CN109932509B - 检测或抑制细胞外游离mg53的方法和用途 - Google Patents

检测或抑制细胞外游离mg53的方法和用途 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种用于检测MG53相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法，该方法包括以下步骤：a.获得待测样品；和b.检测在所述待测样品中的细胞外游离MG53。本申请还涉及一种用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53活性的方法，该方法包括向需要其的客体施用有效量的MG53抑制剂。此外，本申请还涉及一种MG53抗体或其抗原结合片段，编码该等抗体或其抗原结合片段的核酸，包括该等核酸的克隆或表达载体，包括该等克隆或表达载体的宿主细胞，以及包括上述各产品的药物组合物。再者，本申请还涉及一种用于检测细胞外游离MG53的检测试剂及其用途以及MG53抑制剂在制备用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53的药物中的用途。

Description

检测或抑制细胞外游离MG53的方法和用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体地，本申请涉及一种用于检测细胞外游离MG53、或者检测相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法和一种用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53活性的方法，以及用于所述方法的组合物。
背景技术
Mitsugumin 53(MG53)又称为TRIM72，是三结构域蛋白(Tripartite motif-containing Proteins，TRIM)家族中的一员。MG53由N端的TRIM结构域和C端的SPRY结构域组成，TRIM结构域由依次相连的Ring、B-box、coiled-coil结构域组成(参见Chuanxi Caiet al.，the Journal of Biological Chemistry，Vol.284(5)，3314-3322(2009))。MG53主要表达在横纹肌中，对于骨骼肌和心脏甚至整个机体的稳态维持发挥着重要作用。之前发现，MG53具有细胞修复功能和心脏保护功能(参见，例如，Chuanxi Cai et al.，NatureCell Biology，Vol.11，56-64(2009)；CN101797375B)。另外，进一步的研究发现，在缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)和缺血后适应(ischemic postconditioning，PostC)中，MG53也是起保护作用的重要分子之一，MG53分子的两端可以分别与Caveolin-3以及p85-PI3K激酶相互结合形成复合物，并激活下游的再灌损伤保护激酶(reperfusioninjury salvage kinase，RISK)途径，从而实现心肌细胞和心脏的保护作用(参见，Chun-Mei Cao et al.，Circulation 121，2565-2574，(2010))。
之前对MG53的研究还发现，MG53具有E3泛素连接酶活性，参与调控胰岛素抵抗和代谢综合征的发生发展。例如，在两篇文献中报道了MG53 N端的TRIM结构域中的Ring结构域具有E3泛素连接酶活性，可以与胰岛素受体(insulin receptor，IR)及胰岛素受体底物(insulin receptor substrate-1，IRS1)结合，并介导它们的泛素化修饰和蛋白酶体途径的降解，进而阻遏胰岛素信号通路，导致以胰岛素抵抗为发病核心环节的肥胖、糖尿病、高血压、血脂异常等代谢类疾病的发生发展(参见，例如，R.Song et al.，Nature 494，375-379，(2013)；J.S.Yi et al.，Nature communications 4，2354(2013))。
但是，现有技术中普遍认为MG53仅在细胞内发挥与调控胰岛素抵抗和代谢综合征的发生发展相关的活性。
发明概述
本申请涉及一种用于检测MG53相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法以及一种用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53活性的方法。此外，本申请还涉及一种MG53抗体或其抗原结合片段，编码该等抗体或其抗原结合片段的核酸，包括该等核酸的克隆或表达载体，包括该等克隆或表达载体的宿主细胞，以及包括上述各产品的药物组合物。而且，本申请还涉及一种用于检测细胞外游离MG53的检测试剂在制备试剂盒中的用途以及MG53抑制剂在制备用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53的药物中的用途。
一方面，本申请涉及一种用于检测MG53相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法，包括以下步骤：a.获得待测样品；和b.检测在所述待测样品中的细胞外游离MG53。
在某些实施方式中，所述待测样品是体液。在某些实施方式中，所述待测样品选自全血、血浆、血清、组织液、尿液或者汗液。在某些实施方式中，所述待测样品选自全血、血浆或血清。在某些实施方式中，所述待测样品基本上不含细胞。
在某些实施方式中，所述步骤b包括将MG53检测试剂与所述待测样品接触。在某些实施方式中，所述MG53检测试剂是MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段。在某些实施方式中，所述MG53检测试剂是可以与MG53结合的小分子化合物。在某些实施方式中，所述MG53检测试剂具有可检测标记。在某些实施方式中，所述可检测标记具有发光性、磁性、放射性或酶活性。在某些实施方式中，所述步骤b包括进行放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。
在某些实施方式中，本申请所述的方法进一步包括：c.将步骤b中获得的MG53的检测数值与对照数值进行比较。在某些实施方式中，所述对照数值来自于对照样品。在某些实施方式中，所述对照样品与待测样品来自于相同或不同的客体。在某些实施方式中，所述对照样品与待测样品来自于相同的客体，但是对照样品的采集时间早于或晚于待测样品一段时间。在某些实施方式中，所述一段时间中所述客体接受了治疗或健康状态发生了变化。在某些实施方式中，所述对照数值是从健康客体或患有MG53相关疾病的客体中获得的。在某些实施方式中，所述客体是人或非人哺乳动物。
在某些实施方式中，所述MG53相关疾病是代谢综合征。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病是糖代谢或脂质代谢相关疾病。在某些实施方式中，所述糖代谢或脂质代谢相关疾病选自胰岛素抵抗症、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖、高血脂、高血压和肥胖组成的组。
另一方面，本申请涉及一种用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53活性的方法，其包括向需要其的客体施用有效量的MG53抑制剂。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂与MG53特异性结合。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括三个重链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段进一步包括三个轻链互补决定区，所述三个轻链互补决定区包含在SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列中。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括重链，所述重链包括如下序列或者与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、3、9、11、17、19、25、27、33或35所示的序列。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括轻链，所述轻链包括如下序列或者与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34或36所示的序列。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是小分子化合物。在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是具有式Ia或Ib的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001840075660000031
其中，L为化学键、或任选取代的C1-C12亚烷基；M为化学键、或任选取代的C6-C12芳香亚基或5-12元杂环亚基；X为化学键、或任选取代的-CH＝N-NH-C(O)-、-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-O-C(O)-或-O-C(O)-CH＝CH-；Y为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；Q为任选取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；T为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；R1各自独立地为氢、硝基、卤素、羟基、氰基、或任选取代的C1-C12烷基或C1-C12烷氧基；n为1-5的任意正整数。
在某些实施方式中，所述L为化学键或C1-C3亚烷基。在某些实施方式中，所述M为化学键、或任选取代的苯亚基或呋喃亚基。在某些实施方式中，所述Y为任选取代的苯基、呋喃基、喹啉基或苯并二恶茂基。在某些实施方式中，所述Q为任选取代的C1-C3亚烷基或C2-C3亚烯基。在某些实施方式中，所述T为任选取代的苯基或1，3，4-噻二唑基。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是具有式II的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001840075660000041
其中，A为氢、或任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；G为-C(O)-O-R3，其中R3是任选取代的C1-C12烷基；J为任选取代的C6-C12芳基；或者G和J连同其连接的碳原子共同形成
Figure BDA0001840075660000042
其中R4各自独立地为氢、硝基、卤素、羟基、氰基、或任选取代的C1-C12烷基或C1-C12烷氧基，n为1-4的任意正整数；B为化学键、或任选取代的C6-C12芳香亚基或5-12元杂环亚基；D为化学键、或任选取代的-O-R5-，其中R5选自任选取代的C1-C12亚烷基；E为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基。
在某些实施方式中，所述A是任选取代的萘基、苯基或噻吩基。在某些实施方式中，所述G为-C(O)-O-R3，其中R3是任选取代的C1-C3烷基；J选自任选取代的苯基；或者G和J连同其连接的碳原子共同形成
Figure BDA0001840075660000043
其中R4均为氢。在某些实施方式中，所述B为化学键、或任选取代的亚苯基或呋喃亚基。在某些实施方式中，所述D为化学键、或任选取代的-O-CH2-。在某些实施方式中，所述E为任选取代的苯基。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是具有式III的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001840075660000051
其中，A为氢、或任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；Y各自独立地为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；R7为氢、硝基、卤素、羟基、氰基、或任选取代的C1-C12烷基或C1-C12烷氧基。
在某些实施方式中，A为任选取代的苯基。在某些实施方式中，Y为任选取代的苯基。在某些实施方式中，R7为氢、硝基、卤素、羟基或氰基。
在某些实施方式中，上述任一实施方式中提及的所述“任选取代的”是指不被取代基取代或者被选自下组的一个或多个取代基取代：硝基、卤素、羟基、氰基、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、苯甲酰胺基、或-C(O)-O-R6，其中所述C1-C12烷基、C1-C12烷氧基或苯甲酰胺基可以进一步被硝基、卤素、羟基、氰基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基取代，其中R6为氢或C1-C3烷基。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是如下化合物或其药学上可接受的盐。
Figure BDA0001840075660000052
Figure BDA0001840075660000061
Figure BDA0001840075660000071
在某些实施方式中，本申请所述的方法可用于缓解、治疗或预防MG53相关疾病或其症状。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病为代谢综合征。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病为糖代谢或脂质代谢相关疾病。在某些实施方式中，所述糖代谢或脂质代谢相关疾病选自胰岛素抵抗症、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血压和肥胖组成的组。
在某些实施方式中，糖尿病脑血管疾病包括脑动脉硬化、缺血性脑血管病、脑出血、脑萎缩和脑梗塞。
在某些实施方式中，糖尿病眼部并发症包括糖尿病性视网膜病变、糖尿病性白内障、与糖尿病相关的葡萄膜炎和失明。
在某些实施方式中，糖尿病神经病变包括糖尿病周围神经病变。
另一方面，本申请涉及一种MG53抗体或其抗原结合片段，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括三个重链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段进一步包括三个轻链互补决定区，所述三个轻链互补决定区包含在SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列中。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括重链，其中所述重链具有如下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ IDNO：1、3、9、11、17、19、25、27、33或35所示的序列。在某些实施方式中，所述的MG53抗体或其抗原结合片段，其进一步包括轻链，其中所述轻链具有如下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、4、10、12、18、20、26、28、34或36所示的序列。
另一方面，本申请涉及一种抗体或抗原结合片段，其与上述任一实施方式中所述的抗体或抗原结合片段竞争性结合MG53。
另一方面，本申请涉及一种分离的核酸，其编码上述任一实施方式中所述的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，所述分离的核酸包括如下核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或者99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：5、6、7、8、13、14、15、16、21、22、23、24、29、30、31、32、37、38、39或40所示的序列。
另一方面，本申请涉及一种克隆或表达载体，其包括上述任一实施方式中所述的分离的核酸。
另一方面，本申请涉及一种宿主细胞，其包括上述任一实施方式中所述的克隆或表达载体。
再一方面，本申请涉及一种药物组合物，其包括上述任一实施方式中所述的抗体或抗原结合片段、上述任一实施方式中所述的克隆或表达载体、或上述任一实施方式中所述的细胞，以及药学上可接受的辅料。
另一方面，本申请涉及一种用于检测细胞外游离MG53的检测试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测MG53相关疾病、预测MG53相关疾病的风险或进展、鉴定潜在的MG53抑制剂、评估对MG53相关疾病的治疗效果或检测细胞外游离MG53的活性。在某些实施方式中，所述检测细胞外游离MG53的检测试剂可以是上述任一实施方式中所述的MG53检测试剂。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病可以是上述任一实施方式中所述的MG53相关疾病。
另一方面，本申请涉及一种MG53抑制剂在制备用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53的药物中的用途。在某些实施方式中，所述MG53抑制剂可以是上述任一实施方式中所述的MG53抑制剂。在某些实施方式中，所述方法可以用于缓解、治疗或预防MG53相关疾病或其症状。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病可以是上述任一实施方式中所述的MG53相关疾病。
附图说明
图1：野生型MG53的分子结构模式图。
图2：用于检测MG53抗体与抗原蛋白亲和力的SPR实验结果图，该抗体的KD＝17.7nM。
图3：a.用于检测MG53与胰岛素受体胞外区亲和力的SPR实验结果图，MG53与胰岛素受体胞外区的KD＝8.0nM；b.用于检测MG53抗体阻断MG53与胰岛素受体胞外区结合的SPR实验结果图。抗体的Ki＝265nM。
图4：使用本申请的抗体做为一抗通过蛋白质免疫印迹方法检测MG53-/-小鼠(MG53基因敲除)和野生型小鼠血清中MG53的含量。上图是蛋白免疫印记图，下图是根据免疫印迹图计算出的数值绘制的柱状图。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图5：使用本申请的抗体做为一抗通过蛋白质免疫印迹方法检测TG小鼠(MG53基因过表达)和野生型小鼠血清中MG53的含量。上图是蛋白免疫印记图，下图是根据免疫印迹图计算出的数值绘制的柱状图。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图6：使用本申请的抗体做为一抗通过蛋白质免疫印迹方法检测重组小鼠MG53和重组人MG53。
图7：使用本申请的抗体做为一抗通过蛋白质免疫印迹方法检测II型糖尿病病人和正常人血清中MG53的含量。上图是蛋白免疫印记图，下图是根据免疫印迹图计算出的数值绘制的柱状图。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图8：使用本申请的抗体做为一抗通过蛋白质免疫印迹方法检测高脂肪饮食小鼠和正常饮食小鼠血清中MG53的含量。上图是蛋白免疫印记图，下图是根据免疫印迹图计算出的数值绘制的柱状图。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图9：a.禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠的血清MG53的含量；b.禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠中血清MG53浓度与体重的关系图；c.禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠中血清MG53浓度与血糖水平的关系图；d.禁食正常大鼠和禁食ZDF大鼠中血清MG53浓度与血清胰岛素水平的关系图。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图10：检测了在注射或不注射胰岛素，以及随后注射BSA或rhMG53的小鼠中在不同组织(骨骼肌、肝、内脏脂肪以及心脏)中GAPDH(对照)、Akt以及胰岛素诱导的磷酸化后的Akt的浓度。上图是蛋白免疫印记图，下图是根据免疫印迹图计算出的数值绘制的柱状图。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，利用One-way anova统计检验。
图11：a.正常小鼠和糖尿病模型小鼠的血清MG53的含量；b.对照组(给药IgG)和治疗组(给药MG53抗体)中的血糖水平；c.胰岛素耐受实验中，对照组(给药IgG)和治疗组(给药MG53抗体)的血糖水平。其中**表示P＜0.01，具有显著差异，*表示P＜0.05，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图12：分别在HEK293T细胞和HEK293A细胞中共转染IRS1质粒(IRS1-GFP)以及带Myc标记的MG53质粒(MG53-myc)，检测GFP的荧光强度，其中**表示P＜0.01，具有显著差异，*表示P＜0.05，具有显著差异，利用t-test统计检验。
图13：用于筛选不同候选分子的SPR实验的响应值。
图14：a.化合物1的SPR实验的响应值；b.化合物10的SPR实验的响应值；c.化合物26的SPR实验的响应值；d.化合物16的SPR实验的响应值。
图15：在HEK293T中共转染IRS1质粒(IRS1-GFP)以及带Myc标记的MG53质粒(MG53-myc)，并且分别加入化合物1、10、26和16，随后检测GFP的荧光强度。***表示P＜0.001，具有显著差异，利用One-way anova统计检验。
图16：显示抗体#6的重链氨基酸序列SEQ ID NO：3及其编码核酸序列SEQ ID NO：7。其中，阴影标示的序列对应于抗体#6的重链可变区。
图17：显示抗体#6的轻链氨基酸序列SEQ ID NO：4及其编码核酸序列SEQ ID NO：8。其中，阴影标示的序列对应于抗体#6的轻链可变区。
图18：显示抗体#110的重链氨基酸序列SEQ ID NO：11及其编码核酸序列SEQ IDNO：15。其中，阴影标示的序列对应于抗体#110的重链可变区。
图19：显示抗体#110的轻链氨基酸序列SEQ ID NO：12及其编码核酸序列SEQ IDNO：16。其中，阴影标示的序列对应于抗体#110的轻链可变区。
图20：显示抗体#84的重链氨基酸序列SEQ ID NO：19及其编码核酸序列SEQ IDNO：23。其中，阴影标示的序列对应于抗体#84的重链可变区。
图21：显示抗体#84的轻链氨基酸序列SEQ ID NO：20及其编码核酸序列SEQ IDNO：24。其中，阴影标示的序列对应于抗体#84的轻链可变区。
图22：显示抗体#9的重链氨基酸序列SEQ ID NO：27及其编码核酸序列SEQ ID NO：31。其中，阴影标示的序列对应于抗体#9的重链可变区。
图23：显示抗体#9的轻链氨基酸序列SEQ ID NO：28及其编码核酸序列SEQ ID NO：32。其中，阴影标示的序列对应于抗体#9的轻链可变区。
图24：显示抗体#43的重链氨基酸序列SEQ ID NO：35及其编码核酸序列SEQ IDNO：39。其中，阴影标示的序列对应于抗体#43的重链可变区。
图25：显示抗体#43的轻链氨基酸序列SEQ ID NO：36及其编码核酸序列SEQ IDNO：40。其中，阴影标示的序列对应于抗体#43的轻链可变区。
图26：显示人野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：41、猴子野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：42、大鼠野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：43以及小鼠野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：44。
图27：显示猪野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：45、狗野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：46、兔野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：47以及狨猴野生型MG53的氨基酸序列SEQ ID NO：61。
图28：显示一些MG53突变体的序列(SEQ ID NO：48-50)。
图29：显示一些MG53突变体的序列(SEQ ID NO：51-53)。
图30：显示一些MG53突变体的序列(SEQ ID NO：54-57)。
图31：显示人胰岛素受体的序列(SEQ ID NO：58)。
图32：显示高糖和高胰岛素诱导的在离体灌流的啮齿类动物心脏中的MG53释放。图32A示出了代表性的免疫印记(上方板块)和平均数据(下方板块)，其表明高糖会在离体灌流的大鼠心脏中以时间依赖的方式增加灌流液中的MG53(n＝12个心脏)。图32B示出了代表性的免疫印记(上方板块)和平均数据(下方板块)，其表明高糖会在离体灌流的大鼠心脏中以浓度依赖的方式增加灌流液中的MG53水平(n＝10个心脏)。图32C示出了用高浓度的D-葡萄糖(25mM)或者L-葡萄糖(在存在11.1mM的基底D-葡萄糖的条件下，13.9mM L-葡萄糖)(n＝8/组)灌流的离体大鼠心脏中的灌流液中的MG53；获取基础条件下(0分钟，11.1mM D-葡萄糖)的数据和处理30分钟后的数据。图32D用胰岛素刺激，其他条件与图32A一致(n＝11)。图32E用胰岛素刺激，其他条件与图32A一致(n＝6)。图32F示出了在离体灌流的大鼠心脏中用高糖(25mM)结合高胰岛素(10单位/升)(葡萄糖+胰岛素)的代谢刺激(n＝15)。图32G和图32H示出了MG53转基因小鼠心脏灌流液中的MG53比野生型对照小鼠更为丰富，无论是在基础状态还是代谢刺激状态(葡萄糖+胰岛素，25mM葡萄糖结合10单位/升胰岛素)(图32G)，而在mg53-/-小鼠心脏灌流液中无法检测到MG53(图32H)(n＝8/组)。在所有的柱状图中，数据都已归一化至对应的通过亮绿染色得到的非特异性条(NS)，并且以平均值±标准差表示(*P＜0.05，**P＜0.01)；A-E、G和H进行单向ANOVA，并且F进行t-test。各柱状图的对照为各自凝胶的第一泳道。
图33：显示高糖和高胰岛素诱导的离体骨骼肌中的MG53分泌和体内的MG53分泌。图33A示出了代表性的免疫印记(上方板块)和平均数据(下方板块)，其表明经过或不经过高浓度的葡萄糖(25mM)和胰岛素(10单位/升)(葡萄糖+胰岛素)处理(n＝12)，小鼠比目鱼肌的灌流液中的MG53水平。图33B示出了代表性的免疫印记和平均数据，其表明高血糖(葡萄糖，2g/kg，腹腔注射，以40分钟间隔重复三次)增加野生型小鼠中的血清MG53(n＝8)。图33C示出了代表性的免疫印记和平均数据，其表明口服葡萄糖施用(75g，以30分钟间隔施用两次)(n＝8)前后的来自健康人体的血清MG53。图33D示出了BFA剂量依赖性地抑制C2C12细胞中的MG53释放。细胞经Ad-b-gal或Ad-MG53感染，并且用高糖(25mM)孵育3小时(n＝8)。图33E示出了BFA(30mM)阻断高糖(25mM)结合高胰岛素(10单位/升)(葡萄糖+胰岛素)诱导的大鼠离体灌流的心脏中灌流液中MG53的增加(n＝10)。图33F示出了EDTA-Na(0.75mM)阻断代谢压力(葡萄糖+胰岛素，25mM葡萄糖结合10单位/升胰岛素)诱导的大鼠离体灌流的心脏中灌流液中MG53的增加(n＝10)。图33G示出了代谢刺激(葡萄糖+胰岛素，25毫摩尔葡萄糖结合10单位/升胰岛素)提高野生型小鼠的MG53释放，而syt7-/-小鼠心脏则不然(n＝10)。图33H示出了高血糖(葡萄糖，2g/kg，腹腔注射，以40分钟间隔重复三次)增加野生型小鼠中的血清MG53，而syt7-/-小鼠则不然(n＝10)。在所有的下方板块中，数据都已归一化至对应的通过亮绿染色得到的非特异性条(NS)，并且以均值±标准差表示(*P＜0.05，**P＜0.01)；A进行t-test，并且B-H进行单向ANOVA。
