JP3410103B2 - シュワン細胞の分離および培養 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 この発明はシュワン細胞を分離、培養する方法、分離
したシュワン細胞自体、およびその使用に関する。殊
に、本発明はRxe/Ax1受容体活性化剤およびその他の有
糸分裂促進剤を添加した血清不含培養培地中で培養する
ことによってヒトのシュワン細胞の生存率および増殖を
増強する方法を提供する。

関連技術の記載 1.シュワン細胞 シュワン細胞は末梢神経系における主な支持細胞であ
る。この細胞は胚発達の早期に神経堤から発達し、神経
軸索の伸長とともに末梢に移動する。この相の間にシュ
ワン細胞は急速な増殖を行って、軸索の成長に適応する
ために適当な数の細胞を産生する。続いてシュワン細胞
は軸索を鞘で覆いまたは髄鞘形成することによって最終
的に分化し、その後は成人の一生の間休止したままにな
る。しかしながら、シュワン細胞の増殖は病理的状況下
には刺激でき、損傷後の神経再生においては重要な役割
を果たす。末梢神経を切開する時には損傷部位のシュワ
ン細胞は脱髄鞘を始め、細胞周期を再開する（Bunge、C
urrent・Opin.in.Neurobiol.、３巻:805頁［1993
年］）。増殖しているシュワン細胞は神経向性因子およ
び細胞外マトリックス蛋白質を産生して切開された軸索
の再生を促進または誘導し、最後に再生された軸索を再
髄鞘化することによって再生の過程を完了する。

シュワン細胞が末梢神経および中枢神経の両方で神経
繊維再生を促進するこの顕著な末梢神経移植（PainoとB
unge、Experimental.Neurology、114巻:254頁1991
年］）およびシュワン細胞を浸漬した誘導チャネルの移
植（Gunardなど、J.Neuroscience、12巻［９号］:331
0頁［1992年］;Painoなど、J.Neurocytol.、23巻:433頁
［1994年］）によって証明されている。ヒトのシュワン
細胞を含む細胞人工器具を、たとえば脊髄損傷部位での
中枢軸索の再生に影響を与えるための移植および複雑な
末梢神経で長い間隙を含む損傷を再生するための移植の
ような臨床的に使用することが提案されている（Leviな
ど、J.Neuroscience、14巻３号:1309頁［1994年］）。
自己由来シュワン細胞を使用するこの手法の臨床的成功
率は生検で得られる僅かな材料から出発する純粋なシュ
ワン細胞集団の試験管内増殖性能に依存する。

ラットのシュワン細胞を培養する技術を記載している
報告が数報ある。Brockesなど、Brain・Res.、165巻:10
5〜118頁（1979年）;Brockesなど、J.Biol.Chem.、255
巻、18号:8374〜8377頁（1980年）;Brockesなど、Ann.N
eurol.、20巻、３号:317〜322頁（1986年）;Brockes,
J.、Meth.Enzymol.、147巻:217〜225頁（1987年）;Morr
isseyなど、J.Neuroscience、11巻、８号:2433〜2442頁
（1991年）;PainoとBunge、Exp.Neurology、114巻:254
頁（1991年）;Gunardなど、J.Neuroscience、12巻、
９号:3310〜3320頁（1992年）;Peulveなど、Exper.Cell
・Res.、214巻:543〜550頁（1994年）;Liなど、J.Neuro
science、14巻、７号:4050〜4063頁（1994年）;Colliei
rとMartin、Exper.Neurology、124巻:129〜133頁（1993
年）;Schererなど、J.Neurosci.Res.、38巻:575〜589頁
（1994年）;Yamamotoなど、Brain・Res.、653巻:335〜3
39頁（1994年）;Morganなど、Development、120巻:1399
〜1409頁（1994年）;Painoなど、J.Neurocytol.、23巻:
433〜452頁（1994年）;Messingなど、J.Neuroscience、
14巻:3533〜3539頁（1994年）;Haynesなど、J.Neurosc
i.Methods、52巻:119〜127頁（1994年）;WO92/03536;WO
92/18627;WO94/00140;WO94/04560参照。

Watabeなど、J.Neurosci.Res.、39巻:525〜534頁（19
94年）は成体マウスのシュワン細胞に対する血小板由来
増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング
増殖因子−β、およびヘパリン結合血清因子の有糸分裂
促進効果を研究した。

最近、ヒトのシュワン細胞培養技術が報告された。Ru
tkowskiなど、Ann.Neurol.、31巻、６号:580〜586頁（1
992年）;Leviなど、J.Neuroscience、14巻、３号:1309
〜1319頁（1994年）；およびLeviなど、J.Neuroscienc
e、15巻:2号、1329〜1340頁（1995年）参照。

シュワン細胞は通常血清添加培養培地中で増殖されて
きた。殊に成人組織を用いる時はこれらの製品に含まれ
る主な夾雑物は線維芽細胞であってシュワン細胞を駆逐
する程増殖する。線維芽細胞数は培養時間とともに変化
（Leviなど、J.Neuroscience、14巻、３号:1309頁［199
4年］）し、また順次的増殖（Morrisseyなど、J.Neuros
cience、11巻、８号:2433〜2442頁［1991年］）、抗体
による選別（Brockes,J.、Meth.Enzymol.、147巻:217〜
225頁［1987年］およびWatabeなど、J.Neurosci.Res.、
39巻:525〜534頁［1994年］）、または抗有糸分裂促進
剤の使用（Leviなど、J.Neuroscience、15巻、２号:132
9〜1340頁［1994年］）のような複雑なプロトコルによ
っても削減される。

2.RseおよびAx1受容体 Markなどは最近ヒトおよび成体マウスの脳内に優先的
に発現するチロジンキナーゼ受容体Rseの相補DNA配列を
報告した（Markなど、J.Biol.Chem.、269巻:10720頁［1
994年］）。Rse受容体の細胞外ドメインは免疫グロブリ
ン様（Ig−Ｌ）リピート２個とそれに続くフィブロネク
チンIII型リピート２個からなる。ヒトRse（Ohasiな
ど、Oncogene、９巻:699頁［1994年）］およびマウスRs
e（Laiなど、Oncogene、９巻、2567頁［1994年］）と同
一な蛋白質をコードする相補性DNA配列が独立に報告さ
れ、各々SkyおよびTyro3と命名された。FujimotoとYama
moto、Oncogene、９巻:693頁［1994年］がbrtと命名し
たマウスのRse等価物およびDaiなど、Oncogene、９巻:9
75頁（1994年）がtifと命名したヒトの分子に関する報
告も参照。

様々な組織におけるRseの発現が研究された。Laiな
ど、Oncogene、９巻:2567頁［1994年］は成体脳内でRse
のmRNAは新皮質、小脳および海馬のニューロンに局在す
ることを発見した。Schulzなどは同様にRseが高水準で
大脳皮質、外側中隔（lateral・septum）、海馬、嗅
球、および小脳に発現されることを発見した。脳内で最
高レベルのRse発現はニューロンに関するものであった
（Schulzなど、Molec.Brain・Res.、28巻:273〜280頁
［1995年］）。マウスの中枢神経系（CNS）では、最高
レベルのRse発現は胚段階後期および出生後に検出さ
れ、皮質および海馬ニューロン内におけるシナプス回路
構成の樹立と維持に符合する（Laiなど、Oncogene、９
巻:2567頁［1994年］およびSchneiderなど、Cell、54
巻:787〜793頁［1988年］）。この過程は直接接触また
は相互接近している細胞によって局所的に調節されてい
ると信じられる。

Rseは構造的にはAx1（UfoまたはArkとも呼称する）に
関連して、このチロジンキナーゼ受容体と43％のアミノ
酸配列同一性を共有する。Ax1に関してO'Bryanなど、Mo
l.Cell・Biol.、11巻:5016頁（1991年）;Janssenなど、
Oncogene、６巻:2113頁（1991年）;Rescignoなど、Onco
gene、５巻:1908頁（1991年）；およびBellostaなど、1
5巻:614頁（1995年）参照。RseおよびAx1はｃ−Merとと
もに（Grahamなど、Cell・Growth・Differ.、５巻:647
頁［1994年］）その細胞外ドメインがニューロン細胞認
識および接着分子に類似している一群の受容体チロジン
キナーゼを規定する（Ruitishause,U.、Current・Opin.
Neurobiology、３巻:709頁［1993年］およびBrummendor
fとRathjen、J.Neurochem.、61巻:1207頁［1993年］に
綜説がある）。Rseと同様にAx1も神経系内に発現される
が末梢神経組織内ではRseよりも広範に発現される。

RseおよびAx1受容体の推測上のリガンドも報告されて
いる。Varnumなど、Nature、373巻:623頁（1995年）お
よびStittなど、Cell、80巻:661〜670頁（1995年）は最
近gas6（増殖休止特異的遺伝子６）がAx1のリガンドで
あると報告した。gas6はNIH3T3細胞で血清欠乏中で高度
に発現される一組のマウス遺伝子に属する（Schneider
など、Cell、54巻:787〜793頁［1988年］）。これらの
遺伝子はその発現が増殖誘導の間はネガティブに調節さ
れるので増殖休止特異的遺伝子と称する。マウスのgas6
に対応するヒトの同族体はManfiolettiなど、Mol.Cell
・Biol.、13巻、８号:4976〜4985頁（1993年）によって
クローニングされ、配列決定された。彼等はgas6がビタ
ミンＫ依存性蛋白質であると結論し、増殖調節に関連す
るプロテアーゼカスケードの調節に一役を担っていると
推測した。gas6は脳を含む各種の組織で発現される。ga
s6に関するColomboなど、Genome、２巻:130〜134頁（19
92年）およびFerreroなど、J.Cellular・Physiol.、158
巻:263〜269頁（1994年）も参照。

Stittなど、Cell、80巻:661〜670頁（1995年）はさら
にプロテインＳがTyro3のリガンドであると報告した。
プロテインＳは活性化されたプロテインＣによりV a因
子およびVIII a因子の蛋白分解的不活性化を刺激するた
めのコファクターとして作用することにより抗凝固剤と
して機能するビタミンＫ依存性血漿蛋白質である。Easm
onなど、Aterioscler.Thromb、12巻:135頁（1992年）に
綜説がある。従ってプロテインＳは血液凝固カスケード
の重要な負の調節剤である。Walkerなど、J.Biol.Che
m.、255巻:5521〜5524頁（1980年）;Walkerなど、J.Bio
l.Chem.、256巻:11128〜11131頁（1981年）;Walkerな
ど、Arch.Biochem.Biophys.、252巻:322〜328頁（1991
年）;Griffinなど、Blood、79巻:3203頁（1992年）；お
よびEasmon,D.、Arterioscler.Thromb.、12巻:135頁（1
992年）参照。ヒトの血漿中にあるプロテインＳの約半
分がC4BPに結合しているという発見はさらにプロテイン
Ｓが補体カスケードに関与するという見解を裏付ける。
Dahlbackなど、PNAS（USA）、78巻:2512〜2516頁（1981
年）。平滑筋細胞のための有糸分裂促進剤としてのプロ
テインＳの役割も報告されている。Gasicなど、PNAS（U
SA）、89巻:2317〜2320頁（1992年）。

プロテインＳは４個のドメインに分割できる（本明細
書の図1A、図1Cおよび図1D参照）。残基１〜52（Ａ領
域）はγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）残基に富
み、これが負に帯電した燐脂質へのプロテインＳのCa²⁺
依存的な結合に介在する（Walker、J.Biol.Chem.、259
巻:10335頁［1984年］）。Ｂ領域はトロンビン感受性ル
ープを含む。Ｃ領域は表皮増殖因子（EGF）様リピート
４個を含む。Ｄ領域はステロイドホルモン結合グロブリ
ン（SHBG）蛋白質に相同的である（Hammondなど、FEBS
・Lett.、215巻:100頁［1987年］）。JosefおよびBaker
（FASEB・J.、６巻:2477頁［1994年］）が議論するよう
にこの領域はラミニン（23％同一性）およびメロシン
（同一性22％）のＡ鎖中の複数のドメインおよびDrosop
hila・crumbsにあるドメイン１個（19％）と相同的であ
る。

マウスおよびヒトのgas6のcDNAはヒトのプロテインＳ
とそれぞれ43％および44％のアミノ酸配列同一性を有す
る蛋白質をコードする。

発明の要約 この出願は規定された、血清不含培養系の使用を開示
する。それは線維芽細胞の増殖または生存を維持せず
（好適な培養培地内に線維芽細胞特異的阻害因子の不在
にも拘らず）、また実質的に均質なシュワン細胞培養物
を与える。gas6は血清不含規定培養物中では、シュワン
細胞の強力な増殖／生存因子であることが証明された。
gas6とフォルスコリンおよびヘレグリン（heregulin）
との相乗効果は規定培地内で純粋なシュワン細胞集団の
効率的な増殖を可能にする。

従って、本発明はシュワン細胞（特にヒトのシュワン
細胞）の生存および／または増殖を強化する方法に関す
るものであると言うことができる。その方法はシュワン
細胞をRse/Ax1受容体活性化剤（たとえばgas6）および
第二の有糸分裂促進剤（たとえばヘレグリン）を含有す
る血清不含培地中で培養することを含む。このRse/Ax1
受容体活性化剤および第二の有糸分裂促進剤は各々シュ
ワン細胞の生存または増殖を強化するために有効な量で
存在する。好ましくはシュワン細胞はラミニン被覆培養
プレートで培養する。この方法は成人患者から誘導した
シュワン細胞の生存および／または増殖を強化するため
に使用して患者への自己由来的移植を促進することがで
きる。

本発明はさらにシュワン細胞を培養するための血清不
含培養培地を提供する。この培地はRse/Ax1受容体活性
化剤および第二の有糸分裂促進剤（たとえばヘレグリ
ン）を含有する。所望ならば、この培養培地に培養培地
中のcAMPレベルを高める薬剤（たとえばフォルスコリ
ン）、鉄源（たとえばトランスフェリン）、インスリン
またはインスリン様増殖因子（たとえばIGF−ＩまたはI
GF−II）、ビタミン（たとえばビタミンＥ）およびプロ
テアーゼ阻害剤も含める。本発明は（ａ）有糸分裂促進
剤を含有する培養培地中でシュワン細胞を含んでいる神
経組織をシュワン細胞の脱ミエリン化を起こすに十分な
時間プレインキュベーションすること；および（ｂ）脱
ミエリン化したシュワン細胞を前パラグラフの培養培地
中で培養すること、を包含するシュワン細胞を分離する
方法も提供する。

本発明はヒトのシュワン細胞および医薬的に許容され
る担体を含有し、本質的に血清不含な組成物にも関連す
る。これに加えて、ヒトのシュワン細胞をさらに有糸分
裂促進因子を含有する血清不含培養培地中に含む組成物
を提供する。

本明細書中に開示するシュワン細胞は哺乳類（たとえ
ば神経系に損傷を受けたもの）を処置する方法に使用で
きる。その方法は、その哺乳類に有効量のヒトのシュワ
ン細胞を投与することを含み、このシュワン細胞は本明
細書中に記載する操作に従って培養されたものである。
従って、本発明は本明細書に開示する技術を用いて分
離、培養されたシュワン細胞を哺乳類の中枢または末梢
神経系における損傷を受けた領域に移植することを包含
する神経系の修復を促進する方法を提供する。

図面の簡単な説明 図1A〜図1DはプロテインＳおよびgas6（図1A）、およ
びウシ（ｂ）型およびヒト（ｈ）型のプロテインＳ（お
のおの図1Cおよび図1D）とヒトのgas6（図1B）との間で
のアミノ酸相同性を比較して図式的に表現して提供す
る。hgas6について、ボックスはGla領域（すなわちＡド
メイン）、ループ領域（すなわちＢドメイン）、Ｃドメ
インを形成する４個のEGF様リピート（C₁〜C₄−と標識
する）、および性ホルモン結合性グロブリンに相同的
で、ラミニンＡ鎖およびメロシンのＧドメインおよびDr
osophila・crumbsの蛋白質にも関連する領域（すなわち
Ｄドメイン）を表す。対応するボックス内にhgas6とｂ
プロテインＳかｈプロテインＳかのいずれかとの間に共
有されるアミノ酸同一性を百分率で記載する。おのおの
の領域境界にあるアミノ酸はボックスの上部に記載す
る。

図２はマウスのgas6（mgas6）［配列番号１］、ｈ−g
as6［配列番号２］およびｈ−プロテインＳ［配列番号
３］のアミノ酸配列の比較を示す。「プレ」配列および
「プロ」配列の残基を指摘してある（各前駆体配列の最
後の残基を示す矢印で）。Ａ〜Ｄドメインを、Ｄドメイ
ンの中に存在するＧドメイン２個（すなわちＧドメイン
１およびＧドメイン２）とともに示してある。

図３は感覚および運動ニューロン由来因子（SMDF）の
cDNA配列［配列番号４］および演繹したアミノ酸配列
［配列番号５］を描写する。EGF様ドメインおよび無極
性および非帯電ドメイン（すなわち約48〜62から構成さ
れる「無極性Ｉ」残基および約76〜100から構成される
「無極性II」残基）に下線を付す。システインはボック
スで囲む。終止コドンは文字「Ｏ」で示す。

図4A〜図4Bは胚シュワン細胞系列（ESC）および成人
シュワン細胞系列（ASC）におけるフォルスコリンの用
量作用関係を描写する。継代数21のESC細胞および継代
数16のASC細胞をおのおの1.4×10⁴細胞／ウェルおよび
3.1×10⁴細胞／ウェルで12ウェルプレートの「7F」培地
中に接種した。この「7F」培地はF12/DMEMであって、ウ
シ下垂体抽出物（BPE）（２μg/mL）、インスリン（10
μg/mL）、ヘレグリン（1nM）、ビタミンＥ（５μg/m
L）、プロゲステロン（3nM）、トランスフェリン（10μ
g/mL）、フォルスコリン（５μＭ）、およびゲンタマイ
シンを含む。ウェルはラミニンで被覆した。最初はフォ
ルスコリンを除外しておき、後に指定の濃度にまで添加
した。各条件の細胞を複数のウェル中で処理してCoulte
r（商標）カウンターで培養５日目に計数した。図に示
した値は各条件での平均値および標準偏差値である。

