KR20090078349A - 림포톡신-알파에 대한 항체 - Google Patents

림포톡신-알파에 대한 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 림포톡신-α에 결합하는 다양한 항체, 이같은 항체의 제조 방법, 이같은 항체가 혼입된 조성물 및 물품, 및 예를 들어 자가면역 장애를 치료하는 것에서의 이의 용도를 제공한다. 항체에는 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다.
림포톡신-α, 항-림포톡신-α 항체, 자가면역 장애

Description

림포톡신-알파에 대한 항체{ANTIBODIES TO LYMPHOTOXIN-ALPHA}
관련 출원
가출원이 아닌 본 출원은 미국 가출원 일련 번호 60/829,257 (2006년 10월 12일 출원), 및 미국 가출원 일련 번호 60/938,999 (2007년 5월 18일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이들은 거명에 의해 전문이 포함된다.
본 발명은 자가면역 장애를 치료하기 위한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 림포톡신-α에 결합하고, 또한 림포톡신-α 리간드가 하나 이상의 수용체에 결합하는 것을 차단할 수 있는 항체에 관한 것이다.
TNF 및 LT
자가면역 질환은 인간에서 여전히 임상적으로 중요한 질환이다. 명칭이 의미하는 바와 같이, 자가면역 질환은 신체 자신의 면역계를 통해 파괴를 가한다. 자가면역 질환의 개별적인 유형들 간에 병리학적 메커니즘은 상이하지만, 한가지 일반적인 메커니즘은 존재하는 특정 항체 (본원에서 자가-반응성 항체 또는 자가항체로 지칭됨)의 결합을 수반한다. 의사 및 과학자들은 류머티스성 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 혈관염, 면역-매개성 당뇨병, 및 루푸스 예컨대 전신 홍반 루푸스 (SLE)가 포함되는 70가지가 넘는 임상적으로 구분되는 자가면역 질환을 확인 하였다. 총괄적으로 다수의 자가면역 질환은 희귀하지만 (200,000명 미만을 침범함), 이러한 질환은 수백만명의 미국인 (인구의 5％로 추정됨)을 괴롭히고, 이때 대부분의 질환이 여성을 불균형적으로 침범한다. 이러한 질환의 만성적인 성질은 막대한 사회경제적 부담이 된다.
종양 괴사 인자 (TNF)-관련 단백질은 숙주 방어에서 세포자멸사까지의 면역 조절에 이르는 다양한 활성이 있는 대형 패밀리의 단백질로 당업계에서 인식된다. 시험관 내에서 여러 형질전환된 세포주에 세포독성이고 생체 내에서 특정 종양의 괴사를 야기한 혈청-유래 인자로 TNF가 최초로 확인되었다. 수퍼패밀리 내의 유사한 인자가 확인되었고, 이를 림포톡신 ("LT")으로 지칭하였다. 1980년대 초반에 TNF와 LT 간에 유사성이 관찰되었기 때문에, TNF 및 LT를 각각 TNF-α 및 TNF-β로 지칭하는 것이 제안되었다. 따라서, 과학 문헌에서는 양쪽 모두의 명명법이 참조된다. 본 출원에서 사용된 용어 "TNF"는 TNF-α를 지칭한다. 나중의 연구에서 LTα 및 LTβ로 칭해지는 림포톡신의 2가지 형태가 드러났다. US 2005-0129614에는 TL-5로 명시된, 구조적 및 생물학적 유사성을 기초로 하는 TNF 리간드 수퍼패밀리의 또다른 폴리펩티드 구성원이 기술되어 있다.
TNF 패밀리 단백질의 구성원은 세포-세포 접촉을 통해 국소적으로 작용하는 막에 결합된 형태로, 또는 분비형 단백질로 존재한다. TNF-관련 수용체의 패밀리가 이러한 단백질들과 반응하고, 세포 사망 또는 세포자멸사, 세포 증식, 조직 분화 및 전-염증성 응답이 포함되는 다양한 신호전달 경로를 촉발한다. 독자적으로 TNF-α가 염증성 질환, 자가면역 질환, 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 악성 종양, 및/또는 신경변성 질환에 연루되었고, 이는 RA 및 크론(Crohn) 질환과 같은 질환에서의 특정 생물학적 치료법에 대한 유용한 표적이다.
TNF 및 LTα 단백질의 클로닝 및 이들 각각의 생물학적 활성의 추가적인 특성화로 단백질들이 다수의 양상에서 상이한 것으로 드러났다. [Aggarwal et al., Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley-Liss, Inc. 1990, pp. 375-384]. 예를 들어, LTα는 약 20 kDa (N- 및 O-글리코실화되는 경우 25 kDa)의 분비형 가용성 단백질이다. 반면에, TNF는 글리코실화 부위가 없고, 명백한 막횡단 도메인으로 합성되어, 원래의 단백질 전사물이 세포에 회합되게 된다. 세포-회합 TNF 단백질의 단백질분해로 분자량이 약 19 kDa인 가용성 형태의 단백질의 방출이 초래된다. TNF는 활성화된 대식세포에서 주로 생산되는 반면, LT는 활성화된 림프구에 의해 생산된다. [Wong et al., Tumor Necrosis Factors: The Molecules and their Emerging Role in Medicine, Beutler, B., ed., Raven Press (1991), pp. 473-484]. TNF 및 LTα를 코딩하는 서열이 또한 상이하다. TNF 및 LTα는 단지 약 32％의 아미노산 서열 동일성만을 공유한다. TNF 및 LTα의 상이한 생물학적 활성과 관련하여, TNF는 내피 세포 인터루킨-1 ("IL-1")의 생산을 증가시키는 반면, LTα는 이에 대한 효과가 거의 없다. 또한, TNF는 대식세포로부터의 대식세포 콜로니 자극 인자의 생산을 유도하는 반면, LTα는 이에 대한 효과가 거의 없다. 이러한 생물학적 활성 및 기타 생물학적 활성이 [Aggarwal, Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanism of Action, Aggarwal and Vicek, eds. (1992), pp. 61-78]에 논의되어 있다.
TNF 및 LTα는 [Spriggs, "Tumor Necrosis Factor: Basic Principles and Preclinical Studies", Biologic Therapy of Cancer, DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company (1991) Ch. 16, pp. 354-377]; [Ruddle, Current Opinion in Immunology, 4:327-332 (1992)]; [Wong et al., "Tumor Necrosis Factor" Human Monocytes, Academic Press (1989), pp. 195-215]; 및 [Paul et al., Ann. Rev. Immunol., 6:407-438 (1988)]의 리뷰 논문에 추가로 기술되어 있다.
비-종양 세포에서, TNF 및 TNF-관련 사이토카인이 다양한 면역 응답에서 활성이다. TNF 및 LTα 리간드 양쪽 모두 TNF 수용체 (p55 또는 p60 및 p75 또는 p80; 본원에서 "TNF-R"로 칭해짐)에 결합하여 이를 활성화시킨다.
세포 표면 LT 복합체가 높은 수준의 LT를 발현하는 CD4+ T 세포 하이브리도마 세포 (II-23.D7)에서 특성화되었다 ([Browning et al., J. Immunol., 147: 1230-1237 (1991)]; [Androlewicz et al., J. Biol. Chem., 267: 2542-2547 (1992)]). LTβ-R, LT 서브유닛, 및 표면 LT 복합체의 발현 및 생물학적 역할이 [Ware et al., "The ligands and receptors of the lymphotoxin system", Pathways for Cytolysis, Current Topics Microbiol. Immunol., Springer-Verlag, pp. 175-218 (1995)]에 리뷰되어 있다.
주로 활성화된 T 및 B 림프구 및 천연 킬러 (NK) 세포에 의해 LTα 발현이 유도되고 LTα가 분비된다. T 헬퍼 세포 서브클래스들 중에서, LTα는 Th1에 의해서 생산되지만 Th2 세포에 의해서는 그렇지 않는 것으로 보인다. 멜라닌세포에서 LTα가 또한 검출되었다. LTβ (p33으로 또한 칭해짐)는 T 림프구, T 세포주, B 세포주 및 림포카인-활성화 킬러 (LAK) 세포의 표면 상에서 확인되었다. LTβ는 LTα의 부재 하에 기능성이지 않은 것으로 연구에서 나타났다.
LTα는 동종삼량체 (LTα3) 또는 LTβ와의 이종삼량체로 존재한다. 이러한 이종삼량체는 2개의 LTα 서브유닛 및 1개의 LTβ 서브유닛을 함유하거나 (LTα2β1), 또는 1개의 LTα 서브유닛 및 2개의 LTβ 서브유닛을 함유한다 (LTα1β2).
p55 및 p75의 2개의 TNF 수용체만이 LTα 동종삼량체에 대한 세포 표면 수용체로 알려져 있다. 그러나, LTαβ 이종삼량체인 LTα1β2는 TNF 수용체에 결합하지 않고, 대신 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 림포톡신 β 수용체 (본원에서 LTβ-R로 지칭됨)에 결합한다. 이종삼량체성 형태의 LTα2β1은 TNF 수용체들에 결합할 것이다.
LTβ-R은 면역계의 발달, 및 여포성 수지상 세포 및 다수의 기질 세포 유형이 포함되는 면역계 내의 다수의 세포의 기능적인 유지 양쪽 모두에서 잘 설명되어 있는 역할이 있다 ([Matsumoto et al., Immunol. Rev. 156:137 (1997)]). LTβ-R에 대한 공지된 리간드에는 LTα1β2뿐만 아니라, LIGHT로 칭해지는 제2 리간드가 포함된다 ([Mauri et al., Immunity 8:21 (1998)]). LTβ-R의 활성화는 생체 내에서 특정 암 세포주의 세포자멸사성 사망을 유도하는 것으로 나타났다 (US 6,312,691). LTβ-R에 대한 인간화 항체 및 이의 사용 방법이 US 2004-0058394에서 제공되고, 인간에서 신생물을 치료하거나 이의 발달, 중증도 또는 효과를 감소시키는데 유용한 것으로 언급된다. 또한, EP 1585547 (WO 2004/058183) (LePage & Gill)에는 하나 이상의 다른 화학요법제와 조합된 LTβ-R 신호전달을 활성화시키는 조성물을 포함하는 조합 요법, 뿐만 아니라 LTβ-R 작동제와 조합되어 종양 억제에 대한 부가적인 효과가 있는 작용제를 확인하기 위한 스크리닝 방법 및 치료 방법이 개시되어 있다.
LT는 녹아웃(knockout) 마우스에서 명백한 바와 같이 림프신생에 중요하다. LTβ-R이 결핍된 마우스에 림프절 및 파이어판이 없음을 나타내고, 손상된 항체 친화력 성숙을 또한 나타내는 [Futterer et al. Immunity, 9 (1): 59-70 (1998)] 참조. LTβ-R에 대한 작동제 모노클로날(monoclonal) 항체가 LTα 녹아웃 마우스에서 림프절을 만드는 능력을 복구시켰음이 [Rennert et al., Immunity, 9 (1): 71-9 (1998)]에서 보고되었다. [Wu et al., J. Immunology, 166 (3): 1684-9 (2001)] 및 [Endres et al., J. Exp. Med., 189 (1): 159-68 (1999)]; [Dohi et al., J. Immunology, 167 (5): 2781-90 (2001)]; 및 [Matsumoto et al., J. Immunology, 163 (3): 1584-91(1999)]를 또한 참조. [Korner et al. Eur. J. Immun., 27 (10): 2600-9 (1997)]에서는 TNF 및 LT 양쪽 모두가 없는 마우스가 지연된 B-세포 성숙 및 혈청 면역글로불린 결핍을 나타낸 반면, TNF만 없는 마우스는 이같은 결핍을 나타내지 않았음이 보고되었다.
또한, LT는 염증에 중요하다. LTα는 염증, 증가된 케모카인 발현, 및 림프구-유사 구조를 나타낸 RIP.LTα 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 췌장에서 과발현되고, 여기서 LTβ 단독의 과발현은 추가적인 염증이 없는 것으로 나타났다. 또한, LTα-결핍 마우스는 손상된 TNF-α 생산을 나타내고, 이같은 마우스가 TNF-트랜스진(transgene)에 교차되면 불완전한 지라 구조 및 기능이 복구되며 ([Kollias, J. Exp. Med., 188:745 (1998)]; [Chaplin, Ann Rev Imm 17:399 (1999)]), 감소된 TNF 수준이 병원체 챌린지(challenge) 후에 복구된다 ([Eugster, Eur. J.Immun. 31:1935 (2001)]).
TNF-α 또는 LTα3이 TNF 수용체인 TNFRI 및/또는 TNFRII와 상호작용하는 경우, 결과는 전-염증성 응답 및/또는 세포자멸사이다. LTα1β2가 수용체 LTβ-R과 상호작용하는 경우, 결과는 림프신생 및 케모카인 및 부착 분자의 유도이다. 자가면역 질환은 림프신생 및 염증성 응답과 관련되고, MS, 염증성 장 질환 (IBD), 및 RA가 포함되는 자가면역 질환이 있는 환자에서 LT 발현이 증가된다 ([Weyand et al., Curr. Opin. Rheumatol., 15: 259-266 (2003)]; [Selmaj et al., J. Clin. Invest., 87: 949-954 (1991)]; [Matusevicius et al., J. Neuroimm., 66: 115-123 (1996)]; [Powell et al., International Immunology, 2 (6): 539-44 (1990)]; [Zipp et al., Annals of Neurology, 38/5: 723-730 (1995)]; [Voskuhl et al., Autoimmunity 15 (2): 137-43 (1993)]; [Selmaj et al., J. Immunology, 147: 1522-29 (1991)]; [Agyekum et al., Journal Pathology, 199 (1): 115-21 (2003)]; 및 [Takemura et al., J. Immunol., 167: 1072 (2001)]).
구체적으로 MS에 관하여, 혈청 LTα가 MS에서의 병변/질환 부하와 상관된다 ([Kraus et al., Acta Neurologica Scandinavica, 105 (4): 300-8 (2002)]). LTα는 생체내 쿠프리존(cuprizone) 모델에서 말이집탈락에 수반되지만 말이집재형성에는 수반되지 않는 반면, TNF-α는 양쪽 모두에 필요하다 ([Plant et al., Glia 49:1-14 (2005)]).
구체적으로 RA에 관하여, RA 환자에서의 인간 LTα3 및 TNF-α의 수준이 정상적인 도너(donor)에 비해 상승된다 ([Stepien, Eur Cytokine Net 9: 145 (1998)]). RA에서의 LTα의 역할에는 하기의 것들이 포함된다: 혈청 LTα가 일부 RA 환자에서 존재함, 증가된 LTα 단백질이 활막 내에 존재함, LT 경로가 활막에서의 이소성 림프신생과 관련됨, 및 RA 환자에서 섬유모세포-유사 활막세포 상에서 LTβ-R 발현 증가가 있음. 또한, 사례 보고서에서 중화성 LTα3가 인플릭시맵-저항성 RA 환자에 이로운 것으로 개시되었다 ([Buch et al., Ann. Rheum. Dis., 63: 1344-46 (2004)]). 또한, [Han et al., Arthrit. Rheumat., 52: 3202-3209 (2005)]에는 LT 경로의 봉쇄가 Th1 응답을 강화시킴으로써 자가면역 관절염을 악화시킨다는 것이 기술되어 있다.
콜라겐-유도 관절염 (CIA)에서의 LTβR-Ig로의 예방 및 치료에 대한 전-임상 효능이 [Fava et al., J. Immunology, 171 (1): 115-26 (2003)]에서 제시된다. 또한, LTα-결핍 마우스는 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)에 저항성이다 ([Suen et al., J. Exp. Med, 186: 1233-40 (1997)]; [Sean Riminton et al., J. Exp. Med, 187 (9): 1517-28 (1998)]). EAE에서의 LTβR-Ig의 효능이 또한 공개되어 있다 ([Gommerman et al., J. Clin. Invest, 112 (5): 755-67 (2003)]). 또한, LTβR-Ig는 마우스에서 림프생성을 파괴시킨다. [Mackay et al., Europ. J. Immunol. 27 (8): 2033-42 (1997)]). 게다가, LTβR.Ig의 투여는 비-비만형 당뇨병 마우스에서 인슐린-의존성 당뇨병 (IDDM)을 감소시킨다 ([Wu et al., J. Exp. Med , 193 (11): 1327-32 (2001)]). 비-인간 영장류에서의 림프생성에서의 LT의 역할이 [Gommerman et al., J. Clin. Invest. 110 (9): 1359-69 (2002)]에서 LTβR-Ig를 사용하여 연구되었다. 게다가, LTα-결핍 마우스는 TNF-α-결핍 마우스보다 마이코박테리움 보비스(M. bovis) BCG에 덜 감수성이다. [Eugster et al., Europ. J. Immunol., 31: 1935 (2001)].
LT는 암을 치료하는데 또한 사용되어 었다. US 5,747,023 참조.
항체
항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 일반적으로 천연 항체는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 개수는 여러 면역글로불린 이소타입의 중쇄들 간에 상이하다. 또한 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적인 간격의 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 다수의 불변 도메인이 이어지는 가변 도메인 (VH)을 한쪽 말단에 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고 다른쪽 말단에 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간에서 서열이 크게 상이 하고 각각의 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 양쪽 모두에서 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 3개의 절편에 집중된다. 가변 도메인에서 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭해진다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된, β-시트 형상을 주로 채택한 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조).
불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에서 직접적으로 수반되지는 않지만, 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낸다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 여러 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 주요 5개 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(subclass) (이소타입(isotype)), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭해진다. 인간 면역글로불린 클래스들 중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgM만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있고, 인간 IgG1 및 IgG3은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 IgG2 및 IgG4보다 더욱 효과적으로 매개한다.
TNF-α를 억제하는 치료용 화합물을 개발하기 위해 2가지 주요 접근법이 사용되었다. REMICADE®로 또한 공지된 TNF-α에 대한 키메라 모노클로날 항체인 인플릭시맵이 예시되는 첫번째 접근법은 TNF-α가 이의 수용체에 결합하는 것을 방지하는 높은 친화력 및 효능의 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 TNF-α 작용을 중화시키는 것이다. ENBREL®로 또한 공지된 이태너셉트가 예시되는 두번째 접근법은 TNF-α가 이의 천연 수용체에 결합하는 것을 감소시키는 "미끼"로서 기능하는 TNF 수용체-기반 분자를 사용하여 TNF-α를 억제하는 것이다. 양쪽 유형의 분자 모두 TNFα가 이의 수용체에 결합하는 것을 방지할 수 있지만, 이태너셉트와 같은 수용체-기반 억제제는 LTα의 수용체 결합을 또한 방지할 것이다.
특허 문헌에서, EP 212489에 개시된, 카켁틴 (TNF)에 대한 항체가 진단 면역분석법 및 박테리아 감염에서의 쇼크의 치료법에서 유용한 것으로 보고되었다. EP 218868에는 인간 TNF에 대한 모노클로날 항체, 및 이의 용도가 개시되어 있다. EP 288,088에는 항-TNF 항체, 및 병리학의 면역분석법 진단에서의 이의 용도, 특히 가와사끼(Kawasaki) 병리학 및 박테리아 감염에서의 용도가 개시되어 있다. 항-TNF 항체는, 예를 들어, EP 1585477 (Giles-Komar 등); US 2006-0147452; US 2006-0222646; 및 US 2006-0121037에 또한 기술되어 있다. 인간 TNFα가 수용체에 결합하는 것을 길항하는 단일-도메인 항체 폴리펩티드 구축물을 사용하여 RA를 치료하는 방법이 US 2005-0271663에 기술되어 있다. 항-TNF 수용체 융합 단백질을 사용하여 RA를 치료하는 방법이 US 2005-0260201에 기술되어 있다. 메토트렉세이트 및 항-TNF 항체를 포함하는 조성물을 사용하여 RA, 크론 질환, 및 이식과 관련된 급성 및 만성 면역 질환이 포함되는 TNF-매개 질환을 치료하는 방법이 EP 1593393에 기술되어 있다. TNF-R에 결합하는 항체에는 US 7,057,022에 기술된 항체가 포함된다. TNF-알파 길항제 활성이 있는 신규 단백질이 US 7,056,695에 기술되어 있다. US 2006-0147448에는 LT 경로 억제제에 의한 면역학적 신장 장애의 치료가 개시되어 있다.
LTβ 및 LTβ/LTα 복합체 및 LTβ-R 및 이들에 대한 항체, 뿐만 아니라 LTβ 차단제가, 예를 들어, WO 1992/00329; WO 1994/13808; US 5,661,004; US 5,795,964; EP 0954333; US 5,670,149; US 5,925,351; US 2005-0037003; US 6,403,087; US 6,669,941; US 6,312,691; US 7,001,598; US 7,030,080; US 2006-0222644; 및 US 2005-0163747에 기술되어 있다. US 2006-0134102 출원에는 화학요법제와 조합된 LTβ-R 작용제가 개시되어 있다. LTβ-R에 대한 항체가 US 2005-0281811에 기술되어 있다. 비만 및 비만-관련 장애를 방지 및/또는 치료하기 위한 LTβ-R 항체의 용도에 관한 WO 2006/114284를 또한 참조. 치료 방법에서의 LTβ-R에 특이적인 인간화 항체 (단독 또는 화학요법제(들)와 조합됨)가 EP 1539793에 개시되어 있다. LTα 및 이에 대한 항체가, 예를 들어, US 4,959,457; 5,824,509; 4,920,196; 및 5,683,688; US 2005-0266004 (WO 2005/067477) 및 US 5,188,969 (EP 347728B1)에 기술되어 있다. LTβ 또는 LTβ-R 기술에 관한 US 2002-0039580; WO 2004/039329; 및 US 2002-0197254를 또한 참조. 다가 항체 (TNF 수용체 수퍼패밀리에 결합하는 항체)가, 예를 들어, US 2002-0004587 및 US 2006-0025576에 기술되 어 있다.
LTα가 TNF-α 또는 LTβ 단독보다 다양한 수용체와 더 많은 상호작용을 하기 때문에, LTα를 차단하는 항-LTα 항체 또는 이의 단편과 같은 항체, 특히 기능이 개선된 치료용 항체를 생산하는 것이 당업계에서 계속 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 중요한 치료용 표적으로 나타나는 생물학적/세포성 프로세스인 LT 생물학적 경로의 다양한 길항제의 확인을 부분적으로 기초로 한다. 본 발명은 다양한 수용체에 대한 LTα 결합을 방해하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 LTα 활성화의 방해를 기초로 하는 조성물 및 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 청구된 바와 같다. 한 양상에서, 본 발명은
(a) KASQAVSSAVA (서열 1) 또는 RASQAVSSAVA (서열 2)인 아미노산 A1-A11을 포함하거나 또는 KSSQSLLYSTNQKNFLA (서열 3) 또는 KSSQSLLYSANQKNFLA (서열 4) 또는 KSSQSLLYSTNQKNALA (서열 6)인 아미노산 A1-A17을 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 상보성-결정 영역 (CDR)-L1 서열 (각각 키메라 2C8 또는 인간화 2C8.v2/2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14, 또는 3F12 클론 14 또는 17);
(b) SASHRYT (서열 7) 또는 WASTRDS (서열 8)인 아미노산 B1-B7을 포함하는 CDR-L2 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2/인간화 2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14);
(c) QQHYSTPWT (서열 9) 또는 QENYSTPWT (서열 11) 또는 QQYYSYPRT (서열 13) 또는 QQYASYPRT (서열 14) 또는 QQYYAYPRT (서열 15)인 아미노산 C1-C9를 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-L3 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2 또는 2C8 클론 G7 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14 또는 3F12 클론 20 또는 3F12 클론 21);
(d) GYTFTSYVIH (서열 16) 또는 GYTFSSYWIE (서열 17)인 아미노산 D1-D10을 포함하는 CDR-H1 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2/인간화 2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14);
(e) YNNPYNDGTNYNEKFKG (서열 18) 또는 EISPGSGSTNYNEEFKG (서열 19) 또는 YNNPYNAGTNYNEKFKG (서열 101) 또는 EINPGSGSTIYNEKFKG (서열 110)인 아미노산 E1-E17을 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-H2 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5, 또는 인간화 2C8.vX, 또는 인간화 3F12.v14); 및
(f) PTMLPWFAY (서열 20)인 아미노산 F1-F9를 포함하거나 또는 GYHGY (서열 21) 또는 GYHGA (서열 22)인 아미노산 F1-F5를 포함하는 CDR-H3 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2/인간화 2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14 또는 3F12 클론 12)
로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 상보성-결정 영역 (CDR) 서열을 포함하는 단리된 항-림포톡신-α (LTα) 항체를 제공한다.
바람직하게는, 서열 3은 KSSQSLLYSTAQKNFLA (서열 5) (3F12 클론 15)이다. 또다른 바람직한 양상에서, 서열 11은 QESYSTPWT (서열 10) (2C8 클론 A8/인간화 2C8.vX) 또는 QEVYSTPWT (서열 12) (2C8 클론 H6)이다.
추가로 바람직한 실시양태에서, CDR-L1 서열은 서열 2 또는 3 또는 4 또는 6이다.
또다른 바람직한 양상에서, 항체는 (i) 서열 1 또는 2 및 7 및 9의, 또는 서열 1 또는 2 및 7 또는 8 및 11의, 또는 서열 3, 8, 및 13의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 13의, 또는 서열 3, 8, 및 14 또는 15의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 14 또는 15의 CDR-L1 내지 CDR-L3 아미노산 서열 모두; 또는 (ii) 서열 16, 18, 및 20의 CDR-H1 내지 CDR-H3 아미노산 서열 모두, 또는 서열 16, 101, 및 20 모두, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22 모두, 또는 서열 17, 110, 및 21 모두를 포함한다.
추가적인 바람직한 양상에서, 항체는 서열 1 또는 2 및 7 및 9 모두, 또는 서열 16, 18, 및 20 모두, 또는 서열 16, 101, 및 20 모두를 포함한다. 별법적인 실시양태에서, 항체는 서열 3, 8, 및 13 모두, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22 모두를 포함한다. 별법적인 실시양태에서, 항체는 서열 4, 8, 및 14 모두, 또는 서열 17, 110, 및 21 모두를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 (i) 서열 1 또는 2, 7 및 9의, 또는 서열 1 또는 2 및 7 또는 8 및 11의, 또는 서열 3, 8, 및 13의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 13의, 또는 서열 3, 8, 및 14 또는 15의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 14 또는 15의 CDR-L1 내지 CDR-L3 아미노산 서열 모두; 및 (ii) 서열 16, 18, 및 20의, 또는 서열 16, 101, 및 20의, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22의, 또는 서열 17, 110, 및 21의 CDR-H1 내지 CDR-H3 아미노산 서열 모두를 포함한다.
또한, 본원에서의 항체는 바람직하게는 키메라 항체 또는 인간화 항체, 가장 바람직하게는 인간화 항체이다. 항체가 원하는 생물학적 특성 (예를 들어, 원하는 결합 친화력)을 나타내는 한, 본 발명의 인간화 항체는 하나 이상의 적절한 인간 및/또는 인간 컨센서스(consensus) 비-CDR (예를 들어, 프레임워크) 서열을 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 내에 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이같은 인간화 항체 프레임워크 서열의 적어도 일부분이 인간 컨센서스 프레임워크 서열이다.
일부 실시양태에서, 인간 및/또는 인간 컨센서스 비-CDR 서열 내에 하나 이상의 추가적인 변형이 존재한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 도메인은 인간 컨센서스 프레임워크 서열의 적어도 일부 (바람직하게는 모두)를 포함하고, 한 실시양태에서 상기 서열은 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 서열이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 변형된 변이체 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 변이체 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 서열은 위치 71, 73, 및/또는 78 중 하나 이상에서의 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 치환은 임의의 조합으로의 R71A, N73T, 및/또는 N78A이고, 바람직하게는 셋 모두이다. 또다른 실시양태에서, 이러한 항체는 인간 κ 경쇄 컨센서스 프레임워크 서열의 적어도 일부 (바람직하게는 모두)를 포함하거나 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 κ 서브그룹 I 프레임워크 컨센서스 서열의 적어도 일부 (바람직하게는 모두)를 포함한다.
항체의 CDR을 묘사하는 아미노산 위치/경계는 정황 및 당업계에 공지된 다양 한 정의 (하기에 기술된 바와 같음)에 따라 변할 수 있다. 한 기준 셋트 하에서는 CDR 내인 것으로 생각될 수 있는 반면 상이한 기준 셋트 하에서는 CDR 외부인 것으로 생각될 수 있다는 점에서, 가변 도메인 내의 일부 위치는 하이브리드 초가변 위치로 간주될 수 있다. 이러한 위치들 중 하나 이상은 확장된 CDR (하기에서 추가로 정의됨) 내에서 또한 발견될 수 있다. 본 발명은 이러한 하이브리드 초가변 위치에서의 변형을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 하이브리드 초가변 위치는 중쇄 가변 도메인 내의 위치 26-30, 33-35B, 47-49, 57-65, 93, 94, 및 102 중 하나 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 하이브리드 초가변 위치는 경쇄 가변 도메인 내의 위치 24-29, 35-36, 46-49, 56, 및 97 중 하나 이상을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 하나 이상의 하이브리드 초가변 위치에서 변형된 변이체 인간 서브그룹 컨센서스 프레임워크 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 양상에서, 항체는 LTα3에 결합하고, LTα3과 종양 괴사 인자 수용체-1 (TNFRI) 및 종양 괴사 인자 수용체-2 (TNFRII)의 상호작용을 차단한다. 바람직하게는, 이는 하나 이상의 LTαβ 복합체, 특히 세포 표면 상의 복합체에 또한 결합한다. 바람직하게는, 이는 하나 이상의 LTαβ 복합체의 기능을 또한 차단한다. 또한, 이는 시험관내 관절염 분석법 예컨대 시험관내 콜라겐-유도 관절염 분석법 또는 시험관내 항체-유도 관절염 분석법에서 류머티스성 관절염과 관련된 염증성 사이토카인의 수준을 바람직하게 감소시킨다.
일부 양상, 예컨대 뮤린(murine) S5H3 항체에서, 항체는 LTαβ와 LTβ-R의 상호작용을 차단하지 않는다. 또다른 양상에서, 항체는 LTαβ와 LTβ-R의 상호작 용을 차단한다. 바람직하게는, 항체는 LTαβ-발현 세포를 조정한다. 또다른 실시양태에서, 항-LTα 항체는 하나 이상의 LTα 단백질의 한가지 이상의 활성을 실질적으로 중화한다. 바람직하게는, 본원에서의 항체는 LTα를 발현하는 모든 세포를 표적으로 하고, 더욱 바람직하게는 LTα-양성 또는 -분비 세포를 고갈시킨다.
바람직한 항체는 적어도 약 10-12 M (피코몰 수준), 더욱 바람직하게는 적어도 약 10-13 M의 친화력으로 LTα에 결합한다. IgG 항체가 또한 바람직하고, 더욱 바람직하게는 인간 IgG이다. 인간 IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 임의의 인간 IgG 이소타입이 포함된다. 뮤린 IgG에는 IgG1, 2a, 2b, 및 3의 이소타입이 포함된다. 더욱 바람직하게는, 뮤린 IgG는 IgG2a이고, 인간 IgG는 IgG1이다. 인간 IgG의 또다른 바람직한 실시양태에서, 제공된 VH 및 VL 서열이 인간 IgG1 불변 영역에 연결된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 23 또는 24를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 25 또는 26을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 23 및 25 양쪽 모두를 포함하거나 서열 24 및 26 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체를 제공한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 서열 27 또는 28을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 29 또는 30 또는 31을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 27 및 29 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 27 및 30 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 27 및 31 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 28 및 30 양쪽 모두를 포함하거 나, 서열 28 및 31 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체를 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 서열 102를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 103을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 102 및 103 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체를 제공한다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 서열 108을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 109를 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 108 및 109 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체를 제공한다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 항체에 Fc 영역이 있다. 한 양상에서, 이같은 Fc 영역은 야생형 (또는 천연 서열) Fc 영역이다. 또다른 실시양태에서, 항체는 하기의 성질들 중 하나 이상을 나타내는 폴리펩티드를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환을 Fc 영역 내에 추가로 포함한다: 천연 서열 Fc 영역이 있는 항체와 비교하여, 증가된 FcγR 결합, 증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 증가된 보체-의존적 세포독성 (CDC), 감소된 CDC, 증가된 ADCC 및 CDC 기능, 증가된 ADCC와 감소된 CDC 기능, 증가된 FcRn 결합, 및 증가된 혈청 반감기. 더욱 바람직하게는, 항체는 천연 서열 Fc 영역이 있는 동일한 항체와 비교하여 ADCC 기능이 증가된 항체를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환을 Fc 영역 내에 추가로 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 268D, 또는 298A, 또는 326D, 또는 333A, 또는 334A, 또는 298A + 333A, 또는 298A + 334A, 또는 239D + 332E, 또는 239D + 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332A, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 330L 및 332E 및 272Y 및 254T 및 256E, 또는 250Q + 428L, 또는 265A, 또는 297A인 위치들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합에서의 아미노산 치환이 항체의 Fc 영역 내에 있고, 이때 265A는 297A의 부재 하에 치환되고, 297A는 265A의 부재 하에 치환된다. 한 특정 실시양태에서, Fc 영역에는 1개 내지 3개의 이같은 아미노산 치환, 예를 들어, 위치 298, 333, 및 334에서의 치환이 있고, 더욱 바람직하게는 298A, 333A, 및 334A의 조합이다. 각각의 이러한 명칭에서의 숫자 뒤의 문자는 이러한 위치에서의 변화된 아미노산을 나타낸다.
이같은 항-LTα 항체는 LTα/LTβ 신호전달 경로의 다양한 정도의 파괴를 초래한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 인간 LTα에 대한 항체의 1가 친화력 (예를 들어, 인간 LTα에 대한 Fab 단편으로서의 항체의 친화력)이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 접속 번호 (ATCC) PTA-7538 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 (하이브리도마 뮤린 림포톡신(Lymphotoxin) 알파2 베타1 s5H3.2.2)에 의해 생산된 뮤린 항체의 친화력 (예를 들어, 인간 LTα에 대한 Fab 단편으로서의 뮤린 항체의 친화력)과 대략 동일하거나 이보다 큰 항-LTα 항체 (바람직하게는 인간화 항체)를 제공한다. 1가 친화력은 바람직하게는 Kd 값으로 표현되고/되거나, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (BIACORE® 기술)을 사용하는 광학 바이오센서 또는 방사선면역분석법에 의해 측정된다.
추가적인 본원에서의 항체에는 야생형 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산된 동일한 항체 상의 푸코스의 양에 비해 푸코스가 감소된, 상기 기술된 성질들 중 임의의 것이 있는 항체가 포함된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 있는 본원에 기술된 항체를 포함하고, 이때 조성물 내의 항체의 약 20-100％가 푸코스가 없는 Fc 영역 내의 성숙형 코어(core) 탄수화물 구조를 포함하는 항체 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 이같은 조성물은 238, 239, 246, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 314, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 434, 435, 437, 438 및 439로 구성된 군으로부터 선택된 Fc 영역의 위치들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합에서 A, D, E, L, Q, T, 및 Y로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 치환함으로써 야생형 IgG Fc 서열과 비교하여 항체의 ADCC, CDC, 또는 약동학 성질 중 하나 이상이 변화되도록 변경된 Fc 영역이 있는 항체를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 상기 기술된 항체 조성물은 268D 또는 326D 또는 333A + 334A, 또는 298A + 333A, 또는 298A + 334A, 또는 239D + 332E, 또는 239D + 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332A, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 330L 및 332E인 Fc 치환을 항체가 추가로 포함하는 조성물이고, 이때 각각의 이러한 명칭에서의 숫자 뒤의 문자는 이러한 위치에서의 변화된 아미노산을 나타낸다.
추가적으로 바람직하게는, 상기 기술된 항체 조성물은 항체가 FcγRIII에 결합하는 조성물이다. 바람직하게는, 조성물은 인간 야생형 IgG1 Fc를 포함하는 동일한 항체와 비교하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체에 ADCC 활성이 있거나 또는 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체의 ADCC 활성이 증가된 조성물이다. 또한 바람직하게는, 조성물은 항체가 당단백질의 Fc 영역에 부착된 푸코스를 포함하는 성숙형 코어 탄수화물 구조가 있는 당단백질보다 더 양호한 친화력으로 FcγRIII에 결합하거나, 또는 더 효과적으로 ADCC를 매개하는 조성물이다. 또한, 바람직하게는 조성물은 항체가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게는 Lec13 세포에 의해 생산된 조성물이다. 또한 바람직하게는, 조성물은 항체가 푸코실트랜스페라제(fucosyltransferase) 유전자, 더욱 바람직하게는 FUT8 유전자가 없는 포유류 세포에 의해 생산된 조성물이다.
한 실시양태에서, 상기 기술된 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 양분화(bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 없는 조성물이다. 별법적인 실시양태에서, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 양분화 GlcNAc가 있는 조성물이다.
또다른 양상에서, 상기 기술된 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 갈락토스 잔기가 있는 조성물이다. 별법적인 실시양태에 서, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 갈락토스 잔기가 없는 조성물이다.
추가적인 양상에서, 상기 기술된 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 시알산 잔기가 있는 조성물이다. 별법적인 양상에서, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 시알산 잔기가 없는 조성물이다.
상기 기술된 조성물은 바람직하게는 약 2％ 이상의 비-푸코실화(afucosylated) 항체, 더욱 바람직하게는 약 4％ 이상의 비-푸코실화 항체, 더더욱 바람직하게는 약 10％ 이상의 비-푸코실화 항체, 더욱 더 바람직하게는 약 19％ 이상의 비-푸코실화 항체, 가장 바람직하게는 약 100％의 비-푸코실화 항체를 포함한다.
임의의 본원에서의 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입(idiotype) 항체가 또한 본원에 포함된다.
숙주 대상에서 사용하기 위한 치료제는 상기 대상에서 치료제에 대한 면역원성 응답을 거의 일으키지 않거나 일으키지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 숙주 대상에서 뮤린 항체와 비교하여 실질적으로 감소된 수준으로 인간 항-마우스 항체 응답 (HAMA)을 일으키고/키거나 일으킬 것으로 예상되는 키메라 또는 인간화 항체를 제공한다. 또다른 예에서, 본 발명은 최소한도의 인간 항-마우스 항체 응답 (HAMA) 또는 무응답을 일으키고/키거나 일으킬 것으로 예상되는 키메라 또는 인간화 항체를 제공한다. 한 예에서, 본 발명의 항체는 임상적으로 허용가능한 최대 수준이거나 이보다 낮은 항-마우스 항체 응답을 일으킨다.
본 발명의 항체는 LTα 수용체 활성화, 하류 분자성 신호전달, 세포 증식, 세포 이동, 세포 생존, 세포 형태형성, 및 혈관생성이 포함되지만 이에 한정되지 않는 LTα-관련 효과의 하나 이상의 양상을 조절하는데 사용될 수 있다. 이러한 효과들은 리간드 (예를 들어, LTα)의 파괴, LTα3 수용체 또는 이종이량체성 수용체들 중 하나 또는 양쪽 모두에의 결합 및 차단, 뿐만 아니라 수용체 인산화, 및/또는 수용체 다량체화가 포함되는 임의의 생물학적으로 관련된 메커니즘에 의해 조절될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 세포 또는 조직을 유효량의 하나 이상의 본 발명의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, LTα-활성화 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 이같은 LTα-활성화 세포 증식은 자가면역 장애, 더욱 바람직하게는 RA, MS, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 루푸스, 중증 근육무력증, 또는 IBD, 또는 암, 특히 유방암, 폐암, 전립선암, 림프종, 또는 백혈병으로 인한 것이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 세포 또는 조직을 제2 의약과 접촉시키는 것을 포함하고, 이때 제1 의약은 하나 이상의 본원에서의 항체이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 세포 또는 조직은 포유류 세포 또는 조직, 더욱 바람직하게는 인간 세포 또는 조직이고, 더욱 바람직하게는 상기 방법은 생체내 방법이다. 이같은 바람직한 생체내 방법에서, 바람직하게는, 예컨대 정맥내 또는 피하 투여에 의해, 세포 또는 조직이 있는 대상, 가장 바람직하게는 인간 대상에게 유효 량의 본원에서의 항체가 투여된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 자가면역 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 자가면역 장애는 류머티스성 관절염 (RA), 루푸스, 베게너(Wegener) 질환, 염증성 장 질환 (IBD), 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증 (MS), 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증 근육무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노(Raynaud) 증후군, 쇼그렌 증후군, 사구체신염, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 헬리코박터-파일로리(helicobacter-pylori) 위염, 및 만성 C형 간염으로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 자가면역 장애는 RA, MS, 쇼그렌 증후군, 루푸스, 중증 근육무력증, 또는 IBD이고, 더욱 바람직하게는 자가면역 장애는 RA, IBD, 루푸스, 또는 MS이다. 더욱 바람직하게는, 루푸스는 전신 홍반 루푸스 또는 루푸스 신염이고, IBD는 크론 질환 또는 궤양성 대장염이다.
또다른 양상에서, 항체는 네이키드(naked) 항체이다. 추가적인 양상에서, 항체는 또다른 분자, 예컨대 세포독성제에 접합된다.
또다른 양상에서, 상기 방법에서 항체가 정맥내 투여된다. 별법적인 양상에서, 항체가 피하 투여된다.
또다른 실시양태에서, 대상에게 RA가 있고, 항체가 대상에서 주요 임상 응답을 유도한다.
추가적인 양상에서, 대상에서 하나 이상의 사이토카인, 항-핵 항체 (ANA), 항-류머티즘 인자 (RF) 항체, 크레아티닌, 혈액 요소 질소, 항-내피 항체, 항-중성구 세포질 항체 (ANCA), 침윤성 CD20 세포, 항-이중 가닥 DNA (dsDNA) 항체, 항-Sm 항체, 항-핵 리보핵산단백질 항체, 항-인지질 항체, 항-리보솜 P 항체, 항-Ro/SS-A 항체, 항-Ro 항체, 항-La 항체, 쇼그렌-관련 항원 A 또는 B (SS-A 또는 SS-B)에 대해 지시된 항체, 동원체 단백질 B (CENP B) 또는 동원체 단백질 C (CENP C)에 대해 지시된 항체, ICA69에 대한 자가항체, 항-스미스(Smith) 항원 (Sm) 항체, 항-핵 리보핵산단백질 항체, 항-리보솜 P 항체, 중성구의 핵 또는 핵주위 구역을 염색하는 자가항체 (pANCA), 항-사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 항체, GM1 갱글리오사이드 또는 GQ1b 갱글리오사이드에 대한 교차-반응성 항체, 항-아세틸콜린 수용체 (AchR), 항-AchR 서브타입, 또는 항-근육 특이적 티로신 키나제 (MuSK) 항체, 혈청 항-내피 세포 항체, IgG 또는 항-데스모글레인 (Dsg) 항체, 항-동원체, 항-토포이소머라제-1 (Scl-70), 항-RNA 폴리머라제 또는 항-U3-리보핵산단백질 (U3-RNP) 항체, 항-사구체 기저막 (GBM) 항체, 항-사구체 기저막 (GBM) 항체, 항-미토콘드리아 (AMA) 또는 항-미토콘드리아 M2 항체, 항-갑상선 페록시다제 (TPO), 항-갑상선글로불린 (TG) 또는 항-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 항체, 항-핵산 (AN), 항-액틴 (AA) 또는 항-평활근 항원 (ASM) 항체, IgA 항-근섬유막, IgA 항-조직 트랜스글루타미나제, IgA 항-글리아딘 또는 IgG 항-글리아딘 항체, 항-CYP21A2, 항-CYP11A1 또는 항-CYP17 항체, 항-리보핵산단백질 (RNP), 또는 근육염-특이적 항체, 항-말이집 관련 당단백질 (MAG) 항체, 항-C형 간염 바이러스 (HCV) 항체, 항-GM1 갱글리오사이드, 항-술페이트-3-글리쿠로닐 파라글로보사이드 (SGPG), 또는 IgM 항-당접합체 항체, IgM 항-갱글리오사이드 항체, 항-갑상선 페록시다제 (TPO), 항-갑상선글로불린 (TG) 또는 항-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 항체, 항-말이집 염기성 단백질 또는 항-말이집 희소돌기아교세포 당단백질 항체, IgG의 Fc 부분에 대해 지시된 IgM 류머티즘 인자 항체, 항-인자 VIII 항체, 또는 이의 조합물의 수준이 비정상적이다.
이러한 방법의 또다른 바람직한 양상에서, 항체는 대상에게 2주에 약 1회 이하로, 더욱 바람직하게는 1개월에 약 1회로 투여된다.
또다른 실시양태에서, 제2 의약 (항체가 제1 의약임)이 상기 방법에서 대상을 치료하기 위해 유효량으로 대상에게 투여된다. 이같은 제2 의약은 바람직하게는 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제, BAFF 길항제, 질환-변형 항-류머티즘 약물 (DMARD), 인테그린 길항제, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 사이토카인 길항제, 또는 이의 조합물이다. 추가적으로, 이는 활성 전달 비히클로서의 히알루로니다제 당단백질일 수 있다. 가장 바람직하게는, 이는 DMARD 또는 메토트렉세이트이다.
또다른 실시양태에서, 대상은 장애에 대한 의약으로 이전에 치료된 적이 없다. 추가적인 양상에서, 대상은 TNF 길항제로 이전에 치료된 적이 없다.
별법적인 실시양태에서, 대상은 장애에 대한 의약, 바람직하게는 TNF 길항제 (예컨대 항-TNF 항체 또는 TNF 수용체-Ig 예컨대 이태너셉트) 또는 DMARD로 이전에 치료된 적이 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 RA를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 바람직하게는 항체는 대상에서 주요 임상 응답을 유도한다. 더욱 바람직하게는, 대상은 장애에 대한 의약, 바람직하게는 TNF 길항제 (예컨대 항-TNF 항체 또는 TNF 수용체-Ig 예컨대 이태너셉트) 또는 DMARD로 치료된 적이 있다. 이러한 방법의 또다른 바람직한 양상에서, 항체는 대상에게 2주에 약 1회 이하로, 더욱 바람직하게는 1개월에 약 1회로 투여된다.
이러한 RA 치료 방법의 또다른 실시양태에서, 제2 의약 (항체가 제1 의약임)이 RA에 대해 치료되고 있는 대상에게 대상을 치료하기 위한 유효량으로 투여된다. 이같은 제2 의약은 바람직하게는 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제, BAFF 길항제, 질환-변형 항-류머티즘 약물 (DMARD), 인테그린 길항제, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 사이토카인 길항제, 또는 이의 조합물이다. 추가적으로, 이는 활성 전달 비히클로서의 히알루로니다제 당단백질일 수 있다. 가장 바람직하게는, 이는 DMARD 또는 메토트렉세이트이다. 바람직하게는, RA를 치료하는데 사용된 항체는 피하 또는 정맥내 투여된다. 추가로, 이는 네이키드 항체이거나 또는 예를 들어 세포독성제에 접합될 수 있다. 이러한 방법의 또다른 바람직한 양상에서, 항체는 대상에게 2주에 약 1회 이하로, 더욱 바람직하게는 1개월에 약 1회로 투여된다.
본 발명은 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 항체 및 담체, 예컨대 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이다. 이같은 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 항체를 코딩하는 발현 벡터가 또한 제공된다. 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 다양한 숙주 세포들 중 임의의 세포가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들어, 대장균이다. 또다른 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포 또는 포유류 세포 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 적절한 숙주 세포 (바람직하게는, 상기 항체 (또는 이의 단편)을 코딩하는 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 세포)를 항체가 생산되는 조건 하에 배양하고, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-LTα 항체 (본원에 정의된 바와 같이, 전장 및 이의 단편이 포함되고, 단 Fc 영역을 함유함)의 제조 또는 생산 방법을 제공한다. 항체는 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 회수될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 네이키드 항체이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 또다른 분자에 접합되고, 이는 바람직하게는 세포독성제이다.
본 발명의 또다른 양상은 용기, 및 용기 내에 함유된, 상기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 항체를 포함하는 조성물, 및 조성물이 항체가 목적으로 하는 적응증, 예컨대 자가면역 장애를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 가리키는 포장 삽입물을 포함하는 제조품이다. 상기 언급된 바와 같이, 제1 의약인 항체에 더하 여, 제2 의약이, 예를 들어, 별도의 용기 내에서, 이같은 제조품에 첨가될 수 있다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 ATCC에 2006년 4월 19일에 기탁 번호 PTA-7538 하에 기탁된 하이브리도마를 포함한다. 이같은 하이브리도마에 의해 분비되는 항체가 또한 제공된다.
