JPH10507081A - シュワン細胞の分離および培養 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞培養において、シュワン細胞（特にヒトのシュワン細胞）の生存および／または増殖を増強する方法を開示する。この方法はｇａｓ６およびその他の有糸分裂促進剤、たとえばヘレグリンおよびフォルスコリンのようなもの、を含む血清不含培養培地中でシュワン細胞を培養することを含む。一般に、この培養段階にはシュワン細胞を含む神経組織に脱ミエリン化を起こさせるために適当な条件で十分な時間培養するプレインキュベーション期間が先行する。分離されたシュワン細胞は神経系に損傷を受けた患者を処置するための細胞接合剤として使用できる。本発明はシュワン細胞を培養するための細胞培養培地も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 シュワン細胞の分離および培養 発明の背景 発明の分野 この発明はシュワン細胞を分離、培養する方法、分離したシュワン細胞自体、 およびその使用に関する。殊に、本発明はＲｘｅ／Ａｘ１受容体活性化剤および その他の有糸分裂促進剤を添加した血清不含培養培地中で培養することによって ヒトのシュワン細胞の生存率および増殖を増強する方法を提供する。関連技術の記載 １．シュワン細胞 シュワン細胞は末梢神経系における主な支持細胞である。この細胞は胚発達の 早期に神経堤から発達し、神経軸索の伸長とともに末梢に移動する。この相の間 にシュワン細胞は急速な増殖を行って、軸索の成長に適応するために適当な数の 細胞を産生する。続いてシュワン細胞は軸索を鞘で覆いまたは髄鞘形成すること によって最終的に分化し、その後は成人の一生の間休止したままになる。しかし ながら、シュワン細胞の増殖は病理的状況下には刺激でき、損傷後の神経再生に おいては重要な役割を果たす。末梢神経を切開する時には損傷部位のシュワン細 胞は脱髄鞘を始め、細胞周期を再開する（Ｂｕｎｇｅ、Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｏｐｉ ｎ．ｉｎ・Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、３巻：８０５頁［１９９３年］）。増殖して いるシュワン細胞は神経向性因子および細胞外マトリックス蛋白質を産生して切 開された軸索の再生を促進または誘導し、最後に再生された軸索を再髄鞘化する ことによって再生の過程を完了する。 シュワン細胞が末梢神経および中枢神経の両方で神経繊維再生を促進するこの 顕著な能力は末梢神経移植（ＰａｉｎｏとＢｕｎｇｅ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ・Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１１４巻：２５４頁［１９９１年］）およびシュワン ｉｅｎｃｅ、１２巻［９号］：３３１０頁［１９９２年］；Ｐａｉｎｏなど、Ｊ ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．、２３巻：４３３頁［１９９４年］）によって証明され ている。ヒトのシュワン細胞を含む細胞人工器具を、たとえば脊髄損傷部位での 中枢軸索の再生に影響を与えるための移植および複雑な末梢神経で長い間隙を含 む損傷を再生するための移植のような臨床的に使用することが提案されている（ Ｌｅｖｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４巻３号：１３０９頁［１９ ９４年］）。自己由来シュワン細胞を使用するこの手法の臨床的成功率は生検で 得られる僅かな材料から出発する純粋なシュワン細胞集団の試験管内増殖性能に 依存する。 ラットのシュワン細胞を培養する技術を記載している報告が数報ある。Ｂｒｏ ｃｋｅｓなど、Ｂｒａｉｎ・Ｒｅｓ．、１６５巻：１０５〜１１８頁（１９７９ 年）；Ｂｒｏｃｋｅｓなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻、１８号：８ ３７４〜８３７７頁（１９８０年）；Ｂｒｏｃｋｅｓなど、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏ ｌ．、２０巻、３号：３１７〜３２２頁（１９８６年）；Ｂｒｏｃｋｅｓ，Ｊ． 、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１４７巻：２１７〜２２５頁（１９８７年）； Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１１巻、８号：２４ ３３〜２４４２頁（１９９１年）；ＰａｉｎｏとＢｕｎｇｅ、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒ ｏ ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２巻、９号：３３１０〜３３２０頁（１９９２年）； Ｐｅｕｌｖｅなど、Ｅｘｐｅｒ．Ｃｅｌｌ・Ｒｅｓ．、２１４巻：５４３〜５５ ０頁（１９９４年）；Ｌｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４巻、７号 ：４０５０〜４０６３頁（１９９４年）；ＣｏｌｌｉｅｒとＭａｒｔｉｎ、Ｅｘ ｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１２４巻：１２９〜１３３頁（１９９３年）；Ｓ ｃｈｅｒｅｒなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、３８巻：５７５〜５８９ 頁（１９９４年）；Ｙａｍａｍｏｔｏなど、Ｂｒａｉｎ・Ｒｅｓ．、６５３巻： ３３５〜３３９頁（１９９４年）；Ｍｏｒｇａｎなど、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ 、１２０巻：１３９９〜１４０９頁（１９９４年）；Ｐａｉｎｏなど、Ｊ．Ｎｅ ｕｒｏｃｙｔｏｌ．、２３巻：４３３〜４５２頁（１９９４年）；Ｍｅｓｓｉｎ ｇなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４巻：３５３３〜３５３９頁（１９ ９ ４年）；Ｈａｙｎｅｓなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５２巻： １１９〜１２７頁（１９９４年）；ＷＯ９２／０３５３６；ＷＯ９２／１８６２ ７；ＷＯ９４／００１４０；ＷＯ９４／０４５６０参照。 Ｗａｔａｂｅなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、３９巻：５２５〜５３ ４頁（１９９４年）は成体マウスのシュワン細胞に対する血小板由来増殖因子、 線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β、およびヘパリン結合 血清因子の有糸分裂促進効果を研究した。 最近、ヒトのシュワン細胞培養技術が報告された。Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉなど、 Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３１巻、６号：５８０〜５８６頁（１９９２年）；Ｌ ｅｖｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４巻、３号：１３０９〜１３１ ９頁（１９９４年）；およびＬｅｖｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１ ５巻：２号、１３２９〜１３４０頁（１９９５年）参照。 シュワン細胞は通常血清添加培養培地中で増殖されてきた。殊に成人組織を用 いる時はこれらの製品に含まれる主な夾雑物は線維芽細胞であってシュワン細胞 を駆逐する程増殖する。線維芽細胞数は培養時間とともに変化（Ｌｅｖｉなど、 Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４巻、３号：１３０９頁［１９９４年］）し 、また順次的増殖（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、 １１巻、８号：２４３３〜２４４２頁［１９９１年］）、抗体による選別（Ｂｒ ｏｃｋｅｓ，Ｊ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１４７巻：２１７〜２２５頁 ［１９８７年］およびＷａｔａｂｅなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、３ ９巻：５２５〜５３４頁［１９９４年］）、または抗有糸分裂促進剤の使用（Ｌ ｅｖｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻、２号：１３２９〜１３４ ０頁［１９９４年］）のような複雑なプロトコルによっても削減される。 ２．ＲｓｅおよびＡｘ１受容体 Ｍａｒｋなどは最近ヒトおよび成体マウスの脳内に優先的に発現するチロジン キナーゼ受容体Ｒｓｅの相補ＤＮＡ配列を報告した（Ｍａｒｋなど、Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１０７２０頁［１９９４年］）。Ｒｓｅ受容体の細 胞外ドメインは免疫グロブリン様（Ｉｇ−Ｌ）リピート２個とそれに続くフィブ ロネクチンＩＩＩ型リピート２個からなる。ヒトＲｓｅ（Ｏｈａｓｉなど、Ｏｎ ｃｏｇｅｎｅ、９巻：６９９頁［１９９４年］）およびマウスＲｓｅ（Ｌａｉな ど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、９巻：２５６７頁［１９９４年］）と同一な蛋白質をコ ードする相補性ＤＮＡ配列が独立に報告され、各々ＳｋｙおよびＴｙｒｏ３と命 名された。ＦｕｊｉｍｏｔｏとＹａｍａｍｏｔｏ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、９巻：６ ９３頁［１９９４年］がｂｒｔと命名したマウスのＲｓｅ等価物およびＤａｉな ど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、９巻：９７５頁（１９９４年）がｔｉｆと命名したヒト の分子に関する報告も参照。 様々な組織におけるＲｓｅの発現が研究された。Ｌａｉなど、Ｏｎｃｏｇｅｎ ｅ、９巻：２５６７頁［１９９４年］は成体脳内でＲｓｅのｍＲＮＡは新皮質、 小脳および海馬のニューロンに局在することを発見した。Ｓｃｈｕｌｚなどは同 様にＲｓｅが高水準で大脳皮質、外側中隔（ｌａｔｅｒａｌ・ｓｅｐｔｕｍ）、 海馬、嗅球、および小脳に発現されることを発見した。脳内で最高レベルのＲｓ ｅ発現はニューロンに関するものであった（Ｓｃｈｕｌｚなど、Ｍｏｌｅｃ．Ｂ ｒａｉｎ・Ｒｅｓ．、２８巻：２７３〜２８０頁［１９９５年］）。マウスの中 枢神経系（ＣＮＳ）では、最高レベルのＲｓｅ発現は胚段階後期および出生後に 検出され、皮質および海馬ニューロン内におけるシナプス回路構成の樹立と維持 に符合する（Ｌａｉなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、９巻：２５６７頁［１９９４年］ およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒなど、Ｃｅｌｌ、５４巻：７８７〜７９３頁［１９８ ８年］）。この過程は直接接触または相互接近している細胞によって局所的に調 節されていると信じられる。 Ｒｓｅは構造的にはＡｘ１（ＵｆｏまたはＡｒｋとも呼称する）に関連して、 このチロジンキナーゼ受容体と４３％のアミノ酸配列同一性を共有する。Ａｘ１ に関してＯ’Ｂｒｙａｎなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１１巻：５０１ ６頁（１９９１年）；Ｊａｎｓｓｅｎなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、６巻：２１１３ 頁（１９９１年）；Ｒｅｓｃｉｇｎｏなど、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５巻：１９０８ 頁（１９９１年）；およびＢｅｌｌｏｓｔａなど、１５巻：６１４頁（１９９５ 年）参照。ＲｓｅおよびＡｘ１はｃ−Ｍｅｒとともに（Ｇｒａｈａｍなど、Ｃｅ ｌｌ・Ｇｒｏｗｔｈ・Ｄｉｆｆｅｒ．、５巻：６４７頁［１９９４年］）その細 胞外ドメインがニューロン細胞認識および接着分子に類似している一群の受容体 チロジンキナーゼを規定する（Ｒｕｉｔｉｓｈａｕｓｅ，Ｕ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ ・Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、３巻：７０９頁［１９９３年］および ＢｒｕｍｍｅｎｄｏｒｆとＲａｔｈｊｅｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、６１巻 ：１２０７頁［１９９３年］に綜説がある）。Ｒｓｅと同様にＡｘ１も神経系内 に発現されるが末梢神経組織内ではＲｓｅよりも広範に発現される。 ＲｓｅおよびＡｘ１受容体の推測上のリガンドも報告されている。Ｖａｒｎｕ ｍなど、Ｎａｔｕｒｅ、３７３巻：６２３頁（１９９５年）およびＳｔｉｔｔな ど、Ｃｅｌｌ、８０巻：６６１〜６７０頁（１９９５年）は最近ｇａｓ６（増殖 休止特異的遺伝子６）がＡｘ１のリガンドであると報告した。ｇａｓ６はＮＩＨ ３Ｔ３細胞で血清欠乏中に高度に発現される一組のマウス遺伝子に属する（Ｓｃ ｈｎｅｉｄｅｒなど、Ｃｅｌｌ、５４巻：７８７〜７９３頁［１９８８年］）。 これらの遺伝子はその発現が増殖誘導の間はネガティブに調節されるので増殖休 止特異的遺伝子と称する。マウスのｇａｓ６に対応するヒトの同族体はＭａｎｆ ｉｏｌｅｔｔｉなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、１３巻、８号：４９７６ 〜４９８５頁（１９９３年）によってクローニングされ、配列決定された。彼等 はｇａｓ６がビタミンＫ依存性蛋白質であると結論し、増殖調節に関連するプロ テアーゼカスケードの調節に一役を担っていると推測した。ｇａｓ６は脳を含む 各種の組織で発現される。ｇａｓ６に関するＣｏｌｏｍｂｏなど、Ｇｅｎｏｍｅ 、２巻：１３０〜１３４頁（１９９２年）およびＦｅｒｒｅｒｏなど、Ｊ．Ｃｅ ｌｌｕｌａｒ・Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１５８巻：２６３〜２６９頁（１９９４年） も参照。 Ｓｔｉｔｔなど、Ｃｅｌｌ、８０巻：６６１〜６７０頁（１９９５年）はさら にプロテインＳがＴｙｒｏ３のリガンドであると報告した。プロテインＳは活性 化されたプロテインＣによりＶａ因子およびＶＩＩＩａ因子の蛋白分解的不活性 化を刺激するためのコファクターとして作用することにより抗凝固剤として機能 するビタミンＫ依存性血漿蛋白質である。Ｅａｓｍｏｎなど、Ａｔｅｒｉｏｓｃ ｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ、１２巻：１３５頁（１９９２年）に綜説がある。従って プロテインＳは血液凝固カスケードの重要な負の調節剤である。Ｗａｌｋｅｒな ど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻：５５２１〜５５２４頁（１９８０年 ）；Ｗａｌｋｅｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６巻：１１１２８〜１ １１３１頁(１９８１年)；Ｗａｌｋｅｒなど、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ ｏｐｈｙｓ.、２５２巻：３２２〜３２８頁(１９９１年)；Ｇｒｉｆｆｉｎなど 、Ｂｌｏｏｄ、７９巻：３２０３頁(１９９２年)；およびＥａｓｍｏｎ，Ｄ.、 Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．、１２巻：１３５頁（１９９２年） 参照。ヒトの血漿中にあるプロテインＳの約半分がＣ４ＢＰに結合しているとい う発見はさらにプロテインＳが補体カスケードに関与するという見解を裏付ける 。Ｄａｈｌｂａｃｋなど、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、７８巻：２５１２〜２５１６頁 （１９８１年）。平滑筋細胞のための有糸分裂促進剤としてのプロテインＳの役 割も報告されている。Ｇａｓｉｃなど、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８９巻：２３１７ 〜２３２０頁（１９９２年）。 プロテインＳは４個のドメインに分割できる（本明細書の図１Ａ、図１Ｃおよ び図１Ｄ参照）。残基１〜５２（Ａ領域）はγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌ ａ）残基に富み、これが負に帯電した燐脂質へのプロテインＳのＣａ²⁺依存的な 結合に介在する（Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９巻：１０３ ３５頁［１９８４年］）。Ｂ領域はトロンビン感受性ループを含む。Ｃ領域は表 皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピート４個を含む。Ｄ領域はステロイドホルモン結合 グロブリン（ＳＨＢＧ）蛋白質に相同的である（Ｈａｍｍｏｎｄなど、ＦＥＢＳ ・Ｌｅｔｔ．、２１５巻：１００頁［１９８７年］）。ＪｏｓｅｆおよびＢａｋ ｅｒ（ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、６巻：２４７７頁［１９９４年］）が議論するように この領域はラミニン（２３％同一性）およびメロシン（同一性２２％）のＡ鎖中 の複数のドメインおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ・ｃｒｕｍｂｓにあるドメイン１ 個（１９％）と相同的である。 マウスおよびヒトのｇａｓ６のｃＤＮＡはヒトのプロテインＳとそれぞれ４３ ％および４４％のアミノ酸配列同一性を有する蛋白質をコードする。 発明の要約 この出願は規定された、血清不含培養系の使用を開示する。それは線維芽細胞 の増殖または生存を維持せず（好適な培養培地内に線維芽細胞特異的阻害因子の 不在にも拘らず）、また実質的に均質なシュワン細胞培養物を与える。ｇａｓ６ は血清不含規定培養物中では、シュワン細胞の強力な増殖／生存因子であること が証明された。ｇａｓ６とフォルスコリンおよびヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉ ｎ）との相乗効果は規定培地内で純粋なシュワン細胞集団の効率的な増殖を可能 にする。 従って、本発明はシュワン細胞（特にヒトのシュワン細胞）の生存および／ま たは増殖を強化する方法に関するものであると言うことができる。その方法はシ ュワン細胞をＲｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤（たとえばｇａｓ６）および第二の 有糸分裂促進剤（たとえばヘレグリン）を含有する血清不含培地中で培養するこ とを含む。このＲｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤および第二の有糸分裂促進剤は各 々シュワン細胞の生存または増殖を強化するために有効な量で存在する。好まし くはシュワン細胞はラミニン被覆培養プレートで培養する。この方法は成人患者 から誘導したシュワン細胞の生存および／または増殖を強化するために使用して 患者への自己由来的移植を促進することができる。 本発明はさらにシュワン細胞を培養するための血清不含培養培地を提供する。 この培地はＲｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤および第二の有糸分裂促進剤（たとえ ばヘレグリン）を含有する。所望ならば、この培養培地に培養培地中のｃＡＭＰ レベルを高める薬剤（たとえばフォルスコリン）、鉄源（たとえばトランスフェ リン）、インスリンまたはインスリン様増殖因子（たとえばＩＧＦ−ＩまたはＩ ＧＦ−ＩＩ）、ビタミン（たとえばビタミンＥ）およびプロテアーゼ阻害剤も含 める。本発明は（ａ）有糸分裂促進剤を含有する培養培地中でシュワン細胞を含 んでいる神経組織をシュワン細胞の脱ミエリン化を起こすに十分な時間プレイン キュベーションすること；および（ｂ）脱ミエリン化したシュワン細胞を前パラ グラフの培養培地中で培養すること、を包含するシュワン細胞を分離する方法も 提供する。 本発明はヒトのシュワン細胞および医薬的に許容される担体を含有し、本質的 に血清不含な組成物にも関連する。これに加えて、ヒトのシュワン細胞をさらに 有糸分裂促進因子を含有する血清不含培養培地中に含む組成物を提供する。 本明細書中に開示するシュワン細胞は哺乳類（たとえば神経系に損傷を受けた もの）を処置する方法に使用できる。その方法は、その哺乳類に有効量のヒトの シュワン細胞を投与することを含み、このシュワン細胞は本明細書中に記載する 操作に従って培養されたものである。従って、本発明は本明細書に開示する技術 を用いて分離、培養されたシュワン細胞を哺乳類の中枢または末梢神経系におけ る損傷を受けた領域に移植することを包含する神経系の修復を促進する方法を提 供する。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜図１ＤはプロテインＳおよびｇａｓ６（図１Ａ）、およびウシ（ｂ） 型およびヒト（ｈ）型のプロテインＳ（おのおの図１Ｃおよび図１Ｄ）とヒトの ｇａｓ６（図１Ｂ）との間でのアミノ酸相同性を比較して図式的に表現して提供 する。