JPWO2003085119A1 - 抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高める方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高める方法、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を高める方法、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高められた抗体組成物を製造する方法、抗体組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いて製造されたFc融合蛋白質組成物、およびその製造方法に関する。
背景技術
抗体は、高い結合活性、結合特異性および血中での高い安定性を有することから、ヒトの各種疾患の診断、予防および治療への応用が試みられてきた[モノクローナル・アンティボディズ:プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),Wiley−Liss,Inc.,Chapter 2.1(1995)]。また、遺伝子組換え技術を利用して、ヒト以外の動物の抗体からヒト型キメラ抗体或いはヒト型相補性決定領域(以下、CDRと表記する)移植抗体の様なヒト化抗体を作製することが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体V領域(以下、V領域と表記する)がヒト以外の動物の抗体で、定常領域(以下、C領域と表記する)がヒト抗体である抗体である。ヒト型CDR移植抗体とは、ヒト抗体のCDRをヒト以外の動物の抗体のCDRと置換した抗体である。
哺乳類の抗体には、IgM、IgD、IgG、IgA、IgEの5種類のクラスが存在することが明らかとなっているが、ヒトの各種疾患の診断、予防および治療には血中半減期が長く、各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒトIgGクラスの抗体が主として利用されている[モノクローナル・アンティボディズ:プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),Wiley−Liss,Inc.,Chapter 1(1995)]。ヒトIgGクラスの抗体は、更にIgG1、IgG2、IgG3、IgG4の4種類のサブクラスに分類されている。IgGクラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞障害活性(以下、ADCC活性と表記する)や補体依存性細胞障害活性(以下、CDC活性と表記する)については、これまでに多数の研究が行われ、ヒトIgGクラスでは、IgG1サブクラスの抗体が最も高いADCC活性、CDC活性を有していることが報告されている[ケミカル・イムノロジー(Chemical Immunology),65,88(1997)]。以上の観点から、市販のリツキサン、ハーセプチンを始めとして、その効果発現に高いエフェクター機能を必要とする抗腫瘍ヒト化抗体の殆どはヒトIgG1サブクラスの抗体である。
ヒトIgG1サブクラスの抗体のADCC活性およびCDC活性の発現には、抗体Fc領域と、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ等のエフェクター細胞表面上に存在する抗体レセプター(以下、FcγRと表記する)および各種補体成分との結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域およびC領域の第2番目のドメイン(以下、CH2ドメインと表記する)内のいくつかのアミノ酸残基の重要性[ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー(Eur.J.Immunol.),23,1098(1993)、イムノロジー(Immunology),86,319(1995)、ケミカル・イムノロジー(Chemical Immunology),65,88(1997)]の他、CH2ドメインに結合している糖鎖の重要性[ケミカル・イムノロジー(Chemical Immunology),65,88(1997)]が示唆されている。
糖鎖に関しては、ボイド(Boyd)らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞(以下、CHO細胞と表記する)或いはマウスミエローマNSO細胞(以下、NSO細胞と表記する)で生産したヒト型CDR移植抗体CAMPATH−1H(ヒトIgG1サブクラス)を各種糖分解酵素で処理し、糖鎖のADCC活性、CDC活性に対する影響を検討した結果、非還元末端のシアル酸の除去は、両活性に影響を与えないが、更にガラクトース残基を除去することでCDC活性のみが影響を受け、約50%程度活性が低下すること、糖鎖の完全な除去は、両活性を消失させることを報告した[モレキュラー・イムノロジー(Molecular Immunol.),32,1311(1995)]。また、ライフリー(Lifely)らは、CHO細胞、NSO細胞或いはラットミエローマY0細胞(以下、Y0細胞と表記する)で生産したヒト型CDR移植抗体CAMPATH−1H(ヒトIgG1サブクラス)の糖鎖の分析およびADCC活性を測定した結果、Y0細胞由来のCAMPATH−1Hが最も高いADCC活性を示し、その活性にはバイセクティングに位置するN−アセチルグルコサミン(以下、GlcNAcとも表記する)が重要であることを示唆した[グリコバイオロジー(Glycobiology),5,813(1995):WO99/54342]。これらの報告は、ヒトIgG1サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしており、糖鎖の構造を変えることでより高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能であることを示している。しかし、実際には糖鎖の構造は多様かつ複雑であり、エフェクター機能に真に重要な構造を特定できたとは言い難い。
以上のように、IgGクラスの抗体のCH2ドメインに結合している糖鎖は、抗体のエフェクター機能の発現に大きな影響を与える。先にも述べたように、抗体のエフェクター機能のいくつかは、エフェクター細胞表面上に存在するFcγRとの相互作用を介して発揮される[アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),18,709(2000)、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),19,275(2001)]。
FcγRは、3つの異なるクラスが存在することが明らかとなっており、それぞれFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)と呼ばれている。ヒトにおいては、FcγRIIとFcγRIIIは、さらに、FcγRIIa、FcγRIIbとFcγRIIIa、FcγRIIIbに分類される。FcγRは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する膜蛋白質であり、FcγRIIとFcγRIIIは、2つのイムノグロブリン様ドメイン、FcγRIは、3つのイムノグロブリン様ドメインからなる細胞外領域を持つα鎖を構成成分として持ち、α鎖がIgG結合活性を担っている。さらに、FcγRIとFcγRIIIは、α鎖と会合してシグナル伝達機能を有するγ鎖あるいはζ鎖を構成成分として有している[アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),18,709(2000)、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),19,275(2001)]。
FcγRIは、108〜109M−1の結合定数(以下、KAと表記する)を持つ高親和性受容体であり、単量体のIgGに対しても高い結合活性を有している[アナルズ・オブ・ヘマトロジー(Ann.Hematol.),76,231(1998)]。一方、FcγRIIとFcγRIIIは、単量体のIgGに対しては、105〜107M−1の低いKAを示す低親和性受容体であり、抗原などと結合して多量体化したIgG免疫複合体と効率的に結合する[アナルズ・オブ・ヘマトロジー(Ann.Hematol.),76,231(1998)]。FcγRは、その機能から、活性化受容体と抑制性受容体に分けられる[アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),19,275(2001)]。
活性化受容体は、α鎖あるいは会合するγ鎖、ζ鎖の細胞内領域にimmunoreceptor tyrosine−based activation motif(以下、ITAMと表記する)と呼ばれる19アミノ酸残基からなる配列が存在する。IgG免疫複合体の結合に伴ってITAMと相互作用するSrcやSykなどのチロシンキナーゼが活性化して、種々の活性化反応が惹起される。
抑制性受容体は、α鎖の細胞内領域にimmunoreceptor tyrosine−based inhibitory motif(以下、ITIMと表記する)と呼ばれる13アミノ酸残基からなる配列が存在する。活性化受容体との会合を介してITIMがリン酸化されることにより、SHIPと呼ばれるホスファターゼの活性化を始めとして種々の反応が惹起され、活性化受容体からの活性化シグナルを抑制する。
ヒトでは、高親和性のFcγRIおよび低親和性のFcγRIIa、FcγRIIIaは、活性化受容体として機能している。FcγRIは、会合しているγ鎖の細胞内領域にITAM配列が存在している。FcγRIは、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、好酸球などに発現している。FcγRIIaは、単一のα鎖からなり、細胞内領域にITAM様配列が存在している。FcγRIIaは、マクロファージ、マスト細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好中球、好酸球、血小板および一部のB細胞に発現している。FcγRIIIaは、会合しているγ鎖あるいはζ鎖の細胞内領域にITAM配列が存在し、NK細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好酸球などに発現しているが、好中球、B細胞およびT細胞には発現していない。
一方、低親和性受容体のFcγRIIbは、単一のα鎖からなり、細胞外領域のアミノ酸配列においてFcγRIIaと約90%の相同性を有する。しかしながら、細胞内領域にITIM配列が存在し、抑制性受容体として機能している。FcγRIIbは、B細胞、マクロファージ、マスト細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、好塩基球、好中球、好酸球に発現しているが、NK細胞やT細胞には発現していない。FcγRIIIbは、単一のα鎖からなり、細胞外領域のアミノ酸配列においてFcγRIIIaと約95%の相同性を有する。しかしながら、グリコシルホスファチジルイノシトール(以下、GPIと表記する)結合型の膜蛋白質として、好中球に特異的に発現している。FcγRIIIbは、IgG免疫複合体を結合するが、単独では細胞を活性化できず、FcγRIIaなどのITAM配列を有する受容体との会合を介して機能していると考えられている。このように、生体内におけるIgGクラスの抗体のエフェクター機能は、様々なエフェクター細胞上に発現している活性化および抑制性のFcγRとの複雑な相互作用の結果、発揮されている。
IgGクラスの抗体のエフェクター機能の1つであるADCC活性は、NK細胞、好中球、単球、マクロファージなどのエフェクター細胞の活性化の結果、生じると考えられており、中でもNK細胞が、主要な役割を果たしている[ブラッド(Blood),76,2421(1990)、トレンズ・イン・イムノロジー(Trends in Immunol.),22,633(2001)、インターナショナル・レビューズ・オブ・イムノロジー(Int.Rev.Immunol.),20,503(2001)]。
NK細胞上に発現しているFcγRは、FcγRIIIaである。したがって、NK細胞に発現しているFcγRIIIaからの活性化シグナルを増強させることにより、ADCC活性を高めることができると考えられている。
Fc融合蛋白質としては、Etanercept(商品名Enbrel、Immunex社製)(USP 5,605,690)、Alefacept(商品名Amevive、Biogen社製)(USP 5,914,111)などが知られている。また、抗体のCH2ドメインが存在しなければADCC活性を有しないことが知られている(J.Immunol.,152,2753(1994))。
発明の開示
本発明は、以下の(1)〜(48)に関する。
(1) 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖を修飾することを含む、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高める方法。
(2) 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖の修飾が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に結合させることである、(1)に記載の方法。
(3) 糖鎖が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞が合成する糖鎖であることを特徴とする、(1または2)に記載の方法。
(4) N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質が、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、(3)に記載の方法。
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する蛋白質;
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する蛋白質;
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
(5) 細胞が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、(3)または(4)に記載の方法。
(6) 細胞が、少なくとも、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、(3)〜(5)のいずれか1項に記載の方法。
(a)レンズマメレクチン;
(b)エンドウマメレクチン;
(c)ソラマメレクチン;
(d)ヒイロチャワンタケレクチン。
(7) 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、(3〜6のいずれか1項に記載の方法。
(8) 細胞が、以下の(a)〜(i)からなる群から選ばれる細胞である、(3)〜(7)のいずれか1項に記載の方法。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)マウスミエローマ細胞株NSO細胞
(e)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞
(f)ハイブリドーマ細胞;
(g)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(h)胚性幹細胞;
(i)受精卵細胞。
(9) 抗体分子が、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれる抗体分子である、(1)〜(8)のいずれか1項に記載の方法。
(a)ヒト抗体;
(b)ヒト化抗体;
(c)(a)または(b)のFc領域を含む抗体の断片;
(d)(a)または(b)のFc領域を有する融合蛋白質。
(10) 抗体分子のクラスがIgGである、(1)〜(9)のいずれか1項に記載の方法。
(11) 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖において、全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が20%以上である、(1)〜(10)のいずれか1項に記載の方法。
(12) (1)〜(11)のいずれか1項に記載の方法により、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を高める方法。
(13) 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖を修飾することを含む、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性が高められた抗体組成物を製造する方法。
(14) 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖の修飾が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に結合させることである、(13)に記載の方法。
(15) 糖鎖が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞が合成する糖鎖であることを特徴とする、(13)または(14)に記載の方法。
(16) N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質が、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、(15)に記載の方法。
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する蛋白質;
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する蛋白質;
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
(17) 細胞が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、(15)または(16)に記載の方法。
(18) 細胞が、少なくとも、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、(15)〜(17)のいずれか1項に記載の方法。
(a)レンズマメレクチン;
(b)エンドウマメレクチン;
(c)ソラマメレクチン;
(d)ヒイロチャワンタケレクチン。
(19) 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、(15)〜(18)のいずれか1項に記載の方法。
(20) 細胞が、以下の(a)〜(i)からなる群から選ばれる細胞である、(15)〜(19)のいずれか1項に記載の方法。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)マウスミエローマ細胞株NSO細胞
(e)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞
(f)ハイブリドーマ細胞;
(g)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(h)胚性幹細胞;
(i)受精卵細胞。
(21) 抗体分子が、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれる抗体分子である、(13)〜(20)のいずれか1項に記載の方法。
(a)ヒト抗体;
(b)ヒト化抗体;
(c)(a)または(b)のFc領域を含む抗体の断片;
(d)(a)または(b)のFc領域を有する融合蛋白質。
(22) 抗体分子のクラスがIgGである、(13〜21のいずれか1項に記載の方法。
(23) 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖において、全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が20%以上である、(13)〜(22)のいずれか1項に記載の方法。
(24) (12)の方法を含む、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を製造する方法。
(25) (13)〜(24)のいずれか1項に記載の製造方法により製造される抗体組成物。
(26) 抗原と被験抗体組成物とを反応させて抗原と抗体組成物の複合体を形成し、該複合体をFcγ受容体IIIaと接触させてFcγ受容体IIIaに対する結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物中の糖鎖の割合とFcγ受容体IIIaに対する結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法。
(27) 抗原と被験抗体組成物とを反応させたて抗原と抗体組成物の複合体を形成し、該複合体をFcγ受容体IIIaと接触させ、Fcγ受容体IIIaに対する結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性とFcγ受容体IIIaに対する結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を検出する方法。
(28) 被験抗体組成物とFcγ受容体IIIaとを接触させ、抗体組成物とFcγ受容体IIIaとの結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物中の糖鎖の割合とFcγ受容体IIIaとの結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法。
(29) 被験抗体組成物とFcγ受容体IIIaとを接触させ、抗体組成物とFcγ受容体IIIaとの結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性とFcγ受容体IIIaとの結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を検出する方法。
(30) N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いて製造されたFc融合蛋白質組成物。
(31) 細胞が、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、(30)に記載のFc融合蛋白質組成物。
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素蛋白質;
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質;
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。
(32) 細胞が、少なくとも、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、(30)または(31)記載のFc融合蛋白質組成物。
(a)レンズマメレクチン;
(b)エンドウマメレクチン;
(c)ソラマメレクチン;
(d)ヒイロチャワンタケレクチン。
(33) 細胞が、Fc融合蛋白質をコードする遺伝子を導入した細胞である、(30)〜(32)のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
(34) Fcが抗体分子のIgGクラス由来である、(33)に記載のFc融合蛋白質組成物。
(35) 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、(30)〜(34)のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
(36) 細胞が、マウスミエローマ細胞である、(30)〜(35)のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
(37) マウスミエローマ細胞が、NSO細胞またはSP2/0−Ag14細胞である(36)記載のFc融合蛋白質組成物。
(38) 細胞が、以下の(a)〜(g)からなる群から選ばれる細胞である、(30)〜(37)のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)抗体を生産するハイブリドーマ細胞;
(e)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(f)胚性幹細胞;
(g)受精卵細胞。
(39) N−グリコシド結合複合型糖鎖を抗体分子のFc領域に有するFc融合蛋白質からなる組成物であって、該組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が20%以上であるFc融合蛋白質組成物。
(40) フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの1位がN−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にα結合していない糖鎖である、(39)記載のFc融合蛋白質組成物。
(41) 抗体分子のクラスがIgGである、(39)または(40)記載のFc融合蛋白質組成物。
(42) Fc融合蛋白質組成物が、Fc融合繊維芽細胞増殖因子−8である(30)〜(41)のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
(43) (30)〜(42)のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物を生産する細胞。
(44) 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる、(43)記載の細胞。
(45) 細胞が、マウスミエローマ細胞である、(43)または(44)記載の細胞。
(46) マウスミエローマ細胞が、NSO細胞またはSP2/0−Ag14細胞である(45)記載の細胞。
(47) 細胞が、以下の(a)〜(g)からなる群から選ばれる細胞である、(43)〜(46)のいずれか1項に記載の細胞。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)抗体を生産するハイブリドーマ細胞;
(e)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(f)胚性幹細胞;
(g)受精卵細胞。
(48) (43)〜(47)のいずれか1項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中にFc融合蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物からFc融合蛋白質組成物を採取する工程を含む、Fc融合蛋白質組成物の製造方法。
本発明は、抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖を修飾することを含む、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高める方法に関する。
本発明において、抗体分子とは、抗体のFc領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Fc領域を有する融合蛋白質などをあげることができる。
抗体とは、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に産生される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものをいう。抗体としては動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたB細胞と、マウス等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖V領域(以下、重鎖はH鎖としてHVまたはVHとも表記する)および抗体軽鎖V領域(以下、軽鎖はL鎖としてLVまたはVLとも表記する)とヒト抗体のH鎖C領域(以下、CHとも表記する)およびヒト抗体の軽鎖C領域(以下、CLとも表記する)とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン(以下、hIgと表記する)に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列をヒト抗体のVHおよびVLの適切な位置に移植した抗体を意味する。
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDR配列を任意のヒト抗体のVHおよびVLのCDR配列に移植したV領域をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびヒト抗体のCLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するhIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型CDR移植抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物あるいはヒト抗体産生トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、ヒト抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中よりヒト抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、マウスES細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ES細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物としては、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはIgGであることが好ましい。
抗体の断片は、上記抗体の少なくともFc領域の一部を含んだ断片をいう。Fc領域とは、抗体のH鎖のC末端側の領域、CH2領域およびCH3領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともFc領域の一部とは、好ましくはCH2領域を含む断片、より好ましくはCH2領域内に存在する1番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。IgGクラスのFc領域は、カバット(Kabat)らのEU Index[シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins of Immunological Interest),5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)]のナンバリングで226番目のCysからC末端、あるいは230番目のProからC末端までを意味する。抗体の断片としては、H鎖の単量体、H鎖の2量体などがあげられる。
Fc領域の一部を有する融合蛋白質とは、抗体のFc領域の一部を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質(以下、Fc融合蛋白質と称す)を意味する。
本発明において、抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端側にガラクトース−N−アセチルグルコサミン(以下、Gal−GlcNAcと表記する)の枝を並行して1ないしは複数本有し、更にGal−GlcNAcの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのN−アセチルグルコサミンなどの構造を有する複合型をあげることができる。
抗体分子のFc領域には、N−グリコシド結合糖鎖がそれぞれ1箇所ずつ結合する領域を有しているので、抗体1分子あたり2本の糖鎖が結合している。抗体に結合する2本のN−グリコシド結合糖鎖には多数の構造の糖鎖が存在することになるので、Fc領域に結合した糖鎖構造の観点から抗体分子の同一性を判断することができる。
抗体組成物とは、N−グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる組成物であり、該組成物は、単一の糖鎖構造を有する抗体分子で構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖の修飾は、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に結合させることが好ましい。
本発明において、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースの1位が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にα結合していない糖鎖をいう。
該糖鎖は、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の修飾に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞により合成される。
本発明において、フコースの1位が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にα結合していない糖鎖の修飾に関与する酵素蛋白質としては、
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素蛋白質(以下、「GDP−フコース合成酵素」と表記する);
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質(以下、「α1,6−フコース修飾酵素」と表記する);
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質(以下、「GDP−フコース輸送蛋白質」と表記する)などがあげられる。
本発明において、GDP−フコース合成酵素とは、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含し、細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に影響を与える酵素のことをいう。
細胞内の糖ヌクレオチドGDP−フコースは、de novoの合成経路あるいはSalvage合成経路により供給されている。したがって、これら合成経路に関与する酵素はすべてGDP−フコース合成酵素に包含される。
de novoの合成経路に関与するGDP−フコース合成酵素としては、具体的には、GDP−mannose 4−dehydratase(GDP−マンノース4−デヒドラターゼ;以下、GMDと表記する)、GDP−keto−6−deoxymannose 3,5−epimerase,4−reductase(GDP−ケト−デオキシマンノース3,5−エピメラーゼ,4−リダクターゼ;以下、Fxと表記する)などがあげられる。
Salvage合成経路に関与するGDP−フコース合成酵素としては、具体的には、GDP−beta−L−fucose pyrophosphorylase(GDP−ベータ−L−フコース−ピロホスフォリラーゼ;以下、GFPPと表記する)、Fucokinase(フコキナーゼ)などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の細胞内の糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
GMDとしては、以下の(a)および(b)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質、以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号65で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号65で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGMD活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(c)配列番号71で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(d)配列番号71で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGMD活性を有する蛋白質;
(e)配列番号71で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGMD活性を有する蛋白質。
Fxとしては、以下の(a)および(b)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質、以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号48で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号48で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつFx活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(c)配列番号19で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(d)配列番号19で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつFx活性を有する蛋白質;
(e)配列番号19で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつFx活性を有する蛋白質。
GFPPとしては、以下の(a)および(b)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質、以下の(c)、(d)および(e)からなる群から選ばれる蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号51で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号51で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGFPP活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(c)配列番号20で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(d)配列番号20で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGFPP活性を有する蛋白質;
(e)配列番号20で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGFPP活性を有する蛋白質。
本発明において、α1,6−フコース修飾酵素とは、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合する反応に関与する酵素とは、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合する反応に影響を与える酵素を意味する。
α1,6−フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼやα−L−フコシダーゼなどがあげられる。
また、上述のN−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
α1,6−フコシルトランスフェラーゼとしては、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質、以下の(e)、(f)、(g)、(h)、(i)および(j)からなる群から選ばれる蛋白質などがあげられる。
(a)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA;
(c)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(e)配列番号23で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(f)配列番号24で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(g)配列番号23で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(h)配列番号24で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(i)配列番号23で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(j)配列番号24で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
GDP−フコース輸送蛋白質としては、細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質、または細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質であればいかなる蛋白質も包含される。
GDP−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、GDP−フコーストランスポーターなどがあげられる。
また、細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質としては、上述のGDP−フコース輸送蛋白質の活性に影響を与えたり、発現に影響を与える蛋白質も包含される。
本発明のGDP−フコーストランスポーターとしては、以下の(a)〜(h)からなる群から選ばれるDNAがコードする蛋白質があげられる。
(a)配列番号91で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号93で表される塩基配列からなるDNA;
(c)配列番号95で表される塩基配列からなるDNA;
(d)配列番号97で表される塩基配列からなるDNA;
(e)配列番号91で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(f)配列番号93で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(g)配列番号95で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするDNA;
(h)配列番号97で表される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質をコードするDNA。
さらに、本発明のGDP−フコーストランスポーターとしては、以下の(i)〜(t)からなる群から選ばれる蛋白質があげられる。
(i)配列番号92で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(j)配列番号94で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(k)配列番号96で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(l)配列番号98で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(m)配列番号92で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(n)配列番号94で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(o)配列番号96で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(p)配列番号98で表されるアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(q)配列番号92で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(r)配列番号94で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(s)配列番号96で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質;
(t)配列番号98で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとは、例えば配列番号1、2、48、51、65、91、93、95または97で表される塩基配列を有するDNAなどのDNAまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0mol/Lの塩化ナトリウム存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mmol/L塩化ナトリウム、15mmol/Lクエン酸ナトリウムよりなる)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989(以下、モレキュラー・クローニング第2版と略す)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1987−1997(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)、DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なDNAとして具体的には、配列番号1、2、48、51、65、91、93、95または97で表される塩基配列と少なくとも60%以上の相同性を有するDNA、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するDNAをあげることができる。
配列番号19、20、23、24、71、92、94、96または98で表されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性、GMD活性、Fx活性、GFPP活性またはGDP−フコーストランスポーター活性を有する蛋白質は、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号1、2、48、51または65で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換、挿入および/または付加されるアミノ酸の数は1個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、1〜数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
また、用いられる蛋白質が、α1,6−フコシルトランスフェラーゼ活性、GMD活性、Fx活性、GFPP活性またはGDP−フコーストランスポーター活性を有するためには、それぞれ配列番号19、20、23、24、71、92、94、96または98で表されるアミノ酸配列とBLAST[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),215,403(1990)]やFASTA[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),183,63(1990)]等の解析ソフトを用いて計算したときに、少なくとも80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上、最も好ましくは99%以上の相同性を有する。
上述の細胞を取得する方法としては、目的とする酵素活性を低下または欠失させることができる手法であれば、いずれの手法でも用いることができる。上述の酵素活性を低下または欠失させる手法としては、
(a)酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法;
(b)酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法;
(c)酵素についての突然変異を導入する手法;
(d)酵素の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法;などがあげられる。
また、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を選択する方法もあげられる。
レクチン耐性を有する細胞は、細胞培養時に一定の有効濃度のレクチンが存在しても、生育が阻害されない。
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常10μg/ml〜10.0mg/ml、好ましくは0.5〜2.0mg/mlである。親株細胞に変異を導入した場合のレクチンの有効濃度とは、親株細胞が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは2〜5倍、さらに好ましくは10倍、最も好ましくは20倍以上である。
N−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA(Lens Culinaris由来のLentil Agglutinin)、エンドウマメレクチンPSA(Pisum sativum由来のPea Lectin)、ソラマメレクチンVFA(Vicia faba由来のAgglutinin)、ヒイロチャワンタケレクチンAAL(Aleuria aurantia由来のLectin)等をあげることができる。
親株細胞とは、何らかの処理を施す前の細胞、すなわち本発明で用いるレクチンに耐性を有する細胞を選択する工程を行う前の細胞、上述した酵素活性を低下または欠失するために遺伝子工学的な処理を行う前の細胞をいう。
親株細胞としては、特に限定はないが、具体例としては、以下の細胞があげられる。
NSO細胞の親株細胞としては、バイオ/テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY),10,169(1992)、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.),73,261(2001)等の文献に記載されているNSO細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているNSO細胞株(RCB0213)、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