구체적으로 자가면역 질환이 RA인 경우, 한 양상은 환자에게 RA용 의약이 이전에 투여된 적이 없는 방법이다. 별법적인 양상은 환자에게 하나 이상의 RA용 의약이 이전에 투여된 적이 있는 방법이고, 더욱 바람직하게는 환자가 이전에 투여된 하나 이상의 의약에 응답성이지 않은 방법이다. 환자가 비-응답성일 수 있는 이전에 투여된 의약 또는 의약들에는 면역억제제, 사이토카인 길항제, 인테그린 길항제, 코르티코스테로이드, 진통제, DMARD, NSAID, 또는 CD20 길항제가 포함되고, 더욱 바람직하게는 면역억제제, 사이토카인 길항제, 인테그린 길항제, 코르티코스테로이드, DMARD, NSAID, 또는 CD20 길항제, 예컨대 CD20 항체이고, 바람직하게는 이는 리툭시맵 또는 인간화 2H7이 아니다. 가장 바람직하게는, 이같은 이전에 투여된 의약(들)은 DMARD 또는 TNF 억제제 예컨대 항-TNF-알파 항체 또는 TNF-Ig이다.
자가면역 질환 예컨대 RA를 치료하기 위해 본원에서의 항체를 사용하기 위한 본 발명의 또다른 바람직한 양상에서, 환자는 하나 이상의 TNF 억제제 또는 하나 이상의 DMARD에 부적합한 응답을 나타낸 환자이다. 더욱 바람직하게는, RA는 초기 RA 또는 개시성 RA이다.
또다른 실시양태에서, RA 또는 관절 손상이 있는 환자에게 본원에서의 항체 를 투여하고 나서 적어도 약 3개월 후에, 투여 전의 기준선과 비교하여 뼈 또는 연조직 관절 손상에서의 감소를 측정하는 영상화 테스트가 제공되고, 투여된 항체의 양은 관절 손상에서의 감소를 달성하는데 효과적인 방법이 제공된다. 바람직한 양상에서, 테스트는 전체 변형 샤프(Sharp) 점수를 측정한다. 바람직한 양상에서, 상기 방법은 이전의 항체 투여의 효과와 비교하여 지속적이거나 유지되는 관절 손상 감소를 달성하는데 효과적인 양으로 본원에서의 항체를 환자에게 추가적으로 투여하는 것으로 추가로 포함한다. 추가적인 양상에서, 이전의 투여 후의 테스트 시점에 환자에서 임상 개선이 없는 경우에도 본원에서의 항체가 환자에게 추가적으로 투여된다. 바람직하게는, 임상 개선은 압통 관절 또는 종창 관절의 수를 평가함으로써, 환자의 포괄적인 임상 평가를 수행함으로써, 적혈구 침강 속도를 평가함으로써, C-관련 단백질 수준의 양을 평가함으로써, 또는 질환 활성의 복합적인 측정치들을 사용함으로써 결정된다.
RA 및 관절 손상의 치료를 위한 바람직한 제2 의약에는 면역억제제, DMARD, 통증 제어제, 인테그린 길항제, NSAID, 사이토카인 길항제, 비스포스포네이트, B-세포 표면 마커에 대한 길항제, 예를 들어, BR3-Fc, BR3 항체, CD20 항체, CD40 항체, CD22 항체, CD23 항체, 또는 이의 조합물이 포함된다. 제2 의약이 DMARD인 경우, 바람직하게는 이는 오라노핀, 클로로퀸, D-페니실라민, 주사용 금, 경구용 금, 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 미오크리신, 및 메토트렉세이트로 구성된 군으로부터 선택된다. 제2 의약이 NSAID인 경우, 바람직하게는 이는 펜부펜, 나프로신, 디클로페낙, 에토돌락, 인도메타신, 아스피린 및 이부프로펜으로 구성된 군으로부터 선택된다. 제2 의약이 면역억제제인 경우, 바람직하게는 이는 이태너셉트, 인플릭시맵, 아달리무맵, 레플루노미드, 아나킨라, 아자티오프린, 및 시클로포스파미드로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 제2 의약의 또다른 군에는 항-알파4, 이태너셉트, 인플릭시맵, 이태너셉트, 아달리무맵, 키나렛, 에팔리주맵, 오스테오프로테게린 (OPG), NFκB 리간드의 항-수용체 활성화제 (항-RANKL), NFκB-Fc의 항-수용체 활성화제 (RANK-Fc), 파미드로네이트, 알렌드로네이트, 악토넬, 졸렌드로네이트, 클로드로네이트, 메토트렉세이트, 아줄피딘, 히드록시클로로퀸, 독시사이클린, 레플루노미드, 술파살라진 (SSZ), 프레드니솔론, 인터루킨-1 수용체 길항제, 프레드니손, 또는 메틸프레드니솔론이 포함된다. 제2 의약의 또다른 바람직한 군에는 인플릭시맵, 인플릭시맵/메토트렉세이트 (MTX) 조합물, MTX, 이태너셉트, 코르티코스테로이드, 시클로스포린 A, 아자티오프린, 오라노핀, 히드록시클로로퀸 (HCQ), 프레드니솔론, MTX 및 SSZ의 조합물, MTX, SSZ 및 HCQ의 조합물, 시클로포스파미드, 아자티오프린 및 HCQ의 조합물, 및 아달리무맵과 MTX의 조합물이 포함된다. 더욱 바람직하게는, 코르티코스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 히드로코르티손, 또는 덱사메타손이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 제2 의약은 MTX이고, 더욱 바람직하게는 이는 경구적으로 또는 비경구적으로 투여된다.
또다른 양상에서, 본원에서의 치료 방법은 유효량의 본원에서의 항체를 환자에게 재투여함으로써 환자를 재치료하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 재치료는 항체를 1차 투여하고 나서 적어도 약 24주 후에 개시된다. 또다른 실시양 태에서, 2차 재투여가 개시되고, 더욱 바람직하게는 2차 재치료가 항체를 2차 투여하고 나서 적어도 약 24주 후에 개시된다. 또다른 실시양태에서, 자가면역 질환이 RA인 경우, 재치료 후 관절 손상이 감소되었다. 별법적인 실시양태에서, 특히 임상 개선이 압통 관절 또는 종창 관절의 수를 평가함으로써, 환자의 포괄적인 임상 평가를 수행함으로써, 적혈구 침강 속도를 평가함으로써, C-관련 단백질 수준의 양을 평가함으로써, 또는 질환 활성의 복합적인 측정치들을 사용함으로써 결정되는 경우에, 재치료후 테스트 시점에 환자에서 임상 개선이 관찰되지 않는다.
또다른 양상에서, 본 발명은 표적 수신자에게 자가면역 질환 예컨대 RA, MS, 루푸스, 또는 IBD를 나타내는 환자 또는 환자 집단을 치료하기 위한 항체 또는 이의 제약 조성물의 용도를 판촉하는 것을 포함하는, 본원에서의 항체 또는 이의 제약상 허용가능한 조성물을 광고하는 방법을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 함께 포장된, 본원에서의 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물, 및 이러한 항체 또는 제약 조성물이 자가면역 질환 예컨대 RA, MS, 루푸스, 또는 IBD가 있는 환자를 치료하는데 지시된다는 것을 나타내는 표지를 포함하는 제조품을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 제조품은 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 이때 본원에서의 항체가 제1 의약이며, 환자를 유효량의 제2 의약 (바람직하게는 메토트렉세이트)으로 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 지침서를 추가로 포함한다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 항체 또는 제약 조성물과 이러한 항체 또는 제약 조성물이 자가면역 질환 예컨대 RA, MS, 루푸스, 또는 IBD를 나타내는 환자를 치료하는데 지시된다는 것을 나타내는 표지를 포장물에서 조합시키는 것을 포함하는, 본원에서의 항체 또는 항체의 제약 조성물을 포장하는 방법을 제공한다.
도 1A는 2C8 키메라 경쇄 및 중쇄에 대한 전장 서열 (각각 서열 32 및 33)을 도시한다.
도 1B는 3F12 키메라 경쇄 및 중쇄에 대한 전장 서열 (각각 서열 34 및 35), 뿐만 아니라 3F12 키메라 중쇄 가변 영역 (서열 31)을 도시한다.
도 1C는 개선된 3F12 키메라 (하기 실시예에서 키메라2로 지칭됨) (3F12.2D3)에 대한 경쇄 가변 영역의 서열 (서열 36) 및 3F12.2D3의 경쇄 불변 영역의 서열 (서열 37)을 도시한다. 볼드체의 잔기는 다양한 화학적/효소 절단으로부터 확인된 것들을 가리킨다.
도 1D는 개선된 3F12 키메라 (3F12.2D3)에 대한 중쇄 가변 영역의 서열 (서열 38) 및 3F12.2D3의 중쇄 불변 영역의 서열 (서열 39)을 도시한다. 볼드체의 잔기는 다양한 화학적/효소 절단으로부터 확인된 것들을 가리키고, 별표는 글리코실화 부위를 가리킨다.
도 2A는 키메라 2C8 항체 (서열 23), 인간화 2C8.v2 (서열 24), 및 인간 카파 서브그룹 I 컨센서스 서열 (서열 40)에 대한 가변 경쇄의 서열들의 정렬을 도시힌다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 2B는 키메라 2C8 항체 (서열 25), 인간화 2C8.v2 (서열 26), 및 인간 서 브그룹 III 컨센서스 서열 (서열 41)에 대한 가변 중쇄의 서열들의 정렬을 도시힌다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 2C는 2C8.v7 및 2C8.v12 버젼에 대한 경쇄 및 중쇄 서열을 도시한다 (서열 42-45).
도 3A는 키메라 3F12 항체 (서열 27), 인간화 3F12.v5 (서열 28), 및 인간 카파 서브그룹 I 컨센서스 서열 (서열 40)에 대한 가변 경쇄의 서열들의 정렬을 도시힌다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 3B는 원래의 키메라 3F12 항체 (3F12.2D3이 아님) (서열 29), 인간화 3F12.v5 (서열 30), 및 인간 서브그룹 III 컨센서스 서열 (서열 41)에 대한 가변 중쇄의 서열들의 정렬을 도시한다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 4A 및 4B는 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3가 항체-유도 관절염 (AIA)을 억제한다는 것을 나타낸다. 도 4A는 Fc DANA 돌연변이 (항-LT.Fc돌연변이체) 및 TNFRII.Fc 돌연변이체 (TNFR.Ig 면역부착소), 뿐만 아니라 대조군 이소타입 (항-래그위드(ragweed) IgG2a 모노클로날 항체)과 비교하여 항-LTα 항체의 예방적 사용의 결과를 나타낸다. 도 4B는 항-LTα 항체가 대조군 이소타입 및 TNFRII.Fc 돌연변이체와 비교하여 치료용으로 투여되었을 때 AIA 모델에서 관절염의 발달을 억제하였음을 나타낸다.
도 5A 및 5B는 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3가 콜라겐-유도 관절염 (CIA)을 억제한다는 것을 나타낸다. 도 5A는 S5H3가 Fc DANA 돌연변이 (항-LT.Fc 돌연변이체), 뿐만 아니라 대조군 이소타입 (항-래그위드 IgG2a 모노클로날 항체)에 비교하여 CIA-예방 모델에서 관절염을 억제하였고, TNFRII.Fc 돌연변이체에 필적하였음을 나타낸다. 도 5B는 S5H3 항-LTα 항체가 대조군 이소타입과 비교하여 치료용으로 투여되었을 때 CIA 모델에서 관절염의 발달을 억제하였고, TNFRII.Fc 돌연변이체에 필적하였음을 나타낸다.
도 6은 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3가 대조군 이소타입 (항-gp120 IgG1 모노클로날 항체)과 비교하여 MBP-TCR 트랜스제닉 마우스에서 EAE 질환의 발병 및 중증도를 지연시킨다는 것을 나타낸다.
도 7A, 7B, 및 7C는 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3으로의 처치가 이소타입 대조군 (항-래그위드), 항-LT.Fc 돌연변이체, 및 CTLA4.Fc (양성 대조군)와 비교하여 각각 T-세포-의존적 항-TNP IgM, IgG1, 및 IgG2a 응답에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
도 8은 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3으로의 처치가 이소타입 대조군 (항-래그위드) 및 TNFRII.Fc 돌연변이체와 비교하여 T-세포-비의존적 항체 (IgM, IgG1, IgG2a, 및 IgG3) 응답에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
도 9는 항-LTα 키메라 모노클로날 항체 2C8이 DANA 항-LTα 2C8 Fc 돌연변이체 및 이소타입 대조군 (트라스투주맵, 인간 IgG1)과 비교하여 인간 SCID 마우스에서 GVHD를 예방한다는 것을 나타낸다. CTLA4.Fc 돌연변이체가 또한 양성 대조군 으로 사용되었다.
도 10A는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 인간 LTα3에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 10B는 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3, 뿐만 아니라 항-LT.Fc 돌연변이체가 뮤린 LTα3에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 11A는 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 결과를 통해 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα S5H3 항체가 항-LT.Fc 돌연변이체와 같이 뮤린 LTα1β2 복합체에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 11B는 LTβ와 복합체를 형성한 인간 세포의 표면 상의 LTα에 대한 키메라 항-LTα 항체 3F12 및 2C8의 결합에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다. 이는 LTβ-수용체.huIgG1 및 이소타입 대조군 huIgG1 (트라스투주맵)과 비교된다.
도 11C는 LTβ와 복합체를 형성한 뮤린 세포의 표면 상의 LTα에 대한 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3의 결합에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸다. 이는 LTβ-수용체 뮤린 IgG2a, 항-LT S5H3 Fc 돌연변이체, 및 이소타입 대조군 (항-IL122 muIgG2a)과 비교된다.
도 12A 및 12B는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 각각 인간 Th1 및 Th2 세포에 결합한다는 것을 나타내고, 비교를 위한 LTbR.Fc, TNFRII.Fc, 및 이소타입 대조군의 결합 결과를 나타낸다.
도 12C-12E는 항-LTα 인간화 항체 2C8.vX가 휴지 중인 세포에 결합하지 않지만 (도 12C), 인간 Th1 및 Th17 세포에는 결합한다는 것 (각각 도 12D 및 E)을 나타내고, 이때 이의 결합이 이소타입 대조군과 비교된다.
도 13A는 LTbR.Fc (실선), 키메라 항-LTα 3F12 항체 (파선), 및 이소타입 대조군 (음영 영역)으로 처리된 활성화되지 않은 T 세포를 나타낸다.
도 13B는 도 13A의 시약으로 처리된 항-CD3- 및 항-CD28-활성화 CD4 T 세포를 나타낸다.
도 13C는 도 13A의 시약으로 처리된 항-CD3- 및 항-CD28-활성화 CD8 T 세포를 나타낸다.
도 13D는 도 13A의 시약으로 처리된 IL15-활성화 CD56 NK 세포를 나타낸다.
도 13E는 도 13A의 시약으로 처리된 IgM- 및 CD40L-활성화 CD19 B 세포를 나타낸다.
도 14A는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 이소타입 대조군 (트라스투주맵)과 비교하여 인간 LTα3을 기능적으로 차단한다는 것을 나타낸다.
도 14B는 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3 및 항-LT.Fc 돌연변이체가 이소타입 대조군 (트라스투주맵)과 비교하여 뮤린 LTα3을 기능적으로 차단한다는 것을 나타낸다.
도 14C는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 이소타입 대조군 (트라스투주맵)과 비교하여 A549 세포에서 LTα3-유도 IL-8을 차단한다는 것을 나타낸다.
도 14D는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12, 뿐만 아니라 TNFRII.Fc 돌연변이체가 이소타입 대조군 (트라스투주맵)과 비교하여 HUVEC 상에서의 LTα3-유도 ICAM 발현을 차단한다는 것을 나타낸다. 자극되지 않은 세포의 응답 또한 제시된 다.
도 14E는 키메라 항-LTα 항체 2C8이 이소타입 대조군과 비교하여 LTα3-유도 NFkB 활성화를 차단한다는 것을 나타낸다. 자극되지 않은 세포의 응답 또한 제시된다.
도 15A는 키메라 항-LTα 항체 2C8이 이소타입 대조군과 비교하여 LTα1β2-유도 NFkB 활성화를 기능적으로 차단한다는 것을 나타낸다. 자극되지 않은 세포의 응답 또한 제시된다
도 15B, 15C, 및 15D는 키메라 항-LTα 항체 2C8이 각각 LTα3-, LTα2β1-, 및 LTα1β2-유도 세포독성을 차단한다는 것을 나타낸다.
도 15E는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 이소타입 대조군과 비교하여 HUVEC 상에서의 LTα1β2-유도 ICAM 발현을 차단한다는 것을 나타낸다. 자극되지 않은 세포의 응답 또한 제시된다
도 16은 키메라 항-LTα 항체 2C8이 항-LTα 2C8 Fc 돌연변이체과 비교하여 LTαβ-발현 세포를 사망시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
도 17A-H는 키메라 항-LTα 항체 2C8이 HUVEC 세포에서의 사이토카인 및 케모카인 분비를 차단한다는 것을 나타내고, 이때 도 17A-17D는 각각 KC/IL-8, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα1β2를 나타내고, 도 17E-17H는 대조군과 비교하여 각각 KC/IL-8, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα3을 나타낸다.
도 17I-P는 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 S5H3이 3T3 세포에서의 사이토카인 및 케모카인 분비를 차단한다는 것을 나타내고, 이때 도 17I-17L은 각각 KC, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα1β2를 나타내고, 도 17M-17P는 대조군과 비교하여 각각 KC, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα3을 나타낸다.
도 18A는 키메라 2C8 항체 (서열 23), 인간화 2C8.vX (서열 102), 및 인간 카파 서브그룹 I 컨센서스 서열 (서열 40)에 대한 가변 경쇄의 서열들의 정렬을 도시한다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 18B는 키메라 2C8 항체 (서열 25), 인간화 2C8.vX (서열 103), 및 인간 서브그룹 III 컨센서스 서열 (서열 41)에 대한 가변 중쇄의 서열들의 정렬을 도시한다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 19A 및 19B는 TNFRII.Fc/이소타입 대조군과 비교하여 2C8.vX 항체의 LTα3 및 LTα1β2 결합의 ELISA를 각각 나타낸다.
도 20A 및 20B는 인간 LT-유도 세포독성의 차단을 테스트하는 분석법을 사용하여 이소타입 대조군/TNFRII.Fc와 비교하여 2C8vX 항체에 의한 인간 LTα3 및 LTα1β2의 차단을 각각 나타낸다.
도 21은 HUVEC 세포 상에서의 LTα3에 의한 ICAM1 상향조절의 억제를 나타내는 기능적 분석법에서 어떻게 다양한 분자들이 LTα3을 차단하였는지의 비교를 제공한다. 구체적으로, 이소타입, 2C8.vX 및 TNFRII.Fc가 비교되었다.
도 22는 293-LTβR 세포를 사용하여 LTα1β2 차단을 나타내는 기능적 분석법에서 어떻게 다양한 분자들이 LTα1β2를 차단하였는지의 비교를 제공한다. 구 체적으로, 이소타입 및 2C8.vX가 자극되지 않은 세포와 함께 비교되었다.
도 23은 293-LTα1β2 세포를 수반하는 프로토콜을 사용하여 2C8.vX의 ADCC 활성을 나타낸다. 2C8.vX가 2C8.vX DANA 돌연변이체 (Fc 돌연변이체) 및 이소타입 대조군과 비교되었다.
도 24는 대조군 (2C8.vX DANA Fc 돌연변이체 및 이소타입 대조군)과 비교하여, 인간 SCID 모델에서의 2C8.vX 및 CTLA4-Fc로의 GVHD 생존 결과를 나타낸다.
도 25A-D는 인간 SCID GVHD 모델에서 2C8.vX 항체가 LTα1β2-발현 T 및 B 세포를 고갈시킨다는 것을 나타낸다. 도 25A의 결과는 이소타입 대조군, 2C8.vX, 및 2C8.vX.DANA 돌연변이체에 대한 제2일의 전체 양성 인간 세포를 나타낸다. 도 25B-D는 각각 CD4, CD8, 및 CD19 항체를 사용한 게이팅(gating)의 결과를 나타낸다.
도 26A는 키메라 3F12 항체 (서열 27), 인간화 3F12.v14 (서열 108), 및 인간 카파 서브그룹 I 컨센서스 서열 (서열 40)에 대한 가변 경쇄의 서열들의 정렬을 도시한다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 26B는 키메라 3F12 항체 (서열 29), 인간화 3F12.v14 (서열 109), 및 인간 서브그룹 III 컨센서스 서열 (서열 41))에 대한 가변 중쇄의 서열들의 정렬을 도시한다. 각각의 서열의 CDR 서열이 괄호 안에 표시되고, 정렬된 서열 아미노산 잔기들 간의 차이를 나타내기 위해 별표가 사용된다.
도 27은 2C8.vX 및 이의 비-푸코실화 대응물의 ADCC 활성을 나타내고, 이때 AF = 비-푸코실화 항체이고, WT = 정규 CHO 세포주 생산 항체이다.
일반적인 기술
본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않은 한, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이고, 이들은 당업계의 기술 내에 속한다. 이같은 기술들은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)]; [Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)]; [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, 및 정기 개정판)]; [PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; [A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988)]; [Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)]에 충분히 설명되어 있다.
정의
"림포톡신-α 또는 "LTα"은 US 특허 번호 5,824,509의 도 2A에 제시된 아미노산 서열의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드로 본원에서 정의된다. LTα는 인간 TNFα 또는 이의 천연 동물 유사체를 명확하게 배제하는 것으로 정의된다 ([Pennica et al., Nature 312:20/27 : 724-729 (1984)] 및 [Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 260: 2345-2354 (1985)]). LTα는 US 5,661,004에 예를 들어 정의된 바와 같은 인간 LTβ를 명확하게 배제하는 것으로 정의된다.
"림포톡신-α3 삼량체" 또는 "LTα3"는 LTα 단량체의 동종삼량체를 지칭한다. 이러한 동종삼량체는 LTβ, 막횡단 및 세포질 도메인에 의해 세포 표면에 고정된다.
"림포톡신-αβ" 또는 "LTαβ" 또는 "LTαβ 복합체"는 LTα와 LTβ의 이종삼량체를 지칭한다. 이러한 이종삼량체는 2개의 LTα 서브유닛 및 1개의 LTβ 서브유닛을 함유하거나 (LTα2β1), 또는 1개의 LTα 서브유닛 및 2개의 LTβ 서브유닛을 함유한다 (LTα1β2).
"종양 괴사 인자 수용체-I" 또는 "TNFRI" 및 "종양 괴사 인자 수용체-II" 또는 "TNFRII"는 각각 p55 및 p75로 또한 공지된, LTα동종삼량체에 대한 세포-표면 TNF 수용체를 지칭한다.
"림포톡신-β 수용체" 또는 "LTβ-R"은 LTαβ 이종삼량체가 결합하는 수용체를 지칭한다.
"조절성 사이토카인"은 이의 비정상적인 수준이 환자 내의 자가면역 장애의 존재를 가리키는 사이토카인이다. 이같은 사이토카인에는, 예를 들어, 인터루킨-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, BLyS/April, TGF-α, TGF-β, 인터페론-α (IFN-α), IFN-β, IFN-γ, MIP-1, MIF, MCP-1, M-CSF 또는 G-CSF, 림포톡신, LIGHT, 4-1BB 리간드, CD27 리간드, CD30 리간드, CD40 리간드, Fas 리간드, GITR 리간드, OX40 리간드, RNAK 리간드, THANK, TRAIL, TWEAK 및 VEG1이 포함된다. 이러한 군에는 TNF-α, LT 예컨대 LTα, LTβ, 및 LIGHT를 포함하지만 이에 한정되지 않는 TNF 패밀리 구성원이 포함된다. TNF 수퍼패밀리의 리뷰를 위해서, [MacEwan, Br. J. Pharmacology 135: 855-875 (2002)] 참조. 바람직하게는, 조절성 사이토카인은 IL 예컨대 IL-1b 또는 IL-6 및/또는 TNF 패밀리 구성원이다.
"류머티스성 관절염과 관련된 염증성 사이토카인"은 RA 병리학과 관련된 IL-6, IL-1b, 및 TNFα를 지칭하고, 이는 시험관내 콜라겐-유도 관절염 분석법에서 전신적으로 및/또는 관절 내에서 억제될 수 있다.
"LTαβ-발현 세포"는 LTαβ 이종삼량체를 발현하거나 분비하는 세포이다.
"LTαβ-발현 세포를 조정한다"는 표현은 세포에 의해 제조된 단백질 예컨대 사이토카인, 케모카인, 또는 성장 인자를 고갈시키거나 변경시키는 것을 지칭하고, 이때 세포에는, 예를 들어, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 및 B 세포가 포함된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 광범위한 의미로 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날(polyclonal) 항체, 다가 항체, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하며, 특정 항체 단편 (본원에서 더욱 상세하게 기술됨)을 또한 포함할 수 있다. 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및/또는 친화력 성숙 항체일 수 있다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이와 정상적으로 관련된 기능을 하나 이상, 바람직하게는 대부분 또는 모두 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 WO 2005/063816에 기술된 바와 같은 외팔(one-armed) 항체, 예를 들어, "놉(knob)" 및 "홀(hole)"을 구성하는 Fc 돌연변이를 포함하는 항체이다. 예를 들어, 홀 돌연변이는 Fc 폴리펩티드 내의 T366A, L368A 및/또는 Y407V 중 하나 이상일 수 있고, 공동(cavity) 돌연변이는 T366W일 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
본원에서 목적을 위해, "무손상 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 뿐만 아니라 Fc 영역을 포함하는 항체이다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 다른 항체에 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 비-동물 진핵생물, 동물 또는 식물 세포에서의 재조합 DNA 방법 (예를 들어, US 4,816,567 참조)을 사용하여 제조될 수 있다. 또한 "모노클로날 항체"는, 예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기술된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 포함된다 (US 4,816,567; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열(subsequence))이다. 대부분의 부분에 대해서, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력이 있는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (도너 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv FR 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 수입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정련시키고 최대화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은, 비록 FR 영역이 결합 친화력을 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수는 있지만, 인간 면역글로불린 서열의 것이다. FR 내의 이러한 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 사슬 내에서 6개 이하, L 사슬 내에서 3개 이하이다. 또한 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항은 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 참조. 또한 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Trans. 23: 1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994)] 참조. 인간화 항체에는 항체의 항원-결합 영역이, 예를 들어, 당해 항원으로 짧은꼬리 원숭이를 면역화시킴으로써 생산된 항체로부터 유래된 PRIMATIZED® 항체가 포함된다. 인간화 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조용 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리가 포함되는, 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 또한 생산될 수 있다. [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boerner et al., J. Immunol, 147(1):86-95 (1991)]에 기술된 방법들이 인간 모노클로날 항체의 제조에 또한 이용가능하다.
"친화력 성숙된" 항체는 이의 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경이 있어 이러한 변경(들)이 없는 어버이 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화력이 개선된 것이다. 바람직한 친화력 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 친화력이 나노놀 또는 심지어 피코몰일 것이다. 친화력 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al., Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 미리 정해진 항원이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 기타 천연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩티드이다. 본원에서의 목적을 위한 "어셉터(acceptor) 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크로부터, 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 어셉터 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 선재(先在)하는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 아미노산 변화가 선재하는 경우, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 또는 3개 이하의 아미노산 변화가 선재한다. 아미노산 변화가 VH에 선재하는 경우, 바람직하게는 이러한 변화는 위치 71, 73 및 78 중 3개, 2개 또는 1개에서만 선재한다; 예를 들어, 이러한 위치에서의 히스티딘 잔기가 알라닌 잔기일 수 있다. 한 실시양태에서, VL 어셉터 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선집(選集)에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선집은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터의 것이다. 전형적으로, 이러한 서열 서브그룹은 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 서브그룹이다. 한 실시양태에서, VL에 대해, 서브그룹은 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 서브그룹 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH에 대해, 서브그룹은 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 서브그룹 III이다.
"VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크"는 [Kabat et al., 상기 문헌]의 가변 중쇄 서브그룹 III 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일부분 또는 전부를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 46)-H1-WVRQAPGKGLEWVG (서열 47)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 48)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 49) [식중, N은 임의의 아미노산 잔기이다].
또다른 실시양태에서, VH 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일부분 또는 전부를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 46)-H1-WVRQAPGKGLEWVG (서열 47)-H2-RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD (서열 50)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 49) [식중, N은 임의의 아미노산 잔기이다].
"VL 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크"는 [Kabat et al., 상기 문헌]의 가변 경쇄 카파 서브그룹 I 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, VL 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일부분 또는 전부를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 51)-L1-WYQQKPGKAPKLQIY (서열 52)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 53)-L3-FGQGTKVEIKR (서열 54).
또다른 실시양태에서, VL 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일부분 또는 전부를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 51)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 55)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 53)-L3-FGQGTKVEIKR (서열 54).
용어 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"은, 본원에서 사용되었을 때, 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3). 다수의 CDR 서술이 사용되고 있고, 본원에 포함된다. 카밧(Kabat) CDR은 서열 가변성을 기초로 하고, 가장 통상적으로 사용된다 ([Kabat et al., 상기 문헌]). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 ([Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM 초가변 영역은 카밧 CDR과 코티아 구조적 루프 간의 절충안을 나타내고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 입수가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이러한 초가변 영역 각각으로부터의 잔기를 하기에 나타낸다.
Figure 112009028089493-PCT00001
CDR은 하기와 같은 "확장된 CDR"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이러한 정의에 대해 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 번호가 매겨진다. 본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기들의 번호매김은 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 EU 인덱스의 번호매김이다. "카밧에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다.
"변형되지 않은 인간 프레임워크"는 어셉터 인간 프레임워크와 아미노산 서열이 동일한 인간 프레임워크, 예를 들어 어셉터 인간 프레임워크에서 인간 → 비-인간 아미노산 치환(들)이 없는 프레임워크이다.
본원에서의 목적을 위한 "변경된 CDR"은 하나 이상 (예를 들어, 1개 내지 약 16개)의 아미노산 치환(들)을 내부에 포함하는 CDR이다.
본원에서의 목적을 위한 "변형되지 않은 CDR"은 자신이 유래된 비-인간 항체와 아미노산 서열이 동일한 CDR, 즉 하나 이상의 아미노산 치환이 없는 CDR이다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용된 "작동제 항체"는 당해 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법으로 측정시 95 중량％ 초과의 항체, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시(Coomassie) 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성으로 정제될 것이다. 단리된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체의 천연 환경의 1가지 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 번호매김" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 번호매김", 및 이의 변형은 [Kabat et al., 상기 문헌]에서의 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 번호매김 시스템을 지칭한다. 이러한 번호매김 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 이들 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤의 단일 아미노산 삽입물 (카밧에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 뒤의 삽입 잔기 (예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 번호매김은 소정의 항체에 대해 "표준" 카밧 번호매김 서열과 항체 서열의 상동성의 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
"어버이 폴리펩티드"는 하나 이상의 본원에 개시된 Fc 영역 변형이 없고, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 변이체와 비교하여 이펙터 기능이 상이한 폴리펩티드이다. 어버이 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 선재하는 아미노산 서열 변형 (예컨대 부가, 결실 및/또는 치환)이 있는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하도록 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 위치 Cys226 또는 Pro230에서의 아미노산 잔기로부터 카르복실-말단까지 이르는 것으로 일반적으로 정의된다. 면역글로불린의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인인 CH2 및 CH3을 일반적으로 포함한다. IgG1의 중쇄 내의 마지막 잔기인 라이신은 성숙형 단백질 내의 Fc 내의 말단 잔기로서 존재할 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cγ2" 도메인으로 또한 지칭됨)은 통상적으로 대략 아미노산 231에서 대략 아미노산 340까지에 이른다. CH2 도메인은 또다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대체물을 제공할 수 있고 CH2 도메인을 안정화시키는 것을 도울 수 있는 것으로 추측되었다. [Burton, Molec. Immunol. 22:16l-206 (1985)].
"CH3 도메인"은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기들의 신축물을 포함한다 (즉, IgG의 대략 아미노산 잔기 341에서 대략 아미노산 잔기 447까지).
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 지닌다. 대표적인 "이펙터 기능"에는 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, LT 수용체)의 하향 조절 등이 포함된다. 이같은 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 일반적으로 필요로 하고, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 다양한 분석법을 이용하여 평가될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역" 또는 "야생형 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 당업계에 공지되어 있고, 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 임의의 상기의 것들의 천연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 본원에서 정의된 바와 같은 1개 이상의 "아미노산 변형"에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역에는 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환이 있고, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환이 있다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 어버이 폴리펩티드의 Fc 영역과의 상동성이 바람직하게는 약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상, 가장 바람직하게는 약 95％ 이상일 것이다.
용어 "Fc 영역-함유 폴리펩티드"는 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 면역부착소 (본원에서의 정의 참조)를 지칭한다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 한 실시양태에서, FcR은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함하는 FcγR이다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 ([Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]의 리뷰 참조). 이 용어는 동종이형, 예컨대 FcγRIIIA 동종이형인 FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131을 포함한다. FcR은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 리뷰되어 있다. 추후에 확인될 것이 포함되는 기타 FcR이 본원에서의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 IgG가 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이어서 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고, 이같은 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대 US 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 PBMC, NK 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원으로부터, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 PBMC 또는 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"보체-의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적합한 서브클래스의 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
FcR 결합 친화력 또는 ADCC 활성이 "변경된" 변이체 IgG Fc가 있는 폴리펩티드는 어버이 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcR 결합 활성 (FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성이 증강되거나 저하된 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 어버이 폴리펩티드보다 더 양호한 친화력으로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 어버이 폴리펩티드와 비교하여 결합에서의 개선은 약 3배, 바람직하게는 약 5배, 10배, 25배, 50배, 60배, 100배, 150배, 200배, 500배까지, 또는 결합에서의 약 25％ 내지 1000％의 개선일 수 있다. FcR에 대한 "감소된 결합성을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 어버이 폴리펩티드보다 더 낮은 친화력으로 하나 이상의 FcR과 결합한다. 어버이 폴리펩티드와 비교하여 결합에서의 감소는 결합에서의 약 40％ 이상의 감소일 수 있다. FcR에 대한 감소된 결합을 나타내는 이같은 Fc 변이체는 FcR에 대한 감지할 수 있는 결합이 거의 없거나 없을 수 있고, 예를 들어, 천연-서열 IgG Fc 영역에 비해 FcR에 대한 결합이 약 0-20％이다.
야생형 또는 천연-서열 IgG Fc이 있는 폴리펩티드 또는 어버이 폴리펩티드보다 "더 양호한 친화력" 또는 "더 높은 친화력"으로 FcR에 결합하는 변이체 Fc가 있는 폴리펩티드는 결합 분석법 내의 변이체 Fc가 있는 폴리펩티드와 어버이 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일한 경우 천연-서열 Fc가 있는 어버이 폴리펩티드보다 실질적으로 더 양호한 결합 친화력으로 상기 확인된 FcR들 중 임의의 하나 이상에 결합하는 것이다. 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같이 FcR 결합 친화력이 결정되는 경우, FcR 결합 친화력이 개선된 변이체 Fc 폴리펩티드는 어버이 폴리펩티드와 비교하여 FcR 결합 친화력에서 약 2배 내지 약 300배, 바람직하게는 약 3배 내지 약 170배의 개선을 나타낼 수 있다.
야생형 IgG Fc가 있는 폴리펩티드에 비해 "증가된 ADCC를 나타내는" 또는 인간 이펙터 세포의 존재 하에 더욱 효과적으로 ADCC를 매개하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는 분석법에서 사용된 변이체 Fc 영역이 있는 폴리펩티드 및 야생형 Fc 영역이 있는 폴리펩티드의 양이 본질적으로 동일한 경우, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 ADCC를 매개하는데 있어서 실질적으로 더욱 효과적인 것이다. 일반적으로, 이같은 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석법을 사용하여 확인될 것이지만, ADCC 활성을 결정하기 위한 기타 분석법 또는 방법, 예를 들어 동물 모델 등이 구현된다. 바람직한 변이체는 야생형 Fc보다 ADCC를 매개하는데 있어서 약 5배 내지 약 100배, 더욱 바람직하게는 약 25배 내지 약 50배 더 효과적이다.
"아미노산 변형"은 미리 결정된 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변화를 지칭한다. 대표적인 변형에는 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실이 포함된다. 본원에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다.
특정 위치 (예를 들어 Fc 영역의 특정 위치)"에서의 아미노산 변형"은 특정 잔기의 치환 또는 결실, 또는 특정 잔기에 인접한 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 특정 잔기"에 인접한" 삽입은 특정 잔기의 1개 내지 2개 잔기 이내에서의 삽입을 의미한다. 삽입은 특정 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"은 미리 정해진 아미노산 서열 내의 하나 이상의 기존의 아미노산 잔기를 또다른 상이한 "교체" 아미노산 잔기로 교체하는 것을 지칭한다. 교체 잔기 또는 잔기들은 "천연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩되는 잔기)일 수 있고, 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신(Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 라이신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 타이로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 교체 잔기는 시스테인이 아니다. 하나 이상의 비-천연 발생 아미노산 잔기로의 치환이 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 의해 또한 구현된다. "비-천연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 사슬 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유결합으로 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생 아미노산 잔기들 이외의 잔기를 지칭한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예로는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린, 및 기타 아미노산 잔기 유사체 예컨대 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기술된 것들이 포함된다. 이같은 비-천연 발생 아미노산 잔기의 생성을 위해, [Noren et al., Science 244:182 (1989)] 및 [Ellman et al., 상기 문헌]의 절차를 사용할 수 있다. 간략하게, 이러한 절차들은 비-천연 발생 아미노산 잔기로의 억제인자 tRNA를 화학적으로 활성화시키는 것에 이은 이러한 RNA의 시험관내 전사 및 번역을 수반한다.
본 발명에서 사용된 용어 "보존적" 아미노산 치환은 기능적으로 등가인 아미노산들로 치환되는 아미노산 치환을 지칭한다. 보존적 아미노산 변화는 생성된 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 침묵 변화를 초래한다. 예를 들어, 유사한 극성의 하나 이상의 아미노산들은 기능적 등가물로 작용하고, 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 침묵 변경을 초래한다. 일반적으로, 한 군 내에서의 치환은 구조 및 기능과 관련하여 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 특정 잔기의 역할은 이러한 잔기가 존재하는 분자의 3차원 구조 내에서의 이의 정황에 의해 결정된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, Cys 잔기는 산화된 (디술피드) 형태로 존재할 수 있고, 이는 환원된 (티올) 형태보다 덜 극성이다. Arg 측쇄의 긴 지방족 부분은 이의 구조적 또는 기능적 역할의 결정적인 특색을 구성할 수 있고, 이는 또다른 염기성 잔기보다는 비-극성 잔기의 치환에 의해 최상으로 보존될 수 있다. 또한, 방향족 기를 함유하는 측쇄 (Trp, Tyr, 및 Phe)는 이온성-방향족 또는 "양이온-파이" 상호작용에 참여할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 이러한 경우에, 이러한 측쇄들 중 하나가 산성 또는 무전하 극성 군의 구성원으로 치환되는 것은 구조 및 기능과 관련하여 보존적일 수 있다. Pro, Gly, 및 Cys (디술피드 형태)와 같은 잔기는 주쇄 형상에 대한 직접적인 효과가 있을 수 있고, 종종 구조적인 왜곡 없이 치환될 수 없다.
"아미노산 삽입"은 미리 정해진 아미노산 서열 내로의 하나 이상의 아미노산의 혼입을 지칭한다. 삽입은 일반적으로 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의 삽입으로 구성될 것이지만, 본 출원에서는 더 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어, 아미노산 약 3개 내지 약 5개 또는 약 10개까지의 삽입이 구현된다. 삽입된 잔기(들)은 상기 개시된 바와 같은 천연 발생 잔기 또는 비-천연 발생 잔기일 수 있다.
"아미노산 결실"은 미리 정해진 아미노산 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 지칭한다.
아미노산은 측쇄 성질에서의 유사성에 따라 하기와 같이 분류될 수 있다 ([A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 무전하 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
별법적으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기의 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
"힌지 영역"은 인간 IgG1의 Glu216에서 Pro230까지 이르는 것으로 일반적으로 정의된다 ([Burton, Molec. Immunol. 22:16l-206 (1985)]). 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 시스테인 잔기와 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 놓음으로써 기타 IgG 이소타입의 힌지 영역이 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 힌지 영역에 대해 바로 C-말단인 잔기들, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239의 신축물로서 보통 정의된다.
"C1q"는 면역글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. 2개의 세린 프로테아제 C1r 및 C1s와 함께 C1q는 CDC 경로의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다. 인간 C1q는, 예를 들어, Quidel (San Diego, CA)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
용어 "결합 도메인"은 또다른 분자에 결합하는 폴리펩티드의 영역을 지칭한다. FcR의 경우, 결합 도메인은 Fc 영역과 결합하는 것을 담당하는 이의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어, 이의 알파 사슬)의 일부를 포함할 수 있다. 한 유용한 결합 도메인은 FcR α 사슬의 세포외 도메인이다.
본 발명의 항체의 "기능적 단편"은 무손상 항체의 일부분을 포함하고, 여기에는 일반적으로 무손상 항체의 항원-결합 또는 가변 영역 또는 FcR 결합 능력이 유지된 항체의 Fc 영역이 포함된다. 항체 단편의 예로는 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "면역부착소"는 이종성 단백질 ("부착소")의 결합 특이성이 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합된 항체-유사 분자를 의미한다. 구조적으로, 면역부착소는 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌 (즉, "이종성"인) 원하는 결합 특이성이 있는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 전형적으로 면역부착소 분자의 부착소 부분은 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 적어도 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 면역부착소 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 아형, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제2 의약으로 유용한 면역부착소에는 B-림프구 자극인자 (BLyS) 수용체의 막횡단 또는 세포질 서열 없이, BLyS 수용체의 BLyS 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 한 실시양태에서, BR3 (BLyS 수용체 3), TACI (막횡단 활성화인자 및 칼슘-조정인자 및 사이클로필린 리간드 상호작용인자), 또는 BCMA (B-세포 성숙 항원)의 세포외 도메인이 면역글로불린 서열의 불변 도메인에 융합된다.
"융합 단백질" 및 "융합 폴리펩티드"는 2개의 부분이 공유결합으로 함께 연결되어 있는 폴리펩티드를 지칭하고, 이때 각각의 부분은 상이한 성질을 갖는 폴리펩티드이다. 성질은 생물학적 성질, 예컨대 시험관내 또는 생체내 활성일 수 있다. 또한, 성질은 단순한 화학적 또는 물리적 성질, 예컨대 표적 분자에의 결합, 반응의 촉매 등일 수 있다. 2개의 부분은 단일 펩티드 결합에 의해 직접적으로, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 2개의 부분 및 링커는 서로 리딩 프레임 내에 존재할 것이다.
일반적으로 "결합 친화력"은 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어 항원) 간의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 "결합 친화력"은 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화력은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있다. 친화력은 본원에 기술된 것들을 포함하는, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화력 항체는 일반적으로 항원에 느리게 결합하고 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화력 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 더 길게 결합을 유지하는 경향이 있다. 결합 친화력을 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태가 하기에 기술된다.
본 발명에 따른 "온(on)-속도" 또는 "회합의 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"은 약 10 응답 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore®-2000 또는 BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 기술로 또한 결정될 수 있다. 간략하게, 공급자의 지침서에 따라, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore, Inc.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 약 10 응답 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한 후, 동역학 측정을 위해, Fab의 2배 계단 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ Tween™ 20이 있는 포스페이트-완충 염수 (PBS) (PBST)에 주입한다. 회합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시에 핏팅(fitting)함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore® Evaluation Software 버전 3.2™)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로서 계산되었다. 예를 들어, [Chen et al., J. Mol Biol 293:865-881 (1999)] 참조. 그러나, 온-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1S-1을 초과하면, 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (ThermoSpectronic) 또는 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments)와 같은 분광광도계에서 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서의, PBS (pH 7.2) 내의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭(quenching) 기술을 사용하여 온-속도가 바람직하게 결정된다.
한 실시양태에서, 적정 시리즈의 표지되지 않은 항원의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지 항원으로 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅 플레이트로 포획함으로써 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화력을 측정하는 하기의 분석법에 기술된 바와 같이 Fab 버전의 항체 및 항원 분자로 수행된 방사성표지 항원 결합 분석법 (RIA)에 의해 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"이 측정된다 ([Chen et al., J. Mol Biol 293:865-881 (1999)]). 분석 조건을 확립하기 위해, 미량역가 플레이트 (Dynex)를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 내의 포획용 항-Fab 항체 (Cappel Labs) 5 ㎍/㎖으로 하룻밤 동안 코팅하고, 이어서 PBS 내의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (약 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단한다. 비-흡착성 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 당해 Fab의 계단 희석물과 혼합한다 ([Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함). 그 후, 당해 Fab를 하룻밤 동안 인큐베이션한다; 그러나, 평형에 도달되는 것을 확실히 하기 위해 인큐베이션이 더 긴 기간 (예를 들어, 65시간) 동안 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을 포획 플레이트에 옮겨 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 내의 0.1％ TWEEN™-20으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제 (MicroScint-20; Packard)를 첨가하고, 플레이트를 TOPCOUNT™ 감마 카운터 (Packard) 상에서 10분 동안 카운팅한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.
본원에 사용된 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"이라는 구절은 2개의 수치값 (일반적으로, 하나는 본 발명의 항체와 관련되고, 다른 하나는 기준/비교물 항체와 관련됨) 간의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타내어서, 당업자는 2개의 값 간의 차이가 상기 값들에 의해 측정된 생물학적 특징 (예를 들어, Kd 값)의 정황에서 생물학적 및/또는 통계학적 유의성이 거의 없거나 또는 없는 것으로 간주할 것이다. 상기 2개의 값 간의 차이는 기준/비교물 항체에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 50％ 미만, 더욱 바람직하게는 약 40％ 미만, 더더욱 바람직하게는 약 30％ 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 20％ 미만, 가장 바람직하게는 약 10％ 미만이다.
본원에 사용된 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"이라는 구절은 2개의 수치값 (일반적으로, 하나는 본 발명의 항체와 관련되고, 다른 하나는 기준/비교물 항체와 관련됨) 간의 충분히 높은 정도의 차이를 나타내서, 당업자는 2개의 값 간의 차이가 상기 값들에 의해 측정된 생물학적 특징 (예를 들어, Kd 값, HAMA 응답)의 정황에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주할 것이다. 상기 2개의 값 간의 차이는 기준/비교물 분자에 대한 값의 함수로서 바람직하게는 약 10％ 초과, 더욱 바람직하게는 약 20％ 초과, 더더욱 바람직하게는 약 30％ 초과, 더욱 더 바람직하게는 약 40％ 초과, 가장 바람직하게는 약 50％ 초과이다.
펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업계의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGH™ (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교될 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, ％ 아미노산 서열 동일성 값은 Genentech, Inc.에 의해 제작된 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2의 소스(source) 코드는 사용자 문서와 함께 미국 저작국(U.S. Copyright Office) (Washington D.C., 20559)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)를 통해 공개적으로 입수가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영 체제, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서의 사용에 대해 컴파일링(compiling)되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 소정의 아미노산 서열 A의 소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 ％ 아미노산 서열 동일성(소정의 아미노산 서열 B에 대한, B와의 또는 B와 대조된 특정 ％ 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로 별법적으로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
[식중, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 A와 B의 정렬에서 이러한 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 전체 개수이다]. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성은 B의 A에 대한 ％ 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 ％ 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 본원에서 기술된 바와 같이 수득된다.
"장애"는 LTα3 또는 LTαβ의 작용의 억제 또는 차단 및/또는 LTα-양성 세포의 고갈이 포함되지만, 메커니즘과는 상관 없이, 본 발명의 항체 또는 방법으로의 치료가 이로울 임의의 용태이다. 이러한 용태에는 임의의 세포에 의한 LTα3 및/또는 LTαβ의 상승된 발현 또는 활성 또는 비정상적인 활성화에 의해 매개되거나 이와 관련된 의학적 용태 또는 질병이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 이는 포유동물이 당해 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적인 용태와 같은 만성 및 급성 장애를 포함한다
본원에서의 "자가면역 장애"는 개체 자신의 조직 또는 기관 또는 이의 공동-분리물 또는 발현물로부터 발생하고 이에 대해 지시되는 질환 또는 장애, 또는 이로부터 초래되는 용태이다. 많은 이러한 자가면역 및 염증성 장애에서, 고감마글로불린혈증, 높은 수준의 자가항체, 조직 내의 항원-항체 복합체 침착물, 코르티코스테로이드 또는 면역억제성 치료로부터의 이점, 및 감염된 조직 내의 림프계 세포 응집물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 임상 및 실험 마커가 존재할 수 있다. B-세포 매개 자가면역 장애에 관한 어떠한 한 이론에 제한되지 않으면서, 자가항체 생산, 면역 복합체 형성, 수지상 및 T-세포 활성화, 사이토카인 합성, 직접적인 케모카인 방출, 및 이소성 림프신생에 대한 병터 제공이 포함되는 다수의 기계적인 경로를 통해 B 세포가 인간 자가면역 질환에서 병원성 효과를 나타내는 것으로 여겨진다. 각각의 이러한 경로는 자가면역 질환의 병리학에 다양한 정도로 참여할 수 있다.
