DE69920921T2

DE69920921T2 - Leptin vermittelte geninduktion

Info

Publication number: DE69920921T2
Application number: DE69920921T
Authority: DE
Inventors: Dani[L Broekaert; Stefaan Jo[l VANDEKERCKHOVE; Annick Verhee; Wim Waelput; Jan Tavernier
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1998-07-28
Filing date: 1999-07-27
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-07-28
Also published as: CA2335107C; US7291458B2; AU5508499A; JP2002521496A; CA2335107A1; EP1101112A2; DE69920921D1; AU756617B2; WO2000007014A2; US20030036526A1; ATE278952T1; WO2000007014A3; EP1101112B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Leptin und/oder einem Zytokin, das an einen gp130 umfassenden Rezeptorkomplex bindet, gegebenenfalls in Kombination mit einer Verbindung, die auf die Adenylatzyklase oder eines ihrer nachgeschalteten Targets einwirkt, um eine Signalkaskade zu aktivieren, wodurch als Folge davon unmittelbar frühe Antwort-Gene und/oder späte Target-Gene in neuroendokrinen Zellen oder in Zellen neuroendokrinen Ursprungs induziert werden.
Hintergrundinformationen über die Erfindung
Unter gesunden Bedingungen schaffen die Assimilierung, Speicherung und Verbrauch von Nahrungsmittelenergie ein hoch integriertes homöostatisches System. Die Aufrechterhaltung eines relativ konstanten Levels von Energiespeicherung und folglich Körpergewicht erfordert ein Gleichgewicht zwischen Nahrungsaufnahme und Energieverbrauch. Die „Sollwert" Hypothese unterstellt eine koordinierte Regulation von Steuerungszentren im Zentralnervensystem. Es wird geglaubt, dass Hypothalamus-Kerne die Orte sind, wo der „Sollwert" reguliert wird, was ihnen eine wichtige Rolle bei der Installierung der Homöostase durch Regulierung von Nahrungsaufnahme (Hunger versus Sättigung), Körpergewicht, Energieverbrauch (adaptive Thermogenese) und hormonale Integration verleiht, die Substrat-Umwandlung, Speicherung und Mobilisierung termingerecht steuert.
Ein immer größer werdendes Spektrum von (Neuro)peptiden und Neurotransmittern ist entdeckt worden, die auf die Nahrungsaufnahme einwirken, wenn sie peripher oder direkt in den Hypothalamus gegeben werden. Maus-Modelle der Fettleibigkeit umfassen fünf offensichtliche einzelne Genmutationen. Die am intensivsten untersuchten Mutationen erfolgen in den ob und db-Genen, die eng mit der Steuerung von Körperfetteinlagerung verknüpft sind. Diese Steuerung umfasst einen Signalweg, der die Wirkung eines von Fettzellen sezernierten Hormons einschließt, und über spezifische Rezeptoren in den Gehirnbereichen wirkt, die Ingestionsverhalten und Stoffwechselaktivität steuern (Flier, 1997; Flier und Maratos-Flier, 1998; Spiegelman und Flier, 1996).
Klonierung des Maus ob-Gens und dessen humanen Homologs führte zur Identifizierung des ob-Genprodukts (ob-Protein), das heute als Leptin bezeichnet wird (Zhang et al., 1994). Es wird primär von dem weißen Fettzellgewebe als ein nicht glycosyliertes 146-Aminosäurepolypeptid mit einem MG von 16 kDa sezerniert. Entsprechend seiner Rolle als der postulierte Adipose-abgeleitete Sättigungsfaktor, löste die Verabreichung von Leptin an ob/ob Mäuse eine rasche Reversion des fettleibigen Phänotyps (Campfield et al., 1995; Halaas et al., 1995; Pellemounter et al., 1995) durch eine Verringerung der Nahrungsaufnahme und Erhöhung des Energieverbrauchs aus. Darüber hinaus korrigiert die Verabreichung von Leptin die meisten, wenn gar nicht alle metabolischen und endokrinen Defekte, einschließlich Sterilität der ob/ob Mäuse (Chehab et al., 1996).
Leptin zeigt keine offensichtliche Sequenzähnlichkeit zu irgendeinem anderen bekannten Protein. Basierend auf einer prädiktiven Strukturanalyse ist Leptin allerdings als ein Mitglied der hämatopoietischen Zytokinrezeptorfamilie identifiziert worden, die die typische vier α-helikale Bündelstruktur besitzen. Dementsprechend gehört sein Rezeptor zu der Klasse 1 Zytokinrezeptor-Superfamilie. Als ein Zytokin spielt Leptin eine pleiotrope Rolle, einschließlich Effekte auf das hämatopoietische System, in der Immunabwehr und Entzündungsprozessen, Reproduktion und Schwangerschaft, Regulation der Nierenfunktion und Beschleunigung des Beginns der Pubertät bei weiblichen Nagern. Zusätzlich zu seiner zentralen Hypothalamus-Wirkung kann Leptin ebenfalls Wirkungen auf extraneurale Gewebe ausüben, was seine metabolischen Wirkungen erweitert. Dies umfasst die Repression von Fettsäure- und Lipidsynthese, Triacylglycerid-Depletion von Geweben und erhöhte Expression von Enzymen des Fettsäure-Stoffwechsels und des entkoppelnden Proteins UCP-2, von dem geglaubt wird, dass es eine wichtige Rolle in der Thermogenese spielt. Neuere Untersuchungen zeigen, dass Leptin ebenfalls eine Rolle bei der Hämatopoiese, bei der Fettsäure-Homöostase in Zellen, im Leberstoffwechsel und beim Schutz gegen eine TNF-induzierte Toxizität spielt. Leptin stimuliert ebenfalls die Proliferation von CD4⁺ T-Zellen und hat direkte Wirkungen auf Endothelzellen und Zellen des Gastrointestinaltraktes.
Leptin übt ebenfalls seine Wirkungen auf die Bindung an einen Hochaffinitätsrezeptor, das Produkt des db-Gens, aus. Dieser Rezeptor wurde ursprünglich aus dem Maus Choroid-Plexus kloniert und kann in wenigstens sechs Isoformen durch alternatives Spleißen vorliegen (Tartaglia et al., 1995; Lee et al., 1996). Insofern richtete sich die größte Aufmerksamkeit auf eine ubiquitär exprimierte Spleißvariante mit kurzem cytoplasmatischen Schwanz (OB-Ra) und auf die Isoform mit einer langen cytoplasmatischen Domäne (OB-Rb), die überwiegend in bestimmten Kernen des Hypothalamus exprimiert ist. RT-PCR und Northern-Blot Analyse zeigten ebenfalls Expression der letzteren Isoform in peripheren Geweben, einschließlich Pankreas, Leber, Lunge, Niere und Nebennieren, Darm und Fettgeweben wie auch in den Endothelzellen und CD4⁺ T-Helferzellen. Die detaillierte Struktur vom murinen Leptinrezeptor-Gen wurde vor kurzem beschrieben. In den db/db Mäusen führt eine Punktmutation, die die Verwendung kryptischer Spleißstellen verursacht, zur Expression eines Rezeptors mit einem verkürzten cytoplasmatischen Schwanz, der wahrscheinlich signaldefekt ist. Das Fett (fa)-Gen in Ratten scheint ein funktionales Homolog des Maus db-Gens aufgrund einer GIn269Pro Substitution in der extrazellulären Domäne des Rezeptors zu sein, was zu einer Abschwächung des Signals und Fettleibigkeit führt. Dies unterstreicht die evolutionäre konservierte Rolle dieses Stoffwechselweges, vor kurzem wurden homologe Mutationen beim Menschen beschrieben. Schwere frühe Fettleibigkeit wurde bei Patienten mit Mutationen beobachtet, die zu einem beeinträchtigtem Leptin (Montague et al., 1997) oder beeinträchtigtem Leptinrezeptor (Clement et al., 1998) Funktion führten.
