KR101318611B1 - 유전자 재조합 항체 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환된, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체(補體) 의존성 세포 상해 활성을 나타내는 유전자 재조합 항체 조성물, 상기 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 상기 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 형질 전환체를 사용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 상기 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.

Description

유전자 재조합 항체 조성물{GENETICALLY MODIFIED ANTIBODY COMPOSITION}
본 발명은 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스(이하, EU 인덱스)에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환된, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체(補體) 의존성 세포 상해 활성을 나타내는 유전자 재조합 항체 조성물, 상기 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 상기 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 형질 전환체를 사용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 또한 상기 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약에 관한 것이다.
항체는 높은 결합 활성, 결합 특이성 및 혈중에서의 높은 안정성을 갖기 때문에, 인간의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료약으로서의 응용이 시도되어 왔다(비특허 문헌 1). 또한, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 비인간 동물 항체로부터 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체가 제작되었다(비특허 문헌 2∼5). 인간형 키메라 항체는, 항체 가변 영역이 인간 이외의 동물의 항체, 정상 영역이 인간 항체로 구성된다. 인간화 항체란, 인간 이외의 동물의 항체의 상보성 결정 영역(이하, CDR 이라고 표기한다)이 인간 항체의 CDR로 치환된 항체이다.
인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는, 비인간 동물 항체의 높은 면역원성, 낮은 이펙터(effector) 기능, 짧은 혈중 반감기 등의 마우스 항체 등이 갖는 문제를 해결하여, 모노클로날(monoclonal) 항체의 의약품으로서의 응용을 가능하게 하였다(비특허 문헌 6∼9). 이미 미국에서는, 예컨대, 암 치료용 항체로서 복수의 인간화 항체가 인가되어서, 판매되고 있다(비특허 문헌 10).
이들 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체는, 실제로 임상에 있어서 어느 정도의 효과를 나타내고 있으나, 보다 효과가 높은 항체 의약이 요구되고 있다. 예컨대, CD20에 대한 인간형 키메라 항체인 Rituxan(비특허 문헌 11)(IDEC사/Roche사/Genentech사)의 단독 투여에서는, 재발성 저악성도의 비호지킨 림프종 환자에 대한 제III상 임상시험에 있어서의 주효율(奏效率)은 48%(완전 관해(寬解) 6%, 부분 관해 42%)에 불과하고, 또한, 평균의 효과 지속 기간은 12개월이라고 보고되어 있다(비특허 문헌 12). Rituxan과 화학 요법(CHOP: Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine)의 병용에서는, 재발성 저악성도 및 여포성의 비호지킨 림프종 환자에 대한 제II상 임상시험에 있어서, 주효율은 95%(완전 관해 55%, 부분 관해 45%)라고 보고되어 있으나, CHOP에 기인하는 부작용이 보여지고 있다(비특허 문헌 13). HER2에 대한 인간화 항체인 Herceptin(Genentech사)은, 단독 투여에서는, 전이성 유암(乳癌) 환자에 대한 제III상 임상시험에 있어서의 주효율은 불과 15%이며, 평균의 효과 지속 기간은 9.1개월이라고 보고되어 있다(비특허 문헌 14).
인간 항체 분자는 면역글로불린(이하 Ig)이라고도 불리며, 그 분자 구조로부 터 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM의 각 클래스로 분류된다. 항체 의약으로서 주로 사용되는 인간 IgG(이하 IgG라고 칭한다)의 항체 분자는 2개씩의 중쇄(heavy chain, 이하 H쇄라고 칭한다)와 경쇄(light chain, 이하 L쇄라고 칭한다)라 불리는 폴리펩티드에 의해 형성된다. H쇄는 N말단측으로부터 H쇄 가변 영역(이하 VH라고 표기한다), CH1, 힌지, CH2, CH3라 불리는 각 도메인 구조에 의해 형성된다. CH1, 힌지, CH2, CH3의 각 도메인을 합쳐서 중쇄 정상 영역(이하, CH라고 표기한다)이라고도 불리고, CH2, CH3의 각 도메인을 합쳐서 Fc 영역이라고도 불린다. L쇄는 N말단측으로부터 L쇄 가변 영역(이하 VL이라고 표기한다), L쇄 정상 영역(이하 CL이라고 표기한다)이라 불리는 각 도메인 구조에 의해 형성된다.
IgG 항체의 H쇄에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4개의 서브 클래스가 존재한다. 각 IgG 서브 클래스의 H쇄는 서로, 가변성이 풍부한 힌지를 제외하는 정상 영역에 대하여 95% 정도의 아미노산 서열의 상동성(相同性)을 갖는다(도 1).
각 IgG 서브 클래스는 아미노산 서열의 상동성이 높음에도 불구하고, 이들이 갖는 생물 활성의 강약은 다르다(비특허 문헌 15). 생물 활성으로서는, 보체 의존성 세포 상해 활성(이하, CDC 활성이라고 약기한다), 항체 의존성 세포 상해 활성(이하, ADCC 활성이라고 약기한다), 탐식 활성 등의 이펙터 기능을 들 수 있으며, 이들은 생체 내에서 이물이나 병원체 배제 등에 중요한 역할을 수행한다.
내추럴 킬러 세포(이하 NK 세포라고 표기한다), 단구, 대식 세포, 과립구 등의 여러 가지 백혈구의 표면에는, Fcγ 수용체(이하 FcγR이라고 표기한다)의 패밀리가 발현한다. FcγR에는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb의 활성형 Fcγ R과, FcγRIIb의 억제형 FcγR로 분류된다. IgG 항체, 특히 인간에게 있어서는 IgG1과 IgG3는 이들 수용체에 강하게 결합하여, 그 결과 백혈구에 의한 ADCC 활성이나 탐식 활성을 유도한다.
ADCC 활성이란, 항원에 결합한 항체가, Fc 부분을 통하여 주로 NK 세포 표면의 FcγRIIIa에 결합하고, 그 결과, NK 세포로부터 방출되는 페르포린(perforin)이나 그란자임(granzyme) 등의 세포 상해성 분자에 의해 발생하는 세포 융해 반응이다(비특허 문헌 16, 17). ADCC 활성의 강도는, 일반적으로는 IgG1＞IgG3＞＞IgG4≥IgG2의 서열이 된다(비특허 문헌 18, 19).
CDC 활성이란, 항원에 결합한 항체가, 혈청 중의 보체계라 불리는 1군의 혈청 단백질의 반응 캐스케이드를 활성화하여, 최종적으로 표적 세포를 융해하는 반응이다. CDC 활성은, 인간 IgG1 및 IgG3에 있어서 높으며, 그 강도는 일반적으로 IgG3≥IgG1＞＞IgG2≒IgG4의 서열이 된다. 보체계는 C1∼C9의 각 성분으로 분류되고, 그 대부분이 부분 분해를 받아서 효소 활성을 발현하는 효소 전구체이다. CDC 활성은 최초에 C1의 한 성분인 C1q의 표적 세포상의 항체의 Fc 영역에의 결합으로 시작되고, 각 성분이 전단계의 성분에 의해 부분 분해를 받음으로써 활성화의 캐스케이드가 진행되며, 최종적으로는 C5∼C9이 막 침습 복합체라 불리는 구멍 형성 중합체가 표적 세포의 세포막상에서 형성되어, 세포의 용해 반응을 일으킨다(비특허 문헌 16, 17).
임상에 사용되는 항체 의약의 약효 메커니즘에 있어서도, 상술한 이펙터 기능의 중요성이 인식되고 있다. 상기의 Rituxan은, IgG1 서브 클래스의 인간형 키메 라 항체이며, in vitro에서 ADCC 활성 및 CDC 활성을 나타낼(비특허 문헌 21) 뿐만 아니라, 임상 효과에 있어서도, ADCC 활성이 강한 유전자형을 나타내는 환자에게 있어서 치료 효과가 높은 것(비특허 문헌 22), 투여 후에 신속히 혈중에서 보체 성분이 소비되는 것(비특허 문헌 23), 투여 후에 재발한 환자의 암 세포에서는 CDC 활성을 억제하는 인자인 CD59의 발현이 상승하고 있는 것(비특허 문헌 24) 등으로부터, Rituxan이 실제로 환자 체내에서 이펙터 기능을 발휘하고 있는 것이 시사되어 있다. Herceptin도 IgG1 서브 클래스의 인간화 항체이며, in vitro에서 ADCC 활성을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 25).
이상의 점에서, 인간 IgG1 항체는 다른 서브 클래스와 비교해서, 강한 ADCC 활성 및 CDC 활성을 가지며, 또한 인간 혈중에서의 반감기가 긴 것 등으로부터, 항체 의약으로서 최적이다.
IgG 항체를 기능 해석하기 위하여, 다른 IgG 서브 클래스 사이에서 도메인 단위를 교환한 항체를 제작하는 연구가 행해져 왔다. 1980년대 후반, Morrison 등은 IgG1과 IgG4 사이, 또는 IgG2와 IgG3 사이에서 중쇄 정상 영역의 각 도메인(CH1, CH2, CH3, 힌지)을 교체한 항체 분자가 재조합 단백질로서 발현 가능한 것, 또한 IgG3와 IgG4의 힌지를 서로 교체한 항체는, 각각 원래의 항체의 보체 고정화능 및 Fc 수용체 결합능에 변화가 없음을 나타내 보였다(특허 문헌 1). 그 후, 그들은 이들 IgG1과 IgG4, 및 IgG2와 IgG3와의 도메인 교환 항체를 조사한 결과, IgG1의 CDC 활성에는 CH2의 C말단측이, IgG3의 CDC 활성에는 CH2가 중요한 것(비특허 문헌 26), Fc 수용체의 일종인 FcγRI에 대한 IgG1 및 IgG3의 결합에는 CH2 도 메인이나 힌지가 중요한 것(비특허 문헌 27) 등을 나타내 보였다.
C1q는 항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 것이 알려져 있다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 단량체에 대한 C1q의 결합 상수(Ka)는, 각각 1.2×104, 0.64×104, 2.9×104, 0.44×104M-1이다(비특허 문헌 20). 상술과 같이, Fc 영역 중에서도 특히 CH2 도메인이 중요하고(비특허 문헌 26), 더욱 상세하게는 인간 IgG1에서는 Kabat 등에 의한 EU 인덱스의 정의(비특허 문헌 28)에 있어서, CH2 중의 Leu235(비특허 문헌 29), Asp270, Lys322, Pro329, Pro331(비특허 문헌 30), 인간 IgG3에서는 Glu233, Leu234, Leu235, Gly236(비특허 문헌 31), Lys322(비특허 문헌 32)가 중요한 것이 알려져 있다.
CDC 활성이 가장 높은 서브 클래스인 인간 IgG3의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 일부를, 다른 서브 클래스 유래의 아미노산 서열로 치환함으로써 CDC 활성을 보다 증강시키는 시도가 이루어져 왔다. 각 IgG 서브 클래스의 힌지의 길이는, IgG1이 15아미노산, IgG2가 12아미노산, IgG3가 62아미노산, IgG4가 12아미노산이며, 인간 IgG3는 다른 IgG 서브 클래스와 비교하여, 힌지 영역이 길다고 하는 구조상의 특징을 갖는다(비특허 문헌 1). Michaelsen 등은, 폴리펩티드 인간 IgG3의 힌지를 야생형의 62아미노산으로부터 N말단측의 3개의 엑손(exon)을 삭제함으로써 15아미노산으로 단축시킨 Ig의 CDC 활성이, IgG3 및 IgG1보다도 상회하는 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 33). 또한 Norderhaug 등은, 단축한 상술한 힌지의 아미노산 서열을, IgG4의 힌지의 아미노산 서열에 접근시켜 가면 더욱 CDC 활성이 상 승하는 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 34). 또한 Brekke 등은, 힌지 부분을 IgG1으로 치환시킨 IgG3, 및 힌지 부분, 및 CH1의 N말단 부분을 IgG1으로 치환시킨 IgG3는, CDC 활성이 IgG3보다도 높으며, IgG1과 동등 이상이 되는 것을 나타내 보였다(비특허 문헌 35).
또한 인간 IgG 중쇄 정상 영역 중의 모든 아미노산 서열에 변이를 도입한 IgG의 개변체를 제작하고, 이들 개변체의 C1q와의 결합 활성을 상승시킨 CDC 활성의 증강도 검토되고 있다. Idusogie 등은, 인간 IgG1의 정상 영역 및 마우스 유래의 가변 영역을 갖는 항(抗) CD20 키메라 항체 Rituxan의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인 중의 EU 인덱스 326번째의 Lys, 또는 333번째의 Glu를 다른 아미노산으로 치환하면, 최대로 2배 정도 CDC 활성이 증강하는 것을 보고하였다(비특허 문헌 36, 특허 문헌 2). Idusogie 등은, 또한, IgG1의 수 백분의 일 정도의 CDC 활성이던 IgG2의 CDC 활성이, 인간 IgG2의 EU 인덱스 326번째의 Lys, 또는 333번째의 Glu를 다른 아미노산으로 치환함으로써, IgG1의 CDC 활성의 1/25 정도까지 상승하는 것을 나타내 보였다(특허 문헌 3∼5).
항체 의약의 치료 효과에는 ADCC 활성이나 탐식 활성 등의 FcγR 의존적인 활성과 CDC 활성의 양방이 중요하다. 그러나, CDC 활성을 야기하는 초기 단계인 C1q 결합, 및 ADCC 활성을 야기하는 초기 단계인 FcγR에의 결합은 모두 항체의 Fc를 통하고 있기 때문에, CDC 활성을 증강시킨 경우에 ADCC 활성을 손상시켜 버릴 가능성도 있다. Idusogie 등은, CDC 활성을 증강시킨 IgG1의 Fc 아미노산의 점변이 도입체는, ADCC 활성이 크게 저하해 버리는 것을 보고하고 있다(비특허 문헌 36).
또한 인간 IgG 정상 영역을 갖는 항체의 ADCC 활성은, CH2 도메인의 297번째의 아스파라긴에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 구조(도 2에 모식도를 나타낸다)에 의해 변화하는 것이 알려져 있다(특허 문헌 6). 항체에 결합하는 당쇄의 갈락토오스 및 N-아세틸글루코사민의 함량에 의존하여, 항체의 ADCC 활성이 변화한다는 보고가 있으나(비특허 문헌 37∼40), 가장 ADCC 활성에 영향을 끼치는 것은, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 α1,6 결합하는 푸코스(fucose)이다. 푸코스가 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합하지 않은 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 IgG 항체는, 푸코스가 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합한 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 IgG 항체보다도 현저히 높은 ADCC 활성을 나타낸다(비특허 문헌 41, 42, 특허 문헌 7). 푸코스가 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합하지 않은 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 갖는 항체 조성물을 생산하는 세포로서는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase) 유전자가 녹아웃(knockout)된 세포가 알려져 있다(특허 문헌 7, 8).
인간 IgG3는 다른 서브 클래스와 달리, 프로테인 A 결합 활성을 갖지 않기 때문에(비특허 문헌 1), 의약으로서 제조한 경우에 정제가 곤란하다. IgG 분자는, 프로테인 A와 CH2 도메인과 CH3 도메인의 경계면(interface)에서 회합하는 것이 알려져 있으며, 구체적으로는 CH2의 면역글로불린 구조(immunoglobulin fold)의 EU 인덱스 252번째로부터 254번째, 308번째로부터 312번째, CH3의 면역글로불린 구조의 433번째로부터 436번째의 아미노산으로 이루어지는 루프 부분이 중요하다는 것이 X선 결정 해석으로부터 시사되어 있다(비특허 문헌 43). 또한 핵 자기 공명 법(NMR법)에 의한 해석에 의해, IgG1의 CH2 중의 Ile253, Ser254, His310, Gln311, 및 CH3 중의 His433, His435, His436이 특히 중요하다는 것이 나타났다(비특허 문헌 44). 또한 Kim 등은, 인간 IgG1의 중쇄 정상 영역의 His435를, IgG3 유래의 Arg로 치환함으로써 프로테인 A 결합 활성이 약해지는 것을 발견하였다(비특허 문헌 45).
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항원성을 갖지 않으며, 또한 CDC 활성, ADCC 활성 등의 이펙터 기능이 증강된, 치료 효과가 높아진 항체가 요구되고 있다. 또한, 의약품으로서 제조하는 것이 가능한 항체가 요구되고 있다.
본 발명은 이하의 (1)∼(25)에 관한 것이다.
(1) 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스(이하, EU 인덱스)에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환된, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체 의존성 세포 상해 활성을 나타내는 유전자 재조합 항체 조성물.
(2) 프로테인 A에 인간 IgG1 항체와 동등한 결합 활성을 더 갖는 상기 (1)에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(3) 치환되는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 이하의 1∼10 중 어느 하나의 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인 상기 (1)에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
1. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 340번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
2. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 356번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
3. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 358번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
4. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 384번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
5. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 392번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
6. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 397번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
7. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 422번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
8. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 434번째와 436번째로부터 447번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
9. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 435번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
10. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 447번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(4) 치환되는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 이하의 1∼8 중 어느 하나의 폴리펩티드에서 선택되는 상기 (2)에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
1. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 340번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
2. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 356번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
3. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 358번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
4. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 384번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
5. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 392번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
6. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 397번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
7. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 422번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
8. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 434번째와 436번째로부터 447번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(5) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 상기 (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(6) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 상기 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 상기 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄인, 상기 (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물.
(7) 상기 (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자를 코딩하는 DNA.
(8) 상기 (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA.
(9) 상기 (8)에 기재된 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체.
(10) 숙주 세포가, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포인, 상기 (9)에 기재된 형질 전환체.
(11) 숙주 세포가, 항체 분자를 코딩하는 유전자를 도입했을 때, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 능력을 갖는 세포인, 상기 (9)에 기재된 형질 전환체.
(12) 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄가, 상기 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α결합되어 있지 않은 당쇄인, 상기 (11)에 기재된 형질 전환체.
(13) 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 비활성화되도록 게놈이 개변된 세포인, 상기 (9)에 기재된 형질 전환체.
(14) 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈상의 대립 유전자 전부가 녹아웃된 세포인, 상기 (9)에 기재된 형질 전환체.
(15) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(dehydratase)(GMD) 또는 GDP-4-케토-6-데옥시(deoxy)-D-만노스-3,5-에피머라아제(epimerase)(Fx)에서 선택되는 효소인, 상기 (13) 또는 (14)에 기재된 형질 전환체.
(16) GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인, 상기 (15)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(17) GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, 상기 (15)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질.
(18) GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a) 및 (b)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인, 상기 (15)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(19) GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, 상기 (16)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.
(20) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제인 상기 (13) 또는 (14)에 기재된 형질 전환체.
(21) α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인, 상기 (20)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(c) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA;
(d) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
(22) α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(f)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, 상기 (20)에 기재된 형질 전환체.
(a) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(c) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
(d) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
(e) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질;
(f) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질.
(23) 숙주 세포가, 하기의 (a)∼(i)로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 상기 (9)∼(22) 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체.
(a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;
(b) 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포;
(c) 마우스 골수종 세포주 NS0 세포;
(d) 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포;
(e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;
(f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포;
(g) 인간 백혈병 세포주 나말와 세포;
(h) 배아 줄기 세포;
(i) 수정란 세포;
(24) 상기 (9) 내지 (23) 중 어느 1항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시키며, 상기 항체 조성물을 채취하여, 정제하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법.
(25) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
<발명의 효과>
본 발명에 의해, 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환된, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체 의존성 세포 상해 활성을 나타내는 유전자 재조합 항체 조성물, 상기 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또는 상기 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 형질 전환체를 사용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 상기 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약을 제공할 수 있다.
도 1은 각 IgG 서브 클래스의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.
도 2는 IgG 항체의 H쇄 297번째의 아스파라긴에 결합하는 N-결합 복합형 당쇄의 구조의 모식도이다.
도 3은 플라스미드 pKANTEX2B8γ3의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 4는 항 CD20 도메인 교환 항체의 모식도이다.
도 5는 플라스미드 pKTX93/1133을 도시한 도면이다.
도 6은 플라스미드 pKTX93/3311을 도시한 도면이다.
도 7은 각종 항 CD20 도메인 교환 항체, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체의 Daudi 세포에 대한, 항 CD20 항체 CD20-IgG1(+F)과의 경합 저해의 계(系)에 있어서의 결합 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 결합 저해율을 각각 나타낸다. 도면 중의 △ 및 ▲는 그래프 A∼H에 있어서 공통하고 있으며, 음성 대조인 항 Her2 항체 Herceptin(△) 및 항 CCR4 항체 KM3060(▲)을 나타낸다. 도면 중의 ○ 및 ●는, 각 그래프에 있어서 대응하는 샘플이 다르며, 그래프 A에 있어서는 CD20-IgG1(+F)(○) 및 CD20-IgG1(-F)(●)을, 그래프 B에 있어서는 CD20-IgG3(+F)(○) 및 CD20-IgG3(-F)(●)를, 그래프 C에 있어서는 1133(+F)(○) 및 1133(-F)(●)을, 그래프 D에 있어서는 3311(+F)(○) 및 3311(-F)(●)을 각각 나타낸다.
도 8은 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133 및 3311의, Daudi 세포에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플의 명칭, 세로축은 CDC 활성을 각각 나타낸다. 그래프는, 각 샘플의 농도 0.3 ㎍/mL에 있어서의 CDC 활성을 각각 나타낸다.
도 9는 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 및 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의, ST486 세포(A) 또는 Raji 세포(B)에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 CDC 활성을 각각 나타낸다. 도면 중, □는 CD20-IgG1(+F)을, ■는 CD20-IgG1(-F)을, △는 CD20-IgG3(+F)를, ▲는 CD20-IgG3(-F)를, ○는 1133(+F)을, ●는 1133(-F)을 각각 나타낸다.
도 10은 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133 및 3311의, Daudi 세포에 대한 ADCC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 ADCC 활성을 각각 나타낸다. 도면 중의 ○ 및 ●는, 각 그래프에 있어서 대응하는 샘플이 다르며, 그래프 A에 있어서는 CD20-IgG1(+F)(○) 및 CD20-IgG1(-F)(●)을, 그래프 B에 있어서는 CD20-IgG3(+F)(○) 및 CD20-IgG3(-F)(●)를, 그래프 C에 있어서는 1133(+F)(○) 및 1133(-F)(●)을, 그래프 D에 있어서는 3311(+F)(○) 및 3311(- F)(●)을 각각 나타낸다.
도 11은 항 CD20 도메인 교환 항체 1133, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체의, 항원 CD20 비존재하에 있어서의 가용성 인간 FcγRIIIa(발린형)(A∼C) 또는 가용성 인간 FcγRIIIa(페닐알라닌형)(D∼F)에 대한, ELISA계에서의 결합 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 흡광도를 각각 나타낸다. 그래프 A 및 D는 CD20-IgG1(-F)(●) 및 CD20-IgG1(+F)(○)의, 그래프 B 및 E는 CD20-IgG3(-F)(●) 및 CD20-IgG3(+F)(○)의, 그래프 C 및 F는 1133(-F)(●) 및 1133(+F)(○)의 결합 활성을 각각 나타낸다.
