KR20210024663A - 항-gp73　항체　및　면역접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 GP73, 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것으로서, 상기 항원-결합 분자는 GP73의 세포외 부분내의 에피토프에 결합하고, 이는 통상적으로 단백질분해 절단 후에 세포로 내재화된다. 본 발명은 또한 항원-결합 분자, 구체적으로 항-GP73　항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 본 발명의 항원-결합 분자 및 면역접합체는 단독으로 또는 다른 네이키드 (naked) 항체, 또는 치료제, 또는 다른 면역접합체와 조합하여 치료 접합체로서 투여될 수 있거나 또는 진단 접합체 (diagnostic conjugate)로서 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 항 GP73 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 면역접합체, 벡터 및 상기 뉴클레오티드 서열를 포함하는 숙주 세포, 및 항-GP73-항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항원-결합 분자, 항체 및 조성물은 GP73의 발현이 변경되는, 구체적으로 GP73이 과발현되는 질환, 예컨대 암의 진단 및 치료적 적용에 유용하다.

Description

항-GP73　항체　및　면역접합체{ANTI-GP73　ANTIBODIES　AND　IMMUNOCONJUGATES}
본 발명은 GP73, 또는 그의 항원성 부분 (antigenic portion)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것으로서, 상기 항원-결합 분자는 GP73의 세포외 부분내의 에피토프에 결합하고, 이는 통상적으로 단백질분해 절단 (proteolytic cleavage) 후에 세포로 내재화된다. 본 발명은 또한 항원-결합 분자, 구체적으로 항-GP73　항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체 (immunoconjugates)에 관한 것이다. 본 발명의 항원-결합 분자 및 면역접합체는 단독으로 또는 다른 네이키드 (naked) 항체, 또는 치료제, 또는 다른 면역접합체와 조합하여 치료 접합체로서 투여될 수 있거나 또는 진단 접합체 (diagnostic conjugate)로서 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 항 GP73 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 면역접합체, 벡터 및 상기 뉴클레오티드 서열를 포함하는 숙주 세포, 및 항-GP73-항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항원-결합 분자, 항체 및 조성물은 GP73의 발현이 변경되는, 구체적으로 GP73이 과발현되는 질환, 예컨대 암의 진단 및 치료적 적용에 유용하다.
골지 단백질-73 (Golgi protein-73: GP73)은, 선택적으로 골지막 단백질 1 (Golgi Membrane Protein 1: GOLM1), 또는 골지-관련된-인단백질 2 (Golgi-associated-Phosphoprotein 2: GOLPH2)로 불리우며, 단일 통과 막횡단 타입 II 단백질 (single pass transmembrane type II protein)이다. 그의 진정한 기능은 알려져 있지 않다. 상기 GP73의 게놈 서열은 11개의 엑손 및 2개의 스플라이싱 변이체로 예측된다. 전사 변이체 1 (NM_016548.3)은 길이가 3100nt이고 및 엑손 2 내지 11을 포함하고, 전사 변이체 2 (NM_177937.2)는 길이가 3092nt이고 및 엑손 1, 및 3 내지 11을 포함한다. 상기 변이체 모두는 동일한 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)을 코딩한다. 상기 변이체들의 생물학적 유의성은 현재 명확하지 않다; Kim et al., Golgi phosphoprotein 2 in physiology and in diseases. Cell & Bioscience 2012 2:31을 참조한다. 정상-상태 조건하에 GP73은 시스- 및 내측-골지체의 내재성 막 단백질이다. 그러나, GP73은 시스 골지로부터 엔도솜 (endosomes) 및 세포 표면으로 순환할 수 있다; Puri S et al. Cycling of early Golgi proteins via the cell surface and endosomes upon lumenal pH disruption Traffic 2002, 3:641-653을 참조한다. GP73의 엔도솜 거래 (endosomal trafficking)는 전구단백질 전환효소 퓨린 (furin) 매개된 절단을 가능하게 하여, 이를 세포외 공간으로 방출시키고, HCC에 대한 혈청 바이오마커로서 그의 존재에 대한 분자적 설명을 제공한다는 증거가 있다; Bachert C et al., Endosomal trafficking and proprotein convertase cleavage of cis Golgi protein GP73 produces marker for hepatocellular carcinoma Traffic 2007, 8:1415-1423; Marrero JA et al., GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma J Hepatol 2005, 43:1007-1012; Mao Y et al., Golgi protein 73 (GOLPH2) is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma Gut 2010, 59:1687-1693); Li X et al., Serum golgi phosphoprotein 2 level: a better marker than alpha-fetoprotein for diagnosing early hepatocellular carcinoma Hepatology 2009, 50:1682 또는 Zhu et al., Biomarkers for hepatocellular carcinoma: progression in early diagnosis, prognosis, and personalized therapy Biomark Res 2013, 1:10을 참조한다. GP73은 간세포, 담관세포, 식도, 신장, 전립샘 및 다양한 다른 암종을 포함하는 몇몇 암에서 고도로 발현되지만, 인접한 비-종양 조직에서는 발현되지 않는 것으로 나타났다. GP73-포지티브 HCC를 갖는 환자는 GP73-네가티브　HCCs를 갖는 환자보다 더 높은 종양 등급을 갖는다. 담관 암종 (bile duct carcinomas: BDC)에서, GP73 발현은 더 좋은 전체 생존율과 관련이 있고 반면에 HCC에서 GP73 과발현은 전이 위험 증가, 더 높은 재발 가능성 및 생존율 저하와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다; Riener et al. Golgi phosphoprotein 2 (GOLPH2) expression in liver tumors and its value as a serum marker in hepatocellular carcinomas. Hepatology 2009, 49:1602-1609 and Ye et al. 2016, Cancer Cell 30, 444-458 September 12, 2016을 참조한다. GP73을 표적으로 하는 항체는 WO 2014/144355 A2, CN105699653 A 및 CN105734059 A에 개시되어 있다. 암 환자에서 세포-매개된 면역을 향상시키기 위해 GP73을 저해하는 항체를 사용하는 것은 WO2012/112798 A1에 개시되어 있다. GP73은 폐암 진단을 위한 바이오마커로서 WO 2011/093675 A2에 제시되었거나 또는 전신 염증 질환 예컨대 패혈증에서 테스트로서 WO2013/083781 A2에 제시되어 있다. 최근에, GP73 (GOLM1)은 종양 세포의 성장 및 전이를 촉진시킴으로써 EGFR/RTK와 상호작용하는 것으로 개시되어 있다; Ye et al. 2016, Cancer Cell 30, 444-458 September 12, 2016을 참조한다.
따라서, GP73의 변경된 발현을 포함하는 병태 및 질환, 예컨대 암 및 감염의 진단 및 치료를 위해 GP73을 표적으로 하는 활성제가 필요하다. 상기 기술적 문제는 청구범위에 정의되는 구체예에 의해 해결된다.
본 발명은 하기에 관한 것이다:
1. GP73, 또는 그의 항원성 부분 (antigenic portion)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자로서, 상기 항원-결합 분자는 아미노산 서열
a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR 서열 번호: 30
b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 31; 및/또는
c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 32
내의 에피토프에 결합하는 항원-결합 분자.
2. 구체예 1에 있어서, 상기 에피토프는 아미노산 서열 RIMELEGRVRR (서열 번호: 33), 바람직하게는 EGRVRR (서열 번호: 34)내에 있는 것인 항원-결합 분자.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, 상기 항원-결합 분자는 항체, 그의 항원-결합 단편, 이중특이성 항체, 설계된 안키린 반복 단백질 (designed ankyrin repeat protein: DARPIN), 압타머 (aptamer) 또는 다른 항체 모방체 (antibody mimetic)인 것인 항원-결합 분자.
4. 구체예 3에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 재조합 항체의 항원-결합 단편, 인간화 항체, 또는 파지 (phage)의 표면에서 나타나거나 또는 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR) T 세포의 표면에서 나타나는 항체인 것인 항원-결합 분자.
5. 구체예 4에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체인 것인 항원-결합 분자.
6. 구체예 3, 4 또는 5에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 6에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 9에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는 것인 항원-결합 분자.
7. 구체예 3 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는
a) 서열 번호: 4에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 5에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 6에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 7에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 8에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 9에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함하거나;
b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것인 항원-결합 분자.
8. 구체예 3 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는
a) 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35에 대해 90%, 바람직하게는 95% 서열 동일성 (identity)을 갖는 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열; 및
서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36에 대해 90%, 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하거나;
b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것인 항원-결합 분자.
9. 구체예 3, 4 또는 5에 있어서, 상기 항체는 서열 번호: 14에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 17에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 것인 항원-결합 분자.
10. 구체예 3, 4, 5 또는 9에 있어서, 상기 항체는
a) 서열 번호: 12에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 13에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 14에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 15에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 16에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 17에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하거나;
b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것인 항원-결합 분자.
11. 구체예 3, 4, 5, 9 또는 10에 있어서, 상기 항체는
a) 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37에 대해 90%, 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열; 및
서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38에 대해 90%, 바람직하게는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하거나;
b) 상기 (a)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것인 항원-결합 분자.
12. 구체예 3에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fab 단편, F(ab´)2 단편 또는 Fv 단편인 것인 항원-결합 분자.
13. 구체예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원-결합 분자는 세포로 내재화되는 (internalized) 것인 항원-결합 분자.
14. GP73, 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항체의 가변 중쇄 (VH) 서열 및/또는 가변 경쇄 (VL) 서열 중 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 항체는 아미노산 서열
a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR 서열 번호: 30
b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 31; 및/또는
c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 32
내의 에피토프에 결합하는 폴리뉴클레오티드.
15. 구체예 14의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
16. 구체예 15의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체를 생산하는 방법.
17. 폴리펩티드 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법으로서, 피험체에게
a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR 서열 번호: 30
b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 31; 및
c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 32
로부터 선택되는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
18. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 항체 및 세포독성제 (cytotoxic agent) 또는 세포독성제의 프로드러그를 포함하는 면역접합체.
19. 구체예 18에 있어서, 식 Ab(-L-D)p를 가지며, 상기에서:
a) Ab는 구체예 1 내지 18 중 어느 하나의 항체이고;
b) L은 링커이고;
c) D는 세포독성제이고;
d) p는 1-8의 범위에 있는 것인 면역접합체.
20. 구체예 18 또는 19에 있어서, 상기 세포독성제는 마이탄시노이드 (maytansinoid), 칼리케아미신 (calicheamicin), 피롤로벤조디아제핀 및 네모루비신 (nemorubicin) 유도체로부터 선택되는 것인 면역접합체.
21. 구체예 19에 있어서, 상기 D는 하기 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀
Figure pat00001
;
및 그의 염 (예컨대, 약학적으로 허용가능한 염) 및 용매화물 (예컨대, 약학적으로 허용가능한 용매화물)이고, 상기에서:
물결선 (wavy line)은 상기 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
점선 (dotted lines)은 이중 결합의 선택적 존재를 나타내고 (상기 이중 결합은, 예컨대, C1과 C2 사이 또는 C2와 C3 사이에 존재할 수 있음);
R2 및 R12는 각각 독립적으로 -H, -OH, =O, =CH2, -CN, -R, -OR, =CH-RD, =C(RD)2, -O-SO2-R, -CO2R, -COR, 및 -할로겐으로부터 선택되고,
상기 RD는 독립적으로 -H, -CO2R, -C(O)R, CHO, CO2H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
R6, R9, R16 및 R19는 독립적으로 -H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
R7 및 R17은 독립적으로 -H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
Q는 독립적으로 -O-, -S- 및 -N(H)-로부터 선택되고;
R11은 -H 또는 -R이거나 또는, Q가 -O-인 경우에, R11은 -SO3M일 수 있고, 상기 M은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 양이온이고;
R 및 R´는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-8 헤테로시클일, C3-20 헤테로사이클 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, R 및 R'이 동일한 질소 원자에 결합한다면, R 및 R´은, 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
R"은 C3-12 알킬렌 기이고, 상기에서 하나 이상의 탄소 원자는 O, NH 및 S로부터 선택되는 헤테로원자, 및/또는 선택적으로 치환되는 방향족 고리로 대체될 수 있고;
상기 방향족 고리는 5 또는 6개의 탄소 원자 및 N 또는 NH로부터 선택되는 하나 또는 2개의 헤테로원자를 포함하고,
X 및 X´은 독립적으로 O, S, 및 N(H)로부터 선택되는 것인 면역접합체.
22. 구체예 21에 있어서, 상기 D는 하기 구조를 가지며:
Figure pat00002
상기 n은 0 또는 1인 것인 면역접합체.
23. 구체예 19에 있어서, 상기 D는 네모루비신 유도체인 것인 면역접합체.
24. 구체예 23에 있어서, 상기 D는:
Figure pat00003
; 및
Figure pat00004
로부터 선택되는 구조를 갖는 것인 면역접합체.
25. 구체예 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커는 프로테아제로 절단가능 (cleavable)하고, 산-불안정성 (acid-labile)이고 및/또는 히드라존을 포함하는 것인 면역접합체.
26. 구체예 19에 있어서,
Figure pat00005
; 및
Figure pat00006
로부터 선택되는 화학식을 갖는 것인 면역접합체.
27. 구체예 19 내지 26에 있어서, 상기 p는 2-5의 범위인 것인 면역접합체.
28. 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 항체 및 기능제 (functional agent)를 포함하는 면역접합체로서, 상기 기능제는 바람직하게 엔도솜 탈출 도메인 (endosomal escape domain: EED) 펩티드인 것인 면역접합체.
29. 구체예 28에 있어서, 식 Ab(-EEDL-EED 펩티드)를 가지며, 상기 Ab는 구체예 1 내지 17 중 어느 하나의 항체이고 및 EEDL은 EED 링커인 것인 면역접합체.
30. 구체예 28 또는 29에 있어서, 상기 EED 펩티드는 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 (Dengue Virus) EED 펩티드이고 및 상기 EED 링커는 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역접합체.
31. 구체예 18 내지 30 중 어느 하나의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
32. 구체예 31에 있어서, 부가의 치료제를 포함하는 것인 약학적 조성물.
33. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
34. 구체예 33에 있어서, 부가의 치료제를 포함하는 것인 약학적 조성물.
35. GP73-포지티브 암을 갖는 피험체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험체에게 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자, 구체예 18 내지 30 중 어느 하나의 면역접합체 또는 구체예 31 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물의 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
36. 구체예 35에 있어서, 상기 GP73-포지티브 암은 간암인 것인 방법.
37. 구체예 35 또는 36에 있어서, 부가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
38. 구체예 35 내지 37에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 흉골내 (intrasternal), 종양내, 방광내 (intravesical), 자궁내 (intrauterine), 관절내 (intraarticular), 비강내, 피하, 국소, 관장약 (clyster), 또는 위 세척 (gastric lavage)으로 수행하는 것인 방법.
39. GP73-포지티브 세포의 증식을 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자 또는 구체예 18 내지 30 중 어느 하나의 면역접합체에, 상기 세포의 표면에서 항원-결합 분자 또는 면역접합체의 GP73으로의 결합을 허용하는 조건하에 노출시킴으로써, 이에 의해 상기 세포의 증식을 저해하는 것을 포함하는 것인 방법.
40. 구체예 39에 있어서, 상기 세포는 간암 세포인 것인 방법.
41. 생물학적 시료에서 인간 GP73을 검출하는 방법으로서, 상기 생물학적 시료를 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자와, 상기 항원-결합 분자를 자연 발생하는 인간 GP73으로의 결합을 허용하는 조건하에 접촉시키는 단계, 및 상기 생물학적 시료에서 항원-결합 분자와 자연 발생하는 인간 GP73 사이에서 복합체가 형성되는지를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
42. 구체예 41에 있어서, 상기 검출하는 단계는 면역조직화학 (immunohistochemistry), 면역형광 이미징 (immunofluorescence imaging), 효소-연결된 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 및 형광-활성화된 세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting: FACS), 웨스턴 블롯 (Western Blot), 면역침전 (immunoprecipitation), 또는 방사선 이미징 (radiographic imaging)을 포함하는 것인 방법.
43. 피험체가 질환을 갖는지를 확인하는 방법으로서, 상기 피험체로부터의 시료 중에, 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자와 GP73 폴리펩티드 또는 그의 항원성 부분과의 특이적 결합의 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 대조군 시료에 비해 특이적 결합의 변경된 수준을 검출하는 것은 상기 피험체가 질환을 갖는 것으로 확인되는 것인 방법.
44. 구체예 43에 있어서, 상기 질환은 암인 것인 방법.
45. 구체예 43에 있어서, 상기 암은 간암, 난소암, 자궁내막 암종, 악성 흑색종, 전립샘암, 위암, 결장직장 암종, 폐암, 백혈병 및 유방암의 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
46. 인간 GP73의 아미노산 36 내지 55내의 에피토프에 결합할 수 있는, RNA 압타머.
47. 인간 GP73의 아미노산 36 내지 55내의 에피토프에 결합할 수 있는, 키메라 항원 수용체 CAR T-세포.
48. 퓨린 절단 공통 서열 (furin cleavage consensus sequence) EGRVRR에 결합하고, GP73 단백질의 단백질분해 절단을 저해하는 것인 항원-결합 분자.
49. 암의 치료에 사용하기 위한, 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자 및 EGFR 항체 또는 EGFR 신호전달 (signaling)을 저해하는 소분자를 포함하는 조성물.
50. GP73 및 EGFR을 표적으로 하고, EGFR 신호전달을 감수성 암 세포에서 차단하는 것인 이중특이성 항체.
51. GP73에 결합하지만 가용성 GP73 (sGP73)에는 결합하지 않고 그러므로 순환하는 sGP73에 의해 저해 또는 중화되지 않는 것인 항체.
52. GP73의 비정상적인 발현과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자, 구체예 18 내지 30 중 어느 하나의 면역접합체 또는 구체예 31 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물.
53. 구체예 52에 있어서, 상기 질환은 암이고, 바람직하게 상기 암은 간암, 난소암, 자궁내막 암종, 흑색종, 전립샘암, 결장직장 암종, 폐암, 백혈병 및 유방암인 것인 항원-결합 분자, 면역접합체 또는 약학적 조성물.
54. 혈장 중에 순환하는, 가용성 GP73 (sGP73)의 수준을 감소시키는, 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자, 구체예 18 내지 30 중 어느 하나의 면역접합체 또는 구체예 31 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물.
55. 구체예 1 내지 13 중 어느 하나의 항원-결합 분자, 구체예 18 내지 30 중 어느 하나의 면역접합체 또는 구체예 31 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물로 피험체의 치료에 대한 반응을 모니터하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 혈장 중에 순환하는 sGP73의 수준을, 상기 피험체의 치료 전에 하나 이상의 시점 및 치료 후에 하나 이상의 시점에서 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
56. 구체예 55에 있어서, 상기 피험체의 혈장 중에 치료 전의 시점에 비해 치료 후의 시점에서 순환하는 sGP73의 감소된 수준을 검출하는 것은 상기 피험체가 상기 치료에 대해 반응성이 있는 것으로 확인되는 것인 방법.
따라서, 본 발명은 GP73, 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자에 관한 것으로서, 상기 항원-결합 분자는 아미노산 서열 SSRSVDLQTRIMELEGRVRR (서열 번호: 30); SSRSVELQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 31); 및/또는 SSRSVDLQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 32)내의 에피토프에 결합한다. 따라서, 본 발명은 GP73의 세포외 부분내의 특정 에피토프에 결합하는 항원-결합 분자, 구체적으로 항체를 제공한다.
즉, 본 발명은, GP73에 특이적으로 결합하는, 항체, 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 이에 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 네모루비신 및 그의 유도체, 예컨대 PNU-159682 또는 아우리스타틴 (auristatin), 예컨대 MMAF에 접합되는 그의 처리된 단편을 포함하는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugates: ADCs)가 GP73-발현 암 세포를 사멸 및/또는 이의 증식을 저해, 및 GP73-발현 암을 치료하는데 사용될 수 있다는, 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기반한다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명의 항원-결합 분자는 절단되기보다는 세포로 내재화되는 GP73의 세포외 부분내의 영역에 결합하는 것으로 여겨진다. GP73은 짧은 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 긴 세포외 부분으로 구성되어 있다. 상기 세포외 부분은 sGP73으로 불리는 GP73의 C-말단 부분 및 아미노산 R55에서 추정되는 단백질 절단 도메인으로 끝나는, rGP73으로 불리는, 막횡단 도메인에 인접한 짧은 영역을 포함한다. 본 발명의 결합-분자는 rGP73을 표적으로 한다. 세포막에 근접하고 또한 20개의 아미노산을 포함하는 영역내에서 프로테아제 상호작용의 바로 근접해 있음에도 불구하고 rGP73에 대해 피크 결합 활성을 나타내는 2개의 항체가 확인되었다.
따라서, 본 발명은 GP73의 세포외 부분에서 상기 영역, 즉 rGP73에 특이적으로 결합하는 항원-결합 분자에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명은, 결합 에피토프의 적어도 일부가 GP73의 SSRSVDLQTRIMELEGRVRR (서열 번호: 30); SSRSVELQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 31); 및/또는 SSRSVDLQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 32)내의 아미노산 서열 EGRVRR 내에 존재하는 항원-결합 분자에 관한 것이다. 다시 이론에 구애되지 않고, 상기 아미노산 서열 EGRVRR (서열 번호:33)은 추정되는 퓨린 인식 모티프인 것으로 여겨진다. 그러므로, 본원에 제공되는 항원-결합 분자, 구체적으로 항체의 하나의 가능한 작용 방식은 도 12 및 도 23에 개시된 바와 같이 퓨린 절단과 경쟁한다. 본원에 개시된 항체, 예컨대 G2-2, G2-2opti, G2-1, 및 G2-1opti의 결합으로 퓨린 프로테아제에 의한 막 결합된 GP73의 처리를 감소시킨다. 예상되는 결과로는 도 23에서 개시되는 바와 같이, 단백질의 C-말단 부분을 포함하는, 가용성 GP73이 환경 및 혈류에서 감소한다는 것이다. 상기 퓨린 부위의 개별의 항체 결합 및 차단에 의한 상기 퓨린 프로테아제 과정의 간섭 및 교란은 도 13 및 도 24에 개시된 증식 억제를 담당할 수 있다. 본 발명의 항원-결합 분자, 예컨대 본원에 개시된 항체 G2-2, G2-2opti, G2-1 및 G2-1opti에 의한 신규한 기여로는 GP73 단백질의 주요 부분의 처리 및 분비 후에 세포 표면에 남아 있는 절단된 (shedded) 단백질의 세포외 부분에 결합한다. 순환하는 sGP73에 결합하고 및 상기 결합 복합체에 의해 중화될 수 있는 지금까지 알려져 있는 항체와는 달리, 본 발명의 항원-결합 분자, 구체적으로 본원에 개시된 항체는 sGP73에 의해 영향을 받지 않으며, 이들이 GP73의 잔유물 및 상기 퓨린 절단 부위의 근위의 GP73의 전장 단백질에 결합하는 기원 세포에 도달한다. 이러한 효과는 도 11에 개시되어 있다. sGP73을 포함하는 조건화된 배지는 G2-4로 불리는 퓨린 절단 부위 결합 항체의 말단의 경우에 GP73 포지티브 HUH7 세포의 세포 표면에 항체 결합을 감소시킨다. 상기 퓨린 절단 부위 결합 항체 G2-2의 근위는 상등액 중 가용성 GP73의 존재에 의해 영향을 받지 않는다.
최근에, sGP73에 결합하는 항체가 WO 2014/144355 A2에 개시되어 있다. 구체적으로, WO 2014/144355 A2는 GP73의 아미노산 307-339, 276-287, 344-363, 또는 63-96내에 퓨린 절단 부위의 말단에 결합하는 항체를 개시하였다. 유사하게, CN105699653 A는 GP73의 아미노산 56-67, 즉 sGP73내에 결합하는 항체를 개시하였다.
CN105734059 A는 개시된 항체가 결합되는 에피토프를 정의하지 않고 GP73에 결합하는 항체를 개시하였다. 첨부된 실시예에서 개시된 바와 같이, CN105734059 A의 항체의 결합 특이성을 결정하기 위해서, CN105734059 A의 항체를 생성하였고, 에피토프 영역 GP73 AA 36 내지 55을 갖거나 또는 갖지 않는 GP73의 결합뿐만 아니라 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 관련되지 않은 대조 펩티드의 결합에 대해 시험하였다. 도 21 및 도 22에 개시된 바와 같이, CN105734059 A의 에피토프는 본 발명의 에피토프와 중첩되지 않았다.
따라서, 본 발명의 항체는 rGP73에 결합할 수 있고 또한 내재화를 통해 기원 세포에 도달할 수 있기 때문에 당 분야에 알려져 있는 것보다는 유익하다. 본 발명의 항체의 이러한 독특한 특성은 종양 세포의 특이적 표적화를 가능하게 한다.
상기에 따라, GP73에 결합하는 본 발명의 항원-결합 분자, 구체적으로 항체는 하나 이상의 하기 특성들을 갖는다:　
a) 인간 GP73 (서열 번호:1)의 아미노산 36-55내의 에피토프에의 결합;
b) 인간 GP73의 아미노산 E50 내지 R55에서 추정되는 퓨린 절단 인식 모티프에 걸친 에피토프에의 결합;
c) 재조합 인간 GP73에의 결합;
d) 암 세포의 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
e) 간세포 암종 세포의 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
f) HepG2, Hep3B, HuH7, JHH-4, Alexander (PLC/PRF/5), HLE, HuCCT1로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
g) Hep-55.1C, Hepa1-6 (CRL-1830), BpRc1 (CRL-2217), B7IFi1 (CRL-2711), 4T1 (유방암)으로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 쥐과 (murine) GP73에의 결합;
h) PC3 및 DU145 (전립샘암), MDA-468 (유방암), SK-BR-3 (유방암), CaCo2, SW 480 및 HCT 113 (결장직장 암종), H1975 (폐암)으로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 인간 GP73에의 결합;
i) 인간 종양 조직 세포의 표면에서 내인성 인간 GP73에의 결합;
j) 악성 흑색종, 자궁내막 암종, 난소 암종, 위암으로부터 선택되는 인간 종양 조직 세포의 표면에서 내인성 인간 GP73에의 결합;
k) 백혈구, 구체적으로 이에 한정되지 않고 과립구, 림프구, 대식세포 및 수지상 세포의 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
l) 세포주 THP-1로부터의 골수성 백혈병 세포를 포함하는 골수 세포의 표면에서 내인성 GP73에의 결합; 및/또는
m) GP73 발현 세포의 표면에서 절단되지 않은 (uncleaved) GP73에의 결합 (a-l에 언급됨).
본 발명 내에서, 인간 GP73은 서열 번호: 1의 아미노산 서열 (전장 GP73 변이체 1)을 갖거나 또는 인간 GP73은 서열 번호: 1의 아미노산 11 - 401 (전장 GP73 변이체 2)을 포함한다. 서열 번호:1은 서열 번호:30을 포함하고, 반면 서열 번호:31 및 서열 번호:32는 각각 GP73의 쥐과 및 개과 (canine) 형태로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 분자는 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 이중특이성 항체, 또는 그의 항원-결합 부분, 설계된 안키린 반복 단백질 (DARPIN), 압타머 또는 다른 항체 모방체, 예컨대 아피바디 분자 (affibody molecules), 아필린 (affilins), 아피머 (affimers), 아피틴 (affitins), 알파바디 (alphabodies), 안티칼린 (anticalins), 아비머 (avimers), DARPins, 피노머 (fynomers), 쿠니츠 (kunitz) 도메인 펩티드, 모노바디 (monobodies)이다.
본 발명의 항체는, 그 중에서도, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 재조합 항체의 항원-결합 단편, 인간화 항체, 또는 파지 표면에서 나타나거나 또는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 표면에서 나타나는 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체일 수 있다. 상기에 따라, 본 발명의 항체는 인간 GP73의 아미노산 36-55 내의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 쥐과 GP73 및/또는 개과 GP73에 결합한다. 그러므로, 일 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 6에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 9에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 서열 번호: 4에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 5에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 6에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 VH 사슬 및 서열 번호: 7에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 8에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 9에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 VL 사슬을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 (a) 서열 번호: 2, 바람직하게는 서열 번호: 35의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 구체적으로 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VH 사슬 서열; 및 (b) 서열 번호: 3, 바람직하게는 서열 번호: 36의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 구체적으로 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 VL 서열을 포함한다. 부가의 일 구체예에서, 본 발명은, 항체가 서열 번호: 14에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 17에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는, 항체에 관한 것이다. 상기 가변 경쇄의 CDR3은 서열 번호: 44에 정의되는 바와 같을 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 12에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 13에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 14에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 15에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 16에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 17에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함할 수 있다. 다시, 상기 VL 사슬 서열의 CDR3은 또한 서열 번호: 44에 정의되는 바와 같을 수 있다. 더 부가의 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 10, 바람직하게는 서열 번호: 37의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37에 대해 90%, 구체적으로 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열; 및 서열 번호: 11, 바람직하게는 서열 번호: 38의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38에 대해 90%, 구체적으로 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 구체예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 상기 항체는 인간, 인간화, 또는 키메라 항체일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 상기 항체는 GP73에 결합하는 항체 단편일 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b, lgG3, lgG4, lgM, lgA1, lgA2, lgAsec, lgD, lgE일 수 있다. 본원에서 사용되는, "이소타입 (isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예컨대, lgM 또는 lgG1)를 나타낸다. 상기 항체는 전장일 수 있거나 또는 항원-결합 단편으로 예컨대 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgM, lgA1, lgA2, lgAsec, lgD 또는 lgE의 항체 불변 및/또는 가변 도메인만을 포함할 수 있거나 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편으로 구성될 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 28, 바람직하게는 서열 번호: 39의 아미노산 서열 (포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위한 서열 번호: 28의 변형된 버전) 또는 서열 번호: 28 또는 서열 번호: 39에 대해 90%, 구체적으로 95%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 분자, 구체적으로 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 GP73, 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항체의 가변 중쇄 (VH) 서열 및/또는 가변 경쇄 (VL) 서열 중 적어도 하나를 코딩하고, 상기 항체는 아미노산 서열 SSRSVDLQTRIMELEGRVRR (서열 번호: 30); SSRSVELQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 31); 및/또는 SSRSVDLQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 32)내의 에피토프에 결합한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하고, 상기 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 항체를 생산하는 방법은 본 발명의 숙주 세포를 본 발명의 항체를 효과적으로 생산하기에 적당한 조건하에 배양하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 피험체에게 SSRSVDLQTRIMELEGRVRR (서열 번호: 30); SSRSVELQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 31); 및 SSRSVDLQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 32)로부터 선택되는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 분자, 구체적으로 항체 및 EED 펩티드, 또는 세포독성제 또는 세포독성제의 프로드러그를 포함하는, 면역접합체에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 상기 항원-결합 분자 및 EED 펩티드를 포함하는 면역접합체는 식 Ab(-EEDL-EED 펩티드)를 가지며, 상기에서 Ab는 본 발명의 항체이고 및 EEDL은 링커이다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 EED 펩티드는 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 뎅기 바이러스 EED이다. 특정 구체예에서, 상기 항원-결합 분자는 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 EED 링커를 통해 EED 펩티드에 부착된다.
