KR100252621B1

KR100252621B1 - 내피성-백혈구 부착 분자-1 및 그에 대한 항체의 천식치료에 있어서의 용도

Info

Publication number: KR100252621B1
Application number: KR1019930700797A
Authority: KR
Inventors: 에이취. 건델 로버트; 디. 웨그너 그레이그; 고든 렛츠 엘.; 웨인 스미스 씨.
Original assignee: 데이비드 이. 프랭크하우저; 베링거 인겔하임 파마슈티칼즈 인코포레이티드; 크로커 사무엘 에스; 베일러 칼리지 오브 메디신
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-31
Publication date: 2000-09-01
Also published as: CA2083273A1; ATE173503T1; EP0551501A4; HU9300928D0; DE69227618T2; HUT69623A; AU663332B2; US5843441A; ES2123570T3; AU2441092A; DK0551501T3; KR930702025A; HU215549B; WO1993002702A1; DE69227618D1; EP0551501B1; JPH06502195A; EP0551501A1

Abstract

본 발명은 다음 성분 (a) 내지 (h)로 구성된 그룹으로부터 선택된 약제를 사용하여 천식환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

(a) ELAM-1에 결합가능한 항체;

(b) ELAM-1에 결합가능한, 항체(a)의 단편;

(c) 실질적으로 천연 오염물질을 함유하지 않는 ELAM-1;

(d) ELAM-1의 기능적 유도체;

(e) ELAM-1 수용체에 결합가능한 항체;

(f) ELAM-1 수용체에 결합가능한, 항체(e)의 단편;

(g) 실질적으로 천연 오염물질을 함유하지 않는 ELAM-1 수용체; 및

(h) ELAM-1 수용체의 기능적 유도체

Description

[발명의 명칭]

내피성-백혈구 부착 분자-1 및 그에 대한 항체의 천식치료에 있어서의 용도

[발명의 분야]

본 발명은 내피성-백혈구 부착 분자-1(endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 : ELAM-1), 그에 대한 리간드 및 항체의 천식치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.

[발명의 배경]

ELAM-1은 유발성 내피 세포 표면 당 단백질이다. ELAM-1은 염증성 물질에 대한 반응으로 내피세포에 의해 합성되며 호중구, 단구 및 임파구의 아군집(subpopulation)의 부착을 증진시킨다. ELAM-1의 일차적인 아미노산 서열은 렉틴-양 아미노 말단, EGF-양 영역, 및 상보적 조절 단백질에서 발견되는 것과 유사한 여섯개의 동갑성(consensus) 반복물을 함유하는 복합 영역 구조물(complex domain structure)임을 시사한다. 그의 발현은 시험관내 및 생체내에서 활성화된 혈관 내피로 비교적 제한되어 있다. ELAM-1은 혈관계 내에서 순환세포의 상호작용에 필수적인 부착-수용체 당단백질 군의 하나이다. 이러한 당단백질 군은 셀렉틴(selectis) 또는 LEC-CAMS로 명명되어 왔다. 그밖의 다른 셀렉틴은 LecCAM-1 및 CD62이다[참조 : Springer et al, Nature 349(17) : 196(1991) and Bevilacqua et al, “Identification and Characterization of Endothelial-Leukocyte Adhesion Moloecule-1”, Chapter 16, Leukocyte Adhesion Molecules(T.A. Springer, D.C. Anderson, A.S. Rosenthal and R. Rothlein, Eds.)(Springer-Verlag New York Inc. 1990)].

천식은 이종 질병군이다. 천식은 자극에 대한 기관 기관지의 과잉반응에 의해 특정화된다[McFadden, E. R. et al., In : Harrison′s Principles of Internal Medicine, 10th Ed., Petersdorf, R.G. et al., Eds., McGraw-Hill, NY(1983), pages 1512-1519), Kay, A.B., Allergy and Inflammation, Academic Press, NY(1987); 이들은 참고문헌으로 본 발명에 인용되어 있다]. 임상적으로, 천식은 기관기관지의 광범위한 협착, 농조한 점착성 분비물, 호흡곤란의 발작, 기침 및 천명에 의해 특정화된다. 비록 이러한 각각의 상태들의 상대적인 관여도는 알 수 없지만, 순수한 결과는 기도저항의 증가, 폐와 흉곽의 과잉팽창, 환기와 폐혈류의 비정상적인 분포이다. 이 질병은 무증상 기간 사이에 산재된 우발적 기간에 급성 증상을 나타낸다. 급성 에피소드(episode)들은 저산소증을 야기시키며 치명적일 수 있다. 전체 세계 인구의 약 3%가 이 질병을 앓고 있다.

