KR100627754B1 - Ｈｅｒ2 및(또는) ｈｅｒ3 수용체에 대한 리간드를 이용한내이 모 세포 증식의 향상 방법 - Google Patents

Abstract

HER2 및(또는) HER3 수용체와 결합하는 리간드는, 새로운 모 세포의 증식-매개된 발생을 향상시키기 위한 내이-지지 세포 성장 인자로서 유용하다.

HER2 및(또는) HER3, 모 세포의 증식-매개된 발생, 내이-지지 세포 성장 인자, 항체, 변이체

Description

ＨＥＲ2 및(또는) ＨＥＲ3 수용체에 대한 리간드를 이용한 내이 모 세포 증식의 향상 방법 {Method for Enhancing Proliferation of Inner Ear Hair Cells Using Ligands for HER2 and/or HER3 Receptors}

본 출원은 내이 (inner ear) 조직, 특히 내이 상피 모 (hair) 세포 및 지지 세포의 성장, 증식, 수복, 발생 또는 재생을 유도, 증진 또는 향상시키는 것에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 출원은 지지 세포 증식을 효과적으로 자극하고 새로운 모 세포의 증식-매개된 발생을 향상시키는 것에 관한 것이다. 또한, 본 출원은 내이 장애 및 질환, 특히 감각신경성 청각 및 평형 감각 장애의 예방 및 치료 방법, 이를 위한 조성물 및 장치에 관한 것이다. 본 발명은 내이-지지 세포 성장 인자로서의 HER2 리간드, 특히 헤레굴린 (heregulin) 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

청각 및 평형 감각 장애는 많은 사람들에게 영향을 미치는 심각한 신체장애이다. 청각 장애는 감염, 기계적 손상, 소음, 노화, 및 말초 청각계의 신경단위 및(또는) 모 세포에 손상을 주는 화학물질-유도된 내이 신경독성을 포함한 광범위한 원인에 기인될 수 있다. 상기 말초 청각계는 청수용체, 코르티 (Corti) 기관 내의 모 세포, 및 와우 내의 나선형 신경절 신경단위인 1차 청신경단위로 이루어진다. 나선형 신경절 신경단위 ("SGN")는 말초 청수용체, 코르티 기관 내의 모 세포로부터의 시그날을, 와우 신경을 통하여 뇌로 전달하는 1차 구심성 청신경단위이다. 8번째 신경이 이러한 나선형 신경절 중의 1차 청신경단위를 뇌간에 연결시켜 준다. 이러한 8번째 신경은 또한, 평형 감각에 관여하는 1차 구심성 감각 신경단위이고 내이의 소낭, 구형낭 및 팽대부로부터의 시그날을 뇌로 전달하는 전정성 신경절 신경단위 ("VGN")를 뇌간에 연결시켜 준다. 나선형 신경절 및 모 세포 중의 1차 구심성 신경단위의 파괴가 청각 장애의 주요 원인이 되어 왔다. 말초 청각계 손상이 대부분의 청각 장애에 원인이 되고 있다 [참조: Dublin, 1976; Rybak, 1986; Lim, 1986; Pryor, 1994].

청각 상실이나 결함은 포유류에게 통상적으로 일어나는 사건이다. 외이도 (external auditory canal)로부터 중추 신경계까지의 청각 경로 어느 곳에서의 결함도 청각 상실이나 평형 감각 결함을 가져다 줄 수 있다. 청기는 외이 및 중이, 내이와 청신경 및 중추 청각 경로로 나눌 수 있다. 종 마다 약간 다를 수는 있지만, 일반적인 특징은 모든 포유류에서 공통적이다. 청각 자극은 외이도, 고막 및 이소골 쇄를 통하여 내이로 기계적으로 전달된다. 중이와 유양 돌기 (mastoid process)에는 정상적으로 공기가 채워져 있다. 외이 및 중이 장애로 인해, 통상적으로, 이러한 기계적 전달을 방해함으로써 전도성 청각 상실이 발생된다. 전도성 청각 상실의 통상적인 원인으로는 청력 폐쇄 또는 귀에지에 의해 유발될 수 있는 외이도 폐쇄증, 외상이나 감염에 의해 유발될 수 있는 고막 비대 또는 천공, 이소골 쇄 성분들의 고정 또는 흡수, 및 중이 공간이 유체로 채워지는 현상을 일으키는 유스타키오관 (Eustachian tube)의 폐쇄가 있다. 청각 정보는 내이 중의 신경-상피 세포 (모 세포)와 SGN의 작용에 의해 기계적 시그날로부터 신경으로 전도된 전기 자극으로 변환된다. SGN의 모든 중추 섬유는 뇌교 뇌간의 와우 핵 내에 시냅스를 형성한다. 이러한 와우 핵으로부터의 청각 돌출부는 시상의 후사구체, 안쪽 슬상체에 위치한 주요 핵과 측두엽의 청피질을 지니고 있는 이측성이다. 청각과 관련된 신경단위의 수는 와우에서부터 청각 뇌간 및 청피질까지 상당히 증가한다. 모든 청각 정보는 내이의 감각 수용체인 제한된 수의 모 세포에 의해서 변환되며, 이들 중에서 수가 비교적 적은 소위 내이 모 세포가 상당히 중요한데, 이는 이들이 1차 청신경단위의 대략 90%에 달하는 시냅스를 형성하기 때문이다. 비교해 보면, 와우 핵 수준에서는, 관련된 신경 요소의 수가 몇십만개로 측정된다. 따라서, 청각 기관 말단 내의 비교적 적은 수의 세포가 손상되어도, 실질적인 청각 상실이나 평형 감각 결함을 유발시킬 수 있다. 따라서, 감각신경성 상실의 많은 원인이 내이 내에서의 병변으로 인한 것일 수 있다. 이러한 청각 상실과 평형 감각 장애는 진행성일 수 있다. 또한, 청각은 동물의 노화에 따른 귀의 해부학적 변화로 인해 상당히 덜 급성이 되어 간다.

배형성 동안에는, 전정성 신경절, 나선형 신경절 및 이소포 (otic vescle)가 동일한 신경성 외배엽인 청판으로부터 유도된다. 따라서, 이러한 전정계와 청각계는 뇌간 핵에 대한 중추 돌출부 및 모 세포의 말초 신경단위 신경지배를 포함한 많은 특징들을 공유하고 있다. 이들 계 모두는 치료용 약물, 항암제, 식품 및 의약 내의 오염물질, 및 환경상 및 공업상 오염물을 포함하는 내이 신경독에 민감하다. 내이 신경독성 약물에는 광범위하게 사용된 화학요법제 시스플라틴과 이의 유사체 [참조: Fleischman et al., 1975; Stadnicki et al., 1975; Nakai et al., 1982; Berggren et al., 1990; Dublin, 1976; Hood and Berlin, 1986], 그람-음성 세균에 의해 야기된 감염을 치료하기 위해 통상적으로 사용된 아미노글리코시드 항생제, 예를 들면, 젠타마이신 [참조: Sera et al., 1987; Hinojosa and Lerner, 1987; Bareggi et al., 1990], 퀴닌 및 이의 유사체, 살리실레이트 및 이의 유사체, 및 루프-이뇨제가 포함된다.

청세포 및 나선형 신경절 신경단위에 대한 이들 약물의 독성 효과는 종종, 이들의 치료학적 유용성을 제한하는 요인이 된다. 예를 들면, 젠타마이신, 스트렙토마이신, 카나마이신, 토브라마이신 등과 같은 항균성 아미노글리코시드가 심각한 독성, 특히 내이 신경독성과 신독성을 지니고 있어 이러한 항미생물제의 유용성을 저하시키는 것으로 공지되어 있다 [참조: Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6th ed., A. Goodman Gilman et al., eds; Macmillan Publishing Co., Inc., New York, pp. 1169-71 (1980) 또는 최신판]. 아미노글리코시드 항생제는 일반적으로, 예를 들면, 그람-양성, 그람-음성 및 내산성 세균에 대해 유효한 광범위한 항미생물제로서 이용되고 있다. 이에 대한 민감한 미생물로는 에셰리키아 (Escherichia) 종, 헤모필루스 (Hemophilus) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 예르시니아 (Yersinia) 종, 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 엔테로박터 (Enterbacter) 종, 살로넬라 (Salmonella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 (Sterptococcus) 종, 미코박테리아 (Mycobacteria) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 및 세라티아 (Serratia) 종이 있다. 그렇지만, 이러한 아미노글리코시드는, 예를 들면 상승 효과를 위해 페니실린과 함께, 그람-음성 세균에 의해 유발되는 감염을 치료하는데 주로 사용되고 있다. 상기 과에 대한 속명이 암시하는 바와 같이, 모든 아미노글리코시드 항생제는 글리코시드 연결부에 아미노당을 함유하고 있다. 특히 어린이에게 흔히 발생하는 감염 증상인 중이염은 중이의 감염을 나타내기 위해 사용되는 용어이다. 전형적으로, 항생제는, 예를 들어, 반응적 또는 예방적 방식으로 중이의 감염에 대해 전신 투여된다. 중이 감염증을 치료하기 위해 항생제를 전신 투여하게 되면, 일반적으로 중이에서의 치료학적 수준을 달성하기 위해서는 장시간이 소요되며, 이러한 수준에 도달하기 위해서는 초기 투여량이 많아야 한다. 이러한 단점들은 치료학적 수준을 획득하기 위한 능력을 어렵게 만들고 몇몇 항생제의 공동 사용을 방해할 수 있다. 감염이 더욱 진행하여 악화된 상태에서는 가장 흔히 전신 투여가 효과적이지만, 이러한 상태에서는 이미 중이와 내이 구조가 영구적으로 손상되었다. 명백하게, 내이 신경독성은 항생제 투여로 인한 용량-제한적 부작용이다. 예를 들면, 60 내지 120일 동안 매일 스트렙토마이신 2 g을 투여한 환자의 거의 75%가 몇몇 전정성 결함을 나타낸 반면, 매일 1 g을 투여한 환자는 발병률이 25%로 감소하였다 (미국 특허 제5,059,591호). 청각 장애가 관찰되었는데, 1주 이상 동안 매일 1g을 투여한 환자의 4 내지 15%는 측정 가능한 수준의 청각 상실을 나타내고, 이는 서서히 악화되었으며, 이러한 투여가 계속되면 완전히 영구적인 귀머거리로 만들 수 있다.