일부 구체예에서, 상기 면역접합체는 하기 식을 가지며:
Ab(-L-D) p
상기에서
Ab는 본 발명의 항체이고;
L은 링커이고;
D는 세포독성제이고;
p는 1 내지 8의 정수, 바람직하게는 1 내지 6의 정수, 더 바람직하게는 2 내지 5의 정수이다.
상기 세포독성제는 바람직하게 마이탄시노이드, 칼리케아미신, 아우리스타틴일 수 있는 돌라스타틴 (dolastatin) 유도체, 예컨대 MMAF (또한 본원에서 모노메틸아우리스타틴 F (monomethylauristatin F)라고 함), 및 네모루비신 유도체로부터 선택된다.
본 발명의 GP73 항체 약물 접합체 (또한 본원에서 "GP73 ADC" 또는 "ADC"라고 함)는 발린-시트룰린 링커를 통해 독소에 접합된, GP73에 대한 인간 모노클로날 항체, 구체적으로 본 발명의 항체를 포함한다.
D는 하기 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀:
Figure pat00007
;
및 그의 염 (예컨대, 약학적으로 허용가능한 염) 및 용매화물 (예컨대, 약학적으로 허용가능한 용매화물)일 수 있고, 상기에서:
물결선은 상기 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
점선은 이중 결합의 선택적 존재를 나타내고 (상기 이중 결합은, 예컨대, C1과 C2 사이 또는 C2와 C3 사이에 존재할 수 있음);
R2 및 R12는 각각 독립적으로 -H, -OH, =O, =CH2, -CN, -R, -OR, =CH-RD, =C(RD)2, -O-SO2-R, -CO2R, -COR, -O-SO2-H, -CO2H, -COH, 및 -할로겐으로부터 선택되고,
상기 RD는 독립적으로 -H, -CO2R, -C(O)R, CHO, CO2H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
R6, R9, R16 및 R19는 독립적으로 -H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
R7 및 R17은 독립적으로 -H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
Q는 독립적으로 -O-, -S- 및 -N(H)-로부터 선택되고;
R11은 -H 또는 -R이거나 또는, Q가 -O-인 경우, R11은 -SO3M일 수 있고, 상기 M은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 양이온이고;
R 및 R´은 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-8 헤테로시클일, C3-20 헤테로사이클 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 및, R 및 R'이 동일한 질소 원자에 결합되는 경우, R 및 R´은 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
R"은 C3-12 알킬렌 기이고, 상기에서 하나 이상의 탄소 원자는 O, NH 및 S로부터 선택되는 헤테로원자, 및/또는 선택적으로 치환되는 방향족 고리로 대체될 수 있고;
상기 방향족 고리는 5 또는 6개의 탄소 원자 및 N 또는 NH로부터 선택되는 하나 또는 2개의 헤테로원자를 포함하고,
X 및 X´은 독립적으로 O, S, 및 N(H)로부터 선택된다.
더 바람직하게, D는 하기 구조를 가지며
Figure pat00008
상기에서 n은 0 또는 1이다.
D는 또한 네모루비신 유도체일 수 있다. 이 경우에, D는 바람직하게 하기로부터 선택되는 구조를 갖는다:
Figure pat00009
; 및
Figure pat00010
.
본 발명의 면역접합체는 링커를 포함할 수 있고, 상기 링커는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 대안으로서, 상기 링커는 산-불안정성일 수 있고 및/또는 히드라존을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항체를 포함하는 면역접합체가 제공되고, 상기 면역접합체는 하기로부터 선택되는 화학식을 가지며:
Figure pat00011
및
Figure pat00012
,
상기에서 p는 1 내지 8, 바람직하게는 2 내지 5의 범위이고,
Ab는 상기에 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 약학적 제제는 부가의 치료제를 포함한다.
부가의 일 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 부가의 치료제를 포함한다.
다른 양상에서, GP73-포지티브 암을 갖는 피험체를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 피험체에게 본 발명의 항원-결합 분자, 바람직하게는 항체, 또는 본 발명의 면역접합체 또는 본 발명의 약학적 조성물의 유효한 양을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법에 사용되는 면역접합체는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 또는 네모르비신 (Nemorbicin) 또는 네모루비신 대사산물 (PNU) 또는 피롤로벤조디아제핀 (PDB) 또는 다른 독소에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 GP73-포지티브 암은 간암이다. 상기 방법은 개체에게 부가의 치료제로, 예를 들어 세툭시맙 (Cetuximab), 트라스투주맙 (Trastuzumab) 또는 소분자 예컨대 소라페닙 (Sorafenib), 수니티닙 (Sunitinib), 레고라피닙 (Regorafinib)과 같은 잠재적으로 상승효과적인 항체에 한정되지 않는 부가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다. 또한 각각의 GP73 포지티브 종양에 유효한 기존의 화학요법과 항체의 조합은 유익할 수 있다. 마지막으로, 상기 항체는 중재 (interventions) 과정, 예를 들어 외과적 절제술 또는 경동맥 화학색전술 (transcatheter arterial chemoembolization: TACE)과 같은 종양 색전술 절차에 부가될 수 있다.
또한, 본 발명의 항원-결합 분자, 바람직하게는 항체, 또는 본 발명의 면역접합체 또는 본 발명의 약학적 조성물이 GP73-포지티브 암을 치료하는데 사용하기 위해 제공된다.
일부 구체예에서, GP73-포지티브 세포의 증식을 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 개체에게 본 발명의 항원-결합 분자 또는 본 발명의 면역접합체의 유효한 양을, 상기 세포 표면에서 상기 항원-결합 분자 또는 면역접합체의 GP73으로의 결합을 허용하는 조건하에 투여하여, 이로 인해 상기 세포의 증식을 저해하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 증식을 저해하는 것은 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 웨스턴 블롯으로부터 선택되는 방법에 의해 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 GP73-포지티브 세포는 간암 세포이다.
일부 구체예에서, 생물학적 시료에서 인간 GP73을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 생물학적 시료를 본 발명의 항원-결합 분자와, 상기 항원-결합 분자의 자연 발생하는 인간 GP73으로의 결합을 허용하는 조건하에 접촉시키는 단계 및 상기 생물학적 시료에서 항원-결합 분자와 자연 발생하는 인간 GP73 사이에서 복합체가 형성되는지를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 검출하는 단계는 면역조직화학, 면역형광 이미징, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 및 형광-활성화된 세포 분류로부터 선택되는 방법을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 간암 세포, 자궁내막 암종 세포, 난소 암종 세포 또는 흑색종 세포를 포함하는 시료일 수 있다.
도 1은 정상 및 질병 및 종양 조직에서 GP73의 발현을 나타낸다. GP73 발현은 Sigma 및 Santa Cruz로부터의 폴리클로날 토끼 및 폴리클로날 염소 항체에 의해 결정되었다.
도 2 종에 대한 에피토프: 다양한 종들에서 GP73 항원의 상동성이 개시되어 있다.
도 3a GP73 단백질의 조직도. GP73의 세포내 부분은 iGP73으로 나타내었다. GP73의 막횡단 부분은 tGP73으로 나타내었다. rGP73은 단백질분해 절단후에 세포막에 결합되고, 또한 이후에 상기 세포로 내재화되는 세포외 공간에 존재하는 GP73의 잔류물을 나타낸다. 이는 본 발명의 항원-결합 분자, 구체적으로 항체의 특정 에피토프이다. sGP73은 GP73의 절단된 가용성 부분이다. 아미노산 N109, N144, C159, C170, O218, O235 및 N398에서 추정되는 2차 변형 부위가 표시되어 있다.
도 3b 골지체로부터 세포막으로 세포외유출 (exocytosis)에 의해 운반되는 GP73의 도식도. 특정 조건, 예컨대 염증 하에, GP73은 잔기 55에서 단백질분해 절단에 의해 가용성 GP73 (sGP73) 및 GP73의 잔유물, 즉 rGP73으로 처리되고, 이는 세포외 공간에 존재하고 절단 후에 세포막에 결합된다.
도 3c 항체 G2-2 및 G2-1의 결합 부위를 나타내는 GP73의 도식도. 항체의 결합을 통해, 잔기 55에서 단백질분해 절단 부위가 차단된다.
도 3d GP73의 치료 표적으로서의 도식도. A 절단되지 않은 GP73 B 절단된 GP73 C 단백질분해 절단 후에 rGP73은 세포내이입 (endocytosis)에 의해 상기 세포로 회수된다. 네오-항원 (neo-antigen) rGP73은 특정 항체, 예컨대 G2-2에 의해 결합된다 D rGP73 및 항체 또는 ADC는 세포내이입에 의해 세포로 동시-운반된다 (co-transported). 상기 ADC의 세포내 전위 후에, 별표로 표시되는 독소는 세포 손상 및 사멸을 유도한다.
도 4 - A는 인간 단백질 아틀라스 (atlas)에 공개되어 있는 면역형광 사진을 나타내었다. Sigma로부터의 폴리클로날 토끼 유래된 항체 (HPA010638)는 GP73에 mG2-2보다는 C-말단에 더 결합한다. 상기 항체의 통상적인 골지 염색이 개시되어 있다 (좌향 화살표). B는 Alexander 세포에서 C-말단 항체 (Santa Cruz로부터의 sc-48010) (좌향 화살표) 및 mG2-2 (하향 화살표)를 사용하는 이중 염색을 나타내었다. 골지체에서는 염색이 중첩되어 있지만 (2개의 팁이 터칭된 화살표), mG2-2 (하향 화살표)의 외부막 염색은 배제한다.
도 5 항-rGOLPH 항체 G2-2 및 대조군으로 조직의 면역조직화학적 염색. A 정상의 간 B 간염의 간 C 및 D 간세포 암종 (HCC)의 파라핀 포매된 조직들을 쥐과 G2-2 (mG2-2) (A,B,C) 또는 항-GP73 항체 MO6A (Sigma)로 염색하고 그 다음에 항-마우스 항체로 2차 염색하였고, 실시예 3에 개시된 바와 같이 40x 배율의 현미경으로 검사하였다.
도 6 세포주 RAMOS (B-세포 기원), HEK 293 (인간 배아 신장 기원) 및 HEK 293 발현 GP73-myc (HEK 293 GP73-myc)를 G2-2, G2-1, G2-4, 항-Myc 항체 또는 항-CD19 항체 (후자는 ebiosciences로부터 유래됨)로 염색하였다. 세포의 표면 염색의 검출은 연속선으로 나타내었고, 2차 항체 대조군 검출만을 실시예 4에 개시된 바와 같이 대시선으로 나타내었다.
도 7 인간 간세포 암종 세포주 HuH7 및 JHH4에서 다양한 항체 (mG2-2, G2-1, G2-4 및 폴리클로날 염소 항체 SC-48010)로 테스트된 GP73 표면 발현. 각 세포주의 확실성 (positivity)은 실시예 4에 개시된 바와 같이 평균 형광 세기 (mean fluorescence intensity: MFI)로 표시된다.
도 8 경쟁 ELISA 분석
펩티드 ELISA는 결합 항체로서 호스 래디쉬 (horse radish) 퍼옥시다제 표지된 G2-1 (G2-1-HRP) 또는 G2-2 (G2-2-HRP) 및 경쟁 항체로서 G2-1 또는 G2-2를 사용하여 수행되었다. G2-2-HRP와 G2-1 및 G2-1-HRP와 G2-2에 대한 경쟁적 저해를 나타내었다 (검정색 삼각형). GP73의 펩티드 AA 36-55에의 결합은 포지티브 대조군으로 제공되었고 (검정색 원형), 네가티브 대조군은 실시예 5에 개시된 바와 같이 관련이 없는 펩티드에의 결합이었다 (검정색 다이아몬드형).
도 9 G2-1 및 G2-2의 pH 의존성 펩티드 결합
펩티드 ELISA는 GP73의 펩티드 AA 36-55로의 결합의 pH 의존성에 대해 테스트를 수행하였다. 두 항체들 G2-1 및 G2-2에 대한 안정한 결합은 실시예 5에 개시된 바와 같이 pH 7.4 내지 5.4의 범위에서 나타났다.
도 10 유세포 분석법에 의한 G2-2 및 G2-1의 내재화 실험
G2-2의 쥐과 간암 (hepatoma) 세포주 및 인간 전립샘암 세포주 DU145로의 내재화는 유세포 분석법에 의해 테스트되었다. 15분 후에 G2-2 및 G2-1의 세포 표면 검출은 30% 아래로 떨어졌고, 이는 실시예 6에 개시된 바와 같이 37℃에서 빠르게 내재화되는 것을 나타낸다.
도 11 세포 환경에 따른 G2-2 및 대조군의 내재화
항체 내재화는 각 항체에 커플링되는 pH-민감성 염료 pHrodo Green을 사용하여 FACS에 의해 측정되었다. 상기 염료는 pH 5.4 이하에서만 즉 상기 항체의 엔도솜으로의 내재화 및 전위 후에 형광을 나타내었다. 가용성 GP73을 포함하는 조건화된 배지와 사전인큐베이션 (preincubation)으로 sGP73의 c-말단 부분에 결합하는 항체인 G2-4의 내재화를 감소시켰다. rGP73에 결합하는 G2-2의 내재화는 실시예 6에 개시된 바와 같이 변경되지 않았다.
도 12 GP73에의 G2-2 또는 G2-1 결합에 따른 퓨린 절단 정량화
0 유닛 내지 3 유닛 범위의 퓨린을 사용하여 GP73의 퓨린 절단의 측정을 나타내었다. G2-2 또는 G2-1과의 사전인큐베이션으로 실시예 7에 개시된 바와 같이 퓨린 절단 (3 U 및 1.5 U)에서 유의한 감소를 유도하였다.
도 13a 다양한 항체로 처리한 후에 HuH7 세포 (인간 간세포 암종)의 증식. HuH7 세포는 G2-2, G2-2 플러스 세툭시맙, mG2-2, mG2-2 플러스 세툭시맙, 세툭시맙 또는 대조군 항체 각각의, 0.125 mg/ml 내지 2 mg/ml의 증가되는 농도로 처리되었다. 증식하는 세포는 72시간 후에 측정되었다. 세포 증식은 항체 농도에 따라 감소되었다. 이러한 효과는 실시예 8에 개시된 바와 같이 Fc 부분 즉 G2-2에서 인간 IgG1 또는 mG2-2에서 쥐과 IgG2a와는 무관했다.
도 13b 다양한 항체로 처리한 후에 HuH7 세포 (인간 간세포 암종), 4T1 세포 (쥐과 유방 암종) 및 CaCo2 세포 (인간 결장직장 암종)의 증식. 상기 3개의 세포주는 G2-1, G2-1 플러스 세툭시맙, 세툭시맙, 베바시주맙 (Bevacizumab) 또는 베바시주맙 플러스 세툭시맙 2 mg/ml 전체로 처리되었다. 증식하는 세포는 72시간 후에 측정되었다. 실시예 8에 개시되는 바와 같이 HuH7 세포에서 G2-1 및 세툭시맙의 부가적 효과가 있었다.
도 14 G2-2에 연결된 말아미드 (Malamide) 교환 링커에 부착된 MMAF로 구성된 항체 약물 접합체가 HuH7 세포로 첨가되었다. 우측 곡선 (삼각형)은 약물 성분 IC50 277nM로 결정되는 MMAF의 독성을 나타내었다. 가운데 곡선 (사각형)은 항체 성분으로 결정되는 6.34nM의 IC50을 갖는 G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF를 나타내었다. 좌측 곡선 (원형)은 실시예 9 및 10에 개시되는 바와 같이 약물 성분에 의해 결정되는 0.124nM의 IC50을 갖는 G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF를 나타내었다.
도 15 HuH7 이종이식 마우스 모델의 종양 성장 모델. 피하 인간 간세포 암종 (HuH7)을 보유하는 Bulb/c 네이키드 마우스를 0일째에 2 mg/kg G2-2-PNU (ADC) 및 7일째에 1mg/kg G2-2-PNU, 0일째 및 7일째에 2 mg/g G2-2 (네이키드 mAB), 1일째 및 7일째에 G2-2 (네이키드 mAB) 및 PNU (ad mix) 또는 PBS (비히클) 2회로 처리하였다. ADC와 비히클 그룹 사이에서 종양 성장의 차이는 실시예 11에 개시된 바와 같이 21일째에 통계적으로 유의했다 (one-way ANOVA p=0.5; SPSS 18.0).
도 16 HUH7 이종이식 마우스 모델의 Kaplan Meyer 생존 곡선. ADC와 비히클 그룹 사이의 생존의 차이는 통계적으로 유의했다 (Log Rank/Breslow/Tarone-Ware p=0.02; SPSS 18.0).
도 17 면역조직화학: 난소 암종을 항-GP73 항체 MO6 (Sigma) 및 mG2-2로 염색하고 그 다음에 항-마우스 항체로 2차 염색하였고, 실시예 3에 개시된 바와 같이 100x 배율의 현미경으로 검사하였다.
도 18 면역조직화학: 자궁내막 암종을 MO6 및 mG2-2로 염색하고 그 다음에 항-마우스 항체로 2차 염색하였고, 실시예 3에 개시된 바와 같이 100x 배율의 현미경으로 검사하였다.
도 19 면역조직화학: 흑색종을 MO6 및 mG2-2로 염색하고 그 다음에 항-마우스 항체로 2차 염색하였고, 실시예 3에 개시된 바와 같이 40x 배율의 현미경으로 검사하였다.
도 20 실시예 13에 개시된 결합 분석에 사용되는 재조합 단백질 및 펩티드를 나타내었다. C-말단 10xHis-Tag를 갖는 전장 GP73 (AA 1 - 401)은 AA 55에서 단백질분해 절단 후에 sGP73-His로 분비되었다. 그러므로, sGP73-His는 C-말단 10xHis-Tag를 갖는 AA 56 내지 401을 포함한다. 그에 반해서, 세포내 부분 (iGP73 AA 1-12) 및 막횡단 도메인 (tGP73 AA 13 - 35)이 결여된 돌연변이된 변이체 (R52A)인 GP73 AVRR이 분비되지만 절단되지 않았고, 그러므로 이는 AA 36 내지 401 및 C-말단 10xHis-Tag를 포함한다.
도 21(a-c) GP73-His AVRR에 대해 sGP73-HIS에서 이소타입 대조군 항체 (a), 특허 CN105734059A에 개시된 바와 같은 모노클로날 쥐과 항체인 8A10 (IgG2a) (b) 및 G2-2opti (IgG2a) (c)의 결합 곡선으로, 후자 만이 실시예 13에 개시된 바와 같이 청구된 에피토프 AA 36 내지 55를 포함하는 GP73을 포함한다.
도 22(a-c) 실시예 13에 개시된 바와 같이 관련되지 않은 대조군 펩티드에 대해, 청구된 에피토프인, 펩티드 rGP73 (GP73 AA 36 내지 55)에서 이소타입 대조군 항체 (a), 특허 CN105734059A에 개시된 바와 같은 모노클로날 쥐과 항체인 8A10 (IgG2a) (b) 및 G2-2opti (IgG2a) (c)의 결합 곡선.
도 23 베바시주맙 또는 G2-2opti (IgG1)로 293HEK GP73-His 전장 세포의 처리 후에 세포 배양 상등액에서 sGP73의 측정. 퓨린 절단은 sGP73이 상등액에 나타나기 위한 전제조건이다. 실시예 14에서 개시된 바와 같이 증가하는 농도들의 G2-2opti (IgG1)는 퓨린 절단을 차단하였고, GP73 농도를 감소시켰다.
도 24 다양한 인간 암으로부터의 세포주를 1 mg/ml의 항체 G2-2opti (IgG1) 또는 G2-2opti-EED (IgG1) 또는 세툭시맙 또는 베바시주맙으로 96시간 동안 처리하였다. 처리되지 않은 대조군의 증식과 비교하여 상대 증식 (%)을 나타내었다. 실시예 15에 개시된 바와 같이 테스트된 암 대상체는 결장직장암 (HCT116, K-Ras 돌연변이 G12V를 갖는 SW40, CaCo2), 난소암 (SKOV3), 간암 (HUH7, Hepa1-6), 전립샘암 (DU145, PC3) 및 폐암 (EGFR 돌연변이 T790M, L858R을 갖는 H1975)이었다.
본원에서 사용되는, "항원 결합 분자"는 항원에 특이적으로 또는 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자이다. 결합 분자는 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있거나 또는 상기일 수 있다. 항-GP73 결합 분자는 상기에 더 상세하게 개시되는 바와 같이 에피토프인 특이적 인식 부위에서 GP73 항원에 결합하는 분자, 예컨대 항-GP73 항체 또는 그의 단편이다. 즉, 본 발명의 항원-결합 분자는 서열번호 30, 31 및/또는 32 중 어느 하나의 아미노산 서열내의 에피토프에 결합한다. 다른 항-GP73 결합 분자는 또한 다가 분자, 다중-특이성 분자 (예컨대, 디아바디), 융합 분자, 압티머, 아비머, 또는 다른 자연 발생하거나 또는 재조합으로 형성된 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 예시되는 항원-결합 분자는 항체-형 분자를 포함한다. 항체-형 분자는 표적 분자에 결합하여 기능을 나타낼 수 있는 분자이고 (예컨대, Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469; Protein Science 2006, 15:14-27 참조), 예를 들어, DARPins (WO 2002/020565), 아피바디 (WO 1995/001937), 아비머 (WO 2004/044011; WO 2005/040229), 아드넥틴 (Adnectin) (WO 2002/032925) 및 피노머 (WO　2013/135588)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항-GP73 항체" 및 "GP73에 결합하는 항체" 또는 간단히 "항체"는, 상기 항체가 GP73을 표적으로 할 때 진단제 및/또는 치료제로서 유용할 수 있도록, 충분한 친화도로 GP73에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 일 구체예에서, 항-GP73 항체의 관련되지 않은, 비-GP73 단백질에의 결합의 정도는, 예컨대, 방사성면역분석 (radioimmunoassay: RIA)에 의해 측정될 때 상기 항체의 GP73에의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예에서, GP73에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nm, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구체예에서, 항-GP73 항체는 다양한 종들로부터의 GP73 중에 보존되는 GP73의 에피토프에 결합한다. 상기에서 더 상세히 개시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 GP73 세포외 부분 내의 정의된 에피토프에 결합한다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 서열 번호: 30, 31 및/또는 32의 아미노산 서열내의 에피토프에 결합한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 광의로 사용되고, 상기가 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체 (예컨대, 이중특이성 항체), 완전-인간 항체 및 항체 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다. 본 발명내에 항체는 또한 키메라 항체, 재조합 항체, 재조합 항체의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 파지의 표면에서 나타나거나 또는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 표면에서 나타나는 항체일 수 있다.
항체의 "항원-결합 단편"은 온전한 항체 이외에, 온전한 항체의 일부를 포함하고 및 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자 (예컨대 scFv); 및 항체 단편들로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.
단백질의 정의된 영역 내에 "에피토프에 결합하는 항체"는 상기 단백질에 결합하기 위한 상기 영역내에 하나 이상의 아미노산의 존재를 필요로 하는 항체이다.
특정 구체예에서, 단백질의 정의된 영역 내에 "에피토프에 결합하는 항체"는 돌연변이 분석에 의해 확인되고, 상기에서 단백질의 아미노산은 돌연변이되고, 상기 항체의 결과의 변경된 단백질 (예컨대, 에피토프를 포함하는 변경된 단백질)에의 결합은 변경되지 않은 단백질에의 결합의 적어도 20%인 것으로 결정된다. 일부 구체예에서, 단백질의 정의된 영역 내에 "에피토프에 결합하는 항체"는 돌연변이 분석에 의해 확인되고, 상기에서 단백질의 아미노산이 돌연변이되고, 상기 항체의 결과의 변경된 단백질 (예컨대, 에피토프를 포함하는 변경된 단백질)에의 결합은 변경되지 않은 단백질에의 결합의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%인 것으로 결정된다. 특정 구체예에서, 상기 항체의 결합은 FACS, WB 또는 적절한 결합 분석 예컨대 ELISA에 의해 결정된다.
본 발명의 맥락에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기에 정의되는 바와 같은 "항-GP73 항체 또는 그의 항원-결합 단편"인 한, 특별히 제한되지 않는다. 그러므로, 상기 항체는 서열 번호: 30, 31 및/또는 32의 아미노산 서열내에 에피토프와 특이적으로 결합하는/이를 특이적으로 인식하는/이와 상호작용하는 임의의 항체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 제공되는 임의의 특정 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "에 결합하는"은 적어도 2개의 "항원-상호작용-부위"가 서로 결합 (상호작용)하는 것으로 정의한다. 용어 "항원-상호작용-부위"는, 본 발명에 따라, 폴리펩티드의 모티프, 즉 본 발명의 항체의 일부 또는 항원-결합 단편을 정의하고, 이는 GP73의 특정 항원 또는 항원의 특정 그룹과의 특이적 상호작용의 능력을 나타내는 것이다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. 용어 "특이적으로 인식하는"은 본 발명에 따라 상기 항체가 본원에 정의된 바와 같이 GP73의 적어도 2개의 아미노산과 특이적으로 상호작용 및/또는 이에 결합할 수 있는, 구체적으로 서열번호: 30, 31 및/또는 32의 아미노산 서열내의 적어도 2개의 아미노산과 상호작용/이에 결합할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 따라 사용되는 용어 "특이적 상호작용"은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 유사한 구조를 갖는 (폴리) 펩티드와 교차-반응하지 않거나 또는 필수적으로 교차-반응하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호: 30, 31 및/또는 32의 아미노산 서열내의 특정 아미노산 서열에 의해 형성된 GP73의 구조에 특이적으로 결합/이와 상호작용한다. 이러한 분자의 특정 예가 본원에 제공된다.
항원-결합 분자, 구체적으로 조사연구 중에 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 패널의 교차-반응성 (cross-reactivity)은, 예를 들어, 통상적인 조건하에 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 패널 (예컨대, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) and Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999) 참조)의 관심있는 (폴리)펩티드뿐만 아니라 다수의 더 많거나 또는 더 적은 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 긴밀하게 관련된 (폴리)펩티드에의 결합을 평가함으로써, 테스트될 수 있다. 본원에 정의된 바와 같이 GP73의 특정 구조, 예컨대, 본원에 정의된 바와 같은 GP73의 특정 에피토프 또는 (폴리) 펩티드/단백질에 결합하지만, 그러나 동일한 GP73의 다른 에피토프 또는 (폴리) 펩티드에 결합하지 않거나 또는 필수적으로 결합하지 않는 이러한 구조체 (즉 항체, 그의 항원-결합 단편 등)는, 관심있는 에피토프 또는 (폴리) 펩티드/단백질에 특이적인 것으로 고려되고, 본원에 제공된 방법에 따라 추가적인 연구를 위해 선택된다. 상기 방법은, 그 중에서도, 구조적으로 및/또는 기능적으로 긴밀하게 관련된 분자와 결합 연구, 차단 및 경쟁 연구를 포함할 수 있다. 상기 결합 연구는 또한 FACS 분석, 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance: SPR, 예컨대 BIAcoreO), 분석용 초원심분리, 등온 적정 열량계, 형광 비등방성측정 (fluorescence anisotropy), 형광 분광광도계 또는 방사성표지된 리간드 결합 분석을 포함한다.
