TW202417503A - 特異性識別ｂ和ｔ淋巴細胞衰減器（ｂｔｌａ）的抗體及其應用 - Google Patents

特異性識別ｂ和ｔ淋巴細胞衰減器（ｂｔｌａ）的抗體及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明提供特異性識別B和T淋巴細胞衰減器的抗體及其抗原結合片段。同時提供所述抗體的製備及使用方法。

Description

特異性識別B和T淋巴細胞衰減器（BTLA）的抗體及其應用
[序列表]
本發明要求2022年7月19日提交的美國申請US63/386870的優先權，其內容以其整體通過引用併入本文中。
以下提交的XML文字檔的內容以其整體通過引用併入本文中：文本名稱：BTLA WIPO CN seq.xml，記錄日期：2023.05.29，大小：35 KB）。
本發明關於特異性識別B和T淋巴細胞衰減器（BTLA）的抗體，及其製備和使用方法，包括治療癌症或感染性疾病的方法。
BTLA（CD272），CD28家族成員，通過抑制B細胞和T細胞的功能和增殖誘導免疫抑制。從結構上看，BTLA是一種包含289個氨基酸殘基的I型跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白家族（Ning, et al.2021）。值得注意的是，皰疹病毒進入介質（HVEM，也稱為腫瘤壞死因數受體超家族14，TNFRSF14）被確定為BTLA特異性配體，其屬於TNFR家族（Compaan, D.M, et al, 2005; Gonzalez, L.C, et al. 2005; Sedy, J.R, et al. 2005）。除BTLA外，HVEM也與LIGHT（也稱為TNFSF14）和CD160結合。大多數文獻報導，與HVEM上的CRD1/CRD2區域結合的BTLA和CD160介導抑制訊號，而LIGHT通過結合CRD2/CRD3區域介導刺激訊號（Cai G, et al. 2008: Rodriguez-Barbosa JI, et al. 2019; Sedy, J.R, et al. 2005）。然而，也有報導表明BTLA和CD160在某些情況下可以誘導雙向訊號（Gavrieli M和Murphy KM, 2006；Tan CL, et al.2018）。
HVEM在靜息T細胞、初始B細胞和記憶B細胞中高表達，但在活化的T細胞和B細胞中下調。它也在所有其他免疫細胞、某些類型的癌細胞、腸上皮細胞等中廣泛表達。有趣的是，HVEM可以作為配體或受體，在不同的生理和病理條件下發揮多種不同的作用（Demerlé C, et al. 2021）。儘管HVEM/BTLA/CD160/LIGHT介導複雜的訊號通路，但HVEM敲除小鼠對刺激表現出更強的CD4+ T細胞應答，表明HVEM介導的整體功能是抑制性的（Wang Y, et al. 2005）。此外，初始 T 細胞中的HVEM和BTLA形成順式異二聚體複合物，阻斷外部CD160和其他共訊號分子與HVEM的結合，從而維持T細胞的耐受性（Cheung TC, et al. 2009）。
與HVEM的廣泛表達譜相反，BTLA的表達限於淋巴器官中，在其他器官中很少或沒有表達，如心臟、腎臟、腦和肝臟等（Yu, et al. 2019）。在免疫細胞中，BTLA主要在B細胞和T細胞中表達，但在樹突狀細胞（DCs）和單核細胞等固有免疫細胞中也能檢測到其表達（Ning, et al. 2021）。BTLA由一個Ig樣胞外域、一個單跨膜結構域（TMD）和一個胞內尾部組成。BTLA的胞質結構域包含基於免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM）、基於免疫受體酪氨酸的開關基序（ITSM）和生長因數受體結合蛋白2 （Grb-2）關聯基序。HVEM啟動BTLA訊號通路導致ITIM酪氨酸磷酸化，使得與包含Src同源結構域2（SH2）的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2結合，從而抑制免疫細胞中的啟動訊號（Gavrieli M和Murphy KM, 2006；Gavrieli M, et al.2003；Watanabe N, et al.2003）。最近有研究表明，與PD-1通過SHP-2抑制CD28訊號傳導不同，BTLA主要通過SHP-1抑制TCR和CD28訊號傳導（Celis-Gutierrez J, et al.2019；Xu X, et al.2020）。研究還發現，Grb-2關聯基序與Grb-2的結合導致PI3K蛋白亞基p85的募集和T細胞活化。因此，BTLA分子可以發揮雙向調節作用（Gavrieli M和Murphy KM, 2006）。
BTLA在誘導和維持T細胞免疫耐受中起關鍵作用。Krieg等人報導了BTLA參與調控CD8+ T細胞內穩態和記憶細胞生成（Krieg C, et al. 2007）。研究還表明，缺乏BTLA的CD8+ T細胞更容易誘發I型糖尿病。此外，在BTLA基因敲除小鼠中，甚至高劑量的卵清蛋白都不能誘導免疫耐受（Liu X, et al.2009）。此外，BTLA抑制卵泡輔助T細胞產生IL-21，從而降低IgG血清水準（Kashiwakuma D, et al.2010）。除T細胞功能外，BTLA還可能影響B細胞、樹突狀細胞和NKT細胞功能（Vendel AC, et al.2009；Jones A, et al. 2016；Miller ML, et al. 2009）。
BTLA在腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中表達上調，而HVEM可以在腫瘤細胞上表達。大量資料表明，HVEM/BTLA相互作用損害抗腫瘤免疫（Demerlé C, et al.2021）。在一些報導中，BTLA在迴圈CD4+細胞中表達水準升高，而在CD8+ T細胞中表達水準不變，阻斷BTLA/HVEM相互作用可以增強肝癌患者迴圈CD4+和CD8+ T細胞產生IFN-γ（Liu J, et al. 2018；Zhao Q, et al. 2016）。在其他出版物中，發現CD8+ TILs中BTLA上調與膽囊癌患者預後不良相關（Oguro S, et al.2015）。BTLA在腫瘤抗原特異性T細胞中也上調（Fourcade J, et al. 2012；Derre L, et al.2010）。BTLA+腫瘤抗原特異性T細胞表現出其他抑制分子水準升高，如PD-1、淋巴細胞活化基因-3（LAG3）、T細胞免疫球蛋白和含粘蛋白結構域分子3（TIM-3）等（Quan L, et al.2018；Fourcade J, et al.2012）。此外，與單獨阻斷PD-1相比，用抗體阻斷BTLA和PD-1可協同增強黑色素瘤患者NY-ESO-1特異性CD8+ T細胞的擴增、增殖和細胞因數的產生（Fourcade J, et al. 2012）。
因此，本領域仍需要能有效抑制或拮抗BTLA，以及治療BTLA介導的疾病或病症（例如，癌症或感染性疾病）的治療性抗體。
本文提及的所有出版物、專利、專利申請和已公開的專利申請中披露的內容，以其整體通過引用併入本文中。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，包含重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含TFGMGVS（SEQ ID NO: 1）；HC-CDR2，其包含HIYWDDDKRFNPSLKS（SEQ ID NO: 4）；和HC-CDR3，其包含GNWDGETYFDY（SEQ ID NO: 7）；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含KSTQSLLDSDGKTYLN（SEQ ID NO: 10）；LC-CDR2，其包含LVSKLDS（SEQ ID NO: 13）；和LC-CDR3，其包含WQGTHFPWT（SEQ ID NO: 15）。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：V H，所述V H包含如SEQ ID NOs: 18-22中任一氨基酸序列所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，以及V L，所述V L包含如SEQ ID NOs: 25-29中任一氨基酸序列所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：(i) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 18所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 25所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(ii) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 26所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(iii) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 27所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(iv) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(v) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(vi) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 26所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(vii) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 27所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(viii) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(ix) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(x) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 21所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(xi) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 21所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(xii) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 22所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；(xiii) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 22所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：(i)V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，如上所述任一種分離的抗BTLA抗體，其包含：V H，其包含SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體包含：(i)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 18具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少約80%序列同一性；(ii)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性；(iii)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性；(iv)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性；(v)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性；(vi)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性；(vii)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性；(viii)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性；(ix)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性；(x)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性；(xi)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性；(xii)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性；(xiii)V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：(i) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 23所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 30所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：(i)V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，如上所述任一種分離的抗BTLA抗體，其包含：V H，其包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：(i) V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 24所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 31所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其包含：(i)V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，如上所述任一種分離的抗BTLA抗體，其包含：V H，其包含SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其與人BTLA特異性結合的Kd值為0.1pM至10nM。
在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其與上述任一種分離的抗BTLA抗體競爭與BTLA的特異性結合。在一些實施例中，提供一種分離的抗BTLA抗體，其與上述任一種分離的抗BTLA抗體特異性地結合相同的表位。
在一些實施例中，如上所述任一種分離的抗BTLA抗體，所述分離的抗BTLA抗體包含Fc片段。在一些實施例中，所述分離的抗BTLA抗體是全長的IgG抗體。在一些實施例中，所述分離的抗BTLA抗體是全長的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是嵌合的、全人的或人源化的抗體。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是抗原結合片段，所述抗原結合片段選自Fab、Fab’、F(ab)’ 2、Fab’-SH、單鏈Fv（scFv）、Fv片段、dAb、Fd、納米抗體（nanobody）、雙鏈抗體（diabody）和線性抗體組成的組中。
在一些實施例中，提供一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼如上所述任一種抗BTLA抗體。在一些實施例中，提供一種載體，所述載體包含如上所述任一種核酸分子。在一些實施例中，提供一種宿主細胞，所述宿主細胞包含如上所述任一種抗BTLA抗體、如上所述任一種核酸分子或如上所述任一種載體。在一些實施例中，提供一種製備抗BTLA抗體的方法，其包含：a) 在能有效表達抗BTLA抗體的條件下培養上述任一種宿主細胞；和b) 從宿主細胞中獲得表達的抗BTLA抗體。
在一些實施例中，提供一種治療有此需求的個體疾病或病症的方法，包括向所述個體施用有效量的如上所述的任一種抗BTLA抗體。在一些實施例中，提供如上所述的任一種抗BTLA抗體在製備用於治療有此需求的個體疾病或病症的藥物組合物中的用途。在一些實施例中，提供如上所述的任一種抗BTLA抗體或包含抗BTLA抗體的藥物組合物在製備用於治療疾病或病症的藥物中的用途。在一些實施例中，所述疾病或病症與BTLA訊號通路有關，包括癌症或感染性疾病或病症。在一些實施例中，所述疾病或病症選自例如，非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。
同時還提供包含如上所述的任一種抗BTLA抗體的藥物組合物、試劑盒以及生產製品。
本發明一方面提供抗BTLA抗體分子。通過雜交瘤技術、抗體的人源化、親和力成熟以及適當設計的生物化學及生物學實驗的組合，已經鑒定出能夠結合人BTLA並抑制人BTLA與其受體作用的高效抗體分子。本文給出的結果表明，本發明中的抗體與BTLA結合。並且令人驚訝地是，與本領域已知的抗BTLA抗體相比，例如，Icatolimab（也被稱為tifcemalimab，由上海君實開發），在各種生物學實驗中證明了本發明中的抗體更有效。
本發明所提供的抗BTLA抗體包括，例如，全長抗BTLA抗體、抗BTLA單鏈抗體（scFvs）、抗BTLA Fc融合蛋白、多特異性（如雙特異性）抗BTLA抗體、抗BTLA免疫偶聯物以及諸如此類的。
在一些實施例中，所述分離的抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含TFGMGVS（SEQ ID NO: 1）；HC-CDR2，其包含HIYWDDDKRFNPSLKS（SEQ ID NO: 4）；和HC-CDR3，其包含GNWDGETYFDY（SEQ ID NO: 7）；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含KSTQSLLDSDGKTYLN（SEQ ID NO: 10）；LC-CDR2，其包含LVSKLDS（SEQ ID NO: 13）；和LC-CDR3，其包含WQGTHFPWT（SEQ ID NO: 15）。
在一些實施例中，所述分離的抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含DFWIQ（SEQ ID NO: 2）；HC-CDR2，其包含TIYPGDGDTRENQKFKG（SEQ ID NO: 5）；和HC-CDR3，其包含GNGNSWFAY（SEQ ID NO: 8）；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含RASESVDDYGISFIN（SEQ ID NO: 11）；LC-CDR2，其包含AASNQGS（SEQ ID NO: 14）；和LC-CDR3，其包含LQSREIPYT（SEQ ID NO: 16）。
在一些實施例中，所述分離的抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含DTYIY（SEQ ID NO: 3）；HC-CDR2，其包含RIDPANGHTKYDPRFQD（SEQ ID NO: 6）；和HC-CDR3，其包含GGDHPYYVMDW（SEQ ID NO: 9）；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含KSSQNLLDSDGKTYLI（SEQ ID NO: 12）；LC-CDR2，其包含LVSKLDS（SEQ ID NO: 13）；和LC-CDR3，其包含WQGTHFPRT（SEQ ID NO: 17）。
同時還提供編碼抗BTLA抗體的核酸，包含抗BTLA抗體的組合物，以及製備和使用抗BTLA抗體的方法。 [定義]
如本文所述，“治療（treatment）”或“治療（treating）是一種獲得有益的或期望的結果的方法，包括臨床結果。鑒於本發明的目的，所述有益的或期望的臨床結果，包括但不限於以下一種或多種：緩解由疾病引起的一種或多種症狀，減輕疾病程度，穩定疾病（例如，預防或延遲疾病惡化），預防或延遲疾病的擴散（例如，轉移），預防或延遲疾病復發，延遲或減緩疾病進展，改善疾病狀態，緩解疾病（部分或全部），減少治療疾病所需的一種或多種其他藥物的劑量，延遲疾病進展，改善或提高生活品質，增加體重，和/或延長生存期。同時，“治療”還包括疾病病理結果的減少（例如，對癌症而言，腫瘤體積）。本發明的方法考慮了這些治療的任何一個或多個方面。
術語“抗體”包括全長抗體及其抗原結合片段。全長抗體包括兩條重鏈和兩條輕鏈。輕鏈和重鏈的可變區負責抗原的結合。兩條鏈中的可變區通常包括3個高變的環，被稱為互補決定區（CDRs）（輕鏈（LC）CDRs包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，重鏈（HC）CDRs包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3）。本文所披露的抗體或抗原結合片段的CDR邊界可以通過Kabat，Chothia或Al-Lazikani慣例來定義或識別（Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991）。重鏈或輕鏈的3個CDR區插入到被稱為框架區（FRs）的側翼區段之間，所述框架區比CDR區具有更高的保守性，並形成支撐高變環的支架。重鏈和輕鏈的恆定區並不參與抗原結合，但展示出多種效應功能。抗體是基於它們重鏈恆定區的氨基酸序列進行分類的。抗體的五種主要類別或同種型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特徵在於分別具有α、δ、ε、γ和μ型重鏈。幾種主要的抗體類別被分為亞類，如IgG1（γ1重鏈）、IgG2（γ2重鏈）、IgG3（γ3重鏈）、IgG4（γ4重鏈）、IgA1（α1重鏈）或IgA2（α2重鏈）。
如本文所述，術語“抗原結合片段”包括抗體片段，例如，雙鏈抗體（diabody）、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、（dsFv） 2、雙特異性dsFv（dsFv-dsFv’）、二硫鍵穩定的雙鏈抗體（ds雙鏈抗體）、單鏈Fv（scFv）、scFv二聚體（二價雙鏈抗體），由包含一個或多個CDRs的抗體片段組成的多特異性抗體、單域抗體、納米抗體（nanobody）、域抗體、二價域抗體或者能夠與抗原結合但不包含完整抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠與親本抗體或親本抗體片段（如親本scFv）結合相同的抗原。抗原結合片段還包括包含上述抗體片段的融合蛋白。在一些實施例中，抗原結合片段可能包括來自特定人抗體的一個或多個CDRs，該CDRs被移植到來自一個或多個不同人抗體的框架區。
如本文所述，術語“表位”是指抗體或抗體部分結合的抗原上特定的原子或氨基酸組。如果兩種抗體或抗體部分表現出與某抗原競爭性結合，則它們可能結合抗原上的相同表位。
如本文所用，當第一抗體在等莫耳濃度下抑制第二抗體與BTLA靶標結合至少50%（例如至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%）時，第一抗體與第二抗體“競爭”結合BTLA靶標，反之亦然。PCT出版物WO 03/48731描述了基於交叉競爭的高通量抗體“表位歸類”方法。
如本文所述，術語“特異性地結合”、“特異性地識別”或“對..來說是特異性的”是指可測量的和可再現的相互作用，例如抗體與靶標的結合可以確定在異質分子群，包括生物分子中存在該靶標。例如，抗體能夠特異性地識別某靶標（可以是表位）是指，與其它靶標結合相比，該抗體與該靶標的結合具有更高的親和力，親合力，更容易和/或更持久。在一些實施例中，特異性地識別抗原的抗體與抗原的一個或多個抗原決定簇反應，其結合親和力是其與其它靶標結合親和力的至少10倍。
如本文所述，一種“分離的”抗BTLA抗體是指一種抗BTLA抗體，其（1）與天然存在的蛋白無關，（2）不含相同來源的其他蛋白，（3）由不同種屬的細胞所表達，或（4）自然界中不存在。
如本文所述，術語“分離的核酸”，是指基因組、cDNA或合成來源的核酸或其組合。根據其來源，所述“分離的核酸”是指（1）與自然界中發現的“分離的核酸”中的全部或部分多核苷酸無關，（2）可與自然狀態下不與之相連的多核苷酸可操作性地連接，或（3）在自然界中不作為較長序列的一部分而存在。
如本文所用，術語“CDR”或“互補決定區”意指重鏈和輕鏈多肽的可變結構域內發現的非連續抗原結合位點。在文獻Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616（1977）; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest”（1991）; Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917（1987）; Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948（1997）; MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745（1996）; Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839（2008）; Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77（2003）; 和 Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670（2001）中已經描述這些特殊的區域，其中當彼此之間互相比較時，這些定義包括氨基酸殘基的重合或子集。然而，採用任何一種定義方式來指示抗體或移植抗體或其變體的CDR，均包括在本文所定義和使用的術語範圍之內。表1中列了由上述引用的各篇參考文獻所定義的CDR所包括的氨基酸殘基的位置，以示比較。CDR預測的演算法和結合介面在本領域是已知的，包括，例如Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839（2008）; Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307（2010）; 和Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43: D432-D438（2015）中均有描述。本段中所引用的參考文獻的內容以其整體引用併入本文中，以用於本發明和可能包含在本文中的一個或多個請求項中。 [表 1] CDR 定義
   Kabat 1 Chothia 2 MacCallum 3 IMGT 4 AHo 5
V HCDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
V HCDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
V HCDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
V LCDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
V LCDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
V LCDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1氨基酸殘基編號參照上述Kabat et al.中的命名方法 2氨基酸殘基編號參照上述Chothia et al.中的命名方法 3氨基酸殘基編號參照上述MacCallum et al.中的命名方法 4氨基酸殘基編號參照上述Lefranc et al.中的命名方法 5氨基酸殘基編號參照上述Honegger and Plückthun中的命名方法
術語“嵌合抗體”是指，重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定種屬或屬於特定抗體種類或亞類的抗體中的相應序列一致或具有同源性，而這個（些）鏈的剩餘部分與來自另一種屬或屬於其它抗體種類或亞類的抗體中的相應序列一致或具有同源性的抗體，以及此類抗體的片段，只要其具有本發明中的生物學活性（見U.S. Patent No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855（1984））。
“Fv”是包含完整抗原識別及結合位點的最小抗體片段。該片段是由一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域緊密非共價連接形成的二聚體。通過這兩個域的折疊衍生出6個高變環（輕鏈和重鏈中各3個環），所述高變環為抗體提供了用於結合抗原的氨基酸殘基，並且賦予抗體與抗原結合的特異性。然而，即使單個可變結構域（或Fv片段的一半，其僅包含對抗原具有特異性的3個CDRs）也具有識別和結合抗原的能力，儘管其親和力低於完整的結合位點。
“單鏈Fv”，也可簡寫成“sFv”或“scFv”，是包含被連接成單一多肽鏈的V H和V L抗體域的抗體片段。在一些實施例中，scFv多肽進一步包括V H和V L域之間的連接多肽，該連接多肽使得scFv形成抗原結合的理想結構。關於scFv的概述，見 Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 （1994 ）。
術語“雙鏈抗體（diabody）”是在V H和V L域之間採用短接頭（例如5～10個殘基），構建scFv片段（見上段內容）製備而成的一種小抗體片段，這樣就使得可變結構域在鏈間而不是鏈內進行配對，產生一個雙價片段，即具有兩個抗原結合位點的片段。雙特異性的雙鏈抗體是兩個“交叉”scFv片段的異二聚體，其中兩個抗體的V H和V L域位於不同的多肽鏈上。在EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448（1993）中全面描述了雙鏈抗體。
非人源（如齧齒類）抗體的“人源化”形式是嵌合抗體，其包括最少的來自非人源抗體的序列。大多數情況下，人源化抗體是人源免疫球蛋白（受體抗體），其中受體抗體的高變區（HVR）殘基被來自非人源種屬例如小鼠、大鼠、兔或非人類哺乳動物的且具有理想的抗體特異性，親和力和性能的高變區殘基所取代（供體抗體）。在某些情況下，人源免疫球蛋白框架區中的殘基被相應的非人源殘基所取代。另外，人源化抗體可以包括在受體抗體或供體抗體中均不存在的殘基。這些修飾能夠進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體會包含基本上所有，至少一個，通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的高變環均與非人免疫球蛋白的高變環相對應，以及所有或基本上所有的框架區均是人免疫球蛋白序列。人源抗體任選地也還包括免疫球蛋白恆定區（Fc）的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恆定區。具體細節可以參考Jones et al., Nature321:522-525（1986）; Riechmann et al., Nature332:323-329（1988）; 和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596（1992）。
本文所鑒定的多肽和抗體序列的“氨基酸序列同一性百分比（%）”或“同源性”被定義：在認為保守性取代屬於序列同一性的一部分的情況下進行序列對比，候選序列與待比較多肽序列中相同氨基酸殘基所占的百分比。可以通過本領域技術範圍內的多種比對方式來確定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE軟體等可公開獲得的電腦軟體。本領域技術人員可以確定用於測量比對的合適的參數，包括在所比較序列的全長上實現最大化比對所需的任何演算法。然而，為了本文的目的，氨基酸序列同一性百分比數值是使用序列比對電腦程式MUSCLE（Edgar, R.C., Nucleic Acids Research32(5):1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics5(1):113, 2004）生成的。
術語“Fc受體”或“FcR”用於描述結合抗體Fc區的受體。在一些實施例中，本發明所述的FcR是結合IgG抗體（一種γ受體）的FcR，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA（“啟動受體”）和FcγRIIB（“抑制受體”），它們具有相似的氨基酸序列，主要在細胞質結構域有所不同。啟動受體FcγRIIA的胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）。抑制受體FcγRIIB的胞質結構域中含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）（見M. in Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234（1997））。所述術語還包括同種異型，例如FcγRIIIA同種異型：FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol9:457-92（1991）和Capel et al., Immunomethods4:25-34 (1994); 以及de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41（1995）中對FcRs進行了描述。本發明中術語FcR涵蓋其他類型的FcRs，包括將來鑒定的FcRs。術語FcR同時還包括新生兒受體FcRn，其負責向新生兒轉移母體IgGs（Guyer et al., J. Immunol. 117:587（1976）以及Kim et al., J. Immunol. 24:249（1994））。
術語“FcRn”指新生兒Fc受體（FcRn）。FcRn與主要組織相容性複合體（MHC）在結構上相似，由α鏈非共價結合到β2微球蛋白上組成。新生兒Fc受體FcRn的多種功能在Ghetie and Ward（2000） Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766.中進行了綜述。FcRn在免疫球蛋白IgGs從母體向新生兒的被動轉運和調控血清IgG水準中起到重要作用。FcRn作為一種救助受體，可以在細胞內和細胞間以完整的形式結合和運輸胞吞化的IgG，並使它們免於經受默認的降解途徑。
人IgG 重鏈恆定區的“CH1結構域”通常從118位氨基酸延伸到215位元氨基酸（EU編號系統）。
“鉸鏈區”通常被定義為從人IgG1的216位Glu延伸到230位Pro（Burton, Molec. Immunol. 22:161-206（1985））。通過將形成重鏈間二硫鍵的第一個和最後一個半胱氨酸殘基置於與IgG1相同位置後，可以使得其他IgG同種型的鉸鏈區與IgG1序列比對。
人IgG Fc區的“CH2結構域”通常從231位氨基酸延伸到340位氨基酸。CH2結構域的獨特之處在於，它不會與另一個區域緊密配對，而是在完整的天然IgG分子的兩個CH2結構域之間插入了兩條N端連接的支鏈糖鏈。據推測，糖類可能作為域與域間配對的替代，有助於保持CH2結構域穩定。Burton, Molec. Immunol. 22:161-206（1985）。
“CH3”結構域包括在Fc區內從C末端殘基延伸到CH2結構域（從341位元氨基酸到抗體序列的C末端，通常為IgG的第446或447位氨基酸殘基）。
“功能性Fc片段”具有天然Fc區序列所具有的“效應功能”。示例性的“效應功能”包括C1q結合；補體依賴的細胞毒作用（CDC）；Fc受體結合；抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）；吞噬作用；細胞表面受體的下調（如B細胞受體；BCR）等。這類效應功能通常需要Fc區與結合結構域（如抗體可變區）結合，並且可以使用本領域公知的多種實驗方法進行評估。
具有“改變的”FcR結合親和力或ADCC活性的IgG Fc變體的抗體，與親本多肽或包含天然Fc序列的多肽相比，其FcR結合活性和/或ADCC活性增強或減弱。表現出與FcR“結合增強”的Fc變體與親本多肽或包含天然IgG Fc序列的多肽相比，其與至少一種FcR具有更高的結合親和力（例如更低的表觀Kd或IC 50值）。在一些實施例中，與親本多肽相比，結合能力增強3倍，例如5、10、25、50、60、100、150、200，甚至高達500倍或結合力提高25%到1000%。表現出與FcR“結合降低”的Fc變體，與親本多肽相比，其與至少一種FcR具有更低的親和力（例如更高的表觀Kd或IC 50值）。與親本多肽相比，其結合能力下降40%或更多。
“抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用”或“ADCC”是一種細胞毒性形式，指分泌型的Ig與存在於某些細胞毒性細胞（例如自然殺傷細胞（NK）、中性粒細胞、和巨噬細胞）上的Fc受體（FcRs）結合，使這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合攜帶抗原的靶細胞，隨後使用細胞毒素殺死靶細胞。抗體“武裝”細胞毒性細胞並且是這種殺傷所必需的。介導ADCC的主要細胞類型中，NK細胞只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol9:457-92（1991）第464頁的Table 3中總結了在造血細胞上FcR的表達。評估目標分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC實驗，在美國專利No.5,500,362或5,821,337中進行了描述。適用於此類實驗的效應細胞包括外周血單核細胞（PBMC）和自然殺傷性細胞（NK）。可選地，或者此外，目標分子的ADCC活性也可以在體內進行評估，例如在如Clynes et al. PNAS(USA) 95:652-656（1998）中所公開的動物模型中進行了描述。
包含Fc區變體的多肽與包含野生型IgG Fc多肽或親本多肽相比，在人體效應細胞存在下表現出“增強的ADCC活性”或能夠更有效的介導ADCC效應，所述包含Fc區變體的多肽在實驗時與包含野生型IgG Fc多肽（或親本多肽）數量上基本相同時，無論在體外或體內均能更有效的介導ADCC。通常採用本領域已知的任何體外ADCC實驗方法來鑒定此類變體，例如用於鑒定ADCC活性的實驗或方法，例如在動物模型中等。在一些實施例中，此類變體與野生型Fc（或親代多肽）相比，介導ADCC的效率提高5到100倍，例如25到50倍。
“補體依賴的細胞毒作用”或“CDC”是指在補體存在的情況下裂解靶細胞。經典的補體途徑的啟動是由補體系統第一組分（C1q）與結合同源抗原的抗體（具有適宜結構的亞類）相結合而啟動的。為了評估補體啟動，可以進行CDC實驗，如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods202:163（1996）中所描述的。在美國專利No.6,194,551B1和WO99/51642中描述了具有改變的Fc區氨基酸序列並增加或降低的C1q結合能力的多肽變體。這些專利出版物的內容通過引用明確地併入本文中。另見Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184（2000）。
除非另有說明，一種“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括相互之間互為簡並形式且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列也可包括內含子，例如編碼蛋白質的核苷酸序列在某些形式中包含內含子。
術語“可操作性地連接”是指調控序列與異源核苷酸序列之間的功能性連接，從而使後者表達。例如，當第一個核苷酸序列與第二個核苷酸序列處於功能性關係時，第一個核苷酸序列與第二個核苷酸序列為可操作性地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，該啟動子與編碼序列為可操作性地連接。通常，可操作性連接的DNA序列是連續的，並且在必要時，可以在同一個閱讀框中連接兩個蛋白質編碼區。
“同源”是指兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。如果兩個比較序列的同一位置為相同的堿基或氨基酸單體亞基時，例如兩個DNA分子的同一位置均為腺嘌呤，則這兩個DNA分子在該位置是同源的。兩個序列間的同源百分比是指兩個序列中共有的匹配或同源位置的數量與位置總數之比再乘以100所得函數。例如，兩個序列中如果10個位置中有6個位置是相匹配或同源的，則這兩個序列的同源性為60%。舉例來說，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常來說，在比對兩個序列時，以得到最大同源性為目的來進行對比。
本文所公開的抗BTLA抗體或組合物的“有效量”是指足以實現特定目的的量。“有效量”可以憑經驗和通過已知的與所述目的相關的方法確定。
術語“治療有效量”是指本文所公開的抗BTLA抗體或其組合物能夠有效治療個體的疾病或者症狀的用量。例如在癌症的情況中，抗BTLA抗體或其組合物的治療有效量是指能夠減少癌細胞數量；減小腫瘤的大小或重量；抑制（即在一定程度上減緩或較佳停止）腫瘤細胞對周邊器官的浸潤；抑制（即在一定程度上減緩或較佳停止）腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤的生長；和/或在一定程度上緩解與癌症相關的一種或多種症狀。本文所公開的抗BTLA抗體或其組合物在某種程度上能夠阻止和/或殺死現有的腫瘤細胞，它可以是細胞抑制性的或細胞毒性的。在一些實施例中，治療有效量是指能夠延長患者生存期的用量。在一些實施例中，治療有效量是指能夠改善患者無進展生存期的用量。
如本文所用的，“藥學上可接受的”或“藥理學上相容的”是指無生物學活性或者其它不期望性質的材料，例如該材料能夠加入到給予患者的藥物組合物中，而不會引起顯著的不良生物反應，或者，不與組合物中包含的任何其它組分以有害的方式相互作用。藥學上可接受的載體或賦形劑較佳滿足毒理學或製造檢測的所需標準和/或包含在美國食品和藥品管理局編制的非活性成分指南中。
本文中描述的本發明的實施例應理解為包含“由……組成”和/或“基本上由……組成”的實施例。
本文中提及“約”為一個數值或參數，包含（和描述）針對該值或參數本身的變體。例如，涉及“約X”的描述，包括“X”的描述。
如本文所用的，提及“不是（not）”一個數值或參數，通常表示並描述“除了（other than）”某一數值或參數之外。例如，該方法不能用於治療X型癌症，意味著該方法通常用於治療除X型癌症之外的其他類型的癌症。
除非上下文另有明確說明，本文和所述請求項中所採用的單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數物件。 [抗BTLA抗體]
一方面，本發明提供特異性結合人和/或恆河猴BTLA的抗BTLA抗體。所述抗BTLA抗體包括，但不限於，人源化抗體，嵌合抗體，小鼠抗體，人抗體，以及本文所述的包含重鏈和/或輕鏈CDRs的抗體分子。一方面，本發明提供與BTLA結合的分離的抗體。預期的抗BTLA抗體包括，例如，全長抗BTLA抗體（如全長IgG1或IgG4），抗BTLA單鏈抗體，抗BTLA Fc融合蛋白，多特異性（如雙特異性）抗BTLA抗體，抗BTLA免疫偶聯物，以及諸如此類的。在一些實施例中，抗BTLA抗體是全長抗體（如全長IgG1或IgG4）或其抗原結合片段，其特異性結合BTLA。在一些實施例中，抗BTLA抗體是Fab、Fab’、F(ab)’ 2、Fab’-SH、單鏈Fv（scFv）、Fv片段、dAb、Fd、納米抗體（nanobody）、雙鏈抗體（diabody）或線性抗體。在一些實施例中，特異性結合BTLA的抗體是指抗體與BTLA結合的親和力至少是與非靶標結合親和力的10倍以上（包括例如10、10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、或10 7倍）。在一些實施例中，非靶標是指不是BTLA的抗原。結合親和力可通過本領域已知的方法來測定，如ELISA，螢光啟動細胞分選（FACS）分析或放射免疫沉澱分析（RIA）。Kd值可以通過本領域已知的方法來測定，如表面電漿共振（SPR）技術或生物層干涉技術（BLI）。
儘管本文廣泛地討論了包含人序列的抗BTLA抗體（例如，包含人CDR序列的人重鏈和輕鏈可變結構域），但同時也考慮了非人抗BTLA抗體。在一些實施例中，非人抗BTLA抗體包括本文所述的抗BTLA抗體的人CDR序列和非人框架區序列，在一些實施例中，非人框架區序列包括任何的用於使用如本文所述的一種或多種人CDR序列產生重鏈和/或輕鏈可變結構域的序列，包括例如哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔子、豬、牛（例如，牛、公牛、水牛）、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、狗、雪貂、靈長類（例如，小猿，恆河猴）等。在一些實施例中，非人抗BTLA抗體包括將一種或多種本文所述的人CDR序列移植到非人框架區中（例如，鼠或雞的框架區序列）所產生的抗BTLA抗體。
示例性人BTLA的完整氨基酸序列包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列組成。示例性小鼠BTLA胞外區氨基酸序列包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體特異性識別人BTLA中的表位。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體與除人之外其它物種的BTLA發生交叉反應。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體對人BTLA是完全特異性的，並且不與其它非人物種發生交叉反應。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體與BTLA蛋白（或其片段）的至少一種等位基因變體交叉反應。在一些實施例中，等位基因變體與天然存在的BTLA蛋白（或其片段）相比，具有至多30個（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個）的氨基酸取代（例如保守取代）。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體不與BTLA蛋白（或其片段）的任何等位基因變體發生交叉反應。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體與BTLA蛋白的至少一種種間變體發生交叉反應。在一些實施例中，例如，BTLA蛋白（或其片段）是人BTLA，並且BTLA蛋白（或其片段）的種間變體是恆河猴中的變體。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體不與BTLA蛋白的任何種間變體發生交叉反應。
在一些實施例中，如本文所述的任一抗BTLA抗體，所述抗BTLA抗體包含抗體重鏈恆定區和抗體輕鏈恆定區。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含IgG1型重鏈恆定區。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含IgG2型重鏈恆定區。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含IgG3型重鏈恆定區。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含IgG4型重鏈恆定區。在一些實施例中，所述重鏈恆定區包含（包括由…組成或基本上由…組成）氨基酸序列SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，所述重鏈恆定區包含（包括由…組成或基本上由…組成）氨基酸序列SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，所述輕鏈恆定區包含（包括由…組成或基本上由…組成）氨基酸序列SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，所述輕鏈恆定區包含（包括由…組成或基本上由…組成）氨基酸序列SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含抗體重鏈可變結構域和抗體輕鏈可變結構域。
在一些實施例中，所述分離的抗BTLA抗體，包含重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含TFGMGVS（SEQ ID NO: 1）；HC-CDR2，其包含HIYWDDDKRFNPSLKS（SEQ ID NO: 4）；和HC-CDR3，其包含GNWDGETYFDY（SEQ ID NO: 7）；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含KSTQSLLDSDGKTYLN（SEQ ID NO: 10）；LC-CDR2，其包含LVSKLDS（SEQ ID NO: 13）；和LC-CDR3，其包含WQGTHFPWT（SEQ ID NO: 15）。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，HC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，LC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含如SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，所述V L包含如SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 18所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 25所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 26所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 27所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 19所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 26所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 27所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 20所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 21所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 21所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 22所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 28所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 22所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 29所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列，以及V L，所述V L包含SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 18具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 23所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 30所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 23具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 30或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 30具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 30。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 24所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 31所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 24具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 31或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 31具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24，以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 31。
在一些實施例中，上述氨基酸取代限於本文表4中所示的“示例性取代”。在一些實施例中，氨基酸取代限於本文表4中所示的“較佳取代”。
在一些實施例中，功能性表位元可通過組合丙氨酸掃描法來解析。在此過程中，組合丙氨酸掃描技術可用於鑒定BTLA蛋白中與抗BTLA抗體相互作用所必需的氨基酸。在一些實施例中，該表位是構象的，同時可以採用與BTLA蛋白結合的抗BTLA抗體的晶體結構來鑒定表位元。
在一些實施例中，本發明提供與本文所述的任一種抗BTLA抗體競爭性結合BTLA的抗體。在一些實施例中，提供能夠與本文所述的任一種抗BTLA抗體競爭性地結合BTLA上的表位的抗體。在一些實施例中，提供抗BTLA抗體，其與包含V H和V L的抗BTLA抗體分子結合相同的表位，其中所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列，以及所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列。在一些實施例中，提供抗BTLA抗體，其與包含V H和V L的抗BTLA抗體競爭性地結合BTLA，其中所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列，以及所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列。
