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ES2633311T3 - Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas - Google Patents

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Andrew C. Chan
Craig W. Crowley
Henry B. Lowman
Gerald R. Nakamura
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Abstract

Un anticuerpo humanizado que se une a CD20 humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es eficaz para agotar las células B de primate in vivo, opcionalmente en donde las células B de primate son humanas, comprendiendo el anticuerpo (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia CDR1 de la SEQ ID NO.10, la secuencia CDR2 de la SEQ ID NO.11 y la secuencia de la CDR3 de la SEC ID NO. 12, y los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo III de la cadena pesada humana (VHIII), en donde la región variable de la cadena pesada comprende además las sustituciones de aminoácidos R71V, N73K y A49G, y (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia CDR1 de la SEQ ID NO. 4, la secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO. 5, la secuencia de la CDR3 de la SEC ID NO. 6 y los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo I de la cadena ligera humana K del subgrupo I (Vκ I), en donde la región variable de la cadena ligera comprende además la sustitución de aminoácidos L46P.

Description

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DESCRIPCIÓN

Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas

5 Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra CD20, y a su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con las células B.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos son una de las diferentes poblaciones de glóbulos blancos de la sangre; reconocen y responden de forma específica los antígenos extraños. Las tres clases principales de linfocitos son los linfocitos B (células B), linfocitos T (células T) y linfocitos citolíticos naturales (NK). Los linfocitos B son las células responsables de la

15 producción de anticuerpos y proporcionan inmunidad humoral. Las células B maduran en el interior de la médula ósea y abandonan la médula expresando un anticuerpo de unión al antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B no expuesta encuentra por primera vez el antígeno para el que es específico el anticuerpo unido a su membrana, la célula comienza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en células B de memoria y células efectoras denominadas "células plasmáticas". Las células B de memoria tienen una vida útil más larga y siguen expresando el anticuerpo unido a membrana con la misma especificidad que la célula progenitora original. Las células plasmáticas no producen el anticuerpo unido a membrana pero, en su lugar, producen una forma secretada del anticuerpo. Los anticuerpos secretados son las principales moléculas efectoras de la inmunidad humoral.

El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación restringida de los linfocitos B humanos, Bp35) es

25 una proteína transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD situada en los prelinfocitos B y los linfocitos B maduros (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989); y Einfeld et al. EMBO J. 7(3):711-717 (1988)). El antígeno se expresa también en máster del 90 % de linfomas de células B no de Hodgkin (LNH) (Anderson et al. Blood 63(6):1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en los citoblastos hematopoyéticos, procélulas B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). Se cree que CD20 regula una o varias etapas tempranas del proceso de activación del inicio del ciclo celular y la diferenciación (Tedderet al., supra) y posiblemente funciona como un canal de iones calcio (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).

Dada la expresión de CD20 en linfomas de células B, este antígeno ha sido una diana terapéutica útil para tratar

35 este tipo de linfomas. Hay más de 300.000 personas en Estados Unidos con LNH de células B, y cada año se diagnostican más de 56.000 nuevos casos. Por ejemplo, el anticuerpo rituximab (RITUXAN®) que es un anticuerpo monoclonal de murino/humano diseñado mediante ingeniería genética dirigido contra el antígeno CD20 humano (comercialmente disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) se utilizar para el tratamiento de pacientes con linfoma de células B no de Hodgkin positivo para CD20 de bajo grado o folicular con recidiva o resistente al tratamiento. Rituximab es el anticuerpo que se cita como "C2B8" en la patente de Estados Unidos n.º 5.736.137 concedida el 7 de abril de 1998 (Anderson et al.) y en la patente de Estados Unidos n.º

5.776.456. Los estudios realizados in vitro sobre el mecanismo de acción han demostrado que RITUXAN® se une al complemento humano y lisa las líneas de células B linfoides a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Además, tiene una actividad significativa en ensayos

45 que miden la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Los estudios preclínicos realizados in vivo han mostrado que RITUXAN® agota las células B de la sangre periférica, de los ganglios linfáticos y de la médula ósea de los macacos, supuestamente mediante procesos mediados por células y el complemento (Reff et al. Blood 83(2):435-445 (1994)). Otros anticuerpos dirigidos contra CD20 indicados para el tratamientodel LNH incluyen el anticuerpo murino Zevalin™ que está vinculado al radioisótopo itrio-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA), Bexxar™ que es otro anticuerpo totalmente murino conjugado con 1-131 (Corixa, WA).

Una limitación importante del uso de anticuerpos murinos en terapia humana es la respuesta humana contra el anticuerpo de ratón (HAMA) (véase, por ejemplo, Miller, R.A. et al. "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62:988-995, 1983; y Schroff, R.W., et al. "Human anti-murine immunoglobulin 55 response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res., 45:879-885, 1995). El documento US 5576195 describe un anticuerpo dirigido contra CD20 quimérico con CDR representadas según las SEQ ID NO 4, 5, 6 y 10, 11 y 12 descritas en el presente documento. Incluso las moléculas quiméricas, donde los dominios variables

(V) de los anticuerpos de roedor están fusionados a regiones constantes (C) humanas, siguen siendo capaces de suscitar una respuesta inmunitaria significativa (HACA, anticuerpo humano dirigido contra la quimera, por sus siglas en inglés) (Neuberger et al. Nature (Lond.), 314:268-270, 1985). Un potente enfoque para superar estas limitaciones en el uso clínico de los anticuerpos monoclonales es la "humanización" del anticuerpo murino o el anticuerpo procedente de una especie no humana (Jones et al. Nature (Lond), 321:SZ2-525, 1986; Riechman et al., Nature (Lond), 332:323-327, 1988).

65 Por lo tanto, es beneficioso producir anticuerpos terapéuticos contra el antígeno CD20 que produzcan poca o ninguna antigenicidad cuando se administran a pacientes, especialmente para el tratamiento crónico. La presente invención satisface estas y otras necesidades. La presente invención proporciona anticuerpos dirigidos contra CD20 que superan las limitaciones de las actuales composiciones terapéuticas, y ofrecen al mismo tiempo ventajas adicionales que serán evidentes a partir de la descripción detallada siguente.

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5 Sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos de unión contra el CD20 humano o fragmentos funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1, y se refiere a su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a células B. Estos anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos dirigidos contra CD20 descritos en el presente documento pueden comprender además cambios en los restos de aminoácido en la región Fc que dan lugar a una función efectora mejorada, incluyendo una función de CDC y/o ADCC mejorada y la eliminación de células B (también denominada en el presente documento como agotamiento de células B). Los anticuerpos dirigidos contra CD20 de la invención incluyen los que tienen cambios específicos que mejoran la estabilidad. Las variantes 2H7 humanizadas con mayor estabilidad son como se describe en el ejemplo 6, más adelante. Se

15 describen en el presente documento variantes deficientes en fucosa que tieen una función ADCC in vivo mejorada.

En una realización preferida de todas las composiciones de anticuerpo y los métodos de uso de la presente invención, el anticuerpo de unión a CD20 humanizado es 2H7.v16 que tienen la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO. 21 y 22, respectivamente, como se muestra en la Fig. 6 y la Fig. 7. Cuando se hace referencia a las secuencias polipeptídicas de las Figuras 6, 7 y 8, se deberá entender que los primeros 19 aminoácidos, o así, que forman la secuencia de señal secretora no están presentes en el polipéptido maduro. La región V de todas las demás variantes basadas en la versión 16 tendrán las secuencias de aminoácidos de la v16, salvo en las posiciones de las sustituciones de aminoácidos que se hayan indicado en la divulgación. Salvo que se indique otra cosa, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena L que v16.

25 La invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une al CD20 humano, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como se define en las reivindicaciones, en donde el anticuerpo es eficaz para agotar las células B de primate in vivo, comprendiendo el anticuerpo en su región variable de cadena H (VH) al menos una secuencia CDR3 de la SEQ ID NO. 12 procedente de un anticuerpo dirigido contra CD20 humano y los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo III de la cadena pesada humana (VHIII). En una realización, las células B de primate proceden de ser humano y de macaco. El anticuerpo comprende además la secuencia de la CDR1 de la cadena H de la SEQ ID NO. 10 y la secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO. 11 y comprende además la secuencia de la CDR1 de la cadena L de la SEQ ID NO. 4, la secuencia de la CDR2 de la SEC ID NO. 5, la secuencia de la CDR3 de la SEC ID NO. 6 con los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo I de la

35 cadena ligera humana K I (VκI).

El anticuerpo de la presente invención comprende la secuencia de VH de la SEQ ID NO.8 de v16, tal como se muestra en la Figura 1B. En una realización adicional de lo anterior, el anticuerpo comprende además la secuencia de VL de la SEQ ID NO.2 de v16, tal como se muestra en la Figura 1A.

En otras realizaciones, el anticuerpo humanizado es 2H7.v31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de la SEQ ID 21 y 23, respectivamente, como se muestra en la Fig. 6 y en la Fig. 8; 2H7.v31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 23 como se muestra en la Fig. 8; 2H7.v96 con las sustituciones de aminoácidos D56A y N100a en la cadena H y S92A en la cadena L de v16.

45 En realizaciones separadas, el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores comprende además al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que mejora la actividad ADCC y/o CDC con respecto a la del anticuerpo original o precursor del que se deriva, siendo v.16 el anticuerpo precursor con el que se realiza la comparación en la mayoría de los casos, y Rituxan en otros casos. Uno de estos anticuerpos con actividad mejorada comprende la triple sustitución con alanina de S298A/E333A/K334A en la región Fc. Un anticuerpo que tiene la sustitución S298A/E333A/K334A es 2H7.v31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ ID NO. 23.

En otra realización, el anticuerpo comprende además al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que

55 disminuye la actividad CDC en comparación con el anticuerpo precursor del que se deriva que, en la mayoría de los casos, es v16. Uno de estos anticuerpos con una actividad CDC reducida en comparación con v16 comprende al menos la sustitución K322A en la cadena H. La comparación de la actividad ADCC y CDC se puede someter a ensayo como se describe en los ejemplos.

En una realización preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos de longitud complenta en los que la región VH está unida a una región constante de la cadena pesada de la IgG humana. En realizaciones preferidas, la IgG es la IgG1 o la IgG3 humanas.

En una realización, el anticuerpo de unión a CD20 está conjugado con un agente citotóxico. En realizaciones 65 preferidas, el agente citotóxico es una toxina o un isótopo radioactivo.

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En una realización, los anticuerpos de la invención para su uso con fines terapéuticos o de diagnóstico se producen en células CHO.

También se proporciona una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las realizaciones 5 anteriores, y un transportador. En una realización, el transportador es un transportador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden proporcionar en un artículo de fabricación o un kit.

La invención también proporciona una formulación líquida que comprende un anticuerpo 2H7 humanizado a 20 mg/ml de anticuerpo, sulfato de histidina 10 mM pH 5,8, 60 mg/ml de sacarosa (6 %), 0,2 mg/ml polisorbato 20 (0,02 %).

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos divulgados en el presente documento, incluido un vector de expresión para expresar el anticuerpo.

15 Otro aspecto de la invención son las células hospedadoras que comprenden los anteriores ácidos nucleicos, y las células hospedadoras que producen el anticuerpo. En una realización preferida de esto último, la célula hospedadora es una célula CHO. Se proporciona un método para producir estos anticuerpos, comprendiendo el método cultivar la célula hospedadora que produce el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.

Otro aspecto más de la invención es un artículo de fabricación que comprende un recipiente y una composición contenida en su interior, en el que la composición comprende un anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores. Para su uso en el tratamiento del LNH, el artículo de fabricación comprende además un prospecto que indica que la composición se utiliza para tratar el linfoma no de Hodgkin.

25 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para inducir la apoptosis de células B in vivo, que comprende poner en contacto las células B con el anticuerpo de cualquiera de lo anterior, destruyendo de esta forma las células B.

La invención también se refiere a métodos para tratar las enfermedades divulgadas en el presente documento mediante la administración de un anticuerpo de unión a CD20 o fragmento funcional del mismo, a un mamífero tal como un paciente humano que padece la enfermedad. En los métodos para tratar una enfermedad autoinmunitaria o un cáncer positivo para CD20, el anticuerpo puede ser 2H7.v16 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO. 21 y 22, respectivamente, como se muestra en la Fig. 6 y la Fig. 7. Por lo tanto, un método para tratar el cáncer positivo para CD20, puede comprender administrar a un paciente que padece el cáncer,

35 una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención. El cáncer positivo para CD20 puede ser un linfoma de células B o una leucemia, incluido el linfoma no de Hodgldn (LNH) o la enfermedad de Hodgkin con predominancia de linfocitos (LPHD), leucemia linfocítica crónica (CLL) o SLL. En un método para tratar un linfoma o leucemia de células B, el anticuerpo se puede administrar en un intervalo de dosificación de aproximadamente 275-375 mg/m2. El método de tratamiento puede comprender además administrar al paciente al menos un agente quimioterapéutico, en el que para el linfoma no de Hodgkin (LNH), el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona.

Un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria puede comprenden administrar a un paciente que padece la

45 enfermedad autoinmunitaria, una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de unión a CD20 humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores. La enfermedad autoinmunitaria se selecciona entre el grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (LSE), enfermedad de Wegener, enfermedad inflamatoria del intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmunitaria, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis. Cuando la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide, el anticuerpo se puede administrar junto con un segundo agente terapéutico, que es preferentemente metotrexato.

En estos métodos de tratamiento, los anticuerpos de unión a CD20 se pueden administrar solos o junto con u

55 segundo agente terapéutico tal como un segundo anticuerpo, o un agente quimioterapéutico, o un agente inmunosupresor. El segundo anticuerpo puede ser uno que se una a CD20 o a un antígeno de células B diferente, o un NK o un antígeno de células T. En una realización, el segundo anticuerpo es un anticuerpo dirigido contra CD20 radiomarcado. En otras realizaciones, el anticuerpo de unión a CD20 está conjugado con un agente citotóxico que incluye una toxina o un isótopo radioactivo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria seleccionada entre el grupo que consiste en dermatomiositis, granulomatosis de Wegener, ANCA, anemia aplásica, anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA), deficiencia en factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, rechazo al trasplante de órgano sólido, enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), 65 mediada por IgM, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), tiroiditis de Hashimoto, hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (VIH), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain

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Barre, vasculitis de grandes vasos, arteritis de células gigantes (de Takayasu), vasculitis de vasos intermedios, enfermedad de Kawasaki, poliarteritis nodosa, que comprende administrar a un paciente que padece la enfermedad, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a CD20. En una realización de este método, el anticuerpo de unión a CD20 es Rituxan®.

5 Se describe en el presente documento un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.:24 de CD20 de macaco (mostrada en la Fig. 19). Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con las sustituciones de aminoácidos conservativas mostradas en la Fig. 20. Un vector puede comprender el ácido nucleico anterior, incluyendo un vector de expresión para su expresión en una célula hospedadora. Una célula hospedadora puede comprender el vector. También se describe un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la [SEQ ID NO.25; Fig. 20] de CD20 de macaco.

Breve descripción de las figuras

15 La Fig. 1A es una alineación de secuencias que compara las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera (Vl) de cada uno de 2H7 murino (SEQ ID NO. 1), variante 2H7. v16 humanizada (SEQ ID NO. 2), y subgrupo I de la cadena ligera kappa humana (SEQ ID NO. 3). Las CDR de 2H7 de VL y de hu2H7.v16 son como sigue: CDR1 (SEQ ID NO.4), CDR2 (SEQ ID NO.5), y CDR3 (SEQ ID NO.6). La Fig. 1B es una alineación de secuencias que compara las secuencias VH de 2H7 murino (SEQ ID NO. 7), variante 2H7.v16 humanizada (SEQ ID NO. 8), y la secuencia de consenso del subgrupo III de la cadena pesada humana (SEQ ID NO. 9). Las CDR de VH de 2H7 y hu2H7.v16 son como sigue: CDR1 (SEQ ID NO.10), CDR2 (SEQ ID NO. 11), y CDR3 (SEQ ID NO.12). En la Fig. 1A y en la Fig. 1B, la CDR1, CDR2 y CDR3 de cada cadena están incluidas entre corchetes, flanqueadas por las regiones marco, FR1-FR4, como se indica. 2H7 se refiere al anticuerpo murino 2H7. Los

25 asteriscos entre dos filas de secuencias indican las posiciones de las secuencias que son diferentes entre las dos secuencias. La numeración de restos se realiza según Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), con las inserciones mostradas como a,b, c, d, y e. La Fig. 2 muestra la secuencia del fagémido pVX4 (SEQ ID NO. 13) usada para la construcción de plásmidos Fab de 2H7 (véase el Ejemplo 1) así como las secuencias de aminoácidos de la cadena L (SEQ ID NO. 14) y de la cadena H (SEQ ID NO.15) del Fab del anticuerpo humanizado dirigido contra IFN-α injertado con CDR. La Fig. 3 muestra la secuencia del plásmido de expresión que codifica el Fab de 2H7.v6.8 quimérico (SEQ ID NO.16). Se muestran las secuencias de aminoácidos de la cadena L (SEQ ID NO.17) y la cadena H (SEQ ID NO.18).

35 La Fig. 4 muestra la secuencia del plásmido pDR1 (SEQ ID NO.19; 5391 pb) para la expresión de las cadenas ligeras de la inmunoglobulina como se describe en el Ejemplo 1. pDR1 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, la cadena ligera de un anticuerpo humanizado dirigido contra CD3 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)), cuyos codones de inicio y de terminación están indicados en negrita y subrayado. La Fig. 5 muestra la secuencia del plásmido pDR2 (SEQ ID NO.20; 6135 pb) para la expresión de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina como se describe en el Ejemplo 1. pDR2 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, la cadena pesada de un anticuerpo humanizado dirigido contra CD3 (Shalaby et al., supra), cuyos codones de inicio y de terminación están indicados en negrita y subrayado. La Fig. 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena L completa de 2H7.v16 (SEQ ID NO.21). Los primeros 19 aminoácidos antes de DIQ son la secuencia de señal secretora que no está presente en la cadena

45 polipeptídica maduras. La Fig. 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena L completa de 2H7.v16 (SEQ ID NO.22). Los primeros 19 aminoácidos antes de EVQ son la secuencia de señal secretora que no está presente en la cadena polipeptídica maduras. Alineando la secuencia VH de la Fig. 1B (SEQ ID NO. 8) con la secuencia de la cadena H completa, la región constante γ1 humana va desde la posición de aminoácido 114-471 de la SEQ ID NO. 22. La Fig. 8 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena L completa de 2H7.v31 (SEQ ID NO.23). Los primeros 19 aminoácidos antes de EVQ son la secuencia de señal secretora que no está presente en la cadena polipeptídica maduras. La cadena L es la misma que para 2H7.v16 (véase la Fig. 6). La Fig. 9 muestra la estabilidad relativa de las variantes de IgG 2H7.v16 y 2H7.v73. Los resultados de los ensayos se normalizaron a los valores anteriores a la incubación y se notificaron como el porcentaje remanente

55 después de la incubación. La Fig. 10 es una diagrama de flujo que resume los cambios en los aminoácidos entre el 2H7 murino hasta un subconjunto de versiones humanizadas para llegar a v75. La Fig. 11 es un resumen del recuento promedio absoluto de células B [CD3-/CD40+] en todos los grupos (estudio 2H7 y estudio Rituxan combinados), tal como se describe en el Ejemplo 10. La Fig. 12 muestra los resultados de un ensayo ADCC representativo de variantes de 2H7 deficientes en fucosa, como se describe en el Ejemplo 11. La Fig. 13 muestra los resultados de una tinción con Anexina V representada gráficamente en función de la concentración del anticuerpo. Las células Ramos se trataron con un anticuerpo de control IgG 1 irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (cuadrados), o rhuMAb 2H7.v16 (triángulos) en presencia de un anticuerpo

65 secundario de reticulación, y se analizaron mediante FACS. Las Figuras 13-15 se describen en el Ejemplo 13. La Fig. 14 muestra los resultados de una tinción doble con Anexina V y yoduro de propidio representada gráficamente en función de la concentración del anticuerpo. Las células Ramos se trataron con un anticuerpo de control IgG1 irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (cuadrados), o rhuMAb 2H7.v16 (triángulos) en presencia de un anticuerpo secundario de reticulación, y se analizaron mediante FACS. La Fig. 15 muestra el recuento (en 10 s) de células vivas, las células no teñidas se representaron gráficamente

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5 en función de la concentración del anticuerpo. Las células Ramos se trataron con un anticuerpo de control IgG1 irrelevante (Herceptin®; círculos), Rituximab (cuadrados), o rhuMAb 2H7.v16 (triángulos) en presencia de un anticuerpo secundario de reticulación, y se analizaron mediante FACS. Las Figuras 16, 17, 18 muestran la inhibición del crecimiento de células tumorales Raji en ratones atímicos, tal como se describe en el Ejemplo 14. Los animales se trataron semanalmente (como se indica mediante flechas verticales; n=8 ratones por grupo) durante 6 semanas con PBS (control) o con Rituxan® o rhuMAb 2H7.v16 a 5 mg/kg (FIG. 16), 0,5 mg/kg (Fig. 17), o 0,05 mg/kg (Fig. 18). La Fig. 19 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO.14) y aminoácidos (SEQ ID NO.15) de CD20 de macaco, tal como se describe en el Ejemplo 15. La Fig. 20 muestra la secuencia de aminoácidos de CD20 de macaco. Los restos que se diferencian del CD20

15 humano están subrrayados y los restos humanos se indican directamente bajo el resto de mono. El posible dominio extracelular de CD20 de mono está en negrita. La Fig. 21 muestra los resultados de células de macaco que expresan la unión de CD20 a hu2H7.v16, .v31, y Rituxan, tal como se describe en el Ejemplo 15. Los anticuerpos se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para unirse y desplazar la unión del 2H7 de murino conjugado con FITC a CD20 de cinomolgo. La Fig. 22 muestra el esquema de escalado de dosis para el ensayo clínico en fase I/II de artritis reumatoide. La Fig. 23 muestra el vector para la expresión de 2H7.v16 en células CHO.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

25 El antígeno "CD20" es una fosfoproteína transmembrana glicosilada con un peso molecular de aproximadamente 35 kD que se encuentra en la superficie de más del 90 % de las células B de la sangre periférica u órganos linfoides. CD20 se expresa en las primeras etapas del desarrollo de las precélulas B, y permanece hasta la diferenciación de las células en el plasma; no se encuentra en los citoblastos humanos, céluls precursoras linfoides o en células plasmáticas normales. CD20 está presente tanto en las células B normales como en las células B malignas. En la bibliografía, otros nombres de CD20 incluyen "antígeno de diferenciación restringido de linfocitos B" y "Bp35". En antígeno CD20 se describe en, por ejemplo, Clark y Ledbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989) y Valentine et al. J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989).

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales

35 (que incluyen los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anicuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad o función biológica deseada.

La actividad biológica de los anticuerpos de unión a CD20 y de unión a CD20 humanizado de la presente invención incluirán al menos la unión del anticuerpo al CD20 humano, más preferentemente la unión al CD20 humano y de otros primates (incluidos el macaco, mono rhesus, y chimpancé). Los anticuerpos se unirían a CD20 con un valor de Kd no superior a 1 x 10-8, preferentemente un valor de Kd no superior a aproximadamente 1 x 10-9, y será capaz de destruir o agotar las células B in vivo, preferentemente en al menos un 20 % cuando se compara con el correspondiente control negativo que no está tratado con dicho anticuerpo. El agotamiento de células B puede ser el

45 resultado de uno o más de ADCC, CDC, apoptosis, u otro mecanismo. En algunas realizaciones del tratamiento de las enfermedades del presente documento, se pueden desear funciones efectoras o mecanismos específicos y no otros, y algunas variantes del 2H7 humanizado se prefieren para conseguir dichas funciones biológicas, tales como ADCC.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

55 "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión a antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena ligera y de cadena pesada en asociación estrecha no covalente. A partir del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles en cada una de las cadenas H y L) que aportan los restos de aminoácidos para la unión al antígeno y que transmiten al anticuerpo la especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos

65 individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy

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específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones convencionales de anticuerpos (policlonales) que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha obtenido a partir de una población de 5 anticuerpos sustancialmente homogénea, y esto no se debe de tomar como una necesidad de preparar el anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez en Kohler et al., Nature

256:495 (1975), o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos contra fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los "fragmentos funcionales" de los anticuerpos de unión a CD20 de la invención son aquellos fragmentos que retienen la unión al CD20 con prácticamente la misma afinidad que la molécula intacta de longitud completa de la

15 que se derivan, y muestran actividad biológica incluyendo el agotamiento de células B tal como se determina mediante ensayos in vitro o in vivo tales como los descritos en el presente documento.

El término "variable" se refiere al hecho de que algunos segmentos de los dominios variables tienen secuencias que varían ampliamente entre los anticuerpos. El dominio V media en la unión al antígeno, y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a través de los 110 aminoácidos que constituyen los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten en variantes relativamente ajustados que se denominan regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas "regiones hipervairables", cada una con 9-12 aminoácidos de longitud. Cada uno de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprende cuatro

25 regiones FR, que en gran medida adoptan una configuración de β-lámina, unidas entre sí por medio de tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y, en algunos casos forman parte de, la estructura de la β-lámina. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las FR y, junto con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

La expresión "región hipervariable" cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoácido

35 de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende, de forma general, los restos de aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y aproximadamente alrededor de 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos restos procedentes de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) de la VL, y 26-32 (H1), 52A-55 (H2) y 96101 (H3) de la VH (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

Como se hace referencia en el presente documento, la "secuencia consenso" o secuencia consenso del dominio V es una secuencia artificial derivada de la comparación entre secuencias de aminoácidos de secuencias conocidas de

45 la región variable de la inmunoglobulina humana. Basándose en estas comparaciones, se prepararon secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los aminoácidos del dominio V que son un consenso de las secuencias derivadas a partir de los dominios V K humano y del subgrupo III de la cadena H humana. La secuencia V de consenso no tienen ninguna especificidad o afinidad de unión a antígeno conocida.

Los anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricas" tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo concreta, mientras que la cadena (o las cadenas) restante es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase

o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica

55 deseada (patente de Estados Unidos n.º 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Un anticuerpo humanizado, tal como se usa en el presente documento es un subconjunto de anticuerpos quiméricos.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una mínima parte de la secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o aceptor) en las que los restos de la región hipervariable del receptor están sustituidos por restos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un ratón, rata, conejo o un primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de Fv de la inmunoglobulina 65 humana se reemplazan por restos correspondientes no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones

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se efectúan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo, tal como la afinidad de unión. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todas de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de la

5 inmunoglobulina humana, aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que mejoren la afinidad de unión. El número de estas sustituciones de aminoácidos en la FR no suele ser mayor de 6 en la cadena H y, en la cadena L, de no más de 3. El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera opcional al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struck. Biol. 2:593-596 (1992).

Las "funciones efectoras" de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de secuencia de aminoácidos variante) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad

15 dependiente del complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por defecto de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.

La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que una Ig secretada unida a receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta un antígeno y eliminar posteriormente la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para dicha eliminación. Las células principales para mediar la ADCC, las células NK, solo expresan FcγRIII, mientras que los

25 monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede llevar a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa o adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Receptor de Fc" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia de FcR humano natural. Además, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor 35 gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FCKRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores de FcγRII incluyen FcγRIIA (un "receptor activante") y FcγRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activante FcγRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRNB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase la revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se han revisado en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. immunol 9:45792 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término "FcR" del presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG

45 de la madre al feto (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

El documento WO00/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. Véase, además, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y llevan a cabo funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcγRIII y llevan a cabo una función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; prefiriéndose las PBMC y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre.

55 La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta del complemento clásica se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a los anticuerpos (de la subclase adecuada) que están unidos a su antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Las variantes polipeptídicas con secuencias de aminoácidos de la región Fc alterada y capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida se describen en la patente de Estados Unidos n.º 6.194.551 B1, y en el documento WO99/51642. Véase, además, Idusogie et al. J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).

65 El sitio de N-glicosilación en IgG se encuentra en Asn297 del domincio CH2. La presente invención proporciona también composiciones de un anticuerpo humanizado de unión a CD20 que tiene una región Fc, en la que aproximadamente un 80-100 % (y preferentemente aproximadamente un 90-99 %) del anticuerpo de la composición comprende una estructura madura de núcleo de carbohidrato que carece de fucosa, unida a la región Fc de la glicoproteína. Se demuestra en el presente documento que dichas composiciones presentan una mejora

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5 sorprendente en la unión a FcγRIIIA(F158), que no es tan eficaz como FcγRIIIA (V158) para interactuar con la IgG humana. Por lo tanto, se anticipa que las composiciones del presente documento son superiores a las composición de anticuerpo dirigido contra CD20 anteriormente descritas, especialmente para el tratamiento de pacientes humanos que expresan FcγRIIIA (F158). FcγRIIIA (F158) es más habitual que FcγRIIIA (V158) en sujetos afroamericanos y caucásicos sanos normales. Véase Lehmbecher et al. Blood 94:4220 (1999). La presente solicitud demuestra además el aumento sinérgico en la unión de FcγRIII y/o en la función ADCC que es resultado de combinar las variaciones de glicosilación del presente documento con la una o más modificaciones en la secuencia de aminoácidos de la región Fc de la glicoproteína.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su

15 ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que pueden interferir con usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de del 95 % en peso de anticuerpo, según se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos en el extremo N o la secuencia interna de aminoácidos mediante el uso de un secuenciador de copa rotatoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomasie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De forma habitual, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

25 Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada se encuentra en una forma o configuración distinta a la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan normalmente el anticuerpo en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.

