ES2213141T3 - Anticuerpos con especificidad hacia multiples moleculas de adhesion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ANTICUERPOS MONOCLONALES QUE RECONOCEN UN DETERMINANTE COMUN ENCONTRADO SOBRE MOLECULAS DE ADHERENCIA DISTINTA Y SEPARADA. LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES SE USAN PARA BLOQUEAR LA ADHERENCIA CELULAR. LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES LOS HAY TAMBIEN DESCRITOS QUE SON CAPACES DE UNIRSE A UN DETERMINANTE COMUN EXPRESADO SOBRE "SELECTINAS" DISTINTOS Y EN PARTICULAR ANTICUERPOS QUE SE UNEN A SELECTIN-E (TAMBIEN CONOCIDO COMO ELAM-1) Y SELECTIN L (TAMBIEN CONOCIDO COMO LAM-I, LECAM-1, LEU-8, TQ-1, GP 90 MEL-14 Y RECEPTOR DE RETORNO DE NODO DE LINFA PERIFERICA). LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES SON UTILES EN LA DIAGNOSIS, TRATAMIENTO Y PREVENCION DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON INFLAMACION. LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES SON UTILES PARA DETECTAR CELULAS QUE LLEVAN SELECTINAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN LINEAS DE CELULAS CAPACES DE PRODUCIR LOS ANTICUERPOS DESCRITOS ANTERIORMENTE.

Description

Anticuerpos con especificidad hacia múltiples moléculas de adhesión.

Este invento se refiere a anticuerpos que se unen a múltiples moléculas de adhesión, y a tales anticuerpos para uso en métodos para el tratamiento de enfermedades. Otro aspecto del invento se refiere a inmunoensayos para la detección de moléculas de adhesión.

La sangre periférica del sistema circulatorio de los seres humanos y mamíferos está compuesta principalmente de glóbulos rojos, es decir, eritrocitos, y glóbulos blancos, es decir, leucocitos. La familia de los glóbulos blancos está compuesta de monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y diversos tipos de linfocitos. Los neutrófilos, eosinófilos y basófilos son conocidos como "granulocitos" a causa de su contenido de gránulos citoplásmicos.

Los neutrófilos, monocitos, eosinófilos y basófilos son conocidos como "fagocitos" a causa de que su función primaria en el sistema inmune humano es fagocitar o ingerir bacterias, microorganismos y otros tipos de materiales extraños. Estas células se producen a partir de células progenitoras comunes en la médula ósea de un ser humano o un animal y de ellas se sabe que circulan en la sangre periférica y finalmente entran en los tejidos, según sea necesario, para controlar una infección o para participar en reacciones inflamatorias. Sin embargo, cada uno de los fagocitos tiene diferentes funciones y actúa como un sistema relacionado aunque independiente.

El neutrófilo es el leucocito más común de la sangre periférica de seres humanos y animales. Un microlitro de sangre completa humana normal contiene, por término medio, 5.000 leucocitos, de los cuales 3.075 son neutrófilos, 150 son eosinófilos, 25 son basófilos, 250 son monocitos y 1.500 son linfocitos.

En la respuesta a una infección o inflamación, la mayor parte de los leucocitos son primero activados para que migren a la zona apropiada en respuesta a factores quimioatrayentes tales como ciertos productos bacterianos, componentes del complemento, citoquinas y otros factores. Además de leucocitos, estas señales pueden también activar células endoteliales. Como resultado de la activación, los leucocitos y las células endoteliales se vuelven adhesivos.

Este proceso de atracción es denominado "quimiotaxis". Una vez en una zona de la inflamación o infección, la mayor parte de los leucocitos deben establecer una firme fijación a sus dianas. La adhesión celular es mediada a través de diversas interacciones ligando-receptor. Los ejemplos incluyen receptores celulares para el complemento, receptores celulares para el Fc o la porción ligante de células de los anticuerpos, receptores de fibronectina y otras moléculas de adhesión. La mayor parte de los receptores asociados con la adhesión son glicoproteínas.

Esencialmente, los neutrófilos interaccionan con, y salen del sistema arterial-venoso (es decir, se extravasan) a través de, el endotelio de vénulas poscapilares. Durante una respuesta inflamatoria aguda, los neutrófilos son capaces de salir de las vénulas de endotelio alto (HEV; del inglés, high endothelial venules) halladas en ganglios linfáticos, un sitio principal de extravasación de linfocitos. Se ha mostrado que dos clases de antígenos superficiales de los neutrófilos están implicadas en esta interacción: el complejo LFA-1/Mac-1/p150.95 (CD11a-c/CD18) y la L-selectina.

Las selectinas, previamente llamadas LEC-CAMs, representan una nueva familia de proteínas de adhesión que regulan la entrada de leucocitos en tejidos linfoides y sitios de inflamación (Rosen, 1.990, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 3: 397-402). Se han identificado tres miembros de esta familia. Dos de estos, la E-selectina y la P-selectina (originalmente denominadas ELAM-1 y GMP-140/PADGEM, respectivamente), son expresados por células endoteliales. El tercero, la L-selectina (también conocida como LAM-1, LECAM-1, Leu-8, TQ-1, y receptor para dirección a ganglios linfáticos periféricos), es expresado por casi todos los leucocitos de sangre periférica. La P-selectina es una glicoproteína citoplásmica de células endoteliales y plaquetas que puede desplazarse rápidamente (en minutos) a la superficie celular tras activación con trombina [Larsen et al., 1.989, Cell 3: 397-402; Johnston et al., 1.989, Cell 56: 1.033-1-044; Geng et al., 1.990, Nature (London) 343: 757-760]. La E-selectina es también una glicoproteína superficial inducible de las células endoteliales, pero se requieren 2-4 horas para la expresión, lo que refleja las necesidades de síntesis de RNA y proteínas de novo [Bevilacqua et al., 1.989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9.238-42; Bevilacqua et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 243: 116-1.112].

Tanto la P-selectina como la E-selectina son proteínas de adhesión para neutrófilos y monocitos [Larsen et al., 1.989, Cell 59: 305-312; Johnston et al., 1.989, Cell 56: 1.033-1-044; Bevilacqua et al., 1.987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 9.238-9.242; Bevilacqua et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 243: 1.160-1.112]. Se ha mostrado también que una subpoblación de células T de memoria se une a la E-selectina [Picker et al., 1.991, Nature (London) 349: 796-799; Shimizu et al., 1.991, Nature (London) 349: 799). Por contraste con las selectinas vasculares, la L-selectina es constitutivamente expresada por leucocitos y media en la adhesión de linfocitos a las vénulas de endotelio alto (HEV) de los ganglios linfáticos periféricos al unirse a los ligandos de dirección vascular periférica (Berg et al., 1.989, Immunol. Rev. 108: 5-18; Berg et al., 1.991, J. Cell. Biol. 114: 343-349), y en la adhesión de neutrófilos a células endoteliales activadas por citoquinas (Hallman et al., 1.991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 174: 236-243; Smith et al., 1.991, J. Clin. Invest. 87: 609-618; Spertini et al., 1.991, J. Immunol. 147: 2.565-2.573). Recientemente, se ha mostrado que la L-selecti na de neutrófilos es un posiblecontrarreceptor para la E-selectina (Kishimoto et al., 1.990, Blood 78: 805-811; Picker et al., 1.991, Cell 66: 921-933).

La L-selectina es constitutivamente expresada por neutrófilos en reposo de una forma aparentemente funcional. Neutrófilos recién aislados pueden unirse a endotelio estimulado, a temperatura reducida (4-7ºC) in vitro (Hallmann et al., 1.991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 174: 236; Spertini et al., 1.991, J. Immunol. 147: 2.565). Sin embargo, tras minutos de exposición de los neutrófilos a bajos niveles de factores quimiotácticos, la L-selectina es rápidamente infrarregulada de la superficie celular (Kishimoto et al., 1.989, Science 245: 1.238). En minutos puede detectarse in vitro una infrarregulación casi completa de L-selectina. Esta forma de regulación inversa es llevada a cabo por degradación proteolítica de la L-selectina en la superficie celular. Un fragmento grande de L-selectina puede ser recuperado del sobrenadante de células activadas, lo que sugiere que la L-selectina es proteolíticamente cortada cerca del dominio transmembranal (Kishimoto et al., 1.989, Science 245: 1.238).

El análisis de los neutrófilos que se recuperan in vivo del peritoneo inflamado de ratón (Jutila et al., 1.989, J. Immunol. 143: 3.318) y el análisis inmunohistológico de los neutrófilos de sitios cutáneos inflamados (Kishimoto et al., 1.989, Science 245: 1.238) sugieren que esta regulación inversa de moléculas de adhesión también tiene lugar in vivo. Los linfocitos y monocitos también pueden deshacerse de la L-selectina in vivo tras activación, aunque las cinéticas son significativamente más lentas (Jung et al., 1.988, J. Immunol. 141: 4.110; Jutila et al., 1.990, Blood 76: 178; Kishimoto et al., 1.990, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 2.244).

La E-selectina está normalmente ausente de las células endoteliales. Sin embargo, tras una estimulación con citoquinas inflamatorias, las células endoteliales expresan E-selectina en varias horas. La E-selectina es sintetizada de novo, y es bloqueada por inhibidores de la síntesis de proteínas (Bevilacqua et al., 1.987, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84: 9.238). Esta suprarregulación de E-selectina es similar a la vista con otras moléculas de adhesión endotelial, tales como ICAM-1 y VCAM-1. Sin embargo, por contraste con estas otras moléculas de adhesión que permanecen muy expresadas durante más de 24 horas, la expresión de E-selectina alcanza su máximo a las 3-4 horas y luego es infrarregulada durante 8-24 horas in vitro (Bevilacqua et al., 1.987, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 34: 9.238; Pobert et al., 1.986, J. Immunol. 137: 1.893). El curso temporal de la expresión de E-selectina es similar al curso temporal de la infiltración de neutrófilos en sitios inflamatorios agudos in vivo. Estos resultados sugieren que la E-selectina está principalmente implicada en la respuesta inflamatoria aguda. La expresión de E-selectina es también rápidamente inducible in vivo y coincide con la afluencia de neutrófilos (Norris et al., 1.991, J. Invest. Dermatol. 96: 763; Cotran et al., 1.986, J. Exp. Med. 164: 661; Munro et al., 1.991, Lab. Invest. 64: 295; Redl et al., 1.991, Am. J. Pathol. 139: 461; Munro et al., 1.989, Am. J. Pathol. 135: 121; Leung et al., 1.991, J. Clin. Invest. 87: 1.805). Sin embargo, en ciertas lesiones inflamatorias crónicas, notablemente ciertos sitios cutáneos y sinoviales inflamados, la expresión de E-selectina es bastante acusada (Cotran et al., 1.986, J. Exp. Med. 164: 661; Koch et al., 1.991, Lab. Invest. 64: 313; Picker et al., 1.991, Nature 349: 746; Norris et al., 1.991, J. Invest. Dermatol. 96: 763). A diferencia de la L-selectina, no hay evidencia in vitro que sugiera que la E-selectina es despedida de la superficie endotelial.

A nivel molecular, las tres selectinas presentan una estructura mosaica única que consiste en un dominio N-terminal de tipo lectina C, un dominio semejante al factor de crecimiento epidérmico (EGF; del inglés, epidermal growth factor), y múltiples dominios de repeticiones cortas de consenso (SCR; del inglés, short consensus repeat) homólogos a los hallados en proteínas reguladoras del complemento (Johnston et al., 1.989, Cell 56: 1.033-1.044; Bevilacqua et al., 1.987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9.238-9.242; Laskey et al., 1.989, Cell 56: 1.045-1.055; Siegelman et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 243: 1.165-1.172; Camerini et al., 1.989, Nature (London) 342: 78-80; Tedder et al., 1.989, J. Exp. Med. 170: 123-133). En conjunto, estas proteínas comparten una identidad de 40-60% a nivel de nucleótidos y aminoácidos y pueden haber surgido por duplicación génica de un gen ancestral precoz. Se cree que los dominios de lectina de cada selectina son críticos para las funciones adhesivas de las proteínas, y se han definido parcialmente las especificidades ligantes de carbohidratos de las tres selectinas. Tanto P-selectina como E-selectina reconocen el Lewis x sialilado (sLex) que decora glicoproteínas y glicolípidos expresados por células mieloides, aunque existen diferencias en sus propiedades ligantes (Phillips et al., 1.990, Science (Wash. D.C.) 250: 1.130-1.132; Lowe et al., 1.990, Cell 63: 475-484; Goelz et al., 1.990, Cell 63: 1.349-1.356; Walz et al., 1.990, Science 250: 1.132; Polley et al., 1.991, Proc. Natl. Acad. Sci. 8: 6.224-6.228). La función de la L-selectina es bloqueada por ciertos azúcares sencillos, tales como manosa-6-PO_{4}, y ciertos polisacáridos complejos, tales como el fosfomanano rico en manosa-6-PO_{4} (núcleo de monoéster de fosfomanano, es decir, PPME) de la levadura Hansenula holstii (Yednock et al., 1.987, J. Cell. Biol. 104: 725-731; Imami et al., 1.990, J. Cell. Biol. 111: 1.225-1.232, revisado en Rosen, 1.990, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol.). Además, muchos anticuerpos que bloquean la función de la L-selectina reconocen epítopos codificados por el dominio de lectina (Bowen et al., 1.990, J. Cell. Biol. 110: 147-153; Kansas et al., 1.991, J. Cell. Biol. 114: 351-358).

Pueden también existir otros dominios funcionales de las selectinas espacialmente separados y distintos. Anticuerpos contra el dominio EGF de la L-selectina humana o de ratón bloquean la adhesión de linfocitos a HEV, aunque ejercen poco efecto sobre la unión a carbohidratos (Kansas et al., 1.991, J. Cell. Biol. 114: 351-8; Siegelman et al., 1.989, Cell 61: 611-622). Estudios de construcciones quiméricas de L-selectina/inmunoglobulina sugieren que los dominios de SCR también ejercen papeles funcionales importantes para las selectinas (Watson et al., 1.991, J. Cell. Biol. 115: 235-243) pero, por contraste con los dominios de lectina y EGF, no se ha mostrado que anticuerpos bloqueantes de funciones reconozcan esta región. Además, se piensa que el papel funcional de las SCRs se limita al mantenimiento de la apropiada conformación molecular, que es distinta para cada selectina (Watson et al., 1.991, J. Cell. Biol. 115: 235-243).

Aun cuando se han desarrollado muchos anticuerpos monoclonales (mAbs; del inglés, monoclonal Antibodies) anti-selectina, no se ha mostrado que alguno tenga la capacidad de reconocer determinantes de dos selectinas distintas. CL2, que reconoce E-selectina humana, reacciona con L-selectina de perro pero no con ambas en el mismo animal (Abbassi et al., 1.991, J. Immuno. 147: 2.107-2.115). Spertini et al. (1.991, J. Immunol. 147: 942) proporcionan la caracterización funcional y la localización molecular de al menos 11 epítopos diferentes en la L-selectina, pero, de nuevo, ninguno de estos se expresa en dos selectinas diferentes. TQ-1 y Leu-8, que reconocen L-selectina, también muestran un patrón mucho más restringido de tinción y no tiñen otras selectinas. No se ha mostrado que alguno de los mAbs anti-E-selectina o P-selectina publicados reaccione con otras selectinas. Es intrigante que, aun cuando hay un nivel significativo de identidad a nivel de aminoácidos entre las diferentes selectinas y se ha generado un gran número de mAbs anti-selectina, antes de este invento no se haya presentado anticuerpo alguno que reconozca un epítopo compartido por dos selectinas diferentes.

Como mediadores primarios de la respuesta inflamatoria aguda, los neutrófilos representan un componente esencial del sistema inmune. Los neutrófilos se originan en la médula ósea, que contiene una gran reserva de granulocitos maduros prontamente movilizados. Tras su descarga en la sangre, donde existen en equilibrio dinámico entre una reserva libremente conducida por la sangre y una reserva marginal de células que interaccionan reversiblemente con el endotelio, los neutrófilos tienen una semivida relativamente corta (de 4 a 10 horas en los seres humanos). En respuesta a estímulos inflamatorios agudos, los neutrófilos se adhieren fuertemente al endotelio vascular, migran a través de la pared del vaso y posteriormente se mueven a lo largo de un gradiente quimiotáctico hacia el estímulo inflamatorio, donde responden fagocíticamente. De este modo, la interacción entre neutrófilos y células endoteliales vasculares es una fase inicial esencial en la respuesta inflamatoria aguda.

Aunque la respuesta inflamatoria de los leucocitos es vital para la erradicación de microorganismos invasores, un sustancial y convincente conjunto de datos indica que los fagocitos inflamatorios también causan daño a diversos órganos y tejidos cuando estas células son activadas in vivo por factores inflamatorios solubles que son generados por procesos patológicos incitantes (Harlan, 1.985, Blood 65: 513-525). La adhesión y propagación de fagocitos mononucleares y neutrófilos activados a células endoteliales vasculares con la subsiguiente liberación de proteasas y metabolitos oxidativos tóxicos han sido implicadas en el daño a órganos observado en enfermedades tales como el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (ARDS; del inglés, adult respiratory distress syndrome; síndrome de shock pulmonar), glomerulonefritis, rechazos agudo y cronico de aloinjertos, enfermedades inflamatorias de la piel, artritis reumatoide, asma, aterosclerosis, lupus eritematoso sistémico, enfermedades del tejido conjuntivo, vasculitis, y síndromes de isquemia-reperfusión (es decir, reimplantación de miembros, infarto de miocardio, lesión por aplastamiento, shock, accidente cerebrovascular y trasplante de órganos) (revisado en Harlan, ibídem).

La terapia "antiadhesión" representa un nuevo planteamiento para el tratamiento de aquellos trastornos inflamatorios e inmunes en que la adhesión de leucocitos al epitelio contribuye significativamente a una lesión/daño vascular y tisular. El presente invento interacciona específicamente con, y bloquea, el proceso de adhesión y, por lo tanto, es potencialmente útil para dichos trastornos.

La terapia "antiadhesión" ejerce un profundo efecto sobre la respuesta inflamatoria. Pueden reducirse las lesiones cutáneas (Arfors et al., 1.987, Blood 69: 338), pueden reducirse el edema cerebral y la muerte producidas por meningitis bacteriana (Tuomanen et al., 1.989, J. Exp. Med. 170: 959), puede reducirse el edema tisular asociado con reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (Lindbom et al., 1.990, Clin. Immunol. Immunopath. 57: 105), puede reducirse la hipersensibilidad de las vías aéreas en el asma alérgica (Wegner et al., 1.990, Science 247: 456), puede reducirse la lesión pulmonar remota tras una aspiración (Goldman et al., 1.991, FASEB J. 5: A509), puede reducirse la broncoconstricción de fase tardía tras una estimulación antigénica (Gundel et al., 1.991, J. Clin. Invest. 88: 1.407), puede reducirse el edema por alteración de permeabilidad en la inflamación pulmonar aguda (Mulligan et al., 1.991, J. Clin. Invest. 88: 1.396) y puede inhibirse el desarrollo de la diabetes autoinmune (Hutchings et al., 1.990, Nature 346: 639). La terapia "antiadhesión" puede también prolongar la supervivencia de los aloinjertos cardiacos (Flavin et al., 1.991, Transplant Proc. 23: 533), atenuar el daño y la disfunción pulmonares secundarias a la toxicidad por oxígeno (Wegner et al., 1.991, Am. Rev. Respir. Dis. 143: A544), atenuar el rechazo de aloinjertos renales (Cosimi et al., 1.990, J. Immunol. 144: 4.604), mejorar la artritis provocada por antígenos (Jasin et al., 1.990, Arthritis Rheum. 33: S34), proteger contra la lesión vascular y la muerte en el shock endotóxico (Thomas et al., 1.991, FASEB J. 5: A509), y evitar que las quemaduras de segundo grado lleguen a ser quemaduras de tercer grado (Bucky et al., 1.991, Proc. Amer. Burn Assoc. 23: 133).

