JPH06329551A - アルツハイマー病の予防または治療薬およびそのスクリーニング方法 - Google Patents
アルツハイマー病の予防または治療薬およびそのスクリーニング方法Info
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- JPH06329551A JPH06329551A JP5191246A JP19124693A JPH06329551A JP H06329551 A JPH06329551 A JP H06329551A JP 5191246 A JP5191246 A JP 5191246A JP 19124693 A JP19124693 A JP 19124693A JP H06329551 A JPH06329551 A JP H06329551A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tpki
- alzheimer
- therapeutic agent
- disease
- cells
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 タウプロテインキナーゼＩに対し阻害作用を
有する物質を有効成分とするアルツハイマー病の予防ま
たは治療薬、タウプロテインキナーゼＩのＤＮＡまたは
ｍＲＮＡとハイブリタイズ可能なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを有効成分とするアルツハイマー病の予防ま
たは治療薬、並びに、アルツハイマー病の予防または治
療薬として有効であると推定される薬剤、神経細胞およ
びアミロイドβプロテインをインキュベートし、該神経
細胞の細胞死が阻止されれば該薬剤がアルツハイマー病
の予防または治療薬として有効であると判定する、アル
ツハイマー病の予防または治療薬のスクリーニング方
法。 【効果】 本発明のアルツハイマー病の予防および治療
薬によればアミロイドβプロテインによるタウプロテイ
ンキナ−ゼＩのリン酸化活性を抑制することにより、脳
神経細胞死を阻止することができる。さらにその機構を
利用してアルツハイマ−病の予防又は治療薬のスクリー
ニングを行うことが可能である。
有する物質を有効成分とするアルツハイマー病の予防ま
たは治療薬、タウプロテインキナーゼＩのＤＮＡまたは
ｍＲＮＡとハイブリタイズ可能なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを有効成分とするアルツハイマー病の予防ま
たは治療薬、並びに、アルツハイマー病の予防または治
療薬として有効であると推定される薬剤、神経細胞およ
びアミロイドβプロテインをインキュベートし、該神経
細胞の細胞死が阻止されれば該薬剤がアルツハイマー病
の予防または治療薬として有効であると判定する、アル
ツハイマー病の予防または治療薬のスクリーニング方
法。 【効果】 本発明のアルツハイマー病の予防および治療
薬によればアミロイドβプロテインによるタウプロテイ
ンキナ−ゼＩのリン酸化活性を抑制することにより、脳
神経細胞死を阻止することができる。さらにその機構を
利用してアルツハイマ−病の予防又は治療薬のスクリー
ニングを行うことが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアルツハイマー病の予防
または治療薬およびそのスクリーニング方法に存し、詳
しくはタウプロテインキナーゼＩ阻害剤を用いたアルツ
ハイマー病の予防または治療薬およびアミロイドβプロ
テインを利用したアルツハイマー病の予防または治療薬
のスクリーニング方法に関するものである。
または治療薬およびそのスクリーニング方法に存し、詳
しくはタウプロテインキナーゼＩ阻害剤を用いたアルツ
ハイマー病の予防または治療薬およびアミロイドβプロ
テインを利用したアルツハイマー病の予防または治療薬
のスクリーニング方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマ−病は初老期(45〜65才)に
発病する進行性の痴呆で、病的な変化として神経細胞の
変質及び神経細胞数の減少による大脳皮質の萎縮が認め
られ、また病理学的には、脳内に多数の老人斑と神経原
線維変化が認められる。65才以上の老年期に発症する自
然老化による老年痴呆も、病理学的に何等本質的差は認
められないのでアルツハイマ−型老年痴呆と呼ばれてい
る。この疾患の患者数は、高齢者人口の増加と共に増大
し社会的に重要な疾患となっている。しかし、この疾患
の原因については諸説あるものの結果的には未だ不明で
あり早期の解明が望まれている。
発病する進行性の痴呆で、病的な変化として神経細胞の
変質及び神経細胞数の減少による大脳皮質の萎縮が認め
られ、また病理学的には、脳内に多数の老人斑と神経原
線維変化が認められる。65才以上の老年期に発症する自
然老化による老年痴呆も、病理学的に何等本質的差は認
められないのでアルツハイマ−型老年痴呆と呼ばれてい
る。この疾患の患者数は、高齢者人口の増加と共に増大
し社会的に重要な疾患となっている。しかし、この疾患
の原因については諸説あるものの結果的には未だ不明で
あり早期の解明が望まれている。
【０００３】アルツハイマ−病及びアルツハイマ−型老
年痴呆に特徴的な二つの病理変化の出現量は、知能障害
の程度とよく相関することが知られている。そこで、こ
の二つの病理変化を生ずる不溶性の蓄積物質を分子レベ
ルで解明し、この疾患の病因に到達しようとする研究が
1980年代の前半頃から行われてきた。
年痴呆に特徴的な二つの病理変化の出現量は、知能障害
の程度とよく相関することが知られている。そこで、こ
の二つの病理変化を生ずる不溶性の蓄積物質を分子レベ
ルで解明し、この疾患の病因に到達しようとする研究が
1980年代の前半頃から行われてきた。
【０００４】この病理変化の一つである老人斑の主要成
分がアミロイドβプロテイン（以下「ＡβＰ」と略する
こともある）であることが解明されている[Annu.Rev.Ne
urosci.12,463-490(1989)]。また、もう一つの病理変化
である神経原線維変化は、神経細胞内にＰＨＦ(ペア−
ド・ヘリカル・フィラメント：paired helical filamen
t)と呼ばれる二重らせん状の繊維状物質が蓄積してくる
ものであり、近年、その構成成分として脳に特異的な微
小管付随蛋白質の一種であるタウ蛋白質とユビキチンと
が同定されている[J.Biochem.,99,1807-1810(1986);Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,83,4913-4917(1986)]。
分がアミロイドβプロテイン（以下「ＡβＰ」と略する
こともある）であることが解明されている[Annu.Rev.Ne
urosci.12,463-490(1989)]。また、もう一つの病理変化
である神経原線維変化は、神経細胞内にＰＨＦ(ペア−
ド・ヘリカル・フィラメント：paired helical filamen
t)と呼ばれる二重らせん状の繊維状物質が蓄積してくる
ものであり、近年、その構成成分として脳に特異的な微
小管付随蛋白質の一種であるタウ蛋白質とユビキチンと
が同定されている[J.Biochem.,99,1807-1810(1986);Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,83,4913-4917(1986)]。
