CN110023334B - 抗gp73抗体和免疫偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合GP73或其抗原性部分的抗原结合分子，优选抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合分子结合GP73的胞外部分内的表位，该表位通常在蛋白水解切割后内化到细胞中。本发明还涉及免疫偶联物，所述免疫偶联物包含抗原结合分子，特别是抗GP73抗体或其抗原结合片段。本发明的抗原结合分子和免疫偶联物可以单独施用，作为治疗偶联物施用或与其他裸抗体联合施用，或与治疗剂联合施用，或与其他免疫偶联物联合施用或作为诊断偶联物施用。本发明还涉及编码抗GP73抗体的核苷酸序列，和含有所述核苷酸序列的免疫偶联物、载体和宿主细胞，以及制备抗GP73抗体的方法。本发明的抗原结合分子、抗体和组合物可用于GP73表达被改变的疾病(特别是GP73过表达的疾病，诸如癌症)的诊断和治疗应用。

Description

抗GP73抗体和免疫偶联物
本发明涉及特异性结合GP73或其抗原性部分的抗原结合分子，优选抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合分子结合GP73的胞外部分内的表位，该表位通常在蛋白水解切割后内化到细胞中。本发明还涉及免疫偶联物(immunoconjugate)，所述免疫偶联物包含抗原结合分子，特别是抗GP73抗体或其抗原结合片段。本发明的抗原结合分子和免疫偶联物可以单独施用，作为治疗偶联物施用或与其他裸抗体联合施用，或与治疗剂联合施用，或与其他免疫偶联物联合施用或作为诊断偶联物施用。本发明还涉及编码抗GP73抗体的核苷酸序列，和含有所述核苷酸序列的免疫偶联物、载体和宿主细胞，以及制备抗GP73抗体的方法。本发明的抗原结合分子、抗体和组合物可用于GP73表达被改变的疾病(特别是GP73过表达的疾病，诸如癌症)的诊断和治疗应用。
背景技术
高尔基体蛋白-73(GP73)，或者称为高尔基体膜蛋白1(GOLM1)或高尔基体相关磷蛋白2(GOLPH2)是单通道跨膜II型蛋白。它的真正功能未知。GP73的基因组序列预测11个外显子和2个剪接变体。转录变体1(NM_016548.3)的长度为3100nt并且含有外显子2至11，而转录物变体2(NM_177937.2)的长度为3092nt并且含有外显子1和3至11。这两种变体都编码相同的开放阅读框。这些变体的生物学意义目前尚不清楚；参见Kim等人，Golgiphosphoprotein 2in physiology and in diseases.Cell&Bioscience 2012 2:31。在稳态条件下，GP73是顺式高尔基体和中间高尔基体的完整膜蛋白。然而，GP73可以从顺式高尔基体循环到内体和细胞表面；参见Puri S等人，Cycling of early Golgi proteins viathe cell surface and endosomes upon lumenal pH disruption Traffic 2002,3:641–653。有证据表明GP73的内体运输允许蛋白原转化酶弗林蛋白酶(furin)介导的切割，从而导致其被释放到细胞外空间，并为其作为HCC血清生物标志物的存在提供了分子解释；参见Bachert C等人，Endosomal trafficking and proprotein convertase cleavage of cisGolgi protein GP73produces marker for hepatocellular carcinoma Traffic 2007,8:1415–1423；Marrero JA等人，GP73,a resident Golgi glycoprotein,is a novelserum marker for hepatocellular carcinoma J Hepatol 2005,43:1007–1012；Mao Y等人，Golgi protein 73(GOLPH2)is a valuable serum marker for hepatocellularcarcinoma Gut 2010,59:1687–1693)；Li X等人，Serum golgi phosphoprotein 2level:abetter marker than alpha-fetoprotein for diagnosing early hepatocellularcarcinoma Hepatology 2009,50:1682或者Zhu等人，Biomarkers for hepatocellularcarcinoma:progression in early diagnosis,prognosis,and personalized therapyBiomark Res 2013,1:10。GP73已被证明在几种恶性肿瘤中高度表达，所述恶性肿瘤包括肝细胞癌、胆管细胞癌、食道癌、肾癌、前列腺癌和各种其他癌，但在邻近的非肿瘤组织中不表达。GP73阳性HCC患者的肿瘤分级高于GP73阴性HCC患者。在胆管癌(BDC)中，GP73的表达与更好的总生存率相关，而在HCC中，已发现GP73的过度表达与增加的转移风险、更高的复发概率和更差的生存率相关；参见Riener等人，Golgi phosphoprotein 2(GOLPH2)expression in liver tumors and its value as a serum marker in hepatocellularcarcinomas.Hepatology 2009,49:1602–1609和Ye等人，2016,Cancer Cell 30,444-4582016年9月12日。WO 2014/144355 A2、CN105699653 A和CN105734059 A中描述了靶向GP73的抗体。WO2012/112798 A1中描述了抗体用于抑制GP73以增强癌症患者的细胞介导免疫的用途。GP73已被提议在WO 2011/093675 A2中作为肺癌诊断的生物标志物，或在WO2013/083781 A2中作为全身炎症病症如败血症的测试。最近，GP73(GOLM1)被描述为通过促进肿瘤细胞的生长和转移而与EGFR/RTK相互作用；参见Ye等人，2016,Cancer Cell 30,444-4582016年9月12日。
因此，需要靶向GP73的试剂来诊断和治疗涉及GP73表达改变的病症和疾病，诸如癌症和感染。上述技术问题通过权利要求书中定义的实施方案来解决。
发明概述
本发明涉及
1.一种特异性结合GP73或其抗原性部分的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子结合至以下氨基酸序列中的表位
a)SSRSVDLQTRIMELEGRVRR SEQ ID NO:30
b)SSRSVELQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:31；和/或
c)SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:32。
2.根据实施方案1所述的抗原结合分子，其中所述表位在氨基酸序列RIMELEGRVRR(SEQ ID NO:33)内，优选在EGRVRR(SEQ ID NO:34)内。
3.根据实施方案1或2所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体、其抗原结合片段、双特异性抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPIN)、适体或其他抗体模拟物。
4.根据实施方案3所述的抗原结合分子，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段、人源化抗体，或展示在噬菌体表面上或展示在嵌合抗原受体(CAR)T细胞表面上的抗体。
5.根据实施方案4所述的抗原结合分子，其中所述抗体是IgG1、IgG2a或IgG2b、IgG3或IgG4抗体。
6.根据实施方案3、4或5所述的抗原结合分子，其中所述抗体包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO:6中所定义的CDR3，所述可变轻(VL)链包含在SEQ ID NO:9中所定义的CDR3。
7.根据实施方案3至6中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗体
a)包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO:4中定义的CDR1、在SEQ ID NO:5中定义的CDR2和在SEQ ID NO:6中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链包含在SEQ ID NO:7中定义的CDR1、在SEQ ID NO:8中定义的CDR2和在SEQ ID NO:9中定义的CDR3；或者
b)是与(a)的抗体结合至相同表位的抗体。
8.根据实施方案3至7中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗体
a)包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:35具有90％、优选95％序列同一性的序列；以及
可变轻(VL)链序列，所述可变轻(VL)链序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:36具有90％、优选95％序列同一性的序列；或者
b)是与(a)的抗体结合至相同表位的抗体。
9.根据实施方案3、4或5所述的抗原结合分子，其中所述抗体包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO:14中所定义的CDR3，所述可变轻(VL)链序列包含在SEQ ID NO:17中所定义的CDR3。
10.根据实施方案3、4、5或9所述的抗原结合分子，其中所述抗体
a)包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO:12中定义的CDR1、在SEQ ID NO:13中定义的CDR2和在SEQ ID NO:14中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链序列包含在SEQ ID NO:15中定义的CDR1、在SEQ ID NO:16中定义的CDR2和在SEQ ID NO:17中定义的CDR3；或者
b)是与(a)的抗体结合至相同表位的抗体。
11.根据实施方案3、4、5、9或10所述的抗原结合分子，其中所述抗体
a)包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:37的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:37具有90％、优选95％序列同一性的序列；以及
可变轻(VL)链序列，所述可变轻(VL)链序列包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38具有90％、优选95％序列同一性的序列；或者
b)是与(a)的抗体结合至相同表位的抗体。
12.根据实施方案3所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab′)2片段或Fv片段。
13.根据前述实施方案中任一项的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子内化到细胞中。
14.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码特异性结合GP73或其抗原性部分的抗体的可变重(VH)链序列和/或可变轻(VL)链序列中的至少一者，其中所述抗体与以下氨基酸序列内的表位结合
a)SSRSVDLQTRIMELEGRVRR SEQ ID NO:30
b)SSRSVELQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:31；和/或
c)SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:32。
15.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案14所述的多核苷酸。
16.一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养根据实施方案15所述的宿主细胞。
17.一种用于产生特异性结合多肽或其抗原性部分的抗体的方法，所述方法包括向对象施用选自以下的多肽：
a)SSRSVDLQTRIMELEGRVRR SEQ ID NO:30
b)SSRSVELQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:31；以及
c)SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:32。
18.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含根据前述实施方案中任一项所述的抗体，以及细胞毒性剂或细胞毒性剂的前药。
19.根据实施方案18所述的免疫偶联物，其具有式Ab(-L-D)p，其中：
a)Ab是根据前述实施方案中任一项所述的抗体；
b)L是接头；
c)D是细胞毒性剂；并且
d)p的范围为1-8。
20.根据实施方案18或19所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂选自美登素(maytansinoid)、卡里奇霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)和奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物。
21.根据实施方案19所述的免疫偶联物，其中D是式A的吡咯并苯并二氮杂卓：
及其盐(例如，药学上可接受的盐)和溶剂化物(例如，药学上可接受的溶剂化物)，其中：
所述波浪线表示与所述接头共价附接的位点；
所述虚线表示任选存在双键(所述双键可以例如在C1与C2之间或在C2与C3之间)；
R2和R12各自独立地选自–H、–OH、＝O、＝CH2、–CN、–R、–OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、–O-SO2-R、–CO2R、–COR、以及–卤素，
其中RD独立地选自–H、–CO2R、–C(O)R、CHO、CO2H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–和–卤素；
R6、R9、R16和R19独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
R7和R17独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
Q独立地选自–O–、–S–和–N(H)–；
R11是–H或–R，或者在Q是–O–的情况下，R11可以是–SO3M，其中M是碱金属或碱土金属阳离子；
R和R′各自独立地选自任选经取代的C1-12烷基、C3-8杂环基、C3-20杂环和C5-20芳基基团，并且如果R和R'与相同的氮原子结合，则R和R′可以与它们所附接的氮原子一起形成任选经取代的4元、5元、6元或7元杂环；
R"是C3-12烯基基团，其中一个或多个碳原子可以被选自O、NH和S的杂原子和/或任选经取代的芳环取代；
其中所述芳环包含5或6个碳原子以及一个或两个选自N或NH的杂原子，并且
X和X′独立地选自O、S，以及N(H)。
22.根据实施方案21所述的免疫偶联物，其中D具有以下结构：
其中n是0或1；
23.根据实施方案19所述的免疫偶联物，其中D是奈莫柔比星衍生物。
24.根据实施方案23所述的免疫偶联物，其中D具有选自以下的结构：
；以及
25.根据实施方案19至24中任一项所述的免疫偶联物，其中所述接头可被蛋白酶切割、是酸不稳定的和/或包含腙。
26.根据实施方案19所述的免疫偶联物，所述免疫偶联物具有选自以下的式：
；以及
27.根据实施方案19至26所述的免疫偶联物，其中p的范围是2-5。
28.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含根据实施方案1至17中任一项所述的抗体以及功能性试剂，其中所述功能性试剂优选为内体逃逸结构域(EED)肽。
29.根据实施方案28所述的免疫偶联物，其具有式Ab(-EEDL-EED肽)，其中Ab是根据实施方案1至17中任一项所述的抗体并且EEDL是EED接头。
30.根据实施方案28或29所述的免疫偶联物，其中所述EED肽是包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的登革热病毒EED肽，并且所述EED接头包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
31.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案18至30中任一项所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
32.根据实施方案31所述的药物组合物，所述药物组合物包含另一治疗剂。
33.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子，以及药学上可接受的载体。
34.根据实施方案33所述的药物组合物，所述药物组合物包含另一治疗剂。
35.一种治疗患有GP73阳性癌症的对象的方法，该方法包括向所述对象施用有效量的根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子、根据实施方案18至30中任一项所述的免疫偶联物或根据实施方案31至34中任一项所述的药物组合物。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述GP73阳性癌症是肝癌。
37.根据实施方案35或36所述的方法，所述方法还包括向所述个体施用另外的治疗剂。
38.根据实施方案35至37所述的方法，其中施用是静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、瘤内、膀胱内、子宫内、关节内、鼻内、皮下、局部、作为灌肠剂或作为洗胃剂。
39.一种抑制GP73阳性细胞增殖的方法，所述方法包括在允许抗原结合分子或免疫偶联物与所述细胞的表面上的GP73结合的条件下使所述细胞暴露于根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子或根据实施方案18至30中任一项所述的免疫偶联物，从而抑制所述细胞的增殖。
40.根据实施方案39所述的方法，其中所述细胞是肝癌细胞。
41.一种检测生物样品中人GP73的方法，所述方法包括在允许所述抗原结合分子与天然存在的人GP73结合的条件下使所述生物样品与根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子接触，以及检测是否形成所述抗原结合分子与所述生物样品中的天然存在的人GP73之间的复合物。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述检测包括免疫组织化学、免疫荧光成像、酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)、蛋白质印迹、免疫沉淀或放射摄影成像。
43.一种用于将对象鉴定为患有疾病的方法，所述方法包括确定来自所述对象的样品中根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子与GP73多肽或与其抗原性部分的特异性结合水平，其中检测到所述特异性结合的水平相对于对照样品改变将所述对象识别为患有疾病。
44.根据实施方案43所述的方法，其中所述疾病是癌症。
45.根据实施方案43所述的方法，其中所述癌症选自以下组：肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、前列腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、白血病和乳腺癌。
46.一种RNA适体，所述RNA适体能够结合人GP73的氨基酸36至55内的表位。
47.一种嵌合抗原受体CAR T细胞，所述嵌合抗原受体CAR T细胞能够结合人GP73的氨基酸36至55内的表位。
48.一种抗原结合分子，所述抗原结合分子结合弗林蛋白酶切割共有序列EGRVRR并抑制GP73蛋白的蛋白水解切割。
49.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子，以及抑制EGFR信号传导以用于治疗癌症的EGFR抗体或小分子。
50.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体靶向GP73和EGFR并阻断易感癌细胞中的EGFR信号传导。
51.一种抗体，所述抗体结合GP73但不结合可溶的GP73(sGP73)，因此不被循环sGP73抑制或中和。
52.根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子，根据实施方案18至30中任一项所述的免疫偶联物或根据实施方案31至34中任一项所述的药物组合物，它们用于治疗与GP73的异常表达相关的疾病。
53.根据权利要求52所述使用的抗原结合分子、免疫偶联物或药物组合物，其中所述疾病是癌症，优选其中所述癌症是肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、白血病和乳腺癌。
54.根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子，根据实施方案18至30中任一项所述的免疫偶联物或根据实施方案31至34中任一项的药物组合物，它们降低血浆中循环的可溶GP73(sGP73)的水平。
55.一种用于监测对象对使用根据实施方案1至13中任一项所述的抗原结合分子、根据实施方案18至30中任一项所述的免疫偶联物或根据实施方案31至34中任一项所述的药物组合物治疗的应答的方法，所述方法包括在治疗所述对象之前的一个或多个时间点处和治疗所述对象之后的一个或多个时间点处测量所述血浆中循环sGP73的水平。
56.根据实施方案55所述的方法，其中检测到相对于治疗前的时间点，在治疗后的时间点所述对象的所述血浆中循环sGP73的水平降低将所述对象识别为对所述治疗有应答。
因此，本发明涉及一种特异性结合GP73或其抗原性部分的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子结合至以下氨基酸序列中的表位：SSRSVDLQTRIMELEGRVRR(SEQ ID NO:30)；SSRSVELQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:31)；和/或SSRSVDLQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:32)。因此，本发明提供了抗原结合分子，特别是结合GP73的胞外部分中的特定表位的抗体。
也就是说，本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现：抗体以及包含偶联到例如但不限制于奈莫柔比星及其衍生物(例如PNU-159682)或奥瑞斯他汀(例如MMAF)的特异性结合GP73或其经加工的片段的抗体或其抗原结合片段的抗体-药物偶联物(ADC)可用于杀伤表达GP73的癌细胞和/或抑制表达GP73的癌细胞的增殖，以及治疗表达GP73的癌症。不受理论束缚，据信本发明的抗原结合分子与GP73的胞外部分中的区域结合，所述区域内化到细胞中而不是被切除。GP73以短的细胞质结构域、跨膜结构域和长的胞外部分构造。该胞外部分包含与跨膜结构域相邻的短区域，该短区域被命名为rGP73，其终止于氨基酸R55的推定蛋白质切割结构域中；以及GP73的C末端部分，该C末端部分被命名为sGP73。本发明的结合分子靶向rGP73。在该包含二十个氨基酸的区域内鉴定出了两种显示出对rGP73的峰结合活性的抗体，尽管所述抗体接近细胞膜并且紧邻蛋白酶相互作用处。
因此，本发明涉及与GP73的胞外部分中的所述区域(即rGP73)特异性结合的抗原结合分子。在一个特定实施方案中，本发明涉及一种抗原结合分子，其中结合表位的至少部分在GP73的SSRSVDLQTRIMELEGRVRR(SEQ ID NO:30)；SSRSVELQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:31)；和/或SSRSVDLQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:32)内的氨基酸序列EGRVRR中。同样不受理论束缚，据信氨基酸序列EGRVRR(SEQ ID NO:33)是推定的弗林蛋白酶识别基序。因此，本文提供的抗原结合分子，特别是抗体的一种潜在作用模式是与弗林蛋白酶切割进行竞争，如图12和图23所示。本文描述的抗体(例如G2-2、G2-2opti、G2-1和G2-1opti)的结合导致弗林蛋白酶对膜结合的GP73的加工减少。预期的结果是环境中和血流中的可溶GP73减少，包括蛋白质的C末端部分减少，如图23所示。通过对弗林蛋白酶位点的各自相应的抗体结合和阻断而对该弗林蛋白酶加工的干扰和扰动可能是图13和图24中所示的增殖抑制的原因。本发明的抗原结合分子(例如本文所述的抗体G2-2、G2-2opti、G2-1和G2-1opti)的新颖贡献是在加工和分泌GP73蛋白的主要部分之后对保留在细胞表面的脱落蛋白质的胞外部分的结合。与迄今已知的结合循环sGP73并将被该结合复合物中和的抗体相反，本发明的抗原结合分子，特别是本文公开的抗体，不受sGP73的影响并且到达来源细胞，在所述来源细胞处它们结合GP73的残余物和弗林蛋白酶切割位点附近的GP73全长蛋白。这种效应示出在图11中。在被称为G2-4的弗林蛋白酶切割位点结合抗体的远端的情况下，含有sGP73的条件培养基减少抗体与GP73阳性HUH7细胞的细胞表面的结合。弗林蛋白酶切割位点结合抗体G2-2的近端不受上清液中可溶GP73的存在的影响。
最近，WO 2014/144355 A2中描述了与sGP73结合的抗体。具体地，WO 2014/144355A2描述了结合GP73的氨基酸307-339、276-287、344-363或63-96内的弗林蛋白酶切割位点的远端的抗体。类似地，CN105699653 A公开了结合在GP73的氨基酸56-67(即sGP73)内的抗体。
CN105734059 A描述了这样的抗体，所述抗体与GP73结合而不限定所公开的抗体结合的表位。如所附实施例中所示，为了确定CN105734059 A的抗体的结合特异性，产生CN105734059 A的抗体并测试该抗体与GP73的表位区GP73 AA 36至55的结合与否，以及测试该抗体与包含所述表位的肽或不相关的对照肽的结合。如图21和图22中所示，CN105734059A的表位不与本发明的表位重叠。
因此，本发明的抗体优于本领域已知的抗体，因为它们能够结合rGP73并通过内化而到达来源细胞。本发明的抗体的这种独特性质允许特异性靶向肿瘤细胞。
根据以上所述，与GP73结合的本发明的抗原结合分子，特别是抗体，具有以下特征中的一种或多种特征：
a)与人GP73(SEQ ID NO:1)的氨基酸36-55内的表位结合；
b)与跨越在人GP73的氨基酸E50至R55处推定的弗林蛋白酶切割识别基序的表位结合；
c)与重组人GP73结合；
d)与癌细胞表面上的内源性GP73结合；
e)与肝细胞癌细胞表面上的内源性GP73结合；
f)与选自HepG2、Hep3B、HuH7、JHH-4、Alexander(PLC/PRF/5)、HLE、HuCCT1的细胞系的细胞表面上的内源性GP73结合；
g)与选自Hep-55.1C、Hepa1-6(CRL-1830)、BpRc1(CRL-2217)、B7IFi1(CRL-2711)、4T1(乳腺癌)的细胞系的细胞表面上的内源性鼠GP73结合；
h)bind to endogenous人GP73 on the surface of cells of a cell line与选自PC3和DU145(前列腺癌)、MDA-468(乳腺癌)、SK-BR-3(乳腺癌)、CaCo2、SW 480和HCT 113(结直肠癌)、H1975(肺癌)的细胞系的细胞表面上的内源性人GP73结合；
i)与人肿瘤组织细胞表面上的内源性人GP73结合；
j)与选自恶性黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌的人肿瘤组织细胞表面上的内源性人GP73结合；
k)与白血细胞表面上的内源性GP73结合，所述白血细胞特别是但不限于粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞；
l)与骨髓细胞表面的内源性GP73结合，所述骨髓细胞包括来自细胞系THP-1的髓性白血病细胞；和/或
m)与GP73表达细胞表面上未切割的GP73结合(在a-l下提及)。