내이 신경독성은 또한, 고환, 난소, 방광, 및 머리 및 목 암을 포함한 각종 사람 암에 대해 유효한 것으로 입증된, 백금 배위 착물인 시스플라틴에 대한 심각한 용량-제한적 부작용이다. 시스플라틴은 청각계 및 전정계에 손상을 입힌다 [참조: Fleischman et al., 1975; Stadnicki et al., 1975; Nakai et al., 1982; Carenza et al., 1986; Sera et al., 1987; Bareggi et al., 1990]. 아스피린과 같은 살리실레이트는 소염, 진통, 해혈 및 항혈전 효과를 위해 가장 통상적으로 이용되고 있는 치료 약물이다. 불행하게도, 이들은 내이 신경독성 부작용을 지니고 있다. 이들은 종종 이명 ("귀가 울림") 및 일시적인 청각 상실을 유발시킨다 [참조: Myers and Bernstein, 1965]. 그러나, 이러한 약물을 보다 고 용량으로 장기간 사용한 경우에는, 임상적으로 보고된 바와 같이 [참조: Jarvis, 1966], 이러한 청각 장애가 영구적으로 돌이킬 수 없는 것으로 될 수 있다.

따라서, 내이 조직, 특히 내이 모 세포, 및 임의로 이와 연관된 청신경을 포함한 내이 장애 및 청각 장애의 발생 및(또는) 중증을 예방, 감소 또는 치료하기 위한 방법이 요망된다. 특히 관심있는 것은, 시스플라틴 및 이의 유사체, 아미노글리코시드 항생제, 살리실레이트 및 이의 유사체, 또는 루프 이뇨제를 포함한 내이 신경독성 치료 약물의 바람직하지 못한 부작용으로서 야기되는 질환들이다. 또한, 이들 내이 신경독성-유도성 약제학적 약물에 의해 야기된 내이 신경독성 효과를 방지 또는 저하시키면서, 동시에 상기 약물을 보다 많은 양으로 보다 효과적으로 투여하도록 해주는 방법이 요망된다. 특히 내이 신경독소-유도된, 내이 모 세포와 연관된 내이 조직 손상, 상실 또는 변성과 관련된 청각 장애를 예방 또는 치 료하기 위한 안전하고, 효과적이며 장기간 지속되는 수단을 제공하는 방법이 요망된다. 본 발명은 또한, 이러한 목표 및 기타 목표를 달성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

청각 및 평형 감각 장애, 및 모 세포 또는 이들의 지지 세포에 대한 손상과 연관된 기타 질환의 치료 방법이 지속적으로 요망된다.

발명의 요약

일반적으로, 본 발명은 내이 조직 손상이나 상해의 수복 및 치유를 증진시키기 위하여, 내이 조직, 특히 내이 모 세포 및 이들의 지지 세포의 성장, 증식, 수복 또는 재생을 유도, 증진 또는 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 한 목적은 내이 장애 및 질환 치료를 필요로 하는 환자, 주로 사람 환자에게서 이러한 내이 장애 및 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 새로운 모 세포의 발생을 유도하는, 내이-지지 세포 성장, 발생 및 발육을 유도하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 양태에서는, 모 세포 또는 내이-지지 세포 손상 및 상해와 연관된 질환을 치료하기 위한 이들 목적 및 보다 광범위한 목적은, 유효량의 헤레굴린 리간드, 바람직하게는 이의 폴리펩티드 또는 단편을 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 달성된다는 것이 밝혀졌다. 이들 헤레굴린 폴리펩티드에는 HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β3, 및 이들 구성원에 대한 항체와 교차 반응하고/하거나 다음에 정의된 바와 같이 실질적으로 상동성인 기타 헤레굴린 폴리펩티드가 포함되고; 헤레굴린 변이체, 예를 들면, 이의 N-말단 및 C-말단 단편이 포함된다. 바람직한 헤레굴린은 도 1a 내지 1d에 기재된 리간드이고 추가로 HRG-α로 명명되었다. 기타 바람직한 헤레굴린은 도 2a 내지 2e에 기재된, HRG-β1로 명명된 리간드; 도 3a 내지 3e에 기재된, HRG-β2로 명명된 리간드; 도 4a 내지 4c에 기재된, HRG-β3로 명명된 리간드이다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 헤레굴린 아고니스트 항체를 투여하는 방법을 제공한다. 이러한 양태에서는, HER2/HER3 또는 이의 단편 (이는 또한, 시험관내 방법에 의해 합성할 수 있다)을 (재조합 발현이나 시험관내 펩티딜 결합에 의해) 면역원성 폴리펩티드에 융합시키고, 이러한 융합 폴리펩티드를 사용하여 HER2/HER3 에피토프에 대한 항체를 유발시킨다. 아고니스트 항체는 면역화된 동물의 혈청으로부터 회수한다. 또 다른 방법으로는, 통상적인 방식으로 시험관내 세포 또는 생체내 면역화된 동물로부터 모노클로날 항체를 제조한다. 경우에 따라, 항체 또는 항체 단편의 파아지 라이브러리로부터 파아지 디스플레이 선별법에 의해 아고니스트 항체를 수득할 수 있다. 통상적인 스크리닝에 의해 동정된 바람직한 항체는 수용체와 결합할 것이지만, EGF와 같은 기타 공지된 어떠한 리간드와도 실질적으로 교차 반응하지 않을 것이며, HER 수용체인 HER2 또는 HER3, 바람직하게는 Her2를 활성화시킬 것이다. 또한, 헤레굴린족의 개개의 구성원, 예를 들면, HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β3과 특이적으로 결합할 수 있고 이의 아고니스트인 항체를 선별할 수 있다.

일반적으로, 본 발명은 내이-지지 세포의 성장과 증식을 자극하여 새로운 모 세포 발생을 향상시킴으로써 모 세포 또는 내이-지지 세포 상해를 재생 및(또는) 수복시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 모 세포는 많은 유형의 상해 원인, 예를 들면, 외과적 절개 또는 절제, 화학물질 또는 담배연기 흡입 또는 호흡, 화학적 또는 생화학적 궤양 형성, 바이러스 또는 세균성 감염으로 인한 세포 손상 등에 의해 상해를 입을 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 영향을 받을 수 있는 내이-지지 세포에는 HER2 또는 HER3, 바람직하게는 Her3을 발현하는 모든 내이-지지 세포가 포함된다. 본 발명의 방법은 새로운 모 세포의 발생을 가져다 주는 내이-지지 세포의 성장과 증식을 자극하여 이러한 내이에 감각신경성 접촉물을 수복 또는 복구시킴으로써, 이와 같이 영향을 받은 조직이 정상적인 생리 기능을 더욱 신속하게 나타낼 수 있도록 해준다.

따라서, 본 발명의 한 양태는 HER2 수용체를 발현하는 내이-지지 세포를 유효량의 HER2 활성화 리간드와 접촉시킴으로써 내이-지지 세포 성장을 유도하는 방법에 관한 것이다.

추가의 양태는 유효량의 HER2 활성화 리간드를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 예를 들면, 내이 신경독소 또는 소음 폭력으로 말미암은 내이 모 세포 상해를 치료하는 방법에 관한 것이다.

도 1a 내지 1d는 미국 특허 제5,367,060호에 따라서 수득된 클론에 함유된 cDNA 서열 (서열 2)에 대한 추론된 아미노산 서열 (서열 1)을 나타낸 것이다. HRG-α의 개시 메티오닌 (Met)이 45번 위치에 있다.

도 2a 내지 2e는 HRG-β1에 대한 미국 특허 제5,367,060호에 따라서 수득된 클론의 가능한 코딩 서열의 추론된 아미노산 서열 (서열 3) 및 cDNA 서열 (서열 4)을 나타낸 것이다. 개시 메티오닌 (Met)이 M31에 있다.

도 3a 내지 3e는 HRG-β2에 대한 미국 특허 제5,367,060호에 따라서 수득된 클론의 뉴클레오티드 서열의 추론된 아미노산 서열 (서열 5) 및 cDNA 서열 (서열 6)을 나타낸 것이다.

도 4a 내지 4c는 HRG-β3에 대한 미국 특허 제5,367,060호에 따라서 수득된 클론의 뉴클레오티드 서열의 추론된 아미노산 서열 (서열 7) 및 cDNA 서열 (서열 8)을 나타낸 것이다.

도 5a 내지 5d는 HRG-β2-유사 단백질에 대한 미국 특허 제5,367,060호에 따라서 수득된 클론의 뉴클레오티드 서열의 추론된 아미노산 서열 (서열 9) 및 cDNA 서열 (서열 10)을 나타낸 것이다.

도 6a 내지 6c는 몇몇 공지된 헤레굴린 α, β1, β2, β2-유사 및 β3의 아미노산 상동성을 하향 순서로 비교한 것이며, 이들 형태의 헤레굴린을 특징적으로 나타내는 아미노산 삽입, 결실 및 치환물이 예시되어 있다 (서열 1, 3, 5, 9 및 7).

도 7a 내지 7c는 γ-HRG의 추론된 아미노산 서열 (서열 11) 및 cDNA 서열 (서열 12)를 나타낸 것이다. 소수성 영역이 밑줄쳐져 있다. EGF-유사 도메인은 명암이 지게하고, EGF-유사 도메인 중의 시스테인 잔기는 동그라미를 쳤다. N-연결된 글리코실화 부위는 핵산 서열 위에 ( )를 표시하였다.

도 8은 SMDF의 cDNA 서열 (서열 13) 및 아미노산 서열 (서열 14)을 나타낸 것이다. EGF-유사 도메인과 비극성 및 전하를 띠지 않는 도메인 (즉, 약 48 내지 62번 잔기로 이루어진 "비극성 I" 및 약 76 내지 100번 잔기로 이루어진 "비극성 II")이 밑줄쳐져 있다. EGF-유사 도메인과 독특한 N-말단 도메인 중의 "시스테인 마디" 중의 시스테인("NTD-cys 마디")은 사각형 둘레가 쳐져 있다. 정지 코돈은 문자 "O"로 표시되어 있다.

도 9는 대조군과 비교하여 박판당 BrdU 양성 세포 수로 지시된 바와 같은, 쥐 소낭 박판 모 세포층에서의 세포 증식에 대한 각종 폴리펩티드 성장 인자의 효과를 도시한 것이다.

도 10은 대조군과 비교하여 박판당 BrdU 양성 세포 수로 지시된 바와 같은, 쥐 소낭 박판 모 세포층에서의 세포에 대한 헤레굴린의 용량-의존적 증식 효과를 도시한 것이다.