35 La expresión "secuencias de control" se refieren a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de manera operativa a un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se pone en relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa en forma de una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operablemente unido a una secuencia de codificación si altera la transcripción de la secuencia; o

45 un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia de codificación si está colocado de manera que facilite la traducción. En general, "operablemente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y que, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se realiza mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se usan adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica habitual.

"Vector" incluye vectores lanzadera y vectores de expresión. Normalmente, la construcción de plásmido incluirá también un origen de replicación (por ejemplo, el origen de replicación ColE1) y un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a ampicilina o tetraciclina), para replicación y selección, respectivamente, de los plásmidos en la

55 bacteria. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene las secuencias de control o los elementos de regulación necesarios para la expresión de los anticuerpos incluyendo los fragmento de anticuerpos de la invención, en células bacterianas o eucariotas. Los vectores adecuados se describen más adelante.

La célula que produce un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención incluirá las células hospedadoras bacterianas y eucariotas en las que se ha introducir el ácido nucleico que codifica los anticuerpos. Las células hospedadoras adecuadas se divulgan a continuación.

El término "marcador" cuando se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugada directamente o indirectamente con el anticuerpo. El marcador puede ser detectable por sí mismo

65 (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química del compuesto o composición sustrato que es detectable.

En el presente documento, una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno no neoplásico que surge a partir de y se dirige contra los antígenos y/o tejidos propios (auto). Tal como se usa en el presente documento, "agotamiento de células B" se refiere a una reducción en los niveles de células B en un animal o ser humano después del trtamiento con el fármaco o el anticuerpo, en comparación con el

5 nivel de células B antes del tratamiento. Los niveles de células B se pueden medir usando ensayos bien conocidos como los que se describen en los Ejemplos experimentales. El agotamiento de células B puede ser total o parcial. En una realización, el agotamiento de células B que expresan CD20 es al menos un 25 %. Sin limitarse a ningún mecanismo concreto, los posibles mecanismos para el agotamiento de células B incluyen ADCC, CDC, apoptosis, modulación del flujo de calcio o una combinación de dos o más de los anteriores.

La expresión "agente citotóxico" cuando se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o provoca la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, 131I, 125I, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos.

15 Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes o alcalinizantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelamina incluyendo altretamina, t-etilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetillolomelamina; mostazas de nitrógeno, tales como clorambucilo, clomapazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido de mecloretamina clorhidrato, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliceamicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina,

25 cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (adriamicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); ácido fólico y análogos tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; recuperadores de ácido fólico tales como el ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina;

35 demecolcina; diazicuona; elfomitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofirán; espirogermanio, ácido tenuazonico; triazicuona; 2,2’,2"-triclorotriemilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinblastina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales farmacéuticamente

45 aceptables, ácidos y derivados de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores tales como antiestrógenos como por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); antandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; otros agentes quimioterapéuticos como la prednisolona. Están incluidas las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de los anteriores.

"Tratar" o "tratamiento" o "alivio" " se refiere a un tratamiento tanto terapéutico o profiláctico como a medidas preventivas, cuyo objeto es prevenir o ralentizar (atenuar) la afección o trastorno patológico diana. Un sujeto se "trata" satisfactoriamente para un cáncer o enfermedad autoinmunitaria positivo para CD20 si, tras recibir una

55 cantidad terapéutica de un anticuerpo de unión a CD20 de la invención de acuerdo con los métodos de la presente invención, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible en o la ausencia de uno o más signos y síntomas de la enfermedad particular. Por ejemplo, para el cáncer, una reducción en el número de células cancerosas o la ausencia de células cancerosas; reducción en el tamaño del tumor; la inhibición (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) de la metástasis tumoral; la inhibición, hasta cierto punto, del crecimiento tumoral; aumento de la duración de la remisión, y/o alivio en cierta medida, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; reducción de la morbilidad y mortalidad, y mejora en la calidad de vida. La reducción en los signos

o síntomas de una enfermedad también pueden percibirse por el paciente. El tratamiento puede lograr una respuesta completa, definida como la desaparición de todos los signos de cáncer, o bien una respuesta parcial, en la que se reduce el tamaño del tumor, preferentemente en más de un 50 por ciento, más preferentemente en un 75 %.

65 También se considera a un paciente como tratado si el paciente experimenta una enfermedad estable. En una realización preferida, los pacientes de cáncer se mantienen sin progresión en el cáncer después de un año, preferentemente después de 15 meses. Estos parámetros para evaluar un tratamiento exitoso y una mejora en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos rutinarios familiares para un médico experto en la materia.

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5 Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo o fármaco eficaz para “tratar” una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhiben, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición anterior proporcionada para “tratar”.

La administración "crónica" se refiere a la administración de uno o más agentes de una manera continua, a diferencia de un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico (actividad) inicial durante un periodo de tiempo

15 prolongado. La administración "intermitente" es un tratamiento que no se efectúa consecutivamente sin interrupción, sino que es de naturaleza cíclica.

Composiciones y métodos de la invención

La invención proporciona anticuerpos humanizados como se muestra en las reivindicaciones. Un anticuerpo descrito en el presente documento puede tener una cadena H que tiene al menos una, preferentemente dos o todas las CDR de la cadena H de un anticuerpo de una especie no humana dirigido contra CD20 humana (anticuerpo donante) y sustancialmente todos los restos del marco de un anticuerpo de consenso humano como el anticuerpo receptor. El anticuerpo donante puede proceder de varias especies no humanas incluyendo ratón, rata, cobaya, cabra, un

25 conejo, caballo, primate, pero de forma más frecuente será un anticuerpo de murino. "Sustancialmente todo" en este contexto significa que las regiones FR del receptor en el anticuerpo humanizado pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos no originalmente presentes en la secuencia FR de consenso humana. Estos cambios de FR pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o el anticuerpo donante.

El anticuerpo donante puede ser el anticuerpo 2H7 de murino, incluyendo la región V las secuencias de CDR y de FR de cada una de las cadenas H y L que se muestran en las Figs. 1A y 1B. Los restos del marco Fab humano corresponden a la secuencia consenso del subgrupo I de Vκ y del subgrupo III de VH humanas, estas secuencias de consenso se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B, respectivamente. El anticuerpo 2H7 humanizado puede tener al menos una de las CDR en la cadena H del anticuerpo donante de murino. El anticuerpo 2H7 humanizado que se

35 une a CD20 humano puede comprender las CDR de las cadenas H y L del anticuerpo donante.

En un anticuerpo de longitud completa, el anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención comprenderá un dominio V humanizado unido a un dominio C de una inmunoglobulina humana. En una realización preferida, la región C de la cadena H es de IgG humana, preferentemente IgG1 o IgG3. El dominio C de la cadena L es preferentemente de la cadena κ humana.

Salvo que se indique otra cosa, en el presente documento, una versión del anticuerpo 2H7 humanizado tendrá las secuencias del dominio V y el dominio C de la cadena L de 2H7.v16 (Fig. 6, SEQ ID NO. 21) y la cadena H (Fig. 7, SEQ ID NO. 22) excepto en las posiciones de las sustituciones o cambios de aminoácidos indicadas en los ejemplos

45 experimentales siguientes.

Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados se unirán al menos al CD20 humano y se unirán a otros CD20 de primate tal como de monos que incluyen al macaco y a los monos rhesus, y a los chimpancés. Se divulga la secuencia del CD20 de macaco en el Ejemplo 15 y la Figura 19.

La actividad biológica de los anticuerpos de unión a CD20 y de unión a CD20 humanizado de la presente invención incluirán al menos la unión del anticuerpo al CD20 humano, más preferentemente la unión al CD20 humano y de primate (incluidos el macaco, mono rhesus, chimpancés), con un valor Kd no mayor de 1 x 10-8, preferentemente con un valor Kd no mayor de aproximadamente 1 x 10-9, incluso de forma más preferente a un valor Kd no mayor de

55 aproximadamente 1 x 10-10, y capaz de eliminar o agotar las células B in vitro o in vivo, preferentemente en al menos un 20 % cuando se compara con el correspondiente nivel inicial o control negativo que no está tratado con dicho anticuerpo.

El nivel deseado de agotamiento de las células B dependerá de la enfermedad. Para el tratamiento de un cáncer positivo para CD20, puede ser deseable maximizar el agotamiento de células B que son la diana de los anticuerpos dirigidos contra CD20 de la invención. Por lo tanto, para el tratamiento de una neoplasia de células B positiva para CD20, es deseable que el agotamiento de las células B sea suficiente para evitar al menos la progresión de la enfermedad que puede ser evaluada por el médico experto en la materia, por ejemplo, vigilando el crecimiento tumoral (tamaño), la proliferación del tipo de células cancerosas, metástasis, otros signos y síntomas del cáncer 65 concreto. Preferentemente, el agotamiento de las células B es suficiente para evitar la progresión de la enfermedad durante al menos 2 meses, más preferentemente 3 meses, incluso más preferentemente 4 meses, más

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preferentemente 5 meses, incluso más preferentemente 6 o más meses. En realizaciones aún más preferidas, el agotamiento de las células B es suficiente para aumentar el tiempo de remisión durante al menos 6 meses, más preferentemente 9 meses, más preferentemente un año, más preferentemente 2 años, más preferentemente 3 años, aún más preferentemente 5 años o más. En la realización más preferida, el agotamiento de las células B es

5 suficiente para curar la enfermedad. En realizaciones preferidas, el agotamiento de las células B en un paciente con cáncer es al menos aproximadamente del 75 % y más preferentemente, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % e incluso 100 % del nivel valor inicial antes del tratamiento.

Para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, puede ser deseable modular la extensión del agotamiento de células B dependiendo de la enfermedad y/o de la gravedad de la dolencia en el paciente individual, ajustando la dosificación del anticuerpo de unión a CD20. Por lo tanto, el agotamiento de las células B puede, pero no tiene porqué ser completo. O bien, puede desearse el agotamiento total de células B en el tratamiento inicial, pero en tratamientos posteriores, la dosificación puede ajustarse para conseguir solo un agotamiento parcial. En una realización, el agotamiento de las células B es al menos del 20 %, es decir, permanece un 80 % o menos de células

15 B positivas para CD20, en comparación con el valor inicial antes del tratamiento. En otras realizaciones, el agotamiento de células B es del 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o mayor. Preferentemente, el agotamiento de las células B es suficiente para detener la progresión de la enfermedad, más preferentemente para aliviar los signos y síntomas de la enfermedad concreta bajo tratamiento, incluso más preferentemente para curar la enfermedad.

Los anticuerpos de unión a CD20 biespecíficos son anticuerpos en los que un brazo del anticuerpo tiene una cadena H y una cadena L humanizada del anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención, y el otro brazo tiene especificidad de unión a la región V de un segundo antígeno. El segundo antígeno puede seleccionarse entre el grupo que consiste en CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D u otros ligandos de activación de NK.

25 En comparación con Rituxan (rituximab), v16 presenta aproximadamente una potencia de ADCC aumentada de 2 a 5 veces, una CDC disminuida ~3-4 veces con respecto a Rituxan.

Producción de anticuerpos

Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el método de hibridoma descrito en primer lugar por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (patente de Estados Unidos n.º 4.816.567).

35 En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado, tal como un hámster, se inmuniza como se ha descrito anteriormente para estimular a los linfocitos a que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Tras la inmunización, los linfocitos se aíslan y a continuación se fusionan con una línea de células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de esta forma se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de

45 mieloma parental no fusionadas (denominadas también ligandos). Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma que actúan como ligandos preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio selectivo que elimina por selección las células precursoras no fusionadas. Las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores MOPC-21 y MPC-11 de ratón disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE.UU., y SP-2 y los

55 derivados, por ejemplo, células X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EE.UU. Se han descrito también líneas de células de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-ser humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el que están creciendo las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).

65 La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard descrito en Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

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Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad deseada, afinidad, y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y crecen mediante

5 métodos normalizados (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o medio RPMI-1640. Además, se pueden hacer crecer células de hibridoma no humano in vivo como tumores de ascites en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en ratones.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascites o del suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc.

15 El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede introducirse en vectores de expresión, que después se transfecta en células hospedadoras, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra forma proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Los artículos de revisión acerca de la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

25 En una realización adicional, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Por lo tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

35 El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o de anticuerpos de fusión, por ejemplo, sustituyendo las secuencias del dominio constante de la cadena pesada y la cadena ligera humanas (CH y CL) por las secuencias homólogas de murino (patente de Estados Unidos n.º 4.816.567; y en Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o fusionando la secuencia de codificación de la inmunoglobulina con todo o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido no de inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias del polipéptido no de inmunoglobulina pueden sustituir los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

45

Anticuerpos humanizados

Se han descrito en la técnica los métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en este a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se citan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "donante". La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son

55 anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos n.º 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región hipervariable y posiblemente algunos restos de FR están sustituidos por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta HAMA (anticuerpo humano contra Ig de ratón) cuando se pretende el anticuerpo para uso terapéutico humano. De acuerdo con el método llamado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se reconoce frente a la biblioteca completa de 65 secuencias de dominio variable humanas conocidas. Se identifica la secuencia del dominio V humano que sea más próxima a la del roedor, y la región marco (FR) humana de esta se acepta para el anticuerpo humanizado (Sims et

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5 151:2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad de unión al antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Están comúnmente disponibles modelos de tridimensionales de inmunoglobulinas y son familiares para los expertos en la materia. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras tridimensionales conformacionales probables de las secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de

15 inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que afectan a la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de tal forma que se logra la característica deseada del anticuerpo, de tal manera que se consigue una afinidad aumentada por el uno o más antígenos diana. En general, los restos de la región hipervariable están directa y muy sustancialmente involucrados en alterar la unión al antígeno.

El anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos para generar un inmunoconjugado. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de longitud completa, tal como un anticuerpo IgG1 de longitud completa.

25 Anticuerpos humanos y metodología de expresión en fagos

Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, actualmente es ahora posible producir animales transgénicos no humanos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada de anticuerpo (Jh) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de la línea germinal en dichos ratones mutantes en la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551

35 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); las patentes de Estados Unidos con números 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas de GenPharm); 5.545.807; y el documento WO 97/17852.

Como alternativa, se puede usar la tecnología de expresión en fagos (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes del dominio variable (V) de la inmunoglobulina procedentes de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco tanto en un gen de la proteína de revestimiento mayor como en un gen de la proteína de revestimiento menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Como la partícula 45 filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo dan como resultado también la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta dichas propiedades. Por lo tanto, el fago imita alguna de las propiedades de las células B. Se puede llevar a cabo la expresión en el fago en varios formatos, revisados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión en el fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una matriz diversa de anticuerpos dirigidos contra oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria poco aleatorizada de genes V derivados de bazos de ratones humanizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donantes humanos inmunizados y anticuerpos para que se pueda aislar una matriz diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o

55 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse, también las patentes de Estados Unidos con números 5.565.332 y 5.573.905.

Tal como se ha discutido anteriormente, también se pueden generar anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (véanse las patentes de Estados Unidos 5.567.610 y 5.229.275).

Fragmentos de anticuerpo

En determinados casos hay ventajas en cuanto al uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite una rápida eliminación, y puede conducir a accesos

65 mejorados de tumores sólidos.

Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, hoy en día esos fragmentos pueden producirse directamente mediante células hospedadoras 5 recombinantes. Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse de E. coli, permitiendo de este modo una fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las fagotecas de anticuerpos discutidas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab’-SH a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab’)2 pueden aislarse directamente a partir de cultivos de células hospedadoras recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab’)2 con semivida in vivo aumentada que comprenden restos de epítopo de unión a receptor salvajes se describen en la patente de Estados Unidos 5.869.046. Serán evidentes otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos para el experto en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase el documento WO 93/16185; la patente de los Estados Unidos n.º

15 5.571.894; y la patente de los Estados Unidos n.º 5.587.458. Fv y sFv son los únicos tipos con sitios de combinación intacto que están desprovistos de regiones constantes; así, son adecuados para una unión no específica reducida durante su uso in vivo. Las proteínas de fusión de scFv pueden construirse para producir la fusión de una proteína efectora en el extremo amino o en el extremo carboxilo terminal de un sFv. Véase Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, anteriormente citado. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos 5.641.870. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Anticuerpos biespecíficos

25 Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína CD20. Otros anticuerpos de ese tipo pueden combinar un sitio de unión a CD20 con un sitio de unión para otra proteína. Como alternativa, se puede combinar un brazo del anticuerpo dirigido contra CD20 con un brazo que se une a una molécula estimuladora en un leucocito tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD3) o receptores de Fc para IgG (FcγR), tal como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD 16), o NKG2D u otro ligando de activación de los linfocitos NK, con el fin de centrar y localizar los mecanismos de defensa celular para las células que expresan CD20. Se pueden utilizar también anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan CD20. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a CD20 y un brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti interferón α, alcaloides de la vinca, cadena de ricina A, metotrexato o el

35 isótopo radioactivo de hapteno). Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, F(ab’)2 biespecíficos).

El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico dirigido contra ErbB2 y dirigido contra FcγRI 11 y la patente de Estados Unidos n.º 5.837.234 divulga un anticuerpo dirigido contra ErbB2 y dirigido contra FcγRI. Se muestra en el documento WO98/02463 un anticuerpo biespecífico dirigido contra ErbB2/Fcα. La patente de Estados Unidos n.º 5.821.337 ensaña un anticuerpo biespecífico dirigido contra ErB2 y dirigido contra CD3.

Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la expresión simultánea de dos parejas de cadena pesada-cadena

45 ligera de la inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se efectúa normamente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa, y el rendimiento de producto es bajo. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. 55 Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de la bisagra, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión con la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan simultáneamente a una célula hospedadora adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usados en la construcción proporciona el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes de dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado

65 rendimientos elevados o cuando las proporciones no afectan significativamente el rendimiento de la cadena deseada.

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En una realización preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de la inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de

5 combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de Estados Unidos n.º 5.731.168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse mediante ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas de la inferfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o

15 triptófano). En la intefase de la segunda molécula de anticuerpo se crean "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico al de la una o más cadenas laterales medciante la sustitución de largas cadenas laterales de aminoácido por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de Estados Unidos n.º 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse usando cualquier método de reticulación conveniente.

25 Los anticuerpos reticulantes adecuados son bien conocidos en la técnica, y se divulgan en la patente de Estados Unidos n.º 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuación al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla

35 con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmobilización selectiva de enzimas.

El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab’-SH procedentes de E. coli, que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula de F(ab’)2 de cuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ se secretó por separado desde E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera pudo unirse a células que expresaban en exceso el receptor de ErbB2 y las células T humanas normales, así como de estimular la aactividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos frente a dianas de tumores de mama humanos.

45 También se han descrito varias técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" se describe por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante un enlazador que es demasiado corto

55 para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios VL yVH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha comunicado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros monocatenarios de Fv (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticuerpos multivalentes

65 Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una

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célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos a los de clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante la expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un 5 dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fc y tres

o más sitios de unión a antígeno en posición aminoterminal respecto de la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido en el presente documento comprende (o consiste en) de tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena

10 polipeptídica (y preferentemente dos cadenas polipeptídicas), en el que las cadenas polipeptídicas comprenden dos

o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptidíca(s) puede(n) comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) polipeptídica(s) pueden comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-región de la cadena Fc; o VH-CH1-VH15 CH1-región de la cadena Fc. El anticuerpo multivalente del presente documento comprende además preferentemente al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede, por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en el presente documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y,

20 opcionalmente, comprenden además un dominio CL.

Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos

Se contemplan una o varias en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de unión a CD20 descritos en el

25 presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o el resto de propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo dirigido contra CD20 se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo dirigido contra CD20, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo dirigido contra CD20. Se realiza

30 cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos pueden alterar también los procesos posteriores a la traducción del anticuerpo dirigido contra CD20, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.

35 Un método útil para identificar determinados restos o regiones del anticuerpo dirigido contra CD20 que son localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" tal como se describe en Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989). En el presente documento, se identifican un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) que afecta la interacción

40 entre los aminoácidos y el antígeno CD20. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos esté predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación en sí esté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se llevó a cabo el barrido de ala o la mutagénesis

45 aleatoria en el codón o región diana y las variantes de anticuerpos dirigidos contra CD20 expresadas se seleccionan según la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amino y/o carboxilo en el intervalo de longitud de un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos

50 simples o múltiples de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo dirigido contra CD20 con un resto metionilo en el extremo N o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo dirigido contra CD20 incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo dirigido contra CD20 con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o con un polipéptido que aumente la semivida en suero del anticuerpo.

55 Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto aminoácido en la molécula del anticuerpo dirigido contra CD20 sustituido por un resto diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero se contemplan también alteraciones de FR. En la siguiente Tabla siguiente se muestran sustituciones conservativas bajo el encabezamiento

60 de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales, denominadas como "sustituciones ilustrativas" en la Tabla,

o como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos y seleccionarse los productos.

65

TABLA de sustituciones de aminoácidos

Resto original
Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones preferidas

Ala (A)
val; leu; ile val

Arg (R)
lys; gln; asn lys

Asn (N)
gln; his; asp, lys; arg gln

Asp (D)
glu; asn glu

Cys (C)
ser; ala ser

Gln (Q)
asn; glu asn

Glu (E)
asp; gln asp

Gly (G)
ala ala

His (H)
asn; gln; lys; arg arg

Ile (I)
leu; val; met; ala; phe; norleucina leu

Leu (L)
norleucina; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K)
arg; gin; asn arg

Met (M)
leu; phe; ile leu

Phe (F)
leu; val; ile; ala; tyr tyr

Pro (P)
ala ala

Ser (S)
thr thr

Thr (T)
ser ser

Trp (W)
tyr; phe tyr

Tyr (Y)
trp; phe; thr; ser phe

Val (V)
ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu

Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del armazón polipeptídico en la zona de la

5 sustitución, por ejemplo, en una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrófoba: norleucina, met, ala, val, leu, ile; 10 (2) hidrófila neutra: cys, ser, thr;

(3)
ácidas: asp, glu;

(4)
básica: asn, gln, his, lys, arg;

(5)
restos que alteran la orientación de cadena: gly, pro; y

(6)
aromática: trp, tyr, phe.

15 Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Cualquier resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo dirigido contra CD20 puede sustituirse también, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la

20 molécula y evitar la reticulación anómala. Por el contrario, se pueden añadir uno o más enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región

25 hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humano o humanizado). En general, la una o más variantes resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo precursor a partir del cual se generan. Una manera conveniente para generar dichas variantes de sustitución implica la maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. En resumen, se mutan varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en

30 cada sitio. Las variantes de anticuerpos generadas de esta manera se expresan de manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto génico III del M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes expresadas en fagos se seleccionan a continuación según su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en el presente documento. A fin de identificar los sitios candidatos para la modificación de la región hipervariable, se puede llevar a cabo la mutagénesis de barrido de alanina para identificar restos de

35 regiones hipervariables que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. De forma alternativa o adicional, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el CD20 humano. Dichos restos de contacto y restos adyacentes son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en el presente documento y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.

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5 Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. Por alterar se entiende eliminar uno o más restos de hidratos de carbono que se encuentran en el anticuerpo, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

La glucosilación de anticuerpos está por lo general unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un resto asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es un aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de una cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La

15 glucosilación unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptido anteriormente descritas (por ejemplo, sitios de glucosilación unidos a N). La alteración puede realizarse también mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo dirigido

25 contra CD20 se preparan mediante varios métodos conocidos en la materia. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural)

o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), la mutagénesis de la PCR, y la mutagénesis de casete de una variante preparada inicialmente o una versión no variante del anticuerpo dirigido contra CD20.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. De forma alternativa o adicional, pueden introducirse uno o varios restos cisteína en

35 la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una eliminación de células mediada por complemento y citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) aumentadas. Véase Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Se pueden preparar también anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada mediante el uso de reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, puede modificarse por ingeniería genética un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y de este modo puede potenciarse la lisis del complemento y las capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

45 Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la patente de los Estados Unidos 5.739.277, por ejemplo. Tal como se usa en el presente documento, el término "epítope de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media en suero de la molécula de IgG in vivo.

Otras modificaciones en anticuerpos

Se contemplan en el presente documento otras modificaciones en anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir a uno de varios polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, propilenglicol, polioxialquilenos, o

55 copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo puede estar atrapado también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de administración de fármaco en forma coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Oslo, A., Ed., (1980).

Cribado de anticuerpos con las propiedades deseadas

Se pueden seleccionar anticuerpos con determinadas características biológicas como se describe en los Ejemplos 65 experimentales.

Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo dirigido contra CD20 de la invención pueden evaluarse mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo, utilizando células que expresan CD20 tanto de forma endógena como tras la transfección con el gen CD20. Por ejemplo, las líneas de células tumorales y las células transfectadas con CD20 pueden tratarse con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD20 de la invención a

5 diversas concentraciones durante unos pocos días (por ejemplo, 2-7) días y teñirse con cristal violeta o MTT o analizarse mediante algún otro ensayo colorimétrico. Otro método de medir la proliferación sería comparando la captación de 3H-timidina por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo dirigido contra CD20 de la invención. Tras el tratamiento con el anticuerpo, las células se recogen y se cuantifica la cantidad de radioactividad incorporada en el ADN en un contador de centelleo. Los controles positivos adecuados incluyen el tratamiento de una línea de células seleccionada con un anticuerpo inhibidor del crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esta línea de células.

Para seleccionar los anticuerpos que inducen la muerte celular, se puede evaluar la pérdida de la integridad de membrana como se indica mediante, por ejemplo, la captación de yoduro de propidio (IP), azul tripán o 7AAD con

15 respecto al control. Se puede llevar a cabo un ensayo de captación de IP en ausencia del complemento y de células efectoras inmunitarias. Las células tumorales que expresan CD20 se incuban con el medio solo o el medio que contiene el anticuerpo monoclonal adecuado a por ejemplo, aproximadamente 10 µg/ml. Las células se incuban durante un periodo de 3 días. Después de cada tratamiento, las células se lavaron y se distribuyen en alícuotas en tubos de 12 x 75 terminados en un filtro de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para eliminar aglomerados de células. A continuación los tubos reciben IP (10 µg/ml). Las muestras se pueden analizar utilizando el citómetro de flujo FACSCAN™ y el programa informático FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Dichos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular, como se determina por la captación de IP, pueden seleccionarse como anticuerpos inductores de muerte celular.

25 Para seleccionar los anticuerpos que se unen a un epítopo de CD20 unido a un anticuerpo de interés, se puede llevar a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988). Este ensayo se puede usar para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo sitio o epítopo que un anticuerpo dirigido contra CD20 de la invención. De forma alternativa o adicional, se puede llevar a cabo el cartografiado de epítopos mediante métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, se puede mutagenizar la secuencia del anticuerpo tal como mediante un barrido de alanina, para identificar restos de contacto. El anticuerpo mutante se ensaya inicialmente para determinar la unión con un anticuerpo policlonal para asegurar el plegado adecuado. En un método diferente, los péptidos que corresponden a diferentes regiones de CD20 se pueden usar en ensayos de competición con los anticuerpos de ensayo on un anticuerpo de ensayo y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o conocido.

35

Vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes

La invención proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de unión a CD20 humanizado, vectores y células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico, y las técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla e inserta en un vector replicable para su clonación posterior (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso

45 de sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

(i) Componente de la secuencia señal

El anticuerpo de unión a CD20 de la presente invención puede producirse de forma recombinante no solo de forma directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o el

55 polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es aquella que se reconoce y procesa (es decir, se escinde mediante una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo de unión a CD20 natural, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para secreción en levaduras, la secuencia de señal nativa puede sustituirse por, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, el líder de factor α (incluyendo los líderes del factor α Saccharomyces y Kluyveromyces), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión en células de mamífero, están disponibles las secuencias señal de mamífero, así como los líderes de secreción víricos, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

65 El ADN de dicha región precursora está ligado en un marco de lectura con el ADN que codifica el anticuerpo de unión a CD20.

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(ii) Origen de replicación

5 Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células hospedadoras seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del hospedador, e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Dichas secuencias son bien conocidas para varias bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación para el plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para las levaduras, y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión en mamífero (el origen de SV40 puede utilizarse de forma típica solamente por que contiene el promotor temprano).

15 (iii) Componente de gen de selección

Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) transmiten resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas del complemento, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere

25 transmite al fármaco y que por tanto sobrevive al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores de selección adecuados para las células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para capturar el ácido nucleico del anticuerpo de unión a CD20, tales como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína I y II, preferentemente los genes de la metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de

35 DHFR. Una célula hospedadora adecuada cuando se emplea DHFR natural es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Como alternativa, las células hospedadoras (particularmente los hospedadores naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o transformadas simultáneamente con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo de unión a CD20, la proteína DHFR natural, y otro marcador de selección tal como la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) se puede seleccionar mediante crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador de selección tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. véase la patente de Estados Unidos n.º 4.965.199.

