KR20040071254A - Ｃｄ20에 특이적으로 결합하는 항체 조성물 - Google Patents

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Abstract

CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 Fc 영역을 갖는 항체분자로 이루어지는 조성물, 이 조성물을 생산하는 세포 또는 트랜스제닉 비인간 동물 혹은 식물, 이 항체 조성물의 제조방법 및 이 항체 조성물을 함유하는 의약을 제공한다.

Description

ＣＤ20에 특이적으로 결합하는 항체 조성물{COMPOSITION OF ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO CD20}
항체는 높은 결합 활성, 결합 특이성 및 혈중에서의 높은 안정성을 갖는 점에서, 인간의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료에의 응용이 시도되어 왔다 [모노클로날 안티보디즈: 프린시플즈 앤드 어플리케이션즈 (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., Chapter 2.1 (1995)]. 또한 유전자 재조합 기술을 이용하여 인간 이외의 동물의 항체로부터 인간형 키메라 항체 또는 인간형 상보성 결정 영역 (이하, CDR 이라 표기함) 이식 항체와 같은 인간화 항체를 제작하는 것이 시도되고 있다. 인간형 키메라 항체란 항체 가변 영역 (이하, V 영역이라 표기함) 이 인간 이외의 동물의 항체이고, 정상 영역 (이하, C 영역이라 표기함) 이 인간 항체인 항체이다. 인간형 CDR 이식 항체란 인간 항체의 CDR 을 인간 이외의 동물의 항체의 CDR 로 치환한 항체이다.
포유류의 항체에는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE 의 5 종류의 클래스가 존재한다는 것이 판명되어 있는데, 인간의 각종 질환의 진단, 예방 및 치료에는 혈중 반감기가 길고, 각종 이펙터 기능을 갖는 등의 기능 특성으로부터 인간 IgG 클래스의 항체가 주로 이용되고 있다 [모노클로날 안티보디즈: 프린시플즈 앤드 어플리케이션즈 (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)]. 인간 IgG 클래스의 항체는 나아가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 의 4 종류의 서브클래스로 분류된다. IgG 클래스의 항체의 이펙터 기능인 항체 의존성 세포 상해 활성 (이하, ADCC 활성이라 표기함) 이나 보체 의존성 세포 상해 활성 (이하, CDC 활성이라 표기함) 에 대해서는 지금까지 다수의 연구가 행해졌으며, 인간 IgG 클래스에서는 IgG1 서브클래스의 항체가 가장 높은 ADCC 활성, CDC 활성을 갖고 있음이 보고되어 있다 [케미컬 이뮤놀로지 (Chemical Immunology), 65, 88 (1997)]. 실제로, IgG1 서브클래스의 항 CD20 키메라 항체를 원숭이에게 투여한 경우에 검출되는 CD20 양성 B 세포의 제거가, IgG4 서브클래스를 사용한 경우에는 검출되지 않은 것도 보고되어 있다 [바이오케미컬 소사이어티 트랜스액션 (Biochem. Soc. Trans.), 25, 705 (1997)]. 이상의 관점에서, 시판중인 치료용 항체 중, 그 효과 발현에 높은 이펙터 기능을 필요로 하는 항종양 인간화 항체의 대부분은 인간 IgG1 서브클래스의 항체이다.
CD20 은 Bp35 라고도 불리는 약 35kDa 의 폴리펩티드로서, 모노클로날 항체에 의해 인간 B 림프구 특이 항원 B1 으로서 동정되었다 [저널 오브 이뮤놀로지 (J. Immunol.), 125, 1678 (1980)]. 4 회 막 관통형 분자에서, 칼슘 채널로서 기능하고, B 세포의 활성화나 증식, 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다 [이뮤놀로지 투데이 (Immunology Today), 15, 450 (1994)]. CD20 의 발현은 프리 B 세포로부터 성숙 B 세포까지로 한정되고 있으며, 미분화 세포나 형질 세포에는 발현되지 않는다. 또한, 90% 이상의 B 세포성 비호지킨 림프종에 발현되는 것, 항체가 결합해도 세포 내에 이행되지 않은 것 등의 특징도 갖고 있어, 오래 전부터 항 CD20 항체에 의한 B 세포 림프종의 치료가 시도되어 왔다 [블러드 (Blood), 69, 584 (1987)]. 그러나, 당초 사용되고 있던 것은 마우스 모노클로날 항체이고, 인간 체내에 마우스 항체에 대한 인간 항체 (HAMA; Human Anti Mouse Antibody) 가 유도되는 것, 이펙터 기능이 결여되어 있다는 것 등의 이유에서 그 치료 효과는 한정된 것이었다. 따라서, 유전자 재조합 기술을 이용하여 마우스 항체와 인간 IgG1 서브클래스의 항체와의 키메라 항체 제작이 검토되었다 [저널 오브 이뮤놀로지 (J. Immunol.), 139, 3521 (1987), W088/04936]. 또한, 마우스 모노클로날 항체 2B8 을 사용하여 제작된 인간 IgG1 서브클래스의 키메라 항체 IDEC-C2B8 은 원숭이를 사용한 검토에 의해 생체 내에서도 CD20 양성 세포를 제거하는 활성을 갖는 것이 확인되고 [블러드 (Blood), 83, 435 (1994), WO94/11026], 임상 실험을 거쳐 미국에서 Rituxan™(IDEC 사/Genentech 사 제조, Rituximab 라고도 불리지만 이하, Rituxan™이라 표기함) 으로서 1997 년 11 월에 시판되었다.
Rituxan™의 미국에서의 제 III 상 시험은 소림프구성 및 여포성 림프종 166 예에 대해 375㎎/㎡/주의 4 주 투여에 의해 행해지고, 진(秦)효율은 48% (완전 관해 (寬解) 6%, 부분 관해 42%) 였다 [저널 오브 클리니컬 온콜로지 (J. Clin. Oncol.), 16, 2825 (1998)]. Rituxan™의 작용기전으로는 ADCC 활성, CDC 활성에 추가하여 CD20 을 크로스 링크시킴으로써 세포에 아포토시스를 유도시키는 활성 등이 생각되고 있다 [커런트 오피니언 인 이뮤놀로지 (Current Opinion in Immunology), 11, 541 (1999)]. CDC 활성에 관해서는 표적이 되는 B 림프종 세포에 따라 그 감수성이 다르기 때문에, 그 제어에 관여하는 것으로 생각되는 보체 저해 분자 CD55 나 CD59 의 기능을 저해함으로써, Rituxan™의 치료 효과를 높일 수 있는 가능성이 논의되어 왔다 [커런트 오피니언 인 이뮤놀로지 (Current Opinion in Immunology), 11, 541 (1999)]. 그러나, 환자 유래의 종양 세포에서의 이들 저해 분자의 발현이나, 인비트로에서의 CD 활성의 감수성이 임상을 통한 실험과 반드시 상관하지는 않는다는 보고도 있다 (블러드 (Blood), 98, 1352 (2001)). 또한, 마우스에 인간 B 림프종 세포주 Raji 세포를 이식한 모델을 사용한 검토에 있어서, 항체 수용체 (이하, 항체 수용체를 FcγR 이라 표기함) 를 통한 ADCC 활성이 항종양 효과에 중요하다는 것이 나타나 있다 [네이처 메디슨 (Nature Medicine), 6, 443, (2000)].
Rituxan™과 화학 요법 [CHOP; 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 프레드니손(Prednisone)] 의 병용이 검토되고 있고, 제 II 상 시험에서 낮은 악성도 및 여포성 림프종 40 예에 대해 진효율 95% (완전 관해 55%, 부분 관해 45%) 로 보고되어 있으나, CHOP 에 기인하는 부작용이 관찰되었다 (저널 오브 클리니컬 온콜로지 (J. Clin. Oncol.), 17, 268 (1999)]. 또한 다른 치료용 항 CD20 항체로서, 방사성 동위원소 표지 항체인 Zevalin (IDEC 사), Bexxar (Corixa 사) 등이 개발되어 있으나, 모두 마우스 항체인 것과, 방사성 동위원소가 사용되고 있는 점에서, 강한 독성에 따른 부작용이 우려된다.
인간 IgG1 서브클래스의 항체의 ADCC 활성 및 CDC 활성의 발현에는 항체 Fc 영역과, 킬러 세포, 내츄럴 킬러 세포, 활성화된 매크로파지 등의 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 항체 수용체 및 각종 보체 성분과의 결합이 필요하고, 그 결합에 대해서는 항체의 힌지 영역 및 C 영역의 제 2 번째의 도메인 (이하, Cγ2 도메인이라 표기함) 내의 몇몇 아미노산 잔기의 중요성이 시사되어 있다 [유로피언 저널 오브 이뮤놀로지 (Eur. J. Immunol.), 23, 1098 (1993), 이뮤놀로지 (Immunology), 86, 319 (1995), 케미컬 이뮤놀로지 (Chemical Immunology), 65, 88 (1997)]. Rituxan™에 관해서도 Cγ2 도메인의 아미노산 치환체를 사용한 검토에 의해, 주로 CDC 활성에 중요한 아미노산이 동정되고 있다 [저널 오브 이뮤놀로지 (J. Immunol.), 164, 4178 (2000), 저널 오브 이뮤놀로지 (J. Immunol.), 166, 2571 (2001)].
또한 Cγ2 도메인에 결합되어 있는 당 사슬의 중요성 [케미컬 이뮤놀로지 (Chemical Immunology), 65, 88 (1997)] 이 시사되어 있다. 당 사슬에 관해서는 보이드 (Boyd) 등은 차이니스 햄스터 난소 세포 (이하, CHO 세포라고 표기함) 또는 마우스 미엘로머 NSO 세포 (이하, NSO 세포라고 표기함) 에서 생산한 인간형 CDR 이식 항체 CAMPATH-1H (인간 IgG1 서브클래스) 를 각종 당분해 효소로 처리하고, 당 사슬의 ADCC 활성, CDC 활성에 대한 영향을 검토한 결과, 비환원 말단의 시알산의 제거는 양 활성에 영향을 미치지 않지만, 추가로 갈락토스 잔기를 제거함으로써 CDC 활성만이 영향을 받고, 약 50% 정도 활성이 저하되는 것, 당 사슬의 완전한 제거는 양 활성을 소실시키는 것을 보고하였다 [몰레큘러 이뮤놀로지 (Molecular Immunol.), 32, 1311 (1995)]. 또한, 라이플리 (Lifely) 등은 CHO 세포, NSO 세포 또는 래트 미엘로머 YO 세포에서 생산한 인간형 CDR 이식 항체 CAMPATH-1H (인간 IgG1 서브클래스) 의 당 사슬의 분석 및 ADCC 활성을 측정한 결과, YO 세포 유래의 CAMPTH-1H 가 가장 높은 ADCC 활성을 나타내고, 그 활성에는 바이섹팅에 위치하는 N-아세틸글루코사민 (이하, GlcNAc 라고 표기함) 이 중요한 것을 시사하였다 [글리코바이올로지 (Glycobiology, 5, 813 (1995): WO99/54342]. 이들 보고는 인간 IgG1 서브클래스의 항체의 이펙터 기능에 당 사슬의 구조가 매우 중요한 역할을 하고 있고, 당 사슬의 구조를 변경함으로써 보다 높은 이펙터 기능을 갖는 항체를 제작할 수 있음을 나타내고 있다. 그러나, 실제로는 당 사슬의 구조는 다양하고 복잡하여 이펙터 기능에 매우 중요한 구조를 특정하였다고는 하기 어렵다.
당 사슬의 수식에 관한 효소의 유전자를 숙주 세포에 도입하여 생산물의 당 사슬 구조를 개변한 예로는 래트의 β-갈락토시드-α-2,6-시알릴트랜스페라아제를 CHO 세포에 도입함으로써 당 사슬의 비환원 말단에 시알산이 많이 부가된 단백질의 제조가 가능하다는 것이 보고되어 있다 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 (J. Biol. Chem.), 261, 13848 (1989)].
또한, 인간의 β-갈락토시드-2-α-푸코실트랜스페라아제를 마우스 L 세포에 도입함으로써 당 사슬의 비환원 말단에 푸코오스 (이하, Fuc 라고도 표기함) 가 부가된 H 항원 (Fuc α1-2Galβ1-) 의 발현이 확인되어 있다 [사이언시스 (Science), 252, 1668, (1991)]. 또한 유마나 (Umana) 등은 N-글리코시드 결합 당 사슬의 바이섹팅에 위치하는 N-아세틸글루코사민의 부가가 항체의 ADCC 활성에 중요하다는 지견에 기초하여 β-1,4-N-아세틸글루코사민 전이 효소 III (GnTIII) 을 발현시킨 CHO 세포를 제작하여 친주와 비교하고 있다. 친주의 CHO 세포에서는 GnTIII 의 발현이 관찰되지 않고 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 (J. Bio. Chem.), 259, 13370, (1984)], 제작한 GnTIII 발현 CHO 세포를 이용하여 발현시킨 항체는 친주에서 발현시킨 항체에 비해 높은 ADCC 활성을 갖는 것을 확인하였다 [네이처 바이오테크놀로지 (Nature Biotechnol.), 17, 176 (1999): WO99/54342]. 또한, 이 때 유마나 (Umana) 등은 β-1,4-N-아세틸글루코사민 전이 효소 V (GnTV) 의 유전자를 도입한 CHO 세포도 제작하였고, GnTIII 또는 GnTV 의 과잉 발현은 CHO 세포에 대해 독성을 나타낸다는 것을 보고하였다. Rituxan™에 관해서는 GnTIII 를 도입한 CHO 세포를 사용하여 제작한 항체는 친주에서 발현시킨 항체에 비해 높은 ADCC 활성을 나타낸다는 것이 보고되었으나, 그 활성 차이는 10-20 배 정도이다 [바이오테크놀로지 앤드 바이오엔지니어링 (Biotechnol. Bioeng.), 74, 288 (2001).
본 발명은 B 세포성 림프종 등의 CD20 양성 세포가 관여하는 질환의 치료에 유용한 항체 조성물, 항체 조성물을 제조하기 위한 세포, 이 세포를 사용한 항체 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 플라스미드 pBS-2B8L 의 구축 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 플라스미드 pBS-2B8Hm 의 구축 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 플라스미드 pKANTEX2B8P 의 구축 과정을 나타낸 도면이다.
도 4는 형광항체법을 사용하여, 정제한 항 CD20 키메라 항체 KM3065 및 RituxanTM 의 인간 CD20 발현 세포 Raji 세포와의 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 결과이다. 각 농도에서의 상대 형광 강도를 세로축에, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다. ■가 RituxanTM,가 KM3065의 활성을 각각 나타낸다.
도 5는 형광항체법을 사용하여 정제한 항 CD20 키메라 항체 KM3065 및 RituxanTM 의 인간 CD20 음성 세포 CCRF-CEM 세포와의 결합 활성을 측정한 도면이다.
도 6은 정제한 항 CD20 키메라 항체 KM3065 및 RituxanTM의 인간 CD20 발현 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸 도면이다. A는 Raji 세포, B는 Ramos 세포, C는 WIL2-S 세포를 표적 세포로 한 것이다. 세로축에 세포 상해 활성, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다. ■가 RituxanTM,가 KM3065의 활성을 각각 나타낸다.
도 7은 정제한 항 CD20 키메라 항체 KM3065 및 RituxanTM로부터 PA화 당 사슬을 조제하고 역상 HPLC로 분석하여 얻은 용리도를 나타낸 것이다. 세로축에 상대 형광 강도, 가로축에 용출 시간을 각각 나타낸다.
도 8은 플라스미드 CHfFUT8-pCR2.1의 구축을 나타낸 도면이다.
도 9는 플라스미드 ploxPPuro의 구축을 나타낸 도면이다.
도 10은 플라스미드 pKOFUT8gE2-1의 구축을 나타낸 도면이다.
도 11은 플라스미드 pKOFUT8gE2-2의 구축을 나타낸 도면이다.
도 12는 플라스미드 pscFUT8gE2-3의 구축을 나타낸 도면이다.
도 13은 플라스미드 pKOFUT8gE2-3의 구축을 나타낸 도면이다.
도 14는 플라스미드 pKOFUT8gE2-4의 구축을 나타낸 도면이다.
도 15는 플라스미드 pKOFUT8gE2-5의 구축을 나타낸 도면이다.
도 16은 플라스미드 pKOFUT8Puro의 구축을 나타낸 도면이다.
도 17은 형광항체법을 사용하여 렉틴 내성 CHO/DG44 세포가 생산한 항 CD20 키메라 항체 R92-3-1의 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 결과이다. 각 농도에서의 상대 형광 강도를 세로축에, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다. ■가 RituxanTM,가 R92-3-1 의 활성을 각각 나타낸다.
도 18은 렉틴 내성 CHO/DG44 세포가 생산한 항 CD20 키메라 항체 R92-3-1의 ADCC 활성을 Raji 세포를 표적 세포로 하여 평가한 결과를 나타낸 것이다. 그래프의 세로축에 표적 세포의 세포 상해 활성을, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다. ■가 RituxanTM,가 R92-3-1 의 ADCC 활성을 각각 나타낸다.
도 19는 렉틴 내성 CHO/DG44 세포가 생산한 항 CD20 키메라 항체 R92-3-1로부터 조제한 PA화 당 사슬을 역상 HPLC로 분석하여 얻은 용해도를 나타낸 것이다. 새로축에 상대 형광 강도, 세로축에 용출 시간을 각각 나타낸다. 역상 HPLC의분석 조건, 당 사슬 구조의 동정, α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬군의 비율 산출은 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였다.
도 20은 CHO 세포 유래의 GMD cDNA 클론 22-8의 5' 말단에 클론 34-2의 5' 말단을 도입한 플라스미드 CHO-GMD 제작 공정을 나타낸 도면이다.
도 21은 3 종류의 항 CD20 키메라 항체로부터 조제한 PA화 당 사슬을 역상 HPLC 로 분석하여 얻은 용해도를 나타낸 것이다. 세로축에 상대 형광 강도, 가로축에 용출 시간을 각각 나타낸다. 역상 HPLC의 분석 조건, 당 사슬 구조의 동정, α-1,6-푸코오스 비결합 당 사슬군의 비율 산출은 실시예 3과 동일한 방법으로 실시하였다.
도 22는 형광항체법을 사용하여 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체 분자의 비율이 다른 5 종류의 항 CD20 키메라 항체 CD20 발현 세포에 대한 결합 활성을 항체 농도를 변화시켜 측정한 도면이다. 세로축은 CD20과의 결합 활성, 가로축은 항체 농도를 각각 나타낸다. □가 CD20 키메라 항체(96%), ■가 항 CD20 키메라 항체(44%), △가 항 CD20 키메라 항체(35%), ▲가 항 CD20 키메라 항체(26%),가 항 CD20 키메라 항체(6%)의 활성을 각각 나타낸다.
도 23은 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체 분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체의 WIL2-S 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸 도면이다. 도너 A의 이펙터 세포를 사용하여 5lCr법에 의해 측정한 결과를 나타내고, 세로축에 세포 상해 활성, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다. □가 CD20 키메라 항체(96%), ■가 항 CD20 키메라 항체(44%), △가 항 CD20 키메라 항체(35%), ▲가항 CD20 키메라 항체(26%),가 항 CD20 키메라 항체(6%)의 활성을 각각 나타낸다.
도 24는 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체 분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체의 Raji 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸 도면이다. 도너 B의 이펙터 세포를 사용하여 LDH법에 의해 측정한 결과를 나타내고, 세로축에 세포 상해 활성, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다. □가 CD20 키메라 항체(96%), ■가 항 CD20 키메라 항체(44%), △가 항 CD20 키메라 항체(35%), ▲가 항 CD20 키메라 항체(26%),가 항 CD20 키메라 항체(6%)의 활성을 각각 나타낸다.
도 25는 항 CD20 키메라 항체 KM3065를 바이섹팅 GlcNAc를 가진 당 사슬에 친화성이 있는 렉틴이 고정화된 칼럼을 사용하여 분리한 용리도를 나타낸 것이다. 세로축에 280㎚에서의 흡광도, 가로축에 용출 시간을 각각 나타낸다. ①∼④는 각각 분획①∼분획④의 용출 위치를 나타낸다.
도 26은 바이섹팅 GlcNAc를 가진 당 사슬에 친화성이 있는 렉틴이 고정화된 칼럼을 사용하여 분리한 분획①∼④와, 분리전 항 CD20 키메라 항체 KM3065로부터 조제한 PA화 당 사슬을 각각 역상 HPLC로 분석하여 얻은 용리도를 나타낸 것이다. 상단 좌측도에 분리 전 KM3065, 상단 우측도에 분획①, 중단 좌측부에 분획②, 중단 우측부에 분획③, 하단 좌측도에 분획④의 용리도를 각각 나타낸다. 세로축에 상대 형광 강도, 가로축에 용출 시간을 각각 나타낸다. 도면 중 검게 칠한피크는 항체 유래의 PA화 당 사슬을 나타내고, 「*」는 바이섹팅 GlcNAc를 가진 PA화 당 사슬을 나타낸다.
도 27은 바이섹팅 GlcNAc를 가진 당 사슬에 친화성이 있는 렉틴이 고정화된 칼럼을 사용하여 분리한 분획①∼④, 그리고 분리전 항 CD20 키메라 항체 KM3065의 Raji 세포에 대한 ADCC 활성을 나타낸 도면이다. 정상인 도너 유래의 이펙터 세포를 사용하여 LDH법에 의해 측정한 결과를 나타내고, 세로축에 세포 상해 활성, 가로축에 항체 농도를 각각 나타낸다.가 분리 전의 KM3065,가 분획①, △가 분획②, ◇가 분획③, ◆가 분획④, □가 RituxanTM, ×가 항체 비첨가 활성을 각각 나타낸다.
이펙터 기능이 증강된 항 CD20 항체는 치료 효과가 증대하고, 투여량의 감소에 의한 환자의 부담 경감이 기대된다. 또한, 화학 요법이나 방사성 동위 원소 표지 항체 등과의 병용의 필요성이 없어짐에 따른 부작용 저감도 기대된다. 본 발명의 목적은 이펙터 기능이 증강된 항 CD20 항체를 생산하는 세포, 및 이펙터 기능이 증강된 항 CD20 항체 조성물, 이 항체 조성물의 제조 방법, 이 항체 조성물을 함유하는 의약 등을 제공하는 데 있다.
본 발명은 이하의 (1) ∼ (48) 에 관한 것이다.
(1) CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 세포.
(2) 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이, 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬인 상기 (1) 에 기재된 세포.
(3) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 결실된 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 세포.
(4) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인 상기 (3) 에 기재된 세포.
(a) GMD (GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제);
(b) Fx (GDP-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피메라아제, 4-리덕타아제);
(c) GFPP (GDP-베타-L-푸코오스 피로포스포릴라아제).
(5) GMD 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 상기 (4) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(6) GMD 가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 상기 (4) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질.
(7) Fx 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 상기 (4) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(8) Fx 가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 상기 (4) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질.
(9) GFPP 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 상기 (4) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(10) GFPP 가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택된 단백질인 상기 (4) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질;
(c) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질.
(11) N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스페라아제인 상기 (3) 에 기재된 세포.
(12) α-1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 상기 (11) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(c) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA;
(d) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(13) α-1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 상기 (11) 에 기재된 세포.
(a) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(b) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
(c) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질;
(d) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질;
(e) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질;
(f) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.
(14) 효소의 활성이 이하의 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 수법에 의해 저하 또는 결실된 상기 (3) ∼ (13) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(a) 효소의 유전자를 표적한 유전자 파괴의 수법;
(b) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법;
(c) 효소에 대한 돌연 변이를 도입하는 수법;
(d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법;
(e) N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법.
(15) 적어도 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 상기 (1) ∼ (14) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(16) 세포가 하기 (a) ∼ (j) 로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 상기 (1) ∼ (15) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(a) 차이니스 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;
(b) 래트 미엘로머 세포주 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포;
(c) 마우스 미엘로머 세포주 NSO 세포;
(d) 마우스 미엘로머 세포주 SP2/O-Ag 14 세포;
(e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;
(f) 원숭이 COS 세포;
(g) 항체를 생산하는 하이브리도마 세포;
(h) 인간 백혈병 세포주 나말바 세포;
(i) 배성 줄기세포;
(j) 수정란 세포.
(17) CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는, 이 항체 분자를 코드하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(18) 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이, 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬인, 상기 (17) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(19) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하되도록, 게놈이 개변된 상기 (17) 또는 (18) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(20) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 유전자 또는 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자가 녹아웃된 상기 (17) 또는 (18) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(21) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인 상기 (19) 또는 (20) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(a) GMD (GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제);
(b) Fx (GDP-케토-6-데옥시만노오스, 3,5-에피메라아제, 4-리덕타아제);
(c) GFPP (GDP-베타-L-푸코오스 피로포스포릴라아제).
(22) GMD 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 상기 (21)에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(a) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA;
(23) Fx 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인, 상기 (21) 에 기재된 트랜즈제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(a) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(24) GFPP 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인, 상기 (21) 에 기재된 트랜즈제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(a) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(25) N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스페라아제인, 상기 (19) 또는 (20) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(26) α-1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인, 상기 (25) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
(c) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(d) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
(27) 트랜스제닉 비인간 동물이 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이 및 토끼로 이루어지는 군에서 선택되는 동물인, 상기 (17) ∼ (26) 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(28) 항체 분자가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인 상기 (1) ∼ (16) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(a) 인간 항체;
(b) 인간화 항체;
(c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편;
(d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질.
(29) 항체 분자의 클래스가 IgG 인 상기 (1) ∼ (16) 및 (28) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(30) 항체 분자의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 서열 번호 8, 9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 (1) ∼ (16), (28) 및 (29) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(31) 항체 분자의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 상기 (1) ∼ (16), (28), (29) 및 (30) 중 어느 한 항에 기재된 세포.
(32) 항체 분자가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인, 상기 (17) ∼ (27) 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(a) 인간 항체;
(b) 인간화 항체;
(c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편;
(d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질.
(33) 항체 분자의 클래스가 IgG 인, 상기 (17) ∼ (27) 및 (32) 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(34) 항체 분자의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 8,9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 (17) ∼ (27), (32) 및 (33) 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(35) 항체 분자의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 상기 (17) ∼ (27), (32), (33) 및 (34) 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
(36) 상기 (1) ∼ (16), (28) ∼ (31) 중 어느 한 항에 기재된 세포에 의해 생산된 항체 조성물.
(37) 상기 (17) ∼ (27), (32) ∼ (35) 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손을 사육하고, 사육한 동물 또는 식물에 의해 생산된 항체 조성물.
(38) CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물.
(39) 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이, 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬인 상기 (38) 에 기재된 항체 조성물.
(40) 항체 분자가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인 상기 (38) 항에 기재된 항체 조성물.
(a) 인간 항체;
(b) 인간화 항체;
(c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편;
(d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질.
(41) 항체 분자의 클래스가 IgG 인, 상기 (38) ∼ (40) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물.
(42) 항체 분자의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 8, 9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 (38) ∼ (41) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물.
(43) 항체 분자의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 상기 (38) ∼ (42) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물.
(44) 상기 (1) ∼ (16), (28) ∼ (31) 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배지에 배양하고, 배양물 중에 상기 (36), (38) ∼ (43) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 생산 축적시키고, 이 배양물로부터 이 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는, 이 항체 조성물을 제조하는 방법.
(45) 상기 (17) ∼ (27), (32) ∼ (35) 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손을 사육하고, 사육한 동물 또는 식물로부터 조직 또는 체액을 취득하고, 취득한 조직 또는 체액으로부터 상기 (36), (38) ∼ (43) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는, 이 항체 조성물을 제조하는 방법.
(46) 상기 (36) ∼ (43) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
(47) 상기 (36) ∼ (43) 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 CD20 관련 질환의 치료약.
(48) CD20 관련 질환이 암 또는 면역 질환인 상기 (47) 기재의 치료약.
본 발명의 세포로는 CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 세포이면 어느 세포나 포함된다.
본 발명에서, CD20 은 B1 이나 Bp35 로도 불리는 약 35kDa 의 세포 표면막 단백질로서, 서열 번호 4 기재의 아미노산 서열로 표시된 단백질 또는 서열 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열의 1 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 CD20 과 실질적으로 동일한 성질을 갖는 것이면 어느 것이나 포함된다.
본 발명에서 서열 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 CD20 활성을 갖는 단백질은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (이하, 몰레큘러 클로닝 제 2 판이라고 약기함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (이하, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지라고 약기함), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 예컨대 서열 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 개수는 1 개 이상이고 그 개수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지의 기술에 의해, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가할 수 있는 정도의 수이고, 예컨대 1 ∼ 수십 개, 바람직하게는 1 ∼ 20 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개이다.
또한 본 발명에서, 사용되는 단백질이 CD20 활성을 갖기 위해서는 각각 서열 번호 4 로 표시되는 아미노산 서열과 BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 이나 FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)] 등의 해석 소프트를 사용하여 계산하였을 때에, 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
본 발명에서, 항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 당 사슬로는 N-글리코시드 결합 당 사슬을 들 수 있고, 그 N-글리코시드 결합 당 사슬로는 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토스-N-아세틸글루코사민 (이하, Gal-GlcNAc 라고 표시함) 의 분기를 병행하여 1 내지 복수 개 갖고, 또한 Gal-GlcNAc 의 비환원 말단측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민 등의 구조를 갖는 컴플렉스형 (복합형) 당 사슬을 들 수 있다.