따라서, 특이성은 당 분야에 알려져 있는 방법 및 본원에 개시되는 방법에 의해 실험으로 결정될 수 있다. 이러한 방법으로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-테스트 및 펩티드 스캔을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는, 실질적으로 동일한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내고, 즉 상기 집단을 포함하는 개별의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는, 단일 항원 부위에 관련되는, 매우 특이적이다. 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 필수적으로 오염되지 않은, 하이브리도마 배양 (hybridoma culture)에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유익하다. 상기 변형된 "모노클로날"은, 항체의 특성이 실질적으로 동일한 항체 집단인 것을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 Kohler, Nature 256 (1975), 495에 개시된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리클로날 항체"는, 하나 이상의 다른, 비-동일한 항체 중에서 또는 이의 존재하에 생산되는 항체를 나타낸다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 비-동일한 항체를 생산하는 몇몇의 다른 B-림프구의 존재하에 B-림프구로부터 생산된다. 통상적으로, 폴리클로날 항체는 면역화된 동물로부터 직접 수득된다.
본원에서 사용되는 용어 "완전-인간 항체 (fully-human antibody)"는 인간 면역글로불린 단백질 서열 만을 포함하는 항체를 나타낸다. 완전 인간 항체는, 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우 쥐과 탄수화물 사슬을 포함할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "쥐과 항체"는 마우스/쥐과 면역글로불린 단백질 서열 만을 포함하는 항체를 나타낸다. 대안으로서, "완전-인간 항체"는, 래트 (rat), 래트 세포, 래트 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되는 경우 래트의 탄수화물 사슬을 포함할 수 있다. 유사하게, 용어 "래트 항체"는 래트의 면역글로불린 서열 만을 포함하는 항체를 나타낸다. 완전-인간 항체는 또한, 예를 들어, 완전 인간 항체를 생산 및 스크리닝할 수 있는 널리 사용되는 스크리닝 기술인 파지 디스플레이 (phage display)에 의해 생산될 수 있다. 또한 파지 항체는 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 방법은 예를 들어, US 5,403,484, US 5,969,108 및 US 5,885,793에 개시되어 있다. 완전-인간 항체를 개발할 수 있는 다른 기술로는 마우스 하이브리도마 기술의 변형을 포함한다. 마우스를 그들 자신의 마우스 유전자와 교환하여 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하도록 유전자이식하였다 (예를 들어, US 5,877,397 참조).
용어 "키메라 항체"는, 다른, 인간 또는 비-인간 종 (예컨대, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭)으로부터의 항체 영역 (예컨대, 불변 영역)과 융합 (fused) 또는 키메라화된 (chimerized) 본 발명의 가변 영역을 포함하는 항체를 나타낸다.
용어 항체는 또한 재조합 인간 항체, 이종 항체 및 헤테로하이브리드 (heterohybrid) 항체에 관한 것이다. 용어 "재조합 (인간) 항체"는 재조합 수단에 의해, 제조, 발현, 형성 또는 단리되는 모든 인간 서열 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합적 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 형성 또는 단리되는 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포 (germline) 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 및 불변 영역 (존재하는 경우)을 갖는다. 그러나, 이러한 항체는 인 비트로에서 돌연변이화 (mutagenesis) (또는, 인간 Ig 서열에 대해 유전자이식된 동물이 사용될 때, 인 비보에서 체세포 돌연변이화 (somatic mutagenesis))될 수 있어서, 그러므로 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래 및 이와 관련되지만, 인 비보에서 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열이다.
"이종 항체"는 이러한 항체를 생산하는 유전자이식 비-인간 생물체와 관련하여 정의된다. 상기 용어는, 유전자이식 비-인간 동물로 구성되지 않는 생물체에서, 및 일반적으로 상기 유전자이식 비-인간 동물의 것과는 다른 종으로부터 발견되는 항체에 해당하는 아미노산 서열을 갖거나 또는 핵산 서열을 코딩하는 항체를 나타낸다.
용어 "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 생물체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 나타낸다. 예를 들어, 쥐과 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다. 헤테로하이브리드 항체의 예로는 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
용어 항체는 또한 인간화 항체에 관한 것이다. 비-인간 (예컨대 쥐과 또는 토끼) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 종종, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (complementary determining region: CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 역량 (capacity)을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체) 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 예에서, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 외래의 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정제 및 최적화하기 위해 만들어졌다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는, 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하거나 또는 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열의 FR 영역인, 적어도 하나, 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이다. 상기 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 수 있다. 더 자세한 내용은: JonesNature 321 (1986), 522-525; Reichmann Nature 332 (1998), 323-327 and Presta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596을 참조한다.
항체의 인간화에 대한 보편적인 방법은 CDR 이식 (grafting)을 포함하며, 여기서 비-인간 '공여자' 항체로부터의 기능적 항원-결합 부위는 인간 '수용체 (acceptor)' 항체로 이식된다. CDR 이식 방법은 당 분야에 알려져 있고, 예를 들어, US 5,225,539, US 5,693,761 및 US 6,407,213에 개시되어 있다. 다른 관련된 방법은 유전자 재배열 및 유전자 전환을 수행할 수 있는 하나 이상의 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하도록 유전자 조작된 유전자이식 동물로부터의 인간화 항체의 생산이 있다 (예를 들어, US 7,129,084 참조).
따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 "항체"는 전체 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이러한 면역글로불린 분자의 일부 (즉, "그의 항원-결합 단편")에 관한 것이다. 또한, 상기 용어는, 상기에서 토의된 바와 같이, 변형된 및/또는 변경된 항체 분자에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 재조합으로 또는 합성으로 생성된/합성된 항체에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 온전한 항체뿐만 아니라 그의 항체 단편, 예컨대, 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2에 관한 것이다. 상기 용어 항체는 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 완전-인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, CDR-이식된 항체 및 항체 구조체, 예컨대 단쇄 Fvs (scFv) 또는 항체-융합 단백질을 포함한다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은, 본 발명의 맥락에서, 항체의 VH 및 VL 도메인을 가지며, 상기 도메인은 단일의 폴리펩티드 사슬내에 존재한다. 일반적으로, 상기 scFv 폴리펩티드는 상기 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있는 VH와 VL 도메인들 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. 단쇄 항체의 생산을 위해 개시된 기술은, 예컨대, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y. (1994), 269-315에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 "Fab 단편"은 하나의 경쇄와 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 이루어진다. 상기 Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디술피드 (disulfide) 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 상기 2개의 중쇄 단편은 2 이상의 디술피드 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄와 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인들 사이의 영역을 포함하는 하나의 중쇄의 일부를 포함하여, 사슬간 디술피드 결합은 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄들 사이에서 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH2 도메인들 사이에 불변 영역의 일부를 포함하여, 사슬간 디술피드 결합이 상기 2개의 중쇄들 사이에서 형성되는 2개의 중쇄를 포함한다. 그러므로 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄들 사이에서 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 이루어진다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 그러나 불변 영역은 결여되어 있다.
본 발명에 따라 사용되는 항체, 항체 구조체, 항체 단편, 항체 유도체 (모두 Ig-유래됨) 또는 그의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)은, 예를 들어, 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들)을 사용하는 당 분야에 알려져 있는 기존의 기술 및/또는 당 분야에 알려져 있는 다른 변형(들)을 단독 또는 조합하여 추가로 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열에 기반하는 DNA 서열에 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있고; 예컨대, Sambrook (1989), loc. cit를 참조한다. 용어 "Ig-유래된 도메인"은 구체적으로 적어도 하나의 CDR을 포함하는 (폴리) 펩티드 구조체에 관한 것이다. 상기 인용된 Ig-유래된 도메인의 단편 또는 유도체는, 상기 항체 분자의 일부이고 및/또는 화학적/생화학적 또는 분자 생물학적 방법에 의해 변형되는 (폴리) 펩티드로 정의된다. 해당하는 방법이 당 분야에 알려져 있고, 그 중에서도 laboratory manuals에 개시되어 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition (1989) and 3rd edition (2001); Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994); Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press (1997); Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002) 참조).
본원에서 사용되는 용어 "CDR"은 "상보성 결정 영역"에 관한 것이고, 이는 당 분야에 잘 알려져 있다. 상기 CDRs은 상기 분자의 특이성을 결정하고 또한 특정 리간드와 접촉하는 면역글로불린의 일부이다. 상기 CDRs은 상기 분자의 대부분의 가변 부분이고 또한 상기 분자의 다양성에 기여한다. 각 V 도메인에 3개의 CDR 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있다. CDR-H는 가변 중쇄의 CDR 영역을 나타내고, CDR-L은 가변 경쇄의 CDR 영역과 관련이 있다. VH는 가변 중쇄를 의미하고, VL은 가변 경쇄를 의미한다. Ig-유래된 영역의 CDR 영역은 Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917 or Chothia Nature 342 (1989), 877-883에 개시된 바와 같이 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 본원에 개시된 항체 분자는 완전 항체 (면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgA1, IgGA2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 또는 IgE), F(ab)-, Fab'-SH-, Fv-, Fab'-, F(ab')2- 단편, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 완전 인간 항체, 2가 항체-구조체, 항체-융합 단백질, 합성 항체, 2가 단쇄 항체, 3가 단쇄 항체 및 다가 단쇄 항체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
"인간화 접근법"은 당 분야에 잘 알려져 있고, 구체적으로 항체 분자, 예컨대 Ig-유래된 분자에 대해 개시되어 있다. 용어 "인간화"는 비-인간 항체로부터 유래된 서열의 일부를 포함하는 비-인간 (예컨대, 쥐과) 항체 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFvs, 또는 항체의 다른 항원-결합 부분 서열)의 인간화 형태를 나타낸다. 인간화 항체는, 인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 원하는 결합 특이성, 친화도 및 역량을 갖는 비-인간 종 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨, 인간 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이고, 상기에서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 해당하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 FR 영역이다. 상기 인간화 항체는 최적으로 또한 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 통상적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 것이다; 그 중에서도, Jones et al., Nature 321 (1986),522-525, Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992),593-596 참조한다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 항체의 본래의 결합 활성을 여전히 보유하고 있는 비-인간 공급원으로부터 인간화 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산을 갖는다. 항체/항체 분자의 인간화 방법은 Jones et al., Nature 321 (1986),522-525; Reichmann et al., Nature 332 (1988),323-327; 및 Verhoeyen et al., Science 239 (1988), 1534-1536에 더 상세하게 개시되어 있다. 인간화 항체, 예컨대 EpCAM에 대한 항체의 특정 예로는 당 분야에 알려져 있고, 예컨대 (LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 1562 및 Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 847)을 참조하다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 항체 분자 또는 그의 항원-결합 단편이 제공되고, 이는 인간화되어 있고 또한 약학적 조성물에 성공적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 특이성은 상기에 정의된 바와 같은 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열의 특성뿐만 아니라 상기 항체가 결합될 수 있는 에피토프에 의해 발현될 수 있다. 그러므로, 본 발명은, 일 구체예에서, 본 발명의 항체, 바람직하게는 항체 G2-2opti와 동일한 에피토프를 인식하는 항-GP73 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 실시예 부분에 개시된 바와 같이, 상기 에피토프는 서열 번호: 1로 정의되는 GP73의, 서열번호: 30, 31 및/또는 32의 아미노산 서열, 즉 SSRSVDLQTRIMELEGRVRR (서열 번호: 30), SSRSVELQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 31) 및/또는 SSRSVDLQTRIVELEGRVRR (서열 번호: 32) 내에 위치하는 선형 에피토프이다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프는 서열 번호: 30의 아미노산 서열 RIMELEGRVRR, 더 바람직하게는 아미노산 서열 EGRVRR 내에 존재한다.
당업자라면 상기 에피토프는 GP73 단백질 중에 포함될 수 있고, 또한 그의 분해 산물에 포함될 수 있거나 또는 화학적으로 합성된 펩티드일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 아미노산 위치는 단지 상기 GP73 단백질의 서열 중에 상응하는 아미노산 서열의 위치를 나타내기 위해 지시된다. 본 발명은 상기 에피토프를 포함하는 모든 펩티드를 포함한다. 상기 펩티드는 길이가 100개 초과의 아미노산을 갖는 폴리펩티드의 일부일 수 있거나 또는 100개 미만, 바람직하게는 50개 미만, 더 바람직하게는 25개 미만의 아미노산, 좀 더 바람직하게는 16개 미만의 아미노산을 갖는 작은 펩티드일 수 있다. 이러한 펩티드의 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 (예컨대, 베타-아미노산, 감마-아미노산, D-아미노산) 또는 그의 조합일 수 있다. 또한, 본 발명은 에피토프들 각각의 레트로-인버소 펩티드 (retro-inverso peptides)를 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 비결합 또는 결합될 수 있다. 상기는, 예컨대, 소분자 (예컨대, 약물 또는 형광단), 고-분자량 폴리머 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리에틸렌 이민 (PEI), 히드록시프로필메타크릴레이트 (HPMA) 등) 또는 단백질, 지방산, 당 모이어티에 결합될 수 있거나 또는 막에 삽입될 수 있다.
문제의 항체 및 본 발명의 항체가 동일한 에피토프를 인식할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해서, 하기 경쟁 연구가 수행될 수 있다: 3 moi (multiplicity of infection)로 감염된 Vero 세포를 20시간 후에 경쟁인자로서 문제의 항체의 다양한 농도와 1시간 동안 인큐베이트하였다. 제2 인큐베이션 단계에서, 본 발명의 항체는 100 nM의 일정 농도로 적용되고 및 그의 결합은 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 형광-표지된 항체를 사용하여 유세포-분석으로 검출된다. 문제의 항체의 농도에 반-비례로 수행되는 결합은 두 항체들이 동일한 에피토프를 인식하는 것을 나타낸다. 그러나, 사용될 수 있는 많은 다른 분석이 당 분야에 알려져 있다.
본 발명은 또한 GP73의 네이티브 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드에 대한 특정 항체의 생산에 관한 것이다. 상기 생산은, 예를 들어, 동물, 예컨대 마우스의 면역화에 기반한다. 그러나, 항체/항혈청의 생산을 위한 다른 동물도 본 발명내에 포함된다. 예를 들어, 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 토끼, 마우스, 염소, 당나귀 등에 의해 생산될 수 있다. GP73의 상응하게 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터로 서브클로닝 (subcloned)될 수 있고, 상기 재조합 폴리펩티드는 발현할 수 있는 생물체, 예를 들어 박테리아에서 발현될 것이다. 그러므로, 상기 발현된 재조합 단백질은 마우스의 복강내로 주사될 수 있고 및 결과의 특정 항체는, 예를 들어, 심장내 (intra-cardiac) 혈액 천자에 의해 제공되는 마우스 혈청으로부터 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 첨부된 실시예에서 예시되는 바와 같이 DNA 백신 전략을 사용하여 네이티브 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드에 대한 특정 항체의 생산을 포함한다. DNA 백신 전략은 당 분야에 잘-알려져 있고, 리포솜-매개된 전달, 유전자 건 (gene gun) 또는 제트 주사 (jet injection) 및 근육내 또는 피내 주사를 포함한다. 그러므로, GP73의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 에피토프, 구체적으로 본원에 제공된 항체의 에피토프에 대한 항체는, GP73의 원하는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 에피토프, 구체적으로 본 발명의 항체의 에피토프를 발현하는 벡터를 근육내로 직접 주사하여 동물을 직접 면역화하여 수득될 수 있고, 이는 서열번호: 30, 31 및/또는 32의 아미노산 서열내에 있다. 수득된 특정 항체의 양은 ELISA를 사용하여 정량화될 수 있고, 이는 또한 본원에서 하기에 개시되어 있다. 항체를 생산하는 부가의 방법은 당 분야에 잘 알려져 있고, 예컨대 Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988을 참조한다.
그러므로, 지정된 분석 조건하에, GP73의 특정 항체 및 상응하는 에피토프가 서로 결합하고 및 시료 중에 존재하는 다른 성분에 상당한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에 표적 분석물에의 특정 결합은 특정 표적 분석물에 대한 그의 특이성에 대해 선택되는 결합 모이어티를 필요로 할 수 있다. 특정 항원과 특이적으로 반응하는 항체를 선택하기 위한 다양한 면역분석 포맷이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역분석은 분석물과 특이적으로 면역반응하는 모노클로날 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다. Shepherd and Dean (2000), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press and/or Howard and Bethell　(2000) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Crc. Pr. Inc. for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity를 참조한다. 통상적으로 특이적 또는 선택적 반응은 노이즈에 대한 배경 신호가 적어도 2배, 더 통상적으로 배경보다 10배 이상 내지 100배 더 클 것이다. 당업자는 신규한 폴리펩티드에 대한 특정 결합 분자를 제공하고, 이를 생성할 수 있다. 특이적 결합-분석을 위해 이는 원하지 않는 교차-반응성을 회피하기 위해 용이하게 사용될 수 있고, 예를 들어 폴리클로날 항체는 알려져 있는 방법에 의해 용이하게 정제 및 선택될 수 있다 (Shepherd and Dean, loc. cit. 참조).
항체의 "부류"는 중쇄에 의해 포함되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 타입을 나타낸다. 항체는 5개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이 중 몇몇은 하위부류 (이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 나눌 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 해당하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 저해 또는 방지하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 나타낸다. 세포독성제는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 방사성 동위원소 (예컨대, At211, I131 I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예컨대, 메토트렉세이트 (methotrexate), 아드리아마이신 (adriamicin), 빈카 알카로이드 (vinca alkaloids) (빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 에토포시드 (etoposide)), 독소루비신 (doxorubicin), 멜팔란 (melphalan), 미토마이신 (mitomycin) C, 클로람부실 (chlorambucil), 다우노루비신 (daunorubicin) 또는 다른 개재 활성제 (intercalating agents)); 성장 저해제; 효소 및 그의 단편 예컨대 핵산분해 효소 (nucleolytic enzymes); 항생제; 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원, 그의 단편 및/또는 변이체의 독소 예컨대 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소; 및 하기에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다.
"이펙터 기능 (effector functions)"은 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 나타내고, 이는 항체 이소타입에 따라 다양하다. 항체 이펙터 기능의 예로는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (complement dependent cytotoxicity: CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC); 포식작용 (phagocytosis); 세포 표면 수용체 (예컨대 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
활성제, 예컨대 약학적 제제의 "유효한 양"은, 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "엔도솜 탈출 도메인 (EED)"은, 세포에서 엔도솜 사이클링 과정을 방해하고, 세포질에서 엔도솜 함량을 방출시킴으로써 세포 기능을 저해 또는 방해하고 및/또는 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는, 펩티드를 나타낸다. EED는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 뎅기 바이러스 및 다른 바이러스 유래된 EED 및 그의 변이체, 박테리아 유래된 EED 및 2개의 방향족 인돌 고리 또는 하나의 인돌 고리 및 2개의 방향족 페닐기를 포함하는 펩티드를 포함한다 (WO 2016/015621; WO 2016/037985; Kiesgen et al., Protein Eng Des Sel. 27(10):331-7 (2014) and Lohn et al., Sci Rep. 6:32301 (2016)).
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외래 핵산이 도입되어진 세포, 이러한 세포의 후손 (progeny)을 나타낸다. 숙주 세포는 "형질전환체 (transformants)" 및 "형질전환된 세포 (transformed cells)"를 포함하고, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대의 수와 관계없이 이로부터 유래되는 후손을 포함한다. 후손은 모체 세포에 대해 핵산 내용물이 완전히 동일할 수 없지만, 그러나 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 또는 선택되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 후손이 본원에 포함된다.
"면역접합체"는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 세포독성제를 포함하는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체 (individual)" 또는 "피험체 (subject)"는 포유동물이다. 포유동물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 마카크 (macaques)), 토끼, 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 개체 또는 피험체는 인간이다.
"단리된 핵산"은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리되어진 핵산 분자를 나타낸다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 포함하는 세포내에 포함되는 핵산 분자를 포함하지만, 그러나 상기 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-GP73 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)을 코딩하고, 단일 벡터 또는 개별 벡터의 핵산 분자(들)을 포함하는, 하나 이상의 핵산 분자를 나타내고, 이러한 핵산 분자(들)은 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재한다.
본원에서 사용되는, 용어 "GP73"은 임의의 네이티브 GP73을 나타낸다. 상기 용어는, 달리 지시하지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예컨대 인간 및 레서스 마카크 (rhesus macaques) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 출처로부터의 GP73을 포함한다. 상기 용어는 또한 GP73의 자연 발생하는 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 예시되는 인간 GP73 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호: 1에 개시되어 있다. 비제한적인 예시되는 마우스 GP73 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호: 29에 개시되어 있다.
용어 "GP73-포지티브 암"은 세포 표면에서 GP73을 발현하는 세포를 포함하는 암을 나타낸다. 일부 구체예에서, 상기 세포 표면에서 GP73의 발현은, 예를 들어, 면역조직화학, FACS 등과 같은 방법에서 GP73에 대한 항체를 사용하여, 결정된다. 대안으로서, GP73 mRNA 발현은 세포 표면에서 GP73 발현과 상관관계가 있는 것으로 사료되고, 인 시추 (in situ) 하이브리드화 (hybridization) 및 RT-PCR (정량적 RT-PCR 포함)로부터 선택되는 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 포유동물에서 통상적으로 조절되지 않는 세포 성장/증식을 특징으로 하는 생리학적 상태를 나타내거나 또는 개시한다. 암의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 암종, 간암, 간세포암, 위암, 폐암, 식도암, 유방암, 전립샘암, 림프종 (예컨대, 호지킨 (Hodgkin) 및 비-호지킨 (non-Hodgkin) 림프종), 모세포종 (blastoma), 육종, 및 백혈병을 포함한다.
용어 "GP73-포지티브 세포"는 그의 표면에서 전장 또는 일부 GP73을 발현하는 세포를 나타낸다.
참조 폴리펩티드 서열에 대해 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요하다면 서열을 정렬하고 갭을 도입시킨 후에, 상기 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환은 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술의 범위내에서 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어 "약학적 제제" 또는 "약학적 조성물"은 이들 안에 포함되는 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 그러한 형태로 존재하고, 상기 제제가 투여되는 피험체에 대해 허용가능하지 않은 독성이 있는 부가의 성분을 포함하지 않는 제제를 나타낸다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 제제내에, 활성 성분 이외에, 피험체에게 비독성인 성분을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 담체는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 버퍼 (buffer), 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.
본원에서 사용되는, "치료" (및 그의 문법적인 변형으로 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 과정을 변경하려는 시도의 임상적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 원하는 효과는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 예후의 진정 또는 향상을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 지연시키는데 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는, 이에 연결되는 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조를 갖는 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입되는 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본원에서 "발현 벡터"라고 한다.
1가 기
본원에서 사용되는, 용어 "알킬"은, 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있는 1가의 포화된 탄화수소 기를 나타낸다. 바람직하게 상기 용어 "알킬"은 선형 또는 분지형일 수 있고 또한 고리형은 아닌 1가의 포화된 탄화수소 기를 나타낸다. 따라서, "알킬" 기는 임의의 탄소-대-탄소 이중 결합 또는 임의의 탄소-대-탄소 삼중 결합을 포함하지 않는다. "C1-5　알킬"은 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 나타낸다. 바람직한 예시되는 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필 (예컨대, n-프로필 또는 이소프로필), 또는 부틸 (예컨대, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸)이다.
달리 지시하지 않는 한, "알킬"은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 1 내지 18개의 탄소 원자, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 원자를 포함하는, 1가의 포화된 탄화수소 기, 즉 "C1-C18 알킬"이다.
그의 예로는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2) 및 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3이다.
"알킬"의 바람직한 예로는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 1 내지 12개의 탄소 원자, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 탄소 원자를 포함하는, 1가의 포화된 탄화수소 기를 나타내는 "C1-C12 알킬"이다.
"알킬"의 더 바람직한 예로는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 1 내지 8개의 탄소 원자, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 탄소 원자를 포함하는, 1가의 포화된 탄화수소 기를 나타내는, "C1-C8 알킬"이다.
대표적인 "C1-C8 알킬" 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸 및 -n-옥틸을 포함한다.
분지형 "C1-C8 알킬"은, 이에 한정되는 것은 아니지만, -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸을 포함한다.
"알킬"의 좀 더 바람직한 예로는 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 1 내지 6개의 탄소 원자, 즉 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 포함하는, 1가의 포화된 탄화수소 기를 나타내는 "C1-C6 알킬"이다.
대표적인 "C1-C6 알킬" 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, 및 -n-헥실을 포함한다.
분지형 "C1-C6 알킬"은, 이에 한정되는 것은 아니지만, -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 및 2-메틸부틸을 포함한다;
본원에서 사용되는, 용어 "C1-C4 알킬"은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 1 내지 4개의 탄소 원자, 즉 1, 2, 3 또는 4개의 탄소 원자를 포함하는 1가의 포화된 탄화수소 기를 나타낸다.
대표적인 "C1-C4 알킬" 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸을 포함한다. 분지형 "C1-C4 알킬"은, 이에 한정되는 것은 아니지만, -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸을 포함한다;
본원에서 사용되는, 용어 "알켄일"은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고, 하나 이상의 (예컨대, 1 또는 2) 탄소-대-탄소 이중 결합을 포함하지만 임의의 탄소-대-탄소 삼중 결합을 포함하지 않는 1가의 불포화된 탄화수소 기를 나타낸다.
달리 지시하지 않는 한, "알켄일"은, 2 내지 18개의 탄소 원자, 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 원자를 포함하고 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있으며 하나 이상의 (예컨대, 1 또는 2) 탄소-대-탄소 이중 결합을 포함하지만 임의의 탄소-대-탄소 삼중 결합을 포함하지 않는, C2-C18 1가의 불포화된 탄화수소 기이다.
"알켄일"의 바람직한 예로는 2 내지 8개의 탄소 원자, 즉 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 탄소 원자를 갖는 알켄일 기를 나타내는 "C2-C8 알켄일"이다. 바람직한 예시되는 알켄일 기는 에텐일, 프로펜일 (예컨대, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 또는 프로프-2-엔-1-일), 부텐일, 부타디엔일 (예컨대, 부타-1,3-디엔-1-일 또는 부타-1,3-디엔-2-일), 펜텐일, 또는 펜타디에닐 (예컨대, 이소프레닐)이다. 부가의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), -1-부텐일, -2-부텐일, -이소부틸렌일, -1-펜텐일, -2-펜텐일, -3-메틸-1-부텐일, -2-메틸-2-부텐일, 시클로펜텐일 (-C5H7), 1-헥센일, 2-헥센일, 3-헥센일, 5-헥센일 (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2) 및 -2,3-디메틸-2-부텐일을 포함한다.
C2-C6 알켄일의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -비닐, -알릴, -1-부텐일, -2-부텐일, -이소부틸렌일, -1-펜텐일, -2-펜텐일, -3-메틸-1-부텐일, -2-메틸-2-부텐일, -2,3-디메틸-2-부텐일, 1-헥센일, 2-헥센일, 및 3-헥센일을 포함한다.
"알켄일"의 더 바람직한 예로는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알켄일 기를 나타내는 "C2-C4 알켄일"이다. 그러므로 예로는 -비닐, -알릴, -1-부텐일, -2-부텐일, 및 -이소부틸렌일이다.
본원에서 사용되는, 용어 "알킨일"은 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있고 하나 이상의 (예컨대, 1 또는 2) 탄소-대-탄소 삼중 결합 및 선택적으로 하나 이상의 탄소-대-탄소 이중 결합을 포함하는 1가의 불포화된 탄화수소 기를 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 용어 "알킨일"은 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알킨일 기를 나타내는 "C2-8 알킨일"을 나타낸다. 바람직한 예시되는 알킨일 기는 아세틸렌일, 프로핀일, 1-부틴일, 2-부틴일, 1-펜틴일, 2-펜틴일, 시클로펜텐일, 3-메틸-1-부틴일, 5-헥센일, 비닐, 에틸렌이다.
바람직한 알킨일 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킨일 기를 나타내는 "C2-6 알킨일" 및 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킨일 기를 나타내는 "C2-4 알킨일이다.
용어 "알콕시"는 "-O-알킬"로 표시되는 기를 나타내고, 여기서 "알킬"은 상기에 정의된 바와 같고, 알킬의 바람직한 예를 포함한다.
예시되는 알콕시 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 메톡시 (-OCH3) 및 에톡시 (-OCH2CH3)를 포함한다.
"알콕시"의 바람직한 예로는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알콕시 기인 "C1 -C5 알콕시"이고, "-O-C1-C5 알킬"로 개시될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "카르보시클일"은, 모노시클릭 고리뿐만 아니라 브릿지된 (bridged) 고리, 스피로 고리 및/또는 융합된 고리계 (이는 예컨대, 2개 또는 3개의 고리로 이루어질 수 있음)를 포함하는, 고리 기를 나타내고, 여기서 하나 이상의 탄소 고리 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 (즉, 옥소기를 형성할 수 있음), 또한 상기 고리 기는 포화, 부분 불포화 (즉, 불포화되었지만 방향족은 아님) 또는 방향족일 수 있다. 상기 "카르보시클일" 기의 바람직한 예로는 하기에 제공된 "카르보사이클"의 정의에 해당하고 여기서 하나의 수소 원자가 추출된다 (abstracted).
용어 "카르보사이클"은 바람직하게 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화된 모노사이클 또는 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 비사이클을 나타낸다. 모노시클릭 카르보사이클은 바람직하게 3 내지 6개의 고리 원자, 더 바람직하게는 5 또는 6개의 고리 원자를 가지며 및 하기에 정의되는 바와 같은 페닐을 포함한다. 통상적으로 비시클릭 카르보사이클은, 예컨대 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열되는, 7 내지 12개의 고리 원자, 또는 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는다. 모노시클릭 카르보사이클의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-엔일, 1-시클로펜트-2-엔일, 1-시클로펜트-3-엔일, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-엔일, 1-시클로헥스-2-엔일, 1-시클로헥스-3-엔일, 시클로헵틸, 및 시클로옥틸을 포함한다.