본원에서 사용된 "자가면역 장애"는 기관-특이적 질환 (즉, 면역 응답이 내분비계, 조혈계, 피부, 심폐계, 위장관 및 간계, 신장계, 갑상선, 귀, 신경근육계, 중추신경계 등과 같은 기관계에 대해 특이적으로 지시됨), 또는 다수의 기관계에 영향을 미칠 수 있는 전신성 질환 (예를 들어, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 류머티스성 관절염, 다발근육염 등)일 수 있다. 바람직한 이같은 질환에는 자가면역 류머티스성 장애 (예를 들어, 류머티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, 공피증, 루푸스 예컨대 SLE 및 루푸스 신염, 다발근육염/피부근육염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 및 건선성 관절염), 자가면역 위장관 및 간 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염 및 크론 질환), 자가면역성 위염 및 악성 빈혈, 자가면역성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 및 복강 질환), 혈관염 (예를 들어, ANCA-음성 혈관염 및 ANCA-관련 혈관염 (척-스트라우스 (Churg-Strauss) 혈관염, 베게너 육아종증, 및 현미경적 다발혈관염 포함)), 자가면역성 신경 장애 (예를 들어, 다발성 경화증 (MS), 안간대 간대성 근경련 증후군, 중증 근육무력증, 시신경척수염, 파킨슨(Parkinson) 질환, 알츠하이머(Alzheimer) 질환, 및 자가면역성 다발신경병증), 신장 장애 (예를 들어, 사구체신염, 굿패스쳐(Goodpasture) 증후군, 및 버거(Berger) 질환), 자가면역성 피부 장애 (예를 들어, 건선, 담마진, 두드러기, 심상성 천포창, 수포성 유사천포창, 및 피부 홍반성 루프스), 혈액 장애 (예를 들어, 혈소판감소성 자반병, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 수혈후 자반병, 및 자가면역성 용혈성 빈혈), 죽상동맥경화증, 포도막염, 자가면역성 청력 질환 (예를 들어, 내이 질환 및 난청), 베체트(Behcet) 질환, 레이노 증후군, 기관 이식, 및 자가면역성 내분비 장애 (예를 들어, 당뇨-관련 자가면역 질환 예컨대 인슐린-의존적 당뇨병 (IDDM), 애디슨(Addison) 질환, 및 자가면역성 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스 질환 및 갑상선염))가 포함된다. 더욱 바람직한 이같은 질환에는, 예를 들어, RA, IBD (크론 질환 및 궤양성 대장염 포함), ANCA-관련 혈관염, 루푸스, MS, 쇼그렌 증후군, 그레이브스 질환, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염, 및 사구체신염이 포함된다. RA, IBD, 루푸스, 및 MS가 더욱더 바람직하고, RA 및 IBD가 더욱 바람직하며, RA가 가장 바람직하다.
본원에서 정의된 바와 같은 또다른 자가면역 장애의 구체적인 예 (일부 경우에는 상기 열거된 것들이 포함됨)로는 관절염 (급성 및 만성 류머티스성 관절염 (소아 발병형 류머티스성 관절염 및 류머티스성 활막염과 같은 병기 포함), 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 제II형 콜라겐-유도 관절염, 감염성 관절염, 라임(Lyme) 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 스틸(Still) 질환, 척추 관절염, 골관절염, 만성 진행성(chronica progrediente) 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성(chronica primaria) 다발관절염, 반응성 관절염, 폐경기 관절염, 에스트로겐-결핍 관절염, 및 강직성 척추염/류머티스성 척추염), 자가면역성 림프구증식성 질환, 염증성 과증식성 피부 질환, 건선 예컨대 판상 건선, 물방울 건선, 농포성 건선, 및 손톱의 건선, 아토피 (건초열 및 잡(Job) 증후군과 같은 아토피성 질환 포함), 피부염 (접촉성 피부염, 만성 접촉성 피부염, 탈락성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉성 피부염, 두드러기, 포진성 피부염, 화폐상 피부염, 지루성 피부염, 비-특이적 피부염, 원발성 자극성 접촉성 피부염 및 아토피성 피부염 포함), x-연관 과다 IgM 증후군, 알레르기성 안내 염증성 질환, 담마진 예컨대 만성 알레르기성 담마진 및 만성 특발성 담마진 (만성 자가면역성 담마진 포함), 근육염, 다발근육염/피부근육염, 소아형 피부근염, 독성 표피 괴사용해, 경피증 (전신성 경피증 포함), 경화증 예컨대 전신성 경화증, 다발성 경화증 (MS) 예컨대 척수-시각(spino-optical) MS, 원발성 진행성 MS (PPMS) 및 재발-완화형 MS (RRMS), 진행성 전신성 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 실조성 경화증, 시신경 척수염 (NMO), 염증성 장 질환 (IBD) (예를 들어, 크론 질환, 자가면역-매개 위장관 질환, 위장관 염증, 결장염 예컨대 궤양성 결장염, 현미경적 결장염, 콜라겐성 결장염, 폴립성 결장염, 괴사성 소장결장염, 및 전층 결장염, 및 자가면역성 염증성 장 질환), 장 염증, 괴저 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 호흡 곤란 증후군 (성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 포함), 수막염, 포도막 전체 또는 일부분의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역성 혈액 장애, 이식편 대 숙주 질환, 혈관부종 예컨대 유전성 혈관부종, 수막염에서와 같은 뇌신경 손상, 임신성 헤르페스, 임신성 유사천포창, 음낭 소양증, 자가면역성 조숙 난소 부전, 자가면역성 용태로 인한 상태로 인한 돌발성 난청, IgE-매개 질환 예컨대 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염 예컨대 라스무센(Rasmussen) 뇌염 및 변연계 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대 전방 포도막염, 급성 전방 포도막염, 육아종성 포도막염, 비-육아종성 포도막염, 수정체항원성 포도막염, 후방 포도막염 또는 자가면역성 포도막염, 콩팥 증후군을 수반한 사구체신염 (GN) 및 이를 수반하지 않는 GN 예컨대 만성 또는 급성 사구체신염 예컨대 원발성 GN, 면역-매개 GN, 막성 GN (막성 신장병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신장병증, 막성 증식성 GN (MPGN) (제I형 및 제II형 포함), 및 급속 진행성 GN (RPGN), 증식성 신염, 자가면역성 다분비선 내분비 부전, 귀두염 (국한성 형질세포 귀두염 포함), 귀두포피염, 중심원심성 윤상 홍반, 지속성 피부이색성 홍반, 다형성 홍반, 윤상 육아종, 광택 태선, 경화성 및 위축성 태선, 단순 만성 태선, 극상 태선, 편평 태선, 판상 어린선, 표피박리성 과각화증, 전암성 각화증, 괴저성 농피증, 알레르기성 용태 및 응답, 식품 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 알레르기, 희귀 알레르기성 장애 예컨대 비만세포증, 알레르기성 반응, 습진 (알레르기성 또는 아토피성 습진, 건조 습진, 발한장애성 습진 및 소수포성 손,발바닥 습진 포함), 천식 예컨대 기관지성 천식, 기관지 천식, 및 자가면역성 천식, T 세포 침윤 및 만성 염증성 응답이 수반되는 용태, 외래 항원 예컨대 임신 동안의 태아 A-B-O 혈액형에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 루푸스 (루푸스 신염, 루푸스 뇌염, 소아 루푸스, 비-신장 루푸스, 신외성 루푸스, 원판상 루푸스 및 원판상 홍반성 루푸스, 탈모성 루푸스, SLE 예컨대 피부 SLE 또는 아급성 SLE, 신생아 루푸스 증후군 (NLE) 및 파종상 홍반성 루푸스 포함), 소아 발병형 (제I형) 진성 당뇨병 (소아 IDDM 포함), 성인 발병형 진성 당뇨병 (제II형 당뇨병), 자가면역성 당뇨병, 특발성 요붕증, 당뇨성 망막병증, 당뇨성 신장병증, 당뇨성 대장염, 당뇨성 대동맥 장애, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 응답, 결핵, 사르코이드증, 육아종증 (림프종모양 육아종증 포함), 과립구결핍증, 혈관염 (대혈관 혈관염 예컨대 류머티스성 다발근육통증 및 거대 세포(타카야스(Takayasu) 관절염, 중혈관 혈관염 예컨대 가와사키(Kawasaki) 질환 및 결절성 다발동맥염/결절성 동맥주위염, 면역혈관염, CNS 혈관염, 피부 혈관염, 과민성 혈관염, 괴사성 혈관염 예컨대 섬유소성 괴사성 혈관염 및 전신성 괴사성 혈관염, ANCA-음성 혈관염, 및 ANCA-관련 혈관염 예컨대 척-스트라우스 증후군 (CSS), 베게너 육아종증, 및 현미경적 다발혈관염 포함), 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역성 재생불량성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판(Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈성 빈혈 또는 면역 용혈성 빈혈 (자가면역성 용혈성 빈혈 (AIHA) 포함), 악성 빈혈, 애디슨 질환, 진정 적혈구계 빈혈 또는 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍증, 혈우병 A, 자가면역성 호중구감소증, 혈구감소증 예컨대 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출이 수반되는 질환, CNS 염증성 장애, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 다발성 기관 손상 증후군 예컨대 패혈증, 외상 또는 출혈에 대해 2차적인 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 운동신경염, 알레르기성 신경염, 베체트(Bechet) 질환/증후군, 캐슬맨(Castleman) 증후군, 굿패스쳐 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 유사천포창 또는 천포창 예컨대 수포성 유사천포창, 반흔성 (점막) 유사천포창, 피부 유사천포창, 심상성 천포창, 부신생물성 천포창, 낙엽상 천포창, 점막 유사천포창 천포창, 및 홍반성 천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 안구 염증, 바람직하게는 알레르기성 안구 염증 예컨대 알레르기성 결막염, 선형 IgA 수포성 질환, 자가면역-유도 결막 염증, 자가면역성 다발내분비병증, 라이터(Reiter) 질환 또는 증후군, 자가면역 용태로 인한 열 손상, 전자간증, 면역 복합체 장애 예컨대 면역 복합체 신염, 항체-매개 신염, 신경염증성 장애, 다발신경병증, 만성 신경병증 예컨대 IgM 다발신경병증 또는 IgM-매개 신경병증, 저혈소판증 (예를 들어, 심근 경색 환자에 의해 발달되는 바와 같음) (혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 수혈후 자반병 (PTP), 헤파린-유도 저혈소판증, 및 자가면역 또는 면역-매개 저혈소판증 (예를 들어, 만성 또는 급성 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP)가 포함되는 ITP 포함) 포함), 공막염 예컨대 특발성 각-공막염, 상공막염, 고환 및 난소의 자가면역 질환 (자가면역성 고환염 및 난소염 포함), 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 자가면역성 내분비 질환 (갑상선염 예컨대 자가면역성 갑상선염, 하시모토 질환, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염) 또는 아급성 갑상선염 포함), 자가면역성 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스 질환, 그레이브스 안질환 (안병증 또는 갑상선-관련 안병증), 다분비선 증후군 예컨대 자가면역성 다분비선 증후군, 예를 들어, 제I형 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 부신생물성 증후군 (신경학적 부신생물성 증후군 예컨대 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력 증후군 또는 이튼-램버트 증후군 포함), 근육 강직 증후군, 뇌척수염 예컨대 알레르기성 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE), 중증 근육무력증 예컨대 흉선종-관련 중증 근육무력증, 소뇌 변성, 신경근육긴장증, 안간대 또는 안간대 간대성근경련 증후군 (OMS), 및 감각성 신경병증, 다소성 운동 신경병증, 쉬한(Sheehan) 증후군, 자가면역성 간염, 만성 간염, 루포이드 간염, 거대 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 폐렴 예컨대 림프구성 간질성 폐렴 (LIP), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식성) 대 NSIP, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 버거 질환 (IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선형 IgA 피부병, 급성 발열성 호중구성 피부병, 각질하 농포성 피부병, 일과성 극세포해리 피부병, 경화증 예컨대 원발성 담즙성 간경변 및 폐경화증, 자가면역성 장병증 증후군, 복강 질환, 비열대성 스프루 (글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증 예컨대 혼합형 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS; 루게릭(Lou Gehrig) 질환), 관상 동맥 질환, 자가면역성 귀 질환 예컨대 자가면역성 내이 질환 (AIED), 자가면역성 난청, 다발연골염 예컨대 불응성 또는 재발 다발연골염, 폐포 단백증, 각막염 예컨대 코간(Cogan) 증후군/비-매독성 간질성 각막염, 벨(Bell) 마비, 스위트(Sweet) 질환/증후군, 자가면역 딸기코, 포진(zoster)-관련 통증, 아밀로이드증, 비-암성 림프구증가증, 원발성 림프구증가증 (모노클로날 B 세포 림프구증가증 (예를 들어, 양성 모노클로날 감마글로불린병증 및 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS)) 포함), 말초 신경병증, 부신생물성 증후군, 채널병증 예컨대 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 난청, 실명, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소성 또는 분절성 또는 국소 분절성 사구체경화증 (FSGS), 내분비 안병증, 포도막망막염, 맥락망막염, 자가면역성 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 기능부전, 슈미트(Schmidt) 증후군, 부신염, 위 위축, 초로성 치매, 말이집탈락 질환 예컨대 자가면역성 말이집탈락 질환 및 만성 염증성 말이집탈락 다발신경병증, 드레슬러(Dressler) 증후군, 원형 탈모증, 전체 탈모증, CREST 증후군 (석회증, 레이노 현상, 식도 운동장애, 손발가락 경화증 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성의 자가면역성 불임, 예를 들어, 항-정자 항체로 인한 불임, 혼합형 결합 조직 질환, 샤가스(Chagas) 질환, 류머티스성 열, 재발성 유산, 농부의 폐, 다형성 홍반, 심장절개후 증후군, 쿠싱(Cushing) 증후군, 조류 사육자의 폐, 알레르기성 육아종성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트(Alport) 증후군, 폐포염 예컨대 알레르기성 폐포염 및 섬유성 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 기생충 질환 예컨대 리슈만편모충증, 키파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증, 회충증, 아스페르길루스증, 샘프터(Sampter) 증후군, 캐이플란(Caplan) 증후군, 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 확산성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 섬유화 종격염, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭포성 섬유증, 안구내염, 장기 융기성 홍반, 태아 적모구증, 호산구성 근막염, 슐만(Shulman) 증후군, 펠티(Felty) 증후군, 사상충증, 섬모체염 예컨대 만성 섬모체염, 이시성 섬모체염, 홍채섬모체염 (급성 또는 만성), 또는 푹스(Fuch's) 섬모체염, 헤노흐-쉔라인(Henoch-Schonlein) 자반병, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, SCID, 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS), 에코바이러스 감염, 폐혈증 (전신성 염증성 응답 증후군 (SIRS)), 내독소혈증, 췌장염, 갑상선중독증, 파르보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 감염, 볼거리, 에반(Evan) 증후군, 자가면역성 생식선 기능부전, 시덴햄(Sydenham) 무도병, 연쇄상구균 감염후 신염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수 매독, 맥락막염, 거대 세포 다발근육통증, 만성 과민성 폐렴, 결막염, 예컨대 봄철 카타르, 건성 각막결막염 및 유행성 각막결막염, 특발성 신염 증후군, 최소 변화 신장병증, 양성 가족성 및 허혈성 재관류 손상, 이식 장기 재관류, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도/폐 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애 (뇌혈관 기능부족) 예컨대 동맥경화성 뇌병증 및 동맥경화성 망막병증, 정자무형성증, 자가면역성 용혈, 뵈크(Boeck) 질환, 한랭글로불린혈증, 뒤피트렌(Dupuytren) 구축, 수정체과민증성 안구내염, 알레르기성 장염, 나성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 발열, 해먼-리치(Hamman-Rich) 질환, 감각신경성 난청, 발작성 헤모글로불린혈증, 생식선기능저하증, 국소성 회장염, 백혈구감소증, 전염성 단핵구증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액부종, 신장증, 교감성 안염, 신생아 안염, 시각 신경염, 육아종성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저 농피증, 쿼베인(Quervain) 갑상선염, 후천성 비장 위축, 비-악성 흉선종, 림프모낭성 흉선염, 백반증, 독성-쇼크 증후군, 식중독, T 세포의 침윤이 수반되는 용태, 백혈구-부착 결핍, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 연관된 면역 응답, 백혈구 누출이 수반되는 질환, 다발성 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 자가면역성 다발내분비병증, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역성 위축성 위염, 류머티스성 질환, 혼합형 결합 조직 질환, 콩팥 증후군, 췌도염, 다발내분비 기능부전, 자가면역성 다분비선 증후군 (제I형 자가면역성 다분비선 증후군 포함), 성인-발병형 특발성 부갑상선 기능저하증 (AOIH), 심근병증 예컨대 확장형 심근병증, 후천성 수포성 표피박리증 (EBA), 혈색소침착증, 심근염, 콩팥 증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 전두, 상악 또는 접형 부비동염, 알레르기성 부비동염, 호산구-관련 장애 예컨대 호산구증, 폐 침윤 호산구증, 호산구증-근육통 증후군, 로플러(Loffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴, 열대성 폐 호산구증, 기관지폐성 아스페르길루스증, 아스페르길루스종, 또는 호산구를 함유하는 육아종, 아나필락시스, 척추관절병증, 혈청음성 척추관절병증, 다발내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤(Bruton) 증후군, 영아의 일과성 저감마글로불린혈증, 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, 혈관확장성 운동실조증 증후군, 혈관확장증, 콜라겐 질환과 관련된 자가면역 질환, 류머티즘 예컨대 만성 관절류머티즘, 림프절염, 혈압 응답에서의 감소, 혈관 기능장애, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민, 신장 허혈, 뇌 허혈, 및 혈관화가 동반되는 질환, 알레르기성 과민증 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 허혈성 재관류 장애, 심근 또는 기타 조직의 재관류 손상, 림프종성 기관기관지염, 염증성 피부병, 급성 염증성 성분이 있는 피부병, 다발성 기관 부전, 수포성 질환, 신장 피질 괴사, 급성 화농성 수막염 또는 기타 중추 신경계 염증성 장애, 눈 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈-관련 증후군, 사이토카인-유도 독성, 기면증, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 종동맥 과다형성, 소화 궤양, 판막염 및 자궁내막증이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 "류머티스성 관절염" 또는 "RA"는 RA의 분류를 위한 2000년 개정 미국 류머티스 협회 기준, 또는 임의의 유사한 기준에 따라 진단될 수 있는 인지된 질환 상태를 지칭하고, 하기 정의된 바와 같은 활성, 초기 및 개시성 RA를 포함한다. RA의 생리학적 지표에는 대칭성 관절 종창이 포함되고, 이는 류머티스성 관절염에서 특징적이지만 불변성이지 않다. 손의 근위 지간 (PIP) 관절, 뿐만 아니라 중수수지 (MCP), 손목, 팔꿈치, 무릎, 발목 및 중족지절 (MTP) 관절의 방추형 종창이 통상적으로 영향을 받고, 종창이 쉽게 검출된다. 수동 운동에서의 통증이 관절 염증에 대한 가장 민감한 테스트이고, 염증 및 구조적 변형은 감염된 관절에 대한 운동 범위를 종종 제한한다. 전형적인 가시적 변화에는 MCP 관절에서의 손가락의 척골 편위, MCP 및 PEP 관절의 과다접힘 또는 과다굽힘, 팔꿈치의 굽힘 구축, 및 손목뼈 및 발가락의 부분탈구가 포함된다. RA가 있는 대상은 DMARD가 증상을 치료하는데 효과적이지 않거나 충분히 효과적이지 않다는 점에서 DMARD에 대해 저항성일 수 있다. 본 발명에 따른 치료법에 대한 추가적인 후보자에는 독성 또는 부적절한 효능으로 인해 TNF 억제제 예컨대 이태너셉트, 인플릭시맵 및/또는 아달리무맵으로의 이전의 또는 현재의 치료 (예를 들어, 1주일에 2회 25 ㎎으로 3개월 동안의 이태너셉트, 또는 3 ㎎/㎏의 인플릭시맵의 4회 이상의 주입)에 대해 부적절한 응답을 경험한 사람들이 포함된다.
"활성 류머티스성 관절염"이 있는 환자는 RA의 활성이고 잠복성이 아닌 증상이 있는 환자를 의미한다. "초기 활성 류머티스성 관절염"이 있는 대상은 RA의 분류를 위한 개정된 1987년 ACR 기준에 따라 8주 이상, 4년 미만 동안 진단된 활성 RA가 있는 대상이다. "초기 류머티스성 관절염"이 있는 대상은 RA의 분류를 위한 개정된 1987년 ACR 기준에 따라 8주 이상, 4년 미만 동안 진단된 RA가 있는 대상이다. 초기 RA에는, 예를 들어, 소아-발병형 RA, 소아 특발성 관절염 (JIA), 또는 소아형 RA (JRA)가 포함된다.
"개시성 RA"가 있는 환자에게는 RA의 진단을 위한 ACR 기준을 충분히 충족시키지는 않지만 RA-특이적 예후성 바이오마커 예컨대 항-CCP 및 공통 에피토프의 존재와 관련된 초기 다발관절염이 있다. 여기에는 다발관절염을 나타내지만, 아직 RA로 진단되지 않았고, 진정한 ACR 기준 RA가 발달될 위험이 높은 (95％ 확률), 양성 항-CCP 항체가 있는 환자가 포함된다.
"관절 손상"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 결합 조직 및 연골을 포함하는 하나 이상의 관절의 임의의 부분에 대한 손상 또는 부분적 또는 완전한 파괴를 지칭하며, 이때 손상은 임의의 원인의 구조적 및/또는 기능적 손상을 포함하고, 관절 통증/관절통을 야기하거나 야기하지 않을 수 있다. 여기에는 염증성 관절 질환, 뿐만 아니라 비-염증성 관절 질환과 관련되거나 이로부터 초래되는 관절 손상이 비제한적으로 포함된다. 이러한 손상은 임의의 용태, 예컨대 자가면역 질환, 특히 관절염, 가장 특히 RA에 의해 야기될 수 있다. 대표적인 이같은 용태에는 급성 및 만성 관절염, RA (소아-발병형 RA, 소아 특발성 관절염 (JIA), 또는 소아형 RA (JRA), 및 류머티스성 활막염과 같은 병기 포함), 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, 제II형 콜라겐-유도 관절염, 감염성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 스틸 질환, 척추 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 폐경기 관절염, 에스트로겐-결핍 관절염 및 강직성 척추염/류머티스성 척추염), RA 이외의 류머티스성 자가면역 질환, 및 RA에 2차적인 현저한 전신 침습 (혈관염, 폐 섬유증 또는 펠티 증후군이 포함되지만 이에 한정되지 않음)이 포함된다. 본원에서의 목적을 위해, 관절은 골격을 둘러싸고 지지하는 부분들과 함께 골격 (척추동물 예컨대 동물의 골격)의 요소들 간의 접촉 지점이고, 예를 들어, 엉덩이, 척추의 척추골들 간의 관절, 척추와 골반 사이의 관절 (천장 관절), 힘줄 및 인대가 뼈에 부착된 관절, 갈비뼈와 척추 사이의 관절, 어깨, 무릎, 발, 팔꿈치, 손, 손가락, 발목 및 발가락을 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 특히 손 및 발 내의 관절을 포함한다.
본원에서 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 도중에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 질행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 완화 또는 고식, 및 진정 또는 개선된 예후가 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 또는 장애의 발달을 지연시키는데 사용된다. 예를 들어, 자가면역 장애에 대해, 치료량의 본 발명의 항체를 본 발명의 방법에 따라 제공한 후, 대상이 특정 질환의 하나 이상의 징후 및 증상에서의 관찰가능하고/하거나 측정가능한 감소 또는 이러한 징후 및 증상의 부재를 나타낸다면, 대상이 성공적으로 "치료된" 것이다.
성공적인 치료의 한 바람직한 실시양태에서, 항체는 RA가 있는 대상에서 주요 임상 응답을 유도한다. 본원에서의 목적을 위해, "주요 임상 응답"은 연속 6개월 동안 미국 류머티즘 협회(American College of Rheumatology) 70 응답 (ACR 70)을 달성하는 것으로 정의된다. ACR 응답 점수는 ACR 20, ACR 50, 및 ACR 70으로 분류될 수 있고, 이때 ACR 70이 이러한 평가 시스템에서 가장 높은 수준의 징후 및 증상 제어이다. ACR 응답 점수는 관절 종창 및 압통, 통증, 장애 수준 및 전체적인 환자 및 의사의 평가를 포함하여 RA 질환 활성에서의 개선을 측정한다. FDA에 의해 인정되고 본원에서 정의된 바와 같은 주요 임상 응답을 유도하는 상이한 유형의 항체의 예는 이태너셉트 (ENBREL®)이다.
"유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서의 의약의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 응답을 도출하는 의약, 예를 들어, 항체의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 또한 치료적 유효량은 치료적으로 이로운 효과가 당해 약물, 예를 들어, 항체의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 필수적이지는 않지만 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 소형-분자 독소와 같은 독소, 또는 이의 단편을 포함하도록 의도된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN®); 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸렌라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀 (드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN®), CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 경구 알파-4 인테그린 억제제인 CDP323; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, [Nicolaou et al., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 다이네마이신 A가 포함되는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색단백질 엔다이인 항생제 발색단); 기타 항생제 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라바이신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 덱토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (ADRIAMYCIN®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (DOXIL®), 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항-대사물질 예컨대 메토트렉세이트, 젬시타빈 (GEMZAR®), 테가푸르 (UFTORAL®), 카페시타빈 (XELODA®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘; 항-부신제 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 및 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드 예컨대 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제형 (ABRAZANE™), 및 독세탁셀 (TAXOTERE®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN®); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONVOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 임의의 상기 물질들의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 2가지 이상의 상기 물질들의 배합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약자인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 배합된 옥살리플라틴 (ELOXATIN™)으로의 치료 요법에 대한 약자인 FOLFOX가 포함된다.
이러한 정의에는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나, 저하시키거나, 차단하거나 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 온몸 치료의 형태인 항호르몬제가 또한 포함된다. 이들은 자체가 호르몬일 수 있다. 예로는 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜 (EVISTA®), 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (FARESTON®)이 예를 들어 포함되는 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조정인자 (SERM); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향-조절제 (ERD); 에스트로겐 수용체 길항제 예컨대 풀베스트란트 (FASLODEX®); 난소를 저해하거나 정지시키는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작동제 예컨대 류프롤리드 아세테이트 (LUPRON® 및 ELIGARD®), 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테렐린; 항-안드로겐제 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 바이칼루타미드; 및 부신에서의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (MEGASE®), 엑세메스탄 (AROMASIN®), 포르메스타니에, 파드로졸, 보로졸 (RIVISOR®), 레트로졸 (FEMARA®), 및 아나스트로졸 (ARIMIDEX®)이 포함된다. 또한, 화학요법제의 이같은 정의에는 비포스포네이트 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트 (DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (ZOMETA®), 알렌드로네이트 (FOSAMAX®), 파미드로네이트 (AREDIA®), 틸루드로네이트 (SKELID®), 또는 리세드로네이트 (ACTONEL®); 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 사이토신 유사체); 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서의 유전자, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R)의 발현을 억제하는 것들; 백신 예컨대 THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, LURTOTECAN®); rmRH (예를 들어, ABARELIX®); 라파티닙 디토실레이트 (GW572016으로 또한 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 타이로신 키나제 소형-분자 억제제); 및 임의의 상기 물질의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
용어 "사이토카인"은 또다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반명이다. 이같은 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인, 인터루킨 (IL) 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15 (PROLEUKIN® rIL-2 포함), TNF 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β, 및 백혈구-억제성 인자 (LIF) 및 키트 리간드 (KL)가 포함되는 기타 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에 사용된 용어 사이토카인에는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성인 등가물 (이의 합성 생산된 소형-분자 본체 및 제약상 허용가능한 유도체 및 염 포함)이 포함된다. "사이토카인 길항제"는 사이토카인에 대한 항체, 사이토카인 수용체에 대한 항체 및 면역부착소를 예를 들어 포함하는, 임의의 메커니즘에 의해 이같은 사이토카인을 억제하거나 길항하는 분자이다.
본원에서의 목적을 위해, "종양 괴사 인자 알파" 또는 "TNF-알파" 또는 "TNFα"는 [Pennica et al., Nature, 312:721 (1984)] 또는 [Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985)]에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNF-알파 분자를 지칭한다.
"TNF 길항제" 또는 "TNF 억제제"는 시험관내에서, 계내에서, 및/또는 바람직하게는 생체내에서 TNFα 활성을 감소시키거나, 차단하거나, 억제하거나, 폐기하거나 또는 방해하는 분자로 본원에서 정의된다. 이같은 작용제는, 일반적으로 TNF-알파에 결합하여 이의 활성을 중화시키는 것을 통해, TNF-알파의 생물학적 기능을 어느 정도 억제한다. 적절한 TNF 길항제는 TNF RNA, DNA, 또는 단백질 합성, TNFα 방출, TNFα 수용체 신호전달, 막 TNFα 절단, TNFα 활성, 및 TNFα 생산 및/또는 합성을 또한 감소시키고/시키거나, 차단하고/하거나, 폐기하고/하거나, 방해하고/하거나, 방지하고/하거나, 억제할 수 있다. 이같은 TNF 길항제에는 항-TNFα 항체, 이의 항원-결합 단편, TNFα에 특이적으로 결합하는 이의 특정화된 돌연변이체 또는 도메인 (TNFα에의 결합시, 포유동물 내의 TNFα를 발현하는 세포를 파괴 또는 고갈시키고/시키거나 이러한 세포의 하나 이상의 기능을 방해함), 가용성 TNF 수용체 (예를 들어, p55, p70 또는 p85) 또는 단편, 이의 융합 폴리펩티드, 소형-분자 TNF 길항제, 예를 들어, TNF 결합 단백질 I 또는 II (TBP-I 또는 TBP-II), 네렐립몬맵, CDP-571, 인플릭시맵 (REMICADE®), 이태너셉트 (ENBREL®), 아달리무맵 (HUMIRATM™), CDP-571, CDP-870, 아펠리모맵, 레네르셉트 등), 이의 항원-결합 단편, 및 TNFα에 특이적으로 결합하는 수용체 분자, TNFα 합성, TNFα 방출, 또는 표적 세포에 대한 이의 작용을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 탈리도미드, 테니댑, 포스포디에스테라제 억제제 (예를 들어, 펜톡시필린 및 롤리프램), A2b 아데노신 수용체 작동제, 및 A2b 아데노신 수용체 강화제, TNFα 수용체 신호전달을 방지 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 미토겐-활성화 단백질 (MAP) 키나제 억제제, 막 TNFα 절단을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 메탈로프로테이나제 억제제, TNFα 활성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴), 및 TNFα 생산 및/또는 합성을 차단 및/또는 억제하는 화합물, 예컨대 MAP 키나제 억제제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 길항제는 항체 또는 면역부착소를 포함한다. 본원에서 구체적으로 구현되는 TNF 길항제의 예는 이태너셉트 (ENBREL®), 인플릭시맵 (REMICADE®) 및 아달리무맵 (HUMIRA™)이다.
용어 "호르몬"은 폴리펩티드 호르몬을 지칭하고, 이는 관이 있는 샘 기관에 의해 일반적으로 분비된다. 호르몬 중에서, 예를 들어, 성장 호르몬 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 에스트라디올; 호르몬-대체 치료법; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 또는 테스토락톤; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬 예컨대 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 프로락틴, 태반 락토젠, 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드, 성선자극호르몬-방출 호르몬; 인히빈; 액티빈; 뮬러관-억제 물질; 및 트롬보포이에틴이 포함된다. 본원에서 사용된 용어 호르몬에는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 호르몬의 생물학적으로 활성인 등가물 (이의 합성 생산된 소형-분자 본체 및 제약상 허용가능한 유도체 및 염 포함)이 포함된다.
용어 "성장 인자"는 성장을 촉진하는 단백질을 지칭하고, 예를 들어, 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 혈관 내피 성장 인자; 신경 성장 인자 예컨대 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자; 전환 성장 인자 (TGF) 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 및 콜로니 자극 인자 (CSF) 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF), 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF), 및 과립구-CSF (G-CSF)가 포함된다. 본원에서 사용된 용어 성장 인자에는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 성장 인자의 생물학적으로 활성인 등가물 (이의 합성 생산된 소형-분자 본체 및 제약상 허용가능한 유도체 및 염 포함)이 포함된다.
용어 "인테그린"은 세포가 세포외 매트릭스에 결합하여 응답하도록 하고, 다양한 세포 기능 예컨대 상처 치유, 세포 분화, 종양 세포의 귀소 및 세포자멸사에 수반되는 수용체 단백질을 지칭한다. 이들은 세포-세포외 매트릭스 및 세포-세포 상호작용에서 수반되는 세포 부착 수용체의 대형 족의 일부이다. 기능성 인테그린은 비-공유결합적으로 결합된, 알파 및 베타로 칭해지는 2개의 막횡단 당단백질 서브유닛으로 구성된다. 알파 서브유닛 모두는 서로 약간의 상동성을 공유하고, 베타 서브유닛도 마찬가지이다. 수용체는 항상 1개의 알파 사슬 및 1개의 베타 사슬을 함유한다. 예로는 알파6베타1, 알파3베타1 및 알파7베타1, LFA-1 등이 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "인테그린"에는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 인테그린의 생물학적으로 활성인 등가물 (이의 합성 생산된 소형-분자 본체 및 제약상 허용가능한 유도체 및 염 포함)이 포함된다.
"인테그린 길항제"는 임의의 메커니즘에 의해 이같은 인테그린을 억제하거나 길항하는 분자이고, 예를 들어, 인테그린에 대한 항체가 포함된다. 본원에서의 "인테그린 길항제 또는 항체"의 예로는 LFA-1 항체 예컨대 Genentech가 시판하는 에팔리주맵 (RAPTIVA®), 또는 기타 CD11/11a 및 CD18 항체, 또는 알파 4 인테그린 항체 예컨대 Biogen이 판매하는 나탈리주맵 (ANTEGREN®), 또는 디아자시클릭 페닐알라닌 유도체 (WO 2003/89410), 페닐알라닌 유도체 (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 및 WO 2003/53926), 페닐프로피온산 유도체 (WO 2003/10135), 엔아민 유도체 (WO 2001/79173), 프로판산 유도체 (WO 2000/37444), 알칸산 유도체 (WO 2000/32575), 치환된 페닐 유도체 (US 6,677,339 및 6,348,463), 방향족 아민 유도체 (US 6,369,229), ADAM 디스인테그린 도메인 폴리펩티드 (US 2002/0042368), 알파v베타3 인테그린에 대한 항체 (EP 633945), 아자-다리결합(bridged) 2고리형 아미노산 유도체 (WO 2002/02556) 등이 포함된다.
"코르티코스테로이드"는 천연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 이를 증대시키는, 스테로이드의 일반 화학 구조를 갖는 여러 합성 또는 천연 발생 물질들 중 임의의 물질을 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예로는 프레드니손, 프레드니솔론 (메틸프레드니솔론, 예컨대 SOLU-MEDROL® 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트 포함), 덱사메타손 또는 덱사메타손 트리암시클론, 히드로코르티손, 및 베타메타손이 포함된다. 본원에서 바람직한 코르티코스테로이드는 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 히드로코르티손, 또는 덱사메타손이다.
보조 치료법을 위해 본원에서 사용된 용어 "면역억제제"는 본원에서 치료될 포유동물의 면역계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 여기에는 사이토카인 생산을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향조절 또는 억제하거나, MHC 항원을 차폐하는 물질이 포함될 것이다. 이같은 면역억제제의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환 피리미딘 (US 4,665,077 참조); 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID); 간시클로비르; 타크로리무스; 글로코코르티코이드 예컨대 코르티솔 또는 알도스테론, 항-염증제 예컨대 시클로옥시게나제 억제제, 5-리폭시게나제 억제제; 또는 류코트리엔 수용체 길항제; 퓨린 길항제 예컨대 아자티오프린 또는 마이코페놀레이트 모페틸 (MMF); 트로게이트 (Ro32-355); 말초 시그마 수용체 길항제 예컨대 ISR-31747; 알킬화제 예컨대 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 단졸; 댑손; 글루타르알데히드 (US 4,120,649에 기술된 바와 같이 MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린 A; 스테로이드 예컨대 코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코스테로이드 또는 글루코코르티코이드 유사체, 예를 들어, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 (SOLU-MEDROL® 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트 포함), 리멕솔론, 및 덱사메타손; 디히드로폴레이트 환원효소 억제제 예컨대 메토트렉세이트 (경구 또는 피하); 항말라리아제 예컨대 클로로퀸 및 히드록시클로로퀸; 술파살라진; 레플루노미드; 사이토카인 방출 억제제 예컨대 SB-210396 및 SB-217969 모노클로날 항체 및 MHC II 길항제 예컨대 ZD2315; PG1 수용체 길항제 예컨대 ZD4953; VLA4 부착 차단제 예컨대 ZD7349; 항-사이토카인 또는 항-사이토카인 수용체 항체 (항-인터페론-알파, -베타 또는 -감마 항체, 항-TNF-알파 항체 (인플릭시맵 (REMICADE®) 또는 아달리무맵), 항-TNF-알파 면역부착소 (이태너셉트), 항-TNF-베타 항체, 인터루킨-1 (IL-1) 차단제 예컨대 재조합 HuIL-1Ra 및 IL-1B 억제제, 항-인터루킨-2 (IL-2) 항체 및 항-IL-2 수용체 항체 포함); IL-2 융합 독소; 항-L3T4 항체; 레플루노미드; 이종성 항-림프구 글로불린; OPC-14597; NISV (면역 응답 변형제); 필수 지방산 예컨대 감마리놀렌산 또는 에이코사펜타엔산; CD-4 차단제 및 pan-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; 공동-자극성 변형제 (예를 들어, ABATACEPT™으로 또한 공지된 CTLA4-Fc 융합물); 항-인터루킨-6 (IL-6) 수용체 항체 및 길항제; 항-LFA-1 항체 (항-CD11a 및 항-CD18 항체 포함); LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드 (WO 1990/08187); 스트렙토키나제; IL-10; 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타); 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 엔리모맵; CDP-855; PNP 억제제; CH-3298; GW353430; 4162W94, 클로람부실; 데옥시스퍼구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (Cohen 등, US 5,114,721); T-세포 수용체 단편 ([Offner et al. Science, 251:430-432 (1991)]; WO 1990/11294; [Janeway, Nature, 341:482 (1989)]; 및 WO 91/01133); BAFF 길항제 예컨대 BAFF 항체 및 BR3 항체; zTNF4 길항제 ([Mackay and Mackay, Trends Immunol, 23:113-5 (2002)]); T 세포 헬퍼 신호를 방해하는 생물학적 작용제, 예컨대 항-CD40 수용체 또는 항-CD40 리간드 (CD154) (CD40-CD40 리간드에 대한 차단 항체 포함) (예를 들어, [Durie et al., Science, 261:1328-30 (1993)]; [Mohan et al., J. Immunol, 154:1470-80 (1995)]) 및 CTLA4-Ig ([Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)]); 및 T 세포 수용체 항체 (EP 340,109) 예컨대 T10B9가 포함된다. 일부 바람직한 본원에서의 면역억제제에는 시클로포스파미드, 클로람부실, 아자티오프린, 레플루노미드, MMF, 또는 메토트렉세이트가 포함된다.
"질환-변형 항-류머티즘 약물" 또는 "DMARD"에는 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 미오크리신, 오라노핀, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 이태너셉트, 인플릭시맵 (+ 경구 및 피하 메토트렉세이트), 아자티오프린, D-페니실라민, 금 염 (경구), 금 염 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린 (시클로스포린 A 및 국소용 시클로스포린 포함), 포도알균 단백질 A ([Goodyear and Silverman, J. Exp. Med., 197, (9), p1125-39 (2003)]) (이들의 염 및 유도체 포함) 등이 포함된다.
"비-스테로이드성 항-염증 약물" 또는 "NSAID"의 예로는 아스피린, 아세틸살리실산, 이부프로펜 및 이부프로펜 지연물, 페노프로펜, 피록시캄, 플루르비프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 나프록센, 테녹시캄, 베노릴레이트, 디클로페낙, 나프록센, 네부메톤, 인도메타신, 케토프로펜, 메페남산, 디클로페낙, 펜부펜, 아자프로파존, 아세메타신, 티아프로펜산, 인도메타신, 술린닥, 톨레틴, 페닐부타존, 디클로페낙 및 디클로페낙 지연물, 시클로옥시게나제 (COX)-2 억제제 예컨대 GR 253035, MK966, 셀레콕십 (CELEBREX®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일), 벤젠술폰아미드 및 발데콕십 (BEXTRA®), 및 멜록시캄 (MOBIC®) (이들의 염 및 유도체 포함) 등이 포함된다. 바람직하게는, 이는 아스피린, 나프록센, 이부프로펜, 인도메타신, 또는 톨메틴이다. 이같은 NSAID는 임의로 진통제 예컨대 코데닌, 트라마돌, 및/또는 디히드로코디닌 또는 마약 예컨대 모르핀과 함께 사용된다.
"B 세포"는 골수 내에서 성숙된 림프구이고, 나이브 B 세포, 메모리 B 세포, 또는 이펙터 B 세포 (형질 세포)가 포함된다. 본원에서의 B 세포는 정상 또는 비-악성 B 세포이다.
"CD20" 항원 또는 "CD20"은 말초 혈액 또는 림프 기관으로부터의 90％를 초과하는 B 세포의 표면 상에서 발견된 약 35-kDa의 비-글리코실화 인단백질이다. CD20은 정상 B 세포, 뿐만 아니라 악성 B 세포 모두에 존재하지만, 줄기 세포 상에서는 발현되지 않는다. 문헌에서의 CD20에 대한 다른 명칭으로는 "B-림프구-제한 항원" 및 "Bp35"이 포함된다. CD20 항원은, 예를 들어, [Clark et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 82:1766 (1985)]에 기술되어 있다. 바람직한 CD20은 비-인간 영장류 또는 인간 CD20이고, 가장 바람직하게는 인간 CD20이다.
BL-CAM 또는 Lyb8로 또한 공지된 "CD22" 항원 또는 "CD22"는 분자량이 약 130 (환원형) 내지 140kD (비-환원형)인 제1형 통합 막 당단백질이다. 이는 B-림프구의 세포질 및 세포막 모두에서 발현된다. CD22 항원은 CD19 항원과 거의 동일한 단계에서 B-세포 림프구 분화에서 초기에 나타난다. 다른 B-세포 마커와 달리, CD22 막 발현은 성숙형 B 세포 (CD22+)와 형질 세포 (CD22-) 사이에 포함되는 후기 분화 단계에 한정된다. CD22 항원은, 예를 들어, [Wilson et al., J. Exp. Med. 173:137 (1991)] 및 [Wilson et al., J. Immunol. 150:5013 (1993)]에 기술되어 있다.
"B-세포 표면 마커에 대한 길항제"는, B-세포 표면 마커에의 결합 시, 예를 들어 B 세포에 의해 유발되는 체액성 응답을 감소시키거나 방지함으로써, 포유동물 내의 B 세포를 파괴 또는 결핍시키고/시키거나 하나 이상의 B-세포 기능을 방해하는 분자이다. 바람직하게는 길항제는 이것으로 치료된 포유동물에서 B 세포를 결핍시킬 수 있다 (즉, 순환되는 B-세포 수준을 감소시킬 수 있다). 이같은 결핍은 다양한 메커니즘 예컨대 ADCC 및/또는 CDC, B-세포 증식 억제, 및/또는 B-세포 사망 유도 (예를 들어, 세포자멸사를 통한 유도)를 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 범주에 포함되는 길항제에는 B-세포 표면 마커에 결합하는 항체, 합성 또는 천연-서열 펩티드, 면역부착소, 및 소형-분자 길항제가 포함된다 (임의로 또다른 분자와 접합되거나 이에 융합됨). 바람직한 길항제는 항체 또는 면역부착소를 포함한다. 여기에는 BLyS 길항제 예컨대 면역부착소가 포함되고, 이는 바람직하게는 루밀리시맵 (항-CD23), CD20, CD22, 또는 BR3 항체 또는 BLyS 면역부착소이다. 바람직하게는, BLyS 면역부착소는 BR3의 세포외 도메인을 포함하는 BR3 면역부착소, TACI의 세포외 도메인을 포함하는 TACI 면역부착소, 및 BCMA의 세포외 도메인을 포함하는 BCMA 면역부착소로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 BR3 면역부착소는 WO 2005/00351 및 US 2005/0095243의 서열 2의 hBR3-Fc이다. 또한 US 2005/0163775 및 WO 2006/068867 참조. 또다른 바람직한 BLyS 길항제는 항-BLyS 항체 (더욱 바람직하게는, 항-BLyS 항체가 잔기 162-275를 포함하는 BLyS의 영역 내에서 BLyS에 결합하는 경우), 또는 항-BR3 항체 (더욱 바람직하게는 항-BR3 항체가 인간 BR3의 잔기 23-38을 포함하는 영역에서 BR3에 결합하는 경우)이다.
CD20 항체의 예로는 하기의 것들이 포함된다: 현재 "리툭시맵" ("RITUXAN®)으로 칭해지는 "C2B8" (US 5,736,137) 및 CD20에 결합하는 능력이 유지된 이의 단편; IDEC Pharmaceuticals, Inc.에서 시판하는, "Y2B8" 또는 "이브리튜모맵 티욱세탄(Ibritumomab Tiuxetan)" (ZEVALIN®)으로 명명된 이트륨-[90]-표지 2B8 뮤린 항체 (US 5,736,137; 2B8은 접속 번호 HB11388 하에 ATCC에 1993년 6월 22일 기탁됨); "토시튜모맵(Tositumomab)"으로 또한 칭해지는 뮤린 IgG2a "B1" (임의로 131I로 표지되어, Corixa에서 시판하는 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시튜모맵" 항체 (BEXXAR™)가 생성됨) (또한 US 5,595,721 참조); 뮤린 모노클로날 항체 "1F5" ([Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)]), 및 "프레임워크 패치(patched)" 또는 인간화 1F5가 포함되는 이의 변이체 (WO 2003/002607 (Leung, S.); ATCC 기탁 HB-96450); 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 (US 5,677,180); 인간화 2H7 (WO 2004/056312 (Lowman 등), 및 하기에 기재됨); B-세포의 세포막 내의 CD20 분자에 대해 표적화된, 완전한 인간형의 고친화력 항체인 HUMAX-CD20™ (Genmab (Denmark); 예를 들어, [Glennie and van de Winkel, Drug Discovery Today 8:503-510 (2003)] 및 [Cragg et al., Blood 101:1045-1052 (2003)] 참조); WO 2004/035607 (Teeling 등)에 기재된 인간 모노클로날 항체; AME-133™ 항체 (Applied Molecular Evolution); GA101 (GlycArt; US 2005/0123546); A20 항체 또는 이의 변이체 예컨대 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각 cA20, hA20) (US 2003/0219433, Immunomedics); 및 International Leukocyte Typing Workshop으로부터 입수가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 ([Valentine et al., Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))]). 본원에서의 바람직한 CD20 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 CD20 항체, 더욱 바람직하게는 리툭시맵, 인간화 2H7, 키메라 또는 인간화 A20 항체 (Immunomedics), 및 HUMAX-CD20™ 인간 CD20 항체 (Genmab)이다.
순수하게 본원에서의 목적을 위해, 그리고 달리 지시되지 않는 한, "인간화 2H7"은 인간화 CD20 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하고, 이때 항체는 생체내에서 영장류 B 세포를 고갈시키는데 효과적이다. 이러한 항체에는 US 2006/0062787 및 이의 도면에 기재된 것들이 포함되고, US 2006/0188495에서 서열이 제공된 항체들이 포함된다. 또한 US 2006/0034835 및 US 2006/0024300 참조. 본 발명의 다양한 바람직한 실시양태들의 요약에서, US 2006/0062787에 개시된 바와 같은 2H7 버젼 16을 기초로 하는 변이체들의 V 영역은 하기 표에서 지시되는 아미노산 치환의 위치를 제외하고는 v16의 아미노산 서열을 가질 것이다. 달리 지시되지 않는 한, 2H7 변이체는 v16과 동일한 경쇄를 가질 것이다.
Figure 112009028089493-PCT00002
바람직한 인간화 2H7은 버젼 16의 서열을 갖는 무손상 항체 또는 항체 단편, 또는 상기 제시된 버젼들 중 임의의 것이다.