SP2/0−Ag14細胞の親株細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー(J.Immunol.),126,317,(1981)、ネイチャー(Nature),276,269,(1978)、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ(Human Antibodies and Hybridomas),3,129,(1992)等の文献に記載されているSP2/0−Ag14細胞があげられる。また、ATCCに登録されているSP2/0−Ag14細胞(ATCC CRL−1581)あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株(ATCC CRL−1581.1)などもあげられる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞の親株細胞としては、Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)、Genetics,55,513(1968)、Chromosoma,41,129(1973)、Methods in Cell Science,18,115(1996)、Radiation Research,148,260(1997)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)、Proc.Natl.Acad.Sci.60,1275(1968)、Cell,6,121(1975)、Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(p.883−900)等の文献に記載されているCHO細胞などがあげられる。また、ATCCに登録されているCHO−K1株(ATCC CCL−61)、DUXB11株(ATCC CRL−9096)、Pro−5株(ATCC CRL−1781)や、市販のCHO−S株(Lifetechnologies社Cat#11619)、あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞の親株細胞としては、Y3/Ag1.2.3細胞(ATCC CRL−1631)から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、J.Cell.Biol.93,576(1982)、Methods Enzymol.73B,1(1981)等の文献に記載されているYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞があげられる。また、ATCCに登録されているYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL−1662)あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
本発明において、FcγRとは、IgGクラスの抗体に対するFc受容体(以下、FcRとも表記する)をいう。FcRとは、抗体のFc領域に結合する受容体を意味する[アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),9,457(1991)]。FcγRには、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIサブクラスおよびそれらの対立遺伝子変異体およびオルターナティブスプライシングによって生じるアイソフォームも包含される。さらに、FcγRIIは、FcγRIIaおよびFcγRIIbを、FcγRIIIは、FcγRIIIaおよびFcγRIIIbを包含する[アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー(Annu.Rev.Immunol.),9,457(1991)]。
Fc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、好ましくは20%以上、より好ましくは30%以上、さらに好ましくは40%以上、特に好ましくは50%以上、最も好ましくは100%となるように糖鎖を抗体分子のFc領域に結合させることによりFcγRIIIaに対する結合活性を高めることができる。
Fc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるFc領域に結合する全てのN−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。また、糖鎖の割合は、好ましくは、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合をいう。
N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。好ましくは、フコースの1位がN−グリコシド結合複合型糖鎖のN−アセチルグルコサミンの6位にα結合していない糖鎖があげられる。
N−グリコシド結合複合型糖鎖をFc領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法[生物化学実験法23−糖タンパク質糖鎖研究法(学会出版センター)高橋禮子編(1989)]を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をHPAED−PAD法[ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー(J.Liq.Chromatogr.),6,1577(1983)]によって分析することによっても決定することができる。本発明の方法により、FcγRIIIaに対する結合活性が高められた抗体組成物は、高いADCC活性を有する。
本発明において、ADCC活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Fc領域とエフェクター細胞表面上に存在するFcRとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう[モノクローナル・アンティボディズ:プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),Wiley−Liss,Inc.,Capter 2.1(1995)]。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ等があげられる。
以下、本発明の方法に用いられる、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した宿主細胞の製造方法について詳細に説明する。
1.本発明の方法に用いられる宿主細胞の作製
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
(1)酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。GDP−フコース合成酵素としては、具体的には、GMD、Fx、GFPP、Fucokinaseなどがあげられる。α1,6−フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼ、α−L−フコシダーゼなどがあげられる。GDP−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、GDP−フコーストランスポーターなどがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、DNAまたはRNAを含む。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、アンチセンス法、リボザイム法、相同組換え法、RNA−DNA oligonucleotide(RDO)法、RNA interference(RNAi)法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
(a)アンチセンス法またはリボザイム法による本発明の方法に用いられる宿主細胞の作製
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質遺伝子を標的とし、細胞工学,12,239(1993)、バイオ/テクノロジー(BIO/TECHNOLOGY),17,1097(1999)、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス(Hum.Mol.Genet.),5,1083(1995)、細胞工学,13,255(1994)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),96,1886(1999)等に記載されたアンチセンス法またはリボザイム法を用いて、例えば、以下のように作製することができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードするcDNAあるいはゲノムDNAを調製する。
調製したあるいはゲノムDNAの塩基配列を決定する。
決定したDNAの配列に基づき、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードするDNA部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボザイムのコンストラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、またはリボザイムを細胞内で発現させるために、調製したDNAの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の方法に用いられる宿主細胞を得ることができる。また、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することにより、本発明の方法に用いられる宿主細胞を得ることもできる。
本発明の方法に用いられる宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、標的とするGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の3項に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したアンチセンス遺伝子、またはリボザイムを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の3項に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、後述の3項に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、文献[新生化学実験講座3−糖質I,糖タンパク質(東京化学同人)日本生化学会編(1988)]、文献[細胞工学,別冊,実験プロトコールシリーズ,グライコバイオロジー実験プロトコール,糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン(秀潤社)谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修(1996)]、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のmRNA量を測定するノーザン解析やRT−PCR法等があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の1の(5)項に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の6項または後述の7項に記載の方法があげられる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードするcDNAを調製する方法としては、以下に記載の方法があげられる。
DNAの調製方法
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全RNAまたはmRNAを調製する。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞のmRNAは市販のもの(例えばClontech社製)を用いても良いし、以下の如くヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から調製しても良い。ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),154,3(1987)]、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム(AGPC)法[アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry),162,156(1987);実験医学、9,1937(1991)]などがあげられる。
また、全RNAからpoly(A)+RNAとしてmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(モレキュラー・クローニング第2版)等があげられる。
さらに、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)などのキットを用いることによりmRNAを調製することができる。
調製したヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞全RNAまたはmRNAからcDNAライブラリーを作製する。
cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies社製)、ZAP−cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE社製)を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express[STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies),5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research),17,9494(1989)]、Lambda ZAP II(STRATAGENE社製)、λgt10、λgt11[ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ(DNA cloning,A Practical Approach),1,49(1985)]、λTriplEx(Clontech社製)、λExCell(Pharmacia社製)、pT7T318U(Pharmacia社製)、pcD2[モレキュラー・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),3,280(1983)]およびpUC18[ジーン(Gene),33,103(1985)]等をあげることができる。
cDNAライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Escherichia coli XL1−Blue MRF’[STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies),5,81(1992)]、Escherichia coli C600[ジェネティクス(Genetics),39,440(1954)]、Escherichia coli Y1088[サイエンス(Science),222,778(1983)]、Escherichia coli Y1090[サイエンス(Science),222,778(1983)]、Escherichia coli NM522[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),166,1(1983)]、Escherichia coli K802[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),16,118(1966)]およびEscherichia coli JM105[ジーン(Gene),38,275(1985)]等が用いられる。
このcDNAライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長cDNAの割合を下げ、なるべく完全長cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法[ジーン(Gene),138,171(1994);ジーン(Gene),200,149(1997);蛋白質核酸酵素,41,603(1996);実験医学,11,2491(1993);cDNAクローニング(羊土社)(1996);遺伝子ライブラリーの作製法(羊土社)(1994)]を用いて調製したcDNAライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の5’端および3’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法[ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols),Academic Press(1990)]を用いてDNAの増幅を行うことにより、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードするDNAであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),74,5463(1977)]あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をDNAをプローブとして、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるmRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション(モレキュラー・クローニング第2版)を行うことにより、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のDNAを取得することができる。
また、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれるmRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法を用いてスクリーニングを行うことにより、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のDNAを取得することもできる。
取得したGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードするDNAの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),74,5463(1977)]あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定する。
決定したcDNAの塩基配列をもとに、BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、Genbank、EMBLおよびDDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるGDP−フコース合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号48、51または65に記載の塩基配列があげられる。α1,6−フコース修飾酵素をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号1または2に記載の塩基配列があげられる。GDP−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号91、93、95または97記載の塩基配列があげられる。
決定されたDNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のDNA合成機Model 392等のDNA合成機で化学合成することにより、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のcDNAを取得することもできる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のゲノムDNAは、例えば、モレキュラー・クローニング第2版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム(Genome Systems社製)やUniversal GenomeWalkerTM Kits(CLONTECH社製)などを用いることにより、調製することができる。
上記の方法で得られるGDP−フコース合成酵素のゲノムDNAの塩基配列として、例えば配列番号67または70に記載の塩基配列があげられる。α1,6−フコース修飾酵素のゲノムDNAの塩基配列として、例えば配列番号3に記載の塩基配列があげられる。GDP−フコース輸送蛋白質のゲノムDNAの塩基配列として、例えば配列番号99または100に記載の塩基配列があげられる。
また、発現ベクターを用いず、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の方法に用いられる宿主細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムは、常法またはDNA合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードするcDNAおよびゲノムDNAの塩基配列のうち、連続した5〜150塩基、好ましくは5〜60塩基、より好ましくは5〜40塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド)または該オリゴヌクレオチドの配列を含むリボザイムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴRNAおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体(以下、オリゴヌクレオチド誘導体という)等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン(phenoxazine−modified cytosine)で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる[細胞工学,16,1463(1997)]。
(b)相同組換え法による本発明の方法に用いられる宿主細胞の作製
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)(以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す)、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング,ES細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社(1995)(以下、「ES細胞を用いた変異マウスの作製」と略す)等に記載の方法を用い、例えば以下のように行うことができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のゲノムDNAを調製する。
ゲノムDNAの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子(例えば、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子)を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の方法に用いられる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の3項に記載の宿主細胞があげられる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のゲノムDNAを調製する方法としては、上記1の(1)項の(a)に記載のゲノムDNAの調製方法などがあげられる。
上記の方法で得られるGDP−フコース合成酵素のゲノムDNAの塩基配列として、例えば配列番号67または70に記載の塩基配列があげられる。α1,6−フコース修飾酵素のゲノムDNAの塩基配列として、例えば配列番号3に記載の塩基配列があげられる。GDP−フコース輸送蛋白質のゲノムDNAの塩基配列として、例えば配列番号99または100に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の3項に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリA選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法(モレキュラー・クローニング第2版)やPCR法[ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols),Academic Press(1990)]等があげられる。
(c)RDO方法による本発明の細胞の作製
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、RDO法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のcDNAあるいはゲノムDNAを調製する。
調製したcDNAあるいはゲノムDNAの塩基配列を決定する。
決定したDNAの配列に基づき、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのRDOのコンストラクトを設計し合成する。
合成したRDOを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の方法に用いられる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の3項に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのRDOの導入には、後述の3項に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のcDNAを調製する方法としては、例えば、上記1の(1)項の(a)に記載のDNAの調製方法などがあげられる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のゲノムDNAを調製する方法としては、例えば、上記1の(1)項の(a)に記載のゲノムDNAの調製方法などがあげられる。
DNAの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(−)(Stratagene社製)等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー(Sanger)らのジデオキシ法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),74,5463(1977)]あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定する。
RDOは、常法またはDNA合成機を用いることにより調製することができる。
RDOを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子に変異が生じた形質転換体を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、前記1の(1)項の(a)に記載の、導入したGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、後述の1の(5)項に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法、あるいは、後述の6項または後述の7項に記載の産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法も用いることができる。
RDOのコンストラクトは、サイエンス(Science),273,1386(1996);ネイチャー・メディシン(Nature Medicine),4,285(1998);ヘパトロジー(Hepatology),25,1462(1997);ジーン・セラピー(Gene Therapy),5,1960(1999);ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン(J.Mol.Med.),75,829(1997);プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96,8774(1999);プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96,8768(1999);ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nuc.Acids.Res.),27,1323(1999);インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー(Invest.Dematol.),111,1172(1998);ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.),16,1343(1998);ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.),18,43(2000);ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotech.),18,555(2000)等の記載に従って設計することができる。
(d)RNAi方法による本発明の方法に用いられる宿主細胞の作製
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、RNAi法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のcDNAを調製する。
調製したcDNAの塩基配列を決定する。
決定したDNAの配列に基づき、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのRNAi遺伝子のコンストラクトを設計する。
該RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したDNAの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入したGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の方法に用いられる宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の3項に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したRNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の3項に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の3項に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記1の(1)項の(a)に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の1の(5)項に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の6項または後述の7項に記載の方法があげられる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のcDNAを調製する方法としては、例えば、前記1の(1)項の(a)に記載されたDNAの調製方法などがあげられる。
また、発現ベクターを用いず、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したRNAi遺伝子を、直接宿主細胞に導入することで、本発明の方法に用いられる宿主細胞を得ることもできる。
RNAi遺伝子は、常法またはDNA合成機を用いることにより調製することができる。
RNAi遺伝子のコンストラクトは、[ネイチャー(Nature),391,806(1998);プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),95,15502(1998);ネイチャー(Nature),395,854(1998);プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96,5049(1999);セル(Cell),95,1017(1998);プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96,1451(1999);プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),95,13959(1998);ネイチャー・セル・バイオロジー(Nature Cell Biol.),2,70(2000)]等の記載に従って設計することができる。
(e)トランスポゾンを用いた方法による、本発明の方法に用いられる宿主細胞の作製
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、ネイチャー・ジェネティク(Nature Genet.),25,35(2000)等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の方法に用いられる宿主細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、宿主細胞のDNAに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の3項に記載の宿主細胞があげられる。各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の3項に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、前記1の(1)項の(a)に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述の1の(5)項に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、後述の6項または後述の7項に記載の方法があげられる。
(2)酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、該酵素のドミナントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。GDP−フコース合成酵素としては、具体的には、GMD、Fx、GFPP、Fucokinaseなどがあげられる。α1,6−フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼ、α−L−フコシダーゼなどがあげられる。GDP−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、GDP−フコーストランスポーターなどがあげられる。
これらの酵素は、基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊することで、これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。標的とする酵素のうち、GMDを例として、そのドミナントネガティブ体に作製について具体的に以下に述べる。
大腸菌由来のGMDの立体構造を解析した結果、4つのアミノ酸(133番目のトレオニン、135番目のグルタミン酸、157番目のチロシン、161番目のリジン)が酵素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている[ストラクチャー(Structure),8,2(2000)]。すなわち、立体構造の情報にもとづきこれら4つのアミノ酸を異なる他のアミノ酸に置換した変異体を作製した結果、いずれの変異体においても有意に酵素活性が低下していたことが示されている。一方、GMDの補酵素NADPや基質であるGDP−マンノースとの結合能に関しては、いずれの変異体においてもほとんど変化が観察されていない。従って、GMDの酵素活性を担うこれら4つのアミノ酸を置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。大腸菌由来のGMDの結果に基づき、アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造予測を行うことにより、例えば、CHO細胞由来のGMD(配列番号65)では、155番目のトレオニン、157番目のグルタミン酸、179番目のチロシン、183番目のリジンを他のアミノ酸に置換することによりドミナントネガティブ体を作製することができる。このようなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を用い、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第2版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、例えば、以下のように作製することができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子(以下、ドミナントネガティブ体遺伝子と略記する)を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長DNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。
該DNA断片、または全長DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を得る。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の方法に用いられる宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の3項に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、目的とするドミナントネガティブ体をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、後述の3項に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の3項に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、前記1の(1)項の(a)に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の1の(5)項に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、後述の6項または後述の7項に記載の方法があげられる。
(3)酵素に突然変異を導入する手法
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。
GDP−フコース合成酵素としては、GMD、Fx、GFPP、Fucokinaseなどがあげられる。α1,6−フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼ、α−L−フコシダーゼなどがあげられる。GDP−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、GDP−フコーストランスポーターなどがあげられる。
酵素に突然変異を導入する方法としては、1)突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を指標として所望の細胞株を選択する方法、2)突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、3)突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のDNAに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。
具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術 第3版(朝倉書店)日本組織培養学会編(1996)、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genet.),24,314(2000)等に記載の方法をあげることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体をあげることができる。
GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性を測定する方法としては、例えば、前記1の(1)項の(a)に記載の方法があげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の6項または後述の7項に記載の方法があげられる。細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、例えば、後述の1の(5)項に記載の方法があげられる。
(4)酵素の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、アンチセンスRNA/DNA技術[バイオサイエンスとインダストリー,50,322(1992)、化学,46,681(1991)、Biotechnology,9,358(1992)、Trends in Biotechnology,10,87(1992)、Trends in Biotechnology,10,152(1992)、細胞工学,16,1463(1997)]、トリプル・ヘリックス技術[Trends in Biotechnology,10,132(1992)]等を用い、標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
GDP−フコース合成酵素としては、具体的には、GMD、Fx、GFPP、Fucokinaseなどがあげられる。α1,6−フコース修飾酵素としては、具体的には、α1,6−フコシルトランスフェラーゼ、α−L−フコシダーゼなどがあげられる。GDP−フコース輸送蛋白質としては、具体的には、GDP−フコーストランスポーターなどがあげられる。
(5)N−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法
本発明の方法に用いられる宿主細胞は、N−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
N−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法としては、例えば、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス(Somatic Cell Mol.Genet.),12,51(1986)等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、N−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA(Lens Culinaris由来のLentil Agglutinin)エンドウマメレクチンPSA(Pisum sativum由来のPea Lectin)、ソラマメレクチンVFA(Vicia faba由来のAgglutinin)、ヒイロチャワンタケレクチンAAL(Aleuria aurantia由来のLectin)等をあげることができる。
具体的には、1μg/mL〜1mg/mLの濃度の上述のレクチンを含む培地で1日〜2週間、好ましくは1日〜1週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることによって、本発明のN−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択することができる。
レクチン耐性細胞であることを確認する方法としては、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素またはGDP−フコース輸送蛋白質の発現を確認する方法、直接レクチンを加えた培地に細胞を培養する方法などがあげられる。具体的には細胞内のα1,6−フコース修飾酵素の一つであるα1,6−フコシルトランスフェラーゼのmRNAの発現量を測定し、mRNAの発現が低下していればレクチン耐性の細胞であるといえる。
2.トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明の方法に用いられる細胞は、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素蛋白質およびGDP−フコース輸送蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質の少なくとも1つ以上の蛋白質の活性が低下または欠失するようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫を用いて、製造することができる。トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、上述の蛋白質の遺伝子を標的として、1.に記載の手法と同様の手法を用いて作製することができる。
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、前記1項に記載の手法と同様の手法を用いることにより、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失された本発明の方法に用いられる胚性幹細胞を作製することができる。
具体的は、染色体上のGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素またはGDP−フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法[例えば、Nature,326,6110(1987)、Cell,51,503(1987)等]により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作製する。作製した該変異クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞(Blastocyst)への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞でGDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失されたトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),84,7413(1987)]、インジェクション法(マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第2版)、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(日本特許第2606856、日本特許第2517813)、DEAE−デキストラン法[バイオマニュアルシリーズ4−遺伝子導入と発現・解析法(羊土社)横田崇・新井賢一編(1994)]、ウイルスベクター法(マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第2版)等をあげることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Gene Targeting,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press(1993)、ES細胞を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリA選択などの方法を用いることができる。具体的には、hprt遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、hprt遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、hprt遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞をG418を含む培地で培養し、G418耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。DT遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターを導入した胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別する(相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、DT遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、DTの毒性により生育できない)ことにより、DT遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法(モレキュラー・クローニング第2版)やPCR法[ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols),Academic Press(1990)]等があげられる。
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に8細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。胚性幹細胞を注入キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、一般に8細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン(以下、LHRHと略する)あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。LHRHの類縁体としては、例えば[3,5−Dil−Tyr5]−LHRH、[Gln8]−LHRH、[D−Ala6]−LHRH、des−Gly10−[D−His(Bzl)6]−LHRH ethylamide等があげられる。
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、前記1項に記載の手法と同様の手法を用いることにより、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失された本発明の受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第2版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルスまたは細胞に、前記1項に記載の手法と同様の手法を用いることにより、GDP−フコース合成酵素の活性またはN−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位あるいは3位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または欠失した本発明のカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法[組織培養,20(1994);組織培養,21(1995);トレンド・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology),15,45(1997)]に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、GDP−フコース合成酵素、α1,6−フコース修飾酵素、またはGDP−フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジェニック植物を作製することができる。