图34：显示心脏特异性的MG53过表达导致系统性胰岛素抵抗和代谢综合征。图34A示出了代表性的免疫印记和平均数据，其表明14周龄野生型和MG53心脏特异性过表达的转基因小鼠(mg53 h-TG)中的血清MG53水平(野生型n＝12，mg53 h-TG n＝14)。图34B示出了3至38周龄野生型和mg53 h-TG小鼠禁食体重(野生型n＝28，mg53 h-TG n＝22)。图34C示出了在指定年龄的野生型和mg53 h-TG小鼠中的葡萄糖耐受测试(14周龄，野生型和mg53 h-TG均为n＝9；30周龄，野生型n＝7，mg53 h-TG n＝6)。图34D示出了在指定年龄的野生型和mg53 h-TG小鼠中的胰岛素耐受测试(14周龄，野生型n＝9，mg53 h-TG n＝10；30周龄，野生型n＝8，mg53 h-TG n＝7)。图34E示出了30周龄时的血糖(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝13)。图34F示出了30周龄时的禁食血清胰岛素(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝13)。图34G示出了30周龄时的禁食血清甘油三酯水平(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝13)。图34H示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠尸检期间拍摄的照片，其显示腹腔内的脂肪沉积(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34I示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠的皮下和内脏脂肪重量(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34J示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠的棕色脂肪重量(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34K示出了30周龄的野生型和mg53h-TG小鼠的身体非脂肪重量和脂肪重量(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34L示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠的身体非脂肪重量和脂肪重量占体重百分比(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34M示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠白色和棕色脂肪的苏木精和伊红染色(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34N示出了30周龄的野生型和mg53h-TG小鼠肝脏的苏木精和伊红染色(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34O示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠胰腺的苏木精和伊红染色(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。图34P示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠骨骼肌的苏木精和伊红染色(野生型n＝11，mg53 h-TG n＝14)。标尺大小：白色脂肪，50μm；棕色脂肪，25μm，肝脏，100μm；以及胰腺，100μm。图34Q示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠的氧气消耗量(n＝12)。图34R示出了30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠的CO2产量(n＝12)。图34S示出了30周龄的野生型和mg53h-TG小鼠每天的能量消耗(n＝12)。数据为平均值±标准差。相对于野生型，*P＜0.05，**P＜0.01；t-test。
图35：显示高糖和高胰岛素诱导的MG53从横纹肌中的释放。图35A示出了灌流液中的乳酸脱氢酶(LDH，n＝10)，其来自经或不经高糖(25mM)和高胰岛素(10单位/升)刺激30分钟的小鼠心脏的灌流液。图35A示出了来自经或不经高糖(25mM)和高胰岛素(10单位/升)刺激30分钟的小鼠心脏的灌流液的肌酸激酶(CK，n-8)。图35C示出了来自经或不经高糖(25mM)和高胰岛素(10单位/升)处理的小鼠骨骼肌(比目鱼肌)的灌流液的LDH水平(n＝10)。图35D示出了来自经或不经高糖(25mM)和高胰岛素(10单位/升)处理的小鼠骨骼肌(比目鱼肌)的灌流液的CK水平(n＝10)。数据为平均值±标准差。
发明详述
尽管本申请将在以下公开多个方面和实施方式，但是在不违背本申请主题精神和范围的前提下，本领域技术人员显然可以对其进行各种等同改变和修改。本申请公开的多个方面和实施方式仅用于举例说明，其并非旨在限制本申请，本申请的实际保护范围以权利要求为准。除非另外指明，本申请中使用的所有技术和科学术语均具有与本申请所属领域中的普通技术人员通常所理解的含义。本申请中引用的所有参考文献、专利、专利申请均通过整体引用并入本申请。
检测MG53相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法
一方面，本申请涉及一种用于检测MG53相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法，包括以下步骤：a.获得待测样品；和b.检测在所述待测样品中的细胞外游离MG53。
MG53
本申请中使用的术语“MG53”是指动物体内表达的天然存在的野生型MG53以及MG53突变体。
MG53蛋白存在于很多动物体内，包括但不限于，人、大猩猩、猴子、猪、牛、狗、家兔、大鼠、小鼠等哺乳动物。MG53蛋白是一种多功能蛋白，其结构如图1所示。各物种的全长MG53蛋白长度略有不同，但是通常具有约477个氨基酸，由N端的TRIM结构域和C端的SPRY结构域组成，TRIM结构域由依次相连的Ring、B-box、coiled-coil结构域(RBCC)组成。MG53蛋白是膜修复的重要组分之一，在缺血再灌注损伤的预适应保护和后适应保护中发挥重要作用，同时MG53蛋白的高表达也会引起胰岛素抵抗和代谢综合征的发生。关于MG53的结构、功能以及与其他蛋白的相互作用，本领域中已有详细报道(参见，例如，Chuanxi Cai et al.，Journal of Biological Chemistry，284(5)，3314-3322，(2009)；Xianhua Wang et al.，Circulation Research 107，76-83，(2010)；Eun Young Park et al.，Proteins，790-795(2009))。
在某些实施方式中，野生型MG53的氨基酸序列如SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47或61所示，分别对应于人、恒河猴/食蟹猴、大鼠、小鼠、猪、狗、兔和狨猴的野生型MG53蛋白。在某些实施方式中，本申请所使用的术语“MG53”是指来源于所检测或治疗的客体的MG53。
待测样品
本申请中使用的术语“待测样品”，是指从客体体内获得的或者从客体的体外或离体样本获得的样品，包括本领域技术人员认为含有或可能含有细胞外游离MG53的来自客体的任何材料。在某些实施方式中，所述待测样品是血液样品。在某些实施方式中，所述待测样品是体液。在某些实施方式中，所述待测样品选自全血、血浆、血清、组织液、尿液或者汗液。在某些实施方式中，所述待测样品选自全血、血浆或血清。在某些实施方式中，所述待测样品可能进一步包含其它物质，如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物和抗生素等。
在某些实施方式中，所述待测样品中基本上不含细胞，例如不含心肌细胞、横纹肌细胞或血细胞。本申请中使用的术语“基本上不含”是指不含有多于特定量的、或者不含有多于所属领域通过使用一般去除杂质技术后所剩余量的、或者不含有实质性影响其它物质功能的量的特定物质。例如，所述样品中基本上不含细胞可以是指样品中不含有超过特定量的细胞(如，每毫升不超过1000个、800个、500个、200个、100个、50个、20个、10个、5个或1个细胞)；或者是指样品中不含有通过常规的分离手段(例如，离心取上清)后一般剩余的细胞数量的细胞。可以使用本领域已知的任何方法获得样品。例如，可以使用真空或常压采血针获得血液样品。在某些实施方式中，在进行检测前可以对采集的血液样品进行进一步的处理，例如进行离心。
MG53检测试剂
在某些实施方式中，所述MG53检测试剂是MG53抗体或其抗原结合片段、或者MG53配体或其MG53结合片段。可以使用本申请所描述的任一MG53抗体或其抗原结合片段、或MG53配体或其MG53结合片段，或者其组合作为MG53检测试剂。
在某些实施方式中，所述MG53检测试剂是可以与MG53结合的小分子化合物。可以使用本申请所描述的任一可与MG53结合的小分子化合物，或者其组合作为MG53检测试剂。
在某些实施方式中，所述MG53检测试剂进一步具有可检测标记。在某些实施方式中，所述可检测标记具有发光性、磁性、放射性或酶活性。可检测标记的例子包括，荧光标记、酶标记、放射性同位素标记、化学发光标记、电化学发光标记、金属粒子标记和半抗原标记。
荧光标记的例子包括，5-(6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(6)-羧酰胺基己酸、异硫氰酸酯荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、染料(如Cy2、Cy3和Cy5)、任选取代的香豆素(例如，AMCA、PerCP)、藻胆蛋白(例如，R-藻红蛋白(RPE)和别藻红蛋白(APC)、得克萨斯红、普林斯顿红、绿色荧光蛋白(GFP)及其类似物、R-藻红蛋白和别藻红蛋白的偶联物、以及无机荧光标记(如基于半导体材料的粒子(如涂覆CdSe纳米晶的粒子))。
酶标记的例子包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、蔗糖酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。
辣根过氧化物酶常用底物的例子包括，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)、镍增强的二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、联苯胺二盐酸盐(BDHC)、Hanker-Yates试剂(HYR)、靛酚蓝(IB)、四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚派洛宁(α-NP)、邻联茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、2-(p-碘苯基)-3-p-硝基苯基-l-5-苯基氯化四氮唑(INT)、四硝基四氮唑蓝(TNBT)、和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-半乳糖苷/铁-铁氰化钾(BCIG/FF)。
碱性磷酸酶常用底物的例子包括，萘酚-AS-B 1-磷酸盐/快速红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快速红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/-快速红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快速红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚磷酸盐/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)、和5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-吡喃半乳糖苷(BCIG)。
放射性同位素标记的例子包括碘、钴、硒、氚、碳、硫和磷的同位素。
化学发光标记的例子包括鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1，2-二氧戊环和吡啶并哒嗪。
电化学发光标记的例子包括钌衍生物。
金属粒子标记的例子包括金粒子和涂层金粒子，其可以通过银染被转化。
半抗原标记的例子包括DNP、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、生物素和地高辛。
在某些实施方式中，示例性的可检测标记具有如下结构中的一种或多种。
Figure BDA0001840075660000181
这些可检测标记可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、络合、结合、混合或加入等方式与所述MG53检测试剂连接。
检测方法
可以使用本领域常用的方法进行步骤b.检测在所述待测样品中的细胞外游离MG53。在某些实施方式中，这些方法包括但不限于放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。
本领域的一般技术人员知晓在进行上述各种测定法中使用的一般技术和技术的其他变型，并且也能够单独使用上述方法或同核磁共振(NMR)、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)、液相-质谱/质谱(LC-MS/MS)等组合或替换地使用。
在一个实施方式中，酶免疫测定法是一种夹心酶联免疫测定法，其使用特异性地结合MG53的抗体来检测细胞外游离MG53。示例性的夹心酶联免疫测定法包括如下步骤：a.将特异性结合细胞外游离MG53的抗体与固相载体连接，形成固相抗体，并洗涤除去未结合的抗体及杂质；b.加入待测标本，使之与固相抗体接触一定时间以形成固相抗体-抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质；c.加入带有酶标记的能够与细胞外游离MG53结合的抗体，使之与固相抗体-抗原复合物接触一定时间以与固相抗体-抗原复合物充分结合，洗涤除去未结合的带有酶标记的抗体；d.加入上述酶标记的底物，并在适合条件下使酶标记催化底物，并根据底物反应的程度确定细胞外游离MG53的量。
数据处理
本申请所述的检测方法可以进一步包括数据处理步骤。在某些实施方式中，本申请所述的方法进一步包括：c.将步骤b中获得的MG53的检测数值与对照数值进行比较。
在某些实施方式中，所述对照数值来自对照样品。在某些实施方式中，所述对照样品与待测样品来自于不同的客体。例如，对照样品可以来自健康客体或确定患有MG53相关疾病的客体，而待测样品来自于患有或疑似患有MG53相关疾病的客体。
在某些实施方式中，所述对照样品与待测样品来自于相同的客体，但是对照样品的采集时间早于或晚于待测样品一段时间。在某些实施方式中，在所述一段时间中所述客体接受了治疗或健康状态发生了变化。在另一些实施方式中，对照样品和待测样品采集于相同客体的不同部分。
在某些实施方式中，所述对照数值是从健康客体或确定患有MG53相关疾病的客体中获得的。在某些实施方式中，对照数值是以MG53的浓度的形式表征的。
在某些实施方式中，这些对照数值可以是阴性对照值，等于或低于该数值表明待测样品所来源的客体没有患有MG53相关疾病或患有MG53相关疾病的风险较低。在某些实施方式中，可以根据从一定数量健康客体获得的MG53检测数值的平均值制定阴性对照值，例如，将该等平均值、该等平均值的80％、90％、110％、120％、150％或200％作为阴性对照值。
在另一些实施方式中，这些对照数值可以是阳性对照值，等于或高于该数值表明待测样品所来源的客体患有MG53相关疾病或患有MG53相关疾病的风险较高。在某些实施方式中，可以根据从一定数量确定患有MG53相关疾病的客体中获得的MG53检测数值的平均值制定阳性对照值，例如，将该等平均值、该等平均值的80％、90％、110％、120％、150％或200％作为阳性对照值。
客体
本申请中使用的术语“客体”是指，人类和非人动物。非人动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。“客体”也可以是家畜动物(例如，牛、猪、羊、鸡、兔或马)，或啮齿类动物(例如，大鼠或小鼠)，或灵长类动物(例如，大猩猩或猴子)，或家养动物(例如，狗或猫)。“客体”可以是雄性或者雌性，也可以是不同年龄阶段。人类“客体”可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或不同种族的杂合体。人类“客体”可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
在某些实施方式中，所述客体是人或非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
MG53相关疾病
本申请中使用的术语“MG53相关疾病”是指此类疾病的产生、发病、发展等与MG53的活性相关的疾病。本领域技术人员可以通过常规的技术手段来确定某种疾病是否与MG53相关。例如，可以通过过量表达MG53蛋白、或者敲除MG53、或者通过例如反义核酸技术、CRISPR/Cas9技术、Trim21介导蛋白酶体降解的技术来降低MG53在客体中的含量并评估该疾病在该客体中的情况，从而确定该疾病是否与MG53相关。
在某些实施方式中，所述MG53相关疾病是代谢综合征。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病是糖代谢或脂质代谢相关疾病。在某些实施方式中，所述糖代谢或脂质代谢相关疾病选自胰岛素抵抗症、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖、高血脂、高血压和肥胖组成的组。
本申请中使用的术语“代谢综合征”是指以代谢紊乱引起的脂质和非脂质心血管危险因素的簇集为特征的病症。在某些实施方案中，通过以下风险因子中的任意3个的存在来鉴定代谢综合征：男性中腰围大于102cm或女性中腰围大于88cm；至少150mg/dL的血清甘油三酯；男性中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)小于40mg/dL或女性中小于50mg/dL；至少130/85mmHg的血压；和至少110mg/dL的空腹葡萄糖。可在临床实践中容易地测量这些风险因子，例如，根据文献Executive Summary of the Third Report of the NationalCholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection，Evaluation，andTreatment of High Blood Cholesterol in Adults(Adult Treatment Panel III)，JAMA，2001，285：2486-2497中的指引，其全部内容通过引用并入本申请。
检测方法的用途
本申请所述的检测MG53相关疾病或预测MG53相关疾病的风险的方法可用于多种用途。
在某些实施方式中，该检测方法可用于检测客体中是否患有MG53相关疾病或者预测其患有MG53相关疾病的风险。例如，如上文所述，客体中细胞外游离MG53的含量等于或低于阴性对照值表明该客体没有患有MG53相关疾病或患有MG53相关疾病的风险较低；客体中细胞外游离MG53的含量等于或高于阳性对照值表明该客体患有MG53相关疾病或患有MG53相关疾病的风险较高。
在某些实施方式中，该检测方法可用于预测客体中MG53相关疾病的进展。例如，通过确定客体中细胞外游离MG53与相同客体一段时间之前的数值相比的含量和/或活性的变化，预测客体中MG53相关疾病的情况(例如，改善或恶化)。在某些实施方式中，与相同客体一段时间之前的数值相比，客体中细胞外游离MG53的含量和/或活性降低表明该客体中MG53相关疾病得到了改善；与相同客体一段时间之前的数值相比，客体中细胞外游离MG53的含量和/或活性升高表明该客体中MG53相关疾病变得恶化。
在某些实施方式中，该检测方法可用于鉴定潜在的细胞外游离MG53抑制剂。在某些实施方式中，在该用途中通常包括将待测试化合物或试剂与细胞外游离MG53相接触，随后检测细胞外游离MG53。在某些实施方式中，能够将细胞外游离MG53的含量降低至少10％的待测试化合物或试剂可以被认为是细胞外游离MG53抑制剂。在某些实施方式中，能够将细胞外游离MG53的含量降低至少20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多。这些被鉴定出的细胞外游离MG53抑制剂可以用来治疗、预防或缓解MG53相关疾病。待测试化合物或试剂包括，例如，小分子有机和无机化合物(例如，人工合成的化学库和天然产物库中获取的分子)、抗体或其抗原结合片段、配体或其结合片段、或MG53的无功能蛋白片段。
在某些实施方式中，该检测方法可用于确定客体是否会对细胞外游离MG53抑制剂产生响应。在接触细胞外游离MG53抑制剂后，待测样品中细胞外游离MG53的存在情况和水平可以指示所述待测样品来源的个体是否会对细胞外游离MG53抑制剂响应。例如，待测样品中细胞外游离MG53的含量和/或活性降低至少10％表明待测样品来源的客体可能会对细胞外游离MG53抑制剂产生响应。在某些实施方式中，与对照样品相比，待测样品中细胞外游离MG53的含量降低至少20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多。
在某些实施方式中，该检测方法可用于评估对MG53相关疾病的治疗效果。在这些实施方式中，所述对照样品与待测样品来自于相同的客体，但是对照样品的采集时间早于待测样品一段时间，并且在一段时间中所述客体接受了治疗。在某些实施方式中，与对照样品相比，待测样品中细胞外游离MG53的含量降低至少10％表明客体对当前接受的治疗产生了响应。在某些实施方式中，与对照样品相比，待测样品中细胞外游离MG53的含量和/或活性降低至少20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多。根据对响应的评估结果，可以维持或改变对客体的治疗方案。
在某些实施方式中，该检测方法可用于评估利用MG53或其突变体对相关疾病进行治疗后，细胞外游离MG53或其突变体的水平的变化。在这些实施方式中，所述对照样品与待测样品来自于相同的客体，但是对照样品的采集时间早于待测样品一段时间，并且在一段时间中所述客体接受了MG53或其突变体蛋白治疗，使得细胞外游离MG53或其突变体蛋白的含量和/或活性发生改变。根据评估结果，可以维持或改变客体的治疗方案。
降低或抑制客体中细胞外游离MG53活性的方法
另一方面，本申请涉及一种用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53活性的方法，其包括向需要其的客体施用有效量的MG53抑制剂。
MG53抑制剂
MG53抑制剂可以是小分子有机或无机化合物(例如，从人工合成的化学库和天然产物库中获取的分子)、抗体或其抗原结合片段、配体或其MG53结合片段、或MG53的无功能蛋白片段。在某些实施方式中，所述MG53抑制剂能够将细胞外游离MG53活性降低至少5％、10％、20％、40％、50％、80％、90％、95％或更多。
在本申请中，当“活性”与增加或降低一同使用的时候，是指检测到的功能活性，其可以表现为细胞外游离MG53的含量变化、或者含量不变但是功能活性变化。在一些实施方式中，所述MG53的活性与代谢综合征相关。在一些实施方式中，所述MG53的活性与糖代谢或脂质代谢相关。在一些实施方式中，所述MG53的活性与胰岛素抵抗症、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖、高血脂、高血压或肥胖相关。在一些实施方式中，所述MG53的活性是指与胰岛素受体及胰岛素受体底物的结合活性。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂与MG53特异性结合。
本申请中使用的术语“特异性结合”当用于形容MG53抑制剂时是指：在复杂混合物中该MG53抑制剂优选识别MG53，所述抑制剂与MG53的结合常数为其与其他非特异性结合蛋白的结合常数的至少2倍。在某些实施方式中，MG53抑制剂与MG53的平衡解离常数小于或等于10-6或10-7M。在某些实施方式中，MG53抑制剂与MG53的平衡解离常数小于或等于10-7M或10-8M。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段。可以用于本申请的MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段包括但不限于本申请所述描述的任一MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段，或其组合。
在某些实施方式中，所述MG53抑制剂是可以与MG53结合的小分子化合物。可以用于本申请的与MG53结合的小分子化合物包括但不限于本申请所述描述的任一与MG53结合的小分子化合物，或其组合。
降低或抑制方法的用途
在某些实施方式中，本申请所述的降低或抑制方法可用于缓解、治疗或预防MG53相关疾病或其症状，所述的降低或抑制方法包括向客体施用治疗有效量的MG53抑制剂。MG53相关疾病的定义参见上文。
对某种疾病或症状的“缓解”、“治疗”或“预防”包括预防或减轻某种疾病或不适状况，降低某种疾病或不适状况兴起或发展的速度，减少发展出某种疾病或不适状况的风险，预防或延迟与某种疾病或不适状况相关的症状发展，减少或消除与某种疾病或不适状况相关的症状，完全或部分地逆转某种疾病或不适状况，治愈某种疾病或不适状况，或以上的组合。
本申请中使用的术语“治疗有效量”是指，可以缓解或者消除客体的疾病或症状，或者可以预防性地抑制或防止疾病或症状发生的药物的量。治疗有效量可以是将客体的一种或多种疾病或症状缓解到一定程度的药物的量；可以将那些跟疾病或症状成因相关的一种或多种生理或生物化学参数部分或完全恢复到正常的药物的量；和/或可以降低疾病或症状发生的可能性的药物的量。
本申请中提供的MG53抑制剂的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、目前正在接受的治疗、对象的健康状况和药物相互作用的强度、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和疾病发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求相应降低或升高剂量。
在某些实施方式中，本申请提供的MG53抑制剂可在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药(例如，约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在某些实施方式中，所述MG53抑制剂以约50mg/kg或更少的剂量给药。在某些实施方式中，给药剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某一特定剂量可分为多次间隔给药，例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更多月一次。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
给药方案可通过调整达到最优反应(例如，治疗响应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
本申请中公开的MG53抑制剂可通过本领域公知的给药方式给药，例如注射给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或外用给药)。本申请中公开的MG53抑制剂可以以本申请所述的药物组合物的形式给药。
在某些实施方式中，可以将本申请中公开的MG53抑制剂与其它药剂或者疗法进行联合来治疗相关的疾病或者病症。在一些实施方式中，所述MG53抑制剂与其它药剂或者疗法同时施用或者先后施用。在一些实施方式中，所述其它药剂或者疗法是用于治疗胰岛素抵抗症、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖、高血脂、高血压和肥胖中的一种或多种的药剂或者疗法。在一些实施方式中，所述其它药剂是降糖剂，例如，PPAR激动剂、二肽基肽酶(IV)抑制剂、GLP-1类似物、胰岛素或胰岛素类似物、胰岛素促分泌素、SGLT2抑制剂、人糊精类似物、双胍、α-葡糖苷酶抑制剂或其组合。
MG53抗体及其抗原结合片段
本申请的另一方面还提供了一种MG53抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括三个重链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含在SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列中。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段进一步包括三个轻链互补决定区，所述三个轻链互补决定区包含在SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列中。在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述六个互补决定区包含在下组中：SEQ ID NO：1/2、9/10、17/18、25/26或33/34所示的序列中。
在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段包括重链，所述MG53抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有如下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：1、9、17、25或33所示的序列。
