JP7383163B2 - 糖尿病治療用の薬物の製造におけるｇｐ７３阻害剤の使用 - Google Patents
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（関連出願の相互参照）
本願発明は、中国特許庁に提出された、出願番号が２０２０１０１５４７９２．３で、発明の名称が「糖尿病治療用の薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用」である中国特許出願の優先権を主張し、当該出願のすべての内容は引用により本願発明に組み込まれる。
本願発明は、中国特許庁に提出された、出願番号が２０２０１０１５４７９２．３で、発明の名称が「糖尿病治療用の薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用」である中国特許出願の優先権を主張し、当該出願のすべての内容は引用により本願発明に組み込まれる。
本願発明は、中国特許庁に提出された、出願番号がＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７８３４２で、発明の名称が「糖尿病治療用の薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用」であるＰＣＴ出願の優先権を主張し、当該出願のすべての内容は引用により本願発明に組み込まれる。
本願発明は、生物医学の分野に関し、特に、糖尿病治療用の薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用に関する。
国際糖尿病連合の推定によると、２０１７年、世界中で２０～７９歳の成人の糖尿病罹患率は約８．８％であり、約４．２５億人になり、ここで、４００万人が糖尿病で死亡し、全世界の死亡者総数の１０．７％を占める。世界中でも糖尿病患者が多い国としての中国の患者数は、約１．１４４億人である。この数は、年々増加しており、２０４５年までに、全世界で、２０～７９歳の糖尿病患者が、少なくとも６．２９億人になると予想される。
糖尿病は、高血糖を特徴とする代謝性疾患であり、主に、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病および他の特殊型糖尿病などの４つのタイプに分けられる。１型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病であり、主に、自己免疫反応に媒介される膵島β細胞の損傷によって引き起こされ、糖尿病患者総数の５％～１０％を占める。１型糖尿病の発生と発展は、１）遺伝的感受性の段階と、２）ある環境要因によって自己免疫反応が発動される段階と、３）自己免疫反応の活動期で、インスリンの分泌機能がまだ正常な状態である段階と、４）自己免疫反応が継続的にあるが、インスリンの分泌機能が進行性的に低下する段階と、５）臨床的に糖尿病が発生したが、インスリン分泌機能の一部はまだ残存している段階と、６）膵島β細胞が完全に破壊される段階と、の６つの段階に分けられる。２型糖尿病は、主に、有機体のインスリン欠損およびインスリン抵抗性によって引き起こされ、患者総数の９０％～９５％を占める。２型糖尿病の発生と発展は、１）遺伝的感受性の段階と、２）高インスリン血症および／またはインスリン抵抗性の段階と、３）耐糖能が低下する段階と、４）臨床糖尿病段階と、の４つの段階に分けられる。
現在、研究結果は、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ、ＧＣＧ）の過剰が糖尿病の発症の必須条件であることを示し、主な証拠は、１）インスリン欠損症の場合、グルカゴンによって肝臓のグルコースおよびケトン体の生成を増加させ、２）血糖のコントロールがよくない様々なタイプの糖尿病患者は、高グルカゴン血症があり、３）グルカゴン受容体欠損のマウスは、すべてのβ細胞が破壊されても糖尿病にならなく、４）グルカゴン受容体欠損のマウスの体内で膵臓に抗インスリン血清を注入すると、明らかに高いグルカゴン血症を引き起こし、膵島内のインスリンはグルカゴンの分泌に対して持続的なパラクリン阻害効果を有することである。グルカゴンは、主に、膵島α細胞から分泌されるペプチドホルモンであり、２９個のアミノ酸からなる直鎖状ポリペプチドであり、分子量は３４８５ダルトンである。グルカゴンは、その受容体（ＧＣＧＲ）と相互作用し、ｃＡＭＰ、ＡＭＰＫおよびＪＮＫなどのシグナル伝達経路を介してグリコーゲン分解および糖新生を促進して、血中グルコース濃度を上昇させる。肝臓、脳、胃腸管、腎臓、脂肪組織、心臓などの器官は、グルカゴンの標的器官であるが、血糖上昇効果の主な標的器官は肝臓である。
したがって、糖尿病は、インスリン欠損、インスリン抵抗性、グルカゴン過剰二重ホルモン障害性膵臓疾患である。現在、糖尿病治療用の薬物は、その種類が比較的多いが、依然としてインスリンを中心とすることを主としており、血糖コントロールが徐々に悪化することを変えることは困難であり、３分の１以上の患者は、血糖が十分にコントロールされていない。糖尿病の発症は、複数の遺伝的感受性および複数の環境要因の協働結果であり、それにより、当該疾患の不均一性および進行性病理学的変化がもたらされ、既存の治療法の治療効果には顕著な限界がある。また、一部の薬物の使用は、糖尿病の合併症および併存症によって制限される。また、薬物の投与期間が長くなるのにつれて、治療効果を失う薬物もあるため、新しい糖尿病治療薬を継続的に開発することは、現実的な意義が大きい。
ゴルジタンパク質７３（Ｇｏｌｇｉ ｐｒｏｔｅｉｎ ７３、ＧＰ７３）は、ゴルジ体に位置する２型膜貫通タンパク質であり、ゴルジ膜タンパク質１（Ｇｏｌｇｉ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＧＯＬＭ１）またはゴルジリンタンパク質２（Ｇｏｌｇｉ ｐｈｏｓｐｈｏｒｐｒｏｔｅｉｎ ２、ＧＯＬＰＨ２）とも呼ばれる。それは、第９番染色体に位置し、長さが３０４２ｂｐである。その遺伝子内には、読み枠の同じメチオニンコドンが２つあり、２つは互いに１０コドン離れ、それぞれ４００または３９１個のアミノ酸産物が転写される。ＧＰ７３構造は、主に、Ｎ末端の１～１２位の細胞質ドメイン、１２～３５位の膜貫通ドメイン、３６～２０５位のコイルドコイルドメイン、２０６～３４８位のアモルファスドメインおよび３４９～４０１位の酸性断片領域の５つの部分に分けられる。アモルファスドメインが可変領域である以外に、他の幾つかのドメインは全部非常に高い保存性を有する。ＧＰ７３の５５番目のアミノ酸の近傍に、前駆タンパク質転換酵素（ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ、ＰＣ）の切断部位があり、全長ＧＰ７３がＰＣによって切断された後、ゴルジ体から放出され、血液循環系に分泌され、血中に放出されたＧＰ７３断片は、可溶性ＧＰ７３と呼ばれる。ＧＰ７３は、正常な肝組織ではほとんど発現しないが、様々な原因によって発症した肝疾患においては、ほぼすべての肝細胞で発現し、特に、結合組織の周辺および肝硬変結節部位での発現が特に強い。７０％以上の肝臓がん患者は、ＧＰ７３タンパク質の血清および肝組織における発現レベルは、有意にアップレギュレーションし、正常組織の３～５倍になる。したがって、血清中のＧＰ７３は、肝臓がんの診断に有効な血清学的腫瘍マーカーであると考えられる。これに加え、食道がん、乳がん、前立腺がん患者の前立腺組織および尿、膀胱がんおよび子宮頸がんなどの複数の腫瘍におけるＧＰ７３の発現が有意にアップレギュレーションした。
ＧＰ７３の異常に高い発現は、複数の腫瘍と密接に関連するが、ＧＰ７３の生物学的機能は、未だ十分に解明されていない。細胞外における可溶性ＧＰ７３の機能については、よく分かっておらず、現在のところ、肝細胞と免疫細胞との間での小胞体ストレスの伝達が血清におけるＧＰ７３によって媒介されることを示す報告は１つしかなく、このようなカスケード増幅効果によって腫瘍大食細胞の動員が誘発され、腫瘍の微小環境における免疫寛容がもたらされた。
この背景技術の部分に開示された情報は、単に本願発明の全体的な背景に対する理解を高めることを意図したものにすぎず、この情報が当業者に知られている先行技術を構成することを認めるか、またはいかなる形でも暗示するものと見なされるべきではない。
本願発明の実施例において、発明者らは、ＧＰ７３が血糖調節に重要な役割を果たすことを発見し、特に、可溶性ＧＰ７３がグルカゴンに特異的に結合して複合体を形成して、グルカゴンの血糖上昇機能および糖新生機能を増強し、グルカゴンの半減期を延長することができることをすでに発見し、可溶性ＧＰ７３が、グルカゴンに依存しない方法により、肝臓および／または腎臓における糖生成および糖新生シグナル伝達経路を活性化することができることを発見し、発明者らは、さらに、可溶性ＧＰ７３がマウスの空腹時血糖を上昇させ、耐糖能の異常およびピルビン酸耐性の異常を誘発することができることを発見し、発明者らはまた、上で発見された血糖に対するＧＰ７３の調節作用に基づいて、動物実験により、ＧＰ７３阻害剤が糖尿病マウスの血糖値および糖化ヘモグロビンレベルを下げることができ、膵島β細胞に対する保護作用を有し、糖尿病を治療する効果を奏することを証明した。
本願発明は、下記の技術案を提供する。
本願発明の第１態様では、糖尿病およびその合併症を治療する薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用を提供する。
本願発明の第２態様では、糖尿病およびその合併症を治療するための薬物を提供し、前記薬物は、有効成分としてのＧＰ７３阻害剤を含む。
本願発明の第３態様では、糖尿病およびその合併症を治療するための方法を提供し、当該方法は、糖尿病に罹患している被験者に有効量のＧＰ７３阻害剤を投与するステップを含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病が含まれる。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記糖尿病の治療には、（１）空腹および／または食後の血糖を下げること、（２）耐糖能を改善すること、（３）膵島α細胞および／または膵島β細胞を保護すること、（４）グルカゴンの糖上昇能力および／または糖新生能力を下げること、（５）グルカゴンの半減期を短縮すること、（６）ＧＰ７３自体のインスリンに依存しない糖上昇作用および糖新生の機能を下げること、のうちのいずれか１つまたは複数が含まれる。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、糖尿病合併症には、糖尿病性腎症、糖尿病性眼合併症、糖尿病性足、糖尿病性末梢神経障害のうちのいずれか１つまたは複数が含まれ、ここで、糖尿病性眼合併症には、糖尿病性網膜症、糖尿病に関連するブドウ膜炎、糖尿病性白内障のうちの１つまたは複数が含まれる。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３阻害剤は、ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物を含み、場合によって、前記ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物は、（１）ＧＰ７３をコードする遺伝子の転写、正確な切断および／または翻訳を阻害できる性質、（２）ＧＰ７３と有機体内の受容体および／またはリガンドとの結合を阻害または妨害する性質、（３）ＧＰ７３と有機体内の特異性相互作用分子との相互作用を阻害または妨害する性質、（４）ＧＰ７３の有機体内での半減期を短縮する性質のうちの１つまたは複数を有する。さらに場合によって、ＧＰ７３阻害剤は、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含む抗体断片、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含む抗体断片の融合タンパク質、ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸配列のうちの１つまたは複数を含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３は、有機体内に存在するかまたは体外で単離された天然または組換えの全長ＧＰ７３、ＧＰ７３断片、ＧＰ７３突然変異体または修飾されたＧＰ７３から１つまたは複数選択され、場合によって、前記ＧＰ７３は、全長ＧＰ７３または１～５５位のアミノ酸を含まないＧＰ７３から選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞から生成されたモノクローナル抗体、抗体ライブラリからスクリーニングされたモノクローナル抗体、単細胞ＰＣＲから生成されモノクローナル抗体、遺伝子工学により改造されたモノクローナル抗体、異種抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、重鎖抗体（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記抗体断片の種類として、Ｆａｂ、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ＤｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｔｒｉｂｏｄｙ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、［Ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（ＳｃＦｖ－ＳＡ）４から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、核酸アプタマーのうちの１つまたは複数を含み、場合によって、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡは、配列番号：１～配列番号：９によって示されるヌクレオチド配列から１本または複数本選択されるか、または、配列番号：１～配列番号：９によって示されるいずれか１本のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列から選択され、さらに場合によって、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡは、配列番号：４によって示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列から選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、糖尿病およびその合併症を治療する薬物には、さらに、糖尿病を治療する他の薬物が含まれ、糖尿病およびその合併症を治療する方法では、ＧＰ７３阻害剤および糖尿病を治療する他の薬物を併用する。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記糖尿病を治療する他の薬物は、インスリン、ジメチルビグアニド、スルホニル尿素系血糖降下剤、ａグリコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン類、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）類似物、ＳＧＬＴ２（ナトリウム－グルコース共輸送タンパク質－２）阻害剤から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物の可能な実現形態において、前記薬物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容される補助材料を含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記薬物の使用方法は、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与のうちの１つまたは複数である。