【０００５】そして、アルツハイマ−病は、脳神経細胞
内にアミロイドβプロテインが異常に蓄積し、これがＰ
ＨＦの形成と連繋して神経細胞の死を招くものと考えら
れている。タウ蛋白質は、通常SDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分子量48〜65 kd)に数本のバンドを形成
する一群の近縁蛋白質であり微小管の形成を推進する。
アルツハイマ−病脳のＰＨＦ中に組み込まれたタウ蛋白
質は、通常のタウ蛋白質よりも異常にリン酸化されてい
ることが、ＰＨＦに対するポリクロ−ナル抗体[抗ptau:
J.Biochem.,99,1807-1810(1986)]や、タウ蛋白質に対す
るモノクロ−ナル抗体[tau-1抗体:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,83,4913-4917(1986)]を用いて証明されている。
内にアミロイドβプロテインが異常に蓄積し、これがＰ
ＨＦの形成と連繋して神経細胞の死を招くものと考えら
れている。タウ蛋白質は、通常SDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分子量48〜65 kd)に数本のバンドを形成
する一群の近縁蛋白質であり微小管の形成を推進する。
アルツハイマ−病脳のＰＨＦ中に組み込まれたタウ蛋白
質は、通常のタウ蛋白質よりも異常にリン酸化されてい
ることが、ＰＨＦに対するポリクロ−ナル抗体[抗ptau:
J.Biochem.,99,1807-1810(1986)]や、タウ蛋白質に対す
るモノクロ−ナル抗体[tau-1抗体:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,83,4913-4917(1986)]を用いて証明されている。
【０００６】この異常なリン酸化を触媒する酵素が単離
され、タウプロテインキナ−ゼＩ(以下「ＴＰＫＩ」と
略記することもある)と命名され、その理化学的性質が
解明されている[生化学,第64巻,第5号,308頁,(1992)]。
更に、ＴＰＫＩの部分アミノ酸配列に基づいてラット大
脳皮質ｃＤＮＡライブラリ−からラットＴＰＫＩのｃＤ
ＮＡがクロ−ニングされ、その塩基配列が決定されると
共にアミノ酸配列が推定された(特願平4-177241号)。そ
の結果、このラットＴＰＫＩの一次構造がラットＧＳＫ
-３β(グリコ−ゲン・シンタ−ゼ・キナ−ゼ ３β)とし
て知られる酵素の一次構造と一致することが確認されて
いる[EMBO J.,9,2431-2438(1990)]。
され、タウプロテインキナ−ゼＩ(以下「ＴＰＫＩ」と
略記することもある)と命名され、その理化学的性質が
解明されている[生化学,第64巻,第5号,308頁,(1992)]。
更に、ＴＰＫＩの部分アミノ酸配列に基づいてラット大
脳皮質ｃＤＮＡライブラリ−からラットＴＰＫＩのｃＤ
ＮＡがクロ−ニングされ、その塩基配列が決定されると
共にアミノ酸配列が推定された(特願平4-177241号)。そ
の結果、このラットＴＰＫＩの一次構造がラットＧＳＫ
-３β(グリコ−ゲン・シンタ−ゼ・キナ−ゼ ３β)とし
て知られる酵素の一次構造と一致することが確認されて
いる[EMBO J.,9,2431-2438(1990)]。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アルツハイ
マ−病の脳に特異的に見られる、アミロイドβプロテイ
ン及びＰＨＦの蓄積と神経細胞死との関連を解明し、ア
ルツハイマ−病因の解明、更には、これを予防又は治療
する薬物の探索への応用を意図するものである。
マ−病の脳に特異的に見られる、アミロイドβプロテイ
ン及びＰＨＦの蓄積と神経細胞死との関連を解明し、ア
ルツハイマ−病因の解明、更には、これを予防又は治療
する薬物の探索への応用を意図するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の目標
を達成するため検討中のところ、脳神経細胞にアミロイ
ドβプロテインを作用させると、ＴＰＫＩの活性が著る
しく増大してアルツハイマ−病脳のＰＨＦ中に認められ
る異常にリン酸化されたタウ蛋白質が表われ、また神経
細胞が死滅すること、並びに上記ＴＰＫＩ活性の増大及
び脳神経細胞の死滅はＴＰＫＩのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを作用させることによって抑制されることを
確認した。
を達成するため検討中のところ、脳神経細胞にアミロイ
ドβプロテインを作用させると、ＴＰＫＩの活性が著る
しく増大してアルツハイマ−病脳のＰＨＦ中に認められ
る異常にリン酸化されたタウ蛋白質が表われ、また神経
細胞が死滅すること、並びに上記ＴＰＫＩ活性の増大及
び脳神経細胞の死滅はＴＰＫＩのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを作用させることによって抑制されることを
確認した。
【０００９】本発明は上記の知見に基づいて更に検討を
重ねた結果達成されたものであり、その要旨は、タウプ
ロテインキナーゼＩに対し阻害作用を有する物質を有効
成分とするアルツハイマー病の予防または治療薬、タウ
プロテインキナーゼＩのＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブ
リタイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効
成分とするアルツハイマー病の予防または治療薬、およ
び、アルツハイマー病の予防または治療薬として有効で
あると推定される薬剤、神経細胞およびアミロイドβプ
ロテインをインキュベートし、該神経細胞の細胞死が阻
止されれば該薬剤がアルツハイマー病の予防または治療
薬として有効であると判定する、アルツハイマー病の予
防または治療薬のスクリーニング方法に存する。
重ねた結果達成されたものであり、その要旨は、タウプ
ロテインキナーゼＩに対し阻害作用を有する物質を有効
成分とするアルツハイマー病の予防または治療薬、タウ
プロテインキナーゼＩのＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブ
リタイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効
成分とするアルツハイマー病の予防または治療薬、およ
び、アルツハイマー病の予防または治療薬として有効で
あると推定される薬剤、神経細胞およびアミロイドβプ
ロテインをインキュベートし、該神経細胞の細胞死が阻
止されれば該薬剤がアルツハイマー病の予防または治療
薬として有効であると判定する、アルツハイマー病の予
防または治療薬のスクリーニング方法に存する。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいてタウプロテインキナーゼＩ（以下「ＴＰＫＩ」と
略記することもある）に対し阻害作用を有する物質とし
ては、該物質を神経細胞およびアミロイドβプロテイン
とともにインキュベートした際に、該神経細胞の細胞死
を阻止する作用を有する物質であれば良く、化学的に合
成された物質、微生物の菌体から抽出された物質等が挙