본원에서의 "BAFF 길항제"는 BAFF 또는 BR3의 활성을 차단하는 임의의 분자이다. 여기에는 BAFF에 결합하는 BR3, TACI 또는 BCMA의 일부분을 포함하는 면역부착소, 또는 BAFF에 결합하는 이의 변이체가 포함된다. 또다른 실시양태에서, BAFF 길항제는 BAFF 항체이다. "BAFF 항체"는 BAFF에 결합하는, 바람직하게는 인간 BAFF의 잔기 162-275를 포함하는 인간 BAFF의 영역 내에서 BAFF에 결합하는 항체이다. 또다른 실시양태에서, BAFF 길항제는 BR3 항체이다. "BR3 항체"는 BR3에 결합하는 항체이고, 바람직하게는 인간 BR3 서열의 잔기 23-38을 포함하는 인간 BR3의 영역 내에서 BR3에 결합하는 것이다. 인간 BAFF 및 인간 BR3의 서열은, 예를 들어, US 2006/0062787에서 확인된다. BAFF-결합 폴리펩티드 또는 BAFF 항체의 또다른 예들을, 예를 들어, WO 2002/092620, WO 2003/014294, [Gordon et al., Biochemistry 42(20):5977-5983 (2003)], [Kelley et al., J. Biol. Chem., 279(16):16727-16735 (2004)], WO 1998/18921, WO 2001/12812, WO 2000/68378 및 WO 2000/40716에서 확인할 수 있다.
"장기" 투여는 초기의 치료 효과 (활성)가 장기간에 걸친 시간 동안 유지되도록 단기 방식과 대조적으로 연속적인 방식으로 의약(들)을 투여하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 수행되지 않지만 사실상 주기적인 치료이다.
본원에서 사용된 "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에 비독성인 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예로는 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기 산; 아스코르브산이 포함되는 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™이 포함된다.
용어 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등이 포함되는, 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서의 포유동물은 인간이다.
"포장 삽입물"은 의약의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭하고, 이러한 지침서는 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기, 포장된 제품과 조합될 기타 의약, 및/또는 이같은 의약의 사용에 관련된 경고에 관한 정보 등을 함유한다.
"키트"는 하나 이상의 시약, 예를 들어, 자가면역 질환 예컨대 RA, 루푸스, MS, 또는 IBD의 치료를 위한 의약을 포함하는 임의의 제조품 (예를 들어, 포장물 또는 용기)이다. 바람직하게는, 제조품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로서 판촉되거나, 배급되거나, 또는 판매된다.
"표적 수신자"는 특히 특정 용도, 치료, 또는 적응증을 위해, 예컨대 마케팅 또는 광고에 의해, 특정 의약이 판촉되거나 판촉되도록 의도되는 일군의 사람들 또는 시설, 예컨대 개별적인 환자, 환자 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지의 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약 회사 등이다.
"의약"은 당해 장애 또는 이의 증상 또는 부작용을 치료하기 위한 활성 약물이다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 이러한 기술 분야의 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다.
본 발명을 수행하기 위한 방식
한 실시양태에서, 본 발명은
(a) KASQAVSSAVA (서열 1) 또는 RASQAVSSAVA (서열 2)인 아미노산 A1-A11을 포함하거나 또는 KSSQSLLYSTNQKNFLA (서열 3) 또는 KSSQSLLYSANQKNFLA (서열 4) 또는 KSSQSLLYSTNQKNALA (서열 6)인 아미노산 A1-A17을 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-L1 서열 (각각 키메라 2C8 또는 인간화 2C8.v2/2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14, 또는 3F12 클론 14 또는 17);
(b) SASHRYT (서열 7) 또는 WASTRDS (서열 8)인 아미노산 B1-B7을 포함하는 CDR-L2 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2/인간화 2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14);
(c) QQHYSTPWT (서열 9) 또는 QENYSTPWT (서열 11) 또는 QQYYSYPRT (서열 13) 또는 QQYASYPRT (서열 14) 또는 QQYYAYPRT (서열 15)인 아미노산 C1-C9를 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-L3 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2 또는 2C8 클론 G7 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14 또는 3F12 클론 20 또는 3F12 클론 21);
(d) GYTFTSYVIH (서열 16) 또는 GYTFSSYWIE (서열 17)인 아미노산 D1-D10을 포함하는 CDR-H1 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2/인간화 2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14);
(e) YNNPYNDGTNYNEKFKG (서열 18) 또는 EISPGSGSTNYNEEFKG (서열 19) 또는 YNNPYNAGTNYNEKFKG (서열 101) 또는 EINPGSGSTIYNEKFKG (서열 110)인 아미노산 E1-E17을 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-H2 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5, 또는 인간화 2C8.vX, 또는 인간화 3F12.v14); 및
(f) PTMLPWFAY (서열 20)인 아미노산 F1-F9를 포함하거나 또는 GYHGY (서열 21) 또는 GYHGA (서열 22)인 아미노산 F1-F5를 포함하는 CDR-H3 서열 (각각 키메라 2C8/인간화 2C8.v2/인간화 2C8.vX 또는 키메라 3F12/인간화 3F12.v5/인간화 3F12.v14 또는 3F12 클론 12)
로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 단리된 LTα 항체를 구현한다.
한 바람직한 실시양태에서, 서열 3은 KSSQSLLYSTAQKNFLA (서열 5) (3F12 클론 15)이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 서열 11은 QESYSTPWT (서열 10) (2C8 클론 A8/인간화 2C8.vX) 또는 QEVYSTPWT (서열 12) (2C8 클론 H6)이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, CDR-L1 서열은 서열 2 또는 3 또는 4 또는 6이다.
또다른 바람직한 양상에서, 항체는 (i) 서열 1 또는 2 및 7 및 9의, 또는 서열 1 또는 2 및 7 또는 8 및 11의, 또는 서열 3, 8, 및 13의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 13의, 또는 서열 3, 8, 및 14 또는 15의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 14 또는 15의 CDR-L1 내지 CDR-L3 아미노산 서열 모두; 또는 (ii) 서열 16, 18, 및 20의 CDR-H1 내지 CDR-H3 아미노산 서열 모두, 또는 서열 16, 101, 및 20 모두, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22 모두, 또는 서열 17, 110, 및 21 모두를 포함한다.
또다른 양상에서, 항체는 서열 1 또는 2 및 7 및 9 모두, 또는 서열 16, 18, 및 20 모두, 또는 서열 16, 101, 및 20 모두를 포함한다. 별법적인 실시양태에서, 항체는 서열 3, 8, 및 13 모두, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22 모두를 포함한다. 별법적인 실시양태에서, 항체는 서열 4, 8, 및 14 모두, 또는 서열 17, 110, 및 21 모두를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 (i) 서열 1 또는 2, 7 및 9의, 또는 서열 1 또는 2 및 7 또는 8 및 11의, 또는 서열 3, 8, 및 13의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 13의, 또는 서열 3, 8, 및 14 또는 15의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 14 또는 15의 CDR-L1 내지 CDR-L3 아미노산 서열 모두; 및 (ii) 서열 16, 18, 및 20의, 또는 서열 16, 101, 및 20의, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22의, 또는 서열 17, 110, 및 21의 CDR-H1 내지 CDR-H3 아미노산 서열 모두를 포함한다.
한 바람직한 양상은 서열 23 또는 24를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 25 또는 26을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 23 및 25 양쪽 모두를 포함하거나 서열 24 및 26 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체이다. 서열 27 또는 28을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 29, 30 또는 31을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 27 및 29 양쪽 모두, 또는 서열 27 및 30 양쪽 모두, 또는 서열 27 및 31 양쪽 모두, 또는 서열 28 및 30 양쪽 모두, 또는 서열 28 및 31 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체가 또한 바람직하다. 추가적인 양상에서, 본 발명은 서열 102를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 103을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 102 및 103 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체를 제공한다. 추가적인 양상에서, 본 발명은 서열 108을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 109를 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 108 및 109 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-LTα 항체를 제공한다.
또다른 실시양태에서의 항체는 인간 κ 서브그룹 1 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하고/하거나, 중쇄 인간 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하고, 이때 프레임워크 서열은 바람직하게는 위치 71, 73, 및/또는 78에서의 치환을 포함한다. 이같은 치환은 바람직하게는 R71A, N73T, 또는 N78A, 또는 이의 임의의 조합이고, 가장 바람직하게는 셋 모두이다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 LTα3에 결합하고, LTα3과 TNFRI 및 TNFRII의 상호작용을 차단한다. 바람직하게는, 이는 LTαβ 복합체, 특히 세포 표면 상의 복합체에 또한 결합한다. 바람직하게는, 이는 LTαβ 기능을 또한 차단하고/하거나, 바람직하게는 Fc 영역을 함유하고/하거나, 시험관내 콜라겐-유도 관절염 분석법 또는 시험관내 항체-유도 관절염 분석법에서 RA와 관련된 염증성 사이토카인의 수준을 감소시킨다.
추가로 바람직한 항체는 LTαβ와 LTβ-R의 상호작용을 차단하고/하거나 LTαβ-발현 세포를 조정한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본원에서의 항-LTα 항체는 하나 이상의 LTα 단백질의 한가지 이상의 활성을 실질적으로 중화한다. 바람직하게는, 본원에서의 항체는 LTα를 발현하는 모든 세포를 표적으로 하고, 바람직하게는 LTα-양성 또는 -분비 세포를 고갈시킨다.
바람직한 본원에서의 항체는 적어도 약 10-12 M, 더욱 바람직하게는 적어도 약 10-13 M의 친화력으로 LTα에 결합한다. 또한 바람직하게는 항체는 IgG 이소타입의 항체, 예컨대 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 IgG3이고, 더욱 바람직하게는 인간 IgG이며, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2a이다.
또다른 바람직한 항체는 인간 LTα에 대한 1가 친화력이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 접속 번호 PTA-7538 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 (하이브리도마 뮤린 림포톡신 알파2 베타1 s5H3.2.2)에 의해 생산된 뮤린 항체의 인간 LTα에 대한 1가 친화력과 대략 동일하거나 이보다 크다.
당업계에 잘 확립되어 있는 바와 같이, 자신의 수용체에 대한 리간드의 결합 친화력은 다양한 분석법들 중 임의의 분석법을 사용하여 결정할 수 있고, 다양한 정량값으로 표현될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 결합 친화력은 Kd 값으로 표현되고, 고유 결합 친화력 (예를 들어, 결합성(avidity) 효과가 최소화된 친화력)을 반영한다. 일반적으로, 그리고 바람직하게는, 결합 친화력은 무세포 또는 세포-회합 환경에서 시험관내에서 측정된다. 결합 친화력에서의 배수 차이는 인간화 항체 (예를 들어, Fab 형태)의 1가 결합 친화력 값과 기준/비교물 항체 (예를 들어, Fab 형태) (예를 들어, 도너 CDR 서열의 뮤린 항체)의 1가 결합 친화력 값의 비율로 정량화될 수 있고, 이때 결합 친화력 값들은 유사한 분석법 조건 하에 결정된다.
따라서, 한 실시양태에서, 결합 친화력에서의 배수 차이는 Fab 형태의 인간화 항체 및 상기 기준/비교물 Fab 항체의 Kd 값의 비율로 결정된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (A)의 친화력이 기준 항체 (M)의 친화력보다 "3배 더 낮고", A에 대한 Kd 값이 3x인 경우, M의 Kd 값은 1x일 것이고, A의 Kd 대 M의 Kd의 비율은 3:1일 것이다. 반대로, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (C)의 친화력이 기준 항체 (R)의 친화력보다 "3배 더 높고", C에 대한 Kd 값이 1x인 경우, R의 Kd 값은 3x일 것이고, C의 Kd 대 R의 Kd의 비율은 1:3일 것이다. 본원에 기술된 것들을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 분석법이 결합 친화력 측정을 수득하는데 사용될 수 있고, 여기에는, 예를 들어, SPR (BIACORE® 기술)을 사용하는 광학 바이오센서, RIA, 및 ELISA가 포함된다. 바람직하게는, 광학 바이오센서 또는 방사선면역분석법에 의해 측정된다.
본원에서의 항체는 바람직하게는 키메라 또는 인간화 항체이고, 더욱 바람직하게는 인간화 항체이며, 더욱 더 바람직하게는 프레임워크 서열의 적어도 일부분이 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체이다.
또다른 본원에서의 실시양태는 본원에서의 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체이다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체를 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (US 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터를 상기 기술된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발시킨다. 별법적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성시킨다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 어버이 골수종 세포 (융합 파트너로 또한 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게는 함유하는 적절한 배양 배지에 파종하여 성장시킨다. 예를 들어, 어버이 골수종 세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 없는 경우, 하이브리도마용 선별 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 (HAT 배지), 이러한 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
바람직한 융합 파트너 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생산을 지지하며, 융합되지 않은 어버이 세포에 대해 선별하는 선별 배지에 감수성이 있는 것이다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 <Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, California USA)>로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 SP-2 및 유도체, 예를 들어, <아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (Rockville, Maryland USA)>으로부터 입수가능한 X63-Ag8-653 세포이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기술되어 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 분석법, 예컨대 RIA 또는 ELISA에 의해 측정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화력은, 예를 들어, [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기술된 스캐차드(Scatchard) 분석법에 의해 측정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화력 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인되면, 클론을 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다 ([Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적절한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 예를 들어, 마우스 내로의 세포의 복강내 주사에 의해, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 절차, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-SEPHAROSE™ 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 등에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함)을 이용하여 쉽게 단리 및 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이같은 DNA의 바람직한 공급원으로 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 백터 내로 넣을 수 있고, 그 후 이를 형질감염되지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 리뷰 논문에는 [Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)]이 포함된다.
추가적인 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용한 뮤린 및 인간 항체의 단리가 각각 기술되어 있다. 후속 문헌들에는 사슬 셔플링에 의한 고친화력 (nM 범위) 인간 항체의 생산 ([Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]), 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 ([Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)])이 기술되어 있다. 따라서, 이러한 기술들은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
예를 들어, 상동성 뮤린 서열을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 치환함으로써 (US 4,816,567 및 [Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 면역글로불린 코딩 서열을 비-면역글로불린 폴리펩티드 (이종성 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부와 융합시킴으로써, 항체를 코딩하는 DNA를 변형시켜 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 비-면역글로불린 폴리펩티드 서열이 항체의 불변 도메인을 치환할 수 있거나, 또는 이러한 서열로 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환하여, 항원에 대한 특이성이 있는 한 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성이 있는 또다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체가 생성된다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 비-인간 항체를 인간화시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 Winter 및 공동 연구원의 방법 ([Jones et al. Nature 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al. Nature 332: 323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al. Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (US 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 서열이 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 받아들여진다 ([Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)]; [Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)]).
항원에 대한 높은 친화성 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지시키면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 한 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있고, 이는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)에 임의로 접합될 수 있다. 별법적으로, 인간화 항체는 전장 항체, 예컨대 전장 IgG1 항체일 수 있다.
인간 항체 및 파지 디스플레이 방법
인간화의 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시,내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉(trnasgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 US 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852 참조.
별법적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여, 면역화되지 않은 도너로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 하는 선별로 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선별된다. 따라서, 파지는 LTα 세포의 성질을 일부 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, [Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 예를 들어 리뷰되어 있다. V-유전자 절편의 다양한 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 도너로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다. 또한, US 5,565,332 및 5,573,905 참조.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 또한 생성될 수 있다 (US 5,567,610 및 5,229,275 참조).
항체 단편
특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 더 작은 크기는 신속한 소거를 허용하고, 고형 종양에 대한 개선된 접근에 이를 수 있다.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편이 모두 대장균에서 발현되어 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 다량의 이러한 단편들이 손쉽게 생산되도록 한다. 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편들이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 1993/16185; U.S. 5,571,894; 및 U.S. 5,587,458 참조. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적절하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합이 산출되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. 또한 항체 단편은, 예를 들어, U.S. 5,641,870에 기술된 것과 같이, "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 대표적인 이중특이적 항체는 LTα 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또다른 이같은 항체는 LTα 결합 부위를 또다른 단백질에 대한 결합 부위와 조합시킬 수 있다. 별법적으로, 세포성 방어 메카니즘이 LTα-발현 세포에 집중되도록, 항-LTα 결합 팔이 백혈구 상의 촉발 분자 예컨대 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16), 또는 NKG2D 또는 기타 NK-세포-활성화 리간드에 결합하는 팔과 조합될 수 있다. 또한 이중특이적 항체를 사용하여 세포독성제를 LTα를 발현하는 세포에 국소화시킬 수 있다. 이러한 항체들은 LTα-결합 팔, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신(ricin) A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 팔을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
WO 1996/16673에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기술되어 있고, US 5,837,234에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 개시되어 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 1998/02463에 제시되어 있다. US 5,821,337에는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 교시되어 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하고, 이때 두 사슬은 특이성이 상이하다 ([Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하고, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 1993/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)이 있는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 바람직하게는, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA들을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적절한 숙주 세포 내로 공동-형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 동등하지 않은 비율이 원하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 더 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우 또는 원하는 사슬 조합의 수율에 대해 비율이 유의한 효과가 없는 경우, 2개 또는 모든 3개의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 팔 내의 하이브리드 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 한다는 것이 발견되었다. 이러한 접근법이 WO 1994/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성을 위한 추가적인 상세한 내용은, 예를 들어, [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210 (1986)] 참조.
또다른 접근법 (US 5,731,168)에서, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 타이로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동"이 제2 항체 분자의 경계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교된 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 내의 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이같은 항체들은, 예를 들어, 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (US 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 1991/00360, WO 1992/20373 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 다수의 가교 기술과 함께, 적절한 가교제가 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, US 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키는 기술 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 무손상 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 방법이 기술되어 있다. 이러한 단편을 디티올 착화제인 아비산나트륨의 존재하에 환원시켜, 인접한 디티올들을 안정화시키고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 그 후 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나를 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 생산된 이중특이적 항체를 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진보로 대장균으로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌고, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기술되어 있다. 각각의 Fab' 단편이 대장균으로부터 별도로 분비되었고, 시험관내에서 지향성으로 화학적 커플링되어, 이중특이적 항체가 형성되었다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기술되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. [Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 유전자 융합에 의해 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 후, 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체의 생산에 또한 이용될 수 있다. [Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 별법적인 제조 메커니즘을 제공하였다. 단편은 동일한 사슬 상의 두 도메인이 쌍을 이루게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루도록 강요됨으로써, 2개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다. [Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)] 참조.
2가를 초과하는 항체가 구현된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다. [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 빨리 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위가 있는 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고 (예를 들어 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이로 구성된다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역에 대해 아미노 말단인 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 구성된다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 사슬 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 사슬)을 포함하고, 이때 폴리펩티드 사슬(들)은 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VD1-(X1)n- VD2-(X2)n-Fc [식중, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 사슬이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다]를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 사슬(들)은 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 사슬; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 사슬을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서의 다가 항체는, 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 여기서 구현된 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로, CL 도메인을 추가로 포함한다.
벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에 기술된 재조합 모노클로날 항체, 면역부착소, 및 기타 폴리펩티드 길항제를 클로닝 또는 발현시키는데 적절한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 고급 진핵생물 세포이다. 이러한 목적을 위한 적절한 원핵생물에는 유박테리아(eubacteria), 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들어, 장내세균 예컨대 에쉐리키아(Escherichia), 예를 들어, 대장균, 엔테로박테르(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus) 예컨대 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, DD 266,710 (1989년 4월 12일 공개)에 개시된 바실리 리케니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas) 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다. 한 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주 예컨대 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537), 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325)도 적절하다. 이러한 예들은 제한적이기보다는 예시적이다.
특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우에, 예컨대 치료용 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 접합되고 면역접합체 자체가 종양 세포 파괴에서 유효성을 나타내는 경우, 전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질을 박테리아에서 생산할 수 있다. 전장 항체는 순환 반감기가 더 길다. 대장균에서의 생산은 더 빠르고, 비용 면에서 더 효율적이다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 발현 및 분비를 최적화하기 위한 신호 서열 및 번역 개시 영역 (TIR)이 기술되어 있는 US 5,648,237; 5,789,199; 및 5,840,523 참조. 발현 후, 항체를 대장균 세포 페이스트로부터 가용성 분획 내에 단리하고, 예를 들어, 이소타입에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 CHO 세포에서 예를 들어 발현된 항체를 정제하는 프로세스와 유사하게 수행할 수 있다. 일반적인 모노클로날 항체 생산에 대해, US 7,011,974를 또한 참조한다.
원핵생물에 더하여, 진핵생물 미생물 예컨대 필라멘트형 진균 또는 효모가 항체를 코딩하는 벡터, 예컨대 LTα-항체를 코딩하는 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 또는 통상적인 베이커(baker) 효모가 저급 진핵생물 숙주 미생물들 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미이(K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이(K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드라소필라룸(K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스(K. Thermotolerans), 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 리시아(Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 예컨대 슈완니오마이세스 오시덴탈리스(Schanniomyces occidentalis); 및 필라멘트형 진균, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주 예컨대 아스페르길루스 니둘란스(A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르(A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종, 및 계통이 통상적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
발현, 예를 들어, 글리코실화 LTα-결합 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) (과일파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 상응하는 증식허용성 곤충 숙주 세포가 확인되어 있다. 다양한 형질감염용 바이러스 균주, 예를 들어, 오토그래파 칼리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하고, 이같은 바이러스들은, 특히 스포롭테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로 사용될 수 있다.
면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 흥미롭고, 배양물 (조직 배양물)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되어 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 293 또는 현탁액 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포주 (BHK, 예를 들어, ATCC CCL 10); CHO K1, CHO pro3-, CHO DG44, CHO DUXB11, Lec13, B-Ly1, 및 CHO DP12 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]) (바람직하게는 CHO DUX (DHFR-) 또는 이의 서브클론 (본원에서 "CHO DUX"로 칭해짐)이 포함되지만, 이에 한정되지 않음); C127 세포, 마우스 L 세포; Ltk- 세포; 마우스 세르톨리(sertoli) 세포 (TM4, [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 골수종 세포; NS0; 하이브리도마 세포 예컨대 마우스 하이브리도마 세포; COS 세포; 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 ([Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)이다.
숙주 세포를 본원에서의 LTα-결합 항체의 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 배지 예컨대 햄(Ham) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는데 적절하다. 또한, [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], US 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 1990/03430; WO 1987/00195; 또는 US Re.30,985에 기술된 배지들 중 임의의 것을 숙주 세포에 대한 배양 배지로 사용할 수 있다. 임의의 이러한 배지에 필요하다면 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), 미량원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원이 보충될 수 있다. 임의의 기타 필요한 보충물이 당업자에게 공지된 적합한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현에 선택된 숙주 세포와 함께 기존에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다.
한 특정 양상에서, 적절한 배지는 기초 배지 성분 예컨대 DMEM/HAM F-12계 제형 (DMEM 및 HAM F12 배지, 특허 무혈청 배지의 조성에 대해, [American Type Culture Collectionthe Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, Sixth Edition, 1988, pp 346-349]의 배양 배지 제형 참조) (US 5,122,469에 기술된 바와 같은 배지의 제형이 적합할 수 있다)를 함유하고, 이때 배지는 필요하다면 일부 성분 예컨대 아미노산, 염, 당 및 비타민의 농도가 적절하게 변형되고, 글리신, 하이포잔틴, 및 티미딘; 재조합 인간 인슐린, 가수분해된 펩톤, 예컨대 PROTEASE PEPTONE 2 및 3™, PRIMATONE HS™ 또는 PRIMATONE RL™ (Difco, USA; Sheffield, England), 또는 등가물; 세포 보호제, 예컨대 PLURONIC F68™ 또는 등가의 PLURONIC™ 폴리올; GENTAMYCINTM 항생제; 및 미량 원소를 임의로 함유한다. 바람직하게는, 세포 배양 배지는 무혈청 배지이다.
본 발명의 한 양상에서, 항체 생산이 대량으로 발효 공정에 의해 수행된다. 다양한 대규모 페드-뱃치(fed-batch) 발효 절차가 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 용량이 약 1000 리터 이상이고, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량이다. 이러한 발효는 산소 및 영양소, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)을 분배하기 위해 진탕기 임펠러(impeller)를 사용한다. 소규모 발효는 체적 용량이 약 100 리터 이하인 발효기에서의 발효를 일반적으로 지칭하고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서, 단백질 발현의 유도는 세포가 적절한 조건 하에 원하는 밀도, 예를 들어, 약 180-220의 OD550으로 성장한 후에 전형적으로 개시되고, 이러한 단계에서 세포는 초기 정지기 상태이다. 당업계에 공지되고 상기 기술된 바와 같이, 사용된 벡터 구축물에 따라, 다양한 유도제가 사용될 수 있다. 유도 전에 더 짧은 기간 동안 세포가 성장될 수 있다. 세포는 일반적으로 약 12-50 시간 동안 유도될 수 있지만, 더 길거나 더 짧은 유도 시간도 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩티드의 정확한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 샤페론(chaperone) 단백질, 예컨대 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성이 있는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)을 과발현하는 추가적인 벡터가 원핵생물 숙주 세포를 공동-형질감염시키는데 사용될 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 정확한 폴딩 및 가용성을 촉진시키는 것으로 증명되었다. [Chen et al. J Bio Chem 274:19601-19605 (1999)]; US 6,083,715 및 6,027,888; [Bothmann and Pluckthun J. Biol. Chem. 275:17100-17105 (2000)]; [Ramm and Pluckthun J. Biol. Chem. 275:17106-17113 (2000)]; [Arie et al. Mol. Microbiol. 39:199-210 (2001)].
발현된 이종성 단백질 (특히 단백질분해적으로 민감한 것들)의 단백질분해를 최소화하기 위해, 단백질분해성 효소가 결핍된 특정 숙주 균주가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 공지된 박테리아 프로테아제 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 이의 조합물을 코딩하는 유전자에서의 유전자 돌연변이(들)을 초래하기 위해 숙주 세포 균주가 변형될 수 있다. 일부 대장균 프로테아제-결핍 균주가 입수가능하고, 예를 들어, US 5,264,365; 5,508,192; 및 [Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)]에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 단백질분해성 효소가 결핍되고 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주가 본원에서의 발현 시스템에서 숙주 세포로 사용된다.
항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내에서 생산될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫번째 단계로서, 예를 들어, 원심분리 또는 초원심분리에 의해, 입자성 잔해물 (숙주 세포 또는 용해된 단편)이 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 일반적으로 이같은 발현 시스템으로부터의 상등액을 시판되는 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon™ 또는 Millipore Pellicon™ 초여과 유닛을 사용하여 먼저 농축한다. 단백질분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제 예컨대 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)가 임의의 상기 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 추가적인 분석법 및 용도를 위한 실질적으로 균질한 제제를 수득하기 위해 본원에서 생산된 항체 단백질이 추가로 정제된다. 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 하기의 절차들은 대표적인 적절한 정제 절차들이다: 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™ 상에서의 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 면역친화성 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 음이온- 또는 양이온-교환 수지 (예컨대 DEAE 또는 폴리아스파르트산 컬럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 및 SEPHADEX™ G-75 수지가 예를 들어 사용되는 젤 여과. 분석 규모의 정제를 위해서는, 소량이 컬럼에 통과되어 사용되고, 치료용 용도에서 유용한 다량의 항체를 생산하기 위한 제조용 또는 상업적 규모의 정제를 위해서는, 대량이 사용된다 당업자는 어떤 용도를 위해 어떤 규모가 사용되어야 하는지를 이해할 것이다. 바람직하게는, 제조용 규모가 본 발명을 위해 사용된다.
친화성 리간드로서의 단백질 A의 적절성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 ([Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 ([Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정적인 매트릭스 예컨대 제어형 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것에 비해 유속이 더 빠르게 하고 프로세싱 시간이 더 짧게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다.
단백질 A 크로마토그래피를 위해, 단백질 A가 고정된 고체 상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함하는 컬럼, 더욱 바람직하게는 제어형 다공성 유리 컬럼 또는 규산 컬럼이다. 일부 용도에서, 오염물의 비-특이적 부착을 방지하도록 컬럼이 글리세롤과 같은 시약으로 코팅되었다. 그후, 고체 상을 세정하여 고체 상에 비-특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 마지막으로, 당해 항체를 고체 상으로부터 용출에 의해 회수한다.
임의의 예비 정제 단계(들) 후에, 당해 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 pH 약 2.5-4.5의 용출 완충제를 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시킬 수 있고, 이는 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행된다.
감소된 HAMA 응답 또는 이의 부재를 나타내는 변이체 항체의 생성
HAMA 응답의 감소 또는 제거는 적절한 치료제의 임상 개발의 중요한 양상이다. 예를 들어, [Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst., 80:937 (1988)]; [Jaffers et al., Transplantation, 41:572 (1986)]; [Shawler et al., J. Immunol., 135:1530 (1985)]; [Sears et al., J. Biol. Response Mod, 3:138 (1984)]; [Miller et al., Blood, 62:988 (1983)]; [Hakimi et al., J. Immunol., 147:1352 (1991)]; [Reichmann et al., Nature, 332:323 (1988)]; 및 [Junghans et al., Cancer Res, 50:1495 (1990)] 참조. 본원에서의 일부 실시양태에서, 본 발명은 HAMA 응답이 감소되거나 제거되도록 인간화된 항체를 제공한다. 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 이러한 항체들의 변이체가 추가로 수득될 수 있고, 상기 방법들 중 일부가 하기에 추가로 기술된다.
예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 항체로부터의 아미노산 서열이 프레임워크 및/또는 CDR 서열(들)의 다양화를 위한 출발 (어버이) 서열로 작용할 수 있다. 출발 CDR 서열이 연결되는 선별된 프레임워크 서열은 본원에서 어셉터 인간 프레임워크로 지칭된다. 어셉터 인간 프레임워크가 인간 면역글로불린 (이의 VL 및/또는 VH 영역)으로부터의 것이거나 또는 이로부터 유래되지만, 바람직하게는 어셉터 인간 프레임워크는 인간 컨센서스 프레임워크 서열로부터의 것이거나 이로부터 유래되고, 이는 이같은 프레임워크가 인간 환자에서 최소의 면역원성을 나타내거나 면역원성을 나타내지 않는 것으로 증명되었기 때문이다.
어셉터가 인간 면역글로불린으로부터 유래되는 경우, 도너 프레임워크 서열을 인간 프레임워크 서열들의 선집 내의 다양한 인간 프레임워크 서열과 정렬하고, 가장 상동성인 프레임워크 서열을 어셉터로 선별함으로써 도너 프레임워크 서열에 대한 상동성을 기초로 인간 프레임워크 서열을 임의로 선별할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서의 인간 컨센서스 프레임워크는 VH 서브그룹 III 및/또는 VL 카파 서브그룹 I 컨센서스 프레임워크 서열로부터의 것이거나 이로부터 유래된다.
따라서, VH 어셉터 인간 프레임워크는 하기의 프레임워크 서열들 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 46)을 포함하는 FR1,
WVRQAPGKGLEWVG (서열 47)를 포함하는 FR2,
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (서열 48), 또는
RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD (서열 50)을 포함하는 FR3, 및
WGQGTLVTVSS (서열 49)을 포함하는 FR4.
VL 어셉터 인간 프레임워는 하기의 프레임워크 서열들 중 1개, 2개, 3개 또는 모두를 포함할 수 있다: :
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 51)을 포함하는 FR1,
WYQQKPGKAPKLQIY (서열 52), 또는 WYQQKPGKAPKLLIY (서열 55)를 포함하는 FR2,
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 53)을 포함하는 FR3, 및
FGQGTKVEIKR (서열 54)을 포함하는 FR4.
어셉터가 선별된 인간 프레임워크 서열과 서열이 동일할 수 있는 한편, 인간 면역글로불린으로부터의 것이든 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터의 것이든, 어셉터 서열이 인간 면역글로불린 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 비교하여 선재하는 아미노산 치환을 포함할 수 있다는 것이 본 발명에서 구현된다. 이러한 선재하는 치환은 바람직하게는 최소의 치환이고, 일반적으로는 인간 면역글로불린 서열 또는 컨센서스 프레임워크 서열과 비교하여 오직 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 차이이다.
비-인간 항체의 CDR 잔기가 VL 및/또는 VH 어셉터 인간 프레임워크 내로 혼입된다. 예를 들어, 카밧 CDR 잔기, 코티아 초가변 루프 잔기, AbM 잔기, 및/또는 접촉 잔기를 혼입시킬 수 있다. 임의로, 하기와 같은 확장된 CDR 잔기가 혼입된다: 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3).
CDR 잔기의 "혼입"은 다양한 방식으로 달성될 수 있고, 예를 들어, 프레임워크 잔기가 어셉터 인간 프레임워크 잔기로 변화되도록 마우스 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시킴으로써, 또는 CDR 잔기가 비-인간 잔기로 변화되도록 인간 가변 도메인 서열을 코딩하는 핵산을 돌연변이시킴으로써, 또는 원하는 서열을 코딩하는 핵산을 합성함으로써 등등에 의해 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산이 생성될 수 있다.
각각의 CDR에 대해 별도의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 인간 어셉터 서열을 코딩하는 핵산의 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발에 의해 CDR-그래프트 변이체가 생성될 수 있다. [Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987)]. 정확한 CDR-항원 상호작용을 수정하고 재확립시키기 위해, 일상적인 기술을 사용하여 적합한 변화가 프레임워크 및/또는 CDR 내로 도입될 수 있다.
파지(미드) 디스플레이 (본원에서 일부 정황에서는 파지 디스플레이로 또한 지칭됨)가 서열 무작위화에 의해 생성된 라이브러리에서 다수의 상이한 잠재적인 변이체 항체를 생성시키고 스크리닝하기 위한 편리하고 신속한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 변경된 항체를 제조하고 스크리닝하기 위한 또다른 방법들이 당업자에게 이용가능하다.
파지(미드) 디스플레이 기술은 항원과 같은 리간드에 결합하는 신규 단백질을 생성시키고 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지(미드) 디스플레이의 기술을 이용하여, 높은 친화력으로 표적 분자에 결합하는 서열에 대해 신속하게 분류될 수 있는 단백질 변이체의 대형 라이브러리가 생성된다. 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 바이러스 코트 단백질, 예컨대 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 일반적으로 융합된다. 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유전자 III 단백질의 일부를 코딩하는 핵산 서열에 융합된 1가 파지미드 디스플레이 시스템이 개발되었다 ([Bass, Proteins, 8:309 (1990)]; [Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991)]). 1가 파지미드 디스플레이 시스템에서, 유전자 융합물이 낮은 수준으로 발현되고, 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어, 입자의 감염성이 유지된다. 펩티드 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 다수의 특허에 개시되어 있다 (예를 들어, US 5,723,286; 5,432,018; 5,580,717; 5,427,908; 및 5,498,530).
무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 것 또는 관련된 유전자들의 패밀리를 클로닝하는 것을 포함하는 다수의 방식으로 항체의 라이브러리가 제조되었다. 파지(미드) 디스플레이를 사용하여 항체 또는 항원-결합 단편을 디스플레이하는 방법이 US 5,750,373; 5,733,743; 5,837,242; 5,969,108; 6,172,197; 5,580,717; 및 5,658,727에 기술되어 있다. 그후, 라이브러리를 원하는 특성이 있는 항체 또는 항원-결합 단백질의 발현에 대해 스크리닝한다.
올리고뉴클레오티드의 서열은 변경될 CDR 잔기에 대한 디자인된 코돈 셋트들 중 하나 이상을 포함한다. 코돈 셋트는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용된 여러 뉴클레오티드 트리플릿(triplet) 서열들의 셋트이다. IUB 코드에 따라 하기 제시된 바와 같이 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들의 등몰 혼합물을 지정하는 기호를 사용하여 코돈 셋트가 표시될 수 있다.
IUB 코드
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 사이토신
R (A 또는 G)
Y (C 또는 T)
M (A 또는 C)
K (G 또는 T)
S (C 또는 G)
W (A 또는 T)
H (A 또는 C 또는 T)
B (C 또는 G 또는 T)
V (A 또는 C 또는 G)
D (A 또는 G 또는 T) H
N (A 또는 C 또는 G 또는 T)
예를 들어, 코돈 셋트 DVK에서, D는 뉴클레오티드 A 또는 G 또는 T일 수 있고, V는 A 또는 G 또는 C일 수 있으며, K는 G 또는 T일 수 있다. 이러한 코돈 셋트는 18개의 상이한 코돈을 나타낼 수 있고, 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 코딩할 수 있다.
표준 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드 또는 프라이머 셋트를 합성할 수 있다. 코돈 셋트가 제공하는 뉴클레오티드 트리플릿의 모든 가능한 조합을 나타내고 원하는 군의 아미노산을 코딩할 서열들을 함유하는 올리고뉴클레오티드들의 셋트를, 예를 들어, 고체-상 합성에 의해 합성할 수 있다. 특정 위치에 선별된 뉴클레오티드 "동의성"이 있는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있다. 특정 코돈 셋트를 갖는 뉴클레오티드들의 이같은 셋트는 시판되는 핵산 합성기 (예를 들어, Applied Biosystems (Foster City, CA)로부터 입수가능)를 사용하여 합성될 수 있거나, 또는 상업적으로 수득될 수 있다 (예를 들어, Life Technologies (Rockville, MD)로부터 수득). 따라서, 특정 코돈 셋트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드들의 셋트는 상이한 서열을 갖는 다수의 올리고뉴클레오티드를 전형적으로 포함할 것이다 (차이는 전체 서열 내의 코돈 셋트에 의해 확립됨). 본원에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형에 대한 혼성화를 허용하는 서열을 갖고, 클로닝 목적을 위한 제한 효소 부위를 또한 포함할 수 있다.
한 방법에서, 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 이러한 기술은 [Zoller et al. Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987)]에 기술된 바와 같이 당업계에 주지되어 있다. 간략하게, 원하는 코돈 셋트를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 셋트를 DNA 주형에 혼성화시킴으로써 변이체 아미노산을 코딩하는 핵산 서열이 생성되고, 이때 상기 주형은 가변 영역 핵산 주형 서열을 함유하는 단일 가닥 형태의 플라스미드이다. 혼성화 후, DNA 폴리머라제를 사용하여 주형의 전체적인 제2 상보적 가닥이 합성되고, 상기 가닥에는 따라서 올리고뉴크레오티드 프라이머가 혼입될 것이고, 올리고뉴클레오티드 셋트에 의해 제공된 코돈 셋트를 함유할 것이다.
일반적으로, 뉴클레오티드 25개 이상 길이의 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적의 올리고뉴클레오티드에는 돌연변이(들)를 코딩하는 뉴클레오디드(들)의 어느 한쪽 측면 상의 주형에 대해 완전히 상보적인 12개 내지 15개의 뉴클레오티드가 있을 것이다. 이는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자에 정확하게 혼성화될 것을 확실하게 한다. 당업계에 공지된 기술 예컨대 [Crea et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978)]의 기술을 사용하여 올리고뉴클레오티드가 쉽게 합성된다.
박테리오파지 M13 벡터 (시판되는 M13mp18 및 M13mp19 벡터가 적절함)로부터 유래되거나, 또는 [Viera et al., Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기술된 바와 같이 단일 가닥의 파지 복제 기원을 함유하는 벡터에 의해 DNA 주형이 생성된다. 따라서, 돌연변이될 DNA가 이러한 벡터들 중 하나 내로 삽입되어, 단일 가닥 주형이 생성될 수 있다. 단일 가닥 주형의 생산은 [Sambrook et al., 상기 문헌]의 섹션 4.21-4.41에 기술되어 있다.
천연 DNA 서열을 변경시키기 위해, 올리고뉴클레오티드를 적절한 혼성화 조건 하에 단일 가닥 주형에 혼성화시킨다. 그후, DNA 중합효소, 예를 들어, T7 DNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제 I의 클레노우(Klenow) 단편이 첨가되어, 올리고뉴클레오티드를 합성용 프라이머로 사용하여 주형의 상보적 가닥이 합성된다. 1개의 DNA의 가닥은 유전자 1의 돌연변이된 형태를 코딩하고, 다른 가닥 (원래의 주형)은 유전자 1의 천연의 변경되지 않은 서열을 코딩하도록 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 분자가 이렇게 하여 형성된다. 그후, 이러한 헤테로듀플렉스 분자를 적절한 숙주 세포, 일반적으로는 원핵생물 예컨대 대장균 JM101 내로 형질전환시킨다. 세포를 성장시킨 후, 이를 아가로스 플레이트 상에 플레이팅하고, 32P 포스페이트로 방사선표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝하여, 돌연변이된 DNA를 함유하는 박테리아 콜로니를 확인한다.
플라스미드의 양쪽 가닥 모두가 돌연변이(들)을 함유하는 호모듀플렉스(homoduplex) 분자가 생성되도록 바로 위에서 기술된 방법이 변형될 수 있다. 변형은 하기와 같다: 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 상기 기술된 바와 같이 단일 가닥 주형에 어닐링(annealing)시킨다. 데옥시리보아데노신 (dATP), 데옥시리보구아노신 (dGTP), 및 데옥시리보티미딘 (dTT)의 3가지 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물을 dCTP-(aS)로 칭해지는 변형된 티오데옥시리보사이토신 (Amersham으로부터 수득될 수 있음)과 조합한다. 이러한 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 첨가한다. 이러한 혼합물에 DNA 폴리머라제를 첨가하면, 돌연변이된 염기를 제외하고 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, DNA의 이러한 새로운 가닥은 dCTP 대신 dCTP-(aS)를 함유할 것이고, 이는 제한 효소 소화로부터 DNA를 보호하는 작용을 한다. 이중 가닥 헤테로듀플렉스의 주형 가닥을 적절한 제한 효소로 니킹(nicking)시킨 후, 돌연변이유발될 부위(들)을 함유하는 영역 뒤에서 주형 가닥을 ExoIII 뉴클레아제 또는 또다른 적합한 뉴클레아제로 소화시킬 수 있다. 그후, 반응을 정지시켜, 부분적으로만 단일 가닥인 분자를 남긴다. 그후, 4가지 모두의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP, 및 DNA 리가제의 존재 하에 DNA 폴리머라제를 사용하여 완전한 이중 가닥 DNA 호모듀플렉스가 형성된다. 그후, 이러한 호모듀플렉스 분자를 적절한 숙주 세포 내로 형질전환시킨다.
이전에 지시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 셋트의 서열은 주형 핵산에 혼성화기에 충분한 길이이고, 반드시 그럴 필요는 없지만, 제한 부위를 또한 함유할 수 있다. [Viera et al. Meth. Enzymol., 153:3 (1987)]에 기술된 바와 같이 단일 가닥 파지 복제 기원을 함유하는 벡터 또는 박테리오파지 M13 벡터로부터 유래된 벡터에 의해 DNA 주형이 생성될 수 있다. 따라서, 단일 가닥 주형을 생성시키기 위해 돌연변이될 DNA가 이러한 벡터들 중 하나 내로 삽입되어야 한다. 단일 가닥 주형의 생산은 [Sambrook et al., 상기 문헌]의 섹션 4.21-4.41에 기술되어 있다.
또다른 방법에서, 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 셋트를 제공함으로써 라이브러리가 생성될 수 있고, 이때 각각의 셋트에는 서열들이 상이한 다수의 올리고뉴클레오티드가 있다. 이러한 서열들은 올리고뉴클레오티드의 서열 내에 제공된 코돈 셋트에 의해 확립된다. 상류 및 하류 올리고뉴클레오티드 셋트가, 가변 도메인 주형 핵산 서열과 함께, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 사용되어, PCR 생성물의 "라이브러리"가 생성될 수 있다. 확립된 분자 생물학 기술을 사용하여 다른 관련된 또는 관련되지 않은 핵산 서열, 예를 들어, 바이러스 코트 단백질 및 이량체화 도메인과 융합될 수 있기 때문에, PCR 생성물은 "핵산 카셋트"로 지칭될 수 있다.
PCR 프라이머의 서열은 CDR 내의 용매-접근가능하고 고도로 다양한 위치에 대한 원하는 코돈 셋트들 중 하나 이상을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이, 코돈 셋트는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용된 여러 뉴클레오티드 트리플릿 서열들의 셋트이다.
적합한 스크리닝/선별 단계를 통해 선별된 바와 같은, 원하는 기준을 충족시키는 항체 선별물을 표준 재조합 기술을 사용하여 단리 및 클로닝할 수 있다.
활성 분석법
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 이의 물리적/화학적 성질 및 생물학적 기능에 대해 특성화될 수 있다.
정제된 항체를 N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화가 포함되지만 이에 한정되지 않는 일련의 분석법에 의해 추가로 특성화할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본원에서 생산된 항체가 이의 생물학적 활성에 대해 분석된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체가 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트된다. 당업계에 공지되고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 분석법에는 웨스턴 블롯, 방사성면역분석법, ELISA (효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역분석법, 면역침전 분석법, 형광 면역분석법 및 단백질 A 면역분석법과 같은 기술을 사용하는 임의의 직접적 또는 경쟁적 결합 분석법이 비제한적으로 포함된다.
한 실시양태에서, 전부가 아니라 약간의 이펙터 기능을 지니는 변경된 항체가 본 발명에서 구현되고, 이러한 이펙터 기능은 이를 항체의 생체내 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 다수의 용도에 바람직한 후보물이도록 만든다. 특정 실시양태에서, 오직 원하는 성질만이 유지되는 것을 확실히 하기 위해, 생산된 면역글로불린의 Fc 활성이 측정된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석법이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 없지만 (따라서, ADCC 활성이 없기 쉬움), FcRn 결합 능력은 유지되는 것을 확실히 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 분석법이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석법의 예가 US 5,500,362 또는 5,821,337에 기술되어 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 PBMC 및 NK 세포가 포함된다. 별법적으로 또는 추가적으로, 당해 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같이 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 분석법이 또한 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석법이 수행될 수 있다. 당업계에 공지된 방법을 이용하여 FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정을 또한 수행할 수 있다.
항체 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 구현된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 적절한 뉴클레오티드 변화를 항체 핵산 내에 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 이같은 변형에는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 구축물이 원하는 특성을 갖는다는 조건하에 결실, 삽입 및 치환의 임의 조합이 이루어져 최종 구축물에 도달될 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열 내로 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은, [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌-스캐닝 돌연변이유발"로 칭해진다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 전하를 띠는 잔기), 중성 아미노산 또는 음성 전하를 띠는 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어, 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 그 후, 치환에 대해 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정련한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 성질을 미리 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 성과를 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 면역글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입에는 길이 범위가 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기가 있는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체가 포함된다. 항체 분자의 또다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예를 들어 ADEPT용)가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것이 포함된다.
또다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체에서는 항체 분자 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 잔기로 대체된다. 치환성 돌연변이유발에 가장 흥미로운 부위에는 CDR이 포함되지만, FR 변경 또한 구현된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 A에 제시된다. 이같은 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 A에서 "대표적 치환"으로 명명된 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.
본래의 잔기 대표적 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
항체의 생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변화는 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형상과 같은, 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피(bulk)를 유지하는 것에 대한 효과가 현저하게 상이한 치환을 선별함으로써 수행된다. 아미노산은 측쇄 성질에서의 유사성에 따라 하기와 같이 분류될 수 있다 (예를 들어, [A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]에 기술된 바와 같음):
(1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 무전하 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 산성: Asp (D), Glu (E)
(4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His(H)
별법적으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기 군으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중의 하나의 구성원을 또다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이같은 치환된 잔기 또한 보존성 치환 부위 내로, 더욱 바람직하게는 나머지 (보존되지 않은) 부위 내로 도입될 수 있다.
치환 변이체의 한 유형에는 어버이 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 CDR 잔기가 치환되는 것이 수반된다. 일반적으로, 추가적인 개발용으로 선택된 생성된 변이체(들)는 이들이 유래되는 어버이 항체에 비해 생물학적 성질이 개선될 것이다. 이같은 치환 변이체를 생성시키는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화력 성숙을 수반한다. 간략하게, 몇몇 CDR 부위 (예를 들어, 6 내지 7개 부위)가 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체가 필라멘트형 파지 입자로부터 각각의 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 디스플레이된다. 이어서, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 이의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 CDR 부위의 위치에 대해, 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발법을 수행하여 항원 결합에 현저하게 기여하는 CDR 잔기를 확인할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하는 것이 유리할 수 있다. 이같은 접촉 잔기와 이웃 잔기는 본원에서 상술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따른 치환에 대한 후보물이다. 일단 이같은 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에서 기술된 바와 같이 스크리닝하고, 한가지 이상의 관련 분석법에서 탁월한 성질이 있는 항체를 추가적인 개발용으로 선택할 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 천연-서열 Fc 영역을 갖는다. 그러나, 이의 Fc 영역 내로 하나 이상의 아미노산 변형을 도입함으로써, Fc 영역 변이체를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 항체는 이의 야생형 대응물과 비교하여 치료적 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특성을 유지할 것이다. 이같은 아미노산 치환은, 예를 들어, Fc 기능을 개선 또는 감소시킬 수 있거나, 또는 추가로 동일한 Fc 기능을 개선시키거나, 항원-결합 친화력을 증가시키거나, 안정성을 증가시키거나, 글리코실화를 변경시키거나, 동종이형 변이체를 포함할 수 있다. 항체는 하기로부터 선택된 성질들 중 하나 이상을 나타내는 항체를 초래하는 Fc 영역 내에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다: 야생형 Fc 영역이 있는 동일한 항체와 비교하여, 증가된 FcγR 결합, 증가된 ADCC, 증가된 CDC, 감소된 CDC, 증가된 ADCC 및 CDC 기능, 증가된 ADCC와 감소된 CDC 기능 (예를 들어, 주입 반응을 최소화시키기 위해), 증가된 FcRn 결합, 및 증가된 혈청 반감기. 이러한 활성은 본원에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, WO 1999/51642 참조. Fc 영역 변이체의 또다른 예에 관한 [Duncan and Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 1994/29351을 또한 참조.
