TWI414531B - 淋巴毒素α之抗體 - Google Patents

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TWI414531B TW096138038A TW96138038A TWI414531B TW I414531 B TWI414531 B TW I414531B TW 096138038 A TW096138038 A TW 096138038A TW 96138038 A TW96138038 A TW 96138038A TW I414531 B TWI414531 B TW I414531B
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Description

淋巴毒素α之抗體
本發明係關於抗體及其用於治療自體免疫病症之用途。更特定言之，本發明係關於與淋巴毒素α結合且亦可阻斷淋巴毒素α配位體與一或多種受體之結合的抗體。
 TNF及LT
在人類中，自體免疫疾病仍為臨床重要疾病。顧名思義，自體免疫疾病經由身體自身免疫系統造成其嚴重破壞。雖然自體免疫疾病之個別類型間病理機制不相同，但一個一般機制涉及所存在之特定抗體(本文中稱為自反應性抗體或自體抗體)的結合。醫師及科學家已鑑別出多於70種臨床上性質不同之自體免疫疾病，包括類風濕性關節炎(RA)、多發性硬化症(MS)、血管炎、免疫介導糖尿病及諸如全身性紅斑狼瘡(SLE)之狼瘡。雖然許多自體免疫疾病實屬罕見，影響少於200,000個體，但總體而言此等疾病折磨數百萬美國人，估計達人口總數之5%，其中女性不平衡地受到多數疾病之影響。此等疾病之慢性性質導致巨大社會及財政負擔。
腫瘤壞死因子(TNF)－相關蛋白在此項技術中被識別為具有範圍介於宿主防禦至免疫調節至細胞凋亡之多種活動的蛋白大家族。TNF首先經鑑別為血清源性因子，其在活體外對若干經轉化細胞株具細胞毒性且在活體內引起特定腫瘤之壞死。已鑑別出超家族中之類似因子且將其稱作淋巴毒素("LT")。由於在1980年代初期觀察到TNF與LT之間的相似性，因此提出將TNF及LT分別稱為TNF－α及TNF－β。因此科學文獻提及兩種術語。如本申請案中所使用，術語"TNF"係指TNF－α。隨後之研究揭示淋巴毒素之兩種形式，稱作LTα及LTβ。US 2005－0129614描述基於結構及生物學相似性之TNF配位體超家族的另一種多肽成員，稱為TL－5。
TNF蛋白家族之成員以經由細胞－細胞接觸局部地起作用之膜結合形式存在，或以分泌蛋白形式存在。TNF相關受體之家族與此等蛋白反應且觸發多種信號轉導途徑，包括細胞死亡或細胞凋亡、細胞增殖、組織分化及前發炎性反應。TNF－α獨自地已牽涉於發炎性疾病、自體免疫疾病、病毒性感染、細菌性感染及寄生性感染、惡性腫瘤及/或神經退化性疾病中且為諸如RA及克羅恩氏病(Crohn's disease)之疾病之特定生物學療法的適用靶。
TNF及LTα蛋白之選殖及其相應生物學活性之進一步表徵揭示該等蛋白在許多方面不同。Aggarwal等人，Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley－Liss,Inc.1990，第375－384頁。舉例而言，LTα係一種約20 kDa(若經N－及O－糖基化，則為25 kDa)之分泌性、可溶性蛋白。相反，TNF無糖基化位點且經合成具有導致最初蛋白轉錄與細胞相關之明顯跨膜域。細胞相關TNF蛋白之蛋白水解作用導致分子量為約19 kDa之蛋白之可溶性形式的釋放。TNF主要由活化巨噬細胞產生，而LT係由活化淋巴細胞產生。Wong等人，Tumor Necrosis Factors：The Molecules and their Emerging Role in Medicine ,Beutler,B.，編，Raven Press(1991)，第473－484頁。編碼TNF及LTα之序列亦不同。TNF及LTα僅共有約32%胺基酸序列一致性。關於TNF及LTα之不同生物學活性，TNF會增加內皮細胞介白素－1("IL－1")之產生，而LTα對其之作用較小。此外，TNF誘導巨噬細胞群落刺激因子自巨噬細胞之產生，而LTα對其無作用。此等及其他生物學活性係在Aggarwal,Tumor Necrosis Factors：Structure,Function and Mechanism of Action,Aggarwal及Vicek，編(1992)，第61－78頁中論述。
TNF及LTα進一步在以下評論文章中予以描述：Spriggs,"Tumor Necrosis Factor：Basic Principles and Preclinical Studies,"Biologic Therapy of Cancer, DeVita等人，編，J.B.Lippincott Company(1991)第16章，第354－377頁；Ruddle,Current Opinion in Immunology, 4：327－332(1992)；Wong等人，"Tumor Necrosis Factor,"Human Monocytes, Academic Press(1989)，第195－215頁；及Paul等人，Ann.Rev.Immunol, 6：407－438(1988)。
在非腫瘤細胞中，TNF及TNF相關細胞因子在多種免疫反應中具活性。TNF及LTα配位體均與TNF受體(p55或p60及p75或p80；本文中稱為"TNF－R")結合且活化該等TNF受體。
細胞表面LT複合物已在CD4＋T細胞融合瘤細胞(II－23.D7)中得以表徵，其表現高LT含量(Browning等人，J.Immunol.,147：1230－1237(1991)；Androlewicz等人，J.Biol.Chem.,267：2542－2547(1992))。LTβ－R、LT亞單元及表面LT複合物之表現及生物學作用係在Ware等人，"The ligands and receptors of the lymphotoxin system",Pathways for Cytolysis,Current Topics Microbiol.Immunol,Springer－Verlag，第175－218頁(1995)中予以評述。
誘導LTα表現且主要由活化T及B淋巴細胞及自然殺傷(NK)細胞分泌LTα。在T輔助細胞亞類中，LTα似乎係由Th1而非Th2細胞產生。LTα亦在黑素細胞中被偵測到。LTβ(亦稱為p33)已在T淋巴細胞、T細胞株、B細胞株及淋巴因子活化殺傷(LAK)細胞之表面上得以鑑別出。研究已顯示LTβ在LTα不存在情況下不起作用。
LTα以同質三聚體(LTα3)或與LTβ之異質三聚體形式存在。此等異質三聚體含有兩個LTα亞單元及一個LTβ亞單元(LTα2β1)，或一個LTα亞單元及兩個LTβ亞單元(LTα1β2)。對於LTα同質三聚體而言，僅知的細胞表面受體為兩種TNF受體，即p55及p75。然而，LTαβ異質三聚體，即LTα1β2並不與TNF受體結合而與TNF受體超家族成員淋巴毒素β受體(本文中稱為LTβ－R)結合。異質三聚形式LTα2β1可能結合TNF受體。
LTβ－R在免疫系統之發育中及在免疫系統中許多細胞(包括濾泡樹突狀細胞及許多基質細胞類型)之功能維持中的作用已得以充分描述(Matsumoto等人，Immunol.Rev. 156：137(1997))。LTβ－R之已知配位體不僅包括LTα1β2，而且包括稱為LIGHT之第二配位體(Mauri等人，Immunity 8：21(1998))。已顯示LTβ－R之活化誘導活體內特定癌細胞株之凋亡死亡(US 6,312,691)。LTβ－R之人化抗體及其使用方法係在US 2004－0058394中提供且經陳述其在人類中適用於治療或減少瘤形成之發展、嚴重性或影響。此外，EP 1585547(WO 2004/058183)(LePage及Gill)揭示包括能活化LTβ－R信號轉導之組合物與一或多種其他化療劑之組合的組合療法以及治療方法及用於鑑別可與LTβ－R促效劑組合對腫瘤抑制具有疊加效應之藥劑的篩選方法。
如自基因剔除小鼠明顯可見，LT對於淋巴新生很重要。參見Futterer等人之Immunity,9(1)：59－70(1998)，其顯示缺乏LTβ－R之小鼠缺乏淋巴結及派亞氏淋巴叢(Peyer's patches)且亦顯示抗體親和力成熟減弱。Rennert等人，Immunity,9 (1)：71－9(1998)報導一種針對LTβ－R之促效劑單株抗體在LTα基因剔除小鼠中恢愎形成淋巴結之能力。亦參見Wu等人，J.Immunology, 166(3)：1684－9(2001)及Endres等人，J.Exp.Med, 189(1)：159－68(1999)；Dohi等人，J.Immunology, 167(5)：2781－90(2001)；及Matsumoto等人，J.Immunology, 163(3)：1584－91(1999)。Korner等人之Eur.J.Immun.,27(10)：2600－9(1997)報導缺乏TNF及LT兩者之小鼠顯示遲緩B細胞成熟及血清免疫球蛋白缺乏，而僅缺乏TNF之小鼠未顯示該等缺乏。
另外，LT對於炎症很重要。LTα在RIP.LTα轉殖基因小鼠胰腺中過表現，該等胰腺已顯示炎症、趨化因子表現增加及淋巴樣結構且其中單獨LTβ過表現表明無其他炎症。此外，LTα缺乏小鼠展現TNF－α產生減弱，且當該等小鼠與TNF轉基因雜交時，恢復缺陷脾結構及功能(Kollias,J.Exp.Med.,188：745(1998)；Chaplin,Ann Rev Imm 17：399(1999))，且在病原性激發後恢復降低的TNF含量(Eugster,Eur.J.Immun. 31：1935(2001))。
當TNF－α或LTα3 與TNF受體TNFRI及/或TNFRII相互作用時，結果為前發炎性反應及/或細胞凋亡。當LTα1β2與受體LTβ－R相互作用時，結果為淋巴新生及趨化因子與黏附分子之誘導。自體免疫疾病與淋巴新生及發炎性反應相關，且在患有自體免疫疾病(包括MS、發炎性腸病(IBD)及RA)之患者中存在有LT表現的增加(Weyand等人，Curr.Opin.Rheumatol,15：259－266(2003)；Selmaj等人，J.Clin.Invest, 87：949－954(1991)；Matusevicius等人，J.Neuroimm., 66：115－123(1996)；Powell等人，International Immunology, 2(6)：539－44(1990)；Zipp等人，Annals of Neurology, 38/5：723－730(1995)；Voskuhl等人，Autoimmunity 15(2)：137－43(1993)；Selmaj等人J.Immunology, 147：1522－29(1991)；Agyekum等人，Journal Pathology, 199(1)：115－21(2003)；及Takemum等人，J.Immunol., 167：1072(2001))。
特定地就MS而言，血清LTα在MS中與損傷/疾病負荷有關(Kraus等人，Acta Neurologica Scandinavica,105(4)：300－8(2002))。在活體內銅立榮(cuprizone)模型中LTα與脫髓鞘而非髓鞘再生有關，而TNF－α為兩者所需(Plant等人，Glia 49：1－14(2005))。
特定地就RA而言，人類LTα3及TNF－α在RA患者中之含量高於正常供體之彼等含量(Stepien,Eur Cytokine Net 9：145(1998))。LTα在RA中之作用包括：血清LTα存在於一些RA患者中，增加之LTα蛋白存在於滑膜中，LT途徑與滑膜中之異位淋巴新生相關，且在RA患者之纖維母細胞樣滑膜細胞上LTβ－R表現增加。另外，病例報告揭示中和LTα3有益於英利昔單抗(infliximab)抗性RA患者(Buch等人，Ann.Rheum.Dis.,63：1344－46(2004))。又，Han等人，Arthrit.Rheumat,52：3202－3209(2005)描述阻斷LT途徑藉由增強Th1反應而加重自體免疫性關節炎。
Fava等人，J.Immunology,111 (1)：115－26(2003)中展示以LTβR－Ig預防及治療膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)之臨床前功效。此外，缺乏LTα之小鼠對實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)具抗性(Suen等人，J.Exp.Med,186：1233－40(1997)；Sean Riminton等人，J.Exp.Med, 187(9)：1517－28(1998))。亦已公開LTβR－Ig在EAE中之功效(Gommerman等人，J.Clin.Invest, 112(5)：755－67(2003))。又，在小鼠中LTβR－Ig破壞淋巴生成。Mackay等人，Europ.J.Immunol. 27(8)：2033－42(1997)。此外，在非肥胖性糖尿病小鼠中投予LTβR.Ig可減少胰島素依賴性糖尿病(IDDM)(Wu等人，J.Exp.Med, 193(11)：1327－32(2001))。Gommerman等人，J.Clin.Invest. 110(9)：1359－69(2002)使用LTβR－Ig研究LT在非人類靈長類動物之淋巴生成中的作用。此外，缺乏LTα之小鼠比缺乏TNF－α之小鼠對牛分枝桿菌(M.bovis )BCG的敏感性小。Eugster等人，Europ.J.Immunol., 31：1935(2001)。
LT亦已用於治療癌症。參見US 5,747,023。
抗體
抗體為展現對特定抗原之結合特異性的蛋白。天然抗體通常為約150,000道爾頓之異質四聚醣蛋白，其由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈組成。雖然雙硫鍵之數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈之間變化，但每一輕鏈藉由一個共價雙硫鍵與重鏈連接。每一重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內雙硫橋。每一重鏈在一末端處具有一可變域(VH )，接著為許多恆定域。每一輕鏈在一末端處具有一可變域(VL )且在其另一末端處具有一恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。
術語"可變"係指可變域之特定部分的序列在抗體之間廣泛不同且引起每一特定抗體對其特定抗原之結合特異性的事實。然而，可變性在整個抗體可變域中並非均勻分布。其集中在輕鏈及重鏈可變域中之三個稱為互補決定區(CDR)之區段中。可變域之較高度保守部分係稱為構架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個主要採用β－摺疊構型、藉由三個CDR連接之FR，其形成環連接，且在一些情況下形成β－摺疊結構之部分。各鏈中之CDR藉由FR而緊密結合在一起，且與另一鏈之CDR一起促成抗體之抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
恆定域並不直接涉及使抗體與抗原結合，但展現各種效應功能。視其重鏈之恆定區的胺基酸序列而定，抗體或免疫球蛋白可分為不同種類。存在5種主要免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中之若干者可進一步分為亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別被稱為α、δ、ε、γ及μ。在人類免疫球蛋白種類中，已知僅人類IgG1、IgG2、IgG3及IgM可活化補體，且人類IgG1及IgG3比IgG2及IgG4更有效地介導抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)。
兩種主要方法已用於開發可抑制TNF－α之治療化合物。第一，以英利昔單抗，即亦稱為REMICADE之TNF－α之嵌合單株抗體舉例說明，藉由使用高親和力及效力之特異性單株抗體阻止TNF－α與其受體結合來中和TNF－α作用。第二，以亦稱為ENBREL之依那西普(etanercept)舉例說明，藉由使用用作"誘餌"以降低TNF－α與其天然受體之結合的基於TNF－α受體之分子來抑制TNF－α。儘管兩種類型之分子可阻止TNFα與其受體之結合，但基於受體之抑制劑(諸如依那西普)亦將阻止LTα之受體結合。
在專利文獻中，報導由EP 212489揭示之惡病質素之抗體(TNF)適用於診斷免疫檢定且適用於治療細菌感染中之休克。EP 218868揭示人類TNF之單株抗體及其用途。EP 288,088揭示抗TNF抗體及其於病變(尤其川崎氏病變(Kawasaki's pathology)及細菌感染)之免疫檢定診斷中的效用。抗TNF抗體亦在(例如)EP 1585477(Giles－Komar等人)、US 2006－0147452、US 2006－0222646及US 2006－0121037中有描述。一種藉由使用對抗人類TNFα與受體之結合的單域抗體多肽構建體治療RA之方法係在US 2005－0271663之中描述。使用抗TNF受體融合蛋白治療RA之方法係在US 2005－0260201中描述。使用包含甲胺喋呤(methotrexate)及抗TNF抗體之組合物治療TNF介導性疾病(包括RA、克羅恩氏病及與移植相關之急性及慢性免疫疾病)之方法係在EP 1593393中描述。與TNF－R結合之抗體包括US 7,057,022中所述之彼等抗體。具有TNF－α拮抗劑活性之新穎蛋白係在US 7,056,695中描述。US 2006－0147448揭示藉由LT途徑抑制劑治療免疫性腎病。
LTβ及LTβ/LTα複合物及LTβ－R及其抗體以及LTβ阻斷劑係在例如以下專利中描述：WO 1992/00329；WO 1994/13808；US 5,661,004；US 5,795,964；EP 0954333；US 5,670,149；US 5,925,351；US 2005－0037003；US 6,403,087；US 6,669,941；US 6,312,691；US 7,001,598；US 7,030,080；US 2006－0222644；及US 2005－0163747。申請案US 2006－0134102揭示LTβ－R藥劑與化療劑之組合。LTβ－R之抗體係在US 2005－0281811中描述。亦參見WO 2006/114284，其關於使用LTβ－R抗體預防及/或治療肥胖及肥胖相關病症。在治療方法中對單獨LTβ－R或LTβ－R與化療劑之組合具特異性的人化抗體係在EP 1539793中揭示。LTα及其抗體係(例如)在US 4,959,457；5,824,509；4,920,196；及5,683,688；US 2005－0266004(WO 2005/067477)及US 5,188,969(EP 347728B1)中描述。亦參見US 2002－0039580；WO 2004/039329及US 2002－0197254，其關於LTβ或LTβ－R技術。多價抗體(結合TNF受體超家族)係(例如)在US 2002－0004587及US 2006－0025576中描述。
在此項技術中不斷需要製造抗體，詳言之具有改良功能之治療抗體，諸如可阻斷LTα之抗LTα抗體或其片段，此係因為LTα比單獨TNF－α或LTβ具有較多與各種受體之相互作用。
本發明在某種程度上係基於LT生物學途徑之多種拮抗劑的鑑別，該LT生物學途徑為作為重要治療標靶提出之生物學/細胞過程。本發明提供基於干擾LTα活化(包括(但不限於)干擾LTα與各種受體結合)之組合物及方法。
因此，本發明係如所主張。在一態樣中，本發明提供一種經分離之抗淋巴毒素α(LTα)抗體，其包含至少一個選自由以下各者組成之群的互補決定區(CDR)序列：(a)CDR－L1序列，其包含胺基酸A1－A11，其中A1－A11為KASQAVSSAVA(SEQ ID NO：1)或RASQAVSSAVA(SEQ ID NO：2)；或包含胺基酸A1－A17，其中A1－A17為KSSQSLLYSTNQKNFLA(SEQ ID NO：3)或KSSQSLLYSANQKNFLA(SEQ ID NO：4)或KSSQSLLYSTNQKNALA(SEQ ID NO：6)，其中N為任何胺基酸(分別為嵌合2C8或人化2C8.v2/2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14，或3F12純系14或17)；(b)CDR－L2序列，其包含胺基酸B1－B7，其中B1－B7為SASHRYT(SEQ ID NO：7)或WASTRDS(SEQ ID NO：8)(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2/人化2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14)；(c)CDR－L3序列，其包含胺基酸C1－C9，其中C1－C9為QQHYSTPWT(SEQ ID NO：9)或QENYSTPWT(SEQ ID NO：11)或QQYYSYPRT(SEQ ID NO：13)或QQYASYPRT(SEQ ID NO：14)或QQYYAYPRT(SEQ ID NO：15)，其中N為任何胺基酸(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2或2C8純系G7或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14或3F12純系20或3F12純系21)；(d)CDR－H1序列，其包含胺基酸D1－D10，其中D1－D10為GYTFTSYVIH(SEQ ID NO：16)或GYTFSSYWIE(SEQ ID NO：17)(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2/人化2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14)；(e)CDR－H2序列，其包含胺基酸E1－E17，其中E1－E17為YNNPYNDGTNYNEKFKG(SEQ ID NO：18)或EISPGSGSTNYNEEFKG(SEQ ID NO：19)或YNNPYNAGTNYNEKFKG(SEQ ID NO：101)或EINPGSGSTIYNEKFKG(SEQ ID NO：110)，其中N為任何胺基酸(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2或嵌合3F12/人化3F12.v5，或人化2C8.vX，或人化3F12.v14)；及(f)CDR－H3序列，其包含胺基酸F1－F9，其中F1－F9為PTMLPWFAY(SEQ ID NO：20)；或包含胺基酸F1－F5，其中F1－F5為GYHGY(SEQ ID NO：21)或GYHGA(SEQ ID NO：22)(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2/人化2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14或3F12純系12)。
較佳地，SEQ ID NO：3為KSSQSLLYSTAQKNFLA(SEQ ID NO：5)(3F12純系15)。在另一較佳態樣中，SEQ ID NO：11為QESYSTPWT(SEQ ID NO：10)(2C8純系A8/人化2C8.vX)或QEVYSTPWT(SEQ ID NO：12)(2C8純系H6)。
在另一較佳實施例中，CDR－L1序列為SEQ ID NO：2或3或4或6。
在另一較佳態樣中，抗體包含(i)所有SEQ ID NO：1或2及7及9，或SEQ ID NO：1或2及7或8及11，或SEQ ID NO：3、8及13，或SEQ ID NO：4、5或6、8及13，或SEQ ID NO：3、8及14或15，或SEQ ID NO：4、5或6、8及14或15之CDR－L1至CDR－L3胺基酸序列；或(ii)所有SEQ ID NO：16、18及20，或所有SEQ ID NO：16、101及20，或所有SEQ ID NO：17、19及21或22，或所有SEQ ID NO：17、110及21之CDR－H1至CDR－H3胺基酸序列。
在又一較佳態樣中，抗體包含所有SEQ ID NO：1或2及7及9，或所有SEQ ID NO：16、18及20，或所有SEQ ID NO：16、101及20。在一替代實施例中，抗體包含所有SEQ ID NO：3、8及13，或所有SEQ ID NO：17、19及21或22。在一替代實施例中，抗體包含所有SEQ ID NO：4、8及14，或所有SEQ ID NO：17、110及21。在其他實施例中，抗體包含(i)所有SEQ ID NO：1或2、7及9，或SEQ ID NO：1或2及7或8及11，或SEQ ID NO：3、8及13，或SEQ ID NO：4、5或6、8及13，或SEQ ID NO：3、8及14或15，或SEQ ID NO：4、5或6、8及14或15之CDR－L1至CDR－L3胺基酸序列；或(ii)所有SEQ ID NO：16、18及20，或SEQ ID NO：16、101及20，或SEQ ID NO：17、19及21或22，或SEQ ID NO：17、110及21之CDR－H1至CDR－H3胺基酸序列。
另外，本文中之抗體較佳為嵌合或人化抗體，最佳為人化抗體。本發明之人化抗體可在其重鏈及/或輕鏈可變域中包含一或多個合適之人類及/或人類一致非CDR(例如構架)序列，其限制條件為該抗體展現所需生物學特性(例如所需結合親和力)。較佳地，該人化抗體構架序列之至少一部分為人類一致構架序列。
在一些實施例中，一或多種其他修飾存在於人類及/或人類一致非CDR序列中。在一實施例中，本發明之抗體的重鏈可變域包含人類一致構架序列之至少一部分(較佳為全部)，其在一實施例中為亞群III一致構架序列。在一實施例中，本發明之抗體包含在至少一個胺基酸位置處經修飾之變異亞群III一致構架序列。舉例而言，在一實施例中，變異亞群III一致構架序列可於位置71、73及/或78中之一或多者處包含取代。在一實施例中，該取代為呈任何組合形式之R71A、N73T及/或N78A，較佳為所有三者。在另一實施例中，此等抗體包含或進一步包含人類輕鏈一致構架序列之至少一部分(較佳為全部)。在一較佳實施例中，本發明之抗體包含人類亞群I構架一致序列之至少一部分(較佳為全部)。
界定抗體之CDR的胺基酸位置/邊界可視上下文及此項技術中已知之各種定義(如下文所述)而變化。可變域內之一些位置可視作雜合高變位置，因為根據一組標準可認為此等位置位於CDR中，然而根據另一組不同標準認為其位於CDR外。此等位置中之一或多者亦可見於延長之CDR(如下文進一步所定義)中。本發明提供在此等雜合高變位置處包含修飾之抗體。在一實施例中，此等雜合高變位置包括重鏈可變域中之位置26－30、33－35B、47－49、57－65、93、94及102中之一或多者。在一實施例中，此等雜合高變位置包括輕鏈可變域中之位置24－29、35－36、46－49、56及97中之一或多者。在一實施例中，本發明之抗體包含在一或多個雜合高變位置處經修飾之變異人類亞群一致構架序列。
在另一較佳態樣中，抗體與LTα3結合且阻斷LTα3與腫瘤壞死因子受體－1(TNFRI)及腫瘤壞死因子受體－2(TNFRII)之相互作用。較佳地，其亦與一或多種LTαβ複合物結合且尤其在細胞表面上結合。較佳地，其亦阻斷一或多種LTαβ複合物之功能。又，在活體外關節炎檢定(諸如活體外膠原蛋白誘導性關節炎檢定或活體外抗體誘導性關節炎檢定)中，其較佳地可降低與類風濕性關節炎相關之發炎細胞因子之含量。
在諸如鼠類S5H3抗體之一些態樣中，抗體並不阻斷LTαβ與LTβ－R之相互作用。在其他態樣中，抗體阻斷LTαβ與LTβ－R之相互作用。較佳地，抗體調節LTαβ表現細胞。在其他實施例中，抗LTα抗體大體上中和至少一種LTα蛋白之至少一種活性。較佳地，本文中之抗體靶向任何表現LTα之細胞，且更佳地消減LTα陽性細胞或LTα分泌細胞。
較佳抗體以至少約10－12 M(皮莫耳含量)且更佳至少約10－13 M之親和力結合LTα。又，較佳為IgG抗體，更佳為人類IgG。人類IgG包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之人類IgG同型中之任一者。鼠類IgG包括IgG1、2a、2b及3之同型。更佳地，鼠類IgG為IgG2a且人類IgG為IgG1。在人類IgG之其他較佳實施例中，所提供之VH及VL序列與人類IgG1恆定區連接。
在另一實施例中，本發明提供一種抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：23或24之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：25或26之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：23及25兩者或包含SEQ ID NO：24及26兩者之輕鏈及重鏈可變域。
在又一實施例中，本發明提供一種抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：27或28之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：29或30或31之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：27及29兩者，或包含SEQ ID NO：27及30兩者，或包含SEQ ID NO：27及31兩者，或包含SEQ ID NO：28及30兩者，或包含SEQ ID NO：28及31兩者之輕鏈及重鏈可變域。
在又一態樣中，本發明提供一種抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：102之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：103之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：102及103兩者之輕鏈及重鏈可變域。
在又一態樣中，本發明提供一種抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：108之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：109之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：108及109兩者之輕鏈及重鏈可變域。
在其他較佳實施例中，抗體具有Fc區。在一態樣中，該Fc區為野生型(或天然序列)Fc區。在另一實施例中，抗體進一步在其Fc區中包含一或多個胺基酸取代，導致多肽與具有天然序列Fc區之抗體相比展現以下特性中之至少一者：FcγR結合增加、抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)增加、補體依賴性細胞毒性(CDC)增加、CDC降低、ADCC及CDC功能增加、ADCC功能增加但CDC功能降低、FcRn結合增加及血清半衰期增加。更佳地，抗體進一步在其Fc區中包含一或多個胺基酸取代，導致其與具有天然序列Fc區之相同抗體相比具有增加之ADCC功能。
在一特別較佳之實施例中，抗體在其Fc區中於以下位置之任一者或任何組合處具有胺基酸取代：268D，或298A，或326D，或333A，或334A，或298A以及333A，或298A以及334A，或239D以及332E，或239D以及298A及332E，或239D以及268D及298A及332E，或239D以及268D及298A及326A及332A，或239D以及268D及298A及326A及332E，或239D以及268D及283L及298A及332E，或239D以及268D及283L及298A及326A及332E，或239D以及330L及332E及272Y及254T及256E，或250Q以及428L，或265A，或297A，其中265A取代係於297A不存在情況下發生且297A取代係於265A不存在情況下發生。在一特定實施例中，Fc區具有一至三個如此之胺基酸取代，例如於位置298、333及334處之取代，且更佳為298A、333A及334A之組合處的取代。此等標號之每一者中數字後之字母表示在彼位置處改變之胺基酸。
該等抗LTα抗體影響不同程度之LTα/LTβ信號轉導途徑之破壞。舉例而言，在一實施例中，本發明提供一種抗LTα抗體(較佳經人化)，其中抗體對人類LTα之單價親和力(例如，呈Fab片段形式之抗體對人類LTα之親和力)大致與由融合瘤細胞株產生之鼠類抗體之彼親和力(例如，呈Fab片段形式之鼠類抗體對人類LTα之親和力)相同或大於後者，該融合瘤細胞株係以美國菌種保藏中心(ATCC)寄存編號PTA－7538(融合瘤鼠類淋巴毒素α2 β1 s5H3.2.2)寄存。單價親和力較佳係表示為Kd值及/或係藉由使用表面電漿共振(SPR)(BIACORE技術)之光生物感測器或放射免疫檢定量測。
本文中之其他抗體包括具有上述特性中之任一者之彼等抗體，其相對於野生型中國倉鼠卵巢細胞中所產生之相同抗體上之岩藻糖的量而言具有減少之岩藻糖。更佳為彼等不具有岩藻糖之抗體。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體組合物，其包含本文所述之具有Fc區之抗體，其中該組合物中約20－100%之抗體在缺乏岩藻糖之Fc區中包含成熟核心碳水化合物結構。較佳地，該組合物包含具有Fc區之抗體，該Fc區已藉由在選自由以下位置組成之群之Fc區之位置的任一者或任何組合處取代選自由A、D、E、L、Q、T及Y組成之群的胺基酸來改動以與野生型IgG Fc序列相比改變抗體之ADCC、CDC或藥物動力學特性中之一或多者：238、239、246、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、309、312、314、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、428、430、434、435、437、438及439。
上述抗體組合物更佳為抗體進一步包含如下Fc取代之組合物：268D或326D或333A以及334A，或298A以及333A，或298A以及334A，或239D以及332E，或239D以及298A及332E，或239D以及268D及298A及332E，或239D以及268D及298A及326A及332A，或239D以及268D及298A及326A及332E，或239D以及268D及283L及298A及332E，或239D以及268D及283L及298A及326A及332E，或239D以及330L及332E，其中此等標號之每一者中數字後之字母表示在彼位置處改變之胺基酸。
上述抗體組合物另外較佳為抗體結合FcγRIII之組合物。該組合物較佳為抗體在人類效應細胞存在下具有ADCC活性或與包含人類野生型IgG1 Fc之另外相同抗體相比在人類效應細胞存在下具有增加之ADCC活性的組合物。組合物亦較佳為抗體相較於具有成熟核心碳水化合物結構之醣蛋白而言以較好親和力結合FcγIII或較有效地介導ADCC的組合物，其中該成熟核心碳水化合物結構包括連接於該醣蛋白之Fc區的岩藻糖。另外，組合物較佳為抗體已由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、較佳Lec13細胞產生之組合物。組合物亦較佳為抗體已由缺乏岩藻糖基轉移酶基因、更佳FUT8 基因之哺乳動物細胞產生的組合物。
在一實施例中，上述組合物為抗體不含連接於成熟核心碳水化合物結構之平分型N－乙醯葡糖胺(GlcNAc)的組合物。在一替代實施例中，組合物為抗體具有連接於成熟核心碳水化合物結構之平分型GlcNAc的組合物。
在另一態樣中，上述組合物為抗體具有一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之半乳糖殘基的組合物。在一替代實施例中，組合物為抗體不含一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之半乳糖殘基的組合物。
在另一態樣中，上述組合物為抗體具有一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之唾液酸殘基的組合物。在一替代態樣中，組合物為抗體不含一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之唾液酸殘基的組合物。
上述組合物較佳包含至少約2%無岩藻糖基化(afucosylated)抗體、更佳至少約4%無岩藻糖基化抗體、更佳至少約10%無岩藻糖基化抗體、甚至更佳至少約19%無岩藻糖基化抗體，且最佳包含約100%無岩藻糖基化抗體。
本文亦包括一種特異性地結合本文之抗體中之任一者的抗個體基因型抗體。
用於宿主個體之治療劑較佳在該個體體內引起針對該藥劑之很少免疫原性反應或無免疫原性反應。在一實施例中，本發明提供一種嵌合或人化抗體，其在宿主個體體內引起且/或預期引起與鼠類抗體相比大體上程度降低之人類抗小鼠抗體反應(HAMA)。在另一實例中，本發明提供一種嵌合或人化抗體，其引起且/或預期引起最小人類抗小鼠抗體反應(HAMA)或無該反應。在一實例中，本發明之抗體引起臨床上可接受之最高程度或低於該程度的抗小鼠抗體反應。
本發明之抗體可用於調節LTα相關效應之一或多個態樣，包括(但不限於)LTα受體活化、下游分子信號轉導、細胞增殖、細胞遷移、細胞存活、細胞形態發生及血管生成。此等效應可藉由任何生物學相關機制調節，包括破壞配位體(例如LTα)、結合及阻斷LTα3受體或異質二聚受體中之一或兩者以及受體磷酸化作用及/或受體多聚化作用。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制LTα活化細胞增殖之方法，該方法包含使細胞或組織與有效量之本發明之抗體中之一或多者接觸。在一較佳實施例中，該LTα活化細胞增殖係歸因於自體免疫病症，更佳為RA、MS、休格連氏症候群(Sjgren's syndrome)、狼瘡、重症肌無力或IBD，或癌症，尤其乳癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤或白血病。在另一較佳實施例中，該方法進一步包含使該細胞或組織與第二藥劑接觸，其中第一藥劑為本文之抗體中之一或多者。在又一較佳實施例中，該細胞或組織為哺乳動物細胞或組織，更佳為人類，且更佳地，該方法為活體內方法。在該較佳活體內方法中，較佳地，向具有該細胞或組織之個體(最佳為人類個體)投予有效量之本文的抗體，諸如藉由靜脈內或皮下投予來進行。
在另一實施例中，本發明提供一種治療個體之自體免疫病症的方法，其包含向該個體投予有效量之本發明之抗體。較佳地，該自體免疫病症係選自由以下疾病組成之群：類風濕性關節炎(RA)、狼瘡、韋格納氏病(Wegener's disease)、發炎性腸病(IBD)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、栓塞性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症(MS)、牛皮癬、IgA腎病、IgM多發性神經病、重症肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、休格連氏症候群、絲球體腎炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷氏病(Graves' disease)、幽門螺旋桿菌胃炎(helicobacter－pylori gastritis)及C型慢性肝炎。
較佳地，自體免疫病症為RA、MS、休格連氏症候群、狼瘡、重症肌無力或IBD，更佳地，自體免疫病症為RA、IBD、狼瘡或MS。更佳地，狼瘡為全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎，且該IBD為克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。
在其他態樣中，抗體為裸抗體。在另一態樣中，抗體與諸如細胞毒性劑之另一分子結合。
在另一態樣中，方法係經靜脈內投予抗體。在一替代態樣中，抗體係經皮下投予。
在另一實施例中，個體患有RA且抗體在個體體內誘導主要臨床反應。
在另一態樣中，個體具有異常含量之一或多種調節細胞因子、抗核抗體(ANA)、抗類風濕因子(RF)抗體、肌酸酐、血尿素氮、抗內皮抗體、抗嗜中性白血球細胞質抗體(ANCA)、浸潤性CD20細胞、抗雙股DNA(dsDNA)抗體、抗Sm抗體、抗核的核糖核蛋白抗體、抗磷脂抗體、抗核糖體P抗體、抗Ro/SS－A抗體、抗Ro抗體、抗La抗體、針對休格連氏相關抗原A或B(SS－A或SS－B)之抗體、針對著絲點蛋白B(CENP B)或著絲點蛋白C(CENP C)之抗體、ICA69之自體抗體、抗Smith抗原(Sm)抗體、抗核的核糖核蛋白抗體、抗核糖體P抗體、染色嗜中性白血球之核區或核周區之自體抗體(pANCA)、抗釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗體、GM1神經節苷脂或GQ1b神經節苷脂之交叉反應性抗體、抗乙醯膽鹼受體(AchR)、抗AchR亞型或抗肌肉特異性酪胺酸激酶(MuSK)抗體、血清抗內皮細胞抗體、IgG或抗橋粒芯糖蛋白(Dsg)抗體、抗著絲點、抗拓撲異構酶－1(Scl－70)、抗RNA聚合酶或抗U3－核糖核蛋白(U3－RNP)抗體、抗腎小球基底膜(GBM)抗體、抗腎小球基底膜(GBM)抗體、抗粒線體(AMA)或抗粒線體M2抗體、抗甲狀腺過氧化酶(TPO)、抗甲狀腺球蛋白(TG)或抗促甲狀腺激素受體(TSHR)抗體、抗核(AN)、抗肌動蛋白(AA)或抗平滑肌抗原(ASM)抗體、IgA抗肌內膜、IgA抗組織麩醯胺酸轉移酶、IgA抗麥膠蛋白或IgG抗麥膠蛋白抗體、抗CYP21A2、抗CYP11A1或抗CYP17抗體、抗核糖核蛋白(RNP)或肌炎特異性抗體、抗髓鞘相關醣蛋白(MAG)抗體、抗C型肝炎病毒(HCV)抗體、抗GM1神經節苷脂、抗硫酸－3－葡萄糖醛酸基副紅血球糖苷脂(anti－sulfate－3－glycuronyl paragloboside，SGPG)或IgM抗糖結合物抗體、IgM抗神經節苷脂抗體、抗甲狀腺過氧化酶(TPO)、抗甲狀腺球蛋白(TG)或抗促甲狀腺激素受體(TSHR)抗體、抗髓鞘鹼性蛋白或抗髓鞘寡突細胞醣蛋白抗體、針對IgG之Fc部分的IgM類風濕因子抗體、抗因子VIII抗體或其組合。
在此方法之另一較佳態樣中，抗體係至多大約每隔一週一次，更佳大約每月一次投予個體。
在另一實施例中，第二藥劑(其中抗體為第一藥劑)在上述方法中係以有效地治療個體之量投予個體。該第二藥劑較佳為免疫抑制劑、結合B細胞表面標記之拮抗劑、BAFF拮抗劑、改變病情之抗風濕藥物(DMARD)、整合素拮抗劑、非類固醇消炎藥(NSAID)、細胞因子拮抗劑或其組合。另外，其可為作為活性運載工具之玻尿酸酶醣蛋白。最佳地，其為DMARD或甲胺喋呤。
在另一實施例中，個體先前未曾用針對該病症之藥劑治療。在另一態樣中，個體先前未曾用TNF拮抗劑治療。
在一替代實施例中，個體先前已用針對該病症之藥劑治療，較佳用TNF拮抗劑(諸如抗TNF抗體或TNF受體－Ig，諸如依那西普)或DMARD治療。
在另一實施例中，本發明提供一種治療個體之RA的方法，其包含向該個體投予有效量之本發明之抗體。在此方法中，較佳地，該抗體在個體體內誘導主要臨床反應。更佳地，個體已用針對該病症之藥劑治療，較佳用TNF拮抗劑(諸如抗TNF抗體或TNF受體－Ig，諸如依那西普)或DMARD治療。在此方法之另一較佳態樣中，抗體係至多大約每隔一週一次，更佳大約每月一次投予個體。
在此RA治療方法之另一實施例中，第二藥劑(其中抗體為第一藥劑)係以有效地治療正針對RA進行治療之個體之量投予該個體。該第二藥劑較佳為免疫抑制劑、結合B細胞表面標記之拮抗劑、BAFF拮抗劑、改變病情之抗風濕藥物(DMARD)、整合素拮抗劑、非類固醇消炎藥(NSAID)、細胞因子拮抗劑或其組合。另外，其可為作為活性運載工具之玻尿酸酶醣蛋白。最佳地，其為DMARD或甲胺喋呤。較佳地，用於治療RA之抗體係經皮下或經靜脈內投予。此外，其可為裸抗體或例如與細胞毒性劑結合。在此方法之另一較佳態樣中，抗體係至多大約每隔一週一次，更佳大約每月一次投予個體。
本發明亦提供一種組合物，其包含前述實施例中之任一者之抗體及載劑，諸如醫藥學上可接受之載劑。
本發明之另一態樣為一種編碼前述實施例中之任一者之抗體的經分離之核酸。亦提供包含該核酸及編碼本發明之抗體之彼等核酸的表現載體。亦提供一種包含編碼本發明之抗體之核酸的宿主細胞。可使用各種宿主細胞中之任一者。在一實施例中，該宿主細胞為原核細胞，例如大腸桿菌(E.coli )。在另一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如酵母細胞或哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在另一態樣中，本發明提供用於製造本發明之抗體之方法。舉例而言，本發明提供一種製造或產生抗LTα抗體(如本文所定義，其包括全長及其片段，其限制條件為其含有Fc區)之方法，該方法包含在產生該抗體之條件下培養包含編碼本發明之抗體之核酸(較佳包含編碼該抗體(或其片段)之本發明之重組載體)的合適宿主細胞，及回收該抗體。抗體可自宿主細胞或宿主細胞培養物回收。在一較佳實施例中，抗體為裸抗體。在另一較佳實施例中，抗體與另一分子結合，該另一分子較佳為細胞毒性劑。
本發明之又一態樣為一種製品，其包含一容器及含於其中之組合物，其中該組合物包含前述實施例中之任一者之抗體；及一包裝插頁，其指示該組合物可用於治療該抗體意欲用於之適應症，諸如自體免疫病症。除為第一藥劑之抗體以外，可將如上文所述之第二藥劑添加至該物品中，例如添加於一獨立容器中。
在另一態樣中，本發明包括一種融合瘤，其於2006年4月19日以寄存編號PTA－7538寄存於ATCC。此外提供一種由該融合瘤分泌之抗體。
若自體免疫疾病具體言之為RA，則一態樣為一種方法，其中先前未曾投予患者針對RA之藥劑。一替代態樣為一種方法，其中先前已投予患者針對RA之至少一種藥劑，更佳地，其中患者對先前投予之至少一種藥劑無反應。先前投予而患者可能無反應之藥劑包括免疫抑制劑、細胞因子拮抗劑、整合素拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑、DMARD、NSAID或CD20拮抗劑，且更佳為免疫抑制劑、細胞因子拮抗劑、整合素拮抗劑、皮質類固醇、DMARD、NSAID或CD20拮抗劑，諸如CD20抗體，其較佳不為利妥昔單抗(rituximab)或人化2H7。最佳地，該(該等)先前投予之藥劑為DMARD或TNF抑制劑，諸如抗TNF－α抗體或TNF－Ig。
在本發明使用本文中之抗體治療諸如RA之自體免疫疾病的另一較佳態樣中，患者已展現針對一或多種TNF抑制劑或針對一或多種DMARD之不足夠的反應。更佳地，該RA為早期RA或初期RA。
在另一實施例中，提供一種方法，其中在向患有RA或關節損傷之患者投予本文中之抗體後至少約三個月，給予成像測試，其量測與投予之前的基線相比骨或軟組織關節損傷的減輕，且所投予之抗體的量有效達成關節損傷之減輕。在一較佳態樣中，該測試量測總改良Sharp評分(modified Sharp score)。在一較佳態樣中，該方法進一步包含再向患者以與先前投予本文中之抗體之效應相比有效達成關節損傷之持續或保持減輕的量投予該抗體。在另一態樣中，即使在先前投予後測試時患者無臨床改善，亦再向該患者投予本文中之抗體。臨床改善較佳係藉由評估壓痛或腫脹關節之數目，進行患者之總體臨床評估，評估紅血球沈降速率，評估C－反應性蛋白含量之量，或使用疾病活性之綜合量測來判定。
用於治療RA及關節損傷之較佳第二藥劑包括免疫抑制劑、DMARD、疼痛控制劑、整合素拮抗劑、NSAID、細胞因子拮抗劑、雙膦酸鹽、B細胞表面標記之拮抗劑(諸如BR3－Fc、BR3抗體、CD20抗體、CD40抗體、CD22抗體、CD23抗體)或其組合。若第二藥劑為DMARD，則其較佳係選自由金諾芬(auranofin)、氯喹(chloroquine)、D－青黴胺(D－penicillamine)、可注射金劑、口服金劑、羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、硫代苯酸金鈉(myocrisin)及甲胺喋呤組成之群。若第二藥劑為NSAID，則其較佳係選自由以下各物組成之群：芬布芬(fenbufen)、萘普生(naprosyn)、雙氯芬酸(diclofenac)、依託度酸(etodolac)、吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林(aspirin)及布洛芬(ibuprofen)。若第二藥劑為免疫抑制劑，則其較佳係選自由依那西普、英利昔單抗、阿達木單抗(adalimumab)、來氟米特(leflunomide)、阿那白滯素(anakinra)、硫唑嘌呤(azathioprine)及環磷醯胺(cyclophosphamide)組成之群。較佳第二藥劑之其他群包括抗α4、依那西普、英利昔單抗、依那西普、阿達木單抗、開那雷(kinaret)、依法珠單抗(efalizumab)、護骨素(OPG)、NFB配位體之抗受體活化劑(抗RANKL)、NFB－Fc之抗受體活化劑(RANK－Fc)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、阿侖膦酸鹽(alendronate)、利塞膦酸鹽(actonel)、唑來膦酸鹽(zolendronate)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、甲胺喋呤、柳氮磺胺吡啶(azulfidine)、羥氯喹、多西環素(doxycycline)、來氟米特、柳氮磺吡啶(SSZ)、潑尼龍(prednisolone)、介白素－1受體拮抗劑、潑尼松(prednisone)或甲潑尼龍(methylprednisolone)。第二藥劑之另一較佳群包括英利昔單抗；英利昔單抗/甲胺喋呤(MTX)組合；MTX；依那西普；皮質類固醇；環孢素A(cyclosporin A)；硫唑嘌呤；金諾芬；羥氯喹(HCQ)；潑尼龍、MTX及SSZ之組合；MTX、SSZ及HCQ之組合；環磷醯胺、硫唑嘌呤及HCQ之組合；及阿達木單抗與MTX之組合。更佳地，該皮質類固醇為潑尼松、潑尼龍、甲潑尼龍、氫化可的松(hydrocortisone)或地塞米松(dexamethasone)。在另一較佳實施例中，第二藥劑為MTX，其更佳地係經口或非經腸投予。
在另一態樣中，本文中之治療方法進一步包含藉由再向患者投予有效量之本文中之抗體來再治療該患者。較佳地，該再治療係在第一次投予抗體後至少約24週時開始。在另一實施例中，開始第二次再治療，且更佳地，其中該第二次再治療係在第二次投予抗體後至少約24週時開始。在自體免疫疾病為RA之另一實施例中，關節損傷已在再治療後得以減輕。在一替代實施例中，在再治療後測試時未觀察到患者之臨床改善，特定言之其中該臨床改善係藉由評估壓痛或腫脹關節之數目，進行患者之總體臨床評估，評估紅血球沈降速率，評估C－反應性蛋白含量之量，或使用疾病活性之綜合量測來判定。
在另一態樣中，在本文中本發明提供一種為本文中之抗體或其醫藥學上可接受之組合物做廣告的方法，其包含向目標對象宣傳該抗體或其醫藥組合物用於治療展現自體免疫疾病(諸如RA、MS、狼瘡或IBD)之患者或患者群的用途。
在另一態樣中，本發明提供一種製品，其包含包裝在一起之包含本文中之抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物及一說明該抗體或醫藥組合物適用於治療患有自體免疫疾病(諸如RA、MS、狼瘡或IBD)之患者的標籤。在一較佳實施例中，該物品進一步包含一包含第二藥劑之容器，其中本文中之抗體為第一藥劑，該物品進一步包含該包裝插頁上關於用有效量之該第二藥劑治療患者的說明書，該第二藥劑較佳為甲胺喋呤。
在又一態樣中，本發明提供一種用於包裝本文中之抗體或該抗體之醫藥組合物的方法，其包含將該抗體或醫藥組合物及一說明該抗體或醫藥組合物適用於治療展現自體免疫疾病(諸如RA、MS、狼瘡或IBD)之患者的標籤組合於一包裝中。
 通用技術
