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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Chemokinrezeptor-Antagonisten,
einschließlich
Peptid-Antagonisten des CXC-Chemokinrezeptors 4, zur Herstellung
eines Medikaments, das zur Behandlung von Krebs und einer Autoimmunerkrankung
verwendet werden kann.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Cytokine
sind lösliche
Proteine, sezerniert von verschiedenen Zellen, einschließlich Monozyten
oder Lymphozyten, welche die Immunantworten regulieren. Chemokine
sind eine Überfamilie
von Proteinen, die als chemische Lockstoffe wirksam sind. Chemokine
regulieren verschiedene biologische Antworten, und sie fördern die
Rekrutierung zahlreicher Blutzellinien von Leukozyten und Lymphozyten
zu einem Körperorgangewebe.
Chemokine können
entsprechend der relativen Position der ersten zwei Cysteinreste
im Protein in zwei Familien eingeteilt werden. In einer Familie,
den CXC-Chemokinen, sind die ersten zwei Cysteine durch einen Aminosäurerest
voneinander getrennt, und in der anderen Familie, den CC-Chemokinen, grenzen
die beiden ersten Cysteine aneinander.
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Die
molekularen Ziele für
Chemokine sind Zelloberflächenrezeptoren.
Ein derartiger Rezeptor ist der CXC-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4),
ein 7-transmembranäres
Protein, das an G1 gekoppelt ist, und früher LESTR (Loetscher, M., Geiser,
T., O'Reilly, T.,
Zwahlen, R., Baggionlini, M., and Moser, B. (1994), J. Biol. Chem. 269,
232–237),
HUMSTR (Federsppiel, B., Duncan, A. M. V., Delaney, A., Schappert,
K., Clark-Lewis, I., and Jirik, F. R. (1993), Genomics 16, 707–712) und
Fusin (Feng, Y., Broeder, C. C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A.
(1996), HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane
G protein-coupled
receptor, Science 272, 872–877)
genannt wurde. CXCR4 wird in großem Umfang auf Zellen hämatopoetischen
Ursprungs exprimiert und ist ein hauptsächlicher Co-Rezeptor mit CD4+ für
das menschliche Immundefizienzvirus-1 (Human immunodeficiency virus
1, HIV-1) (Feng,
Y., Broeder, C. C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996), HIV-1
entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane
G protein-coupled receptor, Science Gegenwärtig ist der einzige bekannte
Ligand für
CXCR4 der sich von Stromazellen ableitende Faktor-1 (Stromal cell
derived factor 1, SDF-1). Der Stromal cell derived factor-1α (SDF-1α) (SEQ ID NO: 6) und der Stromal
cell derived factor-1β (SDF-1β) (SEQ ID
NO: 7) sind eng miteinander verwandte Mitglieder (hier gemeinsam
als SDF-1 bezeichnet). Die nativen Aminosäuresequenzen von SDF-1α und SDF-1β sind bekannt, ebenso
wie die genomischen Sequenzen, die für diese Proteine kodieren (US-Patent
Nr. 5,563,048, erteilt am B. Oktober 1996, und US-Patent Nr. 5,756,084,
erteilt am 26. Mai 1998).
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SDF-1
unterscheidet sich funktionell insofern von anderen Chemokinen,
als beschrieben wurde, daß dem
Faktor eine fundamentale Rolle beim Wandern von Immunzellen (Trafficking),
beim Export und beim Homing von Knochenmarkvorläuferzellen zukommt (Aiuti,
A., Webb, I. J., Bleul, C., Springer, T., and Guierrez-Ramos, J.
C. (1996), J. Exp. Med. 185, 11–120,
und Nagasawa, T., Hirota, S., Tachibana, K., Takakura N., Nishikawa,
S.-I., Kitamura, Y., Yoshida, N., Kikutani, H., and Kishimoto, T.
(1996), Nature 382, 635–638).
SDF-1 unterscheidet sich strukturell auch insofern, als dieser Faktor
eine nur ungefähr
22%ige Aminosäuresequenzidentität mit anderen
CXC-Chemokinen aufweist (Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas,
J. M., Aiuti, A., and Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184,
1101–1109).
SDF-1 scheint konstitutiv durch verschiedene Zelltypen produziert
zu werden, und besonders hohe Konzentrationen werden in Knochenmarkstromazellen
gefunden (Shirozu, M., Nakano, T., Inazawa, J., Tashiro, K., Tada,
H. Shinohara, T., and Honjo, T. (1995), Genomics, 28, 495–500, und
Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A., and
Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109). Eine grundsätzliche
physiologische Bedeutung von SDF-1 wird durch das hohe Maß an Konservierung
der SDF-1-Sequenz zwischen verschiedenen Spezies nahegelegt. In
vitro stimuliert SDF-1 die Chemotaxis einer großen Auswahl von Zellen, einschließlich Monozyten
und dem Knochenmark entstammenden Vorläuferzellen (Aiuti, A., Webb,
I. J., Bleul, C., Springer, T., and Guierrez-Ramos, J. C. (1996),
J. Exp. Med. 185, 111–120,
und Bleul, C. C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A.,
and Springer, T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109).
Besonders bemerkenswert ist seine Fähigkeit, eine hohe Prozentzahl
ruhender und aktivierter T-Lymphozyten zu stimulieren (Bleul, C.
C., Fuhlbrigge, R. C., Casasnovas, J. M., Aiuti, A., and Springer,
T. A. (1996), J. Exp. Med. 184, 1101–1109, und Campbell, J. J.,
Hendrick, J., Zlotnik, A., Siani, M. A., Thompson, D. A., and Butcher,
E. C., (1998) Science 279, 381–383).
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Die
3-dimensionale Kristallstruktur von SDF-1 ist beschrieben worden
(Crump, M., Gong J.-H.,
Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F.,
Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis,
I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007).
Eine Struktur/Aktivität-Analyse
von SDF-1 (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K.,
Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini,
M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis,
I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007)
zeigt, daß,
obwohl die N-terminalen Reste 1-8 und 1-9 an der Rezeptorbindung
beteiligt sind, die Peptide 1-8 und 1-9 alleine keine in vitro-Aktivität, die eine
Rezeptoraktivität
anzeigen würde,
aufweisen, was eine Schlußfolgerung
unterstützt,
von der berichtet wurde, wonach die Peptide die Konformation, die
für eine
Bindung an den Rezeptor notwendig ist, nicht annehmen. Dieses Ergebnis
wurde zum Anlaß genommen,
zu unterstellen, daß der
Rest des Proteingerüsts und/oder
verschiedene Konsensus-Rezeptorbindungsstellen
an anderer Stelle im Protein zur Vermittlung der konformationellen
Voraussetzungen für
eine N-terminale Bindung an den Rezeptor wichtig sind (Crump, M., Gong
J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos,
F., Virelizier, J.-L.,
Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J.
16, 6996–7007).
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Zwei-Stellen-Modell
für die
Bindung von SDF-1 an CXCR4 vorgeschlagen, das zwei Bindungsstellen
im Bereich der Reste 1-17, eine N-terminale Stelle und eine strangaufwärts liegende
RFFESH-Stelle vorsieht (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam,
K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini,
M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007).
Die beiden putativen Bindungsstellen sind durch die Sequenz: KPVSLSYR-CPC-RFFESH
(SEQ ID NO: 1) charakterisiert, worin die beiden putativen Bindungsstellen
durch das CXC-Motiv, das die gesamte CXC-Chemokinfamilie charakterisiert,
verbunden sind (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam,
K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini,
M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007).
Diese beiden putativen Bindungsregionen wurden auch in anderen CC-
und CXC-Chemokinen als wichtig identifiziert (Crump, M., Gong J.-H.,
Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier,
J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997),
EMBO J. 16, 6996–7007,
und Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara,
A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes,
B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007).
Dies stimmt mit dem Befund überein,
daß, obwohl die
N-terminale Regionen
einer großen
Auswahl von Chemokinen für
eine Rezeptoraktivierung wesentlich sind, von anderen N-terminalen
Peptiden von Chemokinen als SDF-1 das Fehlen einer Rezeptorbindungsaktivität berichtet
worden ist, und daß diese
keine Rezeptor-Agonisten sind (Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P.,
Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini,
M., Sykes, B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007, und
Crump, M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A.,
Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes,
B. D., and Clark-Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007).
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Übereinstimmend
mit der Tatsache, daß CXCR4
ein hautpsächlicher
Co-Rezeptor für
HIV-1 ist, blockiert SDF-1 das Eindringen von HIV-1 in CD4+-Zellen (Oberlin, E., Amara, A., Bachelerie,
F., Bessia, C., Virelizier, J.-L., Arenzana-Seisdedos, F., Schwartz,
O., Heard, J.-M., Clark-Lewis, I., Legler, D. F., Loetscher, M., Baggiolini,
M., and Moser, B. (1996), Nature 382, 833–835, und Bleul, C. C., Farzan,
M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroksi, J., and Springer,
T. A. (1996), Nature 382, 829–833).
Es wurden Fortschritte erzielt, SDF-1-abgeleitete Peptide, die selektiv mit
dem Eindringen des HIV, nicht aber mit der SDF-1-Signaltransduktion interferrieren, zu
identifizieren (Heveker, N. et al., 1998, Current Biology 8(7):
369–376).
Eine große
Auswahl potentieller CXCR4-bindender Fragmente von SDF-1 wurden
zur Verwendung beim Aufhalten einer HIV-Infektion vorgeschlagen
(WO 97/28258, offengelegt am 7. August 1997, WO 98/04698, offengelegt
am 5. Februar 1998). Wie diese Publikationen klarstellen, hängt die
anti-HIV-Aktivität
von SDF-1 oder Fragmenten von SDF-1 nicht von einem Antagonismus
des CXCR4-Rezeptors ab.
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Interferon-gamma
ist eine bedeutendes Cytokin, das durch aktivierte T-Lymphozyten
(T-Zellen) freigesetzt
wird und als ein wirksamer Immunmodulator wirkt. Eine Interferon-gamma-Produktion
durch T-Zellen in vivo kann andere Zellen im Körper veranlassen, zusätzliche
Cytokine, Enzyme und Antikörper,
die in der Lage sind, viele Bereiche einer Immunantwort zu modulieren,
freizusetzen. Wirkstoffe, welche die Fähigkeit aktivierter T-Zellen, Interferon
gamma zu produzieren, beeinflussen, werden als Immunmodulatoren
charakterisiert.
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Autoimmunerkrankungen
stellen eine Gruppe von Krankheiten dar, bei denen allgemein davon
ausgegangen wird, daß sie
durch die Überproduktion
von Cytokinen, Lymphotoxinen und Antikörpern durch weiße Blutzellen,
einschließlich
bestimmter T-Zellen, verursacht wird. Es wird davon ausgegangen,
daß T-Zellen während einer
Autoimmunreaktion chemische Mediatoren, wie etwa Interferon-gamma,
freisetzen, was zur Entwicklung der pathologischen Symptome der
Autoimmunreaktion führt.
Eine Behandlung von Autoimmunerkrankungen kann deshalb die Verwendung
von Wirkstoffen, die in der Lage sind, die Freisetzung von Interferon gamma
aus T-Zellen zu hemmen, beinhalten. Derartige Autoimmunerkrankungen
können
beispielsweise Multiple Sklerose (MS), das Guillain-Barré-Syndrom,
amyotrophische Lateralsklerose, die Parkinson'sche Krankheit, die Alzheimer'sche Krankheit, Gicht,
Lupus und jede andere menschliche Krankheit einschließen, bei
der T-Zellen eine Hauptrolle spielen.
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Interferon-beta
ist ein Cytokin, für
das eine therapeutische Bedeutung bei der Behandlung verschiedener
Autoimmunerkrankungen festgestellt wurde. Bei Autoimmunerkrankungen,
wie etwa MS, wird angenommen, daß die Aktivierung von T-Zellen
vom Typ Th1 ein primärer
Bestandteil der Autoimmunantwort ist. Beim MS wird durch die Autoimmunantwort
die Myelinscheide neuronaler Axone angegriffen. Einer der klassischen Marker
einer Th1-Zellaktivierung
ist die Produktion von Interferon-gamma. Bei der Entwicklung von
Interferon-beta als einem therapeutischen Wirkstoff zur Behandlung
von MS wurden Studien durchgeführt,
um die Fähigkeit
von Interferon-beta, die Produktionsrate von Interferon-gamma aus Lymphozyten
in vitro herabzusetzen, zu demonstrieren (Ann. Neurol. 1998, 44:
27–34,
und Neurology 1998, 50: 1294–1300).
Die Reduktion der Interferon-gamma-Freisetzung durch Behandlung mit Interferon-beta
ist eine Hinweis auf die Wirksamkeit von Interferon-beta bei der
Behandlung von MS. Es besteht ein anhaltender Bedarf an anderen
Wirkstoffen, welche die Produktion von Interferon-gamma hemmen,
insbesondere Wirkstoffen zur Verwendung bei der Behandlung einer
Autoimmunerkrankung, einschließlich
Wirkstoffen, die synergistisch wirken können, um die Wirkung vorhandener
Wirkstoffe, wie etwa Interferon-beta, zu steigern.
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Das
Wachstum solider Tumoren ist allgemein abhängig von einer Angiogenese
(Neovaskularisierung), und Angiogenese-Inhibitoren sind deshalb
als Wirkstoffe zur Behandlung solider Tumoren und Metastasen eingesetzt
worden. Endothelzellen (EC) in der Vaskulatur spielen eine wesentliche
Rolle bei der Angiogenese, und dementsprechend besteht ein Bedarf
an therapeutischen Wirkstoffen, die an dieser Aktivität ansetzen.
Es wird davon ausgegangen, daß die
Proliferation, Migration und Differenzierung von Gefäßendothelzellen
während
der Angiogenese sowohl im Normalzustand als auch bei Krankheitszuständen durch
die komplexen Interaktionen verschiedener Chemokine und Chemokinrezeptoren
moduliert wird. CXCR4 wird auf Gefäß-ECs exprimiert und ist Berichten
zufolge der häufigste
Rezeptor unter allen untersuchten Chemokinrezeptoren (Gupta et al,
1998).