Fc 기능을 개선시키는 추가적인 아미노산 변경에 대해, 예를 들어, US 6,737,056 참조. 임의의 본 발명의 항체는 CDC 활성을 감소시키는 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어, 적어도 치환 K322A을 포함한다. US 6,528,624 (Idusogie 등) 참조.
또다른 바람직한 실시양태에서, 268D, 또는 298A, 또는 326D, 또는 333A, 또는 334A, 또는 298A + 333A, 또는 298A + 334A, 또는 239D + 332E, 또는 239D + 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332A, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 330L 및 332E 및 272Y 및 254T 및 256E, 또는 250Q + 428L, 또는 265A, 또는 297A인 위치들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합에서의 아미노산 치환이 항체에 있고, 이때 265A는 297A의 부재 하에 치환되고, 297A는 265A의 부재 하에 치환된다. 각각의 이러한 명칭에서의 숫자 뒤의 문자는 이러한 위치에서의 변화된 아미노산을 나타낸다.
ADCC 및 CDC를 개선시키는 돌연변이는 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 번호매김)를 포함하는 Fc 영역의 1개 내지 3개의 위치에서의 치환을 포함하고, 특히 S298A + E333A 및 K334A (S298A/E333A/K334A, 또는 동의적으로 298A, 333A, 및 334A의 조합)을 포함하며, 이는 본원에서 삼중 Ala 돌연변이체로 또한 지칭된다. K334L은 CD16에의 결합을 증가시킨다. K322A로는 감소된 CDC 활성이 초래되고, K326A 또는 K326W는 CDC 활성을 강화시킨다. D265A로는 감소된 ADCC 활성이 초래된다.
안정성 변이체는, 예를 들어, 산화 및 탈아미드화와 관련하여 개선된 안정성을 나타내는 변이체이다.
항체의 아미노산 변이체의 추가적인 유형은 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 이같은 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티(moiety)를 결실시키는 것 및/또는 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 부가하는 것을 포함한다. ADCC 기능을 증가시키는 글리코실화 변이체가, 예를 들어, WO 2003/035835에 기술되어 있다. 또한 US 2006/0067930 참조.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (식중 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신 또한 사용될 수 있다.
항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 이루어진다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 또한 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 없는 성숙형 탄수화물 구조를 갖는 항체가 US 2003/0157108 A1 (Presta)에 기술되어 있다. US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 또한 참조. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물 내의 양분화(bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체가, 예를 들어, WO 2003/011878 (Jean-Mairet 등) 및 US 6,602,684 (Umana 등)에 언급되어 있다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당류 내의 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체가 WO 1997/30087 (Patel 등)에 보고되어 있다. 또한, 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물이 변경된 항체에 관한 WO 1998/58964 (Raju) 및 WO 1999/22764 (Raju) 참조. N-연결 올리고당류를 함유하는 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하여, 글리코실화가 변형된 항원-결합 분자에 대한 US 2005/0123546 (Umana 등), US 2004/0072290 (Umana 등), US 2003/0175884 (Umana 등), WO 2005/044859 (Umana 등) 및 US 2007/0111281 (Sondermann 등); 및 US 2007/0010009 (Kanda 등)을 또한 참조.
한 바람직한 본원에서의 글리코실화 항체 변이체는 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조에서 푸코스가 감소되었거나 없는 Fc 영역을 포함하고, 이는 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 구체적으로, 야생형 CHO 세포에서 생산된 동일한 항체 상의 푸코스의 양과 비교하여 푸코스가 감소된 항체가 본원에서 구현된다. 즉, 이는 천연 CHO 세포에 의해 생산되는 경우보다 푸코스의 양이 더 낮은 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 항체는 항체 상의 N-연결 글리칸의 약 10％ 미만이 푸코스를 포함하는 것이고, 더욱 바람직하게는 항체 상의 N-연결 글리칸의 약 5％ 미만이 푸코스를 포함하며, 가장 바람직하게는 항체 상의 N-연결 글리칸이 푸코스를 포함하지 않고, 즉 항체에 푸코스가 전혀 없다.
이같은 "푸코스제거(defucosylated)" 또는 "푸코스-결핍" 항체는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; US 2006/0063254; US 2006/0064781; US 2006/0078990; US 2006/0078991; [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 및 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]에 예를 들어 개시된 것들과 같은 세포주에서 항체를 배양함으로써 예를 들어 생산될 수 있다. 푸코스제거 항체를 생산하는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 ([Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108 A1 (Presta) 및 WO 2004/056312 A1 (Adams 등, 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8이 녹아웃된 CHO 세포 ([Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614 (2004)])가 포함된다. [Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 94: 680-8 (2006)]를 또한 참조. US 2007/0048300 (Biogen-IDEC)에는 원하는 이펙터 기능이 있는 비-글리코실화(aglycosylated) Fc-함유 폴리펩티드, 예컨대 항체를 생산하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법에 따라 생산된 비-글리코실화 항체 및 치료제로서 이같은 항체를 사용하는 방법이 개시되어 있고, 이들 모두는 본원에서 적용가능하다. 추가적으로, US 7,262,039는 알파-1,3-푸코실트랜스페라제 활성이 있는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이러한 폴리펩티드를 사용하여 푸코스-함유 당을 생산하는 방법을 포함한다.
본원에서 적용가능한 재조합 당단백질 및 글리코실화 변이체에 대해 US 2006/024304 (Gerngross 등); 미국 특허 번호 7,029,872 (Gerngross); US 2004/018590 (Gerngross 등); US 2006/034828 (Gerngross 등); US 2006/034830 (Gerngross 등); US 2006/029604 (Gerngross 등); WO 2006/014679 (Gerngross 등); WO 2006/014683 (Gerngross 등); WO 2006/014685 (Gerngross 등); WO 2006/014725 (Gerngross 등); 및 WO 2006/014726 (Gerngross 등)을 또한 참조한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 있는 본원에 기술된 항체를 포함하고, 이때 조성물 내의 항체의 약 20-100％가 푸코스가 없는 Fc 영역 내의 성숙형 코어 탄수화물 구조를 포함하는 항체 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 이같은 조성물은 238, 239, 246, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 314, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 434, 435, 437, 438, 및 439로 구성된 군으로부터 선택된 Fc 영역 상의 위치들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합에서 A, D, E, L, Q, T, 및 Y로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 치환함으로써 야생형 IgG Fc 서열과 비교하여 항체의 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존적 세포독성 (CDC), 또는 약동학 성질 중 하나 이상이 변화되도록 변경된 Fc 영역이 있는 항체를 포함한다.
더욱 바람직하게는, 조성물은 268D 또는 326D 또는 333A + 334A, 또는 298A + 333A, 또는 298A + 334A, 또는 239D + 332E, 또는 239D + 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332A, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 330L 및 332E인 Fc 치환을 항체가 추가로 포함하는 조성물이고, 이때 각각의 이러한 명칭에서의 숫자 뒤의 문자는 이러한 위치에서의 변화된 아미노산을 나타낸다.
추가적으로 바람직하게는, 조성물은 항체가 FcγRIII에 결합하는 조성물이다. 바람직하게는, 추가로 조성물은 인간 야생형 IgG1 Fc를 포함하는 동일한 항체와 비교하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체에 ADCC 활성이 있거나 또는 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체의 ADCC 활성이 증가되도록 한다.
또한 바람직하게는, 조성물은 항체가 당단백질의 Fc 영역에 부착된 푸코스를 포함하는 성숙형 코어 탄수화물 구조가 있는 당단백질보다 더 양호한 친화력으로 FcγRIII에 결합하거나, 또는 더 효과적으로 ADCC를 매개하는 조성물이다. 또한, 바람직하게는 조성물은 항체가 CHO 세포, 바람직하게는 Lec13 세포에 의해 생산된 조성물이다. 또한 바람직하게는, 조성물은 항체가 푸코실트랜스페라제 유전자, 더욱 바람직하게는 FUT8 유전자가 없는 포유류 세포에 의해 생산된 조성물이다.
한 양상에서, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 양분화 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 없는 조성물이다. 별법적으로, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 양분화 GlcNAc가 있도록 한다.
또다른 양상에서, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 갈락토스 잔기가 있는 조성물이다. 별법적으로, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 갈락토스 잔기가 없도록 한다.
추가적인 양상에서, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 시알산 잔기가 있는 조성물이다. 별법적으로, 조성물은 항체에 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 시알산 잔기가 없도록 한다.
이러한 조성물은 바람직하게는 약 2％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함한다. 더욱 바람직하게는 조성물은 약 4％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함한다. 더더욱 바람직하게는 조성물은 약 10％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함한다. 더욱 더 바람직하게는 조성물은 약 19％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함한다. 가장 바람직하게는 조성물은 약 100％의 비-푸코실화 항체를 포함한다.
면역접합체
본 발명은 세포독성제 예컨대 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 항체를 포함하는 면역접합체 또는 항체-약물 접합체 (ADC)에 또한 관련된다.
암의 치료에서 세포독성제 또는 세포증식억제제, 즉 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소적 전달을 위해 항체-약물 접합체를 사용하는 것 ([Syrigos and Epenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999)]; [Niculescu-Duvaz and Springer, Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172 (1997)]; 및 US 4,975,278)은 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화 전달 및 그곳에서의 세포내 축적을 허용하고, 반면에 접합되지 않은 이러한 약물 작용제의 전신 투여는 제거하려고 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다 ([Baldwin et al., Lancet, 603-05 (1986)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506 (1985)]). 이에 의해 최소 독성으로의 최대 효율이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 모두 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되었다 ([Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87 (1986)]). 이러한 방법에서 사용된 약물로는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신이 포함된다. 항체-독소 접합체에 사용된 독소로는 박테리아 독소 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소 예컨대 리신, 소형 분자 독소 예컨대 젤다나마이신 ([Mandler et al., J. Nat. Cancer Inst., 92(19):1573-1581 (2000)]; [Mandler et al., Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10:1025-1028 (2000)]; 및 [Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)]), 메이탄시노이드 (EP 1391213; 및 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]), 및 칼리키아마이신 ([Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998)]; 및 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336- 3342 (1993)])이 포함된다. 어떠한 한가지 이론에 제한되지 않으면서, 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제가 포함되는 메커니즘에 의해 이들의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 대형 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되었을 때 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.
이같은 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제가 상기에 기술되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편으로는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 다양한 방사성핵종이 방사성접합된(radioconjugated) 항체의 생산에 이용가능하다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re가 포함된다. 다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 대표적인 킬레이트화제이다. 예를 들어, WO 1994/11026 참조.
1가지 이상의 소형 분자 독소, 예컨대 칼리키아마이신, 메이탄시노이드, 트리코테센 및 CC1065 및 독소 활성이 있는 이러한 독소들의 유도체와 항체의 접합체 또한 본원에서 구현된다.
본 발명의 ADC에서, 항체 (Ab)는 항체 당 1개 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들어 약 1개 내지 약 20개의 약물 모이어티에 링커 (L)을 통해 접합된다. 화학식 I의 ADC는, (1) 항체의 친핵성(nucleophilic) 기와 2가 링커 시약이 반응하여 공유 결합을 통해 Ab-L이 형성된 후, 약물 모이어티 D와 반응하는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기가 2가 링커 시약과 반응하여 공유 결합을 통해 D-L이 형성된 후, 항체의 친핵성 기와 반응하는 것을 포함하여, 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하여, 여러가지 경로에 의해 제조될 수 있다.
Ab-(L-D)p
항체 상의 친핵성 기로는 (i) N-말단 아민 기, (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 라이신, (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 경우 당 히드록실 또는 아미노 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기가 포 함되는 링커 시약 및 링커 모이어티 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정 항체에는 환원성 사슬간 디술피드, 즉 시스테인 다리가 있다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제로의 처리에 의해 링커 시약과의 접합에 반응성이도록 될 수 있다. 따라서 각각의 시스테인 다리는, 이론적으로, 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 아민이 티올로 전환되는 것을 초래하는 라이신과 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)의 반응을 통해 추가적인 친핵성 기가 항체 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 항체-약물 접합체는 친전자성 모이어티를 도입하는 항체의 변형에 의해 또한 생산될 수 있고, 이 모이어티는 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있다. 글리코실화된 항체의 당이, 예를 들어 페리오데이트 산화 시약으로 산화되어, 링커 시약 또는 약물 모어어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프(Schiff) 염기 기는 안정적인 연결을 형성할 수 있거나, 또는, 예를 들어 보로히드리드 시약에 의해, 환원되어 안정적인 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토스 산화효소 또는 소듐 메타-페리오데이트의 반응으로 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 단백질 내의 카르보닐 기 (알데히드 및 케톤) 기가 산출될 수 있다 ([Domen et al., J. Chromatog., 510: 293-302 (1990)]). 또다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질은 소듐 메타-페리오데이트와 반응할 수 있어, 제1아미노산 대신 알데히드의 생산이 초래된다 ([Geoghegan and Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-146 (1992)] 및 US 5362852). 이같은 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 모이어티 상의 친핵성 기로는 (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할로겐화물; (ii) 알킬 및 벤질 할로겐화물 예컨대 할로아세트아미드; 및 (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기가 포함되는 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
별법적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을, 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해, 만들 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접한 또는 접합체의 원하는 성질을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리된 접합체의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후, 결합되지 않은 접합체는 혈액순환으로부터 소거제를 사용하여 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어 방사선뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여하는 종양 예비-표적화에서 사용하기 위해 항체가 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다.
임의로, 본원에서의 ADC는 가교-링커 시약, 예를 들어, 시판 (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A)로부터 시판)되는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)으로 제조된다. [2003-2004 Applications Handbook and Catalog, pp 467-498] 참조.
항체 유도체
본 발명의 항체는 당업계에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가적인 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적절한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제작에서의 장점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개를 초과하는 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에 치료법에서 사용될 것인지 여부 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
제약 제형
본 발명에 따라 사용되는 항체의 치료용 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본원에서의 추가적인 제형 및 전달 방법은 ENHANZE™ 약물 전달 기술 (Halozyme Inc.)을 포함하는, WO 2004/078140에 예를 들어 기술된 것을 수반한다. 이러한 기술은 재조합 인간 히알루로니다제 (rHuPH20)을 기초로 한다. rHuPH20은 피부와 같은 조직의 매트릭스 내의 공간을 일시적으로 소거시키는 FDA가 승인한 천연 발생 인간 효소의 재조합 형태이다. 즉, 이 효소는 신체 전반에 걸친 조직의 주요 성분인 공간-충전 "젤"-유사 물질 히알루론산 (HA)을 파괴하는 능력이 있다. 이러한 소거 활성은 rHuPH20이 피하 공간을 통한 치료용 분자의 진입을 강화시킴으로써 약물 전달을 개선하도록 할 것으로 예상된다. 따라서, 특정 주사용 약물과 조합되거나 공동-제형되는 경우, 이러한 기술은 피부 아래의 유동 채널을 일시적으로 개방함으로써 이러한 약물의 투과 및 분산을 용이하게 하는 "분자 머쉐티(machete)"로 작용할 수 있다. 200 나노미터 크기의 분자가 천공된 세포외 매트릭스를 자유롭게 통과할 수 있고, 매트릭스는 약 24시간 이내에 원래의 밀도로 회복되어, 약물 전달 플랫폼이 피부의 구조를 영구적으로 변경시키지 않는다.
따라서, 본 발명은 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP) (이러한 단백질은 중성 활성 가용성 히알루로니다제 폴리펩티드, 및 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 공유결합으로 부착된 하나 이상의 N-연결 당 모이어티를 포함함)을 직경이 약 500 나노미터 미만인 채널이 개방되도록 글리코사미노글리칸을 충분히 분해하는데 충분한 양으로 조직에 투여하는 단계, 및 항체를 분해된 글리코사미노글리칸을 포함하는 조직으로 투여하는 단계를 포함하는, 본원에서의 항체를 과량의 글리코사미노글리칸을 함유하는 조직으로 전달하는 방법을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 대상에게 sHASEGP 폴리펩티드를 항체의 직 경보다 작은 채널을 개방시키거나 형성하는데 충분한 양으로 투여하는 단계, 및 항체를 투여하는 단계를 포함함으로써 치료용 물질의 확산이 증가되는, 대상에게 투여된 본원에서의 항체의 확산을 증가시키는 방법을 포함한다. sHASEGP 및 항체는 별도로 또는 단일 제형으로 일제히, 그리고 연속적으로 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다.
대표적인 항-LTα 항체 제형이 WO 1998/56418에 기술되어 있고, 이는 최소 저장 기간이 2-8 ℃에서 2년인, 40 ㎎/㎖의 항-LTα 항체, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9％ 벤질 알콜, 0.02％ 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 액체 다중용량 제형을 포함한다. 또다른 흥미로운 항-LTα 제형은 9.0 ㎎/㎖ 염화나트륨, 7.35 ㎎/㎖ 시트르산나트륨 2수화물, 0.7 ㎎/㎖ POLYSORBATE 80™ 계면활성제, 및 주사용 멸균수 (pH 6.5) 내의 10 ㎎/㎖ 항체를 포함한다. 또다른 수성 제약 제형은 10-30 mM 아세트산나트륨 (약 4.8의 pH 내지 약 5.5의 pH, 바람직하게는 pH 5.5), 약 0.01-0.1％ v/v 양의 계면활성제로서의 POLYSORBATE™, 약 2-10％ w/v 양의 트레할로스, 및 방부제로서의 벤질 알콜을 포함한다 (US 6,171,586). 피하 투여를 위해 채택된 동결건조 제형이, 예를 들어, WO 1997/04801 및 US 6,267,958 (Andya 등)에 기술되어 있다. 이같은 동결건조 제형은 높은 단백질 농도로 적절한 희석제로 재구성될 수 있고, 재구성된 제형이 본원에서 치료될 포유동물에게 피하 투여될 수 있다.
항체의 동결 건조 형태 또한 구현된다. 예를 들어, US 2002/0136719 (Shenoy 등) 참조.
본원에서의 제형은 치료될 특정 적응증에 필요하다면 1가지를 초과하는 활성 화합물 (상기 언급된 바와 같은 제2 의약), 바람직하게는 서로에게 역효과를 일으키지 않는 보완적인 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 길항제, 인테그린 길항제, 또는 면역억제제 (예를 들어 T 세포 상에 작용하는 것, 예컨대 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예를 들어, LFA-1에 결합하는 것)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이같은 제2 의약의 유형 및 유효량은, 예를 들어, 제형 내에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 장애 또는 치료 유형, 대상의 임상 파라미터, 및 상기 논의된 기타 인자들에 따라 좌우된다. 일반적으로 이들은 본원에서 기술된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99 ％로 사용된다. 바람직한 이같은 의약은 상기 언급되어 있다.
활성 성분은 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 포획될 수 있다. 이같은 기술은, 예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로젤 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (US 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용될 제형은 반드시 무균성이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
용도
본 발명의 항체는, 예를 들어, 시험관내, 생체외 및 생체내 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내, 생체외 및/또는 생체내에서 특이적 LTα 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하는 길항제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 적어도 일부는 다른 종으로부터의 항원 활성을 중화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 항원을 함유하는 세포 배양물에서, 인간 대상에서, 또는 본 발명의 항체가 교차-반응하는 항원이 있는 기타 포유류 대상 (예를 들어 침팬지, 비비, 명주원숭이, 사이노몰거스, 붉은털원숭이, 돼지 또는 마우스)에서, 특정 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항원 활성이 억제되도록 항체를 항원과 접촉시킴으로써 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 대상에서의 항원 활성이 억제되도록 본 발명의 항체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 항원 활성이 해로운 장애를 앓고 있는 대상에서 항원을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 인간 단백질 분자이고, 대상은 인간 대상이다. 별법적으로, 대상은 본 발명의 항체가 결합하는 항원을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한 추가적으로, 대상은 (예를 들어 항원의 투여에 의해 또는 항원 트랜스진(transgene)의 발현에 의해) 항원이 도입된 포유동물일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료 목적을 위해 인간 대상에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서, 면역글로불린이 교차-반응하는 항원을 발현하는 비-인간 포유동물 (예를 들어 영장류, 돼지 또는 마우스)에 투여될 수 있다. 동물 모델과 관련하여, 이같은 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료 효능을 평가하는데 (예를 들어 투여량 및 투여의 경시적 과정을 테스트하는데) 유용할 수 있다. 본 발명의 항체는 본원에서 정의된 바와 같은 자가면역 질환, 장애 또는 용태의 치료, 억제, 진행 지연, 재발 방지/지연, 경감, 또는 예방에 사용될 수 있다.
한 양상에서, 본 발명의 차단 항체는 리간드 항원에 특이적이고, 리간드 항원을 수반하는 리간드-수용체 상호작용을 차단하거나 방해하여 항원 활성을 억제함으로써, 상응하는 신호 경로 및 기타 분자성 또는 세포성 이벤트를 억제한다. 본 발명은 리간드 결합을 반드시 방지하지는 않지만 수용체 활성화를 방해함으로써, 정상적으로는 리간드 결합에 의해 개시될 모든 응답을 억제하는 수용체-특이적 항체를 또한 특징으로 한다. 또한 본 발명은 바람직하게는 또는 배타적으로 리간드-수용체 복합체에 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 특정 항원 수용체 의 작동제로서 또한 작용함으로써, 리간드-매개 수용체 활성화의 모든 또는 부분적인 활성을 상승, 증강 또는 활성화시킬 수 있다.
항체는 네이키드 항체일 수 있거나, 또는 별법적으로 또다른 분자, 예컨대 세포독성제와 접합된다. 바람직하게는, 항체는 정맥내 또는 피하 투여되고, 가장 바람직하게는 피하 투여된다.
한 실시양태에서, 대상은 장애를 치료하기 위한 약물(들), 예컨대 면역억제제(들)로 이전에 치료된 적이 없고, 특정 실시양태에서, TNF 길항제로 이전에 치료된 적이 없다. 별법적인 실시양태에서, 대상은 TNF 길항제가 포함되는 장애를 치료하기 위한 약물(들)로 이전에 치료된 적이 있다.
추가적인 양상에서, 환자는 장애가 재발된 환자이다. 별법적인 실시양태에서, 환자는 장애가 재발되지 않은 환자이다.
또다른 양상에서, 본원에서의 항체는 장애를 치료하기 위해 대상에게 투여되는 유일한 의약이다. 별법적인 양상에서, 본원에서의 항체는 장애를 치료하기 위해 사용된 의약들 중 하나이다.
추가적인 양상에서, 대상에게 자가면역 장애로서 RA만 있다. 별법적으로, 대상에게 자가면역 장애로서 MS만 있다. 또한 별법적으로, 대상에게 자가면역 장애로서 루푸스, 또는 ANCA-관련 혈관염, 또는 쇼그렌 증후군만이 있다. 모든 경우에서, 자가면역 장애는 상기 정의되어 있다.
추가적인 실시양태에서, 대상에서 하나 이상의 사이토카인, 항-핵 항체 (ANA), 항-류머티즘 인자 (RF) 항체, 크레아티닌, 혈액 요소 질소, 항-내피 항체, 항-중성구 세포질 항체 (ANCA), 침윤성 CD20 세포, 항-이중 가닥 DNA (dsDNA) 항체, 항-Sm 항체, 항-핵 리보핵산단백질 항체, 항-인지질 항체, 항-리보솜 P 항체, 항-Ro/SS-A 항체, 항-Ro 항체, 항-La 항체, 쇼그렌-관련 항원 A 또는 B (SS-A 또는 SS-B)에 대해 지시된 항체, 동원체 단백질 B (CENP B) 또는 동원체 단백질 C (CENP C)에 대해 지시된 항체, ICA69에 대한 자가항체, 항-스미스 항원 (Sm) 항체, 항-핵 리보핵산단백질 항체, 항-리보솜 P 항체, 중성구의 핵 또는 핵주위 구역을 염색하는 자가항체 (pANCA), 항-사카로마이세스 세레비지아에 항체, GM1 갱글리오사이드 또는 GQ1b 갱글리오사이드에 대한 교차-반응성 항체, 항-아세틸콜린 수용체 (AchR), 항-AchR 서브타입, 또는 항-근육 특이적 티로신 키나제 (MuSK) 항체, 혈청 항-내피 세포 항체, IgG 또는 항-데스모글레인 (Dsg) 항체, 항-동원체, 항-토포이소머라제-1 (Scl-70), 항-RNA 폴리머라제 또는 항-U3-리보핵산단백질 (U3-RNP) 항체, 항-사구체 기저막 (GBM) 항체, 항-사구체 기저막 (GBM) 항체, 항-미토콘드리아 (AMA) 또는 항-미토콘드리아 M2 항체, 항-갑상선 페록시다제 (TPO), 항-갑상선글로불린 (TG) 또는 항-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 항체, 항-핵산 (AN), 항-액틴 (AA) 또는 항-평활근 항원 (ASM) 항체, IgA 항-근섬유막, IgA 항-조직 트랜스글루타미나제, IgA 항-글리아딘 또는 IgG 항-글리아딘 항체, 항-CYP21A2, 항-CYP11A1 또는 항-CYP17 항체, 항-리보핵산단백질 (RNP), 또는 근육염-특이적 항체, 항-말이집 관련 당단백질 (MAG) 항체, 항-C형 간염 바이러스 (HCV) 항체, 항-GM1 갱글리오사이드, 항-술페이트-3-글리쿠로닐 파라글로보사이드 (SGPG), 또는 IgM 항-당접합체 항체, IgM 항-갱글리오사이드 항체, 항-갑상선 페록시다제 (TPO), 항-갑상선글 로불린 (TG) 또는 항-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 항체, 항-말이집 염기성 단백질 또는 항-말이집 희소돌기아교세포 당단백질 항체, IgG의 Fc 부분에 대해 지시된 IgM 류머티즘 인자 항체, 항-인자 VIII 항체, 또는 이의 조합물의 수준이 비정상적이다.
자가면역 장애 (자가면역-관련 질환 포함) 치료의 효능 또는 성공을 평가하기 위한 파라미터들은 특유 질환 분야의 의사에게 공지되어 있을 것이다. 일반적으로, 해당 분야의 의사는 특정 질환의 징후 및 증상에서의 감소를 기대할 것이다. 하기는 예시적인 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 RA를 치료하는데 유용하다. RA는 다수의 관절의 염증, 연골 손실, 및 골 침식을 특징으로 하고, 이는 관절 파괴 및 궁극적으로 감소된 관절 기능에 이른다. 추가적으로, RA는 전신성 질환이기 때문에, 폐, 눈 및 골수와 같은 다른 조직에서의 효과가 있을 수 있다.
대상이 본원에서의 바람직한 적응증인 RA에 걸린 경우, 바람직하게는 본원에서의 항체가 대상에서의 주요 임상 응답을 유도한다.
본원에서의 항체는 항체는 초기 RA에 걸린 환자 (즉, 메토트렉세이트 (MTX) 경험이 없음)에서 제1선 치료법으로서 또는 예를 들어 MTX 또는 시클로포스파미드와 조합되어 사용될 수 있다. 별법적으로, 항체는, 예를 들어 MTX와 조합되어, DMARD 및/또는 TNF 억제제, 및/또는 MTX에 대해 예를 들어 불응성인 환자에 대해 제2선 치료법으로 치료에서 사용될 수 있다. 또한 LTα-결합 항체는 더욱 효과적인 사멸을 위해 B 세포를 혈류 내로 동원시키는 인테그린 항체와 같은 B-세포 동원 제와 조합되어 투여될 수 있다. LTα-결합 항체는 관절 손상의 예방 및 제어, 구조적 손상의 지연, RA의 염증과 관련된 통증의 감소, 그리고 일반적으로 중간 내지 중증 RA의 징후 및 증상 감소에 유용하다. RA 환자는 RA를 치료하는데 사용되는 다른 약물 전에, 후에, 또는 이와 함께 LTα 항체로 치료될 수 있다 (하기에 기술된 조합 요법 참조). 한 실시양태에서, DMARD가 실패하였고/하였거나 MTX 단독에 대한 응답이 부적절하였던 환자가 LTα-결합 항체로 치료된다. 또다른 실시양태에서, 이같은 환자에게 인간화 LTα-결합 항체 + 시클로포스파미드 또는 LTα-결합 항체 + MTX가 투여된다. 가장 바람직하게는, 본원에서의 항체는 RA의 치료를 위해 MTX와 함께 투여되고, 고-용량 스테로이드와 함께 투여되지 않는다.
RA에서의 치료 효능을 평가하는 한가지 방법은 미국 류머티즘 협회 (ACR) 기준을 기초로 하고, 이는 특히 압통 및 부종 관절에서의 개선의 백분율을 측정하는데 사용된다. RA 환자는, 예를 들어, 항체 치료 없음 (예를 들어, 치료 전의 기준선) 또는 위약으로의 치료와 비교하여 ACR 20 (20％ 개선)으로 채점될 수 있다. 항체 치료의 효능을 평가하는 또다른 방식은 골 침식 및 관절 공간 협소화와 같은 구조적 손상을 채점하는데 사용되는 샤프(Sharp) X-선 점수와 같은 X-선 채점을 포함한다. 환자는 건강 평가 앙케이트 (HAQ) 점수, AIMS 점수, 치료 동안 또는 치료 후의 시점에서의 SF-36을 기초로 하는 불구의 예방 또는 개선에 대해 또한 평가될 수 있다. ACR 20 기준은 압통 (통증이 있는) 관절수 및 종창 관절수 양쪽 모두에서의 20％ 개선 + 하기의 5가지의 추가적인 측정값 중 3가지 이상에서의 20％ 개선을 포함할 수 있다:
1. 시각 상사 척도 (VAS)에 의한 환자의 통증 평가,
2. 환자의 포괄적인 질환 활성 평가 (VAS),
3. 의사의 포괄적인 질환 활성 평가 (VAS),
4. 건강 평가 앙케이트에 의해 측정된 환자의 자가-평가 불구, 및
5. 급성기 반응물, CRP 또는 ESR.
ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는, ACR 20 이상, 바람직하게는 ACR 30 이상, 더욱 바람직하게는 ACR 50 이상, 더욱 더 바람직하게는 ACR 70 이상, 가장 바람직하게는 ACR 75 이상의 점수를 달성하는데 효과적인 양의 본 발명의 LTα-결합 항체가 환자에게 투여된다.
건선성 관절염에는 독특하고 명료한 방사선사진 양상이 있다. 건선성 관절염에 대해, 관절 침식 및 관절 공간 협소화가 샤프 점수에 의해 또한 평가될 수 있다. 본원에 개시된 항체가 관절 손상을 방지하는데, 뿐만 아니라 장애의 질환 질후 및 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 루푸스 (전신 홍반 루푸스 (SLE) 및 루푸스 신염 포함)에 걸린 대상에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여함으로써 이같은 질환을 치료하는 방법이다. 예를 들어, SLEDAI 점수는 질환 활성의 수치적 정량화를 제공한다. SLEDAI는 질환 활성과 상호관련되는 것으로 공지된 24개의 임상 및 실험 파라미터들의 가중 지수이며, 수치 범위는 0-103이다. [Gescuk and Davis, Current Opinion in Rheumatology, 14: 515-521 (2002)] 참조. 이중-가닥 DNA에 대한 항체는 신장 플레어(flare) 및 루푸스의 기타 소견을 야기하는 것으로 여겨진다. 항체 치료가 진행되고 있는 환자를 신장 플레어까지의 시간에 대해 모니터링할 수 있고, 이는 혈청 크레아티닌, 소변 단백질 또는 소변 내의 혈액의 유의한, 재현가능한 증가로서 정의된다. 별법적으로 또는 부가적으로, 환자를 항-핵 항체 및 이중-가닥 DNA에 대한 항체의 수준에 대해 모니터링할 수 있다. SLE에 대한 치료는 고-용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.
척추관절병증은 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 크론 질환을 포함하는 관절 질환 군이다. 치료 성공은 인가된 환자 및 의사의 포괄적 평가 측정 도구에 의해 결정될 수 있다.
다양한 약제가 건선을 치료하는데 사용되고, 치료는 질환 중증도와 직접적으로 관련되어 상이하다. 더 순한 형태의 건선이 있는 환자는 전형적으로 국소적인 치료, 예컨대 국소용 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐을 이용하여 질환을 관리하는 반면, 중간정도 및 중증 건선이 있는 환자는 전신성 (메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB) 요법을 이용할 것이다. 타르가 또한 사용된다. 이러한 요법들은 안전성 우려, 시간 소비적 처방계획 및/또는 불편한 치료 프로세스로 인해 불리하다. 또한, 일부는 오피스 환경에서 고가의 설비 및 전용 공간을 필요로 한다. 이같은 전신 약제는 고혈압, 고지혈증, 골수 억제, 간 질환, 신장 질환 및 급성 위장관 이상항진이 포함되는 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 또한, 광선요법의 사용은 피부 암의 발생을 증가시킬 수 있다. 국소 요법의 사용과 관련된 불편함 및 불쾌함에 더하여, 광선요법 및 이같은 전신 치료는 환자를 단속적(on and off) 요법으로 순환시키는 것 및 부작용으로 인 해 일생 동안의 노출을 모니터링하는 것을 필요로 한다.
건선에 대한 치료 효능은 기준선 용태과 비교하여 의사의 포괄적인 평가 (PGA) 변화 및 건선 면적 및 중증도 지수 (PASI) 점수, 및 건선 증상 평가 (PSA)가 포함되는 질환의 임상 징후 및 증상에서의 변화를 모니터링함으로써 평가된다. 특정 시점에서 겪는 가려움의 정도를 가리키는데 사용되는 시각 상사 척도 상에서 치료 전반에 걸쳐 주기적으로 환자를 측정할 수 있다.
분석법
리간드/수용체 결합 연구를 임의의 공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법, 및 면역침전 분석법으로 수행할 수 있다. 세포-기반 분석법 및 동물 모델을 본원에서 확인된 수용체와 리간드 간의 상호작용 및 본원에서 언급된 용태 및 질환의 발달 및 발병기전을 이해하는데 사용할 수 있다.
한 접근법에서, 포유류 세포가 본원에 기술된 리간드 또는 수용체로 형질감염될 수 있고, 결합 또는 활성을 억제하는 본원에서의 항체의 능력이 분석된다. 적절한 세포를 원하는 유전자로 형질감염시켜 활성에 대해 모니터링할 수 있다. 그후, 이같은 형질감염된 세포주를 항체의 능력, 예를 들어, 세포의 LTαβ 복합체 발현을 조정하는 능력을 테스트하는데 사용할 수 있다.
또한, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 1차 배양물이 세포-기반 분석법에서 사용될 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, [Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)] 참조.
한 적절한 세포-기반 분석법은 에피토프 태그가 부착된 리간드 (예를 들어, LTα)를 각각의 수용체가 있거나 이를 발현하는 세포에 첨가하고, 항-태그 항체로의 FACS 염색에 의해 결합 (예상 항체의 존재 또는 부재 하의 결합)을 분석하는 것이다. 또다른 분석법에서, LTαβ 복합체를 발현하는 세포 상에서 이같은 복합체의 발현을 억제하는 본원에서의 항체의 능력이 분석된다. 예를 들어, 적절한 발현 세포주를 예상 항체의 존재 또는 부재 하에 배양하고, LTαβ 복합체 발현의 조정을 3H-티미딘 혼입 또는 세포수에 의해 측정할 수 있다.
세포-기반 시험관내 분석법의 결과를 생체내 동물 모델을 사용하여 추가로 입증할 수 있다. 다수의 동물 모델이 본원에서 확인된 항체의 면역-관련 질환에 예를 들어 관련된 효능을 테스트하는데 사용될 수 있다. 이같은 모델의 생체내 성질은 특히 인간 환자에서의 응답을 예보하도록 한다. 면역-관련 질환의 동물 모델에는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 양쪽 모두가 포함된다. 비-재조합 동물 모델에는, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 뮤린 모델이 포함된다. 이같은 모델은 표준 기술, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 지라 이식, 복강내 이식, 및 신장피막하 이식을 사용하여 세포를 동계 마우스 내로 도입함으로써 생성될 수 있다.
이식편-대-숙주 질환은 동물 모델이 이를 위해 디자인된 질환의 한 예이다. 이식편-대-숙주 질환은 면역적격 세포가 면역억제 또는 내성 환자 내로 이식되는 경우에 발생한다. 도너 세포가 숙주 항원을 인식하여 이에 응답한다. 응답은 생명을 위협하는 심각한 염증에서 설사 및 체중 감소의 가벼운 사례까지 다양할 수 있다. 이식편-대-숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 미량의 이식 항원에 대한 T-세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적절한 절차는 [Current Protocols in Immunology, Eds. Cologan et al., (John Wiley & Sons, Inc., 1994), unit 4.3]에 상세하게 기술되어 있다.
피부 동종이식편 거부에 대한 동물 모델은 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 테스트하여, 항-바이러스 면역에서의 이의 역할을 측정하고, 예를 들어, [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.4]에 기술되어 있다. 본원에서의 항체를 테스트하는데 유용한 기타 이식 거부 모델에는 [Tanabe et al., Transplantation, 58:23 (1994)] 및 [Tinubu et al., J. Immunol., 4330-4338 (1994)]에 기술된 동종이형 심장 이식 모델이 포함된다.
지연형 과민성에 대한 동물 모델은 세포-매개 면역 기능의 분석법을 제공한다. 지연형 과민성 반응은 항원을 챌린지하고 나서 일정 시간이 경과된 후까지 최고점에 도달하지 않는 염증을 특징으로 하는 T 세포-매개 생체내 면역 응답이다. 이러한 반응은 MS 및 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE, MS용 모델)과 같은 조직-특이적 자가면역 질환에서 또한 발생한다. [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.5]에 적절한 대표적인 모델이 상세하게 기술되어 있다.
콜라겐-유도 관절염 (CIA) 모델은 인간 RA와의 많은 면역학적 및 병리학적 유사성, 국소화된 주요 조직적합성의 병발, 완전한 클래스-II-제한 T 헬퍼 림프구 활성화 및 조직학적 병변의 유사성으로 인해 인간 관절염에서 활성인 잠재적인 약물 또는 생물제제를 연구하기 위한 적절한 모델로 간주된다. RA 환자에서 발견되는 것과 유사한 이러한 CIA 모델의 양상에는 관절 가장자리에서의 연골 및 뼈의 침식 (방사선사진에서 볼 수 있음), 증식성 윤활막염, 및 팔다리 골격 (몸통 골격은 아님)에서의 소형 및 중간 크기의 말초 관절의 대칭적인 병발이 포함된다. [Jamieson et al., Invest. Radiol. 20: 324-9 (1985)]. 더욱이, IL-1 및 TNF-α가 CIA뿐만 아니라 RA에서 수반되는 것으로 보인다. [Joosten et al., J. Immunol. 163: 5049-5055, (1999)]. TNF-중화 항체 및 별개로 TNFR.Fc는 이러한 모델에서 RA의 증상을 감소시켰다 ([Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9784-9788 (1992)]; [Wooley et al., J. Immunol., 151: 6602-6607 (1993)])
RA에 대한 이러한 모델에서, 제II형 콜라겐이 소의 관절 연골로부터 정제되어 ([Miller, Biochemistry 11:4903 (1972)]), 마우스를 면역화시키는 데 사용된다 ([Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2762 (1994)]). 관절염의 증상에는 사지의 홍반 및/또는 종창, 뿐만 아니라, 연골 및 뼈에서의 침식 또는 결함 (조직학에 의해 결정됨)이 포함된다. 이러한 널리 사용되는 모델은, 예를 들어, [Holmdahl et al., APMIS, 97:575 (1989)], [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, units 15.5], 및 [Issekutz et al., Immunology, 88:569 (1996)]에 또한 기술되어 있다.
난 알부민으로 동물을 민감화시키고, 에어로졸에 의해 전달되는 동일 단백질 을 동물에게 챌린지함으로써 항원-유도 기도 반응항진, 폐 호산구증가증 및 염증이 유도된 천식 모델이 기술되었다. 설치류 및 비-인간 영장류 모델과 같은 동물 모델은 에어로졸 항원으로의 챌린지 시 인간에서의 아토피성 천식과 유사한 증상을 나타낸다. 천식을 치료하는 것에서의 적절성에 대해 본원에서의 항체를 테스트하기 위한 적절한 절차에는 [Wolyniec et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18:777 (1998)]에 기술된 것이 포함된다.
추가적으로, 본원에서의 항체가 면역 장애에 대해 SCID/SCID 마우스 모델에서 테스트될 수 있다. 예를 들어, [Schon et al., Nat. Med., 3:183 (1997)]에 기술된 바와 같이, 상기 마우스는 건선과 유사한 조직병리학적 피부 병변을 나타낸다. 또다른 적절한 모델은 [Nickoloff et al., Am. J. Path., 146:580 (1995)]에 기술된 바와 같이 제조된 인간 피부/SCID 마우스 키메라이다.
투여량
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적합한 투여량 (단독으로 또는 하기 언급되는 바와 같은 제2 의약과 조합되어 사용될 경우)은 치료될 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 응답, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 바람직하게는, 투여량은 독성 및 부작용을 최소화하면서 이러한 적응증의 치료에 대해 효능이 있다.
항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 별도의 투여에 의한 것이든 또 는 연속 주입에 의한 것이든, 약 1 ㎍/㎏ 내지 500 ㎎/㎏ (바람직하게는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 400 ㎎/㎏)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 500 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 용태에 따라, 치료는 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 일반적으로 지속될 것이다. 한 대표적인 항체 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 400 ㎎/㎏ 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ 또는 50 ㎎/㎏ 또는 100 ㎎/㎏ 또는 300 ㎎/㎏ 또는 400 ㎎/㎏ (또는 이의 임의의 조합) 중 1가지 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2 내지 20회, 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 초기의 높은 로딩 용량에 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 대표적인 용량 처방계획은 약 4 내지 500 ㎎/㎏의 초기 로딩 용량에 이어서 약 2 내지 400 ㎎/㎏의 항체를 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 투여량 처방계획이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법에 의해 쉽게 모니터링된다.
자가면역 장애의 치료를 위해, 치료적 유효 투여량은 전형적으로 약 50 ㎎/㎡ 내지 약 3000 ㎎/㎡, 바람직하게는 약 50 내지 1500 ㎎/㎡, 더욱 바람직하게는 약 50-1000 ㎎/㎡의 범위일 것이다. 한 실시양태에서, 투여량 범위는 약 125-700 ㎎/㎡이다. RA를 치료하기 위해, 한 실시양태에서, 인간화 항체에 대한 투여량 범위는 2회의 용량으로 제공되는 약 50 ㎎/㎡ 또는 125 ㎎/㎡ (약 200 mg/용량과 등 가) 내지 약 1000 ㎎/㎡이고, 예를 들어, 약 200 mg의 제1 용량이 제1일에 투여된 후 약 200 mg의 제2 용량이 제15일에 투여된다. 또다른 실시양태에서, 투여량은 대략 50 ㎎/용량, 80 ㎎/용량, 100 ㎎/용량, 125 ㎎/용량, 150 ㎎/용량, 200 ㎎/용량, 250 ㎎/용량, 275 ㎎/용량, 300 ㎎/용량, 325 ㎎/용량, 350 ㎎/용량, 375 ㎎/용량, 400 ㎎/용량, 425 ㎎/용량, 450 ㎎/용량, 475 ㎎/용량, 500 ㎎/용량, 525 ㎎/용량, 550 ㎎/용량, 575 ㎎/용량, 또는 600 ㎎/용량, 또는 700 ㎎/용량, 또는 800 ㎎/용량, 또는 900 ㎎/용량, 또는 1000 ㎎/용량, 또는 1500 ㎎/용량 중 임의의 하나이다.
질환을 치료하는데 있어서, 이러한 질환의 숙련된 의사가 결정하는 바에 따라 본 발명의 LTα-결합 항체는 장기적으로 또는 간헐적으로 환자에게 투여될 수 있다.
약물이 정맥내 주입에 의해 투여되거나 피하 투여되는 환자는 발열, 오한, 작열감, 무력증 및 두통과 같은 유해 사례를 겪을 수 있다. 이같은 유해 사례를 경감시키거나 최소화하기 위해, 환자에게 최소 컨디셔닝 용량(들)의 항체를 제공한 후 치료 용량을 제공할 수 있다. 컨디셔닝 용량(들)은 치료 용량보다 낮아서, 더 높은 투여량을 허용하도록 환자를 컨디셔닝할 것이다.
본원에서의 항체는 상기 언급된 다양한 인자들, 예를 들어, 투약량에 따라, 실행 의사의 기술 및 판단 내에 속하는 빈도로 투여될 수 있다. 이러한 빈도에는 1주일에 2번, 1주일에 3번, 1주일에 1번, 2주일에 1번, 또는 1달에 1번이 포함된다. 이러한 방법의 바람직한 양상에서, 항체는 격주로 약 1번 이하로, 더욱 바람 직하게는 1달에 약 1번 투여된다.
투여 경로
본 발명의 방법에서 사용된 항체 (뿐만 아니라 임의의 제2 의약)는 투약이 단기 또는 장기인지 여부가 포함되는 다수의 인자에 따라 적절한 방법, 예컨대 개업의에게 공지된 방법에 따라 대상 또는 환자 (인간 환자 포함)에게 투여된다. 이러한 경로에는, 예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 폐내, 뇌척수내, 관절내, 윤활공간내, 수막강내, 병변내, 또는 흡입 경로 (예를 들어, 비강내)에 의한 비경구, 정맥내 투여, 예를 들어, 볼루스 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입이 포함된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항체는 펄스 주입, 특히 항체의 용량이 감쇠되는 펄스 주입으로 적절하게 투여된다. 본원에서의 바람직한 경로는 정맥내 또는 피하 투여이고, 가장 바람직하게는 피하 투여이다.
한 실시양태에서, 본원에서의 항체는 정맥내 주입에 의해 투여되고, 더욱 바람직하게는 주입 비히클로서의 약 0.9 내지 20％ 염화나트륨과 함께 투여된다.
조합 요법
임의의 본원에서의 방법에서, 대상 또는 환자에게 본원에서의 항체와 함께 유효량의 제2 의약 (이때, 본원에서의 항체가 제1 의약임)을 투여할 수 있고, 상기 제2 의약은 치료를 필요로 하는 대상에서 용태를 치료할 수 있는 또다른 활성 작용제이다; 예를 들어, 용태가 자가면역 장애인 경우, 제2 의약은 단독으로 또는 또다른 활성 작용제와 함께 자가면역 장애를 치료할 수 있는 약물이다. 자가면역 장애 의 치료를 위해, 제2 의약은, 예를 들어, 화학요법제, 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제 (예컨대 항체) 예컨대 리툭시맵 또는 인간화 2H7, BAFF 길항제, DMARD, 세포독성제, 인테그린 길항제 예컨대 CD11 또는 CD18 길항제 (CD11a 또는 CD18 항체 포함), 예를 들어, 에팔리주맵 (RAPTIVA®), NSAID, 사이토카인 길항제, 예컨대 TNF 길항제, 항-류머티즘제, 근육 이완제, 마약, 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항균제, 건선치료제, 코르티코스테로이드, 동화성 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 방사성의약, 항우울제, 항정신병약, 자극제, 천식 의약, 베타 작동제, 흡입형 스테로이드, 에피네프린, 사이토카인, WO 2005/027841에 기재된 바와 같은 B-세포 자가항체 분비를 억제하기 위한 세포, WO 2004/078140에 예를 들어 기재된 바와 같은 활성 전달 비히클로서의 히알루로니다제 당단백질, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
증식성 질환 예컨대 암의 치료를 위해, 제2 의약은, 예를 들어, 화학요법제, 호르몬, 세포독성제, 및 기타 생물제제 예컨대 HER-2, VEGF, B-세포 표면 항원 예컨대 TAHO 항원 (예를 들어, US 2006/0251662), CD20, 및 CD22, 및 EGF/EGF-R에 대한 항체를 포함할 것이다.
바람직하게는, 자가면역 질환에 대한 이같은 제2 의약은 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제 (예컨대 항체, 예를 들어, CD20 항체 또는 CD22 항체), BAFF 길항제, DMARD, 인테그린 길항제, 히알루로니다제 당단백질 (활성 전달 비히클), NSAID, 사이토카인 길항제이고, 더욱 바람직하게는 TNF (예를 들어, TNF-알파), CD11, 또는 CD18 길항제, 또는 이의 조합물이다. 더욱 바람직하게는, 이는 메토트렉세이트, TNF 길항제, B-세포 표면 마커에 대한 길항제, 또는 DMARD이다.