Dicha terapia "antiadhesión" es también eficaz en la lesión por isquemia y reperfusión. Dicha terapia puede ser usada para reducir el edema por alteración de permeabilidad después de una isquemia-reperfusión (I/R) de intestino (Hernández et al., 1.987, Am. J. Physiol. 253: H699), reducir el daño miocárdico después de un infarto de miocardio (Winquist et al., 1.990, Circulation 82: III; Ma et al., 1.990, Cir. Res. 82: III), reducir los daños vascular y tisular después de shock hemorrágico y resucitación (Mileski et al., 1.990, Surgery 108: 206), reducir el daño en el sistema nervioso central después de una I/R de la médula espinal (Clark et al., 1.991, Stroke 22: 877), reducir el edema y el daño tisular después de congelación y recalentamiento (Mileski et al., 1.990, Proc. Am. Burn Assoc. 22: 164) y reducir el tamaño del infarto después de una I/R de miocardio (Simpson et al., 1.990, Circulation 81: 226).

Los anticuerpos monoclonales hacia L-selectina evitan la emigración de neutrófilos hacia una piel inflamada (Lewinsohn et al., 1.987, J. Immunol. 138:4.313), evitan la emigración de neutrófilos y monocitos hacia un fluido ascítico inflamado (Jutila et al., 1.989, J. Immunol. 143: 3.318) e inhiben la emigración de neutrófilos hacia un peritoneo inflamado. Los anticuerpos monoclonales hacia E-selectina inhiben la migración de neutrófilos hacia el pulmón y, de este modo, proporcionan una base para su uso en la prevención o el tratamiento del asma (Gundel et al., 1.991, J. Clin. Invest.; Mulligan et al., 1.991, J. Clin. Invest. 88: 1.396). Jasin et al. proporcionan respaldo al uso de anticuerpos para inhibir la acumulación de neutrófilos en una sinovia inflamada (Jasin et al., 1.990, Arthritis Rheum. 33: S34; Koch et al., 1.991, Lab. Invest. 64: 313), entre otros efectos celulares específicos.

Existe la antigua necesidad de la producción de anticuerpos monoclonales, o fragmentos activos de los mismos, que reaccionen con un epítopo o determinante antigénico compartido por diferentes moléculas de selectina, lo que permitiría el diagnóstico, la profilaxis y el tratamiento eficaces de la multitud de enfermedades relacionadas con las respuestas inflamatoria e inmune. Es beneficioso tener mAbs asequibles que puedan reconocer múltiples miembros de esta familia de moléculas de adhesión celular, obteniéndose de este modo un más amplio campo de aplicabilidad a dichas enfermedades y lesiones.

El presente invento se refiere a anticuerpos, fragmentos ligantes de antígeno de los anticuerpos, y sus equivalentes biológicos, que reaccionan con un dominio que está presente en diferentes selectinas, y a las células que producen los anticuerpos.

Los anticuerpos del presente invento reaccionan con las diferentes selectinas, incluyendo las células que llevan o expresan las diferentes selectinas.

Los anticuerpos, fragmentos ligantes de antígeno de los anticuerpos y sus equivalentes biológicos se unen a células que llevan o expresan las diferentes selectinas, e inhiben la función de las diferentes selectinas.

El presente invento también se refiere al uso de los anticuerpos como agentes terapéuticos para prevenir o tratar enfermedades en que las selectinas desempeñan un papel. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades inflamatorias, alergias, enfermedades autoinmunes, asma, artritis, y lesión por isquemia-reperfusión. Es particularmente interesante la prevención o inhibición de la lesión por isquemia-reperfusión en el pulmón al usar los anticuerpos o sus equivalentes funcionales en una cantidad eficaz. Dicho tratamiento es también eficaz para reducir la mortalidad en los mamíferos así aquejados.

El presente invento también abarca métodos para detectar células que llevan o expresan diferentes selectinas. Dichos métodos son útiles para el diagnóstico de enfermedades en que las selectinas y las células que llevan selectinas desempeñan un papel, y para determinar el progreso de tales enfermedades.

Dichos métodos son también útiles para determinar la eficacia de los agentes terapéuticos durante el curso del tratamiento de una enfermedad en que las selectinas y las células que llevan selectinas desempeñan un papel.

El presente invento proporciona anticuerpos, fragmentos ligantes de antígeno y anticuerpos quiméricos que tienen la especificidad del anticuerpo monoclonal EL-246 secretado por un hibridoma que tiene el nº de registro HB 11049 de la ATCC. Dichos anticuerpos reconocen un determinante antigénico común de la E-selectina y la L-selectina. Los anticuerpos del presente invento y sus equivalentes funcionales son capaces de inhibir las interacciones célula-célula mediadas tanto por E-selectina como por L-selectina.

El presente invento abarca métodos que inhiben o modulan simultánea o individualmente las funciones de la E-selectina y la L-selectina, al usar anticuerpos o sus equivalentes funcionales de acuerdo con el presente invento que son capaces de unirse a E-selectina y L-selectina.

Los anticuerpos de acuerdo con el presente invento y sus equivalentes funcionales son capaces de inhibir la unión de neutrófilos a células que expresan E-selectina y son también capaces de prevenir o inhibir la rodadura de neutrófilos sobre capas de células endoteliales que expresan E-selectina.

Los anticuerpos de acuerdo con el presente invento y sus equivalentes funcionales son capaces de prevenir, inhibir o modular la dirección de linfocitos a tejidos linfoides periféricos.

Estos y otros objetos, características y muchas de las concomitantes ventajas del invento se entenderán mejor tras una lectura de la descripción detallada siguiente cuando es considerada en relación con los dibujos adjuntos, en los que:

Figura 1: muestra que EL-246 tiñe células L1-2 transfectadas con cDNA de E-selectina humana. Las flechas señalan histogramas que representan (1) la tinción de L1-2ELAM con EL-246, (2) testigos de transfectantes L1-2 y (3) la tinción de fondo (testigo de segunda fase) de los transfectantes L1-2ELAM;

Figura 2: muestra el reconocimiento, por EL-246, de un antígeno de 110 kDa expresado por células L1-2ELAM. Las transferencias fueron sondadas con EL-81 (anti-E-selectina, carril 3), EL-246 (carril 2) y anticuerpo testigo negativo (carril 1);

Figura 3: muestra el reconocimiento, por EL-246, de vénulas inflamadas de secciones congeladas de amígdala humana;

Figura 4: muestra el reconocimiento, por EL-246, de un antígeno superficial de leucocito de sangre periférica humana;

Figura 5: muestra la cotinción con EL-246 y anticuerpos anti-L-selectina;

Figura 6: muestra que EL-246 reconoce, en transferencias Western, L-selectina purificada por afinidad. La L-selectina fue purificada por afinidad usando el mAb DREG 56 anti-L-selectina, desarrollada sobre un gel de dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés, sodium dodecyl-sulfate) al 8% bajo condiciones no reductoras, transferida a nitrocelulosa y sondada con EL-246 (carril 2), otro mAb anti-L-selectina (DREG 152; carril 3) o un anticuerpo testigo de segunda fase (carril 1);

Figura 7: muestra que EL-246 bloquea la función de la L-selectina (A) y la E- selectina (B);

Figura 8: indica que la posición del epítopo EL-246 está en, o requiere, los dominios de SCR de la L-selectina;

Figura 9: el tratamiento de neutrófilos con EL-246 evita la unión de los neutrófilos a transfectantes (TF) de E-selectina;

Figura 10: EL-246 se transfiere del neutrófilo a los transfectantes de E-selectina durante el ensayo de unión. La Figura 10A muestra que los neutrófilos tratados con EL-246 se teñían intensamente con el isotiocianato de fluoresceína (FITC; del inglés, fluorescein isothiocyanate)-segunda fase antes del ensayo. La Figura 10B muestra la falta de tinción de las mismas células con el FITC-anticuerpo de segunda fase después del ensayo. La Figura 10C muestra las células analizadas en 10B, teñidas con un segundo mAb anti-L-selectina (DREG56). La Figura 10D muestra la falta de tinción de los transfectantes de E-selectina con el FITC-segunda fase antes del ensayo, y la Figura 10E muestra la tinción después del ensayo. La Figura 10F representa los resultados de una tinción indirecta convencional del transfectante para E-selectina. En cada histograma, las líneas punteadas representan la fluorescencia de fondo después de tinción con anticuerpos testigo negativos;

Figura 11: EL-246 bloquea la rodadura de neutrófilos sobre células endoteliales activadas, bajo condiciones de cizallamiento. 11A muestra el efecto de EL-246 sobre la rodadura de neutrófilos. 11B muestra el efecto de un mAb testigo negativo de isotipo sobre la rodadura de neutrófilos;

Figura 12: EL-246 bloquea la unión de transfectantes de E-selectina a HEV de ganglio linfático periférico (PLN; del inglés, peripheral lymph node). La Figura 12A representa la unión de los transfectantes a HEV de PLN, y la Figura 12B muestra los efectos de EL-246 sobre la unión a los mismos vasos en secciones consecutivas. Las flechas señalan el mismo vaso en la sección consecutiva (aumento de 200x);

Figura 13: EL-246 bloquea específicamente la capacidad de linfocitos bovinos para dirigirse a ganglios linfáticos periféricos de ratón. Los gráficos de curvas de nivel representan los análisis del porcentaje de linfocitos bovinos marcados con FITC que se dirigían al bazo y a ganglios linfáticos periféricos (PLN) después del tratamiento (Trtm.) con EL-246, DREG 55 o medio solo (testigo);

Figura 14: el tratamiento de ovejas con EL-246 evita la mortalidad causada mediante lesión por isquemia/reper-
fusión in vivo. Las ovejas fueron tratadas con un anticuerpo monoclonal anti-E/L-selectina (EL-246) o con un anticuerpo monoclonal anti-L-selectina humana (DREG56), o no recibieron tratamiento alguno (testigo isquémico). Se representó gráficamente el porcentaje de supervivencia frente al tiempo (h);

Figura 15: muestra el porcentaje de la máxima tinción fluorescente, de células L½ de ratón transfectadas con cDNA de L-selectina y tratadas con diluciones de muestras de suero extraídas, 30, 90 y 360 minutos después del inicio de la reperfusión, a 8 animales tratados con anticuerpo monoclonal anti-E/L-selectina (EL-246).

En un aspecto, el presente invento proporciona anticuerpos monoclonales (mAbs), fragmentos ligantes de antígeno y sus equivalentes funcionales que tienen la especificidad del anticuerpo monoclonal EL246 secretado por un hibridoma que tiene el nº de registro HB 11049 de la ATCC. En otro aspecto, el presente invento también proporciona células capaces de producir tales mAbs. Este invento también proporciona un nuevo anticuerpo monoclonal, EL-246, y las células capaces de producir el nuevo mAb. Las células que producen el anticuerpo monoclonal EL-246 fueron depositadas el 22 de Mayo de 1.992 bajo las condiciones del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, EE.UU., bajo el nº de registro HB 11049.

En una realización, el presente invento proporciona anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad del anticuerpo monoclonal EL246 secretado por un hibridoma que tiene el nº de registro HB 11049 de la ATCC, y sus equivalentes funcionales, que se unen con uno o más epítopos presentes en el dominio de repeticiones cortas de consenso (SCR) tanto de la L-selectina como de la E-selectina, y las células capaces de producir los mAbs.

El invento incluye los anticuerpos y todos los fragmentos biológicamente activos de los mismos, incluyendo los fragmentos Fab y F(ab')_{2}. Son particularmente interesantes para el presente invento los anticuerpos capaces de unirse a moléculas de adhesión independientes y distintas, preferiblemente los anticuerpos capaces de unirse a selectinas independientes y distintas, muy preferiblemente los anticuerpos capaces de unirse tanto a E-selectina como a L-selectina, que son producidos en seres humanos o son "humanizados" (es decir, no inmunogénicos en un ser humano) por recombinación u otra tecnología. Pueden producirse anticuerpos humanizados, por ejemplo, al sustituir una porción inmunogénica de un anticuerpo por una porción correspondiente pero no inmunogénica (es decir, anticuerpos quiméricos). Dichos anticuerpos quiméricos pueden contener la porción reactiva o ligante de antígeno de un anticuerpo procedente de una especie, y la porción Fc de un anticuerpo (no inmunogénico) procedente de una especie diferente. Los ejemplos de anticuerpos quiméricos incluyen, pero no se limitan a, quimeras de mamífero no humano-ser humano, quimeras de roedor-ser humano, quimeras de murino-ser humano y quimeras de rata-ser humano (Robinson et al., Solicitud de Patente Internacional 184.187; M. Taniguchi, Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison et al., Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al., Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al., 1.988, Science 240: 1.041; Liu et al., 1.987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3.439; Nishimura et al., 1.987, Canc. Res. 47: 999; Wood et al., 1.985, Nature 314: 446; Shaw et al., 1.988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1.553).

S. Morrison, 1.985, Science 229: 1.202, y Oi et al., 1.986, BioTechniques 4: 214, proporcionan revisiones generales sobre anticuerpos quiméricos "humanizados".

Alternativamente, pueden producirse anticuerpos "humanizados" adecuados por sustitución con CDR o CEA (Jones et al., 1.986, Nature 321: 552; Verhoeyan et al., 1.998, Science 239: 1.534; Beidler et al., 1.998, J. Immunol. 141: 4.053).

Los anticuerpos o fragmentos ligante de antígeno de los mismos, de acuerdo con el invento, pueden ser empleados en métodos para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de enfermedades tales como, pero no limitadas a, las asociadas con las respuestas inflamatoria e inmune, ARDS, glomerulonefritis, rechazos agudo y cronico de aloinjertos, enfermedades inflamatorias de la piel, artritis reumatoide, asma, aterosclerosis, lupus eritematoso sistémico, enfermedades del tejido conjuntivo, vasculitis, lesión por isquemia-reperfusión, y cáncer. Por todo ello, el invento proporciona una nueva herramienta de investigación para el estudio de las interacciones leucocito-endotelio y el papel de las moléculas de adhesión en mecanismos de enfermedades.

Se inmunizan linfocitos de mamífero mediante inmunización in vivo del animal o mediante contacto in vitro con células completas, con extractos celulares que expresan moléculas de adhesión o con moléculas de adhesión aisladas o fragmentos de las mismas. Los anticuerpos monoclonales del presente invento que reconocen tanto E-selectina como L-selectina son generados en respuesta al apropiado estímulo antigénico o inmunógeno. Para la producción de los anticuerpos del presente invento, se usa un inmunógeno en forma de células presentes en la naturaleza que expresan establemente cDNA de E-selectina humana, solo o conjugado con otras proteínas, liposomas o similares. El inmunógeno contiene regiones proteínicas comunes tanto a E-selectina como a L-selectina; más preferiblemente, el inmunógeno contiene el dominio de SCR o fragmentos del mismo.

En una realización más del presente invento, se usan como inmunógeno células que expresan establemente el dominio de SCR humano o una porción del mismo. En otra realización, células de linfoma de ratón que expresan establemente cDNA de E-selectina humana son usadas como inmunógeno para la generación de anticuerpos que reaccionan tanto con E-selectina como con L-selectina. En otra realización, se usan como inmunógeno células endoteliales que expresan E-selectina después de estimulación con citoquinas, o leucocitos de sangre periférica que expresan L-selectina.

Para inmunizaciones in vivo, se repiten las inmunizaciones según sea necesario, a intervalos de hasta algunas semanas (por ejemplo, 2-4 semanas), con objeto de obtener un título suficiente de anticuerpos. Las células, extractos celulares o proteínas, péptidos o fragmentos de adhesión antigénicos son conducidos en disoluciones o adyuvantes apropiados. Después del último refuerzo antigénico, se sacrifican los animales y se extraen las células esplénicas.

La formación de hibridomas y la producción de anticuerpos monoclonales pueden ser efectuadas mediante muchas técnicas diferentes que son bien conocidas en este campo técnico. Básicamente, el procedimiento implica obtener primero células inmunes, tales como las del bazo de un mamífero, que han sido previamente estimuladas con un antígeno o inmunógeno in vivo o in vitro. Estas células son luego fusionadas con células, tales como células de mieloma o células transformadas, que son capaces de replicarse indefinidamente en cultivo celular, produciéndose por ello una línea de células inmortales que secretan inmunoglobulina. Las células inmortales o células de mieloma, que son preferiblemente murinas pero pueden también proceder de células de otra especie de mamífero, incluyendo, pero no limitándose a, ratas y seres humanos, son seleccionadas de modo que carezcan de las enzimas necesarias para la utilización de ciertos nutrientes, sean capaces de un rápido desarrollo y tengan una buena capacidad de fusionarse. Muchas de tales líneas celulares o mielomas son conocidas por los expertos en la técnica, y otras son descritas regularmente. Las carencias enzimáticas pueden incluir, por ejemplo, timidina quinasa (TK) e hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT). Estas carencias permiten la selección de células fusionadas, de acuerdo con su capacidad para desarrollarse en, por ejemplo, medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). Preferiblemente, las parejas de la fusión inmortal utilizadas proceden de una línea que no secreta inmunoglobulina. Las células fusionadas resultantes, o hibridomas, son cultivadas bajo condiciones que permiten la supervivencia de las células fusionadas pero no de las no fusionadas, y las colonias resultantes son exploradas en cuanto a la producción de los anticuerpos monoclonales deseados. Las colonias que producen dichos anticuerpos son clonadas, desarrolladas y dejadas crecer in vivo o in vitro con objeto de que produzcan grandes cantidades de anticuerpo (para una descripción de la base teórica y la metodología práctica para fusionar tales células, véase Köhler y Milstein, 1.975, Nature 256: 495).

Aunque dichos métodos son descritos más adelante con mayor detalle, los expertos en este campo técnico apreciarán que pueden hacerse modificaciones y adiciones de las técnicas sin apartarse del alcance del presente invento.