ｈｇａｓ６について、ボックスはＧｌａ領域（すなわちＡドメイン）、ル ープ領域（すなわちＢドメイン）、Ｃドメインを形成する４個のＥＧＦ様リピー ト（Ｃ₁〜Ｃ₄−と標識する）、および性ホルモン結合性グロブリンに相同的で、 ラミニンＡ鎖およびメロシンのＧドメインおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ・ｃｒｕ ｍｂｓの蛋白質にも関連する領域（すなわちＤドメイン）を表す。対応するボッ クス内にｈｇａｓ６とｂプロテインＳかｈプロテインＳかのいずれかとの間に共 有されるアミノ酸同一性を百分率で記載する。おのおのの領域境界にあるアミノ 酸はボックスの上部に記載する。 図２はマウスのｇａｓ６（ｍｇａｓ６）［配列番号１］、ｈ−ｇａｓ６［配列 番号２］およびｈ−プロテインＳ［配列番号３］のアミノ酸配列の比較を示す。 「プレ」配列および「プロ」配列の残基を指摘してある（各前駆体配列の最後の 残基を示す矢印で）。Ａ〜Ｄドメインを、Ｄドメインの中に存在するＧドメイン ２個（すなわちＧドメイン１およびＧドメイン２）とともに示してある。 図３は感覚および運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）のｃＤＮＡ配列［配列 番号４］および演繹したアミノ酸配列［配列番号５］を描写する。ＥＧＦ様ドメ インおよび無極性および非帯電ドメイン（すなわち約４８〜６２から構成される 「無極性Ｉ」残基および約７６〜１００から構成される「無極性ＩＩ」残基）に 下線を付す。システインはボックスで囲む。終止コドンは文字「Ｏ」で示す。 図４Ａ〜図４Ｂは胚シュワン細胞系列（ＥＳＣ）および成人シュワン細胞系列 （ＡＳＣ）におけるフォルスコリンの用量作用関係を描写する。継代数２１のＥ ＳＣ細胞および継代数１６のＡＳＣ細胞をおのおの１．４×１０⁴細胞／ウェル および３．１×１０⁴細胞／ウェルで１２ウェルプレートの「７Ｆ」培地中に接 種した。この「７Ｆ」培地はＦ１２／ＤＭＥＭであって、ウシ下垂体抽出物（Ｂ ＰＥ）(２μｇ／ｍＬ)、インスリン(１０μｇ／ｍＬ)、ヘレグリン(１ｎＭ)、ビ タミンＥ（５μｇ／ｍＬ）、プロゲステロン（３ｎＭ）、トランスフェリン（１ ０μｇ／ｍＬ）、フォルスコリン（５μＭ）、およびゲンタマイシンを含む。ウ ェルはラミニンで被覆した。最初はフォルスコリンを除外しておき、後に指定の 濃度にまで添加した。各条件の細胞を複数のウェル中で処理してＣｏｕｌｔｅｒ （商標）カウンターで培養５日目に計数した。図に示した値は各条件での平均値 および標準偏差値である。 図５Ａ〜図５ＢはＥＳＣおよびＡＳＣ（継代数２１）細胞系列におけるヘレグ リンの用量作用関係を描写する。細胞を各々２．１×１０⁴細胞／ウェルおよび ２．２×１０⁴細胞／ウェルで１２ウェルプレートのＦ１２／ＤＭＥＭ中に接種 した。培地は図４Ａ〜図４Ｂについて記載した７Ｆを加え、全ウェルはラミニン で被覆した。最初はヒトの組換えヘレグリンを除外しておき、後に指定の濃度ま で添加した。各条件の細胞を複数のウェル中で処理してＣｏｕｌｔｅｒ（商標） カウンターで培養５日目に計数した。 図６Ａ〜図６Ｂはおのおの継代数２１および１６のＥＳＣおよびＡＳＣ細胞系 におけるウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）の用量作用関係を描写する。細胞をおのお の１．７×１０⁴細胞／ウェルおよび３．１×１０⁴細胞／ウェルで１２ウェルプ レートのＦ１２／ＤＭＥＭ中に接種した。培地には図４Ａ〜図４Ｂについて記載 した７Ｆを加え、全ウェルはラミニンで被覆した。最初はウシ下垂体抽出物（Ｂ ＰＥ）を除外しておき、後に指定の濃度まで添加した。各条件の細胞を複数のウ ェル中で処理してＣｏｕｌｔｅｒ（商標）カウンターで培養５日目に計数した。 図７Ａ〜図７ＦはＥＳＣおよびＡＳＣ細胞系列でのインスリン（図７Ａ〜図７ Ｂ）、ＩＧＦ−Ｉ（図７Ｃ〜図７Ｄ）、およびＩＧＦ−ＩＩ（図７Ｅ〜図７Ｆ） の用量作用関係を描写する。継代数１６および継代数３０のＥＳＣ細胞およびＡ ＳＣ細胞を各々１．３×１０⁴細胞／ウェル（７Ｂでは３．１×１０⁴細胞／ウェ ル）で１２ウェルプレートのＦ１２／ＤＭＥＭ中に接種した。培地は図４Ａ〜図 ４Ｂについて記載した７Ｆを加え、特に言及しない限り全ウェルはラミニンで被 覆した。最初はヒトの組換えインスリンを除外しておき、後に指定の濃度までイ ンスリン、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを添加した。各条件の細胞を複数のウ ェル中で処理してＣｏｕｌｔｅｒ（商標）カウンターで培養５日目に計数した。 図８Ａ〜図８Ｃはヒトのシュワン細胞の増殖およびＤＮＡ合成におよぼすｇａ ｓ６およびその他の増殖因子の効果を描写する。全データは平均値±標準誤差（ ｎ＝４）で示す。図８Ａはヒトのシュワン細胞に対する様々な濃度のｇａｓ６の 用量反応曲線を示す。培地「６Ｆ」はインスリン（１０μｇ／ｍＬ）、トランス フェリン（１０μｇ／ｍＬ）、ビタミンＥ（５μｇ／ｍＬ）、化学的に規定され た脂質（５０μｇ／ｍＬ）、アプロテイニン（２５μｇ／ｍＬ）およびプロゲス テロン（３×１０^-8Ｍ）を添加したＦ１２／ＤＭＥである。培地「８Ｆ」は培地 「６Ｆ」にフォルスコリン（５μＭ）とヘレグリン（１０ｎｍ）とを添加したも のである。細胞数はＣｏｕｌｔｅｒ（商標）カウンターで所定濃度のｇａｓ６と ともに８４時間培養後に計数した。図８Ｂは様々な濃度のｇａｓ６存在下に図８ Ａ中で培養したシュワン細胞へのチミジン取り込みをｇａｓ６が増加することを 示す。³Ｈ-［メチル］チミジン（０．５μＣｉ／ｍＬ）は培養４８時間目に添加 した。細胞を培養９６時間目に収集してＤＮＡに取込まれた放射能測定用に処理 した。図８Ｃは８Ｆ培地存在下におけるシュワン細胞増殖に対する各増殖因子の 影響を示す。シュワン細胞はＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、塩基性ＦＧＦ（２０ ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１α（１ｎｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍＬ）、 およびｇａｓ６（３０ｎｇ／ｍＬ）を含有または不含の８Ｆ培地に塗布した。細 胞数は １０８時間後に計数した。 図９は培養中におけるヒトのシュワン細胞増殖の時間的経過を図示する。ヒト のシュワン細胞をｇａｓ６または１０％透析濾過ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ま たは不含の８Ｆを添加したＦ１２／ＤＭＥ培地（１：１）に２４ウェルのマルチ プレート中で２×１０⁴細胞／ウェルで塗布した。２４時間毎に各群から４ウェ ルの培養物を取り、細胞を計数した。記載したデータは平均値±標準誤差（ｎ＝ ４）である。 図１０Ａ〜図１０Ｄは６Ｆ＋ヘレグリン（図１０Ａ）、６Ｆ＋ヘレグリン＋ｇ ａｓ６（図１０Ｂ）、８Ｆ＋ｇａｓ６（図１０Ｃ）および８Ｆ＋１０％ウシ胎児 血清（図１０Ｄ）におけるヒトのシュワン細胞の増殖を示す位相差顕微鏡写真で ある。顕微鏡写真は培養９６時間後に撮影した。 好適な態様の詳細な説明 Ｉ．定義 一般に以下の語句は本記載、実施例および請求項で使用する時にはここに指摘 する意味を持つ。 「シュワン細胞」は神経堤起源の細胞であって、原位置では末梢神経の各神経 繊維周囲にある連続した外皮を形成する。シュワン細胞それ自体は、たとえばグ リア原繊維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、Ｓ１００蛋白質、ラミニンまたは神経増殖 因子（ＮＧＦ）受容体のようなシュワン細胞マーカー１種またはそれ以上の存在 を、たとえばこれらマーカーに対する抗体を使用して検出することによって確認 できる。さらに、シュワン細胞は培養物の鏡検によって検出できる特徴的な形態 を有する。実施例２（ｉｖ）参照。分離されたシュワン細胞は、たとえば培養物 中で感覚ニューロンと会合する性能またはミエリンまたは、たとえばＰｏおよび ミエリン会合性グリコプロテイン（ＭＡＧ）のようなミエリン関連蛋白質を産生 する性能のような分化したシュワン細胞機能の維持について評価できる。これを 研究するためには、分離したシュワン細胞を培養中の実質的に純粋な感覚ニュー ロン集団に接種し、細胞相互作用および蛋白質産生を数週間にわたって観察でき る。 用語「細胞培養培地」および「培養培地」は典型的には次のカテゴリーの１種 またはそれ以上からの成分を少なくとも１種提供する哺乳類細胞を増殖させるた めに使用する栄養溶液を示す。 １）通常は、たとえばグルコースのような炭水化物の型であるエネルギー源。 ２）通常はアミノ酸２０種＋シスチンの基本的セットである全必須アミノ酸。 ３）ビタミンおよび／またはその他の低濃度で必要な有機化合物。 ４）遊離脂肪酸。および ５）希物質。ここに希物質は典型的には非常な低濃度、通常はマイクロモル範 囲、で必要な無機化合物または天然起源物質であると定義される。 この栄養溶液は所望ならば次のカテゴリーのいずれかに属する成分を１種また はそれ以上添加することもある。 １）有糸分裂促進剤１種またはそれ以上。 ２）例えばカルシウム、マグネシウムおよび燐酸塩のような塩および緩衝液。 ３）例えばアデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチンのようなヌクレオシド および塩基。および ４）蛋白質および組織加水分解物。 用語「アミノ酸」はＤ−およびＬ−の両立体異性体型の天然起源α−アミノ酸 全ておよびその類似体および誘導体を示す。類似体はそのアミノ酸にある原子を 通常は類似の性質を有する異なる原子によって置換したものであると定義する。 誘導体はその他の分子または原子をが結合しているアミノ酸であると定義する。 誘導体には例えばアミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化またはシス チンを形成するシステイン分子２個の硫黄残基の酸化を含むであろう。 細胞培養培地は一般に「血清不含」であるが、これはその培地が本質的に如何 なる哺乳類起源からの血清（たとえばウシ胎児血清［ＦＢＳ］）も含まないこと を意味する。「本質的に不含」とは細胞培養培地が約０〜５％、好ましくは約０ 〜１％、最も好ましくは約０〜０．１％の血清を含むことを意味する。血清不含 「規定」培地が有利に使用できる。これでは各成分の同一性および濃度が知られ ている（すなわち、たとえばウシ下垂体抽出物［ＢＰＥ］にあるような規定され ていない成分はこの培養培地中には存在しない）。 「有糸分裂促進剤」または「増殖因子」はシュワン細胞の有糸分裂を刺激する 分子である。一般に、有糸分裂促進剤または増殖因子はポリペプチドであって、 細胞培養物中のシュワン細胞の生存および増殖を強化する。この有糸分裂促進性 ポリペプチドは製法を如何を問わず（たとえばその分子の内因性起源から分離で き、また組換え技術を含む合成技術で生産できる）、「在来型」または「在来配 列」ポリペプチド（すなわち天然起源増殖因子のアミノ酸配列を有する）である ことができる。好ましくは有糸分裂促進剤ポリペプチドはヒトに由来する増殖因 子またはその断片と同一のアミノ酸配列を有する。有糸分裂促進剤の例はＲｓｅ ／Ａｘ１受容体活性化剤；ｅｒｂＢ受容体ファミリーの１構成員またはそれ以上 の活性化剤；培養培地中のｃＡＭＰレベルを上昇する薬剤（たとえばフォルスコ リン、コレラトキシン、ｃＡＭＰまたはその類似体）；たとえばニューロン細胞 接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）、ラミニン、またはフィブロネクチンのような接着分子 ；プロゲステロン；神経栄養因子たとえば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およ び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；ニューロトロフィン−３、−４、−５、ま たは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）；または、たとえ ばＮＧＦ−βのような神経成長因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；たとえ ば酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）のような線維芽細胞 増殖因子；たとえばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β ３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−βのようなトランスフォー ミング増殖因子（ＴＧＦ）；ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびデス（１〜３）− ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）を含むインスリン様増殖因子；インスリン様増殖因 子結合性蛋白質；および、たとえばエストロゲン、テストステロン、甲状腺ホル モンおよびインスリンのようなホルモン；を包含する。 「Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤」は、Ｒｓｅおよび／またはＡｘ１受容体の 持つ細胞内キナーゼドメインに基質ポリペプチドにあるチロジン残基を燐酸化さ せることのできる分子からなる。チロシン残基はＲｓｅおよび／またはＡｘ１受 容体に内在することが多い（すなわち「基質」はＲｓｅおよび／またはＡｘ１受 容体の細胞内ドメインを含む）。そこで、活性化の程度はＲｓｅおよび／または Ａｘ１受容体の「自己燐酸化」に相関する。Ｒｓｅおよび／またはＡｘ１受容体 の自己燐酸化は抗ホスホチロジン抗体を使用するウエスタンブロティングにより 検出できる。たとえば実施例２（ｖｉ）参照。しかしながらＲｓｅおよび／また はＡｘ１受容体の活性化はＲｓｅおよび／またはＡｘ１受容体以外の基質（たと えば細胞膜内のＲｓｅおよび／またはＡｘ１受容体に隣接して存在するチロジン キナーゼなど）の燐酸化とも相関することがありうる。これは基質のチロシン燐 酸化を測定する（たとえばウエスタンブロティングによる）ことによって検出で きる。Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤の例にはｇａｓ６、プロテインＳおよびＲ ｓｅまたはＡｘ１受容体に結合して活性化するアゴニスト抗体を含む（Ｍａｒｋ など、前出）参照。 本明細書では用語「ｇａｓ６」および「ｇａｓ６ポリペプチド」はＲｓｅおよ び／またはＡｘ１受容体を活性化することのできるポリペプチドを示し、天然物 からの精製品、化学合成品または組換え産生品のいずれであってもよいがｇａｓ ６ポリペプチドの成熟型、プレー型、プレプロー型およびプロー型を包含する。 この定義は特にＭａｎｆｉｏｌｅｔｔｉなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、 １３巻（８）：４９７６〜４９８５頁（１９９３年）に報告されたアミノ酸配列 からなる「ヒトの」ｇａｓ６ポリペプチドおよびその他の哺乳類ｇａｓ６ポリペ プチド（たとえばマウスｇａｓ６のようなもの）ならびにそれらの変異体および 突然変異体を包含する。 ｇａｓ６は図２に示した様々なアミノ酸ドメインを有する。このポリペプチド のアミノ末端にあるＡドメインまたは「Ｇｌａ領域」はγ−カルボキシグルタミ ン酸（Ｇｌａ残基）に富む複数の残基を有し、細胞膜にある負に帯電した燐脂質 へのｇａｓ６のカルシウム依存性結合を媒介すると思われる。Ａドメインはヒト のｇａｓ６で残基約４９〜８９にわたる。これに続くＢドメインはトロンビン感 受性ループを含み、ヒトのｇａｓ６で残基約９０〜１１７にわたる。第３のドメ インはこの明細書ではＣドメインと呼称し、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピート ４個（Ｃ₁〜Ｃ₄）を有する。このＣドメインはヒトのｇａｓ６で残基約１１８〜 ２７８にわたる。残りのＤドメインはステロイドホルモン結合性グロブリン（Ｓ ＨＢＧ）蛋白質に相同的であって、ヒトのｇａｓ６で残基約２７９〜６７８を含 む。このＤドメインは一対のＧドメインを包含し、各々Ｇドメイン１（すなわち ヒトのｇａｓ６で残基約３１４〜４７１）およびＧドメイン２（すなわちヒトの ｇａｓ６で残基約５０３〜６７１）と呼ばれる。 ｅｒｂＢ受容体ファミリーは上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体（ｅｒｂＢ遺伝子 がコードしている）に相同性を示す受容体を包含し、ＥＧＦ受容体ならびにＨＥ Ｒ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４受容体（すなわち各々ｅｒｂ２〜４）が包含され る。米国特許第５１８３８８４号および欧州特許出願５９９２７４号を参照。こ のファミリーの構成員１種またはそれ以上を活性化することのできる有糸分裂促 進剤の例にはＥＧＦ；ヘレグリン−α（ＨＲＧ−α）、ヘレグリン−β１（ＨＲ Ｇ−β１）、ヘレグリン−β２（ＨＲＧ−β２）、ヘレグリン−β２様（ＨＲＧ −β２様）、ヘレグリン−β３（ＨＲＧ−β３）およびその断片（米国特許第５ ３６７０６０号参照）；アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）（Ｆａｌｌ ｓなど、Ｃｅｌｌ、７２巻：８０１〜８１５頁［１９９３年］）；グリア増殖因 子（ＧＧＦ）（Ｍａｒｃｈｉｏｎｎｉなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：３１２〜 ３１８頁［１９９３年］）；および感覚および運動ニューロン由来因子（ＳＭＤ Ｆ）（本明細書の図３参照）を含む。 用語「抗体」は最広義に使用し、殊にモノクローナル抗体およびポリエピトー プ特異性を有する抗体組成物も包含する。本明細書で使用する用語「モノクロー ナル抗体」は実質的に均質な抗体集団、すなわち微量に存在することがある天然 起源の突然変異体を除き、その集団を構成する各抗体が同一な抗体集団から得ら れる抗体を示す。モノクローナル抗体は高度に特異的で、単一抗原部位に指向す る。さらにその上、典型的には異なる決定因子（エピトープ）に指向する異なる 抗体を包含する通常の（ポリクローナル）抗体製品とは対照的に各モノクローナ ル抗体は抗原にある単一の決定因子に対して指向する。本明細書ではモノクロー ナル抗体は起源の種または免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスの所属に関 係なく、抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含む）と定常ドメイン（たとえ ば「ヒト化」抗体）、または軽鎖と重鎖、または１種からの鎖と他種の鎖、また は異種蛋白質との融合体、をスプライシングすることによって産生したハイブリ ッドおよび組換え抗体、ならびに抗体断片（たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、 およびＦｖ）、をも所望の生物学的活性を示す限り包含する。（たとえば米国特 許第４８１６５６７号およびＭａｇｅとＬａｍｏｙｉ、「モノクローナル抗体・ 生産技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｐｒｏｄｕｃ ｔｉｏｎ・ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ａｎｄ・Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、７ ９頁〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク［１９８７年］） 参照。そこで、修飾詞「モノクローナル」は実質的に均質な抗体集団から得たと いう抗体の性質を示し、いずれかの特定方法による抗体の産生を要件とするもの であるとは理解すべきでない。例えば、本発明に従って使用すべきモノクローナ ル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁 （１９７５年）が最初に報告したハイブリドーマ法によって製造してもよく、ま た組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって製造してもよい。こ の「モノクローナル抗体」は例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、 ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）が報告した技術を使用して作製した ファージライブラリーから分離してもよい。 非ヒト（たとえばマウスの）抗体の「ヒト化」型は特定的キメラ免疫グロブリ ン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、 Ｆ（ａｂ’）₂またはその他の抗原結合性サブ配列）であって、非ヒト免疫グロ ブリンに由来する最小の配列を含むものである。ヒト化抗体はほとんどの部分が ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定 領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、および性能を有するたとえ ばマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）からの 残基によって置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組 領域（ＦＲ）残基を対応する非ヒト残基と置換することもある。さらにその上、 ヒト化抗体はレシピエント抗体にも導入ＣＤＲにも枠組配列にも存在しない残基 を含むこともある。これらの修飾はさらに抗体の動作を精密化、至適化するため に行われる。