3.抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988(以下、アンチボディズと略す)、Monoclonal Antibodies:principles and practice,Third Edition,Acad.Press,1996(以下、モノクローナル・アンチボディズと略す)、Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,1996(以下、アンチボディエンジニアリングと略す)等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子の全長cDNAを調製し、該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。
該DNA断片、または全長cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を、遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
CDNAは、上記1の(1)項の(a)に記載のDNAの調製方法に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[メソッズ・エンザイモロジー(Methods.Enzymol.),194,182(1990)]、スフェロプラスト法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A),84,1929(1978)]、酢酸リチウム法[ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriology),153,163(1983)]、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A),75,1929(1978)]に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社製)、pAGE107[特開平3−22979;サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、pAS3−3(特開平2−227075)、pCDM8[ネイチャー(Nature),329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochemistry),101,1307(1987)]、pAGE210等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ(Namalwa)細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637(特開昭63−299)、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),84,7413(1987)]、インジェクション法[マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル]、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(日本特許第2606856、日本特許第2517813)、DEAE−デキストラン法[バイオマニュアルシリーズ4−遺伝子導入と発現・解析法(羊土社)横田崇・新井賢一編(1994)]、ウイルスベクター法(マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第2版)等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6,47(1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(ともにInvitorogen社製)等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21[カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーBaculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)]、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh 5(Invitrogen社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),84,7413(1987)]等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Tiプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いる方法(特開昭59−140885、特開昭60−70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法(特開昭60−251887)、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(日本特許第2606856、日本特許第2517813)等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Fc領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持する。pHの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション(The Journal of the American Medical Association),199,519(1967)]、EagleのMEM培地[サイエンス(Science),122,501(1952)]、ダルベッコ改変MEM培地邊[ヴュロロジー(Virology),8,396(1959)]、199培地[プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73,1(1950)]、Whitten培地[発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方(講談社)勝木元也編(1987)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6.0〜8.0、30〜40℃、5%CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM−FH培地(Pharmingen社製)、Sf−900 II SFM培地(Life Technologies社製)、ExCell400、ExCell405(いずれもJRH Biosciences社製)、Grace’s Insect Medium[ネイチャー(Nature),195,788(1962)]等を用いることができる。
培養は、通常pH6.0〜7.0、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH5.0〜9.0、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.),264,17619(1989)]、ロウらの方法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),86,8227(1989);ジーン・デベロップメント(Genes Develop.),4,1288(1990)]、または特開平5−336963、特開平6−823021等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするDNA、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするDNAを挿入し、該発現ベクターを発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2−227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体(トランスジェニック非ヒト動物)または植物個体(トランスジェニック植物)を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法[アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition),63,639S(1996);アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition),63,627S(1996);バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),9,830(1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク(特開昭63−309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするDNAを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養,20(1994);組織培養,21(1995);トレンド・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology),15,45(1997)]に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、DEAE−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化学(株)製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のFc領域の一部を有する融合蛋白質などをあげることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の組成物およびFc融合蛋白質の製造方法について記すが、他の抗体組成物を当該方法と同様にして取得することもできる。
A.ヒト化抗体組成物の製造
(1)ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のC領域としては、任意のヒト抗体のCHおよびCLであることができ、例えば、ヒト抗体のH鎖のIgG1サブクラスのC領域(以下、hCγ1と表記する)およびヒト抗体のL鎖のκクラスのC領域(以下、hCκと表記する)等があげられる。
ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、pAGE103[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),101,1307(1987)]、pHSG274[ジーン(Gene),27,223(1984)]、pKCR[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),78,1527(1981)]、pSG1 β d2−4[サイトテクノロジー(Cytotechnology),4,173(1990)]等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),101,1307(1987)]、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR[バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem.Biophys.Res.Commun.),149,960(1987)]、免疫グロブリンH鎖のプロモーター[セル(Cell),41,479(1985)]とエンハンサー[セル(Cell),33,717(1983)]等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体H鎖およびL鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ(以下、タンデム型と表記する)のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods),167,271(1994)]。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
(2)ヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のC領域部分或いはV領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびVLをコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymol.),154,3(1987)]、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(モレキュラー・クローニング第2版)等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)等があげられる。
cDNAの合成およびcDNAライブラリー作製法としては、常法(モレキュラー・クローニング第2版);カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー,Supplement 1−34]、或いは市販のキット、例えば、Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL社製)やZAP−cDNA Synthesis Kit(Stratagene社製)を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express[ストラテジーズ(Strategies),5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),17,9494(1989)]、λzap II(Stratagene社製)、λgt10、λgt11[ディーエヌエー・クローニング:ア・プラクティカル・アプローチ(DNA Cloning:A Practical Approach),I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech社製)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia社製)、pcD2[モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),3,280(1983)]およびpUC18[ジーン(Gene),33,103(1985)]等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1−Blue MRF’[ストラテジーズ(Strategies),5,81(1992)]、C600[ジェネティックス(Genetics),39,440(1954)]、Y1088、Y1090[サイエンス(Science),222,778(1983)]、NM522[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),166,1(1983)]、K802[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),16,118(1966)]およびJM105[ジーン(Gene),38,275(1985)]等が用いられる。
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法(モレキュラー・クローニング第2版)により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction[以下、PCR法と表記する;モレキュラー・クローニング第2版;カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー,Supplement 1−34]によりVHおよびVLをコードするcDNAを調製することもできる。
上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(−)(Stratagene社製)等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),74,5463(1977)]あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列[シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト(Sequences of Proteins of Immunological Interest),US Dept.Health and Human Services(1991)、以下、シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレストと略す]と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
(3)ヒト以外の動物の抗体のV領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列(シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト)と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびN末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、VHおよびVLの各CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列(シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト)と比較することによって見出すことができる。
(4)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
前記3の(1)項に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体VHおよびVLの3’末端側の塩基配列とヒト抗体のCHおよびCLの5’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAとそれぞれ連結し、それぞれを前記3の(1)項に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
(5)ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRを移植するヒト抗体のVHおよびVLのフレームワーク(以下、FRと表記する)のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列(シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト)等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性(少なくとも60%以上)を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度(シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト)を考慮してDNA配列に変換し、ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列を設計する。設計したDNA配列に基づき、100塩基前後の長さから成る数本の合成DNAを合成し、それらを用いてPCR法を行う。この場合、PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから、H鎖、L鎖とも6本の合成DNAを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、前記3の(1)項で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。PCR後、増幅産物をpBluescript SK(−)(Stratagene社製)等のプラスミドにクローニングし、前記3の(2)項に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードするDNA配列を有するプラスミドを取得する。
(6)ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
前記3の(1)項に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、前記3の(5)項で構築したヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、前記3の(5)項でヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、前記3の(1)項に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
(7)ヒト化抗体の安定的生産
前記3の(4)項および(6)項に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体(以下、併せてヒト化抗体と表記する)を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法[特開平2−257891;サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるNSO細胞、SP2/0細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO/dhfr−細胞、CHO/DG44細胞、ラットミエローマYB2/0細胞、IR983F細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるBHK細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるCHO/DG44細胞、ラットミエローマYB2/0細胞、前記1項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平2−257891に開示されている方法に従い、G418 sulfate(以下、G418と表記する;SIGMA社製)等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地(日水製薬社製)、GIT培地(日本製薬社製)、EX−CELL302培地(JRH社製)、IMDM培地(GIBCO BRL社製)、Hybridoma−SFM培地(GIBCO BRL社製)、またはこれら培地に牛胎児血清(以下、FBSとも表記する)等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法(以下、ELISA法と表記する;アンティボディズ,Chapter 14、モノクローナル・アンティボディズ)等により測定できる。また、形質転換株は、特開平2−257891に開示されている方法に従い、dhfr遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる(アンティボディズ,Chapter 8、モノクローナル・アンティボディズ)。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のH鎖、L鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動[以下、SDS−PAGEと表記する;ネイチャー(Nature),227,680(1970)]やウエスタンブロッティング法[アンティボディズ,Chapter 12、モノクローナル・アンティボディズ]等で測定することができる。
B.Fc融合蛋白質の製造
(1)Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築
Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のFc領域としては、CH2とCH3領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、CH1の一部が含まれるものも包含される。またCH2またはCH3の少なくとも1つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にFcγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体DNAを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。それら遺伝子とFc領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、PCR法(レキュラー・クローニング第2版;カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー,Supplement 1−34)を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、pAGE103[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),101,1307(1987)]、pHSG274[ジーン(Gene),27,223(1984)]、pKCR[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),78,1527(1981)]、pSG1 β d2−4[サイトテクノロジー(Cytotechnology),4,173(1990)]等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),101,1307(1987)]、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR[バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem.Biophys.Res.Commun.),149,960(1987)]、免疫グロブリンH鎖のプロモーター[セル(Cell),41,479(1985)]とエンハンサー[セル(Cell),33,717(1983)]等があげられる。
(2)ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードするDNAの取得
ヒト抗体のFc領域と融合させる蛋白質とをコードするDNAは以下のようにして取得することができる。
目的のFcと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymol.),154,3(1987)]、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(モレキュラー・クローニング第2版)等があげられる。また、細胞や組織からmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)等があげられる。
cDNAの合成及びcDNAライブラリー作製法としては、常法(モレキュラー・クローニング第2版;カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー,Supplement 1−34)、或いは市販のキット、例えば、Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(GIBCO BRL社製)やZAP−cDNASynthesis Kit(Stratagene社製)を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express[ストラテジーズ(Strategies),5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),17,9494(1989)]、λzapII(Stratagene社製)、λgt10、λgt11[ディーエヌエー・クローニング:ア・プラクティカル・アプローチ(DNA Cloning:A Practical Approach),I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech社製)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia社製)、pcD2[モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),3,280(1983)]及びpUC18[ジーン(Gene),33,103(1985)]等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1−Blue MRF’[ストラテジーズ(Strategies),5,81(1992)]、C600[ジェネティックス(Genetics),39,440(1954)]、Y1088、Y1090[サイエンス(Science),222,778(1983)]、NM522[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),166,1(1983)]、K802[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),16,118(1966)]及びJM105[ジーン(Gene),38,275(1985)]等が用いられる。
cDNAライブラリーからの目的の蛋白質をコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法(モレキュラー・クローニング第2版)により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法により目的の蛋白質をコードするcDNAを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のFc領域と融合させる方法としては、PCR法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の5’側と3’側に任意の合成オリゴDNA(プライマー)を設定し、PCR法を行いPCR産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のFc領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、PCR産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のPCR産物の3’側とFc領域のPCR産物の5’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた2種類のPCR断片を用いてさらにPCRを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、pBluescript SK(−)(Stratagene社製)等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),74,5463(1977)]あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からFc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含むFc融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
(3)Fc融合蛋白質の安定的生産
前記の(1)項に記載のFc融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりFc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのFc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法[特開平2−257891;サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Fc融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるNSO細胞、SP2/0細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO/dhfr−細胞、CHO/DG44細胞、ラットミエローマYB2/0細胞、IR983F細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるBHK細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるCHO/DG44細胞、ラットミエローマYB2/0細胞、前記1項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平2−257891に開示されている方法に従い、G418等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地(日水製薬社製)、GIT培地(日本製薬社製)、EX−CELL302培地(JRH社製)、IMDM培地(GIBCO BRL社製)、Hybridoma−SFM培地(GIBCO BRL社製)、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にFc融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のFc融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はELISA法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平2−257891に開示されている方法に従い、dhfr遺伝子増幅系等を利用してFc融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Fc融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインAカラムやプロテインGカラムを用いて精製することができる(アンチボディズ,Chapter 8、モノクローナル・アンティボディズ)。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したFc融合蛋白質分子全体の分子量は、SDS−PAGE[ネイチャー(Nature),227,680(1970)]やウエスタンブロッティング法(アンチボディズ,Chapter 12、モノクローナル・アンティボディズ)等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、前記1項に記載した方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、抗体組成物を製造することができる。
4.FcγRIIIaに対する結合活性の測定
抗体組成物のFcγRIIIaに対する結合活性は、以下に述べる手法により測定することができる。
(1)FcγRIIIaの調製
FcγRIIIaとしては、ヒトまたは非ヒト動物の末梢血リンパ球の細胞表面に存在するFcγRIIIa、FcγRIIIaをコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を宿主細胞へ導入して細胞表面へ発現させたFcγRIIIaあるいは該細胞から分泌させたFcγRIIIaなどを用いることができる。
以下にFcγRIIIaをコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を宿主細胞に導入して、宿主細胞上にFcγRIIIaを発現させる方法および該細胞からFcγRIIIaを分泌させることによりFcγRIIIaを取得する方法を述べる。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全RNAまたはmRNAを調製する。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞のmRNAは市販のもの(例えばClontech社製)を用いても良いし、以下の如くヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から調製しても良い。ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法[メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology),154,3(1987)]、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム(AGPC)法[アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry),162,156(1987);実験医学、9,1937(1991)]などがあげられる。
また、全RNAからpoly(A)+RNAとしてmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法(モレキュラー・クローニング第2版)等があげられる。
さらに、Fast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)、Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia社製)などのキットを用いることによりmRNAを調製することができる。
調製したヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞全RNAまたはmRNAからcDNAライブラリーを作製する。
cDNAライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第2版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies社製)、ZAP−cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE社製)を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express[STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies),5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research),17,9494(1989)]、Lambda ZAP II(STRATAGENE社製)、λgt10、λgt11[ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ(DNA cloning,A Practical Approach),1,49(1985)]、λTriplEx(Clontech社製)、λExCell(Pharmacia社製)、pT7T318U(Pharmacia社製)、pcD2[モレキュラー・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.),3,280(1983)]およびpUC18[ジーン(Gene),33,103(1985)]等をあげることができる。
宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Escherichia coli XL1−Blue MRF’[STRATAGENE社、ストラテジーズ(Strategies),5,81(1992)]、Escherichia coli C600[ジェネティクス(Genetics),39,440(1954)]、Escherichia coli Y1088[サイエンス(Science),222,778(1983)]、Escherichia coli Y1090[サイエンス(Science),222,778(1983)]、Escherichia coli NM522[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),166,1(1983)]、Escherichia coli K802[ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.),16,118(1966)]およびEcherichia coli JM105[ジーン(Gene),38,275(1985)]等が用いられる。
このcDNAライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長cDNAの割合を下げ、なるべく完全長cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法[ジーン(Gene),138,171(1994);ジーン(Gene),200,149(1997);蛋白質核酸酵素,41,603(1996);実験医学,11,2491(1993);cDNAクローニング(羊土社)(1996);遺伝子ライブラリーの作製法(羊土社)(1994)]を用いて調製したcDNAライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
各種FcγRIIIaの塩基配列に基づいて、5’端および3’端の塩基配列に特異的なプライマーを作製し、作製したcDNAライブラリーを鋳型としてPCR法[ピーシーアール・プロトコールズ(PCR Protocols),Academic Press(1990)]を用いてDNAの増幅を行うことにより、FcγRをコードする遺伝子を取得することができる。
取得した遺伝子がFcγRIIIaをコードするDNAであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー(Sanger)らのジデオキシ法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),74,5463(1977)]あるいはABI PRISM 377DNAシークエンサー(PE Biosystems社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
上記の方法で得られるFcγRIIIaをコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号27に記載のFcγRIIIaの塩基配列があげられる。
決定されたDNAの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のDNA合成機Model 392等のDNA合成機で化学合成することにより、FcγRIIIaをコードする遺伝子を取得することもできる。
取得したFcγRIIIaをコードするcDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とするFcγRIIIaをコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[メソッズ・エンザイモロジー(Methods.Enzymol.),194,182(1990)]、スフェロプラスト法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A),84,1929(1978)]、酢酸リチウム法[ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacteriology),153,163(1983)]、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A),75,1929(1978)に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNAI、pcDM8(フナコシ社製)、pAGE107[特開平3−22979;サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、pAS3−3(特開平2−227075)、pCDM8[ネイチャー(Nature),329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochemistry),101,1307(1987)]、pAGE210等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)のIE(immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ(Namalwa)細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637(特開昭63−299)、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),84,7413(1987)]、インジェクション法[マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル]、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法[日本特許第2606856、日本特許第2517813]、DEAE−デキストラン法[バイオマニュアルシリーズ4−遺伝子導入と発現・解析法(羊土社)横田崇・新井賢一編(1994)]、ウイルスベクター法(マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第2版)等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)、バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6,47(1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(ともにInvitorogen社製)等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodopterafrugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21[カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,W.H.Freeman and Company,New York(1992)]、Trichoplusianiの卵巣細胞であるHigh 5(Invitrogen社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法(特開平2−227075)、リポフェクション法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),84,7413(1987)]等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Tiプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いる方法(特開昭59−140885、特開昭60−70080、WO94/00977)、エレクトロポレーション法(特開昭60−251887)、パーティクルガン(遺伝子銃)を用いる方法(日本特許第2606856、日本特許第2517813)等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にFcγRIIIaを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、FcγRIIIaを製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、酵母が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持する。pHの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地[ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション(The Journal of the American Medical Association),199,519(1967)]、EagleのMEM培地[サイエンス(Science),122,501(1952)]、ダルベッコ改変MEM培地邊[ヴュロロジー(Virology),8,396(1959)]、199培地[プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73,1(1950)]、Whitten培地[発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方(講談社)勝木元也編(1987)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH6.0〜8.0、30〜40℃、5%CO2存在下等の条件下で1〜7日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM−FH培地(Pharmingen社製)、Sf−900 II SFM培地(Life Technologies社製)、ExCell400、ExCell405(いずれもJRH Biosciences社製)、Grace’s Insect Medium[ネイチャー(Nature),195,788(1962)]等を用いることができる。
培養は、通常pH6.0〜7.0、25〜30℃等の条件下で、1〜5日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ(MS)培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常pH5.0〜9.0、20〜40℃の条件下で3〜60日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、FcγRIIIaをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、FcγRIIIaを生成蓄積させ、該培養物よりFcγRIIIaを採取することにより、FcγRIIIaを製造することができる。
FcγRIIIaの発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第2版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
FcγRIIIaの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるFcγRIIIaの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
FcγRIIIaが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.),264,17619(1989)]、ロウらの方法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),86,8227(1989);ジーン・デベロップメント(Genes Develop.),4,1288(1990)]、または特開平5−336963、特開平6−823021等に記載の方法を準用することにより、該FcγRIIIaを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、FcγRIIIaをコードするDNA、およびFcγRIIIaの発現に適切なシグナルペプチドをコードするDNAを挿入し、該発現ベクターを発現させることにより、目的とするFcγRIIIaを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平2−227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体(トランスジェニック非ヒト動物)または植物個体(トランスジェニック植物)を造成し、これらの個体を用いてFcγRを製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、FcγRIIIaを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該FcγRIIIaを採取することにより、該FcγRIIIaを製造することができる。