在本发明中，人GP73具有SEQ ID NO:1(全长GP73变体1)的氨基酸序列，或者人GP73包括SEQ ID NO:7(全长GP73变体2)的氨基酸11–401。SEQ ID NO:1包含SEQ ID NO:30，而SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32分别来源于GP73的鼠形式和犬形式。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合分子是抗体或其抗原结合部分、双特异性抗体或其抗原结合部分、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein，DARPIN)，适体或另一抗体模拟物，诸如亲合体(affibody)分子、人泛素(affilin)、affimer、affitin、alphabody、anticalin、avimer、DARPin、fynomer、库尼茨型结构域肽(kunitzdomain peptide)、单抗体。
本发明的抗体尤其可以是单克隆抗体、嵌合抗体、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段、人源化抗体，或展示在噬菌体表面上或展示在嵌合抗原受体(CAR)T细胞表面上的抗体。此外，本发明的抗体可以是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体。根据以上所述，本发明的抗体结合人GP73的氨基酸36-55内的表位。在一些实施方案中，抗体结合鼠GP73和/或犬GP73。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体，所述抗体包含可变重链(VH)和可变轻(VL)链，所述可变重链(VH)包含在SEQ ID NO:6中所定义的CDR3，所述可变轻(VL)链包含在SEQ ID NO:9中所定义的CDR3。本发明的抗体可包含VH链和VL链，所述VH链包含在SEQ IDNO:4中所定义的CDR1、在SEQ ID NO:5中所定义的CDR2和在SEQ ID NO:6中所定义的CDR3，所述VL链包含在SEQ ID NO:7中所定义的CDR1、在SEQ ID NO:8中所定义的CDR2和在SEQ IDNO:9中所定义的CDR3。在一些实施方案中，本发明的抗体包含(a)VH链序列，所述VH链序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％、特别是95％序列同一性的序列；以及(b)VL序列，所述VL序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:36的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％、特别是95％序列同一性的序列。在又一实施方案中，本发明涉及一种抗体，其中所述抗体包括可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO:14中所定义的CDR3，所述可变轻(VL)链序列包含在SEQ ID NO:17中所定义的CDR3。可变轻链的CDR3还可以在SEQ ID NO:44中所定义的。在一个具体实施方案中，抗体可包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO:12中定义的CDR1、在SEQ ID NO:13中定义的CDR2和在SEQ ID NO:14中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链序列包含在SEQ ID NO:15中定义的CDR1、在SEQ ID NO:16中定义的CDR2和在SEQ ID NO:17中定义的CDR3。同样，VL链序列的CDR3还可以在SEQ ID NO:44中所限定。在又一实施方案中，所述抗体包含可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:37的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:37具有90％、特别是95％序列同一性的序列；以及可变轻(VL)链序列，所述可变轻(VL)链序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，优选of SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38具有90％，特别是95％序列同一性的序列。
在本文所述的实施方案中的任一实施方案中，抗体可以是单克隆抗体。在本文所述的实施方案中的任一实施方案中，抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在本文所述的实施方案中的任一实施方案中，抗体可以是结合GP73的抗体片段。在本文所述的实施方案中的任一实施方案中，抗体可以是IgG1、IgG2a或IgG2b、lgG3、lgG4、lgM、lgA1、lgA2、lgAsec、lgD、lgE。如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。抗体可以是全长的，或者可以仅包括抗原结合片段，诸如lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgM、lgA1、lgA2、lgAsec、lgD或lgE的抗体恒定和/或可变结构域，或者可以由Fab片段、F(ab')2片段和Fv片段组成。
在某些实施方案中，抗体包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:39(其为SEQ ID NO:28的经修饰版本，用以优化在哺乳动物细胞中的表达)的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:39具有90％、特别是95％序列同一性的序列。
此外，本发明涉及一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的抗原结合分子，特别是抗体。在一个特定实施方案中，本发明的多核苷酸编码特异性结合GP73或其抗原性部分的抗体的可变重(VH)链序列和/或可变轻(VL)链序列中的至少一者，其中所述抗体与以下氨基酸序列内的表位结合：SSRSVDLQTRIMELEGRVRR(SEQ ID NO:30)；SSRSVELQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:31)；和/或SSRSVDLQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:32)。
此外，本发明涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的多核苷酸。此外，本发明涉及一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含本发明的多核苷酸。在一个特定实施方案中，用于产生抗体的方法包括在适合于允许有效产生本发明抗体的条件下培养本发明的宿主细胞。
此外，本发明涉及一种用于产生特异性结合多肽或其抗原性部分的抗体的方法，所述方法包括向对象施用选自以下的多肽：SSRSVDLQTRIMELEGRVRR(SEQ ID NO:30)；SSRSVELQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:31)；以及SSRSVDLQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:32)。
本发明还涉及一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含本发明的抗原结合分子，特别是抗体，以及EED肽，或者细胞毒性剂或细胞毒性剂的前药。
在一些实施方案中，包含抗原结合分子和EED肽的免疫偶联物具有式Ab(-EEDL-EED肽)，其中Ab是本发明的抗体并且EEDL是接头。在一个优选实施方案中，EED肽是包含SEQID NO:42的氨基酸序列的登革热病毒EED。在某个实施方案中，抗原结合分子通过EED接头附接至EED肽，所述EED接头包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列。
在一些实施方案中，免疫偶联物具有式
Ab(-L-D)p
其中
Ab 是本发明的抗体；
L 是接头；
D 是细胞毒性剂；并且
p 是1至8的整数，优选1至6的整数，更优选2至5的整数。
细胞毒性剂优选地选自美登素、卡里奇霉素、尾海兔素衍生物(其可以是奥瑞斯他汀，例如MMAF(在本文中也称为单甲基奥瑞斯他汀F))，以及奈莫柔比星衍生物。
本发明的GP73抗体药物偶联物(在本文中也称为“GP73 ADC”或“ADC”)包含抗GP73的人单克隆抗体，特别是本发明的抗体，所述抗体通过缬氨酸-瓜氨酸接头与毒素偶联。
D可以是式A的吡咯并苯并二氮杂卓：
及其盐(例如，药学上可接受的盐)和溶剂化物(例如，药学上可接受的溶剂化物)，其中：
波浪线表示与所述接头共价附接的位点；
虚线表示任选存在双键(所述双键可以例如在C1与C2之间或在C2与C3之间)；
R2和R12各自独立地选自–H、–OH、＝O、＝CH2、–CN、–R、–OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、–O-SO2-R、–CO2R、–COR、–O-SO2-H、–CO2H、–COH，以及–卤素，
其中RD独立地选自–H、–CO2R、–C(O)R、CHO、CO2H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–和–卤素；
R6、R9、R16和R19独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
R7和R17独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
Q独立地选自–O–、–S–和–N(H)–；
R11是–H或–R，或者在Q是–O–的情况下，R11可以是–SO3M，其中M是碱金属或碱土金属阳离子；
R和R′各自独立地选自任选经取代的C1-12烷基、C3-8杂环基、C3-20杂环和C5-20芳基基团，并且如果R和R'与相同的氮原子结合，则R和R′可以与它们所附接的氮原子一起形成任选经取代的4元、5元、6元或7元杂环；
R"是C3-12烯基基团，其中一个或多个碳原子可以被选自O、NH和S的杂原子和/或任选经取代的芳环取代；
其中所述芳环包含5或6个碳原子以及一个或两个选自N或NH的杂原子，并且
X和X′独立地选自O、S，以及N(H)。
更优选地，D具有以下结构
/>
其中n是0或1；
D还可以是奈莫柔比星衍生物。在这种情况下，D优选具有选自以下的结构
以及/>
本发明的免疫偶联物可包含接头，其中所述接头可被蛋白酶切割。或者，接头可以是酸不稳定的和/或包含腙。
提供了一种包含本文所述抗体的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物具有选自以下的式：
以及
其中p的范围为1至8，优选2至5，
并且Ab如上所定义。
此外，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述制药配方包含另外的治疗剂。
在又一实施方案中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗原结合分子，以及药学上可接受的载体。在一个特定实施方案中，所述药物组合物包含另一治疗剂。
在另一方面，提供了一种治疗患有GP73阳性癌症的对象的方法，包括向所述对象施用有效量的本发明的抗原结合分子，优选抗体，或本发明的免疫偶联物或本发明的药物组合物。在一个特定实施方案中，用于此类方法的免疫偶联物包含与单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)或奈莫柔比星或奈莫柔比星代谢物(PNU)或吡咯并苯并二氮杂卓(PDB)或另一毒素偶联的本发明抗体。在特定实施方案中，GP73阳性癌症是肝癌。所述方法还可以包括向个体施用另外的治疗剂，所述另外的治疗剂为例如但不限于潜在协同的抗体，如西妥昔单抗、曲妥珠单抗，或小分子如索拉非尼、舒尼替尼、瑞戈非尼。此外，抗体与对相应GP73阳性肿瘤有效的常规化学疗法的组合可能是有利的。最后，抗体可以在干预过程中加入，所述干预过程为例如手术切除或作为经导管动脉化学栓塞(TACE)的肿瘤栓塞操作。
此外，提供本发明的抗原结合分子，优选抗体，或本发明的免疫偶联物或本发明的药物组合物以用于治疗GP73阳性癌症。
在一些实施方案中，提供了用于抑制GP73阳性细胞增殖的方法。此类方法可包括在允许抗原结合分子或免疫偶联物与细胞表面上的GP73结合的条件下向个体施用有效量的本发明的抗原结合分子或本发明的免疫偶联物，从而抑制细胞增殖。在一些实施方案中，可以通过选自酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光激活细胞分选(FACS)和蛋白质印迹的方法来检测对增殖的抑制。在一些实施方案中，GP73阳性细胞是肝癌细胞。
在一些实施方案中，提供了用于检测生物样品中人GP73的方法。所述方法包括在允许抗原结合分子与天然存在的人GP73结合的条件下使生物样品与本发明的抗原结合分子接触，以及检测在抗原结合分子与生物样品中天然存在的人GP73之间是否形成复合物。在一些实施方案中，检测可涉及选自免疫组织化学、免疫荧光成像、酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选的方法。在一些实施方案中，生物样品可以是这样的样品，所述样品包括肝癌细胞、子宫内膜癌细胞、卵巢癌细胞，或黑素瘤细胞。
附图说明
图1示出了GP73在正常组织和患病组织以及肿瘤组织中的表达，GP73的表达通过购自Sigma and Santa Cruz的多克隆兔和多克隆山羊抗体确定。
图2跨物种表位：示出了GP73抗原在不同物种中的同源性
图3A GP73蛋白的组构方案。GP73的胞内部分表示为iGP73。GP73的跨膜部分表示为tGP73。rGP73标志着GP73残余物，所述GP73残余物驻留于在蛋白水解切割后与细胞膜结合的细胞外空间中并且随后内化到细胞中。这是本发明的抗原结合分子，特别是抗体的特定表位。sGP73是GP73的经切割且可溶的部分。标记了在氨基酸N109、N144、C159、C170、O218、O235和N398处的推定的二级修饰位点。
图3B通过胞吐作用将GP73从高尔基体转运到细胞膜的方案。在例如炎症的某些条件下，GP73通过在残基55处的蛋白水解切割而被加工为可溶GP73(sGP73)和GP73残余物，所述GP73残余物被命名为rGP73，其驻留在切割后与细胞膜结合的胞外空间中。
图3C GP73的方案，示出了抗体G2-2和G2-1的结合位点。通过任一抗体的结合，残基55处的蛋白水解切割位点被阻断。
图3D GP73作为治疗靶标的方案。A未切割的GP73，B经切割的GP73，C在蛋白水解切割后，rGP73通过内吞作用而被回收到细胞内。新抗原rGP73由特异性抗体如G2-2结合DrGP73和抗体或ADC通过内吞作用而被共同转运到细胞内。在ADC的细胞内转运后，以星形标记的毒素会导致细胞损伤和死亡。
图4-A描绘了公布在人类蛋白质图谱中的免疫荧光图片。购自Sigma的多克隆兔来源抗体(HPA010638)比mG2-2与C73更靠C末端结合。示出了这些抗体的典型高尔基染色(指向左的箭头)。B示出在Alexander细胞上使用C末端抗体(购自Santa Cruz的sc-48010)(指向左的箭头)和mG2-2(指向下的箭头)的双重染色。在高尔基体处有染色重叠(两个尖端触碰的箭头)，但是mG2-2具有独特的外部膜染色(指向下的箭头)。
图5用抗rGOLPH抗体G2-2和对照对组织进行的免疫组织化学染色。将A正常肝脏、B肝炎肝脏、C和D肝细胞癌(HCC)的石蜡包埋组织用鼠G2-2(mG2-2)(A、B、C)或抗GP73抗体MO6A(Sigma)染色，然后用抗小鼠抗体进行二次染色，并在显微镜下以40倍放大倍数检查，如实施例3中所述。
图6将细胞系RAMOS(来源于B细胞)、HEK 293(来源于人胎肾)和表达GP73-myc的HEK 293(HEK 293GP73-myc)用G2-2、G2-1、G2-4、抗Myc抗体或抗CD19抗体(后者购自ebiosciences)染色。检测到细胞表面染色被描绘为实线，仅检测到二次抗体对照被描绘为虚线，如实施例4中所述。
图7用人肝细胞癌细胞系HuH7和JHH4上的不同抗体(mG2-2、G2-1、G2-4和多克隆山羊抗体SC-48010)测试GP73表面表达。如实施例4中所述，各细胞系的阳性表示为平均荧光强度(MFI)。
图8竞争性ELISA测定
使用辣根过氧化物酶标记的G2-1(G2-1-HRP)或G2-2(G2-2-HRP)作为结合抗体和G2-1或G2-2作为竞争抗体来执行肽ELISA。示出了G2-1与G2-2-HRP的竞争性抑制和G2-2与G2-1-HRP的竞争性抑制(实心三角形)。与GP73的肽AA 36-55结合作为阳性对照(实心圆圈)，阴性对照是与无关肽的结合(实心菱形)，如实施例5中所述。
图9G2-1和G2-2的pH依赖性肽结合
执行肽ELISA以测试与GP73的肽AA 36-55结合的pH依赖性。如实施例5中所述，抗体G2-1和G2-2两者的稳定结合被证实在7.4至5.4的pH范围内。
图10通过流式细胞术进行的G2-2和G2-1的内化实验
通过流式细胞术测试G2-2到鼠肝癌细胞系和人前列腺癌细胞系DU145中的内化。15分钟后，G2-2和G2-1的细胞表面检测下降至低于30％，表明在37℃下快速内化，如实施例6所述。
图11G2-2和对照的内化取决于细胞环境
使用与每种抗体偶联的pH敏感性染料pHrodo Green通过FACS测量抗体内化。染料仅在pH 5.4下显示荧光，即在抗体内化和转运至内体后。用含有可溶GP73的条件培养基进行预孵育减少了G2-4的内化，G2-4是一种与sGP73的c-末端部分结合的抗体。如实施例6中所述，与rGP73结合的G2-2的内化未改变。
图12弗林蛋白酶切割定量取决于G2-2或G2-1与GP73的结合
描绘了使用范围为0单位至3单位的弗林蛋白酶进行的GP73的弗林蛋白酶切割的测量。如实施例7中所述，使用G2-2或G2-1预孵育导致弗林蛋白酶切割(3U和1.5U)显著减少。
图13A用不同抗体处理后HuH7细胞(人肝细胞癌)的增殖。用G2-2、G2-2加西妥昔单抗、mG2-2、mG2-2加西妥昔单抗、西妥昔单抗或对照抗体各自以从0.125mg/ml至2mg/ml的递增浓度处理HuH7细胞。72小时后测量增殖细胞。细胞增殖取决于抗体浓度而减少。如实施例8中所述，该效应不依赖于Fc部分，即G2-2中的人IgG1或mG2-2中的鼠IgG2a。
图13B用不同抗体处理后HuH7细胞(人肝细胞癌)、4T1细胞(鼠乳腺癌)和CaCo2细胞(人结直肠癌)的增殖。将这三种细胞系用总共2mg/ml的G2-1、G2-1加西妥昔单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、或贝伐单抗加西妥昔单抗治疗。72小时后测量增殖细胞。如实施例8中所述，在HuH7细胞中存在G2-1和西妥昔单抗的加性效应。
图14将由与G2-2连接的附接到苹果酰胺交换接头的MMAF组成的抗体药物偶联物加入到HuH7细胞中。右曲线(三角形)示出了通过药物组分IC50 277nM所确定的MMAF的毒性。中间曲线(正方形)示出了通过抗体组分确定的IC50为6.34nM的G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF。左曲线(圆圈)示出了如实施例9和10中所述通过药物组分确定的IC50为0.124nM的G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF。
图15HuH7异种移植小鼠模型的肿瘤生长模型。将带有皮下人肝细胞癌(HuH7)的Bulb/c裸小鼠在第0天用2mg/kg G2-2-PNU(ADC)处理，并在第7天用1mg/kg G2-2-PNU处理，在第0天和第7天用2mg/g G2-2(裸mAB)处理，在第1天和第7天用G2-2(裸mAB)和PNU(ad混合物)或PBS(媒剂)处理两次。如实施例11中所述，ADC与媒剂组之间的肿瘤生长差异在第21天是统计学上显著的(单因素方差p＝0.5；SPSS 18.0)。
图16HUH7异种移植小鼠模型的Kaplan Meyer存活曲线。ADC和媒剂组之间的存活差异是统计学上显著的(Log Rank/Breslow/Tarone-Ware p＝0.02；SPSS 18.0)
图17免疫组织化学：将卵巢癌用抗GP73抗体MO6(Sigma)和mG2-2染色，然后用抗小鼠抗体进行二次染色，并在显微镜下以100倍放大倍数检查，如实施例3中所述。
图18免疫组织化学：将子宫内膜癌用MO6和mG2-2染色，然后用抗小鼠抗体进行二次染色，并在显微镜下以100倍放大倍数检查，如实施例3中所述。
图19免疫组织化学：将黑素瘤用MO6和mG2-2染色，然后用抗小鼠抗体进行二次染色，并在显微镜下以40倍放大倍数检查，如实施例3中所述。
图20该方案描述了用于实施例13中所述的结合测定的重组蛋白和肽。在AA 55处蛋白水解切割后，具有C末端10xHis-标签的全长GP73(AA 1–401)作为sGP73-His分泌。因此，sGP73-His包含具有C末端10xHis-标签的AA 56至401。相比之下，GP73 AVRR，即缺失胞内部分(iGP73 AA 1-12)和跨膜结构域(tGP73 AA 13-35)的突变变体(R52A)，被分泌但未被切割，因此它包含AA 36至401和C末端10xHis-标签。
图21(A-C)sGP73-HIS上对比GP73-His AVRR上同种型对照抗体(A)、如专利CN105734059A中所述的单克隆鼠抗体8A10(IgG2a)(B)和G2-2opti(IgG2a)(C)的结合曲线，仅后者包含含有所要求保护的表位AA 36至55的GP73，如实施例13中所述。
图22(A-C)所要求保护的表位肽rGP73(GP73 AA 36至55)上对比无关对照肽上同种型对照抗体(A)、如专利CN105734059A中所述的单克隆鼠抗体8A10(IgG2a)(B)和G2-2opti(IgG2a)(C)的结合曲线，如实施例13中所述。
图23在用贝伐单抗或G2-2opti(IgG1)处理293HEK GP73-His全长细胞后对细胞培养上清液中的sGP73的测量。弗林蛋白酶切割是sGP73在上清液中出现的先决条件。不断增加浓度的G2-2opti(IgG1)阻断弗林蛋白酶切割并降低GP73浓度，如实施例14中所述。
图24将来自不同的人癌症的细胞系用1mg/ml抗体G2-2opti(IgG1)或G2-2opti-EED(IgG1)或西妥昔单抗或贝伐单抗处理96小时。示出了与未处理对照的增殖相比的相对(％)增殖。经测试的癌症实体是结直肠癌(HCT116，具有K-Ras突变G12V的SW40，CaCo2)、卵巢癌(SKOV3)、肝癌(HUH7、Hepa1-6)、前列腺癌(DU145、PC3)和肺癌(具有EGFR突变T790M、L858R的H1975)，如实施例15中所述。
详细描述
如本文所用的“抗原结合分子”是能够特异性地或选择性地结合抗原的任何分子。结合分子可以包括或者是抗体或其片段。抗GP73结合分子是在特定识别位点处(即表位处)结合GP73抗原的分子，诸如抗GP73抗体或其片段，如上面进一步详细描述的。也就是说，本发明的抗原结合分子与SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31和/或SEQ ID NO 32中的任一者的氨基酸序列内的表位结合。其他抗GP73结合分子还可以包括多价分子、多特异性分子(例如，双抗体)、融合分子、适体(aptimer)、亲和体(avimer)，或其他天然存在的或重组产生的分子。可用于本发明中的说明性抗原结合分子包括抗体样分子。抗体样分子是这样的分子，所述分子能够通过与靶分子结合而表现出功能(参见例如，Current Opinion inBiotechnology 2006,17:653-658；Current Opinion in Biotechnology 2007,18:1-10；Current Opinion in Structural Biology 1997,7:463-469；Protein Science 2006,15:14-27)，并且包括例如DARPins(WO 2002/020565)、亲合体(WO 1995/001937)、亲和体(WO2004/044011；WO 2005/040229)、Adnectin(WO 2002/032925)和fynomer(WO 2013/135588)。
如本文所用的术语“抗GP73抗体”和“结合GP73的抗体”或简称“抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合GP73，使得该抗体可用作靶向GP73的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗GP73抗体与不相关的非GP73蛋白的结合程度小于抗体与GP73结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合GP73的抗体具有的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM，或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗GP73抗体结合GP73的在来自不同物种的GP73中是保守的表位。如上文进一步详述，本发明的抗体结合GP73胞外部分内的确定的表位。具体地，本发明的抗体结合SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32的氨基酸序列内的表位。通常，术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全人抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。本发明中的抗体还可以是嵌合抗体、重组抗体、重组抗体的抗原结合片段，人源化抗体，或展示在噬菌体表面上或展示在嵌合抗原受体(CAR)T细胞表面上的抗体。
抗体的“抗原结合片段”是指这样的除了完整抗体以外的分子，所述分子包含完整抗体的一部分并且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
在蛋白质的限定区域内“与表位结合的抗体”是需要存在该区域内的氨基酸中的一个或多个氨基酸以与所述蛋白质结合的抗体。
在某些实施方案中，通过突变分析鉴定在蛋白质的限定区域内“与表位结合的抗体”，其中蛋白质的氨基酸被突变，并且抗体与所得到的改变的蛋白质(例如，包含表位的改变的蛋白质)的结合被确定为是与未改变的蛋白质的结合的至少20％。在一些实施方案中，通过突变分析鉴定在蛋白质的限定区域内“与表位结合的抗体”，其中蛋白质的氨基酸被突变，并且抗体与所得到的改变的蛋白质(例如，包含表位的改变的蛋白质)的结合被确定为是与未改变的蛋白质的结合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在某些实施方案中，通过FACS、WB或通过合适的结合测定(诸如ELISA)来确定抗体的结合。
对如在本发明上下文中提供的抗体或其抗原结合片段没有特别限制，只要所述抗体或其抗原结合片段是如上所定义的“抗GP73抗体或其抗原结合片段”即可。因此，抗体可以是与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32的氨基酸序列内的表位特异性结合/特异性识别所述表位/与所述表位相互作用的任何抗体。因此，本发明还提供了与本文提供的任何特异性抗体结合相同表位的抗体。
如在本发明的上下文中使用的术语“结合”定义了至少两种“抗原相互作用位点”与彼此的结合(相互作用)。根据本发明，术语“抗原相互作用位点”定义了多肽的基序，即本发明的抗体或抗原结合片段的一部分，所述多肽的基序显示出与GP73的特定抗原或特定抗原组进行特异性相互作用的能力。所述结合/相互作用也被理解为定义“特异性识别”。术语“特异性识别”是指根据本发明，抗体能够与如本文所定义的GP73的至少两种氨基酸进行特异性相互作用和/或结合，特别是与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32的氨基酸序列内的至少两个氨基酸相互作用/结合。
根据本发明使用的术语“特异性相互作用”是指本发明的抗体或其抗原结合片段不与或基本上不与具有相似结构的(多)肽交叉反应。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与由SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32的氨基酸序列内的特定氨基酸序列形成的GP73结构特异性结合/相互作用。本文提供了此类分子的具体示例。
可以测试抗原结合分子，特别是所研究的一组抗体或其抗原结合片段的交叉反应性，例如通过在常规条件下评定所述一组抗体或其抗原结合片段(参见例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988)和Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,(1999))与所关注的(多)肽的结合以及与多种更多或更少(结构上和/或功能上)密切相关的(多)肽的结合。只有结合如本文所定义的GP73的某些结构(例如，如本文定义的GP73的特定表位或(多)肽/蛋白质)，但不与或基本上不与相同GP73的任何其他表位或(多)肽结合的那些构建体(即抗体、其抗原结合片段等)，才被视为对所关注的表位或(多)肽/蛋白质具有特异性并且是选择用于根据本文提供的方法进行进一步研究的。这些方法尤其可以包括与结构上和/或功能上密切相关的分子的结合研究、阻断研究和竞争研究。这些结合研究还包括FACS分析、表面等离子体共振(SPR，例如使用)、分析性超速离心、等温滴定量热法、荧光各向异性、荧光光谱法，或通过放射性标记的配体结合测定法。
