JPH09505465A - 神経増殖を調整し、β／Ａ４アミロイド誘発形態を逆転させる為のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アルツハイマー症及びダウン症候群のβ／Ａ４ペプチドの発現を抑制する或る種のオリゴヌクレオチド、及びβ／Ａ４ペプチドにより神経細胞中に生起する形態学的変化を逆転する為の神経増殖因子（ＮＧＦ）から成る組成物を提供する。更に、β／Ａ４アミロイド誘発形態の治療の為の薬理学的組成物、キット及び方法並びにβ／Ａ４アミロイドペプチドにより細胞にもたらされる有害な作用の治療における候補のアンチセンスオリゴヌクレオチド効果をスクリーニングする為のアッセイが開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 神経増殖を調整し、β／Ａ４アミロイド誘発形態を逆転させる為の アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用 発明の背景 技術分野 本発明は、アルツハイマー症及びダウン症候群の治療、特にアルツハイマー症 及びダウン症候群に関連するＡ４アミロイドペプチドに原因する有害な作用を転 換させる事の出来る治療剤の開発に関する。 従来技術の要旨 アルツハイマー症（ＡＤ）は、常に重要性を増している公衆衛生問題を提示す る。カッツマン(Katzman)（N．Engl．J．Med．314:964-973(1986)）は、この症 候群は、職業的、社会的活動を十分に果たす成人の知的劣化が特徴である事を教 示する。ヘイ(Hay)とアーンスト(Ernst)(Am．J．Pub．Health 77:1169-1175(198 7))は、ＡＤは、成人の知的障害発症の最も一般的な形態であり、米国において は、死亡原因の第４位にある事を教示する。 ＡＤに関する知的障害は、脳の中で見出される神経病理学的変化と相関関係が ある。ハイマン等(Hayman et al.)(Science 225:1168-1170(1984))は、海馬の主 たる入口と出口の通路が、著しく高濃度の老化プラーク(SP)及び海馬を機能的に 単離し、それによって記憶を減ずる神経原繊維のもつれ(NFT)を有している事を 開示する。マウントジョイ等(Mountjoy et al.)(Aging 4:1-11(1983))は、ＡＤ 脳での神経細胞のかなりの損失を開示する。コイル等(Coyle et al.)(Science 2 19:1184-1190(1983))は、ＡＤ脳は、アセチルコリンポジティブ部位の減少を示 す事を教示する。 ＡＤに関する一般的な特徴の一つは、脳におけるアミロイド含有老化プラーク (SP)の存在である。マジョカ等(Majocha et al.)(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:6182-6186(1988))は、それらのプラークは、９〜50μmの範囲のもので、形態 及び密度において変わる事を教示する。ビスニウスキー(Wisniewski)及びテリー (Terry)、神経病理学の進歩(Zimmerman，ed.)、グルーネ(Grune)及びストラット ン(Stratton)、New York、N．Y.，pp．1-26(1973)は、ＳＰは、細胞外アミロイ ド、活性細胞、NFTを含む退化している神経突起、リゾゾーム、異常なミトコン ドリア及び星細胞突起から成る事を教示する。メルツ等(Mertz et al.)(Acta Ne uropathol．60:113-124(1983))は、SPの核は、直径が４〜８ｎｍの小繊維からな るアミロイドで形成されている事を開示する。 ＳＰ由来のアミロイドの性質は決定されている。グレンナーとウオング(Glenn er and Wong，Biochem．Biophys．Res．Commun．120:885-890(1984))は、28アミ ノ酸の特異配列を有する4.2キロダルトンのAD脳誘導ペプチドを開示する。類似 配列のポリペプチドは、又グレンナーとウオング(Glenner and Wong，Biochem． Biophys．Res．Commun．122:1131-1135(1984))によって、ダウン症候群脳の脳血 管アミロイドから単離された。11位のグルタミンに対するグルタミン酸の単一ア ミノ酸置換は、２つのタンパク質を区別した。マスターズ等(Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 82:4245-4249）(1985))は、グレンナーとウオングのＡＤ誘導ペプチ ドとほぼ同じ配列を有する4.2ｋｄのアミロイドプラーク核誘導ペプチドを開示 する。これは、種々の溶媒に比較的不溶であった。カスターノ等(Castano et al .，Biochem．Biophys．Res．Commun．141:782-789(1986))は、4.2kd ＡＤペプ チドに相同の構造を有する短い合成ペプチドは、類似の凝集性を示す事を教示す る。カング等(Kang et al.，Nature 325:733-736(1987))は、老化プラークを構 成するペプチドは、42又は43アミノ酸長さである事を教示する。このペプチドは 、現在アミロイド前駆体タンパク質又はAPP、即ち染色体２１の位置で定義され る遍在膜を懸けるグリコプロテインとして知られる大きなタンパク質から分割さ れる(Goldgaber et al.，Science 235:877-880(1987)；Kang et al.，Nature 32 5:733-736(1987)；Kitaguchi et al.，Nature 331:531-534(1988)；Tanzi et al .，Science 235:880-882(1987)；Tanzi et al.，Nature 331:528-530(1988)；Po nte et al.，Nature 331:525-527(1988)；Zain et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 85:929-923(1988))。このペプチドをここでは、 β／Ａ４ペプチドと称する。 分子クローン化実験(Goldgaber et al.，Science 235:877-880(1987)；Kang e t al.，Nature（London）326:733-736(1987)；Robakis et al.，PNAS USA 84:41 90-4194(1987)；Tanzi et al.，Science 235:880-884(1987)；Kitaguchi et al. ，Nature 331:530-532(1988)；Ponte et al.，Nature 331:525-527(1988)；Tanz i et al.，Nature 331:527-530(1988))は、このアミロイドβ-タンパク質は、少 なくとも３つの区分前駆体(βAPP₆₉₅、βAPP₇₅₁、βAPP₇₇₀)の一部であり、これ らは、人間の染色体21の遺伝子によってコード化される事を示す(Robakis et al .，Lancet 1:384-385(1987))。βAPP₇₅₁とβAPP₇₇₀は共に、βAPP₆₉₅からは欠如 しているクニッツ型セリンプロテアーゼインヒビター(Knitz-type serine prote ase inhibitor)(KPI)に対して高い配列相同を持つ56−アミノ酸インサートを含 む(Kitaguchi et al.，Nature 331:530-532(1988)；Ponte et al.，Nature 331: 525-527(1988)；Tanzi et al.，Nature 331:527-530(1988))。 βAPPは、試験される大抵の組織で殆ど発現し(Tanzi et al.，Science 235:88 0-884(1987))、そして脳において、神経細胞及び非神経細胞の両方で見出される (Robakis et al.(1988)In:“Disorders of the Developing Nervous System: Ch anging views on their origins，diagonosis and treatments”（Swan，J．W． ed）Alan R．Liss，Inc．New York，NY)。 ＡＰＰのカルボキシ末端は、凡そ４２アミノ酸のアミロイドに適したベータペ プチドドメインを含む(Kang et al.，Nature 325:733-736(1987))。このAPPのこ の領域は、全体のベータアミロイドペプチドが保護されないので、アミロイド形 成を阻止する過程である所の構造的分泌腺を介してベータペプチド内で分割出来 る(Esch et al.，Science 248:1122-1124(1990))。極最近、４kDaベータアミロ イドペプチドは、ゴルジ-エンドソーム媒介法(Golgi-endsome mediated process )を介して製造される、細胞から放出される正常分泌物である事が示された(Shoj i et al.，Science 258:126-129(1992)；Golde et al.，Science 225:728-730(1 992)；Seubert et al.，Nature 361:260-263(1993))。 最近、アルツハイマー症の病理学において演じるβ/A4ペプチドの役割が何か を決定するのに分子生物学の手法の使用が極めて盛んになってきている。マエス トレ等(Maestre et al.)(Brain Res．599:64-72(1992))は、β/A4ペプチドを産 生する細胞形質移入PC12細胞は、非形質移入の対照物より大きく、長い神経突起 を有し、気泡及び微小絨毛に似た極めて多数の膜制限表面拡張部分を有する事を 教示する。β/A4ペプチドは、それらの膜状突起中に局在化される事が分かった 。マジョカ等(Majocha et al.，Mol．Chem．Neuropathol．18:99-113(1993))は 、形質移入PC12細胞はβ/A4ペプチド分泌因子を発現し、これは、神経細胞表現 型に対して神経突起の伸長及び細胞分化を刺激する事を教示する。ターテ等(Tat e et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7090-7094(1992))は、β/A4ペプチ ドを発現する形質移入PC12細胞は、ネズミの脳に中にグラフトされると、顕著に 概日活性を変える事が出来る事を教示する。 ダウン症候群（ＤＳ）に苦しむ個人は、ＡＤに見られる変化と殆ど同じ脳異常 を有する。ＡＤの特徴であるＮＦＴ及びＳＰは共に４０歳以上のＤＳ患者に見ら れる。ＮＦＴ及びＳＰは、形態学的にも免疫組織化学的にもこの２つの疾患の間 で区別不可能である事は明らかである。神経化学的変質も又同類である。(Ikeda ，S．et al.，Lab．Invest．61:133-137(1989)；Cole et al.,Acta Neuropathol 85:542-552(1993)；Patterson et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.85:8266-8270( 1988)；Ikeda et al.，Prog．Clin．Biol．Res．317:313-323(1989)；及びBeyre uther et al.，Prog．Clin．Biol．Res．379:159-182(1992)参照）。 ＡＰＰは、真核細胞中に広く分布するが、このタンパク質の正常機能は未だ完 全に明らかにされていない。幾つかの証明の方向は、APPと神経増殖因子(NGF)の 間の相関関係を結び付けてきた。NGFでの治療は、KPIドメインを含み、タンパク 質のカルボキシ末端部分を欠く125及び120kDa APP種の放出を誘発した(Refolo e t al.，Biochem．Biophys．Res．Commun．164:664-670(1989))。ネズミの脳への NGFの投与は、APPmRNAの水準を増加した(Refolo et al.，Biochem．Biophys．Re s．Commun．164:664-670(1989))。基礎的な前脳の発達の為のNGFの適用は、プリ オンタンパク質(prion protein)(PrP)とAPPmRNAの増加をも同時に引き起こした( Mobley et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．85:9811-9815(1988))。 695異性体の水準は、高分子量APP種よりもむしろ選択的に増加した。PC12細 胞をNGFで処理後に、細胞質に加えて核と突起を増殖する為に局在化されるので 、APPの再分散が生起した(Fukuyama et al.，Molec．Brain．Res．17:17-22(199 3))。APPに対する抗体は、神経突起の長さ及び分岐に関してNGFの効果を特異的 に減少した(Milward et al.，Neuron 9:129-137(1992))。 更に、動物実験では、脳における上方に向かうコリン性突起は、NGFに対する 低い親和性及び高い親和性受容体を発現し、多分NGF依存性同様にNGF感受性であ る事が証明された。コリン性障害は認識障害を起こし、NGFでの治療は動物にお ける認識挙動を改善する事が出来る。更に、人間の臨床試験では、アルツハイマ ー患者でのNGF治療は、患者のAD作用の部分的回復を示している効果的な結果を 与えた事が観察された(Lars Olson，Experimental Neurology 124:5-15(1993)) 。 これらの重要な発見は、AD及びDSの神経症状において、β/A4ペプチドに対す る活発な役割を示す。然しながら、β/A4ペプチドに帰因するこの症状が可逆的 であるかどうかを決定する必要がある。単に予防薬よりもむしろ治療化合物の開 発は、β/A4ペプチド誘発症状の可逆性、特に細胞寸法の伸長、神経突起の伸長 及び神経細胞表現型への細胞の分化に大いに依存するかも知れない。更に、それ らが臨床試験で使用出来る前に、アルツハイマーアミロイド産生に関してのその 様な潜在的治療化合物の効果を測定する為のex vivoアッセイが必要である。 発明の要旨 本発明は、β/A4ペプチドを過剰に発現する細胞において、β／Ａ４ペプチド の蓄積を停止させ、逆転させる事の発見に関する。斯くして、本発明は、β／Ａ ４ペプチドによって細胞にもたらされる形態学的変化を逆転させる方法を提供す る。第一の観点として、本発明による方法は、β/A4ペプチドで形態学的に変え られた細胞に、β／Ａ４ペプチドの合成を減少又は排除するオリゴヌクレオチド を投与する事から成る。本発明による方法に於いて有用な変性オリゴヌクレオチ ドは、第一に、通常のオリゴヌクレオチドリン酸ジエステルよりヌクレオチド分 解性劣化(nucleolytic degradation)に対して抵抗性があるものである。これら は、種々の変性内部ヌクレオシド結合、混合バックボーン、ヌクレアーゼ抵抗性 ３′キャップ構造、積層三重構造又は自己安定化構造又はそれらの任意の組み合 わせを有するオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、 β／Ａ４ペプチド又はその前駆体タンパク質ＡＰＰ（図13参照）をコードするヌ クレオチド配列に対して、或いはβ／Ａ４ペプチド又はAPPが翻訳される開始コ ドンに対して相補的であるヌクレオチド配列を有する。驚くべきことに、β／Ａ ４ペプチド発現の減少は、β／Ａ４ペプチドによって開始され、引続き他の分子 によって維持されたその他の作用を排除する必要なしに、β／Ａ４ペプチドによ って誘発された形態学的変化を逆転するのに十分である。そこで、人間を含む哺 乳類でのβ／Ａ４ペプチド水準の減少効果を試験する事、全体の組織について減 少したβ／Ａ４ペプチドの効果を決定する事に興味がある。第二の観点として、 本発明は、その様な決定を行う為の方法を提供する。初めは、それらの研究は、 非人間哺乳類で行われるのが好ましい。その様な研究は、β／Ａ４ペプチドによ って細胞にもたらされた形態学的変化を逆転させる事について前述の様な変性オ リゴヌクレオチドを哺乳類に投与する事を含む。 第三の観点として、本発明は又、哺乳類、特に人間におけるアルツハイマー症 の治療または防止をする為の方法に関する。 第四の観点として、本発明は又、哺乳類、特に人間におけるダウン症候群の治 療または防止をする為の方法に関する。 第五の観点として、本発明は、細胞又は動物中のβ／Ａ４ペプチド水準の減少 及びβ／Ａ４ペプチドが原因の細胞における形態学的変化の逆転に効果的なオリ ゴヌクレオチドを提供する。それらのオリゴヌクレオチドは、本発明の第一の観 点の議論において簡単に述べられいる。 第六の観点として、本発明は、薬理学的に受容可能な担体と共に、本発明の少 なくとも１種の抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドの効果的な量を含む薬理学的組成 物に関する。 第七に観点として、本発明は、神経増殖因子及び抗β／Ａ４オリゴヌクレオチ ドを含む組成物に関する。 第八の観点として、本発明は、神経増殖因子及び抗β／Ａ４オリゴヌクレオチ ドを含む薬理学的組成物に関する。 第九の観点として、本発明は、β／Ａ４を発現又は好ましくは過剰発現する哺 乳類細胞、例えばＰＣ１２の第一及び第二培養物を増殖し、標識化メチオニンを 第一及び第二細胞培養物に添加し、この細胞培養物を或る時間培養し、第一及び 第二細胞培養物からの上澄み液、候補のＡＰＰアンチセンス化合物を回収して、 アルツハイマーアミロイド産生に関するＡＰＰアンチセンス化合物の効果を測定 する為の方法を教示する。 