WO2005053728A2 - Mit adipositas assoziierte proteine und deren verwendung in therapie und diagnostik - Google Patents

Mit adipositas assoziierte proteine und deren verwendung in therapie und diagnostik Download PDF

Info

Publication number
WO2005053728A2
WO2005053728A2 PCT/EP2004/013618 EP2004013618W WO2005053728A2 WO 2005053728 A2 WO2005053728 A2 WO 2005053728A2 EP 2004013618 W EP2004013618 W EP 2004013618W WO 2005053728 A2 WO2005053728 A2 WO 2005053728A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
polypeptide
protein
obesity
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/013618
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2005053728A3 (de
Inventor
Dieter Link
Irene Boche
Andreas Finck
Original Assignee
Xantos Biomedicine Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2003156076 external-priority patent/DE10356076A1/de
Application filed by Xantos Biomedicine Ag filed Critical Xantos Biomedicine Ag
Publication of WO2005053728A2 publication Critical patent/WO2005053728A2/de
Publication of WO2005053728A3 publication Critical patent/WO2005053728A3/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics

Definitions

  • the invention relates to obesity-associated proteins and their use in pharmaceutical compositions or diagnostics.
  • the present invention further relates to the use of inhibitors of these proteins for the treatment of type II diabetes.
  • Obesity (obesity) and type II diabetes are two of the most important metabolic diseases that are currently becoming a serious problem, particularly in the western world.
  • tendencies towards a pandemic can now be observed, particularly in type II diabetes.
  • Obesity is a condition that is characterized by an excessive accumulation of adipose tissue in the body.
  • Adipocytes are essential for the formation of adipose tissue and thus for the development of an obese phenotype, i.e. those cells that make up the body's fatty tissue.
  • obesity is a chronic health disorder, which is based on a polygenetic disposition as well as environmental factors and is associated with a high degree of accompanying and secondary morbidity. A long-term treatment and care concept is therefore essential for obesity.
  • BMI Body Mass Index
  • the BMI describes the ratio of body weight to body size.
  • the classification of the BMI is determined by the WHO (World Health Organization) depending on the mortality rate.
  • the normal BMI (18.5-24.4 kg / m 2 ) is the area with the lowest relative mortality risk.
  • the BMI values 25 and 30 kg / m are the corresponding risk-related limit values for adults for the determination of overweight or (clinical) obesity.
  • obesity grade III BMI greater than 40
  • morbid obesity / Super obesity BMI greater than 50.
  • Obesity and obesity go hand in hand with complications or comorbidities. They are an essential risk factor for the development of type II diabetes. They also often result in social isolation and discrimination. They can support or trigger mental disorders and thus reduce life expectancy and quality of life.
  • An increased percentage of fat is described as obesity.
  • an increase in the extracellular mass or the extracellular water in relation to the fat-free body mass indicates an obesity.
  • Studies such as bioelectrical impedance analysis (BIA) or infrared spectometry (NIRI) are suitable and practical methods for determining body fat status.
  • Fat distribution is also important for risk assessment.
  • An increased abdominal fat accumulation central or android distribution type
  • the diagnosis and therapy of obesity is the most important measure in early childhood, for example to prevent the development of pediatric type 2 diabetes.
  • the BMI can be used to assess overweight and obesity, as in adulthood. Since the BMI in childhood and adolescence is influenced by clear age and gender-specific peculiarities in accordance with the physiological changes in the percentage of body fat, one should take age and gender into account when assessing it.
  • the BMI percentile can be used (obtained by extrapolation), which at the age of 18 results in a BMI of 25 kg / m (overweight) or 30 kg / m (obesity) flows.
  • the 90th or 97th age- and gender-specific percentile can be used as a limit for the definition of overweight or obesity.
  • the BMI values 25 and 30 kg / m 2 are the corresponding risk-related limit values for adults. For example, with a BMI of 25 kg / m in men, the relative risk of type II diabetes 2.2 in women is 5.5.
  • cachexia or dystrophy for example lipodystrophy, lipoatrophy
  • lipodystrophy for example lipodystrophy, lipoatrophy
  • Lipodystrophy characterizes a group of diseases caused by the regional or generalized loss of subcutaneous fat. HIV-associated forms, such as congenital lipodystrophy or familial partial lipodystrophy, do not occur, but there is also a high prevalence associated with HIV infection or its treatment.
  • the HIV-associated fat distribution syndrome (HARS) which is characterized by both regional loss and an increase in fat tissue, also belongs in this context.
  • Cachexia can also be tumor-associated.
  • the treatment of cachexia, especially in the presence of a tumor disease, can make a significant contribution to the success of the treatment, since it is immediately life-threatening.
  • Treatment of obesity and obesity either have the goal of slowing down further weight gain, but preferably preventing it, or just as preferably achieving a reduction in body weight.
  • Comorbidities are already manifest, especially if there are signs of developing insulin resistance or type II diabetes.
  • Individuals with a BMI greater than 30 are particularly preferably treated without or with comorbidities which are termed clinically obese. This is particularly preferred for individuals with a higher degree of obesity.
  • BMI or a BMI that qualifies them as overweight, preferably when there are reasons to believe that these individuals are at an elevated level
  • Such reasons may be, for example, a genetic predisposition, a permanent disorder of the lipid or lipoprotein metabolism (dyslipidemia), a lifestyle that promotes obesity and may be difficult to change, and / or obesity due to other diseases.
  • a diagnosis can be helpful for this purpose, which allows, for example, genetic predispositions to be detected directly or indirectly or changed contents or activities of the proteins according to the invention or parameters dependent thereon, for example in the blood or in the adipose tissue.
  • Diabetes mellitus (commonly known as "diabetes") is a chronic metabolic disorder characterized by high blood sugar levels. Different causes of the disease and different forms of the disease require a distinction between two types, type I and type type II diabetes.
  • Type I diabetes is treated by administering insulin.
  • Type II diabetes (formerly adult or adult diabetes) usually develops in old age. It is characterized by the fact that the body cells on which the insulin is supposed to act no longer respond adequately to insulin. This can be attributed, among other things, to the resistance of adipocytes and also skeletal muscle cells to insulin. Interestingly, the older, more mature adipocytes are usually resistant, while younger adipocytes generally have no insulin resistance.
  • Such insulin resistance is seen as the result of persistently high blood sugar and insulin levels, such as e.g. can be observed in overweight people.
  • the treatment of type II diabetes is gradual: First of all, a diet is used to try to lower the blood sugar level in general. If the dietary measures are not sufficient for treatment, blood sugar-lowering medication and, in the advanced stage, insulin are also administered.
  • TNF-alpha a known differentiation inhibitor for fat cells
  • PPAR-gamma agonists as ligands for PPAR-gamma, they activate the PPAR-gamma transcription factor, which differentiates the adipocytes or activates the fat metabolism in mature adipocytes can).
  • transcription factors such as PPAR-gamma
  • PPAR-gamma for therapy is not possible, since the factors must be introduced directly into the target cell or the cell nucleus.
  • the binding to the DNA can only take place through the mediation of further cofactors.
  • a significant disadvantage of symptomatic treatment is the occurrence of sequelae, such as cardiovascular complications, diabetic nephropathies, neuropathies or retinopathies, which require additional treatment.
  • the object is first achieved by using a) a polypeptide with a sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23, or b) a heterotrimer of lymphotoxin alpha and beta or c) a nucleic acid coding for a polypeptide according to a), d) one or more nucleic acids coding for a heterotrimer of lymphotoxin alpha and beta, or e) a functional variant of the molecules according to a) to d)
  • the polypeptides mentioned or nucleic acids coding for them can play an essential role in the treatment of obesity or type II diabetes. More precisely, it has surprisingly been found that the proteins or nucleic acids mentioned are capable of permanently inhibiting the differentiation or function of adipocytes. For the first time, this enables treatment of obesity and / or type II diabetes at the molecular level.
  • SEQ ID numbers listed above relate to the following proteins and nucleic acids:
  • TNFSF-12 (“Tweak") VI protein (NP_003800) ⁇ SEQ ID No: 2 nucleic acid coding for TNFSF-12 VI (NM_003809) SEQ ID No: 3 TNFSF-12 (“Tweak") VI * SEQ ID No: 4 nucleic acid coding for TNFSF-12 VI * SEQ ID No: 5 TNFSF-14 ("Light") (NP_003798) SEQ ID No: 6 nucleic acid coding for TNFSF-14 (NM_003807) SEQ ID No: 7 Calsyntenin- 1 (NP_055759) SEQ ID No: 8 nucleic acid coding for Calsyntenin-1 (NM_014944) SEQ ID No: 9 Cardiotrophin-1 (NP_001321) SEQ ID No: 10 nucleic acid coding for Cardiotrophin-1 (NM_001330) SEQ ID No: ll FGF- 16 (NP_003859) SEQ ID No: 12 nucleic acid coding for FGF-16 (NM_00
  • polypeptides preferably bind to the following proteins:
  • SEQ ID polypeptide (synonyms) number of the Rezej nucleic acid protein I and 3 TNFSF12 TWEAK receptor coding for the access number receptor (Fnl4, NM_016639 NP_057723 VI TNFRSF12A) TNFSF12 V2 TNFS384 / or NM_002342 NP 002333 lymphotoxin beta receptor cardiotrophic LIF receptor (LIFR) and NM 002310 NP_002301 in gp 130 receptor as NM_002184 NP 002175 heterodimer 11 FGF-16 FGFR-4 NM_002011 NP_002002
  • lymphotoxi lymphotoxin beta NM_002342 NP_002333 n receptor NM_001065 NP_001056 alpha2 / beta TNFRSF1A (p55) NM_001066 NP_001057 1 TNFRSF1B (p75)
  • TNFSF-12 (tweak) is a cell surface associated type II membrane protein that was originally described as a member of the tumor necrosis factor (TNF) superfamily (a detailed review can be found in Wiley et al., 2003, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14: 241-249).
  • TNF tumor necrosis factor
  • a small biologically active part can be split into the extracellular environment as a soluble protein with a length of approximately 157 amino acids.
  • TNFSF-12 mRNA is expressed in a variety of tissues and cell types, but mainly in leukocytes. The difference between mRNA expression and protein expression on the cell surface is striking. The expression of TNFSF-12 on the cell surface could only be confirmed on monocytes after IFN-gamma treatment.
  • TNFSF-12 receptor Only one TNFSF-12 receptor is known in the literature to bind tweak with physiological activity. It is described as “TweakR” or "fibroblast growth factor inducible 14" (FN14). This receptor is the smallest member of the TNF receptor group. No other ligands that bind to TweakR are known, nor is it known that tweak itself binds to other known TNF receptors.
  • TNFSF-12 For TNFSF-12, numerous biological activities such as induction of angiogenesis, inflammatory cytokines and, under special conditions (e.g. costimulation with IFN-gamma), the stimulation of apoptosis have been described in the literature. In the context of the present invention, an inhibition of adipocyte differentiation or inhibition of lipid storage in adipocytes was surprisingly shown.
  • TNFSF-12V1 differs from TNFSF-12V1 * in that there is no amino acid in the membrane part of the protein (see example 1).
  • TNFSF-14 (“Light”) is an integral class II membrane protein of the tumor necrosis factor (TNF) ligand family (a detailed review can be found in Granger and Ricert, 2003, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14: 289-296) It is 240 amino acids in length and contains an N-terminal cytosolic domain, a type II transmembrane domain and a C-terminal receptor binding domain. The soluble protein is 167 amino acids long.
  • the protein is a ligand for TNFRSF14, a member of the TNF receptor superfamily, also known as "herpes virus entry mediator” (HVEM).
  • HVEM herpes virus entry mediator
  • Other receptors are lymphotoxin beta receptor and DcR3.
  • T cell proliferation T cell proliferation, cytokine secretion, arteriosclerosis, "graft versus host disease” as well as an association with apoptotic processes
  • the protein stimulates the proliferation of T cells and triggers the apoptosis of various tumor cells
  • TNFSF-14 TNF-alpha-mediated apoptosis in hepatocytes
  • TNFSF-12 / TNFSF-14 it could be shown that the inhibitory effect is reversible. This could be demonstrated by taking the protein away after days three to four. This apparently enables the 3 T3-L1 cells to re-enter the differentiation process, possibly by re-entering the differentiation-specific cell cycle leading to clonal expansion or the specific transcription activation necessary for differentiation. It was also found that the effect is not cytotoxic, since the reversibility of the inhibitory effect shows that the cells are not damaged by the previous inhibition. This is also confirmed by microscopic measurement of the number of living cells.
  • the secreted cytokine cardiotrophin has no canonical signal peptide. It is mainly expressed in the heart, brain, lungs and liver and is known as a "survival factor". A connection with adipocyte differentiation or inhibition of lipid storage in adipocytes is not shown in the prior art.
  • Calsyntenin-1 is a type I membrane protein. It consists of a large extracellular fragment that contains two "cadherin-like repeats" and a small cytoplasmic segment that is able to bind calcium ions. The protein is proteolytically cleaved in the extracellular domain A possible involvement of the cytoplasmic part in the regulation of calcium signals in the CNS has been speculated. The extracellular part has not yet been assigned an independent function. An inhibition of adipocyte differentiation or an inhibition of lipid storage in adipocytes could not be shown in the prior art.
  • FGF-16 is a member of the "fibroblast growth factor” family. These proteins have broad mitogenic and “cell survival” activity. They are in a variety of biological processes such as embryo development, cell growth, morphogenesis, tissue regeneration, tumor growth and invasion are involved. Although the protein is secreted, no signal peptide is known. FGF-16 has been described as a growth factor for brown adipocytes, but not as an inhibitor of the differentiation of preadipocytes.
  • GH-2 (“growth hormone 2”) is a member of the somatotropin prolactin family of hormones that play an important role in growth control. GH-2 was able to inhibit adipocyte differentiation or inhibit lipid storage in adipocytes of technology are not shown.
  • BM045 is an unspecified bone marrow protein. A function is not yet known.
  • GK001 has a transmembrane domain and a signal peptide. A function is not yet known. Due to the predicted transmembrane domain, it is possible that a secreted protein fragment is generated by extracellular / juxtamembrane proteolytic cleavage.
  • Endothelin-2 is a member of the endothelin family (ET-1, ET-2, ET-3), which generate approximately 21 amino acids long peptides by proteolytic cleavage from larger preproproteins.
  • the extracellular protein contains two endothelin domains and is mainly expressed in the kidney.
  • Known functions are vasoconstriction and chemotaxis.
  • An inhibition of adipocyte differentiation or inhibition of lipid storage in adipocytes by endothelin-2 could not be shown in the prior art.
  • lymphotoxin-beta receptor to which TNFSF14 also binds
  • alphal / beta2-lymphotoxin or alpha2 / betal -lymphotoxin alphal / beta2-lymphotoxin or alpha2 / betal -lymphotoxin.
  • Alphal / beta2-lymphotoxin binds exclusively to the lymphotoxin-beta receptor, while for the alpha2 / betal -lymphotoxin binding to the TNF-alpha receptors TNFRI (p55) and TNFRII (p75) has also been described.
  • TNFRI p55
  • TNFRII p75
  • the membrane anchor can be recombinantly eliminated in the lymphotoxin beta subunit, so that soluble recombinant heterotrimers with full receptor binding and activity result.
  • Recombinant alphal / beta2-lymphotoxin or alpha2 / betal -lymphotoxin are therefore heterotrimeric recombinant soluble proteins consisting of lymphotoxin-alpha and lymphotoxin beta monomers in the stoichiometries indicated in each case, which are produced by genetic engineering in the soluble form (R&D Systems , Wiesbaden, Germany.
  • Recombinant alpha / beta2 lymphotoxin catalog number: # 678-LY.
  • Recombinant alpha2 betal lymphotoxin catalog number: # 679-TX).
  • Composition of a lymphotoxin-alpha monomer CD33 signal peptide As Metl-Metl7 followed by human lymphotoxin alpha, amino acids Leu35-Leu 205;
  • Composition of a lymphotoxin beta monomer CD33 signal peptide Metl-Metl7 followed by human lymphotoxin beta, amino acids Leu54-Gly244.
  • the inhibition of lipid storage in adipocytes was also surprisingly shown for alpha l / beta2 lymphotoxin.
  • the inhibition of lipid storage has also not been described so far, and is surprising insofar as the available results for TNFSF14 and Alphal / beta2 lymphotoxin reveal that the inhibitory effect can and cannot be developed via the lymphotoxin beta receptor via the TNF-alpha receptors already described for this (p55 and p75).
  • Lymphotoxin alpha homotrimers also inhibit adipocyte differentiation, but only bind to the TNF-alpha receptors (p55 and p75).
  • TNFSF12 TNFSF14 or lymphotoxin
  • these are therefore preferably polypeptides which are present in a trimeric arrangement.
  • the monomer is administered and the monomers then assemble into their natural form in the patient's body.
  • the invention also relates to the use of functional variants of the molecules listed under a) or b) above for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of obesity.
  • “functional variant” of a polypeptide refers to a polypeptide and / or fragment which essentially has the biological function or functions of the corresponding protein.
  • this can be the ability to store lipids in suitable cells, especially 3T3 cells, a test to determine this activity is shown in Examples 2-5.
  • a “functional variant” of a nucleic acid is understood to mean a nucleic acid which likewise encodes a polypeptide used according to the invention.
  • the expression “functional variant” of a polypeptide or a nucleic acid preferably refers to polypeptides or nucleic acids with a sequence homology, in particular a sequence identity of approximately at least 25%, preferably approximately 40%, particularly approximately 60%, particularly preferably approximately 70%, very particularly preferably about 80%, in particular about 90% and most preferably of 98% with the polypeptide.
  • Such variants are, for example, homologous polypeptides which come from other organisms.
  • Other examples of variants are polypeptides or fragments which are encoded by different alleles of a gene, Polypeptides or fragments from different individuals, from different organs of an organism or from different development phases.
  • Functional variants preferably also include naturally occurring mutations, in particular mutations which quantitatively change the activity of the peptides which are encoded by these sequences. Furthermore, such variants can preferably result from differential splicing of the coding genes.
  • fragment preferably refers to a fragment that is at most 150, preferably 130, 110, 90, 70, 50, N- or C-terminal in comparison to the protein sequences shown in the SEQ IDs. 30, preferably at most 20, more preferably at most 10 amino acids.
  • fragment preferably refers to a fragment which, in comparison to the nucleic acid sequences shown in the SEQ IDs, is N- or C-terminal by at most 450, preferably 390, 330, 270, 210, 150, 90, is preferably shortened at most 60, more preferably at most 30 nucleotides.
  • the term “functional variant” includes derivatives with single nucleotide polymorphisms (“single nucleotide polymorphism” (SNP)).
  • Sequence identity refers to the degree of identity (% identity) of two sequences which can be determined in the case of polypeptides, for example by BLASTP 2.2.5 and in the case of nucleic acids, for example by BLASTN 2.2.6, the low complexity filter (low complexity filter). is turned on and BLOSUM 62 (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402).
  • Sequence homology refers to the similarity (% positives) of two nucleotide or polypeptide sequences, determined, for example, using BLASTN 2.2.6 or BLASTP 2.0.1, with the filter switched on and BLOSUM 62 (BlastP) (Altschul et al. , 1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402).
  • Nucleic acids encoding functional variants can be isolated using appropriate gene sequences in order to identify homologs, using methods which are known to the person skilled in the art, for example PCR amplification or hybridization under stringent conditions (for example 60 ° C. in 2.5 x SSC buffer, followed by various washing steps at room temperature) with suitable samples, for example derived from the corresponding gene sequences or other homologous samples from other organisms.
  • the functional variant is a soluble protein, peptide or fragment.
  • the functional variant is more preferably a soluble variant
  • Protein that lacks the transmembrane domain Preferably that means that
  • Proteins (TNFSF-12, TNFSF-14) contain the N-terminal fragment
  • the C-terminal fragment contains the transmembrane domain.
  • a soluble extracellular fragment is used, the
  • N-terminal (type II proteins) or C-terminal (type I proteins) is shortened by further amino acids. More preferably, an N-terminal fragment (type II proteins) or a C-terminal fragment (type I proteins), e.g. split off a signal sequence.
  • the proteins are protein fragments according to Table 1.
  • treatment is preferably understood to mean that a patient is treated in whom the corresponding disease has been diagonostified.
  • prevention in the context of the present invention is preferably understood to mean that a subject is treated in which the Illness has not (yet) broken out.
  • the obesity is an uncomplicated obesity. Uncomplicated obesity is characterized by the fact that insulin resistance is not yet pronounced.
  • polypeptides or nucleic acids used according to the invention act by inhibiting the formation of terminally differentiated adipocytes.
  • terminally differentiated adipocytes can be inhibited by promoting the proliferation of preadipocytes, by inhibiting differentiation to terminally differentiated adipocytes, in particular by inhibiting the transcription signal pathway for differentiation, or by promoting cell death, in particular apoptosis in preadipocytes.
  • the proliferation can take place, for example, by cell count determination, cell cycle analyzes in the FACS or determination of the metabolic activity of the cells, which are measured as enzymatic turnover of the mitochondria (e.g. by Alamar Blue
  • Differentiation to terminally differentiated adipocytes can be inhibited by measuring lipid incorporation (e.g. by staining with NileRed).
  • reporter gene assays such as PPAR-gamma can measure the inhibition of the transcription signal path.
  • Apoptosis is determined, for example, by CDD + assay (Cell Death Detection ELISA PLUS, Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), DiOC6 assay, AnnexinV assay or CaspaTag TM assay (CaspaTag TM Caspase-3 (DEVD) activity kit, Intergen Company, Purchase, NY, USA) possible.
  • polypeptides or fragments or nucleic acids or fragments used according to the invention can act by inhibiting the function of the terminally differentiated adipocytes. This can be achieved, for example, by inhibiting lipogenesis or by promoting lipolysis. Lipid incorporation in mature adipocytes can be demonstrated by staining with lipophilic dyes such as Nile Red.
  • the patient is administered several, preferably two or three, of the molecules listed above.
  • the pharmaceutical composition has a direct effect on the adipocytes.
  • polypeptides according to the invention or nucleic acids coding for them develop their therapeutic effect preferably by direct action on certain adipose tissue within an individual or else indirectly, mediated by other adipose tissue compartments or also by interaction via other tissues which are involved in the regulation of energy homeostasis.
  • nucleic acid or the functional variant thereof is used in the context of somatic gene therapy.
  • the corresponding techniques and administration forms are known in the prior art
  • TNFSF14 and the lymphotoxin-beta receptor
  • further naturally occurring ligands of the respective receptors of the proteins according to the invention can preferably bring about a similar activity.
  • a ligand such as TNFSF14 can bind various receptors (HVEM and lymphotoxin-beta receptor see FIG. 9 and Zhai et al. J Clin Invest. 1998 Sep 15; 102 (6): 1142-51) on the target cells.
  • the invention therefore further relates to the use of a ligand of the TNFSF-14 receptor for the production of a pharmaceutical composition for prevention and
  • the invention thus also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a) a polypeptide with a sequence according to SEQ ID NO: 21 or 23, b) a nucleic acid coding for a polypeptide according to a) or c) a functional variant of the molecules according to a) or b) ,
  • the invention further relates to a method for treating a patient, in which the patient is administered an effective amount of one and / or more of the molecules defined above.
  • the patient preferably suffers from obesity. All of the embodiments listed above for the inventive use apply to this inventive method.
  • the factors found according to the invention in addition to inhibiting the differentiation of preadipocytes to adipocytes, enable the function of the mature or the maturing adipocytes to be inhibited by inhibiting lipogenesis or promoting lipolysis. If this inhibitor of differentiation is inhibited, differentiation or modulation of the function of the mature differentiated adipocytes thus form new young adipocytes which have no insulin resistance. The ratio of insulin-resistant adipocytes is thus shifted in favor of insulin-sensitive adipocytes.
  • the invention thus also relates to the use of an inhibitor a) a polypeptide with a sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23, or b) a heterotrimer of lymphotoxin alpha and beta, or c ) a functional variant of the molecules according to a) or b)
  • type II diabetes type II related diseases
  • type II related diseases for example cardiovascular complications, arteriosclerosis, dislipidemia, diabetic nephropathy, neuropathy, retinopathy, hyperglycemia, insulin resistance, hyperinsulinemia or high blood pressure
  • cachexia or HARS cachexia or HARS
  • Cardiotrophin and FGF-16 are preferred here.
  • FGF-16 negative regulation of insulin signaling in adipocytes was shown here (see Fig. 10).
  • Cachexia is characterized by a decrease in adipose tissue or an inhibition of the formation of new adipose tissue.
  • HARS HARS
  • These changes are due to an increased expression or activity of the proteins used according to the invention. By inhibiting these proteins, further degradation of the fat tissue depots can be prevented or a build-up of these depots can be achieved.
  • the subcutaneous fat deposits can be built up.
  • the inhibitor is selected from the group consisting of proteins, peptides, peptide fragments, antibodies, decoy receptors, anticalins, affilines, low molecular weight substances (LMWs), antisense RNA, siRNA, aptamers and proteases.
  • LMWs low molecular weight substances
  • inhibitor or “inhibiting” means the complete or partial suppression of a biological function.
  • the term “inhibitor” relates to a biochemical or chemical compound which preferably inhibits and / or reduces the action of the proteins described according to the invention, ie for example the inhibition of fat storage itself. This can be done, for example, by suppressing the expression of the corresponding gene The expression of the gene can be measured by RT-PCR or Western blot analysis.
  • the inhibitor used inhibits the proteins according to the invention which are increased in expression or activity.
  • an activator is a connection with the opposite function.
  • inhibitors are binding proteins or binding peptides which are directed against the molecule, in particular against the active site of the molecule, and nucleic acids which are directed against the corresponding gene.
  • Decoy receptors are understood to mean non-membrane-bound receptors without a transmembrane domain, which bind to ligands, but do not allow signal forwarding (“signaling”) due to the lack of intracellular domains.
  • LMWs are molecules that are not proteins, peptide antibodies or nucleic acids and that have a molecular weight of less than 5000 Da, preferably less than 2000 Da, particularly preferably less than 1000 Da, most preferably less than 500 Da. Such LMWs can be identified in so-called “high-throughput” methods, which are carried out on the basis of corresponding molecular banks. Such methods are known in the prior art.
  • binding protein or "binding peptide” refers to a class of proteins, peptides or peptide fragments which bind or inhibit the particular molecule, including, without limitation, polyclonal or monoclonal antibodies, antibody fragments and protein scaffolds against these proteins, peptides or peptide fragments are directed.
  • the method for producing an antibody or antibody fragment is carried out by means of methods which are known to the person skilled in the art, for example by immunizing a mammal, for example a rabbit, with the corresponding peptide, where appropriate, appropriate adjuvants, for example Freund's adjuvant and / or aluminum hydroxide gels, can be used (see for example Diamond, BA et al.
  • the polyclonal antibodies generated in the animal as a result of an immunological reaction can subsequently be isolated from the blood using methods known in the art and then purified, for example, by column chromatography.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, in accordance with the known method from Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299).
  • the term antibody and antibody fragment is also understood to include antibodies and / or antigen-binding parts thereof, which have been produced recombinantly and, if necessary, modified, for example chimeric antibodies, humanized antibodies, multifunctional antibodies, bispecific or oligo-specific antibodies, single strand antibodies and F (ab) - or F (ab) 2 fragments (see for example EP-Bl 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213 or WO 98/24884) ,
  • protein scaffolds against the respective molecule for example anticalins based on lipocalin (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, 1898 to 1903).
  • the natural ligand binding sites of lipocalins for example the retinol binding protein or the bilin binding protein, can be altered, for example using a "combinatorial protein design" approach, in such a way that they bind selected haptens , (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50)
  • Other known protein scaffolds are known to be alternatives to antibodies (Skerra (2000) J. Mol.
  • nucleic acids directed against the corresponding gene refers to double-stranded or single-stranded DNA or RNA or fragments thereof which, for example, inhibits the expression of the respective gene or the activity of the respective molecules, and includes, without limitation, antisense nucleic acids, Aptamers, siRNAs (small interfering RNAs) and ribozymes, etc.
  • Nucleic acids, for example the antisense nucleic acids or siRNAs can be chemically synthesized, for example according to the phosphotriester method (see, for example, Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90 , 543-584).
  • Aptamers are nucleic acids that bind to a polypeptide with high affinity. Aptamers can be selected from one by selection methods such as SELEX (see, for example, Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981) large pool of different single-stranded RNA molecules can be isolated. Aptamers can also be synthesized and selected in their mirror form, for example as the L-ribonucleotide (Nolte et al. (1996) (Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14 , 1112-5) Forms which have been isolated in this way have the advantage that they are not broken down by naturally occurring ribonucleases and therefore have greater stability.
  • SELEX see, for example, Jayasena (1999) Clin. Chem.
  • Nucleic acids can be degraded by endonucleases or exonucleases, in particular by DNases and lawns, which can be found in the cell. It is therefore advantageous to modify nucleic acids to stabilize them against degradation, thereby ensuring that a high concentration of nucleic acid in the cell is maintained over a long period of time (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res., 23 : 3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Typically, such stabilization can be achieved by introducing one or more internucleotide phosphor groups or by introducing one or more non-phosphor internucleotide analogs.
  • Modified internucleotide Phosphorus groups include, for example, methylphosphonates, phosphorothioates, phosphoramidates, phosphorodithioates and / or phosphate esters, while the non-phosphorus internucleotide analogs contain, for example, siloxane bridges, carbonate bridges, carboxymethyl esters, acetamidate bridges and / or thioether bridges. These modifications are also intended to improve the life of a pharmaceutical composition that can be used in accordance with the uses of the present invention.
  • siRNAs as aids for RNA interference in the process of down-regulating or switching off gene expression is described, for example, in Elbashir, S.M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188, or Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature, 411, 494.
  • SiRNAs preferably have a length of less than 30 nucleotides, the identity region of the sense strand of the siRNA preferably comprising at least 19 nucleotides.
  • Ribozymes are also suitable tools to inhibit the translation of nucleic acids because they are able to specifically bind and cut the mRNAs. They are described, for example, in Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2; or Couture and Stinchcomb (1996) Trends Gene., 12, 510-5. A single stranded DNA or RNA is preferred for use as an antisense oligonucleotide or ribozyme.
  • the nucleic acids described herein can therefore be used to inhibit and / or reduce the expression of the respective genes in the cells both in vivo and in vitro. Therefore, they can act as inhibitors in the context of the present invention.
  • the inhibitor used acts in that the pharmaceutical composition promotes the formation of terminally differentiated adipocytes. This can be done, for example, by inhibiting the proliferation of preadipocytes, by promoting differentiation into terminally differentiated adipocytes, in particular by promoting the transcription signaling pathway of the differentiation, or by inhibiting cell death, preferably apoptosis in preadipocytes.
  • the respective effect can be measured as indicated above.
  • the inhibitor used according to the invention acts in that the pharmaceutical composition promotes the function of the terminally differentiated adipocytes. This can be achieved, for example, by promoting lipogenesis or by inhibiting lipolysis.
  • the inhibitor used acts in that the pharmaceutical composition sensitizes other insulin-dependent non-adipocyte cell types (such as skeletal muscle cells, hepatocytes, islet cells, endothelial cells).
  • insulin-dependent non-adipocyte cell types such as skeletal muscle cells, hepatocytes, islet cells, endothelial cells.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition containing an inhibitor of a polypeptide with a sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 or 23, or a functional variant thereof ,
  • the corresponding molecules are usually formulated with suitable additives or auxiliaries, such as, for example, physiological buffer solution, for example sodium chloride solution, demineralized water, stabilizers, such as protease or nuclease inhibitors, preferably aprotinin, ⁇ -aminocaproic acid or pepstatin A or chelating agents such as EDTA, gel formulations such as white petroleum jelly, paraffin with low viscosity or yellow wax, depending on the type of administration.
  • suitable additives or auxiliaries such as, for example, physiological buffer solution, for example sodium chloride solution, demineralized water, stabilizers, such as protease or nuclease inhibitors, preferably aprotinin, ⁇ -aminocaproic acid or pepstatin A or chelating agents such as EDTA, gel formulations such as white petroleum jelly, paraffin with low viscosity or yellow wax, depending on the type of administration.
  • Suitable additional additives are, for example, detergents, such as, for example, Triton X-100 or sodium deoxycholate, but also polyols, such as, for example, polyethylene glycol or glycerol, sugars, such as, for example, sucrose or glucose, zwitterionic compounds, such as, for example, amino acids, such as glycine or in particular taurine or betaine or a Protein such as bovine or human serum albumin. Detergents, polyols and / or zwitterionic compounds are preferred.
  • the physiological buffer solution preferably has a pH of approximately 6.0-8.0, in particular a pH of approximately 6.8-7.8, in particular a pH of approximately 7.4, and / or an osmolarity of approximately 200-400 milliosmol / Liter, preferably from about 290-310 milliosmol / liter.
  • the pH of the drug is generally adjusted using a suitable organic or inorganic buffer, such as using phosphate buffers, tris buffers (tris (hydroxymethyl) aminomethane), HEPES buffers ([4- (2-hydroxyethyl) piperazino] ethanesulfonic acid) or MOPS buffer (3-Mo ⁇ holino-1-propanesulfonic acid).
  • phosphate buffers tris buffers (tris (hydroxymethyl) aminomethane)
  • HEPES buffers [4- (2-hydroxyethyl) piperazino] ethanesulfonic acid
  • MOPS buffer 3-Mo ⁇ holino-1-propanesul
  • Injection solutions are generally used when only a small amount of a solution or suspension, for example about 1 to about 20 ml, is to be administered.
  • Infusion solutions are generally used when a large amount of a solution or suspension, for example one or more liters, is to be administered. Because, in contrast to the infusion solution, only a few milliliters in the case of injection solutions are administered, small pH differences or the osmotic pressure of the blood or the tissue fluid compared to the solution for injection itself are not noticeable or do not play a major role. Dilution of the formulation before use is therefore generally not necessary. However, if relatively large amounts are administered, the formulation according to the invention should be diluted shortly before administration, so that an isotonic solution is obtained, for example.
  • An example of an isotonic solution is 0.9% saline.
  • the dilution can be achieved, for example, using sterile water, while the administration can be carried out, for example, by means of a so-called bypass.
  • subjects which can be treated or diagnosed in accordance with the present invention preferably include mammals, in particular humans, the dead or the living. As mentioned above, this also includes gene therapy.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be administered parenterally, orally or transdermally in various ways in order to bring about a suitable inhibition of lipid storage or the symptoms of type II diabetes.
  • the effective dose will depend on the weight and condition of the subject being treated. It can be assumed that the person skilled in the art knows how a suitable dosage can be determined.
  • the pharmaceutical composition can be administered in various ways, for example orally, intramuscularly, subcutaneously, intrathecally, into the adipose tissue, percutaneously (dissolved in DMSO), ocularly, buccally, intranasally (inhalation), intravenously or intraperitoneally, or by fusion or gels which contain the respective medication. It is also possible to administer the medication topically and locally, for example in the form of liposome complexes.
  • the medication can also be administered by a transdermal therapeutic system (TTS), which enables the medication to be dispensed in a time-controlled manner.
  • TTS are, for example, from EP 944 398, EP 916 366, EP 889 723 or EP 852 493.
  • a slower release of the protein, peptide, or antibody is achieved by combination with polymers, and a longer half-life is achieved by adding PEG.
  • Suitable polymers also allow oral administration of the pharmaceutical composition, for example through a protected passage through the intestine and the targeted penetration of the cell-cell contact points in the region of the intestinal epithelium.
  • a combination with chemical agents e.g. appetite inhibitors, lipase inhibitors can intensify the effect.
  • proteins, peptides, fragments are preferably in a dose of 1 pg / kg to 15 mg / kg, preferably between 5 pg / kg and 5 mg / kg, and particularly preferably between 0.2 and 2 mg / kg patient weight administered.
  • Continuous infusions can also be used, for example by using an osmotic mini pump as described in Heyman et al., Nat. Med., 1999, 5, 1135-152.
  • an infusion dose between 5 and 20 ⁇ g / kg / minute, preferably between 7 and 15 pg / kg / minute, can be used.
  • nucleic acids or fragments are to be administered, the gene transfer can take place either by means of naked DNA or in a vector.
  • Corresponding vectors are known in the prior art (Barnacal, P. (1998) SRIP's complete Guide to Gene Therapy. PJB Publication)
  • Vectors which can be used for the purposes of the present invention are, for example, vectors based on adenovirus and / or replication-deficient retroviruses. Corresponding techniques are known to the person skilled in the art from the prior art.
  • controllable vectors such as described in Ozawa et al., Annu. Rev. Pharmacol. & Toxicol., 2000, 40, 295-317.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is in a form which enables the active ingredient to come into contact with a component of the cell surface (non-cell-permeable) (Cardiovasc Pharmacol Ther. 2002 Jul; 7 (3): 171-80.
  • the invention further relates to a method for treating a patient, in which patients are administered an effective amount of one or more of the inhibitors defined above.
  • the patient preferably suffers from diabetes type II or diabetes type II related diseases.
  • the patient more preferably suffers from cachexia or HARS. All of the embodiments listed above for the inventive use of the inhibitor apply to these methods according to the invention.
  • the invention further relates to the use of the polypeptides, proteins or fragments or the nucleic acid or the fragments as defined above for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of obesity or type II diabetes.
  • the detection of the protein or peptide in serum, fat, brain or muscle can be done by Western blot, the detection of nucleic acids by PCR analysis.
  • the detection of the expressed protein or peptide serves as a marker for the phenotype of the disease. This is particularly helpful when diagnosing risk groups that have an increased or decreased expression of the marker. For example, the expression of TNFSF12 in the blood serum in obese individuals can be reduced (see FIG. 13). For example, this marker is increased in patients suffering from cachexia or HARS (HIV-associated-adipose redistribution syndrome ").
  • the expression level of the marker can be used for the determination of the therapy method and possibly for the dosage of the therapeutic agent. Based on the determination of the protein level The course of the disease can also be determined during and after therapy.