도 12는 항 CD20 도메인 교환 항체의 모식도이다.
도 13은 플라스미드 pKANTEX2B8P를 도시한 도면이다.
도 14는 플라스미드 pKANTEX93/1133의 제한 효소 인식 사이트 ApaI 및 SmaI의 위치를 도시한 도면이다.
도 15는 플라스미드 pKANTEX93/1113을 도시한 도면이다.
도 16은 플라스미드 pKANTEX93/1131을 도시한 도면이다.
도 17은 정제한 항 CD20 도메인 교환 항체 1133, 1113, 1131, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1 및 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 도시한 도면이다. 단백질의 염색은, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 행하였다. 레인 1은 CD20-IgG1에, 레인 2는 CD20-IgG3에, 레인 3은 1133에, 레인 4는 1113에, 레인 5는 1131에 각각 대응한다.
도 18은 항 CD20 도메인 교환 항체 1133, 1113, 1131, 인간 IgG1 항 CD20 항체 CD20-IgG1 및 인간 IgG3 항 CD20 항체 CD20-IgG3의, ST486 세포(A) 또는 Raji 세포(B)에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 세포 장해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1을, ▲는 CD20-IgG3를, ●는 1133을, ×는 1113을, ◆는 1131을 각각 나타낸다.
도 19는 항 CD20 도메인 교환 항체 1133, 1113, 1131, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1 및 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3의, Daudi 세포에 대한 ADCC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 세포 장해율을 각각 나타낸다. 도면 중, ■는 CD20-IgG1을, ▲는 CD20-IgG3를, ●는 1133을, ×는 1113을, ◆는 1131을 각각 나타낸다.
도 20은 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1(-F), CD20-IgG1(+F), 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체 1133(-F) 및 1133(+F)의, Fc 수용체 패밀리 FcγRI(A) 또는 FcγRIIa(B)에 대한 결합 활성을 ELISA계로 측정한 결과를 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 흡광도를 각각 나타낸다. 그래프 A는 FcγRI에 대한, 그래프 B는 FcγRIIa에 대한, CD20-IgG1(-F)(▲), CD20-IgG1(+F)(△), 1133(-F)(●) 및 1133(+F)(○)의 결합 활성을 각각 나타낸다.
도 21은 항 CD20 도메인 교환 항체 1133의 CH3 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 서열로 치환한 항체 113A, 113B, 113C, 113D, 113E, 113F, 113G 및 113H의 도메인 구조를 모식적으로 도시한 도면이다. 도면 중, □로 표시되는 영역은 IgG1의 아미노산 서열, ■로 표시되는 영역은 IgG3의 아미노산 서열인 것을 나타내고 있으며, IgG3 영역의 양단 상부에 나타낸 숫자는, 양단에 위치하는 IgG3 아미노산 잔기의 위치에 대응하는 EU 인덱스이다.
도 22는 항 CD20 도메인 교환 항체 1133의 CH3 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 서열로 치환한 각종 항체의 발현 벡터 플라스미드의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 23은 항 CD20 도메인 교환 항체 1133의 CH3 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 서열로 치환한 각종 항체의 정제 샘플의 SDS-PAGE 전기영동 패턴을 도시한 도면이다. 단백질의 염색은 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 행하였다. 좌측의 레인으로부터, 분자량 마커, CD20-IgG1(-F), 1133(-F), 113A(-F), 113B(-F), 113C(-F), 113D(-F), 113E(-F), 113F(-F), 113G(-F), 113H(-F)에 대응한다.
도 24는 항 CD20 도메인 교환 항체 1133의 CH3 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 서열로 치환한 각종 항체, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133 및 1131의 CD20 양성 세포에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 CDC 활성을 각각 나타낸다. 도면 중, ●(굵은 선)는 1133(-F)을, ○(굵은 선)는 1131(-F)을, ●(얇은 선)는 113A(-F)를, ○(얇은 선)는 113B(-F)를, ▲는 113C(-F)를, △는 113D(-F)를, ◆는 113E(-F)를, ◇는 113F(-F)를, ■는 113G(-F)를, □는 113H(-F)를 각각 나타낸다.
도 25는 항 CD20 도메인 교환 항체 1133의 CH3 도메인을 부분적으로 인간 IgG1 서열로 치환한 각종 항체, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133, 1131 및 1113의 프로테인 A에 대한 결합 활성을 ELISA계로 측정한 결과를 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 흡광도를 각각 나타낸다. 도 25A는, CD20-IgG1(-F)(●), CD20-IgG3(-F)(○), 1133(-F)(■), 1131(-F)(□) 및 1113(-F)(△)의 Protein-A에 대한 결합 활성을 도시한 도면이다. 도 25B는, CD20-IgG1(-F)(●), 1133(-F)(■), 113A(-F)(○), 113B(-F)(□), 113C(-F)(+), 113D(-F)(*), 113E(-F)(◇), 113F(-F)(◆), 113G(-F)(▲) 및 113H(-F)(△)의 Protein-A에 대한 결합 활성을 도시한 도면이다.
도 26은 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133, 1131 및 113F의 CD20 양성 CLL 세포주 MEC-1(A), MEC-2(B) 또는 EHEB(C)에 대한 CDC 활성을 도시한 도면이다. 가로축은 샘플 농도를, 세로축은 각 샘플 농도에 있어서의 CDC 활성을 각각 나타낸다. 도면 중, ○는 CD20-IgG1(-F)을, ●는 1133(-F)을, △는 1131(-F)을, ▲는 113F(-F)를 각각 나타낸다.
도 27은 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 28은 인간 IgG1 항 Campath 항체의 발현 벡터 플라스미드의 조성 공정을 도시한 도면이다.
도 29는 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드의 조성 공정을 도시한 도면이다.
항체 분자는 H쇄 및 L쇄라고 불리는 폴리펩티드로 구성된다. 또한, H쇄는 N말단측으로부터 가변 영역(VH), CH, L쇄는 N말단측으로부터 가변 영역(VL), CL의 각 영역에 의해, 각각 구성된다. CH는 또한, N말단측으로부터 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인의 각 도메인에 의해 구성된다. 도메인이란, 항체 분자의 각 폴리펩티드를 구성하는 기능적인 구조 단위를 말한다. 또한, CH2 도메인과 CH3 도메인을 아울러 Fc 영역이라고 말한다.
본 발명에 있어서의 CH1 도메인, 힌지 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, Fc 영역은, Kabat 등에 의한 EU 인덱스[시퀀스·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트 제5판(1991)]에 의해, N말단으로부터의 아미노산 잔기의 번호로 특정할 수 있다. 구체적으로는, CH1은 EU 인덱스 118∼215번의 아미노산 서열, 힌지는 EU 인덱스 216∼230번의 아미노산 서열, CH2는 EU 인덱스 231∼340번의 아미노산 서열, CH3는 EU 인덱스 341∼447번의 아미노산 서열로 각각 특정된다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 인간 IgG1 항체에 있어서, 중쇄 정상 영역인 CH1, 힌지, CH2 및 CH3의 각 도메인을 IgG3의 대응하는 도메인으로 교환한 유전자 재조합 항체(이하, 도메인 교환 항체라고도 말한다) 조성물 중, 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환된 유전자 재조합 항체 조성물로서, 인간 IgG1 항체 및 IgG3 항체보다도 높은 보체 의존성 세포 상해 활성을 나타내는 유전자 재조합 항체 조성물이면 어떠한 항체 조성물이어도 좋다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물로서는, 중쇄 정상 영역을 가지며, 또한 표적 분자에의 결합 활성을 갖는 항체, 또는 중쇄 정상 영역을 가지며, 또한 표적 분자에의 결합 활성을 갖는 융합 단백질이면 어떠한 것도 포함된다.
표적 분자에의 결합 활성을 갖는 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 들 수 있다.
중쇄 정상 영역을 가지며, 또한 표적 분자에의 결합 활성을 갖는 융합 단백질로서는, 표적 분자가 리간드인 경우에는, 상기 리간드에 대한 수용체와 중쇄 정상 영역과의 융합 단백질, 표적 분자가 수용체인 경우에는, 상기 수용체에 대한 리간드와 중쇄 정상 영역과의 융합 단백질, 표적 분자에의 결합 활성을 갖는 항체 또는 항체 단편과 중쇄 정상 영역과의 융합 단백질 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 CH 및 CL로 이루어지는 항체를 의미한다. 인간 이외의 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 인간형 키메라 항체는, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 취득하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하며, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜서, 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로서는, 인간 면역글로불린(hIg)에 속하면 어떠한 것이라도 좋으나, hIgG 클래스의 것이 적합하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 γ1, γ2, γ3, γ4와 같은 서브 클래스의 어떠한 것도 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
인간화 항체는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말한다.
본 발명의 인간화 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 V 영역을 코딩하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간화 항체 발현 벡터를 구축하여, 동물 세포에 도입함으로써 발현시켜서 제조할 수 있다.
인간화 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어떠한 것이라도 좋으나, hIgG 클래스의 것이 적합하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 γ1, γ2, γ3, γ4와 같은 서브 클래스의 어떠한 것도 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 사용할 수 있다.
인간 항체는, 원래, 인간 체내에 천연적으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지(phage) 라이브러리 및 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 체내에 존재하는 항체는, 예컨대, 인간 말초혈 림프구를 단리하여, EB 바이러스 등을 감염시켜서 불멸화, 클로닝함으로써, 상기 항체를 생성하는 림프구를 배양할 수 있으며, 배양물 중으로부터 상기 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 상기 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 해서 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은, 또한 유전자 공학적 수법에 의해, 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생성 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포 내에 편입된 동물을 말한다. 구체적으로는, 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 상기 ES 세포를 다른 마우스의 초기 배(胚)에 이식한 후, 발생시킴으로써 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다. 인간 항체 생성 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법은 통상의 인간 이외의 포유동물에서 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법에 의해 인간 항체 생성 하이브리도마를 얻고, 배양함으로써 배양물 중에 인간 항체를 생성 축적시킬 수 있다.
표적 분자와의 결합 활성을 갖는 항체 단편으로서는, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Diabody, dsFv, CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단된다), H쇄의 N말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디 설파이드 결합(S-S 결합)으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
F(ab')2는, IgG를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단된다), Fab가 힌지 영역의 S-S 결합을 통하여 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Fab'는, 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 S-S 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
scFv는, 1개의 VH와 1개의 VL을 12잔기 이상의 적당한 펩티드 링커(P)를 사용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드이며, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
Diabody는, 항원 결합 특이성이 동일 또는 다른 scFv가 2량체를 형성한 항체 단편이며, 동일한 항원에 대한 2가의 항원 결합 활성 또는 다른 항원에 대한 2특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.
dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기 간의 S-S 결합을 통하여 결합시킨 것을 말한다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통하여 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 구체적으로는, 치환된 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 이하의 1∼10 중 어느 하나의 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인, 유전자 재조합 항체 조성물을 들 수 있다.
1. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 340번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
2. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 356번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
3. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 358번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
4. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 384번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
5. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 392번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
6. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 397번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
7. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 422번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
8. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 434번째와 436번째로부터 447번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
9. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 435번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
10. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 447번째의 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 CL 영역의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 아미노산 서열 또는 비인간 동물 유래 아미노산 서열의 어떠한 것이라도 좋으나, 인간 항체의 아미노산 서열의 Cκ 또는 Cλ가 바람직하다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에 있어서의 가변 영역으로서는, VH 및 VL이, 인간 항체의 아미노산 서열, 비인간 동물 항체의 아미노산 서열, 또는 이들의 아미노산 서열의 혼합 아미노산 서열의 어떠한 것이라도 좋다. 구체적으로는, 하이브리도마가 생성하는 항체를 구성하는 가변 영역, 인간화 항체를 구성하는 가변 영역, 인간 항체를 구성하는 가변 영역 등을 들 수 있다.
하이브리도마란, 인간 이외의 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포와, 마우스 등으로부터 유래하는 골수종(myeloma) 세포를 세포 융합시켜서 얻어지는, 원하는 항원 특이성을 가진 모노클로날 항체를 생성하는 세포를 말한다. 따라서, 하이브리도마가 생성하는 항체를 구성하는 가변 영역은, 비인간 동물 항체의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 어떠한 특이성을 갖는 항체도 포함하지만, 종양 관련 항원을 인식하는 항체, 알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 자기 면역 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체, 또는 바이러스 또는 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체인 것이 바람직하다.
종양 관련 항원을 인식하는 항체로서는, 항 GD 2항체[안티·캔서·리서치(Anti cancer Res.), 13, 331(1993)], 항 GD3 항체[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 260(1993)], 항 GM2 항체[캔서·리서치(Cancer Res.), 54, 1511(1994)], 항 HER2 항체[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285(1992)], 항 CD52 항체[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285(1992)], 항 MAGE 항체[브리티시·저널·오브·캔서(British J. Cancer), 83, 493(2000)], 항 HM1.24 항체[몰레큘러·이뮤놀로지(Molecular Immunol.), 36, 387(1999)], 항 부갑상선 호르몬 관련 단백(PTHrP) 항체[캔서(Cancer), 88, 2909(2000)], 항 염기성 섬유아세포 증식 인자 항체, 항 선유아세포 증식 인자 8항체[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 86, 9911(1989)], 항 염기성 섬유아세포 증식 인자 수용체 항체, 항 섬유아세포 증식 인자 8수용체 항체[저널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 265, 16455(1990)], 항 인슐린 유사(insulin-like) 증식 인자 항체[저널·오브·뉴로사이언스·리서치(J. Neurosci. Res.), 40, 647(1995)], 항 인슐린 유사 증식 인자 수용체 항체[저널·오브·뉴로사이언스·리서치(J. Neurosci. Res.), 40, 647(1995)], 항 PSMA 항체[저널·오브·유롤로지(J. Urology), 160, 2396(1998)], 항 혈관 내피세포 증식 인자 항체[캔서·리서치(Cancer Res.), 57, 4593(1997)], 항 혈관 내피세포 증식 인자 수용체 항체[온코진(Oncogene), 19, 2138(2000)], 항 CD20 항체[커런트·오피니언·인·온콜로지(Curr. Opin. Oncol.), 10, 548(1998)], 항 Her2 항체, 항 CD10 항체 등을 들 수 있다.
알레르기 또는 염증에 관련되는 항원을 인식하는 항체로서는, 항 인터류킨6 항체[이뮤놀로지컬·리뷰즈(Immunol. Rev.), 127, 5(1992)], 항 인터류킨6 수용체 항체[몰레큘러·이뮤놀로지(Molecular Immunol.), 31, 371(1994)], 항 인터류킨5 항체[이뮤놀로지컬·리뷰즈(Immunol. Rev.), 127, 5(1992)], 항 인터류킨5 수용체 항체, 항 인터류킨4 항체[사이토카인(Cytokine), 3, 562(1991)], 항 인터류킨4 수용체 항체[저널·오브·이뮤놀로지컬·메소즈(J. Immunol. Methods), 217, 41(1998)], 항종양 괴사 인자 항체[하이브리도마(Hybridoma), 13, 183(1994)], 항종양 괴사 인자 수용체 항체[몰레큘러·퍼머콜로지(Molecular Pharmacol.), 58, 237(2000)], 항 CCR4 항체[네이처(Nature), 400, 776(1999)], 항 케모카인 항체(Peri et al., J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994) 또는 항 케모카인 수용체 항체[저널·오브·이뮤놀로지컬·메소즈(J. Exp. Med.), 186, 1373(1997)]이며, 순환기 질환에 관련되는 항원을 인식하는 항체가 항 GPIIb/IIIa 항체[저널·오브·이뮤놀로지(J. Immunol.), 152, 2968(1994)], 항혈소판 유래 증식 인자 항체[사이언스(Science), 253, 1129(1991)], 항혈소판 유래 증식 인자 수용체 항체[저널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 272, 17400(1997)], 항혈액 응고 인자 항체[서큘레이션(Circulation), 101, 1158(2000)] 등을 들 수 있다.
바이러스 또는 세균 감염에 관련되는 항원을 인식하는 항체로서는, 항 gp120 항체[스트럭처(Structure), 8, 385(2000)], 항 CD4 항체[저널·오브·류마톨로 지(J. Rheumatology), 25, 2065(1998)], 항 CCR5 항체, 항 베로독소(verotoxin) 항체[저널·오브·클리니컬·마이크로바이올로지(J. Clin. Microbiol.), 37, 396(1999)] 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 동일한 EU 인덱스에 상당하는 폴리펩티드로 치환됨으로써, 인간 IgG1 항체 및 IgG3 항체보다도 높은 CDC 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환되어, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체 의존성 세포 상해 활성을 나타내고, 또한 프로테인 A에 인간 IgG1 항체와 동등한 결합 활성을 갖는 유전자 재조합 항체 조성물이 포함된다.
구체적으로는, 치환된 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 이하의 1∼8 중 어느 하나의 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드인, 유전자 재조합 항체 조성물을 들 수 있다.
1. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 340번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
2. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 356번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
3. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 358번째의 아미노산 서 열로 이루어지는 폴리펩티드
4. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 384번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
5. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 392번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
6. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 397번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
7. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 422번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
8. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 434번째 및 436번째로부터 447번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
프로테인 A 결합 활성은, ELISA법, 표면 플라즈몬 공명법 등을 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 플레이트에 고상화(固相化)된 프로테인 A에, 항체 조성물을 반응시킨 후, 각종 표식을 행한 그 항체를 인식하는 항체를 또한 반응시켜서, 프로테인 A에 결합된 항체 조성물을 정량함으로써 측정할 수 있다.
또는 세파로오스 등의 담체에 결합시킨 프로테인 A에, pH5∼pH8 전후의 고 pH 조건에서 항체 조성물을 반응시키고, 세정 후, 또한 pH2∼pH5 전후의 저 pH 조건에서 용출하는 항체 조성물을 정량함으로써 측정할 수 있다.
항체 분자에는 Fc 영역이 있으며, 이들 영역에는 N-글리코시드 결합 당쇄가 결합한다. 따라서, 항체 1분자당 2개의 당쇄가 결합하고 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄로서는, 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토오스-N-아세틸글루코사민(이하, Gal-GlcNAc라고 표기한다)의 측쇄를 병행하여 1 내지는 복수 개 가지며, 또한 Gal-GlcNAc의 비환원 말단측에 시알산(sialic acid), 바이섹팅(bisecting)의 N-아세틸글루코사민 등을 갖는 콤플렉스형(복합형) 당쇄를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄는, 하기 화학식으로 나타난다.
Figure 112008011757474-pct00001
본 발명의 유전자 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물은, 상기의 당쇄 구조를 갖고 있으면, 단일의 당쇄 구조를 갖는 항체 분자로 구성되어 있어도 좋고, 복수의 다른 당쇄 구조를 갖는 항체 분자로 구성되어 있어도 좋다. 즉, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물이란, 단일 또는 복수의 다른 당쇄 구조를 갖는 유전자 재조합 항체 분자로 이루어지는 조성물을 의미한다.
또한, 본 발명의 유전자 재조합 항체 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물이며, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체(全) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물은, CDC 활성 외에 높은 ADCC 활성을 갖는다.
본 발명에 있어서, 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄로서는, 상기에서 나타난 화학식 중, 환원 말단측의 N-아세틸글루코사민에는 푸코스가 결합되어 있지 않으면, 비환원 말단의 당쇄의 구조는 어떠한 것이라도 좋다.
본 발명에 있어서, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않다는 것은, 실질적으로 푸코스가 결합되어 있지 않은 것을 말한다. 실질적으로 푸코스가 결합되어 있지 않은 항체 조성물이란, 구체적으로는, 후술하는 4에 기재된 당쇄 분석에 있어서, 푸코스를 실질적으로 검출할 수 없을 정도의 항체 조성물인 경우를 말한다. 실질적으로 검출할 수 없을 정도란, 측정의 검출 한계 이하인 것을 말한다. 모든 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 유전자 재조합 항체 조성물은, 가장 높은 ADCC 활성을 갖는다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물 중에 포함되는, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄를 갖는 항체 분자의 비율은, 항체 분자로부터 히드라진 분해나 효소 소화 등의 공지의 방법[생물 화학 실험법 23-당단백질 당쇄 연구법(학회 출판 센터) 다카하시 레이코 편찬(1989)]을 사용하여, 당쇄를 유리시키고, 유리시킨 당쇄를 형광 표식 또는 동위 원소 표식하며, 표식한 당쇄를 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다. 또한, 유리시킨 당쇄를 HPAED-PAD법[저널·오브·리퀴 드·크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해 분석함으로써 결정할 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 형질 전환주는, 항체 분자의 가변 영역 및 정상 영역을 코딩하는 DNA를 삽입한 동물 세포 발현 벡터를 동물 세포에 도입함으로써, 취득할 수 있다.
동물 세포 발현 벡터는, 이하와 같이 구축한다.
상술한 CH 및 CL을 코딩하는 DNA를 각각 동물 세포에서의 발현 벡터에 삽입함으로써, 동물 세포용 발현 벡터를 제작한다.
동물 세포용 발현 벡터로서는, pAGE107(일본 특허 공개 평성 제3-22979; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140(1990)), pAGE103(Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310(1987)), pHSG274(Brady G. et al., Gene, 27, 223-232(1984)), pKCR(O'Hare K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 1527-1531(1981)), pSG1βd2-4(Miyaji H. et al., Cytotechnology, 4, 173-180(1990)) 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서(enhancer)로서는, SV40의 초기 프로모터와 인핸서(Mizukami T. and Itoh S., J. Biochem., 101, 1307-1310(1987)), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터와 인핸서(Kuwana Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960-968(1987)), 및 면역글로불린 H쇄의 프로모터(Mason J. O. et al., Cell, 41, 479-487(1985))와 인핸서(Gillies S. D. et al., Cell, 33, 717-728(1983)) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, H쇄 및 L쇄가 각각의 벡터상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터상에 존재하는 타입(탠덤형) 중 어떠한 것이라도 사용할 수 있으나, 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터의 구축하기 용이함, 동물 세포로의 도입하기 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 균형이 잡히는 등의 점에서 탠덤형의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터 쪽이 바람직하다(Shitara K. et al., J. Immunol. Methods, 167, 271-278(1994)). 탠덤형의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터로서는, pKANTEX93(WO97/10354), pEE18(Bentley K. J. et al., Hybridoma, 17, 559-567(1998)) 등을 들 수 있다.