第十の観点として、本発明は、神経増殖因子及び抗β／Ａ４オリゴヌクレオチ ドを含む薬理学的組成物の効果的な量を、それを必要とする患者に投与する事に よって、β／Ａ４アミロイド誘発形態の防止、治療及び／又は逆転の為の方法を 教示する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明のオリゴヌクレオチドの１実施態様で使用される好ましいキャッ プ構造を示す。 図２は、本発明の自己安定化オリゴヌクレオチドの実施態様の１形態を示す。 図３は、本発明の自己安定化オリゴヌクレオチドの実施態様の第二形態を示す。 図４は、アミロイドｃＤＮＡから成るＭｉｎベクターの図式表示を示す。その挿 入セグメントは、β／Ａ４ペプチド（黒の垂直ボックス）、残余はＡＰＰコード 配列（空の垂直ボックス）及び非コード域（細い垂直線）の格納場所を示した。 図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃは、非形質移入細胞（図５Ａ）、アミロイドインサート無 しの形質転換ベクターから成る細胞（５Ｂ）及びＡ４からＡＰＰのＣ−末端域を コードするＤＮＡベクターで形質移入された細胞（５Ｃ）の免疫染色パターンを 示す。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄは、非形質移入細胞（６Ａ）又は挿入無しベクター で形質移入された細胞（６Ｂ）と比較されるβ／Ａ４形質移入ＡＣ１２６（６Ｃ ）とＡＣ１２７（６Ｄの光学顕微鏡写真を示す。 図７は、インサート無しベクター（Ｖ１２０）で形質移入された細胞とβ／Ａ４ 形質移入細胞ＡＣ１２６とＡＣ１２７の神経突起長さ及び細胞寸法のグラフ表示 を示す。 図８Ａ及び８Ｂは、非形質移入（図８Ａ）及びβ／Ａ４形質移入（図８Ｂ）ＰＣ １２細胞の電子顕微鏡写真を示す。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄは、非形質移入細胞（パネルＡ）、インサート無し ベクターで形質移入された細胞（図９Ｂ）及びβ／Ａ４形質移入ＡＣ１２６（図 ９Ｃ）とＡＣ１２７（図９Ｄ）細胞の膜状突起の電子顕微鏡写真を示す。 図１０は、非形質移入（ＮＮ）、インサート無しベクター形質移入（Ｖ１２０） 及びβ／Ａ４形質移入（ＡＣ１２６とＡＣ１２７）細胞の膜における微小絨毛及 び／又は気泡構造の頻度のグラフ表示を示す。 図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄは、非形質移入細胞（図１１Ａ）、インサ ート無しベクターで形質移入された細胞（図１１Ｂ）及びβ／Ａ４形質移入ＡＣ １２６（図１１Ｃ）とＡＣ１２７（図１１Ｄ）細胞の電子顕微鏡写真を示す。 図１２Ａ及び１２Ｂは、抗リボヌクレアーゼインヒビタータンパク質抗体（図１ ２Ａ）又は抗β／Ａ４抗体（図１２Ｂ）を使用する免疫染色細胞の電子顕微鏡写 真を示す。 図１３Ａ及び１３Ｂは、カング等(Kang et al.，Nature 325:733-736(1987))に より開示されたＡＰＰのｃＤＮＡ配列（配列番号１２）を示す。これから、相当 するｍＲＮＡ配列に対して相補的な抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドが構築され得 る。開始コドンは、ヌクレオチド１４７で始まる。β／Ａ４タンパク質のコード 配列はヌクレオチド１９３５から２０６０に拡がる。ＡＰＰコード配列は、ヌク レオチド２２３１で終る。 図１４Ａ及び１４Ｂは、配列番号１を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの 存在しない場合（図１４Ａ）と存在する場合（図１４Ｂ）で増殖した免疫染色Ａ Ｄ１２７細胞を示す。 図１５Ａ、１５Ｂ及び１５Ｃは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加後のＰ Ｃ１２細胞形態を示す。ＰＣ１２細胞は、ＡＰＰｍＲＮＡの５′末端域に相補的 なオリゴ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの種々の濃度で１週間培養された （図１５Ａ）は未処理細胞。（図１５Ｂ）は、１０μｇ／ｍｌオリゴ−１が添加 された。（図１５Ｃ）は、２０μｇ／ｍｌオリゴ−１が添加された。細胞は固定 されて、０.１％のクーマシーブルーで染色した。標準線の長さは５０μｍであ る。 図１６は、細胞表面域でのアンチセンスオリゴヌクレオチド効果の定量化したも のを示す。オリゴ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド及び関連性のないオリゴ −２が、１週間、０、１０及び２０μｇ／ｍｌでＰＣ１２細胞培養物に添加され た。次いでこの細胞を固定して、細胞の本体域の画像分析測定に先立って、０. １％のクーマシーブルーで染色した。１０及び２０μｇ／ｍｌでのオリゴ−１処 理後に、表面域での著しい減退が観察された（ｐ＜０.０１）。オリゴ−２の効 果は顕著ではなかった。それぞれの型の細胞１５０が数えられた。 図１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃは、オリゴ−１の１０μｇ／ｍｌで１０日間処理さ れたＰＣ１２細胞からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットを示す。（図１ ７Ａ）１２０〜１５０kDaの大きなＡＰＰバンドを示している未処理細胞のタン パク質抽出物。分子量マーカーが示される。（図１７Ｂ）１０μｇ／ｍｌのオリ ゴ−１での処理は、未処理の対照物と比較して、ＡＰＰ水準で３３％の減退を起 こし、負荷された全タンパク質に関して発現した。（図１７Ｃ）１５μｇ／ｍｌ での処理は、ＡＰＰ水準を６０％まで減少させる事となった。定量化は、画像分 析で行った。 図１８は、ＮＧＦでの予備処理後のＰＣ１２細胞域でのオリゴ−１の効果を示す 。図に示される通り、細胞は、ＮＧＦの１００ｎｇ／ｍｌで、４８時間処理され 、次いで、０、１及び２日間、１５μｇ／ｍｌの濃度のオリゴ−１に曝露された 。最初のＮＧＦ処理後、細胞本体寸法（０日で示される）は、５００μｍ²未満 であった未処理細胞の寸法より著しく大きくなった（ｐ＜０.０５）。１日及び ２日間のオリゴ−１の追加は、ＮＧＦの応答に関しての効果は明らかでなかった 。細胞を固定し、細胞の本体域の画像分析測定に先立って、０.１％のクーマシ ーブルーで染色した。各柱状グラフは、少なくと１００の観察体の平均値を表示 する。 図１９は、ＮＧＦでの予備処理後のＰＣ１２神経突起長に関するオリゴ−１の効 果を示す。条件及びデータ分析は、図１８の説明文で示したものと同じであった 。 図２０は、オリゴ−１又はオリゴ−２での予備処理後のＰＣ１２細胞域でのＮＧ Ｆの効果を示す。ＰＣ１２細胞は、０、５、１０又は１５μｇ／ｍｌのオリゴ− １で２日間培養され、次いで、更に４日間、同じオリゴヌクレオチド濃度＋ＮＧ Ｆ１００ｎｇ／ｍｌで維持した。１５μｇ／ｍｌで、表面域でのオリゴ−１の効 果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露されていない細胞と比較して、顕 著であった（ｐ＜０.０１）。同じ実験を、オリゴ−２を使用して、０及び１５ μｇ／ｍｌで繰り返した。細胞を固定し、０.１％のクーマシーブルーで染色し 、画像分析で評価した。各柱状グラフは、少なくと１００の試験体の平均値を表 示する。 図２１は、オリゴ−１又はオリゴ−２での予備処理後のＰＣ１２神経突起長に関 するＮＧＦの効果を示す。ＰＣ１２細胞は、示される通り、１５μｇ／ｍｌの濃 度のオリゴ−１又はオリゴ−２の存在下又は非存在下で、２日間培養された。細 胞が処理され、神経突起長が測定された。オリゴ−１の効果は、オリゴ−１に曝 露されていない細胞と比較して、顕著であった（ｐ＜０.０１）。各柱状グラフ は、少なくと１００の試験体の平均値を表示する。 図２２Ａ及び２２Ｂは、アンチセンスオリゴヌクレオチドで予備処理されたＰＣ １２細胞についてのＮＧＦの効果を示す。（図２２Ａ）ＮＧＦ単独で処理された 細胞。（図２２Ｂ）ＰＣ１２細胞は、１５ｎｇ／ｍｌのオリゴ−１で２日間培養 され、次いで、更に４日間、同じオリゴヌクレオチド濃度＋ＮＧＦ１００ｎｇ／ ｍｌで維持された。標準線の長さは５０μｍである。 好適な実施態様についての詳細な説明 本発明は、アルツハイマー症（ＡＤ）及びダウン症候群（ＤＳ）の為の治療の 開発に関する。本発明は、β／Ａ４アミロイドペプチド、即ちＡＤ及びＤＳの症 状にとって重要なペプチドにより細胞が被る有害な作用を防止並びに逆転出来る 強力な治療剤を提供する。故に、本発明において「治療」とは、防止する事、減 少する事、及び／又は逆転する事を意味する。 第一の観点として、本発明は、β／Ａ４ペプチドの発現により細胞に誘発され る形態学的変化を逆転する方法を提供する。本発明方法では、抗β／Ａ４オリゴ ヌクレオチドは、β／Ａ４ペプチドを発現し、β／Ａ４ペプチドのそれらの発現 の結果としての形態学的変化を受けた細胞に投与される。その様な形態学的変化 は、細胞寸法の拡大、細胞の凝集、気泡及び／又は微小絨毛状膜突起の形成、及 び神経突起長の増加を含むが、これらに限定されるものではない。 本発明方法において、「抗β／Ａ４オリゴヌクレオチド」とは、特定のワトソ ン−クリック又はフーグシュタイン(Hoogstein)塩基対を介して、β／Ａ４ペプ チドの発現中に含まれる特定の相補的核酸配列と相互作用するヌクレオチド配列 を有するオリゴヌクレオチドであって、β／Ａ４ペプチドの発現を減少させるも のと定義される。好ましくは、オリゴヌクレオチドとβ／Ａ４ペプチドの発現中 に含まれる特定の核酸配列との間の相互作用は、ワトソン−クリック塩基対によ る二重形成、フーグシュタイン塩基対による三重形成、或いはそれらの組み合わ せのいずれかである。好ましくは、β／Ａ４ペプチドの発現中に含まれる特定の 核酸配列は、少なくともβ／Ａ４ペプチドをコードする遺伝子又はＲＮＡである 。 この文章中で、「遺伝子」という言葉は、プロモーター、少なくともβ／Ａ４ ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び受動ターミネーターから成る構造を 記述するものである。１つの最も好適な実施態様では、この遺伝子は、公知のＡ ＰＰ遺伝子である。同様に、「ＲＮＡ」という言葉は、少なくともβ／Ａ４ペプ チドをコードする核又はメッセンジャーＲＮＡを包含するものである。好ましく は、その様なＲＮＡは、ＡＰＰタンパク質をコードする。本発明方法の或る実施 態様では、細胞に投与されるオリゴヌクレオチドは、β／Ａ４ペプチドが翻訳さ れる開始コドンから成るヌクレオチド配列に対して相補的である。「ヌクレオチ ド配列に対して相補的」と言う言葉は、細胞、即ち生理条件下の細胞中の配列に 対するハイブリッドを許す様な配列に対して十分に相補的である事を意味する。 実際問題として、その様なハイブリッドの存在又は不存在は、遺伝子発現が減少 したかどうかを決める事により評価出来る。「β／Ａ４ペプチドが翻訳される開 始コドン」と言う言葉は、β／Ａ４ペプチドから成るポリアミノ酸生成物を産生 する、翻訳の為の初期コドンの様に作用する翻訳開始コドンを意味する。最も好 ましい実施態様では、本発明方法は、β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチ ド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドの投与を利用する。或いは、その様 なオリゴヌクレオチドは、β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から 成るヌクレオチド配列に対して相補的であってもよい。その後者のオリゴヌクレ オチドの好適な例は、ＡＰＰをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なオ リゴヌクレオチドである。その様なオリゴヌクレオチドの特殊な例としては、次 のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 １．〔配列番号１〕５′−ＣＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣ ＡＴ−３′、 ２．〔配列番号２〕５′−ＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＴＧＴＣＧ−３′ 、 ３．〔配列番号３〕３′−ＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＡ −５′、 ４．〔配列番号４〕３′−ＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣ−５′、 ５．〔配列番号５〕３′−ＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＡ−５′、 ６．〔配列番号６〕３′−ＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣ−５′ 、 ７．〔配列番号７〕３′−ＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧ−５′、 ８．〔配列番号８〕３′−ＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡ−５′、 ９．〔配列番号９〕３′−ＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＡ−５′ 、 10．〔配列番号10〕３′−ＧＣＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＡ−５′、 11．〔配列番号11〕３′−ＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧＣＣＡＡＡ−５′、及び 12．〔配列番号15〕５′−ＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧ −３′。 本発明のこの観点による方法で有用な好適なオリゴヌクレオチドは、本発明の 第三の観点の議論の後で、より一層詳細に議論される。要するに、それらは、通 常のオリゴヌクレオチドリン酸ジエステルより、ヌクレオチド分解性劣化に対し て一般により抵抗性である。或る好適な実施態様では、その様なオリゴヌクレオ チドは、種々の変性内部ヌクレオシド結合、混合バックボーン、ヌクレアーゼ抵 抗性３′キャップ構造、積層三重形成構造又は自己安定化構造或いはそれらの組 み合わせを有してもよい。 本発明のこの観点による方法は、種々の目的に有用である。特に、この方法は 、細胞内の各形態学的変化を造り出すのに必要なβ／Ａ４ペプチドの発現につい ての投与量又は水準についての情報を提供出来る。これは、細胞へ投与されるオ リゴヌクレオチドの量を、β／Ａ４ペプチドの発現が部分的に減少される程度に 減 少させる事によって遂行され得る。この方法は、又β／Ａ４ペプチドによって誘 発された形態学的変化の時と配列についての情報を、最初にその変化を逆転する 事により、次いでオリゴヌクレオチドを除去し、その変化の再現の時期と配列を 観察する事によって提供出来る。適用される応用では、この方法は、β／Ａ４ペ プチドによって誘発された形態学的変化を逆転するのに最も効果的なオリゴヌク レオチドの特定の性質についての情報を提供する。本発明は、驚くべき事に、オ リゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドによって誘発された形態学的変化を逆転 出来ると言う発見にその基礎を置く。然しながら、更に、形態学的変化逆転の投 与量要件及び程度の試験により、この方法は、形態学的変化の逆転の為のヌクレ オチド配列の最も有効な組み合わせ、バックボーン組成、第二構造、塩基変性等 の決定を当業者に可能ならしめる。 第二の観点として、本発明は、人間を含む動物におけるβ／Ａ４ペプチド発現 を減少させる方法を提供する。本発明のこの観点による方法では、オリゴヌクレ オチドは動物に投与され、β／Ａ４ペプチド発現での減少を引き起こす。非人間 動物に対する投与では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、適当な非人 間β／Ａ４ペプチド又はＡＰＰ遺伝子に対して相補的であってもよい。オリゴヌ クレオチドの化学組成は、本発明の第三の観点である以下の議論において詳細に 開示される。これらのオリゴヌクレオチドは、本発明の第一の観点による方法に ついて開示されたものと同様の方法で作用する。このオリゴヌクレオチドは、経 口、静脈、鼻腔、腹腔、肛門、髄液への注射、又は脳への直接注射で投与しても よい。或いは、本発明のオリゴヌクレオチドは、継続的放出を可能とする重合性 担体又はカプセルから成るインプラントの一部として混合される。この様な重合 性担体は、例えば、レミントンの「薬理科学」（Remington's Pharmaceutical S ciences，18th Ed.，Mack Pubkishing Co.，Easton，PA，Osol（ed.）(1990)） に開示される。更なる実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ポンプイ ンプラント又は外部ポンプによって継続的に投与してもよい。 