  • the presence of genetic variants SNPs ("small nuclear polymorphisms”) on the chromosomal level can also have very far-reaching effects on the predisposition of the patient (sensitivity to obesity).
  • the course can be determined by determining genetic variants of the proteins, peptides or fragments according to the invention diagnose and / or predict therapies related to obesity and type II diabetes.
  • the present invention also relates to a diagnostic agent comprising a) a polypeptide or a fragment with a sequence according to SEQ ID NO: 21 and / or 23, b) a nucleic acid or a fragment coding for a polypeptide according to a) and / or c ) a variant of the molecules according to a) or b).
  • the variants can be functional variants as defined above.
  • the term “variant” also includes those nucleic acid molecules with which the respective nucleic acids can be detected, the nucleic acids used for the detection themselves being no functional variants. Examples of these are primers or oligonucleotides which can bind to coding or non-coding sequences and thereby enabling their detection.
  • detectable aberrant expression amounts can be determined in this way, which are also used for diagnostics, for example, when the affected individuals are not yet obese, but carry a high risk of becoming obese due to their personal disposition.
  • diagnostic assays can not only be based on the measurement of the corresponding protein, but also the genetic background which leads to the modulation of the protein expression can be determined.
  • genetic variations SNPs or haplotypes, insertions, deletions or amplifications
  • SNPs or haplotypes, insertions, deletions or amplifications are to be mentioned here, which can control the expression of the protein, for example, in promoters or other regulatory sequences.
  • genetic variations that change the protein itself and thus change the function or stability of the protein.
  • Proteins can be correlated. All of these variants can be detected and used as the basis for corresponding diagnostics.
  • Embodiments for such assays can be, among other things, PCR techniques combined with sequence analysis, hybridization analysis (chips) or sequence-specific antibodies, as well as bioinformatory analysis and detection of specific haplotypes, which are combinations of individual SNPs, deletions, insertions and / or amplifications.
  • the invention further relates to a method for identifying a modulator of a polypeptide with a sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 or 23, a heterotrimer of lymphotoxin alpha and beta or a functional variant thereof, in which a suitable cell with a combination of a potential modulator and a polypeptide with a sequence according to SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 or a heterotrimer of lymphotoxin alpha and beta or a functional variant thereof and then the change in biological activity is determined.
  • This method according to the invention can be carried out, for example, as follows:
  • Producer cells e.g. HEK 293 cells
  • cDNA expression plasmids which code for the corresponding proteins according to the invention.
  • the cells are cultivated for a period of, for example, 2 days (expression of the protein in the cell supernatant).
  • the appropriate modulators are added (Inhibitors or activators) to these cells.
  • the modulators can be selected from collections / libraries of chemical substances (low molecular weight substances, LMWs), peptides, proteins, an igro ⁇ ern, decoy receptors, anticalines, affilines, antisense RNAs, siRNA, aptamers or proteases.
  • Such a modulator can in particular also be another ligand for the receptor of the polypeptide.
  • the cell supernatant is transferred from the producer cells to the recipient cells.
  • the modulator does not necessarily have to be added before the cell supernatant is transferred.
  • the modulator can also be added simultaneously or with a time delay. This can be particularly advantageous if the complex formation from the protein according to the invention with cellular or soluble receptors increases the modulation.
  • a protein can only be recognized by an antibody after complex formation from the protein and the associated receptor.
  • the recipient cells are cultivated for a suitable period of time (for example 5 days).
  • the effect of the modulators on the cells is then determined. This can be, for example, an increased lipid storage (inhibitors) or a reduction in lipid storage (activators). Both can be determined using the Nile Red Assay.
  • recombinantly produced protein (see Example 1) can also be added to the recipient cells.
  • concentration of the recombinant protein added corresponds to the concentration of the secreted protein in the cell supernatant of the producer cell.
  • the cell expresses the receptor of the respective polypeptide naturally or recombinantly or that the receptor is a chimeric receptor.
  • the molecular receptor corresponding to the protein according to the invention is expressed recombinantly, ie with the aid of DNA supplied and coding for the receptor, in these cells and a corresponding reporter gene-coupled assay is used to determine the lipid incorporation or the insulin-dependent signal transmission ("insulin signaling") ,
  • insulin signaling insulin-dependent signal transmission
  • the preferred receptors for those according to the invention Proteins are listed above.
  • Corresponding reporter gene assays are known in the prior art.
  • the recombinant receptor in adipocytes or non-adipocyte cells can also be a receptor chimera.
  • the extracellular binding site of the protein according to the invention in the natural receptor is coupled to an intracellular effector domain of another receptor by recombination - the natural effector domain is preferably eliminated.
  • the transmembrane domain of the chimeric receptor can optionally originate from the natural receptor or originate from the second receptor, which naturally does not bind the polypeptide according to the invention.
  • the result is a chimeric receptor which, upon binding of the protein according to the invention, initiates signaling in the cell which corresponds to that of the effector domain of the second receptor. This can then also be measured in a corresponding reporter gene-coupled assay.
  • the modulator represents a ligand of the receptor.
  • the cell is preferably of human or non-human origin.
  • the cell is a primary adipocyte or is derived from a primary adipocyte.
  • the change in the biological activity of adipocytes is determined.
  • the cell is a primary tissue cell or is derived from primary tissue, the tissue preferably being selected from the group consisting of liver, adrenal gland, blood cells, preferably lymphocytes, endothelial cells, muscles, preferably skeletal muscles, pancreas and brain, preferably hypothalamus , Since soluble proteins, peptides or fragments thereof can act on various tissues for the purpose of integrating a wide variety of tissues into a concerted response to a given status of the energy balance or a related stimulus, it may be expedient to determine the effect of the proteins according to the invention on other tissues , In particular, this relates to tissues that are directly involved in energetic homeostasis (maintaining an equilibrium), such as the liver, muscles, preferably skeletal muscles, pancreas, brain, preferably hypothalamus, adrenal gland, but also blood cells, preferably lymphocytes and endothelial cells. The latter because obesity is also associated with increased inflammatory activity and because blood vessel care can be a determining factor in
  • the cell is particularly preferably selected from a cell line from the group consisting of liver cell lines, in particular HepG2, H4IIE, endothelial cells, in particular HUVEC or microvascular endothelial cells, cardiac muscle cells, skeletal muscle cells, in particular C2C12 or L6, glucose-sensitive beta cells of the pancreas, in particular INS-1 or Min-6, fibroblasts, in particular NIH3T3 or Swiss albino 3T3, HEK-293, COS or CHO cells.
  • liver cell lines in particular HepG2, H4IIE
  • endothelial cells in particular HUVEC or microvascular endothelial cells
  • cardiac muscle cells in particular C2C12 or L6
  • C2C12 or L6 glucose-sensitive beta cells of the pancreas
  • fibroblasts in particular NIH3T3 or Swiss albino 3T3, HEK-293, COS or CHO cells.
  • the change in the biological activity is particularly preferably a reduction or increase in the fat storage in the cells.
  • fat storage is very particularly preferably measured by determining the intracellular stored lipid.
  • the modulator can be identified using high-throughput screening (HTS) methods, as described, for example, in WO 01/48239 or WO 03/014346.
  • HTS high-throughput screening
  • the examples show in particular that the polypeptides used according to the invention are able to inhibit lipid insertion in murine 3T3-L1 cells.
  • the inhibition could also be shown in primary human adipocytes of subcutaneous and omental origin. The detection was carried out in each case by NileRed assay.
  • the percentage inhibition of lipid storage in 3T3-L1 cell cultures is shown based on the negative control (empty vector).
  • 3T3-L1 cell cultures were incubated with supernatants from 293 cells which were transfected with the expression plasmids coding for the respective proteins.
  • a low signal strength means low lipid storage in the 3T3-L1 cells
  • a high signal strength means a strong lipid storage.
  • the dose-response curve is shown, which shows the lipid content of 3T3-L1 cells as a function of the added amount of recombinant secreted or soluble protein fragment TNFSF-12.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 5 after the addition of the protein.
  • the dose-response curve is shown, which shows the lipid content of 3T3-L1 cells as a function of the added amount of recombinant soluble or secreted or soluble protein fragment TNFSF-14.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 5 after the addition of the protein.
  • the dose-response curve is shown, which shows the lipid content of 3T3-L1 cells as a function of the added amount of recombinant cardiotrophin-1 protein.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 5 after the addition of the protein.
  • Fig. 5 The dose-response curve is shown, which shows the lipid content of 3T3-L1 cells as a function of the added amount of recombinant secreted or soluble protein fragment FGF-16.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 5 after the addition of the protein.
  • the percentage inhibition of lipid deposition on day 8 is shown in the form of a dose-effect curve by recombinant secreted or soluble protein fragments of (A): TNFSF12 or (B): TNFSF14 - in primary human adipocyte cell cultures of subcutaneous origin.
  • A TNFSF12
  • B TNFSF14
  • the percentage data relate to control cultures which were treated with an ineffective protein concentration of 0.025ng / ml.
  • a low signal strength means low lipid deposition in the differentiating human adipocytes
  • a high signal strength means a strong lipid deposition.
  • the dose-response curves are shown, which show the lipid content of 3T3-L1 cells as a function of the added amount of recombinant secreted or soluble protein fragment TNFSF14, alpha l / beta2-lymphotoxin, alpha2 / betal -lymphotoxin.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 5 after the addition of the respective protein.
  • a low signal strength means low lipid storage in the differentiating human adipocytes
  • a high signal strength means a strong lipid storage.
  • the inhibition of lipid storage by added recombinant soluble protein fragments of alphal / beta2-lymphotoxin, alpha2 / betal -lymphotoxin, cardiotrophin-1, endothelin-2 and FGF-16 in primary human adipocytes of subcutaneous origin is shown.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 8 after the first addition of the respective protein.
  • a low signal strength means low lipid deposition in the differentiating human adipocytes
  • a high signal strength means a strong lipid deposition.
  • TNFSF12 TWEAK receptor
  • TNFSF14 TNFSF14
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting method
  • the insulin-dependent glucose uptake in primary human adipocytes of subcutaneous origin is shown. Ineffective (10-10M) and effective (10-7M) concentrations of insulin were used. Effective insulin concentrations result in an increased cellular glucose uptake under the chosen conditions (control).
  • the effects of co-incubation with added proteins (TNFSF12 and TNFSF14 each 100 ng / ml) are shown.
  • TNF-alpha 50 ng / ml
  • the measurement results are given as "insulin-dependent intake of pmol glucose within 20 minutes”.
  • a / B Shown is the detection of protein previously applied intravenously in female C57BL / 6 mice in subsequent blood suspension samples. The samples were taken at the times indicated after a single injection of the respective soluble recombinant protein fragment and were carried out for detection by means of specific antibodies (ELISA determination): (A: TNFSF12; B: TNFSF14).
  • C / D The detection of the inhibitory activity in the mouse sera described under A / B is shown. For this purpose, the inhibition of lipid deposition in 3T3-L1 cell cultures was determined by adding suitable dilutions (C: sera with TNFSF14 0.2% - 1%; D: TNFSF12 2%) of the mouse sera.
  • C sera with TNFSF14 0.2% - 1%
  • D TNFSF12 26%
  • TNFSF12 endogenous TNFSF12 in human sera are shown. The donors of the sera were grouped according to their classification as normal weight or obese. The content determination was carried out by means of ELISA determination.
  • A The extent of the inhibition of lipid deposition in 3T3-L1 cell cultures is shown when the recombinant secreted or soluble protein fragments of TNFSF12, TNFSF14, cardiotrophin-1 or FGF-16 are delayed for 3 days compared to the induction for differentiation.
  • the measurement results are given as relative fluorescence units (RFU) on day 6 after induction of the differentiation.
  • a low signal strength means low lipid storage in the differentiating human adipocytes
  • a high signal strength means a strong lipid storage.
  • HEK-293 cells were transfected with cDNA expression plamids which code for the respective proteins. After transfection, the HEK-293 cells were cultivated over a period of 2 days. The cell supernatant of the HEK-293 cells was then removed and transferred to 3T3-L1 cells (3 days after sowing). Immediately afterwards, differentiation stimuli were added to the 3T3-L1 cells. The 3T3-L1 cells were cultivated with the supernatants of the HEK-293 cells for a further 5 days and the inhibition of lipid storage was determined by means of the NileRed assay.
  • Example 1 Production of an active cell culture supernatant using the transfection of a producer cell line (HEK 293 cells):
  • HEK293 cells were cultivated according to standard methods in DMEM medium (10% FCS) and sown for transfection in a cell density of 2.2 x 10 4 cells / well of a 96 well plate in 100 ⁇ l medium.
  • the 293 cells were transfected with the cDNA expression plasmid using common transfection methods, such as, for example, the calcium-phosphate transfection by Roussel et al. (Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 1999-2009). After 48 hours, 50 ⁇ l of the medium supernatant were removed and transferred to the suitably prepared preadipocyte cells (see below).
  • the cDNAs encoding the respective proteins were either obtained from a "full-length" enriched normalized cDNA library (tissue sources: visceral adipose tissue, hypothalamus, skeletal muscle, liver, pancreas), by Invitrogen, Carlsbad, USA, was created by a proprietary Invitrogen technology, from a "Human Fill Length Clone Collection”; OriGene; Rockville MD, USA (human cDNA clones from human cell lines and tissues) or from an MGC clone collection (IRAK collection; "Mammalian Gene Collection”; RZPD, Berlin, which comprises human cDNA clones from human cell lines and tissues and in Strausberg RL , Feingold EA, Klausner RD, Collins FS, The Mammalian Gene Collection, Science, 1999, 286, 455-457.
  • tissue sources visceral adipose tissue, hypothalamus, skeletal muscle, liver, pancreas
  • Invitrogen Carlsbad
  • TNFSF-12 VI comes from a “full-length” “-enriched normalized cDNA library; Invitrogen, Carlsbad, USA.
  • the inhibition of lipid deposition was additionally carried out according to Example 3 with a recombinant, secreted or soluble protein from R&D Systems GmbH, Wiesbaden ; CatNo .: 1090-TW; amino terminal 6X HIS-tagged extracellular domain of human TWEAK (Arg 93-His 249; see Chicheportiche, et al., 1997, J.Biol. Chem. 272: 32401-32410).
  • TNFSF-12 VI * comes from a "full-length" enriched normalized cDNA library; Invitrogen, Carlsbad, USA (Accession Number (Acc. No.) NM 003809).
  • the secreted protein fragment is identical to that of TNFSF12 VI.
  • TNFSF -12 VI * differs from TNFSF-12 VI in that it contains an additional amino acid in the membrane-containing protein portion ..
  • TNFSF12 expression construct which contained a fragment of the mouse homolog, as described in the next paragraph. This fragment encoded a recombinant soluble secreted murine form of TNFSF12.
  • TNFSF-14 comes from a "Human Filling Length Clone Collection”; ORIGENE; Rockville MD, USA. (BC1286_C05; Acc. No. NM 003807).
  • the inhibition of lipid insertion was additionally carried out according to Examples 3 and 7 with a recombinant, secreted or soluble protein fragment protein from R&D Systems GmbH, Wiesbaden: CatNo .: 664-LI [CD33 signal (metl-17) / 10x His / GGGSGGGSGGGSIEGR /] - Asp-74 - Val-240.
  • TNFSF14 expression construct which contained a fragment of the mouse homolog, as described below. This fragment encoded a recombinant soluble secreted murine form of TNFSF14. Construction of vectors coding for recombinant secreted soluble protein fragment of murine TNFSF12 or TNFSF14:
  • TNFSF12 RNA from 3T3-L1 cells or TNFSF14: mouse thymus RNA
  • suitable primers encoding of the sequences coding for: mouse TNFSF12: Arg 105 - His249 or Mouse TNFSF14: Asp-72-Val-239
  • RT-PCR was performed.
  • 6 histidine residues and at the 3' end: 2xTGA stop codons and sequences for the restriction cleavage sites Xhol and BglII were introduced.
  • Cardiotrophin-1 comes from a "full-length" enriched normalized cDNA library; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. No. NM_001330). The inhibition of lipid deposition was additionally carried out according to Examples 3 and 7 with a recombinant protein from R&D Systems GmbH, Wiesbaden: CatNo .: 612-CD (protein sequence from Pennica, D. et al., 1996, Cytokine 8: 183-189).
  • Endothelin-2 comes from an MGC clone collection (IRAK collection; "Mammalian Gene Collection”; RZPD, Berlin (5185394; Acc. No. NM_001956).
  • FGF-16 comes from a "Nolle-length" enriched normalized cD ⁇ A library; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. ⁇ o. ⁇ M_003868).
  • the inhibition of lipid storage was additionally carried out according to Examples 3 and 7 with a recombinant or soluble protein von R&D Systems GmbH, Wiesbaden: CatNo .: 1212-FG / CF (As 2-207 see Miyake, A. et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 243: 148-152).
  • GH-2 comes from a "Human Filling Length Clone Collection”; ORIGENE; Rockville MD, USA. (PL1040_A04; Acc. No. NM_002059).
  • Calsyntenin-1 comes from a "Human Fill Length Clone Collection”; ORIGENE; Rockville MD, USA. (FB2936_B05; Acc. No. NM_014944).
  • BM045 comes from a "Human Filling Length Clone Collection”;ORIGENE; Rockville MD, USA; (Acc. No. NM_018459).
  • GK001 is from a Nolle-length enriched normalized cDNA library; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. No. NMJJ20198).
  • PDGF-D vl comes from a "full-length" enriched normalized cDNA library; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. No. NM_025208).
  • PDGF-D V2 comes from a "Human Fill Length Clone Collection”; ORIGENE; Rockville MD, USA. (FB1975_A05; Acc. No. NM_033135).
  • PDGF-D VI and V2 are two different splice variants of PDGF-D ,
  • Example 2 Cultivation of preadipocyte cells (3T3-L1 and primary human adipocytes) and preparation for induction for differentiation:
  • 3T3-L1 cells are mouse fibroblast cells of embryonic origin which, under suitable conditions, can carry out a terminal differentiation to mature fat cells (adipocytes). For this reason, the 3T3-L1 kept in proliferation culture are also referred to as preadipocytes. They grow in monolayers and have a doubling time of around 24 hours.
  • the 3T3-L1 cells used here were from the ATCC (CL-173). Since the 3T3-L1 cells spontaneously differentiate in the case of confluence and the properties of the culture are changed in the process, the cells were not cultivated up to the confluence (max. 80%; see passage protocol example 3).
  • the passenger was carried out at two daily intervals, with no medium change in between. Except for the transfer of the supernatants, there are basically no media changes.
  • the cells were only used for screening from passage 5 and only up to passage 18.
  • the maintenance culture of the 3T3-L1 cells was carried out in T-75 culture bottles. For passage every 2 days, these were inoculated with 4.5 x 10 5 cells / T-75 bottle. There was no change of medium until the next passage.
  • the 3T3-L1 cells for the experiment were sown in 96 well microtiter plates: The 3T3-L1 cells were sown in a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / well in 200 ⁇ l growth medium / well. The cells were then changed for 3 Incubated for days and then induced for differentiation as described below and brought into contact with the HEK-293 supernatant or recombinant soluble or secreted protein fragment.
  • the 3T3-L1 growth medium (GM) (composition: DMEM, 10% FCS, 1% penicillin streptomycin, 1% glutamine, 1% Na pyruvate) was identical to the medium of the 293 cells with one exception: it has one such a high amount of glutamine (2% instead of 1%; see example 3).
  • the differentiation medium (DM) was basically added as a double concentrate immediately after the addition of the 293 cell supernatant. In this form it consists of a 3T3-L1 growth medium supplemented by induction factors (200 nM insulin, 1 mM IBMX and 2 ⁇ M dexamethasone).
  • the resulting pellet also contained erythrocytes and connective tissue residues and was taken up in erythrocyte lysis buffer (155 mM NH C1, 5.7 mM K HPO, 0.1 mM EDTA, pH 7.3). After a maximum incubation time of 10 minutes at room temperature, the mixture was filtered through a 150 ⁇ M filter and centrifuged as described above.
  • erythrocyte lysis buffer 155 mM NH C1, 5.7 mM K HPO, 0.1 mM EDTA, pH 7.3.
  • 3T3-L1 cells Three days after sowing the 3T3-L1 cells, 140 ⁇ l of medium were removed from the 3T3-L1 cells and 50 ⁇ l of a cell culture supernatant obtained from the HEK293 cells were added. Alternatively, 50 ul growth medium was added in which suitable amounts of recombinant protein (0-3 ug / ml protein) were dissolved. In addition, 100 ⁇ l of 2X differentiation medium was then added to the 3T3-L1 cells, followed by incubation of the 3T3-L1 cells in the incubator for 5 days. After this time the intracellularly stored lipid was determined.
  • Human preadipocytes were sown at a density of 40,000 to 55,000 cells / cm 2 .
  • SGBS cells described in Wabitsch et al., 2001, Int J Obes Relat Metab Disord. 25: 8-15
  • the cell density was 10 times lower.
  • the cells of the primary culture remained in the proliferation medium for 20 hours and the SGBS cells for 3 days (preadipocyte medium with 10% FCS and 50 ⁇ g / ml gentamycin).
  • the cells were washed twice with PBS and then incubated in semm-free differentiation medium (preadipocyte medium with 66 nM insulin, InM T 3 , 100 nM hydrocortisone, 10 ⁇ g / ml transferrin, 50 ⁇ g / ml gentamycin).
  • semm-free differentiation medium preadipocyte medium with 66 nM insulin, InM T 3 , 100 nM hydrocortisone, 10 ⁇ g / ml transferrin, 50 ⁇ g / ml gentamycin.
  • 1 ⁇ g / ml troglitazone and 0.5 mM IBMX were also added. After this time and in the further course every three to four days, the medium was changed with differentiation medium. The cells were used when at least 50% of the cells (based on the cell number) had stored fat.
  • Example 4 Measurement of the intracellularly embedded lipid:
  • NileRed reagent (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands; CAS number 7385-67-3) was used for the quantitative determination of the storage of cellular lipid (Nile Red staining solution: 4 ⁇ g / ml Nile Red in PBS / 40% DMSO). The fluorescence was measured at an excitation wavelength of 485nm and an emission wavelength of 590 nm. The required amount of Nile Red was added to the calculated amount of DMSO and mixed. The calculated amount of PBS is then added and the solution is mixed.
  • FIG. 2-5 7, 15 (recombinant protein on murine 3T3-L1 cells) or FIG. 8 (recombinant Protein on human adipocytes), or as a percentage in comparison to the uninhibited control in FIG. 6 (recombinant protein on human adipocytes).
  • Fig.l The result shows that due to the transfection of the respective expression plasmids in HEK-293 cells, an activity is pronounced in the supernatant of these cell cultures, which after transfer to 3T3-L1 cell cultures can have an inhibitory effect on their differentiation. It is obvious, if not mandatory, to assume that the gene products encoded by the respective cDNAs are directly responsible for this activity.
  • Fig. 2-5 The results show that the lipid incorporation of murine 3T3-L1 cell cultures during the differentiation by the addition of recombinantly soluble protein fragment of TNFSF12 (Fig. 2), recombinantly soluble protein fragment of TNFSF14 (Fig. 3), of recombinant Cardiotrophin-1 (Fig.4), can be inhibited by recombinant FGF-16 (Fig.5) in a dose-dependent manner.
  • the lipid storage can serve as a measure for the differentiation of the adipocytes, or as a measure for the regulation of the Lipogenesis or lipolysis in these cells. In these cases (Fig.
  • the result shows that alternative ligands for the lymphotoxin-beta receptor in 3T3-L1 cells could also inhibit lipid insertion.
  • the half-maximum active concentrations in this case were 12 ng / ml for recombinantly soluble protein fragments of TNFSF14, 25 ng / ml for lymphotoxin alphal / beta2 and 5 ng / ml for lymphotoxin alpha2 / betal.
  • accompanying cytotoxicity has occasionally been observed for the lymphotoxins. This was not the case with recombinantly soluble protein fragment of TNFSF14.
  • Adipocyte differentiation can be adequately accomplished by activating the lymphotoxin-beta receptor, since alphal / beta2 lymphotoxin is known to exclusively activate the lymphotoxin-beta receptor.
  • alphal / beta2 lymphotoxin is known to exclusively activate the lymphotoxin-beta receptor.
  • TNFSF14 this does not exclude involvement of the HVEM receptor.
  • the different effects of TNFSF14 and that of alpha l / beta2-lymphotoxin with regard to the observed toxicity and dose-response relationship could be due to a different way of activating the lymphotoxin-beta receptor.
  • Fig. 8 The result shows that the differentiation of primary human adipocytes by adding a respective dose of TNF-alpha (2ng / ml) and 100 ng / ml each of alpha l / beta2 lymphotoxin, alpha2 / betal lymphotoxin , Cardiotrophin-1, endothelin-2 and FGF 16 can be inhibited. This shows the transferability of the data obtained on the murine 3T3-Ll cells to the human adipocyte cell cultures also for these recombinant proteins.
  • Protein fragment of TNFSF12 and recombinantly soluble protein fragment of TNFSF14 or recombinant cardiotrophin-1 must be carried out at an early point in time after the induction of the differentiation (here: at least in the period from day 1 to 3 days after the induction) so that an inhibition can still be achieved .
  • An addition only from day three after induction of the differentiation no longer had an inhibitory effect.
  • inhibition was still achievable with the delayed addition of recombinant FGF-16. This indicates different mechanisms of inhibition in terms of time and mechanism.
  • FGF-16 may therefore surprisingly affect in the narrower sense physiological processes of lipolysis or lipogenesis in the direction of a reduced lipid content and less of the initial differentiation process.
  • FGF-16 is a proliferation factor that also allows subconfluent 3T3-L1 cells to proliferate (see also FIG. 14D). proliferative
  • Preferred animal models are those that correspond in a special way to the human situation of obesity or type II diabetes. Rodents such as mice or rats as well as dogs, pigs and primates are preferred.
  • a particularly preferred experimental embodiment is diet-induced obesity, possibly associated with insulin resistance or type II diabetes, in mice or rats by adding high-calorie food.
  • the high-calorie food for example a 45 kcal% fat diet, can be administered well before or simultaneously with the administration of the proteins or fragments according to the invention or the pharmaceutical composition.
  • the animals can therefore be normal or already overweight at the time of administration of the protein or protein fragment.
  • the aim is to reduce or prevent weight gain and / or weight loss. If necessary, an improvement in insulin sensitivity or glucose tolerance. This can be done either with an onset or continued high-calorie diet or with a change to a normal or hypocaloric diet - in the case of already overweight animals.
  • the change of diet takes place at the time of the first administration of the protein or protein fragment or the pharmaceutical composition.
  • mice of the C57 / B16 / J strain after determining the maximum tolerated dose (MTD), a) the reduction in weight gain in normal-weight mice (without prior high-calorie diet) and b) the net reduction in obese tissue in mice of normal weight or obese at the start of the experiment (below starting or maintaining high-calorie diet) after adding the protein used according to the invention by weighing or determining the BMI (“body mass index”).
  • the maximum tolerated dose was determined with 3 mice (strain C57B16 / J wild type) by administration of 0.002; 0.02; 0.2; 2.0 and 10 mg protein / kg as a single intravenous dose.
  • mice strain C57B16 / J wild type
  • the dose required for the application is determined by repeated administration of a selected dose over several applications on the basis of blood parameters and serum stability.
  • TNFSF14 and D show the specific inhibitory activity in the mouse sera from the injected mice, which can still be measured on 3T3-L1 cell cultures, in the Nile Red Assay, as described in Examples 2-5. If the activity of TNFSF12 was detected, the FCS in the differentiation medium had to be replaced by the mouse serum - instead of an additional addition - in order to be able to compensate for the inhibitory effect of the mouse serum that occurs with the comparatively larger amounts added. As expected, larger amounts had to be used here due to the approximately 10-fold lower half-maximum active concentration of TNFSF12 (see FIGS. 2 and 3).
  • the proteins can be administered intravenously. Ten minutes after the Hesse injection, protein activities were demonstrated on 3T3-L1 cell cultures. At a later date, this was due to the Mouse serum effects using the 3 T3-L1 cell cultures are no longer technically possible. However, the proteins were detectable in small amounts by ELISA at the latest observation time (24 hours after the injection). There was no clinical toxicity.
  • the maximum dose found above is reduced to a minimum dose which still has a therapeutic effect.
  • the dose determined in this way is administered parenterally (intravenously, intraperitoneally, subcutaneously or intramuscularly). Intraperitoneal, intravenous or subcutaneous administration is preferred)
  • normal-weight mice are kept on a normal-calorie diet (20 kcal% fat diet) or in particular on a high-calorie diet (45% kcal%) in each case without (untreated) and with addition of the protein according to the invention (treated) for 10-14 weeks .
  • the weight gain is determined by weighing and / or determining the BMI.
  • obese mice previously kept on a high-calorie diet (45 kcal% fat diet)), on a normal-calorie diet (20 kcal% fat diet) and / or on a continued high-calorie diet, each without (untreated) and with the addition of protein of the invention (treated) kept for 10-14 weeks.
  • the weight gain is determined by weighing and / or determining the BMI.
  • Treated mice on a normal or continued high-calorie diet may show greater weight loss than untreated mice. A further weight gain can be observed in untreated mice on a high-calorie diet. In contrast, a decrease in weight or a reduced weight gain can be ascertained in treated mice.
  • Transfection procedure The transfection of the plasmids in C57B16 / J mice, coding for recombinant secreted and soluble murine protein fragment of TNFSF12 or TNFSF14, was carried out according to a method first described by Zhang et al. (Gene Therapy 2000; 7: 1344).
  • a hydrodynamic pressure generated by rapid injection of the plasmid-containing solution into the tail vein, preferably causes the entry of the plasmid DNA into liver tissue.
  • a gene expression lasting weeks to months can then be realized there.
  • ELISA antibody pairs for murine TNFSF12 coating: anti-mTWEAK-Antibody (R&D Systems, Wiesbaden Germany catalog number # AF1237), detection antibody anti-mTWEAK-Antibody Biotin-conjugated (e-bioscience, clone MTW-1, catalog number # 13- 9913).
  • coating anti-mTWEAK-Antibody (R&D Systems, Wiesbaden Germany catalog number # AF1237)
  • detection antibody anti-mTWEAK-Antibody Biotin-conjugated e-bioscience, clone MTW-1, catalog number # 13- 9913.
  • FIGS. 12A and B The correlation between protein expression and body weight was examined.
  • the experiments described in FIGS. 12A and B have shown that the extent of expression, from murine recombinant secreted soluble protein fragment of (A) TNFSF12 and (B) TNFSF14, correlates negatively with the observed weight gain in the study period.
  • the correlation coefficient indicates how strict a correlation is. Values between -1 and +1 are possible. A value of 0 means that there is no correlation. +1 or -1 indicate that there is an absolutely strict (minus sign: negative) correlation.
  • the manner in which the proteins according to the invention bring about the inhibition of lipid storage in adipocytes can be determined in more detail by further analyzes in the cell cultures.
  • An inhibition of differentiation or lipid storage in differentiating adipocytes can be achieved, for example, by protein-mediated activities such as cell death, preventing the cell cycle from escaping, blocking the transcription factor cascade which leads to the expression of the differentiation-specific genes, blocking lipogenesis in the narrower sense or by enhancing lipolysis be brought about.
  • Fig. 9 In order to detect the known receptors of TNFSF12 or TNFSF14 on the 3T3-L1 cell cultures, these were detected with specific antibodies using the FACS method.
  • the TNFSF12 receptor was combined with the antibody from TWEAK receptor-specific mouse IgG2b antibody ITEM-4 (company ebioscience, catalog number 14-9018) and a secondary Alexa-Fluor goat anti-mouse IgG specific antibody (company Molecular Probes, Catalog number A-11001).
  • the HVEM receptor of TNFSF14 was made with the antibody from receptor-specific rat IgG antibody (Alexis Biochemicals, catalog number ALX- 804-156-C100) and a secondary Alexa-Fluor goat anti-rat IgM antibody A-21212 from the company Molecular probes detected.
  • the lymphotoxin beta receptor of TNFSF14 was treated with the antibody from receptor-specific rat IgG antibody (Alexis Biochemicals, catalog number ALX-804-145) and a secondary Alexa-Fluor goat anti-rat IgG antibody (from Molecular Probes, Catalog number Al 1006) verified.
  • Subconfluent 3T3 cells were stained according to the following scheme: Sowing 200,000 cells in a 6-well dish.
  • the cells were trypsinized and pelleted and then in 200 ⁇ l buffer solution (PBS + 1% FCS) or buffer solution with receptor-specific antibodies according to the manufacturer's instructions (1-5 ⁇ g / ml) for incubated on ice for one hour. Then 1 ml of PBS + 1% FCS was added and the cells were pelleted. Resumption took place in 200 ⁇ l PBS buffer with 1% FCS in which the secondary antibody (2 ⁇ g / ml) was dissolved. Another incubation on ice followed for a further 45 minutes. The cells were then again mixed with 1 ml of PBS buffer + 1% FCS and pelleted.
  • PBS + 1% FCS buffer solution with receptor-specific antibodies according to the manufacturer's instructions
  • the cells were then fed to the measurement in the FACS device.
  • the measurement of the fluorescence intensities was only carried out for living cells.
  • the result shows that the receptor described for TNFSF12 is expressed on the cell surface of the 3T3-L1 cells.
  • the lymphotoxin beta receptor for TNFSF14 was also detected.
  • the HVEM receptor for TNFSF14 which was otherwise described as being primarily restricted to lymphocyte cells.
  • the cell number of subconfident 3 T3 cell cultures was determined. The cells were seeded at a density of 3,000 cells per well in a 96-well cell culture dish. 24 hours later, the growth medium of the 3T3-L1 cells was exchanged for medium with reduced FCS content (0.5%). Another 48 hours later, another medium change to 2% FCS and additional administration of the proteins according to the invention were carried out. A dose-response relationship was examined over a concentration range of 0.1 to 500 ng / ml protein. 72 hours after the addition of the proteins in medium with 2% FCS, 10 ⁇ l AlamarBlue reagent (from BioSource) were added to 100 ⁇ l culture medium and incubated for 4 hours at 37 ° C.
  • the AlamarBlue reagent provides a substrate for living cells that can be converted enzymatically and the product can be measured fluorometrically at an excision wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 590 nm. This gives an indirect cell count determination in the linear measuring range.
  • the results show that subconfluent 3T3-L1 cell cultures cannot be stimulated to an increased proliferation by the addition of recombinantly soluble protein fragment of TNFSF12 (Fig. 14A) or recombinantly soluble protein fragment of TNFSF14 (Fig. 14B).
  • recombinant FGF-16 Fig. 14D
  • Cardiotrophin-1 Fig. 14C causes an approximately 20% increase in proliferation.
  • Fig. 10 Studies on the interference of TNFSF12 or TNFSF14 (A) and FGF-16 (B) with insulin-dependent glucose uptake in 3T3-L1 cells are shown. 500,000 primary adipocytes (in the case of FGF-16 50,000 SGBS cells) on day 12 after induction for differentiation were kept in a 3 cm dish and treated as follows to determine the insulin-dependent glucose uptake:
  • Controls 1 cell culture for background (0 'insulin stimulation), an empty well / dish to determine the background.
  • the stimulation is carried out with 10 " 7 , (without or 10 " 10 insulin, since 10 "10 insulin did not have a stimulating effect in this context.
  • In each 3 cm bowl there were 800 ⁇ l medium DMEM / Ham F12 with 5 mM glucose. Differentiated cells were four times Wash warm with 2 ml PBS, then add 800 ⁇ l DMEM / F12 with 5mM glucose per dish and the proteins according to the invention in each case, followed by incubation for 1 hour at 37 ° C. Insulin was then added, and the plates were shaken at the lowest shaking frequency for 15 minutes incubated at 37 ° C.
  • 2-Deoxy-D- [l-H3] glucose (Amersham TRK 383) was diluted 1:10 in DMEM / F12. During the incubation period, tubes were made available for the scintillation counter: one for each measuring point and one for the empty well and one for the complete amount of 2-deoxy-D- [l-H3] glucose. After 15 minutes of incubation, 8 ⁇ l of the diluted 2-deoxy-D- [l-H3] -glucose was added to each well. Plates were again incubated for 20 minutes at 37 ° C with gentle shaking. Plates were placed on ice after 20 minutes. Medium was sucked off with the pump. Wash cells 3 times with 1 ml PBS ice cold.
  • the Proteins according to the invention influence the insulin-dependent signaling and, if appropriate, use them to develop their inhibitory effect. If this were the case, the protein according to the invention with simultaneous increased expression and / or activity in individuals with insulin resistance or type II diabetes can be considered as a possible cause for this. If there is no negative influence on the insulin signaling, the protein according to the invention is preferred as a therapeutic agent in the treatment of obesity. Here, generation of insulin resistance in recipients by administration of the protein according to the invention would be undesirable. TNFSF12 and TNFSF14 showed no negative influence on insulin-dependent glucose uptake in this experimental setup. In contrast, as expected, this was clearly pronounced for TNF-alpha. In contrast, FGF-16 showed a significant reduction in insulin-dependent glucose uptake.
  • Biomaterial such as body fluids, tissue samples or cells or DNA, RNA from suitable individuals, can be examined in order to describe or rule out a possible involvement of the proteins according to the invention in the aetiology of obesity, type II diabetes or the other indications claimed according to the invention.
  • significantly changed levels of the proteins according to the invention in the blood serum and / or adipose tissue in the adiposity can suggest an involvement in the aetiology of the obesity.
  • the endogenous expression or availability of the proteins can be reduced.
  • Obesity could possibly be caused by a lack of inhibition of adipocyte differentiation in these individuals.
  • An increased expression or availability could reflect a reduced activability of the receptor, which would also result in a lack of inhibition of adipocyte differentiation.
  • a more precise determination of the cause and effect of the aberrations would be reserved for a subsequent analysis.
  • the prognostic value of the observed aberration with regard to the expression of the disease phenotype should be determined first.
  • Such detectable aberrant expression amounts for example, could then be used for diagnostics in order to define particularly preferred patient groups.
  • Such detectable aberrant expression levels could also be used for diagnostics to define individuals who are not yet obese, but who, due to their personal disposition, carry a high risk of becoming obese.
  • diagnostic assays can not only be based on the measurement of the corresponding protein, but also the genetic background which leads to the modulation of the protein expression can be determined.
  • Genetic variations SNPs or haplotypes, insertions, deletions or amplifications that control the expression of the protein, for example in promoters or other regulatory sequences, are particularly worth mentioning here.
  • Embodiments for such assays can be, among other things, PCR techniques combined with sequence analyzes, hybridization analyzes (chips) or sequence-specific antibodies, and bioinformatory analysis and detection of specific haplotypes, which are combinations of individual SNPs, deletions, insertions and / or amplifications.
  • Fig. 13 A determination of endogenous TNFSF12 in the blood serum by ELISA (Bender MedSystems, Vienna / Austria, catalog number # BMS2006LNST) was carried out on 16 subjects each, classified by the BMI as obese or of normal weight. This classification showed a reduced endogenous TNFSF12 content in obese patients compared to normal weight individuals.
  • protein fragments are Preferred embodiments: protein fragments:
  • TNFSF-12 vl or v2 (AS 93-249 or 250)
  • Lymphotoxin-alpha monomer human lymphotoxin-alpha, amino acids Leu35-Leu 205. preferably N-terminally linked to the CD33 signal peptide As Metl-lMetl7 (e.g. R&D Systems, Wiesbaden, Germany. Recombinant alphal / beta2-lymphotoxin: catalog number: # 678 -LY.Recombinant alpha2 / betal lymphotoxin: catalog number: # 679-TX).
  • Lymphotoxin beta monomer human lymphotoxin beta, amino acids Leu54-Gly244, preferably N-terminally linked to the CD33 signal peptide Metl-Metl7 (e.g. R&D Systems, Wiesbaden, Germany.
  • Recombinant alphal / beta2 lymphotoxin catalog number: # 678 -LY.Recombinant alpha2 / betal lymphotoxin: catalog number: # 679-TX).