Pueden cultivarse células fusionadas individuales en pocillos individuales para cultivo tisular. Pueden usarse células de abastecimiento, tales como timocitos irradiados u otras células, para aumentar la viabilidad de las células. Los sobrenadantes de cultivos de hibridomas procedentes de los pocillos individuales son analizados en cuanto a la unión de anticuerpos a leucocitos o células de mamífero transfectados con cDNA de molécula de adhesión celular humana o a las moléculas de adhesión purificadas o fragmentos de las mismas, usando adecuados métodos de detección conocidos en la técnica, tales como el inmunoensayo con enzimas ligadas (EIA; del inglés, enzyme-linked immunoassay) y el inmunoensayo en forma de manchas ("immunodot"). Para el primero, los sobrenadantes de cultivos son dispuestos en pocillos de reacción que han sido revestidos con las moléculas de adhesión celular (CAM; del inglés, cell adhesion molecule) específicas a las que ha de unirse un anticuerpo. Después de la incubación, los pocillos de reacción son lavados y el restante anticuerpo unido al antígeno es detectado a través de un anticuerpo marcado que reacciona con el anticuerpo anti-CAM. Los marcadores apropiados incluyen radioisótopos, sustratos luminiscentes tales como agentes fluorescentes, y componentes de marcadores enzimáticos.

El método del inmunoensayo en forma de manchas puede ser también utilizado para explorar clones que expresan anticuerpos anti-CAM (Towbin et al., 1.984, Immunol. Method 72: 313). Se aplica CAM purificada a una membrana de nitrato de celulosa en forma de "manchas" y se deja que se seque. Después del bloqueo de los sitios de unión inespecífica con una disolución de gelatina, las membranas son sucesivamente sumergidas en sobrenadante de cultivo, una disolución del producto de conjugación de anti-inmunoglobulina de ratón/peroxidasa, y una disolución de 4-cloro-1-naftol, con lavados intermedios con disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline). Los clones que expresan inmunoglobulina reactiva aparecen como manchas coloreadas. Pueden utilizarse otros sistemas de exploración conocidos por quienes tienen experiencia en la técnica.

Pueden producirse grandes cantidades de anticuerpos monoclonales procedentes de hibridomas secretores, al inyectar los clones en la cavidad peritoneal de ratones y recoger el fluido ascítico de la misma. Los ratones, preferiblemente sometidos a inducción primaria con pristano o algún otro promotor de tumores e inmunosuprimidos químicamente o por irradiación, pueden ser de diversas razas, preferiblemente de las razas New Zealand Black y Balb/c. Se recoge el fluido ascítico de los ratones y se purifica el anticuerpo monoclonal del mismo mediante, por ejemplo, una columna de CM Sepharose u otro medio cromatográfico. De este modo pueden recuperarse elevados títulos de anticuerpos. Alternativamente, los hibridomas pueden ser cultivados in vitro o como cultivos en suspensión, en procesos de cultivo tanto discontinuos como continuos, y los anticuerpos monoclonales pueden ser recuperados del medio o el sobrenadante de cultivo.

Los anticuerpos o los fragmentos ligantes de antígeno pueden ser también producidos por ingeniería genética. En esta técnica, como con el procedimiento estándar para hibridomas, células productoras de anticuerpos son sensibilizadas hacia el antígeno o inmunógeno deseado. El RNA mensajero aislado de las células esplénicas inmunes o los hibridomas es usado como un molde para preparar cDNA usando multiplicación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction). Usando el cDNA, se produce un banco de bacteriófagos, cada uno de los cuales contiene un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que conservan la especificidad antigénica inicial. Se construye un banco combinatorio al combinar el banco de genes de cadena pesada con el banco de genes de cadena ligera. Esto da lugar a un banco de clones que coexpresan una cadena pesada y una ligera (que se parecen al fragmento Fab o fragmento ligante de antígeno de una molécula de anticuerpo).

Se transfectan bacterias con los fagos que llevan estos genes. Cuando se induce la síntesis de genes de anticuerpos en las bacterias transfectadas, las proteínas de las cadenas pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden ser detectados por exploración con el antígeno o inmunógeno.

La tecnología para la expresión de las cadenas tanto pesada como ligera en E. coli es el objeto de las solicitudes de patente PCT: publicaciones números WO 901443, WO 9014424, y de Huse et al., 1.989, Science 246: 1.275-1.281.

Además de reconocer, o unirse a, tanto E-selectina como L-selectina, los anticuerpos monoclonales del presente invento bloquean las funciones adhesivas de ambas moléculas. En una realización, el presente invento es un nuevo mAb (EL-246) que reconoce un epítopo común expresado tanto en E-selectina como en L-selectina humanas. EL-246 bloquea la función de ambas proteínas y reconoce selectinas de una diversidad de animales diferentes, y su epítopo está presente en, o requiere, los dominios de SCR tanto de la E-selectina como de la L-selectina. Los nuevos anticuerpos presentes que reaccionan con los dominios de SCR inhiben la función adhesiva de dos selectinas distintas.

La adhesión de linfocitos (dependiente de L-selectina) a HEV de ganglio linfático periférico (dependiente de E-selectina) fue bloqueada en > 95% con EL-246. Esta inhibición era mayor que con el mAb bloqueante anti-L-selectina DREG 56 (88%), que es un anticuerpo que sólo reacciona con L-selectina y no con E-selectina (Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248). La actividad ligante de carbohidratos (PPME) de la L-selectina no resultó apreciablemente inhibida por EL-246, lo que indica la especificidad de EL-246 por el dominio de SCR. EL-246 bloquea eficazmente (> 90%) la capacidad de E-selectina, expresada en células L adherentes, para unirse a neutrófilos humanos.

El presente invento puede ser especialmente útil como un agente terapéutico en procesos agudos, tales como infarto de miocardio, reacciones asmáticas estimuladas por antígenos, o shock, o incluso en procesos subagudos tales como el rechazo de aloinjertos. Este mAb puede ser también un tratamiento eficaz para trastornos crónicos tales como la artritis reumatoide.

Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento son un método útil para la prevención o el tratamiento del asma en mamíferos. En el Documento U.S. nº de serie 738.633, presentado el 31 de Julio de 1.991, y en Gundel et al., 1.991, J. Clin. Invest. 88: 1.407-1.411, se detalla el método para prevenir o tratar el asma usando anticuerpos anti-selectinas.

Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno inhiben la obstrucción de vías aéreas de fase tardía que acompaña a menudo a las reacciones asmáticas provocadas por antígenos. La molécula de adhesión E-selectina media en esta fase de la reacción. El bloqueo de esta fase mediante los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento sirve como un tratamiento para prevenir la obstrucción de las vías aéreas pulmonares. Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno se administran con una dosificación terapéutica de 1 pg/kg a 10 mg/kg de peso corporal mediante inyección intravenosa en forma de bolo, antes de, o durante, la exposición a un antígeno.

Muchos agentes patógenos o microorganismos causantes de enfermedades usan moléculas de adhesión de la superficie celular como un medio de fijación a células de mamífero. Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno y sus equivalentes biológicos del presente invento pueden ser eficaces a la hora de bloquear o inhibir la unión, mediada por moléculas de adhesión, de agentes patógenos a células de mamífero. Además, los anticuerpos, fragmentos ligantes de antígeno y sus equivalentes biológicos del presente invento pueden ser eficaces a la hora de bloquear o inhibir la unión, mediada por las E- y L-selectinas, de agentes patógenos a células de mamífero. Tales microorganismos causantes de enfermedades incluyen, pero no se limitan a, agentes patógenos víricos, parásitos, bacterianos y fúngicos, y similares.

Los anticuerpos monoclonales del presente invento son útiles como una herramienta de investigación para determinar la diversa actividad funcional de las selectinas.

Mediante un análisis adicional del epítopo EL-246 uno puede hacerse una idea de la diversa actividad funcional de las E- y L-selectinas y de la posible interacción "homotípica" de estas proteínas. La adhesión de neutrófilos a células endoteliales activadas con citoquinas puede ser bloqueada mediante mAbs anti-E-selectina y también anti-L-selectina [Bevilacqua et al., 1.987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9.239-9.241; Bevilacqua et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 243: 1.160-1.112; Hallman et al., 1.991, Biochem. Biophys. Res. Comm. 174: 236-243; Smith et al., 1.991, J. Clin. Invest. 87: 609-618; Spertini et al., 1.991, J. Immunol. 147: 2.565-2.573). Kishimoto et al., 1.990, Blood 78: 805-811, mostraron que los efectos bloqueantes de ciertos mAbs anti-E y L-selectinas sobre la adhesión de células endoteliales activadas por neutrófilos no son aditivos, lo que sugiere que estas dos proteínas participan en la misma ruta de adhesión, quizás como parejas de receptor-contrarreceptor. Esta hipótesis está respaldada por la observación de que la unión de neutrófilos a células L transfectadas con cDNA de E-selectina es bloqueada mediante el tratamiento del leucocito con mAb anti-L-selectina (Kishimoto et al., 1.990, Blood 788: 805-811). Picker et al. (1.991, Cell 66: 921-933) ampliaron estos hallazgos al demostrar que la L-selectina de neutrófilos está decorada con carbohidratos sLex y puede presentar preferentemente estas estructuras a la E-selectina. Por contraste, Spertini et al. (1.991, J. Immunol. 147: 2.565- -2.573) han demostrado también que la adhesión de células endoteliales activadas por neutrófilos implica a las E- y L-selectinas, aunque hallaron que mAbs hacia estas proteínas tienen efectos bloqueantes aditivos, lo que sugiere rutas de adhesión independientes. Puesto que EL-246 es un bloqueador eficaz de la función de las E y L-selectinas y reconoce una región molecular diferente (véase más adelante) a la de los mAbs bloqueantes usados en los estudios anteriores, puede ser útil para determinar la base de algunas de las discrepancias existentes en las diferentes comunicaciones.

Estudios de mapeo de dominios usando proteínas quiméricas de L-selectina/P-selectina permitieron localizar el epítopo EL-246 en el dominio de SCR de la L-selectina. Puede ser que el epítopo de la E-selectina reconocido por el mAb EL-246 también resida en los dominios de SCR de esta selectina. La situación del epítopo EL-246 en las SCRs es coherente con la incapacidad de EL-246 para bloquear la unión al carbohidrato PPME y con recientes comunicaciones que indican que los dominios de SCR de las L- y E-selectinas son esenciales para una función adhesiva óptima (Watson et al., 1.991, J. Cell. Biol. 115: 235-243; Pigott et al., 1.991, J. Immunol. 147: 130). Como se mencionó al comienzo de esta memoria, el dominio de lectina de las selectinas es necesario para su función, y muchos mAbs anti-selectina bloqueantes reconocen epítopos codificados por esta región (Bowen et al., 1.990, J. Cell. Biol. 110: 147-153; Kansas et al., 1.991, Cell. Biol. 114: 351-358; Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248). Se ha mostrado que un mAb para epítopos localizados en el dominio EGF inhibe la adhesión mediada por L-selectina (Polley et al., 1.991, Natl. Acad. Sci. USA 88: 6.224-6.228; Bowen et al., 1.990, J. Cell. Biol. 110: 147-153; Kansas et al., 1.991, Cell. Biol. 114: 351-358; Siegelman et al., 1.990, Cell 61: 611). Los datos aquí presentados amplian esas observaciones y demuestran que mAbs hacia epítopos apropiados de cada dominio extracelular de las selectinas pueden inhibir la función adhesiva.

Sin estar vinculado por la teoría, es posible que los mAbs inhiban la adhesión como resultado de una interferencia directa en la unión del ligando o que la unión del mAb, especialmente de aquellos mAbs que definen epítopos fuera del dominio de lectina, pueda perturbar la conformación de la proteína para deteriorar indirectamente la integridad funcional del dominio de lectina. Si EL-246 bloqueara la adhesión al alterar la conformación funcional de las selectinas, esto sugeriría que el papel de las SCRs en la adhesión es similar para las E- y L-selectinas. Esto contrasta con las opiniones de Watson et al. (1.991, J. Cell. Biol. 115: 234-243), quienes predijeron que el papel de las SCRs es único para cada selectina. Puesto que EL-246 sólo reconoce E- y L-selectinas, esta última predicción puede ser verdad para la P-selectina. De este modo, además de haber mayores números de dominios de SCR (9 frente a 6 y 2 en las E- y L-selectinas, respectivamente), pueden existir diferencias moleculares en las SCRs de la P-selectina que contribuyan a las funciones únicas de esta molécula, tal como la adhesión de plaquetas activadas por trombina.

Una caracterización molecular y funcional adicional del epítopo reconocido por EL-246 conducirá a nuevas ideas acerca de la función de las selectinas y de la conservación evolutiva de esta familia de proteínas de adhesión. Pueden crearse dianas para tratamientos con objeto de regular o bloquear el epítopo que es reconocido por EL-246, regulándose de este modo la actividad de las selectinas in vivo. Es importante que los nuevos agentes terapéuticos que inhiben este sitio tienen la ventaja añadida de bloquear la actividad de adhesión de leucocitos-células endoteliales al inhibir simultáneamente tanto las proteínas de adhesión de leucocitos como las de células endoteliales.

Los anticuerpos monoclonales así producidos tienen diversos usos diagnósticos y terapéuticos. Pueden ser usados en agentes diagnósticos in vitro para examinar la presencia de moléculas de adhesión, preferiblemente selectinas, presentes en forma insoluble o asociadas con células en mamíferos, al someter muestras biológicas o tejidos, u otras sustancias de origen humano, a protocolos de inmunoensayos estándares. Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno son también útiles en el análisis de material de biopsias tisulares, tal como vénulas de endotelio alto, tejido pulmonar o cualquier sitio de inflamación, para detectar la presencia de las células que llevan los epítopos reactivos. Dichos ensayos pueden tener la forma de radioinmunoensayo, EIA, técnica fluorescente o quimioluminiscente, o similar. En uno de tales ensayos, se pone la muestra biológica en contacto con anticuerpos del presente invento y se usa un segundo anticuerpo marcado para detectar la presencia de la selectina a la que se unen los anticuerpos. Además, muchos métodos histoquímicos pueden ser empleados y son bien conocidos en la técnica.

En un ensayo particular se utiliza el anticuerpo monoclonal EL-246 en técnicas estándares conocidas en este campo técnico, para llevar a cabo un inmunoensayo con enzimas ligadas como se describe en Methods in Immunodiagnosis, 2ª edición, compilado por Rose y Bigazzi, John Wiley and Sons, 1.980, y en Campbell et al., Methods of Immunology, W.A. Benjamin, Inc., 1.964. Dicho ensayo puede ser, por ejemplo, de forma directa (en que el primer anticuerpo marcado es reactivo con el antígeno), forma indirecta (en que un segundo anticuerpo marcado es reactivo con el primer anticuerpo), forma competitiva (tal como la adición de un antígeno marcado) o forma de sándwich (en que se utilizan tanto un anticuerpo marcado como uno no marcado), así como de otras formas descritas en la técnica.

En una realización, la muestra biológica de un mamífero es aplicada a una matriz o sustrato sólido insoluble con objeto de que la selectina de las células que llevan selectina se una a esta matriz. Esta matriz es lavada utilizando un tampón fisiológico, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS), para eliminar los materiales no unidos. La matriz sólida con antígeno unido es expuesta a una disolución que contiene un anticuerpo del presente invento, tal como el anticuerpo monoclonal EL-246. Se deja que el anticuerpo reaccione con los antígenos de la matriz sólida y se lava de nuevo la matriz para eliminar todo anticuerpo no unido. Luego se expone este complejo a una disolución que contiene un segundo anticuerpo marcado, tal como anti-IgG de ratón generado en cabra, que es reactivo con el primer anticuerpo. Este anticuerpo está preferiblemente marcado con un componente de una reacción enzimática, tal como peroxidasa; un radioisótopo, tal como ^{125}I; o un sustrato quimioluminiscente o fluorescente. El complejo es lavado de nuevo para eliminar todo anticuerpo no unido. La reacción es verificada por un medio apropiado para el marcador elegido, tal como un contador de centelleo o un espectrofotómetro. Las muestras biológicas apropiadas para dicho ensayo de detección incluyen, pero no se limitan a, extractos de biopsias tisulares, sangre completa, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido pleural, orina y similares.

En otra realización, los anticuerpos del presente invento son aplicados a una matriz o sustrato sólido insoluble con objeto de que los anticuerpos se unan a la matriz. Una muestra biológica de la que se sospecha que contiene células que llevan L- y/o E-selectina, o lisados de dichas células, es añadida a la matriz y es dejada reaccionar con los anticuerpos de la matriz para que se forme un complejo de selectina-anticuerpo. El complejo es detectado usando un segundo anticuerpo marcado. El segundo anticuerpo marcado es EL-246 o un anticuerpo biológicamente equivalente. Este método permite detectar tanto L- como E-selectinas, y células que llevan L- y E-selectinas si están presentes en la muestra biológica. El ensayo es tanto cualitativo como cuantitativo. El ensayo puede ser modificado para diferenciar entre L-selectina y E-selectina usando anticuerpos monoclonales específicos para la selectina individual de interés. Dichos anticuerpos monoclonales son mAbs DREG, como describen Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Sci. 87: 2.244-2.248.

Los métodos para detectar y cuantificar células que llevan L- y/o E-selectina en muestras biológicas son particularmente útiles para diagnosticar estados morbosos tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, cáncer, asma, lesión por isquemia-reperfusión, y similares. Los métodos son también útiles para verificar el progreso de estos estados morbosos. Además, el método es útil para verificar la eficacia de agentes terapéuticos tales como agentes antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos, agentes antiadhesivos y similares, durante el curso del tratamiento.

Para todos los usos terapéuticos, profilácticos y diagnósticos citados, los anticuerpos monoclonales y otros reactivos necesarios y dispositivos y accesorios apropiados pueden disponerse en forma de sistema para que sean prontamente asequibles y facilmente usados.

Los anticuerpos del presente invento pueden ser formulados en preparaciones farmacéuticas que tengan usos terapéuticos, diagnósticos u otros en mamíferos. Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento son especialmente útiles en la prevención y/o el tratamiento de mamíferos con enfermedad coronaria o de aquellos pertenecientes a categorías con alto riesgo de ataques cardiacos o accidentes cerebrovasculares, tales como aquellos con presión sanguínea elevada, diabetes o nivel elevado de colesterol y los fumadores.

Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento son también útiles para la prevención o el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión que tiene lugar durante o después de una cirugía, especialmente después de una cirugía de derivación coronaria.

Los anticuerpos, fragmentos ligantes de antígeno y sus equivalentes funcionales son especialmente útiles en la prevención o inhibición de una lesión pulmonar por isquemia/reperfusión. Se ha mostrado que los anticuerpos del presente invento son un agente terapéutico eficaz para prevenir o inhibir la pérdida de función pulmonar y prevenir la mortalidad en mamíferos tratados con un anticuerpo que es capaz de unirse a E-selectina y L-selectina.

A los mamíferos que necesitan tratamiento para una lesión pulmonar por isquemia/reperfusión, como en el caso de un trasplante de pulmón, se les administra una cantidad de anticuerpo o su equivalente funcional que es eficaz para prevenir o inhibir la pérdida de función pulmonar y prevenir la mortalidad. Dicho tratamiento de mamíferos previene, inhibe o atenúa una respuesta inflamatoria en el sitio afectado.

Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento son también útiles para la prevención o el tratamiento de la rinitis alérgica, el asma y la anafilaxis. Los presentes anticuerpos son también útiles en la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diabetes juvenil, síndrome de Sjögren, enfermedades del tejido conjuntivo, y similares.

