CN118103397A - 特异性识别tnfr2的抗体及其用途 - Google Patents

特异性识别tnfr2的抗体及其用途 Download PDF

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贺冲
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Abstract

本申请提供抗TNFR2抗体、编码所述抗TNFR2抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞、制备所述抗TNFR2抗体的方法、包含所述抗TNFR2抗体的药物组合物、使用所述抗TNFR2抗体或组合物的方法。

Description

特异性识别TNFR2的抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月8日提交的美国临时申请63/219,796的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
参考电子序列表
电子序列表(710262000740SEQLIST.xml；大小：89,434字节；生成日期：2022.07.05)的内容通过整体引用并入本文。
技术领域
本申请涉及特异性识别肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)的抗体，及其制备方法和用途，包括治疗癌症和/或感染性疾病的方法。
背景技术
肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)，又称肿瘤坏死因子受体超家族成员1B(TNFRSF1B)和CD120b，是一种与同源配体TNFα和淋巴毒素-α(LT-α)结合的膜受体。TNFR1在细胞质部分有一个死亡结构域(DD)并且可以激活caspas依赖途径和NFκB途径。与TNFR1相比，TNFR2缺乏DD，但可以招募衔接蛋白TNF受体相关因子2(TRAF2)和TRAF3，并激活NFκB非经典途径和MAP激酶途径(Brenner et al.,2015)。TNFR2在免疫细胞和一些非免疫细胞上表达，包括内皮细胞、心肌细胞、星形胶质细胞等(Ward-Kavanagh et al.,2016)。尽管早期研究表明TNFR2共刺激初始T细胞功能，后来证明TNFR2也通过诱导CD8+T细胞快速收缩从而限制CD8+T细胞介导的病毒清除和抗肿瘤免疫(Bertrand et al.,2015；DeBerge et al.,2015；Kim etal.,2009；Wortzman et al.,2013b)。一些研究表明，调节T细胞(Treg细胞)中TNFR2的表达高于初始T细胞，并且TNFR2信号通路对Treg细胞的发育、增殖和存活非常重要(Chen etal.,2013；Horwitz et al.,2013；Mahmud et al.,2014)。因此，TNFR2信号通路在调节免疫应答中起着关键作用。此外，在肿瘤微环境中，TNFR2在Treg细胞和髓源抑制性细胞(MDSC)中高表达，这表明TNFR2在肿瘤免疫中具有潜在功能(Chen et al.,2013；Hu et al.,2014)。事实上，已有多篇文献报道了抗小鼠TNFR2抗体的抗肿瘤效果，尽管其机制尚不明确(Case et al.,2020；Nie et al.,2016；Tam et al.,2019；Williams et al.,2018)。此外，TNFR2的一个已知突变与T细胞淋巴瘤有关，包括蕈样真菌病和Sezary综合征，这表明它可能是一种原癌基因(Ungewickell et al.,2015)。也有报告称TNFR2在某些类型的癌症中上调，并与不良预后相关(Yang et al.,2017；Zhang et al.,2018)。
因此，本领域仍需要能够有效抑制或以其他方式拮抗TNFR2的治疗性抗体，以及治疗由TNFR2介导的疾病或病症的相关方法，例如癌症或传染性疾病。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请中披露的内容，以引用方式全部并入本文中。
申请概述
一方面，本申请提供一种分离的能够特异性地与人TNFR2上的表位结合的抗TNFR2抗体，所述表位包含选自由SEQ ID NO:83所示人TNFR2序列的Arg99、Lys108、Glu110、Gly111、Arg113、Leu114和Asp136组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:39所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:63所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:39具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:63中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:40所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:64所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:40或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:40具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:64中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:41所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:65所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:41具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:65中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:42所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:66所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:42具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:66中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:43所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:67所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:43具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:67中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:44所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:68所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:44具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:68中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:45所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:69所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:45具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:69中任一具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含氨基酸序SEQ ID NO:27列或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如SEQ IDNOs:46-62中任一氨基酸序列所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如SEQ ID NOs:70-77中任一氨基酸序列所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含：VH，其包含SEQ ID NOs:46-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:46-62中任一氨基酸序列具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含SEQ ID NOs:70-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:70-77中任一氨基酸序列具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体，其包含：(i)VH，其包含氨基酸序列SEQID NO:48或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:48具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％序列同一性；(ii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:70或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:70具有至少约80％序列同一性；(iii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:71具有至少约80％序列同一性；(iv)VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％序列同一性；(v)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:55或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:55具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；(vi)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:56具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％序列同一性；(vii)VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:57或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:57具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；(viii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:58具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；(ix)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:59具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；(x)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:60具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；(xi)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:61具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；(xii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:62具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其与人TNFR2特异性结合的Kd值为约0.1pM至约10nM。
在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其与上述任一种分离的抗TNFR2抗体竞争性地与TNFR2特异性结合。在一些实施例中，提供一种分离的抗TNFR2抗体，其与上述任一种分离的抗TNFR2抗体特异性地结合相同的表位。
在一些实施例中，如上所述任一种分离的抗TNFR2抗体，所述分离的抗TNFR2抗体包含Fc片段。在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体是全长的IgG抗体。在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体是全长的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体是嵌合的、人的或人源化的抗体。在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体是抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、单链Fv(scFv)、Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体(nanobody)、双链抗体(diabody)和线性抗体。
在一些实施例中，提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码如上所述任一种抗TNFR2抗体。在一些实施例中，提供一种载体，所述载体包含如上所述任一种核酸分子。在一些实施例中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞表达如上所述任一种抗TNFR2抗体、如上所述任一种核酸分子或如上所述任一种载体。在一些实施例中，提供一种制备抗TNFR2抗体的方法，其包含：a)在能有效表达抗TNFR2抗体的条件下培养上述任一种宿主细胞；和b)从宿主细胞中获得表达的抗TNFR2抗体。
在一些实施例中，提供一种在所需个体中治疗疾病或病症的方法，包括向所述个体施用有效量的如上所述的任一种抗TNFR2抗体。在一些实施例中，提供如本文所述的任一种抗TNFR2抗体在制备用于在所需个体中治疗疾病或病症的药物组合物中的用途。在一些实施例中，提供如上所述的任一种抗TNFR2抗体或包含如上所述的任一种抗TNFR2抗体的药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。在一些实施例中，所述疾病或病症与TNFR2有关，包括癌症或传染性疾病。在一些实施例中，所述疾病或病症选自由非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管交界处腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和传染性疾病病，包括但不限于人乳头瘤病毒(HPV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。
同时还提供包含如上所述的任一种抗TNFR2抗体的药物组合物、试剂盒以及生产制品。
附图说明
图1A-1B所示结果为通过ELISA分析的示例性嵌合抗TNFR2抗体与人TNFR2或食蟹猴TNFR2的结合亲和力。图1A为51B5、102E4、29G3、85G8.4、15H10或11C1与人TNFR2的结合曲线。图1B为51B5、102E4、29G3、85G8.4、15H10或11C1与食蟹猴TNFR2的结合曲线。
图2A-2B所示结果为通过ELISA分析的示例性嵌合抗TNFR2抗体阻断TNFα与TNFR2结合的配体阻断试验。图2A所示结果为嵌合抗TNFR2抗体51B5、102E4、29G3、85G8.4、15H10和11C1表现出很强的阻断人TNFα与人TNFR2结合的能力。图2B所示结果为抗TNFR2抗体51B5、102E4、29G3、85G8.4、15H10和11C1表现出很强的阻断食蟹猴TNFα与食蟹猴TNFR2结合的能力。
图3A所示结果为嵌合抗TNFR2抗体与dsDNA的非特异性结合。图3B所示结果为嵌合抗TNFR2抗体与胰岛素的非特异性结合。图3C所示结果为嵌合抗TNFR2抗体与杆状病毒颗粒的非特异性结合。
图4A所示结果为通过FACS分析的人抗TNFR2抗体与表达人TNFR2的Expi293细胞的结合能力。图4B所示结果为抗TNFR2抗体抑制可溶性TNFα与表达TNFR2的Expi293细胞结合的能力。
图5所示结果表明与非Treg效应T细胞相比，人Treg细胞表达更高水平的TNFR2，并且IL-2处理略微增加Treg细胞上TNFR2的表达。
图6所示为人Treg细胞增殖试验中抗TNFR2抗体的结果，表明所有抗TNFR2抗体均抑制PBMC中Treg细胞增殖。
图7显示了一组小鼠-人嵌合TNFR2结构，其用于表位解析和结合研究。
图8A所示为通过FACS分析的示例性人源化抗TNFR2抗体的结合试验结果。图8B所示为通过FACS分析的示例性人源化抗TNFR2抗体的配体阻断试验结果。
图9所示为示例性人源化抗TNFR2抗体在体外人原代Treg细胞增殖试验中的结果。
图10A所示结果为不同治疗组小鼠个体的肿瘤体积。图10B所示结果为不同治疗组中平均肿瘤体积的抑制率(％)。
图11A-11B所示为使用丙氨酸扫描分析的示例性人源化抗体SB1901-76的表位解析结果。
本申请的详细描述
本申请一方面提供一种分离的能够特异性地与人和/或食蟹猴TNFR2结合的抗TNFR2抗体。通过杂交瘤技术、人源化方法以及合理设计的生物化学及生物学实验，本发明已经鉴定出能够结合人和/或食蟹猴TNFR2并抑制人和/或食蟹猴TNFα与其受体TNFR2作用的高效抗体分子。本文给出的结果表明，本申请提供的抗体与人和/或食蟹猴TNFR2结合具有高亲和力和生物活性。
本申请所提供的抗TNFR2抗体包括，例如，全长抗TNFR2抗体、抗TNFR2单链抗体(scFvs)、抗TNFR2 Fc融合蛋白、多特异性(如双特异性)抗TNFR2抗体、抗TNFR2免疫偶联物以及诸如此类的。
一方面，本申请提供一种分离的能够特异性地与人TNFR2上的表位结合的抗TNFR2抗体，所述表位包含如SEQ ID NO:83所示人TNFR2序列的氨基酸残基Arg99、Lys108、Glu110、Gly111、Arg113、Leu114和Asp136。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含DDYID(SEQ ID NO:1)；HC-CDR2，其包含EIYPGSGNTYYNEKFKG(SEQ ID NO:7)；和HC-CDR3，其包含SQVYGKIAMDH(SEQ ID NO:14)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含RASESVDNSGNSFMH(SEQ ID NO:20)；LC-CDR2，其包含RASNLES(SEQ ID NO:27)；和LC-CDR3，其包含QQSKEDPYT(SEQ ID NO:33)。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含DFNMD(SEQ ID NO:2)；HC-CDR2，其包含YINPNNGDAAYNQKFKS(SEQ ID NO:8)；和HC-CDR3，其包含WGWAFAY(SEQ ID NO:15)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含KASQDVKTAVA(SEQ ID NO:21)；LC-CDR2，其包含ATSYRYT(SEQ ID NO:28)；和LC-CDR3，其包含QQHYSIPYT(SEQ ID NO:34)。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含DDFIH(SEQ ID NO:3)；HC-CDR2，其包含RINPSNANTEYAPKFQD(SEQ ID NO:9)；和HC-CDR3，其包含NDGYYDGLFY(SEQ ID NO:16)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含KASQDVGTAVA(SEQ IDNO:22)；LC-CDR2，其包含WASTRHT(SEQ ID NO:29)；和LC-CDR3，其包含QQYSSYPFT(SEQ IDNO:35)。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含NFAMS(SEQ ID NO:4)；HC-CDR2，其包含TIRSGDNYSYYSDNVKG(SEQ ID NO:10)；和HC-CDR3，其包含NWDKVFDY(SEQ ID NO:17)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含RASESVDSYGYSFMH(SEQID NO:23)；LC-CDR2，其包含RASNLKS(SEQ ID NO:30)；和LC-CDR3，其包含QQSNEDHT(SEQ IDNO:36)。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含IYGMN(SEQ ID NO:5)；HC-CDR2，其包含WIHTYTGEPTYADDFKG(SEQ ID NO:11)；和HC-CDR3，其包含RERYGSF(SEQ ID NO:18)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含TASQSVDYGGVSYMN(SEQID NO:24)；LC-CDR2，其包含GASNQES(SEQ ID NO:31)；和LC-CDR3，其包含QQSNEDPPT(SEQID NO:37)。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含SGYYWN(SEQ ID NO:6)；HC-CDR2，其包含YITYDGNNNYDPSLKN(SEQ ID NO:12)；和HC-CDR3，其包含GDYGDSAMDY(SEQ ID NO:19)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含SASSSVSYMH(SEQ IDNO:25)；LC-CDR2，其包含EISKLAS(SEQ ID NO:32)；和LC-CDR3，其包含QQWNYPLIT(SEQ IDNO:38)。
在一些实施例中，所述分离的抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域(VH)，所述VH包含：重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含SGYYWN(SEQ ID NO:6)；HC-CDR2，其包含YITYDGNNNYNPSLKS(SEQ ID NO:13)；和HC-CDR3，其包含GDYGDSAMDY(SEQ ID NO:19)；以及轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含SASSGVNYMH(SEQ IDNO:26)；LC-CDR2，其包含EISKLAS(SEQ ID NO:32)；和LC-CDR3，其包含QQWNYPLIT(SEQ IDNO:38)。
同时还提供编码抗TNFR2抗体的核酸，包含抗TNFR2抗体的组合物，以及制备和使用本申请所述的抗TNFR2抗体的方法。
定义
如本文所述，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是一种获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。鉴于本申请的目的，所述有益的或期望的临床结果，包括但不限于以下一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减轻疾病程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)，预防或延迟疾病复发，延迟或减缓疾病进展，改善疾病状态，缓解疾病(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病进展，改善或提高生活质量，增加体重，和/或延长生存期。同时，“治疗”还包括疾病病理结果的减少(例如，对癌症而言，肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗的任何一个或多个方面。
术语“抗体”包括全长抗体及其抗原结合片段。全长抗体包括两条重链和两条轻链。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。两条链中的可变区通常包括3个高变的环，被称为互补决定区(CDRs)(轻链(LC)CDRs包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重链(HC)CDRs包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文所披露的抗体或抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat,Chothia或Al-Lazikani惯例来定义或识别(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)。重链或轻链的3个CDR区插入到被称为框架区(FRs)的侧翼区段之间，所述框架区比CDR区具有更高的保守性，并形成支撑高变环的支架。重链和轻链的恒定区并不参与抗原结合，但展示出多种效应功能。抗体是基于它们重链恒定区的氨基酸序列进行分类或分型的。抗体的五种主要类别或同种型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别具有α、δ、ε、γ和μ型重链。几种主要的抗体类别被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链n)或IgA2(α2重链)。
如本文所述，术语“抗原结合片段”包括抗体片段，包括，例如，双链抗体(diabody)、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双链抗体(ds双链抗体)、单链Fv(scFv)、scFv二聚体(二价双链抗体)，由包含一个或多个CDRs的抗体片段组成的多特异性抗体、单域抗体、纳米抗体(nanobody)、域抗体、二价域抗体或者能够与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段还包括包含如上所述的抗体片段的融合蛋白。抗原结合片段也包括包含如上所述的抗体片段的融合蛋白。抗原结合片段能够与亲本抗体或亲本抗体片段(如亲本scFv)结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段可能包括来自特定人抗体的一个或多个CDRs，该CDRs被移植到来自一个或多个不同人抗体的框架区。
如本文所述，术语“表位”是指抗体或抗体部分结合的抗原上特定的原子或氨基酸组。如果两种抗体或抗体部分表现出与某抗原竞争性结合，则它们可能结合抗原上相同表位。
如本文所述，当第一抗体在等摩尔浓度下抑制第二抗体与TNFR2靶标结合至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)时，第一抗体与第二抗体“竞争”结合TNFR2靶标，反之亦然。PCT出版物WO 03/48731描述了基于交叉竞争的高通量抗体“表位归类”方法。
如本文所述，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对…来说是特异性的”是指可测量的和可再现的相互作用，例如抗体与靶标的结合可以确定在异质分子群，包括生物分子中存在该靶标。例如，抗体能够特异性地识别某靶标(可以是表位)是指，与其他靶标结合相比，该抗体与该靶标的结合具有更高的亲和力，亲合力，更容易和/或更持久。在一些实施例中，特异性地识别抗原的抗体与抗原的一个或多个抗原决定簇反应，其结合亲和力是其与其他靶标结合亲和力的至少10倍。
如本文所述，一种“分离的”抗TNFR2抗体是指一种抗TNFR2抗体，其(1)与天然存在的蛋白无关，(2)不含相同来源的其他蛋白，(3)由不同种属的细胞所表达，或(4)自然界中不存在。
如本文所述，术语“分离的核酸”，是指基因组、cDNA或合成来源的核酸或其组合。根据其来源，所述“分离的核酸”(1)与自然界中发现的“分离的核酸”中的全部或部分多核苷酸无关，(2)可与自然状态下不与之相连的多核苷酸可操作性地连接，或(3)在自然界中不作为较长序列的一部分而存在。
如本文所述，术语“CDR”或“互补决定区”是指重链和轻链多肽的可变结构域内发现的非连续抗原结合位点。在文献Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences of proteins ofimmunological interest”(1991)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Al-Lazikani B.et al.,J.Mol.Biol.,273:927-948(1997)；MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)；Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Lefranc M.P.et al.,Dev.Comp.Immunol.,27:55-77(2003)；和Honegger and Plückthun,J.Mol.Biol.,309:657-670(2001)中已经描述这些特殊的区域，其中当彼此之间互相比较时，这些定义包括氨基酸残基的重合或子集。然而，采用任何一种定义方式来指示抗体或移植抗体或其变体的CDR，均包括在本文所定义和使用的术语范围之内。表1中列了由上述引用的各篇参考文献所定义的CDR所包括的氨基酸残基的位置，以示比较。CDR预测的算法和结合界面在本领域是已知的，包括，例如Abhinandan and Martin,Mol.Immunol.,45:3832-3839(2008)；Ehrenmann F.et al.,Nucleic Acids Res.,38:D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.et al.,Nucleic Acids Res.,43:D432-D438(2015)中均有描述。本段中所引用的参考文献的内容以其整体引用并入本文中，以用于本申请和可能包含在本文中的一个或多个权利要求中。
表1：CDR定义
1氨基酸残基编号参照上述Kabat et al.中的命名方法
2氨基酸残基编号参照上述Chothia et al.中的命名方法
3氨基酸残基编号参照上述MacCallum et al.中的命名方法
4氨基酸残基编号参照上述Lefranc et al.中的命名方法
5氨基酸残基编号参照上述Honegger and Plückthun中的命名方法
术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与来自特定种属或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或具有同源性，而这个(些)链的剩余部分与来自另一种属或属于其他抗体种类或亚类的抗体中的相应序列一致或具有同源性的抗体，以及此类抗体的片段，只要其具有本申请中的生物学活性(见U.S.Patent No.4,816,567；andMorrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
“Fv”是包含完整抗原识别及结合位点的最小抗体片段。该片段是由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域紧密非共价连接形成的二聚体。通过这两个域的折叠衍生出6个高变环(轻链和重链中各3个环)，所述高变环为抗体提供了用于结合抗原的氨基酸残基，并且赋予抗体与抗原结合的特异性。然而，即使单个可变结构域(或Fv片段的一半，其仅包含对抗原具有特异性的3个CDRs)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整的结合位点。
“单链Fv”，也可简写成“sFv”或“scFv”，是包含被连接成单一多肽链的VH和VL抗体域的抗体片段。在一些实施例中，scFv多肽进一步包括VH和VL域之间的连接多肽，该连接多肽使得scFv形成抗原结合的理想结构。关于scFv的概述，见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语“双链抗体(diabodies)”是指，在VH和VL域之间采用短接头(例如5～10个残基)构建scFv片段(见上段内容)制备而成的一种小抗体片段，这样就使得可变结构域在链间而不是链内进行配对，产生一个双价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性的双链抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL域位于不同的多肽链上。在EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中全面描述了双链抗体。
非人源(如啮齿类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包括最少的来自非人源抗体的序列。大多数情况下，人源化抗体是人源免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的高变区(HVR)残基被来自非人源种属例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的且具有理想的抗体特异性，亲和力和性能的高变区残基所取代(供体抗体)。在某些情况下，人源免疫球蛋白框架区(FR)中的残基被相应的非人源残基所取代。另外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中均不存在的残基。这些修饰能够进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包含至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环均与非人免疫球蛋白的高变环相对应，以及所有或基本上所有的框架区均是人免疫球蛋白序列。人源抗体任选地也还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。具体细节可以参考Jones et al.,Nature321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992).。
本文所鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为：在认为保守性取代属于序列同一性的一部分的情况下进行序列对比，候选序列与待比较多肽序列中相同氨基酸残基所占的百分比。可以通过本领域技术范围内的多种比对方式来确定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件等可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较序列的全长上实现最大化比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，氨基酸序列同一性百分比数值是使用序列比对电脑程序MUSCLE(Edgar,R.C.,Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797,2004；Edgar,R.C.,BMCBioinformatics 5(1):113,2004)生成的。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施例中，本申请所述的FcR是结合IgG抗体(一种γ受体)的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要在细胞质结构域有所不同。激活受体FcγRIIA的胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(见M.inAnnu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。所述术语还包括同种异型，例如FcγRIIIA同种异型:FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)和Capel et al.,Immunomethods4:25-34(1994)；and de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中对FcRs进行了描述。本申请中术语FcR涵盖其他类型的FcRs，包括将来鉴定的FcRs。术语FcR同时还包括新生儿受体FcRn，其负责向新生儿转移母体IgGs(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)and Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
术语“FcRn”指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn与主要组织相容性复合体(MHC)在结构上相似，由α链非共价结合到β2微球蛋白上组成。新生儿Fc受体FcRn的多种功能在Ghetieand Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766.中进行了描述。FcRn在免疫球蛋白IgGs从母体向新生儿的被动转运和调控血清IgG水平中起到重要作用。FcRn作为一种救助受体，可以在细胞内和细胞间以完整的形式结合和运输胞吞化的IgG，并使它们免于经受默认的降解途径。
人IgG Fc区的“CH1结构域”通常从118位氨基酸延伸到215位氨基酸(EU编号系统)。
“铰链区”通常被定义为从人IgG1的216位Glu延伸到230位Pro(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过将形成重链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于与IgG1相同位置后，可以使得其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从231位氨基酸延伸到340位氨基酸。CH2结构域的独特之处在于，它不会与另一个区域紧密配对，而是在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间插入了两条N端连接的支链糖链。据推测，糖类可能作为域与域间配对的替代，有助于保持CH2结构域稳定。Burton,Molec Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3”结构域包括在Fc区内从C末端残基延伸到CH2结构域(从341位氨基酸到抗体序列的C末端，通常为IgG的第446或447位氨基酸残基)。
“功能性Fc片段”具有天然Fc区序列所具有的“效应功能”。示例性的“效应功能”包括C1q结合；补体依赖的细胞毒作用(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(如B细胞受体；BCR)等。这类效应功能通常需要Fc区与结合结构域(如抗体可变区)结合，并且可以使用本领域公知的多种实验方法进行评估。
具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的IgG Fc变体的抗体，与亲本多肽或包含天然Fc序列的多肽相比，其FcR结合活性(如FcγR或FcRn)和/或ADCC活性增强或减弱。表现出与FcR“结合增强”的Fc变体与亲本多肽或包含天然IgG Fc序列的多肽相比，其与至少一种FcR具有更高的结合亲和力(例如更低的表观Kd或IC50值)。在一些实施例中，与亲本多肽相比，结合能力增强3倍，例如5、10、25、50、60、100、150、200，甚至高达500倍或结合力提高25％到1000％。表现出与FcR“结合降低”的Fc变体，与亲本多肽相比，其与至少一种FcR具有更低的亲和力(例如更高的表观Kd或IC50值)。与亲本多肽相比，其结合能力下降40％或更多。
“抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”是一种细胞毒性形式，指分泌型的Ig与存在于某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤细胞(NK)、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcRs)结合，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后使用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所必需的。介导ADCC的主要细胞类型中，NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的Table 3中总结了在造血细胞上FcR的表达。评估目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC实验，在美国专利No.5,500,362或5,821,337中进行了描述。适用于此类实验的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤性细胞(NK)。可选地，或者此外，目标分子的ADCC活性也可以在体内进行评估，例如在如Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的动物模型中进行了描述。
包含Fc区变体的多肽与包含野生型IgG Fc多肽或亲本多肽相比，在人体效应细胞存在下表现出“增强的ADCC活性”或能够更有效的介导ADCC效应，所述包含Fc区变体的多肽在实验时与包含野生型IgG Fc多肽(或亲本多肽)数量上基本相同时，无论在体外或体内均能更有效的介导ADCC。通常采用本领域已知的任何体外ADCC实验方法来鉴定此类变体，例如用于鉴定ADCC活性的实验或方法，例如在动物模型中等。在一些实施例中，此类变体与野生型Fc(或亲代多肽)相比，介导ADCC的效率提高5到100倍，例如25到50倍。
“补体依赖的细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典的补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)与结合同源抗原的抗体(具有适宜结构的亚类)相结合而启动的。为了评估补体激活，可以进行CDC实验，如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述的。在美国专利No.6,194,551B1和WO 99/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列并增加或降低的C1q结合能力的多肽变体。这些专利出版物的内容通过引用明确地并入本文中。另见Idusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
除非另有说明，一种“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括相互之间互为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，例如编码蛋白质的核苷酸序列在某些形式中包含内含子。
术语“可操作性地连接”是指调控序列与异源核苷酸序列之间的功能性连接，从而使后者表达。例如，当第一个核苷酸序列与第二个核苷酸序列处于功能性关系时，第一个核苷酸序列与第二个核苷酸序列为可操作性地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，该启动子与编码序列为可操作性地连接。通常，可操作性连接的DNA序列是连续的，并且在必要时，可以在同一个阅读框中连接两个蛋白质编码区。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。如果两个比较序列的同一位置为相同的碱基或氨基酸单体亚基时，例如两个DNA分子的同一位置均为腺嘌呤，则这两个DNA分子在该位置是同源的。两个序列间的同源百分比是指两个序列中共有的匹配或同源位置的数量与位置总数之比再乘以100所得函数。例如，两个序列中如果10个位置中有6个位置是相匹配或同源的，则这两个序列的同源性为60％。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常来说，在比对两个序列时，以得到最大同源性为目的来进行对比。
本文所公开的抗TNFR2抗体或组合物的“有效量”是指足以实现特定目的的量。“有效量”可以凭经验和通过已知的与所述目的相关的方法确定。
术语“治疗有效量”是指本文公开的抗TNFR2抗体或组合物可有效“治疗”个体的疾病或病症的量。在癌症的情况下，本文公开的抗TNFR2抗体或组合物治疗有效量可减少癌细胞数量；减少肿瘤大小和重量；抑制(即，在一定程度上延缓，最好停止)癌细胞浸润周围器官；抑制(即，在一定程度上延缓，最好停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在本文所公开的抗TNFR2抗体或组合物可防止生长和/或杀死现有癌细胞的范围内，其可为细胞抑制性和/或细胞毒性。在一些实施例中，治疗有效量为生长抑制的量。在一些实施例中，治疗有效量是延长病人生存期的量。在某些实施例中，治疗有效量是改善患者无进展生存期的量。
如本文所用的，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”是指无生物学活性或者其他不期望性质的材料，例如该材料能够加入到给予患者的药物组合物中，而不会引起显著的不良生物反应，或者，不与组合物中包含的任何其他组分以有害的方式相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选满足毒理学和制造检测的所需标准和/或包含在美国食品和药品管理局编制的非活性成分指南中。
本文中描述的本申请的实施例应理解为包含“由……组成”和/或“基本上由……组成”的实施例。
本文中提及“约”为一个数值或参数，包含(和描述)针对该值或参数本身的变体。例如，涉及“约X”的描述，包括“X”的描述。
如本文所用的，提及“不是(not)”一个数值或参数，通常表示并描述“除了(otherthan)”某一数值或参数之外。例如，该方法不能用于治疗X型癌症，意味着该方法通常用于治疗除X型癌症之外的其他类型。
除非上下文另有明确说明，本文和所述权利要求中所采用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象。
抗TNFR2抗体
一方面，本申请提供特异性结合人和/或食蟹猴TNFR2的抗TNFR2抗体。所述抗TNFR2抗体包括，但不限于，人源化抗体，嵌合抗体，小鼠抗体，人抗体，以及本文所述的包含重链和/或轻链CDRs的抗体分子。一方面，本申请提供与TNFR2结合的分离的抗体。预期的抗TNFR2抗体包括，例如，全长抗TNFR2抗体(如全长IgG1或IgG4)，抗TNFR2单链抗体，抗TNFR2Fc融合蛋白，多特异性(如双特异性)抗TNFR2抗体，抗TNFR2免疫偶联物，以及诸如此类的。在一些实施例中，抗TNFR2抗体是全长抗体(如全长IgG1或IgG4)或其抗原结合片段，其特异性结合TNFR2。在一些实施例中，抗TNFR2抗体是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、单链Fv(scFv)、Fv片段、dAb、Fd、纳米抗体(nanobody)、双链抗体(diabody)或线性抗体。在一些实施例中，特异性结合TNFR2的抗体是指抗体与TNFR2结合的亲和力至少是与非靶标结合亲和力的10倍以上(包括例如10、102、103、104、105、106、或107倍)。在一些实施例中，非靶标是指不是TNFR2的抗原。结合亲和力可通过本领域已知的方法来测定，如ELISA，荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀分析(RIA)。Kd值可以通过本领域已知的方法来测定，如表面等离子共振(SPR)技术或生物层干涉技术(BLI)。
尽管本文广泛地讨论了包含人序列的抗TNFR2抗体(例如，包含人CDR序列的人重链和轻链可变结构域)，但同时也考虑了非人抗TNFR2抗体。在一些实施例中，非人抗TNFR2抗体包括本文所述的抗TNFR2抗体的人CDR序列和非人框架区序列，在一些实施例中，非人框架区序列包括任何的用于使用如本文所述的一种或多种人CDR序列产生重链和/或轻链可变结构域的序列，包括例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类(例如，小猿，猕猴)等。在一些实施例中，非人抗TNFR2抗体包括将一种或多种本文所述的人CDR序列移植到非人框架区中(例如，鼠或鸡的框架区序列)所产生的抗TNFR2抗体。
示例性的人TNFR2胞外区(ECD)的氨基酸序列包含SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列组成。示例性的小鼠TNFR2胞外区(ECD)的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列组成。示例性的食蟹猴TNFR2胞外区(ECD)的氨基酸序列包含SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列或由SEQID NO:85所示的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体特异性识别人TNFR2中的表位。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体与除人之外的其他物种的TNFR2发生交叉反应。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体对人TNFR2是完全特异性的，并且不与其他非人物种的TNFR2发生交叉反应。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体与人TNFR2内的线性表位特异性结合。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体与人TNFR2内的非线性表位特异性结合。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体与人TNFR2上的表位特异性结合，其中所述表位包含1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个氨基酸残基，所述氨基酸残基选自由SEQ ID NO:83所示人TNFR2序列的Arg99、Lys108、Glu110、Gly111、Arg113、Leu114和Asp136组成的组中。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体与人TNFR2上的表位特异性结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO:83所示人TNFR2序列的Arg99、Lys108、Glu110、Gly111、Arg113、Leu114和Asp136。
在一些实施例中，与已知抗TNFR2抗体相比，本文所述抗TNFR2抗体结合不同的TNFR2区域或表位，并且令人惊讶的是，与已知抗TNFR2抗体相比，本文所述抗TNFR2抗体在以下一个或多个特性中表现出更好的效果。
在一些实施例中，所述特性包括，但不限于：(i)抑制TNF-α与TNFR2结合；(ii)抑制TNFR2信号通路；(iii)与人TNFR2和食蟹猴TNFR2具有交叉反应；(iv)与dsDNA、胰岛素或杆状病毒颗粒的非特异性结合力更低；(v)抑制Treg细胞增殖；(vi)抑制肿瘤生长或消除肿瘤细胞；(vii)降低Treg介导的免疫抑制；(viii)将Treg转化为效应T细胞；(ix)体内药代动力学(PK)曲线；(x)热稳定性(例如：高Tm或Tagg)；(xi)可开发性；(xii)毒性或免疫原性降低；或(xiii)制造便利性提高。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体与TNFR2蛋白(或其片段)的至少一种等位基因变体发生交叉反应。在一些实施例中，等位基因变体与天然存在的TNFR2蛋白(或其片段)相比，具有至多30个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个)的氨基酸取代(例如保守取代)。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体不与TNFR2蛋白(或其片段)的任何等位基因变体发生交叉反应。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体与TNFR2蛋白的至少一种种间变体发生交叉反应。在一些实施例中，例如，TNFR2蛋白(或其片段)是人TNFR2，并且TNFR2蛋白(或其片段)的种间变体是食蟹猴中的变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体不与TNFR2蛋白的任何种间变体发生交叉反应。
在一些实施例中，如本文所述的任一抗TNFR2抗体，所述抗TNFR2抗体包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包括IgG1型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包括IgG2型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包括IgG3型重链恒定区。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包括IgG4型重链恒定区。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQID NO:78。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:79。在一些实施例中，所述重链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:82。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述轻链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ IDNO:80。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施例中，所述轻链恒定区包含(包括由…组成或基本上由…组成)氨基酸序列SEQ ID NO:81。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包括抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:27；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1、7和14，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:20、27和33，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:1、7和14；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:20、27和33。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:39所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:63所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:39所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:63所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:39所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:63所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:39具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:63具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:63所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:28；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:2、8和15，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:21、28和34，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:2、8和15；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:21、28和34。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:40所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:64所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:40所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:64所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:40所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:64所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:40具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:64具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:64所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:29；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:3、9和16，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:22、29和35，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:3、9和16；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:22、29和35。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:41所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:65所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:41所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:65所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:41所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:65所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:41具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:65具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:65所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:30；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:4、10和17，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:23、30和36，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:4、10和17；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:23、30和36。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:42所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:66所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:42所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:66所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:42所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:66所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:42具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:66具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:66所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:31；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:5、11和18，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:24、31和37，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:5、11和18；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:24、31和37。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:43所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:67所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:43所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:67所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:43所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:67所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:43具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:67具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:32；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:6、12和19，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:25、32和38，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:6、12和19；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:25、32和38。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:44所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:68所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:44所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:68所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:44所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:68所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:44具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:68具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:68所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:32；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:6、13和19，或者包含至多5个氨基酸取代的VH变体；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNOs:26、32和38，或者包含至多5个氨基酸取代的VL变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NOs:6、13和19；以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NOs:26、32和38。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ IDNO:45所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQID NO:69所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:45所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:69所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:45所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:69所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID No:45具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:69具有至少约90％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ IDNO:69所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；HC-CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。
在一些实施例中，上述氨基酸取代仅限于如本申请表4所示的“示例性取代”。在一些实施例中，氨基酸取代仅限于如本申请表4所示的“优选取代”。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQID NO:33所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如SEQ ID NOs:46-62中任一氨基酸序列所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如SEQ IDNOs:70-77中任一氨基酸序列所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:48所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:49所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:55所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQID NO:56所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:57所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:58所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:59所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:60所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:61所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含如氨基酸序列SEQ ID NO:62所示的VH包含的1个、2个或3个HC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:72所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含如氨基酸序列SEQ ID NO:70所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:71所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:72所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VL，所述VL包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的1个、2个或3个LC-CDRs。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:48所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:72所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:49所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:70所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:49所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:71所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:49所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:72所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:55所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:56所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:72所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:57所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:58所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:59所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:60所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:61所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:62所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:75所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NOs:46-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:46-62中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含SEQ ID NOs:70-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:70-77中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含SEQ ID NOs:46-62中任一所示的氨基酸序列，以及VL，所述VL包含SEQ ID NOs:70-77中任一所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:48或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:48具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:70或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:70具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:70。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:71或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:71具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:49具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:55或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:55具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:56具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:56，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:57具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:57，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:58具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:59或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:59具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:60或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:60具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:61或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:61具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:62或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:62具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ IDNO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。
在一些实施例中，功能性表位可通过组合丙氨酸扫描法来解析。在此过程中，组合丙氨酸扫描技术可用于鉴定TNFR2蛋白中与抗TNFR2抗体相互作用所必需的氨基酸。在一些实施例中，该表位是构象的，同时可以采用与TNFR2蛋白结合的抗TNFR2抗体的晶体结构来鉴定表位。
在一些实施例中，本申请提供与本文所述的任一种抗TNFR2抗体竞争性地结合TNFR2的抗体。在一些实施例中，提供能够与本文所述的任一种抗TNFR2抗体竞争性结合TNFR2上的表位的抗体。在一些实施例中，提供抗TNFR2抗体，其与包含VH和VL的抗TNFR2抗体分子结合相同的表位，其中所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列。在一些实施例中，提供抗TNFR2抗体，其与包含VH和VL的抗TNFR2抗体竞争性地结合TNFR2，其中所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，可以利用竞争实验来鉴定与本文所述的抗TNFR2抗体竞争性结合TNFR2的单克隆抗体。竞争实验可以通过识别相同的或空间上重叠的表位或者通过一个抗体竞争性抑制另一抗体与抗原结合来确定两个抗体是否结合相同的表位。在某些实施例中，这种竞争性抗体与本文所述的抗体结合相同的表位。一些示例性的竞争实验包括，但不限于如Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)中所提到的常规实验。用于解析抗体结合的表位的详细示例性方法如Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols，"in Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,N.J.)中所述。在一些实施例中，如果每种抗体阻断另一种抗体结合的50％或更多，则称其结合相同的表位。在一些实施例中，与本文所述的抗TNFR2抗体竞争的抗体是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
示例性抗TNFR2抗体序列如表2A-2B和3A-3B所示，其中根据Kabat定义方式进行CDR编号。本领域技术人员将认识到有多种已知算法来预测CDR的位置以及界定抗体轻、重链可变区。包含如本文所述抗TNFR2抗体的CDRs、VH和/或VL序列的，但基于预测算法而非下表中所示例的抗体也在本申请的范围内。
表2A.示例性抗TNFR2抗体CDR序列
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表2B.示例性抗TNFR2抗体CDR序列
表3A.示例性序列
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表3B.示例性序列
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表3C.示例性序列
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TNFR2
肿瘤坏死因子(TNF)受体2(TNFR2)是一种信号分子，位于强效调节性T细胞亚群(Treg)表面，可通过核因子κB(NF-kB)激活这些细胞增殖。TNFR2也在许多人类肿瘤的表面大量表达(Vanameeet al.,TNFR2:A Novel Target for CancerImmunotherapy.Trends Mol Med.2017Nov；23(11):1037-1046)。TNFR2是一种调节细胞存活和增殖的细胞表面受体(Chen,X.et al.(2007)Interaction of TNF with TNFreceptor type 2promotes expansion and function of mouse CD4+CD25+T regulatorycells.J.Immunol.179,154-161)，并且靶向该受体近来已成为潜在的下一代癌症治疗方法(Chen,X.and Oppenheim,J.J.(2017)Targeting TNFR2,an immune checkpointstimulator and oncoprotein,is a promising treatment for cancer.Sci.Signal.10,eaal2328)。某些人肿瘤细胞可以异常表达TNFR2，并且肿瘤浸润以高抑制的TNFR2+Treg为主(Shimizu,J.et al.(1999)Induction of tumor immunity by removing CD25+CD4+Tcells:a common basis between tumor immunity and autoimmunity.J.Immunol.163,5211-5218,Ungewickell,A.et al.(2015)Genomic analysis of mycosis fungoides andSezary syndrome identifies recurrent alterations in TNFR2.Nat.Genet.47,1056-1060).