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Mittel zur Behandlung von Adipositas und Typ II Diabetes, insbesondere Mittel, welche die Einlagerung von Lipidmolekülen in Adipozyten hemmen oder fördern.

Description

Mit Adipositas assoziierte Proteine und deren Verwendung in Therapie und Diagnostik
Die Erfindung betrifft mit Fettleibigkeit assoziierte Proteine sowie deren Verwendung im Rahmen von pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Diagnostika. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Inhibitoren dieser Proteine zur Behandlung von Typ-II-Diabetes.
Adipositas (Fettsucht) und Typ-II-Diabetes sind zwei der derzeit wichtigsten Stoffwechselerkrankungen, die gerade in der westlichen Welt zunehmend ein ernstes Problem darstellen. Ferner sind gerade auch beim Typ-II-Diabetes inzwischen Tendenzen zu einer Pandemie zu beobachten.
Adipositas ist ein Zustand, der durch eine übermäßige Ansammlung von Fettgewebe im Körper gekennzeichnet ist. Wesentlich für die Bildung von Fettgewebe und damit zur Ausprägung eines fettleibigen Phänotyps sind die Adipozyten, d.h. diejenigen Zellen, welche das Fettgewebe des Körpers bilden. Nach neuerem Verständnis ist die Adipositas eine chronische Gesundheitsstörung, die sowohl auf einer polygenetischen Veranlagung beruht als auch durch Umweltfaktoren bedingt ist und mit einer hohen Begleit- und Folgemorbidität einhergeht. Daher ist für Adipositas ein langfristiges Behandlungs- und Betreuungskonzept unerlässlich.
Das Vorliegen von Fettleibigkeit, Fettsucht bzw. Adipositas kann als Übergewichtigkeit oder (klinische) Adipositas im engeren Sinne klassifiziert werden. Sie kann über den so genannten „Body Mass Index" (BMI) definiert werden. Der BMI beschreibt das Verhältnis des Körpergewichtes zur Körpergröße. Der BMI wird nach der folgenden Formel berechnet: BMI = Körpergewicht (kg) / Körpergröße zum Quadrat (m2). Die Klassifizierung des BMI wird von der WHO (Weltgesundheitsorganisation) in Abhängigkeit von der Sterblichkeitsrate festgelegt. Der Normal-BMI (18,5-24,4 kg/m2) ist der Bereich mit dem geringsten relativen Sterblichkeitsrisiko. Die BMI-Werte 25 und 30 kg/m sind die entsprechenden risikobezogenen Grenzwerte für Erwachsene für die Feststellung des Übergewichts bzw. der (klinischen) Adipositas.
Gemäß dieser Nomenklatur wird die Adipositas in unterschiedliche Grade aufgeteilt: Adipositas Grad I (BMI= 30-34,9), Adipositas Grad II (BMI=35-39,9), Adipositas Grad III (BMI größer 40) sowie der morbiden Adipositas/Super Adipositas (BMI größer 50). Übergewicht und Adipositas gehen einher mit Folge- bzw. Begleitkrankheiten (Komorbidität). Sie sind ein wesentlicher Risikofaktor für die Entwicklung eines Typ II Diabetes. Sie bedingen auch häufig soziale Isolation und Diskriminierung. Sie können psychische Störungen unterstützen bzw. auslösen und verringern somit die Lebenserwartung und Lebensqualität. Bei einem BMI größer 30 kg/m2 ist die Mortalität (Sterblichkeit) um 1/3, bei 40 kg/m2 um den Faktor 3, bei größer 40 kg/m2 um den Faktor 3 -20, je nach Gewicht erhöht. Erhöht ist zum Beispiel auch das Risiko einer Krebserkrankung ( Gynäkologische Karzinome (Endometrium-Karzinom 4-fach, Mamma- und Zervix-Karzinom 2-fach), Prostata-, Gallenblasen-, Kolon-Karzinom)). Der BMI als Bewertungsmaßstab für eine Adipositas lässt allerdings die Körpergewebszusammensetzung unberücksichtigt. Erhöhte Muskelmasse, Wassergehalt oder Knochenmasse können die Bewertung beeinträchtigen und können gegebenenfalls berücksichtigt werden. Es kann auch die Körperzusammensetzung aus den Kompartimenten - Fett und fettfreie Masse (Körperwasser wird hier zunächst nicht berücksichtigt) erfasst Werden. Nach diesem Zweikompartimentmodell ist der Normalbereich gegeben durch eine Fettmasse < = 20% und eine fettfreie Körpermasse von > = 80%. Ein erhöhter Fettanteil wird als Adipositas beschrieben. Zudem weist eine Erhöhung der Extrazellulärmasse bzw. des Extrazellulärwassers im Verhältnis zur fettfreien Körpermasse auf eine Adipositas hin. Untersuchungen wie die Bioelektrische Impedanz-Analyse (BIA) oder die Infrarot-Spektometrie (NIRI) sind geeignete und in der Praxis angewandte Methoden zur Ermittlung des Körperfettstatus. Ebenso ist die Fettverteilung für die Risikobewertung wichtig. Eine erhöhte abdominale Fettansammlung (zentraler oder androider Verteilungstyp) stellt ein deutlich höheres Risiko dar, als der periphere oder gynoide Verteilungstyp. Daher kann auch die „waist-to-hip"-Ratio (das Verhältnis von Taillenumfang (cm) zu Hüftumfang (cm)) in die Bewertung miteinbezogen werden. Bei Frauen (>0,8) bzw. Männer (>0,95) sind erhöhte Werte mit einer erhöhten Sterblichkeit assoziiert.
Da Adipositas als wesentlicher Risikofaktor für die Entwicklung eines Typ II Diabetes angesehen werden muss, ist die Diagnostik und Therapie der Adipositas bereits im frühen Kindesalter die wichtigste Maßnahme, um zum Beispiel eine Entwicklung des pädiatrischen Typ-2-Diabetes zu vermeiden. Im Kindes- und Jugendalter kann analog zum Erwachsenenalter der BMI zur Beurteilung von Übergewicht und Adipositas verwendet werden. Da der BMI im Kindes- und Jugendalter entsprechend den physiologischen Änderungen der prozentualen Körperfettmasse von deutlichen alters- und geschlechtsspezifischen Besonderheiten beeinflusst wird, sollte man bei seiner Beurteilung Alter und Geschlecht berücksichtigen. Wegen der geringen Inzidenz von Adipositas- abhängigen Erkrankungen im Kindes- und Jugendalter und mangels ausreichender longitudinaler Untersuchungen zum Gesundheitsrisiko der Adipositas im Kindes- und Jugendalter gibt es im Gegensatz zu der Situation beim Erwachsenen keine festlegbaren Grenzwerte für das gesundheitsgefährdende Ausmaß der Körperfettmasse in diesem Altersbereich. Es kann aber, bei der Definition von Übergewicht bzw. Adipositas im Kindes- und Jugendalter das BMI-Perzentil verwendet werden (gewonnen durch Extrapolierung), welches im Alter von 18 Jahren in einen BMI von 25 kg/m (Übergewicht) bzw. 30 kg/m (Adipositas) mündet. Es kann zum Beispiel das 90. bzw. des 97. alters- und geschlechtsspezifische Perzentil als Grenzwert zur Definition von Übergewicht bzw. Adipositas verwendet werden. Die BMI- Werte 25 und 30 kg/m2 sind die entsprechenden risikobezogenen Grenzwerte für Erwachsene. Bei einem BMI von 25 kg/m beträgt bei Männern zum Beispiel das relative Risiko für einen Typ II Diabetes 2,2 bei Frauen sogar 5,5.
Wird im Erwachsenenalter ein BMI von 18,5 unterschritten, so kann Kachexie oder eine Dystrophie (zum Beispiel Lipodystrophie, Lipoatrophie) vorliegen, die auch jeweils durch eine übermäßige Abnahme von Körperfettmasse gekennzeichnet sein können.
Lipodystrophie kennzeichnet eine Gruppe von Erkrankungen, die durch den regionalen oder generalisierten Verlust von subkutanem Fettgewebe charakterisiert sind. Es treten nicht HlV-assoziierten Formen, wie z.B. die kongenitale Lipodystrophie oder familiäre partielle Lipodystrophie auf, aber auch mit hoher Prävalenz eine solche assoziiert mit einer HIV-Infektion bzw. ihrer Behandlung. In diesen Zusammenhang gehört auch das HIV- assoziierte-Fettgewebsverteilungs-Syndrom (HARS) das sowohl durch regionalen Verlust als auch Zunahme von Fettgewebe gekennzeichnet ist.
Ein weiterer aussagekräftiger Parameter für das Vorliegen einer Kachexie ist der Plasma- Albuminspiegel: je in [g/100 ml] Normal: 3,5; leichtes Untergewicht: 3,0-3,5; mittelschweres Untergewicht: 2,5-3,0; schweres Untergewicht: kleiner 2,5. Eine Kachexie kann auch Tumor-assoziiert sein. Die Behandlung der Kachexie, insbesondere bei Vorliegen einer Tumor-Erkrankung, kann hier wesentlich zum Behandlungserfolg beitragen, da sie unmittelbar lebensbedrohend ist.
Eine Behandlung des Übergewichts und der Adipositas hat entweder das Ziel, eine weitere Gewichtszunahme zu verlangsamen, bevorzugt aber zu verhindern oder aber ebenso bevorzugt eine Reduktion des Körpergewichts zu erreichen. Dementsprechendes gilt insbesondere für das Ausmaß des Fettgewebsanteils der zu behandelnden Individuen.
Umgekehrtes gilt für die Behandlung einer Kachexie oder Lipodystrophie. Eine
Behandlung der Übergewichtigkeit bzw. der Neigung zur Adipositas ist, angesichts des bereits in der Übergewichtigkeit erhöhten Risikos für Komorbiditäten, bevorzugt angezeigt für Individuen mit einem BMI größer gleich 25. Insbesondere gilt dies für den Fall, dass
Komorbiditäten bereits manifest sind, hier insbesondere bei vorliegenden Anzeichen für die Entwicklung einer Insulinresistenz oder eines Typ II Diabetes. Besonders bevorzugt werden Individuen mit einem BMI größer 30 ohne bzw. mit Komorbiditäten behandelt, die als klinisch adipös bezeichnet werden. Ganz besonders bevorzugt gilt dies für Individuen mit einem höheren Grad der Adipositas.
Der Entwicklung einer Adipositas kann vorgebeugt werden bei Individuen mit normalem
BMI oder einem BMI, der diese als übergewichtig qualifiziert, bevorzugterweise dann, wenn es Gründe gibt für die Annahme, dass diese Individuen mit erhöhter
Wahrscheinlichkeit zu einer späteren Ausprägung der Adipositas (Erhöhung des BMI über •y
30 kg/m ), insbesondere assoziiert mit Komorbiditäten, neigen werden. Solche Gründe können zum Beispiel in einer genetischen Prädisposition, einer nachhaltigen Störung des Lipid- oder Lipoprotein-Stoffwechsels (Dyslipidämien), einem der Adipositas förderlichen und eventuell nur schwer veränderbaren Lebensstil, und/oder einer Adipositas infolge anderer Erkrankungen gegeben sein. Dazu kann eine Diagnostik hilfreich sein, die es erlaubt beispielsweise genetische Prädispositionen direkt oder indirekt oder veränderte Gehalte oder Aktivitäten der erfindungsgemässen Proteine oder davon abhängiger Parameter zum Beispiel im Blut oder im Fettgewebe nachzuweisen.
Die im Stand der Technik bekannten Behandlungsverfahren für Adipositas beschränken sich im Wesentlichen auf eine strenge Diät, gekoppelt mit erhöhter Bewegung. Eine bekannte Therapie ist bisher nur über den Noradrenalin-Serotonin-Rezeptoruptake- Inhibitor "Sibutramin" (BASF, Ludwigshafen) oder den Lipasehemmer "Xenical" (Röche, Basel, Schweiz) möglich. Der Einsatzbereich dieser Medikamente ist jedoch auf Grund der auftretenden Nebenwirkungen/Komplikationen eingeschränkt. So ist Sibutramin beispielsweise nicht bei Bluthochdruck - einer typischen Komplikation bei Adipositas - einsetzbar. Zudem kann die Erkrankung nur symptomatisch behandelt werden.
Beim Diabetes mellitus (allgemein auch als „Zuckerkrankheit" bekannt) handelt es sich um eine chronische Stoffwechselerkrankung, die durch einen erhöhten Blutzuckerspiegel gekennzeichnet ist. Unterschiedliche Ursachen der Erkrankung und auch verschiedene Krankheitsausprägungen erfordern die Unterscheidung von zwei Typen, dem Typ-I- und dem Typ-II-Diabetes.
Der Typ-I-Diabetes (früher: juveniler Diabetes) beginnt meist in der Jugend und entsteht durch eine immunologische Zerstörung der Inselzellen des Pankreas (=Bauchspeicheldrüse). Diese Inselzellen produzieren das Hormon Insulin, das für die Verwertung der Glukose aus der Nahrung verantwortlich ist. Durch die Zerstörung der Inselzellen kommt es zu einem absoluten Insulinmangel. Die Glukose aus der Nahrung kann nicht mehr abgebaut werden, und der Blutzuckerspiegel steigt. Die Behandlung des Typ-I-Diabetes geschieht durch die Verabreichung von Insulin. Der Typ-II-Diabetes (früher: Erwachsenen- oder Altersdiabetes) entwickelt sich in der Regel im höheren Lebensalter. Er ist dadurch gekennzeichnet, dass die Körperzellen, an denen das Insulin wirken soll, nicht mehr ausreichend auf Insulin reagieren. Dies kann unter anderem auf eine Resistenz von Adipozyten und auch Skelettmuskelzellen gegenüber Insulin zurückgeführt werden. Interessanterweise sind zumeist die älteren, reiferen Adipozyten resistent, während jüngere Adipozyten in der Regel keine Insulinresistenz aufweisen.
Eine solche Insulinresistenz wird als Folge anhaltend hoher Blutzucker- und Insulinspiegel gesehen, wie sie z.B. bei Übergewichtigen zu beobachten sind. Die Therapie des Typ-II- Diabetes erfolgt stufenweise: Zunächst wird mit einer Diät versucht, den Blutzuckerspiegel allgemein zu senken. Sind die Diätmaßnahmen zur Behandlung nicht ausreichend, werden in der Folge Blutzucker senkende Medikamente und im fortgeschrittenen Stadium auch Insulin verabreicht.
Die Verabreichung von Insulin kann jedoch bei Patienten mit Typ-II-Diabetes aufgrund der Insulinresistenz in den Zielgeweben zu Hyperinsulinämie (erhöhter Insulinspiegel in Plasma, Serum) führen. Eine Therapie ist dann mittels Insulin nicht mehr möglich (Curr Diab Rep. 2003 Oct;3(5):378-85).
Es gibt Versuche, die notwendige Gabe von Insulin deutlich hinauszuzögern oder gar zu verhindern, indem eine immunsuppressive Therapie verabreicht wird, solange die Inselzellen noch Eigeninsulin produzieren. Auch kann die Verabreichung von Nicotinamid in Verbindung mit einer intensivierten Insulintherapie die Funktion der Beta-Zellen bis zu zwei Jahre nach Diagnosestellung erhalten. Solche Therapieansätze befinden sich allerdings alle noch im experimentellen Stadium. Auch die Transplantation von Inselzellen bzw. der gesamten Bauchspeicheldrüse ist bisher noch nicht sehr erfolgreich.
Auch der therapeutische Einsatz von TNF-alpha, einem bekannten Differenzierungsinhibitor für Fettzellen, ist nicht möglich. Zwar konnte für TNF-alpha im
Tiermodell eine Verbesserung der Insulinresistenz, vermittelt durch dessen Inhibition, gezeigt werden, ein derartiger Effekt im humanen Modell konnte in klinischen Studien jedoch nicht nachgewiesen werden. Zudem weist TNF-alpha toxische Nebenwirkungen auf (Int J Exp Diabesity Res. 2003 Apr-Jun;4(2):66-71).
Die bisherigen Therapieansätze erfolgen nur symptomatisch entweder über veränderte Ernährung und/oder beispielsweise die Verabreichung von PPAR-gamma Agonisten (als Liganden für PPAR-gamma aktivieren diese den PPAR-gamma Transkriptionsfaktor, der eine Differenzierung der Adipozyten oder eine Aktivierung des Fettstoffwechsels in reifen Adipozyten bewirken kann).
Ein therapeutischer Einsatz von Transkriptionsfaktoren wie PPAR-gamma zur Therapie ist jedoch nicht möglich, da die Faktoren direkt in die Zielzelle bzw. den Zellkern eingebracht werden müssen. Zudem kann die Bindung an die DNA nur über Vermittlung weiterer Kofaktoren erfolgen.
Ein erheblicher Nachteil einer symptomatischen Behandlung ist zudem das Auftreten von Folgeerscheinungen, wie beispielsweise kardiovaskulären Komplikationen, diabetischen Nephropathien, Neuropathien oder Retinopathien, die zusätzlich therapiert werden müssen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Anmeldung ist es daher, Mittel zur Behandlung und / oder Vorbeugung von Adipositas und Diabetes bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe zunächst gelöst durch die Verwendung von a) einem Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1 , 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, oder b) eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder c) einer Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß a), d) einer oder mehrerer Nukleinsäuren kodierend für ein Heterotrimeres von Lymphotoxin alpha und beta, oder e) einer funktioneilen Variante der Moleküle gemäß a) bis d)
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung und / oder Behandlung von Adipositas.
Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschenderweise gezeigt, dass die genannten Polypeptide oder für sie kodierenden Nukleinsäuren eine wesentliche Rolle bei der Behandlung einer Adipositas oder dem Diabetes Typ II spielen können. Genauer gesagt, hat es sich überraschenderweise herausgestellt, dass die genannten Proteine oder Nukleinsäuren in der Lage sind, die Differenzierung bzw. Funktion von Adipozyten nachhaltig zu hemmen. Dies ermöglicht erstmalig eine Behandlung von Adipositas und/oder Diabetes Typ II auf molekularer Ebene.
Dabei betreffen die oben aufgeführten SEQ ID Nummern die folgenden Proteine und Nukleinsäuren:
SEQ ID No: 1 TNFSF-12 („Tweak") VI -Protein (NP_003800)υ SEQ ID No: 2 Nukleinsäure kodierend für TNFSF-12 VI (NM_003809) SEQ ID No: 3 TNFSF-12 („Tweak") VI* SEQ ID No: 4 Nukleinsäure kodierend für TNFSF-12 VI* SEQ ID No: 5 TNFSF-14 („Light") (NP_003798) SEQ ID No: 6 Nukleinsäure kodierend für TNFSF-14 (NM_003807) SEQ ID No: 7 Calsyntenin-1 (NP_055759) SEQ ID No: 8 Nukleinsäure kodierend für Calsyntenin-1 (NM_014944) SEQ ID No: 9 Cardiotrophin-1 (NP_001321) SEQ ID No: 10 Nukleinsäure kodierend für Cardiotrophin-1 (NM_001330) SEQ ID No: l l FGF-16 (NP_003859) SEQ ID No: 12 Nukleinsäure kodierend für FGF-16 (NM_003868) SEQ ID No: 13 PDGF-D V1 (NP_079484) SEQ ID No: 14 Nukleinsäure kodierend für PDGF-D VI (NM_025208) SEQ ID No: 15 PDGF-D V2 (NP 49126) SEQ ID No: 16 Nukleinsäure kodierend für PDGF-D V2 (NM_033135) SEQ ID No: 17 GH-2 (NP_002050) SEQ ID No: 18 Nukleinsäure kodierend für GH-2 (NM_002059) SEQ ID No: 19 Endothelin-2 (NP_001947) SEQ ID No: 20 Nukleinsäure kodierend für Endothelin-2 (NM_001956) SEQ ID No: 21 BM045 (NP_060929) SEQ ID No: 22 Nukleinsäure kodierend für BM045 (NM_018459) SEQ ID No: 23 GK001 (NP_064583) SEQ ID No: 24 Nukleinsäure kodierend für GK001 (NM_020198) SEQ ID No: 25 Lymphotoxin-beta (NM_002341) SEQ ID No: 26 Nukleinsäure kodierend für Lymphotoxin-beta (NP_002332) SEQ ID No: 27 Lymphotoxin alpha (NM_000595) SEQ ID No: 28 Nukleinsäure kodierend für Lymphotoxin-alpha (NP_000586) Die korrespondierende Acc. No. ist jeweils in Klammern angegeben.
Diese Polypeptide binden vorzugsweise an die folgenden Proteine:
Polypeptid Name des Bevorzugter Rezeptor DatenbankzugangsDatenbank- SEQ ID Polypeptids (Synonyme) nummer der für den zugangsnumrr Rezeptor kodierenden des Rezej Nukleinsäure proteins l und 3 TNFSF12 TWEAK Rezeptor ( Fnl4, NM_016639 NP_057723 VI TNFRSF12A) TNFSF12 V2 TNFSF14 HVEM (TNFRSF14) NM 003820 NP 003811 und/oder NM_002342 NP 002333 Lymphotoxin beta Rezeptor Cardiotroph LIF-Rezeptor (LIFR) und NM 002310 NP_002301 in gp 130 Rezeptor als NM_002184 NP 002175 Heterodimer 11 FGF-16 FGFR-4 NM_002011 NP_002002
13 und 15 PDGF-D PDGFR-alpha (CD 140a) NM_006206 NP_006197 VI PDGFR-beta (CD140b) NM_002609 NP_002600 PDGF-D V2
17 GH-2 „Growth Hormone"- NM_000163 NP_000154 Rezeptor
19 Endothelin- Endothelin Rezeptor beta NM_000115 NP_000106 2 (EDNR-B)
25 und 27 Lymphotoxi Lymphotoxin beta NM_002342 NP_002333 n Rezeptor (LTBR, alpha 1 /beta TNFRSF3) 2
25 und 27 Lymphotoxi Lymphotoxin beta NM_002342 NP_002333 n Rezeptor NM_001065 NP_001056 alpha2/beta TNFRSF1A (p55) NM_001066 NP_001057 1 TNFRSF1B (p75)
TNFSF-12 (Tweak) ist ein Zelloberflächen-assoziiertes Typ-II-Membranprotein, das ursprünglich als ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Superfamilie beschrieben wurde, (ein ausführlicher Review findet sich in Wiley et al., 2003, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:241-249).
Ein kleiner biologisch aktiver Teil kann als lösliches Protein mit einer Länge von etwa 157 Aminosäuren in das extrazelluläre Millieu abgespalten werden.
Die mRNA von TNFSF-12 ist in einer Vielzahl von Geweben und Zelltypen, jedoch hauptsächlich in Leukozyten exprimiert. Auffallend ist der Unterschied zwischen der mRNA-Expression und der Proteinexpression an der Zelloberfläche. Die Expression von TNFSF-12 an der Zelloberfläche konnte nur auf Monozyten nach IFN-gamma Behandlung bestätigt werden. In der Literatur ist bisher nur ein Rezeptor für TNFSF-12 bekannt, der Tweak mit physiologischer Aktivität bindet. Er wird als „TweakR" oder „fibroblast growth factor inducible 14" (FN14) beschrieben. Dieser Rezeptor ist das kleinste Mitglied aus der Gruppe der TNF Rezeptoren. Es sind weder andere Liganden bekannt, die an TweakR binden, noch ist bekannt, dass Tweak selbst an andere bekannte TNF-Rezeptoren bindet.
Für TNFSF-12 sind bisher in der Literatur vielfache biologische Aktivitäten wie Induktion von Angiogenese, inflammatori sehen Zytokinen und unter besonderen Bedingungen (z.B. Costimulation mit IFN-gamma) die Stimulation von Apoptose beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise eine Inhibition der Adipozyten- Differenzierung bzw. Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten gezeigt werden.
TNFSF-12V1 unterscheidet sich von TNFSF-12V1* durch das Fehlen einer Aminosäure im membranständigen Teil des Proteins (siehe Beispiel 1).
TNFSF-14 („Light") ist ein integrales Klasse-II-Membranprotein der Tumor-Nekrose- Faktor (TNF) - Liganden-Familie (ein ausfährlicher Review findet sich in Granger and Ricert, 2003, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:289-296). Es weist eine Länge von 240 Aminosäuren auf und enthält eine N-terminale zytosolische Domäne, eine Typ-II- Transmembran-Domäne sowie eine C-terminale Rezeptorbindungs-Domäne. Das lösliche Protein ist 167 Aminosäuren lang.
Das Protein ist ein Ligand für TNFRSF14, einem Mitglied der TNF-Rezeptor- Superfamilie, der auch als „herpes virus entry mediator" (HVEM) bekannt ist. Weitere Rezeptoren sind Lymphotoxin-beta Rezeptor und DcR3.
Bisher wurde eine Beteiligung in immunologischen Prozessen (T-Zell-Proliferation, Cytokin-Sekretion, Arteriosklerose, „graft versus host disease" sowie eine Assoziation mit apoptotischen Prozessen gezeigt: Das Protein stimuliert die Proliferation von T-Zellen und triggert die Apoptose von verschiedenen Tumorzellen. Bekannt ist auch die Prävention von TNF-alpha-mediierter Apoptose in Hepatozyten. Expression von TNFSF-14 findet sich auf aktivierten T-Zellen, NK- und dendritischen Zellen.
Eine Inhibition der Adipozyten-Differenzierung bzw. Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten konnte erstmals im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden.
Für TNFSF-12/TNFSF-14 konnte gezeigt werden, dass der hemmende Effekt reversibel ist. Dies konnte durch Wegnahme des Proteins nach Tag drei bis vier gezeigt werden. Dies ermöglicht den 3 T3-L1 -Zellen offenbar den Wiedereinstieg in den Differenzierungsprozess, möglicherweise durch Wiedereintritt in den differenzierungsspezifischen, zur klonalen Expansion führenden Zellzyklus oder die zur Differenzierung notwendige spezifische Transkriptionsaktivierung. Ferner ergab sich, dass die Wirkung nicht zytotoxisch ist, da die Reversibilität des hemmenden Effekts zeigt, dass die Zellen durch die vorausgehende Hemmung keinen Schaden nehmen. Dies wird auch durch mikroskopische Messung der Lebendzellzahl bestätigt.
Das sekretierte Zytokin Cardiotrophin weist kein kanonisches Signalpeptid auf. Es wird hauptsächlich in Herz, Hirn, Lunge und Leber exprimiert und ist als „survival factor" bekannt. Ein Zusammenhang mit Adipozyten-Differenzierung bzw. Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten wird im Stand der Technik nicht gezeigt.
Calsyntenin-1 ist ein Typ-I-Membranprotein. Es besteht aus einem großen extrazellulären Fragment, das zwei „Cadherin-like repeats" und ein kleines zytoplasmatisches Segment enthält, das in der Lage ist, Calcium-Ionen zu binden. Das Protein wird in der extrazellulären Domäne proteolytisch gespalten. In der Literatur wird über eine mögliche Involvierung des zytoplasmatischen Teils in die Regulierung von Calcium-Signalen im ZNS spekuliert. Dem extrazellulären Teil wurde bislang keine eigenständige Funktion zuerkannt. Eine Inhibition der Adipozyten-Differenzierung bzw. Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten konnte im Stand der Technik nicht gezeigt werden.
FGF-16 ist ein Mitglied der „fibroblast growth factor" -Familie. Diese Proteine besitzen eine breite mitogene und „cell survival"-Aktivität. Sie sind in einer Vielzahl von biologischen Prozessen wie z.B. Embryo-Entwicklung, Zellwachstum, Morphogenese, Gewebsregenerierung, Tumorwachstum sowie -invasion beteiligt. Obwohl das Protein sekretiert wird, ist kein Signalpeptid bekannt. FGF-16 wurde als Wachstumsfaktor für braune Adipozyten beschrieben, nicht aber als Inhibitor der Differenzierung von Präadipozyten.
GH-2 („growth hormone 2") ist ein Miglied der Somatotropin Prolaktin-Familie von Hormonen, die eine wichtige Rolle in der Wachstumskontrolle spielen. Eine Inhibition der Adipozyten-Differenzierung bzw. Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten durch GH-2 konnte im Stand der Technik nicht gezeigt werden.
Bei BM045 handelt es sich um ein nicht näher charakterisiertes Knochenmarksprotein. Eine Funktion ist bisher nicht bekannt.
GK001 weist eine Transmembrandomäne und ein Signalpeptid auf. Eine Funktion ist bisher nicht bekannt. Aufgrund der prognostizierten Transmembrandomäne ist es möglich, dass ein sekretiertes Proteinfragment durch extrazellulär/juxtamembrane proteolytische Spaltung erzeugt wird.
Endothelin-2 ist ein Mitglied der Endothelin-Familie (ET-1, ET-2, ET-3), die aus größeren Präproproteinen etwa 21 Aminosäuren lange Peptide durch proteolytische Spaltung erzeugen. Das extrazelluläre Protein enthält zwei Endothelin-Domänen und wird hauptsächlich in der Niere exprimiert. Bekannte Funktionen sind Vasokonstriktion und Chemotaxis. Eine Inhibition der Adipozyten-Differenzierung bzw. Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten durch Endothelin-2 konnte im Stand der Technik nicht gezeigt werden.
Weitere bekannte Liganden für den Lymphotoxin-beta Rezeptor, an den auch TNFSF14 bindet, sind das alphal/beta2-Lymphotoxin bzw. alpha2/betal -Lymphotoxin. Alphal/beta2-Lymphotoxin bindet ausschliesslich an den Lymphotoxin-beta Rezeptor, während für das alpha2/betal -Lymphotoxin auch eine Bindung an die TNF-alpha- Rezeptoren TNFRI (p55) und TNFRII (p75) beschrieben wurde. Die Lymphotoxin-beta- Untereinheiten sind dabei natürlicherweise membrangebunden, so daß es sich bei diesen Heterotrimeren um membrangebundene Liganden handelt, die den Rezeptor im Zell-Zell- Kontakt binden. Rekombinant kann man den Membrananker in der Lymphotoxin-beta Untereinheit eliminieren, so daß lösliche rekombinante Heterotrimere mit voller Rezeptorbindung und Aktivität resultieren. Bei rekombinantem alphal/beta2-Lymphotoxin bzw. alpha2/betal -Lymphotoxin handelt es sich demnach um heterotrimere rekombinante lösliche Proteine bestehend aus Lymphotoxin-alpha und Lymphotoxin beta Monomeren in den jeweils angegebenen Stöchiometrien, die in der löslichen Form gentechnisch hergestellt werden (Firma R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland. Rekombinantes alphal/beta2-Lymphotoxin: Katalognummer: #678-LY. Rekombinantes alpha2 betal- Lymphotoxin: Katalognummer: #679-TX). Komposition eines Lymphotoxin-alpha- Monomeres: CD33 Signalpeptid As Metl-lMetl7 gefolgt von humanem Lymphotoxin- alpha, Aminosäuren Leu35-Leu 205; Komposition eines Lymphotoxin-beta-Monomeres: CD33-Signalpeptid Metl-Metl7 gefolgt von humanem Lymphotoxin-beta, Aminosäuren Leu54-Gly244.
Für Alpha l/beta2 -Lymphotoxin konnte hier ebenfalls überraschenderweise die Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten gezeigt werden. Für Alpha2/betal -Lymphotoxin ist die Hemmung der Lipideinlagerung bislang ebenfalls nicht beschrieben worden und insofern überraschend, als dass die vorliegenden Ergebnisse zu TNFSF14 und Alphal/beta2-Lymphotoxin offenbaren, dass die inhibitorische Wirkung über den Lymphotoxin-beta Rezeptor entfaltet werden kann und nicht über die dafür bereits beschriebenen TNF-alpha Rezeptoren (p55 und p75). Lymphotoxin alpha Homotrimere hemmen ebenfalls die Differenzierung der Adipozyten, binden aber ausschliesslich an die TNF-alpha Rezeptoren (p55 und p75).
Wie sich aus den Beispielen 4 und 5 und Figur 1-8 ergibt, sind die genannten Proteine in der Lage, Lipideinlagerung in Adipozyten zu inhibieren.
Bevorzugt verwendet werden jeweils die natürlich vorkommenden Formen. Im Falle von TNFSF12, TNFSF14, bzw. Lymphotoxin zum Beispiel handelt es sich demzufolge bevorzugt um Polypeptide, die in einer trimeren Anordnung vorliegen. Dabei ist es aber erfindungsgemäß auch eingeschlossen, daß nur das Monomer verabreicht wird und sich die Monomere dann im Körper des Patienten zu ihre natürlichen Form zusammenlagern.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Proteine und Nukleinsäuren ausgehend von den hier gezeigten Sequenzen sind im Stand der Technik bekannt und schließen beispielsweise die in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 2001 beschriebenen Verfahren ein.
Wie oben ausgeführt, betrifft die Erfindung ebenso die Verwendung von funktionellen Varianten der oben unter a) oder b) aufgeführten Moleküle zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Adipositas.
„Funktionelle Variante" eines Polypeptids bezieht sich erfindungsgemäß auf ein Polypeptid und/oder Fragment, das im Wesentlichen die biologische Funktion oder Funktionen des entsprechenden Proteins hat. Im Falle der vorliegenden Proteine kann es sich hierbei um die Fähigkeit handeln, die Lipideinlagerung in geeigneten Zellen, insbesondere 3T3-Zellen, zu inhibieren. Ein Test zum Bestimmen dieser Aktivität wird in den Beispielen 2-5 gezeigt.
Unter einer „funktionellen Variante" einer Nukleinsäure wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die ebenfalls ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodiert.
Der Ausdruck „funktionelle Variante" eines Polypeptids oder einer Nukleinsäure bezieht sich vorzugsweise auf Polypeptide oder Nukleinsäuren mit einer Sequenzhomologie, insbesondere einer Sequenzidentität von etwa mindestens 25%, bevorzugt etwa 40%, insbesondere etwa 60%, besonders bevorzugt etwa 70%, ganz besonders bevorzugt etwa 80%, insbesondere etwa 90% und am meisten bevorzugt von 98% mit dem Polypeptid. Solche Varianten sind beispielsweise homologe Polypeptide, die aus anderen Organismen stammen. Andere Beispiele von Varianten sind Polypeptide oder Fragmente, die durch unterschiedliche Allele eines Gens kodiert werden, Polypeptide oder Fragmente aus unterschiedlichen Individuen, aus unterschiedlichen Organen eines Organismus oder aus unterschiedlichen Entwicklungsphasen. Funktionelle Varianten schließen vorzugsweise auch natürlich vorkommende Mutationen ein, insbesondere Mutationen, welche in quantitativer Weise die Aktivität der Peptide verändern, die durch diese Sequenzen kodiert werden. Ferner können solche Varianten vorzugsweise aus einem differenziellen Splicen der kodierenden Gene resultieren.
Im Falle von Proteinen oder Peptiden bezieht sich der Ausdruck „Fragment" vorzugsweise auf ein Fragment, das im Vergleich zu der in den SEQ IDs gezeigten Proteinsequenzen N- oder C-terminal um höchstens 150, bevorzugt 130, 110, 90, 70, 50, 30, bevorzugt höchstens 20, noch bevorzugter höchstens 10 Aminosäuren verkürzt ist.
Im Falle von Nukleinsäuren bezieht sich der Ausdruck „Fragment" vorzugsweise auf ein Fragment, das im Vergleich zu der in den SEQ IDs gezeigten Nukleinsäuresequenzen N- oder C-terminal um höchstens 450, bevorzugt 390, 330, 270, 210, 150, 90, bevorzugt höchstens 60, noch bevorzugter höchstens 30 Nukleotide verkürzt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform schließt der Ausdruck „funktionelle Variante" Derivate mit Einzelnukleotidpolymorphismen („single nucleotide polymorphism" (SNP)) ein.
„Sequenzidentität" bezieht sich auf den Identitätsgrad (% Identität) zweier Sequenzen, die im Fall von Polypeptiden beispielsweise durch BLASTP 2.2.5 und im Fall von Nukleinsäuren beispielsweise durch BLASTN 2.2.6 bestimmt werden kann, wobei der niedrige Komplexitätsfilter (low complexity filter) angeschaltet ist und BLOSUM 62 ist (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402).