도 11a 내지 11d는 헤레굴린 처리에 반응하여, 젠타마이신-처리된 소낭에서 지지 세포 및 모 세포층 중의 3중 수소 처리된-티미딘 표지된 세포의 자가방사선 사진이다. 도 a 내지 d는 유사하게 처리된 기관형 쥐 소낭 전조직 표본도이다.

도 12는 대조군과 비교하여, 헤레굴린 처리에 반응하여 젠타마이신-처리된 소낭에서 지지 세포 및 모 세포층에서의 3중 수소 처리된-티미딘 표지된 세포 (도 11a 내지 11d에 도시됨)의 세포 계수를 도시한 것이다.

도 13은 내이 감각 상피 층으로부터 분리된 RNA 중의 헤레굴린 및 수용체 Her2, Her3 및 Her4의 RNA 농도를 도시한 것이다.

도 14는 Her2에 대한 표지된 모노클로날 항체로 PO 와우 및 성인 소낭을 면역염색시킴으로써 지시된 바와 같이, 내이 감각 상피에서의 헤레굴린 수용체인 Her2의 국재화를 도시한 것이다.

헤레굴린 리간드, 특히 이의 폴리펩티드 및 아고니스트 항체는 HER2 및 덜 바람직하게는 HER3 수용체 또는 이의 조합물에 대해 친화도를 지니고 있어 자가인산화 반응에서 이들을 자극한다. HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β3 및 HRG-β2-유사 이외에, 헤레굴린 리간드의 정의 내에 포함되는 것은, HRG-α 또는 HRG-β1과 실질적인 아미노산 서열 상동성을 지니고 있는 HER2 수용체와 결합하는 기타 폴리펩티드이다. 이러한 부가의 폴리펩티드는 HER2 수용체와 결합하는 폴리펩티드 리간드족으로서 헤레굴린의 정의 내에 속한다.

헤레굴린 폴리펩티드는 HER2 수용체와 다양한 친화도로 결합된다. HER2를 HER3과 이종 이량체화시키면, 상기 언급된 바와 같이 연속적인 수용체 교차-인산화 반응이 일어나는 것으로 또한 공지되어 있다. 본 발명에서는, 헤레굴린 단백질이 수용체 인산화가 유도되도록 수용체 이량체 또는 개개의 수용체 분자와 상호작용하여 이들과 결합되는 경우에, 내이-지지 세포 성장 및(또는) 증식이 유도된다. 따라서, HER2 또는 Her3 또는 이들의 조합물의 결합 및 활성화는 단량체성 수용체와 이량체성 수용체 형태를 포함한, 수용체 활성화와 생물학적 기능에 필요한 모든 형태의 수용체의 활성화를 포함하는 것을 의미한다. 이량체성 수용체 형태는 다음에 예를 들면, HER2/HER3으로서 지칭될 수 있다.

HER (ErbB)족은 아부류 I 수용체 티로신 키나제 거대족에 속하고 3가지 별개의 수용체인 HER2, HER3 및 HER4로 이루어진다. 이러한 ErbB 족에 대한 리간드는 단백질 헤레굴린 (HRG)인데, 이는 15개 이상의 별개의 이소형을 지닌 다중 도메인 함유 단백질이다.

세포 성장과 분화를 조절하는 시그날 전달과정은 부분적으로는 각종 세포내 단백질의 인산화에 의해 조절된다. 단백질 티로신 키나제는 이러한 과정을 촉매하는 효소이다. 수용체 단백질 티로신 키나제는 세포내 기질의 리간드-자극된 티로신 인산화를 통하여 세포 성장을 지시하는 것으로 생각된다. 부류 I 거대족의 성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제에는 erbB1 유전자에 의해 코딩된 170kDa 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)가 포함된다. erbB1은 사람 악성 종양의 원인으로서 관련되어 있다. 특히, 유방, 방광, 폐 및 위의 보다 공격적인 암에서 상기 유전자의 발현 증가가 관찰되었다.

부류 I 거대족의 두 번째 구성원인 p185^neu는 본래, 화학적으로 처리된 쥐의 신경아세포종으로부터 형질전환성 유전자 생성물로서 동정되었다. 이러한 neu 유전자 (또한 erbB2 및 HER2으로 지칭됨)는 185kDa 수용체 단백질 티로신 키나제를 코딩한다. 사람 HER2 유전자의 증폭 및(또는) 과발현은 유방 및 난소암에서의 불충분한 예후와 상관이 있다 [참조: Slamon et al., Science 235:177-182 (1987); and Salmon et al., Science 244:707-712 (1989)]. HER2의 과발현은 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장 및 방광암을 포함한 기타 암과 상관이 있어 왔다. 따라서, 미국 특허 제4,968,603호의 슬라몬 (Slamon) 등은 종양 세포에서의 HER2 유전자 증폭 또는 발현을 결정하기 위한 각종 진단 분석법을 청구 기재하고 있다. 슬라몬 등은 종양 세포 내에 HER2 온코진 (oncogene)의 다중 유전자 복사물이 존재한다는 것은, 질병이 1차 종양 부위를 벗어나 확산되기 시작하였으므로 이러한 질병은 기타 진단 인자들에 의해 지시될 수도 있는 것보다 훨씬 더 공격적인 치료를 요구할 수 있다는 것을 지시한다는 사실을 밝혀내었다. 슬라몬 등은 HER2 유전자 증폭 시험이 림프절 상태의 결정과 함께, 크게 개선된 예후 유용성을 제공해준다고 결론지었다.

erbB3 또는 HER3으로 지칭되는 추가의 관련 유전자가 또한 문헌 [참조: 미국 특허 제5,183,884호; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197 (1989); 유럽 특허출원번호 제444,961A1호; and Kraus et al., Proc. Natl. Acad. USA 90:2900-2904 (1993)]에 기재되어 있다. 크라우스 (Kraus) 등 (1989)은 현저하게 증가된 수준의 erbB3 mRNA가 특정의 사람 유방 종양 세포주에서 발견되었으며, 이는 erbB3이 erbB1 및 erbB2와 마찬가지로 사람 악성 종양에 특정 역할을 할 수도 있다는 것을 지시해준다는 사실을 밝혀내었다. 또한, 크라우스 등 (1993)은 키메릭 EGFR/ErbB3 수용체의 ErbB3 촉매적 영역을 EGF-의존적으로 활성화시키면, 형질감염된 NIH-3T3 세포에서 증식 반응이 일어난다는 사실을 밝혀내었다. 이는 현재 NIH-3T3 중의 내인성 ErbB1 또는 ErbB2의 결과인 것으로 여겨진다. 더욱이, 이들 연구자들은 몇몇 사람 유방 종양 세포주가 정상 상태 ErbB3 티로신 인산화의 상당한 증가를 나타내는데, 이는 상기 수용체가 사람 악성 종양에 특정 역할을 할수 있다는 것을 추가로 지시해준다는 사실을 입증하였다. 암에 있어서의 erbB3의 역할은 다른 연구자들에 의해 조사되었다. 유방암 [참조: Lemoine et al., Br. J. Cancer 66:1116-1121 (1992)], 위장암 [참조: Poller et al., J. Pathol. 168:275-280 (1992), Rajkumer et al., J. Pathol. 170:271-278 (1993), and Sanidas et al., Int. J. Cancer 54:935-940 (1993)] 및 췌장암 [참조; Lemoine et al., J. Pathol. 168:269-273 (1992), and Friess et al., Clinical Cancer Research 1:1413-1420 (1995)]에서 과발현되는 것으로 밝혀졌었다.

성장 인자 수용체 단백질 티로신 키나제의 부류 I 거대족이 HER4/Erb4 수용체를 포함하는 것으로 추가 확대되었다 [참조: EP Pat Appln No 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993); and Plowman et al., Nature 366:473-475 (1993)]. 플로우만 (Plowman) 등은 HER4 발현 증가가 유방 선암을 포함한 특정 상피 기관 암과 밀접하게 상관이 있다는 것을 밝혀내었다. HER4 발현을 평가해주는 사람 종양 형성 질환 (특히 유방암)을 탐지하기 위한 진단 방법이 EP Pat Appln No. 599,274에 기재되어 있다.

HER2 온코진의 활성인자에 대한 탐색으로, 특정 족의 헤레굴린 폴리펩티드을 발견할 수 있었다. 이들 단백질은 문헌 [Orr-Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1867-1871 (1993)]에 의해 사람 염색체 8의 짧은 아암 (arm)에 대해 지도화시킨 단일 유전자의 교대 슬플라이싱으로부터 발생된 것으로 보인다 [참조: Lee and Wood, Genomics, 16:790-791 (1993)].

홈즈 (Holmes) 등은 이들이 헤레굴린-α (HRG-α), 헤레굴린-β1 (HRG-β1), 헤레굴린-β2 (HRG-β2), 헤레굴린-β2-유사 (HRG-β2-유사) 및 헤레굴린-β3 (HRG-β3)으로 칭한 HER2 수용체에 대한 특정 족의 폴리펩티드 활성 인자를 분리하고 클로닝하였다 [참조: Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992); WO 92/20798; 및 미국 특허 제5,367,060호]. 45kDa 폴리펩티드인 HRG-α는 MDA-MB-231 사람 유방암 세포주의 조건화된 배지로부터 정제하였다. 이들 연구자들은 정제된 헤레굴린 폴리펩티드가 MCF7 유방 종양 세포에서 HER2 수용체의 티로신 인산화를 활성화시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 추가로, SK-BR-3 세포 (높은 수준의 HER2 수용체를 발현시킴) 상에서의 헤레굴린 폴리펩티드의 분열촉진 활성이 예시되었다. EGF 족에 속하는 다른 성장 인자와 마찬가지로, 가용성 HRG 폴리펩티드는, 상기 45kDa 가용성 형태를 방출하도록 단백질분해 처리된 막 결합된 전구체 (프로-HRG로 지칭됨)로부터 유도된 것으로 보인다. 이들 프로-HRG에는 N-말단 시그날 펩티드가 결여되어 있다.