在一些实施例中，本文公开的抗TNFR2抗体阻断TNFα与TNFR2的结合和TNFR2信号通路。这里所说的抗TNFR2抗体阻断TNFα与TNFR2结合是指抗体分子与受体TNFR2结合，从而阻止了配体TNFα与同一受体结合。本文公开的抗TNFR2抗体阻断TNFR2信号通路是指其阻断了TNFR2介导的细胞激活。在一些实施例中，本文公开的抗TNFR2抗体对TNFR2阳性细胞具有清除作用，是指在向患者(例如，人类)施用时，这种抗体分子特异性结合TNFR2阳性细胞表面表达的TNFR2，并且这种结合导致此类靶细胞的清除。如上所述，TNFR2在各种癌症患者肿瘤中的Treg上高表达，在此类患者中，本发明的抗体分子将优先结合Treg，从而导致Treg的清除。Treg对其他免疫细胞(如CD8阳性(CD8+)细胞)的增殖、激活和细胞毒性能力具有抑制作用。因此，Treg的清除将至少间接导致CD8+细胞的增殖、激活和迁移增加，从而增加肿瘤内CD8+细胞的数量。
全长抗TNFR2抗体
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体包含IgG恒定区域，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的恒定区域。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体包含λ轻链恒定区。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体包含κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是全长的人抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体包含小鼠免疫球蛋白Fc序列。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体包含已经改变的或以其他方式改变的Fc序列，使其具有增强的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)的效应功能。
因此，例如，在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，所述抗TNFR2抗体与TNFR2特异性结合。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG2恒定区的全长抗TNFR2抗体，所述抗TNFR2抗体与TNFR2特异性结合。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG3恒定区的全长抗TNFR2抗体，所述抗TNFR2抗体与TNFR2特异性结合。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，所述抗TNFR2抗体与TNFR2特异性结合。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs:1-6中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:7-13中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:14-19中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs:20-26中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:27-32中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:33-38中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG2恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs:1-6中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:7-13中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:14-19中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs:20-26中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:27-32中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:33-38中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG3恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs:1-6中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:7-13中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:14-19中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs:20-26中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:27-32中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:33-38中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs:1-6中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:7-13中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:14-19中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs:20-26中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:27-32中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:33-38中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体包含至多约3个(例如1、2或3个)氨基酸的取代。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，上述氨基酸取代仅限于如本申请表4所示的“示例性取代”。在一些实施例中，氨基酸取代仅限于如本申请表4所示的“优选取代”。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs:1-6中任一所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:7-13中任一所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:14-19中任一所示的氨基酸序列；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs:20-26中任一所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:27-32中任一所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQID NOs:33-38中任一所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含SEQ IDNOs:1-6中任一所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:7-13中任一所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs:14-19中任一所示的氨基酸序列；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs:20-26中任一所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs:27-32中任一所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQID NOs:33-38中任一所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：a)重链可变结构域，所述重链可变结构域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19；以及b)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含重链可变结构域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:39-62中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及轻链可变结构域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:63-77中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG2恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含重链可变结构域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:39-62中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及轻链可变结构域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:63-77中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG3恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含重链可变结构域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:39-62中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及轻链可变结构域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:63-77中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含重链可变结构域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:39-62中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性，以及轻链可变结构域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:63-77,中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:63-77,中任一氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含重链可变结构域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列，以及轻链可变结构域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含重链可变结构域VH，所述VH包含SEQ ID NOs:39-62中任一所示的氨基酸序列，以及轻链可变结构域VL，所述VL包含SEQ ID NOs:63-77中任一所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:70。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:40，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:70。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种包含IgG1恒定区的全长抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：重链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，以及轻链可变结构域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQID NO:81组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成以及轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
结合亲和力
结合亲和力可以采用Kd、Koff、Kon或Ka来表示。如本文所用，术语“Koff”是指抗体从抗原/抗体复合物中解离的速率常数，通过动力学选择装置测定。本文所用的术语“Kon”是指抗体与抗原结合形成抗原/抗体复合物的结合速率常数。本文所用的术语解离常数“Kd”是指特定抗体抗原相互作用时的解离常数，描述了在抗体分子溶液中，抗原占据所有抗体结合位点的一半并且达到平衡时所需的抗原浓度，等于Koff/Kon。Kd的测定假设所有的结合分子均在溶液中。抗体与细胞壁连接的情况，例如在酵母表达系统中，相应的解离速率常数采用EC50来表示，其是Kd的一个良好的近似值。亲和结合常数Ka是解离常数Kd的倒数。
平衡解离常数(Kd)可以作为反应抗体部分与抗原亲和力的指标。例如，可以通过Scatchard方法使用标记有各种标记物的抗体，和Biacore仪器(由Amersham Biosciences制造)进行简单分析，根据用户手册或附带试剂盒，通过表面等离子体共振来分析生物分子间的相互作用。使用这些方法得到的Kd值，用单位M(mol)来表示。与靶标特异性结合的抗体可能具有，例如≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M、≤10-12M或≤10-13M的Kd值。
抗体的结合特异性可以通过本领域已知的方法进行实验测定。这些方法包括，但不限于Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描等。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体特异性结合TNFR2靶标，其Kd值为10-7M至10-13M(例如10-7M至10-13M、10-8M至10-13M、10-9M至10-13M或10-10M至10-12M)。因此，在一些实施例中，抗TNFR2抗体与TNFR2之间结合的Kd值为10-7M至10-13M、1×10-7M至5×10-13M、10-7M至10-12M、10-7M至10-11M、10-7M至10-10M、10-7M至10-9M、10-8M至10-13M、1×10-8M至5×10-13M、10-8M至10- 12M、10-8M至10-11M、10-8M至10-10M、10-8M至10-9M、5×10-9M至1×10-13M、5×10-9M至1×10-12M、5×10-9M至1×10-11M、5×10-9M-1×10-10M、10-9M至10-13M、10-9M至10-12M、10-9M至10-11M、10-9M至10-10M、5×10-10M至1×10-13M、5×10-10M至1×10-12M、5×10-10M至1×10-11M、10-10M至10- 13M、1×10-10M至5×10-13M、1×10-10M至1×10-12M、1×10-10M至5×10-12M、1×10-10M至1×10- 11M、10-11M至10-13M、1×10-11M至5×10-13M、10-11M至10-12M、10-12M至10-13M。在一些实施例中，抗TNFR2抗体与TNFR2之间结合的Kd值为10-7M至10-13M。
在一些实施例中，抗TNFR2抗体与非靶标之间结合的Kd值高于抗TNFR2抗体与靶标的Kd值，并且本文中引用的一些实施例中，抗TNFR2抗体与靶标(例如，TNFR2)的结合亲和力高于TNFR2抗体与非靶标的结合亲和力。一些实施例中，非靶标是指非TNFR2抗原。在一些实施例中，抗TNFR2抗体(针对TNFR2)与非TNFR2靶标结合的Kd值是抗TNFR2抗体和靶标TNFR2之间结合的Kd的至少10倍，例如10-100倍、100-1000倍、103-104倍、104-105倍、105-106倍、106-107倍、107-108倍、108-109倍、109-1010倍、1010-1011倍、1011-1012倍。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体与非靶标结合的Kd值为10-1M至10-6M(例如10- 1M至10-6M，10-1M至10-5M，10-2M至10-4M)。在一些实施例中，所述非靶标是指非TNFR2抗原。因此，在一些实施例中，抗TNFR2抗体与非TNFR2靶标之间结合的Kd值为10-1M至10-6M、1×10-1M至5×10-6M、10-1M至10-5M、1×10-1M至5×10-5M、10-1M至10-4M、1×10-1M至5×10-4M、10-1M至10-3M、1×10-1M至5×10-3M、10-1M至10-2M、10-2M至10-6M、1×10-2M至5×10-6M、10-2M至10-5M、1×10-2M至5×10-5M、10-2M至10-4M、1×10-2M至5×10-4M、10-2M至10-3M、10-3M至10-6M、1×10-3M至5×10-6M、10-3M至10-5M、1×10-3M至5×10-5M、10-3M至10-4M、10-4M至10-6M、1×10-4M至5×10-6M、10-4M至10-5M、10-5M至10-6M。
在一些实施例中，当提及抗TNFR2抗体以高结合亲和力特异性地识别TNFR2靶标，并以低结合亲和力结合非靶标时，所述抗TNFR2抗体与TNFR2靶标结合的Kd值为10-7M至10- 13M(例如10-7M至10-13M、10-8M至10-13M、10-9M至10-13M、10-10M至10-12M)，并且与非靶标结合的Kd值为10-1M至10-6M(例如10-1M至10-6M、10-1M至10-5M、10-2M至10-4M)。
核酸
编码抗TNFR2抗体的核酸分子也被考虑在内。在一些实施例中，提供一种(或一组)编码全长抗TNFR2抗体的核酸，包括本文所述的任一种全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，本文所述的抗TNFR2抗体的核酸(或一组核酸)还可以包括编码多肽标签的核酸序列(例如蛋白纯化标签，His-标签、HA标签)。
同时本文还考虑了包含抗TNFR2抗体的分离的宿主细胞，编码抗TNFR2抗体多肽组分的分离的核酸，或者包含编码本文所述的抗TNFR2抗体多肽组分的核酸的载体。
本申请还包括这些核酸序列的变体。例如，变体包括至少在中等严格杂交条件下与编码本申请的抗TNFR2抗体的核酸序列杂交的核苷酸序列。
本申请同时还提供可将本申请中核酸序列插入到其中的载体。
简言之，将编码抗TNFR2抗体的天然或合成的核酸插入到合适的表达载体中，使得核酸可操作性的连接到5’和3’端调控元件，例如包括启动子(例如淋巴细胞特异性启动子)和3’非翻译区(UTR)，可表达抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)。所述载体可适用于在真核宿主细胞中复制和整合。典型的克隆与表达载体包含调控目标核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本申请所述的核酸也可以通过使用标准的基因递送方案，用于核酸免疫和基因治疗。核酸递送方法是本领域已知的。例如参见U.S.Pat.Nos.5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用其全部内容并入本文。在一些实施例中，本申请还提供基因治疗载体。
可以将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，所述载体包括，但不限于，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和柯斯质粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如Green and Sambrook(2013,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学或分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括，但不限于，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包括一个在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记物(参见例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和U.S.Pat.No.6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以应用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后分离重组病毒，在体内或体外递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。衍生自逆转录病毒的载体，例如慢病毒，是实现长期基因转移的合适工具，因为它们使得转基因长期稳定的整合以及在子代细胞中繁殖。慢病毒载体相对于衍生自肿瘤的逆转录病毒例如小鼠白血病病毒具有额外的优势，因为它们可以转导非分裂细胞，例如肝细胞。同时，其还具有低免疫原性的额外优势。
其他的启动子元件，例如，增强子，调控转录起始频率。通常它们位于起始位点上游30-110bp处，虽然最近发现很多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，所以当元件彼此之间位置互换或移动时仍保持启动子的功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔增加到50bp，活性才会开始下降。
合适启动子的一个示例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一个很强的组成型启动子序列，可以驱动任何与其可操作性连接的多核苷酸序列高水平表达。合适启动子的另一个示例是延伸因子1α(EF-1α)启动子。然而，也可以使用其他组成型启动子，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免病缺陷病毒长末端重复序列(HIV-LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子以及人类基因启动子，例如包括但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，不应将本申请局限在仅使用组成型启动子。诱导型启动子也是本申请考虑的部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要这种表达时，能启动其与之可操作性连接的多核苷酸序列表达，当不需要时，则关闭表达。诱导型启动子，包含但不局限于，金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在一些实施例中，抗TNFR2抗体的表达是可诱导的。在一些实施例中，编码抗TNFR2抗体的核酸序列可操作的连接到诱导型启动子上，包括本文所述的任一诱导型启动子。
诱导型启动子
诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要表达时，可启动与之可操作性连接的多核苷酸序列表达，而在不需要表达时，则关闭表达。真核细胞中适用的示例性诱导型启动子，包括但不限于，激素调节元件(例如，参见Mader,S.and White,J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5603-5607)、合成配体调节元件(参见Spencer,D.M.et al(1993)Science 262:1019-1024)以及电离辐射调控元件(参见Manome,Y.et al.(1993)Biochemistry 32:10607-10613；Datta,R.et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1014-10153)。其他适用于体内或体外哺乳动物系统的示例性诱导型启动子参见Gingrichet al.(1998)Annual Rev.Neurosci 21:377-405。在一些实施例中，用于表达抗TNFR2抗体的诱导型启动子系统为Tet系统。在一些实施例中，用于表达抗TNFR2抗体的诱导型启动子系统为大肠杆菌lac抑制系统。
本申请所采用的一个示例性诱导型启动子系统为Tet系统。该系统是基于Gossen等(1993)描述的Tet系统。在一个示例性实施例中，目标多核苷酸由包含一个或多个Tet操纵子(TetO)位点的启动子控制。在非激活状态，Tet阻遏物(TetR)与TetO位点结合并抑制启动子的转录。在激活状态，例如，在存在诱导剂如四环素(Tc)、无水四环素、多西环素(Dox)或其活性类似物的情况下，诱导剂会使TetR从TetO上释放，从而导致转录发生。多西环素是四环素抗生素家族中的一员，其化学名为1-二甲氨基-2,4a,5,7-五羟基-11-甲基-4,6-二氧基-1,4a,11,11a,12,12a-六氢四烯-3-甲酰胺。
在一个实施例中，TetR经密码子优化适用于在哺乳动物细胞中表达，例如小鼠或人类细胞。由于遗传密码的简并性，大多数氨基酸由不止一个密码子编码，从而使得给定核酸的序列具有大量的变体，而其编码的氨基酸序列没有任何改变。然而，许多生物体在密码子使用方面存在差异，也称为“密码子偏好”(即，给定氨基酸使用特定密码子的偏好)。密码子偏好通常与特定密码子的优势tRNA种类的存在有关，反过来又提高了mRNA翻译的效率。因此可以通过密码子优化来定制源自特定物种的编码序列(例如，原核生物)，以提高其在不同物种(例如，真核生物)中的表达。
