌状赤血球と関連する疼痛発作は、本明細書で言及される場合、医療施設への来訪を生じ得る、および／または経口もしくは非経口麻薬性薬剤もしくは非経口非ステロイド性抗炎症薬を用いた処置を生じ得る、血管閉塞性事象以外に医学的に決定される原因がない疼痛の急性エピソードである。一部の実施形態では、急性胸部症候群、肝臓血球貯留、脾臓血球貯留、および持続勃起症が鎌状赤血球と関連する疼痛発作とみなされる。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置されない対象または対象の群（例えば、ＳＣＤを有する患者）における鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片での処置前の同じ対象における鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率は、ＳＣＤを有さない対象または対象の集団における鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率と有意には異ならない。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置されない対象または対象の群（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％長い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片での処置前の同じ対象における第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％長い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値は、ＳＣＤを有さない対象または対象の集団における第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値と有意には異ならない。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置されない対象または対象の群（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値より約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％長い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片での処置前の同じ対象における第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値より約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％長い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値は、ＳＣＤを有さない対象または対象の集団における第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値と有意には異ならない。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置されない対象または対象の群（例えば、ＳＣＤを有する患者）における合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低い。一部の実施形態では、合併症のない発作は、急性胸部症候群、肝臓血球貯留、脾臓血球貯留および／または持続勃起症以外の発作であった。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片での処置前の同じ対象における合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値より約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低い。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）における合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値は、ＳＣＤを有さない対象または対象の集団における合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値と有意には異ならない。
本開示の抗体はまた、ＳＣＤを有する患者における急性ＶＯＣを、ＶＯＣの持続時間（例えば、ＶＯＣが消散するまでの時間の低減）、重症度および／または強度を減少させることによって処置するためにも有利に使用され得る。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの持続時間、重症度および／または強度は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置されない対象または対象の群（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの持続時間、重症度および／または強度と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの持続時間、重症度および／または強度は、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片での処置前の同じ対象におけるＶＯＣの持続時間、重症度および／または強度と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％低減する。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片で処置された対象（例えば、ＳＣＤを有する患者）におけるＶＯＣの持続時間、重症度および／または強度は、ＳＣＤを有さない対象または対象の集団におけるＶＯＣの持続時間、重症度および／または強度と有意には異ならない。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片はまた、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状、例えば、心臓胸部系に影響を及ぼすもの（例えば、慢性拘束性肺疾患、左心室拡張疾患、肺高血圧症、急性胸部症候群、調律異常、突然死、血管閉塞クリーゼ）、神経系に影響を及ぼすもの（例えば、出血性卒中、静脈洞血栓症、無症候性脳梗塞、慢性疼痛、急性虚血性脳卒中、増殖性網膜症、眼窩梗塞、認知障害）、細網内皮系に影響を及ぼすもの（例えば、脾臓血球貯留、機能性脾機能低下症、貧血、溶血）、筋骨格系に影響を及ぼすもの（例えば、無血管性壊死、皮膚潰瘍）、泌尿生殖器系に影響を及ぼすもの（例えば、乳頭壊死、タンパク尿、腎不全、血尿、夜尿症、持続勃起症）および胃腸系に影響を及ぼすもの（例えば、胆石症、胆管症、肝障害、腸間膜血管閉塞症（mesenteric vaso-occlusion））を処置する、予防するおよび／または寛解させるためにも使用され得る。
一部の実施形態では、本開示は、その抗体が、（ａ）内皮細胞への白血球テザリングを減少させる；（ｂ）内皮細胞への安定な接着の活性化を減少させる；（ｃ）白血球を停止させる緩徐なローリングを低減させる；（ｄ）白血球の効率的な経内皮遊走を低減させる；（ｅ）ＣＤ１８インテグリンの親和性および結合力を減少させる；（ｆ）急性炎症の部位への白血球の輸送を低減させる；（ｇ）細胞質カルシウムを減少させる；（ｈ）ｐ３８ ＭＡＰキナーゼおよびＳｙｋキナーゼを活性化するチロシンリン酸化を減少させる；（ｉ）血液から血管内皮への血小板および白血球の動員を低減させる；ならびに／または（ｊ）炎症促進性環境を創出しないような、Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、少なくとも１つの検出可能なＥ－セレクチンの生物学的活性をモジュレートする、単離された抗体またはその抗原結合性断片を含む。
本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を使用する処置の方法は、予防的および／または治療的処置を含む。処置が状態の臨床所見の前に投与される場合、その処置は予防的とみなされる。例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の投与は、ＳＣＤに対する予防的処置（例えば、１つ以上の用量、ある期間にわたって）として利用される場合、ＶＯＣを予防する（例えば、ＶＯＣ事象の頻度を低減させる）ために使用され得る。治療的処置には、例えば、疾患を寛解させるもしくは疾患の重症度を低減させる、または疾患の長さを短縮することが含まれる。例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の投与は、ＳＣＤを有する患者における急性ＶＯＣを、ＶＯＣの持続時間、強度および／または重症度を減少させることによって処置するために使用され得る。
一部の実施形態では、処置される対象は、哺乳動物、特にヒト患者、例えば、ＳＣＤを有する患者であり得る。対象は、ＨＢＢ遺伝子のコード配列における１つ以上の変異の結果として、β－グロビンタンパク質が不適切に発現される、例えば、間違ったアミノ酸配列を有することが原因で、処置を必要としている対象であり得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の投与は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、ＶＯＣ）、ＳＣＤのバリアントまたはＳＣ症を処置および／または予防するために使用され得る。抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の投与は、ＨＢＳＳ、ＨＢＳＣ、ＨＢＳＥ、ＨＢＳ／β°ｔｈａｌ、ＨＢＳ／β＋ｔｈａｌまたはＨＢＳ－バリアント遺伝子型を有する対象における疾患の少なくとも１つの徴候および／または症状を処置および／または予防するために使用され得る。
本開示は、処置および／または予防の定義された方法における使用のための、本明細書で定義される抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物をさらに包含する。本明細書に記載される処置および／または予防の方法に言及する実施形態では、かかる実施形態はまた、その処置および／または予防における使用のための、またはあるいは、ＳＣＤの症状を処置および／または予防するための医薬の製造における使用のための、抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物に関するさらなる実施形態もまた含む。
組み合わせ治療
本開示の抗体またはその抗原結合性断片は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である、１つ以上のさらなる治療的に活性な化合物または処置モダリティと組み合わせて投与され得る。本開示は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を処置および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に、一定量の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせた、一定量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティを投与するステップを含む、方法を包含する。一部の実施形態では、ＳＣＤの症状の処置には、急性ＶＯＣの持続時間および強度を減少させることが含まれる。一部の実施形態では、ＳＣＤの症状の予防には、ＶＯＣ事象の頻度を低減させることが含まれる。
本発明は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を処置および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に、一定量の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、ならびに、一定量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティを投与するステップを含み、これらの量が一緒になって、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である、方法もまた包含する。
別の実施形態では、本発明は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を処置および／または予防する方法であって、それを必要とする患者に、一定量の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、ならびに、一定量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティを投与するステップを含み、これらの量が一緒になって、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において相乗的効果を達成する、即ち、組み合わせが「相乗的」である（即ち、組み合わせが、２つ以上の個々の治療の単なる相加効果よりも大きい効果を提供する）、方法に関する。かかる相乗的組み合わせ治療では、投与される治療剤をより少ない投薬量で有利に利用し、したがって、種々の単剤療法と関連する可能性のある毒性または合併症を回避することができる。
ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防に有用である、さらなる治療的に活性な化合物には、例えば、肺炎球菌感染症を予防するためのペニシリン系予防薬、ヒドロキシウレア（例えば、ＤＲＯＸＩＡ、ＨＹＤＲＥＡ）、Ｌ－グルタミン（例えば、ＥＮＤＡＲＩ）、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ）、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ）、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛薬、一般に、オピオイド鎮痛薬、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ）、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ）およびこれらの組み合わせが含まれる。
ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防に有用である、さらなる治療的に活性な化合物には、抗Ｐ－セレクチン抗体（例えば、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ））、ＨｂＳをモジュレートする化合物、ＨｂＳの酸素親和性をモジュレートする化合物（例えば、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ））、２，３－ジホスホグリセリン酸の生成をモジュレートすることによってＨｂＳ重合を標的とする化合物、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現を誘導することによってＨｂＳ重合を標的とする化合物（例えば、ヒドロキシウレア）、機能障害性細胞接着、血管機能障害および／または炎症を標的とする化合物（例えば、ホスホジエステラーゼ－９阻害剤）、血液中の一酸化窒素のレベルを増加させる化合物（例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激物質、例えば、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ））、静脈内ＩＧ、過凝固状態を標的とする化合物（例えば、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ））、ＮＭＤＡ受容体結合を遮断する化合物（例えば、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ））などの化合物が含まれる。
ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、ＶＯＣ）の処置および／または予防に有用である、さらなる治療的に活性な化合物は、ＨｂＳをそのＲ状態（即ち、酸素化状態）に維持するようにモジュレートする化合物、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１０９９９４に記載されているものである。一部の実施形態では、ＨｂＳをそのＲ状態に維持するようにモジュレートする化合物には、２－アミノキノリン化合物が含まれる。一部の実施形態では、ＨｂＳをそのＲ状態に維持するようにモジュレートする化合物は、任意選択によりそのアミド互変異性体（Ｓ）－６－（１－（（２－アミノ－６－フルオロキノリン－３－イル）オキシ）エチル）－５－（１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ピリジン－２（１Ｈ）－オンとして固体の形態に調製された６－｛（１Ｓ）－１－［（２－アミノ－６－フルオロキノリン－３－イル）オキシ］エチル｝－５－（１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ピリジン－２－オールである。
Figure 0007449390000033
ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防に有用である、治療的に活性な処置モダリティには、酸素補給、任意選択により鉄キレート化を伴う輸血、骨髄移植、遺伝子治療（例えば、ＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ（登録商標））、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＴＸ００１）、ジンクフィンガー技術による遺伝子編集治療およびこれらの組み合わせが含まれる。
本開示は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、ＶＯＣ）の処置および／または予防における使用のための、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティ、ならびに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を包含する。本開示は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、ＶＯＣ）の処置および／または予防における使用のための、相乗的治療有効量の抗Ｅ－セレクチン抗体、相乗的治療有効量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティ、ならびに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を包含する。組成物は、例えば、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、ＶＯＣ）の処置および／または予防において有効である少なくとも１つの他の治療的に活性な化合物または処置モダリティであるがこれらに限定されないさらなる治療剤をさらに含み得る。
当業者は、本明細書で提供される開示に基づいて、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を処置および／または予防する方法が、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状（例えば、ＶＯＣ）を処置および／または予防するために、少なくとも１つのさらなる治療剤で以前に処置されたまたはそれを現在受けている患者に、相乗的治療有効量の抗Ｅ－セレクチン抗体、ならびに、相乗的治療有効量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である治療的に活性な化合物または処置モダリティを投与するステップを包含することを理解する。
かかるさらなる治療剤は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を処置および／または予防するための標準治療である薬剤を包含する。即ち、本発明の組み合わせ治療は、Ｌ－グルタミン、ヒドロキシウレア、輸血（任意選択により鉄キレート化を伴う）および当該分野で公知の任意の他の治療が含まれるがこれらに限定されない異なる治療をすでに受けているＳＣＤ患者の治療レジメンに追加され得る。
当業者は、公知の方法に従って、ＳＣＤを有する患者に投与するために本開示の組み合わせにおいて使用される、各化合物の適切な量、用量または投薬量を、年齢、体重、総体的な健康、投与される化合物、投与の経路、ＳＣＤの処置の性質および進行、ならびに他の薬物療法の存在などの因子を考慮に入れて、決定することができる。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与され得る（例えば、治療薬が共製剤化される）。あるいは、組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で対象に同時発生的に投与され得る（例えば、治療が同時投与される）。組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、同じ投薬レジメンに従って（例えば、両方の治療が毎日投与される）または異なる投薬レジメンに従って（例えば、１つの治療が毎日投与され、他の治療が毎週投与される）投与され得る。予防剤または治療剤は、同じまたは異なる経路の投与によって、対象に投与され得る。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、および、任意選択によりそのアミド互変異性体（Ｓ）－６－（１－（（２－アミノ－６－フルオロキノリン－３－イル）オキシ）エチル）－５－（１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ピリジン－２（１Ｈ）－オンとして固体の形態で調製される６－｛（１Ｓ）－１－［（２－アミノ－６－フルオロキノリン－３－イル）オキシ］エチル｝－５－（１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ピリジン－２－オールを含む組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で対象に同時発生的に投与され得る（例えば、治療が同時投与される）。かかる組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、同じ投薬レジメンに従って（例えば、両方の治療が毎日投与される）または異なる投薬レジメンに従って（例えば、１つの治療が毎日投与され、他の治療が毎週投与される）投与され得る。さらに、かかる予防剤または治療剤は、同じまたは異なる経路の投与によって、対象に投与され得る。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、および、任意選択によりそのアミド互変異性体（Ｓ）－６－（１－（（２－アミノ－６－フルオロキノリン－３－イル）オキシ）エチル）－５－（１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ピリジン－２（１Ｈ）－オンとして固体の形態で調製される６－｛（１Ｓ）－１－［（２－アミノ－６－フルオロキノリン－３－イル）オキシ］エチル｝－５－（１Ｈ－ピラゾール－１－イル）ピリジン－２－オールを含む予防剤または治療剤は、対象におけるＶＯＣの持続時間（例えば、ＶＯＣが消散するまでの時間の低減）、重症度および／もしくは強度を低減させるため、鎌状赤血球と関連する疼痛発作の年率を低減させるため、第１の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値を増加させるため、第２の鎌状赤血球と関連する疼痛発作までの時間の中央値を増加させるため、ならびに／または合併症のない鎌状赤血球と関連する疼痛発作の率の中央値を低減させるために、組み合わせで投与され得る。
本開示は、処置および／または予防の定義された方法における使用のための、本明細書で定義される抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む、組み合わせ治療の予防剤または治療剤をさらに包含する。本明細書に記載される処置および／または予防の方法に言及する実施形態では、かかる実施形態はまた、その処置および／もしくは予防における使用のための、またはあるいは、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／もしくは症状のその処置および／もしくは予防における使用のための医薬の製造のための、抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物が含まれる、組み合わせ治療に関するさらなる実施形態もまた含む。
本開示は、単独での、または他の治療と組み合わせた、本開示のＥ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を必要とする対象への、単独での、または他の治療と組み合わせた、本開示のＥ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物の投与のためのプロトコールを提供する。本開示の組み合わせ治療の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、対象に、付随的または逐次的に投与され得る。本開示の組み合わせ治療の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、周期的にも投与され得る。周期的治療には、治療（例えば、薬剤）のうち１つの副作用を回避もしくは低減させるために治療（例えば、薬剤）のうち１つに対する抵抗性の発達を低減させるため、および／または治療の効力を改善するために、一定期間にわたる第１の治療（例えば、第１の予防剤または治療剤）の投与、その後の、一定期間にわたる第２の治療（例えば、第２の予防剤または治療剤）の投与、およびこの逐次的な投与、を反復すること、即ち、サイクルが関与する。
本開示の組み合わせ治療の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、対象に同時発生的に投与され得る。用語「同時発生的に」は、治療（例えば、予防剤または治療剤）の投与が正確に同時であることに限定されないが、むしろ、それらが他の方法で投与された場合よりも増加した利益を提供するように他の治療と一緒に本開示の抗体またはそのコンジュゲートが作用できるような順番で、かつそのような時間間隔内に、本開示のＥ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物が対象に投与されることを意味する。例えば、各治療は、対象に、同時に、または異なる時点において任意の順序で逐次的に投与され得る；しかし、同時に投与されない場合、これらは、所望の治療効果または予防効果を提供するために、時間的に十分に接近して投与すべきである。各治療は、任意の適切な形態で、任意の適切な経路によって、対象に別々に投与され得る。種々の実施形態では、治療（例えば、予防剤または治療剤）は、１５分未満、３０分未満、１時間未満離れて、約１時間離れて、約１時間～約２時間離れて、約２時間～約３時間離れて、約３時間～約４時間離れて、約４時間～約５時間離れて、約５時間～約６時間離れて、約６時間～約７時間離れて、約７時間～約８時間離れて、約８時間～約９時間離れて、約９時間～約１０時間離れて、約１０時間～約１１時間離れて、約１１時間～約１２時間離れて、２４時間離れて、４８時間離れて、７２時間離れて、または１週間離れて、対象に投与される。他の実施形態では、２つ以上の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、同じ患者来院内に、投与される。
組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与され得る。あるいは、組み合わせ治療の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物で、対象に同時発生的に投与され得る。予防剤または治療剤は、同じまたは異なる経路の投与によって、対象に投与され得る。
診断的使用
本発明の抗Ｅ－セレクチン抗体、抗体組成物および方法は、イムノアッセイ、ならびにＥ－セレクチン媒介性障害の診断、および処置の評価のための使用を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの有用性を有する。これらの方法は、Ｅ－セレクチンの存在と関連する障害を有するヒト患者を診断、評価および処置するために特に適切である。Ｅ－セレクチンの存在と関連するこの障害には、ＳＣＤ、皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）および糖尿病の合併症が含まれるがこれらに限定されない。
本発明は、サンプル中のＥ－セレクチンの存在を検出するための方法であって、Ｅ－セレクチンを含むと疑われるサンプルを、Ｅ－セレクチンに対して特異的な抗体と接触させるステップ、および抗体と結合したＥ－セレクチンの存在を検出するステップを含み、それによって、サンプル中のＥ－セレクチンを検出する、方法を提供する。Ｅ－セレクチンが固体支持体に結合され、サンプルがそれに添加されて、サンプル中のＥ－セレクチンに抗体を結合させるアッセイが含まれるがこれに限定されない、抗体と結合したＥ－セレクチンを検出するための方法が、当該分野で周知である。固体支持体に結合した抗体と同じまたはそれとは異なる第２のＥ－セレクチン抗体が添加され、直接的標識化（即ち、第２の抗体は、検出可能な標識にコンジュゲートされる）によって、または例えば、第２の抗体の定常ドメインと反応し、検出可能な標識を含む、別の種由来の第３の抗体を添加することによって、検出され得る。したがって、このアッセイは、サンプル中のＥ－セレクチンの存在または非存在を検出するために使用され得る。
本発明は、サンプル中のＥ－セレクチンの濃度を決定するための方法であって、検出可能な標識にカップリングされたＥ－セレクチンを含む標識された競合相手を提供するステップ；Ｅ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供するステップ；サンプル、抗体および標識された競合相手を組み合わせるステップであって、サンプル中のＥ－セレクチンが、抗体への結合について、標識された競合相手と競合する、ステップ；ならびに標識の検出によって、抗体に結合していない標識された競合相手の量を測定することによって、このサンプル中のＥ－セレクチンの濃度を決定するステップ、を含む方法もまた提供する。サンプルの非存在下で抗体に結合した標識された競合相手の量が、サンプルが添加された場合の抗体に結合した標識された競合相手の量と比較される。サンプルの存在下での結合した標識された競合相手の減少の量は、サンプル中に存在する標識されていないＥ－セレクチンの量の指標であり、その結果、このアッセイは、サンプル中のＥ－セレクチンの存在およびレベルを評価するために使用され得る。一部の実施形態では、Ｅ－セレクチンは、可溶性Ｅ－セレクチンである。一部の実施形態では、Ｅ－セレクチンは、膜結合型Ｅ－セレクチンである。
一実施形態では、本発明は、対象において、増加したレベルのＥ－セレクチンと関連する疾患または障害に対する処置の有効性を評価するための方法であって、対象に処置を投与するステップ、および処置の前に対象から得られたサンプル中のＥ－セレクチンのレベルを、処置の後に対象から得られた他の点では同一のサンプル中のＥ－セレクチンのレベルと比較するステップ、を含み、サンプル中のＥ－セレクチンのレベルが、Ｅ－セレクチン特異的抗体を使用して評価され、さらに、処置の前に対象から収集されたサンプル中のＥ－セレクチンのレベルと比較した、処置の後に対象から収集されたサンプル中のＥ－セレクチンのより低いレベルが、処置の過程の有効性の指標である、方法を提供する。
Ｅ－セレクチン特異的抗体または標識された競合相手に関して、「標識された」という用語は、検出可能な物質を抗体または標識された競合相手にカップリングする（即ち、物理的に連結する）ことによる直接的標識化、ならびにそれを直接標識される別の試薬にカップリングすることによる、抗体または標識された競合相手の間接的標識化を含む。間接的標識化の一例には、蛍光標識した二次抗体を使用した一次抗体の検出が含まれる。本発明のポリペプチドの検出のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が含まれる。
用語「サンプル」は、対象から単離された組織、細胞および生物学的流体（例えば、血液、ＣＳＦ、尿など）、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む意図である。
本明細書に記載される抗体、標識された競合相手、および潜在的な治療的化合物は、様々な検出システムを用いたいくつかの他の均一および不均一イムノアッセイのいずれかとの使用のためにも適切である。