図5A〜図5BはESCおよびASC（継代数21）細胞系列にお
けるヘレグリンの用量作用関係を描写する。細胞を各々
2.1×10⁴細胞／ウェルおよび2.2×10⁴細胞／ウェルで12
ウェルプレートのF12/DMEM中に接種した。培地は図4A〜
図4Bについて記載した7Fを加え、全ウェルはラミニンで
被覆した。最初はヒトの組換えヘレグリンを除外してお
き、後に指定の濃度まで添加した。各条件の細胞を複数
のウェル中で処理してCoulter（商標）カウンターで培
養５日目に計数した。

図6A〜図6Bはおのおの継代数21および16のESCおよびA
SC細胞系におけるウシ下垂体抽出物（BPE）の用量作用
関係を描写する。細胞をおのおの1.7×10⁴細胞／ウェル
および3.1×10⁴細胞／ウェルで12ウェルプレートのF12/
DMEM中に接種した。培地には図4A〜図4Bについて記載し
た7Fを加え、全ウェルはラミニンで被覆した。最初はウ
シ下垂体抽出物（BPE）を除外しておき、後に指定の濃
度まで添加した。各条件の細胞を複数のウェル中で処理
してCoulter（商標）カウンターで培養５日目に計数し
た。

図7A〜図7FはESCおよびASC細胞系列でのインスリン
（図7A〜図7B）、IGF−Ｉ（図7C〜図7D）、およびIGF−
II（図7E〜図7F）の用量作用関係を描写する。継代数16
および継代数30のESC細胞およびASC細胞を各々1.3×10⁴
細胞／ウェル（7Bでは3.1×10⁴細胞／ウェル）で12ウェ
ルプレートのF12/DMEM中に接種した。培地は図4A〜図4B
について記載した7Fを加え、特に言及しない限り全ウェ
ルはラミニンで被覆した。最初はヒトの組換えインスリ
ンを除外しておき、後に指定の濃度までインスリン、IG
F−ＩまたはIGF−IIを添加した。各条件の細胞を複数の
ウェル中で処理してCoulter（商標）カウンターで培養
５日目に計数した。

図8A〜図8Cはヒトのシュワン細胞の増殖およびDNA合
成におよぼすgas6およびその他の増殖因子の効果を描写
する。全データは平均値±標準誤差（ｎ＝４）で示す。
図8Aはヒトのシュワン細胞に対する様々な濃度のgas6の
用量反応曲線を示す。培地「6F」はインスリン（10μg/
mL）、トランスフェリン（10μg/mL）、ビタミンＥ（５
μg/mL）、化学的に規定された脂質（50μg/mL）、アプ
ロテイニン（25μg/mL）およびプロゲステロン（３×10
^-8M）を添加したF12/DMEである。培地「8F」は培地「6
F」にフォルスコリン（５μＭ）とヘレグリン（10nm）
とを添加したものである。細胞数はCoulter（商標）カ
ウンターで所定濃度のgas6とともに84時間培養後に計数
した。図8Bは様々な濃度のgas6存在下に図8A中で培養し
たシュワン細胞へのチミジン取り込みをgas6が増加する
ことを示す。³H−［メチル］チミジン（0.5μCi/mL）は
培養48時間目に添加した。細胞を培養96時間目に収集し
てDNAに取込まれた放射能測定用に処理した。図8Cは8F
培地存在下におけるシュワン細胞増殖に対する各増殖因
子の影響を示す。シュワン細胞はPDGF（10ng/mL）、塩
基性FGF（20ng/mL）、IL−１α（1ng/mL）、TGF−β１
（1ng/mL）、およびgas6（30ng/mL）を含有または不含
の8F培地に塗布した。細胞数は108時間後に計数した。

図９は培養中におけるヒトのシュワン細胞増殖の時間
的経過を図示する。ヒトのシュワン細胞をgas6または10
％透析濾過ウシ胎児血清（FBS）含有または不含の8Fを
添加したF12/DME培地（1:1）に24ウェルのマルチプレー
ト中で２×10⁴細胞／ウェルで塗布した。24時間毎に各
群から４ウェルの培養物を取り、細胞を計数した。記載
したデータは平均値±標準誤差（ｎ＝４）である。

図10A〜図10Dは6F＋ヘレグリン（図10A）、6F＋ヘレ
グリン＋gas6（図10B）、8F＋gas6（図10C）および8F＋
10％ウシ胎児血清（図10D）におけるヒトのシュワン細
胞の増殖を示す位相差顕微鏡写真である。顕微鏡写真は
培養96時間後に撮影した。

好適な態様の詳細な説明 I.定義 一般に以下の語句は本記載、実施例および請求項で使
用する時にはここに指摘する意味を持つ。

「シュワン細胞」は神経堤起源の細胞であって、原位
置では末梢神経の各神経繊維周囲にある連続した外皮を
形成する。シュワン細胞それ自体は、たとえばグリア原
繊維酸性蛋白質（GFAP）、S100蛋白質、ラミニンまたは
神経増殖因子（NGF）受容体のようなシュワン細胞マー
カー１種またはそれ以上の存在を、たとえばこれらマー
カーに対する抗体を使用して検出することによって確認
できる。さらに、シュワン細胞は培養物の鏡検によって
検出できる特徴的な形態を有する。実施例２（iv）参
照。分離されたシュワン細胞は、たとえば培養物中で感
覚ニューロンと会合する性能またはミエリンまたは、た
とえばPoおよびミエリン会合性グリコプロテイン（MA
G）のようなミエリン関連蛋白質を産生する性能のよう
な分化したシュワン細胞機能の維持について評価でき
る。これを研究するためには、分離したシュワン細胞を
培養中の実質的に純粋な感覚ニューロン集団に接種し、
細胞相互作用および蛋白質産生を数週間にわたって観察
できる。

用語「細胞培養培地」および「培養培地」は典型的に
は次のカテゴリーの１種またはそれ以上からの成分を少
なくとも１種提供する哺乳類細胞を増殖させるために使
用する栄養溶液を示す。

１）通常は、たとえばグルコースのような炭水化物の型
であるエネルギー源。

２）通常はアミノ酸20種＋シスチンの基本的セットであ
る全必須アミノ酸。

３）ビタミンおよび／またはその他の低濃度で必要な有
機化合物。

４）遊離脂肪酸。および ５）希物質。ここに希物質は典型的には非常な低濃度、
通常はマイクロモル範囲、で必要な無機化合物または天
然起源物質であると定義される。

この栄養溶液は所望ならば次のカテゴリーのいずれか
に属する成分を１種またはそれ以上添加することもあ
る。

１）有糸分裂促進剤１種またはそれ以上。

２）例えばカルシウム、マグネシウムおよび燐酸塩のよ
うな塩および緩衝液。

３）例えばアデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチン
のようなヌクレオシドおよび塩基。および ４）蛋白質および組織加水分解物。

用語「アミノ酸」はＤ−およびＬ−の両立体異性体型
の天然起源α−アミノ酸全ておよびその類似体および誘
導体を示す。類似体はそのアミノ酸にある原子を通常は
類似の性質を有する異なる原子によって置換したもので
あると定義する。誘導体はその他の分子または原子をが
結合しているアミノ酸であると定義する。誘導体には例
えばアミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化
またはシスチンを形成するシステイン分子２個の硫黄残
基の酸化を含むであろう。

細胞培養培地は一般に「血清不含」であるが、これは
その培地が本質的に如何なる哺乳類起源からの血清（た
とえばウシ胎児血清［FBS］）も含まないことを意味す
る。「本質的に不含」とは細胞培養培地が約０〜５％、
好ましくは約０〜１％、最も好ましくは約０〜0.1％の
血清を含むことを意味する。血清不含「規定」培地が有
利に使用できる。これでは各成分の同一性および濃度が
知られている（すなわち、たとえばウシ下垂体抽出物
［BPE］にあるような規定されていない成分はこの培養
培地中には存在しない）。

「有糸分裂促進剤」または「増殖因子」はシュワン細
胞の有糸分裂を刺激する分子である。一般に、有糸分裂
促進剤または増殖因子はポリペプチドであって、細胞培
養物中のシュワン細胞の生存および増殖を強化する。こ
の有糸分裂促進性ポリペプチドは製法を如何を問わず
（たとえばその分子の内因性起源から分離でき、また組
換え技術を含む合成技術で生産できる）、「在来型」ま
たは「在来配列」ポリペプチド（すなわち天然起源増殖
因子のアミノ酸配列を有する）であることができる。好
ましくは有糸分裂促進剤ポリペプチドはヒトに由来する
増殖因子またはその断片と同一のアミノ酸配列を有す
る。有糸分裂促進剤の例はRse/Ax1受容体活性化剤;erbB
受容体ファミリーの１構成員またはそれ以上の活性化
剤；培養培地中のcAMPレベルを上昇する薬剤（たとえば
フォルスコリン、コレラトキシン、cAMPまたはその類似
体）；たとえばニューロン細胞接着分子（Ｎ−CAM）、
ラミニン、またはフィブロネクチンのような接着分子；
プロゲステロン；神経栄養因子たとえば骨由来神経栄養
因子（BDNF）および毛様体神経栄養因子（CNTF）；ニュ
ーロトロンフィン−３、−４、−５、または−６（NT−
３、NT−４、NT−５、またはNT−６）；または、たとえ
ばNGF−βのような神経成長因子；血小板由来増殖因子
（PDGF）；たとえば酸性FGF（aFGF）および塩基性FGF
（bFGF）のような線維芽細胞増殖因子；たとえばTGF−
αおよびTGF−β１、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４
またはTGF−β５を含むTGF−βのようなトランスフォー
ミング増殖因子（TGF）;IGF−Ｉ、IGF−IIおよびデス
（１〜３）−IGF−Ｉ（脳IGF−Ｉ）を含むインスリン様
増殖因子；インスリン様増殖因子結合性蛋白質；およ
び、たとえばエストロゲン、テストステロン、甲状腺ホ
ルモンおよびインスリンのようなホルモン；を包含す
る。

「Rse/Ax1受容体活性化剤」は、Rseおよび／またはAx
1受容体の持つ細胞内キナーゼドメインに基質ポリペプ
チドにあるチロジン残基を燐酸化させることのできる分
子からなる。チロシン残基はRseおよび／またはAx1受容
体に内在することが多い（すなわち「基質」はRseおよ
び／またはAx1受容体の細胞内ドメインを含む）。そこ
で、活性化の程度はRseおよび／またはAx1受容体の「自
己燐酸化」に相関する。Rseおよび／またはAx1受容体の
自己燐酸化は抗ホスホチロジン抗体を使用するウエスタ
ンブロティングにより検出できる。たとえば実施例２
（vi）参照。しかしながらRseおよび／またはAx1受容体
の活性化はRseおよび／またはAx1受容体以外の基質（た
とえば細胞膜内のRseおよび／またはAx1受容体に隣接し
て存在するチロジンキナーゼなど）の燐酸化とも相関す
ることがありうる。これは基質のチロシン燐酸化を測定
する（たとえばウエスタンブロティングによる）ことに
よって検出できる。Rse/Ax1受容体活性化剤の例にはgas
6、プロテインＳおよびRseまたはAx1受容体に結合して
活性化するアゴニスト抗体を含む（Markなど、前出）参
照。

本明細書では用語「gas6」および「gas6ポリペプチ
ド」はRseおよび／またはAx1受容体を活性化することの
できるポリペプチドを示し、天然物からの精製品、化学
合成品または組換え産生品のいずれであってもよいがga
s6ポリペプチドの成熟型、プレー型、プレプロー型およ
びプロー型を包含する。この定義は特にManfiolettiな
ど、Mol.Cell・Biol.、13巻（８）:4976〜4985頁（1993
年）に報告されたアミノ酸配列からなる「ヒトの」gas6
ポリペプチドおよびその他の哺乳類gas6ポリペプチド
（たとえばマウスgas6のようなもの）ならびにそれらの
変異体および突然変異体を包含する。

gas6は図２に示した様々なアミノ酸ドメインを有す
る。このポリペプチドのアミノ末端にあるＡドメインま
たは「Gla領域」はγ−カルボキシグルタミン酸（Gla残
基）に富む複数の残基を有し、細胞膜にある負に帯電し
た燐脂質へのgas6のカルシウム依存性結合を、媒介する
と思われる。Ａドメインはヒトのgas6で残基約49〜89に
わたる。これに続くＢドメインはトロンビン感受性ルー
プを含み、ヒトのgas6で残基約90〜117にわたる。第３
のドメインはこの明細書ではＣドメインと呼称し、上皮
増殖因子（EGF）様リピート４個（C₁〜C₄）を有する。
このＣドメインはヒトのgas6で残基約118〜278にわた
る。残りのＤドメインはステロイドホルモン結合性グロ
ブリン（SHBG）蛋白質に相同的であって、ヒトのgas6で
残基約279〜678を含む。このＤドメインは一対のＧドメ
インを包含し、各々Ｇドメイン１（すなわちヒトのgas6
で残基約314〜471）およびＧドメイン２（すなわちヒト
のgas6で残基約503〜671）と呼ばれる。

erbB受容体ファミリーは上皮増殖因子（EGF）受容体
（erbB遺伝子がコードしている）に相同性を示す受容体
を包含し、EGF受容体ならびにHER2、HER3およびHER4受
容体（すなわち各々erb2〜４）が包含される。米国特許
第5183884号および欧州特許出願599274号を参照。この
ファミリーの構成員１種またはそれ以上を活性化するこ
とのできる有糸分裂促進剤の例にはEGF;ヘレグリン−α
（HRG−α）、ヘレグリン−β１（HRG−β１）、ヘレグ
リン−β２（HRG−β２）、ヘレグリン−β２様（HRG−
β２様）、ヘレグリン−β３（HRG−β３）およびその
断片（米国特許第5367060号参照）；アセチルコリン受
容体誘導活性（ARIA）（Fallsなど、Cell、72巻:801〜8
15頁［1993年］）；グリア増殖因子（GGF）（Marchionn
iなど、Nature、362巻:312〜318頁［1993年］）；およ
び感覚および運動ニューロン由来因子（SMDF）（本明細
書の図３参照）を含む。

用語「抗体」は最広義に使用し、殊にモノクローナル
抗体およびポリエピトープ特異性を有する抗体組成物も
包含する。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗
体」は実質的に均質な抗体集団、すなわち微量に存在す
ることがある天然起源の突然変異体を除き、その集団を
構成する各抗体が同一な抗体集団から得られる抗体を示
す。モノクローナル抗体は高度に特異的で、単一抗原部
位に指向する。さらにその上、典型的には異なる決定因
子（エピトープ）に指向する異なる抗体を包含する通常
の（ポリクローナル）抗体製品とは対照的に各モノクロ
ーナル抗体は抗原にある単一の決定因子に対して指向す
る。本明細書ではモノクローナル抗体は起源の種または
免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスの所属に関係
なく、抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含む）と
定常ドメイン（たとえば「ヒト化」抗体）、または軽鎖
と重鎖、または１種からの鎖と他種の鎖、または異種蛋
白質との融合体、をスプライシングすることによって産
生したハイブリッドおよび組換え抗体、ならびに抗体断
片（たとえばFab、Ｆ（ab'）_２、およびFv）、をも所望
の生物学的活性を示す限り包含する。（たとえば米国特
許第4816567号およびMageとLamoyi、「モノクローナル
抗体・生産技術および応用（Monoclonal・Antibody・Pr
oduction・techniques・and・Applications）」、79頁
〜97頁（Marcel・Dekker社、ニューヨーク［1987年］）
参照。そこで、修飾詞「モノクローナル」は実質的に均
質な抗体集団から得たという抗体の性質を示し、いずれ
かの特定方法による抗体の産生を要件とするものである
とは理解すべきでない。例えば、本発明に従って使用す
べきモノクローナル抗体はKohlerとMilstein、Nature、
256巻:495頁（1975年）が最初に報告したハイブリドー
マ法によって製造してもよく、また組換えDNA法（米国
特許第4816567号）によって製造してもよい。この「モ
ノクローナル抗体」は例えばMcCaffertyなど、Nature、
348巻:552〜554頁（1990年）が報告した技術を使用して
作製したファージライブラリーから分離してもよい。

非ヒト（たとえばマウスの）抗体の「ヒト化」型は特
定的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそ
の断片（例えば抗体のFv、Fab、Fab'、Ｆ（ab'）_２また
はその他の抗原結合性サブ配列）であって、非ヒト免疫
グロブリンに由来する最小の配列を含むものである。ヒ
ト化抗体はほとんどの部分がヒト免疫グロブリン（レシ
ピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定領
域（CDR）からの残基が所望の特異性、親和性、および
性能を有するたとえばマウス、ラットまたはウサギのよ
うな非ヒト種のCDR（ドナー抗体）からの残基によって
置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリン
のFv枠組領域（FR）残基を対応する非ヒト残基と置換す
ることもある。さらにその上、ヒト化抗体はレシピエン
ト抗体にも導入CDRにも枠組配列にも存在しない残基を
含むこともある。これらの修飾はさらに抗体の動作を精
密化、至適化するために行われる。一般にヒト化抗体は
その少なくとも１個、典型的には２個のCDR領域の全部
または実質的に全部が非ヒト免疫グルブリンのものに対
応する実質的に全部の可変ドメインを包含し、FR領域の
全部または実質的に全部がヒトの免疫グロブリン共通配
列のものである。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒ
トの免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領
域（Fc）の少なくとも一部も含むことになろう。