在一些實施例中，可以利用競爭實驗來鑒定與本文所述的抗BTLA抗體競爭性結合BTLA的單株抗體。競爭實驗可以通過識別相同的或空間上重疊的表位或者通過一個抗體競爭性抑制另一抗體與抗原結合來確定兩個抗體是否結合相同的表位。在某些實施例中，這種競爭性抗體與本文所述的抗體結合相同的表位。一些示例性的競爭實驗包括，但不限於如Harlow and Lane（1988）Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor, N.Y.)中所提到的常規實驗。用於解析抗體結合的表位的詳細示例性方法如Morris（1996）"Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, N.J.)中所述。在一些實施例中，如果每種抗體阻斷另一種抗體結合的50％或更多，則稱其結合相同的表位。在一些實施例中，與本文所述的抗BTLA抗體競爭的抗體是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。
示例性抗BTLA抗體序列如表2和表3所示，其中根據EU編號系統Kabat定義方式進行CDR編號。本領域技術人員將認識到有多種已知演算法（Kabat定義方式）來預測CDR的位置以及界定抗體輕、重鏈可變區。包含如本文所述抗體的CDRs、VH和/或VL序列，但基於預測演算法而非下表中所示例的抗體也在本發明的範圍內。
表2示例性抗BTLA抗體CDR序列
抗體名稱 HC-CDR1 HC-CDR2 HC-CDR3
86B7 SB2003-1 SB2003-2 SB2003-3 SB2003-4 SB2003-5 SB2003-6 SB2003-7 SB2003-8 SB2003-9 SB2003-10 SB2003-11 SB2003-12 TFGMGVS (SEQ ID NO: 1)             HIYWDDDKRFNPSLKS (SEQ ID NO: 4)                         GNWDGETYFDY (SEQ ID NO: 7)         
83F2 DFWIQ (SEQ ID NO: 2) TIYPGDGDTRENQKFKG (SEQ ID NO: 5) GNGNSWFAY (SEQ ID NO: 8)
96F11 DTYIY (SEQ ID NO: 3) RIDPANGHTKYDPRFQD (SEQ ID NO: 6) GGDHPYYVMDW (SEQ ID NO: 9)
  
抗體名稱 LC-CDR1 LC-CDR2 LC-CDR3
86B7 SB2003-1 SB2003-2 SB2003-3 SB2003-4 SB2003-5 SB2003-6 SB2003-7 SB2003-8 SB2003-9 SB2003-10 SB2003-11 SB2003-12 KSTQSLLDSDGKTYLN (SEQ ID NO: 10) LVSKLDS (SEQ ID NO: 13) WQGTHFPWT (SEQ ID NO: 15)
83F2 RASESVDDYGISFIN (SEQ ID NO: 11) AASNQGS (SEQ ID NO: 14) LQSREIPYT (SEQ ID NO: 16)
96F11 KSSQNLLDSDGKTYLI (SEQ ID NO: 12) LVSKLDS (SEQ ID NO: 13) WQGTHFPRT (SEQ ID NO: 17)
表3示例性序列
序列編號 簡介 序列
18 86B7 V H QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRFNPSLKSRLSISKDTSNNQVFLKITTVDTADTATYYCARGNWDGETYFDYWGQGTTLTVSS
19 SB2003-1 V HSB2003-2 V HSB2003-3 V HSB2003-4 V H QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTFGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRFNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGNWDGETYFDYWGQGTLVTVSS
20 SB2003-5 V HSB2003-6 V HSB2003-7 V HSB2003-8 V H QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTFGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRFNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARGNWDGETYFDYWGQGTLVTVSS
21 SB2003-9 V HSB2003-10 V H QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTFGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRFNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHGNWDGETYFDYWGQGTLVTVSS
22 SB2003-11 V HSB2003-12 V H QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTFGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDDKRFNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHGNWDGETYFDYWGQGTLVTVSS
23 83F2 V H QVQFQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTDFWIQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTRENQKFKGRATLTADKSSSTAYMQLSSLESDDSAVYYCARGNGNSWFAYWGQGTLVTVSA
24 96F11 V H EVQLQQSGAELVKPGASVELSCTASGFNIKDTYIYWVKQRPEQGLQWIGRIDPANGHTKYDPRFQDKATLTAEISSNTAHLQLNSLTSEDTAVYFCVRGGDHPYYVMDWWGQGTSVTVSS
  
25 86B7 V L DVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSTQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKSLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKLEIK
26 SB2003-1 V LSB2003-5 V L DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSTQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPWTFGQGTKVEIK
27 SB2003-2 V LSB2003-6 V L DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSTQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPWTFGQGTKVEIK
28 SB2003-3 V LSB2003-7 V LSB2003-9 V LSB2003-11 V L DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSTQSLLDSDGKTYLNWFQQRPGQSPRSLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPWTFGQGTKVEIK
29 SB2003-4 V LSB2003-8 V LSB2003-10 V LSB2003-12 V L DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSTQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRSLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPWTFGQGTKVEIK
30 83F2 V L DIVLTQSPASLAVSLGQRATFSCRASESVDDYGISFINWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMYFCLQSREIPYTFGGGTKLEIK
31 96F11 V L AVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQNLLDSDGKTYLIWLLQRPGQSPMRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK
32 IgG1 重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
33 IgG4 重鏈恆定區 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
34 輕鏈恆定區（κ） RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
35 輕鏈恆定區（γ） GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
[BTLA]
BTLA（B和T淋巴細胞衰減器）是受體CD28家族成員，該家族還包括CD28、CTLA-4、ICOS和PD-1。該家族的最初成員CD28和ICOS是通過加入單株抗體後增強了T細胞增殖的功能效應而被發現的（Hutloff et al., Nature, 1999.）。BTLA是通過篩選TH1細胞中的差異表達被發現的。此外，BTLA被描述為提供負抑制訊號，類似於CTLA-4。在存在激動型抗BTLA抗體的情況下，抗CD3和抗CD28啟動的T細胞表現出IL-2生成和細胞增殖的減少（Kreig et al., J. Immunol., 2005）。缺乏完整BTLA基因的小鼠在免疫後對DNP-KLH的滴度更高，對EAEA的敏感性增加（Watanabe rt al., Nat. Immunol, 2003）。
BTLA的蛋白結構類似於程式性細胞死亡1（PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4），包括胞外結構域、跨膜結構域和胞質結構域（Sedy JR et al., Nat Immunol., 2005；Gonzalez et al., Proc Natl Acad., 2005）。胞質結構域包含生長因數受體結合蛋白2（Grb-2）關聯基序、基於免疫受體酪氨酸的開關基序（ITSM）和基於免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM）。HVEM結合啟動BTLA中ITIM酪氨酸磷酸化，並招募包含Src同源結構域2（SH2）的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，其通常介導免疫抑制作用（Gavrieli et al., Biochem Biophys Res Commmun, 2003；Watanabe N et al., Nat Immunol, 2003）。BTLA可在淋巴結、胸腺和脾臟中廣泛表達，但在其他器官中很少或沒有表達，如心臟、腎臟、腦和肝臟等（Yu, et al. 2019）。在免疫細胞中，BTLA主要在B細胞和T細胞中表達。在小鼠脾臟中，BTLA在B細胞中的表達高於T細胞中。關於T細胞，BTLA的表達可在CD4+和CD8 + T細胞上檢測到，且CD4+ T細胞比CD8+ T細胞表達更多的BTLA（Rio ML et al., Immunobiology. 2010）。另外，在固有免疫細胞中也可檢測到其表達，如樹突狀細胞（DCs）和單核細胞（De Sousa LA et al., Font Immunol, 2018）。HVEM與BTLA結合對B細胞和T細胞的增殖和活化有直接的負面影響（Cai et al., Immuno Rev, 2009）。 [HVEM]
HVEM（TNFRSF14）是TNFR超家族成員，為共刺激和共抑制受體的共用配體。人和小鼠HVEM是分別由283和276個氨基酸組成的I型細胞表面蛋白，帶有由四個富含半胱氨酸結構域（CRDs）組成的胞外結構域，即CRD1、CRD2、CRD3、CRD4 （Hsu et al. J. Biol. Chem, 1997）。HVEM的CRD2和CRD3結構域與LIGHT相互作用（Rooney et al, J. Biol. Chem, 2000.），BTLA和CD160與HVEM的CRD1和CRD2結合（Gonzalez et al., Proc Natl. Acad. Sci, 2005. Cheung et al. Proc. Natl. Acad. 2005.）。CDR1對抑制重組HVEM-Ig融合蛋白誘導的訊號通路非常重要，因為該結構域的缺失會導致HVEM-Ig的共刺激（Admas, et al. Am. J. Transplant, 2002.）。HVEM具有雙功能活性，結合共抑制受體（如BTLA或CD160）和減弱TCR介導的訊號傳導，或者作為LIGHT的受體，共同刺激T細胞（Admas, et al. Am. J. Transplant, 2002; Watanabe et al.2003, Nat. Immunol.）。
HVEM在造血細胞和非造血細胞中廣泛表達。有趣的是，在同一個細胞上，LIGHT和HVEM的表達是相互調節的（Tamada et al., J. Immunol., 2000.）。HVEM在初始B細胞和記憶B細胞中高表達，但在生髮中心活化的B細胞上卻沒有表達（Duhen et al., J. Immunol., 2004）。與T細胞類似，HVEM通過DC和T細胞上表達的LIGHT作用於初始B細胞，共同刺激B細胞增殖和Ig分泌，從而增強體液免疫反應。除了T細胞和B細胞外，HVEM還廣泛表達於其他造血細胞（DC、Tregs、單核細胞、中性粒細胞和NK細胞）和非造血細胞（實質細胞）。在這些細胞類型上觸發HVEM可啟動其效應功能，增加殺菌活性並促進NK細胞活化（Marsters et al. J. Biol. Chem, 1997；Garrieli et al. Adv. Immunol.2006.；Fan et al. Blood, 2006.）。 [全長抗BTLA抗體]
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體包含IgG恆定區域，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的恆定區域。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體包含λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體包含κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體是全長的人抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體包含小鼠免疫球蛋白Fc序列。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體包含已經改變的或以其他方式改變的Fc序列，使得其具有增強的抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）和補體依賴的細胞毒作用（CDC）的效應功能。
因此，例如，在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，所述抗BTLA抗體與BTLA特異性結合。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG2恆定區的全長抗BTLA抗體，所述抗BTLA抗體與BTLA特異性結合。在一些實施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG3恆定區的全長抗BTLA抗體，所述抗BTLA抗體與BTLA特異性結合。在一些實施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，所述抗BTLA抗體與BTLA特異性結合。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG2恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。在一些實施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG3恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。在一些實施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體包含至多約3個（例如1、2或3個）氨基酸的取代。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列，或者所述重鏈可變結構域的變體，其HC-CDR序列中包含至多約5個（例如1、2、3、4或5個）氨基酸的取代；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列，或者所述輕鏈可變結構域的變體，其LC-CDR序列中包含至多約5個（例如1、2、3、4或5個）氨基酸的取代。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列，或者所述重鏈可變結構域的變體，其HC-CDR序列中包含至多約5個（例如1、2、3、4或5個）氨基酸的取代；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列，LC-CDR2，包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列，或者所述輕鏈可變結構域的變體，其LC-CDR序列中包含至多約5個（例如1、2、3、4或5個）氨基酸的取代。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 1-3中任一所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 4-6中任一所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 7-9中任一所示的氨基酸序列；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含SEQ ID NOs: 10-12中任一所示的氨基酸序列，LC-CDR2，其包含SEQ ID NOs: 13-14中任一所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NOs: 15-17中任一所示的氨基酸序列。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含：a)重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9；以及b)輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG2恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述IgG2是人IgG2。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG3恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述IgG3是人IgG3。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%（例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%）序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述（V H）包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列，以及輕鏈可變結構域（V L），所述（V L）包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：重鏈可變結構域（V H），所述V H包含SEQ ID NOs: 18-24中任一所示的氨基酸序列，以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含SEQ ID NOs: 25-31中任一所示的氨基酸序列。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 18具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 23具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 30或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 30具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG1恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 24具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 31或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 31具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 18具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 23具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 30或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 30具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種包含IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體，其中抗BTLA抗體包含：V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 24具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 31或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 31具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成以及輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。 [結合親和力]
結合親和力採用Kd、Koff、Kon或Ka表示。如本文所用，術語Koff是指抗體從抗原/抗體複合物中解離的速率常數，通過動力學選擇裝置測定。術語Kon是指抗體與抗原結合形成抗原/抗體複合物的結合速率常數。本文所用的平衡解離常數Kd是指特定抗體抗原相互作用時的解離常數，是指在抗體分子溶液中，抗原佔據所有抗體結合位點的一半並且達到平衡時所需的抗原濃度，等於Koff/Kon。Kd的測定假設所有的結合分子均在溶液中。抗體與細胞壁連接的情況，例如在酵母表達系統中，相應的平衡解離速率常數採用EC50來表示，其是Kd的一個良好的近似值。親和結合常數Ka是解離常數Kd的倒數。
解離常數（Kd）可以作為反應抗體部分與抗原親和力的指標。例如，可以通過Scatchard方法使用標記有各種標記物的抗體，和Biacore儀器（由Amersham Biosciences製造）進行簡單分析，根據使用者手冊或附帶試劑盒，通過表面電漿體共振來分析生物分子間的相互作用。使用這些方法得到的Kd值，用單位M來表示。與靶標特異性結合的抗體可能具有，例如≤ 10 -7M、≤ 10 -8M、≤ 10 -9M、≤ 10 -10M、≤ 10 -11M、≤ 10 -12M或≤ 10 -13M的Kd值。
抗體的結合特異性可以通過本領域已知的方法進行實驗測定。這些方法包括，但不限於Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore測試和肽掃描等。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體特異性結合BTLA靶標，其Kd值為10 -7M至10 -13M（例如10 -7M至10 -13M、10 -8M至10 -13M、10 -9M至10 -13M或10 -10M至10 -12M）。因此，在一些實施例中，抗BTLA抗體與BTLA之間結合的Kd值為10 -7M至10 -13M、1×10 -7M至5×10 -13M、10 -7M至10 -12M、10 -7M至10 -11M、10 -7M至10 -10M、10 -7M至10 -9M、10 -8M至10 -13M、1×10 -8M至5×10 -13M、10 -8M至10 -12M、10 -8M至10 -11M、10 -8M至10 -10M、10 -8M至10 -9M、5×10 -9M至1×10 -13M、5×10 -9M至1×10 -12M、5×10 -9M至1×10 -11M、5×10 -9M至1×10 -10M、10 -9M至10 -13M、10 -9M至10 -12M、10 -9M至10 -11M、10 -9M至10 -10M、5×10 -10M至1×10 -13M、5×10 -10M至1×10 -12M、5×10 -10M至1×10 -11M、10 -10M至10 -13M、1×10 -10M至5×10 -13M、1×10 -10M至1×10 -12M、1×10 -10M至5×10 -12M、1×10 -10M至1×10 -11M、10 -11M至10 -13M、1×10 -11M至5×10 -13M、10 -11M至10 -12M、10 -12M至10 -13M。在一些實施例中，抗BTLA抗體與BTLA之間結合的Kd值為10 -7M至10 -13M。