除非另有指示，否則本發明之實施將利用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其屬於熟習此項技術者之範圍內。該等技術在文獻中有充分解釋，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，編，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，編，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，編，1987，且週期性更新)；PCR：The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人，編，1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V.,1988)；Phage Display：A Laboratory Manual (Barbas等人，2001)。
定義
"淋巴毒素α"或"LTα"在本文中係定義為具有美國專利第5,824,509號之圖2A中所示之胺基酸序列的生物學活性多肽。對LTα進行定義以明確地排除人類TNFα或其天然動物類似物(Pennica等人，Nature 312：20/27：724－729(1984)及Aggarwal等人，J.Biol.Chem.260：2345－2354(1985))。對LTα進行定義以明確地排除例如US 5,661,004中所定義之人類LTβ。
"淋巴毒素α3三聚體"或"LTα3"係指LTα單體之同質三聚體。此同質三聚體係藉由LTβ、跨膜及細胞質域錨定於細胞表面。
"淋巴毒素αβ"或"LTαβ"或"LTαβ複合物"係指LTα與LTβ之異質三聚體。此等異質三聚體含有兩個LTα亞單元及一個LTβ亞單元(LTα2β1)，或一個LTα亞單元及兩個LTβ亞單元(LTα1β2)。
"腫瘤壞死因子受體－I"或"TNFRI"及"腫瘤壞死因子受體－II"或"TNFRII"分別係指LTα3同質三聚體之細胞表面TNF受體，亦稱為p55及p75。
"淋巴毒素β受體"或"LTβ－R"係指LTαβ異質三聚體所結合之受體。
"調節細胞因子"為所具有之異常含量表明患者存在有自體免疫病症之細胞因子。該等細胞因子包括(例如)介白素－1(IL－1)、IL－2、IL－3、IL－4、IL－5、IL－6、IL－7、IL－8、IL－10、IL－12、IL－13、IL－14、IL－15、IL－18、IL－23、IL－24、IL－25、IL－26、BLyS/April、TGF－α、TGF－β、干擾素－α(IFN－α)、IFN－β、IFN－γ、MIP－1、MIF、MCP－1、M－CSF或G－CSF、淋巴毒素、LIGHT、4－1BB配位體、CD27配位體、CD30配位體、CD40配位體、Fas配位體、GITR配位體、OX40配位體、RNAK配位體、THANK、TRAIL、TWEAK及VEG1。此群包括TNF家族成員，其包括(但不限於)TNF－α、LT(諸如LTα、LTβ)及LIGHT。對於TNF超家族之評述，參見MacEwan,Br.J.Pharmacology 135：855－875(2002)。較佳地，該調節細胞因子為諸如IL－1b或IL－6之IL及/或TNF家族成員。
"與類風濕性關節炎相關之發炎細胞因子"係指與RA病變相關之IL－6、IL－1b及TNFα，該病變可全身性地受到抑制及/或在活體外膠原蛋白誘導性關節炎檢定中於關節處受到抑制。
"LTαβ表現細胞"為表現或分泌LTαβ異質三聚體之細胞。
表述"調節LTαβ表現細胞"係指用包括(例如)單核細胞、樹突狀細胞、T細胞及B細胞之細胞消減或改變由細胞製造之蛋白，諸如細胞因子、趨化因子或生長因子。
術語"抗體"及"免疫球蛋白"在最廣泛意義上可互換使用且包括單株抗體(例如，全長或完整單株抗體)、多株抗體、多價抗體及多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要其展現所需生物活性即可)，且亦可包括特定抗體片段(如本文中更詳細之描述)。抗體可為嵌合、人類、人化及/或親和力成熟抗體。
"抗體片段"僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留通常與該部分當存在於完整抗體中時相關之功能中的至少一種功能，更佳為多數功能或全部功能。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段(例如包含Fc區之片段)保留通常與Fc區當存在於完整抗體中時相關之生物功能中的至少一種功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為具有大體上類似於完整抗體之活體內半衰期的單價抗體。舉例而言，該抗體片段可包含與能夠賦予片段活體內穩定性之Fc序列連接的抗原結合臂。在一實施例中，本發明之抗體為如WO 2005/063816中所述之單臂抗體，例如包含構成"鈕"及"孔"之Fc突變的抗體。舉例而言，孔突變可為Fc多肽中T366A、L368A及/或Y407V中之一或多者，且穴突變可為T366W。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；微型雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
出於本文之目的，"完整抗體"為包含重鏈及輕鏈可變域以及Fc區之抗體。
如本文所使用之術語"單株抗體"係指自一群大體上同質之抗體獲得之抗體，亦即構成該群之個別抗體除可以微量存在之可能天然存在之突變以外為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑不同，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除其特異性外，單株抗體因其可在不受其他抗體污染之情況下合成而為有利的。修飾語"單株"不應被理解為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，適用於本發明之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature, 256：495(1975)描述之融合瘤方法製備，或可在例如細菌細胞、非動物真核細胞、動物細胞或植物細胞中使用重組DNA方法製造(參見例如US 4,816,567)。"單株抗體"亦可使用例如Clackson等人，Nature, 352：624－628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol., 222：581－597(1991)中所述之技術自噬菌體抗體庫分離。
本文中之單株抗體具體包括"嵌合"抗體，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體的相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可(US 4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81：6851－6855(1984))。製造嵌合抗體之方法在此項技術中係已知的。
"人化"形式之非人類(例如鼠類)抗體為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如抗體之Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或其他抗原結合子序列)。多半而言，人化抗體為如下人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之CDR的殘基由具有所需特異性、親和力及能力的來自諸如小鼠、大鼠或兔子之非人類物種之CDR(供體抗體)的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FvFR殘基由相應非人類殘基置換。此外，人化抗體可包含既不見於受體抗體中亦不見於引入之CDR或構架序列中之殘基。作此等修飾以進一步改進及最大化抗體效能。一般而言，人化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之大體上全部，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之彼等者且所有或大體上所有FR區為人類免疫球蛋白序列之彼等者，不過FR區可包括一或多個改良結合親和力之胺基酸取代。FR中之此等胺基酸取代之數目在H鏈中通常至多6個，且在L鏈中至多3個。人化抗體最佳地亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人類免疫球蛋白之至少一部分。欲知詳情，請參見Jones等人，Nature, 321：522－525(1986)；Reichmann等人，Nature, 332：323－329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol., 2：593－596(1992)。亦參見Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol. 1：105－115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23：1035－1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech. 5：428－433(1994)。人化抗體包括PRIMATIZED抗體，其中該抗體之抗原結合區係源自藉由例如以所關注抗原使獼猴免疫而產生的抗體。製造人化抗體之方法在此項技術中係已知的。
"人類抗體"為具有對應於由人類產生且/或使用如本文所揭示用於製造人類抗體之任何技術製造之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列之抗體。此人類抗體之定義明確地排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。人類抗體亦可使用此項技術中已知之各種技術(包括噬菌體呈現庫)來產生。Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol, 227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol, 222：581(1991)。Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol., 147(1)：86－95(1991)中所述之方法亦可用於製備人類單株抗體。
"親和力成熟"抗體為如下抗體，在其一或多個CDR中具有一或多個變化，導致該抗體與不具有彼等變化之親本抗體相比對抗原之親和力有所改善。較佳之親和力成熟抗體將對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知之程序產生。Marks等人之Bio/Technology 10：779－783(1992)描述藉由VH及VL域改組引起之親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發係由以下文獻所描述：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809－3813(1994)；Schier等人，Gene 169：147－155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994－2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310－9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226：889－896(1992)。
"抗原"為抗體可選擇性地結合之預定抗原。靶抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或另一天然存在或合成化合物。較佳地，靶抗原為多肽。出於本文之目的，"受體人類構架"為包含源自人類免疫球蛋白構架或源自人類一致構架之VL或VH構架之胺基酸序列的構架。"源自"人類免疫球蛋白構架或人類一致構架之受體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或可含有預先存在之胺基酸序列變化。當存在預先存在之胺基酸變化時，存在較佳至多5個，且更佳4個或4個以下，且更佳3個或3個以下預先存在之胺基酸變化。當預先存在之胺基酸變化存在於VH中時，較佳彼等變化僅為位置71、73及78中之三者、兩者或一者處的變化；舉例而言，彼等位置處之組胺酸殘基可為丙胺酸殘基。在一實施例中，VL受體人類構架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類一致構架序列一致。
"人類一致構架"為表示人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最通常存在之胺基酸殘基的構架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之亞群。通常，此序列亞群為如Kabat等人，同上中之亞群。在一實施例中，對於VL而言，該亞群為如Kabat等人，同上中之亞群I。在一實施例中，對於VH而言，該亞群為如Kabat等人，同上中之亞群III。
"VH亞群III一致構架"包含自Kabat等人，同上之可變重鏈亞群III之胺基酸序列獲得的一致序列。在一實施例中，VH亞群III一致構架胺基酸序列包含下列序列每一者之至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：46)－H1－WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：47)－H2－RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：48)－H3－WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：49)，其中N為任何胺基酸殘基。
在另一實施例中，VH亞群III一致構架胺基酸序列包含下列序列每一者之至少一部分或全部：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：46)－H1－WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：47)－H2－RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD(SEQ ID NO：50)－H3－WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：49)，其中N為任何胺基酸殘基。
"VL亞群I一致構架"包含自kabat等人，同上之可變輕鏈亞群I之胺基酸序列獲得的一致序列。在一實施例中，VL亞群I一致構架胺基酸序列包含下列序列每一者之至少一部分或全部：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：51)－L1－WYQQKPGKAPKLQIY(SEQ ID NO：52)－L2－GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：53)－L3－FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：54)。
在另一實施例中，VL亞群I一致構架胺基酸序列包含下列序列每一者之至少一部分或全部：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：51)－L1－WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：55)－L2－GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：53)－L3－FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：54)。
術語"互補決定區"或"CDR"當本文使用時係指序列高變且/或形成結構界定之環的抗體可變域之區域。通常，抗體包含6個高變區；3個在VH(H1、H2、H3)中，且3個在VL(L1、L2、L3)中。使用多種CDR描述且其涵蓋於本文中。Kabat CDR係基於序列可變性且最常使用(Kabat等人，同上)。而Chothia係指結構環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol. 196：901－917(1987))。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷者，且係藉由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體而加以使用。"接觸"高變區係基於可得到之複雜晶體結構之分析。來自此等高變區每一者之殘基在下文指出。
CDR可包含如下"延長之CDR"：VL中之24－36或24－34(L1)、46－56或50－56(L2)及89－97(L3)，以及VH中之26－35(H1)、50－65或49－65(H2)及93－102、94－102或95－102(H3)。對於此等定義中之每一者而言，可變域殘基係根據Kabat等人，同上進行編號。貫穿本說明書及申請專利範圍，免疫球蛋白重鏈中殘基之編號為如Kabat等人，同上中之EU指數的編號。"如Kabat中之EU指數"係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
"未經修飾之人類構架"為如下人類構架，其具有與受體人類構架相同之胺基酸序列，例如在該受體人類構架中缺乏人類至非人類胺基酸之取代。
出於本文之目的，"改變之CDR"為包含一或多個(例如1至約16個)胺基酸取代之CDR。
出於本文之目的，"未經修飾之CDR"為如下CDR，其具有與其所源自之非人類抗體相同之胺基酸序列，亦即缺乏一或多個胺基酸取代之CDR。
"構架"或"FR"殘基為不同於如本文所定義之CDR殘基之彼等可變域殘基。
"阻斷"抗體或"拮抗劑"抗體為抑制或降低所結合之抗原之生物活性的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體大體上或完全抑制抗原之生物活性。
如本文所使用之"促效劑抗體"為模擬所關注多肽之功能活性中之至少一者的抗體。
"經分離"抗體為已自自然環境之組份中鑑別且分離及/或回收的抗體。其自然環境之污染物組份為會干擾抗體之診斷性或治療性用途的物質，且可能包括酶、激素及其他蛋白質性或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，抗體將被純化(1)至如勞立法(Lowry method)所測定之大於95重量%抗體，且最佳至大於99重量%；(2)至足以藉由使用轉杯式測序儀(spinning cup sequenator)獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度；(3)至藉由在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色之SDS－PAGE得知的均質性。經分離之抗體包括重組細胞內原位產生之抗體，此係因為抗體自然環境中之至少一個組份將不會存在。然而，經分離之抗體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
術語"如Kabat中之可變域殘基編號"或"如Kabat中之胺基酸位置編號"及其變體係指Kabat等人，同上中用於抗體編製之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR的縮短或插入其中之少數或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後之單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後之插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由在抗體之序列之同源性區與"標準"Kabat編號序列比對來確定特定抗體之Kabat殘基編號。
"親本多肽"為包含缺乏本文所揭示之Fc區修飾中之一或多者且與如本文所揭示之多肽變異體相比效應功能不同之胺基酸序列的多肽。該親本多肽可包含天然序列Fc區或具有預先存在之胺基酸序列修飾(諸如添加、刪除及/或取代)的Fc區。
術語"Fc區"係用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區。該"Fc區"可為天然序列Fc區或變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常係定義為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基末端。免疫球蛋白之Fc區一般包含2個恆定域，CH2及CH3。IgG1之重鏈中的最後殘基，即離胺酸可(但並非必須)以Fc之末端殘基形式存在於成熟蛋白中。
人類IgG Fc區之"CH2域"(亦稱為"Cγ2"域)通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。該CH2域因其不與另一域緊密配對而為獨特的。更確切而言，2個N連接之支鏈碳水化合物鏈係插入完整天然IgG分子之2個CH2域之間。已推測碳水化合物可提供域域配對之取代且有助於穩定CH2域。Burton,Molec.Immunol.22：161－206 (1985)。
"CH3域"包含Fc區內殘基C末端至CH2域之延伸(亦即自IgG之約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447)。
"功能Fc區"具有天然序列Fc區之"效應功能"。例示性"效應功能"包括Clq結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如LT受體)之下調等。該等效應功能通常需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用例如本文所揭示之各種檢定來評估。
"天然序列Fc區"或"野生型Fc區"包含與自然界中所見之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區在此項技術中係已知的且包括天然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區，以及其天然存在之對偶基因變異體。
"變異Fc區"包含由於至少一個如本文所定義之"胺基酸修飾"而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列。較佳地，與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，該變異Fc區在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如約1個至約10個胺基酸取代，且較佳約1個至約5個胺基酸取代。本文中之變異Fc區將較佳與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，更佳與其具有至少約90%同源性，且最佳與其具有至少約95%同源性。
術語"含Fc區多肽"係指包含Fc區之多肽，諸如抗體或免疫黏附素(參見本文之定義)。
術語"Fc受體"及"FcR"係用於描述與IgG抗體之Fc區結合的受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。在一實施例中，FcR為包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體的FcγR，包括對偶基因變異體及此等受體之替代性拼接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA("活化受體")及FcγRIIB("抑制受體")，其具有主要其細胞質域不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參見Daron,Aram.Rev.Immunol. 15：203－234(1997)中之評述)。該術語包括異型，諸如FcγRIIIA異型：FcγRIIIA－Phe158、FcγRIIIA－Val158、FcγRIIA－R131及/或FcγRIIA－H131。FcR係在Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－492(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25－34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med., 126：330－341(1995)中有評述。包括以後鑑別之彼等者的其他FcR為本文中之術語"FcR"所涵蓋。該術語亦包括新生兒受體，FcRn，其引起母IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol. 117：587(1976)及Kim等人，Eur.J.Immunol. 24：2429－2434(1994))。
"抗體依賴性細胞介導細胞毒性"或"ADCC"係指細胞毒性之一種形式，其中結合於存在於特定細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上之分泌性Ig使此等細胞毒性效應細胞能夠與帶有抗原之靶細胞特異性結合且隨後以細胞毒素殺死靶細胞。抗體"武裝"細胞毒性細胞且為該殺死絕對所需。介導ADCC之主要細胞，即NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現係概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol., 9：457－92(1991)之第464頁上之表3中。為評估所關注分子之ADCC活性，可執行活體外ADCC檢定，諸如US 5,500,362或5,821,337中所述之檢定。適用於該等檢定之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。其他或另外，所關注分子之ADCC活性可在活體內評估，例如在諸如Clynes等人，PNAS(USA) 95：652－656(1998)中所揭示之動物模型中。
"人類效應細胞"為表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。較佳地，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括PBMC、NK細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞為較佳。效應細胞可自其天然來源分離，例如自血液或如本文所述之PBMC分離。
"補體依賴性細胞毒性"或"CDC"係指在補體存在下靶細胞之溶解。典型補體途徑之活化係由補體系統之第一組份(C1q)與(適當亞類之)與同源抗原結合之抗體的結合而引起。為評估補體活化，可執行CDC檢定，例如Gazzano－Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述之檢定。
具有"經改變"FcR結合親和力或ADCC活性之具有變異IgG Fc的多肽為與親本多肽或包含天然序列Fc區之多肽相比具有增強或降低之FcR結合活性(FcγR或FcRn)及/或ADCC活性的多肽。"展現增加之與FcR之結合"的變異Fc以比親本多肽較好之親和力結合至少一個FcR。與親本多肽相比，結合之提高可為約3倍，較佳約5倍、10倍、25倍、50倍、60倍、100倍、150倍、200倍及高達500倍，或約25%至1000%之結合之提高。"展現降低之與FcR之結合"的多肽變異體以比親本多肽較小之親和力結合至少一個FcR。與親本多肽相比，結合之降低可為約40%或以上之結合之降低。展現與FcR之結合降低的該等Fc變異體可能幾乎不具有明顯的與FcR之結合，例如與天然序列IgG Fc區相比約0－20%與FcR結合。
當在結合檢定中具有變異Fc之多肽及親本多肽之量基本上相同時，具有以比具有野生型或天然序列IgG Fc之多肽或親本多肽"較好的親和力"或"較高的親和力"結合FcR之變異Fc的多肽為以比具有天然序列Fc之親本多肽大體上較好的結合親和力結合上述已鑑別FcR中之任一者或多者的多肽。舉例而言，具有提高之FcR結合親和力之變異Fc多肽可展現與親本多肽相比約2倍至約300倍，較佳約3倍至約170倍之FcR結合親和力的提高，其中FcR結合親和力係如此項技術中所知來測定。
當檢定中所用之具有變異Fc區之多肽及具有野生型Fc區之多肽的量基本上相同時，"展現增加之ADCC"或在人類效應細胞存在下比具有野生型IgG Fc之多肽更有效介導ADCC之包含變異Fc區的多肽為活體外或活體內大體上更有效介導ADCC之多肽。通常，該等變異體將使用如本文所揭示之活體外ADCC檢定來鑑別，但亦涵蓋其他用於測定ADCC活性之檢定或方法，例如在動物模型中等。較佳變異體在介導ADCC方面比野生型Fc更有效約5倍至約100倍，更佳為25倍至約50倍。
"胺基酸修飾"係指預定胺基酸序列之胺基酸序列的變化。例示性修飾包括胺基酸取代、插入及/或缺失。本文中之較佳胺基酸修飾為取代。
(例如Fc區之)指定位置處之"胺基酸修飾"係指指定殘基之取代或缺失，或相鄰於指定殘基插入至少一個胺基酸殘基。藉由"相鄰於"指定殘基插入意謂在其一至兩個殘基內進行插入。該插入可為指定殘基之N末端或C末端。
"胺基酸取代"係指在預定胺基酸序列中用另一個不同"置換"胺基酸殘基置換至少一個存在之胺基酸殘基。該(等)置換殘基可為"天然存在之胺基酸殘基"(亦即，由遺傳密碼編碼)且選自由以下胺基酸組成之群：丙胺酸(Ala)；精胺酸(Arg)；天冬醯胺酸(Asn)；天冬胺酸(Asp)；半胱胺酸(Cys)；麩醯胺酸(Gln)；麩胺酸(Glu)；甘胺酸(Gly)；組胺酸(His)；異白胺酸(Ile)：白胺酸(Leu)；離胺酸(Lys)；甲硫胺酸(Met)；苯丙胺酸(Phe)；脯胺酸(Pro)；絲胺酸(Ser)；蘇胺酸(Thr)；色胺酸(Trp)；酪胺酸(Tyr)；及纈胺酸(Val)。較佳地，置換殘基不為半胱胺酸。用一或多個非天然存在之胺基酸殘基取代亦為本文中之胺基酸取代之定義所涵蓋。"非天然存在之胺基酸殘基"係指不同於彼等上文所列之天然存在之胺基酸殘基的殘基，其能夠共價結合多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基。非天然存在之胺基酸殘基的實例包括正白胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸及其他胺基酸殘基類似物，諸如Ellman等人，Meth.Enzym. 202：301－336(1991)中所述之彼等者。對於該等非天然存在之胺基酸殘基之產生而言，可使用Noren等人，Science 244：182(1989)及Ellman等人，同上之程序。簡言之，此等程序涉及化學活化具有非天然存在之胺基酸殘基的抑制tRNA，繼而活體外轉錄及轉譯RNA。
如本發明中所使用之術語"保守"胺基酸取代意欲指以功能等效之胺基酸取代之胺基酸取代。保守胺基酸變化導致所得多肽之胺基酸序列的靜止變化。舉例而言，類似極性之一或多個胺基酸充當功能等效物且導致多肽之胺基酸序列內的靜止變化。一般而言，一群內之取代可視作關於結構及功能為保守的。然而，熟習此項技術者將認識到特定殘基之作用係決定於其在其所存在之分子三維結構內之環境。舉例而言，Cys殘基可以氧化(二硫化物)形式存在，其比還原(硫醇)形式之極性小。Arg側鏈之長脂族部分可構成其結構或功能作用之關鍵特徵，且此可藉由取代非極性殘基而非另一個鹼性殘基而得以保守得最好。又，應認識到，含有芳族基(Trp、Tyr及Phe)之側鏈可參與離子－芳族或"陽離子－π"相互作用。在此等情況下，用酸性或不帶電極性基團之成員取代此等側鏈之一可關於結構及功能為保守的。諸如Pro、Gly及Cys(二硫化物形式)之殘基可對主要鏈構形具有直接影響，且往往不能在無結構變形之情況下被取代。
"胺基酸插入"係指至少一個胺基酸併入預定胺基酸序列中。雖然插入通常將由插入一或兩個胺基酸殘基組成，但本申請案涵蓋較大"肽插入"，例如插入約3個至約5個或甚至多達約10個胺基酸殘基。插入之殘基可為如上文所揭示之天然存在或非天然存在的殘基。
"胺基酸缺失"係指自預定胺基酸序列移除至少一個胺基酸殘基。
胺基酸可根據其側鏈之特性的相似性來分組(A.L.Lehninger,Biochemistry， 第二版，第73－75頁，Worth Publishers,New York(1975))：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、ILe(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，天然存在之殘基可基於共同之側鏈特性而分為以下各組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、ILe；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
"鉸鏈區"通常係定義為自人類IgG1之Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol. 22.161－206(1985))。其他IgG同型之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間S－S鍵之第一及最後半胱胺酸殘基置於相同位置處而與IgG1序列對準。
Fc區之"較低鉸鏈區"通常係定義為緊靠C末端之殘基至鉸鏈區(亦即Fc區之殘基233至239)之延伸。
"C1q"為包括免疫球蛋白之Fc區之結合位點的多肽。C1q以及兩個絲胺酸蛋白酶C1r及C1s形成複合物C1，即CDC途徑之第一組份。人類C1q可購自例如Quidel,San Diego,CA。
術語"結合域"係指多肽與另一個分子結合之區。在FcR之情況下，該結合域可包含負責結合Fc區之其多肽鏈(例如，其α鏈)的一部分。一個適用結合域為FcR α鏈之細胞外域。
本發明之抗體的"功能片段"包含完整抗體之一部分，通常包括該完整抗體之抗原結合區或可變區或保留FcR結合能力之抗體的Fc區。抗體片段之實例包括線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。
如本文所使用，術語"免疫黏附素"表示組合異源蛋白("黏附素")之結合特異性與免疫球蛋白恆定域之效應功能的類抗體分子。在結構上，免疫黏附素包含不同於抗體之抗原識別及結合位點(亦即，"異源")之具有所需結合特異性的胺基酸序列與免疫球蛋白恆定域序列之融合。免疫黏附素分子之黏附素部分通常為至少包含受體或配位體之結合位點的毗連胺基酸序列。免疫黏附素中之免疫球蛋白恆定域序列可自任何免疫球蛋白獲得，諸如IgG－1、IgG－2、IgG－3或IgG－4亞型、IgA(包括IgA－1及IgA－2)、IgE、IgD或IgM。舉例而言，適用作本文中第二藥劑之免疫黏附素包括包含B淋巴細胞刺激物(BLyS)受體之BLyS結合部分而無該BLyS受體之跨膜或細胞質序列的多肽。在一實施例中，BR3(BLyS受體3)、TACI(跨膜活化劑及鈣調節劑及親環素(cyclophilin)配位體相互作用分子)或BCMA(B細胞成熟抗原)之細胞外域與免疫球蛋白序列之恆定域融合。
"融合蛋白"及"融合多肽"係指具有兩個共價連接在一起之部分的多肽，其中每一部分為具有不同特性之多肽。該特性可為生物學特性，諸如活體外或活體內活性。該特性亦可為簡單化學或物理特性，諸如與靶分子結合，催化反應等。該兩個部分可直接藉由單一肽鍵或經由含有一或多個胺基酸殘基之肽連接子連接。通常，兩個部分及連接子彼此將一起處於閱讀框架內。
"結合親和力"通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。如本文所使用，除非另有指示，否則"結合親和力"係指反映結合對之成員(例如抗體與抗原)之間的1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對於其搭配物Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之通用方法量測，包括本文所述之彼等方法。低親和力抗體通常較慢地結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體通常較快地結合抗原且傾向於保持較久結合。各種量測結合親和力之方法在此項技術中係已知的，出於本發明之目的可使用其任一者。特定說明性實施例在下文描述。
根據本發明，"on速率"或"締合之速率"或"締合速率"或"kon "可用表面電漿共振技術，於25℃下使用BIACORE－2000或BIACORE－3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)光生物感測器與約10反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片來測定。簡言之，根據供應商之說明書，用N－乙基－N'－(3－二甲基胺基丙基)－碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore Inc.)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋為5 μg/ml(約0.2 μM)，隨後以5微升/分鐘之流動速率注射以獲得約10反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團後，對於動力學量測，於25℃下將兩倍連續稀釋之Fab(0.78 nM至500 nM)以約25 μl/min之流動速率注入具有0.05% TWEENTM 20(PBST)之磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIACORE評估軟體版本3.2)，藉由同時擬合締合及解離感應圖來計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。將平衡解離常數(Kd)計算為比率koff /kon 。參見例如，Chen等人，J.Mol Biol 293：865－881(1999)。然而，若藉由上文之表面電漿共振檢定得知，on速率超過106 M－1 S－1 ，則較佳藉由於25℃下使用量測於PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增減(激發＝295 nm；發射＝340 nm，16 nm帶通)的螢光淬滅技術在如光譜計所量測之增加濃度的抗原存在下測定on速率，該光譜計諸如具有經攪拌比色皿之停流裝備光譜光度計(Aviv Instruments)或8000系列SLM－AMTNCOTM 光譜光度計(ThermoSpectronic)。
在一實施例中，根據本發明之"Kd"或"Kd值"係藉由用Fab形式之抗體及抗原分子執行的放射性標記抗原結合檢定(RIA)來量測，如由以下檢定所述：藉由在連續滴定之非標記抗原存在下使Fab與最小濃度之(125 I)標記抗原平衡，接著用塗有抗Fab抗體之平板捕捉結合抗原，從而量測Fab對抗原之溶液結合親和力(Chen等人，J.Mol Biol 293：865－881(1999))。為建立檢定之條件，用50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml捕捉抗Fab抗體(Cappel Labs)塗覆微量滴定盤(Dynex)隔夜，隨後於室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑平板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[125 I]抗原與連續稀釋之所關注Fab混合(與Presta等人，Cancer Res. 57：4593－4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab－12之評估一致)。接著將所關注Fab培養隔夜；然而，該培養可持續較長時段(例如65小時)以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉平板上以於室溫下培養一小時。接著移除溶液且用PBS中之0.1% TWEENTM －20將平板洗滌八次。當平板已乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MicroScint－20；Packard)，且將平板以TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)計數歷時十分鐘。選擇產生小於或等於最大結合之20%之濃度的各Fab用於競爭性結合檢定。
如本文所使用之片語"大體上類似"或"大體上相同"表示兩個數值(通常一個與本發明之抗體相關且另一個與參照/比較抗體相關)之間足夠高的相似性程度以使得熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值(例如Kd值)所量度之生物學特徵的範圍內幾乎不具有生物學及/或統計學顯著性。該兩個值之間的差異作為參照/比較抗體之值的函數較佳小於約50%，更佳小於約40%，更佳小於約30%，甚至更佳小於約20%，且最佳小於約10%。
如本文所使用之片語"大體上降低"或"大體上不同"表示兩個數值(通常一個與本發明之抗體相關且另一個與參照/比較抗體相關)之間足夠高的差異程度以使得熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值(例如Kd值，HAMA反應)所量度之生物學特徵的範圍內具有統計學顯著性。該兩個值之間的差異作為參照/比較抗體之值的函數較佳大於約10%，更佳大於約20%，更佳大於約30%，甚至更佳大於約40%，且最佳大於約50%。
關於肽或多肽序列之"胺基酸序列一致性百分比(%)"及"同源性"係定義為在比對序列且必要時引入缺口以達成最大序列一致性百分比且不考慮任何保守取代作為序列一致性之一部分後，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以屬於此項技術技能範圍內之多種方式，例如使用公開可得到之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST－2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體達成比對。為量測比對，熟習此項技術者可確定適當參數，包括在正進行比較的序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文之目的，使用由Genentech,Inc設計之序列比較電腦程式ALIGN－2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN－2之源代碼已在美國版權局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.，20559與使用說明書一起備案，在美國版權局其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN－2程式可公開得自Genentech,Inc.,South San Francisco,California。ALIGN－2程式應經編譯以在UNIX操作系統，較佳數位UNIX V4.0D上使用。所有序列比較參數係藉由ALIGN－2程式設定且並不變化。
在利用ALIGN－2進行胺基酸序列比較之情形下，如下計算特定胺基酸序列A與特定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其或者可表述為特定胺基酸序列A與特定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性%)：100×(X/Y)其中X為在序列比對程式ALIGN－2之A與B的比對中由該程式評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B之胺基酸殘基的總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性%不會等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特別規定，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值係如本文所述使用ALIGN－2電腦程式而獲得。
"病症"為任何將得益於用本發明之抗體或方法治療的病狀，該治療不考慮機制如何，但包括抑制或阻斷LTα3或LTαβ之作用及/或消減LTα陽性細胞。此病狀包括(但不限於)由任何細胞之LTα3及/或LTαβ的高表現或活性或異常活化介導或與之有關的醫學病狀或疾病。此包括慢性及急性病症，諸如使哺乳動物易患所述病症之彼等病理病狀。
本文中之"自體免疫病症"為由個體自身組織或器官產生及針對個體自身組織或器官之疾病或病症，或其共分離(co－segregate)或表現症狀或自此所得之病狀。在許多此等自體免疫及發炎性病症中，可能存在多種臨床及實驗室標記，包括(但不限於)高γ球蛋白血症、高自體抗體含量、組織中之抗原抗體複合物沈積、來自皮質類固醇或免疫抑制劑治療之益處及受感染組織中之淋巴樣細胞聚集體。不受限於關於B細胞介導性自體免疫病症之任一理論，咸信B細胞經由許多機械途徑展現對人類自體免疫疾病之病原性影響，該等途徑包括自體抗體產生、免疫複合物形成、樹突狀及T細胞活化、細胞因子合成、直接趨化因子釋放及提供異位新淋巴生成之病灶。此等途徑之每一者可不同程度地參與自體免疫疾病之病變。
如本文所使用，"自體免疫病症"可為器官特異性疾病(亦即，免疫反應特異性地針對器官系統，諸如內分泌系統、造血系統、皮膚、心肺系統、胃腸及肝系統、腎系統、甲狀腺、耳朵、神經肌肉系統、中樞神經系統等)或可影響多個器官系統之全身性疾病(例如，全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎、多肌炎等)。較佳之該等疾病包括自體免疫風濕性病症(諸如，類風濕性關節炎、休格連氏症候群、硬皮病、諸如SLE及狼瘡腎炎之狼瘡、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗體症候群及牛皮癬性關節炎)、自體免疫胃腸病及肝病(諸如，發炎性腸病(例如，潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病)、自體免疫胃炎及惡性貧血、自體免疫肝炎、原發性膽汁性肝硬化症、原發性硬化性膽管炎及乳糜瀉)、血管炎(諸如ANCA陰性血管炎及ANCA相關血管炎，包括徹奇－斯全司血管炎(Churg－Strauss vasculitis)、韋格納肉牙腫病及顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis))、自體免疫神經病症(諸如多發性硬化症(MS)、眼陣攣肌陣攣症候群、重症肌無力、視神經脊髓炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)及自體免疫多發性神經病)、腎病(諸如絲球體腎炎、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)及伯格氏病(Berger's disease))、自體免疫皮膚病(諸如，牛皮癬、風疹、蕁麻疹、尋常天疱瘡、大皰性類天疱瘡及皮膚性紅斑狼瘡)、血液病(諸如，血小板減少性紫癜、栓塞性血小板減少性紫癜、輸血後紫癜及自體免疫性溶血性貧血)、動脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自體免疫聽力疾病(諸如，內耳病及聽力喪失)、貝西氏病(Behcet's disease)、雷諾氏症候群、器官移植及自體免疫內分泌病症(諸如，糖尿病相關自體免疫疾病，諸如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、艾迪生氏病(Addison's disease)及自體免疫甲狀腺病(例如，格雷氏病及甲狀腺炎))。更佳之該等疾病包括(例如)RA、IBD(包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎)、ANCA相關血管炎、狼瘡、MS、休格連氏症候群、格雷氏病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎及絲球體腎炎。更佳為RA、IBD、狼瘡及MS，且更佳為RA及IBD，且最佳為RA。