好ましくは、オリゴヌクレオチドは、動物の体重の約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ の投与量で投与される。 抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、薬理学的に受容可能な担体、例えば生理食 塩水又は生理グルコース溶液であってもよい担体を含む薬理学的組成物の一部と して投与される。懸濁液の粘度を増加する物質を含んでもよい水性の注射懸濁液 は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデ キストランを含む。必要に応じて、懸濁液は安定剤を含んでもよい。その様な薬 理学的組成物の調製と投与の為の方法は、レミントンの「薬理科学」(Remington 'sPharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack Pubkishing Co.，Easton，PA,Oso l（ed.）(1990))に見る事が出来る。 最初の研究では、オリゴヌクレオチドは、非人間動物、好ましくは哺乳類に投 与するのが好ましい。その様な投与は、動物におけるβ／Ａ４ペプチド発現を減 少させる為の最も有効な投与量と投与径路についての情報を提供する。次に、オ リゴヌクレオチドは、ＡＤ又はＤＳに罹っている人間に投与される。その様な投 与は、治療効果としての、β／Ａ４ペプチドにより脳細胞で誘発された形態学的 変化を逆転する事が期待される。 第三の観点として、本発明は、β／Ａ４ペプチドにより脳で誘発された形態学 的変化を逆転するのに有用な抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドを提供する。本発明 の「抗β／Ａ４オリゴヌクレオチド」は、β／Ａ４ペプチドの発現に含まれる特 異的核酸配列と相互作用するヌクレオチド配列を有する、β／Ａ４ペプチドの発 現が減少されるオリゴヌクレオチドを包含する。好ましくは、このオリゴヌクレ オチドとβ／Ａ４ペプチドの発現中含まれる特異的核酸配列との間の相互作用は 、ワトソン−クリック塩基対による二重形成、フーグシュタイン塩基対による三 重形成、或いはそれらの組み合わせのいずれかである。例えば、ＰＣＴ公開WO91 /06626、WO92/08791、WO92/11390及びWO92/10590を参照。好ましくは、β／Ａ４ ペプチドの発現中含まれる特異的核酸配列は、少なくともβ／Ａ４ペプチドをコ ードする遺伝子又はＲＮＡ分子である。この文章中で、「遺伝子」という言葉は 、プロモーター、少なくともβ／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列及 び受動ターミネーターから成る構造を記述するものである。１つの最も好適な実 施態様では、この遺伝子は、公知のＡＰＰ遺伝子である。同様に、「ＲＮＡ」と いう言葉は、少なくともβ／Ａ４ペプチドをコードする核又はメッセンジャーＲ ＮＡを包含するものである。好ましくは、その様なＲＮＡは、ＡＰＰタンパク質 を コードする。本発明方法の或る実施態様では、細胞に投与されるオリゴヌクレオ チドは、β／Ａ４ペプチドが翻訳される開始コドンから成るヌクレオチド配列に 対して相補的である。「ヌクレオチド配列に対して相補的」と言う言葉は、細胞 、即ち生理条件下の細胞中の配列に対するハイブリッドを許す様な配列に対して 十分に相補的である事を意味する。実際問題として、その様なハイブリッドの存 在又は不存在は、遺伝子発現が減少したかどうかを決める事により評価出来る。 「β／Ａ４ペプチドが翻訳される開始コドン」と言う言葉は、β／Ａ４ペプチド から成るポリアミノ酸生成物を産生する、翻訳の為の初期コドンの様に作用する 翻訳開始コドンを意味する。最も好ましい実施態様では、開始コドンは、ＡＰＰ の為の開始コドンである。他の或る実施態様では、抗β／Ａ４オリゴヌクレオチ ドは、β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配 列に対して相補的である。或いは、その様なオリゴヌクレオチドは、β／Ａ４ペ プチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配列に対して相補的 であってもよい。その後者のオリゴヌクレオチドの好適な例は、ＡＰＰをコード するヌクレオチド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドである。その様なオ リゴヌクレオチドは、約８〜約１００のヌクレオチド塩基から成るものでもよい 。 本発明による抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、任意に、付加的なリボヌクレ オチド、２’−置換リボヌクレオチド、及び／又はデオキシリボヌクレオチドモ ノマーを有してもよく、いずれもこれらは５′を介して３′結合に連結し、公知 の如何なる内部結合を含んでもいてもよい。好ましくは、その様な変性オリゴヌ クレオチドは、任意に、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、リン酸ラミデ ート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデー ト、カーバメート、チオエーテル、架橋リン酸ラミデート、架橋メチレンフォス ホネート、架橋ホスホロチオエート及び／又はスルホン内部ヌクレオチド結合を 含んでもよい。当業者は、これらの内部ヌクレオチド結合を含むオリゴヌクレオ チドの合成は、ウールマン及びペイマン(Uhlmann and Peyman，Chemical Review s 90:543-584(1990))及びシュナイダー及びバンナー(Schneider and Banner，Te trahedron Lett．31:335(1990))によって示される通り、当業者にとっては公知 である事を認めるであろう。好ましくは、本発明による変性オリゴヌクレオチ ドは、全部で約６〜約１００のモノマーを含むべきである。その様な変性オリゴ ヌクレオチドは、付加された置換体、例えばジアミン、コレステリル又は他の親 脂性基と同様に、任意に、変性核酸塩基及び糖を含んでもよい。 １つの好適な実施態様では、本発明による抗β／Ａ４変性オリゴヌクレオチド は、アルキルホスホネート又はアルキルホスホノチオエート内部ヌクレオチド結 合（「アルキルホスホネート又はアルキルホスホノチオエート域」）によって連 結された１以上のヌクレオチド域同様に、ホスホロチオエート又はホスホロジチ オエート内部ヌクレオチド結合（「ホスホロチオエート又はホスホロジチオエー ト域」）によって連結された１以上のヌクレオチド域を有する混合バックボーン オリゴヌクレオチドの形態にある。この実施態様では、少なくとも１つのアルキ ルホスホネート域が、オリゴヌクレオチドの５′末端及び／又は３′末端又はそ の近傍でヌクレオチドを含むのが好ましい。本発明の目的に対して、「オリゴヌ クレオチドの５′末端及び／又は３′末端又はその近傍」とは、オリゴヌクレオ チドの５′又は３′末端から約５ヌクレオチド以内に少なくとも１つのヌクレオ チドを含む事を意味する。好ましくは、アルキルホスホネート又はアルキルホス ホノチオエート域は、アルキルホスホネート結合によって連結された約２〜約１ ０の連続ヌクレオチドから成る。好ましくは、ホスホロチオエート又はホスホロ ジチオエート域、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート結合によって連 結された、少なくとも３で、約１００までの連続ヌクレオチドから成る。 本発明のこの実施態様による抗β／Ａ４変性オリゴヌクレオチドは、Ｈ−ホス ホネート化学及びホスホロチオエート域に対する硫黄酸化、及びアルキルホスホ ネート域に対するアルキルホスホンアミデート化学の何れかの選択による固相法 によって合成される。好適なＨ−ホスホネートのアプローチは、アグラワル等(A grawal et al.，U.S．Patent No．5,149,798)により教示される。この教示は、 ここに参照のため導入される。アルキルホスホンアミデート化学は、アグラワル とグッドチルド(Agrawal and Goodchild，Tetrahedron Lett．28:3539-3542(198 7))により示される通り、当該技術分野においては公知である。ホスホロジチオ エート含有オリゴヌクレオチドの合成は、又米国特許第5,151,510号で示される 通り、当該技術分野においては公知である。この教示は、ここに参照のため 導入される(又、例えば、Marshall and Caruthers，Science 259:1564-1570(199 3)及びそこに引用される参照を参照のこと）。最後に、アルキルホスホノチオエ ート含有オリゴヌクレオチドの合成は、パドマプリヤとアグラワル(Padmapriya and Agrawal，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 3:761-764(1993))に より示される通り、当該技術分野においては公知である。 その他の好適な実施態様では、本発明による抗β／Ａ４変性オリゴヌクレオチ ドは、デオキシリボヌクレオチドの領域（「デオキシリボヌクレオチド域」）及 びリボヌクレオチド又は２’―置換リボヌクレオチドの領域（「リボヌクレオチ ド域」）を有するハイブリッドオリゴヌクレオチドの形態にある。好ましくは、 約１〜約全部の内部ヌクレオチド結合は、ホスホロチオエート又はホスホロジチ オエート結合である。好適な２’―置換リボヌクレオチドは、ハロ、アミノ、ア ルキル又は低級アルキル（１〜６炭素原子）置換リボヌクレオチドであり、特に ２’−ＯＭｅ−リボヌクレオチドである。好ましくは、少なくとも幾つかのリボ ヌクレオチド域は、オリゴヌクレオチドの５′末端及び／又は３′末端又はその 近傍に存在するヌクレオチドを含む。更に好ましくは、リボヌクレオチド域は、 それぞれ、約２、好ましくは約４〜約１００の連続リボヌクレオチド及び／又は ２’−オリゴヌクレオチドから成る。デオキシリボヌクレオチド領域は、任意に 、そして存在する時は、約１〜約１００の連続デオキシリボヌクレオチドを含ん でもよい。 本発明のこの実施態様による抗β／Ａ４変性オリゴヌクレオチドは、一般に、 固相法により、好ましくは、デオキシリボヌクレオチド域に対するデオキシヌク レオチドＨ−ホスホネート、及びリボヌクレオチド域に対するリボヌクレオチド 又は２’―置換リボヌクレオチドＨ−ホスホネートを使用して、ホスホロアミデ ート又はＨ−ホスホネートアプローチによって合成される。 尚また別の好適な実施態様では、本発明による抗β／Ａ４オリゴヌクレオチド は、その５′及び／又は好ましくはその３′末端において、オリゴヌクレオチド に対する外部ヌクレアーゼ抵抗を与えるキャップ構造を有するオリゴヌクレオチ ド形態にある。その様な変性オリゴヌクレオチドは、又１〜約全部の変性（非― リン酸ジエステル）内部ヌクレオチド結合を有することが好ましい。好適なキャ ップ構造は、低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ１２）又はアルコール基同様に、図１に示 すものを含む。好適な変性内部ヌクレオチド結合としては、リン酸トリエステル 、リン酸アミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、 アセトアミデート、カーバメート、チオエーテル、架橋リン酸アミデート、架橋 メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、スルホン、ホスホロチオエー ト及びホスホロジチオエート結合が挙げられる。 本発明のこの実施態様による抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、当該技術分野 において公知の方法によって合成される(Uhlmann and Peyman,Chemical Reviews 90:543-584(1990)；Schneider and Banner，Tetrahedron Lett．31:335(1990) 参照)。３′末端においてキャップ構造を有するオリゴヌクレオチドに対しては 、このキャップ構造は、固体支持体に可逆的に付着し、次いで合成スキームにお いて、最初のヌクレオチドモノマーに結合する。５′末端においてキャップ構造 を有するオリゴヌクレオチドに対しては、このキャップ構造は、合成スキームに おいて、最後のヌクレオチドモノマーの添加後に、オリゴヌクレオチドの末端に 結合する。 その他の好適な実施態様では、抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、外部ヌクレ アーゼ抵抗性ヘアピン状構造を形成する為に、オリゴヌクレオチドと分子内でハ イブリッドする３′末端に自己相補的領域を有する事により自己安定化される。 本発明のこの実施態様による抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、一般に、目標ハ イブリッド領域及び自己相補的領域と言う２つの領域を有する事が特徴である。 目標ハイブリッド領域は、初めに述べられた目標に対して相補的であるヌクレオ チド配列を有する。好ましくは、この領域は、約６〜約１００のヌクレオチドを 有する。本発明のその様な実施態様の１つは、図２で示される。この実施態様で は、目標ハイブリッド領域は、連結した長方形で示される。目標流行性感冒メッ センジャーＲＮＡ分子における相補的核酸配列は、連結した菱形で表示される。 ヌクレオチド間の水素結合は、点線で示される。このオリゴヌクレオチドは、安 定化される。即ち、目標ハイブリッド領域及び自己相補的領域との間の塩基対に よって、及び／又は自己相補的領域内の相補的配列間の塩基対によって、エクソ ヌクレオチド分解性劣化(exonucleolytic degragation)に対し抵抗性が与えられ る。オリゴヌクレオチドが、相補的核酸配列を有する目標核酸分子と出会うと、 オリゴヌクレオチドの目標ハイブリッド領域及び自己相補的領域との間の塩基対 は分裂し、オリゴヌクレオチドの目標ハイブリッド領域と目標核酸分子の相補的 核酸配列との間の塩基対で置き換えられる。塩基対のこの分裂と置換は、目標核 酸配列と目標ハイブリッド領域の間のハイブリッドにより形成される分子間塩基 対構造が、自己相補的オリゴヌクレオチドにより形成される分子間塩基対構造よ りも熱力学的に安定している為に生起する。 本発明のこの実施態様によるオリゴヌクレオチドの第二の形態は、第一の形態 と同様の方法で操作するが、自己相補的塩基対に関して異なる構造を形成する。 この選択的形態は、図３で示される様なハンマー状構造を形成する。この形態で 、自己相補的領域は、その自己相補的領域内で、他のオリゴヌクレオチド配列と 、塩基対を組むことのできるオリゴヌクレオチド配列を含む。自己相補的領域は 、又自己ハイブリッド領域に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列を含んでも よい。 本発明の自己安定化オリゴヌクレオチドの第二の顕著な領域は、自己相補的領 域である。この自己相補的領域は、オリゴヌクレオチド内で他のオリゴヌクレオ チド配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む。これら他のオリゴヌ クレオチド配列は、目標ハイブリッド領域内又は自己相補的領域内にあってもよ く、或いはそれらは両領域にまたがるものであってもよい。この相補的配列は、 結果的に、図２で示される様なヘアピン構造又は図３で示される様なハンマー状 構造の形成となる塩基対を形成する。ヘアピン構造又はハンマー状構造は、ヘア ピン構造の図２で示される様に、非―塩基対ヌクレオチドからのループを持つ事 が出来、或いはハンマー状構造の図３で示される様に、その様なループを欠く事 も出来る。自己相補的領域を含む分子内ハイブリッドで形成されるべき塩基対の 数は変動してもよいが、二重螺旋構造を維持するのに適当でなければならず、従 って３′末端は外部ヌクレアーゼに近づき難い。一般に、約４以上の塩基対が、 その様な二重螺旋構造を維持するのには必要である。好適な実施態様では、連続 していて、３′−が殆どのヌクレオチドを含む１０の塩基対を持つ、自己安定化 オリゴヌクレオチド中で形成される１０の分子内塩基対が存在する。勿論、分子 内塩基対は、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドを含む為に拡張する事 が出来る。好ましくは、これは、約５０以下の自己相補的領域を含む。 この実施態様によるオリゴヌクレオチドは、第四の実施態様の為に述べられた 様に、１〜約全部の変性内部ヌクレオチド結合を有してもよい。好ましくは、少 なくとも目標ハイブリッド領域か自己相補的領域の何れかが、そして最も好まし くは両方が、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート結合で結合さ れている約２〜約全部のヌクレオチドを含む。 前述の通り、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、真核細胞中に広く分 布するが、細胞機能におけるその正確な役割は完全に明らかにはされていない。 ＡＰＰは、グリコプロテイン膜成分であり、膜関連機能(membrane associated f unction）を促進するものである。