組成物
本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、医薬組成物として製剤化され得る。医薬組成物は、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態の、薬学的に許容できる担体、賦形剤および／または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含み得る。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わされた場合に、成分が生物学的活性を保持することを可能にし、かつ、対象の免疫系とは非反応性である任意の材料が含まれる。
例には、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、水、通常の生理食塩水（０．９％）、エマルション（例えば、油／水エマルション）および種々の型の湿潤剤などの標準の医薬担体のいずれかが含まれるがこれらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与のために好ましい希釈剤は、ＰＢＳおよび通常の生理食塩水である。
許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストランが含まれる、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性物質、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０））もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。薬学的に許容できる賦形剤は本明細書にさらに記載される。
本開示の医薬化合物には、１つ以上の薬学的に許容できる塩が含まれ得る。かかる塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、非毒性無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などに由来するもの、ならびに非毒性有機酸、例えば、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換されたアルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族ならびに芳香族スルホン酸などに由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどに由来するもの、ならびに非毒性有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどに由来するものが含まれる。
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤もまた含み得る。薬学的に許容できる抗酸化剤の例には、以下が含まれる：（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
本開示の医薬組成物において使用され得る適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物油、例えば、オリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料、例えば、レシチンの使用によって、分散物の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。
これらの組成物は、アジュバント、例えば、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤もまた含み得る。微生物の存在の防止は、無菌化手順、ならびに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めること、の両方によって確実にされ得る。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能な医薬形態の延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適切な、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の秩序立った構造として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用によって、分散物の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含めることが適切である。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
無菌の注射可能な溶液は、上に列挙した成分のうち１つまたはその組み合わせと共に、適切な溶媒中に活性化合物を要求される量で取り込み、その後、必要に応じて、無菌化精密濾過することによって、調製され得る。
一般に、分散物は、基本分散媒および上に列挙したものからの要求される他の成分を含む無菌のビヒクル中に活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、調製の好ましい方法は、その以前に無菌濾過された溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
本開示の医薬組成物は、点眼投与に適切な製剤で、調製、包装または販売され得る。かかる製剤は、例えば、水性または油性液体担体中の活性成分の０．１％～１．０％（ｗ／ｗ）溶液または懸濁物を例えば含む点眼薬の形態であり得る。かかる点眼薬は、緩衝剤、塩、または本明細書に記載されるさらなる成分のうち１つ以上の他のものをさらに含み得る。有用な他の点眼投与可能な製剤には、微結晶形態で、またはリポソーム調製物中に、活性成分を含むものが含まれる。
本明細書で使用する場合、「さらなる成分」には、以下のうち１つ以上が含まれるがこれらに限定されない：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；香味剤；着色剤；防腐剤；生理学的に分解可能な組成物、例えば、ゼラチン；水性ビヒクルおよび溶媒；油性ビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、乳化破壊剤（demulcent）；緩衝液；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；および薬学的に許容できるポリマー性または疎水性材料。本開示の医薬組成物中に含められ得る他の「さらなる成分」は、当該分野で公知であり、例えば、本明細書で参照によって組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８５）に記載されている。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、水性緩衝溶液１ｍＬ中１００ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片を含有するバイアル中に製剤化される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、水性緩衝溶液１ｍＬ中１５０ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片を含有するバイアル中に製剤化される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により皮下投与のために、水性緩衝溶液１ｍＬ中１５ｍｇ、４０ｍｇ、１００ｍｇ、３００ｍｇ、または６００ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片を含有するバイアル中に製剤化される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、任意選択により静脈内投与のために、水性緩衝溶液１ｍＬ中５００ｍｇの抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片を含有するバイアル中に製剤化される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、約２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍｌの抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬの抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、ＳＣおよび／またはＩＶ投与に適した医薬組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬの抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片を含む。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む無菌の水溶液として、静脈内または皮下製剤で投与される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む無菌の水溶液として、静脈内または皮下製剤で投与される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む無菌の水溶液として、静脈内または皮下製剤で投与される。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）またはその抗原結合性断片は、約５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬの抗体、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬの抗体またはその抗原結合性断片を含有する無菌の水溶液である静脈内または皮下製剤として投与される。一部の実施形態では、静脈内または皮下製剤は、約５～６の範囲のｐＨで酢酸ナトリウム、ポリソルベート８０、および塩化ナトリウムを含む無菌の水溶液である。一部の実施形態では、静脈内製剤は、ｐＨ５．５で、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０および１４０ｍＭ塩化ナトリウムと共に、５または１０ｍｇ／ｍＬの抗体を含む、無菌の水溶液である。さらに、抗体またはその抗原結合性断片を含む溶液は、多くの他の化合物の中でも、グルタミン酸、ヒスチジン、マンニトール、スクロース、トレハロース、グリシン、ポリ（エチレン）グリコール、ＥＤＴＡ、メチオニン、ポリソルベート８０およびそれらの任意の組み合わせ、ならびに当該分野で公知の多くの他の化合物を含み得る。
一実施形態では、本開示の医薬組成物は、以下の構成要素を含む：ｐＨ５．８で、５０ｍｇ／ｍＬまたは１００ｍｇ／ｍＬの本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）または抗原結合性断片、２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロースおよび０．０２％ポリソルベート８０、０．００５％ＥＤＴＡ。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、以下の構成要素を含む：ｐＨ５．８で、１００ｍｇ／ｍＬの本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）または抗原結合性断片、１０ｍＭヒスチジン、５％スクロースおよび０．０１％ポリソルベート８０。
一部の実施形態では、医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗体１４４４）、１．１２ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ヒスチジン、２．６７ｍｇ／ｍＬ Ｌ－ヒスチジン塩酸塩一水和物、８５ｍｇ／ｍＬスクロース、０．０５ｍｇ／ｍＬエデト酸二ナトリウム二水和物および０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０ ｐＨ５．８を公称充填体積１．０ｍＬで含む。かかる医薬組成物は、ＳＣまたはＩＶ投与に適したものである。
かかる医薬組成物は、液体製剤として、または凍結乾燥された粉末として、提供され得る。粉末が最大体積で再構成される場合、組成物は、同じ製剤を保持する。あるいは、粉末は、半分体積で再構成され得、その場合、組成物は、同じ構成要素を含むが、濃度が２倍である。
治療剤に関して、この薬剤が例えば組み合わせ治療において使用される小分子である場合、これは、当該分野で周知のように、例えば、生理的に許容できるカチオンまたはアニオンと組み合わせた、生理的に許容できるエステルまたは塩の形態で、医薬組成物中に存在し得る。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分を、担体または１つ以上の他の補助成分と関連させるステップ、および次いで、必要な場合または望ましい場合、産物を所望の単回用量単位または複数用量単位へと成形または包装するステップを含む。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、エンドトキシンおよび／または関連の発熱性物質を実質的に含まない、発熱物質を含まない製剤である。エンドトキシンには、微生物の内側に制限される毒素が含まれ、これは、微生物が破壊または死亡した場合に放出される。発熱性物質には、細菌および他の微生物の外膜からの、発熱誘導性の熱安定性物質（糖タンパク質）もまた含まれる。これらの物質は、ヒトに投与されると、発熱、低血圧およびショックを引き起こし得る。潜在的な有害作用に起因して、静脈内投与される医薬薬物溶液から、低い量のエンドトキシンでさえも除去することが有利である。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物適用のための、単一の１時間の期間における、体重１キログラム当たり１用量当たり、５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。治療的タンパク質が、体重１キログラム当たり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、微量のエンドトキシンでさえも除去することが有利である。一実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質のレベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。別の実施形態では、組成物中のエンドトキシンおよび発熱物質のレベルは、約１０ＥＵ／ｍｇ未満、または約５ＥＵ／ｍｇ未満、または約１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
投薬および投与
本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬または無菌の組成物を調製するために、抗体は、薬学的に許容できる担体または賦形剤（上記を参照のこと）と混合される。治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥された粉末、スラリー、水溶液、ローションまたは懸濁物の形態の、生理学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
治療薬のために投与レジメンを選択することは、実体の血清または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞のアクセス可能性が含まれるいくつかの因子に依存する。ある特定の実施形態では、投与レジメンは、許容できるレベルの副作用と合致した、患者に送達される治療薬の量を最大化する。したがって、送達される生物製剤の量は、特定の実体、および処置されている状態の重症度に一部依存する。抗体、サイトカインおよび小分子の適切な用量を選択する際のガイダンスは、入手可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ、１９９６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）、１９９１、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂａｃｈ（編）、１９９３、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂａｅｒｔら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００３；３４８：６０１～６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９９９；３４１：１９６６～１９７３；Ｓｌａｍｏｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１；３４４：７８３～７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０００；３４２：６１３～６１９；Ｇｈｏｓｈら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００３；３４８：２４～３２；Ｌｉｐｓｋｙら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０００；３４３：１５９４～１６０２を参照のこと）。
適切な用量の決定は、例えば、当該分野で公知の、または処置に影響を与えると疑われるもしくはは処置に影響を与えると予測される、パラメーターまたは因子を使用して、臨床医によってなされる。一般に、用量は、最適な用量よりもいくらか少ない量で開始し、任意の負の副作用と比較して所望のまたは最適な効果が達成されるまで、その後小さい増分ずつ増加される。特定の投薬プロトコールは、著しい望ましくない副作用を回避する最大用量または投薬頻度を伴うものであり得る。
「Ｅ－セレクチンとの相互作用を低減させる、減少させる、中和するまたは阻害する」は、この用語を本明細書で使用する場合、Ｅ－セレクチンのリガンドとの相互作用を、あらゆる治療介入前の相互作用のレベルと比較して低減させる、減少させる、中和するまたは阻害することを意味する。本明細書で使用する場合、「遊離Ｅ－セレクチン」は、結合していない、またはさもなくば別の分子（例えば、遊離または細胞表面に発現されるＥ－セレクチンリガンド）との複合体中に存在しないＥ－セレクチンを意味する。
Ｅ－セレクチンのレベルには、対象における遊離Ｅ－セレクチンのレベルが含まれ、このレベルは、本明細書で開示される方法または当該分野で公知の遊離Ｅ－セレクチンのレベルを評価するための任意の他の方法を使用して、評価される。
一実施形態では、遊離Ｅ－セレクチンのレベルは、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体の投与前の対象におけるＥ－セレクチンのレベルと比較して低減される。一実施形態では、遊離Ｅ－セレクチンのレベルは、遊離Ｅ－セレクチンと関連するまたはそれによって媒介される疾患、障害または状態に対象が罹患していることと関連するまたはそれを示す標準的なレベルの遊離Ｅ－セレクチンと比較して低減される。
一部の実施形態では、本開示は、遊離Ｅ－セレクチンによって媒介されるまたはそれと関連する検出可能な有害作用の減少または完全な欠如が存在するレベルまで、遊離Ｅ－セレクチンのレベルを低減させることを包含する。一部の実施形態では、Ｅ－セレクチンの機能活性、例えば、（ａ）内皮細胞への白血球テザリング；（ｂ）内皮細胞への安定な接着の活性化；（ｃ）白血球を停止させる緩徐なローリング；（ｄ）白血球の経内皮遊走；（ｅ）ＣＤ１８インテグリンの親和性および結合力；（ｆ）急性炎症の部位への白血球の輸送；（ｇ）細胞質カルシウムの増加；（ｈ）ｐ３８ ＭＡＰキナーゼおよびＳｙｋキナーゼを活性化するチロシンリン酸化の増加；（ｉ）血液から血管内皮への血小板および白血球の動員；ならびに／または（ｊ）炎症促進性環境を創出することを中和するために、有効用量の抗Ｅ－セレクチン抗体が投与される。
本明細書で使用する場合、薬物、化合物または医薬組成物の「有効投薬量」、「有効用量」、「有効量」または「治療有効量」は、任意の１つ以上の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用について、有益なまたは所望の結果には、リスクを排除もしくは低減させること、発生の頻度を低減させること（例えば、ある期間にわたって、例えば、週に１回、月に１回、年に１回）、重症度を低下させること、および／または疾患、その合併症、および疾患の発達の間に存在する中間の病理学的表現型の生化学的、組織学的および／もしくは行動学的症状を含む、疾患の発症を遅延させることが含まれる。治療的使用について、有益なまたは所望の結果には、検出可能な臨床結果、例えば、ＶＯＣの速度を低減もしくは減少させること、またはＥ－セレクチンの発現から生じる１つ以上の症状を低減させること、疾患を処置するために要求される他の薬物療法の用量を減少させること、別の薬物療法の効果を増強すること、および／もしくは患者の疾患の進行を遅延させること、が含まれる。有効投薬量は、１つ以上の投与で投与され得る。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は、予防的処置または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成されてもされなくてもよい。したがって、「有効投薬量」は、１つ以上の治療剤を投与する観点から検討され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成され得るまたは達成される場合に、有効量で与えられたとみなされ得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体の有効用量は、ＳＣＤ、皮膚疾患（例えば、乾癬）、炎症性疾患（例えば、関節リウマチ）および糖尿病の合併症を有する患者に投与される。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）の有効用量は、ＳＣＤ、血管閉塞クリーゼ、疼痛、臓器梗塞、虚血、脳卒中、終末器官機能障害、急性胸部および血管閉塞（vascular obstruction）が含まれるがこれらに限定されない、Ｅ－セレクチンの発現および／またはＥ－セレクチンのリガンド（例えば、ｓＬｅｘＡおよび／またはＸ決定因子）への結合と関連するまたはそれによって媒介される疾患、障害および状態を処置および／または予防するために投与される。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）の有効用量は、ＳＣＤに対する予防的処置として利用される場合、ＶＯＣの発生を予防するまたは低減させるために投与される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）の予防的投与は、１回投与される。一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）の予防的投与は、継続的に投与される（例えば、ある期間にわたって１回以上の投薬）。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）の有効用量は、ＳＣＤを有する患者における急性ＶＯＣを、ＶＯＣの持続時間、強度および／または重症度を減少させることによって処置するために投与される。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）の有効用量は、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状、例えば、心臓胸部系に影響を及ぼすもの（例えば、慢性拘束性肺疾患、左心室拡張疾患、肺高血圧症、急性胸部症候群、調律異常、突然死、血管閉塞クリーゼ）、神経系に影響を及ぼすもの（例えば、出血性卒中、静脈洞血栓症、無症候性脳梗塞、慢性疼痛、急性虚血性脳卒中、増殖性網膜症、眼窩梗塞、認知障害）、細網内皮系に影響を及ぼすもの（例えば、脾臓血球貯留、機能性脾機能低下症、貧血、溶血）、筋骨格系に影響を及ぼすもの（例えば、無血管性壊死、皮膚潰瘍）、泌尿生殖器系に影響を及ぼすもの（例えば、乳頭壊死、タンパク尿、腎不全、血尿、夜尿症、持続勃起症）および胃腸系に影響を及ぼすもの（例えば、胆石症、胆管症、肝障害、腸間膜血管閉塞症（mesenteric vaso-occlusion））を処置する、予防するおよび／または寛解させるために投与される。
一部の実施形態では、方法または使用は、約１ｍｇ～約８００ｍｇの用量を投与することを含む。一部の実施形態では、方法または使用は、約１ｍｇ～８００ｍｇの用量を初期固定用量として投与することを含む。一部の実施形態では、方法または使用は、約１ｍｇ～約２ｍｇ、約２ｍｇ～約５ｍｇ、約５ｍｇ～約１０ｍｇ、約１０ｍｇ～約２０ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約３０ｍｇ～約４０ｍｇ、約４０ｍｇ～約５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約６０ｍｇ、約６０ｍｇ～約７０ｍｇ、約７０ｍｇ～約８０ｍｇ、約８０ｍｇ～約９０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約２００ｍｇ～約３００ｍｇ、約３００ｍｇ～約４００ｍｇ、約４００ｍｇ～約５００ｍｇ、約５００ｍｇ～約６００ｍｇ、約６００ｍｇ～約７００ｍｇまたは約７００ｍｇ～約８００ｍｇの用量を任意選択により初期固定用量として投与することを含む。一部の実施形態では、方法または使用は、本発明の抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物の約１５ｍｇ、４０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、３００ｍｇ、５００ｍｇまたは６００ｍｇの用量を投与することを含む。一部の実施形態では、用量は、初期固定用量である。
一部の実施形態では、方法または使用は、本発明の抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物の約１５０ｍｇの用量を投与することを含む。一部の実施形態では、方法または使用は、本発明の抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物の約１５０ｍｇの用量を毎週投与することを含む。一部の実施形態では、方法または使用は、本発明の抗Ｅ－セレクチン抗体（例えば、抗体１４４４）もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物の約１５０ｍｇの用量を、毎週、皮下投与することを含む。
一部の実施形態では、方法または使用は、本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片または医薬組成物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量を、任意選択により初期用量として投与することを含む。初期用量には、１つ以上の引き続く用量が後に続き得る。一部の実施形態では、１つ以上の引き続く用量は、毎週、１週間おき、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎または１２週間毎の少なくともいずれかで投与され得る。
初期用量には、１つ以上の引き続く用量が後に続き得る。一部の実施形態では、引き続く用量は、抗Ｅ－セレクチン抗体の、初期用量と比較して同じ用量、より少ない用量またはより多い用量である。一部の実施形態では、１つ以上の引き続く用量は、毎週、１週間おき、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎または１２週間毎の少なくともいずれかで投与され得る。特定の投薬プロトコールは、著しい望ましくない副作用を回避する最大用量または投薬頻度を伴うものである。
本開示の医薬組成物は、当該分野で公知の種々の方法のうち１つ以上を使用して１つ以上の経路の投与によっても投与され得る。当業者には理解されるように、投与の経路および／または形式は所望の結果に応じて変動する。本開示の抗体のために選択される投与の経路には、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口経路の投与が含まれる。非経口投与は、通常は注射による、経腸および局部投与以外の投与形式であり得、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。あるいは、本開示の組成物は、非経口でない経路、例えば、局部、表皮または粘膜投与経路によって、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局部に投与され得る。
一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は静脈内投与される。一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は皮下投与される。
一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、毎週、静脈内または皮下投与される。一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、約１５ｍｇ、約４０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約３００ｍｇ、または約６００ｍｇの単位用量で、毎週、皮下投与される。一部の実施形態では、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、約１５０ｍｇまたは約５００ｍｇの単位用量で、毎週、静脈内投与される。
一部の実施形態では、対象は、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を毎週投与され、疾患（例えば、ＳＣＤ）の少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である、治療的に活性な化合物または処置モダリティを毎日、毎週、隔週、毎月、または必要に応じて投与される。本開示は、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物を単独で、または他の治療と組み合わせて、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。本開示の組み合わせ治療の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、対象に、付随的または逐次的に投与され得る。本開示の組み合わせ治療の治療（例えば、予防剤または治療剤）は、周期的にも投与され得る。
一部の実施形態では、抗Ｅ－セレクチン抗体もしくはその抗原結合性断片またはそれを含む医薬組成物は、約１週間に２回、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、８週間毎に１回、９週間毎に１回、１０週間毎に１回、１カ月に２回、１カ月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、４カ月毎に１回、５カ月毎に１回、６カ月毎に１回、７カ月毎に１回、８カ月毎に１回、９カ月毎に１回、１０カ月毎に１回、１１カ月毎に１回または１２カ月毎に１回、投与される。
一部の実施形態では、用量の一部は、静脈内ボーラスによって投与され、用量の残りは、抗体製剤の注入によって投与される。例えば、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の０．０１ｍｇ／ｋｇ静脈内注射は、ボーラスとして与えられ得、抗体用量の残りは、静脈内注射によって投与され得る。所定の用量の抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、１時間半～２時間～５時間の期間にわたって、投与され得る。
必要であれば、組成物は、可溶化剤、および、注射部位の疼痛を和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬もまた含み得る。さらに、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を伴う製剤の使用により、経肺投与もまた使用され得る。例えば、それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、および同第４，８８０，０７８号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、同第ＷＯ９７／３２５７２号、同第ＷＯ９７／４４０１３号、同第ＷＯ９８／３１３４６号、および同第ＷＯ９９／６６９０３号を参照のこと。
キット