„Sequenzhomologie" bezieht sich auf die Ähnlichkeit (% Positive) zweier Nukleotid- bzw. Polypeptidsequenzen, bestimmt beispielsweise mittels BLASTN 2.2.6 bzw. BLASTP 2.0.1, wobei der Filter angeschaltet ist und BLOSUM 62 (BlastP) ist (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Nukleinsäuren, die funktioneile Varianten kodieren, können durch Verwenden von entsprechenden Gensequenzen isoliert werden, um Homologe zu identifizieren, wobei Verfahren angewendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. PCR-Amplifikation oder Hybridisierung unter stringenten Bedingungen (z.B. 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt durch verschiedene Waschschritte bei Raumtemperatur) mit geeigneten Proben, die beispielsweise von den entsprechenden Gensequenzen abstammen oder anderen homologen Proben aus anderen Organismen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die funktioneile Variante ein lösliches Protein, Peptid oder Fragment. Weiter bevorzugt ist die funktionelle Variante ein lösliches
Protein, dem die Transmembrandomäne fehlt. Vorzugsweise bedeutet das, dass das
Fragment, welches die Transmembrandomäne enthält, abgespalten wurde. Bei Typ II-
Proteinen (TNFSF-12, TNFSF-14) enthält hierbei das N-terminale Fragment die
Transmembrandomäne. Bei Typ I-Proteinen (alle übrigen erfindungsgemäß verwendeten Proteine) enthält das C-terminale Fragment die Transmembrandomäne. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wird ein lösliches extrazelluläres Fragment verwendet, das
N-terminal (Typ II-Proteine) bzw. C-terminal (Typ I-Proteine) um weitere Aminosäuren verkürzt ist. Weiter bevorzugt kann ebenfalls ein N-terminales Fragment (Typ II-Proteine) bzw. ein C-terminales Fragment (Typ I-Proteine), z.B. eine Signalsequenz abgespalten sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Proteine Proteinfragmente entsprechend Tabelle 1.
Unter „Behandlung" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise verstanden, dass ein Patient behandelt wird, bei dem die entsprechende Krankheit diagonostiziert worden ist. Unter „Vorbeugung" wird im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise verstanden, dass ein Subjekt behandelt wird, bei dem die Krankheit (noch) nicht ausgebrochen ist. Im Falle der Adipositas wird hierzu auf die obigen Passagen verwiesen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Adipositas eine unkomplizierte Adipositas. Eine unkomplizierte Adipositas ist dadurch gekennzeichnet, dass noch keine Insulinresistenz ausgeprägt ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform wirken die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder Nukleinsäuren dadurch, dass sie die Bildung terminal differenzierter Adipozyten hemmen.
Dabei kann die Bildung terminal differenzierter Adipozyten gehemmt werden durch Förderung der Proliferation von Präadipozyten, durch Hemmung der Differenzierung zu terminal differenzierten Adipozyten, insbesondere durch Hemmung des Transkriptionssignalweges zur Differenzierung, oder durch Förderung des Zelltods, insbesondere der Apoptose in Präadipozyten.
Die Proliferation kann beispielsweise durch Zellzahlbestimmung, Zellzyklus-Analysen im FACS oder Bestimmung der metabolischen Aktivität der Zellen erfolgen, die als enzymatischer Umsatz der Mitochondrien gemessen werden (z.B. durch Alamar-Blue-
Nachweis).
Die Hemmung der Differenzierung zu terminal differenzierten Adipozyten kann durch Messung des Lipideinbaus (z.B. durch Färbung mit NileRed) erfolgen. Mit Reportergenassays wie z.B. PPAR-gamma lässt sich die Hemmung des Transkriptionssignalweges messen. Die Bestimmung von Apoptose ist beispielsweise durch CDD+ Assay (Cell Death Detection ELISA PLUS, Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), DiOC6-Assay, AnnexinV-Assay oder CaspaTag™-Assay (CaspaTag™Caspase-3 (DEVD) Activity Kit, Intergen Company, Purchase, NY, USA) möglich.
Alternativ können die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide oder Fragmente bzw. Nukleinsäuren oder Fragmente dadurch wirken, dass sie die Funktion der terminal differenzierten Adipozyten hemmen. Dies kann beispielsweise durch eine Hemmung der Lipogenese oder durch eine Förderung der Lipolyse bewirkt werden. Durch Färbung mit lipophilen Farbstoffen wie z.B. Nile Red lässt sich Lipideinbau in reifen Adipozyten nachweisen.
Erfindungsgemäß ist auch eingeschlossen, daß dem Patienten mehrere, bevorzugt zwei oder drei, der oben aufgeführten Moleküle verabreicht werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform übt die pharmazeutische Zusammensetzung eine direkte Wirkung auf die Adipozyten aus.
Die erfindungsgemässen Polypetide oder für sie kodierenden Nukleinsäuren entfalten ihre therapeutische Wirkung bevorzugt durch eine direkte Einwirkung auf bestimmte Fettgewebe innerhalb eines Individuums oder auch indirekt, vermittelt durch andere Fettgewebskompartimente oder auch durch Wechselwirkung über andere Gewebe, die in die Regulation der Energie-Homöostase involviert sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Nukleinsäure oder die funktionelle Variante davon im Rahmen einer somatischen Gentherapie eingesetzt wird. Dabei sind die entsprechenden Techniken und Verabreichungsformen im Stand der Technik bekannt
Am Beispiel TNFSF14 und dem Lymphotoxin-beta Rezeptor wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch gezeigt, daß weitere natürlich vorkommende Liganden der jeweiligen Rezeptoren der erfindungsgemässen Proteine bevorzugt eine gleichartige Aktivität bewirken können. Zudem kann ein Ligand wie beispielsweise TNFSF14 verschiedene Rezeptoren (HVEM und Lymphotoxin-beta Rezeptor s. Fig.9 und Zhai et al. J Clin lnvest. 1998 Sep 15;102(6):1142-51) auf den Zielzellen binden.
Die Erfindung betrifft daher ferner die Verwendung eines Liganden des TNFSF-14 Rezeptors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung und
/ oder Behandlung von Adipositas. Für diese erfindungsgemäße Verwendung gelten dieselben Ausführungsformen wie für die andere, oben beschriebene erfindungsgemäße Verwendung.
Wie bereits oben ausgeführt, ist für die Moleküle BM045 und GK001 bislang im Stand der Technik keine Funktion beschrieben worden. Damit betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend a) ein Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO:21 oder 23, b) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß a) oder c) eine funktionelle Variante der Moleküle gemäß a) oder b).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei welchem dem Patienten eine wirksame Menge eines und / oder mehrerer der oben definierten Moleküle verabreicht wird. Bevorzugt leidet der Patient unter Adipositas. Für dieses erfindungsgemäße Verfahren gelten alle oben für die erfindungsgemäße Verwendung aufgeführten Ausführungsformen.
Wie bereits oben beschrieben, ermöglichen die erfmdungsgemäß gefundenen Faktoren neben der Inhibition der Differenzierung von Präadipozyten zu Adipozyten eine Hemmung der Funktion der reifen bzw. des reifenden Adipozyten durch die Hemmung der Lipogenese oder die Förderung der Lipolyse. Bei Hemmung dieses Inhibitors der Differenzierung bilden sich somit durch Differenzierung bzw. Modulation der Funktion der reifen differenzierten Adipozyten neue junge Adipozyten, die keine Insulin-Resistenz aufweisen. Das Verhältnis Insulin-resistenter Adipozyten wird somit zugunsten Insulinsensitiver Adipozyten verschoben.
Dadurch und aufgrund der Tatsache, daß eine Insulin-Resistenz im Fettgewebe auch eine solche im Skelettmuskelgewebe, dem Gewebe mit der mengenmässig grössten Glukoseaufnahme, hervorrufen kann, ist erstmals ein kausaler Therapieansatz von Typ-II- Diabetes direkt im Fettgewebe möglich, der dann eine Entstehung von Folgeerkrankungen unterbinden, verzögern oder lindern kann.
Damit betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines Inhibitors a) eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, oder b) eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta, oder c) einer funktionellen Variante der Moleküle gemäß a) oder b)
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes- Typ-II, Diabetes-Typ-II-verwandten Krankheiten (beispielsweise kardiovaskuläre Komplikationen, Arteriosklerose, Dislipidämie, diabetische Nephropathie, Neuropathie, Retinopathie, Hyperglykämie, Insulinresistenz, Hyperinsulinämie oder Bluthochdruck), Kachexie oder HARS. Bevorzugt sind hier Cardiotrophin und FGF-16. Für FGF-16 wurde eine negative Regulation der Insulin Signalgebung in Adipozyten hier gezeigt (s. Fig.10).
Kachexie zeichnet sich durch Abnahme von Fettgewebe bzw. durch eine Hemmung der Neubildung von Fettgewebe aus. Bei HARS ("HIV-associated-adipose-redistribution- syndrome") kommt es einerseits zu einer Abnahme von subkutanen Fettgewebsdepots und andererseits zu einer Vergrößerung spezifischer kleinerer Fettgewebsdepots ("Stiernacken"). Diese Veränderungen sind auf eine erhöhte Expression bzw. Aktivität der erfindungsgemäß verwendeten Proteine zurückzuführen. Durch die Inhibition dieser Proteine kann weiterer Abbau der Fettgewebsdepots verhindert bzw. ein Aufbau dieser Depots erreicht werden. Bei HARS kann ein Aufbau der subkutanen Fettgewebsdepots erreicht werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, Peptidfragmenten, Antikörpern, Decoy-Receptoren, Antikalinen, Affilinen, niedermolekularen Substanzen (LMWs), Antisense-RNA, siRNA, Aptameren und Proteasen.
Unter „Inhibieren" bzw. „Hemmen" wird erfindungsgemäß das vollständige oder teilweise Unterdrücken einer biologischen Funktion verstanden. Entsprechend der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Inhibitor" auf eine biochemische oder chemische Verbindung, die vorzugsweise die Wirkung der erfindungsgemäß beschriebenen Proteine, d.h. beispielsweise die Inhibierung der Fetteinlagerung selbst inhibiert und/oder reduziert. Dies kann beispielsweise durch Supprimierung der Expression des entsprechenden Gens oder der Aktivität des jeweiligen Proteins erreicht werden. Die Expression des Gens kann mittels RT-PCR oder Western- Blot-Analyse gemessen werden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bewirkt der verwendete Inhibitor eine Inhibition der in der Expression bzw. Aktivität erhöhten erfindungsgemäßen Proteine.
Erfindungsgemäß ist ein Aktivator eine Verbindung mit der entgegengesetzten Funktion.
Beispiele solcher Inhibitoren sind Bindungsproteine oder Bindungspeptide, die gegen das Molekül gerichtet sind, insbesondere gegen die aktive Stelle des Moleküls, und Nukleinsäuren, die gegen das entsprechende Gen gerichtet sind.
Unter „Decoy-Rezeptoren" sind nicht-membranständige Rezeptoren ohne Transmembrandomäne zu verstehen, die an Liganden binden, jedoch aufgrund fehlender intrazellulärer Domänen keine Signalweiterleitung („Signalling") ermöglichen.
LMWs sind Moleküle, die keine Proteine, Peptidantikörper oder Nukleinsäuren sind, und die ein Molekulargewicht von weniger als 5000 Da, vorzugsweise weniger als 2000 Da, besonders bevorzugt weniger als 1000 Da, am meisten bevorzugt weniger als 500 Da aufweisen. Solche LMWs können in so genannten „High-Throughput"-Verfahren identifiziert werden, welche ausgehend von entsprechend Molekülbanken durchgeführt werden. Solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt.
Der Ausdruck „Bindungsprotein" oder „Bindungspeptid" bezieht sich auf eine Klasse von Proteinen, Peptiden oder Peptidfragmenten welche das jeweilige Molekül binden oder inhibieren, einschließlich, ohne Beschränkung, polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente und Proteingerüste, die gegen diese Proteine, Peptide oder Peptidfragmente gerichtet sind. Das Verfahren zum Herstellen eines Antikörpers oder Antikörperfragments wird mittels Verfahren durchgeführt, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise durch Immunisieren eines Säugers, beispielsweise eines Kaninchens, mit dem entsprechenden Peptid, wobei, falls erforderlich, entsprechende Adjuvantien, beispielsweise Freunds Adjuvans und/oder Aluminiumhydroxidgele, verwendet werden können (siehe beispielsweise Diamond, B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine: 1344- 1349). Die polyklonalen Antikörper, die in dem Tier als Ergebnis einer immunologischen Reaktion gebildet werden, können nachfolgend aus dem Blut unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert werden und dann beispielsweise mittels Säulenchromatographie gereinigt werden. Monoklonale Antikörper können beispielsweise in Übereinstimmung mit dem bekannten Verfahren von Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299) hergestellt werden.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck Antikörper und Antikörperfragment auch dahingehend verstanden, dass Antikörper und/oder Antigen- bindende Teile davon eingeschlossen sind, welche rekombinant hergestellt wurden, und, wenn erforderlich, modifiziert wurden, beispielsweise chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bispezifische oder oligospezifische Antikörper, Einzelstrangantiköφer und F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente (siehe beispielsweise EP-Bl 368 684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213 oder WO 98/24884).
Als Alternative zu klassischen An iköφern ist es auch möglich, Proteingerüste (protein scaffolds) gegen das jeweilige Molekül zu verwenden, beispielsweise Anticaline, die auf Lipocalin basieren (Beste et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, 1898-1903). Die natürlichen Liganden-Bindungsstellen von Lipocalinen, beispielsweise dem Retinol- bindenden Protein oder dem Bilin-bindenden Protein, können verändert werden, beispielsweise unter Verwendung eines „kombinatorischen Protein-Design"-Ansatzes, und zwar auf eine solche Weise, dass sie ausgewählte Haptene binden, (Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482, 337-50). Von anderen bekannten Proteingerüsten ist es bekannt, dass sie Alternativen für Antiköφer darstellen (Skerra (2000) J. Mol. Recognit, 13, 167-287). Der Ausdruck „Nukleinsäuren gerichtet gegen das entsprechende Gen" bezieht sich auf Doppelstrang- oder Einzel strang-DNA oder -RNA oder Fragmente davon, die beispielsweise die Expression des jeweiligen Gens oder die Aktivät der jeweiligen Moleküle inhibiert, und schließt ohne Beschränkung Antisense-Nukleinsäuren, Aptamere, siRNAs (small interfering RNAs) und Ribozyme ein. Nukleinsäuren, z.B. die Antisense- Nukleinsäuren oder siRNAs, können chemisch synthetisiert werden, beispielsweise entsprechend dem Phosphotriesterverfahren (siehe beispielsweise Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584).
Aptamere sind Nukleinsäuren, die mit hoher Affinität an ein Polypeptid binden. Aptamere können durch Selektionsverfahren wie SELEX (siehe z.B. Jayasena (1999) Clin. Chem., 45, 1628-50; Klug und Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107; US 5,582,981) von einem großen Pool unterschiedlicher Einzelstrang-RNA-Moleküle isoliert werden. Aptamere können auch in ihrer Spiegelform synthetisiert und selektiert werden, beispielsweise als das L-Ribonukleotid (Nolte et al. (1996) (Nat. Biotechnol., 14, 1116-9; Klussmann et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 1112-5). Formen, die auf diese Weise isoliert wurden, haben den Vorteil, dass sie nicht durch natürlich vorkommende Ribonukleasen abgebaut werden und daher eine größere Stabilität aufweisen.
Nukleinsäuren können durch Endonukleasen oder Exonukleasen abgebaut werden, insbesondere durch DNasen und R asen, die in der Zelle gefunden werden können. Es ist daher vorteilhaft, Nukleinsäuren zu modifizieren, um sie gegenüber Abbau zu stabilisieren, wodurch sichergestellt wird, dass eine hohe Konzentration an Nukleinsäure in der Zelle über einen langen Zeitraum aufrecht erhalten wird (Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res., 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Typischerweise kann eine derartige Stabilisierung durch Einführen einer oder mehrerer Internukleotid- Phosphorgruppen oder durch Einführen einer oder mehrerer Nicht-Phosphor- Internukleotidanaloga erreicht werden.
Geeignete modifizierte Internukleotide werden in Uhlmann und Peyman (1990), siehe oben, beschrieben (siehe auch Beigelman et al. (1995) Nucleic Acids Res., 23:3989-94; WO 95/11910; WO 98/37240; WO 97/29116). Modifizierte Internukleotid- Phosphorgruppen, schließen beispielsweise Methylphosphonate, Phosphorthioate, Phosphoramidate, Phosphordithioate und/oder Phosphatester ein, während die Nicht- Phosphor-Internukleotidanaloga beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten. Es ist auch beabsichtigt, dass diese Modifikationen die Lebensdauer einer pharmazeutischen Zusammensetzung verbessern sollen, die entsprechend den Verwendungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann.
Die Verwendung von geeigneten Antisense-Nukleinsäuren wird ferner in Zheng und Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2; Nellen und Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sei., 18, 419-23; Stein (1992) Leukemia, 6. 697-74; oder Yacyshyn, B.R. et al. (1998) Gastroenterology, 114, 1142) beschrieben.
Die Herstellung und die Verwendung von siRNAs als Hilfsmittel für die RNA-Interferenz im Verfahren zum Herunterregulieren oder Abschalten der Genexpression wird beispielsweise in Elbashir, S.M. et al. (2001) Genes Dev., 15, 188, oder Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature, 411, 494 beschrieben. Vorzugsweise weisen siRNAs eine Länge von weniger als 30 Nukleotiden auf, wobei der Identitätsbereich des Sense-Strangs der siRNA vorzugsweise mindestens 19 Nukleotide umfasst.
Ribozyme sind auch geeignete Hilfsmittel, um die Translation von Nukleinsäuren zu inhibieren, da sie in der Lage sind, spezifisch die mRNAs zu binden und zu schneiden. Sie sind beispielsweise beschrieben in Amarzguioui et al. (1998) Cell. Mol. Life Sei., 54, 1175-202; Vaish et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 5237-42; Persidis (1997) Nat. Biotechnol., 15, 921-2; oder Couture und Stinchcomb (1996) Trends Gene., 12, 510-5. Eine Einzelstrang-DNA oder -RNA ist für die Verwendung als Antisense-Oligonukleotid oder Ribozym bevorzugt.
Daher können die hierin beschriebenen Nukleinsäuren verwendet werden, um die Expression der jeweiligen Gene in den Zellen sowohl in vivo wie in vitro zu inhibieren und/oder zu reduzieren. Daher können sie als Inhibitoren im Rahmen der vorliegenden Erfindung wirken. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wirkt der verwendete Inhibitor dadurch, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die Bildung terminal differenzierter Adipozyten fördert. Dies kann beispielsweise geschehen durch Hemmung der Proliferation von Präadipozyten, durch Förderung der Differenzierung zu terminal differenzierten Adipozyten, insbesondere durch Förderung des Transkriptionssignalweges der Differenzierung oder durch Hemmung des Zelltodes, vorzugsweise der Apoptose in Präadipozyten.
Dabei kann der jeweilige Effekt wie oben angegeben gemessen werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wirkt der erfindungsgemäß verwendete Inhibitor dadurch, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die Funktion der terminal differenzierten Adipozyten fördert. Dies kann beispielsweise durch eine Förderung der Lipogenese oder durch eine Hemmung der Lipolyse bewirkt werden.
Diese Effekte können wie oben beschrieben gemessen werden.
Entsprechend einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wirkt der verwendete Inhibitor dadurch, dass die pharmazeutische Zusammensetzung eine Sensitivierung von weiteren Insulin-abhängigen Nicht-Adipozyten-Zelltypen (wie z.B. Skelettmuskelzellen, Hepatozyten, Inselzellen, Endothelzellen) bewirkt. Hierbei wird die negative Regulation der Insulin-abhängigen Signalübertragung, die durch die erfindungsgemäßen Proteine verursacht wird, durch den verwendeten Inhibitor aufgehoben.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Inhibitor eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 oder 23, oder einer funktionellen Variante davon.
Für alle pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung gilt das folgende: Für die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung werden die entsprechenden Moleküle gewöhnlich mit geeigneten Additiva oder Hilfsstoffen formuliert, wie beispielsweise physiologische Pufferlösung, beispielsweise Natriumchloridlösung, demineralisiertes Wasser, Stabilisatoren, wie Protease- oder Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Aprotinin, ε-Aminocapronsäure oder Pepstatin A oder Chelatbildner wie EDTA, Gelformulierungen, wie weiße Vaseline, Paraffin mit geringer Viskosität oder Gelbwachs (yellow wax), abhängig von der Art der Verabreichung.
Geeignete zusätzliche Additiva sind beispielsweise Detergenzien, wie beispielsweise Triton X-100 oder Natriumdeoxycholat, aber auch Polyole, wie beispielsweise Polyethylenglycol oder Glycerin, Zucker, wie beispielsweise Sucrose oder Glucose, zwitterionische Verbindungen, wie beispielsweise Aminosäuren, wie Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain oder ein Protein, wie beispielsweise bovines oder humanes Serumalbumin. Detergenzien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen sind bevorzugt.
Die physiologische Pufferlösung hat vorzugsweise einen pH von etwa 6,0-8,0, insbesondere einen pH von etwa 6,8-7,8, insbesondere einen pH von etwa 7,4, und/oder eine Osmolarität von ungefähr 200-400 milliosmol/Liter, vorzugsweise von etwa 290-310 milliosmol/Liter. Der pH des Medikaments wird im Allgemeinen unter Verwendung eines geeigneten organischen oder anorganischen Puffers angepasst, wie beispielsweise unter Verwendung von Phosphatpuffern, Trispuffern (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)piperazino]ethansulfonsäure) oder MOPS-Puffer (3- Moφholino-1-propansulfonsäure). Die Wahl des entsprechenden Puffers hängt im Allgemeinen von der gewünschten Puffermolarität ab. Phosphatpuffer ist beispielsweise geeignet für Injektions- oder Infusionslösungen.
Injektionslösungen werden im allgemeinen verwendet, wenn nur eine geringe Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise etwa 1 bis etwa 20 ml, verabreicht werden sollen. Infusionslösungen werden im allgemeinen verwendet, wenn eine größere Menge einer Lösung oder Suspension, beispielsweise ein oder mehrere Liter, verabreicht werden sollen. Da im Gegensatz zur Infusionslösung nur wenige Milliliter im Fall von Injektionslösungen verabreicht werden, sind geringe pH-Differenzen oder des osmotischen Drucks des Bluts oder der Gewebeflüssigkeit im Vergleich zur Injektionslösung selbst nicht bemerkbar oder spielen keine große Rolle. Die Verdünnung der Formulierung vor der Verwendung ist daher im allgemeinen nicht erforderlich. Wenn allerdings relativ große Mengen verabreicht werden, sollte die erfindungsgemäße Formulierung kurz vor der Verabreichung verdünnt werden, so dass etwa eine isotonische Lösung erhalten wird. Ein Beispiel einer isotonischen Lösung ist eine 0,9%-ige Kochsalzlösung. Im Fall von einer Infusion kann die Verdünnung beispielsweise unter Verwendung von sterilem Wasser erreicht werden, während die Verabreichung beispielsweise durch einen so genannten Bypass durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß ist dabei eingeschlossen, dass Subjekte, welche entsprechend der vorliegenden Erfindung behandelt oder diagnostiziert werden können, vorzugsweise Säuger insbesondere Menschen, Tote oder Lebendige einschließen. Dies schliesst auch wie oben ausgeführt eine Gentherapie ein.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedene Arten parenteral, peroral oder transdermal verabreicht werden, um eine geeignete Inhibition der Lipideinlagerung oder der Symptome eines Diabetes Typ II zu bewirken.
Grundsätzlich wird die wirksame Dosis vom Gewicht und dem Zustand des jeweiligen zu behandelnden Subjektes abhängen. Dabei ist davon auszugehen, dass dem Fachmann bekannt ist, wie eine geeignete Dosierung bestimmt werden kann.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedene Art und Weise verabreicht werden, beispielsweise peroral, intramuskulär, subkutan, intrathekal, in das Fettgewebe, perkutan (gelöst in DMSO), okular, bukkal, intranasal (Inhalation), intravenös oder intraperitoneal, oder durch Fusion oder Gele, welche das jeweilige Medikament enthalten. Es ist femer möglich, das Medikament topisch und lokal, beispielsweise in Form von Liposomkomplexen, zu verabreichen. Femer kann das Medikament durch ein transdermales therapeutisches System (TTS) verabreicht werden, welches eine zeitlich kontrollierte Abgabe des Medikaments ermöglicht. TTS sind beispielsweise aus EP 944 398, EP 916 366, EP 889 723 oder EP 852 493 bekannt. Eine langsamere Abgabe des Proteins, Peptids, oder Antiköφers wird durch Kombination mit Polymeren, eine längere Halbwertszeit durch Zugabe von PEG erreicht. Geeignete Polymere erlauben auch eine perorale Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, beispielsweise durch eine geschützte Passage durch den Darm und die gezielte Penetration der Zell-Zell- Kontaktstellen im Bereich des Darmepithels. Eine Kombination mit chemischen Wirkstoffen (z.B. Appetithemmer, Lipasehemmer) kann die Wirkung noch verstärken.
In der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise Proteine, Peptide, Fragmente in einer Dosis von 1 pg/kg bis 15 mg/kg, vorzugsweise zwischen 5 pg/kg und 5 mg/kg, und besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 2 mg/kg Patientengewicht verabreicht. Kontinuierliche Infusionen können auch verwendet werden, beispielsweise durch Verwendung einer osmotischen Minipumpe, wie beschrieben in Heyman et al., Nat. Med., 1999, 5, 1135-152. In diesem Fall kann eine Infusionsdosis zwischen 5 und 20 μg/kg/Minute, bevorzugt zwischen 7 und 15 pg/kg/Minute angewendet werden.
Wenn Nukleinsäuren oder Fragmente verabreicht werden sollen, so kann der Gentransfer entweder mittels nackter DNA oder in einem Vektor erfolgen. Entsprechende Vektoren sind im Stand der Technik bekannt (Barnacal, P. (1998) SRIP's complete Guide to Gene Therapy. PJB Publication)
Vektoren, die im Sinne der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind, sind beispielsweise auf Adenoviren- und/oder replikations-defizienten Retroviren basierende Vektoren. Dementsprechende Techniken sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
Falls gewünscht können regulierbare Vektoren, wie beispielsweise beschrieben in Ozawa et al., Annu. Rev. Pharmacol. & Toxicol., 2000, 40, 295-317, verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Form vor, welche den Kontakt des Wirkstoffes mit einem Bestandteil der Zelloberfläche (nicht zellgängig) ermöglicht (Cardiovasc Pharmacol Ther. 2002 Jul; 7(3): 171 -80. Die Erfindung betrifft femer ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem Patienten eine wirksame Menge eines oder mehrerer der oben definierten Inhibitoren verabreicht wird. Bevorzugt leidet der Patient unter Diabetes-Typ-II- oder unter Diabetes- Typ-II-verwandten Krankheiten. Weiter bevorzugt leidet der Patient unter Kachexie oder HARS. Für diese erfindungsgemäßen Verfahren gelten alle oben für die erfindungsgemäße Verwendung des Inhibitors aufgeführten Ausführungsformen.
Die Erfindung betrifft femer die Verwendung der Polypeptide, Proteine oder Fragmente bzw. der Nukleinsäure oder der Fragmente wie oben definiert zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Adipositas bzw. Typ-II-Diabetes.
Die Detektion des Proteins oder Peptids in Serum, Fett, Hirn oder Muskel kann durch Western Blot, die Detektion von Nukleinsäuren durch PCR-Analyse erfolgen.
Der Nachweis des exprimierten Proteins oder Peptids dient hierbei als Marker für den Phänotyp der Krankheit. Dies ist besonders bei der Diagnose von Risikogruppen hilfreich, die eine vermehrte oder verringerte Expression des Markers aufweisen. Beispielsweise kann die Expression von TNFSF12 im Blutserum in adipösen Individuen reduziert sein (s. Fig.13). Beispielsweise ist dieser Marker in Patienten, die an Kachexie oder HARS (HIV- associated-adipose redistribution syndrome") erhöht. Die Expressionshöhe des Markers kann für die Bestimmung der Therapiemethode und möglicherweise für die Dosierung des Therapeutikums herangezogen werden. Anhand der Bestimmung des Proteinspiegels vor, während und nach der Therapie ist auch eine Bestimmung des Krankheitsverlaufs möglich.
Das Vorhandensein von genetischen Varianten SNPs („small nuclear polymoφhisms") auf chromosomaler Ebene kann zudem sehr weit reichende Auswirkungen auf die Prädisposition der Patienten haben (Sensitivität gegenüber Adipositas). Durch die Bestimmung genetischer Varianten der erfindungsgemäßen Proteine, Peptide oder Fragmente lassen sich der Verlauf von Therapien im Umfeld Adipositas und Typ-II- Diabetes diagnostizieren und/oder vorhersagen. Femer betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnostikum enthaltend a) ein Polypeptid bzw. ein Fragment mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 21 und/oder 23, b) eine Nukleinsäure bzw. ein Fragment kodierend für ein Polypeptid gemäß a) und/oder c) eine Variante der Moleküle gemäß a) oder b). Die Varianten können dabei erfindungsgemäß funktionelle Varianten wie oben definiert sein.
Femer umfasst der Begriff „Variante" erfindungsgemäß auch derartige Nukleinsäuremoleküle, mit denen die jeweiligen Nukleinsäuren nachgewiesen werden können, wobei die zum Nachweis eingesetzten Nukleinsäuren selber keine funktionellen Varianten sind. Beispiele dafür dind Primer oder Oligonukleotide, welche an kodierende oder nicht kodierende Sequenzen binden können und dadurch deren Nachweis ermöglichen.
Beispielsweise können so detektierbaren aberranten Expressionsmengen ermittelt werden, die beispielsweise auch dann für die Diagnostik genutzt werden, wenn die betrofffenen Individuen noch nicht adipös sind, aber aufgrund ihrer persönlichen Anlage ein hohes Risiko tragen, adipös zu werden.
Weiterhin können diagnostische Assays nicht nur auf der Messung des entsprechenden Proteins beruhen, sondern es kann auch der genetische Hintergrund bestimmt werden, welcher zur Modulation der Proteinexpression führt. Hierbei sind insbesondere genetische Variationen zu erwähnen (SNPs oder Haplotypen, Insertionen, Deletionen oder Amplifikationen), welche zum Beispiel in Promotoren oder anderen regulatorischen Seqzuenzen die Expression des Proteins steuern können. Weiterhin gibt es genetische Variationen, die das Protein selbst verändern und damit zu veränderter Funktion oder Stabilität des Proteins führen.
Zusätzlich gibt es genetische Abberationen, welche keine der oben beschriebenen Kriterien erfüllen, aber dennoch klar mit veränderter Expression, Funktion oder Stabilität der
Proteine korreliert werden können. Alle diese Varianten können detektiert und als Basis für entsprechende Diagnostika verwendet werden. Ausführungsformen für solche Assays können unter anderem sein, PCR-Techniken kombiniert mit Sequenzanalysen, Hybridisationsanalysen (Chips) oder auch sequenzspezifische Antiköφer, sowie bioinformatorische Analyse und Detektion von spezifischen Haplotypen, welche Kombinationen von individuellen SNPs, Deletionen, Insertionen und/oder Amplifikationen sind.
Die Erfindung betrifft femer ein Verfahren zum Identifizieren eines Modulators eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder einer funktionellen Variante davon, bei dem man eine geeignete Zelle mit einer Kombination aus einem potentiellen Modulator und einem Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23 oder einem Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder einer funktionellen Variante davon inkubiert und anschließend die Veränderung in der biologischen Aktivität bestimmt.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Produzentenzellen (z.B. HEK 293 -Zellen) werden beispielsweise mit cDNA- Expressionsplasmiden transfiziert, die für die entsprechenden erfindungsgemäßen Proteine kodieren. Nach Transfektion werden die Zellen über einen Zeitraum von beispielsweise 2 Tagen kultiviert (Expression des Proteins in den Zellüberstand).