구축된 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 CH 및 CL을 코딩하는 DNA의 상류에, 각종 항원에 대한 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 클로닝함으로써, 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터를 구축할 수 있다. 숙주 세포로의 발현 벡터의 도입법으로서는, 전기 천공법(일본 특허 공개 평성 제2-257891; Miyaji H. et al., Cytotechnology, 3, 133-140(1990)) 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 숙주 세포로서는, 동물 세포, 식물 세포, 미생물 등, 재조합 단백질 생산에 일반적으로 사용되는 숙주 세포이면 어떠한 것도 포함된다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 숙주 세포로서는, 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포, 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, 마우스 골수종 세포주 NS0 세포, 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포, 인간 백혈병 세포주 나말와 세포, 골수종 세포와 임의의 B 세포를 사용하여 제조된 하이브리도마 세포, 배아 줄기 세포 또는 수정란 세포를 사용함으로써 제조된 인간 이외의 트랜스제닉 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포와 임의의 골수종 세포를 사용해서 제조된 하이브리도마 세포, 상기 골수종 세포와 배아 줄기 세포 또는 수정란 세포를 사용함으로써 제조된 인간 이외의 트랜스제닉 동물에게 항원을 면역하여 취득된 B 세포를 사용해서 제조된 하이브리도마 세포 등을 들 수 있다.
CDC 활성뿐만 아니라, ADCC 활성이 높은 유전자 재조합 항체 조성물을 발현시키는 숙주 세포로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성을 갖는 숙주 세포, 예컨대, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물이며, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 능력을 갖는 숙주 세포, 예컨대, 이하에 드는 적어도 하나의 단백질의 활성이 저하 또는 비활성화된 세포 등을 들 수 있다.
(a) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 단백질;
(b) N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 단백질;
(c) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질.
상기 숙주 세포로서는, 바람직하게는 숙주 세포 내의 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자가 녹아웃된 숙주 세포를 들 수 있다(WO02/31140, WO0 3/85107).
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 단백질로서는, 세포 내에서 당쇄에의 푸코스의 공급원인 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관계되는 효소로서는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 영향을 주는 효소 등을 들 수 있다.
세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스는, de novo의 합성 경로 또는 Salvage 합성 경로에 의해 공급되고 있다. 따라서, 이들 합성 경로에 관여하는 효소는 모두 세포 내 GDP-푸코스의 합성에 관계되는 효소에 포함된다.
세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 de novo의 합성 경로에 관여하는 효소로서는, GDP-mannose 4,6-dehydratase(GDP-만노스 4,6-디히드라타아제; 이하, GMD라고 표기한다), GDP-keto-6-deoxymannose 3,5-epimerase, 4,6-reductase(GDP-케토-데옥시만노스 3,5-에피머라아제, 4,6-리덕타아제; 이하, Fx라고 표기한다) 등을 들 수 있다.
세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 Salvage 합성 경로에 관여하는 효소로서는, GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase(GDP-베타-L-푸코스-피로포스포릴라아제; 이하, GFPP라고 표기한다), Fucokinase(푸코키나아제) 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 영향을 주는 효소로서는, 상술 한 세포 내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성 경로에 관여하는 효소의 활성에 영향을 주거나, 상기 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.
GDP-만노스 4,6-디히드라타아제로서는,
(a) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA;
등을 들 수 있다.
GDP-만노스 4,6-디히드라타아제로서는,
(a) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실(缺失), 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노스 4,6-디히드라타아제 활성을 갖는 단백질;
등을 들 수 있다.
GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제로서는,
(a) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA;
등을 들 수 있다.
GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제로서는,
(a) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질;
등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 단백질로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 관여하는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 관여하는 효소로서는, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 영향을 주 는 효소이면 어떠한 효소도 포함된다. 구체적으로는, α-1,6-푸코실트랜스퍼라아제나 α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
또한, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 영향을 주는 효소로서는, 상술한 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 반응에 관여하는 효소의 활성에 영향을 주거나, 상기 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 주는 효소도 포함된다.
본 발명에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제로서는, 하기 (a), (b), (c) 또는 (d)의 DNA가 코딩하는 단백질,
(a) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(c) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA
(d) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA
또는,
(e) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(f) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(g) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
(h) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
(i) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
(j) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질
등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질로서는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질, 또는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스를 골지체 내로 수송하는 반응에 영향을 주는 단백질이면 어떠한 단백질도 포함된다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질로서는, 구체적으로는, GDP-푸코스트랜스포터 등을 들 수 있다.
또한, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스를 골지체 내로 수송하는 반응에 영향을 주는 단백질로서는, 상술한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체로의 수송에 관여하는 단백질의 활성에 영향을 주거나, 발현에 영향을 주는 단백질도 포함된다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로서는, 서열 번호 18 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 18 또는 20으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.
α1,6-푸코실트랜스퍼라아제의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로서는, 서열 번호 22 또는 23으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 22 또는 23으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등을 들 수 있다.
상술한 효소 활성이 저하 또는 결실된 세포를 취득하는 방법으로서는, 목적으로 하는 효소 활성을 저하 또는 결실시킬 수 있는 수법이면, 어떠한 수법이라도 사용할 수 있다. 구체적으로는,
(a) 효소의 유전자를 표적한 유전자 파괴의 수법;
(b) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법;
(c) 효소에 대한 돌연변이를 도입하는 수법;
(d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법;
(e) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴으로서는, 상기 당쇄 구조를 인식할 수 있는 렉틴이면, 어떠한 렉틴이라도 사용할 수 있다. 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA(Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL(Aleuria aurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.
렉틴에 내성인 세포란, 렉틴을 유효한 농도로 부여했을 때에도, 생육이 저해되지 않는 세포를 말한다. 유효 농도란, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포(이하, 친주(親株) 세포라고도 칭한다)가 정상적으로 생육할 수 없는 농도 이상이며, 바람직하게는, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포가 성육(成育)할 수 없는 농도와 동일한 농도, 보다 바람직하게는 2배∼5배, 더욱 바람직하게는 10배, 가장 바람직하게는 20배 이상이다.
생육이 저해되지 않는 렉틴의 유효 농도는, 세포주에 따라서 적절히 정하면 되고, 통상의 렉틴의 유효 농도는 10 ㎍/mL∼10 ㎎/mL, 바람직하게는 0.5 ㎎/mL∼2.0 ㎎/mL이다.
이하에, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법을 구체적으로 설명한다.
1. 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트· 프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 안티바디즈라고 약칭한다), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993(이하, 모노클로날 안티바디즈라고 약칭한다), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996(이하, 안티보디 엔지니어링이라고 약칭한다) 등에 기재된 방법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 숙주 세포 중에서 발현시켜서 취득할 수 있다.
(1) 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 구축
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터란, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 및 L쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자가 편입된 동물 세포용 발현 벡터이다. 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, 동물 세포용 발현 벡터에 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 H쇄 및 L쇄 정상 영역을 코딩하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 CH 영역을 코딩하는 유전자는, IgG1 및 IgG3 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자를 클로닝한 후, 각 도메인을 코딩하는 유전자 단편을 연결시킴으로써, 제작할 수 있다. 또한, 합성 DNA를 사용하여 전 DNA를 합성할 수도 있고, PCR법에 의한 합성도 가능하다(몰레큘러·클로닝 제2판). 또한, 이들 수법을 복수 조합함으로써, 제작할 수도 있다.
동물 세포용 발현 벡터로서는, 상술한 항체 분자의 정상 영역을 코딩하는 유 전자를 편입시켜서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예컨대, pKANTEX93[몰레큘러·이뮤놀로지(Mol. Immunol.), 37, 1035(2000)], pAGE107[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], pAGE103[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 101, 1307(1987)], pHSG274[진(Gene), 27, 223(1984)], pKCR[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527(1981)], pSG1βd2-4[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 4, 173(1990)] 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 인핸서로서는, SV40의 초기 프로모터와 인핸서[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR[바이오케미컬·앤드·바이오피지컬·리서치·커뮤니케이션즈(Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960(1987)], 면역글로불린 H쇄의 프로모터[셀(Cell), 41, 479(1985)]와 인핸서[셀(Cell), 33, 717(1983)] 등을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, 항체 H쇄 및 L쇄가 각각의 벡터상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터상에 존재하는 타입(이하, 탠덤형이라고 표기한다)의 어느 것이라도 사용할 수 있으나, 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포로의 도입의 용이함, 동물 세포 내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 균형이 잡히는 등의 점에서 탠덤형의 항체 발현용 벡터 쪽이 바람직하다[저널·오브·이뮤놀로지컬·메소즈(J. Immunol. Methods), 167, 271(1994)].
구축한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터는, 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 동물 세포에서의 발현에 사용할 수 있다.
(2) 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 취득
인간 이외의 동물의 항체, 예컨대, 마우스 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA는 이하와 같이 해서 취득할 수 있다.
임의의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로서 사용하여, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 상기 라이브러리로부터, 기존의 마우스 항체의 C 영역 또는 V 영역을 코딩하는 DNA를 프로브로서 사용하여, H쇄 V 영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 및 L쇄 V영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드상의 목적의 마우스 항체의 VH 및 VL의 전 염기 서열을 결정하고, 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전 아미노산 서열을 추정한다.
임의의 인간 이외의 동물의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 항체가 결합하는 항원을 인간 이외의 동물에게 면역하고, 주지의 방법[몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(이하, 안티바디즈라고 약칭한다), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993(이하, 모노클로날 안티바디즈라고 약칭한다), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996(이하, 안티보디 엔지니어링이라고 약칭한다)]에 따라서, 면역된 동물의 항체 생성 세포와 골수종 세포로 하이브리도마를 제작하며, 이어서 단일 세포화한 하이브리도마를 선택하고, 이것을 배양하며, 배양 상청액으로부터 정제하여, 취득할 수 있다.
인간 이외의 동물로서는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전 RNA를 조제하는 방법으로서는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[메소즈·인·엔자이몰로지(Methods in Enzymol.), 154, 3(1987)], 또한 전 RNA로부터 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스칼럼법[몰레큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제하는 키트로서는, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 통상적인 방법[몰레큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지(Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34], 또는 시판의 키트, 예컨대, Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL사 제조)이나 ZAP-cDNA Synthesis Kit(Stratagene사 제조)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리의 제작시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 해서 합성한 cDNA를 편입시키는 벡터는, 상기 cDNA를 편입시킬 수 있는 벡터이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예컨대, ZAP Express[스트래티지즈(Strategies), 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[뉴클레익·애시즈·리서치(Nucleic Acids Research), 17, 9494(1989)], λZAP II(Stratagene사 제조), λgt10, λgt11[디엔에이·클로닝: 어·프랙티컬·어프로치(DNA Cloning: A Practical Approach), 1, 49(1985)], Lambda BlueMid(Clontech사 제조), λExCell, pT7T 318U(Pharmacia사 제조), pcD2[몰레큘러·앤드·셀룰러·바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등을 사용할 수 있다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로서는 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예컨대, XL1-Blue MRF'[스트래티지즈(Strategies), 5, 81(1992)], C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], Y1088, Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], NM522[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], K802[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 JM105[진(Gene), 38, 275(1985)] 등이 사용된다.
cDNA 라이브러리로부터의 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA 클론을 선택하는 방법으로서는, 동위 원소(isotope) 또는 형광 등으로 표식한 프로브를 사용한 콜로니·하이브리다이제이션법 또는 플라크ㆍ하이브리드화법[몰레 큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989]에 의해 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 조제하고, cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, PCR[몰레큘러·클로닝: 어·래버러토리·매뉴얼(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지(Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34]에 의해 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 상기 cDNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전 아미노산 서열을 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL을 완전히 포함하고 있는 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다.
또한, 항체 가변 영역의 아미노산 서열 또는 상기 가변 영역을 코딩하는 DNA의 염기 서열이 이미 공지인 경우에는, 이하의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
아미노산 서열이 공지인 경우에는, 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려하여 상기 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 설계하고, 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA를 합성하며, 이들을 사용하여 PCR법을 행함으로써 DNA를 얻을 수 있다. 염기 서열이 공지인 경우에는, 그 정보를 기초로 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR법을 행함으로써 DNA를 얻을 수 있다.
(3) 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 해석
분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 또한 항체가 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 동일한 방법으로 찾아낼 수 있다.
(4) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터 의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 삽입하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를, 인간 이외의 동물의 항체 VH 및 VL의 3'말단측의 염기 서열과 인간 항체의 CH 및 CL의 5'말단측의 염기 서열로 이루어지며, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA와 각각 연결하고, 각각을 본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 삽입하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(5) 인간화 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA는, 이하와 같이 해서 구축할 수 있다. 우선, 목적으로 하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR을 이식하는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열로서는, 인간 항체의 것이면, 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예컨대, Protein Data Bank 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 서열[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 등을 들 수 있으나, 그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간화 항체를 제작하기 위해서는, 목적으로 하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
다음으로, 선택한 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열에 목적으로 하는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보여지는 코돈의 사용 빈도[시퀀시즈·오브·프로테인즈·오브·이뮤놀로지컬·인터레스트(Sequences of Proteins of Immunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991]를 고려해서 DNA 서열로 변환하여, 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 설계한다. 설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 수 개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR법을 행한다. 이 경우, PCR에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, H쇄, L쇄 모두 4개∼6개의 합성 DNA를 설계하는 것이 바람직하다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5'말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 1의 (1)에서 구축한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 본 항 1의 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 원하는 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(6) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 인간 이외의 동물의 항체에 비해서 저하되어 버리는 것이 알려져 있다[바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 9, 266(1991)]. 이 원인으로서는, 원래의 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL에서는, CDR뿐만 아니라, FR의 몇 갠가의 아미노산 잔기가 직접적 또는 간접적으로 항원 결합 활성에 관여하고 있으며, 이들 아미노산 잔기가 CDR의 이식에 따라, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 다른 아미노산 잔기로 변화해 버리는 것이 생각되고 있다. 이 문제를 해결하기 위해서, 인간화 항체에서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기나 CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하거나, 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 동정(同定)해서, 이들을 원래의 인간 이외의 동물의 항체로부터 유래하는 아미노산 잔기로 개변하여, 저하된 항원 결합 활성을 상승시키는 일이 행해지고 있다[바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 9, 266(1991)].
인간화 항체의 제작에 있어서는, 이들 항원 결합 활성에 관계되는 FR의 아미노산 잔기를 어떻게 효율적으로 동정할지가, 가장 중요한 점이며, 그 때문에 X선 결정 해석[저널·오브·몰레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 112, 535(1977)] 또는 컴퓨터 모델링[프로테인·엔지니어링(Protein Engineering), 7, 1501(1994)] 등에 의한 항체의 입체 구조의 구축 및 해석이 행해지고 있다. 이들 항체의 입체 구조의 정보는, 인간화 항체의 제작에 많은 유익한 정보를 가져왔다. 그러나, 모든 항체에 적응 가능한 인간화 항체의 제작법은 아직 확립되어 있지 않다. 현재 상황으로는 각각의 항체에 대해서 여러 종류의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 등의 여러 가지 시행 착오가 필요하다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기의 개변은, 개변용 합성 DNA를 사용하여 본 항 1의 (5)에 기재된 PCR법을 행함으로써, 달성할 수 있다. PCR 후의 증폭 산물에 대해서 본 항 1의 (2)에 기재된 방법에 의해, 염기 서열을 결정하여, 목적으로 하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(7) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에, 본 항 1의 (5) 및 (6)에서 구축한 인간화 항체의 VH 및 VL을 코딩하는 cDNA를 삽입하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예컨대, 본 항 1의 (5) 및 (6)에서 인간화 항체의 VH 및 VL을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5'말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 1의 (1)에 기재된 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 및 CL을 코딩하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 삽입하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(8) 인간화 항체의 안정적 생산
본 항 1의 (4) 및 (7)에 기재된 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 동물 세포에 도입함으로써 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
동물 세포로의 인간화 항체 발현 벡터의 도입법으로서는, 전기 천공법[일본 특허 공개 평성 제2-257891; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)] 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 동물 세포로서는, 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 생산시킬 수 있는 동물 세포이면, 어떠한 세포라도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 마우스 골수종 세포인 NS0 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO/dhfr-세포, CHO/DG44 세포, 래트 골수종 세포 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리안 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 인간 골수종 세포인 나말와 세포 등을 들 수 있으나, 바람직하게는, 차이니즈 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포, 래트 골수종 YB2/0 세포 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터의 도입 후, 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환주는, 일본 특허 공개 평성 제2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, G418 황산염(이하, G418이라고 표기한다; SIGMA사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 의해 선택할 수 있다. 동물 세포 배양용 배지로서는, RPMI 1640 배지(닛스이 세이야쿠사 제조), GIT 배지(니혼 세이야쿠사 제조), EX-CELL 302 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(GIBCO BRL사 제조), Hybridoma-SFM 배지(GIBCO BRL사 제조), 또는 이들 배지에 소 태아 혈청(이하, FCS라고 표기한다) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용 할 수 있다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청액 중에 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체를 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상청액 중의 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 생산량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[이하, ELISA법이라고 표기한다; 안티바디즈: 어·래버러토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998, 모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질 전환주는, 일본 특허 공개 평성 제2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 생산량을 상승시킬 수 있다.
인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체는, 형질 전환주의 배양 상청액으로부터 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다[안티바디즈: 어·래버러토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988, 모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996]. 또한, 그 외에 통상, 단백질의 정제에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합해서 행하여 정제할 수 있다. 정제한 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, SDS 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동[이하, SDS-PAGE라고 표기한다; 네이처(Nature), 227, 680(1970)]이나 웨스턴 블로팅법[안티바디즈: 어·래버 러토리·매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988, 모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등으로 측정할 수 있다.
이상, 동물 세포를 숙주로 한 항체 조성물의 제조 방법을 나타내었으나, 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 개체 혹은 식물 개체에 있어서도 동물 세포와 동일한 방법에 의해 항체 조성물을 제조할 수 있다.
따라서, 숙주 세포가 항체 분자를 발현하는 능력을 갖는 경우에는, 이하에 나타내는 항체 분자를 발현시키는 숙주 세포에 항체 유전자를 도입한 후에, 상기 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 목적으로 하는 항체 조성물을 정제함으로써, 본 발명의 항체 조성물을 제조할 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, YEP13(ATCC 37115), YEp24(ATCC 37051), YCp50(ATCC 37419) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 효모 균주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것을 사용해도 좋고, 예컨대, 헥소스키나아제 등의 해당계(解糖系)의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 열 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 트리코스포론속, 슈와니오마이세스속 등에 속하는 미생물, 예컨대, Saccharomycescerevisiae, Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyceslactis, Trichosporonpullulans, Schwanniomycesalluvius 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예컨대, 전기 천공법[메소즈·인·엔자이몰로지(Methods·Enzymol.), 194, 182(1990)], 스페로플라스트법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929(1978)], 아세트산리튬법[저널·오브·박테리올로지(J. Bacteriology), 153, 163(1983), 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929(1978)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대 pcDNAI, pcDM8(후나코시사에서 시판), pAGE107[일본 특허 공개 평성 제3-22979; 사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], pAS3-3[일본 특허 공개 평성 제2-227075], pCDM8[네이처(Nature), 329, 84O(1987)], pcDNAI/Amp(Invitrogen사), pREP4(Invitrogen사), pAGE103[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochemistry), 101, 1307(1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로서는 동물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV4O의 초기 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 좋다.
숙주 세포로서는, 인간의 세포인 나말와(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈·햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637[일본 특허 공개 소화 제63-299), 래트 골수종 세포, 마우스 골수종 세포, 시리안 햄스터 신장 유래 세포, 배아 줄기 세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예컨대, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992), 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 6, 47(1988) 등에 기재된 방법에 의해, 단백질을 발현할 수 있다.
즉, 발현 벡터 및 바큘로 바이러스를 곤충 세포에 공도입(共導入)하여 곤충 세포 배양 상청액 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 또한 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜서, 단백질을 발현시킬 수 있다.
상기 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예컨대, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 invitorogen사) 등을 들 수 있다.
바큘로 바이러스로서는, 예컨대, 밤도둑나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그라파ㆍ캘리포니카ㆍ뉴클레어ㆍ폴리헤드로시스ㆍ바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충 세포로서는, Spodopterafrugiperda의 난소 세포인 Sf9, Sf21[커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)], Trichoplusiani의 난소 세포인 High 5(Invitrogen사) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포로의 상기 발현 도입 벡터와 상기 바큘로 바이러스의 공도입 방법으로서는, 예컨대 인산칼슘법[일본 특허 공개 평성 제2-227075], 리보펙션법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)] 등을 들 수 있다.
식물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대 Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 식물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것을 사용해도 좋고, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 식물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예컨대, 아그로박테리움(Agrobacterium)[일본 특허 공개 소화 제59-140885, 일본 특허 공개 소화 제60-70080, WO94/00977], 전기 천공법[일본 특허 공개 소화 제60-251887], 파티클 건(유전자 총)을 사용하는 방법[일본 특허 제2606856, 일본 특허 제2517813] 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예컨대 전기 천공법[사이토테크놀로지(Cytotechnology), 3, 133(1990)], 인산칼슘법[일본 특허 공개 평성 제2-227075], 리보펙션법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언 스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413(1987)], 인젝션법[매니퓰레이팅·더·마우스·엠브리오·어·래버러토리·매뉴얼], 파티클 건(유전자 총)을 사용하는 방법[일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813호], DEAE-덱스트란법[바이오 매뉴얼 시리즈 4-유전자 도입과 발현·해석법(요도사) 요코다 다카시·아라이 겐이치 편찬(1994)], 바이러스 벡터법[매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판] 등을 들 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, Fc 영역과 다른 단백질과의 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
이상과 같이 해서 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 분자를 생성 축적시키며, 상기 배양물로부터 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 형질 전환체를 배양하는 방법은, 숙주 세포의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
효모 등의 진핵 생물을 숙주로 해서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 상기 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지의 어느 것을 사용해도 좋다.
탄소원으로서는, 상기 생물이 자화할 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수 분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등 을 사용할 수 있다.
질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소 함유 화합물, 및, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 옥수수 침지액, 카세인 가수 분해물, 대두박 및 대두박 가수 분해물, 각종 발효 균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기 염류로서는, 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양 온도는 15℃∼40℃가 좋고, 배양 시간은 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중의 pH는 3.0∼9.0으로 유지한다. pH의 조제는, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라시클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서(inducer)를 배지에 첨가해도 좋다. 예컨대, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 좋다.