Tet系统的其他具体变体，包括以下的“Tet-Off”和“Tet-On”系统。在Tet-off系统中，转录在Tc或Dox存在下是失活的。在该系统中，由TetR与单纯疱疹病毒VP16强转录激活结构域融合组成的四环素调控的转录激活蛋白(tTA)，在四环素反应启动子元件(TRE)转录控制下调控靶核酸的表达。TRE元件由TetO序列串联与启动子(通常是来源于人巨细胞病毒即刻早期启动子的最小启动子序列)融合组成。在不存在Tc或Dox的情况下，tTA结合TRE并激活靶基因的转录。在存在Tc或Dox的情况下，tTA不能结合TRE，靶基因不能表达。
相反，在Tet-On系统中，转录在Tc或Dox存在下是激活的。Tet-On系统是基于反向四环素调控的转录激活因子rtTA。与tTA一样，rtTA是由TetR阻遏物与VP16反式激活域组成的融合蛋白。然而，TetR的DNA结合区中4个氨基酸的变化改变了rtTA的结合特性，使其在存在Dox的情况下只能识别靶转基因TRE上的tetO序列。所以在Tet-On系统中，只有在存在Dox的情况下，rtTA才能激活TRE调控的靶基因的转录。
另一种诱导型启动子系统是大肠杆菌的lac阻遏物系统(参见Brown et al.,Cell49:603-612(1987))。Lac阻遏物系统通过调控与包含lac操纵子(lacO)的启动子可操作性连接的目标多核苷酸的转录发挥功能。Lac阻遏物(lacR)与LacO结合，进而阻止目标多核苷酸的转录。通过合适的诱导剂来诱导目标多核苷酸的表达，例如，异丙基-β-D硫代半乳糖吡喃苷(IPTG)。
为了评估多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可包含选择标记基因或报告基因或二者都有，以便于从病毒载体转染或感染的细胞群体中识别和选择表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并在共转染实验中使用。选择标记基因或报告基因都可侧接于合适的调控序列，使其在宿主细胞中能够表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素耐药基因，如neo以及类似基因。
报告基因可用于鉴定潜在的转染细胞和评价调控序列的功能。通常，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，其编码一种多肽，其表达表现为一些易于检测的特性，例如酶活性。当DNA导入受体细胞后，在合适的时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因(例如.,Ui-Tel et al.,2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的，可以通过已知的技术制备或通过商业途径获得。通常，把具有能够显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体认定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接，并用于评估某些物质在调节启动子驱动的转录中能力。
在一些实施例中，提供编码本文所述的任一种全长抗TNFR2抗体的核酸。在一些实施例中，所述核酸包括编码全长抗TNFR2抗体重链和轻链的一个或多个核酸序列。在一些实施例中，所述一个或多个核酸序列中的每一个包含在单独的载体中。在一些实施例中，至少有一些核酸序列包含在同一载体中。在一些实施例中，所有核酸序列包含在同一载体中。载体可以选自，例如，哺乳动物表达载体和病毒载体(如源自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒的载体)。
将基因导入细胞并表达的方法在本领域是已知的。在表达载体的上下文中，通过本领域的任何方法载体可以很容易地导入宿主细胞中，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞。例如表达载体可以通过物理、化学或生物方法导入宿主细胞。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、基因枪法、显微注射、电穿孔法以及诸如此类。制备包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是熟知的。参见例如Green and Sambrook(2013,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。在一些实施例中，通过磷酸钙转染法将多核苷酸导入宿主细胞。
将目标多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物细胞，例如人类细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒1型、腺病毒和腺相关病毒等。参见如U.S.Pat.Nos.5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如高分子复合物、纳米胶囊、微球、磁珠和以脂质为基础的系统，其包括水包油乳剂、胶团、混合胶团和脂质体。一种在体内和体外被用作递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸导入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可被包裹进脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子连接在脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体形成复合物，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，悬浮在脂质中，包含在胶束中或与胶束混合，或以其他方式与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物在溶液中不限于任何特定结构。例如，它们可能以双分子层结构、以胶束或以“塌陷”结构存在。它们也可以简单的分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或是合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃及其衍生物的一类化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
无论采用何种方法将外源核酸导入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本申请的抑制剂中，为了确认重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种实验。这类实验包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”实验。例如Southern和Northern blotting，RT-PCR和PCR；“生物化学”实验，例如检测某一特定多肽是否存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISAs和Western blots)或者通过本文所述的实验来进行鉴定均落入本申请范围内。
抗TNFR2抗体的制备
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是单克隆抗体或源于单克隆抗体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体包括来自单克隆抗体的VH和VL，或者其变体。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体进一步包括来自单克隆抗体的CH1和CL区域，或者其变体。单克隆抗体可以应用例如本领域已知的方法制备，包括杂交瘤细胞法、噬菌体展示方法或应用重组DNA法。此外，示例性的噬菌体展示法在本文及以下的实施例中进行了描述。
在杂交瘤细胞法中，通常用免疫剂免疫仓鼠、小鼠或其他适合的宿主动物，以诱导产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂可包括目标蛋白的多肽或融合蛋白。为获得表位特异性抗体，免疫剂可以是主要包含表位或由表位组成的多肽，或主要包含表位或由表位组成和过表达细胞系的抗原片段或结构域(Greenfield EA.Standard Immunization of Mice,Rats,and Hamsters.ColdSpring Harb Protoc.2020Mar 2；2020(3):100297；P,Hanack K.Generation ofMurine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology.J Vis Exp.2017 Jan 2；(119):54832)。可通过本领域已知的方法鉴定表位特异性抗体，所述方法包括但不限于抗原结构域交换、丙氨酸扫描和抗原-Fab复合物晶体结构研究(Toride King M,BrooksCL.Epitope Mapping of Antibody-Antigen Interactions with X-RayCrystallography.Methods Mol Biol.2018；1785:13-27；Morrison KL,WeissGA.Combinatorial alanine-scanning.Curr Opin Chem Biol.2001Jun；5(3):302-7)。通常，如果需要人源细胞，采用外周血淋巴细胞(PBLs)，而如果需要非人哺乳动物来源细胞，则会使用脾细胞或淋巴结细胞。使用适当的融合剂将淋巴细胞与永生细胞系进行融合，例如聚乙二醇，以形成杂交瘤细胞。永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿类、牛科和人源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中进行培养，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合永生细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤细胞培养基通常包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基)，该培养基能阻止HGPRT缺陷细胞生长。
在一些实施例中，永生化细胞系有效融合，通过所选择的抗体生产细胞保证抗体高水平稳定表达，并且对某些培养基敏感，例如HAT培养基。在一些实施例中，永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，可以从例如，加利福尼亚圣地亚哥的索尔克细胞保藏中心和弗吉尼亚马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心获得。同时还描述了人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细胞系用于制备人源单克隆抗体。
然后可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在针对多肽的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀法或体外结合实验确定，如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。此类技术或分析方法在本领域是已知的。单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)中所述的斯卡查德(Scatchard)分析确定。
在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法对目标克隆进行亚克隆，并通过标准方法进行培养。基于此目的适合的培养基包括，例如改良Eagle培养基(DMEM)和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内以腹水的形式生长。
亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基或腹水中分离或纯化，例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
在一些实施例中，根据本文所述的任一抗TNFR2抗体，所述抗TNFR2抗体包含选自抗体文库(例如展示scFv或Fab片段的噬菌体文库)的克隆的序列。所述克隆可以通过筛选具有所需活性的抗体片段组合文库的方法进行鉴定。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库以及筛选这些文库来获得所需结合特性的抗体。这些方法在例如Hoogenboom et al.,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2001)中进行了综述，并且在例如McCafferty et al.,Nature348:552-554；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；and Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)中进行了进一步描述。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的所有组成成分，并在噬菌体文库中随机重组，然后筛选能够结合抗原的噬菌体，如Winter etal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常以scFv片段或以Fab片段形式展示抗体片段。免疫来源的文库噬菌体提供针对免疫原的高亲和力抗体而不需要构建杂交瘤细胞。或者，可以克隆天然库(例如来自人)，来提供针对多种非自身抗原和自身抗原的单一抗体来源，而不需任何免疫，如Griffiths et al.,EMBO J,12:725-734(1993)中所述。最后，天然文库也可以通过克隆来自干细胞的非重排V-gene片段，并使用包含随机序列的PCR引物编码CDR3高变区并且在体外完成重排的方法进行制备，如Hoogenboom andWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如U.S.Pat.No.5,750,373、和US Patent Publication Nos.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764,、2007/0292936和2009/0002360。
通过噬菌体展示筛选文库中能够特异性结合靶标TNFR2的抗TNFR2抗体部分的方法来制备所述的抗TNFR2抗体。该文库可以是人scFv噬菌体展示文库，具有至少1×109(例如，至少1×109、2.5×109、5×109、7.5×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、7.5×1010或1×1011)种多样性的独特的人抗体片段。在一些实施例中，所述文库是人天然文库，通过从健康受试者的PMBCs和脾脏中提取的DNA构建，包含所有人重链和轻链亚家族。在一些实施例中，所述文库是人天然文库，通过从各种疾病患者体内分离的PMBCs中提取的DNA构建，例如自身免疫病的患者、癌症患者和感染性疾病的患者。在一些实施例中，所述文库是半合成的人文库，其中重链CDR3完全是随机的，所有氨基酸(除了半胱氨酸)以相同的概率存在于任何给定的位置。(参见,例如,Hoet,R.M.et al.,Nat.Biotechnol.23(3):344-348,2005)。在一些实施例中，半合成的人文库的重链CDR3长度在5到24个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个)氨基酸之间。在一些实施例中，所述文库是全合成的噬菌体展示文库。在一些实施例中，所述文库是非人噬菌体展示文库。
对靶标TNFR2具有高亲和力的噬菌体克隆可以通过噬菌体与靶标TNFR2的迭代结合进行筛选，所述靶标TNFR2与固相支持物结合(例如用于溶液淘选的珠子或用于细胞淘选的哺乳动物细胞)，接下来去除未结合的噬菌体，并洗脱特异性结合噬菌体。随后，洗脱结合的噬菌体克隆并用于感染合适的宿主细胞，例如E.coli XL1-Blue，进行表达和纯化。可以通过多轮淘选(例如，2、3、4、5、6或更多轮)，例如溶液淘选、细胞淘选或两者结合以富集特异性结合TNFR2的噬菌体克隆。富集的噬菌体克隆与靶标TNFR2的特异性结合可以通过本领域已知的任何方法进行检测，包括例如ELISA和FACS。
筛选抗体文库的另一种方法是在酵母细胞表面展示蛋白质。Wittrup等人(USPatent Nos.6,699,658and 6,696,25 1)开发了一种酵母细胞展示文库的方法。在所述酵母展示系统中，一种涉及酵母凝集素蛋白(Aga1)的成分被固定在酵母细胞壁上。另一个涉及凝集素蛋白Aga2第二个亚单位的成分可以通过二硫键与Aga1蛋白结合展示在酵母细胞表面。Aga1蛋白在Aga1基因整合后从酵母染色体表达。将单链可变片段(scFv)文库与酵母展示质粒中的Aga2序列进行遗传上的融合，转化后的Aga2序列通过营养标记以游离型保留在酵母中。Aga1和Aga2蛋白均在半乳糖诱导型启动子的控制下表达。
人抗体V基因库(VH和VK片段)通过使用简并引物的PCR方法获得(Sblattero,D.&Bradbury,A.Immunotechnology 3,271-278 1998)。PCR模板来自商用RNA或cDNA，包括PBMC、脾脏、淋巴结、骨髓和扁桃体。将单独的VH和VK PCR文库组合，然后通过重叠延伸PCR以scFv形式组装在一起(Sheets,M.D.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,6157-61621998)。为了构建酵母scFv展示文库，通过同源重组将得到的scFv PCR产物克隆到酵母中的酵母展示质粒中。(Chao,G,et al,Nat Protoc.2006；1(2):755-68.Miller KD,etal.Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30,2008)。
如U.S.patent No.7,732,195B2所述，可使用哺乳动物细胞展示系统找到抗TNFR2抗体，其中抗体部分展示在细胞表面上，并且通过抗原引导筛选方法分离针特异性靶向TNFR2的抗体部分。可以建立代表多数人类IgG抗体基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞文库，并用于发现表达高亲和力抗体基因的克隆。已经开发出另一种展示系统，能够通过交替剪接同时实现高水平的细胞表面展示和相同蛋白质的分泌，其中展示的蛋白质表型仍然与基因型相关，允许在生物物理和基于细胞的功能分析中同时表征可溶性分泌抗体。这种方法克服了以前哺乳动物细胞展示的许多限制，使抗体能够以全长糖基化IgG的形式直接选择和成熟(Peter M.Bowers,et al,Methods 2014,65:44-56)。瞬时表达系统适用于抗体基因恢复前的单轮抗原选择，因此最适用于从较小的文库中选择抗体。稳定的游离型载体提供了一个有吸引力的选择。游离型载体可以高效转染并稳定地保持在低拷贝数，允许多轮平移和更复杂抗体文库的解析。
IgG文库是基于种系序列的V基因片段，这些片段与一组从人供体中分离出来的重排(D)J区相连。从2000份人血液样本中收集的RNA被反转录成cDNA，并且使用VH和VK特异性引物扩增VH和VK片段，并通过凝胶提取纯化。通过将VH和VK片段分别亚克隆到含有IgG1或K恒定区的展示载体中，然后电穿孔或转化293T细胞，以构建IgG文库。为了构建scFv展示文库，通过连接VH和VK生成scFv，然后将其亚克隆到展示载体中，然后通过电穿孔或转化到293T细胞中。如我们所知的，IgG文库是基于种系序列的V-基因片段连接到从供体组分离的重排(D)J区域，供体可以是小鼠、大鼠、兔或猴。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法进行制备，例如U.S.Patent No.4，816,567中所述。编码本申请中所述单克隆抗体的DNA可以通过常规方法(例如通过能特异性结合编码鼠源抗体轻链和重链基因的寡聚核苷酸探针)轻易的分离和测序。如上所述的杂交瘤细胞或本申请的TNFR2特异性噬菌体克隆可以作为这种DNA的来源。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后该载体转染入宿主细胞，例如猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢癌(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，获得在重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。所述DNA也可以被修饰，例如用人类重链和轻链恒定结构和/或用框架区域的编码序列代替同源的非人序列(U.S.Patent No.4,816,567；Morrison et al.,supra)，或者将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白编码序列上。这种非免疫球蛋白多肽可以取代本申请中抗体的恒定区，或可以取代本申请中抗体可变结构域中的一个抗原结合位点，形成嵌合的二价抗体。
所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域已知的。例如，一种涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达方法。通常在Fc区的任意位置截短重链，以阻止重链相互交联。或者，相关的半胱氨酸残基被其他氨基酸残基取代或被缺失以防止交联。
体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体产生抗体片段，特别是Fab片段，可以使用任何本领域已知的方法完成。
具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域可以与免疫球蛋白恒定区融合。优选与免疫球蛋白重链恒定区进行融合，其包括至少部分铰链，CH2和CH3区。在一些实施例中，包含轻链结合必要位点的第一重链恒定区(CH1)至少出现在一种融合体中。编码免疫球蛋白重链融合体的DNA，如果需要，还可以包括编码免疫球蛋白轻链的DNA，被插入进独立的表达载体中，并共转染至合适的宿主生物中。
全人和人源化抗体
所述抗TNFR2抗体(如全长的抗TNFR2抗体)可以是人源化抗体或全人抗体。非人(如小鼠)抗体部分的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或抗体的其他抗原结合子序列)，其通常包括最少的源于非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(受体抗体)，其中受体CDR的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的非人源(供体抗体)CDR残基取代，例如小鼠、大鼠或兔子的CDR。在一些实施例中，人免疫球蛋白Fv框架区残基被相应的非人源残基取代。人源化抗体还可以包含既不属于受体抗体也不在引入的CDR或框架区序列中的氨基酸残基。通常，人源化抗体包含至少一个，通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列。
通常，人源化抗体含有一个或多个从非人源引入的氨基酸残基。那些非人源氨基酸残基通常被称为“移入”残基，通常来自“移入”可变结构域。根据一些实施例，人源化基本上可以按照Winter和其同事的如下方法进行(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物CDRs或CDR序列取代人源抗体的相应序列。因此，这种“人源化”抗体部分(U.S.Patent No.4,816,567)，其基本上少于完整的人源抗体，其可变结构域已被来自非人源的相应序列所取代。在实际中，人源化抗体部分是典型的人源抗体部分，其中一些CDR残基和可能的一些框架区残基被来自啮齿类抗体中类似位点的残基所取代。
全人抗体是人源化的一种替代方式。例如，目前可以制备在免疫后能够产生完整的全人抗体文库而不产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)。例如，已有报道，嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失，完全抑制了内源性抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这种种系突变小鼠体内，可在抗原刺激下产生全人抗体，参见，例如akobovits et al.,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann et al.,Year in Immunol.,7:33(1993)；U.S.Patent Nos.5,545,806,5,569,825,5,591,669；5,545,807；和WO 97/17852。或者，可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物中(例如内源性免疫球蛋白基因已经被部分或全部沉默的小鼠)来制备全人抗体。抗原刺激后，可以发现全人抗体的产生在各个方面都与其在人类中的产生非常相似，包括基因重排、组装和抗体文库。这种方法在例如U.S.Patent Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；and5,661,016,and Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild et al.,NatureBiotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)中进行了描述。
全人抗体也以通过体外活化B细胞(见U.S.Patents 5,567,610和5,229,275)或通过使用本领域已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991).Cole et al.和Boerner et al.等人的技术也可以用于制备全人单克隆抗体。见Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)and Boerner etal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