在一些實施例中，抗BTLA抗體與非靶標之間結合的Kd值高於抗BTLA抗體與靶標的Kd值，並且本文中引用的一些實施例中，抗BTLA抗體與靶標（例如，BTLA）的結合親和力高於抗BTLA抗體與非靶標的結合親和力。一些實施例中，非靶標是指非BTLA的抗原。在一些實施例中，抗BTLA抗體（針對BTLA）與非BTLA靶標結合的Kd值間至少相差10倍，例如10-100倍、100-1000倍、10 3-10 4倍、10 4-10 5倍、10 5-10 6倍、10 6-10 7倍、10 7-10 8倍、10 8-10 9倍、10 9-10 10倍、10 10-10 11倍、10 11-10 12倍。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體與非靶標結合的Kd值為10 -1M至10 -6M（例如10 -1M至10 -6M、10 -1M至10 -5M、10 -2M至10 -4M）。在一些實施例中，所述非靶標是指非BTLA的抗原。因此，在一些實施例中，抗BTLA抗體與非BTLA靶標之間結合的Kd值為10 -1M至10 -6M、1×10 -1M至5×10 -6M、10 -1M至10 -5M、1×10 -1M至5×10 -5M、10 -1M至10 -4M、1×10 -1M至5×10 -4M、10 -1M至10 -3M、1×10 -1M至5×10 -3M、10 -1M至10 -2M、10 -2M至10 -6M、1×10 -2M至5×10 -6M、10 -2M至10 -5M、1×10 -2M至5×10 -5M、10 -2M至10 -4M、1×10 -2M至5×10 -4M、10 -2M至10 -3M、10 -3M至10 -6M、1×10 -3M至5×10 -6M、10 -3M至10 -5M、1×10 -3M至5×10 -5M、10 -3M至10 -4M、10 -4M至10 -6M、1×10 -4M至5×10 -6M、10 -4M至10 -5M、10 -5M至10 -6M。
在一些實施例中，當提及抗BTLA抗體以高結合親和力特異性地識別BTLA靶標，並以低結合親和力結合非靶標時，所述抗BTLA抗體與BTLA靶標結合的Kd值為10 -7M至10 -13M（例如10 -7M至10 -13M、10 -8M至10 -13M、10 -9M至10 -13M、10 -10M至10 -12M），並且與非靶標結合的Kd值為10 -1M至10 -6M（例如10 -1M至10 -6M、10 -1M至10 -5M、10 -2M至10 -4M）。
在一些實施例中，當提及抗BTLA抗體特異性地識別BTLA時，將所述抗BTLA抗體的結合親和力與對照抗BTLA抗體（例如Ref）的結合親和力進行比較。在一些實施例中，對照抗BTLA抗體與BTLA之間結合的Kd值可以是本發明所述的抗BTLA抗體與BTLA之間結合的Kd值的至少2倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、10-100倍、100-1000倍、10 3-10 4倍。 [核酸]
編碼抗BTLA抗體的核酸分子也被考慮在內。在一些實施例中，提供一種（或一組）編碼全長抗BTLA抗體的核酸，包括本文所述的任一種全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，本文所述的抗BTLA抗體的核酸（或一組核酸）還可以包括編碼多肽標籤的核酸序列（例如蛋白純化標籤，His標籤、HA標籤）。
同時本文還考慮了包含抗BTLA抗體的分離的宿主細胞，編碼抗BTLA抗體多肽組分的分離的核酸，或者包含編碼本文所述的抗BTLA抗體多肽組分的核酸的載體。
本發明還包括這些核酸序列的變體。例如，變體包括至少在中等嚴格雜交條件下與編碼本發明的抗BTLA抗體的核酸序列雜交的核苷酸序列。
本發明同時還提供可將本發明中核酸序列插入到其中的載體。
簡言之，將編碼抗BTLA抗體的天然或合成的核酸插入到合適的表達載體中，使得核酸可操作性的連接到5’和3’端調控元件，例如包括啟動子（例如淋巴細胞特異性啟動子）和3’非翻譯區（UTR），可表達抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）。所述載體可適用於在真核宿主細胞中複製和整合。典型的選殖與表達載體包含調控目標核酸序列的表達的轉錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。
本發明所述的核酸也可以通過使用標準的基因遞送方案，用於核酸免疫和基因治療。核酸遞送方法是本領域已知的。例如參見U.S.Pat.Nos.5,399,346、5,580,859、5,589,466，通過引用其全部內容併入本文。在一些實施例中，本發明還提供基因治療載體。
可以將核酸選殖到許多類型的載體中。例如，可以將核酸選殖到載體中，所述載體包括，但不限於，質粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和柯斯質粒。特別感興趣的載體包括表達載體、複製載體、探針生成載體和測序載體。
此外，表達載體可以以病毒載體的形式提供給細胞。病毒載體技術是本領域熟知的，並且描述於例如Green and Sambrook （2013, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York），以及其它病毒學或分子生物學手冊中。可用作載體的病毒包括，但不限於，逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包括一個在至少一種生物體中起作用的複製起點、啟動子序列、方便的限制性內切酶位點以及一個或多個選擇標記物（參見例如，WO 01/96584; WO 01/29058; 和U.S. Pat. No. 6,326,193）。
已經開發了許多基於病毒的系統，用於將基因轉移到哺乳動物細胞中。例如，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供了便利的平臺。可以應用本領域已知的技術，將選擇的基因插入載體中並包裝在逆轉錄病毒顆粒中。然後分離重組病毒，在體內或體外遞送至受試者的細胞中。許多逆轉錄病毒系統在本領域中是已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領域中是已知的。在一些實施例中，使用慢病毒載體。衍生自逆轉錄病毒的載體，例如慢病毒，是實現長期基因轉移的合適工具，因為它們使得轉基因長期穩定的整合以及在子代細胞中繁殖。慢病毒載體相對於衍生自腫瘤的逆轉錄病毒例如小鼠白血病病毒具有額外的優勢，因為它們可以轉導非分裂細胞，例如肝細胞。同時，其還具有低免疫原性的額外優勢。
其它的啟動子元件，例如，增強子，調控轉錄起始頻率。通常它們位於起始位點上游30-110bp處，雖然最近發現很多啟動子也包含起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔通常是靈活的，所以當元件彼此之間位置互換或移動時仍保持啟動子的功能。在胸苷激酶（tk）啟動子中，啟動子元件之間的間隔增加到50bp活性才會開始下降。
合適啟動子的一個示例是即時早期巨細胞病毒（CMV）啟動子序列。該啟動子序列是一個很強的組成型啟動子序列，可以驅動任何與其可操作性連接的多核苷酸序列高水準表達。合適啟動子的另一個示例是延伸因數1α（EF-1α）啟動子。然而，也可以使用其它組成型啟動子，包括但不限於猿猴病毒40（SV40）早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）、人免病缺陷病毒長末端重複序列（HIV-LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、Epstein-Barr病毒即刻早期啟動子、勞斯氏肉瘤病毒啟動子以及人類基因啟動子，例如包括但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子和肌酸激酶啟動子。此外，不應將本發明局限在僅使用組成型啟動子，誘導型啟動子也是本發明考慮的部分。誘導型啟動子的使用提供了一種分子開關，當需要這種表達時，能啟動其與之可操作性連接的多核苷酸序列表達，當不需要時，則關閉表達。誘導型啟動子包含，但不局限於，金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子。
在一些實施例中，抗BTLA抗體的表達是可誘導的。在一些實施例中，編碼抗BTLA抗體的核酸序列可操作的連接到誘導型啟動子上，包括本文所述的任一誘導型啟動子。 [誘導型啟動子]
誘導型啟動子的使用提供了一種分子開關，當需要表達時，可啟動與之可操作性連接的多核苷酸序列表達，而在不需要表達時，則關閉表達。真核細胞中適用的示例性誘導型啟動子包括，但不限於，激素調節元件（例如，參見Mader, S. and White, J. H.（1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5603-5607）、合成配體調節元件（參見Spencer, D. M. et al （1993 ）Science262: 1019-1024）以及電離輻射調控元件（參見Manome, Y. et al. （1993 ） Biochemistry32: 10607-10613; Datta, R. et al. （1992 ） Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 1014- 10153）。其它適用於體內或體外哺乳動物系統的示例性誘導型啟動子參見Gingrich et al. （1998 ） Annual Rev. Neurosci21:377-405。在一些實施例中，用於表達抗BTLA抗體的誘導型啟動子系統為Tet系統。在一些實施例中，用於表達抗BTLA抗體的誘導型啟動子系統為大腸桿菌lac抑制系統。
本發明所採用的一個示例性誘導型啟動子系統為Tet系統。該系統是基於Gossen等（1993）描述的Tet系統。在一個示例性實施例中，目標多核苷酸由包含一個或多個Tet操縱子（TetO）位點的啟動子控制。在非啟動狀態，Tet阻遏物（TetR）與TetO位點結合並抑制啟動子的轉錄。在啟動狀態，例如，在存在誘導劑如四環素（Tc）、無水四環素、多西環素（Dox）或其活性類似物的情況下，誘導劑會使TetR從TetO上釋放，從而導致轉錄發生。多西環素是四環素抗生素家族中的一員，其化學名為1-二甲氨基-2,4a,5,7-五羥基-11-甲基-4,6-二氧基-1,4a,11,11a,12,12a-六氫四烯-3-甲醯胺。
在一個實施例中，TetR經密碼子優化適用於在哺乳動物細胞中表達，例如小鼠或人類細胞。由於遺傳密碼的簡並性，大多數氨基酸由不止一個密碼子編碼，從而使得給定核酸的序列具有大量的變體，而其編碼的氨基酸序列沒有任何改變。然而，許多生物體在密碼子使用方面存在差異，也稱為“密碼子偏好”（即，給定氨基酸使用特定密碼子的偏好）。密碼子偏好通常與特定密碼子的優勢tRNA種類的存在有關，反過來又提高了mRNA翻譯的效率。因此可以通過密碼子優化來定制源自特定物種的編碼序列（例如，原核生物），以提高其在不同物種（例如，真核生物）中的表達。
Tet系統的其它具體變體，包括以下的“Tet-Off”和“Tet-On”系統。在Tet-off系統中，轉錄在Tc或Dox存在下是失活的。在該系統中，由TetR與單純皰疹病毒VP16強轉錄啟動結構域融合組成的四環素調控的轉錄啟動蛋白（tTA），在四環素反應啟動子元件（TRE）轉錄控制下調控靶核酸的表達。TRE元件由TetO序列串聯與啟動子（通常是來源於人巨細胞病毒即刻早期啟動子的最小啟動子序列）融合組成。在不存在Tc或Dox的情況下，tTA結合TRE並啟動靶基因的轉錄。在存在Tc或Dox的情況下，tTA不能結合TRE，靶基因不能表達。
相反，在Tet-On系統中，轉錄在Tc或Dox存在下是啟動的。Tet-On系統是基於反向四環素調控的轉錄啟動因數rtTA。與tTA一樣，rtTA是由TetR阻遏物與VP16轉錄啟動結構域組成的融合蛋白。然而，TetR的DNA結合區中4個氨基酸的變化改變了rtTA的結合特性，使其在存在Dox的情況下只能識別靶轉基因TRE上的tetO序列。所以在Tet-On系統中，只有在存在Dox的情況下，rtTA才能啟動TRE調控的靶基因的轉錄。
另一種誘導型啟動子系統是大腸桿菌的lac阻遏物系統（參見Brown et al., Cell49:603-612（1987））。Lac阻遏物系統通過調控與包含lac操縱子（lacO）的啟動子可操作性連接的目標多核苷酸的轉錄發揮功能。Lac阻遏物（lacR）與LacO結合，進而阻止目標多核苷酸的轉錄。通過合適的誘導劑來誘導目標多核苷酸的表達，例如，異丙基-β-D硫代半乳糖吡喃苷（IPTG）。
為了評估多肽或其部分的表達，待導入細胞的表達載體還可包含選擇標記基因或報告基因或二者都有，以便於從病毒載體轉染或感染的細胞群體中識別和選擇表達細胞。在其他方面，選擇標記可以攜帶在單獨的DNA片段上並在共轉染實驗中使用。選擇標記基因或報告基因都可側接於合適的調控序列，使其在宿主細胞中能夠表達。有用的選擇標記包括，例如，抗生素耐藥基因，如neo以及類似基因。
報告基因可用於鑒定潛在的轉染細胞和評價調控序列的功能。通常，報告基因是不存在於受體生物體或組織中或不由受體生物體或組織表達的基因，其編碼一種多肽，其表達表現為一些易於檢測的特性，例如酶活性。當DNA導入受體細胞後，在合適的時間檢測報告基因的表達。合適的報告基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因（參見, Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters479: 79-82）。合適的表達系統是公知的，可以通過已知的技術製備或通過商業途徑獲得。通常，把可顯示報告基因最高表達水準的最小5’側翼區的構建體認定為啟動子。此類啟動子區可以與報告基因連接，並用於評估某些物質在調節啟動子驅動的轉錄中能力。
在一些實施例中，提供編碼本文所述的任一種全長抗BTLA抗體的核酸。在一些實施例中，所述核酸包括編碼全長抗BTLA抗體重鏈和輕鏈的一個或多個核酸序列。在一些實施例中，所述一個或多個核酸序列中的每一個包含在單獨的載體中。在一些實施例中，至少有一些核酸序列包含在同一載體中。在一些實施例中，所有核酸序列包含在同一載體中。載體可以選自，例如，哺乳動物表達載體和病毒載體（如源自逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒的載體）。
將基因導入細胞並表達的方法在本領域是已知的。在涉及表達載體的上下文中，通過本領域的任何方法載體可以很容易地導入宿主細胞中，如哺乳動物細胞、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如表達載體可以通過物理、化學或生物方法導入宿主細胞。
將多核苷酸導入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質體轉染、基因槍法、顯微注射、電穿孔法以及諸如此類。製備包含載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領域是熟知的。參見例如Green and Sambrook（2013, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）。在一些實施例中，通過磷酸鈣轉染法將多核苷酸導入宿主細胞。
將目標多核苷酸導入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是逆轉錄病毒載體，已成為將基因插入哺乳動物細胞，例如人類細胞中的最廣泛使用的方法。其它病毒載體可以源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒1型、腺病毒和腺相關病毒等。參見如U.S. Pat. Nos. 5,350,674 和5,585,362。
將多核苷酸導入宿主細胞的化學方法包括膠體分散系統，例如高分子複合物、納米膠囊、微球、磁珠和以脂質為基礎的系統，其包括水包油乳劑、膠團、混合膠團和脂質體。一種在體內和體外被用作遞送載體的示例性膠體系統是脂質體（例如，人工膜囊）。
在使用非病毒遞送系統的情況下，示例性的遞送載體是脂質體。考慮使用脂質製劑將核酸導入宿主細胞（體外、離體或體內）。在另一方面，所述核酸可以與脂質結合。與脂質結合的核酸可被包裹進脂質體的水性內部，散佈在脂質體的脂質雙層內，通過與脂質體和寡核苷酸結合的連接分子連接在脂質體，包埋在脂質體中，與脂質體形成複合物，分散在含有脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質結合，懸浮在脂質中，包含在膠束中或與膠束混合，或以其它方式與脂質結合。脂質、脂質/DNA或脂質/表達載體相關的組合物在溶液中不限於任何特定結構。例如，它們可能以雙分子層結構、以膠束或以“塌陷”結構存在。它們也可以簡單的分散在溶液中，可能形成大小或形狀不均勻的聚集體。脂質是脂肪物質，可以是天然存在的或是合成的脂質。例如，脂質包括天然存在於細胞質中的脂肪滴，以及含有長鏈脂肪烴及其衍生物的一類化合物，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
無論採用何種方法將外源核酸導入宿主細胞中或以其他方式將細胞暴露於本發明的抑制劑中，為了確認重組DNA序列存在於宿主細胞中，可以進行多種實驗。這類實驗包括例如本領域技術人員熟知的“分子生物學”實驗。例如Southern和Northern blotting，RT-PCR和PCR；“生物化學”實驗，例如檢測某一特定多肽存在或不存在，例如通過免疫學方法（ELISAs和Western blots）或者通過本文所述的實驗來進行鑒定均落入本發明範圍內。 [抗BTLA抗體的製備]
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是單株抗體或源於單株抗體。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體包含來自單株抗體的V H和V L，或者其變體。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體進一步包括來自單株抗體的CH1和CL區域，或者其變體。單株抗體可以應用例如本領域已知的方法製備，包括雜交瘤細胞法、噬菌體展示方法或應用重組DNA法。此外，示例性的噬菌體展示法在本文及以下的實施例中進行了描述。
在雜交瘤細胞法中，通常採用免疫劑免疫倉鼠、小鼠或其他適合的宿主動物，以引發產生或能夠產生與免疫劑特異性結合的抗體的淋巴細胞。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。免疫劑可包括目標蛋白的多肽或融合蛋白。通常，如果需要人源細胞，採用外周血淋巴細胞（PBLs），而如果需要非人哺乳動物來源細胞，則會使用脾細胞或淋巴結細胞。使用適當的融合劑將淋巴細胞與永生細胞系進行融合，例如聚乙二醇，以形成雜交瘤細胞。永生細胞系通常是轉化的哺乳動物細胞，尤其是齧齒類、牛科和人源的骨髓瘤細胞。通常採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可以在合適的培養基中進行培養，所述培養基較佳含有一種或多種抑制未融合永生細胞生長或存活的物質。例如，如果親本細胞缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT），則雜交瘤細胞培養基通常包括次黃嘌呤、氨蝶呤和胸苷（HAT培養基），該培養基能阻止HGPRT缺陷細胞生長。
在一些實施例中，永生化細胞系有效融合，通過所選擇的抗體生產細胞保證抗體高水準穩定表達，並且對某些培養基敏感，例如HAT培養基。在一些實施例中，永生細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，可以從例如，加利福尼亞聖地牙哥的索爾克細胞保藏中心和維吉尼亞馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心獲得。同時還描述了人骨髓瘤和鼠-人雜交骨髓瘤細胞系用於製備人源單株抗體。
然後可以測定培養雜交瘤細胞的培養基中是否存在針對多肽的單株抗體。由雜交瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性可以通過免疫沉澱法或體外結合實驗確定，如放射性免疫測定法（RIA）或酶聯免疫吸附法（ELISA）。此類技術或分析方法在本領域是已知的。單株抗體的結合親和力可以通過例如Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220（1980）中所述的斯卡查德（Scatchard）分析確定。
在鑒定出所需的雜交瘤細胞後，可以通過有限稀釋法對目標選殖進行亞選殖，並通過標準方法進行培養。基於此目的適合的培養基包括，例如改良Eagle培養基（DMEM）和RPMI-1640培養基。或者，雜交瘤細胞可以在哺乳動物體內以腹水的形式生長。
亞選殖分泌的單株抗體可以通過常規免疫球蛋白純化方法從培養基或腹水中分離或純化，例如蛋白A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石色譜層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
在一些實施例中，根據本文所述的任一抗BTLA抗體，所述抗BTLA抗體包含選自抗體文庫（例如展示scFv或Fab片段的噬菌體文庫）的選殖的序列。所述選殖可以通過篩選具有所需活性的抗體片段組合文庫的方法進行鑒定。例如，本領域已知多種方法用於產生噬菌體展示文庫以及篩選這些文庫來獲得所需結合特性的抗體。這些方法在例如Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology178:1-37 （O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001）中進行了綜述，並且在例如McCafferty et al., Nature348:552-554; Clackson et al., Nature352: 624-628（1991）; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597（1992）; Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology248:161-175 （Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003）; Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310（2004）; Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093（2004）; Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA101(34): 12467-12472（2004）; and Lee et al., J. Immunol. Methods284(1-2): 119-132（2004）中進行了進一步描述。
在某些噬菌體展示方法中，通過聚合酶鏈式反應（PCR）分別選殖V H和V L基因的所有組成成分，並在噬菌體文庫中隨機重組，然後篩選能夠結合抗原的噬菌體，如Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455（1994）中所述。噬菌體通常以scFv片段或以Fab片段形式展示抗體片段。免疫來源的文庫噬菌體提供針對免疫原的高親和力抗體而不需要構建雜交瘤細胞。或者，可以選殖天然庫（例如來自人），來提供針對多種非自身抗原和自身抗原的單一抗體來源，而不需任何免疫，如Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734（1993）中所述。最後，天然文庫也可以通過選殖來自乾細胞的非重排V-gene片段，並使用包含隨機序列的PCR引物編碼CDR3高變區並且在體外完成重排的方法進行製備，如Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388（1992）中所述。描述人抗體噬菌體文庫的專利出版物包括，例如U.S. Pat. No. 5,750,373和 US Patent Publication Nos. 2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
通過噬菌體展示篩選文庫中能夠特異性結合靶標BTLA的抗BTLA抗體部分的方法來製備所述的抗BTLA抗體。該文庫可以是人scFv噬菌體展示文庫，具有至少1×10 9（例如至少1 × 10 9、2.5 × 10 9、5 × 10 9、7.5 × 10 9、1 × 10 10、2.5 × 10 10、5 × 10 10、7.5 × 10 10或1 × 10 11）種多樣性的獨特的人抗體片段。在一些實施例中，所述文庫是人天然文庫，通過從健康受試者的PMBCs和脾臟中提取的DNA構建，包含所有人重鏈和輕鏈亞家族。在一些實施例中，所述文庫是人天然文庫，通過從各種疾病患者體內分離的PMBCs中提取的DNA構建，例如自身免疫病的患者、癌症患者和感染性疾病的患者。在一些實施例中，所述文庫是半合成的人文庫，其中重鏈CDR3完全是隨機的，所有氨基酸（除了半胱氨酸）以相同的概率存在於任何給定的位置。（參見例如, Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005）。在一些實施例中，半合成的人文庫的重鏈CDR3長度在5到24個（例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個）氨基酸之間。在一些實施例中，所述文庫是全合成的噬菌體展示文庫。在一些實施例中，所述文庫是非人噬菌體展示文庫。
與靶標BTLA具有高親和力的噬菌體選殖可以通過噬菌體與靶標BTLA的反覆運算結合進行篩選，所述靶標BTLA與固相支持物結合（例如用於溶液淘選的珠子或用於細胞淘選的哺乳動物細胞），接下來去除未結合的噬菌體，並洗脫特異性結合噬菌體。隨後，洗脫結合的噬菌體選殖並用於感染合適的宿主細胞，例如E. coli XL1-Blue，進行表達和純化。可以通過多輪淘選（例如，2、3、4、5、6或更多輪），例如溶液淘選、細胞淘選或兩者結合以富集特異性結合BTLA的噬菌體選殖。富集的噬菌體選殖與靶標BTLA的特異性結合可以通過本領域已知的任何方法進行檢測，包括例如ELISA和FACS。
篩選抗體文庫的另一種方法是在酵母細胞表面展示蛋白質。Wittrup等（美國專利6,699,658和6,696,251）開發了一種酵母細胞展示文庫的方法。在此酵母展示系統中，一個組分包括錨定在酵母細胞壁上的酵母凝集素蛋白（Aga1），另一個組分包括凝集素蛋白Aga2的第二個亞基，該亞基可以通過二硫鍵與Aga1蛋白結合進而展示在酵母細胞表面上。通過將Aga1基因整合到酵母染色體中來表達Aga1蛋白。將單鏈可變片段（scFv）文庫與酵母展示質粒中的Aga2基因融合，將其轉化後，該文庫由於附加的營養標記的存在可保留在酵母中。Aga1和Aga2蛋白均在半乳糖誘導型啟動子的控制下表達。
人抗體V基因庫（V H和V K片段）是使用一組簡並引物通過PCR方法獲得（Sblattero，D. and Bradbury, A. Immunotechnology3, 271-278 1998）。PCR範本來自可商購的RNA或cDNA，包括PBMC，脾臟，淋巴結，骨髓和扁桃體。將獨立的V H和V KPCR文庫合併後，通過重疊延伸PCR將其組裝成scFv形式（Sheets，M.D. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA95, 6157–6162 1998）。為了構建酵母scFv展示文庫，通過同源重組將所得的scFv PCR產物選殖到酵母中的酵母展示質粒中。（Chao, G, et al, Nat Protoc. 2006;1(2):755-68. Miller KD, et al. Current Protocols in Cytometry4.7.1-4.7.30, 2008）。
可以利用哺乳動物細胞展示系統來篩選抗BTLA抗體，其中抗體部分展示在細胞表面上並通過抗原導向的篩選方法分離出特異性靶向BTLA的抗體（如U.S. patent No. 7,732,195B2中所述）。可以建立展示大量人類IgG抗體基因的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞文庫，並將其用於發現表達高親和力抗體基因的選殖。已開發出另一種展示系統，該系統通過可變剪接使同一蛋白同時在細胞表面展示和分泌，其中展示的蛋白表型保持與基因型相關，使得可同時在生物物理和基於細胞功能的分析中表徵該分泌的可溶性抗體。該方法克服了先前哺乳動物細胞展示的許多局限性，能夠直接篩選和成熟化全長的、糖基化的IgGs形式的抗體（Peter M.Bowers, et al, Methods2014,65：44-56）。暫態表達系統適用於在抗體基因恢復之前進行的單輪抗原選擇，因此對於從較小文庫中選擇抗體最有用。穩定的外顯體載體提供了一種有吸引力的選擇。外顯體載體可以高效轉染並穩定地維持在低拷貝數，從而允許多輪淘選以及更複雜抗體庫的解析。