천식은 알레르기성 천식과 특이체질성 천식의 2가지 타입이 알려져 있다. 알레르기성 천식은 일반적으로 비염, 담마진, 습진 등과 같은 유전적 알레르기성 질병과 관련되어 있다. 이러한 상태는 공기 전달된 항원(예를들면 화분, 환경적 또는 직업적 오염물질 등)의 피내 주입에 대한 양성 팽진-발적 반응(wheal-and-flare reaction) 및 IgE의 증가된 혈청농도에 의해 특정화된다. 대부분의 환자에게 있어서 알레르기성 천식의 발생은 원인적으로 IgE 항체의 존재에 관련되어 있는 것으로 보인다. 상술한 특징들을 나타내지 않는 천식환자는 특이체질성 천식인 것으로 생각된다.

알레르기성 천식은 T 및 B 임파구에 의해 조절되는 IgE 반응에 의존적이며, 공기 전달된 항원과 비만세포-결합된 전 형성된 IgE 분자와의 상호작용에 의해 활성화되는 것으로 믿어진다. 항원적 공격은 개체를 민감하게 하기 위하여 장기간동안 IgE 생산을 유도하기에 충분한 농도에서 일어나야 한다. 일단 민감하게 되면, 천식환자는 매우 낮은 항원수준에 대한 반응으로 증상을 나타낼 수도 있다.

천식증상은 공격성 항원(triggering antigen), 환경적 요인, 직업적 요인, 신체적인 힘의 발휘 및 감정적 스트레스의 존재 및 정도에 의해 악화될 수도 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 천식환자에게 다음 (a) 내지 (h)의 성분들로 구성된 그룹중에서 선택된 약제의 치료학적 유효량을 투여함을 특징으로 하여 천식환자를 치료하는 방법에 관한 것이다 :

(a) ELAM-1에 결합가능한 항체;

(b) ELAM-1에 결합가능한, 항체(a)의 단편;

(c) 실질적으로 천연 오염물질을 함유하지 않는 ELAM-1;

(d) ELAM-1의 기능적 유도체;

(e) ELAM-1 수용체에 결합가능한 항체;

(f) ELAM-1 수용체에 결합가능한, 항체(e)의 단편;

(h) ELAM-1 수용체의 기능적 유도체

[도면의 간단한 설명]

제1도는 항원 흡입 공격 전 및 공격 후 여러 시점에서의 기도세포 조성을 나타낸다. 항원 공격 전에는 대다수의 호산구가 회복된다. 공격 후에 호산구 수는 감소하지만 1일만에 공격 전 수준으로 회복되며, 7일 및 14일째에는 증가된 상태로 유지한다. 말기 기관지 수축반응과 관련하여 호중구의 현저한 유입이 있다.

제2도는 공격 후 6시간째에 조직생검에 의해 수득된 폐 조직상에서 (a) 정상적인 쥐 혈청; (b) ICAM-1에 대한 항체; 및 (c) ELAM-1에 대한 항체로 면역조직 화학적으로 염색한 결과를 나타낸 것이다. ICAM-1 염색은 기도상피 및 혈관내피 모두에서 발견된다. 반면에 ELAM-1에 대한 염색은 기도혈관 내피에서만 명백하다.

제3도는 대조군 동물(비히클로 처리) 및 안티-ELAM-1(CL2) 처리된 동물에 있어서의 총 백혈구(A) 및 호중구(B)의 회복을 나타낸 것이다. CL2(2mg/kg, i.v.)는 항원 흡입후 6시간만에 폐속으로 침윤된 호중구 수 뿐 아니라 총 백혈구 수도 현저히 감소시켰다.

제4도는 급성반응 및 말기 반응에 대한 안티-ELAM-1(CL2) 치료의 효과를 나타낸 것이다. CL2는 말기반응을 현저히 감소시켰으나, 항원 공격 후의 급성기도 폐색에는 뚜렷한 효과를 내지 못하였다.