上記の方法の可能な実現形態において、前記被験者は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、豚、犬から１つまたは複数選択される。
本願発明の第４態様では、グルカゴンを阻害する薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用を提供する。
本願発明の第５態様では、グルカゴンを阻害するための薬物を提供し、前記薬物はＧＰ７３阻害剤を含む。
本願発明の第６態様では、グルカゴンを阻害するための方法を提供し、当該方法は、グルカゴンを阻害する必要のある被験者に有効量のＧＰ７３阻害剤を投与するステップを含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記グルカゴンの阻害には、（１）グルカゴンの半減期を短縮すること、（２）グルカゴンの糖上昇能力および／または糖新生能力を下げることのうちのいずれか１つまたは複数が含まれる。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３阻害剤は、ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物を含み、場合によって、前記ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物は、（１）ＧＰ７３をコードする遺伝子の転写、正確な切断および／または翻訳を阻害できる性質、（２）ＧＰ７３と有機体内の受容体および／またはリガンドとの結合を阻害または妨害する性質、（３）ＧＰ７３と有機体内の特異性相互作用分子との相互作用を阻害または妨害する性質、（４）ＧＰ７３の有機体内での半減期を短縮する性質のうちの１つまたは複数を有する。さらに場合によって、ＧＰ７３阻害剤は、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含む抗体断片、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含む抗体断片の融合タンパク質、ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸配列のうちの１つまたは複数を含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、ＧＰ７３は、有機体内に存在するかまたは体外で単離された天然または組換えの全長ＧＰ７３、ＧＰ７３断片、ＧＰ７３突然変異体または修飾されたＧＰ７３から１つまたは複数選択され、場合によって、前記ＧＰ７３は、全長ＧＰ７３または１～５５位のアミノ酸を含まないＧＰ７３から選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞から生成されたモノクローナル抗体、抗体ライブラリからスクリーニングされたモノクローナル抗体、単細胞ＰＣＲから生成されモノクローナル抗体、遺伝子工学により改造されたモノクローナル抗体、異種抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、重鎖抗体（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記抗体断片の種類として、Ｆａｂ、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ＤｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｔｒｉｂｏｄｙ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、［Ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（ＳｃＦｖ－ＳＡ）４から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、核酸アプタマーのうちの１つまたは複数を含み、場合によって、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡは、配列番号：１～配列番号：９によって示されるヌクレオチド配列から１本または複数本選択されるか、または、配列番号：１～配列番号：９によって示されるいずれか１本のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列から選択され、さらに場合によって、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡは、配列番号：４によって示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列から選択される。
上記の使用、薬物の可能な実現形態において、前記薬物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容される補助材料を含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記薬物の使用方法は、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与のうちの１つまたは複数である。
上記の方法の可能な実現形態において、前記被験者は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、豚、犬から１つまたは複数選択される。
本願発明の第７態様では、ＧＰ７３－グルカゴン複合体を提供し、ここで、ＧＰ７３はグルカゴンと結合する。
上記のＧＰ７３－グルカゴン複合体の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３は、有機体内に存在するかまたは体外で単離された天然または組換えの全長ＧＰ７３、ＧＰ７３断片、ＧＰ７３突然変異体または修飾されたＧＰ７３から１つまたは複数選択され、場合によって、前記ＧＰ７３は、全長ＧＰ７３または１～５５位のアミノ酸を含まないＧＰ７３から選択される。
上記のＧＰ７３－グルカゴン複合体の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３の種源として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、豚、犬から１つまたは複数選択される。
本願発明の第８態様では、ＧＰ７３とグルカゴンとの結合エピトープを決定する方法を提供し、当該方法は、複合体結晶解析法、エピトープ決定部位切除法（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）、水素／重水素交換（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｐａｎｎｉｎｇ法のうちの１つまたは複数を利用して、ＧＰ７３とグルカゴンとの結合エピトープを決定するステップを含む。
本願発明の第９態様では、ＧＰ７３－グルカゴン複合体の形成を阻害する際のＧＰ７３阻害剤の阻害作用の強弱を決定する方法を提供し、当該方法は、方法１と方法２のうちのいずれか１つを含む。
方法１：
候補ＧＰ７３阻害剤とＧＰ７３をインキュベートした後、両者の混合物および／または複合体をグルカゴンと結合し、
ＧＰ７３の、候補ＧＰ７３阻害剤とインキュベートする前とインキュベートした後にグルカゴンと結合する能力を比較する。
候補ＧＰ７３阻害剤とＧＰ７３をインキュベートした後、両者の混合物および／または複合体をグルカゴンと結合し、
ＧＰ７３の、候補ＧＰ７３阻害剤とインキュベートする前とインキュベートした後にグルカゴンと結合する能力を比較する。
方法２：
インシリコシミュレーションを利用して、ＧＰ７３の、候補ＧＰ７３阻害剤とインキュベートする前とインキュベートした後にグルカゴンと結合する能力を比較する。
インシリコシミュレーションを利用して、ＧＰ７３の、候補ＧＰ７３阻害剤とインキュベートする前とインキュベートした後にグルカゴンと結合する能力を比較する。
ＧＰ７３－グルカゴン複合体の形成を阻害する際のＧＰ７３阻害剤の阻害作用の強弱を決定する上記の方法の可能な実現形態において、候補ＧＰ７３阻害剤の供給源には、ハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、抗体ライブラリ、化合物ライブラリ、ＧＰ７３類似物、グルカゴン類似物から選択される１つまたは複数が含まれる。
ＧＰ７３－グルカゴン複合体の形成を阻害する際のＧＰ７３阻害剤の阻害作用の強弱を決定する上記の方法の可能な実現形態において、ＧＰ７３のグルカゴンとの結合能力を決定する方法には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法、マイクロカロリメトリー（ＭＳＴ）測定法、競合ＥＬＩＳＡ法から選択される１つまたは複数が含まれる。
本願発明の第１０態様では、糖尿病検出試薬の製造におけるＧＰ７３を検出する試薬の使用を提供する。
本願発明の第１１態様では、糖尿病を検出するための試薬を提供し、前記試薬は、ＧＰ７３を検出する試薬を含む。
上記の使用、試薬可能な実現形態において、前記糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病が含まれる。
上記の使用、試薬の可能な実現形態において、ＧＰ７３を検出する試薬は、血清中の可溶性ＧＰ７３を検出する試薬を含む。
本願発明の第１２態様では、糖新生シグナル伝達経路阻害剤を製造する薬物におけるＧＰ７３阻害剤の使用を提供する。
本願発明の第１３態様では、糖新生シグナル伝達経路を阻害するための薬物を提供し、前記薬物はＧＰ７３阻害剤を含む。
本願発明の第１４態様では、糖新生シグナル伝達経路を阻害するための方法を提供し、当該方法は、糖新生シグナル伝達経路を阻害する必要のある被験者に有効量のＧＰ７３阻害剤を投与するステップを含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、糖新生シグナル伝達経路を阻害する前記ことには、（１）肝細胞の糖新生による糖生成を阻害すること、（２）糖新生の鍵酵素Ｐｃｘ、Ｐｃｋ１、Ｇ６ｐｃの発現レベルをダウンレギュレートすること、（３）ＰＫＡリン酸化レベルおよびキナーゼ活性をダウンレギュレートすることのうちのいずれか１つまたは複数が含まれる。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３阻害剤は、ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物を含み、場合によって、前記ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物は、（１）ＧＰ７３をコードする遺伝子の転写、正確な切断および／または翻訳を阻害できる性質、（２）ＧＰ７３と有機体内の受容体および／またはリガンドとの結合を阻害または妨害する性質、（３）ＧＰ７３と有機体内の特異性相互作用分子との相互作用を阻害または妨害する性質、（４）ＧＰ７３の有機体内での半減期を短縮する性質のうちの１つまたは複数を有する。さらに場合によって、ＧＰ７３阻害剤は、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含む抗体断片、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を含む抗体断片の融合タンパク質、ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸配列のうちの１つまたは複数を含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、ＧＰ７３は、有機体内に存在するかまたは体外で単離された天然または組換えの全長ＧＰ７３、ＧＰ７３断片、ＧＰ７３突然変異体または修飾されたＧＰ７３から１つまたは複数選択され、場合によって、前記ＧＰ７３は、全長ＧＰ７３または１～５５位のアミノ酸を含まないＧＰ７３から選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞から生成されたモノクローナル抗体、抗体ライブラリからスクリーニングされたモノクローナル抗体、単細胞ＰＣＲから生成されモノクローナル抗体、遺伝子工学により改造されたモノクローナル抗体、異種抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、重鎖抗体（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記抗体断片の種類として、Ｆａｂ、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ＤｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｔｒｉｂｏｄｙ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、［Ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（ＳｃＦｖ－ＳＡ）４から１つまたは複数選択される。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、核酸アプタマーのうちの１つまたは複数を含み、場合によって、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡは、配列番号：１～配列番号：９によって示されるヌクレオチド配列から１本または複数本選択されるか、または、配列番号：１～配列番号：９によって示されるいずれか１本のヌクレオチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列から選択され、さらに場合によって、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡは、配列番号：４によって示されるヌクレオチド配列またはそれと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列から選択される。