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1: Sequenz des nativen SDF-1
(Stand der Technik)
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2: Aktivität von SDF-1-Peptiden
als chemische Lockstoffe. Konzentrationsabhängige Migration von CEM-Zellen
(a) und T-Lymphozyten (b) als Antwort auf die SDF-1-Peptide 1-8 (
);
1-9 (Δ);
1-9 dimer (
); und
1-9 [Aba] (⊞);
und als Antwort auf natives SDF-1 (
).
Die gezeigten Werte stellen Mittelwerte ± SD von gewanderten Zellen
dar. Ähnliche
Ergebnisse wurden in zwei weiteren Experimenten erhalten.
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3: Hemmung der Chemotaxis
durch Chemokin-Antagonisten. CEM-Zellmigration, induziert durch SDF-1
(1-9)-Peptid (10 μM)
in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen des SDF-1-Antagonisten
SDF-1 (1-67) [P2G] (
);
oder des IL-8-Antagonisten IL-8 (6-72) (
.
Die Migrationsereignisse werden angegeben in Prozent der Antwort,
die in Abwesenheit des Antagonisten (Kontrolle,
)
erhalten wurden. Die Werte zeigen die Mittelwerte ± SD von
Doppelbestimmungen aus zwei separaten Experimenten.
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4: Rezeptorbindung von SDF-1-Peptiden.
Dargestellt ist die Kompetition um die spezifische Bindung
125I-SDF-1 (4 nM) an CEM-Zellen mit den Peptiden
1-8 (
);
1-9 (Δ);
1-9 Dimer (
);
1-9 [Aba-9] (⊞;
natives SDF-1 (
)
Gezeigt werden spezifisch gebundene cpm in Prozent in Abwesenheit
des Kompetitors (
).
Repräsentative
Ergebnisse aus zwei bis sechs Experimenten.
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5: Rezeptorselektivität der SDF-1-Peptide.
Mit Fura-2 beladene T-Lymphozyten wurden nacheinander mit Chemokinen
und SDF-1 (1-9) stimuliert, und es wurden die resultierenden (Ca2+)i-abhängigen Änderungen
der Fluoreszenz erfaßt.
- (a) Kreuz-Desensibilisierung von SDF-1 und
dem 1-9-Peptid.
- (b) Fehlen einer Desensibilisierung von SDF-1 (1-9) durch die
angegebenen CXC- oder CC-Chemokine. Die
Chemokine wurden in einer Konzentration von 100 nM zugesetzt, abgesehen
von SDF-1, das in einer Konzentration von 1 nM zugesetzt wurde,
gefolgt von einer Zugabe des 1-9-Peptids (30 μM) nach 60 s. Gezeigt werden
repräsentative
Ergebnisse von zwei bis drei unabhängigen Experimenten.
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6: Zellen der Lungenkarzinomzellinie
Linie-1 (Line-1 lung carcinoma; 5 × 105/50 μl in PBS-Puffer) wurden
jeder BALB/c-Maus (Männchen,
6–8 Wochen
alt, bezogen von Jackson Labs, Bar Harbour, ME) subkutan in den
Rücken
injiziert. Die Mäuse
wurden blind in vier Gruppen eingeteilt (drei in jeder Gruppe).
Unmittelbar nach der Implantation erhielten die Mäuse i. p.
oder s. c. eine Injektion von SDF-1P2G (9 mg/kg in 100 μl PBS-Puffer).
Den Kontrollmäusen
wurde dieselbe Dosis Rinderserumalbumin (BSA) oder lediglich PBS-Puffer
injiziert. Die Injektion erfolgte einmal täglich. Die Größe des Tumors
wurde täglich
erfaßt.
Am Tag 16 wurde die Tumormasse bestimmt. Die Schnitte von Tumor
und Lunge wurden gefärbt
und morphologisch auf Blutgefäße und Metastasen
untersucht. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Tumorgröße.
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7: Zellen der Karzinom-Linie-1
(1 × 106/Maus) wurden implantiert (s. c.), wie oben
beschrieben. Die Mäuse
wurden blind in vier Gruppen (jeweils 2) eingeteilt und mit SDF-1P2G
(9 mg/kg) oder der dimeren Form von SDF (1-9) P2G (18 mg/kg) behandelt.
Den Kontrollgruppen wurde lediglich PBS-Puffer oder BSA injiziert.
Die Injektion erfolgte täglich
i. p. Größe und Masse
der Tumoren wurden wie oben beschrieben bestimmt. Am Tag 12 wurde
die Histologie des Tumors untersucht. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM der Tumorgröße.
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8: Masse des Tumors aus
dem Experiment in 7.
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9: Hemmung des Wachstums
des Mäuse-Lungenkarzinoms
(Lewis-Lungenkarzinom) durch den Vollänge-SDF-1-Antagonisten oder
einen Kurzpeptid-Antagonisten.
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10: Tumormasse (Lewis-Lungekarzinom)
am Tag 12.
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11: Wirkung von SDF-1 auf
die ConA-stimulierte Interferon-gamma-Produktion in menschlichen T-Zellen.
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12: Wirkung eines SDF-1-Antagonisten
auf die ConA-stimulierte Interferon-gamma-Produktion in menschlichen T-Zellen.
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13: Wirkung von 10 nM SDF-1
und einem Antagonisten auf die mit 10 nM ConA stimulierte Interferon-gamma-Produktion.
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14: Dimerstruktur der Peptid-Antagonist-Verbindungen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Der
Gegenstand der Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
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CXCR4-Antagonisten
können
wie folgt therapeutisch angewendet oder verwendet werden, um ein
Medikament für
derartige therapeutische Behandlungen herzustellen: zur Reduktion
der Interferon-gamma-Produktion durch T-Zellen, zur Behandlung einer
Autoimmunerkrankung, zur Behandlung von Multipler Sklerose, zur
Behandlung anderer neurologischer Erkrankungen, zur Behandlung von
Krebs und zur Regulation der Angiogenese. CXCR4-Inhibitoren können, insbesondere zur Behandlung
von Multipler Sklerose, mit oder ohne Interferon-beta verwendet
werden. Zur medizinischen Behandlung soll eine therapeutische Dosis
eines CXCR4-Antagonisten in einer pharmakologisch akzeptablen Formulierung
verabreicht werden. Dementsprechend macht die Erfindung auch eine
therapeutische Zusammensetzung verfügbar, die einen CXCR4-Antagonisten,
Interferon-beta und einen pharmakologisch akzeptablen Arzneimittelträger oder
Träger
umfaßt,
wie oben beschrieben. Die therapeutische Zusammensetzung kann vorteilhafterweise
in einer wäßrigen Lösung bei
einem physiologisch akzeptablen pH-Wert löslich sein.
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Die
CXCR4-Antagonisten können
Peptidverbindungen sein, die ein im wesentlichen gereinigtes Peptidfragment,
ein modifiziertes Fragment, ein Analogon oder ein pharmazeutisch
akzeptables Salz von SDF-1 umfassen. In einigen Ausführungsformen
kann die Peptidverbindung eine N-terminale Aminosäuresequenz KGVSLSYRC-R1 (SEQ ID NO: 2) umfassen, wobei R1 ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Polypeptiden,
die zumindestens zu einem Teil von SDF-1 homolog sind.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann die Peptidverbindung eine dimerisierte N-terminale Aminosäuresequenz
umfassen (hier dargestellt durch das zweite Dimer, geschrieben vom
Carboxy zum Aminoende): KGVSLSYR-X-RYSLSVGK (ein Dimer mit der SEQ
ID NO: 3, wie in 14 gezeigt),
wobei X eine Lysin-Aminosäure
sein kann, bei der sowohl die α-
als auch ε-Aminogruppen
mit der Bildung einer Amidbindung im Zusammenhang stehen und die
Lysylcarboxygruppe geschützt
sein kann. In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Peptidverbindung
weiterhin eine dimerisierte N-terminale Aminosäure enthalten (hier dargestellt durch
das zweite Dimer, geschrieben vom Carboxy zum Aminoende): KGVSLSYRC-X-CRSLSVGK (ein Dimer mit
der SEQ ID NO: 4, wie in 14 gezeigt),
wobei X eine Lysin-Aminosäure
sein kann, bei der sowohl die α-
als auch ε-Aminogruppen
mit der Ausbildung einer Amidbindung in Zusammenhang stehen und
die Lysylcarboxygruppe geschützt
sein kann. Alternativ kann X in den zuvor erwähnten dimerisierten Peptidverbindungen
jede brückenbildende
Gruppe sein, die Peptide kovalent miteinander verbindet, so daß eine Vielzahl
von Peptiden durch die Brücke
miteinander verbunden sind, um eine Vielzahl von N-Termini in den Verbindungen verfügbar zu
machen.
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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In Übereinstimmung
mit verschiedenen Aspekten der Erfindung können CXCR4-Antagonisten verwendet werden, um Medikamente
zur Behandlung verschiedener Autoimmunerkrankungen herzustellen.
Derartige Erkrankungen schließen
Multiple Sklerose, das Guillain-Barré-Syndrom (GBS), amyotrophische
Lateralsklerose (ALS) und andere Erkrankungen der Nerven, rheumatoide
Arthritis, Psoriasis, Diabetes vom Typ 1, Colitis ulzerosa, Gicht,
Lupus und Transplantat-Abstoßungen
ein.
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Antagonisten
von CXCR4 können
therapeutisch verwendet werden, um die Angiogenese und das Zellwachstum
bei menschlichen pathologischen Erkrankungen, einschließlich Krebserkrankungen,
wie etwa einem Lymphom und einem Karzinom, ebenso wie eine Restenose,
zu regulieren. Wie hier beispielhaft dargestellt, sind zwei CXCR4-Peptid-Antagonisten
verwendet worden, um eine Angiogenese und das Tumorwachstum in Mäusemodellen
von Säugetierkrebs
zu hemmen.
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Die
SDF-1-Antagonisten der Erfindung können verwendet werden, um die
Interferon-gamma-Produktion
durch aktivierte T-Zellen zu hemmen. Dies kann bei der Behandlung
einer Autoimmunerkrankung von besonderer Bedeutung sein, bei der
die Produktion von Interferon-gamma
durch T-Zellen einen im Stand der Technik anerkannten Kranheitsmarker
darstellt. Beispiele von Erkrankungen, von denen bekannt ist, daß sie durch
Interferon-gamma vermit telt werden, sind MS (Proc. Natl. Acad Sci.
Vol. 95; 675–680;
1998), das Guillain-Barré-Syndrom (Ann. Neurol,
Vol. 27; S57–S63;
1990), eine autoimmune Nierenschädigung
(J. Immunol. 161; 494–503;
1998), Arthritis (Immunol. 95; 480–487; 1998) sowie verschiedene
andere neurologische Erkrankungen (Acta Neurol. Scand. 90; 19–25; 1994).
Allgemeinere Beschreibungen von durch Interferon-gamma vermittelten
Autoimmunerkrankungen sind in J. Immunol. 161; 6878–6884; 1998,
und J. Exp. Med. 186; 385–391,
1997, zu finden. In einer Ausführungsform
der Erfindung ist der Peptid-Antagonist SDF-1 (1-67) [P2G] beispielsweise
verwendet worden, um eine Produktion von Interferon-gamma durch
T-Zellen zu hemmen. Auch das Peptid SDF-1 (1-9) P2G reduzierte die
Interferon-gamma-Freisetzung aus menschlichen T-Zellen (d. h., diese
Peptide sind Regulatoren menschlicher Autoimmunerkrankungen).
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Die
Anmeldung beschreibt auch einen Test, um CXCR4-Inhibitoren zu identifizieren,
die verwendet werden können,
um eine Interferon-gamma-Produktion zu hemmen, insbesondere bei
einer Autoimmunerkrankung. Ein derartiger Test wird hier in Beispiel
2 offenbart.
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Der
Test umfaßt
Concanavalin A-stimulierte T-Zellen, die Interferon-gamma freisetzen.
In dem Test werden die T-Zellen mit dem putativen CXCR4-Antagonisten
in Kontakt gebracht, und der Grad der Interferon-gamma-Freisetzung
wird gemessen. Die Verbindungen, die auf ihre antagonistische Aktivität hin getestet werden
sollen, können
nach ihrer Fähigkeit,
das Ausmaß der
Interferon-gamma-Produktion herabzusetzen, ausgewählt werden.
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Ein
Test für
Verbindungen, die eine Angiogenese hemmen, wird ebenfalls offenbart.
In dem Test wird ein vaskularisierter Tumor in einer Maus mit dem
putativen CXCR4-Antagonisten in Kontakt gebracht, und der Grad der
Vaskularisierung wird gemessen. Die Verbindungen, die auf ihre anti-angiogenetische
Aktivität
hin untersucht werden sollen, können
nach ihrer Fähigkeit
ausgewählt
werden, das Ausmaß einer
Vaskularisierung in einem Tumor herabzusetzen.
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Die
vorliegende Erfindung nutzt CXCR4-Antagonisten in verschiedener
Hinsicht. In einigen Ausführungsformen
können
die CXCR4-Antagonisten der Erfindung im wesentlichen gereinigte
Peptidfragmente, modifizierte Peptidfragmente, Analoga oder pharmakologisch
akzeptable Salze sowohl von SDF-1α als
auch von SDF-1β sein.
Von SDF-1 abgeleitete Peptid-Antagonisten
von CXCR4 können
durch bekannte physiologische Tests und verschiedenen Synthesetechniken
(wie etwa offenbart in Cramp et al., 1997, The EMBO Journal 16 (23):
6996–7007,
und Heveker et al., 1998, Current Biology 8 (7): 369–376; jede
Publikation ist hiermit durch Bezugnahme aufgenommen) identifiziert
werden. Derartige Analoga von SDF-1 schließen Homologe von nativem SDF-1
ein, wie etwa natürlich
vorkommende Isoformen oder genetische Varianten oder Polypeptide
mit einer wesentlichen Sequenzähnlichkeit
zu SDF-1, wie etwa einer 40%igen Sequenzidentität, einer 60%igen Sequenzidentität, oder
vorzugsweise einer 80%ige Sequenzidentität, mit mindestens einem Bereich
der nativen SDF-1-Sequenz,
vorausgesetzt, daß sie
CXCR4-antagonistische Aktivität
aufweisen. In einigen Ausführungsformen
können
Aminosäuren
in der nativen SDF-1-Sequenz durch chemisch ähnliche Aminosäuren ersetzt
werden (um Substitutionen konservativer Aminosäuren verfügbar zu machen). In einigen
Ausführungsformen
weisen Peptide ein N-terminales LSY-Sequenzmotiv im Bereich von
10, oder vorzugsweise im Bereich von 7, Aminosäuren des N-Terminus auf und/oder
es kann ein N-terminales RFFESH-Sequenzmotiv (SEQ ID NO: 5) im Bereich
von 20 Aminosäuren
des N-Terminus verwendet werden, vorausgesetzt, sie weisen CXCR4-antagonistische Aktivität auf. Der
Einzelbuchstabencode und der Dreibuchstabencode für Aminosäuren wird
hier austauschbar verwendet. Eine Familie derartiger Kandidaten
für Peptid-Antagonisten
weist ein KP-Motiv als N-Terminus und ein LSY-Motiv im Bereich der
Aminosäuren
5–7 auf.