"C3-C8 카르보사이클"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 포화 또는 불포화된 비-방향족 카르보시클릭 고리이다. 대표적인 C3-C8 카르보사이클은, 이에 한정되는 것은 아니지만, -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로펜타디에닐, -시클로헥실, -시클로헥센일, -1,3- 시클로헥사디에닐, -1,4-시클로헥사디에닐, -시클로헵틸, -1,3-시클로헵타디에닐, -1,3,5-시클로헵타트리엔일, -시클로옥틸, 및 -시클로옥타디에닐을 포함한다.
"C3-C8 카르보시클로"는 상기에 정의된 C3-C8 카르보사이클 기를 나타내고 여기서 카르보사이클 기의 수소 원자들 중 하나는 결합으로 대체된다.
본원에서 사용되는, 용어 "아릴"은, 모노시클릭 방향족 고리뿐만 아니라 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 브릿지된 고리 및/또는 융합된 고리계 (예컨대, 고리계는 2 또는 3개의 융합된 고리로 이루어지고, 상기 융합된 고리들 중 적어도 하나는 방향족이거나; 또는 브릿지된 고리계는 2 또는 3개의 고리로 이루어지고, 상기 브릿지된 고리들 중 적어도 하나는 방향족임)를 포함하는, 방향족 탄화수소 고리 기를 나타낸다. "아릴"은, 예컨대, 페닐, 나프틸, 디아리닐 (dialinyl) (즉, 1,2-디히드로나프틸), 테트라리닐 (tetralinyl) (즉, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸), 안트라세닐, 또는 페난트레닐을 나타낼 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 용어 "아릴"은 상기 카르보시클릭 방향족 고리에서 5 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 아릴 기인 "C5-C20 아릴"을 나타낸다.
아릴 기의 더 바람직한 예로는 상기 카르보시클릭 방향족 고리에서 5 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 아릴 기인 "C5-C14 아릴"이다.
본원에서 사용되는, 용어 "헤테로시클일"은, 모노시클릭 고리뿐만 아니라 브릿지된 고리, 스피로 고리 및/또는 융합된 고리계 (이는, 예컨대, 2 또는 3개의 고리로 이루어질 수 있음)를 포함하는, 고리 기를 나타내고, 상기 고리 기는 독립적으로 O, S, P 및 N으로부터 선택되는 하나 이상의 (가령, 예컨대, 1, 2, 3, 또는 4개의) 고리 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리 원자들은 탄소 원자이고, 상기 하나 이상의 P 고리 원자 (존재하는 경우) 및/또는 S 고리 원자 (존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자 (존재하는 경우)는 선택적으로 산화될 수 있고, 상기 하나 이상의 탄소 고리 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 (즉, 옥소 기를 형성함), 부가로 상기 고리 기는 포화, 부분 불포화 (즉, 불포화되었지만 방향족은 아님) 또는 방향족일 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, "헤테로시클일"은 바람직하게 헤테로아릴을 나타낸다.
"헤테로시클일"의 바람직한 예로는, 1 내지 4개의 고리 탄소 원자가 독립적으로 O, S 및 N으로 구성된 그룹으로부터의 헤테로원자로 대체되는, 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 카르보사이클을 나타내는 "C3-C8 헤테로시클일"이다. C3-C8 헤테로사이클의 대표적인 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌일, 벤조피라졸일, 쿠마리닐 (coumarinyl), 이소퀴놀리닐, 피롤일, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸일, 이미다졸일, 피라졸일, 트리아졸일, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸일, 이속사졸일 및 테트라졸일을 포함한다.
예시되는 헤테로사이클은, 예컨대 Paquette, Leo A., "Principles of Modem Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 구체적으로 Chapters 1, 3, 4, 6, 7, and 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; and J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566에 개시되어 있다.
헤테로사이클의 예로는 예로서 한정되지 않고 피리딜, 디히드로피리딜 (dihydroypyridyl), 테트라히드로피리딜 (피페리딜), 티아졸일, 테트라히드로티오페닐, 황 산화된 테트라히드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤일, 피라졸일, 이미다졸일, 테트라졸일, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌일, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸일, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라히드로푸라닐, 비스-테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 비스-테트라히드로피라닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H- 1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤일, 이소티아졸일, 이속사졸일, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌일, 3H-인돌일, 1H-인다졸일, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카르바졸일, 카르바졸일, β-카르볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴뉴클리디닐 (quinuclidinyl), 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸일, 벤즈이속사졸일, 옥스인돌일 (oxindolyl), 벤족사졸리닐, 및 이사티노일 (isatinoyl)을 포함한다.
예로서 한정되지 않고, 탄소 결합된 헤테로사이클은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5, 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5, 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5, 또는 6, 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 위치 2, 3, 4, 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4, 또는 5, 이속사졸, 피라졸, 또는 이소티아졸의 위치 3, 4, 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3, 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에서 결합된다. 좀 더 통상적으로, 탄소 결합된 헤테로사이클은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐 (pyrirnidinyl), 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸일, 4-티아졸일, 또는 5-티아졸일을 포함한다.
예로서 한정되지 않고, 질소 결합된 헤테로사이클은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카르바졸, 또는 β-카르볼린의 위치 9에서 결합된다. 좀 더 통상적으로, 질소 결합된 헤테로사이클은 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤일, 1-이미다졸일, 1-피라졸일, 및 1-피페리디닐을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "헤테로아릴"은, 모노시클릭 방향족 고리뿐만 아니라 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 브릿지된 고리 및/또는 융합된 고리계 (예컨대, 고리계는 2 또는 3개의 융합된 고리로 이루어지고, 여기서 상기 융합된 고리들 중 적어도 하나는 방향족이거나; 또는 브릿지된 고리계는 2 또는 3개의 고리로 이루어지고, 여기서 상기 브릿지된 고리들 중 적어도 하나는 방향족임)를 포함하는 방향족 고리기를 나타내고, 상기 방향족 고리 기는 독립적으로 O, S, P 및 N으로부터 선택되는 하나 이상의 (가령, 예컨대, 1, 2, 3, 또는 4) 고리 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이고, 상기 하나 이상의 S 고리 원자 (존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 P 고리 원자 (존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자 (존재하는 경우)는 선택적으로 산화될 수 있고, 부가로 상기 하나 이상의 탄소 고리 원자는 선택적으로 산화될 수 있다 (즉, 옥소 기를 형성함). "헤테로아릴"은, 예컨대, 티에닐 (즉, 티오페닐), 벤조[b]티에닐, 나프토[2,3-b]티에닐, 티안트레닐, 푸릴 (즉, 푸라닐), 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐 (phenoxathiinyl), 피롤일 (예컨대, 2H-피롤일), 이미다졸일, 피라졸일, 피리딜 (즉, 피리디닐; 예컨대, 2-피리딜, 3-피리딜, 또는 4-피리딜), 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌일, 인돌일 (예컨대, 3H-인돌일), 인다졸일, 푸리닐, 이소퀴놀일, 퀴놀일, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 카르바졸일, 베타-카르볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 페리미디닐, 페난트롤리닐 (예컨대, [1,10]페난트롤리닐, [1,7]페난트롤리닐, 또는 [4,7]페난트롤리닐), 페나지닐, 티아졸일, 이소티아졸일, 페노티아지닐, 옥사졸일, 이속사졸일, 푸라자닐, 페녹사지닐, 피라졸로[1,5-a]피리미디닐 (예컨대, 피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일), 1,2-벤조이속사졸-3-일, 벤조티아졸일, 벤족사졸일, 벤즈이속사졸일, 벤즈이미다졸일, 1H-테트라졸일, 2H-테트라졸일, 쿠마리닐, 또는 크로모닐을 나타낼 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, "헤테로아릴"은 바람직하게, 독립적으로 O, S, P 및 N으로부터 선택되는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의) 고리 헤테로원자를 포함하는 5 내지 14원 (더 바람직하게는 5 내지 10원) 모노시클릭 고리 또는 융합된 고리계를 나타내고, 상기 하나 이상의 S 고리 원자 및/또는 하나 이상의 P 고리 원자 (존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자 (존재하는 경우)는 선택적으로 산화되고, 상기 하나 이상의 탄소 고리 원자는 선택적으로 산화되고; 좀 더 바람직하게, "헤테로아릴"은 독립적으로 O, S, P 및 N으로부터 선택되는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2 또는 3개의) 고리 헤테로원자를 포함하는 5 또는 6 원 모노시클릭 고리를 나타내고, 상기 하나 이상의 S 고리 원자 및/또는 하나 이상의 P 고리 원자 (존재하는 경우) 및/또는 하나 이상의 N 고리 원자 (존재하는 경우)는 선택적으로 산화되고, 상기 하나 이상의 탄소 고리 원자는 선택적으로 산화된다.
바람직한 헤테로아릴 기는 3 내지 20개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 다른 바람직한 헤테로아릴 기는 3 내지 7개의 고리 구성원 (2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 모노사이클 또는 7 내지 10개의 고리 구성원 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 비사이클, 예를 들어: 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
용어 "아릴알킬"은 "-(알킬렌)-(아릴)", "-(알켄일렌)-(아릴)" 및 "-(알킨일렌)-(아릴)"로 표시되는 기를 나타내고, 상기 "알킬렌", "알켄일렌" 및 "알킨일렌"은 하기에 정의된 바와 같고, "아릴"은 상기에 정의된 바와 같다. 상기 알킬렌은 바람직하게 C1-C6 알킬렌이고, 바람직하게는 아시클릭 (acyclic)이다. 상기 아릴 기는 바람직하게 C5-C14 아릴 기이다. 즉, 용어 "아릴알킬"은, 탄소 원자, 통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자들 중 하나가 아릴 라디칼로 대체된, 아시클릭 알킬 라디칼을 나타낸다. 통상적인 아릴알킬 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함한다. 상기 아릴알킬 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하고, 예컨대 상기 아릴알킬 기 중, 알킬, 알켄일 또는 알킨일 기를 포함하는, 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자이고, 아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자이다.
용어 "헤테로아릴알킬"은 "-(알킬렌)-(헤테로아릴)", "-(알켄일렌)-(헤테로아릴)" 및 "-(알킨일렌)-(헤테로아릴)"로 표시되는 기를 나타내고, 상기 "알킬렌", "알켄일렌" 및 "알킨일렌"은 하기에 정의되는 바와 같고, 아릴은 상기에 정의된 바와 같다. 즉, "헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합되는 수소 원자들 중 하나가 헤테로아릴 라디칼로 대체되는 아시클릭 알킬 라디칼을 나타낸다. 통상적인 헤테로아릴알킬 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 2-벤즈이미다졸일메틸, 2-푸릴에틸 등을 포함한다. 상기 헤테로아릴알킬 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하고, 예컨대 상기 헤테로아릴알킬 기 중, 알칸일, 알켄일 또는 알킨일 기를 포함하는, 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자이고, 상기 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자이다. 상기 헤테로아릴알킬 기 중 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7개의 고리 구성원 (2 내지 6개의 탄소 원자)을 갖는 모노사이클 또는 7 내지 10개의 고리 구성원 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P, 및 S로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 비사이클, 예를 들어: 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
2가 기
본원에서 사용되는 용어 "알킬렌"은, 수소들 중 하나가 제거되고 통상적으로 결합으로 대체되는, 용어 "알킬"에 해당하는 2가 기를 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 "알킬렌"은 바람직하게 2개의 1가 라디칼 중심으로부터 2개의 수소 원자의 제거로 유도된 2개의 1가 라디칼 중심 또는 모체 알칸의 2개의 상이한 탄소 원자를 갖는, 1-18개의 탄소 원자의 포화된, 분지형 또는 직쇄 또는 고리형의 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 통상적인 알킬렌 라디칼은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 메틸렌 (-CH2-) 1,2-에틸렌 (-CH2CH2-), 1,3-프로필렌 (-CH2CH2CH2-) 및 1,4-부틸렌 (-CH2CH2CH2CH2-)을 포함한다.
바람직한 "알킬렌"의 예로는 식 -(CH2)1-10-의 직쇄의, 포화된 탄화수소 기인 "C1-C10 알킬렌"이다. "C1-C10 알킬렌"의 예로는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "알켄일렌"은, 수소들 중 하나가 제거되고 통상적으로 결합으로 대체되는, 용어 "알켄일"에 해당하는 2가 기를 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 "알켄일렌"은, 2개의 1가 라디칼 중심으로부터 2개의 수소 원자의 제거로 유도된 2개의 1가의 라디칼 중심 또는 모체 알켄의 2개의 상이한 탄소 원자를 갖는, 2-18개의 탄소 원자의 불포화된, 분지형 또는 직쇄 또는 고리형의 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 바람직한 알켄일렌은 2 내지 12개의 탄소 원자, 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 통상적인 알켄일렌 라디칼은, 이에 한정되는 것은 아니지만 1,2-에틸렌 (-CH=CH-)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킨일렌"은, 수소들 중 하나가 제거되고 통상적으로 결합으로 대체되는, 용어 "알킨일"에 해당하는 2가 기를 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 "알킨일렌"은 2개의 1가의 라디칼 중심으로부터 2개의 수소 원자의 제거로 유도된 2개의 1가의 라디칼 중심 또는 모체 알킨의 2개의 상이한 탄소 원자를 갖는, 2-18개의 탄소 원자의 불포화된, 분지형 또는 직쇄 또는 고리형의 탄화수소 라디칼을 나타낸다. 바람직한 알킨일렌은 2 내지 12개의 탄소 원자, 2 내지 8개의 탄소 원자 또는 2 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 통상적인 알킨일렌 라디칼은, 이에 한정되는 것은 아니지만 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파르길 (-CH2C≡C-), 및 4-펜틴일 (-CH2CH2CH2C≡C-)을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴렌"은, 수소들 중 하나가 제거되고 통상적으로 결합으로 대체되는, 용어 "아릴"에 해당하는 2가 기를 나타낸다. 원자가는 상기 방향족 탄화수소 고리 기 내에 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예로서, 페닐렌 기에서, 원자가는 하기 구조로 개시되는 바와 같이 오르토, 메타, 또는 파라 위치에 존재할 수 있다:
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.
치환기
다양한 기들이 본 명세서에서 "선택적으로 치환"되거나 또는 "치환"될 때 언급된다. 일반적으로, 상기 기들은 하나 이상의 치환기, 가령, 예컨대, 1, 2, 3 또는 4개의 치환기를 포함할 수 있다. 치환기의 최대 수는 치환된 모이어티에 이용가능한 부착 부위의 수로 한정되는 것으로 이해될 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 상기 "선택적으로 치환된" 기는 본 명세서에서 바람직하게 2개 이하의 치환기를 가지며, 구체적으로 1개의 치환기 만을 가질 수 있는 것을 나타낸다. 더욱이, 달리 정의되지 않는 한, 선택적 치환기는 존재하지 않고, 즉 해당하는 기가 치환되지 않은 것이 바람직하다.
알킬, 아릴, 아릴알킬렌, 아릴알킬, 알킬렌, 알켄일렌, 및 알킨일렌의 치환기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -X, -R, -OH,-OR, -SR, -SH, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -P(OH)3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2를 포함하고,
상기에서 각 X는 독립적으로 F, Cl, Br, 및 I로부터 선택되는 할로겐이고; 및
각 R은 독립적으로 -H, C1-C18 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로시클일, 보호기 또는 프로드러그 모이어티이다.
상기 알킬, 아릴, 아릴알킬렌, 아릴알킬, 알킬렌, 알켄일렌, 및 알킨일렌의 바람직한 치환기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하고; 여기서 각 R'은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
달리 정의되지 않는 한, 치환기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하고; 여기서 각 R'은 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
상기 알킬 기의 치환기는 알킬 기를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
치환된 것으로 개시되는 페닐 기는 바람직하게 상기에 정의된 1 내지 4개의 치환기를 포함한다. 치환된 것으로 개시되는 C3-C8 헤테로시클일 기는 바람직하게 상기에 정의된 1 내지 7개의 치환기를 포함한다. 치환된 것으로 개시되는 C3-C8 헤테로시클로 기는 바람직하게 상기에 정의된 1 내지 6개의 치환기를 포함한다. 치환된 것으로 개시되는 C3-C20 헤테로사이클 기는 바람직하게 상기에 정의된 1 내지 7개의 치환기를 포함한다. 치환된 것으로 개시되는 C3-C8 카르보사이클 기는 바람직하게 상기에 정의된 1 내지 7개의 치환기를 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "할로겐"은 플루오로 (-F), 클로로 (-Cl), 브로모 (-Br), 또는 요오도 (-I)를 나타낸다.
본원에서 사용되는, 용어 "선택적", "선택적으로" 및 "일 수 있다 (may)"는 지시된 특성이 존재할 수도 있고 또한 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. 상기 용어 "선택적", "선택적으로" 또는 "일 수 있다"가 사용될 때마다, 본 발명은 구체적으로 2개의 가능성과 관련이 있고, 즉 해당하는 특성이 존재하거나, 또는 대안으로서 해당하는 특성이 존재하지 않는다. 예를 들어, 표현 "X는 선택적으로 Y로 치환되는" (또는 "X는 Y로 치환될 수 있고")은 X가 Y로 치환되거나 또는 비치환되는 것을 의미한다. 마찬가지로, 조성물 중 성분이 "선택적"인 것으로 나타낸 경우, 본 발명은 구체적으로 2개의 가능성과 관련이 있고, 즉 해당하는 성분이 존재하거나 (조성물 중에 포함됨) 또는 해당하는 성분이 상기 조성물 중에 존재하지 않는다.
용어 "링커"는 항체를 약물 모이어티에 공유적으로 부착시키는 공유 결합 또는 원자의 사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 나타낸다. 링커의 예로는 2가의 라디칼 예컨대 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 -(CR2)nO(CR2)n- 또는 알킬옥시 (예컨대 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노 (예컨대 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM)의 반복 단위; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함하는 2가산 (diacid) 에스테르 및 아미드를 포함한다. 다양한 구체예에서, 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 발린, 페닐알라닌, 리신, 및 호모리신 (homolysine)을 포함할 수 있다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너 (mirror image partner)의 비-중첩성 (non-superimposability)의 특성을 갖는 분자를 나타내며, 용어 "아키랄(achiral)"은 그의 거울상 파트너에 중첩될 수 있는 분자를 나타낸다.
용어 "입체이성질체"는 동일한 화학 구성을 갖지만, 공간 내의 원자 또는 기 (group)의 배열에 관하여 상이한 화합물을 나타낸다.
"부분입체이성질체"는 2개 이상의 키랄성 중심을 가지며 그의 분자들이 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체를 나타낸다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 특성, 예컨대 용융점, 끓는점, 스펙트럼 특성 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고분해능 분석 절차하에서 분리될 수 있다.
"거울상이성질체"는 화합물의 2개의 입체이성질체가 서로 비-중첩성 거울상인 화합물의 2개의 입체이성질체를 나타낸다.
본원에 사용되는 입체화학 정의 및 규약은 일반적으로 S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Tenns (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York을 따른다. 많은 유기 화합물들이 광학적으로 활성인 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면 편광의 평면을 회전시킬 수 있는 능력을 갖는다. 광학적으로 활성인 화합물을 개시할 때, 접두어 D와 L, 또는 R과 S는 그의 키랄 중심(들) 주위에서의 분자의 절대 배치를 나타내는데 사용된다. 접두어 d와 l 또는 (+)와 (-)는 화합물에 의한 평면 편광의 회전의 부호를 지정하는데 사용되며, 이때 (-) 또는 1은 화합물이 좌선성 (levorotatory)임을 의미한다. 접두어 (+) 또는 d를 갖는 화합물은 우선성 (dextrorotatory)이다. 주어진 화학 구조에 있어서, 이들 입체이성질체는 이들이 서로 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정 입체이성질체는 또한 거울상이성질체로서 지칭될 수 있으며, 그러한 이성질체의 혼합물은 흔히 거울상이성질체 혼합물이라 부른다. 거울상이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로서 지칭되는데, 이는 화학 반응 또는 과정에서 입체선택성 (stereoselection) 또는 입체특이성 (stereospecificity)이 없는 경우에 발생할 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2개의 거울상이성질체 종의 등몰 혼합물을 나타낸다.
"이탈기"는 다른 관능기에 의해 치환될 수 있는 관능기를 나타낸다. 특정 이탈기는 당 분야에 잘 알려져 있고, 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 할라이드 (예컨대, 클로리드, 브로미드, 요오디드), 메탄술포닐 (메실), p-톨루엔술포닐 (토실), 트리플루오로메틸술포닐 (트리플레이트), 및 트리플루오로메틸술포네이트를 포함한다.
용어 "보호기"는, 화합물에서 다른 관능기와 반응하는 동안 특정 관능기를 차단 또는 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 치환기를 나타낸다. 예를 들어, "아미노-보호기"는 화합물에서 아미노 관능기를 차단 또는 보호하는 아미노기에 부착된 치환기이다. 적합한 아미노-보호기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함한다. 보호기 및 그의 사용에 대한 전반적인 설명에 대해서는, T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, 또는 후속 에디션을 참조한다.
본 발명의 범위는, 무기산 또는 유기산에 의한, 또는 생리학적으로 허용가능한 양이온과 산 기 (예컨대 카르복실산 기)의 염으로서, 아미노 기와 같이 양성자화에 민감한 전자 단독 쌍 (electron lone pair)을 포함하는 원자의 양성자화에 의해, 형성될 수 있는 본원에 개시된 화합물들의 모든 약학적으로 허용가능한 염 형태를 포함한다. 예시되는 염기 부가 염 (base addition salts)은, 예를 들어: 알칼리 금속 염 예컨대 나트륨 또는 칼륨 염; 알칼리 토금속 염 예컨대 칼슘 또는 마그네슘 염; 아연 염; 암모늄 염; 지방족 아민 염 예컨대 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디시클로헥실아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 포카인 (procaine) 염, 메글루민 (meglumine) 염, 에틸렌디아민 염, 또는 콜린 염; 아랄킬 아민 염 예컨대 N,N-디벤질에틸렌디아민 염, 벤자틴 (benzathine) 염, 베네타민 (benethamine) 염; 헤테로시클릭 방향족 아민 염 예컨대 피리딘 염, 피콜린 염, 퀴놀린 염 또는 이소퀴놀린 염; 4차 암모늄 염 예컨대 테트라메틸암모늄 염, 테트라에틸암모늄 염, 벤질트리메틸암모늄 염, 벤질트리에틸암모늄 염, 벤질트리부틸암모늄 염, 메틸트리옥틸암모늄 염 또는 테트라부틸암모늄 염; 및 염기성 아미노산 염 예컨대 아르기닌 염, 리신 염, 또는 히스티딘 염을 포함한다. 예시되는 산 부가 염 (acid addition salts)은, 예를 들어: 무기산 염 예컨대 히드로클로리드, 히드로브로미드, 히드로요오디드, 술페이트 염 (가령, 예컨대, 술페이트 또는 히드로겐 술페이트 염), 니트레이트 염, 포스페이트 염 (가령, 예컨대, 포스페이트, 히드로겐포스페이트, 또는 디히드로겐포스페이트 염), 카르보네이트 염, 히드로겐카르보네이트 염, 퍼클로레이트 (perchlorate) 염, 보레이트 염, 또는 티오시아네이트 염; 유기산 염 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 펜타노에이트, 헥사노에이트, 헵타노에이트, 옥타노에이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 데카노에이트, 운데카노에이트, 올레에이트, 스테아레이트, 락테이트, 말레에이트, 옥살레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아디페이트, 글루코네이트, 글리콜레이트, 니코티네이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 아스코르베이트, 파모에이트 (엠보네이트), 캄포레이트, 글루코헵타노에이트, 또는 피발레이트 염; 술포네이트 염 예컨대 메탄술포네이트 (메실레이트), 에탄술포네이트 (에실레이트), 2-히드록시에탄술포네이트 (이세티오네이트), 벤젠술포네이트 (베실레이트), p-톨루엔술포네이트 (토실레이트), 2-나프탈렌술포네이트 (나프실레이트), 3-페닐술포네이트, 또는 캄포술포네이트 염; 글리세로포스페이트 염; 및 산성 아미노산 염 예컨대 아스파르테이트 또는 글루타메이트 염을 포함한다. 본원에 개시된 화합물의 바람직한 약학적으로 허용가능한 염은 히드로클로리드 염, 히드로브로미드 염, 메실레이트 염, 술페이트 염, 타르트레이트 염, 푸마레이트 염, 아세테이트 염, 시트레이트 염, 및 포스페이트 염을 포함한다. 본원에 개시된 화합물의 특히 바람직한 약학적으로 허용가능한 염은 히드로클로리드 염이다. 따라서, 본원에 개시된 화합물은 히드로클로리드 염, 히드로브로미드 염, 메실레이트 염, 술페이트 염, 타르트레이트 염, 푸마레이트 염, 아세테이트 염, 시트레이트 염, 또는 포스페이트 염의 형태인 것이 바람직하고, 화학식 (I)의 화합물이 히드로클로리드 염의 형태인 것이 특히 바람직하다.
더욱이, 본 발명의 범위는, 물과의 용매화물, 예를 들어 수화물, 또는 유기 용매 가령, 예컨대, 메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴과의 용매화물, 즉 각각 메탄올레이트, 에탄올레이트 또는 아세토니트릴레이트를 포함하는, 본원에 개시된 화합물의 임의의 용매화된 형태, 또는 임의의 다형 (polymorph)의 형태를 포함한다. 본원에 개시된 화합물들의 이러한 용매화물은 또한 본원에 개시된 화합물들의 약학적으로 허용가능한 염의 용매화물을 포함하는 것으로 이해된다.
본 문헌에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 특허 문헌은 참고로 개별적으로 포함된 것처럼 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다. 본 문헌과 참조로 포함된 문헌 사이에 불일치하는 사용이 있는 경우, 포함된 참조문헌(들)에서의 사용은 본 문헌의 사용에 보충되는 것으로 간주되어야 한다; 양립할 수 없는 불일치에 있어서, 본 문헌에서의 사용을 신뢰할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 GP73에 결합하는 항체 및 이러한 항체를 포함하는 면역접합체에 일부 기반한다. 본 발명의 항체 및 면역접합체는 예컨대, GP73-포지티브 암의 진단 또는 치료에 유용하다.
GP73에 결합하는 단리된 항체가 본원에 제공된다. 2개의 예시되는 자연 발생하는 인간 GP73 이소형태가 서열 번호: 1에 개시되어 있고, 예컨대 프로테아제에 의해 절단된, 상응하는 처리된 GP73 형태 (아미노산 56-401)는 도 3에 개시되어 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-GP73-항체는 적어도 하나 이상의 하기 특성들을 임의의 조합으로 갖는다:
a) 재조합 인간 GP73에의 결합;
b) 암 세포의 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
c) 암 세포의 표면에서 인간 GP73의 아미노산 36 내지 55 내의 에피토프 (네오-에피토프)에의 결합;
d) 간세포 암종 세포의 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
e) HepG2, Hep3B, HuH7, JHH-7, Alexander (PLC/PRF/5), HLE, HuCCT1으로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
f) SKBR3 (유방암), SKOV3 (난소암), PC3 및 DU145 (전립샘암), HCT116, CaCo2, SW480 (결장직장암), H1975 (폐암)으로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 GP73에의 결합;
g) Hep55-1C, Hepa1-6, Hep33.1c로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 쥐과 GP73에의 결합;
h) MDA 및 4T1 (유방암) 등으로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 쥐과 GP73에의 결합;
i) CRL2212로부터 선택되는 세포주의 세포 표면에서 내인성 래트 GP73에의 결합;
j) GP73 발현 세포 (a-i에 언급됨)의 표면에서 절단되지 않은 GP73에의 결합;
k) 인간 GP73의 아미노산 36 내지 55 내의 에피토프에의 결합;
l) 인간 GP73의 추정되는 퓨린 절단 인식 모티프 E50 내지 R55에 걸친 에피토프에의 결합.
일부 구체예에서, 항체의 특성은 본원, 예컨대, 하기 실시예에 개시된 바와 같이 결정된다. 일부 구체예에서, 상기 항체의 특성은 293 HEK 세포에서 생산된 재조합 GP73 단백질에 의해 결정된다. 비제한적인 예로서, 일부 구체예에서, 전장 GP73 또는 GP73 비-절단가능한 돌연변이체 (R52A)는 세포 (예컨대 293 HEK 세포)에서 발현되고, 야생형 GP73 또는 GP73 비-절단가능한 돌연변이체 또는 N-말단 절단된 GP73 (AA 56 내지 401)에 결합하는 항체는 ELISA 또는 FACS에 의해 검출된다.
본원에 제공된 특정 구체예는, 인간 GP73 단백질의 아미노산 35 내지 55 내의 에피토프에 결합하는, 항체 G2-2 및/또는 G2-2opti의 개발에 일부 기반한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 GP73의 아미노산 35 내지 55 내의 에피토프에 결합한다. 일부 이러한 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 G2-2의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은, (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 하나, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDRs을 포함하는 항-GP73 항체를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 및 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 부가의 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 부가의 일 구체예에서, 상기 항체는 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
다른 양상에서, 본 발명의 항체는 하기를 포함한다:
(a) (i) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 번호: 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
(b) (i) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
다른 양상에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 그러나 상기 서열을 포함하는 항-GP73 항체는 GP73에 결합하는 역량을 보유한다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 5개의 아미노산이 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (즉 FRs에서) 일어난다. 바람직한 일 구체예에서, 서열 번호: 2에서 전체 3개의 아미노산이 포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위해 치환되었다 (서열 번호: 35). 선택적으로, 상기 항-GP73 항체는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35의 VH 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형 (post-translational modifications)을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VH는 하기로부터 선택되는 1, 2, 또는 3개의 CDRs을 포함한다: (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
다른 양상에서, 항-GP73 항체가 제공되고, 상기 항체는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 그러나 상기 서열을 포함하는 항-GP73 항체는 GP73에 결합하는 역량을 보유한다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 5개의 아미노산이 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDRs 외부의 영역에서 (즉, FRs에서) 일어난다. 바람직한 일 구체예에서, 서열 번호: 3에서 전체 8개의 아미노산이 포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위해 치환되었다 (서열 번호: 36). 선택적으로, 상기 항-GP73 항체는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36의 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VL은 (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDRs을 포함한다.