在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段的重链具有如下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：3、11、19、27或35所示的序列。
在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段进一步包括轻链，所述MG53抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有如下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：2、10、18、26或34所示的序列。
在某些实施方式中，所述MG53抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链具有如下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：4、12、20、28或36所示的序列
本申请的又一方面还提供了一种竞争性抗体或其抗原结合片段，其与上述抗体或抗原结合片段竞争性结合MG53。
本申请中使用的术语“竞争性结合”是指抗体或其抗原结合片段可以特异性抑制其针对的抗原与另一抗体分子(例如，MG53和其它MG53抗体)之间的相互结合作用的能力。在某些实施方式中，阻断两个抗原-抗体分子结合的竞争性抗体或抗原结合片段可将两个抗原-抗体分子之间的相互结合作用抑制至少50％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％，或大于90％。
本申请中使用的术语“抗体”包括任何可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个天然的完整抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由一个可变区和第一、第二、第三恒定区组成；每条轻链由一个可变区和一个恒定区组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ亚型，哺乳动物的轻链可分为λ或κ亚型。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包括一条重链的可变区和第一恒定区，以及与其结合的一条轻链的可变区和恒定区。其中重链的第一恒定区通过铰链区与第二恒定区相连。轻链和重链的可变区决定抗原结合的特异性。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)，轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。本申请公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别，详细内容可参见Al-Lazikani，B.，Chothia，C.，Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.，273(4)，927(1997)；Chothia，C.等人，J Mol Biol.Dec 5；186(3)：651-63(1985)；Chothia，C.and Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.，196，901(1987)；Chothia，C.等人，Nature.Dec 21-28；342(6252)：877-83(1989)和Kabat E.A.等人，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑可变区的结构。重链和轻链的恒定区与抗原结合的特异性无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
本申请中使用的术语“抗原结合片段”指由含有一个或多个CDR的抗体部分但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)和纳米抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。
抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体。
“Fab′”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。
“F(ab′)2”片段是指Fab′的二聚体。
抗体的“Fv”片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
“单链抗体分子”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。详细介绍可以参见例如Huston JS等，Proc Natl Acad SciUSA、85：5879(1988)。
“scFv二聚体”是指由两个scFv形成的聚合体。
“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”(又称为“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”)是指含有两个重链可变区而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2)：25-38(1999)；Muyldermans S.，J Biotechnol.Jun；74(4)：277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.Patent No.6,005,079)。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，但是骆驼化抗体具有抗原结合的全部功能(参见Hamers-Casterman C.等人，Nature.363(6428)：446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chain antibodies inCamelidae；a case of evolutionary innovation，”Immunogenetics.54(1)：39-47(2002)；Nguyen VK.等人，Immunology.109(1)：93-101(2003))，其全部内容通过引用并入本申请。
“纳米抗体”是由一个来自重链抗体的重链可变区和两个恒定区CH2和CH3组成。
在某些实施方式中，本申请所述抗体是全人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体或兔源抗体。在某些实施方式中，本申请所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体。在某些实施方式中，本申请所述抗体是单特异性抗体、双特异性抗体或多特异抗体。在某些实施方式中，本申请所述抗体可以进一步地被标记。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是全人源单克隆抗体，其任选地由转基因大鼠产生，例如，内源性大鼠免疫球蛋白基因表达被失活、且携带具有J基因座缺失和C-kappa突变的重组的人源免疫球蛋白基因座的转基因大鼠，其也可以由改造后的细胞(例如CHO细胞表达)。
本申请中使用的术语“全人源”当用于抗体或抗原结合片段时，是指所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列对应于由人或人免疫细胞生产的、或从例如利用人源抗体库的转基因非人动物等非人来源衍生的抗体的氨基酸序列，或者其他编码人源抗体的序列。
本申请中使用的术语“人源化”当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(当适用时)的抗体或抗原结合片段。由于人源化的抗体或抗原结合片段具有更低的免疫原性，其在某些实施方式中可用作人的治疗剂。在某些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠)。在某些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以外，基本上全部由人源序列组成。
本申请中使用的术语“嵌合”当用于抗体或抗原结合片段时，是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，而所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物(例如小鼠或兔)的可变区。
在某些实施方式中，本申请所述MG53抗体和其抗原结合片段能够以≤10-6M(例如，≤5x10-7M，≤2x10-7M，≤10-7M，≤5x10-8M，≤2x10-8M的结合亲和性与MG53特异性结合。结合亲和性可以用KD值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合达到平衡时的解离速率与结合速率的比值(koff/kon)计算得到。所述抗原结合亲和性(例如，KD)可以通过本领域已知的适宜方法进行检测，所述方法包括使用仪器(例如，Biacore)进行的等离子共振结合法，例如参见Murphy，M.等人，Current protocols in protein science，Chapter 19，unit19.14，2006。
在某些实施方式中，本申请所述抗体和其抗原结合片段以0.2nM-2000nM(例如1nM-1500nM、5nM-1000nM、10nM-900nM、20nM-800nM或50nM-800nM)的IC50抑制MG53与其配体的结合。
本申请中所使用的术语“同源性”的百分比是指，针对氨基酸序列而言，将候选氨基酸序列与对比氨基酸序列进行序列对比，并在必要时引入间隔，使相同的氨基酸数目达到最多，并在此基础上计算两条氨基酸序列之间相同氨基酸的百分比；针对核酸序列而言，将候选核酸序列与对比核酸序列进行序列对比，并在必要时引入间隔，使相同的核苷酸数目达到最多，并在此基础上计算两条核酸序列之间相同核苷酸的百分比。可以通过本领域所知的多种方式进行比对以确定同源性的百分比。例如，可以使用公开工具进行序列比对，例如BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，也可参见，Altschul S.F等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站：http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，可参见，Higgins D.G.等人，Methods inEnzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.等人，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21)：2947-8(2007))和TCoffee(瑞士生物信息学研究所网站，可参见，Poirot O.等人，Nucleic Acids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.等人，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，也可以根据比对的需要适当调整参数，这些都在本领域技术人员的知识范围之内。
在某些实施方式中，本申请所述的MG53抗体或其抗原结合片段还包括通过对本申请所述的MG53抗体或其抗原结合片段进行氨基酸残基的保守替换后得到的那些MG53抗体或其抗原结合片段。
本申请使用的术语氨基酸残基的“保守替换”是指性质相似的氨基酸之间的替换，例如极性氨基酸之间的替换(如，谷氨酰胺和天冬酰胺之间的替换)，疏水性氨基酸之间的替换(如，亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸之间的替换)，以及带相同电荷的氨基酸之间的替换(如，精氨酸、赖氨酸和组氨酸之间的替换，或者谷氨酸和天冬氨酸之间的替换)等。
在某些实施方式中，本申请所述的抗体或其抗原结合片段进一步包括缀合物。
在某些实施方式中，所述缀合物可以是可检测标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。多种缀合物可以与本申请中的抗体或其抗原结合片段结合(参见：例如，Conjugate Vaccines，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruseand R.E.Lewis，Jr.(eds.)，Carger Press，New York(1989))。在某些实施方式中，本申请公开的MG53抗体或其抗原结合片段可以通过工程的方法使其含有一个或多个缀合物结合位点，这些位点可用来结合一种或多种缀合物。例如，这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基(例如，半胱氨酸残基和组氨酸残基)用于协助与缀合物的共价连接。在某些实施方式中，MG53抗体或其抗原结合片段可间接连接缀合物，或通过另一个缀合物相连。例如，所述MG53抗体或其抗原结合片段可连接生物素，然后间接结合第二缀合物(例如，亲和素)，其与生物素相连。在某些实施方式中，所述缀合物可以是可检测标记，例如，荧光标记(例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86y、88y、90y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi、and 32p或其他镧系元素)、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金。在某些实施方式中，所述缀合物可以是PEG，其帮助延长抗体的半衰期。在某些实施方式中，所述缀合物可以是纯化部分(例如，磁珠)。在某些实施方式中，所述缀合物可以是细胞毒性部分，例如，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素和阿霉素)、抗生素(例如，更生霉素、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
MG53配体及其MG53结合片段
本申请的一方面提供了一种MG53配体及其MG53结合片段。在本申请中，可以使用MG53配体及其MG53结合片段作为MG53检测试剂或者MG53抑制剂。不希望受到理论的束缚，可以通过检测MG53配体或其MG53结合片段与细胞外游离MG53结合来检测细胞外游离MG53的存在与否或者浓度；还可以通过向客体施用MG53配体或其MG53结合片段从而竞争性结合MG53，从而阻断或者减少MG53同体内原本的效应配体/受体的结合。
在一些实施方式中，MG53配体是胰岛素受体或其变体，例如如SEQ ID NO：58所示的人胰岛素受体。在一些实施方式中，MG53配体是胰岛素受体的胞外区或其变体。
MG53的无功能蛋白片段
本申请的一方面提供了一种MG53的无功能蛋白片段。本申请所述的“MG53的无功能蛋白片段”可以是任何与天然MG53相比缺少一种或多种生理功能的蛋白片段。在某些实施方式中，MG53的无功能蛋白片段能够与天然MG53竞争性结合MG53配体/受体。在某些实施方式中，与天然MG53相比，MG53的无功能蛋白片段的活性降低至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在某些实施方式中，上述降低的活性是与MG53相关疾病相关的活性。在某些实施方式中，上述降低的活性是MG53激活AKT磷酸化的活性。
在某些实施方式中，所述MG53的无功能蛋白片段是一种MG53突变体。本申请中使用的术语“MG53突变体”或者“MG53蛋白突变体”是指天然的野生型MG53蛋白的氨基酸序列已被修饰的MG53蛋白变体。这类修饰包括但不限于一个或多个氨基酸缺失、添加和/或被取代。在某些实施方式中，本申请中的MG53突变体在野生型MG53的氨基酸序列的基础上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY结构域内具有至少一个丝氨酸缺失和/或突变为任何其他非丝氨酸或苏氨酸的氨基酸。
在某些实施方式中，所述MG53突变体在野生型MG53的氨基酸序列的基础上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY区域内有至少一个丝氨酸突变为非极性氨基酸，所述非极性氨基酸选自下组：甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。优选地，在某些实施方式中，所述非极性氨基酸为丙氨酸。在某些实施方式中，所述MG53突变体在野生型MG53的氨基酸序列的基础上，在所述野生型MG53的coiled-coil-SPRY区域内有至少一个丝氨酸突变为除丝氨酸和苏氨酸之外的极性氨基酸。在某些实施方式中，所述极性氨基酸选自下组：谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。优选地，在某些实施方式中，所述极性氨基酸为半胱氨酸。
在某些实施方式中，所述MG53突变体具有SEQ ID NO：48-57中任一项所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述MG53突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：48-57中任一项所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者至少99％的序列同源性。
其它关于MG53突变体的内容可以参见中国专利申请201610847346.4，其全部内容通过引用并入本申请。
MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋 白片段的制备方法
可以使用本领域常规的方法制备本申请中的MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段，例如，可以通过化学合成方法制备，也可以通过基因工程方法制备。
化学合成方法主要包括固相合成和液相合成两种方法。固相多肽合成方法包括，例如Merrifield固相合成法，该方法已详细记载在文献Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154、M.Bodanszky等人，Peptide Synthesis，John Wiley&Sons，Second Edition，1976”、以及J.Meienhofer，″Hormonal Proteins and Peptides″，Vol.2，p.46，AcademicPress(New York)，1983中，其全部内容通过引用并入本申请。Merrifield固相合成法主要包括以下步骤，根据目标多肽的氨基酸序列，先使被保护的羧基末端氨基酸与树脂连接；连接后洗涤树脂；脱去羧基末端氨基酸α氨基上的保护基(例如，叔丁氧羰基)，脱去这个保护基的时候必须要确保不断裂该氨基酸和树脂间的连接键；然后在所得的树脂上偶联倒数第二个羧基末端被保护的氨基酸，进行这一偶联时，在第二个氨基酸的游离羧基和连在树脂上的第一个氨基酸的氨基之间形成一个酰胺键；根据目标多肽的氨基酸连接顺序，依次重复前述反应过程，直到所有氨基酸都连接到树脂上；最后，从树脂上切落被保护的肽，脱去保护基即可得到目标多肽。本申请的多肽也可以通过液相合成方法制备，例如可以用标准的溶液肽合成法制备，该方法已详细记载在文献E.Schroder and K.Kubke，The Peptides，Vol.1，Academic Press(New York)，1965中，其全部内容通过引用并入本申请。液相合成法主要包括，利用形成酰胺键的化学或酶方法分步偶联氨基酸或肽片段。
可使用基因工程方法通过细胞培养和表达的方式产生MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段。在该方法中，使用带有编码需要表达的目标蛋白的目标基因的克隆或表达载体转化宿主细胞，并将转化的宿主细胞在营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因，有关该方法的详细描述可参考Sambrook等人编著的分子克隆(实验手册，冷泉港，1989)。
本申请中用于产生所述抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基，例如Sigma生产的Ham′s F10、最低基本培液(MEM)、RPMI-1640及Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等人，Meth.Enz.58：44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中提及的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(例如，氯化钠、氯化钙、氯化镁或磷酸盐)、缓冲液(例如，HEPES)、核苷酸(例如，腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(例如，庆大霉素)、微量元素(终浓度通常在微摩尔范围用于提供营养的无机化合物，例如硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌或氯化锰)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。本领域普通技术人员熟知如何选择培养宿主细胞所用的条件，如温度和pH值等。
在使用基因工程技术表达上述目标蛋白时，所述目标蛋白可在细胞内、细胞壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在细胞内生成，首先裂解宿主细胞，然后除去宿主细胞的裂解片断或颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。如果所述抗体在壁膜空间生成，可以使用，例如在文献Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)中描述的方法分离目标蛋白。简要地说，在醋酸钠(pH＝3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下裂解细胞约30分钟以上，随后离心除去细胞碎片。如果所述抗体分泌到培养基中，则通常先使用市售的蛋白浓度过滤器(如Amicon或Millipore的Pellicon ultrafiltrationunit)浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂(例如，PMSF)以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。
从所述细胞中制得的产物可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的产物和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。
分离的核酸
另一方面，本申请涉及一种分离的核酸，其包含编码上述任一实施方式中所述的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，所述分离的核酸包括如下核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或者99％序列同源性的序列：SEQ ID NO：5、6、7、8、13、14、15、16、21、22、23、24、29、30、31、32、37、38、39或40所示的序列。
本申请中使用的术语“分离的”是指一种物质(例如，多肽或者核酸)与它在自然界中正常存在的环境相分离或存在于与它在自然界中正常存在的环境不同的环境中。
“分离的”物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“分离的”物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是“分离的”。在某些实施方式中，抗体和抗原结合片段的纯度为至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％，其纯度可由电泳方法(例如，SDS-PAGE、等电聚焦或毛细管电泳)，或色谱法(例如，离子交换色谱或反相HPLC)确定。
本申请使用的术语“核酸”或“多聚核苷酸”指核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、或核糖核酸-脱氧核糖核酸的混合物(例如，DNA-RNA杂交物)。核酸或多聚核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂交物。核酸或多聚核苷酸可以是线性的或环状的。
本申请使用的术语“编码”或“为......编码”指能够转录为mRNA和/或翻译为肽或蛋白。
在一些实施方式中，包含多核苷酸的核苷酸可以是修饰形式的。所述修饰包括碱基修饰(例如，溴尿核苷)，核糖修饰(例如，阿糖胞苷和2′，3′-二脱氧核糖)以及核苷酸间键修饰(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、缩苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、缩苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯)。
本申请所述的分离的核酸还包括根据遗传密码的简并性替换过的核酸。本申请中使用的术语“遗传密码的简并性”是指，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。例如，脯氨酸具有4个同义密码子，即CCU、CCC、CCA、CCG。本领域公知，由于核酸遗传密码的简并性，可以将某已知核酸序列中的某些位置的核酸进行替换，但却不改变编码的氨基酸序列。本领域技术人员可以很容易地进行遗传密码简并性的替换，例如，通过碱基的定点突变技术。不同生物体对不同的密码子的偏好性存在区别，为在某个选定的生物细胞内表达本申请的抗体或抗原结合片段，可以选择该生物细胞所偏好的密码子，获得相应的编码基因，通过重组表达得到本申请的抗体或抗原结合片段。
克隆或表达载体
另一方面，本申请涉及一种克隆或表达载体，其包括上述任一实施方式中所述的分离的核酸。
本申请中使用的术语“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC))、噬菌体(例如，λ噬菌体或M13噬菌体)，以及动物病毒等。可用作载体的示例性的动物病毒包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(例如，SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。
宿主细胞
再一方面，本申请涉及一种宿主细胞，其包括上述任一实施方式中所述的克隆或表达载体。
本申请中使用的术语“宿主细胞”是指被引入，或能够引入编码本申请所述的一种或多种抗体、MG53配体或无功能MG53片段的核酸序列(“选定基因”)的细胞，并且其进一步表达或能够表达感兴趣的选定基因。该术语包括亲代细胞的子代，无论其在形态学或遗传组成上是否与亲代相同，只要存在选定基因即可。
可以将包括编码选定基因的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本申请中适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。适用于本申请的原核细胞包括真细菌和古生菌。其中真细菌包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和放线菌，示例性的真细菌包括例如，大肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷白氏杆菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、以及志贺氏菌属、假单胞菌属等。
除了原核细胞以外，真核微生物(例如，丝状真菌或酵母)也可作宿主细胞克隆或表达选定基因的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本申请中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主(例如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母)；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP 183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；西方许旺酵母(例如，西方许旺酵母)；和丝状真菌(例如，脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌霉)。
本申请中提供的宿主细胞可以是哺乳动物宿主细胞，且哺乳动物宿主细胞的培养已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，参见Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，参见Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，参见Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(参见Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。