Zu einem geeigneten Zeitpunkt (beispielsweise nach 3 Tagen) nach Aussaat der Empfängerzellen (Empfängerzelllinie oder -zelllinien (z.B. 3T3-L1 Zellen) oder auch von zu testenden Primärzellen) und vorzugsweise nach Induktion der Differenzierung (Zugabe entsprechender Differenzierungsstimuli) erfolgt die Zugabe von entsprechenden Modulatoren (Inhibitoren bzw. Aktivatoren) zu diesen Zellen. Die Modulatoren können hierbei ausgewählt werden aus Sammlungen / Bibliotheken chemischer Substanzen (low molecular weight substances, LMWs), Peptiden, Proteinen, An iköφern, Decoy- Rezeptoren, Antikalinen, Affilinen, Antisense-RNAs, siRNA, Aptameren oder Proteasen. Ein solcher Modulator kann insbesondere auch eine anderer Ligand für den Rezeptor des Polypeptids sein. Danach, beispielsweise nach einer dem Fachmann bekannten Inkubationszeit, erfolgt der Übertrag des Zeilüberstandes von den Produzentenzellen auf die Empfängerzellen. Die Zugabe des Modulators muss hierbei nicht zwingend vor Übertrag des Zellüberstandes erfolgen. Alternativ ist die Zugabe des Modulators auch gleichzeitig oder zeitversetzt möglich. Dies kann besonders dann von Vorteil sein, wenn die Komplex-Bildung aus dem erfindungsgemäßen Protein mit zellulären oder löslichen Rezeptoren die Modulation verstärkt. Beispielsweise ist in bestimmten Fällen eine Erkennung eines Proteins durch einen Antiköφer erst nach Komplexbildung aus Protein und zugehörigem Rezeptor möglich.
Die Empfängerzellen werden für einen geeigneten Zeitraum (beispielsweise 5 Tage) kultiviert. Danach wird die Auswirkung der Modulatoren auf die Zellen bestimmt. Dies kann beispielsweise eine gesteigerte Lipideinlagerung (Inhibitoren) bzw. eine Verringerung der Lipideinlagerung (Aktivatoren) sein. Beides kann mittels Nile-Red- Assay bestimmt werden.
Entsprechende Verfahrensschritte zur Vorbereitung und Kultivierung der Zellen sowie des NileRed-Assays werden in den Beispielen offenbart.
Anstatt der Expression der erfindungsgemäßen Proteine in Produzentenzellen kann auch rekombinant hergestelltes Protein (siehe Beispiel 1) zu den Empfängerzellen zugegeben werden. Die Konzentration des zugegebenen rekombinanten Proteins entspricht dann der Konzentration des sezernierten Proteins im Zellüberstand der Produzentenzelle.
Wie dargestellt ist im Rahmen des erfinungsgemäßen Verfahrens besonders bevorzugt, dass die Zelle den Rezeptor des jeweiligen Polypeptids natürlicherweise oder rekombinant exprimiert oder der Rezeptor ein Chimären-Rezeptor ist.
Hierzu wird beispielsweise der dem erfindungsgemäßen Protein entsprechende molekulare Rezeptor rekombinant, d.h. mit Hilfe zugeführter, für den Rezeptor kodierende DNA in diesen Zellen exprimiert und zur Bestimmung der Lipideinlagerung bzw. der Insulinabhängigen Signalübertragung ("Insulin-Signaling") ein entsprechender Reportergen- gekoppelter Assay verwendet. Die bevorzugten Rezeptoren für die erfindungsgemässen Proteine sind weiter oben aufgeführt. Entsprechende Reportergen-Assays sind im Stand der Technik bekannt.
Alternativ kann der rekombinante Rezeptor in Adipozyten oder Nicht-Adipozytenzellen auch eine Rezeptorchimäre darstellen. In diesem Fall wird die extrazelluläre Bindungsstelle des erfindungsgemässen Proteins im natürlichen Rezeptor mit einer intrazellulären Effektordomäne eines anderen Rezeptors durch Rekombination gekoppelt - die natürliche Effektordomäne wird dabei bevorzugt eliminiert. Die Transmembrandomäne des chimären Rezeptors kann wahlweise aus dem natürlichen Rezeptor stammen oder von dem zweiten Rezeptor stammen, der das erfindungsgemässe Polypeptid natürlicherweise nicht bindet. Es resultiert ein chimärer Rezeptor der auf Bindung des erfindungsgemässen Proteins eine Signalgebung in der Zelle initiiert, die der der Effektordomäne des zweiten Rezeptors entspricht. Diese kann dann ebenfalls in einem entsprechenden Reportergen- gekoppelten Assay gemessen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt der Modulator ein Ligand des Rezeptors darstellt.
Femer ist bevorzugt die Zelle humanen oder nicht-humanen Ursprungs.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle ein primärer Adipozyt oder stammt von einem primären Adipozyten ab.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Veränderung der biologischen Aktivität von Adipozyten, vorzugsweise 3T3-L1- oder 3T3-F442A-Zellen, bestimmt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine primäre Gewebszelle oder stammt von Primärgewebe ab, wobei das Gewebe bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Leber, Nebenniere, Blutzellen, bevorzugt Lymphozyten, Endothelzellen, Muskeln, bevorzugt Sklelettmuskeln, Pankreas und Gehirn, bevorzugt Hypothalamus. Da lösliche Proteine, Peptide oder Fragmente davon, zum Zweck der Integration verschiedenster Gewebe in eine konzertierte Antwort auf einen gegebenen Status des Energiehaushalts oder einen diesbezüglichen Stimulus auf verschiedene Gewebe einwirken können, kann es zweckmässig sein die Wirkung der erfindungsgemässen Proteine auch auf andere Gewebe zu bestimmen. Insbesondere betrifft dies Gewebe, die an der energetischen Homöostase (Aufrechterhaltung eines Gleichgewichts) direkt beteiligt sind, wie Leber, Muskeln, bevorzugt Sklelettmuskeln, Pankreas, Gehirn, bevorzugt Hypothalamus, Nebenniere, aber auch Blutzellen, bevorzugt Lymphozyten und Endothelzellen. Letztere, weil die Adipositas auch mit einer erhöhten inflammatorischen Aktivität in Verbindung gebracht wird und weil die Versorgung mit Blutgefässen ein bestimmender Faktor in der Fettgewebsbildung sein kann.
Besonders bevorzugt ist die Zelle aus einer Zelllinie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Leberzelllinien insbesondere HepG2, H4IIE, Endothelzellen, insbesondere HUVEC oder mikrovaskuläre Endothelzellen, Herzmuskelzellen, Skelettmuskelzellen, insbesondere C2C12 oder L6, Glukose-sensitive beta-Zellen des Pankreas, insbesondere INS-1 oder Min-6, Fibroblasten, insbesondere NIH3T3 oder Swiss albino 3T3, HEK-293, COS oder CHO-Zellen.
Besonders bevorzugt besteht die Veränderung der biologischen Aktivität in einer Verringerung oder Steigerung der Fetteinlagerung in die Zellen.
Diese kann wie oben beschrieben gemessen werden.
Ganz besonders bevorzugt wird wie oben beschrieben die Fetteinlagerung mittels Bestimmung des intrazellulären eingelagerten Lipids gemessen.
Die Identifizierung des Modulators kann unter Verwendung von Hochdurchsatzscreening (HTS)-Verfahren, wie beispielsweise in WO 01/48239 oder WO 03/014346 beschrieben, durchgeführt werden. Die Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele und Figuren erläutert, die in keiner Weise dazu gedacht sind, den Gegenstand der Erfindung einzuschränken.
In den Beispielen wird insbesondere gezeigt, dass die erfindungsgemäß verwendeten Polypeptide in der Lage sind, die Lipideinlagemng in murinen 3T3-L1 Zellen inhibieren. Die Inhibition konnte auch in primären humanen Adipozyten subkutanen sowie omentalen Ursprungs gezeigt werden. Der Nachweis erfolgte jeweils durch NileRed-Assay.
Fe er wird gezeigt, dass lösliche Varianten dieser Proteine, die rekombinant erhältlich sind, bzw. kommerziell erhältliche Proteinfragmente ebenfalls in der Lage sind, die Lipideinlagerung zu inhibieren.
Femer wird gezeigt, dass exprimierte lösliche murine homologe Varianten von TNFSF12 bzw. TNFSF14 bzw. deren Proteinfragmente in der Lage sind, die Gewichtszunahme in Mäusen zu reduzieren.
Beschreibung der Figuren:
Fi l:
Dargestellt ist die prozentuale Hemmung der Lipideinlagerung in 3T3-L1 Zellkulturen bezogen auf die Negativkontrolle (Leervektor). 3T3-L1 Zellkulturen wurden mit Überständen von 293 Zellen inkubiert, die mit den für die jeweiligen Proteine kodierenden Expressionsplasmiden transfiziert wurden. Eine niedrige Signalstärke bedeutet geringe Lipideinlagerung in die 3T3-L1 Zellen, eine hohe Signalstärke bedeutet eine starke Lipideinlagemng.
Fig. 2:
Dargestellt ist die Dosis Wirkungskurve, die den Lipidgehalt von 3T3-L1 Zellen in Abhängigkeit der zugesetzten Menge an rekombinantem sekretiertem bzw. löslichem Proteinfragment TNFSF-12 zeigt. Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 5 nach Zugabe des Proteins angegeben.
Fig. 3:
Dargestellt ist die Dosis Wirkungskurve, die den Lipidgehalt von 3T3-L1 Zellen in Abhängigkeit der zugesetzten Menge an rekombinantem löslichem bzw. sekretiertem bzw. löslichem Proteinfragment TNFSF-14 zeigt.
Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 5 nach Zugabe des Proteins angegeben.
Fig. 4:
Dargestellt ist die Dosis Wirkungskurve, die den Lipidgehalt von 3T3-L1 Zellen in Abhängigkeit der zugesetzten Menge an rekombinantem Cardiotrophin-1 Protein zeigt. Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 5 nach Zugabe des Proteins angegeben.
Fig. 5: Dargestellt ist die Dosis Wirkungskurve, die den Lipidgehalt von 3T3-L1 Zellen in Abhängigkeit der zugesetzten Menge an rekombinantem sekretiertem bzw. löslichem Proteinfragment FGF-16 zeigt. Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 5 nach Zugabe des Proteins angegeben.
Fig. 6
Dargestellt ist die prozentuale Hemmung der Lipideinlagemng am Tag 8 in Form einer Dosis- Wirkungskurve- durch jeweils rekombinante sekretierte bzw. lösliche Proteinfragmente von (A): TNFSF12 bzw. (B): TNFSF14 - in primären humanen Adipozytenzellkulturen subkutanen Urspmngs. Dazu wurden die primären humanen Zellkulturen mit den jeweiligen rekombinanten Proteinen inkubiert. Die prozentualen Daten beziehen sich jeweils auf Kontrollkulturen die mit einer noch unwirksamen Proteinkonzentration von 0,025ng/ml behandelt wurden. Eine niedrige Signalstärke bedeutet geringe Lipideinlagemng in die differenzierenden humanen Adipozyten, eine hohe Signalstärke bedeutet eine starke Lipideinlagerung.
Fig. 7:
Dargestellt sind zwei alternative Liganden für den Lymphotoxin-beta-Rezeptor, einen der Rezeptoren von TNFSF14. Dargestellt sind die Dosis- Wirkungskurven, die den Lipidgehalt von 3T3-L1 Zellen in Abhängigkeit der zugesetzten Menge an rekombinantem sekretiertem bzw. löslichem Proteinfragment TNFSF14, alpha l/beta2-Lymphotoxin, alpha2/betal -Lymphotoxin zeigen. Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 5 nach Zugabe des jeweiligen Proteins angegeben. Eine niedrige Signalstärke bedeutet geringe Lipideinlagerung in die differenzierenden humanen Adipozyten, eine hohe Signalstärke bedeutet eine starke Lipideinlagerung.
Fig. 8:
Dargestellt ist die Hemmung der Lipideinlagerung durch zugesetzte rekombinante lösliche Proteinfragmente von alphal/beta2-Lymphotoxin, alpha2/betal -Lymphotoxin, Cardiotrophin-1, Endothelin-2 bzw. FGF-16 in primäre humane Adipozyten subkutanen Urspmngs. Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 8 nach erstmaliger Zugabe des jeweiligen Proteins angegeben.Eine niedrige Signalstärke bedeutet geringe Lipideinlagemng in die differenzierenden humanen Adipozyten, eine hohe Signalstärke bedeutet eine starke Lipideinlagemng.
Fig. 9:
Dargestellt sind die Nachweise der in der Literatur beschriebenen Rezeptoren von (A) TNFSF12 (TWEAK-Rezeptor) und TNFSF14 ((B) HVEM-Rezeptor und (C) Lymphotoxin-beta Rezeptor) mittels spezifischer Rezeptor- Antiköφer und Fluorophor markierter sekundärer Antiköφer und dem Fluoreszenz-aktivierten Zeil sortierungsverfahren (FACS) auf 3T3-L1 Zellen. Die Messergebnisse sind als Fluoreszenzintensitäten (FL-1) im Verhältnis zur Ereigniszahl („event") angegeben. Verglichen werden jeweils das Fluoreszenz-Intensitätsprofil in Anwesenheit (D) bzw. Abwesenheit (■) des spezifischen Rezeptor- Antiköφers. Eine Verschiebung der Fluoreszenzintensität hin zu stärkeren Intensitäten (Rechtsverschiebung), bedeutet eine Bindung des spezifischen Rezeptorantiköφers gepaart mit dem Fluoreszenz-markierten sekundären Antiköφers an die Zelloberfläche. Dies zeigt die Rezeptor-Exposition an der Zelloberfläche an.
Fig. 10:
Dargestellt ist die insulinabhängige Glukoseaufnahme in primären humanen Adipozyten subkutanen Ursprungs. Unwirksame (10-10M) und wirksame (10-7 M) Konzentrationen an Insulin wurden eingesetzt. Wirksame Insulin-Konzentrationen bewirken eine gesteigerte zelluläre Glukoseaufnahme unter den gewählten Bedingungen (Kontrolle). Die Auswirkungen der Ko-Inkubation mit zugesetzten Proteinen (TNFSF12 und TNFSF14 je 100 ng/ml) sind gezeigt. TNF-alpha (50 ng/ml) diente in diesem Zusammenhang als Positivkontrolle, da seine Interferenz mit der insulinabhängigen Glukoseaufnahme in Adipozyten bereits beschrieben wurde. Die Messergebnisse sind angegeben als „insulinabhängige Aufnahme von pmol Glucose innerhalb von 20 Minuten". (B) Dargestellt ist die insulinabhängige Glukoseaufnahme in An- bzw. Abwesenheit von FGF-16 auf humanen differenzierten SGBS Adipozyten. Eine wirksame Insulin- Konzentration (10-7M) bewirkt eine zelluläre Glukoseaufnahme unter den gewählten Bedingungen (Kontrolle). Die Auswirkungen der Ko-Inkubation mit zugesetztem FGF-16 Protein FGF-16 lOOng/ml sind gezeigt. Die Messergebnisse sind angegeben als „insulinabhängige Aufnahme von pmol Glucose innerhalb von 20 Minuten".
Fig. 11:
A/B: Dargestellt ist der Nachweis von zuvor intravenös in weibliche C57BL/6 Mäuse appliziertem Protein in nachfolgend gewonnenn Blutsemm-Proben. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten nach einmaliger Injektion des jeweiligen löslichen rekombinanten Proteinfragments entnommen und einem Nachweis mittels spezifischer Antiköφer (ELISA-Bestimmung) zugeführt: (A: TNFSF12; B: TNFSF14).
C/D: Dargestellt ist der Nachweis der inhibitiorischen Aktivität in den unter A/B beschriebenen Mausseren. Dazu wurde die Hemmung der Lipideinlagemng in 3T3-L1 Zelkulturen unter Zugabe von geeigneten Verdünnungen (C: Seren mit TNFSF14 0,2%- 1%; D:TNFSF12 2%) der Mausseren bestimmt. Das Maussemm von Kontrollmäusen diente als Referenz für allgemeine Serumeffekte.
Fig.12:
Dargestellt ist die Restriktion der Köφergewichtszunahme in männlichen C57BL/6 Mäusen, 2 Wochen nach Injektion eines geeigneten Expressionsvektors, in Abhängigkeit vom Ausmaß der Expression löslichen bzw. sekretierten Proteinfragments von murinem TNFSF12 (A) bzw. TNFSF14 (B). Das Ausmaß der Expression der Proteinfragmente wurde mittels ELISA-Bestimmung an Serumproben bestimmt. Gezeigt ist die negative Korrelation von Proteinexpression und Köφergewichtszunahme. (C): Gezeigt sind Gewichtsmessungen an ausgewählten Fettdepots von Tieren in denen eine Expression von TNFSF12 nachweisbar war (n=5) im Vergleich zu solchen, in denen diese nicht oder nur vergleichsweise schwach nachweisbar (n=3) war. Exemplarisch untersucht wurden die beiden epidydimalen Fettdepots („Pads") der männlichen Tiere und das perirenale und Kolon-assoziierte Fettgewebe. Dieses Ergebnis zeigt, daß an den ausgewählten Fettdepots eine Abnahme des Gewichts mit der TNFSF12-Expression korreliert.
Fig. 13: Dargestellt sind Gehaltsbestimmungen von endogenem (A) TNFSF12 in humanen Seren. Die Donoren der Seren wurden gruppiert nach ihrer Klassifizierung als normalgewichtig bzw. adipös. Die Gehaltsbestimmung wurde mittels ELISA-Bestimmung durchgeführt.
Fig. 14: Dargestellt sind Untersuchungen zur proliferativen Aktivität von (A) TNFSF12, (B) TNFSF14, (C) Cardiotrophin-1 und (D) FGF-16 auf subkonfluenten 3T3-L1 Zellkulturen. Die proliferative Aktivität wurde durch eine indirekte Lebend-Zellzahlbestimmung mittels des AlamarBlue Assays bestimmt und die Messergebnisse sind in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) angegeben.
Fig. 15:
(A): Dargestellt ist das Ausmaß der Hemmung der Lipideinlagemng in 3T3-L1 Zellkulturen bei gegenüber der Induktion zur Differenzierung 3-tägig verzögerter Zugabe der rekombinanten sekretierten bzw. löslichen Proteinfragmente von TNFSF12, TNFSF14, Cardiotrophin-1 bzw. FGF-16 . Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) am Tag 6 nach Induktion der Differenzierung angegeben.Eine niedrige Signalstärke bedeutet geringe Lipideinlagerung in die differenzierenden humanen Adipozyten, eine hohe Signalstärke bedeutet eine starke Lipideinlagerung.
(B): Dargestellt ist das Ausmaß der Hemmung der Lipideinlagerung in 3T3-L1 Zellkulturen nach Entzug der Faktoren. In allen Fällen erfolgte die Zugabe der rekombinanten sekretierten bzw. löslichen Proteinfragmente (je lOOng/ml) zum Zeitpunkt der Induktion zur Differenzierung. Schwarze Balken: Anwesenheit der Proteinfragmente von Tag 1-5 nach Induktion der Differenzierung und darauffolgende Bestimmung des Lipidgehalts. Graue Balken: Anwesenheit der Proteinfragmente von Tag 1-3, darauffolgend Entzug durch Waschen und weitere Inkubation der Kulturen für 4 weitere Tage, gefolgt von einer Bestimmung des Lipidgehalts. Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) angegeben.Eine niedrige Signalstärke bedeutet geringe Lipideinlagemng in die differenzierenden humanen Adipozyten, eine hohe Signalstärke bedeutet eine starke Lipideinlagerung.
Beispiele:
HEK-293 Zellen wurden mit cDNA-Expressionsplamiden, die für die jeweiligen Proteine kodieren, transfiziert. Nach Transfektion wurden die HEK-293 Zellen über einen Zeitraum von 2 Tagen kultiviert. Danach wurde der Zeilüberstand der HEK-293 Zellen abgenommen und auf 3T3-L1 Zellen (3 Tage nach deren Aussaat) übertragen. Unmittelbar darauf erfolgte eine Zugabe von Differenzierungsstimuli zu den 3T3-L1 Zellen. Die 3T3-L1 Zellen wurden mit den Überständen der HEK-293 Zellen für weitere 5 Tage kultiviert und die Hemmung der Lipideinlagerung mittels NileRed-Assay bestimmt.
Beispiel 1: Produktion eines aktiven Zellkulturüberstandes mit Hilfe der Transfektion einer Produzentenzelllinie (HEK 293 Zellen):
HEK293 Zellen wurden nach Standardmethoden in DMEM Medium (10%FCS) kultiviert und für die Transfektion in einer Zelldichte von 2,2 xlO4 Zellen/Vertiefung einer 96 well Platte in lOOμl Medium ausgesät. Die Transfektion der 293 Zellen mit dem cDNA- Expressionsplasmid erfolgte mit Hilfe gängiger Transfektionsmethoden, wie zum Beispiel der Calcium-Phosphat Transfektion von Roussel et al. (Mol. Cell. Biol. 4 (1984), 1999- 2009). Nach 48 Stunden wurden 50 μl des Medium-Überstandes abgenommen und auf die geeignet vorbereiteten Präadipozytenzellen (s.u.) verbracht.
Die cDNAs, die für die jeweiligen Proteine kodieren, wurden entweder aus einer „Volle- Länge"-angereicherten normalisierten cDNA-Bibliothek (Gewebequellen: viszerales Fettgewebe, Hypothalamus, Skelett-Muskel, Leber, Pankreas), die von Invitrogen, Carlsbad, USA, durch eine proprietäre Invitrogen Technologie erstellt wurde, aus einer „Human Füll Length Clone Collection"; ORIGENE; Rockville MD, USA (humane cDNA- Klone aus humanen Zelllinien und Geweben) oder aus einer MGC Klonkollektion (IRAK- Kollektion; „Mammalian Gene Collection"; RZPD, Berlin, die humane cDNA-Klone aus humanen Zelllinien und Geweben umfasst und in Strausberg RL, Feingold EA, Klausner RD, Collins FS. The Mammalian Gene Collection. Science, 1999, 286, 455-457 beschrieben ist, gewonnen.
Die Herkunft der cDNA-Sequenzen ist im Folgenden aufgelistet: TNFSF-12 VI stammt aus einer „Volle-Länge"„-angereicherten normalisierten cDNA- Bibliothek; Invitrogen, Carlsbad, USA. Die Hemmung der Lipideinlagemng wurde entsprechend Beispiel 3 zusätzlich mit einem rekombinanten, sekretierten bzw. löslichen Protein von R&D Systems GmbH, Wiesbaden; CatNo.: 1090-TW; Aminoterminal 6X HIS-getaggte extrazellulärer Domaine von humanem TWEAK (Arg 93-His 249; s. Chicheportiche, et al., 1997, J.Biol. Chem. 272:32401-32410) bestimmt.
TNFSF-12 VI* stammt aus einer „Volle-Länge"-angereicherten normalisierten cDNA- Bibliothek; Invitrogen, Carlsbad, USA (Accession Number (Acc. No.) NM 003809). Das sekretierte Proteinfragment ist identisch mit dem von TNFSF12 VI. TNFSF-12 VI* unterscheidet sich von TNFSF-12 VI durch eine zusätzliche Aminosäure im membranständigen Proteinanteil. Die Hemmung der Lipideinlagemng wurde entsprechend den Beispielen 3 und 7 zusätzlich mit einem rekombinanten, sekretiertem bzw. löslichem Protein von R&D Systems GmbH, Wiesbaden; CatNo.: 1090-TW; Aminoterminal 6X HIS-getaggte extrazellulärer Domaine von humanem TWEAK (Arg 93-His 249; s. Chicheportiche, et al., 1997, J.Biol. Chem. 272:32401-32410) bestimmt.
Zusätzlich wurde entsprechend dem Beispiel 12 ein TNFSF12-Expressionskonstrukt verwendet, welches ein Fragment des Maus-Homologs enthielt, wie im nächsten Absatz beschrieben. Dieses Fragment kodierte für eine rekombinante lösliche sekretierte murine Form von TNFSF12.
TNFSF-14 stammt aus einer „Human Füll Length Clone Collection"; ORIGENE; Rockville MD, USA. (BC1286_C05; Acc. No. NM 003807). Die Hemmung der Lipideinlagemng wurde entsprechend den Beispielen 3 und 7 zusätzlich mit einem rekombinanten, sekretierten bzw. löslichen Proteinfragment Protein von R&D Systems GmbH, Wiesbaden: CatNo.: 664-LI [CD33 signal (metl-17)/10x His/GGGSGGGSGGGSIEGR/]-Asp-74 - Val-240 bestimmt.
Entsprechend dem Beispiel 12 wurde ein TNFSF14-Expressionskonstrukt verwendet, das ein Fragment des Maus-Homologs enthielt, wie im Anschluss beschrieben. Dieses Fragment kodierte für eine rekombinante lösliche sekretierte murine Form von TNFSF14. Konstmktion von Vektoren kodierend für rekombinantes sekretiertes lösliches Proteinfragment von murinem TNFSF12 bzw. TNFSF14:
Die Expressionskonstrukte wurden erstellt, indem jeweils auf geeigneten murinen RNA- Quellen (TNFSF12: RNA aus 3T3-L1 Zellen bzw. TNFSF14: Maus-Thymus RNA) mit geeigneten Primem (Umfassung der Sequenzen kodierend für: Maus-TNFSF12: Arg 105 - His249 bzw. Maus-TNFSF14: Asp-72 - Val-239) eine RT-PCR durchgeführt wurde. Dabei wurden zusätzlich am 5 '-Ende: 6 Histidinreste und am 3 '-Ende: 2xTGA-Stop Codons und Sequenzen für die Restriktionsspaltstellen Xhol und Bglll eingeführt. Verwendete Primer: ml2-F-His: 5 '-CATCACCATCACCATCACCGAGCTATTGCÄGCCCATTATG - 3 ' m 12-R: 5 '-AGATCTCG AGTC ATC AGTGAACTTGAAAGA-3 ' ml4-F-His: 5'-CATCACCATCACCATCACGATGGAGGCAAAGGCTCCTG- 3' ml4-R: 5 '-AGATCTCGAGTCATCAGACCATGAAAGCTCC- 3 ' Das Reaktionsprodukt wurde direkt in den Vektor pSECTag/FRT/V5-His-TOPO
(Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) nach Angaben des Herstellers für die Kloniemng von PCR-Produkten eingefügt. Auf diese Weise erhielt das jeweilige Proteinfragment von TNFSF12 bzw. TNFSF14 aminoterminal im Leserahmen das Sekretionssignal aus dem Protein für die Ig-kappa-Kette gefolgt von 6 Histidinresten vorangestellt. Somit kodierte der derart generierte offene Leserahmen für die folgenden sekretierten Proteine:
Maus-TNFSFl 2-Leserahmen:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLALHHHHHHRAIAAHYEVHP RPGQDGAQAGVDGTVSGWEETKINSSSPLRYDRQIGEFTVIRAGLYYLYCQVHFD EGKAVYLKLDLLVNGVLALRCLEEFSATAASSPGPQLRLCQVSGLLPLRPGSSLRI RTLPWAHLKAAPFLTYFGLFQVH
Maus-TNFSF 14-Leserahmen :
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPARRARRTKLALHHHHHHDGGKGSWEKLI QDQRSHQANPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPG YYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANS SRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMV Nachfolgend wurden die Leserahmen in den Zielvektor pBS-HCRHPI-A (Miao et al, 2003, Human Gene Therapy 14:1297-1305), bestimmt für die in-vivo Genexpression in Tieren, umkloniert: Die Exzision aus pSECTag/FRT/N5-His-TOPO-Vektoren erfolgte mit Hilfe der Restriktionsspaltstellen Νhel und Bglll und Auffüllung der überstehenden Enden - Einfügen in pBS-HCRHPI-A erfolgte über Öffnung mit dem Restriktionsenzym EcoRV und Verbinden mit den glatten Enden mit den jeweils eingefügten Fragmenten. Die resultierenden Plasmide erhielten die Bezeichnungen pXAPOl (mTΝFSF12) bzw. pXAP02 (mTNFSFH).
Cardiotrophin-1 stammt aus einer „Volle-Länge"-angereicherten normalisierten cDNA- Bibliothek; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. No. NM_001330). Die Hemmung der Lipideinlagemng wurde entsprechend den Beispielen 3 und 7 zusätzlich mit einem rekombinanten Protein von R&D Systems GmbH, Wiesbaden: CatNo.: 612-CD (Protein Sequenz von Pennica, D. et al., 1996, Cytokine 8:183-189) bestimmt.
Endothelin-2 stammt aus einer MGC Klonkollektion (IRAK-Kollektion; „Mammalian Gene Collection"; RZPD, Berlin (5185394; Acc. No. NM_001956).
FGF-16 stammt aus einer ,Nolle-Länge"-angereicherten normalisierten cDΝA-Bibliothek; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. Νo. ΝM_003868). Die Hemmung der Lipideinlagerung wurde entsprechend den Beispielen 3 und 7 zusätzlich mit einem rekombinanten bzw. löslichen Protein von R&D Systems GmbH, Wiesbaden: CatNo.: 1212-FG/CF (As 2-207 siehe Miyake, A. et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 243:148-152) bestimmt.
GH-2 stammt aus einer „Human Füll Length Clone Collection"; ORIGENE; Rockville MD, USA. (PL1040_A04; Acc. No. NM_002059).
Calsyntenin-1 stammt aus einer „Human Füll Length Clone Collection"; ORIGENE; Rockville MD, USA. (FB2936_B05; Acc. No. NM_014944).
BM045 stammt aus einer „Human Füll Length Clone Collection"; ORIGENE; Rockville MD, USA; (Acc. No. NM_018459). GK001 stammt aus einer ,Nolle-Länge"-angereicherten normalisierten cDNA-Bibliothek; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. No. NMJJ20198).
PDGF-D vl stammt aus einer „Volle-Länge"-angereicherten normalisierten cDNA- Bibliothek; Invitrogen, Carlsbad, USA (Acc. No. NM_025208).
PDGF-D V2 stammt aus einer „Human Füll Length Clone Collection"; ORIGENE; Rockville MD, USA. (FB1975_A05; Acc. No. NM_033135). Bei PDGF-D VI und V2 handelt es sich um zwei unterschiedliche Spleißvarianten von PDGF-D.
Beispiel 2: Kultivierung von Präadipozytenzellen (3T3-L1 und primäre humane Adipozyten) und Vorbereitung auf die Induktion zur Differenzierung:
3T3-L1 Zellen sind Maus-Fibroblasten Zellen embryonalen Ursprungs, die unter geeigneten Bedingungen eine terminale Differenziemng zu reifen Fettzellen (Adipozyten) durchführen können. Deshalb werden die in Proliferationskultur gehaltenen 3T3-L1 auch als Präadipozyten bezeichnet. Sie wachsen in Mono-Layem und besitzen in etwa eine Verdopplungszeit von 24 h. Die hier verwendeten 3T3-L1 Zellen stammten von der ATCC (CL-173). Da die 3T3-L1 Zellen bei Konfiuenz spontan differenzieren und dabei die Eigenschaften der Kultur verändert werden, wurden die Zellen nicht bis zur Konfiuenz kultiviert (max. 80%; s. Passageprotokoll Beispiel 3).
Die Passagierung erfolgte in 2 Tagesabständen wobei dazwischen kein Mediumwechsel durchgeführt wurde. Es erfolgen außer bei dem Transfer der Überstände, grundsätzlich keine Medienwechsel. Die Zellen wurden erst ab Passage 5 und nur bis Passage 18 zum Screening verwendet. Die Erhaltungs-Kultur der 3T3-L1 Zellen erfolgte in T-75- Kulturflaschen. Zur Passagierung alle 2 Tage wurden diese mit 4,5 x 105 Zellen / T-75- Flasche angeimpft. Es erfolgte kein Mediumwechsel bis zur nächsten Passage.
Die Aussaat der 3T3-L1 Zellen für das Experiment erfolgte in 96 well Mikrotiteφlatten: Die 3T3-L1 Zellen wurden in einer Zelldichte von l,5xl04Zellen/well in 200 μl Wachstumsmedium/well ausgesät. Die Zellen wurden dann ohne Mediumwechsel für 3 Tage inkubiert und anschließend zur Differenziemng wie weiter unten beschrieben induziert und mit dem HEK-293 Überstand oder rekombinantem löslichem bzw. sekretiertem Proteinfragment in Kontakt gebracht.
Das 3T3-L1 Wachstumsmedium (GM) (Zusammensetzung: DMEM, 10%FCS, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% Glutamin, 1% Na-Pyruvat) war mit dem Medium der 293 Zellen bis auf eine Ausnahme identisch: es besitzt eine doppelt so hohe Glutaminmenge (2% statt 1%; siehe Beispiel 3). Das Differenzierungsmedium (DM) wurde grundsätzlich als 2fach-Konzentrat direkt nach Zugabe des 293-Zell-Überstandes zugegeben. Es besteht in dieser Form aus einem durch Induktionsfaktoren (200 nM Insulin, 1 mM IBMX und 2 μM Dexamethason) ergänzten 3T3-L1 Wachstumsmedium.
Insbesondere für die Isolierung aus Fettgewebe und Kultivierung von primären humanen Adipozyten galt: Isolierung und Differenziemng von Präadipozyten erfolgte wie bei Hauner et al. beschrieben [Methods Mol Biol. 2001; 155: 239-47]. Das bei Operationen gewonnene Fettgewebe wird mechanisch von Bindegewebs- und Blutgefaßresten befreit und danach zerkleinert. Es folgte der Verdau mit 200 U/ml Collagenase NB4 (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg) für 90 min bei 37 °C und 80 φm in PBS mit 2 % BSA (3 ml Collagenaselösung/g Fettgwebe). Im Anschluss wurde für 10 Minuten bei 200 g zentrifugiert. Das entstandene Pellet enthielt neben den Präadipozyten auch Erythrozyten und Bindegewebsreste und wurde in Erythrozytenlysepuffer (155 mM NH C1, 5.7 mM K HPO , 0.1 mM EDTA, pH 7.3) aufgenommen. Nach einer maximalen Inkubationszeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde über einen 150 μM Filter filtriert und wie oben beschrieben zentrifugiert. Da das verbleibende Pellet noch Bindegwebsreste enthielt, wurde nach Aufnahme in Präadiopozyten-Medium (DMEM/F12 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) supplementiert mit 8 mg/1 Biotin, 4 mg/1 Pantothenat, 1.79 g/1 NaHCO3 und 55 mg/1 Pyruvat) erneut über eine 70 μM Filter gereinigt. Die Zellen wurden gezählt, erneut zentrifugiert und in DMEM/F12 mit 10 % FKS und 50 μg/ml Gentamycin resuspendiert. Die Aussaat erfolgte in einer Dichte von 40 000 bis 55 000 Zellen/cm2. Die Zellen wurden bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Beispiel 3: Induktion zur Differenzierung und Zugabe des zu testenden Überstandes bzw. des zu testenden Proteins:
Drei Tage nach der Aussaat der 3T3-L1 Zellen wurden 140 μl Medium von den 3T3-L1 Zellen abgenommen und 50 μl eines von den HEK293 Zellen gewonnen Zellkultur- Überstandes hinzugefügt. Alternativ wurde 50 μl Wachstumsmedium zugegeben, in dem geeignete Mengen an rekombinantem Protein (0-3 μg/ml Protein) gelöst wurden. Zusätzlich erfolgte nun die Zugabe von 100 μl 2X Differenzierungsmedium auf die 3T3- Ll Zellen gefolgt von einer Inkubation der 3T3-L1 Zellen im Brutschrank für 5 Tage. Nach dieser Zeit wurde eine Bestimmung des intrazellulär eingelagerten Lipids vorgenommen.
Insbesondere für die Differenzierung von humanen Präadipozyten und SGBS Zellen galt: Humane Präadipozyten wurden in einer Dichte von 40 000 bis 55 000 Zellen/cm2 ausgesät. Für SGBS Zellen (beschrieben in Wabitsch et al., 2001, Int J Obes Relat Metab Disord. 25:8-15) lag die Zelldichte um den Faktor 10 niedriger. Nach der Aussaat verblieben die Zellen der Primärkultur für 20 Stunden, die SGBS Zellen für 3 Tage im Proliferationsmedium (Präadipozyten-Medium mit 10 % FKS und 50 μg/ml Gentamycin). Zur Induktion der Differenzierung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann in semm-freiem Differenzierungsmedium inkubiert (Präadipozyten-Medium mit 66 nM Insulin, InM T3, 100 nM Hydrocortison, 10 μg/ml Transferrin, 50 μg/ml Gentamycin). Für die ersten drei Tage wurden außerdem 1 μg/ml Troglitazon und 0,5 mM IBMX zugegeben. Nach dieser Zeit und im weiteren Verlauf alle drei bis vier Tage erfolgte ein Mediumwechsel mit Differenzierungsmedium. Die Zellen wurden verwendet, wenn mindestens 50% der Zellen (bezogen auf die Zellzahl) Fett eingelagert hatten.
Beispiel 4: Messung des intrazellulär eingelagerten Lipids:
Zur quantitativen Bestimmung der Einlagerung von zellulärem Lipid wurde NileRed- Reagenz (Molecular Probes, Leiden, Niederlande; CAS Nummer 7385-67-3) verwendet (Nile-Red-Färbelösung: 4 μg/ml Nile Red in PBS / 40 % DMSO). Die Fluoreszenz wurde bei einer Exzitations- Wellenlänge von 485nm und einer Emissions- Wellenlänge von 590 nm gemessen. Die erforderliche Menge Nile Red wurde zur berechneten Menge DMSO zugegeben und gemischt. Anschließend wird die berechnete Menge PBS zugegeben und die Lösung gemischt.
Beispiel 5: Durchführung des NileRed-Assay:
Am Tag 5 (3T3-L1 Zellen) bzw. Tag 8-12 (primäre humane Adipozytenkulturen) nach der Induktion zur Differenziemng wurde 140 μl Medium von den 3T3-L1 Zellkulturen abgenommen und 200 μl PBS zugegeben. Danach wurde 150 μl Flüssigkeit abgenommen und je 50 μl NileRed-Färbe-Lösung zugegeben. Die Inkubation der Platten erfolgte für 4h bei 37°C im CO2-Inkubator. Das Auslesen erfolgte in einem Fluoreszenz-Reader bei einer Exzitation von 485nm und einer Emission von 590 nm (200 msec Lesezeit). Die Messergebnisse sind als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) in Figur 1 (Zeil überstände aus transfizierten HEK-293 Zellen bzw. in Figur 2 - 5, 7, 15 (rekombinantes Protein auf murinen 3T3-L1 Zellen), bzw. Fig.8 (rekombinantes Protein auf humanen Adipozyten), oder als prozentuale Angabe im Vergleich zur nicht inhibierten Kontrolle in Fig.6 (rekombinantes Protein auf humanen Adipozyten) dargestellt.