IgG文庫是基於分離自一群人類供體的種系序列V基因片段與重排的（D）J區域的連接構建而成。將從2000個人體血液樣本中收集的RNA反轉錄為cDNA，使用V H和V K特異性引物擴增V H和V K片段，並通過凝膠提取純化。將V H和V K片段分別亞選殖到包含IgG1或K恆定區的展示載體中，然後電穿孔或轉導293T到細胞，從而製備IgG文庫。為了製備scFv抗體展示文庫，連接V H和V K以產生scFv，然後亞選殖到展示載體中，再將其電穿孔或轉導293T細胞。眾所周知，IgG文庫是基於分離自一群供體的種系序列V基因片段與重排的（D）J區域構建而成，供體可以是小鼠，大鼠，兔或猴。
單株抗體也可以通過重組DNA方法進行製備，例如U.S. Patent No. 4,816,567中所述。編碼本發明中所述單株抗體的DNA可以通過常規方法（例如通過能特異性結合編碼鼠源抗體輕鏈和重鏈基因的寡聚核苷酸探針）輕易的分離和測序。如上所述的雜交瘤細胞或本發明的BTLA特異性噬菌體選殖可以作為這種DNA的來源。分離後，可將DNA置於表達載體中，然後該載體轉染入宿主細胞，例如猿猴COS細胞、中華倉鼠卵巢癌（CHO）細胞或不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞中，獲得在重組宿主細胞中合成的單株抗體。所述DNA也可以被修飾，例如用編碼序列取代人重鏈和輕鏈恆定區和/或用框架區替換同源非人序列（U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al., supra)，或通過共價鍵連接免疫球蛋白的編碼序列的全部或部分非免疫球蛋白多肽的編碼序列。這種非免疫球蛋白多肽可以取代本發明中抗體的恆定區，或可以取代本發明中抗體可變結構域中的一個抗原結合位點，形成嵌合的二價抗體。
所述抗體可以是單價抗體。製備單價抗體的方法是本領域已知的。例如，一種涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾重鏈的重組表達方法。通常在Fc區的任意位置截短重鏈，以阻止重鏈相互交聯。或者，相關的半胱氨酸殘基被其它氨基酸殘基取代或被缺失以防止交聯。
體外方法也適用於製備單價抗體。消化抗體產生抗體片段，特別是Fab片段，可以使用任何本領域已知的方法完成。
具有所需結合特異性（抗體-抗原結合位點）的抗體可變結構域可以與免疫球蛋白恆定區融合。較佳與免疫球蛋白重鏈恆定區進行融合，其包括至少部分鉸鏈，CH2和CH3區。在一些實施例中，包含輕鏈結合必要位點的第一重鏈恆定區（CH1）至少出現在一種融合體中。編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，如果需要，還可以包括編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA，被插入進獨立的表達載體中，並共轉染至合適的宿主生物中。 [全人和人源化抗體]
所述抗BTLA抗體(如全長的抗BTLA抗體)可以是全人抗體或人源化抗體。非人（如小鼠）抗體部分的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’) 2、scFv或抗體的其他抗原結合子序列），其通常包括最少的源於非人免疫球蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（受體抗體），其中受體CDR的殘基被具有所需特異性、親和力和性能的非人源（供體抗體）CDR殘基取代，例如小鼠、大鼠或兔子的CDR。在一些實施例中，人免疫球蛋白Fv框架區殘基被相應的非人源殘基取代。人源化抗體還可以包含既不屬於受體抗體也不在引入的CDR或框架區序列中的氨基酸殘基。通常，人源化抗體包含至少一個，通常兩個可變結構域，其中全部或基本上全部CDR區對應於非人免疫球蛋白的CDR區，全部或基本上全部框架區是人免疫球蛋白共有序列。
通常，人源化抗體含有一個或多個從非人源引入的氨基酸殘基。那些非人源氨基酸殘基通常被稱為“移入”殘基，通常來自“移入”可變結構域。根據一些實施例，人源化基本上可以按照Winter和其同事的如下方法進行（Jones et al., Nature, 321: 522-525（1986）; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327（1988）; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536（1988）），通過用齧齒動物CDRs或CDR序列取代人源抗體的相應序列。因此，這種“人源化”抗體部分（U.S. Patent No. 4,816,567），其基本上少於完整的人源抗體，其可變結構域已被來自非人源的相應序列所取代。在實際中，人源化抗體部分是典型的人源抗體部分，其中一些CDR殘基和可能的一些框架區殘基被來自齧齒類抗體中類似位點的殘基所取代。
全人抗體是人源化的一種替代方式。例如，目前可以製備在免疫後能夠產生完整的全人抗體文庫而不產生內源性免疫球蛋白的轉基因動物（例如，小鼠）。例如，已有報導，嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區（JH）基因的純合子缺失，完全抑制了內源性抗體的產生。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這種種系突變小鼠體內，可在抗原刺激下產生人源抗體，參見，例如akobovits et al., PNAS USA, 90:2551（1993）; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258（1993）; Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33（1993）; U.S. Patent Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669, 5,545,807; 和WO 97/17852。或者，可以通過將人類免疫球蛋白基因座引入轉基因動物中（例如內源性免疫球蛋白基因已經被部分或全部沉默的小鼠）來製備全人抗體。抗原刺激後，可以發現全人抗體的產生在各個方面都與其在人類中的產生非常相似，包括基因重排、組裝和抗體文庫。這種方法在例如U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016, and Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783（1992）; Lonberg et al., Nature, 368: 856-859（1994）; Morrison, Nature, 368: 812-813（1994）; Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851（1996）; Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826（1996）; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93（1995）中進行了描述。
全人抗體也以通過體外活化B細胞（見U.S. Patents 5,567,610 and 5,229,275）或通過使用本領域已知的各種技術來產生，包括噬菌體展示文庫。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381（1991）; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581（1991）. Cole et al.和Boerner et al.等人的技術也可以用於製備全人單株抗體。見Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77（1985） and Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95（1991）。 [抗BTLA抗體變體]
在一些實施例中，本文提供的抗BTLA抗體變體（例如，全長的抗BTLA抗體）的氨基酸序列也在考慮中。例如，可能需要改善抗體的結合親和力和/或其它生物學活性。抗體變體的氨基酸序列可以通過在編碼抗體的核苷酸序列中引入適當的修飾或通過肽合成來製備。此類修飾包括例如，抗體氨基酸序列中殘基的缺失和/或插入和/或取代。可以通過氨基酸殘基缺失、插入和取代的任一組合來完成最終的構建，使其具有所需的特徵。例如，抗原結合性。
在一些實施例中，提供具有一個或多個氨基酸取代的抗BTLA抗體變體。取代突變的目標位元點包括高變區（HVRs）和框架區（FRs）。可以在目標抗體中引入氨基酸取代，篩選所需活性的產物，例如，改善的生物活性，保持/改善抗原結合能力，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
保守取代如下表4所示。
表4 保守取代
原始殘基 示例性取代 較佳取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine Leu
根據側鏈性質將氨基酸分為不同類別： a、疏水氨基酸：去甲亮氨酸Norleucine、蛋氨酸Met、丙氨酸Ala、纈氨酸Val、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile； b、中性親水性氨基酸：半胱氨酸Cys、絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr、天冬醯胺Asn、穀氨醯胺Gln； c、酸性氨基酸：天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu； d、鹼性氨基酸：組氨酸His、賴氨酸Lys、精氨酸Arg； e、含有影響鏈方向的氨基酸：甘氨酸Gly、脯氨酸Pro； f、芳香族氨基酸：色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe。
非保守氨基酸的取代包含將以上一種類別取代為另一種類別。
一種示例性的取代變體是親和力成熟的抗體，可採用例如以噬菌體展示為基礎的親和力成熟技術而方便地產生。簡言之，將一個或多個CDR殘基進行突變，變體抗體部分展示在噬菌體上，並篩選具有特定生物活性（例如，基於Raji-HVEM/T細胞共培養試驗中由T細胞啟動介導的IL-2產生的生物活性或結合親和力）的變體。可以在HVRs區進行改變（例如，取代）來獲得改善的基於Raji-HVEM/T細胞共培養試驗中由T細胞啟動介導的IL-2產生的生物活性或結合親和力。可以在HVR的“熱點區”產生改變，即在體細胞成熟過程中發生高頻突變的密碼子編碼的殘基（參見，例如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196（2008）），和/或在特異的決定性殘基（SDRs），檢測所得變體V H和V L的結合親和力。從二級文庫中構建和重新選擇親和力成熟的方法已經在一些文獻中進行描述，例如，Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ,（2001））。
在一些親和力成熟的實施例中，通過多種方法中的任一種（例如易錯PCR，鏈改組或寡核苷酸定向突變），將多樣性引入選擇的用於親和力成熟的可變基因中。然後創建二級文庫。對該文庫進行篩選，鑒定出具有所需親和力的抗體變體。另一種引入多樣性的方法包括HVR介導的方式，其中幾個HVR殘基（例如，一次4-6個殘基）被隨機化。涉及抗原結合的HVR殘基被特異性地識別，例如，採用丙氨酸掃描誘變或建模。通常CDR-H3和CDR-L3區域尤其是重點靶標。
在一些實施例中，取代、插入或缺失可能發生在一個或多個HVRs內，只要這種改變基本上不降低抗體結合抗原的能力。例如，可以在HVRs中產生基本上不降低結合親和力的保守性改變（例如，本文中提供的保守性取代）。這些改變可能發生在HVR“熱點區”或SDRs區域之外。在一些實施例中上文提供的變體V H和V L序列，每一個HVR或者是未發生改變，或者包含不超過1個、2個或3個氨基酸取代。
一種有用的可以鑒定出抗體中能被靶向性突變的氨基酸殘基或區域的方法稱為“丙氨酸掃描突變”，如Cunningham and Wells（1989） Science, 244:1081-1085中所述。在該方法中，一個或一組目標殘基（例如，帶電殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸）被中性或帶負電荷氨基酸（例如，丙氨酸或谷氨酸）取代，以此來確定抗體與抗原相互作用是否受到影響。可以在氨基酸的位置進一步引入取代，來證明該位置對初始取代具有功能敏感性。或者/另外，通過抗原-抗體複合物的晶體結構來鑒定抗體和抗原之間的接觸位點。這些接觸位點殘基和鄰近殘基可作為取代候選物而被靶向或消除。篩選變體，確定它們是否具有所需要的性質。
氨基酸序列的插入，包括在氨基端和/或羧基末端的融合，長度範圍從1個殘基到包含100個或更多個殘基的多肽，還包括在序列內插入1個或多個氨基酸殘基。末端插入的例子包括N末端具有甲硫氨醯殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體，包括在抗體分子N-末端或C-末端融合一個酶（例如，ADEPT）或增加抗體血清半衰期的多肽。 [Fc區變體]
在一些實施例中，將一個或多個氨基酸修飾引入本文所述的抗體（例如，全長抗BTLA抗體或抗BTLA抗體融合蛋白）的Fc區，從而產生Fc區變體。在一些實施例中，Fc區變體具有增強的ADCC效能，通常與結合Fc的受體（FcRs）有關。在一些實施例中，Fc區變體具有降低的ADCC效能。有很多關於Fc序列的改變或突變影響其效能的例子，例如，WO 00/42072 和 Shields et al. J Biol. Chem. 9(2):6591-6604（2001）描述了與FcRs的結合增強或減弱的抗體變體。這些出版物的內容通過引用併入本文。
抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）是治療性抗體針對腫瘤細胞的作用機制。ADCC是細胞介導的免疫防禦，當靶細胞膜表面的抗原被特異性抗體（例如，抗BTLA抗體）結合，免疫系統的效應細胞主動裂解靶細胞（例如，癌細胞）。通常ADCC效應涉及由抗體啟動的NK細胞。NK細胞表達Fc受體CD16。該受體識別並結合與靶細胞表面相結合的抗體分子的Fc部分。NK細胞表面最常見的Fc受體為CD16或FcγRIII。Fc受體與抗體Fc區的結合導致NK細胞的活化，釋放細胞裂解顆粒，隨後靶細胞凋亡。ADCC對腫瘤細胞的殺傷作用可以通過轉染高親和力FcR的NK-92細胞的特異性實驗來測定。其結果與不表達FcR的野生型NK-92進行比較。
在一些實施例中，本發明還提供抗BTLA抗體變體（例如全長抗BTLA抗體變體），其包含具有部分但不是全部的效應功能Fc區，使得其在體內具有延長的半衰期，然而特定的效應功能（例如CDC或ADCC）是非必需的或有害的，這種抗BTLA抗體成為本發明理想的候選。通過在體外和/或體內進行細胞毒性檢測來確認CDC和/或ADCC活性的減少/消除。例如，通過Fc受體（FcR）結合試驗來確認抗體缺乏FcγR結合能力（因此可能缺乏ADCC活性）但依然保留FcRn的結合能力。介導ADCC的主要細胞中，NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet Annu. Rev. Immunol. 9:457-492（1991）第464頁的表3中總結了FcR在造血細胞上的表達。在體外評估目標分子的ADCC活性的非限制性實例在U.S. Pat. No. 5,500,362中進行了描述（參見例如 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986) and Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985); U.S. Pat. No. 5,821,337 (see Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361（1987））。或者，可以採用非放射性檢測方法（參見，例如ACTI™流式細胞術非放射性細胞毒性檢測（CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.）和CYTOTOX 96™非放射性細胞毒性檢測（Promega, Madison, Wis.））。此類檢測實驗採用的效應細胞包括外周血單核細胞（PBMC）和自然殺傷細胞（NK）。或者，另外地，目標分子的ADCC活性在體內進行檢測，例如，在動物模型中，如Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA95:652-656（1998）中所述。同時還可以進行C1q結合試驗來確認抗體不能與C1q結合，從而缺乏CDC活性。參見，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中C1q和C3c結合ELISA。為了評估補體啟動情況，可進行CDC檢測（參見，例如Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods202:163（1996）; Cragg, M. S. et al., Blood101:1045-1052（2003）; 和Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood103:2738-2743（2004））。使用本領域已知的方法來測定FcRn結合和體內清除/半衰期 （參見，例如，Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769（2006））。
具有降低的效應功能的抗體，包括在Fc區殘基238、265、269、270、297、327和329位進行一個或多個殘基的取代（U.S. Pat. No. 6,737,056）。這些Fc變體包括在265、269、270、297和327位進行兩個或多個殘基的取代的Fc變體，包括被稱為“DANA”的Fc變體，其在265和297位殘基取代為丙氨酸（U.S. Pat. No. 7,332,581）。
這類與FcRs結合能力提高或降低的抗體變體已有描述（參見例如U.S. Pat. No. 6,737,056; WO 2004/056312，和Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604（2001））。
在一些實施例中，提供一種抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）變體，其包含具有一個或多個能夠增強ADCC效應的氨基酸取代的Fc區變體。在一些實施例中，Fc區變體包含一個或多個能夠增強ADCC效應的氨基取代，這些取代的位置在Fc區的298、333和/或334位（EU殘基編號）。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體（例如，全長的抗BTLA抗體）變體包括在Fc區的S298A，E333A和K334A位氨基酸取代。
在一些實施例中，Fc區的改變導致C1q結合和/或補體依賴性細胞毒作用（CDC）的改變（即增強或減弱），參見U.S. Pat. No. 6,194,551, WO 99/51642，和Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184（2000）中所述。
在一些實施例中，提供一種抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）變體，其包含具有一個或多個氨基酸取代的Fc區變體，能夠延長半衰期或增強與Fc受體（FcRn）的結合。具有延長半衰期和改善FcRn結合的抗體在US 2005/0014934A1（Hinton等）中有所描述。這些抗體Fc區包含一個或多個氨基酸取代，增強了Fc區與FcRn的結合。這些Fc變體在Fc區包含238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或434位的殘基中的一個或多個取代，例如Fc區434位殘基的取代（U.S. Pat. No. 7,371,826）。
同時參見Duncan & Winter, Nature322:738-40（1988）; U.S. Pat. No. 5,648,260; U.S. Pat. No. 5,624,821和WO 94/29351中提供其它Fc區變體的例子。
本發明考慮了包括本文所述的任一種Fc變體或其組合的抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）。 [糖基化變體]
在一些實施例中，對本文所提供的抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）進行改變，以增加或降低抗NGF抗體糖基化的程度。通過改變抗NGF抗體或其多肽部分的氨基酸序列以此來增加或去除一個或多個糖基化位點，可以方便地實現添加或刪除抗BTLA抗體上的糖基化位點。
其中抗BTLA抗體包含Fc區，可以改變與其連接的糖。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡糖，該寡糖通常通過N-連接與Fc區CH2結構域Asn297連接，參見例如Wright et al. ， TIBTECH15:26-32（1997）。所述寡糖可包含多種糖類，例如甘露糖、N-乙醯氨基葡萄糖苷（GlcNAc）、半乳糖和唾液酸，以及與雙觸角寡糖結構“莖”部的GlcNAc相連接的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明的抗BTLA抗體進行寡糖修飾，從而產生具有某些改進特性的抗BTLA抗體變體。
與Fc區的CH2結構域連接的N-聚糖是異質的。CHO細胞中產生的抗體或Fc融合蛋白通過岩藻糖基轉移酶活性被岩藻糖基化，參見Shoji-Hosaka et al., J. Biochem. 2006, 140:777-83。通常，可以在人血清中檢測出一小部分天然存在的非岩藻糖基化IgGs。Fc區的N-糖基化對於其與FcγR結合很重要；而非岩藻糖基化的N-聚糖增強了Fc與FcγRIIIa的結合能力。與FcRIIIa結合能力增強使得ADCC效應增強，這在需要細胞毒性的某些抗體治療應用中是有利的。
在一些實施例中，當不需要Fc介導的細胞毒作用時，增強的效應功能可能是有害的。在一些實施例中，Fc片段或CH2結構域是非糖基化的。在一些實施例中，通過對CH2結構域中的N-糖基化位點進行突變以阻止其糖基化。
在一些實施例中，提供抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）變體，其包含Fc區，其中連接於Fc區的糖類結構具有減少的岩藻糖或缺乏岩藻糖，這可能會增強ADCC功能。具體地，本文提供抗BTLA抗體，其相對於野生型CHO細胞產生的相同抗BTLA抗體具有減少的岩藻糖。也就是說，它們的特徵在於，與天然CHO細胞（例如，產生天然糖基化形式的CHO細胞，含有天然FUT8基因的CHO細胞）產生的抗體相比，具有更少量的岩藻糖。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體的N-連接聚糖具有少於50%、40%、30%、20%、10%或 5%的岩藻糖。例如，該抗BTLA抗體的岩藻糖含量可能是1%-80%、1%-65%、5%-65%或20%-40%。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體的N-連接聚糖不包含岩藻糖，即，其中抗BTLA抗體完全不含岩藻糖，或沒有岩藻糖或是去岩藻糖基化。岩藻糖的含量是通過計算連接到Asn297上的糖鏈內岩藻糖平均含量相對於通過MALDI-TOF質譜測量的所有連接在Asn297上的糖結構（如複合、雜交或甘露糖結構）的總量來確定的，如WO 2008/077546所述。Asn297是指位於Fc區297位的天冬醯胺殘基（EU Fc區殘基編號體系）。然而，由於抗體的微小序列變化，Asn297也可位於297位的上游或下游±3個氨基酸，即在294和300位之間。這些岩藻糖基化變體可能具有增強的ADCC功能。參見例如US Patent Publication Nos. US 2003/0157108（Presta, L.），US 2004/0093621（Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd）。與“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”的抗體變體相關的出版物的實例包括，US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249（2004）；Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614（2004）。能夠產生去岩藻糖基化抗體的細胞系包括缺乏蛋白岩藻糖基化功能的Lec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545（1986）；US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L；和WO 2004/056312 A1, Adams et al., 尤其是實施例11），和基因敲除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因，FUT8基因敲除的CHO細胞（參見Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614（2004）；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688（2006）；和 WO2003/085107）。
抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）變體進一步提供二等分寡糖，例如，其中連接於抗BTLA抗體Fc區的雙觸角寡糖被GlcNAc等分。這種抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）變體可能具有減少的岩藻糖基化和/或增強的ADCC功能。這類抗體變體的實例在WO 2003/011878（Jean-Mairet et al.）；U.S. Pat. No. 6,602,684（Umana et al.）；US 2005/0123546（Umana et al.），和Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5):851-861（2006）中有所描述。還提供抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）變體，其在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基。這類抗BTLA抗體變體可能具有增強的CDC功能。這類變體在例如WO 1997/30087（Patel et al.）; WO 1998/58964（Raju, S.）；和WO 1999/22764（Raju, S.）中有所描述。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）變體包含能與FcγRIII結合的Fc區。在一些實施例中，包含Fc區的所述抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）變體在人效應細胞（例如T細胞）存在下具有ADCC活性，或者與具有人野生型IgG1 Fc區的其他相同抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）相比，在人效應細胞存在下，具有增強的ADCC活性。 [半胱氨酸工程變體]