ポリペプチドを指向するポリクローナル抗体は一般に
そのポリペプチドおよびアジュバントを皮下または腹腔
内に多回注射することによって動物中に発生させる。抗
原またはそのペプチド性断片を、たとえばキーホールリ
ンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログ
ロブリン、または大豆トリプシン阻害剤のように免疫す
べき種に対して免疫原性のある担体蛋白質に、例えばマ
レイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエステル（シ
ステイン残基を経る複合）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミド（リジン残基を経る複合）、グルタルアルデヒド、
無水コハク酸、SOCl₂、またはR¹N＝Ｃ＝NR（ここにＲお
よびR¹は異なるアルキル基である）などの二官能試薬ま
たは誘導化試薬を使用して複合することが有用なことも
ある。

これらの抗原−担体蛋白質複合体で動物を免疫するに
は、1mgまたは１μｇ（おのおのウサギおよびマウス
に）の複合体をフロイントの完全アジュバント３容と混
合し、この溶液を多数部位に皮内注射する。１ケ月後に
フロイントの完全アジュバント中の複合体を初回量の５
分の１量から10分の１量を多数部位に皮下注射すること
によって動物を追加免疫する。７日から14日後に動物か
ら採血し、血清の抗gas6抗体力価について検定する。抗
体力価がプラトーに達するまで動物を追加免疫する。同
じ抗原の別の担体蛋白質を有する複合体および／または
別の交差結合試薬による複合体を注射して動物を追加免
疫することが好ましい。その抗原と適当な担体蛋白質と
の複合体も組換え細胞培養で複合蛋白質として製造でき
る。また、たとえば明礬のような凝集剤も免疫反応を強
化するために使用される。

この抗原に対して指向するモノクローナル抗体は連続
的細胞系列によって培養物中に抗体分子を産生する方法
のいずれかを使用して産生される。モノクローナル抗体
を製造するために適当な方法の例には最初のハイブリド
ーマ法、KohlerとMilstein、Nature、256巻:495〜497頁
（1975年）およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Kozbo
r,J.、Immunol.、133巻:3001頁（1984年）;Brodeurな
ど、「モノクローナル抗体・生産技術および応用（Mono
clonal・Antibody・Production・Techniques・and・App
lications）」、51頁〜63頁（Marcel・Dekker社、ニュ
ーヨーク、1987年）を含む。

非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野でよく知ら
れている。一般に、ヒト化抗体は非ヒト起源から導入さ
れたアミノ酸残基１個またはそれ以上を有する。これら
の非ヒトアミノ酸残基は「インポート」残基と呼ばれる
ことが多く、典型的には「インポート」可変ドメインか
ら取られたものである。ヒト化は当技術分野で知られて
いる方法（Jonesなど、Nature、321巻:522〜525頁［198
6年］;Riechmannなど、Nature、332巻:323〜327頁［198
8年］；およびVerhoeyenなど、Science、239巻:1534〜1
536頁［1988年］）に従ってゲッ歯類相補性決定領域（C
DR）をヒト抗体にある対応する領域に置換することによ
って実行できる。

あるいは、今日では内因性免疫グロブリン生産の不在
下に免疫によってヒトの抗体のレパートリー全体を産生
することのできるトランスジェニック動物（たとえばマ
ウス）を作製することが可能である。例えば、キメラお
よび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域
（J_H）遺伝子のホモ接合欠失が完全な内因性抗体産生の
阻害を起こすことが報告されている。この生殖系列突然
変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレ
ーの移植は抗原のチャレンジによってヒトの抗体の産生
を起こすであろう。例えばJakobovitsなど、PNAS、90
巻:2551〜2555頁（1993年）;Jakobovitsなど、Nature、
362巻:255〜258頁（1993年）；およびBruggermannな
ど、Year・in・Immuno.、７巻:33頁（1993年）参照。ヒ
トの抗体はファージディスプレイライブラリーにおいて
も生産できる。Hoogenboomなど、J.Mol.Biol.、227巻:3
81頁（1991年）；およびMarksなど、J.Mol.Biol.、222
巻:581頁（1991年）。

本発明は開示するポリペプチドの「変異体」および
「突然変異体」も意図している。この変異体は在来型ポ
リペプチド配列の断片；在来型ポリペプチド配列のＮ末
端またはＣ末端または内部にアミノ酸残基１個またはそ
れ以上が付加されたポリペプチド；アミノ酸残基１個ま
たはそれ以上が欠失したか、要すればアミノ酸残基１個
またはそれ以上が置換されたもの；および前記蛋白質、
ポリペプチドまたはその断片の誘導体であって、得られ
る生産物が非天然起源アミノ酸になるようにアミノ酸残
基が共有結合的に修飾されているものを含む。ポリペプ
チドの変異体は、例えば部位指向性またはPCR突然変異
誘発によって合成的に製造され、またはアレル型および
その他のヒトまたはその他の動物種に存在することがあ
りうる翻訳アミノ酸配列の天然起源変異体の場合のよう
に天然に存在することもある。使用できるポリペプチド
変異体の例にはヘレグリン断片（たとえばHRG−β１
_177〜244;Holmesなど、Science、256巻:1205〜1210頁
［1992年］参照）およびgas6断片（たとえばgas6のＤド
メイン断片またはＧドメイン断片のようなＡドメインが
欠失したgas6断片など）を含む。

ポリペプチド変異体は機能的に活性である限り、本発
明の範囲内に含まれる。本明細書で使用する有糸分裂促
進因子に関する「機能的に活性」および「機能的活性」
はその有糸分裂促進性ポリペプチドが細胞培養液中でシ
ュワン細胞の生存および／または増殖を強化することが
できることを意味する。

多くの場合にポリペプチド変異体は配列を最大相同性
を提供するように並列した後に例えばNeedlemanなど、
J.Mol.Biol.、48巻:443〜453頁（1970年）が記載したア
ルゴリズムの編集であるFitchなど、PNAS（USA）、80
巻:1382〜1386頁（1983年）で算出すると在来型ポリペ
プチドまたはその断片をコードする翻訳されたアミノ酸
配列と少なくとも約75％（好ましくは80％以上、さらに
好ましくは90％以上）の配列同一性を共有するものであ
る。機能的に活性なポリペプチド変異体をスクリーニン
グするために、細胞培養中でシュワン細胞を変異体と接
触させてシュワン細胞の生存率および／または増殖に及
ぼす変異体の効果を対照１種またはそれ以上（たとえば
在来型ポリペプチドおよびネガティブ対照）と比較して
測定できる。細胞培養中でシュワン細胞の生存率を強化
する変異体、好ましくはシュワン細胞の増殖を促進する
変異体を本明細書に開示する培養技術に使用するために
選択できる。

ポリペプチドのアミノ酸配列変異体はポリペプチドDN
Aに適当なヌクレオチド変化を導入し、後に得られた修
飾DNAを宿主細胞中で発現するか、または試験管内合成
することによって製造できる。この変異体は、例えば在
来型ポリペプチドアミノ酸配列内にあるアミノ酸残基の
欠失、または挿入または置換を含む。欠失、挿入、およ
び置換のいかなる組合せも、その変異体が本明細書に記
載するため所望の特性を有する限り在来型ポリペプチド
のアミノ酸配列変異体に到達するために行うこともあ
る。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体に到達するため
にアミノ酸配列に施す変化は宿主細胞での発現に際して
アミノ酸配列に、例えばグリコシル化の導入の変化また
はその部位の移動などのようなポリペプチドのさらなる
修飾に到ることもある。

ポリペプチドのアミノ酸配列変異体の構築には２種の
本質的な変化物がある：突然変異部位の位置および突然
変異の性質である。これらは在来型ポリペプチドアミノ
酸配列の変異体であって、そのポリペプチドの天然起源
アレル型を表すものか、またはポリペプチドDNAを突然
変異することによって製造されるポリペプチドの予定さ
れた突然変異型であって、いずれも天然には存在しない
アレルまたは変異体に到達するものである。

例えばヌクレオチドコード配列の縮退性のために、コ
ードするポリペプチドのアミノ酸配列に影響することな
しにヌクレオチド配列に突然変異を起こすことができ
る。その他の突然変異には在来型配列とは異なるアミノ
酸配列を有するが、機能的に活性なポリペプチドを与え
るものがある。このような機能的に活性なアミノ酸配列
変異体は、例えば在来型アミノ酸配列にあるアミノ酸残
基１個またはそれ以上を極性または荷電が類似している
か相違している別種のアミノ酸残基と置換することによ
って選択される。

有用な手法の一つは「アラニンスキャンニング突然変
異誘発」と呼称される。ここではアミノ酸残基または標
的残基の基（たとえばarg、asp、his、lysおよびgluの
ような荷電残基など）を決定し、組換えDNA技術によっ
て中性または負に帯電したアミノ酸（最適にはアラニン
またはポリアラニン）で置換してアミノ酸の細胞内外の
周辺水性環境との相互作用に影響を与える。Cunningham
など、Science、244巻:1081〜1085頁（1989年）。置換
に対して機能的感受性を示すドメインを次にさらにまた
は別の変化を置換部位にまたはその近くに導入すること
によって精密化する。

そこで、アミノ酸配列変異を導入する部位は前もって
決定される一方で、突然変異それ自体の性質を予め決定
する必要はない。例えば所与の部位にある突然変異の働
きを最適化するために、標的コドンまたは標的領域にア
ラニンスキャンニングまたはランダム突然変異誘発を行
って発現した変異体を前記のように機能的活性について
スクリーニングする。

アミノ酸配列の欠失は一般に約１から約30残基まで、
より好ましくは約１から10残基までの範囲で、典型的に
は連続したものである。例えば他の有糸分裂促進因子と
実質的に相同性のある領域からの欠失はポリペプチドの
機能的活性に影響を及ぼす可能性が高い。一般に連続的
欠失の数は、たとえばβ−プリーツシートまたはα−螺
旋のような影響を受けるドメインにおけるポリペプチド
の３次元構造を保存するであろうように選択されよう。

アミノ酸配列挿入はアミノ酸残基１個から残基100個
またはそれ以上を含むポリペプチド長までの範囲にわた
るアミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに
単一または多重なアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配
列内挿入は一般に残基約１個から10個まで、より好まし
くは１個から５個まで、最も好ましくは１個から３個ま
での範囲にわたる。末端挿入の例はＮ−末端メチオニル
残基を有する変異体ポリペプチド（たとえば組換え細胞
培養でのポリペプチドの直接的発現から得られるよう
な）および組換え宿主細胞からのポリペプチド分泌を改
善するために異種Ｎ−末端シグナル配列を持つポリペプ
チドを含む。その他の挿入にはポリペプチドＮ−または
Ｃ−末端への免疫原性ポリペプチドの融合（例えばβ−
ラクタメースのような細菌性ポリペプチドまたは大腸菌
trp遺伝子座がコードする酵素または酵母蛋白質）およ
びたとえばPCT公表番号WO89/02922号（1989年４月６日
公表）に記載のある免疫グロブリン定常領域、アルブミ
ンまたはフェリチンのような半減期の長い蛋白質とのＣ
末端融合を含む。

変異体の第３の群は在来型ポリペプチドのアミノ酸配
列におけるアミノ酸残基少なくとも１個、好ましくは１
個のみを除去してその場所に異なる残基を挿入したもの
である。このような置換をする最も興味深い部位は他の
有糸分裂促進因子との相同性が最大なポリペプチドアミ
ノ酸配列の領域である。これらの部位は有糸分裂促進性
因子の機能的活性に重要であると思われる。従って、機
能的活性を維持するためには、これらの部位、特に少な
くとも３つの同一に保存されている部位の配列内にある
部位を比較的保存的に置換する。このような保存的置換
を表１に「好適な置換」の欄に示す。このような置換が
機能的活性を変化させなければ表１の「置換例」の欄に
示したさらに実質的な変化を、またはさらに下記アミノ
酸分類に示すようなものを導入し、得られる変異体を機
能的活性について分析する。

ポリペプチドアミノ酸配列における挿入的、欠失的お
よび置換的変化をポリペプチドの安定性を改善するため
に行うことがある。例えばトリプシンその他のプロテア
ーゼ切断部位はコードされているアルギニルまたはリジ
ニル残基についてアミノ酸配列を検討することによって
確認される。これらはこの残基をその他の残基、好まし
くはたとえばグルタミンのような塩基性残基または、た
とえばセリンのような親水性残基に置換することによっ
て；これらの残基を欠失することによって；またはこれ
ら残基の直後にプロリル残基を挿入することによってプ
ロテアーゼに対して不活性にする。また、機能的活性の
ためにポリペプチドの正しい立体配座を維持することに
関与しないいずれのシステイン残基も一般的にはセリン
のようなもので置換してその分子の酸化的安定性を改善
し、異常な交差結合を予防してもよい。

アミノ酸配列変異体をコードするDNAは当技術分野で
知られている各種方法によって調製する。これらの方法
はこれに限定するものではないが天然起源からの分離
（天然起源アミノ酸配列変異体）または部位指向性（ま
たはオリゴヌクレオチド介在）突然変異誘発、PCR突然
変異誘発、および前に調製したポリペプチドの変異体型
または非変異体型をコードするDNAのカセット突然変異
誘発を包含する。

部位指向性突然変異誘発は置換、欠失および挿入変異
体を調製するために好適な方法である。この技術は当技
術分野でよく知られており（たとえばZollerなど、Met
h.Enz.、100巻:4668〜500頁［1983年］;Zollerなど、Me
th.Enz.、154巻:329〜350頁［1987年］;Carter、Meth.E
nz.、154巻:382〜403頁［1987年］;Horwitzなど、Meth.
Enz.、185巻:599〜611頁［1990年］参照）、例えばトリ
プシンおよびT4リゾチームのアミノ酸配列変異体の製造
に使用されたことがあり、これら変異体はある種の所望
の機能的性質を有する。Perryなど、Science、226巻:55
5〜557頁（1984年）；およびCraikなど、Science、228
巻:291〜297頁（1985年）。

略述すれば、部位指向性突然変異誘発を実施するに当
り、目的DNAを変更する。最初にDNAの一本鎖に所望の突
然変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリッド
化する。ハイブリッド形成後、DNAポリメラーゼを使用
し、ハイブリッドを形成したオリゴヌクレオチドをプラ
イマーに使用し、DNAの一本鎖を鋳型に使用して、第２
の鎖全体を合成する。こうして得られる２本鎖DNAに所
望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを導入す
る。

PCR突然変異誘発もアミノ酸配列変異体の製造に適す
る。Higuchi、「PCRのプロトコル（PCR・Protocol
s）」、177〜183頁、（Academic・Press社、1990年）；
およびValletteなど、Nucleic・Acids・Res.、17巻:723
〜733頁（1989年）参照。略述すれば、PCRで少量の鋳型
DNAを出発物質として使用する時に、鋳型DNAにある対応
する領域とは僅かに異なるプライマーを使用するとプラ
イマーが鋳型と異なる場所のみで鋳型配列と異なる特異
的なDNA断片が比較的大量に作製できる。

変異体を製造するもう一つの方法であるカセット突然
変異誘発はWellsなど、Gene、34巻:315〜323頁（1985
年）が報告した技術に基づく。出発物質は突然変異すべ
きDNAを含むプラスミド（またはその他のベクター）で
ある。DNA中の突然変異すべきコドンを確認する。確認
した突然変異部位の両側には独特の制限エンドヌクレア
ーゼ部位がなければならない。もしも、このような制限
部位が存在しなければ、前記オリゴヌクレオチド介在突
然変異誘発法を使用してDNAの適当な位置に導入して作
製する。プラスミドDNAはこれらの部位で切断してリネ
アライズする。両制限部位の間のDNAの配列をコード
し、所望の突然変異を含む２本鎖オリゴヌクレオチドを
標準的操作法を使用して合成するが、ここではオリゴヌ
クレオチドの鎖２本を別々に合成し、標準的な技術を使
用して相互にハイブリッドを形成させる。この二重鎖の
オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセット
はリネアライズしたプラスミドの両端と適合するような
5'および3'末端を持ち、プラスミドに直接連結できるよ
うに設計する。そこで、このプラスミドは突然変異した
DNA配列を含む。

ポリぺプチド分子の共有結合的修飾もこの発明の範囲
内に包含する。例えば、共有結合的修飾はポリペプチド
の標的アミノ酸残基を選択したアミノ酸側鎖またはＮ−
末端またはＣ−末端残基と反応することができる有機誘
導化試薬と反応させることによってポリペプチドに導入
する。

システイニル残基は最も普通には、例えばクロロ酢酸
またはクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート
（および対応するアミノ）と反応させてカルボキシメチ
ルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システ
イニル残基はまたブロモトリフルオロアセトン、α−ブ
ロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロ
アセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−
ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリ
ジル−ジスルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエー
ト、２クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、また
はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジア
ゾールとの反応によって誘導化される。

ヒスチジル残基はヒスチジル側鎖に対して比較的に特
異的なピロ炭酸ジエチルとのpH5.5〜7.0での反応により
誘導体にできる。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも有用
であるが、この反応は好まいくはpH6.0の0.1M−カコジ
ル酸ナトリウム中で実施する。

リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸、その他カ
ルボン酸の無水物と反応させる。これら試薬による誘導
体形成はリジニル残基の荷電を逆転させる効果を有す
る。α−アミノ含有残基を誘導体形成するその他の適当
な試薬には、たとえばメチルピコリンイミデートのよう
なイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリ
ドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼン
スルホン酸;O−メチルイソ尿素;2,4−ペンタンジオン；
およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒
反応を包含する。

アルギニル残基は通常の試薬１種または数種との反応
によって修飾するが、その中にはフェニルグリオキサー
ル、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオンお
よびニンヒドリンがある。グアニジン官能基のpK_aが高
いためにアルギニン残基の誘導体形成は反応をアルカリ
性条件下で実施する必要がある。その上、これら試薬は
リジンの基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基
と反応することもある。