一般にヒト化抗体はその少なくとも１個、典型的には２個のＣＤＲ 領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グルブリンのものに対応する実質的 に全部の可変ドメインを包含し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒトの免 疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒトの 免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部 も含むことになろう。 ポリペプチドを指向するポリクローナル抗体は一般にそのポリペプチドおよび アジュバントを皮下または腹腔内に多回注射することによって動物中に発生させ る。抗原またはそのペプチド性断片を、たとえばキーホールリンペットヘモシア ニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤の ように免疫すべき種に対して免疫原性のある担体蛋白質に、例えばマレイミドベ ンゾイルスルホサクシンイミドエステル（システイン残基を経る複合）、Ｎ−ヒ ドロキシサクシンイミド（リジン残基を経る複合）、グルタルアルデヒド、無水 コハク酸、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここにＲおよびＲ¹は異なるア ルキル基である）などの二官能試薬または誘導化試薬を使用して複合することが 有用なこともある。 これらの抗原−担体蛋白質複合体で動物を免疫するには、１ｍｇまたは１μｇ （おのおのウサギおよびマウスに）の複合体をフロイントの完全アジュバント３ 容と混合し、この溶液を多数部位に皮内注射する。１ケ月後にフロイントの完全 アジュバント中の複合体を初回量の５分の１量から１０分の１量を多数部位に皮 下注射することによって動物を追加免疫する。７日から１４日後に動物から採血 し、血清の抗ｇａｓ６抗体力価について検定する。抗体力価がプラトーに達する まで動物を追加免疫する。同じ抗原の別の担体蛋白質を有する複合体および／ま たは別の交差結合試薬による複合体を注射して動物を追加免疫することが好まし い。その抗原と適当な担体蛋白質との複合体も組換え細胞培養で複合蛋白質とし て製造できる。また、たとえば明礬のような凝集剤も免疫反応を強化するために 使用される。 この抗原に対して指向するモノクローナル抗体は連続的細胞系列によって培養 物中に抗体分子を産生する方法のいずれかを使用して産生される。モノクローナ ル抗体を製造するために適当な方法の例には最初のハイブリドーマ法、Ｋｏｈｌ ｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁（１９７ ５年）およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒなど、「モノクロ ーナル抗体・生産技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｙ・ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ａｎｄ・Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｓ）」、５１頁〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、１ ９８７年）を含む。 非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト 化抗体は非ヒト起源から導入されたアミノ酸残基１個またはそれ以上を有する。 これらの非ヒトアミノ酸残基は「インポート」残基と呼ばれることが多く、典型 的には「インポート」可変ドメインから取られたものである。ヒト化は当技術分 野で知られている方法（Ｊｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５ ２５頁［１９８６年］；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３ ２３〜３２７頁［１９８８年］；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎなど、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁［１９８８年］）に従ってゲッ歯類相補性 決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体にある対応する領域に置換することによって実行 できる。 あるいは、今日では内因性免疫グロブリン生産の不在下に免疫によってヒトの 抗体のレパートリー全体を産生することのできるトランスジェニック動物（たと えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然 変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ_H）遺伝子のホモ接合欠失が完全な内 因性抗体産生の阻害を起こすことが報告されている。この生殖系列突然変異マウ スへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレーの移植は抗原のチャレンジによ ってヒトの抗体の生産を起こすであろう。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、Ｐ ＮＡＳ、９０巻：２５５１〜２５５５頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ など、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；およびＢｒ ｕ ｇｇｅｒｍａｎｎなど、Ｙｅａｒ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９ ９３年）参照。ヒトの抗体はファージディスプレイライブラリーにおいても生産 できる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８ １頁（１９９１年）；およびＭａｒｋｓなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２ 巻：５８１頁（１９９１年）。 本発明は開示するポリペプチドの「変異体」および「突然変異体」も意図して いる。この変異体は在来型ポリペプチド配列の断片；在来型ポリペプチド配列の Ｎ末端またはＣ末端または内部にアミノ酸残基１個またはそれ以上が付加された ポリペプチド；アミノ酸残基１個またはそれ以上が欠失したか、要すればアミノ 酸残基１個またはそれ以上が置換されたもの；および前記蛋白質、ポリペプチド またはその断片の誘導体であって、得られる生産物が非天然起源アミノ酸になる ようにアミノ酸残基が共有結合的に修飾されているものを含む。ポリペプチドの 変異体は、例えば部位指向性またはＰＣＲ突然変異誘発によって合成的に製造さ れ、またはアレル型およびその他のヒトまたはその他の動物種に存在することが ありうる翻訳アミノ酸配列の天然起源変異体の場合のように天然に存在すること もある。使用できるポリペプチド変異体の例にはヘレグリン断片（たとえばＨＲ Ｇ−β１_{177 〜244}；Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２０５〜 １２１０頁［１９９２年］参照）およびｇａｓ６断片（たとえばｇａｓ６のＤド メイン断片またはＧドメイン断片のようなＡドメインが欠失したｇａｓ６断片な ど）を含む。 ポリペプチド変異体は機能的に活性である限り、本発明の範囲内に含まれる。 本明細書で使用する有糸分裂促進因子に関する「機能的に活性」および「機能的 活性」はその有糸分裂促進性ポリペプチドが細胞培養液中でシュワン細胞の生存 および／または増殖を強化することができることを意味する。 多くの場合にポリペプチド変異体は配列を最大相同性を提供するように並列し た後に例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４ ３〜４５３頁（１９７０年）が記載したアルゴリズムの編集であるＦｉｔｃｈな ど、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８０巻：１３８２〜１３８６頁（１９８３年）で算出 すると在来型ポリペプチドまたはその断片をコードする翻訳されたアミノ酸配列 と少なくとも約７５％（好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上） の配列同一性を共有するものである。機能的に活性なポリペプチド変異体をスク リーニングするために、細胞培養中でシュワン細胞を変異体と接触させてシュワ ン細胞の生存率および／または増殖に及ぼす変異体の効果を対照１種またはそれ 以上（たとえば在来型ポリペプチドおよびネガティブ対照）と比較して測定でき る。細胞培養中でシュワン細胞の生存率を強化する変異体、好ましくはシュワン 細胞の増殖を促進する変異体を本明細書に開示する培養技術に使用するために選 択できる。 ポリペプチドのアミノ酸配列変異体はポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチ ド変化を導入し、後に得られた修飾ＤＮＡを宿主細胞中で発現するか、または試 験管内合成することによって製造できる。この変異体は、例えば在来型ポリペプ チドアミノ酸配列内にあるアミノ酸残基の欠失、または挿入または置換を含む。 欠失、挿入、および置換のいかなる組合せも、その変異体が本明細書に記載する 所望の特性を有する限り在来型ポリペプチドのアミノ酸配列変異体に到達するた めに行うこともある。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体に到達するためにアミ ノ酸配列に施す変化は宿主細胞での発現に際してアミノ酸配列に、例えばグリコ シル化の導入の変化またはその部位の移動などのようなポリペプチドのさらなる 修飾に到ることもある。 ポリペプチドのアミノ酸配列変異体の構築には２種の本質的な変化物がある： 突然変異部位の位置および突然変異の性質である。これらは在来型ポリペプチド アミノ酸配列の変異体であって、そのポリペプチドの天然起源アレル型を表すも のか、またはポリペプチドＤＮＡを突然変異することによって製造されるポリペ プチドの予定された突然変異型であって、いずれも天然には存在しないアレルま たは変異体に到達するものである。 例えばヌクレオチドコード配列の縮退性のために、コードするポリペプチドの アミノ酸配列に影響することなしにヌクレオチド配列に突然変異を起こすことが できる。その他の突然変異には在来型配列とは異なるアミノ酸配列を有するが、 機能的に活性なポリペプチドを与えるものがある。このような機能的に活性なア ミノ酸配列変異体は、例えば在来型アミノ酸配列にあるアミノ酸残基１個または それ以上を極性または荷電が類似しているか相違している別種のアミノ酸残基と 置換することによって選択される。 有用な手法の一つは「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼称される。 ここではアミノ酸残基または標的残基の基（たとえばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、 ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基など）を決定し、組換えＤＮＡ技術によっ て中性または負に帯電したアミノ酸（最適にはアラニンまたはポリアラニン）で 置換してアミノ酸の細胞内外の周辺水性環境との相互作用に影響を与える。Ｃｕ ｎｎｉｎｇｈａｍなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１ ９８９年）。置換に対して機能的感受性を示すドメインを次にさらにまたは別の 変化を置換部位にまたはその近くに導入することによって精密化する。 そこで、アミノ酸配列変異を導入する部位は前もって決定される一方で、突然 変異それ自体の性質を予め決定する必要はない。例えば所与の部位にある突然変 異の働きを最適化するために、標的コドンまたは標的領域にアラニンスキャンニ ングまたはランダム突然変異誘発を行って発現した変異体を前記のように機能的 活性についてスクリーニングする。 アミノ酸配列の欠失は一般に約１から約３０残基まで、より好ましくは約１か ら１０残基までの範囲で、典型的には連続したものである。例えば他の有糸分裂 促進因子と実質的に相同性のある領域からの欠失はポリペプチドの機能的活性に 影響を及ぼす可能性が高い。一般に連続的欠失の数は、たとえばβ−プリーツシ ートまたはα−螺旋のような影響を受けるドメインにおけるポリペプチドの３次 元構造を保存するであろうように選択されよう。 アミノ酸配列挿入はアミノ酸残基１個から残基１００個またはそれ以上を含む ポリペプチド長までの範囲にわたるアミノおよび／またはカルボキシル末端融合 ならびに単一または多重なアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入は一般 に残基約１個から１０個まで、より好ましくは１個から５個まで、最も好ましく は１個から３個までの範囲にわたる。末端挿入の例はＮ−末端メチオニル残基を 有する変異体ポリペプチド（たとえば組換え細胞培養でのポリペプチドの直接的 発現から得られるような）および組換え宿主細胞からのポリペプチド分泌を改善 するために異種Ｎ−末端シグナル配列を持つポリペプチドを含む。その他の挿入 にはポリペプチドＮ−またはＣ−末端への免疫原性ポリペプチドの融合（例えば β−ラクタメースのような細菌性ポリペプチドまたは大腸菌ｔｒｐ遺伝子座がコ ードする酵素または酵母蛋白質）およびたとえばＰＣＴ公表番号ＷＯ８９／０２ ９２２号（１９８９年４月６日公表）に記載のある免疫グロブリン定常領域、ア ルブミンまたはフェリチンのような半減期の長い蛋白質とのＣ末端融合を含む。 変異体の第３の群は在来型ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基 少なくとも１個、好ましくは１個のみを除去してその場所に異なる残基を挿入し たものである。このような置換をする最も興味深い部位は他の有糸分裂促進因子 との相同性が最大なポリペプチドアミノ酸配列の領域である。これらの部位は有 糸分裂促進性因子の機能的活性に重要であると思われる。従って、機能的活性を 維持するためには、これらの部位、特に少なくとも３つの同一に保存されている 部位の配列内にある部位を比較的保存的に置換する。このような保存的置換を表 １に「好適な置換」の欄に示す。このような置換が機能的活性を変化させなけれ ば表１の「置換例」の欄に示したさらに実質的な変化を、またはさらに下記アミ ノ酸分類に示すようなものを導入し、得られる変異体を機能的活性について分析 する。 ポリペプチドアミノ酸配列における挿入的、欠失的および置換的変化をポリペ プチドの安定性を改善するために行うことがある。例えばトリプシンその他のプ ロテアーゼ切断部位はコードされているアルギニルまたはリジニル残基について アミノ酸配列を検討することによって確認される。これらはこの残基をその他の 残基、好ましくはたとえばグルタミンのような塩基性残基または、たとえばセリ ンのような親水性残基に置換することによって；これらの残基を欠失することに よって；またはこれら残基の直後にプロリル残基を挿入することによってプロテ アーゼに対して不活性にする。また、機能的活性のためにポリペプチドの正しい 立体配座を維持することに関与しないいずれのシステイン残基も一般的にはセリ ンのようなもので置換してその分子の酸化的安定性を改善し、異常な交差結合を 予防してもよい。 アミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは当技術分野で知られている各種方法 によって調製する。これらの方法はこれに限定するものではないが天然起源から の分離（天然起源アミノ酸配列変異体）または部位指向性（またはオリゴヌクレ オチド介在）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および前に調製したポリペプ チドの変異体型または非変異体型をコードするＤＮＡのカセット突然変異誘発を 包含する。 部位指向性突然変異誘発は置換、欠失および挿入変異体を調製するために好適 な方法である。この技術は当技術分野でよく知られており（たとえばＺｏｌｌｅ ｒなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１００巻：４６６８〜５００頁［１９８３年］； Ｚｏｌｌｅｒなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１５４巻：３２９〜３５０頁［１９８ ７年］；Ｃａｒｔｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１５４巻：３８２〜４０３頁［１ ９８７年］；Ｈｏｒｗｉｔｚなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８５巻：５９９〜６ １１頁［１９９０年］参照）、例えばトリプシンおよびＴ４リゾチームのアミノ 酸配列変異体の製造に使用されたことがあり、これら変異体はある種の所望の機 能的性質を有する。Ｐｅｒｒｙなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２６巻：５５５〜５５ ７頁（１９８４年）；およびＣｒａｉｋなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８巻：２９ １〜２９７頁（１９８５年）。 略述すれば、部位指向性突然変異誘発を実施するに当り、目的ＤＮＡを変更す る。最初にＤＮＡの一本鎖に所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを ハイブリッド化する。ハイブリッド形成後、ＤＮＡポリメラーゼを使用し、ハイ ブリッドを形成したオリゴヌクレオチドをプライマーに使用し、ＤＮＡの一本鎖 を鋳型に使用して、第２の鎖全体を合成する。こうして得られる２本鎖ＤＮＡに 所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを導入する。 ＰＣＲ突然変異誘発もアミノ酸配列変異体の製造に適する。Ｈｉｇｕｃｈｉ、 「ＰＣＲのプロトコル（ＰＣＲ・Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、１７７〜１８３頁、 （Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、１９９０年）；およびＶａｌｌｅｔｔｅな ど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１７巻：７２３〜７３３頁（１９ ８９年）参照。略述すれば、ＰＣＲで少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として使用す る時に、鋳型ＤＮＡにある対応する領域とは僅かに異なるプライマーを使用する とプライマーが鋳型と異なる場所のみで鋳型配列と異なる特異的なＤＮＡ断片が 比較的大量に作製できる。 変異体を製造するもう一つの方法であるカセット突然変異誘発はＷｅｌｌｓな ど、Ｇｅｎｅ、３４巻：３１５〜３２３頁（１９８５年）が報告した技術に基づ く。出発物質は突然変異すべきＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクタ ー）である。ＤＮＡ中の突然変異すべきコドンを確認する。確認した突然変異部 位の両側には独特の制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。もしも、 このような制限部位が存在しなければ、前記オリゴヌクレオチド介在突然変異誘 発法を使用してＤＮＡの適当な位置に導入して作製する。プラスミドＤＮＡはこ れらの部位で切断してリネアライズする。両制限部位の間のＤＮＡの配列をコー ドし、所望の突然変異を含む２本鎖オリゴヌクレオチドを標準的操作法を使用し て合成するが、ここではオリゴヌクレオチドの鎖２本を別々に合成し、標準的な 技術を使用して相互にハイブリッドを形成させる。この二重鎖のオリゴヌクレオ チドをカセットと称する。このカセットはリネアライズしたプラスミドの両端と 適合するような５’および３’末端を持ち、プラスミドに直接連結できるように 設計する。そこで、このプラスミドは突然変異したＤＮＡ配列を含む。 ポリペプチド分子の共有結合的修飾もこの発明の範囲内に包含する。例えば、 共有結合的修飾はポリペプチドの標的アミノ酸残基を選択したアミノ酸側鎖また はＮ−末端またはＣ−末端残基と反応することができる有機誘導化試薬と反応さ せることによってポリペプチドに導入する。 システイニル残基は最も普通には、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミ ドのようなα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させてカルボキ シメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はまた ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオ ン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２ −ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジル−ジスルフィド、ｐ−クロロマ ーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、または クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって 誘導化される。 ヒスチジル残基はヒスチジル側鎖に対して比較的に特異的なピロ炭酸ジエチル とのｐＨ５．５〜７．０での反応により誘導体にできる。ｐ−ブロモフェナシル ブロミドも有用であるが、この反応は好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍ−カコジ ル酸ナトリウム中で実施する。 リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸、その他カルボン酸の無水物と反応 させる。これら試薬による誘導体形成はリジニル残基の荷電を逆転させる効果を 有する。α−アミノ含有残基を誘導体形成するその他の適当な試薬には、たとえ ばメチルピコリンイミデートのようなイミドエステル；ピリドキサールホスフェ ート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸； Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートによる トランスアミナーゼ触媒反応を包含する。 アルギニル残基は通常の試薬１種または数種との反応によって修飾するが、そ の中にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキ サンジオンおよびニンヒドリンがある。グアニジン官能基のｐＫ_aが高いために アルギニン残基の誘導体形成は反応をアルカリ性条件下で実施する必要がある。 その上、これら試薬はリジンの基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基と 反応することもある。 チロジル残基の特異的修飾はスペクトル標識をチロジル残基に導入するという 特異的な目的で芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応に よって行うこともある。最も通常的にはＮ−アセチルイミダゾールおよびテトラ ニトロメタンを使用して各々Ｏ−アセチルチロジル種および３−ニトロ誘導体を 形成する。チロジル残基は¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉを使用してヨード化してラジオイム ノアッセイに使用する標識プロテインを製造するが、前記のクロラミンＴ法が適 当である。 カルボキシ側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、たとえば１−シクロ ヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エ チル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのよう なカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）、ここにＲおよびＲ’は異なるア ルキル基である、との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチル およびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルお よびグルタミニル残基に変換される。 グルタミルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱アミノ化されて各々対応す るグルタミルおよびアスパルチル残基となる。あるいは、これら残基は緩和な酸 性条件下に脱アミノ化される。これらの残基の両型はこの発明の範囲内に入る。 その他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレ オニル残基のヒドロキシル基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン 側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ−末端 カルボキシル基のアミド化を包含する。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「蛋白質：構造と 分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ・ａｎｄ・Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ・Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、７９〜８６頁（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍｅｎ社、１ ９８３年）。ポリペプチドはまた、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロ ピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの非蛋白質性ポリマーと米国 特許第４１７９３３７；４３０１１４４；４４９６６８９；４６４０８３５；４ ６７０４１７；または４７９１１９２号に記載の方法によって結合できる。 「鉄源」は培養されているシュワン細胞にＦｅイオンを提供する分子または組 成物である。この例には鉄担体（たとえばトランスフェリン）および鉄塩（たと えばＦｅＳＯ₄）を含む。 「プロテアーゼ阻害剤」はシュワン細胞培養の間、たとえばシュワン細胞由来 プロテアーゼなど、プロテアーゼの蛋白質分解的作用を削減または消失させる。 プロテアーゼ阻害剤の例にはアプロチニン、フェニルメチルスルホニルフルオラ イド（ＰＭＳＦ）、リューペプチン、ペプスタチン、４−（２−アミノエチル） −ベンゼンスルホニルフルオライド、ハイドロクロライドーベスタチン、キモス タチンおよびベンズアミジンを含み、好適なプロテアーゼ阻害剤はアプロチニン である。 表現「細胞の生存を強化すること」は細胞培養中のシュワン細胞の生存寿命の 期間を増加する作用を示す。 語句「細胞の増殖を強化すること」は非処理細胞との比較において細胞培養中 の細胞分裂の速度および／または程度を増加する段階を包含する。細胞培養中の 細胞増殖の増加は本明細書に開示する細胞培養培地で培養する前後に細胞数を計 数することによって検出できる。増殖の程度は培養中の有糸分裂像の百分率およ び数の鏡検および集密度を検査することによって定量化できる。細胞の増殖は細 胞による³Ｈ取込みとＤＮＡへの導入を測定することによっても定量化できる。 分離されたシュワン細胞集団は望ましくは「実質的に均質」であるが、これは その集団の中にある細胞の約９０から１００％の間、好ましくは９９％から１０ ０％の間、がシュワン細胞であることを意味する。 「脱ミエリン化」はアクソン周囲のミエリン膜構造の弛緩、破壊および最終的 崩壊を意味する。この表現はシュワン細胞の部分的および完全な脱ミエリン化を 包含する。 「医薬的に許容される」担体または基剤はそれと接触する哺乳類に対して採用 する用量および濃度において無毒なものである。医薬的に許容される担体は水性 ｐＨ緩衝液であることが多い。医薬的に許容される担体の例にはたとえば燐酸、 クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化 剤；低分子量（約１０残基またはそれ以下）ポリペプチド；たとえば血清アルブ ミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；たとえばポリビニルピ ロリドンのような親水性ポリマー；たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギ ン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、また はデキストリンを含む単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；たとえばＥＤ ＴＡのようなキレート剤；たとえばマンニトールまたはソルビトールのような糖 アルコール；たとえばナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはたと えばトゥイーン、プルロン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような 非イオン性界面活性剤を含む。好適な医薬的に許容される担体または基剤は半固 体、ゼラチン状、または粘い支持基剤である。このようなゼラチン状担体または 基剤の例にはコラーゲン、コラーゲン−グリコサミノグリカン、フィブリン、ポ リビニルクロリド、たとえばポリリジンまたはポリオルニチンのようなポリアミ ノ酸、ハイドロゲル、アガロース、デキストラン硫酸塩およびシリコンを含む。 「神経系の損傷」はアクソンの切断、ニューロンの変性または脱ミエリン化を 起こす疾患または障害である。神経系損傷の例には外傷的病変（たとえば物理的 外傷、外科手術または圧迫傷によって起きるもの）；虚血による病変（たとえば 大脳または脊髄の梗塞および虚血）；悪性腫瘍による病変；感染症病変（たとえ ば膿瘍、ヒト免疫不全ウイルス、ライム病、結核、梅毒またはヘルペス感染に関 連するもの）；変性病変（たとえばパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチ ントン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症に関連するもの）；栄養的疾患または 障害に関連する病変（たとえばビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ウエルニッ ケ病、煙草−アルコール性弱視、マルキアファバ−ビグナミ病およびアルコール 性小脳変性）；全身性疾患（たとえば糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、癌腫、または 類肉腫症）に関連する神経学的病変；毒性物質に起因する病変（たとえばアルコ ール、鉛またはニューロトキシン）；および脱ミエリン化病変（たとえば多重硬 化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、種々の病因による横筋脊髄障害、進 行性多病巣性白質脳症および中枢脳橋ミエリン溶解）を包含する。 用語「処置すること」、「処置」、および「療法」は治療的療法、予防的療法 および阻止的療法を示す。 用語「哺乳類」は哺乳類に分類されるいずれの哺乳類をも示し、ヒト、ウシ、 ウマ、イヌ、ヒツジ、およびネコを含む。本発明の好適な態様においては哺乳類 はヒトである。 ＩＩ．本発明実施の態様 １．出発材料およびプレインキュベーション シュワン細胞を含む神経組織（すなわち末梢神経組織）は哺乳類、好ましくは ヒト（患者の承諾を受けた後）に由来する。この組織は胚組織であってもよいが （たとえば後根神経節）、好適な態様では自己由来移植を促進し、患者での不都 合な免疫性反応の可能性を減少するので成人の患者由来のものである。 本発明はシュワン細胞の異種移植（たとえば哺乳類の１種から他種哺乳類に、 または胚から成人患者に）ならびに自己由来移植を提供する。自己移植の患者が 損傷した組織を有するならば、損傷組織はシュワン細胞の源泉を提供できる。あ るいは、たとえば神経生検のような外科的手法を実行し、分離して培養すべきシ ュワン細胞を含む組織を収集できる。末梢神経の源泉の可能性には足首の腓腹神 経、伏在神経、または上肢の上腕神経または前腕神経を含む。これらの神経は好 ましくは感覚神経である。 出発神経組織の適当なサイズは約１０ｍｇから１０ｇの間、好ましくは約１０ ０ｍｇから１ｇの間である。この神経組織は通常本発明の初代培養相に先行する プレインキュベーションの前には培地（たとえばＲＰＭＩ−１６４０［Ｓｉｇｍ ａ社］、ＬｉｅｂｏｖｉｔｚのＬ１５またはＢｅｌｚｅｒのＵＷ溶液）中に貯蔵 できる。プレインキュベーションはシュワン細胞の脱ミエリン化を促進するので 有利である。プレインキュベーション段階では神経組織をプロテアーゼ酵素１種 またはそれ以上で十分な時間処理して結合組織を弛緩させて脱ミエリン化を促進 するのが望ましい。プロテアーゼ酵素多数が購入でき、この段階に使用できるが これには例えばコラーゲネース、ディスペースおよびその他のセリンプロテアー ゼを含む。好適な態様では神経組織を１％コラーゲネース／ディスペース溶液と 接触させる。結合組織を弛緩させるのに必要な時間は選択するプロテアーゼ酵素 に依存して変化するが、通常は約１０分から１００分、好ましくは約２０分から ５０分間である。この酵素処理は例えば約３７℃で実施できる。過剰な酵素は培 養培地で穏やかに洗浄することによって除去できる。 酵素処理に続いて神経組織を適当な条件下にシュワン細胞の脱ミエリン化（既 に始まっていることもある）を促進するに十分な時間培養する。従って、神経組 織を皿（例えば１００ｍｍペトリ皿）に置いて有糸分裂促進剤および他の所望の 成分を添加した培養培地に入れる。例えば培養培地は有糸分裂促進剤１種または それ以上を添加した血清不含培地であってもよい。正常には少なくともｅｒｂＢ 活性化剤（たとえばヘレグリン）、インスリン（またはＩＧＦの一種）、および プロテアーゼ阻害剤少なくとも１種（たとえばアプロチニン）を下記例示の範囲 で培養培地中にプレインキュベーション期間は存在させる。しばしば初代培養の ための培養培地を使用できる。この段階は接着蛋白質によって細胞が培養プレー トに接着しておらず、細胞培養培地に懸濁している点で初代培養相とは区別され る（しかしながら、いくらかの細胞はプレインキュベーションしている皿の表面 に自然に接着していてもよい）。シュワン細胞は脱ミエリン化が起きるに十分な 時間培養されるが、例示的な培養時間は約１２時間から１２０時間の範囲、好ま しくは約１８時間から４８時間である。 要すれば細胞を遠心分離で集め、ピペットで培養培地中に再懸濁する。 ２．シュワン細胞初代培養物の取得 前記プレインキュベーション段階が培養段階に先行する一方で、別の態様では シュワン細胞を直接次の培養操作にかけることができる。また、この培養操作は 所望により他の培養段階に先行または後続できる。 固定相（たとえばプラスチックの組織培養皿またはプレート）を常法によって たとえばラミニン、フィブロネクチン、ポリリジン、またはコラーゲンのような 細胞外マトリックス／接着プロテインで被覆する。この中ではラミニンが好適で ある。これにより被覆した固定相上へのシュワン細胞の優先的な接着および移動 ができる。シュワン細胞をラミニン被覆培養プレート上、適当な培養培地中で培 養する。適当な培養培地は当技術分野の熟練者にはよく知られており、これに限 定するものではないが、商業的に購入できる培地、たとえばＦ１２／ＤＭＥ、Ｈ ａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ社）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ社）、 ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、ダルベッコの修正イーグル培地（［ＤＭ ＥＭ］、Ｓｉｇｍａ社）を含む。これに加えて参考のために本明細書に引用する ＨａｍとＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、５８巻：４４頁（１９ ７９年）；ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻： ２５５頁（１９８０年）、米国特許第４７６７７０４、４６５７８６６、４９２ ７７６２、または４５６０６５５号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１ ９５、米国再発行特許３０９８５号、または米国特許第５１２２４６９号に記載 の培地のいずれかを培養培地として使用してもよい。これら培地のいずれにも必 要に応じて有糸分裂促進剤、イオン（たとえばナトリウム、塩素、カルシウム、 マグネシウム、および燐酸）、緩衝液（たとえばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（ たとえばアデノシンおよびチミジン）、希物質（通常最終濃度がマイクロモルの 範囲で存在する無機化合物と定義する）およびグルコースまたは等価なエネルギ ー源を添加してもよい。その他の必要な添加物も当技術分野の熟練者に知られて いる適当な濃度で含有させてもよい。好適な培養培地としては、Ｆ１２／ＤＭＥ （１：１）がある。 この培養培地には一般にＲｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤である第一の有糸分裂 促進剤を含有する。この中でｇａｓ６は好適な活性化剤である。実施例２（ｉ） はヒトの組換えｇａｓ６の製造技術を記載する。培地中のｇａｓ６濃度は好まし くは約０．１ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬか ら３０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは１０ｎｇ／ｍＬから３０ｎｇ／ｍＬの範囲に あろう。第二の有糸分裂促進剤を培養培地に加えるが、これにはｅｒｂＢ受容体 ファミリーの構成員を活性化する分子が適切である。ヘレグリンは好適な活性化 剤であって、ヒトのヘレグリン−β１_{177 〜244}断片が最も好適な第二の有糸分裂 促進剤である（Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１２０５〜１２ １０頁［１９９２年］参照）。培地中のヘレグリン濃度は好ましくは約０．１ｎ Ｍから５０ｎＭ、より好ましくは０．５ｎＭから２０ｎＭ、最も好ましくは４ｎ Ｍから１０ｎＭの範囲にあろう。通常、さらに別の有糸分裂促進剤を存在させる であろう。望ましくは、ｃＡＭＰ濃度を上昇させる薬剤を培地中に存在させる。 フォルスコリンは好適な薬剤であってこの分子の適当な濃度は０．１μＭから５ ０μＭまでのフォルスコリン、より好ましくは１μＭから２０μＭまでのフォル スコリン、最も好ましくは２μＭから１０μＭまでのフォルスコリンである。培 地にはインスリンまたはＩＧＦ（たとえばＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）を添 加できる。インスリンは培地中に好ましくは０．１μｇ／ｍＬから２００μｇ／ ｍＬ、より好ましくは０．５μｇ／ｍＬから２０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは５ μｇ／ｍＬから２０μｇ／ｍＬが添加されよう。プロゲステロンも培養培地中に ０．１ｎＭから１０００ｎＭ、より好ましくは３ｎＭから２００ｎＭ、最も好ま しくは３ｎＭから５０ｎＭの範囲で添加しうる。有糸分裂促進剤１種またはそれ 以上に加えて、たとえばトランスフェリンのような鉄源を培養培地中に存在させ るのが有利であろう。培地中のトランスフェリン濃度は好ましくは０．１μｇ／ ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１μｇ／ｍＬから２５μｇ／ｍＬ、 最も好ましくは５μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲にあろう。その他に多数 の所望による添加物が存在し、これらにはビタミンＥ（抗酸化剤および抗トラン スフォーミング剤）の好ましくは０．１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より 好ましくは１μｇ／ｍＬから２０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは５μｇ／ｍＬから １０μｇ／ｍＬ；たとえばアプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤の好ましく は１μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０μｇ／ｍＬから１０ ０μｇ／ｍＬ、最も好ましくは２０μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬの範囲；およ び化学的に規定された脂質（Ｓｉｇｍａ社カタログ＃１１９０５−０１５）の好 ましくは１μＬ／ｍＬから５００μＬ／ｍＬ、より好ましくは１０μＬ／ｍＬか ら１００μＬ／ｍＬ、最も好ましくは２５μＬ／ｍＬから５０μＬ／ｍＬを包含 する。その他の必要な添加剤も当技術分野の熟練者に知られている適切な濃度で 添加しうる。 この培養培地は様々な間隔（たとえば約１日から５日毎）で交換でき、細胞を 約３３から３８℃の間、好ましくは約３７℃の生理学的に許容される温度で培養 する。 本発明はまたシュワン細胞、殊にヒトのシュワン細胞を培養するための、前記 成分２種またはそれ以上の適当な組合せからなる（好ましくは前記濃度範囲で） 血清不含培養培地を提供する。この血清不含培養培地は製造用物品またはキット の形で提供できる。製造用物品はラベルを貼付した容器を含む。適当な容器には 例えばビン、バイアル、および試験管を含む。この容器はたとえばガラスまたは プラスチックスのような種々の材料で形成できる。この容器は好ましくは室温で 前記の培地を保持し、その培地はシュワン細胞の生存および／または増殖を強化 するために有効である。容器上のラベルはこの培養培地がシュワン細胞の生存お よび／または増殖を強化するために使用されることを示し、前記のような試験管 内使用のための指示および最適な保存条件の指示を記載してもよい。 ３．ポリペプチドの産生 ポリペプチドが購入できない場合には、次の記載が、たとえば有糸分裂促進性 ポリペプチドおよびその変異体のような本明細書に開示する培養技術で使用する ためのポリペプチド生産の方策を提供する。 在来型ポリペプチドまたはポリペプチド変異体を生産するために適当な技術は 当技術分野ではよく知られており、ポリペプチドの内因性源泉（たとえば血清） からのポリペプチドの分離、ペプチド合成（ペプチド合成機を使用して）および 組換え技術（またはこれらの技術のいずれかの組合せ）を含む。在来型ポリペプ チドまたはポリペプチド変異体の好適な生産技術は組換え技術である。 在来型ポリペプチドをコードする核酸はそのポリペプチドｍＲＮＡを有してお り、検出できるレベルで発現すると信じられる組織（たとえば脳組織）から調製 したｃＤＮＡライブラリーから分離できる。