小分子化合物
本申请的一方面提供了与MG53结合的小分子化合物。在本申请中，可以使用与MG53结合的小分子化合物作为MG53检测试剂或者MG53抑制剂。
在某些实施方式中，所述与MG53结合的小分子化合物是具有式Ia或Ib的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001840075660000371
其中，L为化学键、或任选取代的C1-C12亚烷基；M为化学键、或任选取代的C6-C12芳香亚基或5-12元杂环亚基；X为化学键、或任选取代的-CH＝N-NH-C(O)-、-CH2-O-、-O-CH2-C(O)-NH-、-O-C(O)-或-O-C(O)-CH＝CH-；Y为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；Q为任选取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；T为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；R1各自独立地为氢、硝基、卤素、羟基、氰基、或任选取代的C1-C12烷基或C1-C12烷氧基；n为1-5的任意正整数。
在某些实施方式中，所述与MG53结合的小分子化合物是具有式II的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001840075660000381
其中，A为氢、或任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；G为-C(O)-O-R3，其中R3是任选取代的C1-C12烷基；J为任选取代的C6-C12芳基；或者G和J连同其连接的碳原子共同形成
Figure BDA0001840075660000382
其中R4各自独立地为氢、硝基、卤素、羟基、氰基、或任选取代的C1-C12烷基或C1-C12烷氧基，n为1-4的任意正整数；B为化学键、或任选取代的C6-C12芳香亚基或5-12元杂环亚基；D为化学键、或任选取代的-O-R5-，其中R5选自任选取代的C1-C12亚烷基；E为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基。
在某些实施方式中，所述与MG53结合的小分子化合物是具有式III的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0001840075660000383
其中，A为氢、或任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；Y各自独立地为任选取代的C6-C12芳基或5-12元杂环基；R7为氢、硝基、卤素、羟基、氰基、或任选取代的C1-C12烷基或C1-C12烷氧基。
为了简明起见，在单个实施方式的上下文中描述的本申请的各种特征还可以以分开的方式或者以任何适当的子结合的方式提供。
本申请中使用的术语“取代”，当指化学基团时，指所述化学基团的一个或多个氢原子被去除并且被取代基取代。
本申请中使用的术语“取代基”具有本领域公知的通常含义，指共价连接至或者在适合的情况下稠合至母体基团的化学部分。
本申请中使用的术语“任选地取代”指化学基团可以不具有取代基(即未取代的)或者可以具有一个或多个取代基(即取代的)。应当理解的是在给定原子处的取代受到化合价的限制。在某些实施方式中，上述任一实施方式中提及的取代基的示例性例子为：硝基、卤素、羟基、氰基、C1-C12烷基、C1-C12烷氧基、苯甲酰胺基、或-C(O)-O-R6，其中所述C1-C12烷基、C1-C12烷氧基或苯甲酰胺基可以进一步被硝基、卤素、羟基、氰基、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基取代，其中R6为氢或C1-C3烷基。
本申请中使用的术语“Cn-Cm”表示碳原子数的范围，其中n和m是整数并且碳原子数的范围包括端点(即n和m)和其间的各整数点。例如，C1-C6表示1至6个碳原子的范围，包括1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子和6个碳原子。
本申请中使用的术语“烷基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指饱和的烃基基团，其可以是直链的或支链的。术语“Cn-Cm烷基”指具有n至m个碳原子的烷基。在某些实施方式中，烷基基团含有1至12、1至8、1至6、1至4、1至3或1至2个碳原子。烷基基团的示例包括但不限于化学基团如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、2-甲基-1-丁基、n-戊基、3-戊基、n-己基、1，2，2-三甲基丙基等。
本申请中使用的术语“烯基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指不饱和的烃基基团，其可以是直链的或支链的，具有至少一个碳-碳双键。在某些实施方式中，烯基基团含有2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3个碳原子。在某些实施方式中，烯基基团还能有1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1个碳碳双键。烯基基团的示例包括但不限于化学基团如乙烯基、n-丙烯基、异丙烯基、n-丁烯基、仲丁烯基等。
本申请中使用的术语“亚烷基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指二价饱和的烃部分，其可以是直链的或支链的，并且其连接分子的两个其他部分。术语“Cn-Cm亚烷基”指具有n至m个碳原子的亚烷基。在某些实施方式中，亚烷基基团含有1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4或1至3个碳原子。亚烷基基团的示例包括但不限于化学基团如亚甲基、亚乙基、1-甲基-亚甲基、亚丙基、亚丁基等。
本申请中使用的术语“亚烯基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指二价不饱和的烃基部分，其可以是直链的或支链的，具有至少一个碳-碳双键，并且其连接分子的两个其他部分。术语“Cn-Cm亚烯基”指具有n至m个碳原子的亚烯基。在某些实施方式中，亚烯基基团含有2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、2至4或2至3个碳原子。在某些实施方式中，亚烯基基团还能有1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1个碳-碳双键。
本申请中使用的术语“芳基”或“芳香基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指在形成环的碳原子之间具有交替的双键和单键的单-或多-碳环环系基团。术语“Cn-Cm芳基”指具有n至m个形成环的碳原子的芳基。在某些实施方式中，芳基环系在一个或多个环中具有5至10、5至8或5至6个碳原子。在某些实施方式中，芳基环系具有稠合在一起的2个或多个环。芳基基团的示例包括但不限于化学基团如苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。在某些实施方式中，苯基包括稠合的苯基，例如苯并二恶茂基。
本申请中使用的术语“芳香亚基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指连接分子的两个其他部分的二价芳环或环系，即上述两个部分与环在两个不同的环位置键合。当芳香亚基的芳环是单环环系时，上述两个部分与同一环的两个不同的环位置键合。当芳香亚基的芳环是多环环系时，上述两个部分可以与同一环或不同环的两个不同的环位置键合。术语“Cn-Cm芳基亚基”指具有n至m个形成环的碳原子的芳基亚基。芳香亚基可以是取代的或未取代的。未取代的芳香亚基除了其连接的分子的两部分以外没有其他取代基。取代的芳香亚基除了其连接的分子的两部分以外还具有其他取代基。
本申请中使用的术语“烷氧基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指式“-O-烷基”所示的基团。术语“Cn-Cm烷氧基”指烷氧基的烷基部分具有n至m个碳原子。在某些实施方式中，烷基部分具有1至6、1至4或1至3个碳原子。烷氧基基团的示例包括但不限于化学基团如甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如n-丙氧基和异丙氧基)、t-丁氧基等。
本申请中使用的术语“n元”，其中n是整数，其通常与环系一起使用以描述环系中形成环的原子数。例如，哌啶基为6元杂环烷基环的一个示例，吡唑基为5元杂芳基环的一个示例，吡啶基为6元杂芳基环的一个示例而1，2，3，4-四氢-萘为10元芳基的一个示例。
本申请中使用的术语“杂芳基”指其中在芳环中的至少一个环原子是杂原子并且其余的环原子是碳原子的芳基基团。术语“n-m元杂芳基”指具有n至m个形成环的成员的杂芳基。杂原子的示例包括但不限于氧、硫、氮、磷等。在某些实施方式中，杂芳基可以具有5至10、5至8或5至6个形成环的成员。在某些实施方式中，杂芳基是5元或6元杂芳基。杂芳基的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡咯基、N-低级烷基吡咯基、吡啶基-N-氧化物、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吲哚基等。
5元杂芳基是具有有5个环原子的环的杂芳基，其中一个或多个(例如1、2或3个)环原子可以独立地选自N、O、P和S。5元杂芳基的示例包括但不限于噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、1，2，3-三唑基、四唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，2，4-三唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，4-噁二唑基、1，3，4-三唑基、1，3，4-噻二唑、1，3，4-噁二唑基等。
6元杂芳基是具有有6个环原子的环的杂芳基，其中一个或多个(例如1、2或3个)环原子可以独立地选自氮、氧、硫和磷。6元杂芳基的示例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、哒嗪基等。
本申请中使用的术语“杂芳亚基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指连接分子的两个其他部分的二价杂芳基，即上述两个部分与环在两个不同的环位置键合。当杂芳亚基的芳环是单环环系时，上述两个部分与同一环的两个不同的环位置键合。当杂芳亚基的芳环是多环环系时，上述两个部分可以与同一环或不同环的两个不同的环位置键合。杂芳亚基可以是取代的或未取代的。未取代的杂芳亚基除了其连接的分子的两部分以外没有其他取代基。取代的杂芳亚基除了其连接的分子的两部分以外还具有其他取代基。
本申请中使用的术语“杂环烷基”指在环系中的至少一个原子是杂原子而其余环原子是碳原子的环烷基。术语“n-m元杂环烷基”指具有n至m个形成环的成员的杂环烷基。此外，该环还可以具有一个或多个双键，但不具有完全共轭的系统。在某些实施方式中，杂环烷基是饱和的杂环烷基。杂原子的示例包括但不限于氧、硫、氮、磷等。在某些实施方式中，杂环烷基具有3至8、3至6或4至6个形成环的碳原子。杂环烷基的示例包括但不限于氮杂环丁烷、氮丙啶、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉高哌嗪等。
本申请中使用的术语“杂环烷亚基”，无论是作为其他术语的一部分还是单独使用，指连接分子的两个其他部分的二价杂环烷基，即上述两个部分与环在两个不同的环位置键合。术语“Cn-m杂环烷亚基”指具有n至m个碳原子的杂环烷亚基。在某些实施方式中，杂环烷亚基含有3至8、3至6或4至6个成环碳原子。
本申请中使用的术语“杂环基”包括杂芳基和杂环烷基。
本申请中使用的术语“杂环亚基”包括杂芳亚基和杂环烷亚基。
本申请中使用的术语“卤素”指选自氟、氯、溴和碘的原子。
本申请中使用的术语“氰基”指式“-CN”所示的基团。
本申请中使用的术语“羟基”指式“-OH”所示的基团。
本申请中使用的术语“硝基”指式“-NO2”所示的基团。
本申请中使用的术语“苯甲酰胺基”指式“-NH-C(＝O)-苯基”。
本申请中使用的术语“化合物”旨在包括所示结构的所有立体异构体(例如对映体和非对映体)、几何异构体、互变异构体和同位素。除非另外指明，本申请中通过名称或结构标识为一个特定互变异构形式的化合物旨在包括其他的互变异构形式。
本申请所述的化合物可以是不对称的(例如具有一个或多个立体中心)。除非另外指明，所有的立体异构体，例如对映体和非对映体，都旨在包含在内。可以以光学活化或外消旋的形式分离含有不对称取代的碳原子的本申请的化合物。如何从不具有光学活性的初始原料制备光学活化形式的方法是本领域公知的，如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成。在本申请所述的化合物中还可以存在烯烃、碳-碳双键等多种几何异构体，并且在本申请中已经考虑了所有的这些稳定异构体。本申请描述了化合物的顺式和反式几何异构体并且其可以以异构体的混合物或单独的异构体形式分离。
在某些实施方式中，本申请所述的化合物具有(R)-构型。在某些实施方式中，本申请所述的化合物具有(S)-构型。
可以通过本领域公知的多种方法中的任一对化合物的外消旋混合物进行拆分。示例性的方法包括使用手性拆分酸的分级结晶，手性拆分酸是一种具有光学活性的成盐有机酸。用于分级重结晶方法的适宜的拆分试剂是例如具有光学活性的酸(如，酒石酸、二乙酰酒石酸、二苯甲酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸的D和L形式)或各种具有光学活性的樟脑磺酸。适于分级结晶方法的其他拆分试剂包括N-甲基苄胺、2-苯甘氨醇、去甲麻黄碱、麻黄碱、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1，2-二氨基环己烷等的立体异构纯形式。
还可以通过在装有光学活性拆分试剂(例如二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱上通过洗脱进行外消旋混合物的拆分。可以由本领域技术人员确定适宜的洗脱溶剂组合物。
本申请的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式是由同时伴有质子的迁移的单键与相邻双键的对换导致的。互变异构形式包括具有相同实验式和总电荷的异构质子化状态的质子的互变异构体。质子互变异构体的示例包括酮-烯醇对、酰胺-亚胺酸对、内酰胺-内酰亚胺对、烯胺-亚胺对和环状的形式，其中质子能够占据杂环系统的两个或多个位置，例如1H-和3H-咪唑、1H-，2H-和4H-1，2，4-三唑、1H-和2H-异吲哚以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式通过适宜的取代能够平衡或空间锁定成一种形式。
本申请的化合物还可以包括中间体或最终化合物中出现原子的所有同位素。同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的那些原子。例如，氢的同位素包括氕、氘和氚。
小分子化合物的获得方法
在某些实施方式中，本申请的小分子化合物可以通过有机合成获得。可以使用任意公知的有机合成技术制备并且可以根据多种可能的合成途径合成本申请的化合物，包括其盐、酯、水合物或溶剂化物。
可以在适宜的溶剂中进行制备本申请化合物的反应，有机合成领域的技术人员能够容易地对溶剂进行选择。适宜的溶剂能够在反应进行的温度下(例如可以是从溶剂的冷冻温度至溶剂的沸腾温度的温度范围)基本上不与初始原料(反应物)、中间体或产物反应。可以在一种溶剂或一种以上溶剂的混合物中进行给定的反应。根据特定反应步骤，本领域技术人员能够针对特定反应步骤选择适宜的溶剂。
本申请化合物的制备可能涉及各种化学基团的保护和去保护。本领域技术人员能够容易地确定是否需要保护和去保护以及选择适宜的保护基团。保护基团化学可以参见例如T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，Wiley&Sons，Inc.，New York(1999)，其全部内容通过引用并入本申请。
可以根据本领域公知的任意适宜方法对反应进行监测。例如，可以利用光谱法，如核磁共振光谱(例如1H或13C)、红外光谱、分光光度法(例如UV-可见)、质谱，或者利用色谱法，如高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)或薄层层析(TLC)对产物的形成进行监测。本领域技术人员可以利用多种方法对化合物进行纯化，包括高效液相色谱(HPLC)(例如参见“Preparative LC-MS Purification：Improved Compound Specific MethodOptimization”Karl F.Blom，Brian Glass，Richard Sparks，Andrew P.CombsJ.Combi.Chem.2004，6(6)，874-883，其全部内容通过引用并入本申请)和正相硅胶柱层析。
在某些实施方式中，本申请的小分子化合物可以通过商业途径购买获得。在某些实施方式中，本申请的小分子化合物可以是商业可获得的化合物库，例如荷兰的SPECS化合物库。
药物组合物
再一方面，本申请涉及一种药物组合物，其包括活性物质(例如，上述任一实施方式中所述的抗体或抗原结合片段、MG53配体或MG53无功能片段、上述任一实施方式中所述的克隆或表达载体、或上述任一实施方式中所述的细胞或上述任一种小分子化合物)，以及药学上可接受的辅料。
可以采用药物领域公知的方法制备这些药物组合物。在某些实施方式中，可以将本申请的活性物质与药学上可接受的载体混合用于制备药物组合物。
本申请中使用的术语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内适宜用于与人和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，具有合理的收益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。在某些实施方式中，药学上可接受的化合物、材料、组合物和/或剂型指由管理机构批准(如美国食品药品管理局、中国食品药品管理局或欧洲药品局)或者列于普遍认可的药典中(如美国药典、中国药典或欧洲药典)的用于动物(更特别地用于人)的那些。
可以用在本申请的药物组合物中的药学上可接受的辅料包括，但不限于，例如，药学可接受的液体、凝胶、或固体载剂、水相介质(例如，氯化钠注射液，林格氏液注射液，等渗葡萄糖注射液，无菌水注射液，或葡萄糖和乳酸林格注射液)、非水相介质(例如，植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油)、抗微生物物质、等渗物质(例如氯化钠或葡萄糖)、缓冲液(例如磷酸盐或枸橼酸盐缓冲液)、抗氧化剂(例如硫酸氢钠)、麻醉剂(例如盐酸普鲁卡因)、悬浮剂/分散剂(例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、或聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸))、乳化剂(例如聚山梨醇酯80(吐温-80))、稀释剂、佐剂、辅料、或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分、或以上的多种组合。适用的组分可包括，例如，填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。
在某些实施方式中，所述的药物组合物为口服制剂。口服制剂包括，但不限于，胶囊、囊剂、药丸、片剂、锭剂(用于味道的基底，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉末、颗粒剂、或者是水或非水溶液或悬浮液、或者油包水或水包油的乳剂、或者是酏剂或糖浆、或者是糖果锭剂(适用惰性基质，如白明胶和甘油，或蔗糖或者阿拉伯胶)和/或漱口药及其类似物。
口服的固体制剂(如胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)中包括所述的活性物质与一种或多种药学上可接受的辅料，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下物质：(1)填料或者补充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇，和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻朊酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如丙三醇；(4)分裂剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或者木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；(5)阻滞剂溶液，例如石蜡；(6)加速吸收剂，例如季铵化合物；(7)润滑剂，例如乙酰醇与单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土与皂土；(9)助流剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、及其混合物；与(10)着色剂。
口服的液体制剂包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂等。除了活性物质之外，液体剂型还可以含有常用的惰性稀释剂，例如，水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯(甲)酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯、以及以上两种或多种的混合物。除了惰性稀释液之外，口服的液体制剂也可以添加佐剂例如，润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、颜料、香料和防腐剂。
在某些实施方式中，所述的药物组合物为注射制剂。注射制剂包括无菌水溶液或分散液、混悬剂或乳剂。在所有情况下，所述的注射制剂应当无菌且应当是液体以方便注射。它在生产和贮存条件下应保持稳定，并应当抗微生物(例如，细菌和真菌)的污染。载体可以是一种溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)及其适当的混合物和/或植物油。所述的注射制剂应保持适当的流动性，适当的流动性可通过多种方式维持，例如，通过使用如卵磷脂等涂层，使用表面活性剂等。可以通过加入各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现抗微生物污染。
在某些实施方式中，所述的药物组合物为口腔喷雾制剂或鼻腔喷雾制剂。所述喷雾制剂包括，但不限于，水性气雾剂、非水性悬浮液、脂质体制剂或者固体颗粒制剂等。水性气雾剂是通过将作用剂的水性溶液或者悬浮液和常规的药学上可接受的辅料与稳定剂一同配制。该载体与稳定剂根据特定化合物的需要而变化，但是其一般包括非离子型表面活性剂(吐温类、或聚乙二醇)、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸，缓冲液、盐、糖或者糖醇。气雾剂通常由等渗溶液制备，可以通过喷雾器递送。
在某些实施方式中，所述的药物组合物可以和一种或多种其他药物混合使用。在某些实施方式中，所述的药物组合物包含至少一种其他药物。在某些实施方式中，所述的其他药物为心血管类药物、用于治疗肾脏疾病的药物、用于细胞修复的药物等。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以通过适当的途径递送到对象中，包括但不限于，通过口服途径、注射途径(如静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、心内注射、鞘内注射、胸膜腔内注射、腹腔内注射等)、粘膜途径(如鼻腔内给药、口腔内给药等)、舌下途径、直肠途径、经皮途径、眼内途径、肺部途径。在某些实施方式中，所述药物组合物可通过注射途径给药。
试剂盒
另一方面，本申请涉及一种用于检测细胞外游离MG53的试剂盒。
在某些实施方式中，该试剂盒包括MG53检测试剂(例如本申请所述的MG53检测试剂)。在某些实施方式中，该试剂盒还包括一种或多种其他组分，例如MG53标准溶液、稀释液、洗涤液、终止液、和显色剂等。本申请所述的试剂盒能够用于本申请所述的检测细胞外游离MG53的方法。
试剂盒中的试剂可以置于任意种类的容器中，以使得试剂中的各个组分得以稳定保存且不会被容器的材料吸附或改变。例如，密封玻璃安瓿中可以含有冻干的底物/分子和/或缓冲剂，其在中性、非反应性气体(例如，氮气)下包装。安瓿可以由任意适宜的材料组成，例如玻璃、有机聚合物(例如，聚碳酸酯或聚苯乙烯等)，陶瓷、金属或一般用于存放试剂的任意其他材料。适宜容器的其他例子包括简单的瓶子，其可以由与安瓿类似的物质制造，以及封套，其可以由金属箔内衬(例如，铝或合金)组成。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可能具有无菌入口，如具有可使用皮下注射针穿刺的瓶塞的瓶子。其他容器可以具有两个室，其被易于除去的膜所分隔，将膜除去后可以使所述组分混合。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
在某些实施方式中，该试剂盒还包括酶标板和封板膜。
在某些实施方式中，试剂盒还可以与说明书一并提供。说明书可以被印刷于纸上或其他基材上，和/或以电子可读介质的形式提供，如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、压缩盘、录像带、光盘、录音带等。详细的说明书可以不在实物上与试剂盒相关联；作为替代，可以引导使用者到试剂盒的生产厂商或经销商指定的网站，或以电子邮件形式提供说明。在说明书中记载了检测细胞外游离MG53的方法。
制药用途
另一方面，本申请涉及一种MG53抑制剂在制备用于降低或抑制客体中细胞外游离MG53的药物中的用途。在某些实施方式中，所述MG53抑制剂可以是上述任一MG53抑制剂。在某些实施方式中，所述方法可以用于缓解、治疗或预防MG53相关疾病或其症状。在某些实施方式中，所述MG53相关疾病可以是上述任一MG53相关疾病。在一些实施方式中，所述药物是本申请所述的药物组合物。
又一方面，本申请涉及一种MG53检测试剂在制备用于检测细胞外游离MG53的试剂盒中的用途。在某些实施方式中，所述试剂盒可用于检测MG53相关疾病、预测MG53相关疾病的风险或进展、鉴定潜在的MG53抑制剂、评估对MG53相关疾病的治疗效果或检测细胞外游离MG53的活性。在一些实施方式中，所述MG53检测试剂以本申请所述的药物组合物形式提供。
实施例
提供下述实施例以解释本申请。其并非旨在以任何方式进行限制。
实施例1：MG53抗体的制备以及表征
MG53抗体的制备
利用从小鼠中提取的总RNA做逆转录，合成cDNA。利用OligodT作为引物，利用逆转录酶进行逆转录反应，得到cDNA文库。以合成的cDNA文库做模板，利用特异性引物，通过PCR方法获得小鼠MG53(NP_001073401.1)的编码核酸。PCR程序如下：变性，98摄氏度3分钟；循环过程98摄氏度30秒，65摄氏度30秒，72摄氏度90秒，30个循环；随后72摄氏度5分钟延伸后4摄氏度保存。引物序列如下：上游引物：5’-ataggtaccg ccaccatgtc ggctgcaccc ggcct-3’(SEQ ID NO：59)；下游引物：5’-atactcgagc ggcctgttcc tgctccggcc-3’(SEQ ID NO：60)；携带有KpnI和XhoI酶切位点。
利用KpnI和XhoI对PCR产物进行双酶切，同时利用同样的双酶切处理空载体质粒pcDNA4/TO/myc-HisB，胶回收并利用T4连接酶将PCR产物连接入载体，形成质粒pcDNA4-mMG53-myc。测序验证序列正确。
将表达质粒pcDNA4-mMG53-myc瞬时转染入HEK293细胞中。2天后，将从所述瞬时转染的细胞培养中收获的上清液用于蛋白纯化。将所述蛋白用SDS-PAGE纯化并定量以用于免疫。
将100μg的MG53蛋白通过腹腔注射来分别免疫3只兔子。经过三次到五次免疫后，对兔子取血收集血清并通过ELISA测试测定抗体滴度，选择出滴度最高的兔子。
从滴度最高的兔子的脾脏中分离出B淋巴细胞。将分离的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合(以1∶1比例)。融合的具体实验步骤如下：用5-10ml ECF溶液洗涤并悬浮细胞混合物。加入ECF溶液将浓度调整至2x106细胞/ml。在细胞电融合后，将融合室中的细胞悬液立即转移进入含有更多体积培养基的无菌管中。在37摄氏度培养超过24小时后，将所述细胞悬液混合并移液入96孔板(0.5x106细胞/板)。在37摄氏度、5％CO2条件下培养细胞。当所述克隆足够大时，将100μl上清液从96孔板转移用于抗体筛选测试。
