WO2017026843A1 - 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법 - Google Patents

만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법 Download PDF

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WO2017026843A1
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cobll1
protein
myelogenous leukemia
chronic myelogenous
expression
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PCT/KR2016/008897
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김동욱
김수현
김홍태
한승훈
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가톨릭대학교 산학협력단
성균관대학교 산학협력단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for providing information regarding chronic myelogenous leukemia.
  • Leukemia is a general term for a disease in which leukocytes proliferate oncologically. Types of leukemia can be divided into myeloid leukemia and lymphoid leukemia according to the leukocyte origin of leukemia, and divided into acute leukemia and chronic leukemia according to the progress rate. The clinical manifestations of leukemia vary depending on the type of disease and the nature of the cells involved. Lymphocytic leukemia is caused by lymphoid blood cells, myeloid leukemia by myeloid blood cells, and chronic myelogenous leukemia by malignant clones of pluripotent hematopoietic stem cells.
  • Leukemia is a general term for a disease in which leukocytes proliferate oncologically. Types of leukemia can be divided into myeloid leukemia and lymphoid leukemia according to the leukocyte origin of leukemia, and divided into acute leukemia and chronic leukemia according to the progress rate. The clinical manifestations of leukemia vary depending on the type of disease and the nature of the cells involved. Lymphocytic leukemia is caused by lymphoid blood cells, myeloid leukemia by myeloid blood cells, and chronic myelogenous leukemia by malignant clones of pluripotent hematopoietic stem cells.
  • chronic myeloid leukemia is a malignant blood cancer in which adult hematopoietic stem cells proliferate in the bone marrow and develop abnormally increased various blood cell cells invading peripheral blood or other organs.
  • the most common method for the diagnosis of chronic myelogenous leukemia is to detect the Philadelphia chromosome by chromosome test. In 95% of patients with chronic myelogenous leukemia, translocation between chromosome 9 and chromosome 22 is found. A portion of the abl (abelson oncogene) gene at chromosome q34 is translocated to the break point cluster region (bcr) gene at chromosome q11.2 at 22.
  • BCR-ABL1 rearrangement results in the BCR-ABL1 rearrangement ( BCR-ABL1 rearrangement) (domestic application patent 10-2012-002466).
  • BCR-ABL1 rearrangement results in many studies.
  • many studies are being actively conducted to confirm the rearrangement of BCR-ABL to diagnose chronic myelogenous leukemia and predict the prognosis.
  • leukemias without mutations in the BCR-ABL1 gene are frequently occurring, and in particular, mechanisms for the conversion from chronic myeloid leukemia to acute myeloid leukemia (AML and Acute lymphoid leukemia; ALL) and diagnostic methods therefor. There is little research.
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, diagnosis of the conversion of chronic myelogenous leukemia to acute phase using Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1), after switching from chronic myelogenous leukemia to acute phase Its purpose is to provide a method of providing information such as prognosis prediction, resistance to tyrosine kinase inhibitors, and the like.
  • biological sample refers to all samples capable of confirming the expression level of the Cobll1 gene in the body, and preferably, blood, plasma, serum, bone marrow, tissue, cells, saliva, sputum, Hair, urine, and the like, more preferably, blood, bone marrow cells, etc., but is not limited to any sample that can measure the expression of Cobll1 gene, such as Cobll1 protein, Cobll1 RNA.
  • expression level measurement refers to a process of confirming the presence and / or expression amount of mRNA or protein encoded from a marker gene in a biological sample to confirm information of chronic myelogenous leukemia. By measuring the amount of mRNA using a primer set or a probe set that binds to the mRNA of the marker gene, or by determining the amount of the protein using a binding molecule that specifically binds to the protein of the marker gene.
  • RT-PCR reverse transcriptase reverse transcriptase
  • RNase protection assay RPA
  • northern blotting nodephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiephiepent assay
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • radioimmunoassay radioimmunodiffusion
  • Ouchterlony immunodiffusion rockets
  • Immunoelectrophoresis immunohistochemical staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, etc. If so, it is not limited thereto.
  • kit Means a screening device for confirming and / or measuring the expression of Cobll1 gene to check information about chronic myelogenous leukemia, and there is no limitation as long as it can confirm the expression of Cobll1 from a biological sample isolated from the patient.
  • it may include a probe or primer set having a sequence complementary to Cobll1 mRNA, or an antibody, aptamer, or ligand (specifically binding to Cobll1 protein). ligand) and the like, but is not limited thereto so long as it is possible to identify and / or measure the expression of Cobll1 gene.
  • method for providing information is a method of providing information about chronic myelogenous leukemia by measuring the expression level of Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1) from biological samples isolated from patients. Provides information about chronic myelogenous leukemia, such as whether it has progressed to the acute phase of chronic myelogenous leukemia, predicting survival after chronic myelogenous leukemia has transitioned to acute stage, and whether it is resistant to tyrosine kinase inhibitor drugs. If the information can be confirmed by measuring the expression level of Cobll1 gene, the present invention is not limited thereto.
  • the present invention provides a method of providing information regarding the progression of acute phase of chronic myelogenous leukemia, comprising measuring the expression level of Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1) from a biological sample isolated from a patient.
  • Cobll1 Cordon-bleu protein-like 1
  • the method for providing information on the progression to the acute phase is characterized in that the progression of the acute phase when the expression of Cobll1 increased compared to the normal control.
  • the present invention also provides a method for providing information on the prognosis of chronic myelogenous leukemia comprising measuring the expression level of Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1) from a biological sample isolated from a patient.
  • Cobll1 Cordon-bleu protein-like 1
  • the method for providing information on the prognosis is characterized by predicting the survival time after the transition to acute phase of chronic myelogenous leukemia, preferably the expression of Cobll1 gene compared to the normal control It is characterized by predicting that the survival time is short when increased.
  • the present invention provides a method for providing information on the resistance to tyrosine kinase inhibitors in patients with chronic myelogenous leukemia, comprising measuring the level of expression of Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1) from biological samples isolated from patients. to provide.
  • Cobll1 Cordon-bleu protein-like 1
  • the method for providing information on resistance is characterized by predicting the resistance to tyrosine kinase inhibitors when the expression of Cobll1 is increased compared to the normal control.