目的とする遺伝子またはそれがコー ドする蛋白質を確認するように設計したプローブ（たとえば抗体または約２０〜 ８０塩基のオリゴヌクレオチド）でライブラリーを検索する。選択したプローブ によるｃＤＮＡまたは遺伝子ライブラリーの検索はＳａｍｂｒｏｏｋなど、「分 子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｕａｌ）」、（ニューヨーク、Ｃｏｌｄ・Ｓｐ ｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年） の第１０〜１２章に記載の標準的操作を使用して実行しうる。 野生型核酸の修正によるポリペプチド突然変異体を作製する技術は前記した。 在来型ポリペプチドまたはポリペプチド変異体をコードする核酸（たとえばｃＤ ＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を複製可能なベクターに挿入して追加的クローニング （ＤＮＡ増幅）または発現をする。多数のベクターが入手可能である。一般には ベクター成分にはこれに限定するものではないが、次のもの１種またはそれ以上 を含む：シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子１種またはそれ以上、エン ハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。 このポリペプチドはシグナル配列またはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断 部位を持つ他種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして製造することもある。 一般にシグナル配列はベクターの成分またはベクターに挿入したＤＮＡの一部分 でありうる。選択する異種シグナル配列は宿主細胞が認識し、プロセッシングす るもの（すなわちシグナルペプチダーゼ）が好ましい。原核生物宿主細胞にはシ グナル配列を、たとえばアルカリホスファターゼ、ペニシリネース、ｌｐｐ、ま たは熱安定性エンテロトキシンＩＩのリーダー配列から選択した原核生物シグナ ル配列で置換する。酵母での分泌には在来型シグナル配列を、たとえば酵母イン ベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイベロ ミセスのα−因子リーダーを含み、後者は１９９１年４月２３日発行の米国特許 第５０１０１８２号に記載がある）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３ ６２１７９号）または１９９０年１１月１５日公表のＷＯ９０／１３６４６に記 載のシグナルによって置換してもよい。哺乳類細胞での発現では在来型ポリペプ チドシグナル配列で十分であるが、その他の哺乳類シグナル配列も、例えばヘル ペスシンプレックスｇＤシグナルなどのウイルス分泌リーダーと同様に適当であ る。在来型ポリペプチド／ポリペプチド変異体をコードするＤＮＡの読取り枠に このような前駆体領域を連結する。 発現ベクターおよびクローニングベクターの両者とも選択された宿主細胞１種 またはそれ以上の中でベクターの複製を可能にする核酸配列を含有する。一般に クローニングベクター中ではこの配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製可能に するものであって、複製開始点または自律的複製配列を含む。このような配列は 各種の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ ３２２からの複製開始点は殆どのグラム陰性細菌に適し、２μプラスミド開始点 は酵母に適し、種々のウイルス（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳ ＶまたはＢＰＶ）の開始点は哺乳類細胞中でのクローニングベクターのために有 用である。一般に複製開始点の成分は哺乳類発現ベクターには不要である（ＳＶ ４０の開始点は典型的には早期プロモーターを含むという理由のみで使用するこ ともある）。 発現ベクターおよびクローニングベクターは選択マーカーとも呼称される選択 遺伝子を含有すべきである。典型的な選択遺伝子は次のような蛋白質をコードす る。（ａ）たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテト ラサイクリンのような抗生物質またはその他の毒素に対する耐性を与えるもの。 （ｂ）相補的栄養素要求性欠乏。または（ｃ）複合培地からは入手できない必須 栄養素、たとえばバチルス属に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝 子を供給するもの。選択方式の一例では宿主細胞の増殖を休止させる薬剤を使用 する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は薬剤耐性を与える蛋白質を生産 して選択条件で生存する。この主な選択の例は薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅ ｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１巻：３２７頁［１９８ ２年］）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９ 巻：１４２２頁［１９８０年］）またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎなど、 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｉ．、５巻：４１０〜４１３頁［１９８５年］）を使 用する。前記三例は真核生物制御下に各々適当な薬剤Ｇ４１８またはネオマイシ ン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）、またはハイグロマイシン に対する耐性を伝達するために細菌遺伝子を採用する。 哺乳類細胞に対する適当な選択マーカーの別種の例は、たとえばＤＨＦＲまた チミジンキナーゼのようにポリペプチド核酸の取込みに競合して細胞の確認を可 能にするものである。哺乳類細胞形質転換体を形質転換体のみがマーカー取込み のために独特に生存に適応する選択圧下に置く。選択遺伝子およびポリペプチド をコードするＤＮＡの両者を増幅に導くように培地の選択薬剤濃度を順次変化さ せて形質転換体を培養することによって選択圧を加える。増加したポリペプチド 量は増幅されたＤＮＡから合成される。増幅可能な遺伝子の別種の例にはメタロ チオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデ ノシンデアミネース、オルニチンデカルボキシレース、その他を含む。 例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞は最初にＤＨＦＲの競合的拮 抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体全部 を培養することによって確認する。野生型ＤＨＦＲを用いる時に適当な宿主細胞 はＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、７７巻：４２１６頁（１９８０年）が記載したようにして製造し、増殖した ＤＨＦＲ作用欠失チャイニースハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列である。次に 形質転換した細胞を濃度を上げたメトトレキセートと接触させる。これでＤＨＦ Ｒ遺伝子の多重コピーおよび同時にたとえばポリペプチドをコードするＤＮＡの ような発現ベクターを含む他種ＤＮＡの多重コピーも合成される。例えばＭｔｘ に対して高度に耐性の突然変異ＤＨＦＲ遺伝子を採用（ＥＰ１１７０６０）すれ ば内因性ＤＨＦＲの存在に関係なくこの増幅技術をたとえばＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ６１・ＣＨＯ−Ｋ１など適当な宿主で使用できる。 あるいは、ポリペプチド、野生型ＤＨＦＲ蛋白質およびたとえばアミノグリコ シド３’−ホスホトランスフェレース（ＡＰＨ）のようなその他の選択マーカー をコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換した宿主細胞（特に内因性 ＤＨＦＲを含む野生型宿主）はたとえばカナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８ のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択マーカーに対する選択剤を含む 培地での細胞成長によって選択できる。米国特許第４９６５１９９号参照。 酵母で使用するための適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲ_p７に存在する ｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻： ３９頁［１９７９年］；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど、Ｇｅｎｅ、７巻：１４１頁［１ ９７９年］；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒなど、Ｇｅｎｅ、１０巻：１５７頁［１ ９８０年］）。ｔｒｐ１遺伝子は例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４ −１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５巻：１２頁［１９７７年］）などト リプトファン中で成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを 提供する。そこで酵母宿主細胞ゲノム中にあるｔｒｐ１障害の存在はトリプトフ ァン不在下での成長によって形質転換を検出するために有効な環境を提供する。 同 様にＬｅｕ２−欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）はＬｅｕ２ 遺伝子を有する既知プラスミドによって補足される。 これに加えて１．６μｍ円形プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターはクルイ ベロミセス酵母の形質転換に使用できる。Ｂｉａｎｃｈｉなど、Ｃｕｒｒ．Ｇｅ ｎｅｔ．、１２巻：１８５頁（１９８７年）。最近、Ｋ．ｌａｃｔｉｓについて ウシの組換えキモシンを大規模に生産する発現系が報告された。Ｖａｎ・ｄｅｎ ・Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：１３５頁（１９９０年）。 クルイベロミセスの工業株によるヒトの組換え成熟血清アルブミンの分泌のため の安定な多重コピー発現ベクターも報告された。Ｆｌｅｅｒなど、Ｂｉｏ／Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：９６８〜９７５頁（１９９１年）。 発現ベクターおよびクローニングベクターは通常宿主生物が認識するプロモー ターを含み、ポリペプチド核酸に作動可能に結合している。様々な宿主細胞候補 が認識するプロモーター多数がよく知られている。これらのプロモーターは起源 のＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを取出し、分離したプロモータ ー配列をベクターに挿入することによってポリペプチドをコードするＤＮＡに作 動可能に結合させる。 原核生物宿主で使用するために適当なプロモーターにはβ−ラクタメースおよ びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７５巻：６１ ５頁［１９７８年］；およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：５ ４４頁［１９７９年］）、アルカリホスファテース、トリプトファン（ｔｒｐ） プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ． 、８巻：４０５７頁［１９８０年］；およびＥＰ３６７７６）および、たとえば ｔａｃプロモーター（ｄｅＢｏｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ、８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］）のようなハイブリッドプロ モーターを包含する。しかしながらその他の既知の細菌プロモーターも適当であ る。それらのヌクレオチド配列も報告されており（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔなど、 Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁［１９８０年］）、必要とする制限部位を供給する ためのリンカーまたはアダプターを用いてこのポリペプチドをコードするＤＮＡ にそ れらを作動可能に連結することが熟練した作業者には可能である。細菌系で使用 するためのプロモーターにはポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に結合 するシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含むであろう。 真核生物のためのプロモーター配列が知られている。ほとんど全ての真核生物 遺伝子は転写が開始される部位から約２５から３０塩基上流に存在するＡＴ豊富 な領域を持つ。多数の遺伝子の転写開始点から７０から８０塩基上流に見出され る別の配列はＣＸＣＡＡＴ領域であって、このＸはいかなるヌクレオチドでもよ い。殆どの真核生物遺伝子の３’末端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、これはコード 配列の３’末端にポリＡテイルを付加するシグナルであるかも知れない。これら の配列は全て真核生物発現ベクターに適当に挿入される。 酵母宿主で使用するための適当なプロモーター配列の例には３−ホスホグリセ レートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻 ：２０７３頁［１９８０年］）または、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒ ド−３−ホスフェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルベート脱カルボキシレ ース、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメレース、 ３−ホスホグリセレートミューテース、ピルベートカイネース、トリオースホス フェートイソメレース、ホスホグルコースイソメレース、およびグルコカイネー スのようなその他の解糖酵素（Ｈｅｓｓなど、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ・Ｒｅ ｓ．、７巻：１４９頁［１９６８年］；およびＨｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、１７巻：４９００頁［１９７８年］）のプロモーターを包含する。 誘導プロモーターである酵母プロモーターは転写が増殖条件によって制御され るという別の利点を有するが、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、 酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセ ルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクト ースの利用を起こす酵素のプロモーター領域がある。酵母発現に使用するために 適当なベクターおよびプロモーターはさらにＨｉｔｚｅｍａｎなど、ＥＰ７３６ ５７Ａに記載されている。酵母のエンハンサーは酵母プロモーターとともに有利 に使用される。 哺乳類宿主細胞のベクターからのポリペプチド転写は、例えばポリオーマウイ ルス（１９８９年７月５日発行英国特許第２２１１５０４号）、アデノウイルス （たとえばアデノウイルス２のような）、ウシのパピローマウイルス、トリの肉 腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およ び最も好ましくはサルのウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムか ら得られるプロモーター；たとえばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリン プロモーターなど異種哺乳類プロモーターから得られるプロモーター；または熱 ショックプロモーターから得られるプロモーター；によって制御される。 ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０の制限断片から好 都合に得られ、これにはＳＶ４０ウイルスの複写開始点も含有する。Ｆｉｅｒｓ など、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻：１１３頁（１９７８年）；Ｍｕｌｌｉｇａｎと Ｂｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２〜１４２７頁（１９８０年）； Ｐａｖｌａｋｉｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８ 巻、７３９８〜７４０２頁（１９８１年）。ヒトサイトメガロウイルスの即時型 プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として好都合に得られる。Ｇｒｅｅｎ ａｗａｙなど、Ｇｅｎｅ、１８巻：３５５〜３６０頁（１９８２年）。ウシのパ ピローマウイルスをベクターとして使用する哺乳類宿主でのＤＮＡ発現系は米国 特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１ ９７８号に記載されている。サル細胞中での免疫インターフェロンをコードする ｃＤＮＡの発現に関するＧｒａｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９５巻：５０３〜５０ ８頁（１９８２年）；ヘルペスシンプレックスウイルスから得たチミジンキナー ゼプロモーターの制御下、サル細胞中でのヒトのβ−インターフェロンｃＤＮＡ の発現に関するＲｅｙｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（ １９８２年）；マウスおよびウサギ培養細胞中でのヒトのインターフェロンβ１ 遺伝子の発現に関するＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻、５１６６〜５１７０頁（１９８２年）；およびラ ウス肉腫ウイルスの長末端リピートをプロモーターとして使用するＣＶ−１サル 腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ 細胞、 およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞中での細菌ＣＡＴ配列の発現についてのＧｏｒ ｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：６７７ ７〜６７８１頁（１９８２年）も参照。 ポリペプチドをコードするＤＮＡの高等真核生物による転写はベクターにエン ハンサー配列を挿入することによってしばしば増加する。エンハンサーは比較的 に方向および位置について依存性がなく、転写ユニットに対して５’（Ｌａｉｍ ｉｎｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：９９３ 頁[１９８１年]）および３'（Ｌｕｓｋｙなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ． 、３巻：１１０８頁［１９８３年］）、イントロン中（Ｂａｎｅｒｊｉなど、Ｃ ｅｌｌ、３３巻：７２９頁［１９８３年］）、ならびにコード配列自体の内部（ Ｏｓｂｏｒｎｅなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．、４巻：１２９３頁［１９ ８４年］）に見出されている。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブ ミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）からは多数のエンハンサー配 列が今までに知られている。しかしながら、真核生物細胞のウイルスから得たエ ンハンサーを典型的には利用する。具体例には複製開始点の後期側（ｂｐ１００ 〜２７０）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモータ ーエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびア デノウイルスエンハンサーを包含する。真核生物プロモーターの活性化に対する エンハンサーエレメントに関するＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜 １８頁（１９８２年）も参照。エンハンサーはベクター中にポリペプチドをコー ドする配列の５’または３’の位置にスプライスしてもよいが、プロモーターか ら５’の部位に配置するのが好ましい。 真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他種多細胞生 物からの有核細胞）に使用する発現ベクターは転写終結およびｍＲＮＡ安定化の ために必要な配列を含むであろう。