Los anticuerpos del presente invento, fragmentos ligantes de antígeno y sus equivalentes funcionales son eficaces para prevenir o inhibir las interacciones célula-célula mediadas por E-selectina y/o L-selectina. Los anticuerpos inhiben las interacciones de L-selectina de neutrófilos con células que expresan E-selectina, incluyendo capas de células endoteliales activadas, transfectantes por cDNA de E-selectina, y similares. Los anticuerpos del presente invento previenen o inhiben la rodadura de neutrófilos, mediada por E-selectina, sobre capas de células endoteliales, capas de células que están presentes en arterias, venas, capilares, vasos linfoides y similares. Dichos efectos inhibitorios producidos por los anticuerpos y sus equivalentes funcionales son útiles para prevenir, inhibir o modular una respuesta inflamatoria.

Los anticuerpos del presente invento y sus equivalentes funcionales son capaces de prevenir o inhibir la unión de células que expresan E-selectina a células de vénulas de endotelio alto (HEV) presentes en ganglios linfáticos periféricos.

Usando un modelo xenogénico de dirección in vivo, se halló que linfocitos de seres humanos, cabras, ovejas y vacas se dirigen de un modo tisularmente específico a tejidos linfoides de ratones después de una inyección intravenosa. Estos resultados no son sorprendentes ya que observaciones previas mostraron que los mecanismos de dirección están muy conservados entre los mamíferos (O. Spertini et al., 1.991, J. Immunol. 147: 942; N. W. Wu et al., 1.988, J. Cell Biol. 107: 1.845; B. Walcheck et al., 1.992, Eur. J. Immunol. 22: 469).

Un aspecto del presente invento proporciona anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno de los mismos para uso en un método para prevenir o inhibir la dirección de linfocitos a tejido linfoide en un mamífero. El anticuerpo del presente invento inhibe la capacidad de linfocitos para dirigirse a tejido linfoide.

Los leucocitos pueden distribuir EL-246 en sitios que expresan específicamente E-selectina. En ensayos en que neutrófilos eran prerrevestidos con EL-246, lavados y añadidos a transfectantes por cDNA de E-selectina o a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs; del inglés, human umbilical vein endothelial cells) activadas con citoquinas, el mAb se transfería del leucocito a la E-selectina. La cantidad de EL-246 en los transfectantes de E-selectina, según se midió por tinción con FITC-segunda fase anti-ratón seguida de citometría de flujo después de transferencia desde el leucocito, era mayor que la cantidad después de teñir directamente los transfectantes con niveles saturantes de EL-246. El desprendimiento de EL-246 unido a L-selectina de la superficie no explicaba estos resultados ya que los neutrófilos que perdían EL-246 aún resultaban intensamente teñidos con el mAb anti-L-selectina DREG 56. Es poco probable que DREG 56 reaccionase con nueva L-selectina que se trasladó a la superficie celular durante el curso del ensayo ya que 1) el tiempo de ensayo era relativamente corto (15 minutos) y 2) no se han detectado reservas intracelulares significativas de L-selectina preformada en ningún análisis previo de neutrófilos (M. A. Jutila et al., 1.989, J. Immunol. 143: 3.318; T. K. Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244; M. A. Jutila et al., 1.990, Cell Immunol. 132: 201; T. K. Kishimoto et al., 1.989, Science 245: 1.238). Una vez que los neutrófilos han perdido la L-selectina in vitro, mueren normalmente antes de que se vea nueva expresión. Si se transfiere EL-246 de la L-selectina a la E-selectina cuando estas moléculas entran en estrecha asociación, los leucocitos pueden ser entonces un sistema de distribución eficaz para el mAb in vivo.

Los anticuerpos y fragmentos ligantes de antígeno del presente invento son útiles en la prevención y el tratamiento de infecciones y enfermedades causadas por microorganismos patógenos o potencialmente patógenos. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, fragmentos ligantes de antígeno de los anticuerpos o sus equivalentes biológicos son administradas a células huésped de mamífero que llevan moléculas de adhesión, preferiblemente selectinas, muy preferiblemente L- o E-selectina.

Al proporcionarse los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento a un mamífero receptor, preferiblemente un ser humano, la dosificación de los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno administrados dependerá mucho de factores tales como la edad, el peso, la estatura, el sexo, el estado médico general, la historia médica previa, etc. del mamífero. En general, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (peso corporal del mamífero), aunque puede administrarse una dosificación menor o mayor. La dosis terapéuticamente eficaz puede ser reducida usando combinaciones de los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno anteriormente descritos. Como se usa aquí, se dice que un compuesto es adicionalmente administrado con un segundo compuesto cuando la administración de los dos compuestos es tan temporalmente próxima que ambos compuestos pueden ser detectados al mismo tiempo en el suero del paciente.

Los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento están destinados a ser proporcionados a sujetos receptores en una cantidad suficiente para reducir o atenuar la gravedad, el alcance o la duración de los síntomas inflamatorios.

Los anticuerpos agentes del invento, o sus fragmentos, pueden ser administrados solos o en combinación con uno o más agentes antiinflamatorios o antiasmáticos adicionales (tales como catecolaminas, resorcinoles, saligeninas y efedrina), glucocorticoides (tal como hidrocortisona), cromosomas (tal como cromolina sódica) y anticolinérgicos (tal como atropina), con objeto de disminuir la cantidad de dichos agentes necesaria para tratar los síntomas inflamatorios o asmáticos.

La administración de los agentes del invento puede ser con un fin "profiláctico" o "terapéutico". Cuando se proporcionan profilácticamente, los agentes se proporcionan de antemano a cualquier síntoma. La administración profiláctica de los agentes sirve para prevenir o atenuar cualquier respuesta inflamatoria subsiguiente. Cuando se proporcionan terapéuticamente, los agentes se proporcionan a (o poco después de) el inicio de un síntoma de inflamación. La administración terapéutica de los agentes sirve para atenuar cualquier episodio inflamatorio concreto. De este modo, los agentes del presente invento pueden ser proporcionados antes del inicio de un episodio inflamatorio previsto (con objeto de atenuar la gravedad, la duración o el alcance previstos del episodio) o después de la iniciación del episodio.

Los anticuerpos pueden ser administrados por cualquier vía apropiada para el estado que se trata, incluyendo las vías intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, oral, nasal y similar. Preferiblemente, el anticuerpo es inyectado en la corriente sanguínea del mamífero que se trata. Los expertos en la técnica apreciarán en seguida que la vía preferida variará con el estado que se trata.

Aunque es posible administrar el anticuerpo en forma pura o sustancialmente pura, es preferible presentarlo como una formulación o preparación farmacéutica.

Las formulaciones del presente invento, tanto para uso veterinario como humano, comprenden un anticuerpo como el anteriormente descrito, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El(los) vehículo(s) debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible(s) con los demás ingredientes de la formulación y no deletéreo(s) para el receptor de la misma. Las formulaciones pueden ser convenientemente presentadas en forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas mediante cualquier método bien conocido en la técnica farmacéutica.

Todos los métodos incluyen la operación de poner el ingrediente activo en asociación con el vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan al poner uniforme e íntimamente el ingrediente activo en asociación con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o con ambos, y luego, si es necesario, conformar el producto a la formulación deseada.

Las formulaciones adecuadas para administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal comprenden convenientemente disoluciones acuosas estériles del ingrediente activo, disoluciones que son preferiblemente isotónicas con respecto a la sangre del receptor. Tales formulaciones pueden ser convenientemente preparadas al disolver el ingrediente activo sólido en agua que contiene sustancias fisiológicamente compatibles, tales como cloruro sódico (por ejemplo, 0,1-2,0 M), glicocola y similares, y que tiene un pH tamponado compatible con condiciones fisiológicas para producir una disolución acuosa, y esterilizar dicha disolución. Estas formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o dosis múltiples, tales como, por ejemplo, ampollas o viales sellados.

Las formulaciones del presente invento pueden llevar incorporado un estabilizador. Son estabilizadores ilustrativos: polietilenglicol, proteínas, sacáridos, aminoácidos, ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos, que pueden usarse solos o como mezclas. Estos estabilizadores son preferiblemente incorporados en una cantidad de 0,11-10.000 partes en peso por parte en peso de anticuerpo. Si se van a usar dos o más estabilizadores, su cantidad total está preferiblemente dentro del intervalo anteriormente especificado. Estos estabilizadores se usan en disoluciones acuosas con una concentración y un pH apropiados. La presión osmótica específica de dichas disoluciones acuosas está generalmente en el intervalo de 0,1-3,0 osmoles, preferiblemente en el intervalo de 0,8-1,2. El pH de la disolución acuosa es ajustado para que esté dentro del intervalo de 5,0-9,0, preferiblemente dentro del intervalo de 6-8. Al formularse el agente terapéutico del presente invento, puede usarse un agente antiadsorción.

Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción. Pueden conseguirse preparaciones de liberación controlada mediante el uso de un polímero para complejar o absorber los anticuerpos del presente invento o los fragmentos ligantes de antígeno, o sus derivados funcionales. La distribución controlada puede ser ejercida al seleccionar las macromoléculas apropiadas (por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o sulfato de protamina) y la concentración de las macromoléculas, así como los métodos de incorporación, con objeto de controlar la liberación. Otro posible método para controlar la duración de la acción mediante preparaciones de liberación controlada es incorporar los anticuerpos o los fragmentos ligantes de antígeno, o sus derivados funcionales, a partículas de un material polímero, tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico) o copolímeros de acetato de etilenvinilo. Alternativamente, en lugar de incorporar esos agentes a partículas polímeras, es posible encerrar estos materiales en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, tales como, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en sistemas coloidales para distribución de fármacos, tales como, por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas, o en macroemulsiones. Dichas técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences (1.980).

Cuando se desean preparaciones orales, las composiciones pueden ser combinadas con vehículos típicos, tales como lactosa, sacarosa, almidón, talco, estearato magnésico, celulosa cristalina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, glicerol, alginato sódico y goma arábiga, entre otros.

Ejemplo 1 Producción de hibridomas, y métodos para caracterizar los anticuerpos Inmunización y generación de anticuerpos monoclonales

Como inmunógeno para la generación de anticuerpos del presente invento, se usaron células de linfoma L1-2 de ratón que expresan establemente cDNA de E-selectina humana (L1-2ELAM) (Picker et al., 1.991, Cell 66: 921-933). En resumen, se inyectaron i.p. células L1-2ELAM (2x10^{7}) a ratones C57BL/6 a intervalos bisemanales (un total de 3 inyecciones) en ausencia de adyuvante. El último refuerzo se realizó 4 días antes de la fusión. Se usó la línea de células de mieloma SP2/0 como pareja de fusión y, en la generación de hibridomas, se siguieron procedimientos previamente descritos (Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-48). La línea de células de mieloma SP2/0-Ag14 es asequible de la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, EE.UU., bajo el nº de registro CRL 1581. La fusión fue explorada el día 10 por citometría de flujo usando células L1-2 transfectadas con E-selectina y simuladamente transfectadas. Se exploró un total de 279 pocillos y se seleccionaron 15 para un análisis adicional. Las exploraciones secundarias incluían análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE; del inglés, polyacrylamide gel electrophoresis)-SDS/transferencia Western, inmunohistología y tinción de leucocitos de sangre periférica. Como se describe más adelante, se halló que EL-246, que es una IgG1 de ratón, teñía tanto transfectantes de E-selectina como leucocitos humanos.

Animales

Los animales usados como fuente de sangre (véase más adelante) fueron aleatoriamente seleccionados de las instalaciones para animales grandes de la Montana State University. Se usaron las razas de ratón Balb/C y C57BL/6. Los ratones tenían edades que variaban de 6 a 12 semanas y fueron usados esencialmente para la generación de anticuerpos monoclonales o como fuente de tejidos linfoides. Los ratones fueron alojados en la instalación para animales pequeños de la Montana State University, que está aprobada por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). En algunos experimentos se usaron terneros de un mes de edad, alojados en la instalación para animales grandes de la MSU, como fuentes de sangre periférica.

Anticuerpos monoclonales utilizados

En los análisis por citometría de flujo y transferencia Western descritos más adelante se usaron Leu-8 (adquirido a Becton Dickinson & Co., Mountainview, California, EE.UU.) y la serie DREG de mAb (DREG 56, DREG 200 y DREG 152), que son IgGs de ratón de las que se ha mostrado que reconocen L-selectina humana [Camerini et al., 1.989, Nature (London) 342: 78-80; Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248]. Leu-8 se usó como un producto de conjugación con ficoeritrina (PE; del inglés, phycoerythrin), y los mAbs DREG se usaron como mAbs no conjugados seguidos de una apropiada segunda fase, o como productos de conjugación con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los mAbs DREG fueron parcialmente purificados mediante precipitación con sulfato amónico. En muchos de los experimentos descritos más adelante se usaron otros mAbs, DREG 55 (IgG1 de ratón anti-L-selectina), SH43 (IgG1 de ratón anti-plaqueta de oveja; M. A. Jutila, no publicado) y EL-81 (IgG1 de ratón anti-ELAM-1), como testigos negativos.

El análisis citométrico de flujo fue llevado a cabo en un aparato FACScan® (Becton and Dickinson, Mountainview, California, EE.UU.) del modo descrito [Jutila et al., 1.989, Immunol. 143: 3.318-3.324; Kishimoto et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 245: 1.238-1.241; Jutila et al., 1.990, Cell. Immunol. 132: 201-214].

El análisis citométrico de flujo se llevó a cabo para verificar la especificidad del anticuerpo monoclonal EL-246 para E-selectina y L-selectina, como muestra la fluorescencia de las células que expresan E- o L-selectina y la fluorescencia negativa de las células que no expresan E- ni L-selectina después del tratamiento con EL-246. Para análisis con dos colores, se usó Leu-8 conjugado con PE (Becton Dickinson) o un mAb DREG conjugado con FITC, en combinación con EL-246. Las células teñidas con la segunda fase fueron tratadas con suero de ratón al 10% para bloquear todo sitio ligante de anti-Ig de ratón, y se usaron mAbs de ratón testigos negativos para evaluar el nivel de la tinción de fondo. Se recogieron datos de 10.000-50.000 células y se presentan como histogramas o gráficos de curvas de nivel.

Análisis por SDS-PAGE y transferencia Western

Se llevó a cabo un análisis por transferencia Western para verificar la especificidad del anticuerpo monoclonal EL-246 para E-selectina y L-selectina, usando lisados de células que expresan E-selectina o L-selectina, o E-selectina o L-selectina purificadas por inmunoafinidad. Una tinción positiva, por el anticuerpo EL-246, de bandas proteicas correspondientes al peso molecular apropiado para E-selectina y L-selectina era indicativa de una especificidad para ambas selectinas.

Se prepararon lisados de suspensiones de linfocitos de sangre periférica humana o de células L1-2ELAM al incubar 3x10^{7} células en 1,0 ml de tampón de lisis de NP-040 [NP-40 al 3%, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, EDTA 5 mM, NaN_{3} al 0,02% y 10 \mug/ml de los siguientes inhibidores de proteasas: pepstatina A, antipaína, leupeptina, quimostatina, benzamidina, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF); todo en Tris-HCl 50 mM, pH de 7,5] durante 30 minutos sobre hielo. Los lisados fueron clarificados por centrifugación a 10.000g durante 10 minutos y fueron usados para purificación por afinidad o directamente en el análisis por SDS/PAGE-transferencia Western.

Para el aislamiento por afinidad, glóbulos de Sepharose 4B (Pharmacia) activados con CNBr fueron copulados con el mAb apropiado (4 mg de mAb/ml de glóbulos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia Fine Chemicals) usando columnas para cromatografía polipreparatoria (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, EE.UU.). Un ml de lisado que contenía el antígeno de interés fue mezclado con 3 ml de tampón de lavado (NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, NP40 al 0,1%, NaN_{3} 5 mM, tampón de Tris 20 mM, pH de 7,5), y la mezcla fue combinada con los glóbulos anteriormente descritos en un agitador durante 2 horas a 4ºC. Después de la incubación, los glóbulos fueron lavados con 10 ml de tampón de lavado para eliminar todo antígeno no unido. El antígeno unido fue eluido con 3 ml de tampón de elución (NaCl 500 mM, NP40 al 0,1%, NaN_{3} 5 mM, ácido acético 200 mM), y los productos eluidos fueron recogidos en fracciones de 0,5 ml y fueron neutralizados con 100 \mul de tampón de Tris 1 M, pH de 8,0. Las fracciones que contenían proteínas de interés fueron determinadas mediante análisis por transferencia en forma de manchas.

Para el análisis por SDS/PAGE-transferencia Western, lisados crudos o antígeno purificado por afinidad fueron mezclados con volúmenes iguales de tampón de solubilización-SDS no reductor 2x, desarrollados en un gel de SDS-PAGE al 8%, y transferidos a nitrocelulosa con un aparato BioRad Transblot según las instrucciones del fabricante (BioRad Laboratories). Se usaron condiciones no desnaturalizantes suaves (sin ebullición y la mayoría de los procedimientos realizados a 4ºC). Se incubaron filtros con suero de caballo al 50% en Tween salino tamponado con Tris (TBST; del inglés, Tris buffered salt Tween; Tris-HCl 10 mM, pH de 7,4, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,05%) durante 30 minutos. Utilizando un aparato de 25 carriles para minitransferencias (Immunonetics, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.), los filtros fueron luego incubados durante 30 minutos con mAb específico o testigo negativo de ratón en concentraciones de 50 \mug/ml o como fluido sobrenadante de cultivo. Los filtros de nitrocelulosa fueron después lavados en TBST, incubados con el producto de conjugación de fosfatasa alcalina-anti-Ig de ratón generado en cabra (Sigma Chemical Co., A-9654), diluido a 1:200, y luego lavados de nuevo. Las transferencias fueron desarrolladas por adición de disolución de sustrato (Promega Biotech, Madison, Wisconsin, EE.UU.).

Suspensiones celulares de leucocitos

Se recolectaron leucocitos de la sangre periférica de seres humanos, cabras, ovejas, vacas, caballos, cerdos, ratas y gallinas. Para la tinción rutinaria para inmunofluorescencia, los glóbulos rojos (RBCs; del inglés, red blood cells), salvo los RBCs de gallina, fueron lisados en una disolución hipotónica. Se usó sangre humana como fuente de leucocitos para los ensayos funcionales descritos más adelante. Para aislar tanto células monocucleares como neutrófilos, se usaron métodos previamente descritos (Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248; Jutila et al., 1.989, Immunol. 143: 3.318-3.324; Kishimoto et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 245: 1.238-1.241; Jutila et al., 1.990, Cell. Immunol. 132: 201-214). En resumen, la sangre fue recogida en tubos con anticoagulante de citrato, diluida 1:2 con disolución salina equilibrada de Hank (HBSS; del inglés, Hanks balanced salt solution) caliente, dispuesta bajo Histopaque 1077 y centrifugada a 2.300 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiental. Las células mononucleares fueron recogidas de la interfase de Histoplaque/plasma. El sedimento de centrifugación, que incluye RBCs y neutrófilos, fue resuspendido en HBSS hasta su volumen original, y los neutrófilos fueron aislados por sedimentación en dextrano. Los RBCs residuales tanto de las preparaciones de células mononucleares como de las preparaciones de neutrófilos fueron lisados por tratamiento hipotónico.