45 Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de la levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC n.º 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trpl en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona entonces un ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las células de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, se pueden usar vectores derivados del plásmido circular pKD1 de 1,6 µm para la transformación de levaduras de Kluyveromyces. Como alternativa, se comunicó un sistema de expresión para la producción a gran

55 escala de quimosina de ternero para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Se han divulgado también vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina madura de suero humano recombinante por cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonación contienen normalmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica el anticuerpo de unión a CD20. Los promotores adecuados para el uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor the phoA, los sistemas promotores de la β-lactamasa y la lactosa, el promotor de la fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano 65 (trp), y promotores híbridos tales como el promotor de tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos contendrán también una secuencia

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Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo de unión a CD20.

Se conocen secuencias promotoras de eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente a 25-30 bases en dirección 5' del sitio donde se inicia la transcripción. Otra

5 secuencia encontrada a 70 a 80 bases en dirección 5' del inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de manera adecuada en vectores de expresión de eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras de eucariotas para su uso con hospedadores de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

15 Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotienina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en expresión en levadura se describen además en el documento EP 73.657. También se usan de manera ventajosa potenciadores de levadura junto con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo de unión a CD20 a partir de vectores en células hospedadoras de mamíferos se controlada, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, virus del

25 sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y lo más preferible el virus 40 de simio (SV40), procedentes de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de célula hospedadora.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción del SV40 que contiene también el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII. En la patente de Estados Unidos n.º 4.419.446 se divulga un sistema para expresar ADN en hospedadores mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como vector. En la patente de Estados Unidos n.º 4.601.978 se describe una modificación

35 de este sistema. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) acerca de la expresión del ADNc de interferón β humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa procedente del virus del herpes simple. Como alternativa, se puede usar la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

(v) Componente del elemento potenciador

La transcripción de un ADN que codifica un anticuerpo de unión a CD20 de la presente invención por eucariotas superiores aumenta a menudo insertando una secuencia potenciadora en el vector. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, α-fetoproteína,

45 e insulina). Normalmente, sin embargo, se usará un potenciador procedente de un virus de una célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado posterior del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado posterior del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) acerca de los elementos potenciadores para la activación de los promotores eucariotas. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en la posición 5' o 3' de la secuencia de codificación del anticuerpo de unión a CD20, pero se localiza preferentemente en un sitio en dirección 5' a partir del promotor.

(vi) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas,

55 animales, seres humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están normalmente disponibles a partir de las regiones 5' y, en ocasiones 3', no traducidas de los ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo de unión a CD20. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión divulgado en el anterior.

(vii) Selección y transformación de células hospedadoras

65 Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o la expresión del ADN en los vectores del presente documento son las células procariotas, levaduras, o células de eucariotas superiores descritas anteriormente. Los

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procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P divulgado en el documento

5 DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un hospedador de clonación preferido es E. coli E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325) también son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes.

Los anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, y las proteínas de fusión de anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando las funciones de glicosilación y efectora Fc no son necesarias, como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado muestra eficacia por sí mismo en la destrucción de la célula tumoral. Los anticuerpos de longitud completa tienen una semivida en circulación más larga. La producción en E. coli es más rápida y mayor eficiente en

15 costes. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, el documento U.S. 5.648.237 (Carter et al.), el documento U.S. 5.789.199 (Joly et al.), y el documento U.S. 5.840.523 (Simmons et al.) que describe la región de inicio de la traducción (RIT) y las secuencias señal para la optimización de la expresión y la secreción. Después de la expresión, el anticuerpo se aísla de la pasta de células de E. coli en una fracción soluble y se puede purificar mediante, por ejemplo, columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final puede llevarse a cabo de manera similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos o levaduras filamentosos son hospedadores adecuados de clonación y expresión para vectores que codifican anticuerpos de unión a CD20. Saccharomyces

25 cerevisiae,o la levadura de panadería común, es la más usada entre los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores. Sin embargo, otros numerosos géneros, especies y cepas están comúnmente disponibles y son útiles en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores de tipo Kluyveromyces, tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178),

K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentals; y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, hospedadores de Tolypocladium, y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo de unión a CD20 glicosilado se derivan de

35 organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas y variantes y las células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), yBombyxmori. Están públicamente disponibles varias cepas víricas para la transfección, por ejemplo, la variante L-1 de NPV de Autographa californica y la cepa Bm-5 de NPV de Bombyx mori y dichos virus pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, y tabaco tambien pueden usarse como hospedadores.

45 Sin embargo, ha sido mayor el interés en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea celular de riñón embrionario humano (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón de canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo

55 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; linfocitos FS4+; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células hospedadoras se transformaron con los vectores de expresión o clonación anteriormente descritos para la producción del anticuerpo de unión a CD20 y se cultivaron en medios nutrientes convencionales según fuera adecuado para inducir promotores, seleccionado los transformantes, o amplificando los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de células hospedadoras

65 Las células hospedadoras utilizadas para producir el anticuerpo de unión a CD20 de la presente invención se

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pueden cultivar en varios medios. Medios comercialmente disponibles como F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), patentes de Estados Unidos números 4.767.704; 5 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; o la solicitud de patente de Estados Unidos 30.985 pueden usarse como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como fármaco de GENTAMICINA™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente equivalente de energía. Cualquier otro suplemento necesario puede también introducirse en concentraciones adecuadas que serán conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son las utilizadas anteriormente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para una persona

15 normalmente experta en la técnica.

(ix) Purificación de anticuerpo

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretado directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los residuos en particulas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, se descongela la pasta celular en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante 25 aproximadamente 30 min. Los residuos celulares pueden retirarse mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon

o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasas, tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse anticuerpos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía por afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La adecuación de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse 35 para purificar anticuerpos que están basados en las cadenas pesadas γ1, γ2, o γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es con frecuencia agarosa, pero hay disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permite caudales más rápidos y tiempos de procesado más cortos de los que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación por etanol, HPLC en fase reversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía en hepatina, cromatografía de SEPHAROSE™ en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y

45 precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se va a recuperar.

Después de cualquier (cualesquiera) etapa(s) de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede someterse a una cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH entre aproximadamente 2,5-4,5, realizada preferentemente a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, sal a aproximadamente 0-0,25 M).

Conjugados de anticuerpos

El anticuerpo de unión puede estar conjugado a un agente citotóxico tal como una toxina o un isótopo radioactivo. En

55 determinadas realizaciones, la toxina es calicamicina, un maitansinoide, una dolastatina, auristatina E y análogos o derivados de los mismos, son preferibles.

Los fármacos/toxinas preferidos incluyen agentes perjudiciales para el ADN, inhibidores de la polimerización o despolimerización de microtúbulos y antimetabolitos. Las clases preferidas de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, los inhibidores de enzimas tales como los inhibidores de la dihidrofolato reductasa, y los inhibidores de la timidilato sintasa, intercalantes de ADN, sustancias que escinden el ADN, inhibidores de topoisomerasa, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos de la vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, la familia de fármacos de pteridina, diinenos, las podofilotoxinas y los inductores de la diferenciación. Los miembros especialmente útiles de estas clases incluyen, por ejemplo, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 565 fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalano, leurosina, leurosideina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, N-(5,5-diacetoxipentil)doxorrubicina, morfolino-doxorrubicina, 1-(2-coroetil)-1,2

dimetanosulfonil hidrazida, N8-acetil espermidina, aminopterina, metopterina, esperamicina, mitomicina C, mitomicina A, actinomicina, bleomicina, carminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina y derivados de podofilotoxina tales como etopósido o etopósido fosfato, vinblastina, vincristina, vindesina, taxol, taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, N8-acetil espermidina, camptotecina, caliceamicina, brostatinas, cefalostatinas, ansamitocina, actosina, 5 maitansinoides tales como DM-1, maitansina, maitansinol, N-desmetil-4.5-desepoximaitansinol, C-19decloromaitansinol, C-20-hidroximaitansinol, C-20-demetoximaitansinol, C-9-SH maitansinol, C-14alcoximetilmaitansinol, C-14-hidroxi o acetiloximetilmaitansinol, C-15-hidroxi/acetiloxi-maitansinol, C-15metoximaitansinol, C-18-N-demetilmaitansinol y 4,5-deoximaitansinol, auriestatinas tales como auristatina E, M, PHE y PE; doloestatinas tales como doloestatina A, doloestatina B, doloestatina C, doloestatina D, doloestatina E (20-epi y 11-epi), doloestatina G, doloestatina H, doloestatina I, doloestatina 1, doloestatina 2, doloestatina 3, doloestatina 4, doloestatina 5, doloestatina 6, doloestatina 7, doloestatina 8, doloestatina 9, doloestatina 10, deo-doloestatina 10, doloestatina 11, doloestatina 12, doloestatina 13, doloestatina 14, doloestatina 15, doloestatina 16, doloestatina 17, y doloestatina 18; cefaloestatinas tales como cefaloestatina 1, cefalostatina 2, cefalostatina 3, cefalostatina 4, cefalostatina 5, cefalostatina 6, cefalostatina 7,25’-epi-cefalostatina 7, 20-epi-cefalostatina 7, cefalostatina 8,

15 cefalostatina 9, cefalostatina 10, cefalostatina 11, cefalostatina 12, cefaloestatina 13, cefalostatina 14, cefalostatina 15, cefalostatina 16, cefalostatina 17, cefalostatina 18, y cefalostatina 19.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina seaisló en primer lugar del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de los Estados Unidos n. 3.896.111). Posteriormente, se descubrió que determinados microbios producen también maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres C-3 de maitansinol (patente de Estados Unidos 4.151.042). Se describen el maitansinol sintético y sus derivados y análogos, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; y 4.371.533.

25 La maitansina y los maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Se divulgan inmunoconjugados que contienen maitansinoides y sus usos terapéuticos, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos números 5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describen inmunoconjugados que comprenden un maitansinoide denominado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era muy citotóxico para células de cáncer de colon cultivadas, y mostró actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992) describen inmunoconjugados en los que se conjugó un maitansinoide mediante un enlazador de disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno de líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino

35 TA.1 que se une al oncogén HER-2/neu.

Existen muchos grupos de unión conocidos en la materia para preparar los conjugados de anticuerpo-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los divulgados en la patente de Estados Unidos 5.208.020 o en la patente EP 0 425 235 B1, y en Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles a ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a esterasa, tal como se divulgan en las patentes anteriormente identificadas, prefiriéndose grupos disulfuro y tioéter.

Los conjugados del anticuerpo y maitansinoide se pueden preparar usando varios agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como -succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de

45 succinimidil-4-(N-maleimidometilo), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis azido (tales como (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoilo)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bioactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

El enlazador puede unirse a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace éster mediante reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de

55 acoplamiento convencionales. La reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una realización preferida, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.

Caliqueamicina

Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo de unión a CD20 conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de caliqueamicina es capaz de producir roturas en el ADN bicatenario a concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina,

65 véanse las patentes de los Estados Unidos 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, γ1|, α2|, α3|, N-acetil-γ1|, PSAG y θ|1 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes estadounidenses de American Cyanamid anteriormente mencionadas). Otro fármaco antitumoral al que puede conjugarse el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen sitios de acción intracelulares y no cruzan

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5 fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes mediante internalización mediada por anticuerpo potencia en gran medida sus efectos citotóxicos.

Isótopos radiactivos

Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo muy radioactivo. Está disponible varios isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos dirigidos contra CD20 radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211 , 131I, 125I, Y90 , 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios de gammagrafía, por ejemplo tc99m o I123, o un marcador de espín para la obtención de imágenes mediante resonancia magnética nuclear (RMN),

15 (también conocida como obtención de imágenes de resonancia magnética, IRM), tal como de nuevo yodo-123, yodo131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los marcadores radioactivos u otros marcadores puede incorporarse al conjugado según modos conocidos. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, fluor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores, tales como 99mTc o 123I, 186Re, 188Re y 111In puede unirse mediante un resto de cisteína al péptido. Puede unirse itrio90 a través de un resto de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989) describe detalladamente otros métodos.

25 Los conjugados del anticuerpo y un agente citotóxico se pueden preparar usando varios agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis azido (tales como (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoilo)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno), y compuestos de flúor bioactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino como se describe en Vitetta y col., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3metildietilentriaminopentaacático (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ilustrativo para

35 conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase el documento WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en medio ácido, un enlazador sensible a peptidasa, un enlazador fotolábil, un enlazador que contiene dimetilo o disulfuro (Chari y col. Cancer Research 52: 127-131 (1992); patente de Estados Unidos n.º 5.208.020).

Usos terapéuticos de los anticuerpos de unión a CD20

Los anticuerpos de unión a CD20 de la invención son útiles para tratar numerosas enfermedades neoplásicas y no neoplásicas incluidas enfermedades autoinmunitarias y dolencias relacionadas, y cánceres positivos para CD20 que

45 incluyen linfomas de células B y leucemias. Los citoblastos (precursores de células B) de la médula ósea carecen del antígeno CD20, lo que permite que las células B sanas se regeneren después del tratamiento y vuelvan a los niveles normales en varios meses.

Las enfermedades autoinmunitarias o los trastornos relacionados con enfermedades autoinmunitarias incluyen artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica), psoriasis, dermatitis incluida la dermatitis atópica; la urticaria crónica autoinmunitaria, polimiositis/dermatomiositis, necrolisis epidérmica crónica, escleroderma sistémico y esclerosis, respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), meningitis, rinitis alérgica, encefalitis, uveitis, colitis, glomerulonefritis, dolencias alérgicas, eccema, 55 asma, dolencias que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, ateroesclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus sistémico eritematoso (LSE), lupus (que incluye nefritis, no renal, discoide, alopecia), diabetes de inicio juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, respuestas inmunitarias asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por las citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, incluida la granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis (incluida ANCA), anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, eritroblastopenia congénita de Blackfan-Diamond, anemia hemolítica inmunitaria que incluye la anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia en factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican la diapedesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica, miastenia gravis, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, 65 enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo al trasplante de órgano sólido (incluido el pretratamiento de los títulos elevados de anticuerpos reactivos del panel, depósitos de igA en tejidos, etc), enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), penfigoide ampolloso, pénfigo (todos, incluido el común y el foliar), poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad de Reiter, síndrome del hombre rígido, arteritis de células 5 gigantes, nefritis del complejo inmunitario, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM o polineuropatías mediadas por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del testículo y ovario incluidas la orquitis autoinmunitaria y la ooforitis, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluida la tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromas poliglandulares endocrinopáticos), diabetes Tipo I, también denominada como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (VIH), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barre, vasculitis de vasos grandes (incluida la polimialgia reumática y la arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos intermedios (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa),

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15 espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), glomerulonefritis de progresión rápida, cirrosis biliar primaria, Celiaquía (enteropatía por gluten), crioglobulinemia, ELA, arteriopatía coronaria.

Los cánceres positivos para CD20 son los que comprenden una proliferación anómala de células que expresan CD20 sobre la superficie celular. Las neoplasias de células B positivas para CD20 incluyen la enfermedad de Hodgkin positiva para CD20 que incluye la enfermedad de Hodgkin con predominancia de linfocitos (LPHD); linfoma no de Hodgkin (LNH); linfomas del centro celular folicular (FCC); leucemia linfocítica aguda (ALL); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia de células pilosas. El linfoma no de Hodgkin incluye el linfoma no de Hodgkin (LNH) de bajo grado o folicular, linfoma linfocítico pequeño (SLL), LNH de grado intermedio o folicular, LNH de grado intermedio difuso, LNH inmunoblástico de alto grado, LNH linfoblástico de alto grado, LNH no escindido microcítico

25 de alto grado, enfermedad LNH voluminosa, linfoma linfocítico plasmacitoide, linfoma de células del manto, linfoma relacionado con SIDA y macroglobulinemia de Waldenstrom. También se incluye el tratamiento de las recidivas de estos cánceres. LPHD es un tipo de enfermedad de Hodgkin que tiende a frecuentes recaídas a pesar del tratamiento con radioterapia o quimioterapia, y se caracteriza por células malignas positivas para CD20. La CLL es uno de los cuatro tipos principales de leucemia. Un cáncer de las células B maduras, denominadas linfocitos, la CLL se manifiesta por la acumulación progresiva de las células en la sangre, médula ósea y tejidos linfáticos.

En realizaciones específicas, los anticuerpos de unión a CD20 específicos y los fragmentos funcionales del mismo son para su uso en el tratamiento del linfoma no de Hodgkin (LNH), enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia linfocítica crónica, artritis reumatoide y artritis

35 reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (SLE) incluida la nefritis lúpica, enfermedad de Wegener, enfermedad inflamatoria del intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmunitaria, esclerosis múltiple, psoriasis, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.

Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o fragmentos funcionales de los mismos son útiles como tratamiento en monoterapia, por ejemplo, para el LNH de células B positivo para CD20 de bajo grado o folicular, o se puede administrar a pacientes junto con otros fármacos en un régimen multiterapia.

45 El linfoma indolente es una enfermedad incurable de tratamiento lento en la que el paciente promedio sobrevive de media entre seis y 10 años, tras numerosos periodos de remisión y recidiva. En una realización, los anticuerpos de unión a CD20 humanizados o fragmentos funcionales de los mismos son útiles para tratar el LNH indolente.

Los parámetros para evaluar la eficacia o el éxito del tratamiento de la neoplasia son conocidos del médico experto en el caso adecuado. En general, el médico experto buscará la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Los parámetros pueden incluir la mediana de tiempo transcurrido hasta el progreso de la enfermedad, tiempo en remisión, enfermedad estable.

Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, sus diagnósticos, tratamientos y procedimientos médicos 55 estándar para medir la eficacia del tratamiento.

Las siguientes referencias describen linfomas y CLL, sus diagnósticos, tratamientos y procedimientos médicos estándar para medir la eficacia del tratamiento. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Filadelfia, 1998; van Besien K y Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of NonHodgkin’s Lymphoma, Cáp. 70, págs. 1293-1338, en: Hematology, Basic Principles and Practice, 3ª ed. Hoffman et al. (Editores). Churchill Livingstone, Filadelfia, 2000; y Rai, K y Patel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, Cáp. 72, págs. 1350-1362, en: Hematology, Basic Principles and Practice, 3ª ed. Hoffman et al. (Editores). Churchill Livingstone, Filadelfia, 2000.

65 Los parámetros para evaluar la eficacia o el éxito del tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o relacionada con una enfermedad autoinmunitaria son conocidos del médico experto en la enfermedad correspondiente. En general, el médico experto buscará la reducción en los signos y síntomas de la enfermedad específica. Se proporciona lo siguiente a modo de ejemplo.

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En una realización, los anticuerpos de la invención son útiles para tratar la artritis reumatoide. La AR se caracteriza

5 por una inflamación de varias articulaciones, pérdida de cartílago y erosión ósea que da lugar a la destrucción de la articulación y, finalmente, a un funcionamiento articular reducido. Además, como la AR es una enfermedad sistémica, puede tener efectos en otros tejidos tales como los pulmones, ojos y médula ósea. Menos del 50 por ciento de los pacientes que han padecido AR durante 10 años o más pueden continuar trabajando o actúan con normalidad diariamente.

Los anticuerpos se pueden usar como tratamiento de primera línea en pacientes con AR temprana (es decir, no tratados con metotrexato (MTX)) y en forma de monoterapia, o en combinación con, por ejemplo, MTX o ciclofosfamida. O bien, los anticuerpos se pueden usar como tratamiento de segunda línea para pacientes resistentes a DMARD y/o MTX, tanto en monoterapia como junto con, por ejemplo, MTX. Los anticuerpos de unión a

15 CD20 humanizados son útiles para prevenir y controlar el daño articular, retrasar el daño estructural, disminuir el dolor asociado con la inflamación en la AR, y de forma general, para reducir los signos y síntomas en la AR de moderada a grave. El paciente de AR se puede tratar con el anticuerpo CD20 humanizado antes de, después, o junto con el tratamiento con otros fármacos utilizados en el tratamiento de la AR (véase el tratamiento en combinación, más adelante). En una realización, los pacientes con un fracaso anterior con fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad y/o que hayan tenido una respuesta inadecuada al metotrexato en solitario se tratan con un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención. En una realización de este tratamiento, los pacientes siguen un régimen de tratamiento de 17 días durante el que reciben el anticuerpo de unión a CD20 humanizado solo (infusiones iv de 1g en los días 1 y 15); anticuerpo de unión a CD20 junto con ciclofosfamida (infusión iv de 750 mg los días 3 y 17); o anticuerpo de unión a CD20 junto con metotrexato.

25 Un método para evaluar la eficacia del tratamiento en la AR se basa en los criterios del American College of Rheumatology (ACR), que miden el porcentaje de mejora en articulaciones sensibles a la palpación e inflamadas, entre otras cosas. El paciente de RA puede recibir una puntuación en, por ejemplo, ACR 20 (20 por ciento de mejora) en comparación con no usar tratamiento con anticuerpos (por ejemplo, el nivel inicial antes del tratamiento) o tratamiento con placebo. Otras formas de evaluar la eficacia de un tratamiento con anticuerpos incluyen la puntuación mediante rayos X, tal como la tabla de puntuación Sharp X-ray, utilizada para puntuar daños estructurales tales como erosión ósea y estrechamiento del espacio articular. Los pacientes también se pueden evaluar para la prevención o a mejora en la discapacidad, basándose en la puntuación del cuestionario de evaluación de la salud [HAQ], puntuación AIMS, SF-36 en periodos de tiempo durante o después del tratamiento.

35 Los criterios ACR 20 pueden incluir un 20 % de mejora en el recuento tanto de articulaciones sensibles a la palpación (dolorosas) y de articulaciones dolorosas, junto con un 20 % de mejora en al menos 3 de las 5 medidas siguientes:

1.
evaluación del dolor del paciente mediante la escala analógica visual (EAV),

2.
evaluación global del paciente de la actividad con la enfermedad (VAS),

3.
evaluación global del médico de la actividad con la enfermedad (VAS),

4.
discapacidad autoevaluada por el paciente medida según el Health Assessment Questionnaire, y

5.
reactivos en fase aguda, CRP o ESR.

45 La ACR 50 y 70 se definen de forma análoga. Preferentemente, se administra al paciente una cantidad de un anticuerpo de unión a CD20 de la invención eficaz para conseguir al menos una puntuación de ACR 20, preferentemente al menos ACR 30, de forma más preferente al menos ACR 50, incluso de forma más preferente al menos un ACR 70, lo más preferible, al menos un ACR 75 y superior.

La artritis psoriásica tiene características radiológicas únicas y diferenciadas. Para la artritis psoriásica, la erosión de la articulación y el estrechamiento del espacio articular se pueden evaluar también mediante la puntuación de Sharp. Los anticuerpos de unión a CD20 humanizados de la invención se pueden usar para prevenir el daño articular, así como reducir los signos y síntomas del trastorno.

55 Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para tratar el lupus o el SLE mediante la administración a un paciente que padece SLE, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención. Las puntuaciones SLEDAI proporcionan una cuantificación numérica de la actividad de la enfermedad. El SLEDAI es un índice ponderado de 24 parámetros clínicos y de laboratorios conocidos por su correlación con la actividad de la enfermedad, con un intervalo numérico de 0-103. Véanse Bryan Gescuk y John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" en Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521. Se cree que los anticuerpos dirigidos contra el ADN bicatenario ocasionan agudizaciones renales y otras manifestaciones de lupus. Los pacientes sometidos a tratamiento con anticuerpo se controlan en el tiempo para determinar las agudizaciones renales, que se definen como un importante aumento reproducible de creatinina sérica, proteína en orina o sangre en orina. Como alternativa o adicionalmente, se puede realizar un seguimiento de

65 los niveles de anticuerpos antinucleares y anticuerpos dirigidos contra el ADN bicatenario en los pacientes. Los tratamientos del SLE incluyen altas dosis de corticoesteroides y/o ciclofosfamida (HDCC).

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Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos de las articulaciones, incluyendo espondilitis anquilosante, artritis psoriásica o enfermedad de Crohn. El éxito del tratamiento se puede determinar mediante herramientas de medición para la evaluación global validadas por el médico y el paciente.

5 Se utilizan varias medicaciones para tratar la psoriasis; el tratamiento es diferente directamente en relación con la gravedad de la enfermedad. Los pacientes con una forma más leve de la psoriasis suelen utilizar tratamientos tópicos, tales como los esteroides tópicos, antralina, calcipotriena, clobetasol, y tazaroteno, para gestionar la enfermedad, mientras que es más probable que los pacientes con psoriasis moderada y grave utilicen tratamientos sistémicos (metotrexato, retinoides, ciclosporina, PUVA y UVB). También se usan alquitranes. Estos tratamientos tienen una combinación de problemas de seguridad, pautas de tratamiento que requieren tiempo, o procesos de tratamiento incómodos. Además, algunos requieren un equipo costoso y espacio de uso exclusivo en la consulta. Las medicaciones sistémicas pueden producir efectos secundarios graves, que incluyen hipertensión, hiperlipidemia, supresión de médula ósea, enfermedad hepática, enfermedad renal y colapso gastrointestinal. Además, el uso de la

15 fototerapia puede aumentar la incidencia de los cánceres de piel. Además de la incomodidad y el malestar asociados con el uso de terapias tópicas, la fototerapia y los tratamientos sistémicos requieren que los pacientes entren y salgan continuamente de la terapia, y el control de la exposición durante toda la vida debido a sus efectos secundarios.

La eficacia del tratamiento de la psoriasis se evalúa controlando los cambios en los síntomas y signos clínicos de la enfermedad incluidos los cambios en las puntuaciones de la evaluación global del médico (PGA) y el índice de área y gravedad de la psoriasis (PASI), evaluación de los síntomas de la psoriasis (PSA), en comparación con el estado inicial. El paciente se puede medir periódicamente durante el tratamiento en la escala visual analógica para indicar el grado de picor experimentado en puntos temporales específicos.

25 Los pacientes pueden experimentar una reacción ante la infusión o síntomas relacionados con la infusión en su primera infusión de un anticuerpo terapéutica. La gravedad de estos síntomas varía y, en general, son reversibles con intervención médica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, fiebre de tipo gripal, escalofríos leves/intensos, náuseas, urticaria, cefalea, broncoespasmo, angioedema. Para el tratamiento de la enfermedad, serían deseable los métodos de tratamiento de la presente invención para minimizar las reacciones a la infusión. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es un método para tratar las enfermedades divulgadas mediante la administración de un anticuerpo de unión a CD20 humanizado en el que el anticuerpo tiene una citotoxicidad reducida o no dependiente del complemento y da como resultado una reducción en los síntomas relacionados con la infusión en comparación con el tratamiento con Rituxan®. En una realización, el anticuerpo de unión a CD20 humanizado es 2H7.v116.

35

Dosificación

Dependiendo de la indicación a tratar y de los factores relevantes para la dosificación con los que un médico con experiencia en el campo estaría familiarizado, los anticuerpos de la invención se pueden administrar a una dosis que resulta eficaz para el tratamiento de dicha indicación a la vez que se minimizan la toxicidad y los efectos secundarios. Para el tratamiento de un cáncer positivo para CD20, o una enfermedad autoinmunitaria, la dosificación terapéuticamente eficaz estará comprendida en el intervalo de aproximadamente 250 mg/m2, a aproximadamente 400 mg/m2 o 500 mg/m2, preferentemente de aproximadamente 250-375 mg/m2. En una realización, el intervalo de dosificación es de 275-375 mg/m2. En una realización del tratamiento de una neoplasia de células B positiva para

45 CD20, el anticuerpo se administra en un intervalo de 300-375 mg/m2. Para el tratamiento de pacientes que padecen un linfoma de células B tales como un linfoma no de Hodgkins, los anticuerpos dirigidos contra CD20 y los anticuerpos dirigidos contra CD20 humanizados de la invención se pueden aplicar a un paciente humano a una dosis de 10 mg/kg o 375 mg/m2. Para el tratamiento del LNH, un régimen de dosificación sería administrar una dosis de la composición de anticuerpo a una dosificación de 10 mg/kg durante la primera semana de tratamiento, seguido por un intervalo de 2 semanas, después, se administra una segunda dosis con la misma cantidad de anticuerpos. En general, los pacientes de LNH reciben dicho tratamiento una vez al año pero ante la recurrencia del linfoma, dicho tratamiento se puede repetir. En otro régimen de dosificación, los pacientes tratados que padecen LNH de grado bajo reciben una versión del 2H7 humanizado, preferentemente v16 (375 mg/m2 semanalmente) seguido en la semana cinco por tres ciclos adicionales del anticuerpo junto con la quimioterapia habitual CHOP (ciclofosfamida,

55 doxorrubicina, vincristina y prednisona) o CVP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona), que se proporciona cada tres semanas durante tres ciclos.

Para tratar la artritis reumatoide, en una realización, el intervalo de dosificación para el anticuerpo humanizado es de 125 mg/m2 (equivalente a aproximadamente 200 mg/dosis) a 600 mg/m2, administrada en dos dosis, por ejemplo, la primera dosis de 200 mg se administra un día seguido de una segunda dosis de 200 mg en el día 15. En diferentes realizaciones, la dosis es de 250 mg/dosis, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg, 600 mg.

En el tratamiento de la enfermedad, los anticuerpos de unión a CD20 de la invención se pueden administrar al 65 paciente de forma crónica o intermitente, según determine el médico experto en la enfermedad.

