CN117858905A - 多价抗变体fc区抗体及使用方法 - Google Patents

多价抗变体fc区抗体及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗体，其包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的至少四个结合位点，所述抗体在免疫测定中用作阳性对照和校准标准品，所述免疫测定用于检测和定量针对所述药物抗体的Fc区中的所述一个、两个、三个或四个氨基酸改变的抗药物抗体。

Description

多价抗变体FC区抗体及使用方法
技术领域
本发明涉及多价抗体，特别是特异性结合至变体Fc区的效价增强型抗体和抗体的多聚体(多价抗变体Fc区抗体)，这些抗体可在桥接免疫测定和结构域检测测定中用作阳性对照以及校准标准品。根据本发明的多价抗体特异性结合至变体Fc区，而不结合至对应的野生型Fc区，并且因此可以在免疫测定中例如作为阳性对照或校准标准品特异性桥接所述变体Fc区中的两个。本文还报道了它们的生产方法及其用途。
背景技术
自1974年Koehler和Milstein开发出第一种单克隆抗体以来，已作出了许多努力来开发适合用于人类中疗法的抗体。第一种可用的单克隆抗体是在小鼠和大鼠中开发的。这些抗体在用于人类疗法时导致由诱导的免疫应答(即抗啮齿动物抗体的形成)引起的不想要的副作用。已作出许多努力来减少或甚至消除这种不想要的副作用。
有相当多的人或人源化单克隆抗体目前正处于研究中，并且需要在实验动物中进行研究，之后可考虑进入人体用于初次试验的目的。
除了具有人野生型Fc区的标准抗体之外，越来越多具有变体Fc区的抗体正在被开发出来。这些变型通常也会诱导非自然的免疫应答。
必须借助实验动物来研究重要标准，仅提及它们中的两个，如生物利用率和免疫原性。除其他外，这些研究需要在宿主自身抗体的背景中定量抗药物抗体。在大多数情况下，将哺乳动物用作实验动物。毒理学通常首先在小鼠或大鼠等啮齿动物中进行评定。在药物开发的更晚期阶段，特别是在药物进入人体之前，甚至必须在此类临床前研究中包括猴。
目前，以桥接形式的酶联免疫吸附夹心测定(ELISA)代表了免疫原性测试的最先进的测定形式，因为它具有高通量和高灵敏度，并且易于应用于不同的项目(Mikulskis,A.等人,J.Immunol.Meth.365(2011)38-49)。
使用单克隆抗体的标准固相抗药物抗体免疫测定涉及在吸附在固相上或结合到固相的药物抗体(捕获抗体)、抗药物抗体和缀合至可检测标记(例如酶)的药物抗体(示踪抗体)之间形成复合物。因此，形成了一个夹心：固相捕获抗体-抗药物抗体-示踪抗体。在夹心催化的反应中，抗体缀合酶的活性与抗药物抗体浓度成正比。标准夹心法也称为桥接免疫测定，因为抗药物抗体在捕获抗体与示踪抗体(即药物抗体)之间进行桥接。诸如桥接ELISA的免疫测定是研究患者对抗体药物的免疫原性应答的常见测定类型。
Mire-Sluis,A.R.等人,J.Immunol.Methods 289(2004)1-16总结了使用针对生物技术产品的宿主抗体的检测来设计和优化免疫测定的建议。
Wadhwa,M.等人,J.Immunol.Methods 278(2003)1-17报道了用于检测、测量和表征由治疗性生物制品诱导的不想要的抗体的策略。
不同免疫测定的原理描述于例如Hage,D.S.,Anal.Chem.71(1999)294R-304R中。
Lu,B.等人,Analyst.121(1996)29R-32R报道了用于免疫测定中的抗体的取向固定。
亲和素-生物素介导的免疫测定报道于例如Wilchek,M.和Bayer,E.A.,MethodsEnzymol.184(1990)467-469中。
在WO 2017/072210中已经报道了抗变体Fc区抗体及其使用方法。
Wessels,U.等人,Bioanal.9(2017)849-859报道了针对携带P329G突变的治疗性抗体的新颖药物和可溶性靶标耐受抗药物抗体测定。
在US2008/0118939中已经报道了缀合物及其在免疫测定中作为标准品的用途。
发明内容
桥接抗药物抗体(ADA)测定的可靠性取决于至少一种功能性阳性对照的可用性，该对照产生高于背景的充足测定信号，以及在待使用ADA测定来定量ADA的情况下的校准标准品。特别地，针对Fc区中的修饰检测ADA，特别是如果该修饰存在于药物抗体(治疗性抗体)的Fc区的两条链中，并非易事。此外，结构域检测测定还需要具有合适的灵敏度的阳性对照。
特异性结合至变体Fc区并且基本上不结合至野生型Fc区的抗体被称为抗变体Fc区抗体。
不受该理论的约束，标准的二价Y形抗变体Fc区抗体可以以其两种结合特异性同时结合至单个Fc区。由此，两个结合位点都被阻断，并且不再可能形成桥接复合物。同样，抗变体Fc区抗体可以以空间上非有利的取向结合，从而防止桥接，即同时结合至捕获抗体和示踪药物抗体。因此，在抗药物抗体桥接ELISA中需要功能性阳性对照以及校准标准品。
本发明至少部分地基于以下发现：特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区(变体人IgG1 Fc区)的标准Y形二价抗体的单体无法同时结合至两个变体Fc区，即形成两个变体Fc区之间的桥，其程度使得该单体适合作为桥接ADA测定中的阳性对照或校准标准品。已经发现，与二价抗体相反，通过将特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的抗体中的效价增加至二以上，例如通过添加另外的结合位点或通过形成多聚体，可以同时结合至两个变体Fc区，即可以形成桥并连接两个变体Fc区。
对于缺乏例如ADCC、Fc区效应子功能(例如通过在Fc区域内引入Pro329Gly(PG)取代)的药物抗体，本发明提供了用于ADA测定中的功能性阳性对照以及校准标准品。根据本发明的功能性阳性对照和校准标准品是对药物抗体的Fc区内的取代具有特异性的效价增强型抗体或抗体的多聚体，例如四价或多聚抗PG抗体。
根据本发明的多价抗体与桥接ADA测定相结合现在允许临床样品的详细ADA表征，因为一方面可以确定测定的适当功能，另一方面可以对测定进行校准。利用根据本发明的多价抗体，以桥接形式的ADA免疫测定得到补充，以便深入表征针对Fc区修饰的药物抗体的个体ADA应答。
根据本发明的一个方面是一种抗体，其包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的至少三个结合位点。
根据本发明的一个方面是一种抗体的多聚体，该抗体特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
根据本发明的一个方面是一种抗体，其包含特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的至少三个结合位点，或一种抗体的(二价)(Fab')2片段的多聚体，该抗体特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区，其中该结合位点包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或
(4)
(1)至(3)中任一者的组合；
其中HVR是根据Kabat确定的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，至少三价抗体(包含至少三个结合位点的抗体)是三价、四价、六价、八价或十价抗体。在一个优选的实施例中，该至少三价抗体是四价抗体。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，至少三价抗体(包含至少三个结合位点的抗体)是IgA或IgM抗体。
根据本发明的一个方面是一种抗体的多聚体，该抗体特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区，或一种抗体的(二价)(Fab')2片段的多聚体，该抗体特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区，其中该抗体或该(Fab')2片段包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
其中HVR是根据Kabat确定的。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该抗体或(Fab')2片段特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸并且在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。
根据本发明的一个方面是根据本发明的至少三价抗体作为体外(桥接)免疫测定中的阳性对照的用途。
根据本发明的一个方面是根据本发明的多聚体作为体外(桥接)免疫测定中的阳性对照的用途。
根据本发明的一个方面是根据本发明的至少三价抗体作为体外(桥接)免疫测定中的标准品的用途。在某些实施例中，该用途是用于生成校准函数。在一个优选的实施例中，该校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的一个或多个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
根据本发明的一个方面是根据本发明的多聚体作为体外(桥接)免疫测定中的标准品的用途。在某些实施例中，该用途是用于生成校准函数。在一个优选的实施例中，该校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的一个或多个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该体外(桥接)免疫测定用于确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区。在某些实施例中，该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的一个或多个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，体外免疫测定为体外桥接ELISA。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体包含在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该药物抗体包含在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸并且在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸(根据KabatEU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该体外免疫测定为用于确定抗药物抗体的体外桥接免疫测定，该免疫测定包含该药物抗体作为捕获抗体和作为示踪抗体。
根据本发明的一个方面是一种用于确定(含有血清的)样品中抗药物抗体的存在和/或量的体外免疫测定，
其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的，
其中该免疫测定包含该药物抗体作为捕获抗体和作为示踪抗体，
其特征在于，
根据本发明的至少三价抗体或根据本发明的多聚体用作该免疫测定中的阳性对照或用作校准标准品。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，作为校准标准品的用途是用于生成校准函数。在一个优选的实施例中，该校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，特异性结合至人IgG1亚类的变体免疫球蛋白Fc区的该抗体是单克隆抗体。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体是人、人源化或嵌合抗体。
一个方面是一种生产根据本发明的多聚体的方法，该方法包括对特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的全长抗体进行化学交联，
其中该抗体包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
其中HVR是根据Kabat确定的，
该化学交联使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)进行。
附图说明
图1用根据本发明的多聚体作为阳性对照或校准标准品的免疫测定的方案。
图2在桥接免疫测定中用单体抗PG抗体克隆1.7.24获得的信号，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。
图3抗变体Fc区抗体与Fc区结合的不同模式；(A)：同时结合至具有两个结合位点的单个Fc区；(B)空间位阻。
图4抗变体Fc区抗体的多聚化模式；(A)重组表达；(B)化学交联。
图5具有不同交联程度(即分子大小)的交联抗PG抗体池的SEC色谱图。
图6在桥接免疫测定中用多聚抗PG抗体克隆1.7.24获得的信号，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。
图7在桥接免疫测定中以直接1:1比较显示的根据本发明的单体抗PG抗体和多聚抗PG抗体的信号，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。
图8在桥接免疫测定中以直接1:1比较显示的根据本发明的单体抗PG抗体和多聚抗PG抗体的信噪比，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。
图9桥接免疫测定中根据本发明的多聚抗PG抗体，其中不同形式的药物抗体用作捕获抗体和示踪抗体(均为相同形式)。
图10桥接免疫测定中用作校准标准品的四价抗PG抗体的信号，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。
图11桥接免疫测定中用作校准标准品的IgM形式的抗PG抗体的信号，其中变体Fc区作为捕获剂，并且以TCB形式的药物抗体作为示踪抗体。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的，并且在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体地，将Kabat编号系统(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且将Kabat的EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。
术语“(氨基酸)改变”表示用不同的“替换”氨基酸残基替换预定亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基，以生成变体氨基酸序列。一个或多个替换残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)并且选自由以下项组成的组：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。在某些实施例中，替换残基不是半胱氨酸。本文氨基酸改变的定义也涵盖用非天然存在的氨基酸残基进行取代。“非天然存在的氨基酸残基”表示除上面列出的那些天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其他氨基酸残基类似物，诸如Ellman等人,Meth.Enzym.202(1991)301-336中所述的那些。为了生成此类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人(Science 244(1989)182)和/或Ellman等人(同上)的程序。简而言之，这些程序涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制性tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。非天然存在的氨基酸也可以通过化学肽合成并随后将这些肽与重组产生的多肽(诸如抗体或抗体片段)融合而掺入肽中。
在本申请中，每当提及氨基酸改变时，其都是经过深思熟虑的氨基酸改变而不是随机的氨基酸修饰。
术语“抗变体(人)Fc区抗体”和“特异性结合至变体(人)Fc区的抗体”是指这样的抗体，其能够以足够的亲和力结合变体(人)Fc区，使得该抗体可用作靶向变体(人)Fc区的诊断剂。在某些实施例中，抗变体(人)Fc区抗体与对应的野生型(人)Fc区的结合程度小于该抗体与变体(人)Fc区的结合程度的约10％。这一点可以例如使用表面等离子体共振来确定。在某些实施例中，特异性结合至变体(人)Fc区的抗体具有10-8M或更小的解离常数(KD)，例如10-8M至10-12M。
本文的术语“药物抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体以及多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，只要它们表现出所期望的抗原结合活性即可。
术语“结合至”表示第一实体与第二实体的结合，诸如例如，抗体与其抗原的结合。这种结合可以使用例如测定(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来确定。
例如，在测定的可能实施例中，抗原结合至表面，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗体的结合。