抗TNFR2抗体变体
在一些实施例中，也考虑了本文提供的抗TNFR2抗体的变体(例如，全长的抗TNFR2抗体)的氨基酸序列。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学活性。抗体变体的氨基酸序列可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如，抗体氨基酸序列中残基的缺失和/或插入和/或取代。可以通过氨基酸残基缺失、插入和取代的任一组合来完成最终的构建，使其具有所需的特征。例如，抗原结合性。
在一些实施例中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗TNFR2抗体变体。取代突变的目标位点包括高变区(HVRs)和框架区(FRs)。可以在目标抗体中引入氨基酸取代，筛选所需活性的产物，例如，改善的生物活性，保持/改善抗原结合能力，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
保守取代如下表4所示。
表4保守取代
根据侧链性质将氨基酸分为不同类别：
a、疏水氨基酸：去甲亮氨酸Norleucine、蛋氨酸Met、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile；
b、中性亲水性氨基酸：半胱氨酸Cys、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、谷氨酰胺Gln；
c、酸性氨基酸：天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu；
d、碱性氨基酸：组氨酸His、赖氨酸Lys、精氨酸Arg；
e、影响链方向的氨基酸：甘氨酸Gly、脯氨酸Pro；
f、芳香族氨基酸：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe。
非保守氨基酸的取代包含将以上一种类别取代为另一种类别。
一种示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，可采用例如以噬菌体展示为基础的亲和力成熟技术而方便地产生。简言之，将一个或多个CDR残基进行突变，变体抗体部分展示在噬菌体上，并筛选具有特定生物活性(例如，基于抑制TNFR2依赖的Stat5激活实验的生物学活性或结合亲和力)的变体。可以在HVRs区进行改变(例如，取代)，例如，来获得改善基于抑制TNFR2依赖的Stat5激活实验的生物学活性或抗体亲和力。可以在HVR的“热点区”产生改变，即在体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见，例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或在特异的决定性残基(SDRs)，检测所得变体VH和VL的结合亲和力。从二级文库中构建和重新选择亲和力成熟的方法已经在一些文献中进行描述，例如，Hoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,
(2001))。
在一些亲和力成熟的实施例中，通过多种方法中的任一种(例如易错PCR，链改组或寡核苷酸定向突变)，将多样性引入选择的用于亲和力成熟的可变基因中。然后创建二级文库。对该文库进行筛选，鉴定出具有所需亲和力的抗体变体。另一种引入多样性的方法包括HVR介导的方式，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。涉及抗原结合的HVR残基被特异性地识别，例如，采用丙氨酸扫描诱变或建模。通常CDR-H3和CDR-L3区域尤其是重点靶标。
在一些实施例中，取代、插入或缺失可能发生在一个或多个HVRs内，只要这种改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVRs中产生基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，本文中提供的保守性取代)。这些改变可能发生在HVR“热点区”或SDRs区域之外。在一些实施例中上文提供的变体VH和VL序列，每一个HVR或者是未发生改变，或者包含不超过1个、2个或3个氨基酸取代。
一种有用的可以鉴定出抗体中能被靶向性突变的氨基酸残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描突变”，如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085中所述。在该方法中，一个或一组目标残基(例如，带电残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)被中性或带负电荷氨基酸(例如，丙氨酸或谷氨酸)取代，以此来确定抗体与抗原相互作用是否受到影响。可以在氨基酸的位置进一步引入取代，来证明该位置对初始取代具有功能敏感性。或者/另外，通过抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触位点。这些接触位点残基和邻近残基可作为取代候选物而被靶向或消除。筛选变体，确定它们是否具有所需要的性质。
氨基酸序列的插入，包括在氨基端和/或羧基末端的融合，长度范围从1个残基到包含100个或更多个残基的多肽，还包括在序列内插入1个或多个氨基酸残基。末端插入的例子包括N末端具有甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体，包括在抗体分子N-末端或C-末端融合一个酶(例如，ADEPT)或增加抗体血清半衰期的多肽。
Fc区变体
在一些实施例中，将一个或多个氨基酸修饰引入本文所述的抗体(例如，全长抗TNFR2抗体或抗TNFR2抗体融合蛋白)的Fc区，从而产生Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体具有增强的ADCC效能，通常与结合Fc的受体(FcRs)有关。在一些实施例中，Fc区变体具有降低的ADCC效能。有很多关于Fc序列的改变或突变影响其效能的例子，例如，WO 00/42072和Shields et al.J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述了与FcRs的结合增强或减弱的抗体变体。这些出版物的内容通过引用并入本文。
抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是治疗性抗体针对肿瘤细胞的作用机制。ADCC是细胞介导的免疫防御，当靶细胞膜表面的抗原被特异性抗体(例如，抗TNFR2抗体)结合，免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞(例如，癌细胞)。通常ADCC效应涉及由抗体激活的NK细胞。NK细胞表达Fc受体CD16。该受体识别并结合与靶细胞表面相结合的抗体分子的Fc部分。NK细胞表面最常见的Fc受体为CD16或FcγRIII。Fc受体与抗体Fc区的结合导致NK细胞的活化，释放细胞裂解颗粒，随后靶细胞凋亡。ADCC对肿瘤细胞的杀伤作用可以通过转染高亲和力FcR的NK-92细胞的特异性实验来测定。其结果与不表达FcR的野生型NK-92进行比较。
在一些实施例中，本申请还提供抗TNFR2抗体变体(例如全长抗TNFR2抗体变体)，其包含具有部分但不是全部的效应功能Fc区，使得其在体内具有延长的半衰期，然而特定的效应功能(例如CDC或ADCC)是非必需的或有害的，这种抗TNFR2抗体成为本申请理想的候选。通过在体外和/或体内进行细胞毒性检测来确认CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如，通过Fc受体(FcR)结合试验来确认抗体缺乏FcγR结合能力(因此可能缺乏ADCC活性)但依然保留FcRn的结合能力。介导ADCC的主要细胞中，NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464页的表3中总结了FcR在造血细胞上的表达。在体外评估目标分子的ADCC活性的非限制性实例在U.S.Pat.No.5,500,362中进行了描述(参见例如Hellstrom,I.et al.Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))and Hellstrom,I et al.,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；U.S.Pat.No.5,821,337(见于Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性检测方法(参见，例如ACTITM流式细胞术非放射性细胞毒性检测(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.)和CYTOTOX 96TM非放射性细胞毒性检测(Promega,Madison,Wis.))。此类检测实验采用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤细胞(NK)。
或者，另外地，目标分子的ADCC活性在体内进行检测，例如，在动物模型中，如Clynes et al.Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所述。同时还可以进行C1q结合试验来确认抗体不能与C1q结合，从而缺乏CDC活性。参见，例如WO2006/029879和WO2005/100402中C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活情况，可进行CDC检测(参见，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。使用本领域已知的方法来测定FcRn结合和体内清除/半衰期(参见，例如，Petkova,S.B.etal.,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应功能的抗体，包括在Fc区残基238、265、269、270、297、327和329位进行一个或多个残基的取代(U.S.Pat.No.6,737,056)。这些Fc变体包括在265、269、270、297和327位进行两个或多个残基的取代的Fc变体，包括被称为“DANA”的Fc变体，其在265和297位残基取代为丙氨酸(U.S.Pat.No.7,332,581)。
这类与FcRs结合能力提高或降低的抗体变体已有描述(参见例如U.S.Pat.No.6,737,056；WO 2004/056312,和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在一些实施例中，提供一种抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)变体，其包含具有一个或多个能够增强ADCC效应的氨基酸取代的Fc区变体。在一些实施例中，Fc区变体包含一个或多个能够增强ADCC效应的氨基取代，这些取代的位置在Fc区的298、333和/或334位(EU残基编号)。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体(例如，全长的抗TNFR2抗体)变体包括在Fc区的S298A，E333A和K334A位氨基酸取代。
在一些实施例中，Fc区的改变导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的改变(即增强或减弱)，参见U.S.Pat.No.6,194,551,WO 99/51642,和Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在一些实施例中，提供一种抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)变体，其包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc区变体，能够延长半衰期和/或增强与Fc受体(FcRn)的结合。具有延长半衰期和改善FcRn结合的抗体在US2005/0014934A1(Hinton等)中有所描述。这些抗体Fc区包含一个或多个氨基酸取代，增强了Fc区与FcRn的结合。这些Fc变体在Fc区包含238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434位的残基中的一个或多个取代，例如Fc区434位残基的取代(U.S.Pat.No.7,371,826)。
同时参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；U.S.Pat.No.5,648,260；U.S.Pat.No.5,624,821和WO 94/29351中提供其他Fc区变体的例子。
本申请考虑了包括本文所述的任一种Fc变体或其组合的抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)。
糖基化变体
在一些实施例中，对本文所提供的抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)进行改变，以增加或降低抗TNFR2抗体糖基化的程度。通过改变抗TNFR2抗体或其多肽部分的氨基酸序列以此来增加或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地实现添加或删除抗TNFR2抗体上的糖基化位点。
其中抗TNFR2抗体包含Fc区，可以改变与其连接的糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，该寡糖通常通过N-连接与Fc区CH2结构域Asn297连接，参见例如Wright et al.，TIBTECH 15:26-32(1997)。所述寡糖可包含多种糖类，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖苷(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双触角寡糖结构“茎”部的GlcNAc相连接的海藻糖。在一些实施例中，可对本申请的抗TNFR2抗体进行寡糖修饰，从而产生具有某些改进特性的抗TNFR2抗体变体。
与Fc区的CH2结构域连接的N-聚糖是异质的。CHO细胞中产生的抗体或Fc融合蛋白通过岩藻糖基转移酶活性被岩藻糖基化，参见Shoji-Hosaka et al.,J.Biochem.2006,140:777-83。通常，可以在人血清中检测出一小部分天然存在的非岩藻糖基化IgGs。Fc区的N-糖基化对于其与FcγR结合很重要；而非岩藻糖基化的N-聚糖增强了Fc与FcγRIIIa的结合能力。与FcγRIIIa结合能力增强使得ADCC效应增强，这在需要细胞毒性的某些抗体治疗应用中是有利的。
在一些实施例中，当不需要Fc介导的细胞毒作用时，增强的效应功能可能是有害的。在一些实施例中，Fc片段或CH2结构域是非糖基化的。在一些实施例中，通过对CH2结构域中的N-糖基化位点进行突变以阻止其糖基化。
在一些实施例中，提供抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)变体，其包含Fc区，其中连接于Fc区的糖类结构具有减少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，这可能会增强ADCC功能。具体地，本文提供抗TNFR2抗体，其相对于野生型CHO细胞产生的相同抗TNFR2抗体具有减少的岩藻糖。也就是说，它们的特征在于，与天然CHO细胞(例如，产生天然糖基化形式的CHO细胞，含有天然FUT8基因的CHO细胞)产生的抗体相比，具有更少量的岩藻糖。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体的N-连接聚糖具有少于50％、40％、30％、20％、10％或5％的岩藻糖。例如，该抗TNFR2抗体的岩藻糖含量可能是1％-80％、1％-65％、5％-65％或20％-40％。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体的N-连接聚糖不包含岩藻糖，即，其中抗TNFR2抗体完全不含岩藻糖，或没有岩藻糖或是去岩藻糖基化。岩藻糖的含量是通过计算连接到Asn297上的糖链内岩藻糖平均含量相对于通过MALDI-TOF质谱测量的所有连接在Asn297上的糖结构(如复合、杂交或甘露糖结构)的总量来确定的，如WO 2008/077546所述。Asn297是指位于Fc区297位的天冬酰胺残基(EU Fc区残基编号体系)。然而，由于抗体的微小序列变化，Asn297也可位于297位的上游或下游±3个氨基酸，即在294和300位之间。这些岩藻糖基化变体可能具有增强的ADCC功能。参见例如US Patent Publication Nos.US 2003/0157108(Presta,L.)，US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗体变体相关的出版物的实例，包括US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki etal.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系包括缺乏蛋白岩藻糖基化功能的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US Pat Appl No US2003/0157108 A1,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams et al.,尤其是实施例11)，和基因敲除细胞系，例如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8基因敲除的CHO细胞(参见Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)变体进一步涉及二等分寡糖，例如，其中连接于抗TNFR2抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。这种抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)变体可能具有减少的岩藻糖基化和/或增强的ADCC功能。这类抗体变体的实例在WO2003/011878(Jean-Mairet et al.)；U.S.Pat.No.6,602,684(Umana et al.)；US 2005/0123546(Umana et al.),和Ferrara et al.,Biotechnology and Bioengineering,93(5):851-861(2006)中有所描述。还提供抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)变体，其在与Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基。这类抗TNFR2抗体变体可能具有增强的CDC功能。这类变体在例如WO 1997/30087(Patel et al.)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)中有所描述。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)变体能包含能与FcγRIII相结合的Fc区。在一些实施例中，包含Fc区的所述抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)变体在人效应细胞(例如T细胞)存在下具有ADCC活性，或者与具有人野生型IgG1 Fc区的其他相同抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)相比，在人效应细胞存在下，具有增强的ADCC活性。
半胱氨酸工程变体
在一些实施例中，需要制备半胱氨酸工程化的抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)，在该抗体中一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施例中，取代残基出现在抗TNFR2抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，具有活性的巯基基团位于抗TNFR2抗体的可及位点，可以用于将该抗TNFR2抗体与其他部分偶联，例如药物部分或接头-药物部分，来制备如本文中进一步描述的抗TNFR2免疫偶联物。半胱氨酸工程化的抗TNFR2抗体(例如，全长抗TNFR2抗体)可以按照例如U.S.Pat.No.7,521,541所述进行制备。
衍生物
在一些实施例中，本文所提供的抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)可进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的其他非蛋白部分。适用于衍生化抗TNFR2抗体的部分，包括但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例，包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三氧杂环已烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性，在制造中具有优势。聚合物可以具有任意分子量，可以是支链或非支链的。连接在抗TNFR2抗体上的聚合物数量可以变化，并且如果连接多于一个多聚物，它们可以是相同的或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，包括但不限于，需要改进抗TNFR2抗体的特性或功能，抗TNFR2抗体衍生物是否用于特定条件下的治疗等。
药物组合物
本文还提供包含任一种抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)、编码抗体的核酸、包含编码抗体的核酸的载体或者包含本文所述的核酸或载体的宿主细胞的组合物(例如药物组合物，在这里也称为制剂)。在一些实施例中，提供一种药物组合物，包含本文所述的任一种抗TNFR2抗体和药学上可接受的载体。
可通过混合具有所需纯度的抗TNFR2抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))获得合适的抗TNFR2抗体制剂，制备成冻干制剂或液体制剂形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂如：磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)；示例性制剂如WO98/56418中所述，并通过引用明确并入本文。适合皮下给药的冻干制剂在WO97/04801中有所描述。这类冻干制剂可通过合适的稀释剂重构成高蛋白浓度的制剂，并且重构的制剂可以通过皮下给药的方式给予本文中待治疗个体。阳离子脂质体或脂质体可以用于将本申请中的抗TNFR2抗体递送至细胞。
本文所述的制剂除包含抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)之外，还可以包含一种或多种治疗特定病症所必要的其他活性物质，优选具有活性互补且彼此无不良反应的物质。例如，除了抗TNFR2抗体之外，可能需要进一步包含，例如，抗肿瘤药剂、生长抑制药剂、细胞毒性药剂或化疗药剂。这些分子以对预期目的有效的量组合存在。其他这些物质的有效量取决于制剂中的抗TNFR2抗体的含量，疾病或病症或治疗的类型，以及如上所述的其他因素。这些药物通常以与本文描述的相同剂量和给药途径使用，或者以目前应用剂量的1％至99％使用。
所述抗TNFR2抗体(例如，全长抗TNFR2抗体)也可以包埋在例如通过凝聚技术和界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。可以制备缓释制剂。
可以制备抗TNFR2抗体(例如，全长抗TNFR2抗体)的缓释制剂。缓释制剂的适合的实例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水聚合物半透性基质，这些基质是成型制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(U.S.Pat.No.3,773,919)，L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)以及聚-D(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物可以使分子的释放超过100天，某些水凝胶可以在更短的时间内释放蛋白质。当包封的抗体在体内长时间停留时，它们会因暴露于37℃的潮湿环境中发生变性或聚集，可能导致生物活性的丧失或免疫原性的改变。可以根据相应的机制，设计合理的策略来稳定抗TNFR2抗体。例如，如果发现聚集机制是通过硫代二硫化物交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基残基、在酸性溶液中冻干、控制含水量、使用适当的添加剂、以及开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。
在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)在含有柠檬酸盐、氯化钠、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨酯80(吐温80)或上述任何组合的缓冲液中配制。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过例如应用无菌过滤膜过滤而容易地实现。
使用抗TNFR2抗体的治疗方法