チロジル残基の特異的修飾はスペクトル標識をチロジ
ル残基に導入するという特異的な目的で芳香族ジアゾニ
ウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって
行うこともある。最も通常的にはＮ−アセチルイミダゾ
ールおよびテトラニトロメタンを使用して各々Ｏ−アセ
チルチロジル種および３−ニトロ誘導体を形成する。チ
ロジル残基は¹²⁵Iまたは¹³¹Iを使用してヨード化してラ
ジオイムノアッセイに使用する標識プロテインを製造す
るが、前記のクロラミンＴ法が適当である。

カルボキシ側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）
は、たとえば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−
３−（４−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル）カルボ
ジイミドのようなカルボジイミド（R'−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−
R'）、ここにＲおよびR'は異なるアルキル基である、と
の反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパル
チルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反
応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変
換される。

グルタミルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱ア
ミノ化されて各々対応するグルタミルおよびアスパルチ
ル残基となる。あるいは、これら残基は緩和な酸性条件
下に脱アミノ化される。これらの残基の両型はこの発明
の範囲内に入る。

その他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシ
ル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基の
燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖の
α−アミノ基のメチル化、Ｎ−末端アミンのアセチル
化、およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化を包含す
る。Creighton、「蛋白質：構造と分子特性（Proteins:
Structure・and・Molecular・Properties）」、79〜86
頁（W.H.Freemen社、1983年）。ポリぺプチドはまた、
たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ
コールまたはポリオキシアルキレンなどの非蛋白質性ポ
リマーと米国特許第4179337;4301144;4496689;4640835;
4670417;または4791192号に記載の方法によって結合で
きる。

「鉄源」は培養されているシュワン細胞にFeイオンを
提供する分子または組成物である。この例には鉄担体
（たとえばトランスフェリン）および鉄塩（たとえばFe
SO₄）を含む。

「プロテアーゼ阻害剤」はシュワン細胞培養の間、た
とえばシュワン細胞由来プロテアーゼなど、プロテアー
ゼの蛋白質分解的作用を削減または消失させる。プロテ
アーゼ阻害剤の例にはアプロチニン、フェニルメチルス
ルホニルフルオライド（PMSF）、リューペプチン、ペプ
スタチン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホ
ニルフルオライド、ハイドロクロライドーベスタチン、
キモスタチンおよびベンズアミジンを含み、好適なプロ
テアーゼ阻害剤はアプロチニンである。

表現「細胞の生存を強化すること」は細胞培養中のシ
ュワン細胞の生存寿命の期間を増加する作用を示す。

語句「細胞の増殖を強化すること」は非処理細胞との
比較において細胞培養中の細胞分裂の速度および／また
は程度を増加する段階を包含する。細胞培養中の細胞増
殖の増加は本明細書に開示する細胞培養培地で培養する
前後に細胞数を計数することによって検出できる。増殖
の程度は培養中の有糸分裂像の百分率および数の鏡検お
よび集密度を検査することによって定量化できる。細胞
の増殖は細胞による³H取込みとDNAへの導入を測定する
ことによっても定量化できる。

分離されたシュワン細胞集団は望ましくは「実質的に
均質」であるが、これはその集団の中にある細胞の約90
から100％の間、好ましくは99％から100％の間が、シュ
ワン細胞であることを意味する。

「脱ミエリン化」はアクソン周囲のミエリン膜構造の
弛緩、破壊および最終的崩壊を意味する。この表現はシ
ュワン細胞の部分的および完全な脱ミエリン化を包含す
る。

「医薬的に許容される」担体または基剤はそれと接触
する哺乳類に対して採用する用量および濃度において無
毒なものである。医薬的に許容される担体は水性pH緩衝
液であることが多い。医薬的に許容される担体の例には
たとえば燐酸、クエン酸、およびその他の有機酸のよう
な緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量
（約10残基またはそれ以下）ポリぺプチド；たとえば血
清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのよう
な蛋白質；たとえばポリビニルピロリドンのような親水
性ポリマー；たとえばグリシン、グルタミン、アスパラ
ギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グル
コース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖
類、二糖類、およびその他の炭水化物；たとえばEDTAの
ようなキレート剤；たとえばマンニトールまたはソルビ
トールのような糖アルコール；たとえばナトリウムのよ
うな塩形成対イオン；および／またはたとえばトゥイー
ン、プルロン、またはポリエチレングリコール（PEG）
のような非イオン性界面活性剤を含む。好適な医薬的に
許容される担体または基剤は半固体、ゼラチン状、また
は粘い支持基剤である。このようなゼラチン状担体また
は基剤の例にはコラーゲン、コラーゲン−グリコサミノ
グリカン、フィブリン、ポリビニルクロリド、たとえば
ポリリジンまたはポリオルニチンのようなポリアミノ
酸、ハイドロゲル、アガロース、デキストラン硫酸塩お
よびシリコンを含む。

「神経系の損傷」はアクソンの切断、ニューロンの変
性または脱ミエリン化を起こす疾患または障害である。
神経系損傷の例には外傷的病変（たとえば物理的外傷、
外科手術または圧迫傷によって起きるもの）；虚血によ
る病変（たとえば大脳または脊髄の梗塞および虚血）；
悪性腫瘍による病変；感染症病変（たとえば膿瘍、ヒト
免疫不全ウイルス、ライム病、結核、梅毒またはヘルペ
ス感染に関連するもの）；変性病変（たとえばパーキン
ソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、また
は筋萎縮性側索硬化症に関連するもの）；栄養的疾患ま
たは障害に関連する病変（たとえばビタミンB12欠乏
症、葉酸欠乏症、ウエルニッケ病、煙草−アルコール性
弱視、マルキアファバービグナミ病およびアルコール性
小脳変性）；全身性疾患（たとえば糖尿病、全身性紅斑
性狼瘡、癌腫、または類肉腫症）に関連する神経学的病
変；毒性物質に起因する病変（たとえばアルコール、鉛
またはニューロトキシン）；および脱ミエリン化病変
（たとえば多重硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄
障害、種々の病因による横筋脊髄障害、進行性多病巣性
白質脳症および中枢脳橋ミエリン溶解）を包含する。

用語「処置すること」、「処置」、および「療法」は
治療的療法、予防的療法および阻止的療法を示す。

用語「哺乳類」は哺乳類に分類されるいずれの哺乳類
をも示し、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、およびネ
コを含む。本発明の好適な態様においては哺乳類はヒト
である。

II.本発明実施の態様 1.出発材料およびプレインキュベーション シュワン細胞を含む神経組織（すなわち末梢神経組
織）は哺乳類、好ましくはヒト（患者の承諾を受けた
後）に由来する。この組織は胚組織であってもよいが
（たとえば後根神経節）、好適な態様では自己由来移植
を促進し、患者での不都合な免疫性反応の可能性を減少
するので成人の患者由来のものである。

本発明はシュワン細胞の異種移植（たとえば哺乳類の
１種から他種哺乳類に、または胚から成人患者に）なら
びに自己由来移植を提供する。自己移植の患者が損傷し
た組織を有するならば、損傷組織はシュワン細胞の源泉
を提供できる。あるいは、たとえば神経生検のような外
科的手法を実行し、分離して培養すべきシュワン細胞を
含む組織を収集できる。末梢神経の源泉の可能性には足
首の腓腹神経、伏在神経、または上肢の上腕神経または
前腕神経を含む。これらの神経は好ましくは感覚神経で
ある。

出発神経組織の適当なサイズは約10mgから10gの間、
好ましくは約100mgから1gの間である。この神経組織は
通常本発明の初代培養相に先行するプレインキュベーシ
ョンの前には培地（たとえばRPMI−1640［Sigma社］、L
iebovitzのL15またはBelzerのUW溶液）中に貯蔵でき
る。プレインキュベーションはシュワン細胞の脱ミエリ
ン化を促進するので有利である。プレインキュベーショ
ン段階では神経組織をプロテアーゼ酵素１種またはそれ
以上で十分な時間処理して結合組織を弛緩させて脱ミエ
リン化を促進するのが望ましい。プロテアーゼ酵素多数
が購入でき、この段階に使用できるがこれには例えばコ
ラーゲネース、ディスペースおよびその他のセリンプロ
テアーゼを含む。好適な態様では神経組織を１％コラー
ゲネース／ディスペース溶液と接触させる。結合組織を
弛緩させるのに必要な時間は選択するプロテアーゼ酵素
に依存して変化するが、通常は約10分から100分、好ま
しくは約20分から50分間である。この酵素処理は例えば
約37℃で実施できる。過剰な酵素は培養培地で穏やかに
洗浄することによって除去できる。

酵素処理に続いて神経組織を適当な条件下にシュワン
細胞の脱ミエリン化（既に始まっていることもある）を
促進するに十分な時間培養する。従って、神経組織を皿
（例えば100mmペトリ皿）に置いて有糸分裂促進剤およ
び他の所望の成分を添加した培養培地に入れる。例えば
培養培地は有糸分裂促進剤１種またはそれ以上を添加し
た血清不含培地であってもよい。正常には少なくともer
bB活性化剤（たとえばヘレグリン）、インスリン（また
はIGFの一種）、およびプロテアーゼ阻害剤少なくとも
１種（たとえばアプロチニン）を下記例示の範囲で培養
培地中にプレインキュベーション期間は存在させる。し
ばしば初代培養のための培養培地を使用できる。この段
階は接着蛋白質によって細胞が培養プレートに接着して
おらず、細胞培養培地に懸濁している点で初代培養相と
は区別される（しかしながら、いくらかの細胞はプレイ
ンキュベーションしている皿の表面に自然に接着してい
てもよい）。シュワン細胞は脱ミエリン化が起きるに十
分な時間培養されるが、例示的な培養時間は約12時間か
ら120時間の範囲、好ましくは約18時間から48時間であ
る。

要すれば細胞を遠心分離で集め、ピペットで培養培地
中に再懸濁する。

2.シュワン細胞初代培養物の取得 前記プレインキュベーション段階が培養段階に先行す
る一方で、別の態様ではシュワン細胞を直接次の培養操
作にかけることができる。また、この培養操作は所望に
より他の培養段階に先行または後続できる。

固定相（たとえばプラスチックの組織培養皿またはプ
レート）を常法によってたとえばラミニン、フィブロネ
クチン、ポリリジン、またはコラーゲンのような細胞外
マトリックス／接着プロテインで被覆する。この中では
ラミニンが好適である。これにより被覆した固定相上へ
のシュワン細胞の優先的な接着および移動ができる。シ
ュワン細胞をラミニン被覆培養プレート上、適当な培養
培地中で培養する。適当な培養培地は当技術分野の熟練
者にはよく知られており、これに限定するものではない
が、商業的に購入できる培地、たとえばF12/DME、Hamの
F10（Sigma社）、最小必須培地（［MEM］、Sigma社）、
RPMI−1640（Sigma社）、ダルベッコの修正イーグル培
地（［DMEM］、Sigma社）を含む。これに加えて参考の
ために本明細書に引用するHamとWallace、Meth.Enzymo
l.、58巻:44頁（1979年）;BarnesとSato、Anal.Bioche
m.、102巻:255頁（1980年）、米国特許第4767704、4657
866、4927762、または4560655号、WO90/03430、WO87/00
195、米国再発行特許30985号、または米国特許第512246
9号に記載の培地のいずれかを培養培地として使用して
もよい。これら培地のいずれにも必要に応じて有糸分裂
促進剤、イオン（たとえばナトリウム、塩素、カルシウ
ム、マグネシウム、および燐酸）、緩衝液（たとえばHE
PES）、ヌクレオシド（たとえばアデノシンおよびチミ
ジン）、希物質（通常最終濃度がマイクロモルの範囲で
存在する無機化合物と定義する）およびグルコースまた
は等価なエネルギー源を添加してもよい。その他の必要
な添加物も当技術分野の熟練者に知られている適当な濃
度で含有させてもよい。好適な培養培地としては、F12/
DME（1:1）がある。

この培養培地には一般にRse/Ax1受容体活性化剤であ
る第一の有糸分裂促進剤を含有する。この中でgas6は好
適な活性化剤である。実施例２（ｉ）はヒトの組換えga
s6の製造技術を記載する。培地中のgas6濃度は好ましく
は約0.1ng/mLから100ng/mL、より好ましくは1ng/mLから
30ng/mL、最も好ましくは10ng/mLから30ng/mLの範囲に
あろう。第二の有糸分裂促進剤を培養培地に加えるが、
これにはerbB受容体ファミリーの構成員を活性化する分
子が適切である。ヘレグリンは好適な活性化剤であっ
て、ヒトのヘレグリン−β１_177〜244断片が最も好適な
第二の有糸分裂促進剤である（Holmesなど、Science、2
56巻:1205〜1210頁［1992年］参照）。培地中のヘレグ
リン濃度は好ましくは約0.1nMから50nM、より好ましく
は0.5nMから20nM、最も好ましくは4nMから10nMの範囲に
あろう。通常、さらに別の有糸分裂促進剤を存在させる
であろう。望ましくは、cAMP濃度を上昇させる薬剤を培
地中に存在させる。フォルスコリンは好適な薬剤であっ
てこの分子の適当な濃度は0.1μＭから50μＭまでのフ
ォルスコリン、より好ましくは１μＭから20μＭまでの
フォルスコリン、最も好ましくは２μＭから10μＭまで
のフォルスコリンである。培地にはインスリンまたはIG
F（たとえばIGF−ＩまたはIGF−II）を添加できる。イ
ンスリンは培地中に好ましくは0.1μg/mLから200μg/m
L、より好ましくは0.5μg/mLから20μg/mL、最も好まし
くは５μg/mLから20μg/mLが添加されよう。プロゲステ
ロンも培養培地中に0.1nMから1000nM、より好ましくは3
nMから200nM、最も好ましくは3nMから50nMの範囲で添加
しうる。有糸分裂促進剤１種またはそれ以上に加えて、
たとえばトランスフェリンのような鉄源を培養培地中に
存在させるのが有利であろう。培地中のトランスフェリ
ン濃度は好ましくは0.1μg/mLから100μg/mL、より好ま
しくは１μg/mLから25μg/mL、最も好ましくは５μg/mL
から10μg/mLの範囲にあろう。その他に多数の所望によ
る添加物が存在し、これらにはビタミンＥ（抗酸化剤お
よび抗トランスフォーミング剤）の好ましくは0.1μg/m
Lから100μg/mL、より好ましくは１μg/mLから20μg/m
L、最も好ましくは５μg/mLから10μg/mL;たとえばアプ
ロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤の好ましくは１μ
g/mLから500μg/mL、より好ましくは10μg/mLから100μ
g/mL、最も好ましくは20μg/mLから50μg/mLの範囲；お
よび化学的に規定された脂質（Sigma社カタログ＃11905
−015）の好ましくは１μL/mLから500μL/mL、より好ま
しくは10μL/mLから100μL/mL、最も好ましくは25μL/m
Lから50μL/mを包含する。その他の必要な添加剤も当技
術分野の熟練者に知られている適切な濃度で添加しう
る。

この培養培地は様々な間隔（たとえば約１日から５日
毎）で交換でき、細胞を約33から38℃の間、好ましくは
約37℃の生理学的に許容される温度で培養する。

本発明はまたシュワン細胞、殊にヒトのシュワン細胞
を培養するための、前記成分２種またはそれ以上の適当
な組合せからなる（好ましくは前記濃度範囲で）血清不
含培養培地を提供する。この血清不含培養培地は製造用
物品またはキットの形で提供できる。製造用物品はラベ
ルを貼付した容器を含む。適当な容器には例えばビン、
バイアル、および試験管を含む。この容器はたとえばガ
ラスまたはプラスチックスのような種々の材料で形成で
きる。この容器は好ましくは室温で前記の培地を保持
し、その培地はシュワン細胞の生存および／または増殖
を強化するために有効である。容器上のラベルはこの培
養培地がシュワン細胞の生存および／または増殖を強化
するために使用されることを示し、前記のような試験管
内使用のための指示および最適な保存条件を指示を記載
してもよい。

3.ポリペプチドの産生 ポリぺプチドが購入できない場合には、次の記載が、
たとえば有糸分裂促進性ポリペプチドおよびその変異体
のような本明細書に開示する培養技術で使用するための
ポリペプチド生産の方策を提供する。

在来型ポリペプチドまたはポリペプチド変異体を生産
するために適当な技術は当技術分野ではよく知られてお
り、ポリペプチドの内因性源泉（たとえば血清）からの
ポリぺプチドの分離、ペプチド合成（ペプチド合成機を
使用して）および組換え技術（またはこれらの技術のい
ずれかの組合せ）を含む。在来型ポリペプチドまたはポ
リペプチド変異体の好適な生産技術は組換え技術であ
る。

在来型ポリペプチドをコードする核酸はそのポリペプ
チドmRNAを有しており、検出できるレベルで発現すると
信じられる組織（たとえば脳組織）から調製したcDNAラ
イブラリーから分離できる。目的とする遺伝子またはそ
れがコードする蛋白質を確認するように設計したプロー
ブ（たとえば抗体または約20〜80塩基のオリゴヌクレオ
チド）でライブラリーを検索する。選択したプローブに
よるcDNAまたは遺伝子ライブラリーの検索はSambrookな
ど、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecula
r・Cloning:A・Laboratory・Manual）」、（ニューヨー
ク、Cold・Spring・Harbor・Laboratory・Press社、198
9年）の第10〜12章に記載の標準的操作を使用して実行
しうる。