Basierend auf der Sequenzhomlogie und funktionalen Aspekten wird der Leptinrezeptor als ein Mitglied der Klasse I Zytokinrezeptor-Superfamilie betrachtet und ist sehr eng mit dem gp130, der Signalkomponente des IL-6R Komplexes, und mit den LIF- und G-CSF-Rezeptoren verwandt. Als solcher enthält der Leptinrezeptor typische Motive, die an der Signalgebung beteiligt sind wie eine JAK-Tyrosinkinase-Bindungsstelle, und eine Box 3, die an der Rekrutierung von STAT-3 nach einer Ligand-induzierten Rezeptor-Tyrosin-Phophorylierung beteiligt ist. Es wird allgemein geglaubt, dass die lange Isoform der signalkompetente Rezeptor ist, obwohl abweichende Signalgebungsfähigkeiten für die lange und kurze Isoform, die beide das Box 1 Motiv enthalten, beschrieben worden sind. Der Rezeptor fungiert als ein (Ligand-induziertes) Homodimer, unabhängig von gp130. Bindung von Leptin führt zur Aktivierung von JAK2 und mehreren STATs (STAT-1, STAT-3 und STAT-5b), allerdings war nur die STAT-3 Aktivierung in Hypothalamus-Zentren in vivo beobachtet. In etablierten Hepatom-Zelllinien, die die OB-R lange Isoform stabil exprimieren, scheint der Leptinrezeptor ein funktionales Äquivalent zum endogenen IL-6R zu sein.
Ein Ziel für die Leptin-Wirkung im Hypothalamus ist das Neuropeptid Y (NPY), ein Schlüsseleffektor der Ernährungshomöostase, der den Appetit stimuliert. Leptin induziert eine Hemmung der Biosynthese und Freisetzung von NPY. Die Beobachtung, dass NPY-defiziente Mäuse die Fettleibigkeit nicht vollständig revidieren, obwohl NPY für die vollständige Manifestation des ob/ob Phänotyps erforderlich ist, macht es wahrscheinlich, dass es noch weitere Leptin-Ziele gibt. Derartige alternative Ziele umfassen Glucagon-ähnliches Peptid 1 (GLP-1), das im Hirnstamm gebildet wird und eine verringerte Nahrungsaufnahme verursacht, das Melanin-konzentrierende Hormon, das ebenfalls an der Hypothalamus-Regulation des Ingestionsverhaltens beteiligt ist, den Hypothalamus Corticotropin-releasing Faktor (CRF), der den Appetit hemmt und den Stoffwechsel stimuliert, und die vor kurzem beschriebenen Orexine und das Kokain- und Amphetamin-regulierte Transcript (CART), ein Hypothalamus-Sättigungsfaktor. Wirkungen von Leptin auf die Expression des Pro-Opiomelanocortin-Gens sind ebenfalls beschrieben worden.
Fettleibige Menschen, bis auf jene Patienten, die die seltenen oben erwähnten Mutationen in den Genen für Leptin oder dessen Rezeptor tragen, bilden höhere Levels zirkulierenden Leptins, was vermuten lässt, dass Fettleibigkeit mit einer „Leptinresistenz" assoziiert ist. Eine derartige Resistenz könnte auf mehreren Ebenen vorstellbar sein: periphere Leptin-Dysfunktion, Dysregulation des sattmachenden Leptintransports durch die Blut-Hirn-Schranke und ebenfalls die Expression von und Signalgebung von dem Hypothalamus-Leptinrezeptor. Verschiedene Mechanismen, die zu einer Leptinresistenz führen, sind durch Untersuchungen bei murinen Modellen vermutet worden (Halaas et a., 1997).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Um noch mehr Einblick in die Leptin-Signalgebung und Funktion zu gewinnen, wurde die Analyse einer Leptin-vermittelten Gen-Induktion und Signalgebung in der neuroendokrinen PC12-Zelllinie begonnen und es wurde sowohl unmittelbar frühe Antwort- als auch späte Target-Gen-Sätze identifiziert. Die PC12-Zelllinie scheint eine physiologisch bedeutsame Zelllinie für die Untersuchung einer Leptin-induzierten Genregulation zu sein, da drei der identifizierten Gene bei der Leptin-Funktion oder Fettleibigkeit in vivo impliziert worden sind. Es ist gezeigt worden, dass eine Aktivierung des STAT-3 Proteins und Aufregulation der SOCS-3 Genexpression in Hypothalamus-Kernen durch eine Leptin-Behandlung bei ob/ob Mäusen aber nicht bei db/db Mäusen erfolgt (Vaisse et al., 1996; Bjorbaek et al., 1998). Die Identifizierung von Metallothionein-II als ein Leptin-induziertes unmittelbar frühe Antwort-Gen ist besonders interessant, da vor kurzem gezeigt worden war, dass Mäuse mit gezielter Zerstörung von sowohl MT-I als auch MT-II Genen bei erhöhten Plasma-Leptin-Levels fettleibig werden. Soweit konnte diesen Proteinen keine weitere eindeutige physiologische Rolle zugeschrieben werden. Gemäß der Erfindung ist außerdem gezeigt, dass Leptin die Expression von MT-II in vivo reguliert. Zusätzlich ist die Leptin-vermittelte Regulation in vivo der Serin/Threonin-Kinase Fnk und des Pankreatitis-assoziierten Proteins I gezeigt. Beide Gen-Transcripte wurden als Leptin-induziert in PC12-Zellen identifiziert, und unterstreichen weiter den Wert des in vitro Modellsystems. Darüber hinaus wurden neue Leptin-aufregulierte Transcripte in PC12-Zellen identifiziert, die zu einem neuronalen Phänotyp differenzierten, sowie auch Transcripte, die durch Auslösen der gp130-Signal-Komponente von Rezeptoren für die Interleukin 6 Familie von Zytokinen induziert sind.
Es sollte klar sein, dass Moleküle, die nachgeschaltet vom Leptinrezeptor wirken und die Leptin-Funktion modulieren, sich für eine potenzielle Verwendung bei der Behandlung der menschlichen Fettleibigkeit oder anderen Stoffwechselstörungen, einschließlich Anorexie, anbieten.
Unsere Erfindung ist, dass Leptin und/oder ein Zytokin, das an einen gp130 umfassenden Rezeptorkomplex bindet, gegebenenfalls zusammen mit einer Verbindung, die auf die Adenylatzyklase einwirkt oder direkt oder indirekt auf eines oder mehrere nachgeschalteter Targets besagter Zyklase einwirkt, zur Aktivierung einer Signalkaskade verwendet sein kann, wodurch als Folge davon unmittelbar frühe Antwort-Gene und/oder späte Target-Gene in neuroendokrinen Zellen oder Zellen neuroendokrinen Ursprungs induziert werden.
Besagte Signalkaskade wird bevorzugt durch einen Leptinrezeptor aktiviert, während die neuroendokrinen Zellen PC12-Zellen sind. Zu der Erfindung gehört ebenfalls die Verwendung von Leptin und/oder Zytokin, das an einen gp130 umfassenden Rezeptorkomplex bindet, gegebenenfalls zusammen mit besagter Komponente, worin die Komponente Forskolin ist.
Zusätzlich können PC12-Zellen in ein neuronales Stadium nach Behandlung mit (3-NGF (beta-Nervenwachstumsfaktor) und Forskolin vor der Aktivierung der besagten Rezeptorkomplexe differenziert sein.
Die Verwendung von Leptin gemäß der Erfindung gegebenenfalls zusammen mit Forskolin sorgt für eine Induktion von unmittelbar frühe Antwort-Genen wie STAT-3, SOCS-3, Metallothionein-11, die Serin/Threonin Kinase FNK und MRF-1, wohingegen die Kombination von Leptin und Forskolin eine ausgesprochene induzierte Wirkung auf späte Target-Gene wie Pankreatitis-assoziiertes Protein I, Squalenepoxidase, Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase und Annexin VIII besitzt.
Zwei zusätzliche Transcripts, die Leptin-induziertes Protein I (LIP-I) und Leptininduziertes Protein II (LIP-II) codieren, wurden ebenfalls identifiziert. LIP-II ist ein Ratten-Ortholog des humanen Down-Syndrom Zelladhäsionsmoleküls (DS-CAM). In beiden Fällen wurde keine co-stimulierende Wirkung von Forskolin beobachtet. Auf PC12-Zellen, die zu einem neuralen Phänotyp durch eine kombinierte β-NFG und Forskolin-Behandlung differenzierten, wurden außerdem Pankreatitis-assoziiertes Protein III, Peripherin und Mx2 Protein als Leptin-reguliert identifiziert. Schließlich wurden in einem RDA-Experiment, das zur Suche von Transcripten durchgeführt wurde, die differenziell von Hyper-IL-6 verglichen mit Leptin in PC12-Zellen induziert sind, das Reg-Gen, ein weiteres Mitglied der Pankreatitis-assoziierten Protein-Familie, und HIP-1 als selektiv von N-IL-6 aufreguliert identifiziert.
