JP4429726B2 - 炎症性応答を調節するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、免疫応答の調節因子を同定するための組成物および方法に関し、より詳細には、リンフォトキシン−βレセプター(LTβR)複合体のメンバーを使用して、免疫応答の調節因子を同定するための組成物および方法に関する。
リンフォトキシン−βレセプター(LTβR)(腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)ファミリーの非デスドメイン含有レセプター)は、二次的リンパ様組織の器官発生において重要な役割を果たすことが報告される。LTβRに対する2つのレセプターの型が、記載される。これらは、ヘテロトリマー(LTα1β2)およびホモトリマー(LIGHT)として同定された。
本発明は、リンフォトキシンβレセプター(LTβR)複合体シグナル伝達経路に関連するポリペプチドの発見に一部基づく。ポリペプチドSmac、cIAP1、およびTRAF2、ならびに原始的なホモログのエンハンサー(enhancer of rudimentary homologue:ERH)は、これらの新規に同定されたLTβRの成分に含まれる。LTβR複合体と結合することが以前に示されたTRAF3もまた、同定される。Smacは、ミトコンドリア媒介性アポトーシス経路に関与することが報告された。
本発明は、リンフォトキシン−βレセプター(LTβR)調節因子を同定するための方法を提供し、この調節因子は、LTβRシグナル伝達を活性化または阻害し得る。LTβRまたは複合体のメンバー(本明細書中で新規に同定されたメンバーを含む)は、薬剤として使用され得るか、または薬剤に対する標的として働き、これは、ミトコンドリアアポトーシスを阻害するかまたはミトコンドリアアポトーシスのLTβR媒介性阻害を刺激するために使用され得、例えば、異常な細胞増殖をブロックするかまたは培養中の細胞増殖を継続する。本明細書中で同定される調節因子は、免疫状態および癌を含む種々の徴候を処置するために使用され得る。好ましい徴候は、慢性関節リウマチである。
本発明は、リンフォトキシン−βレセプター複合体の成分として同定されたポリペプチドを包含する。LTbR複合体のこれらの新たに同定されたメンバーとしては、TRAF2、cIAP1、およびSmacが挙げられる。
本発明は、リンフォトキシン(lymphoxin)βレセプターシグナル伝達を調節する薬剤を同定する方法をさらに提供する。この方法としては、上で開示される1つ以上のLTβR複合体ポリペプチドの存在およびまたは活性に依存する方法が挙げられる。
以下の実施例において使用される材料および方法は、以下を含んだ。
U937細胞、HEK293細胞およびMCF7細胞を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、そしてそれぞれ0.01%のインスリンを含有する、RPMI 1640(Gibco BRL)、DME(Gibco BRL)、およびEMEM(ATCC)中で培養した。全ての培地に、10%FBSを補充した。TRAF2抗体およびTRAF3抗体を、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。cIAP1抗体を、R&D Systemsから入手した。抗Flag(M2)抗体およびアフィニティービーズを、Sigmaから入手した。HA抗体(3F10)を、Roche Molecular Chemicalsから購入した。Smac抗体を、Alexis Biochemicals and Cell Signaling Technologyから購入した。全ての化学試薬は、他に特定されない限り、Sigmaから購入した。
pFLAG−CMV2ベクター(Eastman Kodak,Co.)中のN末端FLAGタグ化全長LT Rは、Shie−Liang Hsieh博士から親切にも提供された(Wuら、J.Biol.Chem.274:11868−73、199もまた参照のこと)。C末端HAタグを有するSmacの全長およびΔ76欠失変異体を、ヒト卵巣cDNAライブラリーからPCR反応によって増幅した。次いで、PCRフラグメントを、pcDNA3.1(+)に、NdeI部位およびXhoI部位においてクローニングした。