  • the tyrosine kinase inhibitor may preferably be a drug used as a therapeutic agent for chronic myelogenous leukemia by inhibiting the activity of tyrosine kinase, such as imatinib, nilotinib, etc.
  • Therapeutic agents used for the treatment of myeloid leukemia are not limited to any therapeutic method such as immunotherapy and hematopoietic stem cell transplantation.
  • the biological sample may be preferably blood, plasma, serum, bone marrow, tissue, cells, saliva, sputum, hair, urine, etc., more preferably, blood, bone marrow cells, etc. If the sample can measure the expression of Cobll1, such as Cobll1 protein, Cobll1 RNA is not limited thereto.
  • the method for measuring the expression level of Cobll1 is preferably radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay), sandwich assay, real-time-polymerization Enzyme chain reaction (real-time PCR), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), western blotting, etc. may be used, but if the method of measuring the expression of Cobll1 such as Cobll1 protein, Cobll1 RNA, It is not limited.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing acute stage of chronic myelogenous leukemia, comprising a binding molecule specific to Cobll1, a complementary probe set for Cobll1, or a complementary primer set for Cobll1.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing acute phase progression of chronic myelogenous leukemia comprising the diagnostic composition.
  • the present invention also provides a composition for prognostic diagnosis of chronic myelogenous leukemia comprising a binding molecule specific to Cobll1, a set of complementary probes for Cobll1, or a set of complementary primers for Cobll1.
  • the present invention provides a kit for predicting the prognosis of chronic myelogenous leukemia comprising the diagnostic composition.
  • the present invention also provides a composition for prognostic diagnosis of chronic myelogenous leukemia comprising a binding molecule specific to Cobll1, a set of complementary probes for Cobll1, or a set of complementary primers for Cobll1.
  • the present invention provides a kit for predicting the prognosis of chronic myelogenous leukemia comprising the diagnostic composition.
  • the binding molecule is preferably an antibody (antibody), aptamer (ligamer), ligand (ligand) and the like, more preferably using the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an antigen
  • the antibody may be prepared, but is not limited thereto as long as it is a substance that can specifically bind to Cobll1 protein.
  • the present invention also provides an antibody for binding to Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1), which is prepared using the amino acid sequence of nucleotide sequence 2 as an antigen.
  • Cobll1 Coredon-bleu protein-like 1
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment of chronic myelogenous leukemia comprising an oligonucleotide that specifically binds to Cobll1 (Cordon-bleu protein-like 1) mRNA.
  • the oligonucleotide may be preferably siRNA (silencing RNA), miRNA (miRNA), shRNA (shorthairpinRNA), etc., more preferably one or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to 6
  • siRNA stress RNA
  • miRNA miRNA
  • shRNA shorthairpinRNA
  • SEQ ID NO: 3 to 6 it may be an siRNA including, but it means to prevent the overexpression of the protein by binding to the mRNA of Cobll1, and broadly to inhibit the function of the Cobll1 protein includes all the treatment methods to overcome the progression of chronic myelogenous leukemia, drug resistance .
  • the pharmaceutical composition is characterized by inhibiting the expression of Cobll1 protein to inhibit the progression of chronic myelogenous leukemia in the acute phase.
  • the pharmaceutical composition suppresses the expression of Cobll1 protein overexpressed to return chronic myelogenous leukemia progressed to acute phase, or chronic myelogenous leukemia advanced to acute phase by suppressing the function of overexpressed Cobll1 protein. Can be used to return to the chronic phase.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that the capsule, tablets, granules, injections, ointments, powder or beverage form, the pharmaceutical composition may be characterized in that it is intended for humans.
  • the pharmaceutical composition is not limited to these, but can be used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc.
  • buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have. And others, solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to these, but are oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route of administration and duration, and 0.0001 to 50 mg / kg or It may be administered at 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • a method for providing information on chronic myelogenous leukemia using Cobll1 is diagnosed as acute phase transition from chronic myelogenous leukemia, prediction of prognosis after conversion from chronic myelogenous leukemia to acute phase, tyrosine
  • Cobll1 Coredon-bleu protein-like 1
  • it can be used to diagnose patients who have not been predicted and diagnosed by conventional BCR-ABL1 gene expression measurement, so that various progression of chronic myelogenous leukemia It is expected to be used for resistance, prognosis prediction and diagnosis.
  • oligonucleotides specifically binding to Cobll1 mRNA of the present invention inhibits the expression of Cobll1 protein and effectively inhibits cell proliferation and drug resistance, thereby treating chronic myelogenous leukemia and acute phase of chronic myelogenous leukemia. It is expected to be effective in the development of therapeutics that inhibit the function of Cobll1 protein because it is expected to effectively inhibit the conversion.
  • FIG. 1 is a view showing the results of confirming the genes involved in the acute phase progression of chronic myelogenous leukemia according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing the results of re-checking the genes involved in the acute phase progression of chronic myelogenous leukemia according to an embodiment of the present invention.
  • the first represents CP1 and the second represents BP.
  • FIG. 3 is a view showing the production of antibodies to Cobll1 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing the results of confirming the relationship between the acute phase progression and chronic Cobll1 protein of chronic myelogenous leukemia according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a view showing the results of confirming the difference in the expression of Cobll1 protein according to the patient according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming the relationship between the expression of Cobll1 protein and the amount of leukemia blast cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the results of confirming the difference in the amount of expression of Cobll1 protein according to the sample type according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view showing the results of confirming the difference in the amount of Cobll1 protein expression according to the progression stage of chronic myelogenous leukemia according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing the results of confirming the relationship between Cobll1 protein and BCR-ABL1 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a view showing the results of confirming the relationship between the Cob1 protein and the prognosis of myeloid leukemia patients according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing the results of confirming the expression of Cobll1 protein according to the cell type according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a view showing the results of confirming the sensitivity to nilotinib in cells in which the expression of Cobll1 protein is suppressed according to an embodiment of the present invention.
  • the first is siControl
  • the second is siCobll1-1
  • the third is sicobll-2.