因此，特异性可以通过本领域中已知的方法和本文所述的方法，通过实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试和肽扫描。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即除了可能少量存在的可能的天然存在突变之外，构成所述群体的各个抗体是相同的)获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，基本上不被其他免疫球蛋白污染。经修饰的“单克隆”表示抗体的特征是基本上同质的抗体群，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。如上所述，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler,Nature 256(1975),495描述的杂交瘤方法制备。
如本文所用的术语“多克隆抗体”是指在一种或多种其他不相同的抗体中或在其存在下产生的抗体。通常，在产生不相同的抗体的几种其他B淋巴细胞的存在下，从B淋巴细胞产生多克隆抗体。通常，直接从免疫动物获得多克隆抗体。
如本文所用的术语“全人抗体”是指仅包含人免疫球蛋白的蛋白质序列的抗体。如果在小鼠中、在小鼠细胞中或在源自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则全人抗体可含有鼠碳水化合物链。类似地，“小鼠抗体”或“鼠抗体”是指仅包含小鼠/鼠免疫球蛋白的蛋白质序列的抗体。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中和在源自大鼠细胞的杂交瘤中产生，则“全人抗体”可含有大鼠碳水化合物链。类似地，术语“大鼠抗体”是指仅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗体。全人抗体也可以例如通过噬菌体展示产生，噬菌体展示是广泛使用的筛选技术，其使得能够产生和筛选全人抗体。噬菌体抗体也可用于本发明的上下文中。噬菌体展示方法描述于例如US 5,403,484、US 5,969,108和US 5,885,793中。使得能够开发全人抗体的另一种技术涉及对小鼠杂交瘤技术的改进。使小鼠转基因以含有人免疫球蛋白基因座替代它们自身的小鼠基因(参见例如US 5,877,397)。
术语“嵌合抗体”是指包含与来自另一种人或非人物种(例如，小鼠、马、兔子、狗、牛、鸡)的抗体区域(例如，恒定区)融合或嵌合的本发明可变区的抗体。
术语抗体还涉及重组人抗体、异源抗体和异源杂交抗体。术语“重组(人)抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人序列抗体，诸如分离自对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如，小鼠)的抗体；使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组、组合的人抗体文库分离的抗体；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。然而，可以对此类抗体进行体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列虽然来源于并且与人种系VH和VL序列有关，但在人体内抗体种系库中可能不天然存在。
“异源抗体”的定义与产生这种抗体的转基因非人生物有关。该术语是指这样的抗体，所述抗体具有的氨基酸序列或编码核酸序列对应于在不是由转基因非人动物组成的生物体中发现的氨基酸序列或编码核酸序列，并且通常来自转基因非人动物以外的物种。
术语“异源杂交抗体”是指具有不同生物来源的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异源杂交抗体。异源杂交抗体的示例包括嵌合抗体和人源化抗体。
术语抗体还涉及人源化抗体。非人(例如鼠或兔)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2，或抗体的其他抗原结合子序列)，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，所述人免疫球蛋白中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含这样的残基，所述残基既不在受体抗体中存在也不在导入的CDR或框架序列中存在。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个并且通常两个这样的可变结构域，在所述可变结构域中所有的或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。有关进一步细节，请参见：JonesNature 321(1986),522-525；Reichmann Nature 332(1998),323-327和Presta Curr Op Struct Biol 2(1992),593-596。
用于抗体人源化的常用方法涉及CDR移植，在CDR移植中来自非人‘供体’抗体的功能性抗原结合位点被移植到人‘受体’抗体上。CDR移植方法是本领域已知的并描述于例如US 5,225,539、US 5,693,761和US 6,407,213中。另一种相关方法是从转基因动物产生人源化抗体，所述转基因动物经遗传工程改造以含有一个或多个能够进行基因重排和基因转化的人源化免疫球蛋白基因座(参见例如，US 7,129,084)。
因此，在本发明的上下文中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子以及此类免疫球蛋白分子的部分(即，“其抗原结合片段”)。此外，如上所述，该术语涉及经修饰的和/或改变的抗体分子。该术语还涉及重组或合成产生/合成的抗体。该术语还涉及完整抗体及其抗体片段，如分离的轻链和重链、Fab、Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2。术语抗体还包括但不限于全人抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植性抗体和抗体构建体，如单链Fv(scFv)或抗体-融合蛋白。
在本发明的上下文中，“单链Fv”或“scFv”抗体片段具有抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽还包含在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。描述了用于生产单链抗体的技术，例如在Plückthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,N.Y.(1994),269-315中。
如本文所用的“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有两个包含抗体的CH2结构域和CH3结构域的重链片段。这两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，所述一条重链的一部分含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1结构域与CH2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，所述两条重链含有CH1结构域和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在所述两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，这两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺少恒定区。
可以使用本领域已知的常规技术进一步修饰要根据本发明采用的抗体、抗体构建体、抗体片段、抗体衍生物(均为Ig衍生的)或它们的相应免疫球蛋白链，例如通过单独或组合地使用本领域已知的氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或任何其他修饰。在作为免疫球蛋白链的氨基酸序列的基础的DNA序列中引入这种修饰的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Sambrook(1989)，同前文献。术语“Ig衍生的结构域”具体涉及包含至少一种CDR的(多)肽构建体。所述Ig衍生的结构域的片段或衍生物定义(多)肽，所述(多)肽是上述抗体分子的一部分和/或是通过化学/生物化学或分子生物学方法进行修饰的。相应的方法在本领域中是已知的，并且在实验室手册中进行了描述(参见Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版(1989)和第3版(2001)；Gerhardt等人，Methods for General and Molecular Bacteriology ASMPress(1994)；Lefkovits,Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebookof Techniques；Academic Press(1997)；Golemis,Protein-Protein Interactions:AMolecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002))。
如本文所用的术语“CDR”涉及本领域中熟知的“互补决定区”。CDR是免疫球蛋白的一部分，其确定所述分子的特异性并与特定配体接触。CDR是分子中最可变的部分，并且有助于这些分子的多样性。每个V结构域中有三个CDR区CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H描绘可变重链的CDR区，并且CDR-L涉及可变轻链的CDR区。VH表示可变重链，并且VL表示可变轻链。可以如在Kabat“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，NIH公开号91-3242，U.S.Department of Health and Human Services(1991)；Chothia J.Mol.Biol.196(1987),901-917或Chothia Nature342(1989),877-883中所述地确定Ig衍生的区域的CDR区。
因此，在本发明的上下文中，上文所述的抗体分子选自由以下项组成的组：完整抗体(免疫球蛋白，如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgA1、IgGA2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE)，F(ab)片段、Fab'-SH片段、Fv片段、Fab'片段、F(ab')2片段、嵌合抗体、CDR移植抗体、全人抗体、二价抗体-构建体、抗体-融合蛋白、合成抗体、二价单链抗体、三价单链抗体和多价单链抗体。
“人源化方法”是在本领域中熟知的，并且特别是针对抗体分子，例如Ig衍生分子进行描述的。术语“人源化”是指非人(例如，鼠)抗体或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')、scFv，或抗体的其他抗原结合部分序列)的人源化形式，所述人源化形式含有来源于非人抗体的序列的某一部分。人源化抗体包括这样的人免疫球蛋白，在所述人免疫球蛋白中来自人免疫球蛋白的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需结合特异性、亲和力和能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基取代。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，并且通常两个这样的可变结构域，在所述可变结构域中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区；尤其参见Jones等人，Nature 321(1986),522-525,Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2(1992),593-596。用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人类来源引入人源化抗体中的一个或多个氨基酸，所述人源化抗体仍然保留抗体的原始结合活性。在Jones等人，Nature 321(1986),522-525；Reichmann等人，Nature 332(1988),323-327；和Verhoeyen等人，Science 239(1988),1534-1536中进一步详细描述了抗体/抗体分子的人源化方法。人源化抗体的具体示例，例如针对EpCAM的抗体，是本领域中已知的，参见例如(LoBuglio,Proceedings of the American Society ofClinical Oncology Abstract(1997),1562和Khor,Proceedings of the AmericanSociety of Clinical Oncology Abstract(1997),847)。
因此，在本发明的上下文中，提供了这样的抗体分子或其抗原结合片段，所述抗体分子或其抗原结合片段是人源化的并且能够成功地用于药物组合物中。
本发明的抗体或抗原结合片段的特异性不仅可以通过如上定义的抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的性质来表示，而且还可以通过抗体能够结合的表位来表示。因此，在一个实施方案中，本发明涉及抗GP73抗体或其抗原结合片段，所述抗GP73抗体或其抗原结合片段识别与本发明抗体(优选抗体G2-2opti)相同的表位。如实施例部分中所示，表位是位于SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:31的氨基酸序列内的线性表位，SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:31即为如由SEQ ID NO:1定义的GP73的SSRSVDLQTRIMELEGRVRR(SEQ ID NO:30)、SSRSVELQTRIVELEGRVRR(SEQ ID NO:31)和/或SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO:32。在一个优选实施方案中，由本发明抗体结合的表位在SEQ ID NO:30的氨基酸序列RIMELEGRVRR中，更优选在氨基酸序列EGRVRR中。
本领域的技术人员可以理解，表位可以包含在GP73蛋白中，但也可以包含在其降解产物中，或者可以是化学合成的肽。仅指示氨基酸位置以证明相应氨基酸序列在GP73蛋白序列中的位置。本发明涵盖包含所述表位的所有肽。肽可以是长度超过100个氨基酸的多肽的一部分，或者可以是小于100个氨基酸，优选小于50个氨基酸，更优选小于25个氨基酸，甚至更优选小于16个氨基酸的小肽。这种肽的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸(例如，β-氨基酸、γ-氨基酸、D-氨基酸)或者它们的组合。此外，本发明可以涵盖表位的相应反转肽(retro-inverso peptide)。肽可以是未结合的或结合的。它可以例如与小分子(例如，药物或荧光团)结合、与高分子量聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)等)结合，或者与蛋白质、脂肪酸、糖部分结合，或可以插入膜中。
为了测试所讨论抗体和本发明的抗体是否识别相同的表位，可以进行以下竞争研究：将用3moi感染(多重性感染)的Vero细胞在20小时后用不同浓度的所讨论抗体作为竞争剂孵育1小时。在第二个孵育步骤中，以100nM的恒定浓度施用本发明的抗体，并使用针对本发明抗体的恒定结构域的荧光标记的抗体通过流式细胞术检测本发明的抗体的结合。结合与所讨论抗体的浓度成反比地进行表明两种抗体都识别相同的表位。然而，可以使用本领域已知的许多其他测定法。
本发明还涉及抗GP73的天然多肽和重组多肽的特异性抗体的产生。该产生例如基于对如小鼠的动物的免疫。然而，在本发明中也设想了用于产生抗体/抗血清的其他动物。例如，可以通过兔子、小鼠、山羊、驴等产生单克隆和多克隆抗体。可以将编码相应选择的GP73多肽的多核苷酸亚克隆到适当的载体中，其中所述重组多肽是要在能够用于表达的生物中表达的，例如在细菌中表达。因此，表达的重组蛋白可以腹膜内地注射到小鼠中，并且所得的特异性抗体可以例如从通过心脏内血液穿刺提供的小鼠血清中获得。本发明还设想通过使用如所附实施例中所例示的DNA疫苗策略产生针对天然多肽和重组多肽的特异性抗体。DNA疫苗策略在本领域中众所周知的，并且涵盖通过基因枪或射流注射和肌内注射或皮内注射进行的脂质体介导的递送。因此，针对GP73多肽或蛋白质或表位(特别是本文所提供的抗体的表位)的抗体，可以通过直接肌内注射表达所需的GP73多肽或蛋白质或表位(特别是本发明的抗体的表位)的载体而直接免疫动物来获得，所述本发明的抗体的表位于SEQID NO:30、SEQ ID NO:31和/或SEQ ID NO:32的氨基酸序列内。所获得的特异性抗体的量可以使用ELISA定量，这也在下文中描述。用于产生抗体的其他方法是本领域中熟知的，参见例如Harlow和Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold SpringHarbor,1988。
因此，在指定的测定条件下，指定的抗体和GP73的相应表位彼此结合，并且不与样品中存在的其他组分以显著量结合。在此类条件下与靶分析物的特异性结合可能需要这样的结合部分，所述结合部分被针对其对特定靶分析物的特异性进行了选择。多种免疫测定形式可用于选择与特定抗原特异性反应的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与分析物特异性免疫反应的单克隆抗体。关于对可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定格式和条件的描述，请参见Shepherd和Dean(2000),Monoclonal Antibodies:APractical Approach,Oxford University Press和/或Howard和Bethell(2000)BasicMethods in Antibody Production and Characterization,Crc.Pr.Inc.。通常，特异性或选择性反应将是背景信噪比的至少两倍，并且更通常是背景的大于10倍至100倍。本领域的技术人员能够提供并产生针对新颖多肽的特异性结合分子。对于特异性结合测定，可以容易地采用该特异性结合分子来避免不希望的交叉反应性，例如可以通过已知方法容易地纯化和选择多克隆抗体(参见Shepherd和Dean，同前文献)。
抗体的“类别”是指其重链所拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
本文使用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，t211、I131I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212，以及Lu的放射性同位素)；化疗治疗剂或药物(例如，氨甲蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段其中诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，所述效应子功能随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
例如药物制剂之类的试剂的“有效量”是指有效地以所需剂量和时间段实现所需治疗或预防结果的量。
如本文所用的术语“内体逃逸结构域”(EED)是指破坏细胞中的内体循环过程、释放细胞质中的内体内容物并由此抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的肽。EED包括但不限于登革热病毒和其他病毒来源的EED及其变体，细菌来源的EED，以及含有两个芳族吲哚环或一个吲哚环和两个芳族苯基的肽(WO 2016/015621；WO 2016/037985；Kiesgen等人，Protein Eng Des Sel.27(10):331-7(2014)和等人，Sci Rep.6:32301(2016)。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，所述宿主细胞包括初次转化细胞和由初次转化细胞衍生的后代，而与传代次数无关。子代可能与亲代细胞的核酸含量不完全相同，而是可能含有突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变子代。
“免疫偶联物”是与一个或多个异源分子偶联的抗体，所述异源分子包括但不限于细胞毒性剂。
“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，诸如猕猴)、兔子，以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。
“分离的核酸”是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中所含有的核酸分子，但所述核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码抗GP73抗体的分离核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单个载体或分离载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。
如本文所用，术语“GP73”是指任何天然GP73。除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的GP73，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人和恒河猕猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语还包括GP73的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人GP73蛋白质的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:1中。非限制性的示例小鼠GP73蛋白质的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:29中。
术语“GP73阳性癌症”是指包含在表面上表达GP73的细胞的癌症。在一些实施方案中，GP73在细胞表面上的表达是例如通过免疫组织化学、FACS等方法使用抗GP73的抗体来确定的。或者，GP73mRNA表达被认为与细胞表面上的GP73表达相关，并且可以通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法测定。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的示例包括但不限于癌、肝癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)、胚细胞瘤、肉瘤，以及白血病。
术语“GP73阳性细胞”是指在表面上表达全长或部分GP73的细胞。
与参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列和引入用于实现最大的序列同一性百分比的空位(如果必要的话)并且不将任何保守取代视为序列同一性的组成部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指这样的制备物，所述制备物处于这样的形式，所述形式允许制备物中所包含的活性成分的生物活性是有效的，并且所述制备物不含有对将要施用所述制剂的对象具有不可接受的毒性的附加组分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外的对对象无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂，或者防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat或treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以被执行用于预防或在临床病理学过程期间执行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所用的术语“载体”是指能够使与其相连的另一种核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入到已导入了所述载体的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接至的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
单价基团
如本文所用，术语“烷基”是指单价饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的。优选地，术语“烷基”是指单价饱和烃基，其可以是直链或支链的并且不是环状的。因此，“烷基”基团不包含任何碳-碳双键或任何碳-碳三键。“C1-5烷基”表示具有1至5个碳原子的烷基。优选的示例性烷基是甲基、乙基、丙基(例如，正丙基或异丙基)，或丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基)。
除非另有说明，否则“烷基”是单价饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并含有1至18个碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子，即“C1-C18烷基”。
烷基的示例是甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)和3,3-二甲基-2-丁基(CH(CH3)C(CH3)3。
“烷基”的优选示例是“C1-C12烷基”，其是指单价饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并含有1至12个碳原子，即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个碳原子。
“烷基”的更优选示例是“C1-C8烷基”，其是指单价饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并且含有1至8个碳原子，即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子。
代表性的“C1-C8烷基”包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基和-正辛基。
支链“C1-C8烷基”包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基。
“烷基”的更优选示例是“C1-C6烷基”，其是指单价饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并含有1至5个碳原子，即1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子。
代表性的“C1-C6烷基”基团包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和正己基。
支链“C1-C6烷基”包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基，以及2-甲基丁基；
本文所用的术语“C1-C4烷基”是指单价饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并含有1至4个碳原子，即1个、2个、3个或4个碳原子。
代表性的“C1-C4烷基”基团包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基。支链“C1-C4烷基”包括但不限于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基；
如本文所用，术语“烯基”是指单价不饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并且包含一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳双键，同时其不包含任何碳-碳三键。
除非另有说明，否则“烯基”是C2-C18单价不饱和烃基，其含有2-18个碳原子，即2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17或18个碳原子，可以是直链、支链或环状的并且包含一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳双键，同时其不包含任何碳-碳三键。