이같은 제2 의약의 유형은 자가면역 장애의 유형, 질환의 중증도, 환자의 용태 및 연령, 사용된 제1 의약의 유형 및 용량 등이 포함되는 다양한 인자에 좌우된다.
본원에서의 항체는 제2 의약과 동시에, 순차적으로 또는 교대로, 또는 다른 치료법과 비-반응성일 때 투여될 수 있다. 따라서, 제2 의약의 조합 투여는 별도의 제형들 또는 단일 제약 제형을 사용하는 공동 투여 (동시 투여), 및 임의 순서의 연속 투여 (바람직하게는, 양쪽 (또는 모든) 의약들이 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있음)를 포함한다. 모든 이러한 제2 의약들이 서로 조합되어 또는 단독적으로 제1 의약과 함께 사용될 수 있어서, 본원에서 사용된 "제2 의약"이라는 표현은 이것이 각각 제1 의약 이외의 유일한 의약이라는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 제2 의약은 단일 의약일 필요가 없고, 1가지를 초과하는 이같은 약물로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 이러한 제2 의약은 제1 의약과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 제1 의약의 투여량의 약 1 내지 99％로 일반적으로 사용된다. 이같은 제2 의약이 조금이라도 사용되는 경우, 바람직하게는, 제2 의약은, 특히 제1 의약의 초기 투약 이후의 후속 투약에서, 제1 의약이 존재하지 않는 경우보다 낮은 양으로 사용되어, 이에 의해 야기되는 부작용을 제거하거나 감소시킨다.
RA의 치료를 위해, 예를 들어, 환자를 하기의 약물들 중 임의의 하나 이상과 함께 본 발명의 항체로 치료할 수 있다: 인테그린 길항제, DMARD (예를 들어, MTX), NSAID, 사이토카인 억제제 예컨대 HUMIRA™ (아달리무맵; Abbott Laboratories), ARAVA® (레플루노미드), REMICADE® (인플릭시맵; Centocor Inc. (Malvern, Pa)), ENBREL® (이태너셉트; Immunex, WA), 코르티코스테로이드, 또는 COX-2 억제제. RA에서 통상적으로 사용되는 DMARD에는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 이태너셉트, 인플릭시맵, 아자티오프린, D-페니실라민, 금 (경구), 금 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 포도알균 단백질 A 면역흡착이 포함된다. 아달리무맵은 TNFα에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다. 인플릭시맵은 TNFα에 결합하는 키메라 모노클로날 항체이다. 이태너셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 구성된 "면역부착소" 융합 단백질이다. RA의 통상적인 치료에 대해, 예를 들어, [American College of Rheumatology Subcommittee on Rheumatoid Arthritis Guidelines, Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (2002)] 참조. 특정 실시양태에서, RA 환자가 MTX와 함께 본 발명의 LTα 항체로 치료된다. MTX의 대표적인 투여량은 약 7.5-25 mg/kg/주이다. MTX는 경구 또는 피하 투여될 수 있다.
강직성 척추염, 건선성 관절염, 및 크론 질환의 치료를 위해, 예를 들어, REMICADE® (인플릭시맵; Centocor Inc. (Malvern, PA)) 또는 ENBREL® (이태너셉트; Amgen (CA))와 함께 본 발명의 항체로 환자를 치료할 수 있다.
SLE의 치료는 본원에서의 항체와 조합된 고-용량 코르티코스테로이드 및/또는 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.
건선의 치료를 위해, 환자에게 LTα-결합 항체를 국소 치료제, 예컨대 국소용 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타솔 및 타자로텐과 함께, 또는 MTX, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB 치료법, 및 인테그린 길항제 예컨대 항-CD11a 또는 항-CD18 항체 (예를 들어, 에팔리주맵 (RAPTIVA®) 포함)과 함께 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 건선 환자를 시클로스포린 또는 에팔리주맵과 순차적으로 또는 이와 동시에 LTα-결합 항체로 치료한다.
특정 실시양태에서, 세포독성제와 접합된 본원에서의 항체를 포함하는 면역접합체가 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 면역접합체 및/또는 면역접합체가 결합되는 항원이 세포에 의해 내재화되어, 면역접합체가 결합하는 표적 세포를 사멸시키는 것에서의 면역접합체의 치료 효능의 증가가 초래된다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 표적 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 방해한다. 이같은 세포독성제의 예로는 본원에서 언급된 화학요법제들 (예컨대 메이탄시노이드 또는 칼리키아마이신), 방사성 동위원소, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.
제조품
본 발명의 또다른 실시양태에서, 상기 기술된 장애의 치료에 유용한 제조품이 제공된다. 한 양상에서, 제조품은 (a) 본원에서의 항체를 포함하는 용기 (바람직하게는, 용기는 용기 내의 항체 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다); 및 (b) 환자에서 장애를 치료하기 위한 지침서가 있는 포장 삽입물을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본원에서의 제조품은 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 이때 항체가 제1 의약이다. 이러한 제조품은 환자를 유효량의 제2 의약으로 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 지침서를 추가로 포함한다. 제2 의약은 상기 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있고, 대표적인 제2 의약은 B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제 (예를 들어, CD20 항체), BAFF 길항제, 면역억제제 (MTX 및 코르티코스테로이드 포함), 인테그린 길항제, 사이토카인 길항제 예컨대 TNF, CD11, 또는 CD18 길항제, 또는 이의 조합물이다. 바람직한 제2 의약은 스테로이드, 사이토카인 길항제, 및/또는 면역억제제이다.
이러한 양상에서, 포장 삽입물이 용기 상에서 또는 용기와 결합된다. 적절한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알(vial), 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 당해 장애를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유 또는 함유하고, 멸균 접근 포트(port)가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 1가지 이상의 활성 작용제는 본원에서의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물을 환자에게 투여하는 것에 관한 구체적인 안내 (투약량 및 항체 및 임의의 기타 의약이 제공되는 간격 포함)와 함께 조성물이 치료에 적격인 환자 또는 대상에서 특정 장애를 치료하는데 사용된다는 것을 가리킨다. 포장 삽입물은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 이같은 치료용 제품의 사용에 관련된 경고 등에 관한 정보를 함유하는, 치료용 제품의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 지침서를 지칭한다. 제조품은 제약상 허용가능 한 희석 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 추가적인 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여, 상업용 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 함께 포장된, 본원에서의 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물, 및 항체 또는 제약 조성물이 자가면역 질환 예컨대 RA, MS, 루푸스, 또는 IBD가 있는 환자를 치료하는데 지시된다는 것을 나타내는 표지를 포함하는 제조품이 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 본원에서의 제조품은 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 이때 항체가 제1 의약이며, 상기 제조품은 환자를 유효량의 제2 의약으로 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 지침서를 추가로 포함한다. 제2 의약은 상기 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있고, 대표적인 제2 의약은 상기 기재된 것들, 특히 RA 치료용 의약, 면역억제제, 코르티코스테로이드, DMARD, 인테그린 길항제, NSAID, 사이토카인 길항제, 비스포스포네이트, 또는 이의 조합물이고, 더욱 바람직하게는 DMARD, NSAID, 사이토카인 길항제, 인테그린 길항제, 또는 면역억제제이다. 가장 바람직하게는, 질환이 RA인 경우 제2 의약은 메토트렉세이트 또는 DMARD이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 항체 또는 이의 제약 조성물과 이러한 항체 또는 제약 조성물이 자가면역 질환 예컨대 RA, MS, 루푸스, 또는 IBD이 있는 환자를 치료하는데 지시된다는 것을 나타내는 표지를 포장물에서 조합시키는 것을 포함하 는, 본원에서의 항체 및 또는 이의 제약 조성물을 포장 또는 제작하는 방법을 제공한다.
광고 방법
본 발명은 표적 수신자에게 자가면역 질환 예컨대 RA, MS, 루푸스, 또는 IBD에 걸린 환자 또는 환자 집단을 치료하기 위한 항체 또는 이의 제약 조성물의 용도를 판촉하는 것을 포함하는, 본원에서의 항체 또는 이의 제약상 허용가능한 조성물을 광고하는 방법을 또한 포함한다.
일반적으로 광고는 광고주가 확인되고 메시지가 조절되어 있는, 비-개인적 매체를 통한 유료 커뮤니케이션이다. 본원에서의 목적을 위한 광고에는 선전, 홍보, 간접 광고, 스폰서십, 서명운동 및 판촉이 포함된다. 이러한 용어는 본 발명을 구입하거나, 지지하거나 승인하는 유리한 패턴으로 설득하거나, 정보를 제공하거나, 판촉하거나, 자극하거나 또는 다른 방식으로 행동을 변형시키기 위해 대중에게 호소하도록 디자인된 인쇄 커뮤니케이션 매체들 중 임의의 것에서 나타나는, 후원받은 정보성 공시 또한 포함한다.
본원에서의 치료 방법의 광고 및 판촉은 임의의 수단으로 달성될 수 있다. 이러한 메시지를 전달하기 위해 사용되는 광고 매체의 예로는 텔레비젼, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷, 및 방송 매체에서 나타나는 메시지인 빌보드 (상업방송 포함)가 포함된다. 광고는 식료잡화점 카트의 좌석, 공항 통로의 벽 및 버스 측면 상의 광고, 또는 통화 연결 메시지에서 또는 상점 내에 설치된 PA 시스템에서, 또는 시각적 또는 청각적 커뮤니케이션이 놓일 수 있는 임의의 장소 (일반적으로 공 공 장소 내)에서 들리는 광고를 또한 포함한다. 판촉 또는 광고 수단의 더욱 구체적인 예로는 텔레비젼, 라디오, 영화, 인터넷 예컨대 웹캐스트(webcast) 및 웨비나(webinar), 동시 사용자들에게 도달하도록 의도된 쌍방향 컴퓨터 네트워크, 고정형 또는 전자 빌보드 및 기타 공공 간판, 포스터, 전통적인 문헌 또는 전자 문헌 예컨대 잡지 및 신문, 기타 미디어 아울렛, 프레젠테이션 또는 개별적인 접촉 (예를 들어, 이메일, 전화, 인스턴트 메시지, 우송, 택배, 매스, 또는 배달 우편, 개인 방문 등에 의한 접촉)이 포함된다
사용되는 광고의 유형은 다수의 인자, 예를 들어, 도달될 표적 수신자, 예를 들어, 병원, 보험 회사, 진료소, 의사, 간호사 및 환자의 성질, 뿐만 아니라 비용 고려사항 및 의약 광고에 적용되는 관련된 관할 법 및 규칙에 좌우될 것이다. 광고는 서비스 상호작용에 의해 정의되는 사용자 특성 및/또는 기타 데이터 예컨대 사용자 인구통계 및 지리학적 위치를 기초로 개별화 또는 주문제작될 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 비-제한적인 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명 하에 다양한 기타 실시양태들이 실행될 수 있는 것으로 이해된다. 본 명세서 내의 모든 인용문의 개시내용은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.
실시예 1: 항-인간 및 항-뮤린 LTα 모노클로날 항체 및 햄스터-뮤린 키메라의
제조
항-인간 LTα 모노클로날 항체 2C8 및 3F12이 하기와 같이 생성되었다: DETOX™ 애쥬번트 (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MO) 내의 5 ㎍/용 량의 대장균에 발현된 정제된 재조합 인간 LTα (Genentech, Inc., South San Francisco, CA; Genentech Lot# 8360-2B; [Spriggs, "Tumor Necrosis Factor: Basic Principles and Preclinical Studies", Biologic Therapy of Cancer, DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company (1991) Ch. 16, pp. 354-377]; [Ruddle, Current Opinion in Immunology, 4:327-332 (1992)]; [Wong et al., "Tumor Necrosis Factor", Human Monocytes, Academic Press (1989), pp. 195-215]; [Aggarwal et al., Cytokines and Lipocortins in Inflammation and Differentiation, Wiley-Liss, Inc. 1990, pp. 375-384]; 및 [Paul et al., Ann. Rev. Immunol., 6:407-438 (1988)]를 또한 참조)를 주사하여 BALB/c 마우스 (Charles River Laboratories, Wilmington, DE)를 과면역화시켰다. 구체적으로, 10 ㎍ LTα3을 50 ㎕의 애쥬번트와 혼합하고, 제1일, 제4일, 제15일, 제29일, 제41일, 제56일, 및 제71일에 마우스 (BALB/c 계통)의 뒷발바닥 내로 피하 주사하였다. 결합 ELISA에 의한 항-LTα3-특이적 항체의 검출을 위해 제15일 및 제56일에 혈청을 수집하였다.
제75일에, 동물들을 희생시키고, 지라를 수확하고, 확립된 절차에 의해 50％ 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 4000을 사용하여 3×10E7개의 세포를 5×10E7개의 마우스 골수종 세포주 X63-Ag8.653의 세포와 융합시켰다 ([Oi and Herzenberg, Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishel and S. Schiigi, eds., (W.J.Freeman Co., San Francisco, CA, 1980)]). 융합된 세포들을 선별용 HAT 배지 ([Littlefield, Science, 145:709 (1964)])를 함유하는 96-웰 미량역가 플레이트 내로 2×10E5 개의 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 12일 후, 상등액을 수확하고, 직접적 ELISA에 의해 항체 생산에 대해 스크리닝하였다. 각각의 하이브리도마 계통으로부터 수확된 상등액을 친화성 크로마토그래피 (Pharmacia의 급속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC); Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 의해 정제하였다. 그후, 정제된 항체 제제를 멸균 여과하고 (0.2 ㎛ 세공 크기; Nalgene, Rochester NY), 4℃에서 포스페이트-완충 염수 (PBS)에서 보관하였다.
항-뮤린 LTα 모노클로날 항체 S5H3이 하기와 같이 생성되었다: 아르메니안 햄스터를 재조합 마우스 LTα2β1 (R&D Systems Inc. (1008-LY))으로 면역화시켰다. 2 ㎍의 항원으로 발바닥에 12회 주사하고, 2 ㎍의 항원으로 1번 IP 부스팅시켜서, 햄스터를 면역화시켰다. 림프절 및 지라를 PEG 처리에 의해 융합시켰다. Immunogen- 대 Genentech-제작 뮤린 LTα-6His (6개의 히스티딘이 C-말단 끝에 부착된 뮤린 LTα) 상에서의 ELISA에 의해 1차 스크리닝을 수행하였다. 페록시다제-접합 AFFINIPURE™ 염소 항-아르메니안 햄스터 IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch 127-035-160)로 검출하였다. 2차 스크리닝은 관련이 없는 형질감염된 HEK 293 세포 대 뮤린 LTαβ로 안정적으로 형질감염된 HEK 293 세포 상에서의 FACS에 의해 수행하였다 (G418 선별). R-파이코에리트린-접합 AFFINIPURE™ F(ab')2 염소 항-아르메니안 햄스터 IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch 127-116-160)를 사용하여 검출하였다. 이러한 항체가 유래된 하이브리도마가 ATCC에 기탁 번호 PTA-7538 (하이브리도마 뮤린 림포톡신 알파2 베타1 s5H3.2.2)로 기탁되었다.
이러한 실험에서 생성된 모든 항-뮤린 및 항-인간 LTα항체를 LTα3의 인식 에 대해 선별하였다. 그후, 이를 (a) ELISA에 의해 LTα3이 TNFR1 및 TNFR11에 결합하는 것의 차단에 대해, (b) LTα 및 LTβ로 안정적으로 형질감염된 세포의 ELISA 및 FACS에 의해 LTαβ에 결합하는 것에 대해, 그리고 (c) ELISA에 의해 LTβ 수용체와의 LTαβ 상호작용을 차단하는 것에 대해 스크리닝하였다. 항체 3F12, 2C8, 및 S5H3가 선별되었는데, 이들 모두 LTα3 및 LTαβ에 결합하여 이를 중화시켰기 때문이다.
하기 기술되는 뮤린 생체내 연구에서 사용하기 위해, 햄스터 항-뮤린 LTα 하이브리도마를 햄스터/마우스 키메라로 클로닝하였다. RNEASY MINI™ 키트 (Qiagen) 및 제조자가 제안한 프로토콜을 사용하여 전체 RNA를 S5H3 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. Qiagen ONE-STEP™ 키트를 사용하여 RT-PCR을 수행하였고, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 증폭시키고 클로닝을 위한 제한 효소 부위를 부가하도록 프라이머들이 디자인되었다.
이러한 키메라 항체 S5H3의 경쇄의 구축을 위해, 2개의 순차적인 클로닝 단계가 사용되었다. 첫번째 단계인 RT-PCR에서, ClaI 및 AscI 부위가 프라이머 셋트 1을 사용하여 부가되어, 서열분석용으로 DNA를 증폭시키기 위해 pRK계 벡터 내로 간단하게 클로닝되도록 하였다. 경쇄 가변 도메인의 DNA 서열이 수득된 후, 발현 벡터와 혼화성인 EcoRV 및 KpnI 부위를 부가하기 위해, 이러한 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR 라운드를 수행하였다.
S5H3의 중쇄의 구축을 위해, 유사한 2단계 클로닝 단계가 사용되었다. 구체적으로, RT-PCR을 사용하여, cDNA를 증폭시키고, 서열분석을 위한 벡터 내로의 클 로닝을 위해 ClaI 및 AscI 부위를 부가하였다. 이어서, 이러한 플라스미드를 PCR용 주형으로 사용하여, 발현 벡터와 혼화성인 BsiWI 및 ApaI 부위를 부가하였다.
RT-PCR을 위해, 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
S5H3 경쇄 셋트 1:
5' 프라이머: GGA TCA TCG ATA CAR CTN GTV YTN CAN CAR TCN CC (서열 56)
3' 프라이머: GGT AAC GGC GCG CCG YTC AGA AGA TGG TGG RAA (서열 57)
S5H3 경쇄 셋트 2:
5' 프라이머: GGA TCC GAT ATC CAG CTG GTA TTG ACC CAA TCT (서열 58)
3' 프라이머: GGA TCA GGT ACC GCT GCC AAA AAC ACA CGA CCC (서열 59)
S5H3 중쇄 셋트 1:
5' 프라이머: TGA TAA TCG ATG ARG TNC CAT TTR GTN GAR (서열 60)
3' 프라이머: TAG TAA GGC GCG CCT GGT CAG GGA NCC NGA RTT CCA (서열 61)
S5H3 중쇄 셋트 2:
5' 프라이머: TGA TCG CGT ACG CTG AGG TTC AAT TGG TTG AG (서열 62)
3' 프라이머: TGA TCG TGG GCC CTT TGT TGT GGC TGA GGA GAC GG (서열 63)
[식중, R = A 또는 G이고, Y = C 또는 T이며, N = 4개의 핵산 A, G, C, 및 T 모두이다]. 경쇄 가변 도메인에 대한 정제된 PCR 생성물을 뮤린 카파 불변 도메인을 함유하는 pRK 포유류 세포 발현 벡터 (pRK.LPG2.mukappa) 내로 클로닝하였다. 중쇄에 대해, PCR 생성물을 뮤린 이소타입 IgG2a의 뮤린 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인을 코딩하는 pRK 포유류 세포 발현 벡터 (pRK.LPG10.muIgG2a) 내로 클로닝하였 다. 이러한 벡터들은 293 세포에서의 IgG의 발현을 위한 기존에 기술된 벡터의 유도체이다 ([Shields et al., J. Biol. Chem., 276:6591-6604 (2000)] 및 [Gorman et al., DNA Prot Eng Tech, 2:3-10 (1990)]). S5H3 키메라 항체 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄에 대한 플라스미드들을 293 세포 (아데노바이러스-형질전환 인간 배아 신장 세포주 ([Graham et al., J.Gen. Virol., 36:59-74 (1977)])) 또는 CHO 세포 내로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 항체 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.
LTα3 결합 ELISA를 하기와 같이 수행하였다: 미량역가 플레이트를 50 mM 카르보네이트 완충제 용액 내의 1 ㎍/㎖ LTα3 (50 ㎕/웰)로 하룻밤 동안 코팅하였다. 흡착되지 않은 용액을 웰로부터 흡인하였다. 200 ㎕의 5 mg/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS (PBS-BSA)로 2시간 동안 웰을 차단시켰다. PBS-BSA에 적절하게 희석된 테스트 샘플 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 0.05％ TWEEN-20™ 계면활성제를 함유하는 PBS로 세척하였다. PBS-BSA 완충제 내의 양고추냉이 페록시다제-표지 염소 항-마우스 IgG 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 PBS/0.05％TWEEN-20™ 계면활성제로 세척한 후, 0.1 mg o-페닐렌디아민/㎖ (기질 용액) 및 수성 30％ H2O2를 함유하는 시트레이트 포스페이트 완충제 (pH 5)을 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 30분 동안 인큐베이션한 후, 50 ㎕ 2.5M 황산 H2SO4로 반응을 정지시키고, 흡광도를 490 nm에서 판독하였다.
LTα3-차단 ELISA, LTαβ-결합 ELISA 및 FACS 분석법, 및 LTαβ-차단 ELISA를 하기에 추가로 기술되는 절차에 의해 수행하였다.
실시예 2: 항-LTα 항체 3F12의 서열분석, 인간화 및 친화력 성숙
1. LTQ-FTMS-MS/MS 분석 및 에드만(Edman) 분해를 사용한 항-LTα 3F12의 디 노보(de novo) 서열분석
하이브리도마 세포주 3F12.2D3가 동결 세포주 은행으로부터 분실되었기 때문에, 복수 3F12.2D3로부터 정제된 항-LTα 모노클로날 항체 단백질을 PBS 내의 약 3.0 ㎎/㎖의 농도로 서열분석을 위해 제출하였다. 항체 (Ab)를 환원 조건 하에 4-20％ TRIS™ HCl SDS-PAGE 상에서 분리하고, 각각의 분리된 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 모노클론성을 확립하기 위해 N-말단 서열분석 (25-30개의 잔기가 서열분석됨)에 적용하였다. HC는 N-말단 아미노산을 에드만 서열분석에 이용불가능하도록 하는 피로글루타밀 기로 차단된 것으로 발견되었다. 차단기를 피로글루타메이트 아미노펩티다제 효소 (PGAP)를 사용하여 제거하고, HC 사슬을 다시 서열분석하였다. HC 및 LC 양쪽 모두 모노클로날인 것으로 확인되었다. 그후, [Analytical Biochemistry, 35:77-86 (2006)]에 기술된 전략에 따라 Ab를 다양한 효소 절단 및 화학적 절단으로 처리하였다. 간략하게, 이는 효소 트립신, 엔도(endo) Lys-C, Asp-N, 및 CNBr 및 묽은산으로의 화학 처리 (Asp/Pro 절단)로 구성되었다.
화학적 절단으로 펩티드들의 혼합물이 생성되었고, 이를 모델 494 PROCISE™ 서열분석기 상에서 서열분석하고, Genentech의 SEQSORT 프로그램을 사용하여 확인하였다 (SEQSORT는 Pittsburgh Supercomputing Center의 서열 분석 스위트에 의해 생성된 출력값을 더욱 관리하기 쉽고 판독하기 쉽도록 만들기 위해 디자인된 유틸리티 프로그램이다). 이러한 화학적 절단은 단백질 서열 데이터베이스 내의 항체와의 동일성에 의해 HC 및 LC의 불변 영역이 확인되도록 하였다. 효소 소화에 의해 생성된 펩티드를 모세관 RP-HPLC 분리물로부터 수집하고, 펩티드 질량을 MALDI-TOF 분석을 사용하여 측정하였다. 불변 영역에 매칭(matching)되지 않는 질량의 펩티드는 에드만 분해 또는 LTQ-FT 질량 분광계 상에서의 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 직렬 질량 분광법 (LC-MS/MS)를 사용하는 추가적인 분석에 적용하였다. HC 및 LC의 가변 영역의 서열이 다양한 단백질분해성 절단에 의해 수득된 중첩 서열들이 있는 펩티드들로부터 유도되었다.
LC-MS/MS에 의한 펩티드의 분석을 위해, AGILENT™ 1100 시리즈 모세관 LC 시스템 상에서 1 ㎕/분의 시속을 사용하여 미세모세관 C18 역상 크로마토그래피 컬럼 (0.15 × 150 mm 내경, 5 μm, 300Å)을 이용하였다. 용매 A (물 내의 0.1％ v/v 포름산으로 구성됨)를 적용하고, 2％ → 80％ 구배의 용매 B (아세토니트릴 내의 0.1％ v/v 포름산으로 구성됨)를 적용하였다. LC는 LTQ-FT 질량 분광계와 인-라인(in-line)으로 커플링되었고, m/z가 350 내지 1800 사이인 펩티드들을 데이터-의존적 방식으로 분석하였고, 각각의 전체 질량 범위 서베이 스캔(survey scan)에서 가장 풍부한 5개의 종을 충돌-유도 해리 (CID)에 대해 선별하였다. 생성된 CID 스펙트럼을 검색 프로그램 MASCOT로 스크리닝하여 데이터베이서 서열에 대한 정확한 매치(match)를 발견하고, 잠재적으로 신규성인 서열들을 수동 디 노보 해석에 의해 결정하였다. 완전하게 서열분석될 수 없거나 류신/이소류신 및 글루타민/라 이신의 동중(isobaric) 아미노산 쌍을 함유한 펩티드를 에드만 분해를 사용하여 추가로 분석하였다.
항-LTα의 Fab 부분을 무손상 항체의 파파인 소화로부터 수득한 후, 크기-배제 크로마토그래피하였다. Fab의 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두의 성분의 질량을 사슬간 디술피드를 환원시킨 후 4중 -TOF 질량 분광법에 의해 수득하였다. 실험에 의해 결정된 질량은 수득된 중쇄 및 경쇄 서열을 기초로 계산된 질량에 각각 0.5 Da 이내로 일치하였다.
키메라 3F12.2D3에 대한 항-LTα 경쇄의 서열:
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSTNQKNFLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (서열 64)
키메라 3F12.2D3에 대한 불변 영역 내로 스패닝(spanning)된 항-LTα 중쇄 가변 영역의 서열:
QGQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEISPGSGSTNYNEEFKGKATFTADKSSNTAYIQLSSLSTSEDSAVYYCADGYHGYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPIST (서열 65)
[식중, N은 임의의 아미노산이다].
도 1C는 이러한 클론에 대한 경쇄 가변 영역, 뿐만 아니라 다른 항체와의 상동성에 의해 채워졌지만 자체가 서열분석되지는 않은 경쇄 불변 영역을 나타낸다. 도 1D는 이러한 클론에 대한 중쇄 가변 영역, 뿐만 아니라 다른 항체와의 상동성에 의해 채워진 중쇄 불변 영역을 나타낸다.
2. 키메라 3F12의 유도된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 합성
주형으로서의 항-TGF-베타 모노클로날 항체 2G7 (WO 2005/97832)의 경쇄에 대한 유전자를 함유하는 pRK계 플라스미드 및 상기에서 유도된 아미노산 서열을 사용하여, 키메라 항체 3F12의 경쇄에 대한 유전자가 유도되도록 여러 라운드의 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 수행하였다. 유사하게, 모노클로날 항체 2G7의 중쇄를 3F12의 중쇄의 구축을 위한 주형으로 사용하였다. 경쇄- 및 중쇄 주형 모두 경쇄에 대한 C 카파, 및 중쇄에 대한 IgG1 이소타입의 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3의 인간 불변 도메인을 함유하였다. 합성에서 사용된 올리고뉴클레오티드가 경쇄 및 중쇄에 대해 하기에 제공된다.
3F12의 키메라 경쇄의 합성을 위한 올리고뉴클레오티드:
CA1845
GCT CAT AGT GAC CTT TTC TCC AAC AGA CAC AGC CAG AGA TGA TGG CGA CTG TGA CAT CAC GAT ATC TGA ATG TAC TCC (서열 66)
CA1846
GCT GTA AGT CCA GTC AAA GTC TTT TAT ACA GTA CCA ATC AGA AGA ACT TCT TGG CCT GGT ACC AGC (서열 67)
CA1847
GCG ATC AGG GAC ACC AGA TTC CCT AGT GGA TGC CC (서열 68)
CA1848
GCC ACG TCT TCA GCT TTT ACA CTG CTG ATG G (서열 69)
CA1849
GGT CCC CCC TCC GAA CGT GCG CGG GTA GGA GTA GTA TTG CTG ACA GTA ATA AAC TGC CAG GTC (서열 70)
3F12의 키메라 중쇄의 합성을 위한 올리고뉴클레오티드:
CA1850
GCT GCA GCT GAC CTT CTG AAT GTA CTC C (서열 71)
CA1851
GCC TTG CAG GAG ATC TTC ACT GAA GCC CCA GGC TTC ATC AGC TCA GCT CC (서열 72)
CA1852
CCC ACT CTA TCC AGT AAC TAG AGA AGG TGT ATC CAG TAG CCT TGC AGG (서열 73)
CA1853
CCA CTT CCA GGA CTA ATC TCT CCA ATC CAC TCA AGG CCA TGT CCA GGC C (서열 74)
CA1854
GCC CTT GAA CTC CTC ATT GTA ATT AGT ACT ACC ACT TCC AGG (서열 75)
CA1855
CCG CAG AGT CCT CAG ATG TGA TCA GGC TGC TGA GCT GGA TGT AGG CAG TGT TGG AGG ATT TGT CTG CAG TGA ATG TTG CCT TGC C (서열 76)
CA1856
GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GCC ATG GTA CCC GTC TGC ACA GTA ATA GAC CTC (서열 77)
CA1871
CCA GAC TGC TGC AGC TGA CCT TGT GAA TGT ACT CCA GTT GC (서열 78)
원래의 3F12 뮤린 모노클로날 항체의 이소타입이 IgG2b였기 때문에, 이러한 이소타입의 경쇄 및 중쇄에 대한 뮤린 불변 도메인이 키메라 내의 인간 불변 도메인에 대해 교환되어, 완전한 뮤린 항체가 제공되었다. 비교를 위해, 뮤린 IgG2a 이소타입을 또한 구축하였다. 각각의 변이체의 경쇄 및 중쇄에 대한 DNA를 일시적인 발현을 위해 아데노바이러스로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 내로 공동-형질감염시키고, 컨디셔닝 배지로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하였다. ELISA 포맷에서의 LTα에 대한 결합을 복수로부터의 원래의 3F12 모노클로날 항체와 합성 muIgG2a 및 muIgG2b 변이체 간에 비교하였다.
간략하게, NUNC MAXISORP™ 플레이트를 50 mM 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 내의 2 ㎍/㎖의 LTα (상기 실시예 1에 기술됨)로 하룻밤 동안 4℃에서 코팅한 후, PBS 내의 0.5％ BSA, 10 PPM PROCLIN™으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 0.5％ BSA, 0.05％ TWEEN™, 10 PPM PROCLIN™을 함유하는 PBS 내의 샘플의 계단 희석물을 플레이트 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 항체를 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 기질로 사용하여 양고추냉이 페록시다제-접합 항-인간 Fc (Jackson ImmunoResearch)로 검출하였다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. IgG2a- 및 IgG2b-클론 변이체 모두 복수로부터 정제된 3F12 항체와 유사하게 결합하였고, 이 는 정확한 서열이 합성되었음을 가리킨다.
3. 3F12의 인간화
키메라 클론의 아미노산 서열을 사용하여, 경쇄 및 중쇄의 CDR 잔기를 확인하였다 (카밧). 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 사용하여, 이러한 CDR들을 인간화 항-TGFβ 2G7 버젼 5 (WO 2005/97832)의 경쇄 및 중쇄의 코딩 서열을 함유하는 벡터 상에 교환시켜, 3F12의 CDR교환물 버젼을 수득하였다. 이렇게 유도된 프레임워크 서열은 각각 VL 카파 서브그룹 I 및 VH 서브그룹 III 컨센서스 서열에 대한 것이다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열 51)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열 55)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열 53)-L3-FGQGTKVEIKR (서열 54) 및
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열 46)-H1-WVRQAPGKGLEWVG (서열 45)-H2-RATFSADNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAD (서열 50)-H3-WGQGTLVTVSS (서열 49).
상기 기술된 바와 같은 발현 및 정제 후, LTα에 대한 CDR교환물의 결합을 키메라의 결합과 비교하였다. CDR교환물에 대한 결합이 거의 완전히 손실되었다.
인간화 항체의 결합을 복구시키기 위해, CDR교환물로부터의 DNA를 주형으로 사용하여 돌연변이를 구축하였다. 컴퓨터로 생성된 모델을 사용하여, 변화가 항체-항원 표면의 CDR 형상에 영향을 미칠 수 있는 위치에서 인간 프레임워크 잔기가 이의 뮤린 대응물로 변화되도록 이러한 돌연변이들을 디자인하였다. 돌연변이체 및 상기 기술된 바와 같은 ELISA에 의한 이의 상대적인 결합이 하기 표 1에 제시된다. 이소류신 69를 페닐알라닌로 변화시키는 것 (v2)은, Leu78Ala 변화와 같이, 결합을 현저하게 증가시킨 반면, Asn73Lys 변화는 CDR교환물에 비해 개선을 제공하지 않았다. Ile69Phe 및 Leu78Ala의 조합으로 버젼 5가 제공되었고, 이는 이러한 ELISA 분석 포맷에서 키메라보다 약 5배 더 낮게 LTα에 결합한다.
프레임워크 서열을 인간 컨센서스에 더욱 가깝게 이동시키기 위해 2개의 변이체를 제조하였다. Lys24Arg 및 Ser25Ala 변화가 있는 버젼 6은 결합이 버젼 5과 등가였다. 그러나, 위치 94에서의 일반적인 아스파르트산을 컨센서스 아르기닌으로 변화시키려는 시도 (버젼 7)에서는 결합이 거의 완전히 손실되었다.
Figure 112009028089493-PCT00003
3F12 키메라를 사용하는 하기 기술된 모든 동물 연구는 원래의 키메라를 지칭하고, 상기 각주에 기술된 키메라2는 지칭하지 않는다.
4. 항체 3F12의 친화력 성숙
CDR 내의 어떤 잔기 및 영역이 LTα에 결합하는데 가장 중요한지, 및 따라서 친화력 성숙용 파지 디스플레이 라이브러리에서 포함하기 위한 후보물을 확인하기 위해, v5를 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 위한 단일 가닥 주형으로 사용하여 부분적인 알라닌 스캐닝을 수행하였다.
표 2에 제시된 바와 같이, 알라닌으로 돌연변이되는 경우 LTα에 대한 결합의 손실 또는 증진이 일어나는 여러 잔기들이 확인되었다.
Figure 112009028089493-PCT00004
따라서, 버젼 14, 15, 17, 20, 21, 및 12에는 결합 친화력을 개선시키도록 변화가 일어날 수 있는 위치가 있고, 결합을 증가시키도록 이러한 각각의 위치에서 보존적 치환 (또는 심지어 일상적인 테스트에 의해 당업자가 결정할 수 있는 바와 같이 일부 경우의 비-보존적 치환)이 일어날 수 있을 것으로 예상되었다.
실시예 3: 키메라 항체 2C8의 제조 및 인간화
1. 키메라 항체의 제조
본질적으로 S5H3의 클로닝에 대해 실시예 1에서 상기 기술된 것과 같이, LTα3 및 LTαβ에 결합하여 이를 중화시키는 뮤린 항-LTα 항체 2C8의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 클로닝하여 뮤린/인간 키메라 항체 포맷으로 만들었다.
RT-PCR을 위해, 사용된 프라이머는 하기와 같았다:
2C8 경쇄:
5' 프라이머: GCC ATA GAT ATC GTR ATG CAN CAG TCT C (서열 79)
3' 프라이머: TTT KAT YTC CAG CTT GGT ACC (서열 80)
2C8 중쇄:
5' 프라이머: GAT CGA CGT ACG CTG AGG TYC AGC TSC AGC TSC AGC AGT CTG G (서열 81)
3' 프라이머: ACA GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GMR GAG ACD GTG ASH RDR GT (서열 82).
[식중, K = G 또는 T이고, S = C 또는 G이며, D = A 또는 G 또는 T이고, M = A 또는 C이고, H = A 또는 C 또는 T이고, N은 T, G, A, 또는 C (이러한 4개 중 임의의 핵산)이며, R = A 또는 G이고, Y = C 또는 T이다].
경쇄의 가변 도메인은 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 벡터 pRK.LPG3.HumanKappa 내로 클로닝하고, 중쇄 가변 도메인은 전장 인간 IgG1 불변 도메인을 코딩하는 발현 벡터 pRK.LPG4.HumanHC 내로 클로닝하였다. 이러한 벡터들은 293 세포에서의 IgG의 발현을 위한 기존에 기술된 벡터들의 유도체이다 ([Shields et al., J Biol Chem, 276:6591-6604 (2000)] 및 [Gorman et al., DNA Prot Eng Tech, 2:3-10 (1990)]). 항체의 일시적인 발현을 위해, 이러한 플라스미드들을 293 세포 또는 CHO 포유류 세포주 내로 공동-형질감염시키고, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 단백질을 정제하였다.
이러한 키메라 항체 2C8을 하기 기술되는 동물 실험에서 사용하였다.
2. 2C8의 인간화
항-LTα 항체 2C8의 인간화를 일련의 부위-지정 돌연변이유발 단계들에서 수행하였다. 키메라의 가변 도메인의 서열을 사용하여, 이러한 도메인의 아미노산 서열을 공지된 항체의 서열 ([Kabat et al., 상기 문헌])과 비교함으로써 경쇄 및 중쇄의 CDR 잔기를 확인하였다. 서열 초가변성 ([Kabat et al., 상기 문헌])을 기초로 CDR이 확인되었고, 도 2에 제시된다.
2C8의 CDR교환물을 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 제조하였고, 이때 CDR 영역을 각각 경쇄 및 중쇄에 대한 별도의 pRK5계 벡터 내로 넣었다. 이러한 벡터들은 경쇄 인간 카파 I 불변 도메인을 함유하거나, 또는 중쇄 벡터에 대해서는, 인간 IgG1 불변 도메인 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3을 함유하였다 ([Gorman, Current Opinion in Biotechnology, 1, (1), p36-47 (1990)]).
또다른 인간화 항체에 대한 비교는 2C8의 경쇄는 인간화 항-HER2 항체 4D5 (US 5,821,337)의 경쇄와 매우 유사한 한편, 2C8의 중쇄는 항-TGF-β 2G7 (WO 2005/97832)에 대한 서열과 유사하다는 것을 기라켰다. 따라서, rhuMAb 4D5의 경쇄를 함유하는 벡터를 2C8의 경쇄의 구축을 위한 주형으로 사용하였다. 표 3에 제시된 경쇄 서열의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 이러한 벡터로부터 유도된 데옥시유리딘-함유 주형 상에서 부위-지정 돌연변이유발을 수행하였다. 추가적으로, 올리고뉴클레오티드 CA1730을 사용하여, 프레임워크 3 서열을 인간 카파 I 컨센서스의 서열로 복귀시켰다.　
Figure 112009028089493-PCT00005
중쇄에 대해, 표 4에 제시된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 인간화 항체 2G7 (WO 2005/97832)의 중쇄를 함유하는 벡터로부터 데옥시유리딘-함유 주형이 유도되었다. 올리고뉴클레오티드 KM55, KM56, 및 KM61을 사용하여 프레임워크가 컨센서스로 전환되었다.
Figure 112009028089493-PCT00006
이렇게 하여 유도된 CDR 교환을 포함하는 경쇄 및 중쇄 (v10)을 아데노바이러스-형질전환 인간 배아 신장 세포주, 293 ([Graham et al., 상기 문헌]) 내로 공동-형질감염시켰다. 배양 상등액으로부터 단백질 A-SEPHAROSE CL-4B™ 수지를 사용하여 항체를 정제한 후, 10 mM 숙신산나트륨, 140 mM NaCl (pH 6.0) 내로 완충제를 교환하고, CENTRICON-10™ 농축기 (Amicon)를 사용하여 농축하였다.
인간 LTα에 대한 CDR 교환물 및 후속 2C8 변이체의 상대적 결합 친화력을 측정하기 위해, 플레이트-기반 ELISA를 상기 기술된 바와 같이 사용하였다.
표 5에 나타난 바와 같이, CDR 교환물 v10은 LTα ELISA에서 결합 없음을 나타냈다. 버젼 2 및 후속 변이체가 이러한 결합을 재획득하도록 구축되었다. 버젼 2는 키메라와 등가인 결합을 재획득하였지만, 7개의 비-컨센서스 잔기를 함유하였다. 가능한 한 컨센서스에 가까운 프레임워크를 수득하면서 키메라와 비교하여 여전히 결합을 유지하거나 개선시키도록 추가적인 변이체들을 연구하였다. 버젼 12는 결합이 키메라와 등가이거나 (ELISA), 또는 약간 더 양호하였고 (BIACORE™ 분석), 오직 5개의 비-컨센서스 잔기만을 보유하였다. 버젼 7 및 12의 경쇄 및 중쇄 서열이 도 2C에서 제공된다.
Figure 112009028089493-PCT00007
3. 2C8의 친화력 성숙
LTα에 대한 친화력이 개선된 인간화 2C8 모노클로날 항체를 파지 상에 디스플레이된 1가 Fab의 라이브러리로부터 선별하였다. 인간화 2C8.v2 Fab를 디스플레이하고 CDR-L3 내에 정지 코돈을 함유하는 주형이 생성되었다. 특정 CDR-L3 및 CDR-H3 잔기의 소프트(soft) 무작위화를 위해 올리고뉴클레오티드들 (표 6에 열거됨)을 디자인하였다.
Figure 112009028089493-PCT00008
LTα에 대한 3회 라운드의 분류를 사용하여 항원에 대한 결합이 2 nM 미만인 고-친화력 Fab 분자를 선별적으로 포획하였다. 첫번째 라운드에 대해, 2 ㎍/㎖의 플레이트에 코팅된 LTα에 대해 실온에서 2시간 동안 파지를 포획하였다. 용액 상태의 2 nM 비오틴화 LTα로 30분 동안 파지를 포획한 후, 뉴트라비딘이 코팅된 플레이트 상에서 포획함으로써, 실온에서 두번째 및 세번째 라운드의 선별을 수행하였다. 친화력이 가장 높은 클론을 경쟁적 ELISA를 사용하여 확인하였다. 일정 농도의 파지 클론 (고체-상 LTα 결합 OD에 의해 표준화됨)을 증가하는 농도의 용액 내의 LTα (0-50 nM)와 함께 인큐베이션한 후, 2 ㎍/㎖ LTα로 코팅된 플레이트 상에서 포획하였다. 1개의 클론이 야생형 2C8.v2에 비해 LTα와의 경쟁에서 10배 개선을 나타냈다. 이러한 파지미드 클론의 DNA 서열분석은 CDR-L3에서 야생형 2C8 서열로부터의 2개의 아미노산 변화를 나타냈다: 위치 89의 글루타민이 글루탐산으로 변화되었고, 위치 90의 히스티딘이 세린으로 변화되었다. 이러한 2개의 CDR-L3 변화는 야생형 2C8.v7 경쇄 상에서의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 이루어졌다. v7 경쇄가 2C8.v12 중쇄가 있는 293 세포 내로 형질감염되어 2C8.v16이 제공된 경우, 생성된 항체는 2C8.v2와 비교했을 때 ELISA에 의한 LTα에의 IgG 결합에서 2배 개선을 나타냈다 (표 5).
안정성을 강화시키기 위해, 잠재적인 아스파르트산 이성화 부위를 제거함으로써, 중쇄 CDR2 내의 asp 53이 알라닌으로 변화되었다. 생성된 2C8 변이체 vX는 ELISA에 의한 LTα에의 결합에서 2C8.v2 및 2C8.키메라와 비교하여 각각 3.5배 및 3배 개선되었다 (표 5).
하기의 표 7은 어떻게 CDR-L3 영역 내에서의 잔기 변화가 ELISA 분석에 의해 LTα에 결합하는 능력에 대해 순위가 매겨졌는지를 나타낸다.
Figure 112009028089493-PCT00009
이러한 표로부터 최적의 클론은 A8, G7, 및 H6임을 알 수 있고, 이들은 모두 rhLTα에 야생형 클론보다 높은 친화력으로 결합하였다.
실시예 4: 항-LTα 항체가 항체-유도 관절염 (AIA)을 억제한다
항원 (소의 제II형 콜라겐) 대신에 제II형 콜라겐을 인식하는 항체가 주사된다는 점에서 AIA는 하기 기술된 콜라겐-유도 관절염 (CIA)과 상이하다. 이러한 방식으로, Fc 수용체 및 보체-매개 활성화를 통한 대식세포 및 중성구 상에서의 이펙터 기능을 직접적으로 유도하도록 순응성 B- 및 T-세포 응답이 우회된다.
ARTHROGEN-CIA™ 마우스 B-하이브리도마 세포주에 의해 생성된 4가지 상이한 모노클로날 항체의 조합물의 정맥내 주사에 의해 마우스에서 AIA가 유도되었다. 3개의 모노클로날 항체는 CB11의 아미노산 84개의 잔기 단편인 LyC2 (제II형 콜라겐의 최소 관절염유발원성(arthritogenic) 단편) 내에 클러스터링된 자가항원성 에피토프를 인식하였고, 4번째 모노클로날 항체는 LyC1과 반응하였다. 4개의 항체 모두 다양한 종의 제II형 콜라겐이 공유하는 보존된 에피토프를 인식하였고, 동종성 및 이종성 제II형 콜라겐과 교차반응하였다.
모든 군 (n=5/군)에게 제0일에 100 ㎕ PBS 내의 모노클로날 항체의 칵테일 2 ㎎을 정맥내로 제공한 후, 제3일에 50 ㎕ PBS 내의 25 ㎍ LPS를 복강내로 제공하였다. 동물들을 제-1일 (예방용) 또는 제4일 (치료용)에 10 mg/kg 대조군 이소타입 (항-래그위드), 햄스터-뮤린 키메라 LTα 항체 S5H3 (항-인간 LTα 항체에 대한 대용물), 항-LT.Fc 돌연변이체 (하기 기술되는 바와 같이 Fc 영역 내에 DANA 돌연변이가 있는 항-LTα 항체), 또는 TNFRII.Fc (TNFR.Ig 면역부착소)로 복강내 또는 피하 처치하였다. 발의 종창을 14일 동안 모니터링하였다. 동물 당 16점의 최대 총점으로 각각의 발을 0-4의 점수로 채점하였다.
이러한 실시예 및 하기의 다른 실시예에서 사용된 항-LT.Fc 돌연변이체에서의 DANA 돌연변이는 마우스 또는 인간 IgG의 Fc 영역에서의 2개의 단일-위치 변화를 지칭한다. 이러한 변화는 위치 265에서의 D (아스파르트산) → A (알라닌) 및 위치 297에서의 N (아스파라긴) → A (알라닌)이다. PCR-기반 부위-지정 돌연변이유발 방법 (GENE TAILOR™, Invitrogen Corp.)에 의해 마우스 또는 인간 IgG의 위치 265 및 297 내로 알라닌 잔기를 도입함으로써 DANA 돌연변이체가 구축되었다.
도 4A는 유도 후의 일수의 함수로서 상기 기술된 각각의 군의 예방용 처치에 대한 평균 임상 점수를 나타낸다. TNFRII.Fc 및 항-LT.Fc 돌연변이체 분자를 포함하는 모든 처치 군의 이러한 모델에서 S5H3 항체가 가장 효과적이었음을 알 수 있다. 따라서, 항체 S5H3는 이러한 항체-유도 모델에서 관절염의 발달을 현저하게 억제하였다. Fc DANA 돌연변이가 있는 항-LTα (항-LT.Fc 돌연변이체)는 효능이 없었고, 이는 LTα-발현 세포의 Fc-매개 사멸이 효능에 필요하였음을 가리킨다 (도 4A).
도 4B는 유도 후의 일수의 함수로서 상기 기술된 각각의 군의 치료용 처치에 대한 평균 임상 점수를 나타낸다. 결과는 테스트된 다른 분자들에 비교하여, 치료용으로 투여되었을 때 S5H3 항체가 이러한 항체-유도 모델에서 관절염의 발달을 현저하게 억제하였음을 나타낸다.
결론적으로, 햄스터-마우스 키메라 S5H3로 처치된 동물들은 S5H3.DANA 또는 대조군으로 처치된 동물들과 비교하여 임상 점수가 현저하게 감소되었다. S5H3은 이러한 동물 모델에서 예방용 및 치료용 효능 양쪽 모두를 나타냈다.
실시예 5: 항-LTα가 콜라겐-유도 관절염 (CIA)을 억제한다
RA에서, 여러 관절의 윤활막에서 염증이 생겨, 뼈 및 연골이 포함되는 관절 조직의 파괴에 이를 수 있다. RA의 윤활막은 성질이 고도로 염증성일 수 있고, 림프구 및 단핵 세포 침윤, T-세포 및 항원-제시 세포 (APC) 활성화, B-세포 면역글로불린 (Ig) 분비, 및 전-염증성 사이토카인 생산을 전형적으로 특징으로 한다 ([Potocnik et al., Scand. J. Immunol., 31:213 (1990)]; [Wernick et al., Arthritis Rheum., 28:742 (1985)]; [Ridley et al., Br. J. Rheumatology, 29:84 (1990)]; [Thomas et al., J. Immunol., 152:2613 (1994)]; 및 [Thomas et al., J. Immunol., 156:3074 (1996)]). 만성적으로 염증이 생긴 활막에는 과도한 CD4 T-세포 침윤이 일반적으로 수반된다 ([Pitzalis et al., Eur. J. Immunol., 18:1397 (1988)] 및 [Morimoto et al., Am. J. Med., 84:817 (1988)]).