げられる。また、本発明においてはＴＰＫＩのＤＮＡま
たはｍＲＮＡとハイブリタイズ可能なアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（以下「ＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌ
クレオチド」と略記することもある）をアルツハイマー
病の予防または治療に使用する。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、蛋白質合成を遺伝子レベルで抑制できる
ため、近年、病因となる蛋白質の合成阻害剤として医療
分野で注目されている。その原理は、アンチセンスＲＮ
Ａ又はアンチセンスＤＮＡがセンス配列のｍＲＮＡと塩
基対を形成することにより遺伝情報の流れを遮断し、最
終産物である蛋白質の合成を阻害することにある[医学
のあゆみ,Vol.162,No.13,909-911(1992)]。
おいてタウプロテインキナーゼＩ（以下「ＴＰＫＩ」と
略記することもある）に対し阻害作用を有する物質とし
ては、該物質を神経細胞およびアミロイドβプロテイン
とともにインキュベートした際に、該神経細胞の細胞死
を阻止する作用を有する物質であれば良く、化学的に合
成された物質、微生物の菌体から抽出された物質等が挙
げられる。また、本発明においてはＴＰＫＩのＤＮＡま
たはｍＲＮＡとハイブリタイズ可能なアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（以下「ＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌ
クレオチド」と略記することもある）をアルツハイマー
病の予防または治療に使用する。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、蛋白質合成を遺伝子レベルで抑制できる
ため、近年、病因となる蛋白質の合成阻害剤として医療
分野で注目されている。その原理は、アンチセンスＲＮ
Ａ又はアンチセンスＤＮＡがセンス配列のｍＲＮＡと塩
基対を形成することにより遺伝情報の流れを遮断し、最
終産物である蛋白質の合成を阻害することにある[医学
のあゆみ,Vol.162,No.13,909-911(1992)]。
【００１１】本法に適用されるＴＰＫＩアンチセンスオ
リゴヌクレオチドとしてはＴＰＫＩのＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡとハイブリタイズ可能であって、転写の阻害、pre-
ｍＲＮＡのスプライシングの阻害、ｍＲＮＡ核膜透過の
阻害、翻訳の阻害等によりＴＰＫＩの合成を阻害する配
列を有するものであればよく、通常15〜30個程度のもの
が用いられる。具体的には、例えば、前記のEMBO J.,9,
2431-2438(1990)に記載されているラットＧＳＫ-３βの
一次構造(ＴＰＫＩの一次構造と同一)におけるＴＰＫＩ
の翻訳開始領域の最初の6アミノ酸残基:Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇに対応するＴＰＫＩセン
スオリゴヌクレオチド鎖：５'−ＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＣＣＧＡＧＡ−３’（配列表の配列番号２）と相補
的なＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖：５'
−ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＣＣＧＡＣＡＴ−３’（配列
表の配列番号３）や特願平５−４１１６０号（平成５年
３月２日出願）に記載されているヒトＴＰＫＩの一次構
造におけるＴＰＫＩの翻訳開始領域の最初の6アミノ酸
残基：Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇに
対応するＴＰＫＩセンスオリゴヌクレオチド鎖：５'−
ＡＴＧＴＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡ−３’（配列表
の配列番号４）と相補的なＴＰＫＩアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド鎖：５'−ＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧ
ＡＣＡＴ−３’（配列表の配列番号５）等が用いられ
る。
リゴヌクレオチドとしてはＴＰＫＩのＤＮＡまたはｍＲ
ＮＡとハイブリタイズ可能であって、転写の阻害、pre-
ｍＲＮＡのスプライシングの阻害、ｍＲＮＡ核膜透過の
阻害、翻訳の阻害等によりＴＰＫＩの合成を阻害する配
列を有するものであればよく、通常15〜30個程度のもの
が用いられる。具体的には、例えば、前記のEMBO J.,9,
2431-2438(1990)に記載されているラットＧＳＫ-３βの
一次構造(ＴＰＫＩの一次構造と同一)におけるＴＰＫＩ
の翻訳開始領域の最初の6アミノ酸残基:Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇに対応するＴＰＫＩセン
スオリゴヌクレオチド鎖：５'−ＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＣＣＧＡＧＡ−３’（配列表の配列番号２）と相補
的なＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖：５'
−ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＣＣＧＡＣＡＴ−３’（配列
表の配列番号３）や特願平５−４１１６０号（平成５年
３月２日出願）に記載されているヒトＴＰＫＩの一次構
造におけるＴＰＫＩの翻訳開始領域の最初の6アミノ酸
残基：Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇに
対応するＴＰＫＩセンスオリゴヌクレオチド鎖：５'−
ＡＴＧＴＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＡ−３’（配列表
の配列番号４）と相補的なＴＰＫＩアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド鎖：５'−ＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧ
ＡＣＡＴ−３’（配列表の配列番号５）等が用いられ
る。
【００１２】上記のＴＰＫＩセンスオリゴヌクレオチド
及びＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレオチドは市販の
自動ＤＮＡ合成機を用いて容易に合成することができ
る。なお、本発明のＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは前述したようにＴＰＫＩのＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａとハイブリタイズ可能であれば上記の配列のみに特に
制限はされず、ハイブリッド形成能を損なわない範囲に
おいて一部の配列を任意の塩基に置換しても差し支えな
い。また、Science, 259, 373-377(1993)に記載の、血