この配列は真核生物またはウイルスのＤＮＡ またはｃＤＮＡに共通して５’および時には３’非翻訳領域から得られる。これ らの領域はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中でポリアデニル化 断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 前記成分を１個またはそれ以上含む適当なベクターの構築には標準的連結技術 を採用する。分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、裁断し、必要なプ ラスミドを作製するように設計した形に再連結する。 構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認するための分析用には、連結 混合物を用いて大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、 形質転換に成功したものをアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性の適当 な方で選択する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアー ゼ消化によって分析し、および／またはＭｅｓｓｉｎｇなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・ Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：３０９頁（１９８１年）の方法またはＭａｘａｍ など、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５巻：４９９頁（１９８０年）の方法に よって配列決定する。 この発明の実行に特に有用なものはポリペプチドをコードするＤＮＡの哺乳類 細胞における一過性発現を提供する発現ベクターである。一般に、一過性の発現 には宿主細胞中で効率的に複製することができ、宿主細胞が発現ベクターを多数 コピーを蓄積し、それでこの発現ベクターがコードする所望のポリペプチドを高 濃度で合成する発現ベクターの使用を含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、前出、１６ ．１７〜１６．２２。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる一過性発現系 でクローニングしたＤＮＡがコードするポリペプチドの便利でポジティブな確認 ができ、ならびに所望の結合特異性／親和性を有するポリペプチド変異体の迅速 な検索が可能になる。 組換え脊椎動物細胞培養でポリペプチドの合成に適応させるために適当な他の 方法、ベクター、および宿主細胞はＧｅｔｈｉｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９３ 巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）；Ｍａｎｔｅｉなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８ １巻：４０〜４６頁（１９７９年）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎなど、ＥＰ１１７０６０ 号およびＥＰ１１７０５８号に記載されている。ポリペプチドの哺乳類細胞培養 での発現用に特に有用なプラスミドはｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７）またはｐＳ ＶＩ６Ｂ（１９９１年６月１３日公表のＰＣＴ公表番号ＷＯ９１／０８２９１） である。 ポリペプチド発現のための宿主細胞系列の選択は主として発現ベクターに依存 する。本明細書のベクターをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞 は前記の原核生物、酵母、その他の高等真核生物細胞である。この目的のために 適当な原核生物にはたとえばグラム陰性またはグラム陽性生物のような真性細菌 であって、例えば大腸菌のようなエシェリキア、エンテロバクター、エルウィニ ア、クレブシェラ、プロテウス、チフス菌のようなサルモネラ、セラチアマルセ ッセンスのようなセラチア、およびシゲラ、ならびにたとえばＢ．サチリスおよ びＢ．リヘニホルミス（たとえばＢ．リヘニホルミス４１Ｐは１９８９年４月１ ２日発行のＤＤ２６６７１０に開示されている）のようなバシラス、緑膿菌のよ うなシュードモナス、およびストレプトミセスを含む。好適な大腸菌クローニン グ宿主の一つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、たとえば大腸菌 Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣ Ｃ２７３２５）のようなその他の株も適当である。これらの実例は例示であって 限定ではない。組換えＤＮＡ生成物の発酵のための普通の宿主株であるから株Ｗ ３１１０は殊に好適な宿主または宿主親である。宿主細胞は蛋白質分解酵素の分 泌量が最低なものが好ましい。例えば株Ｗ３１１０に蛋白質をコードする遺伝子 に突然変異を起こすように修飾することもあるが、このような宿主の例には大腸 菌Ｗ３１１０の株２７Ｃ７を含む。２７Ｃ７の完全なゲノタイプはｔｏｎＡ△ｐ ｔｒ３・ｐｈｏＡ△Ｅ１５△（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｏｍｐＴ△ｄｅｇＰ４ １ｋａｎ⁷である。株２７Ｃ７は１９９１年１０月３０日にアメリカンタイプカ ルチャーコレクションにＡＴＣＣ５５２４４として寄託された。あるいは１９９ ０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示されている突然変異周縁 細胞質プロテアーゼを有する大腸菌株を採用しうる。あるいはクローニング法、 例えばＰＣＲまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応も適当である。 原核生物に加え、たとえば糸状菌または酵母のような真核微生物もポリペプチ ドをコードするベクター用に適するクローニングまたは発現宿主である。サッカ ロミセスセレビジェまたはパン酵母は下等真核微生物宿主の中で最も普通に使用 される。しかしながら、その他の属、種、および株の多数が同様に利用可能で本 発明に有用である。たとえばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｐｏｍ ｂｅ（ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：１４０頁［１９８１ 年］；１９８５年５月２日発行のＥＰ１３９３８３号）；たとえばＫ．ｌａｃｔ ｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒ ｔなど、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７３７頁［１９８３年］）、Ｋ．ｆｒａｇ ｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６０ ４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ （ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６９０ ６；Ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｒｇなど、前出）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎ ｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米 国特許第４９４３５２９号；Ｆｌｅｅｒなど、前出）；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３０７０；Ｓｒ ｅｅｋｒｉｓｈｎａなど、Ｊ．Ｂａｓｉｃ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻：２ ６５〜２７８頁［１９８８年］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ・ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ・ｃｒａｓｓａ（Ｃ ａｓｅなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻：５２５ ９〜５２６３頁［１９７９年］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ・ｏｃｃｉｄ ｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ３９４５３８号）のような Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；およびたとえばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎ ｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日発行の ＷＯ９１／００３５７）、およびたとえばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎ ｃｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２ 巻：２８４〜２８９頁［１９８３年］；Ｔｉｌｂｕｒｎなど、Ｇｅｎｅ、２６巻 ：２０５〜２２１頁［１９８３年］；Ｙｅｌｔｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：１４７０〜１４７４［１９８４年］）およ びＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙとＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ・Ｊ．、４巻：４７５〜 ４７９頁［１９８５年］）のようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのような糸状菌；な どがある。 グリコシル化されたポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞は多細胞生物 に由来する。このような宿主細胞は複雑なプロセッシングおよびグリコシル化の 活性を有する。原理的にいずれの脊椎動物または無脊椎動物由来の高等真核生物 細胞培養も作動可能である。無脊椎動物細胞の例は植物および昆虫細胞である。 多数のバキュロウイルス株および変異体および、たとえばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ・ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ・ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄ ｅｓ・ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ・ｍｅｌａｎｏｇａ ｓｔｅｒ（ミバエ）およびＢｏｍｂｙｘ・ｍｏｒｉのような宿主からの対応する 可能な昆虫宿主細胞が確認されている。たとえばＬｕｃｋｏｗなど、Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：４７〜５５頁（１９８８年）；Ｍｉｌｌｅｒなど、 「遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、Ｓｅｔｌｏｗな ど編、８巻、（Ｐｌｅｎｕｍ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１９８６年）中、２７ ７〜２７９頁；およびＭａｅｄａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻：５９２〜５９ ４頁（１９８５年）参照。遺伝子移入のためのウイルス株多種が公共的に入手可 能で、たとえばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ・ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ・ＮＰＶのＬ− １変異体およびＢｏｍｂｙｘ・ｍｏｒｉＮＰＶのＢｍ−５株があり、これらのウ イルスを本発明に従って本明細書のウイルスとして使用してもよく、特にＳｐｏ ｄｏｐｔｅｒａ・ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に遺伝子移入するために本発明に従 って使用してもよい。 綿、トウモロコシ、バレイショ、大豆、ペチュニア、トマトおよび煙草の植物 細胞培養物も宿主として利用できる。典型的には植物細胞は予めポリペプチドＤ ＮＡを含むように操作しておいた細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓのある種の株とインキュベーションして遺伝子移入する。植物細胞 培養物をＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとインキュベーションする間にポリペプチ ドをコードするＤＮＡが植物細胞宿主に移行して遺伝子移入し、適当な条件下に ポリペプチドＤＮＡを発現する。これに加えて植物細胞に適応するたとえばノパ リン合成酵素プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような調節配列 およびシグナル配列が入手可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａ ｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１巻：５６１頁（１９８２年）。これに加え、Ｔ−ＤＮＡ７ ８０遺伝子の上流領域から分離したＤＮＡセグメントは組換えＤＮＡ含有植物組 織中で植物発現遺伝子の転写レベルを活性化または増加することができる。１９ ８９年６月２１日発行のＥＰ３２１１９６。 脊椎動物細胞の培養での増殖（組織培養）は近年では日常的操作になっている （「組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒ ｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、［１９７３年］）。哺乳類宿主細 胞系の実例はＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７、ＡＴＣ Ｃ・ＣＲＬ１６５１）；ヒトの胚腎系列（２９３細胞または懸濁培地での増殖の ためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ ｒｏｌ．、３６巻：５９頁［１９７７年］）；幼若ハムスター腎細胞（ＢＨＫ、 ＡＴＣＣ・ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ 、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ、７７巻：４２１６頁［１９８０年］）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａ ｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁［１９８０年 ］）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細 胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ−１５８７）；ヒトの子宮頚癌細胞（Ｈ ＥＬＡ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ２）；イヌの腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ３ ４）；バッファローラットの肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１４４２） ；ヒトの肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７５）；ヒトの肝細胞（Ｈｅｐ・ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒなど、Ａｎａｌｓ・Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．、３８３巻：４４〜６８頁［１９８２年］）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞； およびヒトの肝癌細胞系（Ｈｅｐ・Ｇ２）である。 宿主細胞にこの発明の前記発現ベクターまたはクローニングベクターを遺伝子 移入し、プロモーターを誘導するために適当に修正した通常の栄養培地で培養し て形質転換体を選択するか、または所期の配列をコードする遺伝子を増幅する。 使用する宿主細胞に依存して、遺伝子移入はその細胞に適する標準的技術を使用 して行う。Ｓａｍｂｒｏｏｋなどの前出の成書の１．８２章に記載の塩化カルシ ウムを採用するカルシウム処理または電気穿孔を一般に実質的細胞壁バリアーを 有する原核生物またはその他の細胞に使用する。Ｓｈａｗなど、Ｇｅｎｅ、２３ 巻：３１５頁（１９８３年）および１９８９年６月２９日公表のＷＯ８９／０５ ８５９に記載のようにある種の植物細胞の形質転換にはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ・ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染を使用する。これに加えて１９９１年 １月１０日公表のＷＯ９１／００３５８号に記載のように超音波処理を用いて植 物に遺伝子移入することもある。 このような細胞壁を持たない哺乳類細胞ではＧｒａｈａｍとｖａｎ・ｄｅｒ・ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７８年）の燐酸カル シウム沈降法が好適である。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面はＡｘｅｌ が１９８３年８月１６日発行の米国特許第４３９９２１６号に記載している。酵 母の形質転換は典型的にはＶａｎ・Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１ ３０巻：９４６頁（１９７７年）およびＨｓｉａｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７６巻：３８２９頁（１９７９年）の方法に従 って実行する。しかしながら、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法、たとえば核内 マイクロインジェクション、電気穿孔、無処置細胞との細菌原形質融合またはた とえばポリブレン、ポリオルニチンなどのポリカオチン、その他も使用しうる。 哺乳類細胞を形質転換する様々な技術についてはＫｅｏｗｎなど、Ｍｅｔｈｏｄ ｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９年）、Ｋｅｏｗｎなど、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻：５２７〜５３７頁（１９９０年 ）およびＭａｎｓｏｕｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３６巻：３４８〜３５２頁（１ ９８８年）を参照。 ポリペプチドを産生するための原核生物細胞はＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、 に一般的に記載されている適当な培地中で培養する。 この発明のポリペプチドを産生するために使用する哺乳類宿主細胞は様々な培 地中で培養してもよい。商業的に購入できる培地、たとえばＨａｍのＦ１０（Ｓ ｉｇｍａ社）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａｓ社）、ＲＰＭＩ−１６ ４０（Ｓｉｇｍａ社）、およびダルベッコの修正イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、 Ｓｉｇｍａ社）は宿主細胞を培養するために適当である。これに加えここに全開 示を参考のために引用するＨａｍとＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、５８ 巻：４４頁（１９７９年）、ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４７６７７０４、４６５ ７８６６、４９２７７６２または４５６０６５５号、ＷＯ９０／０３４３０、Ｗ Ｏ８７／００１９５号；米国再発行特許第３０９８５号；または米国特許第５１ ２２４６９号に記載の培地はいずれも宿主細胞用培養培地として使用しうる。こ れらの培地のいずれも要すれば有糸分裂促進剤（たとえばインスリン、トランス フェリン、または表皮増殖因子のようなもの）、塩（たとえば塩化ナトリウム、 カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートのようなもの）、緩衝液（たとえ ばＨＥＰＥＳのようなもの）、ヌクレオシド（たとえばアデノシンおよびチミジ ンのようなもの）、抗生物質（たとえばゲンタマイシン（商標）薬剤のようなも の）、希エレメント（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と 定義する）、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を添加してもよい。