ＡＰＰが、細胞の栄養応答を仲介する役割を 演じるかも知れない事の可能性が探究された。アンチセンスオリゴヌクレオチド は、ＡＰＰの５′末端に対して調製され、そしてＡＰＰの異性体の水準を特に減 少させる事を示した。続く混合実験では、ＡＰＰアンチセンスオリゴヌクレオチ ドは、ＮＧＦで前処理されたＰＣ１２細胞の栄養応答を顕著に変更しなかった事 が観察された。然しながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの細胞の前処理 は、細胞寸法及び神経突起長において、ＮＧＦ誘発増加を減少させた。これらの 観察は、ＡＰＰは、栄養応答を調整する役割を演じるかも知れない事を示唆する 。ＡＰＰアンチセンスオリゴヌクレオチドと神経栄養剤との組み合わせ使用は、 ＮＧＦは、通常、ＡＰＰ水準の増加の原因となることが知られたいるので、アル ツハイマー型痴呆症の治療に臨床的有用性を見出すかも知れない。 上述の本発明のオリゴヌクレオチドは、in vivo又はin vitroでは、アミロイ ド沈着物によりもたらされる形態学的変化を防止し、逆転させる為に、神経増殖 因子（ＮＧＦ）と共に使用されるのが好ましい。表皮増殖因子（ＥＧＦ）の様な 他の増殖因子は、使用される細胞が、特定の増殖因子にたいする受容体であって 、増殖を刺激する事が出来、又は分化される受容体を有する場合に限り使用出来 る。 更に、ＮＧＦを含めて、その増殖因子の資源は、二十日鼠及び人間を含めて、 あらゆる哺乳類からのものであり得る。このオリゴヌクレオチドは、正常な神経 細胞の増殖及び分化を刺激する為に、ＮＧＦの添加／投与後に添加する事が好ま しい。 パーキンソン症患者でのＮＧＦの大脳内注入の情報を基とした、内核的クロム 親和性組織移植(intraputaminal chromaffin tissue graft)のサポートを試みて いるオルソンの報告(L．Olson，Experimental Neurology 124:5-15(1993))の通 り、研究は、ＮＧＦを側脳室へ配達する為の、無線制御の完全に移植可能なポン プの使用で開始された。幾つかの一過性の、或いは長期持続性改善が、パイロッ トケースで注目された。これらは、ＥＥＧ及び言語エピソード記憶を引き出す或 る種の神経テストの改善同様に陽電子射出断層写真で評価される様な、血流の増 加とニコチン結合を含むものであった。ニコチン受容体部位は、検死体で証明さ れた如く、アルツハイマー脳組織において特徴的に失われる。それ故、[¹¹C]-ニ コチン吸収及び結合は、アルツハイマー症の病巣として知られる皮質域において アルツハイマーの患者で増加した事は極めて興味あることである。興味ある驚き は、標識化ブタノールを使用するＰＥＴにより証明された大脳血流の顕著な増加 であった。更に、ＥＥＧ読み取りは、血流測定に見られるものよりも顕著に長期 持続性の改善を示した。それらは、又患者において、良好な変化のその他の独立 した兆候を提供する。ＥＥＧの部分的正常化が、ＮＧＦ注入の停止後僅か１年で あったという事実は、又有望である。 血流とニコチン結合両方のＰＥＴ測定、ＥＥＧ変化、幾つかの認識テストは、 部分的に回復した言語的意思伝達及び日々の生活活動についての配偶者からの報 告同様に、良好な一過性の変化を示唆する。これらの患者の幾人かが、フォロー アップアセスメントで前処理水準まで戻ったと言う事実は、それらがＮＧＦ注入 と因果関係にあった事を示唆する。 ＮＧＦを受け入れたこの最初のアルツハイマー患者、及び内核的NGF注入にと ってサポートされた内核的副腎骨髄(intraputaminal adrenal medullary)組織自 動移植を受け入れたパーキンソン患者からの結果は、果核の中心又は側脳室のい ずれかへの長期にわたる高度に精製されたマウスベータＮＧＦの人間の脳への配 達は、十分な理由で許容される事を示唆する。 更に、アルツハイマー患者の場合では、ＮＧＦ量と腰椎のＣＳＦサンプルにお ける生物活性の測定は、心室内注入が、腰椎の水準同様に、注入部位からは離れ ているＣＳＦでのＮＧＦの効果的水準をもたらす事を示した。また、ＮＧＦ治療 前、治療中及び治療後の４人の患者からの血液サンプルは、これらの２つの大脳 内ルートからのＮＧＦが、目に見える量で、一般的な循環を達成しない事、そし て又、ＮＧＦに対する抗体の顕著な量が形成されていなかった事を示唆した。 故に、本発明のその他の観点は、神経増殖因子と抗β／Ａ４オリゴヌクレオチ ドから成る組成物に関する。この抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、β／Ａ４ペ プチドが翻訳される開始コドンに対して相補的であってもよい。更に、このオリ ゴヌクレオチドはＲＮＡであってもよく、これはβ／Ａ４ＲＮＡの領域にとって 、相補的である事が好ましい。ＲＮＡとＤＮＡオリゴヌクレオチドは、β／Ａ４ ｍＲＮＡ（例えば、β／Ａ４ｍＲＮＡ中のヘアピンループの一部である曝露され たヌクレオチドに）及び／又はＤＮＡコード化ＡＰＰに結合する事が期待され、 それによってそれらの転写及び／又は翻訳それぞれを防ぐ。その様な組成物は、 例えば、先天性細胞タンパク質の過剰産生に関わる成人病（例えばＡＤ及びＤＳ ）の治療における増殖因子とアンチセンスオリゴヌクレオチドの理想的な組み合 わせを決定する為の分析的アッセイに有用である。その様な病気においては、適 当な増殖因子の適用は、破壊された組織の再構築を促進する一方で、アンチセン スオリゴヌクレオチドは、神経タンパク質の産生の水準を調整する。特に、この アッセイは、投与量或いはβ／Ａ４ペプチドの発現水準及び、ＡＤ患者の異常な 神経細胞の形態学的特徴を表示する細胞におけるそれぞれの異常な形態学的変化 を逆転する為に必要な増殖因子、例えばＮＧＦ又はＥＧＦの投与量と種類につい ての情報を用意する。本発明の他の観点は、１つ以上の容器手段をその中に厳重 に閉じ込めて、収容する為に区分されている担体手段から成る、薬理学的投与を 必要とする患者への薬理学的投与の為のキットに関する。ここにおいて、 （ａ）第１の容器手段は、抗β／Ａ４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、 そして、 （ｂ）第２の容器手段は、増殖因子を含む。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、水性緩衝液又は生理的溶液にあ る溶液としてのキットで提供される。本発明の好適な増殖因子は、神経増殖因子 であるが、他の増殖因子、例えば表皮増殖因子を適用してもよい。増殖因子、例 えば神経増殖因子は、水性緩衝液又は生理的溶液にある溶液としてのキットで提 供されてもよい。増殖因子、例えば神経増殖因子は、凍結された形態で提供され てもよい。 更に、このキットは、 （ｃ）水性緩衝液又は生理的溶液にある溶液として提供される上記（ｂ）の工程 で使用されるものとは異なる増殖因子を含む１以上の容器手段を更に含んでもよ い。 本発明での生理的溶液は、生理的ｐＨ、約７．４にある化合物を含む溶液を意 味し、例えばＣＳＦ、血液、プラズマ等の如き体液又は生物学的液体を厳密に表 示する。 本発明の更なる観点は、薬理学的に受容可能な担体中の、天然産又は合成的に 造られた増殖因子及び抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドから成る組成物から成る薬 理学的組成物に関する。ＡＤ又はＤＳの治療に使用される時は、増殖因子は神経 増殖因子が好ましいが、動物又は人間の患者の神経細胞上にその為の受容体が存 在し、増殖と分化の為に神経細胞を刺激できれば、どの様な増殖因子であっても よい。その様な他の増殖因子の一例に、表皮増殖因子（ＥＧＦ）がある。 ＡＤ及びＤＳでのＮＧＦ緊張(tonus)を増加させる事は、多数の異なる方法で 達成出来る。それらの方法の幾つかでは、ＮＧＦとアンチセンスオリゴヌクレオ チドの両方が、同じルートを経て患者に配達される。他の方法は、アンチセンス オリゴヌクレオチドを患者に配達するのに使用される方法とは別に、ＮＧＦ緊張 を増加させるものである。アンチセンス化合物の大脳内脳室(icv)投与 が、注 入部位からある程度離れている脳領域において効果を持つ事が出来る事を示唆す る報告書は多数存在する。例えば、ワーレシュテッド等(Wahlestedt et al.，Sc ience 259:528-531(1993));サカイ等(Sakai et al.，J．Neurochem．62:2053-20 56(1994));ゾウ等(Zhou et al.，J．Pharmacol．Exp．Ther．268:1015-1023(199 4))を参照。 １．大脳内注入。最も直接的なアプローチは、恐らく中枢神経系に、精製し たＮＧＦ及び／又はオリゴヌクレオチドを直接に配達する事である。ＮＧＦは、 血液脳関門を通過せず、それ故、脳柔組織又はＣＦＳ中に配送されねばならない 。 ＮＧＦの慢性的注入は、パーキンソン症とアルツハイマー症の両方で臨床的に試 みられた。 ２．緩行性生分解性インプラント。慢性的注入に代わるものとして、ＮＧＦ 及び／又はオリゴヌクレオチドは、生分解性重合体カプセル又は微小球で導入し てもよく、斯くして移植可能な緩行性源を用意する(Camarata et al.，Neurosur gery 30:313-319(1992)；Powell et al.，Brain Res．515:309-311(1990))。こ の技術は、ＮＧＦ及び／又はオリゴヌクレオチドの局所源が、決められ時間で、 脳で必要とされる時に有用性を証明するかも知れない。 ３．血液脳関門を横切る担体媒介移送。第３の、非常に約束された方法は、 血液脳関門を横切る移動を可能とする担体に、ＮＧＦ及び／又はオリゴヌクレオ チドを結合させる事を基本とするものである。この様に、ＮＧＦが、トランスフ ェリン受容体に対する抗体に結合されると、静脈注射の様に、血液脳関門を横切 るＮＧＦが与えられ、生物学的活性を完全に維持する事が最近証明された(Fride n et al.，Science 259:373-377(1993)；Cotten et al.，PNAS USA 88:8850-885 4(1991)；Cotten et al.，PNAS USA 89:6094-6098(1992)；Curiel et al.,PNAS USA 88:8850-8854(1991)；Wagner et al.，PNAS USA 87:3410-3414(1990)；Wagn er et al.，PNAS USA 88:4255-4259(1991)；Wagner et al.，Bioconjugate Chem ．2:226-231 (1991))。トランスフェリン受容体は、CNS血管では豊富であるので 、この技術は、静脈注射により、末梢を経て脳中にＮＧＦ及び／又はオリゴヌク レオチドを濃縮させるであろう。 ４．ＮＧＦ産生細胞のグラフト化。第４のアプローチは、大脳内部位に対し てＮＧＦ合成が出来る移植組織細胞を基本とするものである。シュワン細胞(Sch wann cell)の様な、ＮＧＦを正常に産生する細胞、又はマウスの下顎腺細胞のい ずれかの利点を取るか(Springer et al.，Prog．Brain Res．78:401-407(1988) ；Springer et al.，J．Neurosci．Res．19:291-296(1988))、さもなければ、大 量のＮＧＦを産生し、分泌する為に遺伝的に変性されている細胞の利点を取って もよい。この後者の技術は、動物では有効である事が証明されている(Ernfors e t al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:4756-4760(1989);Rosenberg et al.，S cience 242:1575-1578(1988)；Stromberg et al.，J．Neurosci.Res. 25:405-411(1990))。 確立された細胞株はその使用に関して幾つかの問題、例えば腫瘍形成のリスク 及び／又はＮＧＦ産生の下方調節(down-regulation)のリスクの問題を有するが 、これらの問題は、プライマリー細胞株、好ましくは治療を必要とする患者から のプライマリー細胞株を使用し(Kawaja et al.，J．Neurosci．12:2849-2864(19 92))、そして恐らくＮＧＦ産生をいくらか調節出来る追加的遺伝子を挿入する事 によって解決できるかも知れない。 ５．脳への直接的遺伝子の移入。脳への細胞移入の為の興味ある方法に、Ｎ ＧＦを産生するのにだけ必要な遺伝子の移入がある。幾つかの興味ある現在のア プローチは、長期に持続的に増加するＮＧＦ水準を達成する為には、実際に、非 分割の神経及び／又は腺細胞を形質移入する事が可能であるべき事を示唆する(L e Gal La Salle et al.，Sciene 259:988-990(1993))。 ６．ＮＧＦ受容体作働薬の開発。神経組織栄養受容体についての知識は、急 速に増加している(Ebendal，T.，J．Neurosci．Res．32:461-470(1992)；Ebenda l et al.，in Plasticity and regenaration in the Nervous System（P．Timir as and A．Privat，Eds.)，Plenum，New York)。その様な知識は、ＮＧＦの第三 の構造の研究の発展(McDonald et al.，Nature 354:411(1991))と対をなしてお り、受容体の結合及び活性に対する分子の様々な領域の重要性は(Ibanez et al. ，Cell 69:329-341(1992)；Ibanez et al.，EMBO J．10:2105-2110(1991)；Iban ez et al.，EMBO J．12:2281-2293(1993))、血液脳関門の通過が出来、ＮＧＦ同 様の効果を発揮し得る低分子量作働薬の開発が可能となるであろう事を示唆する 。 ７．内因性ＮＧＦ産生の制御。最後に、我々が、内因性ＮＧＦ合成の貯蔵と 放出の制御についてのよりよい理解を得た様に、内因性ＮＧＦの利用性を高める 事の出来る薬理学的治療が考えられる。 本発明のその他の観点は、上記の薬理学的組成物の効果的な量を、それらを必 要とする患者に投与する事から成るβ／Ａ４アミロイド誘発異常形態（アミロイ ドーシス）の治療方法に関する。 アミロイドーシス、即ちβ／Ａ４アミロイド誘発異常形態は、当該技術分野に おいても一般的に知られており、本明細書においても意図される様に、脳の様な 神経組織におけるβ／Ａ４アミロイドの形成が特徴である、人間及び他の動物に おける病原状態を意味する。 本発明の尚その他の観点は、β／Ａ４アミロイドペプチドにより細胞にもたら される有害な作用の治療における候補のアンチセンスオリゴヌクレオチド効果を スクリーニングする為のアッセイに関し、以下の手段を含む。 （ａ）哺乳類の神経細胞培養物の幾つかの容器をプレート化し、 （ｂ）幾つかの容器に、種々の濃度の異なるβ／Ａ４アンチセンスオリゴヌクレ オチドを添加してテストサンプルを作り、 （ｃ）幾つかの容器に、オリゴヌクレオチド無し又はナンセンスオリゴヌクレオ チドのいずれかを添加して対照サンプルを作り、 （ｄ）このテストサンプルと対照サンプルを、標識化メチオニンと共に約６〜約 ２４時間培養し、 （ｅ）各容器から上澄み液を回収し、 （ｆ）各容器からの上澄み液を、タンパク質Ａセファロース（ＰＡＳ）と接触さ せてＰＡＳ−アミロイド複合体を形成し、 （ｇ）ＰＡＳ−アミロイド複合体を、ベータ―アミロイドに対する抗体と接触さ せてＰＡＳ−アミロイド―抗体複合体を形成し、 （ｈ）アクリルアミドゲル上でＰＡＳ−アミロイド―抗体複合体を、電気泳動に よって分離して、各細胞培養物に相当するＰＡＳ−アミロイド―抗体複合体のバ ンドを形成し、 （ｉ）バンド中に存在する４．３ＫＤベータ―アミロイドの水準を濃度計で決定 し、 （ｊ）テストサンプル中に存在する４．３ＫＤベータ―アミロイドの水準を、対 照サンプルと比較し、それによって前記細胞におけるアミロイドの産生を減少さ せるβ／Ａ４アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を決定し、 （ｋ）アミロイド産生を減少させるのに最も効果のあるオリゴヌクレオチドを工 程（ｊ）から選択し、 （ｌ）神経細胞の増殖と分化を刺激する増殖因子で処理された哺乳類の神経細胞 に対する、工程（ｊ）から選択されたオリゴヌクレオチドの添加効果を決定し、 （ｍ）前記増殖因子の栄養効果を抑制しない、工程（ｌ）からのオリゴヌクレオ チドを選択する。 本発明で使用される標識化メチオニンは、当該技術分野で知られる幾つかの方 法を使用して検出出来る物質に対して、任意の形態で結合されるメチオニンであ る。標識化メチオニンの例としては、放射線標識化メチオニン、例えば³⁵Ｓ-メ チオニン又はビオチン化メチオニンがある。 ＰＡＳ−アミロイド複合体又はＰＡＳ−アミロイド―抗体複合体として使用さ れる複合体とは、それらの分子が、結合可能な任意の形態で共に保持されること を意味する。 当業者は、上述の様々な好適な実施態様の要件が、より大きい抗β／Ａ４効果 さえ有するかも知れない追加的実施態様を造る為に組合せる事が出来る事を認識 するであろう。 本発明による抗β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、様々な目的に対して有用であ る。第一に、それらは、β／Ａ４ペプチドの発現に起因する、in vitroでの細胞 における形態学的変化を逆転させるのに有用である。