Alternative Peptide schließen
weiterhin das RFFESH-Motiv (SEQ ID NO: 5) im Bereich der Aminosäuren 12–17 ein.
Bei alternativen Ausführungsformen
ist das LSY-Motiv in den Positionen 3–5 eines Peptids lokalisiert.
Die Erfindung macht auch Peptid-Dimere
mit zwei Aminosäuresequenzen
verfügbar,
die jeweils die vorangehenden Sequenzelemente aufweisen können, verknüpft durch
eine Disulfidbrücke
im Bereich von 20, oder vorzugsweise im Bereich von 10, Aminosäuren des
N-Terminus, wobei Cysteinreste oder α-Aminobutyrsäurereste verbunden sind.
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Unter
einem Aspekt verwendet die Erfindung CXCR-Antagonisten, bei denen
Glycin durch Prolin in der Aminosäureposition 2 ersetzt ist.
Die gesamten (d. h. eine Länge
von 67 Aminosäuren)
Versionen dieses Analogons, bezeichnet als SDF-1 (1-67) [P2G], sind
ein wirksamer CXCR4-Rezeptor-Antagonist (Crump et al., 1997, The
EMBO Journal 16 (23): 6996–7007).
Verschiedene kleine SDF-1-Peptidanaloga können ebenfalls als CXCR4-Antagonisten
verwendet werden. Ein derartiges Peptid ist ein Dimer der Aminosäuren 1-9,
wobei in jedem Monomer des Dimers Prolin in Position 2 durch Glycin
substituiert ist, und wobei die Aminosäureketten durch eine Disulfidbindung
zwischen jedem der Cysteine in Position 9 in jeder Sequenz verbunden
sind (bezeichnet als SDF-1 (1-9 [P2G])2).
SDF-1 (1-9 [P2G])2 fehlte eine nachweisbare
chemotaktische Aktivität (2a), kompetierte jedoch
um die SDF-1-Bindung
mit ähnlicher
Affinität
wie ein SDF-1 (1-9)2-Dimer (4). Das SDF-1 (1-9 [P2G])2-Dimer
hemmte die SDF-1-Aktivität
in einer dosisabhängigen
Weise (3b). Es waren
50 μM des
SDF-1 (1-9 [P2G])2-Dimers erforderlich,
um die Aktivität
von 10 nM SDF-1
um 50%, einem Verhältnis
von 5.000, zu hemmen.
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Die
Erfindung verwendet CXCR4-Antagonisten zur Herstellung pharmazeutischer
Zusammensetzungen. Derartige Zusammensetzungen beinhalten eine CXCR4-Antagonist-Verbindung in einer
therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht,
um die Produktion von Interferon-gamma zu verändern und vorzugsweise zu hemmen,
sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Zusammensetzung beinhaltet
die Verbindung eines CXCR4-Antagonisten in einer therapeutisch oder
prophylaktisch wirksamen Menge, die ausreicht, die Angiogenese,
vorzugsweise diejenige Angiogenese, die mit Karzinomen und Lymphomen
im Zusammenhang steht, zu hemmen, sowie einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger.
Eine „therapeutische
wirksame Menge" bezieht
sich auf eine wirksame Menge in Dosierungen und Zeiträumen, die
notwendig sind, um das gewünschte
therapeutische Ergebnis, wie etwa eine Reduktion oder Umkehrung
der Angiogenese im Fall von Krebs oder eine Reduktion oder Hemmung
der Interferon-gamma-Produktion durch T-Zellen im Fall von Autoimmunerkrankungen,
zu hemmen. Eine therapeutisch wirksame Menge von CXCR4-Antagonisten kann
in Abhängigkeit
von Faktoren, wie etwa dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht und
Gewicht des Individuums, und der Fähigkeit der CXCR4-Antagonisten,
in dem Individuum eine gewünschte
Antwort hervorzurufen, variieren. Dosierungspläne können entsprechend angepaßt werden,
um die optimale therapeutische Antwort hervorzurufen. Eine therapeutisch
wirksame Menge ist auch diejenige, bei der jede toxische oder nachteilige
Wirkung des CXCR4-Antagonisten durch die therapeutisch vorteilhaften
Wirkungen aufgewogen werden. Eine „prophylaktisch wirksame Menge" bezieht sich auf
eine wirksame Menge in Dosierungen oder Zeiträumen, die notwendig sind, um
das gewünschte
prophylaktische Ergebnis zu erzielen, wie etwa die Metatastasierungsrate
eines Tumors oder den Beginn von Anfällen oder Episoden von Multipler
Sklerose zu verhüten
oder zu hemmen. Eine prophylaktisch wirksame Menge kann, wie oben
für die
therapeutisch wirksame Menge beschrieben, bestimmt werden. Da die
prophylaktische Dosis bei Patienten vor oder während eines früheren Krankheitsstadiums
angewendet werden soll, wird die prophylaktisch wirksame Menge typischerweise
geringer sein als die therapeutisch wirksame Menge.
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Ein
bevorzugter Bereich für
therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Mengen an einen CXCR4-Antagonisten
kann bei 0,1 nM bis 0,1 M, vorzugsweise 0,1 nM bis 0,5 M, stärker bevorzugt
0,05 nM bis 15 μM,
und am stärksten
bevorzugt 0,01 nM bis 10 μM,
liegen. Anzumerken ist, daß die
Werte für
die Dosierungen mit der Schwere des Leidens, das gelindert werden
soll, insbesondere Multiple Sklerose, variieren kann. Ferner ist
davon auszugehen, daß für jedes
einzelne Versuchsobjekt entsprechend dem individuellen Bedarf und
der professionellen Beurteilung derjenigen Person, welche die Zusammensetzungen
verabreicht oder die Verabreichung überwacht, eine Anpassung der
speziellen Dosierungspläne über eine
Zeit erfolgen sollte, und daß hier
festgesetzte Dosierungsbereiche lediglich beispielhaft sind und
nicht beabsichtigen, den Umfang oder die Ausführbarkeit der beanspruchten
Zusammensetzung zu beschränken.
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Die
Menge der aktiven Verbindung in der Zusammensetzung kann in Abhängigkeit
von Faktoren, wie etwa dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht
und Gewicht des Individuums, variieren. Dosierungspläne können entsprechend
angepaßt
werden, um die optimale therapeutische Antwort zu erzielen. Beispielsweise
kann ein einzelner Bolus verabreicht werden, es können mehrere
aufgeteilte Dosen über
die Zeit verabreicht werden, oder es kann die Dosis portionsweise
reduziert oder gesteigert werden, je nachdem, was die Anforderungen
der therapeutischen Situation indizieren. Vorteilhaft ist insbesondere,
parenterale Zusammensetzungen in Form von Dosiereinheiten zur erleichterten
Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu formulieren. „Dosiereinheit" (Dosage unit form),
wie hier verwendet, betrifft physikalisch getrennte Einheiten, die
für die
zu behandelnden Säugetier-Versuchsobjekte
als einheitliche Dosierungen geeignet sind; wobei jede Einheit eine vorbestimmte
Menge an aktiver Verbindung enthält,
die berechnet wurde, um den gewünschten
therapeutischen Effekt hervorzurufen, in Verbindung mit dem erforderlichen
pharmazeutischen Träger.
Die Maßangaben für die Dosiereinheiten
der Erfindung werden durch (a) die einzigartigen Kennzeichen der
aktiven Verbindung und die besondere therapeutischen Wirkung, die
erzielt werden soll, sowie durch (b) die Einschränkungen, die der Kunst des
Herstellens einer derartigen aktiven Verbindung zur Behandlung einer Überempfindlichkeit
von Individuen zueigen sind, diktiert und sind davon abhängig.
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Ein „pharmazeutisch
akzeptabler Träger" oder „Arzneistoffträger", wie hier verwendet,
beinhaltet jedes und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Beschichtungen, anti-bakterielle und fungizide
Wirkstoffe, isotonische und resorptionsverzögernde Wirkstoffe und ähnliches,
die physiologisch verträglich
sind. In einer Ausführungsform
ist der Träger
zur parenteralen Verabreichung geeignet. Alternativ kann der Träger zur
intravenösen, intraperitonealen,
intramuskulären,
sublingualen oder oralen Verabreichung geeignet sein. Pharmazeutisch akzeptable
Träger
schließen
sterile wäßrige Lösungen oder
Dispersionen sowie sterile Pulver zur unvorbereiteten Präparation
steril injizierbarer Lösungen
oder Dispersionen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Wirkstoffe
für pharmazeutisch
aktive Substanzen sind im Stand der Technik gut bekannt. Außer insoweit,
als irgendein herkömmliches
Medium oder irgendein herkömmlicher
Wirkstoff mit der aktiven Verbindung unverträglich ist, ist deren Verwendung
in pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung in Betracht
zu ziehen. Unterstützende
aktive Verbindungen können
ebenfalls in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
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Therapeutische
Zusammensetzungen müssen
typischerweise unter Herstellungs- und Lagerungsbedingungen steril
und stabil sein. Die Zusammensetzung kann als Lösung, Mikroemulsion, Liposom
oder einer anderen geordneten Struktur, die für eine hohe Arzneistoffkonzentration
geeignet ist, formuliert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium, das beispielsweise Wasser, Ethanol,
Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und ähnliches)
enthält,
und geeignete Mischungen daraus sein. Die richtige Fluidität kann beispielsweise
aufrechterhalten werden, indem eine Beschichtung, wie etwa Lecithin,
verwendet wird, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Fall
einer Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven
Agenzien. In vielen Fällen
wird bevorzugt sein, isotonische Wirkstoffe, beispielsweise Zucker,
Polyalkohole, wie etwa Mannitol, Sorbitol oder Natriumchlorid, in
die Zusammensetzung aufzunehmen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren
Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem ein Wirkstoff, der
die Absorption verzögert,
beispielsweise Monostearatsalze und Gelatine, in die Zusammensetzung
aufgenommen werden. Darüberhinaus
können
die CXCR4-Antagonisten in einer, an eine zeitlich veränderte Freisetzung
angepaßte
Formulierung verabreicht werden, beispielsweise in einer Zusammensetzung,
die ein Polymer zur verlangsamten Freisetzung (Slow release) einschließt. Die
aktiven Verbindungen können
mit Trägern
hergestellt werden, welche die Verbindung gegen eine rasche Freisetzung
schützen,
wie etwa bei eine Retard-Formulierung (Controlled release formulation),
einschließlich
Implantaten und Freisetzungssystemen auf der Grundlage von Mikrokapseln.
Biologisch abbaubare und biologisch verträgliche Polymere, wie etwa Ethylenvinylacetat,
Polyanhydride, Polyglycolsäure,
Kollagen, Polyorthoester, Polymilchsäure sowie Polylactat- und Polyglycolat- Copolymere (PLG)
können
verwendet werden. Viele Verfahren zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen
sind patentiert oder den Fachleuten allgemein bekannt.
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Steril
injizierbare Lösungen
können
hergestellt werden, indem die aktive Verbindung (z. B. ein CXCR4-Antagonist)
in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel
mit einem der oben aufgezählten
Inhaltsstoffe oder einer Kombination davon aufgenommen wird, erforderlichenfalls
gefolgt von anschließender
Sterilfiltration. Dispersionen werden im allgemeinen hergestellt,
indem die aktive Verbindung in einem sterilen Vehikel aufgenommen
wird, das ein Basis-Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen der
oben aufgezählten
Inhaltsstoffe enthält.
Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung steril injizierbarer
Lösungen
sind bevorzugte Herstellungsverfahren die Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung,
woraus ein Pulver des aktiven Inhaltsstoffs plus jedes zusätzlich gewünschten
Inhaltsstoffs aus einer zuvor sterilfiltrierten Lösung hervorgeht.
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In Übereinstimmung
mit einem alternativen Aspekt der Erfindung kann ein CXCR4-Antagonist mit einer
oder mehreren zusätzlichen
Verbindungen, welche die Löslichkeit
des CXCR4-Antagonisten erhöhen,
formuliert werden.
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Ein
weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zum Auswählen von CXCR4-Antagonisten,
die an den CXCR4-Rezeptor binden. Bei diesem Verfahren wird eine
Testverbindung mit aktivierten menschlichen T-Zellen in Kontakt
gebracht, die Produktion von Interferon-gamma wird gemessen, und
ein CXCR4-Antagonist wird aufgrund der Fähigkeit der Testverbindung,
die Produktion von Interferon-gamma herabzusetzen oder zu hemmen,
ausgewählt.
Die Testverbindung kann ein im wesentlichen gereinigtes Peptidfragment,
ein modifiziertes Fragment, ein Analogon oder ein pharmakologisch
akzeptables Salz von entweder SDF-1α oder SDF-1β sein. Die Testverbindung wird
mit einer Menge an T-Zellen im molaren Überschuß in Kontakt gebracht. Die
Menge und/oder Rate der Interferon-gamma-Produktion in Gegenwart
der Testverbindung kann durch einen geeigneten Test, wie hier an
anderer Stelle beschrieben, bestimmt werden. In Gegenwart einer
Testverbindung, welche die Interferon-gamma-Produktion hemmt, ist die Produktion
von Interferon-gamma im Vergleich zu der Situation, wenn der CXCR4-Antagonist
fehlt, reduziert.