[발명의 설명]

본 발명은 천식환자에게 다음 (a) 내지 (h)의 성분들로 구성된 그룹으로부터 선택된 약제의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 특징으로 하여 천식환자를 치료하는 방법에 관한 것이다 :

(a) ELAM-1에 결합가능한 항체;

(b) ELAM-1에 결합가능한, 항체(a)의 단편;

(c) 실질적으로 천연 오염물질을 함유하지 않는 ELAM-1;

(d) ELAM-1의 기능적 유도체;

(e) ELAM-1 수용체에 결합가능한 항체;

(f) ELAM-1 수용체에 결합가능한, 항체(e)의 단편;

(h) ELAM-1 수용체의 기능적 유도체

본 명세서에서 사용된 것으로 “천식”은 알레르기성 천식이나 특이체질 천식을 의미한다. 약제들은 만약 그것이 천식증상의 중증도, 정도 또는 지속기간을 감소시킬 수(즉 경감시킬 수) 있다면 천식치료에 있어서 치료학적 잠재력을 갖고 있다고 말한다. 본 명세서에서 사용된 것으로 약제는 만약 그 약제가 환자에게 투여되었을때 천식증상의 중증도, 정도 및 지속기간중 어느 하나를 감소시킬 수 있다면 천식을 치료할 수 있는 것으로 본다.

본 발명의 한가지 관점은 ELAM-1이 항원-유도된 기도염증의 발생에 실질적으로 관여한다는 발견으로부터 유도된다.

ELAM-1은 내피세포 표면상에서 발현되는 분자로서, 백혈구가 내피세포에 부착하는 것을 매개한다(Bevilacqua et al, Science 243 : 1160(1989), 이들은 참고문헌으로 본 발명에 인용되었다).

본 명세서에서 사용된 것으로 “ELAM-1 수용체”는 백혈구 표면상에서 발현되는 분자로서, ELAM-1에 결합하며 내피세포에 대한 ELAM-1-매개된 결합에 관련된다. 이것은 ELAM-1의 탄수화물 리간드를 포함한다.

본 발명의 또다른 관점은 호중구의 유입 및 혈관내피상의 ELAM-1에 대한 결합을 예방하거나 억제하는 약제가 천식치료에 이용될 수 있다는 발견이다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 약제의 한가지 예는 ELAM-1 및 ELAM-1의 기능적 유도체이다. ELAM-1은 호중구 세포표면상의 수용체 분자에 결합함으로써 혈관내피에 대한 호중구의 부착을 매개하기 때문에, 호중구 상에 존재하는 ELAM-1 수용체에 결합할 수 있는 ELAM-1의 기능적 유도체는 폐의 내피세포상의 ELAM-1과 상경적일 것이며, 따라서 호중구의 부착을 감소시키고 천식을 치료하게 된다.

ELAM-1의 “기능적 유도체”는 ELAM-1의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적이거나 구조적)을 갖는 화합물이다. “기능적 유도체”란 용어는 분자의 “단편”, “변이체”, 또는 “화학적 유도체”를 포함한다.

ELAM-1과 같은 분자의 “단편”은 그 분자의 어떤 폴리펩티드 또는 탄수화물의 부분집합에 해당하는 것을 의미한다. ELAM-1 활성을 가지며 가용성인(즉, 막에 결합하지 않는) ELAM-1의 단편이 특히 바람직하다.

ELAM-1과 같은 분자의 “변이체”는 전체 분자 또는 그의 단편과 구조 및 기능에 있어서 실질적으로 유사한 분자에 해당하는 것을 의미한다. 두 분자가 실질적으로 유사한 구조를 갖거나, 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 갖는다면 한 분자는 다른 분자와 “실질적으로 유사하다”고 한다. 한 분자가 통상적으로 그 분자의 일부분이 아닌 추가의 화학적 부분을 함유하는 경우에 그것은 다른 분자의 “화학적 유도체”라고 한다. 그러한 부분은 그 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 향상시킬 수 있다.