헤레굴린이 처음 213개 아미노산 잔기에서 실질적으로 동일하긴 하지만, 이들은 이들의 C-말단 부분이 상이한 두 변이체 EGF-유사 도메인을 기준으로 하여 2가지 주요 유형 α와 β로 분류된다. 그렇지만, 이들 EGF-유사 도메인은 이들 내에 함유된 6개 시스테인 잔기의 스페이싱에서 동일하다. 아미노산 서열 비교를 기준으로 하여, 홈즈 등은 EGF-유사 도메인 중의 첫 번째 시스테인과 6번째 시스테인 사이의 HRG가 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자 (HB-EGF)와는 45%의 유사성을 나타내고, 암피레굴린 (AR)과는 35%의 동일성을 나타내며, TGF-α와는 32%의 동일율을 나타내고, EGF와는 27%의 동일성을 나타낸다는 것을 밝혀내었다. 사람 HRG의 쥐 등가물인 44kDa neu 분화 인자 (NDF)가 다음 문헌 [참조: Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992); and Wen et al., Cell, 69:559-572 (1992)]에 처음으로 기재되었다. HRG 폴리펩티드와 마찬가지로, NDF는 면역글로불린 (Ig) 상동 영역에 이어 EGF-유사 도메인을 지니고 있으며 N-말단 시그날 펩티드가 결여되어 있다. 연속적으로, 웬 (Wen) 등은 NDF 족을 확대하기 위해 "완전 클로닝 (exhaustive cloning)"을 수행하였다 [참조: Mol. Cell. Biol., 14 (3):1909-1919 (1994)]. 이러한 연구 결과, 6개의 별개의 섬유아세포성 프로-NDFs가 밝혀졌다. 홈즈 등의 명명법에 따르면, 이러한 NDFs는 EGF-유사 도메인의 서열을 기준으로 하여 α또는 β폴리펩티드로서 분류된다. 이소형 1 내지 4는 (EGF-유사 도메인과 막횡단 도메인 간의) 가변적 저스타멤브레인 (justamembrane) 연장물을 기준으로 하여 성상확인한다. 또한, 이소형 a, b 및 c는 가변적 길이의 세포질성 도메인을 지니고 있는 것으로 기재된다. 이들 연구자들은 상이한 NDF 이소형이 교대 스플라이싱에 의해 생성되고 별개의 조직-특이적 기능을 수행한다고 결론지었다 [NDF에 관한 EP 505 148; WO 93/22424; 및 WO 94/28133 참조].

문헌 [참조: Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993)]에는 또 다른 헤레굴린족 구성원이 기재되어 있으며, 이는 아세틸콜린 수용체 유도 활성 (ARIA) 폴리펩티드로 지칭된다. 치킨 유래의 ARIA 폴리펩티드는 근육 아세틸콜린 수용체의 합성을 자극한다 [참조: WO 94/08007]. ARIA는 β유형 헤레굴린이고, HRGα및 HRGβ1-β3의 Ig-유사 도메인과 EGF-유사 도메인 간의 글리코실화 부위에 풍부한 전체 스페이서 영역이 결여되어 있다.

마르키온니 (Marchionni) 등은 몇몇 소로부터 유도된 단백질을 동정하였으며, 이를 신경교 성장 인자 (GGF)로 지칭하였다 [참조: Nature, 362:312-318 (1993)]. 이들 GGF는 상기 언급된 기타 헤레굴린 단백질과 Ig-유사 도메인 및 EGF-유사 도메인을 공유하고 있지만, 또한 아미노-말단 크링글 도메인을 지니고 있다. GGF는 일반적으로, Ig-유사 도메인과 EGF-유사 도메인 사이에 완전한 글리코실화 스페이서 영역을 지니고 있지 않다. 이러한 GGF 중의 1개, 즉 GGFII 만이 N-말단 시그날 펩티드를 지니고 있다 [GGF 및 이의 용도를 언급하고 있는 WO 92/18627; WO 94/00140; WO 94/04560; WO 94/26298; 및 WO 95/32724 참조].

문헌 [참조: Ho et al., J. Biol. Chem. 270 (4):14523-14532 (1995)]에는 감각성 및 운동성 신경단위-유도된 인자 (SMDF)로 불리우는 헤레굴린족의 또 다른 구성원이 기재되어 있다. 이 단백질은 별개의 N-말단 영역을 제외하고는, 기타 모든 헤레굴린 폴리펩티드에 특징적인 EGF-유사 도메인을 지니고 있다. SMDF와 기타 헤레굴린 폴리펩티드 간의 주요 구조적 차이는 기타 모든 헤레굴린 폴리펩티드에 특징적인 "글리코" 스페이서 및 Ig-유사 도메인의 SMDF 결여이다. SMDF의 또 다른 특징은 N-말단 근처에 소수성 아미노산의 두 연장물이 존재한다는 것이다.

헤레굴린 폴리펩티드가 HER2 수용체를 활성화시키는 이들의 능력을 근거로 하여 처음 동정되긴 하였지만 [Holmes et al., 상기 참조], neu 및 neu-형질감염된 섬유아세포를 발현하는 특정한 난소 세포가 NDF와 결합 또는 가교결합되지 않았을 뿐만 아니라 티로신 인산화를 진행하도록 NDF와 반응하지도 않았다는 것이 밝혀졌다 [참조: Peles et al., EMBO J. 12:961-971 (1993)]. 이는 완전한 헤레굴린 반응성을 부여하는 데에는 또 다른 세포 성분이 필요하다는 것을 지시해준다. 카라웨이 (Carraway) 등은 연속적으로, ¹²⁵I-rHRGβ1_177-244이 소의 erbB3으로 안정하게 형 질감염된 NIH-3T3 섬유아세포와는 결합되었지만, 형질감염되지 않은 모 (parental) 세포와는 결합되지 않았다는 것을 입증하였다. 따라서, 이들은 ErbB3이 HRG에 대한 수용체이고, 고유 티로신 잔기의 인산화 뿐만 아니라 두가지 수용체 모두를 발현하는 세포에서 ErbB2 수용체의 인산화도 매개하는 것으로 결론지었다. 문헌 [참조: Carraway et al., J. Biol. Chem. 269 (19):14303-14306 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269 (20):14661-14665 (1994)]에는 HER3 단독으로만 형질감염된 세포는 헤레굴린에 대한 친화도가 낮은 반면, HER2와 HER3 모두로 형질감염된 세포는 보다 높은 친화도를 나타낸다고 언급되어 있다.

이러한 발견은 문헌 [참조: Kokai et al., Cell 58:287-292 (1989); Stern et al., EMBO j. 7:995-1001 (1988); and King et al., 4:13-18 (1989)]에 앞서 기재된 "수용체 교차-토킹 (cross-talking)"과 상관이 있다. 이들 연구자들은 EGF를 EGFR에 결합시키면, EGFR 키나제 영역이 활성화되고 p185^HER2가 교차-인산화된다는 것을 밝혀내었다. 이는 리간드-유도된 수용체 이종 이량체화 및 이와 동반되는, 이종 이량체 내에서의 상기 수용체의 교차-인산화의 결과인 것으로 생각된다 [참조: Wada et al., Cell 61:1339-1347 (1990)].

플로우만과 그의 동료들은 p185^HER4/p185^HER2 활성화를 유사하게 연구하였다. 이들은 사람 T 임파구에서 p185^HER2 만을 발현시키거나, p185^HER4 만을 발현시키거나 또는 이들 두 수용체를 함께 발현시켰으며, 헤레굴린이 p185^HER4의 티로신 인산화를 자극할 수 있는 있지만 두가지 수용체 모두를 발현하는 세포에서는 단지 p185^HER2인산화만을 자극할 수 있다는 것을 증명하였다 [참조: Plowman et al., Nature 336:473-475 (1993)].

헤레굴린의 생물학적 역할이 몇몇 그룹에 의해 조사되었다. 예를 들면, 폴즈 등 (상기 논의됨)은 ARIA가 마이오튜브 분화에 일정 역할을 하여, 운동성 신경단위의 시냅스 뒤의 근세포에서 신경전달물질 수용체의 합성과 농도에 영향을 미친다는 사실을 밝혀내었다. 코르파스 (Corfas) 및 피쉬바흐 (Fishbach)는 ARIA가 또한, 병아리 근육 중의 나트륨 채널 수를 증가시킨다는 것을 입증하였다 [참조: Corfas and Fishbach, J. Neuroscience, 13 (5):2118-2125 (1993)]. 또한, GGFII가 아밀집성 휴지의 사람 근원세포에 대해 분열촉진성이고, GGFII의 지속적인 존재하에서 클로날 사람 근원세포를 분화시키면, 분화 6일 후에 보다 많은 수의 마이오튜브가 생성되는 것으로 나타났다 [참조: Sklar et al., J. Cell Biochem., Abst. W462, 18D, 540 (1994)] (또한, 1994년 11월 24일자로 공개된 WO 94/26298 참조).

홈즈 등은 HRG가 유방 세포주 (예를 들면, SK-BR-3 및 MCF-7) 상에서 분열촉진 효과를 발휘한다는 것을 밝혀내었다. 쉬반 (Schwann) 세포 상에서의 GGF의 분열촉진 활성이 또한 보고되었다 [참조: Brockes et al., J. Biol. Chem. 255 (18):8374-8377 (1980); Lemke and Brockes, J. Neurosci. 4:75-83 (1984); Brockes et al., J. Neuroscience 4 (1):75-83 (1984); Brockes et al., Ann. Neurol. 20 (3):317-322 (1986); Brockes, J. Methods in Enzym., 147:217-225 (1987) and Marchionni et al., 상기 참조]. 쉬반 세포는 신경단위의 축색돌기 주변에 마이엘린 수초화를 제공함으로써 개개의 신경 섬유를 형성하는 중요한 신경절 세포로 구성된다. 따라서, 쉬반 세포는 말초 신경의 발달, 기능 및 재생에 중요한 역할을 하는 것이 명백하다. 이러한 사실을 치료학적 관점과 연계시킨 것이 레비 (Levi) 등의 문헌 [J. Neuroscience 14 (3):1309-1319 (1994)]에서 중점적으로 다루어졌다. 레비 등은 손상된 척수 영역 내로 이식될 수 있는 사람 쉬반 세포를 포함하는 세포성 보철의 작제 가능성에 대해 논의하였다. 쉬반 세포를 생체외에서 배양하는 방법이 기재되었다 [참조: WO 94/00140 and Li et al., J. Neuroscience 16 (6):2012-2019 (1996)].