動物個体を用いてFcγRIIIaを製造する方法としては、例えば公知の方法[アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition),63,639S(1996);アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション(American Journal of Clinical Nutrition),63,627S(1996);バイオ/テクノロジー(Bio/Technology),9,830(1991)]に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とするFcγRを生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、FcγRIIIaをコードするDNAを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、FcγRIIIaを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中よりFcγRIIIaを採取することにより、FcγRIIIaを製造することができる。該動物中の生成蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク(特開昭63−309192)、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いてFcγRIIIaを製造する方法としては、例えばFcγRをコードするDNAを導入したトランスジェニック植物を公知の方法[組織培養,20(1994);組織培養,21(1995);トレンド・イン・バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology),15,45(1997)]に準じて栽培し、FcγRIIIaを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該FcγRを採取することにより、FcγRIIIaを生産する方法があげられる。
FcγRIIIaをコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたFcγRIIIaは、例えばFcγRIIIaが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、DEAE−セファロース、DIAION HPA−75(三菱化学(株)製)等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S−Sepharose FF(Pharmacia社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、FcγRIIIaの精製標品を得ることができる。
また、FcγRIIIaが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてFcγRIIIaの不溶体を回収する。回収したFcγRIIIaの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該FcγRIIIaを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該FcγRIIIaの精製標品を得ることができる。
FcγRIIIaが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該FcγRIIIaあるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、FcγRIIIaの精製標品を得ることができる。
(2)FcγRIIIaに対する結合活性の測定
細胞膜上に発現しているFcγRIIIaに対する抗体組成物の結合活性は、蛍光抗体法[キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(Cancer Immunol.Immunother.),36,373(1993)]などにより測定することができる。また、前記4の(1)項に記載の方法により調製した精製FcγRIIIaに対する結合活性は、文献[モノクローナル・アンティボディズ:プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),Wiley−Liss,Inc.,(1995);酵素免疫測定法,第3版,医学書院(1987);改訂版,酵素抗体法,学際企画(1985)]等に記載のウエスタン染色、RIA(Radioimmunoassay)、VIA(Viroimmunoassay)、EIA(Enzymoimmunoassay)、FIA(Fluoroimmunoassay)、MIA(Metalloimmunoassay)などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
EIA用のプラスティックプレートにFcγRIIIaを固定化する。抗体組成物を含む試料反応させる。次に、適当な二次抗体を用いて結合した抗体組成物の量を測定する。
また、精製FcγRIIIaに対する結合活性は、バイオセンサー[例えば、BIAcore(BIACORE社製)]を用いた測定[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods),200,121(1997)]やIsothermal Titration Calorimetry法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),97,9026(2000)]等によっても測定できる。
5.抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合活性、FcγRIIIaとの結合活性、エフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性およびFcγRIIIaとの結合活性は、ELISA法および蛍光抗体法[キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(Cancer Immunol.Immunother.),36,373(1993)]、バイオセンサー[例えば、BIAcore(BIACORE社製)]を用いた測定[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods),200,121(1997)]、Isothermal Titration Calorimetry法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),97,9026(2000)]等により測定できる。エフェクター機能のうち、例えば、抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、CDC活性、ADCC活性等を測定することにより、評価することができる[キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(Cancer Immunol.Immunother.),36,373(1993)]。
6.各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、IgG分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、N−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
(1)中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Dionex社製糖組成分析装置(BioLC)を用いる方法があげられる。BioLCはHPAEC−PAD(high performance anion−exchangechromatography−pulsed amperometric detection)法[ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー(J.Liq.Chromatogr.),6,1577(1983)]によって糖組成を分析する装置である。
また、2−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法[アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agruc.Biol.Chem.),55,283(1991)]に従って酸加水分解した試料を2−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、HPLC分析して組成比を算出することができる。
(2)糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、2次元糖鎖マップ法[アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Biochem.),171,73(1988)、生物化学実験法23−糖タンパク質糖鎖研究法(学会出版センター)高橋禮子編(1989年)]により行うことができる。2次元糖鎖マップ法は、例えば、X軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、2−アミノピリジン(以下、PAと略記する)による糖鎖の蛍光標識[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),95,197(1984)]を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のPA化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、2次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード(TaKaRa社製)、文献[アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Biochem.),171,73(1988)]とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のMALDI−TOF−MSなどの質量分析を行い、2次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
7.抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、抗体のFc領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成されている。Fc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物は、前記6項に記載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、文献[モノクローナル・アンティボディズ:プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications),Wiley−Liss,Inc.(1995);酵素免疫測定法,第3版,医学書院(1987);改訂版,酵素抗体法,学際企画(1985)]等に記載のウエスタン染色、RIA(Radioimmunoassay)、VIA(Viroimmunoassay)、EIA(Enzymoimmunoassay)、FIA(Fluoroimmunoassay)、MIA(Metalloimmunoassay)などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、WGA(T.vulgaris由来のwheat−germ agglutinin)、ConA(C.ensiformis由来のconcanavalin A)、RIC(R.communis由来の毒素)、L−PHA(P.vulgaris由来のleukoagglutinin)、LCA(L.culinaris由来のlentil agglutinin)、PSA(P.sativum由来のPea lectin)、AAL(Aleuria aurantia Lectin)、ACL(Amaranthuscaudatus Lectin)、BPL(Bauhinia purpurea Lectin)、DSL(Datura stramonium Lectin)、DBA(Dolichos biflorus Agglutinin)、EBL(Elderberry Balk Lectin)、ECL(Erythrina cristagalli Lectin)、EEL(Euonymus europaeus Lectin)、GNL(Galanthus nivalis Lectin)、GSL(Griffonia simplicifolia Lectin)、HPA(Helix pomatia Agglutinin)、HHL(Hippeastrum Hybrid Lectin)、Jacalin、LTL(Lotus tetragonolobus Lectin)、LEL(Lycopersicon esculentum Lectin)、MAL(Maackia amurensis Lectin)、MPL(Maclura pomifera Lectin)、NPL(Narcissus pseudonarcissus Lectin)、PNA(Peanut Agglutinin)、E−PHA(Phaseolusvulgaris Erythroagglutinin)、PTL(Psophocarpus tetragonolobus Lectin)、RCA(Ricinus communis Agglutinin)、STL(Solanum tuberosum Lectin)、SJA(Sophora japonica Agglutinin)、SBA(Soybean Agglutinin)、UEA(Ulexeuropaeus Agglutinin)、VVL(Vicia villosa Lectin)、WFA(Wisteriafloribunda Agglutinin)があげられる。
N−グルコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、その具体的な例としては、レンズマメレクチンLCA(Lens Culinaris由来のLentilAgglutinin)エンドウマメレクチンPSA(Pisum sativum由来のPea Lectin)、ソラマメレクチンVFA(Vicia faba由来のAgglutinin)、ヒイロチャワンタケレクチンAAL(Aleuria aurantia由来のLectin)をあげることができる。
8.抗体組成物のFcγRIIIaに対する結合活性を測定する方法
本発明は、抗原と被験抗体組成物とを反応させた後に、抗原と抗体組成物との複合体をFcγRIIIaとを接触させることを特徴とする測定方法を用いて、抗体組成物の糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出すること、さらに抗体依存性細胞障害活性を検出することに関する。
以下に、本発明で用いる測定方法について詳細に説明する。
抗原をプレートに固定し、被験抗体組成物を反応させる。抗原抗体反応した複合体に、ヒトFcγRIIIaを反応させる。
反応させるヒトFcγRIIIaに酵素、放射性同位元素、蛍光などの標識体を付して抗原に結合した抗体との結合活性を免疫学的測定法により測定することができる。
免疫学的測定法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
また、ヒトFcγRIIIaをコードする遺伝子に短いペプチドをコードする塩基配列を連結させて遺伝子工学的に発現させることにより、タグの入ったヒトFcγRIIIaを取得することができる。タグとしては、ヒスチジンなどがあげられる。
したがって、タグ入りのヒトFcγRIIIaを用いて上記の反応を行った場合には、反応後にタグに対する抗体を反応させ、タグに対する抗体に上記のような標識を施すか、またはタグに対する抗体に結合する標識抗体を用いることにより、感度の高いイムノアッセイ法を行うことができる。
本発明の検出法は、抗原と被験抗体組成物とを反応させずに、被験抗体組成物を直接FcγRIIIaと接触させて行うこともできる。例えば、タグに対する抗体を固相化し、タグ入りのヒトFcγRIIIaと反応させた後に被験抗体組成物を反応させて、ヒトFc領域を認識する標識抗体で検出することができる。
抗体組成物の糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法としては、以下の方法で行う。
最初に、ある抗体組成物について糖鎖分析を行い、検量線を引くために必要な数だけ糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合の異なる抗体組成物(スタンダード)を用意する。その際に用いる抗体組成物の濃度は予め一定にする。用意した抗体組成物のサンプルについて上記測定方法を用いて、FcγRIIIaに対する結合活性をそれぞれ測定し、糖鎖の割合とFcγRIIIaに対する結合活性との検量線を作成する。
以上の検量線を用いることにより、測定したいサンプルの抗体組成物の濃度を一定にして上記と同様の測定方法を用いて、FcγRIIIaに対する結合活性を測定することにより、サンプルの抗体組成物の糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を求めることができる。
さらにADCC活性を検出するためには、以下の方法で行う。
上述の抗体組成物の糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法で用いた検量線を作成するために用いたスタンダードについてADCC活性を測定する。測定方法としては、後述のADCC測定方法を用いる。用意した抗体組成物のサンプルについて上記測定方法を用いて、FcγRIIIaに対する結合活性をそれぞれ測定し、ADCC活性とFcγRIIIaに対する結合活性との検量線を作成する。
以上の検量線を用いることにより、測定したいサンプルの抗体組成物の濃度を一定にして上記と同様の測定方法を用いて、FcγRIIIaに対する結合活性を測定することにより、ADCC活性を求めることができる。
8.抗体組成物のスクリーニング方法
本発明は、抗原と被験抗体とを反応させた後に、FcγRIIIaとを接触させることを特徴とする、FcγRIIIaに対する結合活性の高い抗体組成物をスクリーニングする方法に関する。
以下に、本発明のスクリーニング方法について詳細に説明する。
抗原をプレートに固定し、被験抗体を反応させる。抗原抗体反応した複合体に、ヒトFcγRIIIaを反応させる。
反応させるヒトFcγRIIIaに酵素、放射性同位元素、蛍光などの標識体を付して抗原に結合した抗体との結合活性を免疫学的測定法により測定することができる。
免疫学的測定法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法など抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
また、ヒトFcγRIIIaをコードする遺伝子に短いペプチドをコードする塩基配列を連結させて遺伝子工学的に発現させることにより、タグの入ったヒトFcγRIIIaを取得することができる。タグとしては、ヒスチジンなどがあげられる。
したがって、タグ入りのヒトFcγRIIIaを用いて上記の反応を行った場合には、反応後にタグに対する抗体を反応させ、タグに対する抗体に上記のような標識を施すか、またはタグに対する抗体に結合する標識抗体を用いることにより、感度の高いイムノアッセイ法を行うことができる。
10.本発明の抗体組成物の利用
本発明のスクリーニング方法で得られた抗体組成物は高いADCC活性を有する。高いADCC活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍は癌細胞が増殖する。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いADCC活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分であり、化学療法との併用療法が行われているが[サイエンス(Science),280,1197(1998)]、本発明の方法で得られた抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもなる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それらの疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いADCC活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いADCC活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウィルスまたは細菌に感染細胞を、高いADCC活性を有する抗体を用いてウィルスまたは細菌に感染細胞の増殖を抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗GD2抗体[アンチ・キャンサー・リサーチ(Anticancer Res.),13,331(1993)]、抗GD3抗体[キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(Cancer Immunol.Immunother.),36,260(1993)]、抗GM2抗体[キャンサー・リサーチ(Cancer Res.),54,1511(1994)]、抗HER2抗体[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89,4285(1992)]、抗CD52抗体[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89,4285(1992)]、抗MAGE抗体[ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー(British J.Cancer),83,493(2000)]、抗1.24抗体[モレキュラー・イムノロジー(Molecular Immunol.),36,387(1999)]、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白(PTHrP)抗体[キャンサー(Cancer),88,2909(2000)]、抗塩基性線維芽細胞増殖因子抗体、抗線維芽細胞増殖因子8抗体[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),86,9911(1989)]、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗線維芽細胞増殖因子8受容体抗体[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.),265,16455(1990)]、抗インスリン様増殖因子抗体[ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ(J.Neurosci.Res.),40,647(1995)]、抗インスリン様増殖因子受容体抗体[ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ(J.Neurosci.Res.),40,647(1995)]、抗PMSA抗体[ジャーナル・オブ・ウロロジー(J.Urology),160,2396(1998)]、抗血管内皮細胞増殖因子抗体[キャンサー・リサーチ(Cancer Res.),57,4593(1997)]、抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体[オンコジーン(Oncogene),19,2138(2000)]などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン6抗体[イムノロジカル・レビューズ(Immunol.Rev.),127,5(1992)]、抗インターロイキン6受容体抗体[モレキュラー・イムノロジー(Molecular Immunol.),31,371(1994)]、抗インターロイキン5抗体[イムノロジカル・レビューズ(Immunol.Rev.),127,5(1992)]、抗インターロイキン5受容体抗体、抗インターロイキン4抗体[サイトカイン(Cytokine),3,562(1991)]、抗インターロイキン4受容体抗体[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods),217,41(1998)]、抗腫瘍壊死因子抗体[ハイブリドーマ(Hybridoma),13,183(1994)]、抗腫瘍壊死因子受容体抗体[モレキュラー・ファーマコロジー(Molecular Pharmacol.),58,237(2000)]、抗CCR4抗体[ネイチャー(Nature),400,776,(1999)]、抗ケモカイン抗体[J.Immunol.Meth.,174,249−257(1994)]または抗ケモカイン受容体抗体[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Exp.Med.),186,1373(1997)]であり、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体が抗GPIIb/IIIa抗体[ジャーナル・オブ・イムノロジー(J.Immunol.),152,2968(1994)]、抗血小板由来増殖因子抗体[サイエンス(Science),253,1129(1991)]、抗血小板由来増殖因子受容体抗体[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.),272,17400(1997)]、抗血液凝固因子抗体[サーキュレーション(Circulation),101,1158(2000)]などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗gp120抗体[ストラクチャー(Structure),8,385(2000)]、抗CD4抗体[ジャーナル・オブ・リューマトロジー(J.Rheumatology),25,2065(1998)]、抗CCR5抗体、抗ベロ毒素抗体[ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J.Clin.Microbiol.),37,396(1999)]などがあげられる。
上記抗体は、ATCC(The American Type Culture Collection)、理化学研究所細胞開発銀行、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、R&D SYSTEMS社、PharMingen社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社からも入手することができる。
本発明の方法で得られた抗体組成物は、種々の疾患治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人1日当たり10μg/kg〜20mg/kgである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、CDC活性測定法、ADCC活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
CDC活性、ADCC活性、抗腫瘍実験は、文献[キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー(Cancer Immunol.Immunother.),36,373(1993);キャンサー・リサーチ(Cancer Research),54,1511(1994)]等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない
発明を実施するための最良の形態
実施例1.抗ガングリオシドGD3ヒト型キメラ抗体の作製
1.抗ガングリオシドGD3ヒト型キメラ抗体のタンデム型発現ベクターpChi641LHGM4の構築
抗ガングリオシドGD3ヒト型キメラ抗体(以下、抗GD3キメラ抗体と表記する)のL鎖の発現ベクターpChi641LGM4[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods),167,271(1994)]を制限酵素MluI(宝酒造社製)とSalI(宝酒造社製)で切断して得られるL鎖cDNAを含む約4.03kbの断片と動物細胞用発現ベクターpAGE107[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]を制限酵素MluI(宝酒造社製)とSalI(宝酒造社製)で切断して得られるG418耐性遺伝子およびスプライシングシグナルを含む約3.40kbの断片をDNALigation Kit(宝酒造社製)を用いて連結、大腸菌HB101株(モレキュラー・クローニング第2版)を形質転換してプラスミドpChi641LGM40を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドpChi641LGM40を制限酵素ClaI(宝酒造社製)で切断後、DNA Blunting Kit(宝酒造社製)を用いて平滑末端化し、更にMluI(宝酒造社製)で切断して得られるL鎖cDNAを含む約5.68kbの断片と抗GD3キメラ抗体のH鎖の発現ベクターpChi641HGM4[ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods),167,271(1994)]を制限酵素XhoI(宝酒造社製)で切断後、DNA Blunting Kit(宝酒造社製)を用いて平滑末端化し、更にMluI(宝酒造社製)で切断して得られるH鎖cDNAを含む約8.40kbの断片をDNALigation Kit(宝酒造社製)を用いて連結、大腸菌HB101株(モレキュラー・クローニング第2版)を形質転換して抗GD3キメラ抗体のタンデム型発現ベクターpChi641LHGM4を構築した。
2.抗GD3キメラ抗体の安定生産細胞の作製
上記実施例1の1項で構築した抗GD3キメラ抗体のタンデム型発現ベクターpChi641LHGM4を各種細胞株に導入し、優良株を選択することで抗GD3キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
(1)ラットミエローマYB2/0細胞を用いた生産細胞の作製
抗GD3キメラ抗体発現ベクターpChi641LHGM4の5μgを4×106細胞のラットミエローマYB2/0細胞[ATCC CRL−1662、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー(J.Cell.Biol.),93,576(1982)]へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、40mLのRPMI1640−FBS(10)[10%牛胎児血清(以下、FBSと表記する;GIBCO BRL社製)を含むRPMI1640培地]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗GD3キメラ抗体の抗原結合活性を実施例1の3項に示すELISA法により測定した。
培養上清中に抗GD3キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、DHFRの阻害剤であるメソトレキセート(以下、MTXと表記する;SIGMA社製)を50nmol/L含むRPMI1640−FBS(10)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に2mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗GD3キメラ抗体の抗原結合活性を実施例1の3項に示すELISA法により測定した。培養上清中に抗GD3キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nmol/L、200nmol/Lと順次上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むRPMI1640−FBS(10)培地で増殖可能かつ、抗GD3キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、2回の限界希釈法による単一細胞化(クローン化)を行った。
このようにして得られた抗GD3キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン7−9−51は平成11年4月5日付で工業技術院生命工学工業技術研究所(日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号)(現・独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6))にFERM BP−6691として寄託されている。
(2)CHO/DG44細胞を用いた生産細胞の作製
抗GD3キメラ抗体発現ベクターpChi641LHGM4の4μgを1.6×106細胞のCHO/DG44細胞[プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77,4216(1980)]へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、10mLのIMDM−FBS(10)−HT(1)[FBSを10%、HT supplement(GIBCO BRL社製)を1倍濃度で含むIMDM培地]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(岩城硝子社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗GD3キメラ抗体の抗原結合活性を実施例1の3項に示すELISA法により測定した。
培養上清中に抗GD3キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、MTXを10nmol/L含むIMDM−dFBS(10)培地[10%透析牛胎児血清(以下、dFBSと表記する;GIBCO BRL社製)を含むIMDM培地]に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(岩城硝子社製)に0.5mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、10nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nmol/Lに上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを100nmol/Lの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地で増殖可能かつ、抗GD3キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、2回の限界希釈法によるクローン化を行った。
(3)マウスミエローマNSO細胞を用いた生産細胞の作製
抗GD3キメラ抗体発現ベクターpChi641LHGM4の5μgを4×106細胞のマウスミエローマNSO細胞へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、40mLのEX−CELL302−FBS(10)[10%FBS、2mmol/L L−グルタミン(以下、L−Glnと表記する;GIBCO BRL社製)を含むEX−CELL302培地]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗GD3キメラ抗体の抗原結合活性を実施例1の3項に示すELISA法により測定した。
培養上清中に抗GD3キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、MTXを50nmol/L含むEX−CELL302−dFBS(10)培地(10%dFBS、2mmol/LL−Glnを含むEX−CELL302培地)に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に2mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗GD3キメラ抗体の抗原結合活性を実施例1の3項に示すELISA法により測定した。培養上清中に抗GD3キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nmol/L、200nmol/Lと順次上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むEX−CELL302−dFBS(10)培地で増殖可能かつ、抗GD3キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株の中から優良株を選択し、2回の限界希釈法によるクローン化を行った。
3.抗体のGD3に対する結合活性の測定(ELISA法)
抗体のGD3に対する結合活性は以下のようにして測定した。
4nmolのGD3(雪印乳業社製)を10μgのジパルミトイルフォスファチジルコリン(SIGMA社製)と5μgのコレステロール(SIGMA社製)とを含む2mLのエタノール溶液に溶解した。該溶液の20μL(40pmol/ウェルとなる)を96ウェルのELISA用のプレート(Greiner社製)の各ウェルにそれぞれ分注し、風乾後、1%牛血清アルブミン(以下、BSAと表記する;SIGMA社製)を含むPBS(以下、1%BSA−PBSと表記する)を100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。1%BSA−PBSを捨て、形質転換株の培養上清或いは精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルを0.05%Tween20(和光純薬社製)を含むPBS(以下、Tween−PBSと表記する)で洗浄後、1%BSA−PBSで3000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(H&L)抗体溶液(American Qualex社製)を二次抗体溶液として、50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液[2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)アンモニウムの0.55gを1Lの0.1mol/Lクエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水素を1μL/mLで添加した溶液(以下、同様)]を50μL/ウェルで加えて発色させ、415nmの吸光度(以下、OD415と表記する)を測定した。
4.抗GD3キメラ抗体の精製
(1)YB2/0細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
上記実施例1の2項(1)で得られた抗GD3キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをBSAを0.2%、MTXを200nmol/L、トリヨードチロニン(以下、T3と表記する;SIGMA社製)を100nmol/Lの濃度で含むHybridoma−SFM培地に3×105細胞/mLとなるように懸濁し、2.0Lスピナーボトル(岩城硝子社製)を用いて50rpmの速度で攪拌培養した。37℃の恒温室内で10日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(Bioprocessing社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗GD3キメラ抗体を精製した。精製した抗GD3キメラ抗体は、YB2/0−GD3キメラ抗体と名付けた。
(2)CHO/DG44細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
上記実施例1の2項(2)で得られた抗GD3キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをL−Glnを3mmol/L、脂肪酸濃縮液(以下、CDLCと表記する;GIBCO BRL社製)を0.5%、プルロニックF68(以下、PF68と表記する;GIBCO BRL社製)を0.3%の濃度で含むEX−CELL302培地に1×106細胞/mLとなるように懸濁し、175mm2フラスコ(Greiner社製)に50mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で4日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(Bioprocessing社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗GD3キメラ抗体を精製した。精製した抗GD3キメラ抗体は、CHO/DG44−GD3キメラ抗体と名付けた。
(3)NSO細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
上記実施例1の2項(3)で得られた抗GD3キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローンをL−Glnを2mmol/L、G418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/L、dFBSを1%の濃度で含むEX−CELL302培地に1×106細胞/mLとなるように懸濁し、175mm2フラスコ(Greiner社製)に200mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で4日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(Bioprocessing社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗GD3キメラ抗体を精製した。精製した抗GD3キメラ抗体は、NSO−GD3キメラ抗体(302)と名付けた。
また、該形質転換細胞クローンをG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むGIT培地に3×105細胞/mLとなるように懸濁し、175mm2フラスコ(Greiner社製)に200mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で10日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(Bioprocessing社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗GD3キメラ抗体を精製した。精製した抗GD3キメラ抗体は、NSO−GD3キメラ抗体(GIT)と名付けた。
(4)SP2/0細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
特開平5−304989(EP533199)に記載の抗GD3キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン(KM−871(FERM BP−3512))をG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むGIT培地に3×105細胞/mLとなるように懸濁し、175mm2フラスコ(Greiner社製)に200mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で8日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(Bioprocessing社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗GD3キメラ抗体を精製した。精製した抗GD3キメラ抗体は、SP2/0−GD3キメラ抗体と名付けた。
5.精製した抗GD3キメラ抗体の解析
上記実施例1の4項で得られた各種動物細胞で生産、精製した5種類の抗GD3キメラ抗体の各4μgを公知の方法[ネイチャー(Nature),227,680(1970)]に従ってSDS−PAGEし、分子量および精製度を解析した。その結果を第1図に示した。第1図に示したように、精製した各抗GD3キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約150キロダルトン(以下、Kdと表記する)の単一のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のH鎖およびL鎖のcDNAの塩基配列から推定される分子量(H鎖:約49Kd、L鎖:約23Kd、分子全体:約144Kd)とほぼ一致し、更に、IgG型の抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のジスルフィド結合(以下、S−S結合と表記する)が切断され、約50Kdの分子量を持つH鎖と約25Kdの分子量を持つL鎖に分解されるという報告[アンティボディズ,Chapter14、モノクローナル・アンティボディズ]と一致し、各抗GD3キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
実施例2.抗GD3キメラ抗体の活性評価
1.抗GD3キメラ抗体のGD3に対する結合活性(ELISA法)
上記実施例1の4項で得られた5種類の精製抗GD3キメラ抗体のGD3に対する結合活性を実施例1の3項に示すELISA法により測定した。第2図は、添加する抗GD3キメラ抗体の濃度を変化させて結合活性を検討した結果である。第2図に示したように、5種類の抗GD3キメラ抗体は、ほぼ同等のGD3に対する結合活性を示した。この結果は抗体の抗原結合活性は、抗体を生産する動物細胞やその培養方法に関わらず、一定であることを示している。また、NSO−GD3キメラ抗体(302)とNSO−GD3キメラ抗体(GIT)の比較から抗原結合活性は、培養に用いる培地にも依らず、一定であることが示唆された。
2.抗GD3キメラ抗体のADCC活性
上記実施例1の4項で得られた5種類の精製抗GD3キメラ抗体のADCC活性を以下のようにして測定した。
(1)標的細胞溶液の調製
RPMI1640−FBS(10)培地で培養したヒトメラノーマ細胞株G−361(ATCCCRL1424)の1×106細胞を調製し、放射性物質であるNa2 51CrO4を3.7MBq当量加えて37℃で1時間反応させ、細胞を放射性物質標識した。反応後、RPMI1640−FBS(10)培地で懸濁および遠心分離操作により3回洗浄し、培地に再懸濁し、4℃で30分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、RPMI1640−FBS(10)培地を5mL加え、2×105細胞/mLに調製し、標的細胞溶液とした。
(2)エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血50mLを採取し、ヘパリンナトリウム(武田薬品社製)0.5mLを加え穏やかに混ぜた。これをLymphoprep(Nycomed Pharma AS社製)を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。RPMI1640−FBS(10)培地で3回遠心分離して洗浄後、培地を用いて2×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
(3)ADCC活性の測定
96ウェルU字底プレート(Falcon社製)の各ウェルに上記(1)で調製した標的細胞溶液の50μL(1×104細胞/ウェル)を分注した。次いで(2)で調製したエフェクター細胞溶液を100μL(2×105細胞/ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は20:1となる)添加した。更に、各種抗GD3キメラ抗体を各種濃度で加え、37℃で4時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の51Cr量をγ−カウンターにて測定した。自然解離51Cr量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の51Cr量を測定することにより求めた。全解離51Cr量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに1mol/Lの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の51Cr量を測定することにより求めた。ADCC活性は下式(1)により求めた。
その結果を第3図に示した。第3図に示したように、5種類の抗GD3キメラ抗体のうち、YB2/0−GD3キメラ抗体が最も高いADCC活性を示し、次いでSP2/0−GD3キメラ抗体、NSO−GD3キメラ抗体、CHO−GD3キメラ抗体の順に高いADCC活性を示した。培養に用いた培地の異なるNSO−GD3キメラ抗体(302)とNSO−GD3キメラ抗体(GIT)では、それらのADCC活性に差は認められなかった。以上の結果は、抗体のADCC活性は、生産に用いる動物細胞によって大きく異なることを示している。その機構としては、抗原結合活性が同等であったことから、抗体のFc領域の構造の差に起因していることが推測された。
実施例3.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗GD3キメラ抗体の活性評価
1.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗GD3キメラ抗体の調製
実施例1の2項(1)に記載した方法に従って、抗GD3キメラ抗体を生産するYB2/0細胞由来の形質転換クローンを複数得た。それぞれのYB2/0細胞由来の形質転換クローンより精製抗体を調製し、それぞれをロット1、ロット2、ロット3とした。抗GD3キメラ抗体ロット1、ロット2、ロット3の糖鎖分析を、以下の方法に従って行った。
精製したそれぞれの抗体を、ウルトラフリー0.5−10K(ミリポア社製)を用いて10mmol/L KH2PO4に溶液を置換した。置換倍率は80倍以上になるように行なった。
100μgの抗体をヒドラクラブS−204用試験管に入れ、遠心濃縮機にて乾固した。サンプルを乾固後、ホーネン社製ヒドラクラブにてヒドラジン分解を行なった。ヒドラジンはホーネン社製ヒドラジン分解試薬を用い、110℃、1時間反応させた[メソッド・オブ・エンザイモロジー(Method of Enzymology),83,263(1982)]。反応後ヒドラジンを減圧留去させて、反応容器を30分間放置して室温に戻した。ホーネン社製アセチル化試薬のacetylation reagentを250μL、無水酢酸を25μL入れてよく攪拌させ、室温で30分間反応させた。さらにacetylation reagentを250μL、無水酢酸を25μL加えてよく攪拌させ、室温で1時間反応させた。試料を−80℃のフリーザーで凍結させ、約17時間凍結乾燥させた。凍結乾燥した試料から、TaKaRa社製セルロースカートリッジ グリカンプレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。試料糖鎖溶液を遠心濃縮機にて乾固後、2−アミノピリジンによる蛍光標識を行った[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),95,197(1984)]。2−アミノピリジン溶液は2−アミノピリジン1gに対し塩酸溶液の760μLを加え(1×PA溶液)、その溶液を逆浸透精製水で10倍に希釈したものを用いた(10倍希釈PA溶液)。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム10mgに対し1×PA溶液20μL、逆浸透精製水430μLを加えて調製した。試料に10倍希釈PA溶液を67μL入れて100℃、15分間反応させ、放冷後にシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を2μL入れて90℃、12時間反応させて試料糖鎖を蛍光標識した。蛍光標識した糖鎖群(PA化糖鎖群)を、Surperdex Peptide HR 10/30カラム(Pharmacia社製)を用いて過剰な試薬と分離した。溶離液は10mmol/L炭酸水素アンモニウム、流速は0.5mL/分、カラム温度は室温、蛍光検出器は励起波長320nm、蛍光波長400nmで行なった。試料添加後20分から30分の溶出液を回収し、遠心濃縮機にて乾固させ、精製PA化糖鎖群とした。
