KR101578940B1 - 이펙터 활성이 증강된 유전자 재조합 항체 조성물 - Google Patents

이펙터 활성이 증강된 유전자 재조합 항체 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 인간 IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이 치환된 CH2 도메인을 갖고, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체(補體) 의존성 세포 상해 활성이 증가한, 유전자 재조합 항체 조성물, 이 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 이 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 이 형질 전환체를 이용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 이 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
항체, 유전자 재조합, 보체 의존성

Description

이펙터 활성이 증강된 유전자 재조합 항체 조성물{GENETICALLY RECOMBINANT ANTIBODY COMPOSITION HAVING ENHANCED EFFECTOR ACTIVITY}
본 발명은, 인간 IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이, 다른 아미노산으로 치환된 CH2 도메인을 갖고, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체(補體) 의존성 세포 상해 활성이 증가한, 유전자 재조합 항체 조성물, 이 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 이 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 이 형질 전환체를 이용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 이 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
항체는, 표적 분자(항원)에 대한 높은 결합 활성 및 결합 특이성을 가지며, 또한, 혈중에서 높은 안정성을 갖는 단백질 분자이기 때문에, 인간의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료약으로서의 응용이 시도되어 왔다(비특허 문헌1). 항체는 인간 이외의 동물에게 항원을 투여(이른바 면역)하는 것에 의한 제작법이 일반적이지만, 인간 이외의 동물로부터 얻어진 항체는 종 특이적인 아미노산 서열을 가지며, 인간 체내에서 이물로서 인식되어 부작용의 원인이 되기 때문에, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 인간 이외의 동물(비인간 동물)의 항체로부터 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체가 제작되었다(비특허 문헌 2∼5).
인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는, 예컨대 마우스 항체 등의 비인간 동물 항체가 갖는 높은 면역원성, 낮은 이펙터 기능, 짧은 혈중 반감기 등의 문제를 해결하여, 모노클로날(monoclonal) 항체의 의약품으로서의 응용을 가능하게 하였다(비특허 문헌 6∼9). 이미 미국에서는, 예컨대, 암 치료용 항체로서 복수의 인간화 항체가 인가되어, 판매되고 있다(비특허 문헌 10).
이들 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는, 실제로 임상에 있어서 어느 정도의 효과를 나타내고 있으나, 보다 효과가 높은 항체 의약이 요구되고 있다. 예컨대, CD20에 대한 인간형 키메라 항체인 리툭산(리툭산)(비특허 문헌 11)(IDEC사/Roche사/Genentech사)의 단독 투여에서는, 재발성 저악성도의 비호지킨 림프종 환자에 대한 제Ⅲ상 임상 시험에서의 주효율(奏效率)은 48%(완전 관해(寬解) 6%, 부분 관해 42%)에 불과하고, 또한, 평균의 효과 지속 기간은 12개월이라고 보고되어 있다(비특허 문헌 12). 리툭산과 화학 요법(CHOP: Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine)의 병용에서는, 재발성 저악성도 및 여포성의 비호지킨 림프종 환자에 대한 제Ⅱ상 임상 시험에 있어서, 주효율은 95%(완전 관해 55%, 부분 관해 45%)라고 보고되어 있으나, CHOP에 기인하는 부작용이 보여지고 있다(비특허 문헌 13). HER2에 대한 인간화 항체인 Herceptin(Genentech사)은, 단독 투여에서는, 전이성 유방암 환자에 대한 제Ⅲ상 임상 시험에서의 주효율은 불과 15%이며, 평균의 효과 지속 기간은 9.1개월이라고 보고되어 있다(비특허 문헌 14).
항체 분자는 면역글로불린(이하, Ig라고 표기함)이라고도 칭해지며, 인간 항체는, 분자 구조의 차이에 따라, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM의 아이소타이프 분류가 존재한다. 아미노산 서열의 상동성이 비교적 높은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 총칭하여 IgG라고도 한다. 항체 의약으로서는 주로 인간 IgG가 이용된다.
항체 분자는, 중쇄(Heavy chain, 이하 H쇄라고 칭함) 및 경쇄(Light chain, 이하 L쇄라고 칭함)의 2종류의 폴리펩티드에 의해 구성되어 있고, 인간 IgG 항체의 1분자는, 2개의 H쇄 및 2개의 L쇄로 이루어진다. 또한, H쇄는 H쇄 가변 영역(이하 VH라고 표기함) 및 H쇄 정상 영역(CH라고도 칭해짐)으로 이루어지고, L쇄는 L쇄 가변 영역(이하 VL이라고 표기함) 및 L쇄 정상 영역(이하 CL이라고 표기함)으로 이루어진다. H쇄 정상 영역은, 4개의 도메인으로 이루어지고, 중쇄 N말단에 위치하는 VH 쪽의 도메인으로부터 순서대로, 각각 CH1, 힌지, CH2 및 CH3이라고 불리며, CH2 도메인과 CH3 도메인을 합쳐서 Fc라고도 칭한다.
항체는, VH 및 VL로 이루어지는 항원 결합 영역(이하 Fv라고 표기함)을 통해 항원에 결합하고, H쇄 정상 영역을 통해, 수용체나 보체 등의 면역계 이펙터 분자와 결합한다. 항체는 면역계 이펙터 분자와의 결합을 통해, 보체 의존성 세포 상해 활성(이하, CDC 활성이라고 약기함), 항체 의존성 세포 상해 활성(이하, ADCC 활성이라고 약기함), 탐식 활성 등의 이펙터 활성을 유도하여, 항원 또는 항원을 발현하고 있는 세포(병원체나 종양 세포)를 배제한다.
항체가, ADCC 활성이나 탐식 활성을 유도하기 위해서는, 내추럴 킬러 세포 (이하 NK 세포라고 표기함), 단구, 대식 세포, 과립구 등, 여러 가지 백혈구의 표면에 발현하고 있는 Fc 감마 수용체(이하 FcγR이라고 표기함) 패밀리와의 결합이 중요하다. FcγR 패밀리에는 활성형 FcγR과 억제형 FcγR이 존재하며, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb는 활성형 FcγR로, FcγRIIb는 억제형 FcγR로 각각 분류된다. 인간 IgG 항체는 이들 수용체에 강하게 결합하고, 그 결과 백혈구에 의한 ADCC 활성이나 탐식 활성을 유도한다.
ADCC 활성이란, 주로 NK 세포 등의 백혈구가 항체를 통해 표적 세포를 융해시키는 반응이다. 항체는, Fv를 통해 표적 세포 표면의 항원에, Fc를 통해 NK 세포 표면의 FcgRIIIa와 결합한다. 그 결과, NK 세포로부터 퍼포린(perforin)이나 그란자임(granzyme) 등의 세포 상해성 분자가 방출되어 표적 세포를 융해시킨다(비특허 문헌 15, 16).
CDC 활성이란, 보체라고 불리는 일군의 혈청 단백질이 항체를 통해 표적 세포를 융해시키는 반응이다. 보체는 C1∼C9의 각 단백질로 분류되며, 이들이 연쇄적으로 반응함으로써 CDC 활성이 유도된다. 각각의 보체 단백질은 특정한 보체 단백질과의 반응에 의해 활성화되어, 다음 보체 단백질과 반응한다. 이 연쇄 반응은, 먼저 처음에, 보체 제1 성분 C1이, C1을 구성하는 단백질의 하나인 C1q를 통해, 표적 세포 표면의 항원에 Fv를 통해 결합되어 있는 항체의 Fc에 결합됨으로써 개시되고, 최종적으로는, C5∼C9으로 이루어지는 복합체가 복수 중합하여, 표적 세포의 세포막에 구멍을 형성함으로써 표적 세포를 융해시킨다(비특허 문헌 15, 16).
인간 IgG의 4개의 아이소타이프(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)는, H쇄 정상 영역 의 아미노산 서열에 있어서, 바리에이션(variation)이 풍부한 힌지를 제외하고, 서로 높은 상동성을 갖고 있다. 그러나, 각 아이소타이프가 유도하는 이펙터 활성의 강약은 다르며(비특허 문헌 17), 일반적으로는, ADCC 활성의 강도는 IgG1＞IgG3＞＞IgG4≥IgG2(비특허 문헌 18, 19), CDC 활성의 강도는 IgG3≥IgG1＞＞IgG2≒IgG4의 서열이 된다. CDC 활성의 유도에는, 상술한 바와 같이 항체와 C1q와의 결합이 중요하다. 단량체의 항체 분자에 대한 C1q의 결합에 있어서의 결합 상수(Ka)는, 인간 IgG 아이소타이프인 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4에 있어서, 각각 1.2×104, 0.64×104, 2.9×104, 0.44×104 M-1이며(비특허 문헌 20), 각 아이소타이프의 CDC 활성의 강약을 반영하고 있다.
임상에 이용되는 항체 의약의 약효 메커니즘에 있어서는, 특히 ADCC 활성과 CDC 활성의 중요성이 주목받고 있다. 상기한 리툭산은, IgG1 아이소타이프의 인간형 키메라 항체이며, 시험관 내(in vitro)에서 ADCC 활성 및 CDC 활성을 나타내는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 21). 또한, 리툭산의 임상 효과에 관해서, ADCC 활성이 강한 유전자형을 나타내는 환자에 있어서 치료 효과가 높은 것(비특허 문헌 22), 투여 후에 신속히 혈중의 보체 성분이 소비되는 것(비특허 문헌 23), 투여 후에 재발한 환자의 암 세포에서는 CDC 활성을 억제하는 인자인 CD59의 발현이 상승하고 있는 것(비특허 문헌 24) 등이 보고되어 있으며, 이들 보고는 리툭산이 실제로 환자 체내에서 이펙터 기능을 발휘하고 있는 것을 시사하고 있다. 상기한 Herceptin도, IgG1 서브클래스의 인간화 항체이며, 시험관 내에서 ADCC 활성을 갖 는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 25).
인간 IgG1 및 인간 IgG3은 ADCC 활성과 CDC 활성이 우수한 아이소타이프이지만, 인간 IgG3 항체는 다른 인간 IgG 아이소타이프에 비하여 혈중 반감기가 짧고, 투여 후 신속히 혈중에서 소실되는 것이 알려져 있다(비특허 문헌 26). 또한, 인간 IgG3은 다른 인간 IgG 아이소타이프와 달리, 프로테인 A 결합 활성을 갖지 않는 것도 알려져 있다(비특허 문헌 27). 공업적인 스케일에서의 항체 제조에 있어서 이용되는 정제 프로세스의 주류는 프로테인 A에 의한 것이며, 프로테인 G 등 다른 방법에 의한 정제는 비용이 높다는 등의 문제가 있다.
프로테인 A는, 인간 IgG 항체 분자에 결합하는 것이 알려져 있고(비특허 문헌 28), 항체 분자 중의 위치를 Kabat 등에 의한 EU 인덱스의 정의(비특허 문헌 29)에 기초하여 표기하면, 252번째로부터 254번째까지의 아미노산으로 이루어지는 루프 부분, 308번째로부터 312번째까지의 아미노산으로 이루어지는 루프 부분, 및 433번째로부터 436번째까지의 아미노산으로 이루어지는 루프 부분이 중요한 것이 X선 결정 해석으로부터 시사되어 있다(비특허 문헌 28). 또한, 핵자기 공명법(NMR법)에 의한 해석에 의해, IgG1의 Fc에 있어서는 Ile253, Ser254, His310, Gln311, His433, His435, His436이 특히 중요한 것으로 나타났다(비특허 문헌 30). 또한, Kim 등은, 인간 IgG1의 His435를, IgG3 유래의 Arg435로 치환함으로써 프로테인 A 결합 활성이 약해지는 것을 발견하였다(비특허 문헌 31). 이후, 항체 분자의 아미노산 서열에서의 각 아미노산의 위치는, Kabat 등에 의한 EU 인덱스의 정의(비특허 문헌 29)에 기초하여 표기한다.
이상의 점에서, 인간 IgG1 항체는, 다른 아이소타이프와 비교하여 ADCC 활성 및 CDC 활성이 강하고, 또한, 프로테인 A에 의한 정제가 가능하며 혈중 반감기도 길고, 생산 비용의 면에서도 장점이 있어, 항체 의약으로서 최적의 아이소타이프라고 할 수 있다. 실제, 상술한 바와 같이, 인간 IgG1 항체가 의약으로서 이용되고 있으나, 현행의 항체 의약이 나타내는 약효는 충분하다고는 할 수 없으며, 보다 효과가 높은 항체 의약이 요구되고 있다. 그 때문에, 이펙터 활성을 증강시킨 항체의 연구도 행해지고 있다. 상술한 바와 같이, 항체의 이펙터 활성의 강약은 항체 H쇄 정상 영역과 면역계 이펙터 분자와의 결합 활성을 반영하고 있기 때문에, 항체 H쇄 정상 영역과 면역계 이펙터 분자와의 결합 활성을 증강시킴으로써, 항체의 이펙터 활성을 증강시킬 수 있다.
인간 항체의 이펙터 활성을 해석하기 위해서, 이펙터 활성의 강도가 서로 다른 2종류의 인간 아이소타이프 항체 사이에서, 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열을 부분적으로 교환한, 2종류의 인간 아이소타이프의 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 연구가 행해져 왔다(특허 문헌 1, 비특허 문헌 32, 비특허 문헌 33). 1980년대 후반, Morrison 등은 이펙터 활성이 높은 IgG1과 이펙터 활성이 낮은 IgG4 사이, 또는 이펙터 활성이 낮은 IgG2와 이펙터 활성이 높은 IgG3 사이에서 중쇄 정상 영역의 각 도메인(CH1, CH2, CH3, 힌지)을 교환한 항체 분자가 재조합 단백질로서 발현 가능한 것을 나타내 보였다(특허 문헌 1). 그 후, 이들 항체 분자의 해석에 의해, IgG1의 CDC 활성에는 CH2 도메인의 C말단측이 중요하고, IgG3의 CDC 활성에는 CH2 도메인이 중요한 것(비특허 문헌 32), IgG1 및 IgG3의 FcγRI에 대한 결합 에는 CH2 도메인 및 힌지가 중요한 것(비특허 문헌 33) 등을 분명히 하였다.
상술한 바와 같이, CDC 활성에는 CH2 도메인이 중요하고, 높은 CDC 활성을 갖는 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체에 대해서는 아미노산 서열의 해석이 이루어지고 있다. CH2의 아미노산 서열은, 인간 IgG1에서는, Leu235(비특허 문헌 34), Asp270, Lys322, Pro329, Pro331(비특허 문헌 35), 인간 IgG3에서는 Gly233, Leu234, Leu235, Gly236(비특허 문헌 36), Lys322(비특허 문헌 37)가 CDC 활성에 중요한 것이 알려져 있다. Brekke 등은, CH2 도메인의 아미노산 서열에 있어서, CDC 활성이 높은 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체에서 공통되어 있는 아미노산 잔기나, CDC 활성이 매우 낮은 인간 IgG4 항체와는 다른 수개의 아미노산 잔기를, 인간 IgG4 항체에 이식한 각종 항체 분자의 해석을 행한 결과, 인간 IgG4의 Ser331을, 인간 IgG1 및 인간 IgG3에서 공통되어 있는 Pro331로 교환함으로써, 인간 IgG4 항체의 CDC 활성이 증강되는 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 38).
또한, CDC 활성이 가장 높은 인간 IgG 아이소타이프인 인간 IgG3 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 일부를, 다른 인간 IgG 아이소타이프 유래의 아미노산 서열로 교환함으로써 CDC 활성을 보다 증강시키는 시도가 이루어져 왔다. 각 IgG 아이소타이프의 힌지의 길이는, IgG1이 15아미노산 잔기, IgG2가 12아미노산 잔기, IgG3이 62아미노산 잔기, IgG4가 12아미노산 잔기이며, 인간 IgG3은 다른 IgG 아이소타이프에 비해서, 힌지가 길다고 하는 구조상의 특징을 갖는다(비특허 문헌 1). 인간 IgG3 항체의 62아미노산으로 이루어지는 힌지는 유전자 상에서는 4개의 엑손에 의해 코딩되어 있으나, Michaelsen 등은, 이들 4개의 엑손 중, N말단 측의 3개의 엑손을 삭제함으로써 15아미노산 잔기로 단축된 힌지를 갖는 인간 Ig3 항체의 CDC 활성이, IgG3 및 IgG1보다 높은 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 39). Norderhaug 등은, 전술한 단축된 힌지의 아미노산 서열을 IgG4의 힌지의 아미노산 서열로 교환함으로써, CDC 활성이 더 상승하는 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 40). 또한 Brekke 등은, 인간 IgG3 항체의 힌지를 인간 IgG1 항체의 힌지로 교환함으로써, CDC 활성이 IgG3보다 높고, IgG1과 동등 이상이 되는 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 41).
한편, 인간 IgG1 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열을, 천연에는 존재하지 않는 인공적인 아미노산 서열로 치환함으로써, C1q와의 결합 활성을 상승시켜, 그 결과 CDC 활성이 증강된 항체에 대해서도 검토되어 있다(비특허 문헌 42, 특허 문헌 2∼5). 상술한 바와 같이, CDC 활성은, 보체 단백질 C1을 구성하는 단백질의 하나인 C1q가, 항체 분자의 Fc에 결합함으로써 야기된다. Idusogie 등은, 상술한 인간 IgG1 키메라 항체 리툭산에 있어서, CH2 도메인 중의 Lys326 또는 Glu333을 다른 아미노산으로 치환함으로써, 최대로 2배 정도 CDC 활성이 증강되는 것을 보고하였다(비특허 문헌 42, 특허 문헌 2). 또한, Idusogie 등은, IgG2에 있어서, Lys326 또는 Glu333을 다른 아미노산으로 치환함으로써, 원래는 IgG1의 CDC 활성의 수백분의 일 정도였던 IgG2의 CDC 활성이, IgG1의 25분의 1 정도로 상승하는 것을 나타내 보였다(특허 문헌 3∼5).
그러나, 천연에는 존재하지 않는 아미노산 서열로의 치환을 행한 항체는, 상술한 비인간 동물 항체와 마찬가지로, 인간 체내에 있어서 이물로서 인식되어 부작 용을 유도할 위험성이 있다. 한편, 인간 아이소타이프 사이에서 아미노산 서열의 교환을 행한 항체의 아미노산 서열은, 인간이 갖는 항체의 아미노산 서열의 조합이다.
또한, 항체 의약의 치료 효과에는, 항체의 Fc 영역이 FcγR과의 결합을 통해 발생되는 ADCC 활성이나 탐식 활성과, 항체와 C1q와의 결합을 통한 CDC 활성의 양방이 중요하다. 그러나, 항체와 C1q와의 결합, 및 FcγR과의 결합은, 모두 Fc를 통한 결합이기 때문에, CDC 활성을 증강시키기 위한 Fc의 아미노산 개변이, ADCC 활성을 손상시켜 버릴 가능성이 있다. 실제, Idusogie 등은, 인간 IgG1 항체의 Fc를 인공적인 아미노산 서열로 치환함으로써 CDC 활성을 증강시킨 항체는, ADCC 활성이 크게 저하되어 버리는 것을 보고하고 있다(비특허 문헌 42).
아미노산 서열의 치환 이외에, 항체의 이펙터 활성을 증강시키는 수법으로서는, 항체 정상 영역에 부가하는 당쇄의 구조의 제어를 들 수 있다. 인간 IgG 항체의 ADCC 활성은, Fc 중의 297번째의 아스파라긴에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 구조(도 1에 모식도를 도시함)에 의해 변화하는 것이 알려져 있다(특허 문헌 6). 이 당쇄에 포함되는 갈락토스 및 N-아세틸글루코사민의 양에 의존하여 항체의 ADCC 활성이 변화한다는 보고도 있다(비특허 문헌 43∼46). 그러나 ADCC 활성에 가장 영향을 미치는 것은 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 α1,6 결합하는 푸코스(fucose)이며, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 IgG 항체는, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당 쇄를 갖는 IgG 항체보다 현저히 높은 ADCC 활성 및 FcγRIIIa 결합 활성을 나타내었다(비특허 문헌 47, 48, 49, 특허 문헌 7). 당쇄 중에 푸코스가 부가되어 있지 않은 항체 분자는 생체 내에도 천연형으로서 존재하는데, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합하지 않은 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 항체 조성물을 특이적으로 생산하는 세포로서는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase) 유전자가 녹아웃(knockout)된 세포가 알려져 있다(특허 문헌 7, 8).
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다른 이펙터 기능을 손상시키지 않으며, 또한, 항원성을 갖지 않고서, CDC 활성, ADCC 활성 등의 이펙터 기능이 증강되어, 치료 효과가 높여진 항체가 요구되고 있다. 또한, 프로테인 A 결합 활성을 갖는 등, 의약품으로서 제조하기에 적합한 항체가 요구되고 있다.
본 발명은, 이하의 (1)∼(24)에 관한 것이다.
(1) 인간 IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이, 다른 아미노산으로 치환된 CH2 도메인을 갖고, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체 의존성 세포 상해 활성이 증가한 유전자 재조합 항체 조성물.
(2) 인간 IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이, 각각 리신 및 트레오닌으로 치환된, (1)에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(3) 또한, Fc 영역 중의 CH3 도메인에 포함되는 폴리펩티드가, EU 인덱스에 있어서, 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인, (1) 또는 (2) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(4) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 인간 IgG1 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(5) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 이 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄인, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자를 코딩하는 DNA.
(7) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA.
(8) 상기 (6)에 기재된 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체.
(9) 숙주 세포가, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포인, 상기 (8)에 기재된 형질 전환체.
(10) 숙주 세포가, 항체 분자를 코딩하는 유전자를 도입했을 때, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 능력을 갖는 세포인, 상기 (8)에 기재된 형질 전환체.
(11) 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄가, 상기 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α결합되어 있지 않은 당쇄인, 상기 (10)에 기재된 형질 전환체.
(12) 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 비활성화되도록 게놈이 개변된 세포인, 상기 (8)에 기재된 형질 전환체.
(13) 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 상의 대립 유전자 전부가 녹아웃(knockout)된 세포인, 상기 (8)에 기재된 형질 전환체.
(14) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(dehydratase)(GMD) 또는 GDP-4-케토-6-데옥시(deoxy)-D-만노스-3,5-에피머라아제(epimerase)(Fx)에서 선택되는 효소인, 상기 (12) 또는 (13)에 기재된 형질 전환체.
(15) GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인, 상기 (14)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격(stringent)한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA
(16) GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, 상기 (14)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질.
(17) GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인, 상기 (14)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(18) GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, 상기 (14)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.