上記の使用、薬物の可能な実現形態において、前記薬物は、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容される補助材料を含む。
上記の使用、薬物、方法の可能な実現形態において、前記薬物の使用方法は、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、経口投与のうちの１つまたは複数である。
上記の方法の可能な実現形態において、前記被験者は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、豚、犬から１つまたは複数選択される。
（１）本願発明の実施例において、発明者らは、ＧＰ７３が血糖調節に重要な役割を果たすことを発見し、特に、可溶性ＧＰ７３がグルカゴンに特異的に結合して複合体を形成して、グルカゴンの血糖上昇機能および糖新生機能を増強し、グルカゴンの半減期を延長することができることをすでに発見し、可溶性ＧＰ７３が、グルカゴンに依存しない方法により、肝臓おける糖生成および糖新生シグナル伝達経路を活性化することができることを発見し、発明者らは、さらに、可溶性ＧＰ７３がマウスの空腹時血糖を上昇させ、耐糖能の異常およびピルビン酸耐性の異常を誘発することができることを発見し、発明者らはまた、上で発見された血糖に対するＧＰ７３の調節作用に基づいて、動物実験により、例えば、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体でＧＰ７３をブロックおよび／または中和する方法、または、ＧＰ７３レベルをダウンレギュレートすることで糖尿病を治療する方法、または、ＲＮＡ干渉でＧＰ７３の発現量を特異的に下げて糖尿病を治療する方法により、ＧＰ７３阻害剤が糖尿病マウスの血糖値および糖化ヘモグロビンレベルを下げることができ、膵島β細胞に対する保護作用を有し、糖尿病を治療する効果を奏することを証明した。
（２）本願発明の実施例において、発明者らは、ＧＰ７３とグルカゴンとの相互結合およびグルカゴンの検出力に対する影響を初めて発見し、したがって、ＧＰ７３阻害剤を、グルカゴンを阻害する薬物の製造に用いることもできる。本願発明の実施例において、発明者らは、ＧＰ７３－グルカゴン複合体の存在を証明し、ＧＰ７３とグルカゴンとの相互作用に対するさらなる研究にガイダンス意味がある。
（３）本願発明の実施例において、発明者らは、可溶性ＧＰ７３が、グルカゴンに依存しない方法により、肝臓の糖生成および糖新生シグナル伝達経路を活性化することができることを初めて発見した。
（４）本願発明の実施例において、発明者らは、ＧＰ７３の糖尿病患者グループにおける発現レベルは、健常者グループにおけるＧＰ７３の発現レベルよりも顕著に高いことを発見し、したがって、ＧＰ７３をマーカーとして糖尿病の検出に用いることができる。
１つ以上の実施例は、それに対応する図面におけるピクチャによって例示的に説明され、これらの例示的な説明は実施例を限定するものではない。本明細書に専用される単語「例示的」は、「例、実施例または説明性として用いられる」ことを意味する。本明細書では、「例示的」として記載されるいずれの実施例は、他の実施例よりも好ましいまたはよいと解釈されるべきではない。
図１Ａは、本願発明の実施例１における、健常者グループおよび糖尿病患者グループのうち、群に入っている人々の性別と年齢のマッチング状況を示し、結果は、２つの群の人々の性別と年齢の分布には有意差がないことを示す。図１Ｂは、本願発明の実施例１における、健常者グループおよび糖尿病患者グループの血清中の可溶性ＧＰ７３タンパク質レベルを示し、結果は、糖尿病患者グループは血清中の可溶性ＧＰ７３タンパク質レベルが健常者グループよりも有意に高い（Ｐ＜０．０１）ことを示す。
図２Ａは、本願発明の実施例２における、組換えマウス可溶性ＧＰ７３（ｒｍｓＧＰ７３）注射実験群およびＰＢＳ対照群のマウスの空腹時血糖値を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群はマウスの空腹時血糖がＰＢＳ対照群よりも有意に高い（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図２Ｂは、本願発明の実施例２における、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群およびＰＢＳ対照群のマウスの腹腔内耐糖能ＩＰＧＴＴレベルを示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群のマウスがＩＰＧＴＴ異常（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）を呈することを示す。図２Ｃは、本願発明の実施例２における、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群およびＰＢＳ対照群のマウスのピルビン酸耐性ＰＴＴレベルを示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群のマウスのＰＴＴ異常（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）を示す。図２Ｄは、本願発明の実施例２における、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群およびＰＢＳ対照群のマウスのインスリン耐性ＩＴＴレベルを示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群のマウスは、対照群と有意差がない（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。
図３Ａは、本願発明の実施例３における、蛍光色素Ｃｙ７対照群、Ｃｙ７標識ｒｍｓＧＰ７３タンパク質（ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７）実験群のマウスに静脈注射をした後の蛍光分布状況を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３タンパク質を注射してから３０分後、肝臓および腎臓への集積が明らかである。図３Ｂは、本願発明の実施例３における、Ｃｙ７対照群、ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７実験群のマウスに静脈注射をした後の各臓器における蛍光の分布状況を示し、結果は、非標識Ｃｙ７色素の広範な分布と異なって、ｒｍｓＧＰ７３タンパク質は、主に肝臓および腎臓に集積することを示す。図３Ｃは、本願発明の実施例３における、Ｃｙ７対照群、ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７実験群のマウスに静脈注射をした後の各臓器における蛍光強度値を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７群は肝臓、腎臓および脾臓における蛍光強度値が対照群よりも有意に高いことを示す。
図４Ａは、本願発明の実施例４における、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲで測定した組換えヒト可溶性ＧＰ７３（ｒｈｓＧＰ７３）とグルカゴン（ＧＣＧ）との結合および解離曲線を示す。図４Ｂは、本願発明の実施例４における、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲで測定した組換えマウス可溶性ＧＰ７３（ｒｍｓＧＰ７３）とＧＣＧとの結合および解離曲線を示す。図４Ｃは、本願発明の実施例４における、組換えラット可溶性ＧＰ７３（ｒｒｓＧＰ７３）とＧＣＧとの結合および解離曲線を示す。図４Ｄは、本願発明の実施例４における、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲで測定した組換えサル可溶性ＧＰ７３（ｒＭｓＧＰ７３）とＧＣＧとの結合および解離曲線を示す。図４Ｅは、本願発明の実施例４における、免疫共沈降実験での可溶性ＧＰ７３とＧＣＧとの体内結合能力を示し、結果は、マウス血清中の可溶性ＧＰ７３がＧＣＧと特異的に相互作用し、このような相互作用は、絶食時間が長くなるのにつれて徐々に増強することを示す。
図５Ａは、本願発明の実施例５における、測定したＧＣＧの半減期に対するｒｍｓＧＰ７３の影響を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３がＧＣＧの半減期を有意に延長することができる（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図５Ｂは、本願発明の実施例５における、ＧＣＧ実験群、ｒｍｓＧＰ７３実験群およびｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ実験群のマウスの血糖状況を示し、結果は、組換えマウス可溶性ＧＰ７３タンパク質が、マウスの体内でＧＣＧの糖上昇能力を有意に促進できる（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図５Ｃは、本願発明の実施例５における、ｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ＋ＩｇＧ実験群およびｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ＋６Ｂ６実験群のマウスの血糖状況を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３がマウスの体内でＧＣＧの糖上昇能力を促進することが特異的な抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６によってブロックされ得る（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。
図６Ａは、本願発明の実施例６における、マウス初代肝細胞が血清あり培養条件で、初代肝細胞の糖生成に対する濃度の異なるｒｍｓＧＰ７３の影響を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３が用量依存性方法でマウス初代肝細胞の糖生成を示す。図６Ｂは、本願発明の実施例６における、マウス初代肝細胞が無血清培養条件で、初代肝細胞の糖生成に対する濃度の異なるｒｍｓＧＰ７３の影響を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３タンパク質がいかなる他のホルモンの助けを借りずに、用量依存性方法で初代肝細胞の糖生成を直接促進することを示す。図６Ｃは、本願発明の実施例６における、マウス初代肝細胞が無血清培養条件で、ｒｍｓＧＰ７３タンパク質がマウス初代肝細胞の糖生成を促進することに対する抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６の影響を示し、結果は、６Ｂ６が、ｒｍｓＧＰ７３によって促進される初代肝細胞の糖生成を特異的にブロックできることを示す。図６Ｄは、本願発明の実施例６における、マウス初代肝細胞が無血清培養条件で、初代肝細胞での糖新生の律速酵素に対するｒｍｓＧＰ７３の影響を示し、結果は、ｒｍｓＧＰ７３が３種類の糖新生鍵酵素（Ｐｃｋ１、ＰｃｘおよびＧ６ｐｃ）の発現のアップレギュレートを促進することを示す。図６Ｅは、本願発明の実施例６における、ＨｅｐＧ２細胞株について、糖新生シグナル伝達経路の鍵キナーゼＰＫＡの酵素活性に対するｒｈｓＧＰ７３の影響を示し、結果は、陽性対照物ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、商品番号：Ｉ５８７９）と同様に、ｒｈｓＧＰ７３はＰＫＡのリン酸化レベル（ＰＫＡ－ｐ）および他のキナーゼ活性（ＲＲＸρＳ／Ｔ）を促進することを示す。図６Ｆは、本願発明の実施例６における、ＰＢＳ対照群、ＧＣＧ実験群、ｒｍｓＧＰ７３実験群およびｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ実験群のマウスの肝臓組織のＣＲＥＢ－ｐ、ＣＲＥＢおよびα－Ｔｕｂｕｌｉｎのイムノブロット図であり、結果は、ｒｍｓＧＰ７３が糖新生シグナル伝達経路の活性化を直接促進し、ＧＣＧの肝臓の糖新生能力を相乗的に増強することを示す。
図７Ａは、本願発明の実施例７における、マウスＩｇＧおよび抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６を３０ｍｇ／ｋｇ注射した群の、注射後の毎週の空腹時血糖値を示し、結果は、６Ｂ６高用量が１型糖尿病マウスの血糖を有意に下げる作用がある（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図７Ｂは、本願発明の実施例７における、マウスＩｇＧおよび６Ｂ６抗体を７．５、１５、３０ｍｇ／ｋｇの異なる用量で注射した群の、注射後の４週目の糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃレベルを示し、結果は、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６の中間用量および高用量が１型糖尿病マウスの糖化ヘモグロビンを有意に下げる作用がある（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。