结合的亲和力由术语ka(缔合常数：缔合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数：复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。可替代地，SPR传感图的结合信号可以直接与参考物的响应信号在共振信号高度和解离行为方面进行比较。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体种类而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞活化。
Fc受体结合依赖性效应子功能可通过抗体的Fc区与Fc受体(FcR)的相互作用来介导，该Fc受体是造血细胞上的特异性细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已被证明可通过吞噬免疫复合物来介导去除抗体包被的病原体，并且通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来裂解涂有相应抗体的红细胞以及其他各种细胞靶点(例如，肿瘤细胞)(参见例如Van de Winkel,J.G.和Anderson,C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR由其对免疫球蛋白同种型的特异性来定义：IgG抗体的Fc受体称为FcγR。Fc受体结合描述于例如Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；Gessner,J.E.等人,Ann.Hematol.76(1998)231-248中。
IgG抗体(FcγR)Fc区受体的交联触发多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞细胞毒性、炎症介质的释放以及免疫复合物清除和抗体产生的调节。已在人体中鉴定出三类FcγR，其中包括：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。Fc区IgG中在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329(根据Kabat的EU索引编号)中的至少一个残基处的修饰降低与FcγRI的结合。位置233–236处的IgG2残基被IgG1和IgG4取代，使得与FcγRI的结合力降低103倍，并且消除了人单核细胞对抗体敏化红细胞的应答(Armour,K.L.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中至低亲和力结合复合的IgG，并得到广泛表达。该受体可以分为两种亚型，FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA是在参与杀伤的许多细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上发现的，并且似乎能够活化杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且存在于B细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上。在B细胞上，它似乎起到抑制免疫球蛋白进一步产生以及同种型转换为例如IgE类的作用。在巨噬细胞上，FcγRIIB用于抑制由FcγRIIA介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B型可能通过IgE与其单独受体的结合而有助于抑制这些细胞的活化。发现例如抗体(包含在至少一个氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414(根据Kabat的EU索引编号)的突变的IgG Fc区)对FcγRIIA的结合力降低。
-FcγRIII(CD16)以中至低亲和力结合IgG，并以两种类型存在。FcγRIIIA是在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和T细胞上发现的，并介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上的表达水平高。发现与FcγRIIIA的结合减少，例如，对于包括具有在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376中的至少一处的突变的IgG Fc区的抗体(根据Kabat的EU索引编号)。
人IgG1上用于Fc受体的结合位点的定位、上述突变位点以及用于测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法描述于Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中。
如本文所用，术语“Fc受体”是指活化受体，其特征在于，存在与受体相关联的细胞质ITAM序列(参见例如，Ravetch,J.V.和Bolland,S.,Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。此类受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。术语“不结合FcγR”表示在抗体浓度为10μg/mL时，如本文所报道的抗体与NK细胞的结合是如WO 2006/029879中报道的抗OX40L抗体LC.001的结合的10％或更少。
虽然IgG4显示FcR结合减少，但其他IgG亚类的抗体显示出强结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(失去Fc碳水化合物)、Pro329和234、235、236和237Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是如果发生改变也可减少FcR结合的残基(Shields,R.L.等人J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434)。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，该C端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统进行的，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。
抗体的Fc区直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但与C1q的结合由Fc区中限定的结合位点引起。此类结合位点是现有技术中已知的并且描述于例如Lukas,T.J.等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人,Nature288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434中。此类结合位点为例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号；除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统进行的，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体活化、C1q结合和C3活化作用，而IgG4则不激活补体系统、不结合C1q并且不激活C3。“抗体的Fc区”是技术人员所熟知的术语，并且基于木瓜蛋白酶对抗体的切割来定义。在某些实施例中，Fc区为人Fc区。在某些实施例中，药物抗体的Fc区属于人IgG1亚类，其包含突变L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：包含氨基酸残基延伸体的抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)和93至101(H3)(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。
“分离的”多聚体是已从其自然环境的组分中分离的抗体。在某些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定，将多聚体纯化至大于95％或99％的纯度。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如，Flatman,S.等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了一小部分抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，借此，铰链区定位在第一恒定结构域与第二恒定结构域之间。类似地，自N末端至C末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，这两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
术语“变体(人)Fc区”表示与“野生型”(人)Fc区氨基酸序列的氨基酸序列区别在于至少一个“氨基酸改变”的氨基酸序列。在某些实施例中，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸改变，诸如相对于天然Fc区的约一个至约十个氨基酸改变，并且在某些实施例中，约一个至约五个氨基酸改变。在某些实施例中，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约80％同源性，并且在某些实施例中，变体Fc区具有至少约90％同源性，在一个优选的实施例中，变体Fc区具有至少约95％同源性。
变体Fc区由所包含的氨基酸改变来定义。因此，例如，术语P329G表示相对于亲本(野生型)Fc区在氨基酸位置329处具有脯氨酸至甘氨酸突变的变体Fc区。野生型氨基酸的同一性可能未指定，在该情况下，前述变体被称为329G。术语“改变”表示对天然存在的氨基酸的改变以及对非天然存在的氨基酸的改变(参见例如，US 6,586,207、WO 98/48032、WO03/073238、US 2004/0214988、WO 2005/35727、WO 2005/74524、Chin,J.W.等人,J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin,J.W.和Schultz,P.G.,ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin,J.W.等人,PICAS United States of America 99(2002)11020-11024；Wang,L.和Schultz,P.G.,Chem.(2002)1-10)。
术语“野生型Fc区”表示与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc区包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。
术语“药物抗体”涉及旨在用于人类中作为治疗剂的任何抗体制剂。优选地，此类药物抗体将是单克隆抗体。进一步优选的此类单克隆抗体将从类人猿获得或者是人单克隆抗体。优选地，它将是人单克隆抗体。还优选的此类药物单克隆抗体将是人源化单克隆抗体。
如在本申请中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。在一个优选的实施例中，根据本发明的至少三价抗体是“四价的”。“结合位点”由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)的同源对形成。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如，Kindt,T.J.等人KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007)，第91页)。单一VH或VL结构域可以足赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库(参见例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
II.组合物和方法
本发明至少部分地基于以下发现：特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的单体二价抗体无法以足够的灵敏度/量结合至两个变体Fc区，即在两个变体Fc区之间形成(可检测的)桥，并且无法用作ADA测定中的阳性对照或校准标准品。
已经发现，特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的抗体的多价形式，与二价形式相反，可以以足够的灵敏度/量结合至两个变体Fc区，即可以以足够的量/灵敏度连接两个变体Fc区，因此该多价形式适合作为ADA测定中的阳性对照和/或校准标准品。
对于缺乏与Fc受体的结合和/或Fc效应子功能(例如通过在Fc区域内引入Pro329Gly(PG)取代)的药物抗体，本文报道了用于ADA测定中的功能性阳性对照以及校准标准品。根据本发明的功能性阳性对照和校准标准品是对药物(治疗性)抗体的Fc区内的氨基酸改变具有特异性的抗体的多价形式，例如抗PG抗体的至少三价形式或多聚形式。
根据本发明的多价抗体与桥接测定相结合现在允许临床样品的详细ADA表征，因为可以确定测定的适当功能。利用根据本发明的多价抗体，桥接抗药物抗体免疫测定得到补充，以便深入表征针对Fc区修饰的药物抗体的个体ADA应答。
根据本发明的一个方面是一种抗体的多价形式，该抗体特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在第一个实例中，本发明在下文中用抗PG抗体的根据图4C的化学缀合多聚体(即特异性结合至具有P329G改变的IgG亚类的人Fc区的抗体)来举例说明。这仅仅是为了对本发明进行举例说明，并且不应解释为限制。真实范畴在所附权利要求书中阐述。
更详细地，测试单体抗PG抗体克隆1.7.24作为桥接免疫测定中的阳性对照，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。结果在图2中示出。
已经发现，100％基质中二价Y形(＝单体)抗PG抗体克隆1.7.24的浓度高达1,000ng/mL时，无法检测到信号。此外，在浓度为10,000ng/mL时，仅获得0.13AU的信号。在抗PG抗体克隆1.7.24的浓度为2,500ng/mL时，信噪比>2AU(参见实例4A)。
监管机构要求阈值为至少100ng/mL。这意味着100％基质中ADA阳性对照的灵敏度应达到100ng/mL(参见例如，2019年FDA指南)。
一般而言，如果信号至少为空白样品(即不含分析物的样品)的双倍值，则认为该信号足以使用。
因此，单体抗PG抗体克隆1.7.24由于其低灵敏度而不适合作为抗药物抗体测定中的阳性对照或校准标准品。
对于不同的克隆，即抗PG抗体克隆1.3.17，观察到相同的行为。使用该单体抗体，在100ng/mL下获得的信号仅为空白值的1.85倍(参见实例4B)。因此，该克隆也是单体形式，不够灵敏，无法用作ADA测定中的阳性对照或校准标准品。
为什么这些单体抗PG抗体不能在ADA测定中形成桥？不受该理论的约束，假定一种抗PG抗体结合具有两个互补位(paratope)的一个药物抗体分子(参见图3A)，或者抗PG抗体只有一个结合位点可以结合至Fc区，而另一个结合位点则被空间阻断(参见图3B)。
已经发现，为了解决该问题，使用多价抗PG抗体是有利的。
可以应用任何类型的效价增强技术，例如重组生产为二聚体或融合分子，改变为不同的抗体形式，诸如例如IgA(参见图4A)或IgM，添加结合位点(参见图4B)，或使用例如N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)进行化学缀合(参见图4C)。
使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)进行了抗PG抗体克隆1.7.24的示例性化学缀合。反应进行得很顺利。使用SEC分析了反应产物并收集了不同的级分。从图5中可以看出，可以获得具有不同多聚化程度的多聚体，即从高度交联的多聚体(池2)到仅二聚体和三聚体。
所有池均在桥接ADA测定中进行了测试。将池2、3、4混合。将池混合在一起是使用化学结合蛋白质的常见程序。在混合池之前，进行ADA ELISA测定，并将具有最高信号的池合并。这导致更高的产量。结果在图6中示出。可以看出，与单体抗体相比，所有池都可以获得增加的信号。这首次允许在桥接ADA确定免疫测定中用作阳性对照和校准标准品。
进一步可以看出，最明显的改善可以通过高交联度获得，即池2和3。
在图7和8中，根据本发明的单体二价抗PG抗体克隆1.7.24和多价抗PG抗体克隆1.7.24在信号和信噪比方面显示为直接1:1比较。在这两种情况下都可以看到明显的改善。例如，多价抗PG抗体克隆1.7.24的信噪比(S/N)在80ng/mL的浓度下为4.5，并且在1000ng/mL的浓度下为83.6。二价抗PG抗体克隆1.7.24在1000ng/mL浓度下的S/N仅为3.8。
进一步，多价抗PG抗体已经用不同形式的不同药物抗体进行了测试。无论形式如何，都可以看到信号的改善(参见图9)。
在第二个实例中，本发明在下文中根据图4B用抗PG抗体的重组产生的四价形式(即特异性结合至具有P329G改变的IgG亚类的人Fc区的抗体)来举例说明。这仅仅是为了对本发明进行举例说明，并且不应解释为限制。真实范畴在所附权利要求书中阐述。
更详细地，将四价抗PG抗体用作桥接免疫测定中的校准标准品，其中使用相同的但不同地衍生的药物抗体作为捕获抗体和示踪抗体。结果在图10中示出。
在第三个实例中，本发明在下文中用抗PG抗体的重组产生的IgM变体(即特异性结合至具有P329G改变的IgG亚类的人Fc区的抗体)来举例说明。这仅仅是为了对本发明进行举例说明，并且不应解释为限制。真实范畴在所附权利要求书中阐述。