Die Ergebnisse der Nile Red Assay zeigen jeweils:
Fig.l : Das Ergebnis zeigt, daß aufgrund der Transfektion der jeweiligen Expressionsplasmide in HEK-293 Zellen, im Überstand dieser Zellkulturen eine Aktivität ausgeprägt wird, die nach Übertrag zu 3T3-L1 Zellkulturen inhibitorisch auf deren Differenzierung wirken kann. Naheliegend, wenn auch nicht zwingend, ist die Annahme, daß die von den jeweiligen cDNAs kodierten Genprodukte direkt für diese Aktivität verantwortlich sind.
Fig. 2-5: Die Ergebnisse zeigen, daß die Lipideinlagerung von murinen 3T3-L1 Zellkulturen während der Differenzierung durch die Zugabe von rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF12 (Fig.2), rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF14 (Fig.3), von rekombinantem Cardiotrophin-1 (Fig.4), von rekombinantem FGF- 16 (Fig.5) dosisabhängig inhibiert werden kann. Die Lipideinlagerung kann als Maß für die Differenzierung der Adipozyten dienen, bzw. als ein Maß für die Regulation der Lipogenese oder Lipolyse in diesen Zellen. Es ergaben sich in diesen Fällen (Fig.2-5) jeweils halbmaximale Wirkkonzentration von etwa 30 ng/ml für das rekombinante lösliche Proteinfragment von TNFSF12 (Fig.2), etwa 2ng/ml für das rekombinante lösliche Proteinfragment von TNFSF14 (Fig.3), etwa 6 ng/ml für das rekombinante Cardiotrophin- 1 (Fig.4) und etwa 35 ng/ml für das rekombinante FGF-16 (Fig.5).
Fig.6: Das Ergebnis zeigt, daß auch die Differenzierung primärer humaner Adipozyten durch die Zugabe von (A) rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF12 bzw. (B) rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF14 dosisabhängig inhibiert werden kann. Es ergaben sich in diesem Fall halbmaximale Wirkkonzentrationen von etwa 28 ng/ml für TNFSF12 bzw. etwa 1,2 ng/ml für TNFSF14. Diese Werte waren jeweils denen größenordnungsmäßig vergleichbar, die auf den murinen 3T3-L1 Zellkulturen beobachtet wurden. Eine ebenfalls derart vergleichbare Inhibition der Differenziemng wurde auch auf primären Fettzellen omentalen Ursprungs und der humanen SGBS Adipozytenzelllinie erreicht. Fig.7: Das Ergebnis zeigt, daß auch alternative Liganden für den Lymphotoxin-beta Rezeptor in 3T3-L1 Zellen eine Hemmung der Lipideinlagemng bewirken konnten. Die halbmaximalen Wirkkonzentrationen betrugen in diesem Fall für rekombinant lösliches Proteinfragment von TNFSF14 12 ng/ml, für Lymphotoxin alphal/beta2 25 ng/ml und für Lymphotoxin alpha2/betal 5 ng/ml. Für die Lymphotoxine wurde gelegentlich allerdings eine begleitende Zytotoxizität beobachtet. Dies war bei rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF14 nicht der Fall. Die Inhibition der
Adipozytendifferenzierung kann hinreichend über eine Aktivierung des Lymphotoxin-beta Rezeptors bewerkstelligt werden, da alphal/beta2 Lymphotoxin bekanntermassen ausschliesslich den Lymphotoxin-beta Rezeptor aktiviert. Dies schliesst für TNFSF14 allerdings nicht eine Beteiligung des HVEM Rezeptors aus. Die bezüglich der beobachteten Toxizität und Dosis- Wirkungsbeziehung unterschiedlichen Effekte von TNFSF14 und der von alpha l/beta2-Lymphotoxin könnten auf eine unterschiedliche Art und Weise der Aktivierung des Lymphotoxin-beta Rezeptors zurückzuführen sein.
Fig.8:Das Ergebnis zeigt, daß die Differenzierung auch von primären humanen Adipozyten durch die Zugabe einer jeweiligen Dosis von TNF-alpha (2ng/ml) und je 100 ng/ml von alpha l/beta2 -Lymphotoxin, alpha2/betal -Lymphotoxin, Cardiotrophin-1, Endothelin-2 und FGF 16 inhibiert werden kann. Dies zeigt die Übertragbarkeit der an den murinen 3T3- Ll -Zellen gewonnenen Daten auf die humanen Adipozyten-Zellkulturen auch für diese rekombinanten Proteine.
Fig.15: Das Ergebnis in (A) zeigt, daß die Zugabe von rekombinant löslichem
Proteinfragment von TNFSF12 und rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF14 oder rekombinantem Cardiotrophin-1 zu einem frühen Zeitpunkt nach der Induktion der Differenzierung (hier: mindestens im Zeitraum von Tag 1 bis zu 3 Tag nach der Induktion) erfolgen muß, damit noch eine Inhibition erreicht werden kann. Eine Zugabe erst von Tag drei nach Induktion der Differenzierung an, hatte hier bereits keine inhibierende Wirkung mehr zur Folge. Im Unterschied dazu war eine Inhibition bei gleichartig verzögerter Zugabe von rekombinantem FGF-16 noch erreichbar. Dies deutet auf zeitlich wie mechanistisch unterschiedliche Inhibitionsmechanismen hin. Möglicherweise beeinflusst FGF-16 daher überraschenderweise im engeren Sinne physiologische Vorgänge der Lipolyse oder Lipogenese in Richtung auf einen erniedrigten Lipidgehalt und weniger den anfänglichen Differenzierungsprozess. Dieser ist zunächst durch einen Ausstieg aus dem Zellzyklus und die Initiation einer Transkriptionsfaktorkaskade gekennzeichnet. Einen Wirkmechanismus für FGF-16, die Regulation des Zellzyklus betreffend, wäre zunächst naheliegend, da es sich bei FGF-16 um einen Proliferationsfaktor handelt, der auch subkonfluente 3T3-L1 Zellen verstärkt proliferieren lässt (s.a. Fig. 14D). Proliferative
Effekte mit Wirkung auf den Zellzyklus noch 3 Tage nach Induktion der 3T3-Zellkulturen zur Differenzierung sind aber nach dem allgemein verbreiteten Kenntnistand unwahrscheinlich, da die 3T3-Zellkulturen dann bereits den Zellzyklus terminal verlassen haben.
Das Ergebnis in (B) zeigt, daß der Entzug der Faktoren, die zuvor für 3 Tage in einer Konzentration von 100 ng/ml nach der Induktion zur Differenziemng anwesend gewesen waren, zu einer Aufhebung des inhibitorischen Effekts führte. Die von rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF12, rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF14 und Cardiotrophin-1 ausgeübte Inhibition der Lipideinlagerung war reversibel. Die nach Entzug der Faktoren (Tag 3) am Tag 7 nach Induktion zur Differenzierung erreichte Lipideinlagerung, hatte noch nicht das Ausmaß unbehandelter 3T3-L1 Adipozytenzellkulturen erreicht. Es ist aber anzunehmen, daß dies bei einem späteren Messzeitpunkt der Fall gewesen wäre.
Beispiel 6: Verringerung des Gewichts bzw. der Gewichtszunahme im Mausmodell
Bevorzugte Tiermodelle sind solche, die der humanen Situation der Adipositas bzw. des Typ II Diabetes in besonderer Weise entsprechen. Dafür kommen bevorzugt Nager wie zum Beispiel Mäuse oder Ratten sowie Hunde, Schweine und Primaten in Betracht. Eine besonders bevorzugte experimentelle Ausführungsform ist eine diät-induzierte Adipositas, gegebenenfalls assoziiert mit einer Insulin-Resistenz oder Typ II-Diabetes, in Mäusen oder Ratten durch Zuführung hochkalorischer Kost. Die hochkalorische Kost, das ist zum Beispiel eine 45 kcal%ige Fettdiät, kann dabei bereits deutlich vor oder zeitgleich mit der Gabe der erfindungsgemässen Proteine oder Fragmente bzw. der pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden.
Die Tiere können demnach zum Zeitpunkt der Gabe des Proteins bzw. Proteinfragments normal- oder bereits übergewichtig sein. Ziel ist es eine Verringerung bzw. Verhindemng einer Gewichtszunahme und/oder eine Gewichtsreduktion zu bewirken. Gegebenenfalls auch eine Verbesserung des Insulin-Sensitivität bzw. der Glukosetoleranz. Dies kann jeweils entweder unter einsetzender oder fortgesetzter hochkalorischer Diät oder unter einem Wechsel zu normal- oder hypokalorischer Diät - für den Fall bereits übergewichtiger Tiere - erfolgen. Der Wechsel der Diäten erfolgt dabei jeweils zum Zeitpunkt der erstmaligen Gabe des Proteins bzw. Proteinfragments bzw. der pharmazeutischen Zusammensetzung.
In Mäusen des Stammes C57/B16/J wird nach Bestimmung der maximal tolerierten Dosis (MTD) a) die Verringerung der Gewichtszunahme in normalgewichtigen Mäusen (ohne vorhergehende Hochkaloriendiät) und b) die Nettoreduktion des adipösen Gewebes in zu Versuchsbeginn normalgewichtigen oder fettleibigen Mäusen (unter einsetzender oder aufrechterhaltener Hochkaloriendiät) nach Zugabe des erfindungsgemäß eingesetzten Proteins durch Wiegen oder Bestimmung des BMI („body mass index") ermittelt. Die Bestimmung der maximal tolerierten Dosis erfolgt mit 3 Mäusen (Stamm C57B16/J Wildtyp) durch Gabe von 0,002; 0,02; 0,2; 2,0 und 10 mg Protein/kg als einmalige intravenöse Dosis. Eine anschließende Feinjustierung der Dosis erfolgt mit je 3 Mäusen (Stamm C57B16/J Wildtyp) durch einmalige Gabe des Proteins. In einem Dosistoleranztest wird durch wiederholte Gabe einer ausgewählten Dosis über mehrere Applikationen anhand von Blutparametem und Serumstabilität die zur Applikation notwendige Dosis ermittelt.
Insbesondere wurde hier bereits gezeigt, daß die einmalige intravenöse Gabe in weibliche C57B16 Mäuse von bis zu 5,4 mg/kg Köφergewicht im Falle von rekombinantem löslichem Proteinfragment von TNFSF12 und von bis zu 10mg/kg Köφergewicht im Falle von rekombinantem löslichem Proteinfragment von TNFSF14 zu keinerlei von den jeweiligen Testsubstanzen verursachten klinischen Symptomen innerhalb von 48 Stunden geführt hat. Fig. 11A und B zeigen für TNFSF12 bzw. TNFSF14, daß die dabei applizierten Proteine im Blutserum mittels ELISA nachweisbar waren. Dabei wurde ein Absinken der Menge an detektierbarem Proteinfragment aus dem Blutserum über einen Zeitraum von 24 h beobachtet, wie es für ein sich im Organismus verteilendes Protein zu erwarten war.
Fig. 1 IC (TNFSF14) und D (TNFSF12) zeigen die noch auf 3T3-L1 Zellkulturen messbare spezifische inhibitorische Aktivität in den Mausseren aus den injizierten Mäusen im Nile Red Assay, wie in Beispielen 2-5 beschrieben. Im Falle der Detektion der Aktivität von TNFSF12 musste dabei das FCS im Differenzierungsmedium durch das Mausserum ersetzt werden - statt einer zusätzlichen Zugabe - um die bei den hier vergleichsweise größeren zugesetzten Mengen auftretende inhibitorische Wirkung des Mausserums selbst kompensieren zu können. Größere Mengen mussten hier erwartungsgemäß aufgrund der etwa 10-fach geringeren halbmaximalen Wirkkonzentraion von TNFSF12 (s. Fig. 2 und3) eingesetzt werden.
Es konnte demnach gezeigt werden, daß die Proteine intravenös verabreicht werden können. Zehn Minuten nach der Injektion Hessen sich noch jeweils Proteinaktivitäten auf 3T3-L1 Zellkulturen demonstrieren. Zu späteren Zeitpunkten war dies aufgrund der Mausserum-Effekte mittels der 3 T3-L1 -Zellkulturen technisch nicht mehr möglich. Die Proteine waren allerdings im ELISA noch zum spätesten Beobachtungszeitpunkt (24 Stunden nach der Injektion) in geringen Mengen per ELISA nachweisbar. Eine klinische Toxizität trat nicht auf.
Im Rahmen der weiterführenden Experimente wird die oben gefundene Maximaldosis bis zu einer geringsten Dosis verringert, die noch einen therapeutischen Effekt bewirkt. In dem anschließenden Test zur Ermittlung der Gewichtsveränderung wird die so ermittelte Dosis parenteral (intravenös, intraperitoneal, subkutan oder intramuskulär) verabreicht. Bevorzugt sind die intraperitoneale, intravenöse oder subkutane Applikation)
Zur Ermittlung der Verringerung der Gewichtszunahme in normalgewichtigen Mäusen werden normalgewichtige Mäuse unter Normalkaloriendiät (20 kcal% Fettdiät) oder insbesondere unter hochkalorischer Diät (45% kcal%) jeweils ohne (unbehandelt) und mit Zugabe des erfindungsgemäßen Proteins (behandelt) 10-14 Wochen gehalten. Während und nach Ablauf der Versuchsreihe wird die Gewichtszunahme durch Wiegen und/oder Bestimmung des BMI ermittelt.
Bei behandelten Mäusen, die unter Normalkaloriendiät gehalten wurden, ist im Gegensatz zu unbehandelten Mäusen eine Gewichtsreduktion oder verringerte Gewichtszunahme zu beobachten. Bei behandelten Mäusen, die unter Hochkaloriendiät gehalten wurden, ist im Vergleich zu unbehandelten Mäusen ein geringerer Gewichtszuwachs bzw. eine Gewichtsreduktion zu beobachten. Diese Gewichtsreduktion kann auch auf eine verringerte Fettgewebsmasse zurückgeführt werden.
Zur Ermittlung der Verringerung der Gewichtszunahme in fettleibigen Mäusen werden fettleibige Mäuse (die zuvor unter Hochkaloriendiät (45 kcal% Fettdiät) gehalten wurden), unter Normalkaloriendiät (20 kcal% Fettdiät) und/ oder unter fortgesetzter Hochkaloriendiät jeweils ohne (unbehandelt) und mit Zugabe des erfindungsgemäßen Proteins (behandelt) 10-14 Wochen gehalten. Während und nach Ablauf der Versuchsreihe wird die Gewichtszunahme durch Wiegen und/oder Bestimmung des BMI ermittelt. Bei behandelten Mäusen, die unter Normalkaloriendiät oder fortgesetzter Hochkaloriendiät gehalten wurden, kann eine stärkere Gewichtsreduktion gezeigt werden als bei unbehandelten Mäusen. Bei unbehandelten Mäusen unter Hochkaloriendiät ist eine weitere Gewichtszunahme zu beobachten. Bei behandelten Mäusen ist hingegen eine Gewichtsabnahme bzw. eine verringerte Gewichtszunahme festzustellen.
Insbesondere wurde hier bereits in einem Tierexperiment folgendes gezeigt: Je acht fünf Wochen alte männliche C57BL6/J Mäuse wurden jeweils mit einem Expressionskonstmkt für rekombinantes sekretiertes und lösliches murines Proteinfragment von TNFSF12 bzw. TNFSF14 (s.o.) injiziert. Zweck dieses Versuchsaufbaues war es, einen Einfluss der Proteinexpression auf die Zunahme an Köφergewicht zu beobachten. Die Tiere wurden über den gesamten Beobachtungszeitraum unter normal-kalorischer Kost gehalten.
Transfektionsprozedur: Die Transfektion der Plasmide in C57B16/J Mäuse, kodierend für rekombinantes sekretiertes und lösliches murines Proteinfragment von TNFSF12 bzw. TNFSF14, erfolgte nach einem Verfahren, erstmals beschrieben von Zhang et al. (Gene Therapy 2000; 7:1344). Dabei wird durch einen hydrodynamischen Druck, erzeugt durch schnelle Injektion der plasmidhaltigen Lösung in die Schwanzvene, der Eintritt der Plasmid-DNA bevorzugt in Lebergewebe erreicht. Dort kann dann eine wochen- bis monatelange Genexpression realisiert werden. Das Verfahren in Kürze: Jeweils 50 μg endotoxinfrei- präpariertes Plasmid wurde in PBS -Lösung in einer Lösungsmittelmenge entsprechend jeweils 10% des Köφergewichts der zu injezierenden Maus mit einer Geschwindigkeit von lml/5 sec verabreicht. In der Folge wurden die Tiere bis 8 Wochen nach Injektion wöchentlich gewogen. An entnommenen Blutseren wurde der Gehalt an jeweils exprimiertem sekretierten löslichen murinen Proteinfragment von TNFSF12 bzw. TNFSF14 mittels ELISA bestimmt. ELISA-Antikörperpaare für murines TNFSF12: Beschichtung: anti-mTWEAK-Antibody (R&D Systems, Wiesbaden Deutschland Katalognummer # AF1237), Detektions- Antiköφer anti-mTWEAK-Antibody Biotin- conjugated (e-bioscience, Klon MTW-1 , Katalognummer #13-9913). Für murines TNFSF14: Für die Beschichtung: anti-Penta-HIS-Antibody (Qiagen, Katalognummer #34660) und für den spezifischen Nachweis: anti-hLIGHT-Antibody Biotin-conjugated (R&D Systems, Katalognummer # BAF664; hat in Vorversuchen auch Kreuzreaktivität gegen Maus-TNFSF14 gezeigt.
Die Korrelation von Proteinexpression und Köφergewicht wurde untersucht. Die Experimente beschrieben in Fig. 12A und B haben gezeigt, daß das Ausmaß der Expression, von murinem rekombinanten sekretierten löslichen Proteinfragment von (A) TNFSF12 bzw. (B) TNFSF14, mit der beobachteten Gewichtszunahme im Untersuchungszeitraum negativ korreliert. Es ergibt sich aufgrund der vorliegenden Ergebnisse ein Korrelationskoeffizient für die Daten aus (Fig.l2A) für TNFSF12 von -0,72 und (Fig. 12B) für TNFSF14 von -0,71. Der Korrelationskoeffizient gibt an, wie strikt eine Korrelation ist. Werte zwischen -1 und +1 sind möglich. Ein Wert von 0 besagt, daß keine Korrelation vorliegt. +1 bzw. -1 sagen aus, daß eine absolut strikte (bei Vorzeichen Minus: negative) Korrelation vorliegt. Diese Korrelationen waren jeweils über den gesamten Beobachtungszeitraum von 8 Wochen zu beobachten. Der durch die Korrelation angegebene Trend konnte für TNFSF12 auch in Wiegungen von ausgewählten Fettgewebsdepots („epidydimale fat pads" - definierte gut messbare Fettgewebe an den Gonaden männlicher Tiere, perirenales und kolon-assoziiertes Fettgewebe) beobachtet werden (Fig.l2C). Die Reduktion des Köφergewichts fand hier eine Entsprechung in einer Reduktion des Gewichts ausgewählter Fettdepots. Es ist daher offenbar, daß weitere experimentelle Versuchsreihen, insbesondere an größeren Tierzahlen, einen gewichtsreduzierenden Effekt bestätigen werden und dieser auch auf eine Begrenzung der Ausmasse und Gewichte von Fettgewebsdepots zurückzuführen sein kann.
Solche weiterführenden Experimente sind bevorzugt, in denen zum Zeitpunkt der Injektion 12 Wochen alte C57B16 Mäuse bis zum Zeitpunkt der Injektion mit normal kalorischer Diät oder hochkalorischer Diät und anschliessend unter hochkalorischer Diät für weitere 8 Wochen gehalten werden. Unter diesen Bedingungen einer Diät-induzierten Adipositas ist zu erwarten, daß die Präsenz der hier beschriebenen Proteinfragmente von TNFSF12 bzw. TNFSF14 zu einer signifikant verminderten Gewichtszunahme oder auch absoluten Gewichtsreduktion führt, bevorzugt verursacht durch ein signifikant vermindertes Gewicht der Fettgewebsdepots. Beispiel 7: Weiterführende Analysen zum zellulären Mechanismus
Die Art und Weise, wie die erfindungsgemässen Proteine die Hemmung der Lipideinlagerung in Adipozyten bewerkstelligen, kann durch weitere Analysen in den Zellkulturen näher bestimmt werden. Eine Inhibition der Differenzierung bzw. der Lipideinlagerung in differenzierenden Adipozyten kann beispielsweise durch proteinvermittelte Aktivitäten wie Zelltod, Verhinderung des Ausstiegs aus dem Zellzyklus, Blockade der Transkriptionsfaktorkaskade die zur Expression der differenzierungsspezifischen Gene führt, die Blockade der Lipogenese im engeren Sinne oder durch eine Verstärkung der Lipolyse herbeigeführt werden.
Insbesondere wurde hierzu folgendes bereits gezeigt:
Fig.9: Um die bekannten Rezeptoren von TNFSF12 bzw. TNFSF14 auf den 3T3-L1 Zellkulturen nachzuweisen wurden diese mit jeweils spezifischen Antikörpern mittels FACS-Verfahren nachgewiesen. Dabei wurde der Rezeptor von TNFSF12 mit dem Antiköφeφaar aus TWEAK-Rezeptor- spezifischem Maus-IgG2b Antiköφer ITEM-4 (Firma ebioscience, Katalognummer 14-9018) und einem sekundären Alexa-Fluor Ziege- anti-Maus IgG spezifischen Antiköφer (Firma Molecular Probes, Katalognummer A- 11001) nachgewiesen. Der HVEM-Rezeptor von TNFSF14 wurde mit dem Antiköφeφaar aus Rezeptor- spezifischem Ratten IgG Antiköφer (Firma Alexis Biochemicals, Katalognummer ALX- 804-156-C100) und einem sekundären Alexa-Fluor Ziege-anti-Ratte IgM spezifischen Antiköφer A-21212 der Firma Molecular Probes nachgewiesen. Der Lymphotoxin-beta- Rezeptor von TNFSF14 wurde mit dem Antiköφeφaar aus Rezeptor-spezifischem Ratten IgG Antiköφer (Firma Alexis Biochemicals, Katalognummer ALX-804-145) und einem sekundären Alexa-Fluor Ziege-anti-Ratte IgG spezifischen Antiköφer (Firma Molecular Probes, Katalognummer A-l 1006) nachgewiesen. Die Färbung subkonfluenter 3T3-Zellen erfolgte nach folgendem Schema: Aussaat von 200.000 Zellen in einer 6-well Schale. 24 Stunden später Färbung und Messung am FACS-Messgerät: Dazu wurden die Zellen trypsinisiert und pelletiert und anschliessend in 200 μl Pufferlösung (PBS + 1% FCS) bzw. Pufferlösung mit Rezeptor-spezifischen Antiköφer nach Herstellerangaben (1-5 μg/ml) für eine Stunde auf Eis inkubiert. Danach erfolgte eine Zugabe von 1ml PBS + 1%FCS und die Pelletierung der Zellen. Wiederaufnahme erfolgte in 200 μl PBS-Puffer mit 1% FCS in dem der sekundäre Antiköφer (2 μg/ml) gelöst war. Es schloss sich eine weitere Inkubation auf Eis für weitere 45 Minuten an. Die Zellen wurden anschliessend wieder mit 1ml PBS Puffer+1% FCS versetzt und pelletiert. Nach Wiederaufnahme in 500 μl Puffer wurden die Zellen anschliessend der Messung im FACS Gerät zugeführt. Dabei wurde die Messung der Fluoreszenzintensitäten nur für lebende Zellen durchgeführt. Das Ergebnis zeigt, dass der für TNFSF12 beschriebene Rezeptor auf der Zelloberfläche der 3T3-L1 Zellen exprimiert wird. Der Lymphotoxin-beta Rezeptor für TNFSF14 konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Überraschenderweise auch der HVEM-Rezeptor für TNFSF14, der sonst als vorwiegend auf Lymphozyten-Zellen beschränkt beschrieben wurde.
Fig. 14A-C: Bestimmt wurde die Zellzahl von subkonfiuenten 3 T3 -Zellkulturen. Die Zellen wurden in einer Dichte von 3.000 Zellen pro Vertiefung einer 96- well Zellkulturschale ausgesät. 24 Stunden später wurde das Wachstumsmedium der 3T3-L1 Zellen gegen Medium mit reduziertem FCS-Gehalt (0,5%) ausgewechselt. Weitere 48 Stunden später wurde ein weiterer Mediumwechsel zu 2% FCS und je zusätzlicher Gabe der erfindungsgemässen Proteine durchgeführt. Dabei wurde eine Dosis- Wirkungsbeziehung über einen Konzentrationsbereich von 0,1 bis 500 ng/ml Protein untersucht. 72 Stunden nach Zugabe der Proteine in Medium mit 2% FCS wurden zu 100 μl Kulturmedium 10 μl AlamarBlue Reagenz (Fa. BioSource) zugefügt und für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Das AlamarBlue Reagenz stellt ein Substrat für lebende Zellen zur Verfügung, das enzymatisch umgesetzt werden kann und das Produkt kann fiuorimetrisch bei einer Exzisionswellenlänge von 530 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm gemessen werden. Damit ist im linearen Messbereich eine indirekte Zellzahlbestimmung gegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß subkonfluente 3T3-L1 Zellkulturen, durch die Zugabe von rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF12 (Fig.l4A) bzw. rekombinant löslichem Proteinfragment von TNFSF14 (Fig.l4B) nicht zu einer verstärkten Proliferation angeregt werden können. Im Unterschied dazu kann rekombinantes FGF-16 (Fig.l4D) eine etwa 50%ige Verstärkung der Proliferation von subkonfiuenten 3T3- Zellkulturen bewirken. Cardiotrophin-1 (Fig.l4C) bewirkt eine etwa 20%ige Steigerung der Proliferation.
Fig. 10: Gezeigt sind Untersuchungen zur Interferenz von TNFSF12 bzw. TNFSF14 (A) und FGF- 16 (B) mit insulin-abhängiger Glukoseaufnahme in 3T3-L1 Zellen. 500.000 primäre Adipozyten (im Falle von FGF-16 50.000 SGBS Zellen) am Tag 12 nach der Induktion zur Differenziemng wurden in einer 3 cm Schale vorgehalten und wie folgt zur Bestimmung der insulinabhängigen Glukoseaufnahme behandelt:
Versuchsansätze: Kontrollen: 1 Zellkultur für Hintergrund (0' Insulinstimulation), Ein leeres well/ Schälchen zur Bestimmung des Hintergrundes. Die Stimulation erfolgt mit 10" 7, (ohne oder 10"10 Insulin, da 10"10 Insulin in diesem Zusammenhang nicht stimulierend wirkte. In jeder 3cm Schale befanden sich 800 μl Medium DMEM/Ham F12 mit 5 mM Glucose Differenzierte Zellen wurden vier mal mit je 2 ml PBS warm waschen, dann je Schale 800 μl DMEM/F12 mit 5mM Glukose und jeweils die erfindungsgemässen Proteine zugegeben. Anschliessend erfolgte eine Inkubation für 1 Stunde bei 37 °C. Anschliessend Zugabe von Insulin. Platten wurden bei geringster Schüttelfrequenz 15 Minuten bei 37 °C inkubiert.
2-Deoxy-D-[l-H3]-Glucose (AmershamTRK 383) wurde 1 :10 verdünnt in DMEM/F12. Während der Inkubationszeit wurden Röhrchen für den Szintillationszähler bereitgestellt: eines je Messpunkt und zusätzlich eines für das leere well und eines für komplette eingesetzte Menge 2-Deoxy-D-[l-H3]-Glucose. Nach 15 Minuten Inkubation wurden zu jedem well 8 μl der verdünnten 2-Deoxy-D-[l-H3]-Glucose gegeben. Platten wurden erneut für 20 Minuten unter leichtem Schütteln bei 37 °C inkubiert. Platten wurden nach 20 Minuten auf Eis gestellt. Medium wurde mit der Pumpe abgesaugt. Zellen 3 mal mit je 1 ml PBS eiskalt gewaschen. Je well 500 μl IGEPAL (Sigma I 3021) zugegeben, 20 min auf Eis lysiert. Komplettes Volumen aus jedem Well wurde in die Szinitillationscups pipettiert. Zusätzlich in ein Cup 500 μl IGEPAL plus 8 μl der verdünnten 2-Deoxy-D-[l- H3]-Glucose. In jedes Cup 3.5 ml der Szinitillationsflüssigkeit (Rotiszint eco plus, Roth, 0016.2) pipettieren. Messung im Szintillograph über den Bereich einer Minute pro Probe. Auswertung mit Hilfe des Programms Mikro Beta Windows. In der Darstellung der Ergebnisse ist die basale Glukoseaufnahme subtrahiert, so daß nur der insulinabhängige Anteil der Glukoseaufnahme gezeigt ist.
Da es sich bei der Differenzierung von Adipozyten und bei der zellulären Lipogenese bzw. Lipolyse um Insulin-abhängige Prozesse handelt, kann auch geklärt werden, ob die erfindungsgemässen Proteine die Insulin-abhängige Signalgebung beeinflussen und gegebenenfalls darüber ihre inhibitorische Wirkung entfalten. Wäre dies der Fall, so kann das erfindungsgemässe Protein bei gleichzeitiger erhöhter Expression und/oder Aktivität in Individiuen mit Insulin-Resistenz oder Diabetes Typ II als mögliche Ursache hierfür in Betracht kommen. Findet sich keine negative Beeinflussung der Insulin-Signalgebung, so kommt das erfindungsgemässe Protein bevorzugt als Therapeutikum in der Behandlung der Adipositas in Betracht. Hier wäre eine Erzeugung einer Insulin-Resistenz in Rezipienten durch Gabe des erfindungsgemässen Proteins unerwünscht. TNFSF12 bzw. TNFSF14 zeigten in diesem Versuchsaufbau keine negative Beeinflussung der insulin-abhängigen Glukoseaufnahme. Im Gegensatz dazu war eine solche erwartungsgemäß für TNF-alpha deutlich ausgeprägt. FGF-16 zeigte demgegenüber eine deutliche Reduktion der insulin-abhängigen Glukoseaufnahme.
Nachfolgend sind einige der bereits angeführten Befunde über die erfindungsgemässen Nukleinsäuren, Proteine bzw. Fragmente und die Ergebnisse einiger weiterer Analysen tabellarisch gezeigt.
Tabelle 2:
Figure imgf000063_0001
Beispiel 8: Analyse und Diagnostik von Patientenmaterial
Biologisches Material, wie zum Beispiel Köφerflüssigkeiten, Gewebeproben oder Zellen oder DNA, RNA von geeigneten Individuen kann untersucht werden, um eine mögliche Beteiligung der erfindungsgemässen Proteine in der Ätiologie von Adipositas, Typ II Diabetes oder der anderen erfindungsgemäß beanspruchten Indikationen zu beschreiben oder auszuschliessen.
Zum Beispiel können signifikant veränderte Gehalte der erfindungsgemäßen Proteine im Blutserum und/oder Fettgewebe in der Adipositas auf eine Beteiligung an der Ätiologie der Adipositas schliessen lassen. Die endogene Expression bzw. Verfügbarkeit der Proteine kann dabei erniedrigt sein. Eine Adipositas könnte hier möglicherweise durch eine mangelnde Inhibition der Adipozytendifferenzierung in diesen Individuen bedingt sein. Eine erhöhte Expression oder Verfügbarkeit könnte eine herabgesetzte Aktivierbarkeit des Rezeptors reflektieren, die im Ergebnis ebenfalls auf eine mangelnde Inhibition der Adipozytendifferenzierung hinausliefe. Eine genauere Bestimmung der Ursache und Wirkung der Abberationen bliebe allerdings einer nachfolgenden Analyse vorbehalten. Vorrangig wäre der prognostische Wert der beobachteten Abberation in bezug auf die Ausprägung des Krankheits-Phänotyps zu bestimmmen. Solche detektierbaren aberranten Expressionsmengen beispielsweise, könnten dann für die Diagnostik genutzt werden, um besonders bevorzugte Patientenkollektive zu definieren.
Solche detektierbaren aberranten Expressionsmengen beispielsweise, könnten auch dann für die Diagnostik genutzt werden, um Individuen zu definieren, welche noch nicht adipös sind, aber aufgmnd ihrer persönlichen Anlage ein hohes Risiko tragen adipös zu werden. Weiterhin können diagnostische Assays nicht nur auf der Messung des entsprechenden Proteins beruhen, sondern es kann auch der genetische Hintergrund bestimmt werden, welcher zur Modulation der Proteinexpression führt. Hierbei sind insbesondere genetische Variationen zu erwähnen (SNPs oder Haplotypen, Insertionen, Deletionen oder Amplifikationen), welche zum Beispiel in Promotoren oder anderen regulatorischen Seqzuenzen die Expression des Proteins steuern. Weiterhin gibt es genetische Variationen, die das Protein selbst verändern und damit zu veränderter Funktion oder Stabilität des Proteins fuhren. Zusätzlich gibt es genetische Abberationen, welche keine der oben beschriebenen Kriterien erfüllen, aber dennoch klar mit veränderter Expression, Funktion oder Stabilität der Proteine korreliert werden können. Alle diese Variationen können detektiert und als Basis für entsprechende Diagnostika verwendet werden. Ausführungsformen für solche Assays können unter anderem sein, PCR-Techniken kombiniert mit Sequenzanalysen, Hybridisationsanalysen (Chips) oder auch sequenzspezifische Antiköφer, sowie bioinformatorische Analyse und Detektion von spezifischen Haplotypen, welche Kombinationen von individuellen SNPs, Deletionen, Insertionen und/oder Amplifikationen sind.
Insbesondere wurde hierzu bereits gezeigt:
Fig.13: An je 16 Probanden, klassifiziert über den BMI als adipös bzw. normalgewichtig wurde eine Bestimmung von endogenem TNFSF12 im Blutserum mittels ELISA (Bender MedSystems, Wien/Österreich, Katalognummer #BMS2006LNST) durchgeführt. Es zeigte sich bei dieser Klassifiziemng ein erniedrigter Gehalt an endogenem TNFSF12 in adipösen Patienten im Vergleich zu normalgewichtigen Individuen.
Tabelle 1
Bevorzugte Ausf hmngsformen: Proteinfragmente:
TNFSF-12 vl bzw. v2 (AS 93-249 bzw. 250)
93 ArgSerAlaProLysGlyArgLysThrArg AlaArgArgAlalleAlaAlaHisTyrGlu 113 ValHisProArgProGlyGlnAspGlyAla GlnAlaGlyValAspGlyThrValSerGly
133 TrpGluGluAlaArglleAsnSerSerSer ProLeuArgTyrAsnArgGlnlleGlyGlu
153 PhelleValThrArgAlaGlyLeuTyrTyr LeuTyrCysGlnValHisPheAspGluGly
173 LysAlaValTyrLeuLysLeuAspLeuLeu ValAspGlyValLeuAlaLeuArgCysLeu
193 GluGluPheSerAlaThrAlaAlaSerSer LeuGlyProGlnLeuArgLeuCysGlnVal 213 SerGlyLeuLeuAlaLeuArgProGlySer SerLeuArglleArgThrLeuProTrpAla
233 HisLeuLysAlaAlaProPheLeuThrTyr PheGlyLeuPheGlnValHis
TNFSF-14 (AS 74-240)
1 ArgLeuGlyGluMetValThrArgLeuPro AspGlyProAlaGlySerTrpGluGlnLeu
21 IleGlnGluArgArgSerHisGluValAsn ProAlaAlaHisLeuThrGlyAlaAsnSer
41 SerLeuThrGlySerGlyGlyProLeuLeu TrpGluThrGlnLeuGlyLeuAlaPheLeu
61 ArgGlyLeuSerTyrHisAspGlyAlaLeu ValValThrLysAlaGlyTyrTyrTyrlle 81 TyrSerLysValGlnLeuGlyGlyValGly CysProLeuGlyLeuAlaSerThrlleThr
101 HisGlyLeuTyrLysArgThrProArgTyr ProGluGluLeuGluLeuLeuValSerGln
121 GlnSerProCysGlyArgAlaThrSerSer SerArgValTrpTrpAspΞerSerPheLeu
141 GlyGlyValValHisLeuGluAlaGlyGlu GluValValValArgValLeuAspGluArg
161 LeuValArgLeuArgAspGlyThrArgSer TyrPheGlyAlaPheMetVal
FGF-16 (AS 2-207)
2 AlaGluValGlyGlyValPheAlaSerLeu AspTrpAspLeuHisGlyPheSerSerSer
22 LeuGlyAsnValProLeuAlaAspSerPro GlyPheLeuAsnGluArgLeuGlyGlnlle 42 GluGlyLysLeuGlnArgGlySerProThr AspPheAlaHisLeuLysGlylleLeuArg
62 ArgArgGlnLeuTyrCysArgThrGlyPhe HisLeuGluIlePheProAsnGlyThrVal
82 HisGlyThrArgHisAspHisSerArgPhe GlylleLeuGluPhelleSerLeuAlaVal
102 GlyLeuIleSerlleArgGlyValAspSer GlyLeuTyrLeuGlyMetAsnGluArgGly 122 GluLeuTyrGlySerLysLysLeuThrArg GluCysValPheArgGluGlnPheGluGlu
142 AsnTrpTyrAsnThrTyrAlaSerThrLeu TyrLysHisSerAspSerGluArgGlnTyr
162 TyrValAlaLeuAsnLysAspGlySerPro ArgGluGlyTyrArgThrLysArgHisGln
182 LysPheThrHisPheLeuProArgProVal AspProSerLysLeuProSerMetSerArg 202 spLeuPheHisTyrArg
Endothelin-2 (AS 49-69)
49 CysSerCysSerSerTrpLeuAspLysGlu CysValTyrPheCysHisLeuAspIlelle 69 Trp
Lymphotoxin
Lymphotoxin-alpha-Monomer: humanesLymphotoxin-alpha, Aminosäuren Leu35-Leu 205. bevorzugt N-terminal verknüpft mit dem CD33 Signalpeptid As Metl-lMetl7 (z.B. Firma R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland. Rekombinantes alphal/beta2- Lymphotoxin: Katalognummer: #678-LY. Rekombinantes alpha2/betal -Lymphotoxin: Katalognummer: #679-TX).
Lymphotoxin-beta-Monomer: humanes Lymphotoxin-beta, Aminosäuren Leu54-Gly244, bevorzugt N-terminal verknüpft mit dem CD33-Signalpeptid Metl-Metl7 (z.B. Firma R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland. Rekombinantes alphal/beta2-Lymphotoxin: Katalognummer: #678-LY. Rekombinantes alpha2/betal -Lymphotoxin: Katalognummer: #679-TX).