如本文所定義，在一些情況下包括彼等上文所列疾病之其他自體免疫病症的特定實例包括(但不限於)關節炎(急性及慢性類風濕性關節炎(包括幼年發病型類風濕性關節炎及諸如類風濕性滑膜炎之階段)、痛風或痛風性關節炎、急性免疫性關節炎、慢性發炎性關節炎、退化性關節炎、II型膠原蛋白誘導性關節炎、傳染性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、增生性關節炎、牛皮癬性關節炎、史提爾氏病(Still's disease)、脊椎關節炎、骨關節炎、慢性漸進性關節炎、關節炎畸形、慢性原發性多發性關節炎、反應性關節炎、絕經期關節炎、雌激素缺乏關節炎(estrogen－depletion arthritis)及強直性脊椎炎/類風濕性脊椎炎)；自體免疫淋巴組織增生性疾病、發炎性高增生性皮膚病；牛皮癬，諸如斑塊狀牛皮癬、點狀牛皮癬、膿皰性牛皮癬及指甲牛皮癬；特異反應，包括異位性疾病，諸如枯草熱及喬布氏症候群(Job's syndrome)；皮炎，包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、蕁麻疹、疱疹樣皮炎、錢幣狀皮炎、脂諡性皮炎、非特異性皮炎、原發性刺激性接觸性皮炎及異位性皮炎；x性聯高IgM症候群(x－linked hyper IgM syndrome)；過敏性眼內發炎性疾病；風疹，諸如慢性過敏性蕁麻疹及慢性特發性蕁麻疹，包括慢性自體免疫風疹；肌炎；多肌炎/皮肌炎；幼年型皮肌炎；中毒性表皮壞死溶解；硬皮病(包括全身性硬皮病)；硬化症，諸如全身性硬化症；多發性硬化症(MS)，諸如視神經脊髓炎型MS(spino－optical MS)、原發性進行性MS(PPMS)及復發緩解型MS(RRMS)；進行性全身性硬化症；動脈粥樣硬化；動脈硬化；播散性硬化症；共濟失調性硬化症；視神經脊髓炎(NMO)；發炎性腸病(IBD)(例如，克羅恩氏病、自體免疫介導性腸胃疾病、腸胃炎症、結腸炎(諸如潰瘍性結腸炎、潰瘍性結腸炎、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎)及自體免疫發炎性腸病)；大腸炎症；壞疽性膿皮病；結節性紅斑；原發性硬化性膽管炎；呼吸窘迫症候群，包括成年或急性呼吸窘迫症候群(ARDS)；腦膜炎；葡萄膜之全部或部分的炎症；虹膜炎；脈絡膜炎；自體免疫血液病；移植物抗宿主疾病；血管性水腫，諸如遺傳性血管性水腫；腦神經損傷，如腦膜炎；妊娠疱疹；妊娠性類天疱瘡；陰囊搔癢症；自體免疫卵巢早衰；由自體免疫病狀引起之突發性耳聾；IgE介導性疾病，諸如過敏症及過敏性及異位性鼻炎；腦炎，諸如拉斯馬森腦炎(Rasmussen's encephalitis)及邊緣葉及/或腦幹腦炎；葡萄膜炎，諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體過敏性葡萄膜炎、後葡萄膜炎或自體免疫葡萄膜炎；伴有或不伴有腎病症候群之絲球體腎炎(GN)，諸如慢性或急性絲球體腎炎，諸如原發性GN、免疫介導性GN、膜性GN(膜性腎病)、特發性膜性GN或特發性膜性腎病、膜性增生性GN(MPGN)(包括I型及II型)及快速進行性GN(RPGN)；增生腎炎；自體免疫多腺性內分泌衰竭；龜頭炎，包括漿細胞性侷限性龜頭炎、龜頭包皮炎；離心性環形紅斑、持久性色素異常性紅斑、多形性紅斑；環狀肉芽腫；光澤苔癬、硬化萎縮性苔蘚、慢性單純性苔癬、小棘苔蘚、扁平苔癬；板層狀魚鱗病；表皮松解性過度角化症、惡變前角化症；壞疽性膿皮病；過敏性病狀及反應；食物過敏；藥物過敏；昆蟲過敏；罕見過敏性病症，諸如肥大細胞增多症；過敏反應；濕疹，包括過敏性或異位性濕疹、皮膚缺乏性濕疹、出汗障礙性濕疹及水泡性掌蹠濕疹(vesicular palmoplantar eczema)；哮喘，諸如支氣管哮喘、支氣管哮喘及自體免疫哮喘；涉及T細胞浸潤之病狀及慢性發炎性反應；針對外來抗原之免疫反應，諸如懷孕期間之胎兒A－B－O血型；慢性肺部發炎性疾病；自體免疫心肌炎；白血球黏附缺乏症；狼瘡，包括狼瘡腎炎、狼瘡性腦炎、小兒狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡及盤狀紅斑狼瘡、禿髮性狼瘡、SLE(諸如皮膚性SLE或亞急性皮膚性SLE)、新生兒狼瘡症候群(NLE)及播散性紅斑狼瘡；幼年發病型(I型)糖尿病，包括小兒IDDM；成年發病型糖尿病(II型糖尿病)；自體免疫糖尿病；特發性尿崩症；糖尿病性視網膜病；糖尿病性腎病；糖尿病性結腸炎；糖尿病性大動脈病症；與由細胞因子及T淋巴細胞介導之急性及遲發超敏反應相關之免疫反應；肺結核；類肉瘤病；肉芽腫病，包括淋巴瘤樣肉芽腫病；顆粒性球缺乏症；血管炎(包括大血管血管炎，諸如風濕性多肌痛及巨細胞(高安氏(Takayasu's))動脈炎；中等血管血管炎，諸如川崎氏病(Kawasaki's disease)及結節性多動脈炎/結節性動脈周圍炎；免疫性血管炎、CNS血管炎、皮膚性血管炎、超敏性血管炎、壞死性血管炎(諸如類纖維蛋白壞死性血管炎及全身性壞死性血管炎)、ANCA陰性血管炎及ANCA相關血管炎，諸如徹奇－斯全司症候群(CSS)、韋格納肉牙腫病及顯微鏡下多脈管炎)；顳動脈炎；再生障礙性貧血；自體免疫再生障礙性貧血；庫姆陽性貧血(Coombs positive anemia)；先天性純紅血球再生障礙性貧血(Diamond Blackfan anemia)；溶血性貧血或免疫性溶血性貧血，包括自體免疫性溶血性貧血(AIHA)；惡性貧血(anemia perniciosa)；艾迪生氏病；純紅血球貧血或發育不全(PRCA)；因子VIII缺乏；A型血友病；自體免疫嗜中性球減少症；血細胞減少症，諸如全血細胞減少症、白血球減少症、涉及白血球血球滲出之疾病；CNS發炎性病症；阿茲海默氏病；帕金森氏病；多器官損傷症候群，諸如繼發於敗血症之彼等者；外傷或出血；抗原抗體複合物介導性疾病；抗腎小球基底膜病；抗磷脂抗體症候群；運動神經炎(motoneuritis)；過敏性神經炎；貝西氏病/症候群；卡索曼氏症候群(Castleman's syndrome)；古德帕斯徹氏症候群；雷諾氏症候群；休格連氏症候群；史蒂芬－瓊森症候群(Stevens－Johnson syndrome)；類天疱瘡或天疱瘡，諸如大皰性類天疱瘡、瘢痕性(黏膜性)類天疱瘡、皮膚類天疱瘡、尋常天疱瘡、副腫瘤性天疱瘡、落葉狀天疱瘡、天疱瘡性黏膜性類天疱瘡及紅斑性天疱瘡；後天性大皰性表皮松解；眼睛炎症，較佳為過敏性眼睛炎症，諸如過敏性結膜炎；線性IgA大皰病；自體免疫誘導性結膜炎症；自體免疫性多內分泌病；萊特爾氏病或症候群(Reiter's disease or syndrome)；由自體免疫病狀引起之熱損傷；子癇前期；免疫複合物病症，諸如免疫複合物性腎炎；抗體介導性腎炎；神經發炎性病症；多發性神經病；慢性神經病，諸如IgM多發性神經病或IgM介導性神經病；血小板減少症(如由例如心肌梗塞患者逐步顯現)，包括栓塞性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血後紫癜(PTP)、肝素誘導性血小板減少症及自體免疫或免疫介導性血小板減少症，包括(例如)特發性血小板減少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP；鞏膜炎，諸如特發性角膜鞏膜炎；上鞏膜炎；睾丸及卵巢之自體免疫疾病，包括自體免疫睾丸炎及卵巢炎；原發性甲狀腺功能低下；副甲狀腺低能症；自體免疫內分泌疾病，包括甲狀腺炎，諸如自體免疫甲狀腺炎、橋本氏病(Hashimoto's disease)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎)或亞急性甲狀腺炎；自體免疫甲狀腺病；特發性甲狀腺功能低下；格雷氏病；格雷氏眼病(Grave's eye disease)(眼病或甲狀腺相關眼病)；多腺性症候群，諸如自體免疫多腺性症候群，例如I型(或多腺性內分泌病症候群)；副腫瘤症候群，包括神經性副腫瘤症候群，諸如蘭伯特－伊頓肌無力症候群(Lambert－Eaton myasthemc syndrome)或伊頓－蘭伯特症候群(Eaton－Lambert syndrome)；僵人症候群(stiff－man/stiff－person syndrome)；腦脊髓炎，諸如過敏性腦脊髓炎及實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE)；重症肌無力，諸如胸腺瘤相關重症肌無力；小腦變性；神經性肌強直；眼陣攣或眼陣攣肌陣攣症候群(OMS)；及感覺神經病；多灶性運動神經病；席漢氏症候群(Sheehan's syndrome)；自體免疫肝炎；慢性肝炎；狼瘡樣肝炎；巨細胞肝炎；慢性活動性肝炎或自體免疫慢性活動性肝炎；肺炎，諸如淋巴細胞間質性肺炎(LIP)；相對於NSIP之阻塞性細支氣管炎(非移植)；古立安－白瑞症候群(Guillain－Barre syndrome)；伯格氏病(IgA腎病)；特發性IgA腎病；線性IgA皮膚病；急性發熱性嗜中性皮膚病；角膜下膿皰性皮膚病；暫時性棘層松解性皮膚病；硬化症，諸如原發性膽汁性肝硬化症及肺硬變；自體免疫腸病症候群；腹腔疾病；乳糜瀉(麩質腸病)；難治癒性口炎性腹瀉；特發性脂肪瀉(idiopathic sprue)；冷球蛋白血症，諸如混合型冷球蛋白血症；肌肉萎縮性側索硬化(ALS；盧伽雷病(Lou Gehrig's disease))；冠狀動脈病；自體免疫耳病，諸如自體免疫內耳病(AIED)；自體免疫聽力喪失；多軟骨炎，諸如難治癒或復發性多軟骨炎；肺泡蛋白質沈積症；角膜炎，諸如柯根氏症候群(Cogan's syndrome)/非梅毒性間質性角膜炎；貝爾氏麻痹(Bell's palsy)；史維特氏病/症候群(Sweet's disease/syndrome)；自體免疫紅斑痤瘡；帶狀疱疹相關疼痛；澱粉樣變性病；非癌性淋巴球增多症；原發性淋巴球增多症，包括單株B細胞淋巴球增多症(例如，良性單株球蛋白症及意義不明之單株球蛋白症，MGUS)；周邊神經病；副腫瘤症候群；通道病，諸如癲癇症、偏頭痛、心律不整、肌肉病、耳聾、失明、週期性麻痹及CNS之通道病；自閉症；發炎性肌病；局灶性或節段性或局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)；內分泌性眼病；葡萄膜視網膜炎；脈絡膜視網膜炎；自體免疫肝病；肌肉纖維疼痛；多發性內分泌衰竭；施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)；腎上腺炎；胃萎縮；早老性癡呆；脫髓鞘病，諸如自體免疫脫髓鞘病及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病；德雷斯勒氏症候群(Dressler's syndrome)；斑禿；普禿；CREST症候群(鈣質沈著症、雷諾氏現象、食道功能異常、指端硬化及毛細血管擴張)；男女自體免疫不孕症，例如歸因於抗精子抗體；混合型結締組織病；卡格氏病(Chagas' disease)；風濕熱；習慣性流產；農民肺；多形性紅斑；心臟切開後症候群；柯興氏症候群(Cushing's syndrome)；飼鳥者肺(bird－fancier's lung)；過敏性肉芽腫性脈管炎；良性淋巴細胞性脈管炎；阿爾波特氏症候群(Alport's syndrome)；肺泡炎，諸如過敏性肺泡炎及纖維性肺泡炎；間質性肺病；輸血反應；麻瘋病；瘧疾；寄生蟲病，諸如利什曼病(leishmaniasis)、kypanosomiasis、血吸蟲病、蛔蟲病；麴菌症；薩姆特氏症候群(Sampter's syndrome)；卡普蘭氏症候群(Caplan's syndrome)；登革熱；心內膜炎；心內膜心肌纖維化；彌漫性間質性肺纖維化；間質性肺纖維化；纖維性縱隔炎；肺纖維化；特發性肺纖維化；囊腫狀纖維化；內眼炎；持久性隆起性紅斑；胎兒成紅細胞增多症；嗜伊紅血球筋膜炎；舒曼氏症候群(Shulman's syndrome)；費爾蒂氏症候群(Felty's syndrome)；絲蟲病；睫狀體炎，諸如慢性睫狀體炎、異時性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(急性或慢性)或富克氏睫狀體炎(Fuch's cyclitis)；亨－舍二氏紫癜(Henoch－Schonlein purpura)；人類免疫缺陷性病毒(HIV)感染；SCID；後天免疫缺陷症候群(AIDS)；埃可病毒感染(echovirus infection)；膿毒症(全身性發炎性反應症候群(SIRS))；內毒素血症；胰腺炎；甲狀腺功能亢進症(thyroxicosis)；細小病毒感染；風疹病毒感染；接種疫苗後症候群；先天性風疹感染；埃－巴二氏病毒(Epstein－Barr virus)感染；流行性腮腺炎；伊氏症候群(Evan's症候群)；自體免疫性腺衰竭；西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)；鏈球菌感染後腎炎；血栓閉塞性脈管炎；甲狀腺毒症；脊髓癆；脈絡膜炎；巨細胞多肌痛；慢性超敏性肺炎；結膜炎，諸如春季卡他炎(vernal catarrh)、乾燥性角膜結膜炎及流行性角膜結膜炎；特發性腎病症候群；微小病變性腎病；良性家族性及缺血再灌注損傷；移植器官再灌注；視網膜自體免疫性；關節炎症；支氣管炎；慢性阻塞性氣管疾病/肺病；矽肺病；口瘡；口瘡性口炎；動脈硬化病(腦血管功能不全)，諸如動脈硬化腦病及動脈硬化視網膜病；不形成精子症；自體免疫溶血；伯克氏病(Boeck's disease)；冷球蛋白血症；杜普特氏攣縮(Dupuytren's contracture)；晶狀體過敏性眼內炎；過敏性腸炎；麻風結節性紅斑；特發性面神經麻痹；慢性疲勞症候群；風濕性發熱(febris rheumatica)；哈麗二氏病(Hamman－Rich's disease)；知覺神經聽力損失；陣發性血紅素尿；性腺機能減退；侷限性回腸炎；白血球減少症；傳染性單核白血球增多症；橫貫性脊髓炎；原發性特發性黏液水腫；腎病；交感性眼炎；新生兒眼炎；視神經炎；肉芽腫性睾丸炎；胰腺炎；急性多神經根炎；壞疽性膿皮病；奎汶氏甲狀腺炎(Quervain's thyreoiditis)；後天性脾萎縮；非惡性胸腺瘤；淋巴樣濾泡性胸腺炎；白斑病；中毒性休克症候群；食物中毒；涉及T細胞浸潤之病狀；白血球黏附缺乏症；與由細胞因子及T淋巴細胞介導之急性及遲發超敏反應相關之免疫反應；涉及白血球血球滲出之疾病；多器官損傷症候群；抗原抗體複合物介導性疾病；抗腎小球基底膜病；自體免疫性多內分泌病；卵巢炎；原發性黏液水腫；自體免疫萎縮性胃炎；風濕病；混合型結締組織病；腎病症候群；胰島炎；多內分泌腺衰竭；自體免疫多腺性症候群，包括I型多腺性症候群；成年發病型特發性副甲狀腺低能症(AOIH)；心肌病，諸如擴張性心肌病；後天性大皰性表皮松解(EBA)；血色病；心肌炎；腎病症候群；原發性硬化性膽管炎；化膿性或非化膿性竇炎；急性或慢性竇炎；篩竇炎、額竇炎、上頜竇炎或蝶竇炎；過敏性竇炎；嗜伊紅血球相關病症，諸如嗜伊紅血球增多、肺部浸潤性嗜伊紅血球增多、嗜伊紅血球增多－肌痛症候群、呂弗勒氏症候群(Loffler's syndrome)、慢性嗜酸性肺炎、熱帶性肺嗜伊紅血球增多、支氣管肺炎性麴菌症、麴菌腫或肉芽腫(含有嗜伊紅血球)；過敏症；脊柱關節病；血清陰性脊柱關節炎；多內分泌自體免疫疾病；硬化性膽管炎；鞏膜；外鞏膜；慢性皮膚黏膜念珠菌病；布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)；嬰兒暫時性低γ球蛋白血症；維－奧二氏症候群(Wiskott－Aldrich syndrome)；共濟失調毛細血管擴張症候群；血管擴張；與膠原病相關之自體免疫病症；風濕病，諸如慢性關節風濕病；淋巴腺炎；血壓反應減少；血管功能障礙；組織損傷；心血管局部缺血；痛覺過敏；腎缺血；大腦局部缺血；及伴有血管形成之疾病；過敏性超敏性病症；腎小球腎炎；再灌注損傷；缺血性再灌注病症；心肌或其他組織之再灌注損傷；淋巴瘤性氣管支氣管炎；發炎性皮膚病；伴有急性發炎性成分之皮膚病；多器官衰竭；大皰病；腎皮質壞死；急性化膿性腦膜炎或其他中樞神經系統發炎性病症；眼睛及眼眶發炎性病症；粒細胞輸注相關症候群；細胞因子誘導性毒性；發作性睡病；急性嚴重炎症；慢性難治性炎症；腎盂炎；動脈內增生；消化性潰瘍；心瓣炎；及子宮內膜異位。
如本文所使用，"類風濕性關節炎"或"RA"係指可根據RA分類之美國類風濕病協會標準2000年修訂版(2000 revised American Rheumatoid Association criteria)或任何類似標準診斷之公認的疾病病況，包括如下文所定義之活動性、早期及初發RA。RA之生理學指標包括對稱關節腫脹，其為特徵，但在類風濕性關節炎中並非一成不變。通常影響手之近端指骨間(PIP)關節以及掌指骨(MCP)、腕、肘、膝、踝及蹠骨(MTP)關節之梭形腫脹且容易偵測到腫脹。被動性運動疼痛為關節發炎之最敏感測試，且發炎及結構變形通常限制受影響關節之活動範圍。典型可見變化包括在MCP關節處手指之尺骨偏移、MCP及PIP關節過度伸展或過度屈曲、肘屈曲攣縮、以及腕骨及腳趾半脫位。患有RA之個體可能對DMARDs有抵抗力，因為DMARDs對於治療症狀並不有效或並不完全有效。適於本發明療法的其他候選者包括該等對先前或當前之TNF抑制劑(諸如依那西普、英利昔單抗及/或阿達木單抗)治療(例如每週兩次25 mg依那西普歷時3個月或至少4次輸注3 mg/kg英利昔單抗)由於毒性或功效不足而反應不足的患者。
患有"活動性類風濕性關節炎"之患者意謂具有RA之活動性而非潛伏性症狀之患者。根據RA分類之ACR標準1987年修訂版，患有"早期活動性類風濕性關節炎"之個體為該等已診斷患有活動性RA至少八週但不長於四年之個體。根據RA分類之ACR標準1987年修訂版，患有"早期類風濕性關節炎"之個體為該等已診斷患有RA至少八週但不長於四年之個體。早期RA包括例如幼年發病型RA、幼年特發性關節炎(JIA)或幼年RA(JRA)。
患有"初發RA"之患者早期具有多發性關節炎，其並不完全符合診斷RA之ACR標準，但與存在RA特異性預兆生物標記物(諸如抗CCP及共有抗原決定基)相關。其包括具有陽性抗CCP抗體之患者，其呈現有多發性關節炎，但尚未診斷為RA，有繼續發展真正ACR標準RA之高度危險(95%可能性)。
"關節損傷"係以最廣泛意義使用，係指一或多個關節之任一部分(包括結締組織及軟骨)的損傷或部分或完全損壞，其中損傷包括任何原因之結構及/或功能損傷，可能或可能不引起關節疼痛/關節痛。其包括(但不限於)與發炎性關節病以及非發炎性關節病相關或引起之關節損傷。此損傷可能由任何病狀引起，諸如自體免疫疾病，尤其關節炎，最尤其RA。該等病狀實例包括急性及慢性關節炎，RA包括幼年發病型RA、幼年特發性關節炎(JIA)或幼年RA(JRA)，及諸如類風濕性滑膜炎之階段、痛風或痛風性關節炎、急性免疫性關節炎、慢性發炎性關節炎、退化性關節炎、II型膠原蛋白誘發性關節炎、傳染性關節炎、膿毒性(septic)關節炎、萊姆(Lyme)關節炎、增生性關節炎、牛皮癬性關節炎、史提爾氏(Still's)病、脊椎關節炎、骨關節炎、慢性漸進性關節炎、關節炎畸形、慢性原發性多發性關節炎、反應性關節炎、絕經期關節炎、雌激素缺乏關節炎及強直性脊椎炎/類風濕性脊椎炎)、除RA外之風濕性自體免疫疾病，以及RA繼發性明顯全身性受累(包括(但不限於)血管炎、肺纖維化或費爾蒂氏症候群)。出於本文之目的，關節為(諸如動物之脊椎動物之)骨骼的元件之間的接觸點以及圍繞且支撐該骨骼之部分，且包括(但不限於)例如髖、脊柱椎骨之間的關節、脊柱與骨盆之間的關節(骶骼關節)、腱及韌帶與骨連接之關節、肋骨與脊柱之間的關節、肩、膝、足、肘、手、手指、踝及腳趾，但尤其為手及足中之關節。
如本文所使用，"治療"係指試圖改變正被治療之個體或細胞之自然病程的臨床干預，且可為預防性目的或在臨床病變過程中執行。所希望之治療效應包括預防疾病之發生或復發、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理學結果、預防轉移、減小疾病進程之速率、改善或減緩疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延緩疾病或病症之發展。若在根據本發明之方法接受治療量之本發明之抗體後，個體顯示可觀察到及/或可量測之特定疾病之一或多個徵象及症狀的減少或消失，則該個體之(例如)自體免疫病症得以成功地"治療"。
在成功治療之一較佳實施例中，抗體誘導患有RA個體之主要臨床反應。出於本文之目的，"主要臨床反應"係定義為達成美國風濕病學學會70反應(American College of Rheumatology 70 response)(ACR 70)歷時連續6個月。ACR反應分數分為ACR 20、ACR 50及ACR 70，其中ACR 70為此評估系統中徵象及症狀控制之最高程度。ACR反應分數衡量RA疾病活性之改善，該RA疾病活性包括關節腫脹及壓痛、疼痛、無力程度及整體患者及醫師評估。如經FDA認可且如本文所定義的可誘導主要臨床反應之不同類型之抗體的一實例為依那西普(ENBREL)。
"有效量"係指在一定劑量及時間段內有效達成所需治療性或預防性效果所必需之量。
本文中之藥劑的"治療有效量"可根據諸如以下者之因素變化；個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及藥劑(例如抗體)引起個體之所需反應的能力。治療有效量亦為所述藥物(例如抗體)之治療有益效應多於任何毒性或有害效應的量。"預防有效量"係指在一定劑量及時間段下有效達成所需預防性效果所必需之量。通常但並非必定，因為預防劑量係在疾病早期階段之前或早期階段時用於個體，所以預防有效量將小於治療有效量。
如本文所使用之術語"細胞毒性劑"係指一種能抑制或阻止細胞之功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 及Lu之放射性同位素)、化療劑及毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段。
"化療劑"為一種適用於治療癌症之化學化合物。化療劑之實例包括烷基化劑，諸如塞替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺類及甲基三聚氰胺類，包括六甲密胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫基磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；乙醯精寧(acetogenin)(特定言之布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ－9－四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β－拉帕醌(β－lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT－11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙醯基喜樹鹼、斯考普萊叮(scopolectin)及9－胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC－1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；自念珠藻環肽(cryptophycin)(詳言之自念珠藻環肽1及自念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物，KW－2189及CB1－TM1)；艾榴素(eleutherobin)；CDP323，即一種口服α－4整合素抑制劑；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海綿他汀(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及瑞甯司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔(enediyne)抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1(參見例如，Nicolaou等人，Angew.Chem Intl.Ed.Engl., 33；183－186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)；其他抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、奧斯拉米辛(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6－重氮基－5－側氧基－L－正白胺酸、阿黴素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、嗎啉基－阿黴素、氰基嗎啉基－阿黴素、2－吡咯啉幷－阿黴素、阿黴素HCl脂質體注射劑(DOXIL)及脫氧阿黴素(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、去甲氧基柔紅黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、喃氟啶(tegafur)(UFTORAL)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA)、埃坡黴素(epothilone)及5－氟尿嘧啶(5－FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)及三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6－巰基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)及硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6－氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮脲苷(floxuridine)；抗腎上腺類，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；及葉酸補充劑，諸如夫羅林酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝司他布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲卡(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖(lentinan)；羅尼代寧(lonidainine)；美登素類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及美登木素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比旦莫耳(mopidanmol)；硝爾靈(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2－乙醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"－三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecene)(尤其T－2毒素、韋拉庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安奎定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE，FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)("Ara－C")；塞替派；紫杉醇類，例如太平洋紫杉醇(TAXOL)、太平洋紫杉醇之白蛋白工程化奈米粒子調配物(ABRAXANETM )及多西他賽(doxetaxel)(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6－硫代鳥嘌呤；巰嘌呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(VELBAN)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP－16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(ONCOVIN)；奧賽力鉑(oxaliplatin)；甲醯四氫葉酸(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，諸如視黃酸；上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及上述物質中兩者或兩者以上之組合，諸如CHOP，一種環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼及潑尼龍之組合療法的縮寫；及FOLFOX，一種奧賽力鉑(ELOXATINTM )與5－FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫。
此定義亦包括抗激素藥劑，其起到調節、降低、阻斷或抑制會促進癌症生長之激素效應的作用，且經常呈全身性或整個身體治療之形式。其自身可能為激素。實例包括抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷諾昔酚(raloxifene)(EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4－羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；雌激素受體拮抗劑，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX)；用以抑制或閉鎖卵巢之藥劑，例如促黃體激素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON及ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲特瑞林(tripterelin)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制酶芳香酶之芳香酶抑制劑，其調節腎上腺中之雌激素產生，諸如4(5)－咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、弗米斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、伏羅唑(vorozole)(RIVISOR)、來曲唑(letrozole)(FEMARA)及安美達錠(anastrozole)(ARIMIDEX)。另外，化療劑之該定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(例如，BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL)、NE－58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(ZOMETA)、阿侖膦酸鹽(FOSAMAX)、帕米膦酸鹽(AREDIA)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3－二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，詳言之能抑制abherant細胞增殖中所涉及之信號轉導途徑中之基因表現的彼等者，諸如PKC－α、Raf、H－Ras及表皮生長因子受體(EGF－R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN)；rmRH(例如ABARELIX)；拉帕替尼二甲苯磺酸鹽(lapatinib ditosylate)(ErbB－2及EGFR雙酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
術語"細胞因子"為由作為細胞間介體作用於另一細胞之一細胞群體所釋放之蛋白的通用術語。該等細胞因子之實例為淋巴因子、單核因子、介白素(IL)，諸如IL－1、IL－1α、IL－2、IL－3、IL－4、IL－5、IL－6、IL－7、IL－8、IL－9、IL－11、IL－12及IL－15，包括PROLEUKINrIL－2、TNF(諸如TNF－α或TNF－β)，及其他多肽因子，包括白血球抑制因子(LIF)及套組配位體(KL)。如本文所使用，該術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白及天然序列細胞因子之生物學活性等效物，包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。"細胞因子拮抗劑"為一種藉由任何機制抑制或拮抗該等細胞因子之分子，包括(例如)細胞因子之抗體、細胞因子受體之抗體及免疫黏附素。
出於本文之目的，"腫瘤壞死因子α"或"TNF－α"或"TNFα"係指包含如Pennica等人，Nature, 312：721(1984)或Aggarwal等人，J.Biol Chem., 260：2345(1985)中所述之胺基酸序列的人類TNF－α分子。
"TNF拮抗劑"或"TNF抑制劑"在本文中係定義為能降低、阻斷、抑制、消除或不然干擾TNFα活體外、原位及/或較佳活體內活性之分子。該藥劑在某種程度上通常經由與TNF－α結合且中和其活性來抑制TNF－α之生物功能。合適之TNF拮抗劑亦可降低、阻斷、消除、干擾、阻止及/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白質合成、TNFα釋放、TNFα受體信號轉導、膜TNFα裂解、TNFα活性及TNFα產生及/或合成。該等TNF拮抗劑包括(但不限於)抗TNFα抗體、其抗原結合片段、其與TNFα特異性結合、在與TNFα結合後破壞或消減哺乳動物中表現TNFα之細胞及/或干擾彼等細胞之一或多種功能的特定突變體或域；可溶性TNF受體(例如，p55、p70或p85)或片段、其融合多肽；小分子TNF拮抗劑，例如TNF結合蛋白I或II(TBP－I或TBP－II)、奈瑞莫單抗(nerelimonmab)、CDP－571、英利昔單抗(REMICADE)、依那西普(ENBREL)、阿達木單抗(HUMIRATM )、CDP－571、CDP－870、阿非莫單抗(afelimomab)、來那西普及其類似物、其抗原結合片段及與TNFα特異性結合之受體分子；阻止及/或抑制TNFα合成、TNFα釋放或其對靶細胞之作用的化合物，諸如沙利度胺(thalidomide)、替尼達普(tenidap)、磷酸二酯酶抑制劑(例如，配妥西菲林(pentoxifylline)及咯利普蘭(rolipram))、A2b腺苷受體促效劑及A2b腺苷受體強化因子；阻止及/或抑制TNFα受體信號轉導之化合物，諸如有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制劑；阻斷及/或抑制膜TNFα裂解之化合物，諸如金屬蛋白酶抑制劑；阻斷及/或抑制TNFα活性之化合物，諸如血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑(例如，卡托普利(captopril))；及阻斷及/或抑制TNFα產生及/或合成之化合物，諸如MAP激酶抑制劑。較佳拮抗劑包含抗體或免疫黏附素。本文特定涵蓋之TNF拮抗劑之實例為依那西普(ENBREL)、英利昔單抗(REMICADE)及阿達木單抗(HUMIRATM )。
術語"激素"係指多肽激素，其通常由具有管之腺器官分泌。所包括之激素為(例如)生長激素，諸如人類生長激素、N－甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；鬆弛素；雌二醇；激素替代療法；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)或睾內酯；前鬆弛素(prorelaxin)；醣蛋白激素，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體素(LH)；促乳素、胎盤生乳素、小鼠促性腺激素相關肽、促性腺激素釋放激素；抑制素；活化素(activin)；苗勒抑制物質(mullerian－inhibiting substance)；及血小板生成素。如本文所使用，該術語激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白及天然序列激素之生物學活性等效物，包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。
術語"生長因子"係指促進生長之蛋白且包括(例如)：肝生長因子；纖維母細胞生長因子；血管內皮生長因子；神經生長因子，諸如NGF－β；血小板衍生生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF－α及TGF－β；類胰島素生長因子－I及類胰島素生長因子－II；紅血球生成素(EPO)；骨生成誘導因子(osteoinductive factor)；干擾素，諸如干擾素－α、干擾素－β及干擾素－γ；及群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞－CSF(M－CSF)、顆粒球－巨噬細胞－CSF(GM－CSF)及顆粒球－CSF(G－CSF)。如本文所使用，該術語生長因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白及天然序列生長因子之生物學活性等效物，包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。
術語"整合素"係指一種允許細胞與細胞外基質結合且對後者產生反應並涉及各種細胞功能之受體蛋白，其中該等細胞功能諸如傷口癒合、細胞分化、腫瘤細胞之歸巢及細胞凋亡。其屬於涉及細胞細胞外基質及細胞與細胞相互作用之細胞黏附受體之大家族。功能性整合素由兩種稱為α及β、非共價結合之跨膜醣蛋白亞單元組成。該等α亞單元彼此皆共有一些同源性，該等β亞單元亦如此。受體始終含有一個α鏈及一個β鏈。實例包括α6β1、α3β1、α7β1、LFA－1等。如本文所使用，該術語"整合素"包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白及天然序列整合素之生物學活性等效物，包括合成產生之小分子實體及其醫藥學上可接受之衍生物及鹽。
"整合素拮抗劑"為藉由任何機制抑制或拮抗該等整合素之分子，包括(例如)整合素之抗體。本文中之"整合素拮抗劑或抗體"之實例包括LFA－1抗體，諸如可購自Genentech之依法珠單抗(RAPTIVA)；或其他CD11/11a及CD18抗體；或α4整合素抗體，諸如可購自Biogen之那他珠單抗(natalizumab)(ANTEGREN)；或二氮雜環狀苯丙胺酸衍生物(WO 2003/89410)；苯丙胺酸衍生物(WO 2003/70709、WO 2002/28830、WO 2002/16329及WO 2003/53926)；苯基丙酸衍生物(WO 2003/10135)；烯胺衍生物(WO 2001/79173)；丙酸衍生物(WO 2000/37444)；鏈烷酸衍生物(WO 2000/32575)；經取代之苯基衍生物(US 6,677,339及6,348,463)；芳族胺衍生物(US 6,369,229)；ADAM去整合素域多肽(US 2002/0042368)；αvβ3整合素之抗體(EP 633945)；氮橋雙環胺基酸衍生物(WO 2002/02556)等。
"皮質類固醇"係指若干種具有類固醇之通用化學結構之合成或天然存在之物質中的任一者，其模擬或增大天然存在之皮質類固醇的效應。合成皮質類固醇之實例包括潑尼松、潑尼龍(包括甲潑尼龍，諸如SOLU－MEDROL甲潑尼龍丁二酸鈉)、地塞米松或地塞米松曲安西龍(triamcinolone)、氫化可的松及倍他米松(betamethasone)。本文中之較佳皮質類固醇為潑尼松、甲潑尼龍、氫化可的松或地塞米松。如本文中用於輔助療法之術語"免疫抑制劑"係指起到抑制或遮蔽本文中正被治療之哺乳動物之免疫系統的作用之物質。此將包括抑制細胞因子產生、下調或抑制自體抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。該等藥劑之實例包括2－胺基－6－芳基－5－取代之嘧啶(參見US 4,665,077)；非類固醇消炎藥(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)；他克莫司(tacrolimus)；糖皮質激素，諸如皮質醇(Cortisol)或醛固酮；消炎劑，諸如環加氧酶抑制劑、5－脂肪加氧酶抑制劑或白三烯受體拮抗劑；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤或黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；曲卡得(trocade)(Ro32－355)；周邊σ受體拮抗劑，諸如ISR－31747；烷基化劑，諸如環磷醯胺；溴隱亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；胺苯碸(dapsone)；戊二醛(如US 4,120,649中所述，其遮蔽MHC抗原)；MHC抗原及MHC片段之抗個體基因型抗體；環孢素A；類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物，例如潑尼松、甲潑尼龍，包括SOLU－MEDROL甲潑尼龍丁二酸鈉、利美索龍(rimexolone)及地塞米松；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如甲胺喋呤(口服或皮下注射)；抗瘧疾藥劑，諸如氯喹及羥氯喹；柳氮磺吡啶；來氟米特；細胞因子釋放抑制劑，諸如SB－210396及SB－217969單株抗體及MHC II拮抗劑，諸如ZD2315；PG1受體拮抗劑，諸如ZD4953；VLA4黏附阻斷劑，諸如ZD7349；抗細胞因子或抗細胞因子受體抗體，包括抗干擾素－α、干擾素－β或干擾素－γ抗體、抗TNF－α抗體(英利昔單抗(REMICADE)或阿達木單抗)、抗TNF－α免疫黏附素(依那西普)、抗TNF－β抗體、介白素－1(IL－1)阻斷劑(諸如重組HuIL－1Ra及IL－1B抑制劑)、抗介白素－2(IL－2)抗體及抗IL－2受體抗體；IL－2融合毒素；抗L3T4抗體；來氟米特；異源性抗淋巴細胞球蛋白；OPC－14597；NISV(免疫反應改質劑)；必需脂肪酸，諸如亞麻酸或二十碳五烯酸；CD－4阻斷劑及pan－T抗體，較佳抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；共刺激改質劑(例如，CTLA4－Fc融合物，亦稱為ABATACEPTTM )；抗介白素－6(IL－6)受體抗體及拮抗劑；抗LFA－1抗體，包括抗CD11a及抗CD18抗體；含有LFA－3－結合域之可溶性肽(WO 1990/08187)；鏈激酶(streptokinase)；IL－10；轉化生長因子－β(TGF－β)；鏈道酶(streptodornase)；來自宿主之RNA或DNA；FK506；RS－61443；恩莫單抗(enlimomab)；CDP－855；PNP抑制劑；CH－3298；GW353430；4162W94、苯丁酸氮芥；去氧斯匹胍素(deoxyspergualin)；雷帕黴素(rapamycin)；T細胞受體(Cohen等人，US 5,114,721)；T細胞受體片段(Offner等人，Science, 251：430－432(1991)；WO 1990/11294；Janeway,Nature, 341：482－483(1989)；及WO 91/01133)；BAFF拮抗劑，諸如BAFF抗體及BR3抗體；zTNF4拮抗劑(Mackay及Mackay,Trends Immunol., 23：113－5(2002))；干擾T細胞輔助信號之生物藥劑，諸如抗CD40受體或抗CD40配位體(CD154)，包括CD40－CD40配位體之阻斷抗體(例如Durie等人，Science, 261：1328－30(1993)；Mohan等人，J.Immunol., 154：1470－80(1995))及CTLA4－Ig(Finck等人，Science, 265：1225－7(1994))；及T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。本文中之一些較佳免疫抑制劑包括環磷醯胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、來氟米特、MMF或甲胺喋呤。
"改變病情之抗風濕藥物"或"DMARD"之實例包括氯喹、羥氯喹、硫代苯酸金鈉、金諾芬、柳氮磺吡啶、甲胺喋呤、來氟米特、依那西普、英利昔單抗(加口服及皮下注射甲胺喋呤)、硫唑嘌呤、D－青黴胺、金鹽(口服)、金鹽(肌肉內注射)、二甲胺四環素(minocycline)、環孢素(包括環孢素A及局部環孢素)、葡萄球菌(staphylococcal )蛋白A(Goodyear及Silverman,J.Exp.Med., 197,(9)，第1125－39頁(2003))，包括其鹽及衍生物等。
"非類固醇消炎藥"或"NSAID"之實例包括阿司匹林、乙醯水楊酸、布洛芬及布洛芬緩釋物、非諾洛芬(fenoprofen)、吡羅昔康(piroxicam)、氟比洛芬(flurbiprofen)、萘普生(naproxen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生、替諾昔康(tenoxicam)、貝諾酯(benorylate)、雙氯芬酸、萘普生、萘丁美酮(nabumetone)、吲哚美辛、酮洛芬、甲芬那酸(mefenamic acid)、雙氯芬酸、芬布芬、阿紮丙酮(azapropazone)、阿西美辛(acemetacin)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、吲哚美辛、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)、苯基丁氮酮、雙氯芬酸及雙氯芬酸緩釋物、環加氧酶(COX)－2抑制劑(諸如GR 253035)、MK966、賽利克西(celecoxib)(CELEBREX；4－(5－(4－甲基苯基)－3－(三氟甲基)－1H－吡唑－1－基)苯磺醯胺)以及伐地考昔(valdecoxib)(BEXTRA)及美儂西康(meloxicam)(MOBIC)，包括其鹽及衍生物等。較佳地，其為阿司匹林、萘普生、布洛芬、吲哚美辛或托美丁。該等NSAID視情況與諸如可的寧(codenine)、曲馬多(tramadol)及/或二氫可的寧(dihydrocodinine)之止痛劑或諸如嗎啡鹼之麻醉劑一起使用。
"B細胞"為在骨髓內成熟之淋巴細胞，且包括原初B細胞、記憶B細胞或效應B細胞(漿細胞)。本文中之B細胞可為正常或非惡性B細胞。
"CD20"抗原或"CD20"為見於大於90%之來自周邊血液或淋巴器官之B細胞的表面上之約35 kDa、非糖基化磷蛋白。CD20存在於正常B細胞以及惡性B細胞上，但不表現於幹細胞上。在文獻中CD20之其他名字包括"B淋巴細胞限制性抗原"及"Bp35"。CD20抗原係描述於例如Clark等人，Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)82：1766(1985)中。較佳CD20為非人類靈長類或人類CD20，最佳為人類CD20。
"CD22"抗原或"CD22"，亦稱為BL－CAM或Lyb8，係分子量為約130 kD(還原)至140 kD(未還原)之1型整合膜醣蛋白。其表現於B淋巴細胞之細胞質及細胞膜兩者中。CD22抗原出現於B細胞淋巴細胞分化初期，大約與CD19抗原相同之階段。不同於其他B細胞標記，CD22膜表現受限於成熟B細胞(CD22＋)與漿細胞(CD22－)之間所包含的後期分化階段。CD22抗原係描述於例如Wilson等人，J.Exp.Med. 173：137(1991)及Wilson等人，J.Immunol.l50：50l3 (1993)中。
"B細胞表面標記之拮抗劑"為在與B細胞表面標記結合後破壞或消減哺乳動物之B細胞及/或干擾一或多種B細胞功能(例如藉由降低或阻止由B細胞引起之體液反應)的分子。該拮抗劑較佳能夠消減用其治療之哺乳動物的B細胞(亦即降低循環之B細胞含量)。該消減可經由各種機制，諸如ADCC及/或CDC、抑制B細胞增殖及/或誘導B細胞死亡(例如經由細胞凋亡)來達成。本發明之範疇內所包括之拮抗劑包括與B細胞表面標記結合、視情況與另一個分子結合或稠合之抗體、合成或天然序列肽、免疫黏附素及小分子拮抗劑。較佳拮抗劑包含抗體或免疫黏附素。其包括BLyS拮抗劑，諸如免疫黏附素，且較佳為魯昔單抗(lumiliximab)(抗CD23)、CD20、CD22或BR3抗體或BLyS免疫黏附素。BLyS免疫黏附素較佳係選自由以下各物組成之群：BR3免疫黏附素，包含BR3之細胞外域；TACI免疫黏附素，包含TACI之細胞外域；及BCMA免疫黏附素，包含BCMA之細胞外域。最佳BR3免疫黏附素為WO 2005/00351及US 2005/0095243之SEQ ID NO：2之hBR3－Fc。亦參見US 2005/0163775及WO 2006/068867。另一較佳BLyS拮抗劑為抗BLyS抗體，更佳地其中抗BLyS抗體在BLyS之包含殘基162－275的區內結合BLyS；或抗BR3抗體，更佳地其中抗BR3抗體在包含人類BR3之殘基23－38的區內結合BR3。
CD20抗體之實例包括："C2B8"，其現稱為"利妥昔單抗"("RITUXAN")(US 5,736,137)及其保留結合CD20能力之片段；稱為"Y2B8"或"替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)"(ZEVALIN)之釔－[90]－標記2B8鼠類抗體，可購自IDEC Pharmaceuticals,Inc.(US 5,736,137；於1993年6月22日以寄存編號HB11388寄存於ATCC之2B8)；鼠類IgG2a"B1"，亦稱為"托西莫單抗(Tositumomab)"，視情況經131 I標記以產生"131 I－B1"或"碘113 I托西莫單抗"抗體(BEXXARTM )，可購自Corixa(亦參見US 5,595,721)；鼠類單株抗體"1F5"(Press等人Blood 69(2)：584－591(1987)及其變異體，包括"構架修補"或人化1F5(WO 2003/002607，Leung,S.；ATCC寄存HB－96450)；鼠類2H7及嵌合2H7抗體(US 5,677,180)；人化2H7(WO 2004/056312(Lowman等人)及如下文所述)；靶向於B細胞之細胞膜中之CD20分子的HUMAX－CD20TM 完全人類、高親和力抗體(Genmab,Denmark；參見例如，Glennie及van de Winkel,Drug Discovery Today 8：503－510(2003)及Cragg等人，Blood 101：1045－1052(2003))；WO 2004/035607中所述之人類單株抗體(Teeling等人)；AME－133TM 抗體(Applied Molecular Evolution)；GA101(GlycArt；US 2005/0123546)；A20抗體或其變異體，諸如嵌合或人化A20抗體(分別為cA20、hA20)(US 2003/0219433，Immunomedics)；及單株抗體L27、G28－2、93－1B3、B－Cl或NU－B2，可得自國際白血球分類研討會(International Leukocyte Typing Workshop)(Valentine等人，In：Leukocyte Typing III(McMichael，編，第440頁，Oxford University Press(1987))。本文中之較佳CD20抗體為嵌合、人化或人類CD20抗體，更佳為利妥昔單抗、人化2H7、嵌合或人化A20抗體(Immunomedics)及HUMAX－CD20TM 人類CD20抗體(Genmab)。
純粹出於本文之目的且除非另有指示，否則"人化2H7"係指人化CD20抗體或其抗原結合片段，其中該抗體在活體內有效消減靈長類B細胞。該抗體包括US 2006/0062787及其圖中所述之彼等者，且包括在US 2006/0188495中提供序列之彼等抗體。亦參見US 2006/0034835及US 2006/0024300。在本發明之各種較佳實施例的概述中，如US 2006/0062787中所揭示之基於2H7變體16之變異體的V區將具有v16之胺基酸序列，但下表中指出之胺基酸取代的位置除外。除非另有指示，2H7變異體將具有與v16相同之L鏈。
較佳人化2H7為完整抗體或具有變體16或上文所示變體中之任一者之序列的抗體片段。
本文中之"BAFF拮抗劑"為阻斷BAFF或BR3之活性的任何分子。其包括包含結合BAFF之BR3、TACI或BCMA或其結合BAFF之變異體之一部分的免疫黏附素。在其他實施例中，BAFF拮抗劑為BAFF抗體。"BAFF抗體"為結合BAFF且較佳在人類BAFF之包含人類BAFF之殘基162－275的區內結合BAFF之抗體。在另一實施例中，BAFF拮抗劑為BR3抗體。"BR3抗體"為結合BR3之抗體，且較佳為在人類BR3之包含人類BR3之殘基23－38的區內結合BR3之抗體。人類BAFF及人類BR3之序列係例如見於US 2006/0062787中。BAFF結合多肽或BAFF抗體之其他實例可例如見於WO 2002/092620、WO 2003/014294、Gordon等人，Biochemistry 42(20)：5977－5983(2003)、Kelley等人，J.Biol.Chem., 279(16)：16727－16735(2004)、WO 1998/18921、WO 2001/12812、WO 2000/68378及WO 2000/40716中。
"長期"投予係指以與短期方式相反之連續方式投予藥劑，以便使初始治療效應(活性)維持延長時間段。"間歇"投予為並非無中斷之連續進行，而實質上為循環的的治療。
如本文所使用之"載劑"包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其對以所用劑量及濃度而暴露之細胞或哺乳動物無毒。生理學上可接受之載劑常常為水性pH值緩衝溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，諸如鈉；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM 、聚乙二醇(PEG)及PLURONICSTM 。
術語"哺乳動物"係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農畜，及動物園動物、運動或玩賞動物，諸如狗、馬、貓、牛等。較佳地，本文中之哺乳動物為人類。
"包裝插頁"係指藥劑之商業包裝中通常包括的說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投予、禁忌、與該包裝產品組合之其他藥劑的訊息及/或關於使用該等藥劑之注意事項等。
"套組"為包含至少一種試劑之任何製品(例如，包裝或容器)，該試劑例如為用於治療諸如RA、狼瘡、MS或IBD之自體免疫疾病的藥劑。該製品較佳係以用於執行本發明之方法的單位宣傳、經銷或出售。
"目標對象"為一組人或機構，特定言之針對特定用途、治療或適應症而言如藉由市場交易或做廣告向其宣傳或意欲宣傳特定藥劑，諸如個別患者；患者群；報紙、醫學文獻及雜誌之讀者；電視或網際網路觀眾；無線電或網際網路聽眾；醫師；藥物公司等。
"藥劑"為用以治療所述病症或其症狀或副作用之活性藥物。
如本文所使用之術語"約"係指熟習此技術領域者易於已知之相應值的常用誤差範圍。
進行本發明之方式