当 技術分野の熟練者に知られているその他の必要な添加物も適当な濃度で添加して もよい。ｇａｓ６の産生のためには、ビタミンＫがｇａｓ６のＡドメインにある γ−カルボキシル化を減少させることがあるので、ｇａｓ６核酸で形質転換した 宿主細胞はビタミンＫ不在下に培養するのが望ましいかもしれない。あるいは、 形質転換した宿主細胞は所望なら例えばワルファリンのようなカルボキシレース 阻害剤の存在下に培養できる。 たとえば温度、ｐＨ、その他のような培養条件は発現用に選択した宿主細胞に 使用した前記のものであって、通常の熟練した専門家には明白となるであろう。 一般に、哺乳類細胞培養物の生産性を最大にする原理、プロトコル、および実際 的技術は「哺乳類細胞バイオテクノロジー：実際的手法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ・ Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ・Ｐｒａｃｔｉｃａｌ・Ａｐｐｒｏ ａｃｈ）」、Ｍ．，Ｂｕｔｌｅｒ編、ＩＬ出版、１９９１年に見出される。この 開示で参照する宿主細胞は培養中の細胞ならびに宿主動物中の細胞を包含する。 ポリペプチドは培養培地に分泌されたポリペプチドから回収するのが好ましい が、宿主細胞の溶解物から回収することもある。 このポリペプチドを他のポリペプチドから精製するために、宿主細胞または溶 解断片いずれかの破砕粒子を例えば遠心分離または限外濾過によって分離する。 所望ならこの蛋白質を商業的に入手できる蛋白質濃縮フィルターで濃縮し、続い てそのポリペプチドをヘパリンセファロースクロマトグラフィー、免疫親和性ク ロマトグラフィー、イオン交換カラム分割(たとえばＤＥＡＥまたはカルボキシ メチルまたはスルホプロピル基を含むマトリックスなど)、ブルーセファロース クロマトグラフィー、ＣＭ−ブルーセファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ 、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、コンＡ−セファロ ース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、またはプ ロテインＡセファロース、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマ トグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（たとえば脂肪族基付加 シリカゲルなど）、たとえばセファデックス分子篩またはサイズ排除クロマトグ ラフィーなどを使用するゲル濾過、ポリペプチドを選択的に結合するカラム上の クロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈降から選択し た段階１個またはそれ以上によって他の不純物から分離してもよい。前記段階の いずれにもプロテオリシスを阻害するためにプロテアーゼ阻害剤を添加してもよ く、また偶発的夾雑物の増殖を防止するために抗生物質を添加してもよい。適当 なプロテーアーゼ阻害剤の例にはフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭ ＳＦ）、リューペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、４−（２−アミノエチ ル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩−ベスタチン、キモスタチンおよび ベンズアミジンを包含する。 残基を欠失、挿入または置換したポリペプチド変異体は変異が起こす実質的な 性質の変化を考慮しつつ在来型ポリペプチドと同じ様式で回収される。例えばエ ピトープで標識したポリペプチド製品はそのエピトープ標識に対する抗体を含有 して融合ポリペプチドを吸着する免疫親和性カラムを使用する精製を促進する。 たとえばウサギポリクローナル抗ポリペプチドのカラムのような免疫親和性カラ ムは少なくとも１個の残留する免疫エピトープに結合することでポリペプチド変 異体を吸着する目的で採用できる。当技術分野の熟練者は在来型ポリペプチドに 適する精製法は組換え細胞培養での生産にはポリペプチドまたはその変異体の性 質の変化に応じた修正が必要かもしれないことを認識することとなろう。 ４．医薬的製剤および人工器具 分離したシュワン細胞および医薬的に許容される担体または基剤を含む前記の 医薬的製剤は当技術分野でよく知られている技術を使用して製造できる。要すれ ばこの医薬的製剤は有糸分裂促進剤（たとえばヘレグリンおよびｇａｓ６など） および他の成分（たとえばラミニンのような細胞外マトリックス蛋白質など）の １種またはそれ以上を含有してもよい。医薬的に許容される基剤としてゼラチン 状支持体を使用するならシュワン細胞を基剤の液相に導入してもよく、後にそれ を固化する処理ができる（たとえば重合前の基剤を重合させることがある）。例 えば、シュワン細胞を酢酸水に溶解したコラーゲンに添加することもある。この 混合物をたとえばＮａＯＨのような適当な塩基の添加によって中性ｐＨとし、塩 の添加で等張性にするとゲルが形成されることとなろう。 シュワン細胞はまた、文献に記載されているような人工器具または装置中でも 送達できる。一般に、シュワン細胞（好ましくはゼラチン状基剤中に製剤化した もの）を封入した固体チューブを末梢神経、視神経または神経系のその他の部分 にある間隙を橋渡しするための人工器具として使用する。例えば、Ｐｉａｎｏと Ｂｕｎｇｅ、Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１１４巻：２５４〜２５７頁（ １９９１年）は神経修復人工器具として使用できるシュワン細胞封入重合コラー ゲ ２巻（９号）：３３１０〜３３２０頁（１９９２年）はシュワン細胞を接種した 半浸透性誘導経路を示している。米国特許第５０３０２２５号は切断した神経の 末端を受入れるのに適合させた開口部およびそれに通じて神経を再生するための 管腔を有する電気的に荷電した膜を含む切断した神経再生のための医療用装置ま たは人工器具に関する。この装置を患者に設置する前にその管腔にはシュワン細 胞を封入できる。米国特許第４６６２８８４号は本明細書に記載する技術を用い て分離したシュワン細胞も封入できる別な型の神経再生促進用人工器具を記載し ている。 ５．シュワン細胞の非治療的使用 シュワン細胞はＮＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＣＮＴＦおよびＢＤＮＦを含む神経栄養 因子および神経突起促進因子を多数産生する（Ｃｏｌｌｉｅｒなど、Ｅｘｐ．Ｎ ｅｕｒｏｌ．、１２４巻：１２９〜１３３頁［１９９３年］）。従って本明細書 に記載の技術を使用して分離し、培養したシュワン細胞はこれら因子を産生する ために使用できる。シュワン細胞特有の因子、たとえばＰ７５^NGFR、Ｓ−１００ 蛋白質、ラミニンおよびＧＦＡＰなど、の分離のためには細胞培養してシュワン 細胞の集団を得るのが好ましい。これらの因子はそれ自体で診断薬として有用で あり、また診断用抗体を作製するための抗原として使用できる。 これとは別の態様ではシュワン細胞は目的ポリペプチドをコードする核酸で形 質転換して、本明細書に前記したようにして組換え技術によってポリペプチドを 生産するために使用できる。 シュワン細胞の初代培養物は細胞培養において他の細胞の増殖および／または 分化を支持するために使用することもある。この様式ではシュワン細胞はニュー ロン生存または細胞培養における胚ニューロン前駆体の増殖および生存率を促進 することもある。 シュワン細胞に対する他の有糸分裂促進剤および増殖阻害因子の確認を促進す るには細胞培養においてこの細胞の安定な集団を持つことが望ましい。 ６．シュワン細胞の治療的使用 哺乳類シュワン細胞（好ましくはヒトのシュワン細胞）の集団を切断した中枢 軸索の再生に影響を与える目的で損傷した脊髄の部分に移植するため、末梢神経 損傷の修復を促進するため、および多重自己移植の代用として、持つことは有益 である。Ｌｅｖｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４巻、３号：１３０ ９頁（１９９４年）参照。少量の生検物から多量の自己移植材料を得る細胞培養 技術は既に広範囲火傷を被覆するためにヒトの表皮細胞を提供することで臨床的 成功を収めている（Ｇａｌｌｉｃｏなど、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３１１巻 ：３３８〜４５１頁［１９８４年］）。さらのその上、ヒト異種移植からのシュ ワン細胞が免疫抑制されたマウスからの末梢性軸索をミエリン化し、再生するこ とができることが証明されている（Ａｇｕａｙｏなど、Ｎａｔｕｒｅ、２６８巻 ：７５３〜７５５頁［１９７７年］；およびＡｇｕａｙｏなど、Ｓｏｃ．Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ．Ｓｙｍｐ．、４巻：３６１〜３８３頁［１９７９年］）。従って、 前記手法がヒトでも成功するであろうことが期待される。 本明細書に記載する技術を使用して分離し、培養したシュワン細胞はたとえば 前記の神経系損傷を処置するために使用できる。分離したシュワン細胞、シュワ ン細胞を含有する医薬組成物またはシュワン細胞を封入した人工器具は当技術分 野で知られているいずれかの方法を使用して神経系障害部に導入できる。哺乳類 にシュワン細胞を導入する方法には神経障害部を露出して細胞を導入する外科的 手法および障害部を露出せずに障害部に細胞を直接に注射するものを包含する。 例えば脊髄が破壊されていれば、椎弓切除術を使用して脊髄の患部を露出する。 反跳巣の後、損傷した脊髄の中枢領域をマクロファージの作用によって取出して 液体が充満した嚢胞を残す。超音波を使用して嚢胞を可視化し、嚢胞欠損部にシ ュワン細胞（要すれば医薬的に許容される担体中の）の注射を行なってもよい。 構造的に明確に規定された神経（たとえば顔面または視神経）の近くに障害が起 きた時はその患部神経セグメントのサイズおよび形に合わせて前記送達器具を成 形して神経人工器具を形成してもよい。患部神経を外科的に露出し、障害部を除 き、神経人工器具に置換え、その場所に縫合、その他の方法で固定してもよい。 別の態様では、脊髄または大脳半球内の梗塞部分または深部脱髄部分の中に起き た障害ではシュワン細胞（好ましくは医薬用液体担体中）を患部に（たとえばパ ーキンソン病の症例では脳に）放射線誘導を使用して組織内圧および／または頭 蓋内圧の上昇を避けるように注射する材料を組織が容易に適応する容積に限定し て注射してもよい。例えばＳｐｅｎｃｅｒなど、パーキンソン病患者尾形核への ヒト胎児中脳組織の片側移植、Ｎｅｗ・Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２７巻：１５ ４１〜１５４８頁（１９９２年）を参照。患部にシュワン細胞を送達するその他 の技術も入手できる。例えば馬尾障害の修復におけるシュワン細胞の送達に関す るＷ Ｏ９２／０３５３６号を参照。 患者に投与すべきシュワン細胞の「有効量」は例えば治療の対象、投与経路、 および患者の状況に依存するものである。従って治療者には最適な治療効果を得 るための用量を決め、投与経路を修正することが必要となろう。典型的な用量は 例えばシュワン細胞約１×１０⁴〜１×１０⁶個の範囲になることもあろう。シュ ワン細胞は患者に単回または多回投与してもよい。可能ならば、例えば最初に前 記のような動物モデルを使用して適当な用量範囲を試験管内で決定し、それから ヒトの患者に対する用量範囲を外挿してもよい。 次の実施例は例示目的で提供するものであって限定のためではない。本明細書 では全ての引用文献の開示は参考のために明示的に引用するものである。実施例１ ラットのシュワン細胞の分離および培養 この実施例は均質なシュワン細胞培養物を与えるが線維芽細胞の増殖は支持し ない血清不含規定培養系を開示する。この血清不含培養系で初代培養の初日から 迅速なシュワン細胞成分の継続的増殖および継代培養ができる。線維芽細胞は増 殖をしないで急速に培養物から消失し、継代数２では純粋なシュワン細胞が得ら れる。この手法を使用して、ラット胚および成体ラット双方の後根神経節（ＤＲ Ｇ）から正常なシュワン細胞系列を連続的に増殖し、また樹立することができる 。これらの細胞は顕著な細胞喪失および形質の変化した表現型の細胞が急増する 「クライシス」期間は経ない。しかしながら、これらの細胞は増殖および付着因 子に対する応答の相違および増殖および付着因子産生の相違によって特徴付けら れる明白な増殖相を経る。 （ｉ）初代培養 Ｅ１４胚および成体Ｓｐｒａｇｕｅ・Ｄａｗｌｅｙラットから後根神経節（Ｄ ＲＧ）を摘出し、解剖用顕微鏡下に結合組織を除去した。清浄なＤＲＧをコラー ゲン／ディスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）とともに胚 では０．３％、成体ＤＲＧでは５％の濃度で４５分間インキュベーションした。 次に、ＤＲＧを１ｍＬＰｉｐｅｔｔｍａｎ（商標）で穏やかに採取して分散させ た。分散した細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）して集め、Ｆ１２／Ｄ ＭＥＭで３×洗浄し、ラミニン被覆皿上で７Ｆ：ヒト組換えインスリン（５μｇ ／ｍＬ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍＬ）、プロゲステロン（２×１０^-8 Ｍ）、ウシ下垂体抽出物（Ｒｏｂｅｒｔｓなど、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ．；Ｌｕｎｇ・Ｃｅｌｌ．＆・Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３巻：４１５〜 ４２５頁［１９９０年］）（１０μＬ／ｍＬ）、組換えヘレグリン（３ｎＭ、Ｈ ＥＲ−β１_{177 〜244}）（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉなど、前出）、フォルスコリン（ ５μＭ）、およびα−トコフエロール（５μｇ／ｍＬ）添加Ｆ１２／ＤＭＥＭ中 に塗布した。胚では４日後、成体細胞は７日後にシュワン細胞は全面密集単層に まで増殖した。 ラミニン基質上に増殖した初代培養物からの細胞をスプリット比１：４で４日 毎にプロゲステロン、インスリン、α−トコフェロール、ヘレグリン、フォルス コリンおよびトランスフェリンならびにウシ下垂体抽出物を添加した培地でラミ ニン被覆皿上で継代培養した。最初に見られた迅速な増殖が第８次培養（１６回 目の倍増）まで継続した。この時点で成体および胚培養物はその増殖を「休止」 した。これは培養物が生きているが分裂しない７〜９日の期間に一致した。この 期間の終わりに培養物中の別個に分裂を開始した複製培養物を含む全細胞が分裂 を再開して最初の迅速な倍増時間が継代培養３０回以上にまで継続した。「クラ イシス」または老化現象に典型的に見られるような個体激減または耐性副集団の 選択は存在しなかった。同様な新らしい初代培養を開始する時にはこの休止は再 現される現象であった。後の継代培養からの調整培地、余分なビタミンまたは栄 養素またはその他の増殖因子はこの増殖休止を変えないようであった。しかしな がら、ヘレグリン濃度を１ｎＭから１０ｎＭに増加すると休止の開始を継代数１ ０まで延期してラグ期間を短縮した。成体および胚シュワン細胞培養物は形態的 には非常に類似しており、初代培養に典型的な双極紡錘形の形態を継続して示し た。シュワン細胞マーカーであるＧＦＡＰおよびＳ−１００蛋白質で染色すると 成体および胚ＳＣ培養物は継代数３には１００％の細胞が染色された。この細胞 系列を正常ラット胚シュワン細胞（ｎｒＥＳＣまたはＥＳＣ）または正常ラット 成体シュワン細胞（ｎｒＡＳＣまたはＡＳＣ）と命名した。連続培養においてＥ ＳＣは継代数４０以後は核型化されて倍数体核型を維持した。しかしながら、早 期継代数に凍結し、解凍すると異数性および染色体異常が起きた。同様な結果は ＡＳＣ細胞系列でも見られた。 （ｉｉ）免疫組織化学 シュワン細胞をラミニン被覆チャンバースライドに塗布して２日間増殖した。 ＮＧＦ受容体免疫組織化学には生細胞を４ｍｇ／ｍＬモノクローナル抗ＮＧＦｒ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、クローン１９２）の１％ＢＳＡ 含有Ｆ１２／ＤＭＥＭ液中４℃で４時間インキュベーションし、次に同じ培地で ５回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。ＧＦＡＰおよびＳ −１００免疫組織化学について、細胞を燐酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、 ４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで３回洗 浄し、１０％ヤギ血清、０．１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ中で２時間３７ ℃でインキュベーションしてブロックした。販売社の示唆に従って１％ヤギ血清 および０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで希釈したポリクローナル 抗−ＧＦＡＰ（ＩＣＮ社）および抗−Ｓ１００（ＩＣＮ社）とのインキュベーシ ョンを４℃で一夜実行した。ＰＢＳで３回洗浄後、抱合第二抗体、ヤギ抗ウサギ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）₂−ＦＩＴＣ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ社）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）₂−ファイコエ リスリン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を使用して結合した第 一抗体を染色した。Ｎｉｋｏｎ社ＭｉｃｒｏｐｈｏｔＦＸ上、螢光マイクログラ フをエピ螢光で撮影した。ラミニン免疫細胞化学では、シュワン細胞をポリ−Ｄ −リジン上で培養するか、または懸濁液中で２代にわたって増殖させた。細胞を 原位置で固定するか、または細胞を遠心後にスライドに固定し、ＧＦＡＰおよび Ｓ−１００蛋白質について前記のように免疫螢光を測定した。 （ｉｉｉ）マトリックスの研究 ２４ウェルプレートの被覆を種々のマトリックスプロテインと室温で１時間、 ラット尾部コラーゲン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ・Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）については１：１０希釈濃度でおよびヒトの血漿フィ ブロネクチン（ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬ社）、マウスラミニン（ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬ 社）、およびポリ−Ｄ−リジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） については１０μｇ／ｍＬとインキュベーションして行った。ポリ−Ｄ−リジン またはコラーゲンで被覆したプレートは使用する前にＰＢＳで２回洗浄して余分 なマトリックスを除去した。７Ｆ培地中の解離した胚ＤＲＧ細胞を種々の細胞外 マトリックスで前被覆した２４ウェルプレートに塗布した。細胞を観察し、Ｎｉ ｋｏｎ社Ｄｉａｐｈｏｔ倒立位相差顕微鏡を使用して顕微鏡写真を撮影した。培 養９６時間後、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液に分散し、Ｃｏｕｌｔｅｒ（商 標）粒子計数機で計数した。 細胞形態に種々の基質（ラミニン、ポリ−リジン、フィブロネクチン、または コラーゲン）上で顕著な相違が見られた。２４時間以内にラミニン上に塗布した 細胞は組織凝塊から移動して離れ、シュワン細胞はニューロンプロセスから離れ た。ポリリジン基質への細胞移動ははるかに少数で、シュワン細胞およびニュー ロンは組織凝塊の近くに残留した。３日間の培養で、種々の基質上の培養物には さらに驚くべき相違が見られた。ポリリジンおよびコラーゲン上の培養物には広 範囲に神経突起の伸長があったが、シュワン細胞は僅数が細胞凝塊の中央から離 れて移動し、細胞分裂は殆ど見られなかった。フィブロネクチン被覆プレートで も同様にシュワン細胞およびニューロンはそれらを結合する長い突起と共に固定 した凝塊中に残留し、細胞複製は殆どなかった。対照的にラミニン基質上の培養 物は広範囲に複製が起き、急速に分裂するシュワン細胞が容易に確認された。シ ュワン細胞は移動してニューロンから離れてニューロンの固定したクラスターに 散在する全面密集単層を形成した。このニューロンクラスターは浮き上がってプ レートを離れ、最初の継代培養で失われた。初代培養物のこの非常に早期な段階 においてさえ、成体および胚ＤＲＧ双方からのシュワン細胞が急速に分裂して培 養物中の細胞の大多数を占めることが明らかであった。これら細胞を胚細胞が強 い優先性を示すラミニン基質で継代培養した。 非常に類似した増殖パターンが成体ＤＲＧから由来する初代培養物でも見られ た。ここでもラミニン基質に塗布した細胞はニューロン突起から移動して離れ、 分裂を開始したが、一方では他の基質上ではさらに凝集して無活動のままであっ た。これらの細胞もラミニン上で二次培養して多回継代培養した。しかしながら それらは胚細胞のようなラミニンに対する後続継代の強い特異性を示さず、ラミ ニンと同様にポリ−Ｄ−リジンを塗布したセル上でもよく増殖したであろう。 （ｉｖ）増殖因子の研究 記載継代数の成体または胚起源シュワン細胞を検討対象の増殖因子を除去した Ｆ７添加Ｆ１２／ＤＭＥＭ中でラミニン被覆多ウェルプレートに塗布した。この 因子は後に一連の濃度で添加した。