図８Ａは、本願発明の実施例８における、ＳＴＺ＋ＩｇＧ群およびＳＴＺ＋６Ｂ６群のマウスの３色免疫蛍光染色図であり、結果は、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６が１型糖尿病マウスの膵島α細胞およびβ細胞に対する顕著な保護作用を有することを示す。図８Ｂは、本願発明の実施例８における、ＳＴＺ＋ＩｇＧ群およびＳＴＺ＋６Ｂ６群のマウスの膵島α細胞および膵島β細胞のカウント図であり、結果は、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６が１型糖尿病マウスの膵島α細胞およびβ細胞に対する有意な保護作用を有する（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図８Ｃは、本願発明の実施例８における、ＳＴＺ＋ＩｇＧ群およびＳＴＺ＋６Ｂ６群のマウスの膵島α細胞および膵島β細胞のカウント図であり、結果は、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６が１型糖尿病マウスの膵島α細胞およびβ細胞に対する有意な保護作用を有する（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図８Ｄは、本願発明の実施例８における、ＳＴＺ＋ＩｇＧ群およびＳＴＺ＋６Ｂ６群のマウスの膵島β細胞／α細胞の比の図であり、結果は、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６が１型糖尿病マウスのβ細胞／α細胞の比に有意な影響がないことを示す。
図９Ａは、本願発明の実施例９における、９本のＧＰ７３ ｓｉＲＮＡにＨ２２細胞をトランスフェクションした後のイムノブロット図であり、結果は、細胞の内因性ＧＰ７３タンパク質レベルに対する異なる配列のノックダウン作用の効率が異なり、４番配列を候補ｓｉＲＮＡとして選択することを示す。図９Ｂは、本願発明の実施例９における、対照（Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡ）群およびＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ群に注射した後の４週目のマウスの空腹時血糖値を示し、結果は、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡが２型糖尿病マウスの空腹時血糖を有意に下げる作用を有する（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図９Ｃは、本願発明の実施例９における、Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡ群およびＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ群に注射した後の４週目のＩＰＧＴＴレベルを示し、結果は、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡが２型糖尿病マウスのＩＰＧＴＴに対する顕著な改善作用を有する（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図９Ｄは、本願発明の実施例９における、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡが２型糖尿病マウスのＩＰＧＴＴのＡＵＣ値（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）への影響の差が有意である（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図９Ｅは、本願発明の実施例９における、Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡ群およびＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ群に注射した後の４週目のＩＴＴレベルを示し、結果は、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡが２型糖尿病マウスのＩＴＴに対する顕著な改善作用を有する（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。図９Ｆは、本願発明の実施例９における、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡが２型糖尿病マウスのＩＴＴのＡＵＣ値への影響の差が有意である（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）ことを示す。
本願発明の実施例の目的、技術案および利点をより明確にするために、以下では、本願発明の実施例の技術案について明確かつ完全に説明し、説明された実施例は本願発明の一部の実施例にすぎず、全ての実施例ではないことは明らかである。本願発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力なしに得たすべての他の実施例は、いずれの本願発明の保護範囲に属されるべきである。
また、本願発明をよりよく説明するために、以下の具体的な実施形態では、多くの具体的な詳細を示した。当業者は、一部の具体的な詳細がなくても、本願発明は実施され得ることを理解できるだろう。一部の実施例において、本願発明の要旨を強調するために、当業者に周知の原材料、要素、方法、手段についての詳細な説明を省略する。
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」またはその変形である「含有」または「備える」などは、他の要素または他の構成要素を排除するものではなく、述べられた要素または構成要素を含むと理解されるべきである。
一、用語の説明
本願発明において、「ＧＰ７３」という用語は、ゴルジ膜貫通糖タンパク質７３（ＧＰ７３）を言い、ＧＯＬＭ１（Ｇｏｌｇｉ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １））またはＧＯＬＰＨ２（Ｇｏｌｇｉ ｐｈｏｓｐｈｏｒｐｒｏｔｅｉｎ ２）とも呼ばれる。ＧＰ７３の５５番目のアミノ酸の近傍に、前駆タンパク質転換酵素（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ、ＰＣ）の切断部位があり、全長ＧＰ７３がＰＣによって切断された後、ゴルジ体から放出され、血液循環系に分泌され、可溶性ＧＰ７３と呼ばれる。本願発明では、ＧＰ７３は、有機体内に存在するかまたは体外で単離された天然または組換えの全長ＧＰ７３、ＧＰ７３断片、ＧＰ７３突然変異体または修飾されたＧＰ７３を包括的に指す。場合によって、前記ＧＰ７３は、全長ＧＰ７３または１～５５位のアミノ酸を含まないＧＰ７３から選択される。「ＧＰ７３」という用語は、他の単語と組み合わせて使用される場合にも、同様に、本明細書で定義された意味を有し、例えば、ＧＰ７３阻害剤、抗ＧＰ７３抗体、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体におけるＧＰ７３は、いずれも本明細書で定義された意味を有する。
本願発明において、「ＧＰ７３」という用語は、ゴルジ膜貫通糖タンパク質７３（ＧＰ７３）を言い、ＧＯＬＭ１（Ｇｏｌｇｉ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １））またはＧＯＬＰＨ２（Ｇｏｌｇｉ ｐｈｏｓｐｈｏｒｐｒｏｔｅｉｎ ２）とも呼ばれる。ＧＰ７３の５５番目のアミノ酸の近傍に、前駆タンパク質転換酵素（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ、ＰＣ）の切断部位があり、全長ＧＰ７３がＰＣによって切断された後、ゴルジ体から放出され、血液循環系に分泌され、可溶性ＧＰ７３と呼ばれる。本願発明では、ＧＰ７３は、有機体内に存在するかまたは体外で単離された天然または組換えの全長ＧＰ７３、ＧＰ７３断片、ＧＰ７３突然変異体または修飾されたＧＰ７３を包括的に指す。場合によって、前記ＧＰ７３は、全長ＧＰ７３または１～５５位のアミノ酸を含まないＧＰ７３から選択される。「ＧＰ７３」という用語は、他の単語と組み合わせて使用される場合にも、同様に、本明細書で定義された意味を有し、例えば、ＧＰ７３阻害剤、抗ＧＰ７３抗体、抗ＧＰ７３モノクローナル抗体におけるＧＰ７３は、いずれも本明細書で定義された意味を有する。
本願発明において、「ＧＰ７３阻害剤」という用語は、ＧＰ７３のレベル（遺伝子レベルまたはタンパク質レベルを含む）、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートすることができるいずれのポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物を指す。場合によって、前記ＧＰ７３のレベル、活性、機能および／または安定性をダウンレギュレートするポリペプチド、タンパク質、核酸配列または小分子化合物は、（１）ＧＰ７３をコードする遺伝子の転写、正確な切断および／または翻訳を阻害できる性質、（２）ＧＰ７３と有機体内の受容体および／またはリガンドとの結合を阻害または妨害する性質、（３）ＧＰ７３と有機体内の特異性相互作用分子との相互作用を阻害または妨害する性質、（４）ＧＰ７３の有機体内での半減期を短縮する性質のうちの１つまたは複数を有する。ＧＰ７３阻害剤は、抗ＧＰ７３抗体（抗ＧＰ７３モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体融合タンパク質を含む）、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｉＲＮＡ、ＧＰ７３を特異的に阻害するｓｈＲＮＡ、ＧＰ７３を特異的に阻害するｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＧＰ７３を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＰ７３を特異的に阻害する核酸アプタマー、ＧＰ７３を特異的に阻害する小分子化合物、ＧＰ７３を特異的に阻害する小分子化合物を含むが、これらに限定されない。
本願発明において、「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指し、４本のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合により互いに連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を指す。
本願発明において、「モノクローナル抗体」という用語は、ある特定のエピトープのみに指向性を有する、高度に均質である抗体を指し、ハイブリドーマ技術、抗体ライブラリ技術、トランスジェニックマウス技術または単一細胞ＰＣＲ技術などの既知の技術により製造できる。
本願発明において、「キメラ抗体」という用語は、ＤＮＡ組換え技術を利用して、異種モノクローナル抗体の軽鎖や重鎖可変領域の遺伝子をヒト抗体定常領域含有の発現ベクターに挿入し、哺乳動物細胞を形質転換してキメラ抗体を発現させることを指し、このように発現された抗体分子の軽鎖や重鎖の可変領域は異種であり、定常領域の供給源はヒトであり、こうすると、抗体分子全体のほぼ２／３の部分の供給源がヒトである。このように生成された抗体は、抗原に特異的に結合する親抗体の能力を保持しながら、異種抗体の免疫原性を下げる。
本願発明において、「ヒト化抗体」という用語は、キメラ抗体の可変領域におけるＦＲに依然としてある程度の免疫原性が残っているため、異種成分を減少させるためには、遺伝子工学技術を利用して、キメラ抗体をベースに、ヒトＦＲで異種ＦＲを置き換え、ヒト化の度合がより高い抗体を形成し、即ち、ＣＤＲが異種である以外に、残りは全部ヒト構造であるため、ヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合特異性を取得しながら、異種性を低下させるか、または、表面リモデリングなどの技術によって異種抗体のアミノ酸配列の大部分をヒト配列で置き換えながら、親の異種モノクローナル抗体の親和性および特異性を基本的に保持し、かつ、異種性を低下させ、ヒトのモノクローナル抗体への使用に有利である。
本願発明において、「完全ヒト抗体」という用語は、遺伝子組み換えまたはトランス染色体技術により、ヒトコード抗体の遺伝子を全部遺伝子工学により改造された抗体遺伝子欠失動物に移して、動物にヒト抗体を発現させ、抗体の供給源が完全にヒトであるという目的を達成するか、またはヒト抗体ライブラリのスクリーニングによってモノクローナル抗体を取得するか、または単細胞ＰＣＲ技術によってヒトモノクローナル抗体を取得する。
本明細書において、「抗体の抗原結合断片」という用語は、全長抗体の一部を指し、典型的には標的結合領域または可変領域を指す。
本明細書において、ナノ抗体、重鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、ＤｓＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｔｒｉｂｏｄｙ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、［Ｓｃ（Ｆｖ）２］２、（ＳｃＦｖ－ＳＡ）４などの具体的に解釈していない名詞も、当該技術分野での通常の意味を有する。
本明細書において、「治療」という用語は、有益または所望の結果をもたらすことができることを指し、当該結果は、１つまたは複数の症状を予防、緩和、改善または治癒すること、病症の重症度が低減すること、生存期間が予想の生存期間よりも長くなることを含むが、これらに限定されない。
本明細書において、「有効量」という用語は、前記有効成分が本願発明の実施例の方法によって投与される場合、疾患を治療するための有効成分を効果的に送達するのに十分な量を指し、患者に有効成分を１回または複数回投与して、診断または治療される患者に予想効果の量または用量を提供する。有効量は、参加している臨床医師が当業者として既知の技術および同様の状況下で得られた観察結果によって決定するものである。投与される有効成分の有効量または用量を決定する際に、参加している臨床医師は、複数の要因を考慮する必要があり、前記要因には、哺乳動物の種と、体積、年齢および一般的な健康と、係る具体的な疾患と、当該疾患の関与度合または重症度と、個別患者の応答と、投与される具体的な化合物と、投与モデルと、投与される製剤のバイオアベイラビリティ性質と、選択された投与計画と、併用薬物療法の使用と、他の関連する状況とが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「薬学的に許容される補助材料」は、通常の製剤用の薬学的ベクター、賦形剤および他の添加剤であってもよく、例えば、一般的な抗体薬物の補助材料などがある。
二、検出方法又は実験方法
１、本願発明において、ヒト血清中の可溶性ＧＰ７３の検出方法は、下記のとおりである。単純ランダムサンプリング方法を用いて、複数の健康検査センターの内分泌科から同じ期間内の１９０名の糖尿病患者を抽出し、複数の健康検査センターから同じ期間内の７５名の健康な被験者をランダムに選択して対照群とすることである。一晩絶食後、患者および健常者グループの両方から静脈血を採取し、血清を－２０℃の低温冷凍庫に保存する。すべてのサンプルを全部収集した後、磁気微粒子化学発光免疫分析法に基づくキット（熱景生物から購入）を用いて、ヒト血清中の可溶性ＧＰ７３レベルを検出する。