다른 양상에서, 항-GP73 항체가 제공되고, 상기 항체는 상기에 제공된 구체예들 중 어느 것에서의 VH, 및 상기에 제공된 구체예들의 어느 것에서의 VL을 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 35 및 서열 번호: 36 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체의 인간화 형태를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3, 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체의 인간화 형태를 포함한다.
부가의 일 양상에서, 본원에 제공된 항-GP73 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 서열 번호: 37의 VH 서열 및 서열 번호: 38의 VL 서열, 각각을 포함하는 항-GP73 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 10의 VH 서열 및 서열 번호: 11의 VL 서열, 각각을 포함하는 항-GP73 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 부가의 일 양상에서, 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 항-GP73 항체는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일 구체예에서, 항-GP73 항체는 항체 단편, 예컨대, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 전장 항체, 예컨대, IgG1 항체, IgG2a 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.
부가의 일 양상에서, 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 항-GP73 항체는 서열 번호: 28, 바람직하게는 서열 번호: 39 (이는 포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위한 서열 번호: 28의 변형된 버전임)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 28 또는 서열 번호: 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
부가의 일 양상에서, 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 항-GP73 항체는 하기에 개시되는 바와 같이, 특성들 중 어느 것을, 단독으로 또는 조합하여, 포함할 수 있다.
본원에 제공된 특정 구체예는 항체 G2-1의 개발에 일부 기반하고, 이는 인간 GP73 단백질의 아미노산 36 내지 55 내의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 GP73의 아미노산 347 내지 366 내의 에피토프에 결합한다. 일부 이러한 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 항체 G2-1의 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-Hl; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-Ll; (e) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 하나, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDRs을 포함하는 항-GP73 항체를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-Hl; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 및 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 부가의 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 및 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 부가의 일 구체예에서, 상기 항체는 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-Hl; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 하기를 포함한다:
(a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
(b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
(c) 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
다른 양상에서, 본 발명의 항체는 하기를 포함한다:
(a) (i) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) 서열 번호: 14로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및
(b) (i) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 적어도 하나, 적어도 2개, 또는 모두 3개의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
다른 양상에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 그러나 상기 서열을 포함하는 항-GP73 항체는 GP73에 결합하는 역량을 보유한다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 5개의 아미노산이 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDRs 외부의 영역에서 (즉, FRs에서) 일어난다. 바람직한 일 구체예에서, 서열 번호: 10에서 전체 6개의 아미노산이 포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위해 치환되었다 (서열 번호: 37). 선택적으로, 상기 항-GP73 항체는 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37의 VH 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VH는 하기로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDRs을 포함한다: (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (c) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
다른 양상에서, 항-GP73 항체가 제공되고, 상기 항체는 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예컨대, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 그러나 상기 서열을 포함하는 항-GP73 항체는 GP73에 결합하는 역량을 보유한다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 전체 1 내지 5개의 아미노산이 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 CDRs 외부 영역에서 (즉, FRs에서) 일어난다. 바람직한 일 구체예에서, 서열 번호: 11에서 전체 10개의 아미노산이 포유동물 세포에서 발현을 최적화하기 위해 치환되었다 (서열 번호: 38). 선택적으로, 상기 항-GP73 항체는 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38의 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 VL은 (a) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 17 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로부터 선택되는 1, 2 또는 3개의 CDRs을 포함한다.
다른 양상에서, 항-GP73 항체가 제공되고, 상기 항체는 상기에 제공된 구체예들 중 어느 것의 VH, 및 상기에 제공된 구체예들 중 어느 것의 VL을 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 37 및 서열 번호: 38, 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 37 및 서열 번호: 38 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체의 인간화 형태를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 항체는 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11, 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하고, 이는 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 10 및 서열 번호: 11, 각각의 VH 및 VL 서열을 포함하는 항체의 인간화 형태를 포함한다.
부가의 일 양상에서, 본원에 제공된 항-GP73 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 바람직한 일 구체예에서, 서열 번호: 35의 VH 서열 및 서열 번호: 36의 VL 서열, 각각을 포함하는 항-GP73 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 2의 VH 서열 및 서열 번호: 3의 VL 서열, 각각을 포함하는 항-GP73 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 부가의 일 양상에서, 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 항-GP73 항체는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 일 구체예에서, 항-GP73 항체는 항체 단편, 예컨대, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 전장 항체, 예컨대, IgG1 항체, IgG2a 항체 또는 본원에 정의되는 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소타입이다.
부가의 일 양상에서, 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 항-GP73 항체는 서열 번호: 28, 바람직하게는 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 항-GP73 항체는 서열 번호: 28 또는 서열 번호: 39의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 불변 영역 서열을 포함한다.
부가의 일 양상에서, 상기 구체예들 중 어느 것에 따른 항-GP73 항체는 하기에 개시되는 바와 같이, 특성들 중 어느 것을, 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ lμM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd)를 가지며, 선택적으로 10-13 M (예컨대 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)이다.
일 구체예에서, Kd는 -10의 반응 유닛 (response units: RU)에서 고정화된 항원 CM5 칩을 구비하는 25℃에서 BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하여 결정된다. 간단하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급자의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로리드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원을 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.8로, 5 μg/ml (-0.2 μM)로 희석시킨 후에 5 μl/분의 유속으로 주입하여 커플링된 단백질의 대략 10개의 반응 유닛 (RU)을 수득하였다. 항원의 주입 후에, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응하지 않은 그룹들을 차단하였다. 키네틱 (kinetics) 측정을 위해, 항체의 2-배의 일련의 희석물 (0.58 nM 내지 200 nM)을, 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20TM) 계면활성제 (PEST)를 갖는 PBS에 25℃에서 대략 25 μl/분의 유속으로 주입하였다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅하여 간단한 1-대-1 Langmuir 결합 모델 (BIACORE ® T100 Evaluation Software)을 사용하여 산출되었다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon 비율로 산출된다. 예컨대, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)을 참조한다. 상기 on-속도가 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106 M-1 s-1을 초과하는 경우, 상기 on-속도는, 분광광도계, 예컨대 스톱-플로우 장치가 구비된 분광광도계 (stop-flow equipped spectrophometer) (Aviv Instruments) 또는 교반된 큐벳을 구비한 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 측정되는, 증가하는 항원의 농도의 존재하에, PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체의 25℃에서의 형광 방출 세기 (여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 대역 (band-pass))의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술 (fluorescent quenching technique)을 사용하여 결정될 수 있다.
1:1 결합을 위한 Biacore 데이터 피트
측정 1 + 2
평균 (+/-)		 측정 1 + 2
평균 (+/-)		 측정 1 + 2
평균 (+/-)
항체 k on [M-1 s-1] k off [s-1] Kd [nM]
G2-2 2.602Х105
(+/- 0.375Х105)		 1.108Х10-3
(+/- 0.375Х10-3)		 4.293
(+/- 0.233)
G2-1 6.352Х105
(+/- 1.810Х105)		 1.981Х10-3
(+/- 0.757Х10-3)		 3.024
(+/- 0.331)
GP73 펩티드: SSRSVDLQTRIMELEGRVRR분석 소프트웨어: Biacore T100 평가 소프트웨어 (GE Healthcare Life Sciences)
특정 구체예에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 적절한 변형을 도입하거나, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 상기 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 이로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합으로 최종 구조체에 도달하도록 만들 수 있고, 단 상기 최종 구조체는 원하는 특성, 예컨대, 항원-결합을 포함한다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이화에 관심있는 부위는 CDRs 및 FRs을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "바람직한 치환"의 머릿말로 개시되어 있다. 더 실질적인 변화는 표 1에서 "예시되는 치환"의 머릿말로 제공되고, 아미노산 곁사슬 부류를 참조하여 하기에 더 개시되어 있다. 아미노산 치환은 관심 있는 항체로 도입될 수 있고, 원하는 활성, 예컨대, 보유된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 산물이 스크리닝될 수 있다.
Figure pat00014
Figure pat00015
아미노산은 일반적인 곁사슬 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 상기 부류들 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모체 항체 (예컨대 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 고가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 결과의 변이체(들)는 모체 항체에 비해 특정 생물학적 특성의 변형 (예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)을 가질 것이고 및/또는 실질적으로 상기 모체 항체의 특정 생물학적 특성을 보유할 것이다. 예시되는 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체이고, 이는 예컨대 본원에 개시된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단하게, 하나 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되고 상기 변이체 항체는 파지에서 디스플레이되고 특정 생물학적 활성 (예컨대 결합 친화도)에 대해 스크리닝되었다.
변경 (예컨대, 치환)은, 예컨대 항체 친화도를 향상시키기 위해, CDRs에서 이뤄질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟 (hotspots)", 체세포 성숙 과정 중에 높은 빈도로 돌연변이하는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예컨대, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) 참조), 및/또는 SDRs (a-CDRs)에서 이뤄질 수 있고, 결과의 변이체 VH 또는 VL이 결합 친화도에 대해 테스트된다. 2차 라이브러리로부터 제작 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예컨대, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 개시되었다. 친화도 성숙의 일부 구체예에서, 다양한 방법 중 어느 것 (예컨대, 에러-유발 (error-prone) PCR, 체인 셔플링 (chain shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이화)에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자로 다양성이 도입된다. 그 다음에 2차 라이브러리가 형성된다. 그 다음에 상기 라이브러리는 원하는 친화도를 갖는 항체 변이체를 동정하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 CDR-지정 접근법을 포함하고, 여기서 몇몇 CDR 잔기 (예컨대, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이화 (alanine scanning mutagenesis) 또는 모델링 (modeling)을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특히 종종 표적이 된다.
특정 구체예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 이러한 변경이 실질적으로 항원에 결합하는 항체의 역량을 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 CDRs 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 결합 친화도를 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨대, 본원에서 제공되는 보존적 치환)이 CDRs에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR 외부 "핫스팟" 또는 SDRs에서 만들어질 수 있다. 상기에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 구체예에서, 각 CDR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이화를 표적으로 할 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science , 244: 1081-1085에 개시되는 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이화"라고 부른다. 상기 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (예컨대, 대전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)이 확인되고 중성 또는 네가티브 대전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 부가의 치환을 도입할 수 있다. 대안으로서, 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조는 항체와 항원 사이에 접촉 점을 확인하기 위해 사용된다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보체로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 포함하는 지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은, 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함할 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예컨대, ADEPT) 또는 폴리펩티드에 대한 상기 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 제공되는 항체는, 상기 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 달성되어 하나 이상의 글리코실화 부위가 형성 또는 제거될 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착되는 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 네이티브 항체는, 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 부착되는 분지형, 비안테나리 (biantennary) 올리고사카리드를 통상적으로 포함한다. 예컨대 Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)를 참조한다. 상기 올리고사카리드는 다양한 탄수화물, 예컨대, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 살리실산, 뿐만 아니라 상기 비안테나리 올리고사카리드 구조의 "줄기 (stem)"에서 GlcNAc에 부착되는 푸코스 (fucose)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체에서 올리고사카리드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 형성하기 위해 만들어질 수 있다.
일 구체예에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착되는 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 개시되는 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광광도계에 의해 측정하여, Asn 297에 부착되는 모든 당구조물 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합에 비해, Asn297에서 당 사슬내에 푸코스의 평균 양을 산출하여 결정된다. Asn297은 상기 Fc 영역에서 위치 297 주위에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타내고 (Fe 영역 잔기의 Eu 넘버링); 그러나, Asn297은 또한, 항체에서 작은 서열 변이에 의해, 위치 297의 상류 또는 하류로 약 ± 3개의 아미노산, 즉, 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 (fucosylation) 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, US 특허공개 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)을 참조한다. "데푸코실화 (defucosylated)" 또는 "푸코스-결핍 (fucose-deficient)" 항체 변이체와 관련된 공보의 예로는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 데푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 US 2003/0157108 Al, Presta, L; and WO 2004/056312 Al, Adams et al., especially at Example 11), 및 녹아웃 (knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트란스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예컨대, Yamane-Ohnuki et al. Bioteeh. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Bioteehnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); and W02003/085 l07 참조)를 포함한다.
이분된 (bisected) 올리코사카리드를 갖는 항체 변이체가 부가로 제공되며, 예컨대, 상기 항체의 Fc 영역에 부착된 비안테나리 올리고사카리드는 GlcNAc에 의해 이분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예컨대 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 제6,602,684호 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착되는 올리고사카리드내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예컨대, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 개시되어 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 항체의 Fc 영역으로 도입되고, 이로 인해 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예컨대 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예컨대, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 일부의 이펙터 기능은 포함하지만 모든 이펙터 기능을 포함하는 것은 아닌 항체 변이체를 고려하고, 이는 인 비보에서 항체의 반감기가 중요하지만, 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 또는 유해한 적용에 대한 바람직한 후보체가 되었다. 인 비트로 및/또는 인 비보 세포독성 분석이 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석에서 상기 항체는 FcyR 결합이 결여되었지만 (그러므로 ADCC 활성이 결핍됨), FcRn 결합 능력을 보유하는지를 확인하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인, NK 세포는 Fc(RIII 만을 발현하고, 반면에 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII을 발현한다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위한 인 비트로 분석의 비-제한적인 예로는 U.S. 특허 제5,500,362호 (예컨대, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499- 1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에 개시되었다.
대안으로서, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, ACTITM non- radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; and CytoTox 96® non-radioactive cytotoxicity assay (Promega, Madison, WI) 참조). 이러한 분석에 대해 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells: PBMC) 및 자연 살해 (Natural Killer: NK) 세포를 포함한다.
대안으로서, 또는 부가적으로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 인 비보에서, 예컨대 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. sci. USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. C1q 결합 분석은 또한 상기 항체가 Clq에 결합할 수 없어서 CDC 활성이 결여되는 것을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석이 수행될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). FcRn 결합 및 인 비보 청소율 (clearance)/반감기 결정은 또한 당 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예컨대, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기들 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (U.S. 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치들 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 미국 제7,332,581호).
FcRs에의 결합을 향상시키거나 또는 감소시킨 특정 항체 변이체가 개시되어 있다. (예컨대, U.S. 특허 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조).
특정 구체예에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 치환 (잔기의 EU 넘버링)을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 변경이 Fc 영역에서 수행되어, 예컨대 US 특허 제6,194,551호, WO 99/51642, and Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 개시된 바와 같이, 변경된 (즉, 향상되거나 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (Complement Dependent Cytotoxicity: CDC)을 유도한다.
모체 IgGs의 태아로의 전달을 담당하는 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kirn et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), 증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대해 향상된 결합을 갖는 항체가, US2005/0014934Al (Hinton et al.)에 개시되었다. 상기 항체는 Fc 영역의 FcRn으로의 결합을 향상시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434에서 치환, 예컨대, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (US 특허 제7,371,826호).
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예와 관련하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 제5,648,260호; U.S. 특허 제5,624,821호; and WO 94/29351을 참조한다.
특정 구체예에서, 항체 중 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는, 시스테인 조작된 항체, 예컨대, "thioMAbs"를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 나타난다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올 기가 상기 항체의 접근가능한 부위에서 위치되고 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시키는데 사용되어, 본원에 더 개시되는 바와 같이 면역 접합체를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 하기 잔기들 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat numbering); 중쇄의 A118 (EU numbering); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU numbering). 시스테인 조작된 항체는 예컨대, U.S. 특허 제7,521,541호에 개시된 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 항체는 당 분야에 알려져 있고 용이하게 이용될 수 있는 부가의 비단백질성 모이어티를 포함하도록 더 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는, 이에 한정되는 것은 아니지만 수 용해성 폴리머를 포함한다. 수 용해성 폴리머의 비-제한적인 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 무작위 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n- 비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모폴리머, 프롤리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코-폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 수중 안정성 때문에 제조시에 장점을 가질 수 있다. 상기 폴리머는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착되는 폴리머의 수는 가변될 수 있고, 1 초과의 폴리머가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 타입은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 향상될 항체의 특별한 특성 또는 기능, 상기 항체 유도체가 한정된 조건하에 치료에서 사용될 수 있는지 등을 포함하는 고려사항에 기반하여 결정될 수 있다.
다른 구체예에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일 구체예에서, 상기 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 통상의 세포에 유해하지 않고, 상기 비단백질성 모이어티를, 항체-비단백질성 모이어티 근위의 세포가 사멸되는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
항체는 예컨대 U.S. 특허 제4,816,567호에 개시된 바와 같은, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 개시된 항-GP73 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예컨대, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 부가의 일 구체예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 부가의 일 구체예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 일 구체예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예컨대, 이와 형질전환되었다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구체예에서, 상기 숙주 세포는 진핵세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 또는 림프계 세포 (예컨대, YO, NSO, Sp20)이다. 일 구체예에서, 항-GP73 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기에서 제공되는 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를, 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 선택적으로 상기 항체를 상기 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
항-GP73 항체의 재조합 생산을 위해, 예컨대 상기에 개시된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리시키고 숙주 세포에서 부가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터로 삽입한다. 이러한 핵산은 기존의 절차를 사용하여 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다 (예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 개시된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 구체적으로 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해, 예컨대 U.S. 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조한다. (또한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Val. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, describing expression of antibody fragments in E. coli. 참조). 발현 후에, 상기 항체는 용해성 분획 중 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 또한 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는, 진균 및 효모 균주를 포함하는, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 (filamentous fungi) 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 구체적으로 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 (baculoviral) 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로 활용될 수 있다. 예컨대 US 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호 (유전자이식 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 개시함)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 조정된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40으로 형질전환된 마카크 신장 CVl 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예컨대, Graham et al., J. Gen Viral. 36:59 (1977)에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (baby hamster kidney cells: BHK); 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 (예컨대, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 마카크 신장 세포 (CV l); 아프리카 그린 마카크 신장 세포 (VER0-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개과 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (Wl38); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예컨대, Mather et al., Annals N. Y Aead. Sei. 383:44-68 (1982)에 개시된 바와 같은, TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함하고, 이는 DHFR CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. cii. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 (myeloma) 세포주 예컨대 YO, NSO 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토에 있어서, 예컨대, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Val. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다.
본원에 제공된 항-GP73 항체는 당 분야에 알려져 있는 다양한 분석에 의해서 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 특성화될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명의 항체는 그의 항원 결합 활성에 대해, 예컨대, ELISA, BIACore®, FACS, 면역형광법 또는 면역조직화학과 같은 알려져 있는 방법에 의해 테스트된다.
다른 양상에서, GP73에의 결합에 있어서 본원에 개시된 항체들 중 어느 것과 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 경쟁 분석이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 경쟁 항체는 본원에 개시된 항체가 결합되는 동일한 에피토프 (예컨대, 선형 또는 입체형태 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합되는 에피토프를 맵핑 (mapping)하는 상세하게 예시되는 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다.
예시되는 경쟁 분석에서, 고정된 GP73을, GP73에 결합하는 제1 표지된 항체 (예컨대, 본원에 개시된 항체) 및 GP73에 결합하는 제1 항체와 경쟁하는 그의 역량에 대해 테스트되는 제2 표지되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이트하였다. 대조군으로서, 고정된 GP73을, 제1 표지된 항체를 포함하지만 제2 표지되지 않은 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이트하였다. 상기 제1 항체의 GP73으로의 결합이 허용되는 조건하에 인큐베이트한 후에, 과량의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정된 GP73과 결합된 표지의 양을 측정하였다. 고정된 GP73과 결합된 표지의 양이 대조군 시료에 비해 테스트 시료에서 실질적으로 감소된 경우, 이는 상기 제2 항체가 제1 항체와 GP73에의 결합에 대해 경쟁하고 있는 것으로 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)를 참조한다.
본 발명은 또한 엔도솜 탈출 도메인 (EED) 펩티드 또는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 저해제, 독소 (예컨대, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 본원의 항-GP73 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
면역접합체는 약물 모이어티의 종양으로의 표적화된 전달을 허용하고, 일부 구체예에서 그안에 세포내 축적되고, 접합되지 않은 약물의 전신 투여는 허용가능하지 않은 수준의 독성을 정상 세포로 유도할 수 있다 (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
항체-EED 접합체 화합물의 예시되는 구체예는 종양 세포를 표적으로 하는 항체 (Ab), EED 펩티드, 및 Ab를 상기 EED 펩티드로 부착시키는 EED 링커 (EEDL)를 포함한다. 상기 EED는 태그 (tag)로서 상기 항체에 서열 번호: 43에 개시된 바와 같은 적합한 링커 펩티드에 의해 직접 부착될 수 있다. 예시되는 항체-EED 접합체 화합물은 식 Ab(-EEDL-EED 펩티드)를 갖는다. EED 펩티드는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 뎅기 바이러스 및 다른 바이러스 유래된 EED 펩티드 및 그의 변이체, 박테리아 유래된 EED 및 2개의 방향족 인돌 고리 또는 1개의 인돌 고리 및 2개의 방향족 페닐 기를 함유하는 펩티드를 포함한다 (WO 2016/015621; WO 2016/037985; Kiesgen et al., Protein Eng Des Sel. 27(10):331-7 (2014) and Lohn et al., Sci Rep. 6:32301 (2016)).
항체-약물 접합체 (ADC)는, 항원-발현 종양 세포에 대해 강력한 세포독성 약물을 표적으로 하여 (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), 이로 인해 효능을 최대화하고 오프-타켓 독성을 최소화하여 치료 지수를 향상시킴으로써 (Carter, and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Ace. Chem. Res. 41:98-107), 항체와 세포독성 약물 모두의 특성들을 조합하는 표적화된 화학요법 분자이다.
본 발명의 ADC 화합물은 항암 활성을 갖는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 ADC 화합물은, 상기 약물 모이어티에 접합된, 즉 공유적으로 부착된, 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 상기 약물 모이어티에 링커를 통해 공유적으로 부착된다. 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물의 유효한 용량을 종양 조직으로 선택적으로 전달하여 이로 인해 더 큰 선택성, 즉 더 적은 유효 용량이 치료 지수 ("치료 범위 (therapeutic window)")를 증가시키면서 달성될 수 있다.
상기 항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 세포독성 또는 세포분열억제 (cytostatic) 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함할 수 있다. 약물 모이어티는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 튜불린 결합 (tubulin binding), DNA 결합 또는 개재 (intercalation), 및 RNA 폴리머라제, 단백질 합성, 및/또는 토포이소머라제 (topoisomerase)의 저해를 포함하는 기전에 의해 그의 세포독성 및 세포분열억제 효과를 나타낼 수 있다. 예시되는 약물 모이어티는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 마이탄시노이드, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 네모루비신 및 그의 유도체, PNU-159682, 안트라사이클린 (anthracycline), 듀오카르마이신 (duocarmycin), 빈카 알카로이드, 탁산 (taxane), 트리코테센 (trichothecene), CC1065, 캄프토테신 (camptothecin), 엘리나피드 (elinafide), 및 세포독성 활성을 갖는 그의 입체이성질체, 동배체 (isosteres), 유사체, 및 유도체를 포함한다. 이러한 면역접합체의 비제한적인 예로는 하기에서 더 상세하게 토의된다.
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시되는 구체예는 종양 세포를 표적으로 하는 항체 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 상기 링커 모이어티 (L)에 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및/또는 시스테인을 통해 부착된다.
1.1 1. 예시되는 항체-약물 접합체
1.2
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시되는 구체예는 종양 세포를 표적으로 하는 항체 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 상기 항체는 상기 링커 모이어티 (L)에 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및/또는 시스테인을 통해 부착될 수 있다.
예시되는 ADC는 화학식 I을 갖는다:
Ab(-L-D) p I
상기에서 p는 1 내지 약 20이다.
항체에 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 유리 시스테인 잔기의 수로 제한될 수 있다. 유리 시스테인 잔기는 상기 항체 아미노산 서열로 본원에 개시된 방법에 의해 도입될 수 있다. 예시되는 화학식 I의 ADC는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 1, 2, 3, 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함한다 (Lyon, R. et al (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). 일부 구체예에서, 하나 이상의 유리 시스테인 잔기가, 조작을 사용하지 않고도 항체내에 이미 존재하고, 이러한 경우 존재하는 유리 시스테인 잔기를 사용하여 상기 항체를 약물에 접합시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 항체를 접합시키기 전에 하나 이상의 유리 시스테인 잔기를 생성하기 위해 상기 항체를 환원 조건에 노출시킨다.
a. 예시되는 링커
"링커" (L)는 하나 이상의 약물 모이어티 (D)를 항체 (Ab)에 연결시켜서 화학식 1의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성시키는데 사용될 수 있는 이관능성 (bifunctional) 또는 다관능성 (multifunctional) 모이어티이다. 일부 구체예에서, 항체-약물 접합체 (ADC)는 상기 약물 및 상기 항체에 공유적으로 부착시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 ADC를 제조하기 위해 링커 또는 약물-링커 중간체의 반응성 관능기와의 결합을 형성할 수 있다.
일 양상에서, 링커는 항체 상에 존재하는 유리 시스테인과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 갖는다. 이러한 반응성 관능기의 비-제한적인 예로는 말레이미드, 할로아세트아미드, a-할로아세틸, 활성화된 에스테르 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로리드, 술포닐 클로리드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다. 예컨대 Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773의 페이지 766 및 본원에 개시된 실시예에 개시된 접합 방법을 참조한다.
링커는 항체에 존재하는 친전자성 기와 반응할 수 있는 관능기를 가질 수 있다. 예시되는 친전자성 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 링커의 반응성 관능기 중 헤테로원자는 항체 상에 친전자성 기와 반응할 수 있고 항체 유닛에 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 반응성 관능기의 비-제한적인 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함한다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시되는 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 (maleimidocaproyl: "MC"), 말레이미도프로파노일 (maleimidopropanoyl: "MP"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("MCC")를 포함한다. 다양한 링커 성분이 당 분야에 알려져 있고, 이 중 일부는 하기에 개시되어 있다.
링커는 약물의 방출을 용이하게 하는, "절단가능한 링커"일 수 있다. 비제한적인 예시되는 절단가능한 링커는 산-불안정성 링커 (예컨대, 히드라존 포함), 프로테아제-민감성 (예컨대, 펩티다제-민감성) 링커, 광분해성 (photolabile) 링커, 또는 디술피드-함유 링커를 포함한다 (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5,208,020).
링커 성분은 항체를 다른 링커 성분 또는 약물 모이어티에 연결하는 "스트레쳐 유닛 (stretcher unit)"을 포함할 수 있다. 비제한적으로 예시되는 스트레쳐 유닛은 하기에 개시되어 있다 (여기서 물결선은 항체, 약물, 또는 부가의 링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타냄):
Figure pat00016
.
링커 성분은 상기 항체를 약물 모이어티에, 직접적으로 또는 스트레쳐 유닛 및/또는 아미노산 유닛을 통해 연결하는 "스페이서 (spacer)" 유닛을 포함할 수 있다. 스페이서 유닛은 "자가-희생 (self-immolative)" 또는 "비-자가-희생 (non-self-immolative)"일 수 있다. "비-자가-희생" 스페이서 유닛은, 상기 스페이서 유닛의 일부 또는 전부가 ADC의 절단시에 약물 모이어티에 결합되어 유지되는 것이다. 비-자가-희생 스페이서 유닛의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 글리신 스페이서 유닛 및 글리신-글리신 스페이서 유닛을 포함한다. 종양-세포 결합된 프로테아제에 의한 글리신-글리신 스페이서 유닛을 포함하는 ADC의 효소적 절단으로 상기 ADC의 나머지 부분으로부터 글리신-글리신-약물 모이어티의 방출을 유도할 수 있다. 상기 일부 사례에서, 상기 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포에서 가수분해 단계를 거쳐서, 상기 약물 모이어티로부터 글리신-글리신 스페이서 유닛을 절단한다.
"자가-희생" 스페이서 유닛은 상기 약물 모이어티의 방출을 허용한다. 링커의 스페이서 유닛은 p-아미노벤질 유닛을 포함할 수 있다. 또한, p-아미노벤질 알콜은 아미노산 유닛에 아미드 결합을 통해 부착될 수 있고, 카르바메이트, 메틸카르바메이트, 또는 카르보네이트가 상기 벤질 알콜과 약물 사이에서 만들어진다 (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). 상기 스페이서 유닛은 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)일 수 있다. 자가-희생 링커를 포함하는 ADC는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pat00017
상기에서 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로, 또는 -시아노이고;
m은 0 내지 4 범위의 정수이고;
p는 1 내지 약 20의 범위이다. 바람직하게, p는 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4의 범위이다.
A는 선택적 아실 기이고, 0 내지 8의 범위이고, W는 선택적 제2 자가 희생 기이고 w는 0-1의 범위이다.