콜라겐-유도 관절염 (CIA)은 인간 질환을 닮은, 인간 RA에 대한 동물 모델이고, 이종성 제II형 콜라겐 (CII)으로의 면역화에 의해 감수성 계통의 마우스에서 유도될 수 있다 ([Courtenay et al., Nature, 283:665 (1980)] 및 [Cathcart et al., Lab. Invest., 54:26 (1986)]). CD4 T 세포 및 CII에 대한 항체 양쪽 모두가 CIA를 발달시키는데 필요하다. 항-CII를 나이브 동물에게 전달하는 것은 CIA와는 꽤 다른 부분적인 조직병리학에 이를 뿐이고, CIA의 완전한 증상은 발달되지 않는다 ([Holmdahl et al., Agents Action, 19:295 (1986)]). 반면에, CII-면역화 마우스로부터 나이브 수용체로의 CD4 T 세포 및 항-CII 항체 양쪽 모두의 입양 전달은 전통적인 CIA의 증상을 완전하게 재구성한다 ([Seki et al., J. Immunol., 148:3093 (1992)]). CIA에서의 T 세포 및 항체 양쪽 모두의 수반은 CIA 내의 염증이 생긴 관절의 조직병리학적 발견과 또한 일치한다. 따라서, B- 세포 또는 T-세포 기능을 차단하거나, 또는 T 세포에 의해 유도된 전-염증성 사이토카인을 억제하는 작용제가 관절염을 예방 또는 치료하는데 효과적일 수 있다. 실제로, CD4 T 세포의 고갈, CD40-CD40L 상호작용의 차단, TNF-α의 중화, 또는 IL-1 수용체의 차단이 마우스에서 CIA의 예방에 이를 수 있다 ([Maini et al., Immunol. Rev., 144:195 (1995)]; [Joosten et al., Arthritis Rheum., 39:797 (1996)]; 및 [Durie et al., Science, 261:1328 (1993)]).
본원에서 사용된 CIA 모델에서, DBA-1J 마우스를 제0일 및 제21일에 100 ㎕의 완전 프로인트 애쥬번트 (CFA) 내의 100 ㎍ 소의 제II형 콜라겐으로 피내 면역화시켰다. 면역화 후 제24일에, 마우스를 처치 군으로 무작위로 나눴다. 동물들에게 100 ㎕ 내의 6 mg/kg 항-래그위드 IgG2a 모노클로날 항체 (대조군 항체) 또는 100 PBS 내의 4 mg/kg의 햄스터-마우스 키메라 항-LTα 항체 (S5H3), 항-LTα.Fc 돌연변이체, 또는 뮤린 TNFRII-Ig를 피하 처치하였다. 연구 기간 동안 동물들을 1주일에 3번씩 처치하였다. 각각의 관절에 대한 1-4의 등급화 시스템 (최대 점수 16)을 사용하여 관절 침윤의 징후에 대해 동물의 사지를 매일 시험하였다.
CIA-예방 모델에서, 햄스터-뮤린 항-LTα 항체 S5H3 및 TNFRII.Fc의 사용은 항-S5H3.DANA Fc 돌연변이체 및 이소타입 대조군 (항-래그위드 IgG2a 모노클로날 항체)와 비교하여 70일까지의 기간에 걸쳐 평균 임상 점수를 감소시켰다. CIA 예방용 뮤린 모델에서 TNFR.Ig에 필적하는 항체 S5H의 효능을 나타내는 도 5A 참조.
도 5B는 치료용 CIA 뮤린 모델에서 90일에 걸친 햄스터-뮤린 키메라 항-LTα 항체 (S5H3)의 TNFRII.Fc와 필적하는 효능을 나타내고, 이러한 효능은 평균 임상 점수를 감소시키는데 있어서 이소타입 대조군보다 훨씬 양호하였다. 도 5A에서의 결과와 함께 이러한 결과는 본원에서의 항체가 RA와 같은 자가면역 질환을 예방하는데, 그리고 이러한 질환에서 효험이 있는데 유용한 것으로 고려된다는 것을 나타낸다. 본원에서의 항-LTα 항체가 TNFR.Ig 및 항-TNFα 항체가 포함되는 일반적인 TNF 치료법에 비-응답성인 대상에서 RA를 예방 및 치료하는데 효과적이어서, 이같은 비-응답자들이 이같은 항체로 예방용으로 및 효험이 있도록 치료될 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 6: 항-LTα가 MBP-TCR 트랜스제닉 마우스에서 뇌척수염 (EAE) 질환의
발병 및 중증도를 지연시킨다
실험적 자가면역/알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 MS와 유사성이 있는 중추 신경계의 염증성 용태이다. 양쪽 질환에서, 혈중 백혈구가 혈액-뇌 장벽에 침투하고 말이집을 손상시켜, 손상된 신경 전도 및 마비가 초래된다. EAE 뮤린 모델 (트랜스제닉 마우스 예방용 모델)이 인간 MS에 대한 모델로 기술되었다 ([Grewal et al., Science, 273:1864-1867 (1996)]).
MBPAc1-11 T-세포 수용체 트랜스제닉 마우스 (Richard Flavell 박사 (Howard Hughes Medical Institute, Yale University)로부터 수득된 동물 번식 쌍으로부터 번식된 10 내지 15주령 수컷 및 암컷 성체 MBP-TCR 트랜스제닉 마우스)를 100 ㎕의 CFA 내의 10 ㎍의 MBPAc1-11로 피하 면역화시켰다. 제1일 및 제2일에, 추가로 모든 마우스에게 백일해 독소를 200 ng/100 ㎕/마우스로 복강내 주사하였다. 제0일에, 마우스 (n=10/군)에게 100 ㎕로 6 mg/kg의 항-gp120 IgG1 모노클로날 항체 (대조군 항체) 또는 햄스터-마우스 키메라 항-LTα 항체 S5H3을 복강내로 제공한 후, 100 ㎕ PBS 내의 6 mg/kg으로 1주일에 3번 피하 제공하였다.
하기의 등급화 시스템을 사용하여 임상 징후에 대해 동물들을 매일 평가하였다: 0 - 정상 마우스; 명백한 질환 징후가 없음; 1 - 맥빠진 꼬리 또는 뒷발 쇠약 (양쪽 모두는 아님); 2 - 맥빠진 꼬리 및 뒷발 쇠약; 3-부분적인 뒷발 마비; 4 - 완전한 뒷발 마비; 5 - 빈사.
결과가 도 6에서 제시된다. 질환 점수가 대조군에 비해 항-LTα-처치 마우스에서 더 낮았고, (대조군에 대한 4점을 초과하는 임상 점수와 비교하여) 연구 동안 단지 3점의 임상 점수에 도달하였다. 결과는 항체 S5H3이 트랜스제닉 마우스에서 EAE 질환의 발병 및 중증도를 지연시켰음을 나타내고, 이는 항체 처치가 명확한 EAE의 발달로부터 마우스를 보호하였음을 시사한다.
실시예 7: 항-LTα 항체 처치가 T-세포-의존적 항체 이소타입 응답에 영향을
미치지 않아, 안전성을 가리킨다
대부분의 마우스 계통에서 정맥내 주사된 트리니트로페놀 (TNP)-FICOLL™에 대한 면역 응답이 매우 높아, 마우스 내의 다양한 이소타입 수준을 측정함으로써 이같은 마우스에 투여된 항체의 상대적인 안정성을 분석하도록 한다.
BALB/c 마우스 (n=12/군)에게 제0일에 100 ㎕ PBS 내의 6 mg/kg의 항-래그위드 이소타입 대조군, 햄스터-마우스 항-LTα 항체 (S5H3), 항-LT.Fc 돌연변이체, 또는 CTLA4-Fc (양성 대조군)를 복강내 처치하였다. 5주 동안 주당 3회로 처치를 계속하였다. 마우스 당 2 mg의 백반 내의 TNP-OVA (100 ㎍)로 제1일에 마우스를 복강내 면역화시키고, 제29일에 마우스 당 PBS 내의 TNP-OVA (50 ㎍)로 복강내 면역화시켰다. 표준 ELISA에 의한 항-TNP Ig 이소타입s IgM, IgG1, 및 IgG2a의 결정을 위해 제0일, 제14일 및 제35일에 혈청을 수집하였다.
각각 항-TNP IgM, IgG1, 및 IgG2a의 Log10 역가로 데이터가 표시된 도 7A-7C에 제시된 결과는 이소타입 대조군, S5H3 항체, 및 DANA Fc 돌연변이체 항체가 각각의 이소타입 수준에 대해 유사한 패턴을 나타낸 반면, CTLA4.Fc 면역부착소는 상이하게 작용하였음을 가리킨다. 이는 본원에서의 S5H3 항체의 투여에 대한 환자에서의 면역 응답이 거의 없을 것임 (있는 경우)을 가리킨다.
실시예 8: 항-LTα 항체 처치가 T-세포-비의존적 항체 이소타입 응답에 영향을
미치지 않아, 안전성을 가리킨다
BALB/c 마우스 (n=10/군)에게 제0일에 100 ㎕ PBS 내의 6 mg/kg의 항-래그위드 (IgG2a 이소타입 대조군), 햄스터-마우스 항-LTα 항체 (S5H3), 또는 TNFRII.Fc를 복강내 처치하였다. 10일 동안 주당 3회로 처치를 계속하였다. 100 ㎕ PBS 내의 TNP-FICOLL™ (100 ㎍)로 제1일에 마우스를 복강내 면역화시켰다. 표준 ELISA에 의한 항-TNP Ig 이소타입 IgM, IgG1, IgG2a, 및 IgG3의 결정을 위해 제0일 및 제10일에 혈청을 수집하였다.
Log10 역가로 데이터가 표시된 도 8은 이소타입 대조군, S2C8 항체, 및 TNFRII.Fc 면역부착소 모두 IgM, IgG1, IgG2a, 및 IgG3 이소타입에 대해 유사하게 행동하였음을 나타낸다. 이는 생체내 투여를 위한 본원에서의 항체의 안정성을 추가로 증명한다.
실시예 9: 항-LTα 항체가 인간 SCID 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 예방한다
이식편-대-숙주 질환 (GVHD)은 면역적격 세포가 면역억제 또는 내성 환자 내로 이식되는 경우에 발생한다. 도너 T 세포가 숙주 항원을 인식하여 활성화되고, 사이토카인을 분비하고, 증식하고, 이펙터 세포로 분화된다. 이러한 응답은 이식편-대-숙주 반응 (GVHR)으로 공지되어 있다. GVHR 응답은 다기관 증후군이고, 생명을 위협하는 심각한 염증에서 설사 및 체중 감소의 가벼운 사례까지 효과가 다양할 수 있다. 마우스에서의 GVHD 모델이 자가면역 질환 및 골수 이식 후에 발생하는 급성 및 만성 GVHR의 임상 장애를 모델링하는데 사용되었다. 일반적인 절차는 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, unit 4.3]에 기술되어 있다.
FICOLL™ 다당류 구배에 의해 정상 도너의 LEUKOPACK™ (혈액 은행 예컨대 Interstate Blood Bank (Memphis, TN)으로부터 입수가능)으로부터 정제된 인간 PBMC로 SCID 마우스를 재구성시켰다. 세슘 137 공급원을 사용하여 350 라드로 모든 마우스 (n=10/군)에게 거의 치사량으로 방사선을 조사하였다. 방사선조사 2시간 후, 200 ㎕ PBS 내의 5000만개의 인간 PBMC/마우스를 마우스에게 정맥내 주사하였다. 세포 주사 직후, 100 ㎕ 염수 내의 300 ㎍의 트라스투주맵 (인간 IgG1 이소타입 대조군 항체), 항-LTα 키메라 항체 2C8, 또는 CTLA4-Fc를 2회/주로 3주 동안 마우스에게 복강내 처치하였다. POLYMYXIN™ B (110 mg/리터) 및 NEOMYCIN™ (1.1 g/리터) 항생제를 방사선조사 후 5일 동안 식수에 첨가하였다. 생존에 의해 지시되는 GVHD에 대해 마우스를 모니터링하였다.
결과가 도 9에 제시되고, 이소타입 대조군과 비교하여, 2C8 항체가 항-LTα 2C8 Fc 돌연변이체 및 이소타입 대조군과 비교하여 인간 SCID 마우스의 생존을 현저하게 증가시켰고 (GVHD를 예방함), CTLA4.Fc 면역부착소가 테스트된 분자들의 이러한 모델에서 최상이었음을 가리킨다. 따라서, 본원에서의 항-LTα 항체는 이식편-대-숙주 질환의 예방 및/또는 치료에서 유용할 것으로 예상된다. 또한, 2C8 Fc 돌연변이체 (DANA)는 효능을 나타내지 않았기 때문에, 결과는 LTα-양성 세포의 고갈이 이러한 모델에서의 효능에 필요하다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 항-LTα 모노클로날 항체가 LTα3에 결합한다
미량역가 웰을 50 mM 카르보네이트 완충제 용액 내의 1 ㎍/㎖ 인간 LTα3 (100 ㎕/웰)으로 하룻밤 동안 코팅하였다. 흡착되지 않은 용액을 웰로부터 따라내었다. 웰을 5 mg/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 150 ㎕ PBS (PBS-BSA)로 1-2시간 동안 차단하였다. 100 ㎕의 적절하게 희석된 테스트 샘플 (PBS-BSA 내에 희석된 항-LTα 키메라 항체 2C8 또는 3F12)을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 0.05％ TWEEN™-20 계면활성제를 함유하는 PBS로 세척하였다. 그후, PBS-BSA 완충제 내의 100 ㎕의 비오틴-표지 래트 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 플레이트를 PBS/0.05％TWEEN™-20 계면활성제로 세척하고, 스트렙타비딘-양고추냉이 페록시다제 (SA-HRP)를 30분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰을 PBS/0.05％TWEEN™-20 계면활성제로 세척하고, 결합된 HRP를 테트라메틸벤지딘 (TMB)/H202의 용액으로 측정하였다. 15분 후, 100 ㎕의 1M 인산을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 650 nm의 기준 파장으로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 10A는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 인간 LTα3에 결합하였음을 나타낸다.
인간 LTα3 대신 뮤린 LTα3을 사용하고, 햄스터-마우스 키메라 항-LTα 항체 S5H3 및 항-LT.Fc 돌연변이체를 결합 능력에 대해 테스트되는 항체로 사용하여상기의 절차를 반복하였다. 도 10B는 S5H3 및 항-LTα.Fc 돌연변이체 양쪽 모두 뮤린 LTα3에 결합하였음을 나타낸다.
실시예 11: 항-LTα 항체가 LTα1β2에 결합한다
LTαβ ELISA를 위해, 미량역가 웰을 50 mM 카르보네이트 완충제 용액 내의 1 ㎍/㎖ 뮤린 LTα1β2 (100 ㎕/웰)로 하룻밤 동안 코팅하였다. 흡착되지 않은 용액을 웰로부터 따라내었다. 웰을 5 mg/㎖ 소 혈청 알부민을 함유하는 150 ㎕ PBS (PBS-BSA)로 1-2시간 동안 차단하였다. 100 ㎕의 적절하게 희석된 테스트 샘플 (PBS-BSA 내에 희석된 항-LTα 키메라 항체 S5H3 또는 항-LTα.Fc 돌연변이체)을 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고, 0.05％ TWEEN™-20 계면활성제를 함유하는 PBS로 세척하였다. 그후, PBS-BSA 완충제 내의 100 ㎕의 비오틴-표지 래트 항-마우스 IgG를 각각의 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 플레이트를 PBS/0.05％TWEEN™-20 계면활성제로 세척하고, 스트렙타비딘-양고추냉이 페록시다제 (SA-HRP)를 30분 동안 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰을 PBS/0.05％TWEEN™-20 계면활성제로 세척하고, 결합된 HRP를 테트라메틸벤지딘 (TMB)/H202의 용액으로 측정하였다. 15분 후, 100 ㎕의 1M 인산을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 650 nm의 기준 파장으로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 11A는 항-LTα 키메라 항체 S5H3가 항-LT.Fc 돌연변이체와 같이 뮤린 LTα1β2 복합체에 결합하였음을 나타낸다.
FACS 분석법을 사용하여, LTβ와 복합체를 형성한 세포 표면 상의 LTα에 대한 항-LTα 항체의 결합을 결정하였다. 인간 LTαβ에 대해, 293 세포를 전장 인간 LTα 및 인간 LTαβ (인간 LTα 서열 GenBank Ref NM_000595; 인간 LTα 서열 GenBank Ref NM_002341)로 형질감염시켜, 안정적인 인간 LTαβ-발현 세포주를 생성시켰다. 세포를 1-5 ㎍/㎖의 항-LTα 키메라 항체 3F12 또는 2C8, 인간 LTβR.huIgG1, 또는 huIgG1 이소타입 대조군 (트라스투주맵)과 함께 20분 동안 2％ FBS가 있는 PBS에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 검출을 위해 항-인간 Ig-PE 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다.
뮤린 LTαβ에 대해, SVT2 세포를 전장 뮤린 LTα 및 뮤린 LTαβ (뮤린 LTα 서열 GenBank Ref NM_010735; 뮤린 LTα 서열 GenBank Ref NM_008518)로 형질감염시켜, 안정적인 뮤린 LTαβ-발현 세포주를 생성시켰다. 2％ FBS가 있는 PBS에서 20분 동안 ALEXA-647™ 형광단에 직접 접합된 햄스터-뮤린 키메라 S5H3, 항-LT.S5H3.Fc 돌연변이체, muLTβR.IgG2a, 또는 이소타입 대조군 (항-IL122 muIgG2a)으로 표면 LT를 검출하였다. 세포를 세척하고, 흡인하고, 2％ FBS가 있는 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 CELLQUEST™ 소프트웨어를 사용하여 FACSCALIBUR™ (이중 레이저) 상에서 분석하고, 결과를 FLOWJO™ 분석기 (Treestar) 상에서 분석하였다.
도 11B는 키메라 항-LTα 항체 3F12 및 2C8이 LTβ와 복합체를 형성한 인간 세포의 표면 상의 LTα에 얼마나 잘 결합하였는지를 나타낸다. 이들을 LTβ-수용체.huIgG1 및 이소타입 대조군 huIgG1 (트라스투주맵)과 비교하였다. 모든 인간 항체가 표면 LTα에 결합하였다.
도 11C는 햄스터-뮤린 항-LTα 항체 S5H3가 LTβ와 복합체를 형성한 뮤린 세포의 표면 상의 LTα에 얼마나 잘 결합하였는지를 나타낸다. 이들을 LTβ-수용체 뮤린 IgG2a, 항-LT S5H3 Fc 돌연변이체, 및 이소타입 대조군 (항-IL122 muIgG2a)와 비교하였다. 모든 뮤린 항체가 표면 LTα에 결합하였다.
실시예 12: 항-LTα 항체가 인간 Th1, Th2, 및 Th17 세포에 결합한다
CD4+ T 세포가 흉선으로부터 성숙되어 말초 림프계 내로 진입하면, 자신의 T 세포 수용체에 특이적인 항원을 만나기 전까지 일반적으로 나이브 표현형으로 유지된다 ([Sprent et al., Annu Rev Immunol. 20:551-79 (2002)]). APC에 의해 제시되는 특이적 항원에의 결합은 T 세포 활성화를 야기한다. 환경 및 사이토카인 자극에 따라, CD4+ T 세포는 Th1 또는 Th2 표현형으로 분화하고, 이펙터 또는 메모리 세포가 된다 ([Sprent et al., 상기 문헌] 및 [Murphy et al., Nat Rev Immunol. 2(12):933-44 (2000)]). 이러한 프로세스는 1차 활성화로 공지되어 있다. 1차 활성화를 겪으면, CD4+ T 세포가 이펙터 또는 메모리 세포가 되고, Th1 또는 Th2으로 표현형을 유지한다. 이러한 세포가 다시 항원을 만나면, 2차 활성화를 겪지만, 이번에는 항원에 대한 응답이 1차 활성화보다 더 신속할 것이고, 1차 활성화에 의해 결정된 바와 같은 이펙터 사이토카인의 생산이 초래된다 ([Sprent et al., 상기 문헌], 및 [Murphy et al., 상기 문헌]).
1차 활성화 상태에 대해, 나이브 T 세포가 항-CD3, 항-CD28, 및 Th1 또는 Th2이 시험되는지 여부에 따른 특정 사이토카인에 의해 활성화되었다. 특히, 인간 PBMC를 혈소판에 결합된 항-CD3 및 항-CD28 (각각 10 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖; BD PharMingen)로 자극함으로써 인간 Th1 및 Th2 세포주가 생성되었다. 제1일에, Th2 분화를 유도하기 위해, 인터루킨 (IL)-4 (5 ng/㎖; R&D Systems Inc.), 항-IL-12 (5 ㎍/㎖; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), 및 항-인터페론 (IFN)-감마 (5 ㎍/㎖; R&D Systems Inc.)을 첨가하였다. Th1 분화를 위해, 제1일에 IL-12 (1 ng/㎖; R&D Systems Inc.), IFN-감마 (10 ng/㎖; R&D Systems Inc.), 및 항-IL-4 (1 ㎍/㎖; R&D Systems Inc.)를 첨가하였다. 제7일 및 제14일에 세포를 다시 자극하였다.
Th1 및 Th2에 대한 항체의 결합을 결정하기 위한 FACS 분석 세포-표면 염색을 위해, 최종 자극 2일 후, 활성화된 인간 T-세포 (Th1/Th2 세포주)를 항-LTα 항체 2C8 (1 ㎍/㎖), 3F12 (1 ㎍/㎖), LTβR.Fc (1 ㎍/㎖), TNFRII.Fc (1 ㎍/㎖) 또는 huIgG1 이소타입 대조군 (1 ㎍/㎖) (모두 ALEXA FLUOR® 647 형광단 (Invitrogen Corp.)에 직접 접합됨)과 함께 20분 동안 2％ FBS가 있는 PBS에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 흡인하고, 2％ FBS가 있는 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 CELLQUEST™ 소프트웨어를 사용하여 FACSCALIBUR™ (이중 레이저) 상에서 분석하고, 결과를 FLOWJO™ 분석기 (Treestar) 상에서 분석하였다.
도 12A 및 12B는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12 가 각각 인간 Th1 및 Th2 세포에 결합하였음을 나타낸다. 그래프는 LTβR.Fc, TNFRII.Fc, 및 이소타입 대조군에 대한 결합 결과를 또한 나타낸다.
LT-α3 및 LT-α1β2가 FACS 분석을 통해 인간 Th1 세포뿐만 아니라 인간 Th17 세포 상에 발현되는 것으로 발견되었기 때문에, 키메라 2C8, 2C8.v2, 및 2C8.vX (실시예 3 및 18에 기술됨)가 포함되는 본원에서의 항-LTα 항체가 (Th1 및 Th2에 결합하는 것과 유사하게)) 인간 Th17 세포에 결합할 것이고, 따라서 MS (뮤린 모델에서 EAE를 구동시킴) 및 루푸스, 뿐만 아니라 RA 및 IBD, 예컨대 크론 질환 및 궤양성 대장염이 포함되는 다수의 자가면역 질환을 치료하는데 유용할 것으로 예상된다.
따라서, 항-LTα 인간화 항체 2C8.vX를 LTα 항체로 사용하고 Th17 세포주 및 Th1 세포주를 사용하지만 Th2 세포주는 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기 기술된 것과 동일한 실험을 수행하였다. 인간 Th17 세포주는 인간 PBMC를 상기 언급된 바와 같은 항-CD3 및 항-CD28 및 IL-23 (10 ng/㎖; R&D Systems Inc.), 항-IFN-gamma (10 ㎍/㎖; R&D Systems Inc.), 및 항-IL-12 (10 ?g/㎖; R&D Systems Inc.)로 자극함으로써 생성되었다. 이러한 실험은, 실제로, 항체 2C8.vX가 인간 Th17 세포, 뿐만 아니라 인간 Th1 세포에 결합하였지만, 휴지 중인 세포에는 결합하지 않았음을 나타냈다. 도 12C-E 참조.
실시예 13: 항-LTα 항체가 인간 세포 T, B 및 NK A에 결합한다
FACS 분석법을 사용하여, 1차 인간 세포의 표면 상의 LTα에 대한 항-LTα 항체의 결합을 결정하였다. 인간 PBMC를 단리하고, 활성화된 CD4 및 CD8 세포에 대해서는 2일 동안 항-CD3 및 항-CD28 (각각 10 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖; BD PharMingen)로, 또는 B 세포에 대해서는 2일 동안 항-IgM (10 ㎍/㎖, R&D Systems Inc.) 및 IL-4 (20 ng/㎖; R&D Systems Inc.)로 활성화시켰다. NK CD56+ 세포를 음성 선별 (Miltenyi Biotec)에 의해 단리하고, IL-15 (20 ng/㎖; R&D Systems Inc.)와 함께 15시간 동안 인큐베이션하였다.
FACS 분석을 위해, 세포를 키메라 항-LTα 항체 3F12 (1 ㎍/㎖), 인간 LTαR.huIgG1 (1 ㎍/㎖), 또는 huIgG1 이소타입 대조군 (트라스투주맵, 1 ㎍/㎖) (모두 ALEXA FLUOR® 647 형광단 (Invitrogen Corp.)에 직접 연결됨)과 함께 20분 동안 2％ FBS가 있는 PBS에서 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 흡인하고, 2％ FBS가 있는 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 CELLQUEST™ 소프트웨어를 사용하여 FACSCALIBUR™ (이중 레이저) 상에서 분석하고, 결과를 FLOWJO™ 분석기 (Treestar) 상에서 분석하였다.
도 13A-13E는 이소타입 대조군과 비교하여 항체가 세포에 결합하였음을 나타낸다. 도 13A는 활성화되지 않은 세포를 나타내고, 도 13B는 항-CD3 및 항-CD28-활성화 CD4 T 세포를 나타내고, 도 13C는 CD8 T 세포를 나타내며, 도 13D는 IL15-활성화 CD56 NK 세포를 나타내고, 도 13E는 IgM 및 CD40L-활성화 CD19 B 세포를 나타낸다.
실시예 14: 항-LTα 모노클로날 항체가 LTα3을 기능적으로 차단한다
1. 인간 및 뮤린 LTα3의 차단
미량역가 웰을 50 mM 카르보네이트 완충제 용액 내의 0.7 ㎍/㎖ 인간 TNFRII.huIgG1 (ENBREL®) (100 ㎕/웰)로 하룻밤 동안 코팅하였다. 흡착되지 않은 용액을 웰로부터 따라내었다. 비오틴화 LTα3 (뮤린 또는 인간)이 포획되었고, 스트렙타비딘-양고추냉이 페록시다제 (HRP)로 검출되었다. 인간 LTα3의 중화를 위해, 증가하는 용량의 키메라 항-LTα 항체 2C8 또는 3F12 또는 대조군 이소타입 (트라스투주맵)을 지시된 농도의 LTα3과 함께 1시간 동안 예비-인큐베이션한 후, 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 햄스터-마우스 키메라 항-LTα 항체 S5H3 또는 항-LT.Fc 돌연변이체 또는 대조군 이소타입 (트라스투주맵)을 사용하여 뮤린 LTα3의 중화를 위해 동일한 절차를 수행하였다. 각각의 웰을 PBS/0.05％TWEEN™ 20 계면활성제로 세척하고, 결합된 HRP를 테트라메틸벤지딘 (TMB)/H202의 용액으로 측정하였다. 15분 후, 각각의 웰에 100 ㎕의 1M 인산을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 650 nm의 기준 파장으로 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다.
도 14A는 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 이소타입 대조군과 비교하여 인간 LTα3을 기능적으로 차단하였음을 나타낸다. 도 14B는 항-LTα 항체 S5H3 및 항-LT.Fc 돌연변이체가 이소타입 대조군과 비교하여 뮤린 LTα3을 기능적으로 차단하였음을 나타낸다.
2. A549 세포에서의 LTα3-유도 IL-8의 차단
상피 세포주 (A549)를 LTα3의 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12로의 LTα3의 효과의 중화를 적합한 웰에 첨가된 항-LTα 항체의 계단 희석물 (10-0 ㎍/㎖)에 의해 결정하였다. 상등액을 사용하여 표준 ELISA에서 IL-8을 검출하였다.
도 14C는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 이소타입 대조군 (트라스투주맵 IgG1)과 비교하여 A549 세포에서 LTα3-유도 IL-8을 차단하였음을 나타낸다.
3. HUVEC 상에서의 LTα3-유도 ICAM 발현의 차단
HUVEC 세포를 LTα3의 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12로의 LTα3의 효과의 중화를 적합한 웰에 첨가된 항-LTα 항체의 계단 희석물 (10-0 ㎍/㎖)에 의해 결정하였다. ICAM-1의 세포 표면 발현을 FACS에 의해 결정하였고, 이는 평균 형광 강도로 표시된다. TNFRII.Fc가 대조군으로 사용되었다.
도 14D는 이소타입 대조군 (트라스투주맵 IgG1)과 비교하여 항-LTα 항체 2C8 및 3F12, 뿐만 아니라 TNFRII.Fc 돌연변이체가 HUVEC 상에서의 LTα3-유도 ICAM 발현을 차단하였음을 나타낸다. 자극되지 않은 세포의 응답 또한 제시된다.
4. LTα3-유도 NFkB 활성화의 차단
항-LTα 항체가 TNF 수용체를 통한 LTα3의 신호전달을 차단하는지를 결정하기 위해, 293 세포주를 DMEM:F12 50:50 (+ 10％ FBS, 글루타민, P/S)에서 75％ 전면성장으로 배양하였다. 표준 형질감염 기술 (Fugene)을 사용하여 표준 NFkB-RE-루시페라제 리포터 구축물로 세포를 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 세척하고 나서, LTα3 (100 ng/㎖)으로 또는 LTα3과 함께 30분 동안 예비-인큐베이션된 키메라 항-LTα 항체 2C8의 계단 희석물 (10-0 ㎍/㎖)로 자극하였다. 6시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 루시페라제 활성을 하기와 같이 측정하였다: LYSIS BUFFER™ (Promega, 125 ㎕/웰)를 15분 동안 첨가하였다. 용해물을 수집하고, 20 ㎕/웰로 96-웰 분석 플레이트 (고-결합, 백색 폴리스티렌, COSTARTM)에 삼중으로 옮기고, LUCIFERASE ASSAY REAGENT™ 및 STOP AND GLO BUFFERS™ (Promega)를 주입한 후 LMAXII™ 플레이트 판독기 (Molecular Devices)에서 판독하였다. 사용된 이소타입 대조군은 트라스투주맵 IgG1이었다.
도 14E는 항-LTα 항체 2C8이 이소타입 대조군과 비교하여 LTα3-유도 NFkB 활성화를 차단하였음을 나타낸다. 자극되지 않은 세포에 대한 효과 또한 제시된다.
실시예 15: 항-LTα 항체가 LTα1β2를 기능적으로 차단한다
1. LTα-유도 NFkB 활성화의 차단
항-LTα 항체가 LTβR를 통한 LTα1β2의 신호전달을 차단하는지를 결정하기 위해, 293 세포주를 DMEM:F12 50:50 (+ 10％ FBS, 글루타민, P/S)에서 75％ 전면성장으로 배양하였다. 표준 형질감염 기술 (Fugene)을 사용하여 표준 NFkB-RE-루시페라제 리포터 구축물로 세포를 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 세척하고 나서, LTα1β2 (R&D Systems Inc.; 100 ng/㎖)으로 또는 LTαβ와 함께 30분 동안 예비-인큐베이션된 키메라 항-LTα 항체 2C8의 계단 희석물 (10-0 ㎍/㎖)로 자극하였다. 6시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 루시페라제 활성을 하기와 같이 측정하였다: LYSIS BUFFER™ (Promega, 125 ㎕/웰)를 15분 동안 첨가하였다. 용해물을 수집하고, 20 ㎕/웰로 96-웰 분석 플레이트 (고-결합, 백색 폴리스티렌, COSTARTM)에 삼중으로 옮기고, LUCIFERASE ASSAY REAGENT™ 및 STOP AND GLO BUFFERS™ (Promega)를 주입한 후 LMAXII™ 플레이트 판독기 (Molecular Devices)에서 판독하였다. 사용된 이소타입 대조군은 트라스투주맵 IgG1이었다.
도 15A는 항-LTα 항체 2C8이 이소타입 대조군과 비교하여 LTα1β2-유도 NFkB 활성화를 차단하였음을 나타낸다. 자극되지 않은 세포의 응답 또한 제시된다.
2. LTα3-, LTα2β1-, 및 LTα1β2-유도 세포독성의 차단
테스트 샘플을 뮤린 L929 세포독성 분석법에서 LTα3, LTα2β1, 및 LTα1β2 (R&D Systems Inc.)의 세포용해 활성을 중화하는 능력에 대해 분석하였다. L929 세포를 미량역가 플레이트에서 3가지 LTα 시약 중 하나 (도 15B-D에 지시된 용량) 및 DNA 억제제 악티노마이신-D의 존재 하에 배양하였다. 중화 키메라 항-LTα 항체 2C8를 배양물에 10 ㎍/㎖로 첨가하였다. 세포 용해가 표준 ALAMARBLUE™ 계통의 생육성 세포에 의해 결정되었고, 상대적 형광 단위 (RFU)로 표시된다.
도 15B, 15C, 및 15D는 키메라 항-LTα 항체 2C8이 LTα3-, LTα2β1-, 및 LTα1β2-유도 세포독성을 각각 차단하였음을 나타낸다.
3. HUVEC 상에서의 LTα1β2-유도 ICAM 발현의 차단
HUVEC 세포를 LTα1β2 (R&D Systems Inc.)의 존재 하에 24시간 동안 배양하였다. 항-LTα 항체로의 LTα1β2의 효과의 중화를 적합한 웰에 첨가된 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12의 계단 희석물 (10-0 ㎍/㎖)에 의해 결정하였다. ICAM-1의 세포 표면 발현을 FACS에 의해 결정하였다.
도 15E는 키메라 항-LTα 항체 2C8 및 3F12가 이소타입 대조군 (트라스투주맵 IgG1)과 비교하여 HUVEC 상에서의 LTα1β2-유도 ICAM 발현을 차단하였음을 나타낸다. 자극되지 않은 세포에 대한 효과 또한 제시된다.
실시예 16: 항-LTα 모노클로날 항체가 LTαβ-발현 세포를 사멸시킬 수 있다
ADCC 분석법을 하기와 같이 이중으로 미량역가 플레이트에서 수행하였다. NK 세포를 100 ㎖의 정상적인 인간 도너의 전혈로부터 음성 선별 (ROSETTESEP™, #15065, StemCell Technologies)을 사용하여 단리하였다. 분석 희석제는 RPMI™ 1640 및 0.25 ㎎/㎖ BSA였다. 키메라 항체 2C8 및 이의 Fc 돌연변이체 (50 ㎕ 내의 100 nM에서 시작하는 계단 희석물)을 50 ㎕의 인간 LTαβ를 발현하는 안정적인 293 세포 (20,000개) (상세사항에 대해 실시예 11 참조)와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 NK 세포 (120,000개)를 첨가하고, 추가로 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 1500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 100 ㎕의 상등액을 96웰의 편평 바닥 마이크로웰 플레이트로 옮겼다. 용해된 세포로부터 방출된 락테이트 탈수소효소의 양을 측정함으로써 세포 용해 수준을 결정하였다 (LDH 키트, #1-644-793, Roche). 100 ㎕의 LDH 키트 반응 혼합물을 100 ㎕의 상등액에 첨가하고, 30분까지 인큐베이션하였다. 플레이트를 490 nm에서 판독하였다. 대조군은 항체의 부재 하의 표적:이펙터 세포 (항체-비의존적 용해), 표적 세포 단독 + 1％ TRITON X-100™ 계면활성제 (전체 용해), 및 항체 ADCC 음성 및 양성 대조군을 포함하였다.
도 16은 항-LTα 항체 2C8이 ADCC 분석법에서 293-인간 LTαβ-발현 세포주를 용해시켰지만, 상응하는 Fc 돌연변이체 모노클로날 항체는 그렇지 않았음을 나타낸다.
실시예 17: 항-LTα 모노클로날 항체가 3T3 및 HUVEC 세포에서
사이토카인 및 케모카인 분비를 차단한다
HUVEC 및 3T3 세포를 각각 인간 또는 뮤린 시약을 사용하여 24시간 동안 인간 LTα3 (100 ng/㎖; R&D Systems Inc.) 또는 인간 LTα1β2 (200 ng/㎖; R&D Systems Inc.)의 존재 하에 배양하였다. 키메라 2C8 또는 S5H3 항-LTα 항체로의 LTα 삼량체의 효과의 중화 (키메라 2C8 + HUVEC, 및 햄스터-마우스 키메라 S5H3 + 뮤린 3T3 세포)를 10-0 ㎍/㎖의 고정 용량에서 결정하였다. 표준 LINCOPLEX™ 키트 및 LUMINEX™ 플레이트 판독기 상에서의 판독을 사용하여, 상등액을 HUVEC 평가를 위해서 인간 RANTES, IL-6, IP-10, 및 IL-8에 대해, 또는 3T3 평가를 위해 뮤린 RANTES, IL-6, IP-10, 및 KC에 대해 분석하였다.
도 17A-H는 항-LTα 항체가 이소타입 대조군에 비해, 그리고 자극되지 않은 세포와 비교하여 HUVEC 세포에서의 사이토카인 및 케모카인 분비를 차단하였음을 나타내고, 이때 도 17A-17D는 각각 KC/IL-8, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα1β2를 나타내고, 도 17E-17H는 각각 KC/IL-8, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα3을 나타낸다.
도 17I-P는 항-LTα 항체가 이소타입 대조군에 비해, 그리고 자극되지 않은 세포와 비교하여 3T3 세포에서의 사이토카인 및 케모카인 분비를 차단한다는 것을 나타내고, 이때 도 17I-17L은 각각 KC, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα1β2를 나타내고, 도 17M-17P는 각각 KC, RANTES, IP10, 및 IL-6 + LTα3을 나타낸다.
요약하면, LTα에 대한 바람직한 본원에서의 항체는:
1) LTα3을 차단한다
2) 세포 표면 상의 LTβ와 복합체를 형성하는 표적으로서의 LTα에 결합함으로써 LTα-양성 세포를 고갈시킨다. 고갈이 중요하다는 데이터는 야생형을 Fc (DANA) 돌연변이체와 비교하는 생체내 데이터이다 - 마우스에 대해: CIA, AIA (도 4 및 5); 인간에 대해: 인간 SCID 마우스 + 2C8 (도 9) 및 ADCC 분석법 (도 16)
3) LTαβ 기능을 차단한다
4) 어떠한 한 이론에 제한되지 않으면서, T-, B-, 및 가능하게는 임의의 Th1- 또는 Th17- 또는 Th2-구동 질환 (및 NK 세포)을 포함하여 LTα를 발현하는 임의의 세포를 표적으로 한다.
본원에서의 항체로의 치료에 이로울 것으로 예상되는 질환에는 RA, IBD, 건선, MS, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스 질환, 중증 근육무력증, 및 루푸스, 특히 RA, MS, 루푸스 (예를 들어, SLE 및 LN), 및 IBD (크론 질환 및 UC 포함)가 포함된다.
실시예 18: 친화력이 성숙된 항-LTα 항체 2C8.vX
실시예 3에서 언급된 항체 2C8의 친화력 성숙으로 인간화 항체 2C8.vX가 된다. 이러한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 CDR이 각각 도 18A 및 18B에 CDR과 함께 제시된다.
하기는 항-LTα 2C8.vX의 전장 중쇄를 코딩하는 DNA 서열이다:
Figure 112009028089493-PCT00010
Figure 112009028089493-PCT00011
하기는 항-LTα 2C8.vX의 전장 경쇄를 코딩하는 DNA 서열이다:
Figure 112009028089493-PCT00012
하기는 2C8.vX에 대한 전장 중쇄 아미노산 서열이다:
Figure 112009028089493-PCT00013
하기는 2C8.vX에 대한 전장 경쇄 아미노산 서열이다:
Figure 112009028089493-PCT00014
에피토프 지도작성은 이러한 분자에 수용체 결합 부위와 부분적인 중첩이 있다는 것을 가리킨다. 활성화된 붉은털원숭이 T 및 B 세포는 표면 LTαβ를 발현한다. 항체 2C8.vX는 붉은털원숭이 표면 LTαβ (FACS에 의해 결정됨) 및 붉은털원숭이 가용성 LTα3 (FORTEBIO™ 옥텟에 의해 결정됨)에 결합하였다 (이들과 교차반응하였다).
도 19A 및 19B는 이소타입 대조군/TNFRII.Fc와 비교하여 2C8.vX 항체의 LTα3 및 LTα1β2 결합의 ELISA를 각각 나타낸다. 이러한 ELISA들을 인간 LTα3을 사용하여 상기 실시예 10에 기술된 것과 동일한 방식으로, LTα1β2를 사용하여 실시예 11에 기술된 것과 동일한 방식으로 수행하였다. LTα3 및 LTα1β2에 대한 이러한 동일한 항체들의 EC50 값은 LTα3에 대해 TNFRII.Fc은 1.03 nM, 2C8.vX은 0.05 nM이었고, LTα1β2에 대해서는 TNFRII.Fc는 결합하지 않았고 2C8.vX는 0.34 nM였다. 결과는 2C8.vX가 양쪽 경우에서 TNFRII.Fc보다 훨씬 더 양호하게 결합하였음을 나타낸다.
도 20A 및 20B는 상기 실시예 15에 기술된 인간 LT-유도 세포독성의 차단을 테스트하는 분석법을 사용하여, 이소타입 대조군/TNFRII.Fc와 비교하여 2C8vX 항체에 의한 인간 LTα3 및 LTα1β2의 차단을 각각 나타낸다. LTα3 및 LTα1β2에 대한 이러한 동일한 항체들의 IC50 값은 LTα3에 대해 TNFRII.Fc은 0.83 nM, 2C8.vX는 0.29 nM였고, 이소타입 차단은 없었으며, LTα1β2에 대해서는 2C8.vX는 0.31 nM이었고, 이소타입 차단은 없었다. 결과는 2C8.vX가 TNFRII.Fc보다 더 양호하게 LTα3을 차단하였음을 나타낸다.
도 21은 상기 실시예 14에 기술된 프로토콜을 사용하는, HUVEC 세포 상에서의 LTα3에 의한 ICAM1 상향조절의 억제를 나타내는 기능적 분석법에 관한 것이다. 도 21은 이러한 기능적 분석법에서 어떻게 다양한 분자들이 LTα3을 차단하였는지의 비교를 나타낸다. 구체적으로, 이소타입 대조군, 2C8.vX, 및 TNFRII.Fc가 비교되었다. 결과는 이러한 분석법에서 양쪽 항체 모두 LTα3을 차단할 수 있었음을 나타낸다.
도 22는 상기 실시예 15에 기술된 프로토콜을 사용하는, 293-LTβR 세포를 사용하여 LTα1β2 차단을 나타내는 기능적 분석법에 관한 것이다. 도 22는 이러한 기능적 분석법에서 어떻게 다양한 분자들이 LTα1β2를 차단하였는지의 비교를 나타낸다. 구체적으로, 이소타입 및 2C8.vX가 자극되지 않은 세포와 함께 비교되었다. 결과는 이러한 분석법에서 2C8.vX가 약 5 nM의 IC50으로 LTα1β2를 차단할 수 있었음을 나타낸다.
도 23은 293-LTα1β2 세포를 수반하는 실시예 16에 기재된 프로토콜을 사용하여 2C8.vX의 ADCC 활성을 나타낸다. 2C8.vX가 2C8.vX DANA 돌연변이체 및 이소타입 대조군과 비교되었다. 결과는 2C8.vX에는 ADCC 활성이 있는 반면, DANA 돌연변이체에는 없었음을 나타낸다.
도 24는 대조군 (DANA Fc 돌연변이체 및 이소타입 대조군)과 비교하여, 인간 SCID 모델에서의 2C8.vX 및 CTLA4-Fc로의 GVHD 생존 결과를 나타내고, 이때 실시예 9에 상기 기술된 것과 동일한 프로토콜이 사용되었고, 3 내지 4주 내에 종결되었다. 결과는 이러한 모델에서 CTLA4-Fc 및 2C8.vX가 생존을 연장시켰고, 따라서 LTα 세포를 고갈시키는데 효과적이었지만, 대조군 2C8.vX-DANA 돌연변이체 및 인간 IgG1 이소타입 대조군 항체는 그렇지 않았음을 가리킨다.
도 25A-D는 인간 SCID GVHD 모델에서 2C8.vX 항체가 LTα1β2-발현 T 및 B 세포를 고갈시켰음을 나타낸다. 이러한 프로토콜에서, FICOLL™ 다당류 구배에 의해 정상 도너의 LEUKOPACK™ (혈액 은행 예컨대 Interstate Blood Bank (Memphis, TN)으로부터 입수가능)으로부터 정제된 PBMC로 SCID 마우스를 재구성시켰다. 세슘 137 공급원을 사용하여 350 라드로 모든 마우스 (n=10/군)에게 거의 치사량으로 방사선을 조사하였다. 방사선조사 2시간 후, 200 ㎕ PBS 내의 5000만개의 인간 PBMC/마우스를 마우스에게 정맥내 주사하였다. 세포 주사 1일 후, 100 ㎕ 염수 내의 300 ㎍의 인간 IgG1 이소타입 대조군 항체, 2C8.vX, 또는 2C8.vX DANA 돌연변이체를 하루 동안 마우스에게 복강내 처치하였다. 방사선조사 후 제2일에, 마우스의 비장세포를 5- (및 6-)카르복시 플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지하고, 절대 세포수 (전체 CFSE 양성 세포)를 측정하고, CD4+, CD8+, 및 CD19+ 세포 상에서 전자적으로 게이팅한 후 CFSE 피크 내의 세포의 백분율을 측정하였다. 이러한 3색 염색을 위해, 하기의 모노클로날 항체들이 사용되었다: PE-표지 항-CD4, PE-표지 항-CD8, 및 PE-표지 CD19. 염색된 세포를 FACSCAN™ 또는 FACSCALIBUR™ 설비 상에서 분석하였다.
도 25A의 결과는 이소타입 대조군, 2C8.vX, 및 2C8.vX.DANA 돌연변이체에 대한 제2일의 전체 CFSE-양성 인간 세포를 나타내고, 고갈이 vX 항체에서 최상이었음을 가리킨다. 도 25B-D는 각각 CD4, CD8, 및 CD19 항체를 사용한 게이팅의 결과를 나타내고, vX 항체가 이소타입 대조군 및 DANA 돌연변이체과 비교하여 LTαβ-양성 T 및 B 세포를 고갈시키는데 최상이었음을 가리킨다.
요약하면, 항체 2C8.vX가 시험관내 ADCC 분석법 및 2가지의 생체내 인간 SCID GVHD 모델에서 LT-발현 세포를 고갈시켰다. 또한 이는 각각 HUVEC 세포 및 293-LTβR 세포를 사용한 기능적 세포 분석법에서 LTα3 및 LTα1β2를 차단하였다. 추가로, 이는 활성화된 붉은털원숭이 1차 세포 및 LTα3 붉은털원숭이 단백질에 의해 결정된 바와 같이 비-인간 영장류 (NHP) 림포톡신과 교차반응하였다.
실시예 19: 친화력이 성숙된 항-LTα 항체 3F12.v14
상기 언급된 항체 3F12이 친화력 성숙되어 인간화 항체 3F12.v14가 된다. 이러한 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 및 CDR이 각각 도 26A 및 26B에 CDR과 함께 제시된다.
상기 언급된 분석법들을 사용하여 LTα3 및 LTαβ에의 결합 및 이의 차단에 대해 테스트했을 때, 항체 2c8.vX가 그랬듯이 3F12.v14 또한 이러한 분자들에 잘 결합하여 이를 차단하였다.
실시예 20: 비-푸코실화 2C8.vX
US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; US 2006/0063254; US 2006/0064781; US 2006/0078990; US 2006/0078991; [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 또는 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004)]에 개시된 세포주 또는 기술을 사용하여 배양함으로써 본원에서의 항체가 푸코스가 없도록 변경될 수 있다. 푸코스가 제거된 항체를 생산하는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 ([Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108 A1 (Presta) 및 WO 2004/056312 A1 (Adams 등, 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스페라제 유전자 FUT8이 녹아웃된 CHO 세포 ([Yamane-Ohnuki et al. 상기 문헌])가 포함된다.