次に、CLC−ODSカラム(Shimadzu社製、φ6.0nm×150nm)を用いて、精製PA化糖鎖群の逆相HPLC分析を行った。カラム温度は55℃、流速は1mL/分、蛍光検出器は励起波長320nm、蛍光波長400nmで行なった。10mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液(pH3.8)でカラムを平衡化し、0.5%1−ブタノールの直線濃度勾配にて80分間溶出した。第4図にロット2の抗GD3キメラ抗体の精製PA化糖鎖群の溶離図を示した。各PA化糖鎖の同定は、分取した各PA化糖鎖のピークのマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF−MS分析)におけるポストソース分解(Post Source Decay)分析、TaKaRa社製PA化糖鎖スタンダードとの溶出位置の比較、並びに各種酵素を用いて各PA化糖鎖を消化後、逆相HPLC分析により行なった。
糖鎖含量は、逆相HPLC分析における各PA化糖鎖のピーク面積より算出した。還元末端がN−アセチルグルコサミンでないPA化糖鎖は、不純物由来であるか、PA化糖鎖調製中の副反応物であるため、ピーク面積の算出から除外した。なお、図中の(i)〜(ix)のピークは、それぞれ以下の糖鎖構造(1)〜(9)を示す。
GlcNAcはN−アセチルグルコサミン、Galはガラクトース、Manはマンノース、Fucはフコース、PAはピリジルアミノ基を示す。第4図において、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない群の割合は、(i)〜(ix)のうち(i)〜(iv)のピークが占める面積、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合した糖鎖群の割合は、(i)〜(ix)のうち(v)〜(ix)のピークが占める面積から算出した。それぞれの糖鎖群の割合は、2回の糖鎖分析の結果を平均した値を用いた。
その結果、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、ロット1、ロット2、ロット3、それぞれ50%、45%、29%であった。以下、これらの試料を、抗GD3キメラ抗体(50%)、抗GD3キメラ抗体(45%)、抗GD3キメラ抗体(29%)と表記する。
また、実施例1の2項(2)で調製したCHO/DG44細胞由来の抗GD3キメラ抗体の糖鎖分析を上記記載の方法に従って行った結果、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、7%であった。以下、本試料を抗GD3キメラ抗体(7%)と表記する。
さらに、抗GD3キメラ抗体(45%)と抗GD3キメラ抗体(7%)を用い、抗GD3キメラ抗体(45%):抗GD3キメラ抗体(7%)=5:3および1:7の割合で混合した。これらの試料を、上記記載の方法に従って糖鎖分析を行った結果、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、24%および13%であった。これらの試料を以下、抗GD3キメラ抗体(24%)、抗GD3キメラ抗体(13%)と表記する。
2.抗体のGD3に対する結合活性の評価(ELISA法)
実施例3の1項で調製した還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる6種類の抗GD3キメラ抗体のGD3に対する結合活性は、実施例1の3項に示すELISA法により測定した。その結果、第5図に示したように、6種類の抗GD3キメラ抗体は、いずれも同等のGD3に対する結合活性を示し、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、抗体の抗原結合活性に影響を与えないことが明らかとなった。
3.ヒトメラノーマ細胞株に対するADCC活性の評価
実施例3の1項で調製した還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる6種類の抗GD3キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株G−361(ATCC CRL1424)に対するADCC活性は、実施例2の2項に記載の方法に従って測定した。
第6図および第7図には、2名の健常人ドナー(A、B)のエフェクター細胞を用いてADCC活性を測定した結果をそれぞれ示した。第6図および第7図に示したように、抗GD3キメラ抗体のADCC活性は、いずれの抗体濃度においても還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合に比例して上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ADCC活性は低下する。
抗体濃度が0.05μg/mLでは、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖が24%、29%、45%および50%のADCC活性はほぼ同様の高い活性を示したが、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖が20%未満の抗体である、13%および7%では、ADCC活性は低かった。本結果は、エフェクター細胞のドナーが異なっても同様であった。
実施例4.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗CCR4キメラ抗体の活性評価
1.抗CCR4キメラ抗体の安定生産細胞の作製
WO01/64754に記載の抗CCR4キメラ抗体のタンデム型発現ベクターpKANTEX2160を用いて抗CCR4キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
(1)ラットミエローマYB2/0細胞を用いた生産細胞の作製
抗CCR4キメラ抗体発現ベクターpKANTEX2160の10μgを4×106細胞のラットミエローマYB2/0細胞(ATCC CRL1662)へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、40mLのHybridoma−SFM−FBS(5)[FBS(PAAラボラトリーズ社製)を5%含むHybridoma−SFM培地(インビトロジェン社製)]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を1mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を実施例4の2項記載のELISA法により測定した。
培養上清中に抗CCR4キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、G418を1mg/mL、DHFRの阻害剤であるMTX(SIGMA社製)を50nmol/L含むHybridoma−SFM−FBS(5)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に1mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を実施例4の2項記載のELISA法により測定した。
培養上清中に抗CCR4キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を上昇させ、最終的にMTXを200nmol/Lの濃度で含むHybridoma−SFM−FBS(5)培地で増殖可能かつ、抗CCR4キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、2回の限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンをKM2760#58−35−16と名付けた。
(2)CHO/DG44細胞を用いた生産細胞の作製
抗CCR4キメラ抗体発現ベクターpKANTEX2160の4μgを1.6×106細胞のCHO/DG44細胞へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、10mLのIMDM−dFBS(10)−HT(1)[dFBS(インビトロジェン社製)を10%、HT supplement(インビトロジェン社製)を1倍濃度で含むIMDM培地(インビトロジェン社製)]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(岩城硝子社製)に100μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、IMDM−dFBS(10)(dFBSを10%で含むIMDM培地)に培地交換し、1〜2週間培養した。HT非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗CCR4キメラ抗体の発現量を実施例4の2項記載のELISA法により測定した。
培養上清中に抗CCR4キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、MTXを50nmol/L含むIMDM−dFBS(10)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(岩城硝子社製)に0.5mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を200nmol/Lに上昇させ、最終的にMTXを200nmol/Lの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地で増殖可能かつ、抗CCR4キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株は5−03株と名付けた。
2.抗体のCCR4部分ペプチドに対する結合活性(ELISA法)
抗CCR4キメラ抗体が反応し得るヒトCCR4細胞外領域ペプチドとして化合物1(配列番号25)を選択した。ELISA法による活性測定に用いるため、以下の方法でBSA(ナカライテスク社製)とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、10mgのBSAを含むPBS溶液900mLに、100mLの25mg/mL SMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシリックアシッドN−ヒドロキシサクシンイミドエステル](シグマ社製)−DMSO溶液を攪拌しながら滴下し、30分間ゆっくりと攪拌した。25mLのPBSで平衡化したNAP−10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液1mLをアプライし、1.5mLのPBSで溶出させた溶出液をBSA−SMCC溶液とした(A280測定からBSA濃度を算出)。次に、0.5mgの化合物1に250mLPBSを加え、次いで250mL DMFを加えて完全に溶解させた後、前述のBSA−SMCC溶液(BSA換算1.25mg)を攪拌下で添加して3時間ゆっくり攪拌した。反応液をPBSに対して4℃、一晩透析し、最終濃度0.05%となるようにアジ化ナトリウムを添加して、0.22μmフィルターでろ過した後BSA−化合物1溶液とした。
96ウェルのELISA用プレート(グライナー社製)に、上述のように調製したコンジュゲートを0.05μg/mL、50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、形質転換株の培養上清を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで6000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(γ)抗体溶液(American Qualex社製)を二次抗体溶液として、50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、20分後に5%SDS溶液を50μL/ウェル加えて反応を停止した。その後OD415を測定した。実施例4の1項で得られた抗CCR4キメラ抗体は、CCR4に対する結合活性を示した。
3.抗CCR4キメラ抗体の精製
(1)YB2/0細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
実施例4の1項(1)で得られた抗CCR4キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンKM2760#58−35−16を200nmol/L MTX、Daigo’s GF21(和光純薬製)を5%の濃度で含むHybridoma−SFM(インビトロジェン社製)培地に2×105細胞/mLとなる様に懸濁し、スピナーボトル(岩城硝子社製)を用いて37℃の恒温室内でFed−Batch攪拌培養した。8−10日間培養して回収した培養上清より、Prosep−A(ミリポア社製)カラムおよびゲルろ過法を用いて、抗CCR4キメラ抗体を精製した。精製した抗CCR4キメラ抗体をKM2760−1と名づけた。
(2)CHO/DG44細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
実施例4の1項(2)で得られた抗CCR4キメラ抗体を生産する形質転換細胞株5−03株をIMDM−dFBS(10)培地中で、182cm2フラスコ(Greiner社製)にて5%CO2インキュベーター内で37℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、25mLのPBSバッファーにて細胞を洗浄後、EXCELL301培地(JRH社製)を35mL注入した。5%CO2インキュベーター内で37℃にて7日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(ミリポア社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗CCR4キメラ抗体を精製した。精製した抗CCR4キメラ抗体はKM3060と名付けた。
KM2760−1およびKM3060のCCR4に対する結合活性を実施例4の2項に記載のELISA法により測定した結果、同等の結合活性を示した。
4.精製した抗CCR4キメラ抗体の解析
実施例4の3項で得られた各種動物細胞で生産、精製した2種類の抗CCR4キメラ抗体の各4μgを公知の方法[ネイチャー(Nature),227,680(1970)]に従ってSDS−PAGEし、分子量および製精度を解析した。精製した各抗CCR4キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約150Kdの単一のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のH鎖およびL鎖のcDNAの塩基配列から推定される分子量(H鎖:約49Kd、L鎖:約23Kd、分子全体:約144Kd)とほぼ一致し、更に、IgG型の抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のS−S結合が切断され、約50Kdの分子量を持つH鎖と約25Kdの分子量を持つL鎖に分解されるという報告(アンティボディズ,Chapter 14、モノクローナル・アンティボディズ)と一致し、抗CCR4キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
5.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗CCR4キメラ抗体の調製
実施例4の3項で調製したYB2/0細胞由来の抗CCR4キメラ抗体KM2760−1とCHO/DG44細胞由来の抗CCR4キメラ抗体KM3060の糖鎖分析を、実施例3の1項に記載の方法に従って行なった。還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、KM2760−1は87%、KM3060は8%であった。以下、これらの試料を、抗CCR4キメラ抗体(87%)、抗CCR4キメラ抗体(8%)と表記する。
さらに、抗CCR4キメラ抗体(87%)と抗CCR4キメラ抗体(8%)を用い、抗CCR4キメラ抗体(87%):抗CCR4キメラ抗体(8%)=1:39、16:67、22:57、32:47、42:37の割合で混合した。これらの試料を実施例3の1項に記載の方法に従って糖鎖分析を行なった。還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、それぞれ9%、18%、27%、39%、46%であった。以下、これらの試料を抗CCR4キメラ抗体(9%)、抗CCR4キメラ抗体(18%)、抗CCR4キメラ抗体(27%)、抗CCR4キメラ抗体(39%)、抗CCR4キメラ抗体(46%)と表記する。
第8図には、各試料の糖鎖分析の結果を示した。還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、2回の結果を平均した値を用いた。
6.抗体のCCR4部分ペプチドに対する結合活性の評価(ELISA法)
実施例4の5項で調製した還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる6種類の抗CCR4キメラ抗体のCCR4部分ペプチドに対する結合活性は実施例4の2項に記載の方法に従って測定した。
その結果、第9図に示したように、6種類の抗CCR4キメラ抗体は、いずれも同等のCCR4に対する結合活性を示し、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、抗体の抗原結合活性に影響を与えないことが明らかとなった。
7.ヒトCCR4高発現細胞株に対するADCC活性の評価
抗CCR4キメラ抗体のヒトCCR4高発現細胞に対するADCC活性は、以下のようにして測定した。
(1)標的細胞溶液の調製
WO01/64754に記載のヒトCCR4を高発現しているCCR4/EL−4細胞の1.5×106細胞を調製し、放射性物質であるNa2 51CrO4を5.55MBq当量加えて37℃で1時間30分間反応させ、細胞を放射性物質標識した。反応後、培地を用いた懸濁および遠心分離操作により3回洗浄し、培地に再懸濁し、4℃で30分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、培地を7.5mL加え、2×105細胞/mLに調製し、標的細胞溶液とした。
(2)エフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血60mLを採取し、ヘパリンナトリウム(清水製薬社製)を0.6mLを加え穏やかに混ぜた。これをLymphoprep(AXIS SHIELD社製)を用いて使用説明書に従い、遠心分離(800g、20分間)して単核球層を分離した。培地で3回遠心分離(1400rpm、5分間)して洗浄後、培地を用いて5×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
(3)ADCC活性の測定
96ウェルU字底プレート(Falcon社製)の各ウェルに上記(1)で調製した標的細胞溶液の50μL(1×104細胞/ウェル)を分注した。次いで上記(2)で調製したエフェクター細胞溶液を100μL(5×105細胞/ウェル、ヒトエフェクター細胞と標的細胞の比は50:1となる)添加した。さらに、抗CCR4キメラ抗体を各最終濃度0.0001〜10μg/mLとなるように加え、37℃で4時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の51Cr量をγ−カウンターにて測定した。自然解離51Cr量は、ヒトエフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清中の51Cr量を測定することにより求めた。全解離51Cr量は、抗体溶液とヒトエフェクター細胞溶液の代わりに1mol/Lの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清中の51Cr量を測定することにより求めた。ADCC活性(%)は前記式(1)により求めた。
第10図および第11図には、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗CCR4キメラ抗体の各種濃度(0.001〜10μg/mL)におけるADCC活性を2名の健常人ドナー(A,B)のエフェクター細胞を用いて測定した結果をそれぞれ示した。第10図および第11図に示したように、抗CCR4キメラ抗体のADCC活性はいずれの抗体濃度においても還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合に比例して上昇する傾向を示した。抗体濃度が低ければ、ADCC活性は低下する。抗体濃度が0.01μg/mLでは、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖が27%、39%および46%のADCC活性はほぼ同様の高い活性を示したが、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖が20%未満の抗体では、ADCC活性は低かった。本結果は、エフェクター細胞のドナーが異なっても同様であった。
実施例5.宿主細胞株におけるα1,6−フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)遺伝子の転写産物の定量
1.各種細胞株由来一本鎖cDNAの調製
dhfr遺伝子を欠損したCHO/DG44細胞およびラットミエローマYB2/0細胞より、以下の手順で一本鎖cDNAを調製した。
CHO/DG44細胞を10%FBS(Life Technologies社製)および1倍濃度のHTsupplement(Life Technologies社製)を添加したIMDM培地(Life Technologies社製)に懸濁し、2×105個/mLの密度で接着細胞培養用T75フラスコ(Greiner社製)に15mL播種した。また、YB2/0細胞を10%FBS(Life Technologies社製)、4mmol/L L−Gln(Life Technologies社製)を添加したRPMI1640培地(Life Technologies社製)に懸濁し、2×105個/mLの密度で浮遊細胞培養用T75フラスコ(Greiner社製)に15mL播種した。これらを37℃の5%CO2インキュベーター内で培養し、培養1日目、2日目、3日目、4日目および5日目に各宿主細胞1×107個を回収後、RNAeasy(QIAGEN社製)により添付の説明書に従って全RNAを抽出した。
全RNAを45μLの滅菌水に溶解し、RQ1 RNase−Free DNase(Promega社製)1μL、付属の10×DNase buffer 5μL、RNasin Ribonuclease inhibitor(Promega社製)0.5μLをそれぞれに添加して、37℃で30分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムDNAを分解した。反応後、RNAeasy(QIAGEN社製)により全RNAを再精製し、50μLの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全RNA3μgに対し、SUPERSCRIPTTM Preamplification Systemfor First Strand cDNA Synthesis(Life Technologies社製)を用いて添付の説明書に従い、オリゴ(dT)をプライマーとした20μLの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖cDNAを合成した。各宿主細胞由来FUT8、β−アクチンのクローニングには該反応液の1倍濃度液を、競合的PCRによる各遺伝子転写量の定量には該反応液の50倍希釈水溶液を用い、各々使用するまで−80℃で保管した。
2.チャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の各cDNA部分断片の取得
チャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の各cDNA部分断片の取得は、以下の手順で行った(第12図)。
まず、ヒトFUT8のcDNA[ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),121,626,(1997)]およびブタFUT8のcDNA[ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.),271,27810,(1996)]に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー(配列番号4および配列番号5に示す)を設計した。
次にDNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いて、実施例5の1項で調製した培養2日目のCHO/DG44細胞由来cDNAおよびYB2/0細胞由来cDNAを各々1μLを含む25μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LdNTPs、0.5μmol/L上記遺伝子特異的プライマー(配列番号4および配列番号5)]を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応(以下、PCRと表記する)を行った。PCRは、94℃で1分間の加熱の後、94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で2分間からなる反応を1サイクルとして30サイクルの後、さらに72℃で10分間加熱する条件で行った。
PCR後、反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片979bpをGENECLEAN Spin Kit(BIO101社製)を用いて精製し、滅菌水10μLで溶出した(以下、アガロースゲルからのDNA断片の精製にはこの方法を用いた)。上記増幅断片4μLを、TOPO TA cloning Kit(Invitrogen社製)の説明書に従って、プラスミドpCR2.1へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌XL1−Blue株をコーエンらの方法[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),69,2110(1972)](以下、大腸菌の形質転換にはこの方法を用いた)により形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちcDNAが組み込まれた6クローンから、公知の方法[ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research),7,1513(1979)](以下、プラスミドの単離方法にはこの方法を用いた)に従って各々プラスミドDNAを単離した。
各プラスミドに挿入されたcDNAの塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Parkin Elmer社製)を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入cDNAがチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8(配列番号6および7に示す)のオープンリーディングフレーム(以下、ORFと表記する)部分配列をコードすることを確認した。このうちPCRに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドDNAを選択した。以下、各プラスミドをCHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1と称す。
3.チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンcDNAの取得
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの取得は、以下の手順で行った(第13図)。
まず、チャイニーズハムスターβ−アクチンゲノム配列(GenBank,U20114)およびラットβ−アクチンゲノム配列[ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research),11,1759(1983)]より、翻訳開始コドンを含む共通配列に特異的なフォワードプライマー(配列番号8に示す)および翻訳終止コドンを含む各配列特異的なリバースプライマー(配列番号9および配列番号10に示す)を設計した。
次にDNAポリメラーゼKOD(東洋紡績社製)を用いて、実施例5の1項で調製した培養2日目のCHO/DG44細胞由来cDNAおよびYB2/0細胞由来cDNA 1μLを含む25μLの反応液[1倍濃度のKOD buffer#1(東洋紡績社製)、0.2mmol/L dNTPs、1mmol/L MgCl2、0.4μmol/L上記遺伝子特異的プライマー(配列番号8および9、または配列番号8および10)、5%DMSO]を調製し、PCRを行った。PCRは、94℃で4分間の加熱の後、98℃で15秒間、65℃で2秒間、74℃で30秒間からなる反応を1サイクルとして、25サイクル行った。
PCR後、反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片1128bpを精製した。このDNA断片に対し、MEGALABEL(宝酒造社製)を用いて、添付の説明書に従い5’末端のリン酸化を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてDNA断片を回収し、滅菌水10μLに溶解した。
一方、プラスミドpBluescriptII KS(+)3μg(Stratagene社製)をNEBuffer2(New England Biolabs社製)35μLに溶解し、16単位の制限酵素EcoRV(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液にpH8.0の1mol/L Tris−HCl緩衝液35μLおよび大腸菌C15株由来Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)3.5μLを添加して65℃で30分間反応させることにより、DNA末端の脱リン酸化を行った。この反応液に対しフェノール/クロロホルム抽出処理の後、エタノール沈殿法を行い回収したDNA断片を滅菌水100μLに溶解した。
上記で得たチャイニーズハムスターcDNA由来増幅断片およびラットcDNA由来増幅断片(1192bp)4μL、プラスミドpBluescriptII KS(+)由来のEcoRV−EcoRV断片(約3.0Kb)1μL、Ligation High(東洋紡績社製)5μLを混合し、16℃で30分間反応させることにより連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌XL1−Blue株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。
各プラスミドに挿入されたcDNAの塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Parkin Elmer社製)を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入cDNAが、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各cDNAのORF全長配列をコードすることを確認した。このうちPCRに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドDNAを選択した。以下、各プラスミドをCHAc−pBSおよびYBAc−pBSと称す。
4.FUT8スタンダードおよび内部コントロールの調製
各細胞内のFUT8遺伝子由来mRNA転写量を測定するために、検量線に用いるスタンダードとして、実施例5の2項で得たチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の各cDNA部分断片をpCR2.1に組み込んだプラスミドであるCHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1を制限酵素EcoRIで切断し直鎖化したDNAを用いた。FUT8定量の内部コントロールとしては、CHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1のうち、チャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の内部塩基配列のScaI−HindIII間203bpを欠失させることにより得られたCHFT8d−pCR2.1およびYBFT8d−pCR2.1を、制限酵素EcoRIで切断し直鎖化したDNAを用いた。以下にその詳細を説明する。
チャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8のスタンダードの調製は次の手順で行った。プラスミドCHFT8−pCR2.1の2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、24単位の制限酵素EcoRI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。一方、プラスミドYBFT8−pCR2.1の2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、24単位の制限酵素EcoRI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8各cDNA部分断片を含むEcoRI−EcoRI断片(約1Kb)がプラスミドCHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1より分離されたことを確認した。各反応液より、1μg/mLパン酵母由来t−RNA(SIGMA社製)を用いて0.02fg/μL、0.2fg/μL、1fg/μL、2fg/μL、10fg/μL、20fg/μL、100fg/μLの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8のスタンダードとした。
チャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の内部コントロールの調製は次のように行った(第14図)。DNAポリメラーゼKOD(東洋紡績社製)を用いて、CHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1の5ngを含む25μLの反応液[1倍濃度のKOD buffer#1(東洋紡績社製)、0.2mmol/L dNTPs、1mmol/L MgCl2、0.4μmol/L遺伝子特異的プライマー(配列番号11および12)、5%DMSO]を調製し、PCRを行った。PCRは、94℃で4分間の加熱の後、98℃で15秒間、65℃で2秒間、74℃で30秒間からなる反応を1サイクルとして、25サイクル行った。PCR後、反応液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約4.7Kbを精製した。該DNA断片に対し、MEGALABEL(宝酒造社製)を用いて、添付の説明書に従い5’末端のリン酸化を行った後、反応液よりエタノール沈殿法を用いてDNA断片を回収し、滅菌水50μLに溶解した。上記で得たDNA断片(約4.7Kb)5μLおよびLigation High(東洋紡績社製)5μLを混合し、16℃で30分間反応させることにより自己環状化反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。各プラスミドDNAに対しDNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Parkin Elmer社製)を用いて配列決定を行い、同プラスミドに挿入されたチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の内部塩基配列ScaI−HindIII間203bpが欠失したことを確認した。得られた各プラスミドをCHFT8d−pCR2.1およびYBFT8d−pCR2.1と称す。
次にプラスミドCHFT8d−pCR2.1の2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、24単位の制限酵素EcoRI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。一方、プラスミドYBFT8d−pCR2.1の2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、24単位の制限酵素EcoRI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8部分断片の内部塩基配列203bpが欠失した断片を含むEcoRI−EcoRI断片(約800bp)がプラスミドCHFT8d−pCR2.1およびYBFT8d−pCR2.1より分離されたことを確認した。各反応液より、1μg/mLパン酵母由来t−RNA(SIGMA社製)を用いて2fg/μLの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の内部コントロールとした。
5.β−アクチンスタンダードおよび内部コントロールの調製
各宿主細胞内のβ−アクチン遺伝子由来mRNA転写量を測定するために、検量線に用いるスタンダードとして、実施例5の3項で得たチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各cDNAのORF全長をpBluescriptII KS(+)に組み込んだプラスミドであるCHAc−pBSおよびYBAc−pBSを、前者は制限酵素HindIIIおよびPstIで、後者は制限酵素HindIIIおよびKpnIで、各々切断し直鎖化したDNAを用いた。β−アクチン定量の内部コントロールとしては、CHAc−pBSおよびYBAc−pBSのうち、チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部塩基配列のDraIII−DraIII間180bpを欠失させることにより得られたCHAcd−pBSおよびYBAcd−pBSを、前者は制限酵素HindIIIおよびPstIで、後者は制限酵素HindIIIおよびKpnIで、切断し直鎖化したDNAを用いた。以下にその詳細を説明する。
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのスタンダードの調製は次の手順で行った。プラスミドCHAc−pBSの2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、25単位の制限酵素HindIII(宝酒造社製)および20単位のPstI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。一方、プラスミドYBAc−pBSの2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、25単位の制限酵素HindIII(宝酒造社製)および24単位のKpnI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各cDNA ORF全長を含むHindIII−PstI断片およびHindIII−KpnI断片(約1.2Kb)がプラスミドCHAc−pBSおよびYBAc−pBSより分離されたことを確認した。各反応液より、1μg/mLパン酵母由来t−RNA(SIGMA社製)を用いて2pg/μL、1pg/μL、200fg/μL、100fg/μL、20fg/μLの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのスタンダードとした。
チャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部コントロールの調製は次の手順で行った(第15図)。CHAc−pBSの2μgを100ng/μLBSA(New England Biolabs社製)を含むNEBuffer 3(New England Biolabs社製)100μLに溶解し、10単位の制限酵素DraIII(New England Biolabs)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてDNA断片を回収し、DNA Blunting Kit(宝酒造社製)を用い、添付の説明書に従ってDNA末端の平滑化を行った後、反応液を2等分した。まず一方の反応液には、pH8.0の1mol/L Tris−HCl緩衝液35μLおよび大腸菌C15株由来Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)3.5μLを添加し、65℃で30分間反応させることによりDNA末端の脱リン酸化を行った。脱リン酸化処理、フェノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿法を行い、回収したDNA断片を滅菌水10μLに溶解した。残る他方の反応液は0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、チャイニーズハムスターβ−アクチンORF部分断片を含む約1.1KbのDNA断片を精製した。
上記で得た脱リン酸化DraIII−DraIII断片0.5μL、約1.1KbのDraIII−DraIII断片4.5μL、Ligation High(東洋紡績社製)5μLを混合し、16℃で30分間反応させることにより連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。各プラスミドDNAに対しDNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Parkin Elmer社製)を用いて配列決定を行い、同プラスミドに挿入されたチャイニーズハムスターβ−アクチンDraIII−DraIII間180bpが欠失したことを確認した。本プラスミドをCHAcd−pBSと称す。
また、ラットβ−アクチンDraIII−DraIII間180bpが欠失したプラスミドをCHAcd−pBSと同様の工程を経て作製した。本プラスミドをYBAcd−pBSと称す。
次にプラスミドCHAcd−pBSの2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、25単位の制限酵素HindIII(宝酒造社製)および20単位のPstI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。一方、プラスミドYBAcd−pBS 2μgをNEBuffer 2(New England Biolabs社製)40μLに溶解し、25単位の制限酵素HindIII(宝酒造社製)および24単位のKpnI(宝酒造社製)を加えて37℃で3時間消化反応を行った。該反応液の一部を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、上記制限酵素消化反応によりチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチン各cDNA ORF全長の内部塩基配列180bpが欠失した断片を含むHindIII−PstI断片およびHindIII−KpnI断片(約1.0Kb)がプラスミドCHAcd−pBSおよびYBAcd−pBSより分離されたことを確認した。各反応液より、1μg/Lパン酵母由来t−RNA(SIGMA社製)を用いて200fg/μLの希釈液を調製し、これらをチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部コントロールとした。
6.競合的PCRによる転写量の定量
実施例5の4項で作製したFUT8内部コントロールDNAおよび実施例5の1項で得た宿主細胞株由来cDNAを鋳型として競合的PCRを行い、各鋳型に由来する増幅産物量の相対値より、宿主細胞株内のFUT8の転写産物の定量値を算出した。一方、β−アクチン遺伝子は各細胞において恒常的に転写されており、その転写量は細胞間で同程度と考えられているため、各宿主細胞株由来cDNA合成反応の効率の目安として、β−アクチン遺伝子の転写量を定量した。すなわち、実施例5の5項で作製したβ−アクチン内部コントロールDNAおよび実施例5の1項で得た宿主細胞株由来cDNAを鋳型としてPCRを行い、各鋳型に由来する増幅産物量の相対値より、宿主細胞株内のβ−アクチンの転写産物の定量値を算出した。以下にその詳細を説明する。
FUT8の転写産物の定量は次の手順で行った。まず、実施例5の2項で得たチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8 ORF部分配列の内部配列に対し、共通配列特異的なプライマーセット(配列番号13および14に示す)を設計した。
次に、実施例5の1項で得た各宿主細胞株由来のcDNA溶液の50倍希釈液5μLおよび内部コントロール用プラスミド5μL(10fg)を含む総体積20μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L上記遺伝子特異的プライマー(配列番号13および14)、5%DMSO]で、DNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いてPCRを行った。PCRは、94℃で3分間の加熱の後、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1分間からなる反応を1サイクルとして32サイクル行った。
また、各宿主細胞株由来cDNAに代えて、実施例5の4項で得たFUT8スタンダードプラスミド5μL(0.1fg、1fg、5fg、10fg、50fg、100fg、500fg、1pg)を添加した系でPCRを行い、FUT8転写量の検量線作成に用いた。
β−アクチンの転写産物の定量は次の手順で行った。まず、実施例5の3項で得たチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンORF全長の内部配列に対し、各遺伝子特異的なプライマーセット(前者を配列番号15および配列番号16に、後者を配列番号17および配列番号18に示す)をそれぞれ設計した。
次に、実施例5の1項で得られた各宿主細胞株由来のcDNA溶液の50倍希釈液5μLおよび内部コントロール用プラスミド5μL(1pg)を含む総体積20μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L上記遺伝子特異的プライマー(配列番号15および配列番号16、または配列番号17および配列番号18)、5%DMSO]で、DNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いてPCRを行った。PCRは、94℃で3分間の加熱の後、94℃で30秒間、65℃で1分間、72℃で2分間から成る反応を1サイクルとした17サイクルの条件で行った。
また、各宿主細胞株由来cDNAに代えて、実施例5の5項で得たβ−アクチンスタンダードプラスミド5μL(10pg、5pg、1pg、500fg、100fg)を添加した系でPCRをそれぞれ行い、β−アクチン転写量の検量線作成に用いた。
第1表に記載のプライマーセットを用いたPCRにより、各遺伝子転写産物および各スタンダードから第1表のターゲット欄に示したサイズのDNA断片を、各内部コントロールから第1表のコンペティター欄に示したサイズのDNA断片を増幅させることができる。
PCR後の溶液のうち、7μLを1.75%アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを1倍濃度のSYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular Probes社製)に30分間浸漬し染色した。増幅された各DNA断片の発光強度をフルオロイメージャー(FluorImager SI;Molecular Dynamics社製)で算出することにより、増幅されたDNA断片の量を測定した。
上記の方法により、スタンダードプラスミドを鋳型としたPCRによって生じた増幅産物量を測定し、その測定値とスタンダードプラスミド量をプロットして検量線を作成した。この検量線を用いて、各発現株由来全cDNAを鋳型とした場合の増幅産物の量より各株中の目的遺伝子cDNA量を算出し、これを各株におけるmRNA転写量とした。
ラットFUT8配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合の各宿主細胞株におけるFUT8転写産物の量を第16図に示した。培養期間を通じてCHO/DG44細胞株はYB2/0細胞株の10倍以上の転写量を示した。この傾向は、チャイニーズハムスターFUT8配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合にも認められた。
また、第2表にβ−アクチン転写産物の量との相対値としてFUT8転写量を示した。培養期間を通じてYB2/0細胞株のFUT8転写量がβ−アクチンの0.1%前後であるのに対し、CHO/DG44細胞株は0.5%〜2%であった。
以上の結果より、YB2/0細胞株のFUT8転写産物量はCHO/DG44細胞株のそれよりも有意に少ないことが示された。
実施例6.抗GD3キメラ抗体生産細胞株におけるFUT8遺伝子の転写物の定量
1.各種生産細胞株由来一本鎖cDNAの調製
抗GD3キメラ抗体生産細胞DCHI01−20株および61−33株より、以下の手順で一本鎖cDNAを調製した。DCHI01−20株は、実施例1の2項(2)記載のCHO/DG44細胞由来の形質転換クローンである。また61−33株は、YB2/0由来の形質転換細胞クローン7−9−51(独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、FERM BP−6691)に対し無血清馴化を行った後、2回の限界希釈法によるクローン化を行って得たクローンである。
DCHI01−20株を3mmol/L L−Gln(Life Technologies社製)、0.3%PLURONIC F−68(Life Technologies社製)および0.5%脂肪酸濃縮液(Life Technologies社製)を添加したEXCELL302培地(JRH BIOSCIENCES社製)に懸濁し、2×105個/mLの密度で浮遊細胞培養用T75フラスコ(Greiner社製)に15mL播種した。また、61−33株を0.2%BSAを添加したHybridoma−SFM培地(Life Technologie社製)に懸濁し、2×105個/mLの密度で浮遊細胞培養用T75フラスコ(Greiner社製)に15mL播種した。これらを37℃の5%CO2インキュベーター内で培養し、培養1日目、2日目、3日目、4日目および5日目に各宿主細胞1×107個を回収し、RNAeasy(QIAGEN社製)により添付の説明書に従って全RNAを抽出した。