자가-희생 스페이서의 다른 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 상기 PAB 기와 전기화학적으로 유사한 방향족 화합물, 예컨대 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (U.S. 특허 제7,375,078호; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함한다. 아미드 결합 가수분해시에 고리화를 수행하는 스페이서, 예컨대 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), 적합하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계 (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867)가 사용될 수 있다. 약물의 글리신 잔기 중의 α-탄소로의 연결은 ADC에서 유용할 수 있는 자가-희생 스페이서의 다른 예이다 (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
상기 링커 L은 1개 초과의 약물 모이어티의 항체로의 분지된, 다관능성 링커 모이어티를 통해 공유 부착시키기 위한 수지상 타입 링커일 수 있다 (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). 수지상 링커는 항체에 대한 약물의 몰 비율, 즉 로딩 (loading)을 증가시킬 수 있고, 이는 상기 ADC의 효능과 관련이 있다. 그러므로, 항체는 1개의 반응성 시스테인 티올기 만을 포함하는 경우, 다수의 약물 모이어티가 수지상 링커를 통해 부착될 수 있다.
일부 구체예에서, 링커는 용해도 및/또는 반응성을 조절하는 기로 치환된다. 비-제한적인 예로서, 대전된 치환기 예컨대 술포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 링커 시약의 수 용해도를 증가시킬 수 있고 상기 ADC를 제조하는데 사용되는 합성 경로에 따라, 상기 링커 시약과 항체 및/또는 약물 모이어티의 커플링 반응을 촉진하거나, 또는 Ab-L (항체-링커 중간체)과 D, 또는 D-L (약물-링커 중간체)과 Ab의 커플링 반응을 촉진할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 링커의 일부는 상기 항체에 커플링되고, 상기 링커의 일부는 상기 약물에 커플링되며, 상기 Ab-(링커 부분)a은 약물-(링커 부분)b에 커플링되어 화학식 1의 ADC를 형성한다. 일부 이러한 구체예에서, 상기 항체는 1개 초과의 (링커 부분)a 치환기를 포함하여, 1개 초과의 약물이 화학식 1의 ADC에서 상기 항체에 커플링된다.
본 발명의 화합물은 분명하게, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기 링커 시약으로 제조된 ADC를 포함한다: 비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜 (BMPEO), N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-히드록시 숙신이미드 에스테르 (BMPS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드 에스테르 (EMCS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르 (GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐술폰 (HBVS), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 (MPBH), 숙신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP), 숙신이미딜 요오도아세테이트 (SIA), 숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 숙신이미딜 6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 이미노티올란 (IT), 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB (술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도페닐)부티레이트)), 및 숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트 (SVSB), 및 비스-말레이미드 시약: 디티오비스말레이미도에탄 (DTME), 1,4-비스말레이미도부탄 (BMB), 1,4-비스말레이미딜-2,3-디히드록시부탄 (BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄 (BMOE), BM(PEG)2 (하기에 개시됨), 및 BM(PEG)3 (하기에 개시됨); 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성인 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔-2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성인 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠).
Figure pat00018
비스-말레이미드 시약은 상기 항체 중에 시스테인의 티올 기의 티올-함유 약물 모이어티, 링커, 또는 링커-약물 중간체에 부착하도록 할 수 있다. 티올기와 반응성이 있는 다른 관능성 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함한다.
특정의 유용한 링커 시약은 다양한 상업적 공급처, 예컨대 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO)로부터 입수될 수 있거나, 또는 당 분야에 개시된 절차; 예를 들어, Dubowchik et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6,2143,45; WO 02/088172; US 2003/130189; US 2003/096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828에 개시된 절차에 따라 합성될 수 있다.
탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드의 상기 항체로의 접합을 위한 예시되는 킬레이트제이다. 예컨대, WO 94/11026을 참조한다.
b) 예시되는 약물 모이어티
(1) 마이탄신 (Maytansine) 및 마이탄시노이드
Figure pat00019
면역접합체는 하나 이상의 마이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 마이탄시노이드는 마이탄신의 유도체이고, 여기서 C1에서의 메틸 기는 바람직하게 티오에탄일 기 또는 CH2C(CH3)2SH로 치환된다. 마이탄시노이드는 튜불린 중합화를 저해하는 작용을 하는 유사분열 (mitototic) 저해제이다. 마이탄신은 처음 동아프리카 관목인 마이테누스 세라타 (Maytenus serrata)로부터 단리되었다 (U.S. 특허 제3,896,111호). 그 후에, 특정 미생물이 또한 마이탄시노이드, 예컨대 마이탄신올 (maytansinol) 및 C-3 마이탄신올 에스테르 (U.S. 특허 제4,151,042호)를 생산하는 것을 발견하였다. 합성 마이탄시노이드는, 예를 들어, U.S. 특허 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
마이탄시노이드 약물 모이어티는 하기의 이유로 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다: (i) 발효 또는 발효 산물의 화학적 변형 또는 유도체화에 의한 제조에 상대적으로 접근가능함, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체로의 접합에 적합한 관능기를 갖는 유도체화로 수정가능함, (iii) 혈장에서 안정함, 및 (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적임.
마이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기에 적합한 특정 마이탄시노이드가 당 분야에 알려져 있고 또한 알려져 있는 방법에 따라 자연 출처로부터 단리될 수 있거나 또한 유전자 조작 기술을 사용하여 생산될 수 있다 (예컨대, Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973 참조). 마이탄시노이드는 또한 알려져 있는 방법에 따라 합성으로 제조될 수 있다 (US 특허 제2011/158991호).
예시되는 마이탄시노이드 약물 모이어티는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 변형된 방향족 고리, 예컨대: C-19-데클로로 (C-19-dechloro) (US 특허 제4,256,746호) (예를 들어, 안사미토신 (ansamytocin) P2의 리튬 알루미늄 히드리드 환원에 의해 제조됨); C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (US 특허 제4,361,650호 및 제4,307,016호) (예를 들어, 스트렙토미세스 (Streptomyces) 또는 악티노미세스 (Actinomyces)를 사용하는 데메틸화 또는 LAH (리튬 알루미늄 히드리드, 비교. U.S. 특허 제4,294,757호)를 사용하는 탈염소화 (dechlorination); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (U.S. 특허 제4,294,757호) (예를 들어, 아실 클로리드를 사용하는 아실화에 의해 제조됨)를 갖는 것, 및 상기 방향족 고리의 다른 위치에서 변형을 갖는 것을 포함한다.
예시되는 마이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 변형을 갖는 것 예컨대: C-9- SH (US 특허 제4,424,219호) (예를 들어, 마이탄신올과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2 OR) (US 4,331,598); C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (US 특허 제4,450,254호) (예를 들어, Nocardia로부터 제조됨); C-15-히드록시/아실옥시 (US 4,364,866) (예를 들어, 스트렙토미세스 (Streptomyces)에 의한 마이탄신올의 변환에 의해 제조됨); C-15-메톡시 (US 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호) (예를 들어, Trewia nudiflora로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 (US 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호) (예를 들어, 스트렙토미세스에 의한 마이탄신올의 데메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 (US 4,371,533) (예를 들어, 마이탄신올의 티타늄 트리클로리드/LAH 환원에 의해 제조됨)를 포함한다.
마이탄시노이드 화합물에서 다수의 위치들이 연결 위치로서 유용하다. 예를 들어, 에스테르 연결은 기존의 커플링 기술을 사용하여 히드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 연결은 마이탄신올 또는 마이탄신올 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
마이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 구조를 갖는 것을 포함한다:
Figure pat00020
여기서 물결선은 마이탄시노이드 약물 모이어티 중 황 원자의 ADC의 링커에 대한 공유 부착을 나타낸다. 각 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다. 황 원자에 아미드 기를 부착시킨, "알킬렌" 사슬, 즉 (CR2)m은 상기에 정의된 바와 같고, 예컨대 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌일 수 있고, 즉 m은 1, 2, 또는 3이고 (US 633410; US 5,208,020; Chari et al. (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623), 이는 그의 전문이 참조로 포함된다.
본 발명의 ADC에 대한 상기 마이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성질체, 즉 키랄 탄소에서 R 및 S 형태의 임의의 조합이 고려된다 (US 7,276,497; US 6,913,748; US 6,441,163; US RE 39,151; US 5,208,020; Widdison et al. (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408, 이는 그의 전문이 참조로 포함된다).
일부 구체예에서, 상기 마이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 입체화학을 갖는다:
Figure pat00021
.
마이탄시노이드 약물 모이어티의 예시되는 구체예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기 구조를 갖는, DM1; DM3; 및 DM4를 포함한다:
Figure pat00022
Figure pat00023
상기에서 물결선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 상기 약물 중 황 원자의 공유 부착을 나타낸다.
다른 예시되는 마이탄시노이드 항체-약물 접합체는 하기 구조 및 약어를 갖는다:
Figure pat00024
상기에서 Ab는 항체이고, p는 1 내지 약 20이고, 바람직하게, p는 1 내지 10이고, p는 1 내지 7이고, p는 1 내지 5이고, p는 1 내지 4이거나 또는 p는 1 내지 2이다. SMCC는 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트이고, DM1은 상기에 정의된 바와 같다.
Figure pat00025
상기에서 Ab는 항체이고, p는 1 내지 약 20이고, 바람직하게, p는 1 내지 10이고, p는 1 내지 7이고, p는 1 내지 5이고, p는 1 내지 4이거나 또는 p는 1 내지 2이다). SPP는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트이고, DM1은 상기에 정의된 바와 같다.
DM1이 BMPEO (비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜) 링커를 통해 항체의 티올기에 연결되는 예시되는 항체-약물 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pat00026
상기에서 Ab는 항체이고; n은 0, 1, 또는 2이고; p는 1 내지 약 20이고, 바람직하게, p는 1 내지 10이고, p는 1 내지 7이고, p는 1 내지 5이거나, 또는 p는 1 내지 4이다.
마이탄시노이드를 포함하는 면역접합체, 이를 제조하는 방법, 및 그의 치료적 용도는, 예를 들어 U.S. 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호; US 2005/0276812 A1 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있고, 개시내용은 명백하게 참조로 포함된다. 또한 Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996); and Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)를 참조한다.
상기 항체-마이탄시노이드 접합체는, 항체 또는 마이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않고, 항체를 마이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결하여 제조될 수 있다. 예컨대, U.S. 특허 제5,208,020호를 참조한다 (개시내용은 명백하게 참조로 본원에 포함됨). 항체 분자 당 접합된 평균 3-4개의 마이탄시노이드 분자를 갖는 ADC는, 상기 항체의 기능 또는 용해도에 부정적인 영향을 주지 않고, 표적 세포의 세포독성을 향상시키는 효능을 보여주었다. 일부 예에서, 독소/항체의 1 분자 조차도 네이키드 항체의 사용보다는 세포독성을 증가시킬 것으로 기대된다.
항체-마이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 예시되는 연결 기는, 예를 들어, 본원에 개시된 것 및 U.S. 특허 제5,208,020호; EP 특허 제0 425 235 B1호; Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); US 2005/0276812 A1; 및 US 2005/016993 A1에 개시된 것을 포함하고, 이의 개시내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
1.1.1.1 (2) 칼리케아미신
상기 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 항생제 중 칼리케아미신 패밀리, 및 그의 유사체는, 피코몰 이하의 농도 (sub-picomolar concentrations)로 이중-가닥 DNA 파단 (breaks)을 생산할 수 있다 (Hinman et al., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., (1998) Cancer Research 58:2925-2928). 칼리케아미신은 세포내 작용 부위를 가지며, 그러나 특정 예에서, 원형질막을 쉽게 가로지르지 못한다. 그러므로, 항체-매개된 내재화를 통한 상기 활성제의 세포 섭취 (cellular uptake)는, 일부 사례에서, 그의 세포독성 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 칼리케아미신 약물 모이어티를 갖는 항체-약물 접합체를 제조하는 비-제한적인 예시되는 방법은, 예를 들어, US 5,712,374; US 5,714,586; US 5,739,116; 및 US 5,767,285에 개시되어 있다.
(4) 피롤로벤조디아제핀
상기 ADC는 피롤로벤조디아제핀 (PBD)을 포함할 수 있다. PDB 다이머는 특정 DNA 서열을 인식하고 이에 결합할 수 있다. 천연 산물인 안트라마이신 (anthramycin)인, PBD는 1965년에 처음 보고되었다 (Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). 그 이후로, 자연-발생하는 것과 유사체인 다수의 PBD들이 보고되었다 (Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465 including dimers of the tricyclic PBD scaffold (US 6,884,799; US 7,049,311; US 7,067,511; US 7,265,105; US 7,511,032; US 7,528,126; US 7,557,099). 임의의 특정 이론에 국한되지 않고, 상기 다이머 구조는 B-형태 DNA의 소수의 홈 (minor groove)을 갖는 등전위성에 적합한 3차원 형태를 부여하여, 결합 부위에서 꼭 끼워 맞춤 (snug fit)을 유도하는 것으로 사료된다 (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham- VanDevanter, (1986) Ace. Chem. Res., 19:230-237). C2 아릴 치환기를 포함하는 다이머 PBD 화합물은 세포독성제로 유용한 것으로 밝혀졌다 (Hartley et al (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).
PBD 화합물은 인 비보에서 제거가능한 질소 보호기로 N10 위치에서 상기를 보호하여 프로드러그로 사용될 수 있다 (WO 00/12507; WO 2005/023814).
PBD 다이머는 항체들에 접합되었고 결과의 ADC는 항-암 특성을 갖는 것으로 나타났다 (US 2010/0203007). 상기 PBD 다이머 상의 비-제한적인 예시되는 연결 부위는 5-원 피롤로 고리, PBD 유닛들 사이의 테더 (tether), 및 N10-C11 이민 기를 포함한다 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
ADCs의 비-제한적인 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 A:
Figure pat00027
및 그의 염 (예컨대, 약학적으로 허용가능한 염) 및 용매화물 (예컨대, 약학적으로 허용가능한 용매화물)을 가지며, 상기에서:
물결선은 상기 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
점선은 이중 결합의 선택적 존재를 나타내고 (상기 이중 결합은, 예컨대, C1과 C2 사이 또는 C2와 C3 사이에 존재할 수 있음);
R2 및 R12는 각각 독립적으로 -H, -OH, =O, =CH2, -CN, -R, -OR, =CH-RD, =C(RD)2, -O-SO2-R, -CO2R, -COR, 및 -할로겐으로부터 선택되고,
상기 RD는 독립적으로 -H, -CO2R, -C(O)R, CHO, CO2H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
R6, R9, R16 및 R19는 독립적으로 -H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
R7 및 R17은 독립적으로 -H, -R, -OH, -OR, -SH, -SR, -NH2, -NHR, -NRR´, -NO2, Me3Sn- 및 -할로겐으로부터 선택되고;
Q는 독립적으로 -O-, -S- 및 -N(H)-로부터 선택되고;
R11은 -H 또는 -R이거나, 또는 Q가 -O-인 경우, R11은 -SO3M일 수 있고, 상기 M은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 양이온이고;
R 및 R´은 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-8 헤테로시클일, C3-20 헤테로사이클 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, R 및 R'이 동일한 질소 원자에 결합하는 경우, R 및 R´은 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있고;
R"은 C3-12 알킬렌 기이고, 상기에서 하나 이상의 탄소 원자는 O, NH 및 S로부터 선택되는 헤테로원자, 및/또는 선택적으로 치환된 방향족 고리로 대체될 수 있고;
상기 방향족 고리는 5 또는 6개의 탄소 원자 및 N 또는 NH로부터 선택되는 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하고,
X 및 X´은 독립적으로 O, S, 및 N(H)로부터 선택된다.
바람직하게, R 및 R'은 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로시클일, 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, R 및 R'이 동일한 질소 원자에 결합하는 경우, R 및 R´은 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 선택적으로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있다.
바람직하게, R9 및 R19는 -H이다.
바람직하게, R6 및 R16은 -H이다.
바람직하게, R7 및 R17은 모두 -OR7A이고, 상기 R7A는 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다. 더 바람직하게, R7A는 Me이다. 대안으로서, R7A는 CH2Ph이고, 여기서 Ph는 페닐 기이다.
바람직하게, X는 O이다.
바람직하게, R11은 H이다.
바람직하게, 각 모노머 유닛 중에 C2와 C3 사이에 이중 결합이 존재한다.
바람직하게, R2 및 R12는 독립적으로 H 및 R로부터 선택된다. 더 바람직하게, R2 및 R12는 독립적으로 R이다. 좀 더 바람직하게, R2 및 R12는 독립적으로, 선택적으로 치환된 C5-20 아릴 또는 C5-10 아릴 또는 C5-7 아릴이다. 좀 더 바람직하게, R2 및 R12는 독립적으로 선택적으로 치환된 페닐, 티에닐, 나프틸, 피리딜, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐이다. 대안으로서, R2 및 R12는 독립적으로 =O, =CH2, =CH-RD, 및 =C(RD)2로부터 선택된다. 바람직하게, R2 및 R12는 각각 =CH2이거나 또는 R2 및 R12는 각각 H이다. 대안으로서, R2 및 R12는 각각 =O이거나, 또는 R2 및 R12는 각각 =CF2이다. R2 및/또는 R12는 또한 독립적으로 =C(RD)2일 수 있다. 바람직하게, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =CH-RD이다.
R2 및/또는 R12가 =CH-RD일 때, 각 기는 독립적으로 하기에 개시된 형태를 가질 수 있다:
Figure pat00028
.
바람직하게, =CH-RD는 형태 (I)이다.
R"은 바람직하게 C3 알킬렌 기 또는 C5 알킬렌 기이다.
ADC의 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 A(I)의 구조를 갖는다:
Figure pat00029
;
상기에서 n은 0 또는 1이다.
ADC의 다른 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 A(II)의 구조를 갖는다:
Figure pat00030
;
상기에서 n은 0 또는 1이다.
ADC의 다른 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 A(III)의 구조를 갖는다:
Figure pat00031
;
상기 RE 및 RE"은 각각 독립적으로 H 또는 RD로부터 선택되고,
상기 RD는 상기와 같이 정의되고;
상기 n은 0 또는 1이다.
바람직하게, n은 0 또는 1이다. RE 및/또는 RE"은 바람직하게 H이다. 더 바람직하게, RE 및 RE"은 H이다. 대안으로서, RE 및/또는 RE"은 RD일 수 있고, 상기 RD는 선택적으로 치환된 C1-12 알킬이다. 바람직하게, RE 및/또는 RE"은 RD이고, 상기 RD는 메틸이다.
ADC의 다른 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 A(IV)의 구조를 갖는다:
Figure pat00032
;
상기 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C5-20 아릴이고;
상기 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
상기 n은 0 또는 1이다.
ADC의 다른 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 A(V)의 구조를 갖는다:
Figure pat00033
;
상기 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 C5-20 아릴이고;
상기 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
상기 n은 0 또는 1이다.
바람직하게, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 페닐, 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜로부터 선택된다. 더 바람직하게, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 페닐이다. 대안으로서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 티엔-2-일 또는 티엔-3-일이다. 대안으로서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 선택적으로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 상기 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기는 PBD 코어에 임의의 이용가능한 고리 위치를 통해 결합될 수 있다. 예를 들어, 상기 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 퀴놀리닐은 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일로부터 선택된다. 상기 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 바람직하게, 상기 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일로부터 선택된다.
ADCs의 부가의 비-제한적인 예시되는 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 B:
Figure pat00034
및 그의 염 및 용매화물을 포함하고, 상기에서:
물결선은 상기 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
OH에 연결된 물결선은 S 또는 R 입체형태를 나타내고;
Rv1 및 Rv2는 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (상기 페닐은 선택적으로 플루오로로, 구체적으로 4 위치에서 치환될 수 있음) 및 C5-6 헤테로시클일로부터 선택되고; 상기 Rv1 및 Rv2는 동일하거나 또는 상이할 수 있고; n은 0 또는 1이다.
바람직하게, Rv1 및 Rv2는 독립적으로 H, 페닐, 및 4- 플루오로페닐로부터 선택된다.
B 고리의 N10 이민, C 고리의 C-2 엔도/엑소 위치, 또는 A 고리를 연결하는 테더 유닛을 포함하는, PBD 다이머 약물 모이어티의 다양한 부위들 중 하나에서 링커가 부착될 수 있다 (하기 구조 C(I) 및 C(II) 참조).
ADCs의 비-제한적인 예시되는 PBD 다이머 성분은 하기 화학식 C(I) 및 C(II)를 포함한다:
Figure pat00035
상기에서 화학식 C(I) 및 C(II)는 그의 N10-C11 이민 형태로 개시되어 있다. 예시되는 PBD 약물 모이어티는 또한 하기 표에 개시된 바와 같이 카르비놀아민 및 보호된 카르비놀아민 형태를 포함한다:
Figure pat00036
상기에서:
n은 X가 CH2인 경우 1 내지 5이고;
n은 X가 N 또는 O인 경우 1이고;
Z 및 Z'은 독립적으로 OR 및 NR2로부터 선택되고, 여기서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 1차, 2차 또는 3차 알킬 사슬이고;
R1, R'1, R2 및 R'2는 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 알켄일, C2-C8 알킨일, C5-20 아릴 (치환된 아릴을 포함), C5-20 헤테로아릴 기, -NH2, -NHMe, -OH, 및 - SH로부터 선택되고, 여기서 알킬, 알켄일 및 알킨일 사슬은 바람직하게 5개 이하의 탄소 원자를 포함하고;
R3 및 R'3은 독립적으로 H, OR, NHR, 및 NR2로부터 선택되고, 여기서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함하는 1차, 2차 또는 3차 알킬 사슬이고;
R4 및 R'4는 독립적으로 H, Me, 및 OMe로부터 선택되고;
R5는 C1-C8 알킬, C2-C8 알켄일, C2-C8 알킨일, C5-20 아릴 (할로, 니트로, 시아노, 알콕시, 알킬 및 헤테로시클일로 치환된 아릴을 포함) 및 C5-20 헤테로아릴 기로부터 선택되고, 여기서, 일부 구체예에서, 알킬, 알켄일 및 알킨일 사슬은 5개 이하의 탄소 원자를 포함하고;
R11은 H, C1-C8 알킬, 또는 보호 기 (예컨대 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ), 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc), 또는 자가-희생 유닛을 포함하는 모이어티 예컨대 발린-시트룰린-PAB)이고;
R12는 H, C1-C8 알킬, 또는 보호 기이고;
상기에서 R1, R'1, R2, R'2, R5, 또는 R12 중 하나에서 수소 또는 A 고리들 사이에 -OCH2CH2(X)nCH2CH3O- 스페이서 중에 수소는 ADC의 링커에 연결되는 결합으로 대체된다.
ADC의 예시되는 PDB 다이머 부분은, 이에 한정되는 것은 아니지만 (물결선은 상기 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타냄) 하기를 포함한다:
Figure pat00037
.
PBD 다이머를 포함하는 부가의 비-제한적인 예시되는 ADC는 모노메틸 디술피드 N10-연결된 PBD (하기에 개시됨)를 항체에 접합시켜서:
Figure pat00038
,
모노메틸 디술피드 N10-연결된 PBD 항체-약물 접합체를 제조하여 만들어질 수 있다:
Figure pat00039
상기 PBD 다이머-말레이미드-아세탈의 링커는 산-불안정성이다.
PBD 다이머 및 PBD 다이머를 포함하는 ADC는 당 분야에 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대 WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157 및 WO 2011/130598을 참조하다.
c. 안트라사이클린
일부 구체예에서, ADC는 안트라사이클린을 포함한다. 안트라사이클린은 세포독성 활성을 나타내는 항생제 화합물이다. 임의의 특정 이론에 국한되지 않고, 안트라사이클린은 하기를 포함하는 다수의 상이한 기전으로 세포를 사멸하도록 작동할 수 있다고 연구되었다:
1) 약물 분자를 세포의 DNA로 개재하여 이로 인해 DNA-의존성 핵산 합성을 저해함;
2) 자유 라디칼의 약물에 의해 생산되어 세포 거대분자와 반응하여 세포를 손상시킴, 및/또는
3) 약물 분자와 세포막의 상호작용 (예컨대, C. Peterson et al., "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. at pp.97-102 참조).
그의 세포독성 가능성 때문에 안트라사이클린은 백혈병, 유방 암종, 폐 암종, 난소 샘암종 및 육종과 같은 다수의 암 치료에 사용되었다 (예컨대, P.H- Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11 참조).
비-제한적인 예시되는 안트라사이클린은 독소루비신, 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 다우노마이신 (daunomycin), 네모루비신, 및 그의 유도체를 포함한다. 다우노루비신 (daunorubicin) 및 독소루비신의 면역접합체 및 프로드러그가 제조되고 연구되었다 (Kratz et al (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et al (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:829-834; Dubowchik et al (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0 328 147; US 6,630,579). 상기 항체-약물 접합체 BR96-독소루비신은 종양-관련된 항원 Lewis-Y와 특이적으로 반응하였고 임상 I 및 II 상 연구에서 평가되었다 (Saleh et al (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et al (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher et al (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484).
PNU-159682는 네모루비신의 유력한 대사산물 (또는 유도체)이다 (Quintieri, et al. (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617). 네모루비신은 독소루비신의 글리코시드 아미노 상에 2-메톡시모르폴리노 기를 갖는 독소루비신의 반합성 유사체이고 임상 평가에 있고 (Grandi et al (1990) Cancer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti et al (1992) Brit. J. Cancer 65:703), 이는 간세포 암종에 대한 임상 II/III 상을 포함한다 (Sun et al (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs 1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44: Ist Ed, Abs 4649; Pacciarini et al (2006) Jour. Clin. Oncology 24: 14116).
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 비-제한적인 예시되는 ADC 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 하기 화학식 Ia로 개시되어 있다:
Figure pat00040
상기에서 R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고
R2는 C1-C5 알콕시 기이고;
R1 및 R2는 모두 메톡시 (-OMe) 일 수 있다.
L1 및 Z는 모두 본원에 개시된 바와 같은 링커 (L)이다.
T는 본원에 개시된 바와 같은 항체 (Ab)이고; 및
m은 1 내지 약 20, 바람직하게 m은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4이다.
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 부가의 비-제한적인 예시되는 ADC 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이 하기 화학식 lb로 개시되어 있다:
Figure pat00041
상기에서 R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고;
R2는 C1-C5 알콕시 기이고;
L2 및 Z는 모두 본원에 개시된 바와 같은 링커 (L)이고;
T는 본원에 개시된 바와 같은 항체 (Ab)이고;
m은 1 내지 약 20, 바람직하게, m은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4이다.
R1 및 R2는 모두 메톡시 (-OMe)일 수 있다.
네모루비신-함유 ADC의 네모루비신 성분은 PNU-159682일 수 있다. 이러한 경우에, 상기 ADC의 약물 부분은 하기 구조들 중 하나를 가질 수 있다:
Figure pat00042
;
상기에서 물결선은 상기 링커 (L)에 대한 부착을 나타낸다.
PNU-159682를 포함하는, 안트라사이클린은 항체에 몇몇의 연결 부위 및 본원에 개시된 링커를 포함하는, 다양한 링커를 통해 접합될 수 있다 (US 2011/0076287; W02009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124).
네모루비신 및 링커를 포함하는 예시되는 ADCs는, 이에 한정되는 것은 아니지만:
Figure pat00043
PNU-159682-말레이미드 아세탈 Ab
및
Figure pat00044
PNU-159682-말레이미드-Ab를 포함한다.
PNU-159682 말레이미드 아세탈-Ab의 링커는 산-불안정성이다.
(6) 기타 약물 모이어티
약물 모이어티는 또한 겔다나마이신 (Mandler et al (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791); 및 이에 한정되는 것은 아니지만, 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성인 단편, 엑소톡신 (exotoxin) A 사슬 (슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래), 리신 (ricin) A 사슬, 아브린 (abrin) A 사슬, 모데신 (modeccin) A 사슬, 알파-사르신 (alpha-sarcin), 유동 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 (dianthin) 단백질, 미국 자리공 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주 (momordica charantia) 저해제, 쿠신 (curcin), 크로틴 (crotin), 비누풀 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌 (gelonin), 미토겔린 (mitogellin), 레스트릭토신 (restrictocin), 페노마이신 (phenomycin), 에노마이신 (enomycin) 및 트리코테센 (tricothecenes)을 포함하는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편을 포함한다. 예컨대, WO 93/21232를 참조한다.
약물 모이어티는 또한 핵산분해 활성 (예컨대, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)을 갖는 화합물을 포함한다.
면역접합체는 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다.
예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 이는 신티그래픽 연구 (scintigraphic studies)를 위한 방사성 원자, 예를 들어 Tc99 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 이미징 (또한 자기 공명 이미징 (magnetic resonance imaging: MRI)로 알려져 있음)을 위한 스핀 표지 (spin label), 예컨대 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이트제와 복합체를 형성할 수 있고, 예컨대 PET 이미징을 위해 항체에 접합될 수 있다 (WO 2011/056983).
방사성-표지 또는 기타 표지가 알려진 방법으로 면역접합체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는, 예를 들어 하나 이상의 수소 대신에 하나 이상의 불소-19 원자를 포함하는 적절한 아미노산 전구체를 사용하여 생합성 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 표지 예컨대 Tc99, I123, Re186, Re188 및 In111은 상기 항체 중에 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 항체의 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57은 요오드-123을 혼입하기 위해 사용될 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)는 특정의 다른 방법을 개시하였다.