本開示は、本明細書に記載される抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片のいずれかまたは全てを含むキットもまた提供する。本開示のキットは、本明細書に記載される抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片および本明細書に記載される本開示の方法のいずれかに従った使用に関する指示を含む１つ以上のコンテナを含む。一般に、これらの指示は、上記の治療的処置のための抗体の投与に関する記載を含む。一部の実施形態では、キットは、単回投薬の投与単位を生じさせるために提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１のコンテナおよび水性製剤を有する第２のコンテナの両方を含み得る。ある特定の実施形態では、アプリケーター、例えば、単一のおよび複数チャンバーの事前充填シリンジまたはデバイス（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringe））を含むキットが含まれる。
一部の実施形態では、キットは、抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片を含むアプリケーターを含み、ここで、アプリケーターは、患者（例えば、ＳＣＤを有する患者）による自己投与のために設計されたまたはそれが許容できるものである。一部の実施形態では、自己投与は皮下投与による。
抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の使用に関する指示は、一般に、意図した処置のための投薬量、投薬スケジュール、および投与の経路（例えば、ＳＣまたはＩＶ）に関する情報を含む。コンテナは、単位用量、バルク包装（例えば、多用量包装）またはサブ単位用量であり得る。本開示のキット中に供給される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット中に含まれる紙シート）上の書面による指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気または光学保存ディスク上で運搬される指示）もまた許容できる。
本開示のキットは、適切な包装中にある。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれるがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、インヘラー、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）または注入デバイス、例えば、ミニポンプと組み合わせた使用のための包装もまた企図される。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。コンテナもまた、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、コンテナは、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤は、本開示の抗Ｅ－セレクチン抗体である。コンテナは、さらなる治療剤をさらに含み得る。
一実施形態では、本発明は、ＳＣＤの症状の処置または予防において有効である第２の治療的に活性な化合物または処置モダリティをさらに含むキットを含み、ここで、抗Ｅ－セレクチン抗体および第２の化合物またはモダリティの量が一緒になって、ＳＣＤの症状の処置または予防において相乗的効果を達成する、即ち、組み合わせが「相乗的」である（即ち、組み合わせが、２つ以上の個々の治療の単なる相加効果よりも大きい効果を提供する）。相乗的組み合わせ治療を含むかかるキットにより、投与される治療剤をより少ない投薬量で有利に利用し、したがって、種々の単剤療法と関連する可能性のある毒性または合併症を回避することができる。
一部の実施形態では、キットは、例えば、ペニシリン、ヒドロキシウレア（例えば、ＤＲＯＸＩＡ、ＨＹＤＲＥＡ）、Ｌ－グルタミン（例えば、ＥＮＤＡＲＩ）、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ）、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ）、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ）、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ）、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛薬、一般に、オピオイド鎮痛薬、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ）、チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ）またはメマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ）が含まれる、ＳＣＤの徴候および／または症状の処置または予防のために有用な少なくとも１つのさらなる治療的に活性な化合物をさらに含み得る。
キットは、任意選択により、さらなる構成要素、例えば、緩衝液および説明情報を提供し得る。通常、キットは、コンテナ、およびコンテナ上にあるまたはそれと関連したラベルまたは添付文書を含む。
本開示は、本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片のいずれかまたは全てを含む診断用キットもまた提供する。診断用キットは、例えば、サンプル中のＥ－セレクチンの存在を検出するために有用である。一部の実施形態では、診断用キットは、個体をＥ－セレクチンに媒介される疾患、障害または状態を発生するリスクにさらす可能性がある不顕性の疾患、障害または状態を有する個体を同定するために使用され得る。一部の実施形態では、診断用キットは、Ｅ－セレクチンに媒介される疾患、障害または状態を有する疑いがある個体におけるＥ－セレクチンの存在および／またはレベルを検出するために使用され得る。
本開示の診断用キットは、本明細書に記載される抗Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片および本明細書に記載される本開示の方法のいずれかに従った使用に関する指示を含む１つ以上のコンテナを含む。一般に、指示は、Ｅ－セレクチンに媒介される疾患、障害または状態、例えばＳＣＤを患っていることが疑われるまたは分かっている患者におけるＶＯＣおよびまたはＨｂＳ、ＨｂＣ、Ｈｂβ＋－サラセミア、Ｈｂβ°－サラセミアもしくは他のＨｂバリアントが含まれる異常な形態のβ－グロビンと関連するまたはそれによって媒介される任意の他の状態のリスクがあるまたはそれを有する疑いがある個体におけるＥ－セレクチンの存在を検出するための、Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片の使用に関する記載を含む。一部の実施形態では、例示的な診断用キットは、例えば、Ｅ－セレクチン抗体またはその抗原結合性断片、陰性対照サンプル、陽性対照サンプルなどの試薬、およびキットの使用に関する指図を含有するように構成され得る。
生物学的寄託
抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４の重鎖および軽鎖は、２０１９年１２月６日に、ブダペスト条約による条項に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０～２２０９、ＵＳＡに寄託された。
Figure 0007449390000034
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下で行われた。これは、寄託の日から３０年間にわたって寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物は、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間での同意を条件として、ブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣによって入手可能にされ、これは、関連する米国特許の発行の際、または任意の米国もしくは外国の特許出願の公衆への公開の際のいずれか早い方の時点における、公衆への寄託物の培養物の子孫の恒久的かつ無制限の入手可能性を保証し、米国特許商標庁長官が米国特許法１２２条およびそれに従う長官規則（特に８８６ ＯＧ ６３８に関連した米国特許規則１．１４を含む）に従って資格ありと決定した者への子孫の入手可能性を保証する。
本出願の譲受人は、寄託にかかる材料の培養物が、適切な条件下で培養した場合に万一死んだり失われたり破壊されたりしたときには、通知があり次第それらの材料が同一物の別のもので速やかに置き換えられることに同意している。寄託された材料の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限の下で与えられた権利に違反して本発明を実施することの許諾として解釈すべきではない。
一般技術
本発明は、当然変動し得る、それを作製する特定の合成方法に限定されないことを理解すべきである。本明細書で他に定義されない限り、本発明と併せて使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションと併せて使用される術語体系、ならびにそれらの技術は、当該分野で周知かつ一般に使用されるものである。
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９８）；Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００３）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献中で完全に説明されている。
酵素反応および精製技術は、当該分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、合成有機化学ならびに医薬品化学および薬化学と併せて使用される術語体系、ならびにそれらの実験室手順ならびに技術は、当該分野で周知かつ一般に使用されるものである。標準的な技術が、化学的合成、化学的分析、医薬の調製、製剤および送達、ならびに患者の処置のために使用される。
等価物
上述の説明および以下の実施例は、本開示のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らによって企図される最良の形態を記載する。しかし、上述がテキスト中に出現し得ることがどんなに詳述されても、本開示が多くの方法で実施され得、本開示が添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物に従って実施されるべきであることが、理解される。
開示された教示は、種々の適用、方法、キットおよび組成物に関して記載されてきたが、種々の変化および改変が、本明細書の教示および以下の特許請求される開示から逸脱することなしになされ得ることが理解される。以下の実施例は、開示された教示をよりよく説明するために提供されるのであって、本明細書に提示された教示の範囲を限定することを意図しない。本明細書の教示は、これらの例示的な実施形態に関して記載されてきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が過度の実験なしに可能であることを容易に理解する。全てのかかるバリエーションおよび改変は、本明細書の教示の範囲内である。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用される全ての参考文献、ならびにまだ引用されていない範囲までその中で引用される参考文献は、それらの全体が本明細書で参照によって組み込まれる。組み込まれた文献および類似の資料のうち１つ以上が、定義された用語、用語の用法、記載された技術などが含まれるがこれらに限定されない本出願とは異なるまたはそれと矛盾する場合、本出願が支配する。
本発明がより良く理解され得るように、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲をいかなる方法によっても限定しないと解釈すべきである。
（実施例１）
ヒトＥ－セレクチンに結合するラットモノクローナル抗体の単離
Ｓｐｒａｑｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｒａｐｐｉｄ ＩＰ免疫化法を使用して、可溶性ヒトＥ－セレクチン細胞外ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６５８１ 残基２２～５５６；配列番号１３３）で免疫化した。ハイブリドーマ上清を、直接結合ＨＲＰ－ＥＬＩＳＡを使用して、可溶性ヒト（配列番号１３３）およびマウス（配列番号１３５）のＥ－セレクチン細胞外ドメインならびに短縮型ヒトＥ－セレクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１６５８１ 残基２２～１７８；配列番号１９７）および短縮型マウスＥ－セレクチン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ００６９０ 残基２２～１７８；配列番号１９９）Ｅ－セレクチンへの結合についてスクリーニングした。結合子のセットのうち、可溶性および短縮型ヒトＥ－セレクチンに結合した６つの抗体（００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０）を選択し、可溶性および短縮型マウスＥ－セレクチンに結合した１つの抗体（００２７）を選択した。これら７つの抗体を、分子クローニングおよびサブ配列分析のために選択した。
（実施例２）
ラット抗Ｅ－セレクチン抗体重鎖および軽鎖可変領域のクローニング
ヒトＥ－セレクチンに結合した抗Ｅ－セレクチン抗体（抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０）またはマウスＥ－セレクチンに結合した抗Ｅ－セレクチン抗体（抗体００２７）の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）可変領域を、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ｃＤＮＡ合成システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してクローニングし、その後ＰＣＲ増幅した。ｃＤＮＡを、ＲＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＳＭＡＲＴ（登録商標）ＩＩＡオリゴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用して、およそ５００，０００個のハイブリドーマ細胞（各クローン００２７、００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０についての）から単離した１μｇの総ＲＮＡから合成した。次いで、ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴ（登録商標）ＩＩＡオリゴ配列にアニールするプライマーおよびラット定常領域特異的プライマー（軽鎖についてはラットカッパ、重鎖についてはラットＩｇＧ１）をＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）と共に使用するＰＣＲによって増幅した。重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングし、核酸配列を決定した。この方法は、ＤＮＡ配列の事前の知識が要求されないという点で有利である。さらに、得られたＤＮＡ配列は、縮重ＰＣＲプライマーの使用によって変更されない。
可変重領域（抗体００３９のＶＨ（配列番号６０のアミノ酸配列）、抗体０１５８のＶＨ（配列番号７５のアミノ酸配列）、抗体０１５９のＶＨ（配列番号９０のアミノ酸配列）、抗体０１６４のＶＨ（配列番号３５のアミノ酸配列）、抗体０１７０のＶＨ（配列番号１０４のアミノ酸配列）、抗体０１８０のＶＨ（配列番号１１８のアミノ酸配列）および抗体００２７のＶＨ（配列番号１２８のアミノ酸配列））を、エフェクター機能を無効にするように変異させたヒトＩｇＧ１定常領域（Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＧｌｙ２３７Ａｌａ、ＥＵ番号付け；米国特許第５，６２４，８２１号）（配列番号１５のアミノ酸配列）を含むｐＴＴ５哺乳動物発現ベクター中にクローニングして、キメラ重鎖を産生した。可変軽領域（抗体００３９のＶＬ（配列番号５７のアミノ酸配列）、抗体０１５８のＶＬ（配列番号７３のアミノ酸配列）、抗体０１５９のＶＬ（配列番号８７のアミノ酸配列）、抗体０１６４のＶＬ（配列番号３２のアミノ酸配列）、抗体０１７０のＶＬ（配列番号１０２のアミノ酸配列）、抗体０１８０のＶＬ（配列番号１１６のアミノ酸配列）および抗体００２７のＶＬ（配列番号１２２のアミノ酸配列））を、ヒトカッパの定常領域（配列番号１４のアミノ酸配列）を含むｐＴＴ５哺乳動物発現ベクター中にクローニングして、キメラ軽鎖を産生した。
（実施例３）
抗Ｅ－セレクチン抗体の結合および中和
ヒトＥ－セレクチン細胞外ドメイン（配列番号１３３のアミノ酸配列プラス１０Ｈｉｓ精製テイル）およびマウスＥ－セレクチン細胞外ドメイン（配列番号１３５のアミノ酸配列プラス１０Ｈｉｓ精製テイル）への抗Ｅ－セレクチン抗体の結合を、組換え抗原結合ＥＬＩＳＡをＨＰＲ検出と共に使用して測定した。３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを使用して、ヒトおよびマウスのＨｉｓタグ化組換えＥ－セレクチンポリペプチドを捕捉した。ポリペプチドを、変動する濃度のキメラ抗体と共にインキュベートし、ＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いて検出した。抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０は、それぞれ０．０２ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭおよび０．０１ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＥ－セレクチンに結合した。これらの抗体のいずれも、＞１３３ｎＭのＥＣ５０で、マウスＥ－セレクチンに結合することはなかった。抗体００２７は、０．０２ｎＭのＥＣ５０で、マウスＥ－セレクチンに結合したが、＞１３３ｎＭのＥＣ５０で、ヒトＥ－セレクチンに結合することはなかった。
抗Ｅ－セレクチン抗体の中和能力を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ均一競合アッセイで測定した。ここで、抗体は、ヒトＥ－セレクチン細胞外ドメイン（配列番号１３３のアミノ酸配列プラス１０Ｈｉｓ精製テイル）、マウスＥ－セレクチン細胞外ドメイン（配列番号１３５のアミノ酸配列プラス１０Ｈｉｓ精製テイル）またはカニクイザルＥ－セレクチン細胞外ドメイン（配列番号１７５のアミノ酸配列プラス１０Ｈｉｓ精製テイル）のシアリルルイスＡリガンドとの相互作用と競合した。この実験のために、１μＬの抗体を、３８４ウェルプレートのウェルに添加し、その後、１μＬのシアリルルイスＡ－ＰＡＡ－ビオチンを、１．７５ｎＭの最終濃度になるように添加した。これを室温で１５分間インキュベートし、その後、７ｎＭの最終濃度になるように添加した１．４μＬのヒト、マウスまたはカニクイザルＥ－セレクチンを添加した。これを室温で１５分間再度インキュベートした。これに、１．４μＬのＡｌｐｈａＬＩＳＡビーズを添加して（Ｎｉ－ドナー／ＳＡ－アクセプター）、１０μｇ／ｍＬの最終アッセイ濃度にした。これを、暗中で室温で少なくとも１０時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＡｌｐｈａＬＩＳＡプロトコール（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）を使用して読み取った。
ヒト、マウスおよびカニクイザルＥ－セレクチンの中和のＥＣ５０を、キメラ抗Ｅ－セレクチン抗体００２７、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０について測定した。抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０は、ヒトＥ－セレクチンに対して＜１ｎＭのＥＣ５０値を有したが、抗体００２７は、ヒトＥ－セレクチンを中和せず、＞１３３ｎＭのＥＣ５０を有した。抗体０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０は、カニクイザルＥ－セレクチンに対して＜１ｎＭのＥＣ５０値を有し、抗体００３９は、カニクイザルＥ－セレクチンに対して＞６３ｎＭのＥＣ５０を有し、抗体００２７は、カニクイザルＥ－セレクチンを中和せず、＞１３３ｎＭのＥＣ５０を有した。抗体００２７は、マウスＥ－セレクチンに対して１ｎＭのＥＣ５０値を有したが、抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０は、マウスＥ－セレクチンを中和せず、＞１３３ｎＭのＥＣ５０を有した（表４）。
Figure 0007449390000035
（実施例４）
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用した抗Ｅ－セレクチンの動態評価
ヒト（配列番号１３３のアミノ酸配列）、マウス（配列番号１３５のアミノ酸配列）およびカニクイザル（配列番号１７５のアミノ酸配列）Ｅ－セレクチン細胞外ドメインタンパク質を調製した。各タンパク質は、精製に利用したＣ末端の１０残基ヒスチジンタグを含んだ。抗ヒトＦｃセンサーチップを、製造業者のプロトコールに従って、カルボキシメチル化デキストランコーティングされたセンサーチップ（ＣＭ５）（カタログ番号ＢＲ１００５３０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の４つ全てのフローセルへの抗ヒトＩｇＧ抗体（カタログ番号ＢＲ－１００８－３９、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のアミンカップリングによって調製した。フローセルを、４００ｍＭの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１００ｍＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の１：１混合物を、１０μＬ／分の流速で７分間注入することによって活性化した。抗ヒトＩｇＧ抗体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０中で２５μｇ／ｍＬに希釈し、１０μＬ／分で７分間にわたって全てのフローセル上に注入した。全てのフローセルを、１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌ（ＥＴＨ）で１０μＬ／分で７分間遮断した。捕捉抗体の最終固定化レベルは、およそ１０，０００レゾナンスユニット（ＲＵ）であった。固定化および反応速度論のためのランニング緩衝液は、ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭの４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）であった。
ヒト、カニクイザルおよびマウスＥ－セレクチンへの抗体の結合を特徴付けるために、抗体を、ＨＢＳ－ＥＰ＋中で０．５μｇ／ｍＬになるように希釈し、１０μＬ／分の流速で３０秒間～１分間にわたってフローセル２、３および４上に固定化された抗ヒトＩｇＧによって捕捉して、７０～３００ＲＵの捕捉レベルを達成した。フローセル１は参照表面として使用した。抗体捕捉後、流速を５０μＬ／分に増加させ、緩衝液、またはＨＢＳ－ＥＰ＋中１５ｎＭ～４０５ｎＭの範囲の濃度のＥ－セレクチンタンパク質を、１．０分間の会合期間にわたって全てのフローセル上に注入し、次いで、６～１５分間解離させた。各捕捉された抗体について収集されたＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液サイクルを、二重参照に使用した（Ｍｙｓｚｋａ ＤＧ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １９９９；１２（５）：２７９～８４）。各サイクルの終了時に、抗ＩｇＧ表面全体を、３ＭのＭｇＣｌ２の３０秒間のパルスおよびイオン性緩衝液（１．８３ＭのＭｇＣｌ２、０．９２Ｍの尿素、１．８３ＭのグアニジンＨＣｌ、ｐＨ７．４）の３０秒間のパルスによって再生した（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｋ．Ａｎａｌｙ．Ｃｈｅｍ．１９９９；７１（１３）：２４７５～８１）。動態アッセイを、１０ヘルツ（Ｈｚ）の収集速度で２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。速度定数および親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１：１結合モデルにデータをフィットさせることによって決定した。
結合親和性を、固定化された抗ヒトＩｇＧに抗体を最初に結合させることによって、抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０に対してヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンについて、ならびにマウスＥ－セレクチン抗体００２７について決定した。抗体捕捉後、Ｅ－セレクチンタンパク質の希釈物を上に流し、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、ｔ１／２およびＫＤ値を、ヒト、カニクイザルおよびマウスＥ－セレクチンへの結合について決定した（表５～７）。このＳＰＲ分析では、ヒトＥ－セレクチンに対する抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０の親和性（ＫＤ）は、それぞれ６８．０ｎＭ、２１．６ｎＭ、３２４ｎＭ、５４．４ｎＭ、６２８ｎＭおよび２９４０ｎＭであった。カニクイザルＥ－セレクチンに対するキメラ抗体００３９、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０の親和性ＫＤは、それぞれ４５．８ｎＭ、２４３．５ｎＭ、４５．４ｎＭ、４９２ｎＭおよび３１４５ｎＭであった。抗体０１５８は、カニクイザルＥ－セレクチンへの結合を示さなかった。マウスＥ－セレクチンへのキメラ抗体００２７の親和性ＫＤは、１．２ｎＭであった。
Figure 0007449390000036
Figure 0007449390000037
Figure 0007449390000038
（実施例５）
静置結合アッセイにおける抗Ｅ－セレクチン抗体のリガンド結合の中和
リガンド結合を中和する抗Ｅ－セレクチン抗体の能力を、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する静置中和アッセイにおいて評価して、Ｅ－セレクチンを発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）へのシアリルルイス抗原の中和を評価した。
簡潔に述べると、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、培養培地（１０％透析胎仔ウシ血清、１００ｎＭのメトトレキサートおよび１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（最小必須培地）アルファ培地）中で成長させ、９６ウェル組織培養プレート中に１ウェル当たり１２，５００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートして、コンフルエントな単層を形成した。プレートを、カルシウムマグネシウムなしのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）２００μＬで引き続いて２回洗浄した。抗Ｅ－セレクチン抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０またはＩｇＧ１アイソタイプ対照を、ビオチン化シアリルルイスＡポリアクリルアミド（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ ＬＬＣ；ＯＳ４５４４６）の小さい合成コンジュゲートの存在下で、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼと共にアッセイに添加し（合計１００μＬ）、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次いで、プレートを、カルシウムマグネシウムなしのＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄した。インキュベーション後、細胞を、２ｍＭの塩化カルシウムを含む洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ［トリスアミノメタン］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム；０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４；２ｍＭの塩化カルシウム）２００μＬで２回洗浄した。シグナルを、１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２８）を添加し、室温で３０分間インキュベートすることによって発生させた。反応を、２Ｍの硫酸を使用して停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ）。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．０．２）を使用して分析およびグラフ化した。推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、分析から導出した（表８）。
試験した抗体は、細胞表面で発現されたヒトＥ－セレクチンへのリガンド結合を抗体用量依存的に中和した。中和アッセイにおいてキメラ抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１７０および０１８０について推定されたＩＣ５０値は、それぞれ３．７６ｎＭ、２．７７ｎＭ、２．８７ｎＭ、３．２４ｎＭ、２．３ｎＭおよび３．８３ｎＭであった。抗体００２７は、細胞表面で発現されたヒトＥ－セレクチンへのシアリルルイスＡポリアクリルアミドリガンド結合の結合を中和しなかった。ヒトＩｇＧ対照抗体は、これらのアッセイにおいて効果を実証しなかった。
（実施例６）
静置接着アッセイにおける抗Ｅ－セレクチン抗体の細胞結合の阻害
静置条件下でのヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＥ－セレクチンリガンドを発現する細胞の接着を阻害するキメラ抗Ｅ－セレクチン抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１７０および０１８０の能力を評価した。
ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、アルファ培地（ＭＥＭ［最小必須培地］アルファ培地、Ｃｏｒｎｉｎｇ）／１０％透析胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）／１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）／１００ｎＭのメトトレキサート中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で維持した。ＨＬ－６０細胞（Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンドを発現するヒト前骨髄球性細胞株）を、ＲＰＭＩ／グルタミン成長培地（Ｇｉｂｃｏ）／１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）／１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で維持した。ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェル平底黒色プレート中に１１，５００細胞／ウェルの密度で播種し、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気で４８時間インキュベートして、コンフルエントな単層を形成した。