동물 세포를 숙주로 해서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지[더·저널·오브·더·아메리칸·메디컬·어 소시에이션(The Journal of the American Medical Association), 199, 519(1967)], Eagle의 MEM 배지[사이언스(Science), 122, 501(1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[바이롤로지(Virology), 8, 396(1959)], 199 배지[프로시딩·오브·더·소사이어티·포·더·바이올로지컬·메디슨(Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1(1950)], Whitten 배지[발생 공학 실험 매뉴얼-트랜스제닉·마우스의 제작 방법(고단사) 가츠키 모토야 편찬(1987)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH6.0∼pH8.0, 30℃∼40℃, 5% CO2 존재하 등의 조건하에서 1일∼7일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
곤충 세포를 숙주로 해서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(Pharmingen사), Sf-900 II SFM 배지(Life Technologies사), ExCell 400, ExCell 405(모두 JRH Biosciences사), Grace's Insect Medium[네이처(Nature), 195, 788(1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH6.0∼pH7.0, 25℃∼30℃ 등의 조건하에서 1일∼5일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
식물 세포를 숙주로 해서 얻어진 형질 전환체는 세포로서, 또는 식물의 세포 나 기관에 분화시켜서 배양할 수 있다. 상기 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게·앤드·스쿠그(MS) 배지, 화이트(White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 시토키닌(cytokinin) 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH5.0∼pH9.0, 20℃∼40℃의 조건하에서 3일∼60일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 좋다.
상기와 같이, 항체 분자를 코딩하는 DNA를 편입시킨 발현 벡터를 보유하는 동물 세포, 또는 식물 세포 유래의 형질 전환체를, 통상의 배양 방법에 따라 배양하여, 항체 조성물을 생성 축적시키고, 상기 배양물로부터 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 몰레큘러·클로닝 제2판에 기재되어 있는 방법에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
항체 조성물의 생산 방법으로서는, 숙주 세포 내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖으로 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막상에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포나, 생산시키는 항체 분자의 구조를 변경함으로써, 상기 방법을 선택할 수 있다.
항체 조성물이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법[저널·오브·바이올로지컬·케미스트리(J. Biol. Chem.), 264, 17619(1989)], 로우 등의 방법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227(1989); 진·디벨롭먼트(Genes Develop.), 4, 1288(1990)] 또는 일본 특허 공개 평성 제05-336963, WO94/23021 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 상기 항체 조성물을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여, 발현 벡터에, 항체 분자를 코딩하는 DNA, 및 항체 분자의 발현에 적절한 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA를 삽입하고, 상기 발현 벡터를 숙주 세포로 도입한 후에 항체 분자를 발현시킴으로써, 목적으로 하는 항체 분자를 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 특허 공개 평성 제2-227075에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체(트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체(트랜스제닉 식물)를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조할 수도 있다.
형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우는, 통상적인 방법에 따라서, 사육 또는 재배하여, 항체 조성물을 생성 축적시키고, 상기 동물 개체 또는 식물 개체로부터 상기 항체 조성물을 채취함으로써, 상기 항체 조성물을 제조할 수 있다.
동물 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 공지의 방법[아메리칸·저널·오브·클리니컬·뉴트리션(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 639S(1996); 아메리칸·저널·오브·클리니컬·뉴트리션(American Journal of Clinical Nutrition), 63, 627S(1996); 바이오/테크놀로지(Bio/Technology), 9, 830(1991)]에 준하여 유전자를 도입해서 조성한 동물 중에 목적으로 하는 항체 조성물을 생산시키는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우는, 예컨대, 항체 분자를 코딩하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하여, 항체 조성물을 상기 동물 중에 생성·축적시키고, 상기 동물 중에서 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 제조할 수 있다. 상기 동물 중의 생성·축적 장소로서는, 예컨대 상기 동물의 젖(일본 특허 공개 소화 제63-309192), 또는 알 등을 들 수 있다. 이때에 사용되는 프로모터로서는, 동물에 서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 예컨대, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카세인 프로모터, β 카세인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터, 유장(whey) 산성 프로테인 프로모터 등이 적합하게 사용된다.
식물 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로서는, 예컨대 항체 분자를 코딩하는 DNA를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지의 방법[조직 배양, 20(1994); 조직 배양, 21(1995); 트렌드·인·바이오테크놀로지(Trends in Biotechnology), 15, 45(1997)]에 준하여 재배하고, 항체 조성물을 상기 식물 중에 생성·축적시켜서, 상기 식물 중에서 상기 항체 조성물을 채취함으로써, 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
항체 분자를 코딩하는 유전자를 도입한 형질 전환체에 의해 제조된 항체 조 성물은, 예컨대 항체 조성물이 세포 내에 용해 상태로 발현한 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨톤 가울린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 상기 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청액으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75(미쯔비시 가가쿠(주) 제조) 등 레진(resin)을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합해서 사용하여, 항체 조성물의 정제 표본을 얻을 수 있다.
또한, 항체 조성물이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현한 경우는, 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심 분리를 행함으로써, 침전 분획으로서 항체 조성물의 불용체를 회수한다. 회수한 항체 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 상기 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 상기 항체 조성물을 정상적인 입체 구조로 복귀시킨 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 상기 항체 조성물의 정제 표본을 얻을 수 있다.
항체 조성물이 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청액에 상기 항체 조성물 또는 그 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 상기 배양물을 상기와 동일한 원심 분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 배양 상청액을 취득하고, 상기 배양 상청액으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써, 항체 조성물의 정제 표본을 얻을 수 있다.
2. 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 생산하는 세포의 제작
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 중, 높은 CDC 활성에 더하여 높은 ADCC 활성을 갖는 항체 조성물을 생산하는 세포는, 이하에 서술하는 수법에 의해, 본 발명의 유전자 항체 조성물을 생산하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 제작하고, 상기 숙주 세포에 상술한 1 (4) 및 (7)에 기재한 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체 발현 벡터를 도입함으로써, 생산할 수 있다.
구체적으로는, 항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당쇄의 수식에 관계되는 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 비활성화된 세포를 선택하거나, 또는 후술에 나타난 여러 가지 인위적 수법에 의해 얻어진 세포를 숙주 세포로서 사용할 수도 있다. 이하, 상세히 설명한다.
(1) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법
높은 ADCC 활성을 갖는 항체(이하, 고 ADCC 활성 항체라고 한다) 생성 세포의 제작을 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유 전자를 표적으로 하고, 유전자 파괴의 방법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(이하, GMD라고 표기한다), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제(이하, Fx라고 표기한다) 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다. 여기에서 말하는 유전자란, DNA 또는 RNA를 포함한다.
유전자 파괴의 방법으로서는, 표적으로 하는 효소의 유전자를 파괴할 수 있는 방법이면 어떠한 방법도 포함된다. 그 예로서는, 안티센스법, 리보자임법, 상동 재조합법, RNA-DNA 올리고뉴클레오티드법(이하, RDO법이라고 표기한다), RNA 인터피어런스법(이하, RNAi법이라고 표기한다), 레트로 바이러스를 사용한 방법, 트랜스포존을 사용한 방법 등을 들 수 있다. 이하에 이들을 구체적으로 설명한다.
(a) 안티센스법 또는 리보자임법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위한 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포의 제작을 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 유전자를 표적으로 하고, 세포 공학, 12, 239(1993), 바이오/테크놀로지(BIO/TECHNOLOGY), 17, 1097(1999), 휴먼·몰레큘러 ·제네틱스(Hum. Mol. Genet.), 5, 1083(1995), 세포 공학, 13, 255(1994), 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886(1999) 등에 기재된 안티센스법 또는 리보자임법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 DNA를 조제한다.
조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기 서열을 결정한다.
결정한 DNA의 서열에 기초하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 안티센스 유전자 또는 리보자임을 설계한다.
상기 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 세포 내에서 발현시키기 위하여, 조제한 DNA의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.
상기 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코 시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물이며, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다. 또한, 세포막상의 당단백질의 당쇄 구조 또는 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작을 위해서 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용되는 숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나, 내지는 염색체 중으로의 편입이 가능하며, 설계한 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입 방법으로서는, 상술한 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 이하의 방법을 들 수 있다.
형질 전환체를 선택하는 방법
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 비활성화된 세포를 선택하는 방법으로서는, 문헌[신생화학 실험 강좌 3-당질I, 당단백질(도쿄 가가쿠 동인) 일본 생화학회 편찬(1988)], 문헌[세포 공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글리코바이올로지 실험 프로토콜, 당단백질·당지질·프로테오글리칸(슈우준사 제조) 다니구치 나오유키·스즈키 아케미·후루카와 기요시·스가하라 가즈유키 감수(1996)], 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 생화학적인 방법 또는 유전자 공학적인 방법 등을 사용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법을 들 수 있다. 생화학적인 방법으로서는, 예컨대, 효소 특이적인 기질을 사용하여 효소 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다. 유전자 공학적인 방법으로서는, 예컨대, 효소 유전자의 mRNA량을 측정하는 노던 해석이나 RT-PCR법 등을 들 수 있다.
세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.
cDNA 의 조제 방법
각종 숙주 세포의 조직 또는 세포로부터 전 RNA 또는 mRNA를 조제한다.
조제한 전 RNA 또는 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 축퇴성(degenerative) 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서 PCR법으로 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 단편을 취득한 다.
취득한 유전자 단편을 프로브로서 사용하고, cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA를 취득할 수 있다.
인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포의 mRNA는 시판의 것(예컨대 Clontech사)을 사용해도 좋고, 이하와 같이 해서 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 조제해도 좋다.
인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 전 RNA를 조제하는 방법으로서는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법[메소즈·인·엔자이몰로지(Methods in Enzymology), 154, 3(1987)], 산성 티오시안산구아니딘·페놀·클로로포름(AGPC)법[애널리티컬·바이오케미스트리(Analytical Biochemistry), 162, 156(1987); 실험 의학, 9, 1937(1991)] 등을 들 수 있다.
또한, 전체 RNA로부터 poly(A)+ RNA로서 mRNA를 조제하는 방법으로서는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법(몰레큘러·클로닝 제2판) 등을 들 수 있다.
또한, Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen사), Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia사) 등의 시판의 키트를 사용함으로써 mRNA를 조제할 수 있다.
조제한 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포 mRNA로부터 cDNA 라이브러 리를 제작한다. cDNA 라이브러리 제작법으로서는, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989) 등에 기재된 방법, 또는 시판의 키트, 예컨대 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies사), ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE사)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 클로닝 벡터로서는, 대장균 K12주 중에서 자립 복제할 수 있는 것이면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등의 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, ZAP Express[STRATAGENE사, 스트래티지스(Strategies), 5, 58(1992)], pBluescript II SK(+)[뉴클레익·애시즈·리서치(Nucleic Acids Research), 17, 9494(1989)], λZAP II(STRATAGENE사), λgt10, λgt11[디엔에이·클로닝·어·프랙티컬·어프로치(DNA cloning, A Practical Approach), 1, 49(1985)], λTriplEx(Clontech사), λExCell(Pharmacia사), pT7T318U(Pharmacia사), pcD2[몰레큘러·셀룰러·바이올로지(Mol. Cell. Biol.), 3, 280(1983)] 및 pUC18[진(Gene), 33, 103(1985)] 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 숙주 미생물로서는, 미생물이면 어느 것이나 사용할 수 있으나, 바람직하게는 대장균이 사용된다. 구체적으로는 Escherichia coli XL1-Blue MRF'[STRATAGENE사, 스트래티지스(Strategies), 5, 81(1992)], Escherichia coli C600[제네틱스(Genetics), 39, 440(1954)], Escherichia coli Y1088[사이언스(Science), 222, 778(1983)], Escherichia coli Y1090[사이언스(Science), 222, 778(1983)], Escherichia coli NM522[저널·오브·몰레큘러·바 이올로지(J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], Escherichia coli K802[저널·오브·모레큘러·바이올로지(J. Mol. Biol.), 16, 118(1966)] 및 Escherichia coli JM105[진(Gene), 38, 275(1985)] 등이 사용된다.
cDNA 라이브러리는, 그대로 이후의 해석에 사용해도 좋으나, 불완전 길이 cDNA의 비율을 낮추고, 완전 길이 cDNA를 효율적으로 취득하기 위하여, 스가노 등이 개발한 올리고캡법[진(Gene), 138, 171(1994); 진(Gene), 200, 149(1997); 단백질 핵산 효소, 41, 603(1996); 실험 의학, 11, 2491(1993); cDNA 클로닝(요도사)(1996); 유전자 라이브러리의 제작법(요도사)(1994)]을 사용해서 조제하여 이하의 해석에 사용해도 좋다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 것이 예측되는 염기 서열의 5'말단 및 3'말단의 염기 서열에 특이적인 축퇴성 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서 PCR법[피씨알·프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)]을 사용하여 DNA의 증폭을 행함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.
취득한 유전자 단편이 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하 는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA인 것은, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 확인할 수 있다.
상기 유전자 단편을 프로브로 하고, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 콜로니 하이브리드화나 플라크 하이브리화(몰레큘러·클로닝 제2판) 등을 사용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 DNA를 취득할 수 있다.
또한, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 단편을 취득하기 위해서 사용한 프라이머를 사용하고, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 해서, PCR법을 사용하여 증폭함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 취득할 수도 있다.
취득한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA의 염기 서열은, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 상기 DNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 cDNA의 염기 서열을 기초로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터 베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA가 데이터 베이스 중의 유전자 중에서 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코드하고 있는 유전자인 것을 확인할 수도 있다.
상기 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열로서는, 예컨대, 서열 번호 18 또는 20에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
상기 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세 틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 염기 서열로서는, 예컨대, 서열 번호 22 또는 23에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
결정된 DNA의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392(Perkin Elmer사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 취득할 수도 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 이하에 기재된 방법을 들 수 있다.
게놈 DNA 의 조제 방법
게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 몰레큘러·클로닝 제2판이나 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 공지의 방법을 들 수 있다. 또한, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템(Genome Systems사)이나 Universal Genome WalkerTM Kits(CLONTECH사) 등을 사용함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관 여하는 효소의 게놈 DNA를 취득할 수도 있다.
취득한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 DNA의 염기 서열은, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463(1977)] 또는 ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 상기 DNA의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 게놈 DNA의 염기 서열을 기초로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터 베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA가 데이터 베이스 중의 유전자 중에서 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코드하고 있는 유전자인 것을 확인할 수도 있다.
결정된 DNA의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392(Perkin Elmer사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 취득할 수도 있다.
상기 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서는, 예컨대 서열 번호 26, 27, 28 및 29에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
상기 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서는, 예컨대 서열 번호 30에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 사용하지 않고, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임을, 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 항체 조성물을 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임은, 공지의 방법 또는 DNA 합성기에 의해 조제할 수 있다. 구체적으로는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA 및 게놈 DNA의 염기 서열 중, 연속된 5∼150 염기, 바람직하게는 5∼60 염기, 보다 바람직하게는 10∼40 염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여, 상기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당 하는 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 상기 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하는 리보자임을 합성하여 조제할 수 있다.
올리고뉴클레오티드로서는, 올리고 RNA 및 상기 올리고뉴클레오티드의 유도체(이하, 올리고뉴클레오티드 유도체라고 말한다) 등을 들 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유도체로서는, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5'포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보스(ribose)와 인산디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5티아졸우라실로 치환된 유도체 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 페녹사진 수식 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-O-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다[세포 공학, 16, 1463(1997)].
(b) 상동 재조합법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위한 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세 포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 염색체상의 표적 유전자를 상동 재조합법을 사용해서 염색체를 개변함으로써 제작할 수 있다.
염색체상의 표적 유전자의 개변은, Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)(이하, 「매니퓰레이팅·더·마우스·엠브리오·어·래버러토리·매뉴얼」이라고 약칭한다), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, 요도사(1995)(이하, 「ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작」이라고 약칭한다) 등에 기재된 방법을 사용하여, 예컨대 이하와 같이 행할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제한다.
게놈 DNA의 염기 서열에 기초하여, 개변하는 표적 유전자(예컨대, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 구조 유전자, 혹은 프로모터 유전자)를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다.
제작한 타겟 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 염색체상의 표적 유전자와 타겟 벡터 사이에서 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 고 ADCC 항체 생산 세포의 제작을 위해서 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 게놈 DNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
상기 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서, 예컨대 서열 번호 26, 27, 28 및 29에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
상기 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA의 염기 서열로서, 예컨대 서열 번호 30에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
염색체상의 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터는, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993),바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작(요도사)(1995) 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다. 타겟 벡터는, 치환형, 삽입형의 어느 것이나 사용할 수 있다.
각종 숙주 세포로의 타겟 벡터의 도입에는, 상술한 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
상동 재조합체를 효율적으로 선별하는 방법으로서, 예컨대, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작(요도사)(1995) 등에 기재된 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 폴리 A 선택 등의 방법을 사용할 수 있다. 선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리드화법(몰레큘러. 클로닝 제2판)이나 PCR법[피씨알·프로토콜즈(PCR Protocols), Academic Press(1990)] 등을 들 수 있다.
(c) RDO 방법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, RDO법을 사용하여, 예 컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA를 상기 1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 사용해서 조제한다.
조제한 cDNA 또는 게놈 DNA의 염기 서열을 결정한다.
결정한 DNA의 서열에 기초하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 RDO의 컨스트럭트를 설계하여 합성한다.
합성한 RDO를 숙주 세포에 도입하여, 표적으로 한 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소에 변이가 생긴 형질 전환체를 선택함으로써, 고 CDC 활성 및 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위한 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 사 용할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 RDO의 도입에는, 상술한 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 상기 2의 (1)의 (a)에 기재된 cDNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 상기 2의 (1)의 (b)에 기재된 게놈 DNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
DNA의 염기 서열은, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(Stratagene사 제조) 등의 플라스미드에 서브 클로닝하고, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생어(Sanger) 등의 디데옥시법[프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463(1977)] 등의 반응을 행하며, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 확인할 수 있다.
RDO는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.
RDO를 숙주 세포에 도입하여, 표적으로 한 효소, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자에 변이가 생긴 세포를 선택하는 방법으로서는, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 염색체상의 유전자의 변이를 직접 검출하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기 2의 (1)의 (a)에 기재된, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법, 후술하는 2의 (5)에 기재된 세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법, 또는, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법도 사용할 수 있다.
RDO는, 사이언스(Science), 273, 1386(1996); 네이처·메디신(Nature Medicine), 4, 285(1998); 헤파톨로지(Hepatology), 25, 1462(1997); 진·세라피( Gene Therapy), 5, 1960(1999); 진·세라피(Gene Therapy), 5, 1960(1999); 저널·오브·몰레큘러·메디신(J. Mol. Med.), 75, 829(1997); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774(1999); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768(1999); 뉴클레익·애시즈·리서치(Nuc. Acids. Res.), 27, 1323(1999); 인베스티게이션·오브·더마톨로지(Invest. Dematol.), 111, 1172(1998); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 16, 1343(1998); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 43(2000); 네이처·바이오테크놀로지(Nature Biotech.), 18, 555(2000) 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(d) RNAi법에 의한 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, RNAi법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 상기 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 사용하여, cDNA를 조제한다.
조제한 cDNA의 염기 서열을 결정한다.
결정한 cDNA의 서열에 기초하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소를 코딩하는 부분 혹은 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자를 설계한다.
상기 RNAi 유전자를 세포 내에서 발현시키기 위해서, 조제한 cDNA의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.
상기 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포표면상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체로의 편입이 가능하고, 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 상술한 1에 기재된 각종 숙주 세포 에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 cDNA를 조제하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 cDNA의 조제 방법 등을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 사용하지 않고, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 RNAi 유전자를, 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 고 CDC 활성 및 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
RNAi 유전자는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.
RNAi 유전자의 컨스트럭트는, [네이처(Nature), 391, 806(1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502(1998); 네이처(Nature), 395, 854(1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049(1999); 셀(Cell), 95, 1017(1998); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451(1999); 프로시딩스·오브·더·내셔널·아카데미·오브·사이언스(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959(1998); 네이처·셀·바이올로지(Nature Cell Biol.), 2, 70(2000)] 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(e) 트랜스포존을 사용한 방법에 의한, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포의 제작
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 네이처·제네틱(Nature Genet.), 25, 35(2000) 등에 기재된 트랜스포존의 시스템을 사용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 돌연변이체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
트랜스포존의 시스템이란, 외래 유전자를 랜덤하게 염색체상에 삽입시킴으로 써 돌연변이를 유발시키는 시스템으로, 통상, 트랜스포존에 삽입된 외래 유전자에 돌연변이를 유발시키는 벡터로서 사용하며, 이 유전자를 염색체상에 랜덤하게 삽입시키기 위한 트랜스포제스(transposase)의 발현 벡터를 동시에 세포 안에 도입한다.
트랜스포제스는, 사용하는 트랜스포존의 서열에 적합한 것이면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
외래 유전자로서는, 숙주 세포의 DNA에 변이를 유발하는 것이면 어떠한 유전자도 사용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다. 각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 상술한 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 해서 돌연변이체를 선택하는 방 법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 돌연변이체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
(2) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 상기 효소의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
이들 효소는, 기질 특이성을 가진 어느 특정한 반응을 촉매하는 효소이며, 이러한 기질 특이성을 가진 촉매 작용을 갖는 효소의 활성 중심을 파괴함으로써, 이들 효소의 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 표적으로 하는 효소 중, GMD를 예로 해서, 그 도미넌트 네거티브체의 제작에 대하여 구체적으로 이하에 서술한다.
대장균 유래의 GMD의 입체 구조를 해석한 결과, 4개의 아미노산(133번째의 트레오닌, 135번째의 글루타민산, 157번째의 티로신, 161번째의 리신)이 효소 활성 에 중요한 기능을 담당하고 있음이 밝혀졌다(Structure, 8, 2, 2000). 즉, 입체 구조의 정보에 기초하여 이들 4개의 아미노산을 상이한 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 제작한 결과, 어떠한 변이체에 있어서도 유의하게 효소 활성이 저하되고 있음이 나타나 있다. 한편, GMD의 보효소(補酵素) NADP나 기질인 GDP-만노스와의 결합능에 대해서는, 어떠한 변이체에 있어서도 거의 변화가 관찰되고 있지 않다. 따라서, GMD의 효소 활성을 담당하는 이들 4개의 아미노산을 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 대장균 유래의 GMD의 도미넌트 네거티브체의 제작의 결과에 기초하여, 아미노산 서열 정보를 기초로 한 상동성 비교나 입체 구조 예측을 행함으로써, 예컨대, CHO 세포 유래의 GMD(서열 번호 19)에서는, 155번째의 트레오닌, 157번째의 글루타민산, 179번째의 티로신, 183번째의 리신을 다른 아미노산으로 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 이러한 아미노산 치환을 도입한 유전자의 제작은, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여 행할 수 있다.
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 상술과 같이 제작한 표적 효소의 도미넌트 네거티브체를 코딩하는 유전자(이하, 도미넌트 네거티브체 유전자라고 약기한다)를 사용하여, 몰레큘러·클로닝 제2판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지, 매니퓰레이팅·마우스·엠브리오 제2판 등에 기재된 유전자 도입의 방법에 따라서, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 도미넌트 네거티브체 유전자를 조제한다.
조제한 도미넌트 네거티브체 유전자의 전체 길이 DNA를 기초로 하고, 필요에 따라, 상기 단백질을 코딩하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
상기 DNA 단편, 또는 전체 길이 DNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.