野生型核酸の修正によるポリペプチド突然変異体を作
製する技術は前記した。在来型ポリペプチドまたはポリ
ペプチド変異体をコードする核酸（たとえばcDNAまたは
ゲノムDNA）を複製可能なベクターに挿入して追加的ク
ローニング（DNA増幅）または発現をする。多数のベク
ターが入手可能である。一般にはベクター成分にはこれ
に限定するものではないが、次のもの１種またはそれ以
上を含む：シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子
１種またはそれ以上、エンハンサーエレメント、プロモ
ーターおよび転写終結配列。

このポリペプチドはシグナル配列またはポリペプチド
のＮ−末端に特異的切断部位を持つ他種ポリペプチドと
の融合ポリペプチドとして製造することもある。一般に
シグナル配列はベクターの成分またはベクターに挿入し
たDNAの一部分でありうる。選択する異種シグナル配列
は宿主細胞が認識し、プロセッシングするもの（すなわ
ちシグナルペプチダーゼ）が好ましい。原核生物宿主細
胞にはシグナル配列を、たとえばアルカリホスファター
ゼ、ペニシリネース、lpp、または熱安定性エンテロト
キシンIIのリーダー配列から選択した原核生物シグナル
配列で置換する。酵母での分泌には在来型シグナル配列
を、たとえば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因
子リーダー（サッカロミセスおよびクルイベロミセスの
α−因子リーダーを含み、後者は1991年４月23日発行の
米国特許第5010182号に記載がある）、または酸性ホス
ファターゼリーダー、C.albicansグルコアミラーゼリー
ダー（1990年４月４日発行のEP362179号）または1990年
11月15日公表のWO90/13646に記載のシグナルによって置
換してもよい。哺乳類細胞での発現では在来型ポリペプ
チドシグナル配列で十分であるが、その他の哺乳類シグ
ナル配列も、例えばヘルペスシンプレックスgDシグナル
などのウイルス分泌リーダーと同様に適当である。在来
型ポリペプチド／ポリペプチド変異体をコードするDNA
の読取り枠にこのような前駆体領域を連結する。

発現ベクターおよびクローニングベクターの両者とも
選択された宿主細胞１種またはそれ以上の中でベクター
の複製を可能にする核酸配列を含有する。一般にクロー
ニングベクター中ではこの配列は宿主染色体DNAとは独
立に複製可能にするものであって、複製開始点または自
律的複製配列を含む。このような配列は各種の細菌、酵
母およびウイルスについてよく知られている。プラスミ
ドpBR322からの複製開始点は殆どのグラム陰性細菌に適
し、２μプラスミド開始点は酵母に適し、種々のウイル
ス（SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBP
V）の開始点は哺乳類細胞中でのクローニングベクター
のために有用である。一般に複製開始点の成分は哺乳類
発現ベクターには不要である（SV40の開始点は典型的に
は早期プロモーターを含むという理由のみで使用するこ
ともある）。

発現ベクターおよびクローニングベクターは選択マー
カーとも呼称される選択遺伝子を含有すべきである。典
型点な選択遺伝式は次のような蛋白質をコードする。
（ａ）たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレ
キセートまたはテトラサイクリンのような抗生物質また
はその他の毒素に対する耐性を与えるもの。（ｂ）相補
的栄養素要求性欠乏。または（ｃ）複合培地からは入手
できない必須栄養素、たとえばバチルス属に対するＤ−
アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するも
の。選択方式の一例では宿主細胞の増殖を休止させる薬
剤を使用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞
は薬剤耐性を与える蛋白質を生産して選択条件で生存す
る。この主な選択の例は薬剤ネオマイシン（Southernな
ど、J.Molec.Appl.Genet.、１巻:327頁［1982年］）、
ミコフェノール酸（Mulliganなど、Science、209巻:142
2頁［1980年］）またはハイグロマイシン（Sugdenな
ど、Mol.Cell・Biol.、５巻:410〜413頁［1985年］）を
使用する。前記三例は真核生物制御下に各々適当な薬剤
G418またはネオマイシン（ゲネチシン）、xgpt（マイコ
フェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性
を伝達するために細菌遺伝子を採用する。

哺乳類細胞に対する適当な選択マーカーの別種の例
は、たとえばDHFRまたチミジンキナーゼのようにポリペ
プチド核酸の取込みに競合して細胞の確認を可能にする
ものである。哺乳類細胞形質転換体を形質転換体のみが
マーカー取込みのために独特に生存に適応する選択圧下
に置く。選択遺伝子およびポリペプチドをコードするDN
Aの両者を増幅に導くように培地の選択薬剤濃度を順次
変化させて形質転換体を培養することによって選択圧を
加える。増加したポリペプチド量は増幅されたDNAから
合成される。増幅可能な遺伝子の別種の例にはメタロチ
オネイン−Ｉおよび−II、好ましくは霊長類メタロチオ
ネイン遺伝子、アデノシンデアミネース、オルニチンデ
カルボキシレース、その他を含む。

例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞は最初に
DHFRの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Mtx）を
含有する培養培地中で形質転換体全部を培養することに
よって確認する。野生型DHFRを用いる時に適当な宿主細
胞はUrlaubとChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77巻:4
216頁（1980年）が記載したようにして製造し、増殖し
たDHFR作用欠失チャイニースハムスター卵巣（CHO）細
胞系列である。次に形質転換した細胞を濃度を上げたメ
トトレキセートと接触させる。これでDHFR遺伝子の多重
コピーおよび同時にたとえばポリペプチドをコードする
DNAのような発現ベクターを含む他種DNAの多重コピーも
合成される。例えばMtxに対して高度に耐性の突然変異D
HFR遺伝子を採用（EP117060）すれば内因性DHFRの存在
に関係なくこの増幅技術をたとえばATCC番号CCL61・CHO
−K1など適当な宿主で使用できる。

あるいは、ポリペプチド、野生型DHFR蛋白質およびた
とえばアミノグリコシド3'−ホスホトランスフェレース
（APH）のようなその他の選択マーカーをコードするDNA
配列で形質転換または共形質転換した宿主細胞（特に内
因性DHFRを含む野生型宿主）はたとえばカナマイシン、
ネオマイシン、G418のようなアミノグリコシド抗生物質
のような選択マーカーに対する選択剤を含む培地での細
胞成長によって選択できる。米国特許第4965199号参
照。

酵母で使用するための適当な選択遺伝子は酵母プラス
ミドYR_p7に存在するtrp1遺伝子である（Stinchcombな
ど、Nature、282巻:39頁［1979年］;Kingsmanなど、Gen
e、７巻:141頁［1979年］；またはTschemperなど、Gen
e、10巻:157頁［1980年］）。trp1遺伝子は例えばATCC
番号44076またはPEP4−１（Jones、Genetics、85巻:12
頁［1977年］）などトリプトファン中で成長する能力を
欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供す
る。そこで酵母宿主細胞ゲノム中にあるtrp1障害の存在
はトリプトファン不在下での成長によって形質転換を検
出するために有効な環境を提供する。同様にLeu2−欠失
酵母株（ATCC20622または38626）はLeu2遺伝子を有する
既知プラスミドによって補足される。

これに加えて1.6μｍ円形プラスミドpKD1に由来する
ベクターはクルイベロミセス酵母の形質転換に使用でき
る。Bianchiなど、Curr.Genet.、12巻:185頁（1987
年）。最近、K.lactisについてウシの組換えキモシンを
大規模に生産する発現系が報告された。Van・den・Ber
g、Bio/Technology、８巻:135頁（1990年）。クルイベ
ロミセスの工業株によるヒトの組換え成熟血清アルブミ
ンの分泌のための安定な多重コピー発現ベクターも報告
された。Fleerなど、Bio/Technology、９巻:968〜975頁
（1991年）。

発現ベクターおよびクローニングベクターは通常宿主
生物が認識するプロモーターを含み、ポリペプチド核酸
に作動可能に結合している。様々な宿主細胞候補が認識
するプロモーター多数がよく知られている。これらのプ
ロモーターは起源のDNAから制限酵素消化によってプロ
モーターを取出し、分離したプロモーター配列をベクタ
ーに挿入することによってポリペプチドをコードするDN
Aに作動可能に結合させる。

原核生物宿主で使用するために適当なプロモーターに
はβ−ラクタメースおよびラクトースプロモーター系
（Changなど、Nature、275巻:615頁［1978年］；および
Goeddelなど、Nature、281巻:544頁［1979年］）、アル
カリホスファテース、トリプトファン（trp）プロモー
ター系（Goeddelなど、Nucleic・Acids・Res.、８巻:40
57頁［1980年］；およびEP36776）および、たとえばtac
プロモーター（deBoerなど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、
80巻:21〜25頁［1983年］）のようなハイブリッドプロ
モーターを包含する。しかしながらその他の既知の細菌
プロモーターも適当である。それらのヌクレオチド配列
も報告されており（Siebenlistなど、Cell、20巻:269頁
［1980年］）、必要とする制限部位を供給するためのリ
ンカーまたはアダプターを用いてこのポリペプチドをコ
ードするDNAにそれらを作動可能に連結することが熟練
した作業者には可能である。細菌系で使用するためのプ
ロモーターにはポリペプチドをコードするDNAに作動可
能に結合するシャイン−ダルガルノ（S.D.）配列も含む
であろう。

真核生物のためのプロモーター配列が知られている。
ほとんど全ての真核生物遺伝子は転写が開始される部位
から約25から30塩基上流に存在するAT豊富な領域を持
つ。多数の遺伝子の転写開始点から70から80塩基上流に
見出される別の配列はCXCAAT領域であって、このＸはい
かなるヌクレオチドでもよい。殆どの真核生物遺伝子の
3'末端はAATAAA配列であり、これはコード配列の3'末端
にポリＡテイルを付加するシグナルであるかも知れな
い。これらの配列は全て真核生物発現ベクターに適当に
挿入される。

酵母宿主で使用するための適当なプロモーター配列の
例には３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanな
ど、J.Biol.Chem.、255巻:2073頁［1980年］）または、
たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルベート脱カル
ボキシレース、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−
６−ホスフェートイソメレース、３−ホスホグリセレー
トミューテース、ピルベートカイネース、トリオースホ
スフェートイソメレース、ホスホグルコースイソメレー
ス、およびグルコカイネースのようなその他の解糖酵素
（Hessなど、J.Adv.Enzyme・Res.、７巻:149頁［1968
年］；およびHolland、Biochemistry、17巻:4900頁［19
78年］のプロモーターを包含する。

誘導プロモーターである酵母プロモーターは転写が増
殖条件によって制御されるという別の利点を有するが、
アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホ
スファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチ
オネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水
素酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用を
起こす酵素のプロモーター領域がある。酵母発現に使用
するために適当なベクターおよびプロモーターはさらに
Hitzemanなど、EP73657Aに記載されている。酵母のエン
ハンサーは酵母プロモーターとともに有利に使用され
る。

哺乳類宿主細胞のベクターからのポリペプチド転写
は、例えばポリオーマウイルス（1989年７月５日発行英
国特許第2211504号）、アデノウイルス（たとえばアデ
ノウイルス２のような）、ウシのパピローマウイルス、
トリの肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウ
イルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサル
のウイルス40（SV40）のようなウイルスのゲノムから得
られるプロモーター；たとえばアクチンプロモーターま
たは免疫グロブリンプロモーターなど異種哺乳類プロモ
ーターから得られるプロモーター；または熱ショックプ
ロモーターから得られるプロモーター；によって制御さ
れる。

SV40ウイルスの早期および後期プロモーターはSV40の
制限断片から好都合に得られ、これにはSV40ウイルスの
複写開始点も含有する。Fiersなど、Nature、273巻:113
頁（1978年）;MulliganとBerg、Science、209巻:1422〜
1427頁（1980年）;Pavlakisなど、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA、78巻、7398〜7402頁（1981年）。ヒトサイトメガ
ロウイルスの即時型プロモーターはHind III E制限断片
として好都合に得られる。Greenawayなど、Gene、18巻:
355〜360頁（1982年）。ウシのパピローマウイルスをベ
クターとして使用する哺乳類宿主でのDNA発現系は米国
特許第4419446号に開示されている。この系の修飾は米
国特許第4601978号に記載されている。サル細胞中での
免疫インターフェロンをコードするcDNAの発現に関する
Grayなど、Nature、295巻:503〜508頁（1982年）；ヘル
ペスシンプレックスウイルスから得たチミジンキナーゼ
プロモーターの制御下、サル細胞中でのヒトのβ−イン
ターフェロンcDNAの発現に関するReyesなど、Nature、2
97巻:598〜601頁（1982年）；マウスおよびウサギ培養
細胞中でのヒトのインターフェロンβ１遺伝子の発現に
関するCanaaniとBerg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、79
巻、5166〜5170頁（1982年）；およびラウス肉腫ウイル
スの長末端リピートをプロモーターとして使用するCV−
１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、およびマウスNIH−3T3
細胞中での細菌CAT配列の発現についてのGormanなど、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA、79巻:6777〜6781頁（1982年）
も参照。

ポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による
転写はベクターにエンハンサー配列を挿入することによ
ってしばしば増加する。エンハンサーは比較的に方向お
よび位置について依存性がなく、転写ユニットに対して
5'（Laiminsなど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78巻:993
頁［1981年］）および3'（Luskyなど、Mol.Cell・Bio
l.、３巻:1108頁［1983年］）、イントロン中（Banerji
など、Cell、33巻:729頁1983年］）、ならびにコード配
列自体の内部（Osborneなど、Mol.Cell・Biol.、４巻:1
293頁［1984年］）に見出されている。哺乳類遺伝子
（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプ
ロテイン、およびインスリン）からは多数のエンハンサ
ー配列が今までに知られている。しかしながら、真核生
物細胞のウイルスから得たエンハンサーを典型的には利
用する。具体的には複製開始点の後期側（bp100〜270）
にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プ
ロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポ
リオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハン
サーを包含する。真核生物プロモーターの活性化に対す
るエンハンサーエレメントに関するYaniv、Nature、297
巻:17〜18頁（1982年）も参照。エンハンサーはベクタ
ー中にポリペプチドをコードする配列の5'または3'の位
置にスプライスしてもよいが、プロモーターから5'の部
位に配置するのが好ましい。

真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、
ヒトまたは他腫多細胞生物からの有核細胞）に使用する
発現ベクターは転写終結およびmRNA安定化のために必要
な配列を含むであろう。この配列は真核生物またはウイ
ルスのDNAまたはcDNAに共通して5'および時には3'非翻
訳領域から得られる。これらの領域はポリペプチドをコ
ードするmRNAの非翻訳部分中でポリアデニル化断片とし
て転写されるヌクレオチドセグメントを含む。

前記成分を１個またはそれ以上含む適当なベクターの
構築には標準的連結技術を採用する。分離したプラスミ
ドまたはDNA断片を切断し、裁断し、必要なプラスミド
を作製するように設計した形に再連結する。

構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認する
ための分析用には、連結混合物を用いて大腸菌K12の294
株（ATCC31446）を形質転換し、形質転換に成功したも
のをアンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性の適
当な方で選択する。形質転換体からのプラスミドを調製
し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析し、およ
び／またはMessingなど、Nucleic・Acids・Res.、９巻:
309頁（1981年）の方法またはMaxamなど、Meth.Enzymo
l.、65巻:499頁（1980年）の方法によって配列決定す
る。

この発明の実行に特に有用なものはポリペプチドをコ
ードするDNAの哺乳類細胞における一過性発現を提供す
る発現ベクターである。一般に、一過性の発現には宿主
細胞中で効率的に複製することができ、宿主細胞が発現
ベクターを多数コピーを蓄積し、それでこの発現ベクタ
ーがコードする所望のポリペプチドを高濃度で合成する
発現ベクターの使用を含む。Sambrookなど、前出、16.1
7〜16.22。適当な発現ベクターおよび宿主細胞からなる
一過性発現系でクローニングしたDNAがコードするポリ
ペプチドの便利でポジティブな確認ができ、ならびに所
望の結合特異性／親和性を有するポリペプチド変異体の
迅速な検索が可能になる。

組換え脊椎動物細胞培養でポリペプチドの合成に適応
させるために適当な他の方法、ベクター、および宿主細
胞はGethingなど、Nature、293巻:620〜625頁（1981
年）;Manteiなど、Nature、281巻:40〜46頁（1979年）;
Levinsonなど、EP117060号およびEP117058号に記載され
ている。ポリペプチドの哺乳類細胞培養での発現用に特
に有用なプラスミドはpRK5（EP307247）またはpSVI6B
（1991年６月13日公表のPCT公表番号WO91/08291）であ
る。

ポリペプチド発現のための宿主細胞系列の選択は主と
して発現ベクターに依存する。本明細書のベクターをク
ローニングまたは発現するために適切な宿主細胞は前記
の原核生物、酵母、その他の高等真核生物細胞である。
この目的のために適当な原核生物にはたとえばグラム陰
性またはグラム陽性生物のような真性細菌であって、例
えば大腸菌のようなエシェリキア、エンテロバクター、
エルウィニア、クレブシェラ、プロテウス、チフス菌の
ようなサルモネラ、セラチアマルセッセンスのようなセ
ラチア、およびシゲラ、ならびにたとえばB.サチリスお
よびB.リヘニホルミス（たとえばB.リヘニホルミス41P
は1989年４月12日発行のDD266710に開示されている）の
ようなバシラス、緑膿菌のようなシュードモナス、およ
びストレプトミセスを含む。好適な大腸菌クローニング
宿主の一つは大腸菌294（ATCC31446）であるが、たとえ
ば大腸菌Ｂ、大腸菌X1776（ATCC31537）および大腸菌W3
110（ATCC27325）のようなその他の株も適当である。こ
れらの実例は例示であって限定ではない。組換えDNA生
成物の発酵のための普通の宿主株であるから株W3110は
殊に好適な宿主または宿主親である。宿主細胞は蛋白質
分解酵素の分泌量が最低なものが好ましい。例えば株W3
110に蛋白質をコードする遺伝子に突然変異を起こすよ
うに修飾することもあるが、このような宿主の例には大
腸菌W3110の株27C7を含む。27C7の完全なゲノタイプはt
onA△ptr3・phoA△E15△（argF−lac）169ompT△degP41
kan^γである。株27C7は1991年10月30日にアメリカンタ
イプカルチャーコレクションにATCC55244として寄託さ
れた。あるいは1990年８月７日発行の米国特許第494678
3号に開示されている突然変異周縁細胞質プロテアーゼ
を有する大腸菌株を採用しうる。あるいはクローニング
法、例えばPCRまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応も
適当である。