항체 분자의 Fc 영역에는 후술하는 N-글리코시드 결합 당 사슬이 각각 1 군데씩 결합하는 영역을 갖고 있으므로, 항체 1 분자당 2 개의 당 사슬이 결합되어 있다. 항체에 결합하는 N-글리코시드 결합 당 사슬로는 하기 구조식 (I) 로 표시되는 어느 당 사슬이나 포함되므로, 항체에 결합하는 2 개의 N-글리코시드 결합 당 사슬에는 다수의 당 사슬의 조합이 존재하게 된다. 따라서, Fc 영역에 결합한 당 사슬 구조의 관점에서 물질의 동일성을 판단할 수 있다.
본 발명에서 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물 (이하, 본 발명의 항체 조성물이라고 함) 이란 본 발명의 효과가 얻어지는 범위이면 단일 당 사슬 구조를 갖는 항체로 구성될 수도 있고, 복수의 다른 당 사슬 구조를 갖는 당 사슬로 구성될 수도 있다.
본 발명에서, 항체 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이란 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 모든 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬의 합계 수에 대해, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 개수가 차지하는 비율을 말한다.
본 발명에서, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬은 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 α결합되지 않은 당 사슬을 말한다. 예컨대 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬을 들 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 특히 바람직하게는 40% 이상, 가장 바람직하게는 50% 이상을 들 수 있고, 이들 당 사슬의 비율을 갖는 항체 조성물은 높은 ADCC 활성을 갖는다.
항체 농도가 저하되면 이에 수반하여 ADCC 활성이 저하되는데, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 경우, 항체 농도가 낮아도 높은 ADCC 활성을 획득할 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물 중에 포함되는, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율은 항체 분자로부터 히드라진 분해나 효소 소화 등의 공지된 방법 [생물 화학 실험법 23 - 당 단백질 당 사슬 연구법 (학회 출판 센터) 타카하시 레이코 편저 (1989)] 을 이용하여, 당 사슬을 유리시키고, 유리시킨 당 사슬을 형광 표지 또는 동위 원소 표지하고, 표지한 당 사슬을 크로마토그래피법에 의해 분리함으로써 결정할 수 있다. 또한, 유리시킨 당 사슬을 HPAED-PAD 법 [저널 오브 리퀴드 크로마토그래피 (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)] 에 의해 분석하는 것에 의해서도 결정할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포로는 본 발명의 조성물을 생산하고, 또한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 결실된 세포가 포함된다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로는 세포 내에서 당 사슬에 대한 푸코오스의 공급원인 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소이면 어느 효소나 포함된다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관한 효소로는 세포내 GDP-푸코오스의 합성에 영향을 미치는 효소도 포함한다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 영향을 미치는 효소로는 상기 서술한 세포내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성 경로에 관여하는 효소의 활성에 영향을 미치거나, 이 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 미치는 효소도 포함된다.
세포내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스는 신생(de novo)합성 경로 또는 구제(salvage) 합성 경로에 의해 공급되고 있다. 따라서, 이들 합성 경로에 관여하는 효소는 모두 세포내 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소에 포함된다.
세포내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 신생합성 경로에 관여하는 효소로는 구체적으로는 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 (GDP-mannose 4,6-dehydratase;이하, GMD 라고 표기함), GDP-케토-데옥시만노오스 3,5-에피메라아제, 4-리덕타아제 (GDP-keto-6-deoxymannose 3,5-epimerase,4-reductase; 이하 Fx 라고 표기함) 등을 들 수 있다.
세포내의 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 구제합성 경로에 관여하는 효소로서는 구체적으로는 GDP-베타-L-푸코오스-피로포스포릴라아제 (GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase; 이하, GFPP 라고 표기함), 푸코키나아제 (Fucokinase) 등을 들 수 있다.
본 발명에서, GMD 로는 하기 (a) 또는 (b) 의 DNA 가 코드하는 단백질,
(a) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
또는
(c) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(d) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열에서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질
(e) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, GMD 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GMD 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서, Fx 로는 하기 (a) 또는 (b) 의 DNA 가 코드하는 단백질,
(a) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
또는
(c) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(d) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질
(e) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, Fx 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Fx 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서, GFPP 로는 하기 (a) 또는 (b) 의 DNA 가 코드하는 단백질,
(a) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
또는
(c) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(d) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질
(e) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, GFPP 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GFPP 활성을 갖는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.
N-클리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소란, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합하는 반응에 관여하는 효소이면 어느 효소나 포함된다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합하는 반응에 관여하는 효소란, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합하는 반응에 영향을 미치는 효소를 말한다.
N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 반응에 관여하는 효소로는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스페라아제나 α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
또한, 상기 서술한 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합하는 반응에 관여하는 효소의 활성에 영향을 부여하거나, 이 효소의 기질이 되는 물질의 구조에 영향을 미치는 효소도 포함된다.
본 발명에서, α-1,6-푸코실트랜스페라아제로는 하기 (a), (b), (c) 또는 (d) 의 DNA 가 코드하는 단백질,
(a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA
(c) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
(d) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA
또는
(e) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(f) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질
(g) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질
(h) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질
(i) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질
(j) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.
또한, α-1,6-푸코실트랜스페라아제의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는 서열 번호 1 또는 2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 1 또는 2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 DNA 란 예컨대 서열 번호 1, 2, 48, 51 또는 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 등의 DNA 또는 그 일부의 단편을 프로브로 하여 콜로니하이브리다이제이션법, 플라크하이브리다이제이션법 또는 서던 블롯 하이브리다이제이션법 등을 이용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하고, 구체적으로는 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 를 고정화한 필터를 사용하여 0.7 ∼ 1.0M 의 염화나트륨 존재 하, 65℃ 에서 하이브리다이제이션을 수행한 후, 0.1 ∼ 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여 65℃ 조건 하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준거하여 수행할 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA 로서 구체적으로는 서열 번호 1, 2, 48, 51 또는 41 로 표시되는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.
본 발명에서, 서열 번호 23, 24, 61, 62 또는 63 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성, GMD 활성, Fx 활성 또는 GFPP 활성을 갖는 단백질은 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 예컨대 서열 번호 1, 2, 41, 48 또는 51 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 개수는 1 개 이상이고 그 개수는 특별히 한정되지 않지만, 상기 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지의 기술에 의해 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 개수이고, 예컨대 1 ∼ 수십 개, 바람직하게는 1 ∼ 20 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개이다.
또한 본 발명에서, 사용되는 단백질이 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성, GMD 활성, Fx 활성 또는 GFPP 활성을 갖기 위해서는 각각 서열 번호 23, 24, 61, 62 또는 63 으로 표시되는 아미노산 서열과 BLAST [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 나 FASTA [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)] 등의 해석 소프트를 사용하여 계산하였을 때에, 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
또한, 본 발명의 세포, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 결실된 세포를 취득하는 방법으로는, 목적으로 하는 효소 활성을 저하시킬 수 있는 수법이면 어느 수법이나 이용할 수 있다. 상기 서술한 효소 활성을 저하 또는 결실시키는 수법으로는
(a) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법;
(b) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법;
(c) 효소에 대한 돌연 변이를 도입하는 수법;
(d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법;
(e) N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법 등을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴으로는 이 당 사슬 구조를 인식할 수 있는 렉틴이면 어느 렉틴이나 사용할 수 있다. 구체적인 예로서는 렌즈콩 렉틴 LCA [렌스 쿨리나리스 (Lens Culinaris) 유래의 렌틸 아굴루티닌(Lentil Agglutinin)], 완두콩 렉틴 PSA [피섬 사티범 (Pisum sativum)유래의 완두콩 렉틴(Pea Lectin)], 누에콩 렉틴 VFA [비씨아 파바(Vicia faba) 유래의 아굴루티닌], 들주발 버섯 렉틴 AAL [알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 유래의 렉틴] 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체 조성물을 생산시키는 숙주 세포로는 항 CD20 항체 분자를 발현할 수 있는 숙주 세포 즉 항 CD20 항체 분자를 코드하는 유전자를 삽입한 숙주 세포이면 어느 세포나 포함한다. 그 예로서, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 들 수 있다. 이들 세포로는 후술 1 에 기재된 것을 들 수 있고, 특히 동물 세포 중에서도 차이니스 햄스터 난소 조직 유래의 CHO 세포, 래트 미엘로머 세포주 YB2/3HL. P2. Cll. 16Ag. 20 세포, 마우스 미엘로머 세포주 NSO 세포, 마우스 미엘로머 세포주 SP2/O-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포, 항체를 생산하는 하이브리도마 세포, 인간 백혈병 세포주 나말바 세포, 배성 줄기세포, 수정란 세포 등이 바람직하다. 구체적으로는 본 발명의 항 CD20 항체의 유전자를 삽입한 래트 미엘로머 세포주 YB2/3HL. P2. Gll. 16Ag. 20 세포 형질 전환 클론 KM3056 (FERM BP-7834) 을 들 수 있다.
본 발명의 인간 항체 생산 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손으로는 CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는, 이 항체 분자를 코드하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 비인간동물 또는 식물, 또는 그 자손이면 어느 것이나 포함된다. 구체적으로는 마우스 ES 세포에 CD20 에 특이적으로 결합하는 항체의 유전자를 도입하고, 이 ES 세포를 다른 마우스의 초기배에 이식 후에 발생시킴으로써 이 항체 생산 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다. 또한, 동물의 수정란에 CD20 에 특이적으로 결합하는 항체의 유전자를 도입하고 이 수정란을 발생시킴으로써 이 항체 생산 트랜스제닉 동물을 제작할 수도 있다.
트랜스제닉 비인간 동물은 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이 또는 토끼 등을 들 수 있다.
본 발명에서, 항체 분자로는 항체의 Fc 영역을 포함하는 분자이면 어느 것이나 포함되지만, 항체, 항체의 단편, Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 등을 들 수 있다.
항체란 외래 항원 자극 결과, 면역 반응에 의해 생체내에 생산되는 단백질로서, 항원과 특이적으로 결합하는 활성을 갖는 것을 말한다. 항체로는 동물에게 항원을 면역시키고, 면역 동물의 비장 세포로 제작한 하이브리도마 세포가 분비되는 항체 외에, 유전자 재조합 기술에 의해 제작된 항체, 즉 항체 유전자를 삽입한 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입시킴으로써 취득된 항체 등을 들 수 있다. 구체적으로는 하이브리도마가 생산하는 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등을 들 수 있다.
하이브리도마로는 인간 이외의 포유 동물에게 항원을 면역시켜 취득된 B 세포와, 마우스 등에 유래하는 미엘로머 세포를 세포 융합시켜 얻어지는, 원하는 항원 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 세포를 들 수 있다.
인간화 항체로는 인간형 키메라 항체, 인간형 상보성 결정 영역 (이하, 상보성 결정 영역을 CDR 이라고도 함) 이식 항체 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는 인간 이외의 동물의 항체 중쇄 가변 영역 (이하, 가변 영역은 V 영역, 중쇄는 H 사슬로서 HV 또는 VH 라고도 함) 및 항체 경쇄 가변 영역 (이하, 경쇄는 L 사슬로서 LV 또는 VL 이라고도 함) 과 인간 항체의 중쇄 정상 영역 (이하, CH 라고도 함) 및 인간 항체의 경쇄 정상 영역 (이하, CL 이라고도 함) 으로 이루어지는 항체를 의미한다. 인간 이외의 동물로는 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마를 제작할 수 있으면 어느 것이나 사용할 수 있다.
인간형 키메라 항체는 모노클로날 항체를 생산하는 하미브리도마로부터, VH 및 VL 을 코드하는 cDNA 를 취득하고, 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL 을 코드하는 유전자를 갖는 숙주 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 숙주 세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH 로는 인간 이뮤노글로불린 (이하, hIg 라 표기함) 에 속하면 어느 것이나 사용할 수 있지만, hIg 클래스의 것이 바람직하고, 또한 hIg 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4 의 서브클래스의 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL 로는 hIg 에 속하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, κ클래스 또는 λ클래스의 것을 사용할 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체란 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL 의 적절한 위치에 이식한 항체를 의미한다.
인간형 CDR 이식 항체는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL 의 CDR 서열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL 의 CDR 서열에 이식한 V 영역을 코드하는 cDNA 를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 인간 항체의 CL 을 코드하는 유전자를 갖는 숙주 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 이 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 인간형 CDR 이식 항체를 발현시켜 제조할 수 있다.
인간형 CDR 이식 항체의 CH 로는 hIg 에 속하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있지만, hIgG 클래스의 것이 바람직하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4 의 서브클래스의 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL 로는 hIg 에 속하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, κ클래스 또는 λ클래스의 것을 사용할 수 있다.
인간 항체는 원래 인간 체내에 천연적으로 존재하는 항체를 의미하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파아지 라이브러리 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물 또는 인간 항체 생산 트랜스제닉 식물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다.
인간 채내에 존재하는 항체는 예컨대 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화, 클로닝함으로써, 이 항체를 생산하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양물 중에서 이 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파아지 라이브러리는 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파아지 유전자에 삽입함으로써 Fab (Fragment of antigen binding), 1 본사슬 항체등의 항체 단편을 파아지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 이 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 발현하고 있는 파아지를 회수할 수 있다. 이 항체 단편은 다시 유전자 공학적 수법에 의해 2 개의 완전한 H 사슬 및 2 개의 완전한 L 사슬로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환시킬 수 있다.
항체의 단편이란 상기 항체의 Fc 영역을 포함한 단편을 의미한다. 항체의 단편으로는 H 사슬의 단량체, H 사슬의 2 량체 등을 들 수 있다.
Fc 영역을 포함하는 융합 단백질로는 항체의 Fc 영역을 포함한 항체 또는 항체의 단편과, 효소, 사이토카인 등의 단백질을 융합시킨 물질을 포함한다.
본 발명의 항체 분자로는 CD20 에 특이적으로 결합하는 항체 분자이면 어느 것이나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 8, 9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, CD20 에 특이적으로 결합하는 항체 분자, 보다 바람직하게는 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, CD20 에 특이적으로 결합하는 항체 분자 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약으로는 상기 서술한 본 발명의 항체 조성물, 즉 항 CD20 항체 분자의 조성물을 유효 성분으로서 포함하는 의약을 들 수 있다.
CD20 관련 질환으로는 B 세포 림프종 등의 암, 염증성 질환, 자기 면역 질환등의 면역 질환 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, ADCC 활성이란 생체내에서, 종양 세포 등의 세포 표면 항원 등에 결합한 항체가 항체 Fc 영역과 이펙터 세포 표면 위에 존재하는 Fc 수용체와의 결합을 통해 이펙터 세포를 활성화시키고, 종양 세포 등을 상해하는 활성을 의미한다 [모노클로날 안티보디즈: 프린시플즈 앤드 어플리케이션즈 (Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., Chapter 2.1 (1995)]. 이펙터 세포로는 킬러 세포, 내츄럴 킬러 세포, 활성화된 매크로파지 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 본 발명의 항체 조성물을 생산하는 세포의 제작
본 발명의 항체 조성물을 이하에 기술하는 수법에 의해 본 발명의 항체 조성물을 생산하기 위해 사용하는 숙주 세포를 제작하고, 이 숙주 세포에 후술 3 에 서술한 방법에 의해 항 CD20 항체를 코드하는 유전자를 도입함으로써 제작할 수 있다.
(1) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴 수법
본 발명의 세포의 제작을 위해 사용하는 숙주 세포는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고 유전자 파괴 방법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로는 구체적으로는 GMD, Fx, GFPP, 푸코키나아제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소로는 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스페라아제, α-L-푸코시타제 등을 들 수 있다.
여기서 말하는 유전자란 DNA 또는 RNA 를 포함한다.
유전자 파괴 방법으로는 표적으로 하는 효소의 유전자를 피괴할 수 있는 방법이면 어느 방법이나 포함된다. 그 예로는 안티센스법, 리보자임법, 상동 재조합법, RNA-DNA 올리고 뉴클레오티드법 (이하 , RDO 법이라고 표기함), RNA 인터페이스법 (이하, RNAi 법이라고 표기함), 레트로바이러스를 사용한 방법, 트랜스포존을 사용한 방법 등을 들 수 있다. 이하, 이들을 구체적으로 설명한다.
(a) 안티센스법 또는 리보자임에 의한 본 발명의 세포를 제작하기 위한 숙주 세포의 제작
본 발명의 세포의 제작을 위해 사용하는 숙주 세포는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소 유전자를 표적으로 하여 세포 공학, 12, 239 (1993), 바이오/테크놀로지 (BIO/TECHNOLOGY), 17, 1097 (1999), 휴먼 몰레큘러 제네틱스 (Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995), 세포 공학, 13, 255 (1994), 프로딩스 오브 더 내쇼널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886 (1999) 등에 기재된 안티센스법 또는 리보자임법을 사용하여 예컨대 이하와 같은제작할 수 있다.
세포내 당뉴클레티오드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 cDNA 또는 게놈 DNA 를 조제한다.
조제한 cDNA 또는 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정한다.
결정한 DNA 의 서열에 기초하여 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 DNA 부분, 비번역 영역 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 안티센스 유전자 또는 리보자임의 컨스트럭트을 설계한다.
이 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 세포 내에서 발현시키기 위해, 조제한 DNA 의 단편, 또는 전장을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다.
이 재조합 벡터를 이 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 것에 의해 본 발명의 세포를 얻을 수 있다. 또한, 세포막 위의 당단백질의 당 사슬 구조 또는 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 것에 의해 본 발명의 세포의 제작을 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용되는 숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP 푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 갖는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는 후술 3 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
발현 벡터로는 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중에 삽입할 수 있고, 설계한 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는 후술하는 3 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입 방법으로는 후술하는 3 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는 예컨대 다음과 같은 방법을 들 수 있다.
형질 전환체를 선택하는 방법
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 결실된 세포를 선택하는 방법으로는 문헌 [신생화학 실험 강좌 3 - 당질 I, 당단백질 (토쿄카가쿠 동인) 일본 생화학회 편저 (1988)], 문헌 [세포 공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글라이코 바이올로지 실험 프로토콜, 당단백질 당지질 프로테오글리칸 (슈준사 제조) 타니구치 나오유키 스즈키 아케미 후루카와 키요시 스가하라 카즈유키 감수 (1996)], 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지 등에 기재된 생화학적인 방법 또는 유전자 공학적인 방법 등을 들 수 있다. 생화학적인 방법으로는 예컨대 효소 특이적인 기질을 사용하여 효소 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다. 유전자 공학적인 방법으로는 예컨대 효소 유전자의 mRNA 량을 측정하는 노던 해석이나 RT-PCR 법 등을 들 수 있다.
세포막 상의 당단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는 예컨대 후술하는 I 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는 예컨대 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 cDNA 를 조제하는 방법으로는 예컨대 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.
DNA 의 조제 방법
각종 숙주 세포의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 또는 mRNA 를 조제한다.
조제한 전체 RNA 또는 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여 디제너레이티브 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 법에 의해 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득한다.
취득한 유전자 단편을 프로브로 사용하고, cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 세포내 당뉴클레이티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 DNA 를 취득할 수 있다.
인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포의 mRNA 는 시판중인 것 (예컨대 Clontech 사) 을 사용해도 되고, 이하와 같이 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 조제해도 된다. 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법 [메서드즈 인 엔자이몰로지(Methods in Enzymology), 154, 3 (1987)], 산성 티오시안산구아니딘 페놀 클로로포름 (AGPC) 법 [애널리티컬 바이오케미스트리 (Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987); 실험 의학, 9, 1937 (1991)] 등을 들 수 있다.
또한, 전체 RNA 로부터 poly (A)＋RNA 로서 mRNA 를 조제하는 방법으로는 올리고 (dT) 고정화 셀룰로스 칼럼법 (몰레큘러 클로닝 제 2 판) 등을 들 수 있다.
또한, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 사), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 사) 등의 키트를 사용하는 것에 의해 mRNA 를 조제할 수 있다.
조제한 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리 제작법으로는 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) 등에 기재된 방법, 또는 시판 중인 키트, 예컨대 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies 사), ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE 사) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 클로닝 벡터로는 대장균 K12 주 중에서 자립 복제할 수 있는 것이면 파아지 벡터, 플라스미드 벡터 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는 ZAP Express [STRATAGENE 사, 스트러티지즈 (Strategies), 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(＋) [뉴클레익 애시드 리서치 (Nucleic Acids Research), 17, 9494 (1989)], Lambda ZAP II (STRATAGENE 사),λgt10, λgt11 [디엔에이 클로닝 어 프랙티컬 어프로치 (DNA cloning, A Practical Approach), 1, 49, (1985), λTriplEx (Clontech 사), λExCell (Pharmacia 사), pT7T318U (Pharmacia 사), pcD2 [몰레큘러 셀룰러 바이올로지 (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] 및 pUC18 [진 (Gene), 33, 103 (1985)] 등을 들 수 있다.
숙주 미생물로는 미생물이면 어느 것이나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 대장균이 사용된다. 구체적으로는 에스쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli) XL1-Blue MRF'[STRATAGENE 사, 스트러티지즈 (Strategies), 5, 81, (1992)], 에스쉐리키아 콜라이 C600 [제네틱스 (Genetics), 39, 440 (1954)], 에스쉐리키아 콜라이 Y1088 [사이언스 (Science), 222, 778 (1983)], 에스쉐리키아 콜라이 Y1090 (사이언스 (Science), 222, 778 (1983)], 에스쉐리키아 콜라이 NM522 [저널 오브 몰레큘러 바이올로지 (J. Mol. Biol.), 166, 1(1983)], 에스쉐리키아 콜라이 K802 [저널 오브 몰레큘러 바이올로지 (J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] 및 에스쉐리키아 콜라이 JM105 [진 (Gene, 38, 275 (1985)] 등을 사용할 수 있다.
이 cDNA 라이브러리를 그대로 이후의 해석에 사용해도 되지만, 불완전 길이 cDNA 의 비율을 낮추고, 가급적 완전 길이 cDNA 를 효율적으로 취득하기 위해 스가하라 등이 개발한 올리고 캡법 [진 (Gene), 138, 171 (1994); 진 (Gene), 200, 149 (1997); 단백질 핵산 효소, 41, 603 (1996); 실험 의학, 11, 2491 (1993); cDNA 클로닝 (요도사) (1996); 유전자 라이브러리의 제작법 (요도사) (1994)] 을 이용하여 조제한 cDNA 라이브러리를 이하의 해석에 사용해도 된다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 아미노산 서열에 기초하여 이 아미노산 서열을 코드하는 것이 예측되는 염기 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 염기 서열에 특이적인 디제너레이티브 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 법 [피시알 프로토콜즈 (PCR Protocols), Academic Press (1990)] 을 이용하여 DNA 의 증폭을 실시함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.
취득한 유전자 단편이 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 DNA 인 것은 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 상거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [프로시딩스 오브 더 내쇼널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 74, 5463 (1977) 또는 ABIPRISM 377 DNA 시퀀서 (Applied Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석하는 것에 의해 확인할 수 있다.
이 유전자 단편 DNA 를 프로브로 하여 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA 로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리에 대해 콜로니 하이브리다이제이션이나 프라크 하이브리다이제이션 (몰레큘러 클로닝 제 2 판) 을 실시함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 DNA 를 취득할 수 있다.
또한, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득하기 위해 사용한 프라이머를 사용하고, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA 로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 PCR 법을 이용하여 스크리닝함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 DNA 를 취득할 수도 있다.
취득한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 DNA 의 염기 서열을 말단으로부터, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대 상거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [프로시딩스 오브 더 내쇼널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 74, 5463 (1977) 또는 ABIPRISM 377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하는 것에 의해 이 DNA 의 염기 서열을 결정한다.
결정한 cDNA 의 염기 서열을 기초로 BLAST 법 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여 GenBank, EMBL 및 DDBL 등의 염기 서열 데이터 베이스를 검색하는 것에 의해 데이터 베이스 중의 유전자 중에서 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하고 있는 유전자를 결정하는 것이다.
상기 방법에서 얻어진 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열로는 예컨대 서열 번호 48, 51 또는 41 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열로는 예컨대 서열 번호 1 또는 2 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
결정된 DNA 의 염기 서열에 기초하여 포스포아미다이트법을 이용한 파킨 엘마사의 DNA 합성기 model 392 등의 DNA 합성기를 이용하여 화학 합성함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 cDNA 를 취득할 수도 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는 예컨대 이하에 기재된 방법을 들 수 있다.
게놈 DNA 의 조제 방법
게놈 DNA 의 제조 방법으로는 몰레큘러 클로닝 제 2 판이나 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 또한 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 사) 이나 Universal GenomeWalker™Kits (CLONTECH 사) 등을 사용함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 를 단리할 수도 있다.
상기 방법에서 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로서 예컨대 서열 번호 57 또는 60 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로서 예컨대 서열 번호 3 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 사용하지 않고 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관한 효소의염기 서열에 기초하여 설계한 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 리보자임을 직접 숙주 세포에 도입함으로써 본 발명의 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 리보자임은 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다. 구체적으로는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관한 관여하는 효소를 코드하는 cDNA 및 게놈 DNA 의 염기 서열 중, 연속한 5 ∼ 150 염기, 바람직하게는 5 ∼ 60 염기, 보다 바람직하게는 10 ∼ 40 염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고머 뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여 이 올리고머 뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고머 뉴클레오티드 (안티센스 올리고머 뉴클레오티드) 또는 이 올리고머 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 리보자임을 합성함으로써 조제할 수 있다.
올리고머 뉴클레오티드로는 올리고 RNA 및 이 올리고머 뉴클레오티드의 유도체 (이하, 올리고머 뉴클레오티드 유도체라고 함) 등을 들 수 있다.
올리고머 뉴클레오티드 유도체로는 올리고머 뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고머 뉴클레오티드 유도체, 올리고머 뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고머 뉴클레오티드 유도체, 올리고머 뉴클레오티드 중의 리보스와 인산디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고머 뉴클레오티드 유도체, 올리고머 뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5프로피닐우라실로 치환된 올리고머뉴클레오티드 유도체, 올리고머 뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 유도체 올리고머 뉴클레오티드, 올리고머 뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고 뉴클레오티드 유도체, 올리고머 뉴클레오티드 중의 시토신이 페녹사진 수식 시토신 (phenoxazine-modified cytosine) 로 치환된 올리고머 뉴클레오티드 유도체, 올리고머 뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-O-프로필리보스로 치환된 올리고머 뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고머 뉴클레오티드 중의 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고머 뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다 [세포 공학, 16, 1463 (1997)].
(b) 상동 재조합법에 의한 본 발명 세포의 제작을 위해 사용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 세포의 제작을 위해 사용하는 숙주 세포는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 염색체 상의 표적 유전자를 상동 재조합법을 이용하여 개변함으로써 제작할 수 있다.
염색체 상의 표적 유전자의 개변은, Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (이하, 「매니플레이팅 더 마우스 엠브리오 어 래보러토리 매뉴얼」이라고 약기한다), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타게팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, 요도사 (1995) (이하, 「ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작」이라고 약기한다) 등에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어 다음과 같이 실시할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 를 조제한다.
게놈 DNA 의 염기 서열에도 기초하여, 개변하는 표적 유전자 (예를 들어, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 구조 유전자, 또는 프로모터 유전자) 를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다.
제작한 타겟 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 표적 유전자와 타겟 벡터의 사이에서 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 본 발명의 세포 제작을 위해 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 게놈 DNA 의 조제 방법 등을 들 수 있다.
상기 방법에서 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로서, 예를 들어 서열 번호 57 또는 60 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로서, 예를 들어 서열 번호 3 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터는, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타게팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작 (요도사) (1995) 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다. 타겟 벡터는, 리플레이스먼트형, 인서숀(insertion)형 모두 사용할 수 있다.
각종 숙주 세포로의 타겟 벡터의 도입에는, 후술 3 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
상동 재조합체를 효율적으로 선별하는 방법으로, 예를 들어, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타게팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작 (요도사) (1995) 등에 기재된 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 폴리 A 선택 등의 방법을 사용할 수 있다. 선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로는, 게놈 DNA 에 대한 서던 하이브리다이제이션법 (몰레큘러 클로닝 제 2 판) 이나 PCR 법 [PCR 프로토콜즈 (PCR Protocols), Academic Press (1990)] 등을 들 수 있다.
(c) RDO 방법에 의한 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, RDO 법을 사용하여, 예를 들어, 다음과 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA 를 조제한다.
조제한 cDNA 또는 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정한다.
결정한 DNA 의 서열에 근거하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 RDO 의 컨스트럭트를 설계하여 합성한다.
합성한 RDO 를 숙주 세포에 도입하고 표적으로 한 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소에 변이가 발생한 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 RDO 의 도입에는, 후술 3 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 cDNA 를 조제하는 방법으로는, 예를 들어, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 「DNA의 조제 방법」등을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 예를 들어, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 게놈 DNA 의 조제 방법 등을 들수 있다.
DNA 의 염기 서열은, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-) (Stratagene 사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하여, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어, 상거 (Sanger) 들의 디데옥시법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),74, 5463 (1977)] 등의 반응을 실시하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예를 들어, A. L. F. DNA 시퀀서 (Pharmacia 사 제조) 등을 사용하여 해석함으로써 그 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.
RDO 는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.
RDO 를 숙주 세포에 도입하고, 표적으로 한 효소, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자에 변이가 발생한 세포를 선택하는 방법으로는, 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지 등에 기재된 염색체 상의 유전자의 변이를 직접 검출하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된, 도입한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법, 후술 1 의 (5) 에 기재된 세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법, 또는, 후술 4 또는 후술 5 에 기재된 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법도 사용할 수 있다.