상기 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성, 혹은 생성 항체 분자 또는 세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖고 있는 것이면 어느 것이나 사 용할 수 있다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 편입이 가능하고, 목적으로 하는 도미넌트 네거티브체를 코딩하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 상술한 1에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 상술한 1에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 2(1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 형질 전환체를 선택하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
(3) 효소에 돌연변이를 도입하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합 하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자에 돌연변이를 도입하고, 상기 효소에 돌연변이를 발생시킨 원하는 세포주를 선택하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
효소에 돌연변이를 도입하는 방법으로서는, 1) 돌연변이 유발 처리로 친주(親株)를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 해서 원하는 세포주를 선택하는 방법, 2) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 생산 항체 분자의 당쇄 구조를 지표로 해서 원하는 세포주를 선택하는 방법, 3) 돌연변이 유발 처리로 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 생긴 돌연변이체로부터, 상기 세포의 세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 지표로 해서 원하는 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
돌연변이 유발 처리로서는, 친주의 세포의 DNA에 점 돌연변이, 결실 또는 프레임 시프트 돌연변이를 유발하는 것이면 어떠한 처리도 사용할 수 있다.
구체적으로는, 에틸니트로소우레아, 니트로소구아니딘, 벤조피렌, 아크리딘 색소에 의한 처리, 방사선의 조사 등을 들 수 있다. 또한, 여러 가지 알킬화제나 발암물질도 돌연변이 유발물질로서 사용할 수 있다. 돌연변이 유발물질을 세포에 작용시키는 방법으로서는, 예컨대 조직 배양의 기술 제3판(아사쿠라 서점) 일본 조직 배양학회 편찬(1996), 네이처·제네틱스(Nature Genet.), 24, 314(2000) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
자연발생적으로 생긴 돌연변이체로서는, 특별한 돌연변이 유발 처리를 실시하지 않고, 통상의 세포 배양의 조건에서 계대배양을 계속함으로써 자연발생적으로 생기는 돌연변이체를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 1의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항의 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다.
(4) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합 하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 안티센스 RNA/DNA 기술[바이오사이언스와 인더스트리, 50, 322(1992), 화학, 46, 681(1991), Biotechnology, 9, 358(1992), Trends in Biotechnology, 10, 87(1992), Trends in Biotechnology, 10, 152(1992), 세포 공학, 16, 1463(1997)], 트리플·헬릭스 기술[Trends in Biotechnology, 10, 132(1992)] 등을 사용하여, 표적으로 하는 유전자의 전사 또는 번역을 억제함으로써 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소로서는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (1)의 (a)에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막상의 당단백질의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 본 항 2의 (5)에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 방법으로서는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5에 기재된 방법을 들 수 있다.
(5) N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주(株)를 선택하는 수법
고 ADCC 활성 항체 생산 세포를 제작하기 위해서 사용하는 숙주 세포는, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다.
N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법으로서는, 예컨대, 소매틱·셀·앤드·몰레큘러·제네틱스(Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51(1986) 등에 기재된 렉틴을 사용한 방법을 들 수 있다.
렉틴으로서는, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴이면 어떠한 렉틴이라도 사용할 수 있으나, 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA(Viciafaba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL(Aleuriaaurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 1 ㎍/mL∼1 ㎎/mL 농도의 상술한 렉틴을 포함하는 배지에서 1일∼2주일, 바람직하게는 1일∼1주일 배양하고, 생존해 있는 세포를 계대배양 또는 콜로니를 픽업해서 다른 배양 용기로 옮기며, 또한 계속해서 렉틴을 포함하는 배지에서 배양을 계속함으로써, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주 를 선택할 수 있다.
3. 항체 조성물의 활성 평가
정제한 항체 조성물의 단백량, 항원과의 결합 활성 또는 세포 상해 활성을 측정하는 방법으로서는, 모노클로날 안티바디즈, 혹은 안티보디 엔지니어링 등에 기재된 공지의 방법을 사용할 수 있다.
구체적인 예로서는, 항체 조성물이 인간형 키메라 항체 또는 인간화 항체인 경우, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은 ELISA법 및 형광 항체법[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993)] 등에 의해 측정할 수 있다. 항원 양성 배양 세포주에 대한 세포 상해 활성은, CDC 활성, ADCC 활성 등을 측정함으로써, 평가할 수 있다[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.), 36, 373(1993)].
ADCC 활성을 측정하는 방법으로서는, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등으로 표식된 표적 세포, 항체 및 이펙터 세포를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리되는 표식 물질의 활성을 측정하는 방법, 표적 세포, 항체, 및 이펙터 세포를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리하는 효소의 생리 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
CDC 활성을 측정하는 방법으로서는, 방사성 동위체, 형광 물질 또는 색소 등 으로 표식된 표적 세포, 항체 및 보체 성분을 포함하는 혈청 등의 생체 시료를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리되는 표식 물질의 활성을 측정하는 방법, 표적 세포, 항체, 및 보체 성분을 포함하는 혈청 등의 생체 시료를 접촉시킨 후, 상해를 입은 표적 세포로부터 유리하는 효소의 생리 활성을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 항체 조성물의 인간에게 있어서의 안전성, 치료 효과는, 게잡이 원숭이 등의 인간에 비교적 가까운 동물종의 적당한 모델을 사용해서 평가할 수 있다.
4. 항체 조성물의 당쇄의 분석
각종 세포로 발현시킨 항체 분자의 당쇄 구조는, 통상의 당단백질의 당쇄 구조의 해석에 준하여 행할 수 있다. 예컨대, IgG 분자에 결합되어 있는 당쇄는 갈락토오스, 만노스, 푸코스 등의 중성당, N-아세틸글루코사민 등의 아미노당, 시알산 등의 산성당으로 구성되어 있으며, 당 조성 분석 및 이차원 당쇄 맵법 등을 사용한 당쇄 구조 해석 등의 수법을 사용해서 행할 수 있다.
(1) 중성당·아미노당 조성 분석
항체 조성물의 당쇄의 조성 분석은, 트리플루오로아세트산 등으로, 당쇄의 산 가수분해를 행함으로써, 중성당 또는 아미노당을 유리하여, 그 조성비를 분석할 수 있다.
구체적인 방법으로서, Dionex사 제조 당 조성 분석 장치를 사용하는 방법을 들 수 있다. Bio LC는 HPAEC-PAD(high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)법[저널·오브·리퀴드·크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577(1983)]에 의해 당 조성을 분석하는 장치이다.
또한, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표식화법으로도 조성비를 분석할 수 있 다. 구체적으로는, 공지의 방법[어그리컬처럴·앤드·바이올로지컬·케미스트리(Agric. Biol. Chem.), 55(1), 283-284(1991)]에 따라서 산 가수분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 레벨화하고, HPLC 분석하여 조성비를 산출할 수 있다.
(2) 당쇄 구조 해석
항체 조성물의 당쇄의 구조 해석은, 2차원 당쇄 맵법[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 171, 73(1988), 생물 화학 실험법 23-당 단백질 당쇄 연구법(학회 출판 센터) 다카하시 레이코 편찬(1989년)]에 의해 행할 수 있다. 2차원 당쇄 맵법은, 예컨대, X축에는 역상(逆相) 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y축에는 순상(順相) 크로마토그래피에 의한 당쇄의 유지 시간 또는 용출 위치를, 각각 플롯하고, 이미 알려진 당쇄의 그들의 결과와 비교함으로써, 당쇄 구조를 추정하는 방법이다.
구체적으로는, 항체를 히드라진 분해하여, 항체로부터 당쇄를 유리하고, 2-아미노피리딘(이하, PA라고 약기한다)에 의한 당쇄의 형광 표식[저널·오브·바이오케미스트리(J. Biochem.), 95, 197(1984)]을 행한 후, 겔 여과에 의해 당쇄를 과잉의 PA화 시약 등과 분리하여, 역상 크로마토그래피를 행한다. 이어서 분리 채취한 당쇄의 각 피크에 대해서 순상 크로마토그래피를 행한다. 이들의 결과를 기초로, 2차원 당쇄 맵상에 플롯하고, 당쇄 스탠더드(TaKaRa사 제조), 문헌[어낼리티컬·바이오케미스트리(Anal. Biochem.), 171, 73(1988)]과의 스폿의 비교로부터 당쇄 구조를 추정할 수 있다.
또한 각 당쇄의 MALDI-TOF-MS 등의 질량 분석을 행하여, 2차원 당쇄 맵법에 의해 추정되는 구조를 확인할 수 있다.
5. 항체 분자의 당쇄 구조의 식별 방법
항체 조성물은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 당쇄 구조가 다른 항체 분자로 구성되어 있다. 본 발명의 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물이며, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물은, 높은 ADCC 활성을 나타낸다. 이러한 항체 조성물은, 상기 4.에 기재된 항체 분자의 당쇄 구조의 분석법을 사용함으로써 식별할 수 있다. 또한, 렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용하는 것에 의해서도 식별할 수 있다.
렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용한 항체 분자의 당쇄 구조의 식별은, 문헌[모노클로날·안티바디즈: 프린시플즈·앤드·애플리케이션즈(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., (1995); 효소 면역 측정법, 제3판, 의학서원(1987); 개정판, 효소 항체법, 가쿠사이 기카쿠(1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA(Radioimmunoassay), VIA(Viroimmunoassay), EIA(Enzymoimmunoassay), FIA(Fluoroimmunoassay), MIA(Metalloimmunoassay) 등의 면역학적 정량 방법에 준하여, 예컨대, 이하와 같이 행할 수 있다.
항체 조성물을 구성하는 항체 분자의 당쇄 구조를 인식하는 렉틴을 표식하고, 표식한 렉틴과 시료인 항체 조성물을 반응시킨다. 다음으로, 표식한 렉틴과 항체 분자의 복합체의 양을 측정한다.
항체 분자의 당쇄 구조를 식별하는 데 사용되는 렉틴으로서는, 예컨대, WGA(T. vulgaris 유래의 wheat-germ agglutinin), ConA(C. ensiformis 유래의 concanavalin A), RIC(R. communis 유래의 독소), L-PHA(P.vulgaris 유래의 leukoagglutinin), LCA(L. culinaris 유래의 lentil agglutinin), PSA(P. sativum 유래의 Pea lectin), AAL(Aleuria aurantia Lectin), ACL(Amaranthus caudatus Lectin), BPL(Bauhinia purpurea Lectin), DSL(Datura stramonium Lectin), DBA(Dolichos biflorus Agglutinin), EBL(Elderberry Balk Lectin), ECL(Erythrina cristagalli Lectin), EEL(Euonymus europaeus Lectin), GNL(Galanthus nivalis Lectin), GSL(Griffonia simplicifolia Lectin), HPA(Helix pomatia Agglutinin), HHL(Hippeastrum Hybrid Lectin), Jacalin, LTL(Lotus tetragonolobus Lectin), LEL(Lycopersicon esculentum Lectin), MAL(Maackia amurensis Lectin), MPL(Maclura pomifera Lectin), NPL(Narcissus pseudonarcissus Lectin), PNA(Peanut Agglutinin), E-PHA(Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin), PTL(Psophocarpus tetragonolobus Lectin), RCA(Ricinus communis Agglutinin), STL(Solanum tuberosum Lectin), SJA(Sophora japonica Agglutinin), SBA(Soybean Agglutinin), UEA(Ulex europaeus Agglutinin), VVL(Vicia villosa Lectin), WFA(Wisteria floribunda Agglutinin)를 들 수 있다.
N-글루코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 렉틴을 사용하는 것이 바람직하며, 그 구체적인 예로서는, 렌즈콩 렉틴 LCA(Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA(Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA(Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL(Aleuria aurantia 유래의 Lectin)을 들 수 있다.
6. 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물의 사용
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물은, IgG1 항체 및 IgG3 항체보다도 높은 CDC 활성을 갖고 있기 때문에, 종래의 항체 조성물보다도 치료 효과가 우수한 성질을 갖는다. 또한, 본 발명의 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물이며, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물은, IgG1 항체 및 IgG3 항체보다도 높은 CDC 활성 및 높은 ADCC 활성을 갖고 있기 때문에, 종래의 항체 조성물보다도 치료 효과가 우수한 성질을 갖고 있다. 또한 본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물 중, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물이며, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 100%인 항체 조성물이 보다 바람직하다.
본 발명의 유전자 재조합 항체 조성물을 함유하는 의약은, 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여, 제제학의 기술분야에서 잘 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 및 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 항체 제제의 경우, 바람직하게는 정맥 내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로서는, 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제(乳劑), 좌제(座劑), 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로서는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 기름류, p-히드록시안식향산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 향미료, 페퍼민트 등의 향미료류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제(賦形劑), 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 활석 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는 염 용액, 포도당 용액, 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제된다. 또는 항체 조성물을 통상적인 방법에 따라서 동결 건조하 고, 이것에 염화나트륨을 첨가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.
좌제는 카카오 기름, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다.
또한, 분무제는 상기 항체 조성물 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 상기 항체 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜서 흡수를 용이하게 시키는 담체 등을 사용하여 조제된다.
담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등이 예시된다. 상기 항체 조성물 및 사용하는 담체의 성질에 따라, 에어로솔, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또한, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 유효 성분의 양으로서, 통상 성인 1일당 10 ㎍/㎏∼20 ㎎/㎏이다.
또한, 항체 조성물의 각종 종양 세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은 인비트로 실험으로서는, CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있으며, 인비보 실험으로서는 마우스 등의 실험 동물에서의 종양계를 사용한 항종양 실험 등을 들 수 있다.
CDC 활성, ADCC 활성, 항종양 실험은 문헌[캔서·이뮤놀로지·이뮤노세라피(Cancer Immunology Immunotherapy), 36, 373(1993); 캔서·리서치(Cancer Research), 54, 1511(1994)] 등에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.
이하에, 실시예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
동물 세포를 사용한, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체, 항 CD20 도메인 교환 항체의 제작
1. 인간 IgG3 항 CD20 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 제작
인간 림프절 유래의 poly A+ RNA(BD Biosciences Clontech사)로부터, cDNA Synthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech사)를 사용하여, 첨부된 사용 설명서에 따라서 cDNA를 합성하였다. cDNA 100 ng을 주형으로 사용하고, KOD plus(도요 보세키사) 및 서열 번호 1, 2에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는, 인간 IgG 정상 영역 특이적 합성 DNA 프라이머(파스맥(fasmac)사 제조)를 사용하여, KOD plus의 첨부 설명서에 따라서 PCR 반응을 행하였다. PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)을 사용하여, 94℃, 1분간으로 열 변성시킨 후, 94℃에서 15초간, 62℃에서 30초간, 68℃에서 90초간의 반응을 30 사이클 행하였다. 또한 68℃에서 7분간 반응시킨 후, 3'말단에 아데닌 부가를 할 목적으로 Taq DNA polymerase(다카라 슈조사)를 2.5 U 첨가하여, 68℃에서 7분간 반응시켰다. 반응액을 1% 아가로오스 겔을 사용한 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen사)를 사용하여, IgG3 중쇄 정상 영역 유전자라고 생각되는 약 1.1 kbp의 증폭 단편을 회수하였다. Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 플라스미드 pCRII-TOPO vector(Invitrogen사)와 연결 반응을 행하고, 상기 반응액 을 사용하여 대장균 DH5α주(도요 보세키사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 공지의 인간 IgG3(Genbank 액세션 번호(accession number) AAH33178)의 중쇄 정상 영역과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 인 것을 확인하였다.
상술한 인간 IgG3 중쇄 정상 영역 유전자 삽입 플라스미드로부터, 제한 효소 ApaI 및 NruI(모두 다카라 슈조사) 처리하여, 1.13 kbp의 IgG3 중쇄 정상 영역 유전자 단편을 정제하였다. 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 Rituxan의 가변 영역, 인간 κ형의 경쇄 정상 영역 및 인간 IgG1의 중쇄 정상 영역을 갖는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 동물 세포 안정 발현 벡터 pKANTEX2B8P(WO03/055993 A1에 기재)를 ApaI 및 NruI로 소화 처리하였다. IgG1 정상 영역 유전자를 잘라낸 나머지 약 12.6 kbp의 단편을 정제하고, 상술한 IgG3 정상 영역 유전자 단편과 Ligation High 용액을 사용해서 연결하여, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3(도 3)를 구축하였다. pKANTEX2B8γ3에 코드된 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체의 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, pKANTEX2B8P에 코드되는 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열이 동일하였다.
2. 항 CD20 도메인 교환 항체 발현 벡터의 제작
가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열이, pKANTEX2B8P에 코드되는 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 동일하고, 중쇄 정상 영역이 인간 IgG1 항체 또는 인간 IgG3 항체의 도메인으로 구성된, CD20에 결합하는 도메인 교환 항체를 이하의 순서에 따라서 제작하였다. CH1과 힌지가 인간 IgG1 항체 유래, Fc 영역(CH2 및 CH3)이 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 정상 영역을 갖는 항 CD20 키메라 항체를 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체, CH1과 힌지가 IgG3 항체 유래, Fc 영역이 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 정상 영역을 갖는 항 CD20 키메라 항체를 3311형 항 CD20 도메인 교환 항체라고 각각 칭한다. 이들 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, 아미노산 서열 데이터 베이스에 의한 검색을 행한 결과, 신규의 아미노산 서열이었다.
설계된 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 각 도메인이 유래하는 서브 클래스, 및 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 1에 나타내었다. 또, 1133형의 아미노산 서열은 서열 번호 16에 나타내었다. 도 4에 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 모식도를 도시하였다.
구조명 CH1 힌지 CH2 CH3
1133 IgG1 IgG1 IgG3 IgG3
3311 IgG3 IgG3 IgG1 IgG1
(1) 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
도 5에 도시한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하와 같이 해서 구축하였다.
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 BmgBI(New England Biolabs사 제조)를 사용하여, 인간 IgG1 항체의 CH1 도메인, 힌지 도메인, 및 Fc 영역의 5'말단측의 일부(인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체에서 동일한 아미노산 서열인 부분)를 코딩하는 약 430 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 본 실시예 1항에 기재된 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 5에 도시한 플라스미드 pKTX93/1133이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 3311형 항 CD20 도메인 교환 항체를 코딩하는 발현 벡터의 구축
도 6에 도시한 3311형 항 CD20 도메인 교환 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하와 같이 해서 구축하였다.
본 실시예 1항에 기재된 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 BmgBI(New England Biolabs사 제조)를 사용하여, 인간 IgG3 항체의 CH1 도메인, 힌지 도메인, 및 Fc 영역의 5'말단측의 일부(인간 IgG1 항체와 인간 IgG3 항체에서 동일한 아미노산 서열인 부분)를 코딩하는 약 570 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, IgG1 항 CD20 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8P에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 6에 도시한 플라스미드 pKTX93/3311이 얻어진 것을 확인하였다.
3. 각종 항 CD20 키메라 항체 및 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항 및 제2항에서 각각 제작한 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8γ3, 항 CD20 도메인 교환 항체 발현 벡터 pKTX93/1133 및 pKTX93/3311을, CHO/DG44 세포[소매틱·셀·앤드·몰레큘러·제네틱스(Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 555(1986)] 및 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 유전자를 녹아웃한 CHO/DG44 세포(이하 CHO/FUT8-/-라고 표기한다)[바이오테크놀로지·앤드·바이오엔지니어링(Biotechnol. Bioeng.), 87, 614(2004)]를 숙주 세포로서 도입하여, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 또는 항 CD20 도메인 교환 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 이하와 같이 해서 제작하였다. CHO/DG44 세포는 재조합 단백질 생산에 널리 사용되는 숙주 세포이다. CHO/FUT8-/- 세포는 CHO/DG44 세포의 FUT8을 게놈상에서 녹아웃한 숙주 세포이다. 또한, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P는, CHO/FUT8-/- 세포에만 도입하여, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 동일하게 해서 제작하였다.
8 ㎍의 발현 벡터 플라스미드를, 전기 천공법[Cytotechnology, 3, 133(1990)]에 의해 1.6×106개의 CHO/DG44 세포 또는 CHO/FUT8-/- 세포에 도입한 후, 40 mL의 IMDM-(10)[투석 소 혈청(dFBS)을 10%로 포함하는 IMDM 배지(GIBCO-BRL사 제조)] 배지에 현탁하여, 96웰 마이크로 플레이트(스미토모 베이크라이트사 제조)에 100 μL/웰씩 나누어 주입하였다. 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 24시간 배양한 후, 500 ㎍/mL의 농도로 G418을 포함하는 IMDM-(10) 배지에 있어서 1주일∼2주일 배양하였다. 배양 후, 각 웰로부터 배양 상청액을 회수하고, 후술하는 본 실시예의 제4항에 나타내는 ELISA법에 의해, 배양 상청액 중의 항 CD20 도메인 교환 항체량을 측정하였다. 배양 상청액 중에 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현이 보여진 웰의 형질 전환주에 대해서는, dhfr 유전자 증폭계를 이용해서 항체 발현량을 증가시킬 목적으로, G418을 500 ㎍/mL의 농도로 포함하고, dhfr 유전자 산물인 디히드로엽산 환원 효소의 저해제인 메토트렉사트(methotrexate)(이하, MTX라고 표기한다: SIGMA사 제조)를 50 nM의 농도로 포함하는 IMDM-(10) 배지에 현탁하며, 37℃의 5% CO2 인큐베이터 내에서 약 1주일 배양하여, 50 nM의 MTX에 내성을 나타내는 형질 전환주를 취득하였다. 다음으로, MTX 농도를 100 nM, 200 nM로 순차 상승시키고, 최종적으로 500 ㎍/mL의 농도의 G418 및 200 nM의 MTX를 포함하는 IMDM-(10) 배지에서 증식 가능하며 또한, 각각의 발현 벡터에 코드되는 항체를 고 발현하는 형질 전환주를 취득하였다.
4. 배양 상청액 중의 항체 농도의 측정(ELISA법)
염소 항 인간 IgG(H&L) 항체(American Qualex사 제조)를 Phosphate Buffed Saline(이하, PBS라고 표기한다)으로 희석해서 1 ㎍/mL로 하고, 96 구멍의 ELISA용 플레이트(그라이너사 제조)에, 50 μL/웰로 나누어 주입하며, 실온에서 1시간 정치(靜置)하여 흡착시켰다. 반응 후, PBS로 세정하고, 1% 소 혈청 알부민(이하, BSA라고 표기한다; Proliant Inc.사 제조)을 포함하는 PBS(이하, 1% BSA-PBS라고 표기한다)를 100 μL/웰로 첨가하며, 실온에서 1시간 반응시켜서 잔존하는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 제거하고, 측정 대상의 배양 상청액을 50μL/웰로 첨가하여, 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 0.05% Tween20을 포함하는 PBS(이하, Tween-PBS라고 표기한다)로 세정한 후, PBS로 500배로 희석한 페록시다아제 표식 염소 항 인간 IgG(Fc) 항체 용액(American Qualex사 제조)을 이차 항체 용액으로서, 각각 50 μL/웰로 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. Tween-PBS로 세정한 후, ABTS 기질액[2,2'-아미노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)암모늄의 0.55g을 1L의 0.1M 구연산 완충액(pH4.2)에 용해하고, 사용 직전에 과산화수소를 1 μL/mL로 첨가한 용액]을 50 μL/웰로 첨가하여 발색시키고, 415 nm의 흡광도(이하, OD415라고 표기한다)를 측정하였다.