在一實施例中，本發明涵蓋一種經分離之LTα抗體，其包含至少一個選自由以下各者組成之群的CDR序列：(a)CDR－L1序列，其包含胺基酸A1－A11，其中A1－A11為KASQAVSSAVA(SEQ ID NO：1)或RASQAVSSAVA(SEQ ID NO：2)；或包含胺基酸A1－A17，其中A1－A17為KSSQSLLYSTNQKNFLA(SEQ ID NO：3)或KSSQSLLYSANQKNFLA(SEQ ID NO：4)或KSSQSLLYSTNQKNALA(SEQ ID NO：6)，其中N為任何胺基酸(分別為嵌合2C8或人化2C8.v2/2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14，或3F12純系14或17)；(b)CDR－L2序列，其包含胺基酸B1－B7，其中B1－B7為SASHRYT(SEQ ID NO：7)或WASTRDS(SEQ ID NO：8)(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2/人化2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14)；(c)CDR－L3序列，其包含胺基酸C1－C9，其中C1－C9為QQHYSTPWT(SEQ ID NO：9)或QENYSTPWT(SEQ ID NO：11)或QQYYSYPRT(SEQ ID NO：13)或QQYASYPRT(SEQ ID NO：14)或QQYYAYPRT(SEQ ID NO：15)，其中N為任何胺基酸(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2或2C8純系G7或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14或3F12純系20或3F12純系21)；(d)CDR－H1序列，其包含胺基酸D1－D10，其中D1－D10為GYTFTSYVIH(SEQ ID NO：16)或GYTFSSYWIE(SEQ ID NO：17)(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2/人化2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14)；(e)CDR－H2序列，其包含胺基酸E1－E17，其中E1－E17為YNNPYNDGTNYNEKFKG(SEQ ID NO：18)或EISPGSGSTNYNEEFKG(SEQ ID NO：19)或YNNPYNAGTNYNEKFKG(SEQ ID NO：101)或EINPGSGSTIYNEKFKG(SEQ ID NO：110)，其中N為任何胺基酸(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2或嵌合3F12/人化3F12.v5，或人化2C8.vX，或人化3F12.v14)；及(f)CDR－H3序列，其包含胺基酸F1－F9，其中F1－F9為PTMLPWFAY(SEQ ID NO：20)；或包含胺基酸F1－F5，其中F1－F5為GYHGY(SEQ ID NO：21)或GYHGA(SEQ ID NO：22)(分別為嵌合2C8/人化2C8.v2/人化2C8.vX或嵌合3F12/人化3F12.v5/人化3F12.v14或3F12純系12)。
在一較佳實施例中，SEQ ID NO：3為KSSQSLLYSTAQKNFLA(SEQ ID NO：5)(3F12純系15)。在另一較佳實施例中，SEQ ID NO：11為QESYSTPWT(SEQ ID NO：10)(2C8純系A8/人化2C8.vX)或QEVYSTPWT(SEQ ID NO：12)(2C8純系H6)。
在另一較佳實施例中，CDR－L1序列為SEQ ID NO：2或3或4或6。
在另一較佳態樣中，抗體包含(i)所有SEQ ID NO：1或2及7及9，或SEQ ID NO：1或2及7或8及11，或SEQ ID NO：3、8及13，或SEQ ID NO：4、5或6、8及13，或SEQ ID NO：3、8及14或15，或SEQ ID NO：4、5或6、8及14或15之CDR－L1至CDR－L3胺基酸序列；或(ii)所有SEQ ID NO：16、18及20，或所有SEQ ID NO：16、101及20，或所有SEQ ID NO：17、19及21或22，或所有SEQ ID NO：17、110及21之CDR－H1至CDR－H3胺基酸序列。
在另一態樣中，抗體包含所有SEQ ID NO：1或2及7及9，或所有SEQ ID NO：16、18及20，或所有SEQ ID NO：16、101及20。在一替代實施例中，抗體包含所有SEQ ID NO：3、8及13，或所有SEQ ID NO：17、19及21或22。在一替代實施例中，抗體包含所有SEQ ID NO：4、8及14，或所有SEQ ID NO：17、110及21。在其他實施例中，抗體包含(i)所有SEQ ID NO：1或2、7及9，或SEQ ID NO：1或2及7或8及11，或SEQ ID NO：3、8及13，或SEQ ID NO：4、5或6、8及13，或SEQ ID NO：3、8及14或15，或SEQ ID NO：4、5或6、8及14或15之CDR－L1至CDR－L3胺基酸序列；或(ii)所有SEQ ID NO：16、18及20，或SEQ ID NO：16、101及20，或SEQ ID NO：17、19及21或22，或SEQ ID NO：17、110及21之CDR－H1至CDR－H3胺基酸序列。
一較佳態樣為抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：23或24之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：25或26之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：23及25兩者或包含SEQ ID NO：24及26兩者之輕鏈及重鏈可變域。其他較佳者為抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：27或28之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：29、30或31之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：27及29兩者，或包含SEQ ID NO：27及30兩者，或包含SEQ ID NO：27及31兩者，或包含SEQ ID NO：28及30兩者，或包含SEQ ID NO：28及31兩者之輕鏈及重鏈可變域。在又一態樣中，本發明提供一種抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：102之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：103之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：102及103兩者之輕鏈及重鏈可變域。在又一態樣中，本發明提供一種抗LTα抗體，其具有包含SEQ ID NO：108之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：109之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：108及109兩者之輕鏈及重鏈可變域。
在其他實施例中，抗體包含人類亞群I一致構架序列，且/或其包含重鏈人類亞群III一致構架序列，其中該構架序列較佳於位置71、73及/或78處包含取代。該等取代較佳為R71A、N73T及/或N78A，或其任何組合，最佳為所有三者。
本發明之抗體較佳與LTα3結合且阻斷LTα3與TNFRI及TNFRII之相互作用。較佳地，其亦與LTαβ複合物結合且尤其於細胞表面上結合。較佳地，其亦阻斷LTαβ功能，且/或較佳含有Fc區，且/或在活體外膠原蛋白誘導性關節炎檢定或活體外抗體誘導性關節炎檢定中降低與RA相關之發炎細胞因子的含量。
其他較佳抗體阻斷LTαβ與LTβ－R之相互作用且/或調節LTαβ表現細胞。在其他實施例中，本文中之抗LTα抗體大體上中和至少一種LTα蛋白之至少一種活性。較佳地，本文中之抗體靶向任何表現LTα之細胞，且較佳消減LTα陽性細胞或LTα分泌細胞。
本文中之較佳抗體以至少約10－12 M、更佳至少約10－13 M之親和力結合LTα。抗體亦較佳具有IgG同型，諸如IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3，更佳為人類IgG，且最佳為IgG1或IgG2a。
另一較佳抗體對人類LTα具有單價親和力，其大致與由以美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)寄存編號PTA－7538寄存之融合瘤細胞株(融合瘤鼠類淋巴毒素α2β1 s5H3.2.2)產生之鼠類抗體對人類LTα之單價親和力相同或大於後者。
如此項技術中所充分確定，配位體對其受體之結合親和力可使用各種檢定中之任一者測定，且以各種數值表示。因此，在一實施例中，結合親和力係表示為Kd值且反映固有結合親和力(例如，最小化親合力效應)。無論用無細胞或細胞相關設置，通常且較佳在活體外量測結合親和力。結合親和力之倍數差異可根據人化抗體(例如呈Fab形式)之單價結合親和力值與參照/比較抗體(例如呈Fab形式)(例如具有供體CDR序列之鼠類抗體)之單價結合親和力值的比率來定量，其中結合親和力值係根據類似檢定條件測定。
因此，在一實施例中，結合親和力之倍數差異係以呈Fab形式之人化抗體之Kd值與該參照/比較Fab抗體之Kd值的比率求出。舉例而言，在一實施例中，若本發明之抗體(A)具有比參照抗體(M)之親和力"低三倍"的親和力，則若A之Kd值為3×，則M之Kd值將為1×，且A之Kd與M之Kd的比率將為3：1。相反，在一實施例中，若本發明之抗體(C)具有比參照抗體(R)之親和力"高三倍"的親和力，則若C之Kd值為1×，則R之Kd值將為3×，且C之Kd與R之Kd的比率將為1：3。此項技術中已知包括本文中所述之彼等者的任何檢定可用於獲得結合親和力量測，包括(例如)使用SPR(BIACORE技術)之光生物感測器、RIA及ELISA。較佳地，該量測係藉由光生物感測器或放射免疫檢定進行。
本文中之抗體較佳為嵌合或人化抗體，更佳為人化抗體，且更佳為如下抗體：其構架序列之至少一部分為人類一致構架序列。
本文中之另一實施例為一種特異性結合本文中之抗體的抗個體基因型抗體。
單株抗體單株抗體可使用由Kohler等人，Nature, 256：495(1975)最先描述之融合瘤方法製造，或可藉由重組DNA方法(US 4,816,567)製造。
在融合瘤方法中，如上文所述使小鼠或其他適當宿主動物(諸如倉鼠)免疫以引出產生或能夠產生將特異性地與用於免疫之蛋白結合之抗體的淋巴細胞。或者，可在活體外使淋巴細胞免疫。免疫後，將淋巴細胞分離且接著使用合適之融合劑(諸如聚乙二醇)與骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第 59－103頁(Academic Press,1986))。
將由此製備之融合瘤細胞接種且生長於合適之培養基中，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞(亦稱為融合搭配物)之生長或存活的物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之選擇性培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止HGPRT缺乏細胞之生長。
較佳融合搭配物骨髓瘤細胞為有效融合、支持由所選抗體產生細胞穩定高量產生抗體及對針對未融合親本細胞選擇之選擇性培養基敏感的彼等細胞。較佳骨髓瘤細胞株為鼠類骨髓瘤株，諸如源自可得自索爾克細胞分布研究中心(Salk Institute Cell Distribution Center)(San Diego,California USA)之MOPC－21及MPC－11小鼠腫瘤的彼等者，及SP－2及衍生物，例如可得自美國菌種保藏中心(Rockville,Maryland USA)之X63－Ag8－653細胞。人類骨髓瘤及小鼠人類雜骨髓瘤細胞株亦已被描述用於產生人類單株抗體(Kozbor,J.Immunol., 133：3001(1984)；及Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51－63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
對融合瘤細胞所生長之培養基檢定針對抗原之單株抗體的產生。較佳地，由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性係藉由免疫沈澱法或藉由活體外結合檢定(諸如RIA或ELISA)測定。
單株抗體之結合親和力可例如藉由Munson等人，Anal.Biochem., 107：220(1980)中所述之 斯凱洽德(Scatchard)分析測定。
產生所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞經鑑別後，可藉由限制稀釋程序次選殖純系且藉由標準方法使其生長(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第 59－103頁(Academic Press,1986))。用於此目的之合適培養基包括(例如)D－MEM或RPMI－1640培養基。另外，可如動物體內之腹水腫瘤使融合瘤細胞在活體內生長，例如藉由將細胞經腹膜內注射至小鼠中。
藉由諸如親和層析法(例如使用蛋白A或蛋白G－SEPHAROSETM 培養基)或離子交換層析、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、滲析等之習知抗體純化程序將由次選殖分泌之單株抗體適當地自培養基、腹水流體或血清分離。
易於將編碼單株抗體之DNA分離且使用習知程序(例如，藉由使用能夠與編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)測序。融合瘤細胞充當該DNA之較佳來源。分離後，DNA可置於表現載體中，接著將其轉染至諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞之並不另外產生抗體蛋白之宿主細胞中，以在重組宿主細胞中獲得單株抗體之合成。關於編碼抗體之DNA在細菌中之重組表現的評述文章包括Skerra等人，Curr.Opinion in Immunol., 5：256－262(1993)及Plckthun,Immunol.Revs., 130：151－188(1992)。
在另一實施例中，單株抗體或抗體片段可自使用McCafferty等人，Nature, 348：552－554(1990)中所述之技術產生的抗體噬菌體庫分離。Clackson等人，Nature, 352：624－628(199l)及Marks等人，J.Mol Biol., 222：581－597(1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。隨後之公開案描述藉由鏈改組(Marks等人，Bio/Technology, 10：779－783(1992))以及作為用於建構極大噬菌體庫之策略的組合感染及活體內再結合(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res., 21：2265－2266(1993))產生高親和力(nM範圍)人類抗體。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術的可行替代者。
編碼抗體之DNA可經修飾以產生嵌合或融合抗體多肽，例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域(CH 及CL )序列取代同源鼠類序列(US 4,816,567及Morrison，等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA, 81：6851(1984))，或藉由將免疫球蛋白編碼測序與非免疫球蛋白多肽(異源性多肽)之編碼序列的全部或一部分融合來修飾。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗體之恆定域，或用其取代抗體之一個抗原結合位點的可變域以產生嵌合二價抗體，其包含一個對抗原具有特異性之抗原結合位點及另一個對不同抗原具有特異性之抗原結合位點。
人化抗體本發明涵蓋人化抗體。用於人化非人類抗體之各種方法在此項技術中係已知的。舉例而言，人化抗體可具有一或多個自非人類來源引入之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常常被稱為"引入"殘基，其通常取自"引入"可變域。人化可基本上按照Winter及同事之方法(Jones等人Nature 321：522－525(1986)；Riechmann等人Nature 332：323－327(1988)；Verhoeyen等人Science 239：1534－1536(1988))藉由用CDR序列取代人類抗體之相應序列來執行。因此，該等"人化"抗體為嵌合抗體(US 4,816,567)，其中大體上小於完整人類可變域已經非人類物種之相應序列取代。實際上，人化抗體通常為如下人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自齧齒類抗體中之類似位點的殘基取代。
用於製造人化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈)之選擇對於降低抗原性極為重要。根據所謂"最佳擬合"方法，針對已知人類可變域序列之整個庫篩選齧齒類抗體之可變域的序列。接著將最接近齧齒類之序列的人類序列視作人化抗體之人類構架(Sims等人，J.Immunol. 151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol. 196：901(1987))。另一種方法使用源自所有人類抗體之輕鏈或重鏈之特定亞群之一致序列的特定構架。相同構架可用於若干種不同人化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89：4285(1992)；Presta等人J.Immunol., 151：2623(1993))。
更重要的為使抗體人化且保持對抗原之高親和力及其他有利生物學特性。為達成此目標，根據一種方法，藉由使用親本及人化序列之三維模型分析親本序列及各種概念性人化產物之方法來製備人化抗體。三維免疫球蛋白模型係市售的且為熟習此項技術者所熟悉。可使用說明及展現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。此等展現之檢查允許分析候選免疫球蛋白序列之功能中殘基的可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自受體及引入序列選擇FR殘基且加以組合以便達成所需抗體特徵，諸如對靶抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最大體上地涉及影響抗原結合。
人化抗體可為抗體片段，諸如Fab，其視情況與一或多種細胞毒性劑結合以產生免疫結合物。或者，人化抗體可為全長抗體，諸如全長IgG1抗體。
人類抗體及噬菌體呈現方法可產生人類抗體以替代人化。舉例而言，現在可能產生在免疫後能夠在不產生內因性免疫球蛋白情況下產生完整人類抗體譜的轉殖基因動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變體小鼠中之抗體重鏈接合區(JH )基因的純合缺失導致內因性抗體產生之完全抑制。人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該等生殖系突變體小鼠中將導致在抗原激發後產生人類抗體。參見例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature, 362：255－258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno., 7：33(1993)；US 5,545,806、5,569,825、5,591,669(均為GenPharm所有)；及5,545,807及WO 1997/17852。
或者，噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature 348：552－553(1990))可用於在活體外自未經免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，將抗體V域基因框內選殖至絲狀噬菌體之主要或次要外殼蛋白基因(諸如M13或fd)中，且於噬菌體粒子之表面上呈現為功能性抗體片段。因為絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股DNA複本，所以基於抗體之功能特性的選擇亦導致選擇編碼展現彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬LTα細胞之一些特性。噬菌體呈現可以例如Johnson及Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3：564－571(1993)中所評述之各種形式執行。若干種來源之V基因區段可用於噬菌體呈現。Clackson等人，Nature,352：624－628(1991)自源自經免疫小鼠之脾之V基因小隨機組合庫分離不同抗噁唑酮抗體組。可建構未經免疫人類供體之V基因譜且不同抗原(包括自體抗原)組之抗體可基本上按照Marks等人，J.Mol.Biol. 222：581－597(1991)或Griffith等人，EMBO J. 12：725－734(1993)所述之技術來分離。亦參見US 5,565,332及5,573,905。
如上文所討論，人類抗體亦可由活體外活化之B細胞產生(參見US 5,567,610及5,229,275)。
抗體片段在特定情況下，存在使用抗體片段而非完整抗體之優點。片段之較小尺寸允許快速清除率，且可導致更易接近實體腫瘤。
已開發各種技術用於產生抗體片段。傳統上，此等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化而得到(參見例如，Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107－117(1992)及Brennan等人，Science, 229：81(1985))。然而，此等片段現在可直接藉由重組宿主細胞產生。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可在大腸桿菌中表現且自其分泌，由此使得容易產生大量此等片段。抗體片段可自上文所論述之抗體噬菌體庫分離。或者，Fab'－SH片段可直接自大腸桿菌回收且化學偶合以形成F(ab')2 片段(Carter等人，Bio/Technology 10：163－167(1992))。根據另一種方法，F(ab')2 片段可直接自重組宿主細胞培養物分離。活體內半衰期增加之包含補救受體結合抗原決定基殘基的Fab及F(ab')2 片段係描述於美國專利第5,869,046號中。其他用於產生抗體片段之技術對於熟練從業者將顯而易見。在其他實施例中，所選之抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見例如，WO 1993/16185；U.S.5,571,894；及U.S.5,587,458。Fv及sFv為具有完整結合位點但缺少恆定區之唯一種類；因此，其適合於在活體內使用期間降低之非特異性結合。可建構sFv融合蛋白以產生效應蛋白在sFv之胺基或羧基末端的融合。舉例而言，抗體片段亦可為(例如)U.S.5,641,870中所述之"線性抗體"。該等線性抗體片段可具單特異性或雙特異性。
雙特異性抗體雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。例示性雙特異性抗體可與LTα蛋白之兩個不同抗原決定基結合。其他該等抗體可組合LTα結合位點與另一蛋白之結合位點。或者，抗LTα臂可與結合白血球上諸如T細胞受體分子(例如CD3)之誘發分子，或諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之IgG的Fc受體(FcγR)，或NKG2D或其他NK細胞活化配位體的臂組合，以便針對LTα表現細胞集中及定位細胞防禦機構。雙特異性抗體亦可用於針對表現LTα之細胞定位細胞毒性劑。此等抗體具有LTα結合臂及結合細胞毒性劑(例如，肥皂草素(saporin)、抗干擾素－α、長春花生物鹼、篦麻毒素(ricin)A鏈、甲胺喋呤或放射性同位素半抗原)之臂。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如，F(ab')2 雙特異性抗體)。
WO 1996/16673描述一種雙特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗體且US 5,837,234揭示一種雙特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗體。雙特異性抗ErbB2/Fca抗體係展示於WO 1998/02463中。US 5,821,337教示一種雙特異性抗ErbB2/抗CD3抗體。
用於製造雙特異性抗體之方法在此項技術中係已知的。全長雙特異性抗體之傳統製造係基於兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對共表現，其中該兩個鏈具有不同特異性(Millstein等人，Nature, 305：537－539(1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈隨機分配，因此此等融合瘤(四源雜交瘤)產生十種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確雙特異性結構。通常藉由親和層析法步驟進行之正確分子之純化相當繁重，且產物產率較低。類似程序係揭示於WO 1993/08829，及Traunecker等人，EMBO J., 10：3655－3659(1991)中。
根據不同方法，將具有所需結合特異性(抗體抗原結合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳地，與包含鉸鏈、CH 2及CH 3區之至少一部分的Ig重鏈恆定域融合。較佳使含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH 1)存在於融合物之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(需要時)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入獨立表現載體中，且共轉染至合適之宿主細胞中。此提供調節實施例中三個多肽片段之相互比例的較高靈活性，屆時不等比率之用於構築之三個多肽鏈提供所需雙特異性抗體之最佳產率。然而，有可能將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列插入單一表現載體中，屆時相等比率之至少兩個多肽鏈的表現導致高產率或屆時該等比率對所需鏈組合之產率無顯著影響。
在此方法之一較佳實施例中，雙特異性抗體係由在一個臂中具有第一結合特異性之混合免疫球蛋白重鏈及在另一臂中之混合免疫球蛋白重鏈/輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。發現此不對稱結構有助於所需雙特異性化合物與不需要之免疫球蛋白鏈組合分離，因為免疫球蛋白輕鏈存在於僅一半雙特異性分子中提供容易分離之方式。此方法係揭示於WO 1994/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他詳細情形，請參見例如，Suresh等人，Methods in Enzymology, 121：210(1986)。
在另一方法(US 5,731,168)中，抗體分子對之間的界面可經工程化以最大化自重組細胞培養物回收之異質二聚體的百分比。較佳界面包含CH 3域之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子之界面的一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)置換。藉由用較小胺基酸側鏈(例如，丙胺酸或蘇胺酸)置換較大胺基酸側鏈而於第二抗體分子之界面上產生與大側鏈相同或類似尺寸之補償性"空穴"。此提供一種用於增加異質二聚體之產率超過其他不需要之終產物(諸如同質二聚體)的機制。
雙特異性抗體包括交聯或"異質結合物"抗體。舉例而言，異質結合物中抗體中之一者可與抗生物素蛋白偶合，另一者可與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使免疫系統細胞靶向不需要之細胞(US 4,676,980)，且用於治療HIV感染(WO 1991/00360、WO 1992/20373及EP 03089)。異質結合物抗體可使用任何便利交聯方法製造。合適之交聯劑在此項技術中眾所周知，且與許多交聯技術一起揭示於例如US 4,676,980中。
用於自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言，雙特異性抗體可使用化學鍵聯製備。Brennan等人，Science, 229：81(1985)描述一種將完整抗體蛋白分解裂解以產生F(ab')2 片段之程序。在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下將此等片段還原以穩定鄰近二硫醇且阻止分子間二硫化物形成。接著將所產生之Fab'片段轉化為硫硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著藉由用巰基乙胺還原將Fab'－TNB衍生物之一者再轉化為Fab'－硫醇且與等莫耳量之另一Fab'－TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作選擇性固定酶之藥劑。
最新發展有助於自大腸桿菌直接回收Fab'－SH，其可經化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby等人，J.Exp.Med., 175：217－225(1992)描述完全人化雙特異性抗體F(ab')2 分子之產生。每一Fab'片段自大腸桿菌單獨分泌且使其經受活體外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。由此形成之雙特異性抗體能夠與過表現ErbB2受體之細胞及正常人類T細胞結合，且誘發人類細胞毒性淋巴細胞針對人類乳腺腫瘤靶之溶解活性。
亦已描述用於直接自重組細胞培養物製造及分離雙特異性抗體片段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人，J.Immunol., 148(5)：1547－1553(1992)。藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接於兩個不同抗體之Fab'部分。於鉸鏈區還原抗體同質二聚體以形成單體且接著再氧化以形成抗體異質二聚體。此方法亦可用於產生抗體同質二聚體。由Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90：6444－6448(1993)描述之"雙功能抗體"技術已提供一種用於製造雙特異性抗體片段之替代性機制。該等片段包含藉由過短而使得同一鏈上之兩個域間無法配對的連接子連接於VL 之VH 。因此，迫使一個片段之VH 及VL 域與另一片段之互補VL 及VH 域配對，由此形成兩個抗原結合位點。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體製造雙特異性抗體片段之策略。參見Gruber等人，J.Immunol., 152：5368(1994)。
本發明涵蓋大於二價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt等人，J.Immunol. 147：60(1991)。
多價抗體多價抗體可藉由表現抗體所結合之抗原的細胞快於二價抗體內在化(及/或異化)。本發明之抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體(其並非IgM種類)(例如，四價抗體)，其可易於藉由重組表現編碼抗體之多肽鏈之核酸產生。該多價抗體可包含二聚域及三個或三個以上抗原結合位點。較佳二聚域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情況下，抗體將包含Fc區及位於該Fc區之胺基末端的三個或三個以上抗原結合位點。本文中之較佳多價抗體包含三至約八個，但較佳四個抗原結合位點(或由其組成)。多價抗體包含至少一個多肽鏈(且較佳兩個多肽鏈)，其中該(等)多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1－(X1)n －VD2－(X2)n －Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第二可變域，Fc為Fc區之一個多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH－CH1－可撓性連接子－VH－CH1－Fc區鏈；或VH－CH1－VH－CH1－Fc區鏈。本文中之多價抗體較佳進一步包含至少兩個(且較佳四個)輕鏈可變域多肽。本文中之多價抗體可(例如)包含約兩至約八個輕鏈可變域多肽。本文中所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視情況進一步包含CL域。
載體、宿主細胞及重組方法
宿主細胞之選擇及轉型用於選殖或表現本文中所述之重組單株抗體、免疫黏附素及其他多肽拮抗劑之合適宿主細胞為原核生物、酵母或較高級真核細胞。用於此目的之合適原核生物包括真細菌類，諸如革蘭氏陰性(Gram－negative)或格蘭氏陽性(Gram－positive)生物，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia )，例如大腸桿菌)；腸桿菌屬(Enterobacter )；伊文氏桿菌屬(Erwinia )；克雷伯氏菌(Klebsiella )；變形桿菌屬(Proteus )；沙門氏菌屬(Salmonella )，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium )；沙雷氏菌屬(Serratia )，例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )；及志賀桿菌屬(Shigella )；以及芽孢桿菌屬(Bacilli )，諸如枯草桿菌(B.subtilis )及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis )(例如1989年4月12日公開之DD 266,710中所揭示之地衣芽孢桿菌41P)；假單胞菌屬(Pseudomonas )，諸如綠膿桿菌(P.aeruginosa )；及鏈黴菌屬(Streptomyces )。一種較佳大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294(ATCC 31,446)，不過諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)之其他菌株亦為合適的。此等實例為說明性的而非限制性的。
全長抗體、抗體片段及抗體融合蛋白可在細菌中產生，尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時，諸如當治療性抗體與細胞毒性劑(例如毒素)結合且免疫結合物獨立顯示對於腫瘤細胞破壞之有效性時。全長抗體在循環中具有較高半衰期。大腸桿菌中之產生更快且更具成本效率。對於抗體片段及多肽於細菌中之表現，參見例如，US 5,648,237；5,789,199；及5,840,523，其描述用於最優化表現及分泌之轉譯起始區(TIR)及信號序列。表現後，自大腸桿菌細胞糊狀物分離抗體於可溶部分中且可經由(例如)蛋白A或G管柱將其純化，此視同型而定。可類似於用於純化表現於(例如)CHO細胞中之抗體的方法進行最後純化。對於通用單株抗體製造，亦參見US 7,011,974。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用於抗體編碼(諸如LTα抗體編碼)載體之合適選殖或表現宿主。在低等真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母或常見麵包酵母(baker's yeast)。然而，許多其他屬、種類及菌株通常係可用的且適用於本文中，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；刻魯維拉菌屬(Kluyveromyces )宿主，諸如乳酸刻魯維拉菌(K.lactis )、脆壁刻魯維拉菌(K.fragilis )(ATCC 12,424)、保加利亞刻魯維拉菌(K.bulgaricus )(ATCC 16,045)、威克刻魯維拉菌(K.wickeramii )(ATCC 24,178)、華特刻魯維拉菌(K.waltii )(ATCC 56,500)、果蠅刻魯維拉菌(K.drosophilarum )(ATCC 36,906)、耐熱刻魯維拉菌(K.thermotolerans )及馬克斯刻魯維拉菌(K.marxianus )；耶氏酵母屬(yarrowia )(EP 402,226)；甲醇酵母(Pichia pastoris )(EP 183,070)；念珠菌屬(Candida )；裏氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244,234)；粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa) ；許旺酵母屬(Schwanniomyces )，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，諸如紅黴屬(Neurospora )、青黴菌屬(Penicillium )、彎頸黴菌屬(Tolypocladium )及麴菌屬(Aspergillus )宿主，諸如構巢麴菌(A.nidulans )及黑麴菌(A.niger )。
用於表現(例如)糖基化LTα結合抗體之合適宿主細胞係源自多細胞生物。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多桿狀病毒菌株及變異體以及來自諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )之相應受納昆蟲宿主細胞。用於轉染之各種病毒株可公開得到，例如，苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica )NPV之L－1變異體及家蠶NPV之Bm－5菌株，且該等病毒可根據本發明用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及煙草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
然而，無脊椎動物細胞最受關注，且於培養基中繁殖脊椎動物細胞(組織培養)已變成常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴子腎CV1株(COS－7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎株(例如，經次選殖生長於懸浮培養基中之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol. 36：59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK，例如ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/－DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))，包括(但不限於)CHO K1、CHO pro3－ 、CHO DG44、CHO DUXB11、Lec13、B－Ly1及CHO DP12細胞，較佳為CHO DUX(DHFR－)或其次純系(本文中稱為"CHO DUX")；C127細胞、小鼠L細胞；Ltk－ 細胞；小鼠塞特利氏細胞(Sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod. 23：243－251(1980))；猴子腎細胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO－76，ATCC CRL－1587)；人類宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠骨髓瘤細胞；NS0；融合瘤細胞，諸如小鼠融合瘤細胞；COS細胞；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci. 383：44－68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌細胞株(Hep G2)。
用用以產生本文中之LTα結合抗體的表現或選殖載體來使宿主細胞轉型，且培養於視誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因酌情改良的習知營養培養基中。
培養宿主細胞用於產生本發明之抗體之宿主細胞可培養於各種培養基中。諸如Ham氏F10(Sigma)、最低必需培養基(Minimal Essential Medium，MEM)(Sigma)、RPMI－1640(Sigma)及達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(Sigma)之市售培養基適合於培養宿主細胞。另外，Ham等人，Meth.Enz. 58：44(1979)、Barnes等人，Anal.Biochem. 102：255(1980)、US 4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 1990/03430；WO 1987/00195；或US Re.30,985中所述之培養基中之任一者可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者可按需要用以下各物補充：激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、痕量元素(經定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。任何其他必要補充亦可以熟習此項技術者將已知之適當濃度包括在內。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為先前用於經選擇以供表現之宿主細胞的彼等條件，且對於一般熟習者將顯而易見。
在一特定態樣中，合適之培養基含有基礎培養基組份，諸如基於DMEM/HAM F－12之調配物(對於DMEM與HAM F12培養基且尤其無血清培養基之組合物，參見美國菌種保藏中心細胞株及融合瘤目錄，第六版，1988，第346－349頁中之培養基調配物)(如US 5,122,469中所述之培養基調配物可為適當的)，其具有濃度經適當修改(必要時)之一些組份，諸如胺基酸、鹽、糖及維生素，且視情況含有甘胺酸、次黃嘌呤及胸苷；重組人類胰島素、水解蛋白腖，諸如PROTEASE PEPTONE 2及3TM 、PRIMATONE HSTM 或PRIMATONE RLTM (Difco,USA；Sheffield,England)或等效物；細胞保護劑，諸如PLURONIC F68TM 或等效物PLURONICTM 多元醇；GENTAMYCINTM 抗生素；及痕量元素。細胞培養基較佳無血清。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵方法大批量進行抗體製造。各種大規模補料分批醱酵程序可用於產生重組蛋白。大規模醱酵具有至少約1000公升之生產力，較佳約1,000至100,000公升之生產力。此等醱酵罐使用攪拌器葉輪以分散氧及營養物，尤其葡萄糖(較佳碳/能源)。小規模醱酵通常係指在至多約100公升容量之醱酵罐中醱酵，且可在約1公升至約100公升範圍內變化。
在醱酵過程中，蛋白質表現之誘導通常係在細胞在合適條件下生長至所需密度(例如約180－220之OD550 )(在該階段細胞處於早期靜止期)後開始。如此項技術中所已知且上文所述，根據所利用之載體構築體，可使用各種誘導物。可在誘導之前使細胞生長較短時間。通常將細胞誘導約12－50小時，不過可使用更長或更短誘導時間。
為改良本發明之多肽之產率及品質，可改良各種醱酵條件。舉例而言，為改善所分泌抗體多肽之適當組裝及摺疊，可使用其他過表現諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨活性之肽基脯胺醯順反異構酶)之伴隨蛋白的載體使宿主原核細胞共轉型。已證明伴隨蛋白有助於細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白的適當摺疊及溶解性。Chen等人，J Bio Chem 274：19601－19605(1999)；US 6,083,715及6,027,888；Bothmann及Pluckthun,J.Biol.Chem. 275：17100－17105(2000)；Ramm及Pluckthun,J.Biol.Chem. 275：17106－17113(2000)；及Arie等人，Mol.Microbiol. 39：199－210(2001)。
為最小化所表現異源蛋白(尤其蛋白分解敏感之彼等者)之蛋白水解作用，缺乏蛋白水解酶之特定宿主菌株可用於本發明。舉例而言，宿主細胞菌株可經改良以實現編碼已知細菌蛋白酶之基因的遺傳突變，該等細菌蛋白酶諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。一些大腸桿菌蛋白酶缺乏菌株係可用的且描述於(例如)US 5,264,365；5,508,192；及Hara等人，Microbial Drug Resistance, 2：63－72(1996)中。
在一實施例中，將缺乏蛋白水解酶且用過表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型之大腸桿菌菌株在本文中之表現系統中用作宿主細胞。
抗體之純化當使用重組技術時，抗體可產生於細胞內，或直接分泌至培養基中。若抗體產生於細胞內，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾來移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。當抗體分泌至培養基中，通常首先使用市售蛋白質濃度過濾器(例如AMICONTM 或MILLIPORE PELLICONTM 超濾裝置)濃縮來自該等表現系統之上清液。諸如苯基甲基磺醯氟(PMSF)之蛋白酶抑制劑可包括在上述步驟之任一者中以抑制蛋白水解，且抗生素可包括在內以防止不定污染物之生長。
在一實施例中，將本文中產生之抗體蛋白進一步純化以獲得大體上同質以供進一步檢定及使用之製劑。可利用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序例示合適之純化程序：羥磷灰石層析法、肝素SEPHAROSETM 層析法、凝膠電泳、透析、免疫親和管柱溶離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析法、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如DEAE或聚天冬胺酸管柱)層析法、層析聚焦、SDS－PAGE、硫酸銨沈澱及使用(例如)SEPHADEXTM G－75樹脂之凝膠過濾。親和層析法為較佳純化技術。對於分析規模純化而言，使較少體積通過管柱且加以使用；對於用以產生大量適用於治療性應用之抗體的製備或商業規模純化而言，利用較大體積。熟習此項技術者應瞭解何種規模應用於何種應用。較佳地，本發明利用製備規模。
蛋白A作為親和力配位體之適合性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的種類及同型而定。蛋白A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，J.Immunol.Meth. 62：1－13(1983))。推薦蛋白G用於所有小鼠同型及用於人類γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575(1986))。親和力配位體所連接之基質最常為瓊脂糖，但其他基質係可用的。諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械性穩定基質允許比可用瓊脂糖所達成更快的流速及更短的處理時間。當抗體包含CH 3域時，BAKERBOND ABXTM 樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。
對於蛋白A層析法而言，使蛋白A固定之固相較佳為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，更佳為受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，該管柱已塗有諸如丙三醇之試劑以防止污染物之非特異性黏著。接著洗滌該固相以移除與固相非特異性結合之污染物。最後，藉由溶離自固相回收所關注之抗體。
在任何初步純化步驟後，可使包含所關注抗體及污染物之混合物經受低pH值疏水性相互作用層析法，其使用pH值介於約2.5－4.5之間的溶離緩衝液，較佳於低鹽濃度(例如約0至0.25 M鹽)下執行。
產生展現HAMA反應降低或無HAMA反應之變異抗體
HAMA反應之降低或消除係合適治療劑之臨床進展的顯著態樣。參見例如，Khaxzaeli等人，J.Natl.Cancer Inst., 80：937(1988)；Jaffers等人，Transplantation, 41：572(1986)；Shawler等人，J.Immunol., 135：1530(1985)；Sears等人，J.Biol.Response Mod, 3：138(1984)；Miller等人，Blood, 62：988(1983)；Hakimi等人，J.Immunol., 147：1352(1991)；Reichmann等人，Nature, 332：323(1988)；及Junghans等人，Cancer Res, 50：1495(1990)。在本文之一些實施例中，本發明提供經人化以便降低或消除HAMA反應之抗體。此等抗體之變異體可進一步使用此項技術中已知之常規方法獲得，其中一些進一步在下文描述。
舉例而言，如本文中所述之抗體的胺基酸序列可充當使構架及/或CDR序列多樣化之起始(親本)序列。起始CDR序列所連接之所選構架序列在本文中稱為受體人類構架。當該受體人類構架可來自或源自人類免疫球蛋白(其VL及/或VH區)時，較佳該受體人類構架來自或源自人類一致構架序列，此係已證明該等構架在人類患者體內具有最小免疫原性或無免疫原性。
當受體源自人類免疫球蛋白時，吾人可藉由比對供體構架序列與人類構架序列集合中之各種人類構架序列且選擇與受體最同源之構架序列而基於其與供體構架序列之同源性來視情況選擇人類構架序列。
在一實施例中，本文中之人類一致構架來自或源自VH亞群III及/或VL亞群I一致構架序列。
因此，VH受體人類構架可包含以下構架序列中之一者、兩者、三者或全部：FR1，包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：46)，FR2，包含WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：47)，FR3，包含RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：48)或RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD(SEQ ID NO：50)，及FR4，包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：49)。