RDO 의 컨스트럭트는, 사이언스 (Science),273, 1386 (1996): 네이처 메디슨 (Nature Medicine),4, 285 (1998); 헤파토로지 (Hepatology),25, 1462 (1997); 진 세라피 (Gene Therapy),5, 1960 (1999); 진 세라피 (Gene Therapy),5, 1960 (1999); 저널 오브 몰레큘러 메디슨 (J. Mol. Med.),75, 829 (1997); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),96, 8774 (1999); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),96, 8768 (1999); 뉴클레익 애시드 리서치 (Nuc. Acids. Res.),27, 1323 (1999); 인베스티게이션 오브 더마톨로지 (Invest. Dematol.),111, 1172 (1998); 네이처 바이오테크놀로지 (Nature Biotech.),16, 1343 (1998); 네이처 바이오테크놀로지 (Nature Biotech.),18, 43 (2000); 네이처 바이오테크놀로지 (Nature Biotech.),18, 555 (2000) 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(d) RNAi 법에 의한 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, RNAi 법을 사용하여, 예를 들어, 다음과 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 cDNA 를 조제한다.
조제한 cDNA 의 염기 서열을 결정한다.
결정한 DNA 의 서열에 근거하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 부분 또는 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자의 컨스트럭트를 설계한다.
그 RNAi 유전자를 세포내에서 발현시키기 위해, 조제한 DNA 의 단편, 또는 전장를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.
그 재조합 벡터를, 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
도입한 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성, 또는 생산 항체 분자 또는 세포 표면 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를얻을 수 있다.
숙주 세포로는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술 3 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 본 항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 본 항 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는,예를 들어, 후술 4 또는 후술 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 cDNA 를 조제하는 방법으로는, 예를 들어, 본 항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 「DNA의 조제 방법」등을 들 수 있다.
또한, 발현 벡터를 사용하지 않고, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 염기 서열에 근거하여 설계한 RNAi 유전자를 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.
RNAi 유전자는, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.
RNAi 유전자의 컨스트럭트는, [네이처 (Nature),391, 806 (1998); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),95, 15502 (l998); 네이처 (Nature),395, 854 (l998): 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),96, 5049 (1999); 셀 (Cell),95, 1017 (l998); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),96, 1451 (1999); 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),95, 13959 (l998); 네이처 셀 바이올로지 (Nature Cell Biol.),2, 70 (2000)] 등의 기재에 따라서 설계할 수 있다.
(e) 트랜스포존을 사용한 방법에 의한, 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 네이처 제네틱 (Nature Genet.),25, 35 (2000) 등에 기재된 트랜스포존의 시스템을 사용하여, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성, 또는 생산 항체 분자 또는 세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 돌연변이체를 선택함으로써, 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
트랜스포존의 시스템이란, 외래 유전자를 랜덤하게 염색체 상에 삽입시킴으로써 돌연변이를 유발시키는 시스템으로, 통상 트랜스포존에 삽입된 외래 유전자를 돌연변이를 유발시키는 벡터로서 사용하고, 이 유전자를 염색체 상에 랜덤하게 삽입시키기 위한 트랜스포제스의 발현 벡터를 동시에 세포 중에 도입한다.
트래스포제스는, 사용하는 트랜스포존의 서열에 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다.
외래 유전자로는, 숙주 세포의 DNA 에 변이를 유도하는 것이면 모든 유전자를 사용할 수 있다.
숙주 세포로는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다. 각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술 3 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 본 항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 본 항 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 후술 4 또는 후술 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.
(2) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 그 효소의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, GMD, Fx, GFPP, 푸코키나아제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 α-1,6-푸코실트랜스페라아제, α-L-푸코시다아제(fucosidase) 등을 들 수 있다.
이들 효소는 기질 특이성을 가지고 있는 특정한 반응을 촉매하는 효소이고, 이러한 기질 특이성을 가진 촉매 작용을 갖는 효소의 활성 중심을 파괴함으로써, 이들 효소의 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 표적으로 하는 효소 중, GMD 를 예로 하여 그 도미넌트 네거티브체의 제작에 대해서 구체적으로 이하에 서술한다.
대장균 유래의 GMD 의 입체 구조를 해석한 결과, 4 개의 아미노산 (133 번째의 트레오닌, 135 번째의 글루타민산, 157 번째의 티로신, 161 번째의 리신) 이 효소 활성에 중요한 기능을 담당하고 있음이 밝혀졌다 (Structure,8, 2, 2000). 즉, 입체 구조의 정보에 근거하여 이들 4 개의 아미노산을 다른 기타 아미노산으로 치환한 변이체를 제작한 결과, 모든 변이체에 있어서 유의하게 효소 활성이 저하되어 있는 것으로 나타나 있다. 한편, GMD 의 보효소 NADP 나 기질인 GDP-만노오스와의 결합능에 관해서는, 모든 변이체에 있어서 거의 변화가 관찰되지 않은다. 따라서, GMD 의 효소 활성을 담당하는 이들 4 개의 아미노산을 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 대장균 유래의 GMD 의 결과에 근거하여,아미노산 서열 정보를 근거로 한 상동성 비교나 입체 구조 예측을 실시함으로써, 예를 들어, CHO 세포 유래의 GMD (서열 번호 41) 에서는, 155 번째의 트레오닌, 157 번째의 글루타민산, 179 번째의 티로신, 183 번째의 리신을 기타 아미노산으로 치환하는 것에 의해 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 이러한 아미노산 치환을 도입한 유전자의 제작은, 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 상기 서술한 바와 같이 제작한 표적 효소의 도미넌트 네거티브체 유전자를 사용하여, 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, 매니플레이팅 마우스 엠브리오 제 2 판 등에 기재된 유전자 도입 방법에 따라서, 예를 들어 다음과 같이 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 도미넌트 네거티브체를 코드하는 유전자 (이하, 도미넌트 네거티브체 유전자라고 약기한다) 를 조제한다.
조제한 도미넌트 네거티브체 유전자의 전장 DNA 를 토대로 하여, 필요에 따라서 그 단백질을 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
그 DNA 단편, 또는 전장 DNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.
그 재조합 벡터를 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성, 또는 생산 항체 분자 또는 세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.
숙주 세포로서는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 가지고 있는 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 목적으로 하는 도미넌트 네거티브체를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술 3 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.
각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술 3 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 후술하는 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다.
세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 후술 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예를 들어, 후술 4 또는 후술 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.
(3) 효소에 대한 돌연변이를 도입하는 수법
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자에 대해서 돌연변이를 도입하고, 그 효소에 돌연변이를 일으킨 원하는 세포주를 선택하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 GMD, Fx, GFPP, 푸코키나아제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, α-1,6-푸코실트랜스페라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
방법으로는, 1) 돌연변이 유발처리에서 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 발생한 돌연변이체로부터 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 2) 돌연변이 유발처리에서 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 발생한 돌연변이체로부터, 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 3) 돌연변이 유발처리에서 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연발생적으로 발생한 돌연변이체로부터, 그 세포의 세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.
돌연변이 유발처리로는, 친주의 세포의 DNA 에 점 돌연변이, 결실 또는 프레임 시프트 돌연변이를 유기하는 것이면 모든 처리를 사용할 수 있다.
구체적으로는, 에틸니트로소우레아, 니트로소구아니딘, 벤조피렌, 아크리딘 색소에 의한 처리, 방사선의 조사 등을 들 수 있다. 또한, 각종 알킬화제나 발암물질도 돌연변이 유발물질로서 사용할 수 있다. 돌연변이 유발물질을 세포에 작용시키는 방법으로는, 예를 들어 조직 배양의 기술 제 3 판 (아사쿠라서점) 일본 조직배양학회 편 (1996), 네이처 제네틱스 (Nature Genet.),24, 314, (2000) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
자연발생적으로 발생한 돌연변이체로는, 특별한 돌연변이 유발처리를 실시하지 않고, 통상의 세포 배양 조건에서 계대 배양을 계속함으로써 자연발생적으로 생기는 돌연변이체를 들 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어, 본 항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생산 항체 분자의 당 사슬 구조를 식별하는 방법으로는, 예를 들어 후술 4 또는 후술 5 에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포막 상의 당 단백질의 당 사슬 구조를 식별하는 방법으로는, 예를 들어 본 항의 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다.
(4) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자를 표적으로 하고, 안티센스 RNA/DNA 기술 [바이오사이언스와 인더스트리,50, 322 (1992), 화학,46, 681 (1991), Biotechnology,9, 358 (1992), Trends in Biotechnology,10, 87 (1992), Trends in Biotechnology,10, 152 (1992), 세포 공학,16, 1463 (1997)], 트리플 헬릭스 기술 [Trends in Biotechnology,10, 132 (1992)] 등을 사용하여, 표적으로 하는 유전자의 전사 또는 번역을 억제함으로써 제작할 수 있다.
세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, GMD, Fx, GFPP, 푸코키나아제 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, α-1,6-푸코실트랜스페라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.
(5) N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴(lectin)에 내성인 주를 선택하는 수법
본 발명의 세포를 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다.
N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법으로는, 예를 들어, 소마틱 셀 앤드 몰레큘러 제네틱스 (Somatic Cell Mol. Genet.),12, 51 (1986) 등에 기재된 렉틴을 사용한 방법을 들 수 있다.
렉틴으로는, N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴이면 어떠한 렉틴도 사용할 수 있는데, 그 구체적인 예로는, 렌즈콩 렉틴 LCA (렌스 쿨리나리스 유래의 렌틸 아굴루티닌), 완두콩 렉틴 PSA (피섬 사티범 유래의 완두콩 렉틴), 누에콩 렉틴 VFA (비씨아 파바 유래의 아굴루티닌), 들주발버섯 렉틴 AAL (알레우리아 아우란티아 유래의 렉틴) 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 1㎍/㎖∼1㎎/㎎ 의 농도의 상기 서술한 렉틴을 포함하는 배지에서 1 일∼2 주간, 바람직하게는 1 일∼1 주간 배양하여, 생존하고 있는 세포를 계대 배양 또는 콜로니를 픽업하여 별도의 배양기로 옮기고, 다시 계속해서 렉틴을 포함하는 배지에서 배양을 계속함으로써, 본 발명의 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택할 수 있다.
2. 본 발명의 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물 또는 이들 자손의 제작
본 발명의 항체 분자의 당 사슬의 수식에 관련되는 효소의 활성이 제어되도록 게놈 유전자가 개변된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물 또는 이들 자손은, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소가 유전자를 표적으로 하여, 상기 1 을 사용하여 제작한 본 발명의 배성 줄기세포, 수정란 세포, 식물 캘러스 세포(callus cell)로부터, 예를 들어 다음과 같이 제작할 수 있다.
트랜스제닉 비인간 동물의 경우, 목적으로 하는 비인간 동물, 예를 들어 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 토끼 등의 배성 줄기세포에 상기 1. 에 기재된 수법을 사용함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 제어된 본 발명의 배성 줄기세포를 제작할 수 있다.
구체적으로는, 염색체 상의 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자를 공지된 상동 재조합의 수법 [예를 들어, Nature,326, 6110, 295 (1987), Cell,51, 3, 503 (1987) 등] 에 의해 불활화 또는 임의의 서열로 치환된 변이 클론을 작성한다. 제작한 배성 줄기세포 (예를 들어, 그 변이 클론) 을 사용하여, 동물의 수정란의 배반포 (blastcyst)로의 주입 키메라법 또는 집합 키메라법 등의 수법에 의해, 배성 줄기세포 클론과 정상 세포로 이루어지는 키메라 개체를 조제할 수 있다. 이 키메라 개체와 정상 개체의 교배에 의해, 전신의 세포에서 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하된 트랜스제닉 비인간 동물을 얻을 수 있다.
또한, 목적으로 하는 비인간 동물, 예를 들어 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이, 토끼 등의 수정란 세포에, 상기 1. 에 기재된 수법과 동일한 수법을 사용함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하된 본 발명의 수정란 세포를 제작할 수 있다.
제작한 수정란 세포를, 매니플레이팅 마우스 엠브리오 제 2 판 등에 기재된 배이식 방법을 사용하여 가임신 (phantom pregnancy) 한 암컷의 난관 또는 자궁에이식하여 출산시킴으로서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하된 트랜스제닉 비인간 동물을 제작할 수 있다.
트랜스제닉 식물의 경우, 목적으로 하는 식물체 캘러스 또는 세포에, 상기 1. 에 기재된 수법과 동일한 수법을 사용함으로써, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하된 본 발명의 캘러스를 제작할 수 있다.
제작한 캘러스를, 공지 방법 [조직배양,20(1994); 조직배양,21(1995); 트렌즈 인 바이오테크놀로지 (Trends in Biotechnology),15, 45 (1997)] 에 준하여 옥신 (auxin) 및 사이토키닌을 함유하는 배지에서 배양함으로써 재분화시켜, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하된 트랜스제닉 식물을 제작할 수 있다.
3. 항체 조성물의 제조 방법
항체 조성물은, 몰레큘러 클로닝 제 2 판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (이하, 안티보디스라고 약기한다), Monoclonal Antibodies: principles andpractice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (이하, 모노클로날 안티보디스라고 약기한다), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at 0xford University Press, 1996 (이하, 안티보디 엔지니어링이라고 약기한다) 등에 기재된 방법을 사용하여, 예를 들어, 다음과 같이 숙주 세포 중에서 발현시켜 취득할 수 있다.
본 발명의 항 CD2O 항체 분자의 전장 cDNA 를 조제하고, 그 항체 분자를 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.
그 DNA 단편, 또는 전장 cDNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.
그 재조합 벡터를 그 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 항체 분자를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주 세포로는, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등 목적으로 하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다.
항체 분자의 Fc 영역에 결합하는 N-글리코시드 결합 당 사슬의 수식에 관련되는 효소, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 결실된 세포를 선택하거나, 또는 전술한 1 에 나타낸 각종 인위적 수법에 의해 얻어진 세포를 숙주 세포로서 사용할 수도 있다.
발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 목적으로 하는 항체 분자를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.
cDNA 는, 상기 1. 의 (1) 의 (a) 에 기재된 DNA 의 조제 방법에 따라서, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터, 목적으로 하는 항체 분자에 특이적인 프로브 프라이머 등을 사용하여 조제할 수 있다.
효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 효모 균주 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 헥소스키나아제 등의 해당(解糖)계가 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로는, 삭카로미세스속, 시조삭카로미세스속, 클류이버로미세스속, 트리코스포론속, 슈와니오미세스속 등에 속하는 미생물, 예를 들어, 사카로마이세스 서레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼비 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀룬란스(Trichosporon pullulans), 샨니오마이세스 알루비우스 (Schwanniomyces alluvius) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 일렉트로포레이션법 [메소드 인 엔자이몰로지(Methods. Enzymol.),194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),84, 1929 (1978)], 아세트산리튬법 [저널 오브 박테리오로지 (J. Bacteriology),153, 163 (1983)], 프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),75, 1929 (1978) 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, pcDNAI, pcDM8 (후나코시사에서 시판), pAGE107 [일본 공개특허공보 평 3-22979; 사이토테크놀로지 (Cytotechnology),3, 133, (1990)], pAS3-3 [일본 공개특허공보 평 2-227075], pCDM8 [네이처 (Nature),329, 840, (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사), pREP4 (Invitrogen 사), pAGE103 [저널 오브 바이오케미스트리 (J. Biochemistry),101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 동물 세포 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 인간 CMV 의 IE 유전자의 엔핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.
숙주 세포로는, 인간의 세포인 나말바 (Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니스 햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299), 래트 미엘로머 세포, 마우스 미엘로머 세포, 시리언 햄스터 신장 유래 세포, 배성 줄기세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로는, 동물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 일렉트로포레이션법 [사이토테크놀로지 (Cytotechnology),3, 133 (1990)], 인산칼슘법 [일본 공개특허공보 평2-227075], 리포펙션법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),84, 7413 (1987)], 인젝션법 [매니플레이팅 더 마우스 엠브리오 어 래보러토리 매뉴얼], 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 [일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813호], DEAE-덱스트란법 [바이오 매뉴얼 시리즈 4 - 유전자 도입과 발현 해석법 (요도사) 요꼬다 다카시 아라이 신이치 편 (1994)], 바이러스 벡터법 [매니플레이팅 마우스 엠브리오 제 2 판] 등을 들 수 있다.
곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들어 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), 바이오/테크놀로지 (Bio/Technology),6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해, 단백질을 발현시킬 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 버큐로 바이러스를 곤충 세포에 공(共)도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 또 다시 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 단백질을 발현시킬 수 있다.
이 방법에 있어서 사용되는 유전자 도입 벡터로는, 예를 들어, pVL1392, pVL1393, pBlueBac Ⅲ (모두 Invitorogen 사) 등을 들 수 있다.
버큐로 바이러스로는, 예를 들어, 야도나방과 곤충에게 감염되는 바이러스인 오토그라파 캘리포니카 뉴클레어 폴리헤드로시스 바이러스 (Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충 세포로는, 스포도프테라푸루지페르다(Spodopterafrugiperda) 의 난소 세포인 Sf9, Sf21 [커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusiani 의 난소 세포인 High 5 (Invitrogen 사) 등을 사용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 버큐로 바이러스의 공도입 방법으로는, 예를 들어, 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075), 리포펙션법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.
식물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.
프로모터로는, 식물 세포 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로는, 담배, 감자, 토마토, 당근, 콩, 머스터드, 앨퍼퍼, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입 방법으로는, 식물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 아그로박테리움 (Agrobacterium) 을 사용하는 방법 [일본 공개특허공보 소59-140885, 일본 공개특허공보 소60-70080, WO94/00977], 일렉트로포레이션법 [일본 공개특허공보 소60-251887], 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 [일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813호] 등을 들 수 있다.
유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 이외에, 몰레큘러 클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, Fc 영역과 기타 단백질과의 융합 단백질 발현 등을 실시할 수 있다.
당 사슬의 합성에 관여하는 유전자를 도입한 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포에 의해 발현시킨 경우에는, 도입한 유전자에 의해 당 또는 당 사슬이 부가된 항체 분자를 얻을 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하여 배양물 중에 항체 분자를 생산 축적시키고, 그 배양물로부터 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다. 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주 세포의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 실시할 수 있다.
대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 그 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 수행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 모두 사용할 수 있다.
탄소원으로는, 그 생물이 자화할 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.
질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 외의 질소함유 화합물, 및 펩톤, 고기(肉) 엑기스, 효모 엑기스, 콘스태치 플리커, 카제인 가수분해물, 대두술지게미 및 대두술지게미 가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염류로는, 인산 제 1 칼륨, 인산 제 2 칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 진탕 배양 또는 심부(深部) 통기 교반 배양 등의 호기적 조건하에 실시한다. 배양 온도는 15∼40℃ 가 좋고, 배양 시간은 통상 16시간∼7일간이다. 배양 중의 pH 는 3.0∼9.0 으로 유지한다. pH 의 조제는, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어,lac프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을,trp프로모터를 사용한 재조합 벡터로 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [더 저널 오브 더 아메리칸 메디컬 어소시에이션 (The Journal of the American Medical Association),199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [사이언스 (Science),122, 501 (1952)], 덜베코 개변 MEM 배지 [비롤로지 (Virology),8, 396 (1959)], 199 배지 [프로시딩스 오브 더 소사이어티 포 더 바이오로지컬 메디슨 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73, 1 (1950)], Whitten 배지 [발생 공학 실험 매뉴얼 - 트랜스제닉 마우스의 제조 방법 (고단샤) 가츠키 모토야 편 (1987)] 또는 이들 배지에 소태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 pH6∼8, 30∼40℃, 5% C02존재하 등의 조건에서 1∼7 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (Pharmingen 사), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (Life Technologies 사), ExCell 400, ExCell 405 (모두 JRH Biosciences 사), Grace's Insect Medium [네이처 (Nature),195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 pH6∼7, 25∼30℃ 등의 조건 하에서 1∼5 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도된다.
식물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체는, 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 그 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스쿠그 (MS: Murashige and Skoog) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 사이토카인 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은, 통상 pH5∼9, 20∼40℃ 의 조건 하에서 3∼60 일간 실시한다.
또한, 배양 중 필요에 따라서, 카나마이신, 하이글로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.
상기한 바와 같이, 항체 분자를 코드하는 DNA 를 삽입한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물, 동물 세포, 또는 식물 세포 유래의 형질 전환체를 통상의 배양 방법에 따라서 배양하여 항체 조성물을 생산 축적시키고, 그 배양물로부터 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다.
항체 유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 외에 몰레큘러 클로닝 제 2 판에 기재되어 있는 방법에 준하여, 분비 생산, 융합 단백질 발현 등을 실시할 수 있다.
항체 조성물의 생산 방법으로는, 숙주 세포내에 생산시키는 방법, 숙주 세포 외에 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포나, 생산시키는 항체 분자의 구조를 바꿈으로써 그 방법을 선택할 수 있다.
항체 조성물이 숙주 세포내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨등의 방법 [저널 오브 바이올로지컬 케미스트리 (J. Biol, Chem.),264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),86, 8227 (1989); 진 디벨롭먼트 (Genes Develop.),4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평5-336963호, 일본 공개특허공보 평6-823021호 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 그 항체 조성물을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여 발현 벡터에 항체 분자를 코드하는 DNA, 및 항체 분자의 발현에 적절한 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입하고, 그 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한 후에 항체 분자를 발현시키는 것에 의해, 목적으로 하는 항체 분자를 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 일본 공개특허공보 평2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수도 있다.
또, 유전자가 도입된 동물 또는 식물의 세포를 재분화시키는 것에 의해, 유전자가 도입된 동물 개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조할 수도 있다.
형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우에는, 통상의 방법에 따라서 사육 또는 재배하고 항체 조성물을 생산 축적시켜 그 동물 개체 또는 식물 개체로부터 그 항체 조성물을 채취함으로써, 그 항체 조성물을 제조할 수 있다.
동물 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로는, 예를 들어 공지의 방법 [아메리칸 저널 오브 클리니컬 뉴트리션 (American Journal of Clinical Nutrition),63, 639S (1996); 아메리칸 저널 오브 클리니컬 뉴트리션 (American Journal of Clinical Nutrition),63, 627S (1996): 바이오/테크놀로지 (Bio/Technology),9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 목적으로 하는 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
동물 개체의 경우는, 예를 들어, 항체 분자를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하여, 항체 조성물을 그 동물 중에 생산 축적시키고, 그 동물 중으로부터 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 제조할 수 있다. 그 동물 중의 생산ㆍ축적 장소로는, 예를 들어, 그 동물의 젖 (일본 공개특허 소63-309192), 알(卵) 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로는, 동물에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예를 들어, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α카제인 프로모터, β카세인 프로모터, β락토글로블린 프로모터, 유청 산성 프로틴 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
식물 개체를 사용하여 항체 조성물을 제조하는 방법으로는, 예를 들어, 항체 분자를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지 방법 [조직배양,20(1994); 조직배양,21(1995); 트렌드 인 바이오테크놀로지 (Trends in Biotechnology),15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하여 항체 조성물을 그 식물 중에 생산 축적시키고, 그 식물 내에서 그 항체 조성물을 채취함으로써 항체 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.
항체 분자를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환체에 의해 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 항체 조성물이, 세포내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하고 수계 완충액에 현탁한 후, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 만톤가우린 호모게니저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 그 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미쓰비시화학 (주) 제) 등 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia 사) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자 체를 사용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 수법을 단독으로 또는 조합 사용하여, 항체 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.
또한, 항체 조성물이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우는, 동일하게 세포를 회수 후 파쇄하고 원심 분리함으로써, 침전 분획으로서 항체 조성물의 불용체를 회수한다. 회수한 항체 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 그 가용화액을 희석 또는 투석함으로써 그 항체 조성물을 정상인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 같은 단리 정제법에 의해 그 항체 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.
항체 조성물이 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청에 그 항체 조성물 또는 그 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 그 배양물을 상기와 같은 원심 분리등의 수법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하고, 그 가용성 분획으로부터 상기와 같은 단리 정제법을 사용함으로써 항체 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.
이렇게 해서 취득되는 항체 조성물로서, 예를 들어, 항체, 항체의 단편, 항체의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질 등을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 항체 조성물의 취득의 보다 구체적인 예로서, 인간화 항체의 조성물의 제조 방법에 대해서 기술하지만, 다른 항체 조성물을 해당 방법과 동일한 방법으로 취득할 수도 있다.
(1) 인간화 항체 발현용 벡터의 구축
인간화 항체 발현용 벡터란, 인간 항체의 중쇄 (H 사슬) 및 경쇄 (L 사슬) C 영역을 코드하는 유전자가 삽입된 동물 세포용 발현 벡터이고, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역을 코드하는 유전자를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역으로는, 임의의 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역일 수 있고, 예를 들어, 인간 항체의 H 사슬의 IgG1 서브 클래스의 C 영역 (이하, hCγ1 이라고 표기한다) 및 인간 항체의 L 사슬의 κ클래스의 C 영역 (이하, hCκ 라고 표기한다) 등을 들 수 있다.
인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역을 코드하는 유전자로는 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA 를 사용할 수 있고, 또한 cDNA 를 사용할 수도 있다.
동물 세포용 발현 벡터로는, 인간 항체의 C 영역을 코드하는 유전자를 삽입발현시킬 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, pAGE107 [사이토테크놀로지 (Cytotechnology),3, 133 (1990)], pAGE103 [저널 오브 바이오케미스트리 (J. Biochem.),101, 1307 (1987)], pHSG274 [진 (Gene),27, 223 (1984)], pKCR [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),78, 1527 (1981)], pSG1βd2-4 [사이토테크놀로지 (Cytotechnology),4, 173 (1990)] 등을 들 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용하는 프로모터와 엔핸서로는, SV40 의 초기 프로모터와 엔핸서 [저널 오브 바이오케미스트리 (J. Biochem.),101, 1307(1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR [바이오케미컬 앤드 바이오피지컬 리서치 커뮤니케이션 (Biochem. Biophys. Res. Commun.),149, 960 (1987)], 면역 글로불린 H 사슬과 프로모터 [셀 (Cell),41, 479 (1985)] 와 엔핸서 [셀 (Cell),33, 717 (1983)] 등을 들 수 있다.
인간화 항체 발현용 벡터는, 항체 H 사슬 및 L 사슬이 별도의 다른 벡터 상에 존재하는 타입 또는 동일한 벡터 상에 존재하는 타입 (이하, 탠덤형이라고 표기한다) 모두 사용할 수 있지만, 인간화 항체 발현 벡터의 구축이 용이하고, 동물 세포로의 도입이 용이하며, 동물 세포내에서의 항체 H 사슬 및 L 사슬의 발현량의 밸런스가 균형을 이룬다는 등의 점에서 탠덤형 인간화 항체 발현용 벡터가 바람직하다 [저널 오브 이뮤놀로지컬 메소드 (J. Immunol. Methods),167, 271 (1994)]. 탠덤형 인간화 항체 발현 벡터로는, pKANTEX 93 [몰레큘러 이뮤놀로지 (Mol. Immunol.),37, 1035 (2000)], pEE18 [하이브리도마 (Hybridoma),17, 559 (1998)]등을 들 수 있다.
구축한 인간화 항체 발현용 벡터는, 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체의 동물 세포에서의 발현에 사용할 수 있다.
(2) 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA 의 취득
인간 이외의 동물의 항체, 예를 들어, 마우스 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 는 다음와 같은 방법으로 취득할 수 있다.
목적으로 하는 마우스 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA 를 추출하여 cDNA 를 합성한다. 합성한 cDNA 를 파아지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 그 라이브러리로부터 기존의 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 프로브로서 사용하고, H 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 파아지 또는 재조합 플라스미드 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 갖는 재조합 파아지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파아지 또는 재조합 플라스미드 상의 원하는 마우스 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 전체 염기 서열을 결정하여, 염기 서열로부터 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 전체 아미노산 서열을 추정한다.
인간 이외의 동물로는, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면 모두 사용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법 [메소드 인 엔자이모로지 (Methods in Enzymol.),154, 3 (1987)], 또한 전체 RNA 에서 mRNA 를 조제하는 방법으로는, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 [몰레큘러 클로닝: 어 래보러토리 매뉴얼 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 등을 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포로부터 mRNA 를 조제하는 키트로는, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 사 제조) 등을 들 수 있다.
cDNA 의 합성 및 cDNA 라이브러리 제작법으로는, 통상적인 방법 [몰레큘러 클로닝: 어 래보러토리 매뉴얼 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지 (Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34], 또는 시판의 키트, 예를 들어, Super Script™Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL 사 제조) 나 ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene 사 제조) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
cDNA 라이브러리의 제작시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA 를 주형으로 하여 합성한 cDNA 를 삽입하는 벡터는, 그 cDNA 를 삽입할 수 있는 벡터이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, ZAP Express [스트러티지즈 (Strategies),5, 58 (1992)], pBluescript Ⅱ SK(+) [뉴클레익 애시드 리서치 (Nucleic Acids Research),17, 9494 (1989)], λzap Ⅱ (Stratagene 사 제조), λgt 10, λgt 11 [디엔에이 클로닝: 어 프랙티컬 어프로치 (DNA Cloning: A Practical Approach),Ⅰ, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech 사 제조), λExCell, pT7T3 18U (Pharmacia 사 제조), pcD2 [몰레큘러 앤드 셀룰러 바이올로지 (Mol. Cell.Biol.),3, 280 (1983)] 및 pUC18 [진 (Gene),33, 103 (1985)] 등을 사용할 수 있다.