천식 치료를 위해 본 발명에 따라 이용될 수 있는 약제의 또다른 예는 ELAM-1 수용체 또는 그의 기능적 유도체이다. 이러한 분자 및 그의 기능적 유도체는 내피세포의 ELAM-1에 결합함으로써, 백혈구의 결합 및 부착을 매개하는 그러한 세포의 능력을 손상시킴으로써 천식을 치료할 수 있다. 본 발명에서 특히 흥미로운 것은 가용성 분자인 ELAM-1 수용체의 기능적 유도체이다. ELAM-1 수용체의 예로는 시알릴화된 락토실세라마이드[참조예 : Tiemeyer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1138(1991)], 또는 시알릴 루이스(Lewis) X 항원을 함유하는 당지질 또는 당단백질[참조예 : Lowe et al., Cell 63 : 475(1990)]와 같은 호중구상의 ELAM-1의 탄수화물 리간드이다.

ELAM-1 및 ELAM-1 수용체는 면역원성 분자이다. 따라서, ELAM-1 또는 ELAM-1 수용체에 결합가능한 항체를 수득할 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 방법에 따라 천식치료에 이용될 수 있다.

이러한 항체는 정제된 분자(또는 이러한 분자를 천연적으로 발현하는 세포)를 복강 주사 등에 의해 적당한 동물에 주입함으로써 수득될 수 있다. 필요에 따라, 이러한 동물의 혈청을 채취하여 이들 분자를 결합시킬 수 있는 폴리클로날 항체의 공급원으로 사용할 수 있다. 그러나 이러한 동물로부터 비세포(splenocyte)를 채취하여 이 비장세포를 골수종 세포주와 융합시키고 이러한 융합세포가 ELAM-1을 결합시킬 수 있는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마(hybridoma) 세포를 형성하도록 하는 것이 바람직하다.

상술한 방법으로 수득된 하이브리도마 세포는 상술한 바와같이 검색하여 ELAM-1 또는 ELAM-1 수용체에 결합가능한 항체를 분비하는 목적하는 하이브리도마 세포를 확인할 수 있다.

이러한 항체들은 ELAM-1 또는 ELAM-1 수용체에 결합할 수 있는 능력을 갖고 있으므로, 이들(및 Fab, F(ab)₂등과 같이 항원 결합 능력을 갖는 그들의 단편들)을 사용하여 호중구 부착을 감소시킬 수 있으며, 따라서 이들은 천식 치료를 위해 본 발명에 따라 이용될 수 있는 약제의 추가의 예로 제공된다.

상기 언급한 바와 같이, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 모두 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에서 특히 흥미로운 것은 인체에서 생성되었거나, 재조합 기술 또는 다른 기술에 의해서 “인체화시킨(humanized)”(즉 인체에서 비 면역원성인) ELAM-1에 대한 항체이다. 인체화된 항체는 예를들어 항체의 면역원성 부분을 상응하는, 그러나 비 면역원성인 부분으로 치환시킴으로써 생성될 수 있다[즉 키메릭(chimeric) 항체](Robinson et al, 국제 특허출원 제184,187호; Taniguchi, M., 유럽 특허원 제171,496호; Morrison, S.L. et al, 유럽 특허원 제173,494호; Neuberger et al, PCT 출원 제WO 86/01533; Cabilly et al, 유럽 특허원 제125,023호; Better et al, Science 240 : 1041(1988); Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3439(1987); Liu et al, J. Immunol. 139 : 3521(1987); Sun et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 214(1987); Nishimura et al, Canc. Res. 47 : 999(1987); Wood et al, Nature 314 : 446(1985)); Shaw et al, J. Natl. Cancer Inst. 80 : 1553(1988)).

“인체화”키메릭 항체의 총괄적인 검토는 문헌[Morrison, S., Science 229 : 1202(1985); Oi et al., BioTechniques 4 : 214(1986)]에 이루어져 있다.

적합한 “인체화”항체는 CDR 또는 CEA 치환에 의해서 선택적으로 생성될 수 있다[Jones et al, Nature 321 : 552(1986); Verhoeyan et al, Science 239 : 1534(1988); Beidler et al, J. Immunol. 141 : 4053(1988)].