静置接着中和アッセイのために、対数期にあるＨＬ－６０細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、５００μＬのＰＢＳおよび等しい体積の２μＭのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル蛍光色素［（ＣＦＳＥ）（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ）］中に再懸濁した。細胞を、暗中で室温で１０分間インキュベートした。標識化を、氷上で５分間にわたる４ｍＬの冷ＨＬ－６０成長培地の添加によって停止させた。標識されたＨＬ－６０細胞を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．１％アジ化ナトリウム中で３回洗浄し、静置接着アッセイにおける使用のために４００，０００細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。
抗Ｅ－セレクチンキメラ抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１５４、０１７０および０１８０、陰性対照抗Ｐ－セレクチン抗体ならびに対照ヒトＩｇＧを、ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウム中に連続的に（１３３３ｎＭ～１．８３ｎＭの範囲の濃度）希釈した。各抗体について抗体なしの対照を調製した。Ｅ－セレクチンＣＨＯ細胞単層を、ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウムで穏やかに３回洗浄し、１００μＬの細胞懸濁物をウェルに添加し、氷上で１時間インキュベートした。１ウェル当たり５０μＬ（２０，０００個）のＣＦＳＥ標識されたＨＬ－６０細胞を、抗体を除去することなく添加した。標識されたＨＬ－６０細胞を、ＣＨＯ細胞単層と共に、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気で１時間インキュベートした。プレートを、ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウムで３回洗浄し、１００μＬのＨＢＳＳ／１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を添加し、暗中で１０分間インキュベートした。結合したＨＬ－６０細胞の蛍光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９４／５２１ナノメートルの励起／発光波長で測定して、接着したＨＬ－６０細胞の数を決定した。背景結合を、細胞なしの対照ウェルからのシグナルを使用して減算し、％接着を、ヒトＩｇＧ対照を１００％として使用して決定した。推定されたＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍスイートにおいて決定した。
静置接着条件下では、抗体０１５８および０１６４は、１６．５ｎＭで＞５０％阻害で、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０細胞接着を阻害した。抗体０１５９は、４９．４ｎＭで＞５０％阻害で、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０細胞接着を阻害した。抗体０１７０および０１８０は、４４４ｎＭで＞５０％阻害で、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０接着を阻害した。抗体００３９は、１３３３ｎＭまでの濃度では、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０細胞接着を阻害しなかった。陰性対照抗体は、ＨＬ－６０細胞の接着を阻害しなかった（表８）。
（実施例７）
抗Ｅ－セレクチン抗体の細胞表面結合（ＦＡＣＳ）
Ｅ－セレクチンまたはＰ－セレクチンを発現するように操作された細胞への抗体結合を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して評価した。カニクイザルとの種交差反応性も評価した。
ヒトＥ－セレクチンまたはＰ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％透析胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したアルファ培地（ＭＥＭ［最小必須培地］アルファ培地、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞については、成長培地に１００ｎＭのメトトレキサートもまた補充した。カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲ１培地（ＲＩダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２改変）中で培養した。細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気で成長培地中で維持した。メトトレキサートまたはＺｅｏｃｉｎを、実験のための培養前に培地から除去した。ＣＨＯ－Ｅセレクチン細胞またはＰ－セレクチン細胞を、クエン酸食塩水（１３５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を使用してＴ－１５０フラスコから剥離し、剥離した細胞への１ｍＭの最終濃度になるまでのＣａＣｌ２の添加によって即座に再石灰化した。成長培地を、剥離した細胞に即座に添加し、次いで、３００×ｇで室温で５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。細胞を、濡れた氷上で５分間、１％の最終濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭの最終濃度の塩化カルシウムおよび０．１％の最終濃度のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４からなる冷ＣＨＯ緩衝液中で、９６ウェルＶ底プレート中にプレートした。インキュベーション後、細胞を、３００×ｇで４℃で２分間遠心分離して、緩衝液を除去した。
試験抗体溶液を、ＣＨＯ緩衝液を希釈剤として使用する連続希釈（１３３３．３ｎＭ～０．００２２ｎＭの範囲）を用いて調製し、１００μＬを添加し、指定された体積の連続希釈した抗体中でインキュベートし、氷上で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、抗体を除去し、細胞を、３００×ｇで４℃で１分間の遠心分離によって３回洗浄し、冷ＣＨＯ緩衝液中に再懸濁した。洗浄した細胞を、１００μＬの１：１０００希釈のＡＰＣコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に濡れた氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリー分析のためのＣＨＯ緩衝液中での再懸濁の前に、３回または４回洗浄した。６４０ナノメートルのレーザー線を使用するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器を使用して、細胞蛍光データを獲得した。細胞の幾何平均蛍光を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）によって分析し、抗体濃度に対してプロットした。推定されたＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍスイート（ＧｒａｐｈＰａｄ、バージョン８）において非線形回帰分析を使用して計算した（表８）。
キメラ抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１５４、０１７０および０１８０は、１．９９ｎＭ～４．９９ｎＭの範囲の推定されたＥＣ５０値で、ＣＨＯ細胞上の細胞表面で発現されたヒトＥ－セレクチンへの結合を示した（表８）。抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１７０および０１８０は、３．３７～１３．９８の範囲の推定されたＥＣ５０値で、カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞にも結合した。抗体０１６４、０１５８、０１５９、０１５４、０１７０および０１８０は、ＣＨＯが発現したヒトＰ－セレクチンには結合せず、Ｅ－セレクチンに対する選択性を示した。抗体００３９は、推定されたＥＣ５０値＞３５４ｎＭで、ＣＨＯが発現したヒトＰ－セレクチンへの最小限の結合を示した。
Figure 0007449390000039
（実施例８）
生理学的流動アッセイを使用した抗Ｅ－セレクチン抗体のｅｘ ｖｉｖｏ中和
ｅｘ ｖｉｖｏ細胞接着を、ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）プレート／チャンバー（Ｆｌｕｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、４８ウェル低剪断、０～２０ダイン／ｃｍ２；９１０－０００４）を使用するＢｉｏＦｌｕｘ（商標）システム（Ｆｌｕｘｉｏｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、生理学的流動条件下で分析した。接着アッセイを、組換えの精製した可溶性Ｅ－セレクチンまたはＰ－セレクチンタンパク質およびヒトＨＬ－６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４０）を使用して実施した。ＨＬ－６０細胞は、Ｅセレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスリガンドを発現する。ＨＬ－６０細胞を、１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）；１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ／グルタミン成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で維持した。細胞を、灌流前に３７℃で維持し、ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）アッセイを室温で実施した。最初に、活性化された内皮細胞の表面を模倣するために、フローチャンバーを、等しい量のヒトＥ－セレクチンおよびＰ－セレクチン可溶性組換えタンパク質の両方でコーティングした。ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）フローマイクロチャネルを、ＰＢＳ中で調製した１０μｇ／ｍＬの可溶性組換えヒトＰ－セレクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＤＰ３）およびＥ－セレクチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＤＰ１）の各々でコーティングし、１ダイン／ｃｍ２で５分間灌流し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで１ダイン／ｃｍ２で３～５分間洗浄した。Ｅ－セレクチンキメラ抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０を、ＰＢＳ中に希釈し、プレートを、１ダイン／ｃｍ２で１時間、試験物品（１．６～１０００ｎＭの濃度）またはビヒクル対照で処置した。ＨＬ－６０細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）；Ｃ３０９９）で３０分間染色し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中に約３×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁した。希釈した抗体ストックもまた、フローチャンバー中での灌流前に細胞懸濁物に添加した。１００μＬのＨＬ－６０細胞のアリコートを、１ダイン／ｃｍ２の生理学的剪断流動で、各チャネル中で１０分間灌流した。ＰＢＳを、１ダイン／ｃｍ２で２～３分間灌流して、非接着細胞を除去した。接着細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｓ（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＢＲ ３．２ ６４ビット）倒立ステージ位相差蛍光顕微鏡を４０×の倍率で使用して可視化およびカウントした。細胞カウントを、リン酸緩衝液ビヒクル対照に対して標準化した。各実験は、１条件当たり２つのウェルを有する。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．２）を使用してグラフ化および分析した。推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、分析から導出した。
脈管構造を介した血流をｅｘ ｖｉｖｏで模倣するために設計したこれらの研究では、Ｅ－セレクチン抗体００３９、０１６４、０１５８、０１５９、０１７０および０１８０は、それぞれ２６４．７ｎＭ、１．７ｎＭ、１７．９ｎＭ、２１ｎＭ、７４．２ｎＭおよび２２４．７ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、可溶性組換えＥ－セレクチンタンパク質へのＨＬ－６０細胞の接着を中和した（表９）。
Figure 0007449390000040
（実施例９）
抗Ｅ－セレクチン抗体のエピトープグループ分け
６つの中和キメラ抗体（００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０）を、Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを使用した競合アッセイに基づいて、エピトープビンにグループ分けした。抗ヒトＦＣ（ＡＨＣ）コーティングされた先端を、７つの抗体のうち１つを２０μｇ／ｍＬで含むウェルに６００秒間移して、第１の抗体を抗ヒトＦＣに結合させた。先端を、３００ｎＭのヒトＥ－セレクチン細胞外ドメイン（配列番号１３３プラス１０Ｈｉｓ精製テイル）を含む第２のウェルに移し、１００秒間会合させた。最後に、先端を、第２の抗体を含む第３のウェルに１００秒間移した。抗体を、第２の抗体が、第１の抗体によって生成されたシグナルを上回る、バイオセンサーシグナルにおける増加を示した場合には、非競合的とスコアリングし、第２の抗体がシグナルにおけるさらなる増加を生成しなかった場合には、競合的とスコアリングした（表１０）。
これらの競合データに基づくと、抗体０１５９、０１６４、０１７０および０１８０は、１つのエピトープ群を規定し、０１５８は、第２のエピトープ群を規定し、００３９は、第３のエピトープ群を規定した。第１の群および第２の群は、部分的に重複し、第２および第３の群は部分的に重複し、第１および第３の群は非重複である。表１０中、「＋」は、第２の抗体（列の見出しによって示される）が、第１の抗体（行の見出しによって示される）の存在下で結合したことを示している。「－」は、シグナルにおける増加が第２の抗体の添加の際に観察されなかったことを示している。
Figure 0007449390000041
（実施例１０）
結晶構造およびエピトープ
抗Ｅ－セレクチンキメラ抗体０１６４のＦａｂ断片を、全長ＩｇＧをパパインで切断し、プロテインＡ樹脂を使用してＦｃを除去することによって得た。Ｆａｂを、１：１のモル比で短縮型ヒトＥ－セレクチン（実施例１に記載される）と混合し、得られた複合体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。複合体の結晶が、２００ｍＭの酢酸カルシウムｐＨ７．５、２０％ＰＥＧ ３３５０中で形成した。データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅにおいて、ビームライン１７－ＩＤにおいて２．６８Åまで収集した。構造を、分子置換によって解明し、０．２４３／０．２５２のＲ／Ｒｆｒｅｅまで精緻化した（図１）。結晶構造は、空間群Ｐ３１２１の非対称単位中に、単一の０１６４ Ｆａｂ断片に結合した単一コピーのＥ－セレクチンを有する。
結晶構造に基づいて、抗体０１６４と相互作用するＥ－セレクチンの残基を、以下に基づいて決定した：ｉ）３．８Å以内にある残基、ｉｉ）０１６４抗体残基およびＥ－セレクチン残基の対間の相互作用に起因して埋没した標準化された表面積（Å２）＞５Å２、ｉｉｉ）塩橋の形成、ｉｖ）水素結合の形成、またはｖ）水媒介性の水素結合の形成。その番号付けが成熟ヒトＥ－セレクチン配列（配列番号１３２）に基づく残基のリストは、Ｔ７、Ｅ８、Ａ９、Ｍ１０、Ｔ１１、Ｐ４６、Ｓ４７、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｑ８５、Ｅ８８、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５、Ｅ１０７、Ｒ１０８、Ｓ１１０、Ｋ１１１、Ｋ１１２およびＫ１１３を含む（表１１）。
Ｘ線結晶解析による、Ｅ－セレクチンの、その天然のリガンドシアリルルイスＸ（ｓＬｅＸ）との相互作用は、ＰＤＢ構造（１ｇ１ｔ）中に示される（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／１ｇ１ｔを参照のこと）。この構造では、ｓＬｅＸの３．８Å以内にあり、抗体０１６４との相互作用と類似するＥ－セレクチン残基は、配列番号１３２の番号付けに基づいて、Ｙ４８、Ｎ８２、Ｎ８３、Ｅ９２、Ｙ９４、Ｒ９７、Ｎ１０５およびＥ１０７である。それらもまたｓＬｅｘの３．８オングストローム以内にあるさらなる残基は、Ｅ８０、Ｅ９８およびＤ１０６である（配列番号１３２の番号付けに基づく）。ｓＬｅｘのエピトープと抗体０１６４との著しい重複を考慮すると、この抗体によって実証された中和活性は、ｓＬｅＸおよび他の類似のリガンド、例えば、シアリルルイスＡ（ｓＬｅＡ）の、Ｅ－セレクチンとの相互作用を直接遮断したことの結果である可能性が高い。
Figure 0007449390000042
（実施例１１）
ラット抗Ｅ－セレクチン抗体のヒト化
ラットキメラ中和抗体００３９、０１５８、０１５９、０１６４、０１７０および０１８０のヒト化バージョンを、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフトによって生成した（本明細書の以下で「ＣＤＲグラフトした」と呼ばれる）。抗体００３９、０１５８、０１６４および０１８０について、重鎖ＣＤＲを、ヒトＤＰ－５４フレームワーク領域上にグラフトした（ＶＨ３サブ群）。ヒト化抗体００３９は、位置４８におけるメチオニン、位置４９におけるグリシンおよび位置７８におけるバリンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。ヒト化抗体０１５８は、位置２４におけるバリン、位置４８におけるメチオニン、位置４９におけるグリシン、位置７３におけるスレオニンおよび位置７８におけるバリンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。ヒト化抗体０１６４は、位置７１におけるアラニン、位置７８におけるアラニンおよび位置９４におけるメチオニンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。ヒト化抗体０１８０は、位置４８におけるイソロイシン、位置４９におけるグリシン、位置６９におけるロイシン、位置７１におけるセリン、位置７３におけるスレオニン、位置７８におけるアラニンおよび位置９４におけるイソロイシンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。
抗体０１５９について、重鎖ＣＤＲを、ＤＰ－７フレームワーク領域上にグラフトした（ＶＨ１サブ群）。ヒト化抗体０１５９は、位置２４におけるバリン、位置６９におけるロイシン、位置７８におけるアラニンおよび位置９４におけるメチオニンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。
抗体０１７０について、重鎖ＣＤＲを、ＤＰ－１０フレームワーク領域上にグラフトした（ＶＨ１サブ群）。ヒト化抗体０１７０は、位置２４におけるバリン、位置６９におけるイソロイシン、位置７３におけるスレオニンおよび位置９４におけるバリンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。
６つ全てのヒト化抗体に、ＪＨ４ Ｊ－セグメント（配列番号６のアミノ酸配列）をグラフトした。
抗体００３９、０１５８、０１６４、０１７０および０１８０について、軽鎖ＣＤＲを、ヒトＤＰＫ９フレームワーク領域上にグラフトした（ＶＫＩサブ群）。ヒト化抗体００３９は、Ｌ８７においてラットアミノ酸残基システインを含んだ。ヒト化抗体０１５８は、位置４においてラットアミノ酸残基メチオニンを含んだ。ヒト化抗体０１６４および１８０は、位置８７においてラットアミノ酸残基フェニルアラニンを含んだ。ヒト化抗体０１７０は、位置４８におけるメチオニンおよび位置８７におけるフェニルアラニンを含むラットアミノ酸残基を含んだ。
抗体０１５９について、軽鎖ＣＤＲを、ヒトＤＰＫ１フレームワーク領域上にグラフトした（ＶＫＩサブ群）。
ヒト化ＶＨ領域を、エフェクター機能変異したヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号１６のアミノ酸配列）に接合させ、次いで、独占所有権のある発現ベクター中にサブクローニングして、ＣＤＲグラフトした重鎖 配列番号５１（００３９ ＣＤＲグラフト；抗体０５２５の重鎖）、配列番号６２（０１５８ ＣＤＲグラフト；抗体２６５＿２５４の重鎖）、配列番号７６（０１５９ ＣＤＲグラフト；抗体０９２９＿０５４８の重鎖）、配列番号２２（０１６４ ＣＤＲグラフト；抗体０８４１の重鎖）、配列番号９１（０１７０ ＣＤＲグラフト；抗体０９５５＿０３００の重鎖）および配列番号１１０（０１８０ ＣＤＲグラフト；抗体０５６４の重鎖）を生成した。
ヒト化ＶＬ領域を、ヒトカッパ定常領域（配列番号１４のアミノ酸配列）に融合させ、次いで、独占所有権のある発現ベクター中にサブクローニングして、ＣＤＲグラフトした軽鎖 配列番号４６（００３９ ＣＤＲグラフト；抗体０５２５の軽鎖）、配列番号６７（０１５８ ＣＤＲグラフト；抗体０２６５＿０２５４の軽鎖）、配列番号８１（０１５９ ＣＤＲグラフト；抗体０９２９＿０５４８の軽鎖）、配列番号１７（０１６４ ＣＤＲグラフト；抗体０８４１の軽鎖）、配列番号９６（０１７０ ＣＤＲグラフト；抗体０９５５＿０３００の軽鎖）および配列番号１０５（０１８０ ＣＤＲグラフト；抗体０５６４の軽鎖）を創出した。
Figure 0007449390000043
（実施例１２）
表面プラズモン共鳴を使用したヒト化抗Ｅ－セレクチンの動態評価
ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンに対する結合親和性を、実施例４に記載された方法と類似の方法でＳＰＲを使用して、ヒト化抗体０８４１（ＨＣ配列番号２２、ＬＣ配列番号１７）について決定した。これは、固定化された抗ヒトＩｇＧに抗体を最初に結合させることによって実施した。抗体捕捉後、Ｅ－セレクチンタンパク質の希釈物を上に流し、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、ｔ１／２およびＫＤ値を、ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンへの結合について決定した（表１３）。このＳＰＲ分析では、ヒトＥ－セレクチンおよびカニクイザルＥ－セレクチンに対するヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体０８４１の親和性は、それぞれ９２．８５ｎＭおよび１３８．５ｎＭであった。
Figure 0007449390000044
（実施例１３）
ヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体（０８４１）の細胞表面結合（ＦＡＣＳ）
抗体結合を、Ｅ－セレクチンを発現するように操作された細胞のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して評価した。カニクイザルとの種交差反応性も評価した。
ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、培養培地（Ｇｉｂｃｏ）中に１０％透析胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）および１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したアルファ培地（ＭＥＭ［最小必須培地］アルファ培地、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞については、成長培地に１００ｎＭのメトトレキサートもまた補充した。カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲ１培地（ＲＩダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２改変）中で培養した。細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気で、成長培地中で維持した。メトトレキサートまたはＺｅｏｃｉｎを、実験のための培養前に培地から除去した。ＣＨＯ－Ｅセレクチン細胞を、クエン酸食塩水（１３５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を使用してＴ－１５０フラスコから剥離し、剥離した細胞への１ｍＭの最終濃度になるまでのＣａＣｌ２の添加によって即座に再石灰化した。成長培地を、剥離した細胞に即座に添加し、次いで、３００×ｇで室温で５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。細胞を、濡れた氷上で５分間、１％の最終濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｍＭの最終濃度の塩化カルシウムおよび０．１％の最終濃度のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４からなる冷ＣＨＯ緩衝液中で、９６ウェル丸底プレート中にプレートした。インキュベーション後、細胞を、３００×ｇで４℃で２分間遠心分離して、緩衝液を除去した。
試験抗体溶液を、ＣＨＯ緩衝液を希釈剤として使用する連続希釈（１３３３．３ｎＭ～０．００２２ｎＭの範囲）を用いて調製し、１００μＬを、指定された体積の連続希釈した抗体中に添加し、氷上で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、抗体を除去し、細胞を、３００×ｇで４℃で１分間の遠心分離によって３回洗浄し、冷ＣＨＯ緩衝液中に再懸濁した。洗浄した細胞を、再懸濁し、１００μＬの１：１０００希釈のＡＰＣコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に濡れた氷上で３０分間インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリー分析のためのＣＨＯ緩衝液中での再懸濁の前に、３回または４回洗浄した。６４０ナノメートルのレーザー線を使用するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器を使用して、細胞蛍光データを獲得した。細胞の幾何平均蛍光を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）によって分析し、抗体濃度に対してプロットした。推定されたＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍスイートにおいて非線形回帰分析を使用して計算した。
ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンへのヒト化抗体０８４１の結合は、それぞれ１．６２および１．５４ｎＭの推定されたＥＣ５０値で類似であった（表１４）。同じアッセイにおいて抗体０１６４について推定されたＥＣ５０値は、ＣＨＯで発現されたヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンについて、それぞれ１．３９および１．７３ｎＭの推定されたＥＣ５０値で類似であった（表１４）。
（実施例１４）
ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのリガンド結合のヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体中和
静置リガンド細胞接着アッセイでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートしたＥ－セレクチンリガンドおよびＥ－セレクチン抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上に発現されたヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンへの結合について競合する。リガンド結合を中和する抗Ｅ－セレクチン抗体の能力を、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する静置中和アッセイにおいて評価して、ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンを発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）へのシアリルルイス抗原の中和を評価した。
ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、培養培地（１０％透析胎仔ウシ血清、１００ｎＭのメトトレキサートおよび１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＭＥＭ（最小必須培地）アルファ培地）中で成長させ、カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲ１培地（ＲＩダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２改変）中で培養した。Ｅ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェル組織培養プレート中に１ウェル当たり１２，５００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートして、コンフルエントな単層を形成した。プレートを、カルシウムマグネシウムなしのＰＢＳ ２００μＬで引き続いて２回洗浄した。抗Ｅ－セレクチン抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照を、ビオチン化シアリルルイスＡポリアクリルアミド（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ ＬＬＣ、ＯＳ４５４４６）またはビオチン化シアリルルイスＸポリアクリルアミド（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、０１－０４５）の小さい合成コンジュゲートの存在下で、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼと共にアッセイに添加し（合計１００μＬ）、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次いで、プレートを、カルシウムマグネシウムなしのＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄した。インキュベーション後、細胞を、２ｍＭの塩化カルシウムを含む洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ［トリスアミノメタン］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム；０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４；２ｍＭの塩化カルシウム）２００μＬで２回洗浄した。シグナルを、１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２８）を添加し、室温で３０分間インキュベートすることによって発生させた。反応を、２Ｍの硫酸を使用して停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ）。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．０．２）を使用して分析およびグラフ化した。推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、分析から導出した。