更详细地，将IgM变体抗PG抗体用作桥接免疫测定中的校准标准品，其中Fc区作为捕获试剂，并且以TCB形式的完整药物作为示踪抗体。结果在图11中示出。
A.示例性抗变体Fc区抗体
在桥接测定中，ADA被差异标记的药物抗体捕获和检测。然而，桥接测定能够检测包括IgM在内的各种Ig亚型的ADA，并且适用于所有类型的治疗性抗体(Mire-Sluis,A.R.等人,J.Immunol.Meth.289(2004)1-16(2004)；Geng,D.等人,J.Pharm.Biomed.Anal.39(2005)364-375)。在桥接测定中，独立于治疗性抗体的结合区域，检测ADA和药物抗体的复合物。另外，根据本发明的测定特别适用于在Fc区内携带P329G修饰的药物抗体。对于这组药物抗体，该测定代表了一种通用方法并且可以很容易地应用。
总之，本文报道的测定为针对Fc区修饰的药物抗体的ADA的稳健且灵敏的检测提供了可能。与标准桥接测定相结合，该测定可用于更详细地表征免疫应答。
本文报道的测定是一种通用方法，并且适用于所有药物抗体，例如具有Pro329Gly取代的药物抗体，即FcγR结合被阻止/消除的药物抗体。根据本发明的测定检测ADA并且基于两种不同标记的药物抗体，(i)bi标记的药物抗体和(ii)dig标记的药物抗体。
此外，除PG取代外，已鉴定出几种其他Fc修饰，这些修饰会影响药物抗体对Fc受体和补体的亲和力，从而改变其功能特征(Moore,G.L.等人,MAbs 2(2010)181-189；Richards,J.O.等人,Mol.Cancer.Ther.7(2008)2517-2527；Lazar,G.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2010)4005-4010；Schlothauer,T.等人,Prot.Eng.Des.Sel.29(2016)457-466)。
本文报道的测定的原理可以转移到广泛的Fc区改变，只要这些改变允许生成特异性抗体。
总之，常规桥接测定与根据本发明的多价抗体的组合有助于表征具有抑制或改变的Fc效应子功能的药物抗体的免疫原性特征。
根据本发明的一个方面是一种多价抗体，其特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
特异性结合表示，抗体以10-8mol/l或更高的KD值结合至人IgG1亚类的野生型免疫球蛋白Fc区。
根据本发明的一个方面是一种多价抗体，其特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区，其中该多价抗体包含至少三个结合位点，该至少三个结合位点包含(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或
(4)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
或
(5)
(1)和/或(2)和/或(3)和/或(4)中任一者的混合物或组合。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该多价抗体特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸并且在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。在一个优选的实施例中，该多价抗体是四价抗体或二价抗体的多聚形式或二价抗体的多聚(Fab')2片段。
二价(Fab')2片段具有两个通过二硫键彼此连接的抗原结合位点。当用木瓜蛋白酶消化全长Y形抗体时，产生了两个单独的Fab片段。通过胃蛋白酶消化IgG或IgM抗体，产生了保留部分铰链区的(Fab')2片段。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。
根据本发明的一个方面是根据本发明的多价抗体作为(桥接)免疫测定中的阳性对照的用途。
根据本发明的一个方面是根据本发明的多价抗体作为(桥接)免疫测定中的校准标准品的用途。在某些实施例中，该用途是用于生成校准函数。在一个优选的实施例中，该校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该(桥接)免疫测定用于确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区。在某些实施例中，抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该免疫测定为桥接ELISA。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体包含在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该药物抗体包含在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸并且在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸(根据KabatEU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体包含在位置253、310和435处包含氨基酸残基丙氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该免疫测定为用于确定抗药物抗体的桥接免疫测定，该免疫测定包含该药物抗体作为捕获抗体和作为示踪抗体。
根据本发明的一个方面是一种用于确定(含有血清的)样品中抗药物抗体的存在和/或量的免疫测定，
其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的，
其中该免疫测定包含该药物抗体作为捕获抗体和作为示踪抗体，
其特征在于，
根据本发明的多价抗体在免疫测定中用作阳性对照或用作校准标准品。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，作为校准标准品的用途是用于生成校准函数。在一个优选的实施例中，该校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，特异性结合至人IgG1亚类的变体免疫球蛋白Fc区的该抗体是单克隆抗体。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体是人、人源化或嵌合抗体。
一个方面是一种生产根据本发明的多聚体的方法，该方法包括使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)对特异性结合至变体Fc区的全长抗体进行化学交联。
一个方面是一种生产根据本发明的多聚体的方法，该方法包括对特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的全长抗体进行化学交联，
其中该抗体包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或
(4)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
或
(5)
(1)至(4)中任一者的混合物或组合；
该化学交联使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)进行。
在本发明的所有方面和实施例的一个优选的实施例中，该抗变体Fc区抗体包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或
(4)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
或
(5)
(1)至(4)中任一者的混合物。
本发明所用的抗体具有以下序列(HVR是根据Kabat确定的)：
SEQ ID NO:36(SEQ ID NO:05，没有信号序列)：E VQLVESGGDL VKPGGSLKLSCAASGFTFSS YGMSWVRQTP DKRLEWVATI SSGGSYIYYPDSVKGRFTIS RDNAKNTLYL QMSSLKSEDTAMYYCARLGMITTGYAMDYW GQGTSVTVSS
SEQ ID NO:06：DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQTIV HSTGHTYLEW FLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP YTFGGGTKLE IK
SEQ ID NO:37(SEQ ID NO:07，没有信号序列)：EV KLLESGGGLV QPGGSLKLSCAASGFDFSRY WMNWVRQAPG KGLEWIGEIT PDSSTINYTPSLKDKFIISR DNAKNTLYLQ MIKVRSEDTALYYCVRPYDY GAWFASWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:08：QAVVTQESAL TTSPGETVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQE KPDHLFTGLIGGTNKRAPGV PARFSGSLIG DKAALTITGA QTEDEAIYFC ALWYSNHWVF GGGTKLTVL
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，抗变体(人)Fc区抗体用于制备根据本发明的多价抗体(抗AAA抗体)。
●特异性结合至包含氨基酸残基(A)253、(A)310和(A)435(根据Kabat EU索引编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区上的表位，
●特异性结合至在位置253、310和435处具有丙氨酸氨基酸残基(根据Kabat EU索引编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区，
●不(特异性)结合至在位置253处具有异亮氨酸氨基酸残基并且在位置310处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置435处具有组氨酸氨基酸残基(根据Kabat EU索引编号)的IgG1亚类的野生型(人)Fc区，
●不(特异性)结合至在位置253处具有异亮氨酸氨基酸残基并且在位置310处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置435处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置329处具有甘氨酸氨基酸残基并且在位置234处具有丙氨酸氨基酸残基并且在位置235处具有丙氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的(人)Fc区，并且
●不(特异性)结合至在位置253处具有异亮氨酸氨基酸残基并且在位置310处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置435处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置329处具有脯氨酸氨基酸残基并且在位置234处具有亮氨酸氨基酸残基并且在位置235处具有亮氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区。
术语“不(特异性)结合至”表示在确定结合的测定中，获得的结果与用不包含所讨论的抗体的样品(即空白样品或缓冲液样品)获得的结果没有显著差异。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，变体(人)Fc区是具有突变I253A、H310A和H435A(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1或IgG4亚类的Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，特异性结合至在位置253、310和435处(根据Kabat EU索引编号)各自包含用于生成根据本发明的多聚体的氨基酸残基丙氨酸的IgG1亚类的Fc区的抗Fc区抗体包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09或10的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ IDNO:12、13或14的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16、17或18的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28、29或30的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成本发明的多价抗体的抗体包含(a)VH结构域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09或10的氨基酸序列、(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12或13或14的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16、17或18的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列、(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28、29或30的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQID NO:23的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQID NO:23的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQID NO:23的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含在以下HVR位置处被取代的任何一个或多个氨基酸：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:11)中：位置5；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:15)中：位置3、7、8、11、12；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:19)中：位置2、10；
-在HVR-L1(SEQ ID NO:25)中：位置3、14；
-在HVR-L2(SEQ ID NO:27)中：位置4；和
-在HVR-L3(SEQ ID NO:31)中：位置1、6。
在某些实施例中，取代是如本文所提供的保守取代。在某些实施例中，以下氨基酸残基中的任何一个或多个氨基酸残基(任何一个单独或彼此独立地组合)可以以任何组合形式存在：
-在HVR-H1(SEQ ID NO:11)中：位置5处为选自由S、T、N和Q组成的氨基酸残基组的中性亲水性氨基酸残基；
-在HVR-H2(SEQ ID NO:15)中：位置3处为选自由S、T、N、Q、D和E组成的氨基酸残基组的中性亲水性或酸性氨基酸残基、位置7处为选自由S、T、N、Q、H、K和R组成的氨基酸残基组的中性亲水性或碱性氨基酸残基、位置8处为选自由S、T、N、Q、G和P组成的氨基酸残基组的中性亲水性氨基酸残基或影响链取向的残基、位置11处为选自由S、T、N、Q、G、P、W、Y和F组成的氨基酸残基组的中性亲水性或芳香族氨基酸残基或影响链取向的残基、位置12处为选自由S、T、N、Q、G和P组成的氨基酸残基组的中性亲水性氨基酸残基或影响链取向的残基；
-在HVR-H3(SEQ ID NO:19)中：位置2处为选自由M、A、V、L、I、W、Y和F组成的氨基酸残基组的疏水性或芳香族氨基酸残基、位置10处为选自由S、T、N、Q、W、Y和F组成的氨基酸残基组的中性亲水性或芳香族氨基酸残基；
-在HVR-L1(SEQ ID NO:25)中：位置3处为选自由S、T、N和Q组成的氨基酸残基组的中性亲水性氨基酸残基、位置14处为选自由S、T、N、Q、D和E组成的氨基酸残基组的中性亲水性或酸性氨基酸残基；
-在HVR-L2(SEQ ID NO:27)中：位置4处为选自由E、D、H、K和R组成的氨基酸残基组的酸性或碱性氨基酸残基；并且
-在HVR-L3(SEQ ID NO:31)中：位置1处为选自由M、A、V、L和I组成的氨基酸残基组的疏水性氨基酸残基、位置6处为选自由S、T、N、Q、D和E组成的氨基酸残基组的中性亲水性或酸性氨基酸残基。
SEQ ID NO:11、15、19、25、27和31的共有序列涵盖了上述取代的所有可能的组合。
SEQ ID NO:07是重链可变结构域的鼠序列，该重链可变结构域在N-末端处包括18个氨基酸残基的信号肽。SEQ ID NO:37通过缺失信号序列而源自SEQ ID NO:07。
SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:04分别为轻链可变结构域的鼠序列，这些轻链可变结构域各自在N-末端处包括19个氨基酸残基的信号肽。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含衍生自SEQ ID NO:01的重链可变结构域氨基酸序列和衍生自SEQ ID NO:02的轻链可变结构域氨基酸序列，并且人源化抗体与嵌合抗体或鼠抗体具有相同的结合特异性，该嵌合抗体或鼠抗体含有SEQ ID NO:01的氨基酸序列作为重链可变结构域，以及SEQID NO:02的氨基酸序列作为轻链可变结构域。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含衍生自SEQ ID NO:03的重链可变结构域氨基酸序列和衍生自SEQ ID NO:04的轻链可变结构域氨基酸序列，并且人源化抗体与嵌合抗体或鼠抗体具有相同的结合特异性，该嵌合抗体或鼠抗体含有SEQ ID NO:03的氨基酸序列作为重链可变结构域，以及SEQID NO:04的氨基酸序列作为轻链可变结构域。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含衍生自SEQ ID NO:07的重链可变结构域氨基酸序列和衍生自SEQ ID NO:08的轻链可变结构域氨基酸序列，并且人源化抗体与嵌合抗体或鼠抗体具有相同的结合特异性，该嵌合抗体或鼠抗体含有SEQ ID NO:07的氨基酸序列作为重链可变结构域，以及SEQID NO:08的氨基酸序列作为轻链可变结构域。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含与SEQ ID NO:01、03和37中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗变体(人)Fc区抗体保留了结合至变体(人)Fc区的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:01、03和37中的任一个中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗变体(人)Fc区抗体包含如SEQ ID NO:01、03和37中的任一个中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含与SEQ ID NO:02、04或08中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗变体(人)Fc区抗体保留了结合至变体(人)Fc区的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:02、04或08中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施例中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗变体(人)Fc区抗体包含SEQ ID NO:02、04或08的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含如上文提供的任何实施例中的VH和如上文提供的任何实施例中的VL。在某些实施例中，该抗体包含(i)SEQ ID NO:01和SEQ ID NO:02中的VH和VL序列，或(ii)分别在SEQID NO:03和SEQ ID NO:04中的VH和VL序列，或(iii)SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:08中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，抗变体(人)Fc区抗体用于制备如本文所报道的根据本发明的多价抗体(抗PG抗体)。
●特异性结合至包含氨基酸残基(A)234、(A)235和(G)329(根据Kabat EU索引编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区上的表位，
●特异性结合至具有(位置234和235处的丙氨酸氨基酸残基，以及)位置329处的甘氨酸氨基酸残基(根据Kabat EU索引编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区，
●特异性结合至在位置234和235处具有丙氨酸氨基酸残基、在位置329处具有甘氨酸氨基酸残基并且在位置253处具有异亮氨酸氨基酸残基并且在位置310处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置435处包含组氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区，
●特异性结合至在位置234、235、253、310和435处具有丙氨酸氨基酸残基并且在位置329处具有甘氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区，
●不(特异性)结合至具有(位置234和235处的亮氨酸氨基酸残基，以及)位置329处的脯氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的野生型(人)Fc区，
●不(特异性)结合至在位置234和235处具有亮氨酸氨基酸残基并且在位置329处具有脯氨酸氨基酸残基并且在位置253处具有异亮氨酸氨基酸残基并且在位置310处具有组氨酸氨基酸残基并且在位置435处包含组氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的野生型(人)Fc区，并且
●不(特异性)结合至在位置234和235处具有亮氨酸氨基酸残基并且在位置329处具有脯氨酸氨基酸残基并且在位置253处具有丙氨酸氨基酸残基并且在位置310处具有丙氨酸氨基酸残基并且在位置435处具有丙氨酸氨基酸残基(根据Kabat编号)的IgG1亚类的变体(人)Fc区。
由于用于生成抗PG抗体的免疫是用携带P329G、L234A和L235A Fc区取代的人IgG1进行的，因此期望获得特异性结合至这些氨基酸残基的抗体。令人惊奇的是，获得的抗体特异性结合至仅具有P329G突变的人IgG1和Fc区片段，与L234A和L235A突变的存在或不存在无关，而具有突变L234A和L235A的人wt-IgG1和人IgG1则不被结合。因此，用于生成根据本发明的多聚体的抗PG抗体对于人IgG1的Fc区中的单个P329G取代具有特异性。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，变体(人)Fc区是具有突变P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1或IgG4亚类的Fc区。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体是抗Fc区抗体，其特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(并且任选地在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸)(根据Kabat EU索引编号)的IgG1亚类的Fc区，该抗Fc区抗体包含选自以下项的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含(a)VH结构域，其包含(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列、(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和(iii)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；以及(b)VL结构域，其包含(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQID NO:32的氨基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；以及(f)HVR-L3，其包含选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，在用于生成根据本发明的多价抗体的抗体中，抗变体(人)Fc区抗体的氨基酸在以下HVR位置处被取代：
-在HVR-L1(SEQ ID NO:33)中：位置9。
在某些实施例中，取代是如本文所提供的保守取代。在某些实施例中，以下氨基酸残基中的任何一个或多个氨基酸残基(任何一个单独或彼此独立地组合)可以以任何组合形式存在：
-在HVR-L1(SEQ ID NO:33)中：位置9处为选自由S、T、N、Q、G和P组成的氨基酸残基组的中性亲水性氨基酸残基或影响链取向的残基。
SEQ ID NO:33的共有序列涵盖了上述取代的所有可能的组合。
SEQ ID NO:05是重链可变结构域的鼠序列，该重链可变结构域在N-末端处包括19个氨基酸残基的信号肽。SEQ ID NO:36通过缺失信号序列而源自SEQ ID NO:05。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含衍生自SEQ ID NO:05的重链可变结构域氨基酸序列和衍生自SEQ ID NO:06的轻链可变结构域氨基酸序列，并且人源化抗体与嵌合抗体或鼠抗体具有相同的结合特异性，该嵌合抗体或鼠抗体含有SEQ ID NO:05的氨基酸序列作为重链可变结构域，以及SEQID NO:06的氨基酸序列作为轻链可变结构域。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗变体(人)Fc区抗体保留了结合至变体(人)Fc区的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:36中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施例中，取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗变体(人)Fc区抗体包含如SEQ ID NO:36中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含与SEQ ID NO:06的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施例中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是包含该序列的抗变体(人)Fc区抗体保留了结合至变体(人)Fc区的能力。在某些实施例中，在SEQ ID NO:06中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施例中，该取代、插入或缺失发生在HVR之外的区域(即，在FR中)。任选地，抗变体(人)Fc区抗体包含SEQ ID NO:06的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体包含如上文提供的任何实施例中的VH和如上文提供的任何实施例中的VL。在某些实施例中，该抗体包含SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:06的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，根据上述实施例中的任一个实施例的抗变体(人)Fc区抗体是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。在某些实施例中，抗变体(人)Fc区抗体是抗体片段，例如双抗体，或F(ab')2片段。在某些实施例中，抗体是全长抗体，例如，如本文定义的人IgG1亚类或其他抗体类别或同种型的完整抗体。
本发明的一个方面是一种抗体，其包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的四个或六个结合位点。
本发明的一个方面是一种抗体多聚体，其包含至少两个共价连接的
i)二价全长抗体，其各自包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的两个结合位点，
或
ii)二价全长抗体的(Fab')2片段，其各自包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的两个结合位点。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体或抗体多聚体，其中特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点为特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据KabatEU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体或抗体多聚体，其中这些结合位点中的每一个结合位点彼此独立地包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或
(4)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
或
(5)
(1)至(4)中任一者的混合物。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体或抗体多聚体，其中特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点为特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸并且在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体多聚体，其中该多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体或抗体多聚体作为体外(桥接)免疫测定中的阳性对照的用途。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体或抗体多聚体作为体外(桥接)免疫测定中的标准品的用途。
本发明的一个方面是根据本发明的抗体或抗体多聚体的用途，其中该用途是用于生成用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体的校准函数，其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的一个或多个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
本发明的一个方面是一种用于确定(含有血清的)样品中抗药物抗体的存在和/或量的免疫测定，
其中该抗药物抗体结合至该药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，该Fc区与野生型Fc区相比是经改变的，
其中该免疫测定包含该药物抗体作为捕获抗体和作为示踪抗体，
其特征在于，
根据本发明的抗体或抗体多聚体在免疫测定中用作阳性对照或用作校准标准品。
本发明的一个方面是一种使用根据本发明的抗体或抗体多聚体的免疫测定，其中该免疫测定为桥接ELISA。
本发明的一个方面是一种免疫测定，其中根据本发明的抗体或抗体多聚体被用作校准标准品并用于生成校准函数，该校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体。
本发明的一个方面是一种通过使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)对二价全长抗体进行化学缀合来生产根据本发明的抗体多聚体的方法，这些二价全长抗体各自包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的两个结合位点。
本发明的一个方面是一种用于生产根据本发明的抗体多聚体的方法，其中该多聚体为全长抗体的多聚体。
本发明的一个方面是一种生产抗体多聚体的方法，该方法包括
对特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的全长抗体进行化学交联，其中该抗体包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
该化学交联使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)进行。
可以使用本领域已知的任何方法生成包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点的抗体。
例如，可以通过向实验动物施用至少包含Fc区的相应变体部分的免疫基因来制备抗体。用于呈递变体Fc区的合适构建体报道于例如WO 2012/150320中。
抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。例如，已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术生产的人抗体也描述于：Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。另外的方法包括例如在US 7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人类杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中。
抗体还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的可变结构域序列生成。然后可以将此类可变结构域序列与预期的人恒定结构域结合。
用于从抗体文库中选择抗体的技术是本领域已知的。
在某些实施例中，根据上述实施例中的任一个实施例的抗变体(人)Fc区抗体可单独或组合地结合如以下1至3节所述的特征：
1.抗体片段
在某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体是二价抗体片段。二价抗体片段包括但不限于F(ab')2和下文描述的其他片段，只要它们是二价的即可。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。关于三体抗体和四体抗体的描述也可参见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(20039129-134)。