본 발명의 천식치료제는 천연적 과정(예를들어, 동물, 식물, 진균, 박테리아 등이 ELAM-1의 비-면역 글로블린 길항제를 생성하도록 유도하거나, 동물이 ELAM-1에 결합할 수 있는 폴리클로날 항체를 생성하도록 유도함으로써); 합성방법(예를들어, 폴리펩티드를 합성하기 위한 메리필드(Merrifield) 방법을 사용하여 ELAM-1, ELAM-1의 기능적 유도체, 또는 ELAM-1의 단백질 길항제(면역 글로블린 또는 비-면역 글로블린)를 합성함으로써); 하이브리도마 기술(예를들어, ELAM-1에 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 생성시킴으로써); 또는 재조합 기술(예를들어, 다양한 숙주(즉, 효모, 박테리아, 진균, 배양된 포유동물세포 등)에서 또는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로부터 본 발명의 천식치료제를 생성시킴으로써), 또는 단백질 가수분해에 의해 수득될 수 있다. 어떤 방법을 이용할 것인가 하는 선택은 편의, 목적하는 수율 등과 같은 요인에 따라 이루어질 것이다. 특정의 천식치료제를 생성시키기 위해서 상술한 방법, 과정, 또는 기술중 단지 한가지만을 이용할 필요는 없으며; 상기 과정, 방법 및 기술을 특정의 천식치료제를 수득하기 위하여 조합할 수도 있다.

약 100개 이하의 잔기를 갖는, ELAM-1의 기능적 유도체는 시험관내 합성에 의해 편리하게 제조할 수 있다. 필요에 따라, 이러한 단편은 정제 단백질 또는 조 단백질의 표적화된 아미노산기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제(derivatizing agent)와 반응시킴으로써 변형될 수 있다. 생성된 공유결합 유도체는 생물학적 활성에 중요한 잔기를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 천식치료제의 치료학적 효과는 이러한 약제를 적당한 방법에 의해(즉, 정맥내, 근육내, 피하, 장내, 또는 비경구적으로) 환자에게 공급함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명의 약제는 비내 분무하거나 면봉(swab) 등에 의해 비내 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 약제는 경구 흡입시키거나, 또는 구강 스프레이 또는 구강 에어로졸에 의해 투여하는 것이 특히 바람직하다. 주사로 약제를 투여할때는 연속 주입에 의할 수도 있고 하나 또는 다수의 농축괴에 의할 수도 있다.

상기 언급된 약제의 치료학적 이점은 담체와의 결합을 증진시키거나 약제의 활성을 증가시키기 위하여 첨가된 추가의 아미노산 잔기를 함유하는 기능적 유도체의 사용에 의해 증대될 수 있다. 또한 특정의 아미노산 잔기가 결여되었거나, 변형된 아미노산 잔기를 함유하는 ELAM-1의 기능적 유도체라도 그러한 유도체가 세포부착에 영향을 주는 능력을 나타내는한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 항체인 ELAM-1 분자 및 ELAM-1 수용체는, 만약 그들을 함유하는 제제가 정상적으로 및 천연적으로 이러한 생성물과 함께 발견되는 물질을 실질적으로 함유하지 않는다면, “실질적으로 천연 오염물질을 함유하지 않는”것으로 본다.

본 발명은 ELAM-1 또는 ELAM-1 수용체에 결합할 수 있는 항체 및 그의 생물학적 활성 단편(폴리클로날이든 모노클로날이든)의 천식 치료시의 사용에까지 확대된다.

수용환자에게 본 발명의 천식치료제를 공급함에 있어서, 투여 약제의 용량은 환자의 연령, 체중, 신장, 성별, 전반적인 건강상태, 이전의 병력 등에 따라 달라진다. 비록 더 소량이나 고용량이 투여될 수 있지만, 일반적으로 수용환자에게 약 1pg/kg 내지 10mg/kg(환자의 체중) 범위의 약제량을 제공하는 것이 바람직하다. 치료학적 유효용량은 상기 약제들의 배합물을 사용함으로써 더 저하시킬 수 있다. 두 화합물의 투여가 시간적으로 몹시 근접하여 양 화합물이 환자의 혈청에서 동시에 검출될 수 있을때는, 여기서 사용된 한 화합물은 두번째 화합물과 부가적으로 투여된 것으로 본다.

본 발명의 천식치료제는 천식증상의 중증도, 정도, 지속기간을 감소시키거나 약화시키기에 충분한 양으로 수용체에게 공급되도록 한다.