핀카스-크라마르스키 (Pinkas-Kramarski) 등은 NDF가 배아 및 성인 쥐 뇌, 및 쥐 뇌 세포의 1차 배양물 중의 신경단위와 신경절 세포에서 발현되는 것으로 여기고, 이 것이 성상교세포에 대한 생존 및 성숙 인자로서 작용할 수 있다고 제안하였다 [참조: Pinkas-Kramarski et al., PNAS, USA 91:9387-9391 (1994)]. 문헌 [참조: Meyer and Birchmeier, PNAS, USA 91:1064-1068 (1994)]에서는 계내 혼성화 및 RNase 보호 실험을 사용하여 마우스 배형성 동안 및 분만 직후 동물에게서 헤레굴린의 발현을 분석하였다 [또한, Meyer et al., Development 124 (18):3575-3586 (1997) 참조]. 이들 저자들은 상기 분자의 발현을 근거로 하여, 헤레굴린이 생체내에서 간엽 조직 및 신경단위 인자로서 작용한다고 결론지었다. 유사하게, 문헌 [참조: Danilenko et al., Abstract 3101, FASEB 8 (4-5):A535 (1994); Danilenko et al., Jourmal of Clinical Investigation 95 (2):842-851 (1995)]에서는, NDF와 HER2 수용체 간의 상호작용이 상처 수복 동안에 표피 이동과 분화를 지시하는데 중요하다는 것을 언급하였다.

문헌 [참조: Ram et al., Jourmal of Celluar Physiology 163:589-596 (1995)]에는, 불멸화 사람 유방 상피 세포주 MCF-10A 상에서의 NDF의 분열촉진 활성이 평가되어 있다. 문헌 [참조: Danilenko et al., J. Clin. Invest. 95:842-851 (1995)]에서는, NDF가 부분적으로 깊게 절제된 상처 수복용 생체내 모델에서 표피 이동에 영향을 미칠 수 있는지 여부가 조사되었다. 대조군 상처 대 rhNDF-α₂로 처리된 상처에서 기저 및 초기저 각질 세포를 증식하는데 있어서 통계적으로 유의한 차이가 없었다고 보고하고 있다. 문헌 [참조: Marikovsky et al., Oncogene 10:1403-1411 (1995)]에서는, 이수배수체 (aneuploid) BALB/MK 연속 각질 세포주의 증식 반응을 연구하였고 표피 각질 세포 상에서의 NDF의 α및 β-이소형의 효과를 평가하였다.

이용 가능한 각종 돌연변이 분석 기술을 사용하여, 새로운 단백질의 구조와 기능 간의 관계를 조사할 수 있다. 이러한 기술의 예로는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 및 파아지미드 디스플레이가 있다. 알라닌 스캐닝을 사용하여 특정 단백질 또는 단백질 도메인 중의 활성 잔기 (즉, 단백질 기능에 대해 상당한 효과를 나타내는 잔기)를 동정할 수 있다. 예를 들면, 커냉햄 (Cunningham)과 웰즈 (Wells)는 알라닌 스캐닝을 사용하여 자신의 수용체 결합에 중요한 사람 성장 호르몬 중의 잔기를 동정하였다 [참조: Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]. 알라닌 스캐닝에서는, 스캐닝될 단백질 또는 영역을 코딩하는 유전자를 발현 벡터 내로 삽입하고, 돌연변이를 유발시켜, 후속 잔기가 알라닌으로 전환되는 단백질 또는 영역을 코딩하는 일련의 벡터를 생성시킨다. 이와 같이 코딩된 단백질 또는 영역을 이들 벡터로부터 발현시킨 다음, 알라닌-치환된 변이체의 활성을 시험하여, 변형된 활성을 지닌 것을 동정한다. 활성 변형은 알라닌-치환된 위치의 잔기가 활성 잔기라는 것을 지시해준다.

다수의 변이체 폴리펩티드를 대상으로 하여, 특정한 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있도록 파아지미드 디스플레이를 개발하였다. 스미드 (Smith)와 팜리 (Parmley)는 짧은 유전자 단편을 fd 파아지의 유전자 III 내로 삽입함으로써 섬유상 파아지의 표면 위에 외래 펩티드를 효율적으로 "디스플레이"할 수 있다는 것을 입증하였다 [참조: Smith, Science 228:1315-1317 (1985); Parmley and Smith, Gene 73:305-318 (1985)]. 이러한 유전자 III 외피 단백질은 상기 파아지 입자의 한 말단에 약 5개 복사물로 존재한다. 이러한 변형된 파아지를 "융합 파아지"로 불리우는데, 이는 이들이 유전자 III 외피 단백질에 융합된 외래 펩티드를 발현하였기 때문이다. 각 융합 파아지 입자가 상기 융합 단백질의 대략 5개 복사물을 발현하였기 때문에, 상기 유형의 파아지 디스플레이는 "다가 디스플레이"로 명명되었다.

스코드 (Scott) 등과 크월라 (Cwirla) 등은 융합 파아지 라이브러리가 "패닝 (panning)"으로서 공지된 순차 친화도 선별법에 의해 스크리닝될 수 있다고 주장하였다 [참조: Scott et al., Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990)]. 그러나, 고 친화도 융합 파아지를 선별하기 위한 초기 노력은 실패하였는데, 이는 아마도 상기 파아지 입자의 다가성 때문이다. 이러한 문제점은, 상기 융합 단백질을 특정 파아지미드로부터 저수준으로 발현시키고 헬퍼 (helper) 파아지가 과량의 야생형 외피 단백질을 제공하는 "1가" 파아지 디스플레이 시스템을 개발함으로써 해결되었다 [참조: Bass et al., Protein 8:309-314 (1990); Lowman et al., Biochem. 30:10832-10838 (1991)]. 1가 파아지 디스플레이를 사용하여, 다수의 변이체 폴리펩티드를 생성 및 스크리닝하여 관심있는 표적과 고친화도로 결합하는 것을 분리할 수 있다.

I. 정의

일반적으로, 다음 단어나 구가 명세서, 실시예 및 청구의 범위에 사용된 경우, 이는 다음에 지시된 정의를 나타낸다.

"헤레굴린" 리간드는 본원에서, 단리된 모든 리간드, 바람직하게는 Her2와 결합하여 이를 활성화시키는 천연 헤레굴린 폴리펩티드의 생물학적 특성을 지니고 있는 폴리펩티드 서열로 정의된다. 본 발명의 범주 내에 속하는 리간드에는 본원에서 상세히 논의된 헤레굴린 폴리펩티드가 포함된다. 헤레굴린에는 도 1a내지 1d, 2a내지 2e, 3a내지 3E, 4a내지 4c, 5a내지 5d, 6a내지 6c 및 7a내지 7c에 도시된 폴리펩티드 및 이의 포유류 동족체가 포함된다. 다음에 기재된 방법을, 임의로 당해 분야에 공지된 알라닌 스캐닝 및 파아지 디스플레이 기술과 함께 사용하여 변이체를 제조할 수 있다 [참조: Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989); Bass et al., Proteins 8:309-14 (1990); Lowman et al., Biochem. 30:10832-38 (1991)].

용어 "정상" 모 세포 또는 내이-지지 세포는 형질전환되지 않은, 즉 비-암 유발성이고/이거나 비-불멸화된 모 세포 또는 내이-지지 세포를 의미한다. 추가로, 정상 모 세포 또는 내이-지지 세포는 바람직하게는 이수배수체가 아니다. 이수배수체는 특정 세포의 핵이 정확한 배수의 염색체 반수체 수를 함유하지 않는 경우에 존재하며, 이때 하나 이상의 염색체는 나머지 보다 많거나 적은 수로 존재한다. 본 발명의 범주에 속하지 않는 형질전환된 세포의 전형적인 특성으로는 면역-결핍된 마우스 (누드 마우스) 내로 이식될 때 종양을 형성하는 능력, 현탁액 또는 반고체 배지 (예를 들면, 한천)에서 성장하는 능력, 세포가 콜로니 또는 병소 내로 필링 업 (piling up)되는 것을 허용해주는 접촉 억제 상실, 성장 인자 또는 혈청에 대한 의존성 상실, 세포 성장이 억제되는 경우의 세포 사멸, 및 액틴 필라멘트의 조직 붕괴가 있다. 구체적으로 언급하면, 마우스에서 종양을 형성하지 않고, 플라스틱이나 유리에 부착하여 성장하며 (앵커리지 의존적임), 접촉 억제를 나타내고, 혈청-함유 호르몬과 성장 인자를 요구하며, 혈청 결여로 인해 성장이 억제되는 경우에도 생존을 유지하며 잘-조직화된 액틴 필라멘트를 함유하는 정상 세포가 본 발명 내에 포함된다. 정상적인 내이-지지 세포는 배양 세포가 아닌 것이 바람직하긴 하지만, 포유류 조직으로부터 단리된 형질전환되지 않고 비-불멸화된 상피 세포가 또한 본 발명에 적합하다. 이들 분리된 세포는 단리된 내이 지지 세포 샘플의 성장 및(또는) 증식을 유도하기 위하여, 즉 상기 샘플을 증식시키기 위하여 헤레굴린의 존재하에 여러 세대 (약 10 또는 심지어 50 세대까지) 동안 배양할 수 있다. 이어서, 이와 같이 증식된 샘플을, 상기 모 세포 또는 내이-지지 세포 조직의 집단을 재정비 (재-상피화)하기 위하여 상기 포유동물에게 재도입할 수 있다. 이는 조직 상해나 손상을 수복하는데 특히 유용하다.

본원의 목적상 "생물학적 특성"은 헤레굴린 서열 (이의 천연 또는 변성된 형태 어느 것이든) 또는 이의 모든 아서열 (subsequence)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 수행되는 생체내 생물학적 또는 항원성 기능 또는 활성을 의미한다. 생물학적 기능에는 수용체 결합, 모든 효소 활성 또는 효소 조절 활성, 모든 운반체 결합 활성, 모든 호르몬성 활성, 세포외 매트릭스 또는 세포 표면 분자에 대한 세포 유착을 증진 또는 억제시키는데 있어서의 모든 활성, 또는 모든 구조적 역할이 포함된다. 그러나, 생물학적 기능에는 항원성 기능, 즉 천연 헤레굴린 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 교차-반응할 수 있는 에피토프 또는 항원 부위의 보유는 포함되지 않는다.