液脳関門を通過するような改変または修飾を施したアン
チセンスオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれ
る。
及びＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレオチドは市販の
自動ＤＮＡ合成機を用いて容易に合成することができ
る。なお、本発明のＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは前述したようにＴＰＫＩのＤＮＡまたはｍＲＮ
Ａとハイブリタイズ可能であれば上記の配列のみに特に
制限はされず、ハイブリッド形成能を損なわない範囲に
おいて一部の配列を任意の塩基に置換しても差し支えな
い。また、Science, 259, 373-377(1993)に記載の、血
液脳関門を通過するような改変または修飾を施したアン
チセンスオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に含まれ
る。
【００１３】上記のＴＰＫＩに対し阻害作用を有する物
質またはＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレオチドをア
ルツハイマー病の予防または治療薬として用いる場合、
通常の担体とともに投与経路に応じた製剤とする事が出
来る。例えば、経口投与では錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、液剤等の形態に調剤される。経口投与用固形
製剤に調製するに当たり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢
剤、その他着色剤、崩壊剤等を用いることができる。賦
形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステ
アリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アル
ギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられ、結合剤
としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、
エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等
が挙げられ、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウ
ム、タルク等が挙げられる。その他、着色剤、崩壊剤も
通常公知のものを用いることができる。なお錠剤は周知
の方法によりコーティングしてもよい。また液状製剤は
水性または油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル
剤、その他であってよく、通常用いられる方法にて調製
される。注射剤を調製する場合は本発明化合物にｐＨ調
整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤、局所麻酔剤等を添加
し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造す
ることができる。坐剤を製造する際の基剤としては、例
えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ウイテプゾー
ル（登録商標ダイナマイトノーベル社）等の油脂性基剤
を用いることができる。
質またはＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレオチドをア
ルツハイマー病の予防または治療薬として用いる場合、
通常の担体とともに投与経路に応じた製剤とする事が出
来る。例えば、経口投与では錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、液剤等の形態に調剤される。経口投与用固形
製剤に調製するに当たり、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢
剤、その他着色剤、崩壊剤等を用いることができる。賦
形剤としては、例えば、乳糖、デンプン、タルク、ステ
アリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アル
ギン酸ナトリウム、アラビアゴム等が挙げられ、結合剤
としてはポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、
エチルセルロース、アラビアゴム、シエラック、白糖等
が挙げられ、滑沢剤としてはステアリン酸マグネシウ
ム、タルク等が挙げられる。その他、着色剤、崩壊剤も
通常公知のものを用いることができる。なお錠剤は周知
の方法によりコーティングしてもよい。また液状製剤は
水性または油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル
剤、その他であってよく、通常用いられる方法にて調製
される。注射剤を調製する場合は本発明化合物にｐＨ調
整剤、緩衝剤、安定化剤、等張剤、局所麻酔剤等を添加
し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造す
ることができる。坐剤を製造する際の基剤としては、例
えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、ウイテプゾー
ル（登録商標ダイナマイトノーベル社）等の油脂性基剤
を用いることができる。
【００１４】かくして調製される製剤の投与量は患者の
症状、体重、年齢等によって異なり、一様に決定するこ
とは出来ないが、通常成人１日当たり本発明化合物を約
１−１０００ｍｇの範囲となる量とするのがよく、これ
は通常１日１−４回に分けて投与されるのが好ましい。
また場合により、投与は１回／１日〜数日あるいはそれ
以上の間隔で投与することも可能である。本発明で使用
される神経細胞としては、哺乳動物から採取した脳神経
細胞の他、脳神経細胞のセルラインに対し、ＮＧＦ（神
経成長・栄養因子）、ＩＧＦ（インシュリン様成長因
子）等の成長因子で誘導をかけて神経突起を伸展させた
ものが挙げられる。前者としては、哺乳動物、例えばラ
ットの海馬の組織を摘出し、完全培地中で培養した培養
液が用いられる。後者としては、ＮＧＦ、ＦＧＦ（繊維
芽細胞因子）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、インター
ロイキン ６等で誘導をかけたＰＣ１２細胞（Annu. Re
v. Pharmacol. Toxicol., 31, 205-228(1991))、ＩＧＦ
で誘導をかけたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（The Journal of C
ell Biology, 102, 1949-1954(1986))のほか、Cell Cul
ture in the Neurosciences, New York:Plenum Press,
p95-123(1985)に記載の、ＮＧＦで誘導をかけたＭＪＢ
細胞、ＮＭＢ細胞、ＮＧＰ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−ＳＹ