  • FIG. 13 is a view showing the results confirming the sensitivity to nilotinib in cells with increased expression of Cobll1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • the first shows 0nM and the second shows 10nM.
  • FIG. 14 is a view showing the results of confirming the effect of Cobll1 protein on cell proliferation according to an embodiment of the present invention.
  • Cobll1 (0 ⁇ g)
  • Cobll1 (5 ⁇ g)
  • Cobll1 (15 ⁇ g)
  • the first represents Mock
  • the second represents Cobll1.
  • 15 is a view showing the results of confirming the effect of the conversion of Cobll1 protein into chronic myelogenous leukemia cells according to an embodiment of the present invention.
  • TKIs tyrosine kinase inhibitors
  • TaqMan Probe and Cobll1 and GAPDH (control) primers were purchased from Applied Biosystems. The results are shown in FIG.
  • Cobll1 gene was increased by 8-fold in the acute phase among the five genes.
  • Cobll1 gene was known to be a negative regulator of apoptosis and a gene showing resistance to low levels of insulin.
  • Cobll1 gene progresses to the acute phase of chronic myelogenous leukemia. In this regard, it could be predicted that they play an important role in the proliferation and survival of cancer cells.
  • Cobll1 Coredon-bleu protein-like 1 protein (SEQ ID NO: 1) in chronic myelogenous leukemia
  • Cobll1 antibody was prepared.
  • the C-terminus (SEQ ID NO: 2: amino acid sequence 701-100) sequence of Cobll1 protein was inserted into the GST-vector, and the vector was first injected into the rabbit by subcutaneous injection as an antigen. .
  • the vector was injected again and the blood was collected on the 55th day, and Rabbit-anti-Cobll1 antibody was isolated from the collected rabbit blood using the Aminolink Coupling Gel Column Kit according to a predetermined protocol. The results are shown in FIG.
  • Cobll1 protein was involved in the acute phase of chronic myelogenous leukemia using Cobll1 antibody prepared in the same manner as in Example 2, Western blotting using bone marrow cells in the acute phase sample of # 1304 patient blotting).
  • the cells were washed twice with cold PBS (phosphate buffered saline) buffer, and the proteins were isolated by lysing the cells using RIPA buffer solution. Measured. And 20ug of protein obtained from each cell line was isolated using 8-10% SDS-polyacrylamide gel (polyacrylamide gel), and transferred to the PVDF membrane (membrane) using electricity.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Protein-transferred PVDP membranes were treated with 5% skim milk powder for 1 hour at room temperature and then 16 hours at 4 ° C with respective primary antibodies against Cobll1 and beta-actin (control). Reacted.
  • the PVDP membrane reacted with the antibody was washed three times with TBST solution to remove unbound primary antibody and further reacted with HPR-bound secondary antibody for 1 hour at room temperature. After the reaction was completed, the secondary antibody was removed by washing with TBST solution, treated with ECL solution, reacted for 3 minutes, and then developed with Kodak X-OMAT AR Film.
  • Anti-Myc was purchased from Roche, and Anti-beta-actin and HRP-conjugated secondary antibodies were purchased from Sigma-Aldrich, and diluted 1: 2000. The percentage of leukemic blasts in the bone marrow of each patient was identified. The results are shown in FIG.
  • Cobll1 protein As shown in Figure 4, it was confirmed that the expression of Cobll1 protein is significantly increased in the acute phase. The results indicate that Cobll1 protein is involved in the acute phase of chronic myelogenous leukemia.
  • Cobll1 protein plays an important role in the progression of chronic myelogenous leukemia.
  • BCR-ABL1 protein As shown in Figure 9, it was confirmed that the expression of BCR-ABL1 protein is not associated with the expression of Cobll1 protein. Through the above results, it was confirmed that BCR-ABL1 protein has no relation in the progression of the chronic myelogenous leukemia associated with Cobll1 protein.
  • Cobll1 protein was able to confirm the prognosis of patients with chronic myelogenous leukemia who were converted to acute phase.
  • Cobll1 protein was converted to acute phase and resistant to tyrosine kinase inhibitors in acute phase cells. We could predict that it plays an important role.
  • siRNA against Cobll1 was used to inhibit Cobll1 expression in K562 cell lines.
  • siRNA was purchased from IDT (SiRNA1 sense (SEQ ID NO: 3): 5'-CUAUGAUGGACUUGUUGAUUU-3 ', SiRNA1 antisense (SEQ ID NO: 4): 5'-AUCAACAAGUCCAUCAUAGUU-3', SiRNA2 sense (SEQ ID NO: 5): 5 '-GACUCAUUCUGUAAAUAAAUU-3', SiRNA2 antisense (SEQ ID NO: 6): 5'-UUUAUUUACAGAAUGAGUCUU-3'.control siRNA is 5'-TTCAATAAATTCTTGAGGTTT-3 ').
  • Cobll1 plasmid (Clone ID: 30345650) for overexpressing Cobll1 protein was purchased from Thermo Scientific, and 20 ug of plasmid DNA purchased for transformation was transformed into cells by electroporation with R buffer. The injected cells were used in the experiment after 24 or 48 hours of incubation.
  • the Cobll1 protein acts as an oncoprotein and plays an important role in the growth of cells and the conversion into chronic myelogenous leukemia cells in chronic myelogenous leukemia cells.
  • Cobll1 protein plays an important role in the stage progression of chronic myelogenous leukemia and drug resistance, and through this suppressing the expression of Cobll1 protein in the progression and drug of chronic myelogenous leukemia It was confirmed that the resistance to chronic myelogenous leukemia can be used to treat chronic myelogenous leukemia, and can be used to recover chronic myelogenous leukemia, which has advanced in the acute stage.
  • Cobll1 protein activates NF-kB to increase the stability of IKKr, thereby increasing the progression of chronic myelogenous leukemia and resistance to drugs.