１、本願発明において、ヒト血清中の可溶性ＧＰ７３の検出方法は、下記のとおりである。単純ランダムサンプリング方法を用いて、複数の健康検査センターの内分泌科から同じ期間内の１９０名の糖尿病患者を抽出し、複数の健康検査センターから同じ期間内の７５名の健康な被験者をランダムに選択して対照群とすることである。一晩絶食後、患者および健常者グループの両方から静脈血を採取し、血清を－２０℃の低温冷凍庫に保存する。すべてのサンプルを全部収集した後、磁気微粒子化学発光免疫分析法に基づくキット（熱景生物から購入）を用いて、ヒト血清中の可溶性ＧＰ７３レベルを検出する。
２、本願発明において、マウスグルコースの検出方法は、下記のとおりである。すべての血液サンプルは尾部から採取され、グルコースオキシダーゼ法で血糖を測定し、全自動血糖計（ＡＣＣＵ－ＣＨＥＫ；Ｒｏｃｈｅ会社）を用いて検出し、正常なマウスおよび糖尿病マウスの両方とも６時間絶食させた後、空腹時血糖を測定し、午前９時にランダム血糖値を測定し、血糖値が３５ｍＭ（血糖計の検出の上限）を超える場合、３５ｍＭ値と記録する。
３、本願発明において、糖代謝実験の検出方法は、下記のとおりである。グルコース、インスリンおよびピルビン酸耐性試験において、マウスを１２時間絶食させた後、Ｄ－グルコース（Ｓｉｇｍａ、商品番号：Ｇ８２７０、１．５ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射し、インスリン（Ｓｉｇｍａ、商品番号：Ｉ９２７８、０．７５Ｕ／ｋｇ体重）またはピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、商品番号：Ｐ２２５６、２ｇ／ｋｇ体重）を尾静脈に注射し、注射後、０分、１５分、３０分、４５分、６０分、１２０分、２４ｈに、マウスの尾静脈から採血し、血糖を測定し、腹腔内注射する耐糖能（ＩＰＧＴＴ）、ピルビン酸耐性（ＰＴＴ）およびインスリン耐糖能（ＩＴＴ）を決定する。
４、本願発明において、ＧＰ７３の糖上昇実験の検出方法は、下記のとおりである。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを選択して、６時間絶食させた後、ｒｍｓＧＰ７３（８０μｇ／ｋｇ体重）を尾静脈に注射し、注射後、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分に、マウスの尾静脈から採血し、血糖を測定する。
５、本願発明において、マウス生体イメージング実験の検出方法は、下記のとおりである。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを選択して、一晩絶食させ、１日前にマウスの全身を剃毛し、ｒｍｓＧＰ７３をＣｙ７色素で標識し、Ｃｙ７色素対照およびｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７タンパク質の蛍光強度を９６ウェルプレートで一致するように調整し、蛍光強度調整済みのＣｙ７色素およびｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７は尾静脈注射によりマウスの体内（即ち、Ｃｙ７対照群およびｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７実験群は、各群に４匹ずつあり、注射量は２００ｕｌ／匹である）に入り、マウスを麻酔ボックスに入れて麻酔を行い、注射後、０分および３０分に生体イメージング機器でマウス生体のイメージングを行って、マウス体内の蛍光分布状況を観察し、その後、迅速にマウスを殺して、白色脂肪、筋肉、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、脳を取り出して、整然と並べて、マウスイメージング機器に入れて各臓器の測定蛍光強度を観察した。
６、本願発明において、マイクロスケール熱泳動実験の検出方法は、下記のとおりである。Ｈｉｓタグ付きの組換え可溶性ＧＰ７３とＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡラベルとを室温で遮光して３０分間インキュベートし、ＰＣＲチューブ内で１５個の濃度勾配のＧＣＧを調製し、濃度の異なるＧＣＧと標識ＧＰ７３タンパク質とを均一に混合して、室温で３０分間インキュベートし、キャピラリーチューブを使用して上記の混合液をそれぞれ吸い取って、順番にキャピラリーカラムスロットに注入し、マイクロスケール熱泳動機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ会社）を利用し、ＮＴ１１５モードを選択してＧＰ７３タンパク質とＧＣＧとの結合を検出し、フィッティング曲線から親和力値を計算する。
７、本願発明において、ＯｐｅｎＳＰＲ実験の検出方法は、下記のとおりである。アミノチップ（ＡｍｉｎｅＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐｓ、商品番号：ＳＥＮ－ＡＵ－１００－３－ＡＭＩＮＥ、ｌｏｔ：＃ＳＡＢ０１２２、Ｎｉｃｏｙａ会社）により組換え可溶性ＧＰ７３をカップリングし、濃度勾配の異なるグルカゴン（ＨＹ－Ｐ００８２、ｌｏｔ：＃３４００６）は移動相であり、ｏｐｅｎＳＰＲ（ＯｐｅｎＳＰＲ－ＸＴ、Ｎｉｃｏｙａ会社製品）により、その結合および解離曲線を測定し、曲線フィッティングにより親和力値を得る。
８、本願発明において、免疫共沈降実験の検出方法は、下記のとおりである。眼窩後静脈叢採血方法を用いて、マウスの血液を収集した後、遠心分離してマウス血清を取得し、抗マウスＧＰ７３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、商品番号：ｓｃ－３６５８１７）、抗グルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ、商品番号：ａｂ９２５１７）、ＲＲＸρＳ／Ｔ抗体（ＣＳＴ会社、商品番号：９６２４）、ＰＫＡ－ｐ抗体（ＣＳＴ会社、商品番号：５６６１）、α－Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、商品番号：Ｔ９０２６）またはＰＫＡ（ＣＳＴ会社、商品番号：５８４２）抗体のうちのいずれか１つを加えて、４℃の振とうで１時間インキュベートした後、アガロースビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、商品番号：ｓｃ－２００３）を加えて引き続き２時間インキュベートする。アガロースビーズを結合したタンパク質をＳＤＳ溶解液に加え、沸騰水浴を１０分間行い、遠心分離後に上清をとってＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。電気泳動が終わった後、セミドライ転写システムを利用してゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ支持膜に転写し、５％のスキムミルクブロッキング液中で、室温の振とうで１時間インキュベートしてブロッキングし、二次抗体の種特異性に応じて、それぞれＨＲＰ標識ヤギ抗マウス二次抗体（中杉金橋、商品番号：ＺＢ－２３０５）またはＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（中杉金橋、商品番号：ＺＢ－２３０１）を加え、室温の振とうで１時間インキュベートする。適量のＥＣＬ発色液をとって、ＰＶＤＦ膜に均一に滴下し、Ｔａｎｏｎ ５２００全自動光学発光イメージング分析システムを利用してイメージングを行う。
９、本願発明において、グルカゴン半減期の検出方法は、下記のとおりである。雌のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの尾静脈にＧＣＧ（１μｇ／ｋｇ体重）またはＧＣＧ（１μｇ／ｋｇ体重）と組換えマウス可溶性ＧＰ７３タンパク質（１ｍｇ／ｋｇ体重）との混合物（室温で１０分間インキュベートする）を注射し、それぞれ注射後、０分、１分、３分、５分、１０分、２０分、３０分に、眼窩後静脈叢採血方法を用いてマウスの血液を収集する。採集チューブ内で、必要の濃度にしたがって３種類のタンパク質酵素阻害剤（ＤＰＰ４、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌおよびＡｐｒｏｔｉｎｉｎ）を加えて、迅速に均一に混合し、室温で１時間静置し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、マウス血清を取得する。ＧＣＧの濃度は、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ＭＡＰ ＲＡＴ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＭＡＧＮＥＴＩＣ ＢＥＡＤ ＰＡＮＥＬ ＫＩＴ ９６ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ Ａｓｓａｙキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品番号ＲＭＨＭＡＧ－８４Ｋ）を用いて検出する。得られたデータを使用して非コンパートメントモデルの薬物動態パラメータを計算し、その後、半減期値を逐次算出する。
ＧＣＧ（ＭＣＥから購入、商品番号：ＨＹ－Ｐ００８２、バッチ番号：３４００６）、組換えマウスの可溶性ＧＰ７３タンパク質ｒｍｓＧＰ７３、本実験室ＨＥＫ２９３細胞発現製品（即ち、実施例２の組換えマウスの可溶性ＧＰ７３）、タンパク質酵素阻害剤（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｏｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｉ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入、商品番号：２０－２０１）、ＤＰＰ４阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入、商品番号：ＤＰＰ４－０１０）、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（Ｓｉｇｍａから購入、商品番号：Ａ６１０６）。
１０、本願発明において、免疫蛍光染色の方法は、下記のとおりである。マウスを殺した後、剥離した膵臓組織を、１０％（ｖ／ｖ）のホルマリンで固定してパラフィンスライス標本を製造し、厚さ５μｍのパラフィンスライスを作成し、免疫蛍光スライスを水に脱パラフィンした後、３０分間ブロッキングし、抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ、商品番号：ａｂ１８１５４７）または抗グルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ、商品番号：ａｂ１０９８８）と共に１時間インキュベートしてから、繰り返して３回洗浄する。対応する蛍光二次抗体を加えて、室温で１時間インキュベートした後、洗浄およびＤＡＰＩ染色を行う。共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）またはオートデジタルスライドスキャナ（３Ｄ ＨＩＳＴＥＣＨ）で画像を撮影する。膵臓毎に５～１０個の等間隔スライスイメージを取り、各群に少なくとも３匹のマウスがあり、少なくとも３つの視野で陽性細胞を染色し、細胞の総数は２００以上である。
実施例１．糖尿病患者グループは、血清中の可溶性ＧＰ７３レベルが健常者グループよりも有意に高い
実験方法：糖尿病患者グループと健常者グループとの間に血清中の可溶性ＧＰ７３のレベルの差があるか否かを比較するために、、複数の健康検査センターの外来検診で身体検査を受けた７５名の健常者グループおよび内分泌科で糖尿病と診断された１９０名の糖尿病患者について、一晩絶食後の血清中の可溶性ＧＰ７３レベルを検出した。これらの群に入っている人々の性別と年齢のマッチングを行い、健常者グループおよび糖尿病患者グループにおける分布には有意差がない（図１Ａに示されるように）。
実験方法：糖尿病患者グループと健常者グループとの間に血清中の可溶性ＧＰ７３のレベルの差があるか否かを比較するために、、複数の健康検査センターの外来検診で身体検査を受けた７５名の健常者グループおよび内分泌科で糖尿病と診断された１９０名の糖尿病患者について、一晩絶食後の血清中の可溶性ＧＰ７３レベルを検出した。これらの群に入っている人々の性別と年齢のマッチングを行い、健常者グループおよび糖尿病患者グループにおける分布には有意差がない（図１Ａに示されるように）。
実験結果：健常者グループにおいて、可溶性ＧＰ７３の平均血清濃度が５２．８１ｎｇ／ｍｌ（３．５～１４６ｎｇ／ｍｌ）であり、糖尿病患者グループにおいて、可溶性ＧＰ７３の平均血清濃度が６８．８２ｎｇ／ｍｌ（１９．３６～１９８ｎｇ／ｍｌ）であり、２つの群には有意な統計的差（Ｐ＜０．０１）がある（図１Ｂに示されるように）。以上の結果は、血清中の可溶性ＧＰ７３レベルは、糖尿病患者グループが健常者グループよりも有意に高いことを示す。
実施例２．組換え可溶性ＧＰ７３で糖代謝を調節する
実験方法：まず、哺乳動物細胞発現システムＨＥＫ２９３細胞でＧＰ７３タンパク質の発現精製を行って、遺伝子組換えマウス可溶性ＧＰ７３タンパク質（ｒｍｓＧＰ７３）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１０３０２９４．１）を取得した。当該タンパク質は、ＧＰ７３の１～５５番目のアミノ酸が欠失しており、血中の可溶性ＧＰ７３の主な存在形態である（本願発明の実施例に係るマウス実験に使用される組換え可溶性ＧＰ７３タンパク質は、いずれも当該組換えマウス可溶性ＧＰ７３タンパク質であり、ｒｍｓＧＰ７３と略称する）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（即ち、実験群およびＰＢＳ対照群は、各群にマウスが１０匹ずつある）に尾静脈からｒｍｓＧＰ７３およびＰＢＳを３００ｎｇ／匹の用量注射し、注射後に、２４時間、４８時間でマウスの空腹時血糖（血糖計および血糖試験紙はＲｏｃｈｅ会社から購入）を検出し、検出方法または実験方法の第３部分にしたって腹腔内注射を行って、耐糖能（ＩＰＧＴＴ）、ピルビン酸耐性（ＰＴＴ）およびインスリン耐糖能（ＩＴＴ）を検出した。