５Ｙ細胞、ＬＡＮ−１細胞、ＫＡ−９細胞、ＩＭＲ−３
２細胞、５−ブロモデオキシウリジンで誘導をかけたＩ
ＭＲ−３２細胞、ＮＭＢ細胞、ＮＧＰ細胞等が挙げられ
る。アミロイドβプロテインは、アルツハイマ−病の老
人斑の主要成分であって、下記43個のアミノ酸残基のペ
プチドから構成されることが知られている[Science250,
279-282(1990)及びProc.Natl.Acad.Sci.USA 87,9020-90
23(1990)]。
症状、体重、年齢等によって異なり、一様に決定するこ
とは出来ないが、通常成人１日当たり本発明化合物を約
１−１０００ｍｇの範囲となる量とするのがよく、これ
は通常１日１−４回に分けて投与されるのが好ましい。
また場合により、投与は１回／１日〜数日あるいはそれ
以上の間隔で投与することも可能である。本発明で使用
される神経細胞としては、哺乳動物から採取した脳神経
細胞の他、脳神経細胞のセルラインに対し、ＮＧＦ（神
経成長・栄養因子）、ＩＧＦ（インシュリン様成長因
子）等の成長因子で誘導をかけて神経突起を伸展させた
ものが挙げられる。前者としては、哺乳動物、例えばラ
ットの海馬の組織を摘出し、完全培地中で培養した培養
液が用いられる。後者としては、ＮＧＦ、ＦＧＦ（繊維
芽細胞因子）、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、インター
ロイキン ６等で誘導をかけたＰＣ１２細胞（Annu. Re
v. Pharmacol. Toxicol., 31, 205-228(1991))、ＩＧＦ
で誘導をかけたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（The Journal of C
ell Biology, 102, 1949-1954(1986))のほか、Cell Cul
ture in the Neurosciences, New York:Plenum Press,
p95-123(1985)に記載の、ＮＧＦで誘導をかけたＭＪＢ
細胞、ＮＭＢ細胞、ＮＧＰ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−ＳＹ
５Ｙ細胞、ＬＡＮ−１細胞、ＫＡ−９細胞、ＩＭＲ−３
２細胞、５−ブロモデオキシウリジンで誘導をかけたＩ
ＭＲ−３２細胞、ＮＭＢ細胞、ＮＧＰ細胞等が挙げられ
る。アミロイドβプロテインは、アルツハイマ−病の老
人斑の主要成分であって、下記43個のアミノ酸残基のペ
プチドから構成されることが知られている[Science250,
279-282(1990)及びProc.Natl.Acad.Sci.USA 87,9020-90
23(1990)]。
【００１５】アミロイドβプロテインのアミノ酸配列
（配列表の配列番号１）：Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈ
ｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＴｙｒＧｌｕ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｐｈｅ ＰｈｅＡｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＡｌａＩｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａ
ｌＩｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ
（配列表の配列番号１）：Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈ
ｅ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＴｙｒＧｌｕ
Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｐｈｅ ＰｈｅＡｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ＡｌａＩｌｅ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａ
ｌＩｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ
【００１６】以下、本発明の一例として、ラット海馬細
胞を用い、これに所定量のアミロイドβプロテイン(以
下「ＡβＰ」と略記する)、比較対照物質としてのＴＰ
ＫＩセンスオリゴヌクレオチド(以下「ＴＰＫＩ−セン
ス」と略記する)及びＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌク
レオチド(以下「ＴＰＫＩ−アンチセンス」と略記する)
を所定の条件下で作用させた場合における海馬細胞の挙
動並びにＴＰＫＩのリン酸化活性について、更に詳細に
説明する。本発明をアルツハイマー病の予防および治療
薬のスクリーニング方法として実施する場合は、神経細
胞としてラット海馬細胞を使用し、アルツハイマー病の
予防または治療薬であると推定される薬剤としてＴＰＫ
Ｉ−センスまたはＴＰＫＩ−アンチセンスを使用する。
胞を用い、これに所定量のアミロイドβプロテイン(以
下「ＡβＰ」と略記する)、比較対照物質としてのＴＰ
ＫＩセンスオリゴヌクレオチド(以下「ＴＰＫＩ−セン
ス」と略記する)及びＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌク
レオチド(以下「ＴＰＫＩ−アンチセンス」と略記する)
を所定の条件下で作用させた場合における海馬細胞の挙
動並びにＴＰＫＩのリン酸化活性について、更に詳細に
説明する。本発明をアルツハイマー病の予防および治療
薬のスクリーニング方法として実施する場合は、神経細
胞としてラット海馬細胞を使用し、アルツハイマー病の
予防または治療薬であると推定される薬剤としてＴＰＫ
Ｉ−センスまたはＴＰＫＩ−アンチセンスを使用する。
【００１７】海馬細胞の培養液に、所定量のＴＰＫＩ−
アンチセンスを所定温度で加え、次いで所定量のＡβＰ
を添加して所定の温度に保持し、時間の経過に伴う生存
細胞数を後記実施例に示す方法により測定した。比較の
ため、ＡβＰのみを添加して同様に処理した場合、及び
ＴＰＫＩ−センスとＡβＰとを添加して同様に処理した
場合について生存細胞数を測定した。その結果、ＴＰＫ
Ｉ−アンチセンスとＡβＰを添加した場合の生存細胞数
は、後記実施例に示すように、ＡβＰのみを添加した場
合及びＴＰＫＩ−センスとＡβＰを添加した場合の生存
細胞数に比較して著しく大きく、ＴＰＫＩ−アンチセン
スがＡβＰによる細胞死を阻止する作用を有することを
示した。
アンチセンスを所定温度で加え、次いで所定量のＡβＰ
を添加して所定の温度に保持し、時間の経過に伴う生存
細胞数を後記実施例に示す方法により測定した。比較の
ため、ＡβＰのみを添加して同様に処理した場合、及び
ＴＰＫＩ−センスとＡβＰとを添加して同様に処理した
場合について生存細胞数を測定した。その結果、ＴＰＫ
Ｉ−アンチセンスとＡβＰを添加した場合の生存細胞数
は、後記実施例に示すように、ＡβＰのみを添加した場
合及びＴＰＫＩ−センスとＡβＰを添加した場合の生存
細胞数に比較して著しく大きく、ＴＰＫＩ−アンチセン