抗体片段可以通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化，以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
2.嵌合和人源化抗体
在某些实施例中，用于生成生根据本发明的多价抗体的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体在以下文献中描述：例如，US 4,816,567；和Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施例中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR，例如CDR(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法例如综述于以下参考文献：Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633，并且进一步描述于以下参考文献中：例如，Riechmann,I.等人,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；US 5,821,337；US 7,527,791；US 6,982,321和US 7,087,409；Kashmiri,S.V.等人,Methods 36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面再塑”)；Dall'Acqua,W.F.等人,Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn,J.等人,Methods 36(2005)61-68和Klimka,A.等人,Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改组的“导向选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims,M.J.等人,J.Immunol.151(1993)2296-2308；源自轻链或重链可变区特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Presta,L.G.等人,J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro,J.C.和Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及源自筛选FR文库的框架区(参见例如，Baca,M.等人,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok,M.J.等人,J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
3.抗体变体
在某些实施例中，设想了用于生成本文提供的根据本发明的多价抗体的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施例中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代突变的目的位点包括HVR和FR。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变提供于下表的“示例性取代”标题下，并且在下文中参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并对产物进行所需活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选。
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别。
一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于亲本抗体，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个HVR残基突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
例如，可改变(例如，取代)HVR，以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程期间经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,P.S.,Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)，和/或接触抗原的残基，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建以及从二级文库中重新选择以实现亲和力成熟的方法已描述于例如Hoogenboom,H.R.等人，Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施例中，利用多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变基因)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中将若干HVR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个HVR内，只要此类改变基本上不降低抗体的抗原结合能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。此类改变可以在HVR的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个HVR保持不变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴定可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham,B.C.和Wells,J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-末端或C-末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体经改变以增加或减少抗体被糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键合连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如：Wright,A.和Morrison,S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以便产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体是具有缺乏(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中岩藻糖的含量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量为通过计算相对于通过MALDI-TOF质谱测得的与Asn 297附接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，糖链中在Asn297处的岩藻糖的平均量，确定，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于位置297上游或下游大约±3个氨基酸，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如US2003/0157108和US2004/0093621。有关“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki,A.等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka,J.等人,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，特别是实例11)，以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki,N.等人,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；WO 2003/085107)。
进一步涵盖了包含两分型寡糖的抗体变体，例如，其中附接至抗体的Fc区的双角寡糖被GlcNAc两分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878、US 6,602,684和US2005/0123546中。还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
c)Fc区变体
在某些实施例中，一个或多个氨基酸修饰可引入用于生成根据本发明的多价抗体的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施例中，用于生成根据本发明的多价抗体的抗体是具有一些但并非所有效应子功能的抗体变体，这使其成为应用的理想候选物，其中抗体在体内的半衰期很重要，但是某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于US 5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。替代性地，可使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或另外地，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如，在动物模型(诸如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的模型)中评估。还可以进行C1q结合测定，以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性(参见例如，WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为评定补体活化，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些(US 6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(US 7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见例如：US 6,737,056；WO 2004/056312以及Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施例中，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处(残基的EU编号)的取代。
在某些实施例中，改变Fc区以使得C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即，改善或减少)，例如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，负责将母体IgG转移至胎儿的抗体(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593；和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)描述于US2005/0014934中。那些抗体包含这样的Fc区，其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如对Fc区残基434的取代(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他实例，另见：Duncan,A.R.和Winter,G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；以及WO 94/29351。
用于生成根据本发明的多聚体的抗体的重链的C-末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C-末端。重链的C-末端可以是缩短的C-末端，在该缩短的C-末端中已经去除了一个或两个C-末端氨基酸残基。在一个优选的实施例中，重链的C-末端为以PG结束的缩短的C-末端。
d)经半胱氨酸工程化的抗体变体
在某些实施例，可期望产生经半胱氨酸工程化的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如US 7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗体。
B.重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。在某些实施例中，提供了编码本文所述的抗变体(人)Fc区抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH(例如，抗体的轻链和/或重链)的氨基酸序列。在进一步的实施例中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在进一步的实施例中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施例中，宿主细胞包含(例如，已经用以下各物转化)：(1)包含核酸的载体，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)第一载体和第二载体，该第一载体包含核酸，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列，该第二载体包含核酸，该核酸编码包含抗体的VH的氨基酸序列。在某些实施例中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、PS20细胞)。在某些实施例中，提供了一种制备抗变体(人)Fc区抗体的方法，其中该方法包括在适于表达抗体的条件下培养包含如上提供的编码抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收该抗体。
为重组生产抗变体(人)Fc区抗体，将例如如上所述的编码抗体的核酸分离并且插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,在：Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，HumanaPress,Totowa,NJ(2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)抗体可在表达后在可溶性级分中从细菌细胞糊中分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，所述真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化抗体的合适宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了许多可以与昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为：由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(如例如以下文献所述的293或293细胞：Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(如例如以下文献所述的TM4细胞：Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如以下文献所述的TRI细胞：Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology，第248卷，Lo,B.K.C.(编辑)，Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。
C.测定
根据本发明的多价抗变体(人)Fc区抗体可以用于本领域已知的各种测定中。
如果需要例如在样品中检测包含Fc区中的相应突变的治疗性抗体或针对此类治疗性抗体的抗药物抗体，则根据本发明的多价抗体特别有用。
在根据本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，药物抗体包含
i)突变P329G或P329G、L234A和L235A，和/或
ii)突变I253A、H310A和H435A。
在根据本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，包含相应突变的抗体是包含以下项的抗体：
i)突变P329G或P329G、L234A和L235A，和/或
ii)突变I253A、H310A和H435A。
根据本发明的一个方面是根据本发明的多价抗体在(抗原桥接)免疫测定中作为阳性对照或作为(校准)标准品用于确定针对/特异性结合至包含Fc区中的相应突变的治疗性抗体(即，包含Fc区中的相应突变的抗体)(在样品中)的抗药物抗体的用途。检测和捕获所需的相应其他试剂是已相应地经衍生化、固定化或标记的治疗性抗体。