在一些實施例中，需要製備半胱氨酸工程化的抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體），在該抗體中一個或多個氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代。在一些實施例中，取代殘基出現在抗BTLA抗體的可及位點。通過用半胱氨酸取代那些殘基，具有活性的巰基基團位於抗BTLA抗體的可及位點，可以用於將該抗BTLA抗體與其它部分偶聯，例如藥物部分或接頭-藥物部分，來製備如本文中進一步描述的抗BTLA免疫偶聯物。半胱氨酸工程化的抗BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）可以按照例如U.S. Pat. No. 7,521,541所述進行製備。 [衍生物]
在一些實施例中，本文所提供的抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）可進一步修飾以包含本領域已知並且容易獲得的其它非蛋白部分。適用於衍生化抗BTLA抗體的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇（PEG）、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三氧雜環已烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或無規共聚物）、右旋糖酐或聚（n-乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性，在製造中具有優勢。聚合物可以具有任意分子量，可以是支鏈或非支鏈的。連接在抗BTLA抗體上的聚合物數量可以變化，並且如果連接多於一個多聚物，它們可以是相同的或不同的分子。通常，用於衍生化的聚合物的數量和/或類型可基於以下考慮因素來確定，包括但不限於，需要改進抗BTLA抗體的特性或功能，抗BTLA抗體衍生物是否用於特定條件下的治療等。 [藥物組合物]
本文還提供包含任一種抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）、編碼抗體的核酸、包含編碼抗體的核酸的載體或者包含本文所述的核酸或載體的宿主細胞的組合物（例如藥物組合物，在這裡也稱為製劑）。在一些實施例中，提供一種藥物組合物，包含本文所述的任一種抗BTLA抗體和藥學上可接受的載體。
可通過混合具有所需純度的抗BTLA抗體與任選的藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑（ Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed.（1980））獲得合適的抗BTLA抗體製劑，製備成凍乾製劑或液體製劑形式。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所用劑量和濃度下對接受者無毒，包括緩衝劑如：磷酸鹽、檸檬酸和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑（例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚）；低分子量（少於10個殘基）多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物（如鋅-蛋白複合物）；和/或非離子表面活性劑如TWEEN™，PLURONICS™或聚乙二醇（PEG）；示例性製劑如WO98/56418中所述，並通過引用明確併入本文。適合皮下給藥的凍乾製劑在WO97/04801中有所描述。這類凍乾製劑可通過合適的稀釋劑重構成高蛋白濃度的製劑，並且重構的製劑可以通過皮下給藥的方式給予本文中待治療個體。陽離子脂質體或脂質體可以用於將本發明中的抗BTLA抗體遞送至細胞。
本文所述的製劑除包含抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）之外，還可以包含一種或多種治療特定病症所必要的其它活性物質，較佳具有活性互補且彼此無不良反應的物質。例如，除了抗BTLA抗體之外，可能需要進一步包含抗腫瘤劑、生長抑制劑、細胞毒劑或化學治療試劑。這些分子以對預期目的有效的量組合存在。其它物質的有效量取決於製劑中的抗BTLA抗體的含量，疾病或病症或治療的類型，以及如上所述的其它因素。這些藥物通常以與本文描述的相同劑量和給藥途徑使用，或者以目前應用劑量的1%至99%使用。
所述抗BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）也可以包埋在例如通過凝聚技術和介面聚合製備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統（例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊）中或粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚（甲基丙烯酸甲酯）微膠囊。可以製備緩釋製劑。
可以製備抗BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）的緩釋製劑。緩釋製劑的適合的實例包括含有抗體(或其片段)的固體疏水聚合物半透性基質，這些基質是成型製品的形式，例如，薄膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠（例如，聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚乳酸（U.S. Pat. No. 3,773,919），L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球）以及聚-D(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之類的聚合物可以使分子的釋放超過100天，某些水凝膠可以在更短的時間內釋放蛋白質。當包封的抗體在體內長時間停留時，它們會因暴露於37°C的潮濕環境中發生變性或聚集，可能導致生物活性的喪失或免疫原性的改變。可以根據相應的機制，設計合理的策略來穩定抗BTLA抗體。例如，如果發現聚集機制是通過硫代二硫化物交換形成分子間S-S鍵，則可以通過修飾巰基殘基、在酸性溶液中凍乾、控制含水量、使用適當的添加劑、以及開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定化。
在一些實施例中，所述抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）配製在含有檸檬酸鹽、氯化鈉、乙酸鹽、琥珀酸鹽、甘氨酸、聚山梨酯80（吐溫80）或上述任何組合的緩衝液中。
用於體內給藥的製劑必須是無菌的。這可以通過例如應用無菌過濾膜過濾而容易地實現。 [使用抗BTLA抗體的治療方法]
抗BTLA抗體（例如，全長的抗BTLA抗體）和/或本發明所述的組合物可以施用於個體（例如，哺乳動物，如人類）來治療與BTLA訊號通路失調導致的疾病和/或病症（例如，癌症或感染性疾病），這些疾病包括但不限於非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。因此，本發明在一些實施例中，提供一種治療BTLA訊號通路失調導致的疾病和/或病症（例如，癌症或感染性疾病）的方法，包括向個體施用有效量的包含抗BTLA抗體（例如，全長的抗BTLA抗體）的組合物（例如，藥物組合物），例如本文所述的任一種抗BTLA抗體（例如，全長的抗BTLA抗體），在一些實施例中，所述個體是人類。
例如，在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含特異性結合人BTLA上表位的BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）的藥物組合物，其中所述表位包含人BTLA的位氨基酸殘基。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是全長抗體。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體是IgG1或IgG4抗體。在一些實施例中，所述疾病或病症選自例如，非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）組成的組中。在一些實施例中，所述個體是人類。
例如，在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）的藥物組合物，＞重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含TFGMGVS（SEQ ID NO: 1）；HC-CDR2，其包含HIYWDDDKRFNPSLKS（SEQ ID NO: 4）；和HC-CDR3，其包含GNWDGETYFDY（SEQ ID NO: 7）；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含KSTQSLLDSDGKTYLN（SEQ ID NO: 10）；LC-CDR2，其包含LVSKLDS（SEQ ID NO: 13）；和LC-CDR3，其包含WQGTHFPWT（SEQ ID NO: 15）。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是全長抗體。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體是IgG1或IgG4抗體。在一些實施例中，所述疾病或病症選自例如，非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。在一些實施例中，所述個體是人類。
在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體的組合物，其中所述抗體包含V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，HC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，和HC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR，其包含SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列1，LC-CDR2，其包含SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列，和LC-CDR3，其包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體的組合物，其中所述抗體包含：V H，所述V H包含SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體的組合物，其中所述抗體包含：V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 4，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 7，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 10，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 15，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 18具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體包含：V H，所述V H包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
例如，在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）的藥物組合物，重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是全長抗體。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體是IgG1或IgG4抗體。在一些實施例中，所述疾病或病症選自例如，非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。在一些實施例中，所述個體是人類。
在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體的組合物，其中所述抗體包含：V H，所述V H包含SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 23所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 30所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
例如，在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體（例如，全長抗BTLA抗體）的藥物組合物，重鏈可變結構域（V H），所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12，LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。在一些實施例中，所述抗BTLA抗體是全長抗體。在一些實施例中，所述全長抗BTLA抗體是IgG1或IgG4抗體。在一些實施例中，所述疾病或病症選自例如，非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。在一些實施例中，所述個體是人類。
在一些實施例中，提供一種用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病）的個體的方法，包括向所述個體施用有效量的包含抗BTLA抗體的組合物，其中所述抗體包含：V H，所述V H包含SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性；以及V L，所述V L包含SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與SEQ ID NO: 31所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
在一些實施例中，本文所述抗BTLA抗體是包含IgG1或IgG4恆定區的全長抗BTLA抗體。在一些實施例中，所述IgG1是人IgG1。在一些實施例中，所述IgG4是人IgG4。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 32組成。在一些實施例中，重鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 33組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 34組成。在一些實施例中，輕鏈恆定區包含或由氨基酸序列SEQ ID NO: 35組成。
在一些實施例中，所述個體是哺乳動物（例如人、非人靈長類、大鼠、小鼠、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓等）。在一些實施例中，所述個體是人類。在一些實施例中，所述個體是臨床患者、臨床試驗志願者、實驗動物等。在一些實施例中，所述個體年齡小於60歲（包括例如小於50、40、30、25、20、15或10歲）。在一些實施例中，所述個體年齡大於60歲（包括例如大於70、80、90或100歲）。在一些實施例中，所述個體是被診斷為或在遺傳角度上易患本文所描述的一種或多種疾病或病症（例如癌症或感染性疾病）。在一些實施例中，所述個體具有一種或多種與本文所述的一種或多種疾病或病症相關的風險因數。
在一些實施例中，本發明提供一種向個體中在其表面表達BTLA的細胞遞送抗BTLA抗體（例如本文所述的任一種抗BTLA抗體，例如分離的抗BTLA抗體）的方法，所述方法包括向該個體施用包含抗BTLA抗體的組合物。
癌症或感染性疾病或其它任何表現出BTLA異常表達的疾病的許多診斷方法和這些疾病的臨床描述在本領域是已知的。這類方法包括，但不限於，例如免疫組化、PCR以及螢光原位雜交（FISH）。
在一些實施例中，本發明所述抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）和/或組合物與第二、第三或第四藥劑（包括例如免疫原性藥物，如純化的腫瘤抗原；標準的癌症治療，如化療方案；可用於啟動宿主免疫應答的抗體；細胞因數治療（例如，干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2）；或提供增強腫瘤抗原呈現的雙特異性抗體治療，或其結合）聯合使用來治療與BTLA訊號通路相關的疾病。
在一些實施例中，癌症治療可通過例如腫瘤消退、腫瘤重量或大小收縮、進展時間、生存期、無進展生存期、總體緩解率、緩解期、生活品質、蛋白表達和/或活性來評估。可以採用確定治療療效的方法，包括例如通過放射成像測量反應。
在一些實施例中，治療效果以腫瘤生長抑制的百分比（%TGI）來衡量，使用方程式100-(T/C × 100)來計算，其中，T為接受治療的腫瘤的平均相對腫瘤體積，C為未接受治療的腫瘤的平均相對腫瘤體積。在一些實施例中，%TGI為約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%或超過95%。在一些實施例中，通過粒細胞形狀的改變和/或粒細胞存活率的增加來衡量治療效果。在一些實施例中，通過增加單核細胞分泌的細胞因數來衡量治療效果。 [抗BTLA抗體的給藥劑量和方法]
施用於個體（例如人）的抗BTLA抗體（例如分離的抗BTLA抗體）組合物的劑量可能因特定組合物、給藥方式和治療疾病類型的不同而不同。在一些實施例中，組合物（例如，包含抗BTLA抗體的組合物）的量可在癌症或感染性疾病治療中有效產生客觀回應（例如，部分回應或完全回應）。在一些實施例中，抗BTLA抗體組合物的量足以在個體中產生完全回應。在一些實施例中，抗BTLA抗體組合物的量足以在個體中產生部分反應。在一些實施例中，抗BTLA抗體組合物的給藥劑量（例如當單獨施用時）足以在使用抗BTLA抗體組合物治療的個體群體中產生高於20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、64%、65%、70%、75%、80%、85%或90%的總回應率。個體對本文所述治療方法的回應可通過，例如，ACR評分來確定。
在一些實施例中，組合物（例如包含分離的抗BTLA抗體的組合物）的量足以延長個體的無進展生存期。在一些實施例中，組合物的量足以延長個體的總體生存期。在一些實施例中，在使用抗BTLA抗體組合物治療的個體群體中，組合物的量（例如當單獨施用時）足以產生高於50%、60%、70%或77%的臨床益處。
在一些實施例中，組合物（例如包含分離的抗BTLA抗體的組合物）的量，單獨使用或與第二，第三、和/或第四藥劑聯合使用時，是指在治療前或與未接受治療的其他受試者的相應活性相比，足以控制症狀和減少病情加重的風險的量。可以採用標準方法來測量該療效的大小，例如純化酶的體外檢測、基於細胞的檢測、動物模型或人體試驗。
在一些實施例中，當將組合物施用於個體時，組合物中抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的量低於引起毒性效應（即，一種高於臨床可接受毒性水準的效應）的水準，或者處於潛在副作用可以控制或耐受的水準。
在一些實施例中，遵循相同的給藥方案，組合物的量接近的組合物的最大耐受劑量(MTD)。在一些實施例中，組合物的量高於MTD的80%、90%、95%或98%。
在一些實施例中，組合物中抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的含量在0.001 µg到1000 µg的範圍之內。
在如上所述任一個實施例中，組合物中的抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的有效量，按照體重時計算，為0.1 µg/kg到100 mg/kg的範圍之內。
抗BTLA抗體組合物可通過多種途徑施用於個體（如人類），包括，例如靜脈注射、動脈內給藥、腹腔注射、肺內給藥、口服給藥、吸入給藥、血管內給藥、肌肉注射、氣管內給藥、皮下注射、眼內給藥、鞘內給藥、粘膜給藥或經皮給藥。在一些實施例中，使用組合物的緩釋製劑。在一些實施例中，組合物通過靜脈給藥。在一些實施例中，組合物通過動脈給藥。在一些實施例中，組合物通過腹膜內給藥。在一些實施例中，組合物通過肝內給藥。在一些實施例中，組合物通過肝動脈輸注給藥。在一些實施例中，組合物施用於遠離第一病灶的部位。 [製品及試劑盒]
在本發明的一些實施例中，提供一種製品，所述製品包含一種物質，所述物質能夠用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如，癌症或感染性疾病），或者用於遞送抗BTLA抗體（例如一種全長抗BTLA抗體）到表面表達BTLA的細胞。所述製品可以包括一種容器以及在容器上或隨該容器附帶的標籤或包裝說明書。合適的容器包括，例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多種材料製成，例如玻璃或塑膠。通常，該容器內裝有能夠有效治療本文所述疾病或病症的組合物，並且具有一個無菌埠（例如該容器可以是一個靜脈輸液袋或是一個具有皮下注射針頭可刺穿蓋子的小瓶）。組合物中的至少一種活性物質即為本發明所述的抗BTLA抗體。標籤或包裝說明書標示了該組合物可以用於治療的特定病症。標籤或包裝說明書進一步包含給患者施用抗BTLA抗體組合物的說明書。包括聯合治療的製品和試劑盒均在本文的考慮範圍之內。
包裝說明書是指通常包含在治療產品的商業包裝內的說明書，其包含關於與這些治療產品使用有關的適應症、用法、劑量、施用、禁忌症和/或警告資訊。在一些實施例中，包裝說明書標明該組合物可以用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如癌症或感染性疾病）。在一些實施例中，包裝說明書標明該組合物可以用於治療以下的疾病，包括非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。
此外，所述製品還可以包括第二容器，其包含藥學上可接受的緩衝液，例如抑菌性注射用水（BWFI）、磷酸鹽緩衝液、格林氏溶液或葡萄糖溶液。還可以包括從商業和用戶角度而言所需的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋液、篩檢程式、針頭和注射器。
同時還涉及可用於各種目的的試劑盒，例如用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如癌症或感染性疾病），或者用於遞送抗BTLA抗體（例如全長抗BTLA抗體）到表面表達BTLA的細胞中，任選與製品組合。本發明的試劑盒包括一個或多個容器，其包含抗BTLA抗體組合物（或單劑量形式和/或製品），並且在一些實施例中，進一步包含另一種藥劑（例如本文所述的藥劑）和/或與本文所述任一方法相一致的使用說明書。該試劑盒可進一步包括選擇適合治療個體的描述。本發明中試劑盒中所附帶的使用說明書通常是標籤或包裝說明書上的書面說明（例如包含在試劑盒內的紙頁），機器可讀的說明（例如，磁性或光學儲存光碟上的說明）也是可以接受的。
例如，在一些實施例中，試劑盒包括一種包含抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的組合物。在一些實施例中，試劑盒包括：a)包含本文所述的任一種抗BTLA抗體的組合物，和b)至少一種有效量的其它藥劑，其能夠增強抗BTLA抗體的效果（如治療效果、檢測效果）。在一些實施例中，試劑盒包括：a)包含本文所述的任一種抗BTLA抗體的組合物，和b)向個體施用抗BTLA抗體組合物用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如癌症或感染性疾病）的使用說明書。在一些實施例中，試劑盒包括：a)包含本文所述的任一種抗BTLA抗體的組合物，和b)至少一種有效量的其它藥劑，其能夠增強抗BTLA抗體的效果（如治療效果、檢測效果）和c)向個體施用抗BTLA抗體組合物和其它物質用於治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如癌症或感染性疾病）的使用說明書。所述抗BTLA抗體和其他物質可以存在於獨立的容器或同一個容器中。例如，該試劑盒可以包括一種特定組合物或兩種或更多種組合物，其中一種組合物包括抗BTLA抗體，另一種組合物包括另一種藥劑。
在一些實施例中，試劑盒包含一種（或一組）編碼抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的核酸。在一些實施例中，試劑盒包含：a)一種（或一組）編碼抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的核酸，和b)一種表達核酸（或一組核酸）的宿主細胞。在一些實施例中，試劑盒包含：a)一種（或一組）編碼抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的核酸，和b)使用說明書，適用於：i)在宿主細胞中表達抗BTLA抗體，ii)製備包含抗BTLA抗體的組合物，和iii)向個體施用包含抗BTLA抗體的組合物來治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如癌症或感染性疾病）。在一些實施例中，試劑盒包括：a)一種（或一組）編碼抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的核酸，b)一種表達核酸（或一組核酸）的宿主細胞，和c)使用說明書，適用於：i)在宿主細胞中表達抗BTLA抗體，ii)製備包含抗BTLA抗體的組合物，和iii)向個體施用包含抗BTLA抗體的組合物來治療與BTLA訊號通路相關的疾病（例如癌症或感染性疾病）。
本發明所述的試劑盒以合適的形式進行包裝。合適的包裝包括，但不限於，小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝（例如密封的聚酯薄膜或塑膠袋）等。試劑盒可以任選地提供其它的組分，例如緩衝液和說明資訊。因此，本發明還提供製品，其包括小瓶、瓶子、廣口瓶、軟包裝（例如密封的聚酯薄膜或塑膠袋）等。
關於抗BTLA抗體組合物的使用說明書，通常包括一些資訊，諸如，劑量，給藥週期和給藥途徑等。容器可以是單位劑量的，大包裝的（如，多劑量包裝）或亞單位劑量的。例如，提供一種包含足夠劑量的如本文所述的抗BTLA抗體（例如全長的抗BTLA抗體）的試劑盒以對個體進行長期有效的治療，例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3個月、4個月、5個月、7個月、8個月、9個月或更長時間。試劑盒還可包含多單位劑量的抗BTLA抗體、藥物組合物和使用說明書，並且以足夠在藥房中儲存和使用的量進行包裝，例如，醫院藥房和複方藥房。
本領域的技術人員將認識到在本發明的範圍和宗旨內可能的若干實施例。現在將通過參考以下非限制性實施例來更詳細地描述本發明。以下實施例進一步闡明本發明，但不應解釋為以任何方式進行限制其範圍。 [具體實施方式]