スがＡβＰによる細胞死を阻止する作用を有することを
示した。
【００１８】また、細胞培養液に、ＴＰＫＩ−アンチセ
ンスとＡβＰを添加して24時間保持した場合、ＡβＰの
みを添加して同時間保持した場合、並びにＴＰＫＩ−セ
ンスとＡβＰを添加して同時間保持した場合の試料の位
相差顕微鏡(倍率:400倍)による観察結果では、ＴＰＫＩ
−アンチセンスを作用させた場合のみがＡβＰによる細
胞毒性が少なくコントロ−ルに近似していることが判明
した。
ンスとＡβＰを添加して24時間保持した場合、ＡβＰの
みを添加して同時間保持した場合、並びにＴＰＫＩ−セ
ンスとＡβＰを添加して同時間保持した場合の試料の位
相差顕微鏡(倍率:400倍)による観察結果では、ＴＰＫＩ
−アンチセンスを作用させた場合のみがＡβＰによる細
胞毒性が少なくコントロ−ルに近似していることが判明
した。
【００１９】更に細胞培養液に、上記と同様にＡβＰの
みを添加して保持した場合、及びＴＰＫＩ−アンチセン
スとＡβＰを添加して保持した場合について、24時間後
のＴＰＫＩによるタウ蛋白質のリン酸化活性を、後記実
施例に示す方法により測定した。その結果、ＴＰＫＩ−
アンチセンスとＡβＰを添加した場合におけるＴＰＫＩ
のリン酸化活性は、後記実施例に示すように、ＡβＰの
みを添加した場合のリン酸化活性の約半分であり、ＴＰ
ＫＩ−アンチセンスが、ＴＰＫＩのリン酸化活性を抑制
する作用を有することを示した。以上の結果より、本発
明をアルツハイマー病の予防および治療薬のスクリーニ
ング方法として実施する場合は、ＴＰＫＩ−アンチセン
スは該予防および治療薬として有効であると判定するこ
とができる。なお、ＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレ
オチド以外の薬剤の有効性も同様にして判定できる。
みを添加して保持した場合、及びＴＰＫＩ−アンチセン
スとＡβＰを添加して保持した場合について、24時間後
のＴＰＫＩによるタウ蛋白質のリン酸化活性を、後記実
施例に示す方法により測定した。その結果、ＴＰＫＩ−
アンチセンスとＡβＰを添加した場合におけるＴＰＫＩ
のリン酸化活性は、後記実施例に示すように、ＡβＰの
みを添加した場合のリン酸化活性の約半分であり、ＴＰ
ＫＩ−アンチセンスが、ＴＰＫＩのリン酸化活性を抑制
する作用を有することを示した。以上の結果より、本発
明をアルツハイマー病の予防および治療薬のスクリーニ
ング方法として実施する場合は、ＴＰＫＩ−アンチセン
スは該予防および治療薬として有効であると判定するこ
とができる。なお、ＴＰＫＩアンチセンスオリゴヌクレ
オチド以外の薬剤の有効性も同様にして判定できる。
【００２０】
【実施例】以下に本発明を実施例について説明するが、
本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限られ
るものではない。なお、本実施例における細胞毒性の判
定、タウ蛋白質のリン酸化の測定、並びにＡｌｚー５０
抗体による免疫組織化学は以下の方法により実施した。
また、以下の実施例は何れも別個に少なくとも3回の実
験を行ない、デ−タはそれらの平均値を示した。
本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限られ
るものではない。なお、本実施例における細胞毒性の判
定、タウ蛋白質のリン酸化の測定、並びにＡｌｚー５０
抗体による免疫組織化学は以下の方法により実施した。
また、以下の実施例は何れも別個に少なくとも3回の実
験を行ない、デ−タはそれらの平均値を示した。
【００２１】細胞毒性の判定：多くの正常で健康な細胞
の数は、位相差顕微鏡により、処理後の生存細胞の指標
としてカウントした。正常な細胞は、形態学的に平滑な
輪郭及び多数の神経細胞突起をもつ細胞を有するものと
した。一方、変成した細胞は、不規則な形状、神経突起
の変成等により判定した。なお、生存細胞数はウエル中
で数えた。標準培養液ではウエル当り400以上の細胞数
であった。この結果を免疫組織化学的手法により確認し
た。
の数は、位相差顕微鏡により、処理後の生存細胞の指標
としてカウントした。正常な細胞は、形態学的に平滑な
輪郭及び多数の神経細胞突起をもつ細胞を有するものと
した。一方、変成した細胞は、不規則な形状、神経突起
の変成等により判定した。なお、生存細胞数はウエル中
で数えた。標準培養液ではウエル当り400以上の細胞数
であった。この結果を免疫組織化学的手法により確認し
た。
【００２２】タウ蛋白質のリン酸化測定：海馬細胞は氷
冷したリン酸塩緩衝液で3回洗浄して培地から採取し
た。細胞を、ホスファタ−ゼ阻害剤(1 mM オカダ酸,生
化工業社製)、プロテア−ゼ阻害剤(1mMのフェニルメチ
ルスルホニルフロライド及び各1μg／mlのロイペプチ
ン,ペプスタチン,アプロチニン)を含有する20 mMの2-[N
-モルホリノ]エタンスルホン酸、0.5 mMの酢酸マグネシ
ウム及び1 mMのEGTAを含有するpH 6.8の緩衝液Ａ中に懸
濁してホモジナイズし14000 gで1時間遠心し、上清をリ
ン酸化の検定に用いた。
冷したリン酸塩緩衝液で3回洗浄して培地から採取し
た。細胞を、ホスファタ−ゼ阻害剤(1 mM オカダ酸,生
化工業社製)、プロテア−ゼ阻害剤(1mMのフェニルメチ
ルスルホニルフロライド及び各1μg／mlのロイペプチ
ン,ペプスタチン,アプロチニン)を含有する20 mMの2-[N
-モルホリノ]エタンスルホン酸、0.5 mMの酢酸マグネシ
ウム及び1 mMのEGTAを含有するpH 6.8の緩衝液Ａ中に懸
濁してホモジナイズし14000 gで1時間遠心し、上清をリ
ン酸化の検定に用いた。
【００２３】遺伝子組換によりE.coli BL21中で発現さ
せたラットタウ蛋白質をJ.Biol.Chem.267,10897-10901
(1992)に記載の方法により精製した。1μlの海馬細胞抽
出物を、1 mMの[γ-32P]ATP(10-20 Ci／mmol)を含む緩
衝液Ａに溶解したラットタウ蛋白質(400μg／ml)の溶液
に添加し、これに10μMのオカダ酸を加えて最終的に10
μlとした。37℃で3時間インキュベ−トした後、電気泳
動用緩衝液を加えて反応を停止した。10％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動後、タウ蛋白質中の32Pをレ−ザ−
イメ−ジ分析機(Fuji BAS 2000)で観察した。
せたラットタウ蛋白質をJ.Biol.Chem.267,10897-10901
(1992)に記載の方法により精製した。1μlの海馬細胞抽
出物を、1 mMの[γ-32P]ATP(10-20 Ci／mmol)を含む緩
衝液Ａに溶解したラットタウ蛋白質(400μg／ml)の溶液
に添加し、これに10μMのオカダ酸を加えて最終的に10
μlとした。37℃で3時間インキュベ−トした後、電気泳
動用緩衝液を加えて反応を停止した。10％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動後、タウ蛋白質中の32Pをレ−ザ−
イメ−ジ分析機(Fuji BAS 2000)で観察した。
【００２４】Ａｌｚ-５０抗体による免疫組織化学：海
馬細胞の培養液をリン酸塩緩衝液中で4％パラホルムア
ルデヒドにより10分間固定した。固定した培養液を0.2
％トリトンX-100を含むトリス緩衝塩液中で30分間イン