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CXCR4-Antagonist-Verbindungen
der Erfindung schließen
SDF-1-Derivate, wie etwa C-terminale
Hydroxymethylderivate, O-modifizierte Derivate (z. B. C-terminale
Hydroxyme thylbenzylether), N-terminal modifizierte Derivate, einschließlich substituierter
Amine, wie etwa Alkylamiden und Hydraziden, und Verbindungen, bei
denen ein C-terminaler Phenylalaninrest durch ein Phenethylamid-Analogon
(z. B. Ser-Ile-Phenethylamid als ein Analogon des Tripeptids Ser-Ile-Phe)
ersetzt ist, ein.
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Eine
CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung kann eine Peptidstruktur
(wie etwa ein SDF-1-abgeleitetes Peptid) direkt oder indirekt an
mindestens eine modifizierende Gruppe gekoppelt sein. Der Begriff „modifizierende
Gruppe" soll Strukturen
einschließen,
die direkt an die Peptidstruktur angehängt sind (z. B. durch kovalente
Kopplung), ebenso wie jene, die indirekt an die Peptidstruktur angehängt sind
(z. B. durch eine stabile, nicht-kovalente Assoziierung oder durch
kovalente Kopplung an zusätzliche
Aminosäurereste
oder Mimetika, Analoga oder Derivate davon, welche die Kernstruktur
des SDF-1-Kernpeptids flankieren). Beispielsweise kann die modifizierende
Gruppe an den Aminoterminus oder Carboxyterminus einer SDF-1-Peptidstruktur
oder an eine Peptid- oder Peptidmimetikum-Region, welche die Kerndomäne flankiert,
gekoppelt sein. Alternativ kann die modifizierende Gruppe an eine
Seitenkette von mindestens einem Aminosäurerest einer SDF-1-Peptidstruktur
oder an eine Peptid- oder Peptidmimetikum-Region, welche die Kerndomäne flankiert
(z. B. durch die epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes/von Lysinresten, über die
Carboxygruppe eines Asparaginsäurerestes/von
Asparaginsäuresten
oder eines Glutaminsäurerestes/von
Glutaminsäuren, über eine
Hydroxygruppe eines Tyrosinrestes/von Tyrosinresten, eines Serinrestes/von
Serinresten oder eines Threoninrestes/von Threoninresten oder andere
geeignete reaktive Gruppen in einer Aminosäureseitenkette) gekoppelt sein.
Modifizierende Gruppen, die kovalent an die Peptidstruktur gekoppelt
sind; können
mittels und unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik
zum Verknüpfen
chemischer Strukturen, einschließlich beispielsweise Amide,
Alkylamino, Carbamate oder Harnstoffbindungen, bekannt sind, angehängt werden.
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Der
Begriff „modifizierende
Gruppe" soll Gruppen
einzuschließen,
die nicht natürlicherweise
an natürliche
SDF-1-Peptide in deren nativer Form gekoppelt sind. Dementsprechend
soll der Begriff „modifizierende Gruppe" nicht Wasserstoff
einschließen.
Die modifizierende Gruppe ist/die modifizierenden Gruppen sind derart
ausgewählt,
daß die
CXCR4-Antagonist-Verbindung
die Interferon-gamma-Produktion verändert, vorzugsweise hemmt.
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Die
Erfindung macht auch „modifizierende
Gruppen" verfügbar, derart
ausgewählt,
daß die CXCR4-Antagonist-Verbindung
eine Angiogenese von Tumoren hemmt, wenn sie mit den T-Zellen bzw. dem Tumor
in Kontakt gebracht wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
die modifizierende Gruppe/die modifizierenden Gruppen eine zyklische,
heterozyklische oder polyzyklische Gruppe. Der Begriff „zyklische
Gruppe", wie hier
verwendet, soll eine zyklische gesättigte oder ungesättigte (d.
h. aromatische) Gruppe mit ungefähr
3 bis 10, vorzugsweise ungefähr
4 bis 8, und stärker
bevorzugt ungefähr
5 bis 7 Kohlenstoffatomen, einschließen. Beispielhafte zyklische
Gruppen beinhalten Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl
und Cyclooctyl. Zyklische Gruppen können nicht-substituiert oder
an einer oder mehreren Ringpositionen substituiert sein. Demnach kann
eine zyklische Gruppe mit z. B. Halogenen, Alkyl-, Cycloalkyl-,
Alkenyl-, Alkynyl-, Arylgruppen, Heterozyklen, Hydroxy-, Amino-,
Nitro-, Thiolamin-, Imin-, Amid-, Phsophonat-, Phosphin-, Carbonyl-,
Carboxyl-, Silyl-, Ether-, Thioether-, Sulfonyl-, Sulfonat-, Selenether-,
Keton-, Aldehyd-, Estergruppen, -CF3, -CN
oder ähnlichem
substituiert sein.
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Der
Begriff „heterozyklische
Gruppe" soll zyklische,
gesättigte
oder ungesättigte
(d. h. aromatische) Gruppen mit ungefähr 3 bis 10, vorzugsweise ungefähr 4 bis
8, und stärker
bevorzugt ungefähr
5 bis 7, Kohlenstoffatomen beinhalten, wobei die Ringstruktur ungefähr 1 bis
4 Heteroatome einschließt.
Heterozyklische Gruppen schließen
Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Imidazol, Oxazol, Piperidin, Piperazin
und Morpholin ein. Der heterozyklische Ring kann an einer oder mehreren
Positionen mit solchen Substituenten substituiert sein, wie beispielsweise
Halogenen, Alkyl-, Cycloalkyl-, Alkenyl-, Alkynyl-, Arylgruppen,
anderen Heterozyklen, Hydroxy-, Amino-, Nitro-, Thiol-, Amin-, Imin-,
Amid-, Phosphonat-, Phosphin-, Carbonyl-, Carboxyl-, Silyl-, Ether-, Thioether-,
Sulfonyl-, Selenether, Keton-, Aldehyd-, Estergruppen, -CF3, -CN oder ähnlichem. Heterozyklen können auch,
wie unten beschrieben, durch Brücken
mit anderen zyklischen Gruppen verbunden oder mit diesen kondensiert
sein.
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Der
Begriff „polyzyklische
Gruppe", wie hier
verwendet, soll sich auf zwei oder mehrere gesättigte oder ungesättigte (d.
h. aromatische) zyklische Ringe beziehen, bei denen sich zwei benachbarte
Ringe zwei oder mehrere Kohlenstoffe teilen, z. B. sind die Ringe „kondensierte
Ringe". Ringe, die über nicht-benachbarte
Atome miteinander verbunden sind, werden als „überbrückte" Ringe bezeichnet. Jeder der Ringe der
polyzyklischen Gruppe kann mit solchen Substituenten, wie oben beschrieben,
substituiert sein, beispielsweise durch Halogene, Alkyl-, Cycloalkyl-,
Alkenyl-, Alkynyl-, Arylgruppen, anderen Heterozyklen, Hydroxy-,
Amino, Nitro, Thiol, Amin-, Imin-, Amid-, Phosphonat-, Phosphin-,
Carbonyl-, Carboxyl-, Silyl-, Ether-Thioether-, Sulfonyl-, Selenether-,
Keton-, Aldehyd-, Estergruppen, -CF3, -CN
oder ähnlichem.
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Der
Begriff „Alkyl" bezieht sich auf
das Radikal gesättigter
aliphatischer Gruppen, einschließlich geradkettiger Alkylgruppen,
verzweigtkettiger Alkylgruppen, Cycloalkylgruppen (alizyklische
Gruppen), Alkyl-substituierte Cycloalkylgruppen und Cycloalkyl-substituierte
Alkylgruppen. In bevorzugten Ausführungsformen weist ein geradkettiges
oder verzweigtkettiges Alkyl 20 oder weniger Kohlenstoffatome in
seinem Gerüst
auf (z. B. C1-C20 bei
einer geraden Kette, C3-C20 bei
einer verzweigten Kette), und stärker
bevorzugt 10 oder weniger. Gleichermaßen weisen bevorzugte Cycloalkyle
4 bis 10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur auf, und stärker bevorzugt
5, 6 oder 7 Kohlenstoffe in der Ringstruktur. Sofern die Anzahl
an Kohlenstoffen nicht anders angegeben ist, bedeutet „niedriges
Alkyl", wie hier
verwendet, eine Alkylgruppe, wie oben definiert, wobei diese jedoch
1 bis 6 Kohlenstoffatome in seiner Gerüststruktur aufweist. Gleichermaßen weisen
ein „niedriges
Alkenyl" und ein „niedriges
Alkynyl" ähnliche
Kettenlängen
auf. Bevorzugte Alkylgruppen sind niedrige Alkylgruppen. In bevorzugten
Ausführungsformen
ist ein hier als Alkyl bezeichneter Substituent ein niedriges Alkyl.
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Der
Begriff „Alkyl" (oder „niedriges
Alkyl"), wie in
der gesamten Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, soll sowohl „nicht-substituierte
Alkyle" als auch „substituierte
Alkyle" beinhalten,
wobei letzteres sich auf Alkylgruppen mit Substituenten bezieht,
die ein Wasserstoff an einem oder mehreren Kohlenstoffen des Kohlenwasserstoffgerüst ersetzen.
Derartige Substituenten können
beispielsweise Halogen, Hydroxy, Carbonyl, wie etwa Carboxyl- und Ketongruppen
(einschießlich
Alkylcarbonyl- und Arylcarbonylgruppen), und Ester (einschließlich Alkyloxycarbonyl-
und Aryloxycarbonylgruppen), Thiocarbonyl, Acyloxy, Alkoxyl, Phosphoryl,
Phosphonat, Phosphinat, Amino, Acylamino, Amido, Amidin, Imino,
Cyano, Nitro, Azido, Sulfhydryl, Alkylthio, Sulfat, Sulfonat, Sulfamoyl,
Sulfonamido, eine heterozyklische Gruppe, Aralkyl oder eine aromatische oder
heteroaromatische Gruppe beinhalten. Der Fachmann wird verstehen,
daß die
an der Kohlenwasserstoffkette substituierten Gruppen erforderlichenfalls
selbst substituiert sein können.
Beispielsweise können
die Substituenten eines substituierten Alkyls substituierte und
nicht-substituierter Formen von Amino-, Azido-, Imino-, Amido-,
Phophorylgruppen (einschließlich
Phosphonat- und Phosphinat guppen), Sulfonyl- (einschließlich Sulfat-,
Sulfonamido-, Sulfamoyl- und Sulfonatgruppen) und Silylgruppen enthalten,
ebenso wie Ether-, Alkylthio-, Carbonylgruppen (einschließlich Keton-,
Aldehyd-, Carboxylat- und Estergruppen), -CF3,
-CN und ähnliches
beinhalten. Beispielhaft substituierte Alkyle werden unten beschrieben.
Cycloalkyle können
weiterhin substituiert sein mit Alkyl-, Alkenyl-, Alkoxy-, Alkylthio-,
Aminoalkylgruppen, Carbonyl-substituierten
Alkylgruppen, -CF3, -CN und ähnlichem.
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Die
Begriffe „Alkenyl" und „Alkynyl" beziehen sich auf
ungesättigte
aliphatische Gruppen, die hinsichtlich ihrer Länge und einer möglichen
Substitution zu den oben beschriebenen Alkylen analog sind, die
jedoch mindestens eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
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Der
Begriff „Aralkyl", wie hier verwendet,
bezieht sich auf eine Alkyl- oder Alkylenylgruppe, die mit mindestens
einer Arylgruppe (z. B. einer aromatischen oder heteroaromatischen
Gruppe) substituiert ist. Beispielhafte Aralkyle beinhalten Benzyl
(z. B. Phenylmethyl), 2-Naphtylethyl,
2-(2-Pyridyl)propyl, 5-Dibenzosuberyl und ähnliches.
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Der
Begriff „Alkylcarbonyl", wie hier verwendet,
bezieht sich auf C(O)-Alkyl. Gleichermaßen bezieht sich der Begriff „Arylcarbonyl" auf C(O)-Aryl. Der
Begriff „Alkyloxycarbonyl", wie hier verwendet,
bezieht sich auf die Gruppe -C(O)-O-Alkyl, und der Begriff „Aryloxycarbonyl" bezieht sich auf
-C(O)-O-Aryl. Der Begriff „Acyloxy" bezieht sich auf
-O-C(O)-R7, wobei R7 Alkyl,
Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Aralkyl oder ein Heterozyklus ist.
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Der
Begriff „Amino", wie hier verwendet,
bezieht sich auf -N(R8)(R9),
wobei R8 und R9 jeweils
unabhängig
Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Aralkyl, Aryl sind, oder R8 und R9 gemeinsam
mit dem Stickstoffatom, an das sie angehängt sind, einen Ring mit 4
bis 8 Atomen bildet. Dementsprechend schließt der Begriff „Amino", wie hier verwendet,
nicht-substituierte,
monosubstituierte (z. B. Monoalkylamino oder Monoarylamino) und
disubstituierte (z. B. Dialkylamino oder Alkylarylamino) Aminogruppen
ein. Der Begriff „Amido" bezieht sich auf
-C(O)-N(R8)(R9),
wobei R8 und R9 wie
oben definiert sind. Der Begriff „Acylamino" bezieht sich auf -N(R'8)C(O)-R7, wobei R7 wie oben
definiert ist und R'8 Alkyl ist.
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Wie
hier verwendet bedeutet der Begriff „Nitro" -NO2; der Begriff „Halogen" bezeichnet -F, -Cl,
-Br oder -I; der Begriff „Sulfhydryl" bedeutet -SH; und
der Begriff „Hydroxy" bedeutet -OH.
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Der
Begriff "Aryl", wie hier verwendet,
beinhaltet 5-, 6- und 7-gliedrige aromatische Gruppen, die 0 bis 4
Heteroatome im Ring enthalten können,
beispielsweise Phenyl, Pyrrolyl, Furyl, Thiophenyl, Imidazolyl,
Oxazol, Thiazolyl, Triazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl
und Pyrimidinyl und ähnliches.
Solche Arylgruppen mit Heteroatomen in der Ringstruktur können auch
als "Arylheterozyklen" oder "Heteroaromaten" bezeichnet werden.
Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen
mit jenen Substituenten substituiert sein, wie oben beschrieben,
wie beispielsweise Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkynyl,
Cycloalkyl, Hydroxy, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphonat,
Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl,
Sulfonamido, Keton, Aldehyd, Ester, einer heterozyklischen, einer
aromatischen oder heteroaromatischen Gruppe, -CF3,
-CN oder ähnlichem.
Arylgruppen können
auch Teil einer polyzyklischen Gruppe sein. Beispielsweise schließen Arylgruppen
kondensierte aromatische Gruppen, wie etwa Naphtyl, Anthracenyl,
Chinolyl, Indolyl und ähnliches
ein.
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Eine
CXCR4-Antagonist-Verbindung kann an ihrem Carboxyterminus mit einer
Cholylgruppe nach Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind,
modifiziert werden (siehe z. B. Wess, G. et al. (1993), Tetrahedron
Letters 34: 817–822;
Wess, G. et al. (1992), Tetrahedron Letters 33: 195–198; und
Kramer, W. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 18598–18604).
Cholylderivate und -analoga können
als modifizierende Gruppen ebenfalls verwendet werden. Ein bevorzugtes
Cholylderivat ist beispielsweise Aic (3-(O-Aminoethyl-iso)-cholyl),
das eine freie Aminogruppe aufweist, die benutzt werden kann, um
die CXCR4-Antagonist-Verbindung weiter
zu modifizieren.
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In
einer Ausführungsform
kann die modifizierende Gruppe eine "Biotinylstruktur" sein, welche Biotinylgruppen und -analoga
und -derivate (wie etwa eine 2-Iminobiotinylgruppe) beinhaltet.
In einer anderen Ausführungsform
kann die modifizierende Gruppe eine "Fluoreszeinenthaltende Gruppe", wie etwa eine Gruppe, die
aus der Reaktion einer SDF-1-abgeleiteten Peptidstruktur mit 5-
(und 6-)-Carboxyfluoreszeinsuccinimidylester oder Fluoreszeinisothiocyanat,
hervorgeht, umfassen. Bei verschiedenen anderen Ausführungsformen kann
die modifizierende Gruppe/können
die modifizierenden Gruppen eine N-Acetylneuraminylgruppe, eine trans-4-Cotinincarboxygruppe,
eine 2-Imino-1-imidazolidinacetylgruppe,
eine (S)-(–)-Indolin-2-carboxygruppe, eine
(–)-Menthoxyacetylgruppe,
eine 2-Norbornanacetylgruppe, ein γ-Oxo-5-acenaphthenbutyryl, eine (–)-2-Oxo-4-Thiazolidincarboxygruppe,
eine Tetrahydro-3-furoylgruppe, eine 2-Iminobiotinylgruppe, eine Diethylentriaminpentaacetylgruppe,
eine 4-Morpholinocarbonylgruppe,
eine 2-Thiophenacetyigruppe oder eine 2-Thiophensulfonylgruppe umfassen.
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Modifizierende
Gruppen können
Gruppen einschließen,
die Biotinylstrukturen, Fluoreszeinenthaltende Gruppen, eine Diethylentriaminpentaacetylgruppe,
eine (–)-Menthoxyacetylgruppe
und eine N-Acetylneuraminylgruppe umfassen. Stärker bevorzugte modifizierende
Gruppen sind solche, die eine Cholylstruktur oder eine Iminobiotinylgruppe
umfassen.
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Zusätzlich zu
den oben besprochenen zyklischen, heterozyklischen und polyzyklischen
Gruppen können
andere Arten modifizierender Gruppen in einem CXCR4-Antagonisten
der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise können kleine hydrophobe Gruppen
geeignete modifizierende Gruppen sein. Ein Beispiel einer geeigneten,
nicht-zyklischen modifizierenden Gruppe ist eine Acetylgruppe.
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Eine
CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung kann weiterhin modifiziert
werden, um die spezifischen Eigenschaften der Verbindung zu verändern, während die
Fähigkeit
der Verbindung, entweder die Angiogenese zu hemmen oder die Interferon-gamma-Produktion
zu hemmen, erhalten bleibt. Beispielsweise wird die Verbindung in
einer Ausführungsform
weiter modifiziert, um eine pharmakokinetische Eigenschaft der Verbindung,
wie etwa Stabilität
oder Halbwertszeit, in vivo zu verändern. In einer weiteren Ausführungsform
wird die Verbindung weiter modifiziert, um eine Verbindung mit einer
detektierbaren Substanz zu markieren. In noch einer weiteren Ausführungsform
wird die Verbindung weiter modifiziert, um die Verbindung an eine
zusätzliche therapeutische
Gruppe zu koppeln.
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Um
die Verbindung weiter chemisch zu modifizieren, etwa um ihre pharmakokinetischen
Eigenschaften zu verändern,
können
reaktive Gruppen derivatisiert werden. Wenn beispielsweise die modifizierende Gruppe
an das aminoterminale Ende der SDF-1-Kerndomäne angehängt wird, kann das carboxyterminale Ende
der Verbindung weiter modifiziert werden. Bevorzugte C-terminale
Modifikationen schließen
jene ein, welche die Fähigkeit
der Verbindung, als Substrat für
Carboxypeptidasen zu wirken, reduzieren. Beispiele bevorzugter C-terminale modifizierender
Gruppen schließen
eine Amidgruppe, eine Ethylamidgruppe und verschiedene nicht-natürliche Aminosäuren, wie
etwa D-Aminosäuren
und β-Alanin,
ein. Wenn alternativ die modifizierende Gruppe an das carboxyterminale
Ende der Aggregationskerndomäne
angehängt
wird, kann das aminoterminale Ende der Verbindung weiter modifiziert
werden, beispielsweise, um die Fähigkeit
der Verbindung, als Substrat für
Aminopeptidasen zu wirken, zu reduzieren.
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Eine
CXCR4-Antagonist-Verbindung kann weiter modifiziert werden, um die
Verbindung durch Reaktionen der Verbindung mit einer detektierbaren
Substanz zu markieren. Geeignete detektierbare Substanzen beinhalten
verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierendes Material,
lumineszierendes Material und radioaktives Material. Beispiele geeigneter
Enzyme beinhalten Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase
oder Acetylcholinesterase; Beispiele geeigneter Komplexe prosthetischer Gruppen
beinhalten Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignetes
Fluoreszenzmaterial beinhalten Umbelliferon, Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat,
Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluoreszein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin;
ein Beispiel eines lumineszierenden Materials schließt Luminol
ein; und Beispiele für
geeignetes radioaktives Material beinhalten 14C, 123I, 124I, 125I, 131I, 99mTc, 35S oder 3H. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine CXCR4-Antagonist-Verbindung
radioaktiv mit 14C markiert, entweder durch
Aufnahme von 14C in die modifizierende Gruppe
oder in eine oder mehrere Aminosäurestrukturen
der CXCR4-Antagonist-Verbindung.
Markierte CXCR4-Antagonist-Verbindungen können benutzt werden, um die
in vivo-Pharmakokinetiken der Verbindungen zu bestimmen, ebenso
wie um das Fortschreiten der Erkrankung oder die Anfälligkeit
eines Versuchsobjekts nachzuweisen, beispielsweise zu diagnostischen
Zwecken. Die Gewebeverteilung von CXCR4-Rezeptoren kann unter Verwendung
einer markierten CXCR4-Antagonist-Verbindung entweder in vivo oder
in einer Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, in vitro
nachgewiesen werden.
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Zur
Verwendung als diagnostischer Wirkstoff in vivo kann eine CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung
mit radioaktivem Technetium oder Jod markiert werden. Es kann eine
modifizierende Gruppe ausgewählt
werden, die eine Stelle verfügbar
macht, an der eine Chelatgruppe für die Markierung eingeführt werden kann,
wie etwa das Aic-Derivat von Cholsäure, das eine freie Aminogruppe
aufweist. In einer anderen Ausführungsform
macht die Erfindung eine CXCR4-Antagonist-Verbindung verfügbar, die
mit radioaktivem Jod markiert ist. Beispielsweise kann ein Phenylalaninrest
in der SDF-1-Sequenz (wie etwa Aminosäurerest 13) mit radioaktivem
Jodtyrosin substituiert sein. Jedes der verschiedenen Isotope von
radioaktivem Jod kann eingebaut werden, um einen diagnostischen
Wirkstoff zu schaffen. Vorzugsweise wird 123I
(Halbwertszeit = 13,2 Stunden) zur Ganzkörper-Szintigraphie verwendet, 124I (Halbwertszeit = 4 Tage) wird zur Positronen-Emissions-Tomographie
(PET) verwendet, 125I (Halbwertszeit = 60
Tage) wird für
Stoffwechselumsatzstudien verwendet und 131I
(Halbwertszeit = 8 Tage) wird zur Ganzkörperzählung und zu Delayed-Low-Resolution-Imaging-Studien verwendet.
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Eine
zusätzliche
Modifikation einer CXCR4-Antagonist-Verbindung der Erfindung kann
dazu dienen, der Verbindung eine zusätzliche therapeutische Eigenschaft
zu verleihen. D. h., die zusätzliche
chemische Modifikation kann eine zusätzliche funktionelle Gruppe
umfassen. Beispielsweise kann eine funktionelle Gruppe, die dazu
dient, eine Apoptose von Tumorzellen herbeizuführen, an die CXCR4-Antagonist-Verbindung
gekoppelt werden. In dieser Form kann der von SDF-1 abgeleitete
Teil des CXCR4-Antagonisten dazu dienen, die Verbindung an den Tumor
zu bringen, um eine Angiogenese zu hemmen, wobei die zusätzliche
funktionelle Gruppe dazu dient, eine Apoptose der Krebszellen auszulösen, nachdem
die Verbindung diese Stellen besetzt hat.
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Bei
einer alternativen chemischen Modifikation wird eine Verbindung
der Erfindung in Form eines "Pro-Pharmakons" hergestellt, wobei
die Verbindung selbst die Interferon-gamma-Produktion oder die Angiogenese eines
Tumors nicht moduliert, sondern in der Lage ist, durch Metabolisierung
in vivo in eine CXCR4-Antagonist-Verbindung, wie hier definiert,
umgewandelt zu werden. Beispielsweise kann bei dieser Art von Verbindung
die modulierende Gruppe in einer Pro-Pharmakon-Form vorhanden sein,
die in der Lage ist, nach Metabolisierung in die Form wie bei einem
aktiven CXCR4-Antagonisten umgewandelt zu werden. Eine derartige
Pro-Pharmakon-Form einer modifizierenden Gruppe wird hier als eine "sekundäre modifizierende Gruppe" bezeichnet. Im Stand
der Technik sind eine Reihe von Strategien zum Herstellen von Pro-Pharmakon-Peptiden
bekannt, die eine Metabolisierung begrenzen, um die Verabreichung
der aktiven Form des Arzneistoffs auf der Grundlage von Peptiden
zu optimieren (siehe z. B. Moss, J. (1995) in: Peptide-Based Drug Design:
Controlling Transport and Metabolism, Taylor, M. D. and Amidon,
G. L. (eds), Chapter 18).
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CXCR4-Antagonist-Verbindungen
der Erfindung können
durch Standardtechniken hergestellt werden, die im Stand der Technik
im Stand der Technik bekannt sind. Die Peptidverbindung eines CXCR4-Antagonisten ist
mindestens teilweise aus einem Peptid aufgebaut, das unter Verwendung
von Standardtechniken, wie etwa jenen, die in Bodansky, M., Principles
of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993), und Grant,
G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company,
New York (1992), beschrieben sind, synthetisiert werden. Automatische
Peptid-Syntheseapparate sind kommerziell verfügbar (z. B. Advanced ChemTech
Model 396 Milligen/Biosearch 9600). Zusätzlich können an den von SDF-1 abgeleiteten
Peptidbestandteilen eine oder mehrere modulierende Gruppen durch
Standardverfahren angehängt
werden, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren zur Reaktion über eine
Aminogruppe (z. B. die alpha-Aminogruppe am Aminoterminus eines
Peptids), einer Carboxylgruppe (z. B. der Carboxy-Terminus eines
Peptids), eine Hydroxygruppe (z. Bein Tyrosin-, Serin- oder Threoninrest)
oder eine andere geeignete Gruppe an einer Aminosäureseitenkette
(siehe z. B. Greene, T. W. and Wuts, P. G. M., Protective Groups
in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Inc., New York (1991)).
Beispielhafte Synthesen bevorzugter CXCR4-Antagonisten werden in
den Beispielen weiter beschrieben.
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Peptide
der Erfindung können
chemisch unter Verwendung von Standardtechniken, wie etwa jenen, die
bei Bodansky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag,
Berlin (1993), und Grant, G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman
and Company, New York (1992) (alle Literaturstellen sind hiermit
durch Referenz aufgenommen), beschrieben sind, chemisch synthetisiert
werden. Automatisierte Peptid-Syntheseautomaten sind kommerziell
verfügbar
(z. B. Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).
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Unter
einem anderen Aspekt der Erfindung können Peptide nach Standardtechniken
beim Umgang mit rekombinanter DNA unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, welches
das Peptid kodiert, synthetisiert werden. Eine Nukleotidsequenz,
welche das Peptid kodiert, kann unter Verwendung des genetischen
Codes bestimmt werden, und ein Oligonukleotidmolekül, das diese
Nukleotidsequenz aufweist, kann durch DNA-Standardsyntheseverfahren
synthetisiert werden (z. B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Syntheseautomaten).
Alternativ kann ein DNA-Molekül,
das für
eine Peptidverbindung kodiert, von dem natürlichen Vorläuferprotein-Gen
oder der cDNA nach molekularbiologischen Standardtechniken abgeleitet werden
(z. B. unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder Restriktionsenzymverdau).
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Die
Erfindung macht auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz,
die ein Peptid der Erfindung kodiert, verfügbar. In einigen Ausführungsformen
kann das Peptid eine Aminosäuresequenz
umfassen, die mindestens eine Aminosäure-Deletion im Vergleich zu
nativem SDF-1 aufweist. Wie hier verwendet, soll die Bezeichnung "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle und RNA-Moleküle, die
einzelstrangig oder doppelstrangig sein können, einschließen. In
alternativen Ausführungsformen
kodiert die isolierte Nukleinsäure
für ein
Peptid, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren des N-Terminus, C-Terminus
und/oder an einer innen gelegenen Stelle von SDF-1 deletiert sind.