原核生物に加え、たとえば糸状菌または酵母のような
真核微生物もポリペプチドをコードするベクター用に適
するクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセ
スセルビジェまたはパン酵母は下等真核微生物宿主の中
で最も普通に使用される。しかしながら、その他の属、
種、および株の多数が同様に利用可能で本発明に有用で
ある。たとえばSchizosaccharomyces・pombe（BeachとN
urse、Nature、290巻:140頁［1981年］;1985年５月２日
発行のEP139383号）；たとえばK.lactis（MW98−8C、CB
S683、CBS4574;Louvencourtなど、J.Bacteriol.、737頁
［1983年］）、K.fragilis（ATCC12424）、K.bulgaricu
s（ATCC16045）、K.wickeramii（ATCC24178）、K.walti
i（ATCC56500）、K.drosophilarum（ATCC36906;Van・de
n・Bergなど、前出）、K.thermotoleransおよびK.marxi
anusのようなKluyveromyces宿主（米国特許第4943529
号;Fleerなど、前出）;yarrowia（EP402226号）;Pichia
・pastoris（EP183070;Sreekrishnaなど、J.Basic・Mic
robiol.、28巻:265〜278頁［1988年］）;Candida;Trich
oderma・reesia（EP244234）;Neurospora・crassa（Cas
eなど、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、76巻:5259〜5263頁
［1979年］）;Schwanniomyces・occidentalis（1990年1
0月31日発行のEP394538号）のようなSchwanniomyces;お
よびたとえばNeurospora、Penicillium、Tolypocladium
（1991年１月10日発行のWO91/00357）、およびたとえば
A.nidulans（Ballanceなど、Biochem.Biophys.Res.Comm
un.、112巻:284〜289頁［1983年］;Tilburnなど、Gen
e、26巻:205〜221頁［1983年］;Yeltonなど、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、81巻:1470〜1474［1984年］）および
A.niger（KellyとHynes、EMBO・J.、４巻:475〜479頁
［1985年］）のようなAspergillusのような糸状菌；な
どがある。

グリコシル化されたポリペプチドの発現のために適当
な宿主細胞は多細胞生物に由来する。このような宿主細
胞は複雑なプロセッシングおよびグリコシル化の活性を
有する。原理的にいずれの脊椎動物または無脊椎動物由
来の高等真核生物細胞培養も作動可能である。無脊椎動
物細胞の例は植物および昆虫細胞である。多数のバキュ
ロウイルス株および変異体および、たとえばSpodoptera
・frugiperda（毛虫）、Aedes・aegypti（蚊）、Aedes
・albopictus（蚊）、Drosophila・melanogaster（ミバ
エ）およびBombyx・moriのような宿主からの対応する可
能な昆虫宿主細胞が確認されている。たとえばLuckowな
ど、Bio/Technology、６巻:47〜55頁（1988年）;Miller
など、「遺伝子工学（Genetic・Engineering）」、Setl
owなど編、８巻、（Plenum・Publishing社、1986年）
中、277〜279頁；およびMaedaなど、Nature、315巻:592
〜594頁（1985年）参照。遺伝子移入のためのウイルス
株多種が公共的に入手可能で、たとえばAutographa・ca
lifornica・NPVのＬ−１変異体およびBombyx・moriNPV
のBm−５株があり、これらのウイルスを本発明に従って
本明細書のウイルスとして使用してもよく、特にSpodop
tera・frugiperda細胞に遺伝子移入するために本発明に
従って使用してもよい。

綿、トウモロコシ、バレイショ、大豆、ペチュニア、
トマトおよび煙草の植物細胞培養物も宿主として利用で
きる。典型的には植物細胞は予めポリペプチドDNAを含
むように操作しておいた細菌Agrobacterium・tumefacie
nsのある種の株とインキュベーションして遺伝子移入す
る。植物細胞培養物をA.tumefaciensとインキュベーシ
ョンする間にポリペプチドをコードするDNAが植物細胞
宿主に移行して遺伝子移入し、適当な条件下にポリペプ
チドDNAを発現する。これに加えて植物細胞に適応する
たとえばノパリン合成酵素プロモーターおよびポリアデ
ニル化シグナル配列のような調節配列およびシグナル配
列が入手可能である。Depickerなど、J.Mol.Appl.Ge
n.、１巻、561頁（1982年）。これに加え、Ｔ−DNA780
遺伝子の上流領域から分離したDNAセグメントは組換えD
NA含有植物組織中で植物発現遺伝子の転写レベルを活性
化または増加することができる。1989年６月21日発行の
EP321196。

脊椎動物細胞の培養での増殖（組織培養）は近年では
日常的操作になっている（「組織培養（Tissue・Cultur
e）」、KruseとPatterson編、Academic・Press社、［19
73年］）。哺乳類宿主細胞系の実例はSV40で形質転換し
たサル腎臓CV1系列（COS−７、ATCC・CRL1651）；ヒト
の胚腎系列（293細胞または懸濁培地での増殖のために
サブクローニングした293細胞、Grahamなど、J.Gen.Vir
ol.、36巻:59頁［1977年］）；幼若ハムスター腎細胞
（BHK、ATCC・CCL10）；チャイニーズハムスター卵巣細
胞−DHFR（CHO、UrlaubとChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.
USA、77巻:4216頁［1980年］）；マウスセルトリ細胞
（TM4、Mather、Biol.Reprod.、23巻:243〜251頁［1980
年］）；サル腎細胞（CV1、ATCC・CCL70）；アフリカミ
ドリザル腎細胞（VERO−76、ATCC・CRL−1587）；ヒト
の子宮頚癌細胞（HELA、ATCC・CCL2）；イヌの腎細胞
（MDCK、ATCC・CCL34）；バッファローラットの肝細胞
（BRL3A、ATCC・CRL1442）；ヒトの肺細胞（W138、ATCC
・CCL75）；ヒトの肝細胞（Hep・G2、HB8065）；マウス
乳腺癌（MMT060562、ATCC・CCL51）;TRI細胞（Matherな
ど、Anals・N.Y.Acad.Sci.、383巻:44〜68頁［1982
年］）、MRC5細胞;FS4細胞；およびヒトの肝癌細胞系
（Hep・G2）である。

宿主細胞にこの発明の前記発現ベクターまたはクロー
ニングベクターを遺伝子移入し、プロモーターを誘導す
るために適当に修正した通常の栄養培地で培養して形質
転換体を選択するか、または所期の配列をコードする遺
伝子を増幅する。使用する宿主細胞に依存して、遺伝子
移入はその細胞に適する標準的技術を使用して行う。Sa
mbrookなどの前出の成書の1.82章に記載の塩化カルシウ
ムを採用するカルシウム処理または電気穿孔を一般に実
質的細胞壁バリアーを有する原核生物またはその他の細
胞に使用する。Shawなど、Gene、23巻:315頁（1983年）
および1989年６月29日公表のWO89/05859に記載のように
ある種の植物細胞の形質転換にはAgrobacterium・tumef
aciensによる感染を使用する。これに加えて1991年１月
10日公表のWO91/00358号に記載のように超音波処理を用
いて植物に遺伝子移入することもある。

このような細胞壁を持たない哺乳類細胞ではGrahamと
van・der・Eb、Virology、52巻:456〜457頁（1978年）
の燐酸カルシウム沈降法が好適である。哺乳類細胞宿主
系形質転換の一般的側面はAxelが1983年８月16日発行の
米国特許第4399216号に記載している。酵母の形質転換
は典型的にはVan・Solingenなど、J.Bact.、130巻:946
頁（1977年）およびHsiaoなど、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）、76巻:3829頁（1979年）の方法に従って実行す
る。しかしながら、DNAを細胞に導入する他の方法、た
とえば核内マイクロインジェクション、電気穿孔、無処
置細胞との細菌原形質融合またはたとえばポリブレン、
ポリオルニチンなどのポリカオチン、その他も使用しう
る。哺乳類細胞を形質転換する様々な技術についてはKe
ownなど、Methods・in・Enzymology（1989年）、Keown
など、Methods・in・Enzymology、185巻:527〜537頁（1
990年）およびMansourなど、Nature、336巻:348〜352頁
（1988年）を参照。

ポリペプチドを産生するための原核生物細胞はSambro
okなど、前出、に一般的に記載されている適当な培地中
で培養する。

この発明のポリペプチドを産生するために使用する哺
乳類宿主細胞は様々な培地中で培養してもよい。商業的
に購入できる培地、たとえばHamのF10（Sigma社）、最
小必須培地（［MEM］、Sigmas社）、RPMI−1640（Sigma
社）、およびダルベッコの修正イーグル培地（［DME
M］、Sigma社）は宿主細胞を培養するために適当であ
る。これに加えここに全開示を参考のために引用するHa
mとWallace、Meth.Enz.、58巻:44頁（1979年）、Barnes
とSato、Anal.Biochem.、102巻:255頁（1980年）、米国
特許第4767704、4657866、4927762または4560655号、WO
90/03430、WO87/00195号；米国再発行特許第30985号；
または米国特許第5122469号に記載の培地はいずれも宿
主細胞用培養培地として使用しうる。これらの培地のい
ずれも要すれば有糸分裂促進剤（たとえばインスリン、
トランスフェリン、または表皮増殖因子のようなも
の）、塩（たとえば塩化ナトリウム、カルシウム、マグ
ネシウムおよびホスフェートのようなもの）、緩衝液
（たとえばHEPESのようなもの）、ヌクレオシド（たと
えばアデノシンおよびチミジンのようなもの）、抗生物
質（たとえばゲンタマイシン（商標）薬剤のようなも
の）、希エレメント（マイクロモル範囲の最終濃度で通
常存在する無機化合物と定義する）、およびグルコース
または同等なエネルギー源を添加してもよい。当技術分
野の熟練者に知られているその他の必要な添加物も適当
な濃度で添加してもよい。gas6の産生のためには、ビタ
ミンＫがgas6のＡドメインにあるγ−カルボキシル化を
減少させることがあるので、gas6核酸で形質転換した宿
主細胞はビタミンＫ不在下に培養するのが望ましいかも
しれない。あるいは、形質転換した宿主細胞は所望なら
例えばワルファリンのようなカルボキシレース阻害剤の
存在下に培養できる。

たとえば温度、pH、その他のような培養条件は発現用
に選択した宿主細胞に使用した前記のものであって、通
常の熟練した専門家には明白となるであろう。一般に、
哺乳類細胞培養物の生産性を最大にする原理、プロトコ
ル、および実際的技術は「哺乳類細胞バイオテクノロジ
ー：実際的手法（Mammalian・Cell・Biotechnology:a・
Practical・Approach）」、M.,Butler編、IL出版、1991
年に見出される。この開示で参照する宿主細胞は培養中
の細胞ならびに宿主動物中の細胞を包含する。

ポリペプチドは培養培地に分泌されたポリペプチドか
ら回収するのが好ましいが、宿主細胞の溶解物から回収
することもある。

このポリペプチドを他のポリペプチドから精製するた
めに、宿主細胞または溶解断片いずれかの破砕粒子を例
えば遠心分離または限外濾過によって分離する。所望な
らこの蛋白質を商業的に入手できる蛋白質濃縮フィルタ
ーで濃縮し、続いてそのポリペプチドをヘパリンセファ
ロースクロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフ
ィー、イオン交換カラム分割（たとえばDEAEまたはカル
ボキシメチルまたはスルホプロピル基を含むマトリック
スなど）、ブルーセファロースクロマトグラフィー、CM
−ブルーセファロース、MONO−Ｑ、MONO−Ｓ、レンチル
レクチン−セファロース、WGA−セファロース、コンＡ
−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパー
ル、フェニルトヨパール、またはプロテインＡセファロ
ース、SDS−PAGEクロマトグラフィー、シリカクロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、逆相HPLC（たと
えば脂肪族基付加シリカゲルなど）、たとえばセファデ
ックス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーなど
を使用するゲル濾過、ポリペプチドを選択的に結合する
カラム上のクロマトグラフィー、およびエタノールまた
は硫酸アンモニウム沈降から選択した段階１個またはそ
れ以上によって他の不純物から分離してもよい。前記段
階のいずれにもプロテオリシスを阻害するためにプロテ
アーゼ阻害剤を添加してもよく、また偶発的夾雑物の増
殖を防止するために抗生物質を添加してもよい。適当な
プロテーアーゼ阻害剤の例にはフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（PMSF）、リューペプチン、ペプスタチ
ン、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼ
ンスルホニルフルオリド塩酸塩−ベスタチン、キモスタ
チンおよびベンズアミジンを包含する。

残基を欠失、挿入または置換したポリペプチド変異体
は変異が起こす実質的な性質の変化を考慮しつつ在来型
ポリペプチドと同じ様式で回収される。例えばエピトー
プで標識したポリペプチド製品はそのエピトープ標識に
対する抗体を含有して融合ポリペプチドを吸着する免疫
親和性カラムを使用する精製を促進する。たとえばウサ
ギポリクローナル抗ポリペプチドのカラムのような免疫
親和性カラムは少なくとも１個の残留する免疫エピトー
プに結合することでポリペプチド変異体を吸着する目的
で採用できる。当技術分野の熟練者は在来型ポリペプチ
ドに適する精製法は組換え細胞培養での生産にはポリペ
プチドまたはその変異体の性質の変化に応じた修正が必
要かもしれないことを認識することとなろう。

4.医薬的製剤および人工器具 分離したシュワン細胞および医薬的に許容される担体
または基剤を含む前記の医薬的製剤は当技術分野でよく
知られている技術を使用して製造できる。要すればこの
医薬的製剤は有糸分裂促進剤（たとえばヘレグリンおよ
びgas6など）および他の成分（たとえばラミニンのよう
な細胞外マトリックス蛋白質など）の１種またはそれ以
上を含有してもよい。医薬的に許容される基剤としてゼ
ラチン状支持体を使用するならシュワン細胞を基剤の液
相に導入してもよく、後にそれを固化する処理ができる
（たとえば重合前の基剤を重合させることがある）。例
えば、シュワン細胞を酢酸水に溶解したコラーゲンに添
加することもある。この混合物をたとえばNaOHのような
適当な塩基の添加によって中性pHとし、塩の添加で等張
性にするとゲルが形成されることとなろう。

シュワン細胞はまた、文献に記載されているような人
工器具または装置中でも送達できる。一般に、シュワン
細胞（好ましくはゼラチン状基剤中に製剤化したもの）
を封入した固体チューブを末梢神経、視神経または神経
系のその他の部分にある間隙を橋渡しするための人工器
具として使用する。例えば、PianoとBunge、Experim.Ne
urol.、114巻:254〜257頁（1991年）は神経修復人工器
具として使用できるシュワン細胞封入重合コラーゲンロ
ールを記載する。Gunardなど、J.Neruoscience、12巻
（９号）:3310〜3320頁（1992年）はシュワン細胞を接
種した半浸透性誘導経路を示している。米国特許第5030
225号は切断した神経の末端を受入れるのに適合させた
開口部およびそれに通じて神経を再生するための管腔を
有する電気的に荷電した膜を含む切断した神経再生のた
めの医療用装置または人工器具に関する。この装置を患
者に設置する前にその管腔にはシュワン細胞を封入でき
る。米国特許第4662884号は本明細書に記載する技術を
用いて分離したシュワン細胞も封入できる別な型の神経
再生促進用人工器具を記載している。

5.シュワン細胞の非治療的使用 シュワン細胞はNGF、IGF−Ｉ、CNTFおよびBDNFを含む
神経栄養因子および神経突起促進因子を多数産生する
（Collierなど、Exp.Neurol.、124巻:129〜133頁［1993
年］）。従って本明細書に記載の技術を使用して分離
し、培養したシュワン細胞はこれら因子を産生するため
に使用できる。シュワン細胞特有の因子、たとえばP75
^NGFR、Ｓ−100蛋白質、ラミニンおよびGFAPなど、の分
離のためには細胞培養してシュワン細胞の集団を得るの
が好ましい。これらの因子はそれ自体で診断薬として有
用であり、また診断用抗体を作製するための抗原として
使用できる。

これとは別の態様ではシュワン細胞は目的ポリペプチ
ドをコードする核酸で形質転換して、本明細書に前記し
たようにして組換え技術によってポリペプチドを生産す
るために使用できる。

シュワン細胞の初代培養物は細胞培養において他の細
胞の増殖および／または分化を支持するために使用する
こともある。この様式ではシュワン細胞はニューロン生
存または細胞培養における胚ニューロン前駆体の増殖お
よび生存率を促進することもある。

シュワン細胞に対する他の有糸分裂促進剤および増殖
阻害因子の確認を促進するには細胞培養においてこの細
胞の安定な集団を持つことが望ましい。

6.シュワン細胞の治療的使用 哺乳類シュワン細胞（好ましくはヒトのシュワン細
胞）の集団を切断した中枢軸索の再生に影響を与える目
的で損傷した脊髄の部分に移植するため、末梢神経損傷
の修復を促進するため、および多重自己移植の代用とし
て、持つことは有益である。Leviなど、J.Neuroscienc
e、14巻、３号:1309頁（1994年）参照。少量の生検物か
ら多量の自己移植材料を得る細胞培養技術は既に広範囲
火傷を被覆するためにヒトの表皮細胞を提供することで
臨床的成功を収めている（Gallicoなど、N.Eng.J.Me
d.、311巻:338〜451頁［1984年］）。さらのその上、ヒ
ト異種移植からのシュワン細胞が免疫抑制されたマウス
からの末梢性軸索をミエリン化し、再生することができ
ることが証明されている（Aguayoなど、Nature、268巻:
753〜755頁［1977年］；およびAguayoなど、Soc.Neuros
ci.Symp.、４巻:361〜383頁［1979年］）。従って、前
記手法がヒトでも成功するであろうことが期待される。