5. 각종 항 CD20 키메라 항체 및 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 정제
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 200nMMTX를 포함하는 IMDM-FCS(10)에 1×105 세포/mL가 되도록 현탁한 후, 트리플 플라스크(나르제눈크(nalgenunc)사 제조)에 100 mL씩 나누어 주입하고, 37℃로 설정한 5% CO2 인큐베이터 내에서 2일간 배양하였다. 플라스크로부터 배양 상청액을 제거하고, 플라스크 내부를 50 mL의 PBS로 세정한 후, 플라스크에 EXCELL 301 배지(JRH Biosciences사 제조) 100 mL를 첨가하여, 37℃로 설정한 5% CO2 인큐베이터 내에서 5일간 배양하였다. 이 배양 상청액을 회수하고, 3000 rpm, 4℃의 조건에서 5분간의 원심 분리를 행한 후, 상청액을 회수하며, 0.22 ㎛ 구멍 직경 PES Membrane(이와키사 제조)을 사용하여 여과 멸균하였다. 멸균한 배양 상청액으로부터, Prosep-A(Protein-A: 밀리포어사 제조) 또는 Prosep-G(Protein-G: 밀리포어사 제조)를 사용한 칼럼으로, 첨부된 설명서에 따라서, 각종 항 CD20 항체를 정제하였다. IgG1 항 CD20 항체는 프로테인 A로 정제 가능하였으나, IgG3 항 CD20 항체는 프로테인 A로 정제할 수 없기 때문에 프로테인 G를 사용하여 정제하였다. 도메인 교환 항체에 대해서는, 3311형은 프로테인 A로 정제할 수 있었다. 한편, 1133형은 프로테인 A로 정제할 수 없었으나, 프로테인 G로 정제할 수 있었다.
각 항체의, 발현 벡터, 숙주 세포, 정제한 항체 샘플의 명칭, 및 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 2에 나타내었다. 또, 표 중, 샘플의 명칭 말미에 (+F)를 갖는 샘플은 CHO/DG44을 숙주 세포로 해서 생산된 항체 샘플을 나타내고, 그 이외의 샘플은 CHO/FUT8-/-로부터 생산된 항체 샘플을 나타낸다.
Figure 112008011757474-pct00002
표 중: +F는 Fc 영역에 결합하는 당쇄에 푸코스가 결합되어 있는 것을 나타낸다. -F는 Fc 영역에 결합하는 당쇄에 푸코스가 결합되어 있지 않은 것을 나타낸다.
6. 각종 항 CD20 키메라 항체 및 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위하여, 각종 항 CD20 항체 정제 샘플 약 1 ㎍을 사용해서, 공지의 방법[Nature, 227, 680(1970)]에 따라서 SDS 변성 폴리아크릴아미드 전기영동(이하, SDS-PAGE라고 표기한다)을 행하였다. 영동도의 비교 대조로서, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 Rituxan(Genentech사에서 구입)에 대해서도 동일한 조작을 행하였다. 이하, Rituxan을 CD20-IgG1(+F)이라고 표기한다.
그 결과, 1133(+F) 및 1133(-F)은, 인간 IgG1 항체인 CD20-IgG1(+F)과 유사한 영동 패턴을 나타내고, 3311(+F) 및 3311(-F)은, 인간 IgG3 항체인 CD20-IgG3(+F)와 유사한 영동 패턴을 나타내었다. CD20-IgG1(+F), CD20-IgG1(-F), 1133(+F) 및 1133(-F)에 있어서는 H쇄가 약 50킬로달톤(이하, kDa라고 표기한다), L쇄가 약 24 kDa 부근에 밴드가 보여지고, CD20-IgG3(+F), CD20-IgG3(-F), 3311(+F) 및 3311(-F)은 H쇄가 약 54 kDa, L쇄가 약 24 kDa 부근에 밴드가 보여지는 것으로부터, 제작한 항 CD20 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적으로 하는 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 2
각종 항 CD20 키메라 항체 및 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 활성 평가
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대하여, 각종 활성 비교를 이하와 같이 해서 행하였다.
1. 각종 항 CD20 항체의 CD20 양성 세포에 대한 결합 활성
실시예 1에서 얻어진 각종 항 CD20 항체의 CD20 양성 세포에 대한 결합 활성을, 비오틴화 Rituxan과의 경합 저해의 계에 있어서, 유세포 분석기(flow cytometer)를 사용한 형광 항체법에 의해 측정하였다. 음성 대조로서 항 Her2 인간 IgG1 항체 Herceptin[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4285(1992)](Genentech사에서 구입) 및 항 CCR4 인간 IgG1 항체 KM3060[Cancer Res. 64, 2127(2004)]을 사용하였다.
CD20 양성인 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma) 유래 세포주 Daudi 세포[ATCC: CCL-213]를 1웰당 5×105개가 되도록 96웰 U자 플레이트(Falcon사 제조)에 나누어 주입한 후, 실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체, 또는 음성 대조인 항 Her2 항체 Herceptin[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4285(1992)] 및 항 CCR4 항체 KM3060(WO02/31140)을 10 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL의 농도로 포함하며, 비오틴 표식화 항 CD20 키메라 항체 Rituxan[EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce사 제조)을 사용하여 Rituxan을 비오틴화한 것]을 0.5 ㎍/mL로 포함하는 FACS용 완충액[0.2 ㎎/mL human-IgG(시그마사 제조), 0.02% EDTA, 0.05% NaN3, 1% BSA]을 50 μL/웰로 첨가하였다. 차광하 4℃에서 60분간 반응시키고, 세포를 FACS용 완충액으로 2회 세정한 후, FACS용 완충액으로 200배로 희석한 PE 표식화 스트렙타비딘(streptavidin)을 50 μL/웰로 첨가하였다. 차광하 4℃에서 60분간 반응시키고, 세포를 FACS용 완충액으로 2회 세정한 후, 1 mL의 FACS용 완충액에 현탁하며, 유세포 분석기 EPICS-XL(Coulter사 제조)로 형광 강도를 측정하였다.
결과를 도 7에 도시하였다. 음성 대조인 항 Her2 항체 Herceptin 및 항 CCR4 항체 KM3060은 비오틴 표식화 항 CD20 키메라 항체 Rituxan의 CD20 양성 세포 Daudi에의 결합을 저해하지 않았으나, 모든 항 CD20 도메인 교환 항체, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체는 농도 의존적으로 결합을 저해하고, 그 정도는 동일한 정도였다. 이들의 결과로부터, 항 CD20 도메인 교환 항체의 항원 결합이 CD20 특이적인 것, 및 항 CD20 도메인 교환 항체의 결합 활성이 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체와 동일한 정도인 것이 보여졌다.
2. 각종 항 CD20 항체의 Daudi 세포에 대한 CDC 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대하여, CD20 양성인 Daudi 세포를 사용한 in vitro CDC 활성을 측정하였다.
반응은 96웰 평저(平底) 플레이트(스미토모 베이크라이트사 제조) 내에서 행하고, 각 반응웰에는, 5×104개의 Daudi 세포를 포함하며, 0.3 ㎍/mL의 항 CD20 도메인 교환 항체, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 또는 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체를 포함하는 인간 보체 희석 배지[FBS(JRH사 제조)를 10% 포함하는 RPMI 1640 배지(GIBCO BRL사 제조)를 사용하여 인간 보체(SIGMA사 제조)를 6배로 희석한 것]를 150 μL씩 나누어 주입하였다. 또한, CDC가 야기되지 않는 경우의 대조로서 항 CD20 도메인 교환 항체를 포함하지 않는 반응웰(0% 반응웰)을, CDC가 야기된 경우의 대조로서 Daudi 세포를 포함하지 않는 반응웰(100% 반응웰)을 각각 준비하였다. 37℃, 5% CO2 분위기하에서 2시간 배양한 후, 각 반응웰에 WST-1 시약(ROCHE사 제조)을 15 μL씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 분위기하에서 4시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 각 웰에 있어서의 OD450을 측정하고, 각 웰의 흡광도로부터 이하의 식을 사용해서 CDC 활성(%)을 산출하였다.
CDC 활성(%)=100×{1-(반응웰 흡광도-100% 반응웰 흡광도)/(0% 반응웰 흡광도-100% 반응웰 흡광도)}
결과를 도 8에 도시하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3(+F) 및 CD20-IgG3(-F)의 CDC 활성은, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1(+F) 및 CD20-IgG1(-F)의 CDC 활성보다도 높고, CDC 활성은 IgG3＞IgG1인 것이 확인되었다. 그러나, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133(+F) 및 1133(-F)은 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체의 CDC 활성보다도 현저히 높은 CDC 활성을 나타내었다. 한편으로 항 CD20 도메인 교환 항체 3311(+F) 및 3311(-F)의 CDC 활성은 낮았다. 또한, 어떠한 항 CD20 항체에 있어서도, CHO/DG44를 숙주 세포로 해서 생산된 항체 샘플과 CHO/FUT8-/-를 숙주 세포로 해서 생산된 항체 샘플은, 동일한 정도의 CDC 활성을 나타내고 있으며, 항체에 결합하는 당쇄의 푸코스 함량에 관계없이, 1133의 활성이 상승하고 있었다. 또한, 항체 농도를 1 ㎍/㎖로 올려도, 상기의 각종 항체의 CDC 활성의 강약의 서열은 변하지 않았다.
3. 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 CDC 활성 측정
본 실시예의 제2항에서 특히 높은 CDC 활성을 갖고 있던 항 CD20 도메인 교환 항체 1133(+F) 및 1133(-F)의 CDC 활성을 더욱 상세히 평가하기 위해서, 모두 CD20 양성인, 버키트 림프종 유래 세포주 ST486 세포[ATCC: CRL-1647] 또는 버키트 림프종 유래 세포주 Raji 세포[ATCC: CCL-86]를 사용하여, 본 실시예의 제2항과 동일한 순서로 CDC 활성의 측정을 행하였다.
결과를 도 9에 도시하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, ST486 세포주(도 9A)와 Raji 세포주(도 9B)의 어떠한 것에 있어서도, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3(+F) 및 CD20-IgG3(-F)의 CDC 활성은 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1(+F) 및 CD20-IgG1(-F)의 CDC 활성보다도 약간 높고, 항 CD20 도메인 교환 항체 1133(+F) 및 1133(-F)은 이들을 상회하는 현저한 CDC 활성을 나타내었다. 또한, 어떠한 항 CD20 항체에 있어서도, CHO/DG44를 숙주 세포로 해서 생산된 항체샘플과 CHO/FUT8-/-를 숙주 세포로 해서 생산된 항체 샘플은, 동일한 정도의 CDC 활성을 나타내었다.
4. 각종 항 CD20 항체의 CD20 양성 세포주에 대한 ADCC 활성의 평가
실시예 1의 제5항에서 얻어진 각종 항 CD20 항체 정제 샘플에 대해서, 표적 세포로서 CD20 양성인 Daudi 세포를 사용하여 in vitro ADCC 활성을 이하와 같이 측정하였다. 측정에는, Cytotox 96 키트(Promega사 제조)를 사용하였다.
(1) 인간 이펙터 세포 용액의 조제
정상인 말초혈 50 mL를 채취하고, 헤파린나트륨(다케다 야쿠힝사 제조) 0.2 mL를 첨가하여 차분하게 혼합하였다. 이것을 Lymphoprep(다이이치 가가쿠 야쿠힝사 제조)을 사용하여 사용 설명서에 따라서 단핵구 분획을 분리한 후, RPMI 1640 배지에서 1회, 10% FBS-RPMI 1640 배지에서 1회 원심 분리하여 세정하고, 이것을 이펙터 세포로 하였다.
(2) ADCC 활성의 측정
반응은 96웰 평저 플레이트(Falcon사 제조) 내에서 행하고, 각 반응웰에는, 2×105개의 이펙터 세포 및 1×104개의 Daudi 세포 또는 ST486 세포를 포함하며, 각종 농도로 항 CD20 항체를 포함하는 10% FBS-RPMI 1640 배지를 200 μL씩 나누어 주입하였다. 또한, ADCC 활성의 산출에 필요한 대상웰로서, 이펙터 세포, 표적 세포 및 항체 모두를 포함하지 않는 배지웰, 이펙터 세포만을 포함하는 이펙터웰, 표적 세포만을 포함하는 표적웰, 이펙터 세포 및 표적 세포를 포함하며 항체를 포함하지 않는 NK웰, 표적 세포만을 포함하며, 반응 개시 후 3시간 15분 후에 키트 첨부의 Lysis-buffer를 20 μL 첨가한 100% 반응웰, 이펙터 세포, 표적 세포 및 항체 모두를 포함하지 않고, 반응 개시 후 3시간 15분 후에 키트 첨부의 Lysis-buffer를 20 μL 첨가한 100% 반응 대조웰을 각각 준비하였다. 각 반응웰을 37℃, 5% CO2 분위기하에서 4시간 반응시킨 후, 반응 플레이트를 원심 분리하여, 각 웰로부터 상청액 50 μL를 회수하였다. 각 웰의 상청액을 96웰 U자 바닥 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조)의 웰에 각각 옮기고, 각 웰에 발색 기질 용액(키트 첨부의 기질 1개분을 키트 첨부의 assay-buffer 12 mL에 용해시킨 것)을 50 μL씩 첨가하였다. 37℃에서 30분간 발색 반응을 행하고, 키트 첨부의 반응 정지액을 각 웰에 50 μL씩 첨가한 후, OD450을 측정하며, 각 웰의 흡광도로부터 이하의 식을 사용해서 ADCC 활성(%)을 산출하였다.
ADCC 활성(%)=100×(S-E-T)/(Max-T)
S=샘플 반응웰 흡광도-배지웰 흡광도
E=이펙터웰 흡광도-배지웰 흡광도
T=표적웰 흡광도-배지웰 흡광도
Max=100% 반응웰-100% 반응 대조웰
결과를 도 10에 도시하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 어떠한 항 CD20 항체에 있어서도, CHO/FUT8-/-로부터 생산된 항체 샘플은 CHO/DG44로부터 생산된 항체 샘플에 비해서 높은 ADCC 활성을 나타내었다. 이 결과로부터, 본 실시예에서 제작된 모든 항 CD20 도메인 교환 항체에 있어서도, 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 결합하고 있지 않은 항체 조성물 쪽이, 항체의 Fc에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 결합하고 있는 항체 조성물보다도 ADCC 활성이 향상하는 것이 발견되었다. 또한, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체는 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체보다도 높은 ADCC 활성을 나타내며, IgG1＞IgG3인 것이 확인되었다. 또한, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체는 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체와 동일한 정도의 높은 ADCC 활성을 유지하고 있었다. 또한, 3311형 항 CD20 도메인 교환 항체의 ADCC 활성은 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체와 동일한 정도로 낮은 것이 발견되었다.
5. 각종 항 CD20 항체의 유전자 재조합 Fcγ 수용체 IIIa(이하, FcγRIIIa라고 약기한다)에 대한 결합 활성의 측정
본 실시예 제4항에서 확인된 항 CD20 도메인 교환 항체에 있어서의 ADCC 활성 증강의 메카니즘을 해석하기 위하여, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1(-F), CD20-IgG1(+F), 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3(-F), CD20-IgG3(+F), 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체 1133(-F) 및 1133(+F)의, NK 세포 표면에 발현하는 Fc 수용체 패밀리 FcγRIIIa에 대한 결합 활성을 공지의 방법[Clin. Cancer Res., 10, 6248(2004)]에 따라서 측정하였다.
결과를 도 11에 도시하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, CHO/FUT8-/-로부터 생산된 항체 샘플은 CHO/DG44로부터 생산된 항체 샘플에 비해서, FcγRIIIa에 대한 높은 결합 활성을 나타내었다. 이것으로부터, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 Fc에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스를 제거하는 것에 의한 항체의 ADCC 활성의 상승은, Fc 영역과 Fc 수용체와의 결합 활성의 향상에 기인하는 것이 확인되었다.
이상의 점에서, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 Rituxan과 동일한 가변 영역을 가지며, H쇄의 CH1 도메인 및 힌지 도메인이 인간 IgG1 항체, Fc 영역이 인간 IgG3 항체의 아미노산 서열인 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 및 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체를 상회하는 CDC 활성을 가지며, 또한, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체와 동등한 ADCC 활성을 갖고 있었다. 또한, Fc에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스 함량을 저감함으로써, Fc의 Fc 수용체에 대한 결합 활성이 향상하여, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체와 마찬가지로 ADCC 활성이 향상하는 것이 보여졌다.
이상에서 얻어진 결과를 기초로, 제작한 각 항체 및 도메인 교환 항체의 구조와 활성의 관계에 대해서, 표 3에 정리하였다. 표 중, ADCC 활성 및 CDC 활성은, 활성의 정도를 강한 순으로 ++++, +++, ++, +로 표기하였다.
Figure 112008011757474-pct00003
이상으로부터, 인간 IgG1 항체의 Fc 영역을 인간 IgG3 항체의 Fc 영역으로 치환한 중쇄 정상 영역을 갖는 항체 분자는, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 CDC 활성을 가지며, 또한, 인간 IgG1과 동등한 항체의 높은 ADCC 활성을 유지하고 있는 것이 보여졌다.
실시예 3
동물 세포를 사용한, 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체의 제작
1. 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체 발현 벡터 및 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 발현 벡터의 제작
실시예 2에 있어서, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 Fc 영역(CH2 및 CH3)을 인간 IgG3 항체의 Fc 영역과 치환한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체가 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체보다도 높은 CDC 활성을 나타내었다. 다음으로 Fc 영역을 구성하는 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 CDC 활성에의 관여를 개별적으로 조사하기 위하여, 이하에 서술하는 2종류의 항 CD20 도메인 교환 항체를 제작하였다.
이하의 실시예에 있어서, CH1, 힌지 및 CH3가 인간 IgG1 항체 유래, CH2가 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 정상 영역을 갖는 항 CD20 키메라 항체를 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체, CH1, 힌지 및 CH2가 인간 IgG1 항체 유래, CH3 도메인이 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 정상 영역을 갖는 항 CD20 키메라 항체를 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체라고 각각 칭한다. 어떠한 것에 있어서도, 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, pKANTEX2B8P에 코드되는 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 동일하다.
1131형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 도메인 구조를 표 4에 나타내었다. 또, 1131형의 아미노산 서열은 서열 번호 31에 나타내었다. 이들 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 작성예는 알려져 있지 않으며, 모두 신규의 구조이다. 또한, 도 12에 각 도메인 교환 항체의 모식도를 도시하였다.
구조명 CH1 힌지 CH2 CH3
1113형 IgG1 IgG1 IgG1 IgG3
1131형 IgG1 IgG1 IgG3 IgG1
(1) 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열은, pKANTEX2B8P에 코드되는 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 가변 영역 및 경쇄 정상 영역의 아미노산 서열과 동일하고, CH1, 힌지 및 CH2가 인간 IgG3 항체 유래, CH3 도메인이 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 정상 영역을 갖는 1113형 항 CD20 키메라 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하와 같이 해서 구축하였다.
도 13에 도시한 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8P로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 SmaI(다카라 슈조사 제조)를 사용하여, 인간 IgG1의 CH1 도메인, 힌지 도메인 및 CH2 도메인을 코딩하는 약 700 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 실시예 1의 2항 (2)에 기재된 도 14에 도시한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 pKANTEX93/1133에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 15에 도시한 플라스미드 pKTX93/1113이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 항 CD20 도메인 교환 항체 1131의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 CD20에 특이적으로 반응하며, CH의 CH2 도메인이 인간 IgG3의 아미노산 서열이고, CH1 도메인, 힌지 도메인 및 CH3 도메인이 인간 IgG1의 아미노산 서열인, 도 16에 도시한 1113형 도메인 교환 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하와 같이 해서 구축하였다.
실시예 1의 2항 (2)에 기재된 도 14에 도시한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 pKANTEX93/1133으로부터, 제한 효소 ApaI(다카라 슈조사 제조) 및 SmaI(다카라 슈조사 제조)를 사용해서, 인간 IgG1의 CH1 도메인, 힌지 도메인 및 인간 IgG3의 CH2 도메인을 코딩하는 약 700 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 도 13에 도시한 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 발현 벡터 pKANTEX2B8P에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA를 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)에 의해 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 도 16에 도시한 플라스미드 pKTX93/1131이 얻어진 것을 확인하였다.
2. 항 CD20 도메인 교환 항체 1113형 및 1131형의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 항 CD20 도메인 교환 항체 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-를 숙주 세포로 해서 도입하고, 도메인 교환된 항 CD20 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 순서로 제작하였다.
3. 항 CD20 도메인 교환 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 또는 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 순서로, 배양해서, 정제하였다. 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체는 Prosep-G 칼럼을 사용하여 정제를 행하였다. 또한, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체, 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체를 Prosep-A 칼럼을 사용하여 정제를 행한 결과, 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체만 정제가 가능하였다.
각 도메인 교환 항체의, 발현 벡터, 숙주 세포 및 정제한 항체의 이름의 대응을 표 5에 나타내었다.
발현 벡터 숙주 세포 정제 항체(명칭)
pKTX93/1113 CHO/FUT8-/- 1113 (-F)
pKTX93/1131 CHO/FUT8-/- 1131 (-F)
4. 정제 항 CD20 도메인 교환 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플의 정제도를 측정하기 위하여, 실시예 1의 제6항과 동일한 순서로 SDS-PAGE를 행하였다. 영동도의 비교 대조로서, 실시예 1의 제5항에서 제작한 각종 정제 샘플 CD20-IgG1형, CD20-IgG3형 및 1133형에 대해서도 동일한 조작을 행하였다.
결과를 도 17에 도시하였다. 1113형 및 1131형은, 각각 CD20-IgG1형 및 1133형과 유사한 영동 패턴을 나타내었다. 1113형 및 1131형을 구성하는 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 각각 유사하며, H쇄가 약 50 kDa, L쇄가 약 24 kDa이다. 이들의 분자량은, CD20-IgG1형 및 1133형의 H쇄 및 L쇄의 분자량과 유사하고, 영동 패턴도 유사한 것으로부터, 1113형 및 1131형은 목적의 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다. 또한, CD20-IgG3형을 구성하는 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 약 24 kDa로 CD20-IgG1형과 유사하지만, H쇄가 약 54 kDa로 CD20-IgG1형의 H쇄보다도 크기 때문에, CD20-IgG3형의 L쇄는 CD20-IgG1형의 L쇄와 유사한 위치에 나타나고 있으나, H쇄는 CD20-IgG1형의 H쇄보다도 고분자량측에 위치하였다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적으로 하는 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 4
항 CD20 도메인 교환 항체 1131형 및 1113형의 활성 평가
실시예 3의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플에 대하여, 각종 활성 비교를 이하와 같이 해서 행하였다.