因此，VL受體人類構架可包含以下構架序列中之一、兩、三者或全部：FR1，包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：51)，FR2，包含WYQQKPGKAPKLQIY(SEQ ID NO：52)或WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：55)，FR3，包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：53)，及FR4，包含FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：54)。
當受體之序列可與來自人類免疫球蛋白或人類一致構架之所選人類構架序列一致時，本發明涵蓋受體序列可包含相對於人類免疫球蛋白序列或人類一致構架序列而言預先存在之胺基酸取代。此等預先存在之取代較佳極小，通常相對於人類免疫球蛋白序列或一致構架序列僅四、三、兩或一個胺基酸差異。
將非人類抗體之CDR殘基併入VL及/或VH受體人類構架中。舉例而言，可合併對應於Kabat CDR殘基、Chothia高變環殘基、AbM殘基及/或接觸殘基之殘基。視情況，合併如下延長之CDR殘基：24－34(L1)、50－56(L2)及89－97(L3)、26－35(H1)、50－65或49－65(H2)及93－102、94－102或95－102(H3)。
CDR殘基之"合併"可以多種方式達成，例如可藉由使編碼小鼠可變域序列之核酸突變以便使其構架殘基變為受體人類構架殘基，或藉由使編碼人類可變域序列之核酸突變以便使CDR殘基變為非人類殘基，或藉由合成編碼所需序列之核酸等來產生編碼所需胺基酸序列之核酸。
CDR接枝變異體可藉由對於各CDR使用獨立寡核苷酸進行編碼人類受體序列之核酸的Kunkel突變誘發來產生。Kunkel等人，Methods Enzymol. 154：367－382(1987)。可使用常規技術將適當變化引入構架及/或CDR內以修正及重建適當CDR－抗原相互作用。
噬菌體(噬粒)呈現(本文中在一些情況下亦稱為噬菌體呈現)可用作一種用於產生及篩選藉由序列隨機化而產生之庫中之許多不同可能變異抗體的便利且快速之方法。然而，熟習此項技術者可使用其他用於製造及篩選經改變之抗體的方法。
噬菌體(噬粒)呈現技術提供一種用於產生及選擇與諸如抗原之配位體結合之新穎蛋白的有效工具。使用噬菌體(噬粒)呈現技術使得可產生能對於以高親和力與靶分子結合之彼等序列迅速分類之大的蛋白質變異體庫。編碼變異多肽之核酸通常與編碼病毒外殼蛋白(諸如基因III蛋白或基因VIII蛋白)之核酸序列融合。已開發單價噬粒顯示系統，其中編碼蛋白質或多肽之核酸序列與編碼基因III蛋白之一部分的核酸序列融合。(Bass,Proteins, 8：309(1990)；Lowman及Wells,Methods：A Companion to Methods in Enzymology, 3：205(1991))。在單價噬粒呈現系統中，低量表現基因融合且亦表現野生型基因III蛋白以便保留粒子之傳染性。產生肽庫且篩選彼等庫之方法已揭示於許多專利(例如，US 5,723,286；5,432,018；5,580,717；5,427,908；及5,498,530)中。
抗體庫已以許多方式製備，包括藉由插入隨機DNA序列改變單一基因或選殖相關基因家族來製備。使用噬菌體(噬粒)呈現來呈現抗體或抗原結合片段之方法係描述於US 5,750,373；5,733,743；5,837,242；5,969,108；6,172,197；5,580,717；及5,658,727中。接著針對具有所需特徵之抗體或抗原結合蛋白的表現篩選庫。
寡核苷酸之序列包括經設計用於欲改變之CDR殘基的密碼子組中之一或多者。密碼子組為一組用於編碼所需變異胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。密碼子組可使用根據IUB代碼表示特定核苷酸或如下文所示之核苷酸之等莫耳混合物的符號表示。
IUB代碼
G鳥嘌呤A腺嘌呤T胸腺嘧啶C胞嘧啶R(A或G)Y(C或T)M(A或C)K(G或T)S(C或G)W(A或T)H(A或C或T)B(C或G或T)V(A或C或G)D(A或G或T)H N(A或C或G或T)。
舉例而言，在密碼子組DVK中，D可為核苷酸A或G或T；V可為A或G或C；且K可為G或T。此密碼子組可提供18種不同密碼子且可編碼胺基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly及Cys。
寡核苷酸或引子組可使用標準方法合成。可例如藉由固體相合成合成一組寡核苷酸，其含有表示由密碼子組提供之核苷酸三聯體之全部可能組合且將編碼胺基酸之所需基團的序列。合成於特定位置處具有所選核苷酸"簡并"之寡核苷酸在此項技術中眾所周知。該等具有特定密碼子組之核苷酸組可使用商業核酸合成器(可得自例如Applied Biosystems,Foster City,CA)合成或可購得(例如，購自Life Technologies,Rockville,MD)。因此，經合成具有特定密碼子組之一組寡核苷酸通常將包括複數個具有不同序列之寡核苷酸，該等差異由整個序列內之密碼子組產生。如本文所使用之寡核苷酸具有允許與可變域核酸模板雜交之序列且亦可包括用於選殖目的之限制酶位點。
在一方法中，編碼變異胺基酸之核酸序列可由寡核苷酸介導突變誘發產生。如Zoller等人Nucleic Acids Res. 10：6487－6504(1987)所述，此技術在此項技術中眾所周知。簡言之，編碼變異胺基酸之核酸序列係藉由使編碼所需密碼子組之寡核苷酸組與DNA模板雜交來產生，其中該模板為含有可變區核酸模板序列之單股形式之質體。雜交後，使用DNA聚合酶合成模板之完整第二互補股，其將由此合併寡核苷酸引子，且將含有如由寡核苷酸組提供之密碼子組。
通常使用長度為至少25個核苷酸之寡核苷酸。最佳寡核苷酸將具有12至15個與模板在編碼突變之核苷酸之兩側完全互補的核苷酸。此舉確保寡核苷酸將與單股DNA模板分子適當地雜交。使用此項技術中已知之技術，諸如Crea等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA, 75：5765(1978)中之技術易於合成寡核苷酸。
DNA模板係由源自噬菌體M13載體(市售M13mp18及M13mp19載體為合適的)或如Viera等人，Meth.Enzymol., 153：3(1987)所述含有單股噬菌體複製起點之彼等載體產生。因此，可將欲突變之DNA插入此等載體之一者中以產生單股模板。單股模板之製造係描述於Sambrook等人，同上之第4.21－4.41節中。
為改變天然DNA序列，根據合適之雜交條件使寡核苷酸與單股模板雜交。接著添加例如T7 DNA聚合酶之DNA聚合酶或DNA聚合酶I之Klenow片段以使用寡核苷酸作為合成之引子來合成模板之互補股。由此形成異源雙鏈體分子以便使DNA之一股編碼基因1之突變形式，且另一股(原始模板)編碼天然、未改變之基因1序列。接著將此異源雙鏈體分子轉型至合適之宿主細胞中，通常為原核生物，諸如大腸桿菌JM101。使細胞生長後，將其塗於瓊脂糖平板上且使用經32 P磷酸鹽放射性標記之寡核苷酸引子篩選以鑑別含有突變DNA之細菌菌落。
上文直接描述之方法可經改良以便產生同源雙鏈體分子，其中質體之兩股含有突變。改良如下：使單股寡核苷酸與如上文所述之單股模板黏接。將三種脫氧核糖核苷酸，即脫氧核糖腺苷(dATP)、脫氧核糖鳥苷(dGTP)及脫氧核糖胸苷(dTT)之混合物與稱為dCTP－(aS)之經修飾硫代脫氧核糖胞嘧啶(其可自Amersham獲得)組合。將此混合物添加至模板寡核苷酸複合物中。將DNA聚合酶添加至此混合物中後，產生除突變鹼基外與模板一致之DNA的一股。另外，DNA之此新股將含有dCTP－(aS)而非dCTP，dCTP－(aS)用以受保護其免於限制性核酸內切酶消化。用適當限制酶缺刻雙股異源雙鏈體之模板股後，可用ExoIII核酸酶或另一通過含有欲誘變處理之位點之區的適當核酸酶消化模板股。接著停止反應以留下僅部分為單股之分子。接著使用DNA聚合酶，在所有四種脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽、ATP及DNA連接酶存在下形成完整雙股DNA同源雙鏈體。接著可將比同源雙鏈體分子轉型至合適之宿主細胞中。
如先前所指出，寡核苷酸組之序列具有足以與模板核酸雜交之長度，且亦可(但並非必定)含有限制性位點。DNA模板可由源自噬菌體M13載體或為如Viera等人Meth.Enzymol., 153：3(1987)所述含有單股噬菌體複製起點之載體的彼等載體產生。因此，必須將欲突變之DNA插入此等載體之一者中以產生單股模板。單股模板之製造係描述於Sambrook等人，同上之第4.21－4.41節中。
在另一方法中，可藉由提供上游及下游寡核苷酸組來產生庫，各組具有複數個具有不同序列之寡核苷酸。藉由寡核苷酸之序列內提供之密碼子組建立此等序列。上游及下游寡核苷酸組以及可變域模板核酸序列可用於聚合酶鏈反應(PCR)中以產生PCR產物之"庫"。PCR產物可稱為"核酸盒"，此係因為使用既定分子生物學技術可將其與其他相關或無關核酸序列(例如病毒外殼蛋白及二聚域)融合。
PCR引子之序列包括經設計用於CDR中之溶劑可接近及高度不同之位置的密碼子組中之一或多者。如上文所述，密碼子組為一組用於編碼所需變異胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。
可使用標準重組技術分離及選殖如經由適當篩選/選擇步驟所選之符合所需標準之抗體選擇物。
活性檢定
可藉由此項技術中已知之各種檢定來鑑定本發明之抗體的物理/化學特性及生物功能。
經純化之免疫球蛋白可進一步藉由一系列檢定表徵，該等檢定包括(但不限於)N末端測序、胺基酸分析、非變性尺寸排阻高壓液相層析(HPLC)、質譜分析法、離子交換層析及木瓜蛋白酶消化。
在本發明之特定實施例中，分析本文中所產生之抗體的生物活性。在一些實施例中，測試本文中之抗體的抗原結合活性。此項技術中已知且本文中適用之抗原結合檢定包括(但不限於)使用諸如以下技術之任何直接或競爭性結合檢定：西方墨點法(Western blots)、放射免疫檢定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定)、"夾心"免疫檢定、免疫沈澱法檢定、螢光免疫檢定及蛋白A免疫檢定。
在一實施例中，本發明涵蓋一種具有一些而非所有效應功能之經改變抗體，此使其成為許多應用之所需候選者，在該等應用中抗體活體內半衰期較為重要，而特定效應功能(諸如補體及ADCC)並非必需或為有害的。在特定實施例中，量測所產生之免疫球蛋白之Fc活性以確保僅保持所需特性。可進行活體外及/或活體內細胞毒性檢定以確認CDC及/或ADCC活性之降低/衰竭。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcγR結合(由此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn結合能力。介導ADCC之初級細胞，即NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上之FcR表現係概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457－92(1991)之第464頁上之表3中。用以評估所關注分子之ADCC活性之活體外檢定的一實例係描述於US 5,500,362或5,821,337中。適用於該等檢定之效應細胞包括PBMC及NK細胞。其他或另外，所關注分子之ADCC活性可在活體內評估，例如在諸如Clynes等人PNAS(USA) 95：652－656(1998)中所揭示之動物模型中。亦可進行C1q結合檢定以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。為評估補體活化，可執行CDC檢定，例如如Gazzano－Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述之檢定。亦可使用此項技術中已知之方法執行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定。
抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋本文中所述之抗體之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體係藉由將適當核苷酸變化引入抗體核酸中或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代中之任何組合以得到最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。可在製造序列時將胺基酸變化引入個體抗體胺基酸序列中。
一種鑑別抗體之為突變誘發之較佳位置的特定殘基或區之適用方法係稱為"丙胺酸掃描突變誘發"，如Cunningham及Wells,Science, 244：1081－1085(1989)所述。此處，鑑別一殘基或一組靶殘基(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且由中性或帶負電胺基酸(最佳為丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。接著藉由在取代位點處或為取代位點引入另外或其他變異來改良顯示對取代具功能敏感性之彼等胺基酸位置。因此，當預先確定引入胺基酸序列變異之位點時，不必預先確定突變自身之性質。舉例而言，為分析特定位點處之突變的效能，於靶密碼子或區進行ala掃描或隨機突變誘發且針對所需活性篩選所表現之免疫球蛋白。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體或與細胞毒性多肽融合之抗體。抗體分子之其他插入性變異體包括抗體之N或C末端與酶(例如對於ADEPT而言)或多肽(增加抗體之血清半衰期)之融合。
另一類型之變異體為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個由不同殘基置換之胺基酸殘基。對於取代性突變誘發而言，最關注之位點包括CDR，但亦涵蓋FR變化。保守取代係在表A中之"較佳取代"標題下展示。若該等取代導致生物活性之變化，則可引入表A中稱為"例示性取代"或如下文進一步關於胺基酸種類所述之更多實質變化且篩選產物。
藉由選擇取代來完成抗體之生物學特性的實質變化，該等取代在其對保持以下特徵之效應方面顯著不同：(a)在取代之區域內多肽主鏈之結構，例如呈摺疊或螺旋構形；(b)在靶位點處分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈之堆積密度。胺基酸可根據其側鏈之特性的相似性來分組(如例如A.L.Lehninger,Biochemistry，第 二版，第73－75頁，Worth Publishers,New York(1975)中所述)：(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，天然存在之殘基可基於常見側鏈特性而分為以下各組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、ILe；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等種類中之一者的成員交換為另一種類。該等經取代之殘基亦可引入保守取代位點或更佳地引入剩餘(非保守)位點。
一種取代性變異體類型涉及取代親本抗體(例如人化或人類抗體)之一或多個CDR殘基。通常，經選擇以供進一步開發之所得變異體將具有相對於產生其之親本抗體而言改良的生物學特性。一種用於產生該等取代性變異體之習知方式涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使若干個CDR位點(例如6－7個位點)突變以於每一位點處產生所有可能之胺基酸取代。自呈與每一絲狀噬菌體粒子內封裝之M13之基因III產物的融合體形式之粒子呈現由此產生之抗體。接著針對如本文中所揭示之生物活性(例如結合親和力)篩選噬菌體呈現之變異體。對於修飾之候選CDR位點的位置而言，可執行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著促進抗原結合之CDR殘基。其他或另外，分析抗原抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點可為有益的。該等接觸殘基及相鄰殘基為根據本文中詳述之技術取代的候選者。產生該等變異體後，如本文中所述，使變異體組經受篩選且可選擇在一或多種相關檢定中具有優良特性之抗體用於進一步開發。
編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子係藉由此項技術中已知之各種方法製備。此等方法包括(但不限於)自天然來源(在天然存在之胺基酸序列變異體的情況下)分離或藉由早先製備之抗體變異體或非變異形式之抗體的寡核苷酸介導(或定點)突變誘發、PCR突變誘發及盒式突變誘發來製備。
本發明之抗體較佳具有天然序列Fc區。然而，可能需要將一或多種胺基酸修飾引入其Fc區中，從而產生Fc區變異體。該Fc區變異體可包含如下人類Fc區序列(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其於一或多個胺基酸位置(包括鉸鏈半胱胺酸之位置)處包含胺基酸修飾(例如，取代)。儘管如此，此等抗體仍將保持與其野生型對應物相比大體上相同之治療效用所需特徵。該等胺基酸取代可(例如)改善或降低其他Fc功能或進一步改善相同Fc功能、增加抗原結合親和力、增加穩定性、改變糖基化或包括異型變異體。該等抗體在Fc區中可進一步包含一或多個胺基酸取代，導致抗體與具有野生型Fc區之相同抗體相比展現選自以下特性之特性中之一或多者：FcγR結合增加、ADCC增加、CDC增加、CDC降低、ADCC及CDC功能增加、ADCC增加但CDC功能降低(例如用以將輸注反應降至最小)、FcRn結合增加及血清半衰期增加。此等活性可藉由本文中所述之方法量測。舉例而言，參見WO 1999/51642。亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738－40(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821及WO 1994/29351，其係關於Fc區變異體之其他實例。
對於其他改善Fc功能之胺基酸變化，例如參見US 6,737,056。本發明之抗體中之任一者可進一步在Fc區內包含至少一個降低CDC活性之胺基酸取代，例如至少包含取代K322A。參見US 6,528,624(Idusogie等人)。
在另一較佳實施例中，抗體於以下位置之任一者或任何組合處具有胺基酸取代：268D，或298A，或326D，或333A，或334A，或298A以及333A，或298A以及334A，或239D以及332E，或239D以及298A及332E，或239D以及268D及298A及332E，或239D以及268D及298A及326A及332A，或239D以及268D及298A及326A及332E，或239D以及268D及283L及298A及332E，或239D以及268D及283L及298A及326A及332E，或239D以及330L及332E及272Y及254T及256E，或250Q以及428L，或265A，或297A，其中265A取代係於297A不存在情況下發生且297A取代係於265A不存在情況下發生。此等標號之每一者中數字後之字母表示在彼位置處改變之胺基酸。
改善ADCC及CDC之突變包括於Fc區之一至三個位置處的取代，包括Fc區之位置298、333及/或334(殘基之Eu編號)，尤其S298A以及E333A及K334A(S298A/E333A/K334A，或同義地，298A、333A及334A之組合)，本文中亦稱為三倍Ala突變體。K334L增加與CD16之結合。K322A導致CDC活性降低；K326A或K326W增強CDC活性。D265A導致ADCC活性降低。
穩定性變異體為顯示與例如氧化及脫醯胺有關之穩定性改善的變異體。
抗體之另一類型的胺基酸變異體改變抗體之原始糖基化模式。該改變包括刪去見於抗體中之一或多個碳水化合物部分，及/或添加抗體中不存在之一或多個糖基化位點。增加ADCC功能之糖基化變異體係描述於例如WO 2003/035835中。亦參見US 2006/0067930。
多肽之糖基化通常為N－連接或者O－連接。N－連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺酸殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸及天冬醯胺酸－X－蘇胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈之酶促連接的識別序列。因此，此等三肽序列中任一者在多肽中之存在產生潛在糖基化位點。O－連接糖基化係指糖N－乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸之連接，該羥基胺基酸最常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5－羥基脯胺酸或5－羥基離胺酸。
便利地藉由改變胺基酸序列達成將糖基化位點添加至抗體中以便使其含有上述三肽序列中之一或多者(對於N－連接糖基化位點而言)。亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至原始抗體之序列中或由其取代來進行該變化(對於O－連接糖基化位點而言)。
當抗體包含Fc區時，其所連接之碳水化合物可能改變。舉例而言，具有成熟碳水化合物結構、缺乏連接於抗體之Fc區之岩藻糖的抗體係描述於US 2003/0157108(Presta)中。亦參見US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。在連接於抗體之Fc區之碳水化合物中具有平分型N－乙醯葡糖胺(GlcNAc)的抗體係在例如WO 2003/011878(Jean－Mairet等人)及US 6,602,684(Umana等人)中提及。在連接於抗體之Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基的抗體係報導於例如WO 1997/30087(Patel等人)中。亦參見WO 1998/58964(Raju)及WO 1999/22764(Raju)，其係關於具有連接於Fc區之經改變碳水化合物的抗體。亦參見US 2005/0123546(Umana等人)；US 2004/0072290(Umana等人)；US 2003/0175884(Umana等人)；WO 2005/044859(Umana等人)；及US 2007/0111281(Sondermann等人)，其係關於具有改良糖基化之抗原結合分子，包括具有含有N－連接寡醣之Fc區的抗體；及US 2007/0010009(Kanda等人)。
本文中之一種較佳糖基化抗體變異體包含Fc區，其中連接於該Fc區之碳水化合物結構具有減少之岩藻糖或缺乏岩藻糖，此可改善ADCC功能。具體而言，本文中涵蓋具有相對於野生型CHO細胞中產生之相同抗體上之岩藻糖的量而言減少之岩藻糖的抗體。亦即，其之特徵在於具有比由天然CHO細胞產生時其將另外具有的更低量之岩藻糖。較佳地，該抗體為其上少於約10%之N－連接聚糖包含岩藻糖、更佳地其上少於約5%之N－連接多醣包含岩藻糖且最佳地其上無N－連接多醣包含岩藻糖(亦即該抗體完全不含岩藻糖或不具有岩藻糖)之抗體。
該等"脫岩藻糖基化"或"缺乏岩藻糖"抗體可例如藉由將抗體培養於諸如(例如)以下文獻中所揭示之細胞株中來產生：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；US 2006/0063254；US 2006/0064781；US 2006/0078990；US 2006/0078991；Okazaki等人J.Mol.Biol. 336：1239－1249(2004)；及Yamane－Ohnuki等人，Biotech.Bioeng. 87：614(2004)。產生脫岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys. 249：533－545(1986)；US 2003/0157108 A1(Presta)及WO 2004/056312 A1(Adams等人，尤其為實例11))及基因剔除細胞株，諸如α－1,6－岩藻糖基轉移酶基因(FUT8) －基因剔除CHO細胞(Yamane－Ohnuki等人，Biotech.Bioeng. 87：614(2004))。亦參見Kanda等人，Biotechnol.Bioeng., 94：680－8(2006)。US 2007/0048300(Biogen－IDEC)揭示一種產生具有所需效應功能之含有無糖基化Fc之多肽(諸如抗體)的方法，以及根據使用該等抗體作為治療劑之方法所產生的無糖基化抗體，所有均適用於本文。另外，US 7,262,039係關於一種具有α－1,3－岩藻糖基轉移酶活性之多肽，包括一種使用該多肽產生含有岩藻糖之糖鏈的方法。
亦參見US 2006/024304(Gemgross等人)；US專利第7,029,872號(Gemgross)；US 2004/018590(Gemgross等人)；US 2006/034828(Gemgross等人)；US 2006/034830(Gemgross等人)；US 2006/029604(Gemgross等人)；WO 2006/014679(Gemgross等人)；WO 2006/014683(Gemgross等人)；WO 2006/014685(Gemgross等人)；WO 2006/014725(Gemgross等人)；及WO 2006/014726(Gemgross等人)，其係關於本文中適用之重組醣蛋白及糖基化變異體。
在另一實施例中，本發明提供一種包含本文所述之具有Fc區之抗體的抗體組合物，其中該組合物中約20－100%之抗體在缺乏岩藻糖之Fc區中包含成熟核心碳水化合物結構。較佳地、該組合物包含具有已藉由在選自由以下位置組成之群之Fc區之位置的任一者或任何組合處取代選自由A、D、E、L、Q、T及Y組成之群的胺基酸來改動以相較於野生型IgG Fc序列改變抗體之抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或藥物動力學特性中之一或多者之Fc區的抗體：238、239、246、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、309、312、314、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、428、430、434、435、437、438及439。
該組合物更佳為抗體進一步包含如下Fc取代之組合物：268D或326D或333A以及334A，或298A以及333A，或298A以及334A，或239D以及332E，或239D以及298A及332E，或239D以及268D及298A及332E，或239D以及268D及298A及326A及332A，或239D以及268D及298A及326A及332E，或239D以及268D及283L及298A及332E，或239D以及268D及283L及298A及326A及332E，或239D以及330L及332E，其中此等標號之每一者中數字後之字母表示在彼位置處改變之胺基酸。
該組合物另外較佳為抗體結合FcγRIII之組合物。該組合物進一步較佳為抗體在人類效應細胞存在下具有ADCC活性或與包含人類野生型IgG1 Fc之另外相同抗體相比在人類效應細胞存在下具有增加之ADCC活性的組合物。
組合物亦較佳為抗體相較於具有成熟核心碳水化合物結構之醣蛋白而言以較好親和力結合FcγIII或較有效地介導ADCC的組合物，其中該成熟核心碳水化合物結構包括連接於該醣蛋白之Fc區的岩藻糖。另外，組合物較佳為抗體已由CHO細胞、較佳Lec13細胞產生之組合物。組合物亦較佳為抗體已由缺乏岩藻糖基轉移酶基因、更佳FUT8 基因之哺乳動物細胞產生的組合物。
在一態樣中，組合物為抗體不含連接於成熟核心碳水化合物結構之平分型N－乙醯葡糖胺(GlcNAc)的組合物。或者，組合物為抗體具有連接於成熟核心碳水化合物結構之平分型GlcNAc的組合物。
在另一態樣中，組合物為抗體具有一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之半乳糖殘基的組合物。或者，組合物為抗體不含一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之半乳糖殘基的組合物。
在另一態樣中，組合物為抗體具有一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之唾液酸殘基的組合物。或者，組合物為抗體不含一或多個連接於成熟核心碳水化合物結構之唾液酸殘基的組合物。
此組合物較佳包含至少約2%無岩藻糖基化抗體。該組合物更佳包含至少約4%無岩藻糖基化抗體。組合物更佳包含至少約10%無岩藻糖基化抗體。組合物甚至更佳包含至少約19%無岩藻糖基化抗體。組合物最佳包含約100%無岩藻糖基化抗體。
免疫結合物
本發明亦關於免疫結合物或抗體藥物結合物(ADC)，其包含與諸如化療劑之細胞毒性劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)結合的抗體。
用於局部傳遞細胞毒性劑或細胞抑制劑之抗體藥物結合物(例如在治療癌症時殺死或抑制腫瘤細胞之藥物)之用途(Syrigos及Epenetos,Anticancer Research 19：605－614(1999)；Niculescu－Duvaz及Springer,Adv.Drug Del.Rev. 26：151－172(1997)；及US 4,975,278)使得藥物部分靶向傳遞至腫瘤，且細胞內累積於其中，其中全身性投予此等非結合性藥物藥劑可導致對於正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞而言不可接受的毒性含量(Baldwin等人，Lancet, 603－05(1986)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review,"Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編)，第475－506頁(1985))。藉此尋找最大功效以及最小毒性。多株抗體及單株抗體均已報導適用於此等策略(Rowland等人，Cancer Immunol.Immunother., 21：183－87(1986))。用於此等方法之藥物包括道諾黴素(daunomycin)、阿黴素(doxorubicin)、甲胺喋呤(methotrexate)及長春地辛(vindesine)。用於抗體毒素結合物之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素(diphtheria toxin)；植物毒素，諸如篦麻毒素(ricin)；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人，J.Nat.Cancer Inst., 92(19)：1573－1581(2000)；Mandler等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters, 10：1025－1028(2000)；及Mandler等人，Bioconjugate Chem., 13：786－791(2002))；美登素類(maytansinoid)(EP 1391213及Liu等人，Yroc.Natl.Acad.Sci.USA, 93：8618－8623(1996))；及卡奇黴素(calicheamicin)(Lode等人，Cancer Res., 58：2928(1998)；及Hinman等人，Cancer Res., 53：3336－3342(1993))。在不限於任一理論之情況下，該等毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來發揮其細胞毒性及抑制細胞效應。一些細胞毒性藥物在與大抗體或蛋白受體配位體結合時傾向於無活性或活性較小。
適用於產生該等免疫結合物之化療劑已在上文描述。可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素(exotoxin)A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ))、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α－帚麴菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii )蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸(Phytolaca americana )蛋白(PAPI、PAPII及PAP－S)、苦瓜(momordica charantia )抑制劑、麻楓樹蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白(gelonin)、有絲分裂素、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。各種放射性核種可用於產生放射性結合抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。抗體及細胞毒性劑之結合物係使用諸如以下者之各種雙官能蛋白偶合劑製造：N－丁二醯亞胺基－3－(2－吡啶基二硫醇)丙酸鹽(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙官能衍生物(諸如己二亞胺二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(諸如雙－(對重氮鎓苄醯基)－乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6－二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯)。舉例而言，篦麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science, 238：1098(1987)中所述來製備。經碳14標記之1－異硫氰酸酯基苄基－3－甲基二伸乙三胺五乙酸(MX－DTPA)為用於放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見例如WO 1994/11026。
抗體與一或多個小分子毒素(諸如卡奇黴素、美登素類、單端孢黴烯族毒素及CC1065)及此等毒素之具有毒素活性之衍生物的結合物亦涵蓋於本文中。
在本發明之ADC中，抗體(Ab)經由連接子(L)與一或多個藥物部分(D)結合，例如每抗體約1個至約20個藥物部分。式IADC可藉由若干種途徑利用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備，該等反應包括：(1)抗體之親核基團經由共價鍵與二價連接子試劑反應，以形成Ab－L，接著與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核基團經由共價鍵與二價連接子試劑反應，以形成D－L，接著與抗體之親核基團反應。
Ab－(L－D)p 式I
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中該抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基為親核的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等連接子部分及連接子試劑包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基鹵；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。特定抗體具有可還原性鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可使抗體具有反應性以藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑處理而與連接子試劑結合。理論上，每一半胱胺酸橋將由此形成兩個反應性硫醇親核體。可經由使離胺酸與2－亞胺基硫雜環戊烷(Traut氏試劑)反應來將其他親核基團引入抗體中，導致胺轉化為硫醇。
本發明之抗體藥物結合物亦可藉由修飾抗體以引入親電子部分來產生，該等親電子部分可與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應。糖基化抗體之糖可例如用高碘酸鹽氧化劑氧化，以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基團。所得亞胺席夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉之反應可在蛋白質中產生羰基(醛及酮)基團，其可與藥物上之適當基團反應(Domen等人，J.Chromatog., 510：293－302(1990))。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏高碘酸鈉反應，導致產生醛而非第一胺基酸(Geoghegan及Stroh,Bioconjugate Chem., 3：138－146(1992)及US 5,362,852)。該醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣，藥物部分上之親核基團包括(但不限於)：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵之胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、羧酸肼及芳基醯肼基團，該等連接子部分及連接子試劑包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵甲酸酯及醯基鹵；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。
或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可例如藉由重組技術或肽合成來製造。DNA之長度可包含編碼結合物之兩個相互相鄰或由編碼並不破壞結合物之所需特性之連接子肽的區分隔之部分的相應區。
在又一實施例中，抗體可與"受體"(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合以用於腫瘤預先靶向中，其中將該抗體受體結合物投予患者，接著使用清除劑自循環移除未結合之結合物且接著投予與細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)結合之"配位體"(例如抗生物素蛋白)。
視情況用交聯劑製備本文中之ADC，該等交聯劑諸如BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC－SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基－EMCS、磺酸基－GMBS、磺酸基－KMUS、磺酸基－MBS、磺酸基－SIAB、磺酸基－SMCC、磺酸基－SMPB及SVSB(丁二醯亞胺基－(4－乙烯基碸)苯甲酸酯)，其均可為市售的(例如，購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。參見2003－2004年應用手冊及目錄(2003－2004Applications Handbook and Catalog)，第467－498頁。
抗體衍生物
本發明之抗體可進一步經修飾以含有此項技術中已知且容易得到之其他非蛋白質性部分。較佳地，適合於抗體之衍生化的部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚－1,3－二氧戊環、聚－1,3,6－三噁烷、伸乙基/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(正－乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可由於其於水中之穩定性而具有製造優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可為支鏈或非支鏈。連接於抗體之聚合物的數目可變化，且若連接多於一種聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)欲改善之抗體的特定特性或功能、是否抗體衍生物將在確定條件下用於療法中等之考慮因素來判定。
醫藥調配物
藉由混合具有所需純度之抗體與視情況醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol,A.Ed.(1980))來製備根據本發明使用之抗體的治療調配物以作儲備，該等調配物呈凍乾調配物或水性溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用之劑量及濃度下對受體無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六烴季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3－戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽之抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn蛋白質複合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
本文中之另一種調配物及傳遞方法包括例如WO 2004/078140中所述者，包括ENHANZETM 藥物傳遞技術(Halo－zyme Inc.)。此技術係基於重組人類玻尿酸酶(rHuPH20)。rHuPH20為FDA批准之一種天然存在的人類酶之重組形式，其暫時清潔諸如皮膚之組織之基質中的間隙。亦即，該酶具有分解玻尿酸(HA)之能力，玻尿酸為填充間隙之"凝膠"樣物質，為遍及全身組織之主要組份。預期此清潔活性使得rHuPH20可藉由增強治療分子經由皮下間隙進入而改善藥物傳遞。因此，當與某些可注射藥物組合或共調配時，此技術可用作"分子大砍刀"以藉由暫時打開皮下流動通道而促進此等藥物之滲透及分散。200奈米大之分子可自由地通過該穿孔之細胞外基質，其在約24小時內恢復正常密度，因而產生一個並不永久改變皮膚結構之藥物傳遞平臺。
因此，本發明包括一種將本文之抗體傳遞至含有過量葡糖胺聚糖之組織的方法，其包含將一種玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)(此蛋白包含一種中性活性可溶玻尿酸酶多肽及至少一個N－連接糖部分，其中該N－連接糖部分共價連接於該多肽之天冬醯胺酸殘基)投予該組織，其量足以將葡糖胺聚糖降解至足以打開直徑小於約500奈米之通道；及將該抗體投予該包含降解之葡糖胺聚糖的組織。
在另一個實施例中，本發明包括一種用於增加本文中投予個體之抗體擴散的方法，包含將sHASEGP多肽以足以打開或形成小於抗體直徑之通道的量投予個體及投予該抗體，藉以增加治療物質之擴散。sHASEGP及抗體可分開投予或以一種調配物同時投予，及以任意順序連續或同時投予。
例示性抗LTα抗體調配物係描述於WO 1998/56418中，其包括液態多劑量調配物，該調配物包含40 mg/mL之抗LTα抗體、25 mM乙鹽酸、150 mM海藻糖、0.9%苄醇、0.02%聚山梨醇酯20(pH 5.0)，其於2－8℃具有兩年儲存之最小存放期。另一種關注之抗LTα調配物包含10 mg/mL抗體於9.0 mg/mL氯化鈉、7.35 mg/mL檸檬酸鈉二水合物、0.7 mg/mL POLYSORBATE 80TM 界面活性劑及pH 6.5之注射用滅菌水中。又一種水性醫藥調配物包含10－30 mM乙酸鈉(約pH 4.8至約pH 5.5，較佳pH 5.5)、約0.01－0.1% v/v量之作為界面活性劑的POLYSORBATETM 、約2－10% w/v量之海藻糖及作為防腐劑之苄醇(US 6,171,586)。適合於皮下投予之凍乾調配物係描述於例如WO 1997/04801及US 6,267,958(Andya等人)中。該等凍乾調配物可用合適之稀釋劑復原(reconstituted)至高蛋白濃度，該復原調配物可經皮下投予本文中欲治療之哺乳動物。
亦涵蓋結晶形式之抗體。參見例如US 2002/0136719(Shenoy等人)。
本文中之調配物亦可含有多於一種所治療特定病症所必需之活性化合物(如上文所述之第二藥劑)，較佳為具有互補活性而不不利地互相影響之彼等者。舉例而言，可能需要進一步提供細胞毒性劑、化療劑、細胞因子拮抗劑、整合素拮抗劑或免疫抑制劑(例如，作用於T細胞者，諸如環孢素或結合T細胞之抗體，例如結合LFA－1之抗體)。該等第二藥劑之類型及有效量視(例如)存在於調配物中之抗體的量、疾病或病症或治療之類型、個體之臨床參數及上述所論述之其他因素而定。此等藥劑通常係以相同劑量及以本文中所述之投予途徑或以迄今所利用的劑量之約1至99%使用。較佳該等藥劑係在上文指出。
活性成份亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊中，分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚－(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包埋於膠態藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)；或包埋於巨乳液中。該等技術係揭示於(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成形物品之形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2－羥乙基－甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(US 3,773,919)、L－麩胺酸及γ乙基－L－麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之伸乙基－乙酸乙烯酯、可降解之乳酸－乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸－乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成之可注射微球體))及聚－D－(－)－3－羥基丁酸。
欲用於活體內投予之調配物必須無菌。此易於藉由經由無菌過濾膜之過濾達成。
用途
本發明之抗體可用於(例如)活體外、離體及活體內治療方法。本發明之抗體可用作拮抗劑以部分或完全阻斷活體外、離體及/或活體內之特異性LTα活性。此外，本發明之至少一些抗體可中和其他種類之抗原活性。因此，本發明之抗體可用於抑制例如含有抗原之細胞培養物、人類個體或其他具有與本發明之抗體交叉反應之抗原的哺乳動物個體(例如，黑猩猩、狒狒、狨猴、獼猴、恆河猴、豬或小鼠)中之特異性抗原活性。在一實施例中，本發明之抗體可用於藉由使該抗體與抗原接觸以便抑制抗原活性來抑制抗原活性。較佳地，該抗原為人類蛋白質分子。
在一實施例中，本發明之抗體可用於用以抑制罹患抗原活性有害之病症之個體體內之抗原的方法，該方法包含將本發明之抗體投予該個體以便抑制個體體內之抗原活性。較佳地，該抗原為人類蛋白質分子且該個體為人類個體。或者，個體可為表現本發明之抗體所結合之抗原的哺乳動物。更進一步地，個體可為已引入抗原(例如藉由投予抗原或藉由表現抗原轉基因)之哺乳動物。本發明之抗體可出於治療目的投予人類個體。此外，本發明之抗體可出於獸醫目的或作為人類疾病之動物模型投予表現與免疫球蛋白交叉反應之抗原的非人類哺乳動物(例如，靈長類、豬或小鼠)。關於後者，該等動物模型可適用於評估本發明之抗體的治療功效(例如，測試劑量及投予時程)。本發明之抗體可用於治療、抑制如本文所定義之自體免疫疾病、病症或病狀，延緩其進展，阻止/延緩其復發，改善或預防該等疾病。
在一態樣中，本發明之阻斷抗體對配位體抗原具特異性，且藉由阻斷或干擾涉及該配位體抗原之配位體受體相互作用來抑制抗原活性，藉此抑制相應信號途徑及其他分子或細胞事件。本發明之特徵亦在於受體特異性抗體，其不一定阻止配位體結合，但干擾受體活化，藉此抑制將通常由配位體結合引起之任何反應。本發明亦包括較佳地或排他地與配位體受體複合物結合之抗體。本發明之抗體亦可充當特定抗原受體之促效劑，藉此加強、增強或活化配位體介導受體活化之全部或部分活性。
抗體可為裸抗體或者與諸如細胞毒性劑之另一分子結合。較佳經靜脈內或經皮下，最佳經皮下投予抗體。
在一實施例中，個體先前未曾用用以治療病症之諸如免疫抑制劑之藥物治療，且在一特定實施例中為先前未曾用TNF拮抗劑治療。在一替代實施例中，個體先前已用用以治療病症之藥物治療，包括用TNF拮抗劑治療。
在又一態樣中，患者病症復發。在一替代實施例中，患者病症未復發。
在另一態樣中，本文中之抗體為投予欲治療病症之個體的唯一藥劑。在一替代態樣中，本文中之抗體為用於治療病症之藥劑之一。
在另一態樣中，個體僅患有作為自體免疫病症之RA。或者，個體僅患有作為自體免疫病症之MS。或者，個體僅患有作為自體免疫病症之狼瘡或ANCA相關血管炎或休格連氏症候群。在所有情況下，自體免疫病症係在上文定義。
在又一實施例中，個體具有異常含量之一或多種調節細胞因子、抗核抗體(ANA)、抗類風濕因子(RF)抗體、肌酸酐、血尿素氮、抗內皮抗體、抗嗜中性白血球細胞質抗體(ANCA)、浸潤性CD20細胞、抗雙股DNA(dsDNA)抗體、抗Sm抗體、抗核的核糖核蛋白抗體、抗磷脂抗體、抗核糖體P抗體、抗Ro/SS－A抗體、抗Ro抗體、抗La抗體、針對休格連氏相關抗原A或B(SS－A或SS－B)之抗體、針對著絲點蛋白B(CENP B)或著絲點蛋白C(CENP C)之抗體、ICA69之自體抗體、抗Smith抗原(Sm)抗體、抗核的核糖核蛋白抗體、抗核糖體P抗體、染色嗜中性白血球之核區或核周區之自體抗體(pANCA)、抗釀酒酵母抗體、GM1神經節苷脂或GQ1b神經節苷脂之交叉反應性抗體、抗乙醯膽鹼受體(AchR)、抗AchR亞型或抗肌肉特異性酪胺酸激酶(MuSK)抗體、血清抗內皮細胞抗體、IgG或抗橋粒芯糖蛋白(Dsg)抗體、抗著絲點、抗拓撲異構酶－1(Scl－70)、抗RNA聚合酶或抗U3－核糖核蛋白(U3－RNP)抗體、抗腎小球基底膜(GBM)抗體、抗腎小球基底膜(GBM)抗體、抗粒線體(AMA)或抗粒線體M2抗體、抗甲狀腺過氧化酶(TPO)、抗甲狀腺球蛋白(TG)或抗促甲狀腺激素受體(TSHR)抗體、抗核(AN)、抗肌動蛋白(AA)或抗平滑肌抗原(ASM)抗體、IgA抗肌內膜、IgA抗組織麩醯胺酸轉移酶、IgA抗麥膠蛋白或IgG抗麥膠蛋白抗體、抗CYP21A2、抗CYP11A1或抗CYP17抗體、抗核糖核蛋白(RNP)或肌炎特異性抗體、抗髓鞘相關醣蛋白(MAG)抗體、抗C型肝炎病毒(HCV)抗體、抗GM1神經節苷脂、抗硫化－3－葡萄糖醛酸基副紅血球糖苷脂(SGPG)或IgM抗糖結合物抗體、IgM抗神經節苷脂抗體、抗甲狀腺過氧化酶(TPO)、抗甲狀腺球蛋白(TG)或抗促甲狀腺激素受體(TSHR)抗體、抗髓鞘鹼性蛋白或抗髓鞘寡突細胞醣蛋白抗體、針對IgG之Fc部分的IgM類風濕因子抗體、抗因子VIII抗體或其組合。
用於評估自體免疫病症(其包括自體免疫相關疾病)之治療之功效或成果的參數將為熟習適當疾病之醫師所已知。通常，熟習醫師將尋找特定疾病之徵象及症狀的減少。以下係以實例說明之。
在一實施例中，本發明之方法及組合物適用於治療RA。RA之特徵為多個關節之炎症、軟骨損失以及導致關節損壞及最終降低關節功能之骨腐蝕。另外，因為RA為全身性疾病，所以其會在諸如肺、眼睛及骨髓之其他組織中具有影響。