全RNAを45μLの滅菌水に溶解し、RQ1 RNase−Free DNase(Promega社製)1μ属の10×DNase buffer 5μL、RNasin Ribonuclease inhibitor(Promega社製)0.5μLをそれぞれに添加して、37℃で30分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムDNAを分解した。反応後、RNAeasy(QIAGEN社製)により全RNAを再精製し、50μLの滅菌水に溶解した。
得られた全RNA3μgに対し、SUPERSCRIPTTMPreamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Life Technologies社製)を用いて添付の説明書に従い、オリゴ(dT)をプライマーとした20μLの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖cDNAを合成した。該反応液を水で50倍希釈し、使用するまで−80℃で保管した。
2.競合的PCRによる各遺伝子転写量の定量
実施例6の1項で得た抗体生産細胞株由来cDNAに対し、実施例5の6項に準じて競合的PCRによる各遺伝子転写量の定量を行った。
各生産細胞株内のFUT8遺伝子由来のmRNA転写量の定量は、以下の手順で行った。
FUT8転写量の定量の際に検量線に用いるスタンダードとして、実施例5の2項で得たチャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8のcDNA部分断片をpCR2.1に組み込んだプラスミドであるCHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1を制限酵素EcoRIで切断し直鎖化したDNAを用いた。
FUT8定量の内部コントロールとしては、実施例5の4項で調製したCHFT8d−pCR2.1およびYBFT8d−pCR2.1のうち、チャイニーズハムスターFUT8およびラットFUT8の内部塩基配列のScaI−HindIII間203bpを欠失させることにより得られたCHFT8d−pCR2.1およびYBFT8d−pCR2.1を、制限酵素EcoRIで切断し直鎖化したDNAを用いた。
実施例6の1項で得た各生産細胞株由来のcDNA溶液の50倍希釈液5μLおよび内部コントロール用プラスミド5μL(10fg)を含む総体積20μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L FUT8遺伝子特異的プライマー(配列番号13および14)、5%DMSO]で、DNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いてPCRを行った。PCRは、94℃で3分間の加熱の後、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1分間からなる反応を1サイクルとして32サイクル行った。
また、各生産細胞株由来cDNAに代えて、FUT8スタンダードプラスミド5μL(0.1fg、1fg、5fg、10fg、50fg、100fg、500fg、1pg)を添加した系でPCRを行い、FUT8転写量の検量線作成に用いた。尚、スタンダードプラスミドの希釈には1μg/mLパン酵母由来t−RNA(SIGMA社製)を用いた。
一方、β−アクチン遺伝子は各細胞において恒常的に転写されており、その転写量は細胞間で同程度と考えられているため、各生産細胞株由来cDNA合成反応の効率の目安として、β−アクチン遺伝子の転写量を以下の手順で定量した。
β−アクチン遺伝子転写量の定量の際に検量線に用いるスタンダードとして、実施例5の3項で調製したチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンのcDNAのORF全長をpBluescriptII KS(+)に組み込んだプラスミドであるCHAc−pBSおよびYBAc−pBSを制限酵素HindIIIおよびKpnIで切断し直鎖化したDNAを用いた。
β−アクチン定量の内部コントロールとしては、実施例5の5項で調製した、CHAc−pBSおよびYBAc−pBSのうちチャイニーズハムスターβ−アクチンおよびラットβ−アクチンの内部塩基配列のDraIII−DraIII間180bpを欠失させることにより得られたCHAcd−pBSおよびYBAcd−pBSを、制限酵素HindIIIおよびKpnIで切断し直鎖化したDNAを用いた。
上記で得た各生産細胞株由来のcDNA溶液の50倍希釈液5μLおよび内部コントロール用プラスミド5μL(1pg)を含む総体積20μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L β−アクチン特異的プライマー(配列番号17および18)、5%DMSO]で、DNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いてPCRを行った。PCRは、94℃で3分間の加熱の後、94℃で30秒間、65℃で1分間、72℃で2分間から成る反応を1サイクルとした17サイクルの条件で行った。また、各生産細胞株由来cDNAに代えて、β−アクチンスタンダードプラスミド10pg、5pg、1pg、500fg、100fgを添加した系でPCRをそれぞれ行い、β−アクチン転写量の検量線作成に用いた。尚、スタンダードプラスミドの希釈には1μg/mLパン酵母由来t−RNA(SIGMA社製)を用いた。
第1表に記載のプライマーセットを用いたPCRにより、各遺伝子転写産物および各スタンダードから第1表のターゲット欄に示したサイズのDNA断片を、各内部コントロールから第1表のコンペティター欄に示したサイズのDNA断片を増幅させることができる。
PCR後の溶液のうち、7μLを1.75%アガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルを1倍濃度のSYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain(Molecular Probes社製)に30分間浸漬し染色した。増幅された各DNA断片の発光強度をフルオロイメージャー(FluorImager SI;Molecular Dynamics社製)で算出することにより、増幅されたDNA断片の量を測定した。
上記の方法により、スタンダードプラスミドを鋳型としたPCRによって生じた増幅産物量を測定し、その測定値とスタンダードプラスミド量をプロットして検量線を作成した。この検量線を用いて、各生産細胞株由来全cDNAを鋳型とした場合の増幅産物の量より各株中の目的遺伝子cDNA量を算出し、これを各株におけるmRNA転写量とした。
第3表にβ−アクチン転写産物の量との相対値としてFUT8転写量を示した。培養期間を通じて、YB2/0細胞由来抗体生産株61−33株のFUT8転写量がβ−アクチンの0.3%以下であるのに対し、CHO細胞由来抗体生産株DCHI01−20株は0.7〜1.5%であった。この結果より、YB2/0細胞由来抗体生産株のFUT8転写産物量はCHO細胞由来抗体生産株のそれよりも有意に少ないことが示された。
実施例7.レクチン耐性CHO/DG44細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生産
1.レクチン耐性CHO/DG44株の取得
CHO/DG44細胞を、IMDM−FBS(10)−HT(1)培地[FBSを10%、HT supplement(GIBCO BRL社製)を1倍濃度含むIMDM培地]にて接着培養用フラスコ75cm2(グライナー社製)中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。5mLのPBS(インビトロジェン社製)にて細胞を洗浄後、PBSで希釈した0.05%トリプシン(インビトロジェン社製)を1.5mL添加して37℃にて5分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心操作により回収し、1(105細胞/mLの密度になるようにIMDM−FBS(10)−HT(1)培地を添加して懸濁後、未添加または0.1μg/mLのアルキル化剤であるN−methyl−N’−nitro−N−nitrosoguanidin(以下、MNNGと表記、Sigma社製)を添加した。CO2インキュベータ(TABAI製)内で37℃にて3日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、IMDM−FBS(10)−HT(1)培地に懸濁後、接着培養用96ウェルプレート(岩城硝子社製)に1×103細胞/ウエルの密度で播種した。各ウエルには培地中終濃度で1mg/mLのレンズマメ凝集素(Lensculinaris agglutinin;以下、LCAと表記、Vector社製)、あるいは1mg/mLのヒイロチャワンタケ凝集素(Aleuria aurantia Lectin;以下、AALと表記、Vector社製)、あるいは1mg/mLのインゲンマメ凝集素(Phaseolus vulgarisLeucoagglutinin;以下、L−PHAと表記、Vector社製)を添加した。CO2インキュベータ内で37℃にて2週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性CHO/DG44株として取得した。取得したそれぞれのレクチン耐性CHO/DG44株については、LCA耐性株をCHO−LCA株、AAL耐性株をCHO−AAL株、L−PHA耐性株をCHO−PHA株と名付けた。取得したこれら株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、CHO−LCA株はAALに対しても耐性であり、CHO−AAL株はLCAに対しても耐性であることが分かった。さらに、CHO−LCA株およびCHO−AAL株は、LCAやAALが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、N−グリコシド結合糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミン残基の1位とフコースの6位がα結合で付加された糖鎖構造を認識するレクチンに対しても耐性を示した。具体的には、終濃度1mg/mLのエンドウマメ凝集素(Pisum sativum Agglutinin;以下、PSAと表記、Vector社製)が添加された培地でもCHO−LCA株およびCHO−AAL株は耐性を示し生存することが分かった。また、アルキル化剤MNNG無添加の場合でも、上述の処理を施す細胞数を増やすことでレクチン耐性株を取得することが可能であった。以後、これら株を解析に用いた。
2.抗CCR4キメラ抗体生産細胞の作製
実施例7の1項で得られた3種類のレクチン耐性株に、実施例4に記載した方法で、抗CCR4キメラ抗体発現プラスミドpKANTEX2160を導入し、薬剤MTXによる遺伝子増幅を行い、抗CCR4キメラ抗体生産株を作製した。抗体発現量の測定は実施例4の2項に記載したELISA法を用いて行い、CHO−LCA株、CHO−AAL株、CHO−PHA株、それぞれから抗体を発現した形質転換株を取得した。取得したそれぞれの形質転換株については、CHO−LCA株由来の形質転換株をCHO/CCR4−LCA株、CHO−AAL株由来の形質転換株をCHO/CCR4−AAL株、CHO−PHA株由来の形質転換株をCHO/CCR4−PHA株と名付けた。なおCHO/CCR4−LCA株はNega−13の株名で、平成13年9月26日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6)にFERM BP−7756として寄託されている。
3.レクチン耐性CHO細胞による高ADCC活性抗体の生産
実施例7の2項で得られた3種類の形質転換株を用い、実施例4の3項に記載した方法で精製抗体を取得した。精製した抗CCR4キメラ抗体の抗原結合活性は実施例4の2項に記載したELISA法を用いて評価した。いずれの形質転換株が生産する抗体も、実施例4で作製した通常のCHO/DG44細胞を宿主とした生産株5−03株が生産する抗体と同等の抗原結合活性を示した。それら精製抗体を用い、実施例4の7項に記載した方法に従って各抗CCR4キメラ抗体のADCC活性を評価した。その結果を第17図に示した。5−03株が生産した抗体と比較して、CHO/CCR4−LCA株およびCHO/CCR4−AAL株が生産した抗体では、約100倍程度のADCC活性の上昇が観察された。一方、CHO/CCR4−PHA株が生産した抗体では有意なADCC活性の上昇は観察されなかった。また、CHO/CCR4−LCA株とYB2/0細胞由来の生産株が生産した抗体のADCC活性を実施例4の7項に記載した方法に従って比較したところ、CHO/CCR4−LCA株が生産した抗体は実施例4の1項で作製したYB2/0細胞由来生産株が生産した抗体KM2760−1と同様の高いADCC活性を示すことが明らかとなった(第18図)。
4.レクチン耐性CHO細胞が生産する抗体の糖鎖分析
実施例7の3項で精製した抗CCR4キメラ抗体の糖鎖分析を実施例3の1項に記載の方法に従って行った。第19図に各種抗CCR4キメラ抗体の精製PA化糖鎖群の溶離図を示した。
第4表には、各種レクチン耐性株が生産した抗CCR4キメラ抗体の糖鎖分析の結果得られた還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合(%)を示す。
5−03株が生産した抗体と比較して、CHO/CCR4−LCA株が生産した抗体では、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が、9%から48%まで上昇していた。CHO/CCR4−AAL株が生産した抗体では、α1,6−フコースを持たない糖鎖の割合が、9%から27%まで上昇していた。一方、CHO/CCR4−PHA株では5−03株と比較して、糖鎖パターンおよびα1,6−フコースを持たない糖鎖の割合に殆ど変化は認められなかった。
実施例8.レクチン耐性CHO細胞株の解析
1.抗CCR4キメラ抗体生産CHO/CCR4−LCA株におけるGMD酵素の発現量解析
実施例7で取得した抗CCR4キメラ抗体生産CHO/CCR4−LCA株における、フコース生合成酵素として知られるGMD、GFPP、FX、およびフコース転移酵素であるFUT8の各遺伝子の発現量を、RT−PCR法を用いて解析した。
(1)各種細胞株からのRNA調製
CHO/DG44細胞、実施例4の1項(2)で取得した抗CCR4キメラ抗体生産細胞株5−03株、実施例7の2項で取得した抗CCR4キメラ抗体生産細胞株CHO/CCR4−LCA株をそれぞれ37℃の5%CO2インキュベーター内にて継代後4日間培養した。培養後、RNeasy Protect Mini kit(キアゲン社製)を用いて、各1×107細胞より添付の使用説明書に従ってRNAを調製した。続いて、SUPER SCRIPT First−Strand synthesis system for RT−PCR(GIBCO BRL社製)を用い、添付の使用説明書に従って各RNA5μgより20μLの反応液中にて一本鎖cDNAを合成した。
(2)RT−PCR法を用いたGMD遺伝子の発現量解析
GMD cDNAをPCR法によって増幅するために、参考例2の1項で示すCHO細胞由来GMD cDNA配列より、配列番号32で示される塩基配列を有する24merの合成DNAプライマーと配列番号33で示される塩基配列を有する26merの合成DNAプライマーを作製した。
続いて、実施例8の1項(1)で作製した各細胞株由来の一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号32と33の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。上記の該PCR反応液10μLをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン(BMA社製)を用いてDNA断片を染色し、予想される約350bpのDNA断片量をFluor Imager SI(モレキュラーダイナミクス社製)を用いて測定した。
(3)RT−PCR法を用いたGFPP遺伝子の発現量解析
GFPP cDNAをPCR法によって増幅するために、参考例1の2項で取得したCHO細胞由来GFPPのcDNA配列に基づいて、配列番号34で示される塩基配列を有する27merの合成DNAプライマーと配列番号35で示される塩基配列を有する23merの合成DNAプライマーを作製した。
続いて、実施例8の1項(1)で作製した各細胞株由来の一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号34と35の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを24サイクル行なった。上記の該PCR反応液10μLをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン(BMA社製)を用いてDNA断片を染色し、予想される約600bpのDNA断片量をFluor Imager SI(モレキュラーダイナミクス社製)を用いて測定した。
(4)RT−PCR法を用いたFX遺伝子の発現量解析
FX cDNAをPCR法によって増幅するために、参考例1の1項で取得したCHO細胞由来FXのcDNA配列に基づいて、配列番号36で示される塩基配列を有する28merの合成DNAプライマーと配列番号37で示される塩基配列を有する28merの合成DNAプライマーを作製した。
続いて、実施例8の1項(1)で作製した各細胞株由来の一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号36と37の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを22サイクル行なった。上記の該PCR反応液10μLをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン(BMA社製)を用いてDNA断片を染色し、予想される約300bpのDNA断片量をFluor Imager SI(モレキュラーダイナミクス社製)を用いて測定した。
(5)RT−PCR法を用いたFUT8遺伝子の発現量解析
FUT8 cDNAをPCR法によって増幅するために、実施例8の1項(1)で作製した各細胞株由来の一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taqpolymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号13と14の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを20サイクル行なった。上記の該PCR反応液10μLをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン(BMA社製)を用いてDNA断片を染色し、予想される約600bpのDNA断片量をFluor Imager SI(モレキュラーダイナミクス社製)を用いて測定した。
(6)RT−PCR法を用いたβ−アクチン遺伝子の発現量解析
β−アクチンcDNAをPCR法によって増幅するために、実施例8の1項(1)で作製した各細胞株由来の一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taqpolymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号15と16の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後、94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを14サイクル行なった。上記の該PCR反応液10μLをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン(BMA社製)を用いてDNA断片を染色し、予想される約800bpのDNA断片量をFluor Imager SI(モレキュラーダイナミクス社製)を用いて測定した。
(7)各細胞株におけるGMD、GFPP、FX、FUT8遺伝子の発現量
実施例8の1項(2)から(6)で測定した各細胞株におけるGMD、GFPP、FX、FUT8cDNA由来PCR増幅断片量の値を、各細胞株におけるβ−アクチンのcDNA由来PCR増幅断片量の値で割り、CHO/DG44細胞におけるPCR増幅断片量を1とした場合の5−03株およびCHO/CCR4−LCA株における各遺伝子のPCR増幅断片量を求めた。結果を第5表に示す。
第5表で示したようにCHO/CCR4−LCA株のGMD遺伝子の発現量が他の細胞株と比べ1/10程度に低下していた。なお、本実験は独立して2回行い、その平均値を使用した。
2.GMD遺伝子を強制発現させた抗CCR4キメラ抗体生産CHO/CCR4−LCA株を用いた解析
(1)CHO細胞由来GMD遺伝子発現ベクターpAGE249GMDの構築
参考例2の1項で取得したCHO細胞由来GMDのcDNA配列に基づいて、配列番号38で示される塩基配列を有する28merのプライマー、および配列番号39で示される塩基配列を有する29merのプライマーを作製した。続いて、実施例8の1項(1)で作製したCHO細胞由来一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号38と39の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、58℃にて1分間、72℃にて1分間のサイクルを8サイクル反復した後、さらに94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを22サイクル反復した。反応終了後、該PCR反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約600bpのDNA断片を回収した。回収したDNA断片はDNALigation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミドmt−Cを得た(第20図)。
次に、参考例2の1項で取得したCHO細胞由来GMDのcDNA配列に基づいて、配列番号40で示される塩基配列を有する45merのプライマー、および配列番号41で示される塩基配列を有する31merのプライマーを作製した。続いて、実施例8の1項(1)で作製したCHO細胞由来一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号40と41の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、57℃にて1分間、72℃にて1分間のサイクルを8サイクル反復した後、さらに94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを22サイクル反復した。反応終了後、該PCR反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約150pのDNA断片を回収した。回収したDNA断片はDNALigation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミドATGを得た(第21図)。
次に、参考例2の1項に記載のプラスミドCHO−GMDの3μgを制限酵素SacI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってDNAを回収し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画後、約900bpのDNA断片を回収した。上記で得られたプラスミドmt−Cの1.4μgを制限酵素SacI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってDNAを回収し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約3.1kbpのDNA断片を回収した。それぞれ回収したDNA断片をDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、プラスミドWT−N(−)を得た(第22図)。
次に、プラスミドWT−N(−)の2μgを制限酵素BamHI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってDNAを回収し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約1kbpのDNA断片を回収した。プラスミドpBluescriptSK(−)(Stratagene社製)の3μgを制限酵素BamHI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってDNAを回収し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約3kbpのDNA断片を回収した。それぞれ回収したDNA断片をDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、プラスミドWT−N(−)inpBSを得た(第23図)。
次に、プラスミドWT−N(−)in pBSの2μgを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってDNAを回収し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約4kbpのDNA断片を回収した。上記で得られたプラスミドATGの2μgを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行なってDNAを回収し、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約150bpのDNA断片を回収した。それぞれ回収したDNA断片をDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、プラスミドWT in pBSを得た(第24図)。
次に、プラスミドpAGE249の2μgを制限酵素HindIIIとBamHI(共に宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約6.5kbpのDNA断片を回収した。プラスミドWT in pBSの2μgを制限酵素HindIIIとBamHI(共に宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約1.2kbpのDNA断片を回収した。それぞれ回収したDNA断片をDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、プラスミドpAGE249GMDを得た(第25図)。
(2)CHO/CCR4−LCA株におけるGMD遺伝子の安定発現
制限酵素FspI(NEW ENGLAND BIOLABS社製)で切断することにより直鎖状としたCHO細胞由来GMD遺伝子発現ベクターpAGE249GMDの5μg、1.6×106細胞のCHO/CCR4−LCA株へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、MTX(SIGMA社製)を200nmol/Lの濃度で含む30mLのIMDM−dFBS(10)培地[10%dFBSを含むIMDM培地(GIBCO BRL社製)]に懸濁し、182cm2フラスコ(Greiner社製)にて37℃の5%CO2インキュベーター内で24時間培養した。培養後、ハイグロマイシンを0.5mg/mL、MTX(SIGMA社製)を200nmol/Lの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地に培地交換してさらに19日間培養し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株のコロニー群を取得した。
また同様に、pAGE249ベクターを上記と同じ方法でCHO/CCR4−LCA株へ導入し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株のコロニー群を取得した。
(3)GMD遺伝子を発現させたCHO/CCR4−LCA株の培養および抗体の精製
実施例8の2項(2)で取得したGMDを発現している形質転換細胞群をMTX(SUGMA社製)を200nmol/L、ハイグロマイシンを0.5mg/mLの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地を用いて、182cm2フラスコ(Greiner社製)にて37℃の5%CO2インキュベーター内で培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、25mLのPBS(GIBCO BRL社製)にて細胞を洗浄後、EXCELL301培地(JRH社製)を35mL注入した。37℃の5%CO2インキュベーター内で7日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(ミリポア社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗CCR4キメラ抗体を精製した。
また同様に、pAGE249ベクターを導入した形質転換細胞群を上記と同じ方法で培養後、培養上清より抗CCR4キメラ抗体を回収、精製した。
(4)形質転換細胞群におけるレクチン耐性度の測定
実施例8の2項(2)で取得したGMD遺伝子を発現している形質転換細胞群を、MTX(SUGMA社製)を200nmol/L、ハイグロマイシンを0.5mg/mLの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地に6×104細胞/mLになるように懸濁し、96ウェル培養用プレート(岩城硝子社製)に50μL/ウェルずつ分注した。続いて、このウェルにMTX(SUGMA社製)を200nmol/L、ハイグロマイシンを0.5mg/mLの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地に0mg/mL、0.4mg/mL、1.6mg/mL、4mg/mLの濃度でLCA(LENSCULINARIS AGGLUTININ:Vector Laboratories社製)を添加した培地を50μLずつ加え、37℃の5%CO2インキュベーター内で96時間培養した。培養後、WST−1(ベーリンガー社製)を10μL/ウェルになるよう加え、37℃の5%CO2インキュベーター内で30分間放置して発色させたのち、マイクロプレートリーダー(BIO−RAD社製)にて450nmと595nmの吸光度(以下OD450、OD595と表記する)を測定した。また同様に、pAGE249ベクターを導入した形質転換細胞群も上記と同じ方法で測定した。以上の実験は独立して2回行なった。
上記で測定したOD450からOD595を引いた値を各細胞群の生存数とし、LCAを加えていないウェルの細胞生存数を100%とした場合の各ウェルの細胞生存数を%で表記し第26図に示した。第26図に示したように、GMDを発現させたCHO/CCR4−LCA株ではLCA耐性度の低下が観察され、0.2mg/mLのLCA存在下での細胞生存率は約40%、0.8mg/mLのLCA存在下での細胞生存率は約20%であった。一方、pAGE249ベクターを導入したCHO/CCR4−LCA株では、0.2mg/mLのLCA存在下での細胞生存率は100%、0.8mg/mLのLCA存在下においても細胞生存率は約80%であった。以上の結果より、CHO/CCR4−LCA株はGMD遺伝子の発現量が低下しており、その結果LCAに対する耐性を獲得していることが示唆された。
(5)GMDを発現させたCHO/CCR4−LCA株より取得した抗CCR4キメラ抗体のADCC活性
実施例8の2項(3)で得られた精製抗CCR4キメラ抗体のADCC活性を以下に示す方法に従い、測定した。
i)標的細胞溶液の調製
WO01/64754に記載のCCR4/EL−4細胞の1×106細胞を調製し、放射性物質であるNa2 51CrO4を3.7MBq当量加えて37℃で90分間反応させ、細胞を放射線標識した。反応後、RPMI1640−FBS(10)培地で懸濁および遠心分離操作により3回洗浄し、培地に再懸濁し、4℃で30分間氷中に放置して放射性物質を自然解離させた。遠心分離後、RPMI1640−FBS(10)培地を5mL加え、2.0×105細胞/mLに調製し、標的細胞溶液とした。
ii)エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血50mLを採取し、ヘパリンナトリウム(武田薬品社製)0.5mLを加え穏やかに混ぜた。これをLymphoprep(Nycomed Pharma AS社製)を用いて使用説明書に従い、遠心分離して単核球層を分離した。RPMI1640−FBS(10)培地で3回遠心分離して洗浄後、培地を用いて2.5×106細胞/mLの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
iii)ADCC活性の測定
96ウェルU字底プレート(Falcon社製)の各ウェルに上記i)で調製した標的細胞溶液の50μL(1×104細胞/ウェル)を分注した。次いでii)で調製したエフェクター細胞溶液を100μL(2.5×105細胞/ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は25:1となる)添加した。更に、各種抗CCR4キメラ抗体を最終濃度0.0025〜2.5μg/mLとなるように加え、37℃で4時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清の51Cr量をγ−カウンターにて測定した。自然解離51Cr量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清の51Cr量を測定することにより求めた。全解離51Cr量は、抗体溶液の代わりに培地のみを、エフェクター細胞溶液の代わりに1mol/Lの塩酸溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清の51Cr量を測定することにより求めた。ADCC活性は前記式(1)により求めた。
ADCC活性測定の結果を第27図に示した。第27図に示したように、GMDを発現させたCHO/CCR4−LCA株より取得した精製抗CCR4キメラ抗体のADCC活性は、実施例4で取得した通常のCHO細胞由来の生産株が生産したKM3060と同程度にまで低下していた。一方、pAGE249ベクターを導入したCHO/CCR4−LCA株より取得した精製抗CCR4キメラ抗体のADCC活性は、CHO/CCR4−LCA株より取得した精製抗CCR4キメラ抗体と同程度のADCC活性を有していた。以上の結果より、CHO/CCR4−LCA株はGMD遺伝子の発現量が低下しており、その結果ADCC活性の高い抗体を生産出来ることが示唆された。
(6)GMDを発現させたCHO/CCR4−LCA株由来の抗CCR4キメラ抗体の糖鎖分析
実施例8の2項(3)で得られた精製抗CCR4キメラ抗体の糖鎖分析を実施例3の1項に示す方法に従って行ない、その解析結果を第28図に示した。実施例7で作製したCHO/CCR4−LCA株より取得した精製抗CCR4キメラ抗体と比較して、GMD遺伝子を発現させたCHO/CCR4−LCA株より取得した精製抗CCR4キメラ抗体では、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が9%に低下していた。以上より、CHO/CCR4−LCA株にGMD遺伝子を発現させることによって、該細胞の生産する抗体の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が5−03株の生産する抗体と同程度まで低下することが示された。
実施例9.抗線維芽細胞増殖因子−8ヒト型キメラ抗体の作製
1.抗線維芽細胞増殖因子−8ヒト型キメラ抗体の安定生産細胞の作製
参考例3に記載の抗線維芽細胞増殖因子−8(以下、FGF−8と表記する)ヒト型キメラ抗体のタンデム型発現ベクターpKANTEX1334を用いて抗FGF−8ヒト型キメラ抗体(以下、抗FGF−8キメラ抗体と表記する)の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
(1)ラットミエローマYB2/0細胞を用いた生産細胞の作製
抗FGF−8キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334の10μgを4×106細胞のラットミエローマYB2/0細胞(ATCC CRL1662)へエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、40mLのHybridoma−SFM−FBS(5)[FBS(PAAラボラトリーズ社製)を5%含むHybridoma−SFM培地(インビトロジェン社製)]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗FGF−8キメラ抗体の抗原結合活性を実施例9の2項記載のELISA法により測定した。
培養上清中に抗FGF−8キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、DHFRの阻害剤であるMTX(SIGMA社製)を50nmol/L含むHybridoma−SFM−FBS(5)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に1mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗FGF−8キメラ抗体の抗原結合活性を実施例9の2項記載のELISA法により測定した。
培養上清中に抗FGF−8キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むHybridoma−SFM−FBS(5)培地で増殖可能かつ、抗FGF−8キメラ抗体を高生産する形質転換株5−Dを得た。得られた形質転換株について、限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンを5−D−10と名付けた。
(2)CHO/DG44細胞を用いた生産細胞の作製
実施例4に記載した方法に従い、抗FGF−8キメラ抗体発現プラスミドpKANTEX1334をCHO/DG44細胞に導入し、薬剤MTXによる遺伝子増幅を行い、抗FGF−8キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。抗体発現量の測定は実施例9の2項に記載したELISA法を用いて行いった。得られた形質転換株について、2回の限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンを7−D−1−5と名付けた。
2.抗体のFGF−8部分ペプチドに対する結合活性(ELISA法)
抗FGF−8キメラ抗体が反応し得るヒトFGF−8ペプチドとして化合物2(配列番号21)を選択した。ELISA法による活性測定に用いるため、以下の方法でBSA(ナカライテスク社製)とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、10mgのBSAを含むPBS溶液900mLに、100mLの25mg/mL SMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシリックアシッドN−ヒドロキシサクシンイミドエステル](シグマ社製)−DMSO溶液を攪拌しながら滴下し、30分間ゆっくりと攪拌した。25mLのPBSで平衡化したNAP−10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液1mLをアプライし、1.5mLのPBSで溶出させた溶出液をBSA−SMCC溶液とした(A280測定からBSA濃度を算出)。次に、0.5mgの化合物2に250mL PBSを加え、次いで250mL DMFを加えて完全に溶解させた後、前述のBSA−SMCC溶液(BSA換算1.25mg)を攪拌下で添加して3時間ゆっくり攪拌した。反応液をPBSに対して4℃、一晩透析し、最終濃度0.05%となるようにアジ化ナトリウムを添加して、0.22μmフィルターでろ過した後BSA−化合物2溶液とした。
96ウェルのELISA用プレート(グライナー社製)に、上述のように調製したコンジュゲートを1μg/mL、50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、形質転換株の培養上清あるいは精製抗体を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで3000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(γ)抗体溶液(American Qualex社製)を二次抗体溶液として、50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、10分後に5%SDS溶液を50μL/ウェル加えて反応を停止した。その後OD415を測定した。
3.抗FGF−8キメラ抗体の精製
(1)YB2/0細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
実施例9の1項(1)で得られた抗FGF−8キメラ抗体を発現する形質転換株5−Dを200nmol/L MTX、Daigo’s GF21(和光純薬製)を5%の濃度で含むHybridoma−SFM(インビトロジェン社製)培地中で、182cm2フラスコ(Greiner社製)にて5%CO2インキュベーター内で37℃にて培養した。8−10日間培養して回収した培養上清より、Prosep−A(ミリポア社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗FGF−8キメラ抗体を精製した。精製した抗FGF−8キメラ抗体をYB2/0−FGF8キメラ抗体と名付けた。
(2)CHO/DG44細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
実施例9の1項(2)で得られた抗FGF−8キメラ抗体を生産する形質転換細胞クローン7−D−1−5をIMDM−dFBS(10)培地中で、182cm2フラスコ(Greiner社製)にて5%CO2インキュベーター内で37℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、25mLのPBSバッファーにて細胞を洗浄後、EXCELL301培地(JRH社製)を35mL注入した。5%CO2インキュベーター内で37℃にて7日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりProsep−A(ミリポア社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗FGF−8キメラ抗体を精製した。精製した抗FGF−8キメラ抗体はCHO−FGF8キメラ抗体と名付けた。
YB2/0−FGF8キメラ抗体およびCHO−FGF8キメラ抗体のFGF−8に対する結合活性を実施例9の2項に記載のELISA法により測定した結果、同等の結合活性を示した。
4.精製した抗FGF−8キメラ抗体の解析
実施例9の3項で得られた各種動物細胞で生産、精製した2種類の抗FGF−8キメラ抗体の各4μgを公知の方法[ネイチャー(Nature),227,680(1970)]に従ってSDS−PAGEし、分子量および製精度を解析した。精製した各抗FGF−8キメラ抗体は、いずれも非還元条件下では分子量が約150Kdの単一のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、抗体のH鎖およびL鎖のcDNAの塩基配列から推定される分子量(H鎖:約49Kd、L鎖:約23Kd、分子全体:約144Kd)とほぼ一致し、更に、IgG型の抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のS−S結合が切断され、約50Kdの分子量を持つH鎖と約25Kdの分子量を持つL鎖に分解されるという報告(アンティボディズ,Chapter 14、モノクローナル・アンティボディズ)と一致し、抗FGF−8キメラ抗体が正しい構造の抗体分子として発現され、かつ精製されたことが確認された。
5.精製した抗FGF−8キメラ抗体の糖鎖分析
実施例9の4項で調製したYB2/0細胞由来の抗FGF−8キメラ抗体であるYB2/0−FGF8キメラ抗体とCHO/DG44細胞由来の抗FGF−8キメラ抗体であるCHO−FGF8キメラ抗体の糖鎖分析を、実施例3の1項に記載の方法に従って行なった。その結果、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は、YB2/0−FGF8キメラ抗体は58%、CHO−FGF8キメラ抗体は13%であった。以下、これらの試料を、抗FGF−8キメラ抗体(58%)、抗FGF−8キメラ抗体(13%)と表記する。
実施例10.可溶性ヒトFcγRIIIa蛋白質の作製
1.可溶性ヒトFcγRIIIa蛋白質の発現ベクターの構築
(1)ヒト末梢血単核球cDNAの作製
健常人の静脈血30mLを採取し、ヘパリンナトリウム(清水製薬社製)0.5mLを加えて穏やかに混和した後、生理的食塩水(大塚製薬社製)30mLと混合した。混合後、各10mLをそれぞれLymphoprep(NYCOMED PHARMA AS社製)4mL上に穏やかに重層し、室温下2000rpmで30分間の遠心分離を行った。分離された単核球画分を各遠心管より集めて混合し、RPMI1640−FBS(10)30mLに懸濁した。室温下1200rpmで15分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、該細胞をRPMI1640−FBS(10)20mLに懸濁した。この洗浄操作を2回繰り返した後、RPMI1640−FBS(10)を用いて2×106個/mLの末梢血単核球懸濁液を調製した。
上記のようにして調製した末梢血単核球懸濁液の5mLを室温下800rpmで5分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、5mLのPBSに懸濁した。室温下800rpmで5分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、QIAamp RNA Blood Mini Kit(QIAGEN社製)を用いて添付の説明書に従い、全RNAを抽出した。
得られた全RNA2μgに対し、SUPERSCRIPTTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Life Technologies社製)を用いて添付の説明書に従い、オリゴ(dT)をプライマーとした40μLの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖cDNAを合成した。
(2)ヒトFcγRIIIa蛋白質をコードするcDNAの取得
ヒトFcγRIIIa蛋白質(以下、hFcγRIIIaと表記する)のcDNAの取得は、以下のようにして行った。
まず、hFcγRIIIaのcDNAの塩基配列[ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J.Exp.Med.),170,481(1989)]より、翻訳開始コドンを含む特異的なフォワードプライマー(配列番号22に示す)および翻訳終止コドンを含む特異的なリバースプライマー(配列番号26に示す)を設計した。
次にDNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いて、実施例10の1項(1)で調製したヒト末梢血単核球由来のcDNA溶液の20倍希釈液5μLを含む50μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、1μmol/L 上記遺伝子特異的プライマー(配列番号22および26)]を調製し、PCRを行った。PCRは、94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で60秒間からなる反応を1サイクルとして、35サイクル行った。
PCR後、反応液をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、滅菌水20μLに溶解した。制限酵素EcoRI(宝酒造社製)およびBamHI(宝酒造社製)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約800bpを回収した。
一方、プラスミドpBluescriptII SK(−)2.5μg(Stratagene社製)を制限酵素EcoRI(宝酒造社製)およびBamHI(宝酒造社製)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約2.9kbpの断片を回収した。
上記で得たヒト末梢血単核球cDNA由来増幅断片とプラスミドpBluescriptIISK(−)由来の断片を、DNA Ligation Kit Ver.2.0(宝酒造社製)を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。
各プラスミドに挿入されたcDNAの塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Parkin Elmer社製)を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入cDNAが、hFcγRIIIaのcDNAのORF全長配列をコードすることを確認した。このうちPCRに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドDNAを選択した。以下、本プラスミドをpBSFcγRIIIa5−3と称す。
決定したhFcγRIIIaの全長cDNA配列を配列番号27、それに対応するアミノ酸配列を配列番号28に示す。
(3)可溶性hFcγRIIIaをコードするcDNAの取得
hFcγRIIIaの細胞外領域(配列番号28の1〜193番目)とC末端にHis−tag配列を持つ可溶性hFcγRIIIa(以下、shFcγRIIIa)をコードするcDNAは、以下のようにして構築した。
まず、hFcγRIIIaのcDNAの塩基配列(配列番号27)より、細胞外領域に特異的なプライマーFcgR3−1(配列番号29に示す)を設計した。
次にDNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いて、実施例10の1項(2)で作製したプラスミドpBSFcγRIIIa5−3を5ngを含む50μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、1μmol/L プライマーFcgR3−1、1μmol/LプライマーM13M4(宝酒造社製)]を調製し、PCRを行った。PCRは、94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で60秒間からなる反応を1サイクルとして、35サイクル行った。
PCR後、反応液をQIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、滅菌水20μLに溶解した。制限酵素PstI(宝酒造社製)およびBamHI(宝酒造社製)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片約110bpを回収した。
一方、プラスミドpBSFcγRIIIa5−3 2.5μgを制限酵素PstI(宝酒造社製)およびBamHI(宝酒造社製)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約3.5kbpの断片を回収した。
上記で得たhFcγRIIIa cDNA由来増幅断片とプラスミドpBSFcγRIIIa5−3由来の断片を、DNA Ligation Kit Ver.2.0(宝酒造社製)を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。