抗TNFR2抗体(例如，全长的抗TNFR2抗体)和/或本申请所述的组合物可以施用于个体(例如，哺乳动物，如人类)来治疗与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)。在一些实施例中，抗TNFR2抗体通过阻断TNFR2的免疫抑制作用增强免疫反应，例如，在肿瘤微环境中。这些疾病包括，但不限于，非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌。因此，在一些实施例中，本申请提供了一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向该个体施用有效量的组合物(如药物组合物)，该组合物包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)，如本文所述的任一种抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)。在一些实施例中，该个体是人类。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含特异性结合人TNFR2表位的抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述表位包含如SEQID NO:83所示人TNFR2序列的氨基酸残基Arg99、Lys108、Glu110、Gly111、Arg113、Leu114和Asp136。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:7；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:14，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:20；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:27；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:33，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:39或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:39具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:63或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:63具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:21；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:34，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:40或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:40具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:64或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:64具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:22；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:35，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:41或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:41具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:65或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:65具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:42或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:42具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:66或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:66具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:43或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:43具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:67或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:67(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:44或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:44具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:68或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:68(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)具有至少约80％序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
例如，在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含：VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6；HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13；和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26；LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32；和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。在一些实施例中，所述抗TNFR2抗体是全长抗体。在一些实施例中，所述全长抗TNFR2抗体是IgG1或IgG4抗体。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:45或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:45具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ IDNO:69或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:69具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，提供一种治疗个体中与TNFR2信号传导相关的疾病和/或病症(例如，癌症或感染性疾病)的方法，包括向所述个体施用有效量的包含抗TNFR2抗体(如全长抗TNFR2抗体)的药物组合物，其中所述抗TNFR2抗体包含VH，其包含SEQ ID NOs:46-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NOs:46-62中任一所示的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性；以及VL，其包含SEQ ID NOs:70-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:70-77中任一所示的氨基酸序列具有至少约80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些实施例中，疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组。在一些实施例中，所述个体是人类。
在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:70。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:49，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:56，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:72。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:57，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:58，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:59，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:60，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:61，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，本文所述抗TSLP抗体包含VH，所述VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:62，以及VL，所述VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:75。在一些实施例中，本文所述抗TNFR2抗体是包含IgG1或IgG4恒定区的全长抗TNFR2抗体。在一些实施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些实施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ IDNO:78组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:82组成。在一些实施例中，重链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:79组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:80组成。在一些实施例中，轻链恒定区包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:81组成。
在一些实施例中，所述个体是哺乳动物(例如人、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在一些实施例中，所述个体是人类。在一些实施例中，所述个体是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等。在一些实施例中，所述个体年龄小于60岁(包括例如小于50、40、30、25、20、15或10岁)。在一些实施例中，所述个体年龄大于60岁(包括例如大于70、80、90或100岁)。在一些实施例中，所述个体是被诊断为或在遗传角度上易患本文所描述的一种或多种疾病或病症(例如癌症或感染性疾病)。在一些实施例中，所述个体具有一种或多种与本文所述的一种或多种疾病或病症相关的风险因子。
在一些实施例中，本申请提供一种向个体中对表面表达TNFR2的细胞递送抗TNFR2抗体(例如本文所述的任一种抗TNFR2抗体，例如分离的抗TNFR2抗体)的方法，所述方法包括向该个体施用包含抗TNFR2抗体的组合物。
癌症或感染性疾病或任何其他与TNFR2信号传导相关的疾病的许多诊断方法和这些疾病的临床描述在本领域是已知的。这类方法包括，但不限于，例如免疫组化、PCR以及荧光原位杂交(FISH)。
在一些实施例中，本申请所述抗TNFR2抗体(例如，全长抗TNFR2抗体)和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如，抗肿瘤药剂、生长抑制剂、细胞毒性药剂、免疫疗法或化疗剂)联合使用来治疗与TNFR2信号传导相关的疾病或病症，包括与TNFR2表达或过表达相关的癌症。
癌症治疗可通过例如，肿瘤消退、肿瘤重量或大小缩小、进展时间、生存期、无进展生存期、总缓解率、缓解期、生活质量、蛋白质表达和/或活性进行评估。可以采用确定治疗效果的方法，包括例如，通过放射成像测量反应。
在一些实施例中，以肿瘤生长抑制率(％TGI)衡量治疗效果，使用等式100-(T/C×100)计算，其中T是治疗肿瘤的平均相对肿瘤体积，C是未治疗肿瘤的平均相对肿瘤体积。在一些实施例中，％TGI为约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或大于95％。在一些实施例中，使用粒细胞的形状变化和/或粒细胞存活率的增加来衡量治疗效果。在一些实施例中，通过单核细胞分泌细胞因子的增加来衡量治疗效果。
施用抗TNFR2抗体的剂量和方法
施用于个体(例如人)的抗TNFR2抗体(例如分离的抗TNFR2抗体)组合物的剂量可能因特定组合物、给药方式和治疗疾病类型的不同而不同。在一些实施例中，组合物(例如，包含分离的抗TNFR2抗体的组合物)的量可在癌症或感染性疾病治疗中有效地产生客观响应(例如，部分响应或完全响应)。在一些实施例中，抗TNFR2抗体组合物的量足以在个体中产生完全响应。在一些实施例中，抗TNFR2抗体组合物的量足以在个体中产生部分响应。在一些实施例中，抗TNFR2抗体组合物的给药剂量(例如当单独施用时)足以在使用抗TNFR2抗体组合物治疗的个体群体中产生高于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、64％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的总响应率。个体对本文所述治疗方法的响应可以确定，例如，根据RECIST评分。
在一些实施例中，组合物(例如包含分离的抗TNFR2抗体的组合物)的量足以控制症状和降低个体病情恶化的风险。在一些实施例中，组合物的量足以控制症状和降低个体病情恶化的风险。在一些实施例中，在使用抗TNFR2抗体组合物治疗的个体群体中，组合物的量(例如当单独施用时)足以产生高于50％、60％、70％或77％的临床益处。
在一些实施例中，组合物(例如包含分离的抗TNFR2抗体的组合物)的量，在单独使用或与第二，第三、和/或第四药剂联合使用时，与同一受试者治疗前相比或与未接受治疗的其他受试者的相应活性相比，其足以控制症状和降低个体病情恶化的风险。可以采用标准方法来测量该疗效的大小，例如纯化酶的体外检测、基于细胞的检测、动物模型或人体试验。
在一些实施例中，当将组合物施用于个体时，组合物中抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的量低于引起毒性效应(即，一种高于临床可接受毒性水平的效应)的水平，或者处于潜在副作用可以控制或耐受的水平。
在一些实施例中，遵循相同的给药方案，组合物的量接近组合物的最大耐受剂量(MTD)。在一些实施例中，组合物的量高于MTD的80％、90％、95％或98％。
在一些实施例中，组合物中抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的含量在0.001μg到1000μg的范围之内。
在如上所述任一个实施例中，组合物中的TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的有效量，按照体重计算，为0.1μg/kg到100mg/kg的范围之内。
抗TNFR2抗体组合物可通过多种途径施用于个体(如人类)，包括，例如静脉注射、动脉内给药、腹腔注射、肺内给药、口服给药、吸入给药、血管内给药、肌肉注射、气管内给药、皮下注射、眼内给药、鞘内给药、粘膜给药或经皮给药。在一些实施例中，使用组合物的缓释制剂。在一些实施例中，组合物通过吸入给药。在一些实施例中，组合物通过静脉给药。在一些实施例中，组合物通过口内给药。在一些实施例中，组合物通过动脉给药。在一些实施例中，组合物通过腹膜内给药。在一些实施例中，组合物通过肝内给药。在一些实施例中，组合物通过肝动脉输注给药。在一些实施例中，组合物施用于远离第一病灶的部位。
制品及试剂盒
在本申请的一些实施例中，提供一种制品，所述制品包含一种物质，所述物质能够用于治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)，或者用于递送抗TNFR2抗体(例如一种全长抗TNFR2抗体)到表面表达TNFR2的细胞。所述制品可以包括一种容器以及在容器上或随该容器附带的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。通常，该容器内装有能够有效治疗本文所述疾病或病症的组合物，并且具有一个无菌端口(例如该容器可以是一个静脉输液袋或是一个具有皮下注射针头可刺穿盖子的小瓶)。组合物中的至少一种活性物质即为本申请所述的抗TNFR2抗体。标签或包装说明书标示了该组合物可以用于治疗的特定病症。标签或包装说明书进一步包含给患者施用抗TNFR2抗体组合物的说明书。包括联合治疗的制品和试剂盒均在本文的考虑范围之内。
包装说明书是指通常包含在治疗产品的商业包装内的说明书，其包含关于与这些治疗产品使用有关的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告信息。在一些实施例中，包装说明书标明该组合物可以用于治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)。在一些实施例中，包装说明书标明该组合物可以用于治疗选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌组成的组中的疾病或病症。
此外，所述制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲液、格林氏溶液或葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户角度而言所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针头和注射器。
同时还提供可用于各种目的的试剂盒，例如用于治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)，或者用于递送抗TNFR2抗体(例如全长抗TNFR2抗体)到表面表达TNFR2的细胞中，任选与制品组合。本申请的试剂盒包括一个或多个容器，其包含抗TNFR2抗体组合物(或单剂量形式和/或制品)，并且在一些实施例中，进一步包含另一种药剂(例如本文所述的药剂)和/或与本文所述任一方法相一致的使用说明书。该试剂盒可进一步包括选择适合治疗个体的描述。本申请中试剂盒中所附带的使用说明书通常是标签或包装说明书上的书面说明(例如包含在试剂盒内的纸页)，机器可读的说明(例如，磁性或光学储存光盘上的说明)也是可以接受的。
例如，在一些实施例中，试剂盒包括一种包含抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的组合物。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗TNFR2抗体的组合物，和b)至少一种有效量的其他药剂，其能够增强抗TNFR2抗体的效果(如治疗效果、检测效果)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗TNFR2抗体的组合物，和b)向个体施用抗TNFR2抗体组合物用于治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)的使用说明书。在一些实施例中，试剂盒包括：a)包含本文所述的任一种抗TNFR2抗体的组合物，和b)至少一种有效量的其他药剂，其能够增强抗TNFR2抗体的效果(如治疗效果、检测效果)和c)向个体施用抗TNFR2抗体组合物和其他物质用于治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)的使用说明书。所述抗TNFR2抗体和其他药剂可以存在于独立的容器或同一个容器中。例如，该试剂盒可以包括一种特定组合物或两种或更多种组合物，其中一种组合物包括抗TNFR2抗体，另一种组合物包括另一种药剂。
在一些实施例中，试剂盒包含一种(或一组)编码抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的核酸。在一些实施例中，试剂盒包含：a)一种(或一组)编码抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的核酸，和b)一种表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞。在一些实施例中，试剂盒包含：a)一种(或一组)编码抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的核酸，和b)使用说明书，适用于：i)在宿主细胞中表达抗TNFR2抗体，ii)制备包含抗TNFR2抗体的组合物，和iii)向个体施用包含抗TNFR2抗体的组合物来治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)。在一些实施例中，试剂盒包括：a)一种(或一组)编码抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的核酸，b)一种表达核酸(或一组核酸)的宿主细胞，和c)使用说明书，适用于：i)在宿主细胞中表达抗TNFR2抗体，ii)制备包含抗TNFR2抗体的组合物，和iii)向个体施用包含抗TNFR2抗体的组合物来治疗与TNFR2信号传导有关的疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)。
本申请所述的试剂盒以合适的形式进行包装。合适的包装包括，但不限于，小瓶、瓶子、广口瓶、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。试剂盒可以任选地提供其他的组分，例如缓冲液和说明信息。因此，本申请还提供制品，其包括小瓶(如密封的小瓶)、瓶子、广口瓶、软包装等。
关于抗TNFR2抗体组合物的使用说明书，通常包括一些信息，诸如，剂量、给药周期和给药途径。容器可以是单位剂量的，大包装的(如，多剂量包装)或亚单位剂量的。例如，提供一种包含足够剂量的如本文所述的抗TNFR2抗体(例如全长的抗TNFR2抗体)的试剂盒以对个体进行长期有效的治疗，例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周，8周，3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更长时间。试剂盒还可包含多单位剂量的抗TNFR2抗体、药物组合物和使用说明书，并且以足够在药房中储存和使用的量进行包装，例如，医院药房和复方药房。
本领域的技术人员将认识到在本申请的范围和宗旨内可能的若干实施例。现在将通过参考以下非限制性实施例来更详细地描述本申请。以下实施例进一步阐明本申请，但不应解释为以任何方式进行限制其范围。
具体实施方式
以下典型示例对本发明的各种特征和实施例进行了说明，这些示例旨在说明而非限制。本领域技术人员能轻而易举地理解，具体示例仅为本发明的说明性示例，在后面的权利要求中进行更充分地描述。本申请描述的每个实施例和特征应理解为可与申请中包含的每个实施例互换和组合。
实施例1：制备TNFR2多肽
本示例旨在说明各种TNFR2多肽构建体的制备，所述TNFR2多肽构建体在诱导产生和筛选本公开的抗TNFR2抗体中用作抗原。
合成人TNFR2(huTNFR2)、小鼠TNFR2(musTNFR2)或食蟹猴TNFR2(cynoTNFR2)胞外域(ECD)编码序列并使用限制性内切酶将其亚克隆到表达载体pTTal上，识别位点为EcoRI和HindIII。氨基酸序列如表5所示。为了进行纯化和检测，所有构建体均具有以下的序列：位于C端的人IgG1 Fc，位于C端的小鼠IgG2a Fc或位于C端的10×His-tag序列。
表5TNFR2多肽序列
按照制造商的操作说明书在Expi293细胞(Thermo Fisher Scientific)中表达融合蛋白。简而言之，分别用表达载体对293F细胞进行转染，并将上述细胞在37℃、8％ CO2和120rpm条件下培养5天。
为纯化Fc融合蛋白，收集后，将澄清的上清培养基与用PBS缓冲液平衡的MabSelect蛋白A树脂(GE Healthcare)混合，室温温和旋转孵育1.5h。孵育后，将悬浮液装入柱中，用20倍柱体积的包含0.15M NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂，然后用3倍柱体积的50mM磷酸钠(pH 3.0)洗脱。用1M Tris-HCl(pH 9.0)将洗脱液的pH快速调至pH 5.2，并将缓冲液替换为PBS缓冲液。
为纯化His-tag蛋白，收集后，将澄清的上清培养基装入预先用含有0.25M NaCl和5mM咪唑(pH 8.0)的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)平衡的Histrap柱(GE Healthcare)中。用10倍柱体积的含有0.25M NaCl和15mM咪唑(pH 8.0)的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗涤柱子，然后用3倍柱体积的含有0.25M NaCl和100mM咪唑(pH 8.0)的20mM磷酸钠缓冲剂(pH7.4)洗脱。将洗脱缓冲液替换为PBS缓冲液。
实施例2：使用杂交瘤法制备抗TNFR2抗体及其筛选与鉴定
本示例旨在说明使用小鼠杂交瘤技术制备抗TNFR2抗体的方法，以及筛选和选择抗体以进一步表征的方法。
免疫接种和融合：用Expi293或CHO细胞中产生的与His-或小鼠IgG2a Fc融合的人TNFR2重组ECD免疫Balb/c和NZB小鼠，RIBI(Sigma Aldrich，cat#S6322-1VL)、Titermax(Sigma Aldrich，cat#T2684-1ML)或/和Freund's(Freund佐剂，不完全)(Sigma Aldrich，cat#F5506-10x-10mL)作为佐剂。如下文所述，通过ELISA测定终点滴度。最后一次免疫后三天，根据标准操作说明书采集脾脏和淋巴结并进行处理。用EasySep小鼠B细胞分离试剂盒(StemCell，cat#19854A)分离小鼠B细胞，并用PEG将上述细胞与骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14细胞(ATCC，CRL 1581)融合。按照标准操作说明书，将融合细胞接种在半固态克隆细胞HY克隆培养基D(StemCell，cat#03804)的六孔板中。使用ClonePix 2仪器(Molecular Devices)将单克隆杂交瘤克隆挑选到96孔/板中，并在HT培养基中培养。