第二に、それらは、人間を 含む動物における、減少されたβ／Ａ４ペプチド発現の効果を試験するのに有用 である。第三に、それらは、アルツハイマー症の治療剤としてのオリゴヌクレオ チドの市場評価を得る為に計画される臨床試験を実施するのに有用である。第四 に、それらは、アルツハイマー症に罹っている患者の治療及び／又はこの病気の 攻撃を防止又は遅延させるのに有用である。最後に、それらは、ＤＳに罹ってい る患者の治療に有用である。 以下の実施例は、本発明の好適な実施態様をさらに例示するものであるが、本 発明は、これらに限定されるものではない。以下の実施例１及び２で開示される 内容は、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:337-341(1989)及びBrain Research 59 9:64-71（1992）において既に公開されたものである。 実施例 材料及び方法 特に指示しない限り、以下の材料及び方法は、実施例で考えられる本発明の典 型的な実施態様を実施するのに使用された。 細胞増殖 ＰＣ１２細胞を、３７℃で、5.0%のCO₂中で、ダルベッコ変性イーグル培地(DM EM；GIBCO，BRL，Grand Island，NY)で、2.0mM(最終濃度0.85%食塩中の350.4mg) のL-グルタミン(GIBCO，BRL，Grand Island，NY)、1.2mM最終濃度のピルビン酸 ナトリウム(Sigma，St．Louis，MO)、0.9%食塩中の120μg/mlのストレプトマイ シンと一緒の100単位ペニシリン/ml、10%の子牛の血清、5%の胎子牛血清及び20 μg/mlのゲンタマイシン(Gentamycin)(Sigma，St．Louis，MO)と共に、組織培養 フラスコ(Becton Dickson，Franklin Lakes，NJ)中に維持した。合流によって、 細胞は、ハンクの平衡塩溶液(Hank's balanced salt solution)中の0.25%トリプ シンを使用してトリプシン化され、２つのフラスコに分けられた。ＰＣ１２細胞 は、冷い10%ジメチルスルホキシド(DMSO)中で、１ｘ１０⁶細胞/mLのエッペンド ルフ管(Eppendorf tube)で凍結され、必要に応じて取り出せるように、液体窒素 中に貯蔵された。細胞の数の計算は、血球計を使用して行った。細胞の生育可能 性は、トリパンブルーを使用して決定した。 細胞の形態学的特徴の定量化 細胞寸法及び神経突起の長さは、微小濃度計コンピュターソフトウエアー(Bio quant，R&M Biometrics，Inc.，Nashville，TN)を含む画像分析測定システムを 使用して光学顕微鏡水準で決定した。細胞は、ガラスチャンバースライド上で48 時間増殖され、4%のパラホルムアルデヒドに30分間固定する前に、ハンクの緩衝 食塩水でリンスした。リンス化に続いて、細胞を、クーマシーブルーで5分 間染色した。次いでスライドをリンスし、乾燥し、カバーを外した。細胞のフィ ールドを、ライツ顕微鏡で、40Xで検査した。画像測定システムを使用して、細 胞本体の境界を際立たせ、細胞本体の平均面積を計算した。個々の実験で測定さ れた細胞の数は、図面の凡例で示される。 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（ＰＳ−オリゴ）は、自動ＤＮＡ合成 装置（モデル8700，Millipore，Milford）で、ホスホルアミデート法を使用して 、10μモル規模で合成した。ＰＳ−オリゴは、初めに報告したのと同じ方法で精 製した(Agarwal et al.，Proc．Natl．Acad．Ｓci．USA 88:7595-7599(1991))。 二つの24−マーPSオリゴ(24-mer PS-oligos)を合成した。即ち、オリゴ−１：５ ′−ＡＡＡＣＣＧＧＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧ−３′（配列番号１５ ）、これはＡＰＰリボソーム結合部位に対して相補的である；及びオリゴ−２： ５′−ＡＣＡＣＡＧＣＧＣＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＴ−３′（配列番号１ ６）、これは、対照ランダムアンチセンスオリゴヌクレオチドである。凍結乾燥 アンチセンスオリゴヌクレオチドを滅菌水に溶解し、貯蔵溶液を調製し、−７０ ℃で貯蔵した。使用前に、アリコート(aliquot)を４℃に貯蔵し、それから室温 までもってきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、実験条件に依って、５〜 ５０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した（結果参照）。オリゴヌクレオチドを、新 鮮な培地に、３日毎に添加した。細胞は、２４ウエルポリスチレン板上で、５ｘ １０³細胞／ウエルで培養した。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＳＤＳページ（ＰＡＧＥ）の為に、細胞を、５ｘ１０⁵細胞／ウエルの濃度で 、３．５ｃｍ６−ウエルポリスチレン板(Becton Dickson，Lincoln Park，NJ)上 でプレート化した。それらを、無血清媒体と、1.2mMカルシウム、1.0mMマグネシ ウム及び温められたHBSS中の0.01Mヘッペス(Hepes)の、pH7.2の溶液でリンス した。 ２％ＳＤＳ溶液の１０００μｌを、各ウエルの中に入れ、室温で、３０分間培 養した。溶解した細胞溶液を、１．５ｍｌ微小遠心分離管の中に、パイプで送っ た。この管を、５分間煮沸し、室温まで冷却した。細胞溶解産物を、更に使用す るまで、４℃で貯蔵した。ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Deutscher，M．P .,“General Methods for Handling Proteins and Enzymes,”in Methods in En zymology，vol．182，60-62(1990)を、負荷前のタンパク質含有量を決定するの に使用した。溶解産物を、7.5%ゲルに適用した。全容量70μl/レーンに対して、 凡そ70μgのタンパク質を、サンプルバッファーのウエル当り負荷した。ゲルを 、15mA／ゲルで一昼夜作動させた。 ウエスタンブロット ゲルを、ＴＥシリーズトランスフォール電気泳動装置(Hoefer Scientific Ins truments,San Francisco,CA)中で、インモビロンＰ、ＰＶＤＦ膜(Immobilon P， PVDF membrane)(Millipore Corp.，Bedford，MA)上に移動させた。移動バッファ ーは、0.19Mグリシン及びpH6.8のTRIS塩基バッファー中のメタノールから成る。 タンパク質を、1000mAで、３時間移動させた。次いで、各レーン上の全タンパク 質含有量を決定する為に、膜を０．２％ポンソーで染色した。染色濃度は、コン ピュター画像分析を使用して決定した（以下参照）。膜を、１０％の粉ミルク溶 液で、３０分間ブロックし、抗ＡＰＰプライマリーモノクローナル抗体(Ａｂ)で 、１μｇ／ｍｌで、一昼夜、室温で免疫染色した(Boehringer Mannheim)。 次いで、プライマリーＡｂを除去し、膜を、TBST(20mM Tris，0.3MNaCl，0.1% Triton-X 100，pH7.2)中で３度洗浄した。セコンダリー抗体は、ICC(2%BSA、0. 3MNaCl、20mMTris、0.1%Triton-X 100及び0.1%チメロサール）中で1:1000に希釈 された、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウス１ｇＧ全体分子であった(Cappel,W est Chester，PA)。セコンダリーＡｂで以て、室温培養１時間後に、ブロットを 、ＴＢＳＴで、それぞれ１５分間で４度洗浄した。視覚化工程は、１mg/mlの最 終濃度のイミダゾールバッファー、pH7.0(Sigma，St．Louis，MO)中の３０％ H₂O₂/mlの０.５μｌと、0.5mg/mlのジアミノベンツアジン(Sigma，St．Louis，M O)を使用した。この膜を、水で数度、十分にリンスした。次いで、ブロットを、 画像処理装置を使用して走査し、抗体染色の光学濃度が、ポンソー染色に対して 正常化された。 画像分析 細胞領域を、画像分析測定システムを使用して、光学顕微鏡で決定した。画像 分析の為に調製された細胞を、５mM EGTA/ウエル及び200μｌの0.4%グルタルア ルデヒドと共にハンク緩衝食塩水中に４分間置いた。これを取り出し、次いで２ ０％メタノールと１％酢酸中で、２０分間、０.１％クーマシーブルーで染色し た。脱染色の為に、クーマシーブルー染料を除去し、細胞を、２０％メタノール と１％酢酸で、２分間リンスした。細胞を、１％酢酸中で２度リンスし、分析さ れるまで１％酢酸中に置いた。細胞のフィールドは、ライヘルトバイオスター倒 立顕微鏡(Reichert Biostar inverted microscope)で検査した。画像分析システ ムは、高解像白黒カメラ(Javelin，model JE7362)、オプチマスソフトウエアー( Optimas software)、バージョン4.2(Image Analysis Systems（Woburn，MA）か ら市販）及びIBMコンパチブルコンピュターから成っていた。この画像測定シス テムを使用して、細胞本体の境界を際立たせ、細胞本体の平均面積を計算した。 統計的分析 標準偏差による平均値を、マイクロソフトエクセルプログラムで電子計算機で計 算した。細胞本体寸法の平均値は、スプレッドシートソフトウエアーで以て、電 子計算機で計算した。 実施例１ β／Ａ４ペプチドを過剰発現するＰＣ１２細胞株の開発 最初のクローニングビヒクルは、シミアンウイルス40(SV40)を基体としたベク ターpKo+RI/MLであり、PML₂、pBR322NO誘導体（真核細胞再現の為の或る種の毒 性原核配列を欠いている）、大腸菌のLacUV5プロモーター、及びエンハンサーを 包含するSV40配列、再現の元、初期プロモーター、小腫瘍(t)／大腫瘍(T)抗原合 わせ部位、及びポリアデニル化部位から成る。初期ベクターの変性は、３つの異 なる翻訳読み取りフレームを持つ３つの変異体、Min+1、Min+2及びMin+3を産生 する為に、Ｔ／ｔ抗原のＡＴＧコドンを使用して行った（図４参照）。出発ベク ター又は変性された形態が実験の為に使用された。Minシリーズの前駆体は、ユ ニークPvuII部位（エンハンサースタート）及びBamHI部位〔ポリ(A)付加部位〕 を含み、両者は標準方法でXbaＩ部位に対して変性された。 バクテリオファージλで調製されたＡＤ脳ｃＤＮＡ発現ベクターライブラリー から、我々は、Ａ４配列及び側腹領域(flanking region)を含む、amy37と称する インサートを得た。Minベクター構造体は、EcoRI-消化amy37 ｃＤＮＡフラグメ ントの挿入の為に、３つの翻訳読み取りフレームにおいて使用された。ベクター は、ユニークEcoRI部位の開裂の為、EcoRI制限エンドヌクレアーゼとアルカリホ スファターゼで消化された。λtll-amy37キメラは、EcoRI酵素で消化され、1.1 キロベース(kb)-ロングフラグメントが、従来技術でMinベクター中に結紮された 。３つの読み取りフレームで別々に発生されたamy37-1.1キメラプラスミドは、 増殖され、次いでＤＮＡが単離され、精製されて形質移入実験に使用された。そ れらの実験に使用された細胞株はＰＣ１２で、ネズミの副腎褐色細胞腫から誘導 された。 通常の永久形質移入実験が行われた。1.1-kbアミロイドcDNAインサートの組み 込みは、amy37-1.1インサートを持つベクター又はアミロイドcDNAインサートを 持たないベクターDNAから成る対照物の10μg、ゲネチシン(Geneticin)に対して 感応性であるネオマイシン耐性の為の遺伝子を運ぶPSV₂CAT DNA(SV40−基体プ ラスミド中にクローン化されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼ）の５μｇを含む形質移入培地を使用して行った。種々の形質移入体が、６日 間、0.4g/lの濃度で、次いで３日間、0.3g/lの濃度で、ゲネチシン(G418，GIBCO )の存在下で生き残りの為に選択された。この細胞は、続いて0.2g/lで維持され た。添付図面で示される細胞は、少なくとも20の細胞分裂をした。 ＤＮＡは、細胞から単離され、サザーンブロットが調製された。ナイトランフ ィルター(Nytran filter)は、3xデンハード溶液(3x Denhardt's solution、1x D enhardt's solution=0.02%ポリビニルピロリドン/0.02%フィコール/0.02%ウシ血 清アルブミン）及び、80℃で、８分間加熱滅菌された、8ng/ml(2.5x10⁶cpm/ml） のamy37-1.1リボプローブを含むハイブリッド溶液中で、52℃で一昼夜ハイブリ ッドされた。調製されたリボプローブは、3.1x10⁸cpm／μgの比活性を有してい た。このフィルターを、2xSSC(1xSSC=0.15M NaCl及び0.015Mクエン酸ナトリウム )/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)中で、25℃で５分間、２度洗浄し、次いで 、0.1%SSC/0.1%SDS中で、53℃で30分間、２度洗浄した。このフィルターを空気 乾燥し、オートラジオグラフ法の為に使用した。β／Ａ４Ｃ−末端形質移入体は 、周囲が１２００〜１３００ｂ．ｐ．、つまりＣ−末端領域をコードする既知の EcoRIフラグメントの寸法である人間のβ／Ａ４ＤＮＡフラグメントに相当する ハイブリッドシグナルを示した。 ＰＣ１２細胞は、インフレイムベクターMin+2-amy37-1.1及びアウトフレーム ベクターMin+3-amy37-1.1で以て、形質移入前及び後で免疫染色された。非−形 質移入細胞の対数期培養物及びＡ４コードインサートを持たないベクターを運ぶ それらは、抗−Ａ４mAbsの適用後に、僅かに検出可能な抗原水準を一般に示した （図5A及び5B）。然しながら、インフレイムベクターは、免疫染色後に、普通で はない高水準の反応生成物を伴う細胞を産生した（図５Ｃ）。幾つかの例では、 現れた抗原は、末梢の周りに濃縮するか、或いは細胞の一端に局在化した。分裂 する細胞は、反応生成物の不均等な分布で以て、軽い免疫染色を示した。Ａ４エ ピトープを過剰発現するＰＣ１２細胞株は、２ヵ月以上の期間、培地で増殖した 。 試験された細胞株は、ＮＮ（非形質移入ＰＣ１２細胞）、Ｖ１２０（インサー トレスベクター−形質移入されたＰＣ１２細胞）、ＡＣ１２６及びＡＣ１２７ （β／Ａ４Ｃ−末端ペプチド発現ＰＣ１２細胞）と称した。 実施例２ 変更された形態細胞過剰発現β／Ａ４ペプチドの評価 神経突起の細胞寸法及び長さを、微小濃度計コンピュータソフトウエアー(Bio quant，R&M Biomertics，Inc.，Nashville，TN)を含む画像分析測定システムを 使用して、光学顕微鏡水準で決定した。細胞を、ガラスチャンバースライド上で 48時間増殖し、4%のパラホルムアルデヒドに30分間固定する前に、ハンク緩衝食 塩水中でリンスした。リンスに続いて、細胞をクーマシーブルーで５分間染色し た。次いで、スライドをリンスし、乾燥し、カバーを外した。細胞のフィールド は、４０ｘのライツ顕微鏡で検査した。画像測定システムを使用して、細胞本体 の境界を際立たせ、細胞本体の平均面積を計算した。各測定細胞からの神経突起 をトレースし、神経突起の長さを計算した。データは、２つの別々の実験からの １００のＶ１２０細胞、及び３つの別々の実験からの１５０のＮＮ、ＡＣ１２６ 及びＡＣ１２７細胞をカウントして導き出した。データを、分散分析で比較した 。 電子顕微鏡の為に、細胞を、0.1Mのカコジレートバッファー(cacodylate buff er)(pH7.4)中の2%パラホルムアルデヒド、2.5%グルタルアルデヒドで、30分間固 定し、Ｏ_SＯ₄で30分間後固定し、標準エタノールで脱水し、カバーを外したガラ ススライド上でエポン(Epon)に封入した。超ミクロトームで断片を切断し、グリ ッド上に置いた。このグリッドを、JEOL 1200EX電子顕微鏡で、5,000X、10.000X 及び40,000Xの倍率で検査した。膜状構造を定量化するための目的で、5,000Xで の写真画面で、合成写真を作成した。 膜状突起は、前に開示した微小絨毛及び気泡に似ている事が観察された。前者 は、直径が0.1〜10μmの範囲の細胞表面で、丸くなった、或いは指状の膜の制限 された細胞質突出として、電子顕微鏡では明らかである。他の膜状突起は、それ らが、内部にリボソーム又は小胞体を含んでいるので、気泡に似て見えた。気泡 は、ブロックの断面を反映すると見られる細胞表面で、小水疱としてしばしば 見られた。 免疫電子顕微鏡の為に、細胞を35mmのプラスチックプレートで増殖した。この プレートをハンクの塩溶液で簡単にリンスし、0.13M NaCl、0.02Mリン酸塩バッ ファー、pH7.4(PBS)中の新鮮な4%パラホルムアルデヒドで、30分間、室温で固定 した。それらを、PBSで、各１０分間、３度リンスした。 細胞を、β／Ａ４配列を持つ合成ポリペプチドに対して、モノクローナル抗体 (IgG)で免疫染色した。比較研究の為、膜抗原に対する親和性を欠くセコンドmAb を使用した。