(19) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase)인, 상기 (12) 또는 (13)에 기재된 형질 전환체.
(20) α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인, 상기 (19)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(c) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA;
(d) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(21) α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(f)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, 상기 (19)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(c) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
(d) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
(e) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
(f) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질.
(22) 숙주 세포가, 하기의 (a)∼(i)로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인, 상기 (8) 내지 (21) 중 어느 1항에 기재된 형질 전환체.
(a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;
(b) 래트 골수종(myeloma) 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포;
(c) 마우스 골수종 세포주 NS0 세포;
(d) 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포;
(e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;
(f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포;
(g) 인간 백혈병 세포주 나말와(Namalwa) 세포;
(h) 배아 줄기 세포;
(i) 수정란 세포.
(23) 상기 (8) 내지 (22) 중 어느 1항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시키며, 이 항체 조성물을 채취하여, 정제하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법.
(24) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
<발명의 효과>
IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이 치환된 CH2 도메인을 갖고, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체 의존성 세포 상해 활성이 증가한, 유전자 재조합 항체 조성물, 이 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 이 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 이 형질 전환체를 이용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 이 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약을 제공할 수 있다.
도 1은 IgG 항체의 중쇄 297번째의 아스파라긴 잔기에 결합하는 N-결합 복합형 당쇄 구조의 모식도이다.
도 2는 플라스미드 pKANTEX2B8γ3의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 3은 인간 IgG1 항체, 인간 IgG3 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 및 3311형 키메라 아이소타이프의 도메인 구조의 모식도이다.
도 4는 플라스미드 pKTX93/1133의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 5는 플라스미드 pKTX93/3311의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 6은 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아 이소타이프 항 CD20 항체 및 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 Daudi 세포에 대한, 항 CD20 항체 CD20-IgG1(+F)과의 경합 저해의 계(系)에서의 결합 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에서의 결합 저해율을 각각 나타내고 있다. 도면 중의 △ 및 ▲는 그래프 A∼H에 있어서 공통되며, 음성 대조인 항 Her2 항체 Herceptin(△) 및 항 CCR4 항체 KM3060(▲)을 나타낸다. 도면 중의 ○ 및 ●는, 각 그래프에 있어서 대응하는 샘플이 다르며, 그래프 A에서는 CD20-IgG1(+F)(○) 및 CD20-IgG1(-F)(●)을, 그래프 B에서는 CD20-IgG3(+F)(○) 및 CD20-IgG3(-F)(●)을, 그래프 C에서는 1133(+F)(○) 및 1133(-F)(●)을, 그래프 D에서는 3311(+F)(○) 및 3311(-F)(●)을 각각 나타낸다.
도 7은 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 Daudi 세포에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플의 명칭, 세로축은 CDC 활성을 각각 나타낸다. 각 항체 샘플의 농도는 0.3 ug/㎖이다.
도 8은 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체 및 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, ST486 세포(A) 또는 Raji 세포(B)에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 CDC 활성을 각각 나타낸다. 도면 중, □는 CD20-IgG1(+F)을, ■는 CD20-IgG1(-F)을, △는 CD20-IgG3(+F)을, ▲는 CD20-IgG3(-F)을, ○는 1133(+F)을, ●는 1133(-F)을 각각 나타낸다.
도 9는 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아 이소타이프 항 CD20 항체 및 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, Daudi 세포에 대한 ADCC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에 있어서의 ADCC 활성을 각각 나타낸다. 도면 중의 ○ 및 ●는, 각 그래프에 있어서 대응하는 샘플이 다르며, 그래프 A에서는 CD20-IgG1(+F)(○) 및 CD20-IgG1(-F)(●)을, 그래프 B에서는 CD20-IgG3(+F)(○) 및 CD20-IgG3(-F)(●)을, 그래프 C에서는 1133(+F)(○) 및 1133(-F)(●)을, 그래프 D에서는 3311(+F)(○) 및 3311(-F)(●)을 각각 나타낸다.
도 10은 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체 및 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, CD20 항원 비존재하에서의 가용성 인간 FcγRIIIa(발린형)(A∼C) 또는 가용성 인간 FcγRIIIa(페닐알라닌형)(D∼F)에 대한, ELISA계에서의 결합 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 결합 활성(흡광도)을 각각 나타낸다. 그래프 A 및 D는 CD20-IgG1(-F)(●) 및 CD20-IgG1(+F)(○)의, 그래프 B 및 E는 CD20-IgG3(-F)(●) 및 CD20-IgG3(+F)(○)의, 그래프 C 및 F는 1133(-F)(●) 및 1133(+F)(○)의 가용성 인간 FcγRIIIa(발린형)(A∼C) 또는 가용성 인간 FcγRIIIa(페닐알라닌형)(D∼F)에 대한 결합 활성을 각각 나타낸다.
도 11은 인간 IgG1 항체, 인간 IgG3 항체, 1133형 키메라 아이소타이프, 1131형 키메라 아이소타이프 및 1113형 키메라 아이소타이프의 도메인 구조의 모식도이다.
도 12는 플라스미드 pKTX93/1131의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 13은 플라스미드 pKTX93/1113의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 14는 정제한 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, SDS-PAGE 전기영동 패턴을 도시한 도면이다. 단백질의 염색은, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 행하였다. 레인 1은 분자량 마커, 레인 2는 CD20-IgG1(-F), 레인 3은 CD20-IgG3(-F), 레인 4는 1133(-F), 레인 5는 1113(-F), 레인 6은 1131(-F)에 각각 대응한다.
도 15는 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, ST486 세포(A) 또는 Raji 세포(B)에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 세포 상해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1(-F), ▲는 CD20-IgG3(-F), ●는 1133(-F), ×는 1113(-F), ◆는 1131(-F)을 각각 나타낸다.
도 16은 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, 다우디(Daudi) 세포에 대한 ADCC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 세포 상해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1(-F), ▲는 CD20-IgG3(-F), ●는 1133(-F), ×는 1113(-F), ◆는 1131(-F)을 각각 나타낸다.
도 17은 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 프로테인 A에 대한 결합 활성을 ELISA계로 측정한 결과를 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 프로테인 A에 대한 결합 활성(흡광도)을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1(-F), ▲는 CD20-IgG3(-F), ●는 1133(-F), ×는 1113(-F), ◆는 1131(-F)을 각각 나타낸다.
도 18은 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체의 CH 도메인의 아미노산 서열을 비교한 모식도이다. 각 아미노산의 위치를 나타내는 번호는 Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 기초하는 것이다. 도면 중, *는 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체에서 아미노산 서열이 다른 위치를 나타낸다.
도 19는 플라스미드 pKTX93/1133(274-IgG1), pKTX93/1133(276-IgG1), pKTX93/1133(296-IgG1), pKTX93/1133(300-IgG1), pKTX93/1133(339-IgG1)의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 20은 각종 정제 항체의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 도시한 도면이다. 단백질의 염색은, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 행하였다. 레인 1은 분자량 마커, 레인 2는 CD20-IgG1(-F), 레인 3은 1133(-F), 레인 4는 1131(-F), 레인 5는 1113(-F), 레인 6은 1133(274-IgG1)(-F), 레인 7은 1133(276-IgG1)(-F), 레인 8은 1133(296-IgG1)(-F), 레인 9는 1133(300-IgG1)(-F), 레인 10은 1133(339-IgG1)(-F)에 각각 대응한다.
도 21은 각종 항 CD20 항체의 Raji 세포에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이 다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 세포 상해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1(-F), ●는 1133(-F), ▲는 1131(-F), □는 1133(274-IgG1)(-F), ○는 1133(276-IgG1)(-F), ◇는 1133(296-IgG1)(-F), ×는 1133(300-IgG1)(-F), △는 1133(339-IgG1)(-F)을 각각 나타낸다.
도 22는 플라스미드 pKTX93/1131(296/300-IgG1), pKTX93/1131(274/296/300-IgG1), pKTX93/1131(274/276/296/300-IgG1), pKTX93/1131(274/296/300/339-IgG1), pKTX93/1131(276/296/300/339-IgG1)의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 23은 각종 정제 항체의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 도시한 도면이다. 단백질의 염색은, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 행하였다. 레인 1은 분자량 마커, 레인 2는 1131(296/300-IgG1)(-F), 레인 3은 1131(274/296/300-IgG1)(-F), 레인 4는 1131(274/276/296/300-IgG1)(-F), 레인 5는 1131(274/296/300/339-IgG1)(-F), 레인 6은 1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)에 각각 대응한다.
도 24는 각종 항 CD20 항체의 Raji 세포에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 세포 상해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1(-F), □는 CD20-IgG3(-F), ▲는 1133(-F), △는 1131(-F), ●는 1131(296/300-IgG1)(-F), ○는 1131(274/296/300-IgG1)(-F), ◆는 1131(274/276/296/300-IgG1)(-F), ◇는 1131(274/296/300/339-IgG1)(-F), ×는 1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)을 각각 나타낸다.
도 25는 각종 항 CD20 항체의 프로테인 A에 대한 결합 활성을 ELISA계로 측정한 결과를 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서 의 프로테인 A에 대한 결합 활성(흡광도)을 각각 나타낸다. 도면 중, ●는 CD20-IgG1(-F), ○는 CD20-IgG3(-F), ▲는 1131(274/296/300/339-IgG1)(-F), △는 1131(274/276/296/300-IgG1)(-F), ■는 1131(274/296/300-IgG1)(-F), □는 1131(-F), ×는 1133(-F)을 각각 나타낸다.
도 26은 플라스미드 pKTX93/Campath-1133의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 27은 플라스미드 pKTX93/Campath-IgG1의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 28은 플라스미드 pKTX93/Campath-1131의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 29는 인간 IgG1 항 Campath 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 MEC-1 세포(A), MEC-2 세포(B), EHEB(C) 세포에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 항체 농도를, 세로축은 각 항체 농도에서의 세포 상해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ●는 Campath1H-1131(-F), ○는 Campath1H-IgG1(-F)을 각각 나타낸다.
항체 분자는 면역글로불린(이하, Ig라고 표기함)이라고도 칭해지며, 인간 항체는, 분자 구조의 차이에 따라, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM의 아이소타이프로 분류된다. 아미노산 서열의 상동성이 비교적 높은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 총칭하여 IgG라고도 말한다.
항체 분자는 중쇄(Heavy chain, H쇄라고도 칭해짐) 및 경쇄(Light chain, L쇄라고도 칭해짐)라고 불리는 폴리펩티드로 구성된다. 또한, H쇄는 N말단측으로부터 H쇄 가변 영역(VH라고도 표기됨), H쇄 정상 영역(CH라고도 표기됨), L쇄는 N말 단측으로부터 L쇄 가변 영역(VL이라고도 표기됨), L쇄 정상 영역(CL이라고도 표기됨)의 각 영역에 의해, 각각 구성된다. CH는 또한, N말단측으로부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인의 각 도메인에 의해 구성된다. 도메인이란, 항체 분자의 각 폴리펩티드를 구성하는 기능적인 구조 단위를 말한다. 또한, CH2 도메인과 CH3 도메인을 아울러 Fc 영역이라고 말한다.
본 발명에 있어서의 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, Fc 영역은, Kabat 등에 의한 EU 인덱스[시퀀스·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트 제5판(1991)]에 의해, N말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호로 특정할 수 있다. 구체적으로는, CH1은 EU 인덱스 118∼215번의 아미노산 서열, 힌지는 EU 인덱스 216∼230번의 아미노산 서열, CH2는 EU 인덱스 231∼340번의 아미노산 서열, CH3은 EU 인덱스 341∼447번의 아미노산 서열이라고 각각 특정된다(이하에 나타내는 아미노산 잔기의 번호는, EU 인덱스에 기초함).
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물로서는, 인간 IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 CH2 도메인을 갖고, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체 의존성 세포 상해 활성이 증가한 유전자 재조합 항체 조성물을 들 수 있다.
다른 아미노산으로서는, 아미노산 치환함으로써, 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다, CDC 활성이 증가하는 아미노산이면 어느 것이라도 좋고, 바람직하게는, 276번째의 아미노산으로서는, 아스파라긴산, 류신, 세린 및 리 신에서 선택되는 아미노산, 339번째의 아미노산으로서는, 아스파라긴산, 페닐알라닌, 이소류신, 리신, 아스파라긴, 세린, 트립토판, 티로신 및 트레오닌에서 선택되는 아미노산을 들 수 있다.
다른 아미노산으로서 특히 바람직하게는, IgG3 항체의 CH2 도메인의 대응하는 아미노산을 들 수 있다.
가장 바람직한 다른 아미노산으로서는, 276번째의 아미노산으로서는 리신, 339번째의 아미노산으로서는 트레오닌을 들 수 있다.
또한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물로서는, Fc 영역 중의 CH3 도메인에 포함되는 폴리펩티드가, EU 인덱스에 있어서, 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 유전자 재조합 항체 조성물이 포함된다.
구체적으로는, Fc 영역 중의 CH3 도메인이 이하의 (a)∼(h) 중 어느 하나의 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인, 유전자 재조합 항체 조성물을 들 수 있다.
(a) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(b) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 356번째까지가 인간 IgG3, 357번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(c) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 358번째까지가 인간 IgG3, 359번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(d) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 384번째까지가 인간 IgG3, 385번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(e) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 392번째까지가 인간 IgG3, 393번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(f) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 397번째까지가 인간 IgG3, 398번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(g) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 422번째까지가 인간 IgG3, 423번째로부터 447번째까지가 인간 IgG1;
(h) EU 인덱스에 있어서, 341번째로부터 434번째까지 및 436번째로부터 447번째까지가 인간 IgG3, 435번째가 인간 IgG1.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 CL 영역의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 유래 아미노산 서열의 어느 것이라도 좋으나, 인간 항체의 아미노산 서열의 Cκ 또는 Cλ가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 키메라 아이소타이프(Chimeric isotype)란, 어떤 인간 아이소타이프 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 일부를, 다른 인간 아이소타이프의 대응하는 부분의 아미노산 서열로 교환하여 얻어진, 2종류 이상의 인간 아이소타이프의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 정상 영역을 말한다. 이하, 키메라 아이소타이프(Chimeric isotype)인 유전자 재조합 항체란, 중쇄 정상 영역이 키메라 아이소타이프인 유전자 재조합 항체를 말한다.
또한, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물로서는, Fc를 가지며, 또한 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 항체, 또는, Fc를 가지며, 또한 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 융합 단백질이면 어떠한 것도 포함된다.
표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 들 수 있다.
Fc를 가지며, 또한 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 융합 단백질로서는, 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 분자와 Fc와의 융합 단백질, 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 항체와 Fc와의 융합 단백질, 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 항체 단편과 Fc와의 융합 단백질 등을 들 수 있다.
Fc 융합 단백질로서는, 구체예로서는, 수용체 또는 리간드와 Fc 영역을 융합시킨 것, 또한 항체의 Fc 영역에 복수의 Fc 영역을 융합시킨 Fc 융합 단백질 등을 들 수 있다.
표적 분자와의 결합 활성을 갖는 항체 단편으로서는, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 디아바디(디아바디), dsFv, CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에서 절단됨), H쇄의 N말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는, IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기에서 절단됨), Fab가 힌지 영역의 S-S 결합을 통해 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항 원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩티드 링커(P)를 이용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드이며, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
디아바디는, 항원 결합 특이성이 동일하거나 또는 다른 scFv가 2량체를 형성한 항체 단편이며, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 다른 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기 사이의 S-S 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물(비인간 동물)의 항체의 VH 및 VL과, 인간 항체의 CH 및 CL로 이루어지는 항체를 의미한다. 비인간 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 이용할 수 있다.
하이브리도마란, 비인간 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포와, 마우스 등으로부터 유래하는 골수종(myeloma) 세포를 세포 융합시켜 얻어지는, 원하는 항원 특이성을 가진 모노클로날 항체를 생성하는 세포를 말한다. 따라서, 하이브리도마가 생성하는 항체를 구성하는 가변 영역은, 비인간 동물 항체의 아미노산 서열로 이루어진다.
인간형 키메라 항체는, 모노클로날 항체를 생산하는 비인간 동물 세포 유래의 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하며, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로서는, 인간 면역글로불린(hIg)에 속하면 어느 것이라도 좋으나, hIgG 클래스의 것이 바람직하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 서브클래스, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4)의 어떠한 것도 이용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ 클래스(Cκ) 또는 λ 클래스(Cλ)의 것을 이용할 수 있다.
인간화 항체란, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 대응하는 CDR에 이식한 항체를 말한다. VH 및 VL의 CDR 이외의 영역은 프레임워크 영역(이하, FR이라고 표기함)이라고 칭해진다.
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열로 이루어지는 VH의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA와, 비인간 동물 항체의 VL의 CDR의 아미노산 서열과 임의의 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열로 이루어지는 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하여, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜, 제조할 수 있다.
인간화 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋으나, hIgG 클래스의 것이 바람직하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 서브클래스, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4)의 어떠한 것도 이용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋으며, Cκ 또는 Cλ의 것을 이용할 수 있다.
인간 항체는, 원래, 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지(phage) 라이브러리 및 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 존재하는 항체는, 예컨대, 인간 말초혈에서 단리한 림프구를, EB 바이러스 등을 감염시킴으로써 불멸화한 후, 클로닝함으로써, 상기 항체를 생성하는 림프구를 배양할 수 있으며, 배양물 중으로부터 상기 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 표면에 발현시킨 파지의 라이브러리이다. 이 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 이 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 수법에 의해, 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생성 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 편입된 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 이 ES 세포를 다른 마우스의 초기 배(胚)에 이식한 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다. 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은 통상의 인간 이외의 포유동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 생성 하이브리도마를 얻고, 배양함으로써 배양물 중에 인간 항체를 생성 축적시킬 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에서의 CL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 항체의 아미노산 서열의 어느 것이라도 좋으나, 인간 항체의 아미노산 서열의 Cκ 또는 Cλ가 바람직하다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에서의 VH 및 VL의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 또는 비인간 동물 항체의 CDR을, 인간 항체의 프레임워크에 이식한 인간화 항체의 아미노산 서열의 어느 것이라도 좋다. 구체적으로는, 하이브리도마가 생성하는 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 어떠한 특이성을 갖는 항체도 포함하지만, 종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 자기 면역 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 혹은 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체인 것이 바람직하고, 종양 관련 항원을 인식하는 항체인 것이 보다 바람직하다.
종양 관련 항원으로서는, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD9, CD10, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD30, CD32, CD33, CD38, CD40, CD40 ligand(CD40L), CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD55, CD59, CD63, CD64, CD66b, CD69, CD70, CD74, CD80, CD89, CD95, CD105, CD134, CD137, CD138, CD147, CD158, CD160, CD162, CD164, CD200, CD227, 아드레노메듈린, 안지오포이어틴 관련 단백질 4(ARP4), 오로라(aurora), B7-H1, B7-DC, 인테그린, 골수 기질 항원 2(BST2), CA125, CA19.9, 카데린, cc-케모키네수용체(CCR)4, CCR7, 암배 항원(CEA), 시스테인 풍부 섬유아세포 성장 인자 수용체-1(CFR-1), c-Met, c-Myc, 콜라겐, CTA, 결합 조직 성장 인자(CTGF), CTLA-4, 싸이토케라틴-18, DF3, E-카테린, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFRvIII, EGFR2(HER2), EGFR3(HER3), EGFR4(HER4), 엔도글린, 상피세포 부착 분자(EpCAM), 내피 단백질 C 수용체(EPCR), 에프린, 에프린 수용체(Eph), EphA2, 엔도테리아제-2(ET2), FAM3D, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fc 수용체 상동체 1(FcRH1), 페리틴, 섬유아세포 성장 인자-8(FGF-8), FGF8 수용체, 염기성 FGF(bFGF), bFGF 수용체, FGF 수용체(FGFR)3, FGFR4, FLT1, FLT3, 폴레이트 수용체, 프리즐드 상동체(Frizzled homologue) 10(FZD10), 프리즐드 수용체 4(FZD-4), G250, G-CSF 수용체, 강글리오시드(GD2, GD3, GM2, GM3 등), globo H, gp75, gp88, GPR-9-6, 헤파라나제I, 간세포 성장 인자(HGF), HGF 수용체, HLA 항원(HLA-DR 등), HM1.24, HMFG(human milk fat globule), hRS7, 열충격 단백질 90(hsp90), 이디오타입 에피토프, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF 수용체(IGFR), 인터루킨(IL-6, IL-15 등), 인터루킨 수용체(IL-6R, IL-15R 등), 인테그 린, 면역 수용체 전위 연관-4(IRTA-4), 칼리크레인 1, KDR, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KS1/4, lamp-1, lamp-2, 라미닌-5, 루이스 y, 사이알릴 루이스(sialyl Lewis) x, 림포톡시-베타 수용체(LTBR), LUNX, 흑색종 연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 메소테린, MICA, 뮐러 억제 기질 II형 수용체(MISIIR), 뮤신, 신경 세포 부착 분자(NCAM), Necl-5, Notch1, 오스테오폰틴, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), PDGF 수용체, 혈소판 인자-4(PF-4), 포스파티딜세린, 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 부갑상선 관련 단백질/펩티드(PTHrP), NF-카파B 리간드의 수용체 활성인자(RANKL), 히아루론산 매개성 이동을 위한 수용체(RHAMM), ROBO1, SART3, 세마포린 4B(SEMA4B), 분비성 백혈구 프로테아제 억제제(SLPI), SM5-1, 스핀고신-1-포스페이트, 종양 관련 당단백질-72(TAG-72), 트랜스페린 수용체(TfR), TGF-베타, Thy-1, Tie-1, Tie2 수용체, T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 1(TIM-1), 인간 조직 인자(hTF), Tn 항원, 종양 괴사 인자(TNF), 톰센-프라이덴리히(Thomsen-Friedenreich) 항원(TF 항원), TNF 수용체, 종양 괴사 인자 관련 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL), TRAIL 수용체(DR4, DR5 등), trkC, TROP-2, TWEAK 수용체 Fn14, type IV 콜라겐ase, 우로키나제 수용체, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3), 비멘틴, VLA-4 등을 들 수 있다.