実験方法：まず、哺乳動物細胞発現システムＨＥＫ２９３細胞でＧＰ７３タンパク質の発現精製を行って、遺伝子組換えマウス可溶性ＧＰ７３タンパク質（ｒｍｓＧＰ７３）（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１０３０２９４．１）を取得した。当該タンパク質は、ＧＰ７３の１～５５番目のアミノ酸が欠失しており、血中の可溶性ＧＰ７３の主な存在形態である（本願発明の実施例に係るマウス実験に使用される組換え可溶性ＧＰ７３タンパク質は、いずれも当該組換えマウス可溶性ＧＰ７３タンパク質であり、ｒｍｓＧＰ７３と略称する）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（即ち、実験群およびＰＢＳ対照群は、各群にマウスが１０匹ずつある）に尾静脈からｒｍｓＧＰ７３およびＰＢＳを３００ｎｇ／匹の用量注射し、注射後に、２４時間、４８時間でマウスの空腹時血糖（血糖計および血糖試験紙はＲｏｃｈｅ会社から購入）を検出し、検出方法または実験方法の第３部分にしたって腹腔内注射を行って、耐糖能（ＩＰＧＴＴ）、ピルビン酸耐性（ＰＴＴ）およびインスリン耐糖能（ＩＴＴ）を検出した。
実験結果：注射実験群は、マウスの空腹時血糖が対照群よりも有意に高い（図２Ａに示されるように）。重要なことは、代謝実験において、ｒｍｓＧＰ７３注射実験群のマウスは対照群と比較すると、耐糖能（ＩＰＧＴＴ）異常（図２Ｂに示されるように）および糖新生能力を代表するピルビン酸耐性（ＰＴＴ）異常（図２Ｃに示されるように）を呈し、インスリン感受性を代表するインスリン耐糖能試験（ＩＴＴ）は、対照群マウスと有意な差がない（図２Ｄに示されるように）ということである。
実施例３．組換え可溶性ＧＰ７３のマウスの肝臓および腎臓への集積
実験方法：検出方法または実験方法の第５部分にしたがって、蛍光色素Ｃｙ７対照群、Ｃｙ７標識ｒｍｓＧＰ７３タンパク質（ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７）実験群のマウスに静脈注射をした後の蛍光分布状況、蛍光強度を検出した。
実験方法：検出方法または実験方法の第５部分にしたがって、蛍光色素Ｃｙ７対照群、Ｃｙ７標識ｒｍｓＧＰ７３タンパク質（ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７）実験群のマウスに静脈注射をした後の蛍光分布状況、蛍光強度を検出した。
実験結果：マウス生体イメージは、Ｃｙ７対照群と比較すると、ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７が主に肝臓および腎臓に集積する（図３Ａに示されるように）ことを示す。その臓器を取って、Ｃｙ７対照群と比較すると、肝臓および腎臓でのｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７の蛍光強度が最も強い（図３Ｂに示されるように）。マウスの各臓器の蛍光強度についての分析処理を行って、ｒｍｓＧＰ７３－Ｃｙ７の肝臓、腎臓、脾臓での蛍光強度が、Ｃｙ７対照群によりも有意に高い（図３Ｃに示されるように）ことを発見した。
実施例４．組換え可溶性ＧＰ７３はグルカゴンと特異的に相互作用する
血糖値が一定の閾値まで下がると、グルカゴンが急速に分泌される。グルタミン、アルギニンおよびアラニンなどの一部のアミノ酸と、血漿中の遊離脂肪酸とは、グルカゴン分泌の強力な刺激剤である。胃阻害ペプチド（ＧＩＰ）は、低血糖状態でグルカゴンの分泌を促進する。インスリン、γ－アミノ酪酸、レプチンおよびソマトスタチンなどは、グルカゴンの分泌を直接阻害し、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）は、グルカゴンの分泌を間接的に阻害する。また、中枢神経系は、重要な血糖値レセプターであり、迷走神経および／またはコリン作動性神経により、グルカゴンの分泌を直接的または間接的に調節する。血中のインスリンとグルカゴンとの比例（Ｉ／Ｇ）は、肝臓のグリコーゲンおよび糖新生をコントロールする鍵となる要因であり、高い比例のＩ／Ｇは、エネルギーが十分な状態であり、グリコーゲン合成が増加し、糖新生が阻害されることを示す。逆であると、グリコーゲンが分解し、糖新生が増強される。
血糖値が一定の閾値まで下がると、グルカゴンが急速に分泌される。グルタミン、アルギニンおよびアラニンなどの一部のアミノ酸と、血漿中の遊離脂肪酸とは、グルカゴン分泌の強力な刺激剤である。胃阻害ペプチド（ＧＩＰ）は、低血糖状態でグルカゴンの分泌を促進する。インスリン、γ－アミノ酪酸、レプチンおよびソマトスタチンなどは、グルカゴンの分泌を直接阻害し、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）は、グルカゴンの分泌を間接的に阻害する。また、中枢神経系は、重要な血糖値レセプターであり、迷走神経および／またはコリン作動性神経により、グルカゴンの分泌を直接的または間接的に調節する。血中のインスリンとグルカゴンとの比例（Ｉ／Ｇ）は、肝臓のグリコーゲンおよび糖新生をコントロールする鍵となる要因であり、高い比例のＩ／Ｇは、エネルギーが十分な状態であり、グリコーゲン合成が増加し、糖新生が阻害されることを示す。逆であると、グリコーゲンが分解し、糖新生が増強される。
高グルカゴン血症は、様々なタイプの糖尿病で見られる。グルカゴンの分泌は、内因性インスリンに調節され、この調節メカニズムの喪失により、有機体がグルカゴンをより多く分泌し、血糖が上昇し、糖尿病が誘発される。２型糖尿病モデルにおいて、グルカゴンは、高血糖の発症の鍵となる要因であり、グルカゴン受容体が欠損している正常なマウスは、低血糖の症状を表したが、グルカゴン受容体が欠損している糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）は、高インスリンまたは高血糖の症状を表さなかった。２型糖尿病において、インスリンの直接や間接的な作用が損なわれるが、グルカゴンシグナルの増強により、グリコーゲン分解および糖新生をさらに悪化させ、それにより、グルコースが多くなり、血糖が上昇する。臨床研究も、グルカゴンをタイミング悪く分泌することは、２型糖尿病患者の高血糖の主な要因であることを示す。２型糖尿病患者は、インスリン分泌およびインスリン抵抗性が低いと同時に、空腹グルカゴンレベルの上昇、食後グルカゴン阻害機能の低下、および血糖およびインスリンによるグルカゴンの阻害分泌に対する細胞の感受性の低下などのグルカゴン調節不全を伴い、したがって、２型糖尿病は、一般的に、インスリン欠損およびインスリン抵抗性、グルカゴン過剰二重ホルモン障害性の膵臓疾患であると見なされる。グルカゴン受容体遺伝子がノックダウンされた（ＧＣＧＲ－／－）マウス（１型糖尿病モデルマウス）は、ほぼすべてのβ細胞が破壊されても、糖尿病の臨床所見を表さないが、肝細胞発現ＧＣＧＲがアデノウイルスグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）の発現ベクターによって回復された後、マウスの血糖値が急速に上昇する。長期的に１型糖尿病に罹患し、かつ膵島細胞が残っている患者にとって、高血糖への重要な寄与物がグルカゴンである可能性がある。すべての研究結果は、いずれもグルカゴンが糖尿病進行の鍵となる要因であり、グルカゴン活性を下げて、糖尿病の治療をより一層進めることを示す。
４．１ 異なる種における組換え可溶性ＧＰ７３およびＧＣＧの親和力の測定
実験方法：ＧＰ７３とグルカゴン（ＧＣＧ、ＭＣＥ会社から購入、ＨＹ－Ｐ００８２）との相互作用を研究するために、まず、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ会社）、マイクロスケール熱泳動実験（ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＭＳＴ、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ会社）およびＯｐｅｎＳＰＲ（ＯｐｅｎＳＰＲ－ＸＴ、Ｎｉｃｏｙａ会社）を用いて、組換え可溶性ＧＰ７３とＧＣＧとの結合活性を測定した。
実験方法：ＧＰ７３とグルカゴン（ＧＣＧ、ＭＣＥ会社から購入、ＨＹ－Ｐ００８２）との相互作用を研究するために、まず、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ会社）、マイクロスケール熱泳動実験（ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ＭＳＴ、ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ会社）およびＯｐｅｎＳＰＲ（ＯｐｅｎＳＰＲ－ＸＴ、Ｎｉｃｏｙａ会社）を用いて、組換え可溶性ＧＰ７３とＧＣＧとの結合活性を測定した。
実験結果：組換えヒト可溶性ＧＰ７３（ｒｈｓＧＰ７３）は、ＧＣＧと特異的に結合することができ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ４ＳＰＲ、ＭＳＴおよびＯｐｅｎＳＰＲの３つの方法で測定された親和力は、それぞれＫＤ＝２．８３μＭ、ＫＤ＝２．４５μＭおよびＫＤ＝２．８０μＭである（図４Ａおよび表１に示されるように）。組換えマウス（ｒｍｓＧＰ７３）、ラット（ｒｒｓＧＰ７３）およびサル（ｒＭｓＧＰ７３）の可溶性ＧＰ７３も、同様に、ＧＣＧと特異的に結合することができる（図４Ｂ、Ｃ、Ｄおよび表１に示されるように）。各種の可溶性ＧＰ７３は、いずれも当社が哺乳動物細胞発現精製を用いて製造したものである。サル可溶性ＧＰ７３：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿０１１７６９３９１．１；ラット可溶性ＧＰ７３：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００１０５６８２５．３；マウス可溶性ＧＰ７３：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１０３０２９４．１；ヒト可溶性ＧＰ７３：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０５７６３２．２。
４．２ 可溶性ＧＰ７３およびＧＣＧの体内結合活性の検出
実験方法：可溶性ＧＰ７３およびＧＣＧの体内結合活性を実証するために、異なる時間を絶食したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採血した後、免疫共沈降実験を行った。マウス抗ＧＰ７３モノクローナル抗体Ｆ１２は、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ会社から購入した。
実験結果：血清中のＧＰ７３沈殿物はＧＣＧと結合する（図４Ｅ）。興味深いことに、ＧＰ７３－ＧＣＧの相互作用バンドは徐々に暗くなり、ＧＰ７３－ＧＣＧ複合体は、絶食時間が長くなるのにつれて徐々に増加することを示す（図４Ｅに示される）。
実験方法：可溶性ＧＰ７３およびＧＣＧの体内結合活性を実証するために、異なる時間を絶食したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスから採血した後、免疫共沈降実験を行った。マウス抗ＧＰ７３モノクローナル抗体Ｆ１２は、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ会社から購入した。
実験結果：血清中のＧＰ７３沈殿物はＧＣＧと結合する（図４Ｅ）。興味深いことに、ＧＰ７３－ＧＣＧの相互作用バンドは徐々に暗くなり、ＧＰ７３－ＧＣＧ複合体は、絶食時間が長くなるのにつれて徐々に増加することを示す（図４Ｅに示される）。
実施例５．組換え可溶性ＧＰ７３は、血漿ＧＣＧの半減期を延長し、ＧＣＧの糖上昇作用を促進する
前述の研究結果は、マウスの空腹時血糖の上昇および耐糖能の異常が、ｒｍｓＧＰ７３によって引き起こされることができ、そして、ｓＧＰ７３はＧＣＧと特異的に結合することが可能であることを示し、我々に、ｓＧＰ７３は、ＧＣＧが急速に分解および／または脱アミド化されて機能しなくなることを回避するために、体内でＧＣＧに対してシャペロン分子の機能を果たす可能性が高いことを示唆する。このため、ｒｍｓＧＰ７３のグルカゴン半減期に対する影響を実験研究した。
前述の研究結果は、マウスの空腹時血糖の上昇および耐糖能の異常が、ｒｍｓＧＰ７３によって引き起こされることができ、そして、ｓＧＰ７３はＧＣＧと特異的に結合することが可能であることを示し、我々に、ｓＧＰ７３は、ＧＣＧが急速に分解および／または脱アミド化されて機能しなくなることを回避するために、体内でＧＣＧに対してシャペロン分子の機能を果たす可能性が高いことを示唆する。このため、ｒｍｓＧＰ７３のグルカゴン半減期に対する影響を実験研究した。
実験方法：Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを１２匹（８週齢、体重２０～２５ｇ、雌）を使用し、ＧＣＧ群およびＧＣＧ＋ｒｍｓＧＰ７３群の２つの群に分けられ、各群に６匹ずつある。実験方法の詳細は、検出方法または試験方法の第９部分を参照できる。
実験結果：組換え可溶性ＧＰ７３は、血漿グルカゴンの半減期を延長することができる（図５Ａおよび表２に示される）。
ＧＣＧの活性に対する可溶性ＧＰ７３の影響を研究するために、ＧＣＧ、ｒｍｓＧＰ７３、ｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧの３つの実験群を設定して糖上昇実験を行った。実験に使用されるマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６～８週齢、体重２０～２５ｇ、雄）であり、各群に６匹ずつあり、血糖の検出に使用される血糖計および血糖試験紙は、Ｒｏｃｈｅ会社から購入した。
実験方法：ＧＣＧ実験群：マウスの尾静脈にＧＣＧ（ＭＣＥ会社から購入）を注射し、用量は１００ｎｇ／匹であり、それぞれ０、１５、３０、６０、９０、１２０分に、マウスの血糖を検出した。ｒｍｓＧＰ７３実験群：マウスの尾静脈にｒｍｓＧＰ７３タンパク質を注射し、用量は１００μｇ／匹であり、それぞれ０、１５、３０、６０、９０、１２０分に、マウスの血糖を検出した。ｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ実験群：１００μｇ／匹の組換えマウス可溶性ＧＰ７３および１００ｎｇ／匹のＧＣＧを共に体外で室温で１０分間インキュベートした後、マウスの尾静脈に同時注射し、それぞれ０、１５、３０、６０、９０、１２０分に、マウスの血糖を検出した。
ＧＣＧを特異的に標的とする可溶性ＧＰ７３タンパク質の糖上昇能力を一層決定するために、、ｒｍｓＧＰ７３とＧＣＧとを共にインキュベートするプロセスにおいて、抗ＧＰ７３特異性抗体６Ｂ６またはマウスＩｇＧを加え、上の実験を繰り返し、即ち、ＧＣＧ＋ｒｍｓＧＰ７３＋ＩｇＧ、ｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ＋６Ｂ６の２つの実験群を設定し、マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６～８週齢、体重２０～２５ｇ、雄）であり、各群に６匹ずつあり、それぞれ０、１５、３０、６０、９０、１２０分に採血して、マウスの血糖を検出した。