1. 항 CD20 도메인 교환 항체 1113형 및 1131형의 CDC 활성
실시예 1의 제5항에서 얻어진 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1형, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3형, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체, 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체에 대하여, CD20 양성 세포주에 있어서의 in vitro CDC 활성을 평가하기 위해서, 모두 CD20 양성인 ST486 세포 또는 Raji 세포를 사용하여, 실시예 2의 제2항과 동일한 순서로 시험을 행하였다.
결과를 도 18에 도시하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, ST486 세포주(도 18A)와 Raji 세포주(도 18B)의 어느 것에 있어서도, CD20-IgG3(-F)의 CDC 활성은 CD20-IgG1(-F)의 CDC 활성보다도 높고, 1133(-F)의 CDC 활성은 CD20-IgG3(-F)의 CDC 활성보다도 높았다. 이에 더하여, 1113(-F) 및 1131(-F)의 CDC 활성은 CD20-IgG3(-F)의 CDC 활성보다 높았다. 또한, 1131(-F)의 CDC 활성이 1113(-F)의 CDC 활성보다도 높았다. 이들의 결과로부터, IgG1의 Fc를 IgG3의 Fc로 치환하는 것에 의한 CDC 활성의 상승에 있어서, IgG3 유래의 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 양자가 기여하고 있는 것이 발견되었다. 또한 상기의 결과로부터, CH2 도메인과 CH3 도메인 중, CH2 도메인의 기여가 보다 큰 것도 발견되었다.
2. CD20 양성 세포주에 대한 ADCC 활성의 평가
실시예 1의 제5항에서 얻어진 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG3, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체, 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체에 대해서, 표적 세포로서 CD20 양성인 Daudi 세포를 사용하여 in vitro ADCC 활성을, 실시예 2의 제5항과 동일한 순서로 측정하였다. 측정에는, Cytotox 96 키트(Promega사 제조)를 사용하였다.
결과를 도 19에 도시하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 1113(-F) 및 1131(-F)도 CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)과 동등한 ADCC 활성을 나타내고 있으며, 이러한 점들은 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인을 인간 IgG3로 도메인 교환하더라도, ADCC 활성은 IgG1과 동등하다는 것을 나타내고 있다.
이상의 점에서, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체와 동일한 가변 영역을 가지며, 중쇄 정상 영역의 CH2 도메인 또는 CH3 도메인만이 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 이외의 도메인은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 이루어지는 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG3 항 CD20 키메라 항체를 상회하는 CDC 활성, 및 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체와 동등한 ADCC 활성을 갖는 것이 확인되었다.
이상에서 얻어진 결과를 기초로, 제작된 각 항체 및 도메인 교환 항체의 구조와 활성의 관계에 대해서, 표 6에 정리하였다. 표 중, ADCC 활성 및 CDC 활성은, 활성의 정도를 강한 순으로 ++++, +++, ++, +로 표기하였다. 또한, 프로테인 A 결합에 대해서는, 프로테인 A에의 결합 활성을 갖는 것은 +, 갖지 않는 것은 -로 나타내었다.
Figure 112008011757474-pct00004
이상으로부터, 인간 IgG1 항체의 중쇄 정상 영역 중, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 중쇄 정상 영역을 갖는 항체 분자(1133형 도메인 교환 항체)의 높은 CDC 활성은, 인간 IgG1 항체의 중쇄 정상 영역 중, CH2 도메인만을 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 중쇄 정상 영역을 갖는 항체 분자(1131형 도메인 교환 항체)에 있어서도 대부분이 유지되는 것이 명백해졌다. 또한, 인간 IgG1 항체의 중쇄 정상 영역 중, CH2 도메인만을 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 중쇄 정상 영역을 갖는 항체 분자(1131형 도메인 교환 항체)는, 인간 IgG1 항체와 동등한 높은 ADCC 활성을 유지하고 있는 것, 또한 Fc에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스를 제거함으로써 더욱 ADCC 활성이 증강하는 것이 보여졌다.
실시예 5
항 CD20 도메인 교환 항체의 각종 유전자 재조합 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성의 측정
실시예 1의 제5항에서 얻어진, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체 CD20-IgG1 및 CD20-IgG1(+F), 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체 1133(-F) 및 1133(+F)의 Fc 수용체 패밀리 FcγRI, 및 FcγRIIa에 대한 결합 활성을 공지의 방법[Clin. Cancer Res., 10, 6248(2004)]에 따라서 측정하였다.
결과를 도 20에 도시하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체는, FcγRI에 대해서도, FcγRIIa에 대해서도, IgG1 항 CD20 항체와 동일한 결합 활성을 나타내었다. 이것은, IgG1 항체의 CH2 및 CH3를 IgG3 항체의 아미노산 서열로 치환하는 것이, Fc 수용체 패밀리 FcγRI, 및 FcγRIIa에의 결합 활성에 영향을 끼치지 않는 것을 나타내고 있다.
또한, 도 20에 도시된 바와 같이, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체에 있어서도, IgG1 항 CD20 항체에 있어서도, Fc에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스의 유무에 관계없이, 각 항체는 동일한 결합 활성을 나타내었다. 이상의 결과는, Fc에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민에 결합하는 푸코스의 유무는, Fc 수용체 패밀리 FcγRI 및 FcγRIIa에의 결합 활성에 영향을 끼치지 않고, IgG1과 동등하다는 것을 나타내고 있다.
실시예 6
동물 세포를 사용한, 인간 IgG1 항체의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인간 IgG3 항체의 동일한 EU 인덱스에 상당하는 폴리펩티드로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 제작
1. CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 구축
실시예 4의 1항에서 발견된 바와 같이, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 양방을 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환하는 것이, 인간 IgG1 항체의 CDC 활성 증강에 크게 기여하는 것이 명백해졌다.
한편으로, 실시예 1의 5항에서 발견된 바와 같이, 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체 및 1113형 항 CD20 도메인 교환 항체는 인간 IgG3 항체와 마찬가지로 프로테인 A에 결합하지 않으나, 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체는 인간 IgG1 항체와 마찬가지로 프로테인 A에 결합하는 것은, 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 이루어지는 CH3 도메인이 프로테인 A에의 결합에 기여하고 있다는 것을 시사하고 있다.
항체를 의약품으로서 제조하는 경우에는, 항체 정제의 용이함에서 항체가 프로테인 A에의 결합 활성을 갖는 것이 중요하다. 그래서, IgG1의 CH2 도메인을 완전히 인간 IgG3 항체 유래의 CH2 도메인으로 치환하고, IgG1의 CH3 도메인을 부분적으로 인간 IgG3 항체 유래의 CH3 도메인으로 치환함으로써, CDC 활성이 1133형과 동등하며, 프로테인 A 결합 활성도 갖는 도메인 교환 항체의 제작을 행하였다.
본 실시예에서 설계한 여러 가지 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 모식도를 도 21에 도시한다. 이들 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 알려져 있지 않으며, 모두 신규의 구조이다. IgG 항체의 CH2 도메인은 EU 인덱스로 231번째로부터 340번째에 위치하는 아미노산 잔기로 이루어지며, CH3 도메인은 EU 인덱스로 341번째로부터 447번째에 위치하는 아미노산 잔기로 이루어진다.
113A형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 356번째까지에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113B형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 358번째까지에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113C형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 384번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113D형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 392번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113E형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 397번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113F형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 422번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113G형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 434번째와 436번째로부터 447번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
113H형 항 CD20 도메인 교환 항체는, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 435번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체이다.
이들 각종 항 CD20 도메인 교환 항체를 이하에 나타내는 순서로 제작하였다.
각종 항 CD20 도메인 교환 항체는, 각종 도메인 교환 항체의 CH3 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 조제하고, 이것을 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 pKTX93/1133의 CH3 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 서열과 치환함으로써 제조할 수 있다. CH3 도메인의 유전자 서열의 치환은, CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I와, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I를 사용하여 행할 수 있다.
(1) 113A형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 356번째까지에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113A형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113A형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 33에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 34에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 356번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 357번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 35 및 36에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 서열 번호 35 및 36에 나타나는 염기 서열은, 각각, 서열 번호 34에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머의 염기 서열이다. 서열 번호 35 및 36에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드를 주형으로 해서 PCR을 행하였다. 2개의 합성 올리고 DNA가 각각 최종 농도 0.5 μM이 되도록, PCR 반응액[0.05 units/uL KOD DNA Polymerase(도요 보세키사 제조), 0.2 mM dNTPs, 1 mM 염산마그네슘, 1/10 체적의 10배 농축 PCR Buffer #2(도요 보세키사 제조, KOD DNA Polymerase에 첨부)]을 조제하고, DNA 서멀 사이클러(thermal cycler) GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여, 94℃에서 4분간 가열한 후, 1사이클이 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 74℃에서 60초간의 3행정으로 이루어지는 반응을 합계 25사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여, 약 300 bp의 PCR 산물을 회수하였다. 회수한 PCR 산물을 제한 효소 Bsp1407 I(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 Nru I(다카라 슈조사 제조)로 소화 처리한 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용해서, 약 300 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v 3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 113A형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113A가 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 113B형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 358번째까지에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113B형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 항 CD20 도메인 교환 항체 113B형의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 37에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 38에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 358번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 359번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 39에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 서열 번호 39에 나타나는 염기 서열은 서열 번호 38에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 센스 프라이머의 염기 서열이며, 서열 번호 36으로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 안티센스 프라이머와 쌍으로 해서 사용하였다. 서열 번호 39 및 36에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드를 주형으로 해서 PCR을 행하였다. 이후, 본 항의 (1)과 동일한 순서로 113B형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113B를 제작하였다.
(3) 113C형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 384번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113C형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113C형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 40에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 41에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 384번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 385번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 42 및 43에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 서열 번호 42 및 43에 나타나는 염기 서열은, 서열 번호 41에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 합성 올리고 DNA의 염기 서열이다. 서열 번호 42에 나타나는 염기 서열의 3'말단측과 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열의 5'말단측은 20 bp 정도가 서로 상보 서열적으로 중복하고 있으며, PCR시에 어닐링이 일어나도록 설계하였다. 서열 번호 42 및 43에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), PCR을 행하였다. 2개의 합성 올리고 DNA가 각각 최종 농도 0.2 μM이 되도록, PCR 반응액[0.02 units/uL KOD+ DNA Polymerase(도요 보세키사 제조), 0.2 mM dNTPs, 1 mM 황산마그네슘, 1/10 체적의 10배 농축 PCR Buffer(도요 보세키사 제조, KOD+ DNA Polymerase에 첨부)]을 조제하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여, 94℃에서 4분간 가열한 후, 1사이클이 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 3행정으로 이루어지는 반응을 합계 25사이클 행하였다. 이후, 본 항의 (1)과 동일한 순서로 113C형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113C를 제작하였다.
(4) 113D형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 392번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113D형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113D형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 44에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 392번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 393번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 46에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 서열 번호 46에 나타나는 염기 서열은 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 합성 올리고 DNA의 염기 서열이며, 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 합성 올리고 DNA와 쌍으로 해서 사용한다. 서열 번호 46에 나타나는 염기 서열의 3'말단측과 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열의 5'말단측은 20 bp 정도가 서로 중복하고 있으며, PCR시에 어닐링이 일어나도록 설계하였다. 서열 번호 46 및 43에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), PCR을 행하였다. 이후, 본 항의 (3)과 동일한 순서로 113D형 항 CD20 도메인교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113D를 제작하였다.
(5) 113E형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 397번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113E형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113E형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 47에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 48에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 397번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 398번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 49에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 서열 번호 49에 나타나는 염기 서열은, 서열 번호 48에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 합성 올리고 DNA의 염기 서열이며, 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 합성 올리고 DNA와 쌍으로 해서 사용한다. 서열 번호 49에 나타나는 염기 서열의 3'말단측과 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열의 5'말단측은 20 bp 정도가 서로 중복하고 있으며, PCR시에 어닐링이 일어나도록 설계하였다. 서열 번호 49 및 43에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), PCR을 행하였다. 이후, 본 항의 (3)과 동일한 순서로 113E형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113E를 제작하였다.
(6) 113F형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 422번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113F형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113F형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 50에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 51에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 422번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 423번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 서열 번호 39 및 36에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 실시예 1의 제1항에서 제작한 인간 IgG3 항 CD20 인간형 키메라 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKANTEX2B8γ3를 주형으로 해서 PCR을 행하였다. 이후, 본 항의 (1)과 동일한 순서로 113F형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113F를 제작하였다.
(7) 113H형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 435번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113H형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113H형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 52에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 53에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 435번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 436번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 54에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 서열 번호 54에 나타나는 염기 서열은, 서열 번호 53에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 안티센스 프라이머의 염기 서열이며, 서열 번호 39로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 센스 프라이머와 쌍으로 해서 사용한다. 서열 번호 39 및 54에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 실시예 1의 제1항에서 제작한 인간 IgG3 항 CD20 인간형 키메라 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKANTEX2B8γ3를 주형으로 해서 PCR을 행하였다. 이후, 본 항의 (1)과 동일한 순서로 113H형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113H를 제작하였다.
(8) 113G형 항 CD20 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 중쇄 정상 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, 인간 IgG3 항체의 EU 인덱스로 231번째로부터 434번째 및 436번째로부터 447번째에 상당하는 폴리펩티드로 치환된 도메인 교환 항체 113G형을 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 22). 113G형 항 CD20 도메인 교환 항체의 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 55에 나타내는 바와 같다.
우선, 서열 번호 56에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터상의, 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열 중의 5'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Bsp1407 I로부터 중쇄 CH3 도메인을 코딩하는 염기 서열의 3'말단측에 위치하는 제한 효소 인식 서열 Nru I까지의 서열을 기초로 하고, 상기 염기 서열에 코드되는 아미노산 서열 중, N말단측으로부터 EU 인덱스로 434번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 435번째의 아미노산 서열은 인간 IgG1 항체 유래의 아미노산 서열, EU 인덱스로 436번째로부터 447번째까지의 아미노산 서열은 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 하였다. 다음으로, 서열 번호 57에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 서열 번호 57에 나타나는 염기 서열은 서열 번호 56에 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하기 위한 안티센스 프라이머의 염기 서열이며, 서열 번호 39로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 센스 프라이머와 쌍으로 해서 사용한다. 서열 번호 39 및 56에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 실시예 1의 제1항에서 제작한 인간 IgG3 항 CD20 인간형 키메라 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKANTEX2B8γ3를 주형으로 해서 PCR을 행하였다. 이후, 본 항의 (1)과 동일한 순서로 113G형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/113G를 제작하였다.
2. CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-를 숙주 세포로 해서 각각 도입하고, CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 순서로 제작하였다.
3. CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 순서로, 배양, 정제하였다. 정제에는 Prosep-G 칼럼을 사용하였다. 각 개변 항체의, 발현 벡터, 숙주 세포, 정제한 항체의 이름, 중쇄 정상 영역의 아미노산 서열의 대응을 표 7에 나타내었다.
Figure 112008011757474-pct00005
4. 정제된 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 실시예 1의 제6항과 동일한 순서로 SDS-PAGE를 행하였다. 영동도의 비교 대조로서, 실시예 1의 제5항에서 제작한 정제 샘플 CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)에 대해서도 동일한 조작을 행하였다.
결과를 도 23에 도시하였다. 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플은, 각각 CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)과 유사한 영동 패턴을 나타내었다. 각종 항 CD20 도메인 교환 항체를 구성하는 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량은 각각 유사하며, H쇄가 약 50킬로달톤(이하, kDa라고 표기한다), L쇄가 약 24 kDa이다. 이들의 분자량은, CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)의 H쇄 및 L쇄의 분자량과 유사하고, 영동 패턴도 유사한 것으로부터, 각종 항 CD20 도메인 교환 항체는 목적으로 하는 H쇄 및 L쇄로 구성되어 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적으로 하는 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것이 확인되었다.
실시예 7
CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 활성 평가
실시예 6의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플에 대하여, 각종 활성 비교를 이하와 같이 해서 행하였다.
1. CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 CDC 활성의 측정
실시예 6의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플, 실시예 1의 제5항에서 얻어진 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체, 및 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1131형 항 CD20 도메인 교환 항체에 대해서, 인간 CD20 유전자 도입 세포주 CD20/EL4-A[클리니컬·캔서·리서치(Clin. Cancer Res.), 11, 2327(2005)]에 있어서의 in vitro CDC 활성을 측정하였다. 반응은 96웰 평저 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조) 내에서 행하고, 각 반응웰에는, 5×104개의 표적 세포를 포함하며, 각종 농도(0.1 ㎍/mL∼30 ㎍/mL)로 항 CD20 도메인 교환 항체를 포함하는 인간 보체 희석 배지를 150 μL씩 나누어 주입하였다. 이하, 실시예 2의 제2항과 동일한 순서로 시험을 행하였다.
결과를 도 24에 도시하였다. 각종 항 CD20 도메인 교환 항체는 모두 1131(-F)과 동등, 또는 그 이상의 CDC 활성을 나타내고, 특히 113E(-F), 113F(-F), 113G(-F), 113H(-F)는 1131(-F)보다도 현저히 높은 CDC 활성을 나타내었다.
2. CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 프로테인 A 결합 활성의 측정(ELISA법)
실시예 6의 제3항에서 얻어진 각종 항 CD20 도메인 교환 항체 정제 샘플, 실시예 1의 제5항에서 얻어진 CD20-IgG1(-F), CD20-IgG3(-F), 1133(-F), 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1131(-F) 및 1113(-F)에 대해서, 프로테인 A와의 결합 활성을 이하에 서술하는 순서로 측정하였다.
염소 항 인간 카파쇄(kappa chain) 항체(Sigma-Aldrich사 제조)를 PBS로 희석하여 5 ㎍/mL로 하고, 96 구멍의 ELISA용 플레이트(그라이너사 제조)에, 50 μL/웰로 나누어 주입하며, 실온에서 1시간 정치하여 흡착시켰다. 반응 후, PBS로 세정한 후, 1% BSA-PBS를 100 μL/웰로 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켜서 잔존하는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 제거한 후, 측정 대상의 항체를 각종 농도(0.01 ㎍/mL∼10 ㎍/mL)로 50 μL/웰로 첨가하며, 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 Tween-PBS로 세정한 다음, PBS로 5000배로 희석한 페록시다아제 표식 프로테인 A 용액(Amersham Bioscience사 제조)을 50 μL/웰로 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. Tween-PBS로 세정한 후, ABTS 기질액을 50 μL/웰로 첨가하여 발색시켜, OD415를 측정하였다.
결과를 도 25에 도시하였다. 우선, CD20-IgG1(-F), CD20-IgG3(-F), 1133(-F), 1131(-F) 및 1113(-F)에 대해서 프로테인 A에의 결합 활성을 비교하였다(도 25A). 도 25A에 도시된 바와 같이, CD20-IgG1(-F) 및 1131(-F)은 모두 농도 의존적인 프로테인 A 결합 활성을 나타내며, 그 활성은 동등하였다. 한편으로, CD20-IgG3(-F), 1133(-F) 및 1113(-F)에 대해서는, 측정한 농도역(濃度域)(10 ㎍/mL 이하)에서는 프로테인 A 결합 활성은 보여지지 않았다
다음으로, 각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 프로테인 A 결합 활성을 CD20-IgG1(-F) 및 1133(-F)과 비교하였다. 도 25B에 도시된 바와 같이, 1133(-F) 및 113H(-F)는 프로테인 A 결합 활성을 나타내지 않았으나, 113A(-F), 113B(-F), 113C(-F), 113D(-F), 113E(-F), 113F(-F) 및 113G(-F)는 IgG1과 동등한 프로테인 A 결합 활성을 나타내었다.
각종 항 CD20 도메인 교환 항체에 있어서의 CDC 활성과 프로테인 A 결합 활성의 강도를 표 8에 나타내었다.
Figure 112008011757474-pct00006
IgG1 항체의 CH2 및 CH3를 IgG3의 아미노산 서열로 치환한 1133형 도메인 교환 항체에서는 CDC 활성은 상승하였으나, 프로테인 A 결합 활성을 상실하였다. 한편, IgG1 항체의 CH2만을 IgG3의 아미노산 서열로 치환한 1131형 항체에서는, 프로테인 A 결합 활성은 유지하였으나, CDC 활성의 증강 비율이 저하하였다. 본 실시예에서 작성한, CH2 도메인의 전부와 CH3 도메인의 일부를 대응하는 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열로 치환한 각종 항 CD20 도메인 교환 항체는, 113H(-F)를 제외한 모두가 IgG1보다도 높은 CDC 활성, 및 프로테인 A 결합 활성을 갖고 있었다. 또한, CH3 도메인 전체에 차지하는 인간 IgG3 항체 유래의 아미노산 서열의 비율이 비교적 많은 113E(-F), 113F(-F) 및 113G(-F)는 1131(-F)보다도 높은 CDC 활성을 나타내고, 또한, 인간 IgG1 항체와 동일한 프로테인 A 결합 활성을 갖고 있었다. 인간 IgG1 항체와 동일한 프로테인 A 결합 활성을 갖는 항 CD20 도메인 교환 항체 중에서는, 특히 113F(-F)의 CDC 활성이 높았다.
이상의 점에서, IgG1 항체의 CH2 도메인의 전부를 인간 IgG3 항체 유래의 CH2 도메인으로 치환하고, 또한, CH3 도메인의 일부를 인간 IgG3 항체 유래의 CH3 도메인으로 치환한 항체는, IgG1 항체의 CH2 도메인만을 인간 IgG3 항체 유래의 CH2 도메인으로 치환한 항체보다도 크게 CDC 활성이 증강되며, 또한, 인간 IgG1 항체와 동일한 프로테인 A 결합 활성을 유지하는 것이 명백해졌다.
실시예 8
각종 항 CD20 도메인 교환 항체의 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포에 대한 CDC 활성 평가
실시예 1의 제5항에서 얻어진 CD20-IgG1(-F), 실시예 1의 제5항에서 얻어진 1133(-F), 실시예 3의 제3항에서 얻어진 1131(-F), 실시예 6의 제3항에서 얻어진 113F(-F)에 대하여, 모두 CD20 양성 CLL 세포주인 MEC-1(DSMZ: ACC497), MEC-2(DSMZ: ACC500) 및 EHEB(DSMZ: ACC67)에 대한 in vitro CDC 활성을 측정하였다. 반응은 96웰 평저 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조) 내에서 행하고, 각 반응웰에는, 5×104개의 표적 세포를 포함하며, 각종 농도(0.04 ㎍/mL∼100 ㎍/mL)로 항 CD20 항체를 포함하는 인간 보체 희석 배지를 150 μL씩 나누어 주입하였다. 이하, 실시예 2의 제2항과 동일한 순서로 시험을 행하였다.