ELISA实验：培养10-14天后，收集上清液，并用带有His或人Fc标签的人或食蟹猴TNFR2胞外域蛋白包被的96孔ELISA板，通过ELISA进行初筛。上述蛋白在包被缓冲液中(1×磷酸盐缓冲液，PBS)的浓度为1μg/mL或0.5μg/mL，将其以50μL/孔包被96孔圆底ELISA板(corning，cat#25381-051)，4℃下过夜。去除包被液后，以250μL/孔加入封闭液以封闭平板，并在室温下孵育2小时，所述封闭液为含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4)。然后用300μL含有0.05％-20(洗涤缓冲液)的PBS洗板3次。将50μL单个的杂交瘤克隆的培养上清液(或指定浓度的纯化抗体)加入单个孔中，然后在室温下孵育2小时或在37℃下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗板3次后，按50μL/孔加入1:2000稀释的山羊抗小鼠抗体-AP(Southern Biotech，cat#1030-04)。室温下孵育平板1小时，用洗涤缓冲液洗4次，并加入50μL/孔的Sigma快速对硝基苯磷酸片(pNPP)(Sigma-Aldrich，cat#N2770-50SET)显色30分钟。在405nm处，用Synergy HT(Bio-TEK)分析平板。
从初筛中鉴定获得的亲本杂交瘤在48或24孔板中扩大培养，并根据初筛操作方法进行验证性ELISA，以进一步确认和筛选抗人或抗食蟹猴TNFR2结合物。
杂交瘤受体阻断试验：进一步测试在初筛中鉴定的杂交瘤上清液阻断人TNFR2与人TNFα之间生化结合的能力。人TNFα重组蛋白(R&D system，Cat#210-TA-100)在包被缓冲液中浓度为0.5μg/mL，将其按50μL/孔包被96孔圆底ELISA板，4℃下过夜。去除包被缓冲液后，将封闭缓冲液加入板中，室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。在封闭期间，将杂交瘤抗体样品与0.5μg/mL TNFR2-huFc以1:1的体积比混合，并在室温下再孵育1.5小时。然后将抗原抗体混合溶液以50μL/孔转移到TNFα包被的孔中，并在室温下孵育1.5小时。用洗涤缓冲液洗板5次。然后，按50μL/孔加入在分析缓冲液中以1:2000稀释的山羊抗人IgG Fc-AP(Southern Biotech，cat#2014-04)，室温下孵育1小时，用洗涤缓冲液洗4次，并用50μL/孔的pNPP底物显色30分钟。在405nm处，用Synergy HT(Bio-TEK)分析平板。具有预期的与人和食蟹猴TNFR2结合以及阻断人TNFR2与人TNFα结合的能力的亲本杂交瘤被优先用于亚克隆并进行进一步表征。用有限稀释法进行亚克隆，通过目测以确保克隆性。用相同的结合和阻断试验筛选杂交瘤亚克隆，冷冻保存所挑选出的阳性克隆。
杂交瘤抗体的纯化：通过初筛抗原结合ELISA确定杂交瘤克隆。阳性克隆在无血清培养基中扩大至30mL，抗体纯化方法如下所述。在300g条件下离心10分钟以去除细胞，并用0.22微米过滤器过滤，以澄清上清培养基。澄清的上清液培养基与用PBS缓冲液平衡后的蛋白A树脂(Thermo Fisher Scientific，cat#A26458)混合，并在室温下缓慢旋转孵育1.5小时。孵育后，将悬浮液装入柱中，用10倍柱体积的含有0.5M NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.8)洗脱。用1M Tris-HCl(pH 8.5)快速中和洗脱液，并将缓冲液替换为PBS。根据上述的操作方法进一步验证纯化的杂交瘤抗体的结合和阻断功能。
杂交瘤抗体克隆的测序及扩增
提取RNA：在T75烧瓶中，单克隆抗人TNFR2杂交瘤在标准杂交瘤培养基(DMEM/F12，10％FBS，1％谷氨酰胺，1％pen/strep)中生长7-10天，直至细胞密度为1-3×105，细胞活力>80％。从培养物中取100-300万个细胞于15mL离心管中，300g离心5分钟以沉淀细胞。用5mL预冷的PBS清洗沉淀的细胞。去除PBS，将细胞重新悬浮于600uL缓冲液RLT Plus(Qiagen，cat#74134)中。按照制备操作说明书(Qiagen，cat#74134)从裂解物中分离总RNA。
PCR扩增以制备cDNA：利用特异的反向PCR引物与重链和κ链的转换寡核苷酸共同合成cDNA。为合成cDNA，使用1μg RNA作为模板，然后用Clontech(TAKARA，cat#639537)的SMART Scribe逆转录酶试剂盒进行逆转录。此外，试剂还包括10uM引物(Integrated DNAtechnologies)、10mM脱氧核苷酸三磷酸混合物(New England Biolab，cat#N0447S)、水和80U/μLRNAse抑制剂(Invitrogen，cat#10000840)。恒定区域特异性反向引物与通用正向引物一起用于5'-RACE-PCR反应。PCR产物经凝胶纯化并克隆到TOPO-TA载体(ThermoFisher，cat#451641)上，然后转化感受态细胞(Thermo Fisher，cat35#451641)。在转化和蓝/白斑筛选后，挑选白色菌落并在含有羧苄青霉素的LB肉汤培养基中培养过夜。使用M13正向和T7正向引物对Miniprep纯化的质粒进行测序。抗人TNFR2杂交瘤的可变结构域序列总结在表2A和3A，并在所附序列表中提供。
实施例3：抗TNFR2嵌合抗体体外试验
本示例旨在说明用于表征抗TNFR2嵌合抗体功能活性的细胞学试验。
制备抗TNFR2抗体重组IgG1变体
利用本领域已知的方法制备具有小鼠抗TNFR2抗体重链和轻链可变区和人恒定区的重组抗TNFR2嵌合抗体构建体。示例性的人重链恒定区和轻链恒定区的序列如表3B所示。根据提供的操作说明书，使用Expi293表达系统表达重组抗TNFR2嵌合抗体。以1:1的比例将重链和轻链质粒共转染到细胞中，转染的细胞培养6天后收集。
按照以下操作说明书纯化重组IgG分子。300g离心10分钟去除细胞并用0.22μm过滤器过滤，以澄清上清培养基。将澄清的上清培养基与用PBS缓冲液平衡后的MabSelect蛋白A树脂混合，并在室温下缓慢旋转孵育1.5小时。孵育后，将悬浮液装入柱中，用20倍柱体积的包含0.15M NaCl的PBS缓冲液洗涤树脂，然后用3倍柱体积的50mM磷酸钠(pH 3.0)洗脱。用1M Tris-HCl(pH 9.0)将洗脱液的pH快速调整至pH 5.2，并将缓冲液替换为PBS缓冲液。
纯化的重组嵌合抗体与TNFR2结合：对纯化的重组嵌合抗体进行huTNFR2、cynoTNFR2抗原结合ELISA。简而言之，用PBS中浓度为1μg/mL的huTNFR2或食蟹猴TNFR2-His包被384孔、透明、平底、高结合板(VWR，cat#29444-096)，4℃过夜。去除包被溶液，加入封闭缓冲液封闭平板，并在室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗板3次。将在PBS中连续稀释的纯化抗体加入单个孔中，室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗板3次。然后按50μL/孔加入在ELISA稀释液中以1:3000稀释的山羊抗hu-Kappa-AP(Southern Biotech，cat#2061-04)或1:3000稀释的山羊抗人IgG Fc-AP，室温下孵育1小时，用洗涤缓冲液洗5次，按50μL/孔加入pNPP底物显色30分钟。在405nm处，用Bio-TEK分析平板。嵌合TNFR2抗体与huTNFR2和cynoTNFR2的结合试验呈阳性。TNFR2结合EC50值如表6、图1A(和huTNFR2的结合)和图1B(和cynoTNFR2的结合)所示。
表6
EC50(nM) 51B5 102E4 29G3 85G8.4 15H10 11C1
huTNFR2 0.03648 0.0400 0.02928 0.03903 0.05105 0.05075
cynoTNFR2 0.04938 0.3379 0.04137 0.0488 0.04995 0.05698
纯化的重组嵌合抗体阻断TNFR2：按照上述相同方案对纯化的重组嵌合体抗体进行人TNFR2阻断ELISA，不同之处仅在于向反应中按50μL/孔加入用分析缓冲液连续稀释(从10μg/mL开始，1:3稀释)的纯化抗体。阻断IC50值表示抑制50％的huTNFR2或cynoTNFR2与包被的人TNFα或食蟹猴TNFα结合时的抗体浓度。如表7、图2A(和huTNFR2的结合)和图2B(和cynoTNFR2的结合)所示，所有TNFR2抗体都能够与huTNFR2或cynoTNFR2结合，阻止TNFR2与其配体人TNFα或食蟹猴TNFα的结合，但102E4除外，102E4不能阻断食蟹猴TNFα与cynoTNFR2结合。
表7
IC50(nM) 51B5 102E4 29G3 85G8.4 15H10 11C1
huTNFR2 0.5168 1.130 0.5052 0.5834 0.5839 0.7228
cynoTNFR2 0.9682 / 0.9271 1.021 1.008 1.094
嵌合抗TNFR2抗体的非特异性结合评价：
使用胰岛素、双链DNA(dsDNA)和杆状病毒颗粒(BVP)ELISA评价嵌合抗TNFR2抗体的非特异性结合(参见Hotzel et al.,MAbs 2012；4(6):753-60.)。简而言之，用胰岛素、dsDNA或杆状病毒颗粒的1％悬浮液包被96孔Maxisorp板(BlueSky Biotech)，4℃过夜。然后在室温下用含有1％BSA和0.05％Tween-20的PBS封闭平板1小时。在平板中加入用含有0.5％BSA的PBS连续稀释的嵌合TNFR2抗体，孵育1小时，然后用PBS洗板。具有高非特异结合的Boco(Bococizumab，Pfizer)和低非特异结合的Evo(Evolocumab，Amgen)作为对照。在ELISA缓冲液中，用山羊抗人IgG-Fc-AP检测结合抗体。在室温下搅拌孵育平板1小时，用洗涤缓冲液洗6次，并按50μL/孔加入pNPP底物显色3-10分钟。在405nm处，用Biotek Gen5平板阅读器(BioTek)分析平板，并与对照抗体进行比较。抗TNFR2嵌合抗体均未检测到与dsDNA、胰岛素和BVP的结合(图3A-3C)。抗体不与人CD40、4-1BB、TNFR1、CD27、GITR、FAS、LTβR和小鼠TNFR2结合(数据未显示)。
结合亲和力测定：
在Octet RED96仪器上，使用生物层干涉法在30℃和1200rpm搅拌下测量抗TNFR2抗体的结合亲和力(单价Kd)。使用动力学缓冲液(PBS、0.1％Tween-20和1％牛血清白蛋白)中的抗人IgG-Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio)进行以下动力学分析：(a)抗体(2μg/mL)300秒，(b)基线120秒，(c)与His-tag-huTNFR2(2.5、0.5和0μg/mL)和His-tag-cynoTNFR2(2.5、0.5和0μg/mL)结合420秒，以及(d)解离1200秒。Savitzky-Golay过滤后，使用Octet数据分析软件8.0(ForteBio)利用1:1结合模型进行数据拟合和分析。计算Koff/Kon的比值，作为平衡解离常数(Kd)，总结在表8(如下)中。
表8抗TNFR2 IgGs与huTNFR2和cynoTNFR2的结合亲和力
与表达huTNFR2的细胞结合
为检测抗TNFR2抗体与表达huTNFR2的细胞的结合，我们使用稳定表达huTNFR2的Expi293细胞进行FACS分析。
将huTNFR2(Uniprot，P20333)的编码序列克隆到慢病毒载体中，并根据病毒包装试剂盒(Lenti-XTMPackaging Single Shots，Cat#631275,Takada)的说明书包装病毒。重组病毒转导Expi293细胞，并用嘌呤霉素筛选。将稳定表达huTNFR2的细胞系与抗TNFR2抗体在含有0.5％BSA、1mM EDTA和0.1％叠氮化钠(FACS缓冲液)的PBS中，4℃孵育30分钟。洗涤细胞，将细胞与10nM藻红蛋白(PE)结合的抗人Fc抗体(Biolegend，cat#409304)在4℃下孵育20分钟。洗涤细胞，用Attune(ThermoFisher Scientific)流式细胞仪分离细胞。使用FlowJo软件分析数据。用平均荧光强度(MFI)表示抗体结合。
表9
抗体 51B5 102E4 29G3 85G8.4 15H10 11C1
EC50(nM) 0.6258 0.8191 0.6537 1.465 2.522 2.045
结果如表9和图4A所示，抗TNFR2抗体51B5、102E4、85G8.4、29G3、11C1和15H10与Expi293-TNFR2细胞能有效地结合，且其结合具有剂量依赖性。
与huTNFR2-Expi293细胞结合并阻断TNFα的结合
将稳定表达huTNFR2的Expi293细胞与抗TNFR2抗体在4℃下孵育30分钟。洗涤细胞，将细胞与连接有10 nM Alexa Fluor 647的(ThermoFisher Scientific，cat#A20186)人TNFα(SinoBiogical，cat#10602-HNAE)在4℃下一起孵育20分钟。洗涤细胞并用流式细胞仪收集细胞。使用FlowJo软件分析数据。用MFI表示TNFα结合。
表10
抗体 51B5 29G3 85G8.4 15H10 11C1
IC50(nM) 0.4932 0.2749 1.574 3.368 2.511
如表10和图4B所示，抗TNFR2嵌合抗体51B5、85G8.4、29G3、11C1和15H10能有效地抑制可溶性TNFα与表达TNFR2的Expi293细胞结合，且其抑制具有剂量依赖性。
人调节性T(Treg)细胞高水平表达TNFR2
本实验探讨了TNFR2在人免疫细胞中的表达水平。以下抗体用于染色：抗人CD3(BDBiosciences，cat#557705)、抗人CD4(Biolegend，cat#317424)、抗人CD8(BDBiosciences，cat#557760)、抗人Foxp3抗体(Fisher Scientific，cat#50-151-75)、抗人TNFR2(R&DSystem，cat#FAB226P)、人TruStain FcX(Biolegend，cat#422302)。人原代外周血单个核细胞(PBMCs)(StemCell Technologies，cat#70025)在加入/不加入200U/ml IL-2(Peprotech，cat#200-02)的条件下培养3天。然后将其与Fc阻断抗体在4℃下孵育10分钟，用抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体在4℃下染色20分钟。洗涤细胞并用固定/透化缓冲液(ThermoFisher Scientific，cat#00-5523-00)在4℃下固定/透化30分钟。用1×透化缓冲液洗细胞，并在1×透化缓冲液中用抗Foxp3抗体在4℃下染色30分钟。洗涤细胞，用2％PFA固定，用流式细胞仪进行分离和分析。用FlowJo软件分析Treg细胞和效应细胞(CD4+Foxp3细胞)中TNFR2的表达(MFI)。
如图5所示，与效应细胞相比，Treg细胞显示出更高的TNFR2表达。IL-2未显著增加TNFR2的表达。
人原代Treg细胞测定
检测了抗TNFR2抗体对人原代Treg细胞的功能活性。于圆形底板中，将PBMC与200U/ml IL-2和20ng/ml TNFα在存在或不存在抗TNFR2抗体的完整培养基中37℃下孵育72小时。在4℃下，用抗CD3抗体和抗CD4抗体在FACS缓冲液中染色细胞30分钟。洗涤细胞，并在4℃下用固定/透化缓冲液固定/透化30分钟。然后用1×透化缓冲液洗涤，并在4℃下用抗人Foxp3抗体在1×透化缓冲液中染色30分钟。洗涤细胞，用2％PFA固定，用流式细胞仪进行分离和分析。用FlowJo软件分析Foxp3+细胞在CD4+细胞中的百分比。
表11
抗体 51B5 102E4 29G3 85G8.4 15H10 11C1 6F12
EC50(nM) 0.1432 0.3327 0.2656 0.4808 0.7434 0.5782 0.3569
如表11和图6所示，抗TNFR2抗体51B5、102E4、85G8.4、29G3、11C1、6F12和15H10能有效地抑制PBMC中Treg细胞的增殖，且该抑制具有剂量依赖性。
实施例4：纯化的嵌合抗TNFR2抗体的结构域结合位点解析
一组小鼠-人嵌合TNFR2构建体，其中小鼠受体的半胱氨酸富集区(CRDs)分别被人受体的相应区域替换，或反之(图7)：按上述方法重组制备huTNFR2-musCRD1(ECD)、huTNFR2-musCRD2(ECD)、huTNFR2-musCRD3(ECD)、huTNFR2-musCRD4(ECD)、musTNFR2-huCRD1(ECD)、musTNFR2-huCRD2(ECD)、musTNFR2-huCRD3(ECD)和musTNFR2-huCRD4(ECD)。构建体的氨基酸序列如表12所示。通过ELISA进行表位解析实验，在平板上捕获抗体，分别检测其与重组hu/mus TNFR2嵌合蛋白的结合。结果如表13所示，鉴定了与人TNFR2受体CRD3结合的TNFR2抗体51B5。
表12TNFR2多肽序列
表13表位解析
实施例5：制备51B5的人源化变体
本示例旨在说明制备来自杂交瘤克隆51B5的鼠抗人TNFR2抗体的人源化变体。
鼠抗人TNFR2抗体的人源化
将来自杂交瘤51B5的小鼠抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列分别与人种系抗体序列进行比对。人种系κ轻链(Gene ID-V gene:IGKV4_1*01)和重链(Gene ID-Vgene:IGHV1_8*01和IGHV1-46*01)作为人框架。
将小鼠TNFR2抗体轻链和重链的互补决定区(CDR)分别移植到经鉴定最接近的人框架中，以制备人源化抗体克隆。在此过程中，通过将来自小鼠抗体V区的CDR移植到人种系抗体V区框架上，使抗体51B5人源化，从供体移植到受体序列的CDR由Kabat定义(Kabat etal.,1987)。为了恢复抗体的活性，在人源化序列中还保留了来自小鼠V区的许多框架残基，发现这些V区是部分VH-VL相互作用界面，或是“Vernier”区的框架残基，这可以调整CDR结构并微调以适合抗原结合(Foote et al.,1992)。
人源化抗体的可变区序列总结在表2B和3B中。
实施例6：人源化抗TNFR2抗体的体外试验
制备重组的IgG形式的人源化抗TNFR2抗体
按上述方法制备全长IgG形式的人源化抗TNFR2抗体(重构为IgG1)。
与表达huTNFR2的细胞的结合
如上文实施例3所述，检测人源化抗TNFR2抗体与表达huTNFR2的细胞的结合。结果如表14所示。
表14
结合亲和力
在Octet RED96仪器(ForteBio)上，使用生物层干涉法在30℃和1200rpm条件下测定抗TNFR2抗体的结合亲和力(单价Kd)。使用动力学缓冲液(PBS、0.1％Tween-20和1％牛血清白蛋白)中的抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio)进行以下动力学分析：(a)抗体(2μg/mL)300秒，(b)基线120秒，(c)与His-tag-huTNFR2(2.5、0.5和0μg/mL)结合420秒，以及(d)解离1200秒。Savitzky-Golay过滤后，使用Octet数据分析软件8.0(ForteBio)利用1:1结合模型进行数据拟合和分析。计算Koff/Kon的比值，作为平衡解离常数(Kd)。人源化抗体的结合亲和力示例如表15所示。
表15人源化抗体与TNFR2抗原的结合亲和力
人源化抗体的体外结合和阻断试验
如上所述，对人源化抗体进行基于FACS的结合和阻断试验。如图8A和8B所示，与嵌合TNFR2抗体相比，TNFR2抗体的人源化不影响其结合和阻断功能。
人原代Treg细胞体外增殖试验
用上述人源化抗体进行人原代Treg细胞增殖试验。示例性试验(图9)表明，与嵌合对照相比，人源化TNFR2抗体可以抑制Treg细胞增殖，这表明人源化不会改变其体外抑制Treg细胞增殖的抗体功能。
实施例7：评价人源化抗TNFR2抗体活性的体内抗肿瘤效果研究
本示例旨在说明人源化抗TNFR2抗体功能活性的体内肿瘤模型研究。
本实施例中使用MC38皮下肿瘤模型，研究概况如表16所示(如下)。
表16体内皮下肿瘤研究操作方案概况
动物和饲养：本研究使用40只雌性C57BL/6-Tnfrsf1btm1(TNF-RSF1B)/Bcgen小鼠(6-9周龄)。用“SPF大鼠和小鼠生长”的繁殖性饲料喂食动物，小鼠可自由饮水。为便于识别，对动物进行耳部标记，并在背部左侧区域剃毛，以备移植细胞。将动物安置在聚碳酸酯笼中(笼大小为320×200×135mm)。环境温度控制在20℃～26℃，湿度控制在40-70％。动物护理和使用符合JOINN LABORATORIES(Suzhou)Inc.的标准操作规程，《实验动物护理与使用指南》(第8版，国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所；国家科学院出版社；华盛顿特区，2010年)，以及美国农业部通过的《动物福利法》(公共法案99-198)进行的规定。
细胞制备和移植：从基础医学研究所购买的小鼠结肠癌细胞系MC38在含有2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清(FBS)和1％100×青霉素/链霉素(PS)的RPMI培养基中培养和扩增。在培养箱中保持37℃、5％CO2的生长环境。扩增完成后，使用0.25％胰蛋白酶EDTA溶液对细胞(第3代)进行胰蛋白酶化。然后洗涤细胞并计数。移植前细胞活率为92％-94％。将细胞悬浮在杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中，浓度为1×107/ml。用酒精准备垫对试验动物的移植部位进行消毒，并使用25号针头和1毫升注射器皮下移植0.2mL。
测量和抗体治疗：让肿瘤生长，然后将小鼠随机分为不同的研究组。分配小鼠以确保所有组的平均体重在研究群体的总平均肿瘤负荷的10％以内。人MOPC21 IgG1同种型抗体(见于Hamlyn PH,Gait MJ,Milstein C.(1981)Complete sequence of animmunoglobulin mRNA using specific priming and the dideoxynucleotide methodof RNA sequencing.Nucleic Acids Res.9(18):4485-4494)和SB1901-72由本公司自行制备。对于每种抗体，小鼠每周接受两次腹腔注射治疗，持续3周，并监测肿瘤体积(n＝10只小鼠/组)。用游标卡尺测量肿瘤的长轴和短轴，记录以计算肿瘤体积，并根据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线，以比较两组之间的差异。根据以下公式计算肿瘤体积：V＝1/2×长轴×短轴2。根据相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增长率T/C(％)计算肿瘤体积抑制率。
RTV＝Vt/V0
Vt：每次测量肿瘤后得到的肿瘤体积。
V0：初始肿瘤体积(第一次注射前)。
T/C(％)＝供试品组平均RTV/对照组平均RTV×100％。
肿瘤体积抑制率IRTV(％)＝100％-T/C(％)。
副作用评估：观察所有动物的临床症状或毒性，至少每天一次。每周给动物称重一次。如果体重减轻超过20％或出现其他需要安乐死的临床症状，则对动物实施安乐死。当单个动物的肿瘤体积达到或超过2500mm3时，对动物实施安乐死。
结果：各组的肿瘤体积变化和平均肿瘤体积抑制率(IRTV，％)如图10A和10B所示。结果显示，在第22天，第1组的肿瘤体积显著低于同种型抗体治疗组(P<0.001)，表明利用SB1901-72阻断TNFR2可有效抑制肿瘤生长。在同一时间点，两组之间的体重没有显著差异。动物在一般临床观察中未显示异常。
实施例8：丙氨酸扫描试验解析表位
在本试验中，通过丙氨酸扫描解析了人源化抗TNFR2抗体SB1901-19、SB1901.72或SB1901/76与人TNFR2结合的表位。在嵌合蛋白musTNFR2-huCRD3(ECD)(SEQ ID NO:92)的huTNFR2 CRD3区域内进行丙氨酸扫描突变。将His-tag添加到嵌合蛋白突变体的C末端以便进行纯化和检测。用人源化TNFR2抗体SB1901-19、SB1901-72或SB1901-76包被平板，4℃下过夜。洗涤后，加入嵌合蛋白的丙氨酸突变，并在室温下振荡孵育2小时。再次洗涤平板。然后，将与AP偶联的抗His抗体添加到平板上，并在室温下孵育1小时。洗涤平板，用pNPP底物显色30分钟。在450nm波长下读取平板。
丙氨酸扫描结果表明，人源化抗TNFR2抗体SB1901-19、SB1901-72或SB1901-76的表位相同(数据未显示)。图11A-11B显示了示例性抗体SB1901-76的丙氨酸扫描结果，以及人TNFR2的CRD3区域(SEQ ID NO 83)中的氨基酸R99、K108、E110、G111、R113、L114和D136是抗体结合到人TNFR2所必需的。结果表明，SB1901-19、SB1901-72或SB1901-76抗体的构象表位包含SEQ ID NO 83的氨基酸残基R99、K108、E110、G111、R113、L114和D136，或由上述残基组成。
实施例9：抗TNFR2抗体可开发性试验
除了与所期望的靶分子结合外，所有抗体药物还必须满足一系列关于其制造可行性、储存稳定性和无脱靶粘性的标准。通常将这一系列特征称为“可开发性”。具有高可开发性的抗体往往具有较少的不良生物物理特征，如碎片、聚集或共纯化杂质。聚集是评估生物制品最关键的因素之一，许多生物物理特性都会导致聚集。聚集倾向会产生一些严重的与制造、保质期、患者给药和免疫原性相关的问题(Bee JS,Davis M,Freund E,CarpenterJF,Randolph TW.Aggregation of a monoclonal antibody induced by adsorption tostainless steel.Biotechnol Bioeng.2010；105(1):121-9)。被广泛接受且互补的用于评估聚集的工具是动态光散射(DLS)和尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)。