Tinción para inmunofluorescencia

La tinción de leucocitos para inmunofluorescencia fue llevada a cabo de la forma descrita (Jutila et al., 1.989, Immunol. 143: 3.318-3.324; Kishimoto et al., 1.989, Science (Wash. D.C.) 245: 1.238-1.241; Jutila et al., 1.990, Cell. Immunol. 132: 201-214; Stamper et al., 1.976, J. Exp. Med. 144: 828). En resumen, se incubaron inicialmente 1x10^{6} células en suero de conejo al 2% durante 10 minutos, sobre hielo, para bloquear los receptores de Fc. Las células fueron lavadas y fueron luego incubadas con anticuerpo primario en una concentración de 50 \mug/ml (o sobrenadante de cultivo sin diluir) durante 20 minutos sobre hielo. Después de un lavado, los anticuerpos unidos fueron revelados por incubación con F(ab)'2 de cabra anti-Ig de ratón, conjugado con PE o FITC (Tago Inc., Burlingame, California, EE.UU.), en una dilución 1:80 en suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal bovine serum) al 5% en medio DMEM.

Tinción por inmunoperoxidasa

Secciones congeladas de amígdalas, de 6 \mum y fijadas con acetona, fueron incubadas con anticuerpos en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (50 \mug/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiental en una cámara humidificada, y fueron luego lavadas en PBS. Usando un conjunto histoquímico TAGO (Histoprobe, TAGO, Burlingame, California, EE.UU.), se realizó una tinción de 3 fases por inmunoperoxidasa utilizando un sistema de avidina-biotina según las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron ligeramente teñidas de contraste con hematoxilina.

Tratamiento in vitro de leucocitos de sangre periférica con PMA

Células mononucleares aisladas de sangre periférica procedentes de los animales anteriormente enumerados fueron incubadas con miristato-acetato de forbol (PMA; del inglés, phorbol myristate acetate) (10 ng/ml; Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) durante 20 minutos a 37ºC en HBSS. Después del periodo de incubación, las células fueron lavadas y fueron luego teñidas para análisis citométrico de flujo.

Ejemplo 2 Reconocimiento de E-selectina humana por EL-246

Se exploró inicialmente EL-246 en células L1-2 de ratón transfectadas con cDNA de E-selectina humana, por citometría de flujo y SDS-PAGE/transferencia Western. Como se muestra en la Figura 1, las células L1-2 transfectadas con E-selectina, pero no las simuladamente transfectadas, resultaban intensamente teñidas con EL-246 en el análisis citométrico de flujo, lo que indicaba una especificidad del anticuerpo por la E-selectina. Las flechas señalan histogramas que representan (1) la tinción de L1-2ELAM con EL-246, (2) testigos negativos de transfectantes L1-2 y (3) la tinción de fondo (testigo de segunda fase) de los transfectantes L1-2ELAM. El peso molecular del antígeno expresado por los transfectantes reconocidos por EL-246 era aproximadamente 110 kDa bajo SDS-PAGE no reductora/transferencia Western (Figura 2), que es el peso molecular apropiado para la E-selectina. El lisado de L1-2ELAM en NP40 fue desarrollado en una SDS/PAGE al 8% no reductora y fue transferido a nitrocelulosa. Las transferencias fueron sondadas con EL-81 (anti-E-selectina, carril 3), EL-246 (carril 2) y anticuerpo testigo negativo (carril 1). Las distancias de migración de los marcadores de peso molecular fueron como se indican. EL-246 también reconocía células L transfectadas con cDNA de E-selectina pero no reconocía células transfectadas con cDNA de P-selectina, como mostraban la citometría de flujo y las transferencias Western. Como un medio adicional para mostrar la reactividad de EL-246 con E- selectina, se tiñeron secciones de tejido amigdalino inflamado para análisis inmunohistológico. Como se muestra en la Figura 3, EL-246 teñía vénulas (E- selectina) de amígdala humana inflamada. Se prepararon secciones congeladas de amígdala humana del modo descrito en el Ejemplo 1 y se tiñeron por inmunoperoxidasa con EL-246 (aumento de 400x). Por lo tanto, usando criterios bioquímicos y moleculares aceptados, EL-246 reconocía claramente E-selectina humana.

Ejemplo 3 Reconocimiento de L-selectina humana por EL-246

Un análisis citométrico de flujo mostró que EL-246 también teñía leucocitos de sangre periférica humana. El antígeno superficial de los leucocitos es infrarregulado después del tratamiento con PMA (Figura 4). Se aislaron leucocitos de sangre periférica humana del modo descrito en el Ejemplo 1 y se tiñeron con EL-246 para análisis citométrico de flujo. En los histogramas representativos se muestra la expresión del antígeno EL-246 en neutrófilos y linfocitos, que fueron identificados por sus distintivos perfiles de dispersión de luces frontal y lateral. Se muestra una comparación de las tinciones antes (no tratados; Figura 4A) y 20 minutos después de la activación con PMA (tratados con PMA; Figura 4B). La fluorescencia de fondo con un testigo de isotipo o una segunda fase solos proporcionó en cada análisis un valor de fluorescencia de modo de < 10. Todos los neutrófilos humanos circulantes expresaban el antígeno EL-246, mientras que números variables de linfocitos eran positivos, lo cual es el mismo patrón de distribución descrito para la L-selectina (Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248; Kansas et al., 1.985, J. Immunol. 134: 2.995). En citometría de flujo de dos colores, se mostró que todas las células positivas para EL-246 eran positivas para DREG-56 (mAb anti-L-selectina; Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248), y los patrones de tinción de los dos anticuerpos fueron similares (Figura 5). La tinción citométrica de flujo de dos colores fue realizada usando DREG-56 [mAb anti-L-selectina (29)] y EL-246 marcados con FITC, como se describió en el Ejemplo 1. Se muestra un gráfico de curvas de nivel que demuestra que todas las células EL-246 son también positivas para L-selectina. El antígeno EL-246 de leucocitos humanos desapareció de la superficie celular tras la activación de los neutrófilos y linfocitos con PMA (Figuras 4B y 4D, respectivamente), lo que también es característico de la L-selectina. Las células transfectadas con cDNA de L-selectina humana, pero no los testigos transfectantes, resultaron específicamente teñidas con EL-246 (véase más adelante). Finalmente, la reactividad de EL-246 fue también confirmada a nivel de proteína ya que la L-selectina purificada por inmunoafinidad era reconocida por el mAb EL-246 en transferencias Western. (Figura 6, carril 2). Por lo tanto, mediante criterios bioquímicos y moleculares aceptados, EL-246 también reaccionaba con L-selectina.

Ejemplo 4 El epítopo EL-246 se expresa en selectinas de una diversidad de animales diferentes

Para evaluar el nivel de conservación evolutiva del epítopo EL-246, células de sangre periférica de una diversidad de animales diferentes fueron exploradas por citometría de flujo en cuanto a tinción por EL-246. Como se muestra en la Tabla 1, EL-246 teñía leucocitos aislados de seres humanos, cabras, ovejas, vacas y cerdos. Los leucocitos de gallinas y ratas eran negativos para EL-246 por análisis citométrico de flujo, lo que también fue confirmado por la falta de tinción de preparaciones de citocentrífuga. El antígeno reconocido por EL-246 en estos otros animales tenía la distribución característica de la L-selectina, con linfocitos que presentaban una distribución bimodal, y su expresión superficial perdida después de que las células fueran tratadas con PMA.

TABLA 1 EL-246 reconoce L-selectina en una diversidad de animales diferentes

	Reactividad con L-selectina de LSP*
Animales	mAb EL-246	mAb DREG 56
Ser humano	+++	+
Oveja	+++	-
Cabra	++	-
Vaca	+++	+
Cerdo	++	-
Caballo	-	-
Rata	-	-
Gallina	-	-
*LSP = linfocitos de sangre periférica

Ejemplo 5 EL-246 bloquea la función tanto de L-selectina como de E-selectina

Se ensayó la capacidad de EL-246 para bloquear la función de las E- y L-selectinas. La función universalmente atribuida a la L-selectina es la adhesión de linfocitos a células de vénulas de endotelio alto (HEV) de ganglios linfáticos periféricos (Rosen, 1.990, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 3: 397-402; Berg et al., 1.989, Immunol. Rev. 108: 5-18). El ensayo de Stamper-Woodruff es un ensayo ex vivo que es aceptado por los expertos en la técnica como una reproducción de las interacciones adhesivas entre linfocitos y el endotelio de órganos linfoides in vivo (L. A. Laskey, 1.992, cápitulo 3 de Adhesion. Its Role In Inflammatory Diseases, J. M. Harlam y D. Y. Liu (redactores), W. H. Freeman and Company, New York, EE.UU., páginas 43-63). En este ensayo, secciones congeladas de diversos órganos linfoides son incubadas con linfocitos y son lavadas, y se determina el grado de unión específica entre los linfocitos añadidos y el especializado endotelio de pared alta de las vénulas poscapilares de estos órganos.

Usando el ensayo de unión ex vivo a secciones congeladas de Stamper y Woodruff (Stamper et al., 1.976, J. Exp. Med. 144: 828), se halló que EL-246 bloqueaba la adhesión de linfocitos a vénulas de endotelio alto de ganglios linfáticos periféricos igual o quizás mejor que nuestro mAb bloqueante anti-L-selectina previo, DREG 56 (95,6 \pm 4,8% frente a 88 \pm 5,1% de bloqueo, respectivamente; Figura 7). Se trataron linfocitos humanos con EL-246, DREG56 o un testigo negativo isotípicamente equivalente (EL-81) durante 20 minutos sobre hielo y se determinó el efecto sobre la unión a HEV de ganglios linfáticos periféricos. El mAb testigo, incluyendo alguno generado en la misma fusión que produjo EL-246, no produjo efecto alguno sobre la unión de linfocitos-HEV (Figura 7). EL-246 no bloqueaba significativamente la unión de FITC-PPME a linfocitos humanos, otra función mediada por L-selectina (Rosen, 1.990, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 3: 397-402). Estos resultados son similares a la actividad bloqueante del mAb dirigido hacia el dominio EGF de la L-selectina (Kansas et al., 1.991, J. Cell. Biol. 114: 351-358; Siegelman et al., 1.989, Cell 61: 611-622).

Para examinar el efecto de EL-246 sobre la función de la E-selectina, se ensayó la capacidad de los neutrófilos para unirse a células L que expresan establemente E-selectina. En este ensayo de unión, la adhesión de neutrófilos a los transfectantes es claramente dependiente de E-selectina (Kishimoto et al., 1.990, Blood 78: 805-811). Los transfectantes fueron tratados con EL-246 durante 30 minutos y fueron lavados antes de la adición de neutrófilos humanos purificados. Se saturaron los receptores de Fc al pretratar los neutrófilos con RBS al 10% durante 20 minutos antes del ensayo. Como se muestra en la Figura 7B, EL-246 bloqueaba casi completamente la unión de neutrófilos a los transfectantes (90%), mientras que otro mAb (EL-81, testigo negativo de isotipo) que reconoce E-selectina producía poco efecto sobre la unión. Asimismo, el tratamiento de los transfectantes de E-selectina con un mAb específico anti-L-selectina (DREG 56) tampoco producía efecto alguno sobre la unión (Figura 7). Los valores fueron registrados como porcentaje de la unión de células testigo, habiéndose incubado las células testigo en medio de ensayo solo. Se repitieron los experimentos 3 veces y se presentan las medias \pm errores estándares de las medias (SEM; del inglés, standard errors of the means). Por lo tanto, EL-246 es un bloqueador eficaz de la función de la E-selectina.

Ensayo de unión de neutrófilos-transfectantes de E-selectina

Se cultivaron células L que expresan establemente cDNA de E-selectina humana (80% positivas en cuanto a ELAM-1; determinado por citometría de flujo), previamente descritas por Kishimoto et al., 1.990, Blood 78: 805-811, en portaobjetos Lab Tek de plástico de 8 pocillos (Miles Scientific). Se resuspendieron neutrófilos aislados de sangre periférica humana en cRPMI en una concentración de 1x10^{6} células/ml, y se añadieron 400 \mul a los pocillos de los cultivos de células L transfectadas. Se dejó que los neutrófilos se adhirieran a temperatura ambiental durante 15 minutos bajo rotación constante, como se describió previamente (Kishimoto et al., 1990, Blood 78: 805-811). Después de la incubación, se aspiró el medio de cada pocillo, se retiraron las cámaras de portaobjetos y se pusieron los portaobjetos en un recipiente de almacenamiento con glutaraldehído al 1,0% en HBSS. La adhesión fue medida contando el número de neutrófilos/célula L. El efecto del tratamiento de las células L con mAb fue determinado del modo siguiente. En todos los experimentos, los neutrófilos fueron prerrevestidos con suero de conejo al 10% para bloquear los sitios ligantes de Fc disponibles. Los transfectantes de E-selectina fueron tratados con EL-246 (sobrenadante de cultivo o 50 \mug/ml de anticuerpo purificado), DREG56 o un mAb testigo negativo de isotipo durante 20 minutos sobre hielo, lavados y luego usados en el ensayo de adhesión.

Ensayo de HEV de ganglios linfáticos periféricos

El ensayo in vitro de unión de linfocitos a HEVs de secciones congeladas (Stamper et al., 1.976, J. Exp. Med. 144: 828) ha sido ampliamente descrito (recientemente revisado por Berg et al., 1.989, Immunol. Rev. 108: 5). Se ha mostrado previamente que HEV de ganglios linfáticos periféricos de ratón se unen bien a linfocitos humanos, y esta unión depende de L-selectina (Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248). Se incubaron linfocitos purificados humanos con EL-246, un mAb bloqueante anti-L-selectina (DREG 56) o diferentes testigos de isotipo y se determinó el efecto sobre la adhesión a HEV de ganglios linfáticos periféricos. La unión celular fue cuantificada identificando primero HEVs en cada campo por su autofluorescencia característica o su morfología rellenita única, y contando luego las células unidas a HEV, como se describió (Kishimoto et al., 1.990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2.244-2.248). Los datos fueron calculados como número de células unidas por HEV individualmente señalada. Para cada punto de datos, se contaron 150 HEVs en > 3 secciones, y representan 4 experimentos independientes. Los valores se presentan como porcentaje del medio testigo.

Ejemplo 6 Mapeo del epítopo EL-246 con relación a los dominios de SCR Mapeo del epítopo EL-246 en dominios

El epítopo definido por el mAb EL-246 fue localizado usando quimeras de L-selectina/P-selectina del modo descrito por Kansas et al., 1.991, J. Cell. Biol. 114: 351-358. Se produjeron transfectantes estables de la línea 300.19 de células pre-B de ratón (Alt et al., 1.981, Cell 27: 381) que expresaban o L-selectina nativa, o L2P, que contiene de la L-selectina el dominio de lectina y de la P-selectina el resto de la proteína, o L2P3L, en que sólo el dominio EGF de la L-selectina ha sido sustituido por el de la P-selectina, del modo descrito en otra parte (Kansas et al., manuscrito en preparación). 5 x 10^{5} células de cada tipo fueron incubadas sobre hielo durante quince minutos en 100 \mul de sobrenadantes de cultivo o PBS/suero de ternera fetal al 1% que contenía fluido ascítico diluido del mAb indicado, lavadas e incubadas con anti-Ig de ratón, generado en cabra, conjugado con FITC (TAGO, Burlingame, California, EE.UU.). Las células fueron luego lavadas y fueron analizadas por citometría de flujo en un aparato EPICS Profile (Coulter Immunology, Hialeah, Florida, EE.UU.).

Se utilizó el patrón de unión del mAb EL-246 a quimeras de L-selectina/P-selectina para determinar el dominio de L-selectina en que reside el epítopo EL-246. Como testigos, se usaron los mAb LAM1-3 (Coulter), LAM1-1 y LAM1-14, que definen epítopos en los dominios de lectina, EGF y SCR de la L-selectina, respectivamente (Kansas et al., 1.991, J. Cell. Biol. 114: 351-358; Spertini et al., 1.991, J. Immunol. 147: 942), y el mAb AC1.2 (Hsu-Lin et al., 1.984, J. Biol. Chem. 259: 9.121), que identifica un epítopo en los dominios de SCR de la P-selectina (Rosen, 1.990, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 3: 397-402). EL-246 reconocía específicamente L-selectina nativa pero no LP2, que sólo contiene el dominio de lectina de la L-selectina (Figura 8). El análisis fue llevado a cabo por citometría de flujo del modo descrito en el Ejemplo 1. Por lo tanto, el epítopo EL-246 no está dentro del dominio de lectina de la L-selectina. Además, EL-246 reconocía L2P3L, en que sólo el dominio EGF de la L-selectina ha sido sustituido por el de la P-selectina. Por lo tanto, EL-246 reconoce sólo las selectinas que contienen los dominios de SCR de la L-selectina. Estos datos indican que al menos parte del epítopo EL-246 está dentro de, o requiere, los dominios de SCR de la L-selectina.

Datos adicionales que respaldan estos resultados son que EL-246 no bloquea la actividad de lectina de la L-selectina ni bloquea cruzadamente la unión de cuatro mAbs (DREG 200, DREG 55, DREG 56 y Leu-8) que reconocen el dominio de L-selectina.

Ejemplo 7 Método para inhibir la migración de leucocitos dependiente de L-selectina

Los métodos para usar anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento para inhibir la migración de leucocitos dependiente de L-selectina son descritos por Jutila et al., 1.989, J. Immunol. 143: 3.318.

Pueden usarse dos métodos para demostrar la presencia de anticuerpos en la inhibición in vivo de la dirección de neutrófilos inflamatorios. El primero es una modificación del método de Rosen y Gordon (1.987, J. Exp. Med. 166: 1.685). Se inyectan i.v. 500 \mug de los diversos anticuerpos o de disolución salina sola a ratones 1 hora antes de la provocación de inflamación en la cavidad peritoneal con 1 ml de caldo de tioglicolato. Tres horas más tarde, se lavan las cavidades peritoneales de los ratones con 10 ml de HBSS y se evalúa en cada animal el número de neutrófilos peritoneales recién llegados. También se recoge sangre periférica de cada animal, se lisan los RBCs y se cuantifica el efecto del tratamiento de los neutrófilos circulantes con anticuerpo. El porcentaje de neutrófilos en el peritoneo y la sangre periférica de cada animal es determinado por análisis microfluorométrico de flujo (FMF; del inglés, flow microfluorimetric) después de tinción con el anticuerpo RB6-8C5 para neutrófilos y por diferencias con el colorante de Wright. El análisis FMF es llevado a cabo en un aparato FACS Star® o FACScan® (Becton Dickinson, Mountain View, California, EE.UU.) del modo descrito por Jutila et al., 1.988, Eur. J. Immunol. 18: 1.819. Los datos de bloqueo por anticuerpos se presentan como porcentaje del medio testigo.