Un paciente que recibe un fármaco mediante infusión intravenosa o por vía subcutánea puede experimentar efectos adversos tales como fiebre, escalofríos, sensación de ardor, astenia y cefalea. Para aliviar o minimizar dichos efectos adversos, el paciente puede recibir una o varias dosis iniciales de acondicionamiento del anticuerpo seguido de una dosis terapéutica. La una o varias dosis de acondicionamiento serán menores que la dosis terapéutica para

5 preparar al paciente para tolerar las dosis más altas.

Vía de administración

Los anticuerpos de unión a CD20 son para administrarse a un paciente humano de acuerdo con los métodos conocidos, tales como mediante administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, intraarticular, intrasinovial intratecal, o por inhalación, en general mediante administración intravenosa o subcutánea.

Un anticuerpo 2H7 humanizado puede estar destinado a la administración mediante infusión intravenosa con una 15 solución de cloruro sódico al 0,9 % como vehículo de infusión.

Terapia de combinación

En el tratamiento de las neoplasias de células B que se han descrito anteriormente, el paciente se puede tratar con los anticuerpos de unión a CD20 de la presente invención junto con uno o más agentes terapéuticos tales como un agente quimioterapéutico en un tratamiento multifármaco. El anticuerpo de unión a CD20 se puede administrar de forma paralela, secuencial o alternante con el agente quimioterapéutico, o después de no responder a otra terapia. La quimioterapia habitual para el tratamiento del linfoma puede incluir ciclofosfamida, citarabina, melfalano y mitoxantrona junto con melfalano. CHOP es una de las pautas de quimioterapia más habituales para tratar el linfoma 25 no de Hodgkin. Se indican a continuación los fármacos usados en el régimen CHOP: ciclofosfamida (marcas comerciales cytoxan, neosar); adriamicina (doxorrubicina / hidroxidoxorrubicina); vincristina (Oncovin); y prednisolona (a veces llamada Deltasona u Orasona). El anticuerpo de unión a CD20 se puede administrar al paciente que lo necesita junto con uno o más de los siguientes agentes quimioterapéuticos de doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona. Un paciente que padece un linfoma (tal como un linfoma no de Hodgkin) se puede tratar con un anticuerpo dirigido contra CD20 de la presente invención junto con terapia CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona). Un paciente con cáncer se puede tratar con un anticuerpo de unión a CD20 humanizado de la invención combinado con quimioterapia CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona). Un paciente que padece LNH positivo para CD20 se puede tratar con 2H7.v16 humanizado junto con CVP. En el tratamiento de la CLL, se puede administrar un anticuerpo de unión a CD20 junto con la quimioterapia

35 con uno o ambos de fludarabina y citoxano.

En el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias o de las dolencias relacionadas con enfermedades autoinmunitarias anteriormente descritas, el paciente se puede tratar con los anticuerpos de unión a CD20 de la presente invención junto con un segundo agente terapéutico, tal como un agente inmunosupresor, tal como en un régimen multifármaco. El anticuerpo de unión a CD20 se puede administrar de forma paralela, secuencial o alternante con el agente inmunosupresor, o cuando no responde a otra terapia. El agente inmunosupresor se puede administrar a la misma dosis o a una dosis inferior de los establecido en la técnica. El agente inmunosupresor complementario preferido dependerá de muchos factores, entre los que se incluyen el tipo de trastorno que se está tratando, así como los antecedentes médicos del paciente.

45 "Agente inmunosupresor" tal como se usa en el presente documento para el tratamiento complementario se refiere a sustancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario de un paciente. Dichos agentes incluirían sustancias que suprimen la producción de citoquinas, regulan defectivamente, o suprimen, la expresión de autoantígenos, o enmascaran los antígenos MHC. Los ejemplos de estos agentes incluyen esteroides tales como glucocorticoesteroides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona, y dexametasona; pirimidinas 2-amino-6-aril-5sustituidas (véase la patente de Estados Unidos n.º 4.665.077), azatioprina (o ciclofosfamida, si hay reacción adversa a la azatioprina); bromocriptina; glutaraldehido (que enmascara los antígenos MHC, tal como se describe en la patente de Estados Unidos n.º 4.120.649); anticuerpos contra idiotipo de antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; citoquinas o antagonistas del receptor de citoquinas incluyendo los anticuerpos dirigidos contra el

55 interferón γ, β,o α; anticuerpos dirigidos contra el factor de necrosis tumoral α; anticuerpos dirigidos contra el factor de necrosis tumoral β; anticuerpos dirigidos contra interleuquina 2 y anticuerpos dirigidos contra el receptor de IL-2; anticuerpos dirigidos contra L3T4; globulina heteróloga dirigida contra linfocitos; anticuerpos pan-T, preferentemente anticuerpos dirigidos contra CD3 o CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión a LFA-3 (documento WO 90/08187 publicado el 26 de julio de 1990); estreptocinasa; TGF-β; estreptodomasa; ARN o ADN del hospedador; FK506; RS-61443; deoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (patente de Estados Unidos n.º 5.114.721); fragmentos del receptor de células T (Offner et al., Science 251:430-432 (1991); documento WO 90/11294; y WO 91/01133); y anticuerpos del receptor de células T (documento EP 340.109) tales como T10B9.

Para el tratamiento de la artritis reumatoide, el paciente se puede tratar con un anticuerpo CD20 de la invención

65 junto con uno o más de los siguientes fármacos: DMARDS (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (por ejemplo, metotrexato), AINE (fármaco antiinflamatorio no esteroideo), HUMIRA™ (adalimumab; Abbott Laboratories), AR-AVA® (leflunomida), REMICADE® (infliximab; Centocor Inc., de Malvern, Pa), ENBREL (etanercept; Immunex, WA), inhibidores de COX-2. Los DMARD habitualmente usados en la AR son hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab, azatioprina, D-penicilamina, oro (oral), oro (intramuscular), minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción de proteína A de estafilococo. Adalimumab es

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5 un anticuerpo monoclonal humano que se une a TNFα. Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico que se une a TNFα. Etanercept es una proteína de fusión de "inmunoadhesina" que consiste en l porción de unión al ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral de 75 kD (p75) humano (TNFR) unido a la porción Fc de una IgG1 humana. Para el tratamiento convencional de la AR, véanse, por ejemplo, "Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritics & Rheumatism 46(2): 328-346 (febrero de 2002). En una realización específica, el paciente de AR se trata con un anticuerpo de CD20 de la invención junto con metotrexato (MTX). Una dosis ilustrativa de MTX es de aproximadamente 7,5-25 mg/kg/sem. El MTX se puede administrar por vía oral y por vía subcutánea.

Para el tratamiento de la espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Crohn, el paciente se puede

15 tratar con los anticuerpos de unión a CD20 de la invención junto con, por ejemplo, Remicade® (infliximab; de Centocor Inc., de Malvern, Pa.), ENBREL (etanercept; Immunex, WA).

Los tratamientos del SLE incluyen altas dosis de corticoesteroides y/o ciclofosfamida (HDCC).

Para el tratamiento de la psoriasis, los pacientes pueden recibir un anticuerpo de unión a CD20 junto con los tratamientos tópicos, tales como los esteroides tópicos, antralina, calcipotriena, clobetasol, y tazarotene, o con metotrexato, retinoides, ciclosporina, tratamientos PUVA y UVB. Un paciente de psoriasis se puede tratar con el anticuerpo de unión a CD20 de forma secuencial o paralela con ciclosporina.

25 Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos de unión a CD20 de acuerdo con la presente invención se preparan para su almacenamiento mezclando un anticuerpo que tenga el grado deseado de pureza con transportadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los transportadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol

35 butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Se describen formulaciones de anticuerpo dirigido contra CD20 ilustrativas en el documento WO98/56418. Otra formulación es una formulación líquida multidosis que comprende el anticuerpo dirigido contra CD20 a 40 mg/ml, 45 acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol bencílico al 0,9 %, polisorbato 20 al 0,02 % a pH 5,0 que tiene una vida útil mínima de dos años en almacenamiento a 2-8°C. Otra formulación de anticuerpo dirigido contra CD20 de interés comprende 10 mg/ml de anticuerpo en 9,0 mg/ml de cloruro de sodio, 7,35 mg/ml de citrato de sodio dihidrato, 0,7 mg/ml de polisorbato 80, y agua estéril para inyección, pH 6,5. Otra formulación farmacéutica acuosa comprende acetato de sodio 10-30 mM de aproximadamente pH 4,8 a aproximadamente pH 5,5, preferentemente a pH 5,5, polisorbato como tensioactivo en una cantidad de aproximadamente 0,01-0,1 % v/v, trehalosa en una cantidad de aproximadamente 2-10 % p/v, y alcohol bencílico como conservante (documento US 6.171.586). Las formulaciones adaptadas para la administración subcutánea se describen en el documento WO97/04801. Dichas formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con un diluyente adecuado hasta conseguir una elevada concentración de la proteína, y la formulación reconstituida se puede administrar por vía subcutánea al mamífero que se va a tratar en el

55 presente documento.

Una formulación del anticuerpo humanizado es un anticuerpo al 12-14 mg/ml en histidina 10 mM, sacarosa al 6 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 5,8.

Un anticuerpo de la presente invención y, en particular, 2H7.v16 se puede formular a 20 mg/ml de anticuerpo en sulfato de histidina 10 mM, 60 mg/ml de sacarosa, 0,2 mg/ml de polisorbato 20, y agua estéril para inyección a pH 5,8.

La formulación del presente documento puede contener también más de un principio activo según sea necesario

65 para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, citoquina o agente inmunosupresor (por ejemplo, uno que actúa sobre las células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que se une a las células T, por ejemplo, uno que se une a LFA-1). La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tiempo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan

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5 generalmente a las mismas dosis y con rutas de administración que se han descrito anteriormente en el presente documento o de aproximadamente del 1 al 99 % de las dosis empleadas anteriormente.

Los principios activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco en forma coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se han descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).

15 Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el antagonista, matrices que tienen la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (patente de Estados Unidos n.º 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-Lglutamato, acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico).

Las formulaciones que van a usarse para administración in vivo tienen que ser estériles. Esto se consigue fácilmente 25 mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Artículos de fabricación y kits

Se describe en el presente documento un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y dolencias relacionadas y cánceres positivos para CD20 tales como el linfoma no de Hodgkin. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar formados a partir de varios materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa

35 para inyección intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo de la composición es un anticuerpo de unión a CD20 de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición es de utilidad para tratar la dolencia concreta. La etiqueta o prospecto comprenderá instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente. El prospecto se refiere a las instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. En una realización, el prospecto indica que la composición es de utilidad para tratar un linfoma no de Hodgkins.

Además, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase que comprenda un tampón

45 farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), suero salino tamponado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Los kits son útiles para varios fines, por ejemplo, en ensayos de eliminación de células R, como control positivo para ensayos de apoptosis, para aplicación o inmunoprecipitación de CD20 a partir de las células. Para aislamiento y purificación de CD20, el kit puede contener un anticuerpo dirigido contra CD20 acoplado a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Los kits se pueden proporcionar con anticuerpos para la detección y cuantificación de CD20 in vitro, por ejemplo, en un ELISA o transferencia Western. Como en el caso del artículo de fabricación, el kit comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. El envase contiene una composición

55 que comprende al menos un anticuerpo dirigido contra CD20 de la invención. Se pueden incluir envases adicionales que contengan, por ejemplo, diluyentes y tampones, anticuerpos de control. La etiqueta o prospecto pueden proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso in vitro o diagnóstico previsto.

CD20 de macaco

Un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.:24 de CD20 de macaco se muestra en la Fig. 19. El ácido nucleico puede ser un ADNc. Un ácido nucleico que codifica CD20 de mono puede estar incluido en un vector de expresión para su expresión en una célula hospedadora. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.:24 del vector de expresión se puede unir operativamente a una secuencia que controla la 65 expresión tal como un promotor o un promotor y un potenciador. La secuencia de control de la expresión puede ser la secuencia natural normalmente asociada con el gen CD20 de macaco, o bien ser heteróloga respecto al gen.

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También se describe un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la [SEQ ID NO.25; Fig. 19 y 20] de CD20 de macaco, así como las células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico de CD20 de macaco. Las células hospedadoras pueden ser células eucariotas, por ejemplo, células CHO. También se contemplas las proteínas de fusión que comprenden la secuencia de aminoácidos de CD20 de macaco, o

5 fragmentos de dicha secuencia.

Ejemplos experimentales

Ejemplo 1

10

Humanización del anticuerpo monoclonal de murino 2H7 dirigido contra CD20

La humanización del anticuerpo 2H7 de murino (denominado también en el presente documento m2H7, m de murino) dirigido contra CD20 humano, se llevó a cabo en una serie de etapas de mutagénesis dirigida a sitio. Se han 15 descrito las secuencias de la región variable del anticuerpo 2H7 de murino y del 2H7 quimérico con la V de ratón y la C humana, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.846.818 y 6.204.023. Los restos de la CDR de 2H7 se identificaron comparando la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de 2H7 de murino (divulgados en el documento de US 5.846.818) con las secuencias de anticuerpos conocidos (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ed. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, 20 Bethesda, MD (1991)). Las regiones de la CDR de las cadenas ligera y pesada se definieron basándose en la hipervariabilidad de la secuencia) (Kabat et al., supra) y se muestran en la Fig. 1A y la Fig. 1B, respectivamente. Utilizando los oligonucleótidos sintéticos (Tabla 1), la mutagénesis dirigida a sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)) se utilizó para introducir las seis regiones de la CDR de 2H7 de murino en un marco Fab humano completo que corresponde a una secuencia consenso VκI,VHIII (VL kappa subgrupo I, VH subgrupo III) contenida en

25 el plásmido pVX4 (Fig. 2).

Se usó el fagémido pVX4 (Fig. 2) tanto para la mutagénesis como para la expresión de F(ab)s en E. coli. Basándose en el fagémido pb0720, un derivado de pB0475 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989)), pVX4 contiene un fragmento de ADN que codifica un anticuerpo dirigido contra IFN-α (interferón α) de la cadena ligera del subgrupo 30 κ consenso humanizado (VLκI-CL) y de la cadena pesada del subgrupo III consenso humanizado (VHIII-CH1). pVX4 tiene también un promotor de la fosfatasa alcalina y una secuencia Shine-Dalgamo, ambos derivados de otro plásmido basado en pUC119 descrito anteriormente, pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)). Se introdujo un único sitio de restricción SpeI entre el ADN que codificaba las cadenas ligera y pesada de F(ab). Los primeros 23 aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo dirigido contra IFN-α son la

35 secuencia señal de secreción (Chang et al., Gene 55: 189-196 (1987)).

Para construir la versión CDR-swap de 2H7 (2H7.v2), se llevó a cabo la mutagénesis dirigida a sitio en un molde de pVX4 que contiene desoxiuridina; las seis CDR del anti-IFN-α se cambiaron por las CDR de 2H7 de murino. La molécula resultante se denomina versión 2 de 2H7 humanizado (2H7.v2), o la "versión CDR-swap" de 2H7; tiene los

40 restos de la CDR de m2H7 junto con los restos consenso del FR humano que se muestra en las Figuras 1A y 1B. Se usó 2H7.v2 humanizado para la humanización adicional.

La Tabla 1 muestra la secuencia de oligonucleótidos utilizada para crear cada una de las CDR de 2H7 de murino (m2H7) en la cadena H y la cadena L. Por ejemplo, se utilizó el oligonucleótido CDR-H1 para recrear la CDR1 de la

45 cadena H de m2H7. CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 se refieren a la CDR1 de la cadena H, CDR2 y CDR3, respectivamente; de manera similar, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se refieren a cada una de las CDR de la cadena L. Las sustituciones en CDR-H2 se llevaron a cabo es dos etapas con dos oligonucleótidos, CDR-H2A y CDR-H2B.

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos utilizadas para la construcción de la CDR-swap de las CDR de 2H7 de 50 murino en un marco humano en pVX4. Los restos cambiados en cada oligonucleótido están subrayados.

Sustitución
Secuencia de oligonucleótidos

CDR-H1
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CDR-H2A
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CDR-H2B
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CDR-H3
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CDR-L1
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CDR-L2
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CDR-L3
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Para la comparación con construcciones humanizadas, se construyó un plásmido que expresa un Fab quimérico de 2H7 Fab (que contiene dominios VL y VH murinos y dominios CL y CH1 humanos) mediante mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, supra) usando oligonucleótidos sintéticos para introducir los restos del marco murino en 2H7.v2. La

5 secuencia de la construcción plásmida resultante para la expresión del Fab quimérico conocido como 2H7.v6.8 se muestra en la Fig. 3. Cada cadena codificada del Fab tiene una secuencia señal de la secreción SfII de 23 aminoácidos como se describa para el pVX4 (Fig. 2) anterior.

Basándose en una comparación de secuencias de los restos marco de 2H7 de murino con el marco consenso

10 VκI,VHIII humano (Figuras 1A y 1B) y los anticuerpos previamente humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)), se introdujeron varias mutaciones del marco en la construcción 2H7.v2 Fab mediante mutagénesis dirigida a sitio. Estas mutaciones dan como resultado un cambio de determinados restos consenso humanos en aquellos que se encuentran en el marco 2H7 de murino, en sitios que puede alterar las conformaciones de la CDR o los contactos del antígeno. La versión 3 contenía VH(R71V, N73K), la versión 4 contenía VH(R71V), la

15 versión 5 contenía VH(R71V, N73K) y VL(L46P), y la versión 6 contenía VH(R71V, N73K) y VL(L46P, L47W).

Las versiones Fab humanizadas y quiméricas del anticuerpo m2H7 se expresaron en E. coli y se purificaron del siguiente modo. Los plásmidos se transformaron en la cepa XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, San Diego, CA) para la preparación de ADN bicatenario y monocatenario. Para cada variante, las cadenas ligera y pesada se secuenciaron 20 completamente utilizando el método del didesoxinucleótido (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Los plásmidos se transformaron en la cepa 16C9 de E. coli, un derivado de MM294, se sembraron en placas LB que contenían 5 µg/ml de carbenicilina, y se seleccionó una única colonia para la expresión de la proteína. La única colonia se hizo crecer en 5 ml de LB-100 µg/ml de carbenicilina durante 5-8 h a 37° C. El cultivo de 5 ml se añadió a 500 ml de AP5-100 de µg/ml de carbenicilina y se dejó crecer durante 16 h en un matraz de 4 l con deflectores a 37 ºC con medio AP5 que

25 consiste en: 1,5 g de glucosa, 11,0 de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura (certificado), 0,19 g de MgSO4 anhidro, 1,07 g de NH4Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl,120 ml de trietanolamina 1 M, pH 7,4, hasta 1 l de agua y a continuación se filtró a esterilidad a través de un filtro Sealkeen de 0,1 µm.

Las células se recogieron mediante centrifugación en un frasco de centrífuga de 1 l (Nalgene) a 3000xg y se eliminó

30 el sobrenadante. Tras congelar durante 1 h, el aglomerado se volvió a suspender en 25 ml de EDTA 10 mM MES-10 mM frío, pH 5,0 (tampón A). Se añadieron 250 µl de PMSF 0,1M (Sigma) para inhibir la proteolisis y se añadieron 3,5 ml de solución madre de 10 mg/ml de lisozima de clara de huevo de gallina (Sigma) para ayudar a la lisis de la pared de la célula bacteriana. Tras agitar suavemente en hielo durante 1 h, la muestra se centrifugó a 40.000xg durante 15 min. El sobrenadante se llevó a 50 ml con tampón A y se cargó en una columna DEAE de 2 ml equilibrada con

35 tampón A. A continuación se aplicó flujo pistón a una columna G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (0,5 ml de volumen de lecho) equilibrada con tampón A. Se lavó la columna con 10 ml de tampón A y se eluyó con 3 ml de glicina 0,3 M, pH 3,0, en 1,25 ml de Tris 1 M, pH 8,0. El F(ab) se intercambió a continuación con tampón en PBS utilizando un Centricon-30 (Amicon) y se concentró hasta un volumen final de 0,5 ml. Se analizaron geles SDS-PAGE de todos los F(ab) para discernir la pureza y se verificó el peso molecular de cada variante mediante espectrometría de masas

40 por electropulverización.

En los ensayos de unión a ELISA basados en células (descritos a continuación), la unión de los Fab, incluyendo el Fab de 2H7 quimérico, a CD20 fue difícil de detectar. Por lo tanto, las versiones 2H7 Fab se reformaron como anticuerpos IgG1 de longitud completa para los ensayos y la mutagénesis adicional.

45 Se construyeron plásmidos para la expresión de las IgG de longitud completa subclonando los dominios VL y VH del 2H7 (v6.8) Fab quimérico, así como las versiones 2 a 6 del Fab humanizado en vectores pRK descritos anteriormente para su expresión de células de mamífero (Gorman et al.; DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). En resumen, cada construcción Fab se digirió con EcoRV y BlpI para escindir un fragmento VL, que se clonó en los

50 sitios EcoRV/BIpI del plásmido pDR1 (Fig. 4) para la expresión de la cadena ligera completa (DOMINIOS VL-CL). Además, cada construcción de Fab se digirió con PvuII y ApaI para escindir un fragmento VH, que se clonó en los sitios PvuIIIApaI del plásmido pDR2 (Fig. 5) para la expresión de la cadena pesada completa (dominios VH-CH1Nnge-CH2-CH3). Para cada variante de IgG, se realizaron las transfecciones transitorias transfectando simultáneamente un plásmido que expresa la cadena ligera y un plásmido que expresa la cadena pesada en una

55 línea de células de riñón embriónico humano transformadas con adenovirus, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)). En resumen, células 293 se dividieron en el día antes de la transfección, y se sembraron en placas en medio que contenía suero. Al día siguiente, se añadió ADN bicatenario preparado como un precipitado de fosfato de calcio, seguido por ADN pAdVAntage™ (Promega, Madison, WI), y se incubaron las células durante la noche a 37 ºC. Se cultivaron las células en medio exento de suero y se recogieron después de 4 días. Los

60 anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo utilizando la proteína A-Sepharose CL-4B, a continuación, el tampón se intercambió en succinato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 y se concentró utilizando un Centricon-10 (Amicon). Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante el análisis cuantitativo de aminoácidos.

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Para medir las afinidades de unión relativas al antígeno CD20, se desarrolló un ensayo ELISA de tipo celular. Células WIL2-S de B-linfoblastoide humano (ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD) se hicieron crecer en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM, HEPES 20 mM, pH 7,2 y suero de feto bovino inactivado térmicamente al 10 % en una incubadora de CO2 al 5 % humidificada. Las células se lavaron con PBS 5 que contenía FBS al 1 % (tampón de ensayo) y se sembraron a 250-300.000 células/pocillo en placas de fondo redondo de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca). El patrón se diluyó en serie dos veces (15,6-1000 ng/ml de IgG quimérica de 2H7 v6.8) y las muestras diluidas en serie tres veces (2,7-2000 ng/ml) en tampón de ensayo se añadieron a las placas. Las placas se enterraron en hielo y se incubaron durante 45 min. Para eliminar el anticuerpo no unido, se añadió 0,1 ml de tampón de ensayo a los pocillos. Las placas se centrifugaron y se retiraron los 10 sobrenadantes. Se lavaron las células dos veces más con 0,2 ml de tampón de ensayo. Se detectó el anticuerpo unido a las placas añadiendo anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa dirigido contra Fc humano (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a las placas. Después de una incubación de 45 min, se lavaron las células como se ha descrito anteriormente. El sustrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametil benzidina; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) se añadió a las placas. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido fosfórico 1 M. Se 15 ajustaron las curvas de titulación con un programa de ajuste de una curva de regresión no lineal de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Se determinaron la absorbancia en el punto medio de la curva de titulación (mid-OD) y su concentración correspondiente del patrón. A continuación se determinó la concentración de cada variante en esta mid-OD y la concentración del patrón se dividió por la de cada variante. Por tanto, los valores son una índice de la unión de cada variante con respecto al patrón. Las desviaciones estándar en

20 la afinidad relativa (concentración equivalente) fueron generalmente +/-10 % entre los experimentos.

Como se muestra en la Tabla 2, la unión de la variante CDR-swap (v.2) fue extremadamente reducida en comparación con el 2H7 quimérico (v.6.8). Sin embargo, las versiones 3 a 6 mostraron una unión mejorada. Para determinar el número mínimo de mutaciones que pueden requerirse para restaurar la afinidad de unión a la del 2H7 25 quimérico, se construyeron mutaciones y combinaciones adicionales de mutaciones mediante la mutagénesis dirigida a sitio para producir las variantes 7 a 17 como se indica en la Tabla 2. En particular, estas incluyeron las mutaciones de VH A49G, F67A, I69L, N73K, y L78A; y las mutaciones de VL M4L, M33I, y F71Y. Las versiones 16 y 17 mostraron las mejores afinidades de unión relativas, del doble de las de la versión quimérica, sin diferencias significativas (s.d. = +/-10 %) entre las dos. Para minimizar el número de mutaciones, la versión 16, que tiene solo 4

30 mutaciones de los restos del marco humano a restos de marco de murino (Tabla 2) se seleccionaron de esta manera como la forma humanizada para su caracterización adicional.

Tabla 2. Afinidad de unión relativa de las variantes de IgG de 2H7 humanizadas para CD20 en comparación con el ELISA de 2H7 quimérico de tipo celular. La unión relativa se expresa como la concentración del 2H7 quimérico 35 respecto a la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una relación<1 indica una

afinidad más débil por la variante. Desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10 %. Las sustituciones del marco en los dominios variables son relativas a la versión CDR-swap de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., anteriormente citado).

Versión 2H7
Sustituciones de la cadena pesada (VH) Sustituciones de la cadena ligera (VL) Unión relativa

6,8
(Quimera) (Quimera) -1

2
(CDR swap) (CDR swap) 0,01

3
R71V, N73K (CDR swap) 0,21

4
R71V (CDR swap) 0,21

5
R71V, N73K L46P 0,50

6
R71V, N73K L46P, L47W 0,58

7
R71V L46P 0,33

8
R71V, L78A L46P 0,19

9
R71V, F67A L46P 0,07

10
R71V, F67A, I69L L46P 0,12

11
R71V, F67A, L78A I46P 0,19

12
R71V I46P, M4L 0,32

13
R71V L46P, M33I 0,31

14
R71V L46P, F71Y 0,25

15
R71V LA6P, M4L, M33I 0,26

16
R71V, N73K, A49G L46P 0,65

17
R71V, N73K, A49G L46P, L47W 0,67

40 Tabla 3 Secuencias de oligonucleótidos utilizadas para la construcción de mutaciones VH(A49G, R71V, N73K) y

VL(L46P) en la versión 16 de 2H7 humanizado (2H7.vl6). Los codones subrayados codifican las sustituciones de aminoácidos indicadas. Para VH (R71V, N73K) y VL (L46P), los oligonucleótidos se muestran como la hebra de sentido directo ya que se usaron para la mutagénesis en el molde de Fab, mientras que para VH (A49G), el oligonucleótido se muestra como la hebra de sentido contrario, ya que se usó con el molde de pRK (cadena pesada

45 de IgG). En la Fig. 6 y la Fig. 7 se muestra la secuencia de proteínas de la versión 16.

imagen36

Sustitución
Secuencia de oligonucleótidos

VH (K71V, N73K)
imagen37

VH (A49G)
imagen38

VL (L46P)
imagen39

Ejemplo 2

Determinantes de unión a antígeno (parátopo) de 2H7

5 Se prepararon las sustituciones de alanina (Cunningham & Wells, Science 244: 1081-1085 (1989) en 2H7.v16 o 2H7.v17 para someter a ensayo las contribuciones de las cadenas laterales individuales del anticuerpo en la unión a CD20. Las variantes de IgG se expresaron en células 293 a partir de vectores pDR1 y pDR2, se purificaron y se evaluaron para determinar la afinidad de unión relativa como se ha descrito anteriormente. Varias sustituciones de la

10 alanina dieron como resultado disminuciones significativas en la unión relativa a CD20 en células WIL-2S (Tabla 4).

Tabla 4. Efectos de las sustituciones de alanina en las regiones CDR de 2H7.v16 humanizado medido utilizando ELISA de tipo celular (células WIL2-S). La unión relativa se expresa como la concentración del 2H7.v16 precursor respecto a la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una relación<1 indica una

15 afinidad más débil por la variante; una relación >1 indica mayor afinidad por la variante. Desviación estándar en la

determinación de la afinidad relativa promedió +/-10 %. Las sustituciones del marco en los dominios variables son relativas a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., anteriormente citado). NBD significa unión no detectable. Los dos números de la versión 45 proceden de experimentos diferentes.