ヒト化抗体０８４１による、ＣＨＯ細胞の表面上に発現されたヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンへのシアリルルイスリガンド結合の中和は、それぞれ３．８１および１．７４ｎＭの推定されたＩＣ５０値で類似であった（表１４）。同じアッセイにおいて０１６４について推定されたＩＣ５０値は、ＣＨＯで発現されたヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンについて、それぞれ５．１７および２．００ｎＭの推定されたＩＣ５０値で類似であった。
（実施例１５）
生理学的流動下での細胞接着のヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体中和
ｅｘ ｖｉｖｏ細胞ローリング／接着研究を実施して、生理学的流動システムを使用してＣＨＯ－ヒトＥ－セレクチン細胞へのＨＬ－６０細胞の接着を阻害する抗体０８４１および０１６４の有効性および中和活性を評価した。
ＣＨＯ－ヒトＥ－セレクチン細胞を、アルファ培地／１０％透析胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）／ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）および１００ｎＭのメトトレキサート中で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で維持した。ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）プレートを、１ダイン／ｃｍ２の流速でＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコーティングし、室温で１時間インキュベートした。ヒトＥ－セレクチンを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ヒトＣＨＯ－Ｅ－セレクチン細胞）を、１：１の比の０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ；Ａ１１１０５０１）による３７℃で５分間の処置によってアッセイのために調製し、等しい体積の成長培地で中和し、収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、成長培地中に約３０×１０６細胞／ｍＬの最終濃度になるように再懸濁した。プレートを、１ダイン／ｃｍ２で室温で２～３分間、ＣＨＯ－ヒトＥ－セレクチン成長培地で２回灌流した。全ての培地を除去し、３０μＬのＣＨＯ－ヒトＥ－セレクチン細胞（約３０×１０６細胞／ｍＬ）を、３～４ダイン／ｃｍ２で２５秒間灌流した。プレートを機器から取り出し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベートした。培地を除去し、５００μＬの新たな成長培地を添加し、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ＣＨＯ－Ｅ単層を、ＢｉｏＦｌｕｘ機器上で新たな成長培地を用いて洗浄した（３～４ダイン／ｃｍ２）。ＰＢＳ中の抗体０８４１（連続希釈）、アイソタイプ対照抗体およびＩｇＧ１対照抗体（２００ｎＭ）、ならびにビヒクル対照を、１ダイン／ｃｍ２で１時間灌流した。
ＨＬ－６０細胞を、１０％胎仔ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ）；および１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ／グルタミン成長培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で維持した。細胞を、灌流前に３７℃で維持した。ＨＬ－６０細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）；Ｃ３０９９）で３０分間染色し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中に約３×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁した。希釈した抗体ストックもまた、フローチャンバー中での灌流前に細胞懸濁物に添加した。１００μＬのＨＬ－６０細胞のアリコートプラス阻害剤を、１ダイン／ｃｍ２の生理学的剪断流動で、各チャネル中で１０分間灌流した。ＰＢＳを、１ダイン／ｃｍ２で２～３分間灌流して非接着細胞を除去し、プレートを画像化し、分析した。アッセイを室温で実施した。
抗体０８４１および０１６４は、生理学的流動条件下で、それぞれ４．１７および３．７３ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０細胞の中和を阻害した（表１４）。
Figure 0007449390000045
（実施例１６）
ヒト化抗Ｅ－セレクチンの生物物理学的特徴付け
熱安定性
示差走査熱量測定を使用して、ヒト化抗体０８４１（配列番号２２のＨＣアミノ酸配列および配列番号１７のＬＣアミノ酸配列を含む）の安定性を決定した。この分析のために、０．３ｍｇ／ｍＬのサンプルを、Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣのサンプルトレイ中に分配し、１０℃で５分間平衡化し、次いで、１時間当たり１００℃の速度で、１１０℃までスキャンした。１６秒間のフィルタリング期間を選択した。生データをベースライン補正し、タンパク質濃度を標準化した。Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、データを、適切な数の遷移を有するＭＮ２－Ｓｔａｔｅ Ｍｏｄｅｌにフィットさせた。以下の表１５は、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、８．５％スクロース、ｐＨ７．５）、Ｈｉｓ／Ｓｕｃ緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン、８．５％スクロース、０．００５％ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）およびＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液（２０ｍＭのグルタミン酸、８．５％トレハロース、ｐＨ４．５）中での分子の融解温度（Ｔｍ１～Ｔｍ４およびＦＡＢ）を示している。この分子は、良好な安定性を示し、ＣＨ２ドメインにおける第１の遷移（Ｔｍ１）は、Ｔｒｉｓ／ＳｕｃおよびＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中では、６５℃よりも高く、Ｇｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中では、６５℃をほんの少し下回った。
Figure 0007449390000046
強制的分解
ヒト化抗体０８４１を、４０℃での４週間の強制的分解研究のために、３つの緩衝液中に広範に透析した：Ｔｒｉｓ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）、Ｈｉｓ（２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．８）およびＧｌｕ（２０ｍＭのグルタミン酸、ｐＨ４．５）。透析後、サンプル濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整した。Ｔ０、Ｔ２およびＴ４週の時点で、サンプルを、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）、画像化キャピラリー電気泳動（ｉＣＥ）およびバイオアッセイ試験のために取った。
加熱したサンプルの凝集状態を、ａＳＥＣによって決定した。サンプルを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２を移動相として用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に接続されたＹＭＣ－Ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ－２００カラム（３００×８．０ｍｍ、孔サイズ２００Å）上に注入した。０．７５ｍＬ／分の流速で２０分間にわたるアイソクラチックプログラムを、サンプル溶出のためにａＳＥＣカラムに適用し、データを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬＡＢ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して分析して、凝集体、目的のタンパク質および低分子量種のピーク面積を積分および定量化した。全てのサンプルが、％ＨＭＭＳ（高分子量種）および％ＬＭＭＳ（低分子量種）における最小限の変化を示した、即ち、パーセンテージは、５％未満であった（表１６）。
Figure 0007449390000047
ｉＣＥを使用して、強制的分解サンプルの電荷ベースの不均一性を検出した。ｉＣＥは、高電圧下でタンパク質荷電種を分離し、吸光度を２８０ｎｍで検出する。担体である両性電解質がｐＨ勾配を生じ、その正味の荷電がゼロになるまで、タンパク質が移動する。電気泳動図を分析して、酸性種、主要種および塩基性種についてｐＩ値およびピーク面積を決定した。ＰｒｉｎＣＥ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを備えたＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３機器を使用して、サンプルを分析した。タンパク質を、水中で２ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。サンプル希釈剤は、０．０１ｍｇ／ｍＬのｐＩマーカー４．６５、０．０１ｍｇ／ｍＬのｐＩマーカー９．５、４．０％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ ｐＨ３～１０、０．２５％メチルセルロースおよび２．０Ｍの尿素を含んだ。サンプルは、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質１５μＬおよび８５μＬのサンプル希釈剤を含んだ。サンプルに、１５００ボルトで１分間、次いで、３０００ボルトで６分間、焦点を当てた。Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアをデータ分析に使用した。
ｉＣＥ分析において高いパーセンテージの酸性種／塩基性種を有するサンプルについては、さらなる質量分析による分析が、ＣＤＲ領域上の配列責任を同定するために要求された。ヒスチジンおよびグルタミン酸緩衝液中のサンプルの分析は、酸性種および塩基性種における典型的な増加を示した。しかし、Ｔｒｉｓ緩衝液中の安定な抗体について期待されたものよりも大きい、塩基性種における増加が存在し、これは、可能な化学的改変を示唆している（表１７）。３つ全ての緩衝液中のサンプルを、質量分析３部分析およびペプチドマッピングを使用してさらに分析した。
Figure 0007449390000048
質量分析による分析
３部の質量分析による分析のために、抗体を、ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡを使用して消化した。５０μｇの抗体ｍＡｂを、１００～１５０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ７．０に、２５μＬの体積になるように添加した。１．５μＬのＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ酵素（４０Ｕ／μＬ）を添加し、穏やかに振盪しながら３７℃で一晩（１６～１８時間）インキュベートした。この後に、５０μＬの８Ｍ Ｇｕａｎ－ＨＣｌ、１２．５μＬの１Ｍ ＤＴＴおよび１２．５μＬの１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０を添加した。これを、穏やかに振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。７～８μｇ（約１５μＬ）を、３部液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ）分析に使用した。
ＬＣ－ＭＳ分析を、Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）ＵＰＬＣに連結されたＢｒｕｋｅｒ ｍａＸｉｓ ＩＩ質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して実施した。ＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡで消化し、還元したサンプルを、３００μＬ／分の流速で、６５℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ４（１．７Å、２．１×１５０ｍＭ）カラム上で分離した。移動相Ａは、５％のアセトニトリルおよび０．０５％のＴＦＡを含む水であり、移動相Ｂは、５０：５０のアセトニトリル：２－プロパノールおよび０．０５％ＴＦＡであった。質量分析器を、ポジティブＭＳのみのモードで実行し、データをｏＴＯＦ制御ソフトウェアで獲得した。ＴＯＦ－ＭＳシグナルを、Ｃｏｍｐａｓｓ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ ｖ ４．２（Ｂｒｕｋｅｒ）においてＭａｘｉｍｕｍ Ｅｎｔｒｏｐｙを使用してデコンボリュートした。４週の時点（Ｔ４Ｗ）におけるグルタミン酸、ヒスチジンおよびＴｒｉｓ緩衝液中の強制的分解０８４１サンプルの分析は、時間０（Ｔ０）におけるサンプルと比較して類似のプロファイルを示した（図２）。ＰｙｒｏＥ－Ｆｄ（Ｎ末端にピログルタミン酸（ＰｙｒｏＥ）を有するＩｇＧ重鎖由来のＦｄ断片）は、Ｔ４Ｗサンプルにおいて、特にＴｒｉｓ緩衝液中で、僅かな増加を示した（約３．５％）。さらに、約５％のＦｄ Ｄ／Ｐクリップ（アスパラギン酸／プロリン（Ｄ／Ｐ）部位が切断されたＦｄ断片）が、Ｔ０およびＴ４Ｗサンプルにおいて検出された。
ＬＣ－ＭＳによるペプチドマッピング
サンプル安定性をさらに調査するために、ペプチドマッピングＬＣ－ＭＳを利用した。ペプチドマッピングのために、抗体０８４１の変性および還元を、５ＭのＧｕａｎ：ＨＣｌ ＮａＡｃ、ｐＨ５．０、１０ｍＭのＴＣＥＰ中で３７℃で１時間実施した。反応混合物を、１００ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、０．５ｍＭのＴＣＥＰ緩衝液で１０倍希釈した。次に、ＬｙｓＣ／トリプシンミックスを１：１０の比で添加し、その後、３７℃で一晩消化した。反応を０．５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（最終濃度）でクエンチした。次いで、この消化混合物を、ＬＣ－ＭＳ分析のためにＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ上に注入した。
ＬＣ－ＭＳペプチドマッピング分析を、Ｗａｔｅｒｓ Ｈ－Ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）ＵＰＬＣに連結されたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して実施した。消化したサンプルを、２００μＬ／分の流速で、６０℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８（３００Å、１．７ｕｍ ２．１×１５０ｍＭ）カラム上で分離した。移動相Ａは、水中０．０５％のＴＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．０５％のＴＦＡであった。ペプチドを、勾配：０．５％～３５％のＢを使用して、１３５分間かけてカラムから溶出させた。質量分析器を、３００から１６００ｍ／ｚまでスキャンするポジティブＭＳのみのモードで実行し、データをＸｃａｌｉｂｕｒソフトウェアで獲得した。データ分析およびデータベース検索を、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）およびＰｅａｋｓ ＡＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）の両方を使用して実施した。
Ｔｒｉｓ、ヒスチジンおよびグルタミン酸緩衝液についてのＴ４Ｗサンプルの高忠実度ペプチドマッピング分析は、配列ＩＤＰＡＮ＊ＧＮＴＩＹＡＥＫ（ＮＧ脱アミド部位は下線付きである；配列番号１７６）を有するＨＣ ＣＤＲ２ペプチドにおける微量の脱アミド（＜１％）を同定した。ＮＧは、一般的な脱アミド部位であるが、この場合には、大抵は安定であった。潜在的脱アミド（スクシンイミド－Ｎの形態）が、配列ＴＳＱＮＩＮ＊ＲＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫ（ＮＲ脱アミド部位は下線付きである；配列番号１７７）を有するＬＣ ＣＤＲ１ペプチドにおいて検出され、脱アミドは、Ｔｒｉｓ Ｔ４Ｗサンプルにおいて約５．１％まで増加した（ＭＳ２スペクトルが示したＮ（３０）Ｒ部位が、脱アミド部位である可能性が最も高かったが、Ｎ２８およびＮ３４もまた、微量の脱アミドを潜在的に有し得た）（表１８）。
Figure 0007449390000049
競合結合ＥＬＩＳＡ
強制的分解サンプルの安定性をさらに評価するために、ストレスをかけたサンプルの活性を、競合結合ＥＬＩＳＡにおいて評価した。ここでは、Ｔ０、Ｔ２ＷおよびＴ４Ｗサンプルの安定性を、ヒトＥ－セレクチンへの結合についてビオチン化キメラ抗体０１６４（ＨＣ配列番号３４およびＬＣ配列番号３１を含む）と競合するそれらの能力について比較した。ヒトＥ－セレクチンを、５００μｇ／ｍＬのＣａ／Ｍｇを含むＰＢＳ中で貯蔵し、１μｇ／ｍＬの濃度のＣａ／Ｍｇを含むＰＢＳで希釈した。これを、３８４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレートに添加し、密封し、穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。次の日、各ウェル中の試薬を除去し、その後、５０μＬの遮断緩衝液（Ｃａ／Ｍｇを含むＰＢＳ中１％のＢＳＡ）を各ウェルに添加した。ウェルを密封し、穏やかに振盪しながら室温で約１時間インキュベートした。０．２ｍｇ／ｍＬの出発濃度で、抗体０８４１を、合計１２個の濃度になるように、Ｃａ／Ｍｇを含むＰＢＳによる１／３希釈のステップで連続希釈した。
ビオチン化抗体０１６４を、２％ＢＳＡ／Ｃａ／Ｍｇｗを含むＰＢＳ中で０．０４μｇ／ｍＬになるように希釈した。等しい体積の希釈した抗体０８４１を、ビオチン化抗体０１６４と混合した。次に、洗浄プレートを、各洗浄のために８０μＬを使用して、３サイクルにわたってＴＩＴＥＲＴＥＫ上でＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を含む１％ＢＳＡで遮断した。プレートを、ペーパータオル上でタップして水気を切った。抗体０８４１およびビオチン標識された抗体０１６４の混合物２５μＬを、二連のウェルで３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で２～４時間インキュベートした。洗浄ステップを、３サイクルの２回の洗浄で反復した。次いで、希ストレプトアビジン－ＨＲＰ（遮断緩衝液中に約１／７５００希釈）を各ウェルに添加し、プレートを、穏やかに振盪しながら室温で約４０分間～１時間インキュベートした。洗浄ステップを、３サイクルの２回の洗浄で再度反復し、タップして乾燥させ、その後、２５μＬのＴＭＢ基質（１構成要素のＨＲＰマイクロウェル基質）を添加した。この後、色が飽和（発色を観察することによって決定される）に達したときに、０．１８Ｍの硫酸２５μＬを添加して反応を停止させた。次いで、プレートのＯＤ４５０測定値をＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取り、データをＧｒａｐｈＰａｄ、Ｐｒｉｓｍ７で分析した。
競合結合結果は図３に示され、３つの緩衝液のいずれにおいても、Ｔ０サンプルとＴ２ＷサンプルとＴ４Ｗサンプルとの間で差異は見られなかった。これらのデータは、抗体０８４１が、高温条件（即ち、４０℃）下での貯蔵後にＥ－セレクチンに結合するその能力を保持したことを実証している。
高濃度安定性
ヒト化抗体０８４１を、３つの緩衝液、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、８．５％スクロース、ｐＨ７．５）、Ｈｉｓ／Ｓｕｃ（２０ｍＭのヒスチジン、８．５％スクロース、０．００５％ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）およびＧｌｕ／Ｔｒｅ（２０ｍＭのグルタミン酸、８．５％トレハロース、ｐＨ４．５）中に広範に透析した。透析後、サンプルを、スピンフィルター濃縮器を使用して１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、４℃および２５℃で貯蔵した。Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ４およびＴ６週の時点で、サンプルを、リアルタイムａＳＥＣ分析のために取った。
高濃度サンプルの凝集状態を、強制的分解分析について上記したように、ａＳＥＣによって決定した。４℃および２５℃で貯蔵したサンプルは、３つ全ての緩衝液条件下で、ＨＭＭＳのパーセンテージにおける増加をほとんど伴わずに（＜５％）、Ｔ６週（Ｔ６Ｗ）の時点で高濃度で安定であった（表１９）。
Figure 0007449390000050
Ｔ０、Ｔ３（Ｔ３Ｗ）およびＴ６週の時点で、サンプルを、ｉＣＥおよびキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって分析した。ｉＣＥを使用して、強制的分解研究で使用した方法と類似の方法を使用して、高濃度サンプルの電荷ベースの不均一性を検出した。％酸性種および％塩基性種における最小限の変化が、Ｈｉｓ／ＳｕｃおよびＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中で２５℃での６週間の貯蔵にわたって観察され、酸性種および塩基性種におけるより大きい変化は、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ緩衝液と関連した（表２０）。
Figure 0007449390000051
ＣＧＥを実施して、抗体０８４１の高濃度サンプルの断片化を決定した。サンプルを、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＬａｂＣｈｉｐ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｓｓａｙを使用して解析した。アッセイを、製造業者の指示に従ってセットアップし、改変法を使用してサンプルを調製した。簡潔に述べると、１ｍｇ／ｍＬのサンプル５μＬを、非還元性（ｎｒＣＧＥ）についてはヨードアセトアミドを含み、または還元性ＣＧＥについてはジチオスレイトールを含むサンプル緩衝液３５μＬと混合し、７０℃で１０分間インキュベートした。加熱後、７０μＬの脱イオン水を、Ｔｏｕｃｈシステムでの分析の前に、各サンプルに添加した。各サンプルについての断片化のサイズおよびレベルを、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェアを使用して定量化した。
％断片化および％ＨＭＭＳの定量化は、高濃度の抗体０８４１が、３つ全ての緩衝液中で安定であったことを実証した（表２１）。
Figure 0007449390000052
（実施例１７）
ヒト化抗Ｅ－セレクチンのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ免疫原性リスクおよびＴ細胞エピトープ予測
ヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体０８４１の免疫原性リスクを、ＭＨＣＩＩペプチド結合の予測のためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して予測した。これらのツールを以下のために使用した：（１）配列中の各個々のペプチドについての潜在的ＭＨＣＩＩ結合のエピトープ同定、（２）潜在的ＭＨＣＩＩペプチド結合子のリスクを評価するためのエピトープ分類、および（３）ＭＨＣＩＩ結合関連の免疫原性リスクを有する配列全体の全体的リスクを予測するための全体的配列スコア。これらの方法は以下に記載される。
エピトープ同定
配列を２つのプロトコール（以下に記載される）を使用して分析して、エピトープを同定した。いずれかのプロトコールについて本明細書に記載される規則によってフラグ付けされた任意の配列を、エピトープとみなした。これらの方法は、主にアミノ酸９マーのレベルで、配列を試験する。
プロトコール１：ＩＳＰＲＩ／ＥｐｉＭａｔｒｉｘ
配列を、ＩＳＰＲＩソフトウェアパッケージ（ＩＳＰＲＩ ｖ １．８．０、ＥｐｉＶａｘ Ｉｎｃ．、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、ＲＩ（２０１７）；Ｓｃｈａｆｅｒ ＪＲＡら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６（１９）：１８８０～８４）でのＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析に供した。生結果は、８つの異なるＨＬＡ型に対する各９マーアミノ酸断片の結合の可能性のランキングを提供した。したがって、各９マーについて、８つの予測（「観測」）が存在した。これらの９マーを、配列の各個々の直線的な番号付け位置で開始して生成した（したがって、同じ９マーが同じ配列中に１回よりも多く存在することが可能であった）。任意の４つの観測が、９マーが結合子の上位５％にあることを示した場合（少なくとも４つのＨＬＡ型について、それが結合子の上位５％にあると予測されたことを意味する）、その９マーを、予測されたエピトープ（「エピトープ」）とみなした。あるいは、８つの予測のうちいずれか１つが、９マーが結合子の上位１％にあることを示した場合、この９マーも、予測されたエピトープとみなした。
プロトコール２：ＩＥＤＢコンセンサス法
配列を、ＩＥＤＢ（Ｖｉｔａ Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５；２８（４３）：Ｄ４０５～１２；ＩＥＤＢ ＭＨＣ－ＩＩ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）においてＭＨＣ－ＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｍｅｔｈｏｄ（Ｗａｎｇ Ｐ．ら（２０１０）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １１：５６８；Ｗａｎｇ Ｐ．ら（２００８）ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．４（４）、ｅ１００００４８）を使用する分析に供した。ソフトウェアのアウトプットは、結果を１５マーずつ配置した。コンセンサススコアおよびパーセンタイルランキングを、１５マーおよびＨＬＡ型の各組み合わせについて提供した。各１５マーのコンセンサスが由来した個々のスコアは、１５マー中に見出される特定の９マーのランキングであった：コンセンサスのために使用される各方法は、１５マー内の９マーについてのパーセンタイルランクを報告した。１５マー全体についての値として取られたコンセンサスは、中央値スコアを有する９マーについての予測であった。９マーを、（ａ）それが１５マーを代表するコンセンサスとして選択された場合、および（ｂ）検討されているＨＬＡ型に対する結合子の上位１０％中にパーセンタイルランキングを有した場合、ならびに基準（ａ）および（ｂ）が、同じ９マーについて３つ以上の別個のＨＬＡ型（即ち、３つの観測）について生じた場合、エピトープとして分類した。検討したＨＬＡ型は、ＤＲＢ１＊０１、１＊０３、１＊０４、１＊０７、１＊０８、１＊１１、１＊１３および１＊１５であり、これらは、標準的なＩＳＰＲＩ／ＥｐｉＭａｔｒｉｘ報告では、同じＨＬＡ型であった。このように、プロトコール１との比較の容易さのために、この方法の一次アウトプットは、１５マーのランキングであったが、本発明者らは、データを再解釈して、予測された９マーエピトープのリストを得た。
エピトープ分類
各エピトープを、生殖系列または非生殖系列エピトープとして分類した。抗体について、本発明者らは、抗体内でのその位置（例えば、ＣＤＲまたは非ＣＤＲ）に基づいて、各エピトープをさらに分類した。本発明者らは、ＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）から得たヒトＶドメインの配列をフィルタリングして、偽遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）としてアノテーションされた生殖系列を除去した。残りの配列中に見出される任意の予測された９マーエピトープを、生殖系列エピトープとみなした。ＪもしくはＣ領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）またはこれらの領域間の接合部中に見出されるエピトープもまた、生殖系列エピトープとして分類した。さもなければ、エピトープは、非生殖系列エピトープとして分類した。可変ドメイン残基を、Ｋａｂａｔの番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ＥＡら（１９９１）ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）に基づいて番号付けした。番号付け後、ＣＤＲを、以下の残基を含むと定義した：ＣＤＲ－Ｈ１（例えばＨ３５Ａであるが、Ｈ３６未満の挿入を含むＨ２６～Ｈ３５）、ＣＤＲ－Ｈ２（Ｈ５０～Ｈ６５包含的）、ＣＤＲ－Ｈ３（Ｈ９５～Ｈ１０２包含的）、ＣＤＲ－Ｌ１（Ｌ２４～Ｌ３４包含的）、ＣＤＲ－Ｌ２（Ｌ５０～Ｌ５６包含的）、ＣＤＲ－Ｌ３（Ｌ８９～Ｌ９７、包含的）。予測された９マーエピトープは、そのアミノ酸のうちいずれか１つがＣＤＲ領域の一部であった場合、ＣＤＲエピトープであった。ＣＤＲ－Ｈ１についての本発明者らの選択した開始位置（Ｈ２６）は、Ｋａｂａｔのアノテーションを使用する一部の他の刊行物とは異なることに留意されたい。
全体的配列スコア（Ｔ－ｒｅｇ調整済スコア）
個々の鎖について、または抗体ＶＨおよびＶＬドメインの対形成について、全体的スコアを、以下のように、構成成分９マーの各々を合計することによって計算した。９マーおよびＨＬＡ型の全ての個々の組み合わせ（「観測」）を、９マーがエピトープであったかどうかにかかわりなく試験した。特定の観測が、そのペプチドが所与のＨＬＡ型に対する結合子の上位５％にあることを示した場合、この観測についてのＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｚスコアを、タンパク質配列全体と関連する中間合計に加算した。試験した観測の総数もまた記録した。唯一の例外は、ＩＳＰＲＩによって「Ｔ－レジトープ」として同定された９マーについての全ての観測が、ゼロのＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアを有すると仮定したことであった。中間合計では、０．０５＊２．２２４８のベースラインスコアを、各観測（Ｔ－レジトープを含む）から減算した。最終スコアは、以下のように計算した：
Ｔ－ｒｅｇ調整済スコア＝（中間合計）＊１０００／（観測の数）
より低いスコアは、より低い予測される免疫原性潜在力を示した。スコアは、ＩＳＰＲＩ／ＥｐｉＭａｔｒｉｘからの予測のみを含み、ＩＥＤＢからの情報は含まなかったことに留意されたい。したがって、ＩＥＤＢによって予測されたがＩＳＰＲＩによっては予測されなかったいずれの強いＨＬＡ結合子も、スコアに寄与しなかった。理論上、配列は、多くのＩＥＤＢ予測されたＨＬＡ結合子を含み得、ＥｐｉＭａｔｒｉｘもまた同じ配列を結合子である可能性が高いと予測しない場合、好ましいＴ－ｒｅｇ調整済スコアをなおも有する。
これらのツールを使用して、ヒト化抗体０８４１（配列番号２５のＶＨアミノ酸配列および配列番号２１のＶＬアミノ酸配列を含む）における非生殖系列Ｔ細胞エピトープの数および全体的配列スコアを予測した。２つのプロトコールを使用して、８つの非生殖系列エピトープが、ＶＨおよびＶＬ配列において同定された（Ｈ２７：ＹＮＩＲＳＳＹＭＨ（配列番号１７８）、Ｈ６３：ＦＫＩＲＦＴＩＳＡ（配列番号１７９）、Ｈ６５：ＩＲＦＴＩＳＡＤＮ（配列番号１８０）、Ｌ２９：ＩＮＲＹＬＮＷＹＱ（配列番号１８１）、Ｌ４６：ＬＬＩＹＮＡＮＳＬ（配列番号１８２）、Ｌ４７：ＬＩＹＮＡＮＳＬＱ（配列番号１８３）、Ｌ４８：ＩＹＮＡＮＳＬＱＴ（配列番号１８４）およびＬ４９：ＹＮＡＮＳＬＱＴＧ（配列番号１８５））（図４）。さらに、全体的配列スコアは、－３０．３４であった。エピトープの数および全体的配列スコアにおける低減は、配列の全体的免疫原性リスクを減少させると予測される。
（実施例１８）
ヒト化抗Ｅ－セレクチン抗体の最適化