"생물학적 활성" 헤레굴린은 본원에서, 항원성 기능을 추가로 보유할 수도 있는 (반드시 필요한 것은 아님) 헤레굴린 서열의 생물학적 기능을 공유하고 있는 폴리펩티드로서 정의된다. 공지된 헤레굴린의 주요 효과 또는 기능은 HER2에 대한 정성적 생물학적 결합 활성을 지니고 있으므로 수용체 티로신 키나제를 활성화시킬 수 있는 리간드 폴리펩티드로서이다 ("리간드를 활성화시킴"). 리간드를 활성화시키기 위한 한 가지 시험이 다음에 기재된 헤레굴린 티로신 자가인산화 분석법이다. 상기 용어가 본원에 사용시, 본원에 제시된 바와 같은 완전한 사람 헤레굴린의 번역된 성숙한 아미노산 서열을 지닌 헤레굴린, 헤레굴린과 공통의 생물학적 특성을 나타낼 수 있는, 헤레굴린의 탈글리코실화 또는 비-글리코실화 유도체, 헤레굴린 서열의 아미노산 서열 변이체 및 헤레굴린의 유도체가 헤레굴린의 범주 내에 포함된다. 천연의 헤레굴린이 막-결합된 폴리펩티드이긴 하지만, 기능상 막횡단 도메인이 결여된 형태와 같은 가용성 형태가 또한 상기 정의 내에 포함된다. 특히, 약 S216에서부터 약 A227까지의 임의의 잔기에 N-말단을 지니고 있고, 약 K268에서부터 약 R286까지의 임의의 잔기에 C-말단을 지니고 있으며, 도 6a내지 6c에 도시된 상동 서열 (이는 모든 헤레굴린에 대해 집합적으로 성장 인자 영역 (GFD)으로서 후술된다)을 지니고 있는 헤레굴린 서열의 폴리펩티드 단편이 포함된다.

"항원적 활성" 헤레굴린은 헤레굴린의 항원성 기능을 보유하고 생물학적 기능을 추가로 보유할 수도 있는 (반드시 필요한 것은 아님) 폴리펩티드로서 정의된다.

바람직한 양태에서는, 항원적 활성 헤레굴린이, 천연 헤레굴린 서열에 대해 생성된 항체와 약 10^-9ℓ/mole 이상의 친화도로 결합되는 폴리펩티드이다. 통상적으로, 이러한 폴리펩티드는 약 10^-8ℓ/mole 이상의 친화도로 결합된다. 가장 바람직하게는, 항원적 활성 헤레굴린은 본래 형태를 지니고 있는 헤레굴린 중의 하나에 대해 생성된 항체와 결합되는 폴리펩티드이다. 본래 형태의 헤레굴린은 일반적으로, 예를 들면, 비-환원, 비-변성 사이징 겔 상에서의 이동으로써 관찰된 바와 같이, 헤레굴린의 3차원 구조를 실질적으로 변형시키는 카오트로픽제, 열 또는 기타 처리에 의해 변성되지 않은 천연 상태로 발견되는 헤레굴린이다. 이러한 결정법에 사용된 항체는 비-토끼 종으로부터의 천연 헤레굴린을 프로인트 완전 보조액 내에 제제화시키고, 이 제제를 피하 주사하고, 항-헤레굴린 항체 역가가 안정 수준에 도달할 때까지 상기 제제를 복강내 주사하여 면역 반응을 촉진시킴으로써 생성된 토끼 폴리클로날 항체일 수 있다.

통상적으로, 생물학적 또는 항원적으로 활성인 헤레굴린은 소정의 헤레굴린 서열과의 아미노산 서열 동일성이 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상인 아미노산 서열을 지닐 것이다. 헤레굴린 서열에 대한 동일성 또는 상동성은 본원에서, 서열들을 정렬하고, 경우에 따라 최대 상동성을 달성하기 위해 갭을 도입하며, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환물도 고려하지 않은 후에, 도 6a내지 6c의 헤레굴린 중의 헤레굴린 잔기와 동일한 후보 서열 중에서의 아미노산 잔기 비율 (%)로서 정의된다. N-말단, C-말단 또는 내부 연장물, 결실물 또는 헤레굴린 서열 내로의 치환물 중의 어떠한 것도 상동성에 영향을 미치지 않을 것이다.

따라서, 본 발명의 주제인 생물학적 활성 및 항원적 활성 헤레굴린 폴리펩티드에는 각각의 완전한 헤레굴린 서열; 헤레굴린 서열로부터 5, 10, 15, 20, 25, 30 또는 40개 이상의 아미노산 연속 서열을 갖는 이의 단편; 아미노산 잔기에 헤레굴린 서열 또는 상기 정의된 바와 같은 이의 단편에 대한 또는 이러한 단편 내에서의 N-말단 또는 C-말단을 삽입시킨, 헤레굴린 서열의 아미노산 변이체; 또 다른 잔기에 의해 치환시킨 헤레굴린 또는 상기 정의된 바와 같은 이의 단편의 아미노산 서열 변이체가 포함된다. 헤레굴린 폴리펩티드에는, 예를 들어, 위치 지정된 돌연변 이 또는 PCR 돌연변이에 의한 예정된 돌연변이물을 함유하는 것, 및 토끼, 쥐, 돼지, 비-사람 영장류, 말, 쥐 및 양 헤레굴린과 같은 기타 동물 종의 헤레굴린 폴리펩티드 및 대립유전자, 또는 앞서 언급된 서열 및 사람 서열의 기타 천연 변이체; 헤레굴린 또는 이의 단편을 치환, 화학물질, 효소, 또는 천연 아미노산 이외의 잔기 (예를 들면, 효소 또는 방사성 동위원소와 같이 탐지 가능한 잔기)를 갖는 기타 적절한 수단에 의해 공유적으로 변형시킨, 헤레굴린 또는 상기 정의된 바와 같은 이의 단편의 유도체; 헤레굴린의 글리코실화 변이체 (적당한 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환에 의한 어느 한 글리코실화 부위의 결실물 또는 특정 글리코실화 부위의 삽입물); 및 가용성 형태의 헤레굴린, 예를 들면, HGR-GFD 또는 기능상 막횡단 도메인이 결여된 것이 포함된다.

"단리된"이란 이의 천연 환경의 특정 성분으로부터 동정 및 분리되고/되거나 회수된 리간드, 예를 들면, 헤레굴린을 의미한다. 이의 천연 환경의 오염 성분은 헤레굴린에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 수도 있는 물질이며, 이에는 단백질, 호르몬 및 기타 물질이 포함될 수 있다. 바람직한 양태에서는, 헤레굴린이 (1) 로우리법 (Lowry method) 또는 기타 인증된 단백질 결정법으로 측정된 바와 같이, 단백질이 95 중량%를 초과하고, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도로 정제되거나, (2) 이의 출원시 판매된 가장 우수한 시판용 아미노산 시퀘네이터 (sequenator)를 사용하여, N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은염색법을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 균일하게 정제될 것이다. 헤레굴린 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 헤레굴린에는 재조합 세포 내의 계내에서의 헤레굴린이 포함된다. 단리된 헤레굴린에는 또 다른 종의 재조합 세포 배양물 중의 한 종으로부터의 헤레굴린이 포함되는데, 이는 이러한 상황의 헤레굴린에는 공급원 폴리펩티드가 결여될 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 헤레굴린은 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본 발명에 따르면, 헤레굴린 핵산은 생물학적 또는 항원적으로 활성인 헤레굴린을 코딩하고, 이러한 헤레굴린을 코딩하는 핵산 서열에 상보적이거나 이러한 헤레굴린을 코딩하는 핵산 서열과 혼성화되며 엄격한 조건 하에서 이와 안정적으로 결합되어 있는 염기를 10개 초과하여 함유하는 RNA 또는 DNA이다.

바람직하게는, 헤레굴린 핵산은 헤레굴린 서열과의 서열 동일성이 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%인 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 혼성화되는 헤레굴린 핵산은 염기를 20개 이상, 더욱 바람직하게는 약 40개 이상, 가장 바람직하게는 약 90개 이상 함유한다.

단리된 헤레굴린 핵산에는 헤레굴린 핵산의 천연 공급원 중에서 통상적으로 결합된 하나 이상의 포함 핵산으로부터 정제되어 분리되는 핵산이 포함된다. 따라서, 단리된 헤레굴린 핵산은 천연 상태로 발견되는 형태 또는 셋팅 이외의 것으로 존재한다. 그러나, 단리된 헤레굴린 코딩 핵산에는, 핵산이 천연 세포의 것과는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 천연에서 발견된 것과는 상이한 DNA 서열에 의해 플랭킹되는, 통상 헤레굴린-발현성 세포 중의 헤레굴린 핵산이 포함된다. 헤레굴린을 코딩하는 핵산, 특히 기타 공지된 DNA 서열과는 혼성화하지 않는 서열을 코딩하는 헤레굴린의 일부분은 특이적 혼성화 분석에 사용할 수 있다. "엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도와 고온, 예를 들면, 50℃ 하에서의 0.015M NaCl/0.0015M 나트륨 시트레이트/0/1% NaDodSO₄를 이용하거나; (2) 혼성화 동안 포름아미드와 같은 변성제, 예를 들면, 42℃ 하에서 0.1% 소의 혈청 알부민을 갖는 50% (v/v) 포름아미드, 0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 50mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5), 750mM NaCl, 75mM 나트륨 시트레이트를 이용하거나; 또는 (3) 42℃ 하에서 50% 포름아미드, 5x SSC (0.75M NaCl, 0.075M 나트륨 시트레이트), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정액 DNA (50g/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 이용하고, 0.2 x SSC 및 0.1% SDS에서 42℃ 하에 세척하는 조건이다.

용어 "조절 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵 생물용으로 적합한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 임의의 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위, 및 가능하게는 아직 완전하게 이해되지 않은 기타 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서 (enhancer)를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 기능상 관계를 설정할 경우에 "작동가능하게 연결된다". 예를 들면, 전서열 또는 분비 시그날에 대한 DNA는 이것이 특정 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우에 이러한 폴리펩티드에 대한 DNA와 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 특정 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 촉진시키도록 위치되는 경우에 특정 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란 연결된 DNA 서열이 연속적으로 있고, 분비 리더인 경우에는, 연속적으로 판독 상 내에 있다. 그러나, 인핸서는 연속적이어야 하는 것은 아니다. 연결은 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 이루어진다. 이러한 부위가 존재하지 않을 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용한다.

"외인성" 요소는 본원에서, 세포에 대해 외래이거나, 또는 세포에 대해 상동성이지만 상기 요소가 통상 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내에 위치하고 있는 핵산 서열을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 모든 명칭에는 그의 자손도 포함된다. 따라서, 용어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 1차 피검자 세포 및 전이물 수에 상관없이 이로부터 유도된 배양물이 포함된다. 계획적이거나 부주의한 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 성분에 있어서 정확하게 동일하지 않을 수 있다는 것을 또한 인식해야 한다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 바와 동일한 기능이나 생물학적 활성을 지니고 있는 돌연변이체 자손도 포함된다. 이는 별개의 명칭이 의도되는 맥락으로부터 명백할 것이다.