El segundo planteamiento es el método usado por Lewisohn et al. (1.987, J. Immunol. 138: 4.313). Se marcan neutrófilos de médula ósea con FITC (Sigma) del modo previamente descrito (Butcher et al., Handbook in Exp. Immunol. 57.1-57.3) y luego se inyectan i.v. de 2 a 5 x 10^{7} células a ratones que habían recibido i.p. de 1 a 2 ml de caldo de tioglicolato 3 horas antes. Los neutrófilos de médula ósea marcados con FITC se localizan eficazmente in vivo en sitios de inflamación (Lewisohn et al., 1.987, J. Immunol. 138: 4.313). Las células que se acumulan en la cavidad peritoneal inflamada son reveladas por análisis FMF de 50.000 células. Los datos son registrados como porcentaje de neutrófilos de donante marcados con FITC frente a neutrófilos de huésped no marcados en la cavidad peritoneal inflamada. Los neutrófilos de huésped no marcados sirven como patrón para el nivel de inflamación en un animal dado. El porcentaje de neutrófilos marcados con FITC que se acumulan en el peritoneo inflamado varía rutinariamente de 2 a 8%. Para estudios de bloqueo, los neutrófilos marcados con FITC son previamente revestidos con los anticuerpos del presente invento en concentraciones saturantes durante un periodo de 20 a 30 minutos sobre hielo. Las células son lavadas y son luego inyectadas a animales que han recibido tioglicolato 3 horas antes. Se lleva a cabo un análisis FMF de 50.000 células aisladas de la cavidad peritoneal de cada ratón. Se evalúa el aclaramiento de las células revestidas con anticuerpo examinando los niveles en sangre periférica de cada animal de ensayo. Se determina el porcentaje de neutrófilos marcados con FITC frente a neutrófilos huésped no marcados en el peritoneo y la sangre de cada animal. Los datos después del tratamiento con anticuerpo se presentan como porcentaje del medio testigo. La especificidad del bloqueo por anticuerpo se determina calculando un SER para cada animal al dividir el porcentaje de neutrófilos marcados con FITC en el peritoneo por el porcentaje de neutrófilos marcados con FITC en la sangre periférica [SER = (neutrófilos-FITC/neutrófilos huésped) peritoneales/(neutrófilos-FITC/neutrófilos huésped) sanguíneos]. Si la localización de neutrófilos en el sitio inflamatorio resulta bloqueada a causa de que las células revestidas con anticuerpo son aclaradas de la circulación, se obtienen valores SER similares a los de la disolución salina testigo.

Ejemplo 8 Método de exploración de anticuerpos útiles para la prevención y el tratamiento de las inflamaciones alveolar y dérmica

El método para demostrar la eficacia de los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento en la prevención o el tratamiento de las inflamaciones alveolar y dérmica es descrito por Mulligan et al. (1.991, J. Clin. Invest. 88: 1.396-1.406).

Anticuerpos monoclonales

Se generan anticuerpos dirigidos contra L-selectina y E-selectina del modo descrito en el Ejemplo 1.

El anticuerpo monoclonal testigo (no ligante de selectina) consiste en fragmentos F(ab')_{2} procedentes de digestión con pepsina. Para el estudio de complejos inmunes de lesiones vasculares pulmonar y dérmica, se inyecta intravenosamente un total de 135 \mug de anticuerpos del presente invento o F(ab')_{2} testigo en tres dosis igualmente divididas, 2,5, 3,0 y 3,5 horas después de una inyección intravenosa de albúmina sérica bovina (BSA; del inglés, bovine serum albumin) y la instilación intratraqueal o la inyección intradérmica de anti-BSA (que consiste en IgG policlonal de conejo, rica en anticuerpo hacia albúmina sérica bovina). A los animales testigo negativos no se les inyecta BSA.

Modelos animales de vasculitis dérmica y alveolitis por complejos inmunes

Se usa IgG policlonal de conejo, rica en anti-BSA, para provocar lesiones vasculares pulmonar y dérmica (Johnson y Ward, 1.981, J. Immunol. 126: 2.365). La IgG es adquirida a Organon Teknika, West Chester, Pennsylvania, EE.UU. Las preparaciones de IgG anti-BSA y de BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EE.UU.) que se usan para inyección a ratas contenían 20 pg/ml y 12 pg/ml de actividad endotoxínica, respectivamente, según se midió mediante el ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (E-Toxate, Sigma Chemical Co.). Para todos los estudios se usan machos de rata Long-Evans exentos de agentes patógenos específicos (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Wilmington, Massachusetts, EE.UU.), de 300-350 g. Se administran intraperitonealmente ketamina (25-50 mg/100 g de peso corporal) y pentobarbital sódico (5 mg/100 g de peso corporal) para sedación y anestesia. Se provoca una lesión pulmonar por complejos inmunes mediante la inyección intravenosa de 100 mg de BSA (en 1,0 ml de disolución salina) y la instilación intratraqueal de anti-BSA en 300 \mul. Se usan las siguientes dosis intratraqueales de anti-BSA: 0,75 mg, 1,50 mg, 2,50 mg, y 3,33 mg. Se sacrifican las ratas 4 horas después de la lesión y se purga la circulación pulmonar con 10 ml de disolución salina por medio de una inyección en la arteria pulmonar. Se determinan los índices de permeabilidad, como una medida de la lesión pulmonar, al comparar los escapes de albúmina marcada con ^{125}I al parénquima con respecto a la cantidad que queda en 1,0 ml de sangre.

Se provocan reacciones dérmicas de Arthus pasivas invertidas mediante la inyección intradérmica de 0,10-0,84 mg de anti-BSA contenidos en un volumen de 0,10 ml, seguida de una inyección intravenosa de 10 mg de BSA en 1,0 ml de disolución salina. Se sacrifican las ratas 4 horas más tarde y se calculan los índices de permeabilidad al medir la relación entre la radiactividad presente en biopsias de piel de grosor completo y la radiactividad presente en 1,0 ml de sangre. Los testigos negativos incluyen animales con sitios intradérmicos en que se ha inyectado anti-BSA pero con la omisión de la inyección intravenosa de BSA.

Para la evaluación de la hemorragia pulmonar o dérmica, se recogen glóbulos rojos (RBC) de sangre heparinizada obtenida de ratas Long-Evans adultas normales. Se diluyen nueve ml de sangre con 40 ml de disolución salina que contiene heparina a 1:1.000 (peso/peso). A esta mezcla se añaden 3,7x10^{6} Bq de ^{51}Cr, lo que va seguido de incubación durante 1 hora a 37ºC con sacudimiento continuo. Después de una centrifugación a 1.000 rpm (a 4ºC) durante 6 minutos, las células son lavadas en PBS tres veces y quedan luego listas para usar. Se inyectan RBC marcados con ^{51}Cr (45 \mul que contenían 80.000, CCiD) a los animales ½ hora antes de las inyecciones de BSA y anti-BSA. En el momento del sacrificio, se mide la radiactividad por ^{51}Cr en los sitios cutáneos y en los pulmones sometidos a perfusión con disolución salina y se compara con las cuentas presentes en 1,0 ml de sangre. A la conclusión de cada experimento, se centrifugan muestras de sangre de cada animal y se mide la radiactividad en las células y el suero. Para las lesiones pulmonar y cutánea provocadas por complejos inmunes se usan unos protocolos de lesión y tratamiento iguales que los anteriormente descritos.

Exudados peritoneales provocados por glucógeno

Se generan exudados ricos en neutrófilos en cavidades peritoneales de ratas mediante la inyección de 25 ml de glucógeno de ostra al 0,1% (peso/volumen) 4 horas antes de su sacrificio. Se inyectan intravenosamente 135 \mug de fragmentos F(ab')_{2} del presente invento en tres dosis igualmente divididas al grupo de tratamiento (a las 2,5, 3,0 y 3,5 horas) para evaluar los efectos sobre la reunión de neutrófilos en cavidades peritoneales.

Contenido de mieloperoxidasa (MPO) tisular

Se establece primero una curva de referencia estándar al medir la MPO en pulmones y sitios cutáneos en que se ha inyectado un número conocido de neutrófilos. Los sitios pulmonares y cutáneos son sometidos a extracción mediante procedimientos de homogeneización y sonicación que han sido previamente descritos (Warren et al., 1.989, J. Clin. Invest. 84: 1.873). La actividad MPO en los sobrenadantes es medida mediante el cambio de densidad óptica (a 460 nm) que resulta de la descomposición de H_{2}O_{2} en presencia de o-dianisidina.

Análisis inmunohistoquímico de células y tejido pulmonar

Monocapas de células endoteliales de arteria pulmonar de rata (RPAEC; del inglés, rat pulmonary artery endothelial cell) en portaobjetos de plástico son estimuladas con 50 ng/ml de factor \alpha de necrosis tumoral (TNF\alpha; del inglés, tumor necrosis factor \alpha) recombinante humano durante 4 horas, lavadas con PBS y fijadas con acetona. Los portaobjetos que contienen monocapas de células estimuladas y no estimuladas son luego incubados con anticuerpos del presente invento (1,0 ng/ml) durante 45 minutos. Los portaobjetos son luego lavados con PBS y después teñidos en cuanto al mAb unido usando el sistema de biotina/avidina-peroxidasa para IgG de ratón (Vectastain; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California, EE.UU.). Tras una tinción de contraste con hematoxilina, las secciones son revestidas con Aqua-Mount (Lerner Laboratories, Pittsburgh, Pennsylvania, EE.UU.) y son examinadas por microscopía óptica en cuanto a la presencia de productos de reacción de peroxidasa. La lesión pulmonar provocada por complejos inmunes es producida usando los mismos protocolos anteriormente descritos. Se sacrifican los animales a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas. Se hinchan los pulmones con 8-9 ml de compuesto para temperatura óptima de corte (OCT; del inglés, optimal cutting temperature) (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, EE.UU.) y se obtienen secciones congeladas de los pulmones de ratas normales y de aquéllas que han padecido el depósito intraalveolar de complejos inmunes. Después del montaje en portaobjetos revestidos con poli-L-lisina y la fijación con acetona, las secciones tisulares son hechas reaccionar con anticuerpos del presente invento, como se describió anteriormente.

Para evaluar si HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) estimuladas con TNF-\alpha quitan reactividad de anticuerpo, se lleva también a cabo un experimento adicional utilizando el mismo procedimiento de tinción y usando el pulmón de la reacción de complejos inmunes de 4 horas. Antes de su uso, la preparación de mAb del presente invento (1,0 ng/ml) es incubada durante 1 hora a 27ºC con monocapas (5 x 10^{6} células) de HUVEC estimuladas con TNF-\alpha (50 ng/ml) o no estimuladas, precediendo a la aplicación de anticuerpo a las secciones pulmonares.

Evaluación morfológica de pulmones y piel

Los pulmones son fijados en formalina al 10% tamponada con fosfato para la tinción con hematoxilina y eosina y el examen por microscopía óptica subsiguientes. Las muestras de piel son tratadas similarmente.

Citotoxicidad de células endoteliales mediada por neutrófilos

La citotoxicidad de RPAEC mediada por neutrófilos es medida mediante un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr (Varani et al., 1.985, Lab. Invest. 53: 656). Se siembran RPAEC en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos, con 5 x 10^{4} células por pocillo en 1 ml de medio de cultivo. Cada pocillo recibe 7,4 x 10^{4} Bq de Na ^{51}CrO_{4} (New England Nuclear, Boston, Massachusetts, EE.UU.) y luego se incuban las monocapas durante 14 horas. Luego se añade TNF-\alpha en una concentración de 50 ng/ml y se incuban las monocapas durante 4 horas adicionales. Luego se lavan dos veces las placas con HBSS (disolución salina equilibrada de Hank) que contiene BSA al 0,02% para eliminar la radiactividad no incorporada. Las monocapas de células endoteliales están entonces listas para usar. Cuando se emplean anticuerpos, se añaden a las monocapas y se incuban durante 30 minutos. Se aislan neutrófilos sanguíneos humanos y se suspenden en HBSS complementada con BSA al 0,02%. Después de la incubación con Ab, se añaden los neutrófilos a pocillos duplicados para obtener relaciones de células efectoras a células diana de 30:1 en un volumen final de 1,0 ml. Se deja que los neutrófilos se depositen sobre las monocapas de células endoteliales durante 30 minutos antes de la adición de miristato-acetato de forbol (PMA; 50 ng/ml), que se añade en un volumen de 0,1 ml por pocillo. Después de una incubación adicional a 37ºC durante 6 horas, se sacan 0,9 ml de sobrenadante de cada pocillo y se eliminan las células de las suspensiones por centrifugación. El fluido sobrenadante (0,5 ml) es aspirado y es analizado en un contador de centelleo \gamma para determinar la liberación de ^{51}Cr.

Ejemplo 9 Método para la prevención y el tratamiento del asma

El método para demostrar la eficacia de los anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento en el tratamiento del asma se describe en el Documento U.S. nº de serie 738.633 y en Gundel et al., 1.991, J. Clin. Invest. 88: 1.407-1.411.

Animales

Los animales son machos adultos de mono cinomolgus (Macaca fascicularis) capturados en estado salvaje, que pesan aproximadamente de 4 a 8 kg (Charles River Breeding Laboratories, Inc., Primate Imports, Port Washington, New York, EE.UU.).

Anticuerpo monoclonal

Se diluyen disoluciones de reserva de anticuerpos con disolución salina (2 mg/ml de concentración final) inmediatamente antes de inyecciones intravenosas en una vena periférica de una pata. El tratamiento con anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno se administra 1 hora antes de la estimulación antigénica por inhalación. Como testigo positivo, puede usarse un anticuerpo específico para ELAM-1 solo. Se generó un anticuerpo contra ELAM-1 (CL2) del modo descrito por Picker et al., Nature: 349: 796 (1.991).

Mediciones de Rrs

Se mide la impedancia del sistema respiratorio (Rrs; del inglés, respiratory resistance) mediante oscilaciones sinusoidales forzadas de frecuencias discretas (4-40 Hz en 11 pasos logarítmicos iguales) superpuestas a la ventilación pulmonar, del modo descrito por Wegner et al., 1.984, Respir. Physiol. 55: 47. Luega se calcula la media del componente real o en fase de Rrs a lo largo de la frecuencia completa para obtener una representación de Rrs de valor único.

Lavado broncoalveolar (BAL; del inglés, bronchoalveolar lavage)

Se lleva a cabo el BAL guiando un broncoscopio de fibra óptica (Olympus Optical, modelo 3C-10, Lake Success, New York, EE.UU.) más allá de la carina y encajándolo en un bronquio de 5ª a 7ª generación. Una parte alícuota de 15 ml de disolución salina tamponada con bicarbonato (pH de 7,4, 23ºC) es administrada por infusión y es lentamente aspirada a través de un canal del broncoscopio. Las muestras recogidas son centrifugadas a 2.000 rpm durante 10 minutos, y los sedimentos celulares de centrifugación resultantes son resuspendidos en disolución salina equilibrada de Hank, exenta de Ca^{++} y Mg^{++}. Se ha mostrado que el procedimiento del BAL provocará una suave respuesta inflamatoria. De este modo, para evitar los posibles efectos del BAL sobre la composición celular del pulmón, se lleva a cabo el BAL alternando los pulmones derecho e izquierdo antes y después de la estimulación antigénica. El volumen de retorno del tampón administrado por infusión es muy constante a lo largo del estudio, y el procedimiento es bien tolerado por los animales. Se obtienen las cuentas de glóbulos blancos totales usando un contador Coulter (Coulter Electronics, modelo nº 10, Hialeah, Florida. EE.UU.).

Estimulación antigénica por inhalación

Las estimulaciones antigénicas por inhalación se administran mediante ventilación con presión positiva intermitente, con un respirador y micronebulizador Bird 7A (Bird Corporation, modelo nº 8158). Cada estimulación consistía en 15 ventilaciones por minuto (máxima presión inspiratoria de 1.960 Pa) durante 2 minutos. Se diluye extracto de Ascaris summ (Greer Laboratories, Lenoir, North Carolina, EE.UU.) con disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH de 7,4) hasta la concentración apropiada para cada animal (dosis requerida para causar un aumento de Rrs del 200-500% durante la respuesta inmediata). Las estimulaciones antigénicas están separadas por 14 días para cada animal. Cada animal es mantenido en ayunas durante 18 horas antes del día de estudio.

Histoquímica

Se evalúan las células del BAL usando preparaciones de citocentrífuga teñidas con colorante Diff-Quick (Fisher Scientific, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Se determinan cuentas celulares diferenciales mediante la cuenta de 200 células y se registra el porcentaje de cada tipo celular.

Histología

Se obtienen muestras de biopsia pulmonar antes de la estimulación antigénica y durante la respuesta máxima de fase tardía, con fórceps para biopsias y el broncoscopio de fibra óptica. La tinción inmunohistoquímica para la identificación de E- o L-selectina en el endotelio vascular pulmonar y el epitelio de las vías aéreas es llevada a cabo del modo descrito por Wegner et al., 1.990. Science 247:456.

Análisis estadístico

Los datos son analizados estadísticamente usando un análisis de varianza de dos vías y el test de rango múltiple de Friedman.

Protocolo de estudio

Cada animal es anestesiado con una inyección intramuscular de ketamina (4 mg/kg; Ketaset, Myoderm Medical Supply, Norristown, Pennsylvania, EE.UU.) y xilacina (1 mg/kg; Rompun, Miles Laboratories, Inc., Naperville, Illinois, EE.UU.), intubado con un tubo endotraqueal rebordeado, y colocado en posición supina. Se usa ketamina (4 mg/kg, i.m.) como anestesia complementaria cuando es necesario. Cada animal recibe luego una inyección intravenosa de anticuerpo monoclonal o vehículo (disolución salina) en forma de bolo. Luego se evalúa la composición celular de las vías aéreas llevando a cabo un lavado broncoalveolar (BAL) con un broncoscopio pediátrico de fibra óptica, después de lo cual los animales son sentados en posición erguida en una silla con respaldo especialmente diseñado. Se determina la resistencia de línea de base del sistema respiratorio (Rrs) durante aproximadamente 15 minutos, lo que va seguido de una estimulación por antígeno inhalado (1 hora después del tratamiento i.v.). Se determina continuamente la Rrs durante 1 hora, después de lo cual se deja que los animales se recuperen de la anestesia y se les lleva de nuevo a sus jaulas. Se determina la Rrs a lo largo de un periodo de 15 minutos, 4, 6, 8 y 10 horas después de la inhalación del antígeno. Después de un periodo de recuperación, se evalúa la respuesta de fase tardía llevando un BAL a cabo (pulmón opuesto lavado antes de la estimulación antigénica).

El estudio está diseñado para que se lleven a cabo experimentos testigo de horquillado (tratamiento con vehículo) sobre cada animal, de modo que cada animal sirva como su propio testigo. Cada estudio está separado por 14 días.

El pretratamiento con anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento 1 hora antes de la inhalación del antígeno atenúa significativamente en todos los animales tanto la infiltración total de leucocitos como el número de neutrófilos que se infiltran. El tratamiento con anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno del presente invento da lugar a una reducción significativa de la broncoconstricción de fase tardía pero no produce efecto evidente alguno sobre la respuesta aguda.

Ejemplo 10 Método para detectar células que llevan L- y E-selectinas en muestras biológicas Productos biológicos

Los expertos en la técnica pueden crear genéticamente una molécula de adhesión unida a membrana basándose en la secuencia de nucleótidos (Marlin et al., 1.990, Nature 344: 70-72; incorporado aquí por referencia). En la bibliografía se encuentran las secuencias de nucleótidos completas de la E-selectina (Bevilacqua et al., 1.989, Science 243: 1.160-1.165) y la L-selectina (Bowen et al., 1.989, J. Cell Biol. 109: 421-427; Siegelman et al., 1.989, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 5.562-5.566; Tedder et al., J. Exp. Med. 170: 123-133). La secuencia que contiene la secuencia de codificación más los dominios transmembranal y citoplásmico puede ser multiplicada por PCR, como describe Mullis, Patente de EE.UU. nº 4.683.195. Se subclona el gen para la E- o L-selectina en uno de los muchos vectores de expresión eucarióticos o procarióticos disponibles y se hace que aquél se exprese en una línea celular huésped apropiada.