1×1010個のU937細胞を、加温したPBS(37℃)で2回洗浄し、そして1×107細胞/mlの濃度で再懸濁した。細胞を、20ng/mlのFlag−LIGHT(Alexis)で、37℃で10分間処理するか、または未処理のままにした。次いで、細胞を、50mlの溶解緩衝液(20mM Tris.HCl、pH7.2、150mM NaCl、1% Triton X−100、1mM EDTA、30mM NaF、1mM NaVO4およびプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche))中に溶解し、そして4℃で30分間穏やかに振盪した。細胞細片を、10,000gで30分間、2回遠心分離することによって除去した。溶解物を、Gamma Bindingビーズ(Pharmacia)と共に1時間インキュベートすることによって予備浄化した。得られた溶解物を、0.2mlのM2−アフィニティービーズ(Sigma)のミニカラム(BioRad)に2回適用した。このビーズを、高塩(1M NaCl)溶解緩衝液で2回洗浄し、溶解緩衝液でさらに3回洗浄し、次いで、エッペンドルフチューブに移した。免疫複合体を、初めに、2mg/mlの濃度のFlagペプチド(Sigma)で溶出した。残留している結合タンパク質を、次いで、8M 尿素でさらに溶出した。2分の1のペプチドで溶出したタンパク質または1/10の8M 尿素で溶出したタンパク質を、4〜12%のSDS−PAGEゲルで分離し、そしてTRAF3抗体を使用して、ウエスタンブロッドのためのニトロセルロース膜に移した。これらのサンプルをまた、4〜12%のSDS−PAGEゲルで分離し、そして銀染色によって可視化した。
目的のタンパク質バンドを、ゲルから手で切り出し、ヨードアセトアミドで還元しそしてアルキル化し、次いで、Houthaeveら、J.Protein Chemistry 16:343−48,1997に記載されるように、自動化消化ロボット(ABIMED,Germany)を使用してトリプシンでインサイチュで消化した。次いで、このペプチド消化物を、マイクロエレクトロスプレイ逆相液体クロマトグラフィーインターフェースを備えるハイスループットタンデム質量分光計(ThermoQuest LCQ−DECA,San Jose CA)を使用して、配列決定した。データを、LCQを備えるデータ取得ソフトウェアを使用して自動化MS/MSモードで取得し、ペプチドがカラムから溶出されると、各ペプチドを検出しそして配列決定した。動的除去機能および同位体除去機能を用いて、分析されたペプチドイオンの数を増加させた。LS−MS/MS実行の間、代表的に1000を超える断片化スペクトルを、各サンプルから収集し、そしてSequestソフトウェアパッケージ(ThermoQuest)を使用して、非冗長データベース(NCBI)に対して一致させた。
免疫沈降について、1×108のU937細胞を、異なる時間、20ng/mlのFLAG−LIGHTで処理するか、または未処理のままにした。次いで、細胞を収集し、そして4mlの溶解緩衝液(上記を参照のこと)中に溶解した。細胞細片を、14,000×gで10分間の遠心分離によって除去し、そして得られた溶解物を、Gamma Bindingビーズ(Pharmacia Biotech)を用いて4℃で1時間予備浄化した。次いで、20 lのM2ビーズを、この細胞溶解物に添加し、そして4℃で3時間インキュベートした。結合後、ビーズを、溶解緩衝液で5回洗浄した。このビーズに結合した免疫複合体を、サンプル緩衝液で溶出し、4〜12%のSDS−PAGEゲルで分離し、PVDF膜に移し、そしてTRAF2、TRAF3またはcIAP1抗体でプローブした。シグナルを、HRP結合体化二次抗体およびECL検出キット(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて検出した。HEK 293細胞の免疫沈降について、4μgのpFlag−CMV2−LTβR、pcDNA3−Smac−HAまたはpcDNA3−Δ76Smac−HAを、Fugene 6(Roche Molecular Biochemicals)を使用し、製造者の指示書に従って、100mmディッシュ上で細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を、細胞リフターを用いて収集し、そして0.5mlの溶解緩衝液中に溶解した。LT RについてM2ビーズを用いて、またはSmacまたはΔ76 SmacについてHAモノクローナル抗体を用いてのいずれかで、U937細胞と同じ様式で、免疫沈降を実施した。次いで、免疫複合体中のSmac、LTβR、TRAF2およびcIAP1の存在を、ウエスタンブロットによって分析した。
MCF7細胞(5×105細胞/ウェル)を、トランスフェクションの1日前に、6ウェルプレート中のカバーガラス上に播種した。各ウェル中の細胞を、Fugene 6(Roche Molecular Chemicals)を使用して、1μgのpcDNA3ベクター、pcDNA3−Smac−HAまたはpcDNA3−Δ76Smac−HA発現構築物を、pEMC−βGalと共に用いて、トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を、PBS(コントロール)、LIGHT(20ng/ml)またはLTα1β2(20ng/ml)で6時間処理し、次いで、固定し、そしてX−gal(Sigma)で染色した。アポトーシスを、形態学分析によって評価し、そしてトランスフェクトされた全ての青色細胞中のアポトーシス(丸く、かつ分離されている)細胞の割合として表した。