細胞はＣｏｕｌｔｅｒ（商標）粒子計数機で 計数する前に９６時間培養した。 細胞は有糸分裂促進剤（プロゲステロン、インスリンおよびヘレグリン）、ビ タミン（α−トコフェロール、ビタミンＥ）、鉄源（トランスフェリン）、なら びにフォルスコリン、およびウシ脳下垂体抽出物を添加した培地中で多回継代培 養した。これらの因子に対する胚および成体細胞の応答を比較した。ＥＳＣおよ びＡＳＣはいずれもｃＡＭＰ刺激剤であるフォルスコリンに対して二相性の増殖 反応を示した。他の増殖因子全部の存在下には両細胞系列において約２．５μＭ −フォルスコリンで最高の刺激が見られた（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの条 件下にヘレグリンもまた主な増殖刺激剤であった。図５Ａおよび図５Ｂは培養継 代数２１におけるＡＳＣおよびＥＳＣのヘレグリンに対する応答を比較する。各 細胞は１〜２ｎＭ−ヘレグリンで半最大応答を示す。ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰ Ｅ）の効果（図６Ａおよび図６Ｂ）はヘレグリンの存在下に見られ、またヘレグ リンの効果はウシ脳下垂体抽出物存在下に両細胞系列で見られる。両細胞系列は ０．１２５μＬ（２１μｇ全蛋白質）までの微量なＢＰＥによって明確に刺激さ れるが、最高の刺激は２〜８μＬに見られる。これら細胞には¹²⁵Ｉ−ヘレグリ ンとの直接的な競合的結合によって証明されるヘレグリン受容体を有する。 両細胞系列で他の主たる増殖刺激剤の一つはインスリンである。インスリン、 ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩに対する応答を図７Ａ〜図７Ｆに示す。ＡＳＣ 細胞は低濃度のＩＧＦ−Ｉおよびインスリンに応答したが、ＩＧＦ−ＩＩの低濃 度までには到らなかった。対照的にＥＳＣ細胞は基本的にＩＧＦ−ＩＩに応答し たが、生理学的濃度でのインスリンまたはＩＧＦ−ＩＩには僅かな刺激しか示さ なかった。非常に高濃度のこの因子３種全部によって両細胞系列ともいくらかの 増殖刺激を示した。 ラミニン基質は前記初代培養段階のみならず、細胞付着およびホルモンおよび 増殖因子に応答する後続する増殖反応がラミニン被覆の存在に依存する後続継代 培養段階においても培養条件の重要な部分である。 （ｖ）ミエリン化の研究 後根神経節ニューロンを６０〜７０日齢成体ラットから分離した。清浄な後根 神経節（ＤＲＧ）を５％コラーゲナーゼ／ディスパーゼで３７℃で解離した。遠 心分離（９００ｒｐｍ、２分間）で細胞を集め、付随細胞を伴うＤＲＧニューロ ンを５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）クッションを利用する遠心分離で豊富化 した。収集した細胞をさらにトリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬ社）で３０分 間３７℃で解離し、９００ｒｐｍで２分間ペレット化した。ペレットをＦ１２／ ＤＭＥＭ中に再懸濁し、単位重力加速度で１％〜３％ＢＳＡ勾配により２回沈降 させてＤＲＧニューロンを精製した。マイクロウェル培養物の滴定および夾雑し ているかも知れないシュワン細胞の観察で測定するとこのプロトコルで精製した ＤＲＧの純度は９９．９％を超えた。再ミエリン化を検討するためＤＲＧニュー ロンおよび樹立したシュワン細胞系列を５ｎｇ／ｍＬのＮＴ−３および１５％ウ シ胎児血清添加Ｆ１２／ＤＭＥＭ中で別々に培養するか、共培養した。培養培地 は毎週１回交換した。培養１週間後、２日毎にＬ−アスコルビン酸を最終濃度５ ０μｇ／ｍＬまで添加した。共培養物は培養４０日目に髄鞘をスーダンブラック で染色した。糖蛋白質関連ミエリン（ＭＡＧ）を免疫細胞化学によって免疫染色 した。培養物を抗ＭＡＧモノクローナル抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ社）と４０℃で４時間インキュベーションし、遊離の抗体を除去するた めに培地で５回洗浄した後に４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細 胞をＰＢＳで３回洗浄し、１０％ヤギ血清ＰＢＳ溶液と２時間インキュベーショ ンしてブロックし、次にヤギの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ペルオキシダーゼ複 合体とインキュベーションした。第二の抗体の特異的結合はＤＡＢ−Ｈ₂Ｏ₂によ る呈色反応を示した。４０日間培養後、ＭＡＧに対して陽性に染色される多数の 軸索が観察された。これはＥＳＣ細胞が軸索をミエリン化する性能を維持してい たことを示す。実施例２ ヒトのシュワン細胞の分離および培養 （ｉ）ｇａｓ６およびヘレグリンの産生 Ｒｓｅ−およびＡｘ１−特異的な抗体を利用してＲｓｅおよびＡｘ１受容体の チロジンキナーゼをヒトのシュワン細胞中に検出した。ヒトシュワン細胞の増殖 を強化するｇａｓ６の性能を測定した。 ヒトのｇａｓ６は組換え的に製造した。ｇａｓ６のｃＤＮＡはヒト脳ｃＤＮＡ の逆転写物からポリメラーゼ連鎖反応クローニングによって取得した。アミノ酸 １〜３１８をコードするｃＤＮＡおよびアミノ酸３１９〜６７８をコードするｃ ＤＮＡを結合することによって全長ヒトｇａｓ６クローンを構築した。ｇａｓ６ のｃＤＮＡはヒト胚脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１μｇを鋳型として使用 するＰＣＲによって報告（Ｍａｒｋなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻 ：２６１６６頁［１９９２年］）のようにしてＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによっ て取得した。ｈｇａｓ６の５’−部分および３’−部分を得るように設計した正 方向および逆方向プライマーは各々次の通り： 組換えｇａｓ６は調整培地から親和性クロマトグラフィーで精製した。ヒトの 胎児腎臓２９３細胞にＭａｒｋなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７巻：２ ６１６６頁（１９９２年）が記載したようにして一過性に遺伝子移入した。４時 間インキュベーションした後に、培地を抗生物質および２μｇ／ｍＬビタミンＫ 含有血清不含増殖培地に置換した。遺伝子移入の２日後および４日後に調整培地 を集めた。遺伝子移入した細胞の調整培地は¹²⁵Ｉ−Ｒｓｅ−ＩｇＧの結合を活 性化したが（Ｍａｒｋなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻：１０７２０ 頁［１９９４年］参照）、非遺伝子移入またはモック遺伝子移入２９３細胞のも のは活性化しなかった。集めた調整培地１Ｌを遠心分離して清澄にし、緩衝液Ａ （５０ｍＭ−トリス塩酸、ｐＨ７．５、０．１％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ−ベンズア ミジン）１容で希釈し、あらかじめ緩衝液Ａと平衡させておいたＲｅｓｏｕｒｃ ｅＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）６ｍＬに適用した。カラムを０〜０．４Ｍ −ＮａＣｌ勾配の緩衝液Ａ１２カラム容で溶離した。活性画分を集めて緩衝液Ａ １容で希釈し、納入社（Ｐｉｅｒｃｅ社）の指示書に従ってＥｍｐｈａｓｅ樹脂 ｍＬ当りＲｓｅ−ＩｇＧ２ｍｇを使用して調製したＲｓｅ−ＩｇＧ親和性カラム に適用した。 組換えｇａｓ６の同一性はアミノ末端配列によって検証した。この配列からの グルタミン酸残基のシグナルが弱く、γ−カルボキシル化に一致する。 組換えヘレグリン−β１_{177 〜244}断片はＨｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、 ２５６巻：１２０５〜１２１０頁（１９９２年）に記載のようにして調製した。 （ｉｉ）プレインキュベーション 末梢神経組織はマイアミ大学医学部から前記（Ｌｅｖｉなど、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉｅｎｃｅ、１５巻、２号：１３２９〜１３４０頁［１９９５年］）のよう に患者の適切な同意の下に入手した。末梢神経繊維の断片をＢｅｌｚｅｒのＵＷ 溶液に入れてカリホルニアあて発送された。受領後、神経繊維を新鮮なＦ１２／ ＤＭＥ（１：１）で洗浄し、１％コラーゲナーゼ／ディスパーゼ溶液（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）と３０分間３７℃でインキュベーションし た。次に組織を新鮮な組織培養培地に移動させながら組織を穏やかに３回洗浄し た。繊維を１００ｍｍペトリ皿の次のものを添加した血清不含培地中に塗布した ：インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍＬ）、α− トコフェロール（５μｇ／ｍＬ）、組換えヒトのヘレグリン−β１_{177 〜244}（１ ０ナノモル／Ｌ）、フォルスコリン（５μモル）、プロゲステロン（３×１０^-8 モル）および実施例１記載のように調製したウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）（３ μＬ／ｍＬ）添加Ｆ１２／ＤＭＥ（１：１）。シュワン細胞は懸濁液で４８時間 培養して部分的に脱髄させた。次に神経繊維を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離 して集め、穏やかにピペット吸引して再懸濁および分散をさせた。 （ｉｉｉ）初代培養物の調製 アプロチニン（２５μｇ／ｍＬ）および化学的に規定された脂質（Ｓｉｇｍａ 社カタログ番号１１９０５−０１５；Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社）を加えた規定培地 に分散させたシュワン細胞をラミニン（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社）被覆組織培養４ ８ウェルマルチプレートに８×１０³細胞／ウェルで再塗布した。これら培養物 を「初代培養物」と命名した。培地は５日毎に交換した。全面密集増殖した純粋 シュワン細胞は２週間以内に得ることができた。第一および第二継代では細胞を コラーゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社） を利用してプレートから取出し、３％ＢＳＡ含有培地で洗浄し、前記のように塗 布した。使用した培地はインスリン（１０μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１ ０μｇ／ｍＬ）、α−トコフェロール（５μｇ／ｍＬ）、プロゲステロン（３× １０^-8モル）、アプロチニン（２５μｇ／ｍＬ）および化学的に規定された脂質 （Ｓｉｇｍａ社カタログ番号１１９０５−０１５）（５０μｇ／ｍＬ）を添加し たＦ１２／ＤＭＥ（１：１）である「６Ｆ」培地であった。８Ｆ培地は６Ｆ培地 の添加物ならびに組換えヒトヘレグリン−β１_{177 〜244}（１０ナノモル／Ｌ）お よびフォルスコリン（５μＭ）を含有する。シュワン細胞の生存率および増殖に 及ぼすｇａｓ６の効果はこれら培養培地のいずれかにｇａｓ６を添加することに よって研究した。 ｇａｓ６はヒトシュワン細胞の増殖を用量依存的に刺激し、明白な効果が１ｎ ｇ／ｍＬ（１４ｐＭ）で見られ、最大効果が１０ｎｇ／ｍＬ以上で見られた（図 ８Ａ）。ｇａｓ６単独でも対照に比較してシュワン細胞数を明確に増加させた。 ｃＡＭＰ活性化剤フォルスコリンの存在下にはｇａｓ６による全細胞数の増加は さらに強調される。ｇａｓ６およびヘレグリンの間には相乗効果も観察される。 好適な濃度のフォルスコリンおよびヘレグリン両方の存在下においてさえ、ｇａ ｓ６は細胞数およびチミジン導入の両方を増加した（図８Ｂ）。 好適な濃度のフォルスコリンおよびヘレグリン両方の存在下では、シュワン細 胞増殖を刺激すると報告したその他前記の増殖因子は無効であるか（ＰＤＧＦ、 ＦＧＦ−β）または細胞数を減少した（ＩＬ−１αおよびＴＧＦ−β１）（図８ Ｃ）。ヒトのまたはウシのプロテインＳを１０ｎｇ〜５μｇ添加しても５日間の 培養ではシュワン細胞数は増加しなかった。これとは対照的に、ｇａｓ６は３０ μｇ／ｍＬで細胞数を最高に増加した。ｇａｓ６とフォルスコリンおよびヘレグ リンの組合せは５日間の期間で６Ｆ＋フォルスコリン＋ヘレグリン＋５％ＢＳＡ の組合せで見られるものに匹敵する最大細胞増殖を示した。 （ｉｖ）細胞の形態学 ｇａｓ６は位相差顕微鏡で観察される６Ｆ＋ヘレグリン；６Ｆ＋ヘレグリン＋ ｇａｓ６；８Ｆ＋ｇａｓ６；および８Ｆ＋１０％ウシ胎児血清内で増殖させたヒ トシュワン細胞の形態に顕著な効果を示した。９６時間培養した後に顕微鏡写真 を撮影した。ｇａｓ６存在下に増殖したシュワン細胞はヘレグリンまたはフォル スコリンおよびヘレグリンの存在下に増殖した細胞に見られたものよりはるかに 長い突起を有していた（図１０Ａ〜図１０Ｃ）。完全に発達したシュワン細胞の 紡錘型形態を持つ細胞でさえ、８Ｆ＋ｇａｓ６培養物中では明白な有糸分裂像も 見られた。８Ｆ培養物に血清を添加すると細胞形態を変化させ、細胞は平たくな り、拡がり、また時には空胞が形成された（図１０Ｄ）。 （ｖ）シュワン細胞マーカー 細胞をシュワン細胞マーカーＧＦＡＰおよびＳ１００プロテインで免疫螢光に よって染色した。略述すれば、８Ｆ＋ｇａｓ６で培養した継代数４のヒトのシュ ワン細胞をラミニン被覆したチャンバースライド上で２４時間培養し、１０％ホ ルマリンＰＢＳで固定した。固定した細胞を１０％ヤギ血清でブロックし、ウサ ギの抗ＧＦＡＰ（ＩＣＮ社）および抗Ｓ１００プロテイン（ＩＣＮ社）と販売社 の推奨する希釈率でインキュベーションした。初代抗体の特異的結合体をヤギの 抗ウサギＩｇＧ（Ｆａｂ’）₂ＦＩＴＣ複合体で染色した。細胞をＤＮＡ色素プ ロピジウムヨーディドでカウンター染色した。ネガティブ対照処置をＷＩ−３８ 細胞で行ったが染色されなかった。４回継代培養後、増殖した細胞はシュワン細 胞マーカーＧＦＡＰおよびＳ１００プロテインについて１００％の免疫螢光染色 を示した。 （ｖｉ）Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体の活性化 Ａｘ１−Ｒｓｅファミリーのチロシンキナーゼ受容体によってヒトのシュワン 細胞増殖を刺激するｇａｓ６の性能を研究した。０、０．０１、０．１または１ μｇ／ｍＬのヒトｇａｓ６（ｈｇａｓ６）でヒトのシュワン細胞を３７℃のイン キュベーター中で１５分間刺激した。細胞溶解物を調製し、ウサギの抗ｈＲｓｅ Ｆｃ融合蛋白質抗体およびウサギ抗ｈＡｘ１抗体で免疫沈降させた。ｈＲｓｅお よびｈＡｘ１受容体のチロシン燐酸化を４Ｇ１０抗−燐酸化抗体で検出した。ヒ トのシュワン細胞１０⁶個を規定培地（８Ｆ＋ｇａｓ６）中で全面密集近くまで 増殖させ、実験の２４時間前に６Ｆ培地に変更した。細胞を精製組換えｈｇａｓ ６で１５分間３７℃のインキュベータ中で処理し、氷上で溶解緩衝液（２０ｍＭ −ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１３５ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭ−ＮａＦ、１ｍＭ −バナジン酸ナトリウムおよび１ｍＭ−モリブデン酸ナトリウム、２ｍＭ−ＥＤ ＴＡおよび２ｍＭ−ＥＧＴＡ、１０％グリセリン、１％ＮＰ４０、１μＭ−オカ ダ酸、１ｍＭ−ＰＭＳＦおよび１ｍＭ−ＡＥＢＳＦ）１ｍＬによって溶解した。 細胞溶解物を４℃で１０分間１４０００×ｇで遠心分離して清澄にした。ウサギ の抗ｈＲｓｅＦｃ融合蛋白質抗体１μｇまたはｈＡｘ１のＣＯＯＨ末端にあるア ミノ酸１０個に対するウサギ抗ｈＡｘ１抗体２μＬを使用して２時間４℃で免疫 沈降させた。免疫複合体をプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ１０μＬ で集めた。Ｎｏｖｅｘ４〜１２％勾配ゲル上で蛋白質を分離し、ニトロセルロー ス膜に移した。４Ｇ１０マウス抗ホスホチロシン抗体（ＵＢＩ社）、ヤギ抗マウ スセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体およびＥＣＬ発色キット（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ社）を使用して抗ホスホチロシン免疫ブロットを作製した。 ヒトのｇａｓ６をヒトのシュワン細胞細胞に添加するとＡｘ１およびＲｓｅ両 受容体のチロシン残基上に自己燐酸化を起こした。Ａｘ１およびＲｓｅの活性化 は１．４〜１４μＭ−ｇａｓ６で検出できた。このＡｘ１およびＲｓｅの燐酸化 はヘレグリンで刺激した培養物では観察されなかった。培養ラットシュワン細胞 中でのｇａｓ６発現はノーザンブロットでは検出されなかった。さらにその上、 ラットシュワン細胞調製培地中でのｇａｓ６活性は見られていない。如何なる理 論によるものではないが、ｇａｓ６が成長する軸索によってまたは近くの線維芽 細胞（そこから最初のｇａｓ６がクローニングされた）によって生産されている 可能性がある。たとえばＰＤＧＦおよびＦＧＦのような他のチロジンキナーゼ受 容体に作用することが知られている他の増殖因子はこれらの規定条件下にはヒト のシュワン細胞増殖を増大しないので、このシュワン細胞にあるＡｘ１−Ｒｓｅ 受容体の活性化は高度に特異的である。ｅｒｂＢ受容体ファミリーを経て独立に 作用するシュワン細胞増殖因子、ＧＧＦ／ヘレグリン、はこの研究ではｇａｓ６ と相乗作用する。 （ｖｉｉ）ＥＲＫ２活性化 ｈｇａｓ６処理後のヒトのシュワン細胞にあるｐ４２ＥＲＫ２の活性化を研究 した。ヒトのシュワン細胞をｈｇａｓ６で１５分間刺激して細胞溶解物を調製し た。同量の蛋白質を含む細胞溶解物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで処理した。蛋 白質をニトロセルロース膜に移し、Ｃ２０マウス抗ＥＲＫ１＋２モノクローナル 抗体（Ｓａｎｔａ・Ｃｒｕｚ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ヤギ抗マウス セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体およびＥＣＬ発色キットで免疫ブロット した。Ａｘ１およびＲｓｅ受容体の活性化はＥＲＫ２の活性化に合致し、ｐ４２ ＥＲＫ２に特徴的なゲル易動性の変化が誘導された。増殖因子受容体によるＥＲ Ｋ２の活性化は細胞増殖を含む多面的な細胞事象を誘導する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 チェン，ジャン アメリカ合衆国94010カリフォルニア州 バーリンゲイム、オグデン・ドライブ・ナ ンバー104、1860番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤を含む第一の有糸分裂促進剤および第二 の有糸分裂促進剤を含むシュワン細胞を培養するための血清不含培養培地。 ２．Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤がｇａｓ６を含む請求項１の培養培地。 ３．第二の有糸分裂促進剤がヘレグリンを含む請求項１の培養培地。 ４．さらに培養培地のｃＡＭＰレベルを上昇させる薬剤を含む請求項１の培 養培地。 ５．さらにフォルスコリンを含む請求項１の培養培地。 ６．さらに鉄源を含む請求項１の培養培地。 ７．鉄源がトランスフェリンを含む請求項６の培養培地。 ８．さらにインスリンまたはインスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）を含 む請求項１の培養培地。 ９．さらにビタミンＥを含む請求項１の培養培地。 １０．さらにプロテアーゼ阻害剤を含む請求項１の培養培地。 １１．Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤を含む第一の有糸分裂促進剤および第二 の有糸分裂促進剤が共にシュワン細胞の生存または増殖を強化するために有効な 量で存在する血清不含の培養培地中でシュワン細胞を培養することを含む細胞培 養におけるシュワン細胞の生存または増殖を増強する方法。 １２．シュワン細胞がヒトのシュワン細胞を含む請求項１１の方法。 １３．Ｒｓｅ／Ａｘ１受容体活性化剤がｇａｓ６を含む請求項１１の方法。 １４．第二の有糸分裂促進剤がヘレグリンを含む請求項１１の方法。 １５．シュワン細胞の生存と増殖を強化する請求項１１の方法。 １６．培養をラミニンの存在下に実行する請求項１１の方法。 １７．シュワン細胞をラミニン被覆培養プレート中で培養することを含む請求 項１６の方法。 １８．（ａ）シュワン細胞が脱ミエリン化を起こすように有糸分裂促進剤を含 む血清不含培養培地中で約１日から約５日までの期間シュワン細胞を含む神経組 織をプレインキュベーションすること、および （ｂ）脱ミエリン化を起こしたシュワン細胞を請求項１の培養培地中で培養す ること、 を含むシュワン細胞を分離するための方法。 １９．神経組織を約１０分間から約１００分間プロテアーゼと接触させる段階 が段階（ａ）に先行する請求項１８の方法。 ２０．段階（ａ）に先行して神経組織をコラーゲナーゼおよびディスパーゼに 接触させる請求項１９の方法。 ２１．培養培地がヘレグリン、インスリンおよびフォルスコリンを含む請求項 １８の方法。 ２２．段階（ｂ）が脱ミエリン化を起こしたシュワン細胞をラミニン被覆培養 プレートで培養することを含む請求項１８の方法。 ２３．ヒトのシュワン細胞および医薬的に許容される担体を含み、本質的に血 清不含な組成物。 ２４．ヒトのシュワン細胞を血清不含培養培地中に含む組成物であって、その 培養培地がさらに有糸分裂促進剤を含むもの。 ２５．請求項１２に従って培養されたヒトのシュワン細胞。 ２６．請求項１２に従って培養されたヒトのシュワン細胞の有効量を哺乳類に 投与することを含む哺乳類の処置法。 ２７．請求項２３の組成物の有効量を哺乳類に投与することを含む哺乳類の処 置法。 ２８．その哺乳類が神経系に損傷を受けているものである請求項２７の方法。