Para uso como patrones en inmunoensayos tales como el ensayo de inmunosorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay), transferencia Western y transferencia en forma de manchas, cantidades conocidas de células que llevan L-selectina y E-selectina o de lisados celulares son sucesivamente diluidas en disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) que contiene BSA al 1% (BSA-DPBS).

Preparación de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos de ratón anti-L/E-selectina se preparan del modo previamente descrito en el Ejemplo 1.

Preparación de muestras de ensayo

Se recoge sangre periférica humana de un animal de ensayo en viales con heparina y se aislan las células mononucleares de sangre periférica (PBMC; del inglés, peripheral blood mononuclear cells) usando Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las PBMC, tres veces lavadas, son luego resuspendidas en medio completo como una suspensión celular al 5%. Se añaden dos mililitros de la suspensión celular a pocillos apropiados de unas placas de 24 pocillos de fondo plano. En los momentos apropiados, se recogen los pocillos de cada donante. El sobrenadante celular es centrifugado durante 5 minutos a 5.600 x g para eliminar toda sustancia en partículas, y el sobrenadante celular es congelado a -20ºC hasta que se recogen todas las muestras para análisis por ELISA. Los sobrenadantes son descongelados, clarificados por centrifugación a 10.000 x g durante 5 minutos y luego concentrados a la octava parte en dispositivos Centricon 30 según las instrucciones del fabricante (Amicon, Beverley, Massachusetts, EE.UU.). Las muestras concentradas son luego inmediatamente analizadas en cuanto a E- o L-selectina por ELISA.

ELISA para células que llevan L-selectina y E-selectina

Se añade el anticuerpo del presente invento en DPBS a placas para microtitulación por EIA, de 96 pocillos de fondo plano (Linbro), en una cantidad de 50 \mul/pocillo a temperatura ambiental durante 1 hora. Los pocillos son lavados tres veces con DPBS y son luego bloqueados con 200 \mul de BSA al 2%-DPBS durante 1 hora a 37ºC. Se vacían los pocillos con un movimiento rápido y se añaden (50 \mul/pocillo) patrones de L-selectina y E-selectina titulados (diluciones sucesivas al doble, 8-1.024 ng/ml) y muestras de ensayo (diluidas en BSA al 1%-DPBS), de las que se sospecha que contienen células que llevan L- y/o E-selectina, por triplicado durante 1 hora a 37ºC. Los pocillos son lavados tres veces con DPBS. Se añade el mAb anti-L/E-selectina (EL-246) biotinilado en una concentración de 2 \mug/ml (50 \mul/pocillo) durante 30 minutos a 37ºC. Los pocillos son lavados tres veces con DPBS. Se añade una parte alícuota de 50 \mul/pocillo de peroxidasa de rábano picante-estreptavidina (1:4.000; Zymed, San Francisco, California, EE.UU.) durante 30 minutos a 37ºC. Los pocillos son lavados tres veces con DPBS y una vez con tampón para sustrato ABTS (Zymed). Se añade tampón para sustrato ABTS (50 \mul/pocillo) y se leen las placas (410 nm) en un lector Dynatech de placas de microtitulación por ELISA hasta que se obtienen lecturas de máxima densidad óptica (OD; del inglés, optical density). Se calculan las lecturas de OD medias.

Ejemplo 11 Purificación de células que llevan L- y E-selectina, por inmunoafinidad

El presente invento puede ser útil, en combinación con técnicas de terapia génica conocidas en este campo técnico, en el tratamiento de la enfermedad genética: deficiencia de CD11/CD18. Los leucocitos que carecen de genes CD11 y CD18 funcionales llevan el receptor de la superficie celular: L-selectina y/o E-selectina. Los mAbs del presente invento son unidos a un soporte sólido que se usa como una columna de afinidad. La columna de afinidad se une específicamente a células que llevan L-selectina y/o E-selectina procedentes de una fuente tal como la sangre de un paciente, lo que permite su purificación o su separación de otras células. Dichas células, una vez purificadas, son sometidas a terapia génica con un DNA vector que lleva los genes CD11 y CD18 y son luego reintroducidas por infusión en el paciente, estableciéndose de este modo una ruta de adhesión funcional.

Ejemplo 12 El tratamiento sólo de neutrófilos con EL-246 bloquea su capacidad para unirse a transfectantes por cDNA de E-selectina

El pretratamiento, con EL-246, de fibroblastos transfectados con cDNA de E-selectina bloquea la capacidad de los transfectantes para unirse a neutrófilos. Puesto que la E-selectina de células endoteliales y la L-selectina de neutrófilos pueden servir potencialmente como parejas de receptor- contrarreceptor (T. K. Kishimoto et al., 1.990, Blood 78: 805; L. J. Picker, 1.991, Cell 66: 921), se examinó la inhibición de la unión de neutrófilos a E-selectina tratando sólo los neutrófilos. Neutrófilos de sangre periférica fueron incubados con niveles saturantes de EL-246 sobre hielo durante 20 minutos, lavados y luego añadidos a cultivos de células L de ratón transfectadas con cDNA de E-selectina humana. Se evaluó el efecto de EL-246 sobre la unión y se comparó con el de un mAb anti-L-selectina (DREG 56) y 2 mAbs testigo negativos de isotipo: anti-T200 y EL-81, que tiñen leucocitos y E-selectina, respectivamente. Los neutrófilos fueron tratados con los anticuerpos indicados en concentraciones de 50 \mug/ml durante 20 minutos sobre hielo, lavados y luego añadidos a los transfectantes de E-selectina. El ensayo de unión fue realizado del modo descrito. El efecto de los tratamientos con anticuerpo fue cuantificado y fue registrado como porcentaje de la unión de células testigo (no tratadas). Los valores representan medias \pm desviaciones estándares de 8 valores de 2 experimentos independientes. Como se muestra en la Figura 9, EL-246 bloqueaba la adhesión en un 64%, DREG 56 inhibía en un 53% y los mAbs testigo negativos producían poco efecto. Estos resultados muestran que el tratamiento de neutrófilos con EL-246 bloquea su capacidad para unirse a transfectantes de E-selectina.

Se llevaron a cabo pruebas para determinar si podía hallarse EL-246 en la superficie de los transfectantes de E-selectina después del ensayo de unión, mediante la adición de anticuerpo de segunda fase anti-ratón marcado con FITC a las células, seguida de análisis citométrico de flujo. Los neutrófilos usados en los experimentos fueron pretratados con EL-246, lavados y luego analizados en cuanto a la presencia de EL-246 en su superficie celular antes y después del ensayo mediante la adición de anticuerpo de segunda fase anti-Ig de ratón marcado con FITC, seguida de citometría de flujo. Los transfectantes de E-selectina fueron similarmente analizados. Se compararon los niveles de EL-246 en la superficie del neutrófilo antes y después del ensayo. Los neutrófilos fueron saturados con EL-246 al inicio del ensayo (Figura 10A); sin embargo, no pudo detectarse anticuerpo alguno en su superficie celular después de una coincubación de 15 minutos con los transfectantes de E-selectina (Figura 10B). Puesto que la L-selectina puede desprenderse de la superficie de los leucocitos (T. K. Kishimoto et al., 1.989, Science 245: 1.238), se llevaron a cabo pruebas para determinar si la pérdida de anticuerpo EL-246 en el neutrófilo durante el ensayo de unión era debida al desprendimiento de la molécula. Los neutrófilos que ya no tenían EL-246 en su superficie celular después del ensayo (Figura 10B) resultaban intensamente teñidos con un segundo mAb anti-L-selectina (DREG56) que reconoce un epítopo distinto de aquél al que se une EL-246 (Figura 10C). Esto indica que no había tenido lugar desprendimiento de L-selectina en los neutrófilos tratados con EL-246.

Por contraste con la falta de EL-246 en los neutrófilos después del ensayo, se detectaron niveles elevados de EL-246 en la superficie de los transfectantes de E-selectina (Figura 10E). Los transfectantes que no recibieron neutrófilos tratados con EL-246 no reaccionaron con la segunda fase (Figura 10D). El nivel de intensidad de fluorescencia de los transfectantes expuestos a neutrófilos tratados con EL-246, seguidos del anticuerpo de segunda fase (Figura 10E), era igual o ligeramente mayor que el nivel de fluorescencia obtenido después de una tinción indirecta convencional de los transfectantes de E-selectina usando EL- 246 (Figura 10F). Estos resultados mostraban que, cuando los neutrófilos son pretratados con EL-246, el mAb tiene aparentemente la capacidad para transferirse del neutrófilo a la E-selectina de los transfectantes de células L. Se obtuvieron resultados similares con E-selectina de célula endotelial. En ese caso, se trataron células endoteliales de cordón umbilical humano con 10 unidades/ml de TNF durante 4 horas para provocar la expresión de E-selectina. A las células endoteliales se añadieron neutrófilos pretratados con EL-246, como se describió anteriormente. En 15 minutos todos los neutrófilos perdían el EL-246, que entonces podía hallarse en la superficie de las células endoteliales activadas con citoquina. Este bloqueo de la unión de neutrófilos a E-selectina por EL-246 era probablemente a nivel de E-selectina y no de L-selectina. Además, estos resultados sugieren que los neutrófilos pueden distribuir eficazmente EL-246 en los sitios de expresión de E-selectina.

Ejemplo 13 EL-246 bloquea la "rodadura" de neutrófilos sobre células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) activadas

Las selectinas están implicadas en la reunión de neutrófilos y otros leucocitos en sitios de inflamación. La reunión de neutrófilos en sitios de inflamación puede ser dividida en tres etapas: 1) fijación y "rodadura" iniciales de células sobre el endotelio activado de vénulas poscapilares; 2) activación de neutrófilos y firme adhesión al endotelio; y 3) extravasación de las células al tejido circundante (J. C. Paulson, 1.992, cápitulo 2 de Adhesion, Its Role In Inflammatory Disease, redactado por J. M. Harlan y D. Y. Liu, W. H. Freeman and Company, New York, EE.UU., páginas 19-42). Las selectinas participan en la adhesión o "rodadura" inicial de los neutrófilos sobre el endotelio activado. La terapia antiadhesión previene o inhibe este daño.

El tráfico de leucocitos a través de la pared del vaso hacia tejido extravascular es necesario para la defensa del huésped frente a organismos microbianos o antígenos extraños y la reparación del daño tisular. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, las interacciones leucocito-endotelio pueden tener consecuencias deletéreas para el huésped. Durante el proceso de adherencia y migración transendotelial, los leucocitos pueden liberar productos que dañen directamente el endotelio, causando disfunción endotelial y daño tisular (J. M. Harlan et al., 1.992, cápitulo 6 de Adhesion, Its Role In Inflammatory Disease, ibídem, páginas 117-150). La terapia antiadhesión previene o inhibe este daño.

Se usó un sistema de células de flujo in vitro que remeda la fuerza de cizallamiento in vivo del flujo sanguíneo en las vénulas poscapilares y la rodadura de neutrófilos, para determinar la capacidad de EL-246 para inhibir la rodadura de neutrófilos sobre una capa de células endoteliales activadas.

Células endoteliales de cordón umbilical humano recién aisladas, que eran positivas para el Factor VIII y el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL), fueron cultivadas hasta confluencia en la superficie interna de tubos capilares de vidrio estériles de 1,36 mm (Drummond Scientific, Broomall, Pennsylvania, EE.UU.). Cuatro horas antes del ensayo, las células endoteliales fueron tratadas con 10 ng/ml de PMA o IL-1 pulmonar (IL-1 beta, Immunex, Seattle, Washington, EE.UU.), que provoca la máxima expresión de E-selectina. Se fijó un conducto a cada extremo del tubo capilar para formar un sistema cerrado en que pudiera hacerse recircular fluido y células usando una bomba peristáltica variable. El tubo capilar fue montado en la platina de un microscopio invertido, modificado para video-microscopía. Se inyectaron neutrófilos humanos purificados en el sistema en una concentración de 1x10^{7} células/ml en DMEM más FBS al 2%. Se detectó una interacción de rodadura reproducible, que no tenía lugar sobre células endoteliales no activadas, bajo un caudal de 10,1 mm/s. Se dejó que la interacción de rodadura transcurriera durante 5 minutos mientras era grabada en videocinta, y luego se inyectaron sucesivamente EL-246 o un anticuerpo testigo negativo de isotipo en una concentración de 50 \mug/ml, o ambos, al sistema. Las interacciones de leucocito-célula endotelial fueron luego grabadas en videocinta durante hasta 10 minutos. Mediante el análisis de cada imagen de la grabación en videocinta, se determinó el número de neutrófilos que rodaban sobre las células endoteliales activadas a intervalos de 10-30 segundos antes y después de la inyección del mAb. Los datos fueron registrados como número de células rodantes en el campo de visión frente al tiempo (segundos).

Se ensayó EL-246 para determinar si podía inhibir la capacidad de las células endoteliales activadas para soportar la rodadura de neutrófilos. Se cultivaron HUVECs en la superficie interna de tubos capilares de vidrio estériles y fueron inducidas a expresar E-selectina (confirmado por tinción con EL-246), como se describió. Los tubos fueron dispuestos en un sistema que mide las interacciones de leucocitos con ligandos bajo condiciones de cizallamiento. El ensayo en circuito cerrado in vitro fue usado para analizar el efecto de EL-246 sobre la capacidad de los neutrófilos para rodar sobre células endoteliales activadas, como se describió. Se estableció una interacción de rodadura y luego se inyectó EL-246 en el sistema. El número de neutrófilos rodantes dentro del campo microscópico de observación fue cuantificado a lo largo del tiempo por análisis de imágenes individuales de la grabación de la interacción en videocinta. Bajo condiciones de cizallamiento controladas, las HUVECs activadas fueron bastante eficaces para soportar la rodadura de neutrófilos humanos y de ratón (datos no mostrados). Para probar el efecto de EL-246, se estableció una interacción de rodadura entre neutrófilos humanos aislados y luego se inyectó EL-246 (concentración final de 50 \mug/ml) en el sistema de circuito cerrado, y durante 10 minutos se grabó mediante video-microscopía el efecto sobre la rodadura de los neutrófilos. Se determinó el número de neutrófilos que rodaban sobre las células endoteliales antes y después de la inyección de EL-246 al analizar imágenes individuales de la videocinta. La Figura 11A muestra un gráfico del número de células que ruedan sobre las células endoteliales activadas frente al tiempo. Antes de 90 segundos tras la inyección de EL-246, más del 75% de la interacción de rodadura resultó bloqueada, y antes de 4 minutos el bloqueo fue del 100%. En los tubos en que sólo se inyectó medio, no se detectó efecto inhibitorio alguno sobre la rodadura de neutrófilos. Además, anticuerpos hacia CD44 y P-selectina no produjeron efecto inhibitorio alguno en este ensayo (datos no mostrados).

Se realizó un segundo tipo de experimento para controlar los efectos inespecíficos del mAb sobre la rodadura de neutrófilos en el mismo tubo en que finalmente se inyectó EL-246. Se estableció una interacción de rodadura como antes y luego se inyectó un mAb testigo negativo de isotipo (12.2, que no reconoce neutrófilos ni endotelio) en el sistema (50 \mug/ml) y se determinó su efecto durante 150 segundos. Como se muestra en la Figura 11B, 12.2 no alteró la interacción de rodadura. Después de 180 segundos, se inyectó EL-246 en el sistema, el cual bloqueó completamente la rodadura (Figura 11B). En algunos tubos, la falta de efecto del mAb testigo negativo fue vista durante más de 20 minutos (datos no mostrados).

Los resultados de estos experimentos demuestran que el anticuerpo monoclonal EL-246 es único en cuanto a su capacidad para inhibir la rodadura de neutrófilos sobre endotelio activado y respaldan su uso in vivo para inhibir la rodadura de neutrófilos con objeto de prevenir o inhibir la migración de leucocitos y la inflamación.

Ejemplo 14 EL-246 bloquea la capacidad de transfectantes por cDNA de E-selectina para unirse a HEV de ganglios linfáticos periféricos Ensayo de unión a a HEV de ganglios linfáticos periféricos

El ensayo in vitro de unión de linfocitos a HEVs de secciones congeladas y las células L 1/2 pre-B de ratón transfectadas con cDNA de E-selectina o cDNA vector fueron los mismos que los usados en el Ejemplo 5. Se resuspendieron células L 1/2 de ratón que expresan E-selectina humana funcional, y la línea originaria testigo no transfectada, en cRPMI en una concentración de 1x10^{7} células/ml, se añadieron 100 \mul de estas suspensiones a secciones de 10 \mum de ganglio linfático periférico de ratón y se evaluó la unión a HEV. La unión celular fue cuantificada identificando primero HEVs en cada campo por su autofluorescencia característica o su morfología rellenita única, y contando luego las células unidas a HEV, como se describió en el Ejemplo 5. Después del ensayo, las secciones fueron teñidas con tionina, que marca preferentemente de azul oscuro las células ligantes. Los datos fueron calculados como número de células unidas por HEV individualmente señalada. El efecto del tratamiento con anticuerpo sobre los transfectantes fue comparado con el del medio solo.

E. L. Berg, M. Robinson y colaboradores han mostrado que hay especificidades de unión solapantes entre L-selectina y E-selectina (E. L. Berg et al., 1.992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1.048). Ambas moléculas se unen a los mismos carbohidratos, y es interesante que los transfectantes de E-selectina se adhieren ávidamente a HEV de ganglio linfático periférico (Berg et al., ibídem), una interacción molecular de la que se pensaba originalmente que era única para L-selectina (E. C. Butcher, 1.991, Cell 67: 1.033). Se probó EL-246 para determinar si bloqueaba la interacción de los transfectantes de E-selectina con HEV de PLN. Como se muestra en las fotomicrografías de la Figura 12, la línea celular de linfoma L 1/2 de ratón, transfectada con cDNA de E-selectina humana, se unió ávidamente a HEV de PLN de ratón. El tratamiento de los transfectantes con EL-246 bloqueó completamente esta interacción (Figura 12). Este experimento fue repetido 4 veces y, en cada experimento, el bloqueo de EL-246 fue del 100%.