파아지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균으로는 그 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, XL1-Blue MRF' [스트러티지즈 (Strategies),5, 81 (1992)], C600 [제네틱스 (Genetics),39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [사이언스 (Science),222, 778 (1983)], NM522 [저널 오브 몰레큘러 바이올로지 (J. Mol. Biol.),166, 1 (1983)], K802 [저널 오브 몰레큘러 바이올로지 (J. Mol. Biol.),16, 118 (1966)] 및 JM105 [진 (Gene),38, 275 (1985)] 등을 사용할 수 있다.
cDNA 라이브러리로부터의 인간 이외의 동물의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 클론의 선택법으로는, 아이소토프 (isotope) 또는 형광 표지한 프로브를 사용한 콜로니 하이브리다이제이션법 또는 플라크 하이브리다이제이션법 (plaque hybridization) [몰레큘러 클로닝: 어 래보러토리 매뉴얼 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 에 의해 선택할 수 있다. 또한, 프라이머를 조제하고, mRNA 로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, Polymerase Chain Reaction [이하, PCR 법이라고 표기한다 ; 몰레큘러 클로닝: 어 래보러토리 매뉴얼 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지 (Current Protocols in Molecular Biology), Supplement 1-34] 에 의해 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를조제할 수도 있다.
상기 방법에 의해 선택된 cDNA 를, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-) (Stratagene 사 제조) 들의 플라스미드에 클로닝하여, 통상 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예를 들어, 상거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.),74, 5463 (1977)] 등의 반응을 실시하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예를 들어, A.L.F.DNA 시퀀서 (Pharmacia 사 제조) 등을 사용하여 해석함으로써 그 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.
결정한 염기 서열로부터 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 전체 아미노산 서열을 추정하여, 기지의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 전체 아미노산 서열 [시퀀시즈 오브 프로틴스 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 (Sequences of Proteins of Imnunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 과 비교함으로써, 취득한 cDNA 가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 확인할 수 있다.
또, 항체 가변 영역의 아미노산 서열 또는 그 가변 영역을 코드하는 DNA 의 염기 서열이 이미 공지인 경우에는, 이하의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
아미노산 서열이 공지인 경우에는, 아미노산 서열을, 코돈의 사용 빈도 [시퀀시즈 오브 프로틴스 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 (Sequences of Proteins of Imnunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 를 고려하여 DNA 서열로 변환하고, 설계한 DNA 서열에 근거하여 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 여러개의 합성 DNA 를 합성한 후, 이들을 사용하여 PCR 법을 실시함으로써 DNA 를 얻을 수 있다. 염기 서열이 공지인 경우에는, 그 정보를 토대로 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 여러개의 합성 DNA 를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR 법을 실시함으로써 DNA 를 얻을 수 있다.
(3) 인간 이외의 동물의 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 해석
분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 완전한 아미노산 서열에 대해서는, 기지의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 전체 아미노산 서열 [시퀀시즈 오브 프로틴스 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 (Sequences of Proteins of Imnunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단 아미노산 서열을 추정할 수 있고, 또한 이들이 속하는 서브 그룹을 알 수 있다. 또한, H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 각 CDR 의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 아미노산 서열 [시퀀시즈 오브 프로틴스 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 (Sequences of Proteins of Imnunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 과 비교함으로써 발견해 낼 수 있다.
(4) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
본 항 3 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역을 코드하는 유전자의 상류에, 인간 이외의 동물의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 클로닝하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들어, 인간 이외의 동물의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V영역을 코드하는 cDNA 를, 인간 이외의 동물의 항체 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 3' 말단측의 염기 서열과 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역의 5' 말단측의 염기 서열로 이루어지고, 또한 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA 와 각각 연결하여, 각각을 본 항 3 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역을 코드하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현될 수 있도록 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(5) 인간형 CDR 이식 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA 의 구축
인간형 CDR 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 는, 다음과 같이 다음과 같은 방법으로 구축할 수 있다. 우선, 목적으로 하는 인간 이외의 동물의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 CDR 을 이식하는 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 프레임 워크 (이하, FR 로 표기한다) 의 아미노산 서열을 선택한다. 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 FR 의 아미노산 서열로는, 인간 항체 유래의 것이라면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어, Protein Data Bank 등의 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 FR 의 아미노산 서열, 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬의 V 영역의 FR 의 각 서브 그룹의 공통 아미노산 서열 [시퀀시즈 오브 프로틴스 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 (Sequences of Proteins of Imnunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 등을 들 수 있지만, 그 중에서도, 충분한 활성을 갖는 인간형 CDR 이식 항체를 제작하기 위해서는 목적으로 하는 인간 이외의 동물의 항체의 H 사슬및 L 사슬 V 영역의 FR 의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성 (적어도 60% 이상) 을 갖는 아미노산 서열을 선택하는 것이 바람직하다.
다음으로, 선택한 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 FR 의 아미노산 서열에 목적으로 하는 인간 이외의 동물의 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 CDR 의 아미노산 서열을 이식하고, 인간형 CDR 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 아미노산 서열을 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에서 보이는 코돈의 사용 빈도 [시퀀시즈 오브 프로틴스 오브 이뮤놀로지컬 인터레스트 (Sequences of Proteins of Imnunological Interest), US Dept. Health and Human Services, 1991] 를 고려하여 DNA 서열로 변환하고, 인간형 CDR 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 설계한다. 설계한 DNA 서열에 근거하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 여러개의 합성 DNA 를 합성하고, 이들을 사용하여 PCR 법을 실시한다. 이 경우, PCR 에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA 의 길이로부터, H 사슬, L 사슬 모두 4∼6 개의 합성 DNA 를 설계하는 것이 바람직하다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 3 의 (1) 에서 구축한 인간화 항체 발현용 벡터에 용이하게 클로닝할 수 있다. PCR 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-) (Stratagene 사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 본 항 3 의 (2) 에 기재된 방법에 의해 염기 서열을 결정하고, 목적으로 하는 인간형 CDR 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(6) 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터의 구축
본 항 3 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역을 코드하는 유전자의 상류에, 본 항 3 의 (5) 에서 구축한 인간형 CDR 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 를 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다. 예를 들어, 본 항 3 의 (5) 에서 인간형 CDR 이식 항체의 H 사슬 및 L 사슬 V 영역을 구축할 때에 사용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA 의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, 본 항 3 의 (1) 에 기재된 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 H 사슬 및 L 사슬 C 영역을 코드하는 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 클로닝하여, 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
(7) 인간화 항체의 안정적 생산
본 항 3 의 (4) 및 (6) 에 기재된 인간화 항체 발현 벡터를 적당한 동물 세포에 도입함으로써 인간형 키메라 항체 및 인간형 CDR 이식 항체 (이하, 합하여 인간화 항체라고 한다) 를 안정적으로 생산하는 형질 전환주를 얻을 수 있다.
동물 세포로의 인간화 항체 발현 벡터의 도입법으로는, 일렉트로포레이션법 [일본 공개특허공보 평2-257891; 사이토테크놀로지 (Cytotechnology),3, 133 (1990)] 등을 들 수 있다.
인간화 항체 발현 벡터를 도입하는 동물 세포로는, 인간화 항체를 생산시킬 수 있는 동물 세포이면, 모든 세포를 사용할 수 있다.
구체적으로는, 마우스 미엘로머 세포인 NS0 세포, SP2/O 세포, 차이니스 햄스터 난소 세포 CH0/dhfr- 세포, CHO/DG44 세포, 래트 미엘로머 YB2/0 세포, IR983F 세포, 시리언 햄스터 신장 유래인 BHK 세포, 히트 미엘로머 세포인 나말바 세포 등을 들 수 있지만, 바람직하게는, 차이니스 햄스터 난소 세포인 CHO/DG44 세포, 래트 미엘로머 YB2/0 세포 등을 들 수 있다.
인간화 항체 발현 벡터의 도입 후, 인간화 항체를 안정적으로 생산하는 형질 전환주는, 일본 공개특허공보 평2-257891에 개시되어 있는 방법에 따라서, G418 sulfate (이하, G418 로 표기한다; SIGMA 사 제조) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에 의해 선택할 수 있다. 동물 세포 배양용 배지로는, RPMI1640 배지 (닛스이세이야꾸사 제조), GIT 배지 (닛뽄세이야꾸사 제조), EX-CELL302 배지 (JRH 사 제조), IMDM 배지 (GIBCO BRL 사 제조), Hybridoma-SFM 배지 (GIBCO BRL 사 제조), 또는 이들 배지에 소태아 혈청 (이하, FCS 로 표기한다) 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다. 얻어진 형질 전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 인간화 항체를 생산 축적시킬 수 있다. 배양 상청 중의 인간화 항체의 생산량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법 [이하, ELISA 법이라고 표기한다: 안티보디즈: 어 래보러토리 매뉴얼 (Antibodies; A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1998, 모노크로날 안티보디즈; 프린시플 앤드 프랙티스 (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등에 의해 측정할 수 있다. 또, 형질 전환주는, 일본 공개특허공보 평2-257891 에 개시되어 있는 방법에 따라서, DHFR 유전자 증폭계 등을 이용하여 인간화 항체의 생산량을 상승시킬 수 있다.
인간화 항체는 형질 전환주의 배향 상청으로부터 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제할 수 있다[안티보디즈：어 래보러토리 매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988, 모노클로날 안티보디즈：프린시플 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996]. 또, 그 외에 통상 단백질의 정제에서 사용되는 정제 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외 여과 등을 조합하고 실시하여 정제할 수 있다. 정제한 인간화 항체의 H 사슬, L 사슬 또는 항체 분자 전체의 분자량은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동[이하, SDS-PAGE라 표기함；네이처(Nature),227, 680(1970)]이나 웨스턴 블로팅법[안티보디즈：어 래보러토리 매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988, 모노클로날 안티보디즈：프린시플 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996] 등으로 측정할 수 있다.
이상, 동물 세포를 숙주로 한 항체 조성물의 제조 방법을 나타내었는데, 상기 서술한 바와 같이 효모, 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 개체 또는 식물 개체에서도 동물 세포와 동일한 방법에 의해 항체 조성물을 제조할 수 있다.
이미 숙주 세포가 항체 분자를 발현하는 능력을 갖는 경우에는 후술하는 1 에 기재된 방법을 사용하여 항체 분자를 발현시키는 세포를 조제한 후에 그 세포를 배향하고, 그 배양물로부터 목적으로 하는 항체 조성물을 정제함으로써 본 발명의 항체 조성물을 제조할 수 있다.
4. 항체 조성물의 활성 평가
정제한 항체 조성물의 단백량, 항원과의 결합 활성 또는 이펙터 기능을 측정하는 방법으로는, 모노클로날 안티보디즈, 또는 안티보디 엔지니어링 등에 기재된 공지된 방법을 사용할 수 있다.
그 구체적인 예로는, 항체 조성물이 인간화 항체인 경우, 항원과의 결합 활성, 항원 양성 배양 세포주에 대한 결합 활성은 ELISA법 및 형광항체법[캔서 이뮤놀로지 이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.),36, 373(1993)] 등에 의해 측정할 수 있다. 항원 양성 배향 세포주에 대한 세포 상해 활성은 CDC 활성, ADCC 활성 등을 측정함으로써 평가할 수 있다[캔서 이뮤놀로지 이뮤노세라피(Cancer Immunol. Immunother.),36, 373(1993)].
또, 항체 조성물의 인간에서의 안전성, 치료효과는 게잡이원숭이(crab-eating macaque) 등의 인간과 비교적 가까운 동물의 적당한 모델을 사용하여 평가할 수 있다.
5. 항체 조성물의 당 사슬의 분석
각종 세포에서 발현시킨 항체 분자의 당 사슬 구조는 통상의 당단백질의 당 사슬 구조의 해석에 준하여 실시할 수 있다. 예컨대 IgG 분자에 결합되어 있는 당 사슬은 갈락토오스, 만노오스, 푸코오스 등의 중성 당, N-아세틸글루코사민 등의 아미노 당, 시알산 등의 산성 당으로 구성되어 있고, 당 조성 분석 및 2차원 당 사슬 맵법 등을 사용한 당 사슬 구조 해석 등의 수법을 사용하여 실시할 수 있다.
(1)중성 당ㆍ아미노 당 조성 분석
항체 분자의 당 사슬의 조성 분석은 트리플루오로 아세트산 등으로 당 사슬의 산가수분해를 실시함으로써 중성 당 또는 아미노 당을 유리시켜 그 조성비를 분석할 수 있다.
구체적인 방법으로, Dionex사 제조 당 조성 분석장치를 사용하는 방법을 들 수 있다. BioLC는 HPAEC-PAD(high perfomance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection)법[저널 오브 리퀴드 크로마토그래피(J. Liq. Chromatogr.),6, 1577(1983)]에 의해 당 조성을 분석하는 장치이다.
또, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는, 공지된 방법[어그리컬처럴 앤드 바이올로지컬 케미스트리(Agric. Biol. Chem.),55(1), 283-284(1991)]에 따라 산 가수분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 라벨화하고 HPLC 분석하여 조성비를 산출할 수 있다.
(2)당 사슬 구조 해석
항체 분자의 당 사슬의 구조 해석은 2차원 당 사슬 맵법[어낼리티컬 바이오케미스트리(Anal. Biochem.),171, 73(1988), 생물화학 실헙법 23-당 단백질 당 사슬 연구법(학회출판센터) 다카하시 레이코 편(1989년)]에 의해 실시할 수 있다. 2차원 당 사슬 맵법은 예컨대 X 축에는 역상 크로마토그래피에 의한 당 사슬의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y 축에는 순상 크로마토그래피에 의한 당 사슬의 유지시간 또는 용출 위치를 각각 플롯하여 이미 알고 있는 당 사슬의 그 결과와 비교함으로써, 당 사슬 구조를 추정하는 방법이다.
구체적으로는, 항체를 히드라진 분해하고 항체로부터 당 사슬을 유리시켜2-아미노피리딘(이하, PA 라 함)에 의한 당 사슬의 형광표지[저널 오브 바이오케미스트리(J. Biochem.),95, 197(1984)]을 실시한 후 겔 여과에 의해 당 사슬을 과잉 PA화 시약 등과 분리하여 역상 크로마토그래피를 실시한다. 이어서, 분리 채취한 당 사슬의 각 피크에 관해 순상 크로마토그래피를 실시한다. 이들 결과를 기준으로 2차원 당 사슬 맵 상에 플롯하여 당 사슬 스탠다드(TaKaRa사 제조), 문헌[어낼리티컬 바이오케미스트리(Anal. Biochem.),171, 73(1988)]과의 스폿 비교로부터 당 사슬 구조를 추정할 수 있다.
그리고 각 당 사슬의 MALDI-TOF-MS 등의 질량을 분석하여 2차원 당 사슬 맵법에 의해 추정되는 구조를 확인할 수 있다.
6. 항체 분자의 당 사슬 구조를 식별하는 면역학적 정량 방법
항체 조성물은 항체의 Fc 영역에 결합되는 당 사슬 구조가 상이한 항체 분자로 구성되어 있다. 본 발명의 항체 조성물은 Fc 영역에 결합되어 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상이며, 높은 ADCC 활성을 나타내는 특징을 가지고 있다. 이러한 항체 조성물은 상기 5에 기재된 항체 분자의 당 사슬 구조의 분석법을 사용함으로써 식별할 수 있다. 또, 렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용함으로써도 식별할 수 있다.
렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용한 항체 분자의 당 사슬 구조의 식별은, 문헌[모노클로날 안티보디즈：프린시플 앤드 어플리케이션(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications), Wiley-Liss, Inc., (1995)；효소면역측정법, 제3판, 의학서원(1987)；개정판, 효소항체법, 학제기획(1985)] 등에 기재된 웨스턴 면역, RIA(Radioimmunoassay), VIA(Viroimmunoassay), EIA(Enzymoimmunoassay), FIA(Fluoroimmunoassay), MIA(Metalloimmunoassay) 등의 면역학적 정량 방법에 준하여 예컨대 이하와 같이 실시할 수 있다.
항체 조성물을 조성하는 항체 분자의 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴을 표지하고, 표지한 렉틴과 시료인 항체 조성물을 반응시킨다. 이어서 표지된 렉틴과 항체 분자의 복합체의 양을 측정한다.
항체 분자의 당 사슬 구조를 식별하는데 사용하는 렉틴으로는 예컨대 WGA[티. 불가리스(T. vulgaris) 유래의 밀배아 아굴루티닌], ConA[시. 엔시포르미스 (C. ensiformis) 유래의 콘카나발린(concanavalin) A], RIC[ 알. 콤뮤니스 (R. communis) 유래의 독소], L-PHA[피. 불가리스 (P. vulgaris) 유래의 류코아굴루티닌(leukoagglutinin)], LCA[엘. 쿨리나리스(L. culinaris) 유래의 렌틸 아굴루티닌], PSA[피. 사티범(P. sativum) 유래의 완두콩 렉틴], AAL[알레우리아 아우란티아(Aleuria aurantia) 렉틴], ACL[아마란써스 카우다투수(Amaranthus caudatus) 렉틴], BPL[바우히니아 퍼푸레아(Bauhinia Purpurea)렉틴], DSL[다투라 스트라모니움(Datura stramonium) 렉틴], DBA[돌리초스 비플로러스(Dolichos biflorus) 아굴루티닌], EBL[엘더베리 발크(Elderberry Balk)렉틴], ECL[에리쓰리나 크리스타겔리(Erythrina cristagalli)렉틴], EEL[유오니머스 유로파에우스(Euonymus europaeus) 렉틴], GNL[갈란써스 니발리스(Galanthus nivalis) 랙틴], GSL[그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia) 렉틴],HPA[헬릭스 포마티아(Helix pomatia) 아굴루티닌], HHL[히페아스트럼 히브리드(Hippeastrum Hybrid) 렉틴], 자칼린(Jacalin), LTL[로터스 테트라고노로부스(Lotus tetragonolobus) 렉틴], LEL[리코페르시콘 에스쿨렌텀(Lycopersicon esculentum) 렉틴], MAL[맥키아 아무레시스(Maackia amuresis) 렉틴], MPL[맥클루라 포미페라(Maclura pomifera) 렉틴], NPL[나르시서스 슈도나르시서스(Narcissus pseudonarcissus) 렉틴], PNA[땅콩 아굴루티닌(Peanut Agglutinin)], E-PHA[파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 에리쓰로아굴루티닌(Erythroagglutinin)], PTL[프소포카르퍼스 테트라고놀로부스(Psophocarpus tetragonolobus) 렉틴], RCA[리시너스 콤뮤니스(Ricinus communis) 아굴루티닌], STL[솔라눔 튜버로섬(Solanum tuberosum) 렉틴], SJA[소포라 자포니카(Sophora japonica) 아굴루티닌], SBA[대두 아굴루티닌(Soybean Agglutinin)], UEA[울렉스 유로파에우스(Ulex europaeus )아굴루티닌], VVL[비씨아 빌로사(Vicia villosa) 렉틴], WFA[위스테리아 플로리분다 (Wisteria floribunda) 아굴루티닌]을 들 수 있다.
N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되어 있는 당 사슬 구조를 특이적으로 인식하는 렉틴을 사용하는 것이 바람직하고, 그 구체적인 예로는 렌즈콩 렉틴 LCA(렌스 쿨리나리스유래의 렌틸 아굴루티닌), 완두콩 렉틴 PSA(피섬 사티범 유래의 완두콩 렉틴), 누에콩 렉틴 VFA(비시아 파바 유래의 아굴루티닌), 들주발버섯 렉틴 ALL(알레우리아 아우란티아 유래의 렉틴)을 들 수 있다.
7. 본 발명의 항체 분자의 이용
본 발명의 항체 조성물는 CD20 에 특이적으로 결합되어 높은 항체 의존성 세로 상해 활성을 갖기 때문에, 암을 비롯한 각종 CD20 발현 세포 관련 환자의 예방 및 치료에 유용하다.
암, 즉 악성 종양은 암세포가 증식, 예컨대 B 세포성 림프종에서는 특정 B 세포가 이상증식한다. 통상의 항암제는 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 한다. 그러나, 높은 항체 의존성 세포 상해 활성을 갖는 항체는 살세포 효과에 의해 항원을 발현하고 있는 암세포를 상해함으로써 암을 치료할 수 있기 때문에, 통상의 항암제보다도 치료약으로서 효과적이다. 특히 암의 치료약에서 현재에는 항체 의약 단독의 항종양 효과는 불충분하며, 화학요법과의 병용요법이 실시되고 있으나[사이언스(Science),280, 1197(1998)], 본 발명의 항체 조성물 단독에 의한 보다 강한 항종양 효과가 인정된다면 화학요법에 대한 의존도가 낮아져 부작용이 저감되기도 한다.
본 발명의 항체 조성물을 함유하는 의약은 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하여 제제학의 기술 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조한 의약제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있으며, 항체 제제의 경우 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로는 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제,연고, 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제로는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.
유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은 물, 자당, 솔비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 유류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 부패방지제, 딸기향, 페퍼민트 등의 향료류를 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은 젖당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.
비경구 투여에 적당한 제제로는, 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.
주사제는 염 용액, 포도당 용액 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제된다. 또는 항체 조성물을 통상적인 방법에 따라 동결 건조하고 여기에 염화 나트륨을 가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.
좌제는 카카오유, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다.
또, 분무제는 그 항체 조성물 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고 또한 그 항체 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜 용이하게 흡수시키는 담체 등을 사용하여 제조된다.
담체로서 구체적으로는 젖당, 글리세린 등이 예시된다. 그 항체 조성물 및 사용하는 담체의 성질에 따라 에어로졸, 드라이 파우더 등의 제제가 가능하다. 또, 이들 비경구제에서도 경구제에서 첨가제로 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
투여량 또는 투여 횟수는 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 다르지만, 유효성분의 양으로서 통상 성인 1일당 10㎍/㎏∼20㎎/㎏ 이다.
또, 항체 조성물의 각종 종양 세포에 대한 항종양 효과를 검토하는 방법은, 인 비트로 실험으로는 CDC 활성 측정법, ADCC 활성 측정법 등을 들 수 있고, 인 비보 실험으로는 마우스 등의 실험 동물에서의 종양계를 사용한 항종양 실험 등을 들 수 있다.
CDC 활성, ADCC 활성, 항종양 실험은 문헌[캔서 이뮤놀로지 이뮤노세라피(Cancer Immunology Immunotherapy),36, 373(1993)；암 리서치(Cancer Research),54, 1511(1994)] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 나타내는 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 항 CD20 인간형 키메라 항체의 제작
1. 항 CD20 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 제작
(1) 항 CD20 마우스 모노클로날 항체의 L 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA 의 구축
WO94/11026에 기재되어 있는 항 CD20 마우스 모노클로날 항체 2B8의 L 사슬 V 영역(이하, VL이라 표기함)의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA(서열 번호 11에 기재)를 PCR법을 사용하여 이하와 같이 하여 구축하였다.
먼저, WO94/11026에 기재된 VL의 염기 서열의 5' 말단과 3' 말단에 PCR 반응시의 증폭용 프라이머의 결합 염기 서열(인간화 항체 발현용 벡터에 클로닝하기 위한 제한 효소 인식 서열도 포함)을 부가하였다. 설계한 염기 서열을 5' 말단측으로부터 약 100염기씩 계 6개의 염기 서열로 나누고(인접하는 염기 서열은 그 말단에 약 20염기의 중복서열을 갖도록 한다), 이들을 센스 사슬, 안티센스 사슬이 교대하는 순서로, 실제로는 서열 번호 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 6개의 합성 DNA를 제작(GENSET사 제조에 위탁)하였다.
각 올리고 뉴클레오티드를 최종 농도가 O.1μM이 되도록 50㎕의 반응액[KOD DNA Polymerase 첨부 PCR Buffer #1(도요방적사 제조), 0.2mM dNTPs, 1mM 염화마그네슘, 0.5μM M13 primer M4(다카라주조사 제조), 0.5μM M13 primer RV(다카라주조사 제조)]에 첨가하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer사 제조)를 사용하여, 94℃에서 3분간 가열한 후, 2.5단위의 KOD DNA Polymerase(도요방적사 제조)를 첨가하여 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 74℃에서 1분간의 사이클을 25사이클 실시하고, 다시 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액 25㎕를 아갈로스 겔 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여 약 0.44kb의 VL의 PCR 산물을 회수하였다.
다음에, 플라스미드 pBluescriptⅡ SK(-)(Stratagene사 제조)를 제한 효소SmaⅠ(다카라주조사 제조)하여 얻어진 DNA O.1㎍과 상기에서 얻어진 PCR 산물 약 O.1㎍을 멸균수에 가하여 7.5㎕로 하고, TAKARA ligation kit ver.2의 solution Ⅰ(다카라주조사 제조) 7.5㎕, 제한 효소SmaⅠ(다카라주조사 제조) 0.3㎕을 가하여 22℃에서 2시간 반응시켰다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주(도요방적사 제조)를 형질 전환하였다. 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, BigDye Teminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 첨부한 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377에 의해 염기 서열을 해석하였다. 이렇게 하여 원하는 염기 서열을 갖는 도 1에 나타낸 플라스미드 pBS-2B8L을 얻었다.
(2) 항 CD20 마우스 모노클로날 항체의 H 사슬 V 영역을 코드하는 cDNA의 구축
WO94/11026에 기재되어 있는 항 CD20 마우스 모노클로날 항체 2B8 의 H 사슬 V 영역(이하 VH라 표기함)의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA(서열 번호 13 에 기재)를 PCR법을 사용하여 이하와 같이 구축하였다.
먼저, WO94/11026 에 기재된 VH의 염기 서열의 5' 말단과 3' 말단에 PCR 반응시의 증폭용 프라이머의 결합 염기 서열(인간화 항체 발현용 벡터에 클로닝하기 위한 제한 효소 인식 서열도 포함)을 부가하였다. 설계한 염기 서열을 5' 말단측으로부터 약 100염기씩 계 6개의 염기 서열로 나누고(인접하는 염기 서열은 그 말단에 약 20염기의 중복서열을 갖도록 한다), 이들을 센스사슬, 안티센스사슬이 교대하는 순서로, 실제로는 서열 번호 25, 26, 27, 28, 29 및 30의 6개의 합성 DNA를 제작(GENSET사 제조에 위탁)하였다.
각 올리고 뉴클레오티드를 최종농도가 0.1μM이 되도록 50㎕의 반응액[KOD DNA Polymerase 첨부 PCR Buffer #1(도요방적사 제조), O.2mM dNTPs, 1mM 염화마그네슘, 0.5μM M13 primer M4(다카라주조사 제조), 0.5μM M13 primer RV(다카라주조사 제조)]에 첨가하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer사 제조)를 사용하여 94℃에서 3분간 가열한 후, 2.5단위의 KOD DNA Polymerase(도요방적사 제조)를 첨가하여 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 74℃에서 1분간의 사이클을 25사이클 실시하고, 다시 72℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액 25㎕를 아갈로스 겔 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여 약 0.49kb의 VH의 PCR 산물을 회수하였다.
다음에, 플라스미드 pBluescriptⅡ SK(-)(Stratagene사 제조)를 제한 효소 SmaⅠ(다카라주조사 제조)하여 얻어진 DNA O.1㎍과 상기에서 얻어진 PCR 산물 약 O.1㎍을 멸균수에 가하여 7.5㎕로 하고, TAKARA ligation kit ver.2의 용액 I(다카라주조사 제조) 7.5㎕, 제한 효소SmaⅠ(다카라주조사 제조) 0.3㎕를 가하여 22℃에서 하룻밤 반응시켰다.
이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주(도요방적사 제조)를 형질 전환하였다. 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0(Applied Biosystems사 제조)을 사용하여 첨부한 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377에 의해 염기 서열을 해석하였다. 이렇게 하여 원하는 염기 서열을 갖는 도 2에 나타낸 플라스미드 pBS-2B8H를 얻었다.
다음에, 14번째 아미노산 잔기를 Ala에서 Pro로 치환하기 위하여 서열 번호 31로 나타낸 합성 DNA를 설계하고, LA PCRin vitroMutagenesis Primer Set for pBluescriptⅡ(다카라주조사 제조)를 사용한 PCR 법에 의해 이하와 같이 염기를 치환하였다. 상기 플라스미드 pBS-2B8H를 1ng 함유하는 50㎕의 반응액[LA PCR Buffer Ⅱ(다카라주조사 제조), 2.5단위의 TaKaRa LA Taq, 0.4mM dNTPs, 2.5mM 염화마그네슘, 50nM T3 BcaBEST 염기서열분석 프라이머(다카라주조사 제조), 50nM 상기 변이 도입용 프라이머(서열 번호 31, GENSET사 제조)]를 조제하고 DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer사 제조)를 사용하여, 94℃에서 30초간, 55℃에서 2분간, 72℃에서 1분 30초간의 사이클을 25사이클 실시하였다. 그 반응액 30㎕를 아갈로스 겔 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여 약 0.44kb의 PCR 산물을 회수하여 30㎕의 수용액으로 하였다. 또한, 마찬가지로 상기 플라스미드 pBS-2B8H를 1ng 함유하는 50㎕의 반응액[LA PCR Buffer Ⅱ(다카라주조사 제조), 2.5단위의 TaKaRa LA Taq, 0.4mM dNTPs, 2.5mM 염화마그네슘, 50nM T7 BcaBEST 염기서열분석 프라이머(다카라주조사 제조), 50nM MUT B1 primer(다카라주조사 제조)]의 PCR 반응을 실시하였다. 그 반응액 30㎕를 아갈로스 겔 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사 제조)를 사용하여 약 0.63kb의 PCR 산물을 회수하여 30㎕의 수용액으로 하였다. 이어서, 상기에서 얻어진 0.44kb의 PCR 산물과 0.63kb의 PCR 산물을 O.5㎕ 씩 47.5㎕의 반응액[LA PCR Buffer Ⅱ(다카라주조사 제조), O.4mM dNTPs, 2.5mM 염화마그네슘]에 첨가하고, DNA 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer사 제조)를 사용하여 90℃에서 10분간 가열한 후, 60분간에 걸쳐 37℃까지 냉각한 후, 37℃에서 15분간 유지함으로써 DNA를 어닐링시켰다. 2.5단위의 TaKaRa LA Taq(다카라주조사 제조)를 첨가하여 72℃에서 3분간 반응시킨 후, 10pmol씩의 T3BcaBEST 염기서열분석 프라이머(다카라주조사 제조)와 T7 BcaBEST 염기서열분석 프라이머(다카라주조사 제조)를 첨가하여 반응액을 50㎕로 하여, 94℃에서 30초간, 55℃에서 2분간, 72℃에서 1분 3O초간의 사이클을 10사이클 실시하였다. 이 반응액 25㎕를 QIA quick PCR purification kit(QIAGEN사 제조)로 정제한 후, 1/2량을 10단위의 제한 효소 KpnⅠ(다카라주조사 제조)와 10단위의 제한 효소SacⅠ(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응액을 아갈로스 겔 전기 영동으로 분획하여 약 0.59kb의KpnⅠ-SacⅠ단편을 회수하였다.