“烯基”的优选示例是“C2-C8烯基”，其表示具有2至8个碳原子(即2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子)的烯基基团。优选的示例性烯基基团是乙烯基、丙烯基(例如，丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基或丙-2-烯-1-基)、丁烯基、丁二烯基(例如丁-1,3-二烯-1-基或丁-1,3-二烯-2-基)、戊烯基或戊二烯基(例如，异戊二烯基)。其他示例包括但不限于乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、环戊烯基(-C5H7)、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)和-2,3-二甲基-2-丁烯基。
C2-C6烯基的示例包括但不限于-乙烯基、-烯丙基，-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基和3-己烯基。
“烯基”的更优选示例是“C2-C4烯基”，其表示具有2至4个碳原子的烯基。因此，示例是-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基和-异丁烯基。
如本文所用，术语“炔基”是指单价不饱和烃基，其可以是直链、支链或环状的并且包含一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳三键和任选的一个或多个碳-碳双键。
除非另有说明，否则术语“炔基”是指“C2-8炔基”，其表示具有2至8个碳原子的炔基基团。优选的示例性炔基是乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、环戊烯基、3-甲基-1-丁炔基、5-己烯基、乙烯基、乙烯。
优选的炔基基团是“C2-6炔基”，其表示具有2至6个碳原子的炔基基团；以及“C2-4炔基”，其表示具有2至4个碳原子的炔基基团。
术语“烷氧基”是指由“-O-烷基”表示的基团，其中“烷基”如上所定义，包括烷基的优选示例。
示例性烷氧基包括但不限于甲氧基(-OCH3)和乙氧基(-OCH2CH3)。
“烷氧基”的优选示例是“C1-C5烷氧基”，其是具有1至5个碳原子的烷氧基并且可以被描述为“-O-C1-C5烷基”。
如本文所用，术语“碳环基”是指环基，包括单环以及桥环、螺环和/或稠环系统(其可以由例如两个或三个环组成)，其中一个或更多碳环原子可任选地被氧化(即，形成氧代基团)，并且此外其中所述环基团可以是饱和的、部分不饱和的(即，不饱和的但不是芳族的)，或芳族的。“碳环基”的优选示例对应于下面给出的“碳环”的定义，其中一个氢原子被提取。
术语“碳环”优选是指具有3至7个碳原子的饱和或不饱和单环或具有7至12个碳原子的双环。单环碳环优选具有3至6个环原子，更优选5或6个环原子并且包括如下定义的苯基。双环碳环通常具有例如排列为双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统的7至12个环原子，或排列为双环[5,6]或[6,6]系统的9或10个环原子。单环碳环的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基，以及环辛基。
“C3-C8碳环(carbocyle)”是3元、4元、5元、6元、7元或8元饱和或不饱和的非芳族碳环。代表性的C3-C8碳环包括但不限于-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-环庚基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基、-环辛基和-环辛二烯基。
“C3-C8碳环(carbocyclo)”是指如上定义的C3-C8碳环基团，其中碳环基团的一个氢原子被键取代。
如本文所用，术语“芳基”是指芳烃环基团，包括单环芳环以及含有至少一个芳环的桥环和/或稠环系统(例如，由两个或三个稠环组成的环系，其中这些稠环中的至少一个是芳族的；或由两个或三个环组成的桥环系统，其中这些桥环中的至少一个是芳族的)。“芳基”可以例如是指苯基、萘基、二氢萘基(即，1,2-二氢萘基)、四氢萘基(即，1,2,3,4-四氢萘基)、蒽基或菲基。
除非另有说明，否则术语“芳基”是指“C5-C20芳基”，其为碳环芳环中具有5至20个碳原子的芳基。
芳基的更优选示例是“C5-C14芳基”，其是碳环芳环中具有5至14个碳原子的芳基。
如本文所用，术语“杂环基”是指环基，包括单环以及桥环、螺环和/或稠环系统(其可以由例如两个或三个环组成)，其中所述环基团包含一个或多个(诸如，一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S、P和N的环杂原子，并且剩余的环原子是碳原子，其中一个或多个P环原子(如果存在的话)和/或S环原子(如果存在的话)和/或一个或多个N环原子(如果存在的话)可任选被氧化，其中一个或多个碳环原子可任选被氧化(即，形成氧代基团)，并且此外其中所述环基团可以是饱和的、部分不饱和的(即，不饱和的但不是芳族的)，或芳族的。除非另外定义，否则“杂环基”优选是指杂芳基。
“杂环基”的优选示例是“C3-C8杂环基”，其是指芳族或非芳族C3-C8碳环，其中一至四个环碳原子独立地被选自由O、S和N组成的组的杂原子取代。C3-C8杂环的代表性示例包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基，香豆素基、异喹啉基、吡咯基、苯硫基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶并、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。
示例性杂环描述于例如Paquette,Leo A.,"Principles of Modem HeterocyclicChemistry"(W.A.Benjamin,New York,1968)，具体是第1章、第3章、第4章、第6章、第7章和第9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs"(JohnWiley&Sons,New York,1950至今)，特别是第13卷、第14卷、第16卷、第19卷和第28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中。
杂环的示例包括例如但不限于吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化的四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫杂萘基、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基，哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双四氢呋喃基、四氢吡喃基、双-四氢吡喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基，异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、酚黄素基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩噁嗪基、异色满基、色满基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基，以及靛红酰基(isatinoyl)。
举例而言但并非限制，碳键合的杂环键合于吡啶的2位、3位、4位、5位或6位，哒嗪的3位、4位、5位或6位，嘧啶的2位、4位、5位或6位，吡嗪的2位、3位、5位或6位，呋喃、四氢呋喃、噻吩(thiofuran)、噻吩(thiophene)、吡咯或四氢吡咯的2位、3位、4位或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2位，4位或5位，异噁唑、吡唑或异噻唑的3位、4位或5位，氮丙啶的2位或3位，氮杂环丁烷的2位、3位或4位，喹啉的2位、3位、4位、5位、6位、7位或8位，或异喹啉的1位、3位、4位、5位、6位、7位或8位。更典型地，碳键合的杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基，或5-噻唑基。
举例而言但并非限制，氮键合的杂环键合在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位，异吲哚或异吲哚啉的2位，吗啉的4位，以及咔唑或β-咔啉的9位。更典型地，氮键合的杂环包括1-氮杂环丙基、1-氮杂环丁二烯基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基，以及1-哌啶基。
如本文所用，术语“杂芳基”是指芳环基，包括单环芳环以及含有至少一个芳环的桥环和/或稠环系统(例如，由两个或三个稠环组成的环系，其中这些稠环中的至少一个是芳族的；或由两个或三个环组成的桥环系统，其中这些桥环中的至少一个是芳族的)，其中所述芳环基团包括一个或多个(例如，一个、两个、三个或四个)独立地选自O、S、P和N的环杂原子，并且其余的环原子是碳原子，其中一个或多个S环原子(如果存在的话)和/或一个或多个P环原子(如果存在的话)和/或一个或多个N环原子(如果存在的话)可任选被氧化，并且此外其中一个或多个碳环原子可任选被氧化(即，形成氧代基团)。“杂芳基”可以例如指噻吩基(即，苯硫基)、苯并[b]噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基(furyl)(即，呋喃基(furanyl))、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、吩噻基、吡咯基(例如，2H-吡咯基)、咪唑基、吡唑基、吡啶基(pyridyl)(即，吡啶基(pyridinyl)；例如，2-吡啶基、3-吡啶基、或4-吡啶基)、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、吲哚基(例如，3H-吲哚基)、吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基(例如，[1,10]菲咯啉基、[1,7]菲咯啉基，或[4,7]菲咯啉基)、吩嗪基、噻唑基、异噻唑基、吩噻嗪、噁唑基、异噁唑基、呋喃基、吩噁嗪基、吡唑并[1,5-a]嘧啶基(例如，吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)、1,2-苯并异噻唑-3-基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、1H-四唑基、2H-四唑基、香豆素基或者色酮基。
除非另外定义，否则“杂芳基”优选是指包含一个或多个(例如，一个，两个，三个或四个)独立地选自O、S、P和N的环杂原子的5至14元(更优选5至10元)单环或稠环系统，其中一个或多个S环原子和/或一个或多个P环原子(如果存在的话)和/或一个或多个N环原子(如果存在的话)任选被氧化，并且其中一个或多个碳环原子任选被氧化；甚至更优选地，“杂芳基”是指包含一个或多个(例如，一个、两个或三个)独立地选自O、S、P和N的环杂原子的5或6元单环，其中一个或多个S环原子和/或一个或多个P环原子(如果存在的话)和/或一个或多个N环原子(如果存在的话)任选被氧化，并且其中一个或多个碳环原子任选被氧化。
优选的杂芳基包含3至20个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子。其他优选的杂芳基可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的单环，或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
所述术语“芳基烷基”是指由“-(烷基)-(芳基)”、“-(烯基)-(芳基)”和“-(炔基)-(芳基)”表示的基团，其中：“烷基”、“烯基”和“炔基”如下所定义，并且“芳基”如上所定义。亚烷基优选为C1-C6亚烷基，并且优选为非环状的。芳基优选为C5-C14芳基。换句话说，术语“芳基烷基”是指非环状的烷基基团，其中键合到碳原子(典型地为末端或sp3碳原子)的氢原子中的一个氢原子被芳基基团替代。典型的芳烷基包括但不限于苄基、2-苯基乙烷-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙烷-1-基、2-萘基乙烯-1-基，萘并苄基、2-萘并苯基乙烷-1-基等。芳基烷基包含6至20个碳原子，例如芳基烷基的烷基部分，包括烷基、烯基或炔基是1至6个碳原子，并且芳基部分是5至14个碳原子。
术语“杂芳基烷基”是指由“-(烷基)-(杂芳基)”、“-(烯基)-(杂芳基)”和“-(炔基)-(杂芳基)”表示的基团，其中：“烷基”、“烯基”和“炔基”是如下所定义，并且芳基是如上所定义。换句话说，“杂芳基烷基”是指非环状的烷基基团，其中键合到碳原子(典型地为末端或sp3碳原子)的氢原子中的一个氢原子被杂芳基基团替代。典型的杂芳基烷基包括但不限于2-苯并咪唑甲基、2-呋喃基乙基等。杂芳基烷基包含6至20个碳原子，例如杂芳基烷基的烷基部分，包括烷基、烯基或炔基是1至6个碳原子，并且杂芳基部分是5至14个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子。杂芳基烷基的杂芳基部分可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至3个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
二价基团
如本文所用，术语“亚烷基”是指对应于术语“烷基”的二价基团，其中一个氢被去除并且通常被键取代。除非另有说明，否则术语“亚烷基”优选是指1-18个碳原子的饱和、支链或直链或环状烃基，并且具有通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子去除两个氢原子而衍生的两个一价基团中心。典型的亚烷基包括但不限于亚甲基(-CH2-)、1,2-亚乙基(-CH2CH2-)、1,3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)和1,4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)。
“亚烷基”的优选示例是“C1-C10亚烷基”，其是式-(CH2)1-10-的直链饱和烃基。“C1-C10亚烷基”的示例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
如本文所用，术语“亚烯基”是指对应于术语“烯基”的二价基团，其中一个氢被去除并且通常被键取代。除非另有说明，否则术语“亚烯基”是指2-18个碳原子的不饱和支链或直链或环状烃基，并且具有通过从母体烯基的相同或两个不同碳原子去除两个氢原子而衍生的两个一价基团中心。优选的亚烯基包括2至12个碳原子、2至8个碳原子或2至4个碳原子。典型的亚烯基包括但不限于1,2-乙烯基(-CH＝CH-)。
如本文所用，术语“亚炔基”是指对应于术语“炔基”的二价基团，其中一个氢被去除并且通常被键取代。除非另有说明，否则术语“亚炔基”是指2-18个碳原子的不饱和支链或直链或环状烃基，并且具有通过从母体炔基的相同或两个不同碳原子去除两个氢原子而衍生的两个一价基团中心。优选的亚炔基包括2至12个碳原子、2至8个碳原子或2至4个碳原子。典型的亚炔基包括但不限于乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
如本文所用，术语“亚芳基”是指对应于术语“芳基”的二价基团，其中一个氢被去除并且通常被键取代。所述化合价可以在芳烃环基团内的任何位置处。作为示例，在亚苯基中，化合价可以在邻位、间位或对位，如以下结构中所示：
取代基
在本说明书中，多种基团被称为“被任选取代的”或“被取代的”。通常，这些基团可带有一个或多个取代基，诸如一个、两个、三个或四个取代基。应理解，取代基的最大数量受被取代部分上可用的附接位点的数目的限制。除非另外定义，否则本说明书中提到的“被任选取代的”基团优选带有不超过两个取代基，并且可以特别地仅带有一个取代基。此外，除非另有说明，否则优选不存在任选的取代基，即相应的基团是未取代的。
烷基、芳基、芳基亚烷基、芳基烷基、亚烷基、亚烯基和亚炔基的取代基包括但不限于-X、-R、-OH,-OR、-SR、-SH、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-P(OH)3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2，
其中：每个X独立地为选自F、Cl、Br和I的卤素；并且
每个R独立地为-H、C1-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14杂环基、保护基或前药部分。
烷基、芳基、芳基亚烷基、芳基烷基、亚烷基、亚烯基和亚炔基的优选取代基包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中每个R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
除非另有定义，否则取代基包括但不限于C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中每个R'独立地选自H、-C1-C8烷基和芳基。
优选烷基的取代基不包含烷基。
被描述为被取代的苯基优选含有1-4个上面定义的取代基。被描述为被取代的C3-C8杂环基优选含有1至7个上面定义的取代基。被描述为被取代的C3-C8杂环基优选含有1至6个上面定义的取代基。被描述为被取代的C3-C20杂环基团优选含有1至7个上面定义的取代基。被描述为被取代的C3-C8碳环基团优选含有1至7个上面定义的取代基。
如本文所用，术语“卤素”是指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
如本文所用，术语“任选的”、“任选地”和“可以”表示所指示的特征可以存在但也可以不存在。无论何时使用术语“任选的”、“任选地”或“可以”，本发明具体涉及两种可能性，即，存在相应的特征，或者替代地不存在相应的特征。例如，表述“X任选被Y取代”(或“X可以被Y取代”)表示X被Y取代或未被取代。同样地，如果组合物的组分被指示为“任选的”，则本发明具体涉及两种可能性，即存在相应的组分(包含在组合物中)或组合物中不存在相应的组分。
术语“接头”是指包含共价键或原子链的化学部分，所述化学部分将抗体共价附接至药物部分。接头的示例包括二价基团，诸如亚烷基、亚芳基、亚杂芳基或-(CR2)nO(CR2)n-或烷氧基的重复单元(例如聚亚乙氧基、PEG、聚亚甲氧基)和烷基氨基(例如聚亚乙氨基、JeffamineTM)；和二酸酯以及酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。在各种实施方案中，接头可包括一种或多种氨基酸残基，诸如缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和高赖氨酸。
术语“手性”是指具有镜像配对体的不可重叠性特性的分子，而术语“非手性”是指可重叠在其镜像配对体上的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但在空间中原子或基团的排列方面不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析程序如电泳和色谱法下分离。
“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，它们是彼此的不可重叠的镜像。
本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker编辑，McGraw-HillDictionary of Chemical Tenns(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；和Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述光学活性化合物时，前缀D和L、或R和S，用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。采用前缀d和1或(+)和(-)来表示由化合物旋转平面偏振光的符号，其中(-)或1表示该化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体是相同的，区别在于它们是彼此的镜像。特定的立体异构体也可称为对映异构体，并且此类这些异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映体的50:50混合物被称为外消旋混合物或外消旋体，其可以在化学反应或过程中没有立体选择性或立体特异性的情况下发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指没有光学活性的两种对映体物质的等摩尔混合物。
“离去基团”是指可由另一官能团取代的官能团。某些离去基团在本领域中是熟知的，并且示例包括但不限于卤素(例如氯、溴、碘)、甲磺酰基(mesyl)、对甲苯磺酰基(tosyl)、三氟甲基磺酰基(triflate)和三氟甲磺酸根。
术语“保护基团”是指通常用于在化合物上的其他官能团反应时阻断或保护特定官能团的取代基。例如，“氨基-保护基团”是附接到氨基上的取代基，其阻断或保护化合物中的氨基官能团。合适的氨基保护基包括但不限于乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBZ)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。关于保护基团及其用途的一般描述，参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991，或更新版本。
本发明的范围包括本文公开的化合物的所有药学上可接受的盐形式，所述药学上可接受的盐形式可以例如通过带有易于质子化的电子孤对的原子，诸如氨基，与无机或有机酸，或者作为具有生理学上可接受的阳离子的酸基团(诸如羧酸基团)的盐进行质子化来形成。示例性的碱加成盐包括，例如：碱金属盐，诸如钠盐或钾盐；碱土金属盐，诸如钙盐或镁盐；锌盐；铵盐；脂肪胺盐，诸如三甲胺、三乙胺、二环己胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、普鲁卡因盐、葡甲胺盐、乙二胺盐或胆碱盐；芳烷基胺盐，诸如N,N-二苄基乙二胺盐、苄星青霉素盐、苯明青霉素盐；杂环芳香胺盐，诸如吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐或异喹啉盐；季铵盐，诸如四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐或四丁基铵盐；以及碱性氨基酸盐，诸如精氨酸盐、赖氨酸盐或组氨酸盐。示例性的酸加成盐包括例如：无机酸盐、诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐(例如，硫酸盐或硫酸氢盐)、硝酸盐、磷酸盐(诸如磷酸盐、磷酸氢盐，或二氢磷酸盐)、碳酸盐、碳酸氢盐、高氯酸盐、硼酸盐或硫氰酸盐；有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、己酸盐、庚酸盐、辛酸盐、环戊烷丙酸盐、癸酸盐、十一酸盐、油酸盐、硬脂酸盐、乳酸盐、马来酸盐、草酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、己二酸盐、葡萄糖酸盐、乙醇酸盐、烟酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐、双羟萘酸盐(思波酸盐)、樟脑酸盐、葡庚酸盐或新戊酸盐；磺酸盐，诸如甲磺酸盐(mesylate)、乙磺酸盐(esylate)、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、苯磺酸盐(besylate)、对甲苯磺酸盐(甲苯磺酸盐)、2-萘磺酸盐(萘磺酸盐)、3-苯基磺酸盐或樟脑磺酸盐；甘油磷酸盐；和酸性氨基酸盐，诸如天冬氨酸盐或谷氨酸盐。本文公开的化合物的优选的药学上可接受的盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、甲磺酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。本文公开的化合物的特别优选的药学上可接受的盐是盐酸盐。因此，优选本文公开的化合物为盐酸盐、氢溴酸盐、甲磺酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的形式，并且特别优选地，式(I)化合物为盐酸盐形式。
此外，本发明的范围涵盖本文公开的任何溶剂化形式的化合物，包括例如与水的溶剂化物如水合物，或与有机溶剂如甲醇、乙醇或乙腈的溶剂化物，即分别作为甲醇化物、乙醇化物或乙腈化物，或者为任何多晶相的形式。应理解，本文公开的化合物的此类溶剂化物还包含本文公开的化合物的药学上可接受的盐的溶剂化物。
本文件中提及的所有出版物、专利申请、专利和专利文件在此以引用方式整体并入，如同单独以引用方式并入一样。在本文件与以引用方式并入的那些文件之间用法不一致的情况下，并入的参考文献中的用法应视为对本文件的用法的补充；对于相互矛盾的不一致性，应以本文件中的用法为准。
在一个方面，本发明部分基于结合GP73的抗体和包含此类抗体的免疫偶联物。本发明的抗体和免疫偶联物可用于例如诊断或治疗GP73阳性癌症。
本文提供了与GP73结合的分离的抗体。两种示例性天然存在的人GP73同种型描述于SEQ ID NO:1中，并且蛋白酶裂解，并且相应的经加工的GP73形式(氨基酸56-401)例如由图3所示的蛋白酶切割。
在一些实施方案中，本发明的抗GP73抗体具有以下特征中的至少一种或多种的任何组合：
a)与重组人GP73结合
b)与癌细胞表面上的内源性GP73结合；
c)与癌细胞表面上的人GP73的氨基酸36至55中的表位(新表位)结合
d)与肝细胞癌细胞表面上的内源性GP73结合；
e)与选自HepG2、Hep3B、HuH7、JHH-7、Alexander(PLC/PRF/5)、HLE、HuCCT1的细胞系的细胞表面上的内源性GP73结合；
f)与选自SKBR3(乳腺癌)、SKOV3(卵巢癌)、PC3和DU145(前列腺癌)、HCT116、CaCo2、SW480(结直肠癌)、H1975(肺癌)的细胞系的细胞表面上的内源性GP73结合；
g)与选自Hep55-1C、Hepa1-6、Hep33.1c的细胞系的细胞表面上的内源性鼠GP73结合；
h)与选自MDA和4T1(乳腺癌)的细胞系的细胞表面上的内源性鼠GP73结合；
i)与选自CRL2212的细胞系的细胞表面上的内源性大鼠GP73结合；
j)与GP73表达细胞表面上未切割的GP73结合(在a-i下提及)；
k)与人GP73的氨基酸36至55中的表位结合；
l)与跨越在人GP73的E50至R55处推定的弗林蛋白酶切割识别基序的表位结合；
在一些实施方案中，抗体的特征是例如在以下实施例中如本文所述地确定的。在一些实施方案中，抗体的特征是通过在293HEK细胞中产生的重组GP73蛋白确定的。作为非限制性示例，在一些实施方案中，全长GP73或GP73不可切割突变体(R52A)在细胞(诸如293HEK细胞)中表达，并且通过ELISA或FACS检测抗体与野生型GP73或GP73不可切割突变体或N-末端截短的GP73(AA 56至401)的结合。
本文提供的某些实施方案部分地基于抗体G2-2和/或G2-2opti的开发，抗体G2-2和/或G2-2opti与人GP73蛋白的氨基酸35至55内的表位结合。在一些实施方案中，本文提供的抗体与人GP73的氨基酸35至55内的表位结合。在一些此类实施方案中，本文提供的抗体包含抗体G2-2的一个或多个CDR序列。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗GP73抗体，所述抗GP73抗体包含选自以下的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3和包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。在又一实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3，以及包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2。在又一实施方案中，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一方面，本发明发明提供了一种抗体，所述抗体包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，所述抗体包含
(a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1；
(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2；以及
(c)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3.