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Abstract

본 발명은 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)을 이용한 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 만성골수성백혈병에서 급성기로의 전환 진단, 만성골수성백혈병에서 급성기로 전환된 이후의 예후 예측, 타이로신 카이네이즈 억제제를 포함한 만성골수성백혈병의 각종 치료제에 대한 저항성 등과 같은 다양한 정보를 동시에 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 BCR-ABL1 유전자 측정에 의하여 예측 및 진단되지 못했던 환자들을 진단하는데 사용될 수 있기 때문에 만성골수성백혈병의 진행, 재발, 약물내성 등 다양한 예후 예측 및 진단에 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 Cobll1 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 이용하면 Cobll1 단백질의 발현을 억제하여 효과적으로 세포 증식 및 약물에 대한 저항성을 억제하여, 만성골수성백혈병의 치료 및 만성골수성백혈병의 급성기로의 전환을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법
본 발명은 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상학적 양상은 질환의 유형과 침범한 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성골수성백혈병은 변이가 생긴 조혈모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)의 악성 클론들에 의해서 발생한다.
백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라 골수성 백혈병과 림프성 백혈병으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상학적 양상은 질환의 유형과 침범한 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성골수성백혈병은 변이가 생긴 조혈모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)의 악성 클론들에 의해서 발생한다.
특히, 만성골수성백혈병(Chronic myeloid leukemia; CML)은 조혈모세포가 골수 내에서 대량 증식하여 비정상적으로 증가한 각종 혈구세포가 말초 혈액이나 기타 장기를 침습하는 악성 혈액 질환으로 성인에서 주로 발병하는 악성 혈액암이다. 만성골수성백혈병의 진단을 위한 가장 일반적인 방법은 염색체 검사를 통해서 필라델피아 염색체를 발견하는 것으로, 실제 만성골수성백혈병환자의 95% 정도에서 9번 염색체와 22번 염색체 사이의 전좌가 발견되며, 전기 전좌는 9번 염색체의 q34 위치에 존재하는 abl(abelson oncogene) 유전자 일부가 22번 염색체 q11.2 위치에 존재하는 bcr(break point cluster region) 유전자로 전위되어 형성되는데, 이러한 재배열을 BCR-ABL1 재배열(BCR-ABL1 rearrangement)이라고 한다(국내출원특허 10-2012-002466). 이로 인하여 BCR-ABL의 재배열을 확인하여 만성골수성백혈병을 진단하고 예후를 예측하고자 하는 많은 연구들이 활발히 일어나고 있다. 그러나 BCR-ABL1 유전자에서 돌연변이가 발생하지 않은 백혈병들이 빈번히 발생하고 있으며, 특별히 만성골수성백혈병에서 급성백혈병(Acute myeloid leukemia; AML 및 Acute lymphoid leukemia; ALL)으로 전환되는 기작 및 이를 위한 진단 방법들에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
또한, 과거에는 만성골수성백혈병의 일차 치료법이 조혈모세포이식이었지만 최근에는 각종 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosine kinase inhibitor; TKI)를 이용하여 BCR-ABL1 암 단백질을 억제하는 방법이 일반적인 치료 방법이다. 그러나 일부 환자들은 처음부터 또는 치료 과정 중에 이에 대한 저항성을 가지게 된다. 이에 대하여 BCR-ABL1 카이네이즈 도메인(domain)에 발생한 돌연변이가 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나. 일부 환자들에게는 이에 대한 돌연변이가 관찰되지 않으며, 여전히 저항성을 가지는 기작에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
이와 같이, BCR-ABL1과는 독립적인 만성골수성백혈병의 진단, 진행, 약제 내성 및 예후를 예측할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)을 이용한 만성골수성백혈병의 급성기로의 전환 진단, 만성골수성백혈병에서 급성기로 전환된 이후의 예후 예측, 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성 등과 같은 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "생물학적 시료(biological sample)"란, 체내의 Cobll1 유전자의 발현 정도를 확인할 수 있은 모든 시료를 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액, 골수세포 등 일 수 있으나, Cobll1 단백질 , Cobll1 RNA 등 Cobll1 유전자의 발현을 측정할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서 "발현 수준(expression level) 측정"이란, 만성골수성백혈병의 정보를 확인하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 코딩(coding)된 mRNA 또는 단백질의 존재 여부 및/또는 발현량을 확인하는 과정으로 마커 유전자의 mRNA에 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브 세트를 이용하여 mRNA의 양을 측정하거나, 마커 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 결합분자를 이용하여 단백질의 양을 확인함으로써 측정할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석(immunoprecipitation assay), 보체고정분석(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 마커 유전자의 mRNA 또는 마커 유전자의 단백질을 확인할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서 "키트(kit)"란. Cobll1 유전자의 발현 여부를 확인 및/또는 측정하여 만성골수성백혈병에 관한 정보를 확인할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1의 발현 여부를 확인할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 바람직하게는 Cobll1 mRNA에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer) 세트를 포함할 수 있으며, 또는 Cobll1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(antibody), 압타머(aptamer), 리간드(ligand) 등을 포함하는 형태일 수 있으나, Cobll1 유전자의 발현 여부를 확인 및/또는 측정할 수 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서 "정보를 제공하는 방법"이란, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하여 만성골수성백혈병에 관한 정보를 제공하는 방법으로서, 바람직하게는 만성골수성백혈병의 급성기로 진행되었는지의 여부, 만성골수성백혈병이 급성기로 전환된 이후에 생존 기간 예측, 타이로신 카이네이즈 억제제 약물에 대한 저항성(resistance) 여부 등의 만성골수성백혈병에 관한 정보를 제공하는 방법이나, Cobll1 유전자의 발현 정도를 측정하여 확인될 수 있는 정보라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 급성기로의 진행에 관한 정보를 제공하는 방법은 Cobll1의 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가하였을 때 급성기로 진행되었음을 진단하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 만성골수성백혈병의 예후에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 예후에 관한 정보를 제공하는 방법은 만성골수성백혈병의 급성기로의 전환 이후 생존 기간을 예측하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 Cobll1 유전자의 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가하였을 때 생존 기간이 짧은 것을 예측하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 만성골수성백혈병 환자의 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 저항성에 관한 정보를 제공하는 방법은 Cobll1의 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가하였을 때 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성을 가지는 것을 예측하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 타이로신 카이네이즈 억제제는 바람직하게는 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib) 등, 타이로신 카이네이즈의 활성을 억제하여 만성골수성백혈병의 치료제로 사용되는 약물일 수 있으나, 만성골수성백혈병의 치료에 사용되는 치료제라면 면역요법, 조혈모세포이식 등 어떠한 치료 방법이라도 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락, 소변 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액, 골수세포 등 일 수 있으나, Cobll1 단백질 , Cobll1 RNA 등 Cobll1의 발현을 측정할 수 있는 