종양 관련 항원을 인식하는 항체로서는 항GD2 항체[안티·캔서·리서치(Anticancer Res.), 13, 331(1993)], 항GD3 항체[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 260(1993)], 항 GM2 항체[캔서·리서 치(Cancer Res.), 54, 1511(1994)], 항 HER2 항체[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285(1992)], 항 CD52 항체[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285(1992)], 항 MAGE 항체[브리티시·저널·오브·캔서(British J. Cancer), 83, 493(2000)], 항 HM1.24 항체[몰레큘러·이뮤놀로지(Molecular Immunol.), 36, 387(1999)], 항 부갑상선 호르몬 관련 단백(PTHrP) 항체[캔서(Cancer), 88, 2909(2000)], 항 염기성 섬유아세포 증식 인자 항체, 항 섬유아세포 증식 인자 8항체[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 86, 9911(1989)], 항 염기성 섬유아세포 증식 인자 수용체 항체, 항 섬유아세포 증식 인자 8수용체 항체[저널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 265, 16455(1990)], 항 인슐린 유사(insulin-like) 증식 인자 항체[저널·오브·뉴로사이언스·리서치(J. Neurosci. Res.), 40, 647(1995)], 항 인슐린 유사 증식 인자 수용체 항체[저널·오브·뉴로사이언스·리서치(J. Neurosci. Res.), 40, 647(1995)], 항 PSMA 항체[저널·오브·유롤로지(J. Urology), 160, 2396(1998)], 항 혈관 내피세포 증식 인자 항체[캔서·리서치(Cancer Res.), 57, 4593(1997)], 항 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 항체[온코진(Oncogene), 19, 2138(2000)], 항 CD20 항체[커런트·오피니언·인·온콜로지(Curr. Opin. Oncol.), 10, 548(1998)], 항 Her2 항체, 항 CD10 항체 등을 들 수 있다.
알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체로서는, 항 인터류킨 6 항체[이뮤놀로지컬·리뷰즈(Immunol. Rev.), 127, 5(1992)], 항 인터류킨 6 수용체 항체[몰레큘러·이뮤놀로지(Molecular Immunol.), 31, 371(1994)], 항 인터류킨 5 항체[이뮤놀로지컬·리뷰즈(Immunol. Rev.), 127, 5(1992)], 항 인터류킨 5 수용체 항체, 항 인터류킨 4 항체[사이토카인(Cytokine), 3, 562(1991)], 항 인터류킨 4 수용체 항체[저널·오브·이뮤놀로지컬·메소즈(J. Immunol. Methods), 217, 41(1998)], 항종양 괴사 인자 항체[하이브리도마(Hybridoma), 13, 183(1994)], 항종양 괴사 인자 수용체 항체[몰레큘러·퍼머콜로지(Molecular Pharmacol.), 58, 237(2000)], 항 CCR4 항체[네이처(Nature), 400, 776(1999)], 항 케모카인 항체(Peri et al., J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994) 또는 항 케모카인 수용체 항체[저널·오브·이뮤놀로지컬·메소즈(J. Exp. Med.), 186, 1373(1997)]이며, 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체가 항 GPIIb/IIIa 항체[저널·오브·이뮤놀로지(J. Immunol.), 152, 2968(1994)], 항혈소판 유래 증식 인자 항체[사이언스(Science), 253, 1129(1991)], 항혈소판 유래 증식 인자 수용체 항체[저널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 272, 17400(1997)], 항혈액 응고 인자 항체[서큘레이션(Circulation), 101, 1158(2000)] 등을 들 수 있다.
바이러스 또는 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체로서는, 항 gp120 항체[스트럭처(Structure), 8, 385(2000)], 항 CD4 항체[저널·오브·류마톨로지(J. Rheumatology), 25, 2065(1998)], 항 CCR5 항체, 항 베로독소 항체[저널·오브·클리니컬·마이크로바이올로지(J. Clin. Microbiol.), 37, 396(1999)] 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 프로테인 A 결합 활성을 갖는 유전자 재조합 항체 조성물에 관한 것이다.
프로테인 A 결합 활성을 갖는다는 것은, 유전자 재조합 항체 조성물이 프로테인 A를 이용하여 정제 가능한 것을 말한다.
프로테인 A 결합 활성은, ELISA법, 표면 플라즈몬 공명법 등을 이용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 플레이트에 고상화(固相化)된 프로테인 A에, 항체 조성물을 반응시킨 후, 각종 표지(標識)를 행한 그 항체를 인식하는 항체를 또한 반응시켜, 프로테인 A에 결합된 항체 조성물을 정량함으로써 측정할 수 있다.
IgG1 항체와 동등한 프로테인 A 결합 활성이란, 상술한 측정계를 이용하여, 본 발명의 유전자 재조합 항체 및 IgG1 항체의 프로테인 A에 대한 결합 활성을 측정한 경우, IgG1 항체와 실질적으로 동등한 결합 활성 또는 친화성(affinity)을 갖는 활성을 말한다.
또는 세파로스 등의 담체에 결합시킨 프로테인 A에, pH5∼pH8 전후의 고 pH 조건에서 항체 조성물을 반응시키고, 세정 후, 또한 pH2∼pH5 전후의 저 pH 조건에서 용출하는 항체 조성물을 정량함으로써 측정할 수 있다.
항체 분자에는 Fc가 있고, 이들 영역에는 N-글리코시드 결합 당쇄가 결합한다. 따라서, 항체 1분자당 2개의 당쇄가 결합하고 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄로서는, 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토스-N-아세틸글루코사민(이하, Gal-GlcNAc라고 표기함)의 측쇄를 병행하여 1 내지는 복수 개 가지며, 또한 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측에 시알산(sialic acid), 바이섹 팅(bisecting)의 N-아세틸글루코사민 등을 갖는 콤플렉스형(복합형) 당쇄를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄는, 하기 화학식으로 표시된다.
Figure 112009051261985-pct00001
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물은, 상기한 당쇄 구조를 갖고 있으면, 단일의 당쇄 구조를 갖는 항체 분자로 구성되어 있어도 좋고, 복수의 다른 당쇄 구조를 갖는 항체 분자로 구성되어 있어도 좋다. 즉, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물이란, 단일 또는 복수의 다른 당쇄 구조를 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 조성물을 의미한다.
또한, 본 발명의 유전자 재조합 항체 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄를 갖는 항체 조성물은, CDC 활성 외에 높은 ADCC 활성을 갖는다.
항체의 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율로서는, CDC 활성 외에 ADCC 활성이 증가하면, 어떠한 비율의 항체도 포함되지만, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 51%-100%, 더 바람직하게는 80%-100%, 특히 바람직하게는 90%-99%, 가장 바람직하게는 100%의 비율을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄로서는, 상기에서 나타낸 화학식 중, 환원 말단측의 N-아세틸글루코사민에는 푸코스가 결합되어 있지 않으면, 비환원 말단의 당쇄의 구조는 어느 것이라도 좋다.
본 발명에 있어서, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않다는 것은, 실질적으로 푸코스가 결합되어 있지 않은 것을 말한다. 실질적으로 푸코스가 결합되어 있지 않은 항체 조성물이란, 구체적으로는, 후술 4에 기재된 당쇄 분석에 있어서, 푸코스를 실질적으로 검출할 수 없을 정도의 항체 조성물인 경우를 말한다. 실질적으로 검출할 수 없을 정도란, 측정의 검출 한계 이하인 것을 말한다. 모든 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 유전자 재조합 항체 조성물은, 가장 높은 ADCC 활성을 갖는다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물 중에 포함되는, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄를 갖는 항체 분자의 비율은, 항체 분자로부터 히드라진 분해나 효소 소화 등의 공지의 방법[생물 화학 실험법 23-당단백질 당쇄 연구법(학회 출판 센터) 다카하시 레이코 편찬(1989)]을 이용하여, 당쇄를 유리시키고, 유리시킨 당쇄를 형 광 표지 또는 동위 원소 표지하며, 표지한 당쇄를 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다. 또한, 유리시킨 당쇄를 HPAED-PAD법[저널·오브·리퀴드·크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해 분석함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 형질 전환주는, 항체 분자의 가변 영역 및 정상 영역을 코딩하는 DNA를 삽입한 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터를 동물 세포에 도입함으로써, 취득할 수 있다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터는, 이하와 같이 구축한다.
전술한 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 삽입함으로써, 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터를 제작한다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터로서는, pAGE107(일본 특허 공개 평성 제3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140(1990)), pAGE103(Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310(1987)), pHSG274(Brady G. et al., Gene, 27, 223-232(1984)), pKCR(O'Hare K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527-1531(1981)), pSG1βd2-4(Miyaji H. et al., Cytotechnology, 4, 173-180(1990)) 등을 들 수 있다. 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 이용하는 프로모터와 인핸서(enhancer)로서는, SV40의 초기 프로모터와 인핸서(Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310(1987)), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터와 인핸서(Kuwana Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960-968(1987)), 및 면역글로불린 H쇄의 프로모터(Mason J. O. et al., Cell, 41, 479-487(1985))와 인핸서(Gillies S. D. et al., Cell, 33, 717-728(1983)) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, H쇄 및 L쇄가 각각의 벡터 상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 어느 것이라도 이용할 수 있으나, 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터의 구축이 용이하고, 동물 세포로의 도입이 용이하며, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이루는 등의 점에서 탠덤형의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터 쪽이 바람직하다(Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278(1994)). 탠덤형의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터로서는, pKANTEX93(WO97/10354), pEE18(Bentley K. J. et al., Hybridoma, 17, 559-567(1998)) 등을 들 수 있다.
구축된 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA의 상류에, 각종 항원에 대한 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝함으로써, 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터를 구축할 수 있다.
숙주 세포로의 발현 벡터의 도입법으로서는, 일렉트로포레이션법(일본 특허 공개 평성 제2-257891; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140(1990)) 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 숙주 세포로서는, 동물 세포, 식물 세포, 미생물 등, 재조합 단백질 생산에 일반적으로 이용되는 숙주 세포이면 어떠한 것도 포함된다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 숙주 세포로서는, 차이니 즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포, 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, 마우스 골수종 세포주 NS0 세포, 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포, 인간 백혈병 세포주 나말와 세포, 골수종 세포와 임의의 B 세포를 이용하여 제조된 하이브리도마 세포, 배아 줄기 세포 또는 수정란 세포를 이용함으로써 제조된 인간 이외의 트랜스제닉 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포와 임의의 골수종 세포를 이용해서 제조된 하이브리도마 세포, 상기 골수종 세포와 배아 줄기 세포 또는 수정란 세포를 이용함으로써 제조된 인간 이외의 트랜스제닉 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포를 이용해서 제조된 하이브리도마 세포 등을 들 수 있다.
CDC 활성뿐만 아니라, ADCC 활성이 높은 유전자 재조합 항체 조성물을 발현시키는 숙주 세포로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는 숙주 세포, 예컨대, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물이며, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 능력을 갖는 숙주 세포, 예컨대, 이하에 드는 적어도 하나의 단백질의 활성이 저하 또는 비활성화된 세포 등을 들 수 있다.
(a) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소;
(b) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위 치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소;
(c) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질.
상기 숙주 세포로서는, 바람직하게는 숙주 세포 내의 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자가 녹아웃된 숙주 세포를 들 수 있다(WO 02/31140, WO 03/85107).
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 세포 내에서 당쇄에의 푸코스의 공급원인 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관계되는 효소로서는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 영향을 주는 효소 등을 들 수 있다.
세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스는, 새로운(de novo) 합성 경로 또는 Salvage 합성 경로에 의해 공급되고 있다. 따라서, 이들 합성 경로에 관여하는 효소는 모두 세포 내 GDP-푸코스의 합성에 관계되는 효소에 포함된다.
세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 새로운 합성 경로에 관여하는 효소로서는, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(이하, GMD라고 표기함), GDP-케토-데옥시만노스 3,5-에피머라아제, 4,6-리덕타제(이하, Fx라고 표기함) 등을 들 수 있다.
세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 Salvage 합성 경로에 관여하는 효소로서는, GDP-베타-L-푸코스-피로포스포릴라아제(이하, GFPP라고 표기함), 푸코키나아제 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 영향을 주는 효소로서는, 상술한 세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성 경로에 관여하는 효소의 활성에 영향을 주거나, 상기 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.
GDP-만노스 4,6-디히드라타아제로서는,
(a) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA;
등을 들 수 있다.
GDP-만노스 4,6-디히드라타아제로서는,
(a) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실(缺失), 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질;
등을 들 수 있다.
GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제로서는,
(a) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA;
등을 들 수 있다.
GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제로서는,
(a) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질;
등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 관여하는 효소로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아 세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 영향을 주는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. 구체적으로는, α-1,6-푸코실트랜스퍼라아제나 α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
또한, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 영향을 주는 효소로서는, 상술한 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 관여하는 효소의 활성에 영향을 주는 효소, 상기 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.
본 발명에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제로서는, 하기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 DNA가 코딩하는 단백질,
(a) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(c) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA
(d) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA
또는,
(e) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(f) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(g) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
(h) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
(i) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
(j) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질로서는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질, 또는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스를 골지체 내로 수송하는 반응에 영향을 주는 단백질이면 어떠한 단백질도 포함된다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질로서는, 구체적으로는, GDP-푸코스트랜스포터 등을 들 수 있다.
또한, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스를 골지체 내로 수송하는 반응에 영향을 주는 단백질로서는, 상술한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로 의 수송에 관여하는 단백질의 활성에 영향을 주는 단백질, 발현에 영향을 주는 단백질도 포함된다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로서는, 서열 번호 18 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 18 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.
α1,6-푸코실트랜스퍼라아제의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로서는, 서열 번호 22 또는 23으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 22 또는 23으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA란, 예컨대, 상기 서열 번호 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 등의 DNA 또는 그 일부의 단편을 프로브로 하여, 콜로니·하이브리드화법 또는 플라크ㆍ하이브리드화법 또는 서던 블롯 하이브리드화법 등을 이용함으로써 얻어지는 DNA를 의미하며, 구체적으로는, 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA를 고정화한 필터를 이용하여, 0.7 M∼1.0 M의 염화나트륨 존재하에, 65℃에서 하이브리드화를 행한 후, 0.1배∼2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어짐)을 이용하여, 65℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정(同定)할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 하이브리드화는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989(이하, 몰레큘러·클로닝 제2판이라고 약기함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997(이하, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지라고 약기함), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University(1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 하이브리드화 가능한 DNA로서 구체적으로는, 상기 서열 번호 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열 번호 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 활성을 갖는 단백질은, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409(1982), Gene, 34, 315(1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488(1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 예컨대, 상기 서열 번호 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이며 그 수는 특별히 한정되지 않으나, 상기한 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지의 기술에 의해 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있을 정도의 수 이고, 예컨대, 1개∼수십 개, 바람직하게는 1개∼20개, 보다 바람직하게는 1개∼10개, 더 바람직하게는 1개∼5개이다.
또한, 본 발명에 있어서, 이용되는 단백질이, 상기 활성을 갖기 위해서는, 상기 서열 번호 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 BLAST〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕나 FASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63(1990)〕등의 해석 소프트를 이용하여 계산했을 때, 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
상술한 효소 활성이 저하 또는 결실된 세포를 취득하는 방법으로서는, 목적으로 하는 효소 활성을 저하 또는 결실시킬 수 있는 수법이면, 어떠한 수법이라도 이용할 수 있다. 구체적으로는,
(a) 효소 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법;
(b) 효소 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법;
(c) 효소에 대한 돌연변이를 도입하는 수법;
(d) 효소 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법;
(e) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴으로서는, 상기 당쇄 구조를 인식 할 수 있는 렉틴이면, 어떠한 렉틴이라도 이용할 수 있다. 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA(Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL(Aleuria aurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.
렉틴에 내성인 세포란, 렉틴을 유효한 농도로 부여했을 때에도, 생육이 저해되지 않는 세포를 말한다. 유효 농도란, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포(이하, 친주(親株) 세포라고도 칭함)가 정상적으로 생육할 수 없는 농도 이상이며, 바람직하게는, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포가 성육(成育)할 수 없는 농도와 동일한 농도, 보다 바람직하게는 2배∼5배, 더 바람직하게는 10배, 가장 바람직하게는 20배 이상이다.
생육이 저해되지 않는 렉틴의 유효 농도는, 세포주에 따라서 적절히 정하면 되고, 통상의 렉틴의 유효 농도는 10 ㎍/㎖∼10 ㎎/㎖, 바람직하게는 0.5 ㎎/㎖∼2.0 ㎎/㎖이다.
이하에, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법을 구체적으로 설명한다.
1. 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 안티바디즈라고 약기함), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993(이하, 모노클로날 안티바디즈라고 약기함), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996(이하, 안티보디 엔지니어링이라고 약기함) 등에 기재된 방법을 이용하여, 예컨대, 이하와 같이 숙주 세포 중에서 발현시켜 취득할 수 있다.
(1) 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터의 구축
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터란, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자가 편입된 동물 세포용 발현 벡터이다. 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, 동물 세포용 발현 벡터에 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자는, IgG1 항체의 H쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자를 클로닝한 후, 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 단편을 연결시킴으로써, 제작할 수 있다. 또한, 합성 DNA를 이용하여 전체 DNA를 합성할 수도 있고, PCR법에 의한 합성도 가능하다(몰레큘러·클로닝 제2판). 또한, 이들 수법을 복수 조합함으로써, 제작할 수도 있다.
동물 세포용 발현 벡터로서는, 상술한 항체 분자의 정상 영역을 코딩하는 유전자를 편입시켜 발현할 수 있는 것이면 어느 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, pKANTEX93[몰레큘러·이뮤놀로지(Mol. Immunol.), 37, 1035(2000)], pAGE107[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], pAGE103[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 101, 1307(1987)], pHSG274[진(Gene), 27, 223(1984)], pKCR[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527(1981)], pSG1βd2-4[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 4, 173(1990)] 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 이용하는 프로모터와 인핸서로서는, SV40의 초기 프로모터와 인핸서[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR[바이오케미컬·앤드·바이오피지컬·리서치·커뮤니케이션즈(Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960(1987)], 면역글로불린 H쇄의 프로모터[셀(Cell), 41, 479(1985)]와 인핸서[셀(Cell), 33, 717(1983)] 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, 항체 H쇄 및 L쇄가 각각의 벡터 상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(이하, 탠덤형이라고 표기함)의 어느 것이라도 이용할 수 있으나, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포로의 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스가 균형을 이루는 등의 점에서 탠덤형의 항체 발현용 벡터 쪽이 바람직하다[저널·오브·이뮤놀로지컬·메소즈(J. Immunol. Methods), 167, 271(1994)].
구축한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터는, 인간형 키메라 항체 인간화 항체 및 인간 항체의 동물 세포에서의 발현에 사용할 수 있다.
(2) 비인간 동물 항체의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 취득
비인간 동물 항체, 예컨대, 마우스 항체의 H쇄 가변 영역(이하, VH라고 표기함) 및 L쇄 가변 영역(이하, VL이라고 표기함)을 코딩하는 cDNA는 이하와 같이 하여 취득할 수 있다.
임의의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로서 이용하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 이 라이브러리로부터, 기존의 마우스 항체의 정상 영역 또는 가변 영역을 코딩하는 DNA를 프로브로서 이용하여, VH를 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 및 L쇄 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적의 마우스 항체의 VH 및 VL의 전체 염기 서열을 결정하고, 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정한다.
임의의 비인간 동물 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 항체가 결합하는 항원을 비인간 동물에게 면역시키고, 주지의 방법[몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 안티바디즈라고 약기함), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993(이하, 모노클로날 안티바디즈라고 약기함), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996(이하, 안티보디 엔지니어링이라고 약기함)]에 따라서, 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포로 하이 브리도마를 제작하며, 이어서 단일 세포화한 하이브리도마를 선택하고, 이것을 배양하며, 배양 상청액으로부터 정제하여, 취득할 수 있다.
비인간 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 이용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[메소즈·인·엔자이몰로지(Methods in Enzymol.), 154, 3(1987)], 또한 전체 RNA로부터 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스칼럼법[몰레큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제하는 키트로서는, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 통상적인 방법[몰레큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지(Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34], 또는 시판의 키트, 예컨대, Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL사 제조)이나 ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene사 제조)를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 편입시키는 벡터는, 상기 cDNA를 편입시킬 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, ZAP Express[스트래티지즈(Strategies), 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[뉴클레익·애시즈·리서치(Nucleic Acids Research), 17, 9494(1989)], λZAP II(Stratagene사 제조), λgt10, λgt11[디엔에이·클로닝: 어·프랙티컬·어프로치(DNA Cloning: A Practical Approach), I, 49(1985)], Lambda BlueMid(Clontech사 제조), λExCell, pT7T3 18U(Pharmacia사 제조), pcD2[몰레큘러·앤드·셀룰러·바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등을 이용할 수 있다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, XL1-Blue MRF'[스트래티지즈(Strategies), 5, 81(1992)], C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], NM522[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], K802[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 JM105[진(Gene), 38, 275(1985)] 등이 이용된다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA 클론을 선택하는 방법으로서는, 동위 원소(isotope) 또는 형광 등으로 표지한 프로브를 이용한 콜로니·하이브리드화법 또는 플라크ㆍ하이브리드화법[몰레큘러·클로 닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]에 의해 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 조제하고, cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR[몰레큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지(Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34]에 의해 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써 상기 cDNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL을 완전히 포함하고 있는 아미노산 서열을 코딩하고 있는지를 확인할 수 있다.
또한, 항체 가변 영역의 아미노산 서열 또는 상기 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열이 이미 공지인 경우에는, 이하의 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
아미노산 서열이 공지인 경우에는, 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려하여 그 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 설계하고, 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA를 합성하며, 이들을 이용하여 PCR법을 행함으로써 DNA를 얻을 수 있다. 염기 서열이 공지인 경우에는, 그 정보를 기초로 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 이용하여 PCR법을 행함으로써 DNA를 얻을 수 있다.
(3) 비인간 동물 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 해석
분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 나아가서는 항체가 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 동일한 방법으로 찾아낼 수 있다.
(4) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터 의 인간 항체의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자의 상류에, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 각각 삽입하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를, 비인간 동물 항체 VH 및 VL의 3'말단측의 염기 서열과 인간 항체의 CH 및 CL의 5'말단측의 염기 서열로 이루지며, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA와 각각 연결하고, 각각을 본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 H쇄 정상 영역 및 L쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 삽입하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(5) 인간화 항체의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다. 먼저, 목적의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크 영역(이하, FR이라고 표기함)의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 것이면, 어떠한 것이라도 이용할 수 있다. 예컨대, Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 등을 들 수 있으나, 그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해서는, 목적의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
다음으로, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열에 목적의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보여지는 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려해서 DNA 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 설계한다. 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 이용하여 PCR법을 행한다. 이 경우, PCR에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, H쇄, L쇄 모두 4개∼6개의 합성 DNA를 설계하는 것이 바람직하다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5'말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 1의 (1)에서 구축한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 본 항 1의 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(6) 인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 동물의 항체에 비해서 저하되어 버리는 것이 알려져 있다[바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 9, 266(1991)]. 이 원인으로서는, 원래의 비인간 동물 항체의 VH 및 VL에서는, CDR뿐만 아니라, FR의 몇 갠가의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있으며, 이들 아미노산 잔기가 CDR의 이식에 따라, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 다른 아미노산 잔기로 변화해 버리는 것이 생각되고 있다. 이 문제를 해결하기 위해서, 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정해서, 이들을 원래의 비인간 동물 항체로부터 유래하는 아미노산 잔기로 개변하여, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 일이 행해지고 있다[바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 9, 266(1991)].