抗体０８４１の構造ベースの合理的変異誘発
抗Ｅ－セレクチン抗体０８４１は、対象に投与した場合に免疫原性のリスクを増加させ得るいくつかの予測されたＴ細胞エピトープを含んだ。これらには、ＶＨおよびＶＬ配列中に含まれる８つの非生殖系列エピトープが含まれた（Ｈ２７：ＹＮＩＲＳＳＹＭＨ、Ｈ６３：ＦＫＩＲＦＴＩＳＡ、Ｈ６５：ＩＲＦＴＩＳＡＤＮ、Ｌ２９：ＩＮＲＹＬＮＷＹＱ、Ｌ４６：ＬＬＩＹＮＡＮＳＬ、Ｌ４７：ＬＩＹＮＡＮＳＬＱ、Ｌ４８：ＩＹＮＡＮＳＬＱＴおよびＬ４９：ＹＮＡＮＳＬＱＴＧ）。さらに、熱強制的分解後の抗体のペプチドマッピングは、Ｌ３０位置においてＮＲ脱アミド責任を同定した。Ｌ３０におけるＮＲ脱アミド責任に加えて、重鎖位置Ｈ５４におけるＮＧ部位、位置Ｌ５２におけるＮＳ部位および位置Ｌ９２におけるＮＳ部位が含まれる、他の潜在的責任部位が同定された。構造ベースの最適化法を利用して、予測されたＴ細胞エピトープおよび配列責任部位を除去した。
しかし最初は、ＣＤＲ－Ｌ２をＤＰＫ９ ＣＤＲ－Ｌ２（ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号３））に生殖系列化し、ＣＤＲ－Ｈ２の末端を（Ｈ５９～Ｈ６５ ＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号１８６））のＤＰ－５４配列に生殖系列化するさらなるヒト化抗体０９７８（配列番号２８のＨＣアミノ酸配列および配列番号２６のＬＣアミノ酸配列を含む）を生成した。抗体０９７８は、実施例１６に記載される競合結合アッセイを使用して、抗体０８４１と類似の結合を維持することが示された。これら２つのストレッチを生殖系列化することで、予測されたＴ細胞エピトープのうち５つ（Ｈ６３：ＦＫＩＲＦＴＩＳＡ（配列番号１７９）、Ｌ４６：ＬＬＩＹＮＡＮＳＬ（配列番号１８２）、Ｌ４７：ＬＩＹＮＡＮＳＬＱ（配列番号１８３）、Ｌ４８：ＩＹＮＡＮＳＬＱＴ（配列番号１８４）およびＬ４９：ＹＮＡＮＳＬＱＴＧ（配列番号１８５））を除去したが、新たな予測されたＴ細胞エピトープ（Ｈ６３：ＶＫＧＲＦＴＩＳＡ（配列番号１８７））を導入した。さらに、Ｌ２の変異は、位置Ｌ５２における潜在的ＮＳ責任部位を除去したが、Ｈ２の末端の変異は、位置Ｈ６１において、別の潜在的責任部位であるＤＳ部位を付加した。構造ベースの最適化を、Ｅ－セレクチンのｃ型レクチンドメイン（残基２２～１７８）に結合した抗体０１６４のｘ線結晶構造を使用して抗体０９７８に対して実施して、残りの３つの予測されたＴ細胞エピトープおよび配列責任を除去した。
変異誘発に適切な位置を決定するために、親和性における変化および安定性における変化の両方についての変異の計算的予測を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ４．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｖｉａ Ｃｏｒｐ．）およびＦｏｌｄＸを使用して行った。許容される変異は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ法およびＦｏｌｄＸ法の両方についてΔΔＧ＞１ｋｃａｌ／ｍｏｌを有するとは予測されない変異である。これらの予測から、予測されたＴ細胞エピトープおよび配列責任を除去しつつ、結合および安定性に対して最小限の影響を有すると予測される残基のセットが同定され、表２２に示された。
Figure 0007449390000053
このセットの変異を使用して、表２２において同定された３つの配列責任および３つのＴ細胞エピトープを除去する４つの最適化された構築物を生成した。これらの構築物は、抗体１２８２（配列番号４３のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）、抗体１２８４（配列番号４０のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）、抗体１４４４（配列番号１３のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）および抗体１４４８（配列番号３７のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）である。抗体０９７８と比較した変異が表２３に示される。これらの変異体の結合親和性は、実施例１６に記載される競合結合アッセイを使用して抗体０９７８と類似であることが確認された。
Figure 0007449390000054
（実施例１９）
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体（０１６４、０８４１、１２８２、１２８４、１４４４、１４４８）の中和
細胞表面Ｅ－セレクチンを発現するＣＨＯへのリガンド結合の中和
静置リガンド細胞接着アッセイでは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートしたＥ－セレクチンリガンド（シアリルルイス抗原）およびＥ－セレクチン抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上に発現されたヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンへの結合について競合する。リガンド結合を中和する抗Ｅ－セレクチン抗体の能力を、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する静置中和アッセイにおいて評価して、ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンを発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）へのシアリルルイス抗原の中和を評価した。
ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％（体積／体積）透析胎仔ウシ血清、１００ｎＭのメトトレキサートおよび１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充した培養培地（ＭＥＭ（最小必須培地）アルファ培地）中で成長させた。カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１２５μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲ１培地（ＲＩダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ１２改変）中で培養した。
Ｅ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェル組織培養プレート中に１ウェル当たり１２，５００細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートして、コンフルエントな単層を形成した。プレートを、カルシウムマグネシウムなしのＰＢＳ ２００μＬで引き続いて２回洗浄した。抗Ｅ－セレクチン抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩｇＧ対照）を、ビオチン化シアリルルイスＡポリアクリルアミド（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ ＬＬＣ、ＯＳ４５４４６）またはビオチン化シアリルルイスＸポリアクリルアミド（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ、０１－０４５）の小さい合成コンジュゲートの存在下で、ストレプトアビジン／西洋ワサビペルオキシダーゼと共にアッセイに添加し（合計１００μＬ）、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。次いで、プレートを、カルシウムおよびマグネシウムなしのＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄した。インキュベーション後、細胞を、２ｍＭの塩化カルシウムを含む洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ［トリスアミノメタン］、１５０ｍＭの塩化ナトリウム；０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４；２ｍＭの塩化カルシウム）２００μＬで２回洗浄した。シグナルを、１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２８）を添加し、室温で３０分間インキュベートすることによって発生させた。反応を、２Ｍの硫酸を使用して停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ）。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．０．２）を使用して分析およびグラフ化した。分析から導出した推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値は、ヒトＥ－セレクチンについては１．３８～２．８９ｎＭの範囲であり、カニクイザルＥ－セレクチンについては１．８５～２．６５ｎＭの範囲であった（図５および図６）（表２４）。
Figure 0007449390000055
上記方法と類似の方法を使用するさらなる静置中和アッセイでは、抗体１４４４は、それぞれ１．８８ｎＭ～２．３３ｎＭおよび１．４７ｎＭ～１．４９ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ＣＨＯ細胞によって発現されたヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンタンパク質の両方へのリガンド結合を中和した。
可溶性組換えタンパク質へのリガンド結合の中和
組換えヒスチジンタグ化Ｅ－セレクチン；カニクイザルＥ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；１９０１６９－Ｃ０８Ｈ）およびヒトＥ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；１３０２５－Ｈ０８Ｈ）ストック溶液を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で３μｇ／ｍＬの最終濃度になるように調製した。１ウェル当たり１００μＬの希釈した組換えＥ－セレクチンタンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ ９６ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ、３５０６１）中に添加し、プレートを、オービタルシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。合成Ｅ－セレクチンリガンドであるシアリルルイスＡポリアクリルアミドビオチン（ＧｌｙｃｏＴｅｃｈ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ０１－０４４）を、ストレプトアビジンＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）（Ｕｌｔｒａ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｎ５０４）にコンジュゲートし、２ｍＭの塩化カルシウムを含むアッセイ希釈剤（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ緩衝液；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５５２１３）中に希釈した。
抗体（ＩｇＧ１対照、０１６０、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８）の２倍濃縮したストック溶液もまた、２ｍＭの塩化カルシウムを含むアッセイ希釈剤中で作製した。インキュベーション後、プレートを、２ｍＭの塩化カルシウムを含む洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ［トリスアミノメタン］；１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４；２ｍＭの塩化カルシウム）２００μＬで５回洗浄した。この後に、抗体（ＩｇＧ１対照、０１６０、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８）およびＨＲＰコンジュゲートしたシアリルルイスＡの混合物１００μＬを、二連で添加し、プレートを、オービタルシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。最終抗体濃度は、２００ｎＭ～０．０９ｎＭの範囲であり、ＨＲＰコンジュゲートしたシアリルルイスＡの最終濃度は、５μｇ／ｍＬであった。プレートを前述のように洗浄し、１ウェル当たり１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２８）を添加し、室温で５分間インキュベートした。反応を、２Ｍの硫酸１００μＬで停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ）。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．０．２）を使用して分析およびグラフ化した。推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、分析から導出した（表２５）。
推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を分析から導出したところ、可溶性組換えヒトＥ－セレクチンへのリガンド結合の抗体中和については２．９６ｎＭ～３．５９ｎＭの範囲であり、可溶性組換えカニクイザルＥ－セレクチンへのリガンド結合の抗体中和については２．７４ｎＭ～３．２９ｎＭの範囲であった。
Figure 0007449390000056
上記方法と類似の方法を使用するさらなる静置中和アッセイでは、抗体１４４４は、それぞれ２．８７ｎＭ～２．９１ｎＭおよび２．３９ｎＭ～２．４５ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンタンパク質の両方へのリガンド結合を中和した。
（実施例２０）
表面プラズモン共鳴を使用した最適化抗Ｅ－セレクチンの動態評価
ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンに対する結合親和性を、実施例４と類似の方法でＳＰＲを使用して、最適化抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８について決定した。これは、固定化された抗ヒトＩｇＧに抗体を最初に結合させることによって実施した。抗体捕捉後、Ｅ－セレクチンタンパク質の希釈物を上に流し、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、ｔ１／２およびＫＤ値を、ヒトおよびカニクイザルへの結合について決定した（表２６）。このＳＰＲ分析では、ヒトＥ－セレクチンに対する１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の親和性は、それぞれ７０．３ｎＭ、６５．２ｎＭ、６１．８ｎＭおよび６０．５ｎＭであった。カニクイザルＥ－セレクチンに対する１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の親和性は、それぞれ７８．３ｎＭ、７６．５ｎＭ、８１．５ｎＭおよび６７．８ｎＭであった。
Figure 0007449390000057
（実施例２１）
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体（０１６４、０８４１、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８）の細胞表面結合（ＦＡＣＳ）および中和
ＦＡＣＳによる細胞表面結合
膜結合したＥ－セレクチンへの抗体０８４１、０１６４、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の結合を、ＦＡＣＳによって分析した。ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１０％の最終濃度の透析胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１×）を補充し、メトトレキサートを補充したアルファ培地（ＭＥＭ［最小必須培地］アルファ培地、５０－０１２－ＰＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養した。簡潔に述べると、解凍した細胞を、１００ｎＭのメトトレキサートの存在下で最初に成長させた。引き続く培養について、メトトレキサートを成長培地から除外した。
内皮細胞を、凍結ストックから解凍し、無菌０．１％ゼラチン溶液（Ｓｉｇｍａ、ＥＳ－００６－Ｂ）で再コーティングしたＴ－２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５３１０８）中に最初にプレートした。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、２１１－５００）中で成長させたが、カニクイザル肺微小血管内皮細胞（ＣＬＭＥＣ）は、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｏｎｋｅｙ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＭＫ１１６８）中で成長させた。細胞を、９０％コンフルエンシーに達した時点で分割し、０．１％ゼラチンで事前コーティングした３つのＴ－１７５フラスコ中にプレートした。
ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞株を、無酵素Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ、１３１５１０１４）を使用して、コンフルエントなフラスコから剥離した。成長培地を、剥離した細胞に即座に添加し、次いで、３００×ｇで室温で５分間遠心分離して、細胞をペレット化した。次いで、細胞を、１％の最終濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ３０５９）、１ｍＭの最終濃度の塩化カルシウムおよび０．１％の最終濃度のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４からなる冷ＣＨＯ緩衝液中に再懸濁した。
初代細胞ＨＵＶＥＣまたはＣＬＭＥＣについて、９０％コンフルエンシーの培養物を、成長培地をＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、２１０－５００）で置き換えることによって血清飢餓させた。細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気で２時間インキュベートした。血清飢餓の直後に、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組織壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α；ＧＩＢＣＯ）を含むＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを細胞に添加して、Ｅ－セレクチン発現を誘導した。４時間のＴＮＦ－α刺激後、細胞を、クエン酸食塩水（１３５ｍＭの塩化カリウム、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）を使用して剥離し、１ｍＭの最終濃度になるまでの塩化カルシウムの添加によって、即座に再石灰化した。細胞を、３００×ｇで４℃で遠心分離し、濡れた氷中で１５分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０）を含むＰＢＳ中での再懸濁によって固定した。ＰＦＡを、遠心分離によって除去し、細胞を、ＣＨＯ緩衝液中に一晩再懸濁した。
ＣＨＯ細胞を用いた結合研究は、２行の９６ウェル丸底プレートを使用して二連で実施したが、初代内皮細胞を用いた結合研究は、単一行の９６ウェルＶ底プレート中で実施した。プレートを、３００×ｇで４℃で２分間遠心分離し、細胞を再懸濁し、濡れた氷上で１０分間のＣＨＯ緩衝液中でのインキュベーションによって遮断した。インキュベーション後、細胞を、３００×ｇで４℃で２分間遠心分離して、緩衝液を除去した。次いで、各ウェル中の細胞ペレットを、再懸濁し、指定された体積の連続希釈した抗体（ヒトＩｇＧ１対照、０８４１、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８）中でインキュベートし、濡れた氷上で３０分間インキュベートした。試験抗体溶液を、ＣＨＯ緩衝液を希釈剤として使用する３倍希釈シリーズ（１３３３ｎＭ～０．０２２６ｎＭ）によって調製した。抗体とのインキュベーション後、細胞を、３００×ｇで４℃で１分間の遠心分離によって３回洗浄し、冷ＣＨＯ緩衝液中に再懸濁した。洗浄した細胞を、再懸濁し、１００μＬの１：１０００希釈のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲートしたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片（Ｆｃγ断片特異的抗体、［Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－６０６－１７０］と共に濡れた氷上で４５分間（ＣＨＯ細胞）または３０分間（内皮細胞）インキュベートした。細胞を、フローサイトメトリー分析のためのＣＨＯ緩衝液中での再懸濁の前に、３回または４回洗浄した。６４０ナノメートルのレーザー線を使用するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器を使用して、細胞蛍光データを獲得した。細胞の幾何平均蛍光を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）によって分析し、抗体濃度に対してプロットした。推定されたＥＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍスイート（ＧｒａｐｈＰａｄ、バージョン８）において非線形回帰分析を使用して計算した。
抗体０８４１、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８は、ｎＭ未満～低いｎＭの範囲の類似の推定されたＥＣ５０値で、ヒトＥ－セレクチンを発現するように操作されたＣＨＯ細胞に結合した（表２７）。対照ヒトＩｇＧは、ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのいずれの結合も示さなかった。
抗体０１６４、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８は、ＴＮＦ－αで４時間処置してＥ－セレクチンの発現を誘導したＨＵＶＥＣおよびＣＬＭＥＣ上の細胞表面ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンに結合した。結合が検出されなかったＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、ＴＮＦ－αで活性化されたＨＵＶＥＣまたはＣＬＭＥＣの細胞表面上の内因性に発現されたＥ－セレクチンへの結合が観察された。高い蛍光背景が観察され、ＥＣ５０値は計算しなかった（表２７）。
Figure 0007449390000058
（実施例２２）
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体による細胞接着の静置中和
Ｅ－セレクチンは、血球の表面上に発現されたシアル化ルイス改変リガンドに結合する。この研究では、ヒト前骨髄球性細胞株（ＨＬ－６０）を、Ｅ－セレクチンリガンドの細胞供給源として使用した。細胞表面Ｅ－セレクチン（ＣＨＯ細胞上の）へのＨＬ－６０細胞の接着に対する抗体０１６４、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の中和活性を、静置中和接着アッセイで評価した。
ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、１００ｎＭのメトトレキサートを補充した新たな成長培地中で成長させた。細胞のこの初回継代の後、メトトレキサートを、引き続く培養のために成長培地から除外した。カニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞を、Ｒ１培地中で培養した。細胞のこの初回継代の後、Ｚｅｏｃｉｎを、引き続く培養のために成長培地から除外した。
対数期にあるＨＬ－６０細胞を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル蛍光色素（ＣＦＳＥ）標識化キット（ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ、６５－０８５０－８４）を使用して標識した。標識されたＨＬ－６０細胞を、静置接着アッセイにおける使用のために、４００，０００細胞／ｍＬの密度で、ＣＨＯ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４／１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）／０．１％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３））中に再懸濁した。
静置条件下で、Ｅ－セレクチン発現ＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０細胞の細胞接着を阻害する抗体０１６４、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の能力を評価した。簡潔に述べると、ＣＨＯ細胞を、１００，０００細胞／ウェルの密度で２行の９６ウェル（技術的複製）平底黒色プレート上に播種し、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気でコンフルエントな単層を（典型的には２４時間後に）形成させた。細胞単層を、ＣＨＯ緩衝液を使用して穏やかに洗浄し、次いで、指定されたウェルを、３倍希釈シリーズ（２００μｇ／ｍＬまたは１３３３ｎＭ～０．００３μｇ／ｍＬまたは０．０２２ｎＭの範囲）で、抗体溶液（０１６４、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８）と共にインキュベートした。適切な体積のＣＦＳＥ標識されたＨＬ－６０細胞懸濁物（４００，０００細胞／ｍＬ）を、最終抗体濃度（２００μｇ／ｍＬまたは１３３３ｎＭ～０．００３μｇ／ｍＬまたは０．０２２ｎＭの範囲）が維持されるように、ウェルに即座に添加した。標識されたＨＬ－６０細胞を、加湿インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気で４５分間、ＣＨＯ細胞単層と共にインキュベートした。インキュベーション後、プレートを、ＣＨＯ緩衝液で３回洗浄し、結合したＨＬ－６０細胞の蛍光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４９４／５２１ナノメートルの励起／発光波長で測定した。蛍光単位を、抗体濃度の関数としてプロットし、ＩＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．０．２）を使用する非線形回帰分析を使用して推定した。
これらの抗体についての推定されたＩＣ５０値は類似しており、３．４ｎＭ～６．２ｎＭの範囲であった（図７）（表２８）。
Figure 0007449390000059
上記方法と類似の方法を使用するさらなる静置中和アッセイでは、抗体１４４４は、それぞれ３．３６ｎＭおよび３．８４ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、細胞表面ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンの両方へのＨＬ－６０接着を中和した（表３８）。
（実施例２３）
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体の内因性ヒトＥ－セレクチン結合
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８によるヒト血漿中のＥ－セレクチン結合阻害の分析を、ＩＰ－ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用して実施した。この方法は、ヒト血清中の遊離可溶性ヒトＥ－セレクチンまたはカニクイザル血清中の遊離可溶性サルＥ－セレクチンを定量化した。この方法は、２５０μＬのＰＢＳ中５０μＬの血清を使用し、これを、１．０μｇのビオチン化抗Ｅ－セレクチン抗体０１６４と共に、４℃で一晩インキュベートした（コールドルーム中、５００ｒｐｍで振盪）。インキュベーション後、３０μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔ１ストレプトアビジン磁気ビーズを各サンプルに添加し、その後、室温で４０分間インキュベートした（１０００ｒｐｍで振盪）。次いで、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓｔａｒを使用して、磁気ビーズをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で２回洗浄し、その後、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、可溶性Ｅ－セレクチンを、３０ｍＭの塩酸（ＨＣｌ）１４５μＬを用いてビーズから溶出させ、１ＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８ ３２μＬで中和した。引き続いて、５０ｆｍｏｌの安定なアイソトープ標識された（ＳＩＬ）内部標準を添加し、その後、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、１０μＬ×５０ｍＭ）を添加した。６０℃で３５分間インキュベートした後、サンプルを、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ、１０μＬ×１００ｍＭ）の添加前に、室温まで冷却させた。次いで、サンプルを、暗中に３０分間置き、これに、１μｇのＰｒｏｍｅｇａ ＬｙｓＣ／トリプシン（１０μＬ×１００μｇ／ｍＬ）を添加し、次いで、３７℃で一晩消化した。
一晩のインキュベーション後、５０μＬの調製したサンプルを、ｎａｎｏ ＥＳＩＬＣ－ＭＳ／ＭＳ上に注入した。定量化を、可溶性Ｅ－セレクチンについてのトリプシンペプチド（ＣＳＳＬＡＶＬＥＫ（配列番号１９３））をモニタリングすることによって実施した。この定量化は、抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８が、それぞれ２．４ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭおよび１．８ｎＭのＩＣ５０ならびにそれぞれ４．９ｎＭ、４．８ｎＭ、６．５ｎＭおよび８．６ｎＭのＩＣ９０で、ヒトＥ－セレクチンの類似の阻害を有したことを示した。
（実施例２４）
ヒト化抗Ｅ－セレクチンの生物物理学的特徴付け
熱安定性
示差走査熱量測定を使用して、４つの最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の安定性を決定した。実施例１６に記載される方法と類似のＤＳＣ法を使用した。以下の表２９は、Ｔｒｉｓ／スクロース（「Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ」）緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、８．５％スクロース、ｐＨ７．５）、ヒスチジン／スクロース（「Ｈｉｓ／Ｓｕｃ」）緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン、８．５％スクロース、０．００５％ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）およびグルタミン酸／トレハロース（「Ｇｌｕ／Ｔｒｅ」）緩衝液（２０ｍＭのグルタミン酸、８．５％トレハロース、ｐＨ４．５）中でのこれらの分子の融解温度（Ｔｍ１～Ｔｍ３およびＦＡＢ）を示している。４つ全ての分子が、良好な安定性を実証し、ＣＨ２ドメインにおける第１の遷移（Ｔｍ１）は、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ、Ｈｉｓ／ＳｕｃおよびＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中では、６５℃よりも高かった。これらの分子は、Ｈｉｓ／ＳｕｃおよびＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中では安定性における僅かな増加を示し、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ緩衝液中では安定性における僅かな減少を示した。