다음에, pBluescriptⅡ SK(-)(Stratagene사 제조) 1㎍을 10단위의 제한 효소KpnⅠ(다카라주조사 제조)와 10단위의SacⅠ(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃ 1시간 반응시킨 후, 그 반응액을 아갈로스 겔 전기 영동으로 분획하여 약 2.9kb의KpnⅠ-SacⅠ 단편을 회수하였다.
상기에서 얻어진 PCR 산물 유래의KpnⅠ-SacⅠ 단편과 플라스미드 pBluescriptⅡ SK(-) 유래의KpnⅠ-SacⅠ 단편을 DNA Ligation Kit Ver.2(다카라주조사 제조)의 Solution Ⅰ을 사용하여 첨부한 설명서에 따라 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주(도요방적사 제조)를 형질 전환하여, 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 첨부한 설명서에 따라 반응시킨 후, 동사의 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377에 의해 염기 서열을 해석하였다.
이렇게 하여 원하는 염기 서열을 갖는 도 2에 나타낸 플라스미드 pBS-2B8Hm을 얻었다.
(3) 항 CD20 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93(Mol. Immunol.,37, 1035, 2000)와 실시예 1 의 1 항 (1) 및 (2)에서 얻어진 플라스미드 pBS-2B8L 및 pBS-2B8Hm을 사용하여 항 CD20 인간형 키메라 항체(이하, 항 CD20 키메라 항체라 표기함)의 발현 벡터 pKANTEX2B8P를 이하와 같이 구축하였다.
실시예 1 의 1 항 (1)에서 얻어진 플라스미드 pBS-2B8L의 2㎍을 10단위의 제한 효소BsiWI(New England Biolabs사 제조)를 사용하여 55℃에서 1시간 반응시킨 후, 다시 10단위의 제한 효소EcoRI(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 반응액을 아갈로스 겔 전기 영동으로 분획하여 약 O.41kb의BsiWI-EcoRI 단편을 회수하였다.
다음에, 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93의 2㎍을 10단위의 제한 효소BsiWI(New England Biolabs사 제조)를 사용하여 55℃에서 1시간 반응시킨 후, 다시 10단위의 제한 효소EcoRI(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 반응액을 아갈로스 겔 전기 영동으로 분획하여 약 12.75kb의BsiWI-EcoRI 단편을 회수하였다.
다음에, 상기에서 얻어진 플라스미드 pBS-2B8L 유래BsiWI-EcoRI 단편과 플라스미드 pKANTEX93 유래의BsiWI-EcoRI 단편을 DNA Ligation Kit Ver.2(다카라주조사 제조)의 Solution Ⅰ을 사용하여 첨부한 설명서에 따라 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주(도요방적사 제조)를 형질 전환하여, 도 3에 나타낸 플라스미드 pKANTEX2B8-L을 얻었다.
다음에, 실시예 1의 1항 (2)에서 얻어진 플라스미드 pBS-2B8Hm의 2㎍을 10단위의 제한 효소ApaⅠ(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 다시 10단위의 제한 효소NotⅠ(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 반응액을 아갈로스 겔 전기 영동으로 분획하여 약 0.45kb의ApaⅠ-NotⅠ 단편을 회수하였다.
다음에, 상기에서 얻어진 플라스미드 pKANTEX2B8-L의 3㎍을 10단위의 제한 효소ApaⅠ(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 다시 10단위의 제한 효소NotⅠ(다카라주조사 제조)를 사용하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그 반응액을 아갈로스 겔 전기 영동으로 분획하여 약 13.16kb의ApaⅠ-NotⅠ 단편을 회수하였다.
다음에, 상기에서 얻어진 플라스미드 pBS-2B8Hm 유래의ApaⅠ-NotⅠ 단편과 플라스미드 pKANTEX2B8-L 유래의ApaⅠ-NotⅠ 단편을 DNA Ligation Kit Ver.2(다카라주조사 제조)의 Solution Ⅰ을 사용하여 첨부한 설명서에 따라 연결하였다. 이렇게 하여 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 용액을 사용하여 대장균 DH5α주(도요방적사 제조)를 형질 전환하여, 형질 전환주의 클론으로부터 각 플라스미드 DNA를 조제하였다.
얻어진 플라스미드를 사용하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0(Applied Biosystems사 제조)를 동사의 DNA 시퀀서 377을 사용하여 염기 서열을 해석한 결과, 목적으로 하는 DNA가 클로닝되어 있는 도 3에 나타낸플라스미드 pKANTEX2B8P가 얻어진 것을 확인하였다.
2. 항 CD20 키메라 항체의 동물세포를 사용한 안정 발현
(1) 래트 미엘로머(myeloma) B/O 세포를 사용한 생산 세포의 제작
상기 실시예 1의 1항 (3)에서 얻어진 항 CD20 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P를 사용하여 항 CD20 키메라 항체의 동물세포에서의 발현을 이하와 같이 실시하였다.
플라스미드 pKANTEX2B8P의 10㎍을 4×106세포의 래트 미엘로머 세포주 YB2/O 세포(ATCC CRL1662)로 일렉트로포레이션법[사이토테크놀로지(Cytotechnology),3, 133(l990)]에 의해 도입한 후, 40㎖의 H-SFM(GIBCO-BRL사 제조) 배지(소 태아 혈청(FCS)을 5% 첨가)에 현탁하여 96 웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트(스미토모베이크라이트사 제조)에 200㎕/웰씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 24시간 배양한 후, G418을 1㎎/㎖가 되도록 첨가하여 1∼2주일 배양하였다. G418 내성을 나타내는 형질 전환주의 콜로니가 출현하여, 콘플루언트(confluent)가 된 웰로부터 배양 상청을 회수하여 배양 상청 중의 인간 IgG 항체의 생산량을 실시예 1 의 2 항 (2)에 나타내는 ELISA법에 의해 측정하였다.
배양 상청 중에 인간 IgG 항체의 발현이 인정된 웰의 형질 전환주에 관해서는, dhfr 유전자 증폭계를 이용하여 항체 발현량을 증가시킬 목적으로, G418을 1㎎/㎖, dhfr 유전자 산물의 디히드로엽산 환원 효소(이하, DHFR라 함)의 저해제인메토트렉세이트(Methotrexate; 이하, MTX라 표기：SIGMA사 제조)를 50nM 함유하는 H-SFM 배지에 1∼2×105세포/㎖가 되도록 현탁하여, 24웰 플레이트(Greiner사 제조)에 1㎖ 씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃에서 1∼2주일 배양하여, 50nM MTX 내성을 나타내는 형질 전환주를 유도하였다. 형질 전환주가 웰에 콘플루언트가 된 시점에서 배양 상청 중의 인간 IgG 항체의 생산량을 실시예 1의 2항 (2)에 나타내는 ELISA법에 의해 측정하였다. 배양 상청 중에 인간 IgG 항체의 발현이 인정된 웰의 형질 전환주에 관해서는, 상기와 같은 방법에 의해 MTX 농도를 100nM, 200nM으로 차례로 상승시켜, 최종적으로 G418를 1㎎/㎖, MTX를 20OnM의 농도로 함유하는 H-SFM 배지로 증식가능하고, 또한 항 CD20 키메라 항체를 고발현하는 형질 전환주를 얻었다. 얻어진 형질 전환주에 관해서는, 한계 희석법에 의해 단일 세포화(클론화)하여, 항 CD20 키메라 항체를 발현하는 클론 KM3065을 취득하였다. 또한, WO00/61739의 실시예 8 에 나타내는 α-1,6-푸코오실트랜스페라아제의 유전자 전사물의 정량법을 사용하여 그 전사물의 양이 비교적 낮은 주를 우량주로서 선택하여 사용하였다.
이렇게 하여 얻어진 항 CD20 키메라 항체를 생산하는 형질 전환 클론 KM3065은 2001년 12월 21일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 추오 제 6)에 FERM BP-7834로서 기탁되어 있다.
(2) 배양 상청 중의 인간 IgG 항체 농도의 측정(ELISA법)
염소 항인간 IgG(H&L) 항체(American Qualex사 제조)를 인산완충식염수(이하, PBS 라 표기함)로 희석하여 1㎍/㎖로 하고, 96웰의 ELISA용 플레이트(그라이너사 제조)에 50㎕/웰로 분주하고 4℃에서 하룻밤 방치하여 흡착시켰다. PBS로 세정 후, 1% 소혈청 알부민(이하, BSA라 표기함；AMPC사 제조)를 함유하는 PBS(이하, 1% BSA-PBS라 표기함)를 100㎕/웰로 가하고 실온에서 1시간 반응시켜 잔존하는 활성기를 블록하였다. 1% BSA-PBS를 버리고 형질 전환주의 배양 상청, 정제한 인간형 키메라 항체의 각종 희석 용액을 50㎕/웰로 가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 각 웰을 O.05%Tween20을 함유하는 PBS(이하, Tween-PBS라 표기함)로 세정 후, 1% BSA-PBS로 3000배로 희석한 퍼옥시다아제 표지 염소 항인간 IgG(1㎖) 항체 용액(American Qualex사 제조)를 2차 항체 용액으로 하여 각각 50㎕/웰로 가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 Tween-PBS로 세정 후, ABTS 기질액[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)암모늄 O.55g을 1ℓ의 0.1M 시트르산 완충액(pH 4.2)에 용해하고, 사용 직전에 과산화수소를 1㎕/㎖로 첨가한 용액]을 50㎕/웰로 가하고 발색시켜, 415㎚의 흡광도(이하, OD415라 표기함)를 측정하였다.
3. 항 CD20 키메라 항체의 배양 상청으로부터의 정제
실시예 1의 2항 (1)에서 얻어진 항 CD20 키메라 항체를 발현하는 형질 전환세포 클론 KM3065을 MTX를 200nM, Daigo's GF21(와코쥰야쿠 제조)를 5%의 농도로 함유하는 H-SFM(GIBCO-BRL사 제조)에 1×105세포/㎖가 되도록 현탁하여 182㎠ 플라스크(그라이너사 제조)에 50㎖ 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃에서 7일간 배양하여 콘플루언트가 된 시점에서 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 Prosep-A(밀리포어사 제조)칼럼을 사용하여 첨부한 설명서에 따라 항 CD20 키메라 항체 KM3065를 정제하였다. 얻어진 항 CD20 키메라 항체 KM3065의 약 3㎍을 공지된 방법[네이처(Nature),227, 680(1970)]에 따라 전기 영동하여 분자량 및 정제도를 조사하였다. 그 결과, 정제한 항 CD20 키메라 항체 KM3065는 비환원 조건하에서는 약 150킬로달튼(이하, Kd라 표기함)이고, 환원조건하에서는 약 50Kd과 약 25Kd의 2개의 밴드가 인정되었다. 이들 단백질의 크기는, IgG 형의 항체는 비환원 조건하에서는 분자량은 약 150Kd이고, 환원조건하에서는 분자 내의 디술피드 결합(이하, S-S 결합이라 표기함)이 절단되어, 약 50Kd의 분자량을 갖는 H 사슬과 약 25Kd의 분자량을 가지는 L 사슬로 분해된다는 보고[안티보디즈：어 래보러토리 매뉴얼(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988, 모노클로날 안티보디즈：프린시플 앤드 프랙티스(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice), Academic Press Limited, 1996]와 일치하고 RituxanTM의 영동 패턴과도 거의 일치한다는 점에서, 항 CD20 키메라 항체 KM3065가 옳은 구조의 항체 분자로서 발현되어 있는 것이 확인되었다.
실시예 2. 항 CD20 키메라 항체의 활성 평가
1. 항 CD20 키메라 항체의 CD20 발현 세포에 대한 결합 활성(형광항체법)
상기 실시예 1의 3항에서 얻어진 정제 CD2O 키메라 항체의 결합 활성을 플로 사이토메트리(flow cytometry)를 사용한 형광항체법에 의해 평가하였다. CD20 양성 세포인 인간 림프종 세포주 Raji 세포(JCRB9012)를 2×105개씩 96웰 U자 플레이트(Falcon사 제조)에 분주하였다. 항 CD20 키메라 항체를 FACS 용 완충액(1% BSA-PBS, 0.02% EDTA, 0.05% NaN3)으로 희석한 항체 용액(농도 0.039∼40㎍/㎖)을 50㎕/웰로서 가하여 얼음 속에서 30분간 반응시켰다. FACS 용 완충액으로 200㎕/웰로 2회 세정 후, PE 표지 항인간 IgG 항체(콜터사 제조)를 FACS 용 완충액을 사용하여 100배 희석한 것을 50㎕/웰 가하였다. 차광하여 얼음 속에서 30분간 반응시킨 후 200㎕/웰로 3회 세정하고 최종적으로 500㎕로 현탁하여, 플로 사이토미터로 형광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. KM3065, RituxanTM모두 항체 농도 의존적으로 형광 강도의 증가가 인정되어 거의 동등한 결합 활성을 나타내는 것이 확인되었다. 또한, CD20 음성 세포인 인간 CCRF-CEM 세포(ATCC CCL119)에 대한 결합 활성을 항체 농도를 40㎍/㎖로 하여 동일한 방법에 의해 검토하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. KM3065, RituxanTM모두 결합하지 않고, KM3065는 CD20 특이적으로 결합하는 것이 시사되었다.
2. 항 CD20 키메라 항체의in vitro세포 상해 활성(ADCC 활성)
상기 실시예 1의 3항에서 얻어진 정제 항 CD20 키메라 항체의in vitro세포 상해 활성을 평가하기 위하여, 이하에 나타내는 방법에 따라 ADCC 활성을 측정하였다.
(1) 표적 세포 용액의 조제
RPMI1640-FCS(10) 배지(FCS를 10% 함유하는 RPMI1640 배지(GIBCO BRL사 제조))로 배양한 인간 B 림프구 배양 세포주 WIL2-S 세포(ATCC CRL8885) 또는 Ramos 세포(ATCC CRL1596), Raji 세포(JCRB9012)를 원심 분리 조작 및 현탁에 의해 RPMI1640-FCS(5) 배지(FCS를 5% 함유하는 RPMI1640 배지(GIBCO BRL사 제조))로 세정한 후, RPMI1640-FCS(5) 배지에 의해 2×105세포/㎖로 조제하여 표적 세포 용액으로 하였다.
(2) 이펙터 세포 용액의 조제
건강인 정맥혈 50㎖를 채취하고 헤파린나트륨(시미즈제약사 제조) 0.5㎖을 가하여 천천히 섞었다. 이것을 Lymphoprep(AXIS SHIELD사 제조)를 사용하여 사용 설명서에 따라 원심 분리(800g, 20분간)하여 단핵구층을 분리하였다. RPMI1640-FCS(5) 배지로 3회 원심 분리하여 세정 후, 동 배지를 사용하여 4×106세포/㎖의 농도로 재현탁하여 이펙터 세포 용액으로 하였다.
(3) ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon사 제조)의 각 웰에 상기 (1)에서 조제한 표적 세포 용액의 50㎕(1×104세포/웰)을 분주하였다. 이어서 (2)에서 조제한 이펙터 세포 용액을 5O㎕(2×105세포/웰, 이펙터 세포와 표적 세포의 비는 20：1 이됨) 첨가하였다. 또한, 각종 항 CD20 키메라 항체를 각 최종 농도 0.3∼3000ng/㎖이 되도록 가하여 전량을 150㎕로 하고, 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 원심 분리하고 상청 중의 락트산디히드로게나아제(LDH) 활성을 CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega사 제조)를 사용하여 첨부한 설명서에 따라 흡광도 데이터를 취득함으로써 측정하였다. 표적 세포 자연 유리의 흡광도 데이터는 이펙터 세포 용액, 항체 용액 대신에 배지만을 사용하고, 또한 이펙터 세포 자연 유리의 흡광도 데이터는 표적 세포 용액, 항체 용액 대신에 배지만을 사용하여 상기와 같은 조작을 실시함으로써 취득하였다. 표적 세포 전체 유리의 흡광도 데이터는 항체 용액, 이펙터 세포 용액 대신 배지를 사용하여 반응 종료 45분전에 15㎕의 9% Triton X-100 용액을 첨가하여 상기와 같은 조작을 실시하고 상청의 LDH 활성을 측정함으로써 구하였다. ADCC 활성은 다음 식에 의해 구하였다.
세포 상해 활성(%)＝{[검체의 흡광도]－[이펙터 세포 자연 유리의 흡광도]－[표적 세포 자연 유리의 흡광도]}/{[표적 세포 전체 유리의 흡광도]－[표적 세포 자연 유리의 흡광도]}×100
도 6에는 3종류의 세포주를 표적으로 한 결과를 나타내었다. 도 6A는 Raji 세포(JCRB9012)를, 도 6B는 Ramos 세포를(ATCC CRL1596), 도 6C는 WIL2-S 세포(ATCC CRL8885)를 표적으로 한 결과이다. 도 6에 나타낸 바와 같이 KM3065는 어느 항체 농도에서나 RituxanTM보다도 높은 ADCC 활성을 나타내고, 최고 세포 상해활성치도 높았다.
실시예 3. 항 CD20 키메라 항체의 당 사슬 해석
실시예 1 의 3 항에서 정제한 항 CD20 키메라 항체의 당 사슬 해석을 하였다. KM3065 및 RituxanTM의 히드라진 분해를 하여 당 사슬을 단백질로부터 절단하였다[메소드 인 엔자이몰로지(Method in Enzymology),83, 263(1982)]. 감압 증류 제거함으로써 히드라진을 제거한 후, 아세트산 암모늄 수용액과 무수아세트산을 가하여 N-아세틸화하였다. 동결 건조후, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지를 실시하였다[저널 오브 바이오케미스트리(Journal of Biochemistry),95, 197, 1984]. 형광 표지한 당 사슬군(이하, PA화 당 사슬군이라 표기함)을 Surperdex Peptide HR10/30칼럼(Pharmacia사 제조)을 사용하여 과잉 시약과 분리하였다. 당 사슬 분획을 원심 농축기로 건고(乾固)시켜 정제 PA화 당 사슬군으로 하였다. 다음에, CLC-ODS 칼럼(Shimadzu사 제조)을 사용하여 정제 PA화 당 사슬군의 역상 HPLC 분석을 실시하였다.
도 7은 항 CD20 키메라 항체로부터 조제한 PA화 당 사슬을 각각 역상 HPLC으로 분석하여 얻은 용리도를 나타낸 것이다. 도 7A에 KM3065, 도 7B에 RituxanTM의 용리도를 각각 나타낸다. 세로축에 상대 형광 강도, 가로축에 용출 시간을 각각 나타낸다. 완충액 A로서 10mM 인산나트륨 완충액(pH 3.8), 완충액 B로서 10mM 인산나트륨 완충액(pH 3.8)＋0.5%-1-부탄올을 사용하여 이하의 그라디엔트로 분석하였다.
시간(분) 0 80 90 90.1 120
완충액 B(%) 0 60 60 0 0
도 7에서 나타낸 ①∼⑩의 피크는 이하 (1)- (10)에 기재된 구조를 나타낸다.
GlcNAc는 N-아세틸글루코사민, Gal은 갈락토스, Man은 만노오스, Fuc는 푸코오스, PA는 피리딜아미노기를 나타낸다. 도 7에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 1위에 푸코오스의 6위가 α결합되지 않은 당 사슬군(이하, α-1,6-푸코오스를 가지지 않은 당 사슬군 또는 α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬군이라 함)의 비율은, ①∼⑩의 각 피크가 차지하는 면적의 합계 중 ①∼④, ⑨ 및 ⑩의 피크가 차지하는 면적의 합계로부터 산출하였다. 또, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 1 위에 푸코오스의 6위가 α결합된 당 사슬군(이하, α-1,6-푸코오스가 결합된 당 사슬군이라 함)의 비율은 ①∼⑩의 각 피크가 차지하는 면적의 합계 중 ⑤∼⑧의 피크가 차지하는 면적의 합계로부터 산출하였다.
그 결과, RituxanTM의 α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬 함량은 6%, α-1,6-푸코오스 결합 당 사슬 함량은 94%이었다. KM3065의 α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬 함량은 96%, α-1,6-푸코오스 결합 당 사슬 함량은 4%이었다. 이상의 결과로부터, KM3065는 α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬 함량의 비율이 많은 것을 알았다.
실시예 4. CHO 세포 α-1,6-푸코오실트랜스페라아제(FUT8) 유전자의 취득
(1) CHO 세포 α-1,6-푸코오실트랜스페라아제(FUT8) cDNA 서열의 취득
WO00/61739의 실시예 8(1)에서 배양 2일째의 차이니스 햄스터 난소 유래 CHO/DG44 세포로 조제한 1개 사슬 cDNA로부터 이하의 순서로 차이니스 햄스터 FUT8 cDNA를 취득하였다(도 8).
먼저, 마우스 FUT8의 cDNA 서열(GenBank, AB025198)로부터 5'측 비번역 영역에 특이적인 포워드 프라이머(서열 번호 21에 나타냄) 및 3'측 비번역 영역에 특이적인 리버스 프라이머(서열 번호 22에 나타냄)를 설계하였다.
다음에 DNA 폴리메라아제 ExTaq(다카라주조사 제조)를 사용하여 상기 서술한 CHO/DG44 세포 유래 cDNA 1㎕를 함유하는 25㎕의 반응액[ExTaq buffer(다카라주조사 제조), 0.2mmol/ℓ dNTPs, 4% DMSO, 0.5μmol/ℓ 상기 특이적 프라이머(서열 번호 21 및 서열 번호 22)]를 조제하여 PCR을 실시하였다. PCR은 94℃에서 1분간 가열한 후 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 2분간으로 이루어지는 반응을 1사이클로 하여 30사이클한 후, 다시 72℃에서 10분간 가열하는 조건으로 실시하였다.
PCR 후, 반응액을 0.8% 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 특이적 증폭 단편 약 2Kb를 정제하였다. 이 DNA 단편 4㎕를 TOPO TA cloning Kit(Invitrogen사 제조)의 설명서에 따라 플라스미드 pCR2.1에 삽입하고, 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하였다. 얻어진 카나마이신 내성 콜로니 중 cDNA가 삽입된 8클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다.
각 플라스미드에 삽입된 cDNA의 염기 서열은, DNA 시퀀서 377(Applied Biosystems사 제조) 및 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 결정하고, 방법은 첨부 매뉴얼에 따랐다. 본 법에 의해, 모든 삽입 cDNA가 CHO 세포 FUT8의 ORF 전장를 포함하는 서열을 코드하는 것을 확인하였다. 이 중 PCR에 수반되는 염기의 오판독을 그 서열 내에 전혀 포함하지 않은 플라스미드 DNA를 선택하였다. 이하, 이 플라스미드를 CHfFUT8-pCR2.1이라 부른다. 결정한 CHO 세포 FUT8 cDNA의 염기 서열을 서열 번호 1에 나타낸다. 서열 번호 1의 번역 부분(오픈 리딩 프레임：ORF)은 염기 서열 10O∼1827이고, 종지 코돈을 제거한 염기 번호 100∼1824에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 23에 나타낸다.
(2) CHO 세포 α-1,6-푸코오실트랜스페라아제(FUT8) 게놈 서열의 취득
본 항 (1)에서 취득한 CHO 세포 FUT8 ORF 전장 cDNA 단편을 프로브로서 사용하고, CHO-K1 세포 유래 λ-파아지 게놈 라이브러리(STRATEGENE사 제조)로부터 몰레큘러 클로닝 제2판, 커런트 프로토콜즈 인 몰레큘러 바이올로지, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) 등에 기재된 공지된 게놈 스크리닝 방법에 따라 CHO 세포 FUT8 게놈 클론을 취득하였다. 다음에, 취득한 게놈 클론을 각종 제한 효소를 사용하여 소화 후, CHO 세포 FUT8 cDNA의 개시 코돈을 함유하는 AfaI-Sau3AI 단편(약 280bp)을 프로브로서 서던 하이브리다이제이션하여, 양성을 나타낸 제한 효소 단편 중XbaⅠ-XbaⅠ 단편(약 2.5Kb) 및SacⅠ-SacⅠ 단편(약 6.5Kb)을 선택하여 pBluescriptⅡ KS(+)(Strategene사 제조)로 각각 삽입하였다.
취득한 각 게놈 단편의 염기 서열은 DNA 시퀀서 377(Applied Biosystems사 제조) 및 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Applied Biosystems사 제조)를 사용하여 결정하고, 방법은 첨부 매뉴얼에 따랐다. 본 법에 의해XbaⅠ-XbaⅠ 단편은 CHO 세포 FUT8의 엑손 2를 함유하는 상류 인트론 약 2.5Kb의 서열을,SacⅠ-SacⅠ 단편은 CHO 세포 FUT8의 엑손 2를 함유하는 하류 인트론 약 6.5Kb의 서열을 각각 코드하는 것을 확인하였다. 이하,XbaⅠ-XbaⅠ 단편을 포함하는 플라스미드를 pFUT8fgE2-2,SacⅠ-SacⅠ 단편을 함유하는 플라스미드를 pFUT8fgE2-4라 부른다. 결정한 CHO 세포 FUT8의 엑손 2를 함유하는 게놈 영역의 염기 서열(약 9.0Kb)을 서열 번호 3에 나타낸다.
실시예 5. α-1,6-푸코오스 전이 효소 유전자를 파괴한 CHO 세포의 제작
CHO 세포 α-1,6-푸코오실트랜스페라아제(FUT8) 유전자 엑손 2를 함유하는 게놈 영역을 결실한 CHO 세포를 제작하여, 그 세포가 생산하는 항체의 ADCC 활성을 평가하였다.
1. 차이니스 햄스터 α-1,6-푸코오실트랜스페라아제(FUT8) 유전자 엑손 2 타게팅 벡터 플라스미드 pKOFUT8Puro의 구축
(1) 플라스미드 ploxPPuro의 구축
이하의 순서로 플라스미드 ploxPPuro를 구축하였다(도 9).
플라스미드 pKOSelectPuro(Lexicon사 제조) 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고 20단위의 제한 효소AscⅠ(New England Biolabs사제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 퓨로마이신 내성 유전자 발현 유닛을 함유하는 약 1.5Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 일본 공개특허공보 평11-314512호에 기재된 플라스미드 ploxP 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고 20단위의 제한 효소AscⅠ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 2.0Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pKOSelectPuro 유래의AscⅠ-AscⅠ 단편(약 1.5Kb) 4.5㎕, 플라스미드 ploxP 유래의AscⅠ-AscⅠ 단편(약 2.0Kb) 0.5㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하 ploxPPuro라 부른다.
(2) 플라스미드 pKOFUT8gE2-1의 구축
실시예 4(2)에서 얻은 차이니스 햄스터 FUT8의 엑손 2를 함유하는 게놈 영역을 갖는 플라스미드 pFUT8fgE2-2를 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-1를 구축하였다(도 10).
플라스미드 pFUT8fgE2-2 2.0㎍을 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 1(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 제한 효소SacⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고 20단위의 제한 효소EcoRV(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 1.5Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 플라스미드 LITMUS28(New England Biolabs사 제조) 1.0㎍을 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 1(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 제한 효소SacⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소EcoRV(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 2.8Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pFUT8fgE2-2 유래의EcoRV-SacⅠ 단편(약 1.5Kb) 4.5㎕, 플라스미드 LITMUS28 유래의EcoRV-SacⅠ 단편(약 2.8Kb) 0.5㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-1라 부른다.
(3) 플라스미드 pKOFUT8gE2-2의 구축
본 항(2)에서 얻은 플라스미드 pKOFUT8gE2-1를 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-2를 구축하였다(도 11).
플라스미드 pKOFUT8gE2-1 2.0㎍을 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 제한 효소EcoRV(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 1(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소KpnⅠ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 O.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 1.5Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 플라스미드 ploxPPuro 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 제한 효소HpaⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer 1(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소KpnⅠ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 3.5Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pKOFUT8gE2-1 유래의EcoRV-KpnⅠ 단편(약 1.5Kb)4.0㎕, 플라스미드 ploxPPuro 유래의HpaⅠ-KpnⅠ 단편(약 3.5Kb) 1.0㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-2라 부른다.
(4) 플라스미드 pscFUT8gE2-3의 구축
실시예 4(2)에서 얻은 차이니스 햄스터 FUT8의 엑손 2를 함유하는 게놈 영역을 갖는 플라스미드 pFUT8fgE2-4를 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pscFUT8gE2-3을 구축하였다(도 12).
플라스미드 pFUT8fgE2-4 2.0㎍을 NEBuffer 1(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소HpaⅡ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, Blunting High(도요방적사 제조)를 사용하여 첨부한 설명서에 따라 DNA 말단을 평활화하였다. 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 하여 DNA 단편을 회수한 후, NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소HindⅢ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 O.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 3.5Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 플라스미드 LITMUS39(New England Biolabs사 제조) 1.0㎍을 NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소EcoRV(NewEngland Biolabs사 제조) 및 20단위의 제한 효소HindⅢ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 2.8Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pFUT8fgE2-4 유래의HpaⅡ-HindⅢ 단편(약 3.5Kb) 4.0㎕, 플라스미드 LITMUS39 유래의EcoRV-HindⅢ 단편(약 2.8Kb) 1.0㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pscFUT8gE2-3라 부른다.