"플라스미드"는 소문자 "p"가 앞에 온 다음 대문자 및(또는) 숫자가 오도록 명시된다. 본원에서의 출발 플라스미드는 시판되고 있으며, 마음대로 구입할 수 있거나 공개된 절차에 따라서 이러한 입수 가능한 플라스미드로부터 작제할 수 있다. 또한, 기타 등가의 플라스미드가 당해 분야에 공지되어 있고 숙련인에게는 명백할 것이다.

DNA의 "제한 효소 분해"는 이러한 DNA 내의 특정 위치에서만 작용하는 효소를 사용하여 DNA를 촉매적으로 절단하는 것을 지칭한다. 이러한 효소는 제한 엔도뉴클레아제로 불리우며, 이들 각각이 특이적인 부위는 제한 부위라 칭한다. 본원에서 사용된 각종 제한 효소는 시판되고 있으며, 효소 공급업자에 의해 설정된 바와 같은 이들의 반응 조건, 보조인자 및 기타 요건이 이용된다. 제한 효소는 통상적으로, 대문자에 이어 각 제한 효소가 본래 수득되는 미생물을 나타내는 다른 문자를 표시하고, 그 다음에 특정한 효소를 나타내는 숫자로 구성된 약어로써 명시된다. 일반적으로, 약 1㎎의 플라스미드 또는 DNA 단편을 약 20㎖의 완충액 중의 약 1 내지 2 units의 효소와 함께 사용한다. 특정한 제한 효소에 적절한 완충액 및 기질 양은 제조업자에 의해 명시된다. 통상, 37℃에서 약 1시간 동안 항온 배양하지만, 공급업자의 지시에 따라서 다를 수 있다. 항온 배양 후, 단백질 또는 폴리펩티드를 페놀 및 클로로포름으로 추출하여 제거하고, 상기와 같이 분해된 핵산은 에탄올로 침전시켜 수성 분획으로부터 회수한다. 제한 효소로 분해한 다음, 말단 5' 포스페이트를 세균성 알칼린 포스파타제 가수분해시켜, 특정 DNA 단편의 두 제한 절단된 말단이 "폐환"되는 것을 방지하거나 또는 상기 제한 부위에서 또 다른 DNA 단편의 삽입을 방해할 수도 있는 밀폐된 루프를 형성하는 것을 방지할 수 있 다. 달리 언급되지 않는 한, 플라스미드의 분해에 이어 5' 말단 탈인산화를 수행하지 않는다. 탈인산화용 시약과 이에 대한 과정은 문헌 [참조: section 1.56-1.61 of Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같이 통상적이다.

제한 분해물로부터의 소정의 DNA 단편의 "회수" 또는 "단리"는 상기 분해물을 폴리아크릴아미드 또는 아가로즈 겔 상에서 전기영동시켜 분리시고, 관심있는 단편의 이동도와 공지된 분자량의 마아커 DNA 단편의 이동도를 비교함으로써 상기 관심있는 단편을 동정하며, 목적하는 단편을 함유하는 겔 절편을 제거하고, 이러한 겔을 DNA로부터 분리시키는 것을 의미한다. 이러한 과정은 일반적으로 공지되어 있다 [예를 들면, Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 (1981), and Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980) 참조].

"노던 (Northern) 분석"은 올리고뉴클레오티드, DNA 단편, cDNA 또는 이의 단편, 또는 RNA 단편과 같이 공지된 프로브와 혼성화되는 RNA 서열을 동정하기 위해 사용되는 방법이다. 이러한 프로브는 ³²P와 같은 방사성 동위원소로 표지하거나, 비오틴화시킴으로써 표지하거나, 또는 효소로 표지한다. 분석하고자 하는 RNA를 통상, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시켜 분리시키고, 이를 니트로셀룰로즈, 나일론 또는 기타 적합한 막으로 옮긴 다음, 문헌 [sections 7.39-7.52 of Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같이 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 상기 프로브와 혼성화시킨다.

"라이게이션"이란 두 핵산 단편 간에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. DNA 단편을 함께 라이게이션시키기 위해서는, 이러한 DNA 단편의 말단들이 서로 적합해야만 한다. 몇몇 경우에는, 이들 말단이 엔도뉴클레아제 분해 후에 바로 적합할 것이다. 그러나, 엔도뉴클레아제 분해 후에 통상적으로 생성된 스태거드 말단을 먼저 블런트 (blunt) 말단으로 전환시켜 이들의 라이게이션하기에 적합하도록 만드는 것이 필요할 수 있다. 말단을 블런트하게 만들기 위해서는, DNA를 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재하에 DNA 폴리머라제 I 또는 T4 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편 약 10 units와 함께 약 15℃에서 15분 이상 동안 적합한 완충액에서 처리한다. 이어서, 상기 DNA를 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전시킴으로써 정제한다. 함께 라이게이션되는 DNA 단편을 대략 등몰량으로 용액 중에 놓아둔다. 이 용액은 ATP, 리가제 완충액, 및 T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 DNA 0.5 ㎎당 약 10 units로 함유할 것이다. 상기 DNA를 벡터 내로 라이게이션시키는 경우에는, 이 벡터를 적당한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 분해하여 먼저 선형화시킨다. 이어서, 상기와 같이 선형화된 단편을 세균성 알칼리 포스파타제 또는 소 장 포스파타제로 처리하여 라이게이션 단계 동안의 자가-라이게이션을 방지시킨다.

세포로부터의 DNA의 "제조"는 숙주 세포 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하는 것을 의미한다. DNA 제조에 통상적으로 사용되는 방법은 문헌 [section 1.25-1.33 of Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 대규모 및 소규모 플라스미드 제조 방법이다. 이러한 DNA를 제조한 후, 이를 문헌 [section 1.40 of Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 정제할 수 있다.

"올리고뉴클레오티드"는 공지된 방법 [예를 들면, EP 266,032 (1988. 5.4.)에 기재된 바와 같은 고상 기술을 사용하거나 문헌 (Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14:5399-5407 (1986)에 기재된 바와 같은 데옥시뉴클레오시드 H-포스포네이트 중간체를 통한, 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포르아미다이트 화학]에 의해 화학적으로 합성되는 짧은 길이의 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리데옥시뉴클레오티드이다. 이어서, 이들을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제한다.

본원에서 사용되는 "폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"의 기술은 핵산, RNA 및(또는) DNA의 미량의 특정 단편을 미국 특허 제4,683,195호 (1987. 7. 28)에 기재된 바와 같이 증폭시키는 과정을 일반적으로 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안할 수 있도록 관심이 있거나 관심 밖의 영역 말단으로부터의 서열 정보는 입수 가능해야 하며, 이러한 프라이머는 증폭될 주형의 반대편 가닥과 서열이 동일하거나 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR을 사용하여 특이적 RNA 서열, 전체 게놈 DNA로부터의 특이적 DNA 서열, 및 전체 세포 RNA, 박테리오파아지 또는 플라스미드 서열로부터 전사된 cDNA 등을 증폭시킬 수 있다 [참조: Muilis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)]. 본원에서 사용된 PCR은 프라이머로서 공지된 핵산 (DNA 또는 RNA)을 사용하는 것을 포함하는, 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵 산 폴리머라제 반응 방법의 한 예이나 유일한 예는 아니며, 핵산 폴리머라제를 이용하여 특정 핵산 조각을 증폭 또는 생성시키거나 특정 핵산에 상보적인 특정 핵산 조각을 증폭 또는 생성시킨다.

헤레굴린 리간드의 존재 여부 또는 생활성을 탐지하기 위한 "헤레굴린 티로신 자가 인산화 분석법"을 이용하여 HER2 수용체에 대한 리간드의 정제를 모니터할 수 있다. 이 분석법은 상기 수용체에 대한 특이적 리간드가, EGF 및 이의 EGF 수용체 자가인산화 자극과 유사하게, 상기 수용체의 자가인산화를 자극할 것이라는 가설에 근거하고 있다 [참조: Sadich et al., Anal. Biochem. 235:207-214 (1996)]. p185^HER2 수용체는 높은 수준으로 함유하지만 사람 EGF 수용체는 무시할 만한 수준으로 함유하는 MDA-MB-453 세포 또는 MCF7 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, Rockville, Md (ATCC No HTB-131))으로부터 수득하고, DMEM/Hams F12 (1:1) 배지 중의 10% 태내 송아지 혈청을 지닌 조직 배양으로 유지시킨다. 분석을 위해, 상기 세포를 트립신으로 처리하고, 24웰 디쉬 (Costar)에 150,000 세포/웰로 플레이팅한다. 혈청 함유 배지를 밤새 인큐베이션한 후, 분석하기 전에 2 내지 18시간 동안 상기 세포를 혈청 무함유 배지에 놓아둔다. 100 ㎕ 분취액의 시험 샘플을 각 웰에 가한다. 상기 세포를 37℃에서 5 내지 30분 (통상 30분) 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 제거한다. 각 웰 중의 세포를 100 ㎕ SDS 겔 변성 완충액 (SEPROSOL, Enpotech, Inc.)으로 처리하고, 상기 플레이트를 100℃에서 5분 동안 가열하여 세포를 용해하고 상기 단백질을 변성시킨다. 각 웰로부터의 분취액을 제조업자의 지시에 따라서 5 내지 20% 구배 SDS 겔 (NOVEX, Encinitas, CA) 상에서 전기영동시킨다. 염료 앞면이 겔의 바닥에 도달한 후에, 상기 전기영동을 종결하고 PVDF 막 (PROBLOTT, ABI)판을 상기 겔 위에 놓아두면, 상기 단백질이 30 내지 60분 동안 200 mAmps로 블롯팅 챔버 (BioRad) 내에서 상기 겔로부터 상기 막으로 이동한다. 블롯팅 후, 상기 막을, 5% BSA를 갖는 0.1% TWEEN 20 세제 완충액을 함유하는 TRIS 완충 식염수와 함께 2 내지 18시간 동안 인큐베이션하여 비특이적 결합을 차단시킨 다음, 마우스 항-포스포티로신 항체 (Upstate Biological Inc., N.Y.)로 처리한다. 연속적으로, 상기 막 블롯을 알칼리 포스파타제에 접합된 고우트 항-마우스 항체로 처리한다. PROTOBLOT 시스템 (공급원: Promega)을 사용하여 상기 겔을 전개시킨다. 상기 막을 건조시킨 후, 각 샘플 레인 중의 p185^HER2에 상응하는 밴드의 밀도를 매킨토시 컴퓨터에 부착된 휴렛 팩커드 (Hewlett Packard) SCANJET 플러스 스캐너로 정량화한다. MDA-MB-453 세포 중에서 세포당 수용체의 수는 이들 실험 조건 하에서 p185^HER2 수용체 단백질이 표지되는 주요 단백질이 되도록 한 것이다.