인간화 항체의 제작에 있어서는, 이들 항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정하는지가, 가장 중요한 점이며, 그 때문에 X선 결정 해석[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[프로테인·엔지니어링(Protein Engineering), 7, 1501(1994)] 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 행해지고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는, 인간화 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 가져왔다. 그러나, 모든 항체에 적응 가능한 인간화 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않다. 현재 상황으로는 각각의 항체에 대해서 여러 종류의 개변체를 제작하고, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 여러 가지 시행 착오가 필요하다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기의 개변은, 개변용 합성 DNA를 이용하여 본 항 1의 (5)에 기재된 PCR법을 행함으로써, 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대해서 본 항 1의 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(7) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에, 본 항 1의 (5) 및 (6)에서 구축한 인간화 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 삽입하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대, 본 항 1의 (5) 및 (6)에서 인간화 항체의 VH 및 VL을 구축할 때에 이용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5'말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 삽입하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(8) 인간화 항체의 안정적 생산
본 항 1의 (4) 및 (7)에 기재된 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 동물 세포에 도입함으로써 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
동물 세포로의 인간화 항체 발현 벡터의 도입법으로서는, 일렉트로포레이션 법[일본 특허 공개 평성 제2-257891; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)] 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 동물 세포로서는, 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 생산시킬 수 있는 동물 세포이면, 어떠한 세포라도 이용할 수 있다.
구체적으로는, 마우스 골수종 세포인 NS0 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO/dhfr-세포, CHO/DG44 세포, 래트 골수종 세포 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리안 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 인간 골수종 세포인 나말와 세포 등을 들 수 있으나, 바람직하게는, 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/0 세포 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터의 도입 후, 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환주는, 일본 특허 공개 평성 제2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, G418 황산염(이하, G418이라고 표기함; SIGMA사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 의해 선택할 수 있다. 동물 세포 배양용 배지로서는, RPMI 1640 배지(닛스이 세이야쿠사 제조), GIT 배지(니혼 세이야쿠사 제조), EX-CELL 302 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(GIBCO BRL사 제조), Hybridoma-SFM 배지(GIBCO BRL사 제조), 또는 이들 배지에 소 태아 혈청(이하, FCS라고 표기함) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청액 중에 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상청액 중의 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 생산량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[이하, ELISA법이라고 표기함; 안티바디즈: 어·래버러토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998, 모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, 일본 특허 공개 평성 제2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 생산량을 상승시킬 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체는, 형질 전환주의 배양 상청액으로부터 프로테인 A 칼럼을 이용하여 정제할 수 있다[안티바디즈: 어·래버러토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988, 모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996]. 또한, 그 외에 통상, 단백질의 정제에서 이용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합해서 행하여 정제할 수 있다. 정제한 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, SDS 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동[이하, SDS-PAGE라고 표기함; 네이처(Nature), 227, 680(1970)]이나 웨스턴 블로팅법[안티바디즈: 어·래버러토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988, 모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티 스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등으로 측정할 수 있다.
이상, 동물 세포를 숙주로 한 항체 조성물의 제조 방법을 나타내었으나, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 개체 혹은 식물 개체에 있어서도 동물 세포와 동일한 방법에 의해 항체 조성물을 제조할 수 있다.
따라서, 숙주 세포가 항체 분자를 발현하는 능력을 갖는 경우에는, 이하에 나타내는 항체 분자를 발현시키는 숙주 세포에 항체 유전자를 도입한 후에, 상기 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 목적으로 하는 항체 조성물을 정제함으로써, 본 발명의 항체 조성물을 제조할 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, YEP13(ATCC 37115), YEp24(ATCC 37051), YCp50(ATCC 37419) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모 균주 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것을 이용해도 좋고, 예컨대, 헥소스키나아제 등의 해당계(解糖系)의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 트리코스포론속, 슈와니오마이세스속 등에 속하는 미생물, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈와니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 이용할 수 있고, 예컨대, 일렉트로포레이션법[메소즈·인·엔자이몰로지(Methods·Enzymol.), 194, 182(1990)], 스페로플라스트법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929(1978)], 아세트산리튬법[저널·오브·박테리올로지(J. Bacteriology), 153, 163(1983), 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929(1978)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대 pcDNAI, pcDM8(후나코시사에서 시판), pAGE107[일본 특허 공개 평성 제3-22979; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], pAS3-3[일본 특허 공개 평성 제2-227075], pCDM8[네이처(Nature), 329, 84O(1987)], pcDNAI/Amp(Invitrogen사), pREP4(Invitrogen사), pAGE103[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochemistry), 101, 1307(1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 동물 세포 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV4O의 초기 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 이용해도 좋다.
숙주 세포로서는, 인간의 세포인 나말와(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈·햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637(일본 특허 공개 소화 제63-299), 래트 골수종 세포, 마우스 골수종 세포, 시리안 햄스터 신장 유래 세포, 배아 줄기 세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 이용하는 경우에는, 예컨대, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992), 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 6, 47(1988) 등에 기재된 방법에 의해, 단백질을 발현할 수 있다.
즉, 발현 벡터 및 바큘로 바이러스를 곤충 세포에 공도입(共導入; cotransfection)하여 곤충 세포 배양 상청액 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 또한 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜, 단백질을 발현시킬 수 있다.
상기 방법에서 이용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예컨대, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 invitorogen사) 등을 들 수 있다.
바큘로 바이러스로서는, 예컨대, 밤나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그라파ㆍ캘리포니카ㆍ뉴클레어ㆍ폴리헤드로시스ㆍ바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 이용할 수 있다.
곤충 세포로서는, Spodopterafrugiperda의 난소 세포인 Sf9, Sf21[커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)], Trichoplusiani의 난소 세포인 High 5(Invitrogen사) 등을 이용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포로의 상기 발현 도입 벡터와 상기 바큘로 바이러스의 공도입 방법으로서는, 예컨대 인산칼슘법[일본 특허 공개 평성 제2-227075], 리포펙션법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
식물 세포를 숙주 세포로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 식물 세포 중에서 발현될 수 있는 것이면 어떠한 것을 이용해도 좋고, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 식물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 이용할 수 있고, 예컨대, 아그로박테리움(Agrobacterium)[일본 특허 공개 소화 제59-140885, 일본 특허 공개 소화 제60-70080, WO94/00977], 일렉트로포레이션법[일본 특허 공개 소화 제60-251887], 파티클 건(유전자 총)을 이용하는 방법[일본 특허 제2606856, 일본 특허 제2517813] 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 이용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], 인산칼슘법[일본 특허 공개 평성 제2-227075], 리포펙션법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언 스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)], 인젝션법[매니퓰레이팅·더·마우스·엠브리오·어·래버러토리·매뉴얼], 파티클 건(유전자 총)을 이용하는 방법[일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813호], DEAE-덱스트란법[바이오 매뉴얼 시리즈 4-유전자 도입과 발현·해석법(요도사) 요코다 다카시·아라이 겐이치 편찬(1994)], 바이러스 벡터법[매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판] 등을 들 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, Fc와 다른 단백질과의 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 분자를 생성 축적시키며, 상기 배양물로부터 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 형질 전환체를 배양하는 방법은, 숙주 세포의 배양에 이용되는 통상적인 방법에 따라서 행할 수 있다.
효모 등의 진핵 생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 상기 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지의 어느 것을 이용해도 좋다.
탄소원으로서는, 상기 생물이 자화할 수 있는 것이면 되고, 글루코스, 프락토스, 수크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수 분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 이 용할 수 있다.
질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소 함유 화합물, 및, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카세인 가수 분해물, 대두박 및 대두박 가수 분해물, 각종 발효 균체 및 그 소화물 등을 이용할 수 있다.
무기 염류로서는, 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 이용할 수 있다.
배양은, 통상 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양 온도는 15℃∼40℃가 좋고, 배양 시간은 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중의 pH는 3.0∼9.0으로 유지한다. pH의 조제는, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라시클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서(inducer)를 배지에 첨가해도 좋다. 예컨대, lac 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 좋다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지[더·저널·오브·더·아메리칸·메디컬·어 소시에이션(The Journal of the American Medical Association), 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[사이언스(Science), 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[바이롤로지(Virology), 8, 396(1959)], 199 배지[프로시딩·오브·더·소사이어티·포·더·바이올로지컬·메디슨(Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1(1950)], Whitten 배지[발생 공학 실험 매뉴얼-트랜스제닉·마우스의 제작 방법(고단사) 가츠키 모토야 편찬(1987)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.
배양은 통상 pH6.0∼pH8.0, 30℃∼40℃, 5% CO2 존재하 등의 조건하에서 1일∼7일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 이용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사), Sf-900 II SFM 배지(Life Technologies사), ExCell 400, ExCell 405(모두 JRH Biosciences사), Grace's Insect Medium[네이처(Nature), 195, 788(1962)] 등을 이용할 수 있다.
배양은 통상 pH6.0∼pH7.0, 25℃∼30℃ 등의 조건하에서 1일∼5일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
식물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포 나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 상기 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게·앤드·스쿠그(MS) 배지, 화이트(White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 시토키닌(cytokinin) 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다.
배양은 통상 pH5.0∼pH9.0, 20℃∼40℃의 조건하에서 3일∼60일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
상기와 같이, 항체 분자를 코딩하는 DNA를 편입시킨 발현 벡터를 보유하는 동물 세포, 또는 식물 세포 유래의 형질 전환체를, 통상의 배양 방법에 따라 배양하여, 항체 조성물을 생성 축적시키고, 그 배양물로부터 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
항체 조성물의 생산 방법으로서는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖으로 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포나, 생산시키는 항체 분자의 구조를 변경함으로써, 그 방법을 선택할 수 있다.
항체 조성물이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법[저널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227(1989); 진·디벨롭먼트(Genes Develop.), 4, 1288(1990)], 또는 일본 특허 공개 평성 제05-336963, WO94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 상기 항체 조성물을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 이용하여, 발현 벡터에, 항체 분자를 코딩하는 DNA, 및 항체 분자의 발현에 적절한 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA를 삽입하고, 그 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한 후에 항체 분자를 발현시킴으로써, 목적으로 하는 항체 분자를 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 특허 공개 평성 제2-227075에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 이용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체(트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체(트랜스제닉 식물)를 조성하고, 이들 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조할 수도 있다.
형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우에는, 통상적인 방법에 따라서, 사육 또는 재배하고, 항체 조성물을 생성 축적시키며, 상기 동물 개체 또는 식물 개체로부터 상기 항체 조성물을 채취함으로써, 상기 항체 조성물을 제조할 수 있다.
동물 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 공지의 방법[아메리칸·저널·오브·클리니컬·뉴트리션(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S(1996); 아메리칸·저널·오브·클리니컬·뉴트리션(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S(1996); 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 9, 830(1991)]에 준하여 유전자를 도입해서 조성한 동물 중에 목적으로 하는 항체 조성물을 생산시키는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우에는, 예컨대, 항체 분자를 코딩하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하고, 항체 조성물을 상기 동물 중에 생성·축적시키며, 상기 동물 중에서 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 상기 동물 중의 생성·축적 장소로서는, 예컨대 상기 동물의 젖(일본 특허 공개 소화 제63-309192), 또는 알 등을 들 수 있다. 이때에 이용되는 프로모터로서는, 동물에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있으나, 예컨대, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카세인 프로모터, β 카세인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터, 유장(whey) 산성 프로테인 프로모터 등이 적합하게 이용된다.
식물 개체를 이용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 항체 분자를 코딩하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지의 방법[조직 배양, 20(1994); 조직 배양, 21(1995); 트렌드·인·바이오테크놀로지(Trends in Biotechnology), 15, 45(1997)]에 준하여 재배하고, 항체 조성물을 상기 식물 중에 생성·축적시키며, 상기 식물 중에서 상기 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
항체 분자를 코딩하는 유전자를 도입한 형질 전환체에 의해 제조된 항체 조 성물은, 예컨대 항체 조성물이 세포 내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤 가울린(Menton Gaulin) 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 상기 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청액으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쯔비시 가가쿠(주) 제조) 등 레진(resin)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 이용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합해서 이용하여, 항체 조성물의 정제 표준물을 얻을 수 있다.
또한, 항체 조성물이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는, 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 분획으로서 항체 조성물의 불용체를 회수한다. 회수한 항체 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 그 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 상기 항체 조성물을 정상적인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 상기 항체 조성물의 정제 표준물을 얻을 수 있다.
항체 조성물이 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청액에 상기 항체 조성 물 또는 그 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 그 배양물을 상기와 동일한 원심 분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상청액을 취득하고, 그 배양 상청액으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 이용함으로써, 항체 조성물의 정제 표준물을 얻을 수 있다.
2. 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 세포의 제작
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 중, 높은 CDC 활성에 더하여 높은 ADCC 활성을 갖는 항체 조성물을 생산하는 세포는, 이하에 서술하는 수법에 의해, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작하고, 이 숙주 세포에 전술 1 (4) 및 (7)에 기재된 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 도입함으로써, 생산할 수 있다.
구체적으로는, 항체 분자의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 수식에 관계되는 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 비활성화된 세포를 선택하거나, 또는 후술하는 여러 가지 인위적 수법에 의해 얻어진 세포를 숙주 세포로서 이용할 수도 있다. 이하, 상세히 설명한다.
(1) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법
높은 ADCC 활성을 갖는 항체(이하, 고 ADCC 활성 항체라고 함) 생성 세포의 제작을 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루 코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 유전자 파괴의 방법을 이용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(이하, GMD라고 표기함), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제(이하, Fx라고 표기함) 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다. 여기서 말하는 유전자란, DNA 또는 RNA를 포함한다.
유전자 파괴의 방법으로서는, 표적으로 하는 효소의 유전자를 파괴할 수 있는 방법이면 어떠한 방법도 포함된다. 그 예로서는, 안티센스법, 리보자임법, 상동 재조합법, RNA-DNA 올리고뉴클레오티드법(이하, RDO법이라고 표기함), RNA 인터피어런스법(이하, RNAi법이라고 표기함), 레트로바이러스를 이용한 방법, 트랜스포존을 이용한 방법 등을 들 수 있다. 이하에 이들을 구체적으로 설명한다.
(a) 안티센스법 또는 리보자임법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위한 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포의 제작을 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 유전자를 표적으로 하고, 세포 공학, 12, 239(1993), 바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 17, 1097(1999), 휴먼·몰레큘러·제네틱스(Hum. Mol. Genet.), 5, 1083(1995), 세포 공학, 13, 255(1994), 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886(1999) 등에 기재된 안티센스법 또는 리보자임법을 이용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 DNA를 조제한다. 조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기 서열을 결정한다. 결정한 DNA의 서열에 기초하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 안티센스 유전자 또는 리보자임을 설계한다.
상기 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 세포 내에서 발현시키기 위해서, 조제한 DNA의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.
상기 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코 시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다. 또한, 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조 또는 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용되는 숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나, 내지는 염색체 중으로의 편입이 가능하며, 설계한 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입 방법으로서는, 전술 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 이하의 방법을 들 수 있다.
형질 전환체를 선택하는 방법
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 비활성화된 세포를 선택하는 방법으로서는, 문헌[신생화학 실험 강좌 3-당질I, 당단백질(도쿄 가가쿠 동인) 일본 생화학회 편찬(1988)], 문헌[세포 공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글리코바이올로지 실험 프로토콜, 당단백질·당지질·프로테오글리칸(슈준사 제조) 다니구치 나오유키·스즈키 아케미·후루카와 기요시·스가하라 가즈유키 감수(1996)], 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 생화학적인 방법 또는 유전자 공학적인 방법 등을 이용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법을 들 수 있다. 생화학적인 방법으로서는, 예컨대, 효소 특이적인 기질을 이용하여 효소 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다. 유전자 공학적인 방법으로서는, 예컨대, 효소 유전자의 mRNA량을 측정하는 노던 해석이나 RT-PCR법 등을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.
cDNA의 조제 방법
각종 숙주 세포의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 또는 mRNA를 조제한다. 조제한 전체 RNA 또는 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 축퇴성(degenerative) 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법으로 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 단편을 취득한 다.
취득한 유전자 단편을 프로브로서 이용하고, cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA를 취득할 수 있다.
인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포의 mRNA는 시판되어 있는 것(예컨대 Clontech사)을 이용해도 좋고, 이하와 같이 해서 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 조제해도 좋다.
인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA를 조제하는 방법으로서는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[메소즈·인·엔자이몰로지(Methods in Enzymology), 154, 3(1987)], 산성 티오시안산구아니딘·페놀·클로로포름(AGPC)법[애널리티컬·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 162, 156(1987); 실험 의학, 9, 1937(1991)] 등을 들 수 있다.
또한, 전체 RNA로부터 poly(A)+ RNA로서 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법(몰레큘러·클로닝 제2판) 등을 들 수 있다.
또한, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사) 등의 시판되어 있는 키트를 이용함으로써 mRNA를 조제할 수 있다.
조제한 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포 mRNA로부터 cDNA 라이브러 리를 제작한다. cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989) 등에 기재된 방법, 또는 시판되어 있는 키트, 예컨대 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies사), ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE사)를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 클로닝 벡터로서는, 대장균 K12주 중에서 자립 복제할 수 있는 것이면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, ZAP Express[STRATAGENE사, 스트래티지스(Strategies), 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[뉴클레익·애시즈·리서치(Nucleic Acids Research), 17, 9494(1989)], λZAP II(STRATAGENE사), λgt10, λgt11[디엔에이·클로닝·어·프랙티컬·어프로치(DNA cloning, A Practical Approach), 1, 49(1985)], λTriplEx(Clontech사), λExCell(Pharmacia사), pT7T3 18U(Pharmacia사), pcD2[몰레큘러·셀룰러·바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 숙주 미생물로서는, 미생물이면 어느 것이라도 이용할 수 있으나, 바람직하게는 대장균이 이용된다. 구체적으로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) XL1-Blue MRF'[STRATAGENE사, 스트래티지스(Strategies), 5, 81(1992)], 에스케리치아 콜라이 C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], 에스케리치아 콜라이 Y1088[사이언스(Science), 222, 778(1983)], 에스케리치아 콜라이 Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], 에스케리치아 콜라이 NM522[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], 에스케리치아 콜라이 K802[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 에스케리치아 콜라이 JM105[진(Gene), 38, 275(1985)] 등이 이용된다.
cDNA 라이브러리는, 그대로 이후의 해석에 이용해도 좋으나, 불완전 길이 cDNA의 비율을 낮추고, 완전 길이 cDNA를 효율적으로 취득하기 위해서, 스가노 등이 개발한 올리고캡법[진(Gene), 138, 171(1994); 진(Gene), 200, 149(1997); 단백질 핵산 효소, 41, 603(1996); 실험 의학, 11, 2491(1993); cDNA 클로닝(요도사)(1996); 유전자 라이브러리의 제작법(요도사)(1994)]을 이용해서 조제하여 이하의 해석에 이용해도 좋다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 것이 예측되는 염기 서열의 5'말단 및 3'말단의 염기 서열에 특이적인 축퇴성 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR법[피씨알·프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)]을 이용하여 DNA의 증폭을 행함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.
취득한 유전자 단편이 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA인 것은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 확인할 수 있다.
상기 유전자 단편을 프로브로 하고, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 콜로니 하이브리드화나 플라크 하이브리드화(몰레큘러·클로닝 제2판) 등을 이용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 DNA를 취득할 수 있다.
또한, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 단편을 취득하기 위해서 이용한 프라이머를 사용하고, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR법을 이용해서 증폭함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하 는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 취득할 수도 있다.
취득한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA의 염기 서열은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 상기 DNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 cDNA의 염기 서열을 기초로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 이용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA가 데이터베이스 중의 유전자 중에서 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 유전자인 것을 확인할 수도 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열로서는, 예컨대, 서열 번호 18 또는 20에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열로서는, 예컨대, 서열 번호 22 또는 23에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
결정된 DNA의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392(Perkin Elmer사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 취득할 수도 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 이하에 기재된 방법을 들 수 있다.
게놈 DNA의 조제 방법
게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 몰레큘러·클로닝 제2판이나 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 공지의 방법을 들 수 있다. 또한, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템(Genome Systems사)이나 Universal GenomeWalkerTM Kits(CLONTECH사) 등을 이용함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 취득할 수도 있다.
취득한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA의 염기 서열은, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 상기 DNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 게놈 DNA의 염기 서열을 기초로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 이용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA가 데이터베이스 중의 유전자 중에서 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 유전자인 것을 확인할 수도 있다.
결정된 DNA의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392(Perkin Elmer사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 취득할 수도 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서는, 예컨대 서열 번호 26, 27, 28 및 29에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서는, 예컨대 서열 번호 30에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 이용하지 않고, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임을, 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 항체 조성물을 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임은, 공지의 방법 또는 DNA 합성기에 의해 조제할 수 있다. 구체적으로는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA 및 게놈 DNA의 염기 서열 중, 연속된 5∼150 염기, 바람직하게는 5∼60 염기, 보다 바람직하게는 10∼40 염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레 오티드의 서열 정보에 기초하여, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 상기 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하는 리보자임을 합성하여 조제할 수 있다.
올리고뉴클레오티드로서는, 올리고 RNA 및 이 올리고뉴클레오티드의 유도체(이하, 올리고뉴클레오티드 유도체라고 말함) 등을 들 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유도체로서는, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5'포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스와 인산디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5티아졸우라실로 치환된 유도체 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 페녹사진 수식 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-O-프로필리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-메톡시에톡시리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다[세포 공학, 16, 1463(1997)].
(b) 상동 재조합법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위한 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 염색체 상의 표적 유전자를 상동 재조합법을 이용해서 염색체를 개변함으로써 제작할 수 있다.
염색체 상의 표적 유전자의 개변은, Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)(이하, 「매니퓰레이팅·더·마우스·엠브리오·어·래버러토리·매뉴얼」이라고 약기함), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작, 요도사(1995)(이하, 「ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작」이라고 약기함) 등에 기재된 방법을 이용하여, 예컨대 이하와 같이 행할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제한다.
게놈 DNA의 염기 서열에 기초하여, 개변하는 표적 유전자(예컨대, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 구조 유전자, 혹은 프로모터 유전자)를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다.