2H7
CDR Cadena pesada Cadena ligera Unión relativa

versión
localización sustituciones sustituciones

16
- - - -1

140
H1 G26A - 0,63

141
H1 Y27A - 0,47

34
H1 T28A - 0,86

35
H1 F29A - 0,07

36
H1 T30A - 0,81

37
H1 S31A - 0,97

142
H1 Y32A - 0,63

143
H1 N33A - NDB

144
H1 M34A - 1,2

145
H1 H35A - <0,25

146
H2 A50G - 0,31

147
H2 I51A - 0,65

38
H2 Y52A - 0,01

148
H2 P52aA - 0,66

39
H2 G53A - 0,89

67
H2 N54A - 1,4

40
H2 G55A - 0,79

41
H2 D56A - 2,0

89
H2 T57A - 0,61

90
H2 S58A - 0,92

91
H2 Y59A - 0,74

92
H2 N60A - 0,80

93
H2 Q61A - 0,83

94
H2 K62A - 0,44

95
H2 F63A - 0,51

83
H2 V71A - 0,96

149
H2 K64A - 0,82

150
H2 G65A - 1,2

153
H3 V95A - 0,89

42
H3 V96A - 0,98

43
H3 Y97A - 0,63

44
H3 Y98A - 0,40

imagen40

45
H3 399A - 0,84; 0,92

46
H3 N100A - 0,81

47
H3 S100aA - 0,85

48
H3 Y100bA - 0,78

49
H3 W100cA - 0,02

59
H3 Y100dA - 0,98

60
H3 F100eA - NDB

61
H3 D101A - 0,31

151
H3 V102A - 1,1

117
LI - R24A 0,85

118
L1 - A25G 0,86

119
L1 - S26A 0,98

120
L1 - (S27A 0,98

121
L1 - S28A 1,0

122
L1 - V29A 0,41

50
L1 - S30A 0,96

51
L1 - Y32A 1,0

123
L1 - M33A 1,0

124
L1 - H34A 0,21

125
L2 - A50G 0,92

126
L2 - P51A 0,88

52
L2 - S52A 0,80

53
L2 - N53A 0,76

54
L2 - L54A 0,60

127
L2 - A55G 1,1

128
L2 - S56A 1,1

129
L3 - Q89A 0,46

130
L3 - Q90A <0,22

55
L2 - W91A 0,88

56
L3 - S92A 1,1

57
L3 - F93A 0,36

58
L3 - N94A 0,61

131
L3 - P95A NDB

132
L3 - P96A 0,18

133
L3 - T97A <0,22

Ejemplo 3

Mutaciones adicionales en las regiones de la CDR de 2H7

5 Se sometieron a ensayo también las sustituciones de restos adicionales y las combinaciones de sustituciones en las posiciones de la CDR que se identificaron como importantes mediante el barrido de Ala. Algunas variantes de combinación, particularmente v.96 parecieron unirse más fuertemente que v.16.

10 Tabla 5. Efectos de las combinaciones de mutaciones y sustituciones no de alanina en las regiones de la CDR de

2H7.v16 humanizado medido utilizando ELISA basado en células (células WIL2-S). La unión relativa a CD20 se expresó como la concentración del 2H7.v16 precursor sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una relación<1 indica una afinidad más débil por la variante; una relación >1 indica mayor afinidad por la variante. Desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10 %. Las

15 sustituciones del marco en los dominios variables son relativas a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., anteriormente citado).

Versión 2H7
Sustituciones de la cadena pesada Sustituciones de la cadena ligera Unión relativa

16
- - -1

96
D56A, N100A S92A 3,5

97
N100G, Y100bI - 0,99

98
N100S, Y100bI - 1,6

99
N100G, Y100bI - 0,80

101
N54S, D56A - 1,7

102
N54K, D56A - 0,48

imagen41

103
D56A, N100A - 2,1

104
S99T, N100G - 0,81

105
399G, N100S - 1,1

106
N100G - ~ 1

167
S100aG, Y100bS -

136
D56A, N100A S56A, S92A 2,6

137
D56A, N100A A55G, S92A 2,1

156
D56A, N100A S26A, S56A, S92A 2,1

107
D56A, N100A, Y100bI S92A no expresada

182
Y27W -

183
Y27F -

184
F29Y -

185
F29W -

186
Y32F -

187
Y32W -

188
N33Q -

189
N33D -

190
N33Y -

191
N33S -

208
H35S -

209
A50S -

210
A50R -

211
A50V -

212
A50L -

168
Y52W -

169
Y52F - 0,75

170
N54D - 0,25

171
N54S - 1,2

172
D56K - 1

173
D56R -

174
D56H - 1,5

175
D56E - 1,2

213
D56S -

214
D56G -

215
D56N -

216
D56Y -

176
Y59W -

177
Y59F -

180
K62R -

181
K62D -

178
F63W -

179
F63Y -

157
Y97W - 0,64

158
Y97F - 1,2

159
Y98W - 0,64

160
Y98F - 0,88

106
N100G -

161
W100cY - 0,05

162
W100cF - 0,27

163
F100eY - 0,59

164
F100eW - 0,71

165
D101N - 0,64

166
S99G, N100G, S100aD, Y100b eliminados - 0,99

217
V102Y - 1,0

207
- H34Y

192
- Q89E

193
- Q89N

194
- Q90B

imagen42

195
- Q90N

196
- W91Y

197
- W91F

205
- S92N

206
- S92G

198
- F93Y

199
- F93W

204
- F93S, N94Y

200
- P96L

201
- P96Y

202
- P96W

203
- P96R

Ejemplo 4

Mutaciones en los sitios de sustituciones de humanización del marco

5 Se sometieron a ensayo también las sustituciones de restos adicionales en las posiciones del marco que se cambiaron durante la humanización en el fondo de 2H7.v16. En particular, Las sustituciones alternativas del marco que no se encontraron ni el 2H7 precursor murino ni en el marco de consenso humano se realizaron en VL(P46) y VH(G49, V71, y K73).

10 Estas sustituciones conducen generalmente a pocos cambios en la unión relativa (Tabla 6) indicando que existe cierta flexibilidad en los restos del marco en estas posiciones.

Tabla 6. Unión relativa en un ensayo de tipo celular (WIL2-S) de sustituciones marco. Las variantes de IgG se 15 muestran con mutaciones con respecto al fondo de 2H7.v16. La unión relativa se expresa como la concentración de

la quimera de 2H7.v6.8 sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una relación<1 indica una afinidad más débil por la variante; una relación >1 indica mayor afinidad por la variante. Desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10 %. Las sustituciones del marco en los dominios variables son relativas a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al.,

20 anteriormente citado). (*) Variantes que se evaluaron con 2H7.v16 como el comparador normalizado; los valores relativos se normalizan al de la quimera.

Versión 2H7
Sustituciones de la cadena pesada Sustituciones de la cadena ligera Unión relativa

6,8
(quimera) (quimera) -1

16
- - 0,64

78
K73R - 0,72

79
K73H - 0,49

80
K73Q - 0,58

81
V71I - 0,42

82
V71T - 0,58

83
V71A -

84
G49S - 0,32

85
G49L -

86
- P46E 0,22

87
- P46V 0,51

88
- P46T

108
-G49A, V71T, K73R S92A, M32L, P46T 0,026*

109
G49A, A49G, V71T, K73R S92A, M32L, P46T 0,026*

110
K73R, D56A, N100A S92A, M32L No expresada

111
G49A, V71T, K73R - 0,46*

112
G49A, A50G, V71T, K73R - 0,12*

(*) Variantes que se evaluaron con 2H7.v16 como el comparador normalizado; los valores relativos se normalizan al de la quimera.

Ejemplo 5

25 Variantes de 2H7 humanizadas con funciones efectoras potenciadas

Como 2H7 puede mediar en la lisis de las células B a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), los inventores pensaron en producir variantes de 2H7.v16 humanizado con actividad CDC y ADCC mejoradas. Se han descrito las mutaciones de determinados

restos en las regiones Fc de otros anticuerpos (Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)) para mejorar la CDC a través de la unión potenciada al componente C1q del complemento. Se han descrito también mutaciones (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30:487-490 (2002)) para mejorar la ADCC a través de la unión a IgG potenciada para activar los receptores de Fcγ y reducir la unión de IgG a

5 los receptores de Fcγ inhibidores. En particular, se han identificado tres mutaciones que mejoran la actividad de CDC y ADCC: S298A/E333A/K334A (denominada también en el presente documento como mutante o variante triple Ala; la numeración en la región Fc es de acuerdo con el sistema de numeración de la UE; Kabat et al., anteriormente citado) como se describe (Idusogie et al., anteriormente citado (2001); Shields et al., anteriormente citado).

10 Para potenciar la actividad de CDC y ADCC de 2H7, se construyó un mutante triple Ala del 2H7 Fc. Se ha producido una variante humanizada del anticuerpo 4d5 dirigido contra HER2 con las mutaciones S298A/E333A/K334A y se conoce como 4D5Fc110 (es decir, IgG1 anti-p185HER2 (S298A/E333A/K334A); Shields et al., anteriormente citado). Un plasmido, p4D5Fc110 que codifica el anticuerpo 4D5Fc110 (Shields et al., anteriormente citado) se digirió con ApaI y HindIII, y el fragmento Fc (que contenía las mutaciones S298A/E333A/K334A) se ligó en los sitios ApaI/HindIII

15 del vector pDR2-v16 de la cadena pesada de 2H7, para producir pDR2-v31. En la Fig. 8 se muestra la secuencia de aminoácidos de la versión 31 de la cadena H completa. La cadena L es la misma que la de v16.

Aunque los dominios constantes de la región Fc de los anticuerpos IgG1 se conservan relativamente en una especie dada, existen variaciones alélicas (revisadas por Lefranc y Lefranc, en The human IgG subclasses: molecular

20 analysis of structure, function, and regulation, págs. 43-78, F. Shakib (ed.), Pergammon Press, Oxford (1990)).

Tabla 7. Efectos de las sustituciones en la región Fc sobre la unión a CD20. Se midió la unión relativa a CD20 en un ensayo de tipo celular (WIL2-S) de sustituciones del marco. Las mutaciones Fc (*) se indican mediante la numeración de la UE (Kabat, anteriormente citado) y en relación al precursor de 2H7.v16. La combinación de los tres

25 cambios de Ala en la región Fc de v.31 se describe como "Fc110". Las variantes de IgG se muestran con mutaciones con respecto al fondo de 2H7.v16. La unión relativa se expresa como la concentración de la quimera de 2H7.v6.8 sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una relación <1 indica una afinidad más débil por la variante. Desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/10 %.

Versión 2H7
Fc Sustituciones* Unión relativa

6,8
- -1

16
- 0,65

31
S298A, E333A, K334A 0,62

30

Ejemplo 6

Variantes de 2H7 humanizadas con estabilidad potenciada

35 Para el desarrollo como proteínas terapéuticas, es deseable seleccionar variantes que sigan siendo estables con respecto a la oxidación, la desaminación, u otros procesos que puedan afectar la calidad del producto, en un tampón de formulación adecuado. En 2H7.v16, se identificaron algunos restos como fuentes posibles de inestabilidad: VL (M32) y VH (M34, N100). Por lo tanto, se introdujeron mutaciones en estos sitios para su comparación con v16.

40 Tabla 8. Unión relativa de las variantes de 2H7 diseñadas para la estabilidad potenciada y/o la función efectora, a CD20 en un ensayo de tipo celular (WIL2-S). Las variantes de IgG se muestran con mutaciones con respecto al fondo de 2H7.v16. La unión relativa se expresa como la concentración de la quimera de 2H7.v6.8 sobre la concentración de la variante requerida para la unión equivalente; por tanto, una relación<1 indica una afinidad más débil por la variante. Desviación estándar en la determinación de la afinidad relativa promedió +/-10 %. Las

45 sustituciones del marco en los dominios variables son relativas a 2H7.v16 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat y las mutaciones Fc (*) se indican mediante la numeración de la UE (Kabat et al., anteriormente citado). (**) Variantes que se evaluaron usando 2H7.v16 como el comparador normalizado; los valores relativos se normalizan al de la quimera.

Se combinaron las mutaciones de Fc adicionales con las mutaciones de potenciación de la estabilidad o la afinidad para alterar o potenciar las funciones efectoras basándose en las mutaciones notificadas anteriormente (Idusogie et al. (2000); Idusogie et al. (2001); Shields et al. (2001)). Estos cambios incluyen S298, E333A, K334A como se describe en el Ejemplo 5; K322A para reducir la actividad de CDC; D265A para reducir la actividad de ADCC; K326A o K326W para potenciar la actividad de CDC; y E356D/M358L para probar los efectos de los cambios alotípicos en la región Fc. Ninguna de estas mutaciones produjo diferencias significativas en la afinidad de unión a CD20.

Versión 2H7
Cambios en la cadena pesada (VH) Cambios en la cadena ligera (VL) Cambios de Fc * Unión relativa

imagen43

6,8
(quimera) (quimera) - -1

16
- - - 0,65

62
- M32I - 0,46

63
M34I - - 0,49

64
N100A - -

65
N100A L47W - 0,74

66
S99A L47W - 0,62

67
N54A - -

68
- M32I - 0,48

69
- M32L - 0,52

70
N100A - S298A, E333A, K334A 0,80

71
N100D - S298A, E333A, K334A 0,44

72
N100A M32I - 0,58

73
N100A M32L - 0,53

74
N100A M32I S298A, E333A, K334A 0,61

75
N100A M32L S298A, E333A, K334A 0,60

113
- - E356D, M358L 0,60**

114
D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A 1 2**

115
D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, E356D, M358L 1,4**

116
D56A, N100A M32L, S92A S298A, K334A, K322A 1,2**

134
D56A, N100A M32L, S92A E356D, M358L, D265A 1,5**

135
D56A, N100A M32L, S92A E356D, M358L, D265A, K326W 0,95**

138
D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A 1,2**

139
D56A, N100A M32L, S92A S298A, E333A, K334A, K326A, E356N, M358L 1,1**

154
- - D265A 0,70**

155
- - S298A, K322A, K334A 0,70**

(**) Variantes que se midieron con 2H7.v16 como comparador; los valores de unión relativa se normalizaron a los de la quimera.

Para probar los efectos de las mutaciones de estabilidad sobre la velocidad de degradación de la proteína, se formularon 2H7.v16 y 2H7.v73 a los 12-14 mg/ml en histidina 10 mM, sacarosa al 6 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 5,8 y se incubaron a 40°C durante 16 días. A continuación, se evaluaron las muestras incubadas para determinar los

5 cambios en las variantes de carga mediante cromatografía de intercambio iónico, agregación y fragmentación mediante cromatografía de exclusión por tamaño, y unión relativa mediante un ensayo de tipo celular (WIL2-S).

Los resultados (Fig. 9) muestran que 2H7 v.73 tenía mayor estabilidad en comparación con 2H7v.16 con respecto a las pérdidas en la fracción del pico principal mediante cromatografía de intercambio iónico en condiciones de 10 estabilidad acelerada. No se observaron diferencias significativas con respecto a la agregación, fragmentación, o afinidad de unión.

Ejemplo 7

15 Análisis Scatchard de la unión de anticuerpo a CD20 en células WIL2-S

Se determinaron las constantes de disociación del equilibrio (Kd) para las variantes de IgG de 2H7 en unión a células WIL2-S usando IgG de 2H7 radiomarcada. Las variantes de IgG se produjeron en células CHO. Rituxan® (la fuente de todos los experimentos es Genentech, S. San Francisco, CA) y 2H7 de murino (BD PharMingen, San Diego, CA) 20 se usaron para comparación con las variantes humanizadas. El anticuerpo 2H7 de murino está también disponible de otras fuentes, por ejemplo, eBioscience, y Calbiochem (ambas de San Diego, CA), Accurate Chemical & Scientific Corp., (Westbury, NY), Ancell (Bayport, MN), y Vinci-Biochem (Vinci, Italia). Todas las diluciones se llevaron a cabo en un tampón de ensayo de la unión (medio DMEM conteniendo 1 % de albúmina de suero bovino, HEPES 25 mM pH 7,2 y azida de sodio al 0,01 %). Se dispensaron alícuotas (0,025 ml) de 125I-2H7.v16 (yodado con lactoperoxidasa) a una concentración de 0,8 nM a los pocillos de una placa de microensayo de 96 pocillos de fondo 5 en V, y se añadieron y mezclaron diluciones en serie (0,05 ml) de anticerpo frío. A continuación se añadieron células WEIL2-S (60.000 células en 0,025 ml). La placa se precintó y se incubó a temperatura ambiente durante 24 h, a continuación se centrifugó durante 15 min a 3500 RPM. A continuación se aspiró el sobrenadante y el aglomerado celular se lavó y centrifugó. El sobrenadante se aspiró de nuevo, y los aglomerados se disolvieron en NaOH 1 N y se transfirieron a tubos para el recuento gamma. Se utilizaron los datos para el análisis Scatchard (Munson y Rodbard,

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10 Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)) usando el programa Ligand (McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107114 (1983)). Los resultados, mostrados en la Tabla 9, indican que las variantes de 2H7 humanizadas tenían una afinidad de unión a CD20 similar en comparación a 2H7 de murino, y afinidad de unión similar a Rituxan®. Se espera que 2H7.v31 tendrá una Kd muy similar a v.16 sobre la base de la unión que se muestra en la Tabla 7 anterior.

15 Tabla 9. Afinidad de unión en el equilibrio de variantes de 2H7 según el análisis Scatchard

Variante de anticuerpo
Kd (nM) n

Rituxan
0,99±0,49 3

2H7 (murino)
1,23±0,29 3

2H7.v16
0,84±0,37 4

2H7.v73
1,22 60:39 4

2H7.v75
1,09±0,17 4

Ejemplo 8

20 Ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)

Se evaluaron variantes de IgG de 2H7 por su capacidad de mediar en la lisis dependiente del complemento de células WIL2-S, una línea de células B linfoblastoide que expresa CD20, esencialmente como se describe (Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184 (2000); Idusogie et al., J. Immunol. 166:2571-2575 (2001)). Los anticuerpos se 25 diluyeron en serie 1:3 a partir de una solución madre de 0,1 mg/ml. Se añadió una alícuota de 0,05 ml de cada dilución a una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contenía 0,05 ml de una solución del complemento humano normal (Quidel, San Diego, CA) A esta mezcla, se añadieron 50.000 células WIL2-S en un volumen de 0,05 ml. Tras la incubación durante 2 h a 37 ºC, se añadieron 0,05 ml de una solución de Alamar blue (Accumed International, Westlake, OH), y se continuó la incubación durante 18 h más a 37 ºC. A continuación se eliminaron las

30 tapas de las placas, y se agitaron durante 15 min a temperatura ambiente sobre un agitador orbital. Se leyeron las unidades de fluorescencia relativa (UFR) utizando un filtro de excitación a 530 nm y un filtro de emisión a 590 nm. Se calculó una CE50 ajustando las UFR como función de la concentración para cada anticuerpo utilizando el programa informático KaleidaGraph.

35 Los resultados (Tabla 10) muestran una sorprendente mejora en la CDC por los anticuerpos 2H7 humanizados, con una potencia relativa similar a Rituxan® para v.73, 3 veces más potente que Rituxan® para v.75 y 3 veces más débil que Rituxan® para v. 16.

Tabla 10. Actividad CDC de los anticuerpos 2H7 en comparación con Rituxan. Los números > 1 indican una 40 actividad de CDC menos potente que Rituxan® y los números <1 indican una actividad más potente que Rituxan®. Los anticuerpos se produjeron a partir de líneas CHO estables, salvo los indicados por (*). que se produjeron transitoriamente.

Variante de anticuerpo
n CE50(variante)/CE50(Rituxan)

Rituxan®
4 -1

2H7.v16
4 3,72; 4,08

2H7.v31*
4 2,21

2H7.v73
4 1,05

2H7.v75
4 0,33

2H7.v96*
4 0,956

2H7.v114*
4 0,378

2H7.v115*
4 0,475

2H7.v116*
1 >100

2H7.v135*
2 0,42

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Ejemplo 9

Ensayos de citotoxicidad dependiente del Anticuerpo (ADCC)

5 Se evaluaron variantes de IgG de 2H7 por su capacidad de mediar en la lisis de las células WIL2-S por los linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK), una línea de células B linfoblastoide que expresa CD20, esencialmente como se ha descrito (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)) usando una lectura de lactato deshidrogenasa (LDH). Los linfocitos NK se prepararon a partir de 100 ml de sangre heparinizada, diluida con 100 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato), obtenida de donantes humanos normales que se habían isotipado para FcγRIII, conocido también como CD16 (Koene et al., Blood 90:1109-1114 (1997)). En este experimento, los linfocitos NK eran de donantes humanos heterocigóticos para CD16 (F158/V158). La sangre diluida se distribuyó en capas sobre 15 ml de medio de separación de linfocitos (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) y se centrifugó durante 20 min a 2000 RPM. Los glóbulos blancos de la interfase entre capas se dispensaron a 4 tubos limpios de 50 ml, que se llenaron con medio RPMI que contenía suero de feto de ternera al 15 %. Los tubos se centrifugaron durante 5 min a

15 1400 RPM y se descartó el sobrenadante. Los aglomerados se volvieron a suspender en tampón MACS (BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM) y los linfocitos NK se purificaron usando perlas (kit de aislamiento de linfocitos NK, 130-046-502) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotech). Los linfocitos NK se diluyeron en tampón MACS a 2x106 células/ml.

Se añadieron las diluciones en serie de anticuerpo (0,05 ml) en medio de ensayo (F12/DMEM 50:50 sin glicina, tampón HEPES 1 mM pH 7,2, penicilina/estreptomicina (100 unidades/ml; Gibco), glutamina y suero de feto bovino inactivado térmicamente al 1 %) a una placa de cultivo de tejido de fondo redondo de 96 pocillos. Las células WIL2-S se diluyeron en tampón de ensayo hasta una concentración de 4 x 105 células/ml. Las células WIL2-S (0,05 ml por pocillo) se mezclaron con anticuerpo diluido en la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 30 min a temperatura

25 ambiente para permitir la unión del anticuerpo a CD20 (opsonización).

La reacción ADCC se inició añadiendo 0,1 ml de linfocitos NK a cada pocillo. En los pocillos del control, se añadió Triton X-100 al 2 %. A continuación se incubó la placa durante 4 h a 37 ºC. Se midieron los niveles de LDH liberada utilizando un kit de detección de la citotoxicidad (LDH) (kit n.º 1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se añadieron 0,1 ml del revelador de LDH a cada pocillo, seguido por mezclado durante 10s. A continuación se cubrió la placa con una hoja de aluminio y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación se leyó la densidad óptica a 490 nm que se usó para calcular el % de lisis dividiendo por la LDH total medida en los pocillos del control. La lisis se representó gráficamente en función de la concentración de anticuerpo, y se usó un ajuste de la curva de 4 parámetros (KaleidaGraph) para

35 determinar las concentraciones de la CE50.

Los resultados mostraron que los anticuerpos 2H7 humanizados fueron activos en la ADCC, con una potencia relativa 20 veces mayor que Rituxan® para v.31 y v.75, 5 veces más potente que Rituxan® para v.16,y casi 4 veces mayor que Rituxan® para v.73.

Tabla 11. Actividad ADCC de los anticuerpos 2H7 respecto a células WIL2-S en comparación con 2H7.v16, basándose en n experimentos. (Los valores >1 indican una potencia menor que 2H7.v16 y los valores <1 indican mayor potencia.)

Variante de anticuerpo
n CE50(variante)/CE50(2H7.v16)

Rituxan®
4 5,3

2H7.v16
5 1

2H7.v31
1 0,24

2H7.v73
5 1,4

2H7.v75
4 0,25

45 Se llevaron a cabo ensayos adicionales de ADCC para comparar las variantes combinadas de 2H7 con Rituxan®. Los resultados de estos ensayos indicaron que 2H7.v114 y 2H7.v115 tienen una potencia mejorada >10 veces en comparación con Rituxan® (Tabla 12).

Tabla 12. Actividad ADCC de los anticuerpos 2H7 respecto a células WIL2-S en comparación con Rituxan®, basándose en n experimentos (Los valores >1 indican una menor potencia que Rituxan®, y los valores <1 indican mayor potencia).

Variante de anticuerpo
CE50(variante)/CE50(Rituxan)

Rituxan®
2 -1

2H7 v.16
2 0,52

2H7 v.96
2 0,58

2H7.v114
2 0,093

2H7.v115
2 0,083

2H7.v116
2 0,30

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Ejemplo 10

Efectos in vivo de variantes 2H7 en un estudio piloto en macacos

5 Variantes de 2H7, producidas por transfección transitoria de células CHO, se sometieron a ensayo en macacos macho normales (Macaca fascicularis) a fin de evaluar sus actividadesin vivo. Otros anticuerpos dirigidos contra CD20, tales como C2B8 (Rituxan®) han demostrado capacidad de agotar las células B en primates normales (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)).

En un estudio, se compararon las variantes de 2H7 humanizadas. En un estudio paralelo, también se sometió a ensayo Rituxan® en macacos. Se usaron cuatro monos en cada uno de cinco grupos de dosis: (1) vehículo, (2) 0,05 mg/kg de hu2H7.v16, (3) 10 mg/kg de hu2H7.v16, (4) 0,05 mg/kg de hu2H7.v31, y (5) 10 mg/kg de hu2H7.v31. Se administraron los anticuerpos por vía intravenosa a una concentración de 0, 0,2 o 20 mg/ml, para un total de dos dosis, una en el día 1 del estudio y otra en el día 8. El primer día de la dosificación se designó día 1 y el día anterior

15 se designó día -1; el primer día de la recuperación (para 2 animales en cada grupo) se designo como día 11. Se extrajeron muestras de sangre en los días -19, -12, 1 (antes de la dosificación), y a las 6 h, 24 h y 72 h tras la primera dosis. Se tomaron muestras adicionales en el día 8 (antes de la dosificación), día 10 (antes del sacrificio de 2 animales/grupo), y en los días 36 y 67 (para los animales recuperados).

Se determinaron las concentraciones de células B periféricas mediante un método FACS que hizo el recuento de células CD3-/CD40+. Se obtuvieron los porcentajes de células B CD3-CD40+ de los linfocitos totales en muestras de mono mediante la siguiente estrategia de clasificación. Se marcó la población de linfocitos en el diagrama de dispersión del dispersor delantero/dispersor lateral para definir la Región 1 (R1). Utilizando los casos de R1, se trazaron las gráficas de puntos de la intensidad de la fluorescencia de los marcadores CD40 y CD3. Se usaron los

25 controles de los isotipos marcados fluorescentemente para determinar los respectivos puntos de corte para la positividad a CD40 y CD3.

Los resultados indicaron que 2H7.v16 y 2H7.v31 fueron capaces de producir el agotamiento total de las células B periféricas a la dosis de 10 mg/kg y el agotamiento parcial de las células B periféricas a la dosis de 0,05 mg/kg (Fig. 11). El curso temporal y la extensión del agotamiento de las células B medidos durante las primeras 72 h de la dosificación fueron similares para los dos anticuerpos. El posterior análisis de los animales en recuperación indicó que los animales tratados con 2H7.v31 mostraron un agotamiento prolongado de las células B en comparación con aquellos a los que se dosificó con 2H7.v16. En particular, los animales en recuperación tratados con 10 mg/kg de 2H7.v16, las células B mostraron una sustancial recuperación de células B en algún momento entre el muestreo del

35 Día 10 y del Día 36. Sin embargo, para los animales en recuperación tratados con 10 mg/kg de 2H7.v31, las células B no muestran recuperación hasta algún momento entre el Día 36 y el Día 67 (Fig. 11). Esto sugiere una mayor duración del agotamiento completo en aproximadamente un mes para 2H7.v31 en comparación a 2H7.v16.

No se observó toxicidad en el estudio de monos a una dosis baja o alta y la patología grosera fue normal. En otros estudios, v16 se toleró bien hasta la dosis más elevada evaluada (100mg/kgx2 = 1200 mg/m2x2) tras la administración i.v. de 2 dosis administradas con 2 semanas de separación es estos monos.

Los datos en los macacos con 2H7.v16 frente a Rituxan® sugieren que una reducción de 5 veces en la actividad de CDC no afecta adversamente la potencia. Un anticuerpo con una actividad ADCC potente pero con una actividad

45 CDC reducida puede tener un perfil de seguridad más favorable con respecto a las primeras reacciones de infusión que uno con mayor actividad de CDC.

Ejemplo 11

Anticuerpos variantes 2H7 deficientes en fucosa con función efectora potenciada

Células CHO y HEK293 normales añaden fucosa al oligosacárido IgG hasta un alto grado (97-98 %). la IgG sérica también queda fuertemente fucosilada.

55 DP12, una línea de células CHO dihidrofolato reductasa menos (DHFR-) que es competente para fucosilación, y Lec13, una línea celular que es deficiente en fucosilación de proteínas se usaron para producen los anticuerpos de este estudio. La línea de células CHO Pro-Lec13.6a (Lec13) se obtuvo de la Profesora Pamela Stanley del Albert Einstein College of Medicine de la Universidad de Yeshiva. Las líneas precursoras son Pro-(prolina auxótrofas) y Gat-(glicina, adenosina, timidina auxótrofas). La línea de células CHO-DP12 es un derivado de línea celular CHO-K1 (ATCC n.º CCL-61), que es deficiente en dihidrofolato reductasa, y tiene una menor necesidad de insulina. Las líneas celulares se transfectaron con ADNc utilizando el método Superfect (Qiagen, Valencia, CA). La selección de las células Lec13 que expresan los anticuerpos transfectados se realizó usando diclorhidrato de puromicina (Calbiochem, San Diego, CA) a 10 µg/ml en medio de crecimiento que contenía: medio MEM Alpha con L-glutamina, ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), suplementado con FBS al 10 %

65 inactivado (GIBCO), HEPES 10 mM, y 1X penicilina/estreptomicina (GIBCO). Las células CHO se seleccionaron de una forma análoga en medio de crecimiento que contiene F12 de Ham sin GHT: DMEM bajo en glucosa sin glicina

con NaHCO3 suplementado con FBS al 5 % (GIBCO), HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM, 1X GHT(glicina, hipoxantina, timidina), y 1X de penicilina/estreptomicina.