以下典型示例對本發明的各種特徵和實施例進行了說明，這些示例旨在說明而非限制。本領域技術人員能輕而易舉地理解，具體示例僅為本發明的說明性示例，在後面的請求項中進行更充分地描述。本發明描述的每個實施例和特徵應理解為可與申請中包含的每個實施例互換和組合。 實施例1：製備BTLA多肽
本示例描述了各種BTLA多肽構建體的製備，所述BTLA多肽構建體作為抗原，用於誘導產生和篩選本公開的抗BTLA抗體。
合成人BTLA（huBTLA）和小鼠BTLA（musBTLA）胞外域（ECD）編碼序列，利用In-Fusion 無縫選殖試劑盒（Takara, cat# 639691），使用識別位點為HindIII和EcoRIde 限制性內切酶將其亞選殖到表達載體pTTal上。huBTLA（ECD）和 musBTLA（ECD）的氨基酸序列如表5所示。為了進行純化和檢測，所有構建體均具有以下的序列：位於C端的人IgG1 Fc，位於C端的小鼠IgG2a Fc或位於C端的10×His-tag序列。一共表達和純化了六條融合蛋白。
表5 BTLA多肽序列
SEQ ID NO 蛋白 序列
36 huBTLA（ECD） KESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVKYCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNLIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMASRPWLLYR
37 musBTLA（ECD） EKATKRNDEECPVQLTITRNSKQSARTGELFKIQCPVKYCVHRPNVTWCKHNGTICVPLEVSPQLYTSWEENQSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYSCSTNFNSQVINSHSVTIHVRERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEERPGRTWLLY
按照製造商的操作說明書，在Expi293細胞（Thermo Fisher Scientific）中表達融合蛋白。簡而言之，用表達載體對Expi293細胞進行轉染，並將上述細胞在37°C、8% CO 2和120rpm條件下培養5天。
為純化Fc融合蛋白，收集後，將澄清的上清培養基與用PBS緩衝液平衡的MabSelect蛋白A樹脂（GE Healthcare）混合，室溫溫和旋轉培養1.5h。培養後，將懸浮液裝入柱中，用20倍柱體積的包含0.15M NaCl的PBS緩衝液洗滌樹脂，然後用3倍柱體積的50mM磷酸鈉（pH 3.0）洗脫。用1M Tris-HCl（pH 9.0）將洗脫液的pH快速調至pH 5.2，並用PD-10柱（GE Healthcare）將緩衝液替換為PBS緩衝液。
為純化His-tag蛋白，收集後，將澄清的上清培養基裝入預先用含有0.25M NaCl和5mM咪唑（pH 8.0）的20mM磷酸鈉緩衝液（pH 7.4）平衡的Histrap柱（GE Healthcare）中。用10倍柱體積的含有0.25M NaCl和15mM咪唑（pH 8.0）的20mM磷酸鈉緩衝液（pH 7.4）洗滌柱子，然後用3倍柱體積的含有0.25M NaCl和100mM咪唑（pH 8.0）的20mM磷酸鈉緩衝劑（pH 7.4）洗脫。用PD-10柱將洗脫緩衝液替換為PBS緩衝液。 實施例2：使用雜交瘤法製備抗BTLA抗體及其篩選與鑒定
本示例描述了使用小鼠雜交瘤技術製備抗BTLA抗體的方法，以及篩選和選擇抗體以進一步表徵的方法。
免疫接種和融合：用Expi293細胞中產生的與His-或小鼠IgG2a Fc標籤融合的重組人BTLA ECD免疫Balb/c小鼠，佐劑依次為RIBI（Sigma Aldrich，cat# S6322-1VL）、Titermax（Sigma Aldrich，cat# T2684-1ML）、Freund's（Freund佐劑，不完全）（Sigma Aldrich，cat# F5506-10x-10mL），或以其他順序。如下文所述，通過ELISA測定終點滴度。最後一次免疫後三天，根據標準操作說明書採集脾臟和淋巴結並進行處理。用EasySep小鼠B細胞分離試劑盒（StemCell，cat# 19854A）分離小鼠B細胞，並用PEG將上述細胞與骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14細胞（ATCC，CRL 1581）融合。按照標準操作說明書，將融合細胞接種在半固態選殖細胞HY選殖培養基D（StemCell，cat#03804）的六孔板中。使用Clone Pix 2儀器（Molecular Devices）將單株雜交瘤選殖挑選到96孔/板中，並在low-Ig HT培養基中培養。
ELISA 結合實驗：培養10-14天后，收集上清液，並用帶有His標籤（Sino Biologica，cat# 90250-C08H）的純化的人His-BTLA或恆河猴BTLA胞外域蛋白包被的96孔ELISA板，通過ELISA進行初篩。帶有His標籤的人His-BTLA或恆河猴BTLA胞外域蛋白在包被緩衝液中（1×磷酸鹽緩衝液，PBS）的濃度為1μg/mL或0.5μg/mL，將其以50μL/孔包被96孔圓底ELISA板（Corning，cat#25381-051），4°C下過夜。去除包被液後，以250μL/孔加入封閉液以封閉平板，並在室溫下培養2小時，所述封閉液為含有1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸鹽緩衝液（PBS）（pH 7.4）（ELISA稀釋液）。然後用300μL含有0.05%TWEEN®-20（洗滌緩衝液）的PBS洗板3次。將50μL單個雜交瘤選殖的培養上清液加入單個孔中，然後在室溫下培養2小時或在37°C下培養1小時。用洗滌緩衝液洗板3次後，按50μL/孔加入在ELISA稀釋液中1:2000稀釋的山羊抗小鼠抗體-AP（Southern Biotech，cat# 1030-04）。室溫下培養平板1小時，用洗滌緩衝液洗4次，並加入50μL/孔的Sigma快速對硝基苯磷酸片（pNPP）（Sigma-Aldrich，cat#N2770-50SET）顯色30分鐘。在405 nm處，用Synergy HT（Bio-TEK）分析平板。
從初篩中鑒定獲得的親本雜交瘤在48或24孔板中擴大培養，並根據初篩操作方法進行驗證性ELISA，以進一步確認和篩選抗人或抗恆河猴BTLA結合物。
雜交瘤抗體的純化：陽性雜交瘤選殖在無血清培養基中擴繁至30mL，抗體純化方法如下所述。在300g條件下離心10分鐘以去除細胞，並用0.22微米篩檢程式過濾，以澄清上清培養基。澄清的上清液培養基與用PBS緩衝液平衡後的蛋白A樹脂（Thermo Fisher Scientific，cat# A26458）混合，並在室溫下緩慢旋轉培養1.5小時。培養後，將懸浮液裝入柱中，用10倍柱體積的含有0.5M NaCl的PBS緩衝液洗滌樹脂，然後用0.1M甘氨酸-HCl（pH 2.8）洗脫。用1M Tris-HCl（pH 8.5）快速中和洗脫液，並將緩衝液替換為PBS。根據上述操作方法進一步驗證純化的雜交瘤抗體的結合能力。 [雜交瘤抗體選殖的測序及擴增 ]
提取RNA：在T75燒瓶中，單株抗人BTLA雜交瘤在標準雜交瘤培養基（DMEM/F12，10%FBS，1%穀氨醯胺，1%pen/strep）中生長7-10天，直至細胞密度為1-3×10 5，細胞活力＞80%。從培養物中取1-3百萬個細胞於15mL離心管中，300g離心5分鐘。用5mL預冷的PBS清洗沉澱的細胞。去除PBS，將細胞重懸於600uL緩衝液RLT Plus（Qiagen，cat#74134）中。按照製備操作說明書（Qiagen，cat# 74134）從裂解物中分離總RNA。
PCR 擴增以製備cDNA：利用特異的反向PCR引物與重鏈和κ鏈的轉換寡核苷酸共同合成cDNA。為合成cDNA，使用1μg RNA作為範本，然後用Clontech（TAKARA，cat# 639537）的SMART Scribe逆轉錄酶試劑盒進行逆轉錄。此外，試劑還包括10uM引物（Integrated DNA technologies）、10mM去氧核苷酸三磷酸混合物（New England Biolab，cat# N0447S）、水和80U/μLRNAse抑制劑（Invitrogen，cat# 10000840）。恆定區域特異性反向引物與通用正向引物一起用於5'-RACE PCR反應。PCR產物經凝膠純化並選殖到TOPO TA載體（ThermoFisher，cat# 451641）上，然後轉化感受態細胞（Thermo Fisher，cat35# 451641）。在轉化和藍/白斑篩選後，挑選白色菌落並在含有羧苄青黴素的LB肉湯培養基中培養過夜。使用M13正向和T7正向引物對Miniprep純化的質粒進行測序。抗人BTLA雜交瘤86B7、83F2和96F11的可變結構域序列總結在表2和3中，並在所附序列表中提供。 實施例3：抗BTLA嵌合抗體體外試驗
本示例描述了用於表徵上述實施例的抗BTLA嵌合抗體功能活性的細胞學試驗。 [製備抗BTLA抗體重組IgG1變體]
製備具有小鼠抗BTLA抗體重鏈和輕鏈可變區和人恆定區的重組抗BTLA嵌合抗體構建體。示例性的人重鏈恆定區和輕鏈恆定區的序列如表3所示。根據提供的操作說明書，使用Expi293表達系統表達重組抗BTLA嵌合抗體。以1:1的比例將重鏈和輕鏈質粒共轉染到細胞中，培養6天后收集轉染的細胞。按照以下操作說明書純化重組IgG分子。300g離心10分鐘去除細胞並用0.22µm篩檢程式過濾，以澄清上清培養基。將澄清的上清培養基與MabSelect蛋白A樹脂混合，並如實施例1所述進行純化。 [嵌合抗BTLA抗體的結合親和力和解離常數（Kd）的表徵]
在Octet RED96儀器（ForteBio）上，使用生物層干涉法在30°C和1200rpm攪拌下測量抗BTLA抗體的結合親和力（單價Kd）。使用動力學緩衝液（PBS、0.1%Tween-20和1%牛血清白蛋白）中的抗人IgG Fc捕獲（AHC）生物感測器（ForteBio）進行以下動力學分析：(a) 抗體（2µg/mL）300秒，(b) 基線120秒，(c) 與純化的His-tag-huBTLA（2.5、0.5和0µg/mL）和His-tag-恆河猴BTLA（Sino Biologcal，cat# 90250-C08H）（2.5、0.5和0µg/mL）結合420秒，以及(d) 解離1200秒。Savitzky-Golay過濾後，使用Octet資料分析軟體8.0（ForteBio）利用1:1結合模型進行資料擬合和分析。計算Koff/Kon的比值，作為平衡解離常數（Kd），總結在表6（如下）中。
表6：抗BTLA IgGs與HuBTLA 的結合親和力
選殖 HuBTLA-His
Kd (M) Kon (1/Ms) Koff (1/s)
86B7 2.57E-10 3.89E+05 9.98E-04
83F2 2.91E-09 1.88E+05 5.48E-04
96F11 1.18E-09 6.07E+05 6.97E-04
通過ELISA 分析純化的重組嵌合抗體與BTLA 結合：對純化的重組嵌合抗體進行huBTLA和恆河猴BTLA抗原結合ELISA。簡而言之，用PBS中濃度為0.333µg/mL的huBTLA或恆河猴BTLA包被384孔、透明平底高結合板（Corning，cat# 3700），4°C過夜。除二抗用山羊抗人IgG Fc-AP（Southern Biotech，cat#2014-04）之外，其他後續純化操作根據實施例2所述的ELISA結合試驗進行。
如圖1A-1B所示，嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7、96F11與huBTLA（圖1A）和恆河猴BTLA（圖1B）的結合呈陽性。BTLA結合EC 50值如表7所示。
表7
抗體 83F2 86B7 96F11
huBTLA EC 50 （nM ） 0.05642 0.05114 0.04817
恆河猴BTLA EC 50 （nM ） 0.05418 0.05589 0.05698
通過ELISA 分析純化的重組嵌合抗體阻斷HVEM：對純化的重組嵌合體抗體進行人HVEM（huHVEM）阻斷ELISA。簡而言之，用PBS中濃度為0.333µg/mL的帶有mIgG2a Fc標籤的純化的huBTLA（包被緩衝液）包被384孔透明平底高結合板（Corning，cat# 3700），4°C過夜。去除包被緩衝液後，將封閉緩衝液加入板中，室溫培養1小時。然後，用洗滌緩衝液洗板3次。將PBS連續稀釋的純化的嵌合抗體加入各孔中，37°C培養1小時。用洗滌緩衝液洗板3次。按30μL/孔向反應中加入在分析緩衝液中2µg/ml的帶有His標籤（Sino Biological，cat#10334-H08H）的人HVEM並培養1小時。用洗滌緩衝液洗板3次。按30μL/孔加入在ELISA稀釋液中以1:500稀釋的小鼠抗his-AP（Southern Biotech，cat: 4603-04），37°C培養30分鐘，用洗滌緩衝液洗5次，並用30μL/孔的pNPP底物顯色30分鐘。在405nm處，用Bio-TEK分析平板。阻斷IC 50值表示當50%的huHVEM與包被的人BTLA結合被抑制時時的抗體濃度。
如表8和圖2所示，嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7和96F11可與huBTLA結合並阻斷huHVEM與BTLA相互作用。
表 8
抗體 83F2 86B7 96F11
IC 50 （nM ） 1.243 1.024 1.04
[通過FACS分析嵌合抗BTLA抗體與huBTLA過表達細胞的結合]
為檢測嵌合抗BTLA抗體與huBTLA過表達細胞的結合，使用穩定過表達huBTLA的Expi293細胞進行FACS分析。簡而言之，將huBTLA（Uniprot，Q7Z6A9）的編碼序列選殖到慢病毒載體中，並根據病毒包裝試劑盒（Lenti-X™ Packaging Single Shots，Cat# 631275, Takada）的說明書包裝病毒。重組病毒轉導Expi293細胞。用嘌呤黴素篩選過表達huBTLA的Expi293細胞，並用流式細胞儀分離細胞（如圖3A所示）。
將穩定過表達huBTLA的Expi293細胞與嵌合抗BTLA抗體83F2或86B7在含有0.5%BSA、1mM EDTA和0.1%疊氮化鈉（FACS緩衝液）的PBS中，4℃培養30分鐘。洗滌細胞，將細胞與10nM藻紅蛋白（PE）結合的抗人Fc抗體（Biolegend，cat# 409304）在4℃下培養20分鐘。洗滌細胞，用Attune（ThermoFisher Scientific）流式細胞儀分離細胞。使用FlowJo軟體分析資料。用平均螢光強度（MFI）表示抗體結合。
示例性嵌合抗BTLA抗體83F2和86B7的EC 50值總結在表9中。MFI值如圖3B所示。如圖3B所示，示例性嵌合抗BTLA抗體83F2和86B7與huBTLA過表達Expi293細胞能有效地結合，且其結合具有劑量依賴性。
表 9
抗體 83F2 86B7
EC 50 （nM ） 1.847 0.5541
[通過FACS分析嵌合抗BTLA抗體阻斷HVEM與BTLA結合]
將穩定過表達huBTLA的Expi293細胞與嵌合抗BTLA抗體83F2或86B7在4℃下培養30分鐘。洗滌細胞，將細胞與濃度為1 μg/ml的人HVEM-小鼠 IgG2a Fc重組蛋白（Acro Biosystems，cat#HVM-H5255）在4℃下培養20分鐘。用山羊抗小鼠Alexa 488二抗（ThermoFisher，cat# A-11029）檢測人HVEM的結合。洗滌細胞並用流式細胞儀收集細胞。使用FlowJo軟體分析資料。用MFI表示BTLA結合。
示例性嵌合抗BTLA抗體83F2和86B7的IC 50值總結在表10中。MFI值如圖3C所示。如圖3C所示，示例性嵌合抗BTLA抗體83F2和86B7可有效地抑制可溶性人HVEM與huBTLA過表達Expi293細胞的結合，且其結合具有劑量依賴性。
表 10
抗體 83F2 86B7
IC 50 （nM ） 0.6565 0.2592
[Raji-HVEM/Jurkat-BTLA共培養試驗 ]
如圖4A所示，使用Raji-Jurkat共培養系統檢測抗BTLA拮抗型抗體對人T細胞的功能活性。簡而言之，HVEM-BTLA訊號通路抑制TCR/CD28共刺激訊號，可以由細胞因數（如IL-2）產生的減少來指示。因此，通過靶向BTLA的抗體阻斷HVEM和BTLA的相互作用，從而抑制HVEM-BTLA訊號通路，可增強T細胞活性。在Raji-Jurkat共培養試驗中，在抗BTLA抗體存在或不存在的條件下，在抗αCD3/CD19雙特異性抗體刺激下，HVEM過表達Raji細胞與BTLA過表達Jurkat細胞共培養。可通過測量IL-2水準來監測抗BTLA抗體的能力。
通過上述慢病毒轉導製備過表達人HVEM的Raji細胞（ATCC，cat# CCL-86）和過表達人BTLA的Jurkat細胞（ATCC, cat#TIB-152）。在96孔圓底平板，在存在或不存在（作為對照組）連續稀釋的抗BTLA拮抗型抗體的完全生長培養基中，將上述兩個細胞系與1ng/ml αCD3/CD19雙特異性抗體（InvivoGen, CAT# bimab-hcd19cd3）共培養，37 oC培養72小時。對照組不用抗BTLA抗體處理。使用Human IL-2 ELISA MAX Deluxe試劑盒（BioLegend, cat# 431804）通過ELISA測定上清液中的IL-2濃度。通過與不存在抗BTLA抗體條件下αCD3/CD19雙特異性抗體處理的Raji-HVEM/Jurkat-BTLA細胞進行比較來計算IL-2的百分比。
嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7和96F11的EC 50值總結在表11中。IL-2水準如圖4B所示。如圖4B所示，嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7和96F11可有效逆轉HVEM-BTLA介導的T細胞中IL-2產生的抑制，具呈劑量依賴性。
表 11
抗體 83F2 86B7 96F11
EC 50 （nM ） 1.847 0.5541 2.537
實施例4：製備86B7的人源化變體
本實施例描述了製備來自雜交瘤選殖86B7的小鼠抗人BTLA抗體的人源化變體。 [小鼠抗人BTLA抗體的人源化 ]
將來自雜交瘤86B7的小鼠抗體的輕鏈可變區（V L）和重鏈可變區（V H）序列分別與人種系抗體序列進行比對，人種系κ輕鏈（Gene ID–V gene: IGKV2_30*01）和人種系重鏈（Gene ID – V gene: IGHV2_5*01）作為人框架。
將小鼠BTLA抗體輕鏈和重鏈的互補決定區（CDR）分別移植到經鑒定最接近的人框架中，以製備人源化抗體選殖。在此過程中，通過將來自小鼠86B7 V L的CDR-L1（即位點24-34）、CDR-L2（即位點50-56）和 CDR-L3（即位點89-97）（根據EU編號系統Kabat定義對殘基進行編號）移植到人κ輕鏈框架上，將來自小鼠86B7 V H的CDR-H1（即位點31-35）、CDR-H2（即位點50-65）和 CDR-H3（即位點 95-102 ）（根據EU編號系統Kabat定義對殘基進行編號）移植到人重鏈框架上。
小鼠BTLA抗體輕鏈框架（IGKV2_30*01）結構域2（FW-L2）中的位點36，重鏈框架（IGHV2_5*01）結構域2（FW-H2）中的位點2，重鏈框架結構域2（FW-H3）中的位點94也移植到人κ輕鏈和重鏈框架上，發現這些位元點是部分VH-VL相互作用介面，或是“Vernier”區的框架殘基，這可以調整CDR結構並微調以適合抗原結合（Foote et al., 1992）。
人源化抗體的可變區序列總結在表2和3中。 [製備重組的IgG形式的人源化抗BTLA抗體 ]
按上述方法將人源化抗BTLA抗體的重鏈和輕鏈可變結構域製備成全長IgG形式的人源化抗BTLA抗體。 實施例5.1：人源化抗BTLA抗體的體外試驗 [人源化抗BTLA抗體的結合親和力和解離常數（Kd）的表徵 ]
如實施例3所述，在Octet RED96儀器（ForteBio）上，使用生物層干涉法測定抗BTLA抗體的結合親和力（單價Kd），除了(c) 與His-tag-huBTLA（1、0.33和0 μg/mL）結合420秒。示例性人源化抗BTLA抗體的結合親和力如表12所示。
如表12所示，與對應的嵌合抗體86B7相比，示例性人源化抗BTLA抗體具有與之相當的與huBTLA的結合活性，並且與參考抗體Icatolimab相比，示例性人源化抗BTLA抗體具有更好的與huBTLA的結合活性。
表12 人源化抗體與BTLA抗原的結合親和力
抗體 Kd （nM ） Kon （1/Ms ） Koff （1/s ）
SB2003-2 7.97E-10 1.20E+05 1.09E-04
SB2003-3 3.08E-10 2.91E+05 9.48E-05
SB2003-4 3.12E-10 3.07E+05 9.19E-05
SB2003-6 6.04E-10 1.34E+05 8.06E-05
SB2003-7 1.54E-10 3.66E+05 5.76E-05
SB2003-8 1.98E-10 4.18E+05 8.05E-05
SB2003-9 1.48E-10 4.40E+05 6.50E-05
SB2003-10 5.51E-10 3.56E+05 1.79E-04
SB2003-11 1.28E-10 3.84E+05 4.99E-05
SB2003-12 1.98E-10 4.18E+05 8.05E-05
Icatolimab 2.09E-09 6.21E+05 1.24E-03
[人源化抗BTLA抗體的體外結合試驗 ]
根據實施例3所述進行基於FACS的人源化抗BTLA抗體的結合試驗。
如圖5A所示，與對應的嵌合抗體86B7相比，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-3、SB2003-4、SB2003-11和SB2003-12具有與之相當的與huBTLA過表達細胞的結合活性，抗BTLA抗體的人源化未影響其結合功能。 [人源化抗BTLA抗體的體外阻斷試驗 ]
根據實施例3所述進行基於FACS的人源化抗BTLA抗體的阻斷試驗。
如圖5B所示，與對應的嵌合抗體86B7相比，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-3、SB2003-4、SB2003-11和SB2003-12具有與之相當的阻斷HVEM與細胞表面huBTLA相互作用的活性，嵌合抗BTLA抗體的人源化未影響其阻斷功能。 [使用Jurkat-huBTLA-FAS細胞進行細胞凋亡試驗 ]
使用huBTLA-FAS-過表達Jurkat細胞檢測人源化抗BTLA拮抗型抗體對人T細胞的功能活性。在本試驗中，一旦BTLA與其配體HVEM結合，Fas介導的凋亡訊號便被啟動，而抗BTLA抗體通過干擾HVEM-BTLA相互作用來阻斷該途徑。簡而言之，用嘌呤黴素篩選法將包含帶有FAS的人BTLA胞外域的慢病毒導入Jurkat細胞，獲得Jurkat huBTLA FAS細胞。huHVEM-Fc蛋白（Sino Biological，cat# 10334-H02H）包被96孔板， 37 oC條件下2小時。用PBS洗平板1次，在存在連續稀釋的抗BTLA拮抗型抗體或抗MOPC21人IgG1同種型對照抗體（Hamlyn PH, et al. 1981，由公司自行製備）的條件下，接種Jurkat-huBTLA-FAS細胞，37 oC條件下18小時。根據製造商的操作說明書使用ATPLite 1 step assay kit（PerkinElmer，cat#6016731）測量各樣品的ATP含量。用發光法測量ATP含量，用Prism軟體計算人源化抗BTLA抗體的EC 50。
示例性人源化抗BTLA抗體的EC 50值總結在表13中。發光值如圖6所示。如圖6所示，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-11和SB2003-12 在Jurkat-huBTLA-FAS細胞中可有效降低huHVEM-Fc誘導的細胞凋亡，且呈劑量依賴性，其活性與相應的嵌合抗體86B7相當，說明人源化未改變抗體在體外對T細胞功能活性。
表 13
抗體 86B7    SB2003-11    SB2003-12
EC 50 （nM ） 0.109 0.1174 0.06137
[人源化抗體的Raji-HVEM/Jurkat-BTLA共培養試驗 ]
根據實施例3所述，使用Raji-Jurkat共培養系統進行人源化抗BTLA拮抗型抗體對人T細胞的功能試驗。
如圖7A所示，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-12可誘導T細胞中IL-2產生， 並且在恢復T細胞的IL-2產生方面，其活性優於參考抗體Icatolimab。 [Raji-HVEM/原代T細胞共培養試驗 ]
如圖4A所示（用原代T細胞替換Jurkat-BTLA細胞），使用Raji-原代T細胞共培養系統檢測人源化抗BTLA拮抗型抗體對原代人T細胞的功能活性。簡而言之，過表達HVEM蛋白的Raji細胞接種在96孔板上。使用EasySep Human T Cell Isolation Kit（STEMCELL，cat#17951）分離原代人T細胞，並在96孔圓底平板中，在存在或不存在（作為對照組）連續稀釋的抗BTLA拮抗型抗體的完全生長培養基中，將上述原代人T細胞與1ng/ml αCD3/CD19雙特異性抗體培養，37 oC培養72小時。對照組不用抗BTLA抗體處理。使用Human IL-2 ELISA MAX Deluxe kit（BioLegend, cat# 431804）通過ELISA測定上清液中的IL-2濃度。通過與不存在抗BTLA抗體條件下αCD3/CD19雙特異性抗體處理的Raji-HVEM/Jurkat-BTLA細胞進行比較來計算IL-2的百分比。
示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-11和SB2003-12的EC 50值總結在表14中。IL-2水準如圖7B所示。如圖7B所示，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-11和SB2003-12可有效逆轉HVEM-BTLA介導的原代人T細胞中IL-2產生的抑制，具呈劑量依賴性，並且這種活性與其相應的嵌合抗體86B7相當，說明人源化未改變在體外啟動原代人T細胞的抗體功能。
表 14
抗體 86B7 SB2003-11 SB2003-12
EC 50 （nM ） 1.68 2.305 4.91
實施例5.2：評價抗BTLA抗體活性的體內腫瘤模型
本實施例描述了人源化抗BTLA抗體在體內腫瘤模型中功能活性的研究。 [A. 小鼠HVEM與人BTLA結合及抗BTLA抗體阻斷其相互作用的驗證 ]
為檢測小鼠HVEM是否與人BTLA結合及抗BTLA抗體是否阻斷其相互作用，His小鼠HVEM蛋白（Sino Biolobical, cat#，10567-M03H）與Expi 293-huBTLA細胞系在冰上培養30分鐘。洗滌細胞並用PE偶聯的抗His抗體（(Thermofisher Scientific，CAT: TA150130）染色。為進行抗體阻斷試驗，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-12與細胞系預培養，然後進行小鼠HVEM和抗His抗體染色。洗滌細胞，用2%PFA固定，用Attune通過流式細胞術分析。用FlowJo軟體分析HVEM染色的MFI。
如圖8A所示，小鼠HVEM可以與人BTLA結合且抗BTLA抗體可以阻斷其相互作用。 [B.人BTLA轉基因小鼠MC38皮下腫瘤模型 ]