使用ELISA检测杂交瘤上清液与MG53蛋白的结合。简言之，用1μg/ml的人MG53蛋白在4℃包被平板过夜。在封闭和洗涤后，将所述杂交瘤上清液以不同的倍数稀释后，转移至所述包被的平板并在室温下孵育1小时。之后洗涤所述平板并随后用山羊抗兔IgG(H+L)HRP的二抗(Goat Anti-Rabbit HRP(IgG H&L)(ab6721)|Abcam)孵育45分钟。洗涤后，加入TMB底物并用2M HCl终止反应。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸收光值。根据结果筛选出结合性质最好并且适于检测的5个单克隆杂交瘤细胞，5个单克隆杂交瘤的结合数据如下表所示。
Figure BDA0001840075660000481
Figure BDA0001840075660000491
其中，阳性标准值(市售的MG53抗体)为0.456；阴性标准值(无关抗体)为0.083。
将5个杂交瘤细胞系进行亚克隆。简言之，对于每个杂交瘤细胞系，将细胞进行计数并在克隆培养基中稀释至5细胞/孔、1细胞/孔和0.5细胞/孔。将200μl/孔铺板入96孔板，一个平板为5细胞/孔，一个平板为1细胞/孔和四个平板为0.5细胞/孔。将所有平板置于37摄氏度、5％CO2。孵育直至所有细胞系可以通过ELISA测试。
随后对5个单克隆杂交瘤细胞进行基因测序，结果显示MG53抗体分别为抗体#6(重链核苷酸序列：如SEQ ID NO：7所示，轻链核苷酸序列：如SEQ ID NO：8所示)、抗体#110(重链核苷酸序列：如SEQ ID NO：15所示，轻链核苷酸序列：如SEQ ID NO：16所示)、抗体#84(重链核苷酸序列：如SEQ ID NO：23所示，轻链核苷酸序列：如SEQ ID NO：24所示)、抗体#9(重链核苷酸序列：如SEQ ID NO：31所示，轻链核苷酸序列：如SEQ ID NO：32所示)、抗体#43(重链核苷酸序列：如SEQ ID NO：39所示，轻链核苷酸序列：如SEQ ID NO：40所示)。
MG53抗体的结合能力表征
通过表面等离子共振(SPR)来验证MG53抗体与MG53结合的能力。将重组人MG53蛋白(rhMG53)溶解在10mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.5)中，并随后使用Amine Coupling试剂盒(GEHealthcare)通过伯氨基将rhMG53固定在CM5芯片上，并用1M的氨基乙醇封闭其它的活性位点。将对照流体室激活并且在不存在MG53的情况下进行封闭。将固定水平固定在500Biacore反应单位(RU)，并逐渐增加流经芯片表面的MG53抗体#84的浓度(氨基酸重链序列：如SEQ ID NO：19所示，轻链序列：如SEQ ID NO：20所示，浓度从1.95nM-1000nM)，数据结果如图2所示。由上述实验结果可知，本申请的MG53抗体能够与rhMG53以高亲和性结合。
通过表面等离子共振(SPR)来验证MG53抗体阻断MG53与胰岛素受体胞外区结合的能力。将重组的胰岛素受体胞外区(IR)溶解在10mM醋酸钠缓冲液(pH＝4.5)中，并随后使用Amine Coupling试剂盒(GE Healthcare)通过伯氨基将IR固定在CM5芯片上，并用1M的氨基乙醇封闭其它的活性位点。将对照流体室激活并且在不存在IR的情况下进行封闭。将固定水平固定在500Biacore反应单位(RU)，并逐渐增加流经芯片表面的反应物的浓度(在图3a所示的实验中，使用的是rhMG53，浓度从0.49nM-500nM；在图3b所示的实验中，使用的是rhMG53以及MG53抗体#84的混合物，其中MG53抗体的浓度固定为500nM，而rhMG53的浓度从0nM-2000nM)。
上面两个结合实验均在25摄氏度，PBS-P(20mM磷酸缓冲液，2.7mM NaCl，137mMKCl，0.05％(体积比)的表面活性剂P-20，pH＝7.4)缓冲液中进行。在每次样品注射后用10mM NaOH(pH＝10)进行再生。使用Biacore T200仪器进行检测并使用其软件进行数据分析。
实施例2：细胞外游离MG53的功能研究
实施例2中使用的蛋白质免疫印迹的步骤如下：
(1)制胶：将玻璃板洗净，烘干。组装垂直电泳仪，按顺序分别灌注8％分离胶和5％浓缩胶。
(2)配制电泳缓冲液：用Tris和甘氨酸配制5×电泳缓冲液的母液，稀释至1×，取600ml加入垂直电泳槽。
(3)上样：将制好的蛋白样品冷却至室温融化并且离心混匀，从左至右依次上样为蛋白标准品，蛋白样品，若有孔无样，则应加入等量的1×上样缓冲液补充以配平，不留空道，以防条带歪斜。
(4)跑胶：将电泳装置与电源连接，加7V/cm的电压，当溴酚蓝前沿进入分离胶并且蛋白标准品分离出明显的条带之后，把电压提高到11V/cm，持续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部。
(5)配制转膜缓冲液：用Tris和甘氨酸配制20×转膜缓冲液的母液，稀释至1×，加入20％的甲醇混匀，备用。
(6)转膜：用湿式电转槽转膜，按“三明治”式的顺序依次从黑色塑料板上摆放海绵、双层滤纸、凝胶、PVDF膜、双层滤纸、海绵，小心夹紧后放入电转槽，(注意PVDF膜和凝胶之间切勿出现气泡，否则影响转膜的效果)加入转膜缓冲液1000ml，将装置放在冰上，接通电源，恒流275mA转膜2小时。
(7)封闭：将10×TBS溶液先稀释至1×，加0.1％的Tween20配制成1×TBST溶液，然后加入5％(w/v)的脱脂奶粉作为封闭缓冲液，转膜完成后，小心取出PVDF膜，放入封闭缓冲液中，室温在摇床上慢摇封闭1小时。
(8)孵一抗：一抗溶液的配制，在含5％(w/v)BSA的TBST溶液中加入1‰一抗。膜封闭完成以后，用TBST洗三次，每次5min，加入对应的一抗溶液，4℃摇床慢摇孵育过夜。
(9)孵二抗：配制二抗溶液，二抗在含5％脱脂奶粉的TBST中以1∶2000的比例稀释即为二抗溶液，注意二抗需和一抗对应，即需要注意是鼠抗还是兔抗等。将一抗孵育过夜的膜取出，用TBST洗三次，每次5min，然后加入二抗溶液，室温摇床慢摇孵育1小时。
(10)化学发光检测：将二抗孵育过的PVDF膜取出，用TBST洗三次，每次5min，将膜浸在TBST中备用。配制化学发光反应底物A、B，按照体积比为1∶1的比例混合，注意避光操作，然后加在PVDF膜上，反应5min，用BIO-RAD的ChemiDocXRS进行化学发光检测条带。
(11)重新孵育一抗：用TBST洗膜2次，每次5min。加入洗脱缓冲液，50℃，50rpm洗膜30min。TBST洗膜6次，每次5min。抗体洗脱后，又可以通过孵育其他一抗-二抗检测相应蛋白质。化学发光检测条带印迹图片用ImageJ软件分析灰度值。
使用本申请的抗体检测细胞外游离MG53
从14周龄的WT小鼠以及MG53-/-(通过基因敲除技术敲除MG53基因)小鼠的尾静脉取血，离心取血清。使用0.5μL血清上样，将MG53抗体#84作为一抗，HRP抗兔抗体作为二抗，进行蛋白质免疫印迹检测，检测结果如图4所示。由实验结果可知，使用本申请的MG53抗体能够清楚区分表达MG53的样品以及不表达MG53的样品。
从14周龄的WT小鼠以及TG小鼠(通过基因技术使得MG53基因过表达)的尾静脉取血，离心取血清。使用0.5μL血清上样，将MG53抗体#84作为一抗，HRP抗兔抗体作为二抗，进行蛋白质免疫印迹检测，检测结果如图5所示。由实验结果可知，使用本申请的MG53抗体进行的实验能够清楚区分不同浓度的血清MG53。
使用上述相同的蛋白质免疫印迹方法，使用MG53抗体#84检测rmMG53-myc(HEK293细胞表达的带有myc标签的重组小鼠MG53蛋白)以及rhMG53(HEK293细胞表达的纯化重组人MG53蛋白)，检测结果如图6所示。由实验结果可知，本申请的MG53抗体能够用于检测人源和鼠源的细胞外游离MG53。
细胞外游离MG53的功能验证
获取37名2型糖尿病患者的血清(T2D)以及21名正常人的血清(对照)。使用上述相同的蛋白质免疫印迹方法，检测上述血清样品，检测结果如图7所示。由实验结果可知，2型糖尿病患者中的血清MG53含量相对于正常人中的含量具有统计学意义(利用t-test检验)，从而能够基于血清MG53的含量来判断是否患有糖尿病以及患有糖尿病的风险。
获取18只用高脂肪饮食(使用Cat.#D12492饲料，购自ResearchDiets Inc.，其中60％的能量来自于脂肪，喂养35周)小鼠的血清以及15只用正常饮食小鼠的血清。使用上述相同的蛋白质免疫印迹方法，检测上述血清样品，检测结果如图8所示。由实验结果可知，高脂肪饮食会诱导血清MG53的升高，从而能够根据血清MG53的含量来判断患有脂肪代谢类疾病的风险。
获取6只12周大的ZDF大鼠(Zucker diabetic fatty rat，购自Vital RiverLaboratories(中国，北京)，Cat#123)以及6只正常SD大鼠的血清，用ELISIA试剂盒(Cusbio)检测血清中的MG53含量，用血糖仪(Roche)检测血糖含量，用ELISIA试剂盒(Millipore)检测血胰岛素含量，并测量体重。数据如图9所示。由实验结果可知，血清MG53的含量与体重、血糖以及血胰岛素的含量呈线性相关，从而能够根据血清MG53的含量来判断糖尿病的风险和进展，以及对治疗的响应。
选择8-10周大小的C57(购自维通利华)小鼠，整夜禁食，随后以6mg/kg的剂量尾静脉注射重组人MG53蛋白(rhMG53)或BSA，在10分钟后以1U/kg的剂量腹腔注射或不注射胰岛素。再过10分钟后，处死小鼠并获取相应的组织材料。使用蛋白质免疫印迹检测实验各组骨骼肌、肝脏、脂肪及心脏组织中的胰岛素信号通路重要分子akt的磷酸化水平，进而检测几种组织的胰岛素敏感性。其中各抗体来源如下：Anti-phospho Ser473 Akt(p-AktS473)，CST Cat#4060；Anti-total Akt(t-Akt)，CST Cat#9272；Anti-GAPDH，BioeasyTechnology，Cat#BE0023。利用One-way anova进行统计分析。**表示P＜0.01。检测结果如图10所示。由实验结果可知，血清MG53会降低胰岛素的敏感性，从而能够通过降低血清MG53的浓度或者活性来改善胰岛素的敏感性。
高糖和高胰岛素诱导的来自离体灌流啮齿动物心脏的MG53释放
成年SD大鼠(250至300g)或小鼠(20至30g)用戊巴比妥麻醉(70mg/kg体重，腹腔注射)。大鼠或小鼠的心脏被切离，并且在Langendorff装置上以55mm汞柱的恒定压力用Krebs-Henseleit缓冲液灌流(NaCl 118mM，KCl 4.7mM，CaCl2 2.5mM，MgSO4·7H2O 1.2mM，KH2PO4 1.2mM以及葡萄糖11.1mM)。缓冲液持续通有95％O2/5％CO2(pH 7.4)，并且通过热浴/循环泵加热。持续监控心脏的温度，并且使其持续保持在37±0.5℃。收集不同时间段流出的灌流液。对于EDTA或BFA处理，灌流液溶液中包括0.75mM EDTA-Na(灌流液溶液中无Ca2 +)或30M BFA。收集的灌流液样品用Amicon Ultra-15 10K滤膜离心装置(Millipore，Cat#UFC801096)以3,000rpm离心15分钟并重复3次。经浓缩的灌流液样品用于后续的分析。
用生理盐水给离体啮齿动物的心脏进行Langendorff灌流之后，我们通过对在大鼠心脏中经过30分钟时间段的累积以及在小鼠心脏中经过60分钟时间段的累积的流出灌流液进行免疫印迹分析，检测到了大量MG53的释放(图32)。引人注目的是，用高糖(25mM)代谢挑战使大鼠心肌MG53释放在刺激后的第一个30分钟增加3倍(图32A)。升高的MG53释放持续到葡萄糖挑战的第二个30分钟期间(30-60分钟)，并且以葡萄糖浓度依赖的方式递增(图32A和32B)。与此形成强烈对比的是，不能被生物体利用的L-葡萄糖无法改变心肌MG53的释放(图32C)。为了模仿代谢综合征和T2D的条件，我们研究了葡萄糖和胰岛素共同刺激的效应。用基底浓度的葡萄糖(11.1mM)刺激胰岛素使得离体灌流的大鼠心脏中的心肌MG53释放以时间依赖的和浓度依赖的方式增加(图32D和32E)。高糖和高胰岛素共同存在刺激MG53以～4倍于基线的速率释放(图32C)。另外，我们使用MG53过表达(mg53 TG)和敲除(mg53-/-)小鼠模型，证明了糖和胰岛素的结合刺激诱导的MG53从mg53 TG心脏中释放与野生型(wt)小鼠相比增加至少两倍，而在mg53-/-心脏的灌流液中没有检测到MG53的释放(图32G和32H)。这证实了免疫印迹检测到的释放的蛋白。如图35A和35B所示，高糖加高胰岛素引起的MG53释放的发生不会带来灌流的大鼠心脏中心肌乳酸脱氢酶(LDH)或肌酸激酶(CK)释放(指示细胞膜完整性丧失)的任何变化，这表明代谢调节的MG53释放不是由于心肌损伤造成的。
高糖和高胰岛素引起离体骨髓肌中的MG53释放和体内的MG53释放
成年雄性C57小鼠(20至30g)用戊巴比妥麻醉(70mg/kg，腹腔注射)。自小鼠分离比目鱼肌，并且在室温(22℃)下以改良的Krebs-Henseleit溶液(NaCl 118mM，KCl 4.7mM，CaCl2 2.5mM，MgSO4·7H2O 1.2mM，KH2PO4 1.2mM，葡萄糖5mM)在通有95％O2/5％CO2混合气体的情况下以1.0ml/min的速度连续灌流。适应灌流10分钟后，用含有或不含有高糖(25mM)结合高胰岛素(10U/L)的改良的Krebs-Henseleit溶液缓冲液处理比目鱼肌2小时。灌流液样品在超滤浓缩后用免疫印迹实验分析。
除了心肌，高糖(25mM)和高胰岛素(10U/L)的结合处理还有效地引起从来自野生型小鼠的离体灌流的骨骼肌(比目鱼肌)中释放MG53(图33A)。葡萄糖诱导的从骨骼肌中释放MG53的发生不会带来任何灌流液中的LDH或CK浓度的升高(图35C和35D)。这一结果表明，代谢刺激在生理条件下能够促使骨骼肌以及心肌释放MG53。由于骨骼肌占个体身体非脂肪重量的大约40％，我们假设高糖诱导的MG53释放将足以升高体内的循环MG53水平。高血糖(葡萄糖，2g/kg，腹腔注射，以40分钟间隔重复三次)提高了野生型小鼠的血清MG53(图33B)。
健康人体中葡萄糖的口服递送
健康的志愿者禁食过夜，然后以30分钟间隔口服递送葡萄糖(75g)两次。在葡萄糖处理之前以及在第二次给药后30和90分钟采集血样。血样以3,000rpm离心，并且收集血清用于进行免疫印迹。
在健康人体中，葡萄糖的口服施用显著升高了血清MG53水平(图33C)，同时提高了血糖水平，而不带来血清LDH浓度的变化。
调节分泌途径介导代谢诱导的MG53释放
利用药理学和基因学的方法，我们随后尝试解释代谢调节MG53的释放的潜在机制。首先，为了区别调节MG53分泌与被动漏出，我们评价了一种蛋白转运抑制剂BrefeldinA(BFA)的作用效果。在表达MG53-myc的HEK293细胞中，BFA以剂量依赖的方式抑制高糖诱导的MG53释放(图33D)。BFA(30μM)还可以在离体灌流的大鼠心脏中阻断葡萄糖诱导的MG53释放(图33E)，这说明葡萄糖引起的MG53释放是由经典分泌途径介导的。对于大多数的调节分泌，胞质Ca2+浓度的升高是分泌囊泡膜与细胞质膜的融合以及通过胞吐作用释放囊泡内容物的先决条件。用EDTA(0.75mM)缓冲胞外Ca2+离子实际上会很大程度上阻断代谢调节的MG53分泌(图33F)。在syt7-/-小鼠中，离体灌流的心脏中和体内的高糖加高胰岛素刺激的MG53释放被阻断(图33G和33H)，这表明代谢调节的MG53分泌需要Syt7。值得注意的是，不论是EDTA处理还是Syt7缺失，均没有改变灌流的啮齿动物心脏中(图33F和33G)或体内(图33H)的基础MG53释放，这说明基础MG53释放可能归因于非经典的分泌或者漏出。将这些结果汇总在一起，我们认为，和多种细胞因子一样，代谢诱导的MG53释放是由Ca2+离子和SNARE结合蛋白依赖的分泌机制介导的。
MG53的心脏特异性过表达足以引起系统性胰岛素抵抗和代谢综合征
为了进一步研究血液中MG53的慢性增高和代谢疾病发生可能的因果关系，我们构建了心脏特异过表达MG53的转基因小鼠(mg53 h-TG)。心肌MG53分泌会持续提供循环MG53，而骨骼肌中的MG53表达不会被干扰。图34A示出了14周龄的年轻成年mg53 h-TG小鼠中的基础血清MG53水平明显高于同窝的野生型小鼠。
测量了3至38周龄野生型和mg53 h-TG小鼠禁食体重，并且分别对14和30周龄的野生型和mg53 h-TG小鼠进行了葡萄糖耐受测试(GTT)和胰岛素耐受测试(ITT)。简言之，对于GTT，小鼠禁食过夜(16小时)并且随后腹腔注射D-葡萄糖(2g/kg，Sigma-Aldrich)。对于ITT，小鼠随机喂食并且用牛胰岛素攻毒(0.75单位/kg，Sigma-Aldrich，腹腔注射)在注射前以及注射后的不同时间点(如图34C和34D中所示)收集来自尾静脉的血液并测量血糖。
年轻的mg53 h-TG小鼠表现出中度肥胖(图34B)、葡萄糖不耐受和胰岛素不耐受(图34C和34D)。在30周龄时，MG53的心脏特异性过表达足以引起全面的代谢综合征，表现为高血糖症、高胰岛素血症和血脂异常(图34E-34G)、腹部脂肪堆积、白色脂肪、棕色脂肪和脂肪非脂肪比增加(图34H-34M)，以及脂肪肝和胰腺增生(图34N和34O)。随着系统性胰岛素抵抗的发展，在此时间点mg53 h-TG小鼠显示出严重的肥胖、葡萄糖不耐受和胰岛素不耐受(图34B-34D)。同时mg53 h-TG小鼠每天的能量消耗显著低于野生型对照(图34Q-34S)，但是他们每天的进食量、核心体温或身体活力并没有发生变化(图34Q-34S)。在后面的时间点，mg53 h-TG小鼠也发展出糖尿病并发症，如糖尿病心肌病。因此，循环MG53的慢性增高首先损伤全身的胰岛素响应，其次导致造成肥胖、糖尿病和多种心血管并发症的系统性代谢综合征。
实施例3：抗体治疗效果的研究
选择8-10周龄的20只db/db小鼠(糖尿病模型小鼠，购自Jackson Laboratory(BarHarbor，ME)Cat#000642)，其中10只小鼠作为对照组，仅注射IgG(Sigma，I5381)；另10只作为治疗组，注射MG53抗体#84。同时订购年龄相同的5只db/+小鼠。db/+小鼠仅用于最后取材，不进行注射。
小鼠到达后，稳定1周，而后测小鼠的体重、血糖，并检查状态。实验当天，动物不禁食，早8点测量体重和血糖。而后进行分组，注意严格匹配体重和血糖。根据分组情况进行注射。随后，以1mg/只/次，注射体积0.24ml/只/次，于9点注射1次。之后小鼠禁食，在实验当天15点、19点分别测量血糖。并在之后的每天9点测量体重，9点和15点分别测量血糖，连续测量10天。
在注射后的第8天进行胰岛素耐受实验(ITT)，实验条件参见文献Song等人，Central role of E3 biquitin ligase MG53 in insulin resistance and metabolicdisorders，Nature，494，375-381，2013中的描述。
检测结果如图11所示。由实验结果可知，MG53抗体能够有效降低血糖并且能够改善胰岛素的敏感性，从而能够用于治疗糖尿病。
实施例4：MG53小分子抑制剂的研究
实施例4所用的所有小分子化合物均购买自荷兰的SPECS化合物库，MG53蛋白由ORIGENE公司合成制备。
计算机虚拟筛选
首先对MG53蛋白进行同源模建，选择蛋白一级结构即氨基酸序列同源性较高并且被解析的结构分辨率较高的已有蛋白结构作为参考结构，然后用Cavity 2.0对小分子结合口袋进行预测，选择口袋体积相对较大、解离常数(pKD)较大并且具有两亲性的口袋作为目标口袋。
筛选的原则是通过不同角度不同方式去筛选，每种筛选方法按照小分子化合物和蛋白的结合强弱打分，而每次都选择打分较高的分子，最后取不同方法筛选结果的交集。具体操作如下：首先，使蛋白口袋中的各个基团固定，用小分子化合物去自由对接，选取打分高的两万个化合物；然后让小分子化合物和基团都可以自由旋转对接，选取打分高的四千个化合物；接下来用pymol软件进行手动筛选，筛选的标准有以下五个：a.化合物的分子量要大于300Da，分子量太小特异性响应会变弱；b.化合物与口袋中的基团之间要有至少三个氢键的相互作用，这是为了增加化合物和蛋白之间的相互作用；c.化合物对蛋白口袋要有80％以上的占有率，这也是为了降低非特异性；d.化合物不能是一个多肽，这是为了避免机体内的多肽的非特异性结合；e.化合物中不含有金属原子。最后得到了140个小分子化合物。
细胞筛选
接下来对这140个分子进行细胞层面的筛选。为了进行大量的筛选实验，构建专用细胞筛选体系。首先构建带GFP荧光标记的IRS1质粒(IRS1-GFP)以及带Myc标记的MG53质粒(MG53-myc)，同时将这两种质粒转染细胞当中使其高表达，正常情况下，MG53会行使其E3连接酶的活性介导IRS1的泛素化降解，使其产生的荧光强度与对照组相比显著降低，从而破坏细胞胰岛素信号通路。将这两种质粒共转细胞的同时再加入一个小分子化合物，如果小分子化合物对MG53蛋白活性有抑制作用，会阻碍其在细胞内行使其正常的功能，此时IRS1的荧光强度会得到一定的恢复，据此来甄别对MG53具有抑制作用的小分子化合物。为了选择一种可控性比较好并且容易操作的细胞，在HEK293T和HEK293A细胞中做了比较实验。即，分别在这两种细胞中共转MG53-Myc和IRS1-GFP。筛选结果如图12所示。发现HEK293T细胞中，MG53能够使IRS1的荧光强度有一个较大的减弱。为了增大后续筛选实验的操作窗口，选择在HEK293T细胞中进行后续实验。
建立筛选体系以后，在HEK293T细胞中进行140个小分子化合物的筛选。首先用10ml的细胞培养皿培养HEK293T细胞，两天换一次培养基，挑选生长健康状态较好的细胞，等到细胞铺满整个细胞培养皿80％的时候进行MG53-Myc和IRS1-GFP的共转染，并且同时进行对照组pcDNA4空载体和IRS1-GFP的共转染。转染后细胞培养24小时，对照组在荧光显微镜下可以看到GFP有很强的表达，而此时实验组的荧光强度有50％以上的减弱。接下来，用0.125％的胰酶将细胞分别消化下来，低速离心收集细胞，再把细胞混匀以后分别铺在96孔板的酶标板上，继续培养。24小时以后对细胞进行换液和加入待测小分子化合物。继续培养24小时，最后用PBS将细胞洗3次，进行485nm/528nm的荧光信号检测。分别对化合物进行浓度为100μM、10μM和1μM的筛选。共筛选出48个候选化合物分子。
SPR筛选
对这48个候选的化合物分子进行SPR实验的初步筛选。根据理论计算，MG53蛋白和小分子化合物之间相互结合的理论响应值为5，因此筛选的标准之一就是响应值要大于或等于5。我们选择了两个浓度，分别是50μM和100μM进行筛选，另外对照组是PBS溶液。如图13所示，在这48个小分子化合物中总共有15个分子的响应值不小于5(其中，10号、14号、16号、17号、25号、68号、13号、16号和28号相对高响应；1号、3号、26号、28号、56号和10号相对低响应)，这些化合物作为下一步筛选的候选分子。
接下来，通过浓度依赖的SPR实验探究这15个候选分子与MG53结合的动力学特征。筛选标准包括解离常数要小于50μM，不是非特异性结合，分子纯度要高，最后筛选得到4个候选分子(数据参见图14，分别是1号，10号，26号和16号)。这4个分子的解离常数均小于50μM(看右边对应的S型曲线，解离常数为当响应值达到最大响应值一半时的化合物浓度)，最低响应浓度都非常小，达到了纳摩尔级别，这表明该化合物与MG53蛋白结合的特异性越高，成药性越好，相应的动力学曲线也都是“S”型曲线，表明这4个化合物分子有较好的动力学特征。另外的11个化合物分子由于分子纯度不够(通过小分子质谱的方式进行检测)，或者是解离常数太大(解离常数在50μM以上)，亦或是表现出糟糕的动力学特征(动力学曲线呈直线或不是S型曲线，表明分子和MG53蛋白结合具有很强的非特异性)，等等。在所有的这4个候选分子中，值得一提的是第26号分子，其最低响应浓度仅仅1.2nM，解离常数为100nM，表明这个分子和MG53蛋白具有非常好的特异性结合，而且其SPR的响应曲线是“慢上慢下”类型，这表明，如果将其用于给药治疗的话，将表现出用药量少，药效长，药效稳定，并且给药时间间隔长等诸多优点，因此具有很大的成药可能性。
降解实验验证
接下来，对4个候选分子的细胞内活性进行了进一步的验证。将培养状态良好的HEK293T细胞分为6组，分别转染IRS1以及MG53-myc，对于转染了IRS1和MG53-myc的4组细胞分别进行加化合物处理，所加化合物浓度均为50μM，加入化合物24小时以后进行细胞总蛋白的提取以及SDS-PAGE胶垂直电泳实验。曝光时分别检测了IRS1以及MG53蛋白的表达情况，以GAPDH作为内参对照。我们发现这4个化合物分子对于MG53介导的IRS1的泛素化降解均具有一定的不同程度的恢复作用(参见图15)，这表明这些化合物分子对于MG53在细胞内行使其E3连接酶的功能具有一定程度的抑制作用。
筛选出的4个化合物的结构如下：
Figure BDA0001840075660000591
Figure BDA0001840075660000601
序列表
<110> 北京大学
<120> 检测或抑制细胞外游离MG53的方法和用途
<130> 066467-8002CN01
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 136
<212> PRT
<213> 兔
<400> 1
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser
35 40 45
Arg Asn Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Tyr Val Asp Phe Glu Asp Asp Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ser Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Val Arg Gly Asn Pro Gly Ala Thr Arg Gly Gly Ile Ile Trp Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 2
<211> 134
<212> PRT
<213> 兔
<400> 2
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Val Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Lys Ser Val Pro Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Val Tyr Ser Asn Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Thr Glu Val Val Val Lys
130
<210> 3
<211> 459
<212> PRT
<213> 兔
<400> 3
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Leu Ser
35 40 45
Arg Asn Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Tyr Val Asp Phe Glu Asp Asp Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Arg Gly Asn Pro Gly Ala Thr Arg Gly Gly Ile Ile Trp Gly Pro
115 120 125
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Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val
180 185 190
Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr
225 230 235 240
Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr
275 280 285
Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg
290 295 300
Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile
305 310 315 320
Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His
325 330 335
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg
340 345 350
Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu
355 360 365
Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu
385 390 395 400
Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly
420 425 430
Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 4
<211> 238
<212> PRT
<213> 兔
<400> 4
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Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Val Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ile Leu Ala Ser
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<212> DNA