在另一方面，本发明的抗体包含
(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VHCDR序列：(i)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2，以及(iii)包含选自SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；以及
(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VLCDR序列：(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，抗GP73抗体包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH序列含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗GP73抗体保留与GP73结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:35中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:35中总共有1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。在一个优选实施方案中，SEQ ID NO:2中总共3个氨基酸被取代以优化哺乳动物细胞中的表达(SEQ ID NO:35)。任选地，抗GP73抗体包含SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:35的VH序列，包括对该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDRH2，以及(c)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一方面，提供了一种抗GP73抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:36的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:36的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL序列含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗GP73抗体保留与GP73结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:36中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:36中总共有1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。在一个优选实施方案中，SEQID NO:3中总共3个氨基酸被取代以优化哺乳动物细胞中的表达(SEQ ID NO:36)。任选地，抗GP73抗体包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:36的VL序列，包括对该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-L2，以及(c)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，提供了抗GP73抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个优选实施方案中，抗体包含分别在SEQID NO:35和SEQ ID NO:36中的VH序列和VL序列，包括对这些序列的翻译后修饰。在另一优选实施方案中，抗GP73抗体包含包含分别在SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中的VH序列和VL序列的抗体的人源化形式。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的VH序列和VL序列，包括对这些序列的翻译后修饰。在另一实施方案中，抗GP73抗体包含包含分别在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的VH序列和VL序列的抗体的人源化形式。
在另一方面，本文提供了这样的抗体，所述抗体与本文提供的抗GP73抗体结合相同的表位。在一个优选实施方案中，提供了这样的抗体，所述抗体与包含分别为SEQ ID NO:37的VH序列和SEQ ID NO:38的VL序列的抗GP73抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，提供了这样的抗体，所述抗体与包含分别为SEQ ID NO:10的VH序列和SEQ ID NO:11的VL序列的抗GP73抗体结合相同的表位。
在本发明的另一方面，根据任何上述实施方案的抗GP73抗体是单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗GP73抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体，或F(ab')2片段.在另一个实施方案中，抗体是基本上全长的抗体，例如本文定义的IgG1抗体、IgG2a抗体或其他抗体类别或同种型。
在另一方面，根据上述任一实施方案的抗GP73抗体包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:28，优选SEQ ID NO:39的氨基酸序列(其为SEQ ID NO:28的修饰版本，用以优化在哺乳动物细胞中的表达)。在另一方面，抗GP73抗体包含与SEQ IDNO:28或SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链恒定区序列。
在另一方面，根据任何上述实施方案的抗GP73抗体可以单独或组合地掺入任何特征，如下所述。
本文提供的某些实施方案部分地基于抗体G2-1的开发，抗体G2-1与人GP73蛋白的氨基酸36至55内的表位结合。在一些实施方案中，本文提供的抗体与人GP73的氨基酸347至366内的表位结合。在一些此类实施方案中，本文提供的抗体包含抗体G2-1的一个或多个CDR序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗GP73抗体，所述抗GP73抗体包含选自以下的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR：(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VH CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H3。在一个实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3。在另一个实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3和包含SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:44的氨基酸序列的CDR-L3。在又一实施方案中，所述抗体包含包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3、包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3，以及包含SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2。在又一实施方案中，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2；以及(c)包含SEQID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一方面，本发明发明提供了一种抗体，所述抗体包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VL CDR序列：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1；(b)包含SEQID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2；以及(c)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3。在一个实施方案中，抗体包含
(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1。
(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2；以及
(c)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，本发明的抗体包含
(a)VH结构域，所述VH结构域包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VHCDR序列：(i)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2，以及(iii)包含选自SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；以及
(b)VL结构域，所述VL结构域包含选自以下的至少一种、至少两种或所有三种VLCDR序列：(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，以及(iii)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2；以及(f)包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，抗GP73抗体包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VH序列含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗GP73抗体保留与GP73结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:37中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:37中总共有1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。在一个优选实施方案中，SEQ ID NO:10中总共6个氨基酸被取代以优化哺乳动物细胞中的表达(SEQ ID NO:37)。任选地，抗GP73抗体包含SEQID NO:10或SEQ ID NO:37的VH序列，包括对该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VH包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDRH2，以及(c)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-H3。
在另一方面，提供了一种抗GP73抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:11或SEQID NO:38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:38的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL序列含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗GP73抗体保留与GP73结合的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:38中总共有1至10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，在SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:38中总共有1至5个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR外部的区域中(即，在FR中)。在一个优选实施方案中，SEQID NO:11中总共10个氨基酸被取代以优化哺乳动物细胞中的表达(SEQ ID NO:38)。任选地，抗GP73抗体包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:38的VL序列，包括对该序列的翻译后修饰。在一个特定实施方案中，VL包含选自以下的一个、两个或三个CDR：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-L2，以及(c)包含SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一方面，提供了抗GP73抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH和如上文提供的任何实施方案中的VL。在一个优选实施方案中，抗体包含分别在SEQID NO:37和SEQ ID NO:38中的VH序列和VL序列，包括对这些序列的翻译后修饰。在另一实施方案中，抗GP73抗体包含包含分别在SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中的VH序列和VL序列的抗体的人源化形式。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的VH序列和VL序列，包括对这些序列的翻译后修饰。在另一实施方案中，抗GP73抗体包含包含分别在SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中的VH序列和VL序列的抗体的人源化形式。
在另一方面，本文提供了这样的抗体，所述抗体与本文提供的抗GP73抗体结合相同的表位。在一个优选实施方案中，提供了这样的抗体，所述抗体与包含分别为SEQ ID NO:35的VH序列和SEQ ID NO:36的VL序列的抗GP73抗体结合相同的表位。在某些实施方案中，提供了这样的抗体，所述抗体与包含分别为SEQ ID NO:2的VH序列和SEQ ID NO:3的VL序列的抗GP73抗体结合相同的表位。
在本发明的另一方面，根据任何上述实施方案的抗GP73抗体是单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗GP73抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体，或F(ab')2片段.在另一个实施方案中，抗体是基本上全长的抗体，例如本文定义的IgG1抗体、IgG2a抗体或其他抗体类别或同种型。
在另一方面，根据上述任一实施方案的抗GP73抗体包含重链恒定区序列，所述重链恒定区序列包含SEQ ID NO:28，优选SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在另一方面，抗GP73抗体包含与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链恒定区序列。
在另一方面，根据任何上述实施方案的抗GP73抗体可以单独或组合地掺入任何特征，如下所述。
在某些实施方案中，本文提供的抗体具有的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM，或≤0.001nM，或者任选地为10-13M(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，在25℃下使用-2000或/>-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，使用表面等离子体共振测定法测量Kd，其中固定抗原CM5芯片为-10响应单位(RU)。简而言之，根据供应商的说明，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗原在以5μl/分钟的流速注射前用pH 4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/ml(-0.2μM)，以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。在抗原注射后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下将抗体在含有0.05％聚山梨醇酯-20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PEST)的PBS中的两倍连续稀释液(0.58nM至200nM)以约25μl/min的流速注射。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(T100评估软件)计算缔合率(k接通)和解离率(k关断)。平衡解离常数(Kd)计算为比率k断开/k接通。参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子共振分析获得的接通速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术来确定接通速率，该荧光猝灭技术在分光光度计(诸如配备阻流器的分光光度计(AvivInstruments)或具有搅拌池的8000系列SLM-AMINCO TM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量的不断增加浓度的抗原存在下，在25℃下测量在pH 7.2的PBS中的20nM抗抗原抗体的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，
表1-针对1:1结合的Biacore数据拟合
GP73肽：SSRSVDLQTRIMELEGRVRR
分析软件：Biacore T100评估软件(GE Healthcare Life Sciences)
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能希望提高抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过在编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。这种修饰包括例如从抗体的氨基酸序列内的残基进行缺失和/或向所述残基进行插入和/或取代。缺失、插入和取代的任何组合都可以得到最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需的特征，例如抗原结合。
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。替代诱变的所关注位点包括CDR和FR。保守取代列于表1“优选取代”标题下。表1在标题“示例性取代”下提供了更实质性的变化，如下面参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并对产物进行所需活性的筛选，例如保留/改善抗原结合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC。
表2
氨基酸可根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类中的一个类的成员替换为另一类的成员。
一种类型的取代变体涉及取代亲代抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将具有相对于亲代抗体在某些生物学特性方面的修饰(例如，改进)(例如，增加亲和力，降低免疫原性)，和/或将基本上保留亲代抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和成熟技术(诸如本文所述的技术)方便地产生。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并将变异抗体展示在噬菌体上，并针对特定的生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以对CDR进行改变(例如，取代)，例如以提高抗体亲和力。这种改变可以在CDR“热点”中进行，CDR“热点”即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和或在SDR(a-CDR)中进行，其中测试所得变体的VH或VL的结合亲和力。例如在Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178:1-37(O'Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,(2001).)中已经描述了通过构建和从二级文库重新选择来进行亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组，或寡核苷酸定向诱变)中的任何一种，将多样性引入被选择用于成熟的可变基因中。然后创建次级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR指导的方法，其中随机化几个CDR残基(例如，每次4-6个残基)。参与抗原结合的CDR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。CDR H3和CDR-L3特别地通常是靶向的。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个CDR内发生，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。这种改变可以在CDR“热点”或SDR之外。在上面提供的变体的VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR没有改变，或者包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085描述了一种用于鉴定可被靶向进行诱变的抗体的残基或区域的有用方法，被称为“丙氨酸扫描诱变”。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入进一步的取代，以证明对初始取代的功能敏感性。替代地或者另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来识别抗体与抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基以作为取代候选。可以筛选变体以确定它们是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入物的示例包括具有N末端甲硫基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与酶(例如，对于ADEPT)多肽融合，这延长了抗体的血清半衰期。
在某些实施方案中，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体的糖基化程度。可以通过改变氨基酸序列以便产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地完成向抗体添加或缺失糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变附接到其的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，该支链的双触角寡糖通常通过N-键附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接至双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了具有缺乏(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，这种抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算相对于通过MALDI-TOF质谱法测量的附接到Asn 297的所有糖结构(例如复合、杂交和高甘露糖结构)的总和，Asn297处的糖链内的岩藻糖平均量来确定岩藻糖的量，例如如在WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中大致位置297的天冬酰胺残基(Fc区残基的Eu编号)；然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可位于位置297上游或下游(即，在位置294和300之间)的约±3个氨基酸处。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利申请号US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去糖基化”或“岩藻糖缺陷”抗体变体相关的出版物的示例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；W02005/053742；W02002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去糖基化的抗体的细胞系的示例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108 Al,Presta,L；和WO 2004/056312 Al,Adams等人，尤其是在实施例11处)，以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人，Bioteeh.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Bioteehnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及W02003/085l07)。
抗体变体还具有等分寡糖，例如其中附接至抗体Fc区的二元寡糖被GlcNAc二等分。这种抗体变体可能具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。例如在WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利申请号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)中描述了此类抗体变体的示例。还提供了这样的抗体变体，所述抗体变体的寡糖中的至少一个半乳糖残基附接到Fc区。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。例如在WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中描述了此类抗体变体。
在某些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是所有效应子功能的抗体变体，这使其成为这样的应用的理想候选者，在所述应用中抗体体内半衰期是重要的但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达Fc(RIII，而单核细胞表达Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。用于评估所关注分子的ADCC活性的体外测定的非限制性示例描述于美国专利号5,500,362中(参见例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。
或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。
另外或替代地，可以例如在诸如于Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.sci.USA95:652-656(1998)中所公开的动物模型中体内评定所关注分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c结合ELISA。为了评定补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域中已知的方法执行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有对Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个氨基酸位置处具有取代的Fc突变体，包括将残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善或减弱的FcR结合的某些抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO2004/056312，以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在某些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如Fc区的位置298、333和/或334处的取代(EU残基编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减弱)，例如如在美国专利号6,194,551、WO 99/51642，以及Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
负责将母体IgG转移至胎儿的具有延长的半衰期和改善的新生Fc受体(FcRn)结合的抗体(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kirn等人，J.Immunol.24:249(1994))描述于US2005/0014934Al(Hinton等人)中。这些抗体包含其中具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的取代的Fc区。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如在Fc区残基434处的取代(美国专利号7,371,826)。
关于Fc区变体的其他示例，还参见Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定的实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代这些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可及位点处，并且可以用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)偶联，以产生免疫偶联物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。经半胱氨酸工程化的抗体可以如在例如美国专利号7,521,541中所述地产生。
在某些实施方案中，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知且易于获得的其他非蛋白质性部分。适于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，以及葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，以及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。附接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果附接了多于一种聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于考虑因素来确定，所述考虑因素包括但不限于待改进的抗体的特定性质或功能、抗体衍生物是否将用于确定条件下的治疗等。
在另一实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性加热的抗体与非蛋白质性部分的偶联物。在一个实施方案中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞但是将非蛋白质性部分加热到抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗GP73抗体的分离的核酸。此类核酸可编码构成抗体VL的氨基酸序列和/或构成抗体VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在又一实施方案中，提供了一个或多个包含这此类核酸的载体(例如，表达载体)。在又一实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含以下物质(例如，已被用以下物质转化)：(1)一个载体，其包含编码构成抗体VL的氨基酸序列和构成抗体VH的氨基酸序列的核酸，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码构成抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码构成抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞就是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者淋巴样细胞(例如，YO、NSO、Sp20)。在一个实施方案中，提供了一种制备抗GP73抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含编码上文所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为了重组产生抗GP73抗体，将编码例如如上所述的抗体的核酸分离，并插入到一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸可以使用常规方法容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)表达后，可以从细菌细胞糊状物的可溶性级分中分离抗体，并且可以将其进一步纯化。
除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括糖基化途径已经“被人源化”从而导致产生具有部分或部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，以及Li等人，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，所述杆状病毒株可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染Spodoptera frugiperda细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是由SV40转化的猕猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如例如在Graham等人，J.Gen Viral.36:59(1977)中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠足细胞(如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的TM4细胞)；猕猴肾细胞(CV l)；非洲绿猕猴肾细胞(VER0-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(Wl38)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather等人，Annals N.Y Aead.Sei.383:44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.cii.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NSO和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。
可通过本领域已知的各种测定法来鉴定、筛选或表征本文提供的抗GP73抗体的物理/化学性质和/或生物活性。
在一个方面，测试本发明的抗体的抗原结合活性，例如通过已知的方法，诸如ELISA、FACS，免疫荧光或免疫组织化学。
在另一方面，竞争测定法可用于鉴定与本文所述的任何抗体竞争结合GP73的抗体。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合与由本文所述抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。用于绘制抗体结合的表位的详细示例性方法提供在Morris(1996)"Epitope Mapping Protocols,"Methods in Molecular Biology，第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在示例性竞争测定中，将固定化的GP73在包含结合GP73的第一标记抗体(例如，本文所述的任何抗体)和正在测试与第一抗体竞争结合GP73的能力的第二未标记抗体的溶液中孵育。作为对照，将固定化的GP73在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与GP73结合的条件下孵育后，去除过量的未结合的抗体，并测量与固定的GP73缔合的标记物的量。如果相对于对照样品，测试样品中与固定化GP73缔合的标记物的量显著减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合GP73。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual，第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
本发明还提供这样的免疫偶联物，所述免疫偶联物包含与内体逃逸结构域(EED)肽或一种或多种细胞毒性剂偶联的抗GP73抗体，所述细胞毒性剂为诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或它们的片段)，或放射性同位素(即，放射性偶联物)。
免疫偶联物允许将药物部分靶向递送至肿瘤，并且在一些实施方案中，在肿瘤中细胞内积累，其中全身施用未偶联的药物可导致对正常细胞的不可接受的毒性水平(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
抗体-EED偶联化合物的示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)，EED肽，以及将Ab附接至EED肽的EED接头(EEDL)。可以使用如SEQ ID NO:43中所述的合适的接头肽将EED作为标签直接附接至抗体。示例性抗体-EED偶联化合物具有式Ab(-EEDL-EED肽)。EED肽包括但不限于登革热病毒和其他病毒来源的EED肽及其变体，细菌来源的EED，以及含有两个芳族吲哚环或一个吲哚环和两个芳族苯基的肽(WO 2016/015621；WO 2016/037985；Kiesgen等人，Protein Eng Des Sel.27(10):331-7(2014)和等人，Sci Rep.6:32301(2016)。
抗体-药物偶联物(ADC)是靶向的化学治疗分子，其通过将有效的细胞毒性药物靶向表达抗原的肿瘤细胞来将抗体与细胞毒性药物的特性进行组合(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9:982-1004)，从而增强通过最大化功效和最小化脱靶毒性实现的治疗指数(Carter和Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Ace.Chem.Res.41:98-107。
本发明的ADC化合物包括具有抗癌活性的那些ADC化合物。在一些实施方案中，ADC化合物包括与药物部分偶联(即共价附接)的抗体。在一些实施方案中，抗体通过接头共价附接至药物部分。本发明的抗体-药物偶联物(ADC)选择性地将有效剂量的药物递送至肿瘤组织，由此可以在增大治疗指数(“治疗窗”)的同时实现更高的选择性，即更低的有效剂量。
抗体-药物偶联物(ADC)的药物部分(D)可包括具有细胞毒性或细胞抑制效应的任何化合物、部分或基团。药物部分可通过包括但不限于微管蛋白结合、DNA结合或嵌入、以及对RNA聚合酶、蛋白质合成和/或拓扑异构酶进行抑制的机制来赋予其细胞毒性和细胞抑制效应。示例性的药物部分包括但不限于美登素、卡里奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽环霉素、倍癌霉素、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢霉烯、CC1065、喜树碱、依利奈法德(elinafide)，以及它们的具有细胞毒活性的立体异构体、电子等排体、类似物和衍生物。下文进一步详细讨论了此类免疫偶联物的非限制性示例。
抗体-药物偶联物(ADC)化合物的示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物部分(D)和将Ab附接至D的接头部分(L)。在一些实施方案中，抗体通过一个或多个氨基酸残基如赖氨酸和/或半胱氨酸而附接至接头部分(L)。
1.1 1.示例性抗体-药物偶联物
1.2
抗体-药物偶联物(ADC)化合物的示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞的抗体(Ab)、药物部分(D)和将Ab附接至D的接头部分(L)。所述抗体可通过一个或多个氨基酸残基如赖氨酸和/或半胱氨酸而附接至接头部分(L)。
示例性ADC具有式I：
Ab(-L-D)p I
其中p为1至约20。
可以与抗体偶联的药物部分的数量可以受游离半胱氨酸残基的数量的限制。可通过本文所述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。式I的示例性ADC包括但不限于具有1个、2个、3个或4个经工程化的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，一个或多个游离半胱氨酸残基已经存在于抗体中，而无需使用工程化，在这种情况下，现有的游离半胱氨酸残基可用于将抗体与药物偶联。在一些实施方案中，将抗体在抗体偶联之前暴露于还原条件，以产生一个或多个游离半胱氨酸残基。
a.示例性接头
“接头”(L)是双功能或多功能部分，其可用于将一个或多个药物部分(D)与抗体(Ab)连接以形成式1的抗体-药物偶联物(ADC)。在一些实施方案中，可以使用具有反应性官能团的接头来制备抗体-药物偶联物(ADC)，所述接头用于共价附接至药物和抗体。例如，在一些实施方案中，抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能团形成键以制备ADC。