Las colonias se formaron durante dos o tres semanas y se combinaron para su expansión y expresión de proteínas.

5 Los combinados celulares se sembraron inicialmente a 3 x 106 células/placa de 10 cm para la expresión de proteínas en lotes pequeños. Las células se convirtieron en medio exento de suero una vez que crecieron al 90-95 % de confluencia y después de 3-5 días, los sobrenadantes de las células se recogieron y se sometieron a ensayo en un ELISA de IgG Fc y de IgG intacta para estimar los niveles de expresión de proteínas. Las células Lec13 y CHO se sembraron a aproximadamente 8 x 106 células/placa de 15 cm el día antes de pasar al medio de producción PS24, suplementado con 10 mg/l de insulina recombinante humana y 1 mg/l de elementos traza.

Las células Lec13 y las células DP12 permanecieron en medio de producción exento de suero durante 3-5 días. Los sobrenadantes se recogieron y se clarificaron mediante centrifugación en tubos cónicos de 150 ml para eliminar células y residuos. Se añadieron inhibidores de la proteasa PMSF y aprotinina (Sigma, St. Louis, MO) y los

15 sobrenadantes se concentraron 5 veces en células en agitación usando filtros MWCO30 (Amicon, Beverly, MA) antes de su purificación inmediata usando cromatografía con proteína G (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)). Todas las proteínas se intercambiaron con tampón en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando concentradores Centripriep-30 (Amicon) y se analizó por electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida. Las concentraciones de proteína se determinaron usando A280 y se verificaron usando análisis de la composición de aminoácidos.

Las células CHO se transfectaron con vectores que expresaban 2H7v16 y 2H7v.31 humanizados, y se seleccionan como se ha descrito. El anticuerpo 2H7v.16 retiene la región Fc natural, mientras que v.31 (véase el Ejemplo 5, Tabla 7 anterior) tiene una región Fc en la que se realizaron 3 cambios de aminoácidos (S298A, E333A, K334A) que

25 dan como resultado una mayor afinidad por el receptor de FcγRIIIa (Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (9):6591-6604 (2001)). Después de la transfección y la selección, las colonias individuales de células se aislaron y se evaluaron para determinar el nivel de la expresión de proteínas y los mayores productores se sometieron a selección con metotrexato para seleccionar las células que habían amplificado el número de copias del plásmido y que producían, por tanto, los niveles más altos del anticuerpo. Las células se hicieron crecer, se transfirieron a medio exento de suero durante un período de un 7 días, a continuación el medio se recogió, se cargó en una columna de proteína A, y el anticuerpo se eluyó usando las técnicas habituales. La concentración final del anticuerpo se determinó usando un Blisa que mide el anticuerpo intacto. Todas las proteínas se intercambiaron con tampón en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando concentradores Centripriep-30. (Amicon) y se analizaron por electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida.

35 Análisis mediante espectrometría de masas con desorción/ionización con láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDI-TOF) de los oligosacáridos unidos a asparagina: Los oligosacáridos unidos a N se liberaron de las glicoproteínas recombinantes mediante el procedimiento de Papac et al., Glycobiology 8,445-454 (1998). En resumen, los pocillos de una placa de microtitulación revestida con PVDF de 96 pocillos (Millipore, Bedford, MA) se acondicionaron con 100 µl de metanol que se pasó por las membranas de PVDF aplicando vacío al colector de vacío Millipore Multiscreen. Las membranas de PVDF acondicionadas se lavó con 3 X 250 µl de agua. Entre todas las etapas de lavado, los pocillos se drenaron completamente aplicando un suave vacío al colector. Las membranas se lavaron con tampón de reducción y carboximetilación (RCM) consistente en clorhidrato de guanidina 6 M, Tris 360 mM, EDTA 2 mM, pH 8,6. Las muestras de glicoproteína (50 µg) se aplicaron a los pocillos individuales, se volvieron

45 a hacer pasar por las membranas PVDF con un suave vacío y los pocillos se lavaron con 2 X 50 µl de tampón RCM. Las muestras inmovilizadas se redujeron añadiendo 50 µl de una solución de ditiotreitol (TdT) 0,1 M a cada pocillo e incubando la placa de microtitulación a 37°C durante 1 h. El DTT se eliminó al vacío, y los pocillos se lavaron con 4 x 250 µl de agua. Los restos cisteína se carboxilmetilaron mediante la adición de 50 µl de una solución de ácido yodoacético (IAA) 0,1 M que se preparó recientemente en NaOH 1 M y se diluyó hasta 0,1 M en tampón RCM. La carboximetilción se llevó a cabo mediante incubación durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se aplicó vacío a la placa para eliminar la solución de IAA y los pocillos se lavaron con 4 x 250 µl de agua purificada. Las membranas de PVDF se bloquearon mediante la adición de 100 µl de una solución de PVP360 (polivinilpirrolidona 360.000 MW) (Sigma) al 1 % e incubación durante 1 h a temperatura ambiente. La solución de PVP-360 se eliminó al vacío, y los pocillos se lavaron con 4 x 250 µl de agua. La solución de digestión PNGase F

55 (New England Biolabs, Beverly, MA), 25 µl de una solución de 25 Unidades/ml en Tris acetato 10 mM, pH 8,4, se añadió a cada pocillo, y la digestión continuó durante 3 h a 37°C. Tras la digestión, las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf de 500 µl y se añadieron a cada pocillo 2,5 µl de una solución de ácido acético 1,5 M. Las muestras acidificadas se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente para convertir los oligosacáridos de glicosilaminas a su forma de hidroxilo. Antes del análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF, los oligosacáridos liberados se desalaron usando un lecho de 0,7 ml de una resina de intercambio catiónico (resina AGSOW-X8 en forma de hidrógeno) (Bio-Rad, Hercules, CA) en suspensión compactada en tubos de reacción (US Biochemical, Cleveland, OH).

Para el análisis por espectrometría de masas de las muestras en el modo positivo, los oligosacáridos desalados

65 (alícuotas de 0,5 µl) se aplicaron a las dianas de acero inoxidable con 0,5 µl de la matriz de ácido 2,5dihidroxibenzoico (sDHB) que se preparó disolviendo 2 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzoico con 0,1 mg de ácido 5metoxisilicílico en 1 ml de etanol/cloruro sódico 10 mM 1:1 (v/v). La mezcla muestra/matriz se secó al vacío. Para el análisis en el modo negativo, los oligosacáridos unidos a N desalados (alícuotas de 0,5 µl) se aplicaron a la diana de acero inoxidable junto con 0,5 µl de matriz de 2’,4’,6’-trihidroxiacetofenona (THAP) preparada en acetonitrilo 3,3 mM en tampón citrato de amonio 1:3 (v/v). La mezcla muestra/matriz se secó al vacío y se dejó que absorbiera la

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5 humedad atmosférica antes del análisis. Los oligosacáridos liberados se analizaron mediante MALDI-TOF en un espectrómetro de masas PerSeptive BioSystems Voyager-DE. El espectrómetro de masas funcionó a 20 kV tanto en modo positivo como en modo negativo con la configuración lineal, y usando la extracción retardada. Los datos se adquirieron con una potencia láser de 1300 y en el modo de sumatorio de datos (240 barridos) para mejorar la relación entre señal y ruido. El instrumento se calibró usando una mezcla de patrones de oligosacáridos, y los datos se suavizaron usando el algoritmo de 19 puntos de Savitsky-Golay antes de asignar las masas. La integración de los datos de los espectros de masas se consiguió usando el paquete informático de análisis de datos Caesar 7.0 (SciBridge Software).

Ensayos de celular dependiente anticuerpo de linfocitos citolíticos naturales (NK).

15 Los ensayos ADCC se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 9. La proporción entre NK y célula diana (WIL2-S) fue 4 a 1, los ensayos se realizaron durante 4 horas, y la toxicidad se midió como antes usando el ensayo de la lactosa deshidrogenasa. Las células diana se opsonizaron con las concentraciones de anticuerpo indicadas para 30 min antes de la adición de linfocitos NK. El anticuerpo Rituxan® usado pertenecía a Genentech (S. San Francisco, CA). La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo ADCC representativo.

Los resultados muestran que los anticuerpos poco fucosilados median la destrucción de las células diana mediadas por los linfocitos NK de forma más eficaz de los que lo hacen los anticuerpos con un complemento completo de fucosa. El anticuerpo poco fucosilado, 2H7v.31, es el más eficaz para mediar en la destrucción de las células diana.

25 Este anticuerpo es eficaz a concentraciones más bajas y es capaz de mediar en la destrucción de un mayor porcentaje de células diana a mayores concentraciones de lo que lo hacen otros anticuerpos. La actividad de los anticuerpos es la siguiente: 2H7 v31 derivado de Lec13 > 2H7v16 derivado de Lec13 > 2H7v31 derivado de Dip12 > 2H7v16 derivado de Dip12 > o = a Rituxan. Las alteraciones en la proteína y los carbohidratos son aditivas. La comparación entre el carbohidrato encontrado en la IgG natural y la IgG producida en Lec13 y producida en CHO no mostró diferencias apreciables en la extensión de la galactosilación y, por tanto, los resultados se pueden atribuir solamente a la presencia o ausencia de fucosa.

Ejemplo 12

35 Anticuerpos variantes 2H7 deficientes en fucosa con ADCC potenciada in vivo

Este ejemplo describe la actividad ADCC in vivo de las variantes 2H7 humanizadas deficientes en fucosa incluyendo los v.16 y v.31 producidas en Lec13 comparados con sus homólogos fucosilados normales producidos en DP12, en ratones que expresan CD16 [FcRγIII] humano y CD20 humano.

Generación de ratones huCD20Tg+ huCD16Tg+ mCD16-/-

Se generaron ratones transgénicos con CD20 humano a partir de ADN BAC CD20 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los ratones se cribaron basándose en el análisis FACS de la expresión de CD20 humano. Los ratones HuCD20 Tg+ se

45 cruzaron a continuación con ratones huCD16Tg+mCD16-/-para generar ratones huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/-.

Tratamiento in vivo

De diez a 100 µg de cada una de las variantes 2H7 o Rituxan® se administraron a los ratones huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/-mediante inyecciones intraperitoneales. Se aplicaron cantidades iguales de anticuerpos emparejados por isotipo de una forma similar al grupo control negativo de los animales.

Preparación de los linfocitos de ratón

55 Los linfocitos de ratón procedentes de sangre completa, bazo, ganglios linfáticos y médula ósea se prepararon según el protocolo normalizado descrito en "Current Protocols in Immunology, editado por John Coligan, Ada Kruisbeek, David Margulies, Ethan Shevach y Warren Strober, 1994".

Análisis FACS

Medio millón de células se lavaron y se resuspendieron en 100 µl de tampón FACS, que es solución salina tamponada con fosfato con BSA al 1 %, que contiene 5 µl de anticuerpo de tinción o de control. Todos los anticuerpos de tinción, incluidos los controles de isotipo, se obtuvieron de PharMingen, San Diego, CA. La expresión de CD20 humano se evaluó mediante tinción con Rituxan® junto con el anticuerpo secundario dirigido contra IgG1 65 humana conjugado con FITC. El análisis FACS se realizó usando un FACScan y Cell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Todos los linfocitos se definieron mediante dispersión de luz hacia

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adelante y lateral, mientras que todos los linfocitos B se definen con la expresión de B220 sobre la superficie celular.

El agotamiento y la recuperación de las células B se evaluó analizando los recuentos de células B periféricas y el análisis de células B de hCD20+ B mediante FACS en el bazo, ganglios linfáticos y médula ósea diariamente 5 durante la primera semana después de la inyección y posteriormente de forma semanal. Se realizó un seguimiento de los niveles séricos del anticuerpo variante 2H7 inyectado.

Los resultados de este ensayo in vivo confirman los hallazgos in vitro de la actividad ADCC aumentada, y un mayor agotamiento de células be de las variantes 2H7 deficientes en fucosa en comparación con sus análogos de glicosilación natural (con respecto a la fucosilación).

Ejemplo 13

Actividad de apoptosis

15 Los anticuerpos dirigidos contra CD20 incluyendo Rituxan® han demostrado inducir apoptosis in vitro cuando se reticulan mediante un anticuerpo secundario o por medios químicos (Shan et al., Blood 9:1644-1652 (1998); Byrd et al., Blood 99:1038-43 (2002); Pederson et al., Blood 99:1314-19 (2002)). Cuando se reticulan químicamente, los dímeros 2H7 de murino indujeron apoptosis de células Daudi (Ghetie et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:7509-14 (1997)). La reticulación con una anticuerpo secundario también indujo la apoptosis con el anticuerpo murino 2H7 (Shan et al., 1998). Se cree que estas actividades son fisiológicamente relevantes porque varios mecanismos podría dar lugar a la reticulación de los anticuerpos dirigidos contra CD20 unidos al CD20 de la superficie celular in vivo.

RhuMAb 2H7.v16 [2H7 v16 humanizado; RhuMAb significa anticuerpo monoclonal humano recombinante] y

25  in vitro usando un anticuerpo secundario para reticulación. Células Ramos (CRL-1596, ATCC, Manassas, VA), una línea celular de linfocitos B humanos que expresan CD20, se usaron para medir la capacidad de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD20 rhuMAb 2H7.v16 y Rituximab frente a un anticuerpo de control negativo, Trastuzumab (Herceptin®, Genentech, South San Francisco, CA), para inducir la apoptosis medida por tinción con Anexina V y exclusión del colorante yoduro de propidio (Vybrant® Apoptosis Assay Kit, Molecular Probes, Seattle, WA). Las células Ramos se cultivaron en medio RPMI1640 (Gibco, Rockville, MD) que contenía suero de feto de ternera al 10 % (Biosource International, Camarillo, CA) y L-glutamina 2 mM (Gibco). Antes del ensayo, las células se lavaron dos veces en medio reciente y a continuación se ajustó a una concentración de células de 2 X 106 por ml. Las células (150 µl) se añadieron a placas de ensayo de 96 pocillos (Becton Dickinson, Palo Alto, CA) que contenían 150 µl de una cantidad predeterminada de IgG1 de control,

35 rhuMAb 2H7.v16, o Rituximab, junto con F(ab)’2 de cabra dirigido contra Fc humano (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Las concentraciones finales de IgG fueron 100, 10, 1,0, 0,1, 0,01 y 0,001 nM, y la concentración del F(ab)’2 de cabra dirigido contra Fc humano se ajustó a dos veces la concentración del anticuerpo de la muestra respectiva. Cada dilución se realizó por triplicado. Después de una incubación de 24 horas a 37°, las células se lavaron dos veces con PBS y a continuación se tiñeron con Anexina V y yoduro de propidio según las recomendaciones del fabricante. Los patrones de tinción de las células Ramos se analizaron mediante citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACscan (Becton Dickinson, San Jose, CA), y los datos se recogieron en periodos de 10 s. Los datos se redujeron usando el programa informático Cellquest Pro (Becton Dickinson). Las células Ramos con resultado positivo para (1) la tinción con Anexina V, (2) tinción doble con Anexina V y yoduro de propidio, y (3) el número de células vivas no teñidas, se contaron y se representaron gráficamente usando el programa

45 informático KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA).

Tanto rhuMAb 2H7.v16 como Rituximab indujeron apoptosis de las células Ramos cuando se reticularon con anticuerpo dirigido contra Fc humano y en comparación con el anticuerpo de control IgG1 irrelevante (Figuras 1315). La actividad apoptótica de (rhuMAb 2H7) fue ligeramente inferior a la de Rituximab. A concentraciones 10 nM de los anticuerpos reticulados rhuMAb 2H7, Rituximab, e IgG1 de control, las fracciones de células teñidas con Anexina V fueron 18,5, 16,5, 2,5 %, respectivamente, las fracciones de células con marca doble fueron de 29, 38, y 16 %, y el número de células vivas contadas durante 10 s fueron 5200, 3100 y 8600.

Estos datos in vitro demuestran que la apoptosis es un posible mecanismo para el agotamiento de células B in vivo.

55 La reticulación in vivo de rhuMAb 2H7 o Rituximab unido al CD20 de la superficial celular se puede producir a través de FcγR sobre las superficies de las células efectoras inmunitarias.

Ejemplo 14

Supresión in vivo del crecimiento tumoral

La capacidad de rhuMAb 2H7.v16 para inhibir el crecimiento de células B Raji humanas, una línea celular de linfoma (ATCC CCL 86), se evaluó en ratones Balb/c lampiños (atímicos). Las células Raji expresan CD20, y se ha notificado que crecen en ratones lampiños, produciendo enfermedad metastásica; el crecimiento tumoral se inhibe 65 mediante Rituxan® (Clynes et al., Nature Medicine 6,443-446 (2000)). Cincuenta y seis ratones lampiños Balb/c de 8-10 semanas de edad se dividieron en 7 grupos (A-G), consistiendo cada grupo en 8 ratones. El día 0, cada ratón

imagen49

recibió una inyección subcutánea de 5 x 106 células de linfoma B Raji en el costado. A partir del día 0, cada ratón recibió bien 100 ul de solución del control negativo (PBS; suero salino tamponado con fosfato), Rituxan® o 2H7.v16. La dosis dependió del peso, y la administración del fármaco fue por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Los ratones del grupo A recibieron PBS. Los grupos B-D recibieron Rituxan® a 5,0, mg/kg, 0,5 mg/kg, y 0,05 mg/kg

5 respectivamente. Los ratones de los grupos E-G recibieron 2H7 v.16 a 5,0 mg/kg, 0,5 mg/kg, y 0,05 mg/kg respectivamente. Las inyecciones se repitieron cada semana durante 6 semanas. En intervalos semanales durante el tratamiento, cada ratón se inspeccionó para determinar la presencia de tumores palpables en el lugar de la inyección y el volumen de los tumores, si había, se midió y se registró. Se realizó una inspección final en la semana 8 (después de un intervalo de dos semanas sin tratamientos).

Los resultados de este estudio mostraron que tanto rhuMAb 2H7.v16 como Rituxan® fueron eficaces para inhibir el crecimiento de tumores de células Raji subcutáneos en ratones lampiños (Figs. 16-18). Se observó crecimiento tumoral en el grupo del control de PBS a partir de las 4 semanas. Sin embargo, no se observó crecimiento en los grupos tratados con Rituxan® o 2H7.v16 a 5 mg/kg o 0,5 mg/kg en las 8 semanas de duración del estudio. En los

15 grupos de tratamiento con baja dosis de 0,05 mg/kg, se observaron tumores en un animal del grupo 2H7 y en un animal del grupo Rituxan® (Fig. 18).

Ejemplo 15

Clonación de CD20 de macaco y unión del anticuerpo

La secuencia de ADN de CD20 de macaco (Macaca fascicularis) se determinó tras el aislamiento del ADNc que codifica CD20 procedente de una biblioteca de ADNc de bazo de macaco. Un sistema de plásmido SUPERSCRIPT™ para la síntesis de ADNc y el clonación del plásmido (n.º de cat. 18248-013, Invitrogen, Carlsbad,

25 CA) se utilizó con ligeras modificaciones para construir la biblioteca. La biblioteca de ADNc se ligó en un vector PRK5e con sitios de restricción Xho I-y Not I. El aRNm se aisló del tejido del bazo ((California Regional Research Primate Center, Davis, CA). Los cebadores para amplificar el ADNc que codifica CD20 se diseñaron basándose en las secuencias no codificantes del CD20 humano. La región del extremo N del cebador 5’-AGTTTTGAGAG-CAAAATG-3’ y la región del extremo C del cebador 5’-AAGCTATGAACACTAATG-3’ se utilizaron para clonación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADNc que codifica el CD20 de macaco. La reacción de la PCR se llevó a cabo la PCR utilizando el Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity de acuerdo con la recomendación del fabricante (Gibco, Rockville, MD). El producto de la PCR se subclonó en el pCR ®2.1-TOPO ®Vector (Invitrogen) y se transformó en E. coli XL-1 blue (Stratagene. La Jolla, CA). El ADN plásmido que contiene los productos de la PCR ligados se aisló de los clones individuales y se secuenció.

35 La secuencia de aminoácidos de CD20 de macaco se muestra en la Figura 19. La Figura 20 muestra una comparación entre CD20 de macaco y humano. El CD20 de macaco tiene una similitud del 97,3 % con el CD20 humano, con 8 diferencias. El dominio extracelular contiene un cambio en V157A, mientras que los 7 restos restantes se pueden encontrar en las regiones transmembrana o citoplásmica.

Los anticuerpos dirigidos contra el CD20 humano se analizaron para determinar su capacidad para unirse y desplazar el 2H7 murino conjugado con FITC de su unión a las células de macaco que expresan CD20. Se extrajeron veintidós mililitros de sangre de 2 macacos (California Regional Research Primate Center, Davis, CA) en heparina sódica, y se enviaron directamente a Genentech Inc. El mismo día, las muestras de sangre se combinaron 45 y se diluyeron 1:1 mediante la adición de 40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). 20 ml de la sangre diluida se estratificó en 4 x 20 ml de Ficoll-Paque ™Plus (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) en tubos cónicos de 50 ml (n.º de cat. 352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ) y se centrifugaron a 1300 rpm durante 30 minutos a T.A: en una centrífuga Sorval 7. (Dupont, Newtown, CT). La capa de PBMC se aisló y se lacó en PBS. Los eritrocitos se lisaron en una solución de NaCl al 0,2 %, se restauraron a la isotonicidad con un volumen equivalente de una solución de NaCl 1,6 %, y se centrifugaron durante 10 minutos a 1000 rpm. El aglomerado de PBMC se resuspendió en RPMI 1640 (Gibco, Rockville, MD) que contenía suero de feto bovino al 5 % (FBS) y se dispensó en una placa de cultivo de tejido de 10 cm durante 1 hora a 37° C. Las poblaciones de células B y T no adherentes se eliminaron mediante aspiración, se centrifugaron y se contaron. Se recuperaron un total de 2,4 x 107 células. Las PBMC resuspendidas se distribuyeron en veinte tubos de cultivo de 12 x 75 mm (n.º de cat. 352053, Falcon), conteniendo

55 cada tubo 1 x 106 células en un volumen de 0,25 ml. Los tubos se dividieron en cuatro conjuntos de cinco tubos. A cada conjunto se añadió bien medio (RPMI1640; 5 % FBS), cantidades tituladas de anticuerpo de control IgG1 humano, Rituxan®, 2H7.v16, o 2H7.v31, La concentración final de cada anticuerpo fue de 30, 10, 3,3 y 1,1 nM. Además, cada tubo también recibió 20 ul de anticuerpo dirigido contra CD20 humano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (n.º Cat 555622, BD Biosciences, San Diego, CA). Las células se mezclaron suavemente, se incubaron durante 1 hora sobre hielo, y a continuación se lavaron dos veces en PBS frío. La tinción de la superficial celular se analizó con un Epic XL-MCL (Coulter, Miami, FL), se derivó la media geométrica, se representó gráficamente (KaleidaGraph™, Synergy Software, Reading, PA) frente a las concentraciones de los anticuerpos.

Los datos de la Figura 21 muestran que 2H7 v.I6 y 2H7 v.31 desplazaron de forma competitiva la unión de 2H7

65 murino-FTTG a células de macaco. Además, Rituxan® también desplazó la unión de 2H7 murino-FTTG, demostrando de esta manera que tanto 2H7 como Rituxan® se unen a un epítopo solapante en CD20. Además, los datos muestran que el valor de CI50 para 2H7 v.16, 2H7 v.31 y Rituxan son similares y están comprendidos en el intervalo de 4-6 nM.

imagen50

Ejemplo 16

5

Estudio en fase I/II de rhuMAb 2H7 (2H7.v16) en artritis reumatoide de moderada a grave

Sinopsis del protocolo

Estudio aleatorizado y controlado con placebo, multicéntrico, doblemente enmascarado, en fase I/II de la seguridad del aumento de la dosificación de PRO70769 (rhumab 2H7) en pacientes con artritis reumatoide de moderada a grave que recibieron dosis estables de metotrexato concomitante.

Objetivos

15 El objetivo principal de este estudio es evaluar y tolerabilidad del aumento de la dosificación intravenosa (IV) de PRO7076 (rhuMAb 2H7) en sujetos con artritis reumatoide de moderada a grave (AR).

Diseño del estudio

Se trata de un ensayo clínico aleatorizado, controlado con placebo, multicéntrico, en fase I/II, con enmascaramiento del investigador y del sujeto, acerca de la seguridad de dosis crecientes de PRO70769 combinado con MTX en sujetos con RA de moderada a grave. El estudio consiste en una fase de aumento de la dosis y una segunda fase con inscripción de un número mayor de sujetos. El Patrocinador permanece sin enmascarar con respecto a la asignación del tratamiento.

25 Se inscribirán sujetos con AR moderada a grave con fracaso en el tratamiento con entre uno y cinco fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad o sustancias biológicas quiénes tienen respuestas clínicas insatisfactorias al tratamiento con MTX.

Se pedirá a los sujetos que tomen MTX en el intervalo de 10-25 mg semanalmente durante al menos 12 semanas antes de iniciar el estudio, y que sigan con una dosis estable durante al menos 4 semanas tras recibir la dosis inicial del fármaco del estudio (PR070769 o placebo). Los sujetos también pueden recibir dosis estables de corticoesteroides orales (hasta un máximo de 10 mg diarios o equivalentes de prednisona) y dosis estables de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Los sujetos recibirán dos infusiones IV de PRO70769 o placebo 35 equivalente en la dosis indicada los Días 1 y 15 según el siguiente plan de aumento de la dosis (véase la Figura 22).

El aumento de dosis se produce de acurdo con criterios específicos (véanse las reglas de amento de dosis) y, tras la revisión de los datos de seguridad interna por una comité interno de revisión de datos de seguridad y la valoración de la toxicidad aguda 72 h después de la segunda infusión recibida por el último sujeto tratado en cada cohorte. Tras la fase de aumento de la dosis, 40 sujetos adicionales (32 para el principio activo y 8 para el placebo) se aleatorizarán en cada uno de los siguientes niveles de dosis: 2x50 mg, 2x200 mg, 2x500 mg, y 2x1000 mg, si se demuestra que los niveles de dosis se toleran durante la fase de aumento de la dosis. Se inscribirán en el estudio aproximadamente 205 sujetos.

45 Se obtendrán y registrarán los recuentos de células B (para valoraciones del estudio, véanse la Sección 4.5 y el Apéndice A-1). La campana de recuento se evaluará usando citometría de flujo durante un periodo de seguimiento de 48 semanas a partir del sexto mes de evaluación de la eficacia. La campana de agotamiento no se tendrá en cuenta en la toxicidad limitante de la dosis (DLC), sino en su lugar, el resultado farmacodinámico esperado del tratamiento con PRO7076.

En un subestudio opcional, se obtendrán de los sujetos sangre para análisis de suero y ARN, así como muestras de orina, en diferentes puntos temporales (véase la Sección 3.3.3). Dichas muestras se usarán para identificar biomarcadores que puedan ser predictivos de la respuesta del tratamiento con PRO70769 en sujetos con AR de moderada a grave.

55

Medidas de resultados

La medida de resultado principal de este estudio es la seguridad y la tolerabilidad de PRO70769 en sujetos con AR de moderada a grave.

Tratamiento del estudio

Las cohortes recibirán dos infusiones IV de PRO70769 o placebo equivalente en la dosis indicada los Días 1 y 15 según el siguiente plan de aumento de la dosis:

65 -10 mg de PRO70769 o placebo equivalente: 4 sujetos con el principio activo, 1 control

-50 mg de PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con el principio activo, 2 control -200 mg de PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con el principio activo, 2 control -500 mg de PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con el principio activo, 2 control -1000 mg de PRO70769 o placebo equivalente: 8 sujetos con el principio activo, 2 control

5 Eficacia

La eficacia de PRO70769 se medirá según las respuestas ACR. El porcentaje de sujetos que consigue una respuesta ACR20, ACR50, y ACR70 se resumirá por grupo de tratamiento y se generarán los intervalos de confianza del 95 % para cada grupo. Los componentes de esta respuesta y su variación respecto del valor inicial se resumirán por tratamiento y visita.

Conclusión

15 Los datos anteriores demostraron el éxito en la producción de anticuerpos de unión a CD20 humanizados, en particular de variantes de anticuerpos 2H7 humanizados, que mantuvieron e incluso mejoraron sus propiedades biológicas. Los anticuerpos 2H7 humanizados de la invención se unen a CD20 con afinidades similares al donante murino y los anticuerpos 2H7 quiméricos, y fueron eficaces para la eliminación de las células B en primates, conduciendo al agotamiento de las células B. Algunas variantes mostraron una actividad ADCC mejorada respecto a un anticuerpo quimérico dirigido contra CD20 actualmente utilizado para tratar el LNH, favoreciendo el uso de dosis más bajas de los anticuerpos terapéuticos en los pacientes. Además, aunque puede ser necesario que un anticuerpo quimérico que tiene restos FR de murino se administre a una dosis eficaz para conseguir un agotamiento completo de las células B para derivar una respuesta de los anticuerpos frente al mismo, los presentes anticuerpos humanizados se pueden administrar a dosis que consiguen un agotamiento parcial o completo de las células B, y

25 para diferentes duraciones de tiempo, según se desee para la enfermedad y el paciente en particular. Además, estos anticuerpos demostraron estabilidad en solución. Estas propiedades de los anticuerpos 2H7 humanizados son perfectas para su uso como agente inmunoterapéutico en el tratamiento de cánceres positivos para CD20 y enfermedades autoinmunitarias; no se espera que estos anticuerpos sean inmunógenos o que sean al menos de inmunogenicidad menor que los anticuerpos dirigidos contra CD20 totalmente murinos o quiméricos en pacientes humanos.