본 발명의 항체 제제 또는 그의 단편은 단독 투여될 수도 있고, 천식증상을 치료하기 위해 요구되는 약제량을 감소시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 추가의 천식치료제, 예를들어 메틸크산틴(예를들어, 데오필린), 베타-아드레날린성 작동제(agonist)(예를들어 카테콜아민, 레조르시놀, 살리게닌 및 에페드린), 글루코코르티코이드(예를들어, 히드로코티손), 크로몬(예를들어, 크로몰린 나트륨) 및 항콜린제(예를들어 아트로핀)와 배합하여 투여될 수도 있다.

본 발명의 약제의 투여는 예방목적이거나 치료목적일 수 있다. 예방적으로 투여되는 경우에는, 어떠한 천식증상도 나타나기 전에 약제를 공급한다. 약제의 예방적 투여는 추후의 천식성 반응을 방지하거나 약화시키는데 도움이 된다. 치료목적으로 투여하는 경우에는, 약제를 천식 증상의 발현시에(또는 그 직후에) 공급한다. 약제의 치료학적 투여는 어떤 실제적인 천식 에피소드를 약화시키는데 도움이 된다. 따라서 본 발명의 약제는 예상되는 천식 에피소드의 발현전이나(예상되는 에피소드의 중증도, 지속기간 또는 정도를 약화시키기 위해서) 에피소드의 개시후에 공급될 수 있다.

조성물은 만약 그의 투여가 수용환자에게 있어서 내약성이 있으면 “약리학적으로 허용가능한”것으로 본다. 이러한 약제는 만약 투여량이 생리학적으로 중요한 것이라면, 치료학적 유효량으로 투여된 것으로 본다. 약제는 만약 그것의 존재가 수용환자의 생리기능에 감지할만한 변화를 가져온다면 생리학적으로 의미있다고 본다.

본 발명의 약제는 공지의 방법에 따라 이러한 성분 또는 그의 기능적 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체 비히클과의 혼합물로 결합시킴으로써, 약제학적으로 유용한 조성물로 제형화시킬 수 있다. 인체 혈청 알부민과 같은 여타의 인체 단백질을 포함하는 적당한 비히클 및 그의 제형화는 예를들어 문헌[Remington′s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A., Ed., Mack, Easton PA(1980)]에 기술되어 있다. 효과적인 투여에 적합한, 약제학적으로 허용되는 조성물을 형성하기 위하여, 그러한 조성물은 적합한 양의 담체 비히클과 함께 유효량의 안티-ELAM-1 항체 또는 ELAM-1 분자, 또는 그들의 기능적 유도체를 함유할 것이다.

작용의 지속기간을 조절하기 위하여 추가의 약제학적 방법이 이용될 수 있다. 방출 조절형 제제는 중합체를 사용하여 안티-ELAM-1 항체 또는 ELAM-1, 또는 그들의 기능적 유도체를 복합체화하거나 흡착시킴으로써 달성될 수 있다. 조절된 방출은 방출을 조절하기 위한 혼합방법 뿐 아니라 적당한 거대분자(예를들어 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시 메틸셀룰로오스, 또는 프로타민 설페이트) 및 거대 분자의 농도를 선택함으로써 수행될 수 있다. 방출 조절형 제제에 의하여 작용 지속기간을 조절하는 또다른 가능한 방법은 안티-ELAM-1 항체 또는 ELAM-1 분자, 또는 그들의 기능적 유도체를 폴리에스테르, 폴리아미노산, 히드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체와 같은 중합체 물질의 입자내에 혼입시키는 것이다. 또는 이러한 약제를 중합체 입자내에 혼입시키는 대신에, 예를들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합방법에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를들어 각각 히드록시메틸 셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타실레이트)마이크로 캡슐내에, 또는 리포조옴, 알부민 중심체, 마이크로에멀션, 나노입자, 나노캅셀 또는 마크로에멀션과 같은 콜로이드성 약물전달 시스템내에 이러한 약제를 포함시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington′s Pharmaceutical Sciences(1980)]에 기술되어 있다.

지금까지 본 발명을 전반적으로 기술하여 왔는데 이들은 다음의 실시예를 참고로 하여 더 용이하게 이해될 것이며, 이들 실시예는 설명의 목적으로 제시된 것으로서 만약 지정되지 않았다면 본 발명에만 국한되지는 않는다.