この場合、mAbは、アルカリリボヌクレアーゼインヒビタータンパ ク質(RIP)(Promega)、RNAを安定化する為に機能する内部細胞質調節タンパク質( intracytoplasmic regulatory protein)及びリボソームに対して調製された。雑 種細胞株を作る抗RIP抗体(IgG)からの上澄み液は、結果が、抗β／Ａ４免疫染色 と比較される時に、免疫細胞化学に対してネガティブコントロールとして働いた 。 プライマリー抗体上澄み液を、免疫染色バッファー(2%ウシ血清アルブミン、0 .3MNaCl、0.02Mリン酸塩、pH7.2、0.01% Triton X-100）中で1:5に希釈した。培 養は、４℃で、一昼夜であった。次の日の細胞を、0.3MNaClと20mMTrisを含むバ ッファーで、10分間、３度洗浄し、次いで、免疫染色バッファー（洗浄剤なし） 中で５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗−マウスIgG(Jackson Immunoresearch)で 以て、２時間培養した。細胞を、前述の様に洗浄した。次いで、これらを、免疫 染色バッファー（洗浄剤なし）中で0.25μｇ／ｍｌのストレプタビジン−ホルセ ラディシュ−パーオキシダーゼ複合体(Sigma)で、２時間培養し、上記の様に洗 浄した。使用したクロモゲンは、100mM Tris(pH7.0)中のジアミノベンジジン(Si gma)0.5mg/ml、イミダゾール(Sigma)１mg/mlであった。過酸化水素を、使用直前 に、0.015%(1μlの30%H₂O₂/2ml)で添加した。反応を、室温で２時間行い、次い で蒸留水で２度リンスした。次いで、細胞を、写真に撮った断片を、鉛又はウラ ニウム塩で対比染色しなかった点を除いては、通常の電子顕微鏡用として、２％ グルタルアルデヒド中で後固定した。 電子顕微鏡水準での膜状突起の頻度に相当する平均値を、ＡＮＯＶＡを使用し て比較し、次いで、ツーキー保護Ｔ−テスト(Tukey protected T-test)を行った 。 β／Ａ４Ｃ−末端ＤＮＡ(AC126及びAC127)で形質移入されたＰＣ１２細胞株は 、形態学的に変化されたものであることが観察された。非形質移入PC12細胞(NN) と、ベクター単独(V120)で形質移入された細胞を比較すると、β／Ａ４-ポジテ ィブ形質移入体は、顕著に大きく（図６、パネルＣ及びＤ）、高濃度で凝集する 傾向を有していた。 定量外形測定光学顕微鏡分析(quantitative morphometric light microscopic analysis)は、神経突起の数は、AC126及びAC127細胞では上昇しなかった(NNの7 5%と85%)事を示した。反対に、神経突起長は、細胞面積同様に（それぞれ、144% 及び234%）（図７）、NNに比べてAC126及びAC127で著しく増加した（それぞれ、 123%及び254%）。Ｖ１２０は、神経突起の長さ又は細胞の面積での増加を示さな かった（図７、それぞれ76%及び96%、NNの値）。 電子顕微鏡では、ＮＮ及びＶ１２０細胞は、β／Ａ４-ポジティブ形質移入体 とは形態学的に非類似であった。光学水準の顕微鏡から予測される様に、ＡＣ１ ２６とＡＣ１２７細胞及び核は、対照物より大きいのは明らかであり、全体の細 胞表面に沿って、より広範囲で不規則な突起を含んでいた。代表的実施例は、図 ８に示される。細胞質比に対する核に関しては、４つの細胞タイプ（ＮＮ、Ｖ１ ２０、ＡＣ１２６、ＡＣ１２７）の中での顕著な相違は存在しなかった。即ち、 核は、細胞の全容積の凡そ２９％から成っていた。 ＡＣ１２６及びＡＣ１２７細胞株は、細胞質全体にクロム親和性粒子を含む事 が明らかであった。然しながら、ミトコンドリアサイズ及び濃度は、対照物に比 べて、β／Ａ４-ポジティブ形質移入体では不変であった。特徴的な形及びウエ ル定義のクリステは保持され、ミトコンドリアで占められた細胞の面積では、顕 著な相違は観察されなかった。褐色色素粒子の数は顕著に変化しなかった。リボ ソーム、ポリソーム、粗い又は滑らかな小胞体、層状体又はゴルジ装置(Golgi a pparatus)に関して、相違は観察されなかった。 細胞膜を、対照物との比較で、β／Ａ４アミロイド−ポジティブ形質移入体で の明らかな形態学的変性を評価する為に、電子顕微鏡で検査した。ＡＣ１２６及 びＡＣ１２７細胞株の精査では、微小絨毛及び気泡に似た膜状同化の数が増加し た事を示した（図９）。 対照物及びβ／Ａ４-ポジティブ形質移入体での細胞表面同化を定性化し、比 較した。正常の対照物及びＶ１２０細胞と比較して、β／Ａ４-ポジティブ形質 移入体では、それらの構造の頻度が著しく増加した（図１０）。Ｖ１２０とＮＮ 細胞の間には顕著な相違は存在しなかった。 増加したβ／Ａ４蓄積の部位と細胞表面での膜拡張の出現との間の可能な相関 関係を、免疫染色部分の電子顕微鏡で検査した。β／Ａ４に対して調製されたモ ノクローナル抗体の適用後、ＡＣ１２６とＡＣ１２７形質移入体の電子顕微鏡写 真を、対照細胞と対比させてみた。２つのβ／Ａ４-ポジティブ細胞株は、細胞 本体内での抗原の水準を増加した事を示し、プラズマ膜の長さに沿って顕著な免 疫染色が存在した（図１１）。β／Ａ４アミロイド抗原の沈積物は、気泡及び微 小絨毛に似た膜状突起内に濃縮した（図１１）。 抗−アミロイドｍＡｂが、プラズマ膜を非特異的にラベル化しなかった事を証 明する為に、細胞質タンパク質とは関係のない対照のｍＡｂを比較の為に含めた 。後者は、ネズミ及び人間のリボヌクレアーゼインヒビタータンパク質(RIP)に 高い親和性を有する。両方のｍＡｂを、同じ方法を使用して、ＡＣ１２６細胞に 適用した。抗−ＲＩＰｍＡｂは、分散パターンで、細胞質細胞を簡単にラベル化 したが、膜は検出しなかった（図１２Ａ）。逆に、β／Ａ４ｍＡｂは、IgGの非 特異的結合は、開示された免疫細胞化学的方法を使用すると、優先的に生起しな かった事を示し、前と同様に（図１２Ｂ）、突起膜を染色した。 これらの結果は、ＰＣ１２細胞は、ベータアミロイドペプチドの発現によって 実質的に変えられる事を証明する。これらは、β／Ａ４ペプチドの細胞膜への挿 入は、その拡張を許し、他の非同定因子との関連においてＰＣ１２細胞が拡大し 、異常に細長くなった神経突起を形成する事を許す様に作用する事を示唆する。 最後に、それらは、β／Ａ４ペプチドが、形質移入されたＰＣ１２細胞の凝集増 加に、同様に寄与する事を示唆する。 多数の実験で平均化された、ＰＣ１２細胞とＡＣ１２７細胞の細胞面積と神経 突起長さのデータは、以下の表Ｉに示される。 実施例３ オリゴヌクレオチドによるβ／Ａ４ペプチド誘発形態学的変化の逆転 ２つのオリゴヌクレオチドにつき、ＰＣ１２細胞でのβ／Ａ４ペプチド誘発形 態学的変化を逆転するそれらの能力をテストした。テストされたオリゴヌクレオ チドは、共にオリゴヌクレオチドホスホロチオエート（全てホスホロチオエート 内部ヌクレオシド結合）であった。第一のオリゴヌクレオチドは、〔配列番号１ 〕５′−ＣＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴ−３′のヌクレ オチド配列を有していた。この配列は、β／Ａ４ペプチド配列が単離される開始 コドンを含む核酸配列に対して相補的で、この場合、ＳＶ４０Ｔ抗原開始コドン を包含している。テストされた第二のオリゴヌクレオチドは、〔配列番号２〕５ ′−ＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＴＧＴＣＧ−３′のヌクレオチド配列を 有していた。このオリゴヌクレオチドは、ＡＰＰコード配列（アミノ酸６０１− ６０７をコードする）の一部に対して相補的で、β／Ａ４ペプチドのアミノ酸５ −１１をコードする配列に相当する。 続く実験で、神経突起の細胞寸法及び長さを、微小濃度計コンピュータソフト ウエアー(Bioquant，R&M Biomertics，Inc.，Nashville，TN)を含む画像分析測 定システムを使用して、光学顕微鏡水準で決定した。一般に、比較目的の為の細 胞パラメーター（容積、長さ）に関する定量データは、写真の定量比較によるよ りはむしろコンピューターを基本とした光学画像システムの使用によってのみ得 る事が出来る。 最初に、データは、正常の対照ＰＣ１２細胞から集め、ベースラインデータを 確立する為にベータアミロイドを過剰発現するＡＣ１２７細胞と比較された。幾 つかの実験では、細胞面積の増加が、神経突起の延長を進めた事は明らかであっ た。推計学的測定を上述の様に行った。対照ＰＣ１２細胞は、２７４．７６±３ １μｍ²の細胞面積を有し、神経突起は、10.36±1.21μｍの長さを有していた。 ＡＣ１２７細胞は、６４２.２８±５９μｍ²の細胞面積を有し（面積で２３４ ％増加）、神経突起は、26.27±3.32μｍの長さを有していた（長さで２５４％ の増加）。表Ｉ参照。 第一セット実験では、実施例２で述べた様に調製されたＰＣ１２細胞を、２つ のテストオリゴヌクレオチドの内の１つの５０μｇ／ｍｌの存在又は非存在下に ８日間培養した。次いで、形態学的ポイントを、オリゴヌクレオチド処理及び未 処理細胞で比較した。β／Ａ４ペプチドが翻訳される〔配列番号１〕開始コドン に対して相補的であるオリゴヌクレオチドでの細胞処理は、β／Ａ４ペプチドに 対する免疫染色を大いに減らす結果となった。図１４Ａ及び１４Ｂで示される様 に、免疫染色は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを受け入れた細胞（図１４Ｂ ）に比較して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを受け入れなかったアミロイド ポジティブ細胞（図１４Ａ）は著しく暗かった。更に、これら処理された細胞は 、明らかに非凝集性であった。個々の実験では、処理細胞の寸法は、４５５.７ ６±３３.１１μｍ²から２９９.１２±３１.９８μｍ²に減った（５０細胞の平 均）。別の個別実験では、β／Ａ４ペプチドコード配列〔配列番号２〕に対して 相補的なオリゴヌクレオチドでの細胞処理は、細胞面積を、７５１.６７±１１ １.３５μｍ²から２８６.２５±６０.５５μｍ²に減少した（２５細胞の平均） 。 一緒の比較では、各オリゴヌクレオチドは、β／Ａ４ペプチドにより、ＰＣ１ ２細胞中で誘発された形態学的変化を逆転する点では、等しく効果的であり、こ の２つの組み合わせは、同様に効果的であった。未処理細胞は、７１５.１６± ６６.９６μｍ²の面積を有していた。配列番号１を有するオリゴヌクレオチドで 処理された細胞は、３７８.７１±３６.２９μｍ²の面積を有していた。配列番 号２を有するオリゴヌクレオチドで処理された細胞は、３４７.１２±３５.３６ μｍ²の面積を有していた。５０細胞が、各実験で測定された。 更なる実験では、アミロイドポジティブＰＣ１２細胞の細胞面積に関するこの ２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物の効果を決定した。培養された 細胞に対して、配列番号１及び配列番号２を有するアンチセンスオリゴヌクレオ チドの混合物の０又は５０μｇ／ｍｌを添加した。アンチセンスオリゴヌクレオ チド無しで培養された細胞は、混合物で処理された細胞の３８６.５５±３４.０ ８μｍ²に比較して、７８６.６９±６８.２３μｍ²の面積を有していた。５０細 胞が測定された。この様に、この結果は、２つのアンチセンスオリゴヌクレオチ の混合物は、細胞の寸法を著しく減少させた事を示す。 次に、アミロイドポジティブＰＣ１２細胞の神経突起の長さに関する、配列番 号２を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を決定した。ベータアミロ イドを過剰発現する細胞は、最終的には正常の対照ＰＣ１２細胞の神経突起の長 さの凡そ２倍に達する長さに迄神経突起を延長する。この実験で、配列番号２を 有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果が、正常の長さを有する細胞及び 異常に長い延長を有する細胞について決定された。正常な対照ＰＣ１２神経突起 は、１０.３６±１.２１μｍの長さを有していた。第一のグループでは、アミロ イドポジティブ細胞の神経突起長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処 理後の１３.３１±１.０６μｍに比較して、１３.１２±１.２１μｍであった。 第二のグループでは、アミロイドポジティブ細胞の神経突起長さは、アンチセン スオリゴヌクレオチドでの処理後の１１.８０±０.９４μｍに比較して、１４. ２９±１.２３μｍであった。第三のグループでは、アミロイドポジティブ細胞 の神経突起長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後の８.９５２± １.１４μｍに比較して、２２.６６±３.４５μｍであった。この最後のグルー プの細胞は、異常に長い神経突起を有していた。これらのデータは、配列番号２ を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、形質移入体が、対照物の値に比較 して、正常の長 さ以上の長さにまで延長を引き延ばす時にのみ、ベータアミロイドを過剰発現す る細胞において、神経突起の長さを減少させるのに効果的である事を証明する。 更なる実験では、以下の配列を有し、ベータアミロイドタンパク質とは完全に 関係のないアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果がテストされた。 〔配列番号１３〕 ５′−ＴＴＧＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣ−３′ 〔配列番号１４〕 ５′−ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＣ Ａ−３′ ２つのオリゴヌクレオチドの当モル混合物を、全濃度５０μｇ／ｍｌで使用し た。処理前の形質移入された細胞の平均寸法は、〔配列番号１３〕及び〔配列番 号１４〕を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物での処理後の３７９ .２９μｍに比較して、５６０.４５μｍであった。 全て一緒にして、これらのデータは、抗−β／Ａ４オリゴヌクレオチドは、ベ ータポジティブ細胞の増加した寸法を、凡そ５０％、効果的に減少する事を示す 。得られた処理細胞は、平均では、正常な対照ＰＣ１２細胞より、１８％以上大 きくはなかった。逆に、ベータアミロイド調節とは無関係のオリゴヌクレオチド は、ベータポジティブＰＣ１２細胞の寸法を３２％まで減少させた。得られた処 理細胞は、平均では、正常な対照ＰＣ１２細胞より、２８％大きかった。この様 に、β／Ａ４ペプチが翻訳される開始コドン、或いはヌクレオチド配列コード化 β／Ａ４ペプチのいずれかに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 β／Ａ４ペプチにより、細胞に引き起こされた形態学的変化を逆転する事が出来 る。 実施例４ アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されたＰＣ１２細胞の形態 ＡＰＰの５′末端に相補的なオリゴ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの１ ０又は２０μｇ／ｍｌで１週間処理された細胞を、光学顕微鏡で、形態学的に 評価した。細胞本体寸法において明らかな減少の原因となるアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの添加を（図１５Ｂ、１５Ｃ）、正常の対照ＰＣ１２細胞（図１５ Ａ）と、無関係なランダムオリゴヌクレオチド、オリゴ−２で処理した細胞とを 比較した。細胞は活力を残し、形態は、別に保持されて残った。 細胞面積の明らかな減少は、未処理及び処理ＰＣ１２細胞の定量的体型測定に よって確認された。図１６で示される様に、１０μｇ／ｍｌのオリゴ−１存在下 で、１週間培養された細胞は、細胞面積において顕著な減少を示した。そして、 未処理細胞と比較して、２０μｇ／ｍｌのアンチセンスオリゴヌクレオチドでは 、更なる面積の減退があった。オリゴ−２の添加は、細胞面積の顕著な減少を生 まなかった。 実施例５ アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理後のＡＰＰ水準 正常な対照ＰＣ１２細胞及びＰＳ−オリゴで処理された細胞からの洗剤抽出タ ンパク質を、ＳＤＳゲル変性で分離し、抗−ＡＰＰ抗体で免疫染色した。免疫ブ ロットでは、ＡＰＰは、１２０−１５０kDaの寸法範囲に移動した2つの大きなバ ンドとして現れた（図１７Ａ）。１０μｇ／ｍｌのオリゴ−１で、１０日間処理 されたＰＣ１２細胞は、未処理の対照細胞と比較して、洗剤抽出ＡＰＰ水準で、 ３３％の減退を示した（図１７Ｂ）。１５μｇ／ｍｌのアンチセンスオリゴヌク レオチドでは、抽出ＡＰＰ水準で、６０％の減少であった（図１７Ｃ）。無関係 のオリゴ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じ濃度で、顕著な効果を有 していなかった。チロシンヒドロキシラーゼの為に免疫染色されたウエスターン ブロットに関して、ＰＳ−オリゴ−処理細胞及び未処理細胞間でのチロシンヒド ロキシラーゼの水準に顕著な相違は存在しなかった。 