In noch anderen Ausführungsformen
kodiert die isolierte Nukleinsäure
ein Peptidfragment, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren im
Vergleich zu nativem SDF-1 deletiert sind.
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Um
die Expression einer Peptidverbindung in einer Wirtszelle durch
Rekombinate-DNA-Standardtechniken
zu erleichtern, kann die isolierte Nukleinsäure, die das Peptid kodiert,
in einen rekombinanten Expressionsvektor eingefügt werden. Dementsprechend
macht die Erfindung auch rekombinante Expressionsvektoren verfügbar, welche
die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung
umfassen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in
der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der es verknüpft ist,
zu transportieren. Eine Vektorart ist ein Plasmid, was sich auf
eine zirkuläre
doppelstrangige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert
sein können.
Ein weiterer Typ von Vektor ist ein viraler Vektor, bei dem zusätzliche
DNA-Segmente in das Virusgenom ligiert sein können. Bestimmte Vektoren sind
zu einer autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in welche sie
eingeführt
wurden (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung
sowie episomale Säugetiervektoren)
fähig.
Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden in
das Genom einer Wirtszelle nach Einführung in die Wirtszelle integriert und
werden dadurch mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus
sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, an
die sie funktionsfähig
gekoppelt sind, zu dirigieren. Derartige Vektoren werden hier als "rekombinante Expressionsvektoren" oder einfach als "Expressionsvektoren" bezeichnet.
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Bei
rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung kann die Nukleotidsequenz,
die ein Peptid kodiert, funktionsfähig an eine oder mehrere regulatorische
Sequenzen geknüpft
sein, die auf der Grundlage der zur Expression verwendeten Wirtszellen
ausgewählt
werden. Die Begriffe "funktionsfähig verknüpft" oder "wirksam verknüpft" bedeuten, daß die das
Peptid kodierende Sequenzen mit der regulatorischen Sequenz/den
regulatorischen Sequenzen in einer Weise verknüpft ist, welche eine Expression
der Peptidverbindung erlaubt. Der Begriff "regulatorische Sequenz" beinhaltet Promotoren,
Enhancer, Polyadenylierungssignale und andere Elemente der Expressionskontrolle.
Derartige regulatorische Sequenzen werden beispielsweise bei Goeddel,
Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, Calif. (1990) (durch Bezugnahme hier aufgenommen),
beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen jene ein, die eine konstitutive
Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen dirigieren,
solche, die eine direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in
bestimmen Wirtszellen dirigieren (z. B. gewebsspezifische regulatorische
Sequenzen) und solche, die eine Expression auf eine regulierbare
Weise dirigieren (z. B. nur in Gegenwart eines induzierenden Wirkstoffs).
Der Fachmann wird erkennen, daß die
Ausgestaltung des Expressionsvektors von solchen Faktoren abhängen kann,
wie etwa der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression
der gewünschten
Peptidverbindung etc. Die Expressionsvektoren der Erfindung können dabei
in Wirtszellen eingeführt
werden, um Peptidverbindungen, welche durch Nukleinsäuren, wie
hier beschrieben, kodiert werden, zu produzieren.
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Die
rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für eine Expression
von Peptidverbindungen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen
entworfen werden. Beispielsweise können Peptidverbindungen in
Bakterienzellen, wie etwa E. coli, in Insektenzellen (unter Verwendung
von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen
exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden bei Goeddel, Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,
San Diego, Calif. (1990), ausführlicher
besprochen. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in
vitro transkribiert und translatiert werden, beispielsweise unter
Verwendung von regulatorischen Sequenzen des T7-Promotors und T7-Polymerase. Beispiele
für Vektoren
zur Expression in der Hefe S. cerivisae beinhalten pYepSec1 (Baldari
et al. (1987), EMBO J. 6: 229–234),
pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982), Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al.
(1987), Gene 54: 113–123)
und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.). Baculovirus-Vektoren,
verfügbar zur
Expression von Proteinen oder Peptiden in kultivierten Insektenzellen
(z. B. Sf 9-Zellen), schließen
die pAc-Serien (Smith et al. (1983), Mol. Cell. Biol. 3: 2156–2165) und
die pVL-Serien (Lucklow,
V. A., and Summers, M. D. (1989), Virology 170: 31–39) ein.
Beispiele für
Säugetier-Expressionsvektoren
beinhalten pCDM8 (Seed, B. (1987), Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman
et al. (1987), EMBO J. 6: 187–195).
Bei Verwendung in Säugetierzellen
werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch
virale regulatorische Elemente vermittelt. Häufig verwendete Promotoren
sind beispielsweise von Polyom, Adenovirus-2, Cytomegalovirus und
Simian-Virus40 abgeleitet.
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Zusätzlich zu
den oben besprochenen regulatorischen Kontrollsequenzen kann der
rekominante Expressionsvektor weitere Nukleotidsequenzen enthalten.
Beispielsweise kann der rekombinante Expressionsvektor für ein selektionsfähiges Marker-Gen
kodieren, um Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, zu identifizieren.
Derartige selektionsfähige
Marker-Gene sind im Stand der Technik bestens bekannt. Um darüber hinaus
eine Sekretion der Peptidverbindung durch eine Wirtszelle, insbesondere
Säugetierwirtszellen
zu erleichtern, umfaßt
der rekominante Expressionsvektor vorzugsweise eine Signalsequenz,
die funktionsfähig mit
Sequenzen verbunden ist, die den Aminoterminus der Peptidverbindung
kodieren, so daß nach
einer Expression die Peptidverbindung mit der Signalsequenz, die
mit deren Aminoterminus fusioniert ist, synthetisiert wird. Diese
Signalsequenz dirigiert die Peptidverbindung in den Sekretionsweg
der Zelle und wird dann gespalten, was die Freisetzung der reifen
Peptidverbindung (d. h. der Peptidverbindung ohne die Signalsequenz)
aus der Wirtszelle erlaubt. Die Verwendung einer Signalsequenz,
um die Sekretion von Proteinen oder Peptiden aus Säugetierwirtszellen
zu erleichtern, ist Stand der Technik.
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Ein
rekominanter Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure umfaßt, die
eine Peptidverbindung kodiert, die entweder die Interferon-gamma-Produktion
hemmt oder die Angiogenese hemmt, kann in eine Wirtszelle eingeführt werden,
um dadurch die Peptidverbindung in der Wirtszelle zu produzieren.
Demgemäß macht
die Erfindung auch Wirtszellen mit den rekominanten Expressionsvektoren
der Erfindung verfügbar.
Die Bezeichnungen "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" wird hier austauschbar
verwendet. Es ist klar, daß sich
solche Begriffe nicht nur auf die bestimmte Zelle eines Versuchsobjekts
beziehen, sondern auch auf die Vorläuferzelle oder die potentielle
Vorläuferzelle.
Da bestimmte Modifikationen in aufeinanderfolgenden Generationen entweder
aufgrund einer Mutation oder von Umwelteinflüssen auftreten, muß eine Vorläuferzelle
nicht tatsächlich
mit der Elternzelle identisch sein, sondern ist noch vom Umfang
der Bezeichnung, wie hier verwendet, umfaßt. Eine Wirtszelle kann jede
prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann
eine Peptidverbindung in Bakterienzellen, wie etwa E. coli, in Insektenzellen,
Hefe- oder Säugetierzellen
exprimiert werden. Vorzugsweise wird die Peptidverbindung in Säugetierzellen
exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Peptidverbindung
in Säugetierzellen
in vivo in einem Säugetier-Versuchsobjekt
exprimiert, um das Versuchsobjekt durch Gentherapie (wie weiter
unten besprochen) zu behandeln. Vorzugsweise wird die Peptidverbindung,
die durch den rekombinanten Expressionsvektor kodiert wird, von
der Wirtszelle sezerniert, nachdem sie in der Wirtszelle exprimiert
worden ist.
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Die
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels
konventioneller Transformation- oder Transfektionstechniken eingeführt werden.
Wie hier verwendet, sollen sich die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" auf verschiedene Standardtechniken
zum Einführen
fremder Nukleinsäuren
(d. h. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, einschließlich Kalziumphosphat-
oder Kalziumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte
Transfektion, Lipofectin, Elektroporation, Mikroinjektion und virusvermittelte
Transfektion. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren
von Wirtszellen können
bei Sambrock et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory
press (1989)) und anderen Laborhandbüchern gefunden werden. Verfahren
zum Einführen
von DNA in Säugetierzellen
in vivo sind im Stand der Technik ebenfalls bekannt und können verwendet
werden, um die Vektor-DNA einem Versuchobjekt zu gentherapeutischen
Zwecken (wie weiter unten besprochen) zu verabreichen.
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In
Bezug auf eine stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt,
daß je
nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfektionstechnik
nur eine kleine Fraktion von Zellen die fremde DNA in ihr Genom
integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu
selektieren, wird im allgemeinen ein Gen, daß für einen selektionsfähigen Marker
(z. B. eine Resistenz gegenüber
Antibiotika) kodiert, gemeinsam mit dem interessierenden Gen in
die Wirtszelle eingeführt.
Bevorzugte selektionsfähige
Marker beinhalten solche, die eine Resistenz gegenüber Wirkstoffen,
wie etwa G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Nukleinsäuren, die
für einen
selektionsfähigen
Marker kodieren, können
auf dem selben Vektor, wie dem, der für die Peptidverbindung kodiert,
oder auf einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingeführt werden.
Zellen, die mit der eingeführten
Nukleinsäure
stabil transfiziert wurden, können
durch eine Selektion mittels Wirkstoffen identifiziert werden (z.
B. werden Zellen, die das Selektionsmarker-Gen aufgenommen haben, überleben, während die
anderen Zellen sterben).
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Eine
Nukleinsäure
der Erfindung kann Zellen in vivo verabreicht werden, wobei im Stand
der Technik bekannte Verfahren verwendet werden, wie etwa eine direkte
Injektion von DNA, rezeptorvermittelte DNA-Aufnahme oder virusvermittelte
Transfektion. Die direkte Injektion ist verwendet worden, um nackte
DNA in Zellen in vivo einzuführen
(siehe z. B. Acsadi et al. (1991), Nature 332: 815–818 und
Wolff et al. (1990), Science 247: 1465–1468). Es kann eine Apparatur
zum Injizieren von DNA in Zellen in vivo (z. B. "Gene Gun") verwendet werden. Ein derartiger Apparat
ist kommerziell erhältlich
(z. B. von BioRad). Nackte DNA kann in Zellen auch eingeführt werden,
indem die DNA mit einem Kation, wie zum Polylysin, das an einen
Liganden eines Zell-Oberflächenrezeptors
gekoppelt ist, komplexiert wird (siehe beispielsweise Wu, G. and
Wu, C. H. (1988), J. Biol. Chem. 263: 14621, Wilson et al. (1992),
J. Biol. Chem. 267: 963–967
und das US-Patent 5,166,320). Eine Bindung des DNA-Ligand-Komplexes an den
Rezeptor erleichtert die Aufnahme der DNA durch rezeptorvermittelte
Endocytose. Zusätzlich
kann ein DNA-Ligand-Komplex, gebunden an die Adenovirus-Capside, die natürlicherweise
Endosomen ausbrechen, wodurch Material in das Zytoplasma freigesetzt
wird, verwendet werden, um den Abbau des Komplexes durch intrazelluläre Lysosomen
zu verhindern (siehe beispielsweise Curiel et al. (1991); Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850 und Cristiano et al. (1993), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122–2126).
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Fehlerhafte
Retroviren für
die Verwendung zum Gentransfer zu gentherapeutischen Zwecken sind
gut charakterisiert (zur Übersicht
siehe Miller, A. D. (1990), Blood 76: 271). Protokolle zum Herstellen
rekombinanter Retroviren und zum Infizieren von Zellen in vitro
oder in vivo mit derartigen Viren können in den Current Protocols
in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing
Associates, (1989), Sections 9.10–9.14 und anderen Standard-Laborhandbüchern gefunden
werden. Beispiele geeigneter Retroviren schließen pLJ, pZIP, pWE und pEM
ein, welche dem Fachmann bestens bekannt sind. Beispiele geeigneter Verpackungsviruslinien
schließen
die .pψi.Crip,
.pψi.Cre,
.pψi.2
and .pψ.Am.
ein. Retroviren sind eingesetzt worden, um verschiedene Gene in
viele verschiedene Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Endothelzellen, Lymphozyten,
Myoblasten, Hepatozyten, Knochenmarkzellen in vitro und/oder in
vivo einzuführen
(siehe beispielsweise Eglitis, et al. (1985), Science 230: 1395–1398, Danos
and Mulligan (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460–6464, Wilson
et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014–3018, Armentano
et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141–6145, Huber
et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039–8043, Ferry
et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377–8381, Chowdhury
et al. (1991), Science 254: 1802–1805, van Beusechem et al.
(1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640–7644, Kay et al. (1992), Human Gene
Therapy 3: 641–647,
Dai et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892–10895,
Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104–4115, sowie das US-Patent
4,868,116, das US-Patent. 4,980,286, die PCT-Anmeldung WO 89/07136,
die PCT-Anmeldung WO 89/02468, die PCT-Anmeldung WO 89/05345 und
die PCT-Anmeldung
WO 92/07573).
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Alternativ
kann das Genom eines Adenovirus manipuliert werden, derart, daß es für eine Peptidverbindung
der Erfindung kodiert und diese exprimiert, daß es jedoch im Hinblick auf
seine Fähigkeit,
sich in einem normalen lytischen Viruslebenszyklus zu replizieren,
inaktiviert ist. Siehe beispielsweise Berkner et al. (1988), BioTechniques
6: 616, Rosenfeld et al. (1991), Science 252: 431–434 und
Rosenfeld et al. (1992), Cell 68: 143–155. Geeignete adenovirale
Vektoren, abgeleitet vom Adenovirus-Stamm Ad Typ 5 dl324 oder anderen
Stämmen
von Adenoviren (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) sind dem Fachmann gut
bekannt. Rekombinante Adenoviren sind vorteilhaft insofern, als
sie keine sich teilenden Zellen benötigen, um wirksame Genübertragungsvehikel
zu sein und verwendet werden können,
um eine große
Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Zellen des Atemwegepithels
(Rosenfeld et al. (1992), wie oben zitiert), Endothelzellen (Lemarched
et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6482–6486),
Hepatozyten (Herz and Gerard (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90: 2812–2816)
und Muskelzellen (Quantin et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 2581–2584)
zu infizieren.