该测定适用于任何非人血清。在某些实施例中，该用途是用于非人实验动物的血清样品中的确定。
此类测定的定量下限(阈值)低于100pg/mL，例如，在10％食蟹猴血清(测定浓度)中为40-80pg/mL。
根据本发明的一个方面是根据本发明的多价抗体在免疫测定中的用途，该免疫测定用于确定针对治疗性抗体的抗药物抗体，其中该治疗性抗体包含Fc区中的相应突变(在样品中)。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体用作捕获抗体。在某些实施例中，捕获抗体被固定至固体表面。在一个优选的实施例中，固体表面是多孔板的孔(孔的壁或底部或两者)。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该药物抗体用作示踪抗体。为了检测，将示踪抗体与合适的标记缀合。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，样品获自实验动物，该实验动物选自狨猴和绢毛猴科、旧大陆猴科、矮狐猴和鼠狐猴科、长臂猿和小型猿科、真狐猴科成员以及其杂交种，或者获自人类。在某些实施例中，样品获自恒河猴、或狨猴、或狒狒猴、或食蟹猴、或人类。在某些实施例中，实验动物是猕猴或短尾猴。在某些实施例中，样品获自食蟹猴或恒河猴或人类。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，该免疫测定为夹心免疫测定。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，药物(治疗性)抗体与其缀合配偶体的缀合通过经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，抗体氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团，和/或抗体的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合来进行。在某些实施例中，捕获抗体通过特异性结合对固定。在一个优选的实施例中，捕获抗体与生物素缀合，并且经由固定化的亲和素或链霉亲和素进行固定。在某些实施例中，示踪抗体经由特异性结合对缀合至可检测标记。在一个优选的实施例中，示踪抗体缀合至地高辛，并且经由针对地高辛的抗体与可检测标记连接。在某些实施例中，药物抗体是人或人源化抗体。在某些实施例中，人或人源化抗体是单克隆抗体。
根据本发明的一个方面是一种用于确定夹心/桥接免疫测定的正确/适当功能的方法，该夹心/桥接免疫测定用于确定针对治疗性抗体，该治疗性抗体具有经修饰的(效应子功能沉默的)Fc区，或其Fc区(在样品中)的抗药物抗体，该方法包括以下步骤：
a)将根据本发明的多价抗体与已固定在固体表面上的药物(治疗性)抗体或其Fc区(片段)一起孵育以形成二聚复合物，
b)将所述二聚复合物与缀合至可检测标记的药物(治疗性)抗体一起孵育以形成三元复合物，以及
c)如果在步骤b)中形成了三元复合物/可以检测到在步骤b)中形成的三元复合物，则确定夹心/桥接免疫测定的正确/适当功能。
根据本发明的一个方面是一种用于校准夹心/桥接免疫测定的方法，该夹心/桥接免疫测定用于确定针对治疗性抗体，该治疗性抗体具有经修饰的(效应子功能沉默的)Fc区，或其Fc区(在样品中)的抗药物抗体，该方法包括以下步骤：
a)将根据本发明的多价抗体以至少两种不同的浓度单独与已固定在固体表面上的药物(治疗性)抗体或其Fc区(片段)一起孵育至二聚复合物，
b)将所述二聚复合物中的每一个单独与缀合至可检测标记的药物(治疗性)抗体一起孵育以形成三元复合物，
c)通过确定可检测标记的量来确定步骤c)中形成的三元复合物中的每一个的量，以及
d)基于步骤c)中确定的量来计算校准曲线，从而校准夹心/桥接免疫测定。
根据本发明的一个方面是一种抗药物抗体免疫测定，其用于确定针对Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体(即，包含Fc区中的相应突变的抗体)(在样品中)/Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体(即，包含Fc区中的相应突变的抗体)(在样品中)的Fc区的抗药物抗体的存在，其中该方法按以下顺序包括以下步骤：
a)将固定有Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体或其Fc区片段的固相与包含哺乳动物血清的样品一起孵育(从而形成固相结合的药物抗体-抗药物抗体复合物)，
b)将(步骤a)中形成的药物抗体-抗药物抗体复合物所结合的)固相与缀合至可检测标记的药物抗体或其Fc区片段一起孵育，以及
c)通过确定可检测标记的存在，从而确定样品中针对Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体的抗药物抗体的存在，来确定步骤b)中固相结合复合物的形成，
由此，已使用根据本发明的多价抗体确定了免疫测定的正确功能。
根据本发明的一个方面是一种抗药物抗体免疫测定，其用于确定针对Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体(即，包含Fc区中的相应突变的抗体)(在样品中)/Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体(即，包含Fc区中的相应突变的抗体)(在样品中)的Fc区的抗药物抗体的存在，其中该方法按以下顺序包括以下步骤：
a)将固定有Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体的固相与包含哺乳动物血清的样品一起孵育(从而形成固相结合的药物抗体-抗药物抗体复合物)，
b)将(步骤a)中形成的药物抗体-抗药物抗体复合物所结合的)固相与缀合至可检测标记的药物抗体一起孵育，以及
c)通过确定可检测标记的存在，从而确定样品中针对Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体的抗药物抗体的存在，来确定步骤b)中固相结合复合物的形成，
由此，已使用根据本发明的多价抗体确定了免疫测定的标准/校准曲线。
在根据本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，每个孵育步骤之后是以下步骤：
-洗涤固相以去除未结合的化合物。
在根据本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，通过以下方式确定可检测标记的存在或量：
-通过确定可检测标记的存在来确定前一步骤中固相结合复合物的形成，并通过确定所确定的标记的量来确定复合物的量。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体属于人IgG1或IgG4亚类。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体属于人IgG1亚类并且在两个Fc区多肽中具有突变L234A、L235A和P329G，或者Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体属于人IgG4亚类并且在两个Fc区多肽中具有突变S228P、L235E和P329G(根据Kabat根据EU编号系统编号)。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体属于人IgG1亚类并且在两个Fc区多肽中具有突变I253A、H310A和H435A(根据Kabat根据EU编号系统编号)。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施咯中，Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体是双特异性抗体、或三特异性抗体、或四特异性抗体、或五特异性抗体、或六特异性抗体。在一个优选的实施例中，Fc受体结合受抑制的人或人源化药物抗体是双特异性抗体。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，哺乳动物血清是人血清或食蟹猴血清或小鼠血清。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，使用酶联显色反应、表面等离子体共振、电化学发光或放射免疫测定来确定标记的存在和/或量。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，固相缀合至结合对的第一成员，并且待固定在固相上的化合物缀合至结合对的第二成员。在某些实施例中，此类结合对(第一成员/第二成员)选自链霉亲和素或亲和素/生物素、抗体/抗原(参见例如，Hermanson,G.T.等人,Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996))、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。在某些实施例中，待固定在固相上的化合物通过经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，多肽氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团，和/或多肽的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合缀合至结合对的第二成员。
此类通过不同氨基的缀合可以在第一步中通过用化学保护剂对部分ε-氨基进行酰化(例如通过柠康酰化)来进行。在第二步中，通过剩余的氨基进行缀合。随后去除柠康酰化，并且将结合配偶体通过剩余的游离氨基固定在固相上，即，将获得的结合配偶体通过尚未被柠康酰化保护的氨基固定在固相上。合适的化学保护剂在未受保护的侧链胺处形成键，并且不如N-末端处的那些键稳定并且不同于N-末端处的那些键。许多此类化学保护剂是已知的(参见例如EP 0 651 761)。在某些实施例中，化学保护剂包括环状二羧酸酐，如马来酸酐或柠康酸酐。
在一个优选的实施例中，结合对的第一成员是链霉亲和素，并且结合对的第二成员是生物素。在某些实施例中，固相缀合至链霉亲和素，并且待固定在固相上的化合物被生物素化。在某些实施例中，固相是链霉亲和素包被的顺磁珠或链霉亲和素包被的琼脂糖珠或多孔板的链霉亲和素包被的孔。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，待缀合至固相的化合物是包含至少两种化合物的混合物，该至少两种化合物在它们缀合至生物素并由此固定在固相上的位点上不同。
在根据本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的多聚体中的多聚化通过经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，多肽氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团，和/或多肽的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合来进行。
通过不同氨基的偶联可以在第一步中通过用化学保护剂对部分ε-氨基进行酰化(例如通过柠康酰化)来进行。在第二步中，通过剩余的氨基进行缀合。随后去除柠康酰化，并且将结合配偶体通过剩余的游离氨基缀合至固相，即，将获得的结合配偶体通过尚未被柠康酰化保护的氨基缀合至固相。合适的化学保护剂在未受保护的侧链胺处形成键，并且不如N-末端处的那些键稳定并且不同于N-末端处的那些键。许多此类化学保护剂是已知的(参见例如EP 0 651 761)。在某些实施例中，化学保护剂包括环状二羧酸酐，如马来酸酐或柠康酸酐。
在本发明的所有方面和实施例的某些实施例中，药物抗体或其Fc区通过被动吸附缀合至固相。被动吸附例如由Butler,J.E.在“Solid Phases in Immunoassay”(1996)205-225中描述，并且由Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编辑)在“Immunoassay”(1996)Academic Press(San Diego)中描述。
术语“药物抗体”表示这样一种抗体，其正在或已经在临床研究中测试以批准作为人类治疗剂，并且可以施用于个体以治疗疾病。在某些实施例中，药物抗体是单克隆抗体。在进一步的实施例中，药物抗体获自类人猿或用人抗体基因座转化的动物，或者是人单克隆抗体，或者是人源化单克隆抗体。在某些实施例中，药物抗体是人单克隆抗体。在某些实施例中，药物抗体是人源化单克隆抗体。药物抗体被广泛用于治疗多种疾病，诸如肿瘤疾病(例如血液和实体恶性肿瘤，包括非霍奇金氏淋巴瘤、乳腺癌和结直肠癌)、免疫疾病、中枢神经疾病、血管疾病或传染病。
术语“表位”表示能够特异性结合至抗体的蛋白决定簇。表位通常由分子诸如氨基酸或糖侧链的化学活性表面大组组成，并且通常表位具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合而不是后者的结合会丢失。
不同免疫测定的原理如例如Hage,D.S.(Anal.Chem.71(1999)294R-304R)所述。Lu,B.等人(Analyst 121(1996)29R-32R)报道了用于免疫测定的抗体的取向固定。亲和素-生物素介导的免疫测定报道于例如Wilchek,M.和Bayer,E.A.在Methods Enzymol.184(1990)467-469中。
多肽和单克隆抗体及其恒定结构域含有许多反应性氨基酸侧链，用于缀合至结合对的成员，诸如多肽/蛋白质、聚合物(例如PEG、纤维素或聚苯乙烯)或酶。氨基酸的化学反应性基团是例如氨基(赖氨酸、α-氨基)、硫醇基(胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)、甲酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。这种方法是例如由Aslam M.和Dent,A.在“Bioconjugation”,MacMillan Ref.Ltd.1999,第50-100页中描述。
多肽和抗体最常见的反应性基团之一是氨基酸赖氨酸的脂肪族ε-胺。一般来说，几乎所有的多肽和抗体都含有丰富的赖氨酸。赖氨酸胺在pH 8.0以上(pKa＝9.18)是相当好的亲核试剂，因此容易且干净地与各种试剂反应，形成稳定的键。胺反应性试剂主要与赖氨酸和蛋白质的α-氨基反应。反应性酯，特别是N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)酯，是最常用的胺基改性试剂。在水性环境中反应的最佳pH是pH 8.0至9.0。异硫氰酸酯是胺修饰试剂，并且与蛋白质形成硫脲键。它们与水溶液中的蛋白质胺反应(最佳pH为9.0至9.5)。醛在温和的水性条件下与脂族和芳族胺、肼和酰肼反应，形成亚胺中间体(希夫碱)。希夫碱可以用温和或强还原剂(诸如硼氢化钠或氰基硼氢化钠)选择性还原，以衍生出稳定的烷基胺键。已用于改性胺的其他试剂是酸酐。例如，二乙烯三胺五乙酸酐(DTPA)是含有两个胺反应性酸酐基团的双功能螯合剂。它可以与氨基酸的N-末端和ε-胺基反应形成酰胺键。酸酐环打开形成多价金属螯合臂，能够与配位复合物中的金属紧密结合。
多肽和抗体中另一个常见的反应性基团是来自含硫氨基酸胱氨酸及其还原产物半胱氨酸(或半胱氨酸)的硫醇残基。半胱氨酸含有游离硫醇基团，它比胺类更具亲核性，且通常是蛋白质中反应性最强的官能团。硫醇通常在中性pH下具有反应性，因此可以在胺存在的情况下选择性地与其他分子偶联。由于游离巯基具有相对反应性，因此具有这些基团的蛋白质通常以其氧化形式作为二硫基或二硫键与其一起存在。在此类蛋白质中，需要用诸如二硫苏糖醇(DTT)等试剂还原二硫键以生成反应性游离硫醇。硫醇反应性试剂是那些将与多肽上的硫醇基团偶联，形成硫醚偶联产物的试剂。这些试剂在弱酸性至中性pH下反应迅速，因此可以在胺基团存在的情况下选择性地反应。文献报道了几种硫醇化交联试剂的诸如Traut试剂(2-亚氨基硫烷)、琥珀酰亚氨基(乙酰硫基)乙酸酯(SATA)和磺基琥珀酰亚胺6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)的使用提供经由反应性氨基引入多个巯基的高效方式。卤代乙酰基衍生物，例如碘乙酰胺，形成硫醚键，且也是硫醇修饰的试剂。另外有用的试剂是马来酰亚胺。马来酰亚胺与硫醇反应性试剂的反应与碘乙酰胺的反应基本相同。马来酰亚胺在弱酸性至中性pH下反应迅速。
多肽和抗体中另一个常见的反应性基团是甲酸。多肽和抗体在C-末端位置以及天冬氨酸和谷氨酸的侧链内含有甲酸基团。甲酸在水中相对较低的反应性通常使得难以使用这些基团来选择性地修饰多肽和抗体。完成此操作后，通常使用水溶性碳二亚胺将甲酸基团转化为反应性酯，并与亲核试剂诸如胺、酰肼或肼反应。含胺试剂应该是弱碱性的，以便在赖氨酸的碱性更强的ε-胺存在的情况下与活化的甲酸选择性地反应，形成稳定的酰胺键。当pH值升至8.0以上时，可能发生蛋白质交联。
高碘酸钠可用于氧化与醛的抗体连接的碳水化合物部分内的糖的醇部分。每个醛基都可以与胺、酰肼或肼反应，如针对甲酸所述。由于碳水化合物部分主要存在于抗体的可结晶片段(Fc)区，因此可通过远离抗原结合位点的碳水化合物定点修饰实现缀合。形成希夫碱中间体，可通过用氰基硼氢化钠(温和且选择性)或硼氢化钠(强)水溶性还原剂还原该中间体，将其还原为烷基胺。
术语“样品”包括但不限于来自生物或以前生物的任何量的物质。这种生物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其他动物。在某些实施例中，样品获自猴，特别是食蟹猴，或兔，或小鼠，或大鼠，或人。在某些实施例中，此类物质包括但不限于来自个体的全血或血清，它们是临床常规中最广泛使用的样品来源。