実施例６ ＮＧＦ処理ＰＣ１２細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加効果 期待通り、１００μｇ／ｍｌで処理されたＰＣ１２細胞は、顕著な栄養応答を 有していた。細胞面積は、３日間にわたって５００μｍ²未満から１３００μｍ² 以上に増加し、それらは、未刺激細胞より大きい、２以上のひだを残した。同じ 時間間隔の間に、神経突起長は、凡そ１００μｍに増加した。 ＮＧＦで前処理されたＰＣ１２細胞についてのＡＰＰアンチセンスオリゴヌク レオチドの潜在的効果を評価した。４８時間、ＮＧＦに曝露されたＰＣ１２細胞 は分化して、１５μｇ／ｍｌのオリゴ−１の追加添加でも、顕著な影響を受けな かった。細胞面積（図１８）及び神経突起長（図１９）は増加し、アンチセンス オリゴヌクレオチドに曝露されていないＮＧＦ処理細胞に似た水準に達した。Ｐ Ｃ１２細胞の栄養応答を妨害するオリゴ−１の無能力性は、オリゴ−２の結果と 類似する（図１９）。 実施例７ アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されたＰＣ１２細胞についてのＮＧＦ添 加効果 ＰＣ１２細胞を、オリゴ−１の存在下、種々の濃度で、６日間、連続的に培養 した。２日後、細胞を、又残りの４日の為にＮＧＦに曝露し、この時点で形態学 的測定を行った。図２０及び２１で示される通り、ＡＰＰアンチセンスオリゴヌ クレオチドの濃度増加は、ＮＧＦに対する栄養応答を妨害する容積増加となった 。逆に、同じ条件下で、ランダム配列オリゴ−２は、顕著な効果を有しなかった 。 光学顕微鏡は、寸法及び神経突起長を除いて、ＰＣ１２細胞は、細胞の生活活 性に対して明らかな有害作用なしの形態学的正常さを残したオリゴ−１に曝露さ れた事を証明した（図２２Ａ及び２２Ｂ）。 実施例４〜７において、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる、神経栄養剤 の効果へのＡＰＰの貢献が試験された。最近の論文は、ＮＧＦと、培養細胞から のＡＰＰの再分布と放出との間の相関関係を示している(Fukuyama et al.,Molec .Brain Res．17:17-22(1993)；Mobley et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.85:9811 -9815（1988）；Refolo et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun．164:664-670 (1989)；Schubert et al.，Neuron．3:689-694(1989))。然しながら、以前の研 究は、ＡＰＰ水準とＮＧＦの栄養応答との間の作用機序を試験していなかった。 ＡＰＰ水準の調節が、ＰＣ１２細胞表面積と神経突起長の維持に関係付けられ るこの作用機序は、知られていない。ＡＰＰは、直接的には分子結合研究を通し て(Ghiso et al.，J．Biochem．288:1053-1059(1992)；Kibbey et al.，Proc．N atl．Acad．Sci．USA 90:336-342(1993)；Maestre et al.，Neuroscience 18:14 37[abs．60.1]，1437(1992)；Schubert et al.，Neutron．3:689-694(1989))、 そして、間接的には、抗−ＡＰＰ抗体の手段(Breen et al.，J．Neurosci．Res ．28:90-100(1991)；Chen&Yanker，Neurosci．Lett.125:223-226(1991))によっ て、共に細胞接着に関係があるとされてきた。この様に、細胞表面積でのオリゴ −１誘発減退は、減少した細胞接着に関係があるかも知れない。一層丸まった細 胞形態とする、減少した表面アタッチメントは、表面積での明らかな減少に貢献 するかも知れない。別に、細胞寸法の維持は、ＰＣ１２細胞によって分泌される 事が知られている、ＡＰＰの可能な刺激性効果に関係するかも知れない(Schuber t et al.，Neuron．3:689-694(1989)；Refolo et al.，Biochem．Biophys．Res ．Commun．164:664-670(1989))。オリゴ−１での処理は、ＡＰＰの分泌の減少と なり、組織培養培地での水準を下げるかも知れない。分泌されるＡＰＰの水準の 調節は、細胞アタッチメント及び生活活性にとって重要である。最近の研究では 、ＡＰＰのＣ−末端領域を過剰発現するＰＣ１２細胞からの調整された培地は、 正常のＰＣ１２細胞に関して栄養効果を有する事が観察された。 オリゴ−１の活性は、非特異的効果に帰し得るものであるとする事の可能性は 、ランダムＰＳ−オリゴの適用から引き出される結果によっては支持されない。 オリゴ−２は、ＰＣ１２形態及びＮＧＦの栄養応答に関しては顕著な効果を有し ていなかった。オリゴ−１が、非特異的細胞結果を仲介しなかった事の更なる証 拠 は、オリゴ−１の効果が、本研究で使用されるアッセイシステムで、濃度依存で あった事の観察であった。 ＮＧＦへの応答でのＰＣ１２の分化状態は、アンチセンスオリゴヌクレオチド の追加添加によって影響を受ける事はなかった。反対に、オリゴ１−１での細胞 の前処理は、ＮＧＦへの順次栄養応答を変更した。これらの観察は、ＡＰＰ水準 が、分化の初期段階にとって重要である事を示唆する。ＮＧＦで処理されたＰＣ １２細胞では、ＡＰＰの６９５異性体が増加する(Fukuyama et al.，Molec．Bra in Res．17:17-22(1993))。ＡＰＰは、また非分化状態で、円錐体、突起及びＮ ＧＦ処理後の細胞質を増殖する為に、細胞質から再分布する。ＡＰＰの分泌は、 ＮＧＦに曝露後、直ちに増加した(Fukuyama et al.，Molec．Brain Res．17:17- 22(1993))。本研究で観察されたＡＰＰ水準の、アンチセンスオリゴヌクレオチ ド誘発減少は、ＮＧＦの細胞効果の或るものを直接に調節するには十分であるか も知れない。別に或いは同じく、ＡＰＰの減少は、ＮＧＦ受容体活性を変更する のに十分なプラズマ膜における構造変更の原因であるかも知れない。 ＡＤの治療に対するＮＧＦの潜在的価値は、種々の論文で議論されて来ており (Mobley，W.C.，Neurobiol．Aging 10:578-580(1989)；Olson L.，Exp．Neurol ．124:5-15(1993))、ＮＧＦは、臨床的に適用され始めた(Seiger et al.,Behav ．Brain Res．57:255-261 81993))。然しながら、この治療方法に対する潜在的 邪魔者が、ＮＧＦは、更なる栄養刺激又は非特異的効果の原因となるＡＰＰの産 生を誘発するとの観察によって示唆される(Fukuyama et al.，Molec．Brain Res ．17:17-22(1993)；Mobley et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．85:9811-9815（19 88）；Refolo et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun．164:664-670(1989))。 ＡＰＰのＮＧＦ誘発上昇が、ＡＤの特徴であるアミロイドーシスに貢献するか どうかは知られていない。然しながら、ＡＤは、皮質ＮＧＦ水準の減少よりもむ しろ増加によって特徴付けられる事が報告されている(Crutcher et al.，Detect ion of NGF-Like Activity in Human Brain Tissue：Increased Levels in Alzh eimer's Disease(1993))。本研究は、ＡＰＰ水準は、アンチセンスオリゴヌクレ オチドの特異性で以て調節出来る事を示す。ＡＤの為に提案された神経栄養治療 の潜在的利益に関して検討してみると、ＡＰＰ水準を調節する様に設計 された、アンチセンスオリゴヌクレオチドでフォローされる増殖因子の順次的適 用は、アルツハイマー症の治療における臨床的適用を見出すかも知れない事が、 可能性として上がってくる。 実施例８ アルツハイマーアミロイド産生についてのＡＰＰアンチセンス化合物の効果測定 方法 材料と方法 ＰＣ１２（どんな神経細胞株を使用してもよい）細胞を、グリーンとティシュ ラー(Greene&Tischler，Proc．Natl．Acad．Sci USA 73:2424-2428(1976))によ って開示されている様にして、次のものを除いて増殖した：２mM L-グルタミン 、１mMピルビン酸ナトリウム、100μg/mlストレプトマイシン、100単位/mlペニ シリン、10%の子牛の血清、5%の胎子牛血清のダルベッコ変性イーグル培地(DMEM )。添加される場合、ＮＧＦ（2.5S又は好ましくは7Sマウス、シグマ；ネズミ由 来のＮＧＦ（マウス又は人間のＮＧＦも使用出来る））が、48時間の予備培養後 に、100ng/ml(50-200ng)で使用され、３日（２−４日）間隔で更新された。培養 物を、湿潤培養器中で、３７℃、５％CO₂に保つた。 細胞を、50−100,000/cm²でプレート化し、上記培地中で24時間、（12-48時間 ）培養した。オリゴヌクレオチド(20-25mers)を生理食塩水中で造り、１０μｇ ／ｍｌ(10-50μｇ／ｍｌ=1.5-7.7μM)で培養物に添加した。 タンパク質Ａセファローズは、ＤＡＫＯから入手出来る。アルツハイマーのβ −アミロイドに対する抗体は、1993年７月27日発行の米国特許第5,231,000号か ら得るか、又は作られる。 固相免疫沈殿によるアミロイドの検出 細胞は、血清なしで、1%のウシ血清アルブミン以外は、開示された様に増殖し た。ナンセンスから成る種々のオリゴの幾つかの濃度を使用した（１−８μＭ） 。ナンセンスオリゴは、何等のオリゴも含まない対照物の対照物として使用した 。この対照物は、任意の非特異的応答の検出を許す。即ち、ナンセンスオリゴ対 照物は、オリゴのそれ自身の毒性の検出を更に許す。³⁵S-メチオニンは、100μC i/ml(10-100μCi/ml)で添加した。細胞は、一昼夜(6-24時間)培養した。 β／Ａ４は、この細胞培養物の上澄み液中に分泌される。それ故に、細胞培養 物の上澄み液を回収し、２００μＭの冷メチオニンを、³⁵S-メチオニンの非特異 的結合を防ぐ為にそれぞれに添加した。上澄み液を、室温（１８−２５℃）で、 ３０分間、40,000xgで遠心分離に掛け、細胞破片又はその他の抽出性物質を除去 した。次の段階で添加される抗−アミロイド抗体へのアミロイド以外の化合物の 非特異的結合を減少させる為に、それぞれの遠心分離したサンプルからの上澄み 液を取り除き、室温で、２時間（１−４時間）、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質Ａセ ファロース（ＰＡＳ）と共に培養した。この方法のバリエーションは、セファロ ースビーズへの直接的抗−アミロイド抗体のカップリング又は、プライマリー抗 体が造られた種に対する、セファロース複合セコンダリー、例えば山羊、兎、羊 又は馬の抗体の使用を含む。然しながら、プロトコールは、それらの代替方法に 対しては僅かに異なる。その様な調整は通常のものであり、当業者の知識範囲内 である。ＰＡＳは、５時間、10,000xgでの遠心分離によって除去した。アルツハ イマーのβ−アミロイドに対する抗体（モノクローナルか、β−アミロイドアミ ノ酸1-42の種々の配列に関するポリクローナルのいずれか）は、モノクローナル 又は類似のポリクローナル抗体、好ましくは親和性精製ポリクローナル抗体に対 して、５μｇ／ｍｌで上澄み液に添加した。室温で２時間培養した。２時間、上 述の様にタンパク質Ａセファロースを添加した。抗体結合ＰＡＳを回収し、0.5% TritonX-100洗剤を含むリン酸塩バッファー食塩水で数度洗浄した。 ＰＡＳ−アミロイド−抗体複合体は、16%アクリルアミドゲル上での分離の為 に調整した(Schagger&von Jagow，Anal．Biochem．166:368-379(1987))。このゲ ルを乾燥し、フィルムとした。次いで、得られるバンドの分子量を決定した。バ ンド強度は、濃度計で測定した。種々の細胞培養サンプルの4.3kD β−アミロイ ドバンドを、対照物と比較した。それにより、細胞中のベータ−アミロイドの 産生に関する各アンチセンスオリゴの効果が、各オリゴのん潜在能力の程度及び ベータ−アミロイド産生を減少させるのに最も効果的な濃度同様に決められた。 アミロイドの産生を防止及び／又は減少させるのに最も効果的なオリゴの濃度 が、一度決められれば、それらの治療の効力は、上述の実施例４−７で述べた様 に、細胞培養で試験出来る。次いで、最も効果的なオリゴ／ＮＧＦの組み合わせ を、動物及び／又は人間の治療に使用出来る。 実施例９ ＮＧＦ及び／又はオリゴ配達システム。遠隔操作される移植可能な注入システ ムを使用した。経皮的に再充填出来るポンプ及び脳の側脳室末端の皮下カテーテ ルが、限られた量で患者に長期間薬剤を配達する事に関する問題点を解決するの に使用した(Harbaugh，R.，Psychopharmacol．Bull．22:106-108(1986)；Harbau gh et al.，J．Neurosurg．71:481-486(1989))。このポンプシステムは、走触性 手術を使用して一般的麻酔の下で移植され、頭頂後頭側頭連結部における大脳皮 質の円柱上の生検材料が、ＮＧＦ−及び／又はオリゴ−配達カニューレ(cannula )が挿入されるべき部位から得られた。カニューレのチップの配置は、脳脊髄液 の自由な流れによって検証された。プログラム出来るポンプ(Synchromed，Medit ronic)を腹壁中に置き、ＮＧＦ及び／又はオリゴの輸送を、直ちに開始した。15 μl/時のポンプ速度で、凡そ75μg/24時のＮＧＦ投与量が患者に配達された。 実施例１０ ＮＧＦ製剤。マウスβ−ＮＧＦを得て、副腎髄質自己移植をサポートする為に 、パーキンソン氏病患者の一人に使用する為に、最近に述べられた様な、臨床使 用前にテストされた(Olson et al.，Arch．Neurol．48:373-381(1991))。雄の成 体マウスの顎下腺が、ＮＧＦを抽出するのに使用され(Chapman et al.，Fed.Eur .Biochem．Soc．Lett．104:341-344(1979)；Ebendal et al.，in Cellular and Molecular Biology of Neuronal Development,I．Black，ed.,Plenum，New york (1984)，pp．231-242；Mobley et al.，Biochemistry 15:5543-5552(1976))、こ のＮＧＦを、精製の為に、そして特定の活性の為に使用した。好ましくは、この 製剤は、５ｎｇ／ｍｌの濃度で、標準化ヒナ胎芽神経節バイオアッセイ(standar dized chick embryo ganglia bioassay)で、in vitroで完全な生物学的活性（Ｉ ＢＵ）を発揮すべきである。臨床使用前に、このＮＧＦ製剤を、２度滅菌ろ過し 、リンガーグルコースに対して透析し、公的な標準の高い規格条件下で滅菌性を テストした。平行のバッチも、それらが、汚物を含まない事を確認する為に、パ イロジェン及び外来遺伝子物質の存在についてテストした。ＮＧＦ製剤は、３７ ℃で数週間、完全な生物学的活性を維持すべきである(Olson et al.，Arch．Neu rol．48:373-381 (1991))。 実施例１１ ＮＧＦ及びＮＧＦ抗体の測定。患者の治療前、治療中及び治療後の繰り返し血 液サンプルを得、抗−ＮＧＦの存在同様に、ＮＧＦの存在を分析する為に使用し た。これらの技術はケース報告に纏められる(Olson，J．Neural．Transm.（PD-S ect.）4:79-95(1992);詳細は、Larkfors&Ebendal，J．Imunol．Methods 97:31-4 7(1987)；Olson et al.，Arch．Neurol．48:373-381(1991)；Soderstrom et al. ，J．Neurosci．Res．27:665-677(1990)に述べられる)。 実施例１２ 認識テストバッテリー。７つの異なるテスト、ミニメンタル状態のモニタリン グ(Folstein et al.，J．Psychiatr．Res．12:189-198(1975))、面接認識、空間 記憶(Sharps&Gollins，J．Gerontol．42:336-341(1987))、言語認識(Backman，L .，Exp．Aging Res．12:135-140(1986))、選択的思い出し(Buschke，H.，J．Ver b．Behav．12:543-550(1973))、指スパン(digit span)(Wechsler，D.，Wechsler Adult Inrelligence Scale：Manual，Psychological Corp.，New York (1955))、及び単語流暢性(Lezak，M.，Neuropsychological Assessment，Oxford Univ．Press，New York(1983))、それぞれを、認識機能に関する治療の潜在効 果を試験する為に使用した（これらテストの為のテストバッテリー及び参考例の 更なる記載については、Oblon，J．Neural．Ttansm.（PD-Sect.）4:79-95(1992) )を参照されたい）。 実施例１３ 陽電子射出断層撮影。