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Das
adeno-assoziierte Virus (AAV) kann ebenfalls zur Übertragung
von DNA zu gentherapeutischen Zwecken verwendet werden. AAV ist
ein natürliche
vorkommendes fehlerhaftes Virus, das einen weiteren Virus, wie etwa
einen Adenovirus oder einen Herpesvirus als Helfervirus für eine wirksame
Replikation und einen produktiven Lebenszyklus benötigt (zur Übersicht
siehe Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. And Immunol. (1992),
158: 97–129).
Er ist auch einer der wenigen Viren, die ihre DNA in sich nicht
teilende Zellen integrieren können,
und weist eine hohe Frequenz stabiler Integrationen auf (siehe beispielsweise
Flotte et al. (1992), Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349–356, Samulski
et al. (1989), J. Virol. 63: 3822–3828 und McLaughlin et al. (1989),
J. Virol. 62: 1963–1973).
Ein AAV-Vektor, wie etwa der von Tratschin et al. (1985), Mol. Cell.
Biol. 5: 3251–3260
beschrieben, kann verwendet werden, um DNA in Zellen einzuführen. Verschiedene
Nukleinsäuren
wurde in verschiedene Zelltypen unter Verwendung von AAV-Vektoren
eingeführt
(siehe treispielsweise Hermonat et al. (1984), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 6466–6470,
Tratschin et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 4: 2072–2081, Wondisford
et al. (1988), Mol. Endocrinol. 2: 32–39, Tratschin et al. (1984),
J. Virol. 51: 611–619 und
Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781–3790).
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In
einer weiteren Ausführungsform
macht die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines Versuchsobjekts,
das an Krebs oder einer Autoimmunerkrankung (z. B. Multiple Sklerose)
leidet, verfügbar,
das ein Verabreichen eines rekombinanten Expressionsvektors umfaßt, der
für eine
von SDF-1 abgeleitete Peptidverbindung kodiert, an das Versuchsobjekt
derart, daß die
Peptidverbindung in dem Versuchsobjekt synthetisiert wird, und das
Versuchsobjekt wegen einer Störung,
die mit Krebs oder einer Autoimmunerkrankung verbunden ist, behandelt
wird. Die Peptidverbindung kann ein Peptidfragment umfassen, das
im Vergleich zu nativem SDF-1 mindestens eine Aminosäure-Deletion
aufweist.
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Eine
weitere Anwendung von CXCR4-Antagonisten kann auch auf dem Gebiet
der Krebstherapie liegen. Da das Wachstum solider Tumoren von einer
Angiogenese abhängig
ist und die Endothelzellen (die wesentlich sind für die Blutgefäßbildung)
den SDF-1-Rezeptor tragen, ist es möglich, daß von SDF-1 abgeleitete Antagonisten
das Tumorwachstum durch ihre anti-angiogenetische Wirkung hemmen.
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Allgemeine
Verfahren zur Gentherapie sind nach dem Stand der Technik bekannt.
Siehe beispielsweise das US-Patent 5,399,346 von Anderson et al.
Eine biologisch verträgliche
Kapsel zum Verabreichen genetischen Materials wird in der PCT-Offenlegungsschrift
WO 95/05452 von Baetge et al. beschrieber. Verfahren zum Einpflanzen
genetisch modifizierter Zellen, um Störungen des zentralen Nervensystems
zu behandeln, werden in dem US-Patent 5,082,670 und in den PCT-Offenlegungsschriften
WO 90/06757 und WO 93/10234, alle von Gage et al., beschrieben.
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Weiterhin
kann alternativ zur Expression eines von SDF-1 abgeleiteten Peptids,
um eine Interferon-gamma-Produktion zu hemmen oder eine Angiogenese
zu hemmen, ein Antisense-Oligonukleotid,
das zu einer Region der mRNA des SDF-1-Vorläuferproteins komplementär ist, das
mit den hier beschriebenen Peptiden korrespondiert, in einem Versuchsobjekt
exprimiert werden, um eine Interferon-gamma-Produktion zu hemmen
oder eine Angiogenese zu hemmen. Allgemeine Verfahren zum Exprimieren
von Antisense-Oligonukleotiden um Störungen des Nervensystems zu
modulieren, werden in der PCT-Offenlegungsschrift WO 95/09236 beschrieben.
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Peptide
können
nach Standardverfahren hergestellt werden (wie etwa bei Clark-Lewis,
I., Dewald, B., Loetscher, M., Moser, B., and Baggiolini, M., (1994),
J. Biol. Chem., 269, 16075–16081
offenbart) und auf CXCR4-antagonistische Aktivität nach Standardverfahren getestet
werden. Peptide können
durch HPLC gereinigt und durch Massenspektrometrie analysiert werden.
Peptide können
mittels einer Disulfidbrücke
dimerisiert werden, die sich durch milde Oxidation der Cysteine
unter der Verwendung von 10% DMSO in Wasser bildet. Nach der HPLC-Reinigung
kann die Dimer-Bildung durch Massenspektrometrie verifiziert werden.
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Für Tests
der CXCR4-Antagonisten können
menschliche periphere mononukleäre
Blutzellen unter Verwendung von Standardverfahren isoliert werden,
wie etwa aus Buffy coats aus Spenderblut durch Zentrifugation über Ficoll-Paque.
Die Zellen werden mit Phytohämagglutinin
(1,0 μg·ml–1)
zentrifugiert und in Gegenwart von IL-2 (100 U·ml–1)
7 bis 17 Tage wie beschrieben (Loetscher, P., Seitz, M., Clark-Lewis,
I., Baggiolini, M., and Moser, B. (1994), FASEB J., 8,1055–1060) expandiert.
Diese Zellen können
als "T-Lymphozyten" für verschiedene
Tests auf CXCR4-Rezeptoraktivität
verwendet werden. CEM-Zellen, eine menschliche lymphoblastoide CD4+T-Zellinie (ATCC, Rockville, MD) kann in
RPMI-Medium mit 15 μg·ml–1 8-Azaguanin
(Aldrich Chemical Company, Milwaukee WI) und 10% FCS kultiviert
werden.
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Die
Migration von T-Lmyphozyten oder CEM-Zellen kann nach Standardverfahren
getestet werden. Derartige Verfahren können 48-Well-Kammern (NeuroProbe,
Cabin John, MD) unter Verwendung von Kollagen-beschichteten Polyvinylpyrrolidon-freien
Polycarbonat-Membranen
mit 3 μm-Poren
verwenden (Loetscher, P., Seitz; M., Clark-Lewis, I., Baggiolini,
M., and Moser, B. (1994), FASEB J., 8,1055–1060). Gewanderte Zellen können nach
einstündiger
Migration in fünf
zufällig
ausgewählten
Feldern bei 1000-facher gezählt
werden. Einweg-Transwell-Träger
(Colstar, Cambridge, MA) mit Kammern von 6,5 mm Durchmesser und
einer Membran-Porengröße von 3
um können
verwendet werden, um die Chemotaxis der CEM-Zellen zu bestimmen.
Der putative Antagonist in Hepes-gepuffertem RPMI 1640, supplementiert
mit 10 mg·ml–1 BSA
(0,6 ml), kann in das untere Well gegeben werden, und 0,1 ml CEM-Zellen
(1 × 107·ml–1)
in dem selben Medium ohne Antagonist wurde in die oberen Wells gegeben.
Der monoklonale Antikörper
12G5 (von Tscharner, V., Prod'hom,
B., Baggiolini, M., and Reuter, H. (1986), Nature, 324, 369–372; R&D Systems, Minneapolis,
MN) kann in einer Konzentration von 10 μg·ml–1 mit
den Zellen 15 Minuten bei 0°C
vorinkubiert werden. Der Antikörper
kann auch in einer Konzentration von 10 μg·ml–1 in
das untere Well gegeben werden. Nach 2 Stunden können Zellen, die in die unteren
Wells gewandert sind, gezählt
werden. Die chemotaktische Migration kann durch Subtraktion der
Zellen, die in das Medium ohne Agonist gewandert sind, bestimmt
werden.
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Die
Sequenzen verschiedener Peptide, die auf ihre Aktivität an CXCR4
getestet wurden, werden in 1 gezeigt.
Sowohl die SDF (1-8)- als auch die SDF (1-9)-Peptide induzierten
eine dosisabhängige
Chemotaxis von CEM-Zellen (2a).
Die Konzentrationen, die für
50% der maximalen Antwort (EC50) erforderlich sind, sind in Tabelle
1 zusammengefaßt.
Das 1-9-Peptid war
ungefähr
1000-fach weniger wirksam als natives SDF-1. Das 1-9-Peptid war
jedoch um das 7-fache stärker
wirksam als das 1-8-Peptid. Die Peptide wurden auch an T-Lymphozyten (2b) getestet, und die Ergebnisse
waren denen ähnlich,
die mit CEM-Zellen erhalten
wurden, außer,
daß die
T-Lymphozyten auf SDF-1 oder die Peptide weniger gut reagierten.
Die chemische Lockstoff-Aktivität
von SDF-1 (1-9) wurde durch den SDF-1-Antagonisten SDF-1 (1-67) [P2G] (Crump, M.,
Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos,
F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark Lewis,
I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007),
vollständig
gehemmt, nicht jedoch durch einen IL-8-Antagonisten, der CXCR1 blockiert
(Crump M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A.,
Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes,
B. D., and Clark Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007) (3).
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Um
die Wirkung einer zunehmenden Peptid-Länge zu untersuchen, damit sowohl
das N-terminale CXC-Motiv
als auch RFFESH-bindende Domänen
aufgenommen werden konnten, präparierten
wir SDF-1 (1-17). Dieses Peptid war stärker wirksam als das (1-9)-Peptid,
seine chemotaktische Aktivität
war jedoch mehrfach geringer als die des (1-9)-Dimers (2a). Die Dimerisierung des
(1-17)-Peptids beeinflußte
dessen Wirksamkeit nicht (nicht gezeigt). Dies legt nahe, daß ein SDF-1
(1-17)-Peptid, in dem sich eine P2G-Substitution befindet, einen
aktiven CXCR4-Antagonisten darstellen würde.
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Ein
Test auf Kompetition der Bindung von 125I-markiertem
SDF-1 an CEM-Zellen kann durchgeführt werden, wie beschrieben
(Crump M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A.,
Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier, J.-L., Baggiolini, M., Sykes,
B. D., and Clark Lewis, I. (1997), EMBO J. 16, 6996–7007. Die Bindung
von MCP-1 und RANTES kann mit THP-1-Zellen gemessen werden (Gong,
J.-H., Uguccioni, M., Dewald, B., Baggiolini, M., and Clark-Lewis,
I. (1996), J. Biol. Chem., 271, 10521–10527).
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CEM-Zellen
können
verwendet werden, um die Bindung des SDF-1-Peptids an CXCR4 zu bestimmen (Crump
M., Gong J.-H., Loetscher, P., Rajarathnam, K., Amara, A., Arenzana-Seisdedos, F., Virelizier,
J.-L., Baggiolini, M., Sykes, B. D., and Clark Lewis, I. (1997),
EMBO J. 16, 6996–7007).
Die Kompetition um die Bindung von 125I-markiertem,
nativem SDF-1 durch unmarkiertes natives SDF-1 und die N-terminalen
Peptide wird beispielsweise in 4 gezeigt.
Die Kd-Werte sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Um zu
bestimmen, ob Peptide an andere Chemokinrezeptoren binden, kann
eine Kompetition um die Bindung von MCP-1 oder RANTES an THP-1-Zellen
gemessen werden. THP-1-Zellen exprimieren CXCR4 ebenso wie eine
Reihe von CC-Chemokinrezeptoren, einschließlich Rezeptoren für MCP-1
und RANTES.
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T-Lymphozyten
und CEM-Zellen, die mit Fura-2 beladen sind, können mit dem putativen Antagonisten stimuliert
werden, und die [Ca2+]i-abhängigen Änderungen
der Fluoreszenz können
0–60 Sekunden
aufgezeichnet werden (Jones, S. A., Dewald, B., Clark-Lewis, I.,
and Baggiolini, M., (1997), J. Biol. Chem. 272, 16166–16169).
Eine Rezeptor-Desensibilisierung kann geprüft werden, indem Änderungen
während
aufeinanderfolgender Zugaben in 60 Sekunden-Intervallen dargestellt
werden. Die Zellen können
vor einer Chemokinbehandlung mit dem 12G5-Antikörper vorinkubiert werden.
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CXCR4-Agonisten,
wie etwa nativer SDF-1 und die N-terminalen Peptide induzieren einen
raschen und vorübergehenden
Anstieg der cytoplasmatischen [Ca2+]i-Konzentration bei T-Lymphozyten (5a) ebenso wie bei CEM-Zellen (6). Die Rate und Größe kann
mit der Konzentration zunehmen. Während eine Antwort auf SDF-1
bei 1 × 10–9 M
beobachtet wurde, induzierten die Peptide [Ca2+]i-Änderungen
im mikromolaren Bereich. Eine Rezeptorbindung durch SDF-1-abgeleitete
Peptiden kann durch Aufzeichnung von [Ca2+]i-Änderungen
nach aufeinanderfolgender Stimulation bestimmt werden. Wie in 5a gezeigt, wurde durch
die Behandlung von T-Lymphozyten mit SDF-1 die Reaktionsfähigkeit
auf das (1-9)-Peptid
vollständig
unterbunden, und umgekehrt schwächte
das (1-9)-Peptid die Antwort auf nativen SDF-1 deutlich ab. Das
(1-9)-Dimer (50 μM)
desensibilisierte die Antwort auf nachfolgenden nativen SDF-1 vollständig (nicht
gezeigt). Kein Effekt auf die durch das (1-9)-Peptid ausgelöste Antwort wurde beobachtet,
wenn T-Lymphozyten mit MCP-1, RANTES, MIP-1β, IP10 oder Mig vorinkubiert
wurden (5b). Unter den
eingesetzten Bedingungen wurde bei diesen Zellen keine Antwort auf
Eotaxin, 1–309
oder TARC (5b) erhalten,
und erwartungsgemäß wurde
keine Desensibilisierung gegenüber
dem (1-9)-Peptid bewirkt.