Im Rahmen der Erfindung liegt ebenfalls ein Verfahren zum Screening auf Moleküle in Säugerzellen, insbesondere in humanen Zellen, unter Verwendung humaner Homologe der Gene, die gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert sind, die direkt oder indirekt mit der Induktion unmittelbar frühe Antwort-Gene und/oder später Target-Gene oder mit der Aktivität der Produkte von besagten Genen interferieren; wobei besagte Gene von Leptin und/oder Zytokin induzierbar sind, das an einen gp130 umfassenden Rezeptorkomplex bindet, gegebenenfalls in Kombination mit einer Verbindung, die auf die Adenylatzyklase einwirkt oder direkt oder indirekt auf ein oder mehrere ihrer nachgeschalteten Targets einwirkt.
Tei der Erfindung sind folglich Moleküle, die mittels Screeningverfahren zu erhalten sind, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend besagtes Molekül oder Moleküle.
Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Zusammensetzung" eine beliebige Zusammensetzung wie eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als einen aktiven Bestandteil besagtes Molekül oder Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung möglicherweise in Gegenwart geeigneter Arzneimittelträger, die dem Fachmann bekannt sind, und folglich in Form einer beliebigen geeigneten Zusammensetzung, wie es detailliert unten angeführt ist, mit Hilfe eines beliebigen geeigneten Verabreichungsverfahren, soweit es dem Wissen eines Fachmanns unterliegt, verabreicht sein kann. Der bevorzugte Verabreichungspfad ist die parenterale Verbreichung. Bei der parenteralen Verabreichung sind die Zusammensetzungen dieser Erfindung in Form einer injizierbaren Dosierungseinheit wie eine Lösung, Suspension oder Emulsion in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträger formuliert. Derartige Arzneimittelträger sind an sich nicht toxisch und nicht therapeutisch. Beispiele für derartige Arzneimittelträger sind Saline, Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung und Hank-Lösung. Nichtwässrige Arzneimittelträger wie nichtflüssige Öle und Ethyloelat können ebenfalls verwendet sein. Ein bevorzugter Arzneimittelträger ist 5% Dextrose in Saline. Der Arzneimittelträger kann kleinere Mengen an Additiven enthalten wie beispielsweise Substanzen, die die Isotonität und die chemische Stabilität, einschließlich Puffer und Konservierungsmittel, verstärken.
Die so erhaltenen isolierten funktionellen Moleküle der Erfindung werden in einer Konzentration verabreicht, die therapeutisch wirksam ist, um eine Fremdtransplantationsabstoßung, GVHD, allergische und Autoimmunkrankheiten zu verhindern. Die Dosierung und Art der Verabreichung hängt vom Individuum ab. Im Allgemeinen sind die Zusammensetzungen so verabreicht, dass das/die isolierte(n) funktionelle(n) Protein(e)/Molekül(e) in einer Dosis zwischen 1 μg/kg und 10 mg/kg, bevorzugter zwischen 10 μg/kg und 5 mg/kg, am bevorzugtesten zwischen 0,1 mg/kg und 2 mg/kg verabreicht ist/sind. Bevorzugt sind sie als eine Bolus-Dosis gegeben. Kontinuierliche Kurzzeit-Infusionen (innerhalb 30 Minuten) können ebenfalls eingesetzt sein. Die Zusammensetzungen, umfassend das/die isolierte(n) funktionelle(n) Proteine)/Molekül(e) gemäß der Erfindung, können in einer Dosis zwischen 5 und 20 μg/kg/Minute, bevorzugter zwischen 7 und 15 μg/kg/Minute infundiert sein.
Gemäß einem spezifischen Fall sollte die „therapeutisch wirksame Menge" des benötigten isolierten funktionellen Proteins gemäß der Erfindung als die Menge bestimmt werden, die zur Heilung des Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, oder wenigstens zum partiellen Stillstand der Erkrankung und ihrer Komplikationen hinreichend ist. Wirksame Mengen für eine derartige Verwendung hängen von der Schwere der Krankheit und von dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab. Einmalige oder mehrmalige Verabreichungen können abhängig von der Dosierung und der Häufigkeit erforderlich sein, wie es vom Patienten benötigt und toleriert wird.
Im Kontext dieser Beschreibung sind die Begriffe „Moleküle", „Proteine" und „Verbindungen" austauschbar, außer gegenteiliges ist erwähnt. Zur weiteren Offenlegung der vorliegenden Erfindung folgt unten eine detailliertere Erläuterung.
Synergieeffekte von Leptin und Forskolin oderβ-NFG auf PC12-Zellen
Um die Leptinrezeptor-Signalgebung in einem neuroendokrinenverwandten Zelltyp zu untersuchen, haben wir PC12-Zellen mit Expressionsvektoren für die lange und kurze Isoform des Maus Leptinrezeptors (pMET7-mLRlo beziehungsweise MET7-mLRsh) transient transfiziert und die Gen-Induktion von Leptin kontrolliert. Die PC12-Zelllinie wurde aus einem transplantierbaren Ratten Nebennieren-Pheochromocytom etabliert und ist häufig als ein Modellsystem für Differenzierung neuronaler Zellen verwendet. Stimulation mit rekombinantem Ratten (β-Nervenwachstumsfaktor (β-NFG) führt zu einem Wachstumsstillstand und zur Bildung dendritischer Fortsätze und Expression neuronaler Marker. Bindungsuntersuchungen unter Verwendung eines Maus Leptin-SEAP Fusionsproteins und RT-PCR Analyse zeigten, dass weder undifferenzierte noch differenzierte PC12-Zellen Leptinrezeptoren exprimieren. Um die Leptin-Ansprechempfindlichkeit zu bestimmen, wurden verschiedene Reporter-Genkonstrukte entwickelt, de auf der Beobachtung basierten, dass eine Stimulation von Leptinrezeptoren zu Änderungen in der Expression von verschiedenen Neuropeptiden einschließlich NPY und POMC führte. Ein erstes Reporterkonstrukt enthält ein 500 bp Fragment der Ratten Neuropeptid Y (rNPY) Promotorsequenz an das Luciferase Gen gekoppelt (pGL3-rNPYluc). 1A zeigt, dass eine Leptin-Stimulation von PC12-Zellen, die mit dem rNPY-Reporterkonstrukt und pMET7-mLRlo aber nicht mit MET7-LRsh co-transfiziert waren, zu einer mäßigen Stimulation von Luciferase-Aktivität führte. Allerdings zeigte ein Co-Stimulation in dem ersten Fall mit Forskolin, einem Stimulator der Adenylatzyklase, eine bis zu 14fach verstärkte Reporteraktivität. Optimale co-stimulierende Bedingungen wurden als 100 ng/ml Leptin und 10 μM Forskolin bestimmt (1B). Diese Wirkung war ungefähr 72 Stunden nach Stimulation optimal.
Leptin-Ansprechempfindlichkeit in PC12-Zellen wurde unter Verwendung eines Klons näher untersucht, der die lange Isoform des Maus Leptinrezeptors (PC12-LR8, siehe unten) exprimiert. Nach Transfektion von PC12-LR8 mit einem Reporterkonstrukt, das auf dem humanen POMC (Proopiomelanocortin) Promotor (pGL3-POMCIuc) (1C) basierte, oder mit einem Reporterkonstrukt, das auf dem Ratten Pankreatitis-assoziierten Protein I Promotor (siehe unten) (1D) basierte, wurde die Leptin-induzierte Luciferase-Aktivität gemessen. Verabreichung von (β-NFG (1 ng/ml) imitierte für beide Reporterkonstrukte die co-stimulierende Wirkung von Forskolin. Die β-NFG und Forskolin-Effekte schienen in diesem Klon additiv zu sein (1C und 1D).
Identifizierung von Leptin-regulierten Genen in PC12-Zellen.
Für die Suche nach Genen, die von Leptin in den PC12-Zelllinie reguliert sind, wurde ein RDA (repräsentative differenzielle Analyse) Experiment unter Anwendung einer Modifikation des ursprünglichen Verfahrens (Hubank und Schatz, 1994) durchgeführt. Mit der Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich, Amplicons zu klonieren, die den Transcripten von Leptin-Forskolin co-stimulierten PC12-Zellen entsprechen, die mit pMET7-mLRlo transient transfiziert sind. Nach drei Subtraktions/Amplifikationszyklen wurden selektiv amplifizierte Banden gereinigt und in den pCDNA3 oder pCR-Blunt Vektor (Invitrogen) subkloniert. Nachfolgende DNA-Sequenzierung zeigte, dass ein stark induziertes Transcript das Ratten Pankreatitisassoziierte Protein I (rPAP I) codierte. Gestützt auf diese Beobachtung wurde eine einfache One-Tube RT-PCR basiertes Verfahren durchgeführt, um auf PC12-Subklone zu selektieren, die die lange Isoform des Leptinrezeptors exprimieren (2A). Ein stabiler Klon, PC12-LR8, wurde für weitere Versuche ausgewählt (2B). Einzelne Inserts von der geklonten Amplicon-Sammlung wurden radiomarkiert und die Leptin-abhängige Genregulation wurde geprüft und genauer mittels Northern-Blot Analyse auf der PC12-LR8-Zelllinie untersucht. Insgesamt wurden 11 Leptinregulierte Gene identifiziert, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist. Es wurden nur aufregulierte Gene festgestellt; ein paralleles Experiment, das auf die Leptin-induzierte Herab-Modulation der Genexpression selektierte, ergab keine Amplicons.
Interessanterweise sind einige der identifizierten Genprodukte bereits bei der Leptin-Signalgebung oder Fettleibigkeit impliziert worden.
Annexin VIII ist ein Calcium-abhängiges Phospholipid-bindendes Protein, das in Lunge, Haut, Leber und Niere exprimiert ist. Die physiologische Funktion von Annexin VIII bleibt unbekannt.
FGF-induzierbare Kinase (Fnk) wurde zunächst als eine vom Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF-1 induzierte Serin/Threonin Kinase in murinen NIH 3T3 Fibroblasten identifiziert. Sie ist mit der Polo-Familie von Serin/Threonin Protein-Kinasen (einschließlich humane Prk, Maus Snk, humane und murine Plk, Maus Sak, Drosophila Polo und Hefe Cdc5) eng verwandt. In ausgewachsenen Tieren ist Fnk-mRNA in hohen Levels in der Haut exprimiert, wird aber ebenfalls in Gehirn, Darm, Niere, Lunge und Ovarien detektiert. In neugeborenen Tieren sind Fnk-Transcripte in hohen Levels in Darm, Niere, Leber, Lunge und Haut exprimiert. Die verwandten Prk und Plk Kinasen sind von Zytokinen in hämatopoietischen Zellen (Li et al., 1996) beziehungsweise in primären T-Zellen (Holtrich et al., 1994) induziert. Die Kinasen können eine Rolle bei der Zellproliferation spielen, aber ihre genaue Rolle bleibt unklar.
Metallothionein-II (MT-II) ist ein Mitglied einer Familie Metall-bindender Proteine, von denen berichtet wird, dass sie bei der Detoxifikation und Homöostase von Schwermetallen, beim Einfangen freier Radikale und in der akuten Phase-Antwort wirken. Bedeutsam ist, wie vor kurzem berichtet wurde, dass MT-I/II defiziente Mäuse mit einem C57BL/6J-129Ola genetischen Hintergrund einen leichten späten Ausbruch von Fettleibigkeit zeigen (Beatti et al., 1998).
Modulator-Erkennungsfaktor 1 (MRF-1) ist ein DNA-bindendes Protein, das zu einer kaum charakterisierten Proteinfamilie gehört. (GenBank Hinterlegungsnummer für Sequenzen des humanen Homologs und des verwandten humanen MRF-2 sind M62324 beziehungsweise M73837).
Pankreatitis-assoziiertes Protein I (PAP I) ist ein C-Typ Lektin-verwandtes sekretorisches Protein, das in kleinen Mengen im Ratten-Pankreas (sowohl in endokrinen als auch exokrinen Zellen) vorhanden ist und während der akuten Phase einer Pankreatitis schnell überexprimiert ist. Die physiologische Rolle von PAP I ist heute noch unklar, aber seine Beteiligung bei akuter Pankreatitis als ein akute Phase-Protein lässt eine Rolle bei Gewebeschutz und/oder Gesundung vermuten. PAP I ist ebenfalls in normalem Darm exprimiert und ist durch Nahrungszufuhr induziert (Dusetti et al., 1995).
Signalwandler und Aktivator der Transcription 3 (STAT-3) ist ein Schlüsseltranscriptionsfaktor, der die Signale einer Reihe von Zytokinen vermittelt. Eine entscheidende Rolle für STAT-3 bei der Leptin-Signalgebung ist für Zelllinien (Baumann et al., 1996) und in ob/ob Mäusen (Vaisse et al., 1996) berichtet worden.
Sgualenepoxidase ist ein die Geschwindigkeit limitierendes Enzym in der Cholesterol-Biosynthese. Transcriptionelle Regulation der Squalenepoxidase durch Sterol ist Teil eines koordiniert gesteuerten Biosynthesewegs (Nakamura et al., 1996).
Suppressor von Zytokin-Signalgebung-3 (SOCS-3) gehört zu einer größer werdenden Familie von SOCS-Proteinen. Diese Proteine wirken als intrazelluläre Inhibitoren von mehreren Zytokin-Signaltransduktionswegen. Vor kurzem wurde berichtet, dass SOCS-3 zu einer Leptin-Resistenz in vivo beitragen kann (Bjorbaek et al., 1998).
Uridindiphosphat-Glucuronyl-Transferase (UGT) ist ein Schlüsselenzym, das bei der Bilirubin- und Arzneimittel-Detoxifikation wie auch bei der Steroid-Inaktivierung und Exkretion und bei der Proteoglycan-Seitenkettenbildung beteiligt ist. Konjugation von Verbindungen mit Glucuronsäure macht das Molekül stark sauer und wasserlöslicher bei physiologischem pH als das Vorläufer-Molekül, wodurch Stoffwechsel, Transport und Sekretion erleichtert sind.
Zwei Amplicons wurden geklont beziehungsweise stammten von Transcripten von bislang nicht identifizierten Genen, die für Leptin-induzierte Proteine LIP-I und LIP-II (3, 4) codierten. LIP-II gehört zu der Immunglobulin-Superfamilie und ist ein Ratten-Ortholog des humanen Down-Syndrom Zelladhäsionsmoleküls, DSCAM. Expression von DSCAM erfolgt primär im Gehirn und ist bei der Nervenentwicklung impliziert.
Diese Leptin-induzierten Proteine LIP-I und LIP-II sind bis jetzt unbekannt und sind deshalb neue identifizierte Nucleinsäuren/Proteinsequenzen als solche und bilden folglich einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Die Suche nach Leptin-regulierten Genen wurde ebenfalls auf differenzierte PC12-Zellen ausgeweitet (5). Adhärente PC12-LR8-Zellen wurden mit β-NFG und Forskolin 5 Tage behandelt, was zu einem Wachstumstillstand, zur Bildung von verzweigten neuritischen Fortsätzen und zur Akkumulation von kleinen Vesikeln führte. Wiederum wurde ein RDA-Experiment unter Verwendung von mRNAs von differenzierten Zellen, die 24 h mit Leptin behandelt waren, oder von unbehandelten Zellen und beide Male in ständiger Präsenz von β-NFG und Forskolin durchgeführt. Drei Leptin-aufregulierte Transcripte wurden identifiziert (Tabelle 1). Interessanterweise gehört eines der Genprodukte, PAP III, zur gleichen Proteinfamilie wie PAP I.
Mx2 ist ein Typ I Interferon-induzierbares Gen, das an der antiviralen Abwehr beteiligt ist. Hohe Expressionslevels werden in differenzierten PC12-Zellen im Gegensatz zu einer sehr schwachen Expression bei undifferenzierten Zellen beobachtet.
Peripherin ist eine Zytoskelett-Komponente, die Teil des Typ III intermediären Filaments ist. Erhöhte Expressionslevels sind in differenzierten Zellen beobachtet, wenn sie mit undifferenzierten Zellen verglichen werden. Aufregulation ist durch Interleukin 6 (IL-6) und Leukämie-Hemmfaktor (LIF) beschrieben worden.
Pankreatitis-assoziiertes Protein III (PAP III) ist ein Mitglied der PAP-Familie vom C-Typ tierischer Lektine, wie oben erwähnt. Es wird ebenfalls in normalem Darm nach Nahrungsaufnahme induziert (Dusetti et al., 1995).
Ein weiteres RDA-Experiment wurde durchgeführt, um Transcripte zu identifizieren, die differenziell (und selektiv) von Hyper-IL-6 (H-IL-6) verglichen mit Leptin induziert sind (6). H-IL-6 ist ein Fusionsprotein von IL-6 und der sezernierten IL-6R Untereinheit (Fischer et al., 1997). In den meisten Fällen führte eine H-IL-6 Behandlung zu einer Aufregulation des gleichen Gen-Satzes wie es mit Leptin beobachtet war. Zwei H-IL-6 induzierte Transcripte, die nicht von Leptin induziert werden, wurden identifiziert. HIP-I (Hyper-IL-6 induziertes Protein I) entspricht einem neuen Gentranscript. (7). Req ist ein weiteres Mitglied der PAP-Familie von C-Typ Lektinen. Req wurde ursprünglich aus einer cDNA-Bibliothek von regenerierenden Ratten Pankreas-Inseln isoliert. Andere Bezeichnungen sind Pankreasstein-Protein (PSP), Pancreatic Thread Protein (PTP), Inselzellregenerationsfaktor und Lithostatin. Es wird als Wachstumsfaktor für Pankreas beta-Zellen angesehen. Ähnlich scheinen die zuvor identifizierten, verwandten PAP I und PAP II codierenden Transcripte von N-IL-6 streng induziert zu sein im Gegensatz zu Leptin, das eine Forskolin Co-Stimulation benötigt.
Induktionskinetiken identifizieren unmittelbar frühe Antwort-Gene und späte Target-Gene
Zunächst wurden die Induktionskinetiken der oben erwähnten Transcripte in nicht-differenzierten PC12-Zellen nach Leptin-Behandlung untersucht. Interessanterweise konnten zwei Arten von Gen-Sätzen unterschieden werden: eine Gruppe unmittelbar frühe Antwort-Gene, einschließlich Fnk, MT-II, MRF-1, STAT-3 und SOCS-3, in diesen Fällen erfolgt eine Induktion innerhalb von 4 Stunden ( 8A), und eine Reihe an später aktivierter Target-Gene, einschließlich PAP I, UGT, Ann VIII und Squalenepoxidase, mit einer Induktion nicht vor 6 Stunden nach dem Stimulus (8C). Zunächst wurde die Induktion von unmittelbar frühe Antwort-Genen genauer erforscht (8B). Optimale Stimulierung variierte zwischen 30 Minuten (SOCS-3) und 8 Stunden (STAT-3) nach Induktion. Synthesekinetiken von SOCS-3 mRNA zeigten schon 2 Stunden nach Stimulation einen raschen Abfall. Im Falle des späten Target-Gen-Satzes wurden optimale mRNA-Levels zwischen 22 Stunden (PAP I, UGT) und über 96 Stunden (Annexin VIII, Squalenepoxidase) nach Induktion beobachtet.
Wie es aus 8 hervorgeht, erlaubt die Forskolin Co-Stimulierung ebenfalls die Unterscheidung beider Gen-Sätze. Im Falle von den unmittelbar frühe Antwort-Genen ist eine gewisse Co-Stimulierung für MT-II und MRF-1 erkennbar, aber nur zu späteren Zeitpunkten, und nicht in der frühen Induktionsphase. Im Falle von SOCS-3 führt eine Forskolin Co-Behandlung sogar zu einer verringerten Induktion. Im Gegensatz dazu ist eine starke co-stimulierende Wirkung im Falle von PAP I, UGT, Ann VIII und Squalenepoxidase 22 Stunden nach Stimulation zu erkennen.
Um sich dem Induktionsmechanismus des späten Gen-Satzes zu widmen, wurde die Wirkung des Proteinsynthese-Inhibitors Cycloheximid auf rPAP I und Annexin VIII mRNA-Expression gemessen. Behandlung mit Cycloheximid (50 μM, Beginn 30 Minuten vor Induktion für 8,5 Stunden) zeigte eine stark verringerte Expression 24 Stunden nach Induktion, was vermuten lässt, dass eine de novo Proteinsynthese für Induktion des späten Target-Gen-Satzes erforderlich ist.
Regulation von MT-II, Fnk und PAP I Expression durch Leptin in ob/ob Mäusen
Um die Bedeutung unseres in vitro Modells für die Fettleibigkeit zu bewerten, erforschten wir die Regulation durch Leptin von einer Teilmenge der identifizierten Gene in vivo. Rekombinantes humanes Leptin (R&D Systems) wurde Leptin-defizienten ob/ob Mäusen in einer einzigen Dosis von 100 μg Leptin/Maus intraperitoneal verabreicht. Mäuse wurden mittels Genickbruch 5 Stunden nach Behandlung getötet und Gesamt-RNA wurde von Leber und Jejunum isoliert. Northern-Blot Analyse wurde unter Verwendung von jeweils MT-II, Fnk und PAP I als Sonde durchgeführt (9). Leptin-Behandlung von ob/ob Mäusen verursachte eindeutig eine Induktion von MT-II und Fnk mRNA-Expression in der Leber, wohingegen Expression von PAP I in Jejunum von Leptin herabreguliert war. In einem separaten Versuch zeigten 3 von 4 ob/ob Mäusen eine eindeutige Induktion von MT-II und Fnk mRNA in der Leber zwei Stunden nach Stimulation mit Leptin (100 μg/Maus) zusammen mit dem 2A5 Antikörper (200 μg/Maus). Von 2A5 ist zuvor gezeigt worden, dass er die Leptin-Aktivität in vivo verstärkt (Verploegen et al., 1997). Zwölf Stunden nach Injektion fielen die Expressionslevels wieder auf die Kontrolllevels zurück.
Wirkungen von Hunger auf MT-II, Fnk- und PAP I-Expression in Wildtyp-Mäusen.
Wir erforschten ebenfalls die Wirkung von Hunger auf MT-II und Fnk-Expression in der Leber von Wildtyp-Mäusen (10A). Mäuse, die 24 Stunden gehungert hatten, erhielten eine einzige intraperitoneale Injektion humanes Leptin (R&D Systems, 50 μg/Maus) zusammen mit dem 2A5 anti-humanen Leptin Antikörper (200 μg/Maus). Als Kontrolle erfolgte eine einzige Endotoxin freie PBS-Injektion auf ähnliche Weise. Die Leptinwirkung wurde mittels Northern Blot nach 2, 6 und 12 Stunden bei verlängerten Hungerbedingungen bewertet. Hungerbedingungen führten zu einem mäßigen Anstieg von MT-II und Fnk mRNA-Expression in der Leber. Diese Wirkung war durch eine Leptin plus 2A5 Behandlung deutlich verstärkt, die zu einer starken Induktion von MT-II und Fnk Expression zwei Stunden nach Injektion führte. Sechs Stunden nach Leptin-Verabreichung fiel MT-II mRNA Expressionslevel wieder auf den Level, der in PBS-behandelten Mäusen zu beobachten war, wohingegen Fnk-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe bei einem höheren Expressionslevel aufrechterhalten wurde. Hunger führte ebenfalls zu einer spontanen Induktion von MT-II mRNA im Jejunum. Im Gegensatz zu der Beobachtung in der Leber war dieser Effekt durch eine Leptin + 2A5 Behandlung 6 Stunden nach Injektion supprimiert. Die Expressionslevels von MT-II erreichten 12 Stunden nach Injektion wieder die Kontrolllevels (10B). Ein ähnliches Muster wurde für PAP I mRNA-Expression in Jejunum beobachtet, das eine Verringerung 24 Stunden nach Leptin + 2A5 Behandlung in hungernden Mäusen im Vergleich mit PBS-behandelten Kontrollen zeigte.
Zur näheren Erklärung der Erfindung sind nachfolgend einige Beispiele zur Klarstellung angeführt.
Beispiele
Beispiel 1
Zellkultur und Transfektion.
PC12-Zellen wurden in RPMI 1640 Medium mit Glutamax-I (GibcoBRL), das 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (iFCS) und Gentamycin (50 μg/ml) enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden nur mit Medium oder Medium mit 100 ng/ml Maus Leptin (R&D Systems), mit Forskolin (Sigma) in einer Konzentration von 10 μM oder mit einer Kombination aus beiden, außer anderes ist angegeben, behandelt. Für eine neuronale Differenzierung wurden resuspendierte PC12-Zellen auf Rattenschwanz-Kollagen (Collaborative Biomedical Products) beschichtete Platten mit 2–3 × 10⁶ Zellen/25 cm² Kolben in RPMI 1640 Medium mit Glutamax-I, das 10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 5% iFCS und Gentamycin enthielt, ausgesät. Nach einem Kultivierungstag wurde die nichtadhärente Zellfraktion durch Erneuern des Mediums entfernt. Differenzierung wurde durch eine kombinierte β-NFG (10 ng/ml, R&D Systems) und Forskolin (10 μM) Behandlung über ungefähr 5 Tage induziert. Medium wurde nach 2–3 und 5 Tagen ersetzt.
Der pMet7-Vektor wurde als Expressionsvektor für die langen und kurzen Isoformen des Maus Leptinrezeptors (als pMET7-mLRlo beziehungsweise pMET7-mLRsh bezeichnet) verwendet. pMet7 ist eine modifizierte Version des Säuger pME18S-Expressionsvektors, der den SRα-Promotor nutzt, wie von Takebe beschrieben (Takebe et al., 1988). PC12-Zellen wurden mittels Elektroporation unter Zuhilfe nahme des Equibio „Easyject one" Elektroporators transfiziert. Typischerweise wurden 10⁷ Zellen in 0,4 cm Elektroporationsküvetten mit 5 μg Vektor mit 300 V und 1500 C elektroporiert. Zelloberflächen-Expression von jedem Protein wurde mittels spezifischen Bindens des Leptin – sezernierte alkalische Phosphatase Fusionsproteins gemessen (siehe unten).
Cos1 Zellen wurden in DMEM, das mit 10% iFCS (GibcoBRL) supplementiert war, gehalten und mit pMET7-LeptinSEAP (ein das Maus Leptin – sezernierte alkalische Phosphatase Fusionsprotein exprimierender Vektor) unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies) transfiziert. Medium wurde nach 16 h ersetzt und konditioniertes Medium (CM) wurde nach 64 h geerntet. Die geschätzte Konzentration des Leptin-SEAP Fusionsproteins betrug ungefähr 1 μg/ml.
Beispiel 2
Selektion von Zelllinien, die die lange Isoform des Leptinrezeptors stabil exprimieren.
PC12-Zellen wurden mit dem pMET7-mLRlo Expressionsvektor zusammen mit dem den Neomycin-Resistenzmarker enthaltenden pHCMV-MCS Vektor elektroporiert. Transfizierte Zellen wurden auf Wachstum in Glutamax-I haltigem RPMI 1640 Medium (GibcoBRL), das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (iFCS) und Gentamycin (50 μg/ml) supplementiert war, selektiert. Zellen wurden zuerst in 500 μg/ml G418 Sulfat (Calbiochem) sieben Tage und in 750 μg/ml G418 haltigem Selektivmedium ab Tag acht angezogen. Nach vier Wochen Wachstum wurden die Kolonien auf Platten mit 48 Vertiefungen in 750 μg/ml G418 enthaltendes Medium transferiert. Subklone wurden auf Leptin-Ansprechempfindlichkeit und PAP I Genaktivierung unter Zuhilfenahme eines ein One-Tube PCR-Verfahrens selektiert. Zusammengefasst: nach Zelllyse wurde mRNA mit Biotin markierten Oligo dT hybridisiert und an Streptavidin-beschichteten Röhrchen eingefangen. Nach dreimaligem Waschen wurden die gleichen Röhrchen für die RT-PCR verwendet, die für eine Detektion der PAP I Geninduktion optimiert waren (mRNA-Einfang und Titan-One-Tube-Verfahren, Boehringer Mannheim).
Leptin-Bindungsassay
Zelloberflächenexpression von Leptinrezeptoren auf PC12-Zellen wurden unter Verwendung eines Maus Leptin – sezernierte alkalische Phosphatase chimären Proteins, wie beschrieben (Baumann et al., 1996; Flanagan und Leder, 1990) gemessen. Kurz: Zellen wurden 48 h nach Transfektion gewaschen (Waschpuffer: RPMI 1640, 0,1 % NaN₃, 20 mM Hepes pH 7,0, 0,01 % Tween 20) und wurden 90 min bei Raumtemperatur mit einer 1/10 Verdünnung des Cos1 CM inkubiert, das das chimäre Protein in Waschpuffer enthielt. Nach 6 aufeinanderfolgenden Waschschritten wurden die Zellen in einem Puffer, der 1 % TX–100, 10 mM Tris–HCl pH 7,4 enthielt, lysiert und die Lysate wurden bei 65°C 30 min behandelt, um endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde unter Verwendung eines CSPD-Substrates (PhosphaLight, Tropix) nach Herstelleranleitung in einem
TopCount.NXT Chemiluminescence Counter (Packard) gemessen.
Beispiel 3
RDA (repräsentative Differenzanalyse).
RDA wurde angewandt, um differenziell exprimierte cDNAs von PC12-Zellen, die mit der langen Isoform des Leptinrezeptors transient transfiziert waren, oder von neuronal differenzierten PC12-LR8-Zellen, die die lange Isoform des Leptinrezeptors stabil exprimieren, zu klonieren. In beiden Fällen wurde die Klonierung unter Verwendung von mRNA von Zellen durchgeführt, die entweder mit Leptin+Forskolin oder ausschließlich mit Forskolin stimuliert waren. Dieses RDA-Verfahren wurde im Wesentlichen wie ursprünglich beschrieben (Hubank und Schatz, 1994) und modifiziert von Braun (Braun et al., 1995) durchgeführt. PC12-Zellen wurden mit dem pMET7-LRIo Expressionsvektor transfiziert und ausschließlich mit Forskolin oder mit einer Kombination aus Forskolin und Leptin 72 Stunden stimuliert. Im Falle neuronal differenzierter PC12-LR8-Zellen wurde mRNA aus Zellen erhalten, die mit β-NFG und Forskolin wie oben beschrieben 5 Tage behandelt waren, um neuronale Differenzierung zu induzieren, und erhielten eine anschließende 24 h Behandlung mit Leptin (100 ng/ml) oder waren ohne zusätzliche Behandlung. Im Falle einer Hyper-IL-6-Behandlung wurden nicht-differenzierte PC12-LR8-Zellen entweder mit H-IL-6 (5 ng/ml) oder Leptin (100 ng/ml) 24 h vor mRNA-Isolierung und RDA-Analyse behandelt.
mRNAs wurden unter Zuhilfenahme des Fast Track Verfahrens (Invitrogen) isoliert. Eine 2 μg mRNA-Probe von jeder Zellpopulation wurde für die RDA-Analyse eingesetzt. cDNAs wurden von den mRNAs synthetisiert und mit Dpnll verdaut. Zwei Oligonucleotid-Adaptermoleküle, 5'AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA 3' (R-Bgl-24) und 5'GATCTGCGGTGA 3' (R-Bgl-12) wurden an die Dpnll-verdaute cDNA ligiert. Diese Mischung wurde mit PCR mit R-Bgl-24 Oligonucleotiden amplifiziert und die Adapter wurden mit Dpnll abgeschnitten. Ein zweites Adapter-Paar, 5'ACCGACGTCGACTATCCATGAACA 3' (J-Bgl-24) und 5'GATCTGGTTCATG 3' (J-Bgl-12) wurde an die amplifizierten Fragmente von der Leptin-Forskolin-stimulierten Zellpopulation ligiert und mit den R-Bgl-24 amplifizierten cDNA-Fragmenten von der Forskolin-stimulierten Zellpopulation (R-Bgl Adapter entfernt) in einem 1:100 Verhältnis 24 h hybridisiert. Die Hybridisierungsmischung wurde als Template für eine Amplifikation mittels PCR eingesetzt. Eine zweite Subtraktionsrunde wurde durch Entfernen der J-Bgl-Adapter von diesem PCR-Produkt der ersten Runde, Ligieren eines dritten Oligonucleotid-Adapterpaars, 5'AGGCAACTGTGCTATCCG-AGGGAA 3' (N-Bgl-24) und 5'GATCTTCCCTCG 3' (N-Bgl-12) durchgeführt und mit Treiber-Amplicons mit einem 1:800 Verhältnis hybridisiert. Eine dritte Subtraktionsund Amplifikationsrunde wurde unter denselben Bedingungen wie in der ersten Runde durchgeführt. Anschließend wurden die Transcripte in den pCDNA3 oder pCR-Blunt (Invitrogen) Vektor subkloniert. Der größte Teil der Insert-DNAs wurden unter Zuhilfenahme des Alf Express Sequencer (Pharmacia) mit dem Autoread Sequencing Kit nach Herstelleranleitung sequenziert. Primer zur Sequenzierung der Inserts waren die C15-markierten M13-Vorwärtsprimer für die pCR-Blunt Klone und der 5'-GAACCCACTGCTTAACTGGC Vorwärts- und 5'-GTCGAGGCTGATCAGCG-AGC Rückwärtsprimer für die pCDNA3 Klone. In anderen Fällen erfolgte die Sequenzierung unter Verwendung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenzierers (Perkin Elmer) unter Verwendung des M13-Vorwärtsprimers.
Beispiel 4
Northern-Blot und Reporter-Analyse
Geamt-RNA wurde aus PC12-Zellen unter Verwendung des RNeasy^TM Verfahrens (Qiagen) präpariert. RNA (10 μg) wurde auf einem 1,5% Agarose, 6% Formaldehyd-Gel getrennt, auf eine Nylonmembran (Zeta-Probe GT Genomic, Bio-Rad) transferiert und mittels UV-Bestrahlung vernetzt. Die Filter wurden 1 Stunde bei 68°C in ExpressHyb^TM Lösung (Clontech) mit [³²P]dCTP-markierten DNA-Sonden hybridisiert und dreimal mit 2x SSC, 0,05% SDS bei Raumtemperatur und zweimal in 0,1x SSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen. Autoradiographien wurden durch Exponieren der Blots an BioMax MS Film (Kodak) mit Verstärkerfolie bei –70°C erhalten. Alle Northern-Blots waren durch Hybridisierung unter Vennrendung einer β-Actin-Sonde normiert.
Luciferase-Aktivität wurde in transfizierten Zellen mittels Chemilumineszenz gemessen. Zusammengefasst: 1 × 10⁵ Zellen wurden in 100 μl Lyse-Puffer (25 mM Tris, pH 7,8 mit H₃PO₄; 2 mM CDTA; 2 mM DTT; 10% Glycerol; 1 % Triton X–100) lysiert. 70 μl Luciferase-Substrat-Puffer (20 mM Tricin; 1,07 mM (MgCO₃)₄Mg(OH)₂5H₂O; 2,67 mM MgSO₄; 0,1 mM EDTA; 33,3 mM DTT; 270 μM Coenzym A (Lithiumsalz); 470 μM Luciferin (Duchefa); 530 μM ATP, End-pH 7,8) wurde zu 100 μl Zelllysat gegeben und 5 Sekunden mit TopCount.NXT Chemiluminescence Counter (Packard) gemessen.
Beispiel 5
Analyse der in vivo Genexpression
Spezielle Pathogen-freie weibliche C57BL/6J-Lep^ob Mäuse, bei Versuchsbeginn 9 Wochen alt, nachfolgend als ob/ob bezeichnet, waren von The Jackson Laboratory (Maine, USA) erhalten. Spezielle Pathogen-freie C57BL/6NCrlBr Mäuse, bei Versuchsbeginn 8 Wochen alt, nachfolgend als Wildtyp (wt) bezeichnet, waren von Charles Rivers Labs erhalten. Die Tiere waren in einer Temperaturkontrollierten Umgebung mit 12 stündigen hell/dunkel Zyklen untergebracht und erhielten Wasser und Nahrung ad libitum, mit Ausnahme des Hungerexperiments. Alle Versuche wurden gemäß den Europäischen Richtlinien für Tierhaltung und -nutzung durchgeführt. Rekombinantes humanes Leptin (R&D Systems) wurde in Endotoxin-freier PBS verdünnt und in einer Dosis von 100 μg/Maus intraperitoneal verabreicht. Im Falle einer Co-Verabreichung von 2A5, ein gegen humanes Leptin gezüchteter Antikörper (Verploegen et al., 1997), war die Leptin-Dosis auf 50 μg/Maus verringert. Die Antikörper-Dosis betrug 200 μg/Maus. Der Endotoxin-Gehalt des Antikörpers betrug 0,07 ng/ml Protein, wie es mit einem chromogenem Limulus Amöben-Lysat-Assay (Coatest, Chromogenix, Stockholm, Schweden) gemessen wurde. Tiere wurden durch Genickbruch getötet. Gewebe wurden unmittelbar entnommen und in Flüssigstickstoff eingefroren. RNA-Extraktion und Northern-Blot Analyse wurde durchgeführt, wie oben beschrieben.
Legenden der Figuren
1. Synergistische Signalgebung von Leptin und Forskolin in PC12-Zellen

(A) Leptin-induzierte NPY-Promotoraktivität in transient transfizierten PC12-Zellen. PC12-Zellen waren mit einem Kontrollvektor (Säule 1 und 2), pMET7-mLRsh (Säule 3 und 4) oder pMET7-mLRlo (Säule 5 und 6) zusammen mit dem pGL3-rNPYluc Reporter co-transfiziert. Die verschiedenen Subkulturen waren scheinstimuliert (nur Wachstumsmedium) oder 72 Stunden mit Maus Leptin (100 ng/ml) behandelt. Luciferase-Aktivität in Zelllysaten ist gezeigt; Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifach durchgeführten Assays.
(B) Co-Stimulierung mit Forskolin auf Leptin-induzierte pGL3-rNPY-Luciferase-Aktivität. PC12-Zellen waren mit pMET7-mLRlo und dem pGL3-rNPYluc Reporter transient co-transfiziert. Die Subkulturen waren nur mit Maus Leptin (schwarze Quadrate) oder zusammen mit Forskolin mit einer Konzentration von 10 μM (schwarze Dreiecke) behandelt. Nach 72 Stunden wurden die Zellen lysiert und auf Luciferase-Aktivität getestet. Durchschnittliche Werte von normierten, relativen Luciferase-Aktivitäten (Xfacher Anstieg) von drei unabhängigen Versuchen sind gezeigt.
(C, D) Analyse von β-NFG und Forskolin Co-Stimulierung auf Leptin-induzierte POMC-Luciferase- (C) oder rPAP-Luciferase-Aktivität (D). PC12-Zellen waren mit pGL3-hPOMCIuc oder pGL3-rPAPluc Reporter transient co-transfiziert und nach zwei Tagen mit Forskolin (F: 10 μM), Leptin (L: 100 ng/ml) und Ratten β-NFG (N: 1 ng/ml) behandelt, wie angegeben, oder blieben unbehandelt (NI). 24 Stunden nach Behandlung wurden die Zellen lysiert und auf Luciferase-Aktivität getestet. Die Daten zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung der fünffach durchgeführten Assays.

2. Selektion eines Leptin-ansprechempfindlichen PC12-Subklons.

(A) Expression von rPAP I mRNA in PC12-Zellen, die mit der langen Isoform des Maus Leptinrezeptors transient transfiziert waren. PC12-Zellen waren mit pMET7-mLRlo transfiziert und 48 Stunden mit Medium (NI, nicht-induziert), Leptin (L), Forskolin (F) oder Forskolin plus Leptin (F+L) behandelt. Gesamt-RNA wurde präpariert und einer RT-PCR Analyse auf rPAP I unterzogen. Amplifizierte PCR-Fragmente wurden auf einem 1 % Agarose-Gel sichtbar gemacht. β-Actin-Amplifikation wurde als Kontrolle verwendet.
(B) Expression von rPAP I mRNA in PC12-LR8-Zellen.

Zellen wurden 48 Stunden mit Medium (NI, nicht induziert) oder Leptin (L) behandelt. RT-PCR Analysen von rPAP I Expression. β-Actin-Amplifikation wurde als Kontrolle verwendet.
3. Northern-Blot Analyse von LIP-I und LIP-II Expression in nicht-differenzierten PC12-Zellen.
PC12-LR8-Zellen wurden mit Leptin (L), Forskolin (F) oder einer Kombination aus beiden (F/L) über die angegebenen Zeiträume behandelt. Hybridisierung mit Maus β-Actin-Sonde wurde als Kontrolle verwendet. NI bezeichnet die nicht-induzierten Kontrollzellen. Die Größen der Transcripte sind rechts angegeben. Biomax MS Film Expositionszeiten waren 5,5 Tage für LIP-1 und LIP-II und 1 Tag für den entsprechenden β-Actin-Blot, alle bei –80°C.
4. DNA-Sequenzen geklonter Amplicons, die LIP-I und LIP-II entsprechen.
Sequenz A beziehungsweise B entspricht den geklonten Amplicons von Ratten LIP-1 und Ratten LIP-II.
LIP-I (349 bp)
LIP-II (484 bp)
5. Northern-Blot Analyse von Leptin-ansprechempfindlichen Genen in differenzierten PC12-LR8-Zellen und Vergleich mit der Induktion in nicht-differenzierten Zellen.
Adhärente PC12-LR8-Zellen wurden mit β-NFG und Forskolin 5 Tage behandelt, um neuronale Differenzierung zu indizieren. Differenzierte Zellen wurden mit Leptin (nF/L) 24 Stunden behandelt oder blieben unbehandelt (nF) bei ständiger Gegenwart von β-NFG und Forskolin. Nicht-differenzierte Zellen wurden 24 Stunden mit Leptin und Forskolin (F/L) oder nur mit Forskolin (F) behandelt. Hybridisierung erfolgte mit Sonden wie angegeben. Maus β-Actin Sonde wurde als Kontrolle eingesetzt. BioMax Film Exposition bei –80°C dauerte 3 Tage für Mx2, 3 Stunden für Peripherin, 4 Tage für PAP III und 16 Stunden für β-Actin.
6. Vergleich der Induktionsmuster differenzierter Transcripte von Leptin und Hyper-IL-6 in nicht-differenzierten PC12-Zellen.
Autoradiographien von Northern-Blot Experimenten sind unter Verwendung von mRNA von PC12-LR8-Zellen gezeigt, die entweder mit Forskolin, Leptin, Hyper-IL-6 oder Kombinationen davon behandelt waren.

(A) Induktionsmuster von Reg I, HIP-I und Peripherin nach einer 12 stündigen Stimulation mit Forskolin (F), Leptin (L), Forskolin plus Leptin (F/L), Hyper-IL-6 (H) oder Forskolin plus Hyper-IL-6 (F/H). Unbehandelte Zellen wurden als Kontrolle (NI) analysiert. BioMax MS Film Expositionszeiten für Reg I, HIP-I und β-Actin waren 4 Tage, 5 Tage beziehungsweise 3 Stunden; und in einem separaten Experiment für Peripherin und β-Actin 16 Stunden und 2 Tage.
(B) Induktionsmuster von PAP I, PAP III, MT-II, Fnk, MRF-1, SOCS-3 und STAT-3 nach einer Stimulation mit Leptin (L) oder Hyper-IL-6 (H) im Vergleich zu nichtbehandelten Kontrollzellen (NI). In allen Fällen dauerte die Stimulation 12 Stunden, mit der Ausnahme von PAP III, wo die Stimulation über 24 Stunden erfolgte. β-Actin-Hybridisierungsmuster sind als Kontrolle gezeigt. BioMax MS Film Expositionszeiten bei –80°C waren 16 Stunden für PAP I und 1 Stunde für β-Actin; 4 Tage für PAP III und 1 Stunde für β-Actin; 3 Tage für MT-II und Fnk und 2 Tage für β-Actin; 3 Tage für MFR-1, 2,5 Tage für SOCS-3 und 2 Tage für β-Actin; und 16 Stunden für STAT-3 und 3 Stunden für β-Actin.

7. DNA-Sequenzen für das HIP-I entsprechende klonierte Amplicon
HIP-I (274 bp)
8. Induktionskinetiken von Leptin-ansprechempfindlichen Genen in nicht-differenzierten PC12-LR8-Zellen.
Es sind Autoradiographien von Northern-Blot Experimenten unter Verwendung von PC12-LR8-Zellen gezeigt, die wie gezeigt behandelt und auf eine Expression der angegebenen Gene besondet wurden. T₀ gibt den Expressionslevel vor Stimulation an. Hybridisierung mit der Maus β-Actin-Sonde wurde als Kontrolle verwendet. Größen der Transcripte sind auf der rechten Seite markiert.

(A) Northern-Blot Analyse der unmittelbar frühe Antwort-Gene. PC12-LR8-Zellen waren unbehandelt gelassen (NI: nicht induziert) oder waren mit Forskolin (F), Leptin (L) oder einer Kombination aus beiden (F/L) zu den angegebenen Zeitpunkten behandelt. BioMax MS Film Expositionszeiten für die verschiedenen Transcripte waren Fnk: 6 Tage, MT-II: 5 Tage, MRF-1: 6 Tage, SOCS-3: 14 Stunden, STAT-3: 14 Stunden, β-Actin: 5 Stunden.
(B) Unmittelbar frühe Antwort-Gen-Satz: frühe Kinetiken. PC12-LR8-Zellen waren ausschließlich mit Leptin (L) oder mit einer Kombination aus Leptin und Forskolin (F/L) für die angegebene Zeitdauer behandelt. BioMax MS Film Expositionszeiten waren: Fnk: 3 Tage, MT-II: 3 Tage, MRF-1: 3 Tage, SOCS-3: 2,5 Tage, STAT-3: 2,5 Tage, β-Actin: 1 Stunde.
(C) Northern-Blot Analyse der späten Target-Gene. PC12-LR8-Zellen waren unbehandelt gelassen (NI: nicht induziert) oder waren mit Forskolin (F), Leptin (L) oder einer Kombination aus beiden (F/L) für die angegebenen Zeiträume behandelt. BioMax MS Film Expositionszeiten waren: Ann VIII: 6 Tage, PAP I: 14 Stunden, Squalenepoxidase: 5 Tage, UGT: 5 Tage, β-Actin: 14 Stunden.

9. MT-II, Fnk und PAP I Genexpression in Leptin-behandelten ob/ob Mäusen.
Leptin-defiziente ob/ob Mäuse waren unbehandelt gelassen(-) oder waren mit Leptin (100 μg; +) intraperitoneal behandelt. Mäuse wurden 5 Stunden nach der Behandlung getötet. Es ist Northern-Blot Analyse von MT-II und Fnk in Leber und PAP I Expression in Jejunum gezeigt. Hybridisierung mit β-Actin-Sonde wurde als Kontrolle verwendet und ist unten gezeigt. BioMax MS Film Expositionszeiten waren 4 Stunden, 3 Tage, 4 Stunden und 8 Stunden für MT-II, Fnk, PAP I beziehungsweise β-Actin.
10. MT-II und Fnk Genexpression in hungernden Wildtyp-Mäusen.
WT-Mäuse mussten 36 Stunden hungern. Nach 24 Stunden wurden die Mäuse mit PBS (–) oder Leptin (50 μg, mit 200 μg 2A5 anti-humanem Leptin Antikörper supplementiert; +) behandelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (–24, 0, 2, 6, 12 Stunden, oben angegeben) wurden die Mäuse getötet. RNA wurde aus Lebergewebe (Panel A) oder Jejunum (Panel B) extrahiert und Northern-Blot Analyse unter Verwendung von MT-II und Fnk-Sonden, wie angegeben, unterzogen. Hybridisierung mit der Maus β-Actin-Sonde wurde als Kontrolle verwendet und ist unten gezeigt. Assays wurden durchgeführt und sind doppelt dargestellt. BioMax MS Film Expositionszeiten in Panel A waren 2 Stunden, 2 Tage und 3 Stunden für MT-II, Fnk, beziehungsweise β-Actin. In Panel B waren die Expositionszeiten 2 Stunden für MT-II und 3 Stunden für β-Actin.
Tabelle 1:
Tabelle 1. Charakteristika der identifizierten Amplicons. Die Längen der entsprechenden Transcripte wurden aus den Northern-Blot Analysen abgeschätzt. In der RDA Zahlenspalte entsprechen 1, 2 beziehungsweise 3 einem RDA-Experiment von nicht-differenzierten PC12-Zellen, die mit Forskolin oder Forskolin plus Leptin behandelt waren; von differenzierten PC12-Zellen, die in β-NFG und Forskolin gehalten und mit Leptin behandelt waren oder unbehandelt blieben; oder von nicht-differenzierten PC12-Zellen, die mit Hyper-IL-6 beziehungsweise Leptin behandelt waren.
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SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung des Gens, welches für das Pankreatitis-assoziierte Protein I oder ein funktionales Fragment davon kodiert, für das Screening nach Molekülen, die direkt oder indirekt in die späte Leptin-Induktion eingreifen.
Verwendung des Gens, welches für das Pankreatitis-assoziierte Protein I oder ein funktionales Fragment davon kodiert, für das Screening nach Molekülen, die nach Bindung eines Zytokins direkt oder indirekt in die Induktion eines Rezeptorkomplexes, der gp130 umfasst, eingreifen.
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Zytokin Leptin ist.
Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das funktionale Fragment der Promotor des Gens ist.
Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Induktion von einer Verbindung, die auf die Adenylatzyklase einwirkt, unterstützt wird.
Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Induktion von einer Verbindung, die auf eines der nachgeschalteten Targets der Adenylatzyklase einwirkt, unterstützt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die auf die Adenylatzyklase oder ihre nachgeschalteten Targets einwirkende Verbindung Forskolin ist.