LIGHTは、LTβRおよびTR2/HVEMの両方に結合する。U937細胞において、LTβRは、構成的に発現され、一方、TR2/HVEMの発現は、分化因子によって誘導される。この現象は、特異的リガンド−LTβR複合体を形成するために開発された。未分化のU937細胞を、Flagタグ化LIGHTで10分間処理して、LIGHT−LTβR複合体を形成した。内因性レセプター複合体を、抗Flag抗体(M2)結合体化ビーズでアフィニティー精製し、次いで、Flagペプチドで溶出した。溶出したタンパク質を、4〜12%のSDS−PAGEゲルで分離し、そして銀染色によって可視化した。
βRの検出は、LIGHT−LTβR複合体の首尾良い単離をさらに確証した。TRAF2およびTRAF3もまた、検出された(表1)。さらに、バンド2の位置におけるcIAP1由来の4種のペプチド、およびバンド6の位置におけるSmac由来の2種のペプチドが、検出された(表1)。図2Aおよび2Bは、それぞれ、cIAP1由来ペプチドおよびSMAC由来ペプチドの2つの代表的な質量スペクトルを示す。
Smacは、UV照射のようないくつかの刺激(ミトコンドリア媒介性アポトーシス経路を引き起こす)に応答してアポトーシスを促進することが示されている(Duら、Cell 102:33〜42、2000)。MCF7細胞を、β−ガラクトシダーゼ(pEMC−βgal)およびSmac−HA、Δ76 Smac−HAまたは空のベクターを発現するプラスミドを用いて同時トランスフェクトした。24時間後、細胞を、PBS、LIGHT(20ng/ml)、またはLTα1β2(20ng/ml)を用いて、それぞれ6時間処理し、次いで固定して、X−galで染色した。アポトーシスを、βgal発現細胞の形態学的分析によって評価した(詳細については、実施例1を参照のこと)。
Claims (14)
- リンフォトキシンβレセプター(LTβR)ポリペプチド、Smacポリペプチド、cIAP1ポリペプチド、およびTRAF2ポリペプチドを含む、精製された複合体。
- 前記LTβRポリペプチドが、LTβRリガンドに結合されている、請求項1に記載の複合体。
- 前記LTβRリガンドが、LIGHTポリペプチド複合体である、請求項2に記載の複合体。
- 前記LTβRリガンドが、Ltα1β2である、請求項2に記載の複合体。
- 前記cIAP1ポリペプチドが、ヒトcIAP1ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の複合体。
- 前記TRAF2ポリペプチドが、ヒトTRAF2ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の複合体。
- TRAF3ポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記TRAF3ポリペプチドが、ヒトTRAF3ポリペプチドのアミノ酸配列を有する、請求項7に記載の複合体。
- 原始的なホモログのエンハンサー(ERH)ポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の複合体。
- 以下:
リンフォトキシンβレセプター(LTβR)ポリペプチド;
LTβRリガンド;
TRAF2ポリペプチド;
TRAF3ポリペプチド;
cIAP1ポリペプチド;および
Smacポリペプチド;
ERHポリペプチド
を含む、精製された複合体。 - 前記LTβRリガンドが、LIGHTポリペプチド複合体である、請求項10に記載の複合体。
- 前記LTβRリガンドが、Ltα1β2ポリペプチド複合体である、請求項10に記載の複合体。
- リンフォトキシンβレセプター(LTβR)複合体シグナル伝達経路の調節因子を同定する方法であって、該方法は、以下:
LTβRポリペプチドを発現している細胞と試験因子とを接触させる工程、ならびに
該細胞において該試験因子がSmacポリペプチドの活性または発現を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。 - LTβR複合体シグナル伝達経路の調節因子を同定するための方法であって、該方法は、以下:
Smacポリペプチドと試験因子とを接触させる工程;および
該試験因子が、該Smacポリペプチドの活性を阻害するか否かを決定し、それによってLTβR複合体シグナル伝達経路のインヒビターを同定する工程、
を包含する、方法。
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