<213> 兔
<400> 5
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tcgctggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagcctctg gaatcgacct cagtaggaat gatataaatt gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg atacgttgat tttgaggatg acagatacta cgcgagctgg 240
gtgaaaggcc gcttcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300
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cgtggtggaa tcatctgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctcg 408
<210> 6
<211> 402
<212> DNA
<213> 兔
<400> 6
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tgcccacccc ctgaactcct ggggggaccg tctgtcttca tcttcccccc aaaacccaag 780
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ccgccgctac gggagcagca gttcaacagc acgatccgcg tggtcagcac cctccccatc 960
gcgcaccagg actggctgag gggcaaggag ttcaagtgca aagtccacaa caaggcactc 1020
ccggccccca tcgagaaaac catctccaaa gccagagggc agcccctgga gccgaaggtc 1080
tacaccatgg gccctccccg ggaggagctg agcagcaggt cggtcagcct gacctgcatg 1140
atcaacggct tctacccttc cgacatctcg gtggagtggg agaagaacgg gaaggcagag 1200
gacaactaca agaccacgcc ggccgtgctg gacagcgacg gctcctactt cctctacagc 1260
aagctctcag tgcccacgag tgagtggcag cggggcgacg tcttcacctg ctccgtgatg 1320
cacgaggcct tgcacaacca ctacacgcag aagtccatct cccgctctcc gggtaaatga 1380
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<212> DNA
<213> 兔
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atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgcca tcgtggtgac ccagactcca tcttccaagt ctgtccctgt gggaggcaca 120
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cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatt atgcatccat tctggcatct 240
ggggtctcat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gatgtggtgt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gatataaata tcgtgacagt 360
gataatactg ctttcggcgg agggaccgag gtggtggtca aaggtgatcc agttgcacct 420
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aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717
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<212> PRT
<213> 兔
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Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ser Ile Asn Asn Leu Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Arg Gly Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ser Tyr Asn Ile Trp Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
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<212> PRT
<213> 兔
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Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Thr Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly
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Thr Glu Val Val Val Lys
130
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<212> PRT
<213> 兔
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Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Ser Ile Asn Asn Leu Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
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Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Arg Gly Ser Gly Gly Thr Ser Asn Ser Tyr Asn Ile Trp Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val
180 185 190
Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr
195 200 205
Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn
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Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
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260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr
275 280 285
Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg
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Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 兔
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Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser
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Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Thr Ile Tyr Asn Asn Asn Gln Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro
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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gln Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Ser Thr Asp Gly Ser Ala Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
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Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
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Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
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<212> DNA
<213> 兔
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<212> DNA
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atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
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Val Gln Cys Leu Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Val Arg Gly Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Asn Trp Gly Pro Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser
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50 55 60
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Val Val Val Arg
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Val Gln Cys Leu Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Lys Val Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser
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Val Arg Gly Gly Pro Gly Ser Gly Ala Ala Asn Trp Gly Pro Gly Thr
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Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
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Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
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Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
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Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
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Val Val Val Arg Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
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gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggcggatct gaaaatgacc 300
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgtca gaggtggtcc tggtagtggt 360
gctgctaatt ggggcccagg caccctggtc accgtctcct cagggcaacc taaggctcca 420
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ggcttctacc cttccgacat ctcggtggag tgggagaaga acgggaaggc agaggacaac 1200
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<400> 24
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcctccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca gttgccagtc cagtcagagt gtttataata acaactactt atcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc ctgatctatt atacatccac tctgccatct 240
ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gacctggagt gtgacgatgc tgccacttac tactgtgcag gcgcttatag cgttaatatt 360
gatgctttcg gcggagggac cgaggtggtg gtcagaggtg atccagttgc acctactgtc 420
ctcatcttcc caccagctgc tgatcaggtg gcaactggaa cagtcaccat cgtgtgtgtg 480
gcgaataaat actttcccga tgtcaccgtc acctgggagg tggatggcac cacccaaaca 540
actggcatcg agaacagtaa aacaccgcag aattctgcag attgtaccta caacctcagc 600
agcactctga cactgaccag cacacagtac aacagccaca aagagtacac ctgcaaggtg 660
acccagggca cgacctcagt cgtccagagc ttcaataggg gtgactgtta g 711
<210> 25
<211> 139
<212> PRT
<213> 兔
<400> 25
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Ala Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Val Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Arg Leu Ser Tyr Tyr Thr Tyr Gly His Ala Tyr Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 26
<211> 135
<212> PRT
<213> 兔
<400> 26
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Tyr Asn His Asn Ser Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ala
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gly Ser Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys
130 135
<210> 27
<211> 462
<212> PRT
<213> 兔
<400> 27
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Ala Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ile Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Val Ile Tyr Ala Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp
85 90 95
Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Arg Leu Ser Tyr Tyr Thr Tyr Gly His Ala Tyr Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser
145 150 155 160
Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe
180 185 190
Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
210 215 220
Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser
225 230 235 240
Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
245 250 255
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val
275 280 285
Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro
290 295 300
Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr
305 310 315 320
Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys
325 330 335
Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
340 345 350
Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro
355 360 365
Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
370 375 380
Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly
385 390 395 400
Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp
405 410 415
Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp
420 425 430
Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
435 440 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 28
<211> 239
<212> PRT
<213> 兔
<400> 28
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Pro
20 25 30
Val Ser Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Ser Leu Tyr Asn His Asn Ser Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Ala
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Asp Val Gln Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gly Ser Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp Cys Thr Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 29
<211> 417
<212> DNA
<213> 兔
<400> 29
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggcggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
gcggtctctg gaatatccct cagtagctat gcaatgaact gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg agtcatttat gctagtggtg gcacatacta cgcgagctgg 240
gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcaa gattgagtta ctatacttat 360
ggccatgctt atcttaagga catctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctca 417
<210> 30
<211> 405
<212> DNA
<213> 兔
<400> 30
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactgca tcgcccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca agtgccagtc cagtcagagt ctttataatc acaactcctt agcctggttt 180
cagcagaaag cagggcagcc tcccaagcgc ctgatctatt ctgcatccac tctggcatct 240
ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gacgtgcagt gtgccgatgc tgccacttac tactgtcaag gcagttatga ttgtagtagt 360
gctgattgta ctgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaa 405
<210> 31
<211> 1389
<212> DNA
<213> 兔
<400> 31
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggcggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
gcggtctctg gaatatccct cagtagctat gcaatgaact gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg agtcatttat gctagtggtg gcacatacta cgcgagctgg 240
gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgtcgacca cggtggatct gaaaatgacc 300
agtctgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcaa gattgagtta ctatacttat 360
ggccatgctt atcttaagga catctggggc ccaggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggg 420
caacctaagg ctccatcagt cttcccactg gccccctgct gcggggacac acccagctcc 480
acggtgaccc tgggctgcct ggtcaaaggg tacctcccgg agccagtgac cgtgacctgg 540
aactcgggca ccctcaccaa tggggtacgc accttcccgt ccgtccggca gtcctcaggc 600
ctctactcgc tgagcagcgt ggtgagcgtg acctcaagca gccagcccgt cacctgcaac 660
gtggcccacc cagccaccaa caccaaagtg gacaagaccg ttgcgccctc gacatgcagc 720
aagcccacgt gcccaccccc tgaactcctg gggggaccgt ctgtcttcat cttcccccca 780
aaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840
gtgagccagg atgaccccga ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgc 900
accgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt ggtcagcacc 960
ctccccatcg cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac 1020
aaggcactcc cggcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccagagggca gcccctggag 1080
ccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctg 1140
acctgcatga tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacggg 1200
aaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg acagcgacgg ctcctacttc 1260
ctctacagca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgc 1320
tccgtgatgc acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccg 1380
ggtaaatga 1389
<210> 32
<211> 720
<212> DNA
<213> 兔
<400> 32
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactgca tcgcccgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca agtgccagtc cagtcagagt ctttataatc acaactcctt agcctggttt 180
cagcagaaag cagggcagcc tcccaagcgc ctgatctatt ctgcatccac tctggcatct 240
ggggtcccat cgcggttcaa aggcagtgga tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
gacgtgcagt gtgccgatgc tgccacttac tactgtcaag gcagttatga ttgtagtagt 360
gctgattgta ctgctttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 420
cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480
gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600
aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660
tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
<210> 33
<211> 133
<212> PRT
<213> 兔
<400> 33
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Val Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Asp Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 34
<211> 135
<212> PRT
<213> 兔
<400> 34
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Gly Tyr Tyr Asn Val Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys
130 135
<210> 35
<211> 456
<212> PRT
<213> 兔
<400> 35
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ser
35 40 45
Ser Tyr Ala Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Lys Val Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Asp Arg Asp Tyr Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser
195 200 205
Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile
275 280 285
Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln
290 295 300
Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro
340 345 350
Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser
355 360 365
Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe
420 425 430
Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 36
<211> 239
<212> PRT
<213> 兔
<400> 36
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Ala Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Gly Ala Gly Tyr Tyr Asn Val Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 37
<211> 399
<212> DNA
<213> 兔
<400> 37
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattgtccct cagtagctat gcagtgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg aatcatttat gctagtggta aaacatacta cgcgagctgg 240
gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa ggtgaccagt 300
ctgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag accgagatta ttacggcatg 360
gacccctggg gcccagggac cctcgtcacc gtctcttca 399
<210> 38
<211> 405
<212> DNA
<213> 兔
<400> 38
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120
acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag agcattagtg actacttatc ctggtatcag 180
cagaaaccag ggcagcgtcc caagctcctg atctatgaag catccaagct ggcctctggg 240
gtcccgtcgc ggttcagcgg cagtggatat gggacagagt tcactctcac catcagcgac 300
ctggagtgtg ccgctgctgc catttactac tgtcaaacca cttatggtag tagtggtgct 360
ggttattata atgtttttgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaa 405
<210> 39
<211> 1371
<212> DNA
<213> 兔
<400> 39
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga cacccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattgtccct cagtagctat gcagtgagct gggtccgcca ggctccaggg 180
aaggggctgg aatggatcgg aatcatttat gctagtggta aaacatacta cgcgagctgg 240
gcgaaaggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa ggtgaccagt 300
ctgacaaccg aggacacggc cacctatttc tgtgccagag accgagatta ttacggcatg 360
gacccctggg gcccagggac cctcgtcacc gtctcttcag ggcaacctaa ggctccatca 420
gtcttcccac tggccccctg ctgcggggac acacccagct ccacggtgac cctgggctgc 480
ctggtcaaag ggtacctccc ggagccagtg accgtgacct ggaactcggg caccctcacc 540
aatggggtac gcaccttccc gtccgtccgg cagtcctcag gcctctactc gctgagcagc 600
gtggtgagcg tgacctcaag cagccagccc gtcacctgca acgtggccca cccagccacc 660
aacaccaaag tggacaagac cgttgcgccc tcgacatgca gcaagcccac gtgcccaccc 720
cctgaactcc tggggggacc gtctgtcttc atcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780
atgatctcac gcacccccga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca ggatgacccc 840
gaggtgcagt tcacatggta cataaacaac gagcaggtgc gcaccgcccg gccgccgcta 900
cgggagcagc agttcaacag cacgatccgc gtggtcagca ccctccccat cgcgcaccag 960
gactggctga ggggcaagga gttcaagtgc aaagtccaca acaaggcact cccggccccc 1020
atcgagaaaa ccatctccaa agccagaggg cagcccctgg agccgaaggt ctacaccatg 1080
ggccctcccc gggaggagct gagcagcagg tcggtcagcc tgacctgcat gatcaacggc 1140
ttctaccctt ccgacatctc ggtggagtgg gagaagaacg ggaaggcaga ggacaactac 1200
aagaccacgc cggccgtgct ggacagcgac ggctcctact tcctctacag caagctctca 1260
gtgcccacga gtgagtggca gcggggcgac gtcttcacct gctccgtgat gcacgaggcc 1320
ttgcacaacc actacacgca gaagtccatc tcccgctctc cgggtaaatg a 1371
<210> 40
<211> 720
<212> DNA
<213> 兔
<400> 40
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120
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cagaaaccag ggcagcgtcc caagctcctg atctatgaag catccaagct ggcctctggg 240
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ggttattata atgtttttgg cggagggacc gaggtggtgg tcaaaggtga tccagttgca 420
cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480
gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600
aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660
tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
<210> 41
<211> 477
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 42
<211> 477
<212> PRT
<213> 恒河猴/食蟹猴
<400> 42
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Gly Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ser
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Ser Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 43
<211> 477
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 43
Met Ser Thr Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Asp Asp
35 40 45
Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Ser Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Ala Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Glu Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ala Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Thr Cys Gln Phe Asp Lys Thr Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Lys Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Thr Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Thr
420 425 430
Asp Ala Leu Thr Pro Leu Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Met Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ser
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Ser Glu Gln Ala
465 470 475
<210> 44
<211> 477
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 44
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Thr Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Gln Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Pro
420 425 430
Asp Val Leu Thr Pro Ile Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Ile Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gln Glu Gln Ala
465 470 475
<210> 45
<211> 478
<212> PRT
<213> 猪
<400> 45
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Ser Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Gln Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Val Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Gly Val Leu Glu Gln Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Leu Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Met
275 280 285
Gln Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Thr Ala His Pro Ser Leu Val Leu
290 295 300
Ser Ala Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Thr
325 330 335
His Gln Leu Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Gly Ala Gln Ala Gly Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Ser Arg Ile Gly Ile Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Ser Gly Gly Glu Ala
465 470 475
<210> 46
<211> 477
<212> PRT
<213> 狗
<400> 46
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ser Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Pro Cys Pro Cys Cys Gln Ala Leu Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Gln Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Leu Leu Glu His Gln Leu Met Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Met Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Val Thr
275 280 285
Lys Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Leu
290 295 300
Ser Pro Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Cys Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Gln Gln Val Leu Ser Asp Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Gln Val Gly
340 345 350
Glu Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Gln Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Ile Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Pro
420 425 430
Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Gly Glu Glu Ala
465 470 475
<210> 47
<211> 477
<212> PRT
<213> 兔
<400> 47
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ser Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Asn Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Val Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ser Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Ser
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Thr Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Ser Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Gly Leu His Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Pro Thr Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Asp Asp Ala Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
Gln Gln Leu Leu Ser Asp Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ser Glu Ala Ser Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Asp Gly Lys Thr Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Leu Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Glu Leu Leu Phe Ala Phe Arg Glu Arg Leu Pro Gly Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Asp Gly Gln Glu Ala
465 470 475
<210> 48
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 48
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ala Pro
245 250 255
Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe
260 265 270
Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val
290 295 300
Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro
305 310 315 320
Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala
325 330 335
His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly
340 345 350
Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg
355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
420 425 430
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
435 440 445
Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala
450 455 460
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
465 470 475
<210> 49
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 49
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg
115 120 125
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130 135 140
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Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
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225 230 235 240
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245 250 255
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475
<210> 50
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 50
Met Ser Thr Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
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<210> 51
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 51
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
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<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 52
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
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<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 53
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
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Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
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340 345 350
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465 470 475
<210> 54
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 54
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly
370 375 380
Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro
385 390 395 400
Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr
405 410 415
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465 470 475
<210> 55
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 55
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Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
325 330
<210> 56
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 56
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
1 5 10 15
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Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala
275 280 285
Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala
325 330
<210> 57
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 57
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln
65 70 75 80
Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr
85 90 95
Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg
115 120 125
Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys
130 135 140
Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu
165 170 175
Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg
180 185 190
Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu
195 200 205
Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys
210 215 220
Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys
225 230 235 240
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<211> 1382
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
Met Gly Thr Gly Gly Arg Arg Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Val