(5) 플라스미드 pK0FUT8gE2-3의 구축
실시예 4(2)에서 얻은 차이니스 햄스터 FUT8의 엑손 2를 함유하는 게놈 영역을 갖는 플라스미드 pFUT8fgE2-4를 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-3를 구축하였다(도 13).
플라스미드 pFUT8fgE2-4 2.0㎍을 NEBuffer forEcoRI(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소EcoRI(New England Biolabs사 제조) 및 20단위의 제한 효소HindⅢ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 1.8Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+)(Strategene사 제조) 1.0㎍을 NEBuffer forEcoRI(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한효소EcoRI(New England Biolabs사 제조) 및 20단위의 제한 효소HindⅢ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 3.0Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pFUT8fgE2-4 유래의HindⅢ-EcoRI 단편(약 1.8Kb) 4.0㎕, 플라스미드 pBluescriptⅡ KS(+) 유래의HindⅢ-EcoRI 단편(약 3.0Kb) 1.0㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-3라 부른다.
(6) 플라스미드 pKOFUT8gE2-4의 구축
본 항 (4) 및 (5)에서 얻은 플라스미드 pscFUT8gE2-3 및 pKOFUT8gE2-3을 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-4를 구축하였다(도 14).
플라스미드 pscFUT8gE2-3 1.0㎍을 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer forSalⅠ(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 제한 효소SalⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소HindⅢ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 3.6Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 플라스미드 pKOFUT8gE2-3 1.0㎍을 100㎍/㎖ BSA(New England Biolabs사 제조)를 함유하는 NEBuffer forSalⅠ(Ncw England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 제한 효소SalⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 35㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소HindⅢ(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, pH 8.0의 1mol/ℓTris-HCl 완충액 35㎕ 및 대장균 C15주 유래 Alkaline Phosphatase(다카라주조사 제조) 3.5㎕를 첨가하여, 65℃에서 30분간 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈인산화를 하였다. 탈인산화 처리 후 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 하고, 회수한 DNA 단편을 멸균수 10㎕에 용해하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pscFUT8gE2-3 유래의SalⅠ-HindⅢ 단편(약 3.1Kb) 4.0㎕, 플라스미드 pKOFUT8gE2-3 유래의SalⅠ-HindⅢ 단편(약 4.8Kb) 1.0㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-4라 부른다.
(7) 플라스미드 pKOFUT8gE2-5의 구축
본 항 (3) 및 (6)에서 얻은 플라스미드 pKOFUT8gE2-2 및 pKOFUT8gE2-4를 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pKOFUT8gE2-5를 구축하였다(도 15).
플라스미드 pKOFUT8gE2-2 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 제한 효소SmaⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 25℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, NEBuffer2(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소BamHI(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, pH 8.0의 1mol/ℓTris-HCl 완충액 30㎕ 및 대장균 C15주 유래 Alkaline Phosphatase(다카라주조사 제조) 3.0㎕를 첨가하고, 65℃에서 1시간 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈인산화를 실시하였다. 탈인산화 처리 후, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 하고, 회수한 DNA 단편을 멸균수 10㎕에 용해하였다.
한편, 플라스미드 pKOFUT8gE2-4 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 제한 효소SmaⅠ(New England Biolabs사 제조) 20단위를 가하여 25℃에서 2시간 소화 반응을 실시하였다. 그 반응액으로부터 에탄올 침전법으로 DNA 단편을 회수한 후, NEBuffer 2(New England Biolabs사 제조) 30㎕에 용해하고, 20단위의 제한 효소BamHI(New England Biolabs사 제조)를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 O.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 약 5.2Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pKOFUT8gE2-2 유래의SmaⅠ-BamHI 단편(약 5.0Kb) 0.5㎕, 플라스미드 pKOFUT8gE2-4 유래의SmaⅠ-BamHI 단편(약 5.2Kb) 4.5㎕,Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하고, 16℃에서 15시간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8gE2-5라 부른다.
(8) 플라스미드 pKOFUT8Puro의 구축
본 항(7)에서 얻은 플라스미드 pKOFUT8gE2-5를 사용하여 이하의 순서로 플라스미드 pKOFUT8Puro를 구축하였다(도 16).
플라스미드 pKOSelectDT(Lexicon사 제조) 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 50㎕에 용해하여 제한 효소RsrⅡ(New England Biolabs사 제조) 16단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, 그 액을 0.8%(w/v) 아갈로스 겔 전기 영동에 넣어 디프테리아톡신 발현 유닛을 함유하는 약 1.2Kb의 DNA 단편을 정제하였다.
한편, 플라스미드 pKOFUT8gE2-5 1.0㎍을 NEBuffer 4(New England Biolabs사 제조) 50㎕에 용해하고, 제한 효소RsrⅡ(New England Biolabs사 제조) 16단위를 가하여 37℃에서 2시간 소화 반응을 행하였다. 소화 반응 후, pH 8.0의 1mol/ℓ Tris-HCl 완충액 30㎕ 및 대장균 C15주 유래 Alkaline Phosphatase(다카라주조사 제조) 3.0㎕를 첨가하고, 65℃에서 1시간 반응시킴으로써 DNA 말단의 탈인산화를 실시하였다. 탈인산화 처리후, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하고, 회수한 DNA 단편을 멸균수 10㎕에 용해하였다.
상기에서 얻은 플라스미드 pKOSelectDT 유래의RsrⅡ-RsrⅡ 단편(약 1.2Kb)1.0㎕, 플라스미드 pKOFUT8gE2-5 유래의RsrⅡ-RsrⅡ 단편(약 10.4Kb) 1.0㎕, 멸균수 3.0㎕, Ligation High(도요방적사 제조) 5.0㎕를 혼합하여 16℃에서 30분간 반응시킴으로써 결합반응을 행하였다. 그 반응액을 사용하여 대장균 DH5α주를 형질 전환하고, 얻어진 암피실린 내성 클론으로부터 공지된 방법에 따라 각각 플라스미드 DNA를 단리하였다. 본 플라스미드를 이하, pKOFUT8Puro라 부른다. 그 플라스미드는 CHO 세포의 FUT8 유전자 녹아웃 세포를 제작하기 위한 타케팅 벡터로서 사용된다.
실시예 6. 렉틴 내성 CHO/DG44 세포의 제작과 그 세포를 사용한 항체의 생산
1. 렉틴 내성 CHO/DG44주의 취득
CHO/DG44 세포를, IMDM-FBS(10) 배지[소 태아 혈청(FBS)을 10%, HT supplement(GIBCO BRL사 제조)를 1배 농도 함유하는 IMDM 배지]에서 접착 배양용 플라스크 75㎠(그라이너사 제조) 중에서 배양하여 콘플루언트 직전까지 증식시켰다. 5㎖의 덜베코 PBS(인비트로젠사 제조)로 세포를 세정 후, 덜베코 PBS로 희석한 0.05% 트립신(인비트로젠사 제조)을 1.5㎖ 첨가하여 37℃에서 5분간 방치하여 세포를 배양기 저면으로부터 박리시켰다. 박리시킨 세포를 통상의 세포배양에서 실시되는 원심 조작에 의해 회수하여, 1×105세포/㎖의 밀도가 되도록 IMDM-FBS(10) 배지를 첨가하고 현탁 후, 미첨가 또는 0.1㎍/㎖의 알킬화제인 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin(이하, MNNG라 표기, Sigma사 제조)를 첨가하였다. CO2인큐베이터(TABAI 제조) 중에서 37℃에서 3일간 방치 후 배양 상청을 제거하고,다시 상기 서술한 조작과 동일한 조작으로 세포를 세정, 박리, 회수하여 IMDM-FBS(10) 배지에 현탁 후, 접착 배양용 96웰 플레이트(이와키가라스사 제조)에 1000세포/웰의 밀도로 파종하였다. 각 웰에는 배지 중 종농도로 1㎎/㎖의 렌즈콩 응집소(Lens culinaris agglutinin；이하, LCA라 표기, Vector사 제조) 또는 1㎎/㎖의 들주발버섯 응집소(Aleuria aurantia Lectin；이하, AAL이라 표기, Vector사 제조) 또는 1㎎/㎖의 강낭콩 응집소(Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin；이하, L-PHA라 표기, Vector사 제조)를 첨가하였다. CO2인큐베이터 내에서 37℃에서 2주일 배양 후, 출현한 콜로니를 렉틴 내성 CHO/DG44주로서 취득하였다. 취득한 각각의 렉틴 내성 CHO/DG44주에 관해서는, LCA 내성주를 CHO-LCA주, AAL 내성주를 CHO-AAL주, L-PHA 내성주를 CHO-PHA주라고 명명하였다. 취득한 이들 주의 각종 렉틴에 대한 내성을 조사하였더니, CHO-LCA주는 AAL에 대해서도 내성이고, CHO-AAL주는 LCA에 대해서도 내성인 것을 알았다. 또한, CHO-LCA주 및 CHO-AAL주는 LCA나 AAL이 인식하는 당 사슬 구성과 동일한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴, 즉 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민 잔기의 6위와 푸코오스의 1위가 α결합으로 부가된 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 대해서도 내성을 나타내었다. 구체적으로는, 종농도 1㎎/㎖의 완두콩 응집소(Pisum sativum Agglutinin；이하, PSA라 표기, Vector사 제조)가 첨가된 배지에서도 CHO-LCA주 및 CHO-AAL주는 내성을 나타내어 생존하는 것을 알았다. 또, 알킬화제 MNNG 무첨가의 경우에도 상기 서술한 처리를 실시하는 세포수를 늘림으로써 렉틴 내성주를취득하였다.
2. 항 CD20 인간형 키메라 항체 생산 세포의 제작
상기 1에서 얻어진 LCA 렉틴 내성주에 항 CD20 인간형 키메라 항체 발현 벡터 pKANTEX2B8P의 4㎍을 1.6×106세포의 CHO/DG44 세포로 일렉트로포레이션법[사이토테크놀로지(Cytotechnology),3, 133(1990)]에 의해 도입 후 10㎖의 IMDM-dFBS(10)-HT(1)[dFBS(인비트로젠사 제조)를 10%, HT supplement(인비트로젠사 제조)를 1배 농도로 함유하는 IMDM 배지(인비트로젠사 제조)]에 현탁하여 96웰 배양용 플레이트(이와키가라스사 제조)에 100㎕/웰씩 분주하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃, 24시간 배양한 후, IMDM-dFBS(10)(투석 FBS를 10%로 함유하는 IMDM 배지)에 배지 교환하여 1∼2주일 배양하였다. HT 비의존적인 증식을 나타내는 형질 전환주의 콜로니가 출현하였기 때문에, 증식이 인정된 웰의 형질 전환주에 관해서는 DHFR 유전자 증폭계를 이용하여 항체 생산량을 증가시켰다. 구체적으로는, MTX를 50nM 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지에 1∼2×105세포/㎖가 되도록 현탁하고, 24웰 플레이트(이와키가라스사 제조)에 0.5㎖씩 분주하였다. 5% C02인큐베이터 내에서 37℃에서 1∼2주일 배양하여 50nM MTX 내성을 나타내는 형질 전환주를 유도하였다. 증식이 인정된 웰의 형질 전환주에 관해서는, 상기와 같은 방법에 의해 MTX 농도를 200nM으로 상승시키고, 최종적으로 MTX를 200nM의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 배지로 증식가능하고, 또한 항 CD20 인간형 키메라 항체를고생산하는 형질 전환주를 얻었다.
3. 항체 발현 세포주의 배양 및 항체의 정제
상기 2. 에서 얻어진 항 CD20 키메라 항체를 고생산하는 LCA 렉틴 내성 CHO/DG44 형질 전환세포를 R92-3-1주라고 명명하였다. R92-3-1주는 2002년 3월 26일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1초메 1반치 추오 제 6)에 FERM BP-7976으로서 기탁되어 있다.
R92-3-1주를, 200nM MTX 농도의 IMDM-dFBS(10)로 콘플루언트가 될 때까지 배양하여 덜베코 PBS(인비트로젠사 제조)로 세정 후, EX-CELL301(JRH사 제조)에 배지 교환하였다. 5% CO2인큐베이터 내에서 37℃에서 7일간 배양하여 배양 상청을 회수하였다. 배양 상청으로부터 Prosep-A(밀리포어사 제조) 칼럼을 사용하여 항 CD20 키메라 항체를 정제하였다. 얻어진 항체는 R92-3-1 항체라고 명명하였다.
실시예 7. 렉틴 내성 CHO/DG44 세포가 생산하는 항 CD20 키메라 항체의 정제와 활성 평가
1. 렉틴 내성 CHO/DG44 세포 유래 항체의 결합 활성의 평가(형광항체법)
상기 실시예 6의 3항에서 얻어진 R92-3-1 항체의 CD20 발현 세포주 Raji 세포에 대한 결합 활성을 실시예 2의 1항에 나타낸 형광 항체법에 따라 검토하여, 통상의 CHO 세포 유래인 시판 항체 RituxanTM의 활성과 비교하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, R92-3-1 항체, RituxanTM모두 항체 농도 의존적으로 형광 강도의 증가가 인정되어, 거의 동일한 결합 활성을 나타내는 것이 확인되었다.
2. 렉틴 내성 CHO/DG44 세포 유래 항체의in vitro세포 상해 활성의 평가(ADCC 활성)
상기 실시예 6의 3항에서 얻어진 R92-3-1 항체의in vitroADCC 활성을 평가하기 위하여, 실시예 2의 2항에 나타낸 방법에 준하여 ADCC 활성을 측정하였다. 또, 이펙터 세포와 타겟세포인 Raji 세포의 비는 25：1, 최종 항체 농도는 0.001∼10㎍/㎖로 하여 전량 200㎕이 되도록 첨가하여 반응시켰다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
LCA 렉틴 내성 CHO/DG44 세포 유래 R92-3-1 항체는 RituxanTM보다도 높은 ADCC 활성을 나타내고 있었다.
3. 렉틴 내성 CHO/DG44 세포 유래 항체의 당 사슬 분석
상기 실시예 6의 3항에서 얻어진 R92-3-1 항체의 당 사슬 해석을 실시예 3에 나타낸 방법에 따라 실시하였다. 도 19에 그 결과를 나타내었다. 도 19에서 나타낸 피크①∼⑧의 당 사슬 구조는 도 7에서 나타낸 피크①∼⑧의 당 사슬 구조와 동일하다.
도 19에 있어서, α-1,6-푸코오스를 가지지 않은 당 사슬군의 비율은 ①∼⑩의 각 피크가 차지하는 면적의 합계 중 ①∼④, ⑨ 및 ⑩의 피크가 차지하는 면적의 합계로부터 산출하였다. 또한, α-1,6-푸코오스가 결합된 당 사슬군의 비율은 ①∼⑩의 각 피크가 차지하는 면적의 합계 중 ⑤∼⑧의 피크가 차지하는 면적의합계로부터 산출하였다.
그 결과, R92-3-1 항체의 α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬 함량은 33%, α-1,6-푸코오스 결합 당 사슬 함량은 67%이고, 실시예 3에서 당 사슬 분석한 RituxanTM과 비교하면, LCA 렉틴 내성 CHO/DG44 세포로 생산한 항체는 α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬 함량이 많았다.
실시예 8. CHO 세포 유래 GMD 유전자의 취득
1. CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열의 결정
(1) CHO 세포 유래 GMD 유전자의 cDNA 취득 (5' 및 3' 말단 서열을 제외한 부분 cDNA 취득)
GenBank 에 등록되어 있는 인간 GMD cDNA 서열 (GenBank Accession No. AF042377) 을 퀴어리 (query) 로 하여 설치류 유래 GMD cDNA 를 공적 데이터 베이스 (BLAST) 를 이용하여 검색한 결과, 3 종류의 마우스 EST 서열이 얻어졌다 (GenBank Accesssion No. BE986856, BF158988, BE284785). 이들 EST 서열을 연결시킴으로써, 추정되는 마우스 GMD cDNA 서열을 결정하였다.
이 마우스 GMD cDNA 서열로부터, 서열 번호 32 로 표시되는 염기 서열을 갖는 28mer 의 프라이머, 서열 번호 33 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 27mer 의 프라이머, 서열 번호 34 로 표시되는 염기 서열을 갖는 25mer 의 프라이머, 서열 번호 35 로 표시되는 염기 서열을 갖는 24mer 의 프라이머, 서열 번호 36 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 25mer 의 프라이머를 제작하였다.
계속해서 CHO/DG44 세포를 37℃ 의 5% CO2인큐베이터내에서 계대 후 4일간 배양하였다. 배양 후, Rneasy Protect Mini kit (키아겐사 제조) 를 사용하고, 각 1×107세포로부터 첨부의 사용설명서에 따라 RT-PCR (GIBCO BRL사 제조) 을 사용하여, 첨부의 사용설명서에 따라 각 RNA 5㎍ 으로부터 20㎕ 의 반응액 중에서 1개 사슬 cDNA 를 합성하였다.
이 CHO 세포 유래 cDNA 를 증폭하기 위해 이하의 방법으로 PCR 을 행하였다. CHO 세포 유래 1개 사슬 cDNA 0.5㎕ 을 주형으로 함유하는 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM 의 dNTP's, 0.5 단위의 EX Taq polymerase (다카라주조사 제조), 0.5㎛ 의 합성 DNA 프라이머 2 종류] 을 조제하였다. 또한 합성 DNA 프라이머에는 서열 번호 32 와 서열 번호 33, 서열 번호 34 와 서열 번호 33, 서열 번호 32 와 서열 번호 35, 서열 번호 32 와 서열 번호 36 의 조합을 사용하였다. 이 반응액을 DNA 서멀 사이쿠라 480 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여 94℃ 에서 5분간 가열한 후, 94℃ 에서 1분간, 68℃ 에서 2분간의 사이클을 30 사이클 행하였다.
이 PCR 반응액을 아갈로스 전기 영동으로 분획한 결과, 서열 번호 32 와 서열 번호 33 의 합성 DNA 프라이머를 사용한 PCR 산물에서는 약 1.2kbp, 서열 번호 33 과 서열 번호 34 의 합성 DNA 프라이머를 사용한 PCR 산물에서는 약 1.1kbp, 서열 번호 32 와 서열 번호 35 의 합성 DNA 프라이머를 사용한 PCR 산물에서는 약 350bp, 서열 번호 32 와 서열 번호 36 의 합성 DNA 프라이머를 사용한 PCR 산물에서는 약 1kbp 의 DNA 단편이 증폭되었다. 이들 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수하였다. 회수한 DNA 단편은 DNA Ligation kit (다카라주조사 제조) 를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터 (Novagen사 제조) 에 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5주 (도요방적사 제조) 를 형질전환하여, 플라스미드 22-8 (서열 번호 32 와 서열 번호 33 의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 1.2kbp 의 DNA 단편을 가짐), 23-3 (서열 번호 34 와 서열 번호 33 의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 1.1kbp 의 DNA 단편을 가짐), 31-5 (서열 번호 32 와 서열 번호 35 의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 350bp 의 DNA 단편을 가짐), 34-2 (서열 번호 32 와 서열 번호 36 의 합성 DNA 프라이머로부터 증폭된 약 1kbp 의 DNA 단편을 가짐) 를 얻었다. 이들 플라스미드에 함유되는 CHO 세포 유래의 GMD cDNA 서열을, DNA 시퀀서 ABI PRISM 377 (파킨 엘마사 제조) 를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 결정하였다 (5' 말단측의 개시 메티오닌부터 하류 28 염기의 서열, 및 3' 말단측의 종료 코돈부터 상류 27 염기의 서열은 합성 올리고 DNA 서열 유래이기 때문에 마우스 GMD cDNA 서열임).
또한 플라스미드 22-8 과 34-2 에 함유되는 CHO 세포 유래 GMD cDNA 를 조합한 플라스미드를 제작하기 위해 이하의 공정을 실행하였다. 1㎍ 의 플라스미드 22-8 을 제한 효소EcoRI (다카라주조사 제조) 로 37℃ 에서 16시간 반응 후 아갈로스 전기 영동으로 분획하여, 약 4kbp 의 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수하였다. 2㎍ 의 플라스미드 34-2 를 제한 효소EcoRI 로 37℃ 에서 16시간 반응 후 아갈로스 전기 영동으로 분획하여, 약 150bp 의 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수하였다. 각각 회수한 DNA 단편을, Calf Intestine Alkaline Phosphatase (다카라주조사 제조) 로 말단을 탈인산화한 후, DNA Ligation kit (다카라주조사 제조) 를 사용하여 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α주 (도요방적사 제조) 를 형질 전환하여 플라스미드 CHO-GMD 를 얻었다 (도 20).
(2) CHO 세포 유래 GMD cDNA 의 5' 말단 서열의 결정
CHO 세포 유래 GMD cDNA 의 5' 말단측 비코드 (non-coding) 영역의 염기 서열부터 서열 번호 37 로 표시되는 염기 서열을 갖는 24mer 의 프라이머, 및 CHO 유래 GMD cDNA 서열부터 베열번호 38 로 표시되는 염기 서열을 갖는 32mer 의 프리이머를 제작하고, cDNA 를 증폭하기 위해 이하의 방법으로 PCR 을 실행하였다. CHO 세포 유래의 1개 사슬 cDNA 0.5㎕ 을 주형으로 함유하는 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM 의 dNTP's, 0.5 단위의 EX Taq polymerase (다카라주조사 제조), 0.5㎛ 의 서열 번호 37 과 서열 번호 38 의 합성 DNA 프라이머] 를 조제하고, DNA 서멀 사이쿠라 480 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5분간 가열한 후, 94℃ 에서 1분간, 55℃ 에서 1분간, 72℃ 에서 2분간의 사이클을 20 사이클 실행한 후, 다시 94℃ 에서 1분간, 68℃ 에서 2분간의 사이클을 18 사이클 행하였다. 이 PCR 반응액을 아갈로스 전기 영동으로 분획 후, 약 300 bp 의 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부의 설명서에 따라 회수하였다. 회수한 DNA 단편은 DNA Ligation kit (다카라주조사 제조) 를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터 (Novagen사 제조) 에 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α주 (도요방적사 제조) 를 형질전환하여 플라스미드 5'GMD 를 얻었다. DNA 시퀀서 377 (파킨 엘마사 제조) 를 사용하여, 이 플라스미드에 함유되는 CHO 유래 GMD cDNA 의 개시 메티오닌부터 하류 28 염기의 서열을 결정하였다.
(3) CHO 세포 유래 GMD cDNA 의 3' 말단 서열의 결정
CHO 세포 유래 GMD 의 3' 말단 cDNA 서열을 얻기 위해 이하의 방법으로 RACE 법을 행하였다. CHO 세포 유래 RNA 로부터, 3'RACE용 1개 사슬 cDNA 의 제작을 SMARTTMRACE cDNA Amplification kit (CLONTECH사 제조) 를 사용하여 첨부의 설명서에 따라 행하였다. 단, 역전사 효소에는 PowerScriptTMReverse Transcriptase (CLONTECH사 제조) 를 사용하였다. 조제 후의 1개 사슬 cDNA 는 키트 첨부의 Tricin-EDTA buffer 로 10배로 희석한 것을 PCR 의 주형으로 사용하였다.
이어서 상기 3' RACE용 1개 사슬 cDNA 1㎕ 을 주형으로 함유하는 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM dNTP's, 0.5 단위의 EX Taq polymerase (다카라주조사 제조), 0.5㎛ 의 서열 번호 39 로 표시하는 24mer 의 합성 DNA 프라이머 [본 항목 (1) 에서 결정한 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열로 제작], 1배 농도의 Universal Primer Mix (SMARTTMRACE cDNA Amplification kit 에 부속 ; CLONTECH사 제조)] 을 조제하고, DNA 서멀 사이쿠라 480 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5분간 가열한 후, 94℃ 에서 1분간, 68℃ 에서 2분간의 사이클을 30 사이클 행하였다.
반응 종료 후, 이 PCR 반응액으로부터 1㎕ 을 취해, Tricin-EDTA buffer (CLONTECH사 제조) 로 20배 희석한 수용액 1㎕ 을 주형으로 함유하는 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM dNTP's, 0.5 단위의 EX Taq polymerase (다카라주조사 제조), 0.5㎛ 의 서열 번호 40 으로 표시하는 25mer 의 합성 DNA 프라이머 [본 항목 (1) 에서 결정한 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열로 제작], 0.5㎛ 의 Nested Universal Primer (SMARTTMRACE cDNA Amplification kit 에 부속 ; CLONTECH사 제조)] 을 조제하고, DNA 서멀 사이쿠라 480 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5분간 가열한 후, 94℃ 에서 1분간, 68℃ 에서 2분간의 사이클을 30 사이클 행하였다.
반응 종료 후, 이 PCR 반응액을 아갈로스 전기 영동으로 분획 후, 약 700bp 의 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수하였다. 회수한 DNA 는 DNA Ligation kit (다카라주조사 제조) 를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터 (Novagen사 제조) 에 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α주 (도요방적사 제조) 를 형질전환하여 플라스미드 3'GMD 를 얻었다. DNA 시퀀서 377 (파킨 엘마사 제조) 를 사용하고, 이 플라스미드에 함유되는 CHO 유래 GMD cDNA 의 종지 코돈으로부터 상류 27 염기의 서열, 및 3'측의 non-coding 영역 415bp 의 염기 서열을 결정하였다.
이상 본 항목 (1), (2), (3) 으로부터 결정한 CHO 유래 GMD 유전자의 전장 cDNA 서열을 서열 번호 41, 그것에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 61로 표시한다.
2. CHO/DG44 세포의 GMD 유전자를 함유하는 게놈 서열의 결정
실시예 8 의 1 항에서 결정한 마우스 GMD cDNA 서열로부터, 서열 번호 56 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 25mer 의 프라이머를 제작하였다. 이어서 이하의 방법으로 CHO 세포 유래 게놈 DNA 를 취득하였다. CHO/DG44 세포를 IMDM-dFBS(10)-HT(1) 배지 [HT supplement (인비트로젠사 제조) 를 1배 농도로 함유하는 IMDM-dFBS (10) 배지] 에 3×105세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, 접착세포용 평저 6웰 플레이트 (Greiner사 제조) 에 2㎖/웰씩 분주하였다. 37℃ 의 5% CO2인큐베이터내에서 컨플루언트 (confluent) 가 될 때까지 배양한 후, 이 플레이트로부터 공지된 방법 [누클레익 애시드 리서치 (Nucleic Acids Research),3, 2303 (1976)] 에 따라 게놈 DNA 를 조제하고, TE-RNase 완충액 (pH8.0) (10m㏖/ℓTris-HCl, 1m㏖/ℓEDTA, 200㎍/㎖ RNase A) 150㎕ 에 하룻밤 용해하였다.
상기에서 취득한 CHO/DG44 세포 유래 게놈 DNA 를 100ng, 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM dNTP's, 0.5 단위의 EX Taq polymerase (다카라주조사 제조), 0.5㎛ 의 서열 번호 35 와 서열 번호 56 의 합성 DNA 프라이머] 을 조제하고, DNA 서멀 사이쿠라 480 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5분간 가열한 후 94℃ 에서 1분간, 68℃ 에서 2분간의 사이클을 30사이클 행하였다. 반응 종료 후, 이 반응액을 아갈로스 전기 영동으로 분획 후, 약 100bp 의 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수하였다. 회수한 DNA 단편은 DNA Ligation kit (다카라주조사 제조) 를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터 (Novagen사 제조) 에 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α주 (도요방적사 제조) 를 형질전환하여 플라스미드 ex3 을 얻었다. DNA 시퀀서 377 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여 이 플라스미드에 함유되는 CHO 세포 유래 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정하였다. 결정한 염기 서열을 서열 번호 57 로 나타낸다.
다음에 실시예 8 의 1 항에서 결정한 CHO 세포 유래 GMD cDNA 서열로부터, 서열 번호 58 로 표시되는 염기 서열을 갖는 25mer 의 프라이머, 및 서열 번호 59 로 표시되는 염기 서열을 갖는 25mer 의 프라이머를 제작하였다. 이어서 CHO/DG44 유래 게놈 DNA 를 100ng, 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM dNTP's, 0.5 단위의 EX Taq polymerase (다카라주조사 제조), 0.5㎛ 의 서열 번호 58 과 서열 번호 59 의 합성 DNA 프라이머] 을 조제하고, DNA 서멀 사이쿠라 480 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5분간 가열한 후 94℃ 에서 1분간, 68℃ 에서 2분간의 사이클을 30 사이클 행하였다.
반응 종료 후, 이 반응액을 아갈로스 전기 영동으로 분획 후, 약 200bp 의 DNA 단편을 Gene Clean II kit (BIO101사 제조) 를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라 회수하였다. 회수한 DNA 단편은 DNA Ligation kit (다카라주조사 제조) 를 사용하여 pT7Blue(R) 벡터 (Novagen사 제조) 에 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드DNA 를 사용하여 대장균 DH5α주 (도요방적사 제조) 를 형질전환하여 플라스미드 ex4 를 얻었다. DNA 시퀀서 377 (파킨 엘마사 제조) 을 사용하여 이 플라스미드에 함유되는 CHO 세포 유래 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정하였다. 결정한 염기 서열을 서열 번호 60 으로 표시한다.