术语“固相”表示非流体物质，并且包括：由诸如聚合物、金属(顺磁性颗粒、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷等材料制成的颗粒(包括微粒和珠粒)；凝胶物质，诸如二氧化硅凝胶、氧化铝凝胶和聚合物凝胶；毛细管，其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成；沸石和其他多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；以及比色皿、管或其他光谱仪样品容器。固相组分与惰性固体表面的区别在于，“固相”在其表面上包含至少一个部分，其旨在与样品中的物质发生相互作用。固相可以是固定组分，诸如管、条、比色皿或微量滴定板，或者可以是非固定组分，诸如珠粒和微粒。可以使用允许蛋白质和其他物质非共价连接或共价连接的多种微粒。此类颗粒包括聚合物颗粒，诸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒，诸如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷颗粒，诸如二氧化硅颗粒、玻璃颗粒和金属氧化物颗粒。参见例如Martin,C.R.,等人,Analytical Chemistry-News&Features,70(1998)322A-327A或Butler,J.E.,Methods 22(2000)4-23。
在某些实施例中，可检测标记选自色原(荧光或发光基团和染料)、酶、NMR活性基团、金属颗粒或半抗原，诸如地高辛。可检测标记也可以是可光活化的交联基团，例如叠氮基或吖丙啶基团。在某些实施例中，可通过电化学发光检测的金属螯合物也是信号发射基团，特别优选钌螯合物，例如钌(双吡啶基)3 2+螯合物。合适的钌标记基团描述于例如EP 0580 979、WO 90/05301、WO 90/11511和WO 92/14138中。
本文报道的免疫测定和方法中使用的一些化合物与结合对的成员缀合。在某些实施例中，该缀合通过经由N-末端和/或ε-氨基(赖氨酸)，不同赖氨酸的ε-氨基，化合物氨基酸骨架的羧基-、巯基-、羟基-和/或酚官能团，和/或化合物的碳水化合物结构的糖醇基团的化学结合来进行。在某些实施例中，缀合的化合物是与结合对的成员缀合的至少两种化合物的混合物，其中该混合物中的至少两种化合物在它们与结合对的成员缀合的位点上不同。例如，混合物可以包含通过氨基酸骨架的氨基酸进行的缀合和通过碳水化合物的糖醇基团进行的缀合。另外，例如，混合物可以包含通过氨基酸骨架的不同氨基酸残基缀合至结合对的成员的化合物。表述“不同的氨基酸残基”表示两种不同类型的氨基酸，诸如例如赖氨酸和天冬氨酸，或酪氨酸和谷氨酸，或表示在化合物氨基酸序列中位置不同的氨基酸骨架的两个氨基酸残基。在后一种情况下，氨基酸可以是相同种类或不同种类的。表述“位点不同”表示位点类型的差异，例如氨基酸或糖醇基团，或氨基酸骨架的氨基酸数量的差异，例如化合物与结合对的成员缀合的氨基酸骨架。
对于直接检测，标记基团可选自任何已知的可检测标志物基团，诸如染料、发光标记基团，诸如化学发光基团，例如吖啶酯或二氧杂环丁烷，或荧光染料，例如荧光素、香豆素、若丹明、恶嗪、试卤灵、花青及其衍生物。标记基团的其他实例是发光金属复合物，诸如钌或铕复合物、酶(例如，如用于ELISA或用于CEDIA(克隆酶供体免疫测定，例如EP-A-0 061888))和放射性同位素。
间接检测系统包括，例如，检测试剂，例如检测抗体用生物亲和结合对的第一配偶体标记。合适的结合对的实例是半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物诸如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/亲和素或链霉亲和素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补核酸和受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。优选的第一结合对成员包括半抗原、抗原和激素。特别优选的是半抗原，如地高辛和生物素及其类似物。此类结合对的第二配偶体，例如抗体、链霉亲和素等通常被标记以允许直接检测，例如通过上述标记。
免疫测定是技术人员熟知的。相关教科书中总结了进行此类测定的方法以及实际应用和程序。相关教科书的实例为Tijssen,P.,Preparation of enzyme-antibody orother enzyme-macromolecule conjugates(在："Practice and theory of enzymeimmunoassays"(1990),第221-278页,编辑：R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg,Elsevier,Amsterdam)和"Methods in Enzymology"(编辑：S.P.Colowick,N.O.Caplan,AcademicPress)的各卷，涉及免疫学检测方法，特别是第70、73、74、84、92和121卷。
在所有上述免疫学检测方法中，选择允许所用试剂结合(例如允许抗体与其对应抗原的结合)的试剂条件。技术人员通过使用术语复合物来指代此类结合事件的结果。在根据本发明的测定方法中形成的复合物通过现有技术程序与所述治疗性抗体的对应浓度相关联。根据所使用的检测试剂，该相关步骤将产生总的、活性的或抗原结合的治疗性抗体的浓度。
根据本发明的方法和免疫测定为体外方法和免疫测定。
III.实例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。
实例1
材料和方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))根据编号对抗体链的氨基酸进行编号和引用。
重组DNA技术
可以使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
基因合成
可以从通过化学合成制得的寡核苷酸来制备所需的基因区段。侧翼可以是单个限制性内切核酸酶切割位点的长基因片段可以通过退火和连接寡核苷酸(包括PCR扩增)来组装，并随后通过指定的限制性位点进行克隆。可以通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。
DNA序列测定
可以通过双链测序确定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
可以使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)的软件包10.2版和Infomax的Vector NT1 Advance套件8.0版来进行序列创建、图谱绘制、分析、注释和说明。
表达载体
为了表达抗体，可以应用基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA组织或基于具有CMV启动子的基因组组织的用于瞬时表达(例如在HEK293细胞中)的表达质粒。
除抗体表达盒外，载体可以含有：
-复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
抗体基因的转录单位可以由以下元件组成：
-5'端的独特限制性位点
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，
-在cDNA组织的情况下，内含子A序列，
-源自人抗体基因的5'非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-相应的抗体链编码核酸，无论是作为cDNA还是具有基因组外显子-内含子组织，
-具有聚腺苷酸化信号序列的3'非翻译区，以及
-3'端的独特限制性位点。
可以通过PCR和/或基因合成生成编码抗体链的融合基因，并将该融合基因通过已知的重组方法和技术，通过例如使用相应载体中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行装配。可以通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染，可以通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒。
细胞培养技术
可以使用描述于Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑),JohnWiley&Sons,Inc.中的标准细胞培养技术。
在HEK293系统中通过瞬时转染产生重组抗体
抗体可以通过瞬时表达来产生。因此，可以根据制造商的说明使用HEK293系统(Invitrogen)进行相应质粒的转染。简而言之，可以将在摇瓶或搅拌发酵管中在无血清FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293细胞(Invitrogen)用相应表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物转染。对于2L摇瓶(Corning)，可以将HEK293细胞以1.0*106个细胞/mL的密度接种于600mL中并在120rpm、8％ CO2下孵育。第二天，可以将细胞以约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用约42mL的以下项的混合物转染：A)包含600μg总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM培养基(Invitrogen)和B)补充有1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)的20mL Opti-MEM培养基。根据葡萄糖消耗量，可以在发酵过程中添加葡萄糖溶液。通常在5-10天后收获含有分泌的抗体的上清液，并且可以直接从上清液纯化抗体，或者将上清液冷冻并储存。
蛋白质测定
可以通过使用根据Pace等人，Protein Science 4(1995)2411-1423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数测定280nm处的光密度(OD)，来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓度。
上清液中的抗体浓度测定
可以通过用蛋白A琼脂糖珠粒(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德国)进行免疫沉淀来估计细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。因此，可以将60μL蛋白A琼脂糖珠粒在TBS-NP40(50mM Tris缓冲液，pH 7.5，补充有150mM NaCl和1％ Nonidet-P40)中洗涤三次。随后，可以将1-15mL的细胞培养上清液施加至在TBS-NP40中预平衡的蛋白A琼脂糖珠粒。在室温下孵育1小时后，可以将珠粒在Ultrafree-MC-过滤器柱(Amicon)上用0.5mLTBS-NP40洗涤一次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲盐水(2xPBS，Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德国)洗涤两次，并用0.5mL 100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)短暂洗涤四次。可以通过添加35μL的LDS样品缓冲液(Invitrogen)来洗脱结合的抗体。可以将一半样品分别与样品还原剂混合或保持不还原，并在70℃加热10分钟。由此，可以将5-30μL施加至4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(使用MOPS缓冲液进行非还原SDS-PAGE，并使用具有抗氧化剂电泳缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液进行还原SDS-PAGE)，并用考马斯蓝染色。
可以通过亲和HPLC色谱法定量地测量细胞培养上清液中的抗体的浓度。简而言之，可以将含有与蛋白A结合的抗体的细胞培养物上清液施加至200mM KH2PO4、100mM柠檬酸钠，pH 7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱，并在Agilent HPLC 1100系统上用200mM NaCl、100mM柠檬酸，pH 2.5洗脱。可以通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的抗体。将纯化的标准IgG1抗体用作标准品。
替代性地，可以通过Sandwich-IgG-ELISA测量细胞培养物上清液中抗体和衍生物的浓度。简而言之，可以将StreptaWell High Bind Streptavidin A-96孔微量滴定板(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德国)用100μL/孔的0.1μg/mL的生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab')2-抗人Fcγ抗体-BI(Dianova)在室温下包被1小时或替代性地在4℃包被过夜，并随后用200μL/孔的PBS、0.05％的吐温(PBST，Sigma)洗涤三次。此后，可以将100μL/孔的含有相应抗体的PBS(Sigma)稀释系列的细胞培养上清液加入到孔中，并在室温下在振荡器上孵育1-2小时。可以将孔用200μL/孔的PBST洗涤三次，并用100μL 0.1μg/mL的F(ab')2-抗人Fcγ抗体-POD(Dianova)作为检测抗体，在室温下在振荡器上孵育1-2小时来检测结合的抗体。通过用200μL/孔PBST洗涤三次，可以去除未结合的检测抗体。可以通过添加100μL ABTS/孔然后孵育来检测结合的检测抗体。在Tecan Fluor光谱仪上，在405nm的测量波长(参考波长为492nm)下执行吸光度测定。
制备型抗体纯化
可以参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化抗体。简言之，可以将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(GE Healthcare)并用PBS洗涤。可以在pH2.8下实现抗体的洗脱，之后立即进行中和。可以通过尺寸排阻色谱法(Superdex200,GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸缓冲液(包含150mM NaCl)(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体抗体分离。可将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃。可以提供部分样品以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
可以根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen)。特别地，可以使用10％或4-12％Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和MES(还原凝胶，具有抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。
CE-SDS
可以使用微流体Labchip技术(PerkinElmer，美国)通过CE-SDS分析纯度和抗体完整性。因此，可以使用HT Protein Express试剂盒根据制造商的说明制备5μL抗体溶液用于CE-SDS分析，并使用HT Protein Express芯片在LabChip GXII系统上进行分析。可以使用LabChip GX软件分析数据。
分析型尺寸排阻色谱法
可以通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(SEC)。简而言之，可以将蛋白A纯化的抗体施加至Dionex 系统(ThermoFischer Scientific)上的300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH 7.5)中的TosohTSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC系统上的2x PBS中的Superdex 200柱(GEHealthcare)。可以通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的抗体。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。
质谱
可以在37℃以1mg/mL的蛋白质浓度将抗体用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F脱糖基化至多17小时。可以将限制性LysC(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim，德国)消化用Tris缓冲液(pH 8)中的100μg脱糖基化的抗体分别在室温执行120小时或在37℃执行40分钟。在质谱法之前，可以将样品经由HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS来确定总质量。
使用杂交瘤生产抗体
将杂交瘤细胞系以每毫升1.0x105和2.2x105个细胞之间的初始细胞密度(活细胞)接种在补充有10％ FCS和常用补充剂的RPMI 1640中，并在T型瓶(Celline，IBS)中扩增，持续大约三周的时间。根据标准蛋白质化学方法，例如，报道于Bruck,C.等人,MethodsEnzymol.121(1986)587-596中的方法，从培养物上清液中纯化抗体。