면역접합체는 프로드러그-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로드러그-활성화 효소는 프로드러그 (예컨대, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)를 활성 약물, 예컨대 항-암 약물로 전환할 수 있다. 이러한 면역접합체는, 일부 구체예에서, 항체-의존성 효소-매개된 프로드러그 요법 (antibody-dependent enzyme-mediated prodrug therapy: "ADEPT")에서 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포스페이트-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 알칼리 포스파타제 (alkaline phosphatases); 술페이트-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 아릴술파타제 (arylsulfatases); 비-독성의 5-플루오로시토신에서 항-암 약물, 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한, 시토신 데아미나제 (cytosine deaminase); 펩티드-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 프로테아제, 예컨대 세라티아 (serratia) 프로테아제, 서모리신 (thermolysin), 서브틸리신 (subtilisin), 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 포함하는 프로드러그를 전환하는데 유용한, D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 탄수화물-절단 효소 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제 (neuraminidase); β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한, β-락타마제; 및 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기 각각으로 그의 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한, 페닐실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제를 포함한다. 일부 구체예에서, 효소는 당 분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유적으로 결합될 수 있다. 예컨대, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)를 참조한다.
특정 구체예에서, 면역접합체는 프로드러그-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 일부 이러한 구체예에서, 프로드러그-활성화 효소는 프로드러그 (예컨대, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)를 활성 약물, 예컨대 항-암 약물로 전환한다. 이러한 면역접합체는 일부 구체예에서, 항체-의존성 효소-매개된 프로드러그 요법 ("ADEPT")에 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포스페이트-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 알칼리 포스파타제; 술페이트-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 아릴술파타제; 비-독성의 5-플루오로시토신에서 항-암 약물, 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한, 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 서모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 포함하는 프로드러그를 전환하는데 유용한, D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 프로드러그를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 탄수화물-절단 효소 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한, β-락타마제; 및 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기 각각으로 그의 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환하는데 유용한, 페닐실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제를 포함한다. 일부 구체예에서, 효소는 당 분야에 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유적으로 결합될 수 있다. 예컨대, Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)를 참조한다.
약물 로딩은, 화학식 1의 분자에서 항체 당 약물 모이어티의 평균 수인 p로 나타낸다. 약물 로딩은 항체 당 1 내지 20개의 약물 모이어티 (D) 범위일 수 있다. 화학식 I의 ADCs는 1 내지 20의, 약물 모이어티의 범위로 접합된 항체의 콜렉션을 포함한다. 접합 반응으로부터 ADC의 제조에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 기존의 수단 예컨대 질량 분광분석법, ELISA 분석, 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. p의 관점에서 ADC의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. 일부 예에서, 다른 약물 로딩을 갖는 ADC로부터 p가 특정 값인 경우 균일한 ADC의 분리, 정제, 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체에 있어서, p는 항체 상에 부착 부위의 수로 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 부착이 시스테인 티올인 경우, 상기 특정의 예시되는 구체예에서와 같이, 항체는 1개 또는 수개의 시스테인 티올 기를 가질 수 있거나, 또는 링커를 통해 부착될 수 있는 1개 또는 수개의 충분하게 반응성인 티올 기를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 약물 로딩이 더 높아지면, 예컨대 p >5, 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성의 손실을 유발할 수 있다. 특정 구체예에서, ADC에 있어서 평균 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5의 범위이다. 실제로, 특정 ADCs에 있어서, 항체 당 약물 모이어티의 최적 비율은 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있다 (US 7498298).
특정 구체예에서, 약물 모이어티의 이론적 최대값보다 더 적게 접합 반응 중에 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들어, 하기에서 토의되는 바와 같이, 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올 기를 포함하지 않는다; 실제로 항체 중에 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 브릿지 (disulfide bridges)로 존재한다. 특정 구체예에서, 항체는 디티오트레이톨 (dithiothreitol: DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)과 같은 환원제에 의해, 일부 또는 전부 환원 조건하에 환원되어, 반응성 시스테인 티올 기를 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 변성 조건으로 처리되어 리신 또는 시스테인과 같은 반응성 친핵성 기를 나타내었다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비율)은 다양한 방법, 예를 들어: (i) 항체에 비해 몰 과량의 약물-링커 중간체 또는 링커 시약을 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도를 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 환원 조건을 일부 또는 제한하여 조절될 수 있다.
1 초과의 친핵성 기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우, 결과의 산물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물들의 혼합물인 것으로 이해된다. 항체 당 약물의 평균 수는 이중 ELISA 항체 분석에 의해 혼합물로부터 산출될 수 있고, 이는 항체에 대해 특이적이고 또한 상기 약물에 대해 특이적이다. 개별의 ADC 분자는 질량 분광분석법에 의해 혼합물에서 확인될 수 있고, HPLC, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다 (예컨대, McDonagh et al (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). 특정 구체예에서, 단일 로딩 값을 갖는 균일한 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 분리될 수 있다.
화학식 I의 ADC는 당업자에게 알려져 있는, (1) 항체의 친핵성 기와 2가 링커 시약의 반응으로 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성하고, 그 다음에 약물 모이어티 D와의 반응; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기와 2가 링커 시약의 반응으로, 공유 결합을 통해, D-L을 형성하고, 그 다음에 항체의 친핵성 기와의 반응을 포함하는, 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하는 몇몇 경로에 의해 제조될 수 있다.
항체에서 친핵성 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만: (i) N-말단 아민 기, (ii) 곁사슬 아민 기, 예컨대 리신, (iii) 곁사슬 티올 기, 예컨대 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 경우 당 히드록실 또는 아미노 기를 포함한다. 아민, 티올, 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드 기를 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약에서 친전자성 기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있다. 특정 항체는 환원성 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)과 같은 환원제로 처리하여 항체를 전부 또는 일부 환원시킴으로써 항체를 링커 시약과의 접합을 위해 반응성으로 만들 수 있다. 그러므로 각 시스테인 브릿지는, 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 부가의 친핵성 기는 항체로 리신 잔기의 변형을 통해, 예컨대 리신 잔기와 2-이미노티올란 (Traut 시약)과의 반응에 의해 도입되어, 아민을 티올로 전환시킬 수 있다. 반응성 티올 기는 또한 1, 2, 3, 4, 또는 초과의 시스테인 잔기를 도입하여 (예컨대, 하나 이상의 비-네이티브 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조하여) 항체로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 또한 항체 상에 친전자성 기, 예컨대 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기와, 링커 시약 또는 약물 상에 친핵성 기 사이의 반응에 의해 생성될 수 있다. 링커 시약 상에 유용한 친핵성 기는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함한다. 일 구체예에서, 항체가 변형되어 링커 시약 또는 약물 상에 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입한다. 다른 구체예에서, 글리코실화 항체 중 당은, 예컨대 퍼요오데이트 (periodate) 산화 시약으로 산화되어, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 결과의 이민 Schiff 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예컨대 보로히드리드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 글리코실화 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타 퍼요오데이트의 반응으로 약물 상에 적절한 기와 반응할 수 있는 항체 중에 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기를 수득할 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 다른 구체예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 항체는 소듐 메타-퍼요오데이트와 반응하여, 제1 아미노산 대신에 알데히드를 생성할 수 있다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
약물 모이어티 상에 예시되는 친핵성 기는: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실, 및 말레이미드 기를 포함하는 링커 모이어티 및 링커 시약 상에 친전자성 기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는, 이에 한정되는 것은 아니지만: 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기를 포함한다.
ADC를 제조하기 위해 사용될 수 있는 비제한적인 예시되는 가교-링커 (cross-linker) 시약은 본원에서 "예시되는 링커" 부분에 개시되어 있다. 단백질성 모이어티 및 화학적 모이어티를 포함하는, 2개의 모이어티를 연결하기 위해 이러한 가교-링커 시약을 사용하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 일부 구체예에서, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예컨대, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는, 서로 인접하거나 또는 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되는, 상기 접합체의 세포독성 부분 및 항체를 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 항체는 종양 사전-표적화 (tumor pre-targeting)에서 활용하기 위한 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘 (streptavidin))에 접합될 수 있고, 상기 항체-수용체 접합체는 환자에게 투여되고, 그 다음에 청소제 (clearing agent)를 사용하여 순환으로부터 결합되지 않은 접합체를 제거하고 그 다음에 세포독성제 (예컨대, 약물 또는 방사성뉴클레오티드)에 접합되는 "리간드" (예컨대, 아비딘)를 투여한다.
특정 구체예에서, 본원에 제공되는 항-GP73 항체는 생물학적 시료 중에 GP73의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포함한다. "생물학적 시료"는 예컨대, 세포 또는 조직 (예컨대, 암성 또는 잠재적인 암성 림프구 조직, 예컨대 림프구, 림프모구, 단핵구, 골수성단핵구, 및 그의 혼합물을 포함하는 생검 물질)을 포함한다.
일 구체예에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-GP73 항체가 제공된다. 부가의 일 양상에서, 생물학적 시료 중에 GP73의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 상기 생물학적 시료를 본원에 개시된 바와 같은 항-GP73 항체와, 상기 항-GP73 항체의 GP73에의 결합을 허용하는 조건하에 접촉시키는 단계, 및 상기 생물학적 시료 중에 항-GP73 항체와 GP73 사이에서 복합체가 형성되는 지를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 인 비트로 또는 인 비보 방법일 수 있다. 일 구체예에서, 항-GP73 항체는 항-GP73 항체에 의한 요법에 적합한 피험체를 선택하는데 사용되고, 예컨대 GP73은 환자 선택을 위한 바이오마커이다. 부가의 일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 세포 또는 조직이다.
부가의 일 구체예에서, 항-GP73 항체는, 예컨대, 암을 진단, 예후, 또는 단계화하거나, 요법의 적절한 과정을 결정하거나, 또는 요법에 대한 암의 반응을 모니터하기 위해, 피험체에서 GP73-포지티브 암을 예컨대, 인 비보에서 영상화함으로써, 인 비보에서 검출하는데 사용된다. 인 비보 검출을 위해 당 분야에 알려져 있는 한가지 방법은, 예컨대, van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) and Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003)에 개시된 바와 같은, 면역-양전자 방출 단층촬영 (immuno-positron emission tomography: immuno-PET)이다. 이러한 구체예에서, 피험체에서 GP73-포지티브 암을 검출하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 표지된 항-GP73 항체를 GP73-포지티브 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 피험체에게 투여하는 단계, 및 상기 피험체에서 표지된 항-GP73 항체를 검출하는 단계로서, 상기 표지된 항-GP73 항체의 검출은 피험체에서 GP73-포지티브 암을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 표지된 항-GP73 항체는 양성자 방출체, 예컨대 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I에 접합된 항-GP73 항체를 포함한다.
부가의 구체예에서, 진단 또는 검출 방법은 기재에 고정된 제1 항-GP73 항체를 GP73의 존재에 대해 테스트될 생물학적 시료와 접촉시키는 단계, 상기 기재를 제2 항-GP73 항체에 노출시키는 단계, 및 상기 제2 항-GP73이 상기 생물학적 시료 중에 제1 항-GP73 항체와 GP73 사이의 복합체에 결합하는지를 검출하는 단계를 포함한다. 기재는 임의의 지지 매체, 예컨대, 유리, 금속, 세라믹, 폴리머 비드, 슬라이드, 칩, 및 다른 기재일 수 있다. 특정 구체예에서, 생물학적 시료는 세포 또는 조직을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 또는 제2 항-GP73 항체는 본원에 개시된 항체이다.
상기 구체예에 따라 진단 또는 검출될 수 있는 예시되는 질환은, 이에 한정되는 것은 아니지만, GP73-포지티브 암, 예컨대 GP73-포지티브 간암, GP73-포지티브 간세포 암종, GP73-포지티브 위암, GP73-포지티브 식도암 GP73-포지티브 췌장암, GP73-포지티브 폐암, GP73-포지티브 결장암, GP73-포지티브 유방암, GP73-포지티브 전립샘암, GP73-포지티브 백혈병, 및 GP73-포지티브 림프종을 포함한다. 일부 구체예에서, GPC-포지티브 암은 간암이다. 일부 구체예에서, GPC-포지티브 암은 간세포 암종이다. 일부 구체예에서, GP73-포지티브 암은 "0"보다 큰 항-GP73 면역조직화학 (IHC) 또는 인 시투 혼성화 (in situ hybridization: ISH) 점수를 받은 암으로, 이는 종양 세포의 >90%에서 염색이 매우 약하거나 또는 염색되지 않은 것에 해당한다. 다른 구체예에서, GP73-포지티브 암은 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 GP73을 발현한다. 일부 구체예에서, GP73-포지티브 암은 GP73 mRNA를 검출하는 역-전사효소 PCR (RT-PCR) 분석에 따라 GP73을 발현하는 암이다. 일부 구체예에서, 상기 RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
특정 구체예에서, 표지된 항-GP73 항체가 제공된다. 표지는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색단, 전자-밀집, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해, 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시되는 표지는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 (fluorescein) 및 그의 유도체, 로다민 (rhodamine) 및 그의 유도체, 단실 (dansyl), 움벨리페론 (umbelliferone), 루세리페라제 (luceriferases), 예컨대, 개똥벌레 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (U.S. 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase: HRP), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카리드 옥시다제, 예컨대, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 미크로퍼옥시다제와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위한 히드로겐 퍼옥시드를 사용하는 효소와 커플링되는, 헤테로시클릭 옥시다제 예컨대 우리카제 (uricase) 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다. 다른 구체예에서, 표지는 양성자 방출체이다. 양성자 방출체는 이에 한정되는 것은 아니지만 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 1241를 포함한다. 특정 구체예에서, 양성자 방출체는 89Zr이다.
본원에 개시되는 바와 같은 항-GP73 항체 또는 면역접합체의 약학적 제제는 원하는 순도를 갖는 이러한 항체 또는 면역접합체를 하나 이상의 선택적 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에 한정되는 것은 아니지만: 버퍼 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로리드; 헥사메토늄 클로리드; 벤즈알코늄 클로리드; 벤즈에토늄 클로리드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카리드, 디사카리드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 본원에서 예시되는 약학적으로 허용가능한 담체는 또한 사이질 (insterstitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 포함한다. 특정 예시되는 sHASEGPs 및 rHuPH20을 포함하는, 사용 방법은, US 특허 공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 개시되어 있다. 일 양상에서, sHASEGP는 하나 이상의 부가의 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시되는 동결건조된 항체 또는 면역접합체 제제는 US 특허 제6,267,958호에 개시되어 있다. 수성 항체 또는 면역접합체 제제는 US 특허 제6,171,586호 및 W02006/044908에 개시된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 버퍼를 포함한다.
본원에서 제제는 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 1개 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해 영향을 주지 않는 보완 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다.
활성 성분은, 예를 들어, 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합 (interfacial polymerization)에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템에서, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 포집될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
지효성 (Sustained-release) 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적당한 예로는 항체 또는 면역접합체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 물건, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. [0329] 인 비보 투여를 위해 사용될 제제는 일반적으로 멸균되었다. 멸균은 예컨대, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
본원에 제공된 항원-결합 분자, 항-GP73 항체 또는 면역접합체는, 치료 방법과 같은 방법에 사용될 수 있다.
일 양상에서, 본원에 제공된 항-GP73 항체 또는 면역접합체는 GP73-포지티브 세포의 증식을 저해하는 방법에 사용되고, 상기 방법은 상기 세포를 항-GP73 항체 또는 면역접합체에, 세포 표면에서 GP73에 항-GP73 항체 또는 면역접합체의 결합을 허용하는 조건하에 노출시키는 단계, 이로 인해 상기 세포의 증식을 저해하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 인 비트로 또는 인 비보 방법이다. 부가의 구체예에서, 상기 세포는 과립구 또는 골수모세포 (myeloblast)이다.
인 비트로에서 세포 증식의 저해는 CellTiter-GloTM 형광 세포 생존력 분석 (Luminescent Cell Viability Assay)을 사용하여 분석될 수 있고, 이는 Promega (Madison, WI)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 분석으로 존재하는 ATP의 정량화에 기반하여 배양물 중 생존하는 세포의 수를 결정하고, 이는 대사작용으로 활성인 세포를 나타낸다. Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88, US 특허 제6602677호를 참조한다. 상기 분석은 96- 또는 384-웰 포맷으로 수행될 수 있고, 이는 자동화된 고-처리량 스크리닝 (high-throughput screening: HTS)으로 수정될 수 있다. Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404를 참조한다.
상기 분석 절차는 단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 직접 배양된 세포로 첨가하는 것을 포함한다. 이는 세포 용해 및 루시퍼라제 반응에 의해 생성된 형광 신호의 발생을 유도한다. 상기 형광 신호는 존재하는 ATP의 양에 비례하고, 이는 배양물 중 존재하는 살아있는 세포의 수에 직접 비례한다. 데이터는 발광계 (luminometer) 또는 CCD 카메라 이미징 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력은 상대 광 유닛 (relative light units: RLU)으로 표시된다.
다른 양상에서, 약제로 사용하기 위한 항-GP73 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 부가의 양상에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-GP73 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 구체예에서, GP73-포지티브 암을 치료하는데 사용하기 위한 항-GP73 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 GP73-포지티브 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-GP73 항체 또는 면역접합체를 제공하고, 상기 방법은 상기 개체에게 유효한 양의 항-GP73 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 개체에게 하기에 개시되는 바와 같은 유효한 양의 적어도 하나의 부가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다.
부가의 일 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 항-GP73 항체 또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 약제는 GP73-포지티브 암의 치료를 위한 것이다. 부가의 일 구체예에서, 상기 약제는 GP73-포지티브 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 상기 방법은 GP73-포지티브 암을 갖는 개체에게 유효한 양의 약제를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 개체에게 하기에 개시된 바와 같은 유효한 양의 적어도 하나의 부가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다.
부가의 일 양상에서, 본 발명은 GP73-포지티브 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 이러한 GP73-포지티브 암을 갖는 개체에게 유효한 양의 항-GP73 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 개체에게 하기에 개시된 바와 같은 유효한 양의 적어도 하나의 부가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다.
상기 구체예에 따른 GP73-포지티브 암은, 예컨대, GP73-포지티브 간암, GP73-포지티브 간세포 암종, GP73-포지티브 췌장암, GP73-포지티브 폐암, GP73-포지티브 결장암, GP73-포지티브 유방암, GP73-포지티브 전립샘암, GP73-포지티브 백혈병, 또는 GP73-포지티브 림프종일 수 있다. 일부 구체예에서, GP73-포지티브 암은 "O"보다 큰 항-GP73 면역조직화학 (IHC) 또는 인 시투 혼성화 (ISH) 점수를 받는 암이고, 이는 종양 세포의 >90%에서 염색이 매우 약하거나 또는 염색되지 않은 것에 해당한다. 다른 구체예에서, GP73-포지티브 암은 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 GP73을 발현한다.
상기 구체예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
부가의 일 양상에서, 본 발명은, 예컨대, 상기 치료 방법들 중 어느 것에 사용하기 위한, 본원에 제공된 항-GP73 항체 또는 면역접합체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 일 구체예에서, 약학적 제제는 본원에 제공되는 항-GP73 항체 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 다른 구체예에서, 약학적 제제는 본원에 제공되는 항-GP73 항체 또는 면역접합체 및 하기에 개시되는 바와 같은 적어도 하나의 부가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 치료에서 단독으로 또는 다른 활성제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 적어도 하나의 부가의 치료제와 병용-투여될 수 있다.
상기에 언급된 이러한 병용 요법은 조합된 투여 (여기서 2 이상의 치료제가 동일하거나 또는 개별의 제형에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이러한 경우에, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 투여는, 부가의 치료제 및/또는 아쥬반트의 투여 이전, 동시에, 및/또는 이후에 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 또한 방사선 요법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체 (및 임의의 부가의 치료제)는, 비경구, 폐내, 및 비강내, 및, 국소 치료를 원하는 경우, 병변내, 자궁내 또는 방광내 투여를 포함하는, 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 인퓨젼은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는, 상기 투여가 간단하게 또는 만성인지에 일부 의존하여, 예컨대 주사, 가령 정맥내 또는 피하 주사와 같이, 임의의 적절한 경로에 의해 수행될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만 단일 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 (bolus) 투여, 및 펄스 인퓨젼 (pulse infusion)을 포함하는 다양한 투여 일정이 본원에서 고려되었다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 양호한 의학적 실시에 일치하는 형태로 제형화, 용량화, 및 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려해야할 요인은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 질환의 원인, 활성제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 알려져 있는 다른 요인을 포함한다. 상기 항체 또는 면역접합체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 활성제와 선택적으로 제형화된다. 이러한 다른 활성제의 유효한 양은 상기 제형 중에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 질환 또는 치료의 타입, 및 상기에 토의된 다른 요인에 의존한다. 이는 일반적으로 본원에 개시된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로, 또는 본원에 개시된 투여량의 약 1 내지 99%의 투여량, 또는 실험적으로/임상적으로 적절할 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 부가의 치료제와 조합하여 사용될 때)은 치료될 질환의 타입, 항체 또는 면역접합체의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 항체 또는 면역접합체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 환자의 병력 및 항체 또는 면역접합체에 대한 반응, 및 전문의의 견해에 의존할 것이다. 상기 항체 또는 면역접합체는 상기 환자에게 한번에 또는 일련의 치료들에 대해 적절하게 투여된다. 상기 질환의 타입 및 중증도에 따라, 항체 또는 면역접합체의 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예컨대 0.1 mg/kg-10 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있고, 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여, 또는 연속 인퓨젼으로 수행된다. 한가지 통상적인 1일 투여량은 상기에 언급된 요인에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 초과의 범위일 수 있다. 병태에 따라, 몇 일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여를 위해, 상기 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 나타날 때까지 지속될 것이다. 상기 항체 또는 면역접합체의 하나의 예시되는 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위에 있을 것이다. 그러므로, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합)의 하나 이상의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투여량은 간헐적으로, 예컨대 매주 또는 3주 마다 투여될 수 있다 (예컨대 환자에게 약 2 내지 약 20, 또는 예컨대 약 6 < 항체의 손실로 투여됨). 초기 보다 높은 로딩 용량, 그 다음에 하나 이상의 더 적은 <손실로 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 용법 (dosage regimens)이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 기존의 기술 및 분석에 의해 용이하게 모니터된다.
상기 제형 또는 치료 방법은 본 발명의 면역접합체 및 항-GP73 항체 모두를 사용하여 수행될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 상기에 개시된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제조품이 제공된다. 상기 제조품은 용기 및 상기 용기 상에 또는 이와 관련된 표지 또는 패키지 설명서를 포함한다. 적절한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 (solution bags) 등을 포함하다. 상기 용기는 다양한 물질들 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 자체로 또는 상기 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 조합시킨 조성물을 보유하고, 멸균 액세스 포트 (sterile access port)를 가질 수 있다 (예를 들어 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼 (stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 상기 조성물 중에 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 표지 또는 패키지 설명서는 상기 조성물이 선택 질환을 치료하는데 사용되는 것을 나타낸다. 더욱이, 상기 제조품은 (a) 그 안에 조성물이 포함되는 제1 용기로서, 상기 조성물은 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 것인 제1 용기; 및 (b) 그 안에 조성물이 포함되는 제2 용기로서, 상기 조성물은 부가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 것인 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 구체예의 제조품은 상기 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 설명서를 더 포함할 수 있다. 대안으로서, 또는 부가적으로, 상기 제조품은, 주사용 정균수 (bacteriostatic water for injection: BWFI), 포스페이트-완충된 식염수, Ringer 용액 또는 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로-허용가능한 버퍼를 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 더 포함할 수 있다. 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 더 포함할 수 있다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명에 따라, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있음을 이해할 수 있다.
실시예 1: 모노클로날 항체 생성
A. GP73 세포외 잔유물 도메인 항체 검출 및 특성화
인간 GP73에 대한 모노클로날 항체를, 인간 GP73 세포외 도메인의 짧은 잔유물을 포함하는 펩티드 (rGP73, 서열 번호: 1 AA 36 내지 55)에 의해 2개의 인간 scFV 라이브러리 (Creative Biolabs)를 스크리닝하여 하기 절차를 사용하여 생성하였다. 4회의 패닝 (panning)이 수행되었고 41개의 결합제가 ELISA에 의해 테스트되었고, 6개가 확인되고 시퀀싱되었다. 2개의 완전한 scFv 클론이 확인되었고, (i) 인간 IgG1 중쇄 및 인간 Igk 경쇄 불변 영역인, G2-2 및 G2-1에 의해, 및 (ii) mG2-2로 언급되는, 쥐과 IgG2a 중쇄 및 인간 Igk 경쇄 불변 영역에 의해 클로닝되었다. 항체 G2-2의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들은 각각 서열 번호: 2 및 3에 개시되어 있다. 상기 항체 G2-1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들은 각각 서열 번호: 10 및 11에 개시되어 있다. 상기 인간 중쇄 불변 영역 (IgG1)은 서열 번호: 26에 개시되어 있고, 상기 인간 카파 (kappa) 경쇄 서열은 서열 번호: 27에 개시되어 있다. 상기 쥐과 중쇄 불변 영역 (IgG2a)은 서열 번호: 28에 개시되어 있다.
B. GP73 가용성 단편 항체 검출 및 특성화
인간 GP73에 대한 모노클로날 항체를, 인간 GP73 (서열번호 1)의 AA 347-366을 포함하는 펩티드로 2마리의 Balb/c 마우스를 면역화하여 하기 절차를 사용하여 생성하였다. 융합 후에 6개의 하이브리도마는 펩티드 347-366에 결합하는 항체를 발현하였다. 3개의 항체가 시퀀싱되었고, 항체 생성을 위해 배양되었다.
포지티브 클론이 증량되었고, ELISA 및 FACS에 의해 인간 GP73, Hep3B 세포, HepG2 세포 및 HuH 7 세포에의 결합에 대해 재-스크리닝 (re-screened)되었다. 1개의 항체가 선택되었고, 정제되었다 (G2-4). 항체 G2-4의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 각각 서열번호: 18 및 19에 개시되어 있다.
더 큰 규모로 항체를 생산하기 위해, 항체를 CHO 및 293HEK 세포에서 생산하였다. VL 및 VH를 코딩하는 벡터를 CHO 세포 및 293HEK 세포로 형질감염시켰고, IgG는 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 정제되었다.
실시예 2: 면역형광 분석
Alexander 세포를 4개의 챔버 슬라이드에서 성장시켰고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 0.2% 사포닌으로 처리하였고, 10% 우혈청 알부민으로 차단하였다. 세포를 1시간 동안 염소 항-GP73 (santa cruz sc-48010) 및 mG2-2와 인큐베이트하고, 세척하였다. 결합된 항체를 항 염소 Alexa Fluor 488 (abcam ab150129) 및 항 마우스 Alexa Fluor 647 (abcam ab150115)로 염색하였다. 핵을 DAPI로 처리하였다.
실시예 3: 다양한 종양에서 면역조직화학 분석
정상의 간, 간염 간, 간세포 암종 (HCC), 자궁내막 암종, 난소 암종, 흑색종, 소세포 폐암 및 위암의 파라핀 포매된 조직을 쥐과 G2-2 (mG2-2) 또는 마우스 항 GOLPH (MO6A Sigma)로 염색하였고 그 다음에 항-마우스 IgG로 2차로 염색하였다. 핵은 헤마톡실린 (hematoxylin) (블루)으로 염색하였고, 세포질은 헤말룸-에오신 (hemalum-eosin)으로 염색하였다.
실시예 4: 항-GOLPH 항체인 G2-2, G2-1 및 대조군을 갖는 다양한 세포주의 유세포 분석
다양한 인간 및 쥐과 세포주 예컨대 HuH7, JHH4, HEK293, HEK293-GP73-myc 및 Ramos를, 그의 세포 표면 상에 GP73의 발현 및 G2-2, G2-1 및 G2-4의 결합에 대해 유세포 분석에 의해 테스트되었다. 세포를 배양하였고, 펠렛화하였고, PFA 4%로 고정하였고, mG2-2, mG2-1, G2-4, 항 myc 또는 항 CD19 IgG (BD HIB19)와 인큐베이트하였고, 세척하였고, 2차 형광 항 마우스 항체 (Alexa Fluor 488)로 염색하였다.
실시예 5: 경쟁 및 pH 의존성 펩티드 ELISA
ELISA를 비오티닐화 (biotinylated) 펩티드로 코팅된 96 웰 플레이트에서 밤새 수행하였고, 2% 젤라틴으로 차단하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 항체 G2-1 (G2-1-HRP) 또는 G2-2 (G2-2-HRP)를 적용하였고, 1.5시간 동안 인큐베이트하였다. 경쟁 테스트를 위해, 비표지된 G2-1 또는 G2-2를 고농도로 첨가하였다. pH 의존성 결합을 위해 상기 항체들을 포스페이트 버퍼 pH 4.4, 5.4, 6.4 또는 7.4에 적용하였다. 광범위한 세척 후에 발색 기질 (chromogenic substrate) (TMB Amersham)을 첨가하여 퍼옥시다제를 검출하였다. 상기 반응을 중지시키고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다.
실시예 6: G2-2의 내재화
세포주 DU145 (전립샘암) 및 Hep55.1C (간세포 암종)를 항체 G2-2 및 G2-1을 내재화하는 그의 역량을 테스트하였다. 세포를 10 ug/ml의 G2-2 또는 G2-1과 1시간 동안 4℃에서 PBS 중에서 인큐베이트하였다. 결합되지 않은 G2-2를 세척하였고, 세포를 10% FCS를 갖는 조직 배양 배지로 옮기고 그 다음에 내재화하기 위해 37℃로 가온하거나 또는 4℃로 유지하였다. 상기 내재화 과정은 15, 30, 60 또는 120분 후에 상기 세포를 0.1% 소듐 아시드 (sodium acide)를 갖는 빙냉 버퍼로 옮김으로써 중지되었다. 세포를 APC-접합된 염소 항-인간 Fab (Jackson Immuno)로 염색하였고, FACS로 분석하였다. 세포 표면 G2-2의 잔류 수준을 평균 형광 세기 (mean fluorescence intensity: MFI)에 기반하여 산출하였다. 15분 후에 G2-2 및 G2-1의 세포 표면 검출은 HuH7에서 30%로 및 DU145에서 10% 미만으로 감소되었다.
G2-2 및 G2-1이 GP73에 결합하고 조건하에 내재화되는 것을 입증하기 위해, C-말단 GP73 결합 항체 예컨대 G2-4가 결합에서 저해되는 경우, 항체는 pHrodo Green STP Ester (Thermofisher)로 표지되었다. 상기 염료는 중성 pH에서 비형광이지만, 예컨대 엔도솜에서 pH가 더 산성이 되면 형광이 증가하는 것을 나타내었다. 표지된 항체를 크기 배제 (40K MWCO)로 정제하였다. pHrodo® Green STP Ester에 의해 표지되지 않은 비 결합 이소타입 항체는 배경 형광을 위해 대조군으로 사용되었다. 10 ug/ml의 각 항체를 밤새 4℃에서 새로운 배양 배지 또는 조건화된 배지와 함께 사전-인큐베이트하였다. 조건화된 배지에 72시간 동안 배양된 HEK 293 또는 HEK 293 GP73-myc 세포로부터의 상등액을 제공하고, 이는 각각 1L의 새로운 배지에 대해 투석되었다 (10k MWCO). 투석 후에 분비된 가용성 GP73의 존재를 확인하기 위해서 상등액을 항-myc 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 300 ul/웰의 각 사전-인큐베이트된 항체에 0.6x106 HuH7 세포를 제공하였고 24 웰 플레이트에서 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 세포를 세척하였고 FACS로 분석하였다.
실시예 7: G2-2 또는 G2-1 결합에 따른 GP73의 퓨린 절단 분석
퓨린 절단의 테스트는 항체 G2-1 및 G2-2가 퓨린 절단 부위 56R의 GP73 N-말단 또는 퓨린 절단 부위 56R에 결합하고 반면에 C-말단 HIS 태그를 갖는 재조합 GP73 (GP73-HIS)은 GP73의 C-말단에서 항 HIS 항체에 의해 검출된다는 사실을 활용한다. 플레이트 결합된 항 인간 IgG는 G2-1 또는 G2-2를 포획할 수 있고, 이는 GP73-HIS에 결합한다. G2-1 또는 G2-2가 이미 GP73-HIS에 결합된 세팅에서 퓨린 절단이 일어나는 경우, GP73의 N-말단 부분만이 G2 항체에 잔류할 것이다. 반면에 퓨린 절단이 G2 항체에 의해 방해되는 경우, GP73-HIS는 항 HIS 항체에 의해 검출될 수 있다.
퓨린 절단은 1.5 ml의 튜브에서 수행된다. G2 항체가 퓨린 절단을 방해할 수 있는지를 테스트하기 위해 재조합 GOLPH-HIS 단백질 (Biolegend) 및 G2-2 또는 G2-1을 2시간 동안 100 mM HEPES 및 1 mM CaCl2 버퍼 pH 7.5에서 인큐베이트하여 항체를 GP73에 결합시켰다. 30℃에서 2시간 동안 절단을 위해 각 반응에 3U, 1.5U, 0.75U, 0.375U 또는 0U의 퓨린 (New England Biolabs)이 보충되었다. 상기 분석 세팅에서 퓨린 절단의 최대를 테스트하기위해 재조합 GOLPH-HIS 단백질 (Biolegend) 및 각각 3U, 1.5U, 0.75U, 0.375U 또는 0U의 퓨린을 2시간 동안 100 mM HEPES 및 1 mM CaCl2 버퍼 pH 7.5에서 인큐베이트하여 퓨린을 절단시켰다. 30℃에서 결합시키기 위해 2시간 동안 각 반응에 G2-2 또는 G2-1을 보충하였다.
각 반응으로부터 2 x 100 ul를, 항 인간 IgG로 밤새 코팅된 96 웰 플레이트의 웰로 옮기고, PBS 중의 1% 젤라틴으로 차단시켰다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이트한 후에 상기 플레이트를 세척하였고, 항 HIS-hrp 항체와 1시간 동안 인큐베이트하였고, 다시 세척하였고, 발색 기질 (TMB Amersham)과 인큐베이트하여 퍼옥시다제를 검출하였고, 중지시키고, 450 nm에서 판독하였다. 결과는 G2-1 및 G2-2의 결합으로 인한 퓨린 절단의 감소를 나타내었다.
실시예 8: 항-GP73 항체 및 다양한 세포주의 세포 생존력에 대한 그의 효과
세포주 HuH7 (인간 간세포 암종), 4T1 (쥐과 유방 암종) 및 CaCo2 (인간 결장직장 암종)로부터의 세포를 5% CO2와 37℃에서 10 % 우태아 혈청 (FCS)이 보충된 Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM)에서 표준 조건하에 배양하였다. HuH7 세포를 96 웰 플레이트로 옮기고, G2-2, G2-2 플러스 세툭시맙, mG2-2, mG2-2 플러스 세툭시맙, 세툭시맙 또는 대조군 항체 각각의 0.125 mg/ml 내지 2 mg/ml의 증가하는 농도로 처리하였다. 각 테스트는 3중으로 실시되었다. 72시간 후에 각 웰에 PrestoBlue 시약 (ThermoFischer)을 보충하였고, 20분 동안 37℃에서 인큐베이트하였다. 형광을 615 nm에서 판독하여 세포 생존력을 정량화하였다. PrestoBlue 시약은 대사적으로 활성인 세포에 의해 감소되었다. 세포 생존력은 항체 농도에 따라 감소되었다. 이러한 효과는 Fc 부분 즉 G2-2에서 인간 IgG1 또는 mG2-2에서 쥐과 IgG2a와 무관하다.
다양한 세포주에서 G2-1의 효과를 테스트하기 위해서, HuH7, 4T1 및 CaCo2 세포를 96 웰 플레이트로 옮겼다. 각 웰을 G2-1 2 mg/ml, G2-1 1 mg/ml 플러스 세툭시맙 1 mg/ml, 세툭시맙 2 mg/ml, 베바시주맙 2 mg/ml 또는 베바시주맙 1 mg/ml 플러스 세툭시맙 1 mg/ml로 처리하였다. 각 테스트는 3중으로 수행되었다. 세포 생존력은 72시간 후에 PrestoBlue 시약을 사용하고 615 nm에서 형광을 측정하여 정량화하였다. 또한 G2-1 플러스 세툭시맙의 부가적인 효과가 HuH7 세포에서 발견되었다.
실시예 9: 항-GP73 항체-약물 접합체 (ADCs)
항-GP73 항체-약물 접합체 (ADCs)는, 부분 감소된 G2-2 (인간 IgG1/카파) 및 mG2-2 (쥐과 IgG2/카파)를 약물-링커 모이어티 말레이미드 아세탈 PNU-159682 또는 마이탄시노이드 (MMAF)에 접합하여 생산되었다. 예컨대 Junutula et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:925-932 및 US 2011/0301334에서 이전에 개시된 바와 같이, 상기 항체를 상기 약물-링커 모이어티와 조합하여 상기 약물-링커 모이어티를 항체의 유리 시스테인 잔기에 접합시켰다. 수 시간 후에, 상기 ADCs를 정제하였다. 각 ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 모이어티의 평균 수)를 결정하였고 PNU에 대해 2이고 MMAF 접합체에 대해 2였다.
실시예 10: HuH7 세포에서 G2-2-ADC의 효능
G2-2에 말라메이드 (malameide) 교환 링커에 의해 부착된 MMAF로 구성된 항체 약물 접합체를 다양한 농도의 HUH7 세포의 세포 배양 배지에 첨가하였다. 배지를 1시간 후에 교환하였다. 세포 생존력은 98시간 후에 PrestoBlue 시약 (ThermoFischer)을 사용하여 분석하였다. 검정색 곡선은 항체 성분에 의해 결정되는 6.34nM의 IC50을 갖는 G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF를 나타내었다. 적색 곡선은 약물 성분에 의해 결정되는 0.124nM의 IC50을 갖는 G2-2-Mal-VC-PAB-MMAF를 나타내었다. 청색 곡선은 약물 성분에 의해 결정되는 IC50 277nM의 MMAF의 독성을 나타내었다. MMAF의 독성은 도 10에 개시된 바와 같이 G2-2 항체로의 부착에 의해 팩터 (Factor) 2234 만큼 증가하였다.
실시예 11: HuH7 세포주 이종이식 모델에서 G2-2-ADC의 효능
항-GP73 ADCs의 효능을 인간 HuH7 이종이식 모델을 사용하여 연구하였다. 암컷 Balb/c 누드 마우스 (Crown Bio Laboratories; Beijing, China)의 옆구리 부위에 HuH7의 10,000,000개의 세포를 피하로 각각 접종하였다. 상기 이종이식 종양이 183 mm3의 평균 종양 부피에 도달했을 때 (0일로 나타냄), 동물들을 그룹당 각각 12마리의 마우스로 무작위로 그룹화하고 0일째에 2 mg/kg ADC 및 7일째에 1 mg/kg ADC 또는 대조군 물질을 정맥내로 주사하였다. 마우스의 종양 및 체중을 연구 기간 동안 매일 측정하였다. 마우스의 체중이 그의 처음 체중의 > 20% 감소되면 마우스를 신속하게 안락사시켰다. 동물들의 종양이 2000 mm3에 도달했을 때 모든 동물들을 안락사시켰다. 이종이식 마우스로부터 단리된 HuH7 세포 및 HuH7 종양의 표면에서 GP73의 발현을 FACS 및 IHC로 확인하였다.
도 15에서 개시된 바와 같이 실질적인 종양 성장 저해가 G2-2-PNU에 의해 달성되었다. 누적 생존율의 차이는 도 12에 개시된 바와 같이 비히클 그룹과 ADC 그룹 사이에서 통계적으로 유의했다. 데이터는 SPSS를 사용하여 분석되었다.
상기 발명은 이해를 명확하게 하기 위해 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세하게 설명되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 명확하게 그의 전문이 참조로 포함된다.
실시예 12: 최적화된 GP73 항체
항체 G2-2 및 G2-1은, 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 (예컨대 IMGT/mAb-DB)에서 발견되는 항체와의 컴퓨터 비교로부터 유래되는 지정 돌연변이화에 의해 포유동물 세포에서 발현을 위해 최적화되었다. 각각의 조정으로 쥐과 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역의 프레임워크에 영향을 주었다. 이로 인해, CDRs은 그대로 유지되었다. 상기 최적화된 서열을 G2-2opti (IgG1) 및 G2-1opti (IgG1)라고 하였다. 특정 실험을 위해 G2-2opti (IgG1)를, 쥐과 CH2 및 CH2를 갖는 키메라 인간/쥐과 버전인 G2-2opti (IgG2a)로 전환시켰다. 기능적 분석에서 이러한 구조체는 G2-2 또는 G2-1 각각과 동일하거나 또는 이보다 좋게 수행되었다.
실시예 13: GP73 단백질 및 펩티드에서 특허 CN105734059A로부터의 항체 8A10 및 G2-2의 차별적 결합
특허 CN105734059A로부터의 항체 8A10을 생성하여, GP73에서 G2-2의 결합과 비교하여 GP73에서 8A10의 차별적 결합을 테스트하였다. 구체적으로, 8A10이 본 발명의 항체와 동일한 에피토프를 인식하는지를 테스트하기 위한 실험을 수행하였다.
특허 CN105734059A로부터의 항체 8A10의 공개된 뉴클레오티드 서열은 카파 경쇄의 불변 영역 중에 점 돌연변이를 포함하였다 (Y193C). 충분히 발현시키기 위해 상기 서열을, Y193으로의 역 돌연변이 (back mutation)에 의해 정준 (canonical) 쥐과 카파 서열로 피팅시켰다. 8A10의 다른 변경되지 않은 뉴클레오티드 서열은 GenScript NJ, USA에 의해 합성되었다. 분비 신호를 N-말단에 부가하였고 중쇄에 쥐과 IgG2a의 적절한 서열이 보충되었다. 각 사슬은 HEK293 세포의 일시적 형질감염을 위해 포유동물 발현 벡터로 클로닝되었다. 상기 항체를, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)에 의해 세포 상등액으로부터 추출하였고 웨스턴 블롯팅 및 ELISA에 의해 온전성 (integrity)을 테스트하였다.
293HEK 세포를, 10xHIS-Tag로 태그된 전장 GP73 AA 1-401 C-말단을 포함하는 cDNA 또는 R52A 돌연변이를 갖는 AA 36 내지 401을 포함하는 GP73 △N 변이체로, 형질감염시켜서, 10xHIS-Tag로 태그된 C-말단 비-절단가능한 변이체를 수득하였다 (GP73-His AVRR). 상기 구조체 모두에서 분비 신호를 프레임에서 N-말단에 부가하였다. 전장 GP73 발현 세포의 상등액은 GP73 AA 56 내지 401을 포함하는, sGP73-10xHis를 포함하고 (sGP73; 서열 번호: 40), 이는 AA 55에서 퓨린 또는 다른 프로테아제에 의해 단백질분해로 절단되었다. GP73 △N 변이체의 상등액은 도 20에 개시되는 바와 같이 GP73 AA 36 내지 401을 포함하는, GP73-10xHis AVRR을 포함한다 (GP73 AVRR; 서열 번호: 41). 2개의 구조체 중 후자 만이 rGP73 에피토프를 포함한다. 두 단백질들은 IMAC로 단리되었다.
ELISA는 sGP73 또는 GP73 AVRR로 밤새 코팅된 96 웰 플레이트에서 수행되었고 2% 젤라틴으로 차단되었다. 항체 8A10, G2-2opti (IgG2a) 또는 이소타입 대조군 항체가 적용되었고, 1.5시간 동안 인큐베이트되었고, 세척되었다. 2차 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 항 마우스 항체를 1시간 동안 첨가하였고, 광범위한 세척 후에 발색 기질 (TMB Amersham)을 적용하여 퍼옥시다제를 검출하였다. 반응을 중지시키고, 흡광도는 450 nm에서 판독되었고, 도 21에 개시되어 있다. 결과는 8A10이 sGP73에만 결합하고 GP73 AVRR에는 결합하지 않으며, 반면에 G2-2opti (IgG2a)는 GP73 AVRR에 결합하고 sGP73에 결합하지 않는 것을 나타내었고, 이는 인식된 에피토프가 중첩되지 않는다는 것을 나타내었다.
ELISA는 비오티닐화 펩티드 gp73 AA 36-55 또는 관련되지 않은 펩티드로 밤색 코팅된 96 웰 플레이트에서 수행되었고, 2% 젤라틴으로 차단되었다. 항체 8A10, G2-2opti (IgG2a) 또는 이소타입 대조군 항체 (IgG2a)를 적용하였고, 1.5시간 동안 인큐베이트하였고 그 다음에 세척하였다. 2차 호스래디쉬 퍼옥시다제 표지된 항 마우스 항체를 1시간 동안 첨가하였고 광범위한 세척 후에 발색 기질 (TMB Amersham)을 적용하여 퍼옥시다제를 검출하였다. 반응을 중지시키고 흡광도는 450 nm에서 판독되었고, 도 22에 개시되어 있다. 결과는 8A10이 rGP73에 결합하지 않는 것을 나타내었고, 이는 8A10 및 G2-2opti (IgG2a)의 인식된 에피토프들이 중첩되지 않는다는 것을 확인하였다.
실시예 14: HEK293-GP73-His 세포에서 퓨린 차단 실험
HEK293 GP73-His 전장 세포를 96 웰 플레이트에서 웰당 1500개의 세포로 시딩하였고 밤새 배양하였다. 다음 날, 배지를 교환하였고 세포를 베바시주맙 31.3 ug/ml, 베바시주맙 62.5 ug/ml, G2-2opti(IgG1) 31.3 ug/ml 또는 G2-2opti (IgG1) 62.5 ug/ml로 처리하였다. 퓨린 절단 저해를 조사하기 위해 개별의 항체 농도는 세포 증식에 영향을 주지 않는 범위로 선택되었다. 96시간 후에 UCP (Up-converting Phosphor Technology)를 이용하는 sGP73의 측정을 위해 상등액을 수집하였고 나머지 세포 층은 실시예 8에 개시된 PrestoBlue 시약 (Thermofisher)에 의한 증식 분석에 사용되었다. 여기서, G2-2opti (IgG1)는 HEK293 GP73-His 전장 세포에 의해 상등액으로 sGP73 분비를 감소시켰고, 반면에 이소타입 대조군인 베바시주맙은 상등액 중에 sGP73 수준에 대해 영향을 주지 않았다.
sGP73 검출을 위해 각 상등액을 항 GP73 UCP 표지된 항체를 포함하는 Hotgen 희석 버퍼에서 1:1로 희석시켰다. 그의 0.1 ml을 니트로셀룰로스 막으로 코팅된 마우스 항 GP73 항체를 포함하는 Hotgen GP73 테스트 카세트로 로딩하였고 (C 라인), 크로마토그래피 과정을 위해 15분 동안 인큐베이트하여 이로 인해 염소 항 마우스 표지된 항체로 코팅된 멤브레인 섹션에 도달하였다 (T 라인). GP73 농도는 테스트 카세트를 Hotgen UCP (Up-converting Phosphor Technology) 분석기에 삽입하여 측정되는 C 및 T 라인에서 발광의 차이로부터 추론되었다.
실시예 15: 다양한 세포주의 세포 생존력에 대한 항체 G2-2opti (IgG1) 및 G2-2opti-EED (IgG1)의 효과
최적화된 항체 G2-2opti (IgG1) 및 그의 항체 변이체이고, 엔도솜 탈출 서열 (EED)을 포함하는 G2-2opti-EED (IgG1)를, 인간 및 쥐과 암 세포주에서 효능에 대해 테스트하였다. 인간 암 세포 HCT 116 p53wt, HCT 116 p53-/-, 돌연변이된 SW 480 K-Ras G12V, Caco2 (모든 결장직장암 세포주), SKOV3 (난소암), HUH7 (인간 간세포 암종 세포주), Hepa1-6 (쥐과 간세포 암종 세포주), DU145, PC3 (인간 전립샘암 세포주) 및 H1975 (EGFR 돌연변이 T790M 및 L858R을 포함하는 폐암 세포주)를 96 웰 플레이트에서 웰당 1500개의 세포로 시딩하였고 DMEM에서 밤새 배양하였다. 다음 날 배지를 교환하였고 세포를 1 mg/ml의 G2-2opti (IgG1) 또는 G2-2opti-EED (IgG1) 또는 세툭시맙 또는 베바시주맙 또는 PBS로 처리하였다. 96시간 후에 세포 생존력을 실시예 8에 개시된 바와 같이 PrestoBlue 시약 (Thermofisher)을 사용하여 정량화하였다. PBS로 처리된 세포의 결과를 100% 생존력 수준으로 제공하였다 (도 23 참조).
SEQUENCE LISTING <110> cureab GmbH <120> ANTI-GP73 ANTIBODIES AND IMMUNOCONJUGATES <130> Z2254 PCT BS <150> EP16 19 9882.8 <151> 2016-11-21 <160> 44 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> GP73 UniProtKB Q8NBJ4 <400> 1 Met Met Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Ile Ile Val Leu Gly Phe Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu 35 40 45 Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu 50 55 60 Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln 65 70 75 80 Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn 85 90 95 Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr 100 105 110 Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln 115 120 125 Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn 130 135 140 Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile 145 150 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Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 29 <211> 393 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> GP73 UniProt Q91XA2 <400> 29 Met Met Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu 1 5 10 15 Ile Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Val Ile Val Leu Gly Phe Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Glu Leu Gln Thr Arg Ile Val Glu 35 40 45 Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu 50 55 60 Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Gln Lys Gln Arg Glu Gln 65 70 75 80 Leu Asp Arg Ile Gln Ser Ser His Ser Phe Gln Leu Glu Asn Val Asn 85 90 95 Lys Leu His Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr 100 105 110 Gly Glu Lys Leu Ile Arg Asp Leu Gln Asp Gln Leu Lys Ala Leu Gln 115 120 125 Arg Ser Tyr Ser Ser Leu Gln Gln Asp Ile Phe Gln Phe Gln Lys Asn 130 135 140 Gln Thr Ser Leu Glu Lys Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Gln Cys Ile 145 150 155 160 Ser Gln Met Thr Glu Val Lys Glu Gln Cys Asp Glu Arg Ile Glu Glu 165 170 175 Val Ile Arg Lys Arg Asn Glu Ala Pro Gly Ser Arg Asp Leu Ala Glu 180 185 190 Thr Asn Asn Gln His Gln Gln Ala Leu Lys Pro Gln Pro Lys Leu Gln 195 200 205 Glu Glu Val Pro Ser Glu Glu Gln Met Pro Gln Glu Lys Gly Asp Val 210 215 220 Pro Arg Asn Lys Ser Gln Ile Pro Ala Pro Asn Ser Glu Ser Leu Gly 225 230 235 240 Leu Lys Pro Gln Val Gln Asn Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln Ala Val 245 250 255 Gly Glu Glu His Gln Gln Ala Ser Ile Gln Gly Gln Ala Val Ala Asp 260 265 270 Gly Thr Arg Val Gly Ala Glu Lys Leu Asp Gln His Thr Gln Leu Pro 275 280 285 Ala Gly Leu Leu Ala Arg Pro Glu Glu Asp Ser Gln Tyr Pro Glu Arg 290 295 300 Glu Gln Leu Val Ile Arg Asp Arg Gln Glu Gln Gln Arg Ala Ser Glu 305 310 315 320 Glu Gly Gly Gly Gln Lys Asn Pro Gly Asp Glu Tyr Asp Met Asp Glu 325 330 335 Asn Glu Ala Glu Ser Glu Arg Glu Lys Gln Ala Ala Leu Ala Gly Asn 340 345 350 Asp Arg Asn Ile Asn Val Leu Asn Ala Asp Ala Gln Lys Arg Gly Ile 355 360 365 Ile Asn Val Pro Val Gly Ser Glu Arg Gln Ser His Ile Leu Asn Gln 370 375 380 Val Gly Ile His Ile Pro Gln Gln Ala 385 390 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> GP73 aa 36 to 55 UniProt Q8NBJ4 <400> 30 Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Arg Val Arg Arg 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> GP73 aa 36 to 55 UniProt Q91XA2 <400> 31 Ser Ser Arg Ser Val Glu Leu Gln Thr Arg Ile Val Glu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Arg Val Arg Arg 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Canis <220> <223> GP73 aa 36 to 55 UniProt E2RLA5 <400> 32 Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Val Glu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Arg Val Arg Arg 20 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> epitope of antibodies of the invention <400> 33 Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> epitope of antibodies of the invention <400> 34 Glu Gly Arg Val Arg Arg 1 5 <210> 35 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2-2opti (IgG1) and G2-2opti (IgG2a) heavy chain variable region (VH) <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ser Ala Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2-2opti (IgG1) and G2-2opti (IgG2a) light chain variable region (VL) <400> 36 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Asp Ile Ser Val Gly Phe 20 25 30 His Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr 35 40 45 Leu Leu Arg Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ile Trp His Thr Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 37 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2-1opti (IgG1) and G2-1opti (IgG2a) heavy chain variable region (VH) <400> 37 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Ser Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2-1opti (IgG1) and G2-1opti (IgG2a) light chain variable region (VL) <400> 38 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Ile Ile Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp Thr Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asp Gln Arg Pro Phe Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Ala Ala Ile Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Thr Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser His Ser 85 90 95 Thr Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 39 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2-2opti (IgG2a)/ G2-1opti (IgG2a) heavy chain constant region (IgG2a) <400> 39 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 210 215 220 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 245 250 255 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 260 265 270 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 275 280 285 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 290 295 300 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 305 310 315 320 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 325 330 <210> 40 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GP73 aa 56 to 401-His (sGP73) <400> 40 Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln 1 5 10 15 Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser 20 25 30 His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys 35 40 45 Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val 50 55 60 Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln 65 70 75 80 Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys 85 90 95 Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile Asn Gln Met Lys Glu Val Lys 100 105 110 Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu 115 120 125 Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln 130 135 140 Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu 145 150 155 160 Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser 165 170 175 Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser Glu Val Val Leu Asp Ser Lys 180 185 190 Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln Val Val Asn Glu 195 200 205 Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val 210 215 220 Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu 225 230 235 240 Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu 245 250 255 Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp 260 265 270 Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln 275 280 285 Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu 290 295 300 Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile 305 310 315 320 Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu 325 330 335 Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr Leu Ala His His His His His 340 345 350 His His His His His 355 <210> 41 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GP73 aa 36 to 401 (R52A)-His (GP73-His AVRR) <400> 41 Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Ala Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln Leu Asp Lys 35 40 45 Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Tyr 50 55 60 Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr Gly Glu Arg 65 70 75 80 Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln Arg Asn Tyr 85 90 95 Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn Gln Thr Asn 100 105 110 Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile Asn Gln Met 115 120 125 Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu Val Thr Lys 130 135 140 Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu Asn Asn Asp 145 150 155 160 Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro Arg Leu Gln 165 170 175 Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys Gly Asn Val 180 185 190 Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser Glu Val Val 195 200 205 Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn Glu Ile Gln 210 215 220 Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln Glu Pro Gly 225 230 235 240 Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg Gly Phe Gly 245 250 255 Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala Ala Leu Ser 260 265 270 Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg Asp Gln Leu 275 280 285 Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala Gly Glu Gly 290 295 300 Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn Met Asp Glu 305 310 315 320 Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu Ala Gly Asn 325 330 335 Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys Arg Asp Thr 340 345 350 Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr Leu Ala His 355 360 365 His His His His His His His His His 370 375 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Endosomal escape domain (EED) <400> 42 Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly 1 5 10 15 Gly Ile Val Gly Ser 20 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EED Linker <400> 43 Ser Ala Ala Ala Gly Thr 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2-1 HVR-L3 variant <400> 44 Gln Ser Ser His Ser Thr Ala Val Val 1 5

Claims (17)

  1. GP73, 또는 그의 항원성 부분 (antigenic portion)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열 RIMELEGRVRR (서열 번호: 33) 내에 존재하는 에피토프에 결합하는 것인,
    항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    (a) 서열 번호: 6에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 9에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)을 포함하는 항체; 또는
    (b) 서열 번호: 14에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 17에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 것인
    항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 (a)의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    a) 서열 번호: 4에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 5에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 6에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 7에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 8에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 9에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함하거나; 또는
    b) 상기 (a) 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체이고; 혹은
    상기 (b)의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    c) 서열 번호: 12에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 13에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 14에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 서열 번호: 15에 정의되는 바와 같은 CDR1, 서열 번호: 16에 정의되는 바와 같은 CDR2 및 서열 번호: 17에 정의되는 바와 같은 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하거나; 또는
    d) 상기 c)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것인
    항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
    a) 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 35에 대해 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열; 및
    서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 36에 대해 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하거나;
    b) 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 10 또는 서열 번호: 37에 대해 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열; 및
    서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 11 또는 서열 번호: 38에 대해 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하거나; 또는
    c) 상기 a) 또는 b)의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체인 것인
    항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항체의 가변 중쇄 (VH) 서열 및/또는 가변 경쇄 (VL) 서열 중 적어도 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 폴리펩티드 또는 그의 항원성 부분에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 방법으로서, 인간을 제외한 피험체에게
    a) SSRSVDLQTRIMELEGRVRR 서열 번호: 30
    b) SSRSVELQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 31; 및
    c) SSRSVDLQTRIVELEGRVRR 서열 번호: 32
    로부터 선택되는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제 (cytotoxic agent) 또는 세포독성제의 프로드러그를 포함하는 면역접합체 (immunoconjugate).
  8. 청구항 7에 있어서, 식 Ab(-L-D)p를 가지며, 상기 식에서:
    a) Ab는 상기 항체이고;
    b) L은 링커이고;
    c) D는 세포독성제이고;
    d) p는 1-8의 범위에 있는 것인 면역접합체.
  9. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항체 및 기능제 (functional agent)를 포함하는 면역접합체로서, 상기 기능제는 엔도솜 탈출 도메인 (endosomal escape domain: EED) 펩티드인 것인 면역접합체.
  10. 청구항 7 내지 9 중 어느 한 항의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, GP73-포지티브 암 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 GP73-포지티브 암은 간암, 난소암, 자궁내막 암종, 악성 흑색종, 전립샘암, 결장직장암, 또는 유방암인 약학적 조성물.
  12. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, GP73-포지티브 암 치료용 약학적 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 GP73-포지티브 암은 간암, 난소암, 자궁내막 암종, 악성 흑색종, 전립샘암, 결장직장암, 또는 유방암인 약학적 조성물.
  14. GP73-포지티브 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법으로서,
    피험체로부터의 시료 중에, 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의, GP73 폴리펩티드 또는 그의 항원성 부분과의 특이적 결합의 수준을 결정하는 단계; 및
    대조군 시료에 비해 특이적 결합의 변경된 수준을 검출하는 단계로서, 상기 검출이 질병을 갖는 피험체를 동정하는 것인 단계를 포함하는 것인 분석방법
  15. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 키메라 항원 수용체 (CAR)에 포함되는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 퓨린 절단 공통 서열 (furin cleavage consensus sequence) EGRVRR에 결합하고, GP73 단백질의 단백질분해 절단을 저해하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 GP73에 결합하지만 가용성 GP73 (sGP73)에는 결합하지 않고 따라서 순환하는 sGP73에 의해 저해 또는 중화되지 않는 것인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
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