시료라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 Cobll1의 발현 수준을 측정하는 방법은 바람직하게는 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 샌드위치 분석법(sandwich assay), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 웨스턴 블롯팅(western blotting) 등 일 수 있으나 Cobll1 단백질, Cobll1 RNA 등 Cobll1의 발현을 측정할 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은 Cobll1에 특이적인 결합분자, Cobll1에 대한 상보적인 프로브(probe) 세트, 또는 Cobll1에 대한 상보적인 프라이머(primer) 세트를 포함하는 만성골수성백혈병의 급성기 진행 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 만성골수성백혈병의 급성기 진행 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 Cobll1에 특이적인 결합분자, Cobll1에 대한 상보적인 프로브(probe) 세트, 또는 Cobll1에 대한 상보적인 프라이머(primer) 세트를 포함하는 만성골수성백혈병의 예후 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 만성골수성백혈병의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 Cobll1에 특이적인 결합분자, Cobll1에 대한 상보적인 프로브(probe) 세트, 또는 Cobll1에 대한 상보적인 프라이머(primer) 세트를 포함하는 만성골수성백혈병의 예후 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 만성골수성백혈병의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 결합분자는 바람직하게는 항체(antibody), 압타머(aptamer), 리간드(ligand) 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용하여 제조되는 항체일 수 있으나, Cobll1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 염기서열 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용하여 제조되는 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1) 결합용 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 만성골수성백혈병 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 siRNA(silencing RNA), miRNA(miRNA), shRNA(shorthairpinRNA) 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3 내지 6의 염기서열 중 하나 이상을 포함하는 siRNA일 수 있으나, Cobll1의 mRNA에 결합하여 단백질의 과발현을 막는 것을 의미하며, 광범위하게는 Cobll1 단백질의 기능을 억제하여 만성골수성백혈병의 진행, 약제 내성을 극복하는 모든 치료방법을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 Cobll1 단백질의 발현을 억제하여 만성골수성백혈병이 급성기로 진행되는 것을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 과발현된 Cobll1 단백질의 발현을 억제하여 급성기로 진행된 만성골수성백혈병을 다시 만성기로 되돌리거나, 과발현된 Cobll1 단백질의 기능을 억제하여 급성기로 진행된 만성골수성백혈병을 다시 만성기로 되돌리는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 , Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)을 이용한 만성골수성백혈병에 관한 정보 제공 방법은 만성골수성백혈병에서 급성기로의 전환 진단, 만성골수성백혈병에서 급성기로 전환된 이후의 예후 예측, 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성 등과 같은 다양한 정보를 동시에 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 BCR-ABL1 유전자 발현량 측정에 의하여 예측 및 진단되지 못했던 환자들을 진단하는데 사용될 수 있기 때문에 만성골수성백혈병의 다양한 진행, 약제 저항성, 예후 예측 및 진단에 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 Cobll1 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 이용하면 Cobll1 단백질의 발현을 억제하여 효과적으로 세포 증식 및 약물에 대한 저항성을 억제하여, 만성골수성백혈병의 치료 및 만성골수성백혈병의 급성기로의 전환을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 예상되기 때문에 Cobll1 단백질의 기능을 억제하는 치료법 개발에도 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 만성골수성백혈병의 급성기 진행에 연관되어져 있는 유전자를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 만성골수성백혈병의 급성기 진행에 연관되어져 있는 유전자를 재확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 2a의 그래프에서, 첫 번째가 CP1을 나타내며, 두 번째가 BP를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Cobll1에 대한 항체 제조를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 만성골수성백혈병의 급성기 진행과 Cobll1 단백질의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 환자에 따른 Cobll1 단백질의 발현 차이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈병 모세포의 양과 Cobll1 단백질의 발현과의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 시료 종류에 따른 Cobll1 단백질의 발현량 차이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 만성골수성백혈병의 진행 단계에 따른 Cobll1 단백질 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cobll1 단백질과 BCR-ABL1과의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 Cob1 단백질과 골수성백혈병 환자의 예후와의 연관관계를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 종류에 따른 Cobll1 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cobll1 단백질의 발현이 억제된 세포에서의 닐로티닙에 대한 감수성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 그래프에서, 첫 번째가 siControl, 두 번째가 siCobll1-1, 세 번째가 sicobll-2를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 Cobll1 단백질의 발현이 증가된 세포에서의 닐로티닙에 대한 감수성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 그래프에서, 첫 번째가 0nM, 두 번째가 10nM를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cobll1 단백질이 세포 증식에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 14a의 그래프에서, 위부터 차례로 각각 Cobll1(0㎍), Cobll1(5㎍) 및 Cobll1(15㎍)를 나타낸다. 도 14b의 그래프에서, 첫 번째가 Mock를 나타내고, 두 번째가 Cobll1을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 Cobll1 단백질이 만성골수성백혈병 세포로의 전환에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 만성골수성백혈병의 급성기 진행에 연관되어져 있는 유전자의 확인
BCR-ABL1 단백질과는 독립적으로 약물에 대한 저항성 및 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 관련되어져 있는 유전자를 확인하기 위하여, DNA microarray(지노첵)를 이용하여 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosine kinase inhibitor; TKI)에 대한 저항성을 가지고 있는 K562 CML BP 세포주와 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성을 가지고 있지 않은 K562 원세포주의 유전자 발현을 비교하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, Cobll1, ITGA4, ASB9, CD109 및 ZNF462 유전자의 발현이 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosine kinase inhibitor; TKI)에 대한 저항성을 가진 세포주에서 급격히 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 환자의 검체를 이용한 실험에서 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 유전자들의 발현 양상이 만성골수성백혈병(Chronic myeloid leukemia; CML)이 급성기로 진행될 때 변화되며, 만성골수성백혈병이 급성백혈병(Acute leukemia; AML 또는 ALL)으로 진행되고 있는 환자들에게서 발현이 증가하여 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성이 높은 비율로 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행과 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성 기작이 일부 연관되어져 있다는 것을 예측할 수 있었다.