本明細書に記載する技術を使用して分離し、培養した
シュワン細胞はたとえば前記の神経系損傷を処置するた
めに使用できる。分離したシュワン細胞、シュワン細胞
を含有する医薬組成物またはシュワン細胞を封入した人
工器具は当技術分野で知られているいずれかの方法を使
用して神経系障害部に導入できる。哺乳類にシュワン細
胞を導入する方法には神経障害部を露出して細胞を導入
する外科的手法および障害部を露出せずに障害部に細胞
を直接に注射するものを包含する。例えば脊髄が破壊さ
れていれば、椎弓切除術を使用して脊髄の患部を露出す
る。反跳巣の後、損傷した脊髄の中枢領域をマクロファ
ージの作用によって取出して液体が充満した嚢胞を残
す。超音波を使用して嚢胞を可視化し、嚢胞欠損部にシ
ュワン細胞（要すれば医薬的に許容される担体中の）の
注射を行なってもよい。構造的に明確に規定された神経
（たとえば顔面または視神経）の近くに障害が起きた時
はその患部神経セグメントのサイズおよび形に合わせて
前記送達器具を成形して神経人工器具を形成してもよ
い。患部神経を外科的に露出し、障害部を除き、神経人
工器具に置換え、その場所に縫合、その他の方法で固定
してもよい。別の態様では、脊髄または大脳半球内の梗
塞部分または深部脱髄部分の中に起きた障害ではシュワ
ン細胞（好ましくは医薬用液体担体中）を患部に（たと
えばパーキンソン病の症例では脳に）放射線誘導を使用
して組織内圧および／または頭蓋内圧の上昇を避けるよ
うに注射する材料を組織が容易に適応する容積に限定し
て注射してもよい。例えばSpencerなど、パーキンソン
病患者尾形核へのヒト胎児中脳組織の片側移植、New・E
ng.J.Med.、327巻:1541〜1548頁（1992年）を参照。患
部にシュワン細胞を送達するその他の技術も入手でき
る。例えば馬尾障害の修復におけるシュワン細胞の送達
に関するWO92/03536号を参照。

患者に投与すべきシュワン細胞の「有効量」は例えば
治療の対象、投与経路、および患者の状況に依存するも
のである。従って治療者には最適な治療効果を得るため
の用量を決め、投与経路を修正することが必要となろ
う。典型的な用量は例えばシュワン細胞約１×10⁴〜１
×10⁶個の範囲になることもあろう。シュワン細胞は患
者に単回または多回投与してもよい。可能ならば、例え
ば最初に前記のような動物モデルを使用して適当な用量
範囲を試験管内で決定し、それからヒトの患者に対する
用量範囲を外挿してもよい。

次の実施例は例示目的で提供するものであって限定の
ためではない。本明細書では全ての引用文献の開示は参
考のために明示的に引用するものである。

実施例１ ラットのシュワン細胞の分離および培養 この実施例は均質なシュワン細胞培養物を与えるが線
維芽細胞の増殖は支持しない血清不含規定培養系を開示
する。この血清不含培養系で初代培養の初日から迅速な
シュワン細胞成分の継続的増殖および継代培養ができ
る。線維芽細胞は増殖をしないで急速に培養物から消失
し、継代数２では純粋なシュワン細胞が得られる。この
手法を使用して、ラット胚および成体ラット双方の後根
神経節（DRG）から正常なシュワン細胞系列を連続的に
増殖し、また樹立することができる。これらの細胞は顕
著な細胞喪失および形質の変化した表現型の細胞が急増
する「クライシス」期間は経ない。しかしながら、これ
らの細胞は増殖および付着因子に対する応答の相違およ
び増殖および付着因子産生の相違によって特徴付けられ
る明白な増殖相を経る。

（ｉ）初代培養 E14胚および成体Sprague・Dawleyラットから後根神経
節（DRG）を摘出し、解剖用顕微鏡下に結合組織を除去
した。清浄なDRGをコラーゲン／ディスパーゼ（Boehrin
ger・Mannheim社）とともに胚では0.3％、成体DRGでは
５％の濃度で45分間インキュベーションした。次に、DR
Gを1mLPipettman（商標）で穏やかに採取して分散させ
た。分散した細胞を遠心分離（1000rpm、５分間）して
集め、F12/DMEMで３×洗浄し、ラミニン被覆皿上で7F:
ヒト組換えインスリン（５μg/mL）、トランスフェリン
（10μg/mL）、プロゲステロン（２×10^-8M）、ウシ下
垂体抽出物（Robertsなど、Amer.J.Physiol.;Lung・Cel
l.＆・Molec.Physiol.、３巻:415〜425頁［1990年］）
（10μL/mL）、組換えヘレグリン（3nM、HER−β１
_177〜244）（Sliwkowskiなど、前出）、フォルスコリン
（５μＭ）、およびα−トコフエロール（５μg/mL）添
加F12/DMEM中に塗布した。胚では４日後、成体細胞は７
日後にシュワン細胞は全面密集単層にまで増殖した。

ラミニン基質上に増殖した初代培養物からの細胞をス
プリット比1:4で４日毎にプロゲステロン、インスリ
ン、α−トコフェロール、ヘレグリン、フォルスコリン
およびトランスフェリンならびにウシ下垂体抽出物を添
加した培地でラミニン被覆皿上で継代培養した。最初に
見られた迅速な増殖が第８次培養（16回目の倍増）まで
継続した。この時点で成体および胚培養物はその増殖を
「休止」した。これは培養物が生きているが分裂しない
７〜９日の期間に一致した。この期間の終わりに培養物
中の別個に分裂を開始した複製培養物を含む全細胞が分
裂を再開して最初の迅速な倍増時間が継代培養30回以上
にまで継続した。「クライシス」または老化現象に典型
的に見られるような個体激減または耐性副集団の選択は
存在しなかった。同様な新らしい初代培養を開始する時
にはこの休止は再現される現象であった。後の継代培養
からの調整培地、余分なビタミンまたは栄養素またはそ
の他の増殖因子はこの増殖休止を変えないようであっ
た。しかしながら、ヘレグリン濃度を1nMから10nMに増
加すると休止の開始を継代数10まで延期してラグ期間を
短縮した。成体および胚シュワン細胞培養物は形態的に
は非常に類似しており、初代培養に典型的な双極紡錘形
の形態を継続して示した。シュワン細胞マーカーである
GFAPおよびＳ−100蛋白質で染色すると成体および胚SC
培養物は継代数３には100％の細胞が染色された。この
細胞系列を正常ラット胚シュワン細胞（nrESCまたはES
C）または正常ラット成体シュワン細胞（nrASCまたはAS
C）と命名した。連続培養においてESCは継代数40以後は
核型化されて倍数体核型を維持した。しかしながら、早
期継代数に凍結し、解凍すると異数性および染色体異常
が起きた。同様な結果はASC細胞系列でも見られた。

（ii）免疫組織化学 シュワン細胞をラミニン被覆チャンバースライドに塗
布して２日間増殖した。NGF受容体免疫組織化学には生
細胞を4mg/mLモノクローナル抗NGFr（Boehringer・Mann
heim社、クローン192）の１％BSA含有F12/DMEM液中４℃
で４時間インキュベーションし、次に同じ培地で５回洗
浄し、４％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。GF
APおよびＳ−100免疫組織化学について、細胞を燐酸緩
衝液食塩水（PBS）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒ
ドで30分間固定した。固定した細胞をPBSで３回洗浄
し、10％ヤギ血清、0.1％トリトンＸ−100含有PBS中で
２時間37℃でインキュベーションしてブロックした。販
売社の示唆に従って１％ヤギ血清および0.1％トリトン
Ｘ−100を含有するPBSで希釈したポリクローナル抗−GF
AP（ICN社）および抗−S100（ICN社）とのインキュベー
ションを４℃で一夜実行した。PBSで３回洗浄後、抱合
第二抗体、ヤギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ab'）_２−FI
TC（Boehringer・Mannheim社）およびヤギ抗マウスIgG
（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ab'）_２−ファイコエリスリン（Boehrin
ger・Mannheim社）を使用して結合した第一抗体を染色
した、Nikon社MicrophotFX上、螢光マイクログラフをエ
ピ螢光で撮影した。ラミニン免疫細胞化学では、シュワ
ン細胞をポリ−Ｄ−リジン上で培養するか、または懸濁
液中で２代にわたって増殖させた。細胞を原位置で固定
するか、または細胞を遠心後にスライドに固定し、GFAP
およびＳ−100蛋白質について前記のように免疫螢光を
測定した。

（iii）マトリックスの研究 24ウェルプレートの被覆を種々のマトリックスプロテ
インと室温で１時間、ラット尾部コラーゲン（Collabor
ative・Research・Laboratories社）については1:10希
釈濃度でおよびヒトの血漿フィブロネクチン（GIBCO・B
RL社）、マウスラミニン（GIBCO・BRL社）、およびポリ
−Ｄ−リジン（Boehringer・Mannheim社）については10
μg/mLとインキュベーションして行った。ポリ−Ｄ−リ
ジンまたはコラーゲンで被覆したプレートは使用する前
にPBSで２回洗浄して余分なマトリックスを除去した。7
F培地中の解離した胚DRG細胞を種々の細胞外マトリック
スで前被覆した24ウェルプレートに塗布した。細胞を観
察し、Nikon社Diaphot倒立位相差顕微鏡を使用して顕微
鏡写真を撮影した。培養96時間後、細胞をトリプシン−
EDTA溶液に分散し、Coulter（商標）粒子計数機で計数
した。

細胞形態に種々の基質（ラミニン、ポリ−リジン、フ
ィブロネクチン、またはコラーゲン）上で顕著な相違が
見られた。24時間以内にラミニン上に塗布した細胞は組
織凝塊から移動して離れ、シュワン細胞はニューロンプ
ロセスから離れた。ポリリジン基質への細胞移動ははる
かに少数で、シュワン細胞およびニューロンは組織凝塊
の近くに残留した。３日間の培養で、種々の基質上の培
養物にはさらに驚くべき相違が見られた。ポリリジンお
よびコラーゲン上の培養物には広範囲に神経突起の伸長
があったが、シュワン細胞は僅数が細胞凝塊の中央から
離れて移動し、細胞分裂は殆ど見られなかった。フィブ
ロネクチン被覆プレートでも同様にシュワン細胞および
ニューロンはそれらを結合する長い突起と共に固定した
凝塊中に残留し、細胞複製は殆どなかった。対照的にラ
ミニン基質上の培養物は広範囲に複製が起き、急速に分
裂するシュワン細胞が容易に確認された。シュワン細胞
は移動してニューロンから離れてニューロンの固定した
クラスターに散在する全面密集単層を形成した。このニ
ューロンクラスターは浮き上がってプレートを離れ、最
初の継代培養で失われた。初代培養物のこの非常に早期
な段階においてさえ、成体および胚DRG双方からのシュ
ワン細胞が急速に分裂して培養物中の細胞の大多数を占
めることが明らかであった。これら細胞を胚細胞が強い
優先性を示すラミニン基質で継代培養した。

非常に類似した増殖パターンが成体DRGから由来する
初代培養物でも見られた。ここでもラミニン基質に塗布
した細胞はニューロン突起から移動して離れ、分裂を開
始したが、一方では他の基質上ではさらに凝集して無活
動のままであった、これらの細胞もラミニン上で二次培
養して多回継代培養した。しかしながらそれらは胚細胞
のようなラミニンに対する後続継代の強い特異性を示さ
ず、ラミニンと同様にポリ−Ｄ−リジンを塗布したセル
上でもよく増殖したであろう。

（iv）増殖因子の研究 記載継代数の成体または胚起源シュワン細胞を検討対
象の増殖因子を除去したF7添加F12/DMEM中でラミニン被
覆多ウェルプレートに塗布した。この因子は後に一連の
濃度で添加した。細胞はCoulter（商標）粒子計数機で
計数する前に96時間培養した。

細胞は有糸分裂促進剤（プロゲステロン、インスリン
およびヘレグリン）、ビタミン（α−トコフェロール、
ビタミンＥ）、鉄源（トランスフェリン）、ならびにフ
ォルスコリン、およびウシ脳下垂体抽出物を添加した培
地中で多回継代培養した。これらの因子に対する胚およ
び成体細胞の応答を比較した。ESCおよびASCはいずれも
cAMP刺激剤であるフォルスコリンに対して二相性の増殖
反応を示した。他の増殖因子全部の存在下には両細胞系
列において約2.5μＭ−フォルスコリンで最高の刺激が
見られた（図4Aおよび図4B）。これらの条件下にヘレグ
リンもまた主な増殖刺激剤であった。図5Aおよび図5Bは
培養継代数21におけるASCおよびESCのヘレグリンに対す
る応答を比較する。各細胞は１〜2nM−ヘレグリンで半
最大応答を示す。ウシ脳下垂体抽出物（BPE）の効果
（図6Aおよび図6B）はヘレグリンの存在下に見られ、ま
たヘレグリンの効果はウシ脳下垂体抽出物存在下に両細
胞系列で見られる。両細胞系列は0.125μＬ（21μｇ全
蛋白質）までの微量なBPEによって明確に刺激される
が、最高の刺激は２〜８μＬに見られる。これら細胞に
は¹²⁵I−ヘレグリンとの直接的な競合的結合によって証
明されるヘレグリン受容体を有する。

両細胞系列で他の主たる増殖刺激剤の一つはインスリ
ンである。インスリン、IGF−Ｉ、およびIGF−IIに対す
る応答を図7A〜図7Fに示す。ASC細胞は低濃度のIGF−Ｉ
およびインスリンに応答したが、IGF−IIの低濃度まで
には到らなかった。対照的にESC細胞は基本的にIGF−II
に応答したが、生理学的濃度でのインスリンまたはIGF
−IIには僅かな刺激しか示さなかった。非常に高濃度の
この因子３種全部によって両細胞系列ともいくらかの増
殖刺激を示した。

ラミニン基質は前記初代培養段階のみならず、細胞付
着およびホルモンおよび増殖因子に応答する後続する増
殖反応がラミニン被覆の存在に依存する後続継代培養段
階においても培養条件の重要な部分である。

（ｖ）ミエリン化の研究 後根神経節ニューロンを60〜70日齢成体ラットから分
離した。清浄な後根神経節（DRG）を５％コラーゲナー
ゼ／ディスパーゼで37℃で解離した。遠心分離（900rp
m、２分間）で細胞を集め、付随細胞を伴うDRGニューロ
ンを５％ウシ血清アルブミン（BSA）クッションを利用
する遠心分離で豊富化した。収集した細胞をさらにトリ
プシン溶液（GIBCO・BRL社）で30分間37℃で解離し、90
0rpmで２分間ペレット化した。ペレットをF12/DMEM中に
再懸濁し、単位重力加速度で１％〜３％BSA勾配により
２回沈降させてDRGニューロンを精製した。マイクロウ
ェル培養物の滴定および夾雑しているかも知れないシュ
ワン細胞の観察で測定するとこのプロトコルで精製した
DRGの純度は99.9％を超えた。再ミエリン化を検討する
ためDRGニューロンおよび樹立したシュワン細胞系列を5
ng/mLのNT−３および15％ウシ胎児血清添加F12/DMEM中
で別々に培養するか、共培養した。培養培地は毎週１回
交換した。培養１週間後、２日毎にＬ−アスコルビン酸
を最終濃度50μg/mLまで添加した。共培養物は培養40日
目に髄鞘をスーダンブラックで染色した。糖蛋白質関連
ミエリン（MAG）を免疫細胞化学によって免疫染色し
た。培養物を抗MAGモノクローナル抗体（Boehringer・M
annheim社）と40℃で４時間インキュベーションし、遊
離の抗体を除去するために培地で５回洗浄した後に４％
パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞をPBS
で３回洗浄し、10％ヤギ血清PBS溶液と２時間インキュ
ベーションしてブロックし、次にヤギの抗マウスIgG
（Ｈ＋Ｌ）−ペルオキシダーゼ複合体とインキュベーシ
ョンした。第二の抗体の特異的結合はDAB−H₂O₂による
呈色反応を示した。40日間培養後、MAGに対して陽性に
染色される多数の軸索が観察された。これはESC細胞が
軸索をミエリン化する性能を維持していたことを示す。

実施例２ ヒトのシュワン細胞の分離および培養 （ｉ）gas6およびヘレグリンの産生 Rse−およびAx1−特異的な抗体を利用してRseおよびA
x1受容体のチロジンキナーゼをヒトのシュワン細胞中に
検出した。ヒトシュワン細胞の増殖を強化するgas6の性
能を測定した。