各プラスミドに挿入されたcDNAの塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Parkin Elmer社製)を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全ての挿入cDNAが、目的のshFcγRIIIaのcDNAのORF全長配列をコードすることを確認した。このうちPCRに伴う塩基の読み誤りを該配列内に全く含まないプラスミドDNAを選択した。以下、本プラスミドをpBSFcγRIIIa+His3と称す。
決定したshFcγRIIIaの全長cDNA配列を配列番号30、それに対応するアミノ酸配列を配列番号31に示す。
(4)shFcγRIIIaの発現ベクターの構築
shFcγRIIIaの発現ベクターは、以下のようにして構築した。
実施例10の1項(3)で得られたプラスミドpBSFcγRIIIa+His3 3.0μgを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)およびBamHI(宝酒造社製)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約620bpの断片を回収した。
一方、WO97/10354に記載のプラスミドpKANTEX93 2.0μgを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)およびBamHI(宝酒造社製)で消化後、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約10.7kbpの断片を回収した。
上記で得たshFcγRIIIa cDNAを含むDNA断片とプラスミドpKANTEX93由来の断片を、DNA Ligation Kit Ver.2.0(宝酒造社製)を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。
各プラスミドに挿入されたcDNAの塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBigDye Terminator Cycle Sequencing FS ReadyReaction Kit(Parkin Elmer社製)を添付マニュアルに従い使用して決定した。本法により配列決定した全てのプラスミドが、目的のshFcγRIIIaのcDNAを含むことを確認した。得られた発現ベクターを以下、pKANTEXFcγRIIIa−Hisと称す。
2.shFcγRIIIaの安定生産細胞の作製
実施例10の1項で構築したshFcγIIIaの発現ベクターpKANTEXFcγRIIIa−HisをラットミエローマYB2/0細胞[ATCC CRL−1662、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー(J.Cell.Biol.),93,576(1982)]に導入し、shFcγRIIIaの安定生産細胞を以下のようにして作製した。
制限酵素AatIIで消化し、線状化したpKANTEXFcγRIIIa−Hisの10μgを4×106細胞のヘエレクトロポレーション法[サイトテクノロジー(Cytotechnology),3,133(1990)]により導入後、40mLのHybridoma−SFM−FBS(10)[10%FBSを含むHybridoma−SFM培地(Life Technologie社製)]に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を1.0mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中のshFcγRIIIaの発現量を実施例10の3項に示すELISA法により測定した。
培養上清中にshFcγRIIIaの発現が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、G418を1.0mg/mL、DHFRの阻害剤であるMTX(SIGMA社製)を50nmol/L含むHybridoma−SFM−FBS(10)培地に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に2mLずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中のshFcγRIIIaの発現量を実施例10の3項に示すELISA法により測定した。培養上清中にshFcγRIIIaの発現が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nmol/L、200nmol/Lと順次上昇させ、最終的にG418を1.0mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むHybridoma−SFM−FBS(10)培地で増殖可能かつ、shFcγRIIIaを高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株に対して、2回の限界希釈法によるクローン化を行った。このようにして得られた形質転換株をKC1107株と名付けた。
3.shFcγRIIIaの検出(ELISA法)
培養上清中あるいは精製したshFcγRIIIaの検出、定量は、以下に示すELISA法により行った。
His−tagに対するマウス抗体Tetra・His Antibody(QIAGEN社製)をPBSを用いて5μg/mLに調製した溶液を96ウェルのELISA用のプレート(Greiner社製)に50μL/ウェルで分注し、4℃、12時間以上反応させた。反応後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。1%BSA−PBSを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したshFcγRIIIaの各種希釈溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで50倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトCD16抗体溶液(PharMingen社製)を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識Avidin D溶液(Vector社製)を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415を測定した。
4.shFcγRIIIaの精製
実施例10の2項で得られたshFcγRIIIaを生産する形質転換細胞クローンKC1107をG418を1.0mg/mL、MTXを200nmol/Lで含むHybridoma−SFM−GF(5)[5%Daigo’s GF21(和光純薬社製)を含むHybridoma−SFM培地(Life Technologie社製)]に3×105細胞/]mLとなるように懸濁し、182cm2フラスコ(Greiner社製)に50mL分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃で4日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりNi−NTA agarose(QIAGEN社製)カラムを用いて、添付の説明書に従い、shFcγRIIIaを精製した。
5.精製したshFcγRIIIaの解析
実施例10の4項で得られた精製shFcγRIIIaの濃度は、以下のようにしてアミノ酸組成分析を行い、算出した。精製shFcγRIIIaの一部を6mol/L塩酸、1%フェノール溶液に懸濁し、110℃で20時間、気相中で加水分解を行った。加水分解には、Waters社製ワークステーションを使用した。加水分解後のアミノ酸をBidlingmeyerらの方法[ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー(J.Chromatogr.),336,93(1984)]に従い、PTC−アミノ酸誘導体として、PicoTagアミノ酸分析装置(Waters社製)を用いて分析した。
次に、精製したshFcγRIIIaの約0.5μgを公知の方法[ネイチャー(Nature),227,680,(1970)]に従って還元条件下でのSDS−PAGEを行い、分子量および精製度を解析した。その結果を第29図に示した。第29図に示したように、精製したshFcγRIIIaは、分子量36〜38Kdのブロードなバンドが検出された。hFcγRIIIaの細胞外領域には、5箇所のN−グリコシド型の糖鎖結合可能部位が存在していることが知られており[ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン(J.Exp.Med.),170,481(1989)]、精製したshFcγRIIIaのブロードな分子量の分布は、糖鎖付加の不均一性に起因すると考えられた。一方、精製したshFcγRIIIaのN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ−10(島津製作所製)を用いて自動エドマン分解により解析した結果、shFcγRIIIaのcDNAより予想される配列が得られたことより、目的のshFcγRIIIaが精製できたことが確認された。
実施例11.各種キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性の評価
1.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗GD3キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性の評価
実施例3の1項に記載の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる2種類の抗GD3キメラ抗体である抗GD3キメラ抗体(45%)と抗GD3キメラ抗体(7%)のshFcγRIIIaに対する結合活性は、以下のようにしてELISA法を用いて測定した。
実施例1の3項に記載の方法に従い、96ウェルのELISA用プレート(グライナー社製)に、100pmol/wellでGD3を固定化した。1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、各種抗GD3キメラ抗体の1%BSA−PBSによる希釈溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで2.3μg/mLに希釈したshFcγRIIIa溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、His−tagに対するマウス抗体Tetra・His Antibody(QIAGEN社製)を1%BSA−PBSを用いて1μg/mLに調製した溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで200倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG1抗体溶液(ZYMED社製)を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415を測定した。また、別のプレートに各種抗GD3キメラ抗体を添加し、実施例1の3項に記載のELISA法を行うことにより、プレートに結合した各種抗GD3キメラ抗体量に差がないことを確認した。第30図に、各種抗GD3キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を測定した結果を示した。第30図に示したように、抗GD3キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性は、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の高い抗GD3キメラ抗体(45%)の方が10倍以上高かった。
2.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗FGF−8キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性の評価
実施例9の5項に記載の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる2種類の抗FGF−8キメラ抗体である抗FGF−8キメラ抗体(58%)と抗FGF−8キメラ抗体(13%)のshFcγRIIIaに対する結合活性は、以下のようにしてELISA法を用いて測定した。
実施例9の2項で調製したヒトFGF−8ペプチドコンジュゲートを96ウェルのELISA用プレート(グライナー社製)に、1.0μg/mLで50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、各種抗FGF−8キメラ抗体の1%BSA−PBSによる希釈溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで3.0μg/mLに希釈したshFcγRIIIa溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、His−tagに対するマウス抗体Tetra・His Antibody(QIAGEN社製)を1%BSA−PBSを用いて1μg/mLに調製した溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで200倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG1抗体溶液(ZYMED社製)を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415を測定した。また、別のプレートに各種抗FGF−8キメラ抗体を添加し、実施例9の2項に記載のELISA法を行うことにより、プレートに結合した各種抗FGF−8キメラ抗体量に差がないことを確認した。第31図に、各種抗FGF−8キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を測定した結果を示した。第31図に示したように、抗FGF−8キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性は、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の高い抗FGF−8キメラ抗体(58%)の方が100倍以上高かった。
3.還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗CCR4キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性の評価
実施例4の5項で調製した還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合の異なる7種類の抗CCR4キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性は、以下のようにしてELISA法を用いて測定した。
実施例4の2項で調製したヒトCCR4細胞外領域ペプチドコンジュゲートを96ウェルのELISA用プレート(グライナー社製)に、1.0μg/mLで50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、各種抗CCR4キメラ抗体の1%BSA−PBSによる希釈溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで3.0μg/mLに希釈したshFcγRIIIa溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、His−tagに対するマウス抗体Tetra・His Antibody(QIAGEN社製)を1%BSA−PBSを用いて1μg/mLに調製した溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで200倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG1抗体溶液(ZYMED社製)を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄後、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415を測定した。また、別のプレートに各種抗CCR4キメラ抗体を添加し、実施例4の2項に記載のELISA法を行うことにより、プレートに結合した各種抗CCR4キメラ抗体量に差がないことを確認した。第32A図に、各種抗CCR4キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を測定した結果を示した。第32A図に示したように、抗CCR4キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性は、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合に比例して上昇した。第32B図に、抗体濃度が4μg/mLおよび40μg/mLにおける還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合(横軸)とshFcγRIIIa結合活性(縦軸)との関係をプロットした図を示した。第32B図に示したように、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が20%未満の抗体である、抗CCR4キメラ抗体(8%)、抗CCR4キメラ抗体(9%)、抗CCR4キメラ抗体(18%)では、shFcγRIIIa結合活性は、ほとんど検出されなかった。
以上の結果は、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を持つ抗体は、α1,6−フコースを持つ糖鎖を持つ抗体よりも、高いFcγRIIIa結合活性を有することを明確に示したものである。そして、実施例3および4に示したように、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を持つ抗体は、α1,6−フコースを持つ糖鎖を持つ抗体よりも高いADCC活性を示したことから、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を持つ抗体の高いADCC活性は、高いFcγRIIIa結合活性に起因することが強く示唆された。また、第32B図に示すようにFcγRIIIa結合活性と還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合との間には比例関係があるので、このような検量線を予め作成しておくことにより、FcγRIIIa結合活性を測定することにより抗体組成物の還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合を定量することができる。この方法により、抗体組成物の有する細胞障害活性の測定をすることなく、簡便に細胞障害活性の予測を行うことができる。
実施例12.レクチン耐性CHO/DG44細胞が生産する抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性の評価
実施例7の3項で精製したレクチン耐性CHO/CCR4−LCA株が生産した抗CCR4キメラ抗体[以下、抗CCR4キメラ抗体(48%)と表記する]、実施例4の3項で精製したYB2/0細胞由来の生産株が生産した抗CCR4キメラ抗体KM2760−1[抗CCR4キメラ抗体(87%)]およびCHO/DG44細胞由来の生産株5−03株が生産した抗CCR4キメラ抗体KM3060[抗CCR4キメラ抗体(8%)]のshFcγRIIIaに対する結合活性を実施例11の3項に記載の方法に従って測定した。その結果、第33図に示したように、レクチン耐性CHO/CCR4−LCA株が生産した抗CCR4キメラ抗体(48%)は、5−03株が生産した抗CCR4キメラ抗体(8%)と比較して100倍以上高いshFcγRIIIaに対する結合活性を示した。また、その活性は、YB2/0細胞由来の生産株が生産した抗CCR4キメラ抗体(87%)の約1/3であった。
以上の結果は、レクチン耐性CHO/DG44細胞を用いることにより、親株細胞であるCHO/DG44細胞を用いるよりも、100倍以上FcγRIIIaに対する結合活性の高い抗体を作製することが可能であることを明確に示すものである。
実施例13.shFcγRIIIaに対する結合活性を指標とした高いADCC活性を有する抗体組成物のスクリーニング法
実施例7の1項で得られたLCA耐性株CHO−LCA株に、実施例1の2項(2)に記載の方法に従って、抗GD3キメラ抗体発現プラスミドpCHi641LHGM4を導入し、薬剤MTXによる遺伝子増幅を行い、抗GD3キメラ抗体を生産する形質転換株を作製した。
得られた形質転換株を用いて限界希釈法によるクローン化を行い、複数個のクローンを得た。各クローンを培養し、コンフルエントになった時点で培養液を回収し、培養上清中の抗GD3キメラ抗体の濃度が1μg/mLとなるように希釈し、該希釈抗体溶液を用いて実施例11の1項に記載のELISA法により、shFcγRIIIa結合活性を測定した。同時に、実施例1の4項で精製したYB2/0細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体およびCHO/DG44細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体を1μg/mLに希釈した溶液を調製し、それらのshFcγRIIIa結合活性も測定した。
測定結果に基づき、CHO/DG44細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体の結合活性以上で、かつYB2/0細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体の結合活性以下の活性を示す抗体を生産する形質転換細胞クローンを選択した。
選択した形質転換細胞クローンを実施例1の4項(2)に記載の方法に従って培養し、培養上清より精製抗体を取得した。精製抗体の単糖組成分析を実施例3の1項に記載の方法に従って行った結果、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合は42%であった。以下、本試料を抗GD3キメラ抗体(42%)と表記する。精製した抗GD3キメラ抗体(42%)の抗原結合活性は実施例1の3項に記載したELISA法を用いて評価した結果、実施例1の4項で精製したYB2/0細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体およびCHO/DG44細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体と同等であった。さらに、実施例2の2項に記載した方法に従って各抗GD3キメラ抗体のADCC活性を評価した。比較のために、CHO/DG44細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体で、単糖組成分析の結果、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が12%の試料[以下、抗GD3キメラ抗体(12%)と表記する]のADCC活性を測定した。その結果を第34図に示した。CHO/DG44細胞由来の生産株が生産した抗GD3キメラ抗体(12%)と比較して、shFcγRIIIaに対する高い結合活性を指標に選択した生産株が生産した抗GD3キメラ抗体(42%)では、約30倍程度のADCC活性の上昇が観察された。
以上の結果から、shFcγRIIIaに対する結合活性の高い抗体組成物をスクリーニングすることで、高いADCC活性を有する抗体組成物をスクリーニングできることが明らかとなった。
実施例14.FGF−8b/Fc融合蛋白質の作製
1.FGF−8b/Fc融合タンパクの発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93(Mol.Immunol.,37,1035(2000))を制限酵素ApaIとBamHIで切断してQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて約1.0kbpのヒトIgG1サブクラスCH(hCγ1)を含む断片を得た。プラスミドpBluescript II SK(−)(STRATAGENE社製)も同様の制限酵素で切断して約2.9kbpの断片を得た。これらの断片をTAKARA DNA Ligation Kit Ver.2のsolution I(宝酒造社製)を用いて連結、大腸菌DH5α株(東洋紡社製)を形質転換してプラスミドphCγ1/SK(−)を構築した。
hCγ1とFGF8のcDNAを連結するために配列番号86で示した塩基配列を有する合成DNAを設計した。この合成DNAは5’末端にpBluescript II SK(−)へクローニングするための複数の制限酵素認識配列を含んでおり、DNAの合成はプロリゴ社に委託した。TaKaRa Ex Taq添付EX Taq Buffer(Mg2+ plus)(宝酒造社製)を1倍濃度で含む50μLの溶液中にプラスミドphCγ1/SK(−)を1ng、0.25mM dNTPs、0.5μmol/Lの配列番号86に示した塩基配列を有する合成DNA、0.5μMのM13primer RV、1.25UnitのTaKaRa Ex Taqを含むように添加し、DNAサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 9700(PERKIN ELMER社製)を用いて、94℃にて30秒間、56℃にて30秒間、72℃にて1分間のサイクルを35サイクル行った。該反応液全量をQIAquick PCR purification Kit(QIAGEN社製)を用いてPCR増幅断片を精製した。精製断片を制限酵素KpnIとBamHIで切断し、約0.75kbpの断片を得た。また、プラスミドpBluescript II SK(−)(STRATAGENE社製)も同様の制限酵素で切断して約2.9kbpの断片を得た。これらの断片をLigation high(東洋紡績社製)を用いて連結、大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換してプラスミドpΔhCγ1/SK(−)を構築した。
FGF−8b遺伝子がクローニングされているプラスミドpSC17(Proc.Natl.Acad.Sci.,89,8928(1992))を鋳型として、下記のようにPCRを行いFGF−8bの構造遺伝子領域断片を得た。TaKaRa Ex Taq添付EX Taq Buffer(Mg2+ plus)(宝酒造社製)を1倍濃度で含む50μLの溶液中にプラスミドpSC17を1ng、0.25mMdNTPs、10μmol/Lの配列番号87、88に示した塩基配列を有する合成DNA、2.5UnitのTaKaRa Ex Taqを含むように添加し、DNAサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 9700(PERKIN ELMER社製)を用いて、94℃にて1分間、55℃にて1分間、72℃にて2分間のサイクルを30サイクル行い、さらに72℃10分間反応させた。該反応液全量からPCR増幅断片を精製し、精製断片を制限酵素EcoRIとBamHIで切断し、約0.66kbpの断片を得た。また、プラスミドpBluescript II SK(−)(STRATAGENE社製)も同様の制限酵素で切断して約2.9kbpの断片を得た。これらの断片をT4 DNA Ligase(宝酒造社製)を用いて連結、大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換してプラスミドpFGF−8b/SK(−)を構築した。
次に、プラスミドpΔhCγ1/SK(−)を制限酵素ApaIとEcoRIで切断し、約3.7kbpの断片を得た。また、プラスミドpFGF−8b/SK(−)も同様の制限酵素で切断し、約0.6kbpの断片を得た。これらの断片をLigation high(東洋紡績社製)を用いて連結、大腸菌DH5α株(東洋紡社製)を形質転換してプラスミドpFGF8b+hIgG/SK(−)を構築した。
次に、上記で構築したプラスミドpFGF8b+hIgG/SK(−)を制限酵素EcoRIとBamHIで切断し、約1.34kbpの断片を得た。またpKANTEX93も同様の制限酵素で処理し、約8.8kbpの断片を得た。これらの断片をLigation high(東洋紡績社製)を用いて連結、大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換して配列番号89に示されるFGF8b−Fc融合蛋白質のcDNAを含む動物細胞用発現ベクターpKANTEX/FGF8Fcを構築した。
2.FGF−8b/Fc融合タンパクの動物細胞を用いた安定発現
上記実施例14の1項で構築したFGF8−Fc融合蛋白質の動物細胞用発現ベクターpKANTEX/FGF8Fcを各種細胞に導入し、優良株を選択することでFGF8−Fc融合蛋白質の安定発現株を以下のようにして作製した。
(1)ラットミエローマYB2/0細胞を用いた生産細胞の作製
FGF8−Fc融合蛋白質発現ベクターpKANTEX/FGF8Fcの10μgを4×106細胞のラットミエローマYB2/0細胞へエレクトロポレーション法により導入後、20〜40mLのRPMI1640−FBS(10)に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に200μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中のFGF8−Fc融合蛋白質の抗FGF−8抗体への結合活性を実施例14の4項記載のELISA法により測定した。抗FGF−8抗体としては、KM1334(USP5952472)を用いた。
培養上清中にFGF−8/Fc融合蛋白質の産生が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用し融合蛋白質の産生量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、DHFRの阻害剤であるMTX(SIGMA社製)を50nmol/L含むHybridoma−SFM−FBS(5)培地に懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に拡大培養した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/LMTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中のFGF8−Fc融合蛋白質のKM1334への結合活性を実施例14の4項記載のELISA法により測定した。
培養上清中にFGF−8/Fc融合蛋白質の産生が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nmol/Lの濃度で含むHybridoma−SFM−FBS(5)培地で増殖可能かつ、FGF8−Fc融合蛋白質を高生産する形質転換株KC1178を得た。KC1178は、WO00/61739の実施例8に示されたFUT8遺伝子の転写物の定量法を用いて該転写物の量が比較的低い株であり、レクチン耐性であった。なお、KC1178は、平成15年4月1日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地 中央第6)にFERM BP−8350として寄託されている。
(2)CHO/DG44細胞を用いた生産細胞の作製
FGF8−Fc融合蛋白質発現ベクターpKANTEX/FGF8Fcの10μgを1.6×106細胞のCHO/DG44細胞へエレクトロポレーション法により導入後、30mLのIMDM−dFBS(10)−HT(1)に懸濁し、96ウェル培養用プレート(住友ベークライト社製)に100μL/ウェルずつ分注した。5%CO2インキュベーター内で37℃、24時間培養した後、IMDM−dFBS(10)に培地交換し、1〜2週間培養した。HT非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中のFGF8−Fc融合蛋白質のKM1334への結合活性を実施例14の4項記載のELISA法により測定した。
培養上清中にFGF−8/Fc融合蛋白質の産生が認められたウェルの形質転換株については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体産生量を増加させる目的で、MTX(SIGMA社製)を50nmol/L含むIMDM−dFBS(10)培地に懸濁し、24ウェルプレート(Greiner社製)に拡大培養した。5%CO2インキュベーター内で37℃で1〜2週間培養して、50nmol/L MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの培養上清中のFGF8−Fc融合蛋白質のKM1334への結合活性を実施例14の4項記載のELISA法により測定した。
培養上清中にFGF−8/Fc融合蛋白質の産生が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、MTX濃度を上昇させ、MTXを500nmol/Lの濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地で増殖可能かつ、FGF8−Fc融合蛋白質を高生産する形質転換株KC1179を得た。なお、KC1179は、平成15年4月1日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地 中央第6)にFERM BP−8351として寄託されている。
3.FGF8−Fc融合蛋白質の精製
上記実施例14の2項で作製したFGF8−Fc融合蛋白質の生産細胞を適当な培地(YB2/0細胞由来の細胞は5%GF21(和光純薬製))、0.5mg/mL G418、200nmol/LMTXを含むH−SFM、CHO/DG44細胞由来の細胞はMTXを500nmol/Lを含むEXCELL301培地(JRH社製))を用いて100〜200mLのスケールで培養した。培養上清よりProsep G(ミリポア社製)カラムを使用説明書に従い、用いてFGF8−Fc融合蛋白質を精製した。精製蛋白質の推定アミノ酸配列を配列番号90に示した。
4.抗FGF−8抗体に対する結合活性
実施例14の2項に記載のYB2/0産生のFGF−8/Fc融合蛋白質と、CHO産生のFGF−8/Fc融合蛋白質のKM1334に対する結合活性を以下の様にしてELISA法を用いて測定した。96ウェルのELISA用プレート(Greiner社製)に、KM1334を1μg/mL、50μL/ウェルで分注し、4℃で1晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、形質転換株の培養上清あるいは精製蛋白質を50μL/ウェルで加え、室温で時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで3000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG(γ)抗体溶液(American Qualex社製)を二次抗体溶液として、50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄し、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて反応させ、充分な発色後に5%SDS溶液を50μL/ウェル加えて反応を停止した。その後測定波長415nm、参照波長490nmにて吸光度を測定した。第35図に示したように、実施例14の2項で得られたFGF−8/Fc融合蛋白質は、KM1334に対する結合活性を示した。
5.FcγRIIIaに対する結合活性
実施例14の2項に記載のYB2/0産生のFGF−8/Fc融合蛋白質と、CHO由来のFGF−8/Fc融合蛋白質のFcγRIIIaに対する結合活性を以下の様にしてELISA法を用いて測定した。
96ウェルのELISA用プレート(Greiner社製)に、His−tagに対するマウス抗体Tetra・His Antibody(QIAGEN社製)を5μg/mL、50μl/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSA−PBSを100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをTween−PBSで洗浄後、1%BSA−PBSで5μg/mLに希釈したshFcγRIIIa(V)溶液を50μL/ウェルで加え、室温で2時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄し、精製FGF−8/Fc融合蛋白質を1%BSA−PBSで各濃度に希釈した溶液を50μL/ウェルで加え、室温で2時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄し、1%BSA−PBSで1μg/mLに希釈したビオチン化KM1334をそれぞれ50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、各ウェルをTween−PBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識Avidin−D(Vector社製)を1%BSA−PBSで4000倍に希釈した溶液を50μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させた。反応後、Tween−PBSで洗浄し、ABTS基質液を50μL/ウェルで加えて発色させ、15分後に5%SDS溶液を50μL/ウェル加えて反応を停止した。その後測定波長415nm、参照波長490nmにて吸光度を測定した。
第36図には、各種のFGF−8/Fc融合蛋白質のshFcγRIIIa(V)に対する結合活性を測定した結果を示した。第36図に示したように、YB2/0産生のFGF−8/Fc融合蛋白質はCHO/DG44細胞が産生するFGF−8/Fc融合蛋白質よりも高いshFcγRIIIa(V)に対する結合活性を有していた。
参考例1.CHO細胞由来の糖鎖合成に係わる各種酵素遺伝子の取得
1.CHO細胞のFX cDNA配列の決定
(1)CHO/DG44細胞由来全RNAの抽出
CHO/DG44細胞を10%FBS(Life Technologies社製)および1倍濃度のHTsupplement(Life Technologies社製)を添加したIMDM培地(LifeTechnologies社製)に懸濁し、2×105個/mLの密度で接着細胞培養用T75フラスコ(Greiner社製)に15mL播種した。37℃の5%CO2インキュベーター内で培養し、培養2日目に1×107個を回収後、RNAeasy(QIAGEN社製)により添付の説明書に従って全RNAを抽出した。
(2)CHO/DG44細胞由来全一本鎖cDNAの調製
参考例1の1項(1)で調製した全RNAを45μLの滅菌水に溶解し、RQ1 RNase−Free DNase(Promega社製)1μL、付属の10×DNase buffer 5μL、RNasin Ribonuclease inhibitor(Promega社製)0.5μLをそれぞれに添加して、37℃で30分間反応させることにより、試料中に混入したゲノムDNAを分解した。反応後、RNAeasy(QIAGEN社製)により全RNAを再精製し、50μLの滅菌水に溶解した。
得られた各々の全RNA3μLに対しSUPERSCRIPTTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Life Technologies社製)を用いて添付の説明書に従い、オリゴ(dT)をプライマーとした20μLの系で逆転写反応を行うことにより、一本鎖cDNAを合成した。GFPPおよびFXのクローニングには該反応液の50倍希釈水溶液を使用した。使用するまで−80℃で保管した。
(3)チャイニーズハムスターFXのcDNA部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターFXのcDNA部分断片を取得した。まず公的データーベースに登録されているヒトFXのcDNA(Genebank登録番号U58766)およびマウスのcDNA(Genebank登録番号M30127)に共通の塩基配列に対して特異的なプライマー(配列番号42および配列番号43に示す)を設計した。
次にDNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いて、参考例1の1項(2)で調製したCHO/DG44由来一本鎖cDNAを1μLを含む25μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L上記遺伝子特異的プライマー(配列番号42および配列番号43)]を調製し、PCRを行った。PCRは94℃で5分間の加熱の後、94℃で1分、58℃で2分間、72℃で3分間からなる反応を1サイクルとして30サイクルの後、さらに72℃で10分間加熱する条件で行った。
PCR後、反応液を2%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片301bpをQiaexII Gel Extraction kit(キアゲン社製)を用いて精製し、滅菌水20μLで溶出した(以下、アガロースゲルからのDNA断片の精製にはこの方法を用いた)。上記増幅断片4μLをTOPO TA cloning kit(invitrogen社製)の説明書に従って、プラスミドpCR2.1へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌DH5αを形質転換し、得られたカナマイシン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミドDNAを単離した。その結果、FX cDNA部分断片が組み込まれた2クローンを得た。各々pCRFXクローン8、pCRFXクローン12と称す。
FXクローン8、FXクローン12に挿入されたcDNAの塩基配列はDNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit(Perkin Elmer社製)を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入cDNAがチャイニーズハムスターのFXのORF部分配列をコードすることを確認した。
(4)RACE用一本鎖cDNAの合成
参考例1の1項(1)で抽出したCHO/DG44細胞全RNAからの5’および3’RACE用一本鎖cDNAの作製を、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用いて行った。方法は添付の説明書に従った。ただしPowerScriptTM Reverse Transcriptase(CLONTECH社製)を逆転写酵素として用いた。調製後の一本鎖cDNAは各々、キット添付のTricin−EDTA bufferで10倍に希釈したものをPCRの鋳型として用いた。
(5)RACE法によるチャイニーズハムスターFX全長cDNAの決定
参考例1の1項(3)項で決定したチャイニーズハムスターFXの部分配列をもとにチャイニーズハムスターFXに特異的な5’RACE用プライマーFXGSP1−1(配列番号44)およびFXGSP1−2(配列番号45)、チャイニーズハムスターFX特異的な3’RACE用プライマーFXGSP2−1(配列番号46)およびFXGSP2−2(配列番号47)を設計した。
次にAdvantage2 PCR Kit(CLONTECH社製)を用いて、参考例1の1項(4)で調製したCHO/DG44細胞由来RACE用一本鎖cDNAを1μLを含む50μLの反応液[1倍濃度のAdvantage 2 PCR buffer(CLONTECH社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.2μmol/LチャイニーズハムスターFX特異的RACE用プライマー、1倍濃度の共通プライマー(CLONTECH社製)]を調製し、PCRを行った。PCRは94℃で5秒間、68℃で10秒間、72℃で2分間からなる反応を1サイクルとして20サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より1μLをとりTricin−EDTA bufferで50倍に希釈した水溶液1μLをテンプレートとして使用し、再度反応液を調製し、同条件でPCRを行った。一回目および2回目のPCRで用いたテンプレート、プライマーの組み合わせおよび増幅されるDNA断片長を第6表に示した。
PCR後、反応液を1%アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片を回収し、滅菌水20μLで溶出した。上記増幅断片4μLをTOPO TA cloning kit(Invitrogen社製)の説明書に従って、プラスミドpCR2.1へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたカナマイシン耐性クローンよりプラスミドDNAを単離し、チャイニーズハムスターFXの5’領域を含むcDNA5クローンを得た。各々をFX5’クローン25、FX5’クローン26、FX5’クローン27、FX5’クローン28、FX5’クローン31、FX5’クローン32と称す。
同様にチャイニーズハムスターFXの3’領域を含むcDNA5クローンを得た。各々FX3’をFX3’クローン1、FX3’クローン3、FX3’クローン6、FX3’クローン8、FX3’クローン9と称す。
上記、5’および3’RACEにより取得した各クローンのcDNA部分の塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法より決定した各cDNAの塩基配列を比較し、PCRに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターFXcDNA全長の塩基配列を決定した。決定した配列を配列番号48に示す。
2.CHO細胞のGFPP cDNA配列の決定
(1)チャイニーズハムスターGFPPのcDNA部分断片の取得
以下の手順によりチャイニーズハムスターGFPPのcDNA部分断片を取得した。まず公的データーベースに登録されているヒトGFPPのcDNA(Genebank登録番号AF017445)、該配列と相同性の高いマウスEST配列(Genebank登録番号AI467195、AA422658、BE304325、AI466474)、およびRat EST配列(Genebank登録番号BF546372、AI058400、AW144783)の塩基配列を比較し、3種間で保存性の高い領域にラットGFPPに特異的なプライマーGFPP FW9およびGFPP RV9(配列番号49および配列番号50)を設計した。
次にDNAポリメラーゼExTaq(宝酒造社製)を用いて、参考例1の1項(2)で調製したCHO/DG44細胞由来一本鎖cDNAを1μLを含む25μLの反応液[1倍濃度のExTaq buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L上記GFPP特異的プライマーGFPP FW9およびGFPP RV9(配列番号49および配列番号50)]を調製し、PCRを行った。PCRは94℃で5分間の加熱の後、94℃で1分、58℃で2分間、72℃で3分間からなる反応を1サイクルとして30サイクルの後、さらに72℃で10分間加熱する条件で行った。
PCR後、反応液を2%アガロースゲル電気泳動に供し、特異的増幅断片1.4Kbpを回収し、滅菌水20μLで溶出した。上記増幅断片4μLをTOPO TA cloning kit(Invitrogen社製)の説明書に従って、プラスミドpCR2.1へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたカナマイシン耐性クローンよりプラスミドDNAを単離し、GFPP cDNA部分断片が組み込まれた3クローンを得た。各々GFPPクローン8、GFPPクローン11、GFPPクローン12と称す。
GFPPクローン8、GFPPクローン11、GFPPクローン12に挿入されたcDNAの塩基配列はDNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)およびBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS Raedy Reaction Kit(Perkin Elmer社製)を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。本法により配列決定した挿入cDNAがチャイニーズハムスターのGFPPのORFの部分配列をコードすることを確認した。
(2)RACE法によるチャイニーズハムスターGFPP全長cDNAの決定
参考例1の2項(1)で決定したチャイニーズハムスターFXの部分配列をもとにチャイニーズハムスターFXに特異的な5’RACE用プライマーGFPP GSP1−1(配列番号52)およびGFPP GSP1−2(配列番号53)、チャイニーズハムスターGFPP特異的な3’RACE用プライマーGFPP GSP2−1(配列番号54)およびGFPP GSP2−2(配列番号55)を設計した。
次にAdvantage2 PCR Kit(CLONTECH社製)を用いて、参考例1の1項(4)で調製したCHO/DG44細胞由来RACE用一本鎖cDNA1μLを含む50μLの反応液[1倍濃度のAdvantage2 PCR buffer(CLONTECH社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.2μmol/LチャイニーズハムスターGFPP特異的RACE用プライマー、1倍濃度の共通プライマー(CLONTECH社製)]を調製し、PCRを行った。PCRは94℃で5秒間、68℃で10秒間、72℃で2分間からなる反応を1サイクルとして20サイクル繰り返す条件で行った。
反応終了後、反応液より1μLをとりTricin−EDTA bufferで50倍に希釈した水溶液1μLをテンプレートとして、再度反応液を調製し、同条件でPCRを行った。一回目および2回目のPCRで用いたテンプレート、プライマーの組み合わせおよび増幅されるDNA断片長を第7表に示した。
PCR後、反応液を1%アガロースゲル電気泳動に供し、目的の特異的増幅断片を回収し、滅菌水20μLで溶出した。上記増幅断片4μLをTOPO TA cloning kit(Invitrogen社製)の説明書に従って、プラスミドpCR2.1へ挿入し、該反応液を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られたカナマイシン耐性クローンよりプラスミドDNAを単離し、チャイニーズハムスターGFPPの5’領域を含むcDNA4クローンを得た。各々をGFPP5’クローン1、GFPP5’クローン2、GFPP5’クローン3、GFPP5’クローン4と称す。
同様にチャイニーズハムスターGFPPの3’領域を含むcDNA5クローンを得た。各々をGFPP3’クローン10、GFPP3’クローン16、GFPP3’クローン20と称す。
上記、5’および3’RACEにより取得した各クローンのcDNA部分の塩基配列は、DNAシークエンサー377(Parkin Elmer社製)を使用して決定した。方法は添付のマニュアルに従った。塩基配列決定後、各cDNAの塩基配列を比較し、PCRに伴う塩基の読み誤りを除き、チャイニーズハムスターGFPP cDNA全長の塩基配列を決定した。決定した配列を配列番号51に示す。
参考例2.CHO細胞由来GMD遺伝子の取得
1.CHO細胞由来GMD cDNA配列の決定
(1)CHO細胞由来GMD遺伝子のcDNA取得(5’および3’末端配列を除く部分cDNAの取得)