제작한 타겟 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 염색체 상의 표적 유전자와 타겟 벡터 사이에서 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 고 ADCC 항체 생산 세포의 제작을 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 게놈 DNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서, 예컨대 서열 번호 26, 27, 28 및 29에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
상기한 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서, 예컨대 서열 번호 30에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
염색체 상의 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터는, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작(요도사)(1995) 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다. 타겟 벡터는, 치환형, 삽입형의 어느 것이나 이용할 수 있다.
각종 숙주 세포로의 타겟 벡터의 도입에는, 전술 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
상동 재조합체를 효율적으로 선별하는 방법으로서, 예컨대, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 이용한 변이 마우스의 제작(요도사)(1995) 등에 기재된 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 폴리 A 선택 등의 방법을 이용할 수 있다. 선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리드화법(몰레큘러·클로닝 제2판)이나 PCR법[피씨알·프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)] 등을 들 수 있다.
(c) RDO 방법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, RDO법을 이용하여, 예 컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA를 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 이용하여 조제한다. 조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기 서열을 결정한다.
결정한 DNA의 서열에 기초하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 RDO의 컨스트럭트를 설계하여 합성한다.
합성한 RDO를 숙주 세포에 도입하고, 표적으로 한 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소에 변이가 생긴 형질 전환체를 선택함으로써, 고 CDC 활성 및 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위한 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 이 용할 수 있다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 RDO의 도입에는, 전술 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 상기 2의 (1)의 (a)에 기재된 cDNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 상기 2의 (1)의 (b)에 기재된 게놈 DNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
DNA의 염기 서열은, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 서브클로닝하고, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 수행하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 이용하여 분석함으로써, 확인할 수 있다.
RDO는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다. RDO를 숙주 세포에 도입하고, 표적으로 한 효소, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스 의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자에 변이가 생긴 세포를 선택하는 방법으로서는, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 염색체 상의 유전자의 변이를 직접 검출하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기 2의 (1)의 (a)에 기재된, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법, 후술 2의 (5)에 기재된 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법, 또는, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법도 이용할 수 있다.
RDO는, 사이언스(Science), 273, 1386(1996); 네이처·메디신(Nature Medicine), 4, 285(1998); 헤파톨로지(Hepatology), 25, 1462(1997); 진·세라피(Gene Therapy), 5, 1960(1999); 진·세라피(Gene Therapy), 5, 1960(1999); 저널·오브·몰레큘러·메디신(J. Mol. Med.), 75, 829(1997); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774(1999); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768(1999); 뉴클레익·애시즈·리서치(Nuc. Acids. Res.), 27, 1323(1999); 인베스티게이션·오브·더마톨로지(Invest. Dematol.), 111, 1172(1998); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 16, 1343(1998); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 43(2000); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 555(2000) 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(d) RNAi법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, RNAi법을 이용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 상기 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 이용하여, cDNA를 조제한다. 조제한 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 결정한 cDNA의 서열에 기초하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 부분 혹은 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자를 설계한다.
상기 RNAi 유전자를 세포 내에서 발현시키기 위해서, 조제한 cDNA의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡 터를 제작한다. 이 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포 표면 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체로의 편입이 가능하고, 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 전술 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 cDNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 이용하지 않고, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 RNAi 유전자를, 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 고 CDC 활성 및 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
RNAi 유전자는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 이용함으로써 조제할 수 있다. RNAi 유전자의 컨스트럭트는, [네이처(Nature), 391, 806(1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502(1998); 네이처(Nature), 395, 854(1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049(1999); 셀(Cell), 95, 1017(1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451(1999); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959(1998); 네이처·셀·바이올로지(Nature Cell Biol.), 2, 70(2000)] 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(e) 트랜스포존을 이용한 방법에 의한, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 네이처·제네틱(Nature Genet.), 25, 35(2000) 등에 기재된 트랜스포존의 시스템을 이용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 돌연변이체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
트랜스포존의 시스템이란, 외래 유전자를 랜덤하게 염색체 상에 삽입시킴으로써 돌연변이를 유발시키는 시스템이며, 통상, 트랜스포존에 삽입된 외래 유전자에 돌연변이를 유발시키는 벡터로서 이용하고, 이 유전자를 염색체 상에 랜덤하게 삽입시키기 위한 트랜스포제스(transposase)의 발현 벡터를 동시에 세포 안에 도입한다.
트랜스포제스는, 이용하는 트랜스포존의 서열에 적합한 것이면 어떠한 것도 이용할 수 있다.
외래 유전자로서는, 숙주 세포의 DNA에 변이를 유발하는 것이면 어떠한 유전자도 이용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다. 각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 전술 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
(2) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 상기 효소의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법을 이용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
이들 효소는, 기질 특이성을 가진 어느 특정한 반응을 촉매하는 효소이며, 이러한 기질 특이성을 가진 촉매 작용을 갖는 효소의 활성 중심을 파괴함으로써, 이들 효소의 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 표적으로 하는 효소 중, GMD를 예로 하여, 그 도미넌트 네거티브체의 제작에 대해서 구체적으로 이하에 서술한다.
대장균 유래의 GMD의 입체 구조를 해석한 결과, 4개의 아미노산(133번째의 트레오닌, 135번째의 글루타민산, 157번째의 티로신, 161번째의 리신)이 효소 활성에 중요한 기능을 담당하고 있는 것이 분명해졌다(Structure, 8, 2, 2000). 즉, 입체 구조의 정보에 기초하여 이들 4개의 아미노산을 상이한 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 제작한 결과, 어떠한 변이체에 있어서도 유의하게 효소 활성이 저하되고 있는 것으로 나타났다. 한편, GMD의 보효소(補酵素) NADP나 기질인 GDP-만노스 와의 결합능에 관해서는, 어떠한 변이체에 있어서도 거의 변화가 관찰되고 있지 않다. 따라서, GMD의 효소 활성을 담당하는 이들 4개의 아미노산을 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 대장균 유래의 GMD의 도미넌트 네거티브체의 제작 결과에 기초하여, 아미노산 서열 정보를 기초로 한 상동성 비교나 입체 구조 예측을 행함으로써, 예컨대, CHO 세포 유래의 GMD(서열 번호 19)에서는, 155번째의 트레오닌, 157번째의 글루타민산, 179번째의 티로신, 183번째의 리신을 다른 아미노산으로 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 이러한 아미노산 치환을 도입한 유전자의 제작은, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 행할 수 있다.
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 상술한 바와 같이 제작한 표적 효소의 도미넌트 네거티브체를 코딩하는 유전자(이하, 도미넌트 네거티브체 유전자라고 약기함)를 이용하여, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, 매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판 등에 기재된 유전자 도입의 방법에 따라서, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 도미넌트 네거티브체 유전자를 조제한다. 조제한 도미넌트 네거티브체 유전자의 전체 길이 DNA를 기초로 하고, 필요에 따라, 그 단백질을 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
상기 DNA 단편, 또는 전체 길이 DNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 이 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 이용할 수 있다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 편입이 가능하고, 목적으로 하는 도미넌트 네거티브체를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 이용된다. 구체적으로는, 전술 1에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 전술 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 이용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 2(1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
(3) 효소에 돌연변이를 도입하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자에 돌연변이를 도입하고, 상기 효소에 돌연변이를 발생시킨 원하는 세포주를 선택하는 수법을 이용함으로써 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
효소에 돌연변이를 도입하는 방법으로서는, 1) 돌연변이 유발 처리로 친주(親株)를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 2) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 생산 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 3) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 그 세포의 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
돌연변이 유발 처리로서는, 친주의 세포의 DNA에 점 돌연변이, 결실 또는 프레임 시프트 돌연변이를 유발하는 것이면 어떠한 처리도 이용할 수 있다. 구체적으로는, 에틸니트로소우레아, 니트로소구아니딘, 벤조피렌, 아크리딘 색소에 의한 처리, 방사선의 조사 등을 들 수 있다. 또한, 여러 가지 알킬화제나 발암물질도 돌연변이 유발 물질로서 이용할 수 있다. 돌연변이 유발 물질을 세포에 작용시키는 방법으로서는, 예컨대 조직 배양의 기술 제3판(아사쿠라 서점) 일본 조직 배양학회 편찬(1996), 네이처·제네틱스(Nature Genet.), 24, 314(2000) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
자연발생적으로 생긴 돌연변이체로서는, 특별한 돌연변이 유발 처리를 실시하지 않고, 통상의 세포 배양의 조건에서 계대배양을 계속함으로써 자연발생적으로 생기는 돌연변이체를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항의 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다.
(4) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 안티센스 RNA/DNA 기술[바이오사이언스와 인더스트리, 50, 322(1992), 화학, 46, 681(1991), Biotechnology, 9, 358(1992), Trends in Biotechnology, 10, 87(1992), Trends in Biotechnology, 10, 152(1992), 세포 공학, 16, 1463(1997)], 트리플·헬릭스 기술[Trends in Biotechnology, 10, 132(1992)] 등을 이용하여, 표적으로 하는 유전자의 전사 또는 번역을 억제함으로써 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N- 아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 후술 4 또는 후술 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
(5) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주(株)를 선택하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 이용하는 숙주 세포는, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법을 이용함으로써 제작할 수 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법으로서는, 예컨대, 소매틱·셀·앤드·몰레큘러·제네틱스(Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51(1986) 등에 기재된 렉틴을 이용한 방법을 들 수 있다.
렉틴으로서는, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴이면 어떠한 렉틴이라도 이용할 수 있으나, 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(렌스 쿨리나리스(Lens Culinaris) 유래의 렌틸 아글루티닌), 완두콩 렉틴 PSA(피섬 사티범(Pisum sativum ) 유래의 완두콩 렉틴), 잠두콩 렉틴 VFA(비시아파바(Viciafaba ) 유래의 아글루티닌), 들주발버섯 렉틴 AAL(알루리아아우라티아(Aleuriaaurantia ) 유래의 렉틴) 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 1 ㎍/㎖∼1 ㎎/㎖ 농도의 상술한 렉틴을 포함하는 배지에서 1일∼2주일, 바람직하게는 1일∼1주일 배양하고, 생존해 있는 세포를 계대배양 또는 콜로니를 픽업하여 다른 배양 용기로 옮기고, 또한 계속해서 렉틴을 포함하는 배지에서 배양을 계속함으로써, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택할 수 있다.
3. 항체 조성물의 활성 평가
정제한 항체 조성물의 단백량, 항원과의 결합 활성 또는 세포 상해 활성을 측정하는 방법으로서는, 모노클로날 안티바디즈, 혹은 안티보디 엔지니어링 등에 기재된 공지의 방법을 이용할 수 있다.
구체적인 예로서는, 항체 조성물이 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체인 경우, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은 ELISA법 및 형광 항체법[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993)] 등에 의해 측정할 수 있다. 항원 양성 배양 세포주에 대한 세포 상해 활성은, CDC 활성, ADCC 활성 등을 측정함으로써, 평가할 수 있다[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993)].
ADCC 활성을 측정하는 방법으로서는, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표지된 표적 세포, 항체 및 이펙터 세포를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리되는 표지 물질의 활성을 측정하는 방법, 표적 세포, 항체, 및 이펙터 세포를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리하는 효소의 생리 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
CDC 활성을 측정하는 방법으로서는, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표지된 표적 세포, 항체 및 보체 성분을 포함하는 혈청 등의 생체 시료를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리되는 표지 물질의 활성을 측정하는 방법, 표적 세포, 항체, 및 보체 성분을 포함하는 혈청 등의 생체 시료를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리하는 효소의 생리 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 항체 조성물의 인간에게 있어서의 안전성, 치료 효과는, 게잡이 원숭이 등의 인간에 비교적 가까운 동물종의 적당한 모델을 이용하여 평가할 수 있다.
4. 항체 조성물의 당쇄의 분석
각종 세포에서 발현시킨 항체 분자의 당쇄 구조는, 통상의 당단백질의 당쇄 구조의 해석에 준하여 행할 수 있다. 예컨대, IgG 분자에 결합되어 있는 당쇄는 갈 락토스, 만노스, 푸코스 등의 중성당, N-아세틸글루코사민 등의 아미노당, 시알산 등의 산성당으로 구성되어 있으며, 당 조성 분석 및 이차원 당쇄 맵법 등을 이용한 당쇄 구조 해석 등의 수법을 이용하여 행할 수 있다.
(1) 중성당·아미노당 조성 분석
항체 조성물의 당쇄의 조성 분석은, 트리플루오로아세트산 등으로, 당쇄의 산 가수분해를 행함으로써, 중성당 또는 아미노당을 유리하여, 그 조성비를 분석할 수 있다.
구체적인 방법으로서, Dionex사 제조 당 조성 분석 장치를 이용하는 방법을 들 수 있다. Bio LC는 HPAEC-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)법[저널·오브·리퀴드·크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해 당 조성을 분석하는 장치이다.
또한, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는, 공지의 방법[어그리컬처럴·앤드·바이올로지컬·케미스트리(Agric. Biol. Chem.), 55(1), 283-284(1991)]에 따라서 산 가수분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 레벨화하고, HPLC 분석하여 조성비를 산출할 수 있다.
(2) 당쇄 구조 해석
항체 조성물의 당쇄의 구조 해석은, 2차원 당쇄 맵법[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 171, 73(1988), 생물 화학 실험법 23-당단백질 당쇄 연구법(학회 출판 센터) 다카하시 레이코 편찬(1989년)]에 의해 행할 수 있다. 2차원 당쇄 맵법은, 예컨대, X축에는 역상(逆相) 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y축에는 순상(順相) 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를, 각각 플롯하고, 이미 알고 있는 당쇄들의 결과와 비교함으로써, 당쇄 구조를 추정하는 방법이다.
구체적으로는, 항체를 히드라진 분해하여, 항체로부터 당쇄를 유리하고, 2-아미노피리딘(이하, PA라고 약기함)에 의한 당쇄의 형광 표지[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 95, 197(1984)]를 행한 후, 겔 여과에 의해 당쇄를 과잉의 PA화 시약 등과 분리하여, 역상 크로마토그래피를 행한다. 이어서 분리 채취한 당쇄의 각 피크에 대해서 순상 크로마토그래피를 행한다. 이들의 결과를 기초로, 2차원 당쇄 맵 상에 플롯하고, 당쇄 스탠더드(TaKaRa사 제조), 문헌[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 171, 73(1988)]과의 스폿의 비교로부터 당쇄 구조를 추정할 수 있다.
또한 각 당쇄의 MALDI-TOF-MS 등의 질량 분석을 행하여, 2차원 당쇄 맵법에 의해 추정되는 구조를 확인할 수 있다.
5. 항체 분자의 당쇄 구조의 식별 방법
항체 조성물은, 항체의 Fc에 결합하는 당쇄 구조가 다른 항체 분자로 구성되어 있다. 본 발명의 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성 물은, 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 이러한 항체 조성물은, 상기 4.에 기재된 항체 분자의 당쇄 구조의 분석법을 이용함으로써 식별할 수 있다. 또한, 렉틴을 이용한 면역학적 정량 방법을 이용하는 것에 의해서도 식별할 수 있다.
렉틴을 이용한 면역학적 정량 방법을 이용한 항체 분자의 당쇄 구조의 식별은, 문헌[모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·애플리케이션즈(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., (1995); 효소 면역 측정법, 제3판, 의학서원(1987); 개정판, 효소 항체법, 가쿠사이 기카쿠(1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA(Radioimmunoassay), VIA(Viroimmunoassay), EIA(Enzymoimmunoassay), FIA(Fluoroimmunoassay), MIA(Metalloimmunoassay) 등의 면역학적 정량 방법에 준하여, 예컨대, 이하와 같이 행할 수 있다.
항체 조성물을 구성하는 항체 분자의 당쇄 구조를 인식하는 렉틴을 표지하고, 표지한 렉틴과 시료인 항체 조성물을 반응시킨다. 다음으로, 표지한 렉틴과 항체 분자의 복합체의 양을 측정한다.
항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 데 이용되는 렉틴으로서는, 예컨대, WGA(티. 불가리스(T. vulgaris) 유래의 맥아 아글루티닌), ConA(씨. 엔시포르미스(C. ensiformis) 유래의 콘카나발린 A), RIC(알. 코뮤니스(R. communis) 유래의 독소), L-PHA(피. 불가리스(P. vulgaris) 유래의 류코아글루티닌), LCA(엘. 쿨리나리스(L. culinaris) 유래의 렌틸 아글루티닌), PSA(피. 사티범(P. sativum) 유래의 완두콩 렉틴), AAL(Aleuria aurantia Lectin), ACL(Amaranthus caudatus Lectin), BPL(Bauhinia purpurea Lectin), DSL(Datura stramonium Lectin), DBA(Dolichos biflorus Agglutinin), EBL(Elderberry Balk Lectin), ECL(Erythrina cristagalli Lectin), EEL(Euonymus europaeus Lectin), GNL(Galanthus nivalis Lectin), GSL(Griffonia simplicifolia Lectin), HPA(Helix pomatia Agglutinin), HHL(Hippeastrum Hybrid Lectin), Jacalin, LTL(Lotus tetragonolobus Lectin), LEL(Lycopersicon esculentum Lectin), MAL(Maackia amurensis Lectin), MPL(Maclura pomifera Lectin), NPL(Narcissus pseudonarcissus Lectin), PNA(Peanut Agglutinin), E-PHA(Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin), PTL(Psophocarpus tetragonolobus Lectin), RCA(Ricinus communis Agglutinin), STL(Solanum tuberosum Lectin), SJA(Sophora japonica Agglutinin), SBA(Soybean Agglutinin), UEA(Ulex europaeus Agglutinin), VVL(Vicia villosa Lectin), WFA(Wisteria floribunda Agglutinin)를 들 수 있다.
N-글루코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 렉틴을 이용하는 것이 바람직하며, 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(렌스 쿨리나리스 유래의 렌틸 아글루티닌), 완두콩 렉틴 PSA(피섬 사티범 유래의 완두콩 렉틴), 잠두콩 렉틴 VFA(비시아 파바 유래의 아글루티닌), 들주발버섯 렉틴 AAL(A알루리아 아우란티아 유래의 렉틴)을 들 수 있다.
6. 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 사용
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, IgG1 항체 및 IgG3 항체보다 높은 CDC 활성을 갖고 있기 때문에, 종래의 항체 조성물보다 치료 효과가 우수한 성질을 갖는다. 또한, 본 발명의 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물은, IgG1 항체 및 IgG3 항체보다 높은 CDC 활성 및 높은 ADCC 활성을 갖고 있기 때문에, 종래의 항체 조성물보다 치료 효과가 우수한 성질을 갖고 있다. 또한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 100%인 항체 조성물이 보다 바람직하다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 함유하는 의약은, 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하긴 하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술 분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료 시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 및 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 항체 제제의 경우, 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로서는, 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제(乳劑), 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 기름류, p-히드록시안식향산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 향미료, 페퍼민트 등의 향미료류 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제(賦形劑), 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는 염 용액, 포도당 용액, 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 이용하여 조제된다. 또는 항체 조성물을 통상적인 방법에 따라서 동결 건조하고, 이것에 염화나트륨을 첨가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.
좌제는 카카오 기름, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 이용하여 조제된다.
또한, 분무제는 상기 항체 조성물 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 상기 항체 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 이용하여 조제된다.
담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등이 예시된다. 상기 항체 조성물 및 이용하는 담체의 성질에 따라, 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 유효 성분의 양으로서, 통상 성인 1일당 10 ㎍/㎏∼20 ㎎/㎏이다.
또한, 항체 조성물의 각종 종양 세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은 시험관 내 실험으로서는, CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있으며, 생체 내 실험으로서는, 마우스 등의 실험 동물에서의 종양계를 이용한 항종양 실험 등을 들 수 있다.
CDC 활성, ADCC 활성, 항종양 실험은 문헌[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunology Immunotherapy), 36, 373(1993); 캔서·리서치(Cancer Research), 54, 1511(1994)] 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.
이하에, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
동물 세포를 이용한, 인간 IgG1 항 CD20 항체, 인간 IgG3 항 CD20 항체 및 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 제작
1. 인간 IgG3 항 CD20 항체 발현 벡터의 제작
인간 림프절 유래의 poly A+ RNA(BD Biosciences Clontech사)로부터, cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech사)를 사용하여, 첨부된 이용 설명서에 따라 cDNA를 합성하였다. cDNA 100 ng을 주형으로 이용하고, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 1, 2에 나타내는 염기 서열로 이루어지는, 인간 IgG 정상 영역 특이적 합성 DNA 프라이머(파스맥(fasmac)사 제조)를 이용하여, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 1분간 열변성시킨 후, 94℃에서 15초간, 62℃에서 30초간, 68℃에서 90초간의 반응을 30 사이클 행하였다. 또한 68℃에서 7분간 반응시킨 후, 3'말단에 아데닌을 부가할 목적으로 Taq DNA polymerase(다카라 슈조사)를 2.5 U 첨가하여, 68℃에서 7분간 반응시켰다. 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, IgG3 중쇄 정상 영역 유전자에 상당하는 약 1.1 kbp의 증폭 단편을 회수하였다. Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 플라스미드 pCRII-TOPO vector(Invitrogen사)와 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 DH5α주(도요 보세키사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사(同社)의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 공지의 인간 IgG3(Genbank 수탁 번호(accession number) AAH33178)의 중쇄 정상 영역과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서 열인 것을 확인하였다.
상술한 인간 IgG3 중쇄 정상 영역 유전자 삽입 플라스미드를, 제한 효소 ApaI 및 NruI(모두 다카라 슈조사) 처리하고, 1.13 kbp의 IgG3 중쇄 정상 영역 유전자 단편을 정제하였다. 인간 IgG1 항 CD20 항체 리툭산의 마우스 유래 가변 영역과 동일한 가변 영역을 가지며, 인간 κ형의 경쇄 정상 영역 및 인간 IgG1의 중쇄 정상 영역을 갖는, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 동물 세포 안정 발현 벡터 pKANTEX2B8P(WO03/055993)를 ApaI 및 NruI로 소화 처리하였다. IgG1 정상 영역 유전자를 잘라낸 나머지 약 12.6 kbp의 단편을 정제하고, 상술한 IgG3 정상 영역 유전자 단편과 Ligation High 용액을 이용해서 연결하여, 인간 IgG3 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3(도 2)을 구축하였다. pKANTEX2B8γ3에 코딩된 인간 IgG3 항 CD20 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, pKANTEX2B8P에 코딩되는 인간 IgG1 항 CD20 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 각각 동일하였다.