ヒトのgas6は組換え的に製造した。gas6のcDNAはヒト
脳cDNAの逆転写物からポリメラーゼ連鎖反応クローニン
グによって取得した。アミノ酸１〜318をコードするcDN
Aおよびアミノ酸319〜678をコードするcDNAを結合する
ことによって全長ヒトgas6クローンを構築した。gas6の
cDNAはヒト胚脳cDNA（Clontech社）１μｇを鋳型として
使用するPCRによって報告（Markなど、J.Biol.Chem.、2
67巻:26166頁［1992年］）のようにしてPfuDNAポリメラ
ーゼによって取得した。hgas6の5'−部分および3'−部
分を得るように設計した正方向および逆方向プライマー
は各々次の通り： 組換えgas6は調整培地から親和性クロマトグラフィー
で精製した。ヒトの胎児腎臓293細胞にMarkなど、J.Bio
l.Chem.、267巻:26166頁（1992年）が記載したようにし
て一過性に遺伝子移入した。４時間インキュベーション
した後に、培地を抗生物質および２μg/mLビタミンＫ含
有血清不含増殖培地に置換した。遺伝子移入の２日後お
よび４日後に調整培地を集めた。遺伝子移入した細胞の
調整培地は¹²⁵I−Rse−IgGの結合を活性化したが（Mark
など、J.Biol.Chem.、269巻:10720頁［1994年］参
照）、非遺伝子移入またはモック遺伝子移入293細胞の
ものは活性化しなかった。集めた調整培地1Lを遠心分離
して清澄にし、緩衝液Ａ（50mM−トリス塩酸、pH7.5、
0.1％CHAPS、5mM−ベンズアミジン）１容で希釈し、あ
らかじめ緩衝液Ａと平衡させておいたResourceQカラム
（Pharmacia社）6mLに適用した。カラムを０〜0.4M−Na
Cl勾配の緩衝液A12カラム容で溶離した。活性画分を集
めて緩衝液A1容で希釈し、納入社（Pierce社）の指示書
に従ってEmphase樹脂mL当りRse−IgG2mgを使用して調製
したRse−IgG親和性カラムに適用した。

組換えgas6の同一性はアミノ末端配列によって検証し
た。この配列からのグルタミン酸残基のシグナルが弱
く、γ−カルボキシル化に一致する。

組換えヘレグリン−β１_177〜244断片はHolmesなど、
Science、256巻:1205〜1210頁（1992年）に記載のよう
にして調製した。

（ii）プレインキュベーション 末梢神経組織はマイアミ大学医学部から前記（Leviな
ど、J.Neuroscience、15巻、２号:1329〜1340頁［1995
年］）のように患者の適切な同意の下に入手した。末梢
神経繊維の断片をBelzerのUW溶液に入れてカリホルニア
あて発送された。受領後、神経繊維を新鮮なF12/DME
（1:1）で洗浄し、１％コラーゲナーゼ／ディスパーゼ
溶液（Boehringer・Mannheim社）と30分間37℃でインキ
ュベーションした。次に組織を新鮮な組織培養培地に移
動させながら組織を穏やかに３回洗浄した。繊維を100m
mペトリ皿の次のものを添加した血清不含培地中に塗布
した：インスリン（10μg/mL）、トランスフェリン（10
μg/mL）、α−トコフェロール（５μg/mL）、組換えヒ
トのヘレグリン−β１_177〜244（10ナノモル/L）、フォ
ルスコリン（５μモル）、プロゲステロン（３×10^-8モ
ル）および実施例１記載のような調製したウシ脳下垂体
抽出物（BPE）（３μL/mL）添加F12/DME（1:1）。シュ
ワン細胞は懸濁液で48時間培養して部分的に脱髄させ
た。次に神経繊維を1000rpmで５分間遠心分離して集
め、穏やかにピペット吸引して再懸濁および分散させ
た。

（iii）初代培養物の調製 アプロチニン（25μg/mL）および化学的に規定された
脂質（Sigma社カタログ番号11905−015;Gibco・BRL社）
を加えた規定培地に分散させたシュワン細胞をラミニン
（Gibco・BRL社）被覆組織培養48ウェルマルチプレート
に８×10³細胞／ウェルで再塗布した。これら培養物を
「初代培養物」と命名した。培地は５日毎に交換した。
全面密集増殖した純粋シュワン細胞は２週間以内に得る
ことができた。第一および第二継代では細胞をコラーゲ
ナーゼ／ディスパーゼ（Boehringer・Mannheim社）を利
用してプレートから取出し、３％BSA含有培地で洗浄
し、前記のように塗布した。使用した培地はインスリン
（10μg/mL）、トランスフェリン（10μg/mL）、α−ト
コフェロール（５μg/mL）、プロゲステロン（３×10^-8
モル）、アプロチニン（25μg/mL）および化学的に規定
された脂質（Sigma社カタログ番号11905−015）（50μg
/mL）を添加したF12/DME（1:1）である「6F」培地であ
った。8F培地は6F培地の添加物ならびに組換えヒトヘレ
グリン−β１_177〜244（10ナノモル/L）およびフォルス
コリン（５μＭ）を含有する。シュワン細胞の生存率お
よび増殖に及ぼすgas6の効果はこれら培養培地のいずれ
かにgas6を添加することによって研究した。

gas6はヒトシュワン細胞の増殖を用量依存的に刺激
し、明白な効果が1ng/mL（14pM）で見られ、最大効果が
10ng/mL以上で見られた（図8A）。gas6単独でも対照に
比較してシュワン細胞数を明確に増加させた。cAMP活性
化剤フォルスコリンの存在下にはgas6による全細胞数の
増加はさらに強調される。gas6およびヘレグリンの間に
は相乗効果も観察される。好適な濃度のフォルスコリン
およびヘレグリン両方の存在下においてさえ、gas6は細
胞数およびチミジン導入の両方を増加した（図8B）。

好適な濃度のフォルスコリンおよびヘレグリン両方の
存在下では、シュワン細胞増殖を刺激すると報告したそ
の他前記の増殖因子は無効であるか（PDGF、FGF−β）
または細胞数を減少した（IL−１αおよびTGF−β１）
（図8C）。ヒトのまたはウシのプロテインＳを10ng〜５
μｇ添加しても５日間の培養ではシュワン細胞数は増加
しなかった。これとは対照的に、gas6は30μg/mLで細胞
数を最高に増加した。gas6とフォルスコリンおよびヘレ
グリンの組合せは５日間の期間で6F＋フォルスコリン＋
ヘレグリン＋５％BSAの組合せで見られるものに匹敵す
る最大細胞増殖を示した。

（iv）細胞の形態学 gas6は位相差顕微鏡で観察される6F＋ヘレグリン;6F
＋ヘレグリン＋gas6;8F＋gas6;および8F＋10％ウシ胎児
血清内で増殖させたヒトシュワン細胞の形態に顕著な効
果を示した。96時間培養した後に顕微鏡写真を撮影し
た。gas6存在下に増殖したシュワン細胞はヘレグリンま
たはフォルスコリンおよびヘレグリンの存在下に増殖し
た細胞に見られたものよりはるかに長い突起を有してい
た（図10A〜図10C）。完全に発達したシュワン細胞の紡
錘型形態を持つ細胞でさえ、8F＋gas6培養物中では明白
な有糸分裂像も見られた。8F培養物に血清を添加すると
細胞形態を変化させ、細胞は平たくなり、拡がり、また
時には空胞が形成された（図10D）。

（ｖ）シュワン細胞マーカー 細胞をシュワン細胞マーカーGFAPおよびS100プロテイ
ンで免疫螢光によって染色した。略述すれば、8F＋gas6
で培養した継代数４のヒトのシュワン細胞をラミニン被
覆したチャンバースライド上で24時間培養し、10％ホル
マリンPBSで固定した。固定した細胞を10％ヤギ血清で
ブロックし、ウサギの抗GFAP（ICN社）および抗S100プ
ロテイン（ICN社）と販売社の推奨する希釈率でインキ
ュベーションした。初代抗体の特異的結合体をヤギの抗
ウサギIgG（Fab'）₂FITC複合体で染色した。細胞をDNA
色素プロピジウムヨーディドでカウンター染色した。ネ
ガティブ対照処置をWI−38細胞で行ったが染色されなか
った。４回継代培養後、増殖した細胞はシュワン細胞マ
ーカーGFAPおよびS100プロテインについて100％の免疫
螢光染色を示した。

（vi）Rse/Ax1受容体の活性化 Ax1−Rseファミリーのチロシンキナーゼ受容体によっ
てヒトのシュワン細胞増殖を刺激するgas6の性能を研究
した。０、0.01、0.1または１μg/mLのヒトgas6（hgas
6）のヒトのシュワン細胞を37℃のインキュベーター中
で15分間刺激した。細胞溶解物を調製し、ウサギの抗hR
seFc融合蛋白質抗体およびウサギ抗はhAx1抗体で免疫沈
降させた。hRseおよびhAx1受容体のチロシン燐酸化を4G
10抗−燐酸化抗体で検出した。ヒトのシュワン細胞10⁶
個を規定培地（8F＋gas6）中で全面密集近くまで増殖さ
せ、実験の24時間前に6F培地に変更した。細胞を精製組
換えhgas6で15分間37℃のインキュベータ中で処理し、
氷上で溶解緩衝液（20mM−HEPES、pH7.4、135mM−NaC
l、50mM−NaF、1mM−バナジン酸ナトリウムおよび1mM−
モリブデン酸ナトリウム、2mM−EDTAおよび2mM−EGTA、
10％グリセリン、１％NP40、１μＭ−オカダ酸、1mM−P
MSFおよび1mM−AEBSF）1mLによって溶解した。細胞溶解
物を４℃で10分間14000×ｇで遠心分離して清澄にし
た。ウサギの抗hRseFc融合蛋白質抗体１μｇまたはhAx1
のCOOH末端にあるアミノ酸10個に対するウサギ抗hAx1抗
体２μＬを使用して２時間４℃で免疫沈降させた。免疫
複合体をプロテインＡセファロースCL−4Bビーズ10μＬ
で集めた。Novex4〜12％勾配ゲル上で蛋白質を分離し、
ニトロセルロース膜に移した。4G10マウス抗ホスホチロ
シン抗体（UBI社）、ヤギ抗マウスセイヨウワサビペル
オキシダーゼ複合体およびECL発色キット（Amersham
社）を使用して抗ホスホチロシン免疫ブロットを作製し
た。

ヒトのgas6をヒトのシュワン細胞細胞に添加するとAx
1およびRse両受容体のチロシン残基上に自己燐酸化を起
こした。A1xおよびRseの活性化は1.4〜14μＭ−gas6で
検出できた。このAx1およびRseの燐酸化はヘレグリンで
刺激した培養物では観察されなかった。培養ラットシュ
ワン細胞中でのgas6発現はノーザンブロットでは検出さ
れなかった。さらにその上、ラットシュワン細胞調製培
地中でのgas6活性は見られていない。如何なる理論によ
るものではないが、gas6が成長する軸索によってまたは
近くの線維芽細胞（そこから最初のgas6がクローニング
された）によって生産されている可能性がある。たとえ
ばPDGFおよびFGFのような他のチロジンキナーゼ受容体
に作用することが知られている他の増殖因子はこれらの
規定条件下にはヒトのシュワン細胞増殖を増大しないの
で、このシュワン細胞にあるAx1−Rse受容体の活性化は
高度に特異的である。erbB受容体ファミリーを経て独立
に作用するシュワン細胞増殖因子、GGF/ヘレグリン、は
この研究ではgas6と相乗作用する。

（vii）ERK2活性化 hgas6処理後のヒトのシュワン細胞にあるp42ERK2の活
性化を研究した。ヒトのシュワン細胞をhgas6で15分間
刺激して細胞溶解物を調製した。同量の蛋白質を含む細
胞溶解物を８％SDS−PAGEゲルで処理した。蛋白質をニ
トロセルロース膜に移し、C20マウス抗ERK1＋２モノク
ローナル抗体（Santa・Cruz・Biotechnology社）、ヤギ
抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体および
ECL発色キットで免疫ブロットした。Ax1およびRse受容
体の活性化はERK2の活性化に合致し、p42ERK2に特徴的
なゲル易動性の変化が誘導された。増殖因子受容体によ
るERK2の活性化は細胞増殖を含む多面的な細胞事象を誘
導する。

配列表 （１） 一般的情報 （ｉ） 出願人：ジェネンテク・インコーポレイテッ
ド （ii） 発明の名称：シュワン細胞の分離および培養 （iii） 配列の数:9 （iv） 連絡先： （Ａ） 宛名：ジェネンテク・インコーポレイテッ
ド （Ｂ） 通り：ポイント・サン・ブルノ・ブールバ
ード460番 （Ｃ） 市：サウス・サン・フランシスコ （Ｄ） 州：カリフォルニア （Ｅ） 国：アメリカ合衆国 （Ｆ） ZIP:94080 （ｖ） コンピューター解読書式： （Ａ） 媒体型:3.5インチ、1.44Mbフロッピー・デ
ィスク （Ｂ） コンピューター:IBM PC適合 （Ｃ） オペレーティング・システム:PC−DOS/MS
−DOS （Ｄ） ソフトウエア:WinPatin（Genentech） （vi） 本出願のデータ： （Ａ） 出願番号： （Ｂ） 出願日： （Ｃ） 分類： （viii） 弁理士／代理人情報 （Ａ） 氏名：リー，ウェンディ・エム （Ｂ） 登録番号:00,000 （Ｃ） 参照／整理番号:P0946PCT （ix） 電話連絡先情報 （Ａ） 電話番号:415/225−1994 （Ｂ） ファックス番号:415/952−9881 （Ｃ） テレックス:910/371−7168 （２） 配列番号１の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:673アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号1: （２） 配列番号２の情報： （ｉ） 配列の特徴 （Ａ） 長さ:678アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号2: （２） 配列番号３の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:676アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号3: （２） 配列番号４の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:1872塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号4: （２） 配列番号５の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:296アミノ酸 （Ｂ） 型：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号5: （２） 配列番号６の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:28塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号6: （２） 配列番号７の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:31塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号7: （２） 配列番号８の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:28塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号8: （２） 配列番号９の情報： （ｉ） 配列の特徴： （Ａ） 長さ:27塩基対 （Ｂ） 型：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列：配列番号9:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リ，ロンガオ アメリカ合衆国94030カリフォルニア州 ミルブレイ、リチャードソン・ドライ ブ・ナンバー203、401番 (72)発明者 チェン，ジャン アメリカ合衆国94010カリフォルニア州 バーリンゲイム、オグデン・ドライ ブ・ナンバー104、1860番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 5/06 C12N 5/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (27)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】gas6を含む第一の有糸分裂促進剤および第
   二の有糸分裂促進剤を含むシュワン細胞を培養するため
   の血清不含培養培地。
2. 【請求項２】gas6を含む請求項１の培養培地。
3. 【請求項３】第二の有糸分裂促進剤がヘレグリンを含む
   請求項１の培養培地。
4. 【請求項４】さらに培養培地のcAMPレベルを上昇させる
   薬剤を含む請求項１の培養培地。
5. 【請求項５】さらにフォルスコリンを含む請求項１の培
   養培地。
6. 【請求項６】さらに鉄源を含む請求項１の培養培地。
7. 【請求項７】鉄源がトランスフェリンを含む請求項６の
   培養培地。
8. 【請求項８】さらにインスリンまたはインスリン様増殖
   因子−Ｉ（IGF−Ｉ）を含む請求項１の培養培地。
9. 【請求項９】さらにビタミンＥを含む請求項１の培養培
   地。
10. 【請求項１０】さらにプロテアーゼ阻害剤を含む請求項
    １の培養培地。
11. 【請求項１１】gas6を含む第一の有糸分裂促進剤および
    第二の有糸分裂促進剤が共にシュワン細胞の生存または
    増殖を強化するために有効な量で存在する血清不含の培
    養培地中でシュワン細胞を培養することを含む細胞培養
    におけるシュワン細胞の生存または増殖を増強する方
    法。
12. 【請求項１２】シュワン細胞がヒトのシュワン細胞を含
    む請求項11の方法。
13. 【請求項１３】gas6を含む請求項11の方法。
14. 【請求項１４】第二の有糸分裂促進剤がヘレグリンを含
    む請求項11の方法。
15. 【請求項１５】シュワン細胞の生存と増殖を強化する請
    求項11の方法。
16. 【請求項１６】培養をラミニンの存在下に実行する請求
    項11の方法。
17. 【請求項１７】シュワン細胞をラミニン被覆培養プレー
    ト中で培養することを含む請求項16の方法。
18. 【請求項１８】（ａ）シュワン細胞が脱ミエリン化を起
    こすように有糸分裂促進剤を含む血清不含培養培地中で
    約１日から約５日までの期間シュワン細胞を含む神経組
    織をプレインキュベーションすること、および （ｂ）脱ミエリン化を起こしたシュワン細胞を請求項１
    の培養培地中で培養すること、 を含むシュワン細胞を分離するための方法。
19. 【請求項１９】神経組織を約10分間から約100分間プロ
    テアーゼと接触させる段階が段階（ａ）に先行する請求
    項18の方法。
20. 【請求項２０】段階（ａ）に先行して神経組織をコラー
    ゲナーゼおよびディスパーゼに接触させる請求項19の方
    法。
21. 【請求項２１】培養培地がヘレグリン、インスリンおよ
    びフォルスコリンを含む請求項18の方法。
22. 【請求項２２】段階（ｂ）が脱ミエリン化を起こしたシ
    ュワン細胞をラミニン被覆培養プレートで培養すること
    を含む請求項18の方法。
23. 【請求項２３】請求項11に記載の方法で得られたヒトの
    シュワン細胞および医薬的に許容される担体を含み、本
    質的に血清不含な神経系損傷の処置用医薬組成物。
24. 【請求項２４】ヒトのシュワン細胞を、gas6を含んでい
    る血清不含培養培地中に含む、神経系損傷の処置用医薬
    組成物。
25. 【請求項２５】gas6の有効量を含んでおらず、かつ有効
    量の第二の有糸分裂促進剤をも含んでいない血清含有培
    養培地にて培養されたシュワン細胞より長い突起を有し
    ている、請求項12の方法に従って培養されたヒトのシュ
    ワン細胞。
26. 【請求項２６】請求項12の方法に従って培養されたヒト
    のシュワン細胞の有効量をヒト以外の哺乳類に投与する
    ことを含む、ヒト以外の哺乳類の神経系損傷の処置法。
27. 【請求項２７】請求項23の組成物の有効量をヒト以外の
    哺乳類に投与することを含むヒト以外の哺乳類の神経系
    損傷の処置法。