결과를 도 26에 도시하였다. MEC-1(도 26A), MEC-2(도 26B) 및 EHEB(도 26C)의 어떠한 CD20 양성 CLL 세포주에 있어서도, 1133(-F), 1131(-F) 및 113F(-F)는 C D20-IgG1과 비교해서 CDC 활성이 현저히 증강되었다. 이상의 결과는, 이들 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약은, CLL의 치료에 유효하다는 것을 시사하고 있다.
실시예 9
동물 세포를 사용한, 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 및 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 제작
1. 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 및 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 발현 벡터 구축
실시예 4의 1항에서 행한 항 CD20 도메인 교환 항체 1131(-F)과 1113(-F)의 CDC 활성 비교에 있어서, 1131(-F)과 1113(-F)은 모두 IgG1을 상회하는 CDC 활성을 나타내었으나, 특히 1131(-F)은 1113(-F)을 상회하는 CDC 활성을 나타내어, CH2 도메인이 IgG3인 것이 CDC 활성 증강에 크게 기여하고 있는 것이 명백해졌다. 다른 항원에 대한 항체에 있어서도, 동일한 CDC 활성 증강이 보여지는 것을 확인하기 위해서, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H에 대해서도, 인간 IgG1, 1133형 및 1131형을 제작하고, CDC 활성을 비교하였다.
(1) 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 Campath 항원(CD52)을 특이적으로 인식하며, 중쇄 정상 영역 아미노산 서열 중, CH1 및 힌지가 인간 IgG1의 아미노산 서열, CH2 및 CH3가 인간 IgG3의 아미노산 서열인 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 27).
우선, National Center of Biotechnology Information(NCBI)의 데이터 베이스로부터, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역(Accession: S79311) 및 경쇄 가변 영역(Accession: S79307)의 아미노산 서열 및 유전자 서열을 입수하였다. 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 58에, 유전자 서열을 서열 번호 59에, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 60에, 유전자 서열을 서열 번호 61에 각각 나타내었다. 이들의 서열 정보를 기초로, 서열 번호 62로 나타나는, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역과 1133형 중쇄 정상 영역 서열로 이루어지는 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 중쇄의 아미노산 서열, 및, 서열 번호 63으로 나타나는, 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 경쇄 가변 영역과 인간 항체 경쇄 정상 영역 서열로 이루어지는 항 Campath 항체 경쇄의 아미노산 서열을 각각 설계하였다.
다음으로, 서열 번호 64에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 서열 번호 59에 나타나는 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역 유전자 서열의, 5'말단측에 제한 효소 Not I 인식 서열을, 3'말단측에 제한 효소 Apa I 인식 서열을 부가한 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 64에 나타나는 염기 서열을 기초로, 서열 번호 65, 66, 67 및 68에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 이들의 서열은, 서열 번호 64에 나타나는 염기 서열을 4분할한 염기 서열이며, 또한, 인접하는 서열끼리가 대략 20 bp의 중복을 갖고, 센스쇄와 안티센스쇄가 교대로 되 도록 설계하였다.
실제로는, 서열 번호 65, 66, 67 및 68에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 이들을 사용하여 PCR을 행하였다. 양단에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.5 μM이 되도록, 내측에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.1 μM이 되도록, PCR 반응액[0.02 units/uL KOD+ DNA Polymerase(도요 보세키사 제조), 0.2 mM dNTPs, 1 mM 황산마그네슘, 1/10 체적의 10배 농축 PCR Buffer(도요 보세키사 제조, KOD DNA Polymerase에 첨부)]을 조제하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여, 94℃에서 4분간 가열한 후, 1사이클이 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 3행정으로 이루어지는 반응을 합계 25사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여, 약 480 bp의 PCR 산물을 회수하였다. 회수한 PCR 산물을 제한 효소 Not I(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 Apa I(다카라 슈조사 제조)로 소화 처리한 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용해서, 약 450 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 실시예 2의 제2항에서 제작한 1133형 항 CD20 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 중쇄 가변 영역을 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열로 치환한 1133형 발현 벡터 플라스미드가 얻어진 것을 확인하였다.
다음으로, 서열 번호 69에 나타나는 염기 서열을 설계하였다. 상기 서열은, 서열 번호 61에 나타나는 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 경쇄 가변 영역 유전자 서열의, 5'말단측에 제한 효소 EcoR I 인식 서열을, 3'말단측에 제한 효소 BsiW I 인식 서열을 부가한 염기 서열이다. 또한, 서열 번호 69에 나타나는 염기 서열을 기초로, 서열 번호 70, 71, 72 및 73에 나타나는 염기 서열을 각각 설계하였다. 이들의 서열은, 서열 번호 69에 나타나는 염기 서열을 4분할한 염기 서열이며, 또한, 인접하는 서열끼리가 대략 20 bp의 중복을 갖고, 센스쇄와 안티센스쇄가 교대로 되도록 설계하였다. 이들의 염기 서열로 나타나는 4개의 합성 올리고 DNA를 사용하여 PCR을 행함으로써, 각각이 인접하는 서열과의 중복 서열을 통해서 연결되며, 서열 번호 69에 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 증폭시켰다.
실제로는, 서열 번호 70, 71, 72 및 73에 나타나는 염기 서열의 합성 올리고 DNA를 각각 제작하고(파스맥사 제조), 이들을 사용하여 PCR을 행하였다. 양단에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.5 μM이 되도록, 내측에 위치하는 2개의 합성 올리고 DNA는 각각 최종 농도 0.1 μM이 되도록, PCR 반응액[0.02 units/uL KOD+ DNA Polymerase(도요 보세키사 제조), 0.2 mM dNTPs, 1 mM 황산마그네슘, 1/10 체적의 10배 농축 PCR Buffer(도요 보세키사 제조, KOD DNA Polymerase에 첨부)]을 조제하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여, 94℃에서 4분간 가열한 후, 1사이클이 94℃에서 30초간, 50℃에서 30초간, 68℃에서 60초간의 3행정으로 이루어지는 반응을 합계 25사이클 행하였다. PCR 반응 종료 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여, 약 420 bp의 PCR 산물을 회수하였다. 회수한 PCR 산물을 제한 효소 EcoR I(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 BsiW I(도요 보세키사 제조)로 소화 처리한 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용해서, 약 400 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 본 항에서 제작한, 중쇄 가변 영역을 인간화 항 Campath 항체 Campath-1H의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열로 치환한 1133형 발현 벡터 플라스미드에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 13 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 1133형 항 Campath 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/Campath1H-1133이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 인간 IgG1 항 Campath 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 Campath 항원(CD52)을 특이적으로 인식하며, 중쇄 정상 영역이 인간 IgG1의 아미노산 서열인 인간 IgG1 항 Campath 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 28).
본 항에서 제작한 1133형 항 Campath 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/Campath1H-1133을, 제한 효소 EcoR I(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 Apa I(다카라 슈조사 제조)로 소화 처리한 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용해서, 약 3300 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 인간 IgG1 항 CD20 키메라 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKANTEX2B8P에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 10 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 인간 IgG1 항 Campath 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/Campath1H-IgG1이 얻어진 것을 확인하였다.
(3) 1131형 항 Campath 항체의 유전자 서열을 코딩하는 발현 벡터의 구축
인간 Campath 항원(CD52)을 특이적으로 인식하며, 중쇄 정상 영역 아미노산 서열 중, CH1 및 힌지가 인간 IgG1의 아미노산 서열, CH2가 인간 IgG3의 아미노산 서열, CH3가 인간 IgG1의 아미노산 서열인 인간 1131형 항 Campath 항체를 코딩하는 발현 벡터를 이하에 나타내는 순서로 구축하였다(도 29).
본 항에서 제작한 1133형 항 Campath 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/Campath1H-1133을, 제한 효소 EcoR I(다카라 슈조사 제조) 및 제한 효소 Apa I(다카라 슈조사 제조)로 소화 처리한 후, 상기 반응액을 아가로오스 겔 전기영동에 제공하고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용해서, 약 3300 bp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 한편으로, 실시예 3의 제1항에서 제작한 1131형 항 CD20 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/1131에 대하여 동일한 제한 효소 처리를 행하고, 약 10 kbp의 DNA 단편을 잘라내어 정제하였다. 이들의 정제 DNA 단편을 혼합한 후, Ligation High 용액(도요 보세키사 제조)을 첨가하여 연결 반응을 행하고, 상기 반응액을 사용하여 대장균 XL1-BLUE MRF'주(Stratagene사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주의 클론으로부터 각각 플라스미드 DNA를 조제하고, Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라서 반응시킨 후, 같은 회사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer에 의해 각 플라스미드에 삽입된 DNA의 염기 서열을 해석하여, 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 발현 벡터 플라스미드 pKTX93/Campath1H-1131이 얻어진 것을 확인하였다.
2. 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 및 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 동물 세포에서의 안정 발현
본 실시예의 제1항에서 제작한 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 및 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 발현 벡터를, 실시예 1의 제3항에 기재된 CHO/FUT8-/-를 숙주 세포로 해서 각각 도입하고, 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 또는 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체를 안정적으로 생산하는 세포를 실시예 1의 제3항과 동일한 순서로 각각 제작하였다.
3. 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 및 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 정제
본 실시예의 제2항에서 얻어진 인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 또는 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체를 발현하는 형질 전환주의 각각을, 실시예 1의 제5항과 동일한 순서로, 배양, 정제하였다. 각 개변 항체의, 발현 벡터, 숙주 세포, 정제한 항체의 이름의 대응을 표 9에 나타내었다.
Figure 112008011757474-pct00007
4. 정제된 각종 항 Campath 항체의 SDS-PAGE에 의한 정제도의 평가
본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 개변 항체 정제 샘플의 정제도를 평가하기 위해서, 실시예 1의 제6항과 동일한 순서로 SDS-PAGE를 행하여, 본 실시예의 제3항에서 얻어진 각종 개변 항체 정제 샘플 중에는, 각각 H쇄 및 L쇄로 구성되는 목적으로 하는 IgG 분자가 충분한 비율로 포함되는 것을 확인하였다.
실시예 10
인간 IgG1 항 Campath 항체, 1133형 항 Campath 도메인 교환 항체 및 1131형 항 Campath 도메인 교환 항체의 CDC 활성 측정
실시예 9의 제3항에서 얻어진 각종 항 Campath 항체 정제 샘플 Campath1H-IgG1, Campath1H-1133 및 Campath1H-1131에 대하여, Campath 항원 양성인 CLL 세포주 MEC-1, MEC-2 및 EHEB에 대한 in vitro CDC 활성을 측정하였다. 실시예 8과 동일한 순서로 시험을 행하여, MEC-1, MEC-2 및 EHEB의 어떠한 세포주에 있어서도, Campath1H-1133 및 Campath1H-1131은 Campath1H-IgG보다도 높은 CDC 활성을 나타내었다.
본 발명에 따르면, 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환된, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체 의존성 세포 상해 활성을 나타내는 유전자 재조합 항체 조성물, 상기 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자 또 는 상기 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체, 상기 형질 전환체를 사용한 유전자 재조합 항체 조성물의 생산 방법, 및 상기 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약을 제공할 수 있다.
<서열표 프리텍스트>
서열 번호 1-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 2-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 4-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 5-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 6-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 7-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 8-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 9-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 10-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 11-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 12-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 13-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 14-인공 서열의 설명: 합성 DNA
서열 번호 15-인공 서열의 설명: 합성 DNA
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SEQUENCE LISTING <110> KYOWA HAKKO KIRIN, CO., LTD. <120> RECOMBINANT ANTIBODY COMPOSITION <130> 1000P11749 <150> JP2005-212979 <151> 2005-7-22 <150> JP2006-108216 <151> 2006-4-11 <160> 85 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 caaaggtacc caagggccca tcggtcttcc 30 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 gtttggatcc tcgcgagtcg cactcattta cccggagaca gggag 45 <210> 3 <211> 1130 <212> DNA <213> Homo Sapience <400> 3 cttccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 acacctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagctca 300 aaaccccact tggtgacaca actcacacat gcccacggtg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 gggggtaccg ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctctggggg 60 cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg 120 gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg 180 actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta 240 cacctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa 300 atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc 360 gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 420 ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgaagct tggg 454 <210> 5 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 gggggtaccg ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctctggggg 60 cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg 120 gaactcagg 129 <210> 6 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 ggtctgggtg 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 12 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 60 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacc 119 <210> 13 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 gcatctagga caagtatgtg tggtgtctcc gagaggtgtt ttgagctcaa ctctcttgtc 60 caccttggtg ttgctgggct tgtgattcac gttgcagatg taggtctggg tgcccaagct 120 gc 122 <210> 14 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 14 ccacacatac ttgtcctaga tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct cccccgtgcc 60 cacggtgccc agagcccaaa tcttgtgaca cacctccccc atgcccacgg tgcccagagc 120 ccaaatcttg tgacacacct ccaccctgtc ccagatgtcc tgcacctgag c 171 <210> 15 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 15 cccaagcttc acgtccacca ccacgcacgt gacctcaggg gtccgggaaa 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gagccccagg gatccaggag 120 gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180 tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240 ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300 tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360 gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420 ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480 aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540 gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600 ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660 tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720 tacagggaaa ccacggaggc agttcatcta ctcactggac ctagcccggc tcttcatctg 780 ggtcctgcgg gagtacaatg aagttgagcc catcatcctc tcagtgggcg aggaagatga 840 agtctccatt aaggaggcag ctgaggctgt agtggaggcc atggacttct gtggggaagt 900 cacttttgat tcaacaaagt cagatgggca gtataagaag acagccagca atggcaagct 960 tcgggcctac ttgcctgatt tccgtttcac acccttcaag caggctgtga aggagacctg 1020 tgcctggttc accgacaact atgagcaggc ccggaagtga agcatgggac aagcgggtgc 1080 tcagctggca atgcccagtc agtaggctgc agtctcatca tttgcttgtc aagaactgag 1140 gacagtatcc agcaacctga gccacatgct ggtctctctg ccagggggct tcatgcagcc 1200 atccagtagg gcccatgttt gtccatcctc gggggaaggc cagaccaaca ccttgtttgt 1260 ctgcttctgc cccaacctca gtgcatccat gctggtcctg ctgtcccttg tctaga 1316 <210> 21 <211> 321 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 21 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn 85 90 95 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val 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attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680 atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740 ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800 cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860 gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc cagactaaca tatggttcat tgacagacat 1920 gctccgcacc aagagcaagt gggaaccctc agatgctgca ctggtggaac gcctctttgt 1980 gaagggctgc tgtgccctca agcccatg 2008 <210> 23 <211> 1728 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 23 atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60 ttgttatttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga tcactccagc 120 agagaactct ccaagattct tgcaaagctt gaacgcttaa aacagcaaaa tgaagacttg 180 aggcgaatgg ctgagtctct ccgaatacca gaaggcccca ttgaccaggg gacagctaca 240 ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300 aagaaacaag ctagaaatgg tctggggaag gatcatgaaa tcttaagaag gaggattgaa 360 aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagcgaac tgaagaaatt 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ttcatccaaa ctttctaccc acatcacttt 240 aaatagaaat tagacccaat atgactcctt ttttcctaag ctgtttatag agattgtgct 320 ggagcagtga gcttttgtgt ttgtttgttt gttttgtaat tttccccatg aaaatttctc 300 taaactcaaa cctaagaggg aaaaaaaaaa aacagactta tatgtgccac acttgtaaaa 360 aaaaatcatg aaagatgtat atgatatttt taaacagttt gaatattaag atcacaattt 420 ctattttaaa aacaatcttg ttttacatat caatcaccca attcccttgc cttcccatcc 480 tcccattccc cccactgatc cccc ??????????????????? 504 <210> 28 <211> 120 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 28 atgaatgttc attctttggg tatatgccca agagtagaat tgctaaatat tgaggtagac 60 tgattcccat tttcttgagg agtcgccata ttgatttcca aagtgactgt acaagttaac 120 <210> 29 <211> 274 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 29 aggcactagg taaatatttt tgaagaaaga atgagtatct cctatttcag aaaaactttt 60 attgacttaa atttaggata tcagaattag aaaacagtaa aaatttatag gagagttttt 120 aatgaatgtt attttaaggt tccatacaaa tagtaattaa aacttacaca aactatttgt 180 agtaatgatt cagtctggta taccctgatg agcattatac acttttaaat tctttttgta 240 aattttttta 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Synthetic peptide <400> 44 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 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Synthetic DNA <400> 61 gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60 atcacctgta aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtacca gcagaagcca 120 ggtaaggctc caaagctgct gatctacaat acaaacaatt tgcaaacggg tgtgccaagc 180 agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca 240 gaggacatcg ccacctacta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 62 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75 80 Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His 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ggtgaagcca gacacggtgc aggtcaggct cagggtctgg 120 ctaggtctca caagacctgg 140 <210> 67 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 67 ggattggatt tattagagac aaagctaaag gttacacaac agagtacaat ccatctgtga 60 aggggagagt gacaatgctg gtagacacca gcaagaacca gttcagcctg agactcagca 120 gcgtgacagc cgccgacacc 140 <210> 68 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 68 gaagaccgat gggcccttgg tggaggctga ggagactgtg acgaggctgc cttgacccca 60 gtaatcaaaa ggagcagcag tgtggccctc tcttgcacaa taatagaccg cggtgtcggc 120 ggctgtcacg c 131 <210> 69 <211> 421 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 69 cccacaagct gaattcgcct cctcaaaatg ggatggagct gtatcatcct cttcttggta 60 gcaacagcta caggtgtcca ctccgacatc cagatgaccc agagcccaag cagcctgagc 120 gccagcgtgg gtgacagagt gaccatcacc tgtaaagcaa gtcagaatat tgacaaatac 180 ttaaactggt accagcagaa gccaggtaag gctccaaagc tgctgatcta caatacaaac 240 aatttgcaaa cgggtgtgcc aagcagattc agcggtagcg gtagcggtac cgacttcacc 300 ttcaccatca gcagcctcca gccagaggac atcgccacct actactgctt gcagcatata 360 agtaggccgc gcacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgtac ggtggctgca 420 c 421 <210> 70 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 70 cccacaagct gaattcgcct cctcaaaatg ggatggagct gtatcatcct cttcttggta 60 gcaacagcta caggtgtcca ctccgacatc cagatgaccc agagcccaag cagcctgagc 120 <210> 71 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 71 ggagccttac ctggcttctg ctggtaccag tttaagtatt tgtcaatatt ctgacttgct 60 ttacaggtga tggtcactct gtcacccacg ctggcgctca ggctgcttgg gctctgg 117 <210> 72 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 72 gcagaagcca ggtaaggctc caaagctgct gatctacaat acaaacaatt tgcaaacggg 60 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sequence: constant region of human IgG1 <400> 76 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 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Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 115 120 125 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of the artificial sequence: a peptide of 436-447 <400> 85 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5 10

Claims (25)

  1. 인간 IgG1 항체에 있어서, Fc 영역 중의 CH2 도메인으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가, Kabat 등에 의한 EU 인덱스(이하, EU 인덱스)에 있어서 인간 IgG3 항체의 동일한 위치에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드로 치환되고, 또한 상기 Fc 영역중의 CH2 도메인으로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가, 이하의 1~8의 폴리펩티드에서 선택되는 폴리펩티드이고, 인간 IgG1 항체 및 인간 IgG3 항체보다도 높은 보체(補體) 의존성 세포 상해 활성을 나타내고, 또한 프로테인 A에 인간 IgG1 항체와 동등한 결합 활성을 보유하는 유전자 재조합 항체 조성물:
    1. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 340번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    2. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 356번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 78로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    3. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 358번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    4. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 384번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 80로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    5. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 392번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    6. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 397번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 82로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    7. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 422번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드)
    8. EU 인덱스에 있어서, IgG1 항체의 231번째로부터 434번째와 436번째로부터 447번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(서열번호 84로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 85로 표시되는 아민노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 상기조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 유전자 재조합 항체 조성물.
  6. 제1항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 유전자 재조합 항체 조성물로서, 상기 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄가 상기 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄인 유전자 재조합 항체 조성물.
  7. 제1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자를 코딩하는 DNA.
  8. 제1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물에 포함되는 항체 분자의 중쇄 정상 영역을 코딩하는 DNA.
  9. 제8항에 기재된 DNA를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질 전환체.
  10. 제9항에 있어서, 숙주 세포가, N-글리코시드 결합 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치와 푸코스의 1위치가 α결합한 당쇄 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포인 형질 전환체.
  11. 제9항에 있어서, 숙주 세포가, 항체 분자를 코딩하는 유전자를 도입했을 때, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄를 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 상기 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 중, 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 능력을 갖는 세포인 형질 전환체.
  12. 제11항에 있어서, 푸코스가 결합되어 있지 않은 당쇄가, 상기 푸코스의 1위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 α결합되어 있지 않은 당쇄인 형질 전환체.
  13. 제9항에 있어서, 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 비활성화되도록 게놈이 개변된 세포인 형질 전환체.
  14. 제9항에 있어서, 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소의 게놈상의 대립 유전자 전부가 녹아웃(knockout)된 세포인 형질 전환체.
  15. 제13항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제(dehydratase)(GMD) 또는 GDP-4-케토-6-데옥시(deoxy)-D-만노스-3,5-에피머라아제(epimerase)(Fx)에서 선택되는 효소인 형질 전환체.
  16. 제15항에 있어서, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 하기 (a)의 DNA가 코딩하는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  17. 제15항에 있어서, GDP-만노스 4,6-디히드라타아제가, 하기 (a)의 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
  18. 제15항에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 하기 (a)의 DNA가 코딩하는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  19. 제16항에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노스-3,5-에피머라아제가, 하기 (a)의 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
  20. 제13항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당쇄 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위치에 푸코스의 1위치가 α결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소가 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase)인 형질 전환체.
  21. 제20항에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(b)로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA가 코딩하는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA.
  22. 제20항에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a)∼(b)로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 형질 전환체:
    (a) 서열 번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
  23. 제9항에 있어서, 숙주 세포가, 하기의 (a)∼(i)로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 형질 전환체:
    (a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;
    (b) 래트 골수종 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포;
    (c) 마우스 골수종 세포주 NS0 세포;
    (d) 마우스 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 세포;
    (e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;
    (f) 항체를 생성하는 하이브리도마 세포;
    (g) 인간 백혈병 세포주 나말와 세포;
    (h) 배아 줄기 세포;
    (i) 수정란 세포.
  24. 제9항에 기재된 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 항체 조성물을 생성 축적시키며, 상기 항체 조성물을 채취하여, 정제하는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 항체 조성물의 제조 방법.
  25. 제1항에 기재된 유전자 재조합 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는, 버키트 림프종 및 만성 림프구성 백혈병(CLL) 치료용 의약.
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