GenBankに登録されているヒトGMD cDNA配列(GenBank Accession No.AF042377)をクエリーとして、げっ歯類由来GMD cDNAを公的データベース(BLAST)を用いて検索した結果、3種類のマウスEST配列が得られた(GenBank Accesssion No.BE986856、BF158988、BE284785)。これらEST配列を連結させることにより、推定されるマウスGMD cDNA配列を決定した。
このマウスGMD cDNA配列より、配列番号56で示される塩基配列を有する28merのプライマー、配列番号57で示される塩基配列を有する27merのプライマー、配列番号58で示される塩基配列を有する25merのプライマー、配列番号59で示される塩基配列を有する24merのプライマー、配列番号60で示される塩基配列を有する25merのプライマーを作製した。
続いて、CHO細胞由来GMD cDNAを増幅するために以下の方法でPCRを行なった。実施例8の1項(1)で作製したCHO細胞由来一本鎖cDNA 0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの合成DNAプライマー2種類]を調製した。なお、合成DNAプライマーには配列番号56と配列番号57、配列番号58と配列番号57、配列番号56と配列番号59、配列番号56と配列番号60の組み合わせを用いた。該反応液をDNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて94℃にて5分間加熱した後、94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。
このPCR反応液をアガロース電気泳動にて分画した結果、配列番号56と配列番号57の合成DNAプライマーを用いたPCR産物では約1.2kbp、配列番号57と配列番号59の合成DNAプライマーを用いたPCR産物では約1.1kbp、配列番号56と配列番号59の合成DNAプライマーを用いたPCR産物では約350bp、配列番号56と配列番号60の合成DNAプライマーを用いたPCR産物では約1kbpのDNA断片が増幅された。これらDNA断片を回収し、DNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミド22−8(配列番号56と配列番号57の合成DNAプライマーから増幅された約1.2kbpのDNA断片を有する)、23−3(配列番号58と配列番号57の合成DNAプライマーから増幅された約1.1kbpのDNA断片を有する)、31−5(配列番号56と配列番号59の合成DNAプライマーから増幅された約350bpのDNA断片を有する)、34−2(配列番号56と配列番号60の合成DNAプライマーから増幅された約1kbpのDNA断片を有する)を得た。これらプラスミドに含まれるCHO細胞由来GMD cDNA配列を、DNAシークエンサーABI PRISM 377(パーキンエルマー社製)を用い、常法に従って決定した(5’末端側の開始メチオニンより下流28塩基の配列、および3’末端側の終了コドンより上流27塩基の配列は合成オリゴDNA配列由来のため、マウスGMD cDNA配列である)。
さらに、プラスミド22−8と34−2に含まれるCHO細胞由来GMD cDNAを組み合わせたプラスミドを作製するため、以下の工程を行った。プラスミド22−8の1μgを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約4kbpのDNA断片を回収した。プラスミド34−2の2μgを制限酵素EcoRIで37℃にて16時間反応後アガロース電気泳動にて分画し、約150bpのDNA断片を回収した。それぞれ回収したDNA断片を、Calf Intestine Alkaline Phosphatase(宝酒造社製)で末端を脱リン酸化した後、DNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いて連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミドCHO−GMDを得た(第37図)。
(2)CHO細胞由来GMD cDNAの5’末端配列の決定
ヒトおよびマウスGMD cDNAの5’末端側非コード(non−coding)領域の塩基配列より配列番号61で示される塩基配列を有する24merのプライマー、およびCHO由来GMD cDNA配列より配列番号62で示される塩基配列を有する32merのプライマーを作製し、cDNAを増幅するために以下の方法でPCRを行なった。実施例8の1項(1)で得られたCHO細胞由来の一本鎖cDNA0.5μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/LのdNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号61と配列番号62の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後、94℃にて1分間、55℃にて1分間、72℃にて2分間のサイクルを20サイクル行なった後、さらに94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを18サイクル行なった。該PCR反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約300bpのDNA断片を回収した。回収したDNA断片はDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミド5’GMDを得た。DNAシークエンサー377(パーキンエルマー社製)を用い、該プラスミドに含まれるCHO由来GMD cDNAの開始メチオニンより下流28塩基の配列を決定した。
(3)CHO細胞由来GMD cDNAの3’末端配列の決定
CHO細胞由来GMDの3’末端cDNA配列を得るため、以下の方法でRACE法を行なった。実施例8の1項(1)で取得したCHO細胞由来RNAより、3’RACE用一本鎖cDNAの作製をSMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い、添付の説明書に従って行なった。ただし、逆転写酵素にはPowerScriptTM Reverse Transcriptase(CLONTECH社製)を用いた。調製後の一本鎖cDNAは、キット添付のTricin−EDTA bufferで10倍に希釈したものをPCRの鋳型として用いた。
続いて、上記3’RACE用一本鎖cDNA 1μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号63で示す24merの合成DNAプライマー[参考例2の1項(1)で決定したCHO細胞由来GMD cDNA配列より作製]、1倍濃度のUniversal Primer Mix(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitに付属;CLONTECH社製)]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後、94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。
反応終了後、該PCR反応液より1μLを取り、Tricin−EDTA buffer(CLONTECH社製)で20倍希釈した水溶液1μLを鋳型として含む20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号64で示す25merの合成DNAプライマー[参考例2の1項(1)で決定したCHO細胞由来GMD cDNA配列より作製]、0.5μmol/LのNested Universal Primer(SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitに付属;CLONTECH社製)]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後、94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。
反応終了後、該PCR反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約700bpのDNA断片を回収した。回収したDNAはDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミド3’GMDを得た。DNAシークエンサー377(パーキンエルマー社製)を用い、該プラスミドに含まれるCHO由来GMD cDNAの終止コドンより上流27塩基の配列、および3’側のnon−coding領域415bpの塩基配列を決定した。
以上、参考例2の1項(1)、(2)、(3)より決定したCHO由来GMD遺伝子の全長cDNA配列を配列番号65、それに対応するアミノ酸配列を配列番号71に示す。
2.CHO/DG44細胞のGMD遺伝子を含むゲノム配列の決定
参考例2の1項で決定したマウスGMD cDNA配列より、配列番号66で示される塩基配列を有する25merのプライマーを作製した。続いて、以下の方法でCHO細胞由来ゲノムDNAを取得した。CHO/DG44細胞由来KC861株をIMDM−dFBS(10)−HT(1)培地[HT supplement(インビトロジェン社製)を1倍濃度で含むIMDM−dFBS(10)培地]に3×105細胞/mLになるように懸濁し、接着細胞用平底6ウェルプレート(Greiner社製)に2mL/ウェルずつ分注した。37℃の5%CO2インキュベーター内でコンフルエントになるまで培養したのち、該プレートより公知の方法[ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research),3,2303(1976)]に従ってゲノムDNAを調製し、TE−RNase緩衝液(pH8.0)(10mmol/L Tris−HCl、1mmol/L EDTA、200μg/mL RNase A)150μLに一晩溶解した。
上記で取得したCHO/DG44細胞由来ゲノムDNAを100ng、20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5単位のEX Taq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号59と配列番号66の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約100bpのDNA断片を回収した。回収したDNA断片はDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミドex3を得た。DNAシークエンサー377(パーキンエルマー社製)を用いて該プラスミドに含まれるCHO細胞由来ゲノムDNAの塩基配列を決定し、配列番号67に示した。
次に、参考例2の1項で決定したCHO細胞由来GMD cDNA配列より、配列番号68で示される塩基配列を有する25merのプライマー、および配列番号69で示される塩基配列を有する25merのプライマーを作製した。続いて、CHO/DG44由来ゲノムDNAを100ng、20μLの反応液[1倍濃度のEX Taq Buffer(宝酒造社製)、0.2mmol/L dNTPs、0.5単位のEX Tq polymerase(宝酒造社製)、0.5μmol/Lの配列番号68と配列番号69の合成DNAプライマー]を調製し、DNAサーマルサイクラー480(パーキンエルマー社製)を用いて、94℃にて5分間加熱した後、94℃にて1分間、68℃にて2分間のサイクルを30サイクル行なった。
反応終了後、該反応液をアガロース電気泳動にて分画後、約200bpのDNA断片を回収した。回収したDNA断片はDNA Ligation kit(宝酒造社製)を用いてpT7Blue(R)ベクター(Novagen社製)に連結し、得られた組換えプラスミドDNAを用いて大腸菌DH5α株(東洋紡績社製)を形質転換し、プラスミドex4を得た。DNAシークエンサー377(パーキンエルマー社製)を用いて該プラスミドに含まれるCHO細胞由来ゲノムDNAの塩基配列を決定し、配列番号70に示した。
参考例3.抗FGF−8キメラ抗体の作製
1.FGF−8に対するマウス抗体のV領域をコードするcDNAの単離、解析(1)FGF−8に対するマウス抗体生産ハイブリドーマ細胞からのmRNAの調製
FGF−8に対するマウス抗体(抗FGF−8マウス抗体)を生産するハイブリドーマKM1334(FERM BP−5451)の1×107細胞より、mRNAの調製キットであるFast Track mRNA Isolation Kit(Invitrogen社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、mRNAを約8μg調製した。
(2)抗FGF−8マウス抗体のH鎖およびL鎖cDNAライブラリーの作製
参考例3の1項(1)で取得したKM1334のmRNAの5μgから、Time Saver cDNASynthesis Kit(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にEcoRI−NotIアダプターを有するcDNAを合成した。作製したcDNA全量を20μlの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、IgGクラスの抗体のH鎖に対応する約1.5kbのcDNA断片とκクラスのL鎖に対応する約1.0kbのcDNA断片をそれぞれ約0.1μg回収した。次に、各々の約1.5kbのcDNA断片0.1μgおよび約1.0kbのcDNA断片0.1μgと、制限酵素EcoRIで消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphataseで末端を脱リン酸化したλZAPIIベクター1μgをλZAPII Cloning Kit(Stratagene社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、連結した。
連結後の各々の反応液のうち4μlをGigapack II Packaging Extracts Gold(Stratagene社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、適当量を大腸菌株XL1−Blue(Biotechniques,5,376,1987)に感染させて、KM1334のH鎖cDNAライブラリーおよびL鎖cDNAライブラリーとしてそれぞれ約8.1×104個と、5.5×104個のファージクローンを取得した。次に各々のファージを常法(モレキュラー・クローニング第2版)に従い、ナイロンメンブレン上に固定した。
(3)抗FGF−8マウス抗体のH鎖およびL鎖cDNAのクローニング
参考例3の1項(2)で作製したKM1334のH鎖cDNAライブラリーおよびL鎖cDNAライブリーのナイロンメンブレンを、ECL Direct Nucleic Acid Labelling andDetection Systems(Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のC領域のcDNA[H鎖はマウスCγ1cDNAを含むDNA断片(J.Immunol.,146,2010,1991)、L鎖はマウスCκcDNAを含むDNA断片(Cell,22,197,1980)]をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをH鎖、L鎖各10クローン取得した。次に、λZAPII Cloning Kit(Stratagene社製)の使用説明書に従い、in vivo excision法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるcDNAの塩基配列をBig Dye Terminator Kit ver.2(Appliedbiosystems社製)を用いてジデオキシ法(モレキュラー・クローニング第2版)により決定した。その結果、cDNAの5’末端に開始コドンと推定されるATG配列が存在する完全長の機能的なH鎖cDNAを含むプラスミドpKM1334H7−1およびL鎖cDNAを含むプラスミドpKM1334L7−1を得た。
(4)抗FGF−8マウス抗体のV領域のアミノ酸配列の解析
配列番号72にプラスミドpKM1334H7−1に含まれていたVHの全塩基配列を、配列番号73に推定された全アミノ酸配列を、配列番号74にプラスミドpKM1334L7−1に含まれていたVLの全塩基配列を、配列番号75に推定された全アミノ酸配列をそれぞれ示す。既知のマウス抗体の配列データ(Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,1991)との比較および精製した抗FGF−8マウス抗体KM1334のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ−10(島津製作所製)を用いて自動エドマン分解により解析した結果との比較から、単離した各々のcDNAは分泌シグナル配列を含む抗FGF−8マウス抗体KM1334をコードする完全長cDNAであり、H鎖については配列番号73に記載のアミノ酸配列の1から19番目が、L鎖については配列番号75に記載のアミノ酸配列の1から19番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗FGF−8マウス抗体KM1334のVHおよびVLのアミノ酸配列(分泌シグナル配列を除いた配列)の新規性について検討した。配列解析システムとしてGCG Package(version 9.1、Genetics Computer Group社製)を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース(PIR−Protein(Release 56.0))をBLAST法(J.Mol.Biol.,215,403,1990)により検索した。その結果、H鎖、L鎖ともに完全に一致する配列は認められず、抗FGF−8マウス抗体KM1334のVHおよびVLは新規なアミノ酸配列であることが確認された。
また、抗FGF−8マウス抗体KM1334のVHおよびVLのCDRを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗FGF−8マウス抗体KM1334のVHのCDR1、2および3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号76、77および78に、VLのCDR1、2および3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号79、80および81に示した。
2.抗FGF−8キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
(1)抗FGF−8キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334の構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と参考例3の1項(3)で得られたプラスミドpKM1334H7−1およびpKM1334L7−1を用いて抗FGF−8キメラ抗体発現ベクターpKANTEX1334を以下の様にして構築した。
参考例3の1項(3)で得られたプラスミドpKM1334H7−1の50ngを鋳型とし、配列番号24、25に記載の塩基配列を有する合成DNA(GENSET社製)をプライマーとして終濃度0.3μMとなるように加え、KOD plus polymerase(TOYOBO社製)に添付の取扱説明書に従い、50μlの系でまず94℃で2分間加熱した後、94℃15秒間、55℃30秒間、68℃1分間の条件で30サイクルのPCRを行った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、10単位の制限酵素ApaI(宝酒造社製)および10単位の制限酵素NotI(New England Biolabs社製)を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.47kbのApaI−NotI断片を約0.3μg回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の3μgを10単位の制限酵素ApaI(宝酒造社製)および10単位の制限酵素NotI(New England Biolabs社製)を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約12.75kbのApaI−NotI断片を約2μg回収した。
次に、上記で得られたPCR産物由来のNotI−ApaI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX93由来のNotI−ApaI断片0.1μgを全量10μlの滅菌水に加え、Ligation High(TOYOBO社製)を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第38図に示したプラスミドpKANTEX1334Hを得た。
次に、参考例1の1項(3)で得られたプラスミドpKM1334L7−1の50ngを鋳型とし、配列番号82、83に記載の塩基配列を有する合成DNA(GENSET社製)をプライマーとして終濃度0.3μMとなるように加え、KOD plus polymerase(TOYOBO社製)に添付の取扱説明書に従い、50μlの系でまず94℃で2分間加熱した後、94℃15秒間、55℃30秒間、68℃1分間の条件で30サイクルのPCRを行った。該反応液をエタノール沈殿したのち滅菌水に溶解し、10単位の制限酵素EcoRI(宝酒造社製)および10単位の制限酵素BsiWI(New England Biolabs社製)を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.44kbのEcoRI−BsiWI断片を約0.3μg回収した。
次に、上記で得られたプラスミドpKANTEX1334Hの3μgを10単位の制限酵素EcoRI(宝酒造社製)および制限酵素BsiWI(New England Biolabs社製)を用いて37℃で1時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約13.20kbのEcoRI−BsiWI断片を約2μg回収した。
次に、上記で得られたPCR産物由来のEcoRI−BsiWI断片0.1μgとプラスミドpKANTEX1334H由来のEcoRI−BsiWI断片0.1μgを全量10μlの滅菌水に加え、Ligation High(TOYOBO社製)を用いて連結した。この様にして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌JM109株を形質転換し、第38図に示したプラスミドpKANTEX1334を得た。
得られたプラスミドの400ngを用い、Big Dye Terminator Kit ver.2(Appliedbiosystems社製)を用いてジデオキシ法(モレキュラー・クローニング第2版)による塩基配列の解析を行った結果、目的のDNAがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
産業上の利用可能性
本発明は、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高める方法、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を高める方法、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高められた抗体組成物を製造する方法、抗体組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いて製造されたFc融合蛋白質組成物、およびその製造方法を提供することができる。
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【配列表】
【図面の簡単な説明】
第1図は、精製した5種類の抗GD3キメラ抗体のSDS−PAGE(4〜15%グラジエントゲルを使用)の電気泳動パターンを示した写真である。第1A図が非還元条件、第1B図が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った写真である。レーン1が高分子量マーカー、2がYB2/0−GD3キメラ抗体、3がCHO/DG44−GD3キメラ抗体、4がSP2/0−GD3キメラ抗体、5がNSO−GD3キメラ抗体(302)、6がNSO−GD3キメラ抗体(GIT)、7が低分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。
第2図は、精製した5種類の抗GD3キメラ抗体のGD3との結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はGD3との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。○がYB2/0−GD3キメラ抗体、●がCHO/DG44−GD3キメラ抗体、□がSP2/0−GD3キメラ抗体、■がNSO−GD3キメラ抗体(302)、△がNSO−GD3キメラ抗体(GIT)の活性をそれぞれ示す。
第3図は、精製した5種類の抗GD3キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株G−361に対するADCC活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○がYB2/0−GD3キメラ抗体、●がCHO/DG44−GD3キメラ抗体、□がSP2/0−GD3キメラ抗体、■がNSO−GD3キメラ抗体(302)、△がNSO−GD3キメラ抗体(GIT)の活性をそれぞれ示す。
第4図は、ロット2の抗GD3キメラ抗体から調製したPA化糖鎖を、逆相HPLCで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第5図は、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が異なる6種類の抗GD3キメラ抗体のGD3に対する結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はGD3との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。●が抗GD3キメラ抗体(50%)、□が抗GD3キメラ抗体(45%)、■が抗GD3キメラ抗体(29%)、△が抗GD3キメラ抗体(24%)、▲が抗GD3キメラ抗体(13%)、×が抗GD3キメラ抗体(7%)の活性をそれぞれ示す。
第6図は、各ドナーのエフェクター細胞を用いたADCC活性の結果である。第6A図はドナーA、第6B図はドナーBのエフェクター細胞を用いた、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が異なる6種類の抗GD3キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株G−361に対するADCC活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。●が抗GD3キメラ抗体(50%)、□が抗GD3キメラ抗体(45%)、■が抗GD3キメラ抗体(29%)、△が抗GD3キメラ抗体(24%)、▲が抗GD3キメラ抗体(13%)、×が抗GD3キメラ抗体(7%)の活性をそれぞれ示す。
第7図は、ドナーAおよびドナーBの還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖含量とADCC活性とを示した図である。
第8図は、6種類の抗CCR4キメラ抗体から調製したPA化糖鎖を、逆相HPLCで分析して得た溶離図を示したものである。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第9図は、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が異なる6種類の抗CCR4キメラ抗体のCCR4に対する結合活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。縦軸はCCR4との結合活性、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗CCR4キメラ抗体(46%)、□が抗CCR4キメラ抗体(39%)、▲が抗CCR4キメラ抗体(27%)、△が抗CCR4キメラ抗体(18%)、●が抗CCR4キメラ抗体(9%)、○が抗CCR4キメラ抗体(8%)の活性をそれぞれ示す。
第10図は、ドナーAのエフェクター細胞を用いた、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が異なる抗CCR4キメラ抗体のCCR4/EL−4細胞に対するADCC活性を示した図である。エフェクター細胞には、ドナーAのエフェクター細胞を用いた。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗CCR4キメラ抗体(46%)、□が抗CCR4キメラ抗体(39%)、▲が抗CCR4キメラ抗体(27%)、△が抗CCR4キメラ抗体(18%)、●が抗CCR4キメラ抗体(9%)、○が抗CCR4キメラ抗体(8%)の活性をそれぞれ示す。
第11図は、ドナーBのエフェクター細胞を用いた、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が異なる抗CCR4キメラ抗体のCCR4/EL−4細胞に対するADCC活性を示した図である。エフェクター細胞には、ドナーBのエフェクター細胞を用いた。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■が抗CCR4キメラ抗体(46%)、□が抗CCR4キメラ抗体(39%)、▲が抗CCR4キメラ抗体(27%)、△が抗CCR4キメラ抗体(18%)、●が抗CCR4キメラ抗体(9%)、○が抗CCR4キメラ抗体(8%)の活性をそれぞれ示す。
第12図は、プラスミドCHFT8−pCR2.1およびYBFT8−pCR2.1の構築を示した図である。
第13図は、プラスミドCHAc−pBSおよびYBAc−pBSの構築を示した図である。
第14図は、プラスミドCHFT8d−pCR2.1およびYBFT8d−pCR2.1の構築を示した図である。
第15図は、プラスミドCHAcd−pBSおよびYBAcd−pBSの構築を示した図である。
第16図は、競合的PCR法を用いた各宿主細胞株におけるα1,6−フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)転写産物量の定量結果を示した図である。ラットFUT8配列をスタンダード、内部コントロールに用いた場合の各宿主細胞株におけるFUT8転写産物の量を示す。■がCHO細胞株、□がYB2/0細胞株を宿主細胞として用いた結果をそれぞれ示す。
第17図は、レクチン耐性株が生産した抗CCR4キメラ抗体のADCC活性を評価した結果を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□は5−03株、■はCHO/CCR4−LCA株、◆はCHO/CCR4−AAL株、▲はCHO/CCR4−PHA株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第18図は、レクチン耐性株が生産した抗CCR4キメラ抗体のADCC活性を評価した結果を示したものである。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□はYB2/0株(KM2760#58−35−16)、△は5−03株、●はCHO/CCR4−LCA株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第19図は、精製した抗CCR4キメラ抗体から調製したPA化糖鎖を、逆相HPLCで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。27A図は5−03株が生産する抗体、27B図はCHO/CCR4−LCA株が生産する抗体、27C図はCHO/CCR4−AAL株が生産する抗体、および27D図はCHO/CCR4−PHA株が生産した抗体の分析結果を示す。
第20図は、CHO細胞由来GMDの発現ベクター構築(全6工程)の第1の工程を示した図である。
第21図は、CHO細胞由来GMDの発現ベクター構築(全6工程)の第2の工程を示した図である。
第22図は、CHO細胞由来GMDの発現ベクター構築(全6工程)の第3の工程を示した図である。
第23図は、CHO細胞由来GMDの発現ベクター構築(全6工程)の第4の工程を示した図である。
第24図は、CHO細胞由来GMDの発現ベクター構築(全6工程)の第5の工程を示した図である。
第25図は、CHO細胞由来GMDの発現ベクター構築(全6工程)の第6の工程を示した図である。
第26図は、GMDを発現させたCHO/CCR4−LCA株のLCAレクチンに対する耐性度を示した図である。LCAレクチンを添加せずに培養した細胞群の生存率を100%とし、2回測定を行った図である。図中249は、発現ベクターpAGE249を導入したCHO/CCR4−LCA株のLCAレクチンに対する生存率を示す。GMDはGMD発現ベクターpAGE249GMDを導入したCHO/CCR4−LCA株のLCAレクチンに対する耐性度を示す。
第27図は、GMDを発現させたCHO/CCR4−LCA株の細胞群が生産した抗CCR4キメラ抗体のADCC活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。
第28図は、GMD遺伝子を発現させたCHO/CCR4−LCA株より精製した抗CCR4キメラ抗体から調製したPA化糖鎖を、逆相HPLCで分析して得た溶離図を示した図である。縦軸に相対蛍光強度、横軸に溶出時間をそれぞれ示す。
第29図は、精製したshFcγRIIIaの還元条件下でのSDS−PAGE(4〜15%グラジエントゲルを使用)の電気泳動パターンを示した写真である。レーン1がshFcγRIIIa、レーンMが分子量マーカーの泳動パターンをそれぞれ示す。
第30図は、各種抗GD3キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○が抗GD3キメラ抗体(45%)、●が抗GD3キメラ抗体(7%)の活性をそれぞれ示す。
第31図は、各種抗抗線維芽細胞増殖因子−8(FGF−8)キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○が抗FGF−8キメラ抗体(58%)、●が抗FGF−8キメラ抗体(13%)の活性をそれぞれ示す。
第32図は、各種抗CCR4キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を示した図である。第32A図は、縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○が抗CCR4キメラ抗体(87%)、●が抗CCR4キメラ抗体(46%)、□が抗CCR4キメラ抗体(39%)、■が抗CCR4キメラ抗体(27%)、△が抗CCR4キメラ抗体(18%)、▲が抗CCR4キメラ抗体(9%)、×が抗CCR4キメラ抗体(8%)の活性をそれぞれ示す。第32B図は、縦軸に結合活性、横軸に還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合をそれぞれ示した結果である。●が抗体濃度が40μg/mL、○が抗体濃度が4μg/mLの活性をそれぞれ示す。
第33図は、各種抗CCR4キメラ抗体のshFcγRIIIaに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○が抗CCR4キメラ抗体(87%)、が抗CCR4キメラ抗体(48%)、●が抗CCR4キメラ抗体(8%)の活性をそれぞれ示す。
第34図は、各種抗GD3キメラ抗体のヒトメラノーマ細胞株G−361に対するADCC活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。▲が抗GD3キメラ抗体(42%)、●が抗GD3キメラ抗体(7%)の活性をそれぞれ示す。
第35図は、FGF−8/Fc融合蛋白質のKM1334に対する結合活性を測定した結果を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がYB2/0細胞株、○がCHO/DG44細胞株を宿主細胞として生産されたFGF−8/Fc融合蛋白質の活性の結果をそれぞれ示す。
第36図は、各種のFGF−8/Fc融合蛋白質のshFcγRIIIa(V)に対する結合活性を測定した結果を示した図である。縦軸に結合活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。■がYB2/0細胞株、○がCHO/DG44細胞株を宿主細胞として生産されたFGF−8/Fc融合蛋白質の活性の結果をそれぞれ示す。
第37図は、CHO細胞由来のGMD cDNAクローン22−8の5’末端にクローン34−2の5’末端を導入したプラスミドCHO−GMDの作製工程を示した図である。
第38図は、プラスミドpKANTEX1334HおよびプラスミドpKANTEX1334の造成工程を示した図である。
Claims (48)
- 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖を修飾することを含む、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性を高める方法。
- 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖の修飾が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に結合させることである、請求の範囲1に記載の方法。
- 糖鎖が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞が合成する糖鎖であることを特徴とする、請求の範囲1または2に記載の方法。
- N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質が、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲3に記載の方法。
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する蛋白質;
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する蛋白質;
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。 - 細胞が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、請求の範囲3または4に記載の方法。
- 細胞が、少なくとも、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲3〜5のいずれか1項に記載の方法。
(a)レンズマメレクチン;
(b)エンドウマメレクチン;
(c)ソラマメレクチン;
(d)ヒイロチャワンタケレクチン。 - 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が、以下の(a)〜(i)からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲3〜7のいずれか1項に記載の方法。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)マウスミエローマ細胞株NSO細胞
(e)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞
(f)ハイブリドーマ細胞;
(g)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(h)胚性幹細胞;
(i)受精卵細胞。 - 抗体分子が、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれる抗体分子である、請求の範囲1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(a)ヒト抗体;
(b)ヒト化抗体;
(c)(a)または(b)のFc領域を含む抗体の断片;
(d)(a)または(b)のFc領域を有する融合蛋白質。 - 抗体分子のクラスがIgGである、請求の範囲1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖において、全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が20%以上である、請求の範囲1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求の範囲1〜11のいずれか1項に記載の方法により、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を高める方法。
- 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖を修飾することを含む、抗体組成物のFcγ受容体IIIaに対する結合活性が高められた抗体組成物を製造する方法。
- 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖の修飾が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖を抗体分子のFc領域に結合させることである、請求の範囲13に記載の方法。
- 糖鎖が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞が合成する糖鎖であることを特徴とする、請求の範囲13または14に記載の方法。
- N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースを結合する糖鎖の修飾に関与する蛋白質が、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲15に記載の方法。
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する蛋白質;
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する蛋白質;
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。 - 細胞が、N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、請求の範囲15または16に記載の方法。
- 細胞が、少なくとも、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲15〜17のいずれか1項に記載の方法。
(a)レンズマメレクチン;
(b)エンドウマメレクチン;
(c)ソラマメレクチン;
(d)ヒイロチャワンタケレクチン。 - 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞が、以下の(a)〜(i)からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲15〜19のいずれか1項に記載の方法。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)マウスミエローマ細胞株NSO細胞
(e)マウスミエローマ細胞株SP2/0−Ag14細胞
(f)ハイブリドーマ細胞;
(g)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(h)胚性幹細胞;
(i)受精卵細胞。 - 抗体分子が、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれる抗体分子である、請求の範囲13〜20のいずれか1項に記載の方法。
(a)ヒト抗体;
(b)ヒト化抗体;
(c)(a)または(b)のFc領域を含む抗体の断片;
(d)(a)または(b)のFc領域を有する融合蛋白質。 - 抗体分子のクラスがIgGである、請求の範囲13〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体分子のFc領域に結合するN−グリコシド結合複合型糖鎖において、全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合していない糖鎖の割合が20%以上である、請求の範囲13〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 請求の範囲12の方法を含む、抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物を製造する方法。
- 請求の範囲13〜24のいずれか1項に記載の製造方法により製造される抗体組成物。
- 抗原と被験抗体組成物とを反応させて抗原と抗体組成物の複合体を形成し、該複合体をFcγ受容体IIIaと接触させてFcγ受容体IIIaに対する結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物中の糖鎖の割合とFcγ受容体IIIaに対する結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法。
- 抗原と被験抗体組成物とを反応させたて抗原と抗体組成物の複合体を形成し、該複合体をFcγ受容体IIIaと接触させ、Fcγ受容体IIIaに対する結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性とFcγ受容体IIIaに対する結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を検出する方法。
- 被験抗体組成物とFcγ受容体IIIaとを接触させ、抗体組成物とFcγ受容体IIIaとの結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物中の糖鎖の割合とFcγ受容体IIIaとの結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合を検出する方法。
- 被験抗体組成物とFcγ受容体IIIaとを接触させ、抗体組成物とFcγ受容体IIIaとの結合活性を測定し、スタンダードの抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性とFcγ受容体IIIaとの結合活性を示す検量線と比較することにより、抗体組成物の抗体依存性細胞障害活性を検出する方法。
- N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を用いて製造されたFc融合蛋白質組成物。
- 細胞が、以下の(a)、(b)および(c)からなる群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、請求の範囲30に記載のFc融合蛋白質組成物。
(a)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースの合成に関与する酵素蛋白質;
(b)N−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にフコースの1位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質;
(c)細胞内糖ヌクレオチドGDP−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質。 - 細胞が、少なくとも、以下の(a)、(b)、(c)および(d)からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲30または31に記載のFc融合蛋白質組成物。
(a)レンズマメレクチン;
(b)エンドウマメレクチン;
(c)ソラマメレクチン;
(d)ヒイロチャワンタケレクチン。 - 細胞が、Fc融合蛋白質をコードする遺伝子を導入した細胞である、請求の範囲30〜32のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
- Fcが抗体分子のIgGクラス由来である、請求の範囲33に記載のFc融合蛋白質組成物。
- 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲30〜34のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
- 細胞が、マウスミエローマ細胞である、請求の範囲30〜35のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
- マウスミエローマ細胞が、NSO細胞またはSP2/0−Ag14細胞である請求の範囲36記載のFc融合蛋白質組成物。
- 細胞が、以下の(a)〜(g)からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲30〜37のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)抗体を生産するハイブリドーマ細胞;
(e)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(f)胚性幹細胞;
(g)受精卵細胞。 - N−グリコシド結合複合型糖鎖を抗体分子のFc領域に有するFc融合蛋白質からなる組成物であって、該組成物中に含まれるFc領域に結合する全N−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が20%以上であるFc融合蛋白質組成物。
- フコースが結合していない糖鎖が、該フコースの1位がN−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位にα結合していない糖鎖である、請求の範囲39に記載のFc融合蛋白質組成物。
- 抗体分子のクラスがIgGである、請求の範囲39または40に記載のFc融合蛋白質組成物。
- Fc融合蛋白質組成物が、Fc融合繊維芽細胞増殖因子−8である請求の範囲30〜41のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物。
- 請求の範囲30〜42のいずれか1項に記載のFc融合蛋白質組成物を生産する細胞。
- 細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる、請求の範囲43に記載の細胞。
- 細胞が、マウスミエローマ細胞である、請求の範囲43または44に記載の細胞。
- マウスミエローマ細胞が、NSO細胞またはSP2/0−Ag14細胞である請求の範囲45に記載の細胞。
- 細胞が、以下の(a)〜(g)からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲43〜46のいずれか1項に記載の細胞。
(a)チャイニーズハムスター卵巣組織由来CHO細胞;
(b)ラットミエローマ細胞株YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞;
(c)シリアンハムスター腎臓組織由来BHK細胞;
(d)抗体を生産するハイブリドーマ細胞;
(e)ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(f)胚性幹細胞;
(g)受精卵細胞。 - 請求の範囲43〜47のいずれか1項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中にFc融合蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物からFc融合蛋白質組成物を採取する工程を含む、Fc融合蛋白質組成物の製造方法。
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