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Die
Peptide können
auf eine Rezeptorbindung unter Verwendung eines CXCR4-blockierenden monoklonalen
Antikörpers
(von Tscharner, V., Prod'hom,
B., Baggiolini, M., and Reuter, H. (1986), Nature 324, 369–372) getestet
werden.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel zeigt die hemmenden Wirkungen von CXCR4-Antagonisten auf
das Tumorwachstum unter Verwendung von Mäusemodellen.
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Zwei
CXCR4-Antagonisten wurden verwendet: (i) der Vollänge SDF-1-Antagonist,
SDF-1 (1-67) [P2G] und (ii) der dimere Kurzpeptid-Antagonist SDF-1
(1-9) [P2G])2. Die beiden eingesetzten Tiermodelle
waren: (i) das Lewis-Lungenkarzinom in seinem Gen-identischen Wirt,
den C57BL/6-Mäusen
und (ii) das Linie-1-Karzinom (ein schwach antigenes, hochmalignes
Metastasierungsmodell) in seinem Gen-identischen Wirt, den BALB/c-Mäusen. Mäusemännchen im
Alter von 1,5–3
Monaten wurden eingesetzt.
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Die
Behandlungsprotokolle waren wie folgt: an Tag 0 wurden Tumorzellen
(1–2 × 106) subkutan (sc) am Rücken jeder Maus implantiert.
Eine Behandlung mit den CXCR4-Antagonisten
begann unmittelbar nach der Tumorimplantation. Das SDF-1 (1-67)
[P2G] (9 mg/kg/Tag) oder das SDF-1 (1-9) [P2G])2-Dimer
(18 mg/kg/Tag), gelöst
in Phosphatpuffer, wurden intraperitoneal (i. p.) verabreicht, wie
in den Figuren angegeben. Die Injektion erfolgte einmal täglich insgesamt
12–16
Tage lang. Die Tumorgröße wurde
mit einem Mikrometer bestimmt, und das Volumen des Tumors wurde
durch die Formel Breite2 × Länge berechnet.
Die Tumormasse wurde am Ende jedes Experiments bestimmt.
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Sowohl
die CXCR4-Antagonisten, die von dem Vollänge-SDF-1 (SDF-1 P2G) als auch
die, die von dem Kurzpeptid-SDF-1 abgeleitet sind, hemmten das Wachtung
der Linie-1- und Lewis-Lungenkarzinome. Im Vergleich zu den Kontrollen
am Tag 12 hemmte der SDF-1 (1-67) [P2G] das Wachstum des Linie-1-Lungenkarzinoms
um >80% bei einer
Dosis von 9 mg/kg (6)
oder 64% bei einer Dosis von 4 mg/kg (7).
Im Fall des Lewis-Lungenkarzinoms
hemmte das SDF-1 (1-67) [P2G] zum Tag 12 das Tumorwachstum um 45% bei
eine Dosis von 4 mg/kg (9).
Eine subkutane Injektion hemmte das Tumorwachstum ebenfalls, die
Wirksamkeit war jedoch geringer als die bei einer i. p.-Injektion.
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Der
Grad der Hemmung des Tumorwachstums durch CXCR4-Inhibitoren korrelierte
mit dem Aktivitätsgrad
des CXCR4-Antagonisten in der Zusammensetzung. Das SDF-1 (1-9) P2G-Dimer war allgemein
ein weniger wirksamer Inhibitor des Tumorwachstums als das Vollänge-SDF-1
(1-67) [P2G]-Analogon. Dies weist darauf hin, daß es die antagonistische Aktivität dieser
Verbindungen ist, die deren chemotherapeutische Wirkung vermitteln.
Dennoch zeigte selbst das SDF-1 (1-9) P2G-Dimer eine signifikante,
das Tumorwachstum hemmende Aktivität. In einer Dosis von 18 mg/kg
hemmte das SDF-1 (1-9) P2G-Dimer das Wachstum des Linie-1-Tumors
um 35% am Tag 12, und es und hemmte das Wachstum des Lewis-Lungenkarzinoms um
43% am Tag 12. Die Tumormasse korrelierte im allgemeinen mit der
gemessenen Tumorgröße (8 und 10).
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Histologische
Studien zeigen, daß die
Tumoren der mit CXCR4-Antagonisten behandelten Mäusen eine geringere Dichte
an Blutgefäßen aufwies
als Tumoren in den Kontrollmäusen,
was darauf hinweist, daß es
SDF-1-Antagonisten als Angiogenese-Inhibitoren wirken, um eine Neovaskularisierung
von Tumoren zu reduzieren.
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In
den Mäusemodellen
wurde während
der Behandlung bis zu der Dosis von 18 mg/kg keine Toxizität von CXCR4-Antagonisten
gefunden.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel zeigt die Hemmung der Interferon-gamma-Produktion von aktivierten
T-Zellen durch CXCR4-Inhibitoren.
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T-Zellen
wurden unter Verwendung von Standardverfahren wie folgt isoliert
und kultiviert. Menschliches Blut wurde gesunden Spendern durch
Venenpunktion abgenommen. Das Blut wurde in eine gerinnungshemmende
Lösung
(ACD) abgezapft, damit und mit einem gleichen Volumen Salzlösung gemischt
und über Histopaque
geschichtet. Nach Zentrifugation (1200 Upm, 30 Minuten) wurde die
obere Lösung
aus Plasma verworfen, und es wurden die Zellen in der Zwischenschicht
zwischen den Lösungen
gewonnen. Die Zellen wurden zweimal durch Resuspension in Tyrode-Puffer
und Zentrifugation, um die Zellen zu pelletieren, gewaschen. Das
endgültige
Zellpellet wurde in RPMI 1640 mit Antibiotika und 20% fötalem Rinderserum
resuspendiert. Die Zellen wurden in Gewebekulturflaschen für 2 Stunden
ausgesät,
um den adhärenten
Zellen zu erlauben, sich anzuheften. Die nicht-adhärenten Zellen
(angereichert mit T-Lymphozyten) wurden unter Verwendung von Trypanblau
gezählt,
um wachstumsfähige
Zellen nachzuweisen. Die Zellen wurden mit einer Anfangskonzentration
von 1 × 106 pro ml 48 Stunden bei 37°C in einem
befeuchteten Inkubator mit 5% CO2, 95% Luft
inkubiert. Zum Zeitpunkt 0 wurden 1 μg/ml Concanavalin A, 1000 Units/ml
Interferon-beta und/oder Peptide in verschiedenen Konzentrationen
zugesetzt. Um die Interferon-gamma-Produktion zu testen, wurde die Zellsuspension
zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und der Überstand
wurde unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Testkits (Pharmingen)
getestet.
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Tabelle
2 zeigt durch T-Zellen in Kultur produziertes Interferon-gamma nach
Stimulation mit 1 μg/ml Concanavalin-A
(ConA) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von SDF-1 (d.
h. 0, 2,5, 5, 7,5 oder 10 nM). Bei diesen Untersuchungen bildeten
mit Interferon-beta behandelte Zellen als Antwort auf SDF-1 kein
zusätzliches
Interferon-gamma. Allerdings wurde eine signifikante Abnahme der
Produktion von Interferon-gamma beobachtet, wenn die Zellen synergistisch
mit Interferon-beta und SDF-1 (–67)
[P2G] stimuliert wurden.
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Tabelle
1: Interferon-gamma-Produktion (pg/ml Interferon-Gamma)
-
Tabelle
1 zeigt, daß die
Konzentration von Interferon-gamma, das aus T-Zellen in Kultur als
Antwort auf eine Stimulation mit Concanavalin A freigesetzt wird,
nahezu 4.000 pg/ml beträgt,
und daß diese
durch Behandlung mit Interferon-beta reduziert wird. Eine Behandlung
von T-Zellen mit SDF-1 zur selben Zeit wie Concanvalin A steigert
die Produktion von Interferon-gamma. SDF-1-Zugabe zeigt keinen Effekt
hinsichtlich eines Rückgängigmachens
der Wirkung von Interferon-beta.
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Von
SDF-1 abgeleitete CXCR4-Antagonisten weisen im Gegensatz dazu eine
signifikante Wirkung auf die Produktion von Interferon-gamma aus
den T-Zellen auf. Dies wird durch Experimente gezeigt, die den Untersuchungen
mit Interferon-beta ähnlich
sind. Menschliche Lymphozyten wurden verschiedenen Konzentrationen
an SDF-1-Antagonist (SDF-1-P2G) ausgesetzt, und die Zellen wurden
dann mit Concanavalin A (ConA) aktiviert. Die Produktion von Interferon-gamma
aus T-Zellen, die einem SDF-1-Antagonisten ausgesetzt waren, wurde
gemessen und mit derjenigen Menge verglichen, die aus T-Zellen,
die nicht mit dem Antagonisten behandelt wurden, freigesetzt wurde.
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Tabelle
2 zeigt die Wirkung eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1 (1-67) [P2G])
auf die Freisetzung von Interferon-gamma aus mit Concanavalin A
(ConA) aktivierten T-Zellen in Gegenwart von Interferon-beta und ohne
(Kontrolle) Interferon-beta-Behandlung.
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Tabelle
2: SDF-1 (1-67) [P2G]-Konzentration (nM)
-
Die
Werte in Tabelle 2 zeigen, daß ein
CXCR4-Antagonist die Freisetzung von Interferon-gamma durch die T-Zellen vermindern
kann. Darüber
hinaus ist die Wirkung auf die Reduktion der Interferon-gamma-Produktion
sogar noch größer, wenn
der SDF-1-Antagonist zusammen mit Interferon-beta zugesetzt wird. Dementsprechend
kann ein CXCR4-Antagonist zusammen mit Interferon-beta verwendet
werden, um die Interferon-gamma-Produktion durch aktivierte T-Zellen,
beispielsweise T-Zellen, die physiologisch in einem Patienten aktiviert
worden sind, zu reduzieren. Beispielsweise können CXCR4-Antagonisten mit
Interferon-beta zur Behandlung von Patienten mit MS eingesetzt werden.
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Tabelle
3 zeigt die verschiedenen Wirkungen eines CXCR4-Agonisten (SDF-1)
und eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1 (1-67) [P2G]) auf die Produktion
von Interferon-Gamma aus den ConA-aktivierten T-Zellen, wenn jeder
mit Interferon-beta verwendet wurde. Zum Vergleich zeigt Tabelle
4 auch Werte für
Interferon-beta alleine.
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Tabelle
3: Wirkung von 10 nM SDF-1 und SDF-1 (1-67 (P2G] (Antagonist) auf
die Produktion von Interferon-gamma durch menschliche T-Zellen
| Interferon-gamma
(pg/ml) |
Kontrolle
(ConA) | 3
950 |
Interferon-beta | 3
500 |
SDF-1
+ Interferon-beta | 3
500 |
Antagonist
(SDF-1-P2G) + Interferon-beta | 1
300 |
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Der
CXCR4-Antagonist (SDF-1 (1-67) [P2G]) ist in der Lage, die Wirkung
von Interferon-beta
beim Abregulieren der Produktion von Interferon-gamma durch aktivierte
T-Zellen synergistisch zu potenzieren. Die Zugabe von Interferon-beta
selbst hatte nur eine geringe Wirkung auf die Reduktion der Interferon-gamma-Freisetzung
aus T-Zellen. Die SDF-1-Behandlung
veränderte
die Wirkung von Interferon-beta nicht, der SDF-1-Antagonist (SDF-1-P2G) verursachte
jedoch eine dramatische Reduktion der Interferon-gamma-Produktion.
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Tabelle
4 zeigt die verschiedenen Wirkungen eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1
(1-67) [P2G]) auf die Freisetzung von Interferon-gamma aus mit Concanavalin
A (ConA) aktivierten T-Zellen in Abwesenheit von Interferon-beta.
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Tabelle
4: Wirkung von 0,1 μM
und 1 μM
SDF-1 (1-67) [P2G] auf die Produktion von Interferon-gamma aus menschlichen
T-Zellen
| Interferon-gamma
(pg/ml) |
Kontrolle
(unstimuliert) | 80 |
ConA
(aktiviert) | 2
200 |
ConA
+ SDF-1 (1-67)[P2G] (0,1 μM) | 1
050 |
ConA
+ SDF-1 (1-67)[P2G] (1 μM) | 1
100 |
-
Die
Werte in Tabelle 4 zeigen, daß ein
CXCR4-Antagonist die Freisetzung von Interferon-gamma durch T-Zellen vermindern kann.
Dementsprechend kann ein CXCR4-Antagonist verwendet werden, um die Interferon-Gamma-Produktion
durch aktivierte T-Zellen, beispielsweise T-Zellen, die physiologisch
in einem Patienten, der an multipler Sklerose leidet, aktiviert
wurden, zu reduzieren.
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Tabelle
5 zeigt die verschiedenen Wirkungen eines CXCR4-Antagonisten (SDF-1
(1-9) P2G) auf die Freisetzung von Interferon-gamma aus durch Concanavalin
A (ConA) aktivierten T-Zellen
in Abwesenheit von Interferon-beta.
-
Tabelle
5: Wirkung von 1 μM
und 10 μM
SDF-1 (1-9) [P2G] auf die Produktion von Interferon-gamma aus menschlichen
T-Zellen
| Interferon-gamma
(pg/ml) |
Kontrolle
(unstimuliert) | 100 |
ConA
(aktiviert) | 2
200 |
ConA
+ SDF-1 (1-9) [P2G] (1 μM) | 1
100 |
ConA
+ SDF-1 (1-9) [P2G] (10 μM) | 1
000 |
-
Die
Werte in Tabelle 5 zeigen weiter, daß ein verkürztes CXCR4-Antagonist-Peptid
die Freisetzung von Interferon-gamma durch T-Zellen vermindern kann.
Dementsprechend kann ein CXCR4-Antagonist von kürzerer Länge verwendet werden, um die
Interferon-gamma-Produktion
durch aktivierte T-Zellen zu reduzieren.
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SEQUENZPROTOKOLL
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