在一个方面，接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应形成共价键的官能团。这种反应性官能团的非限制性示例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、活化酯，诸如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯、酸酐、氯化酰基、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。参见例如在Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773的第766页上公开的偶联方法，和本文公开的实施例。
接头可具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能团。示例性的亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基基团。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可以与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。此类反应性官能团的非限制性示例包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯，以及芳酰肼。
接头可包含一种或多种接头组分。示例性的接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(“SPP”)，以及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(“MCC”)。各种接头组分是本领域已知的，其中一些在下面描述。
接头可以是“可切割的接头”，从而促进药物的释放。非限制性示例性可切割接头包括酸不稳定接头(例如，包含腙)、蛋白酶敏感性(例如，肽酶敏感性)接头、光不稳定接头，或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；US 5,208,020)。
接头部件可包含“延伸物单元(stretcher unit)”，所述延伸物单元将抗体与另一接头组分或药物部分连接。非限制性示例性延伸物单元如下所示(其中波浪线表示共价附接至抗体、药物或其他接头组分的位点)：
接头组分可包含“间隔物”单元，所述“间隔物”单元直接或通过延伸物单元和/或氨基酸单元将抗体与药物部分连接。间隔物单元可以是“自我牺牲型”或“非自我牺牲型”的。“非自我牺牲型”的间隔物单元是这样的间隔物单元，其中部分或全部的间隔物单元在ADC切割时保持与药物部分结合。非自我牺牲型的间隔物单元的示例包括但不限于甘氨酸间隔物单元和甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。通过肿瘤细胞相关蛋白酶对含有甘氨酸-甘氨酸间隔物单元的ADC进行酶促切割可以导致甘氨酸-甘氨酸药物部分从ADC的其余部分释放。在这些情况中的一些情况中，甘氨酸-甘氨酸-药物部分在肿瘤细胞中经历水解步骤，从而从药物部分切割甘氨酸-甘氨酸间隔物单元。
“自我牺牲型”间隔物单元允许释放药物部分。接头的间隔物单元可包含对氨基苄基单元。此外，对氨基苯甲醇可以通过酰胺键而附接至氨基酸单元，并且在苯甲醇与药物之间制备氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)ExpertOpin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。间隔物单元可以是对-氨基苄氧羰基(PAB)。包含自我牺牲型接头的ADC可具有以下结构：
其中：Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基，或-氰基；
m是范围为0到4的整数；
p的范围为1至约20。优选地，p的范围为1至10、1至7、1至5，或1至4。
A是任选的酰基，a范围为从0到8，W是任选的第二自我牺牲型基团，其中w的范围为0-1。
自我牺牲型间隔物的其他示例包括但不限于与PAB基团在电化学上类似的芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利号7,375,078；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)，以及邻氨基苄基缩醛或对氨基苄基缩醛。可以使用在酰胺键水解时经历环化的间隔物，诸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2:223)、经适当取代的二环[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基的α-碳的连接是可用于ADC中的自我牺牲型间隔物的另一个示例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
接头L可以是树突型接头，用于通过支化多功能接头部分将多于一个药物部分共价附接到抗体(Sun等人(2002)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。树突型接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即负载，其与ADC的效力有关。因此，当抗体携带仅一个反应性半胱氨酸硫醇基团时，可以通过树突型接头附接多个药物部分。
在一些实施方案中，接头被调节溶解度和/或反应性的基团取代。作为非限制性示例，带电荷的取代基如磺酸根(-SO3 -)或铵可以增加接头试剂的水溶性并促进接头试剂与抗体和/或药物部分的偶联反应，或促进Ab-L(抗体-接头中间体)与D或DL(药物-接头中间体)与Ab的偶联反应，具体取决于用于制备ADC的合成路线。在一些实施方案中，接头的一部分与抗体偶联，并且接头的一部分与药物偶联，然后Ab-(接头部分)a与药物-(接头部分)b偶联以形成式1的ADC。在一些此类实施方案中，抗体包括多于一个(接头部分)a取代基，使得多于一个药物耦联到式1的ADC中的抗体。
本发明化合物明确地包括但不限于用以下接头试剂制备的ADC：双-马来酰亚胺基-三氧化乙二醇(BMPEO)、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)-N-羟基琥珀酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-马来酰亚胺基己酰氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS)，N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双乙烯基砜(HBVS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯)(LC-SMCC)、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)，琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、N琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)己酸酯](SMPH)、亚氨基噻吩(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基苯基))丁酸盐))，以及琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，并且包括双马来酰亚胺试剂：二硫代双马来酰亚胺基乙烷(DTME)、1,4-双马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4-双马来酰亚胺基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、双马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(如下所示)和BM(PEG)3(如下所示)；亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二酰亚胺酯盐酸酯)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(诸如戊二醛)，双叠氮基化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(诸如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯-2,6-二异氰酸酯)，以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
双马来酰亚胺试剂可以使抗体中半胱氨酸的巯基附接至含巯基的药物部分、接头或接头-药物中间体。与巯基反应的其他官能团包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、二硫化吡啶、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
某些有用的接头试剂可以从各种商业来源获得，诸如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder,CO)，或根据本领域中描述的方法合成；例如在Dubowchik等人(1997)Tetrahedron Letters,38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frisch等人(1996)Bioconjugate Chem.7:180-186；US6,2143,45；WO 02/088172；US 2003/130189；US 2003/096743；WO 03/026577；WO 03/043583；以及WO04/032828中。
碳14标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于使放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)示例性药物部分
(1)美登生碱(maytansine)和美登素(maytansinoids)
免疫偶联物可包含与一种或多种美登素分子偶联的抗体。美登素是美登生碱的衍生物，其中C1处的甲基优选被硫代乙酰基或CH2C(CH3)2SH取代。美登素是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美登生碱开始是从东非灌木齿叶美登木(Maytenusserrata)中分离出来的(美国专利号3,896,111)。随后，发现某些微生物也产生美登素，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成的美登素公开于例如美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；以及4,371,533中。
美登素药物部分在抗体-药物偶联物中是有吸引力的药物部分，因为它们是：(i)通过发酵或化学修饰或发酵产物的衍生化而相对容易地制备，(ii)适合用适合通过非二硫键接头与抗体偶联的官能团衍生化，(iii)在血浆中稳定，并且(iv)对多种肿瘤细胞系有效。
适合用作美登素药物部分的某些美登素是本领域已知的，并且可以根据已知方法从天然来源分离或使用基因工程技术产生(参见例如Yu等人(2002)PNAS 99:7968-7973)。美登素也可以根据已知方法合成制备(美国专利号2011/158991)。
示例性美登素药物部分包括但不限于具有经修饰的芳环的那些，诸如：C-19-脱氯(美国专利号4,256,746)(例如，通过氢化铝锂还原安丝菌素P2来制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(例如，通过使用Streptomyces或Actinomyces的去甲基化或使用LAH的去氯化制备(氢化铝锂，参见美国专利号4,294,757)；以及C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利号4,294,757)(例如，通过使用酰氯的酰化制备)，以及在芳环的其他位置具有修饰的那些。
示例性的美登素药物部分还包括具有诸如以下修饰的那些：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(例如，通过美登醇与H2S或P2S5的反应制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)(例如，从诺卡氏菌(Nocardia)制备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4,364,866)(例如，通过链霉菌(Streptomyces)转化美登醇而制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(例如，从滑桃树(Trewia nudiflora)分离)；C-18-N-去甲基(美国专利号4,362,663和4,322,348)(例如，通过链霉菌(Streptomyces)对美登醇去甲基化而制备)；以及4,5-去氧(US 4,371,533)(例如，通过三氯化钛/LAH还原美登醇而制备)。
美登素化合物上的许多位置可用作键合位置。例如，可以通过使用常规偶联技术与羟基反应而形成酯键。在一些实施方案中，反应可以在具有羟基的C-3位置，用羟甲基修饰的C-14位置，用羟基修饰的C-15位置、具有羟基的C-20位置处发生。在一些实施方案中，键在美登醇或美登醇类似物的C-3位置处形成。
美登素药物部分包括具有以下结构的那些：
其中波浪线表示美登素药物部分的硫原子与ADC的接头共价附接。每个R可以独立地为H或C1-C6烷基。将酰胺基团附接到硫原子的“亚烷基”链，即(CR2)m是如上所定义的，并且可以例如是亚甲基、亚乙基、亚丙基，即m是1、2或3(US 633410；US 5,208,020；Chari等人(1992)Cancer Res.52:127-131；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA93:8618-8623)，这些文献全文以引用方式并入。
美登素药物部分的所有立体异构体都被考虑用于本发明的ADC，即在手性碳上的R和S构型的任何组合(US 7,276,497；US 6,913,748；US 6,441,163；US RE 39,151；US 5,208,020；Widdison等人(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，这些文献全文以引用方式并入)。
在一些实施方案中，美登素药物部分具有以下立体化学：
美登素药物部分的示例性实施方案包括但不限于具有以下结构的DM1；DM3；和DM4：
其中波浪线表示药物的硫原子与抗体-药物偶联物的接头(L)共价附接。
其他示例性美登素抗体-药物偶联物具有以下结构和缩写：
其中Ab是抗体并且p是1至约20，优选p是1至10、p是1至7、p是1至5、p是1至4，或p是1至2。SMCC是琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯，并且DM1如上所定义。
其中Ab是抗体并且p是1至约20，优选p是1至10、p是1至7、p是1至5、p是1至4，或p是1至2。SPP是N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶硫基)戊酸酯，并且DM1如上所定义。
其中DM1通过BMPEO(双-马来酰亚胺基-三氧乙二醇)接头与抗体的硫醇基团连接的示例性抗体-药物偶联物具有以下结构：
其中Ab是抗体；n为0、1或2；p为1至约20，优选p为1至10、p为1至7、p为1至5，或p为1至4。
含有美登素的免疫偶联物、其制备方法及其治疗用途公开于例如美国专利号5,208,020、5,416,064；US 2005/0276812 A1和欧洲专利EP 0 425 235 B1中，这些文献的公开内容由此以引用方式明确并入。还参见Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)；和Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)。
抗体-美登素偶联物可以通过将抗体与美登素分子化学连接而不显著降低抗体或美登素分子的生物活性来制备。参见例如美国专利号5,208,020(该文献的公开内容由此以引用方式明确并入)。每个抗体分子偶联有平均3-4个美登素分子的ADC已显示为增强靶细胞的细胞毒性而不会不利地影响抗体的功能或溶解度的功效。在一些情况下，甚至一种毒素/抗体分子预计会相较于使用裸抗体增强细胞毒性。
用于制备抗体-美登素偶联物的示例性连接基团包括例如在本文中描述的那些和在美国专利号5,208,020；欧洲专利0 425 235 B1；Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；US 2005/0276812 A1；以及US 2005/016993 A1中描述的那些，这些文献的公开内容由此以引用方式并入。
1.1.1.1(2)卡里奇霉素
免疫偶联物可包含与一种或多种卡里奇霉素分子偶联的抗体。卡里奇霉素家族的抗生素及其类似物能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂(Hinman等人，(1993)CancerResearch 53:3336-3342；Lode等人，(1998)Cancer Research 58:2925-2928)。卡里奇霉素具有细胞内作用位点，但在某些情况下，不易跨过质膜。因此，在某些情况下，通过抗体介导的内化对这些药物的细胞摄取可以极大地增强它们的细胞毒性作用。制备具有卡里奇霉素药物部分的抗体-药物偶联物的非限制性示例性方法描述于例如US 5,712,374；US 5,714,586；US 5,739,116；以及US 5,767,285中。
(4)吡咯并苯并二氮杂卓
ADC可包含吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。PDB二聚体可识别并结合特定的DNA序列。一种PBD天然产物安曲霉素于1965年首次报道(Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795；Leimgruber,等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。从那以后，已经报道了许多天然存在的PBD和PBD类似物(Thurston,等人，(1994)Chem.Rev.1994,433-465，包括三环PBD支架的二聚体(US6,884,799；US7,049,311；US7,067,511；US7,265,105；US7,511,032；US7,528,126；US7,557,099)。不受任何特定理论的束缚，据信二聚体结构赋予与B型DNA的小沟的异螺旋性(isohelicity)的适当三维形状，导致在结合位点的滑动配合(Kohn，在Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11页(1975)中；Hurley和Needham VanDevanter,(1986)Ace.Chem.Res.,19:230-237)。具有C2芳基取代基的二聚PBD化合物已显示可用作细胞毒性剂(Hartley等人(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganic andMed.Chem.Letters 19(22):6463-6466)。
PBD化合物可以通过用在体内可去除的氮保护基团在N10位置保护它们而用作前药(WO 00/12507；WO 2005/023814)。
PBD二聚体已与抗体偶联，并且所得ADC显示具有抗癌特性(US 2010/0203007)。PBD二聚体上的非限制性示例性连接位点包括五元吡咯环、PBD单元之间的系链，以及N10-C11亚胺基团(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC的非限制性示例性PBD二聚体组分具有式A：
及其盐(例如，药学上可接受的盐)和溶剂化物(例如，药学上可接受的溶剂化物)，其中：
波浪线表示与所述接头共价附接的位点；
虚线表示任选存在双键(所述双键可以例如在C1与C2之间或在C2与C3之间)；；
R2和R12各自独立地选自–H、–OH、＝O、＝CH2、–CN、–R、–OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、–O-SO2-R、–CO2R、–COR、以及–卤素，
其中RD独立地选自–H、–CO2R、–C(O)R、CHO、CO2H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–和–卤素；
R6、R9、R16和R19独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
R7和R17独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR′、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
Q独立地选自–O–、–S–和–N(H)–；
R11是–H或–R，或者在Q是–O–的情况下，R11可以是–SO3M，其中M是碱金属或碱土金属阳离子；
R和R′各自独立地选自任选经取代的C1-12烷基、C3-8杂环基、C3-20杂环和C5-20芳基基团，并且如果R和R'与相同的氮原子结合，则R和R′可以与它们所附接的氮原子一起形成任选经取代的4元、5元、6元或7元杂环；
R"是C3-12烯基基团，其中一个或多个碳原子可以被选自O、NH和S的杂原子和/或任选经取代的芳环取代；
其中所述芳环包含5或6个碳原子以及一个或两个选自N或NH的杂原子，并且
X和X′独立地选自O、S，以及N(H)。
优选地，R和R'各自独立地选自任选经取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基基团，并且如果R和R'与相同的氮原子结合，则R和R′可以与它们所附接的氮原子一起形成任选经取代的4元、5元、6元或7元杂环。
优选地，R9和R19是–H。
优选地，R6和R16是–H。
优选地，R7和R17都是–OR7A，其中R7A是任选经取代的C1-4烷基。更优选地，R7A是Me。或者，R7A是CH2Ph，其中Ph是苯基。
优选地，X是O。
优选地，R11是H。
优选地，在每个单体单元中的C2与C3之间存在双键。
优选地，R2和R12独立地选自H和R。更优选地，R2和R12独立地为R。甚至优选地，R2和R12独立地为任选经取代的C5-20芳基或C5-10芳基或C5-7芳基。还更优选地，R2和R12独立地是任选取代的苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。或者，R2和R12独立地选自＝O、＝CH2、＝CH-RD，以及＝C(RD)2。优选地，R2和R12各自为＝CH2或R2和R12各自为H。或者，R2和R12各自为＝O，或者R2和R12各自为＝CF2。R2和/或R12还可独立地为＝C(RD)2。优选地，R2和/或R12独立地为＝CH-RD。
当R2和/或R12为＝CH-RD时，每个基团可以独立地具有如下所示的任一配置：
优选地，＝CH-RD处于构象(I)。
R"优选地为C3亚烷基基团或C5亚烷基基团。
ADC的示例性PBD二聚体组分具有式A(I)的结构：
其中n是0或1；
ADC的另一示例性PBD二聚体组分具有式A(II)的结构：
其中n是0或1；
ADC的另一示例性PBD二聚体组分具有式A(III)的结构：
其中RE和RE"各自独立地选自H或RD，
其中RD如上所定义；并且
其中n是0或1；
优选地，n为0或1。RE和/或RE"优选地为H。更优选地，RE和RE"为H。或者，RE和/或RE"可为RD，其中RD未任选经取代的C1-12烷基。优选地，RE和/或RE"为RD,其中RD为甲基。
ADC的另一示例性PBD二聚体组分具有式A(IV)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选经取代的C5-20芳基；
其中Ar1和Ar2可以相同或不同；并且
其中n是0或1；
ADC的另一示例性PBD二聚体组分具有式A(V)的结构：
其中Ar1和Ar2各自独立地为任选经取代的C5-20芳基；
其中Ar1和Ar2可以相同或不同；并且
其中n是0或1。
优选地，Ar1和Ar2各自独立地选自任选经取代的苯基、呋喃基、噻吩基和吡啶基。更优选地，Ar1和Ar2各自独立地为任选经取代的苯基。或者，Ar1和Ar2各自独立地为任选经取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。或者，Ar1和Ar2各自独立地为任选经取代的喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可通过任何可用的环位置与PBD核结合。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉基-6-基、喹啉基-7-基和喹啉基啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以是异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。优选地，异喹啉基选自异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。
ADC的其他非限制性示例性PBD二聚体组分具有式B：
及其盐和溶剂化物，其中：
波浪线表示与所述接头共价附接的位点；
连接到OH的波浪线表示S或R构型；
Rv1和Rv2独立地选自H、甲基、乙基和苯基(该苯基可任选被氟取代，特别是在4位)和C5-6杂环基；其中Rv1和Rv2可以相同或不同；并且n为0或1。
优选地，Rv1和Rv2独立地选自H、苯基和4-氟苯基。
接头可以附接在PBD二聚体药物部分的各个位点中的一个位点处，包括B环的N10亚胺、C环的C-2内/外位置，或连接A环的系链单元(参见以下结构C(I)和C(II))。
ADC的非限制性示例PBD二聚体组分包括式C(I)和C(II)：
其中式C(I)和C(II)以其N10-C11亚胺形式显示。示例性PBD药物部分还包括碳酰胺以及受保护的甲醇胺形式，如下表所示：
并且其中：
如果X是CH2，则n为1至5；
如果X是N或O，则n为1；
Z和Z'独立地选自OR和NR2，其中R是含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烷基链；
R1、R'1、R2和R'2各自独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括取代的芳基)、C5-20杂芳基、-NH2、-NHMe、-OH，以及-SH，其中烷基、烯基和炔基链优选包含至多5个碳原子；
R3和R'3独立地选自H、OR、NHR和NR2，其中R是含有1至5个碳原子的伯、仲或叔烷基链；
R4和R'4独立地选自H、Me和OMe；
R5选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括被卤素、硝基、氰基、烷氧基、烷基和杂环基取代的芳基)和C5-20杂芳基，其中在一些实施方案中，烷基、烯基和炔基链包含至多5个碳原子；
R11为H、C1-C8烷基、或保护基(诸如乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBZ)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，或包含自我牺牲型单元的部分，诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；
R12为H、C1-C8烷基、或保护基；
其中R1、R'1、R2,、R'2、R5或R12中的一者中的氢或A环之间的-OCH2CH2(X)nCH2CH3O-间隔物中的氢被连接到ADC的接头的键替换。
ADC的示例性PDB二聚体部分包括但不限于(波浪线表示与接头共价附接的位点)：
包含PBD二聚体的另一个非限制性示例性ADC可以通过将在N10处连接有单甲基二硫化物的PBD(如下所示)与抗体偶联来制备：
以产生在N10处连接有单甲基二硫化物的PBD抗体-药物偶联物：
PBD二聚体-马来酰亚胺-缩醛的接头是酸不稳定的。
可以根据本领域已知的方法来制备PBD二聚体和包含PBD二聚体的ADC。参见例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157和WO 2011/130598。
c.蒽环霉素
在一些实施方案中，ADC包含蒽环霉素。蒽环霉素是表现出细胞毒活性的抗生素化合物。虽然不打算受任何特定理论的束缚，但研究表明蒽环霉素可通过多种不同机制杀死细胞，所述机制包括：
1)将药物分子嵌入细胞DNA中，从而抑制DNA依赖性核酸合成；
2)通过药物产生自由基，然后将自由基与细胞大分子反应以对细胞造成损伤，和/或
3)药物分子与细胞膜的相互作用(参见例如C.Peterson等人，"Transport AndStorage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia"，在Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy中；N.R.Bachur,"Free RadicalDamage"，相同文献，在第97-102页处)。
蒽环霉素由于其细胞毒性而已用于治疗多种癌症，诸如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤(参见例如P.H-Wiernik，在Anthracycline:Current Status And NewDevelopments中，第11页)。
非限制性示例蒽环霉素包括多柔比星、表柔比星、伊达比星、道诺霉素、奈莫柔比星，以及它们的衍生物。已经制备并研究了柔红霉素和多柔比星的免疫偶联物和前药(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362；Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sei.USA 97:829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532；King等人(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP0 328147；US6,630,579)。抗体-药物偶联物BR96-多柔比星与肿瘤相关抗原Lewis-Y特异性地反应，并且已在I期和II期研究中进行了评估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour.6:78-81；Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology 17:478-484)。
PNU-159682是一种奈莫柔比星的有效代谢产物(或衍生物)(Quintieri等人(2005)Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基的半合成的多柔比星类似物，并且已经进行了临床评估(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rev.17:133；Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65:703)，所述临床评估包括用于肝细胞癌的II/III期试验(Sun等人(2003)Proceedings ofthe American Society for Clinical Oncology 22,Abs 1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research,44:第1版，Abs 4649；Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology 24:14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的非限制性示例性ADC显示在式Ia中
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基，并且
R2为C1-C5烷氧基，
或其药学上可接受的盐；
R1和R2可以都是甲氧基(-OMe)。
L1和Z一起是如本文所述的接头(L)。
T是如本文所述的抗体(Ab)；并且
m为1至约20，优选m为1至10、1至7、1至5或1至4。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的另一非限制性示例性ADC显示在式lb中：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基，并且
R2为C1-C5烷氧基，或者
其药学上可接受的盐；
L2和Z一起是如本文所述的接头(L)。
T是如本文所述的抗体(Ab)；并且
m为1至约20，优选m为1至10、1至7、1至5或1至4。
R1和R2可以都是甲氧基(-OMe)。
含有奈莫柔比星的ADC的奈莫柔比星组分可以是PNU-159682。在这种情况下，ADC的药物部分可具有以下结构中的一种结构：
其中波浪线表示附接至接头(L)。
蒽环霉素，包括PNU-159682在内，可通过几个键合位点和多种接头与抗体偶联(US2011/0076287；W02009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)，所述多种接头包括本文所述的接头。
包含奈莫柔比星和接头的示例性ADC包括但不限于：
PNU-159682-马来酰亚胺缩醛Ab
以及
PNU-159682-马来酰亚胺-Ab。
PNU-159682马来酰亚胺缩醛-Ab的接头是酸不稳定的。
(6)其他药物部分
药物部分还包括格尔德霉素(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)；以及酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII，以及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酸霉素(phenomycin)、伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如WO93/21232。
药物部分也包括具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA内切核酸酶)。
免疫偶联物可包含放射性原子。多种放射性同位素可用于生产放射性偶联抗体。
示例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212，以及Lu的放射性同位素。在一些实施方案中，当免疫偶联物用于检测时，其可包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如Tc99或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可以与各种金属螯合剂络合并与抗体偶联，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
放射性标记或其他标记可以以已知方式掺入免疫偶联物中。例如，肽可以使用合适的氨基酸前体进行生物合成或化学合成，包括例如一个或多个荧光染料-19原子替代一个或多个氢。例如，可以通过抗体中的半胱氨酸残基附接标记，诸如Tc99、I123、Re 186、Re188和In111。钇-90可以通过抗体的赖氨酸残基附接。IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57可用于掺入碘-123。"Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy"(Chatal,CRC Press 1989)描述了某些其他方法。
免疫偶联物可包含与前药活化酶偶联的抗体。例如，前药活化酶可以将前药(例如，肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性药物，例如抗癌药物。在一些实施方案中，此类免疫偶联物可用于抗体依赖性酶介导的前药治疗(“ADEPT”)。可以与抗体偶联的酶包括但不限于碱性磷酸酶，其可用于将含磷酸酯的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，可用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其可用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含有肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，其可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其可用于将分别用苯氧基乙酰基或苯乙酰基在胺氮处衍生的药物转化成游离药物。在一些实施方案中，酶可以通过本领域熟知的重组DNA技术与抗体共价结合。参见例如Neuberger等人，Nature 312:604-608(1984)。
在某些实施方案中，免疫偶联物可包含与前药活化酶偶联的抗体。在一些此类实施方案中，前药活化酶将前药(例如，肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为活性药物，例如抗癌药物。在一些实施方案中，此类免疫偶联物可用于抗体依赖性酶介导的前药治疗(“ADEPT”)。可以与抗体偶联的酶包括但不限于碱性磷酸酶，其可用于将含磷酸酯的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，可用于将含硫酸酯的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其可用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶(serratia protease)、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含有肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，诸如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，其可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其可用于将分别用苯氧基乙酰基或苯乙酰基在胺氮处衍生的药物转化成游离药物。在一些实施方案中，酶可以通过本领域熟知的重组DNA技术与抗体共价结合。参见例如Neuberger等人，Nature 312:604-608(1984)。
药物负载由p表示，即式1分子中每个抗体的药物部分的平均数。药物负载可以是每抗体1至20个药物部分(D)。式I的ADC包括与一系列从1至20个药物部分偶联的抗体的集合。在从偶联反应制备ADC的过程中每种抗体的药物部分的平均数可以通过常规手段表征，诸如质谱、ELISA测定和HPLC。还可以确定以p表示的ADC的定量分布。在一些情况下，均质ADC的分离、纯化和表征可以通过诸如反相HPLC或电泳的手段来实现，其中p是来自具有其他药物负载的ADC的特定值。
对于一些抗体-药物偶联物，p可能受抗体上附接位点数量的限制。例如，在附接是半胱氨酸硫醇的情况下，如在以上某些示例性实施方案中，抗体可以仅具有一个或几个半胱氨酸硫醇基团，或者可以仅具有一个或几个足够反应性的硫醇基团，接头可以通过所述基团附接。在某些实施方案中，较高的药物负载，例如p>5，可引起某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施方案中，ADC的平均药物负载范围为1至约8；从约2至约6；或者从约3至约5。实际上，已经表明，对于某些ADC，每个抗体的药物部分的最佳比率可以小于8，并且可以是约2至约5(US 7498298)。
在某些实施方案中，在偶联反应期间，少于理论最大值的药物部分与抗体偶联。抗体可以含有例如不与药物-接头中间体或接头试剂反应的赖氨酸残基，如下所述。通常，抗体不含有许多可以与药物部分连接的游离和反应性的半胱氨酸硫醇基团；实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在。在某些实施方案中，可以在部分或总还原条件下用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体，以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中，使抗体经历变性条件以显示反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC的负载(药物/抗体比)可以以不同方式控制，例如通过：(i)限制药物-接头中间体或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制偶联反应时间或温度，以及(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
应当理解，当多于一个亲核基团与药物-接头中间体或接头试剂反应时，则所得产物是这样的ADC化合物的混合物，所述ADC化合物具有附接至抗体的一个或多个药物部分的分布。每个抗体的平均药物数可以通过双重ELISA抗体测定来根据混合物计算，所述双重ELISA抗体测定对抗体具有特异性并且对药物具有特异性。可以通过质谱法在混合物中鉴定单个ADC分子，并将其通过HPLC分离，例如疏水相互作用色谱(参见例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett等人(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等人"Effect of drug loading on thepharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drugconjugate,"摘要号624，美国癌症研究协会，2004年年会，2004年3月27-31日，AACR论文集，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人"Controlling the location of drug attachmentin antibody-drug conjugates,"摘要号627，美国癌症研究协会，2004年年会，2004年3月27-31日，AACR论文集，第45卷，2004年3月)。在某些实施方案中，可以通过电泳或色谱法从偶联混合物中分离具有单一负载值的均质ADC。
式I的ADC可以通过采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂的几种途径制备，包括：(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成Ab-L，然后与药物部分D反应；以及(2)药物部分的亲核基团与二价接头试剂反应以通过共价键形成D-L，然后与抗体的亲核基团反应。