実験結果：マウスの尾静脈にＧＣＧを注射した後、血糖値が急激に上昇し、ｒｍｓＧＰ７３はＧＣＧの糖上昇能力を有意に促進する（図５Ｂに示される）。ｒｍｓＧＰ７３がＧＣＧの糖上昇能力を促進することが特異性の抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６によってブロックされる（図５Ｃに示される）。
本願発明に使用される抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、ヒト可溶性ＧＰ７３抗原を使用して動物を免疫させ、マウス可溶性ＧＰ７３抗原を用いてハイブリドーマクローンをスクリーニングすることによって得られるものである。具体的に言えば、本願発明の抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、下記の方法により製造される。ヒト可溶性ＧＰ７３組換え抗原の精製品（ＮＰ＿０５７６３２．２）を使用してＢａｌｂ／ｃマウスを免疫させ、免疫マウスの脾臓細胞を取ってマウスの骨髄腫細胞ＳＰ２／０と融合させてから、マウス可溶性ＧＰ７３抗原（ＮＰ＿００１０３０２９４．１）を使用してＧＰ７３特異的なハイブリドーマモノクローナルをスクリーニングし、安定した細胞株（当該ハイブリドーマ細胞６Ｂ６Ｇ６（６Ｂ６と略称）は、中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号に位置する中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターにブダペスト条約に基づく国際寄託されており、同寄託センターに登録された登録番号は、ＣＧＭＣＣ ＮＯ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であり、提案された分類の名前は、マウスハイブリドーマ細胞である）を確立した。培養した当該モノクローナル細胞をマウスの腹腔内に注射し、腹水を採取し、モノクローナル抗体を精製した。
実施例６．組換え可溶性ＧＰ７３は、肝臓の糖新生シグナル伝達経路の活性化および肝臓の糖生成を促進する
実験方法：肝臓の糖新生および肝臓の糖生成に対する可溶性ＧＰ７３の直接作用を研究するために、、マウスを１２ｈ飢餓状態にさせた後、マウスの初代肝細胞を抽出し、１０％の血清含有低糖ＤＭＥＭ培養液を使用して細胞を培養し、６つの細胞培養皿に播種し、３７℃の細胞培養ボックスで培養した。無血清培養の場合は、細胞が付着した後に無血清培地に交換し、引き続き一晩培養した。実験用の細胞には、血清ありおよび無血清の２つの培養方法が採用される。試験の前に、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、無糖ＤＭＥＭ培地に交換し、ピルビン酸、乳酸糖新生原材料を加え、６皿の細胞を対照群（ＰＢＳを加えたもの）の３皿および実験群（ＧＰ７３精製タンパク質１６ｎＭを加えたもの）の３皿に分け、３７℃細胞培養ボックスに入れて培養し、それぞれ０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに培地の上清を２０ｕｌ吸い取って、グルコース含有量を検出し、最後に細胞を収集してタンパク質含有量を検出し、グルコース／タンパク質で、単位細胞タンパク質の糖生成量を得た。３つの６ウェルプレートに、０ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、６３ｎＭの濃度勾配にしたがってＧＰ７３精製タンパク質を追加し、３７度の細胞培養ボックスに入れて培養し、４ｈ後に培地の上清を収集してグルコース含有量を検出し、細胞を収集してタンパク質含有量を検出し、グルコース／タンパク質で、単位細胞タンパク質の糖生成量を得た。
実験方法：肝臓の糖新生および肝臓の糖生成に対する可溶性ＧＰ７３の直接作用を研究するために、、マウスを１２ｈ飢餓状態にさせた後、マウスの初代肝細胞を抽出し、１０％の血清含有低糖ＤＭＥＭ培養液を使用して細胞を培養し、６つの細胞培養皿に播種し、３７℃の細胞培養ボックスで培養した。無血清培養の場合は、細胞が付着した後に無血清培地に交換し、引き続き一晩培養した。実験用の細胞には、血清ありおよび無血清の２つの培養方法が採用される。試験の前に、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、無糖ＤＭＥＭ培地に交換し、ピルビン酸、乳酸糖新生原材料を加え、６皿の細胞を対照群（ＰＢＳを加えたもの）の３皿および実験群（ＧＰ７３精製タンパク質１６ｎＭを加えたもの）の３皿に分け、３７℃細胞培養ボックスに入れて培養し、それぞれ０ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに培地の上清を２０ｕｌ吸い取って、グルコース含有量を検出し、最後に細胞を収集してタンパク質含有量を検出し、グルコース／タンパク質で、単位細胞タンパク質の糖生成量を得た。３つの６ウェルプレートに、０ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、６３ｎＭの濃度勾配にしたがってＧＰ７３精製タンパク質を追加し、３７度の細胞培養ボックスに入れて培養し、４ｈ後に培地の上清を収集してグルコース含有量を検出し、細胞を収集してタンパク質含有量を検出し、グルコース／タンパク質で、単位細胞タンパク質の糖生成量を得た。
ｒｍｓＧＰ７３タンパク質がマウスの初代肝細胞の糖新生鍵酵素の発現に影響を与えることができるか否かを研究するために、上記の実験を繰り返し、細胞を取得した後、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を溶解させ、細胞ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、糖新生鍵酵素Ｐｃｘ、Ｐｘｋ１、Ｇ６ｐｃに基づいて上流および下流のプライマーを設計し、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。
組換えヒト可溶性ＧＰ７３タンパク質（ｒｈｓＧＰ７３タンパク質）が肝細胞の糖新生鍵キナーゼＰＫＡのリン酸化レベルおよび酵素活性に影響を与えることができるか否かを研究するために、ＨｅｐＧ細胞でｒｈｓＧＰ７３を加え、異なる時間後、細胞溶解液を取得し、イムノブロット実験を行った。
実験結果：ＰＢＳ対照群およびｒｍｓＧＰ７３実験群は、血清あり培養の場合、マウス初代肝細胞の糖新生による糖生成量が異なり、ｒｍｓＧＰ７３実験群は、糖生成量が対照群よりも多く、かつ、飽和するまで、用量の増加に伴って多くなる（図６Ａに示される）。ＰＢＳ対照群およびｒｍｓＧＰ７３実験群は、無血清培養の場合、マウス初代肝細胞の糖新生による糖生成量が異なり、ｒｍｓＧＰ７３の実験群は、糖生成量が対照群よりも多く、かつ、飽和するまで、用量の増加に伴って多くなる（図６Ｂに示される）。６Ｂ６は、ＧＰ７３が初代肝細胞の糖新生による糖生成を促進することを特異的に阻害することができる（図６Ｃに示される）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ｒｍｓＧＰ７３群の糖新生鍵酵素Ｐｃｘ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ １）、Ｐｃｋ１ （ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、Ｇ６ｐｃ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の発現レベルが、明らかにアップレギュレートする（図６Ｄに示される）。ＰＢＳ対照群と比較すると、ｒｈｓＧＰ７３群のＰＫＡリン酸化レベル（ＰＫＡ－ｐ）およびキナーゼ活性（ＲＲＸρＳ／Ｔ）が、明らかにアップレギュレートする（図６Ｅに示される）。
糖新生プログラムの複雑な調節ネットワークにおいて、転写因子応答エレメント結合タンパク質ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＲＥＢ）は非常に重要な調節因子であり、それらは肝臓でグルカゴン－ｃＡＭＰ－ＰＫＡシグナル伝達経路を介して糖新生を促進し、したがって、ＣＲＥＢのリン酸化レベルは糖新生の状態を代表する。
実験方法：マウスの体内での糖新生に対するｒｍｓＧＰ７３の影響を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雄、８週齢、体重２０～２５ｇ）は、ＰＢＳ、ｒｍｓＧＰ７３、ＧＣＧ、ｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧの４つの群を設定し、各群に３匹ずつあり、それぞれＰＢＳ、ｒｍｓＧＰ７３（１００μｇ／匹）、ＧＣＧ（１００ｎｇ／匹）およびｒｍｓＧＰ７３＋ＧＣＧ（１００μｇ／匹のｒｍｓＧＰ７３および１００ｎｇ／匹のＧＣＧ、体外で、室温で共に１０分間インキュベートした後に注射する）を尾静脈に注射し、注射してから４８時間後、マウスを殺して、肝臓組織を単離して、イムノブロット実験を行った。イムノブロット実験には、ウサギ抗ｐＣＲＥＢポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ会社から購入、ａｂ３２０９６）およびウサギ抗ＣＲＥＢモノクローナル抗体（ＣＳＴ会社から購入、＃９１９７）が使用された。
実験結果：ＧＣＧを単独で注射すると、ＣＲＥＢのリン酸化レベルを増強することができ、ｒｍＧＰ７３は、ＧＣＧ活性化ＣＲＥＢリン酸化を有意に増強し、ｒｍｓＧＰ７３がＧＣＧとの相互作用により、その肝臓の糖新生能力を増強し、ＧＣＧの活性を促進する（図６Ｆに示される）ことを示す。同時に、ｒｍｓＧＰ７３を単独で処理しても、依然として肝臓の糖新生を促進でき、我々に、可溶性ＧＰ７３がＧＣＧに依存する方法及びＧＣＧに依存しない方法の両方で、糖新生シグナル伝達経路の活性化に関与することを再度示唆した。
実施例７．１型糖尿病マウスに対する抗ＧＰ７３抗体の糖低下作用
実験方法：６Ｂ６抗体の体内糖低下効果を一層研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔にＳＴＺを注射して、１型糖尿病が誘発されたマウスモデル（６～８週齢、体重２０～２５ｇ、雄）を用いて、１０日の安定期間後に、マウスを、対照マウスＩｇＧ群、７．５、１５、３０ｍｇ／ｋｇ用量の６Ｂ６群の計４つの群にランダムに割り当て、各群に７匹ずつある（具体的な群分け状況は、表３に示すとおりである）。実験が終了するまで、毎日尾静脈に投与し、７日おきにマウスの体重と空腹時血糖をモニターした。
実験方法：６Ｂ６抗体の体内糖低下効果を一層研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔にＳＴＺを注射して、１型糖尿病が誘発されたマウスモデル（６～８週齢、体重２０～２５ｇ、雄）を用いて、１０日の安定期間後に、マウスを、対照マウスＩｇＧ群、７．５、１５、３０ｍｇ／ｋｇ用量の６Ｂ６群の計４つの群にランダムに割り当て、各群に７匹ずつある（具体的な群分け状況は、表３に示すとおりである）。実験が終了するまで、毎日尾静脈に投与し、７日おきにマウスの体重と空腹時血糖をモニターした。
実験結果：６Ｂ６抗体治療群のマウスの体重は、対照群のマウスと有意差がない（表４に示されるように）。６Ｂ６抗体は、マウスの空腹時血糖を有意に下げる効果を有し、用量依存的な作用も有する（表５および図７Ａに示されるように）。
実験方法：４週間治療した後、採血して糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）および血中脂質のレベルを測定した。ＨｂＡ１ｃ検出キットは、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ会社（商品番号：８０３１０）から購入し、ＴＥＣＡＮ ＳＰＡＲＫ多機能酵素マーカーを用いて検出した。肝機能および血中脂質検出キットは、瑞爾達社（商品番号：ＡＬＴ１９１２３０およびＡＳＴ２００２１８）から購入し、ＲＩＥＬＥ会社のＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｌ１００生化学分析装置を用いて検出した。
実験結果：ＩｇＧで治療した糖尿病対照群のマウス血清において、ＨｂＡ１ｃの平均は８．７８±１．７％であり、中間用量および高用量の６Ｂ６抗体で治療した糖尿病マウスのＨｂＡ１ｃの平均は、それぞれ６．９９±１．６および６．７１±１．５（表６および図７Ｂ）であり、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６が、ＳＴＺ－誘発性Ｔ１ＤマウスのＨｂＡ１ｃレベルを用量依存方法で下げることを示す。肝機能および血中脂質結果は、抗体を連続的に４週間注射した後、マウスＡＳＴのレベルが中間用量の抗体によって有意に下げられ（表６）、抗体がＳＴＺ誘発性肝臓損傷に対してある程度の保護作用を有する可能性があることを示唆する。これに加え、抗体治療群のマウスは、トリグリセリドおよびコレステロールのレベルも対照群マウスよりも有意に低い（表６）。
実施例８．１型糖尿病マウスの膵島に対する抗ＧＰ７３抗体の保護作用
実験方法：ＧＰ７３によってＳＴＺの誘発による膵島損傷に対する保護効果がブロックされることを一層研究するために、ＳＴＺの腹腔内注射によって誘発される１型糖尿病マウスモデルを用いた。この実施例において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを一晩絶食させ（雄、８～１０週齢、２０～２２ｇ）、ＳＴＺ（１７５ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射を行った。１０日の安定期間後、動物の体重および空腹時血糖に基づいて、コンピュータによって生成されるランダムプロセスを使用して、マウスをマウスＩｇＧ対照群および２４ｍｇ／ｋｇ用量の６Ｂ６実験群の計２つの群にランダムに割り当て、各群に３匹ずつある。実験が終了するまで、毎日尾静脈を介して投与した。４週間投与した後、マウスを殺して、膵島組織を取得した後、ホルマリンで固定して、パラフィンスライスを製造し、３色免疫蛍光を用いて染色した。ここで、ＤＡＰＩ青色が細胞の核であり、インスリン染色が陽性のβ細胞は緑色であり、グルカゴン染色が陽性のα細胞は赤色である。