实例2
表征根据本发明的多聚体的单体
将生物素化抗PG Fc区抗体或生物素化抗AAA Fc区抗体分别结合至链霉亲和素包被的多孔板(SA-MTP)的孔，以产生捕获板。通过洗涤去除过量的未结合抗体。将掺入人和食蟹猴血清(10％终浓度)的样品/标准品抗体添加到涂有捕获板的SA-MTP多孔板的孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，将孔与地高辛化抗人κ抗体M1.7.10一起孵育(参见例如WO2011/048043，其通过援引并入本文)。洗涤后，将结合的地高辛化抗人κ抗体复合物与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体一起孵育。在另一个洗涤步骤后，将ABTS溶液添加到孔中并孵育。通过Elisa酶标仪在405nm波长下测量显色反应产物(参考波长：490nm)。一式三份地确定每个样品或标准品的吸光度值。
下表示出了用本文报道的抗变体(人)Fc区抗体M1.3.17(SEQ ID NO:03和04)作为捕获抗体针对血清中具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体确定的消光值。
下表示出了使用本文报道的不同抗体作为捕获抗体和示踪抗体针对Fc区中具有不同突变的不同特异性的抗体确定的消光值。
测定B：捕获抗体：M1.6.22-Bi/M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
示踪抗体：1.7.10-Dig
测定C：捕获抗体：M1.6.22-Bi/M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
示踪化合物：FcγRI-Dig
M1.6.22＝抗AAA变体Fc区抗体；
M1.7.10＝抗IgG1κ抗体；
M1.7.24＝抗PG变体Fc区抗体；
M1.3.17＝抗PG变体Fc区抗体；
样品：
1)抗VEGF/ANG2抗体(具有突变P329G/L234A/L235A/I253A/H310A/H435A的IgG1亚类)；
2)抗VEGF/ANG2抗体(具有突变P329G/L234A/L235A的IgG1亚类)；
3)抗IGF-1R抗体(具有突变I253A/H310A/H435A的IgG1亚类)；
4)抗P-选择素抗体(具有突变S228P/L235E的IgG4亚类)；
5)抗VEGF/ANG2抗体(野生型IgG1亚类)。
测定D：捕获抗体：M1.7.24-Bi/M1.3.17-Bi
示踪抗体：1.7.10-Dig/M1.19.31-Dig
M1.7.10＝抗IgG1κ抗体
M1.19.31＝抗IgG1κ抗体
M1.7.24＝抗PGLALA变体Fc区抗体
M1.3.17＝抗PGLALA变体Fc区抗体
样品：
6)抗Dig抗体(具有突变P329G/L234A/L235A的IgG1亚类)
实例3
形成根据本发明的多价抗体
抗PG抗体克隆1.7.24SATP的制备
将单体二价抗PG抗体克隆1.7.24针对含有150mM NaCl(pH 7.8)的100mM磷酸钾缓冲液进行透析，并调节至约15mg/mL的蛋白质浓度。将N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)溶解在DMSO中，并以1:5的摩尔比(单体抗体:SATP)添加到抗体溶液中。将pH调节至pH 7.1，并将混合物在25℃孵育60分钟。通过添加终浓度为10mM的L-赖氨酸来终止反应，并通过针对10mM磷酸钾缓冲液(含有200mM NaCl、1mM EDTA，pH 6.1)进行透析去除多余的SATP。
抗PG抗体克隆1.7.24MH的制备
将单体二价抗PG抗体克隆1.7.24针对30mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)进行透析，然后调节至约25mg/mL的蛋白质浓度。将马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MHS)溶解在DMSO中，并以1:6的摩尔比(单体IgG:MHS)添加到抗体溶液中。将pH调节至pH 7.1，并将混合物在25℃孵育60分钟。通过添加L-赖氨酸至终浓度为10mM来终止反应，将pH调节至pH6.2，并通过针对10mM磷酸钾缓冲液(含有200mM NaCl、1mM EDTA，pH 6.1)进行透析去除多余的MHS。
抗PG抗体克隆1.7.24 SATP和抗PG抗体克隆1.7.24 MH的化学缀合
通过与2％(v/v)1M羟胺(pH 7.5)一起孵育，将抗PG抗体克隆1.7.24SATP脱乙酰化，并在25℃孵育45分钟。将脱乙酰化抗体与抗PG抗体克隆1.7.24MH混合(脱乙酰化IgG:IgG-MH摩尔比＝1:3)，并用10mM磷酸钾缓冲液(含有200mM NaCl、1mM EDTA，pH 6.1)稀释至终浓度为1.5mg/mL脱乙酰化抗PG抗体克隆1.7.24和4.5mg/mL抗PG抗体克隆1.7.24MH。将pH调节至pH 7.1并将混合物在25℃孵育。用分析凝胶过滤柱(例如TSK 3000)分析缀合过程。45分钟后，通过添加半胱氨酸至终浓度为1mM，停止缀合。另外30分钟孵育时间后，添加N-甲基马来酰亚胺(NMM)至终浓度为5mM，并将pH调节至pH 7.5。在25℃孵育60分钟后，将缀合物通过S300凝胶过滤色谱法纯化并按大小分级，以消除未缀合的抗体。获得了六个池。池6仅含有单体抗PG抗体克隆1.7.24。
实例4-比较例
二价单体抗体作为抗药物抗体测定中的校准标准品
制备单体全长抗PG Fc区抗体克隆1.3.17的稀释系列作为用于检查生成标准曲线的可能性的标准品。
将具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A的生物素化抗VEGF/ANG2抗体和具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A的地高辛化抗VEGF/ANG2抗体与标准品一起在室温下预孵育过夜。预孵育后，将样品转移至链霉亲和素包被的多孔板中，并在室温下孵育1小时。通过洗涤去除过量的未结合抗体。在洗涤步骤后，将包含具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A的生物素化和地高辛化抗VEGF/ANG2抗体以及单体全长抗PG Fc区抗体M1.3.17(SEQ ID NO:03和04)的结合的地高辛化复合物用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗地高辛抗体进行检测。经过洗涤步骤并与相应底物一起孵育后，形成的复合物中存在的HRP催化ABTS转化为有色产物。通过Elisa酶标仪在405nm波长下测量信号(参考波长：490nm)。一式三份地确定每个血清样品的吸光度值。
下表示出了用单体全长抗变体(人)Fc区抗体M1.3.17(SEQ ID NO:03和04)作为标准品针对血清中作为捕获抗体(生物素化)以及示踪抗体(地高辛化)的具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A的抗VEGF/ANG2抗体确定的消光值。
浓度为125ng/mL时，信噪比为1.85。监管机构对免疫原性测定灵敏度的要求为100ng/mL。因此，单体二价抗PG抗体M1.3.17灵敏度低，不适合作为ADA测定的阳性对照或校准标准品。可以看出，浓度为125ng/mL时，信号仅为空白信号的1.85倍，因此，未达到监管机构要求的有效测定阈值。
实例5
通过化学缀合获得的根据本发明的多价抗体作为阳性对照和校准标准品的用途
通用测定：
所有步骤均在室温(RT)下进行，并且样品和质量控制在5％ HPS(人合并血清)存在下进行分析。通过在含有Drug-BI(生物素化药物抗体)和Drug-DIG(地高辛化药物抗体)的低交叉缓冲液中稀释，将样品调节至相应的浓度。将相应浓度的生物素化捕获抗体和地高辛化检测抗体(＝药物(治疗性)抗体)直接在SA-MTP(链霉亲和素包被的多滴度(孔)板)上或未衍生的MTP(预孵育板)上孵育2小时，孵育条件为RT(室温)和450rpm振荡。此后，如果需要，将样品(100μL)转移至SA包被的MTP，并在RT(450rpm)下孵育1小时。然后，将孔洗涤三次(每次300μL洗涤缓冲液)。添加100μL多克隆抗DIG-S-Fab-HRP缀合物(50mU/mL)并孵育1小时后，再次洗涤板(三次，每次使用300μL洗涤缓冲液)。最后，每孔添加100μL ABTS底物，并在405nm(参考波长为490nm)下通过光度测定评估显色反应。重复测量样品并取平均值。如果重复的精度≤变异系数(CV)的20％，则测量结果被视为有效。
池选择
对于池选择，使用桥接ELISA，其中包含0.115μg/mL生物素化非靶向抗体IL2融合体(非靶向IgG-IL2)和0.230μg/mL地高辛化非靶向IgG-IL2(不含任何基质)。该测定直接在链霉亲和素包被的微量滴定板(SA-MTP)上进行，孵育2小时。
第一步，在测定缓冲液中分别对池1至池5进行测试，浓度在10倍稀释步骤中从10,000ng/mL至100ng/mL。
用生物素化和地高辛化非靶向IgG-IL2缀合物将池以1比20稀释。
将池2、池3和池4合并在一起；所有三个池在上述ADA测定中均显示出高结合信号。将源自克隆1.7.24的纯化的多价抗PG抗体池浓缩至约0.5mg/mL，并储存在-80℃下。
多聚体与单体比较
为了比较单体与多聚体，使用以下测定。将源自克隆1.7.24的多价抗PG抗体和单体二价抗PG抗体克隆1.7.24的混合池2、3、4从10,000ng/mL开始1比2逐步稀释至0.6ng/mL。然后用生物素化和地高辛化非靶向IgG-IL2缀合物稀释这些样品，稀释倍数为20，并在预孵育板上孵育两小时，然后转移至SA-MTP。随后添加过氧化物酶缀合的多克隆抗DIG抗体和底物ABTS。在405nm处测量光密度(OD)(参考波长为490nm)。
不同形式的药物抗体
为了检查多价抗PG抗体的通用适用性，即它是否可以用作独立于药物抗体形式的阳性对照和校准标准品，测试了三种不同形式的药物抗体：非靶向IgG-IL2(融合至种系抗体重链的C-末端的白介素-2，该种系抗体不结合至靶标)、靶向IgG-IL2(融合至抗体重链的C-末端的白介素-2，该抗体特异性结合至治疗性靶标)和TCB(T细胞双特异性形式)。靶向IgG-IL2-BI和-DIG以及TCB-BI和-DIG的浓度均为0.5μg/mL。对于非靶向IgG-IL2，使用与上述池选择实例中使用的浓度相同的浓度(0.115μg/mL药物-BI和0.230μg/mL药物-DIG)。
将源自克隆1.7.24的多价抗PG抗体在人合并血清中按稀释系列1比2从10μg/mL稀释至0.6ng/mL。
因此，通过将12.5μL样品和237.5μL Drug-BI/Drug-DIG溶液添加到预孵育板中，用Drug-BI和Drug-DIG稀释源自克隆1.7.24的经稀释的多价抗PG抗体。孵育2小时后，将形成的复合物添加至SA-MTP，并如前所述进一步处理。
实例6
通过重组表达生成的根据本发明的多价抗体作为四价融合蛋白作为校准标准品的用途
在本实例中，使用了四价形式的抗PG抗体克隆1.7.24。该四价形式是通过将抗PG抗体克隆1.7.24的附加Fab融合至每个重链C-末端而获得的。
将变体Fc区-BI(生物素化变体Fc区片段)和变体Fc区-DIG(地高辛化变体Fc区片段)用作捕获分子和示踪分子。
结果在图10中示出。
实例7
通过重组表达生成的根据本发明的多价抗体作为IgM作为校准标准品的用途
在本实例中，使用了IgM形式的抗PG抗体。这种IgM形式是重组产生的。将IgM作为细胞培养物的未纯化上清液用于ELISA。将上清液在未稀释的情况下进行测试，并在缓冲液中按1:5连续稀释。
将变体Fc区-BI(生物素化变体Fc区片段)和以TCB形式的药物抗体(地高辛化药物抗体)用作捕获分子和示踪分子。
结果在图11和下表中示出。

Claims (15)

1.一种抗体，其包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的四个或六个结合位点。
2.一种抗体多聚体，其包含至少两个共价连接的
i)二价全长抗体，其各自包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的两个结合位点，
或
ii)二价全长抗体的(Fab')2片段，其各自包含特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的两个结合位点。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的抗体或抗体多聚体，其中特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的所述结合位点为特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据KabatEU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗体多聚体，其中所述结合位点中的每一个结合位点彼此独立地包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或
(4)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
或
(5)
(1)至(4)中任一者的混合物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗体多聚体，其中特异性结合至与人IgG1亚类的野生型Fc区相比包含一个、两个、三个或四个氨基酸改变的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的所述结合位点为特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸并且在位置234和235处包含氨基酸残基丙氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的结合位点。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的抗体多聚体，其中所述多聚体为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体多聚体作为体外(桥接)免疫测定中的阳性对照的用途。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体多聚体作为体外(桥接)免疫测定中的标准品的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述用途是用于生成用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体的校准函数，其中所述抗药物抗体结合至所述药物抗体的Fc区中的一个或多个氨基酸残基，所述Fc区与野生型Fc区相比是经改变的。
10.一种用于确定(含有血清的)样品中抗药物抗体的存在和/或量的免疫测定，
其中所述抗药物抗体结合至所述药物抗体的Fc区中的至少一个氨基酸残基，所述Fc区与野生型Fc区相比是经改变的，
其中所述免疫测定包含所述药物抗体作为捕获抗体和作为示踪抗体，
其特征在于，
根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体多聚体在所述免疫测定中用作阳性对照或用作校准标准品。
11.根据权利要求10所述的免疫测定，其中所述免疫测定为桥接ELISA。
12.根据权利要求10至11中任一项所述的免疫测定，其中根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗体多聚体被用作校准标准品并用于生成校准函数，所述校准函数用于定量确定针对药物抗体的抗药物抗体。
13.一种通过使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)通过化学缀合来生产根据权利要求2至6中任一项所述的抗体多聚体的方法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多聚体为全长抗体的多聚体。
15.一种生产抗体多聚体的方法，所述方法包括
对特异性结合至在位置329处包含氨基酸残基甘氨酸(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1亚类的免疫球蛋白Fc区的全长抗体进行化学交联，
其中所述抗体包含
(1)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:09的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
或
(2)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
或
(3)
(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；
(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；和
(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
所述化学交联使用N-琥珀酰亚氨基-3-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和马来酰亚氨基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MHS)进行。
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