抗体上的亲核基团包括但不限于：(i)N末端胺基团，(ii)侧链胺基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羟基或氨基，其中抗体是糖基化的。胺、硫醇和羟基是亲核的并且能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应形成共价键，接头试剂包括：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；以及(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)处理以使抗体被完全或部分还原，可以使抗体反应以与接头试剂偶联。因此，每个半胱氨酸桥在理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可通过修饰赖氨酸残基将额外的亲核基团引入抗体中，例如通过使赖氨酸残基与2-亚氨基噻吩(Traut试剂)反应以使胺转化为硫醇。还可以通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，通过制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的变异抗体)来将反应性硫醇基团引入抗体中。
本发明的抗体-药物偶联物还可以通过抗体上的亲电子基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上的亲核基团之间的反应来产生。接头试剂上有用的亲核基团包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯，以及芳酰肼。在一个实施方案中，修饰抗体以引入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。在另一实施方案中，糖基化抗体的糖可以被氧化，例如用高碘酸盐氧化剂氧化，以形成醛或酮基团，所述醛或酮基团可以与接头试剂或药物部分的胺基团反应。所得的亚胺席夫碱基团可以形成稳定的键，或者可以例如用硼氢化物试剂还原以形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化的抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在抗体中产生羰基(醛和酮)基团，所述羰基基团可以与药物上的适当基团反应(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一个实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的抗体可以与偏高碘酸钠反应，导致产生醛替代第一个氨基酸(Geoghegan和Stroh，(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US5362852)。这种醛可以与药物部分或接头亲核体反应。
药物部分上的示例性亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸盐和芳基酰肼基团，所述亲核基团能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应以形成共价键，所述接头试剂包括：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酰卤；(ii)烷基和苄基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和马来酰亚胺基团。
可用于制备ADC的非限制性示例性交联剂试剂在本文的标题为“示例性接头”的小节中描述。使用此类交联剂试剂连接两个部分(包括蛋白质性部分和化学部分)的方法是本领域中已知的。在一些实施方案中，可以例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。重组DNA分子可包含编码偶联物的抗体和细胞毒性部分的区域，所述区域彼此相邻或由编码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏偶联物的所需特性。
在另一实施方案中，抗体可以与“受体”(诸如链霉亲和素)偶联，以用于肿瘤预靶向，其中抗体-受体偶联物被施用于患者，然后使用清除剂从循环中去除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒性剂(例如，药物或放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如，亲和素)。
在某些实施方案中，本文提供的任何抗GP73抗体可用于检测生物样品中GP73的存在。如本文所用的术语“检测”包括定量或定性检测。
“生物样品”包括例如细胞或组织(例如，活组织检查材料，包括癌性或潜在癌性淋巴组织，诸如淋巴细胞、淋巴母细胞、单核细胞、骨髓单核细胞，以及它们的混合物)。
在一个实施方案中，提供了用于诊断或检测方法的抗GP73抗体。在另一方面，提供了一种检测生物样品中GP73的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括在允许抗GP73抗体与GP73结合的条件下使生物样品与如本文所述的抗GP73抗体接触，以及检测在抗GP73抗体与生物样品中的GP73之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗GP73抗体被用于选择适合用抗GP73抗体治疗的对象，例如其中GP73是用于选择患者的生物标志物。在又一实施方案中，生物样品是细胞或组织。
在另一实施方案中，抗GP73抗体在体内用于检测(例如，通过体内成像)对象中的GP73阳性癌症，例如用于对癌症进行诊断、预后或分期的目的，确定适当的治疗过程，或监测癌症对治疗的响应。本领域中已知的用于体内检测的一种方法是免疫-正电子放射断层造影术(免疫-PET)，如例如在vanDongen等人，The Oncologist 12:1379-1389(2007)和Verel等人，J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所述。在此类实施方案中，提供了用于检测对象中GP73阳性癌症的方法，该方法包括向患有或怀疑患有GP73阳性癌症的对象施用标记的抗GP73抗体，以及检测所述对象中标记的抗GP73抗体，其中检测到所述标记的抗GP73抗体表明对象患有GP73阳性癌症。在某些此类实施方案中，经标记的抗GP73抗体包含与正电子发射体偶联的抗GP73抗体，所述正电子发射体为诸如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr，以及124I。
在另一些实施方案中，一种诊断或检测的方法包括使固定至衬底的第一抗GP73抗体与待测试GP73存在的生物样品接触，将该衬底暴露于第二抗GP73抗体，以及检测该第二抗GP73抗体是否与第一抗GP73抗体与生物样品中的GP73之间的复合物结合。衬底可以是任何支撑介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合物珠粒、载玻片、晶片，以及其他衬底。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在某些实施方案中，第一种或第二种抗GP73抗体是本文所述的任何抗体。
可根据任何上述实施方案诊断或检测的示例性病症包括但不限于GP73阳性癌症，诸如GP73阳性肝癌、GP73阳性肝细胞癌、GP73阳性胃癌、GP73-阳性食管癌、GP73阳性胰腺癌、GP73阳性肺癌、GP73阳性结肠癌、GP73阳性乳腺癌、GP73阳性前列腺癌、GP73阳性白血病，以及GP73阳性淋巴瘤。在一些实施方案中，GPC阳性癌症是肝癌。在一些实施方案中，GPC阳性癌症是肝细胞癌。在一些实施方案中，GP73阳性癌症是接受抗GP73免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)评分大于“0”的癌症，其对应于>90％肿瘤细胞的染色非常弱或无染色。在另一实施方案中，GP73阳性癌症以1+、2+或3+水平表达GP73。在一些实施方案中，GP73阳性癌症是根据检测GP73mRNA的逆转录酶PCR(RT-PCR)测定表达GP73的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR是定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供了标记的抗GP73抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及间接检测(例如，通过酶促反应或分子相互作用检测)的部分，诸如酶或配体。示例性标记包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、荧光团(诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物)、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮、荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456))、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、与采用过氧化氢来氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)偶联的杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、生物素/亲和素、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等。在另一个实施方案中，标记是正电子发射体。正电子发射体包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr，以及1241。在一个特定实施方案中，正电子发射体是89Zr。
通过将具有所需纯度的这种抗体或免疫偶联物与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合来制备如本文所述的抗GP73抗体或免疫偶联物的药物制剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑(1980))，所述药物制剂为冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体通常是在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖，以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，诸如可溶的中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20在内，描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体或免疫偶联物制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体或免疫偶联物制剂包括在美国专利号6,171,586和W02006/044908中描述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文的制剂还可含有多于一种的对于所治疗的具体适应症是必需的活性成分，优选是那些具有不会不利地影响彼此的互补活性的活性成分。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基-甲基丙烯酸酯)微胶囊，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子和纳米胶囊)中，或在粗乳液中。此类技术描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑(1980)中。
可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有抗体或免疫偶联物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。[0329]用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌。
本文提供的抗原结合分子、抗GP73抗体或免疫偶联物中的任一者可用于方法，例如治疗方法中。
在一个方面，本文提供的抗GP73抗体或免疫偶联物用于抑制GP73阳性细胞增殖的方法中，该方法包括在允许抗GP73抗体或或免疫偶联物与细胞表面上的GP73结合的条件下将细胞暴露于抗GP73抗体或免疫偶联物，从而抑制所述细胞的增殖。在某些实施方案中，该方法是体外或体内方法。在其他实施方案中，细胞是粒细胞或成髓细胞。
可以使用CellTiter-GloTM发光细胞活力测定来评定对体外细胞增殖的抑制，该CellTiter-GloTM发光细胞活力测定可从Promega(Madison,WI)商购获得。该测定基于存在的ATP的定量来确定培养物中存活细胞的数量，ATP是代谢活性细胞的指示。参见Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88，美国专利号6602677。该测定可以96孔或384孔格式进行，以使其适合于自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。
测定过程包括将单一试剂(CellTiter-试剂)直接加入培养的细胞中。这导致细胞裂解并产生由荧光素酶反应产生的发光信号。该发光信号与存在的ATP量成比例，存在的ATP量与培养物中存在的活细胞数成正比。可以通过发光计或CCD相机成像装置记录数据。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
在另一方面，提供了用作药物的抗GP73抗体或免疫偶联物。在其他方面，提供了用于治疗方法的抗GP73抗体或免疫偶联物。在某些实施方案中，提供了用于治疗GP73阳性癌症的抗GP73抗体或免疫偶联物。在某些实施方案中，本发明提供用于治疗患有GP73阳性癌症的个体的方法中的抗GP73抗体或免疫偶联物，该方法包括向个体施用有效量的抗GP73抗体或免疫偶联物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种附加治疗剂，例如如下所述。
在另一方面，本发明提供抗GP73抗体或免疫偶联物在制备或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗GP73阳性癌症。在另一实施方案中，所述药物用于治疗GP73阳性癌症的方法中，所述方法包括向患有GP73阳性癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种附加治疗剂，例如如下所述。
另一方面，本发明提供了治疗GP73阳性癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括向患有这种GP73阳性癌症的个体施用有效量的抗GP73抗体或免疫偶联物。在一个此类实施方案中，所述方法还包括向个体施用有效量的至少一种附加治疗剂，如下所述。
根据上述实施方案中的任一实施方案的GP73阳性癌可以是例如GP73阳性肝癌、GP73阳性肝细胞癌、GP73阳性胰腺癌、GP73阳性肺癌、GP73阳性结肠癌、GP73阳性乳腺癌、GP73阳性前列腺癌、GP73阳性白血病或GP73阳性淋巴瘤。在一些实施方案中，GP73阳性癌症是接受抗GP73免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)评分大于“0”的癌症，其对应于>90％肿瘤细胞的染色非常弱或无染色。在另一实施方案中，GP73阳性癌症以1+、2+或3+水平表达GP73。
根据上述实施方案中的任一实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含本文提供的抗GP73抗体或免疫偶联物中的任一者，例如以用于上述治疗方法中的任一者。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的抗GP73抗体或免疫偶联物中的任一者，以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，药物制剂包含本文提供的抗GP73抗体或免疫偶联物中的任一者，以及至少一种附加治疗剂，例如如下所述。
本发明的抗体或免疫偶联物可以单独使用或与治疗中的其他药剂组合使用。例如，本发明的抗体或免疫偶联物可以与至少一种附加的治疗剂共同施用。
上述此类组合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一或单独的制剂中)，以及单独施用，在这种情况下，本发明的抗体或免疫偶联物的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和和/或之后进行。本发明的抗体或免疫偶联物也可以与放射疗法组合使用。
本发明的抗体或免疫偶联物(和任何附加治疗剂)可以通过任何合适的手段施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及如果需要进行局部治疗的话则病灶内，子宫内或膀胱内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内，或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，具体部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配方案，包括但不限于在各个时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。
本发明的抗体或免疫偶联物将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定疾病、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、疾病的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用方案，以及医生已知的其他因素。抗体或免疫偶联物不必是，但任选地用一种或多种目前用于预防或治疗所论述的病症的药剂配制。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体或免疫偶联物的量、病症或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或者以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以经验地/临床地确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体或免疫偶联物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体或免疫偶联物的类型、疾病的严重程度和病程、抗体或免疫偶联物是被施用用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史，以及对抗体或免疫偶联物的响应，以及主治医师的自由裁量权。将抗体或免疫偶联物适当地一次性或以一系列治疗施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体或免疫偶联物可以是用于施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用还是通过连续输注。取决于上述因素，一种典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，通常持续治疗直至发生所需的对疾病症状抑制。抗体或免疫偶联物的一个示例性剂量范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)中的一种或多种剂量可以施用于患者。此类剂量可以间歇施用，例如每周一次或每三周一次(例如使得患者接受约二次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。施用初始较高的负载量，然后一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可以是可用的。通过常规技术和测定容易地监测该治疗的进展。
应当理解，上述制剂或治疗方法中的任一者可以使用本发明的免疫偶联物和抗GP73抗体进行。
在本发明的另一个方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。制品包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉输注(IV)溶液袋等。容器可以由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。所述容器容纳组合物，所述组合物本身或与另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合并且可具有无菌进入口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可用皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或免疫偶联物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体或免疫偶联物；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施方案中的制品还可包含包装插页，所述包装插页指示该组合物可用于治疗特定病症。另外或替代地，制品还可包括第二(或第三)容器，所述二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。其还可包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
实施例1：单克隆抗体生成
A.GP73细胞外残留结构域的抗体检测和表征
通过用包含人GP73细胞外结构域的短残余物的肽(rGP73，Seq NO:1AA 36至55)筛选两个人scFV文库(Creative Biolabs)，使用以下程序产生针对人GP73的单克隆抗体。进行四轮淘选，通过ELISA测试41种结合剂，并对六种进行验证和测序。鉴定出并克隆了两种完整的scFv克隆：(i)具有人IgG1重链和人Igk轻链恒定区，G2-2和G2-1，以及(ii)具有鼠IgG2a重链和人Igk轻链恒定区，表示为mG2-2。抗体G2-2的重链和轻链可变区序列分别显示在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中。抗体G2-1的重链和轻链可变区序列分别显示在SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11中。人重链恒定区(IgG1)显示在SEQ ID NO:26中，人κ轻链序列显示在SEQ ID NO:27中。鼠重链恒定区(IgG2a)显示在SEQ ID NO:28中。
B.GP73可溶性片段抗体的检测和表征
通过用包含人GP73(SEQ ID NO 1)的AA 347-366的肽免疫2只Balb/c小鼠，使用以下程序产生针对人GP73的单克隆抗体。融合后6个杂交瘤表达结合肽347-366的抗体。将三种抗体进行测序并保持在培养物中以用于产生抗体。
扩增阳性克隆并通过ELISA和FACS重新筛选与人GP73、Hep3B细胞、HepG2细胞和HuH 7细胞的结合。选择并纯化出一种抗体G2-4。抗体G2-4的重链和轻链可变区序列分别显示在SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19中。
对于更大规模的抗体产生，在CHO细胞和293HEK细胞中产生抗体。将编码VL和VH的载体转染到CHO细胞中并转染到293HEK细胞中，并通过蛋白A亲和层析从细胞培养基中纯化IgG。
实施例2：免疫荧光分析
使Alexander细胞在4室载玻片上生长，用4％多聚甲醛固定，用0.2％皂苷处理并用10％牛血清白蛋白封闭。将细胞与山羊抗GP73(santa cruz sc-48010)和mG2-2一起孵育一个小时，并进行洗涤。用抗山羊Alexa Fluor 488(abcam ab150129)和抗小鼠AlexaFluor 647(abcam ab150115)对结合的抗体进行染色。将细胞核用DAPI处理。
实施例3：对多种肿瘤的免疫组织化学分析
将正常肝脏、肝炎肝、肝细胞癌(HCC)、子宫内膜癌、卵巢癌、黑色素瘤、小细胞肺癌和胃癌的石蜡包埋组织用鼠G2-2(mG2-2)或小鼠抗GOLPH(MO6A Sigma)染色，然后用抗小鼠IgG进行二次染色。将细胞核用苏木精(蓝色)染色，将细胞质用苏木精明矾-伊红染色。
实施例4：用抗GOLPH抗体G2-2、G2-1和对照对多种细胞系进行流式细胞术
通过以下方式来测试不同的人和鼠细胞系(例如HuH7、JHH4、HEK293、HEK293-GP73-myc和Ramos)：对所述细胞的细胞表面上的GP73表达和G2-2、G2-1和G2-4的结合进行流式细胞术分析。将细胞培养、沉淀、用4％PFA固定，并与mG2-2、mG2-1、G2-4、抗myc或抗CD19IgG(BD HIB19)一起孵育，洗涤，并用二级荧光抗小鼠抗体(Alexa Fluor 488)染色。
实施例5：竞争和pH依赖性肽ELISA
在用生物素化肽包被过夜并用2％明胶封闭的96孔板中进行ELISA。施用辣根过氧化物酶标记的抗体G2-1(G2-1-HRP)或G2-2(G2-2-HRP)，并孵育1.5小时。对于竞争测试，加入高浓度的未标记G2-1或G2-2。对于pH依赖性结合，将抗体施加于pH 4.4、5.4、6.4或7.4的磷酸盐缓冲液中。在充分洗涤后，加入生色底物(TMB Amersham)以检测过氧化物酶。停止反应，并读取450nm处的吸光度。
实施例6：内化G2-2
测试细胞系DU145(前列腺癌)和Hep55.1C(肝细胞癌)内化抗体G2-2和G2-1的能力。将细胞与10μg/ml的G2-2或G2-1在PBS中于4℃下孵育一个小时。洗去未结合的G2-2，并将细胞转移到含有10％FCS的组织培养基中，然后加热至37℃以允许内化或保持在4℃。通过将细胞转移到含有0.1％叠氮化钠的冰冷缓冲液中，在15、30、60或120分钟后停止内化过程。用APC偶联的山羊抗人Fab(Jackson Immuno)对细胞进行染色，并通过FACS进行分析。基于平均荧光强度(MFI)计算细胞表面G2-2的残留水平。15分钟后，细胞表面检测到在HuH7中G2-2和G2-1降低至30％，并且在DU145中降低至小于10％。
为了证明G2-2和G2-1与GP73结合并在条件下内化，其中在结合中抑制C末端GP73结合抗体(例如G2-4)，用pHrodo Green STP Ester(Thermofisher)标记抗体。该染料在中性pH下是非荧光的，但随着例如在内体中pH变得更加酸性，而表现出增加的荧光。通过尺寸排阻(40KMWCO)纯化标记的抗体。将未用Green STP Ester标记的非结合同种型抗体(Iso.)用作背景荧光的对照。将10μg/ml的每种抗体在4℃下用新鲜培养基或条件培养基预孵育过夜。作为条件培养基，将来自培养72小时的HEK 293或HEK 293GP73-myc细胞的上清液各自用1L新鲜培养基透析(10k MWCO)。为了确认透析后分泌的可溶性GP73的存在，使用抗myc抗体通过蛋白质印迹法分析上清液。将300μl/孔的每种预孵育的抗体给予到在24孔板中在37℃和5％CO2下生长的0.6x106个HuH7细胞。洗涤细胞并通过FACS进行分析。
实施例7：GP73的弗林蛋白酶切割分析取决于G2-2或G2-1结合
弗林蛋白酶切割的测试利用了以下事实：抗体G2-1和G2-2结合GP73的N末端或弗林蛋白酶切割位点56R处，而具有C末端HIS标签的重组GP73(GP73-HIS)通过抗HIS抗体在GP73的C末端处检测。板结合的抗人IgG可以捕获G2-1或G2-2，所述G2-1或G2-2结合GP73-HIS。如果在G2-1或G2-2已经与GP73-HIS结合的环境中发生弗林蛋白酶切割，则仅GP73的N末端部分将驻留在G2抗体处。相比之下，如果弗林蛋白酶切割受到G2抗体的阻碍，则可以通过抗HIS抗体来检测GP73-HIS。
在1.5ml试管中进行弗林蛋白酶切割。为了测试G2抗体是否能够阻碍弗林蛋白酶切割，将重组GOLPH-HIS蛋白(Biolegend)和G2-2或G2-1在pH 7.5的100mM HEPES和1mMCaCl2缓冲液中孵育2小时，以使抗体与GP73结合。每个反应补充3U、1.5U、0.75U、0.375U或0U的弗林蛋白酶(New England Biolabs)，以在30℃下切割2小时。为了测试该测定环境中弗林蛋白酶切割的最大值，将重组GOLPH-HIS蛋白(Biolegend)和3U、1.5U、0.75U、0.375U或0U的弗林蛋白酶在pH 7.5的100mM HEPES和1mM CaCl2缓冲液中孵育2小时以允许弗林蛋白酶切割。每个反应在2小时内补充G2-2或G2-1，以在30℃下结合。
从每个反应中将2×100μl转移到已用抗人IgG包被过夜的96孔板的孔中，并用1％明胶的PBS溶液封闭。在室温下孵育一个小时后，洗涤板，与抗HIS-hrp抗体一起孵育一个小时，再次洗涤，与生色底物(TMB Amersham)一起孵育以检测过氧化物酶，停止并在450nm处读取。结果表明由于G2-1和G2-2的结合导致弗林蛋白酶切割减少。
实施例8：抗GP73抗体及其对不同细胞系的细胞活力的影响
将来自细胞系HuH7(人肝细胞癌)、4T1(鼠乳腺癌)和CaCo2(人结直肠癌)的细胞在标准条件下在补充有10％胎牛血清(FCS)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中在37℃以及5％CO2下培养。将HuH7细胞转移到96孔板中，并用G2-2、G2-2加西妥昔单抗、mG2-2、mG2-2加西妥昔单抗、西妥昔单抗或对照抗体各自以从0.125mg/ml至2mg/ml的递增浓度处理HuH7细胞。每个测试一式三份进行。72小时后，向每孔补充PrestoBlue试剂(ThermoFischer)并在37℃下孵育20min。在615nm处读取荧光以定量细胞活力。PrestoBlue试剂被代谢活性细胞减少。细胞活力取决于抗体浓度而减小。该效应不依赖于Fc部分，即G2-2中的人IgG1或mG2-2中的鼠IgG2a。
为了测试G2-1对不同细胞系的影响，将HuH7、4T1和CaCo2细胞转移到96孔板中。每孔用2mg/ml的G2-1、1mg/ml的G2-1加1mg/ml的西妥昔单抗、2mg/ml的西妥昔单抗、2mg/ml的贝伐单抗、或1mg/ml的贝伐单抗加1mg/ml的西妥昔单抗处理。每个测试一式三份进行。72小时后，使用PrestoBlue试剂定量细胞活力，并测量615nm处的荧光。并且在HuH7细胞中发现了G2-1加西妥昔单抗的加性效应。
实施例9：抗GP73抗体-药物偶联物(ADC)
通过将部分还原的G2-2(人IgG1/κ)和mG2-2(鼠IgG2/κ)偶联至药物-接头部分马来酰亚胺缩醛PNU-159682或美登素(MMAF)来产生抗GP73抗体-药物偶联物(ADC)。如先前在例如Junutula等人(2008)Nat.Biotechnol.26:925-932和US 2011/0301334中所述，将抗体与药物-接头部分组合以允许药物-接头部分与抗体的游离半胱氨酸残基偶联。数小时后，纯化ADC。测定每种ADC的药物负载(每种抗体的药物部分的平均数)，PNU的药物负载为2，并且MMAF偶联物的药物负载为2。
实施例10：G2-2-ADC在HuH7细胞中的功效
将通过马拉梅德交换接头与G2-2附接的MMAF组成的抗体药物偶联物以不同浓度加入到HUH7细胞的细胞培养基中。一个小时后更换培养基。使用PrestoBlue试剂(ThermoFischer)在98小时后分析细胞活力。黑色曲线示出了通过抗体组分确定的IC50为6.34nM的G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF。红色曲线示出了通过药物组分确定的IC50为0.124nM的G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF。蓝色曲线示出了通过药物组分IC50 277nM所确定的MMAF的毒性。由于附接至G2-2抗体，所以MMAF的毒性增强了2234倍，如图10所示。
实施例11：G2-2-ADC在HuH7细胞系异种移植模型中的功效
使用人HuH7异种移植模型研究抗GP73 ADC的功效。将雌性Balb/c裸鼠(Crown BioLaboratories；Beijing,China)各自在侧腹区皮下接种1000万个HuH7细胞。当异种移植肿瘤达到183mm3的平均肿瘤体积(表示为第0天)时，将动物随机分成每组12只小鼠的组，并在第0天静脉注射2mg/kg的ADC和在第7天静脉注射1mg/kg的ADC，或静脉注射对照物质。在整个研究中每隔一天测量小鼠的肿瘤和体重。当体重减轻>小鼠起始体重的20％时，立即将小鼠安乐死。当肿瘤达到2000mm3时，对所有动物进行安乐死。通过FACS和IHC证实了从异种移植小鼠分离的HuH7细胞和HuH7肿瘤表面上的GP73表达。
如图15所示，用G2-2-PNU实现了显著的肿瘤生长抑制。如图12所示，媒剂组与ADC组之间的累积存活率的差异在统计学上是显著的。使用SPSS分析数据。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了前述发明，但是描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容全文以引用方式明确并入本文。
实施例12：优化的GP73抗体
通过定向诱变优化抗体G2-2和G2-1在哺乳动物细胞中的表达，所述定向诱变来自与公众可获得的数据库(例如IMGT/mAb-DB)中发现的抗体的计算比较。相应的调节影响了鼠重链的可变区和恒定区的框架。因此，CDR保持不变。这些优化的序列命名为G2-2opti(IgG1)和G2-1opti(IgG1)。对于某些实验，将G2-2opti(IgG1)转化为G2-2opti(IgG2a)，G2-2opti(IgG2a)是具有鼠CH2和CH2的嵌合人/鼠版本。在功能测定中，这些构建体分别与G2-2或G2-1相同或比G2-2或G2-1更好地表现。
实施例13：来自专利CN105734059A的抗体8A10和G2-2对GP73蛋白和肽的差异结合
产生来自专利CN105734059A的抗体8A10，以测试8A10对GP73的结合与G2-2对GP73的结合的差异。具体地，进行实验以测试8A10是否识别与本发明的抗体相同的表位。
来自专利CN105734059A的抗体8A10的公开核苷酸序列在κ轻链(Y193C)的恒定区中含有点突变。为了充分表达，通过回复突变为Y193来将序列与标准鼠κ序列进行拟合。由GenScript NJ,USA合成在其他方面未改变的8A10核苷酸序列。在N末端添加分泌信号，并且向重链补充适当的鼠IgG2a序列。将各个链克隆到哺乳动物表达载体中以用于瞬时转染HEK293细胞。通过固定化金属亲和层析(IMAC)从细胞上清液中提取抗体，并通过蛋白质印迹法和ELISA测试其完整性。
将293HEK细胞用含有在C末端用10xHIS-标签标记的全长GP73 AA1-401的cDNA转染，或用含有具有R52A突变的AA 36至401的GP73ΔN变体转染，以产生在C末端用10xHIS-标签标记的不可切割的变体(GP73-His AVRR)。在这两种构建体中，将分泌信号符合读框地加入到N末端。表达全长GP73的细胞的上清液含有sGP73-10xHis，包括GP73 AA56至401(sGP73；SEQ ID NO:40)，其已经在AA 55处被弗林蛋白酶或另一种蛋白酶蛋白水解切割。GP73 ΔN变体的上清液含有GP73-10xHis AVRR，包括GP73 AA 36至401(GP73 AVRR；SEQ IDNO:41)，如图20所示。这两种构建体中只有后一种含有rGP73表位。将两种蛋白质均通过IMAC分离。
在用sGP73或GP73 AVRR包被过夜并用2％明胶封闭的96孔板中进行ELISA。涂布抗体8A10、G2-2opti(IgG2a)或同种型对照抗体，孵育1.5小时并洗去。加入二级辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体1小时，并在充分洗涤后施加生色底物(TMB Amersham)以检测过氧化物酶。停止反应，并读取450nm处的吸光度，如图21所示。结果证明8A10仅结合sGP73而不结合GP73 AVRR，而G2-2opti(IgG2a)结合GP73 AVRR而不结合sGP73，表明识别的表位不重叠。
在用生物素化的肽gp73 AA 36-55或无关肽包被过夜并用2％明胶封闭的96孔板中进行ELISA。涂布抗体8A10、G2-2opti(IgG2a)或同种型对照抗体(IgG2a)，孵育1.5小时，然后洗去。加入二级辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体1小时，并在充分洗涤后施加生色底物(TMB Amersham)以检测过氧化物酶。停止反应，并读取450nm处的吸光度，如图22所示。结果证明8A10不与rGP73结合，证实8A10和G2-2opti(IgG2a)所识别的表位不重叠。
实施例14：在HEK293-GP73-His细胞中的弗林蛋白酶阻断实验
将HEK293GP73-His全长细胞接种于96孔板中，每孔1500个细胞并培养过夜。第二天，更换培养基，并用31.3ug/ml的贝伐单抗、62.5ug/ml的贝伐单抗、31.3ug/ml的G2-2opti(IgG1)或62.5ug/ml的G2-2opti(IgG1)处理细胞。为了检查弗林蛋白酶切割抑制，在对细胞增殖没有影响的范围内选择相应的抗体浓度。96小时后，收集上清液以利用上转换磷光技术(UCP)测量sGP73，并将剩余的细胞层用于实施例8中描述的使用PrestoBlue试剂(Thermofisher)的增殖测定。此处，G2-2opti(IgG1)减少由HEK293GP73-His全长细胞到上清液中的sGP73分泌，而同种型对照贝伐单抗对上清液中的sGP73水平没有影响。
对于sGP73检测，将每种上清液在含有抗GP73 UCP标记抗体的Hotgen稀释缓冲液中1:1稀释。将0.1ml稀释液加载到含有小鼠抗GP73抗体包被的硝酸纤维素膜(C线)的Hotgen GP73测试盒上并孵育15分钟以用于色谱过程，从而到达用山羊抗小鼠标记抗体包被的膜部分(T线)。根据通过将测试盒插入Hotgen上转换磷光技术(UCP)分析仪中而测量的C线和T线处的光发射差异来推导GP73浓度。
实施例15：抗体G2-2opti(IgG1)和G2-2opti-EED(IgG1)对不同细胞系的细胞活力的影响
优化的抗体G2-2opti(IgG1)及其抗体变体G2-2opti-EED(IgG1)，后者携带内体逃逸序列(EED)，测试它们对人和鼠癌细胞系的功效。将人癌细胞HCT 116 p53wt、HCT 116p53-/-、SW 480 K-Ras G12V突变的、Caco2(所有结直肠癌细胞系)、SKOV3(卵巢癌)、HUH7(人肝细胞癌细胞系)、Hepa1-6(小鼠肝细胞癌细胞系)、DU145、PC3(人前列腺癌细胞系)和H1975(具有EGFR突变T790M和L858R的肺癌细胞系)接种于96孔板中，每孔1500个细胞，并在DMEM中培养过夜。第二天更换培养基，并用1mg/ml的G2-2opti(IgG1)或G2-2opti-EED(IgG1)或西妥昔单抗或贝伐单抗或PBS处理细胞。如实施例8所述，在96小时后，使用PrestoBlue试剂(Thermofisher)定量细胞活力。将PBS处理的细胞的结果用作100％活力水平(参见图23)。
序列表
<110> 科雅博有限责任公司
<120> 抗GP73抗体和免疫偶联物
<130> Z2254 PCT BS
<150> EP16 19 9882.8
<151> 2016-11-21
<160> 44
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 401
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> GP73 UniProtKB Q8NBJ4
<400> 1
Met Met Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu
1 5 10 15
Val Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Ile Ile Val Leu Gly Phe Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu
35 40 45
Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu
50 55 60
Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln
65 70 75 80
Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn
85 90 95
Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr
100 105 110
Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln
115 120 125
Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn
130 135 140
Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile
145 150 155 160
Asn Gln Met Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu
165 170 175
Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu
180 185 190
Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro
195 200 205
Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys
210 215 220
Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser
225 230 235 240
Glu Val Val Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn
245 250 255
Glu Ile Gln Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln
260 265 270
Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg
275 280 285
Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala
290 295 300
Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg
305 310 315 320
Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala
325 330 335
Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn
340 345 350
Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu
355 360 365
Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys
370 375 380
Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr
385 390 395 400
Leu
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 heavy chain variable region (VH)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 light chain variable region (VL)
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Asp Ile Ser Val Gly Phe
20 25 30
His Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ile Trp His Thr Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Glu Ile Lys
115
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 HVR-H1
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 HVR-H2
<400> 5
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 HVR-H3
<400> 6
Ala Arg Glu Gly Ser Ala Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 HVR-L1
<400> 7
Ser Asp Ile Ser Val Gly Phe His Arg
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 HVR-L2
<400> 8
Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2 HVR-L3
<400> 9
Val Ile Trp His Thr Ser Gly Val Val
1 5
<210> 10
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 heavy chain variable region (VH)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 light chain variable region (VL)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Val Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Ile Ile Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp Thr Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Phe Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ala Ile Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Ala Glu Asp Glu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser His Ser
85 90 95
Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-H1
<400> 12
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-H2
<400> 13
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-H3
<400> 14
Ala Arg Gly Arg Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-L1
<400> 15
Gly Gly Ser Ile Asp Thr Asn Tyr
1 5
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-L2
<400> 16
Glu Asp Asp
1
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-L3
<400> 17
Gln Ser Ser His Ser Thr Ala Val
1 5
<210> 18
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 heavy chain variable region (VH)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Ser Thr Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 light chain variable region (VL)
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 HVR-H1
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 HVR-H2
<400> 21
Arg Asn Lys Ala Lys Gly Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 HVR-H3
<400> 22
Asp Pro Ser Thr Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 HVR-L1
<400> 23
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 HVR-L2
<400> 24
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-4 HVR-L3
<400> 25
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> G2-2/G2-1 heavy chain constant region (IgG1)
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> G2-2/G2-1 light chain constant region (kappa)
<400> 27
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 28
<211> 330
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> mG2-2/mG2-1 heavy chain constant region (IgG2a)
<400> 28
Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 29
<211> 393
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> GP73 UniProt Q91XA2
<400> 29
Met Met Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu
1 5 10 15
Ile Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Val Ile Val Leu Gly Phe Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Glu Leu Gln Thr Arg Ile Val Glu
35 40 45
Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu
50 55 60
Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Gln Lys Gln Arg Glu Gln
65 70 75 80
Leu Asp Arg Ile Gln Ser Ser His Ser Phe Gln Leu Glu Asn Val Asn
85 90 95
Lys Leu His Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr
100 105 110
Gly Glu Lys Leu Ile Arg Asp Leu Gln Asp Gln Leu Lys Ala Leu Gln
115 120 125
Arg Ser Tyr Ser Ser Leu Gln Gln Asp Ile Phe Gln Phe Gln Lys Asn
130 135 140
Gln Thr Ser Leu Glu Lys Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Gln Cys Ile
145 150 155 160
Ser Gln Met Thr Glu Val Lys Glu Gln Cys Asp Glu Arg Ile Glu Glu
165 170 175
Val Ile Arg Lys Arg Asn Glu Ala Pro Gly Ser Arg Asp Leu Ala Glu
180 185 190
Thr Asn Asn Gln His Gln Gln Ala Leu Lys Pro Gln Pro Lys Leu Gln
195 200 205
Glu Glu Val Pro Ser Glu Glu Gln Met Pro Gln Glu Lys Gly Asp Val
210 215 220
Pro Arg Asn Lys Ser Gln Ile Pro Ala Pro Asn Ser Glu Ser Leu Gly
225 230 235 240
Leu Lys Pro Gln Val Gln Asn Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln Ala Val
245 250 255
Gly Glu Glu His Gln Gln Ala Ser Ile Gln Gly Gln Ala Val Ala Asp
260 265 270
Gly Thr Arg Val Gly Ala Glu Lys Leu Asp Gln His Thr Gln Leu Pro
275 280 285
Ala Gly Leu Leu Ala Arg Pro Glu Glu Asp Ser Gln Tyr Pro Glu Arg
290 295 300
Glu Gln Leu Val Ile Arg Asp Arg Gln Glu Gln Gln Arg Ala Ser Glu
305 310 315 320
Glu Gly Gly Gly Gln Lys Asn Pro Gly Asp Glu Tyr Asp Met Asp Glu
325 330 335
Asn Glu Ala Glu Ser Glu Arg Glu Lys Gln Ala Ala Leu Ala Gly Asn
340 345 350
Asp Arg Asn Ile Asn Val Leu Asn Ala Asp Ala Gln Lys Arg Gly Ile
355 360 365
Ile Asn Val Pro Val Gly Ser Glu Arg Gln Ser His Ile Leu Asn Gln
370 375 380
Val Gly Ile His Ile Pro Gln Gln Ala
385 390
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> GP73 aa 36 to 55 UniProt Q8NBJ4
<400> 30
Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Arg Val Arg Arg
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> GP73 aa 36 to 55 UniProt Q91XA2
<400> 31
Ser Ser Arg Ser Val Glu Leu Gln Thr Arg Ile Val Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Arg Val Arg Arg
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> Canis
<220>
<223> GP73 aa 36 to 55 UniProt E2RLA5
<400> 32
Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Val Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Arg Val Arg Arg
20
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<223> epitope of antibodies of the invention
<400> 33
Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg
1 5 10
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<220>
<223> epitope of antibodies of the invention
<400> 34
Glu Gly Arg Val Arg Arg
1 5
<210> 35
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2opti (IgG1) and G2-2opti (IgG2a) heavy chain variableregion
(VH)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2opti (IgG1) and G2-2opti (IgG2a) light chain variableregion
(VL)
<400> 36
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Asp Ile Ser Val Gly Phe
20 25 30
His Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ile Trp His Thr Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115
<210> 37
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1opti (IgG1) and G2-1opti (IgG2a) heavy chain variableregion
(VH)
<400> 37
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1opti (IgG1) and G2-1opti (IgG2a) light chain variableregion
(VL)
<400> 38
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Ile Ile Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp Thr Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Phe Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Ala Ile Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Thr Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser His Ser
85 90 95
Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 39
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-2opti (IgG2a)/ G2-1opti (IgG2a) heavy chain constant region
(IgG2a)
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 40
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GP73 aa 56 to 401-His (sGP73)
<400> 40
Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln
1 5 10 15
Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser
20 25 30
His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys
35 40 45
Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val
50 55 60
Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln
65 70 75 80
Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys
85 90 95
Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile Asn Gln Met Lys Glu Val Lys
100 105 110
Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu
115 120 125
Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln
130 135 140
Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu
145 150 155 160
Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser
165 170 175
Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser Glu Val Val Leu Asp Ser Lys
180 185 190
Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln Val Val Asn Glu
195 200 205
Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val
210 215 220
Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu
225 230 235 240
Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu
245 250 255
Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp
260 265 270
Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln
275 280 285
Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu
290 295 300
Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile
305 310 315 320
Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu
325 330 335
Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr Leu Ala His His His His His
340 345 350
His His His His His
355
<210> 41
<211> 377
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GP73 aa 36 to 401 (R52A)-His (GP73-His AVRR)
<400> 41
Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Ala Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln Leu Asp Lys
35 40 45
Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Tyr
50 55 60
Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr Gly Glu Arg
65 70 75 80
Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln Arg Asn Tyr
85 90 95
Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn Gln Thr Asn
100 105 110
Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile Asn Gln Met
115 120 125
Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu Val Thr Lys
130 135 140
Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu Asn Asn Asp
145 150 155 160
Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro Arg Leu Gln
165 170 175
Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys Gly Asn Val
180 185 190
Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser Glu Val Val
195 200 205
Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln
210 215 220
Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln Glu Pro Gly
225 230 235 240
Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg Gly Phe Gly
245 250 255
Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Ser
260 265 270
Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg Asp Gln Leu
275 280 285
Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala Gly Glu Gly
290 295 300
Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn Met Asp Glu
305 310 315 320
Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu Ala Gly Asn
325 330 335
Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys Arg Asp Thr
340 345 350
Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr Leu Ala His
355 360 365
His His His His His His His His His
370 375
<210> 42
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Endosomal escape domain (EED)
<400> 42
Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly
1 5 10 15
Gly Ile Val Gly Ser
20
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EED Linker
<400> 43
Ser Ala Ala Ala Gly Thr
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G2-1 HVR-L3 variant
<400> 44
Gln Ser Ser His Ser Thr Ala Val Val
1 5

Claims (47)

1.特异性结合GP73或其抗原性部分的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至以下氨基酸序列中的表位
a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR SEQ ID NO: 30
b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO: 31；和/或
c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO: 32，
其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO: 4中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 5中定义的CDR2和在SEQ ID NO: 6中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链包含在SEQ ID NO: 7中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 8中定义的CDR2和在SEQ ID NO: 9中定义的CDR3。
2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 35或与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 35具有90%序列同一性的序列的氨基酸序列；
所述可变轻(VL)链序列包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 36或与SEQ ID NO: 3或SEQID NO: 36具有90%序列同一性的序列的氨基酸序列。
3. 特异性结合GP73或其抗原性部分的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与以下氨基酸序列中的表位结合
a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR SEQ ID NO: 30
b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO: 31；和/或
c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO: 32，
其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链包含在SEQ ID NO: 12中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 13中定义的CDR2和在SEQ IDNO: 14中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链序列包含在SEQ ID NO: 15中定义的CDR1、在SEQID NO: 16中定义的CDR2和在SEQ ID NO: 17中定义的CDR3。
4. 根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链序列包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 37或与SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 37具有90%序列同一性的序列的氨基酸序列；和
所述可变轻(VL)链序列包含SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 38或与SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 38具有90%序列同一性的序列的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段内化到细胞中。
6. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位在氨基酸序列RIMELEGRVRR (SEQ ID NO: 33)中。
7. 根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位在氨基酸序列EGRVRR(SEQ ID NO: 34)中。
8. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是双特异性抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体，或展示在噬菌体表面上或展示在嵌合抗原受体(CAR) T细胞表面上的抗体。
9.根据权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是IgG1、IgG2a或IgG2b、IgG3或IgG4抗体。
10. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab´)2片段或Fv片段。
11. 多核苷酸，所述多核苷酸编码特异性结合GP73或其抗原性部分的抗体，其中所述抗体与以下氨基酸序列中的表位结合
a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR SEQ ID NO: 30
b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO: 31；和/或
c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR SEQ ID NO: 32，
其中所述抗体包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链，所述可变重(VH)链包含在SEQ IDNO: 4中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 5中定义的CDR2和在SEQ ID NO: 6中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链包含在SEQ ID NO: 7中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 8中定义的CDR2和在SEQID NO: 9中定义的CDR3；或
其中所述抗体包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，所述可变重(VH)链包含在SEQID NO: 12中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 13中定义的CDR2和在SEQ ID NO: 14中定义的CDR3，所述可变轻(VL)链序列包含在SEQ ID NO: 15中定义的CDR1、在SEQ ID NO: 16中定义的CDR2和在SEQ ID NO: 17中定义的CDR3。
12.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种用于产生抗体的方法，所述方法包括培养权利要求12所述的宿主细胞。
14.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体以及细胞毒性剂或细胞毒性剂的前药。
15.根据权利要求14所述的免疫偶联物，其具有式Ab(-L-D)p，其中：
a) Ab是前述权利要求中任一项所述的抗体；
b) L是接头；
c) D是细胞毒性剂；以及
d) p的范围为1-8。
16.根据权利要求14或15所述的免疫偶联物，其中所述细胞毒性剂选自美登素、卡里奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓和奈莫柔比星衍生物。
17.根据权利要求16所述的免疫偶联物，其中D是式A的吡咯并苯并二氮杂卓：
及其盐和溶剂化物，其中：
波浪线表示与所述接头共价附接的位点；
虚线表示存在双键；
R2和R12各自独立地选自–H、–OH、=O、=CH2、–CN、–R、–OR、=CH-RD、=C(RD)2、–O-SO2-R、–CO2R、–COR、以及–卤素，
其中RD独立地选自–H、–CO2R、–C(O)R、CHO、CO2H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR´、–NO2、Me3Sn–和–卤素；
R6、R9、R16和R19独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR´、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
R7和R17独立地选自–H、–R、–OH、–OR、–SH、–SR、–NH2、–NHR、–NRR´、–NO2、Me3Sn–，以及–卤素；
Q 独立地选自–O–、–S–和–N(H)–；
R11是–H或–R，或者在Q是–O–的情况下，R11可以是–SO3M，其中M是碱金属或碱土金属阳离子；
R和R´各自独立地选自经取代或未经取代的C1-12烷基、C3-8杂环基、 C3-20杂环和C5-20芳基基团，以及如果R和R'与相同的氮原子结合，则R和R´可以与它们所附接的氮原子一起形成经取代或未经取代的4元、5元、6元或7元杂环；
R"是C3-12烯基基团，其中一个或多个碳原子可以被选自O、NH和S的杂原子和/或经取代或未经取代的芳环替换；
其中所述芳环包含5或6个碳原子以及一个或两个选自N或NH的杂原子，以及
X和X´独立地选自O、S，和N(H)。
18.根据权利要求17所述的免疫偶联物，其中D具有以下结构：
其中n是0或1。
19.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中D是奈莫柔比星衍生物。
20. 根据权利要求19所述的免疫偶联物，其中D具有选自以下的结构：
；以及
。
21.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中所述接头可被蛋白酶切割、是酸不稳定的和/或包含腙。
22. 根据权利要求15所述的免疫偶联物，所述免疫偶联物具有选自以下的式：
；以及
其中p的范围是1-8。
23.根据权利要求15所述的免疫偶联物，其中p的范围是2-5。
24.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含权利要求1至10中任一项所述的抗体以及功能性试剂，其中所述功能性试剂为内体逃逸结构域(EED)肽。
25. 根据权利要求24所述的免疫偶联物，其具有式Ab(-EEDL-EED肽)，其中Ab是权利要求1至10中任一项所述的抗体并且EEDL是EED肽接头，其中所述EED肽是包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列的登革热病毒EED肽，并且所述EED肽接头包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
26.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，所述药物组合物包含另一治疗剂。
28.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，所述药物组合物包含另一治疗剂。
30.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物，或权利要求26至28中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗患有GP73阳性癌症的对象的药物中的用途，所述GP73阳性癌症选自肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、前列腺癌、胃癌、结直肠癌和肺癌。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述GP73阳性癌症是肝癌。
32.根据权利要求30或31所述的用途，所述用途还包括向个体施用另外的治疗剂。
33.根据权利要求30所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段通过以下途径施用：静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、瘤内、膀胱内、子宫内、关节内、或皮下。
34.根据权利要求30所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段经鼻内施用。
35.根据权利要求30所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段经局部施用。
36.根据权利要求30所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段作为灌肠剂或作为洗胃剂施用。
37.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物在制备用于抑制GP73阳性细胞增殖的药物或制品中的用途，所述药物或制品的使用包括在允许抗体或其抗原结合片段或免疫偶联物与所述细胞的表面上的GP73结合的条件下使所述细胞暴露于权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物，从而抑制所述细胞的增殖；其中所述GP73阳性细胞选自肝癌细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、前列腺癌细胞和肺癌细胞。
38.根据权利要求37所述的用途，其中所述细胞是肝癌细胞。
39.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测生物样品中的人GP73的制品中的用途，所述制品的使用方法包括在允许抗体或其抗原结合片段与天然存在的人GP73结合的条件下使所述生物样品与权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，以及检测是否形成所述抗体或其抗原结合片段与所述生物样品中的天然存在的人GP73之间的复合物。
40.根据权利要求39所述的用途，其中所述检测包括免疫组织化学、免疫荧光成像、酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)、蛋白质印迹、免疫沉淀或放射摄影成像。
41.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于鉴定对象为患有疾病的制品中的用途，所述制品的使用方法包括确定来自所述对象的样品中权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与GP73多肽或与其抗原性部分的特异性结合水平，其中检测到所述特异性结合的水平相对于对照样品改变将所述对象鉴定为患有疾病，其中所述疾病是癌症，所述癌症选自肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、前列腺癌、胃癌、结直肠和肺癌。
42.组合物，所述组合物包含权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及抑制EGFR信号传导的EGFR抗体或小分子，所述组合物用于治疗癌症。
43.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，根据权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求26至29中任一项所述的药物组合物，其用于治疗与GP73的异常表达相关的疾病，其中所述疾病是癌症。
44.根据权利要求43所述的抗体或其抗原结合片段、免疫偶联物或药物组合物，其中所述癌症是肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、前列腺癌、结直肠癌和/或乳腺癌。
45. 根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，根据权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求26至29中任一项的药物组合物，其降低血浆中循环的可溶GP73 (sGP73)的水平。
46.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求26至29中任一项所述的药物组合物在制备用于监测对象对使用根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求14至25中任一项所述的免疫偶联物或根据权利要求26至29中任一项所述的药物组合物治疗的应答的制品中的用途，所述制品的使用方法包括在治疗所述对象之前的一个或多个时间点和治疗所述对象之后的一个或多个时间点测量血浆中循环sGP73的水平，其中所述治疗是癌症的治疗，所述癌症选自肝癌、卵巢癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、前列腺癌、胃癌、结直肠和肺癌。
47.根据权利要求46所述的用途，其中检测到相对于治疗前的时间点，在治疗后的时间点所述对象的血浆中循环sGP73的水平降低将所述对象鉴定为对所述治疗有应答。
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