Figure 0007449390000060
強制的分解
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８を、３つの緩衝液：Ｔｒｉｓ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）、Ｈｉｓ（２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．８）およびＧｌｕ（２０ｍＭのグルタミン酸、ｐＨ４．５）中への広範な透析によって、４０℃での４週間の強制的分解研究のために調製した。透析後、サンプル濃度を５ｍｇ／ｍＬに調整する。Ｔ０、Ｔ２およびＴ４週の時点で、サンプルを、ａＳＥＣ、ｉＣＥおよびバイオアッセイ試験のためにアリコート化した。
強制的分解サンプルの凝集状態を、実施例１６に記載されるａＳＥＣによって決定した。全てのサンプルが、Ｔ４週の時点において、最小限の変化、５％未満のＬＭＭＳ種および１％未満のＨＭＭＳ種を示した（表３０）。
Figure 0007449390000061
画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＥ）を使用して、強制的分解サンプルの電荷ベースの不均一性を検出した。これは、実施例１６で使用した方法と類似の方法を使用して実施した。ｉＣＥ分析において高い％の酸性種／塩基性種を有するサンプルについては、さらなる質量分析による分析が、ＣＤＲ領域中の配列責任を同定するために要求された。Ｔｒｉｓ、ＨｉｓおよびＧｌｕ緩衝液中のサンプルの分析は、酸性種および塩基性種における典型的な増加を示した（表３１）。抗体１４４４を、ヒト化０８４１との比較のために、質量分析３部分析およびペプチドマッピングを使用してさらに分析した。
Figure 0007449390000062
Figure 0007449390000063
質量分析による分析
３部の質量分析による分析を、最適化抗体１４４４に対して実施した。Ｔ４ＷにおけるＧｌｕ、ＨｉｓおよびＴｒｉｓ緩衝液中での抗体１４４４の強制的分解の分析は、Ｔ０と比較して類似のプロファイルを示した。ストレスをかけたサンプルにおいて、低レベルのｓｃＦｃ（単鎖Ｆｃ）酸化およびＤ／Ｐクリップが観察され、低レベルのｏｘｉ＿Ｆｄ（酸化されたＦｄ）が検出され、微量のＦｄ＋ＨｅｘＮＡｃ（糖化されたＦｄ）が検出され、微量Ｆｄ Ｄ／Ｐクリップ（Ｄ／Ｐ部位が切断されたＦｄ断片）が検出され、低レベルのＰｙｒｏＥ Ｆｄ（Ｎ末端にピログルタミン酸を有するＦｄ断片）が観察された（図８）。
ペプチドマッピングを、実施例１６で使用した方法と類似の方法を使用して、抗体１４４４について実施した。Ｔｒｉｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕ緩衝液中のＴ０およびＴ４週の強制的分解サンプルの高忠実度ペプチドマッピング分析は、痕跡レベルのみの異性化および脱アミドが、抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４ ＨＣ ＣＤＲ ２ペプチドＩＤＰＡＮＧＮＴＩＹＶＤＳＶＴＧＲ（配列番号１９４）において検出されたことを示した（表３２）。全てのサンプルが、＞９６％のレギュラーペプチドを有し、１％未満が脱アミドペプチドとして見出され、２％未満が異性化含有ペプチド（ＩｓｏＤ）として見出された。軽鎖位置３０における化学的に不安定なモチーフはＧｌｕに変異させたので、この最適化されたバリアントは、かかるモチーフをもはや含まない。ＬＣ ＣＤＲ１ペプチドＴＳＱＮＩＥＲＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号１９５）について、改変は検出されなかった。
Figure 0007449390000064
強制的分解サンプルの安定性をさらに評価するために、ストレスをかけたサンプル（抗体１２８２、１２８４、１４４４、１４４８）の活性を、競合結合ＥＬＩＳＡで評価した。ここで、Ｔ０、Ｔ２ＷおよびＴ４Ｗサンプルを、ヒトＥ－セレクチンへの結合についてビオチン化キメラ抗体０１６４と競合するそれらの能力について比較した。この方法は、実施例１６に記載される方法と類似であった。競合結合結果は、図９Ａ～９Ｄに示され、Ｔ０サンプルとＴ２ＷサンプルとＴ４Ｗサンプルとの間で差異は見られず、これは、Ｅ－セレクチンに結合する抗体の能力が高温インキュベーション後に安定していたことを示している。
高濃度安定性
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８を、３つの緩衝液、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、８．５％スクロース、ｐＨ７．５）、Ｈｉｓ／Ｓｕｃ（２０ｍＭのヒスチジン、８．５％スクロース、０．００５％ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）およびＧｌｕ／Ｔｒｅ（２０ｍＭのグルタミン酸、８．５％トレハロース、ｐＨ４．５）中に広範に透析した。透析後、サンプルを、スピンフィルター濃縮器を使用して１５０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、４℃および２５℃で貯蔵した。時間ゼロ（Ｔ０）、１週（Ｔ１Ｗ）、２週（Ｔ２Ｗ）、４週（Ｔ４Ｗ）、６週（Ｔ６Ｗ）および７週（Ｔ７Ｗ）の時点で、サンプルを、リアルタイムａＳＥＣ分析のためにアリコート化し、Ｔ０、Ｔ３およびＴ７週の時点におけるｉＣＥおよびＣＧＥ分析を、研究の終了時に実施した。
高濃度サンプルの凝集状態を、実施例１６に記載したように、ａＳＥＣによって決定した。４℃および２５℃のサンプルは、３つ全ての緩衝液条件において、ＨＭＭＳにおける増加をほとんど伴わずに（合計の＜５％）、全ての時点において良好な高濃度安定性を示した（図１０Ａ～１０Ｄ）。
ｉＣＥを使用して、実施例１６に記載される方法と類似の方法を使用して、高濃度サンプルの電荷ベースの不均一性を検出した。％酸性種および％塩基性種における最小限の変化が、７週間の研究にわたって、Ｔｒｉｓ／Ｓｕｃ、Ｈｉｓ／ＳｕｃおよびＧｌｕ／Ｔｒｅ緩衝液中で２５℃で貯蔵した抗体において見られた（表３３）。
Figure 0007449390000065
Figure 0007449390000066
ＣＧＥ分析を実施して、最適化抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の高濃度サンプルの断片化を決定した。この分析は、実施例１６に記載される方法と類似の方法を使用して実施した。％断片化および％ＨＭＭＳの定量化は、３つ全ての緩衝液中で、２５℃で、抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８について良好な高濃度安定性を実証した（表３４）。
Figure 0007449390000067
Figure 0007449390000068
粘度
最適化抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の粘度を、以下のＤＬＳ（動的光散乱）ビーズベースの方法を使用して測定した。ＰＢＳ中のタンパク質を、メンブレンカセットデバイス１０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２０ｍＭのヒスチジン、８５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０に対して広範に透析した。タンパク質を透析から回収し、０．２μＭシリンジフィルターを使用して濾過した。タンパク質を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器１０Ｋ ＭＷＣＯ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して濃縮した。タンパク質体積が低減され、タンパク質濃度が増加したので、サンプルアリコート（１２μＬ）を濃縮器残余分から取り出した。３００ｎｍビーズ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、タンパク質サンプルおよび緩衝液ブランクに添加した。ビーズを、２０ｍＭのヒスチジン、８５ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．０５ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中に１：１０希釈し、０．７５μＬの希釈されたビーズを、タンパク質サンプル中にスパイクした。タンパク質／ビーズおよび緩衝液／ビーズサンプルを、穏やかにボルテックスすることによって混合した。８μＬのサンプルを、ＤＬＳによる分析のために１５３６ウェルプレート（ＳｅｎｓｏＰｌａｔｅ、ガラス底、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）に移した。プレートを、光学的に透明なテープで密封し、２０００ＲＰＭで２分間遠心分離して、泡を除去した。
ＤＬＳ測定を、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して行った。サンプルを２５℃でインキュベートし、１５回の連続的な２５秒獲得で測定した。許容できる減衰曲線を有したビーズの半径を、データ獲得のために平均した。粘度を、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式に基づいて計算した。サンプル粘度を、公称ビーズ半径で除算した測定された見かけの半径×０．８９３センチポアズ（ｃＰ）として計算し、０．８９３センチポアズは、２５℃での水の粘度である。
高濃度製剤は、より高頻度および低頻度の投薬を可能にする、抗体にとっての望ましい特性である。最適化抗体は全て、良好な粘度プロファイルを示し、それらの粘度は、およそ１６０ｍｇ／ｍＬまで、２０ｃＰに達しなかった。この測定値を確認するために、各最適化抗体についての単一の濃度でのさらなる粘度測定を、以下に記載されるＡｎｔｏｎ Ｐａａｒ法を使用して実施した。
タンパク質サンプルを、５０ｋＤａ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ遠心濾過ユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、１７０～１８０ｍｇ／ｍＬの標的に濃縮した。タンパク質濃度を、ＳｏｌｏＶＰＥ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）での２８０ｎｍ分析によって決定した。粘度測定を、２５℃で１５０ｒｐｍの一定の回転速度で、ＭＣＲ－３０２血流計（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＶＡ）上でＣＰ２５－１円錐およびプレートを使用して実施した。各々１０秒間の合計１０個の測定値を、サンプル１つ当たり収集し、データを、Ｒｈｅｏｐｌｕｓ（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）Ｖ ３．６２ソフトウェアを使用して分析した。１２８２の粘度を１７９．５ｍｇ／ｍＬで測定したところ、３６．２９ｃＰであった。１２８４の粘度を１７１．９ｍｇ／ｍＬで測定したところ、２７．３８ｃＰであった。１４４４の粘度を１８５．７ｍｇ／ｍＬで測定したところ、３３．４３ｃＰであった。１４４８の粘度を１８６．８ｍｇ／ｍＬで測定したところ、３３．３５ｃＰであった。これらの測定値の全てが、ＤＬＳ粘度測定値の曲線フィットに良好にフィットし、その精度を強化している（図１１）。
（実施例２５）
最適化抗Ｅ－セレクチンのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ免疫原性リスクおよびＴ細胞エピトープ予測
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の免疫原性リスクを、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して予測して、ＭＨＣＩＩペプチド結合を予測した。使用した方法は、実施例１７に記載される方法と類似であった。最適化抗体は、ヒト化抗体０８４１についての－３０．３４から、抗体１２８２についての－４６．２６、抗体１２８４についての－４６．１６、抗体１４４４についての－４５．１１および抗体１４４８についての－４５．３２のスコアまで減少する、改善された全体的配列スコアを示した。さらに、８つの予測された非生殖系列Ｔ細胞エピトープを、最適化抗体において除去した（表３５）。
Figure 0007449390000069
（実施例２６）
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体の自己相互作用および多反応性
最適化抗体１４４４（配列番号１３のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）、１２８２（配列番号４３のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）、１２８４（配列番号４０のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）および１４４８（配列番号３７のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）を、ＤＮＡおよびインスリンへの結合について試験し、さらに、ＡＣ－ＳＩＮＳアッセイ（親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法；Ｌｉｕら（２０１４）ｍＡｂｓ ６：４８３～９２）において自己相互作用について試験した。ＡＣ－ＳＩＮＳアッセイでは、金ナノスフェア上に捕捉されたｍＡｂは、それらが互いに結合し、それによって、ビーズをクラスター化させる場合、吸光度最大におけるシフトを誘導する。このアッセイにおける高いスコアは、低いまたは不十分な溶解度および非特異的膜相互作用と相関することが示唆されてきた（Ｌｉｕら、ｍＡｂｓ ２０１４；６：４８３～９２）。抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８は、陰性対照のものと匹敵する、非常に低いＡＣ－ＳＩＮＳスコアおよびＤＮＡ／インスリンスコアを有した（表３６）。これらのデータは、これらの抗体が、陰性対照のものと類似して、多反応性のリスクが低いことを示している。
Figure 0007449390000070
（実施例２７）
表面プラズモン共鳴を使用した最適化抗Ｅ－セレクチンの交差反応性評価
ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンに対する結合親和性を、実施例２０に記載されるＳＰＲを使用して、最適化抗体１４４４（配列番号１３のＨＣアミノ酸配列および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）について決定した。４０５ｎＭの高い分析物濃度を用いた類似の方法を使用して、本発明者らは、実施例５に記載される方法と類似の方法を使用して、ラットＥ－セレクチン、マウスＥ－セレクチン、ウサギＥ－セレクチン、ヒトＬ－セレクチンおよびヒトＰ－セレクチンのホモログに対するこの抗体の結合親和性もまた評価した。２５℃では、４０５ｎＭまで、ラットＥ－セレクチン、マウスＥ－セレクチン、ウサギＥ－セレクチン、ヒトＬ－セレクチンおよびヒトＰ－セレクチンへの抗体１４４４の結合は観察されなかった（図１２）。抗体１４４４は、６８．３５＋／－３．１８ｎＭのＫＤでヒトＥ－セレクチンに結合し、６４．９＋／－１．１３ｎＭのＫＤでカニクイザルＥ－セレクチンに結合した。
（実施例２８）
抗体１２８２、１２８４、１４４４および１４４８のプレートベースの直接結合ＥＬＩＳＡ分析
直接結合ＥＬＩＳＡを使用して、種々の固定化された可溶性組換えセレクチンへの抗体０８４１、１２８２、１２８４、１４４４および１４４８の結合を特徴付けた。組換えヒスチジンタグ化ヒトＰ－セレクチン、Ｅ－セレクチンまたはＬ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、マウスＥ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ラットＥ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）およびカニクイザルＥ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）ストック溶液を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝溶液中で１μｇ／ｍＬの最終濃度になるように調製した。対照は、Ｌ－セレクチン指向性抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；３０４８１１）またはＰ－セレクチン指向性抗体または陰性対照ＩｇＧを含んだ。１ウェル当たり１００μＬの希釈した組換えセレクチンタンパク質を、Ｎｉ－ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ ９６ウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ；３５０６１）中に添加した。プレートを、オービタルシェーカー上で室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、２００μＬの洗浄緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ［トリスアミノメタン］；１５０ｍＭの塩化ナトリウム；０．０５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。非特異的結合を減少させるために、プレートを、２００μＬの遮断緩衝液（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ緩衝液；５５５２１３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処置し、オービタルシェーカー上で室温で１時間インキュベートし、上記のように洗浄した。抗体（ＩｇＧ１対照抗体、抗Ｅ－セレクチン抗体、抗Ｐ－セレクチン抗体または抗Ｌ－セレクチン抗体）を、４倍希釈シリーズ（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ緩衝液中で作製した、１３３．３３ｎＭ～０．００４の範囲）で二連で、１ウェル当たり１００μＬで反応に添加し、オービタルシェーカー上で１時間インキュベートし、上記のように洗浄した。１００μＬの特異的検出抗体（以下に記載される）を添加し、１時間インキュベートした：
・ ＩｇＧ１対照、０８４１、１２８２、１２８４、１４４４、１４４８、抗マウス－Ｅ－セレクチンおよび抗Ｐ－セレクチン抗体は、１対２５０００または１対５００００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃガンマ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ；１０９－０３５－００８）を使用して検出した；
・ 抗Ｌ－セレクチンおよび抗ラット－Ｅ－セレクチン抗体は、１対２５０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を使用して検出した。
プレートを洗浄し、１ウェル当たり１００μＬの１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、室温で５分間インキュベートした。反応を、２Ｍの硫酸１００μＬで停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｅ）。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（８．０．２）を使用して分析およびグラフ化した。推定された最大半量濃度（ＥＣ５０）値を、分析から導出した。
固定化されたヒトＬ－セレクチンまたはヒトＰ－セレクチンへの用量依存的結合が、それぞれ０．３６２ｎＭおよび０．０８１ｎＭの推定されたＥＣ５０値で、Ｌ－セレクチンまたはＰ－セレクチン指向性抗体で観察された。対照的に、可溶性ヒトＬ－セレクチンまたはＰ－セレクチンタンパク質との０８４１、１２８２、１２８４、１４４４または１４４８の交差反応性は観察されなかった（図１３）。これらの研究は、抗体（例えば、１４４４）が、ヒトＬ－セレクチンまたはＰ－セレクチンへの結合の観察を伴わずに、Ｅ－セレクチンに選択的に結合することを実証している。
マウスＥ－セレクチンおよびラットＥ－セレクチンへの用量依存的結合が、低い～ナノモル濃度未満の結合（それぞれ０．１５３ｎＭおよび０．０１３９ｎＭ）で、対照ラットまたはマウス抗Ｅ－セレクチン抗体で観察された。対照的に、マウスおよびラットＥ－セレクチンへの０８４１、１２８２、１２８４、１４４４または１４４８の弱い結合が観察され、結合曲線は、陽性対照抗体と比較して右にシフトした。結合曲線は、対照ラットまたはマウスＥ－セレクチン指向性抗体と比較して、より弱い、非飽和性のまたは可変な結合を示した（表３７）。
Figure 0007449390000071
上記方法と類似の方法を使用するさらなる直接結合ＥＬＩＳＡでは、抗体１４４４は、０．０８５のＥＣ５０で、固定化された可溶性組換えヒトＥ－セレクチンに結合し、０．０７１～０．０７５ｎＭのＥＣ５０で、固定化された可溶性組換えカニクイザルＥ－セレクチンに結合した（表３８）。
（実施例２９）
静脈内または皮下投与後のサルにおける最適化抗体１４４４の薬物動態
最適化抗体１４４４の薬物動態研究を、静脈内および皮下投与を使用してカニクイザルにおいて実施した。血清抗体１４４４（配列番号７のＨＣアミノ酸配列（これは末端リジンを含む）および配列番号１のＬＣアミノ酸配列を含む）濃度の定量化を、Ｍｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）（ＭＳＤ）アッセイプラットフォーム上でのイムノアッセイを使用して決定した。このアッセイでは、抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４を定量化するために、ビオチン化ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、遮断されたストレプトアビジンコーティングされた小スポットプレート上に結合させた。抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４を、リガンドである組換えヒト可溶性Ｅ－セレクチンによって捕捉した。結合した抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４を、ルテニル化（ruthenylated）ヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。プレートを、ＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で読み取り、最終検出を、ルテニウム標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体およびトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を使用することによって実施して、ＭＳＤ機器内で、結合した抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４の量を示す電気化学発光シグナルを生成した。サンプル濃度を、５パラメーターロジスティック方程式を使用してフィットさせた標準曲線からの内挿によって決定した（標準曲線のための重み付け式は、１／ｙ＾２である）。１００％血清中での定量化の範囲は、４０．０ｎｇ／ｍＬ～２５６０ｎｇ／ｍＬであった。
各々２匹の動物への０．３、０．６、１、３または１０ｍｇ／ｋｇでの静脈内（ＩＶ）投与の後、抗体１４４４は、それぞれ０．３９、０．３１、０．１５、０．１８および０．１８ｍＬ／ｈ／ｋｇの、時間０から最後の測定可能な濃度まで計算した平均全身性クリアランス（ＣＬ０－ｔｌａｓｔ）、ならびにそれぞれ２５、２２、２７、３５および３６ｍＬ／ｋｇの、定常状態における見かけの分布容積（Ｖｓｓ（０－ｔｌａｓｔ））を示した。抗体１４４４は、用量依存的薬物動態を示し、クリアランスは、用量が増加するにつれて減少し、標的媒介性薬物処分を示している。０．３、０．６、１、３または１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶ投与についての平均半減期（ｔ１／２）は、それぞれ１０２、２６４、１８８、２８７および３４５時間であった。
各々２匹の動物への１または３ｍｇ／ｋｇでの皮下（ＳＣ）投与の後、抗体１４４４は、１ｍｇ／ｋｇでの抗体のＩＶ投与と比較した場合、１ｍｇ／ｋｇでのＳＣ投与の後に５０％の平均バイオアベイラビリティ（％Ｆ）を有した。３ｍｇ／ｋｇでの抗体１４４４のＳＣ投与の後、抗体１４４４は、３ｍｇ／ｋｇでの抗体１４４４のＩＶ投与と比較した場合、６５％の平均％Ｆを有した。１および３ｍｇ／ｋｇでの抗体１４４４のＳＣ投与についての平均半減期（ｔ１／２）は、それぞれ２４３および５１８時間であった。
リガンド結合アッセイを検証して、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォームで、カニクイザル血清中の抗薬物抗体（ＡＤＡ）の存在を検出した。この方法では、カニクイザル血清中にスパイクしたマウスモノクローナル抗抗体１４４４抗体からなる２つの異なる濃度での陽性対照、およびプールした正常カニクイザル血清からなる陰性対照を、各プレート上に含めて、アッセイ性能をモニタリングした。抗体１４４４に対するＡＤＡ誘導の全発生率は、全ての用量群にわたって０％（０／１８匹の動物）であった。
（実施例３０）
生理学的流動アッセイにおける最適化抗体１４４４による細胞接着のｅｘ ｖｉｖｏ中和
ｅｘ ｖｉｖｏ細胞接着実験を、組換えタンパク質または細胞単層でコーティングされたミクロ流体チャネルの内側で実施して、Ｅ－セレクチンリガンドを発現する細胞の接着を阻害する抗体１４４４の有効性および中和活性を評価した。細胞接着を、ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）（Ｓ／Ｎ－００８－０１８０－０８）システム（Ｆｌｕｘｉｏｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、生理学的流動条件下で分析した。接着アッセイを、組換えの精製した可溶性Ｅ－セレクチンもしくはＰ－セレクチンタンパク質、または細胞表面上にＥ－セレクチン（ヒトまたはカニクイザル）を発現するように操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して実施した。Ｅ－セレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスＸリガンドを発現するヒトＨＬ－６０細胞、Ｅ－セレクチンリガンドを発現する精製されたヒト好中球、または鎌状赤血球症を有する患者から得た全血を使用して、組換えＥ－セレクチンおよびＰ－セレクチンタンパク質、ならびにＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞への接着を試験した。
ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）プレート／チャンバー（Ｆｌｕｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、４８ウェル低剪断、０～２０ダイン／ｃｍ２；９１０－０００４）を、これらの研究で使用した。ヒトＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＨＯ－Ｅ、Ｐｆｉｚｅｒ）またはカニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞（カニクイザルＣＨＯ－Ｅ、Ｐｆｉｚｅｒ）およびＨＬ－６０細胞を、そのそれぞれの成長培地中で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で維持した。ＨＬ－６０細胞または精製されたヒト好中球を使用する研究では、細胞を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）；Ｃ３０９９）で３０分間染色し、カルシウムおよびマグネシウムを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号１４０４０－１３３）で２回洗浄し、フローチャンバー中での灌流前に、ＰＢＳ中に３×１０６細胞／ｍＬの濃度になるように再懸濁した。細胞を、灌流前に３７℃で維持し、ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）アッセイを室温で実施した。接着細胞を、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｓ（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＢＲ ３．２ ６４ビット）倒立ステージ位相差蛍光顕微鏡を４０×の倍率で使用して可視化およびカウントした。細胞カウントを、リン酸緩衝液ビヒクル対照に対して標準化した。各実験は、１条件当たり２つのウェルを有した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０．２）を使用してグラフ化および分析した。分析から導出した推定された最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）値を、小数点から有効数字２桁に四捨五入した。推定されたＩＣ５０値を、データをビヒクル対照（＝１００％、阻害なし）に対して標準化することによって計算した。
組換えＥ－セレクチンへの細胞接着の中和
最初に、活性化された内皮細胞の表面を模倣するために、フローチャンバーを、等しい量のヒトＥ－セレクチンおよびＰ－セレクチン可溶性組換えタンパク質の両方でコーティングした。ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）フローマイクロチャネルを、ＰＢＳ中で調製した２０μｇ／ｍＬの可溶性組換えヒトＰ－セレクチンおよびＥ－セレクチン（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の各々でコーティングし、１ダイン／ｃｍ２で５分間灌流し、室温で１時間インキュベートし、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳで１ダイン／ｃｍ２で３～５分間洗浄した。プレートを、ＰＢＳ中の抗体１４４４を含む試験物品（０．７８～２００ｎＭの濃度）、アイソタイプ陰性対照抗体（２００ｎＭ）、陽性対照抗Ｅセレクチン抗体（２００ｎＭ）、およびビヒクル対照で、１ダイン／ｃｍ２で１時間処置した。１００μＬのＨＬ－６０細胞のアリコートを、各チャネル中で、１ダイン／ｃｍ２の生理学的剪断流動で１０分間灌流した。ＰＢＳを、１ダイン／ｃｍ２で２～３分間灌流し、非接着細胞を除去し、記載されたように分析した。
抗体１４４４（０．７８～２００ｎＭ）、アイソタイプ陰性対照抗体またはビヒクルを、チャンバー中で灌流して、Ｅ－セレクチン結合を阻害した。これらの研究では、Ｅ－セレクチンリガンド、ＰＳＧＬ－１および他のシアリルルイスＸリガンドを発現するＨＬ－６０細胞を、１ダイン／ｃｍ２で流した。抗体１４４４は、１５．２６ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、精製された可溶性ヒトＥ－セレクチンタンパク質へのＨＬ－６０細胞接着を低減させた。アイソタイプ陰性対照は、このアッセイにおいて効果を有さなかった。陽性対照抗Ｅセレクチン抗体は、ＨＬ－６０接着を約４３％低減させた。
上記方法と類似の方法を使用するさらなる流動接着中和アッセイでは、抗体１４４４は、１３．２８ｎＭ～１５．９４ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、組換えヒトＥ－セレクチンタンパク質へのＨＬ－６０接着を中和した（表３８）。
Ｅ－セレクチンを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞への細胞接着の中和