Referencias

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología

35 molecular y similares, que se encuentran dentro de las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican ampliamente en la bibliografía. Véanse por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 actualizado); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukarvotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu et al. eds., Academic Press 1995); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed, Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J.

45 Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2ª Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Wirth M. y Hauser H. (1993); Immunochemistry in Practice, 3ª edición, A. Johnstone y R. Thorpe, Blackwell Science, Cambridge, MA, 1996; Techniques in Immunocytochemistry, (G. Bullock y P. Petrusz eds., Academic Press 1982,1983,1985,1989); Handbook of Experimental Immunology, (D. Weir y C. Blackwell, eds.); Current Protocols in Immunology (J. Coligan et al. eds. 1991); Immunoassay (E. P. Diamandis & T.K Christopoulos, eds., Academic Press, Inc., 1996); Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed) Academic Press, Nueva York; Ed Harlow y David Lane, Antibodies A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988; Antibody Engineering, 2ª edición (C. Borrebaeck, ed., Oxford University Press, 1995); y la serie Annual Review of Immunology; la serie Advances in Immunology.

55 Tambiés se divulga en el presente documento:

1.
Un anticuerpo humanizado que se une a CD20 humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo es eficaz para agotar las células B de primate in vivo, comprendiendo el anticuerpo la región variable de la cadena H. (VH) al menos una secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO. 12 procedente de un anticuerpo dirigido contra CD20 humano y prácticamente los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo III de la cadena pesada humana (VHIII).

2.
El anticuerpo de 1, que comprende además la secuencia de la CDR1 de la cadena H de la SEQ ID NO. 10 y la secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO. 11.

65 3. El anticuerpo de 2, que comprende además la secuencia de la CDR1 de la cadena L de la SEQ ID NO. 4, la secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO. 5, la secuencia de la CDR3 de la SEQ ID NO. 6 y prácticamente los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo I de la cadena ligera humana k I (VκI).

imagen51

4. El anticuerpo de las reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia VH de la SEQ ID NO.8 (v16, como se muestra en la Fig.1B).

. El anticuerpo de 4, además que comprende la secuencia VL de la SEQ ID NO.2 (v16, como se muestra en la 5 Fig.1A).

6.
El anticuerpo de 3, en el que la región VH está unida a una región constante de la cadena de IgG humana.

7.
El anticuerpo de 6, en el que la IgG humana es IgG1 o IgG3.

8.
El anticuerpo de 1, en el que el anticuerpo es 2H7.v16, que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO. 21 y 22, respectivamente, [como se muestra en la Fig. 6 y la Fig. 7.]

9.
El anticuerpo de 1, en el que el anticuerpo es 2H7.v31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO. 2 y 23, respectivamente, [como se muestra en la Fig. 6 y en la Fig. 8].

. El anticuerpo de 5, pero con las sustituciones de aminoácidos D56A y N100a en la cadena H y S92A en la cadena L. [v.96]

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una 15 sustitución de aminoácido en la región Fc que mejora la actividad ADCC y/o CDC.

12.
El anticuerpo de 11, en el que las sustituciones de aminoácidos son S298A/E333A/K334A.

13.
El anticuerpo de 12, en el que el anticuerpo es 2H7.v31 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de la SEQ LID NO. 23 [como se muestra en la Fig. 8].

14.
El anticuerpo de cualquiera de 1-10, que comprende además al menos una sustitución de aminoácido en la

región Fc que disminuye la actividad CDC. . El anticuerpo de cualquiera de 14, que comprende al menos la sustitución K322A.

16. El anticuerpo de 1-10 el que el anticuerpo es 2H7.v114 o 2H7.v115 que tiene una actividad ADCC mejorada al menos 10 veces en comparación con Rituxan.

17. El anticuerpo de 1 en el que las células B de primate proceden de ser humano y de macaco. 25 18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado con un agente citotóxico.

19. El anticuerpo de 18 en el que el agente citotóxico es un isótopo radioactivo o una toxina.

. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se produce en células CHO.

21.
Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

22.
Un vector de expresión que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

23.
Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de 21.

24.
La célula hospedadora de 23 que produce el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores. . La célula hospedadora de 24 que es una célula CHO.

26. Un método para producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende 35 cultivar la célula que produce el anticuerpo de 24 y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.

27.
Una composición que comprende el anticuerpo de 1 y un transportador.

28.
La composición de 27 en la que el anticuerpo es 2H7.v16 y el transportador es un transportador farmacéuticamente aceptable.

29.
Un artículo de fabricación que comprende un envase y una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

. El artículo de fabricación de 29, que comprende además un prospecto que indica que la composición se puede usar para tratar el linfoma no Hodgkins.

31. Un método para inducir apoptosis en células B in vivo, que comprende poner en contacto las células B con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, destruyendo de esta forma las células B.

45 32. Un método para tratar un cáncer positivo para CD20, que comprende administrar a un paciente que padece el cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de unión a CD20 humanizado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

33.
El método de 32 en el que el cáncer positivo para CD20 es un linfoma de células B o una leucemia.

34.
El método de 33 en el que el cáncer positivo para CD20 es un linfoma de células no de Hodgkin (LNH) o una

enfermedad de Hodgkin con predominancia de linfocitos (LPHD). . El método de 32, en el que el cáncer es una leucemia linfocítica crónica o SLL.

36. El método de 34 o 35, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en 2H7.v16, v31.v96, v114, v115 que tienen las correspondientes secuencias de aminoácidos que se muestran en las figuras y en las tablas.

55 37. El método de 34 o 35 el anticuerpo es 2H7.v16 que tiene la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y pesada de la SEQ ID NO. 21 y 22, respectivamente, como se muestra en la Fig. 6 y la Fig. 7.

38.
El método de la reivindicación 33, en el que el anticuerpo se administra en un intervalo de dosificación de aproximadamente 275-375 mg/m2

39.
El método de la reivindicación 32, que comprende además administrar al paciente al menos un agente quimioterapéutico.

. El método de la reivindicación 39, en el que el cáncer es un linfoma no de Hodgkin (LNH), y el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona.

41. Un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria, que comprende administrar a un paciente que

65 padece la enfermedad autoinmunitaria, una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de unión a CD20 humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