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von f) einem Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, oder g) eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder h) einer Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß a), oder i) einer oder mehrerer Nukleinsäuren kodierend für ein Heterotrimeres von Lymphotoxin alpha und beta, oder j) einer funktionellen Variante der Moleküle gemäß a) bis d) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung und / oder Behandlung von Adipositas.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die Bildung terminal differenzierter Adipozyten hemmt.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung terminal differenzierter Adipozyten gehemmt wird durch Fördemng der Proliferation von Präadipozyten, durch Hemmung der Differenziemng zu terminal differenzierten Adipozyten, insbesondere durch Hemmung des Transkriptions-Signalweges der Differenziemng oder durch Fördemng des Zelltodes, vorzugsweise der Apoptose in Präadipozyten.
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die Funktion der terminal differenzierten Adipozyten hemmt.
5. Verwendung nach Anspruch 3 und 4, wobei die Hemmung durch eine Hemmung der Lipogenese oder durch eine Fördemng der Lipolyse bewirkt wird.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung eine direkte Wirkung auf die Adipozyten ausübt.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure oder die funktionelle Variante davon im Rahmen einer somatischen Gentherapie eingesetzt wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Adipositas eine unkomplizierte Adipositas ist.
9. Verwendung eines Liganden des TNFSF-14 Rezeptors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vorbeugung und / oder Behandlung von Adipositas.
10. Verwendung nach Anspruch 9, mit den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 6 und 8.
1 1. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend a) ein Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 21 oder 23, oder b) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß a), oder c) eine funktionelle Variante der Moleküle gemäß a) oder b).
12. Verwendung eines Inhibitors a) eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, oder b) eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta, oder c) einer funktionellen Variante der Moleküle gemäß a) oder b) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes-Typ-II, Diabetes-Typ-II-verwandten Krankheiten, Kachexie oder Lipodystrophien, insbesondere HARS.
13. Verwendung nach Anspruch 11 , wobei der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antiköφern, Decoy-Rezeptoren, Peptiden, Proteinen, Peptidfragmente, Antikalinen, Affilinen, Aptameren, niedermolekularen Substanzen (LMWs), Antisense-RNA, siRNA und Proteasen.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die Bildung terminal differenzierter Adipozyten fördert.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung terminal differenzierter Adipozyten gefördert wird durch Hemmung der Proliferation von Präadipozyten, durch Fördemng der Differenziemng zu terminal differenzierten Adipozyten, insbesondere durch Fördemng des Transkriptions-Signalweges der Differenziemng oder durch Hemmung des Zelltodes, vorzugsweise der Apoptose in Präadipozyten.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung die Funktion der terminal differenzierten Adipozyten fördert.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Förderung durch eine Fördemng der Lipogenese oder durch eine Hemmung der Lipolyse bewirkt wird.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Hemmung der Insulin-abhängigen Signalübertragung bei Nicht-Adipozyten- Zelltypen aufgehoben wird.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Inhibitor eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 21 oder 23 oder eine funktionellen Variante davon.
20. Verwendung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in einer Form vorliegt, welche den Kontakt des Wirkstoffes mit einem Bestandteil der Zelloberfläche, ermöglicht.
21. Verfahren zum Identifizieren eines Modulators eines Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder einer funktionellen Variante davon, bei dem man eine geeignete Zelle mit einer Kombination aus einem potentiellen Modulator und einem Polypeptids mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23 oder einem Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder einer funktionellen Variante davon inkubiert und anschließend die Veränderung in der biologischen Aktivität bestimmt.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle den Rezeptor des jeweiligen Polypeptids natürlicherweise oder rekombinant exprimiert oder der Rezeptor ein Chimären-Rezeptor ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Modulator ein Ligand des Rezeptors darstellt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle humanen Urspmngs ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle nicht humanen Ursprungs ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein primärer Adipozyt ist oder von einem primären Adipozyten abstammt.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Verändemng der biologischen Aktivität von Adipozyten, vorzugsweise 3T3-L1- oder 3T3-F442A- Zellen, bestimmt wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine primäre Gewebszelle ist oder von Primärgewebe abstammt, wobei das Gewebe bevorzugt ausgewählt ist aus der Gmppe bestehend aus Leber, Nebenniere, Blutzellen, bevorzugt Lymphozyten, Endothelzellen, Muskeln, bevorzugt Sklelettmuskeln, Pankreas und Gehirn, bevorzugt Hypothalamus.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle aus einer Zelllinie ausgewählt aus der Gmppe bestehend aus Leberzelllinien insbesondere HepG2, H4IIE, Endothelzellen, insbesondere HUVEC oder mikrovaskuläre Endothelzellen, Herzmuskelzellen, Skelettmuskelzellen, insbesondere C2C12 oder L6, Glukose-sensitive beta-Zellen des Pankreas, insbesondere INS-1 oder Min-6, Fibroblasten, insbesondere NIH3T3 oder Swiss albino 3T3, HEK-293, COS oder CHO-Zellen.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 biss 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Verändemng der biologischen Aktivität in einer Verringerung oder Steigemng der Fetteinlagerung in die Zellen besteht.
31. Verfahren nach Anspmch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Fetteinlagemng mittels Bestimmung des intrazellulären eingelagerten Lipids gemessen wird.
32. Verwendung von a) einem Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, oder 23, oder b) eines Heterotrimeren von Lymphotoxin alpha und beta oder c) einer Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß a), oder d) einer oder mehrerer Nukleinsäuren kodierend für ein Heterotrimeres von Lymphotoxin alpha und beta, oder e) einer Variante der Moleküle gemäß a) bis d) zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von Adipositas, Diabetes-Typ- II, Diabetes-Typ-II-verwandten Krankheiten, Kachexie und Lipodystrophien, insbesondere HARS.
33. Diagnostikum enthaltend a) ein Polypeptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID No: 21 oder 23, oder b) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß a), oder c) eine Variante der Moleküle gemäß a) oder b).
PCT/EP2004/013618 2003-12-01 2004-12-01 Mit adipositas assoziierte proteine und deren verwendung in therapie und diagnostik WO2005053728A2 (de)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52637403P 2003-12-01 2003-12-01
US60/526,374 2003-12-01
DE2003156076 DE10356076A1 (de) 2003-12-01 2003-12-01 Mit Adipositas assoziierte Proteine und deren Verwendung in Therapie und Diagnostik
DE10356076.9 2003-12-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2005053728A2 true WO2005053728A2 (de) 2005-06-16
WO2005053728A3 WO2005053728A3 (de) 2005-10-27