2. 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터의 제작
중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열이, pKANTEX2B8P에 코딩되는 인간 IgG1 항 CD20 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 각각 동일하며, 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열이, pKANTEX2B8P에 코딩되는 인간 IgG1 항 CD20 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 pKANTEX2B8γ3에 코딩되는 인간 IgG3 항 CD20 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열로 이루어지는, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 이하의 절차에 따라 제작하였다. 중쇄 정상 영역에 있어서, CH1과 힌지가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열이고, Fc가 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열인 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, CH1과 힌지가 IgG3 항체의 아미노산 서열, Fc가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열인 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체라고 각각 칭한다. 이들 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, 아미노산 서열 데이터베이스에 의한 검색을 행한 결과, 신규의 아미노산 서열이었다. 설계된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 각 도메인이 유래하는 서브클래스, 및 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 1에 나타내었다. 또한, 이들 항 CD20 항체의 모식도를 도 3에 도시하였다.
Figure 112013006489601-pct00044
(1) 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1133(도 4)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, 인간 IgG1 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 BmgBI(New England Biolabs사 제조)을 이용하여, 인간 IgG1 항체의 CH1 및 힌지를 코딩하는 약 430 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 본 실시예 1항에 기재된 인간 IgG3 항 CD20 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 4에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/3311(도 5)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, 본 실시예 1항에 기재된 인간 IgG3 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3으로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 BmgBI(New England Biolabs사 제조)을 이용하여, 인간 IgG3 항체의 CH1 및 힌지를 코딩하는 약 570 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8P에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 5에 도시한 플라스미드 pKTX93/3311이 얻어진 것을 확인하였다.
3. 각종 항 CD20 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항 및 제2항에서 각각 제작한 인간 IgG3 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133 및 pKTX93/3311을, CHO/DG44 세포[소매틱·셀·앤드·몰레큘러·제네틱스(Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 555(1986)] 및 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자를 녹아웃시킨 CHO/DG44 세포(이하 CHO/FUT8-/-이라고 표기함)[바이오테크놀로지·앤드·바이오엔지니어링(Biotechnol. Bioeng.), 87, 614(2004)]를 숙주 세포로서 도입하여, 인간 IgG3 항 CD20 항체 또는 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 이하와 같이 하여 제작하였다. CHO/DG44 세포는 재조합 단백질 생산에 널리 이용되는 숙주 세포이다. CHO/FUT8-/- 세포는 CHO/DG44 세포의 FUT8을 게놈 상에서 녹아웃시킨 숙주 세포이다. 또한, 인간 IgG1 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P는, CHO/FUT8-/- 세포에만 도입하여, 인간 IgG1 항 CD20 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 동일하게 해서 제작하였다.
8 ㎍의 발현 벡터를, 일렉트로포레이션법[Cytotechnology, 3, 133(1990)]에 의해 1.6×106개의 CHO/DG44 세포 또는 CHO/FUT8-/- 세포에 도입한 후, 40 ㎖의 IMDM-(10)[투석 소 혈청(dFBS)을 10%로 포함하는 IMDM 배지(GIBCO-BRL사 제조)] 배지에 현탁하여, 96웰 마이크로 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조)에 100 ㎕/웰씩 나누어 주입하였다. 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 24시간 배양한 후, 500 ㎍/㎖의 농도로 G418을 포함하는 IMDM-(10) 배지에서 1주일∼2주일 배양하였다. 배양 후, 각 웰로부터 배양 상청액을 회수하고, 후술하는 본 실시예의 제4항에 나타내는 ELISA법에 의해, 배양 상청액 중의 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체량을 측정하였다. 배양 상청액 중에 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 발현이 보여진 웰의 형질 전환주에 대해서는, dhfr 유전자 증폭계를 이용하여 항체 발현량을 증가시킬 목적으로, G418을 500 ㎍/㎖의 농도로 포함하고, dhfr 유전자 산물인 디히드로엽산 환원 효소의 저해제인 메토트렉세이트(이하, MTX라고 표기함: SIGMA사 제조)를 50 nM의 농도로 포함하는 IMDM-(10) 배지에 현탁하며, 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 약 1주일 배양하여, 50 nM의 MTX에 내성을 나타내는 형질 전환주를 취득하였다. 다음으로, MTX 농도를 100 nM, 200 nM로 순차적으로 상승시키고, 최종적으로 500 ㎍/㎖의 농도의 G418 및 200 nM의 MTX를 포함하는 IMDM-(10) 배지에서 증식 가능하며 또한, 각각의 발현 벡터에 코딩되는 항체를 고 발현하는 형질 전환주를 취득하였다.
4. 배양 상청액 중의 항체 농도의 측정(ELISA법)
염소 항 인간 IgG(H&L) 항체(American Qualex사 제조)를 Phosphate Buffed Saline(이하, PBS라고 표기함)으로 희석하여 1 ㎍/㎖로 하고, 96 구멍의 ELISA용 플레이트(그라이너사 제조)에, 50 ㎕/웰로 나누어 주입하고, 실온에서 1시간 정치(靜置)하여 흡착시켰다. 반응 후, PBS로 세정하고, 1% 소 혈청 알부민(이하, BSA라고 표기함; Proliant Inc.사 제조)을 포함하는 PBS(이하, 1% BSA-PBS라고 표기함)를 100 ㎕/웰로 첨가하며, 실온에서 1시간 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 제거하고, 측정 대상의 배양 상청액을 50 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 0.05% Tween20을 포함하는 PBS(이하, Tween-PBS라고 표기함)로 세정한 후, PBS로 500배로 희석한 페록시다아제 표지 염소 항 인간 IgG(Fc) 항체 용액(American Qualex사 제조)을 이차 항체 용액으로서, 각각 50 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. Tween-PBS로 세정한 후, ABTS 기질액[2,2'-아미노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)암모늄의 0.55 g을 1 ℓ의 0.1 M 시트르산 완충액(pH4.2)에 용해하고, 사용 직전에 과산화수소를 1 ㎕/㎖로 첨가한 용액]을 50 ㎕/웰로 첨가하여 발색시켜, 415 nm의 흡광도(이하, OD415라고 표기함)를 측정하였다.
5. 각종 항 CD20 항체의 정제
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 200 nM MTX를 포함하는 IMDM-FCS(10)에 1×105 세포/㎖가 되도록 현탁한 후, 트리플 플라스크(날지 눈크(nalge nunc)사 제조)에 100 ㎖씩 나누어 주입하고, 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터 내에서 2일간 배양하였다. 플라스크로부터 배양 상청액을 제거하고, 플라스크 내부를 50 ㎖의 PBS로 세정한 후, 플라스크에 EXCELL 301 배지(JRH Biosciences사 제조) 100 ㎖를 첨가하여, 37℃로 설정된 5% CO2 인큐베이터 내에서 5일간 배양하였다. 이 배양 상청액을 회수하고, 3000 rpm, 4℃의 조건에서 5분간의 원심 분리를 행한 후, 상청액을 회수하며, 0.22 ㎛ 구멍 직경 PES Membrane(이와키사 제조)을 이용하여 여과 멸균하였다. 멸균한 배양 상청액으로부터, Prosep-A(프로테인 A 결합 수지: 밀리포어사 제조) 또는 Prosep-G(프로테인 G 결합 수지: 밀리포어사 제조)를 충전한 칼럼으로, 첨부된 설명서에 따라, 각종 항 CD20 항체를 정제하였다. IgG1 항 CD20 항체는 프로테인 A로 정제 가능하였으나, IgG3 항 CD20 항체는 프로테인 A로 정제할 수 없기 때문에 프로테인 G를 이용하여 정제하였다. 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에 관해서는, 3311형은 프로테인 A로 정제할 수 있었다. 한편, 1133형은 프로테인 A로 정제할 수 없었으나, 프로테인 G로 정제할 수 있었다.
각 항체의, 발현 벡터, 숙주 세포 및 정제한 항체 샘플의 명칭 대응을 표 2에 나타내었다. 또한, 표 중, 명칭에 (+F)를 갖는 샘플은, CHO/DG44를 숙주 세포로 하여 생산되고, Fc에 결합하는 당쇄에 푸코스가 부가되어 있는 항체 샘플을 나타내며, 명칭에 (-F)를 갖는 샘플은, CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 하여 생산되고, Fc에 결합하는 당쇄에 푸코스가 부가되어 있지 않은 항체 샘플을 나타낸다.
Figure 112009051261985-pct00003
6. 각종 항 CD20 항체 정제 샘플의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 각종 항 CD20 항체 정제 샘플 약 1 ㎍을 이용하여, 공지의 방법[Nature, 227, 680(1970)]에 따라 SDS 변성 폴리아크릴아미드 전기영동(이하, SDS-PAGE라고 표기함)을 행하였다. 영동도의 비교 대조로서, 인간 IgG1 항 CD20 항체 리툭산에 대해서도 동일한 조작을 행하였다. 이하, 리툭산을 CD20-IgG1(+F)이라고 표기한다.
그 결과, 1133(+F) 및 1133(-F)은, 인간 IgG1 항체인 CD20-IgG1(+F)과 유사한 영동 패턴을 나타내고, 3311(+F) 및 3311(-F)은, 인간 IgG3 항체인 CD20-IgG3(+F)과 유사한 영동 패턴을 나타내었다. CD20-IgG1(+F), CD20-IgG1(-F), 1133(+F) 및 1133(-F)에 서는 H쇄가 약 50 킬로달톤(이하, kDa라고 표기함), L쇄가 약 24 kDa 부근에 밴드가 보여지고, CD20-IgG3(+F), CD20-IgG3(-F), 3311(+F) 및 3311(-F)은 H쇄가 약 54 kDa, L쇄가 약 24 kDa 부근에 밴드가 보여지는 것으로부터, 제작한 항 CD20 항체는 목적의 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적의 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 2
각종 항 CD20 항체의 활성 평가
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대해서, 각종 활성 비교를 이하와 같이 하여 행하였다.
1. 각종 항 CD20 항체의 CD20 양성 세포에 대한 결합 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대해서, CD20 양성 세포에 대한 결합 활성을, 비오틴화 리툭산과의 경합 저해의 계에 있어서, 유세포 분석기(flow cytometer)를 이용한 형광 항체법에 의해 측정하였다. 음성 대조로서 항 Her2 인간 IgG1 항체 Herceptin[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4285(1992)] 및 항 CCR4 인간 IgG1 항체 KM3060[Cancer Res. 64, 2127(2004)]을 이용하였다.
CD20 양성인 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma) 유래 세포주 다우디 세포[ATCC: CCL-213]를 1웰당 5×105개가 되도록 96웰 U자 플레이트(Falcon사 제조)에 나누어 주입한 후, 실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체, 또는 음성 대조인 항 Her2 항체 Herceptin[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4285(1992)] 및 항 CCR4 항체 KM3060(WO02/31140)을 10 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖의 농도로 포함하며, 비오틴 표지화 항 CD20 키메라 항체 리툭산[EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce사 제조)을 사용하여 리툭산을 비오틴화한 것]을 0.5 ㎍/㎖로 포함하는 FACS용 완충액[0.2 ㎎/㎖ 인간-IgG(시그마사 제조), 0.02% EDTA, 0.05% NaN3, 1% BSA]을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 차광하 4℃에서 60분간 반응시키고, 세포를 FACS용 완충액으로 2회 세정한 후, FACS용 완충액으로 200배로 희석한 PE 표지화 스트렙타비딘(streptavidin)을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 차광하 4℃에서 60분간 반응시키고, 세포를 FACS용 완충액으로 2회 세정한 후, 1 ㎖의 FACS용 완충액에 현탁하여, 유세포 분석기 EPICS-XL(Coulter사 제조)로 형광 강도를 측정하였다.
결과를 도 6에 도시하였다. 음성 대조인 항 Her2 항체 Herceptin 및 항 CCR4 항체 KM3060은 비오틴 표지화 리툭산의 CD20 양성 세포 다우디에 대한 결합을 저해하지 않았으나, 모든 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 인간 IgG1 항 CD20 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 항체는 농도 의존적으로 결합을 저해하고, 그 정도는 같은 정도였다. 또한, 어떠한 항 CD20 항체에서도, CHO/DG44를 숙주 세포로 하여 생산된 항체 샘플과 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 해서 생산된 항체 샘플은 같은 정도의 결합 저해 활성을 나타내고, 항체에 부가하는 당쇄 중의 푸코스의 유무는 결합 저해 활성에 영향을 미치지 않았다. 이들의 결과로부터, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 항원 결합이 CD20 특이적인 것, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 항원 결합 활성이 인간 IgG1 항 CD20 항체와 같은 정도인 것, 및 Fc에 부가한 당쇄 중의 푸코스의 유무가 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
2. 각종 항 CD20 항체의 다우디 세포에 대한 CDC 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체의 정제 샘플에 대해서, CD20 양성인 다우디 세포에 대한 시험관 내 CDC 활성을 측정하였다.
반응은 96웰 평저(平底) 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조) 내에서 행하고, 각 반응웰에는, 5×104개의 다우디 세포 및 최종 농도 0.3 ㎍/㎖의 정제 항체 샘플을 포함하는, 인간 보체 희석 배지[FBS(JRH사 제조)를 10% 포함하는 RPMI 1640 배지(GIBCO BRL사 제조)를 이용하여 인간 보체(SIGMA사 제조)를 6배로 희석한 것]를 150 ㎕씩 나누어 주입하였다. 또한, CDC가 야기되지 않는 경우의 대조로서 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 포함하지 않는 반응웰(0% 반응웰)을, CDC가 야기된 경우의 대조로서 다우디 세포를 포함하지 않는 반응웰(100% 반응웰)을 각각 준비하였다. 37℃, 5% CO2 분위기하에서 2시간 배양한 후, 각 반응웰에 WST-1 시약(ROCHE사 제조)을 15 ㎕씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 분위기하에서 4시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 각 웰에 있어서의 OD450을 측정하고, 각 웰의 흡광도로부터 이하의 식을 이용하여 CDC 활성(%)을 산출하였다.
CDC 활성(%)=100×{1-(반응웰 흡광도-100% 반응웰 흡광도)/(0% 반응웰 흡광도-100% 반응웰 흡광도)}
결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에 도시되는 바와 같이, 인간 IgG3 항 CD20 항체의 CDC 활성은, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 CDC 활성보다 높고, CDC 활성은 IgG3＞IgG1인 것이 확인되었다. 그러나, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 인간 IgG3 항 CD20 항체의 CDC 활성보다 현저히 높은 CDC 활성을 나타내었다. 한편으로 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성은 인간 IgG1 항 CD20 항체와 같은 정도로 낮았다. 또한, 어떠한 항 CD20 항체에서도, CHO/DG44를 숙주 세포로 하여 생산된 항체 샘플과 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 하여 생산된 항체 샘플은 같은 정도의 CDC 활성을 나타내며, 항체에 부가하는 당쇄 중의 푸코스의 유무는 CDC 활성에 영향을 미치지 않았다. 또한, 항체 농도 1 ㎍/㎖에 있어서도 동일한 결과가 확인되었다. 이들의 결과로부터, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성은 인간 IgG1 항 CD20 항체 및 인간 IgG3 항체보다 높은 것, 및 Fc에 부가한 당쇄 중의 푸코스의 유무가 CDC 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
3. 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성의 측정
본 실시예의 제2항에서 특히 높은 CDC 활성을 갖고 있었던 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성을 더 상세히 평가하기 위해서, 모두 CD20 양성인, 버키트 림프종 유래 세포주 ST486 세포[ATCC: CRL-1647] 또는 버키트 림프종 유래 세포주 Raji 세포[ATCC: CCL-86]를 이용하여, 본 실시예의 제2항과 동일한 절차로 CDC 활성을 측정하였다.
결과를 도 8에 도시하였다. 도 8에 도시되는 바와 같이, ST486 세포주(도 8A)와 Raji 세포주(도 8B)의 어떠한 것에 있어서도, 인간 IgG3 항 CD20 항체는 인간 IgG1 항 CD20 항체보다 높은 CDC 활성을 나타내었으나, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 인간 IgG1 항 CD20 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 항체의 어떠한 것보다 높은 CDC 활성을 나타내었다. 또한, 어떠한 항 CD20 항체에서도, CHO/DG44를 숙주 세포로 하여 생산된 항체 샘플과 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 하여 생산된 항체 샘플은 같은 정도의 CDC 활성을 나타내며, 항체에 부가하는 당쇄 중의 푸코스의 유무는 CDC 활성에 영향을 미치지 않는 것이 분명해졌다.
4. 각종 항 CD20 항체의 CD20 양성 세포주에 대한 ADCC 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대해서, 표적 세포로서 CD20 양성인 다우디 세포를 이용하여 시험관 내 ADCC 활성을 이하와 같이 측정하였다. 측정에는, Cytotox 96 키트(Promega사 제조)를 사용하였다.
(1) 인간 이펙터 세포 용액의 조제
건강한 사람의 말초혈 50 ㎖를 채취하고, 헤파린나트륨(다케다 야쿠힝사 제조) 0.2 ㎖를 첨가하여 차분하게 혼합하였다. 이것을 Lymphoprep(다이이치 가가쿠 야쿠힝사 제조)을 이용하여 사용 설명서에 따라 단핵구 분획을 분리한 후, RPMI 1640 배지에서 1회, 10% FBS-RPMI 1640 배지에서 1회 원심 분리하여 세정하고, 이것을 이펙터 세포로 하였다.
(2) ADCC 활성의 측정
반응은 96웰 평저 플레이트(Falcon사 제조) 내에서 행하고, 각 반응웰에는, 2×105개의 이펙터 세포 및 1×104개의 다우디 세포 또는 ST486 세포를 포함하며, 각종 농도로 항 CD20 항체를 포함하는 10% FBS-RPMI 1640 배지를 200 ㎕씩 나누어 주입하였다. 또한, ADCC 활성의 산출에 필요한 대상웰로서, 이펙터 세포, 표적 세포 및 항체 모두를 포함하지 않는 배지웰, 이펙터 세포만을 포함하는 이펙터웰, 표적 세포만을 포함하는 표적웰, 이펙터 세포 및 표적 세포를 포함하고 항체를 포함하지 않는 NK웰, 표적 세포만을 포함하고, 반응 개시 후 3시간 15분 후에 키트 첨부의 Lysis-buffer를 20 ㎕ 첨가한 100% 반응웰, 이펙터 세포, 표적 세포 및 항체 모두를 포함하지 않고, 반응 개시 후 3시간 15분 후에 키트 첨부의 Lysis-buffer를 20 ㎕ 첨가한 100% 반응 대조웰을 각각 준비하였다. 각 반응웰을 37℃, 5% CO2 분위기하에서 4시간 반응시킨 후, 반응 플레이트를 원심 분리하여, 각 웰로부터 상청액 50 ㎕를 회수하였다. 각 웰의 상청액을 96웰 U자 바닥 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조)의 웰에 각각 옮기고, 각 웰에 발색 기질 용액(키트 첨부의 기질 1개분을 키트 첨부의 assay-buffer 12 ㎖에 용해시킨 것)을 50 ㎕씩 첨가하였다. 37℃에서 30분간 발색 반응을 행하고, 키트 첨부의 반응 정지액을 각 웰에 50 ㎕씩 첨가한 후, OD450을 측정하며, 각 웰의 흡광도로부터 이하의 식을 이용하여 ADCC 활성(%)을 산출하였다.
ADCC 활성(%)=100×(S-E-T)/(Max-T)
S=샘플 반응웰 흡광도-배지웰 흡광도
E=이펙터웰 흡광도-배지웰 흡광도
T=표적웰 흡광도-배지웰 흡광도
Max=100% 반응웰-100% 반응 대조웰
결과를 도 9에 도시하였다. 도 9에 도시되는 바와 같이, 어떠한 항 CD20 항체에서도, CHO/FUT8-/-로부터 생산된 항체는, CHO/DG44로부터 생산된 항체에 비해서 높은 ADCC 활성을 나타내었다. 이 결과로부터, 본 실시예에서 제작된 모든 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서도, 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중의 환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 항체 조성물 쪽이, 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중의 환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 항체 조성물보다 ADCC 활성이 높은 것이 발견되었다. 또한, 인간 IgG1 항 CD20 항체는 인간 IgG3 항 CD20 항체보다 높은 ADCC 활성을 나타내며, IgG1＞IgG3인 것이 확인되었다. 또한, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 인간 IgG1 항 CD20 항체와 같은 정도의 높은 ADCC 활성을 나타내었다. 또한, 3311형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 ADCC 활성은 인간 IgG3 항 CD20 항체와 같은 정도로 낮은 것이 발견되었다.
5. 각종 항 CD20 항체의 유전자 재조합 Fcγ 수용체 IIIa에 대한 결합 활성의 측정
본 실시예 제4항에서 확인된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서의 ADCC 활성 증강의 메카니즘을 해석하기 위해서, 실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대하여, NK 세포 표면에 발현하는 Fc 수용체 패밀리의 하나인 Fcγ 수용체 IIIa(이하, FcγRIIIa라고 약기함)에 대한 결합 활성을 공지의 방법[Clin. Cancer Res., 10, 6248(2004)]에 따라 측정하였다.
결과를 도 10에 도시하였다. 도 10에 도시되는 바와 같이, CHO/FUT8-/-로부터 생산된 항 CD20 항체는 모두, CHO/DG44로부터 생산된 항 CD20 항체에 비해서, FcγRIIIa에 대한 높은 결합 활성을 나타내었다. 이러한 점에서, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스의 유무에 의한 항체의 ADCC 활성의 상승은, Fc와 Fc 수용체와의 결합 활성의 상승에 기인하는 것이 분명해졌다.
이상의 점에서, 인간 IgG1 항 CD20 항체 리툭산과 동일한 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역을 가지며, 중쇄 정상 영역 중의 CH1 및 힌지가 인간 IgG1 항체, Fc가 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열인 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 항체를 상회하는 CDC 활성을 가지며, 또한, 인간 IgG1 항 CD20 항체와 동등한 ADCC 활성을 갖고 있었다. 또한, Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 부가하는 푸코스를 제거함으로써, Fc의 Fc 수용체에 대한 결합 활성이 향상되어, 인간 IgG1 항 CD20 항체와 마찬가지로 ADCC 활성이 향상되는 것으로 나타났다.
이상으로부터 얻어진 결과를 기초로, 제작한 각종 키메라 아이소타이프 항체의 구조와 활성과의 관계를 표 3에 나타내었다. 표 중, ADCC 활성 및 CDC 활성은, 활성의 정도를 강한 순으로 +++, ++, +로 표기하였다. 또한, 프로테인 A에 대한 결합 활성에 대해서는 결합이 보여진 것을 +로, 보여지지 않은 것을 －로 나타내었다.