다음의 실시예에는 영장류에서의 항원-유도된 급성 기도염증 및 말기 기도폐색의 발생시에 두가지 혈관 부착분자, 즉 ICAM-1 및 ELAM-1의 기능이 기술되어 있다.

[실시예 1]

A. 재료 및 방법

동물 : 본 시험에서 사용된 동물은 체중 약 4 내지 8kg의 야생 포획된 성숙한 수컷 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이(Macaca fascicularis)이다(Charles River Breeding Laboratories, Inc., Primate Imports, Port Washington, N.Y.). 각 동물은 특별히 고안된 개발 메쉬(mesh) 우리에 제각기 수용되었으며, 하루에 두끼의 식사를 제공하고 물은 무제한으로 공급한다.

시험방법 : 각 동물은 케타민(4mg/kg; Ketaset, Myoderm Medical Supply, Norristown, PA) 및 크실라진(1mg/kg; Rompun, Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL)을 근육주사하여 마취시키고, 커프(cuff)된 기관내 튜브를 삽관시킨 후 앙와위로 놓는다. 필요할 경우 보충적 마취를 위해 케타민을 사용한다. 그 후, 각 동물에 모노클로날 항체 또는 비히클(식염수)을 농축괴 정맥주사한다. 그다음 동물을 특별히 고안된 지지의자에 직립자세로 앉힌 후에 소아과용 섬유광시 기관지경(Pediatric fiberoptic bronchoscope)으로 기관지 폐포세척(bronchoalveolar lavage : BAL)을 수행함으로써 기도세포 조성을 평가한다. 기저 호흡기계 저항(Rrs)을 약 15분동안 검사한 후 흡입 항원 공격을 행한다(정맥치료 후 1시간). 1시간동안 연속적으로 Rrs를 검사한 후 동물을 마취에서 깨어나게 하여 우리로 되돌려 보낸다. 말기 반응을 기록하기 위해서 항원 흡입 후 4, 6, 8 및 10시간째에 Rrs를 15분간에 걸쳐 검사한다. 피크(peak) 말기 반응동안 폐내로의 세포 유입은 BAL(항원 공격전에 세척된 반대쪽 폐)을 수행함으로써 평가한다.

시험은 각 동물이 그 자신의 대조군 역할도 하게끔, 일괄된 대조 실험(비히클 처리)이 각 동물에 대해 수행되도록 고안되었다. 각 시험은 14일 간격을 두어 행한다.

모노클로날 항체 CL2 : ELAM-1에 대한 항체(CL2)는 문헌(Picker et al, Nature 349 : 796(1991))에 기술된 바와같이 생성되었다. 저장용 CL2 용액은 말초다리 정맥에 정맥내 주사하기 직전에 식염수로 희석한다(최종 농도 2mg/ml). CL2 치료는 항원 흡입 공격 1시간 전에 제공된다.

Rrs 측정 : 호흡기계 임피던스(impedance)(Rrs)는 문헌(Wegner et al, Respir, Physiol. 55 : 47(1984))에 기술된 바와 같이 호흡에 가해진 불연속 진동수(11의 동일한 로가리즘 스텝에서 4 내지 40Hz) 사인곡선형 강제 진동에 의하여 측정한다. Rrs의 단일 수치표시를 제공하기 위해 전체 진동수 범위에 걸쳐서 Zrs의 실수 또는 인페이즈(inphase) 성분의 평균값을 계산한다.

기관지 폐포 세척(BAL) : BAL은 섬유광시 기관지경(Olympus Optical, model 3C-10, Lake Success, N.Y.)을 기관 분기부를 지나 5번째에서 7번째 발생 기관지 사이로 밀어넣도록 유도함으로써 수행된다. 중탄산염 완충된 식염수 용액(pH 7.4, 23℃) 15ml 분취액을 주입한 다음 기관지경내의 통로를 통하여 온화하게 흡인시킨다. 수집된 시료는 2000RPM에서 10분간 원심분리하고, 수득된 세포 펠릿은 Ca⁺⁺및 Mg⁺⁺부재 행크(Hank)의 균형 염용액에 재현탁시킨다. BAL 방법이 온화한 염증성 반응을 일으킨다는 것은 이미 밝혀져 있다. 따라서 폐 세포 조성에 대한 BAL의 가능한 영향을 피하기 위하여 항원 공격 전후에 우측 및 좌측 폐에 번갈아 가면서 BAL을 수행한다. 주입된 완충액의 회수된 부피는 시험 전반에 걸쳐 매우 일정했으며, 동물도 이 방법을 잘 견디었다. 전체 백혈구 수는 코울터(Coulter) 계수기(Coulter Electronics, model #10, Hialeah, FL)를 사용하여 얻는다.