1 5 10 15
Ala Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly His Leu Tyr Pro Gly
20 25 30
Glu Val Cys Pro Gly Met Asp Ile Arg Asn Asn Leu Thr Arg Leu His
35 40 45
Glu Leu Glu Asn Cys Ser Val Ile Glu Gly His Leu Gln Ile Leu Leu
50 55 60
Met Phe Lys Thr Arg Pro Glu Asp Phe Arg Asp Leu Ser Phe Pro Lys
65 70 75 80
Leu Ile Met Ile Thr Asp Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Tyr Gly Leu
85 90 95
Glu Ser Leu Lys Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Ser
100 105 110
Arg Leu Phe Phe Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Val His Leu
115 120 125
Lys Glu Leu Gly Leu Tyr Asn Leu Met Asn Ile Thr Arg Gly Ser Val
130 135 140
Arg Ile Glu Lys Asn Asn Glu Leu Cys Tyr Leu Ala Thr Ile Asp Trp
145 150 155 160
Ser Arg Ile Leu Asp Ser Val Glu Asp Asn Tyr Ile Val Leu Asn Lys
165 170 175
Asp Asp Asn Glu Glu Cys Gly Asp Ile Cys Pro Gly Thr Ala Lys Gly
180 185 190
Lys Thr Asn Cys Pro Ala Thr Val Ile Asn Gly Gln Phe Val Glu Arg
195 200 205
Cys Trp Thr His Ser His Cys Gln Lys Val Cys Pro Thr Ile Cys Lys
210 215 220
Ser His Gly Cys Thr Ala Glu Gly Leu Cys Cys His Ser Glu Cys Leu
225 230 235 240
Gly Asn Cys Ser Gln Pro Asp Asp Pro Thr Lys Cys Val Ala Cys Arg
245 250 255
Asn Phe Tyr Leu Asp Gly Arg Cys Val Glu Thr Cys Pro Pro Pro Tyr
260 265 270
Tyr His Phe Gln Asp Trp Arg Cys Val Asn Phe Ser Phe Cys Gln Asp
275 280 285
Leu His His Lys Cys Lys Asn Ser Arg Arg Gln Gly Cys His Gln Tyr
290 295 300
Val Ile His Asn Asn Lys Cys Ile Pro Glu Cys Pro Ser Gly Tyr Thr
305 310 315 320
Met Asn Ser Ser Asn Leu Leu Cys Thr Pro Cys Leu Gly Pro Cys Pro
325 330 335
Lys Val Cys His Leu Leu Glu Gly Glu Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr
340 345 350
Ser Ala Gln Glu Leu Arg Gly Cys Thr Val Ile Asn Gly Ser Leu Ile
355 360 365
Ile Asn Ile Arg Gly Gly Asn Asn Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ala Asn
370 375 380
Leu Gly Leu Ile Glu Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Lys Ile Arg Arg Ser
385 390 395 400
Tyr Ala Leu Val Ser Leu Ser Phe Phe Arg Lys Leu Arg Leu Ile Arg
405 410 415
Gly Glu Thr Leu Glu Ile Gly Asn Tyr Ser Phe Tyr Ala Leu Asp Asn
420 425 430
Gln Asn Leu Arg Gln Leu Trp Asp Trp Ser Lys His Asn Leu Thr Ile
435 440 445
Thr Gln Gly Lys Leu Phe Phe His Tyr Asn Pro Lys Leu Cys Leu Ser
450 455 460
Glu Ile His Lys Met Glu Glu Val Ser Gly Thr Lys Gly Arg Gln Glu
465 470 475 480
Arg Asn Asp Ile Ala Leu Lys Thr Asn Gly Asp Gln Ala Ser Cys Glu
485 490 495
Asn Glu Leu Leu Lys Phe Ser Tyr Ile Arg Thr Ser Phe Asp Lys Ile
500 505 510
Leu Leu Arg Trp Glu Pro Tyr Trp Pro Pro Asp Phe Arg Asp Leu Leu
515 520 525
Gly Phe Met Leu Phe Tyr Lys Glu Ala Pro Tyr Gln Asn Val Thr Glu
530 535 540
Phe Asp Gly Gln Asp Ala Cys Gly Ser Asn Ser Trp Thr Val Val Asp
545 550 555 560
Ile Asp Pro Pro Leu Arg Ser Asn Asp Pro Lys Ser Gln Asn His Pro
565 570 575
Gly Trp Leu Met Arg Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln Tyr Ala Ile Phe
580 585 590
Val Lys Thr Leu Val Thr Phe Ser Asp Glu Arg Arg Thr Tyr Gly Ala
595 600 605
Lys Ser Asp Ile Ile Tyr Val Gln Thr Asp Ala Thr Asn Pro Ser Val
610 615 620
Pro Leu Asp Pro Ile Ser Val Ser Asn Ser Ser Ser Gln Ile Ile Leu
625 630 635 640
Lys Trp Lys Pro Pro Ser Asp Pro Asn Gly Asn Ile Thr His Tyr Leu
645 650 655
Val Phe Trp Glu Arg Gln Ala Glu Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Asp
660 665 670
Tyr Cys Leu Lys Gly Leu Lys Leu Pro Ser Arg Thr Trp Ser Pro Pro
675 680 685
Phe Glu Ser Glu Asp Ser Gln Lys His Asn Gln Ser Glu Tyr Glu Asp
690 695 700
Ser Ala Gly Glu Cys Cys Ser Cys Pro Lys Thr Asp Ser Gln Ile Leu
705 710 715 720
Lys Glu Leu Glu Glu Ser Ser Phe Arg Lys Thr Phe Glu Asp Tyr Leu
725 730 735
His Asn Val Val Phe Val Pro Arg Lys Thr Ser Ser Gly Thr Gly Ala
740 745 750
Glu Asp Pro Arg Pro Ser Arg Lys Arg Arg Ser Leu Gly Asp Val Gly
755 760 765
Asn Val Thr Val Ala Val Pro Thr Val Ala Ala Phe Pro Asn Thr Ser
770 775 780
Ser Thr Ser Val Pro Thr Ser Pro Glu Glu His Arg Pro Phe Glu Lys
785 790 795 800
Val Val Asn Lys Glu Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Arg His Phe Thr
805 810 815
Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gln Ala Cys Asn Gln Asp Thr Pro Glu Glu
820 825 830
Arg Cys Ser Val Ala Ala Tyr Val Ser Ala Arg Thr Met Pro Glu Ala
835 840 845
Lys Ala Asp Asp Ile Val Gly Pro Val Thr His Glu Ile Phe Glu Asn
850 855 860
Asn Val Val His Leu Met Trp Gln Glu Pro Lys Glu Pro Asn Gly Leu
865 870 875 880
Ile Val Leu Tyr Glu Val Ser Tyr Arg Arg Tyr Gly Asp Glu Glu Leu
885 890 895
His Leu Cys Val Ser Arg Lys His Phe Ala Leu Glu Arg Gly Cys Arg
900 905 910
Leu Arg Gly Leu Ser Pro Gly Asn Tyr Ser Val Arg Ile Arg Ala Thr
915 920 925
Ser Leu Ala Gly Asn Gly Ser Trp Thr Glu Pro Thr Tyr Phe Tyr Val
930 935 940
Thr Asp Tyr Leu Asp Val Pro Ser Asn Ile Ala Lys Ile Ile Ile Gly
945 950 955 960
Pro Leu Ile Phe Val Phe Leu Phe Ser Val Val Ile Gly Ser Ile Tyr
965 970 975
Leu Phe Leu Arg Lys Arg Gln Pro Asp Gly Pro Leu Gly Pro Leu Tyr
980 985 990
Ala Ser Ser Asn Pro Glu Tyr Leu Ser Ala Ser Asp Val Phe Pro Cys
995 1000 1005
Ser Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu Val Ser Arg Glu Lys Ile
1010 1015 1020
Thr Leu Leu Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr
1025 1030 1035
Glu Gly Asn Ala Arg Asp Ile Ile Lys Gly Glu Ala Glu Thr Arg
1040 1045 1050
Val Ala Val Lys Thr Val Asn Glu Ser Ala Ser Leu Arg Glu Arg
1055 1060 1065
Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met Lys Gly Phe Thr Cys
1070 1075 1080
His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val Ser Lys Gly Gln Pro
1085 1090 1095
Thr Leu Val Val Met Glu Leu Met Ala His Gly Asp Leu Lys Ser
1100 1105 1110
Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Ala Glu Asn Asn Pro Gly Arg
1115 1120 1125
Pro Pro Pro Thr Leu Gln Glu Met Ile Gln Met Ala Ala Glu Ile
1130 1135 1140
Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Lys Lys Phe Val His Arg
1145 1150 1155
Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala His Asp Phe Thr Val
1160 1165 1170
Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile Tyr Glu Thr Asp
1175 1180 1185
Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro Val Arg Trp Met
1190 1195 1200
Ala Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asp
1205 1210 1215
Met Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile Thr Ser Leu Ala
1220 1225 1230
Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn Glu Gln Val Leu Lys Phe
1235 1240 1245
Val Met Asp Gly Gly Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Asn Cys Pro Glu
1250 1255 1260
Arg Val Thr Asp Leu Met Arg Met Cys Trp Gln Phe Asn Pro Lys
1265 1270 1275
Met Arg Pro Thr Phe Leu Glu Ile Val Asn Leu Leu Lys Asp Asp
1280 1285 1290
Leu His Pro Ser Phe Pro Glu Val Ser Phe Phe His Ser Glu Glu
1295 1300 1305
Asn Lys Ala Pro Glu Ser Glu Glu Leu Glu Met Glu Phe Glu Asp
1310 1315 1320
Met Glu Asn Val Pro Leu Asp Arg Ser Ser His Cys Gln Arg Glu
1325 1330 1335
Glu Ala Gly Gly Arg Asp Gly Gly Ser Ser Leu Gly Phe Lys Arg
1340 1345 1350
Ser Tyr Glu Glu His Ile Pro Tyr Thr His Met Asn Gly Gly Lys
1355 1360 1365
Lys Asn Gly Arg Ile Leu Thr Leu Pro Arg Ser Asn Pro Ser
1370 1375 1380
<210> 59
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ataggtaccg ccaccatgtc ggctgcaccc ggcct 35
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
atactcgagc ggcctgttcc tgctccggcc 30
<210> 61
<211> 609
<212> PRT
<213> 狨猴
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(71)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (480)..(480)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 61
Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu
1 5 10 15
Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser
20 25 30
Phe Cys His Ile Cys Leu Arg Arg Met Lys Thr Glu Pro Ala Ala Asp
35 40 45
Asp Thr Val Pro Xaa Thr Ser Cys Gln Ala Asn Lys Pro Thr Asn Leu
50 55 60
Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Arg Trp Pro Pro Gly Ser Thr
65 70 75 80
Ala Arg Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr Cys Glu Gln Asp Arg
85 90 95
Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly Ser His Arg Gly His
100 105 110
Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg Ser Arg Asp Arg Glu
115 120 125
Met Gly Gly Arg Ile Pro Gly Ala Gly Leu Met Gly Gly Ala Glu Pro
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Thr Gly Gln Arg Pro Lys Trp Tyr Ser Cys Thr Arg
145 150 155 160
Trp Ala Gly Arg Thr Gly Ser Pro Arg Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala
165 170 175
Phe Gly Arg Glu Pro Gly Gly Arg Gly Gly Ala Val Leu Met Ser Ser
180 185 190
Ala Glu Ala His Ala Pro Leu Lys Leu Arg Asn Leu Gly Arg Pro Asp
195 200 205
Gly Leu Gln Ala Gly Leu Thr Gly Arg Glu Ala Gly Trp Pro Gly Arg
210 215 220
Pro Phe Ala Thr Gly Glu Gly Leu Ala Gly Gly Leu Arg Glu Asp Pro
225 230 235 240
Arg Arg Glu Pro Glu Gly Gly Gly Arg Pro Glu Gly Ser Gly Arg Asp
245 250 255
Pro Ile Pro Gly Ser Leu Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu
260 265 270
Gln Glu Ala Cys Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His
275 280 285
Gln Leu Val Glu Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Ala Ala Val
290 295 300
Gly Asp Gln Leu Gly Lys Met Arg Leu Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly
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Ser Leu Asp Arg Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala
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Leu Arg Arg Glu Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg
340 345 350
Gln Met Glu Lys Val Leu Glu Glu Val Thr Asp Lys Pro Gln Thr Glu
355 360 365
Phe Leu Met Lys Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu
370 375 380
Ala Glu Ser Pro Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile
385 390 395 400
Ser Asp Asp Phe Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu
405 410 415
Met Pro Ala Leu Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro
420 425 430
Ser Leu Val Val Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln
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Lys Ala Pro Pro Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val
450 455 460
Ala Val Val Ala His Gln Arg Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Xaa
465 470 475 480
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Trp Leu Leu Gly Leu Arg Glu Ser Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu
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545 550 555 560
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565 570 575
Leu Pro Gly Pro Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys
580 585 590
Gly Lys Asn Ala Gln Pro Leu Leu Leu Leu Gly Pro Glu Gly Ala Glu
595 600 605
Ala

Claims (23)

1.一种用于检测细胞外游离MG53的检测试剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测MG53相关疾病、预测MG53相关疾病的风险或进展、或评估对MG53相关疾病的治疗效果，其中所述MG53相关疾病是代谢综合征，其中所述检测包括以下步骤：
a.获得待测样品，所述待测样品选自全血、血浆或血清；
b.检测在所述待测样品中的细胞外游离MG53；
c.将步骤b中获得的MG53的检测数值与对照数值进行比较：
其中，客体中细胞外游离MG53的含量等于或高于阳性对照值表明该客体患有MG53相关疾病或患有MG53相关疾病的风险较高；或
与相同客体一段时间之前的数值相比，客体中细胞外游离MG53的含量和/或活性升高表明该客体中MG53相关疾病变得恶化；或
对照样品与待测样品来自于相同的客体，但是对照样品的采集时间早于待测样品一段时间，并且在一段时间中所述客体接受了治疗，与对照样品相比，待测样品中细胞外游离MG53的含量降低至少10％表明客体对当前接受的治疗产生了响应。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述代谢综合症包括糖代谢或脂质代谢相关疾病。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述待测样品中基本上不含细胞。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述步骤b包括将所述用于检测细胞外游离MG53的检测试剂与所述待测样品接触。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述用于检测细胞外游离MG53的检测试剂是MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述用于检测细胞外游离MG53的检测试剂是与MG53结合的小分子化合物。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述用于检测细胞外游离MG53的检测试剂具有可检测标记。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述可检测标记具有发光性、磁性、放射性或酶活性。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述步骤b包括进行放射免疫测定、Western印迹分析、邻位连接技术、免疫荧光测定法、酶免疫测定法、免疫沉淀测定法、化学发光法、免疫组织化学测定法、斑点印迹测定或狭缝印迹检测法。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述对照数值来自对照样品。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述对照数值是从健康客体或患有MG53相关疾病的客体中获得的。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述客体是人或非人哺乳动物。
13.根据权利要求2所述的用途，其中所述糖代谢或脂质代谢相关疾病选自胰岛素抵抗症、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血糖、高血脂、高血压和肥胖组成的组。
14.MG53抑制剂在制备用于治疗或预防血液游离MG53相关疾病的药物中的用途，其中所述MG53相关疾病是代谢综合征，所述MG53抑制剂具有阻断MG53与胰岛素受体胞外区结合的能力。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述代谢综合征包括糖代谢或脂质代谢相关疾病。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述MG53抑制剂与MG53特异性结合。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述MG53抑制剂是MG53抗体或其抗原结合片段、MG53配体或其MG53结合片段、或者MG53的无功能蛋白片段。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述MG53抗体重链核苷酸序列：如SEQ ID NO：23所示，轻链核苷酸序列：如SEQ ID NO：24所示。
19.根据权利要求15所述的用途，其中所述糖代谢或脂质代谢相关疾病选自胰岛素抵抗症、糖尿病脑血管疾病、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高血压和肥胖组成的组。
20.根据权利要求14所述的用途，其中所述MG53抑制剂是一种分离的核酸，其编码权利要求17或18所述的用途中所述的抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求14所述的用途，其中所述MG53抑制剂是一种克隆或表达载体，其包括权利要求20所述的用途中所述的分离的核酸。
22.根据权利要求14所述的用途，其中所述MG53抑制剂是一种宿主细胞，其包括权利要求21所述的用途中所述的克隆或表达载体。
23.根据权利要求14所述的用途，其中所述MG53抑制剂是一种药物组合物，其包括权利要求17或18所述的用途中所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求20所述的用途中所述的核酸、权利要求21所述的用途中所述的克隆或表达载体、或权利要求22所述的用途中所述的细胞，以及药学上可接受的辅料。
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