Ejemplo 15 EL-246 bloquea la dirección de linfocitos a ganglios linfáticos periférico in vivo Ensayo de dirección in vivo de linfocitos xenogénicos

Linfocitos bovinos fueron aislados de sangre periférica, lavados, suspendidos en una concentración de 1x10^{7} células/ml en HB101 (NEN) y marcados con FITC del modo descrito (M. A. Jutila et al., 1.989, J. Immunol. 143: 3.318; M. A. Jutila, 1.990, Cell Immunol. 132: 201). Estos procedimientos condujeron a un 100% de eficacia en la marcación homogénea de todos los linfocitos, con valores de fluorescencia de modo resultantes que variaban de 100 a 500. Los linfocitos marcados con FITC fueron lavados en HBSS y resuspendidos en una concentración de 1x10^{8} células/ml, y se inyectaron 0,5 ml de la preparación celular en la vena lateral de la cola de hembras de ratón BALB/c de 6-12 semanas de edad. Después de 4 horas, se sacrificaron los animales y se recogieron placas de Peyer (PP), ganglios linfáticos mesentéricos (MLN; del inglés, mesenteric lymph nodes), ganglios linfáticos periféricos (PLN), bazo y sangre periférica. Se obtuvieron preparaciones celulares individuales de cada tejido. Se lisaron RBCs de la sangre periférica mediante lisis hipotónica y luego se realizó un análisis citométrico de flujo para cuantificar la capacidad de los linfocitos transferidos para entrar en tejidos linfoides del ratón, como se describió previamente (M. A. Jutila, 1.990, Cell Immunol. 132: 201). Se determinó el porcentaje de linfocitos transferidos frente a linfocitos huésped para cada tejido. El efecto del anticuerpo sobre la dirección de los linfocitos fue comparado con el de los testigos de medio. Fueron testigos adicionales en este ensayo: 1) la cuantificación de niveles sanguíneos para mostrar que no tenía lugar el aclaramiento de las células tratadas con anticuerpo, y 2) los efectos tisularmente específicos de EL-246. La L-selectina media preferentemente en la dirección de linfocitos a través de ganglios linfáticos periféricos. Para conseguir resultados óptimos, los animales donantes tenían que estar sanos y tener menos de 1 mes de edad (la edad en que la L-selectina se expresa a su mayor nivel en el mayor porcentaje de los linfocitos circulantes). Además, las técnicas de separación y marcación de células no podían durar más de 2 horas, de lo contrario había una caída en la viabilidad celular. No se incluían ensayos para el análisis si no tenía lugar la dirección de linfocitos xenogénicos en animales testigo (al menos el 0,2% de los linfocitos de ganglios linfáticos periféricos del huésped, por ejemplo).

El modelo de dirección xenogénica fue usado para probar si EL-246 era eficaz para bloquear la dirección de linfocitos a ganglios linfáticos periféricos en cuanto a una función in vivo mediada por otra selectina. Los linfocitos xenogénicos se dirigen con la especificidad apropiada a tejidos linfoides de ratones en ensayos de dirección de corta duracción (R. Bargatze y M. A. Jutila, observaciones no publicadas). Esto no es sorprendente ya que las rutas de adhesión primarias requeridas para la dirección están muy conservadas en mamíferos (M. A. Jutila et al., 1.992, J. Exp. Med. 175: 1.565; O. Spertini et al., 1.991, J. Immunol. 147: 942; N. W. Wu, 1.988, J. Cell Biol. 107: 1.845; B. Walcheck et al., 1.992, Eur. J. Immunol. 22: 469). El ensayo se completa en 4 horas; de este modo, se detectan pocas complicaciones relativas a respuestas xenogénicas. Este planteamiento proporciona un potente sistema para medir la capacidad de dirección de los linfocitos procedentes de animales grandes, en los que los experimentos de dirección homóloga son difíciles a causa de las grandes cantidades de células requeridas. Se examinó la dirección de linfocitos bovinos en el ratón porque 1) EL-246 reconoce L-selectina bovina, 2) pueden obtenerse fácilmente grandes cantidades de células, y 3) pueden usarse fácilmente animales jóvenes sanos (1 mes), en los que casi todos los linfocitos circulantes son positivos para L-selectina (conforme madura un animal, cae el porcentaje de linfocitos positivos para L-selectina).

Se inyectaron linfocitos bovinos tratados con EL-246 o con medio solo y marcados con FITC a ratones idénticos y se dejó que se dirigieran durante 4 horas. Después de la incubación, se sacrificaron los animales y se recogieron sangre y diversos órganos linfoides. Se determinó el porcentaje de células marcadas con FITC con respecto a células huésped no marcadas para cada tejido y se comparó dicho porcentaje con el de diversos tratamientos. La Tabla 2 muestra los datos combinados de 7 experimentos diferentes (excepto para la placa de Peyer que fue analizada 3 veces).

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TABLA 2 El pretratamiento de linfocitos bovinos con EL-246 bloquea su capacidad para dirigirse a ganglios linfáticos periféricos del ratón

	Tejido	Porcentaje de células huésped^{a}	Porcentaje de bloqueo^{b}
		Testigo	EL-246
	PLN	0,4 \pm 0,14	0,14 \pm 0,05 (P, 0,10)	65% (n = 7)
	MLN	0,48 \pm 0,22	0,24 \pm 0,08	50% (n = 7)
	PP	0,45 \pm 0,24	0,34 \pm 0,03	25% (n = 3)
	Bazo	1,54 \pm 0,63	1,30 \pm 0,50	15% (n = 7)
	Sangre	0,66 \pm 0,32	1,10 \pm 0,55	Sin reducción (n = 7)

a Los valores representan el porcentaje de células marcadas con FITC en 50.000 células analizadas de cada tejido y son medias \pm SEM procedentes del número de experimentos indicados. b Porcentaje de bloqueo por EL-246, calculado del modo siguiente: 100 (100x porcentaje de células en los tejidos después del tratamiento con EL-246/porcentaje de células en los tejidos de testigos). Los testigos eran células tratadas sólo con medio y luego inyectadas a ratones.

El porcentaje de linfocitos testigo marcados con FITC hallados en el ganglio linfático periférico variaba de 0,2% a 1,6%. Como se esperaba, hubo variabilidad (indicada por un SEM elevado) en el nivel de dirección entre experimentos que era probablemente debida a una variabilidad en las preparaciones celulares, animales y/o otros factores. Incluso con esta variación, los datos reunidos de ganglios linfáticos periféricos de tratamiento con testigo y con EL-246 eran significativamente diferentes (65% de inhibición, valor P de 0,10). Si se calculaba y promediaba el porcentaje de inhibición en cada experimento, se veía mucha menos variación (64% \pm 10 de SEM, significativo para un valor P < 0,01). También se vio bloqueo en todos los demás tejidos probados, aunque sólo fue ligeramente significativo en el ganglio linfático mesentérico (valor P de 0,30). La dirección reducida después del tratamiento con EL-246 no fue debida a que las células tratadas experimentaran un aclaramiento aumentado de la circulación, ya que los niveles sanguíneos eran iguales en los dos grupos de tratamiento (Tabla 2).

Se examinó el efecto de un anticuerpo testigo negativo (DREG55). Este anticuerpo tiene el mismo isotipo y era preparado de la misma manera que EL-246, pero no reconoce linfocitos bovinos. El ensayo de dirección in vivo de linfocitos xenogénicos fue realizado del modo descrito en la Tabla 2, y los efectos de EL-246 y de un anticuerpo testigo negativo (DREG55, que tiene igual isotipo que EL-246 pero no reconoce linfocitos bovinos) fueron evaluados por citometría de flujo. Los gráficos de curvas de nivel mostrados en la Figura 13 representan los análisis de este experimento y presentan el porcentaje de linfocitos bovinos marcados con FITC que se dirigían al bazo y los PLN después de tratamiento con EL-246, DREG 55 o medio solo (testigo). Se analizaron 50.000 células para cada punto temporal, y el umbral para las curvas de nivel fue el mismo en cada gráfico. Los cuadrantes se basaron en el límite superior de la fluorescencia de fondo.

La Figura 13 muestra gráficos citométricos de flujo por curvas de nivel representativos de los datos recogidos de animales a los que se había inyectado células tratadas con medio solo, DREG55 y EL-246, y marcadas con FITC. De nuevo, EL-246 bloqueaba la dirección al ganglio linfático periférico y disminuía ligeramente la acumulación en el bazo. DREG55 no producía efecto alguno sobre la acumulación de células en el PLN; sin embargo, afectaba de igual grado que EL-246 a la acumulación en el bazo. Es importante que EL-246 bloqueaba la dirección a PLN un 70% en comparación con el efecto de DREG55 aun cuando había 2 veces el nivel de células circulantes tratadas con EL-246 frente a las tratadas con DREG55 en los animales de ensayo. Estos resultados muestran que EL-246 es un inhibidor eficaz de L-selectina en este modelo in vivo.

Ejemplo 16 Tratamiento de la isquemia/reperfusión EL-246 mejora o inhibe la lesión por isquemia/reperfusión in vivo

En los experimentos se usaron ovejas de aproximadamente 24-30 kg de peso. Se siguió el aceptado modelo de isquemia/reperfusión de pulmón descrito por D. P. Kapelanski et al., 1.993, J. Heart Lung Transplant. 12: 294-306, incorporado aquí por referencia. En resumen, se provocó anestesia general en las ovejas con tiopental sódico y se mantuvo la misma mediante la administración continua de citrato de fentanilo. Se mantuvo una parálisis completa mediante la administración continua de bromuro de pancuronio.

Se proporcionó ventilación volúmicamente controlada (volumen de ventilación pulmonar: 600 ml; fracción de oxígeno inspirado: 0,53; relación de inspiración:espiración: 1:1; presión espiratoria final positiva: 490 Pa) (ventilador 608, Harvard Apparatus, Inc., S. Natick, Massachusetts, EE.UU.; mezclador de aire-oxígeno, Sechrist Industries, Inc., Anaheim, California, EE.UU.; válvula de presión espiratoria final positiva, Boehringer Laboratories, Inc., Norristown, Pennsylvania, EE.UU.) a través de un tubo tubo endotraqueal rebordeado de 8 mm. Se ajustó el índice del ventilador (10 a 15/min) en los donantes para alcanzar una presión arterial de dióxido de carbono (PaCO_{2}) de aproximadamente 4.000 Pa. Estos ajustes del ventilador se mantuvieron durante el resto del experimento.

Se midieron las presiones de oxígeno y dióxido de carbono en sangre y gas con electrodos micro-Clark y Severinghaus calibrados (NOVA Biomedical Corporation), a 37ºC. Se midió el pH sanguíneo usando un electrodo Sanz calibrado (NOVA Biomedical Corporation), a 37ºC. Las presiones en sangre y gas y el pH fueron corregidos en cuanto a temperatura corporal, presión y saturación usando los algoritmos de L. J. Thomas (1.972, J. Appl. Physiol. 33: 154-8). El consumo de oxígeno (VO_{2}) fue calculado a partir de la diferencia de contenidos de oxígeno arterial y venoso mixto y del rendimiento cardiaco. La eliminación de dióxido de carbono (VCO_{2}) fue calculada a partir de la presión de dióxido de carbono en el gas espirado mixto y de la ventilación espirada por minuto, suponiendo que no estaba presente dióxido de carbono en el gas inspirado. El VO_{2} y la VCO_{2} fueron ajustados como índices con respecto al peso corporal y fueron convertidos con respecto a condiciones estándares de temperatura, presión y humedad (STPD; del inglés, standard temperature pressure dry).

Se estimaron distribuciones de ventilación:perfusión continuas (VA/Q) usando la técnica de eliminación de gases inertes múltiples, del modo descrito por P. D. Wagner et al., (1.974, J. Appl. Physiol. 36: 588-99) y P. D. Wagner et al., (1.974, J. Appl. Physiol. 36: 600-5). Los gases inertes fueron extraídos de la sangre por equilibrio con nitrógeno a 37ºC. Las concentraciones de gases inertes en la fase gaseosa fueron determinadas por cromatografía de gases usando columnas de gran calibre (DB1, J&W Scientific, Folsom, California, EE.UU.; Pora Plot U, Chrompack, Middleburg, Holanda) y una máquina provista de detectores de ionización por llama y captura electrónica (Hewlett-Packard Co., Medical Products Group, Andover, Massachusetts, EE.UU.).

Se inició un periodo de tres horas de isquemia en el pulmón izquierdo de 19 animales por oclusión de la arterial pulmonar principal izquierda. Se administraron EL-246, que reconoce tanto L-selectina como E-selectina de oveja, y DREG 56, que reconoce el dominio de lectina de la L-selectina humana, por infusión a 8 y 3 animales, respectivamente, 10 minutos antes de la reperfusión del pulmón izquierdo. Cada animal recibió intravenosamente una infusión en forma de bolo en disolución salina al 0,9%, en una dosis de 1 mg de anticuerpo/kg de peso corporal. Ocho animales no recibieron tratamiento alguno con anticuerpo. Se registraron los parámetros fisiológicos de todos los sujetos a diversos intervalos de tiempo durante hasta 6 horas después del inicio de la reperfusión.

Cinco de los ocho animales no tratados (62,5% de mortalidad) murieron antes de 6 horas, como se muestra en la Figura 14. Todos los animales no tratados (testigos isquémicos) mostraron una pérdida de función pulmonar antes de 30 minutos después del inicio de la reperfusión, que decaía progresivamente durante toda la reperfusión. La pérdida de función pulmonar venía indicada por una reducción de la presión arterial de oxígeno (P_{a}O_{2}) con un aumento de la presión arterial de dióxido de carbono (P_{a}CO_{2}).

Dos de los tres animales tratados con DREG 56 (66,7% de mortalidad) murieron antes de 6 horas, como se muestra en la Figura 14. Todos los animales tratados con DREG 56 mostraron una pérdida de función pulmonar durante todo el experimento. Estos resultados no eran estadísticamente diferentes de los resultados de los testigos no tratados. Por lo tanto, DREG 56, que reconoce el dominio de lectina de la L-selectina de seres humanos y bovinos pero no reconoce la L-selectina de ovejas, falló a la hora de proteger a las ovejas de la lesión por isquemia/reperfusión.

Los ocho animales tratados con EL-246 (cero por ciento de mortalidad) sobrevivieron a lo largo del experimento entero (Figura 14). Todos los animales tratados con EL-246 mostraron una pérdida inmediata de función pulmonar (antes de 30 minutos) después del inicio de la reperfusión. Sin embargo, antes de 2 horas, la función pulmonar de todos los animales tratados con EL-246 mejoró significativamente hasta alcanzarse los niveles de P_{a}O_{2} y P_{a}CO_{2} hallados en la sangre de animales normales. Por lo tanto, EL-246 es un agente terapéutico eficaz in vivo ya que dio lugar a una supervivencia de animales tratados del 100%, así como a una función pulmomar mejorada.

Ejemplo 17 Determinación de niveles saturantes de anticuerpo en el suero de animales tratados

El suero de animales tratados (véase el Ejemplo 15) fue analizado 30 minutos después de la inyección de EL-246 o DREG 56 en cuanto a niveles saturantes de anticuerpo. Para estos análisis se usó la tinción de células L1/2 de ratón transfectadas con cDNA de E-selectina y L-selectina, mediante citometría de flujo. Se usaron diluciones sucesivas al doble de las muestras de suero para teñir los transfectantes, seguidas de FITC-segunda fase, y se comparó la fluorescencia con la proporcionada por niveles saturantes del anticuerpo EL-246 o DREG 56 purificado. La máxima tinción de los transfectantes fue detectada en todas las muestras de suero diluidas 1:8 (tanto para EL-246 como para DREG 56), lo que indicaba que se alcanzaban niveles saturantes de anticuerpo en los animales.

Ejemplo 18 Semivida de EL-246 en circulación

El título de EL-246 en el suero de los ocho animales tratados fue seguido a lo largo de las 6 horas de experimento (Ejemplo 15). No se advirtió caída significativa alguna en el nivel de EL-246. La Figura 15 muestra el porcentaje de tinción máxima de los transfectantes de L-selectina tratados con diferentes diluciones de las muestras de suero tomadas de los ocho animales 30, 90 y 360 minutos después del inicio de la reperfusión. Se mantuvieron durante 6 horas niveles saturantes de EL-246 después de la inyección de 1 mg/kg, aunque se advirtió variabilidad en los títulos a las 6 horas (Figura 15). De este modo, EL-246 no resultó rápidamente aclarado de la circulación.

Claims (24)

1. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento ligante de antígeno del mismo, que tienen la especificidad del anticuerpo monoclonal EL 246 secretado por un hibridoma que tiene el nº de registro HB11049 de la ATCC.

2. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento ligante de antígeno es capaz de unirse tanto a E-selectina como a L-selectina en el mismo animal.

3. Un anticuerpo monoclonal o un fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento ligante de antígeno es capaz de inhibir las interacciones célula-célula mediadas tanto por E-selectina como por L-selectina.

4. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con la Reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo o fragmento ligante de antígeno no se une a P-selectina.

5. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo o fragmento ligante de antígeno es capaz de inhibir la rodadura de leucocitos sobre una capa de células endoteliales.

6. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo o fragmento ligante de antígeno es capaz de inhibir la dirección de linfocitos a tejidos periféricos.

7. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo o fragmento ligante de antígeno es capaz de inhibir una respuesta inflamatoria.

8. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.

9. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo está humanizado, de modo que es no inmunogénico en un ser humano.

10. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para uso en la inhibición de la rodadura de leucocitos, asociada con inflamación, sobre una capa de células endoteliales.

11. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para uso en la inhibición de la dirección de linfocitos, asociada con inflamación, a tejidos periféricos.

12. Un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para uso en la inhibición de una respuesta inflamatoria.

13. Uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de la rodadura de leucocitos, asociada con inflamación, sobre una capa de células endoteliales.

14. Uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de la dirección de linfocitos, asociada con inflamación, a tejidos periféricos.

15. Uso de un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para uso en la inhibición de una respuesta inflamatoria.

16. Un método in vitro para inhibir la adhesión de una primera célula que lleva una molécula de selectina a una segunda célula que lleva un receptor de selectina, que comprende poner dichas células en contacto con anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 bajo condiciones en que los anticuerpos se unen a las células en una cantidad suficiente para evitar que la primera célula se una a la segunda célula.

17. Un método de acuerdo con la Reivindicación 16, en el que la selectina es E-selectina o L-selectina.

18. Una línea celular que secreta un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones
1-9.

19. Una línea celular de acuerdo con la Reivindicación 18, que tiene el nº de registro HB11049 de la ATCC.

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20. Un método para detectar células que llevan E-selectina o L-selectina en una muestra biológica de la que se sospecha que contiene células que llevan selectina, que comprende:

(a) poner la muestra en contacto con anticuerpos o fragmentos ligantes de antígeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, para formar un complejo inmune con células que llevan E-selectina o L-selectina, y

(b) detectar la presencia del complejo inmune.

21. Un método para diagnosticar enfermedades inflamatorias, que comprende el método de acuerdo con la Reivindicación 20.

22. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento ligante de antígeno de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Una composición farmacéutica de acuerdo con la Reivindicación 22, que comprende además un agente antiinflamatorio seleccionado del grupo que consiste en catecolaminas, resorcinoles, saligeninas, efedrina, glucocorticoides, cromolina sódica y anticolinérgicos.

24. Un procedimiento para producir un anticuerpo monoclonal que reconozca E-selectina humana y L-selectina humana, que comprende:

(a) inmunizar un mamífero con un inmunógeno compuesto de una célula transfectada con cDNA de E-selectina humana,

(b) fusionar linfocitos del mamífero inmunizado, con células de mieloma,

(c) seleccionar células híbridas que secreten anticuerpos que reconozcan un determinante antigénico común de la L-selectina humana y la E-selectina humana, y

(d) aislar los anticuerpos.