Figure 112009051261985-pct00004
이상으로부터, 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열 중의 CH1 및 힌지가, 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열이고, CH2 및 CH3이 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열인 1133형 키메라 아이소타이프 항체 분자는, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다 높은 CDC 활성을 가지며, 또한, 인간 IgG1과 동등한 항체의 높은 ADCC 활성을 유지하고 있는 것으로 나타났다.
이상의 결과에 의해, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 중쇄 정상 영역 중, Fc를 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열로 교환함으로써, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 CDC 활성을 현저하게 증강시킬 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 3
동물 세포를 이용한, 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 제작
1. 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터의 제작
다음으로, Fc 영역의 어떠한 부분을, 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열로 교환하는 것이, CDC 활성의 증강에 중요한지를 확인하기 위해서, 1133형의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인을 각각 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열로 되돌린 키메라 아이소타이프 항체를 제작하고, CDC 활성을 측정함으로써, 어느 쪽의 도메인이 CDC 활성을 증강시키기 위해서 중요한지를 비교하였다. 중쇄 정상 영역 중, CH1, 힌지 및 CH3은 인간 IgG1 항체이고, CH2 도메인만이 인간 IgG3인 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1131형이라고 칭하고, CH1, 힌지 및 CH2는 인간 IgG1 항체이고, CH3 도메인만이 인간 IgG3인 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1113형이라고 칭한다. 어떠한 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서도, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, pKANTEX2B8P에 코딩되는 인간 IgG1 항 CD20 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 동일하다. 이들 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 중쇄 정상 영역의 도메인 구조, 및 아미노산 서열의 대응을 표 4에 나타내었다. 이들 키메라 아이소타이프 항체는 모두 신규의 중쇄 정상 영역을 갖고 있었다. 또한, 도 11에 각 키메라 아이소타이프 항체의 모식도를 도시하였다.
Figure 112013006489601-pct00045
(1) 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1131(도 12)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, 본 실시예 1항에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133으로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 SmaI(다카라 슈조사 제조)을 이용하여, CH1, 힌지 및 CH2를 코딩하는 약 700 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 인간 IgG1 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 12에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1113을 코딩하는 발현 벡터의 구축
1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1113(도 13)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, 인간 IgG1 항 CD20 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 SmaI(다카라 슈조사 제조)을 이용하여, CH1, 힌지 및 CH2를 코딩하는 약 700 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 본 실시예 1항에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 13에 도시한 플라스미드 pKTX93/1113이 얻어진 것을 확인하였다.
2. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 해서 도입하여, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 절차로 제작하였다.
3. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 또는 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 절차로, 배양하여, 정제하였다. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 Prosep-G(프로테인 G 결합 수지: 밀리포어사 제조) 충전 칼럼을 이용하여 정제하였다. 또한, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 Prosep-A(프로테인 A 결합 수지: 밀리포어사 제조) 충전 칼럼을 이용하여 정제한 결과, 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체만 정제가 가능하였다.
각 키메라 아이소타이프 항체의, 발현 벡터 및 정제한 항체의 명칭의 대응을 표 5에 나타내었다. 숙주 세포는 모두 CHO/FUT8-/-이다.
Figure 112009051261985-pct00006
4. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 정제도를 측정하기 위해서, 실시예 1의 제6항과 동일한 절차로 SDS-PAGE를 행하였다. 영동도의 비교 대조로서, 실시예 1의 제5항에서 제작한 각종 CD20-IgG1(-F), CD20-IgG3(-F) 및 1133(-F)에 대해서도 동일한 조작을 행하였다.
결과를 도 14에 도시하였다. 1113(-F) 및 1131(-F)은, 각각 CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)과 유사한 영동 패턴을 나타내었다. 1113(-F) 및 1131(-F)을 구성하는 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 각각 유사하며, H쇄가 약 50 kDa, L쇄가 약 24 kDa이다. 이들의 분자량은, CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)의 H쇄 및 L쇄의 분자량과 유사하고, 영동 패턴도 유사한 점에서, 1113(-F) 및 1131(-F)은 목적의 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, CD20-IgG3(-F)을 구성하는 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 약 24 kDa로 CD20-IgG1(-F)과 유사하지만, H쇄가 약 54 kDa로 CD20-IgG1(-F)의 H쇄보다 크기 때문에, CD20-IgG3(-F)의 L쇄는 CD20-IgG1(-F)의 L쇄와 유사한 위치에 나타나 있으나, H쇄는 CD20-IgG1(-F)의 H쇄보다 고분자량측에 위치하였다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적의 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 4
1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 활성 평가
실시예 3의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 정제 샘플에 대해서, 각종 활성 비교를 이하와 같이 하여 행하였다.
1. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 인간 IgG1 항 CD20 항체 CD20-IgG1(-F), 인간 IgG3 항 CD20 항체 CD20-IgG3(-F), 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1133(-F), 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1131(-F) 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1113(-F)에 대해서, CD20 양성 세포주에 대한 CDC 활성을 평가하기 위해서, 모두 CD20 양성인 ST486 세포 또는 Raji 세포를 이용하여, 실시예 2의 제2항과 동일한 절차로 시험을 행하였다.
결과를 도 15에 도시하였다. 도 15에 도시되는 바와 같이, ST486 세포주(도 15A)와 Raji 세포주(도 15B)의 어떠한 것에 있어서도, 1133(-F)은, CD20-IgG1(-F) 및 CD20-IgG3(-F)보다 높은 CDC 활성을 나타내었다. 1113(-F) 및 1131(-F)은, CD20-IgG1(-F) 및 CD20-IgG3(-F)보다 높으나 1133(-F)보다 낮은 CDC 활성을 나타내었다. 이상으로부터, 이들 항체의 CDC 활성의 강약의 서열은, 1133(-F)＞1131(-F)＞1113(-F)＞IgG3(-F)＞IgG1(-F)이었다.
이 결과에 의해, 인간 IgG1 항체의 Fc를 인간 IgG3 항체의 Fc로 교환함으로써 CDC 활성이 증강된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는, Fc 내의 CH2 도메인을 인간 IgG1 항체로 되돌림으로써 그 CDC 활성이 크게 약해져 버리는 것이 분명해졌다.
이상의 결과는, CDC 활성을 증강시키기 위해서는, Fc 내의 CH2 도메인 내의 아미노산 서열을 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열로 교환하는 것이 중요한 것을 나타내고 있다.
2. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CD20 양성 세포주에 대한 ADCC 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 인간 IgG1 항 CD20 항체 CD20-IgG1(-F), 인간 IgG3 항 CD20 항체 CD20-IgG3(-F), 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1133(-F), 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1131(-F) 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1113(-F)에 대해서, 표적 세포로서 CD20 양성인 다우디 세포를 이용하여, 실시예 2의 제5항과 동일한 절차로 시험관 내시험관 내성을 측정하였다. 측정에는, Cytotox 96 키트(Promega사 제조)를 이용하였다.
결과를 도 16에 도시하였다. 1113(-F) 및 1131(-F)은 CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)과 동등한 ADCC 활성을 나타내었다.
3. 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 프로테인 A 결합 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 인간 IgG1 항 CD20 항체 CD20-IgG1(-F), 인간 IgG3 항 CD20 항체 CD20-IgG3(-F), 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1133(-F), 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1131(-F) 및 1113형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 1113(-F)에 대해서, 이하의 절차에 따라 프로테인 A 결합 활성을 측정하였다.
항 인간 카파쇄(kappa chain) 항체(Sigma사 제조)를 PBS로 희석하여 5㎍/㎖로 하고, 이것을 96 구멍의 ELISA용 플레이트(그라이너사 제조)에 50 ㎕/웰로 나누어 주입하며, 실온에서 1시간 정치(靜置)하여 흡착시켰다. 반응 후, PBS로 세정하고, 1% BSA-PBS를 100 ㎕/웰로 첨가하며, 실온에서 1시간 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 제거하고, 측정 대상의 항 CD20 항체를 50 ㎕/웰로 첨가하여, 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 Tween-PBS로 세정하고, PBS로 5000배로 희석한 페록시다아제 표지 Potei n A(Amersham Bioscience사 제조)를 50 ㎕/웰로 첨가하며, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 Tween-PBS로 세정하고, ABTS 기질액을 50 ㎕/웰로 첨가하여 발색시키며, 415 ㎚의 흡광도(이하, OD415라고 표기함)를 측정하였다.
결과를 도 17에 도시하였다. 1133(-F) 및 1113(-F)은 CD20-IgG3(-F)과 마찬가지로 프로테인 A 결합 활성을 나타내지 않았으나, 1131(-F)은 CD20-IgG1(-F)과 동등한 프로테인 A 결합 활성을 나타내었다.
또한, 이상의 결과를 기초로, 제작된 각종 키메라 아이소타이프 항체의 구조와 활성과의 관계를 표 6에 나타내었다. 표 중, ADCC 활성 및 CDC 활성은, 활성의 정도를 강한 순으로 +++++, ++++, +++, ++, +로 표기하였다. 또한, 프로테인 A에 대한 결합 활성에 대해서는, 프로테인 A에 대한 결합 활성을 갖는 것은 ＋, 갖지 않는 것은 －로 나타내었다.
Figure 112009051261985-pct00007
실시예 4의 제1항에 있어서, 인간 IgG1 항체의 Fc를 인간 IgG3 항체의 Fc로 교환함으로써 CDC 활성이 증강된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는, Fc 내의 CH2 도메인을 인간 IgG1 항체로 되돌림으로써 그 CDC 활성이 크게 약해져 버리는 것이 분명해졌다. 이 결과는, CDC 활성을 증강시키기 위해서는, Fc 내의 CH2 도메인 내의 아미노산 서열을 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열로 교환하는 것이 중요한 것을 나타내고 있다.
또한, CH1 및 힌지가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열이고, Fc가 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 키메라 아이소타이프인 항체의 ADCC 활성은 인간 IgG1 항체와 동등한 것, 및 Fc에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스의 제거에 의한 ADCC 활성의 증가도, 인간 IgG1 항체와 동등한 것으로 나타났다.
실시예 5
1. 동물 세포를 이용한, 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 제작(1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서의 CH2 도메인의 아미노산 서열과 CDC 활성의 해석)
다음으로, 인간 IgG3 항체의 CH2 도메인 내의 어떤 영역이 CDC 활성을 증강시키기 위해서 중요한지를 해석하기 위해서, 상기와 마찬가지로, 1133형의 CH2 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 항체로 되돌린 각종 항체를 이하와 같이 하여 제작하였다.
먼저, 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 CH2 도메인의 아미노산 서열을 비교한 결과, Kabat 등에 의한 EU 인덱스의 표기법에 따르면, 274번째, 276번째, 296번째, 300번째 및 339번째로 각각 표시되는 위치의 아미노산 잔기가 다른 것이 확인되었다(도 18). 그래서, 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서, 이들 5부위를 각각 인간 IgG1의 아미노산 서열로 되돌린 항체를 설계하였다. 274번째를 인간 IgG1 항체로 되돌린 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1133(274-IgG1)형, 276번째를 인간 IgG1 항체로 되돌린 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1133(276-IgG1)형, 296번째를 인간 IgG1 항체로 되돌린 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1133(296-IgG1)형, 300번째를 인간 IgG1 항체로 되돌린 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1133(300-IgG1)형, 및 339번째를 인간 IgG1 항체로 되돌린 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 1133(339-IgG1)형이라고 각각 칭한다. 이들 항체의 CH3 도메인은 모두 인간 IgG3 항체이다. 이들 항체에서, 상기한 5부위의 아미노산 잔기가, 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 어떠한 아미노산 잔기인지를 표 7에 나타내었다.
Figure 112013006489601-pct00046
(1) 1133(274-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1133(274-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1133(274-IgG1)(도 19)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 12, 13에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133을 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1133(274-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 19에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133(274-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 1133(276-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1133(276-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1133(276-IgG1)(도 19)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 13, 14에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133을 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1133(276-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 19에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133(276-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(3) 1133(296-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1133(296-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1133(296-IgG1)(도 19)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD(도요 보세키사) 및 서열 번호 15, 16에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, KOD의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1133(296-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 96℃에서 5분간 열변성시킨 후, 96℃에서 30초간, 55℃에서 10초간, 74℃에서 15초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 19에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133(296-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(4) 1133(300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1133(300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1133(300-IgG1)(도 19)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD(도요 보세키사) 및 서열 번호 16, 17에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, KOD의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1133(300-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 96℃에서 5분간 열변성시킨 후, 96℃에서 30초간, 55℃에서 10초간, 74℃에서 15초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 19에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133(300-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(5) 1133(339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1133(339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1133(339-IgG1)(도 19)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 31, 32에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133을 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1133(339-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 1에 기재된 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 19에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133(339-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
2. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 해서 도입하여, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 절차로 제작하였다.
3. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 절차로, 배양하여, 정제하였다. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 Prosep-G(프로테인 G 결합 수지: 밀리포어사 제조) 충전 칼럼을 이용하여 정제하였다.
각 키메라 아이소타이프 항체의, 발현 벡터 및 정제한 항체의 명칭의 대응을 표 8에 나타내었다. 숙주 세포는 모두 CHO/FUT8-/-이다.
Figure 112009051261985-pct00009
4. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 정제 샘플의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 정제 샘플의 정제도를 측정하기 위해서, 실시예 1의 제6항과 동일한 절차로 SDS-PAGE를 행하였다. 영동도의 비교 대조로서, 실시예 1의 제5항에서 제작한 정제 샘플 CD20-IgG1(-F), 1133(-F), 및 실시예 3의 제3항에서 제작한 정제 샘플 1131(-F), 1113(-F)에 대해서도 동일한 조작을 행하였다.
결과를 도 20에 도시하였다. 본 실시예의 제3항에서 얻어진 1133(274-IgG1)(-F), 1133(276-IgG1)(-F), 1133(296-IgG1)(-F), 1133(300-IgG1)(-F) 및 1133(339-IgG1)(-F)은 1113(-F) 및 1131(-F)은, 각각 CD20-IgG1(-F), 1133(-F), 1131(-F) 및 1113(-F)과 유사한 영동 패턴을 나타내었다. 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 구성하는 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 각각 유사하며, H쇄가 약 50 kDa, L쇄가 약 24 kDa이다. CD20-IgG1(-F), 1133(-F), 1131(-F) 및 1113(-F)의 H쇄 및 L쇄의 분자량과 유사하고, 영동 패턴도 유사한 점에서, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 목적의 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적의 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 6
1. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성의 측정(1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서의 CH2 도메인의 아미노산 서열과 CDC 활성의 해석)
실시예 5의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, CD20 양성 세포주에 대한 CDC 활성을 평가하기 위해서, CD20 양성인 Raji 세포를 이용하여, 실시예 2의 제2항과 동일한 절차로 시험을 행하였다.
결과를 도 21에 도시하였다. 도 21에 도시되는 바와 같이, 1133(-F)은 가장 높은 CDC 활성을, CD20-IgG1(-F)은 가장 낮은 CDC 활성을 나타내고, 1113(-F)의 CDC 활성은 이들의 중간이었다. 이 결과는, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 CH2 및 CH3의 아미노산 서열을 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열로 교환함으로써 증강된 CDC 활성은, CH2 내의 5부위의 IgG3형 아미노산 서열을 모두 IgG1형 아미노산 서열로 되돌림으로써, 대폭으로 약해져 버리는 것을 나타내고 있다. 또한, 1133(296-IgG1)(-F) 및 1133(300-IgG1)(-F)은 1133(-F)과 동등한 CDC 활성을 나타내었으나, 1133(274-IgG1)(-F), 1133(276-IgG1)(-F) 및 1133(339-IgG1)(-F)에서는 1133(-F)에 비해서 낮은 CDC 활성을 나타내고, 특히 1133(276-IgG1)(-F)은 1113(-F)과 같은 정도의 CDC 활성이었다. 각종 항체의, 아미노산 서열과 CDC 활성의 강약의 대응을 표 9에 나타내었다. 표 중, CDC 활성의 정도를 강한 순으로 +++++, ++++, +++, ++, +로 표기하였다.
Figure 112009051261985-pct00010
이상의 결과로부터, CH1 및 힌지가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열이고, Fc가 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 키메라 아이소타이프인 항체에 대해서, 274번째, 276번째 및 339번째의 아미노산 잔기는 IgG3형 쪽이 CDC 활성에 적합한 것, 및 276번째와 339번째의 아미노산 잔기가 IgG3형인 것이 CDC 활성 증강에 특히 적합한 것으로 나타났다.
실시예 7
1. 동물 세포를 이용한, 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 제작(1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서의 CH2 도메인의 아미노산 서열과 CDC 활성의 해석)
다음으로, 더 상세하게 CH2 도메인의 아미노산 서열과 CDC 활성의 관계를 해석하기 위해서, CH2 도메인만이 인간 IgG3 항체인 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서, CH2 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 항체로 되돌린 항체를 제작하기 위해서, 이하의 각종 항체를 설계하였다.
먼저, 1131형 키메라 아이소타이프 항체에서, 1133형에서는 CDC 활성의 저하가 보여지지 않은 296번째 및 300번째의 아미노산 서열을 인간 IgG1형의 아미노산 서열로 되돌린, 1131(296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 설계하고, 다음으로, 1133형에서 CDC 활성의 저하가 보여진 274번째, 276번째 및 339번째의 아미노산 서열을 인간 IgG1형의 아미노산 서열로 되돌린 각종 키메라 아이소타이프 항체를 더 설계하였다. 즉, 296번째 및 300번째에 더하여 274번째를 인간 IgG1형의 아미노산 서열로 되돌린 1131(274/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 296번째 및 300번째에 더하여 274번째 및 276번째를 인간 IgG1형의 아미노산 서열로 되돌린 1131(274/276/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 296번째 및 300번째에 더하여 274번째 및 339번째를 인간 IgG1형의 아미노산 서열로 되돌린 1131(274/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체, 및, 296번째 및 300번째에 더하여 276번째 및 339번째를 인간 IgG1형의 아미노산 서열로 되돌린 1131(276/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체이다.
이들 항체에서 상기한 5부위의 아미노산 잔기가, 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 어떠한 아미노산 잔기인지를 표 10에 나타내었다.
Figure 112013006489601-pct00047
상기한 바와 같이 설계한 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를, 이하에 서술하는 절차로 제작하였다.
(1) 1131(296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1131(296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1131(296/300-IgG1)(도 22)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 13, 31에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, pKANTEX2B8P를 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1131(296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 3에 기재된 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 22에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131(296/300-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 1131(274/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1131(274/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1131(274/296/300-IgG1)(도 22)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 12, 13에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, pKANTEX2B8P를 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1131(274/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 3에 기재된 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 22에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131(274/296/300-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(3) 1131(274/276/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1131(274/276/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1131(274/276/296/300-IgG1)(도 22)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 13, 38에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, pKANTEX2B8P를 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1131(274/276/296/300-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 3에 기재된 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 22에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131(274/276/296/300-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(4) 1131(274/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1131(274/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1131(274/296/300/339-IgG1)(도 22)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 12, 32에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, pKANTEX2B8P를 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1131(274/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 3에 기재된 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 22에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131(274/296/300/339-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
(5) 1131(276/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
1131(276/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 코딩하는 발현 벡터 pKTX93/1131(276/296/300/339-IgG1)(도 22)을, 이하의 절차에 따라 구축하였다. 먼저, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 14, 32에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 합성 DNA 프라이머(파스맥사 제조)를 이용하여, pKANTEX2B8P를 주형으로 해서, KOD plus의 첨부 설명서에 따라 PCR 반응을 행하였다. 이 PCR 반응에 의해, 1131(276/296/300/339-IgG1)형 키메라 아이소타이프의 CH2 도메인을 코딩하는 유전자가 생성되었다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 이용하여, 94℃에서 4분간 열변성시킨 후, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 반응을 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 반응액을 1% 아가로스 겔을 이용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 이용하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 DNA 단편을, 제한 효소 BmgBI(New England Biolabs사 제조) 및 Bsp1407I(다카라 슈조사 제조)을 이용해서 처리하여, CH2 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 약 250 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 3에 기재된 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 22에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131(276/296/300/339-IgG1)이 얻어진 것을 확인하였다.
2. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 해서 도입하여, 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 절차로 제작하였다.
3. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 절차로, 배양하여, 정제하였다. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 Prosep-A(프로테인 A 결합 수지: 밀리포어사 제조) 충전 칼럼을 이용하여 정제하였다.
각 키메라 아이소타이프 항체의, 발현 벡터 및 정제한 항체의 이름의 대응을 표 11에 나타내었다. 숙주 세포는 모두 CHO/FUT8-/-이다.
Figure 112009051261985-pct00012
4. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 정제 샘플의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 정제 샘플의 정제도를 측정하기 위해서, 실시예 1의 제6항과 동일한 절차로 SDS-PAGE를 행하였다.
결과를 도 23에 도시하였다. 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 구성하는 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 각각 유사하며, H쇄가 약 50 kDa, L쇄가 약 24 kDa이다. 이들의 분자량은 CD20-IgG1(-F) 및 1131(-F)의 H쇄 및 L쇄의 분자량과 유사하고, 실시예 4 및 6에서 얻어진 영동 패턴과도 유사한 점에서, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체는 목적의 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적의 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 8
각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 각종 활성의 측정(1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에서의 CH2 도메인의 아미노산 서열과 CDC 활성의 해석)
실시예 7의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체에 대해서, 각종 활성 비교를 이하와 같이 하여 행하였다.
1. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 CDC 활성의 측정
실시예 7의 제3항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의, CD20 양성 세포주에 대한 CDC 활성을 평가하기 위해서, CD20 양성인 Raji 세포를 이용하여, 실시예 2의 제2항과 동일한 절차로 시험을 행하였다.
결과를 도 24에 도시하였다. 도 24에 도시되는 바와 같이, 1133(-F)은 가장 높은 CDC 활성을, CD20-IgG1(-F)은 가장 낮은 CDC 활성을 나타내고, 1131(-F)은 1133(-F)보다 약간 낮은 CDC 활성을 나타내었다. 또한, 1131(296/300-IgG1)(-F), 1131(274/296/300-IgG1)(-F) 및 1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)은 1131(-F)과 같은 정도 또는 그 이상의 CDC 활성을 나타내었으나, 1131(274/296/300/339-IgG1)(-F) 및 1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)에서는 1131(-F)보다 낮은 CDC 활성을 나타내고, 특히 1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)은 IgG3(-F)과 같은 정도의 낮은 CDC 활성을 나타내었다. 각종 항체의, 아미노산 서열과 CDC 활성의 강약의 대응을 표 12에 나타내었다. 표 중, CDC 활성의 정도를 강한 순으로 ++++++, +++++, ++++, +++, ++, +로 표기하였다.