또한, 상기 다섯 개의 유전자가 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 영향을 미치는지 재확인하기 위하여, #1059 환자 및 #1304 환자의 만성기 및 급성기에서의 골수(bone marrow; BM) 세포에서 유전자의 발현 정도를 quantitative real-time RT-PCR을 통하여 확인하였다. RT-PCR을 위하여 1mL Trizol reagent 및 0,2mL의 클로로포름(chloroform)을 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA에 0.5mL의 이소프로필알콜(isopropyl alcohol)을 첨가하고 12,000Xg에서 15분간 원심분리하여 RNA를 침전시켜 분리하였다. 그리고 정해진 프로토콜에 따라 분리된 RNA를 Reverse Transcription System(Promega)을 이용하여 역전사시킨 후, TaqMan® universal PCR master mix를 이용하여 RT-PCR(50°C에서 2분, 95°C에서 20초 동안 반응시킨 후에 95°C에서 3초, 60°C에서 30초를 45회 반복)을 실시하였다. 택맨 프로브(TaqMan Probe)와 Cobll1 및 GAPDH(대조군) 프라이머(primer)는 Applied Biosystems에서 구입하여 사용하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 5개의 유전자 중에서 Cobll1 유전자가 급성기에서 발현이 8배 정도 증가되는 것을 확인하였다. Cobll1 유전자는 세포사멸(apoptosis)에 대한 음성 조절자(negative regulator)인 동시에 저농도의 인슐린에 대한 저항성을 나타내는 유전자로 알려져 있었는데, 상기 결과를 통하여, 이 외에도 Cobll1 유전자가 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 있어서, 암세포의 증식 및 생존에 중요한 역할을 담당하고 있을 것을 예측할 수 있었다.
실시예 2: Cobll1 항체의 제조
만성골수성백혈병에 있어서 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1) 단백질(서열번호 1)의 역할을 확인하기 위하여, Cobll1 항체를 제조하였다. 항체 제조를 위하여 GST-벡터에 Cobll1 단백질의 C-terminus(서열번호 2: 아미노산 서열 701번 내지 100번) 서열을 삽입하고, 이 벡터를 항원(antigen)으로서 피하 주사를 통하여 토끼에게 1차 주입하였다. 그리고 2주 후에 벡터를 다시 2차 주입한 후에 55일째 채혈하였고, 채혈된 토끼의 혈액으로부터 Aminolink Coupling Gel Column Kit를 이용하여 정해진 프로토콜에 따라 Rabbit-anti-Cobll1 antibody를 분리하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, Cobll1 단백질에 결합하는 항체가 정상적으로 제조되었다는 것을 확인하였다.
실시예 3: Cobll1 단백질과 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행과의 연관관계 확인
3.1. Cobll1 단백질과 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행과의 연관관계 확인
실시예 2와 동일한 방법으로 제조된 Cobll1 항체를 이용하여 Cobll1 단백질이 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 연관되어져 있는지 확인하기 위하여, #1304 환자의 급성기 시료 중 골수 세포를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 실시하였다. 세포를 차가운 PBS(phosphate buffered saline) 완충용액을 이용하여 두 번 세척하고, RIPA 완충용액을 이용하여 세포를 용해시켜 단백질을 분리하였으며, 분리된 단백질은 이후 실험을 위하여 BCA assay를 통하여 단백질의 양을 측정하였다. 그리고 각각의 세포주로부터 획득한 단백질 20ug을 8-10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)을 이용하여 분리하고, 전기를 이용하여 PVDF 막(membrane)으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 PVDP 막은 5% 탈지분유를 이용하여 실온에서 1시간 동안 처리한 후에 Cobll1 및 beta-actin(대조군, control)에 대한 각각의 1차 항체(primary antibody)와 함께 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응시킨 PVDP 막은 TBST 용액을 이용하여 세 번 세척하여 결합하지 않은 1차 항체를 제거하고 HPR이 결합되어 있는 2차 항체(secondary antibody)와 실온에서 1시간 동안 추가 반응시켰다. 반응이 완료된 후에 TBST 용액을 이용하여 세척하여 2차 항체를 모두 제거하고 ECL 용액을 처리하고 3분 동안 반응시킨 후에 Kodak X-OMAT AR Film으로 현상하였다. 웨스턴 블롯팅을 위한 항체 중 Anti-Myc은 Roche에서, Anti-beta-actin 및 HRP-conjugated secondary antibody는 Sigma-Aldrich에서 각각 구입하여 사용하였으며, 사용 시에는 1:2000으로 희석하여 사용하였다. 그리고 각각의 환자의 골수에서 백혈병 모세포(leukemic blasts)가 차지하고 있는 퍼센트를 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 급성기에서 Cobll1 단백질의 발현이 확연히 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여 Cobll1 단백질이 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 연관되어져 있다는 것을 확인할 수 있었다.
3.2. 환자에 따른 Cobll1 단백질과 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행과의 연관관계 차이 확인
환자에 따른 Cobll1 단백질의 발현에 차이가 있는지 확인하기 위하여 6명의 환자를 대상으로 하여 실시예 3.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 6명의 환자 중 4명의 환자에서만 Cobll1 단백질의 발현이 증가된 것을 확인하였으며, 이는 백혈병 모세포의 수와 연관이 있는 것을 확인하였다.
*이를 재확인하기 위하여, 만성기로 진단된 후에 각종 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosine kinase inhibitor; TKI)로 치료를 받던 중, 급성기로 진행된 43명의 환자를 대상으로 하여 Cobll1 단백질의 발현량 및 백혈병 모세포의 양을 확인하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 43명의 환자 중 Cobll1 단백질의 발현이 증가된 환자는 25명이었으며, 백혈병 모세포의 퍼센트가 60% 이하일 때는 높은 확률로 Cobll1 단백질의 발현이 증가되지 않았으며, 70% 이상일 때는 높은 확률로 Cobll1 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 만성골수성백혈병의 진행에 있어서 말초혈액 및 골수 내의 백혈병 모세포의 수와 Cobll1 단백질의 발현이 직접적으로 연관되어져 있다는 것을 확인할 수 있었다.