항원 흡입 공격 : 항원 흡입 공격은 버드 마드(Bird Mard) 7A 호흡계(respirator) 및 마이크로분무기(micronebulizer : Bird Corporation, model #8158)에 의한 간헐적인 양압 호흡으로 제공한다. 각각의 공격은 2분동안 분당 15호흡(최대 흡입 압력 20cmH₂O)으로 이루어진다. 아스카리스 섬(Ascaris summ) 추출물(Greer Laboratories, Lenoir, NC)을 인산염 완충된 식염수(PBS, pH 7.4)로 각 동물에 대해 적절한 농도(급성 반응 동안에 Rrs를 200 내지 500% 증가시키는데 필요한 양)가 되도록 희석한다. 항원 공격은 각 동물에 대해 14일 간격을 두고 행한다. 각 동물은 시험당일전 18시간동안 단식시킨다.

조직화학 : BAL 세포는 디프-퀵(Diff-Quick) 염료(Fisher Scientific, St. Louis, MO)로 염색된 세포 원심분리 제제를 이용하여 평가한다. 감별 세포수는 200개의 세포를 세어 결정하며 각 세포 타입의 비율을 기록한다.

조직학 : 폐 조직 생검 시료는 항원 공격전 및 피크 말기반응중에 조직생검용 겸자(forcep) 및 섬유광시 기관지경에 의해 수득한다. 폐 형관내피 및 기도 상피상의 ELAM-1을 확인하기 위한 면역 조직 화학적 염색을 문헌(Wegner et al., Science 247 : 456(1990))에 기술된 바와 같이 수행한다.

통계학적 분석 : 데이타는 분산의 이원분석 및 프리드만(Friedman)의 중복 범위 시험을 이용하여 통계적으로 분석한다.

B. 결과

최초의 일련의 실험에서 항원 공격 전 및 일회 항원 공격 후 여러 시점에서의 폐세포 조성을 BAL로 조사하였다(제1도). 항원 공격 전에는 다수의 호산구가 BAL에 의해 회수되었다. 공격 후 6시간 째에는(피크 말기 기관지 수축동안) 호산구 수는 감소하였으나 1일 만에 투여전 수치로 회복되었다. 호산구는 7일 및 14일째에 만성적 증가상태를 유지하였다. 그러나 호중구는 항원 공격 전에 BAL 세포의 매우 작은 비율을 차지하였으나 말기 기관지 수축중에는(6시간) 급격한 증가를 보였다. 호중구는 1일만에 기초 수준으로 회복되었고 7일 및 14일째에는 낮은 상태를 유지하였다. 호중구의 유입은 말기 반응의 크기(r=-0.61, p≤0.05)와 밀접하게 연계되어 있다.

폐조직의 면역 조직화학적 염색에 의해 폐 혈관내피 및 기도 상피의 ICAM-1은 항원 흡입전 및 흡입 공격후 6시간째에 양성 염색된다는 것이 밝혀졌다(제2도). 반면에, 폐 혈관 내피의 ELAM-1은 항원 공격전에는 염색되지 않다가 공격후 6시간째에 현저하게 증가된 염색을 나타내었다. 기도상피에서는 항원 공격 전이나 항원 공격 6시간 후에도 ELAM-1이 염색되지 않았다.

항원 흡입 1시간 전에 안티-ELAM-1(CL2)로 전 처리하면 총 백혈구 침윤과 침윤 호중구수 모두가 모든 동물, 특히 3동물에서 현저하게 저하되었다(제3도). CL2 처리는 말기 기관지 수축의 현저한 감소를 야기하였으나 급성 반응에는 외견상 효과를 나타내지 않았다(제4도).

Claims

ELAM-1에 결합가능한 항체를 치료학적 유효량으로 함유하는 천식치료용 의약 조성물.
ELAM-1에 결합가능한, 제1항에 따른 항체의 단편을 치료학적 유효량으로 함유하는 천식치료용 의약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 조성물.