若個體患有在本文中為較佳適應症之RA，則本文中之抗體較佳在個體體內誘導主要臨床反應。
本文中之抗體可用作患有早期RA之患者的第一線療法(亦即，未用甲胺喋呤(MTX)處理)，或與例如MTX或環磷醯胺組合使用。或者，抗體可用於與例如MTX組合作為(例如)用DMARD及/或TNF抑制劑及/或MTX難治癒之患者之第二線療法的治療。LTα結合抗體亦可與使B細胞驅離至血流中以更有效殺死之諸如整合素抗體的B細胞動員劑組合投予。LTα結合抗體適用於防止及控制關節損傷、延緩結構破壞、減少與RA炎症相關之疼痛且通常減少中度至嚴重RA之徵象及症狀。RA患者可在用其他用於治療RA之藥物治療之前、之後或同時用LTα抗體治療(參見本文中所述之組合療法)。在一實施例中，用LTα結合抗體治療先前用DMARD失敗及/或對單獨用MTX具有不足反應之患者。在另一實施例中，投予該等患者人化LTα結合抗體加環磷醯胺或LTα結合抗體加MTX。最佳地，將本文中之抗體與MTX一起投予以治療RA，而非與高劑量類固醇一起投予。
一種評估RA之治療功效的方法係基於美國風濕病學學會(American College of Rheumatology，ACR)標準，其尤其用於量測壓痛及腫脹關節之改善百分比。與未用抗體治療(例如治療前之基線)或用安慰劑治療比較，可將RA患者評為例如ACR 20(改善20%)。其他評估抗體治療之功效的方式包括X射線評分，諸如用於評定諸如骨侵蝕及關節間隙變窄之結構破壞的Sharp X射線評分。亦可在治療期間或之後的時間段，基於健康評估調查表(Health Assessment Questionnaire，HAQ)評分、AIMS評分或SF－36評估患者無力之預防或改善。ACR 20標準可包括壓痛(疼痛)關節計數及腫脹關節計數之20%改善加上5種其他量測中之至少三者的20%改善：1.患者藉由視覺類比量表(VAS)之疼痛評估，2.患者對疾病活性之總體評估(VAS)，3.醫師對疾病活性之總體評估(VAS)，4.患者藉由健康評估調查表量測之自我評估無力，及5.急性相反應物，CRP或ESR。
ACR 50及70係類似地定義。較佳地，投予患者一定量之本發明之LTα結合抗體，其有效達成至少ACR 20之分數，較佳至少ACR 30，更佳至少ACR 50，甚至更佳至少ACR 70，且最佳至少ACR 75。
牛皮癬性關節炎具有獨特及不同放射攝影特徵。對於牛皮癬性關節炎而言，亦可藉由Sharp評分評估關節侵蝕及關節間隙變窄。本文中所揭示之抗體可用於防止關節損傷以及減少病症之疾病徵象及症狀。
本發明之又一態樣為一種藉由投予患有狼瘡之個體有效量之本發明之抗體來治療該疾病的方法，該狼瘡包括全身性紅斑狼瘡(SLE)及狼瘡腎炎。舉例而言，SLEDAI評分提供疾病活性之數值定量。SLEDAI為已知與疾病活性有關之24個臨床及實驗室參數的加權指數，其數值範圍為0－103。參見Gescuk及Davis,Current Opinion in Rheumatology, 14：515－521(2002)。咸信雙股DNA之抗體引起腎發炎及狼瘡之其他表現形式。可監測經歷抗體治療之患者腎發炎之時間，該腎發炎係定義為尿中血清肌酸酐、尿蛋白或血液之顯著、可複現的增加。其他或另外，可監測患者的抗核抗體及雙股DNA之抗體之含量。對SLE之治療包括高劑量皮質類固醇及/或環磷醯胺(HDCC)。
脊柱關節病為一組關節病症，包括強直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎及克羅恩氏病。治療成果可藉由有效患者及醫師總體評估量測工具來判定。
使用各種藥療法治療牛皮癬；治療直接相對於疾病嚴重性而不同。患有較輕度形式之牛皮癬的患者通常利用諸如局部類固醇、蒽三酚、鈣泊三醇、氯倍他索(clobetasol)及他紮羅汀(tazarotene)之局部治療來控制該疾病，而患有中度及嚴重牛皮癬之患者較可能利用全身性(甲胺喋呤、類視色素、環孢素、PUVA及UVB)療法。亦使用焦油。此等療法由於安全性關係、耗時方式及/或不方便治療過程而為不利的。此外，一些療法需要昂貴設備及辦公室配置之專用空間。該等全身性藥療法可產生嚴重副作用，包括高血壓、高脂質血症、骨髓抑制、肝病、腎病及腸胃紊亂。又，使用光療法可增加皮膚癌之發病率。除與使用局部療法相關之不便及不適外，光療法及該等全身性治療亦由於副作用而需要使患者循環斷續地治療及監測壽命暴露。
藉由監測疾病之臨床徵象及症狀的變化來評估對於牛皮癬之治療功效，包括與基線病狀相比之醫師總體評估(PGA)變化、牛皮癬面積及嚴重性指數(PASI)評分及牛皮癬症狀評估(PSA)。可在整個治療期間根據用於指示特定時刻經歷之發癢程度的視覺類比量表(VAS)來週期性地量測患者。
檢定配位體/受體結合研究可以任何已知檢定方法進行，諸如競爭性結合檢定、直接及間接夾心檢定及免疫沈澱法檢定。基於細胞之檢定及動物模型可用於認識本文中所鑑別之配位體與受體之間的相互作用及本文中提及之病狀及疾病之發展及發病機理。
在一方法中，可用本文中所述之配位體或受體轉染哺乳動物細胞，且分析本文中之抗體抑制結合或活性的能力。合適之細胞可用所需基因轉染，且監測其活性。接著可使用該等經轉染之細胞株測試抗體(例如)調節細胞之LTαβ複合物表現的能力。
另外，源自轉殖基因動物之初級培養物可用於基於細胞之檢定。自轉殖基因動物得到連續細胞株之技術在此項技術中眾所周知。參見例如Small等人，Mol.Cell.Biol., 5：642－648(1985)。
一種合適之基於細胞的檢定為將經抗原決定基標記之配位體(例如，LTα)添加至具有或表現相應受體之細胞中且藉由用抗tag抗體之FACS染色來分析結合(在預期抗體存在或不存在情況下)。在另一檢定中，檢定本文中之抗體抑制LTαβ複合物於表現該複合物之細胞上之表現的能力。舉例而言，在預期抗體存在或不存在情況下培養合適之表現細胞株且可藉由3 H－胸苷合併或細胞數目來量測LTαβ複合物表現之調節。
基於細胞之活體外檢定之結果可進一步使用活體內動物模型來檢驗。許多動物模型可用於測試本文中所鑑別之抗體對於(例如)免疫相關疾病之功效。該等模型之活體內性質使其尤其預示人類患者體內之反應。免疫相關疾病之動物模型包括非重組及重組(轉殖基因)動物兩者。非重組動物模型包括(例如)齧齒類，例如鼠類模型。該等模型可藉由使用標準技術將細胞引入同源小鼠中來產生，該等標準技術例如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內植入及腎囊下植入。
移植物抗宿主疾病為已設計動物模型之疾病的一實例。移植物抗宿主疾病在將免疫活性細胞移植至免疫抑制或耐受患者中時發生。供體細胞識別宿主抗原及對其產生反應。該反應可自危急生命之嚴重炎症至腹瀉及重量減輕之輕度情況變化。移植物抗宿主疾病模型提供評估T細胞針對MHC抗原及次要移植抗原之反應性的方式。合適之程序係詳述於Current Protocols in Immunology ，編輯：Cologan等人，(John Wiley & Sons,Inc.,1994)，第4.3單元中。
針對皮膚同種異體移植排斥反應之動物模型測試T細胞介導活體內組織損壞之能力以量測其在抗病毒免疫性方面之作用，且係描述於(例如)Current Protocols in Immunology， 同上，第4.4單元中。其他適用於測試本文中之抗體的移植排斥反應模型包括由Tanabe等人，Transplantation, 58：23(1994)及Tinubu等人，J.Immunol., 4330－4338(1994)描述之同種異體心臟移植模型。
針對延發型超敏反應之動物模型提供細胞介導免疫功能之檢定。延發型超敏反應為T細胞介導活體內免疫反應，其特徵為並不達到峰值直至一段時間後用抗原激發後消逝之炎症。此等反應亦存在於諸如MS及實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE，用於MS之模型)之組織特異性自體免疫疾病中。合適之例示性模型係詳述於Current Protocols in Immunology ，同上，第4.5單元。
由於與人類RA之許多免疫學及病理學相似性、連及局部主要組織相容性、完整II型限制性T輔助淋巴細胞活化及組織學損傷之相似性，膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)模型係視作用於研究在人類關節炎中具活性之潛在藥物或生物製劑之合適模型。此CIA模型類似於見於RA患者中的特徵包括：軟骨及骨於關節邊緣之侵蝕(如可在射線照片中看見)、增生性滑膜炎及四肢而非軸、骨架之小型及中型周邊關節的對稱受累。Jamieson等人，Invest.Radiol. 20 ：324－9(1985)。此外，IL－1及TNF－α似乎與CIA以及RA有關。Joosten等人，J.Immunol., 163 ：5049－5055(1999)。TNF中和抗體及單獨TNFR.Fc減少此模型中RA之症狀(Williams等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89：9784－9788(1992)；Wooley等人，J.Immunol., 151：6602－6607(1993))。
在RA之此模型中，自牛關節軟骨提煉II型膠原蛋白(Miller,Biochemistry 11：4903(1972))且用於經免疫小鼠(Williams等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91：2762(1994))。關節炎之症狀包括如由組織學所判定之四肢之紅斑及/或腫脹以及軟骨及骨之侵蝕或缺損。此廣泛使用之模型亦由(例如)Holmdahl等人，APMIS, 97：575(1989),Current Protocols in Immunology ，同上，第15.5單元，及Issekutz等人，Immunology, 88：569(1996)描述。
哮喘之模型已有描述，其中抗原誘導性氣管高反應性、肺嗜伊紅血球增多及炎症係由用卵白蛋白使動物過敏及用藉由氣霧劑傳遞之相同蛋白激發該動物來誘導。諸如齧齒類及非人類靈長類模型之動物模型展現類似於用氣霧劑抗原激發後之人類異位性哮喘的症狀。用以測試本文中之抗體治療哮喘之適合性的合適程序包括Wolyniec等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol., 18：777(1998)所述之彼等者。
另外，對於免疫病症而言，本文中之抗體可在SCID/SCID小鼠模型中測試。舉例而言，如由Schon等人，Nat.Med., 3：183(1997)所述，該等小鼠表現類似牛皮癬之組織病理學皮膚損害。另一合適之模型為如由Nickoloff等人，Am.J.Path., 146：580(1995)所述製備之人類皮膚/SCID小鼠嵌合體。
劑量對於預防或治療疾病而言，本發明之抗體的適當劑量(當單獨使用或與如下文所示之第二藥劑組合使用時)將視(例如)以下情況而定：待治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重性及病程、是否為出於預防或治療目的投予抗體、先前療法、患者臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷。該劑量較佳有效治療彼適應症，同時將毒性及副作用降至最小。
適當地以一次或經一系列治療將該抗體投予患者。視疾病之類型及嚴重性而定，無論(例如)藉由一或多次獨立投予或藉由連續輸注，約1 μg/kg至500 mg/kg(較佳約0.1 mg/kg至400 mg/kg)之抗體為投予患者之初始候選劑量。一典型日劑量可能在約1 μg/kg至500 mg/kg或更多之範圍內變化，此視上文所提及之因素而定。對於經若干天或更長時間之重複投予(視病狀而定)而言，持續治療直至發生疾病症狀之所需抑制。抗體之一例示性劑量將在約0.05 mg/kg至約400 mg/kg之範圍內。因此，可投予患者約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg或50 mg/kg或100 mg/kg或300 mg/kg或400 mg/kg(或其任何組合)中之一或多個劑量。該等劑量可間歇地投予，例如每週或每三週(例如，以便使患者接受約2個至約20個(例如約6個)劑量之抗體)。可投予初始較高負荷劑量，接著一或多個較低劑量。一例示性給藥方案包含投予約4至500 mg/kg之初始負荷劑量，接著約2至400 mg/kg之每週維持劑量之抗體。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進展易於藉由習知技術及檢定監測。
對於治療自體免疫病症而言，治療有效劑量將通常在約50 mg/m2 至約3000 mg/m2 ，較佳約50至1500 mg/m2 ，更佳約50至1000 mg/m2 之範圍內。在一實施例中，該劑量範圍為約125至700 mg/m2 。對於治療RA而言，在一實施例中，人化抗體之劑量範圍為約50 mg/m2 或125 mg/m2 (等於約200毫克/劑量)至約1000 mg/m2 ，以兩個劑量給予，例如，第1天投予約200 mg之第一劑量，接著第15天投予約200 mg之第二劑量。在不同實施例中，該劑量為約以下劑量中之任一者：50毫克/劑量、80毫克/劑量、100毫克/劑量、125毫克/劑量、150毫克/劑量、200毫克/劑量、250毫克/劑量、275毫克/劑量、300毫克/劑量、325毫克/劑量、350毫克/劑量、375毫克/劑量、400毫克/劑量、425毫克/劑量、450毫克/劑量、475毫克/劑量、500毫克/劑量、525毫克/劑量、550毫克/劑量、575毫克/劑量、或600毫克/劑量、或700毫克/劑量、或800毫克/劑量、或900毫克/劑量、或1000毫克/劑量或1500毫克/劑量。
在治療疾病時，如由熟習疾病之醫師所判定，本發明之LTα結合抗體可長期地或間歇地投予患者。
藉由靜脈內輸注或經皮下投予藥物之患者可經歷不良情況，諸如發燒、寒慄、燒灼感、乏力及頭痛。為減輕該等不良情況或將該等不良情況降至最小，患者可接受初始調節劑量之抗體，接著為治療劑量。該(該等)調節劑量將低於治療劑量以調節患者使其耐受較高劑量。
本文中之抗體可以處於執業醫師之技能及判斷內之頻率投予，此視上文所指之各種因素而定，例如給藥量。此頻率包括一週兩次、一週三次、一週一次、雙週一次或一月一次。在此方法之一較佳態樣中，至多大約每隔一週一次，更佳大約一月一次投予抗體。
投藥途徑根據合適之方法將用於本發明之方法之抗體(以及任何第二藥劑)投予個體或患者，包括人類患者，該等方法諸如醫師已知之彼等者，此視許多因素而定，包括短期或長期給藥。此等途徑包括(例如)非經腸、靜脈內投予(例如呈大丸藥形式或藉由經一段時間連續輸注)、經由皮下、肌肉內、動脈內、腹膜內、肺內、腦脊髓內、關節內、滑膜內、鞘內、病灶內或吸入途徑(例如，鼻內)。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。另外，適當地藉由脈衝輸注投予抗體，尤其對於下降劑量之抗體為如此。本文中之較佳途徑為靜脈內或皮下投予，最佳為皮下投予。
在一實施例中，藉由靜脈內輸注且更佳地用約0.9%至20%氯化鈉溶液作為輸注媒劑來投予本文中之抗體。
組合療法在本文中之方法之任一者中，吾人可將有效量之第二藥劑(其中本文中之抗體為第一藥劑)與本文中之抗體一起投予個體或患者，該第二藥劑為可治療需要治療之個體之病狀的另一活性劑；舉例而言，若病狀為自體免疫病症，則第二藥劑為可單獨或與另一活性劑一起治療該自體免疫病症之藥物。對於治療自體免疫病症而言，第二藥劑包括(例如)化療劑、免疫抑制劑、結合B細胞表面標記之拮抗劑(諸如抗體)(諸如利妥昔單抗或人化2H7)、BAFF拮抗劑、DMARD、細胞毒性劑、整合素拮抗劑(諸如CD11或CD18拮抗劑，包括CD11a或CD18抗體，例如依法珠單抗(RAPTIVA))、NSAID、細胞因子拮抗劑(諸如TNF拮抗劑)、抗類風濕藥、肌肉鬆弛藥、麻醉藥、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬藥、皮質類固醇、同化類固醇、紅血球生成素、免疫劑、免疫球蛋白、放射性藥物、抗抑鬱藥、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、β促效劑、吸入型類固醇、腎上腺素、細胞因子、如WO 2005/027841中所述用於抑制B細胞自體抗體分泌的細胞、如(例如)WO 2004/078140中所述作為活性傳遞媒劑之玻尿酸酶醣蛋白或其組合。
對於治療諸如癌症之增生性疾病而言，第二藥劑將包括(例如)化療劑、激素、細胞毒性劑及其他生物製劑，諸如HER－2之抗體、VEGF之抗體、B細胞表面抗原(諸如TAHO抗原(例如US 2006/0251662)、CD20及CD22)之抗體及EGF/EGF－R之抗體。
較佳地，用於自體免疫疾病之該第二藥劑為免疫抑制劑、結合B細胞表面標記之拮抗劑(諸如抗體，例如CD20抗體或CD22抗體)、BAFF拮抗劑、DMARD、整合素拮抗劑、玻尿酸酶醣蛋白(作為活性傳遞媒劑)、NSAID、細胞因子拮抗劑、(更佳地)TNF(例如TNF－α)、CD11或CD18拮抗劑或其組合。更佳地，其為甲胺喋呤、TNF拮抗劑、B細胞表面標記之拮抗劑或DMARD。
該第二藥劑之類型視各種因素而定，包括自體免疫病症之類型、疾病之嚴重性、患者之病狀及年齡、所利用之第一藥劑之類型及劑量等。
本文中之抗體可與第二藥劑同時、依序或交替地投予或在用其他療法無反應後投予。因此，第二藥劑之組合投予包括使用單獨調配物或單一醫藥調配物共投予(同時投予)及以任意順序連續投予，其中較佳存在兩種(或所有)藥劑同時發揮其生物學活性之時間段。所有此等第二藥劑可互相組合使用或單獨與第一藥劑一起使用，因此如本文所使用之表述"第二藥劑"並不分別意謂其為除第一藥劑外之唯一藥劑。因此，第二藥劑不必為一種藥劑，而可包含多於一種該藥物。
如本文中所述之此等第二藥劑通常係以與第一藥劑相同之劑量及相同之投予途徑使用，或以約第一藥劑之1至99%的劑量使用。若完全使用該等第二藥劑，則其較佳係以低於不存在第一藥劑時之量使用，尤其在第一藥劑之初始給藥之後的隨後給藥中，以便消除或減少由此引起之副作用。
對於治療RA而言，例如可用本發明之抗體結合以下藥物中之任一者或多者治療患者：整合素拮抗劑、DMARD(例如，MTX)、NSAID、細胞因子抑制劑，諸如HUMIRATM (阿達木單抗；Abbott Laboratories)、ARAVA(來氟米特)、REMICADE(英利昔單抗；Centocorlnc,of Malvern,Pa)、ENBREL(依那西普；Immunex,WA)、皮質類固醇或COX－2抑制劑。通常用於RA之DMARD包括羥氯喹、柳氮磺吡啶、甲胺喋呤、來氟米特、依那西普、英利昔單抗、硫唑嘌呤、D－青黴胺、金劑(口服)、金劑(肌肉內注射)、二甲胺四環素、環孢素或葡萄球菌(Staphylococcal )蛋白A免疫吸附。阿達木單抗為與TNFα結合之人類單株抗體。英利昔單抗為與TNFα結合之嵌合單株抗體。依那西普為由與人類IgG1之Fc部分連接的人類75 kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)之細胞外配位體結合部分組成的"免疫黏附素"融合蛋白。關於RA之習知治療，參見例如American College of Rheumatology Subcommittee on Rheumatoid Arthritis Guidelines,Arthritis & Rheumatism 46(2)：328－346(2002)。在一特定實施例中，用本發明之LTα抗體結合MTX來治療RA患者。MTX之例示性劑量為約7.5－25 mg/kg/wk。MTX可經口及經皮下投予。
對於治療強直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎及克羅恩氏病而言，可用本發明之抗體結合(例如)REMICADE(英利昔單抗；來自Centocor Inc.,Malvern,PA)或ENBREL(依那西普；Amgen,CA)來治療患者。
對SLE之治療包括高劑量皮質類固醇及/或環磷醯胺(HDCC)結合本文中之抗體。
對於治療牛皮癬而言，可投予患者LTα結合抗體結合局部治療，諸如局部類固醇、蒽三酚、鈣泊三醇、氯倍他索及他紮羅汀，或結合MTX、類視色素、環孢素、PUVA及UVB療法以及整合素拮抗劑，諸如抗CD11a或抗CD18抗體，包括(例如)依法珠單抗(RAPTIVA)。在一實施例中，用LTα結合抗體與環孢素或與依法珠單抗依序或同時治療牛皮癬患者。
在特定實施例中，將包含與細胞毒性劑結合之本文中之抗體的免疫結合物投予患者。在一些實施例中，該免疫結合物及/或其所結合之抗原經細胞內在化，導致免疫結合物殺死其所結合之靶細胞的治療功效增加。在一實施例中，細胞毒性劑靶向或干擾靶細胞中之核酸。該等細胞毒性劑之實例包括本文中所示之化療劑(諸如美登素類或卡奇黴素)、放射性同位素、核糖核酸酶或DNA核酸內切酶中之任一者。
製品
在本發明之另一實施例中，提供含有適用於治療上文所述病症之物質的製品。在一態樣中，該製品包含(a)一容器，該容器包含本文中之抗體(該容器較佳在容器內包含該抗體及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑)；及(b)一包裝插頁，其具有關於治療患者之病症的說明書。
在一較佳實施例中，本文中之製品進一步包含一包含第二藥劑之容器，其中該抗體為第一藥劑。此物品進一步包含該包裝插頁上關於用有效量之該第二藥劑治療患者的說明書。第二藥劑可為上文所述之彼等藥劑中之任一者，其中例示性第二藥劑為與B細胞表面標記結合之拮抗劑(例如，CD20抗體)、BAFF拮抗劑、免疫抑制劑(包括MTX及皮質類固醇)、整合素拮抗劑、細胞因子拮抗劑(諸如TNF、CD11或CD18拮抗劑)或其組合。較佳第二藥劑為類固醇、細胞因子拮抗劑及/或免疫抑制劑。
在此態樣中，該包裝插頁係位於容器上或與容器相連。合適之容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納或含有有效治療所述病症之組合物且可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺入之塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑為本文中之抗體。標籤或包裝插頁指示組合物用於治療適於治療之患者或個體之特定病症，其中特定指導關於將組合物投予患者，包括抗體與所提供之任何其他藥劑的給藥量及間隔時間。包裝插頁係指通常包括在治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投予、禁忌症的資訊及/或關於使用該等治療產品之注意事項。製品可進一步包含另一容器，其包含醫藥學上可接受之稀釋緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及/或右旋糖溶液。製品可進一步包括自商業及用戶觀點所需之其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
在本發明之一特定實施例中，提供一種製品，其包含包裝在一起之包含本文中之抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物及一說明該抗體或醫藥組合物適用於治療患有自體免疫疾病(諸如RA、MS、狼瘡或IBD)之患者的標籤。
在一較佳實施例中，本文中之製品進一步包含一包含第二藥劑之容器，其中抗體為第一藥劑，且該物品進一步包含包裝插頁上關於用有效量之第二藥劑治療患者之說明書。該第二藥劑可為上文所述之彼等藥劑中之任一者，其中例示性第二藥劑為上文所述之彼等者，包括尤其用於RA治療之免疫抑制劑、皮質類固醇、DMARD、整合素拮抗劑、NSAID、細胞因子拮抗劑、雙膦酸鹽或其組合，更佳為DMARD、NSAID、細胞因子拮抗劑、整合素拮抗劑或免疫抑制劑。若該疾病為RA，則第二藥劑最佳為甲胺喋呤或DMARD。
在另一態樣中，本發明提供一種用於包裝或製造本文中之抗體或其醫藥組合物的方法，其包含將該抗體或醫藥組合物及一說明該抗體或醫藥組合物適用於治療患有自體免疫疾病(諸如RA、MS、狼瘡或IBD)之患者的標籤組合於一包裝中。
做廣告之方法
在本文中本發明亦包括一種為本文中之抗體或其醫藥學上可接受之組合物做廣告的方法，其包含向目標對象宣傳使用該抗體或其醫藥組合物治療患有自體免疫疾病(諸如RA、MS、狼瘡或IBD)之患者或患者群。
做廣告通常為經由非個人媒體之付費傳播，其中已確定廣告主且控制訊息。出於本文中之目的，做廣告包括公共宣傳、公共關係、植入式營銷(product placement)、贊助、承銷及銷售推廣。此術語亦包括在為說服、告知、宣傳、促動或改變行為朝向購買、支持或認可本文中之本發明之有利型式而經設計以吸引大眾觀者的印刷傳播媒體之任一者中出現的廣告主訊息公告。
可藉由任何方式為本文中之治療方法做廣告及宣傳本文中之治療方法。用於傳達此等訊息之廣告媒體的實例包括電視、無線電、電影、雜誌、報紙、網際網路及廣告牌，包括廣播片，其為出現在廣播媒體中之訊息。廣告亦包括食品雜貨大車之座椅上、機場走道之牆上及公共汽車之側面上之彼等者，或電話保留訊息或店內PA系統中聽見之彼等者，或可置放視覺或聽覺傳播之任何地方(通常在公共場所)的彼等者。宣傳或做廣告方式之更特定實例包括電視、無線電、電影、網際網路(諸如網路廣播及網路會議)、意欲到達併發用戶之互動式電腦網路、固定或電子廣告牌及其他公共標牌、海報、傳統或電子印刷品(諸如雜誌及報紙)、其他媒體輸出、介紹或個別接觸(藉由例如電子郵件、電話、即時訊息、明信片、快報、大規模宣傳或郵遞員郵件)、親自訪問等。
所用之廣告類型將視許多因素而定，例如欲延及之目標對象之性質，例如醫院、保險公司、診所、醫師、護士及患者；以及成本考慮因素及管理藥劑廣告之相關所轄法律法規。廣告可基於由服務互動及/或其他資料(諸如用戶人口統計狀況及地理位置)所定義之用戶特徵而個別化或用戶化。
以下為本發明之方法及組合物的非限制性實例。應理解，在上文所提供之一般說明下，可實施各種其他實施例。本說明書中所有引文之揭示內容明確地以引用方式併入本文中。
實例1：抗人類及抗鼠類LTα單株抗體及倉鼠－鼠類嵌合體之製備
抗人類LTα單株抗體2C8及3F12係如下產生：藉由注射5微克/劑量之於DETOXTM 佐劑(RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MO)中之表現於大腸桿菌中的經純化重組人類LTα來使BALB/c小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,DE)超免疫(Genentech,Inc.,South San Francisco,CA；Genentech Lot# 8360－2B；亦參見Spriggs,"Tumor Necrosis Factor：Basic Principles and Preclinical Studies,"Biologic Therapy of Cancer, DeVita等人，編，J.B.Lippincott Company(1991)第16章，第354－377頁；Ruddle,Current Opinion in Immunology, 4：327－332(1992)；Wong等人，"Tumor Necrosis Factor,"Human Monocytes, Academic Press(1989)，第195－215頁；Aggarwal等人，Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley－Liss,Inc.1990，第375－384頁；及Paul等人，Ann.Rev.Immunol., 6：407－438(1988))。具體而言，於第1、4、15、29、41、56及71天將10 μg LTα3與50 μL佐劑混合且經皮下注入小鼠(品系BALB/c)之後足墊中。於第15及56天收集血清以藉由結合ELISA偵測抗LTα3特異性抗體。
於第75天，使動物死亡，採集脾，且藉由常規程序(Oi及Herzenberg，於Selected Methods in Cellular Immunology 中，B.Mishel及S.Schiigi，編，(WJ.Freeman Co.,San Francisco,CA,1980))使用50%聚乙二醇(PEG)4000將3×10E7個細胞與5×10E7個小鼠骨髓瘤株X63－Ag8.653細胞融合。將融合之細胞以2×10E5個細胞/孔之密度塗於含有HAT培養基的96孔微量滴定盤中以供選擇(Littlefield,Science,145：709(1964))。12天後，採集上清液且藉由直接ELISA針對抗體產生進行篩選。藉由親和層析法(Pharmacia快速蛋白質液相層析(fast protein liquid chromatography，FPLC)；Pharmacia,Uppsala,Sweden)純化自各融合瘤系採集之上清液。接著使經純化之抗體製劑無菌過濾(0.2－μm孔徑；Nalgene,Rochester NY)且於4℃下儲存於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中。
抗鼠類LTα單株抗體S5H3係如下產生：用重組小鼠LTα2β1(R&D Systems Inc.(1008－LY))使亞美尼亞(Armenian)倉鼠免疫。藉由12次足墊注射來用2 μg抗原使該等倉鼠免疫，其中IP加強為一次2 μg抗原。藉由PEG治療將淋巴結與脾融合。藉由ELISA對Immunogen製造之鼠類LTα－6His(具有連接於C末端之6個組胺酸的鼠類LTα)相較於Genentech製造之鼠類LTα－6His進行初次篩選。用結合過氧化酶之AFFINIPURETM 山羊抗亞美尼亞倉鼠IgG(H＋L)(Jackson ImmunoResearch 127－035－160)進行偵測。藉由對不相關之經轉染HEK 293細胞相較於用鼠類LTαβ穩定轉染之HEK 293細胞的FACS(在G418選擇下)執行二次篩選。使用結合R－藻紅蛋白之AFFINIPURETM F(ab')2 山羊抗亞美尼亞倉鼠IgG(H＋L)(Jackson ImmunoResearch 127－116－160)執行偵測。此抗體所源自之融合瘤係以寄存編號PTA－7538(融合瘤鼠類淋巴毒素α2 β1 s5H3.2.2)寄存於ATCC。
選擇此等實驗中所產生之所有抗鼠類及抗人類LTα抗體以識別LTα3。接著針對以下情況對此等抗體進行篩選：(a)根據ELISA，LTα3與TNFR1及TNFR11之結合的阻斷；(b)根據對用LTα及LTβ穩定轉染之細胞的ELISA及FACS，LTαβ之結合；及(c)根據ELISA，LTαβ與LTβ受體相互作用之阻斷。選擇抗體3F12、2C8及S5H3，因為其均結合及中和LTα3及LTαβ。
對於用於下文所述之鼠類活體內研究而言，將倉鼠抗鼠類LTα融合瘤選殖為倉鼠/小鼠嵌合體。使用RNEASY MINITM 套組(Qiagen)及製造商之建議方案自S5H3融合瘤細胞提取總RNA。使用Qiagen ONE－STEPTM 套組完成RT－PCR，且設計引子以擴增輕鏈及重鏈可變域且添加限制酶位點以供選殖。
對於建構此嵌合抗體S5H3之輕鏈而言，使用兩個連續選殖步驟。在第一步驟RT－PCR中，使用第一組引子添加Cla I及Asc I位點，使其簡單選殖至基於pRK之載體中以擴增DNA以供測序。在獲得輕鏈可變域之DNA序列後，使用此質體作為模板執行一輪PCR，以添加與表現載體相容之Eco RV及Kpn I位點。
對於建構S5H3之重鏈而言，使用同樣兩個選殖步驟。具體而言，使用RT－PCR擴增cDNA且添加Cla I及Asc I位點選殖至載體中以供測序。隨後，使用此質體作為PCR之模板以添加與表現載體相容之Bsi WI及Apa I位點。
對於RT－PCR而言，所用之引子係如下：第一組S5H3輕鏈：5'引子：GGA TCA TCG ATA CAR CTN GTV YTN CAN CAR TCN CC(SEQ ID NO：56)3'引子：GGT AAC GGC GCG CCG YTC AGA AGA TGG TGG RAA(SEQ ID NO：57)第二組S5H3輕鏈：5'引子：GGA TCC GAT ATC CAG CTG GTA TTG ACC CAA TCT(SEQ ID NO：58)3'引子：GGA TCA GGT ACC GCT GCC AAA AAC ACA CGA CCC(SEQ ID NO：59)第一組S5H3重鏈：5'引子：TGA TAA TCG ATG ARG TNC CAT TTR GTN GAR(SEQ ID NO：60)3'引子：TAG TAA GGC GCG CCT GGT CAG GGA NCC NGA RTT CCA(SEQ ID NO：61)第二組S5H3重鏈：5'引子：TGA TCG CGT ACG CTG AGG TTC AAT TGG TTG AG(SEQ ID NO：62)3'引子：TGA TCG TGG GCC CTT TGT TGT GGC TGA GGA GAC GG(SEQ ID NO：63)其中R＝A或G，Y＝C或T，且N＝所有四種核酸A、G、C及T。
將輕鏈可變域之經純化之PCR產物選殖至含有鼠類恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體(pRK.LPG2.mu)中。對於重鏈而言，將PCR產物選殖至編碼鼠類同型IgG2a之鼠類CH1、鉸鏈、CH2及CH3域之pRK哺乳動物細胞表現載體(pRK.LPG10.muIgG2a)中。此等載體為用於使IgGs於293細胞中表現之先前所述載體的衍生物(Shields等人，J.Biol.Chem., 276：6591－6604(2000)及Gorman等人，DNA ProtEng Tech, 2：3－10(1990))。對於S5H3嵌合抗體表現而言，將輕鏈及重鏈之質體暫時共轉染至293細胞(經腺病毒轉型之人類胚腎細胞株(Graham等人，J.Gen.Virol., 36：59－74(1977)))或CHO細胞中。藉由蛋白A親和層析法自細胞培養物上清液純化抗體蛋白。
如下進行LTα3結合ELISA：用50 mM碳酸鹽緩衝溶液中之1 μg/ml LTα3塗覆微量滴定孔(50微升/孔)隔夜。自該等孔抽出未吸收之溶液。用200 μL含有5 mg/ml牛血清白蛋白之PBS(PBS－BSA)阻斷孔歷時2小時。將50 μL適當地稀釋於PBS－BSA中之測試樣品添加至每一孔中，培養一小時，且用含有0.05% TWEEN－20TM 界面活性劑之PBS洗滌。將100 μL於PBS－BSA緩衝液中之經辣根過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG添加至每一孔中且培養一小時。將每一孔用PBS/0.05% TWEEN－20TM 界面活性劑洗滌且接著用含有0.1 mg鄰苯二胺/ml(受質溶液)之檸檬酸鹽磷酸鹽緩衝液(pH 5)洗滌，且將30% H2 O2 水溶液添加至每一孔中。將該等孔培養30分鐘；接著用50 μL 2.5 M硫酸H2 SO4 停止反應，且於490 nm下讀取吸光度。
藉由下文進一步描述之程序進行LTα3阻斷ELISA、LTαβ結合ELISA及FACS檢定及LTαβ阻斷ELISA。
實例2：抗LTα抗體3F12之測序、人化及親和力成熟
1.使用LTQ－FTMS－MS/MS分析及埃德曼降解(Edman degradation)對抗LTα 3F12重新測序因為融合瘤細胞株3F12.2D3自冷凍細胞株庫丟失，所以提交自腹水3F12.2D3純化之抗LTα單株抗體蛋白以在於PBS中約3.0 mg/mL之濃度下測序。以4－20% TRISTM HCl SDS－PAGE在還原條件下分離抗體(Ab)且使每一經拆分之重鏈(HC)及輕鏈(LC)經受N末端測序(對25－30個殘基進行測序)以建立單株性。發現HC經焦麩胺醯基(pyroglutamyl)封端，使得N末端胺基酸難達成埃德曼測序。隨後使用焦麩胺酸胺基肽酶酶(PGAP)移除封端基團且再次使HC鏈經受測序。HC及LC均被確認為單株。接著根據Analytical Biochemistry, 35：77－86(2006)中所述之策略，用各種酶促及化學裂解處理Ab。簡言之，此等裂解由酶胰蛋白酶、內Lys－C、Asp－N及用CNBr及稀酸之化學處理(Asp/Pro裂解)組成。
化學裂解產生肽之混合物，將其以494型PROCISETM 測序器測序且使用Genentech之SEQSORT程式(SEQSORT為一種經設計以使由Pittsburgh Supercomputing Center之序列分析組中之程式產生之計算結果更易管理及易讀的實用程式)鑑別。此等化學裂解允許藉由與蛋白質序列資料庫中之抗體的一致性來鑑別HC及LC之恆定區。自毛細管RP－HPLC分離收集由酶促消化產生之肽且使用MALDI－TOF分析量測肽質量。使用埃德曼降解或液相層析－電噴電離聯合質譜法(LC－MS/MS)於LTQ－FT質譜儀上使具有並不匹配恆定區之質量的肽經受進一步分析。HC及LC之可變區之序列係源自藉由各種蛋白水解裂解獲得之具有重疊序列的肽。
對於藉由LC－MS/MS分析肽而言，利用微毛細管C18逆相層析管柱(0.15×150 mm i.d.，5 μm，300)，於AGILENTTM 1100系列毛細管LC系統上使用1微升/分鐘之流動速率。應用溶劑A，且應用2至80%溶劑B之梯度，溶劑A由水中之0.1% v/v甲酸組成且溶劑B由乙腈中之0.1% v/v甲酸組成。使LC與LTQ－FT質譜儀線性耦合，且以資料相關模式分析m/z介於350與1800之間的肽，在每一全質量範圍全譜掃描中選擇五個最充足種類作碰撞誘導解離(CID)分析。用搜索程式MASCOT篩選所得CID光譜以找到與資料庫序列之精確匹配，且藉由手動重新判讀來測定潛在新穎序列。使用埃德曼降解進一步分析不能被完全測序或含有白胺酸/異白胺酸及麩醯胺酸/離胺酸之同量異位胺基酸對之肽。
由完整抗體之木瓜蛋白酶消化、接著尺寸排阻層析法獲得抗LTα之Fab部分。在減少鏈間二硫化物後，藉由四極桿TOF質譜法獲得Fab之重鏈及輕鏈組份之質量。實驗性質量對應於基於重鏈及輕鏈之所得序列計算的彼等質量，各自在0.5 Da內。
嵌合體3F12.2D3之抗LTα輕鏈之序列：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSTNQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO：64)；嵌合體3F12.2D3之跨入恆定區之抗LTα重鏈可變區的序列：QGQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEISPGSGSTNYNEEFKGKATETADKSSNTAYIQLSSLSTSEDSAVYYCADGYHGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPIST(SEQ ID NO：65)，其中N為任何胺基酸殘基。
圖1C顯示此純系之輕鏈可變區，以及藉由與其他抗體之同源性而提供而非自身定序之輕鏈恆定區。圖1D顯示此純系之重鏈可變區，以及藉由與其他抗體之同源性而提供之重鏈恆定區。
2.編碼嵌合3F12之所得胺基酸序列之DNA的合成使用含有抗TGF－β單株抗體2G7之輕鏈之基因的基於pRK之質體(WO 2005/97832)作為模板，且使用上文所得到之胺基酸序列，執行若干輪寡核苷酸定向突變誘發以得到嵌合抗體3F12之輕鏈的基因。類似地，單株抗體2G7之重鏈為用於建構3F12之重鏈之模板。輕鏈及重鏈模板兩者均含有人類恆定域，輕鏈為文對於輕鏈及重鏈給出用於合成之寡核苷酸。
用於合成3F12之嵌合輕鏈之寡核苷酸： CA1845 GCT CAT AGT GAC CTT TTC TCC AAC AGA CAC AGC CAG AGA TGA TGG CGA CTG TGA CAT CAC GAT ATC TGA ATG TAC TCC(SEQ ID NO：66)CA1846 GCT GTA AGT CCA GTC AAA GTC TTT TAT ACA GTA CCA ATC AGA AGA ACT TCT TGG CCT GGT ACC AGC(SEQ ID NO：67)CA1847 GCG ATC AGG GAC ACC AGA TTC CCT AGT GGA TGC CC(SEQ ID NO：68)CA1848 GCC ACG TCT TCA GCT TTT ACA CTG CTG ATG G(SEQ ID NO：69)CA1849 GGT CCC CCC TCC GAA CGT GCG CGG GTA GGA GTA GTA TTG CTG ACA GTA ATA AAC TGC CAG GTC(SEQ ID NO：70)
用於合成3F12之嵌合重鏈之寡核苷酸： CA1850 GCT GCA GCT GAC CTT CTG AAT GTA CTC C(SEQ ID NO：71)CA1851 GCC TTG CAG GAG ATC TTC ACT GAA GCC CCA GGC TTC ATC AGC TCA GCT CC(SEQ ID NO：72)CA1852 CCC ACT CTA TCC AGT AAC TAG AGA AGG TGT ATC CAG TAG CCT TGC AGG(SEQ ID NO：73)CA1853 CCA CTT CCA GGA CTA ATC TCT CCA ATC CAC TCA AGG CCA TGT CCA GGC C(SEQ ID NO：74)CA1854 GCC CTT GAA CTC CTC ATT GTA ATT AGT ACT ACC ACT TCC AGG(SEQ ID NO：75)CA1855 CCG CAG AGT CCT CAG ATG TGA TCA GGC TGC TGA GCT GGA TGT AGG CAG TGT TGG AGG ATT TGT CTG CAG TGA ATG TTG CCT TGC C(SEQ ID NO：76)CA1856 GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GCC ATG GTA CCC GTC TGC ACA GTA ATA GAC CTC(SEQ ID NO：77)CA1871 CCA GAC TGC TGC AGC TGA CCT TGT GAA TGT ACT CCA GTT GC(SEQ ID NO：78)
因為原始3F12鼠類單株抗體具有IgG2b之同型，所以以此同型之輕鏈及重鏈之鼠類恆定域交換嵌合體中之人類恆定域，產生完全鼠類抗體。為作比較，亦建構鼠類IgG2a同型。將各變異體之輕鏈及重鏈的DNA共轉染至經腺病毒轉型之人類胚腎細胞株293中以暫時表現，且使用蛋白A親和層析法自改良性培養基純化蛋白質。在來自腹水之原始3F12單株抗體與合成muIgG2a及muIgG2b變異體之間比較在ELISA形式中與LTα之結合。
簡言之，於4℃下用50 mM碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中之2微克/毫升LTα(如上文實例1中所述)塗覆NUNC MAXISORPTM 培養盤，隔夜，且接著於室溫下用PBS中之0.5% BSA、10 PPM PROCLINTM 阻斷1小時。將樣品於含有0.5% BSA、0.05% TWEENTM 、10 PPM PROCLINTM 之PBS中之連續稀釋液於培養盤上培養2小時。洗滌後，使用3,3',5,5'－四甲基聯苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)作為受質，用結合辣根過氧化酶之抗人類Fc(Jackson ImmunoResearch)偵測經結合之抗體。於450 nm下讀取吸光度。經IgG2a及IgG2b選殖之變異體兩者均類似地與自腹水純化之3F12抗體結合，指示已合成正確序列。
3. 3F12之人化使用嵌合純系之胺基酸序列，鑑別輕鏈及重鏈之CDR殘基(Kabat)。使用寡核苷酸定向突變誘發交換含有人化抗TGFβ 2G7變體5(WO 2005/97832)之輕鏈及重鏈之編碼序列的載體上之此等CDR，從而獲得3F12之CDR交換變體。由此得到之構架序列係分別針對於VL亞群I及VH亞群III一致序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：51)－L1－WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：55)－L2－GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：53)－L3－FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：54)及EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO：46)－H1－WVRQAPGKGLEWVG(SEQ ID NO：45)－H2－RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD(SEQ ID NO：50)－H3－WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：49)。
如上文所述之表現及純化後，將CDR交換與LTα之結合與嵌合體之結合比較。CDR交換之結合幾乎完全失去。
為恢愎人化抗體之結合，使用來自CDR交換之DNA作為模板來建構突變。使用電腦產生之模型，設計此等突變以於變化可能影響抗體抗原表面之CDR構形的位置處將人類構架殘基變為其鼠類對應物。突變體及其藉由如上文所述之ELISA得知的相對結合係展示於下文表1中。將異白胺酸69變為苯丙胺酸以產生v2，結合顯著增加，變化Leu78Ala亦如此，而變化Asn73Lys無優於CDR交換之改善。將Ile69Phe與Leu78Ala組合產生變體5，在此ELISA檢定形式中其結合LTα比嵌合體少約5倍。
得到兩種變異體以使構架序列移至接近人類一致序列。具有變化Lys24Arg及Ser25Ala之變體6在結合方面與變體5等效。然而，試圖將位置94處之常見天冬胺酸變為一致精胺酸(變體7)導致結合幾乎完全失去。
＊ 此等值係相對於原始嵌合體(具有圖1B中所列之重鏈SEQ ID NO：35及重鏈可變區)，隨後發現其在重鏈之FR3中具有"額外"絲胺酸(在圖3B中SEQ ID NO：29中之位置c處的L後之絲胺酸)。去掉此絲胺酸以製造嵌合體2(具有圖1D中之SEQ ID NO：38之重鏈可變區)，且發現ELISA結合與上文相同。
所有下文所述之使用3F12嵌合體的動物研究係指原始嵌合體，而非如上文腳註中所述之嵌合體2。
4.抗體3F12之親和力成熟對於鑑別CDR中何種殘基及區可能對結合LTα最重要且因此為包含於親和力成熟之噬菌體呈現庫中的候選者而言，使用v5作為寡核苷酸定向突變誘發之單股模板來執行部分丙胺酸掃描。
如表2中所示，發現若干種殘基在突變為丙胺酸時產生與LTα之結合之損失或增加。
因此，變體14、15、17、20、21及12具有可進行變化以改善結合親和力之位置，且預期可在彼等相應位置進行保守取代(或甚至在一些情況下如由熟習技術者藉由常規測試所判定之非保守取代)以增加結合。
實例3：嵌合抗體2C8之製備及人化
1.嵌合抗體之製備選殖結合及中和LTα3及LTαβ之鼠類抗LTα抗體2C8之重鏈及輕鏈的可變區且格式化為基本上如上文實例1對於S5H3之選殖所述的鼠類/人類嵌合抗體。
對於RT－PCR而言，所用之引子係如下：2C8輕鏈：5'引子：GCC ATA GAT ATC GTR ATG CAN CAG TCT C(SEQ ID NO：79) 3'引子：TTT KAT YTC CAG CTT GGT ACC(SEQ ID NO：80)2C8重鏈：5'引子：GAT CGA CGT ACG CTG AGG TYC AGC TSC AGC TSC AGC AGT CTG G(SEQ ID NO：81) 3'引子：AC A GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GMR GAG ACD GTG ASH RDR GT(SEQ ID NO：82)。
其中K＝G或T，S＝C或G，D＝A或G或T，M＝A或C，H＝A或C或T，N為T、G、A或C(此等四種中之任何核酸)，R＝A或G，且Y＝C或T。
將輕鏈之可變域選殖至含有人類恆定域之載體pRK.LPG3.人類中，而將重鏈可變域選殖至編碼全長人類IgG1恆定域之表現載體pRK.LPG4.人類HC中。此等載體為使IgGs於293細胞中表現之先前所述載體的衍生物(Shields等人，J Biol Chem, 276：6591－6604(2000)及Gorman等人，DNA Prot Eng Tech, 2：3－10(1990))。對於抗體之暫時表現，將此等質體共轉染至293細胞或CHO哺乳動物細胞株中且如上文實例1中所述純化該蛋白。
將此嵌合抗體2C8用於下文所述之動物實驗。
2. 2C8之人化以一系列定點突變誘發步驟進行抗LTα抗體2C8之人化。使用嵌合體之可變域之序列，藉由比較此等域之胺基酸序列與已知抗體之序列(Kabat等人，同上)來鑑別輕鏈及重鏈之CDR殘基。基於序列高變性(Kabat等人，同上)定義CDR且展示於圖2中。
使用寡核苷酸定點突變誘發產生2C8之CDR交換，其中將CDR區分別添加至輕鏈及重鏈之單獨基於pRK5之載體上。此等載體含有輕鏈人類I恆定域，或對於重鏈載體而言，含有人類IgG1恆定域CH1、鉸鏈、CH2及CH3(Gorman,Current Opinion in Biotechnology, 1,(1)，第36－47頁(1990))。
與其他人化抗體之比較指示2C8之輕鏈極其類似於人化抗HER2抗體4D5之輕鏈(US 5,821,337)，而2C8之重鏈的序列類似於抗TGF－β 2G7(WO 2005/97832)。因此，將含有rhuMAb 4D5之輕鏈之載體用作用於建構2C8之輕鏈的模板。使用具有表3中所示之輕鏈序列的寡核苷酸，對源自此載體之含脫氧尿苷模板執行定點突變誘發。另外，使用寡核苷酸CA1730將構架3回復為人類I一致序列。
(所有寡核苷酸被定為編碼股之反向互補序列，因為f1 ori在pRK載體中與在基於pBR之載體中的取向相反。)
對於重鏈而言，使用表4中所示之寡核苷酸自含有人化抗體2G7之重鏈的載體(WO 2005/97832)得到含脫氧尿苷模板。使用寡核苷酸KM55、KM56及KM61將構架轉化為一致。
將包含由此得到之CDR交換v10之輕鏈及重鏈共轉染至經腺病毒轉型之人類胚腎細胞株293(Graham等人，同上)中。使用蛋白A－SEPHAROSE CL－4BTM 樹脂自培養物上清液純化抗體，接著緩衝液交換至10 mM丁二酸鈉、140 mM NaCl(pH 6.0)中，且使用CENTRICON－10TM 濃縮器(Amicon)濃縮。
對於量測CDR交換及隨後2C8變異體與人類LTα之相對結合親和力而言，如上文所述使用基於培養盤之ELISA。
如表5中所示，CDR交換v10在LTα ELISA中顯示無結合。建構變體2及隨後之變體以恢復此結合。變體2恢復等效於嵌合體之結合，但含有7個非一致殘基。研究其他變異體以獲得儘可能接近一致但仍然保持或改善相對於嵌合體之結合之構架。變體12具有等效於嵌合體之結合(根據ELISA)，或比嵌合體稍微較好之結合(根據BIACORETM 分析)，且僅保留5個非一致殘基。變體7及12之輕鏈及重鏈序列提供於圖2C中。
3. 2C8之親和力成熟與LTα之親和力改善的人化2C8單株抗體係選自呈現於噬菌體上之單價Fab庫。產生呈現人化2C8.v2 Fab且在CDR－L3中含有終止密碼子之模板。設計寡核苷酸(列於表6中)以軟隨機化特異性CDR－L3及CDR－H3殘基。
1 軟隨機化代碼(A＝5，G＝6，C＝7且T＝8)：各簡并鹼基為70%野生型，其中添加10%等莫耳量之剩餘三種核苷酸。
對LTα之三輪分選係用於選擇性地捕捉高親和力Fab分子，其中小於2 nM與抗原結合。對於第一輪而言，於周圍溫度下針對2 μg/ml培養盤塗覆之LTα捕捉噬菌體歷時2小時。於周圍溫度下藉由用呈溶液相之2 nM生物素標記LTα捕捉噬菌體歷時30分鐘，接著捕捉於塗有中性鏈親和素(neutravidin)之培養盤上來執行第二及第三輪選擇。使用競爭性ELISA鑑別最高親和力純系。將恆定濃度之噬菌體純系(藉由固相LTα結合OD來標準化)與增加濃度之呈溶液狀態之LTα(0－50 nM)一起培養，隨後以塗有2 μg/ml LTα之培養盤捕捉。一個純系在與LTα之競爭方面較之野生型2C8.v2顯示10倍的改善。此噬粒純系之DNA測序揭示自野生型2C8序列在CDR－L3中之兩個胺基酸變化：位置89處之麩醯胺酸變為麩胺酸，及位置90處之組胺酸變為絲胺酸。藉由對野生型2C8.v7輕鏈之定點突變誘發而產生此兩個CDR－L3變化。當將v7輕鏈與2C8.v12重鏈一起轉染至293細胞中以產生2C8.v16時，所得抗體在根據ELISA之IgG與LTα的結合方面與2C8.v2相比顯示兩倍的改善(表5)。