3.3. 시료 종류에 따른 Cobll1 단백질 발현량의 차이 확인
시료 종류에 따라 측정되는 Cobll1 단백질의 발현량이 차이가 나는지 확인하기 위하여, 환자 10명의 말초혈액(peripheral blood) 및 골수에서 시료를 채취하고 각각의 Cobll1 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 말초 혈액 및 골수에서 동일한 결과가 나타나는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 골수 뿐만 아니라 혈액을 채취하여도 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행을 예측할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
3.4. 만성골수성백혈병의 진행 단계에 따른 Cobll1 단백질 발현량의 차이 확인
만성골수성백혈병의 진행 단계에 따른 Cobll1 단백질의 발현을 세부적으로 확인하기 위하여, 골수성백혈병이 재발된 환자 네 명을 대상으로 하여 만성골수성백혈병의 진행 단계에 따른 Cobll1 단백질의 발현을 실시예 3.1과 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 만성골수성백혈병의 진행 단계에 따라 Cobll1 단백질의 발현이 급격히 변화하는 것을 확인하였으며, 특별히 급성기 진행 초기에 Cobll1 단백질의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 만성골수성백혈병의 진행에 Cobll1 단백질이 중요한 역할을 담당하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: Cobll1 단백질과 BCR - ABL1과의 연관관계 확인
만성골수성백혈병의 진행에 있어서, BCR-ABL1과 Cobll1 단백질의 연관관계를 확인하기 위하여 실시예 3.1과 동일한 방법으로 급성기에서의 발현량을 각각 측정하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, BCR-ABL1 단백질의 발현은 Cobll1 단백질의 발현과는 연관관계가 없는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, Cobll1 단백질과 연관된 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 있어서 BCR-ABL1 단백질은 아무 연관관계가 없는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 의학적 정보 확인
Cobll1 단백질과 연관된 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 있어서 다른 의학적 정보를 확인하기 위하여, 실시예 3.2의 43개의 시료에 대한 대상자의 나이, 성별, 급성기의 종류, BCR-ABL 돌연변이, 생존기간 등 다양한 의학적 정보를 확인하였다. 그 결과는 도 10, 표 1 및 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2016008897-appb-T000001
도 10A 및 표 1에 나타난 바와 같이, 백혈병 모세포 퍼센트에 따른 Cobll1 단백질의 발현량에 차이가 나타나는 것을 재확인하였으며, 또한, 급성기로의 진행 이후 사망까지의 기간에 유의성 있는 차이가 나타나는 것을 확인하였다. Cobll1 단백질의 발현량이 증가한 환자의 경우에는 급성기 진행 이후 평균 4.7개월 동안 생존하였으며, Cobll1 단백질의 발현량이 증가하지 않은 환자의 경우에는 평균 12.4개월을 더 생존한 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2016008897-appb-T000002
또한 도 10B 및 표 2에 나타난 바와 같이, BCR-ABL1 돌연변이보다 Cobll1 유전자의 발현 증가가 급성기로의 진행 후의 만성골수성백혈병 환자의 예후에 영향을 더 미치는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, Cobll1 단백질의 발현을 확인하여 급성기로 전환된 만성골수성백혈병 환자의 예후를 확인할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 급성기 세포에 있어서 Cobll1 단백질이 급성기로의 전환 및 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성에 중요한 역할을 하고 있다는 것을 예측할 수 있었다.
또한 상기 결과들을 통하여, 만성골수성백혈병 환자들의 생물학적 시료를 채취하여 Cobll1 단백질의 발현을 측정함으로써 급성기로의 전환 이후 생존 예후를 예측할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: Cobll1 단백질의 역할 확인
6.1. 세포주에 따른 Cobll1 단백질 발현 차이 확인
만성골수성백혈병에 있어서 Cobll1 단백질의 역할을 확인하기 위하여, 일차적으로 만성기 세포, 급성기 세포 및 K562 세포주에서 Cobll1 단백질의 발현량을 실시예 3.1과 동일한 방법으로 확인하였다. 실험을 위하여 각각의 세포들은 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS)이 첨가된 RPMI 배지에서 배양하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, K562 세포주 및 만성기 세포에서는 Cobll1 단백질의 발현이 증가되지 않는 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 K562 세포주를 이용하여 Cobll1 단백질의 역할을 확인하였다.