Family

ID=34654840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/013618 WO2005053728A2 (de) 2003-12-01 2004-12-01 Mit adipositas assoziierte proteine und deren verwendung in therapie und diagnostik

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2005053728A2 (de)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006125632A2 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 Rechtsanwalt Dr. Martin Prager Als Insolvenzverwalter Über Das Vermögen Der Xantos Biomedicine Ag, Pluta Rechtsanwalts Gmbh Agonistic antibodies that bind to the tweak receptor fn14 and thereby modulate adiposity-associated phenotypes as well as their use in therapy
EP1764371A1 (de) * 2005-04-25 2007-03-21 Xantos Biomedicine AG Agonistische Antikörper, welche an den LT-Beta-Rezeptor binden und dadurch Adipositas assoziierte Phänotypen modulieren, und deren Verwendung in der Therapie
EP1764109A1 (de) * 2005-05-24 2007-03-21 Xantos Biomedicine AG Agonistische Antikörper, welche an den Tweak Rezeptor Fn14 binden und dadurch Adipositas assoziierte Phänotypen modulieren, und deren Verwendung in der Therapie
WO2009033773A2 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondobiotech Laboratories Ag Use endothelin 2, alone or combined with a nonapeptide, a peptide as a therapeutic agent
EP2391385A1 (de) * 2009-01-30 2011-12-07 Biogen Idec MA Inc. Verfahren für pankreasgeweberegeneration
JP2012517459A (ja) * 2009-02-12 2012-08-02 プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ 代謝障害治療のためのカルジオトロフィン１の使用
WO2014043421A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Berg Llc Use of markers in the identification of cardiotoxic agents
US9775899B2 (en) 2005-02-17 2017-10-03 Biogen Ma Inc. Treating neurological disorders

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010051502A2 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001089550A2 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of ciliary neurotrophic factor
US20020041876A1 (en) * 1999-12-20 2002-04-11 Wiley Steven R. TWEAK receptor
US20030060605A1 (en) * 1997-07-07 2003-03-27 Carl Ware Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
WO2003047611A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung Ptp10d, tec and edtp involved in triglycerid-metabolism
WO2003066834A2 (en) * 2002-02-08 2003-08-14 Wyeth Composition and method for modulating an inflammatory response
WO2003086311A2 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Biogen, Inc. Methods for treating tweak-related conditions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030060605A1 (en) * 1997-07-07 2003-03-27 Carl Ware Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
US20020041876A1 (en) * 1999-12-20 2002-04-11 Wiley Steven R. TWEAK receptor
WO2001089550A2 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of ciliary neurotrophic factor
WO2003047611A2 (en) * 2001-12-04 2003-06-12 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung Ptp10d, tec and edtp involved in triglycerid-metabolism
WO2003066834A2 (en) * 2002-02-08 2003-08-14 Wyeth Composition and method for modulating an inflammatory response
WO2003086311A2 (en) * 2002-04-09 2003-10-23 Biogen, Inc. Methods for treating tweak-related conditions

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRANGER STEVE W ET AL: "LIGHT-HVEM signaling and the regulation of T cell-mediated immunity." CYTOKINE AND GROWTH FACTOR REVIEWS, Bd. 14, Nr. 3-4, 3. Mai 2003 (2003-05-03), Seiten 289-296, XP002341500 ISSN: 1359-6101 *
PAKALA SYAMASUNDAR V ET AL: "TNF-alpha receptor 1 (p55) on islets is necessary for the expression of LIGHT on diabetogenic T cells" CLINICAL IMMUNOLOGY (ORLANDO), Bd. 100, Nr. 2, August 2001 (2001-08), Seiten 198-207, XP002341507 ISSN: 1521-6616 *
WU QIANG ET AL: "Reversal of spontaneous autoimmune insulitis in nonobese diabetic mice by soluble lymphotoxin receptor" JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, Bd. 193, Nr. 11, 4. Juni 2001 (2001-06-04), Seiten 1327-1332, XP002341499 ISSN: 0022-1007 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9775899B2 (en) 2005-02-17 2017-10-03 Biogen Ma Inc. Treating neurological disorders
EP1764371A1 (de) * 2005-04-25 2007-03-21 Xantos Biomedicine AG Agonistische Antikörper, welche an den LT-Beta-Rezeptor binden und dadurch Adipositas assoziierte Phänotypen modulieren, und deren Verwendung in der Therapie
WO2006125632A3 (en) * 2005-05-24 2007-02-22 Rechtsanwalt Dr Martin Prager Agonistic antibodies that bind to the tweak receptor fn14 and thereby modulate adiposity-associated phenotypes as well as their use in therapy
EP1764109A1 (de) * 2005-05-24 2007-03-21 Xantos Biomedicine AG Agonistische Antikörper, welche an den Tweak Rezeptor Fn14 binden und dadurch Adipositas assoziierte Phänotypen modulieren, und deren Verwendung in der Therapie
WO2006125632A2 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 Rechtsanwalt Dr. Martin Prager Als Insolvenzverwalter Über Das Vermögen Der Xantos Biomedicine Ag, Pluta Rechtsanwalts Gmbh Agonistic antibodies that bind to the tweak receptor fn14 and thereby modulate adiposity-associated phenotypes as well as their use in therapy
WO2009033773A2 (en) * 2007-09-11 2009-03-19 Mondobiotech Laboratories Ag Use endothelin 2, alone or combined with a nonapeptide, a peptide as a therapeutic agent
WO2009033773A3 (en) * 2007-09-11 2009-07-23 Mondobiotech Lab Ag Use endothelin 2, alone or combined with a nonapeptide, a peptide as a therapeutic agent
EP2391385A1 (de) * 2009-01-30 2011-12-07 Biogen Idec MA Inc. Verfahren für pankreasgeweberegeneration
EP2391385A4 (de) * 2009-01-30 2013-05-01 Biogen Idec Inc Verfahren für pankreasgeweberegeneration
JP2012517459A (ja) * 2009-02-12 2012-08-02 プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ 代謝障害治療のためのカルジオトロフィン１の使用
WO2014043421A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Berg Llc Use of markers in the identification of cardiotoxic agents
EP2895861A4 (de) * 2012-09-12 2016-06-22 Berg Llc Verwendung von markern für die identifizierung von kardiotoxischen mitteln
US10352947B2 (en) 2012-09-12 2019-07-16 Berg Llc Use of markers in the identification of cardiotoxic agents and in the diagnosis and monitoring of cardiomyopathy and cardiovascular disease

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005053728A3 (de) 2005-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Soilu-Hänninen et al. Nerve growth factor signaling through p75 induces apoptosis in Schwann cells via a Bcl-2-independent pathway
Han et al. Paracrine and endocrine actions of bone—the functions of secretory proteins from osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts
Verdú et al. Influence of aging on peripheral nerve function and regeneration
DE60103052T2 (de) Verwendung von cxcr4 antagonisten zur behandlung von krebs und autoimmunkrankheiten
Sjöberg et al. Insulin-like growth factor (IGF-1) as a stimulator of regeneration in the freeze-injured rat sciatic nerve
DE69914463T2 (de) Therapeutische chemokine rezeptor antagonisten
Hefti Pharmacology of neurotrophic factors
Jones et al. Axonal regeneration through regions of chondroitin sulfate proteoglycan deposition after spinal cord injury: a balance of permissiveness and inhibition
Gregory et al. Membrane Fas ligand activates innate immunity and terminates ocular immune privilege
AU669894B2 (en) Use of IGF-1
Huard et al. Potential usefulness of losartan as an antifibrotic agent and adjunct to platelet-rich plasma therapy to improve muscle healing and cartilage repair and prevent adhesion formation
Goïot et al. Antral mucosa expresses functional leptin receptors coupled to STAT-3 signaling, which is involved in the control of gastric secretions in the rat
DE69915310T2 (de) Methoden zur behandlung der salzabhängigen hypertonie
Rotter et al. Erythropoietin improves functional and histological recovery of traumatized skeletal muscle tissue
WO2005053728A2 (de) Mit adipositas assoziierte proteine und deren verwendung in therapie und diagnostik
Venters et al. Tumor necrosis factorα and insulin-like growth factor-I in the brain: is the whole greater than the sum of its parts?
DE69920921T2 (de) Leptin vermittelte geninduktion
AU772103B2 (en) Inhibitors for use in hemostasis and immune function
Calegari et al. Suppressor of cytokine signaling 3 is induced by angiotensin II in heart and isolated cardiomyocytes, and participates in desensitization
EP3845550A1 (de) Zusammensetzung zur beschleunigung der zellproliferation mit peptid aus erythropoietin
DE69912743T2 (de) Behandlung von follikulären lymphomen unter verwendung von inhibitoren des lymphotoxin (lt)-aktivierungsweges
JP2003529554A (ja) サバイビンによる血管形成の促進
CA2349038C (en) Methods of alleviating cancer symptoms
WO2016018761A1 (en) Mesenchymal stem cells expressing biomarkers that predict the effectiveness of the mesenchymal stem cells for treating diseases and disorders
DE69822810T2 (de) Somatostatin und somatostatin agoniste zur behandlung der insulinsunempfindlichkeit und syndrome x

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase