JPWO2002101034A1 - レプチン誘導遺伝子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、レプチン投与によって誘導される、新規なレプチン誘導遺伝子を提供する。本遺伝子はレプチンシグナルのすぐ下流に位置するため、本遺伝子の動きを追跡することにより、レプチン抵抗性を評価することができる。また、本発明の遺伝子を指標として、レプチン抵抗性を改善することができる薬剤のスクリーニングが可能となる。
Description
技術分野
本発明は、レプチン(Leptin)によって誘導される遺伝子に関する。
背景技術
レプチンは肥満疾患モデルマウスであるob/obマウスからpositional cloningによって単離されたサイトカインである。ob/obマウスはレプチン遺伝子の変異によって野生型のレプチンが産生されず、過食、肥満、II型糖尿病などの表現型を呈する。このマウスにレプチンを投与するとこれらの症状は改善される。このことから、レプチンが生体内でエネルギーバランスの調節に働いていることが明らかである。
レプチンは成熟脂肪細胞より産生される。その血中量は絶食(空腹)において減少し、反対に摂食により増大する。他のサイトカインと同様に、レプチンはそのシグナルを固有の受容体を介して細胞内へと伝達している。レプチン受容体は生体内のさまざまな臓器に存在することが明らかにされている。その中で、特に食欲制御、エネルギーバランスの調節に直接関わっていると考えられる部位は、脳内視床下部である。
現在までにレプチン投与により、Stat3と呼ばれる転写因子が視床下部において急速に活性化されるのが確認されている。しかし現在のところ、この活性化の生理的意義は定かではない。ob/obマウスにレプチンを投与して先の病的症状を改善させるのには、数週間に渡る投与が必要である。さらにレプチン投与により転写レベルで各種ニューロペプチドの発現レベルの変化が観察される。具体的には、レプチンの投与後数日してから、pro−opiomelanocortin(POMC)の上昇、並びにneuropeptide Y(NPY)やagouti−related peptide(AGRP)の減少が観察される。このことから、視床下部においてはレプチン投与により何らかの遺伝子が活性化もしくは不活性化されてPOMC、NPY、AGRPなどの転写調節、ひいては肥満、II型糖尿病などの解消へと導くカスケードが想定される。そこで、レプチン投与後に活性化または不活性化される遺伝子を同定できればPOMC、NPY、AGRPなどへの転写のカスケードの解明につながる。更に、このカスケードを構成する因子は、肥満やII型糖尿病などの新たな創薬のターゲットとなることが考えられる。
発明の開示
本発明の課題は、レプチン投与に応答して発現レベルが変化する新規なレプチン応答性遺伝子、この遺伝子によってコードされる蛋白質、並びにそれらの製造方法および用途を提供することにある。
マウスなどの実験動物を用いてレプチンによって早期に誘導される遺伝子を取得する試みは、米国 Millenium pharmacuetical社で行われたが成功に到らなかった。この原因として彼等は、視床下部に存在するneuronが全てレプチン受容体を有するものでなく、レプチンに反応するものがあってもノイズに埋もれてしまうことを指摘している(White,D.W.Zhou,J.Stricker−Krongrad,A.Ge,P.Morgenstern,J.P.Dembski,M.Tartaglia,L.A.2000.Identification of leptin−induced transcripts in the mouse hypothalamus.Diabetes 49,pp 1443−1450)。
これに対して本発明者らは、受容体側のシグナル経路は正常であるが、リガンドであるレプチンの合成が正常にできないため肥満になっているob/obマウスを実験に用いた。ob/obマウスは外部から投与したレプチンに反応することから、レプチン投与の有無によってもたらされる遺伝子発現の差異を大きくできると考えた。また差異発現遺伝子を取得するため、Clontech社のPCR−select subtraction kitを使用して、subtracted cDNAを作成した。さらに真に発現差異のあるものをスクリーニングするため、subtracted cDNAのinsertをPCRによって増幅してこれをナイロン膜上に並べ、希少cDNAを検出できるように、ジゴキシゲニン(DIG)標識したDNAプローブを作成することによってレプチン誘導遺伝子をクローン化することに成功した。すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、並びにそれらを用いたスクリーニング方法に関する。
〔1〕下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(b)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
(c)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(d)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(e)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に見出される部分アミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔2〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
〔3〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
〔4〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔3〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔5〕〔4〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質またはペプチドを回収する工程を含む、〔2〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔6〕〔2〕に記載の蛋白質に結合する抗体。
〔7〕配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔8〕次の工程を含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性の評価方法。
(a)被験化合物の存在下で〔1〕に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
(b)前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
〔9〕次の工程を含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
(a)〔8〕に記載の方法によって、被験化合物の〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
(b)被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
〔10〕〔1〕に記載のポリヌクレオチド、〔2〕に記載の蛋白質、および〔3〕に記載のベクターからなる群から選択された少なくとも1つの成分を含有する医薬組成物。
〔11〕次の工程を含む、生体試料中の〔2〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドの測定方法。
(1)生体試料を〔6〕に記載の抗体と接触させる工程、および
(2)〔2〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドに結合する、〔6〕に記載の抗体を検出する工程
〔12〕〔6〕に記載の抗体を含む、〔2〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドの測定用キット。
〔13〕次の工程を含む、生体試料中の〔1〕に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
(1)生体試料を〔7〕に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、および
(2)生体試料中に含まれる、〔7〕に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する工程
〔14〕〔7〕に記載のポリヌクレオチドを含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドの測定用キット。
〔15〕〔2〕に記載の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物。
〔16〕ノックアウト動物またはトランスジェニック動物である、〔15〕に記載の非ヒト脊椎動物。
〔17〕配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現が抑制されているマウス胚性幹細胞。
〔18〕配列番号:1に記載された塩基配列を構成することができるエキソンにおいて、少なくとも開始コドンに変異を有する〔17〕に記載のマウス胚性幹細胞。
本発明は、新規なレプチン誘導遺伝子を提供する。本発明のレプチン誘導遺伝子の塩基配列配列番号:1(マウス)、および配列番号:3(ヒト)に、そして本発明のレプチン誘導遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:2(マウス)、および配列番号:4(ヒト)に示す。本発明の遺伝子のESTs(AK002535,Riken full length cDNA project,cDNA from mouse kidney)、ならびにそのORFより予想されるアミノ酸配列は知られていた。しかし、遺伝子産物として実際に生体中に存在するか否かは不明であった。また塩基配列のホモロジー検索の結果、ホモロジーのある遺伝子としてはヒトのオーソログ(GenB ank Acc.No.Z84479)が見出されるのみである。しかもホモロジーを示した塩基配列は、アンチセンス配列となっており、正しい塩基配列とアミノ酸配列を導き出すことはできない。更に、本発明のレプチン誘導遺伝子によってコードされるアミノ酸配列には、既知のモチーフなどは確認できなかった。したがって、これらの遺伝子がレプチンによって誘導されることは、本発明によってもたらされた新規な知見である。
加えて本遺伝子産物が実際に生体内に存在することをノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット、そして免疫化学染色によって証明した。ノーザンブロットおよび免疫化学染色解析の結果、本発明の遺伝子は脳にも発現がみられるが、腎、肝臓に強い発現が見られた。
本発明の遺伝子は、レプチンに応答して発現が誘導されることから、レプチン応答性の指標として有用である。すなわちレプチン受容体を発現する肝臓hepatocytesにおけるレプチン依存的なグリコーゲンの貯蔵を変化させる薬剤のスクリーニングのための指標として使用できる。あるいは、免疫化学染色解析より睾丸の間細胞(Leidig cell)にこの遺伝子の発現が確認されたこと、そしてレプチンの投与によりテストステロンの産生が阻害されることなどから、これらの男性ホルモン産生経路を調節する化合物のスクリーニングの指標としても使用可能である。
ob/obマウスでは、レプチンの欠損が肥満の原因となっていた。一方ヒトにおいては、レプチンの欠損によって肥満になっている場合は非常に稀で、多くの肥満患者では血中のレプチン濃度が肥満の程度とともに上昇している。この事実は、肥満を有するヒトに単にレプチンを投与するだけでは、肥満を改善できないことを示している。このような状態は、レプチンのシグナルが正しく伝達できない状態、すなわちレプチン抵抗性の状態と言うことができる。ヒトの肥満においては、レプチンの投与ではなく、レプチンに対する反応性の低下、すなわちレプチン抵抗性を解除する必要がある。このように、本発明の遺伝子の発現レベルに基づいて、肥満の治療方針を選択することができる。本発明に基づいて、次の工程を含む、レプチン応答性を診断する方法が提供される。
(a)被検者から採取された生体試料における以下の指標i)〜iv)のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および
i)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
ii)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
iii)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
iv)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
(b)(a)の測定値をレプチン応答性と関連付ける工程
上記診断方法において、各ポリヌクレオチドの発現レベルとは、ポリヌクレオチドの発現強度、および各ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の発現レベルのいずれかを測定することによって評価することができる。与えられた塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現強度は、ハイブリダイゼーションやPCRを利用して測定することができる。また、与えられたアミノ酸配列を有する蛋白質の発現レベルは、イムノアッセイなどによって測定することができる。
本発明において前記発現レベルの測定値は、被検者のレプチン応答性を示している。たとえば測定値が低い場合には、レプチン応答性が低いと判断される。特に、血中のレプチン濃度に異常が無い場合、あるいは十分量のレプチンの投与を受けているのにもかかわらず、前記測定値が健常者に比較して低い場合には、レプチン応答性が低いと見なすことができる。本発明の診断方法は、血中のレプチン濃度を考慮することによって、より適切な結果が期待できる。あるいは本発明の診断方法は、レプチンの投与を受けている被検者における、レプチン応答性の評価に有用である。
本発明の診断方法を実施するために必要な要素を組み合せて、レプチン応答性の診断用キットを構成することができる。たとえば後に述べるような、本発明のポリヌクレオチドや蛋白質を測定するためのキットは、レプチン応答性の診断用キットとして有用である。
本発明の遺伝子は、レプチンによるシグナルの伝達経路の中で、レプチンの刺激に対して短時間のうちに応答する。POMC、NPY、あるいはAGRPなどの各種のニューロペプチド遺伝子の転写が、レプチンの投与によって影響を受けることは公知である。しかし、これらのニューロペプチドの転写レベルに変化が現れるのは、レプチン投与後数日してからである。他方、本発明の遺伝子は、レプチン投与に速やかに応答する。つまり、本発明の遺伝子は、レプチンのシグナル伝達経路において上記ニューロペプチドより上流において機能しているものと考えることができる。したがって、本遺伝子とこれらのニューロペプチドとの関連性の解明は、レプチンのシグナル伝達経路の全体像を明らかにすることにつながる。また本発明の遺伝子は、レプチンによって速やかに応答する遺伝子であることから、本遺伝子の動きを指標として、本遺伝子とレプチン抵抗性との関連を調べることができる。更に、肥満の程度に対応して本遺伝子の発現レベルに差異があれば、肥満の指標として用いることもできる。
加えて、これらの事実により、本発明の遺伝子は、抗肥満薬のスクリーニングに使用することができる。すなわち、本発明の遺伝子がレプチンに応答して発現が上昇することから、レプチンの存在下で本遺伝子の発現を増加させる化合物には、レプチン抵抗性を解除し、肥満を抑制する作用が期待できる。レプチン抵抗性は、ヒトにおける肥満の重要な原因の一つと考えられることから、本発明の遺伝子は、肥満の治療薬開発や肥満の分子生物学的解明において、重要な標的となる。
また本発明は、前記(a)−(e)のいずれかに記載されたポリヌクレオチドによってコードされる実質的に純粋な蛋白質に関する。本発明において、実質的に純粋な蛋白質とは、当該蛋白質の他に生物に由来する大型分子を実質的に含まない状態にあることを言う。本発明における実質的に純粋な蛋白質は、少なくとも70%以上、通常80%、好ましくは90%、より好ましくは95%以上、たとえば99%の純度を有する蛋白質を言う。蛋白質の純度を測定する手法は公知である。蛋白質の純度を知るための手法として、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やHPLC等を示すことができる。
本発明の蛋白質は、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質は、例えば、後述するように本発明の蛋白質をコードするDNAを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現した蛋白質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然の蛋白質は、例えば、後述する本発明の蛋白質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 16.1−16.19)。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーション(例えば、「On the fidelity of mRNA translation in the nuclease−treated rabbit reticulocyte lysate system.Dasso,M.C.,Jackson,R.J.(1989)Nucleic Acids Res.17:3129−3144」参照)などにより本発明の蛋白質を調製することも可能である。
本発明には、本実施例において同定されたマウス、またはヒト由来の蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質には、例えば、配列番号:2(マウス)または配列番号:4(ヒト)に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の変異体、ホモログ、バリアントなどが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がレプチンの投与によって生体内で発現誘導されることを言う。このような機能は、その発現の消失または低下により推測することができる。
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法(例えば、部位特異的変異誘発法(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 8.1−8.5))を利用して調製することができる。また、このような蛋白質は、自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列(配列番号:2または配列番号:4)において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/もしくは付加などにより異なる蛋白質が含まれる。
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、30アミノ酸以内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内(例えば、3アミノ酸以内)である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能の保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。蛋白質を構成するアミノ酸を似た性質のアミノ酸に置換することは、保存的置換(conservative substitution)と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 6.3−6.4)、あるいは遺伝子増幅技術(PCR)(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 6.1−6.4)を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、本実施例において同定された蛋白質をコードするポリヌクレオチド(配列番号:1、または配列番号:3)またはその一部をプローブとして、あるいは該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離することができる。さらに単離したポリヌクレオチドを基に、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を調製することができる。本発明には、本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が含まれる。機能的に同等な蛋白質を単離するための生物としては、例えば、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ等の脊椎動物が挙げられるが、これらに制限されない。
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常「1xSSC、0.1%SDS、37℃」程度であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1%SDS、42℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「0.1xSSC、0.1%SDS、65℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号:2または配列番号:4に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%以上)の配列の同一性を指す。アミノ酸配列の相同性は、BLASTXによる相同性検索により決定することができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。本発明の蛋白質の部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に結合する抗体の調製に利用することができる。特に、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列から選択され、該アミノ酸配列に特異的に見出されるアミノ酸配列は、本発明の蛋白質に結合する抗体を得るための免疫原として有用である。特異的に見出されるアミノ酸配列とは、他の蛋白質を構成するアミノ酸配列とは異なる連続したアミノ酸配列を言う。なお他の蛋白質とは、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる蛋白質を言う。したがって、配列番号:2および配列番号:4に記載のアミノ酸配列の間で共有されたアミノ酸配列は、本発明の部分ペプチドに含まれる。本発明の部分ペプチドは、少なくとも7アミノ酸、好ましくは9アミノ酸以上、より好ましくは12アミノ酸以上、より好ましくは15アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
また本発明は、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の蛋白質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNA、RNAなども含まれる。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように、配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列もしくはその一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法やこれら塩基配列の情報に基づき設計したプライマーを用いた遺伝子増幅法(PCR)等の常法により単離することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明において単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在するポリヌクレオチドやその断片とは構造的に異なるポリヌクレオチドを言う。単離されたポリヌクレオチドとして、具体的には、たとえば次のようなポリヌクレオチドを示すことができる。
ベクターやゲノムに人為的に組み込まれた状態にあるDNA
分離されたDNA(cDNA、ゲノム断片、制限酵素断片、あるいはPCRの合成産物等を含む)
本発明の蛋白質に他の蛋白質を融合させた融合蛋白質、あるいはタグを付加した蛋白質などをコードするDNA
本発明は、また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、挿入したポリヌクレオチドを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター(プロメガ社製)を、大腸菌における発現であればpETベクター(Invitrogen社製)を、培養細胞における発現であればpME18S−FL3ベクター(GenBank Accession No.AB009864)を、生物個体における発現であればpME18Sベクター(Mol Cell Biol.8:466_472(1988))を、好適に用いることができる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドのベクターへの挿入は常法、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.4_11.11)により行うことができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを保持する形質転換体を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造のために使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。
また、本発明の宿主細胞には、レプチン誘導蛋白質の機能解析やレプチン誘導蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤のスクリーニングのために用いる細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 9.1−9.9)、リポフェクタミン法(GIBCO−BRL社製)、マイクロインジェクション法などの方法で行うことが可能である。形質転換体からのレプチン誘導蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離・精製法を利用して行なうことができる。
本発明はまた、配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な、少なくとも15塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするDNAを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp−100bp、好ましくは15bp−35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、3’側の領域は相補的である必要があるが、5’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明のレプチン誘導蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスが含まれる。アンチセンスは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも15bp以上、好ましくは100bp、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有し、好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。このようなアンチセンスは、例えば、配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオネート法(Stein,1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides.Nucleic Acids Res 16,3209−21(1988))などにより調製することができる。
本発明のポリヌクレオチドには、例えば、遺伝子治療への応用が考えられる。本発明のポリヌクレオチドを利用した遺伝子治療の標的となる疾患としては、例えば、肥満や糖尿病が好適である。すなわち、本発明の遺伝子の変異や発現異常によって、レプチン抵抗性が形成されているときには、本発明の遺伝子を生体内で発現させることによって、レプチン抵抗性を解除できる可能性がある。これら分子を遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与すればよい。
また、本発明のポリヌクレオチドのアンチセンスは、レプチン抵抗性のモデルの構築に有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチドのドミナントネガティブな変異により、本発明のポリヌクレオチドが肥満をもたらす場合には、本発明のポリヌクレオチドの発現の抑制によって、レプチン抵抗性モデルとすることができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、公知の方法によって得ることができる。たとえばポリクローナル抗体の場合には、常法に従い免疫原を家兎に免疫することにより得ることが可能である(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.12_11.13)。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従い免疫原でマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.4_11.11)。
免疫原には、本発明のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなるオリゴペプチドや、本発明の遺伝子を大腸菌などで発現し精製した組換え蛋白質を用いることができる。オリゴペプチドを構成するアミノ酸配列として、配列番号:2と配列番号:4の間で保存されたアミノ酸配列を用いれば、種を越えて本発明の蛋白質を認識することができる抗体を得ることができる。また、両配列の間で相違するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを免疫原とすれば、種特異的な抗体とすることができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、これら蛋白質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞などから蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療などの目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス(例えば、「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice,Mendez,M.J.et al.(1997)Nat.Genet.15:146−156」参照)に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる(Methods in Enzymology 203,99−121(1991))。
また本発明は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する方法を提供する。この方法は、次の工程(a)および(b)を含む。
(a)被験化合物の存在下で本発明ののポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
(b)前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する方法は、この活性を有する化合物のスクリーニング方法に有用である。すなわち本発明は、次の工程を含む、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
(a)前記評価方法によって、被験化合物の本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
(b)被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法に用いる、本発明の遺伝子を発現する細胞には、たとえば腎臓の尿細管もしくは肝臓のhepatocytes由来の細胞株などを用いることができる。スクリーニングの具体的な方法としては、被験化合物の存在下でレプチンと前記細胞とを接触させる。一定時間の培養の後に、本発明の遺伝子の発現レベルの変化を測定し、被験化合物非存在下でレプチンと接触させて培養した対照における発現レベルと比較する。
遺伝子の発現レベルは、遺伝子や発現産物である蛋白質の量を指標として測定することができる。遺伝子は定量的PCR等の公知の手法により定量することができる。また蛋白質の量は、ELISAなどの手法によって測定される。
スクリーニングに用いる被験試料には、あらゆる化合物を用いることができる。具体的には、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。
このスクリーニングにより単離される化合物は、レプチンに対する応答性を調節する化合物の候補となる。また、生体内において、本発明の蛋白質とこれと相互作用する分子との該相互作用を阻害する化合物の候補となる。
本発明の遺伝子、その蛋白質、該遺伝子の発現を制御する化合物、あるいは該蛋白質の活性を制御する化合物を医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、ポリヌクレオチドを治療薬として使用する場合には、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに組込み、患者に投与することも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能であろう。
遺伝子の発現レベルは、転写生成物であるmRNAや、翻訳産物である蛋白質、ならびにそれらの断片を測定することにより明らかにすることができる。本発明は、以下のポリヌクレオチドの測定方法、あるいは蛋白質および/またはその部分ペプチドの測定方法と、該測定方法のためのキットを提供する。
まず本発明のポリヌクレオチドは、配列番号:1に示す塩基配列の相補配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションにより測定することができる。あるいは、配列番号:1に示す塩基配列およびその相補鎖に相補的な少なくとも15塩基からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法によって、本発明の遺伝子の発現レベルを測定することもできる。mRNAを鋳型とするRT−PCR法も公知である。
また本発明の遺伝子の翻訳生成物である蛋白質は、本発明の蛋白質を認識する抗体を使って、イムノアッセイの原理に基づいて測定することができる。本発明の蛋白質を認識する抗体を取得する方法は既に述べたとおりである。
上記測定方法に必要な成分を、予め組み合わせてキットとすることができる。たとえば、mRNAを鋳型としてRT−PCRを行うためのプライマー、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、および反応に好適な緩衝液からなるキットを構成することができる。また、本発明の蛋白質を認識する標識抗体、標識を測定するための試薬、そして免疫反応に好適な緩衝液からなるキットを構成することもできる。
また、本発明は、本発明の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物を提供する。ここで「発現の改変」には、発現の増強および減弱が含まれる。また、「蛋白質の発現の改変」は、転写と翻訳のいずれのステップの改変も含まれる。このような非ヒト脊椎動物には、内因性の本発明の蛋白質の発現を停止または減少させるように操作された動物(ノックアウト動物)および外来性の本発明の蛋白質を発現するように該蛋白質をコードする遺伝子が導入された動物(トランスジェニック動物)が含まれる。このようなノックアウトおよびトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、文献「ニューロサイエンス・ラボマニュアル3、神経生物学のための胚と個体の遺伝子操作法(編集・近藤寿人、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社)」に従って作製することができる。
例えば、本発明の蛋白質をコードするDNAが染色体に組込まれたトランスジェニック動物を作製することにより、これらの蛋白質の発現を上昇させたり、発現パターンや分布の改変を行うことができる。また、これらの内因性遺伝子の発現制御領域に変異を導入したり、他の発現制御領域を付加または置換することなどにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に転写レベルを上昇、下降、または発現パターンや分布の改変を行うことができる。一方、エキソンの一部を欠損させたり、翻訳領域への点突然変異の導入により終止コドンへ置換することにより、タンパク質への翻訳を修飾することもできる。また、アンチセンスRNAやリボザイムを発現させることで、本発明の遺伝子の発現を制御することも可能である。これらの変異の導入は、公知の方法により行うことができる。
このような非ヒト脊椎動物は、転写機能の研究、転写に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング等に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
前に述べたように、本発明の遺伝子は、レプチンによるシグナル伝達経路の上流を構成する遺伝子と考えられる。したがって、本発明の遺伝子の発現を抑制した動物や細胞は、レプチン抵抗性を解除する薬剤のスクリーニングに有用である。中でも、本発明の遺伝子の発現を欠失させた胚性幹細胞(embryonic stem cell;ES細胞)は、たとえば当該遺伝子の発現を抑制したノックアウト動物の作成に有用である。
非ヒト動物における、本発明の遺伝子の発現抑制には、公知の方法を応用することができる。たとえばマウスであれば、配列番号:1に示した塩基配列中、とくに蛋白質コード領域を構成するエキソンをゲノムの塩基配列上にマッピングし、その塩基配列の少なくとも一部に変異を導入して蛋白質への翻訳を正常に行えないようにする。具体的には、たとえばエキソンの一部の塩基配列の置換、欠失、付加、あるいは挿入などにより、エキソンの途中にストップコドンを生じるようにする。その結果、変異を導入された細胞においては、本発明の遺伝子の正常な発現が行えなくなる。ゲノムの塩基配列に変異をもたらすには、相同組み換えの技術が用いられる。
こうして構築された、本発明の遺伝子の発現を欠失させたES細胞によって、ノックアウトマウスを得ることができる。ノックアウトマウスを得るには、まずこのES細胞をマウスの胚盤胞期の卵子に注入し、仮親の子宮に移植する。ES細胞を注入した卵子からは、本来の受精卵とES細胞由来の細胞からなるキメラマウス(ファウンダー)が生まれる。ファウンダーと野生マウスの交配によって生まれてくる子孫にノックアウトされたゲノムが確認できれば、その子孫は、ノックアウトされた遺伝子をヘテロに持つノックアウト動物である。ヘテロの子孫を更に交配することによって、ノックアウトマウス(ホモ)を得ることができる。
本発明者らは、配列番号:1に示す塩基配列の蛋白質コード領域中、特に開始コドンを含む領域を欠失させることにより、マウスにおける本発明の遺伝子の発現を、ほぼ完全に抑制できることを確認した。したがって、本発明の遺伝子の発現を抑制した非ヒト動物として、本発明の遺伝子における開始コドンに変異を有するノックアウト動物は好ましい。あるいは本発明の遺伝子の発現を抑制した細胞として、本発明の遺伝子における開始コドンに変異を有する細胞は好ましい。開始コドンの変異は、塩基の置換、欠失、付加、あるいは挿入によってもたらされる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1] マウスのレプチン誘導遺伝子の単離
ob/obマウスにおけるレプチン投与の有無によって発現レベルが変動する遺伝子を、マウスレプチン誘導遺伝子として単離した。ob/obマウスは、受容体側のシグナル経路は正常であるが、リガンドであるレプチン合成が正常にできないため肥満を呈する。このマウスにレプチンを投与すれば、レプチンによって誘導される遺伝子を見出すことができる。このような条件とすることにより、レプチン投与の有無によってもたらされる遺伝子発現の差異を大きくできると考えた。発現レベルの異なる遺伝子の取得には、サブトラクション法を利用した。具体的な操作は以下のとおりである。
まずob/obマウスにレプチンを投与した。ob/obマウスは米国ジャクソン研究所より購入した。体重1gにつき1μgのマウスレプチン(R & D社)、もしくはPBSを静脈注射によって投与し、1時間後に視床下部を採取し、Total RNAをグアニジン−チオシアネート法によって抽出した。その後Roche社のoligo dT cellulose columnを用いてmRNAを精製した。このmRNAを用いてPCRサブトラクション法を実施した。
PCRサブトラクション法には、市販のキット「PCR−SelectTM cDNA Subtraction kit」(CLONTECH製)を用いた。
まず各mRNA2μgからAMV逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。レプチン投与後のcDNAをテスター、PBS投与後のcDNAをドライバーとした。cDNAはRsaIで消化し断片化した。RsaIによる断片は、平滑末端を有する。
次に、テスターcDNAを2群に分け、それぞれに異なるcDNAアダプター1、2Rを結合した。各アダプターの塩基配列は次のとおりである。なおドライバーcDNAにはアダプターを結合しない。
アダプター1
アダプター2R
次に、1stハイブリダイゼーションと2ndハイブリダイゼーションの2回のハイブリダイゼーションを行った。1stハイブリダイゼーションでは、各テスターに過剰量ドライバーcDNAを加え、98℃1.5分間の熱変性を行った後、68℃で8時間インキュベーションした。2ndハイブリダイゼーションでは、1stハイブリダイゼーションから得られたサンプルを変性せずに混合し、さらに変性cDNAドライバーを加え、68℃で一晩インキュベーションした。反応後のハイブリダイゼーション溶液を希釈用バッファーで希釈し、75℃で5分インキュベートして1本鎖のアダプター部を2本鎖に伸長し、PCRの鋳型に用いた。アダプターに対応するプライマーであるPCRプライマー1を用いたPCRを行い、両端に異なるアダプターを持ったcDNAのみを選択的に増幅した。このとき、ドライバーcDNAの末端にはアダプターが結合していないので、ドライバーcDNAとハイブリダイズしたテスターcDNAは増幅されない。
これの一部を鋳型とし、アダプタープライマー1、2Rの内側のプライマーであるNested PCRプライマー1と2Rを用いてPCRを行い、さらに選択性を増した生成物を得た。
この生成物をpT−Adv(Clontech社)ベクターにクローニングし、BRL社のElctroMaxDH10Bセルを用いて形質転換を行い、サブトラクションライブラリーを作成した。
ライブラリーの各クローンcDNAのインサートをPCRによって増幅し、ナイロンメンブレン上にスポットしてアレイを作製した。次に、レプチン投与およびPBS投与マウスcDNAから調製したジゴキゲニン標識プローブを用いて、ハイブリダイズを行った。検出にはRoche社の抗ジゴキゲニン抗体、CDP−starを用いた。ハイブリダイゼーションの結果、発現量に差が見られたクローンをスクリーニングした。
サブトラクションライブラリーのスクリーニング
レプチン、もしくはPBS投与後の視床下部より調整した各mRNA1μgを使用して逆転写酵素反応によりDIG−dUTPを取り込んだcDNAプローブを作成した。作成はRoche社‘The DIG system user’s guide for filter hybridization、pp20−21,Preparing cDNA with digoxigenin−11−dUTP’.に従った。生成物を5−10ng/mlの濃度でstandard hybridization buffer(5xSSC,0.1%N−lauroylsarcosine,0.02%SDS,1%blocking reagent{Roche社Blocking Reagent})に溶解し、ハイブリダイゼーションに用いた。PBS−投与後のmRNAをドライバーとして得られたサブトラクションライブラリーより384well,3枚分(計1152クローン)のコロニーを任意に選択した。
これらの大腸菌のストックよりpT−Advベクターに挿入されているcDNAをPCR法によって増幅し、Amersham−Pharmacia社のpositively charged Nylon膜上にduplicateでスポットした(サブトラクションcDNAアレイ)。これらのアレイを4組作成し、それぞれPBS−,レプチン投与後のDIG標識cDNAプローブで68℃1晩ハイブリダイズした。その後、2xSSC、0.1%SDS溶液を用いて室温で五分ずつ二回洗浄し、68℃の0.1xSSC、0.1%SDS溶液で20分ずつ二回洗浄した。その後アレイ上で発現量に差の見られたクローンのインサートをプローブとしてcRNAを作成し、ノーザンブロットを行い、実際に発現量に差異があるか否かを検討した。
次に発現量に差異があるポジティブクローンをマウスのレプチン誘導遺伝子として選択し、そのインサートの塩基配列を決定した。本サブトラクションライブラリーはRsaIによる切断を経ているためこのライブラリーでは全長cDNAが得られなかった。ノーザンブロット解析により本遺伝子は腎臓、肝臓にその発現が多く見られたことからマウス腎臓由来のmRNAを使用してcDNAライブラリーを作成した。cDNAライブラリーはBRL社(現In Vitrogen社)のSuperscript Plasmid Systemを使用して作成し、pSPORT1ベクターにcDNAを挿入した。先に同定された遺伝子断片をプローブとしてライブラリーをスクリーニングして全長を取得した。マウスレプチン誘導遺伝子の塩基配列を配列番号:1に、また、オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列番号:2に記載する。
[実施例2] レプチンによるob/obマウス視床下部における遺伝子誘導 ob/obマウスに体重1g当たり1μgのマウスレプチン(+)、またはPBS(−)を静脈経由で投与し、1時間後に視床下部を摘出してTotal RNAおよびmRNAを抽出した。抽出したmRNA0.4μgをアガロースゲル上で分離し、Amersham−Pharmacia社のpositively charged Nylon膜上にキャピラリートランスファーした。本発明の遺伝子の全長cDNAより調製したDIG標識cRNAをプローブとしてハイブリダイズさせ、ストリンジェントな条件下(0.1xSSC,0.1%SDS,68℃)で洗浄した。その後アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体、およびCDP−Starを用いてシグナルを検出した。化学発光シグナルはATTO社のCCDカメラで定量した。
その結果レプチン投与によりこの転写産物量は約2倍になることが明らかになった。さらにネガチィブコントロールとして同量のmRNAがのせられたメンブレンを別のプローブ(BRI遺伝子,AF272044)でプロービングを行った。この場合にはレプチン、PBS投与による遺伝子のmRNAレベルの差異は観察されなかった。以上の結果を図1に示した。この実験により、本発明の遺伝子(A9)が、ob/obマウスの視床下部において、レプチンの投与1時間後に顕著に発現が増強することが裏付けられた。
[実施例3] マウスレプチン誘導遺伝子の組織特異的発現
マウスレプチン誘導遺伝子の組織特異的発現をノーザンブロットにより解析した。
野生型マウス各組織よりTotal RNAをグアニジン−チオシアネート法によって抽出した。このTotal RNAを各8μgずつ使用し、該遺伝子のDIG標識cRNAをプローブとしてノーザンブロットを行った。Total RNAはアガロースゲルによって分離した後Amersham−Pharmacia社のpositively charged Nylon膜上にキャピラリートランスファーによってブロッティングした。
本発明の遺伝子のDIG標識cRNAをプローブとしてハイブリダイズさせた。洗浄は実施例2の場合と同様に非常にきつい条件で行い、シグナル検出も同様の方法で行った。結果を図2に示した。転写産物の大きさは800−900bpと推定される。このサイズは、配列番号:1に示した塩基配列の長さ(827b)と一致する。各臓器中で腎臓での発現が最も高く、次いで肝臓でも強い発現が見られた。本発明の遺伝子が野生型マウスにおいても発現していることが確認できた。
[実施例4] マウスレプチン誘導遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体
配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質を認識する抗体の調製を試みた。該遺伝子のORFから予測される全長部分をPCR反応によって増幅し、Amersham−Pharmacia社のpGEX4T−1のEcoRI−XhoIに組み込んだ。このベクターを大腸菌に形質転換し、IPTGで誘導したところ約50kDaのタンパク質(GSTタンパク質との融合産物)の産生増幅が観察された。組み換えタンパク質は大腸菌を超音波によって破壊し、Glutathione Sepharose 4Bを用いて精製した。このタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成するため精製組み換えタンパク質2mgをウサギに3回に分けて免疫し、抗血清を得た。抗血清を更にProtein Aカラムで精製して、抗A9抗体として用いた。
抗A9抗体の特異性と、本発明の遺伝子によってコードされる蛋白質の存在をウエスタンブロット法によって確認した。抗原としては、次の蛋白質、あるいは細胞抽出液を用いた。
・GSTと本発明の蛋白質の融合蛋白質
・マウス腎臓の全細胞抽出液
・本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7の細胞抽出液
本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7の細胞抽出液は、次のようにして調製した。すなわち、本発明の遺伝子をSRαのプロモーターを持つpM18Sに挿入し、COS7細胞にリポフェクタミン法でトランスフェクトした。遺伝子導入後3日目に細胞をRIPAバッファーで溶かして細胞抽出液とした。
これらの蛋白質、あるいは細胞抽出液を、SDSサンプルバッファーに溶解し、熱処理後、SDSポリアクリルアミド電気泳動によって分離した。分離した蛋白質をブロッティングしたメンブランに、抗A9抗体を反応させた。抗A9抗体はTBST−5% non−fat milkで1/1000に薄めて使用し、HRP(ホースラデシユパーオキシダーゼ)標識二次抗体(抗ウサギIgG 1/3000)でインキュベート後、NEB社Renaissance試薬で検出した。結果を図3に示した。
その結果、抗A9抗体は、融合タンパク質(約50kDa)への反応性は確認されたが、GSTに対する反応性は検出できなかった。また本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7細胞の細胞抽出液(レーン5)では、配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質に相当する約23kDaのバンドが確認された。以上の結果から、抗A9抗体は、本発明の蛋白質に対し、高い特異性を有することが確認された。
更に、マウス腎臓の全細胞抽出液(レーン3−4、および6)において、レーン5と同じ約23kDaのバンドが確認された。このことは、マウスの腎臓において、配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質が存在していることを示している。
[実施例5] ヒトのレプチン誘導遺伝子
実施例1において決定したマウスに由来するレプチン誘導遺伝子の塩基配列(配列番号:1)をqueryとして、GenBankのデータをホモロジーサーチした。その結果、あるヒトESTの塩基配列(GenBank Acc.No.Z84479)が見出された。Z84479は、ヒト16番染色体16p13.3にマッピングされたESTである。公知の情報によれば、Z84479にいくつかのrepeat regionが見出されているが、ORFは明らかでない。両者の塩基配列を更に詳細に比較解析したところ、Z84479の塩基配列と、配列番号:1の塩基配列は、逆向き相補配列となっていた。そこで、Z84479の塩基配列に基づいて逆向き相補配列を導き、更にORFを解析した。
最終的に、Z84479の逆向き相補配列(配列番号:3)によって、配列番号:4に示すアミノ酸配列がコードされていることが明らかになった。そして配列番号:4のアミノ酸配列は、配列番号:2のアミノ酸配列(マウス)と高い相同性を示した(図4)。これらの結果に基づいて、配列番号:3に示す塩基配列からなる遺伝子を、レプチン誘導遺伝子のヒトにおけるオーソログであると判断した。
念のため、Z84479に基づくプローブでantisense cRNAのプローブを作成しノーザンブロット解析を行ったところ全くシグナルが検出できなかった。Z84479はアンチセンス配列となっているため、mRNAの検出ができなかったためと考えられた。
[実施例6] 抗A9抗体による免疫組織化学的な解析
抗A9抗体を用いて、様々な組織を免疫組織化学的に解析した。配列番号:2(マウス)のアミノ酸配列と、配列番号:4(ヒトのアミノ酸配列)は、図4に示すように高いホモロジーを有する。したがって、マウスの蛋白質を免疫原として得た抗A9抗体は、ヒトの蛋白質を認識する可能性が高い。
実施例4と同じ抗A9抗体、および二次抗体を用いて、免疫組織化学的解析を行った。解析に用いたヒト組織は次のとおりである。これらの組織の切片を常法にしたがってスライドガラスに固定し解析に用いた。
肝臓(図5) 睾丸(図8)
腎臓皮質(図6) 胃上皮(図9)
副腎皮質(図7)
解析の結果を図5−図9に示す。抗A9抗体は、ヒトのレプチン誘導遺伝子によってコードされるタンパク質を認識することが示された。またヒト組織における局在から、ヒトにおけるレプチン誘導遺伝子には、以下のような機能が推測された。
まず肝臓のヘパトサイトに、強いシグナルが見られた(図5)。レプチン依存的なグリコーゲンの貯蔵に本発明の蛋白質が関与する可能性が考えられた。また腎臓皮質においては尿細管への局在が見られた(図6)。副腎皮質の球状層にも本発明の蛋白質の局在が見られた(図7)。副腎皮質の球状層はステロイドホルモンの産生に関与する組織であることから、レプチンとステロイドホルモン産生系との関連が示唆された。また睾丸の間細胞(Leidig cell)における本発明の蛋白質の局在(図8)は、レプチン投与による男性ホルモン産生系の阻害作用を裏付ける結果と思われた。更に、胃上皮細胞におけるシグナル(図9)は、レプチンによる消化機能の制御を示唆していた。
[実施例7] 本発明の蛋白質の細胞内局在
本発明の蛋白質の細胞内における局在について、抗体を使用しコンフォーカル顕微鏡を用いて検討した。Hela細胞に本発明の遺伝子を強発現させた細胞を固定化後、実施例4と同じ抗A9抗体、および蛍光標識された二次抗体を用いて、細胞内局在を解析した。また同様に調製した標本について、小胞体のマーカータンパク質であるcalnexinの局在と比較した。その結果、本発明の蛋白質はcalnexinと同じ部分に局在していることが確認できた。この結果から、本発明の蛋白質は、細胞質の小胞体に多く存在することが明らかになった。
[実施例8] 本発明の蛋白質の発現を抑制したES細胞
先に述べたように本発明の遺伝子には既知のモチーフが存在せず、いかなる既知のタンパク質とも相同性を有しない。したがって、その生理機能を明らかにする上で、本発明の遺伝子の欠損マウス(ノックアウトマウス)が果たす役割は大きい。ノックアウトマウスを得ることができれば、このマウスにおける表現形の変化を観察することによって、本発明の遺伝子の生理機能を明らかにすることができる。
ノックアウトマウスを作成するため、まず本遺伝子のゲノミックDNAを取得した。Stratagene社の129SvJ由来のゲノミックライブラリーを、本発明の遺伝子の塩基配列に基づいてデザインしたプローブを用いてスクリーニングした。プローブには29merのDIG標識オリゴヌクレオチドを用いた。プローブの塩基配列を以下に示す。
ポジティブクローンをpKS(+)ベクター(Stratagene社)のNotI siteにサブクローン化し6塩基認識制限酵素を使用して本発明の遺伝子のゲノミックマッビングを行った。マッピングの結果は図10の「ゲノミックDNA」として示したとおりである。次にマッピングの結果に基づいてターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターの5’アームにはSpeIとAsp718の配列を用いた。また3’アームとしてはNotI−ScaIの部位を使用した。tk−Neo遺伝子(図10の「neogene」)をこれらの配列で挟み込み、tk−Neo遺伝子がATGを含むエキソン(Asp718からNotI部位まで)と入れ替わるように設計した。ターゲティングベクターの構造とゲノミックDNAとの関係を、図10に示した。
ターゲティングベクターは、エレクトロポレーションによってES細胞に導入した。G418耐性クローンを1000ヶ選択し、用いたベクターアームの外側の配列(3’側)をプローブとしサザンブロットを行った。tk−Neo遺伝子が本発明の遺伝子のゲノムDNA上に正確に組み込まれれば、ゲノミックDNAは、開始コドンATGを含むBamHIサイトを失う。その結果、BamHIによる制限酵素断片のパターンは変化する。つまり、図10に示されるように、3’側のプローブを使用したとき4.2kbpと8kbpの二本のバンドが観察されれば、ターゲティングベクターによって正しく組み換えの起ったES細胞であることがわかる。1000ヶのG418耐性クローンより4ヶの組み換えが起ったES細胞を取得することができた。またこれらのクローンはtk−Neo遺伝子をプローブとしたサザンブロットで8kbpのバンドを与えることを確認している。
産業上の利用の可能性
本発明の遺伝子は、レプチン応答の指標として有用である。本発明の遺伝子は、レプチンの投与によって、速やかにその発現が誘導される。したがって、本発明の遺伝子を指標とすることにより、細胞や、生体のレプチン応答の程度を評価することができる。既に述べたように、ヒトにおいてはレプチンの発現レベルではなく、レプチンに対する応答性のレベルが、肥満と密接に関連していることが推測されている。したがって、レプチンに対する応答性の指標となる遺伝子は重要である。
また本発明の遺伝子は、レプチン抵抗性の診断指標として有用である。すなわち、本発明の遺伝子の発現レベルを測定し正常なレベルと比較することにより、レプチン抵抗性の程度を知ることができる。本発明の遺伝子は、レプチンに応答して短期間にその発現レベルが上昇するので、レプチン応答性の指標として望ましい。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、レプチン投与による、ob/obマウス視床下部における本発明の遺伝子の誘導をノーザンブロットによって調べた結果を示す写真。A9が本発明の遺伝子、BRIが対照である。図中、レプチン(−)と示したレーンがPBSを投与した場合、(+)がマウスレプチンを投与した場合の結果である。
図2は、本発明の遺伝子の組織分布をノーザンブロットによって調べた結果を示す写真。各レーンは図中に示した組織に対応する。
図3は、本発明の蛋白質のウエスタンブロット解析の結果を示す写真。各レーンは、以下の蛋白質、または細胞抽出液に対応する。
レーン1:精製本発明の蛋白質−GST融合タンパク質(免疫原)5ng
レーン2:精製本発明の蛋白質−GST融合タンパク質(免疫原)15ng
レーン3:10μgのマウス腎臓の全細胞抽出液
レーン4:30μgのマウス腎臓の全細胞抽出液
レーン5:本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7細胞(全細胞抽出液約5μg)
レーン6:30μgのマウス腎臓の全細胞抽出液(レーン4とは別のマウス)
図4は、マウスとヒトにおける本発明の蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図。マウスのアミノ酸配列を上に、ヒトのアミノ酸配列を下に示した。
図5は、ヒト肝臓組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真。A(上)が150倍、B(下)が300倍。
図6は、ヒト腎臓皮質組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真。A(上)が150倍、B(下)が300倍。
図7は、ヒト副腎皮質組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真(300倍)。
図8は、ヒト睾丸組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真(300倍)。
図9は、ヒト胃上皮組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真(300倍)。
図10は、マウスにおける本発明のレプチン誘導遺伝子の発現を抑制したES細胞の構築工程を示す図と写真。ゲノミックDNAにターゲティングベクターで「ネオマイシン耐性遺伝子(neogene)」を導入することにより、レプチン誘導遺伝子の開始コドンを含むBamHIサイトを失う(上)。その結果、サザンブロットで3’probeによる8kbのバンドが現れる(下)。
本発明は、レプチン(Leptin)によって誘導される遺伝子に関する。
背景技術
レプチンは肥満疾患モデルマウスであるob/obマウスからpositional cloningによって単離されたサイトカインである。ob/obマウスはレプチン遺伝子の変異によって野生型のレプチンが産生されず、過食、肥満、II型糖尿病などの表現型を呈する。このマウスにレプチンを投与するとこれらの症状は改善される。このことから、レプチンが生体内でエネルギーバランスの調節に働いていることが明らかである。
レプチンは成熟脂肪細胞より産生される。その血中量は絶食(空腹)において減少し、反対に摂食により増大する。他のサイトカインと同様に、レプチンはそのシグナルを固有の受容体を介して細胞内へと伝達している。レプチン受容体は生体内のさまざまな臓器に存在することが明らかにされている。その中で、特に食欲制御、エネルギーバランスの調節に直接関わっていると考えられる部位は、脳内視床下部である。
現在までにレプチン投与により、Stat3と呼ばれる転写因子が視床下部において急速に活性化されるのが確認されている。しかし現在のところ、この活性化の生理的意義は定かではない。ob/obマウスにレプチンを投与して先の病的症状を改善させるのには、数週間に渡る投与が必要である。さらにレプチン投与により転写レベルで各種ニューロペプチドの発現レベルの変化が観察される。具体的には、レプチンの投与後数日してから、pro−opiomelanocortin(POMC)の上昇、並びにneuropeptide Y(NPY)やagouti−related peptide(AGRP)の減少が観察される。このことから、視床下部においてはレプチン投与により何らかの遺伝子が活性化もしくは不活性化されてPOMC、NPY、AGRPなどの転写調節、ひいては肥満、II型糖尿病などの解消へと導くカスケードが想定される。そこで、レプチン投与後に活性化または不活性化される遺伝子を同定できればPOMC、NPY、AGRPなどへの転写のカスケードの解明につながる。更に、このカスケードを構成する因子は、肥満やII型糖尿病などの新たな創薬のターゲットとなることが考えられる。
発明の開示
本発明の課題は、レプチン投与に応答して発現レベルが変化する新規なレプチン応答性遺伝子、この遺伝子によってコードされる蛋白質、並びにそれらの製造方法および用途を提供することにある。
マウスなどの実験動物を用いてレプチンによって早期に誘導される遺伝子を取得する試みは、米国 Millenium pharmacuetical社で行われたが成功に到らなかった。この原因として彼等は、視床下部に存在するneuronが全てレプチン受容体を有するものでなく、レプチンに反応するものがあってもノイズに埋もれてしまうことを指摘している(White,D.W.Zhou,J.Stricker−Krongrad,A.Ge,P.Morgenstern,J.P.Dembski,M.Tartaglia,L.A.2000.Identification of leptin−induced transcripts in the mouse hypothalamus.Diabetes 49,pp 1443−1450)。
これに対して本発明者らは、受容体側のシグナル経路は正常であるが、リガンドであるレプチンの合成が正常にできないため肥満になっているob/obマウスを実験に用いた。ob/obマウスは外部から投与したレプチンに反応することから、レプチン投与の有無によってもたらされる遺伝子発現の差異を大きくできると考えた。また差異発現遺伝子を取得するため、Clontech社のPCR−select subtraction kitを使用して、subtracted cDNAを作成した。さらに真に発現差異のあるものをスクリーニングするため、subtracted cDNAのinsertをPCRによって増幅してこれをナイロン膜上に並べ、希少cDNAを検出できるように、ジゴキシゲニン(DIG)標識したDNAプローブを作成することによってレプチン誘導遺伝子をクローン化することに成功した。すなわち本発明は、以下のポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、並びにそれらを用いたスクリーニング方法に関する。
〔1〕下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(b)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
(c)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(d)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(e)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に見出される部分アミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
〔2〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
〔3〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
〔4〕〔1〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔3〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔5〕〔4〕に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質またはペプチドを回収する工程を含む、〔2〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔6〕〔2〕に記載の蛋白質に結合する抗体。
〔7〕配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔8〕次の工程を含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性の評価方法。
(a)被験化合物の存在下で〔1〕に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
(b)前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
〔9〕次の工程を含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
(a)〔8〕に記載の方法によって、被験化合物の〔1〕に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
(b)被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
〔10〕〔1〕に記載のポリヌクレオチド、〔2〕に記載の蛋白質、および〔3〕に記載のベクターからなる群から選択された少なくとも1つの成分を含有する医薬組成物。
〔11〕次の工程を含む、生体試料中の〔2〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドの測定方法。
(1)生体試料を〔6〕に記載の抗体と接触させる工程、および
(2)〔2〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドに結合する、〔6〕に記載の抗体を検出する工程
〔12〕〔6〕に記載の抗体を含む、〔2〕に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドの測定用キット。
〔13〕次の工程を含む、生体試料中の〔1〕に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
(1)生体試料を〔7〕に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、および
(2)生体試料中に含まれる、〔7〕に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する工程
〔14〕〔7〕に記載のポリヌクレオチドを含む、〔1〕に記載のポリヌクレオチドの測定用キット。
〔15〕〔2〕に記載の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物。
〔16〕ノックアウト動物またはトランスジェニック動物である、〔15〕に記載の非ヒト脊椎動物。
〔17〕配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現が抑制されているマウス胚性幹細胞。
〔18〕配列番号:1に記載された塩基配列を構成することができるエキソンにおいて、少なくとも開始コドンに変異を有する〔17〕に記載のマウス胚性幹細胞。
本発明は、新規なレプチン誘導遺伝子を提供する。本発明のレプチン誘導遺伝子の塩基配列配列番号:1(マウス)、および配列番号:3(ヒト)に、そして本発明のレプチン誘導遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号:2(マウス)、および配列番号:4(ヒト)に示す。本発明の遺伝子のESTs(AK002535,Riken full length cDNA project,cDNA from mouse kidney)、ならびにそのORFより予想されるアミノ酸配列は知られていた。しかし、遺伝子産物として実際に生体中に存在するか否かは不明であった。また塩基配列のホモロジー検索の結果、ホモロジーのある遺伝子としてはヒトのオーソログ(GenB ank Acc.No.Z84479)が見出されるのみである。しかもホモロジーを示した塩基配列は、アンチセンス配列となっており、正しい塩基配列とアミノ酸配列を導き出すことはできない。更に、本発明のレプチン誘導遺伝子によってコードされるアミノ酸配列には、既知のモチーフなどは確認できなかった。したがって、これらの遺伝子がレプチンによって誘導されることは、本発明によってもたらされた新規な知見である。
加えて本遺伝子産物が実際に生体内に存在することをノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション、ウエスタンブロット、そして免疫化学染色によって証明した。ノーザンブロットおよび免疫化学染色解析の結果、本発明の遺伝子は脳にも発現がみられるが、腎、肝臓に強い発現が見られた。
本発明の遺伝子は、レプチンに応答して発現が誘導されることから、レプチン応答性の指標として有用である。すなわちレプチン受容体を発現する肝臓hepatocytesにおけるレプチン依存的なグリコーゲンの貯蔵を変化させる薬剤のスクリーニングのための指標として使用できる。あるいは、免疫化学染色解析より睾丸の間細胞(Leidig cell)にこの遺伝子の発現が確認されたこと、そしてレプチンの投与によりテストステロンの産生が阻害されることなどから、これらの男性ホルモン産生経路を調節する化合物のスクリーニングの指標としても使用可能である。
ob/obマウスでは、レプチンの欠損が肥満の原因となっていた。一方ヒトにおいては、レプチンの欠損によって肥満になっている場合は非常に稀で、多くの肥満患者では血中のレプチン濃度が肥満の程度とともに上昇している。この事実は、肥満を有するヒトに単にレプチンを投与するだけでは、肥満を改善できないことを示している。このような状態は、レプチンのシグナルが正しく伝達できない状態、すなわちレプチン抵抗性の状態と言うことができる。ヒトの肥満においては、レプチンの投与ではなく、レプチンに対する反応性の低下、すなわちレプチン抵抗性を解除する必要がある。このように、本発明の遺伝子の発現レベルに基づいて、肥満の治療方針を選択することができる。本発明に基づいて、次の工程を含む、レプチン応答性を診断する方法が提供される。
(a)被検者から採取された生体試料における以下の指標i)〜iv)のいずれかに記載のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、および
i)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
ii)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、
iii)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド、および
iv)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド
(b)(a)の測定値をレプチン応答性と関連付ける工程
上記診断方法において、各ポリヌクレオチドの発現レベルとは、ポリヌクレオチドの発現強度、および各ポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質の発現レベルのいずれかを測定することによって評価することができる。与えられた塩基配列を有するポリヌクレオチドの発現強度は、ハイブリダイゼーションやPCRを利用して測定することができる。また、与えられたアミノ酸配列を有する蛋白質の発現レベルは、イムノアッセイなどによって測定することができる。
本発明において前記発現レベルの測定値は、被検者のレプチン応答性を示している。たとえば測定値が低い場合には、レプチン応答性が低いと判断される。特に、血中のレプチン濃度に異常が無い場合、あるいは十分量のレプチンの投与を受けているのにもかかわらず、前記測定値が健常者に比較して低い場合には、レプチン応答性が低いと見なすことができる。本発明の診断方法は、血中のレプチン濃度を考慮することによって、より適切な結果が期待できる。あるいは本発明の診断方法は、レプチンの投与を受けている被検者における、レプチン応答性の評価に有用である。
本発明の診断方法を実施するために必要な要素を組み合せて、レプチン応答性の診断用キットを構成することができる。たとえば後に述べるような、本発明のポリヌクレオチドや蛋白質を測定するためのキットは、レプチン応答性の診断用キットとして有用である。
本発明の遺伝子は、レプチンによるシグナルの伝達経路の中で、レプチンの刺激に対して短時間のうちに応答する。POMC、NPY、あるいはAGRPなどの各種のニューロペプチド遺伝子の転写が、レプチンの投与によって影響を受けることは公知である。しかし、これらのニューロペプチドの転写レベルに変化が現れるのは、レプチン投与後数日してからである。他方、本発明の遺伝子は、レプチン投与に速やかに応答する。つまり、本発明の遺伝子は、レプチンのシグナル伝達経路において上記ニューロペプチドより上流において機能しているものと考えることができる。したがって、本遺伝子とこれらのニューロペプチドとの関連性の解明は、レプチンのシグナル伝達経路の全体像を明らかにすることにつながる。また本発明の遺伝子は、レプチンによって速やかに応答する遺伝子であることから、本遺伝子の動きを指標として、本遺伝子とレプチン抵抗性との関連を調べることができる。更に、肥満の程度に対応して本遺伝子の発現レベルに差異があれば、肥満の指標として用いることもできる。
加えて、これらの事実により、本発明の遺伝子は、抗肥満薬のスクリーニングに使用することができる。すなわち、本発明の遺伝子がレプチンに応答して発現が上昇することから、レプチンの存在下で本遺伝子の発現を増加させる化合物には、レプチン抵抗性を解除し、肥満を抑制する作用が期待できる。レプチン抵抗性は、ヒトにおける肥満の重要な原因の一つと考えられることから、本発明の遺伝子は、肥満の治療薬開発や肥満の分子生物学的解明において、重要な標的となる。
また本発明は、前記(a)−(e)のいずれかに記載されたポリヌクレオチドによってコードされる実質的に純粋な蛋白質に関する。本発明において、実質的に純粋な蛋白質とは、当該蛋白質の他に生物に由来する大型分子を実質的に含まない状態にあることを言う。本発明における実質的に純粋な蛋白質は、少なくとも70%以上、通常80%、好ましくは90%、より好ましくは95%以上、たとえば99%の純度を有する蛋白質を言う。蛋白質の純度を測定する手法は公知である。蛋白質の純度を知るための手法として、たとえば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動やHPLC等を示すことができる。
本発明の蛋白質は、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質は、例えば、後述するように本発明の蛋白質をコードするDNAを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現した蛋白質を精製することにより調製することが可能である。一方、天然の蛋白質は、例えば、後述する本発明の蛋白質に対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 16.1−16.19)。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーション(例えば、「On the fidelity of mRNA translation in the nuclease−treated rabbit reticulocyte lysate system.Dasso,M.C.,Jackson,R.J.(1989)Nucleic Acids Res.17:3129−3144」参照)などにより本発明の蛋白質を調製することも可能である。
本発明には、本実施例において同定されたマウス、またはヒト由来の蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質には、例えば、配列番号:2(マウス)または配列番号:4(ヒト)に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の変異体、ホモログ、バリアントなどが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がレプチンの投与によって生体内で発現誘導されることを言う。このような機能は、その発現の消失または低下により推測することができる。
これら本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者であれば、例えば、蛋白質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法(例えば、部位特異的変異誘発法(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 8.1−8.5))を利用して調製することができる。また、このような蛋白質は、自然界におけるアミノ酸の変異により生じることもある。本発明には、このように本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、そのアミノ酸配列(配列番号:2または配列番号:4)において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/もしくは付加などにより異なる蛋白質が含まれる。
蛋白質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、30アミノ酸以内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内(例えば、3アミノ酸以内)である。置換されるアミノ酸は、蛋白質の機能の保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。蛋白質を構成するアミノ酸を似た性質のアミノ酸に置換することは、保存的置換(conservative substitution)と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
本実施例において同定された蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術(Current Protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 6.3−6.4)、あるいは遺伝子増幅技術(PCR)(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons Section 6.1−6.4)を利用して単離することも可能である。即ち、当業者であれば、本実施例において同定された蛋白質をコードするポリヌクレオチド(配列番号:1、または配列番号:3)またはその一部をプローブとして、あるいは該ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離することができる。さらに単離したポリヌクレオチドを基に、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を調製することができる。本発明には、本実施例において同定された蛋白質と同等の機能を有する限り、これら蛋白質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が含まれる。機能的に同等な蛋白質を単離するための生物としては、例えば、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ等の脊椎動物が挙げられるが、これらに制限されない。
機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件は、通常「1xSSC、0.1%SDS、37℃」程度であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1%SDS、42℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「0.1xSSC、0.1%SDS、65℃」程度であり、ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用して単離される蛋白質は、配列番号:2または配列番号:4に記載の本発明の蛋白質と比較して、通常、そのアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%以上)の配列の同一性を指す。アミノ酸配列の相同性は、BLASTXによる相同性検索により決定することができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを提供する。本発明の蛋白質の部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に結合する抗体の調製に利用することができる。特に、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列から選択され、該アミノ酸配列に特異的に見出されるアミノ酸配列は、本発明の蛋白質に結合する抗体を得るための免疫原として有用である。特異的に見出されるアミノ酸配列とは、他の蛋白質を構成するアミノ酸配列とは異なる連続したアミノ酸配列を言う。なお他の蛋白質とは、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなる蛋白質を言う。したがって、配列番号:2および配列番号:4に記載のアミノ酸配列の間で共有されたアミノ酸配列は、本発明の部分ペプチドに含まれる。本発明の部分ペプチドは、少なくとも7アミノ酸、好ましくは9アミノ酸以上、より好ましくは12アミノ酸以上、より好ましくは15アミノ酸以上の連続したアミノ酸配列からなる。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
また本発明は、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の蛋白質をコードしうるものであれば、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNA、RNAなども含まれる。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、上記のように、配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列もしくはその一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法やこれら塩基配列の情報に基づき設計したプライマーを用いた遺伝子増幅法(PCR)等の常法により単離することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明において単離されたポリヌクレオチドとは、天然に存在するポリヌクレオチドやその断片とは構造的に異なるポリヌクレオチドを言う。単離されたポリヌクレオチドとして、具体的には、たとえば次のようなポリヌクレオチドを示すことができる。
ベクターやゲノムに人為的に組み込まれた状態にあるDNA
分離されたDNA(cDNA、ゲノム断片、制限酵素断片、あるいはPCRの合成産物等を含む)
本発明の蛋白質に他の蛋白質を融合させた融合蛋白質、あるいはタグを付加した蛋白質などをコードするDNA
本発明は、また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、挿入したポリヌクレオチドを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター(プロメガ社製)を、大腸菌における発現であればpETベクター(Invitrogen社製)を、培養細胞における発現であればpME18S−FL3ベクター(GenBank Accession No.AB009864)を、生物個体における発現であればpME18Sベクター(Mol Cell Biol.8:466_472(1988))を、好適に用いることができる。本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドのベクターへの挿入は常法、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.4_11.11)により行うことができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを保持する形質転換体を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造のために使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。
また、本発明の宿主細胞には、レプチン誘導蛋白質の機能解析やレプチン誘導蛋白質を利用したその機能阻害剤や機能促進剤のスクリーニングのために用いる細胞も含まれる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 9.1−9.9)、リポフェクタミン法(GIBCO−BRL社製)、マイクロインジェクション法などの方法で行うことが可能である。形質転換体からのレプチン誘導蛋白質の調製は、当業者に公知の蛋白質の分離・精製法を利用して行なうことができる。
本発明はまた、配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な、少なくとも15塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなポリヌクレオチドは、本発明の蛋白質をコードするDNAを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp−100bp、好ましくは15bp−35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のポリヌクレオチドが用いられる。プライマーとして用いる場合、3’側の領域は相補的である必要があるが、5’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
また、本発明のポリヌクレオチドには、本発明のレプチン誘導蛋白質の発現を抑制するためのアンチセンスが含まれる。アンチセンスは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも15bp以上、好ましくは100bp、さらに好ましくは500bp以上の鎖長を有し、好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。このようなアンチセンスは、例えば、配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列情報を基にホスホロチオネート法(Stein,1988 Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides.Nucleic Acids Res 16,3209−21(1988))などにより調製することができる。
本発明のポリヌクレオチドには、例えば、遺伝子治療への応用が考えられる。本発明のポリヌクレオチドを利用した遺伝子治療の標的となる疾患としては、例えば、肥満や糖尿病が好適である。すなわち、本発明の遺伝子の変異や発現異常によって、レプチン抵抗性が形成されているときには、本発明の遺伝子を生体内で発現させることによって、レプチン抵抗性を解除できる可能性がある。これら分子を遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより患者へ投与すればよい。
また、本発明のポリヌクレオチドのアンチセンスは、レプチン抵抗性のモデルの構築に有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチドのドミナントネガティブな変異により、本発明のポリヌクレオチドが肥満をもたらす場合には、本発明のポリヌクレオチドの発現の抑制によって、レプチン抵抗性モデルとすることができる。
本発明は、また、本発明の蛋白質に結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には特に制限はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体または抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。
本発明の抗体は、公知の方法によって得ることができる。たとえばポリクローナル抗体の場合には、常法に従い免疫原を家兎に免疫することにより得ることが可能である(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.12_11.13)。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従い免疫原でマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ることができる(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley & Sons.Section 11.4_11.11)。
免疫原には、本発明のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなるオリゴペプチドや、本発明の遺伝子を大腸菌などで発現し精製した組換え蛋白質を用いることができる。オリゴペプチドを構成するアミノ酸配列として、配列番号:2と配列番号:4の間で保存されたアミノ酸配列を用いれば、種を越えて本発明の蛋白質を認識することができる抗体を得ることができる。また、両配列の間で相違するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを免疫原とすれば、種特異的な抗体とすることができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質の精製に加え、例えば、これら蛋白質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用することも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、または細胞などから蛋白質を抽出し、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検査・診断することができる。
本発明の蛋白質に結合する抗体は、本発明の蛋白質に関連した疾患の治療などの目的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトのものと入れ換えたマウス(例えば、「Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice,Mendez,M.J.et al.(1997)Nat.Genet.15:146−156」参照)に免疫することにより調製することができる。また、ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝子組み換えによって調製することができる(Methods in Enzymology 203,99−121(1991))。
また本発明は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する方法を提供する。この方法は、次の工程(a)および(b)を含む。
(a)被験化合物の存在下で本発明ののポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
(b)前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、
本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する方法は、この活性を有する化合物のスクリーニング方法に有用である。すなわち本発明は、次の工程を含む、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
(a)前記評価方法によって、被験化合物の本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
(b)被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法に用いる、本発明の遺伝子を発現する細胞には、たとえば腎臓の尿細管もしくは肝臓のhepatocytes由来の細胞株などを用いることができる。スクリーニングの具体的な方法としては、被験化合物の存在下でレプチンと前記細胞とを接触させる。一定時間の培養の後に、本発明の遺伝子の発現レベルの変化を測定し、被験化合物非存在下でレプチンと接触させて培養した対照における発現レベルと比較する。
遺伝子の発現レベルは、遺伝子や発現産物である蛋白質の量を指標として測定することができる。遺伝子は定量的PCR等の公知の手法により定量することができる。また蛋白質の量は、ELISAなどの手法によって測定される。
スクリーニングに用いる被験試料には、あらゆる化合物を用いることができる。具体的には、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられる。
このスクリーニングにより単離される化合物は、レプチンに対する応答性を調節する化合物の候補となる。また、生体内において、本発明の蛋白質とこれと相互作用する分子との該相互作用を阻害する化合物の候補となる。
本発明の遺伝子、その蛋白質、該遺伝子の発現を制御する化合物、あるいは該蛋白質の活性を制御する化合物を医薬品として用いる場合には、それ自体を医薬品として用いることも可能であるが、公知の製剤学的方法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して用いることが考えられる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、ポリヌクレオチドを治療薬として使用する場合には、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに組込み、患者に投与することも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能であろう。
遺伝子の発現レベルは、転写生成物であるmRNAや、翻訳産物である蛋白質、ならびにそれらの断片を測定することにより明らかにすることができる。本発明は、以下のポリヌクレオチドの測定方法、あるいは蛋白質および/またはその部分ペプチドの測定方法と、該測定方法のためのキットを提供する。
まず本発明のポリヌクレオチドは、配列番号:1に示す塩基配列の相補配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションにより測定することができる。あるいは、配列番号:1に示す塩基配列およびその相補鎖に相補的な少なくとも15塩基からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法によって、本発明の遺伝子の発現レベルを測定することもできる。mRNAを鋳型とするRT−PCR法も公知である。
また本発明の遺伝子の翻訳生成物である蛋白質は、本発明の蛋白質を認識する抗体を使って、イムノアッセイの原理に基づいて測定することができる。本発明の蛋白質を認識する抗体を取得する方法は既に述べたとおりである。
上記測定方法に必要な成分を、予め組み合わせてキットとすることができる。たとえば、mRNAを鋳型としてRT−PCRを行うためのプライマー、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、および反応に好適な緩衝液からなるキットを構成することができる。また、本発明の蛋白質を認識する標識抗体、標識を測定するための試薬、そして免疫反応に好適な緩衝液からなるキットを構成することもできる。
また、本発明は、本発明の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物を提供する。ここで「発現の改変」には、発現の増強および減弱が含まれる。また、「蛋白質の発現の改変」は、転写と翻訳のいずれのステップの改変も含まれる。このような非ヒト脊椎動物には、内因性の本発明の蛋白質の発現を停止または減少させるように操作された動物(ノックアウト動物)および外来性の本発明の蛋白質を発現するように該蛋白質をコードする遺伝子が導入された動物(トランスジェニック動物)が含まれる。このようなノックアウトおよびトランスジェニック非ヒト脊椎動物は、文献「ニューロサイエンス・ラボマニュアル3、神経生物学のための胚と個体の遺伝子操作法(編集・近藤寿人、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社)」に従って作製することができる。
例えば、本発明の蛋白質をコードするDNAが染色体に組込まれたトランスジェニック動物を作製することにより、これらの蛋白質の発現を上昇させたり、発現パターンや分布の改変を行うことができる。また、これらの内因性遺伝子の発現制御領域に変異を導入したり、他の発現制御領域を付加または置換することなどにより、本来の遺伝子の発現レベルと比較して人工的に転写レベルを上昇、下降、または発現パターンや分布の改変を行うことができる。一方、エキソンの一部を欠損させたり、翻訳領域への点突然変異の導入により終止コドンへ置換することにより、タンパク質への翻訳を修飾することもできる。また、アンチセンスRNAやリボザイムを発現させることで、本発明の遺伝子の発現を制御することも可能である。これらの変異の導入は、公知の方法により行うことができる。
このような非ヒト脊椎動物は、転写機能の研究、転写に関連する疾患のメカニズムの解明、医薬品のスクリーニング等に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
前に述べたように、本発明の遺伝子は、レプチンによるシグナル伝達経路の上流を構成する遺伝子と考えられる。したがって、本発明の遺伝子の発現を抑制した動物や細胞は、レプチン抵抗性を解除する薬剤のスクリーニングに有用である。中でも、本発明の遺伝子の発現を欠失させた胚性幹細胞(embryonic stem cell;ES細胞)は、たとえば当該遺伝子の発現を抑制したノックアウト動物の作成に有用である。
非ヒト動物における、本発明の遺伝子の発現抑制には、公知の方法を応用することができる。たとえばマウスであれば、配列番号:1に示した塩基配列中、とくに蛋白質コード領域を構成するエキソンをゲノムの塩基配列上にマッピングし、その塩基配列の少なくとも一部に変異を導入して蛋白質への翻訳を正常に行えないようにする。具体的には、たとえばエキソンの一部の塩基配列の置換、欠失、付加、あるいは挿入などにより、エキソンの途中にストップコドンを生じるようにする。その結果、変異を導入された細胞においては、本発明の遺伝子の正常な発現が行えなくなる。ゲノムの塩基配列に変異をもたらすには、相同組み換えの技術が用いられる。
こうして構築された、本発明の遺伝子の発現を欠失させたES細胞によって、ノックアウトマウスを得ることができる。ノックアウトマウスを得るには、まずこのES細胞をマウスの胚盤胞期の卵子に注入し、仮親の子宮に移植する。ES細胞を注入した卵子からは、本来の受精卵とES細胞由来の細胞からなるキメラマウス(ファウンダー)が生まれる。ファウンダーと野生マウスの交配によって生まれてくる子孫にノックアウトされたゲノムが確認できれば、その子孫は、ノックアウトされた遺伝子をヘテロに持つノックアウト動物である。ヘテロの子孫を更に交配することによって、ノックアウトマウス(ホモ)を得ることができる。
本発明者らは、配列番号:1に示す塩基配列の蛋白質コード領域中、特に開始コドンを含む領域を欠失させることにより、マウスにおける本発明の遺伝子の発現を、ほぼ完全に抑制できることを確認した。したがって、本発明の遺伝子の発現を抑制した非ヒト動物として、本発明の遺伝子における開始コドンに変異を有するノックアウト動物は好ましい。あるいは本発明の遺伝子の発現を抑制した細胞として、本発明の遺伝子における開始コドンに変異を有する細胞は好ましい。開始コドンの変異は、塩基の置換、欠失、付加、あるいは挿入によってもたらされる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1] マウスのレプチン誘導遺伝子の単離
ob/obマウスにおけるレプチン投与の有無によって発現レベルが変動する遺伝子を、マウスレプチン誘導遺伝子として単離した。ob/obマウスは、受容体側のシグナル経路は正常であるが、リガンドであるレプチン合成が正常にできないため肥満を呈する。このマウスにレプチンを投与すれば、レプチンによって誘導される遺伝子を見出すことができる。このような条件とすることにより、レプチン投与の有無によってもたらされる遺伝子発現の差異を大きくできると考えた。発現レベルの異なる遺伝子の取得には、サブトラクション法を利用した。具体的な操作は以下のとおりである。
まずob/obマウスにレプチンを投与した。ob/obマウスは米国ジャクソン研究所より購入した。体重1gにつき1μgのマウスレプチン(R & D社)、もしくはPBSを静脈注射によって投与し、1時間後に視床下部を採取し、Total RNAをグアニジン−チオシアネート法によって抽出した。その後Roche社のoligo dT cellulose columnを用いてmRNAを精製した。このmRNAを用いてPCRサブトラクション法を実施した。
PCRサブトラクション法には、市販のキット「PCR−SelectTM cDNA Subtraction kit」(CLONTECH製)を用いた。
まず各mRNA2μgからAMV逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。レプチン投与後のcDNAをテスター、PBS投与後のcDNAをドライバーとした。cDNAはRsaIで消化し断片化した。RsaIによる断片は、平滑末端を有する。
次に、テスターcDNAを2群に分け、それぞれに異なるcDNAアダプター1、2Rを結合した。各アダプターの塩基配列は次のとおりである。なおドライバーcDNAにはアダプターを結合しない。
アダプター1
アダプター2R
次に、1stハイブリダイゼーションと2ndハイブリダイゼーションの2回のハイブリダイゼーションを行った。1stハイブリダイゼーションでは、各テスターに過剰量ドライバーcDNAを加え、98℃1.5分間の熱変性を行った後、68℃で8時間インキュベーションした。2ndハイブリダイゼーションでは、1stハイブリダイゼーションから得られたサンプルを変性せずに混合し、さらに変性cDNAドライバーを加え、68℃で一晩インキュベーションした。反応後のハイブリダイゼーション溶液を希釈用バッファーで希釈し、75℃で5分インキュベートして1本鎖のアダプター部を2本鎖に伸長し、PCRの鋳型に用いた。アダプターに対応するプライマーであるPCRプライマー1を用いたPCRを行い、両端に異なるアダプターを持ったcDNAのみを選択的に増幅した。このとき、ドライバーcDNAの末端にはアダプターが結合していないので、ドライバーcDNAとハイブリダイズしたテスターcDNAは増幅されない。
これの一部を鋳型とし、アダプタープライマー1、2Rの内側のプライマーであるNested PCRプライマー1と2Rを用いてPCRを行い、さらに選択性を増した生成物を得た。
この生成物をpT−Adv(Clontech社)ベクターにクローニングし、BRL社のElctroMaxDH10Bセルを用いて形質転換を行い、サブトラクションライブラリーを作成した。
ライブラリーの各クローンcDNAのインサートをPCRによって増幅し、ナイロンメンブレン上にスポットしてアレイを作製した。次に、レプチン投与およびPBS投与マウスcDNAから調製したジゴキゲニン標識プローブを用いて、ハイブリダイズを行った。検出にはRoche社の抗ジゴキゲニン抗体、CDP−starを用いた。ハイブリダイゼーションの結果、発現量に差が見られたクローンをスクリーニングした。
サブトラクションライブラリーのスクリーニング
レプチン、もしくはPBS投与後の視床下部より調整した各mRNA1μgを使用して逆転写酵素反応によりDIG−dUTPを取り込んだcDNAプローブを作成した。作成はRoche社‘The DIG system user’s guide for filter hybridization、pp20−21,Preparing cDNA with digoxigenin−11−dUTP’.に従った。生成物を5−10ng/mlの濃度でstandard hybridization buffer(5xSSC,0.1%N−lauroylsarcosine,0.02%SDS,1%blocking reagent{Roche社Blocking Reagent})に溶解し、ハイブリダイゼーションに用いた。PBS−投与後のmRNAをドライバーとして得られたサブトラクションライブラリーより384well,3枚分(計1152クローン)のコロニーを任意に選択した。
これらの大腸菌のストックよりpT−Advベクターに挿入されているcDNAをPCR法によって増幅し、Amersham−Pharmacia社のpositively charged Nylon膜上にduplicateでスポットした(サブトラクションcDNAアレイ)。これらのアレイを4組作成し、それぞれPBS−,レプチン投与後のDIG標識cDNAプローブで68℃1晩ハイブリダイズした。その後、2xSSC、0.1%SDS溶液を用いて室温で五分ずつ二回洗浄し、68℃の0.1xSSC、0.1%SDS溶液で20分ずつ二回洗浄した。その後アレイ上で発現量に差の見られたクローンのインサートをプローブとしてcRNAを作成し、ノーザンブロットを行い、実際に発現量に差異があるか否かを検討した。
次に発現量に差異があるポジティブクローンをマウスのレプチン誘導遺伝子として選択し、そのインサートの塩基配列を決定した。本サブトラクションライブラリーはRsaIによる切断を経ているためこのライブラリーでは全長cDNAが得られなかった。ノーザンブロット解析により本遺伝子は腎臓、肝臓にその発現が多く見られたことからマウス腎臓由来のmRNAを使用してcDNAライブラリーを作成した。cDNAライブラリーはBRL社(現In Vitrogen社)のSuperscript Plasmid Systemを使用して作成し、pSPORT1ベクターにcDNAを挿入した。先に同定された遺伝子断片をプローブとしてライブラリーをスクリーニングして全長を取得した。マウスレプチン誘導遺伝子の塩基配列を配列番号:1に、また、オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列を配列番号:2に記載する。
[実施例2] レプチンによるob/obマウス視床下部における遺伝子誘導 ob/obマウスに体重1g当たり1μgのマウスレプチン(+)、またはPBS(−)を静脈経由で投与し、1時間後に視床下部を摘出してTotal RNAおよびmRNAを抽出した。抽出したmRNA0.4μgをアガロースゲル上で分離し、Amersham−Pharmacia社のpositively charged Nylon膜上にキャピラリートランスファーした。本発明の遺伝子の全長cDNAより調製したDIG標識cRNAをプローブとしてハイブリダイズさせ、ストリンジェントな条件下(0.1xSSC,0.1%SDS,68℃)で洗浄した。その後アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体、およびCDP−Starを用いてシグナルを検出した。化学発光シグナルはATTO社のCCDカメラで定量した。
その結果レプチン投与によりこの転写産物量は約2倍になることが明らかになった。さらにネガチィブコントロールとして同量のmRNAがのせられたメンブレンを別のプローブ(BRI遺伝子,AF272044)でプロービングを行った。この場合にはレプチン、PBS投与による遺伝子のmRNAレベルの差異は観察されなかった。以上の結果を図1に示した。この実験により、本発明の遺伝子(A9)が、ob/obマウスの視床下部において、レプチンの投与1時間後に顕著に発現が増強することが裏付けられた。
[実施例3] マウスレプチン誘導遺伝子の組織特異的発現
マウスレプチン誘導遺伝子の組織特異的発現をノーザンブロットにより解析した。
野生型マウス各組織よりTotal RNAをグアニジン−チオシアネート法によって抽出した。このTotal RNAを各8μgずつ使用し、該遺伝子のDIG標識cRNAをプローブとしてノーザンブロットを行った。Total RNAはアガロースゲルによって分離した後Amersham−Pharmacia社のpositively charged Nylon膜上にキャピラリートランスファーによってブロッティングした。
本発明の遺伝子のDIG標識cRNAをプローブとしてハイブリダイズさせた。洗浄は実施例2の場合と同様に非常にきつい条件で行い、シグナル検出も同様の方法で行った。結果を図2に示した。転写産物の大きさは800−900bpと推定される。このサイズは、配列番号:1に示した塩基配列の長さ(827b)と一致する。各臓器中で腎臓での発現が最も高く、次いで肝臓でも強い発現が見られた。本発明の遺伝子が野生型マウスにおいても発現していることが確認できた。
[実施例4] マウスレプチン誘導遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体
配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質を認識する抗体の調製を試みた。該遺伝子のORFから予測される全長部分をPCR反応によって増幅し、Amersham−Pharmacia社のpGEX4T−1のEcoRI−XhoIに組み込んだ。このベクターを大腸菌に形質転換し、IPTGで誘導したところ約50kDaのタンパク質(GSTタンパク質との融合産物)の産生増幅が観察された。組み換えタンパク質は大腸菌を超音波によって破壊し、Glutathione Sepharose 4Bを用いて精製した。このタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成するため精製組み換えタンパク質2mgをウサギに3回に分けて免疫し、抗血清を得た。抗血清を更にProtein Aカラムで精製して、抗A9抗体として用いた。
抗A9抗体の特異性と、本発明の遺伝子によってコードされる蛋白質の存在をウエスタンブロット法によって確認した。抗原としては、次の蛋白質、あるいは細胞抽出液を用いた。
・GSTと本発明の蛋白質の融合蛋白質
・マウス腎臓の全細胞抽出液
・本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7の細胞抽出液
本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7の細胞抽出液は、次のようにして調製した。すなわち、本発明の遺伝子をSRαのプロモーターを持つpM18Sに挿入し、COS7細胞にリポフェクタミン法でトランスフェクトした。遺伝子導入後3日目に細胞をRIPAバッファーで溶かして細胞抽出液とした。
これらの蛋白質、あるいは細胞抽出液を、SDSサンプルバッファーに溶解し、熱処理後、SDSポリアクリルアミド電気泳動によって分離した。分離した蛋白質をブロッティングしたメンブランに、抗A9抗体を反応させた。抗A9抗体はTBST−5% non−fat milkで1/1000に薄めて使用し、HRP(ホースラデシユパーオキシダーゼ)標識二次抗体(抗ウサギIgG 1/3000)でインキュベート後、NEB社Renaissance試薬で検出した。結果を図3に示した。
その結果、抗A9抗体は、融合タンパク質(約50kDa)への反応性は確認されたが、GSTに対する反応性は検出できなかった。また本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7細胞の細胞抽出液(レーン5)では、配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質に相当する約23kDaのバンドが確認された。以上の結果から、抗A9抗体は、本発明の蛋白質に対し、高い特異性を有することが確認された。
更に、マウス腎臓の全細胞抽出液(レーン3−4、および6)において、レーン5と同じ約23kDaのバンドが確認された。このことは、マウスの腎臓において、配列番号:2のアミノ酸配列からなる蛋白質が存在していることを示している。
[実施例5] ヒトのレプチン誘導遺伝子
実施例1において決定したマウスに由来するレプチン誘導遺伝子の塩基配列(配列番号:1)をqueryとして、GenBankのデータをホモロジーサーチした。その結果、あるヒトESTの塩基配列(GenBank Acc.No.Z84479)が見出された。Z84479は、ヒト16番染色体16p13.3にマッピングされたESTである。公知の情報によれば、Z84479にいくつかのrepeat regionが見出されているが、ORFは明らかでない。両者の塩基配列を更に詳細に比較解析したところ、Z84479の塩基配列と、配列番号:1の塩基配列は、逆向き相補配列となっていた。そこで、Z84479の塩基配列に基づいて逆向き相補配列を導き、更にORFを解析した。
最終的に、Z84479の逆向き相補配列(配列番号:3)によって、配列番号:4に示すアミノ酸配列がコードされていることが明らかになった。そして配列番号:4のアミノ酸配列は、配列番号:2のアミノ酸配列(マウス)と高い相同性を示した(図4)。これらの結果に基づいて、配列番号:3に示す塩基配列からなる遺伝子を、レプチン誘導遺伝子のヒトにおけるオーソログであると判断した。
念のため、Z84479に基づくプローブでantisense cRNAのプローブを作成しノーザンブロット解析を行ったところ全くシグナルが検出できなかった。Z84479はアンチセンス配列となっているため、mRNAの検出ができなかったためと考えられた。
[実施例6] 抗A9抗体による免疫組織化学的な解析
抗A9抗体を用いて、様々な組織を免疫組織化学的に解析した。配列番号:2(マウス)のアミノ酸配列と、配列番号:4(ヒトのアミノ酸配列)は、図4に示すように高いホモロジーを有する。したがって、マウスの蛋白質を免疫原として得た抗A9抗体は、ヒトの蛋白質を認識する可能性が高い。
実施例4と同じ抗A9抗体、および二次抗体を用いて、免疫組織化学的解析を行った。解析に用いたヒト組織は次のとおりである。これらの組織の切片を常法にしたがってスライドガラスに固定し解析に用いた。
肝臓(図5) 睾丸(図8)
腎臓皮質(図6) 胃上皮(図9)
副腎皮質(図7)
解析の結果を図5−図9に示す。抗A9抗体は、ヒトのレプチン誘導遺伝子によってコードされるタンパク質を認識することが示された。またヒト組織における局在から、ヒトにおけるレプチン誘導遺伝子には、以下のような機能が推測された。
まず肝臓のヘパトサイトに、強いシグナルが見られた(図5)。レプチン依存的なグリコーゲンの貯蔵に本発明の蛋白質が関与する可能性が考えられた。また腎臓皮質においては尿細管への局在が見られた(図6)。副腎皮質の球状層にも本発明の蛋白質の局在が見られた(図7)。副腎皮質の球状層はステロイドホルモンの産生に関与する組織であることから、レプチンとステロイドホルモン産生系との関連が示唆された。また睾丸の間細胞(Leidig cell)における本発明の蛋白質の局在(図8)は、レプチン投与による男性ホルモン産生系の阻害作用を裏付ける結果と思われた。更に、胃上皮細胞におけるシグナル(図9)は、レプチンによる消化機能の制御を示唆していた。
[実施例7] 本発明の蛋白質の細胞内局在
本発明の蛋白質の細胞内における局在について、抗体を使用しコンフォーカル顕微鏡を用いて検討した。Hela細胞に本発明の遺伝子を強発現させた細胞を固定化後、実施例4と同じ抗A9抗体、および蛍光標識された二次抗体を用いて、細胞内局在を解析した。また同様に調製した標本について、小胞体のマーカータンパク質であるcalnexinの局在と比較した。その結果、本発明の蛋白質はcalnexinと同じ部分に局在していることが確認できた。この結果から、本発明の蛋白質は、細胞質の小胞体に多く存在することが明らかになった。
[実施例8] 本発明の蛋白質の発現を抑制したES細胞
先に述べたように本発明の遺伝子には既知のモチーフが存在せず、いかなる既知のタンパク質とも相同性を有しない。したがって、その生理機能を明らかにする上で、本発明の遺伝子の欠損マウス(ノックアウトマウス)が果たす役割は大きい。ノックアウトマウスを得ることができれば、このマウスにおける表現形の変化を観察することによって、本発明の遺伝子の生理機能を明らかにすることができる。
ノックアウトマウスを作成するため、まず本遺伝子のゲノミックDNAを取得した。Stratagene社の129SvJ由来のゲノミックライブラリーを、本発明の遺伝子の塩基配列に基づいてデザインしたプローブを用いてスクリーニングした。プローブには29merのDIG標識オリゴヌクレオチドを用いた。プローブの塩基配列を以下に示す。
ポジティブクローンをpKS(+)ベクター(Stratagene社)のNotI siteにサブクローン化し6塩基認識制限酵素を使用して本発明の遺伝子のゲノミックマッビングを行った。マッピングの結果は図10の「ゲノミックDNA」として示したとおりである。次にマッピングの結果に基づいてターゲティングベクターを構築した。ターゲティングベクターの5’アームにはSpeIとAsp718の配列を用いた。また3’アームとしてはNotI−ScaIの部位を使用した。tk−Neo遺伝子(図10の「neogene」)をこれらの配列で挟み込み、tk−Neo遺伝子がATGを含むエキソン(Asp718からNotI部位まで)と入れ替わるように設計した。ターゲティングベクターの構造とゲノミックDNAとの関係を、図10に示した。
ターゲティングベクターは、エレクトロポレーションによってES細胞に導入した。G418耐性クローンを1000ヶ選択し、用いたベクターアームの外側の配列(3’側)をプローブとしサザンブロットを行った。tk−Neo遺伝子が本発明の遺伝子のゲノムDNA上に正確に組み込まれれば、ゲノミックDNAは、開始コドンATGを含むBamHIサイトを失う。その結果、BamHIによる制限酵素断片のパターンは変化する。つまり、図10に示されるように、3’側のプローブを使用したとき4.2kbpと8kbpの二本のバンドが観察されれば、ターゲティングベクターによって正しく組み換えの起ったES細胞であることがわかる。1000ヶのG418耐性クローンより4ヶの組み換えが起ったES細胞を取得することができた。またこれらのクローンはtk−Neo遺伝子をプローブとしたサザンブロットで8kbpのバンドを与えることを確認している。
産業上の利用の可能性
本発明の遺伝子は、レプチン応答の指標として有用である。本発明の遺伝子は、レプチンの投与によって、速やかにその発現が誘導される。したがって、本発明の遺伝子を指標とすることにより、細胞や、生体のレプチン応答の程度を評価することができる。既に述べたように、ヒトにおいてはレプチンの発現レベルではなく、レプチンに対する応答性のレベルが、肥満と密接に関連していることが推測されている。したがって、レプチンに対する応答性の指標となる遺伝子は重要である。
また本発明の遺伝子は、レプチン抵抗性の診断指標として有用である。すなわち、本発明の遺伝子の発現レベルを測定し正常なレベルと比較することにより、レプチン抵抗性の程度を知ることができる。本発明の遺伝子は、レプチンに応答して短期間にその発現レベルが上昇するので、レプチン応答性の指標として望ましい。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、レプチン投与による、ob/obマウス視床下部における本発明の遺伝子の誘導をノーザンブロットによって調べた結果を示す写真。A9が本発明の遺伝子、BRIが対照である。図中、レプチン(−)と示したレーンがPBSを投与した場合、(+)がマウスレプチンを投与した場合の結果である。
図2は、本発明の遺伝子の組織分布をノーザンブロットによって調べた結果を示す写真。各レーンは図中に示した組織に対応する。
図3は、本発明の蛋白質のウエスタンブロット解析の結果を示す写真。各レーンは、以下の蛋白質、または細胞抽出液に対応する。
レーン1:精製本発明の蛋白質−GST融合タンパク質(免疫原)5ng
レーン2:精製本発明の蛋白質−GST融合タンパク質(免疫原)15ng
レーン3:10μgのマウス腎臓の全細胞抽出液
レーン4:30μgのマウス腎臓の全細胞抽出液
レーン5:本発明の遺伝子を過剰発現させたCOS7細胞(全細胞抽出液約5μg)
レーン6:30μgのマウス腎臓の全細胞抽出液(レーン4とは別のマウス)
図4は、マウスとヒトにおける本発明の蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図。マウスのアミノ酸配列を上に、ヒトのアミノ酸配列を下に示した。
図5は、ヒト肝臓組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真。A(上)が150倍、B(下)が300倍。
図6は、ヒト腎臓皮質組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真。A(上)が150倍、B(下)が300倍。
図7は、ヒト副腎皮質組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真(300倍)。
図8は、ヒト睾丸組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真(300倍)。
図9は、ヒト胃上皮組織の免疫組織化学的解析結果を示す写真(300倍)。
図10は、マウスにおける本発明のレプチン誘導遺伝子の発現を抑制したES細胞の構築工程を示す図と写真。ゲノミックDNAにターゲティングベクターで「ネオマイシン耐性遺伝子(neogene)」を導入することにより、レプチン誘導遺伝子の開始コドンを含むBamHIサイトを失う(上)。その結果、サザンブロットで3’probeによる8kbのバンドが現れる(下)。
Claims (18)
- 下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(b)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド。
(c)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(d)配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(e)配列番号:2または配列番号:4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質に特異的に見出される部分アミノ酸配列を含む蛋白質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは請求項3に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
- 請求項4に記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質またはペプチドを回収する工程を含む、請求項2に記載の蛋白質の製造方法。
- 請求項2に記載の蛋白質に結合する抗体。
- 配列番号:1または配列番号:3に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15塩基の連続した塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- 次の工程を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性の評価方法。
(a)被験化合物の存在下で請求項1に記載のポリヌクレオチドを発現する細胞にレプチンを接触させる工程、および
(b)前記ポリヌクレオチドの発現レベルを測定する工程、 - 次の工程を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法。
(a)請求項8に記載の方法によって、被験化合物の請求項1に記載のポリヌクレオチドの発現を調節する活性を評価する工程、および
(b)被験化合物非存在下でレプチンを接触させた対照と比較して前記ポリヌクレオチドの発現レベルを変化させる化合物を選択する工程 - 請求項1に記載のポリヌクレオチド、請求項2に記載の蛋白質、および請求項3に記載のベクターからなる群から選択された少なくとも1つの成分を含有する医薬組成物。
- 次の工程を含む、生体試料中の請求項2に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドの測定方法。
(1)生体試料を請求項6に記載の抗体と接触させる工程、および
(2)請求項2に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドに結合する、請求項6に記載の抗体を検出する工程 - 請求項6に記載の抗体を含む、請求項2に記載の蛋白質、および/またはその部分ペプチドの測定用キット。
- 次の工程を含む、生体試料中の請求項1に記載のポリヌクレオチドの測定方法。
(1)生体試料を請求項7に記載のポリヌクレオチドと接触させる工程、および
(2)生体試料中に含まれる、請求項7に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する工程 - 請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドの測定用キット。
- 請求項2に記載の蛋白質の発現が改変されるように操作された非ヒト脊椎動物。
- ノックアウト動物またはトランスジェニック動物である、請求項15に記載の非ヒト脊椎動物。
- 配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の発現が抑制されているマウス胚性幹細胞。
- 配列番号:1に記載された塩基配列を構成することができるエキソンにおいて、少なくとも開始コドンに変異を有する請求項17に記載のマウス胚性幹細胞。
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