キュベ−トして細胞を浸透し易くした。次いで、この培
養液を1:5に希釈したＡｌｚ-５０マウス モノクロ−ナ
ル一次抗体、ベクタステイン(Vectastain)ＡＢＣ アビ
ジン-ビオチン-過酸化酵素検出キット(ベクタ−ラボラ
トリ−社製)を用い、色素としてジアミノベンジジンテ
トラハイドロクロライドを用いて免疫標識した。
馬細胞の培養液をリン酸塩緩衝液中で4％パラホルムア
ルデヒドにより10分間固定した。固定した培養液を0.2
％トリトンX-100を含むトリス緩衝塩液中で30分間イン
キュベ−トして細胞を浸透し易くした。次いで、この培
養液を1:5に希釈したＡｌｚ-５０マウス モノクロ−ナ
ル一次抗体、ベクタステイン(Vectastain)ＡＢＣ アビ
ジン-ビオチン-過酸化酵素検出キット(ベクタ−ラボラ
トリ−社製)を用い、色素としてジアミノベンジジンテ
トラハイドロクロライドを用いて免疫標識した。
【００２５】実施例１ 細胞培養液の調製：ラットの海馬胚の初期培養液をBrai
n Res.126,397-425(1977)に記載の方法に準じて調製し
た。即ち、受精後18日のラット胚から海馬組織を採取
し、パパイン(プロテア−ゼ)10 U／ml中において37℃で
20分間消化した。得られた細胞を、ダルベッコ修飾イ−
グル媒地に、5％牛胎児血清、5％馬血清、インシュリン
10μg／ml、トランスフェリン0.1 mg／ml、アプロティ
ニン1μg／ml、ピルビン酸ナトリウム1 mM及びゲンタマ
イシン84μg／mlを補足した媒地中に加えた。これをポ
リ-L-リジンで被覆した組織培養ウエルに、2×105セル
／cm2の密度で播いて3日間培養し、次いで1μMのシトシ
ン-β-アラビノフラノサイドで24時間処理して培養5日
目の細胞を使用した。
n Res.126,397-425(1977)に記載の方法に準じて調製し
た。即ち、受精後18日のラット胚から海馬組織を採取
し、パパイン(プロテア−ゼ)10 U／ml中において37℃で
20分間消化した。得られた細胞を、ダルベッコ修飾イ−
グル媒地に、5％牛胎児血清、5％馬血清、インシュリン
10μg／ml、トランスフェリン0.1 mg／ml、アプロティ
ニン1μg／ml、ピルビン酸ナトリウム1 mM及びゲンタマ
イシン84μg／mlを補足した媒地中に加えた。これをポ
リ-L-リジンで被覆した組織培養ウエルに、2×105セル
／cm2の密度で播いて3日間培養し、次いで1μMのシトシ
ン-β-アラビノフラノサイドで24時間処理して培養5日
目の細胞を使用した。
【００２６】ＡβＰの調製：Science 250,279-282(199
0)及びProc.Natl.Acad.Sci.USA 87,9020-9023(1990)に
記載の方法により、前記43個のアミノ酸残基からなるＡ
βＰペプチドを合成し、精製した後、35％アセトニトリ
ルに溶解して2 mMの貯蔵溶液を調製した。
0)及びProc.Natl.Acad.Sci.USA 87,9020-9023(1990)に
記載の方法により、前記43個のアミノ酸残基からなるＡ
βＰペプチドを合成し、精製した後、35％アセトニトリ
ルに溶解して2 mMの貯蔵溶液を調製した。
【００２７】ＴＰＫＩ−センス及びＴＰＫＩ−アンチセ
ンスの調製：ラットＧＳＫ-３β[EMBO J.,9,2431-2438
(1990)]の一次構造の翻訳開始領域に対応する下記18塩
基のＴＰＫＩ−センス及びこれと相補的なＴＰＫＩ−ア
ンチセンスを自動ＤＮＡ合成機(MilliGen)を用いて合成
し、20％アクリルアミド-尿素ゲルから回収してエタノ
−ル沈澱法により精製し、沈澱物を水に溶解して1μMの
濃度に調整した。 ＴＰＫＩ−センス ：５'−ＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＣＣＧＡＧＡ−３’ ＴＰＫＩ−アンチセンス：５'−ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＣ
ＣＣＣＧＡＣＡＴ−３’
ンスの調製：ラットＧＳＫ-３β[EMBO J.,9,2431-2438
(1990)]の一次構造の翻訳開始領域に対応する下記18塩
基のＴＰＫＩ−センス及びこれと相補的なＴＰＫＩ−ア
ンチセンスを自動ＤＮＡ合成機(MilliGen)を用いて合成
し、20％アクリルアミド-尿素ゲルから回収してエタノ
−ル沈澱法により精製し、沈澱物を水に溶解して1μMの
濃度に調整した。 ＴＰＫＩ−センス ：５'−ＡＴＧＴＣＧＧＧＧＣ
ＧＡＣＣＧＡＧＡ−３’ ＴＰＫＩ−アンチセンス：５'−ＴＣＴＣＧＧＴＣＧＣ
ＣＣＣＧＡＣＡＴ−３’
【００２８】脳神経細胞死の阻止作用：前記方法で調製
した海馬細胞の培養液を用いて以下に示す(ｂ)〜(ｄ)の
処理を行ない、時間の経過に伴う生存細胞数を数え、そ
の結果を表１に示した。 (ａ)無処理培養液(コントロ−ル)。 (ｂ)細胞培養液1 mlに1μMのＴＰＫＩ−アンチセンスを
加え5分後、20μMのＡβＰを添加して37℃で24時間保持
した。 (ｃ)細胞培養液1 mlに20μMのＡβＰを加えて37℃で24
時間保持した。 (ｄ)細胞培養液1 mlに1μMのＴＰＫＩ−センスを加え5
分後、20μMのＡβＰを添加し37℃で24時間保持した。
した海馬細胞の培養液を用いて以下に示す(ｂ)〜(ｄ)の
処理を行ない、時間の経過に伴う生存細胞数を数え、そ
の結果を表１に示した。 (ａ)無処理培養液(コントロ−ル)。 (ｂ)細胞培養液1 mlに1μMのＴＰＫＩ−アンチセンスを
加え5分後、20μMのＡβＰを添加して37℃で24時間保持
した。 (ｃ)細胞培養液1 mlに20μMのＡβＰを加えて37℃で24
時間保持した。 (ｄ)細胞培養液1 mlに1μMのＴＰＫＩ−センスを加え5
分後、20μMのＡβＰを添加し37℃で24時間保持した。
【００２９】
【表１】
【００３０】表１は、上記の(ｂ)、(ｃ)及び(ｄ)の処理
の時間経過に伴う生存細胞数を示し、生存細胞数はコン
トロ−ルに対する百分率(％)で表わした。表１に示され
るように、海馬細胞にＴＰＫＩ−アンチセンス及びＡβ
Ｐを作用させた場合(ｂ)の6時間及び21時間経過後の生
存細胞数は、ＡβＰのみを作用させた場合(ｃ)及びＴＰ
ＫＩ−センスとＡβＰとを作用させた場合(ｄ)の生存細
胞数を遥かに凌駕した。この事実は、ＴＰＫＩ−アンチ
センスが、ＡβＰによる細胞死を著しく阻止する作用を
有することを明瞭に示している。また、上記(ｂ)〜(ｄ)
の37℃、24時間経過後の位相差顕微鏡(倍率:400倍)観察
では、海馬細胞にＴＰＫＩ−アンチセンス及びＡβＰを
作用させた場合(ｂ)のみがＡβＰによる細胞毒性が少な
くコントロ−ルに近似することが判明した。
の時間経過に伴う生存細胞数を示し、生存細胞数はコン
トロ−ルに対する百分率(％)で表わした。表１に示され
るように、海馬細胞にＴＰＫＩ−アンチセンス及びＡβ
Ｐを作用させた場合(ｂ)の6時間及び21時間経過後の生
存細胞数は、ＡβＰのみを作用させた場合(ｃ)及びＴＰ
ＫＩ−センスとＡβＰとを作用させた場合(ｄ)の生存細
胞数を遥かに凌駕した。この事実は、ＴＰＫＩ−アンチ
センスが、ＡβＰによる細胞死を著しく阻止する作用を
有することを明瞭に示している。また、上記(ｂ)〜(ｄ)
の37℃、24時間経過後の位相差顕微鏡(倍率:400倍)観察
では、海馬細胞にＴＰＫＩ−アンチセンス及びＡβＰを
作用させた場合(ｂ)のみがＡβＰによる細胞毒性が少な