動物和飼養：本研究使用雌性C57BL/6-Btla tm1(BTLA)/Bcgen小鼠（7-9周齡）。用“SPF大鼠和小鼠生長”的繁殖性飼料餵食動物，小鼠可自由飲水。為便於識別，對動物進行耳部標記，並在背部左側區域剃毛，以備移植細胞。將動物安置在聚碳酸酯籠中（籠大小為320×200×135mm）。環境溫度控制在20℃~26℃，濕度控制在40-70%。動物護理和使用符合JOINN LABORATORIES（Suzhou）Inc.的標準操作規程，《實驗動物護理與使用指南》（第8版，國家研究委員會生命科學委員會實驗動物資源研究所；國家科學院出版社；華盛頓特區，2010年），以及美國農業部通過的《動物福利法》（公共法案99-198）進行的規定。
細胞製備和移植：從基礎醫學研究所購買的小鼠結腸癌細胞系MC38，根據本領域已知的操作方法進行培養。移植前細胞活率為92%-94%。將細胞懸浮在杜氏磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS）中，濃度為1×10 7/ml。用酒精準備墊對試驗動物的移植部位進行消毒，並使用25號針頭和1毫升注射器皮下移植0.2mL。
測量和抗體治療：讓腫瘤生長，然後將小鼠隨機分為不同的研究組。分配小鼠以確保所有組的平均體重在研究群體的總平均腫瘤負荷的10%以內。對於每種抗體，小鼠每週接受兩次10 mg/kg腹腔注射治療，持續3周，並監測腫瘤體積（n=10隻小鼠/組）。組1接受抗MOPC21人 IgG1同種型抗體（本公司自行製備，作為對照），組2接受SB2003-12抗體。
副作用評估：觀察所有動物的臨床症狀或毒性，至少每天一次。每週給動物稱重一次。如果體重減輕超過20%或出現其他需要安樂死的臨床症狀，則對動物實施安樂死。當單個動物的腫瘤體積達到或超過2500mm 3時，對動物實施安樂死。 [結果 ]
如圖8B所示，在MC38腫瘤模型中，與同種型抗體相比，示例性抗BTLA抗體SB2003-12治療顯著抑制了腫瘤的生長，說明阻斷BTLA介導的抑制訊號可以增強抗腫瘤免疫。另外，組間的體重沒有顯著差異，動物在一般臨床觀察中未顯示異常。 實施例6：體內B16F10皮下腫瘤模型來評價抗BTLA抗體與抗PD-1抗體組合的活性
本實施例描述了抗BTLA抗體與抗PD-1抗體組合在腫瘤模型中的功能活性體內研究。
動物和飼養：本研究使用雌性C57BL/6-Btla tm1(BTLA)/Bcgen小鼠（7-9周齡）。根據實施例5所述餵食動物。
細胞製備和移植：從基礎醫學研究所購買的小鼠黑色素瘤癌細胞系B16F10，根據本領域已知的操作方法進行培養。移植前細胞活率為92%-94%。將細胞懸浮在杜氏磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS）中，濃度為1×10 6/ml。用酒精準備墊對試驗動物的移植部位進行消毒，並使用25號針頭和1毫升注射器皮下移植0.2mL B16F10細胞系。
測量和抗體治療：讓腫瘤生長，然後將小鼠隨機分為不同的研究組。分配小鼠以確保所有組的平均體重在研究群體的總平均腫瘤負荷的10%以內。對於每種抗體，小鼠每週接受兩次10 mg/kg腹腔注射治療，持續3周，並監測腫瘤體積（n=10隻小鼠/組）。組1接受抗MOPC21人 IgG1同種型抗體（本公司自行製備），組2接受抗PD1抗體（CAT# BE0146, BioCell），組3接受SB2003-12抗體，組4接受抗PD1抗體和SB2003-12抗體。
副作用評估：根據實施例5所述評價副作用。 [結果 ]
在B16F10腫瘤小鼠模型中，示例性抗BTLA抗體SB2003-12和抗PD1抗體的組合的抗腫瘤效果顯著優於單獨的抗BTLA抗體或抗PD1抗體。上述結果表明，與單靶點阻斷相比，抗BTLA抗體和抗PD1抗體組合阻斷可協同提高抗腫瘤效果（資料未顯示）。 參考文獻 1.      Cai G, Anumanthan A, Brown JA, Greenfield EA, Zhu B, Freeman GJ. CD160 inhibits activation of human CD4+ T cells through interaction with herpesvirus entry mediator. Nat Immunol (2008) 9:176–85. 2.      Celis-Gutierrez J, Blattmann P, Zhai Y, Jarmuzynski N, Ruminski K, Grégoire C, Ounoughene Y, Fiore F, Aebersold R, Roncagalli R, Gstaiger M, Malissen B. Quantitative Interactomics in Primary T Cells Provides a Rationale for Concomitant PD-1 and BTLA Coinhibitor Blockade in Cancer Immunotherapy. Cell Reports. 2019;27:3315–3330. 3.      Cheung TC, Oborne LM, Steinberg MW, Macauley MG, Fukuyama S, Sanjo H, et al. T cell intrinsic heterodimeric complexes between HVEM and BTLA determine receptivity to the surrounding microenvironment. J Immunol (2009) 183:7286–96. 4.      Compaan, D.M., L.C. Gonzalez, I. Tom, K.M. Loyet, D. Eaton, and S.G. Hymowitz. 2005. Attenuating lymphocyte activity: the crystal structure of the BTLA-HVEM complex. J. Biol. Chem. 280:39553–39561 5.      Demerlé C, Gorvel L, Olive D. BTLA-HVEM Couple in Health and Diseases: Insights for Immunotherapy in Lung Cancer. Front Oncol. 2021 Aug 31;11:682007. 6.      Derre L, Rivals JP, Jandus C, Pastor S, Rimoldi D, Romero P, et al. BTLA mediates inhibition of human tumor-specific CD8þ T cells that can be partially reversed by vaccination. J Clin Invest 2010;120: 157–67. 7.      Fourcade J, Sun Z, Pagliano O, Guillaume P, Luescher IF, Sander C, Kirkwood JM, Olive D, Kuchroo V, Zarour HM. CD8(+) T cells specific for tumor antigens can be rendered dysfunctional by the tumor microenvironment through upregulation of the inhibitory receptors BTLA and PD-1. Cancer Res. 2012 Feb 15;72(4):887-96. 8.      Gavrieli M, Murphy KM. 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無
圖1A-1B所示為通過ELISA分析的嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7和96F11 與人BTLA或恆河猴BTLA的結合親和力。圖1A所示為83F2、86B7和96F11 與人BTLA的結合親和力。圖1B為83F2、86B7和96F11 與恆河猴BTLA的結合親和力。
圖2所示為通過ELISA分析的嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7和96F11阻斷人HVEM與人BTLA結合的阻斷活性。
圖3A所示為通過FACS分析的穩定過表達huBTLA的Expi293細胞。圖3B所示為通過FACS分析的示例性嵌合抗BTLA抗體83F2和86B7與 huBTLA過表達Expi293細胞的結合親和力。圖3C所示為通過FACS分析的示例性嵌合抗BTLA抗體83F2和86B7抑制可溶性HVEM與 huBTLA過表達Expi293細胞結合的阻斷活性。
圖4A所示為在抗BTLA抗體存在或不存在的條件下，在抗αCD3/CD19雙特異性抗體刺激下的Raji-HVEM/Jurkat-BTLA共培養系統示意圖，其包含HVEM過表達Raji細胞與BTLA過表達Jurkat細胞共培養。圖4B所示為在Raji-HVEM/Jurkat-BTLA共培養系統中，嵌合抗BTLA抗體83F2、86B7和96F11通過抑制HVEM-BTLA訊號通路來恢復T細胞IL-2產生。
圖5A所示為通過FACS分析的示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-3、SB2003-4、SB2003-11和SB2003-12與huBTLA過表達Expi293細胞的結合親和力。圖5B所示為通過FACS分析的示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-3、SB2003-4、SB2003-11和SB2003-12抑制可溶性HVEM與 huBTLA過表達Expi293細胞結合的阻斷活性。
圖6所示為在Jurkat-BTLA-FAS細胞系統中分析的人源抗BTLA抗體SB2003-11和SB2003-12抑制huHVEM-Fc-誘導的細胞凋亡.
圖7A所示為在Raji-HVEM/Jurkat-BTLA共培養系統中，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-12通過抑制HVEM-BTLA訊號通路來恢復T細胞IL-2產生。圖7B所示為在Raji-HVEM/原代人T細胞共培養系統中，示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-11和SB2003-12通過抑制HVEM-BTLA訊號通路來恢復T細胞IL-2產生。
圖8A所示為小鼠HVEM與人BTLA結合，而示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-12阻斷該相互作用。圖8B所示為示例性人源化抗BTLA抗體SB2003-12和同種型對照抗體處理後，各小鼠的平均腫瘤體積。
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Claims (27)

  1. 一種分離的抗BTLA抗體，其包含： 重鏈可變結構域（V H），所述V H包含： 重鏈互補決定區（HC-CDR）1，其包含TFGMGVS （SEQ ID NO: 1）或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代； HC-CDR2 ，其包含 HIYWDDDKRFNPSLKS（SEQ ID NO: 4）或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；和 HC-CDR3，其包含GNWDGETYFDY（SEQ ID NO: 7）或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代； 以及輕鏈可變結構域（V L），所述V L包含： 輕鏈互補決定區（LC-CDR）1，其包含 KSTQSLLDSDGKTYLN（SEQ ID NO: 10）或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代； LC-CDR2，其包含LVSKLDS（SEQ ID NO: 13）或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代；和 LC-CDR3，其包含WQGTHFPWT（SEQ ID NO: 15）或其變體，所述變體包含至多約3個氨基酸的取代。
  2. 如請求項1所述之分離的抗BTLA抗體，其包含： V H，其包含SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與 SEQ ID NOs: 18-22中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性； 以及V L，其包含SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與 SEQ ID NOs: 25-29中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
  3. 如請求項1-2中任一項所述之分離的抗BTLA抗體，其包含： (i)    V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 18或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 18具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 25或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 25具有至少約80%序列同一性； (ii)   V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性； (iii)  V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性； (iv)  V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性； (v)   V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 19或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 19具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性； (vi)  V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 26或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 26具有至少約80%序列同一性； (vii) V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 27或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 27具有至少約80%序列同一性； (viii)       V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性； (ix)  V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 20或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 20具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性； (x)   V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性； (xi)  V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 21或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 21具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性； (xii) V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 28或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 28具有至少約80%序列同一性；或 (xiii)       V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 22或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 22具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 29或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 29具有至少約80%序列同一性。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之分離的抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含如SEQ ID NOs: 18-22中任一氨基酸序列所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，所述V L包含如SEQ ID NOs: 25-29中任一氨基酸序列所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
  5. 分離的抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含： (i)    V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 5，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 8，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 11， LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 14，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 16，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；或 (ii)   V H，所述V H包含：HC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 3，HC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 6，和HC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 9，或者所述V H的變體，其HC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代；以及V L，所述V L包含：LC-CDR1，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 12， LC-CDR2，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 13，和LC-CDR3，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 17，或者所述V L的變體，其LC-CDRs中包含至多約5個氨基酸的取代。
  6. 如請求項5所述之分離的抗BTLA抗體，其包含： V H，其包含SEQ ID NOs: 23 -24中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與 SEQ ID NOs: 23 -24中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性； 以及V L，其包含SEQ ID NOs: 30-31中任一所示的氨基酸序列或其變體，所述變體與 SEQ ID NOs: 30-31中任一所示的氨基酸序列具有至少約80%序列同一性。
  7. 如請求項5-6中任一項所述之分離的抗BTLA抗體，其包含： (i)    V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 23或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 23具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 30或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 30具有至少約80%序列同一性；或 (ii)   V H，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 24或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 24具有至少約80%序列同一性；以及V L，其包含氨基酸序列SEQ ID NO: 31或其變體，所述變體與 氨基酸序列SEQ ID NO: 31具有至少約80%序列同一性。
  8. 如請求項5-7中任一項所述之分離的抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含V H，所述V H包含如SEQ ID NOs: 23-24中任一氨基酸序列所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，所述V L包含如SEQ ID NOs: 30-31中任一氨基酸序列所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
  9. 如請求項5-8中任一項所述之分離的抗BTLA抗體，其中所述抗BTLA抗體包含： (i)    V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 23所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 30所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；或 (ii)   V H，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 24所示的V H包含的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；以及V L，其包含如氨基酸序列SEQ ID NO: 31所示的V L包含的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
  10. 一種分離的抗BTLA 抗體，其與請求項1-9中任一項所述之分離的抗BTLA 抗體競爭與BTLA 的特異性結合，或與請求項1-9中任一項所述之分離的抗BTLA 抗體特異性結合相同的表位。
  11. 如請求項1-10中任一項所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體與BTLA 結合的K d值為約0.1pM至約1nM。
  12. 如請求項11所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體包含Fc片段。
  13. 如請求項12所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體是全長的IgG抗體。
  14. 如請求項13所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體是如請求項12所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
  15. 如請求項1-14中任一項所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體是嵌合的、全人的或人源化的抗體。
  16. 如請求項1-11中任一項所述之分離的抗BTLA 抗體，其中所述抗BTLA 抗體是抗原結合片段，其中所述抗原結合片段選自由Fab、Fab’、F(ab)’2、Fab’-SH、單鏈抗體（scFv）、Fv片段、dAb、Fd或雙鏈抗體（diabody）組成的組中。
  17. 一種分離的核酸分子，其編碼請求項1-16中任一項所述之分離的抗BTLA 抗體。
  18. 一種載體，其包含請求項17所述之分離的核酸分子。
  19. 一種分離的宿主細胞，其包含請求項1-16中任一項所述之分離的抗BTLA抗體、請求項17所述之分離的核酸分子或請求項18所述之載體。
  20. 一種製備分離的抗BTLA抗體的方法，其包含： a) 在能有效表達抗BTLA抗體的條件下培養請求項19所述之宿主細胞；和 b) 從宿主細胞中獲得表達的抗BTLA抗體。
  21. 一種藥物組合物，其包含請求項1-16中任一項所述之抗BTLA抗體、請求項17所述之核酸分子、請求項18所述之載體、請求項19所述之分離的宿主細胞以及藥學上可接受的載體。
  22. 如請求項21所述之藥物組合物，其中所述藥物組合物進一步包含特異性識別PD-1的抗原結合蛋白。
  23. 一種治療有此需求的個體的疾病或病症的方法，包括向所述個體施用有效量的請求項1-16中任一項所述之抗BTLA抗體、請求項17所述之核酸、請求項18所述之載體、請求項19所述之分離的宿主細胞、由請求項 20 中所述方法製備得到的抗體或請求項21-22中任一項所述之藥物組合物。
  24. 如請求項23所述之方法，其中所述方法進一步包括向所述個體施用有效量的特異性識別PD-1的抗原結合蛋白。
  25. 如請求項23所述之方法，其中所述抗BTLA抗體和特異性識別PD-1的抗原結合蛋白是同時給藥或連續給藥。
  26. 如請求項23-25中任一項所述之方法，其中所述疾病或病症是癌症或感染性疾病，可選地，所述疾病或病症與BTLA信號通路有關。
  27. 如請求項26所述之方法，其中所述疾病或病症選自非小細胞肺癌、腎上腺癌、膀胱癌、腦癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、黑色素瘤、食管癌、胃癌、宮頸癌、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、小細胞肺癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌，以及任何類型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤，以及感染性疾病，包括但不限於人類乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus）（HPV）、人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）（HIV）、單純皰疹病毒（Herpes Simplex Virus）（HSV）、水痘帶狀皰疹病毒（Varicella Zoster Virus）（VSV）、巨細胞病毒（Cytomegalovirus）（CMV）、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）（EBV）、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌（conococci）、克雷伯菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、瘟疫、鉤端螺旋體病和萊姆斯病細菌（Lymes disease bacteria）。
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