Claims (22)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo humanizado que se une a CD20 humano, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es eficaz para agotar las células B de primate in vivo, opcionalmente en donde las células B de primate son humanas, comprendiendo el anticuerpo (a) una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia CDR1 de la SEQ ID NO.10, la secuencia CDR2 de la SEQ ID NO.11 y la secuencia de la CDR3 de la SEC ID NO. 12, y los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo III de la cadena pesada humana (VHIII), en donde la región variable de la cadena pesada comprende además las sustituciones de aminoácidos R71V, N73K y A49G, y (b) una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia CDR1 de la SEQ ID NO. 4, la secuencia de la CDR2 de la SEQ ID NO. 5, la secuencia de la CDR3 de la SEC ID NO. 6 y los restos del marco de consenso (FR) humano del subgrupo I de la cadena ligera humana K del subgrupo I (VκI), en donde la región variable de la cadena ligera comprende además la sustitución de aminoácidos L46P.
  2. 2.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de VH de SEQ ID NO.8.
  3. 3.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, que comprende además la secuencia VL de SEQ ID NO.2.
  4. 4.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la región VH se une a una región constante de la cadena de IgG humana, opcionalmente en la que la IgG humana es IgG1 o IgG3.
  5. 5.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 3, pero con las sustituciones de aminoácidos D56A y N100A en la cadena H y S92A en la cadena L.
  6. 6.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprenden además una región Fc, en donde dicha región Fc comprende al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que mejora la actividad ADCC y/o CDC, de manera opcional en donde las sustituciones de aminoácidos son S298A/E333A/K334A; o que comprende además al menos una sustitución de aminoácido en la región Fc que disminuye la actividad CDC, de manera opcional que comprende al menos la sustitución K322A.
  7. 7.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores conjugado con un agente citotóxico, de manera opcional en donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo o una toxina.
  8. 8.
    Un ácido nucleico aislado o un vector de expresión que codifican el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  9. 9.
    Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 8, o vectores de expresión que codifican el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno, opcionalmente en donde la célula hospedadora produce el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno y, de manera opcional, en donde la célula hospedadora es una célula CHO.
  10. 10.
    Un método para producir el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende cultivar la célula que produce el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9 y recuperar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno.
  11. 11.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente a un paciente que padece la enfermedad autoinmunitaria, de manera opcional en donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona entre el grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (LSE), enfermedad de Wegener, enfermedad inflamatoria del intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmunitaria, psoriasis, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.
  12. 12.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno para el uso de la reivindicación 11, en donde la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis múltiple.
  13. 13.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7 para su uso en un método de agotamiento de las células B in vivo, comprendiendo el método poner en contacto las células B con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, agotando de esta forma las células B.
  14. 14.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7 para su uso en el tratamiento de un cáncer positivo para CD20, que comprende administrar una cantidad
    97
    imagen2
    terapéuticamente eficaz del agente a un paciente que padece el cáncer, de manera opcional en donde el cáncer positivo para CD20 es un linfoma de células B, leucemia, linfoma no de Hodgkin (LNH), enfermedad de Hodgkin predominante de linfocitos (LPHD), leucemia linfocítica crónica o SLL.
  15. 15.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno para el uso de la reivindicación 14, en donde el cáncer positivo para CD20 es un linfoma de linfocitos B o una leucemia, y el anticuerpo se administra en un intervalo de dosificación de aproximadamente 275-375 mg/m2.
  16. 16.
    El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno para el uso de la reivindicación 14, comprendiendo el método además administrar al paciente al menos un agente quimioterapéutico, de manera opcional en donde el cáncer es un linfoma no de Hodgkin (LNH) y el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona.
  17. 17.
    Uso del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para usar en un método de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente a un paciente que padece la enfermedad autoinmunitaria, de manera opcional en donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona entre el grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus sistémico eritematoso (LSE), enfermedad de Wegener, enfermedad inflamatoria del intestino, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), trombocitopenia autoinmunitaria, psoriasis, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, miastenia gravis, vasculitis, diabetes mellitus, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjorgen y glomerulonefritis.
  18. 18.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis múltiple.
  19. 19.
    Uso del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para agotar las células B in vivo, comprendiendo el método poner en contacto las células B con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, agotando de esta forma las células
    B.
  20. 20.
    Uso del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7 en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer positivo para CD20, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del agente a un paciente que padece el cáncer, de manera opcional en donde el cáncer positivo para CD20 es un linfoma de células B o leucemia, de manera opcional en donde el cáncer positivo para CD20 es un linfoma no de Hodgkin (LNH) o una enfermedad de Hodgkin con predominancia de linfocitos (LPHD) y de manera opcional en donde el cáncer es una leucemia linfocítica crónica o SLL.
  21. 21.
    Uso del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno para el uso de la reivindicación 20, en donde el cáncer positivo para CD20 es un linfoma de linfocitos B o una leucemia y el anticuerpo se administra en un intervalo de dosificación de aproximadamente 275-375 mg/m2.
  22. 22.
    Uso del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno para el uso de la reivindicación 21, comprendiendo el método además administrar al paciente al menos un agente quimioterapéutico, de manera opcional en donde el cáncer es un linfoma no de Hodgkin (LNH) y el agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo que consiste en doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y prednisolona.
    98
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Families Citing this family (424)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
KR20080038453A (ko) 1998-08-11 2008-05-06 바이오겐 아이덱 인크. B-세포 림프종을 치료하기 위한 항-cd20 항체를포함하는 약제
CN1679934B (zh) 1998-11-09 2012-09-05 生物基因Idec公司 使用抗cd20嵌合抗体治疗循环肿瘤细胞相关的血液恶性肿瘤
DE69941903D1 (de) * 1998-11-09 2010-02-25 Biogen Idec Inc Behandlung von patienten die eine knochenmarktransplantation oder eine transplantation peripherer blutstammzellen erhalten mit anti-cd20 antikörpern
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000067796A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to b cell surface markers
EP1216056A1 (en) * 1999-07-12 2002-06-26 Genentech Inc. Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US20020058029A1 (en) * 2000-09-18 2002-05-16 Nabil Hanna Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using B cell depleting/immunoregulatory antibody combination
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE60232265D1 (de) * 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
WO2003089614A3 (en) * 2002-04-18 2004-02-26 Genencor Int Production of functional antibodies in filamentous fungi
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
WO2006085967A3 (en) * 2004-07-09 2007-02-15 Bassil I Dahiyat OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
DK1931709T3 (da) 2005-10-03 2017-03-13 Xencor Inc Fc-varianter med optimerede fc-receptorbindingsegenskaber
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
ES2633311T3 (es) 2002-12-16 2017-09-20 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas
RU2358762C9 (ru) * 2003-04-09 2016-10-10 Джинентех, Инк. Лечение аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа
DK1631313T3 (en) * 2003-06-05 2015-06-15 Genentech Inc Combination therapy for b cell disorders
WO2005044859A3 (en) 2003-11-05 2005-08-04 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
WO2005063815A3 (en) * 2003-11-12 2006-03-16 Biogen Idec Inc Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
CA2568336A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-22 Genentech, Inc. Method for treating lupus
CN1993143A (zh) 2004-06-04 2007-07-04 健泰科生物技术公司 用于治疗多发性硬化的方法
JP2008504289A (ja) * 2004-06-25 2008-02-14 メディミューン,インコーポレーテッド 部位特異的突然変異誘発による哺乳動物細胞における組換え抗体の産生の増加
US20060062787A1 (en) * 2004-07-22 2006-03-23 Genentech, Inc. Method for treating Sjogren's syndrome
EP1776384B1 (en) 2004-08-04 2013-06-05 Mentrik Biotech, LLC Variant fc regions
CN101052654A (zh) * 2004-08-19 2007-10-10 健泰科生物技术公司 具有改变的效应子功能的多肽变体
US20060110387A1 (en) * 2004-10-05 2006-05-25 Genentech, Inc. Method for treating vasculitis
CA2582919A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 Wyeth Immunotherapy of autoimmune disorders
JP5025482B2 (ja) * 2004-10-20 2012-09-12 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗体製剤
CA2587617C (en) 2004-11-12 2011-02-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
ES2557587T3 (es) 2004-12-28 2016-01-27 Innate Pharma Anticuerpos monoclonales contra NKG2A
US20060188495A1 (en) * 2005-01-13 2006-08-24 Genentech, Inc. Treatment method
CA2595792A1 (en) * 2005-02-07 2006-08-10 Genentech, Inc. Cd20 antibody variants and uses thereof
WO2006093923A8 (en) * 2005-02-28 2007-09-07 Genentech Inc Treatment of bone disorders
RU2007142188A (ru) * 2005-04-15 2009-05-20 Дженентек, Инк. (Us) Способ лечения воспалительного заболевания кишечника (взк) анти-cd-20 антителом
US20090215639A1 (en) * 2005-04-26 2009-08-27 Bioren, Inc. Method of Producing Human IgG Antibodies with Enhanced Effector Functions
EP1891113A2 (en) * 2005-06-02 2008-02-27 AstraZeneca AB Antibodies directed to cd20 and uses thereof
WO2007019618A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-22 Garvan Institute Of Medical Research Phrophylactic and/or therapeutic method for treatment of autoimmune disease
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP4860703B2 (ja) 2005-10-06 2012-01-25 ゼンコー・インコーポレイテッドXencor、 Inc. 最適化された抗cd30抗体
EP1940881B1 (en) * 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP1951304B1 (en) * 2005-11-15 2014-10-22 F. Hoffmann-La Roche AG Method for treating joint damage
ES2618543T3 (es) 2005-11-23 2017-06-21 Genentech, Inc. Métodos y composiciones relacionados con ensayos de linfocitos B
EP2623516B1 (en) 2005-12-02 2015-07-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to il-22 and il-22r
US8101365B2 (en) 2006-01-05 2012-01-24 Genentech, Inc. Anti-EphB4 antibodies and methods using same
WO2007127506A8 (en) 2006-01-20 2008-08-28 Genentech Inc Anti-ephrinb2 antibodies and methods using same
EP1994056B1 (en) 2006-03-16 2014-05-07 Genentech, Inc. Antibodies to egfl7 and methods for their use
ES2543475T3 (es) 2006-05-30 2015-08-19 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD22, sus inmunoconjugados y usos de los mismos
CA2654000A1 (en) 2006-06-06 2008-05-22 Genentech, Inc. Anti-dll4 antibodies and methods using same
FR2902799B1 (fr) 2006-06-27 2012-10-26 Millipore Corp Procede et unite de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide
JP5829004B2 (ja) 2006-06-30 2015-12-09 ノボ・ノルデイスク・エー/エス 抗nkg2a抗体とその使用
US20130004480A1 (en) 2006-07-04 2013-01-03 Paul Parren CD20 Binding Molecules for the Treatment of Copd
WO2008008482A3 (en) * 2006-07-13 2008-06-19 Genentech Inc Altered br3-binding polypeptides
JP2009543579A (ja) 2006-07-19 2009-12-10 ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア 抗炎症反応のための標的としてのWSX−1/p28
EP2059536B1 (en) 2006-08-14 2014-01-08 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target cd19
WO2008034076A3 (en) * 2006-09-15 2009-01-08 Richard F Ambinder Cyclophosphamide in combination with immune therapeutics
CA2660795C (en) 2006-09-18 2014-11-18 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
RU2486201C2 (ru) 2006-10-12 2013-06-27 Дженентек, Инк. Антитела к лимфотоксину-альфа
EP2845866B1 (en) 2006-10-27 2017-05-03 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
EP2662091A3 (en) * 2006-12-01 2014-03-12 Selexys Pharmaceuticals Corporation Anti-P-selectin antibodies and methods of using the same to treat inflammatory diseases
US8362217B2 (en) 2006-12-21 2013-01-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
US8569464B2 (en) 2006-12-21 2013-10-29 Emd Millipore Corporation Purification of proteins
KR101431856B1 (ko) 2007-01-22 2014-08-27 제넨테크, 인크. 항체의 고분자전해질 침전 및 정제
CN101652389A (zh) 2007-02-09 2010-02-17 健泰科生物技术公司 抗robo4抗体及其用途
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
RU2476443C2 (ru) 2007-06-04 2013-02-27 Дженентек, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ NRR Notch1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP2158315B1 (en) * 2007-06-25 2016-03-23 ESBATech, an Alcon Biomedical Research Unit LLC Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties
CA2704064A1 (en) 2007-09-13 2009-03-29 University Of Zurich Humanized antibodies against the .beta.-amyloid peptide
GB0718684D0 (en) * 2007-09-24 2007-10-31 Roche Products Ltd Treatment method
US20090098118A1 (en) 2007-10-15 2009-04-16 Thomas Friess Combination therapy of a type ii anti-cd20 antibody with an anti-bcl-2 active agent
EP2211903A4 (en) * 2007-10-17 2011-07-06 Nuvelo Inc Antibodes to cll-1
ES2533266T3 (es) 2007-10-30 2015-04-08 Genentech, Inc. Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de intercambio catiónico
KR20100100914A (ko) 2007-11-30 2010-09-15 제넨테크, 인크. 항―vegf 항체
CN101952317B (zh) * 2008-01-24 2015-07-22 诺沃-诺迪斯克有限公司 人化抗-人nkg2a单克隆抗体
US8333966B2 (en) 2008-04-11 2012-12-18 Emergent Product Development Seattle, Llc CD37 immunotherapeutics and uses thereof
CN102076355B (zh) * 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US9109026B2 (en) * 2008-06-03 2015-08-18 Abbvie, Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
US9035027B2 (en) * 2008-06-03 2015-05-19 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2009151514A1 (en) 2008-06-11 2009-12-17 Millipore Corporation Stirred tank bioreactor
EP2321422A4 (en) * 2008-07-08 2013-06-19 Abbvie Inc Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2010019148A1 (en) 2008-08-14 2010-02-18 Genentech, Inc. Methods for removing a contaminant using indigenous protein displacement ion exchange membrane chromatography
WO2010030670A3 (en) 2008-09-10 2010-05-06 Genentech, Inc. Compositions and methods for the prevention of oxidative degradation of proteins
WO2010033587A3 (en) 2008-09-16 2010-09-16 Genentech, Inc. Methods for treating progressive multiple sclerosis
EP2352521A1 (en) * 2008-10-14 2011-08-10 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CA2742990A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Genentech, Inc. Method and formulation for reducing aggregation of a macromolecule under physiological conditions
CN102307993B (zh) 2008-12-09 2014-06-25 哈洛齐梅公司 延长的可溶性ph20多肽及其用途
JP2012511929A (ja) 2008-12-16 2012-05-31 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン 攪拌タンク反応器及び方法
EP2376117A1 (en) 2008-12-17 2011-10-19 Genentech, Inc. Hepatitis c virus combination therapy
WO2010075249A3 (en) 2008-12-22 2010-10-07 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CN102264759B (zh) 2008-12-23 2016-05-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 与蛋白a的结合改变的免疫球蛋白变体
CN102439163A (zh) * 2009-02-16 2012-05-02 拜奥雷克斯治疗公司 人源化抗cd20抗体及使用方法
CN102333548B (zh) 2009-02-27 2013-01-30 健泰科生物技术公司 用于蛋白质标记的方法和组合物
RU2504553C2 (ru) 2009-03-20 2014-01-20 Дженентек, Инк. Антитела к her
WO2010111254A9 (en) 2009-03-25 2010-12-02 Genentech, Inc. NOVEL ANTI-α5β1 ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR101822663B1 (ko) 2009-03-25 2018-01-29 제넨테크, 인크. 항-fgfr3 항체 및 그의 사용 방법
US20100247484A1 (en) 2009-03-31 2010-09-30 Heinrich Barchet Combination therapy of an afucosylated antibody and one or more of the cytokines gm csf, m csf and/or il3
WO2010129609A3 (en) * 2009-05-07 2011-03-03 The Regents Of The University Of California Antibodies and methods of use thereof
EP2430153A4 (en) * 2009-05-13 2013-02-27 Gliknik Inc Methods of using immunoglobulin aggregates
EP2435476A4 (en) * 2009-05-27 2013-04-17 Synageva Biopharma Corp Avian derived antibodies
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
KR20120047274A (ko) * 2009-07-29 2012-05-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
ES2513292T3 (es) 2009-07-31 2014-10-24 Genentech, Inc. Inhibición de metástasis tumoral usando anticuerpos anti-G-CSF
CA2769595A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with fludarabine and/or mitoxantrone
CA2769674C (en) 2009-08-14 2018-01-23 Roche Glycart Ag Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with bendamustine
KR20120060877A (ko) * 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2011028950A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
CN107385034A (zh) 2009-09-03 2017-11-24 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于治疗、诊断和监控类风湿性关节炎的方法
KR101782195B1 (ko) 2009-09-11 2017-09-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20 항체를 포함하는 고농축 약제
EP3009455A1 (en) 2009-09-16 2016-04-20 Immunomedics Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
DK2477603T3 (en) 2009-09-17 2016-06-13 Baxalta Inc STABLE CO-DEVELOPMENT OF hyaluronidase and Immunoglobulin, AND METHODS OF USE THEREOF
CN102666875A (zh) * 2009-10-15 2012-09-12 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
JP5814925B2 (ja) 2009-10-22 2015-11-17 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗ヘプシン抗体及びその使用方法
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056494A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations
CN102770451A (zh) 2009-10-28 2012-11-07 雅培制药有限公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2011056997A1 (en) 2009-11-04 2011-05-12 Fabrus Llc Methods for affinity maturation-based antibody optimization
WO2011057120A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Genentech, Inc. Methods and composition for secretion of heterologous polypeptides
KR101802260B1 (ko) 2009-11-30 2017-11-28 바이오테스트 아게 전신 홍반성 낭창을 치료하기 위한 인간화된 항-il-10 항체
JP2013512674A (ja) 2009-12-02 2013-04-18 アクセルロン ファーマ, インコーポレイテッド Fc融合タンパク質の血清半減期を増加させるための組成物および方法
JP5818805B2 (ja) 2009-12-11 2015-11-18 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗vegf−c抗体及びその使用方法
ES2585350T3 (es) 2009-12-23 2016-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti Bv8 y usos de los mismos
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
WO2011100403A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Immunogen, Inc Cd20 antibodies and uses thereof
US20110200595A1 (en) 2010-02-18 2011-08-18 Roche Glycart TREATMENT WITH A HUMANIZED IgG CLASS ANTI EGFR ANTIBODY AND AN ANTIBODY AGAINST INSULIN LIKE GROWTH FACTOR 1 RECEPTOR
DK2536748T3 (da) 2010-02-18 2014-10-13 Genentech Inc Neuregulin-antagonister og anvendelse deraf ved behandling af kræft
CA2792125A1 (en) 2010-03-22 2011-09-29 Genentech, Inc. Compositions and methods useful for stabilizing protein-containing formulations
US8846041B2 (en) 2010-03-24 2014-09-30 Genentech, Inc. Anti-LRP6 antibodies
JP6042801B2 (ja) 2010-04-27 2016-12-14 ロシュ グリクアート アーゲー mTORインヒビターとのアフコシル化CD20抗体の併用療法
CA2794864A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Genentech, Inc. Compositions and methods useful for reducing the viscosity of protein-containing formulations
US9403855B2 (en) 2010-05-10 2016-08-02 Academia Sinica Zanamivir phosphonate congeners with anti-influenza activity and determining oseltamivir susceptibility of influenza viruses
RU2615173C2 (ru) 2010-05-14 2017-04-04 Эббви Инк. Связывающие il-1 белки
KR101551295B1 (ko) 2010-05-17 2015-09-08 이엠디 밀리포어 코포레이션 생체분자 정제용 자극 반응성 중합체
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
JP6048973B2 (ja) 2010-06-03 2016-12-27 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗体及びイムノコンジュゲートのイムノpetイメージング及びこれらの使用方法
EP3098240A3 (en) 2010-06-18 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-axl antibodies and methods of use
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
CN103068367B (zh) 2010-06-24 2016-09-07 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于稳定含有蛋白质的制剂的含有烷基糖苷的组合物和方法
EP2591004A1 (en) 2010-07-09 2013-05-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-neuropilin antibodies and methods of use
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
JP5953303B2 (ja) 2010-07-29 2016-07-20 ゼンコア インコーポレイテッド 改変された等電点を有する抗体
KR20130100118A (ko) 2010-08-03 2013-09-09 아비에 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CA2806855A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 F. Hoffmann - La Roche Ag Chronic lymphocytic leukemia (cll) biomarkers
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 抗mhc抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
WO2012019168A3 (en) 2010-08-06 2012-07-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2806021A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
JP5841149B2 (ja) 2010-08-13 2016-01-13 ロシュ グリクアート アーゲー 抗テネイシンca2抗体及び使用の方法
EP2605793A1 (en) 2010-08-17 2013-06-26 Roche Glycart AG Combination therapy of an afucosylated cd20 antibody with an anti-vegf antibody
KR101603001B1 (ko) 2010-08-25 2016-03-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 Il-18r1에 대한 항체 및 그의 용도
WO2012027570A4 (en) 2010-08-26 2012-07-19 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN103221825A (zh) 2010-08-31 2013-07-24 基因泰克公司 生物标志物和治疗方法
CA2813466A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
KR20130086628A (ko) 2010-11-08 2013-08-02 제넨테크, 인크. 피하 투여용 항―il―6 수용체 항체
CN103228674A (zh) 2010-11-10 2013-07-31 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物
US20120156194A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
RU2013131444A (ru) 2010-12-16 2015-01-27 Рош Гликарт Аг Сочетанная терапия афукозилированным антителом к cd20 и ингибитором mdm2
EP3296321A1 (en) 2010-12-20 2018-03-21 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates
JP2014511106A (ja) 2010-12-22 2014-05-08 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗pcsk9抗体及び使用方法
WO2012092539A3 (en) 2010-12-31 2012-10-04 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
EP2482074A1 (en) * 2011-01-27 2012-08-01 Medizinische Hochschule Hannover Methods and means for diagnosing vasculitis
EP2672999A2 (en) 2011-02-10 2013-12-18 Roche Glycart AG Improved immunotherapy
EP2680884B1 (en) 2011-02-28 2018-01-17 F.Hoffmann-La Roche Ag Biological markers and methods for predicting response to b-cell antagonists
US20120222851A1 (en) * 2011-03-04 2012-09-06 GM Global Technology Operations LLC Hvac system damper
JP5926791B2 (ja) 2011-03-29 2016-05-25 ロシュ グリクアート アーゲー 抗体Fc変種
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
KR20140021589A (ko) 2011-04-07 2014-02-20 제넨테크, 인크. 항-fgfr4 항체 및 사용 방법
WO2013101771A3 (en) 2011-12-30 2013-10-10 Genentech, Inc. Compositions and method for treating autoimmune diseases
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
CA2831008A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Roche Glycart Ag Novel immunoconjugates
RU2638806C2 (ru) 2011-05-12 2017-12-15 Дженентек, Инк. Lc-ms/ms способ мониторинга множественных реакций для выявления терапевтических антител в образцах животных с помощью каркасных сигнатурных пептидов
WO2012158704A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Genentech, Inc. Fgfr1 agonists and methods of use
JP6141831B2 (ja) 2011-05-21 2017-06-07 マクロジェニクス,インコーポレーテッド ヒト及び非ヒトcd3に結合可能なcd3結合分子
US8623666B2 (en) 2011-06-15 2014-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for detecting erythropoietin (EPO) receptor using anti-human EPO receptor antibodies
US9512228B2 (en) 2011-06-17 2016-12-06 Novo Nordisk A/S Selective elimination of erosive cells
WO2012175508A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Removal of target cells by circulating virus-specific cytotoxic t-cells using mhc class i comprising complexes
CA2835242A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Genentech, Inc. Anti-c-met antibody formulations
CA2842481A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Genentech, Inc. Inhibition of angiogenesis in refractory tumors
CN103890007A (zh) 2011-08-17 2014-06-25 霍夫曼-拉罗奇有限公司 神经调节蛋白抗体及其用途
CN103890006A (zh) 2011-08-23 2014-06-25 罗切格利卡特公司 抗mcsp抗体
CN103764681A (zh) 2011-08-23 2014-04-30 罗切格利卡特公司 双特异性抗原结合分子
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2014109395A (ru) 2011-09-15 2015-10-20 Дженентек, Инк. Способы стимуляции дифференциации
CN103930111A (zh) 2011-09-19 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗
WO2013090648A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
US20130089562A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genenthech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
EP2766393A4 (en) 2011-10-14 2015-07-01 Hoffmann La Roche ANTI-HtrA1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US9358250B2 (en) 2011-10-15 2016-06-07 Genentech, Inc. Methods of using SCD1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
US20140302021A1 (en) 2011-10-25 2014-10-09 Onclave Therapeutics Limited Antibody formulations and methods
JP6251682B2 (ja) 2011-10-28 2017-12-20 ジェネンテック, インコーポレイテッド メラノーマ治療の治療の組み合わせ及び方法
KR20150023214A (ko) 2011-11-17 2015-03-05 군드람 정 의학적 용도를 위한 이중특이성 항체
CN104066748A (zh) 2011-11-21 2014-09-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗c-met抗体的纯化
US20130302274A1 (en) 2011-11-25 2013-11-14 Roche Glycart Ag Combination therapy
US20140335084A1 (en) 2011-12-06 2014-11-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibody formulation
RU2014117975A (ru) 2011-12-15 2016-02-10 Алтернатив Инновейтив Текнолоджиз Ллц Гибридные белки и белковые конъюгаты на основе белков теплового шока-70 (бтш70) и способы их применения (варианты)
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2794635A1 (en) 2011-12-22 2014-10-29 Genentech, Inc. Ion exchange membrane chromatography
CA2853955A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Expression vector organization, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
KR20140107295A (ko) 2011-12-22 2014-09-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 진핵 세포용 전장 항체 표시 시스템 및 그것의 용도
US20160208284A1 (en) 2011-12-22 2016-07-21 Hoffmann-La Roche Inc. Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
WO2013096791A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Process for making high concentration protein formulations
US9120870B2 (en) 2011-12-30 2015-09-01 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-13 and IL-17
WO2013102144A3 (en) 2011-12-30 2014-02-06 Halozyme, Inc. Ph20 polypeptide variants, formulations and uses thereof
EP2802601A1 (en) 2012-01-09 2014-11-19 The Scripps Research Institute Humanized antibodies with ultralong cdr3s
US9200072B2 (en) 2012-01-18 2015-12-01 Genentech Inc. Anti-LRP5 antibodies and methods of use
RU2014133547A (ru) 2012-01-18 2016-03-10 Дженентек, Инк. Способы применения модуляторов fgf19
EP2804952A4 (en) * 2012-01-19 2015-09-09 Therapeutic Proteins Int Llc Stabilization of the anti-cd20 antibody rituximab
CA2863066A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Genentech, Inc. Anti-ig-e m1' antibodies and methods using same
EP2812350A1 (en) 2012-02-11 2014-12-17 F.Hoffmann-La Roche Ag R-spondin translocations and methods using the same
JP6152120B2 (ja) 2012-02-15 2017-06-21 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft Fc受容体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
RU2014136886A (ru) 2012-03-27 2016-05-20 Дженентек, Инк. Диагностика и виды лечения, связанные с ингибиторами her3
RU2014137554A (ru) 2012-03-27 2016-05-20 Дженентек, Инк. Усовершенствованные способы выделения рекобинантных белков
US20150064235A1 (en) 2012-03-30 2015-03-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides
KR20150003162A (ko) 2012-03-30 2015-01-08 제넨테크, 인크. 항-lgr5 항체 및 면역접합체
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
JP2015513913A (ja) 2012-04-02 2015-05-18 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドModerna Therapeutics,Inc. 修飾ポリヌクレオチド
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CN104520322A (zh) 2012-04-05 2015-04-15 Ac免疫有限公司 人源化tau抗体
US9056910B2 (en) 2012-05-01 2015-06-16 Genentech, Inc. Anti-PMEL17 antibodies and immunoconjugates
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
WO2013188855A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies, formulations, dosing, and methods of use
CA2872192A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-biotin antibodies and methods of use
CA2871112A1 (en) 2012-07-04 2014-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked antigen-antibody conjugates
KR20150023938A (ko) 2012-07-04 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-테오필린 항체 및 이의 사용 방법
DK2870157T3 (da) 2012-07-04 2017-11-06 Rhizen Pharmaceuticals S A Selektive pi3k delta-hæmmere
US9803191B2 (en) 2012-07-05 2017-10-31 Genentech, Inc. Expression and secretion system
CA2873889A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
KR20150030754A (ko) 2012-07-09 2015-03-20 제넨테크, 인크. 항-cd22 항체를 포함하는 면역접합체
CA2873884A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-cd79b antibodies
US20140030282A1 (en) 2012-07-09 2014-01-30 Genentech, Inc. Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates
US9670276B2 (en) 2012-07-12 2017-06-06 Abbvie Inc. IL-1 binding proteins
CN104428315B (zh) 2012-07-13 2017-09-29 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗‑vegf/抗‑ang‑2抗体及其在治疗眼血管疾病中的应用
WO2014020056A1 (en) 2012-08-02 2014-02-06 F. Hoffmann-La Roche Ag METHOD FOR PRODUCING SOLUBLE FcR AS Fc-FUSION WITH INERT IMMUNOGLOBULIN Fc-REGION AND USES THEREOF
JP6290209B2 (ja) 2012-08-07 2018-03-07 ロシュ グリクアート アーゲー 低下した及び増加したエフェクター機能を有するように操作された2つの抗体を含む組成物。
WO2014031498A1 (en) 2012-08-18 2014-02-27 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
JP6211084B2 (ja) 2012-08-21 2017-10-11 アカデミア シニカAcademia Sinica ベンゾシクロオクチン化合物およびその使用
US9777067B2 (en) 2012-09-27 2017-10-03 Massachusetts Institute Of Technology HER2- and VEGF-A-binding proteins with enhanced stability
RU2636043C2 (ru) 2012-11-01 2017-11-17 Эббви Инк. Анти-vegf/dll4-иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применения
JP2016505515A (ja) 2012-11-02 2016-02-25 ティージー セラピューティクス インコーポレイテッド 抗cd20抗体およびpi3キナーゼ選択的阻害剤の組み合わせ
CA2884431A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
EP2919813A2 (en) 2012-11-13 2015-09-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
CA2898146A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Charles Andrew BOSWELL Methods and compositions for radiohalogen protein labeling
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
WO2014120555A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 The Regents Of The University Of California Antibodies specific for urokinase-type plasminogen activator and methods of use thereof
KR20150118159A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법
EP2961772A1 (en) 2013-02-26 2016-01-06 Roche Glycart AG Anti-mcsp antibodies
CA2902263A1 (en) 2013-03-06 2014-09-12 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
KR20150126605A (ko) * 2013-03-12 2015-11-12 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 세포 내재화를 유도하기 위한 cd20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법
RU2015138576A (ru) 2013-03-14 2017-04-19 Дженентек, Инк. Комбинации соединения ингибитора мек с соединением ингибитором her3/egfr и способы применения
EP2970474B1 (en) 2013-03-14 2017-12-20 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
CN105307683A (zh) 2013-03-14 2016-02-03 基因泰克公司 治疗癌症和预防癌症药物抗性的方法
KR20150130451A (ko) 2013-03-15 2015-11-23 제넨테크, 인크. 암 치료 방법 및 항암제 내성 예방을 위한 방법
CA2905798A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Genentech, Inc. Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
CN105143264A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 豪夫迈·罗氏有限公司 用于肝癌诊断和治疗的组合物和方法
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CN105143265A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗CRTh2抗体及其用途
WO2014150877A3 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Ac Immune S.A. Anti-tau antibodies and methods of use
WO2014144280A3 (en) 2013-03-15 2015-01-15 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-1 beta and il-17
CN105143252A (zh) 2013-03-15 2015-12-09 豪夫迈·罗氏有限公司 IL-22多肽和IL-22Fc融合蛋白及其使用方法
WO2014161845A1 (en) 2013-04-03 2014-10-09 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for fap and dr5, antibodies specific for dr5 and methods of use
CA2908653A1 (en) 2013-04-29 2014-11-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
JP2016528167A (ja) 2013-04-29 2016-09-15 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft ヒトFcRn結合改変抗体及び使用方法
KR20160015286A (ko) 2013-05-31 2016-02-12 제넨테크, 인크. 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체
KR20160015227A (ko) 2013-05-31 2016-02-12 제넨테크, 인크. 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체
US20150010529A1 (en) 2013-07-03 2015-01-08 Ge Wei Thermally stable ph20 hyaluronidase variants and uses thereof
US20160159928A1 (en) 2013-07-18 2016-06-09 Fabrus, Inc. Humanized antibodies with ultralong complementary determining regions
WO2015017146A3 (en) 2013-07-18 2015-10-01 Fabrus, Inc. Antibodies with ultralong complementarity determining regions
WO2015017600A1 (en) 2013-08-01 2015-02-05 Five Prime Therapeutics, Inc. Afucosylated anti-fgfr2iiib antibodies
WO2015023596A1 (en) 2013-08-12 2015-02-19 Genentech, Inc. Compositions and method for treating complement-associated conditions
EP3041484A4 (en) 2013-09-06 2017-04-12 Acad Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS WITH ALTERED GLYCOSYL GROUPS
CA2922889A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 Genentech, Inc. Methods of using anti-lgr5 antibodies
CN103524621B (zh) * 2013-09-27 2015-04-01 北京济福霖生物技术有限公司 一种抗人cd20嵌合单克隆抗体
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
WO2015054670A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Genentech, Inc. Nsp4 inhibitors and methods of use
CN105744954A (zh) 2013-10-18 2016-07-06 豪夫迈·罗氏有限公司 抗rspo2和/或抗rspo3抗体及其用途
CA2924268A1 (en) 2013-11-21 2015-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
CN105916519A (zh) 2013-12-09 2016-08-31 阿拉科斯公司 抗Siglec-8抗体及其使用方法
CA2931340A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Genentech, Inc. Anti-cd33 antibodies and immunoconjugates
CN105899535A (zh) 2013-12-17 2016-08-24 豪夫迈·罗氏有限公司 用pd-1轴结合拮抗剂和抗cd20抗体治疗癌症的方法
CN105934253A (zh) 2013-12-17 2016-09-07 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和抗her2抗体治疗her2阳性癌症的方法
KR20160099092A (ko) 2013-12-17 2016-08-19 제넨테크, 인크. Ox40 결합 효능제 및 pd-1 축 결합 길항제를 포함하는 조합 요법
EP3192812A1 (en) 2013-12-17 2017-07-19 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
KR20160099088A (ko) 2013-12-20 2016-08-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간화 항-타우(pS422) 항체 및 사용 방법
RU2016129894A (ru) 2014-01-03 2018-02-08 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Ковалентно связанные конъюгаты хеликар-антитело против хеликара и их применения
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
KR20160105880A (ko) 2014-01-03 2016-09-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 공유 연결된 폴리펩티드 독소-항체 콘쥬게이트
US20160324984A1 (en) 2014-01-03 2016-11-10 Hoffmann-La Roche Inc. Biospecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
CN105873947A (zh) 2014-01-06 2016-08-17 豪夫迈·罗氏有限公司 单价血脑屏障穿梭模块
EP3094647A1 (en) 2014-01-15 2016-11-23 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
US20170043034A1 (en) 2014-01-24 2017-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
EP3102197A2 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP3102231A1 (en) 2014-02-08 2016-12-14 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating alzheimer's disease
WO2015120280A1 (en) 2014-02-08 2015-08-13 Genentech, Inc. Methods of treating alzheimer's disease
CA2937556A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Genentech, Inc. Anti-il-13/il-17 bispecific antibodies and uses thereof
WO2015130540A1 (en) 2014-02-26 2015-09-03 Eli Lilly And Company Combination therapy for cancer
CA2937024A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 Eli Lilly And Company Anti-met in combination with anti-vegfr2 antibodies therapy for cancer
EP3116999A1 (en) 2014-03-14 2017-01-18 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
WO2015140591A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
EP3122900A1 (en) 2014-03-24 2017-02-01 F.Hoffmann-La Roche Ag Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
WO2015148915A9 (en) 2014-03-27 2016-12-22 Academia Sinica Reactive labelling compounds and uses thereof
CN106103486A (zh) 2014-03-31 2016-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗ox40抗体和使用方法
JP2017514795A (ja) 2014-03-31 2017-06-08 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗血管新生剤及びox40結合アゴニストを含む併用療法
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
CA2946662A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Genentech, Inc. Anti-gpc3 antibodies and immunoconjugates
CA2944717A1 (en) 2014-05-23 2015-11-26 Genentech, Inc. Mit biomarkers and methods using the same
CA2949932A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Rhizen Pharmaceuticals Sa Improved forms of a pi3k delta selective inhibitor for use in pharmaceutical formulations
WO2015191715A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Genentech, Inc. Anti-lgr5 antibodies and uses thereof
CN107073121A (zh) 2014-06-13 2017-08-18 基因泰克公司 治疗及预防癌症药物抗性的方法
CA2954868A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genentech, Inc. Anti-pd-l1 antibodies and diagnostic uses thereof
KR20170029490A (ko) 2014-07-11 2017-03-15 제넨테크, 인크. 노치 경로 억제
CA2962915A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for cd19
US20170246272A1 (en) 2014-09-05 2017-08-31 Opexa Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating b cell mediated autoimmune disorders
KR20170042802A (ko) 2014-09-08 2017-04-19 아카데미아 시니카 당지질을 사용한 인간 iNKT 세포 활성화
CN107001465A (zh) 2014-09-12 2017-08-01 基因泰克公司 抗‑cll‑1抗体和免疫缀合物
JP2017531620A (ja) 2014-09-12 2017-10-26 ジェネンテック, インコーポレイテッド システイン操作抗体及びコンジュゲート
WO2016044396A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Genentech, Inc. Immunoconjugates comprising anti-her2 antibodies and pyrrolobenzodiazepines
CN107074938A (zh) 2014-10-16 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 抗‑α‑突触核蛋白抗体和使用方法
KR20170086540A (ko) 2014-11-03 2017-07-26 제넨테크, 인크. T 세포 면역 하위세트를 검출하기 위한 검정 및 그의 사용 방법
KR20170075793A (ko) 2014-11-05 2017-07-03 제넨테크, 인크. 박테리아 내 2쇄 단백질을 생산하는 방법
CN107075548A (zh) 2014-11-05 2017-08-18 基因泰克公司 在细菌中产生双链蛋白质的方法
WO2016073157A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-ang2 antibodies and methods of use thereof
CN107073126A (zh) 2014-11-06 2017-08-18 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和tigit抑制剂的组合疗法
WO2016077369A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Animal model for nephropathy and agents for treating the same
KR20170080604A (ko) 2014-11-10 2017-07-10 제넨테크, 인크. 항-인터류킨-33 항체 및 그것의 용도
WO2016081384A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
US20170362339A1 (en) 2014-11-19 2017-12-21 Genentech, Inc. Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy
EP3221362A1 (en) 2014-11-19 2017-09-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
JP2018505652A (ja) 2014-11-19 2018-03-01 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体/抗bace1多重特異性抗体および使用方法
WO2016090038A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Anti-staphylococcus aureus antibody rifamycin conjugates and uses thereof
JP2018507166A (ja) 2014-12-03 2018-03-15 ジェネンテック, インコーポレイテッド 抗staphylococcus aureus抗体リファマイシン抱合体及びその使用
CN107108739A (zh) 2014-12-05 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 抗CD79b抗体和使用方法
JP2018502840A (ja) 2014-12-10 2018-02-01 ジェネンテック, インコーポレイテッド 血液脳関門受容体抗体及び使用方法
KR20170099963A (ko) 2014-12-19 2017-09-01 레제네상스 비.브이. 인간 c6에 결합하는 항체 및 이의 용도
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
CN107428833A (zh) 2015-01-16 2017-12-01 朱诺治疗学股份有限公司 Ror1特异性抗体和嵌合抗原受体
EP3247723A1 (en) 2015-01-22 2017-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
EP3253784A1 (en) 2015-02-04 2017-12-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR20170110129A (ko) 2015-02-05 2017-10-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
WO2016149276A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Genentech, Inc. Methods of detecting and quantifying il-13 and uses in diagnosing and treating th2-associated diseases
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
CA2980005A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to gp120 and their use
EP3274370A2 (en) 2015-03-23 2018-01-31 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anti-ceacam6 antibodies and uses thereof
WO2016164480A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Genentech, Inc. Antigen binding complex having agonistic activity and methods of use
CA2982246A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
CN107810197A (zh) 2015-04-24 2018-03-16 豪夫迈·罗氏有限公司 鉴定包含结合多肽的细菌的方法
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
WO2016196381A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Genentech, Inc. Pd-l1 promoter methylation in cancer
CA2984003A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2016196343A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Genentech, Inc. Humanized anti-ebola virus glycoprotein antibodies and methods of use
CN107810012A (zh) 2015-06-02 2018-03-16 豪夫迈·罗氏有限公司 使用抗il‑34抗体治疗神经疾病的组合物和方法
WO2016196975A8 (en) 2015-06-03 2017-01-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
CA2986942A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
CA2988420A1 (en) 2015-06-08 2016-12-15 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
CA2985483A1 (en) 2015-06-08 2016-12-15 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies
US20170002086A1 (en) 2015-06-15 2017-01-05 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
US9840554B2 (en) 2015-06-15 2017-12-12 Abbvie Inc. Antibodies against platelet-derived growth factor (PDGF)
US20160368985A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. HUMANIZED AND AFFINITY MATURED ANTIBODIES TO FcRH5 AND METHODS OF USE
WO2016204966A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
CN107847568A (zh) 2015-06-16 2018-03-27 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cll‑1抗体和使用方法
WO2016205531A3 (en) 2015-06-17 2017-02-09 Genentech, Inc. Anti-her2 antibodies and methods of use
CN107771076A (zh) 2015-06-17 2018-03-06 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd‑1轴结合拮抗剂和紫杉烷治疗局部晚期或转移性乳腺癌的方法
EP3108897A1 (en) 2015-06-24 2016-12-28 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r for use in inducing lymphocytosis in lymphomas or leukemias
US20170029520A1 (en) 2015-06-29 2017-02-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for use in organ transplantation
WO2017040342A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Genentech, Inc. Anti-hypusine antibodies and uses thereof
WO2017046994A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Il-8-binding antibodies and uses thereof
WO2017050729A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Spring Bioscience Corporation Anti-ox40 antibodies and diagnostic uses thereof
CA2992602A1 (en) 2015-09-23 2017-03-30 Genentech, Inc. Optimized variants of anti-vegf antibodies
WO2017053906A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Abvitro Llc Hiv antibody compositions and methods of use
US20170114135A1 (en) 2015-10-02 2017-04-27 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
US20170114141A1 (en) 2015-10-02 2017-04-27 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
CA2997801A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
CA2996902A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use
WO2017055540A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human a-beta/human transferrin receptor antibodies and methods of use
CA2997799A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd1 antibodies and methods of use
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
WO2017062682A8 (en) 2015-10-06 2018-02-01 Genentech, Inc. Method for treating multiple sclerosis
WO2017062748A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Il-7r-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
CA2992900A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
US20170112891A1 (en) 2015-10-16 2017-04-27 Genentech, Inc. Hindered disulfide drug conjugates
WO2017068511A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
CA2998208A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
WO2017072210A1 (en) 2015-10-29 2017-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-variant fc-region antibodies and methods of use
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
US20170145112A1 (en) 2015-10-30 2017-05-25 Genentech, Inc. Anti-factor d antibodies and conjugates
WO2017079479A8 (en) 2015-11-03 2018-03-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 gp41 and their use
WO2017079768A1 (en) 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
US20170145102A1 (en) 2015-11-23 2017-05-25 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr2 inhibitors alone or in combination with immune stimulating agents in cancer treatment
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
WO2017127764A1 (en) 2016-01-20 2017-07-27 Genentech, Inc. High dose treatments for alzheimer's disease
WO2017136558A1 (en) 2016-02-04 2017-08-10 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2017151502A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2017148879A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Obinutuzumab and rituximab variants having reduced adcp
WO2017159699A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
WO2017172994A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 Geltor, Inc. Expression of proteins in gram-negative bacteria wherein the ratio of periplasmic volume to cytoplasmic volume is between 0.5:1 and 10:1
WO2017180864A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
US20170320959A1 (en) 2016-04-15 2017-11-09 Alpine Immune Sciences, Inc. Icos ligand variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2017181079A3 (en) 2016-04-15 2017-12-28 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
WO2017181111A3 (en) 2016-04-15 2017-12-07 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
WO2017181152A3 (en) 2016-04-15 2018-02-15 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4120649A (en) 1975-04-10 1978-10-17 Israel Schechter Transplants
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
EP0274394A3 (en) 1987-01-08 1990-01-17 Oncogen Chimeric antibody with specificity to human b cell surface antigen
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
WO1989008114A1 (en) 1988-02-25 1989-09-08 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
DE68915834D1 (de) 1988-03-15 1994-07-14 Yeda Res & Dev Herstellung von T-Zellen und T-Zellmembranen, verwendbar zur Verhütung und Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0682040B1 (en) 1988-12-28 1999-08-25 Protein Design Labs, Inc. Production of Humanized Immunoglobulins and Corresponding Polynucleotiodies
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
JP3472297B2 (ja) 1989-03-21 2003-12-02 ザ イミューン レスポンス コーポレイション 特定のt細胞集団の病原性応答により生じる疾患に対するワクチン接種および方法
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE69031919D1 (de) 1989-07-19 1998-02-12 Connetics Corp T-zell-rezeptor-peptide als heilmittel für autoimmune und bösartige krankheiten
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
JP4124480B2 (ja) * 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッドGenentech,Inc. 免疫グロブリン変異体
EP0861893A3 (en) 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US20010056066A1 (en) 1996-07-26 2001-12-27 Smithkline Beecham Corporation Method of treating immune cell mediated systemic diseases
US20020041847A1 (en) 1998-03-12 2002-04-11 Goldenberg David M. Immunotherapy of malignant and autoimmune disorders in domestic animals using naked antibodies, immunoconjugates and fusion proteins
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
ES2190087T3 (es) 1997-06-13 2003-07-16 Genentech Inc Formulacion estabilizada de un anticuerpo.
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6368596B1 (en) 1997-07-08 2002-04-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
KR20080038453A (ko) 1998-08-11 2008-05-06 바이오겐 아이덱 인크. B-세포 림프종을 치료하기 위한 항-cd20 항체를포함하는 약제
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
DE69941903D1 (de) 1998-11-09 2010-02-25 Biogen Idec Inc Behandlung von patienten die eine knochenmarktransplantation oder eine transplantation peripherer blutstammzellen erhalten mit anti-cd20 antikörpern
CN1679934B (zh) 1998-11-09 2012-09-05 生物基因Idec公司 使用抗cd20嵌合抗体治疗循环肿瘤细胞相关的血液恶性肿瘤
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US6383276B1 (en) 1999-03-12 2002-05-07 Fuji Photo Film Co., Ltd. Azomethine compound and oily magenta ink
WO2000067796A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to b cell surface markers
EP2289551A1 (en) 1999-06-09 2011-03-02 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target B-cells
CA2376288A1 (en) * 1999-06-11 2000-12-21 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Use of antibodies against cd20 for the treatment of the graft versus host disease
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
EP1216056A1 (en) 1999-07-12 2002-06-26 Genentech Inc. Blocking immune response to a foreign antigen using an antagonist which binds to cd20
CN101259270A (zh) 1999-08-11 2008-09-10 拜奥根Idec公司 用抗cd20抗体治疗累及骨髓的非霍奇金淋巴瘤患者
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
WO2001013945A1 (en) 1999-08-23 2001-03-01 Biocrystal Ltd. Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion of a disease condition comprising multiple sclerosis
RU2305561C2 (ru) 1999-11-08 2007-09-10 Байоджен Айдек Инк. Лечение в-клеточных злокачественных опухолей с использованием антител против cd40l в комбинации с антителами против cd20 и/или химиотерапией и лучевой терапией
KR20080039547A (ko) 2000-07-12 2008-05-07 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 B 세포 고갈 항체 및 면역 조절 항체 관련 적용의 조합을이용한 b 세포 악성종양의 치료
US20020006404A1 (en) 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20030185796A1 (en) 2000-03-24 2003-10-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
CA2469045A1 (en) 2001-12-07 2003-06-19 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
US20020009427A1 (en) 2000-03-24 2002-01-24 Wolin Maurice J. Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma
CA2404365A1 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Idec Pharmaceutical Corporation Combined use of anti-cytokine antibodies or antagonists and anti-cd20 for the treatment of b cell lymphoma
KR20020093029A (ko) 2000-04-11 2002-12-12 제넨테크, 인크. 다가 항체 및 그의 용도
EP1286692A4 (en) 2000-04-25 2004-11-17 Idec Pharma Corp Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
CA2411102A1 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Idec Pharmaceutical Corporation Cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
DK1296714T3 (da) 2000-06-22 2009-12-07 Coley Pharm Gmbh Kombination af CpG og antistoffer, der er rettet mod CD19, CD20, CD22 eller CD40 til behandling eller forebyggelse af kræft
US20020058029A1 (en) 2000-09-18 2002-05-16 Nabil Hanna Combination therapy for treatment of autoimmune diseases using B cell depleting/immunoregulatory antibody combination
WO2002034790A1 (en) 2000-10-20 2002-05-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Variant igg3 rituxan r and therapeutic use thereof
JP4731793B2 (ja) 2000-12-28 2011-07-27 アルセア テクノロジーズ インコーポレイテッド 抗体全体またはそのフラグメントの結晶、ならびにこの結晶を作製および使用するための方法
WO2002096948A3 (en) 2001-01-29 2003-08-07 Idec Pharma Corp Engineered tetravalent antibodies and methods of use
EP1373321A2 (en) 2001-01-29 2004-01-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Modified antibodies and methods of use
US20030103971A1 (en) 2001-11-09 2003-06-05 Kandasamy Hariharan Immunoregulatory antibodies and uses thereof
CA2440831C (en) 2001-04-02 2013-05-28 Genentech, Inc. Combination therapy using cd40 and cd20 ligands
JP2005500018A (ja) 2001-04-02 2005-01-06 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション GnTIIIと同時発現する組換え抗体
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
EP1404366A4 (en) 2001-06-14 2006-06-07 Intermune Inc Combination therapy of gamma-interferon and b cell specific antibodies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
DE60233744D1 (de) 2001-09-20 2009-10-29 Univ Texas Bestimmung der zirkulierenden therapeutischen antikörper, antigene sowie antigen-antikörper-komplexe mit elisa-tests
DE60232265D1 (de) 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US7127096B2 (en) * 2001-11-20 2006-10-24 Accuimage Diagnostics Corp. Method and software for improving coronary calcium scoring consistency
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CA2476166C (en) * 2002-02-14 2011-11-15 Immunomedics, Inc. Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20030180292A1 (en) 2002-03-14 2003-09-25 Idec Pharmaceuticals Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy
US20030219818A1 (en) 2002-05-10 2003-11-27 Bohen Sean P. Methods and compositions for determining neoplastic disease responsiveness to antibody therapy
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
ES2524694T3 (es) 2002-10-17 2014-12-11 Genmab A/S Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20
ES2633311T3 (es) 2002-12-16 2017-09-20 Genentech, Inc. Variantes de inmunoglobulina y usos de las mismas
RU2358762C9 (ru) * 2003-04-09 2016-10-10 Джинентех, Инк. Лечение аутоиммунных заболеваний у пациента с неадекватным ответом на ингибитор tnf-альфа
CA2525139C (en) 2003-05-20 2012-12-04 Applied Molecular Evolution, Inc. Cd20 binding molecules
CN1993143A (zh) 2004-06-04 2007-07-04 健泰科生物技术公司 用于治疗多发性硬化的方法
RU2007147426A (ru) * 2005-05-20 2009-06-27 Дженентек, Инк. (Us) Предварительная обработка биологического образца, взятого у индивидуума с аутоиммунным заболеванием
US8144978B2 (en) 2007-08-01 2012-03-27 Tandent Vision Science, Inc. System and method for identifying complex tokens in an image
KR101041914B1 (ko) * 2008-06-26 2011-06-15 부산대학교 산학협력단 셀레늄에 의해 탈분화된 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도
WO2010033587A3 (en) 2008-09-16 2010-09-16 Genentech, Inc. Methods for treating progressive multiple sclerosis

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