SEC-HPLC：使用SEC-HPLC在40℃下测试示例性抗TNFR2抗体SB1902-72的聚集，时长4周。简而言之，使用TSKgel G3000SWxl(7.8mm×30cm)柱，流动相A溶液(0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.7)+0.05％NaN3)中加入5μg抗体样品(1mg/mL)。使用安捷伦HPLC系统，在流动相A溶液中以1mL/min的流速在约8到15分钟内洗脱抗体，并在280nm下进行UV吸光度监测。
表17为通过SEC-HPLC方法测得的稳定性结果。就聚集而言，加速热应激条件(40℃下4周)不会诱导聚集。
表17
结合亲和力：示例性抗TNFR2抗体SB1902-72在40℃下放置4周后，在Octet RED96仪器(ForteBio)上，使用生物层干涉法，在30℃和1200rpm条件下，测定上述抗体的结合亲和能力。在动力学缓冲液(PBS、0.1％Tween-20和1％牛血清白蛋白)中使用抗人IgG-Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio)进行以下动力学分析：(a)抗体样品(2μg/mL)300秒，(b)基线120秒，(c)与His-tag-huTNFR2(2.5、0.5和0μg/mL)结合420秒，以及(d)解离1200秒。在Savitzky-Golay过滤后，使用Octet数据分析软件8.0(ForteBio)利用1:1结合模型进行数据拟合和分析。
结合动力学数据如表18所示，表明在加速热应激条件下(40℃条件下4周)，与人TNFR2的结合不受影响。
表18
样品说明 Kd(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
SB1901-72(1mg/mL),pH7.2,40℃(w0) 1.68E-09 2.95E+05 4.95E-04
SB1901-72(1mg/mL),pH7.2,40℃(w2) 1.35E-09 3.48E+05 4.71E-04
SB1901-72(1mg/mL),pH7.2,40℃(w4) 1.06E-09 4.97E+05 5.27E-04
这些数据表明，示例性SB1901-72抗体在加速热应激条件下(40℃条件下4周)表现出优异的可开发性。
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Claims (25)

1.一种分离的特异性结合人TNFR2表位的抗TNFR2抗体，其中所述表位包含如SEQ IDNO:83所示人TNFR2序列的氨基酸残基Arg99、Lys108、Glu110、Gly111、Arg113、Leu114和Asp136或由上述氨基酸残基组成。
2.一种分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：
重链可变结构域(VH)，所述VH包含：
重链互补决定区(HC-CDR)1，其包含DDYID(SEQ ID NO:1)或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；
HC-CDR2，其包含EIYPGSGNTYYNEKFKG(SEQ ID NO:7)或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；和
HC-CDR3，其包含SQVYGKIAMDH(SEQ ID NO:14)或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；以及
轻链可变结构域(VL)，所述VL包含：
轻链互补决定区(LC-CDR)1，其包含RASESVDNSGNSFMH(SEQ ID NO:
20)或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；
LC-CDR2，其包含RASNLES(SEQ ID NO:27)或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代；和
LC-CDR3，其包含QQSKEDPYT(SEQ ID NO:33)或其变体，所述变体包含至多约3个氨基酸的取代。
3.一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如SEQ ID NOs:39、46-62中任一氨基酸序列所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如SEQ ID NOs:63、70-77中任一氨基酸序列所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体，其包含：
VH，其包含SEQ ID NOs:39、46-62中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQID NOs:39、46-62中任一氨基酸序列具有至少约80％序列同一性；以及
VL，其包含SEQ ID NOs:63、70-77中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQID NOs:63、70-77中任一氨基酸序列具有至少约80％序列同一性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体，其包含：
(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:39或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:39具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:63或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:63具有至少约80％序列同一性；
(ii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:48或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:48具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％序列同一性；
(iii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:49具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:70或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:70具有至少约80％序列同一性；
(iv)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:49具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:71或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:71具有至少约80％序列同一性；
(v)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:49或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:49具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％序列同一性；
(vi)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:55或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:55具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；
(vii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:56具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:72或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:72具有至少约80％序列同一性；
(viii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ IDNO:57具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；
(ix)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:58具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；
(x)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:59或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:59具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；
(xi)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:60或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:60具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；
(xii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:61或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:61具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性；或
(xiii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:62或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ IDNO:62具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQID NO:75或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:75具有至少约80％序列同一性。
6.一种分离的抗TNFR2抗体，其包含VH，所述VH包含如SEQ ID NOs:40-45中任一氨基酸序列所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，所述VL包含如SEQ ID NOs:64-69中任一氨基酸序列所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
7.根据权利要求6中所述的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：
(i)VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:40所示的VH包含的HC-CDR1、
HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:64所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；
(ii)VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:41所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:65所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；
(iii)VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:42所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:66所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；
(iv)VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:43所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:67所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；
(v)VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:44所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:68所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；或
(vi)VH，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:45所示的VH包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及VL，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO:69所示的VL包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
8.根据权利要求7中所述的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含：
(i)VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:15，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQID NO:21，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:28，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQID NO:34，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；
(ii)VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:16，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQID NO:22，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:29，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQID NO:35，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；
(iii)VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:10，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:17，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:23，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:30，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:36，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；
(iv)VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:11，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:18，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:24，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:31，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:37，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；
(v)VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:12，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:25，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；或
(vi)VH，所述VH包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:13，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:19，或者所述VH的变体，其HC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代；以及VL，所述VL包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:26，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:32，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:38，或者所述VL的变体，其LC-CDRs中包含至多约5个氨基酸的取代。
9.根据权利要求8中所述的分离的抗TNFR2抗体，其包含：
VH，其包含SEQ ID NOs:40-45中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:40-45中任一氨基酸序列具有至少约80％序列同一性；以及
VL，其包含SEQ ID NOs:64-69中任一所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ IDNOs:64-69中任一氨基酸序列具有至少约80％序列同一性。
10.根据权利要求9中所述的分离的抗TNFR2抗体，其包含：
(i)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:40或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:40具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:64或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:64具有至少约80％序列同一性；
(ii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:41或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:41具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:65或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:65具有至少约80％序列同一性；
(iii)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:42或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:42具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:66或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:66具有至少约80％序列同一性；
(iv)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:43或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:43具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:67或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:67具有至少约80％序列同一性；
(v)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:44或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:44具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:68或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:68具有至少约80％序列同一性；或
(vi)VH，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:45或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQID NO:45具有至少约80％序列同一性；以及VL，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:69或其变体，所述变体与氨基酸序列SEQ ID NO:69具有至少约80％序列同一性。
11.一种分离的抗TNFR2抗体，其与权利要求1-10中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体竞争与TNFR2的特异性结合，或与权利要求1-10中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体特异性地结合相同的表位。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体与人TNFR2结合的Kd值为约0.1pM至约10nM。
13.根据权利要求1-12中任一项的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体包含Fc片段。
14.根据权利要求13中的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体是全长的IgG抗体。
15.根据权利要求14中的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体是全长的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
16.根据权利要求1-15中任一项的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体是嵌合的、人的或人源化的抗体。
17.根据权利要求1-12中任一项的分离的抗TNFR2抗体，其中所述抗TNFR2抗体是抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、单链Fv(scFv)、Fv片段、dAb、Fd或双链抗体(diabody)。
18.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-17中任一项所述的抗TNFR2抗体。
19.一种载体，其包含权利要求18中所述的分离的核酸分子。
20.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1-17中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体、权利要求18中所述的核酸分子或权利要求19中所述的载体。
21.一种制备分离的抗TNFR2抗体的方法，其包含：
a)在能有效表达抗TNFR2抗体的条件下培养权利要求20中所述的宿主细胞；和
b)从宿主细胞中获得表达的抗TNFR2抗体。
22.一种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项所述的抗TNFR2抗体、权利要求18中所述的核酸分子、权利要求19中所述的载体、权利要求20中所述的分离的宿主细胞或根据权利要求21中所述的方法制备的抗TNFR2抗体，以及药学上可接受的载体。
23.一种治疗疾病或有需要的个体的病症的方法，包括：使所述个体摄入有效量的权利要求1-17中任一项所述的分离的抗TNFR2抗体、权利要求18中所述的核酸分子、权利要求19中所述的载体、权利要求20中所述的分离的宿主细胞、根据权利要求21中所述的方法制备的抗TNFR2抗体，或权利要求22中所述的药物组合物。
24.根据权利要求23中的方法，其中所述疾病或病症为癌症或感染性疾病，可选地，所述癌症或感染性疾病与TNFR2信号传导或TNFR2表达异常有关。
25.根据权利要求24中的方法，其中所述疾病或病症选自非小细胞肺癌、肾上腺癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、胃食管结合部腺癌、食管癌、食管腺癌、胆囊癌、胃癌、宫颈癌、胃腺癌、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、肾癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、前列腺腺癌、脾癌、小细胞肺癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌，以及感染性疾病，包括但不限于，人乳头瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VSV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、衣原体、结核分枝杆菌、链球菌、肺炎球菌、假单胞菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、烟曲霉、黄曲霉、新型隐球菌和荚膜组织胞浆菌。
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