Figure 112013006489601-pct00048
이상의 결과로부터, CH1 및 힌지가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열이고, Fc가 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 키메라 아이소타이프인 항체에 대해서, 적어도 276번째 및 339번째의 아미노산 잔기가 인간 IgG3의 아미노산 잔기인 것이 CDC 활성의 증강에 적합한 것으로 나타났다.
2. 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 프로테인 A 결합 활성의 측정
본 실시예의 제1항에서 특히 CDC 활성이 높았던 1131(296/300-IgG1)(-F), 1131(274/296/300-IgG1)(-F) 및 1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)의 프로테인 A 결합 활성을, 실시예 4의 제3항과 동일한 절차로 측정하였다.
결과를 도 25에 도시하였다. 도 25에 도시되는 바와 같이, 1131(296/300-IgG1)(-F), 1131(274/296/300-IgG1)(-F) 및 1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)은, CD20-IgG1(-F) 및 1131(-F)과 동등한 프로테인 A 결합 활성을 나타내었다. 이 결과는, 276번째, 및/또는 339번째의 아미노산 서열이 IgG3형인 것은, 프로테인 A 결합 활성에 영향을 미치지 않는 것을 나타내고 있다.
이상의 결과로부터, CH1 및 힌지가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열, Fc가 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 키메라 아이소타이프이고, 프로테인 A 결합 활성을 갖는 항체에 대해서, 276번째 및 339번째의 아미노산 잔기가, IgG3형의 아미노산 잔기인 리신 및 트레오닌인 것이, CDC 활성의 증강에 적합한 것으로 나타났다.
실시예 9
동물 세포를 이용한, 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 제작
1. 각종 발현 벡터 구축
실시예 2 및 4의 결과로부터, 인간 IgG1 항 CD20 항체의 CH2 또는 Fc를, 인간 IgG3의 아미노산 서열과 교환함으로써 CDC 활성이 증강되는 것이 분명해졌다. 다른 항원에 대한 항체에서도, 동일한 CDC 활성 증강이 보여지는 것을 확인하기 위해서, 인간화 항 Campath 항체인 Campath-1H에 대해서도, 인간 IgG1, 1133형 및 1131형을 제작하고, CDC 활성을 비교하였다.
(1) 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 Campath 항원(CD52)을 특이적으로 인식하며, 중쇄 정상 영역 아미노산 서열 중, CH1 및 힌지가 인간 IgG1의 아미노산 서열, CH2 및 CH3가 인간 IgG3의 아미노산 서열인 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 절차로 구축하였다(도 26).
먼저, National Center of Biotechnology Information(NCBI)의 데이터베이스로부터, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역(Accession: S79311) 및 경쇄 가변 영역(Accession: S79307)의 아미노산 서열 및 유전자 서열을 입수하였다. 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 39, 유전자 서열을 서열 번호 40에, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 41, 유전자 서열을 서열 번호 42에 각각 나타내었다. 이들의 서열 정보를 기초로, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역과 1133형 키메라 아이소타이프 중쇄 정상 영역으로 이루어지는, 서열 번호 43으로 나타나는, 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체 중쇄의 아미노산 서열, 및 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 경쇄 가변 영역과 인간 항체 경쇄 정상 영역 서열로 이루어지는, 서열 번호 44로 나타나는 항 Campath 항체 경쇄의 아미노산 서열을 각각 설계하였다.
다음으로, 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 이 염기 서열은, 서열 번호 40에 나타나는 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역 유전자 서열의, 5'말단측에 제한 효소 NotI 인식 서열을, 3'말단측에 제한 효소 ApaI 인식 서열을 부가한 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열을 기초로, 서열 번호 46, 47, 48 및 49에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 이들 서열은, 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열을 4분할한 염기 서열이고, 또한, 인접하는 서열끼리가 대략 20 bp의 중복을 가지며, 센스쇄와 안티센스쇄가 교대로 되도록 설계하였다.
실제로는, 서열 번호 46, 47, 48 및 49에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 이들을 이용하여 PCR을 행하였다. 양단에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.5 μM이 되도록, 내측에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.1 μM이 되도록, PCR 반응액[0.02 units/uL KOD+ DNA Polymerase(도요 보세키사 제조), 0.2 mM dNTPs, 1 mM 황산마그네슘, 1/10 체적의 10배 농축 PCR Buffer(도요 보세키사 제조, KOD DNA Polymerase에 첨부)]을 조제하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여, 94℃에서 4분간 가열한 후, 1 사이클이 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 3행정으로 이루어지는 반응을 합계 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 480 bp의 PCR 산물을 회수하였다. 회수한 PCR 산물을 제한 효소 NotI(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조)으로 소화 처리한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 450 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 1에서 제작한 1133형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 발현 벡터 pKTX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 중쇄 가변 영역이 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열로 치환된 1133형 키메라 아이소타이프 발현 벡터가 얻어진 것을 확인하였다.
다음으로, 서열 번호 50에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 이 서열은, 서열 번호 42에 나타나는 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 경쇄 가변 영역 유전자 서열의, 5'말단측에 제한 효소 EcoRI 인식 서열을, 3'말단측에 제한 효소 BsiWI 인식 서열을 부가한 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 50에 나타나는 염기 서열을 기초로, 서열 번호 51, 52, 53 및 54에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 이들 서열은, 서열 번호 50에 나타나는 염기 서열을 4분할한 염기 서열이며, 또한, 인접하는 서열끼리가 대략 20 bp의 중복을 갖는, 센스쇄와 안티센스쇄가 교대로 되도록 설계하였다. 이들 4개의 합성 올리고 DNA를 이용해서 PCR을 행하여, 서열 번호 50에 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시켰다.
실제로는, 서열 번호 51, 52, 53 및 54에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 이들을 이용하여 PCR을 행하였다. 양단에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.5 μM이 되도록, 내측에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.1 μM이 되도록, PCR 반응액[0.02 units/uL KOD+ DNA Polymerase(도요 보세키사 제조), 0.2 mM dNTPs, 1 mM 황산마그네슘, 1/10 체적의 10배 농축 PCR Buffer(도요 보세키사 제조, KOD DNA Polymerase에 첨부)]을 조제하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여, 94℃에서 4분간 가열한 후, 1 사이클이 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 3행정으로 이루어지는 반응을 합계 25 사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 420 bp의 PCR 산물을 회수하였다. 회수한 PCR 산물을 제한 효소 EcoRI(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 BsiWI(도요 보세키사 제조)으로 소화 처리한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 400 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 본 항에서 제작한, 중쇄 가변 영역을 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열로 치환한 1133형 키메라 아이소타이프 발현 벡터에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 발현 벡터 pKTX93/Campath1H-1133이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 인간 IgG1 항 Campath 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 Campath 항원(CD52)을 특이적으로 인식하며, 중쇄 정상 영역이 인간 IgG1의 아미노산 서열인 인간 IgG1 항 Campath 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 절차로 구축하였다(도 27).
본 실시예 제1항에서 제작한 1133형 항 Campath 항체의 발현 벡터 pKTX93/Campath1H-1133을, 제한 효소 EcoRI(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조)으로 소화 처리한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 3300 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8P에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 10 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 인간 IgG1 항 Campath 항체의 발현 벡터 pKTX93/Campath1H-IgG1이 얻어진 것을 확인하였다.
(3) 1131형 항 Campath 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 Campath 항원(CD52)을 특이적으로 인식하며, 중쇄 정상 영역 아미노산 서열 중, CH1 및 힌지가 인간 IgG1의 아미노산 서열, CH2가 인간 IgG3의 아미노산 서열, CH3이 인간 IgG1의 아미노산 서열인 1131형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 절차로 구축하였다(도 28).
본 실시예 제1항에서 제작한 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 발현 벡터 pKTX93/Campath1H-1133을, 제한 효소 EcoRI(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조)으로 소화 처리한 후, 그 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 이용하여, 약 3300 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편, 실시예 3에서 제작한 1131형 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체의 발현 벡터 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행해서, 약 10 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 그 반응액을 이용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 이용하여 첨부된 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 1131형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 발현 벡터 pKTX93/Campath1H-1131이 얻어진 것을 확인하였다.
2. 각종 항 Campath 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 각종 항 Campath 항체 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-을 숙주 세포로 해서 도입하여, 항 Campath 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 절차로 제작하였다.
3. 각종 항 Campath 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 각종 키메라 아이소타이프 항 CD20 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 절차로, 배양하여, 정제하였다. 인간 IgG1 항 Campath 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체는 Prosep-A(프로테인 A 결합 수지: 밀리포어사 제조) 충전 칼럼을 이용하여 정제하였다. 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체는 Prosep-G(프로테인 G 결합 수지: 밀리포어사 제조) 충전 칼럼을 이용하여 정제하였다.
각 키메라 아이소타이프 항체의, 발현 벡터 및 정제한 항체의 명칭의 대응을 표 8에 나타내었다. 숙주 세포는 모두 CHO/FUT8-/-이다.
Figure 112009051261985-pct00014
4. 정제된 각종 항 Campath 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 개변 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 실시예 1의 제6항과 동일한 절차로 SDS-PAGE를 행하여, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 개변 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는, 목적의 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것을 확인하였다.
실시예 10
각종 항 Campath 항체의 CDC 활성 측정
실시예 9의 제3항에서 얻어진 인간 IgG1 항 Campath 항체 및 1131형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 정제 샘플에 대해서, 모두 Campath 항원 양성인 세포주, 인간 만성 B 세포성 백혈병 세포주 MEC-1(DSMZ: ACC497), MEC-2(DSMZ: ACC500) 및 EHEB(DSMZ: ACC67)에 대한 CDC 활성을, 실시예 2의 제2항과 동일한 절차로 측정하였다. 결과를 도 29에 도시하였다. MEC-1, MEC-2 및 EHEB의 어떠한 세포주에 있어서도, Campath1H-1131(-F)은 Campath1H-IgG(-F)보다 높은 CDC 활성을 나타내었다. 또한, 1133형 키메라 아이소타이프 항 Campath 항체의 정제 샘플에 대해서도 동일한 시험을 행한 결과, MEC-1, MEC-2 및 EHEB의 어떠한 세포주에 있어서도, Campath1H-1133(-F)은 Campath1H-IgG(-F)보다 높은 CDC 활성을 나타내었다.
이상의 결과로부터, 항 CD20 항체와 마찬가지로, CH1 및 힌지가 인간 IgG1 항체의 아미노산 서열이고, Fc가 인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체의 키메라 아이소타이프인 항 Campath 항체에 대해서도, Fc 영역의 아미노산 서열을 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열로 교환하는 것이, CDC 활성의 증강에 중요한 부분은 CH2 도메인 내에 있는 것으로 나타났다.
본 발명에 따르면, 인간 IgG1 항체에서, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이, 다른 아미노산으로 치환된 CH2 도메인을 가지며, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체 의존성 세포 상해 활성이 증가한, 유전자 재조합 항체 조성물, 이 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 이 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 이 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 이 형질 전환체를 이용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 이 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으 로서 함유하는 의약을 제공할 수 있다.
<서열표 프리텍스트>
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Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 16 catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta cacctgtggt tctcggggct gtcctttggt 60 tttggagatg gttttctcga tgggggctgg gagggctttg ttggagacct tgcacttgta 120 ctccttgccg ttcagccagt cctggtgcag gacgg 155 <210> 17 <211> 158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 17 cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaagtggt acgtggacgg 60 cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg 120 tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggc 158 <210> 18 <211> 1504 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> CDS <222> (1)..(1119) <400> 18 atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct ggg gac 48 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc 96 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc 336 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat 384 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt 432 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga 480 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg 528 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac 576 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat 624 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tca 864 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat 960 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc 1008 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac 1056 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc 1104 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 aac ccc aac gcc tga gcacctctac aaaaaaattc gcgagacatg gactatggtg 1159 Asn Pro Asn Ala 370 cagagccagc caaccagagt ccagccactc ctgagaccat cgaccataaa ccctcgactg 1219 cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac 1279 actccagagc taaggccact tcgcttttgt caaaggctcc tctcaatgat tttgggaaat 1339 caagaagttt aaaatcacat actcatttta cttgaaatta tgtcactaga caacttaaat 1399 ttttgagtct tgagattgtt tttctctttt cttattaaat gatctttcta tgacccagca 1459 aaaaaaaaaa aaaaaaggga tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1504 <210> 19 <211> 372 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 19 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr 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Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 20 <211> 1316 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 20 gccccgcccc ctccacctgg accgagagta gctggagaat tgtgcaccgg aagtagctct 60 tggactggtg gaaccctgcg caggtgcagc aacaatgggt gagccccagg gatccaggag 120 gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180 tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240 ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300 tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360 gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420 ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480 aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540 gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600 ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660 tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720 tacagggaaa ccacggaggc agttcatcta ctcactggac ctagcccggc tcttcatctg 780 ggtcctgcgg gagtacaatg aagttgagcc catcatcctc tcagtgggcg aggaagatga 840 agtctccatt aaggaggcag ctgaggctgt agtggaggcc atggacttct gtggggaagt 900 cacttttgat tcaacaaagt cagatgggca gtataagaag acagccagca atggcaagct 960 tcgggcctac ttgcctgatt tccgtttcac acccttcaag caggctgtga aggagacctg 1020 tgcctggttc accgacaact atgagcaggc ccggaagtga agcatgggac aagcgggtgc 1080 tcagctggca atgcccagtc agtaggctgc agtctcatca tttgcttgtc aagaactgag 1140 gacagtatcc agcaacctga gccacatgct ggtctctctg ccagggggct tcatgcagcc 1200 atccagtagg gcccatgttt gtccatcctc gggggaaggc cagaccaaca ccttgtttgt 1260 ctgcttctgc cccaacctca gtgcatccat gctggtcctg ctgtcccttg tctaga 1316 <210> 21 <211> 321 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 21 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn 85 90 95 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys 100 105 110 Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu 115 120 125 Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser 130 135 140 Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln 145 150 155 160 His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro 165 170 175 His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile 180 185 190 His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp 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agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420 ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480 ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540 catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600 tactacctca gtcaaacaga tggagcaggt gagtggcggg aaaaagaagc caaagatctg 660 acagagctgg tccagcggag aataacatat ctgcagaatc ccaaggactg cagcaaagcc 720 agaaagctgg tatgtaatat caacaaaggc tgtggctatg gatgtcaact ccatcatgtg 780 gtttactgct tcatgattgc ttatggcacc cagcgaacac tcatcttgga atctcagaat 840 tggcgctatg ctactggagg atgggagact gtgtttagac ctgtaagtga gacatgcaca 900 gacaggtctg gcctctccac tggacactgg tcaggtgaag tgaaggacaa aaatgttcaa 960 gtggtcgagc tccccattgt agacagcctc catcctcgtc ctccttactt acccttggct 1020 gtaccagaag accttgcaga tcgactcctg agagtccatg gtgatcctgc agtgtggtgg 1080 gtatcccagt ttgtcaaata cttgatccgt ccacaacctt ggctggaaag ggaaatagaa 1140 gaaaccacca agaagcttgg cttcaaacat ccagttattg gagtccatgt cagacgcact 1200 gacaaagtgg gaacagaagc agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa 1260 gaacattttc agcttctcga acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc 1320 actgatgacc cttctttgtt aaaggaggca aagacaaagt actccaatta tgaatttatt 1380 agtgataact ctatttcttg gtcagctgga ctacacaacc gatacacaga aaattcactt 1440 cggggcgtga tcctggatat acactttctc tcccaggctg acttccttgt gtgtactttt 1500 tcatcccagg tctgtagggt tgcttatgaa atcatgcaaa cactgcatcc tgatgcctct 1560 gcaaacttcc attctttaga tgacatctac tattttggag gccaaaatgc ccacaaccag 1620 attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680 atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740 ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800 cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860 gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc cagactaaca tatggttcat tgacagacat 1920 gctccgcacc aagagcaagt gggaaccctc agatgctgca ctggtggaac gcctctttgt 1980 gaagggctgc tgtgccctca agcccatg 2008 <210> 23 <211> 1728 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 atgcgggcat 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ctccccattg tagacagcct ccatcctcgg 900 cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag accgactcct aagagtccat 960 ggtgaccctg cagtgtggtg ggtgtcccag tttgtcaaat acttgattcg tccacaacct 1020 tggctggaaa aggaaataga agaagccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt 1080 ggagtccatg tcagacgcac agacaaagtg ggaacagaag cagccttcca ccccatcgag 1140 gagtacatgg tacacgttga agaacatttt cagcttctcg cacgcagaat gcaagtggat 1200 aaaaaaagag tatatctggc tactgatgat cctactttgt taaaggaggc aaagacaaag 1260 tactccaatt atgaatttat tagtgataac tctatttctt ggtcagctgg actacacaat 1320 cggtacacag aaaattcact tcggggtgtg atcctggata tacactttct ctcacaggct 1380 gactttctag tgtgtacttt ttcatcccag gtctgtcggg ttgcttatga aatcatgcaa 1440 accctgcatc ctgatgcctc tgcgaacttc cattctttgg atgacatcta ctattttgga 1500 ggccaaaatg cccacaatca gattgctgtt tatcctcaca aacctcgaac tgaagaggaa 1560 attccaatgg aacctggaga tatcattggt gtggctggaa accattggga tggttattct 1620 aaaggtatca acagaaaact tggaaaaaca ggcttatatc cctcctacaa agtccgagag 1680 aagatagaaa cagtcaagta tcccacatat 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gctcagtgtt tagctgtggg tgtctgcatc tgcttccatc agctactgga 7980 tgagggctct aggatggcat ataaggtagt catcagtctc attatcagag aagggctttt 8040 aaggtagcct cttgattatt gcttagattg ttagttgggg tcaaccttgt aggtctctgg 8100 acagtgacag aattctcttt aaacctataa tggctccctc tgtggtggta tcccttttct 8160 tgctctcatc cgttcctccc ctgactagat cttcctgctc cctcatgtcc tcctctcccc 8220 tccccttctc cccttctctt tcttctaact ccctctcccc tccacccacg atccccatta 8280 gcttatgaga tcttgtcctt attttagcaa aacctttttg gctataaaat taattaattt 8340 aatatgctta tatcaggttt attttggcta gtatttgtat gtgtttggtt agtgttttta 8400 accttaattg acatgtatcc ttatatttag acacagattt aaatatttga agtttttttt 8460 tttttttttt ttaaagattt atttattttt tatgtcttct gcctgcatgc cagaagaggg 8520 caccagatct cattcaaggt ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggaa ttgaactcag 8580 gacctctgga agaacagtca gtgctcttaa ccgctgagcc atctctccag cccctgaagt 8640 gtttctttta aagaggatag cagtgcatca tttttccctt tgaccaatga ctcctacctt 8700 actgaattgt tttagccatt tatatgtaat gctgttacca ggtttacatt ttcttttatc 8760 ttgctaaatt tcttccctgt ttgtctcatc tcttattttt gtctgttgga ttatataggc 8820 ttttattttt ctgtttttac agtaagttat atcaaattaa aattatttta tggaatgggt 8880 gtgttgacta catgtatgtc tgtgcaccat gtgctgacct ggtcttggcc agaagaaggt 8940 gtcatattct ctgaaactgg tattgtggat gttacgaact gccatagggt gctaggaatc 9000 aaaccccagc tcctctggaa aagcagccac tgctctgagc cactgagtcc tctcttcaag 9060 caggtgatgc caacttttaa tggttaccag tggataagag tgcttgtatc tctagcaccc 9120 atgaaaattt atgcattgct atatgggctt gtcacttcag cattgtgtga cagagacagg 9180 aggatcccaa gagctc 9196 <210> 31 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 31 cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaagtggt acgtgg 56 <210> 32 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 32 catctcctat gggggcaggg cctgtggttc tcggggctgt cctttggctt tggagatgg 59 <210> 33 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly 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Claims (24)

  1. 인간 IgG1 항체이며, Kabat 등의 EU 인덱스로 표시되는 276번째 및 339번째의 아미노산이 각각 리신 및 트레오닌으로 치환된 CH2 도메인을 갖고, 또한 아미노산 치환하기 전의 CH2 도메인을 갖는 항체보다 보체(補體) 의존성 세포 상해 활성이 증가한 것인 유전자 재조합 항체 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 또한, Fc 영역 중의 CH3 도메인에 포함되는 폴리펩티드가 EU 인덱스에 있어서, 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드인 유전자 재조합 항체 조성물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 인간 IgG1 항체 분자를 포함하는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 유전자 재조합 항체 조성물.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 인간 IgG1 항체 분자를 포함하는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 상기 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 이 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄인 유전자 재조합 항체 조성물.
  6. 제1항 또는 제3항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자를 코딩하는 DNA.
  7. 제1항 또는 제3항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA.
  8. 제6항에 기재된 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체.
  9. 제8항에 있어서, 숙주 세포가, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포인 형질 전환체.
  10. 제8항에 있어서, 숙주 세포가, 항체 분자를 코딩하는 유전자를 도입했을 때, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc에 갖는 항체 분자를 포함하는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 능력을 갖는 세포인 형질 전환체.
  11. 제10항에 있어서, 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄가, 상기 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α결합되어 있지 않은 당쇄인 형질 전환체.
  12. 제8항에 있어서, 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 비활성화되도록 게놈이 개변된 세포인 형질 전환체.
  13. 제8항에 있어서, 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 상의 대립 유전자 전부가 녹아웃(knockout)된 세포인 형질 전환체.
  14. 제12항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(dehydratase)(GMD) 또는 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제(epimerase)(Fx)에서 선택되는 효소인 형질 전환체.
  15. 제14항에 있어서, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 이하의 (a)의 DNA가 코딩하는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  16. 제14항에 있어서, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질.
  17. 제14항에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a)의 DNA가 코딩하는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  18. 제14항에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.
  19. 제12항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase)인 형질 전환체.
  20. 제19항에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  21. 제19항에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (c) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
    (d) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질.
  22. 제8항에 있어서, 숙주 세포가, 하기의 (a)∼(i)로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 형질 전환체:
    (a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;
    (b) 래트 골수종(myeloma) 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포;
    (c) 마우스 골수종 세포주 NS0 세포;
    (d) 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포;
    (e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;
    (f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포;
    (g) 인간 백혈병 세포주 나말와(Namalwa) 세포;
    (h) 배아 줄기 세포;
    (i) 수정란 세포.
  23. 제8항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시키며, 그 유전자 재조합 항체 조성물을 채취하여, 정제하는 것을 특징으로 하는 항체 조성물의 제조 방법.
  24. 제1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
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