6.2. Cobll1 단백질과 약물 저항성과의 연관관계 확인
Cobll1 단백질이 약물 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 일차적으로 Cobll1에 대한 siRNA를 이용하여 K562 세포주에서 Cobll1 발현을 억제하였다. siRNA는 IDT에서 구매하여 사용하였다(SiRNA1 sense(서열번호 3): 5'-CUAUGAUGGACUUGUUGAUUU-3', SiRNA1 antisense(서열번호 4): 5'-AUCAACAAGUCCAUCAUAGUU-3', SiRNA2 sense(서열번호 5): 5'-GACUCAUUCUGUAAAUAAAUU-3', SiRNA2 antisense(서열번호 6): 5'-UUUAUUUACAGAAUGAGUCUU-3'. control siRNA is 5'-TTCAATAAATTCTTGAGGTTT-3'). 그리고 Cobll1 단백질의 발현이 억제된 세포에 2세대 타이로신 카이네이즈 억제제인 닐로티닙(nilotinib)을 처리하고 정해진 프로토콜에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Science)을 이용하여 세포사멸(apoptosis)을 확인하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, Cobll1 단백질의 발현이 억제된 세포의 경우 닐로티닙에 의해 유도된 세포 사멸이 증가되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 Cobll1 단백질의 발현이 억제되면 닐로티닙에 대한 감수성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, Cobll1 단백질의 발현과 약물에 대한 저항성의 연관관계를 재확인하기 위하여 Cobll1 단백질 전체(서열번호 1), Cobll1 단백질의 N-terminus(아미노산 서열 1 내지 700번), 및 C-terminus(아미노산 서열 701내지 1128번)을 이용하여 닐로티닙에 의한 세포사멸 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, Cobll1 단백질이 과발현되는 세포의 경우에는 닐로티닙에 의한 세포사멸이 줄어드는 것을 확인하였으며, Cobll1 단백질의 N-terminus 부분이 C-terminus 부분보다 세포사멸에 대한 저항성이 큰 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, Cobll1 단백질이 타이로신 카이네이즈 억제제 약물에 대한 저항성에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었으며, 특별히 Cobll1 단백질의 N-terminus이 이에 약물 저항성에 대한 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
6.3. Cobll1 단백질의 세포 성장 및 백혈병 세포로의 전환에 미치는 영향 확인
Cobll1 단백질이 세포의 성장(growth) 및 만성골수성백혈병 세포로의 전환에 미치는 영향을 확인하기 위하여, K562 세포주에서 Cobll1 단백질을 과발현시킨 후 세포의 증식(proliferation) 정도를 확인하였다. Cobll1 단백질을 과발현하기 위한 Cobll1 플라스미드(Clone ID: 30345650)는 Thermo Scientific에서 구입하여 사용하였고, 형질전환을 위하여 구입한 플라스미드 DNA 20ug을 R 완충용액(buffer)과 함께 전기천공법(electroporation)을 통하여 세포 내로 주입하고 주입된 세포는 24 또는 48시간을 배양한 후에 실험에 사용하였다. 세포 증식 정도는 정해진 프로토콜에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay(Promega)를 실시하여 확인하였다. 또한, soft agar assay를 이용하여 만성골수성백혈병 세포로의 전환 정도를 확인하였다. 그 결과는 도 14 및 15에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, Cobll1 단백질 농도에 따라 세포 증식이 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 도 15에 나타난 바와 같이, Cobll1 단백질의 농도에 따라 만성골수성백혈병 세포로의 전환이 유의성있게 증가되는 것을 확인하였으며, Cobll1 단백질의 N-terminus 부분이 만성골수성백혈병 세포로의 전환에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, Cobll1 단백질이 종양단백질(oncoprotein)로 작용하여 만성골수성백혈병 세포에 있어서 세포의 성장 및 만성골수성백혈병 세포로의 전환에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, Cobll1 단백질의 발현은 만성골수성백혈병의 단계 진행 및 약물에 대한 저항성을 증가시키는데 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 Cobll1 단백질의 발현을 억제하면 만성골수성백혈병의 진행 및 약물에 대한 저항성을 감소시켜 만성골수성백혈병의 치료에 사용 가능할 뿐만 아니라 급성기로 진행되었던 만성골수성백혈병 환자를 다시 만성기로 회복시키는데 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 추가적인 신호전달 실험들을 통하여 Cobll1 단백질은 NF-kB를 활성화시켜 IKKr의 안정성을 증가시키고 이를 통하여 최종적으로는 만성골수성백혈병의 진행 및 약물에 대한 저항성을 증가시킨다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (32)

  1. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만성골수성백혈병의 급성기로의 진행에 관한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 급성기로의 진행에 관한 정보를 제공하는 방법은 Cobll1의 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가하였을 때 급성기로의 진행을 진단하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 Cobll1의 발현 수준을 측정하는 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 샌드위치 분석법(sandwich assay), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. Cobll1에 특이적인 결합분자, Cobll1에 대한 상보적인 프로브(probe) 세트, 또는 Cobll1에 대한 상보적인 프라이머(primer) 세트를 포함하는, 만성골수성백혈병의 급성기 진행 진단용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 결합분자는 항체(antibody), 압타머(aptamer), 또는 리간드(ligand)인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는, 만성골수성백혈병의 급성기 진행 진단용 키트.
  9. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만성골수성백혈병의 예후에 관한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 예후에 관한 정보를 제공하는 방법은 만성골수성백혈병의 급성기로의 전환 이후 생존 기간을 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 Cobll1의 발현 수준을 측정하는 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 샌드위치 분석법(sandwich assay), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. Cobll1에 특이적인 결합분자, Cobll1에 대한 상보적인 프로브(probe) 세트, 또는 Cobll1에 대한 상보적인 프라이머(primer) 세트를 포함하는, 만성골수성백혈병의 예후 진단용 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 결합분자는 항체(antibody), 압타머(aptamer), 또는 리간드(ligand)인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는, 만성골수성백혈병의 예후 예측용 키트.
  17. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만성골수성백혈병 환자의 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성에 관한 정보를 제공하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 저항성에 관한 정보를 제공하는 방법은 Cobll1의 발현이 정상 대조군과 비교하여 증가하였을 때 타이로신 카이네이즈 억제제, 면역요법, 또는 조혈모세포이식에 대한 저항성을 가지는 것을 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 타이로신 카이네이즈 억제제는 이마티닙(imatinib) 또는 닐로티닙(nilotinib)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수, 조직, 세포, 타액, 객담, 머리카락 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 Cobll1의 발현 수준을 측정하는 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 샌드위치 분석법(sandwich assay), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 및 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. Cobll1에 특이적인 결합분자, Cobll1에 대한 상보적인 프로브(probe) 세트, 또는 Cobll1에 대한 상보적인 프라이머(primer) 세트를 포함하는, 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성 진단용 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 결합분자는 항체(antibody), 압타머(aptamer), 또는 리간드(ligand)인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  25. 제 22 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 포함하는, 타이로신 카이네이즈 억제제에 대한 저항성 진단용 키트.
  26. 염기서열 2의 아미노산 서열을 항원으로 이용하여 제조되는, Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1) 결합용 항체.
  27. Cobll1(Cordon-bleu protein-like 1)의 mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 만성골수성백혈병 치료용 약학 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA(silencing RNA), miRNA(miRNA), 또는 shRNA(shorthairpinRNA)인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 siRNA는 서열번호 3 내지 6의 염기서열 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  30. 제 27 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 Cobll1 단백질의 발현을 억제하여 만성골수성백혈병이 급성기로 진행되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  31. 제 27 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 과발현된 Cobll1 단백질의 발현을 억제하여 급성기로 진행된 만성골수성백혈병을 다시 만성기로 되돌리는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  32. 제 27 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 과발현된 Cobll1 단백질의 기능을 억제하여 급성기로 진행된 만성골수성백혈병을 다시 만성기로 되돌리는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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