실시예 9. CHO 세포 유래의 당 사슬 합성에 관련되는 각종 효소 유전자의 취득
1. CHO 세포의 Fx cDNA 서열의 결정
(1) CHO/DG44 세포 유래 전체 RNA 의 추출
CHO/DG44 세포를 10% 소 태아 혈청 (Life Technologies사 제조) 및 1배 농도의 HT supplement (Life Technologies사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지 (Life Technologies사 제조) 에 현탁하고, 2×105개/㎖ 의 밀도로 접착 세포 배양용 T75 플라스크 (Greiner사 제조) 에 15㎖ 파종하였다. 37℃ 의 5% CO2인큐베이터내에서 배양하고, 배양 2일째에 1×107개를 회수 후, RNAeasy (QIAGEN사 제조) 에 의해 첨부의 설명서에 따라 전체 RNA 를 추출하였다.
(2) CHO/DG44 세포 유래 1개 사슬 cDNA 의 조제
상기 (1) 에서 조제한 전체 RNA 를 45㎕ 의 멸균수에 용해하고, RQ1 RNase-Free DNase (Promega사 제조) 1㎕, 부속의 10×DNase buffer 5㎕, RNasin Ridonuclease inhibitor (Promega사 제조) 0.5㎕을 각각에 첨가하여, 37℃ 에서 30분간 반응시킴으로써, 시료중에 혼입한 게놈 DNA 를 분해하였다. 반응 후,RNAeasy (QIAGEN사 제조) 에 의해 전체 RNA 를 재정제하고, 50㎕ 의 멸균수에 용해하였다.
얻어진 전체 RNA 3㎕ 에 대해 SUPERSCRIPTTMPreamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Life Technologies사 제조) 를 사용하여 첨부된 설명서에 따라, 올리고 (dT) 를 프라이머로 한 20㎕ 의 계에서 역전사반응을 행함으로써 1개 사슬 cDNA 를 합성하였다. GFPP 및 Fx 의 클로닝에는 이 반응액의 50배 희석 수용액을 사용하였다. 사용할 때까지 -80℃ 에서 보관하였다.
(3) 차이니스 햄스터 Fx 의 cDNA 부분 단편의 취득
이하의 수순에 의해 차이니스 햄스터 Fx 의 cDNA 부분 단편을 취득하였다. 먼저 공적 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 Fx 의 cDNA (Genebank 등록번호 U58766) 및 마우스의 cDNA (Genebank 등록번호 M30127) 에 공통의 염기 서열에 대해 특이적인 프라이머 (서열 번호 42 및 서열 번호 43 으로 표시함) 를 설계하였다.
다음에 DNA 폴리메라아제 ExTaq (다카라주조사 제조) 를 사용하여, 본 항목 (2) 에서 조제한 CHO/DG44 유래 1개 사슬 cDNA 를 1㎕ 을 함유하는 25㎕ 의 반응액 [ExTaq buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM dNTPs, 0.5μ㏖/ℓ상기 유전자 특이적 프라이머 (서열 번호 42 및 서열 번호 43)] 을 조제하고, 폴리메라아제 연사슬반응 (PCR) 을 행하였다. PCR 은 94℃ 에서 5분간의 가열 후, 94℃에서 1분간, 58℃ 에서 2분간, 72℃ 에서 3분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 하여 30 사이클후, 다시 72℃ 에서 10분간 가열하는 조건에서 행하였다.
PCR 후, 반응액을 2% 아갈로스 겔 전기 영동을 실시하고, 특이적 증폭 단편 301bp 를 QiaexII Gel Extraction kit (키아겐사 제조) 로 정제하여 멸균수 20㎕ 로 용출하였다 (이하 아갈로스 겔로부터의 DNA 단편의 정제에는 이 방법을 사용함). 상기 증폭 단편 4㎕ 을 TOPO TA cloning kit (invitrogen사 제조) 의 설명서에 따라 플라스미드 pCR2.1 에 삽입하고, 이 반응액을 사용하여 대장균 DH5α를 코엔 등의 방법 [프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A),69, 2110(1972)] (이하, 대장균의 형질전환에는 이 방법을 사용함) 에 의해 형질전환하였다.
얻어진 복수의 카나마이신 내성 콜로니로부터, 공지된 방법 [누클레익 어시드 리서치 (Nucleic Acids Research),7, 1513(1979)] (이하 플라스미드의 단리 방법에는 이 방법을 이용함) 에 따라, 플라스미드 DNA 를 단리하고, Fx cDNA 부분 단편이 삽입된 2 클론을 얻었다. 각각을 pCRFX 클론 8, pCRFX 클론 12 로 칭한다.
Fx 클론 8, Fx 클론 12 에 삽입된 cDNA 의 염기 서열은 DNA 시퀀서 377 (Applied Biosystems사 제조) 및 Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Applied Biosystems사 제조) 를 사용하여 결정하였다. 방법은 첨부한 매뉴얼에 따랐다. 본 법에 의해 서열 결정한 삽입 cDNA 가 차이니스 햄스터의 Fx 의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 부분 서열을 코드하는 것을 확인하였다.
(4) RACE용 1개 사슬 cDNA 의 합성
본 항목 (1) 에서 추출한 CHO/DG44 전체 RNA 로부터의 5' 및 3' RACE용 1개 사슬 cDNA 의 제작을, SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (CLONTECH사 제조) 를 사용하여 실행하였다. 방법은 첨부된 설명서에 따랐다. 단 PowerScriptTMReverse Transcriptase (CLONTECH사 제조) 를 역전사 효소로서 사용하였다. 조제 후의 1개 사슬 cDNA 는 각각, 키트 첨부의 Tricin-EDTA buffer 로 10배로 희석한 것을 PCR 의 주형으로서 사용하였다. (5) RACE 법에 의한 차이니스 햄스터 Fx 전장 cDNA 의 결정
상기 (3) 항에서 결정한 차이니스 햄스터 Fx 의 부분 서열을 근거로 차이니스 햄스터 Fx 에 특이적인 5' RACE용 프라이머 FXGSP1-1 (서열 번호 44) 및 FXGSP1-2 (서열 번호 45), 차이니스 햄스터 Fx 특이적인 3' RACE용 프라이머 FXGSP2-1 (서열 번호 46) 및 FXGSP2-2 (서열 번호 47) 을 설계하였다.
다음에 Advantage2 PCR Kit (CLONTECH사 제조) 를 사용하여, 본 항목 (4) 에서 조제한 CHO/DG44 유래 RACE용 1개 사슬 cDNA 를 1㎕ 을 함유하는 50㎕ 의 반응액 [Advantage 2 PCR buffer (CLONTECH사 제조) 0.2mM dNTPs, 0.2μ㏖/ℓ차이니스 햄스터 Fx 특이적 RACE용 프라이머, 1배 농도의 공통 프라이머 (CLONTECH사 제조)] 을 조제하고, 폴리메라아제 연사슬반응 (PCR) 을 행하였다.
PCR 은 94℃ 에서 5초간, 68℃ 에서 10초간, 72℃ 에서 2분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 하여 20 사이클 반복하는 조건에서 실행하였다.
반응 종료 후, 반응액으로부터 1㎕ 을 취해 Tricin-EDTA buffer 에 의해 50배로 희석한 수용액 1㎕ 을 템플레이트로 사용하여, 다시 반응액을 조제하고 동 조건에서 PCR 을 행하였다. 1회째 및 2회째의 PCR 로 사용한 프라이머의 재조합 및 증폭되는 DNA 단편길이를 표 2 에 나타냈다.
차이니스 햄스터 FxcDNA RACE PCR 에 사용한 프라이머의 조합과 PCR 산물의 길이
5' RACE FX특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭 산물의 크기
1회째 FXGSP1-1 UPM(Univarsal primer mix)
2회째 FXGSP1-2 NUP(Nested Univarsal primer) 300bp
3' RACE FX특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭 산물의 크기
1회째 FXGSP2-1 UPM(Univarsal primer mix)
2회째 FXGSP2-2 NUP(Nested Univarsal primer) 1100bp
PCR 후, 반응액을 1% 아갈로스 겔 전기 영동을 실시하고, 목적으로 하는 특이적 증폭 단편을 QiaexII Gel Extraction kit (키아겐사 제조) 로 정제하여 멸균수 20㎕ 로 용출하였다. 상기 증폭 단편 4㎕ 을 TOPO TA cloning kit (invitrogen사 제조) 의 설명서에 따라, 플라스미드 pCR2.1 에 삽입하고, 이 반응액을 사용하여 대장균 DH5α을 형질전환하였다.
얻어진 복수의 카나마이신 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA 를 단리시켜, 차이니스 햄스터 Fx 의 5' 영역을 포함하는 cDNA 를 6 클론 얻었다. 각각을 Fx5' 클론 25, Fx5' 클론 26, Fx5' 클론 27, Fx5' 콜론 28, Fx5' 클론 31, Fx5' 클론 32 라고 한다.
마찬가지로 차이니스 햄스터 Fx 의 3' 영역을 포함하는 cDNA 를 5 클론 얻었다. 각각 Fx3' 를 Fx3' 클론 1, Fx3' 클론 3, Fx3' 클론 6, Fx3' 클론 8, Fx3' 클론 9 라고 한다.
상기 5' 및 3' RACE 에 의해 취득한 각 클론의 cDNA 부분의 염기 서열은, DNA 시퀀서 377 (Applied Biosystems사 제조) 을 사용하여 결정하였다. 방법은 첨부 매뉴얼에 따랐다. 본 법에 의해 결정한 각 cDNA 의 염기 서열을 비교하여, PCR 에 수반하는 염기의 오판독을 없애고, 차이니스 햄스터 FxcDNA 전장의 염기 서열을 결정하였다. 결정한 염기 서열을 서열 번호 48 로 나타낸다. 서열 번호 48 의 ORF 는, 염기 번호 95∼1060 이고, 종지 코돈을 제외한 염기 번호 95∼1057 에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 62 로 표시한다.
2. CHO 세포의 GFPP cDNA 서열의 결정
(1) 차이니스 햄스터 GFPP 의 cDNA 부분 단편의 취득
이하의 수순에 의해 차이니스 햄스터 GFPP 의 cDNA 부분 단편을 취득하였다. 먼저 공적 데이터 베이스에 등록되어 있는 인간 GFPP 의 cDNA (Genebank 등록번호 AF017445), 이 서열과 상동성이 높은 마우스 EST 서열 (Genebank 등록번호 AI467195, AA422658, BE304325, AI466474) 및 Rat EST 서열 (Genebank 등록번호 BF546372, AI058400, AW144783) 의 염기 서열을 비교하고, 3종 사이에서 보존성이 높은 영역에 래트 GFPP 에 특이적인 프라이머 GFPP FW9 및 GFPP RV9 (서열 번호 49 및 서열 번호 50) 를 설계하였다.
다음에 DNA 폴리메라아제 ExTaq (다카라주조사 제조) 를 사용하여, 본 항목 1(2) 에서 조제한 CHO/DG44 유래 1개 사슬 cDNA 를 1㎕ 을 함유하는 25㎕ 의 반응액 [ExTaQ buffer (다카라주조사 제조), 0.2mM dNTPs, 0.5μ㏖/ℓ상기 GFPP 특이적 프라이머 GFPP FW9 및 GFPP RV9 (서열 번호 49 및 서열 번호 50)] 을 조제하고, 폴리메라아제 연사슬반응 (PCR) 을 행하였다. PCR 은 94℃ 에서 5분간의 가열 후, 94℃ 에서 1분, 58℃ 에서 2분간, 72℃ 에서 3분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 하여 30 사이클 후, 다시 72℃ 에서 10분간 가열하는 조건으로 행하였다.
PCR 후, 반응액을 2% 아갈로스 겔 전기 영동을 실시하고, 특이적 증폭 단편 1.4kbp 를 QiaexII Gel Extraction kit (키아겐사 제조) 로 정제하여 멸균수 20㎕ 로 용출하였다. 상기 증폭 단편 4㎕을 TOPO TA cloning kit (invitrogen사 제조) 의 설명서에 따라, 플라스미드 pCR2.1 에 삽입하고, 이 반응액을 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환하였다.
얻어진 복수의 카나마이신 내성 콜로니로부터 플라스미드 DNA 를 단리시켜 GFPPcDNA 부분 단편이 삽입된 3 클론을 얻었다. 각각 GFPP 클론 8, GFPP 클론 11, GFPP 클론 12 라고 한다.
GFPP 클론 8, GFPP 클론 11, GFPP 클론 12 에 삽입된 cDNA 의 염기 서열은 DNA 시퀀서 377 (Applied Biosystems사 제조) 및 Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit (Applied Biosystems사 제조) 를 사용하여 결정하였다. 방법은 첨부한 매뉴얼에 따랐다. 본 법에 의해 서열 결정한 삽입 cDNA 가 차이니스 햄스터의 GFPP 의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 의 부분 서열을 코드하는 것을 확인하였다.
(2) RACE법에 의한 차이니스 햄스터 GFPP 전장 cDNA 의 결정
본 항 2(1) 에서 결정한 차이니스 햄스터 Fx 의 부분 서열을 근거로 차이니스 햄스터 Fx 에 특이적인 5' RACE용 프라이머 GFPP GSP-1 (서열 번호 52) 및 GFPPGSP1-2 (서열 번호 53), 차이니스 햄스터 GFPP 특이적인 3' RACE용 프라이머 GFPP GSP2-1 (서열 번호 54) 및 GFPP GSP2-2 (서열 번호 55) 를 설계하였다.
다음에 Advantage2 PCR Kit (CLONTECH사 제조) 를 사용하여, 본 항목 (4) 에서 조제한 CHO/DG44 유래 RACE용 1개 사슬 cDNA 1㎕ 을 함유하는 50㎕ 의 반응액 [Advantage2 PCR buffer (CLONTECH사 제조), 0.2mM dNTPs, 0.2μ㏖/ℓ차이니스 햄스터 GFPP 특이적 RACE용 프라이머, 1배 농도의 공통 프라이머 (CLONTECH사 제조)] 를 조제하고, 폴리메라아제 연사슬반응 (PCR) 을 행하였다.
PCR 은 94℃ 에서 5초간, 68℃ 에서 10초간, 72℃ 에서 2분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 하여 20 사이클 반복하는 조건으로 실행하였다.
반응 종료 후, 반응액으로부터 1㎕ 을 취해 Tricin-EDTA buffer 로 50 배로 희석한 수용액 1㎕ 을 템플레이트로 하여 다시 반응액을 조제하고, 동 조건에서 PCR 을 행하였다. 1회째 및 2회째의 PCR 에서 사용한 프라이머의 조합 및 증폭되는 DNA 단편길이를 표 3 에 나타냈다,
차이니스 햄스터 GFPP cDNA RACE PCR 에 사용한 프라이머의 조합과 PCR 산물의 길이
5' RACE GFPP 특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭 산물의 크기
1회째 GFPPGSP1-1 UPM(Univarsal primer mix)
2회째 GFPPGSP1-2 NUP(Nested Univarsal primer) 1100bp
3' RACE GFPP특이적 프라이머 공통 프라이머 PCR 증폭 산물의 크기
1회째 GFPPGSP2-1 UPM(Univarsal primer mix)
2회째 GFPPGSP2-2 NUP(Nested Univarsal primer) 1400bp
PCR 후, 반응액을 1% 아갈로스 겔 전기 영동을 실시하고, 목적으로 하는 특이적 증폭 단편을 QiaxII Gel Extraction kit (키아겐사 제조) 로 정제하고, 멸균수 20㎕ 로 용출하였다. 상기 증폭 단편 4㎕ 을 TOPO TA cloning kit (invitrogen사 제조) 의 설명서에 따라, 플라스미드 pCR2.1 에 삽입하고, 이 반응액을 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환하였다.
얻어진 복수의 카나마이신 내성 콜로니로부터, 플라스미드 DNA 를 단리하고, 차이니스 햄스터 CFPP 의 5' 영역을 포함하는 cDNA 를 4 클론을 얻었다. 각각을 GFPP5' 클론 1, GFPP5' 클론 2, GFPP5' 클론 3, GFPP5' 클론 4 라고 한다.
마찬가지로 차이니스 햄스터 GFPP 의 3' 영역을 포함하는 cDNA 를 3 클론을 얻었다. 각각을 GFPP3' 클론 10, GFPP3' 클론 16, GFPP3' 클론 20 이라 한다.
상기 5' 및 3' RACE 에 의해 취득한 각 클론의 cDNA 부분의 염기 서열은, DNA 시퀀서 377 (Applied Biosystems사 제조) 를 사용하여 결정하였다. 방법은 첨부한 매뉴얼에 따랐다. 염기 서열 결정 후, 각 cDNA 의 염기 서열을 비교하여, PCR 에 수반되는 염기의 오판독을 제거하고, 차이니스 햄스터 GFPP cDNA 전장의 염기 서열을 결정하였다. 결정한 염기 서열을 서열 번호 51 로 표시한다. 서열 번호 51 의 ORF 는 염기 번호 27∼1799 이고, 종지 코돈을 제외한 염기 번호 27∼1796 에 대응하는 아미노산 서열을 서열 번호 63 으로 표시한다.
실시예 10 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체 분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체의 활성 평가
1. α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 다른항 CD20 키메라 항체의 조제
실시예 1 의 3 항에서 정제한 KM3065 와, CHO 세포 유래의 RituxanTM을 사용하고, KM3065 : RituxanTM=24:66, 34:56, 44:46 의 비율로 혼합하였다. 이들 시료를 실시예 3 의 방법에 따라 당 사슬 분석을 실행하였다. α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율은 각각 26%, 35%, 44% 이었다. 이하 이들 시료를 항 CD20 키메라 항체 (26%), 항 CD20 키메라 항체 (35%), 항 CD20 키메라 항체 (44%) 로 표기한다. 도 21 에는 각 시료의 당 사슬 분석의 결과를 나타내었다.
2. CD20 발현 세포주에 대한 결합 활성의 평가 (형광 항체법)
실시예 10 의 1 항에서 조제한 3 종류의 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체에, 실시예 3 에서 당 사슬 분석을 행한 KM3065 및 RituxanTM(각각 항 CD20 키메라 항체 (96%), 항 CD20 키메라 항체 (6%) 로 표기함) 을 첨가한 5 종류의 항체의 결합활성을 실시예 2 의 1 항에 나타낸 형광항체법에 따라 측정하였다. 도 22 에 나타낸 바와 같이 항체 농도 0.016∼2㎍/㎖ 에서 어느 항체도 CD20 양생 Raji 세포 (JCRB9012) 에 대해 대략 동등한 결합활성을 나타내고, α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율은, 항체의 항원 결합 활성에 영향을 주지 않은 것이 밝혀졌다.
3. CD20 발현 세포주에 대한 세포 상해 활성의 평가 (51Cr 릴리스법)
CD20 양성인 인간 B 림파구 세포주 WIL2-S (ATCC CRL8885) 에 대한 ADCC 활성을, 건강인 도너 A 로부터 채취한 이펙터 세포를 사용하여, 이하와 같이 하여 측정하였다.
(1) 표적 세포 용액의 조제
WIL2-S 세포의 2×106세포를 조제하고, 방사성 물질인 Na2 51CrO4를 3.7MBq 당량 첨가하여 37℃ 에서 1시간 반응시켜 세포를 방사 표지하였다. 반응 후, RPMI1640-FCS(10) 배지를 사용한 현탁 및 원심 분리조작에 의해 3회 세정하고, 배지에 재현탁하여 4℃ 에서 30분간 얼음 속에 방치하여 방사성 물질을 자연 해리시켰다. 원심 분리 후 배지를 10㎖ 첨가하고 2×105세포/㎖ 로 조제하여 표적 세포 용액으로 하였다.
(2) 인간 이펙터 세포 용액의 조제
건강인 말초혈 50㎖ 를 채취하고, 헤파린나트륨 (시미즈제약사 제조) 을 0.5㎖ 첨가하여 천천히 혼합하였다. 이것을 Lymphoprep (AXIS SHIELD사 제조) 를 사용하여 사용설명서에 따라, 원심 분리 (800g, 20분간) 하여 단핵구층을 분리하였다. 배지에서 3회 원심 분리 (1400rpm, 5분간) 하여 세정 후, 배지를 사용하여 2×106세포/㎖ 의 농도로 재현탁하여 인간 이펙터 세포 용액으로 하였다.
(3) ADCC 활성의 측정
96 웰 U자 바닥의 플레이트 (Falcon사 제조) 의 각 웰에 (1) 에서 조제한 표적 세포 용액의 50㎕ (1×104세포/웰) 을 분주하였다. 이어서 (2) 에서 조제한 인간 이펙터 세포 용액을 100㎕ (2×105세포/웰, 인간 이펙터 세포와 표적 세포의 비는 20:1이 됨) 첨가하였다. 추가로 각종 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체를 각 최종농도 0.001∼1㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 37℃ 에서 4시간 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 원심 분리하여, 상청 중의51Cr량을 γ-카운터로 측정하였다. 자연 해리51Cr량은 인간 이펙터 세포 용액, 항체 용액 대신 배지만을 사용하여 상기와 동일하게 조작하여, 상청 중의15Cr량을 측정함으로써 구하였다. 전체 해리51Cr량은 항체 용액과 인간 이펙터 세포 용액 대신에 1㏖/ℓ의 염산용액을 첨가하고, 상기와 동일하게 조작하여 상청 중의51Cr량을 측정함으로써 구하였다. 세포 상해 활성 (%) 은 하기 식에 의해 구하였다.
세포 상해 활성 (%)={(검체 상청 중의51Cr량-자연 해리51Cr량)/(전체 해리51Cr량-자연 해리51Cr량)}×100
도 23 에는 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체의 각종 농도 (0.001∼1㎍/㎖) 에서의 ADCC 활성을 건강인 도너 A 의 이퍽터 세포를 사용하여 상기의 방법에 의해 측정한 결과를 나타냈다. 도 23 에 나타낸 바와 같이 항 CD20 키메라 항체의 ADCC 활성은 어느 항체농도에 있어서도 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 증가되면 상승되는 경향을 나타냈다. 항체 농도가 낮으면 ADCC 활성은 저하된다. 항체 농도가 0.01㎍/㎖ 에서는, α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이 26%, 35%, 44% 및 96% 의 항체는 대략 동일한 높은 ADCC 활성을 나타냈지만, α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이 6% 인 항체에서는 ADCC 활성은 낮았다.
4. CD20 발현 세포주에 대한 ADCC 활성의 평가 (LDH법)
Raji 세포에 대한 ADCC 활성을, 실시예 2 의 2 항에 나타낸 LDH (락트산 데히드로게나아제) 활성 측정법에 의해, 건강인 도너 B 에서 채취한 이펙터 세포를 사용하여 평가하였다. 이펙터 세포와 표적 세포의 비는 20:1, 최종 항체 농도는 0.0001∼1㎍/㎖ 로 하고, 전량 200㎕ 이 되도록 첨가하여 37℃ 에서 4시간 반응시킨 후, 실시예 2 의 2 항에 따라 측정하였다. 도 24 에는 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 상이한 항 CD20 키메라 항체의 각종 농도 (0.0001∼1㎍/㎖) 에서의 ADCC 활성을 건강인 도너 B 의 이펙터 세포를 사용하여 측정한 결과를 나타내었다. 도 24 에 나타낸 바와 같이 항 CD20 키메라 항체의 ADCC 활성은, 어느 항체 농도에서도 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체 분자의 비율이 증가되면 상승되는 경향을 나타냈다. 항체 농도가 낮으면 ADCC 활성은 저하된다. 항체 농도가 0.01㎍/㎖ 에서는, α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이 26%, 35%, 44% 및 96% 의 항체는 높은 ADCC 활성을 나타내었으나, α-1,6-푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이 6% 항체에서는 ADCC활성은 낮았다.
도 23 및 도 24 의 결과는, α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율에 따라 ADCC 활성이 상승되는 것, α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 약 20% 이상의 항체 조성물은, 충분히 높은 ADCC 활성을 갖는 것을 나타내고, 인간 이펙터 세포의 도너 또는 표적 세포가 달라도 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 11 : 바이섹팅 GlcNAc 를 갖는 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 다른 항 CD20 키메라 항체의 활성평가
(1) 렉틴 크로마토그래피에 의한 항 CD20 키메라 항체의 분리
바이섹팅 GlcNAc 를 갖는 당 사슬에 친화성이 있는 렉틴이 고정화된 칼럼을 사용하여, 실시예 1 의 3 항에서 정제한 항 CD20 키메라 항체 KM3065 를 분리하였다.
정제된 항 CD20 키메라 항체 KM3065 를 함유하는 용액을 렉틴 칼럼 (LA-PHA-E4, 4.6×150㎜, 호넨코포레이션사 제조) 에 통탑하였다. HPLC 시스템으로는 Shimadzu사 제조의 LC-6A 를 사용하여 유속 0.5㎖/분, 칼럼 온도는 실온에서 렉틴 크로마토그래피를 행하였다. 50mM 트리스-황산 완충액 (pH8.0) 으로 칼럼을 평형화하고, 정제된 KM3065 를 함유하는 용액을 주입한 후, 50mM 트리스-황산 완충액 (pH8.0) 중 0M 에서 58mM 으로의 사붕산칼륨 (K2B4O7, 나카라이텍스사 제조) 에 의한 리니어 그라젠트 (35분간) 로 용출하였다. 그 후 5분간 사붕산칼륨 농도를100mM 으로 유지하고, 그 후 다시 50mM 트리스-황산 완충액 (pH8.0) 을 20분간 통탑함으로써, 항 CD20 키메라 항체 KM3065 를 9∼14분, 14∼17분, 17∼22분, 22∼34분에 용출한 4개의 분획 (분획의 ①∼④) 으로 분리하였다 (도 25).
(2) 당 사슬 분석
전항에서 분리한 4개의 분획 (분획 ①∼④) 과 분리 전의 항 CD20 키메라 항체 KM3065 의 당 사슬 분석을, 실시예 3 에 나타내는 방법으로 실행하였다. PA 화 당 사슬군은 15분 내지 45분의 범위에 용출되었다. 각 PA화 당 사슬의 피크면적의 합계에 차지하는, 바이섹팅 GlcNAc 를 갖는 당 사슬의 비율을 산출한 결과, 분리 전의 항 CD20 키메라 항체 KM3065 의 이 당 사슬의 비율은 20% 인 것에 대해, 분획 ①:0%, 분획②:8%, 분획③:33%, 분획④:45% 이었다 (도 26). α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율은 각각 분리 전의 항 CD20 키메라 항체 KM3065:96%, 분획①:93%, 분획②:94%, 분획③:92%, 분획④:90% 이었다. 이상의 결과로부터 바이섹팅 GlcNAc 를 갖는 당 사슬에 친화성이 있는 렉틴이 고정화된 칼럼을 사용하여, α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 대략 균일하고, 또한 바이섹팅 GlcNAc 를 갖는 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 상이한 항 CD20 키메라 항체가 조제된 것을 확인하였다.
(3) in vitro 세포 상해 활성 (ADCC 활성) 의 측정
렉틴 크로마토그래피에 의해 분리된 4개의 분획 (분획 ①∼④), 및 분리 전의 항 CD20 키메라 항체 KM3065 의in vitro세포 상해 활성 (ADCC 활성) 측정을, 실시예 2 의 2 항에 나타내는 방법으로 행하였다 (도 27). 그 결과, 렉틴 크로마토그래피에 의해 분리한 4개의 분획은, 분리 전의 항 CD20 키메라 항체 KM3065 와 대략 동일한 크기의 ADCC 활성을 나타냈다. α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율은 전항의 결과로부터 90%∼96% 로 대략 균일하고, α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자가 ADCC 활성에 부여하는 영향은 대략 동일한 것으로 생각되었다. α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 항체분자의 비율이 높고 ADCC 활성이 높은 항체에, 추가로 바이섹팅 GlcNAc 를 부가해도 ADCC 활성의 크기는 증강되지 않았다. 즉 α-1,6-푸코오스를 갖지 않은 당 사슬이 결합된 비율이 높은 항체는 바이섹팅 GlcNAc 의 유무에는 관계없이, α-1,6-푸코오스를 갖는 당 사슬이 결합된 비율의 높은 항체에 비하여 ADCC 활성이 높은 것을 알 수 있다.
본 발명에 의해 CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체분자로 이루어지는 조성물, 이 항체 조성물을 생산하는 세포 또는 트랜스제닉 비인간 동물 혹은 식물, 이 항체 조성물의 제조방법 및 이 항체 조성물을 함유하는 의약이 제공된다.