調剤的ＰＥＴ研究は、放射能標識化ニコチン、放射能標 識化ブタノール及び放射能標識化２−デオキシグルコースを含む。術後に、放射 能活性の量及び患者へのストレスを減少させる為に、ニコチン及びブタノールＰ ＥＴだけを行った。血流測定は、比較的簡単であるが、ニコチンデータの解釈は 、それが脳組織における特異的結合によるばかりでなく、血流及び血液中の特異 的及び非特異的結合によって影響を受けるので、モデル化の観点から一層複雑で ある。（これらの方法及びデータの解釈についての詳細な議論は、Olson et al. ，Arch．Neurol．48:373-381（1991）及びNordberg及び共同研究者の研究(Nordb erg et al.，J．Neural．Transm.（PD-Sect.）2:215-224(1990)；Nordberg et al.，in Alzheimer's Disease：Basic Mechanisms，Diagnosis and Therapeutic Strategies，K．Iqbal et al.，eds.，John WIley，New York(1991)，pp．517- 523；Nordberg et al.，J．Neural．Transm.（PD-Sect.）1：195-205(1989)；No rdberg et al.，in Alzheimer's Disease：Current Research in Early Diagnos is，Becker&Giacobini，eds.，Taylor and Francis，New York(1990)，pp．329- 338；Nordberg & Winblad，Neurosci．Lett．72:115-119(1986)を参照されたい ）。 実施例１４ ＥＥＧ記録。多重記録部位での標準技術を使用した。ＥＥＧ記録は個々に分析 され、また、コンピュターアシストパワースペクトル分析が使用された。 上述の全ての文献は、その文献において引用された参考例同様に、ここに参考 例としてその全体が導入される。 前述の発明は、明確の為及び理解の為に幾分詳細に開示されたが、形式及び詳 細な点での様々な変化は、この発明及び添付されたクレームの真の範囲から離れ る事なく成しうるを、この記述を読む事から、当業者によって認められるであろ う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｌ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マロッタ チャールズ エイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02140 ケンブリッジ ワン リッチデイ ル アベニュー ８ (72)発明者 マジョーカ ロナルド イー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02067 シャロン ファーナス ストリー ト 60 (72)発明者 アグラワル スドヒル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01545 シュローズバリー ランプライタ ー ドライヴ 61

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞中で、β／Ａ４ペプチドに起因する形態学的変化を逆転させる方法であ って、該細胞に、抗体−β／Ａ４オリゴヌクレオチドの効果的量を投与する工程 を含む方法。 ２．動物のアルツハイマー症の治療又は防止方法であって、該動物に、抗体−β ／Ａ４オリゴヌクレオチドの効果的量を投与する工程を含む方法。 ３．動物のダウン症候群の治療方法であって、該動物に、抗体−β／Ａ４オリゴ ヌクレオチドの効果的量を投与する工程を含む方法。 ４．抗体−β／Ａ４オリゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドが翻訳される開始 コドンに対して相補的である、請求の範囲１〜３のいずれか１項記載の方法。 ５．開始コドンが、ＡＰＰｍＲＮＡの開始コドンである、請求の範囲１〜３のい ずれか１項記載の方法。 ６．抗体−β／Ａ４オリゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドをコードするヌク レオチド配列から成るヌクレオチド配列に対して相補的である、請求の範囲１〜 ３のいずれか１項記載の方法。 ７．β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配列 が、ＡＰＰ遺伝子又はＲＮＡである、請求の範囲６項記載の方法。 ８．人間を含む動物におけるβ／Ａ４ペプチドを減少させる方法であって、該動 物に、抗体−β／Ａ４オリゴヌクレオチドの効果的量を投与する工程を含む方法 。 ９．抗体−β／Ａ４オリゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドが翻訳される開始 コドンに対して相補的である、請求の範囲８項記載の方法。 １０．開始コドンが、ＡＰＰｍＲＮＡの開始コドンである、請求の範囲９項記載 の方法。 １１．抗体−β／Ａ４オリゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドをコードするヌ クレオチド配列から成るヌクレオチド配列に対して相補的である、請求の範囲８ 項記載の方法。 １２．β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配 列が、ＡＰＰ遺伝子又はＲＮＡである、請求の範囲１１項記載の方法。 １３．β／Ａ４ペプチドが翻訳される開始コドンに対して相補的である、抗−β ／Ａ４オリゴヌクレオチド。 １４．開始コドンが、ＡＰＰｍＲＮＡの開始コドンである、請求の範囲１３項記 載のオリゴヌクレオチド。 １５．β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配 列に対して相補的である、抗−β／Ａ４オリゴヌクレオチド。 １６．β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配 列が、ＡＰＰ遺伝子又はＲＮＡである、請求の範囲１５項記載のオリゴヌクレオ チド。 １７．オリゴヌクレオチドが、１以上のホスホロチオエート又はホスホロジチオ エート領域及び１以上のアルキルホスホネート又はアルキルホスホノチオエート 領域から成る混合バックボーンオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１３項記 載のオリゴヌクレオチド。 １８．オリゴヌクレオチドが、１以上のデオキシリボヌクレオチド領域及び１以 上のリボヌクレオチド領域から成るハイブリッドオリゴヌクレオチドであり、約 １から約全部の内部ヌクレオチド結合が、ホスホロチオエート又はホスホロジチ オエート結合である請求の範囲１３項記載のオリゴヌクレオチド。 １９．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端及び、任意にその５′−末端に、 低級アルキル又はアルコール基及び図１で示される構造から成る群から選ばれる キャップ構造を有する、請求の範囲１３項記載のオリゴヌクレオチド。 ２０．オリゴヌクレオチドが、３′−末端において、自己相補的領域を有する自 己安定化オリゴヌクレオチドである、請求の範囲１３項記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２１．オリゴヌクレオチドが、１以上のホスホロチオエート又はホスホロジチオ エート領域及び１以上のアルキルホスホネート又はアルキルホスホノチオエート 領域から成る混合バックボーンオリゴヌクレオチドである、請求の範囲１５項記 載のオリゴヌクレオチド。 ２２．オリゴヌクレオチドが、１以上のデオキシリボヌクレオチド領域及び１以 上のリボヌクレオチド領域から成るハイブリッドオリゴヌクレオチドであり、 約１から約全部の内部ヌクレオチド結合が、ホスホロチオエート又はホスホロジ チオエート結合である請求の範囲１５項記載のオリゴヌクレオチド。 ２３．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端及び、任意にその５′−末端に、 低級アルキル又はアルコール基及び図１で示される構造から成る群から選ばれる キャップ構造を有する、請求の範囲１５項記載のオリゴヌクレオチド。 ２４．オリゴヌクレオチドが、３′−末端において、自己相補的領域を有する自 己安定化オリゴヌクレオチドである、請求の範囲１３項記載のオリゴヌクレオチ ド。 ２５．請求の範囲１３項又は１５項記載のオリゴヌクレオチド及び薬理学的に受 容可能な担体から成る薬理学的組成物。 ２６．神経増殖因子及び抗−β／Ａ４オリゴヌクレオチドを含有する組成物。 ２７．抗−β／Ａ４オリゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドが翻訳される開始 コドンに対して相補的である、請求の範囲２６項記載の組成物。 ２８．開始コドンが、ＡＰＰｍＲＮＡの開始コドンである、請求の範囲２７項記 載の組成物。 ２９．抗−β／Ａ４オリゴヌクレオチドが、β／Ａ４ペプチドをコードするヌク レオチド配列から成るヌクレオチド配列に対して相補的である、請求の範囲２６ 項記載の組成物。 ３０．β／Ａ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配 列が、ＡＰＰ遺伝子又はＲＮＡである、請求の範囲２９項記載の組成物。 ３１．オリゴヌクレオチドが、１以上のホスホロチオエート又はホスホロジチオ エート領域及び１以上のアルキルホスホネート又はアルキルホスホノチオエート 領域から成る混合バックボーンオリゴヌクレオチドである、請求の範囲２７項記 載の組成物。 ３２．オリゴヌクレオチドが、１以上のデオキシリボヌクレオチド領域及び１以 上のリボヌクレオチド領域から成るハイブリッドオリゴヌクレオチドであり、約 １から約全部の内部ヌクレオチド結合が、ホスホロチオエート又はホスホロジチ オエート結合である請求の範囲２７項記載の組成物。 ３３．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端に、低級アルキル又はアルコール 基及び図１で示される構造から成る群から選ばれるキャップ構造を有する、請求 の範囲２７項記載の組成物。 ３４．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端及びその５′−末端に、低級アル キル又はアルコール基及び図１で示される構造から成る群から選ばれるキャップ 構造を有する、請求の範囲２７項記載の組成物。 ３５．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端において、自己相補的領域を有す る自己安定化オリゴヌクレオチドである、請求の範囲２７項記載の組成物。 ３６．オリゴヌクレオチドが、１以上のホスホロチオエート又はホスホロジチオ エート領域及び１以上のアルキルホスホネート又はアルキルホスホノチオエート 領域から成る混合バックボーンオリゴヌクレオチドである、請求の範囲２９項記 載の組成物。 ３７．オリゴヌクレオチドが、１以上のデオキシリボヌクレオチド領域及び１以 上のリボヌクレオチド領域から成るハイブリッドオリゴヌクレオチドであり、約 １から約全部の内部ヌクレオチド結合が、ホスホロチオエート又はホスホロジチ オエート結合である請求の範囲２９項記載の組成物。 ３８．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端に、低級アルキル又はアルコール 基及び図１で示される構造から成る群から選ばれるキャップ構造を有する、請求 の範囲２９項記載の組成物。 ３９．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端及びその５′−末端に、低級アル キル又はアルコール基及び図１で示される構造から成る群から選ばれるキャップ 構造を有する、請求の範囲２９項記載の組成物。 ４０．オリゴヌクレオチドが、その３′−末端において、自己相補的領域を有す る自己安定化オリゴヌクレオチドである、請求の範囲２９項記載の組成物。 ４１．薬理学的に受容可能な担体中に、請求の範囲２６項〜４０項のいずれか１ 項記載の組成物を含む薬理学的組成物。 ４２．（ａ）第１容器手段が、β／Ａ４アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み 、且つ （ｂ）第２容器手段が、増殖因子を含む、 １以上の容器手段を厳重に閉じ込めた状態で受容する様に区分されている担 体手段を含む、薬理学的投与を必要とする患者の為の薬理学的投与の為のキット 。 ４３．アンチセンスオリゴヌクレオチドが、水性バッファー溶液又は生理的溶液 として存在する、請求の範囲４２項記載のキット。 ４４．増殖因子が、神経増殖因子である、請求の範囲４２項記載のキット。 ４５．増殖因子が、表皮増殖因子である、請求の範囲４２項記載のキット。 ４６．神経増殖因子が、水性バッファー溶液又は生理的溶液として存在する、請 求の範囲４４項記載のキット。 ４７．神経増殖因子が、凍結された形態で存在する、請求の範囲４４項記載のキ ット。 ４８．（ｃ）水性バッファー溶液又は生理的溶液として存在する、工程（ｂ）で 使用されるものとは異なる増殖因子を含む１以上の容器手段を更に含む、請求の 範囲４２項記載のキット。 ４９．（ｃ）水性バッファー溶液又は生理的溶液として存在する、工程（ｂ）で 使用されるものとは異なる増殖因子を含む１以上の容器手段を更に含む、請求の 範囲４２項記載のキット。 ５０．請求の範囲４１項記載の薬理学的組成物の効果的量を、それらを必要とす る患者に投与する事を含むアミロイドーシスの治療方法。 ５１．（ａ）β／Ａ４アミロイドアンチセンスオリゴの効果的量を、それらを必 要とする患者に投与する事、 （ｂ）該患者における神経栄養効果を刺激する為に、中枢神経系の一部又 は全部で、神経増殖因子の水準を増加させる事を含む、患者のアミロイドーシス の治療方法。 ５２．神経増殖因子の水準が、大脳内部位へのＮＧＦ産生細胞のグラフト化によ って増加される、請求の範囲５１項記載の方法。 ５３．神経増殖因子の水準が、非分割神経又は腺細胞中に、神経増殖因子の産生 に必要な遺伝子を移入させる事によって増加される、請求の範囲５１項記載の方 法。 ５４．神経増殖因子の水準が、大脳内神経増殖因子注入によって増加される、請 求の範囲５１項記載の方法。 ５５．神経増殖因子の水準が、緩行性生分解性インプラントの移植によって増加 される、請求の範囲５１項記載の方法。 ５６．神経増殖因子の水準が、血液脳関門横断担体媒介移動によって増加される 、請求の範囲５１項記載の方法。 ５７．β／Ａ４アミロイドペプチドにより細胞にもたらされる有害な作用の治療 における候補のアンチセンスオリゴヌクレオチド効果をスクリーニングする為の アッセイであって、 （ａ）哺乳類の神経細胞培養物の幾つかの容器をプレート化し、 （ｂ）工程（ａ）でプレート化した容器に、種々の濃度の異なるβ／Ａ４ア ンチセンスオリゴヌクレオチドを添加してテストサンプルを作り、 （ｃ）工程（ａ）でプレート化した容器に、オリゴヌクレオチド無し又はナ ンセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを添加して対照サンプルを作り、 （ｄ）このテストサンプルと対照サンプルを、標識化メチオニンと共に約６ 〜約２４時間培養し、 （ｅ）各容器から上澄み液を回収し、 （ｆ）各容器からの上澄み液を、タンパク質Ａセファロース（ＰＡＳ）と接 触させてＰＡＳ−アミロイド複合体を形成し、 （ｇ）ＰＡＳ−アミロイド複合体を、ベータ−アミロイドに対する抗体と接 触させてＰＡＳ−アミロイド−抗体複合体を形成し、 （ｈ）アクリルアミドゲル上でＰＡＳ−アミロイド−抗体複合体を、電気泳 動によって分離して、各細胞培養物に相当するＰＡＳ−アミロイド−抗体複合体 のバンドを形成し、 （ｉ）バンド中に存在する４．３ＫＤベータ−アミロイドの水準を濃度計で 決定し、 （ｊ）テストサンプル中に存在する４．３ＫＤベータ−アミロイドの水準を 、対照サンプルと比較し、それによって前記細胞におけるアミロイドの産生を減 少させるβ／Ａ４アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を決定し、 （ｋ）アミロイド産生を減少させるのに最も効果のあるオリゴヌクレオチド を工程（ｊ）から選択し、 （ｌ）神経細胞の増殖と分化を刺激する増殖因子で処理された哺乳動物の神 経細胞に対する、工程（ｊ）から選択されたオリゴヌクレオチドの添加効果を決 定し、 （ｍ）前記増殖因子の栄養効果を抑制しない、工程（ｌ）からのオリゴヌク レオチドを選択する、 ことを含むアッセイ。 ５８．増殖因子が、神経増殖因子である、請求の範囲５７項記載のアッセイ。 ５９．神経増殖因子が、人間の神経増殖因子である、請求の範囲５８項記載のア ッセイ。 ６０．神経増殖因子が、ねずみ科の神経増殖因子である、請求の範囲５８項記載 のアッセイ。 ６１．神経増殖因子が、表皮増殖因子である、請求の範囲５７項記載のアッセイ 。 ６２．神経増殖因子が、人間の表皮増殖因子である、請求の範囲６１項記載のア ッセイ。 ６３．神経増殖因子が、ねずみ科の表皮増殖因子である、請求の範囲６１項記載 のアッセイ。 ６４．該哺乳動物の神経細胞株がＰＣ１２である、請求の範囲５７項記載のアッ セイ。 ６５．該哺乳動物の神経細胞株がＩＭＲ−３２である、請求の範囲５７項記載の アッセイ。