為增強穩定性，藉由移除可能天冬胺酸異構化位點，將重鏈CDR2中之asp 53變為丙胺酸。所得2C8變異體vX在根據ELISA之與LTα之結合方面分別與2C8.v2及2C8.嵌合體相比具有3.5倍及3倍的改善(表5)。
下文表7顯示CDR－L3區中之何種殘基變化根據ELISA分析歸為結合LTα之能力。
自此表可見，最佳純系為A8、G7及H6，其均以比野生型純系高之親和力結合rhLTα。
實例4：抗LTα抗體抑制抗體誘導性關節炎(AIA)
AIA不同於下文所述之膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)之處在於注入識別II型膠原蛋白之抗體以替代注入抗原(II型牛膠原蛋白)。以此方式，防止適應性B細胞及T細胞反應以經由Fc受體及補體介導活化直接誘導巨噬細胞及嗜中性白血球之效應功能。
藉由靜脈內注射由ARTHROGEN－CIATM 小鼠B融合瘤細胞株產生之四種不同單株抗體之組合誘導小鼠之AIA。單株抗體中之三種識別叢集於CB11之84個胺基酸殘基之片段LyC2(II型膠原蛋白之最小關節源性片段)內之自體抗原性抗原決定基，且第四種單株抗體與LyC1反應。所有四種抗體識別由各種II型膠原蛋白共有之保守抗原決定基且與同源及異源II型膠原蛋白交叉反應。
所有組(n＝5/組)於第0天以靜脈內注射接受單株抗體於100 μl PBS中之2 mg混合物，接著於第3天接受於50 μl PBS中之25 μg LPS(腹膜內)。於第－1天(預防性)或第4天(治療性)用10 mg/kg對照同型(抗豬草)、倉鼠－鼠類嵌合LTα抗體S5H3(作為抗人類LTα抗體之替代物)、抗LT.Fc突變體(如下文所述在Fc區中具有DANA突變之抗LTα抗體)或TNFRII.Fc(TNFR.Ig免疫黏附素)經腹膜內或經皮下治療動物。監測爪之腫脹歷時14天。給出每一爪0－4之評分，每隻動物最大總共為16分。
用於此實例及下文其他實例中之抗LT.Fc突變體中的DANA突變係指小鼠或人類IgG之Fc區中的兩個單一位置變化。此等變化為在位置265處D(天冬胺酸)變為A(丙胺酸)及在位置297處N(天冬醯胺酸)變為A(丙胺酸)。藉由基於PCR之定點突變誘發方法(GENE TAILORTM ,Invitrogen Corp.)經由將丙胺酸殘基引入小鼠或人類IgG之位置265及297來建構DANA突變體。
圖4A顯示上文所述之各組之預防性治療的平均臨床評分與誘導後天數之函數關係。可見S5H3抗體在包括TNFRII.Fc及抗LT.Fc突變分子之所有治療組之此模型中最有效。因此，抗體S5H3顯著抑制此抗體誘導模型中之關節炎的發展。具有Fc DANA突變之抗LTα(抗LT.Fc突變體)無功效，此指示LTα表現細胞之Fc介導性殺死為產生功效所需的(圖4A)。
圖4B顯示上文所述之各組之治療性治療的平均臨床評分與誘導後天數之函數關係。結果顯示當治療性投予時，與所測試之其他分子相比，在此抗體誘導性模型中S5H3抗體顯著抑制關節炎的發展。
總之，用倉鼠－小鼠嵌合體S5H3治療之動物與用S5H3.DANA或對照物治療之動物相比具有顯著降低之臨床評分。S5H3在此動物模型中展現預防性及治療性功效兩者。
實例5：抗LTα抑制膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)
在RA中，多個關節之滑膜可變得發炎，從而導致損壞包括骨及軟骨之關節組織。RA之滑膜實質上可具高度發炎性且特徵通常為淋巴細胞及單核細胞浸潤、T細胞及抗原呈遞細胞(APC)活化、B細胞免疫球蛋白(Ig)分泌及原發炎性細胞因子產生(Potocnik等人，Scand.J.Immunol., 31：213(1990)；Wernick等人，Arthritis Rheum., 28：742(1985)；Ridley等人，Br.J.Rheumatology, 29：84(1990)；Thomas等人，J.Immunol., 152：2613(1994)；及Thomas等人，J.Immunol, 156：3074(1996))。長期發炎滑膜通常伴隨大量CD4 T細胞浸潤(Pitzalis等人，Eur.J.Immunol., 18：1397(1988)及Morimoto等人，Am.J.Med., 84：817(1988))。
膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)係人類RA之動物模型，其類似人類疾病，且可藉由用異源II型膠原蛋白(CII)免疫在易感染品系之小鼠中誘導(Courtenay等人，Nature, 283：665(1980)及Cathcart等人，Lab.Invest., 54：26(1986))。CD4 T細胞及CII之抗體兩者均為逐漸形成CIA所需的。將抗CII轉移至未處理動物僅導致完全不同於CIA之部分組織病變，且並不逐步顯現CIA之全部症狀(Holmdahl等人，Agents Action, 19：295(1986))。相反，將CD4 T細胞及抗CII抗體兩者自經CII免疫之小鼠接受性轉移至未處理受體會完全重新構成典型CIA症狀(Seki等人，J.Immunol., 148：3093(1992))。CIA涉及T細胞及抗體兩者亦與CIA之發炎關節的組織病理學所見一致。因此，阻斷B細胞或T細胞功能或抑制由T細胞誘導之原發炎性細胞因子的藥劑可有效防止或治療關節炎。實際上，CD4 T細胞之消減、CD40－CD40L相互作用之阻斷、TNF－α之中和或IL－1受體之阻斷可導致預防小鼠之CIA(Maini等人，Immunol.Rev., 144：195(1995)；Joosten等人，Arthritis Rheum., 39：797(1996)；及Durie等人，Science, 261：1328(1993))。
在本文中所用之CIA模型中，於第0天及第21天用100 μl完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)中之100 μg II型牛膠原蛋白經皮內使DBA－1J小鼠免疫。於免疫後第24天，隨機地將小鼠分為治療組。用100 μl中之6 mg/kg抗豬草IgG2a單株抗體(對照抗體)或用100 PBS中之4 mg/kg倉鼠－小鼠嵌合抗LTα抗體(S5H3)、抗LTα.Fc突變體或者鼠類TNFRII－Ig經皮下治療動物。每週治療動物三次歷時研究之持續時間。對於每一關節而言使用1－4之分級系統，每日檢查動物之四肢的關節浸潤徵象，得到最大評分16。
在CIA預防性模型中，在多達70天之時段中，與抗S5H3.DANA Fc突變體及同型對照(抗豬草IgG2a單株抗體)相比，使用倉鼠－鼠類抗LTα抗體S5H3及TNFRII.Fc降低平均臨床評分。參見圖5A，顯示抗體S5H3與TNFR.Ig在CIA預防性鼠類模型中的可比性功效。
圖5B顯示於此治療性CIA鼠類模型中在90天內倉鼠－鼠類嵌合抗LTα抗體(S5H3)與TNFRII.Fc之可比性功效，該功效在降低平均臨床評分方面比同型對照好得多。此等結果以及圖5A中之彼等結果顯示認為本文中之抗體適用於防止諸如RA之自體免疫疾病且在該等疾病中為有效的。預期本文中之抗LTα抗體將有效防止及治療一般對包括TNFR.Ig及抗TNFα抗體之TNF療法不起反應之彼等患者的RA，以便使可用該等抗體預防性及有效地治療該等無反應者。
實例6：抗LTα延緩MBP－TCR轉殖基因小鼠之腦脊髓炎(EAE)疾病之發作及嚴重化
實驗性自體免疫/過敏性腦脊髓炎(EAE)為與MS具有相似性之中樞神經系統的發炎性病狀。在兩種疾病中，循環白血球穿透血腦屏障且損傷髓鞘，導致神經傳導減弱及麻痹。EAE鼠類模型(轉殖基因小鼠預防性模型)已被描述為人類MS之模型(Grewal等人，Science, 273：1864－1867(1996))。
用100 μl CFA中之10 μg MBPAc1－11 經皮下使MBPAc1－11 T細胞受體轉殖基因小鼠(自由Dr.Richard Flavell,Howard Hughes Medical Institute,Yale University獲得之動物繁殖對繁殖之10至15週齡雄性及雌性成年MBP－TCR轉殖基因小鼠)免疫。於第1天及第2天，另外用200奈克/100微升/小鼠之百日咳毒素經腹膜內注射所有小鼠。於第0天，小鼠(n＝10/組)每週三次接受於100 μl中之6 mg/kg抗gp120 IgG1單株抗體(對照抗體)或倉鼠－小鼠嵌合體抗LTα抗體S5H3(腹膜內方式)且接著接受於100 μl PBS中之6 mg/kg(皮下方式)。
針對臨床徵象使用以下分級系統每日對動物進行評估：0－正常小鼠，無外顯疾病徵象；1－尾巴貼地或後肢無力，但不同時存在；2－尾巴貼地及後肢無力；3－部分後肢麻痹；4－完全後肢麻痹；5－瀕死。
結果展示於圖6中。在研究期間，經抗LTα治療之小鼠的疾病評分比對照組低，僅達到臨床評分3(相較於對照組之臨床評分超過4分)。結果顯示抗體S5H3在此等轉殖基因小鼠中延緩EAE疾病之發作及嚴重化，從而表明抗體治療保護小鼠免於患上外顯EAE。
實例7：抗LTα抗體治療並不影響指示安全性之T細胞依賴性抗體同型反應
對靜脈內注射之三硝基苯酚(TNP)－FICOLLTM 之免疫反應在多數小鼠品系中極高，此允許吾人藉由量測小鼠體內之各種同型含量來檢定投予該等小鼠之抗體的相對安全性。
於第0天，用100 μl PBS中之6 mg/kg抗豬草同型對照、倉鼠－小鼠抗LTα抗體(S5H3)、抗LT.Fc突變體或CTLA4－Fc(作為陽性對照)經腹膜內治療BALB/c小鼠(n＝12/組)。治療每週三次，持續5週。於第1天每隻小鼠用2 mg明礬中之TNP－OVA(100 μg)經腹膜內使小鼠免疫，且於第29天每隻小鼠用PBS中之TNP－OVA(50 μg)經腹膜內使小鼠免疫。於第0、14及35天收集血清以藉由標準ELISA測定抗TNP Ig同型IgM、IgG1及IgG2a。
圖7A－7C(其中將數據分別表示為抗TNP IgM、IgG1及IgG2a之Log10效價)中所示之結果指示同型對照、S5H3抗體及DANA Fc突變抗體對於每一同型含量展現類似圖案，而CTLA4.Fc免疫黏附素表現不同。此指出在患者體內將存在對投予本文中之S5H3抗體的極少(若存在)免疫反應。
實例8：抗LTα抗體治療並不影響指示安全性之T細胞非依賴性抗體同型反應
於第0天以於100 μl PBS中之6 mg/kg抗豬草(IgG2a同型對照)、倉鼠－小鼠抗LTα抗體(S5H3)或TNFRII.Fc經腹膜內治療BALB/c小鼠(n＝10/組)。治療每週三次，持續10天。於第1天用100 μl PBS中之TNP－FICOLLTM (100 μg)(i.p.)經腹膜內使小鼠免疫。於第0及10天收集血清以藉由標準ELISA測定抗TNP Ig同型IgM、IgG1、IgG2a及IgG3。
圖8(其中將數據表示為Log10效價)顯示同型對照、S2C8抗體及TNFRII.Fc免疫黏附素對於IgM、IgG1、IgG2a及IgG3同型均表現類似。此進一步證明本文中之抗體對於活體內投予的安全性。
實例9：抗LTα抗體防止人類SCID移植物抗宿主疾病(GVHD)
移植物抗宿主疾病(GVHD)在將免疫活性細胞移植至免疫抑制或耐受患者中時發生。供體T細胞識別宿主抗原且變得活化，分泌細胞因子，增殖並分化為效應細胞。此反應被稱為移植物抗宿主反應(GVHR)。該GVHR反應係多器官症候群，且影響可自危急生命之嚴重炎症至腹瀉及重量減輕之輕度情況變化。已將小鼠之GVHD模型用於模仿在骨髓移植後發生之急性及慢性GVHR之臨床病症及自體免疫疾病。通用程序係描述於Current Protocols in Immunology ，同上，第4.3單元中。
藉由FICOLLTM 多醣梯度，用自正常供體之LEUKOPACKTM (可得自血庫，諸如Interstate Blood Bank,Memphis,TN)純化之人類PBMC重新構成SCID小鼠。使用銫137來源以350雷得(rad)亞致死地照射所有小鼠(n＝10/組)。在照射後兩小時，用200 μl PBS中之5千萬人類PBMC/小鼠經靜脈內注射小鼠。在細胞注射後立即用100 μl生理食鹽水中之300 μg曲妥珠單抗(trastuzumab)(人類IgG1同型對照抗體)、抗LTα嵌合抗體2C8或CTLA4－Fc經腹膜內治療小鼠每週兩次，歷時三週。照射後將POLYMYXINTM B(110毫克/公升)及NEOMYCINTM (1.1公克/公升)抗生素添加至飲用水中歷時5天。如藉由存活率所指示，監測小鼠之GVHD。
結果係展示於圖9中，且指示與同型對照相比，2C8抗體顯著增加人類SCID小鼠之存活率(防止GVHD)，與抗LTα 2C8 Fc突變體及同型對照相比，CTLA4.Fc免疫黏附素在此模型中於所測試之分子中為最佳。因此，預期本文中之抗LTα抗體適用於防止及/或治療移植物抗宿主疾病。此外，結果顯示LTα陽性細胞之消減在此模型中為產生功效所需的，因為2C8 Fc突變體(DANA)並不顯示功效。
實例10：抗LTα單株抗體與LTα3結合
用50 mM碳酸鹽緩衝溶液中之1 μg/ml人類LTα3塗覆微量滴定孔(100微升/孔)隔夜。自該等孔輕輕倒出未吸收之溶液。用150 μL含有5 mg/ml牛血清白蛋白之PBS(PBS－BSA)阻斷孔歷時1－2小時。將稀釋於PBS－BSA中之100 μL經適當稀釋之測試樣品(抗LTα嵌合抗體2C8或3F12)添加至每一孔中，培養一小時，且用含有0.05% TWEENTM －20界面活性劑之PBS洗滌。接著將100 μL於PBS－BSA緩衝液中之經生物素標記之大鼠抗小鼠IgG添加至每一孔中且培養一小時。接著用PBS/0.05% TWEENTM －20界面活性劑洗滌培養盤，且將抗生蛋白鏈菌素－辣根過氧化酶(SA－HRP)添加至每一孔中歷時30分鐘。用PBS/0.05% TWEENTM －20界面活性劑洗滌每一孔，且用四甲基聯苯胺(TMB)/H2 O2 之溶液量測經結合之HRP。15分鐘後，藉由添加100 μl 1 M磷酸中止反應。以650 nm為參考波長，讀取450 nm下之吸光度。
圖10A顯示嵌合抗LTα抗體2C8及3F12與人類LTα3結合。
使用鼠類LTα3替代人類LTα3及倉鼠－小鼠嵌合抗LTα抗體S5H3及抗LT.Fc突變體作為測試結合能力之抗體來重複上述程序。圖10B顯示S5H3及抗LTα.Fc突變體兩者均與鼠類LTα3結合。
實例11：抗LTα抗體與LTα1β2結合
對於LTαβ ELISA而言，用50 mM碳酸鹽緩衝溶液中之1 μg/ml鼠類LTα1β2塗覆微量滴定孔(100微升/孔)隔夜。自該等孔輕輕倒出未吸收之溶液。用150 μL含有5 mg/ml牛血清白蛋白之PBS(PBS－BSA)阻斷孔歷時1－2小時。將100 μL經適當稀釋之測試樣品(稀釋於PBS－BSA中之抗LTα嵌合抗體S5H3或抗LTα.Fc突變體)添加至每一孔中，培養一小時，且用含有0.05% TWEENTM 20界面活性劑之PBS洗滌。接著將100 μL於PBS－BSA緩衝液中之經生物素標記之大鼠抗小鼠IgG添加至每一孔中且培養一小時。接著用PBS/0.05% TWEENTM －20界面活性劑洗滌培養盤，且將抗生蛋白鏈菌素－辣根過氧化酶(SA－HRP)添加至每一孔中歷時30分鐘。用PBS/0.05% TWEENTM －20界面活性劑洗滌每一孔，且用四甲基聯苯胺(TMB)/H2 O2 之溶液量測經結合之HRP。15分鐘後，藉由添加100 μl 1 M磷酸中止反應。以650 nm為參考波長，讀取450 nm下之吸光度。
圖11A顯示抗LTα嵌合抗體S5H3與鼠類LTα1β2複合物結合，抗LT.Fc突變體亦如此。
使用FACS檢定測定抗LTα抗體與細胞表面上與LTβ複合之LTα的結合。對於人類LTαβ而言，用全長人類LTα及人類LTαβ(人類LTα序列GenBank Ref NM_000595；人類LTβ序列GenBank Ref NM_002341)轉染293細胞以產生穩定人類LTαβ表現細胞株。將細胞與1－5 μg/ml之抗LTα嵌合抗體3F12或2C8、人類LTβR.huIgG1或huIgG1同型對照(曲妥珠單抗)於具有2% FBS之PBS中一起培養20分鐘。將細胞洗滌且與抗人類Ig－PE二次抗體一起培養以進行偵測。
對於鼠類LTαβ而言，用全長鼠類LTα及鼠類LTαβ(鼠類LTα序列GenBank Ref NM_010735；鼠類LTβ序列GenBank Ref NM_008518)轉染SVT2細胞以產生穩定鼠類LTαβ表現細胞株。於具有2% FBS之PBS中用直接與ALEXA－647TM 螢光團結合之倉鼠－鼠類嵌合體S5H3、抗LT.S5H3.Fc突變體、muLTβR.IgG2a或同型對照(抗IL122 muIgG2a)偵測表面LT，歷時20分鐘。將細胞洗滌，吸出，且再懸浮於具有2% FBS之PBS中。以FACSCALIBURTM (雙雷射器)使用CELLQUESTTM 軟體分析細胞，且以FLOWJOTM 分析器(Treestar)分析結果。
圖11B顯示嵌合抗LTα抗體3F12及2C8如何較好地與人類細胞表面上與LTβ複合之LTα結合。將其與LTβ－受體.huIgG1及同型對照huIgG1(曲妥珠單抗)比較。所有人類抗體均結合表面LTα。
圖11C顯示倉鼠－鼠類抗LTα抗體S5H3如何較好地與鼠類細胞表面上與LTβ複合之LTα結合。將其與LTβ－受體鼠類IgG2a、抗LT S5H3 Fc突變體及同型對照(抗IL122 muIgG2a)比較。所有鼠類抗體均結合表面LTα。
實例12：抗LTα抗體與人類Th1、Th2及Th17細胞結合
當CD4＋T細胞自胸腺成熟且進入周邊淋巴系統中時，其通常在遇到對其T細胞受體具特異性之抗原前維持其未處理表型(Sprent等人，Annu Rev Immunol. 20：551－79(2002))。與由APC提供之特異性抗原的結合引起T細胞活化。視環境及細胞因子刺激而定，CD4＋T細胞分化為Th1或Th2表型且變成效應或記憶細胞(Sprent等人，同上及Murphy等人，Nat Rev Immunol. 2(12)：933－44(2000))。此過程被稱為初次活化。經歷初次活化後，CD4＋T細胞變成效應或記憶細胞，其維持其Th1或Th2之表型。此等細胞再次遇到抗原後，其經歷二次活化，但此次對抗原之反應將比初次活化快且導致產生如由初次活化所測定之效應細胞因子(Sprent等人，同上及Murphy等人，同上)。
對於初次活化條件而言，藉由抗CD3、抗CD28及特異性細胞因子活化未處理T細胞，此視是否正在檢查Th1或Th2而定。尤其，藉由用培養盤結合之抗CD3及抗CD28(分別為10 μg/ml及5 μg/ml；BD PharMingen)刺激人類PBMC來產生人類Th1及Th2細胞株。於第1天，為誘導Th2分化，添加介白素(IL)－4(5 ng/ml；R&D Systems Inc.)、抗IL－12(5 μg/ml；R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)及抗干擾素(IFN)－γ(5 μg/ml；R&D Systems Inc.)。對於Th1分化而言，於第1天添加IL－12(1 ng/ml；R&D Systems Inc.)、IFN－γ(10 ng/ml；R&D Systems Inc.)及抗IL－4(1 μg/ml；R&D Systems Inc.)。於第7及14天再刺激細胞兩次。
為FACS分析細胞表面染色以測定抗體與Th1及Th2之結合，在最終刺激後2天，於具有2% FBS之PBS中將經活化之人類T細胞(Th1/Th2細胞株)與均直接與ALEXA FLUOR647螢光團(Invitrogen Corp.)結合之抗LTα抗體2C8(1 μg/ml)、3F12(1 μg/ml)、LTβR.Fc(1 μg/ml)、TNFRII.Fc(1 μg/ml)或huIgG1同型對照(1 μg/ml)一起培養，歷時20分鐘。將細胞洗滌，吸出，且再懸浮於具有2% FBS之PBS中。以FACSCALIBURTM (雙雷射器)使用CELLQUESTTM 軟體分析細胞，且以FLOWJOTM 分析器(Treestar)分析結果。
圖12A及12B分別顯示與人類Th1及Th2細胞結合之嵌合抗LTα抗體2C8及3F12。該等圖亦顯示LTβR.Fc、TNFRII.Fc及同型對照之結合結果。
因為經由FACS分析發現LT－α3及LT－α1β2表現於人類Th17細胞以及人類Th1細胞上，所以預期本文中包括嵌合2C8、2C8.v2及2C8.vX(描述於實例3及18中)之抗LTα抗體將(類似於Th1及Th2)與人類Th17細胞結合且因此適用於治療許多自體免疫疾病，包括MS(其在鼠類模型中為EAE)及狼瘡以及RA及IBD，諸如克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎。
因此，除使用抗LTα人化抗體2C8.vX作為LTα抗體且使用Th17細胞株以及Th1細胞株而非Th2細胞株以外，執行上文所述之相同實驗。藉由用如上文所述之抗CD3及抗CD28以及IL－23(10 ng/ml；R&D Systems Inc.)、抗IFN－γ(10 μg/ml；R&D Systems Inc.)及抗IL－12(10 μg/ml；R&D Systems Inc.)刺激人類PBMC來產生人類Th17細胞株。此實驗顯示事實上抗體2C8.vX與人類Th17細胞以及人類Th1細胞結合，而非與靜止細胞結合。參見圖12C－E。
實例13：抗LTα抗體與人類細胞：T、B及NKA結合
使用FACS檢定測定抗LTα抗體與初級人類細胞表面上之LTα的結合。將人類PBMC分離且對於活化CD4及CD8細胞而言，用抗CD3及抗CD28(分別為10 μg/ml及5 μg/ml；BDPharMingen)活化2天；或對於B細胞而言，用抗IgM(10 μg/ml，R&D Systems Inc.)及IL－4(20 ng/ml；R&D Systems Inc.)活化2天。藉由陰性選擇(Miltenyi Biotec)分離NK CD56＋細胞且與IL－15(20 ng/ml；R&D Systems Inc.)一起培養15小時。
對於FACS分析而言，於具有2% FBS之PBS中將細胞與均直接與ALEXA FLUOR647螢光團(Invitrogen Corp.)結合之嵌合抗LTα抗體3F12(1 μg/ml)、人類LTβR.huIgG1(1 μg/ml)或huIgG1同型對照(曲妥珠單抗，1 μg/ml)一起培養，歷時20分鐘。將細胞洗滌，吸出，且再懸浮於具有2% FBS之PBS中。以FACSCALIBURTM (雙雷射器)使用CELLQUESTTM 軟體分析細胞，且以FLOWJOTM 分析器(Treestar)分析結果。
圖13A－13E顯示與同型對照比較，抗體與細胞結合。圖13A表示未活化之細胞，圖13B顯示經抗CD3及抗CD28活化之CD4 T細胞，圖13C顯示CD8 T細胞，圖13D顯示經IL15活化之CD56 NK細胞，且圖13E顯示經IgM及CD40L活化之CD19 B細胞。
實例14：抗LTα單株抗體在功能上阻斷LTα3
1.人類及鼠類LTα3之阻斷用50 mM碳酸鹽緩衝溶液中之0.7 μg/ml人類TNFRII.huIgG1(ENBREL)塗覆微量滴定孔(100微升/孔)隔夜。自該等孔抽吸未吸收之溶液。捕捉經生物素標記之LTα3(鼠類或人類)且用抗生蛋白鏈菌素－辣根過氧化酶(HRP)偵測。對於中和人類LTα3而言，於指定濃度下將增加劑量之嵌合抗LTα抗體2C8或3F12或對照同型(曲妥珠單抗)與LTα3一起預培養1小時，隨後添加至經塗覆之微量培養盤中。進行相同程序以使用倉鼠－小鼠嵌合抗LTα抗體S5H3或抗LT.Fc突變體或對照同型(曲妥珠單抗)中和鼠類LTα3。用PBS/0.05% TWEENTM －20界面活性劑洗滌每一孔，且用四甲基聯苯胺(TMB)/H2 O2 之溶液量測經結合之HRP。15分鐘後，藉由將100 μl 1 M磷酸添加至每一孔中來中止反應。以650 nm為參考波長，讀取450 nm下之吸光度。
圖14A顯示與同型對照比較，抗LTα抗體2C8及3F12在功能上阻斷人類LTα3。圖14B顯示與同型對照比較，抗LTα抗體S5H3及抗LT.Fc突變體在功能上阻斷鼠類LTα3。
2. A549細胞中LTα3誘導IL－8之阻斷在LTα3存在下將上皮細胞株(A549)培養24小時。藉由添加至適當孔中之抗LTα抗體的連續稀釋液(10－0 μg/ml)來測定用嵌合抗LTα抗體2C8及3F12中和LTα3之效應。使用上清液以標準ELISA偵測IL－8。
圖14C顯示與同型對照(曲妥珠單抗IgG1)比較，嵌合抗LTα抗體2C8及3F12阻斷A549細胞中LTα3誘導之IL－8。
3. HUVEC上LTα3誘導性ICAM表現之阻斷在LTα3存在下將HUVEC細胞培養24小時。藉由添加至適當孔中之抗LTα抗體的連續稀釋液(10－0 μg/ml)來測定用嵌合抗LTα抗體2C8及3F12中和LTα3之效應。藉由FACS測定ICAM－1之細胞表面表現，展示為平均螢光強度。使用TNFRII.Fc作為對照。
圖14D顯示與同型對照(曲妥珠單抗IgG1)比較，抗LTα抗體2C8及3F12以及TNFRII.Fc突變體阻斷HUVEC上之LTα3誘導性ICAM表現。亦顯示對未受刺激之細胞的效應。
4. LTα3誘導性NFkB活化之阻斷為判定是否抗LTα抗體阻斷LTα3經由TNF受體之信號轉導，將293細胞株於DMEM：F12 50：50(＋10% FBS、麩醯胺酸、P/S)中培養至75%融合。使用標準轉染技術(Fugene)用標準NFkB－RE－螢光素酶報導構築體轉染細胞。24小時後，將該等細胞洗滌，且接著用LTα3(100 ng/ml)或用與LTα3一起預培養30分鐘之嵌合抗LTα抗體2C8的連續稀釋液(10－0 μg/ml)刺激。6小時後，用PBS洗滌細胞，且如下量測螢光素酶活性：添加LYSIS BUFFERTM (Promega，125微升/孔)歷時15分鐘。收集溶胞物且分三份以20微升/孔轉移至96孔檢定培養盤(高度結合，白色聚苯乙烯，COSTARTM )中且在注射LUCIFERASE ASSAY REAGENTTM 及STOP AND GLO BUFFERSTM (Promega)後於LMAXIITM 培養盤讀取器(Molecular Devices)中讀取。所用之同型對照為曲妥珠單抗IgG1。
圖14E顯示與同型對照比較，抗LTα抗體2C8阻斷LTα3誘導性NFkB活化。亦顯示對未受刺激之細胞的效應。
實例15：抗LTα抗體在功能上阻斷LTα1β2
1. LTα誘導性NFkB活化之阻斷為判定是否抗LTα抗體阻斷LTα1β2經由LTβR之信號轉導，將293細胞株於DMEM：F12 50：50(＋10% FBS、麩醯胺酸、P/S)中培養至75%融合。使用標準轉染技術(Fugene)用標準NFkB－RE－螢光素酶報導構築體轉染細胞。24小時後，將該等細胞洗滌，且接著用LTα1β2(R&D Systems Inc.；100 ng/ml)或用與LTαβ一起預培養30分鐘之嵌合抗LTα抗體2C8之連續稀釋液(10－0 μg/ml)刺激。6小時後，用PBS洗滌細胞，且如下量測螢光素酶活性：添加LYSIS BUFFERTM (Promega，125微升/孔)歷時15分鐘。收集溶胞物且分三份以20微升/孔轉移至96孔檢定培養盤(高度結合，白色聚苯乙烯，COSTARTM )中且在注射LUCIFERASE ASSAY REAGENTTM 及STOP AND GLO BUFFERSTM (Promega)後於LMAXIITM 培養盤讀取器(Molecular Devices)中讀取。所用之同型對照為曲妥珠單抗IgG1。
FIG.15A顯示與同型對照比較，抗LTα抗體2C8在功能上阻斷LTα1β2誘導性NFkB活化。亦顯示未受刺激之細胞的反應。
2. LTα3、LTα2β1及LTα1β2誘導性細胞毒性之阻斷在鼠類L929細胞毒性檢定中檢定測試樣品中和LTα3、LTα2β1及LTα1β2(R&D Systems Inc.)之細胞溶解活性的能力。在三種LTα試劑中之一(劑量於圖15B－D中指出)及DNA抑制劑放線菌素－D存在下將L929細胞培養於微量滴定培養盤中。將10 μg/ml之中和嵌合抗LTα抗體2C8添加至培養物中。藉由活細胞之標準ALAMARBLUETM 染色測定細胞溶解作用且表示為相對螢光單位(RFU)。
圖15B、15C及15D顯示嵌合抗LTα抗體2C8分別阻斷LTα3、LTα2β1及LTα1β2誘導性細胞毒性。
3. HUVEC上LTα1β2誘導性ICAM表現之阻斷在LTα1β2(R&D Systems Inc.)存在下將HUVEC細胞培養24小時。藉由添加至適當孔中之嵌合抗LTα抗體2C8及3F12的連續稀釋液(10－0 μg/ml)來測定用抗LTα抗體中和LTα1β2之效應。藉由FACS測定ICAM－1之細胞表面表現。
圖15E顯示與同型對照(曲妥珠單抗IgG1)比較，嵌合抗LTα抗體2C8及3F12阻斷HUVEC上之LTα1β2誘導性ICAM表現。亦顯示對未受刺激之細胞的效應。
實例16：抗LTα單株抗體可殺死LTαβ表現細胞。
如下分兩份於微量滴定培養盤中執行ADCC檢定。使用陰性選擇(ROSETTESEPTM ，#15065，StemCell Technologies)自100 ml正常人類供體全血分離NK細胞。檢定稀釋劑為RPMITM 1640及0.25 mg/mL BSA。於室溫下將50 μl起始於100 nM之連續稀釋的嵌合抗體2C8及其Fc突變體與50 μl穩定293細胞表現人類LTαβ(20,000)一起培養(細節參見實例11)30分鐘。添加50 μL NK細胞(120,000)且於37℃下再培養4小時。以1500 rpm將培養盤離心10分鐘，且將100 μl上清液轉移至96平底微量孔培養盤中。藉由量測自溶解之細胞釋放之乳酸脫氫酶(LDH套組，#1－644－793，Roche)的量來測定細胞溶解之程度。將100 μl LDH套組反應混合物添加至100 μl上清液中且培養至多30分鐘。於490 nm下讀取培養盤。對照包括在抗體不存在下之靶細胞：效應細胞(對於抗體非依賴性溶解而言)、單獨靶細胞及1% TRITON X－100TM 界面活性劑(對於總體溶解而言)以及抗體ADCC陰性及陽性對照。
圖16顯示在ADCC檢定中抗LTα抗體2C8使293人類LTαβ表現細胞株溶解，但相應Fc突變體單株抗體並不如此。
實例17：抗LTα單株抗體阻斷3T3及HUVEC細胞中之細胞因子及趨化因子分泌
在人類LTα3(100 ng/ml；R&D Systems Inc.)或人類LTα1β2(200 ng/ml；R&D Systems Inc.)存在下分別使用人類或鼠類試劑將HUVEC及3T3細胞培養24小時。使用10－0 μg/ml之靜態劑量來測定用嵌合2C8或S5H3抗LTα抗體(對於HUVEC為嵌合2C8，對於鼠類3T3細胞為倉鼠－小鼠嵌合S5H3)中和LTα三聚體之效應。使用標準LINCOPLEXTM 套組針對人類RANTES、IL－6、IP－10及IL－8檢定上清液以作HUVEC評估；或針對鼠類RANTES、IL－6、IP－10及KC以作3T3評估，且於LUMTNEXTM 培養盤讀取器上讀取。
圖17A－H顯示與同型對照比較且與未受刺激之細胞相比，抗LTα抗體在HUVEC細胞中阻斷細胞因子及趨化因子分泌，其中圖17A－17D分別就LTα1β2而言顯示KC/IL－8、RANTES、IP10及IL－6，且圖17E－17H分別就LTα3而言顯示KC/IL－8、RANTES、IP10及IL－6。
圖17I－P顯示與同型對照比較且與未受刺激之細胞相比，抗LTα抗體在3T3細胞中阻斷細胞因子及趨化因子分泌，其中圖17I－17L分別就LTα1β2而言顯示KC、RANTES、IP10及IL－6，且圖17M－17P分別就LTα3而言顯示KC、RANTES、IP10及IL－6。
總之，本文中對抗LTα之較佳抗體：1)阻斷LTα3；2)藉由結合作為靶之LTα來消減LTα陽性細胞，該LTα於細胞表面上與LTβ複合。消減較重要之資料為比較野生型與Fc(DANA)突變體之活體內資料－對於小鼠為：CIA、AIA(圖4及5)；對於人類為：具有2C8之人類SCID小鼠(圖9)及ADCC檢定(圖16)；3)阻斷LTαβ功能；4)在不受限於任一理論之情況下，靶向任何細胞表現LTα，包括T、B及也許或可能任何Th1或Th17或Th2驅使之疾病(及NK細胞)。
預期可得益於本文中之抗體治療的疾病包括RA、IBD、牛皮癬、MS、休格連氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、格雷氏病、重症肌無力及狼瘡，尤其RA、MS、狼瘡(例如，SLE及LN)及IBD，包括克羅恩氏病及UC。
實例18：親和力成熟抗LTα抗體2C8.vX
實例3中所指之抗體2C8的親和力成熟產生人化抗體2C8.vX。此抗體之輕鏈及重鏈可變區及CDR分別連同CDR展示於圖18A及18B中。
以下為編碼抗LTα2C8.vX之全長重鏈的DNA序列：GAAGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCT TCTGGCTACACATTCACCAGCTATGTGATCCATTGGGTCCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTCGAGTGGGTTGGTTATAACAATCCTTATAACGCCGGCACCAACTATAACGAGAAGTTCAAGGGGCGCTTCACTATCAGTTCTGACAAGTCGAAAAACACAGCATACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTCGACCCACAATGCTCCCATGGTTCGCCTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：104)。
以下為編碼抗LTα 2C8.vX之全長輕鏈的DNA序列：GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGCTGTGTCTTCCGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCTGCATCCCACCGTTACACTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCGGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGGAATCTTATTCTACTCCTTGGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO：105)。
以下為2C8.vX之全長重鏈胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYVIHWVRQAPGKGLEWVGYNNPYNAGTNYNEKFKGRFTISSDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRPTMLPWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：106)。
以下為2C8.vX之全長輕鏈胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASHRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQESYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：107)。
抗原決定基定位指示此分子具有與受體結合位點之部分重疊。活化之恆河猴T細胞及B細胞表現表面LTαβ。抗體2C8.vX結合恆河猴表面LTαβ(與其交叉反應)(如由FACS判定)及恆河猴可溶性LTα3(與其交叉反應)(如由FORTEBIOTM 八隅體判定)。
圖19A及19B分別顯示與同型對照/TNFRII.Fc相比，2C8.vX抗體之LTα3及LTα1β2結合的ELISA。以與上文使用人類LTα3之實例10及使用LTα1β2之實例11中所述相同的方法執行此等ELISA。此等相同抗體對於LTα3及LTα1β2之EC50 值中對於LTα3之TNFRII.Fc的EC50 值為1.03 nM且對於LTα3之2C8.vX的EC50 值為0.05 nM，而TNFRII.Fc與LTα1β2無結合且對於LTα1β2之2C8.vX的EC50 值為0.34 nM。在兩種情況下，結果顯示2C8.vX比TNFRII.Fc結合好得多。
圖20A及20B分別顯示使用用於測試上文實例15中所述之人類LT誘導性細胞毒性之阻斷的檢定，與同型對照/TNFRII.Fc相比，2C8vX抗體對人類LTα3及LTα1β2之阻斷。此等相同抗體對於LTα3及LTα1β2之IC50 值中對於LTα3之TNFRII.Fc的IC50 值為0.83 nM且對於LTα3之2C8.vX的IC50 值為0.29 nM，其中無同型阻斷，並對於LTα1β2之2C8.vX為0.31 nM，其中無同型阻斷。結果顯示2C8.vX阻斷LTα3比TNFRII.Fc阻斷LTα3好。
圖21係關於使用上文實例14所述之方案顯示由HUVEC細胞上之LTα3抑制ICAM1上調的功能性檢定。圖21顯示在此功能性檢定中各種分子如何阻斷LTα3之比較。具體而言，比較同型對照、2C8.vX及TNFRII.Fc。結果顯示在此檢定中兩種抗體均能夠阻斷LTα3。
圖22係關於使用上文實例15中所述之方案顯示使用293－LTβR細胞阻斷LTα1β2之功能性檢定。圖22顯示在此功能性檢定中各種分子如何阻斷LTα1β2之比較。具體而言，比較同型對照及2C8.vX以及未受刺激之細胞。結果顯示在此檢定中2C8.vX能夠阻斷LTα1β2，IC50 為約5 nM。
圖23顯示使用實例16中所述涉及293－LTα1β2細胞之方案的2C8.vX之ADCC活性。將2C8.vX與2C8.vX DANA突變體及同型對照比較。結果顯示2C8.vX具有ADCC活性，而DANA突變體並不具有ADCC活性。
圖24顯示在人類SCID模型中使用如上文實例9中所述之相同方案，在三至四週內結束，與對照(Fc突變體及同型對照)相比，對於2C8.vX及CTLA4－Fc之GVHD存活率結果。結果指出在此模型中CTLA4－Fc及2C8.vX延長存活率，且因此有效消減LTα細胞，但對照2C8.vX－DANA突變體及人類IgG1同型對照抗體並不如此。
圖25A－D顯示在人類SCID GVHD模型中2C8.vX抗體消減LTα1β2表現T細胞及B細胞。在此方案中，藉由FICOLLTM 多醣梯度，用自正常供體之LEUKOPACKTM (可得自血庫，諸如Interstate Blood Bank,Memphis,TN)純化之PBMC重新構成SCID小鼠。使用銫137來源以350雷得(rad)亞致死地照射所有小鼠(n＝10/組)。在照射後兩小時，用200 μl PBS中之5千萬人類PBMC/小鼠經脾內注射小鼠。在細胞注射後一天，用100 μl生理食鹽水中之300 μg人類IgG1同型對照抗體、2C8.vX或2C8.vX DANA突變體經腹膜內治療小鼠，歷時一天。照射後第2天，用5－(及6－)羧基螢光素二乙酸鹽丁二醯亞胺基酯(CFSE)標記小鼠之脾細胞，且量測絕對細胞數目(總CFSE陽性細胞)且在對CD4＋ 、CD8＋ 及CD19＋ 細胞電子設門後量測於CFSE峰值時之細胞百分比。對於此三色染色而言，使用以下單株抗體：PE標記之抗CD4、PE標記之抗CD8及PE標記之CD19。以FACSCANTM 或FACSCALIBURTM 儀器分析經染色之細胞。
圖25A中之結果顯示第2天時同型對照、2C8.vX及2C8.vX.DANA突變體之總CFSE陽性人類細胞，且指出vX抗體之消減最好。圖25B－D分別顯示使用CD4、CD8及CD19抗體設門之結果，指出與同型對照及DANA突變體相比，vX抗體在消減LTαβ陽性T細胞及B細胞方面最好。
總之，在活體外ADCC檢定及活體內兩種人類SCID GVHD模型中抗體2C8.vX消減LT表現細胞。在分別使用HUVEC細胞及293－LTβR細胞之功能性細胞檢定中，其亦阻斷LTα3及LTα1β2。此外，如由活化之恆河猴初級細胞及LTα3恆河猴蛋白所測定，其與非人類靈長類(NHP)淋巴毒素交叉反應。
實例19：親和力成熟抗LTα抗體3F12.v14
上文所示之抗體3F12的親和力成熟產生人化抗體3F12.v14。此抗體之輕鏈與重鏈可變區及CDR分別連同CDR展示於圖26A及26B中。
當使用上文所示之檢定測試結合及阻斷LTα3及LTαβ時，3F12.v14如抗體2c8.vX般結合及阻斷此等分子。
實例20：無岩藻糖基化2C8.vX
本文中之抗體可經改變以便藉由使用以下文獻中所揭示之細胞株或技術對其進行培養而使其缺乏岩藻糖：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；US 2006/0063254；US 2006/0064781；US 2006/0078990；US 2006/0078991；Okazaki等人J.Mol.Biol. 336：1239－1249(2004)；或Yamane－Ohnuki等人Biotech.Bioeng. 87：614－622(2004)。產生脫岩藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys., 249：533－545(1986)；US 2003/0157108 A1(Presta)及WO 2004/056312 A1(Adams等人，特定言之在實例11))，及基因剔除細胞株，諸如α－1,6－岩藻糖基轉移酶基因(FUT8) 剔除CHO細胞(Yamane－Ohnuki等人，同上)。
事實上，將抗體2C8.vX無岩藻糖基化以產生稱為抗LTα 2C8.vX AF之抗體。使用藉由Yamane－Ohnuki等人，同上中之方法所述之具有FUT8 剔除基因的穩定CHO細胞株產生此分子。其100%經無岩藻糖基化。
2C8.vX之生物物理學特性(包括阻斷及結合資料)在其無糖基化後除ADCC以外大體上無變化。藉由使用實例16中所述涉及293－LTα1β2細胞之方案進行實驗來測定野生型及無岩藻糖基化分子之ADCC特性。結果展示於圖27中。該圖顯示無岩藻糖基化抗體抗LTα 2C8.vX AF超過野生型(WT)抗體(如上文所述之正常CHO細胞株產生)約有十倍的增加。
實例21：低岩藻糖基化2C8.vX
作為達成哺乳動物細胞中未岩藻糖基化抗體之高產率的替代方式，可利用RNAi方法敲除FUT8 基因之表現。可使用質體產生由對FUT8 之基因具特異性之19 nt(核苷酸)有義siRNA序列組成的短髮夾siRNA，其藉由短間隔基(9 nt髮夾環)、接著3'末端處之5－6個U'與其反向互補反義siRNA序列連接。
四種不同RNAi探針經設計以靶向基於可得到之CHOFUT8 DNA序列的不同區。
對於測試此等RNAi探針之功效而言，使用可得到之CHOFUT8 DNA序列(Genbank寄存編號第P_AAC63891號)建構FLAG標記之FUT8 融合蛋白。用FUT8 引子執行RT－PCR且所得PCR片段與5'FLAG標記序列融合。將經標記之FUT8 片段選殖至表現載體中。將RNAi探針質體及flag標記之FUT8 質體共轉染至CHO細胞中。轉染後24小時提取細胞溶胞物且藉由免疫墨點法(immuno－blotting)使用抗flag M2抗體分析FUT8 融合蛋白量。在RNAi探針存在下，預期融合蛋白表現在大多數情況下得到顯著抑制。
將兩種顯示最好抑制效應之探針轉染至表現如本文中所述之抗體(諸如2C8.vX)的CHO細胞株中。藉由蛋白A管柱純化所表現之抗LT－α抗體且提交如下文所述之天冬醯胺酸連接寡醣之基質輔助雷射脫附/離子化飛行時間(Matrix－Assisted Laser Desorption/Ionization Time－of－flight，MALDI－TOF)質譜分析(包括岩藻糖含量)及FcγR結合檢定。
通常如下進行藉由MALDI－TOF分析寡醣之方法：使用Papac等人，Glycobiology 8,445－454(1998)之肽－N－糖苷酶－F(PNGase F)程序自重組醣蛋白釋放N連接寡醣。簡言之，用100 μl甲醇調節96孔聚偏二氟乙烯(PVDF)作襯之微量滴定培養盤(Millipore,Bedford,MA)之孔，該甲醇係藉由向MILLIPORETM 多孔真空歧管施加真空而經由PVDF膜吸取。用3×250 μl水洗滌經調節之PVDF膜。在所有洗滌步驟之間，藉由向該歧管施加平緩真空來完全排乾該等孔。用由6 M鹽酸胍、360 mM TRIS緩衝液、2 mM EDTA(pH 8.6)組成之還原及羧甲基化作用緩衝液(RCM)洗滌該等膜。將醣蛋白樣品(50 μg)塗覆於個別孔，又藉由平緩真空經由PVDF膜抽吸且用2×50 μl RCM緩衝液洗滌孔。藉由將50 μl 0.1 M二硫蘇糖醇(DTT)溶液添加至每一孔中且於37℃下將微量滴定培養盤培養1 hr來還原固定樣品。藉由真空移除DTT且用4×250 μl水洗滌孔。藉由添加新鮮製備於1 M NaOH中且用RCM緩衝液稀釋至0.1 M之50 μl 0.1 M碘乙酸(IAA)溶液將半胱胺酸殘基羧甲基化。
藉由於周圍溫度下在黑暗中培養30 min來完成羧甲基化。向培養盤施加真空以移除IAA溶液且用4×250 μl純水洗滌孔。藉由添加100 μl 1% PVP－360TM (聚乙烯吡咯啶360,000 MW)(Sigma)溶液且於周圍溫度下培養30分鐘來阻斷PVDF膜。藉由平緩真空移除PVP－360TM 溶液且用4×250 μl水洗滌孔。將肽：N－糖苷酶F(PNGase FTM )醯胺酶(New England Biolabs,Beverly,MA)以25 μl於10 mM TRIS乙酸鹽(pH 8.3)中之25單位/毫升溶液添加至每一孔中且於37℃下進行消化3 hr。消化後，將樣品轉移至500 μl EPPENDORFTM 管中且將2.5 μl 1.5 M乙酸溶液添加至每一樣品中。於周圍溫度下將經酸化之樣品培養兩小時以將寡醣自糖基胺轉化為羥基形式。在MALDI－TOF質譜分析之前，使用裝入緻密反應管(US Biochemical,Cleveland,OH)中之0.7 ml陽離子交換樹脂(氫形式之AG50W－X8樹脂)(Bio－Rad,Hercules,CA)漿料床使所釋放之寡醣脫鹽。
對於以陽性模式MALDI－TOF質譜分析樣品而言，將經脫鹽之寡醣(0.5 μl等分試樣)與0.5 μl 2,5－二羥基苯甲酸基質(sDHB)一起塗覆於不鏽靶，該基質係藉由將2 mg 2,5－二羥基苯甲酸與0.1 mg 5－甲氧基水楊酸溶解於1 ml於25%水性乙醇中之1 mM NaCl中來製備。真空乾燥樣品/基質混合物且接著使其吸收大氣水分，隨後進行分析。藉由MALDI－TOF以PERSEPTIVE BIOSYSTEMS VOYAGER－ELITETM 質譜儀分析所釋放之寡醣。以陽性模式於20 kV下以線性組態且利用延遲引出來操作該質譜儀。使用約1100之雷射功率且以資料總和模式(240次掃描)獲得資料以改善訊雜比。用標準寡醣之混合物校準儀器且使用19點Savitsky－Golay演算法平滑數據，然後對質量賦值。使用CAESAR 7.2TM 數據分析軟體套件(SciBridge Software)達成質譜數據之積分。
對照及測試物質與人類Fcγ受體之結合可使用最初由Shields等人，J Biol Chem, 276：6591－604(2001)所述之程序的改良型式來評估。
為證實經RNAi轉染之細胞確實具有較少FUT8 RNA表現，可使用自轉染後24小時之經轉染細胞提取的RNA樣品執行北方墨點法。可純化來自含有對照質體(隨機小鼠DNA序列，與任何已知小鼠蛋白無同源性)及兩種RNAi質體之細胞的總RNA且與300 bp探針雜交。內因性α 1,6－岩藻糖基轉移酶RNA之敲除可進一步藉由定量PCR證實。
物質之寄存
以下物質已寄存於美國菌種保藏中心，10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110－2209,USA(ATCC)：
根據國際承認用於專利程序之微生物寄存的布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)規定及其所依法規(布達佩斯條約)進行此寄存。此保證寄存之活菌種自寄存之日起保持30年。將藉由ATCC根據布達佩斯條約之條款使寄存可行，且服從Genentech,Inc.與ATCC之間的協議，此保證在相關美國專利發布後或向任何美國或國外專利申請案之公眾公開後(無論何者先發生)寄存菌種之子代對於公眾之永久及無限制可用性，且保證由有資格之美國專利商標委員(U.S.Commissioner of Patents and Trademarks)根據35 USC §122及所依據之委員規則(包括37 CFR §1.14，特別為有關886 OG 638)所判定之菌種子代的可用性。
本發明申請案之受讓人已同意，若寄存物質之菌種當在合適條件下培養時將會死亡或損失或受到破壞，則須在通告後即時以相同之另一者代替該等物質。所寄存物質之可用性並不應理解為許可可違背由任何政府機關依照其專利法所授予之權利來實施本發明。
應認為以上所寫之描述足以使熟習此項技術者能夠實施本發明。本發明並不受限於本文中所提供之實例的範疇。實際上，根據以上描述，除本文中所示及所述之彼等以外，本發明的各種修改對於熟習此項技術者將變得顯而易見且屬於附加申請專利範圍之範疇內。
圖1A圖示2C8嵌合體輕鏈及重鏈之全長序列(分別為SEQ ID NO：32及33)。
圖1B圖示3F12嵌合體輕鏈及重鏈之全長序列(分別為SEQ ID NO：34及35)，以及3F12嵌合體重鏈可變區之全長序列(SEQ ID NO：31)。
圖1C圖示改良3F12嵌合體(在上文實例中稱作嵌合體2)(3F12.2D3)之輕鏈可變區的序列(SEQ ID NO：36)及3F12.2D3之輕鏈恆定區的序列(SEQ ID NO：37)。黑體字之殘基表示根據各種化學/酶促裂解所鑑別之彼等殘基。
圖1D圖示改良3F12嵌合體(3F12.2D3)之重鏈可變區的序列(SEQ ID NO：38)及3F12.2D3之重鏈恆定區的序列(SEQ ID NO：39)。黑體字之殘基表示根據各種化學/酶促裂解所鑑別之彼等殘基，且星號表示糖基化位點。
圖2A圖示以下各者之可變輕鏈之序列的比對：嵌合2C8抗體(SEQ ID NO：23)、人化2C8.v2(SEQ ID NO：24)及人類亞群I一致序列(SEQ ID NO：40)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖2B圖示以下各者之可變重鏈之序列的比對：嵌合2C8抗體(SEQ ID NO：25)、人化2C8.v2(SEQ ID NO：26)及人類亞群III一致序列(SEQ ID NO：41)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖2C圖示變體2C8.v7及2C8.v12之輕鏈及重鏈序列(SEQ ID NO：42－45)。
圖3A圖示以下各者之可變輕鏈之序列的比對：嵌合3F12抗體(SEQ ID NO：27)、人化3F12.v5(SEQ ID NO：28)及人類亞群I一致序列(SEQ ID NO：40)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖3B圖示以下各者之可變重鏈之序列的比對：原始嵌合3F12抗體(非3F12.2D3)(SEQ ID NO：29)、人化3F12.v5(SEQ ID NO：30)及人類亞群III一致序列(SEQ ID NO：41)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖4A及4B顯示倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3抑制抗體誘導性關節炎(AIA)。圖4A顯示比較抗LTα抗體與Fc DANA突變體(抗LT.Fc突變體)及TNFRII.Fc突變體(TNFR.Ig免疫黏附素)以及對照同型(抗豬草IgG2a單株抗體)之預防性使用的結果。圖4B顯示在AIA模型中，當治療性投予時，與對照同型及TNFRII.Fc突變體比較，抗LTα抗體抑制關節炎發展。
圖5A及5B顯示倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3抑制膠原蛋白誘導性關節炎(CIA)。圖5A顯示在CIA預防性模型中，與Fc DANA突變體(抗LT.Fc突變體)以及對照同型(抗豬草IgG2a單株抗體)比較，S5H3抑制關節炎且與TNFRII.Fc突變體相當。圖5B顯示在CIA模型中，當治療性投予時，與對照同型比較，S5H3抗LTα抗體抑制關節炎發展且與TNFRII.Fc突變體相當。
圖6顯示與對照同型(抗gp120 IgG1單株抗體)比較，倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3在MBP－TCR轉殖基因小鼠中延緩EAE疾病之發作及嚴重化。
圖7A、7B及7C分別顯示與同型對照(抗豬草)、抗LT.Fc突變體及CTLA4.Fc(陽性對照)相比，用倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3之治療並不影響T細胞依賴性抗TNP IgM、IgG1及IgG2a反應。