ＢｉｏＦｌｕｘ（商標）プレートを、１ダイン／ｃｍ２の流速でＰＢＳ中１００μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ、カタログ番号５０５０－１ＭＧ）でコーティングし、室温で１時間インキュベートした。Ｅ－セレクチンを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ヒトまたはカニクイザルＣＨＯ－Ｅ）を、１：１の比の０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｇｉｂｃｏ、２５３０００５４）およびＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ；Ａ１１１０５０１）による３７℃で５分間の処置によってアッセイのために調製し、等しい体積の成長培地で中和し、収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そのそれぞれの成長培地中に６０×１０６細胞／ｍＬの最終濃度になるように再懸濁した。プレートを、１ダイン／ｃｍ２で室温で２～３分間、２５０μＬのＣＨＯ成長培地で２回灌流し、全ての培地を除去し、１０～２０μＬのＣＨＯ－Ｅ細胞（６０×１０６細胞／ｍＬ）を、２～３ダイン／ｃｍ２で１５秒間灌流した。プレートを機器から取り出し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベートした。培地を除去し、５００μＬの新たな成長培地を添加し、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ＣＨＯ－Ｅ単層を、ＢｉｏＦｌｕｘ機器上で新たな成長培地を用いて洗浄した（３～４ダイン／ｃｍ２）。プレートを、ＰＢＳ中の抗体１４４４を含む試験物品（０．７８～２００ｎＭの濃度）、アイソタイプ陰性対照抗体（２００ｎＭ）、陽性対照である市販の抗Ｅセレクチン抗体（２００ｎＭ）、およびビヒクル対照で、１ダイン／ｃｍ２で１時間の灌流によって処置した。１００μＬのＨＬ－６０細胞のアリコートを、１ダイン／ｃｍ２の生理学的剪断流動で、各チャネル中で１０分間灌流した。ＰＢＳを、１ダイン／ｃｍ２で２～３分間灌流して非接着細胞を除去し、プレートを、記載されたように画像化し、分析した。
Ｅ－セレクチンは、内皮細胞表面上で発現される。Ｅ－セレクチン（ヒトまたはカニクイザル）を発現するＣＨＯ細胞を、フローチャンバーの表面に結合させて、細胞単層を形成した。抗体１４４４を、チャンバー中で灌流し（０．７８～２００ｎＭ）、ＨＬ－６０細胞を、１ダイン／ｃｍ２の生理学的流動下で灌流した。陰性対照には、アイソタイプ陰性対照抗体およびビヒクルが含まれた。抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４は、４．４１ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ヒトＣＨＯ－Ｅ－セレクチン細胞へのＨＬ－６０細胞の細胞接着を中和した。さらに、カニクイザルＥ－セレクチンを発現する細胞へのＨＬ－６０の中和についての推定されたＩＣ５０値は、４．３４ｎＭであった。アイソタイプ陰性対照抗体は、ヒトまたはカニクイザルのいずれのＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０結合も中和しなかった。２００ｎＭでの陽性対照抗体試験は、ヒトＥ－セレクチンを発現する細胞へのＨＬ－６０接着を、約４４％低減させた。
上記方法と類似の方法を使用するさらなる流動接着中和アッセイでは、抗体１４４４は、それぞれ４．２５ｎＭ～４．５６ｎＭおよび４．３２ｎＭ～４．３５ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチン発現ＣＨＯ細胞へのＨＬ－６０接着を中和した（表３８）。
Ｅ－セレクチンを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞への精製された好中球接着の中和
ヒトおよびカニクイザルＣＨＯ細胞単層を、記載されたようにＢｉｏｆｌｕｘプレート上で調製した。全血を、４人の健康なボランティアドナー（Ｐｆｉｚｅｒ）から得、各々３ｍＬをプールし、好中球を、製造業者のプロトコールに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｋｉｔ（ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ全血好中球単離キット、ヒト、１３０－１０４－４３４）を使用して精製した。
ＰＢＳ中の抗体１４４４を含む試験物品（０．７８～２００ｎＭの濃度）、アイソタイプ陰性対照抗体（２００ｎＭ）、陽性対照抗Ｅセレクチン抗体（２００ｎＭ）、およびビヒクル対照を、１ダイン／ｃｍ２で１時間灌流した。精製された好中球を、Ｃａｌｃｅｉｎで染色し、アッセイ前に３７℃で１０分間、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）（Ｂｉｏｔａｎｇ Ｉｎｃ、５０－７５１－５６８１）で処置した。好中球を、３００×ｇで室温で１０分間収集し、ＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含む）中に再懸濁した。好中球を、１ダイン／ｃｍ２で１０分間灌流した。ＰＢＳを、１ダイン／ｃｍ２で２～３分間灌流して非接着細胞を除去し、プレートを画像化し、分析した。
好中球は、Ｅ－セレクチンリガンドを発現し、Ｅ－セレクチンは、内皮への好中球接着を媒介する。ｅｘ ｖｉｖｏの生理学的流動下でのＥ－セレクチン（ヒトまたはカニクイザル）を発現するＣＨＯ単層へのヒト好中球の抗Ｅ－セレクチン抗体中和を評価した。抗体１４４４、アイソタイプ陰性対照抗体またはビヒクルを、チャンバー中に灌流した。ヒト好中球を、４人の健康なドナーから精製し、プールし、ＴＮＦ－αで活性化された（１０ｎｇ／ｍＬ）好中球を、このアッセイで評価した。抗体１４４４は、２．８７ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ヒトＣＨＯ－Ｅ－セレクチン細胞への活性化されたヒト好中球の接着を中和した。カニクイザルＣＨＯ－Ｅ－セレクチン細胞への活性化されたヒト好中球の接着の中和についての推定されたＩＣ５０は、１６．３３ｎＭであった。
上記方法と類似の方法を使用するさらなる流動接着中和アッセイでは、抗体１４４４は、それぞれ４．６５ｎＭおよび９．４５ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、ヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチン発現ＣＨＯ細胞への活性化されたヒト好中球の接着を中和した（表３８）。
ＳＣＤ血球接着の中和
ＳＣＤにおける炎症促進性応答は、鎌状赤血球および活性化された内皮細胞における変更によって促進される（Ｍａｎｗａｎｉ ＤおよびＦｒｅｎｅｔｔｅ ＰＳ Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２（２４）：３８９２～９８）。赤血球鎌状化、溶血および内皮細胞機能障害は、炎症および細胞活性化をもたらし、ＳＣＤ病理発生に寄与する。ＳＣＤを有する２人のドナー由来の全血を、ＣａｌｃｉｅｎおよびＨｏｅｃｈｓｔで標識して、ローリングおよび接着を可視化した。簡潔に述べると、血液を、到着の２４時間後にアッセイし、１ｍＭの塩化カルシウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのＮ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ－２－エタンスルホン酸、０．２５％ＢＳＡ、０．１％グルコース、ｐＨ７．４を含むＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）緩衝液で、１５％のヘマトクリットになるように希釈した。血球を、アッセイの前に３７℃で３０分間、ＣａｌｃｅｉｎおよびＨｏｅｃｈｓｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３３３４２）色素（１：１０００）で染色した。フローチャンバーを、ＰＢＳ中で調製した２０μｇ／ｍＬの可溶性組換えヒトＥ－セレクチンおよびＰ－セレクチンタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の各々で１ダイン／ｃｍ２で５分間コーティングし、室温で１～２時間インキュベートし、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１ダイン／ｃｍ２で３～５分間洗浄した。
両方のドナー由来の血液を、組換えヒトＥ－セレクチンおよびＰ－セレクチンタンパク質への接着について評価した。抗体１４４４を含む試験物品、ＰＢＳ中の抗Ｐ－セレクチン抗体対照（０．７８～２００ｎＭ）、アイソタイプ陰性対照抗体（２００ｎＭ）、対照抗Ｅ－セレクチン抗体（２００ｎＭ）、またはビヒクルを、１ダイン／ｃｍ２で１時間流した。希釈されたＳＣＤ血液を、０．６ダイン／ｃｍ２で１０分間流した。ＰＢＳを、１ダイン／ｃｍ２で２～３分間灌流して非接着細胞を除去し、プレートを画像化し、分析した。推定されたＩＣ５０値を、上記のように計算した。推定されたＩＣ２０、ＩＣ８０およびＩＣ９０を、以下の式に基づいて計算した：（ＩＣ５０ ＊効果）／（１００－効果）。計算は、ＥｍａｘＴｍｏｄｅｌ［Ｅ＝（Ｅｍａｘ＋Ｃ）／（Ｃ＋ＥＣ５０）］に基づく。
アイソタイプ陰性対照抗体は、結合を中和しなかった。２００ｍＭで試験した陽性対照抗体は、細胞結合接着を、１０～３５％の間で低減させた。抗体１４４４は、１２．４ｎＭの平均で、６．１７ｎＭおよび１８．６６ｎＭの推定されたＩＣ５０値で、組換えＥ－セレクチンへのヒトＳＣＤ細胞の結合を中和した（図１４）。ＩＣ２０、ＩＣ８０およびＩＣ９０値は、それぞれ３．１ｎＭ、４９．６ｎＭおよび１１１．６ｎＭであると推定された。可溶性Ｅ－セレクチンおよびＰ－セレクチンタンパク質コーティングされたチャンバーを使用する類似の生理学的流動条件下でのＰ－セレクチン阻害と比較して、細胞接着のより高い中和が、Ｅ－セレクチン阻害で観察された。
Figure 0007449390000072
Figure 0007449390000073
（実施例３１）
最適化抗Ｅ－セレクチン抗体１４４４の細胞表面結合（ＦＡＣＳ）および中和
Ｅ－セレクチンは、内皮細胞表面上で発現され、内皮細胞機能障害、例えば、炎症応答の条件下では、循環血球は、リガンド－接着分子相互作用を介して血管内皮に接着する。細胞表面で発現されたＥ－セレクチンに結合する抗体１４４４の能力を評価した。これらの研究では、膜結合したヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞株を使用して、細胞表面で発現されたＥ－セレクチンへの抗体１４４４の結合を特徴付けた。
細胞表面上にＥ－セレクチン（ヒトまたはカニクイザル）またはヒトＰ－セレクチンを発現するＣＨＯ細胞およびトランスフェクトされていない対照ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＤＵＫＸ）を、抗体１４４４、アイソタイプ対照ＩｇＧ１および２つの対照Ｐ－セレクチン抗体を使用するＦＡＣＳ分析によって評価した。抗体１４４４は、０．６６～２．３３ｎＭの推定されたＥＣ５０で、ヒトＥ－セレクチンに結合した（６回の実験に基づく）。抗体１４４４は、０．７５～１．３７ｎＭの推定されたＥＣ５０で、カニクイザルＥ－セレクチンに結合した（６回の実験に基づく）。抗体１４４４は、対照ＣＨＯ－ＤＵＫＸには結合せず、これは、検出可能な細胞表面結合の非存在を示している。さらに、抗体１４４４は、細胞表面Ｐ－セレクチンに結合しなかった。ＣＨＯ－Ｐ－セレクチン細胞への対照抗Ｐ－セレクチン抗体の用量依存的結合が観察され、これは、Ｐ－セレクチンの発現を示している。アイソタイプ対照ＩｇＧ１では結合は観察されなかった（表３８）。
（実施例３２）
カニクイザルにおける忍容性および毒物動態学的研究
カニクイザルは、Ｅ－セレクチン結合および／または生物学的活性を阻害する抗体１４４４の能力を評価するために設計したｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理学研究に基づく唯一の薬理学的に適切な非臨床種であった。ヒトおよびカニクイザルＥ－セレクチンに対する結合親和性は、マウス、ウサギまたはラット由来のＥ－セレクチンへの強力な結合の非存在とは対照的に、評価したアッセイにわたって類似であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的アッセイでは、抗体１４４４は、可溶性組換えヒトＥ－セレクチンタンパク質および細胞により発現された組換えヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンへのヒト前骨髄球性細胞の細胞接着を、用量依存的に中和した。さらに、抗体１４４４は、低いｎＭ範囲の推定された５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値で、ヒトおよびカニクイザルの細胞Ｅ－セレクチンの両方への精製された好中球の接着を中和した。３０ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量は、３５３μｇ／ｍＬの全体的最大観察濃度（Ｃｍａｘ）および９２，５００μｇ・ｈ／ｍＬの、時間０から３３６時間までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ３３６）と関連した；一方で、１００ｍｇ／ｋｇのＩＶ用量は、６９３μｇ／ｍＬの全体的Ｃｍａｘおよび１０８，０００μｇ・ｈ／ｍＬのＡＵＣ３３６と関連した。抗体１４４４を、１カ月にわたり最大で２００ｍｇ／ｋｇ／週ＩＶの毎週１回の用量で雄性および雌性カニクイザルに投与し、同様に許容された。ｉｎ ｖｉｔｒｏヒト補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）および結晶化可能断片ガンマＦｃ受容体（ＦｃγＲ）結合アッセイならびに組織交差反応性評価は、安全性の懸念をもたらさなかった。
（実施例３３）
動物における薬物動態学的および産物代謝
単回用量ＰＫおよび反復用量ＴＫを、抗体１４４４のＩＶおよび／またはＳＣ投薬後に、カニクイザルにおいて評価した。カニクイザルにおける単回ＩＶ投薬の後、用量依存的クリアランス（ＣＬ）を観察したところ、飽和性の標的媒介性薬物処分（ＴＭＤＤ）と一致していた。０．３～１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲の単回ＩＶ投薬の後、抗体１４４４は、それぞれおよそ０．３９～０．１５ｍＬ／ｈ／ｋｇおよび２２～３６ｍＬ／ｋｇの、平均ＣＬおよび平均ＶＳＳを示した。１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇでの抗体１４４４の単回ＳＣ用量の後、Ｔｍａｘを、それぞれ７２および９６時間の時点で観察し、ＳＣバイオアベイラビリティは＞５０％であった。３ｍｇ／ｋｇ ＩＶでの抗体１４４４の推定されたＴ１／２は、およそ１２日間であった。
１カ月のＧＬＰ反復用量毒性研究では、反復ＳＣおよびＩＶ投薬の後に、全身性曝露（最大観察濃度［Ｃｍａｘ］および濃度－時間曲線下面積［ＡＵＣ］によって評価した）において、見かけの性関連の差異は存在しなかった。全身性曝露は、用量の増加とともに増加し（ＳＣ）、反復ＳＣおよびＩＶ投薬の後により高かった。抗体１４４４を、１カ月にわたり１５もしくは５０ｍｇ／ｋｇ／週ＳＣまたは２００ｍｇ／ｋｇ／週ＩＶの毎週１回の用量で雄性および雌性カニクイザルに投与した（５つの合計用量）。１５および５０ｍｇ／ｋｇ／週での毎週１回の反復投薬の後、平均Ｔｍａｘは、１日目および２２日目の用量後、７２時間と１１２時間との間であった。全身性曝露は、それぞれ１５（ＳＣ）、５０（ＳＣ）および２００（ＩＶ）ｍｇ／ｋｇ／週について、５．５、３．２および１．９の平均蓄積率（ＡＵＣ１６８、２２日目／１日目）で、反復投薬後により高かった。
ヒトにおける予測された有効な用量は、１５０ｍｇでの抗体１４４４の単回ＳＣ投与である。１５０ｍｇのＳＣ投薬における予測された最小有効濃度および曝露は、それぞれ、平均濃度（Ｃａｖ［１～１６８時間］）については１４μｇ／ｍＬであり、ＡＵＣ１６８については２４００μｇ・ｈ／ｍＬである。
（実施例３４）
動物におけるＥ－セレクチンレベル、凝集体およびＩＣＡＭ－１発現
可溶性Ｅ－セレクチンを、０．３～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の抗体１４４４の用量後に、液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ）によって、カニクイザル由来の血清において特徴付けた。抗体１４４４は、濃度依存的様式で、Ｅ－セレクチンの有効な結合を示し、可溶性Ｅ－セレクチンに対する＞９０％の阻害効果が全ての用量群において観察され、これは、抗体１４４４のｉｎ ｖｉｖｏ Ｅ－セレクチン結合活性を示している。
抗体１４４４による投薬後、血液を、カニクイザルから収集し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して分析して、細胞の凝集体および接着マーカーを検出した。単球－血小板凝集体および好中球－血小板凝集体を試験した。このＦＡＣＳ分析では、ＣＤ１４を使用して、サイズスキャンを使用して単球と好中球とを識別し、ＣＤ４１を使用して、単球－血小板凝集体および好中球－血小板凝集体を検出した。抗体１４４４は、処置後のカニクイザルにおいて、単球－血小板および好中球－血小板凝集体の減少に対して効果を示した。
白血球細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）発現を、抗体１４４４の投薬後に、ＦＡＣＳ分析を使用してカニクイザル由来の白血球において試験した。ＩＣＡＭ－１における減少が、投薬後に観察された。

Claims (30)

  1. ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ－１）、配列番号３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－２、配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ－３、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ－１）、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－２および配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ－３を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 請求項１に記載のヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 請求項１に記載のヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）、および配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含む抗体重鎖定常領域（ＣＨ）、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  5. 配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣおよび配列番号７または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣを含む、ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する単離された抗体。
  6. ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する単離された抗体であって：
    配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ－１、配列番号３のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ－２、および配列番号４のアミノ酸配列からなるＬＣＤＲ－３を含むＶＬ領域；ならびに配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号８のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ－１、配列番号９のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ－２、および配列番号１０のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ－３を含むＶＨ領域
    を含む、単離された抗体。
  7. ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する単離された抗体であって、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドによって産生されるポリペプチドを構成するアミノ酸配列を含む抗体ＨＣ、およびＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドによって産生されるポリペプチドを構成するアミノ酸配列を含む抗体ＬＣを含む、単離された抗体。
  8. ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のＦｃドメインからなる群から選択されるヒトＦｃドメイン、カッパもしくはラムダから選択される軽鎖定常領域、もしくはその組み合わせを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された抗体。
  9. 前記抗体の重鎖のアイソタイプがＩｇＧ１、前記軽鎖定常領域がカッパ軽鎖、またはその両方である、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  10. ２００ｎＭ～２ｎＭのＫＤでヒトまたはカニクイザルＥ－セレクチンに結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片。
  11. Ｅ－セレクチンに特異的に結合し、以下から選択される少なくとも１つの検出可能な特徴を示す、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合性断片：
    （ｉ）ＳＰＲによって測定した場合に、２００ｎＭ以下のＫＤで、ヒトＥ－セレクチンに結合すること；
    （ｉｉ）ＳＰＲによって測定した場合に、２００ｎＭ以下のＫＤで、カニクイザルＥ－セレクチンに結合すること；
    （ｉｉｉ）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ―ａｃｔｉｖａｔｅｄ
    ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）によって測定した場合に、５０ｎＭ以下のＥＣ５０で、細胞表面に発現されるＥ－セレクチンに結合すること；
    （ｉｖ）ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、２ｎＭ以下のＥＣ５０で、可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合すること；
    （ｖ）ＡｌｐｈａＬｉｓａ（商標）競合アッセイによって測定した場合に、２ｎＭ以下のＥＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を中和すること；
    （ｖｉ）１ｎＭ～３ｎＭのＩＣ５０で、ヒト血清中の遊離可溶性ヒトＥ－セレクチンに結合すること；
    （ｖｉｉ）静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの可溶性ヒトＥ－セレクチンへの結合を中和すること；
    （ｖｉｉｉ）静置条件下で競合ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、５０ｎＭ以下のＩＣ５０で、シアリルルイスＡリガンドの、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの結合を中和すること；
    （ｉｘ）静置条件下で測定した場合に、１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンドを発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害すること；
    （ｘ）生理的流動条件下で測定した場合に、１００ｎＭ以下のＩＣ５０で、Ｅ－セレクチンリガンドを発現する細胞の、細胞表面に発現されるヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害すること；
    （ｘｉ）生理的流動条件下で測定した場合に、６．１７ｎＭ～１８．６６ｎＭのＩＣ５０で、鎌形赤血球症（ＳＣＤ）患者由来の血液細胞の可溶性ヒトＥ－セレクチンへの接着を阻害すること；
    （ｘｉｉ）１０ｍｇ／ｋｇの用量での静脈投与投与（ＩＶ）後、１４．４日間（３４５時間）の平均半減期を有すること；
    （ｘｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇの用量での皮下投与（ＳＣ）後、２１．５日間（５１８時間）の平均半減期を有すること；
    （ｘｉｖ）２５℃で、Ａｎｔｏｎ Ｐａｒｒ法によって測定した場合に、１８５．７ｍｇ／ｍＬで３３．４ｃＰの粘度を有すること；
    （ｘｖ）高濃度における高度の熱安定性および最小の凝集を含めた、商業的に適切な製剤特性を示すこと；ならびに
    （ｘｖｉ）大規模製造条件下で再現性のある発現および純度を示すこと。
  12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする、単離された核酸分子。
  13. 以下のうち少なくとも１つ：
    ａ）ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＶＨおよびＶＬをコードする核酸配列であって、それぞれ配列番号１３６の核酸配列および配列番号１３７の核酸配列を含む核酸配列；
    ｂ）ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＨＣおよびＬＣをコードする核酸配列であって、配列番号２０６もしくは配列番号１３８の核酸配列、および配列番号１３９の核酸配列を含む核酸配列；ならびに
    ｃ）ヒトＥ－セレクチンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のＨＣおよびＬＣをコードする核酸配列であって、ＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５２９を有するプラスミドのＨＣの核酸配列、およびＡＴＣＣに寄託され、アクセッション番号ＰＴＡ－１２６５３０を有するプラスミドのＬＣの核酸配列
    を含む、単離された核酸分子。
  14. 請求項１２または１３に記載の核酸を含む、ベクター。
  15. 請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  16. 抗体またはその抗原結合性断片を作製する方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を、前記抗体またはその抗原結合性断片が前記宿主細胞によって発現される条件下で培養するステップを含む、方法。
  17. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
  18. ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗体もしくはその抗原結合性断片、ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を含むＬＣを含む抗体もしくはその抗原結合性断片、またはｉｉｉ）それら両方を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. Ｅ－セレクチンの発現および／またはＥ－セレクチンのリガンドへの結合によって媒介されるまたはそれと関連する医学的状態、疾患または障害を治療するための、請求項１７または１８に記載の医薬組成物であって、治療有効量の、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  20. 前記医学的状態、疾患または障害がＳＣＤである、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 請求項２０に記載の医薬組成物であって、心臓胸部系に影響を及ぼすもの、神経系に影響を及ぼすもの、細網内皮系に影響を及ぼすもの、筋骨格系に影響を及ぼすもの、泌尿生殖器系に影響を及ぼすものおよび胃腸系に影響を及ぼすもの、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状を処置し、予防し、および／または寛解させるための医薬組成物。
  22. 心臓胸部系に影響を及ぼすＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状が、慢性拘束性肺疾患、左心室拡張疾患、肺高血圧症、急性胸部症候群、調律異常、突然死、血管閉塞クリーゼ（ＶＯＣ）、およびそれらの組合せから選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. ＶＯＣの処置が、ｉ）ＶＯＣの持続時間、強度、または両方を減少させることによる急性ＶＯＣの処置、ｉｉ）ＶＯＣの発生の予防もしくは低減、またはｉｉｉ）それら両方を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. Ｅ－セレクチンの生物学的活性の減少を必要とする対象において、Ｅ－セレクチンの生物学的活性を減少させるための、請求項１７または１８に記載の医薬組成物であって、治療有効量の、Ｅ－セレクチンに特異的に結合する請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  25. 少なくとも１つの検出可能なＥ－セレクチンの生物学的活性を減少させ、減少させる活性が、（ａ）内皮細胞への白血球テザリング；（ｂ）内皮細胞への白血球の安定な接着の活性化；（ｃ）白血球を停止させる緩徐な内皮細胞上の白血球ローリング；（ｄ）白血球の効率的な経内皮遊走；（ｅ）Ｅ－セレクチンのＣＤ１８インテグリンに対する親和性および結合力；（ｆ）急性炎症の部位への白血球の輸送；（ｇ）細胞質カルシウムの濃度；（ｈ）ｐ３８ ＭＡＰキナーゼおよびＳｙｋキナーゼを活性化するチロシンリン酸化；（ｉ）血液から血管内皮への血小板および白血球の動員；（ｊ）炎症促進性環境の創出、ならびに（ｋ）それらの組合せからなる群から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. 治療有効量の少なくとも１つのさらなる治療的に活性な化合物または処置モダリティと組み合わせることを含み、さらなる化合物およびモダリティが、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防をするためのものである、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  27. 前記少なくとも１つのさらなる治療的に活性な化合物が、ペニシリン系予防薬、ヒドロキシウレア（ＤＲＯＸＩＡ（登録商標）、ＨＹＤＲＥＡ（登録商標））、Ｌ－グルタミン（ＥＮＤＡＲＩ（登録商標））、クリザンリズマブ（ＡＤＡＫＶＥＯ（登録商標））、ボキセロートル（ＯＸＢＲＹＴＡ（登録商標））、アピキサバン（ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））、リバーロキサバン（ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））、非ステロイド性抗炎症薬、鎮痛薬、ＩＷ－１７０１、リオシグアト（ＡＤＥＭＰＡＳ（登録商標））、チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ（登録商標））、メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ（登録商標））、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記少なくとも１つのさらなる治療的に活性な処置モダリティが、酸素補給、鉄キレート化を伴う輸血、骨髄移植、遺伝子治療、ＣＲＩＳＰＲまたはジンクフィンガー技術による遺伝子編集治療およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  29. 治療有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗Ｅ－セレクチン抗体を含む、ＳＣＤを処置するためのキット。
  30. 相乗的治療有効量の、ＳＣＤの少なくとも１つの徴候および／または症状の処置および／または予防において有効である少なくとも１つのさらなる治療的に活性な化合物または処置モダリティをさらに含む、請求項２９に記載のキット。
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