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> ANTI-CD20 ANTIBODY COMPOSITION <130> 11440WO1 <150> JP2001-392753 <151> 2001-12-25 <150> JP2002-106948 <151> 2002-04-09 <150> JP2002-319975 <151> 2002-11-01 <160> 63 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2008 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60 tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120 tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180 catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240 gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300 cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360 gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420 ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480 ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540 catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600 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cagcctattt tgttatacat ttttgcgtaa 180 attattcttt tttgaaagtt ttgttgtcca taatagtcta gggaaacata aagttataat 240 ttttgtctat gtatttgcat atatatctat ttaatctcct aatgtccagg aaataaatag 300 ggtatgtaat agcttcaaca tgtggtatga tagaattttt cagtgctata taagttgtta 360 cagcaaagtg ttattaattc atatgtccat atttcaattt tttatgaatt attaaattga 420 atccttaagc tgccagaact agaattttat tttaatcagg aagccccaaa tctgttcatt 480 ctttctatat atgtggaaag gtaggcctca ctaactgatt cttcacctgt tttagaacat 540 ggtccaagaa tggagttatg taaggggaat tacaagtgtg agaaaactcc tagaaaacaa 600 gatgagtctt gtgaccttag tttctttaaa aacacaaaat tcttggaatg tgttttcatg 660 ttcctcccag gtggatagga gtgagtttat ttcagattat ttattacaac tggctgttgt 720 tacttgtttc tatgtcttta tagaaaaaca tatttttttt gccacatgca gcttgtcctt 780 atgattttat acttgtgtga ctcttaactc tcagagtata aattgtctga tgctatgaat 840 aaagttggct attgtatgag acttcagccc acttcaatta ttggcttcat tctctcagat 900 cccaccacct ccagagtggt aaacaacttg aaccattaaa cagactttag tctttatttg 960 aatgatagat ggggatatca gatttatagg cacagggttt tgagaaaggg agaaggtaaa 1020 cagtagagtt taacaacaac aaaaagtata ctttgtaaac gtaaaactat ttattaaagt 1080 agtagacaag acattaaata ttccttggga ttagtgcttt ttgaattttg ctttcaaata 1140 atagtcagtg agtatacccc tcccccattc tatattttag cagaaatcag aataaatggt 1200 gtttctggta cattcttttg tagagaattt attttctttg ggtttttgtg catttaaagt 1260 caataaaaat taaggttcag taatagaaaa aaaactctga tttttggaat cccctttctt 1320 cagcttttct atttaatctc ttaatgataa tttaatttgt ggccatgtgg tcaaagtata 1380 tagccttgta tatgtaaatg ttttaaccaa cctgccttta cagtaactat ataattttat 1440 tctataatat atgacttttc ttccatagct ttagagttgc ccagtcactt taagttacat 1500 tttcatatat gttctttgtg ggaggagata attttatttc taagagaatc ctaagcatac 1560 tgattgagaa atggcaaaca aaacacataa ttaaagctga taaagaacga acatttggag 1620 tttaaaatac atagccaccc taagggttta actgttgtta gccttctttt ggaattttta 1680 ttagttcata tagaaaaatg gattttatcg tgacatttcc atatatgtat ataatatatt 1740 tacatcatat ccacctgtaa ttattagtgt ttttaaatat atttgaaaaa ataatggtct 1800 ggtttgatcc atttgaacct tttgatgttt ggtgtggttg ccaattggtt gatggttatg 1860 ataacctttg cttctctaag gttcaagtca gtttgagaat atgtcctcta aaaatgacag 1920 gttgcaagtt aagtagtgag atgacagcga gatggagtga tgagaatttg tagaaatgaa 1980 ttcacttata ctgagaactt gttttgcttt tagataatga acatattagc ctgaagtaca 2040 tagccgaatt gattaattat tcaaagatat aatcttttaa tccctataaa agaggtatta 2100 cacaacaatt caagaaagat agaattagac ttccagtatt ggagtgaacc atttgttatc 2160 aggtagaacc ctaacgtgtg tggttgactt aaagtgttta ctttttacct gatactgggt 2220 agctaattgt ctttcagcct cctggccaaa gataccatga aagtcaactt acgttgtatt 2280 ctatatctca aacaactcag ggtgtttctt actctttcca cagcatgtag agcccaggaa 2340 gcacaggaca agaaagctgc ctccttgtat caccaggaag atctttttgt aagagtcatc 2400 acagtatacc agagagacta attttgtctg aagcatcatg tgttgaaaca acagaaactt 2460 attttcctgt gtggctaact agaaccagag tacaatgttt ccaattcttt gagctccgag 2520 aagacagaag ggagttgaaa ctctgaaaat gcgggcatgg actggttcct ggcgttggat 2580 tatgctcatt ctttttgcct gggggacctt attgttttat ataggtggtc atttggttcg 2640 agataatgac caccctgacc attctagcag agaactctcc aagattcttg caaagctgga 2700 gcgcttaaaa caacaaaatg aagacttgag gagaatggct gagtctctcc ggtaggtttg 2760 aaatactcaa ggatttgatg aaatactgtg cttgaccttt aggtataggg tctcagtctg 2820 ctgttgaaaa atataatttc tacaaaccgt ctttgtaaaa ttttaagtat tgtagcagac 2880 tttttaaaag tcagtgatac atctatatag tcaatatagg tttacatagt tgcaatctta 2940 ttttgcatat gaatcagtat atagaagcag tggcatttat atgcttatgt tgcatttaca 3000 attatgttta gacgaacaca aactttatgt gatttggatt agtgctcatt aaattttttt 3060 attctatgga ctacaacaga gacataaatt ttgaaaggct tagttactct taaattctta 3120 tgatgaaaag caaaaattca ttgttaaata gaacagtgca tccggaatgt gggtaattat 3180 tgccatattt ctagtctact aaaaattgtg gcataactgt tcaaagtcat cagttgtttg 3240 gaaagccaaa gtctgattta aatggaaaac ataaacaatg atatctattt ctagatacct 3300 ttaacttgca gttactgagt ttacaagttg tctgacaact ttggattctc ttacttcata 3360 tctaagaatg atcatgtgta cagtgcttac tgtcacttta aaaaactgca gggctagaca 3420 tgcagatatg aagactttga cattagatgt ggtaattggc actaccagca agtggtatta 3480 agatacagct gaatatatta ctttttgagg aacataattc 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gaaagaaaat gtgttattgt 4380 aatgtgaaat tctctgtccc tgcagggtcc cacatccgcc tcaatcccaa ataaacacac 4440 agaggctgta ttaattatga aactgttggt cagttggcta gggcttctta ttggctagct 4500 ctgtcttaat tattaaacca taactactat tgtaagtatt tccatgtggt cttatcttac 4560 caaggaaagg gtccagggac ctcttactcc tctggcgtgt tggcagtgaa gaggagagag 4620 cgatttccta tttgtctctg cttattttct gattctgctc agctatgtca cttcctgcct 4680 ggccaatcag ccaatcagtg ttttattcat tagccaataa aagaaacatt tacacagaag 4740 gacttccccc atcatgttat ttgtatgagt tcttcagaaa atcatagtat cttttaatac 4800 taatttttat aaaaaattaa ttgtattgaa aattatgtgt atatgtgtct gtgtgtcgat 4860 ttgtgctcat aagtagcatg gagtgcagaa gagggaatca gatctttttt taagggacaa 4920 agagtttatt cagattacat tttaaggtga taatgtatga ttgcaaggtt atcaacatgg 4980 cagaaatgtg aagaagctgg tcacattaca tccagagtca agagtagaga gcaatgaatt 5040 gatgcatgca ttcctgtgct cagctcactt ttcctggagc tgagctgatt gtaagccatc 5100 tgatgtcttt gctgggaact aactcaaagg caagttcaaa acctgttctt aagtataagc 5160 catctctcca gtccctcata tggtctctta agacactttc tttatattct tgtacataga 5220 aattgaattc ctaacaactg cattcaaatt acaaaatagt ttttaaaagc tgatataata 5280 aatgtaaata caatctagaa catttttata aataagcata ttaactcagt aaaaataaat 5340 gcatggttat tttccttcat tagggaagta tgtctcccca ggctgttctc tagattctac 5400 tagtaatgct gtttgtacac catccacagg ggttttattt taaagctaag acatgaatga 5460 tggacatgct tgttagcatt tagacttttt tccttactat aattgagcta gtatttttgt 5520 gctcagtttg atatctgtta attcagataa atgtaatagt aggtaatttc tttgtgataa 5580 aggcatataa attgaagttg gaaaacaaaa gcctgaaatg acagttttta agattcagaa 5640 caataatttt caaaagcagt tacccaactt tccaaataca atctgcagtt ttcttgatat 5700 gtgataaatt tagacaaaga aatagcacat tttaaaatag ctatttactc ttgatttttt 5760 tttcaaattt aggctagttc actagttgtg tgtaaggtta tggctgcaaa catctttgac 5820 tcttggttag ggaatccagg atgatttacg tgtttggcca aaatcttgtt ccattctggg 5880 tttcttctct atctaggtag ctagcacaag ttaaaggtgt ggtagtattg gaaggctctc 5940 aggtatatat ttctatattc tgtatttttt tcctctgtca tatatttgct ttctgtttta 6000 ttgatttcta ctgttagttt gatacttact ttcttacact ttctttggga tttattttgc 6060 tgttctaaga tttcttagca agttcatatc actgatttta acagttgctt cttttgtaat 6120 atagactgaa tgccccttat ttgaaatgct tgggatcaga aactcagatt tgaacttttc 6180 ttttttaata tttccatcaa gtttaccagc tgaatgtcct gatccaagaa tatgaaatct 6240 gaaatgcttt gaaatctgaa acttttagag tgataaagct tccctttaaa ttaatttgtg 6300 ttctatattt tttgacaatg tcaacctttc attgttatcc aatgagtgaa catattttca 6360 atttttttgt ttgatctgtt atattttgat ctgaccatat ttataaaatt ttatttaatt 6420 tgaatgttgt gctgttactt atctttatta ttatttttgc ttattttcta gccaaatgaa 6480 attatattct gtattatttt agtttgaatt ttactttgtg gcttagtaac tgccttttgt 6540 tggtgaatgc ttaagaaaaa cgtgtggtct actgatattg gttctaatct tatatagcat 6600 gttgtttgtt aggtagttga ttatgctggt cagattgtct tgagtttatg caaatgtaaa 6660 atatttagat gcttgttttg ttgtctaaga acaaagtatg cttgctgtct cctatcggtt 6720 ctggtttttc cattcatctc ttcaagctgt tttgtgtgtt gaatactaac tccgtactat 6780 cttgttttct gtgaattaac cccttttcaa aggtttcttt tctttttttt tttaagggac 6840 aacaagttta ttcagattac attttaagct gataatgtat gattgcaagg ttatcaacat 6900 ggcagaaatg tgaagaagct aggcacatta catccacatg gagtcaagag cagagagcag 6960 tgaattaatg catgcattcc tgtggtcagc tcacttttcc tattcttaga tagtctagga 7020 tcataaacct ggggaatagt gctaccacaa tgggcatatc cacttacttc agttcatgca 7080 atcaaccaag gcacatccac aggaaaaact gatttagaca acctctcatt gagactcttc 7140 ccagatgatt agactgtgtc aagttgacaa ttaaaactat cacacctgaa gccatcacta 7200 gtaaatataa tgaaaatgtt gattatcacc ataattcatc tgtatccctt tgttattgta 7260 gattttgtga agttcctatt caagtccctg ttccttcctt aaaaacctgt tttttagtta 7320 aataggtttt ttagtgttcc tgtctgtaaa tactttttta aagttagata ttattttcaa 7380 gtatgttctc ccagtctttg gcttgtattt tcatcccttc aatacatata tttttgtaat 7440 ttattttttt tatttaaatt agaaacaaag ctgcttttac atgtcagtct cagttccctc 7500 tccctcccct cctcccctgc tccccaccta agccccaatt ccaactcctt tcttctcccc 7560 aggaagggtg aggccctcca tgggggaaat cttcaatgtc tgtcatatca tttggagcag 7620 ggcctagacc ctccccagtg tgtctaggct gagagagtat ccctctatgt ggagagggct 7680 cccaaagttc atttgtgtac taggggtaaa tactgatcca ctatcagtgg ccccatagat 7740 tgtccggacc tccaaactga cttcctcctt cagggagtct ggaacagttc tatgctggtt 7800 tcccagatat cagtctgggg tccatgagca accccttgtt caggtcagtt gtttctgtag 7860 gtttccccag cccggtcttg acccctttgc tcatcacttc tccctctctg caactggatt 7920 ccagagttca gctcagtgtt tagctgtggg tgtctgcatc tgcttccatc agctactgga 7980 tgagggctct aggatggcat ataaggtagt catcagtctc attatcagag aagggctttt 8040 aaggtagcct cttgattatt gcttagattg ttagttgggg tcaaccttgt aggtctctgg 8100 acagtgacag aattctcttt aaacctataa tggctccctc tgtggtggta tcccttttct 8160 tgctctcatc cgttcctccc ctgactagat cttcctgctc cctcatgtcc tcctctcccc 8220 tccccttctc cccttctctt tcttctaact ccctctcccc tccacccacg atccccatta 8280 gcttatgaga tcttgtcctt attttagcaa aacctttttg gctataaaat taattaattt 8340 aatatgctta tatcaggttt attttggcta gtatttgtat gtgtttggtt agtgttttta 8400 accttaattg acatgtatcc ttatatttag acacagattt aaatatttga agtttttttt 8460 tttttttttt ttaaagattt atttattttt tatgtcttct gcctgcatgc cagaagaggg 8520 caccagatct cattcaaggt ggttgtgagc caccatgtgg 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Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 tca agt gta agt tac atc cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc 192 Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 gtt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg act tct tac tct ctc acc atc 288 Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag cag tgg 336 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 act agt aac cca ccc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa atc aaa 384 Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 12 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 100 105 110 Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 420 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <400> 13 atg ggt tgg agc ctc atc ttg ctc ttc ctt gtc gct gtt gct acg cgt 48 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 gtc ctg tcc cag gta caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gcc tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agt tac aat atg cac tgg gta aaa cag aca cct ggt cgg ggc ctg 192 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 gaa tgg att gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg tac ttc aat 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn 115 120 125 gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tct gca 420 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210> 14 <211> 140 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn 115 120 125 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala 130 135 140 <210> 15 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 15 caggaaacag ctatgacgaa ttcgcctcct caaaatggat tttcaggtgc agattatcag 60 cttcctgcta atcagtgctt cagtcataat g 91 <210> 16 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 16 gtgaccttct cccctggaga tgcagacagg attgctggag actgggagag aacaatttgt 60 cctctggaca ttatgactga agcactgatt a 91 <210> 17 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 17 ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatccact 60 ggttccagca gaagccagga tcctccccca 90 <210> 18 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 18 ccagacccac tgccactgaa gcgaacaggg actccagaag ccaggttgga tgtggcataa 60 atccagggtt tgggggagga tcctggctt 89 <210> 19 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 19 tcagtggcag tgggtctggg acttcttact ctctcaccat cagcagagtg gaggctgaag 60 atgctgccac ttattactgc cagcagtgga c 91 <210> 20 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 20 gttttcccag tcacgaccgt acgtttgatt tccagcttgg tcccccctcc gaacgtgggt 60 gggttactag tccactgctg gcagtaataa 90 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 21 gtctgaagca ttatgtgttg aagc 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 22 gtgagtacat tcattgtact gtg 23 <210> 23 <211> 575 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 23 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu 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Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 24 <211> 575 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val 275 280 285 Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu 290 295 300 Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His 305 310 315 320 Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile 325 330 335 Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp 355 360 365 Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val 370 375 380 His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp 385 390 395 400 Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile 420 425 430 Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg 435 440 445 Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val 450 455 460 Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln 465 470 475 480 Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile 485 490 495 Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro 500 505 510 His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile 515 520 525 Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn 530 535 540 Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu 545 550 555 560 Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys 565 570 575 <210> 25 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 25 caggaaacag ctatgacgcg gccgcgaccc ctcaccatgg gttggagcct catcttgctc 60 ttccttgtcg ctgttgctac gcgtgtcctg tcccaggta 99 <210> 26 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 26 atgtgtagcc agaagccttg caggacatct tcactgaggc cccagccttc accagctcag 60 ccccaggctg ctgcagttgt acctgggaca ggacacgc 98 <210> 27 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 27 caaggcttct ggctacacat ttaccagtta caatatgcac tgggtaaaac agacacctgg 60 tcggggcctg gaatggattg gagctattta tcccgga 97 <210> 28 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequense: Synthetic DNA <400> 28 gtaggctgtg ctggaggatt tgtctgcagt caatgtggcc ttgcctttga acttctgatt 60 gtaggaagta tcaccatttc cgggataaat 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 34 tccggggatg gcgagatggg caagc 25 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 35 cttgacatgg ctctgggctc caag 24 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 36 ccacttcagt cggtcggtag tattt 25 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 37 cgctcacccg cctgaggcga catg 24 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 38 ggcaggtgct gtcggtgagg tcaccatagt gc 32 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 39 ggggccatgc caaggactat gtcg 24 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 40 atgtggctga tgttacaaaa tgatg 25 <210> 41 <211> 1504 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> CDS <222> (1)..(1116) <400> 41 atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct ggg gac 48 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc 96 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 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Phe Asn 195 200 205 cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tca 864 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat 960 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc 1008 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac 1056 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc 1104 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 aac ccc aac gcc tgag cacctctaca aaaaaattcg cgagacatgg actatggtgc 1160 Asn Pro Asn Ala 370 agagccagcc aaccagagtc cagccactcc tgagaccatc gaccataaac cctcgactgc 1220 ctgtgtcgtc cccacagcta agagctgggc cacaggtttg tgggcaccag gacggggaca 1280 ctccagagct aaggccactt cgcttttgtc aaaggctcct ctcaatgatt ttgggaaatc 1340 aagaagttta aaatcacata ctcattttac ttgaaattat gtcactagac aacttaaatt 1400 tttgagtctt gagattgttt ttctcttttc ttattaaatg atctttctat gacccagcaa 1460 aaaaaaaaaa aaaaagggat ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1504 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 42 gccatccaga aggtggt 17 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 43 gtcttgtcag ggaagat 17 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 44 ggcaggagac caccttgcga gtgcccac 28 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 45 gggtgggctg taccttctgg aacagggc 28 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 46 ggcgctggct tacccggaga ggaatggg 28 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 47 ggaatgggtg tttgtctcct ccaaagatgc 30 <210> 48 <211> 1316 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 48 gccccgcccc ctccacctgg accgagagta 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<210> 57 <211> 59 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 57 ccgacagcac ctgcctagta aaaatcatca atgaagtcaa acctacagag atctacaat 59 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 58 gacttagcag agtacactgc agatg 25 <210> 59 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 59 accttggata gaaaggggtg gtctc 25 <210> 60 <211> 125 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 60 ttgatggagt tggcaccttg cggcttctgg atgcaattaa gacttgtggc cttataaatt 60 ctgtgaagtt ctaccaggcc tcaactagtg aactgtatgg aaaagtgcaa gaaatacccc 120 agaaa 125 <210> 61 <211> 372 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 61 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 62 <211> 321 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 62 Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu 35 40 45 Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr 50 55 60 His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile 65 70 75 80 Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn 85 90 95 Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys 100 105 110 Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu 115 120 125 Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser 130 135 140 Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln 145 150 155 160 His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro 165 170 175 His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile 180 185 190 His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp 195 200 205 Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala 210 215 220 Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile 225 230 235 240 Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala 245 250 255 Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp 260 265 270 Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys 275 280 285 Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala 290 295 300 Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg 305 310 315 320 Lys <210> 63 <211> 590 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 63 Met Ala Ser Leu Arg Glu Ala Ser Leu Arg Lys Leu Arg Arg Phe Ser 1 5 10 15 Glu Met Arg Gly Lys Pro Val Ala Thr Gly Lys Phe Trp Asp Val Val 20 25 30 Val Ile Thr Ala Ala Asp Glu Lys Gln Glu Leu Ala Tyr Lys Gln Gln 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Leu Lys Arg Lys Glu Leu Pro Leu Gly Val Asn Tyr 50 55 60 His Val Phe Thr Asp Pro Pro Gly Thr Lys Ile Gly Asn Gly Gly Ser 65 70 75 80 Thr Leu Cys Ser Leu Gln Cys Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Asp Lys Trp 85 90 95 Asn Ser Phe Thr Val Leu Leu Ile His Ser Gly Gly Tyr Ser Gln Arg 100 105 110 Leu Pro Asn Ala Ser Ala Leu Gly Lys Ile Phe Thr Ala Leu Pro Leu 115 120 125 Gly Glu Pro Ile Tyr Gln Met Leu Asp Leu Lys Leu Ala Met Tyr Met 130 135 140 Asp Phe Pro Ser Arg Met Lys Pro Gly Val Leu Val Thr Cys Ala Asp 145 150 155 160 Asp Ile Glu Leu Tyr Ser Ile Gly Asp Ser Glu Ser Ile Ala Phe Glu 165 170 175 Gln Pro Gly Phe Thr Ala Leu Ala His Pro Ser Ser Leu Ala Val Gly 180 185 190 Thr Thr His Gly Val Phe Val Leu Asp Ser Ala Gly Ser Leu Gln His 195 200 205 Gly Asp Leu Glu Tyr Arg Gln Cys His Arg Phe Leu His Lys Pro Ser 210 215 220 Ile Glu Asn Met His His Phe Asn Ala Val His Arg Leu Gly Ser Phe 225 230 235 240 Gly Gln Gln Asp Leu Ser Gly Gly Asp Thr Thr Cys His Pro Leu His 245 250 255 Ser Glu Tyr Val Tyr Thr Asp Ser Leu Phe Tyr Met Asp His Lys Ser 260 265 270 Ala Lys Lys Leu Leu Asp Phe Tyr Glu Ser Val Gly Pro Leu Asn Cys 275 280 285 Glu Ile Asp Ala Tyr Gly Asp Phe Leu Gln Ala Leu Gly Pro Gly Ala 290 295 300 Thr Ala Glu Tyr Thr Lys Asn Thr Ser His Val Thr Lys Glu Glu Ser 305 310 315 320 His Leu Leu Asp Met Arg Gln Lys Ile Phe His Leu Leu Lys Gly Thr 325 330 335 Pro Leu Asn Val Val Val Leu Asn Asn Ser Arg Phe Tyr His Ile Gly 340 345 350 Thr Thr Glu Glu Tyr Leu Leu His Phe Thr Ser Asn Gly Ser Leu Gln 355 360 365 Ala Glu Leu Gly Leu Gln Ser Ile Ala Phe Ser Val Phe Pro Asn Val 370 375 380 Pro Glu Asp Ser His Glu Lys Pro Cys Val Ile His Ser Ile Leu Asn 385 390 395 400 Ser Gly Cys Cys Val Ala Pro Gly Ser Val Val Glu Tyr Ser Arg Leu 405 410 415 Gly Pro Glu Val Ser Ile Ser Glu Asn Cys Ile Ile Ser Gly Ser Val 420 425 430 Ile Glu Lys Ala Val Leu Pro Pro Cys Ser Phe Val Cys Ser Leu Ser 435 440 445 Val Glu Ile Asn Gly His Leu Glu Tyr Ser Thr Met Val Phe Gly Met 450 455 460 Glu Asp Asn Leu Lys Asn Ser Val Lys Thr Ile Ser Asp Ile Lys Met 465 470 475 480 Leu Gln Phe Phe Gly Val Cys Phe Leu Thr Cys Leu Asp Ile Trp Asn 485 490 495 Leu Lys Ala Met Glu Glu Leu Phe Ser Gly Ser Lys Thr Gln Leu Ser 500 505 510 Leu Trp Thr Ala Arg Ile Phe Pro Val Cys Ser Ser Leu Ser Glu Ser 515 520 525 Val Ala Ala Ser Leu Gly Met Leu Asn Ala Ile Arg Asn His Ser Pro 530 535 540 Phe Ser Leu Ser Asn Phe Lys Leu Leu Ser Ile Gln Glu Met Leu Leu 545 550 555 560 Cys Lys Asp Val Gly Asp Met Leu Ala Tyr Arg Glu Gln Leu Phe Leu 565 570 575 Glu Ile Ser Ser Lys Arg Lys Gln Ser Asp Ser Glu Lys Ser 580 585 590

Claims (48)

  1. CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이, 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬인 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하 또는 결실된 세포.
  4. 제 3 항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인 세포.
    (a) GMD (GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제);
    (b) Fx (GDP-케토-6-데옥시만노오스 3,5-에피메라아제, 4-리덕타아제);
    (c) GFPP (GDP-베타-L-푸코오스 피로포스포릴라아제).
  5. 제 4 항에 있어서, GMD 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  6. 제 4 항에 있어서, GMD 가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질;
    (c) 서열 번호 61 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질.
  7. 제 4 항에 있어서, Fx 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  8. 제 4 항에 있어서, Fx 가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질;
    (c) 서열 번호 62 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질.
  9. 제 4 항에 있어서, GFPP 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  10. 제 4 항에 있어서, GFPP 가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서선택된 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질;
    (c) 서열 번호 63 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질.
  11. 제 3 항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스페라아제인 세포.
  12. 제 11 항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (c) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA;
    (d) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  13. 제 11 항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인 세포.
    (a) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (b) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질;
    (c) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질;
    (d) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질;
    (e) 서열 번호 23 으로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질;
    (f) 서열 번호 24 로 표시되는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질.
  14. 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 효소의 활성이 이하의 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 수법에 의해 저하 또는 결실된 세포.
    (a) 효소의 유전자를 표적한 유전자 파괴의 수법;
    (b) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법;
    (c) 효소에 대한 돌연 변이를 도입하는 수법;
    (d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법;
    (e) N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위와 푸코오스의 1 위가 α결합한 당 사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 세포.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 하기 (a) ∼ (j) 로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 세포.
    (a) 차이니스 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포;
    (b) 래트 미엘로머 세포주 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포;
    (c) 마우스 미엘로머 세포주 NSO 세포;
    (d) 마우스 미엘로머 세포주 SP2/O-Ag 14 세포;
    (e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포;
    (f) 원숭이 COS 세포;
    (g) 항체를 생산하는 하이브리도마 세포;
    (h) 인간 백혈병 세포주 나말바 세포;
    (i) 배성 줄기세포;
    (j) 수정란 세포.
  17. CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물을 생산하는, 이 항체 분자를 코드하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  18. 제 17 항에 있어서, 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이, 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬인 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의합성에 관여하는 효소의 활성 또는 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 저하되도록, 게놈이 개변된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  20. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소의 유전자 또는 N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소의 유전자가 녹아웃된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코오스의 합성에 관여하는 효소가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
    (a) GMD (GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제);
    (b) Fx (GDP-케토-6-데옥시만노오스, 3,5-에피메라아제, 4-리덕타아제);
    (c) GFPP (GDP-베타-L-푸코오스 피로포스포릴라아제).
  22. 제 21 항에 있어서, GMD 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인, 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
    (a) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 41 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GMD 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  23. 제 21 항에 있어서, Fx 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인, 트랜즈제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
    (a) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 48 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Fx 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  24. 제 21 항에 있어서, GFPP 가, 이하의 (a) 또는 (b) 인 DNA 가 코드하는 단백질인, 트랜즈제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
    (a) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 51 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 GFPP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  25. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, N-글리코시드 결합 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 푸코오스의 1 위가 α결합하는 당 사슬 수식에 관여하는 효소가 α-1,6-푸코실트랜스페라아제인, 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  26. 제 25 항에 있어서, α-1,6-푸코실트랜스페라아제가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인, 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
    (a) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (b) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA;
    (c) 서열 번호 1 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
    (d) 서열 번호 2 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 α-1,6-푸코실트랜스페라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
  27. 제 17 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스제닉 비인간 동물이 소, 양, 염소, 돼지, 말, 마우스, 래트, 닭, 원숭이 및 토끼로 이루어지는 군에서 선택되는 동물인 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  28. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인 세포.
    (a) 인간 항체;
    (b) 인간화 항체;
    (c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편;
    (d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질.
  29. 제 1 항 내지 제 16 항 또는 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 클래스가 IgG 인 세포.
  30. 제 1 항 내지 제 16 항, 제 28 항 또는 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 서열 번호 8, 9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포.
  31. 제 1 항 내지 제 16 항, 제 28 항, 제 29 항 또는 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 세포.
  32. 제 17 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인, 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
    (a) 인간 항체;
    (b) 인간화 항체;
    (c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편;
    (d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질.
  33. 제 17 항 내지 제 27 항 또는 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 클래스가 IgG 인, 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  34. 제 17 항 내지 제 27 항, 제 32 항 또는 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 8, 9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  35. 제 17 항 내지 제 27 항, 제 32 항, 제 33 항 또는 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손.
  36. 제 1 항 내지 제 16 항 또는 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 세포에 의해 생산된 항체 조성물.
  37. 제 17 항 내지 제 27 항 또는 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손을 사육하고, 사육한 동물 또는 식물에 의해 생산된 항체 조성물.
  38. CD20 에 특이적으로 결합하고, N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬을 Fc 영역에 갖는 항체 분자로 이루어지는 조성물로서, 이 조성물 중에 포함되는 Fc 영역에 결합하는 전체 N-글리코시드 복합형 당 사슬 중, 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬의 비율이 20% 이상인 항체 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 푸코오스가 결합되지 않은 당 사슬이, 이 푸코오스의 1 위가 N-글리코시드 결합 복합형 당 사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위에 α결합되지 않은 당 사슬인 항체 조성물.
  40. 제 38 항에 있어서, 항체 분자가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 분자인 항체 조성물.
    (a) 인간 항체;
    (b) 인간화 항체;
    (c) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 포함하는 항체 단편;
    (d) (a) 또는 (b) 의 Fc 영역을 갖는 융합 단백질.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 클래스가 IgG 인 항체 조성물.
  42. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 5, 6, 7, 및/또는 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역 1, 상보성 결정 영역 2, 상보성 결정 영역 3 이 각각 서열 번호 8, 9, 10 으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 조성물.
  43. 제 38 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 경쇄 가변 영역이 서열 번호 12, 및/또는 중쇄 가변 영역이 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체 조성물.
  44. 제 1 항 내지 제 16 항 또는 제 28 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배지에 배양하고, 배양물 중에 제 36 항 또는 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 생산 축적시키고, 이 배양물로부터 이 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는, 이 항체 조성물을 제조하는 방법.
  45. 제 17 항 내지 제 27 항 또는 제 32 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스제닉 비인간 동물 또는 식물, 또는 그 자손을 사육하고, 사육한 동물 또는 식물로부터 조직 또는 체액을 취득하고, 취득한 조직 또는 체액으로부터 제 36 항 또는 제 38 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 채취하는 공정을 포함하는, 이 항체 조성물을 제조하는 방법.
  46. 제 36 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
  47. 제 36 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 CD20 관련 질환의 치료약.
  48. 제 47 항에 있어서, CD20 관련 질환이 암 또는 면역 질환인 치료약.
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