圖8顯示相對於同型對照(抗豬草)及TNFRII.Fc突變體而言，用倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3之治療並不影響T細胞非依賴性抗體(IgM、IgG1、IgG2a及IgG3)反應。
圖9顯示與DANA抗LTα 2C8 Fc突變體及同型對照(曲妥珠單抗(trastuzumab)、人類IgG1)相比，抗LTα嵌合單株抗體2C8在人類SCID小鼠中預防GVHD。CTLA4.Fc突變體亦用作陽性對照。
圖10A顯示嵌合抗LTα抗體2C8及3F12與人類LTα3結合。
圖10B顯示倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3以及抗LT.Fc突變體與鼠類LTα3結合。
圖11A顯示酶聯結免疫吸附劑分析法(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)結果，倉鼠鼠類嵌合抗LTα S5H3抗體與鼠類LTα1β2複合物結合，抗LT.Fc突變體亦如此。
圖11B顯示嵌合抗LTα抗體3F12及2C8與在人類細胞表面上與LTβ複合之LTα結合的FACS檢定結果。將其與LTβ－受體.huIgG1及同型對照huIgG1(曲妥珠單抗)比較。
圖11C顯示倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3與在鼠類細胞表面上與LTβ複合之LTα結合的FACS檢定結果。將其與LTβ－受體鼠類IgG2a、抗LT S5H3 Fc突變體及同型對照(抗IL122 muIgG2a)比較。
圖12A及12B分別顯示嵌合抗LTα抗體2C8及3F12與人類Th1及Th2細胞結合，且為比較顯示LTbR.Fc、TNFRII.Fc及同型對照之結合結果。
圖12C－12E顯示抗LTα人化抗體2C8.vX並不與靜止細胞結合(圖12C)，但與人類Th1及Th17細胞結合(分別為圖12D及E)，其中將其結合與同型對照之結合進行比較。
圖13A顯示用LTbR.Fc(實線)、嵌合抗LTα 3F12抗體(虛線)及同型對照(陰線區域)治療之未活化I細胞。
圖13B顯示用圖13A之藥劑治療之抗CD3及抗CD28活化CD4 T細胞。
圖13C顯示用圖13A之藥劑治療的抗CD3及抗CD28活化CD8 T細胞。
圖13D顯示用圖13A之藥劑治療之IL15活化CD56 NK細胞。
圖13E顯示用圖13A之藥劑治療之IgM及CD40L活化CD19 B細胞。
圖14A顯示與同型對照(曲妥珠單抗)比較，嵌合抗LTα抗體2C8及3F12在功能上阻斷人類LTα3。
圖14B顯示與同型對照(曲妥珠單抗)比較，倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3及抗LT.Fc突變體在功能上阻斷鼠類LTα3。
圖14C顯示與同型對照(曲妥珠單抗)比較，嵌合抗LTα抗體2C8及3F12在A549細胞中阻斷LTα3誘導之IL－8。
圖14D顯示與同型對照(曲妥珠單抗)比較，嵌合抗LTα抗體2C8及3F12以及TNFRII.Fc突變體阻斷HUVEC上之LTα3誘導性ICAM表現。亦顯示未受刺激之細胞的反應。
圖14E顯示與同型對照比較，嵌合抗LTα抗體2C8阻斷LTα3誘導性NFkB活化。亦顯示未受刺激之細胞的反應。
圖15A顯示與同型對照比較，嵌合抗LTα抗體2C8在功能上阻斷LTα1β2誘導性NFkB活化。亦顯示未受刺激之細胞的反應。
圖15B、15C及15D分別顯示嵌合抗LTα抗體2C8阻斷LTα3、LTα2β1及LTα1β2誘導性細胞毒性。
圖15E顯示與同型對照比較，嵌合抗LTα抗體2C8及3F12阻斷HUVEC上之LTα1β2誘導性ICAM表現。亦顯示未受刺激之細胞的反應。
圖16顯示與抗LTα 2C8 Fc突變體比較，嵌合抗LTα抗體2C8可殺死LTαβ表現細胞。
圖17A－H顯示與對照組比較，嵌合抗LTα抗體2C8在HUVEC細胞中阻斷細胞因子及趨化因子分泌，其中圖17A－17D分別就LTα1β2而言顯示KC/IL－8、RANTES、IP10及IL－6，且圖17E－17H分別就LTα3而言顯示KC/IL－8、RANTES、IP10及IL－6。
圖17I－P顯示與對照組比較，倉鼠鼠類嵌合抗LTα抗體S5H3在3T3細胞中阻斷細胞因子及趨化因子分泌，其中圖17I－17L分別就LTα1β2而言顯示KC、RANTES、IP10及IL－6，且圖17M－17P分別就LTα3而言顯示KC、RANTES、IP10及IL－6。
圖18A圖示以下各者之可變輕鏈之序列的比對：嵌合2C8抗體(SEQ ID NO：23)、人化2C8.vX(SEQ ID NO：102)及人類亞群I一致序列(SEQ ID NO：40)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖18B圖示以下各者之可變重鏈之序列的比對：嵌合2C8抗體(SEQ ID NO：25)、人化2C8.vX(SEQ ID NO：103)及人類亞群III一致序列(SEQ ID NO：41)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖19A及19B分別顯示與TNFRII.Fc/同型對照相比，2C8.vX抗體之LTα3及LTα1β2結合的ELISA。
圖20A及20B分別顯示使用用於測試人類LT誘導性細胞毒性之阻斷的檢定，與同型對照/TNFRII.Fc相比，2C8vX抗體對人類LTα3及LTα1β2之阻斷。
圖21提供在顯示HUVEC細胞上LTα3抑制ICAM1上調的功能檢定中各種分子如何阻斷LTα3之比較。具體而言，比較同型、2C8.vX及TNFRII.Fc。
圖22提供在顯示使用293－LTβR細胞阻斷LTα1β2之功能檢定中各種分子如何阻斷LTα1β2之比較。具體而言，比較同型及2C8.vX以及未受刺激之細胞。
圖23顯示使用涉及293－LTα1β2細胞之方案得到之2C8.vX的ADCC活性。將2C8.vX與2C8.vX DANA突變體(Fc突變體)及同型對照比較。
圖24顯示在人類SCID模型中，與對照組(2C8.vX DANA Fc突變體及同型對照)相比，對於2C8.vX及CTLA4－Fc之GVHD存活率結果。
圖25A－D顯示在人類SCID GVHD模型中2C8.vX抗體消減LTα1β2表現T細胞及B細胞。圖25A中之結果顯示對於同型對照、2C8.vX及2C8.vX.DANA突變體而言第2天之陽性人類細胞總數。圖25B－D分別顯示使用CD4、CD8及CD19抗體設門(gating)之結果。
圖26A圖示以下各者之可變輕鏈之序列的比對：嵌合3F12抗體(SEQ ID NO：27)、人化3F12.v14(SEQ ID NO：108)及人類亞群I一致序列(SEQ ID NO：40)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖26B圖示以下各者之可變重鏈之序列的比對：嵌合3F12抗體(SEQ ID NO：29)、人化3F12.v14(SEQ ID NO：109)及人類亞群III一致序列(SEQ ID NO：41)。每一者之CDR序列係以方括弧顯示，且星號用於顯示比對序列胺基酸殘基之間的差異。
圖27顯示2C8.vX及其無岩藻糖基化對應物之ADCC活性，其中AF＝無岩藻糖基化抗體且WT＝正常CHO細胞株產生抗體。
<110> 美商建南德克公司<120> 淋巴毒素α之抗體<130> P2237R1 <140> 096138038 <141> 2007－10－11 <150> US 60/829,257 <151> 2006－10－12 <150> US 60/938,999 <151> 2007－05－18 <160> 110 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 1<210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 2<210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 3<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 4<210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 5<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 6<210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 7<210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 8<210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 9<210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 10<210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 11<210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 12<210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 序列係合成的<400> 13<210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> 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(無元件符號說明)

Claims (54)

  1. 一種分離之抗淋巴毒素α(LTα)抗體，其中該抗體包含：(a)CDR-L1序列，其包含胺基酸A1-A11，其中A1-A11為KASQAVSSAVA(SEQ ID NO：1)或RASQAVSSAVA(SEQ ID NO：2)；或包含胺基酸A1-A17，其中A1-A17為KSSQSLLYSTXQKNFLA(SEQ ID NO：3)或KSSQSLLYSAXQKXFLA(SEQ ID NO：4)或KSSQSLLYSTXQKXALA(SEQ ID NO：6)，其中X為任何胺基酸；(b)CDR-L2序列，其包含胺基酸B1-B7，其中B1-B7為SASHRYT(SEQ ID NO：7)或WASTRDS(SEQ ID NO：8)；(c)CDR-L3序列，其包含胺基酸C1-C9，其中C1-C9為QQHYSTPWT(SEQ ID NO：9)或QEXYSTPWT(SEQ ID NO：11)或QQYYSYPRT(SEQ ID NO：13)或QQYASYPRT(SEQ ID NO：14)或QQYYAYPRT(SEQ ID NO：15)，其中X為任何胺基酸；(d)CDR-H1序列，其包含胺基酸D1-D10，其中D1-D10為GYTFTSYVIH(SEQ ID NO：16)或GYTFSSYWIE(SEQ ID NO：17)；(e)CDR-H2序列，其包含胺基酸E1-E17，其中E1-E17為YXXPYXDGTXYXEKFKG(SEQ ID NO：18)或EISPGSGSTXYXEEFKG(SEQ ID NO：19)或YXXPYXAGTXYXEKFKG(SEQ ID NO：101)或 EIXPGSGSTIYXEKFKG(SEQ ID NO：110)，其中X為任何胺基酸；及(f)CDR-H3序列，其包含胺基酸F1-F9，其中F1-F9為PTMLPWFAY(SEQ ID NO：20)；或包含胺基酸F1-F5，其中F1-F5為GYHGY(SEQ ID NO：21)或GYHGA(SEQ ID NO：22)。
  2. 如請求項1之抗體，其中：(i)SEQ ID NO：3係KSSQSLLYSTAQKXFLA(SEQ ID NO：5)；及/或(ii)SEQ ID NO：11係QESYSTPWT(SEQ ID NO：10)或QEVYSTPWT(SEQ ID NO：12)。
  3. 如請求項1之抗體，其中該CDR-L1序列係SEQ ID NO：2、3、4或6。
  4. 如請求項1之抗體，其包含：(i)所有SEQ ID NO：1或2及7及9，或所有SEQ ID NO：1或2及7或8及11，或所有SEQ ID NO：16、18及20，或所有SEQ ID NO：16、101及20；或(ii)所有SEQ ID NO：3、8及13，或所有SEQ ID NO：4、5或6、8及13，或所有SEQ ID NO：3、8及14或15，或所有SEQ ID NO：4、5或6、8及14或15，或所有SEQ ID NO：17、19及21或22，或所有SEQ ID NO：17、110及21。
  5. 如請求項1之抗體，其包含(i)所有SEQ ID NO：1或2及7及9，或SEQ ID NO：1或2及7或8及11，或SEQ ID NO：3、8及13，或SEQ ID NO：4、5或6、8及13，或SEQ ID NO：3、8及14或15，或SEQ ID NO：4、5或6、8及14或15之CDR-L1至CDR-L3胺基酸序列；或(ii)所有SEQ ID NO：16、18及20，或SEQ ID NO：16、101及20，或SEQ ID NO：17、19及21或22，或SEQ ID NO：17、110及21之CDR-H1至CDR-H3胺基酸序列。
  6. 如請求項1之抗體，其包含：(i)一個人類κ亞群I一致構架序列(SEQ ID NO：40)；或(ii)一個重鏈人類亞群III一致構架序列(SEQ ID NO：41)。
  7. 如請求項6之抗體，其中該構架序列包含R71A、N73T或N78A之取代或其組合。
  8. 如請求項1之抗體，其：(i)與淋巴毒素αβ異質二聚體(LTαβ)複合物結合；及/或(ii)阻斷LTαβ功能；及/或(iii)消減(depletes)LTα陽性細胞；及/或(iv)與淋巴毒素α3三聚體(LTα3)結合且阻斷LTα3與腫瘤壞死因子受體-1(TNFRI)及腫瘤壞死因子受體-2(TNFRII)之相互作用。
  9. 如請求項1之抗體，其為嵌合或人類化抗體。
  10. 如請求項1之抗體，其為IgG同型(IgG isotype)。
  11. 如請求項10之抗體，其中該IgG同型為IgG1或IgG2a。
  12. 如請求項1之抗體，其包含野生型Fc區。
  13. 如請求項1之抗體，其進一步在其Fc區包含一至五個胺基酸取代，導致其與具有天然序列Fc區之相同抗體相比具有增加之抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)功能。
  14. 如請求項1之抗體，其進一步在其Fc區包含一至三個胺基酸取代。
  15. 如請求項14之抗體，其中該Fc區於以下位置之任一者或任何組合具有胺基酸取代：268D，或298A，或326D，或333A，或334A，或298A以及333A，或298A以及334A，或239D以及332E，或239D以及298A及332E，或239D以及268D及298A及332E，或239D以及268D及298A及326A及332A，或239D以及268D及298A及326A及332E，或239D以及268D及283L及298A及332E，或239D以及268D及283L及298A及326A及332E，或239D以及330L及332E及272Y及254T及256E，或250Q以及428L，或265A，或297A，其中該265A取代係於297A不存在之情況下，且該297A取代係於265A不存在之情況下。
  16. 如請求項1之抗體，其對人類LTα具有單價親和力，其大致相同於或大於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)寄存編號PTA-7538及食品工業發展研究所寄存編號BCRC 960332所寄存之融合瘤細胞株(融合瘤鼠類淋巴毒素α2 β1 s5H3.2.2)產生之鼠類抗體對人類LTα之單價親和力。
  17. 如請求項16之抗體，其中該單價親和力係以Kd值表示，可選性的藉由光學生物感測器或放射免疫檢定測量。
  18. 如請求項1之抗體，其具有：(i)包含SEQ ID NO：23或24之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：25或26之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：23及 25兩者或包含SEQ ID NO：24及26兩者之輕鏈及重鏈可變域；或(ii)包含SEQ ID NO：27或28之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：29或30或31之重鏈可變域，或具有包含(a)SEQ ID NO：27及29兩者，或(b)包含SEQ ID NO：27及30兩者，或(c)包含SEQ ID NO：27及31兩者，或(d)包含SEQ ID NO：28及30兩者，或(e)包含SEQ ID NO：28及31兩者之輕鏈及重鏈可變域；或(iii)包含SEQ ID NO：102之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：103之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：102及103兩者之輕鏈及重鏈可變域；或(iv)包含SEQ ID NO：108之輕鏈可變域，或包含SEQ ID NO：109之重鏈可變域，或具有包含SEQ ID NO：108及109兩者之輕鏈及重鏈可變域。
  19. 如請求項1或18之抗體，其相對於野生型中國倉鼠卵巢細胞中所產生之相同抗體上之岩藻糖的量，具有減少之岩藻糖。
  20. 如請求項19之抗體，其不具有岩藻糖。
  21. 一種抗體組合物，其包含如請求項1至20中任一項之具有Fc區之抗體，其中該組合物中約20-100%之抗體在其Fc區包含一個缺乏岩藻糖之成熟核心碳水化合物結構。
  22. 如請求項21之組合物，其中：(i)該抗體包含一個Fc區已藉由在選自由以下位置組成之群之Fc區之位置的任一者或任何組合處取代一個選自由 A、D、E、L、Q、T及Y組成之群的胺基酸而改變，與野生型IgG Fc序列相比，改變該抗體之抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或藥物動力學特性之一或多者：238、239、246、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、309、312、314、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、428、430、434、435、437、438及439；或(ii)該抗體在人類效應細胞存在下具有抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)活性，或與包含人類野生型IgG1 Fc之其他相同抗體相比在人類效應細胞存在下具有增加之ADCC活性；或(iii)該抗體進一步包含如下Fc取代：268D或326D或333A以及334A，或298A以及333A，或298A以及334A，或239D以及332E，或239D以及298A及332E，或239D以及268D及298A及332E，或239D以及268D及298A及326A及332A，或239D以及268D及298A及326A及332E，或239D以及268D及283L及298A及332E，或239D以及268D及283L及298A及326A及332E，或239D以及330L及332E。
  23. 如請求項21或22之組合物，其中： (i)該抗體結合FcγRIII；或(ii)相較於具有一個成熟核心碳水化合物結構包括岩藻糖連接於Fc區之醣蛋白，該抗體以較好親和力結合該FcγRIII或較有效地介導抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)。
  24. 如請求項21或22之組合物，其中：(i)該抗體已由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生；或(ii)該抗體已由缺乏岩藻糖基轉移酶基因之哺乳動物細胞產生。
  25. 如請求項24之組合物，其中該CHO細胞為Lec13細胞。
  26. 如請求項24之組合物，其中該岩藻糖基轉移酶基因為FUT8 基因。
  27. 如請求項21之組合物，其中：(i)該抗體不含平分(bisecting)之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)連接於其成熟核心碳水化合物結構；或(ii)該抗體具有平分之N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)連接於其成熟核心碳水化合物結構。
  28. 如請求項21之組合物，其中：(i)該抗體具有一或多個半乳糖殘基連接於其成熟核心碳水化合物結構；或(ii)該抗體不含一或多個半乳糖殘基連接於其成熟核心碳水化合物結構；或(iii)該抗體具有一或多個唾液酸殘基連接於其成熟核心碳水化合物結構；或 (iv)其中該抗體不含一或多個唾液酸殘基連接於其成熟核心碳水化合物結構。
  29. 如請求項21之組合物，其包含：(i)至少約2%無岩藻糖基化(afucosylated)抗體；或(ii)至少約4%無岩藻糖基化抗體；或(iii)至少約10%無岩藻糖基化抗體；或(iv)至少約19%無岩藻糖基化抗體；或(v)約100%無岩藻糖基化抗體。
  30. 一種組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體及載劑。
  31. 如請求項30之組合物，其進一步包含第二藥劑，其中該抗LTα抗體為第一藥劑。
  32. 如請求項31之組合物，其中該第二藥劑為免疫抑制劑、結合B細胞表面標記之拮抗劑、BAFF拮抗劑、改變病情之抗風濕藥物(DMARD)、整合素拮抗劑、非類固醇消炎藥(NSAID)、細胞因子拮抗劑或其組合。
  33. 一種融合瘤，其於2006年4月19日以寄存編號PTA-7538寄存於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，並於2007年12月17日以寄存編號BCRC 960332寄存於食品工業發展研究所。
  34. 一種抗體，其係由如請求項33之融合瘤分泌。
  35. 一種活體外抑制淋巴毒素α活化細胞增殖之方法，該方法包含使細胞或組織與有效量之如請求項1至20中任一項之抗體接觸。
  36. 如請求項1至20中任一項之抗體，其係用於治療個體淋巴毒素α介導之自體免疫病症。
  37. 如請求項36之抗體，其中該自體免疫病症係選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、狼瘡、韋格納氏病(Wegener's disease)、發炎性腸病(IBD)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、栓塞性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症(MS)、牛皮癬、IgA腎病、IgM多發性神經病、重症肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、絲球體腎炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷氏病(Graves' disease)、幽門螺旋桿菌胃炎(helicobacter-pylori gastritis)及慢性C型肝炎。
  38. 如請求項37之抗體，其中該狼瘡為全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎。
  39. 如請求項37之抗體，其中該IBD為克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎。
  40. 如請求項36或37之抗體，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎。
  41. 一種如請求項1至20中任一項之抗體的用途，其用於製造用以治療淋巴毒素α介導之自體免疫病症之藥劑。
  42. 如請求項41之用途，其中該自體免疫病症係選自由以下組成之群：類風濕性關節炎、狼瘡、韋格納氏病(Wegener's disease)、發炎性腸病(IBD)、特發性血小板 減少性紫癜(ITP)、栓塞性血小板減少性紫癜(TTP)、自體免疫血小板減少症、多發性硬化症(MS)、牛皮癬、IgA腎病、IgM多發性神經病、重症肌無力、血管炎、糖尿病、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、絲球體腎炎、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、格雷氏病(Graves' disease)、幽門螺旋桿菌胃炎(helicobacter-pylori gastritis)及慢性C型肝炎。
  43. 如請求項42之用途，其中該狼瘡為全身性紅斑狼瘡或狼瘡腎炎。
  44. 如請求項42之用途，其中該IBD為克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性結腸炎。
  45. 如請求項41或42之用途，其中該自體免疫病症為類風濕性關節炎。
  46. 如請求項41或42之用途，其進一步包含治療有效量之另一藥劑作為第二藥劑，其中該抗LTα抗體為第一藥劑，其中該第二藥劑為免疫抑制劑、結合B細胞表面標記之拮抗劑、BAFF拮抗劑、改變病情之抗風濕藥物(DMARD)、整合素拮抗劑、非類固醇消炎藥(NSAID)、細胞因子拮抗劑或其組合。
  47. 如請求項46之用途，其中該第二藥劑為DMARD或甲胺喋呤(methotrexate)。
  48. 如請求項41或42之用途，其中：(i)該個體先前未曾用針對該病症之藥劑治療；或 (ii)該個體先前未曾用TNF拮抗劑治療；或(iii)該個體先前已用針對該病症之藥劑治療；或(iv)該個體先前已用TNF拮抗劑或DMARD治療。
  49. 如請求項41或42之用途，其中該抗體為裸抗體或該抗體係與另一分子結合。
  50. 如請求項49之用途，其中該另一分子為細胞毒性劑。
  51. 如請求項41或42之用途，其中該藥劑係適於靜脈內或皮下投予。
  52. 如請求項41或42之用途，其中該個體患有類風濕性關節炎且該藥劑在該個體體內誘發主要臨床反應。
  53. 如請求項41或42之用途，其中該個體具有異常量之一或多種調節細胞因子、抗核抗體(ANA)、抗類風濕因子(RF)抗體、肌酸酐、血尿素氮、抗內皮抗體、抗嗜中性白血球細胞質抗體(ANCA)、浸潤性CD20細胞、抗雙股DNA(dsDNA)抗體、抗Sm抗體、抗核的核糖核蛋白抗體、抗磷脂抗體、抗核糖體P抗體、抗Ro/SS-A抗體、抗Ro抗體、抗La抗體、針對休格連氏相關抗原A或B(SS-A或SS-B)之抗體、針對著絲點(centromere)蛋白B(CENP B)或著絲點蛋白C(CENP C)之抗體、ICA69之自體抗體、抗Smith抗原(Sm)抗體、抗核的核糖核蛋白抗體、抗核糖體P抗體、染色嗜中性白血球之核區或核周區之自體抗體(pANCA)、抗釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗體、GM1神經節苷脂(ganglioside)或GQ1b神經節苷脂之交叉反應性抗體、抗乙醯膽鹼受體(AchR)、抗AchR亞型 或抗肌肉特異性酪胺酸激酶(MuSK)抗體、血清抗內皮細胞抗體、IgG或抗橋粒芯糖蛋白(desmoglein)(Dsg)抗體、抗著絲點、抗拓撲異構酶-1(Scl-70)、抗RNA聚合酶或抗U3-核糖核蛋白(U3-RNP)抗體、抗腎小球基底膜(GBM)抗體、抗腎小球基底膜(GBM)抗體、抗粒線體(AMA)或抗粒線體M2抗體、抗甲狀腺過氧化酶(TPO)、抗甲狀腺球蛋白(TG)或抗促甲狀腺激素受體(TSHR)抗體、抗核(AN)、抗肌動蛋白(AA)或抗平滑肌抗原(ASM)抗體、IgA抗肌內膜、IgA抗組織麩醯胺酸轉移酶、IgA抗麥膠蛋白(gliadin)或IgG抗麥膠蛋白抗體、抗CYP21A2、抗CYP11A1或抗CYP17抗體、抗核糖核蛋白(RNP)、或肌炎特異性抗體、抗髓鞘相關醣蛋白(MAG)抗體、抗C型肝炎病毒(HCV)抗體、抗GM1神經節苷脂、抗硫酸-3-葡萄糖醛酸基副紅血球糖苷脂(anti-sulfate-3-glycuronyl paragloboside，SGPG)或IgM抗糖結合物抗體、IgM抗神經節苷脂抗體、抗甲狀腺過氧化酶(TPO)、抗甲狀腺球蛋白(TG)或抗促甲狀腺激素受體(TSHR)抗體、抗髓鞘鹼性蛋白或抗髓鞘寡突細胞醣蛋白抗體、針對IgG之Fc部分的IgM類風濕因子抗體、抗因子VIII抗體或其組合。
  54. 如請求項41或42之用途，其中：(a)該抗體係每隔一週投予不多於一次；或(b)該抗體係大約每月投予一次。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080415B2 (en) * 2008-09-26 2011-12-20 Eureka Therapeutics, Inc. Modified host cells and uses thereof
BRPI0913687A2 (pt) * 2008-09-30 2015-10-13 Genentech Inc marcadores biológicos preditivos da resposta da artrite reumatóide aos antagonistas da linfotoxina
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
WO2011060015A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for detecting target proteins
CA2795734A1 (en) * 2010-04-07 2011-10-13 Abbvie Inc. Tnf-.alpha. binding proteins
JPWO2011152503A1 (ja) 2010-06-02 2013-08-01 大日本住友製薬株式会社 自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療剤
CN102621310B (zh) * 2011-01-28 2014-07-02 上海科新生物技术股份有限公司 胶体金层析法抗u1-rnp抗体检测试纸及其制备方法
KR20130036993A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 ｃ-Ｍｅｔ의 ＳＥＭＡ 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체
WO2013114164A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for obtaining glycoprotein composition with increased afucosylation content
KR102115438B1 (ko) 2012-05-21 2020-05-27 제넨테크, 인크. 혈액-뇌 장벽 수송의 안전성을 개선하는 방법
GB201314052D0 (en) * 2013-08-06 2013-09-18 Apitope Int Nv Peptides
JP2016538878A (ja) * 2013-10-14 2016-12-15 シンアフィックス ビー．ブイ． 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法
WO2015057906A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cd200 receptor 1 agonists
KR101820572B1 (ko) * 2015-08-12 2018-01-19 가톨릭대학교 산학협력단 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법
BR112018007356A2 (pt) * 2015-11-02 2018-10-23 Genentech Inc métodos de produção de formas fucosiladas e não fucosiladas de uma proteína
CN112153983A (zh) * 2018-05-23 2020-12-29 杰克逊实验室 抗ngly-1抗体及使用方法
CN111285936A (zh) * 2020-03-11 2020-06-16 北京双赢科创生物科技有限公司 靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266004A1 (en) * 2003-12-08 2005-12-01 Jill Giles-Komar Anti-human lymphotoxin alpha antibodies, compositions, methods and uses

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) * 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4920196A (en) 1982-07-30 1990-04-24 Genentech, Inc. Human lymphotoxin
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4959457A (en) 1984-05-31 1990-09-25 Genentech, Inc. Anti-lymphotoxin
US5683688A (en) 1984-05-31 1997-11-04 Genentech, Inc. Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions
IL75318A (en) * 1984-05-31 1994-08-26 Genentech Inc Recombinant human memotoxin and methods for its recombinant production
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
JP2755395B2 (ja) 1987-09-23 1998-05-20 ブリストル―マイアーズ スクイブ コムパニー Ｈｉｖ感染細胞に殺作用する抗体異種結合体
JPH023698A (ja) 1988-06-20 1990-01-09 Denki Kagaku Kogyo Kk ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6475787B1 (en) 1989-07-28 2002-11-05 Wyeth Method for producing monoclonal antibodies
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US5795964A (en) 1990-06-27 1998-08-18 Biogen, Inc. Lymphotoxin-beta and lymphotoxin-beta complexes
US7030080B2 (en) 1990-06-27 2006-04-18 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
AU8228891A (en) 1990-06-27 1992-01-23 Biogen, Inc. Surface complexed lymphotoxin
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
RU2048521C1 (ru) * 1992-05-25 1995-11-20 Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ Способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
US20050255104A1 (en) 1993-01-29 2005-11-17 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis using anti-TNF receptor fusion proteins
US5747023A (en) 1994-07-01 1998-05-05 Genentech, Inc. Cancer therapy using lymphotoxin
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6312691B1 (en) 1996-01-26 2001-11-06 Jeffrey L. Browning Lymphotoxin-α/β complexes and anti-lympotoxin-β receptor antibodies as anti-tumor agents
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5925351A (en) 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
WO1997038123A1 (en) 1996-04-05 1997-10-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US5747373A (en) * 1996-09-24 1998-05-05 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Ltd. Nitride-oxide sidewall spacer for salicide formation
DE69736244T2 (de) 1996-10-25 2007-05-31 Biogen Idec Ma Inc., Cambridge Lösliche lymphotoxin-beta rezeptoren, anti-lymphotoxin-antikörper und anti-lymphotoxin ligand antikörper als therapeutische wirkstoffe zur behandlung von immunologischen krankheiten
US7255854B1 (en) 1996-10-25 2007-08-14 Biogen, Inc. Use of lymphotoxin-β receptor blocking agents for the treatment of antibody mediated immunological diseases
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU4930399A (en) * 1998-07-29 2000-02-21 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Novel Polypeptide
TR200504220T2 (tr) 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PL209786B1 (pl) * 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
AU756677B2 (en) 1999-03-02 2003-01-23 Centocor Inc. Anti-TNFalpha antibodies in therapy of asthma
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US7056695B2 (en) 2000-03-02 2006-06-06 Xencor TNF-α variants
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
KR101287395B1 (ko) 2000-06-16 2014-11-04 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 면역특이적으로 ＢＬｙＳ에 결합하는 항체
WO2002000879A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US20060029604A1 (en) * 2000-06-28 2006-02-09 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US20060034828A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform
US20060034830A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GalGlcNAcMan5GLcNAc2 glycoform
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1326897A2 (en) 2000-10-13 2003-07-16 Biogen, Inc. Humanized anti-lt-beta-r antibodies
EP1345968A2 (en) 2000-12-28 2003-09-24 Altus Biologics Inc. Crystals of whole antibodies and fragments thereof and methods for making and using them
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
EP1478740A2 (en) 2001-07-27 2004-11-24 Human Genome Sciences, Inc. Heteromultimeric tnf ligand family members
AU2002339845B2 (en) 2001-08-03 2009-03-26 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US20030143603A1 (en) 2001-11-30 2003-07-31 Jill Giles-Komar Anti-TNF antibodies, compositions, methods and uses
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003066834A2 (en) * 2002-02-08 2003-08-14 Wyeth Composition and method for modulating an inflammatory response
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
EA200401325A1 (ru) 2002-04-09 2005-04-28 Киова Хакко Когио Ко., Лтд. Клетки с модифицированным геномом
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
WO2003085118A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
EP1499353A4 (en) 2002-04-15 2006-04-05 Human Genome Sciences Inc SPECIFIC TO TL5 BINDING ANTIBODIES
AU2003248782A1 (en) 2002-07-01 2004-01-19 Biogen Idec Ma Inc. Humanized anti-lymphotoxin beta receptor antibodies
US6873910B2 (en) * 2002-10-22 2005-03-29 Qualcomm Incorporated Procedure for searching for position determination signals using a plurality of search modes
CA2505852A1 (en) 2002-10-31 2004-05-13 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of immunological renal disorders by lymphotoxin pathway inhibitors
SI1572744T1 (sl) 2002-12-16 2010-09-30 Genentech Inc Imunoglobulinske variante in njihove uporabe
PL377611A1 (pl) 2002-12-20 2006-02-06 Biogen Idec Ma Inc. Czynniki dla receptora limfotoksyny beta w połączeniu z czynnikami chemioterapeutycznymi
DE602004024041D1 (de) 2003-03-05 2009-12-24 Halozyme Inc Lösliches hyaluronidase-glycoprotein (shasegp), verfahren zu seiner herstellung, verwendungen und dieses enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
AU2004279742A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
US20070134759A1 (en) 2003-10-09 2007-06-14 Harue Nishiya Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
TR201809892T4 (tr) 2003-11-05 2018-07-23 Roche Glycart Ag Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller.
KR100772800B1 (ko) 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
EP1771479A1 (en) 2004-07-21 2007-04-11 Glycofi, Inc. IMMUNOGLOBULINS COMPRISING PREDOMINANTLY A GlCNACMAN5GLCNAC2 GLYCOFORM
EP1771480A1 (en) 2004-07-21 2007-04-11 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a man3glcnac2 glycoform
AU2005269713A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GlcNac2 glycoform
CA2573745A1 (en) 2004-07-21 2007-01-12 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a glcnac2man3glcnac2 glycoform
WO2006014683A2 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a gal2glcnac2man3glcnac2 glycoform
WO2006031370A2 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
JP2006228261A (ja) 2005-02-15 2006-08-31 Micron Technology Inc デジット線絶縁ゲートの負電圧駆動
EP1888649A2 (en) 2005-05-09 2008-02-20 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050266004A1 (en) * 2003-12-08 2005-12-01 Jill Giles-Komar Anti-human lymphotoxin alpha antibodies, compositions, methods and uses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Browning JL, Dougas I, Ngam-ek A, Bourdon PR, Ehrenfels BN, Miatkowski K, Zafari M, Yampaglia AM, Lawton P, Meier W, et al.，" Characterization of surface lymphotoxin forms. Use of specific monoclonal antibodies and soluble receptors"，The Journal of Immunology，1995，Vol.154，page 33~46 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ576032A (en) 2012-03-30
CO6220841A2 (es) 2010-11-19
PE20080980A1 (es) 2008-09-02
RU2486201C2 (ru) 2013-06-27
CR10705A (es) 2009-05-07
TW200825101A (en) 2008-06-16
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AU2007324135A1 (en) 2008-05-29
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IL197937A0 (en) 2011-08-01
JP2010506568A (ja) 2010-03-04
US8541552B2 (en) 2013-09-24
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JP5298021B2 (ja) 2013-09-25
CL2007002926A1 (es) 2008-05-16
WO2008063776A3 (en) 2009-03-05
AU2007324135B2 (en) 2013-06-27
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EP2084188A2 (en) 2009-08-05
US7923011B2 (en) 2011-04-12
AR063257A1 (es) 2009-01-14
US20110150865A1 (en) 2011-06-23
US20110208673A1 (en) 2011-08-25
WO2008063776A2 (en) 2008-05-29
RU2009117680A (ru) 2010-11-20
KR20090078349A (ko) 2009-07-17
US20090285830A1 (en) 2009-11-19
US20130011412A1 (en) 2013-01-10
US8216807B2 (en) 2012-07-10
US8642740B2 (en) 2014-02-04
CA2665644A1 (en) 2008-05-29
MX2009003774A (es) 2009-04-22

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