실제로, 항체 2C8.vX가 비-푸코실화되어, 항-LTa 2C8.vX AF로 칭해지는 항체가 생산되었다. [Yamane-Ohnuki et al., 상기 문헌]의 방법에 기술된 바와 같이 FUT8 녹아웃 유전자가 있는 안정적인 CHO 세포주를 사용하여 이러한 분자가 생성되었다. 이는 100％ 비-푸코실화되었다.
2C8.vX의 생물물리학적 성질 (차단 및 결합 데이터 포함)은 ADCC를 제외하고는 비-푸코실화 시 실질적으로 변하지 않았다. 293-LTα1β2 세포를 수반하는 실시예 16에 기재된 프로토콜을 사용하여 실험을 수행함으로써 야생형 및 비-푸코실화 분자의 ADCC 성질을 결정하였다. 결과가 도 27에 제시된다. 도 27은 비-푸코실화 항체 항-LTα 2C8.vX AF에서 야생형 (WT) 항체 (상기 기술된 바와 같이 정상 CHO 세포주에서 생산됨)에 비해 약 10배 증가되었음을 나타낸다.
실시예 21: 과소푸코실화 2C8.vX
포유류 세포에서 비-푸코실화 항체의 높은 수율을 달성하기 위한 별법적인 방식으로, RNAi 접근법을 사용하여, FUT8 유전자의 발현을 녹다운(knock down)시켰다. 플라스미드를 사용하여, 짧은 스페이서 (9nt 헤어핀 루프)에 의해 역-상보적 안티센스 siRNA 서열에 연결된, FUT8의 유전자에 특이적인 19nt (뉴클레오티드) 센스 siRNA 서열로 구성되고, 3' 말단에 5-6개의 U가 이어진 짧은 헤어핀 siRNA를 생산할 수 있다.
입수가능한 CHO FUT8 DNA 서열을 기초로 상이한 영역들을 표적으로 하기 위해 4개의 상이한 RNAi 프로브를 디자인하였다.
이러한 RNAi 프로브들의 효능을 테스트하기 위해, 입수가능한 CHO FUT8 DNA 서열 (Genbank 접속 번호 P_AAC63891)을 사용하여 FLAG 태그가 부착된 FUT8 융합 단백질을 구축하였다. FUT8 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하고, 생성된 PCR 단편을 5' FLAG 태그 서열과 융합시켰다. 태그가 부착된 FUT8 단편을 발현 벡터 내로 클로닝하였다. RNAi 프로브 플라스미드 및 FLAG 태그가 부착된 FUT8 플라스미드를 CHO 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후 세포 용해물을 추출하고, 면역-블롯팅에 의해 항-FLAG M2 항체를 사용하여 FUT8 융합 단백질 수준을 분석하였다. RNAi 브로브의 존재 하에, 대부분의 경우에 융합 단백질 발현이 현저하게 억제될 것으로 예상되었다.
최상의 억제 효과를 나타내는 2개의 프로브를 본원에 기술된 항체, 예컨대 2C8.vX를 발현하는 CHO 세포주 내로 형질감염시켰다. 발현된 항-LT-알파 항체를 단백질 A 컬럼에 의해 정제하고, 하기 기술되는 바와 같은 아스파라긴-연결 올리고당류 (푸코스 함량 포함)의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 및 FcγR 결합 분석법용으로 제출하였다.
MALDI-TOF에 의한 올리고당류의 분석 방법은 일반적으로 하기와 같이 수행되었다: [Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)]의 펩티드-N-글리코시다제-F (PNGase F) 절차를 사용하여 재조합 당단백질로부터 N-연결 올리고당류를 방출시켰다. 간략하게, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF)가 라이닝(lining)된 96-웰 미량역가 플레이트 (Millipore, Bedford, MA)의 웰을 100 ㎕의 메탄올로 컨디셔닝시키고, MILLIPORE™ 멀티스크린 진공 다기관에 진공을 가함으로써 PVDF 막에서 메탄올을 제거하였다. 컨디셔닝된 PVDF 막을 3 × 250 ㎕ 물로 세척하였다. 모든 세척 단계들 사이에, 알맞은 진공을 다기관에 가함으로써 웰을 완전히 배수시켰다. 막을 6 M 구아니딘 히드로클로라이드, 360 mM TRIS 완충제, 2 mM EDTA (pH 8.6)으로 구성된 환원 및 카르복시메틸화 완충제 (RCM)로 세척하였다. 당단백질 샘플 (50 ㎍)을 개별적인 웰에 적용하고, 알맞은 진공에 의해 PVDF 막을 다시 배수시키고, 웰을 2 × 50 ㎕의 RCM 완충제로 세척하였다. 50 ㎕의 0.1 M 디티오트레이톨 (DTT) 용액을 각각의 웰에 첨가하고 미량역가 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 고정된 샘플을 환원시켰다. 진공에 의해 DTT를 제거하고, 웰을 4 × 250 ㎕ 물로 세척하였다. 1 M NaOH에서 신선하게 제조되고 RCM 완충제로 0.1 M로 희석된 50 ㎕의 0.1 M 요오도아세트산 (IAA) 용액의 첨가에 의해 시스테인 잔기가 카르복시메틸화되었다.
실온의 암실에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 카르복시메틸화가 달성되었다. 플레이트에 진공을 적용하여 IAA 용액을 제거하고, 웰을 4 × 250 ㎕ 정제수로 세척하였다. 100 ㎕의 1％ PVP360™ (폴리비닐피롤리딘 360,000 MW) (Sigma) 용액의 첨가 및 실온에서 30분 동안의 인큐베이션에 의해 PVDF 막을 차단하였다. PVP-360™ 용액을 알맞은 진공에 의해 제거하고, 웰을 4 × 250 ㎕ 물로 세척하였다. 펩티드: N-글리코시다제 F (PNGase FTM) 아미다제 (New England Biolabs, Beverly, MA)의 10 mM TRIS 아세테이트 (pH 8.3) 내의 25 유닛/㎖ 용액 25 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 3시간 동안 37℃에서 소화를 진행시켰다. 소화 후, 샘플을 500 ㎕ EPPENDORF™ 튜브로 옮기고, 2.5 ㎕의 1.5 M 아세트산 용액을 각각의 샘플에 첨가하였다. 산성화된 샘플을 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하여, 글리코실아민으로부터의 올리고당류를 히드록실 형태로 전환시켰다. MALDI-TOF 질량 분광 분석 전에, 방출된 올리고당류를 컴팩트 반응 튜브 (US Biochemical, Cleveland, OH) 내로 충전된 양이온-교환 수지 (수소 형태의 AG50W-X8 수지) (Bio-Rad, Hercules, CA) 슬러리의 0.7 ㎖ 베드를 사용하여 탈염시켰다.
양성 방식의 샘플의 MALDI-TOF 질량 분광 분석을 위해, 탈염된 올리고당류 (0.5 ㎕ 분취량)을 2 ㎎의 2,5 디히드록시벤조산 + 0.1 ㎎의 5-메톡시살리실산을 1 ㎖의 25％ 수성 에탄올 내의 1 mM NaCl에 용해시킴으로써 제조된 2,5 디히드록시벤조산 매트릭스 (sDHB) 0.5 ㎕와 함께 스테인레스 표적에 적용하였다. 샘플/매트릭스 혼합물을 진공 건조시킨 후, 분석 전에 대기 수분을 흡수하도록 하였다. 방출된 올리고당류를 PERSEPTIVE BIOSYSTEMS VOYAGER-ELITE™ 질량 분광계 상에서 MALDI-TOF에 의해 분석하였다. 선형 구조 및 지연형 추출의 사용과 함께 20 kV에서 양성 방식으로 질량 분광계가 작동되었다. 약 1100의 레이저 파워를 사용하여, 데이터 합계 방식 (240회의 스캔)으로 데이터를 취득하여, 신호 대 노이즈 비율을 개선시켰다. 표준 올리고당류의 혼합물로 설비를 검정하고, 19-포인트 사비츠키-골레이(Savitsky-Golay) 알고리즘을 사용하여 데이터를 스무딩(smoothing)시킨 후, 질량을 할당하였다. CAESAR 7.2™ 데이터 분석 소프트웨어 패키지 (SciBridge Software)를 사용하여 질량 분광 데이터의 통합을 달성하였다.
인간 Fcγ 수용체에 대한 대조군 및 테스트 물질의 결합을 [Shields et al., J Biol Chem, 276:6591-604 (2001)]에 본래 기술된 절차의 변형된 버젼을 사용하여 평가할 수 있었다.
RNAi로 형질감염된 세포에서 FUT8 RNA 발현이 더 적다는 것을 증명하기 위해, 형질감염된 세포로부터 형질감염 24시간 후 추출된 RNA 샘플을 사용하여 노던 블롯을 수행할 수 있었다. 대조군 플라스미드 (무작위 마우스 DNA 서열, 어떠한 공지된 마우스 단백질에 대해서도 상동성 없음) 및 2개의 RNAi 플라스미드를 함유하는 세포로부터의 전체 RNA를 정제하여, 300-bp 프로브에 혼성화시킬 수 있었다. 내인성 α 1,6-푸코실트랜스페라제 RNA의 녹다운을 정량적 PCR에 의해 추가로 증명할 수 있었다.
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물질 기탁
하기의 물질이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA)에 기탁되었다:
물질 기탁 번호 기탁일
하이브리도마 뮤린 림포톡신 알파2 베타1 s5H3.2.2 PTA-7538 2006년 4월 19일
이러한 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이의 규정 (부다페스트 조약)의 조항 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생육성 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조건 하에, 그리고 Genentech, Inc.와 ATCC 간의 협약을 조건으로 ATCC로부터 입수가능할 것이고, 상기 협약은 관련된 미국 특허의 허여 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시 (어느쪽이든 더 빠른 것), 기탁물의 배양물의 자손을 영구적이고 비제한적으로 일반인이 입수할 수 있는 것을 보장하고, 35 USC § 122 및 이에 따른 특허상표청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 참조와 함께 37 CFR § 1.14 포함)에 따라 자격이 있는 것으로 미국 특허상표청장에 의해 결정된 이가 자손을 입수할 수 있는 것을 보장한다.
본 출원의 특허권자는 기탁된 물질의 배양물이 적절한 조건 하에 배양되었을 때 사망하거나, 손실되거나 파괴되면, 물질이 공고시에 즉시 동일한 또다른 것으로 대체될 것이라는 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 입수가능성은 임의의 정부의 권한 하에 이의 특허법에 따라 수여된 권리를 위반하여 발명을 실행하는 자격증으로 해석되지 않아야 한다.
상기에 기술된 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실행할 수 있도록 하는데 충분한 것으로 간주된다. 본 발명은 본원에 게시된 예에 의해 범주가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에서 제시되고 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 이는 첨부된 청구항의 범주 내에 속한다.
<110> Adams, Camellia W. Grogan, Jane L. Gurney, Austin L. McCutcheon, Krista <120> ANTIBODIES TO LYMPHOTOXIN-ALPHA <130> P2237R1 WO (1) <141> 2007-10-11 <150> US 60/829,257 <151> 2006-10-12 <150> US 60/938,999 <151> 2007-05-18 <160> 110 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 1 Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala Val Ala 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 2 Arg Ala Ser Gln Ala Val Ser Ser Ala Val Ala 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 11 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 14 <223> any amino acid <400> 3 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Xaa Gln Lys Xaa Phe 1 5 10 15 Leu Ala <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 11 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 14 <223> any amino acid <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ala Xaa Gln Lys Xaa Phe 1 5 10 15 Leu 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Ser Ser Tyr Trp Ile Glu 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 2-3 <223> any amino acid <220> <221> Unsure <222> 2-3,6,10,12 <223> Unknown amino acid <220> <221> Xaa <222> 6 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 10 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 12 <223> any amino acid <400> 18 Tyr Xaa Xaa Pro Tyr Xaa Asp Gly Thr Xaa Tyr Xaa Glu Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gly <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 10 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 12 <223> any amino acid <400> 19 Glu Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Glu Glu Phe 1 5 10 15 Lys Gly <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 20 Pro Thr Met Leu Pro Trp Phe Ala Tyr 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 21 Gly Tyr His Gly Tyr 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 22 Gly Tyr His Gly Ala 5 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala Val Ser 20 25 30 Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 35 40 45 Leu Gln Ile Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Ser 20 25 30 Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 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<223> Sequence is synthesized <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Tyr Asn Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Pro Thr Met Leu Pro Trp Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 27 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 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PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 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Xaa <222> 18 <223> any amino acid <400> 50 Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Xaa Ser Lys Xaa Thr Ala Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 Ala Asp <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 52 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Gln Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 53 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 1 5 10 15 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 54 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 5 10 <210> 55 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 55 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 15, 30 <223> R = A or G <220> <221> Unknown <222> 18, 24, 27, 33 <223> N= A, G, C, and T <220> <221> Unknown <222> 22 <223> Y = C or T <400> 56 ggatcatcga tacarctngt vytncancar tcncc 35 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 3 <223> R = A or G <220> <221> Unknown <222> 18 <223> Y = C or T <400> 57 aarggtggta gaagactygc cgcgcggcaa tgg 33 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 58 ggatccgata tccagctggt attgacccaa tct 33 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 59 cccagcacac aaaaaccgtc gccatggact agg 33 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 14, 24, 30 <223> R = A or G <220> <221> Unknown <222> 17, 27 <223> N = A, G, C, and T <400> 60 tgataatcga tgargtncca tttrgtngar 30 <210> 61 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 6 <223> R = A or G <220> <221> Unknown <222> 9, 12 <223> N = A, G, C, and T <400> 61 accttragnc cnagggactg gtccgcgcgg aatgat 36 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 62 tgatcgcgta cgctgaggtt caattggttg ag 32 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 63 ggcagaggag tcggtgttgt ttcccgggtg ctagt 35 <210> 64 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 64 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp 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<221> Xaa <222> 61 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 77 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 157 <223> any amino acid <400> 65 Gln Gly Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr Xaa Tyr 50 55 60 Xaa Glu Glu Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser 65 70 75 Ser Xaa Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu 80 85 90 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Tyr His Gly Tyr Trp 95 100 105 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro 110 115 120 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly 125 130 135 Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 140 145 150 Ser Val Thr Val Thr Trp Xaa Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val 155 160 165 His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser 170 175 180 Ser Ser Val 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63 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 71 gctgcagctg accttctgaa tgtactcc 28 <210> 72 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 72 gccttgcagg agatcttcac tgaagcccca ggcttcatca gctcagctcc 50 <210> 73 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 73 cccactctat ccagtaacta gagaaggtgt atccagtagc cttgcagg 48 <210> 74 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 74 ccacttccag gactaatctc tccaatccac tcaaggccat gtccaggcc 49 <210> 75 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 75 gcccttgaac tcctcattgt aattagtact accacttcca gg 42 <210> 76 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 76 ccgcagagtc ctcagatgtg atcaggctgc tgagctggat gtaggcagtg 50 ttggaggatt tgtctgcagt gaatgttgcc ttgcc 85 <210> 77 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 77 ggctgaggag acggtgactg tggtgccttg gccccagtag ccatggtacc 50 cgtctgcaca gtaatagacc tc 72 <210> 78 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 78 ccagactgct gcagctgacc ttgtgaatgt actccagttg c 41 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 15 <223> R = A or G <220> <221> Unknown <222> 21 <223> N = T, G, A or C <400> 79 gccatagata tcgtratgca ncagtctc 28 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 15 <223> Y = C or T <220> <221> Unknown <222> 18 <223> K = G or T <400> 80 ccatggttcg acctytaktt t 21 <210> 81 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 20 <223> Y = C or T <220> <221> Unknown <222> 26 <223> S = C or G <400> 81 gatcgacgta cgctgaggty cagctscagc tscagcagtc tgg 43 <210> 82 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unknown <222> 3, 5, 18 <223> R = A or G <220> <221> Unknown <222> 4, 12 <223> D = A or G or T <220> <221> Unknown <222> 6 <223> H = A or C or T <220> <221> Unknown <222> 7 <223> S = C or G <220> <221> Unknown <222> 19 <223> M = A or C <400> 82 tgrdrhsagt gdcagagrmg tcggaggtgg ttcccgggta gaca 44 <210> 83 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 83 cctggtttct gttgatacca ggctacagcg gaagacacag cctgactggc 50 acggcagg 58 <210> 84 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 84 gcgagaaggg actccagtgt aacggtggga tgcagagtaa atctgtagtt 50 tcggagc 57 <210> 85 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 85 ggtaccctgt ccgaacgtcc aaggagtaga ataatgttgc tgacagtaat 50 aagttgc 57 <210> 86 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 86 ggtcagagtg aaatccgtcc cagatccgga tccagagaag cg 42 <210> 87 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 87 ggcctgacgg acccaatgga tcacatagct ggtgaatctg tagccagaag 50 ctgc 54 <210> 88 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 88 ccccttgaac ttctcgttat agttggtgcc gtcgttataa ggattgttat 50 aaccaaccca ctcgaggcc 69 <210> 89 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 89 ggttccttga ccccagtagg cgaaccatgg gagcattgtg ggtcgagaac 50 aataatagac ggcagtgtcc tcagc 75 <210> 90 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 90 ccgtcgttat aaggattgtt ataactaacc cactcgaggc c 41 <210> 91 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 91 catctgcagg tatagtgtgt ttttcgaatt gtcacgactg atagtgaagc 50 gccccttgaa c 61 <210> 92 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 92 ccatgggagc attgtgggtc gagcacaata atagacggca gtgtcc 46 <210> 93 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 93 ggaagacttc gcaacttatt actgtcagca acattattct actccttgga 50 cgttcggaca gggtaccaag gtgg 74 <210> 94 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 94 ggacactgcc gtctattatt gttctcgacc cacaacgctc ccatggttcg 50 cctactgggg tcaaggaacc ctgg 74 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 95 Gln Glu His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 96 Gln Gln His Tyr Tyr Thr Pro Trp Thr 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 97 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 98 Gln Lys Thr Phe Ser Thr Pro Trp Thr 5 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 99 Gln Gln Phe Tyr Ser Val Pro Trp Thr 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 100 Gln Gln Lys Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 5 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 2-3 <223> any amino acid <220> <221> Unsure <222> 2-3,6,10,12 <223> Unknown amino acid <220> <221> Xaa <222> 6 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 10 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 12 <223> any amino acid <400> 101 Tyr Xaa Xaa Pro Tyr Xaa Ala Gly Thr Xaa Tyr Xaa Glu Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gly <210> 102 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 102 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Ser 20 25 30 Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu 80 85 90 Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg <210> 103 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Tyr Asn Asn Pro Tyr Asn Ala Gly Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Pro Thr Met Leu Pro Trp Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 104 <211> 1704 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 104 gaagttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc cagggggctc 50 actccgtttg tcctgtgcag cttctggcta cacattcacc agctatgtga 100 tccattgggt ccgtcaggcc ccgggtaagg gcctcgagtg ggttggttat 150 aacaatcctt ataacgccgg caccaactat aacgagaagt tcaaggggcg 200 cttcactatc agttctgaca agtcgaaaaa cacagcatac ctgcagatga 250 acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgttc tcgacccaca 300 atgctcccat ggttcgccta ctggggtcaa ggaaccctgg tcaccgtctc 350 ctcagcctcc gaagttcagc tggtggagtc tggcggtggc ctggtgcagc 400 cagggggctc actccgtttg tcctgtgcag cttctggcta cacattcacc 450 agctatgtga tccattgggt ccgtcaggcc ccgggtaagg gcctcgagtg 500 ggttggttat aacaatcctt ataacgccgg caccaactat aacgagaagt 550 tcaaggggcg cttcactatc agttctgaca agtcgaaaaa cacagcatac 600 ctgcagatga acagcctgcg tgctgaggac actgccgtct attattgttc 650 tcgacccaca atgctcccat ggttcgccta ctggggtcaa ggaaccctgg 700 tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 750 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 800 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc 850 tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 900 tactccctca gcagcgtggt gactgtgccc tctagcagct tgggcaccca 950 gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca 1000 agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1050 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa 1100 acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg 1150 tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1200 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta 1250 caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 1300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1350 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 1400 acaggtgtac accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg 1450 tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1500 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1550 cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 1600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1650 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 1700 taaa 1704 <210> 105 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 105 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga 50 tagggtcacc atcacctgcc gtgccagtca ggctgtgtct tccgctgtag 100 cctggtatca acagaaacca ggaaaagctc cgaaactact gatttactct 150 gcatcccacc gttacactgg agtcccttct cgcttctctg gatccggatc 200 tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg gaagacttcg 250 caacttatta ctgtcaggaa tcttattcta ctccttggac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat 350 cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt 400 gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 450 gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga 500 cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag 550 cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 106 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 106 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Tyr Asn Asn Pro Tyr Asn Ala Gly Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Pro Thr Met Leu Pro Trp Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 110 115 120 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 125 130 135 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 140 145 150 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 155 160 165 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 170 175 180 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 185 190 195 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 200 205 210 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 215 220 225 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 320 325 330 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 335 340 345 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 350 355 360 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 365 370 375 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 380 385 390 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 395 400 405 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 410 415 420 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 425 430 435 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445 <210> 107 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 107 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Val Ser 20 25 30 Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu 80 85 90 Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 108 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 108 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu 20 25 30 Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60 Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 80 85 90 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly 95 100 105 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 110 <210> 109 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Glu Ile Asn Pro Gly Ser Gly Ser Thr Ile Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Tyr His Gly Tyr Trp Gly 95 100 105 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> sequence is synthesized <220> <221> Xaa <222> 3 <223> any amino acid <220> <221> Xaa <222> 12 <223> any amino acid <400> 110 Glu Ile Xaa Pro Gly Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Xaa Glu Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gly

Claims (102)

  1. (a) KASQAVSSAVA (서열 1) 또는 RASQAVSSAVA (서열 2)인 아미노산 A1-A11을 포함하거나 또는 KSSQSLLYSTNQKNFLA (서열 3) 또는 KSSQSLLYSANQKNFLA (서열 4) 또는 KSSQSLLYSTNQKNALA (서열 6)인 아미노산 A1-A17을 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 상보성-결정 영역 (CDR)-L1 서열;
    (b) SASHRYT (서열 7) 또는 WASTRDS (서열 8)인 아미노산 B1-B7을 포함하는 CDR-L2 서열;
    (c) QQHYSTPWT (서열 9) 또는 QENYSTPWT (서열 11) 또는 QQYYSYPRT (서열 13) 또는 QQYASYPRT (서열 14) 또는 QQYYAYPRT (서열 15)인 아미노산 C1-C9를 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-L3 서열;
    (d) GYTFTSYVIH (서열 16) 또는 GYTFSSYWIE (서열 17)인 아미노산 D1-D10을 포함하는 CDR-H1 서열;
    (e) YNNPYNDGTNYNEKFKG (서열 18) 또는 EISPGSGSTNYNEEFKG (서열 19) 또는 YNNPYNAGTNYNEKFKG (서열 101) 또는 EINPGSGSTIYNEKFKG (서열 110)인 아미노산 E1-E17을 포함하고, 이때 N은 임의의 아미노산인 CDR-H2 서열; 및
    (f) PTMLPWFAY (서열 20)인 아미노산 F1-F9를 포함하거나 또는 GYHGY (서열 21) 또는 GYHGA (서열 22)인 아미노산 F1-F5를 포함하는 CDR-H3 서열
    로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 상보성-결정 영역 (CDR) 서열을 포함하는 단리된 항-림포톡신-α (LTα) 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 3이 KSSQSLLYSTAQKNFLA (서열 5)인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 11이 QESYSTPWT (서열 10) 또는 QEVYSTPWT (서열 12)인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CDR-L1 서열이 서열 2 또는 3 또는 4 또는 6인 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 1 또는 2 및 7 및 9 모두, 또는 서열 1 또는 2 및 7 또는 8 및 11 모두, 또는 서열 16, 18, 및 20 모두, 또는 서열 16, 101, 및 20 모두를 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 3, 8, 및 13 모두, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8 및 13 모두, 또는 서열 3, 8, 및 14 또는 15 모두, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 14 또는 15 모두, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22 모두, 또는 서열 17, 110, 및 21 모두를 포함하는 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 서열 1 또는 2 및 7 및 9의, 또는 서열 1 또는 2 및 7 또는 8 및 11의, 또는 서열 3, 8, 및 13의; 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 13의, 또는 서열 3, 8, 및 14 또는 15의, 또는 서열 4, 5 또는 6, 8, 및 14 또는 15의 CDR-L1 내지 CDR-L3 아미노산 서열 모두, 및 (ii) 서열 16, 18, 및 20의, 또는 서열 16, 101, 및 20의, 또는 서열 17, 19, 및 21 또는 22의, 또는 서열 17, 110, 및 21의 CDR-H1 내지 CDR-H3 아미노산 서열 모두를 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 κ 서브그룹 1 컨센서스(consensus) 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 인간 서브그룹 III 컨센서스 프레임워크 서열을 포함하는 항체.
  10. 제9항에 있어서, 프레임워크 서열이 위치 71, 73, 또는 78에서의 치환을 포함하는 항체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 치환이 R71A, N73T, 또는 N78A 또는 이의 조합인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 림포톡신-α3 삼량체 (LTα3)에 결합하고, LTα3와 종양 괴사 인자 수용체-I (TNFRI) 및 종양 괴사 인자 수용체-II (TNFRII)의 상호작용을 차단하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 림포톡신-αβ 이종이량체 (LTαβ) 복합체에 결합하는 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, LTαβ 기능을 차단하는 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 있고, 시험관내 관절염 분석법에서 류머티스성 관절염과 관련된 염증성 사이토카인의 수준을 감소시키는 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, LTαβ와 림포톡신-베타 수용체 (LTβ-R)의 상호작용을 차단하는 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, LTα-양성 세포를 고갈시키는 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, LTαβ-발현 세포를 조정하는 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 항체.
  20. 제19항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  21. 제20항에 있어서, 프레임워크 서열의 적어도 일부분이 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 LTα에 약 10-12 M 이상의 친화력으로 결합하는 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 이소타입의 항체인 항체.
  24. 제23항에 있어서, IgG가 IgG1 또는 IgG2a인 항체.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 야생형 Fc 영역인 항체.
  26. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 서열 Fc 영역이 있는 동일한 항체와 비교하여 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 기능이 증가된 항체를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환을 Fc 영역 내에 추가로 포함하는 항체.
  27. 제26항에 있어서, 1개 내지 3개의 아미노산 치환을 Fc 영역 내에 추가로 포함하는 항체.
  28. 제26항에 있어서, Fc 영역 내에 268D, 또는 298A, 또는 326D, 또는 333A, 또는 334A, 또는 298A + 333A, 또는 298A + 334A, 또는 239D + 332E, 또는 239D + 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332A, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 330L 및 332E 및 272Y 및 254T 및 256E, 또는 250Q + 428L, 또는 265A, 또는 297A인 위치들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합에서의 아미노산 치환이 있고, 이때 265A는 297A의 부재 하에 치환되고, 297A는 265A의 부재 하에 치환되는 항체.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LTα에 대한 1가 친화력이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 접속 번호 PTA-7538 하에 기탁된 하이브리도마 세포주 (하이브리도마 뮤린(murine) 림포톡 신(Lymphotoxin) 알파2 베타1 s5H3.2.2)에 의해 생산된 뮤린 항체의 인간 LTα에 대한 1가 친화력과 대략 동일하거나 이보다 큰 항체.
  30. 제29항에 있어서, 1가 친화력이 Kd 값으로 표현되는 인간화 항체.
  31. 제30항에 있어서, 1가 친화력이 광학 바이오센서 또는 방사선면역분석법에 의해 측정되는 인간화 항체.
  32. 서열 23 또는 24를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 25 또는 26을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 23 및 25 양쪽 모두를 포함하거나 서열 24 및 26 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-림포톡신-α (LTα) 항체.
  33. 서열 27 또는 28을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 29 또는 30 또는 31을 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 27 및 29 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 27 및 30 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 27 및 31 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 28 및 30 양쪽 모두를 포함하거나, 서열 28 및 31 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-림포톡신-α (LTα) 항체.
  34. 서열 102를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 103을 포함하는 중쇄 가 변 도메인이 있거나, 또는 서열 102 및 103 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-림포톡신-α (LTα) 항체.
  35. 서열 108을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 서열 109를 포함하는 중쇄 가변 도메인이 있거나, 또는 서열 108 및 109 양쪽 모두를 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인이 있는 항-림포톡신-α (LTα) 항체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산된 동일한 항체 상의 푸코스의 양에 비해 푸코스가 감소된 항체.
  37. 제35항에 있어서, 푸코스가 없는 항체.
  38. Fc 영역이 있는 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 이때 조성물 내의 항체의 약 20-100％가 푸코스가 없는 Fc 영역 내의 성숙형 코어(core) 탄수화물 구조를 포함하는 항체 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 238, 239, 246, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 314, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 434, 435, 437, 438 및 439로 구성된 군으로부터 선택된 Fc 영역의 위치들 중 임의의 하나 또는 이들의 임의의 조합에서 A, D, E, L, Q, T, 및 Y로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산을 치환함으로써 야생형 IgG Fc 서열과 비교하여 항체의 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존적 세포독성 (CDC), 또는 약동학적 성질 중 하나 이상이 변화되도록 변경된 Fc 영역을 항체가 포함하는 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 항체가 인간 이펙터 세포의 존재 하에 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성이 있거나 또는 인간 야생형 IgG1 Fc를 포함하는 동일한 항체와 비교하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에 증가된 ADCC 활성을 갖는 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 항체가 268D 또는 326D 또는 333A + 334A, 또는 298A + 333A, 또는 298A + 334A, 또는 239D + 332E, 또는 239D + 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332A, 또는 239D + 268D 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 332E, 또는 239D + 268D 및 283L 및 298A 및 326A 및 332E, 또는 239D + 330L 및 332E인 Fc 치환을 추가로 포함하는 조성물.
  42. 제38항에 있어서, 항체가 FcγRIII에 결합하는 조성물.
  43. 제38항에 있어서, 항체가 당단백질의 Fc 영역에 부착된 푸코스를 포함하는 성숙형 코어 탄수화물 구조가 있는 당단백질보다 더 양호한 친화력으로 FcγRIII에 결합하거나, 또는 더 효과적으로 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 매개하는 조성물.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에 의해 생산된 조성물.
  45. 제44항에 있어서, CHO 세포가 Lec13 세포인 조성물.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 푸코실트랜스페라제(fucosyltransferase) 유전자가 없는 포유류 세포에 의해 생산된 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 푸코실트랜스페라제 유전자가 FUT8 유전자인 조성물.
  48. 제38항에 있어서, 항체에 이의 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 양분화(bisecting) N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 없는 조성물.
  49. 제38항에 있어서, 항체에 이의 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 양분화 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)이 있는 조성물.
  50. 제38항에 있어서, 항체에 이의 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 갈락토스 잔기가 있는 조성물.
  51. 제38항에 있어서, 항체에 이의 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 갈락토스 잔기가 없는 조성물.
  52. 제38항에 있어서, 항체에 이의 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 시알산 잔기가 있는 조성물.
  53. 제38항에 있어서, 항체에 이의 성숙형 코어 탄수화물 구조에 부착된 하나 이상의 시알산 잔기가 없는 조성물.
  54. 제38항에 있어서, 약 2％ 이상의 비-푸코실화(afucosylated) 항체를 포함하는 조성물.
  55. 제38항에 있어서, 약 4％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함하는 조성물.
  56. 제38항에 있어서, 약 10％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함하는 조성물.
  57. 제38항에 있어서, 약 19％ 이상의 비-푸코실화 항체를 포함하는 조성물.
  58. 제38항에 있어서, 약 100％의 비-푸코실화 항체를 포함하는 조성물.
  59. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입(idiotype) 항체.
  60. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체 및 담체를 포함하는 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 제2 의약을 추가로 포함하고, 이때 항-LTα 항체가 제1 의약인 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 제2 의약이 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제, BAFF 길항제, 질환-변형 항-류머티즘 약물 (DMARD), 인테그린 길항제, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 사이토카인 길항제, 또는 이의 조합물인 조성물.
  63. 2006년 4월 19일에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)에 기탁 번호 PTA-7538 하에 기탁된 하이브리도마.
  64. 제63항의 하이브리도마에 의해 분비된 항체.
  65. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  66. 제65항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  67. 제65항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  68. 제67항의 숙주 세포를 항체를 생산하기 위한 조건 하에 배양하고, 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체의 생산 방법.
  69. 세포 또는 조직을 유효량의 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 림포톡신-α-활성화 세포 증식을 억제하는 방법.
  70. 유효량의 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 자가면역 장애를 치료하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 자가면역 장애가 류머티스성 관절염, 루푸스, 베게너(Wegener) 질환, 염증성 장 질환 (IBD), 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈 전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증 (MS), 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증 근육무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노(Raynaud) 증후군, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 사구체신염, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 헬리코박터-파일로리(helicobacter-pylori) 위염, 및 만성 C형 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 자가면역 장애가 류머티스성 관절염, MS, 쇼그렌 증후군, 루푸스, 중증 근육무력증, 또는 IBD인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 자가면역 장애가 류머티스성 관절염, IBD, 루푸스, 또는 MS인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 루푸스가 전신 홍반 루푸스 또는 루푸스 신염이고, IBD가 크론(Crohn) 질환 또는 궤양성 대장염인 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 의약이 유효량으로 투여되고, 이때 항-LTα 항체가 제1 의약인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 제2 의약이 1가지를 초과하는 의약인 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 제2 의약이 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제, BAFF 길항제, 질환-변형 항-류머티즘 약물 (DMARD), 인테그린 길항제, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 사이토카인 길항제, 또는 이의 조합물인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 제2 의약이 DMARD 또는 메토트렉세이트인 방법.
  79. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 장애에 대한 의약으로 이전에 치료된 적이 없는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 대상이 TNF 길항제로 이전에 치료된 적이 없는 방법.
  81. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 장애에 대한 의약으로 이전에 치료된 적이 있는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 대상이 TNF 길항제 또는 DMARD로 이전에 치료된 적이 있는 방법.
  83. 제70항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 네이키드(naked) 항체인 방법.
  84. 제70항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 또다른 분자에 접합된 방법.
  85. 제84항에 있어서, 또다른 분자가 세포독성제인 방법.
  86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 정맥내 투여되는 방법.
  87. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 피하 투여되는 방법.
  88. 제70항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 류머티스성 관절염이 있고, 항체가 대상에서 주요 임상 응답을 유도하는 방법.
  89. 제70항 내지 제88항에 있어서, 대상에서 하나 이상의 조절성 사이토카인, 항-핵 항체 (ANA), 항-류머티즘 인자 (RF) 항체, 크레아티닌, 혈액 요소 질소, 항-내피 항체, 항-중성구 세포질 항체 (ANCA), 침윤성 CD20 세포, 항-이중 가닥 DNA (dsDNA) 항체, 항-Sm 항체, 항-핵 리보핵산단백질 항체, 항-인지질 항체, 항-리보솜 P 항체, 항-Ro/SS-A 항체, 항-Ro 항체, 항-La 항체, 쇼그렌 관련 항원 A 또는 B (SS-A 또는 SS-B)에 대해 지시된 항체, 동원체 단백질 B (CENP B) 또는 동원체 단백질 C (CENP C)에 대해 지시된 항체, ICA69에 대한 자가항체, 항-스미스(Smith) 항원 (Sm) 항체, 항-핵 리보핵산단백질 항체, 항-리보솜 P 항체, 중성구의 핵 또는 핵주위 구역을 염색하는 자가항체 (pANCA), 항-사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 항체, GM1 갱글리오사이드 또는 GQ1b 갱글리오사이드에 대한 교차-반응성 항체, 항-아세틸콜린 수용체 (AchR), 항-AchR 서브타입, 또는 항-근육 특이적 티로신 키나제 (MuSK) 항체, 혈청 항-내피 세포 항체, IgG 또는 항-데스모글레인 (Dsg) 항체, 항-동원체, 항-토포이소머라제-1 (Scl-70), 항-RNA 폴리머라제 또는 항-U3-리보핵산단백질 (U3-RNP) 항체, 항-사구체 기저막 (GBM) 항체, 항-사구체 기저막 (GBM) 항체, 항-미토콘드리아 (AMA) 또는 항-미토콘드리아 M2 항체, 항-갑상선 페록시다제 (TPO), 항-갑상선글로불린 (TG) 또는 항-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 항체, 항-핵산 (AN), 항-액틴 (AA) 또는 항-평활근 항원 (ASM) 항체, IgA 항-근섬유막, IgA 항-조직 트랜스글루타미나제, IgA 항-글리아딘 또는 IgG 항-글리아딘 항체, 항-CYP21A2, 항-CYP11A1 또는 항-CYP17 항체, 항-리보핵산단백질 (RNP), 또는 근육염-특이적 항체, 항-말이집 관련 당단백질 (MAG) 항체, 항-C형 간염 바이러스 (HCV) 항체, 항-GM1 갱글리오사이드, 항-술페이트-3-글리쿠로닐 파라글로보사이드 (SGPG), 또는 IgM 항-당접합체 항체, IgM 항-갱글리오사이드 항체, 항-갑상선 페록시다제 (TPO), 항-갑상선글로불린 (TG) 또는 항-갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR) 항체, 항-말이집 염기성 단백질 또는 항-말이집 희소돌기아교세포 당단백질 항체, IgG의 Fc 부분에 대해 지시된 IgM 류머티즘 인자 항체, 항-인자 VIII 항체, 또는 이의 조합물의 수준이 비정상적인 방법.
  90. 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 2주에 약 1회 이하로 투여되는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 항체가 1개월에 약 1회로 투여되는 방법.
  92. 용기 및 용기 내에 함유된, 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물, 및 조성물이 자가면역 장애를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 가리키는 포장 삽입물을 포함하는 제조품.
  93. 제92항에 있어서, 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 이때 항체가 제1 의약이며, 대상을 제2 의약으로 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 지침서를 추가로 포함하는 제조품.
  94. 제93항에 있어서, 제2 의약이 면역억제제, B-세포 표면 마커에 결합하는 길항제, BAFF 길항제, 질환-변형 항-류머티즘 약물 (DMARD), 인테그린 길항제, 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAID), 사이토카인 길항제, 또는 이의 조합물인 제조품.
  95. 표적 수신자에게 자가면역 질환을 나타내는 환자 또는 환자 집단을 치료하기 위한 항체 또는 이의 제약 조성물의 용도를 판촉하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 제약상 허용가능한 조성물을 광고하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 자가면역 질환이 류머티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 또는 염증성 장 질환인 방법.
  97. 함께 포장된, 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물, 및 이러한 항체 또는 제약 조성물이 자가면역 질환이 있는 환자를 치료하는데 지시된다는 것을 나타내는 표지를 포함하는 제조품.
  98. 제97항에 있어서, 자가면역 질환이 류머티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 또는 염증성 장 질환인 방법.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하고, 이때 항체가 제1 의약이며, 환자를 유효량의 제2 의약으로 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 지침서를 추가로 포함하는 제조품.
  100. 제99항에 있어서, 제2 의약이 DMARD 또는 메토트렉세이트인 제조품.
  101. 항체 또는 항체의 제약 조성물과 이러한 항체 또는 제약 조성물이 자가면역 질환을 나타내는 환자를 치료하는데 지시된다는 것을 나타내는 표지를 포장물에서 조합시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 제약 조성물을 포장하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 자가면역 질환이 류머티스성 관절염, 루푸스, 다발성 경화증, 또는 염증성 장 질환인 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017026843A1 (ko) * 2015-08-12 2017-02-16 가톨릭대학교 산학협력단 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080415B2 (en) * 2008-09-26 2011-12-20 Eureka Therapeutics, Inc. Modified host cells and uses thereof
CA2737379A1 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 Genentech, Inc. Biological markers predictive of rheumatoid arthritis response to lymphotoxin antagonists
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
WO2011060015A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 Genentech, Inc. Methods and compositions for detecting target proteins
KR20150038556A (ko) * 2010-04-07 2015-04-08 애브비 인코포레이티드 ＴＮＦ-α 결합 단백질
CA2801509A1 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Treatment drug for autoimmune diseases and allergic diseases
CN102621310B (zh) * 2011-01-28 2014-07-02 上海科新生物技术股份有限公司 胶体金层析法抗u1-rnp抗体检测试纸及其制备方法
KR20130036993A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 ｃ-Ｍｅｔ의 ＳＥＭＡ 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체
WO2013114164A1 (en) * 2012-01-30 2013-08-08 Dr. Reddy's Laboratories Limited Method for obtaining glycoprotein composition with increased afucosylation content
JP6419068B2 (ja) 2012-05-21 2018-11-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド 血液脳関門輸送の安全性を改善するための方法
GB201314052D0 (en) * 2013-08-06 2013-09-18 Apitope Int Nv Peptides
CN105829543B (zh) * 2013-10-14 2021-06-01 西纳福克斯股份有限公司 糖基改造的抗体、抗体-缀合物及其制备方法
WO2015057906A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 Janssen Biotech, Inc. Cd200 receptor 1 agonists
WO2017079165A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of making fucosylated and afucosylated forms of a protein
EP3796935A4 (en) * 2018-05-23 2022-03-16 The Jackson Laboratory ANTI-NGLY-1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CN111285936A (zh) * 2020-03-11 2020-06-16 北京双赢科创生物科技有限公司 靶向肿瘤的酸性敏感纳米肽段及其应用

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4920196A (en) 1982-07-30 1990-04-24 Genentech, Inc. Human lymphotoxin
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5683688A (en) 1984-05-31 1997-11-04 Genentech, Inc. Unglycosylated recombinant human lymphotoxin polypeptides and compositions
NZ212207A (en) * 1984-05-31 1991-07-26 Genentech Inc Recombinant lymphotoxin
US4959457A (en) 1984-05-31 1990-09-25 Genentech, Inc. Anti-lymphotoxin
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
CA1338518C (en) 1987-09-23 1996-08-13 Joyce M. Zarling Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells
JPH023698A (ja) 1988-06-20 1990-01-09 Denki Kagaku Kogyo Kk ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6475787B1 (en) 1989-07-28 2002-11-05 Wyeth Method for producing monoclonal antibodies
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
US7030080B2 (en) 1990-06-27 2006-04-18 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
US5670149A (en) 1990-06-27 1997-09-23 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, Lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
EP0536299B1 (en) 1990-06-27 2001-06-06 Biogen, Inc. Surface complexed lymphotoxin
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
RU2048521C1 (ru) * 1992-05-25 1995-11-20 Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ Способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US20050260201A1 (en) 1993-01-29 2005-11-24 Centocor, Inc. Methods of treating rheumatoid arthritis using anti-TNF receptor fusion proteins
US5747023A (en) 1994-07-01 1998-05-05 Genentech, Inc. Cancer therapy using lymphotoxin
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6312691B1 (en) 1996-01-26 2001-11-06 Jeffrey L. Browning Lymphotoxin-α/β complexes and anti-lympotoxin-β receptor antibodies as anti-tumor agents
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
US5925351A (en) 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6027888A (en) 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US5747373A (en) * 1996-09-24 1998-05-05 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Ltd. Nitride-oxide sidewall spacer for salicide formation
EE05213B1 (et) 1996-10-25 2009-10-15 Biogen, Incorporated Lmfotoksiin- β retseptori (LT- β-R) blokeeriva agensi kasutamine ja LT- β-R-i blokeerivat agensit ning CD40L-i blokeerivat agensit sisaldav farmatseutiline kompositsioon
US7255854B1 (en) 1996-10-25 2007-08-14 Biogen, Inc. Use of lymphotoxin-β receptor blocking agents for the treatment of antibody mediated immunological diseases
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
JP4482233B2 (ja) 1998-07-29 2010-06-16 協和発酵キリン株式会社 新規ポリペプチド
TR200504220T2 (tr) 1998-12-17 2007-04-24 Biogen Idec Ma Inc. Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem.
ES2694002T3 (es) * 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2364026C (en) 1999-03-02 2012-08-21 Centocor, Inc. Anti-tnf.alpha. antibodies in therapy of asthma
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US7056695B2 (en) 2000-03-02 2006-06-06 Xencor TNF-α variants
NZ521540A (en) 2000-04-11 2004-09-24 Genentech Inc Multivalent antibodies and uses therefor
NZ522700A (en) * 2000-06-16 2006-02-24 Human Genome Sciences Inc Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US20060034828A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAcMAN5GLCNAC2 glycoform
DE60139720D1 (de) 2000-06-28 2009-10-08 Glycofi Inc Verfahren für die Herstellung modifizierter Glykoproteine
US20060029604A1 (en) 2000-06-28 2006-02-09 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
US20060034830A1 (en) 2000-06-28 2006-02-16 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GalGlcNAcMan5GLcNAc2 glycoform
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
GEP20063752B (en) 2000-10-13 2006-02-27 Biogen Inc Humanized Anti-LT-Beta-R Antibodies
IL156618A0 (en) 2000-12-28 2004-01-04 Altus Biologics Inc Crystals of whole antibodies and fragments thereof, methods for the preparation thereof and diagnostic kits utilizing the same
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
US20040038349A1 (en) 2001-07-27 2004-02-26 Hilbert David M. Heteromultimeric TNF ligand family members
CN1555411A (zh) 2001-08-03 2004-12-15 ���迨�����＼���ɷݹ�˾ 抗体-依赖性细胞毒性增大的抗体糖基化变体
EP1443961B1 (en) * 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
AU2002359495A1 (en) 2001-11-30 2003-06-17 Centocor, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JP4429726B2 (ja) 2002-02-08 2010-03-10 ワイス 炎症性応答を調節するための組成物および方法
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
WO2003089575A2 (en) 2002-04-15 2003-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to tl5
NZ537965A (en) 2002-07-01 2008-04-30 Biogen Idec Inc Humanized anti-lymphotoxin beta receptor antibodies
US6873910B2 (en) * 2002-10-22 2005-03-29 Qualcomm Incorporated Procedure for searching for position determination signals using a plurality of search modes
EP1565214A2 (en) 2002-10-31 2005-08-24 Biogen Idec MA Inc. Treatment of immunological renal disorders by lymphotoxin pathway inhibitors
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CN1753692A (zh) 2002-12-20 2006-03-29 比奥根艾迪克Ma公司 淋巴毒素β受体药剂与化疗剂的联合用药
CA2517145C (en) 2003-03-05 2017-08-01 Halozyme, Inc. Soluble hyaluronidase glycoprotein (shasegp), process for preparing the same, uses and pharmaceutical compositions comprising thereof
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
WO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 融合蛋白質組成物
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
RS55723B1 (sr) 2003-11-05 2017-07-31 Roche Glycart Ag Molekuli koji se vezuju za antigen sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
KR100772800B1 (ko) 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
EP1699486A4 (en) 2003-12-08 2007-07-18 Centocor Inc ANTI-LYMPHOTOXIN HUMAN ALPHA ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
CA2573842A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a gal2glcnac2man3glcnac2 glycoform
EP1776385A1 (en) 2004-07-21 2007-04-25 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a glcnac2man3glcnac2 glycoform
CA2573864A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a glcnacman5glcnac2 glycoform
AU2005269765A1 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a Man3GlcNAc2 glycoform
WO2006014726A2 (en) 2004-07-21 2006-02-09 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a man5glcnac2 glycoform
KR20070057839A (ko) 2004-08-19 2007-06-07 제넨테크, 인크. 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체
JP2006228261A (ja) 2005-02-15 2006-08-31 Micron Technology Inc デジット線絶縁ゲートの負電圧駆動
BRPI0611445A2 (pt) 2005-05-09 2010-09-08 Glycart Biotechnology Ag molécula de ligação a antìgeno glicomanipulada, polinucleotìdeo, polipeptìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção, uso e composição farmacêutica

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017026843A1 (ko) * 2015-08-12 2017-02-16 가톨릭대학교 산학협력단 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US8642740B2 (en) 2014-02-04
MA30876B1 (fr) 2009-11-02
US8541552B2 (en) 2013-09-24
RU2009117680A (ru) 2010-11-20
PE20080980A1 (es) 2008-09-02
US20110150865A1 (en) 2011-06-23
CL2007002926A1 (es) 2008-05-16
CA2665644A1 (en) 2008-05-29
US8216807B2 (en) 2012-07-10
WO2008063776A2 (en) 2008-05-29
AU2007324135A1 (en) 2008-05-29
NO20091841L (no) 2009-07-13
AR063257A1 (es) 2009-01-14
US20090285830A1 (en) 2009-11-19
US20130011412A1 (en) 2013-01-10
EP2084188A2 (en) 2009-08-05
IL197937A0 (en) 2011-08-01
UA94484C2 (uk) 2011-05-10
RU2486201C2 (ru) 2013-06-27
NZ576032A (en) 2012-03-30
TWI414531B (zh) 2013-11-11
JP2010506568A (ja) 2010-03-04
AU2007324135B2 (en) 2013-06-27
US20110208673A1 (en) 2011-08-25
MX2009003774A (es) 2009-04-22
US7923011B2 (en) 2011-04-12
JP5298021B2 (ja) 2013-09-25
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