くコントロ−ルに近似することが判明した。
【００３１】タウ蛋白質のリン酸化： 無処理細胞培養液(コントロ−ル)、細胞培養液1 ml
に1μMのＴＰＫＩ−アンチセンスを加え5分後に20μMの
ＡβＰを添加した試料、及び細胞培養液1 mlに20μM
のＡβＰを加えた試料について、前記の方法によりＴＰ
ＫＩのリン酸化活性を測定し、その結果を表２に示し
た。なお、表２におけるＴＰＫＩのリン酸化活性は、上
清中の蛋白質1 mg当りのリン酸化活性(単位／mg 蛋白
質)を表わし、一単位はレ−ザ−イメ−ジ分析機(BAS 20
00,Fuji)により測定した放射能の強度と等価である。
に1μMのＴＰＫＩ−アンチセンスを加え5分後に20μMの
ＡβＰを添加した試料、及び細胞培養液1 mlに20μM
のＡβＰを加えた試料について、前記の方法によりＴＰ
ＫＩのリン酸化活性を測定し、その結果を表２に示し
た。なお、表２におけるＴＰＫＩのリン酸化活性は、上
清中の蛋白質1 mg当りのリン酸化活性(単位／mg 蛋白
質)を表わし、一単位はレ−ザ−イメ−ジ分析機(BAS 20
00,Fuji)により測定した放射能の強度と等価である。
【００３２】
【表２】
【００３３】表２に示すように、細胞培養液にＴＰＫＩ
−アンチセンス及びＡβＰを作用させた場合のＴＰＫ
Ｉのリン酸化活性は、ＡβＰのみを作用させた場合の
リン酸化活性の約半分であり、ＴＰＫＩ−アンチセンス
が、ＡβＰによるＴＰＫＩのリン酸化活性を大幅に抑制
することが明らかである。
−アンチセンス及びＡβＰを作用させた場合のＴＰＫ
Ｉのリン酸化活性は、ＡβＰのみを作用させた場合の
リン酸化活性の約半分であり、ＴＰＫＩ−アンチセンス
が、ＡβＰによるＴＰＫＩのリン酸化活性を大幅に抑制
することが明らかである。
【００３４】
【発明の効果】本発明のアルツハイマー病の予防および
治療薬によればアミロイドβプロテインによるタウプロ
テインキナ−ゼＩのリン酸化活性を抑制することによ
り、脳神経細胞死を阻止することができる。さらにその
機構を利用してアルツハイマ−病の予防又は治療薬のス
クリーニングを行うことが可能である。
治療薬によればアミロイドβプロテインによるタウプロ
テインキナ−ゼＩのリン酸化活性を抑制することによ
り、脳神経細胞死を阻止することができる。さらにその
機構を利用してアルツハイマ−病の予防又は治療薬のス
クリーニングを行うことが可能である。
【００３５】
配列番号：１ 配列の長さ：４３ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 15 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala 20 25 30 Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40
【００３６】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGTCGGGGC GACCGAGA 18
【００３７】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCTCGGTCGC CCCGACAT 18
【００３８】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATGTCAGGGC GGCCCAGA 18
【００３９】配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TCTGGGCCGC CCTGACAT 18
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年６月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】Ａｌｚ-５０抗体による免疫組織化学：海
馬細胞の培養液をリン酸塩緩衝液中で4％パラホルムア
ルデヒドにより10分間固定した。固定した培養液を0.2
％トリトンX-100を含むトリス緩衝塩液中で30分間イン
キュベ−トして細胞を浸透し易くした。次いで、この培
養液を1:5に希釈したＡｌｚ-５０マウス モノクロ−ナ
ル一次抗体（Science,232,648-650(1986）)、ベクタス
テイン(Vectastain)ＡＢＣ アビジン-ビオチン-過酸化
酵素検出キット(ベクタ−ラボラトリ−社製)を用い、色
素としてジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド
を用いて免疫標識した。
馬細胞の培養液をリン酸塩緩衝液中で4％パラホルムア
ルデヒドにより10分間固定した。固定した培養液を0.2
％トリトンX-100を含むトリス緩衝塩液中で30分間イン
キュベ−トして細胞を浸透し易くした。次いで、この培
養液を1:5に希釈したＡｌｚ-５０マウス モノクロ−ナ
ル一次抗体（Science,232,648-650(1986）)、ベクタス
テイン(Vectastain)ＡＢＣ アビジン-ビオチン-過酸化
酵素検出キット(ベクタ−ラボラトリ−社製)を用い、色
素としてジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド
を用いて免疫標識した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斎藤 健一 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 三 菱化成株式会社総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 タウプロテインキナーゼＩに対し阻害作
用を有する物質を有効成分とするアルツハイマー病の予
防または治療薬。 - 【請求項２】 タウプロテインキナーゼＩに対し阻害作
用を有する物質が、該物質を神経細胞およびアミロイド
βプロテインとともにインキュベートした際に、該神経
細胞の細胞死を阻止する作用を有することを特徴とする
請求項１記載のアルツハイマー病の予防または治療薬。 - 【請求項３】 タウプロテインキナーゼＩのＤＮＡまた
はｍＲＮＡとハイブリタイズ可能なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを有効成分とするアルツハイマー病の予防
または治療薬。 - 【請求項４】 アルツハイマー病の予防または治療薬と
して有効であると推定される薬剤、神経細胞およびアミ
ロイドβプロテインをインキュベートし、該神経細胞の
細胞死が阻止されれば該薬剤がアルツハイマー病の予防
または治療薬として有効であると判定する、アルツハイ
マー病の予防または治療薬のスクリーニング方法。 - 【請求項５】 脳神経細胞にタウプロテインキナ−ゼＩ
に対し阻害作用を有する物質を作用させることを特徴と
する脳神経細胞死を阻止する方法。 - 【請求項６】 脳神経細胞にタウプロテインキナ−ゼＩ
のＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリタイズ可能なアンチ
センスオリゴヌクレオチドを作用させることを特徴とす
る脳神経細胞死を阻止する方法。
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1993
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