実験方法：ＧＰ７３によってＳＴＺの誘発による膵島損傷に対する保護効果がブロックされることを一層研究するために、ＳＴＺの腹腔内注射によって誘発される１型糖尿病マウスモデルを用いた。この実施例において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを一晩絶食させ（雄、８～１０週齢、２０～２２ｇ）、ＳＴＺ（１７５ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内注射を行った。１０日の安定期間後、動物の体重および空腹時血糖に基づいて、コンピュータによって生成されるランダムプロセスを使用して、マウスをマウスＩｇＧ対照群および２４ｍｇ／ｋｇ用量の６Ｂ６実験群の計２つの群にランダムに割り当て、各群に３匹ずつある。実験が終了するまで、毎日尾静脈を介して投与した。４週間投与した後、マウスを殺して、膵島組織を取得した後、ホルマリンで固定して、パラフィンスライスを製造し、３色免疫蛍光を用いて染色した。ここで、ＤＡＰＩ青色が細胞の核であり、インスリン染色が陽性のβ細胞は緑色であり、グルカゴン染色が陽性のα細胞は赤色である。
実験結果：抗ＧＰ７３抗体によってブロックされた後、膵島α、β細胞の数はそれぞれ１倍以上増加し（図８Ａ～Ｃ）、抗ＧＰ７３抗体６Ｂ６は、１型糖尿病マウスの膵島α細胞およびβ細胞のいずれに対しても顕著な保護作用を有することを示す。β細胞／α細胞の比は２０％から約２３％まで上昇し、やや上昇したが、統計学的有意差がない（図８Ｄ）。
実施例９．２型糖尿病マウスに対するＧＰ７３を特異的にブロックするＲＮＡｉの糖低下作用
ＧＰ７３をブロックすることによる血糖降下作用をさらに確認するために、、高脂肪食誘発性２型糖尿病モデルを構築し、ＧＰ７３特異性ＲＮＡｉ ｏｌｉｇｏｓノックダウン方法を用いて、２型糖尿病マウスに対する糖低下作用を研究する。
ＧＰ７３をブロックすることによる血糖降下作用をさらに確認するために、、高脂肪食誘発性２型糖尿病モデルを構築し、ＧＰ７３特異性ＲＮＡｉ ｏｌｉｇｏｓノックダウン方法を用いて、２型糖尿病マウスに対する糖低下作用を研究する。
実験方法：、まず、マウスＧＰ７３の異なる位置について計９本のＲＮＡｉ ｏｌｉｇｏｓ（表７、配列番号．１～９）を合成し、Ｈ２２マウス肝臓細胞をトランスフェクションすることにより、２４時間トランスフェクションした後、細胞を収集してイムノブロット実験を行った。
実験結果：Ｎｏ．４ ＲＮＡｉ ｏｌｉｇｏｓ配列は、細胞内因性ＧＰ７３に対してよいノックダウン効率を有する（図９Ａ）。その後、、吉瑪基因会社で３’末端コレステロール修飾、両末端チオバックボーン修飾および全鎖メトキシ修飾のＮｏ．４ ＧＰ７３ ＲＮＡｉ ｏｌｉｇｏｓ（ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ）を合成し、このような化学修飾されたｓｉＲＮＡの体内での安定性は３～６日であり、配列が乱されたＲＮＡｉ ｏｌｉｇｏｓを対照とする（Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡ；表７）。
実験方法：これを基に、、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雄、８～１０週齢、２０～２２ｇ）を選択して、高脂肪飼料で２０週間飼育した後、動物を６時間絶食させた後、空腹時血糖を検出し、血糖値が１１．３ｍＭを超えると、モデリングに成功した。空腹時血糖にしたがって、Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡ群およびＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ実験群にランダムに分け、各群に６匹ずつあり、５日ごとに１回注射し、注射方法は、先に、１回あたり４ｎＭを尾静脈に注射し、その後、腹腔に４ｎＭを注射した。１回目の注射から４週間後、マウスを殺し、血糖および糖化ヘモグロビンなどの指標を検出した。
実験結果：ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ注射群は、高脂肪誘発性２型糖尿病マウスの空腹時血糖が効果的に下がった（表８および図９Ｂ）。重要なことは、Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡ群と比較すると、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡ注射実験群のマウスは、有意な耐糖能改善（図９Ｃ－Ｄ）およびインスリン感受性の向上（図９Ｅ－Ｆ）を示す。４週間治療した後、Ｃｔｒ ｓｉＲＮＡで治療した糖尿病対照群のマウスの血清では、ＨｂＡ１ｃの平均が４．３９±０．６７％であり、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡで治療した糖尿病のマウスのＨｂＡ１ｃの平均は、それぞれ３．３７±０．５３％（表９）であり、ＧＰ７３特異性ｓｉＲＮＡが、高脂肪誘発性Ｔ２ＤマウスのＨｂＡ１ｃレベルを下げることができることを示す。肝機能および血中脂質の結果は、ＧＰ７３ ｓｉＲＮＡを連続的に４週間注射した後、マウスの血清中のＡＳＴ、ＡＬＴおよびコレステロールのレベルを有意に下げ、我々に、ＧＰ７３のブロックは、血中脂質低下、肝機能保護の作用を有する（表９）ことを示唆する。
本願発明において、血清中のＧＰ７３レベルの上昇は、ヒト糖尿病と密接に関連し、糖尿病を治療する魅力的な標的であることが証明され、ＧＰ７３はグルカゴンと相互作用し、グルカゴン依存およびグルカゴン不依存の２つの方法で、肝臓および／または腎臓の糖新生を促進するため、ＧＰ７３を阻害することは、糖尿病を治療する効果的な策略である。
本願発明の実施例は、糖尿病治療用の薬物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用を提供し、当該使用で血糖を調節し、発明者らはさらに、動物実験により、ＧＰ７３阻害剤が糖尿病マウスの血糖値および糖化ヘモグロビンレベルを下げることができ、膵島β細胞に対して保護作用を有し、糖尿病の治療効果を奏することを証明した。
Claims (19)
- 糖尿病およびその合併症の治療用医薬組成物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用であって、前記ＧＰ７３阻害剤が抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９若しくはそれと少なくとも９０％の相同性を有するＧＰ７３ ｓｉＲＮＡであり、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である前記使用。
- 有効成分としてのＧＰ７３阻害剤を含む、ことを特徴とする糖尿病およびその合併症の治療用医薬組成物であって、前記ＧＰ７３阻害剤が抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９若しくはそれと少なくとも９０％の相同性を有するＧＰ７３ ｓｉＲＮＡであり、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である前記医薬組成物。
- 前記糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病が含まれる、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。 - 前記糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病が含まれる、
ことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。 - 前記糖尿病の治療には、（１）空腹および／または食後の血糖を下げること、（２）耐糖能を改善すること、（３）膵島α細胞および／または膵島β細胞を保護すること、（４）グルカゴンの糖上昇能力および／または糖新生能力を下げること、（５）グルカゴンの半減期を短縮すること、（６）ＧＰ７３自体のインスリンに依存しない糖上昇作用および糖新生の機能を下げること、のうちのいずれか１つまたは複数が含まれる、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。 - 前記糖尿病の治療には、（１）空腹および／または食後の血糖を下げること、（２）耐糖能を改善すること、（３）膵島α細胞および／または膵島β細胞を保護すること、（４）グルカゴンの糖上昇能力および／または糖新生能力を下げること、（５）グルカゴンの半減期を短縮すること、（６）ＧＰ７３自体のインスリンに依存しない糖上昇作用および糖新生の機能を下げること、のうちのいずれか１つまたは複数が含まれる、
ことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。 - 糖尿病合併症には、糖尿病性腎症、糖尿病性眼合併症、糖尿病性足、糖尿病性末梢神経障害のうちのいずれか１つまたは複数が含まれ、ここで、糖尿病性眼合併症には、糖尿病性網膜症、糖尿病に関連するブドウ膜炎、糖尿病性白内障のうちの１つまたは複数が含まれる、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。 - 糖尿病合併症には、糖尿病性腎症、糖尿病性眼合併症、糖尿病性足、糖尿病性末梢神経障害のうちのいずれか１つまたは複数が含まれ、ここで、糖尿病性眼合併症には、糖尿病性網膜症、糖尿病に関連するブドウ膜炎、糖尿病性白内障のうちの１つまたは複数が含まれる、
ことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。 - 糖尿病およびその合併症を治療する医薬組成物には、さらに、糖尿病を治療する他の医薬または医薬組成物医薬が含まれ、場合によって、前記糖尿病を治療する他の医薬または組成物は、インスリン、ジメチルビグアニド、スルホニル尿素系血糖降下剤、ａグリコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン類、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）類似物、ＳＧＬＴ２阻害剤から１つまたは複数選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。 - 糖尿病およびその合併症を治療する医薬組成物には、さらに、糖尿病を治療する他の医薬または医薬組成物医薬が含まれ、場合によって、前記糖尿病を治療する他の医薬または組成物は、インスリン、ジメチルビグアニド、スルホニル尿素系血糖降下剤、ａグリコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン類、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）阻害剤、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）類似物、ＳＧＬＴ２阻害剤から１つまたは複数選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。 - グルカゴンの阻害用医薬組成物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用であって、前記ＧＰ７３阻害剤が抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９若しくはそれと少なくとも９０％の相同性を有するＧＰ７３ ｓｉＲＮＡであり、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である前記使用。
- ＧＰ７３阻害剤を含む、
ことを特徴とするグルカゴンの阻害用医薬組成物であって、前記ＧＰ７３阻害剤が抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９若しくはそれと少なくとも９０％の相同性を有するＧＰ７３ ｓｉＲＮＡであり、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である前記医薬組成物。 - 前記グルカゴンの阻害には、（１）グルカゴンの半減期を短縮すること、（２）グルカゴンの糖上昇能力および／または糖新生能力を下げることのうちのいずれか１つまたは複数が含まれる、
ことを特徴とする請求項１１に記載の使用。 - 前記グルカゴンの阻害には、（１）グルカゴンの半減期を短縮すること、（２）グルカゴンの糖上昇能力および／または糖新生能力を下げることのうちのいずれか１つまたは複数が含まれる、
ことを特徴とする請求項１２に記載の医薬組成物。 - 糖尿病検出試薬の製造における血清中の可溶性ＧＰ７３検出試薬の使用。
- 前記糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病が含まれる、
ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。 - ＧＰ７３を検出する試薬は、血清中の可溶性ＧＰ７３を検出する試薬を含む、
ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。 - 糖新生シグナル伝達経路阻害用医薬組成物の製造におけるＧＰ７３阻害剤の使用であって、前記ＧＰ７３阻害剤が抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９若しくはそれと少なくとも９０％の相同性を有するＧＰ７３ ｓｉＲＮＡであり、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体であり、かつ前記糖新生シグナル伝達経路を阻害することには、（１）肝細胞の糖新生による糖生成を阻害すること、（２）糖新生の鍵酵素Ｐｃｘ、Ｐｃｋ１、Ｇ６ｐｃの発現レベルをダウンレギュレートすること、（３）ＰＫＡリン酸化レベルおよびキナーゼ活性をダウンレギュレートすることのうちのいずれか１つまたは複数が含まれる前記使用。
- ＧＰ７３阻害剤を含む、
ことを特徴とする糖新生シグナル伝達経路の阻害用医薬組成物であって、前記ＧＰ７３阻害剤が抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９若しくはそれと少なくとも９０％の相同性を有するＧＰ７３ ｓｉＲＮＡであり、前記抗ＧＰ７３モノクローナル抗体６Ｂ６は、中国微生物菌種保存管理委員会普通微生物センターに保存され、寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１８１６５であり、寄託日は２０１９年６月２０日であるハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体であり、かつ前記糖新生シグナル伝達経路を阻害することには、（１）肝細胞の糖新生による糖生成を阻害すること、（２）糖新生の鍵酵素Ｐｃｘ、Ｐｃｋ１、Ｇ６ｐｃの発現レベルをダウンレギュレートすること、（３）ＰＫＡリン酸化レベルおよびキナーゼ活性をダウンレギュレートすることのうちのいずれか１つまたは複数が含まれる前記医薬組成物。
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