"단백질 마이크로시퀀싱 (microsequencing)"은 다음 과정을 기준으로 하여 수행하였다. 최종 HPLC 단계로부터의 단백질을, 120A PTH 아미노 분석기가 장착된 모델 470A 어플라이드 바이오시스템즈 기상 서열 분석기를 사용하여 자동화 에드만 분해에 의해 직접적으로 서열 분석하거나, 또는 각종 화학물질 또는 효소를 사용하여 분해한 후에 서열 분석하였다. CHROMPERFECT 데이타 시스템 (Justice Innovations, Palo Alto, CA)을 사용하여 PTH 아미노산을 통합하였다. 문헌 [참조: Henzel et al., J. Chromatography 404:41-52 (1987)]에 기재된 바와 같이 VAX 11/785 디지탈 이큅먼트 코포레이션 (Digital Equipment Corporation) 컴퓨터 상에서 서열 해석을 수행하였다. 몇몇 경우에는, 분취액의 HPLC 분획을 5 내지 20% SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시키고, PVDF 막 (PROBLOTT, ABI, Foster City, CA)으로 전기적으로 이동시킨 다음, 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다 [참조: Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262-10035-10038, 1987]. N-말단 서열 분석을 위해 상기 특정 단백질을 상기 블롯으로부터 절단하였다. 내부 단백질 서열을 결정하기 위하여, HPLC 분획을 진공 (SPEEDVAC) 하에 건조시키고, 적당한 완충액에 재현탁시켜, 라이신-특이적 효소 Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) 또는 Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)인 시아노겐 브로마이드로 분해하였다. 분해 후, 이로써 생성된 펩티드를 혼합물로서 서열 분석하거나 또는 상기 언급된 바와 같이 서열 분석 이전에 0.1% TFA 중의 프로판올 구배를 이용하여 전개된 C4 칼럼 상에서 HPLC에 의해 분해하였다.

"항체" (Abs) 및 "면역글로불린" (Igs)은 동일한 구조적 특징을 지니고 있는 당단백질이다. 항체가 특이적 항원에 대한 결합 특이성을 나타내긴 하지만, 면역글로불린에는 항체와, 항원 특이성이 결여된 기타 항체-유사 분자 모두가 포함된다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로 생성되고 골수종에 의해 증가된 수준으로 생성된다.

항체를 파파인 분해시키면, 각각 단일의 항원-결합 부위를 지니고 있는 2개 의 동일한 항원-결합 단편 ("Fab" 단편으로 불리움)과 나머지 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화되는 이의 능력을 반영하고 있다)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원-결합 부위를 지니고 있고 항원과 가교결합할 수 있는 F (ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위와 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중쇄와 1개의 경쇄 가변 영역이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 이루어진다. 이러한 배열에서는, 각 가변 영역의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정짓는다. 집합적으로 설명하면, 6개의 초가변 영역이 항체에 항원-결합 특이성을 부여해준다. 그러나, 심지어 1개의 가변 영역 (또는 특정 항원에 특이적인 단지 3개의 초가변 영역을 포함하는 Fv의 절반)이, 전체 결합 부위보다는 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하여 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.

Fab 단편은 경쇄의 불변 영역과 중쇄의 제1 불변 영역 (CH1)을 또한 함유하고 있다. 또한, 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하여 중쇄 CH1 영역의 카르복실 말단에 수 개의 잔기가 부가된 Fab 단편이 포함된다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 영역의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하고 있는 Fab'에 대한 명칭이다. F (ab')₂ 항체 단편은 본래, 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖고 있는 한 쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

모든 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 이들의 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 하여, 명백하게 별개인 2가지 유형 [카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리움] 중의 하나일 수 있다.

이들 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 유형일 수 있다. 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM과 같이 5가지 주요 부류로 분류할 수 있다. 이들 중의 몇몇은 아부류 (이소유형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류할 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린의 아단위 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되며, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중 특이적 항체 (예를 들면, 이중 특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 이에 속한다.

"항체 단편"은 완전한 항체의 일정 부분, 일반적으로는 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F (ab')₂ 및 Fv 단편, 디아보디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체가 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단 (즉, 이러한 집단에 속하는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일함)으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 추가로, 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어구 "모노클로날"은, 해당 항체가 실질적으로 상동성인 항체 집단으로부터 수득된다는 특징을 지시해주며, 특정한 어떠한 방식에 의해 항체를 생성할 필요가 있다는 것으로 간주되지 말아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [참조: Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조하거나, 또는 재조합 DNA 방법 [미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어, 문헌 [참조: Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.

본원에서, 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유도된 항체 또는 특정한 항체 부류 및(또는) 아부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이지만, 쇄의 나머지가 또 다른 종으로부터 유도된 항체 또는 또 다른 항체 부류 및(또는) 아부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편 (이는 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 함) 중의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메릭" 항체 (면역글로불린)가 포함된다 [참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)].

비-사람 (예를 들어, 쥐) 항체의 "사람화" 형태는 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체이다. 대부분의 경우, 사람화 항체는, 수용자의 초가변 영역이 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 지니고 있는 마우스, 쥐, 토끼 또는 비-사람 영장류와 같은 비-사람 종 (공여자 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체되는 사람 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 사람 면역글로불린의 프레임 워크 (FR) 잔기가 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 추가로, 사람화 항체는 수용자 항체나 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형물은 항체 성능을 추가로 정련시킨다. 일반적으로, 사람화 항체는 1개 이상, 및 전형적으로는 2개의 가변 영역을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 가변 영역은 비-사람 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 사람 면역글로불린 서열의 것이다. 이러한 사람화 항체는 또한, 임의로 적어도 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 사람 면역글로불린의 불변 영역의 일정 부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조할 수 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 영역을 포함하는데, 이들 영역은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있도록 해주는, V_H 및 V_L 영역 간의 폴리펩 티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 고찰은 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Spring-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)]을 참조할 수 있다.

용어 "디아보디"는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 영역 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 (V_H - V_L), 2개의 항원-결합 부위를 지니고 있는 작은 항체 단편을 지칭한다. 동일한 쇄 상에서 두 영역 간에 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 영역들이 또 다른 쇄의 상보 영역과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성시키도록 한다. 디아보디는, 예를 들어, 문헌 [참조: EP 404 097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 표현 "선형 항체"는 문헌 [참조: Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게 언급하면, 이들 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 종렬식 Fd 세그먼트 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)를 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일 특이적이다.

II. 헤레굴린 서열의 용도 및 제조

H. 변이체를 포함한, 헤레굴린 서열의 제조

헤레굴린 서열을 제조하는데 이용될 시스템은 선택된 특정한 헤레굴린 서열에 좌우될 것이다. 이러한 서열이 충분히 작을 경우, 헤레굴린은 시험관내 폴리펩티드 합성법으로 제조할 수 있다. 그러나, 가장 통상적으로는, 헤레굴린은 다음에 기재된 숙주-벡터 시스템을 사용하여 재조합 세포 배양물로부터 제조될 것이다. 적합한 헤레굴린에는 생물학적 활성 및 항원적 활성 헤레굴린이 포함된다.

일반적으로, 포유류 숙주 세포가 이용될 것이며, 이러한 숙주는 헤레굴린 프리프로서열을 정상적인 방식으로 프로세싱하기 위한 번역 후 시스템을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 이러한 숙주 세포가 상기 시스템을 함유하는 경우에는, 배양물로부터 천연의 서브도메인 단편을 회수하는 것이 가능할 것이다. 그렇지 않은 경우에는, 상기 숙주를 요구되는 효소(들)로 형질전환시키거나 이들을 시험관내 방법에 제공함으로써 적당한 프로세싱을 수행할 수 있다. 그러나, 헤레굴린 서열 단편의 생성만을 목적으로 하는 경우에는, 선별된 특정 헤레굴린에 대한 완전한 프리프로 또는 구조적 유전자로 세포를 형질전환시킬 필요가 없다. 예를 들면, 개시 코돈을 HRG-GFD를 코딩하는 DNA의 5' 말단에 연결시키고, 이 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키면, 이 생성물이 Met N-말단 형태로서 직접적으로 발현되었다 (경우에 따라, 여분의 Met가 시험관내에서 제거되거나 내인성 N-말단 데메티오닐라제에 의해 제거될 수 있다). 또 다른 방법으로는, HRG-GFD가 숙주 세포에 의해 인식된 시그날 서열과의 융합물로서 발현되며, 이는 다음에 추가로 논의되는 바와 같이 프로세싱되어 성숙한 HRG-GFD를 분비할 것이다. 본래의 HRG-GFD 서열의 아미노산 서열 변이체가 동일한 방식으로 생성된다.

HRG-GFD 서열의 제1의 N-말단 성숙한 잔기와 제1의 N-말단 잔기 사이에 위치한 헤레굴린 서열 (HRG-NTD로 명명됨)은 적어도 부분적으로는, 독특한 시그날 서열로서 작용하거나 독특한 생물학적 활성을 지니고 있는 HRG-GFD에 대해 정상적으로 순환되고 있는 운반체/전구체로서 작용할 수 있다. HRG-NTD는 전장의 분자와 동일한 방식으로 생성되긴 하지만, 정지 코돈이 HRG-NTD의 C-말단에 위치하는 DNA의 발현으로부터 생성된다. 또한, 헤레굴린 변이체는, GFD와 NTD 영역 모두가 이들의 적당한 배향으로 존재하지만 GFD-NTD 절단 부위 (서열 VKC 내에 위치함)에 생체내 NTD-GFD 결합 부위의 단백질 분해적 절단을 억제 또는 방지시키는 아미노산 삽입물, 결실물 또는 치환물을 함유하고 있고, 정지 코돈이 GFD-코딩 서열의 3' 말단에 위치하는 DNA 코딩 단백질로부터 발현된다. 이러한 그룹의 변이체의 한 예 (HRG-NTDXGFD로 명명됨)에서는, (1) NTD-GFD 결합 서열 내에서 발견되는 라이신 잔기가 결실되거나 (바람직하게는) 아르기닐 이외의 또 다른 잔기, 예를 들면, 히스티딜, 알라닐, 트레오닐 또는 세릴로 치환되고 (2) 정지 코돈이 시스테이닐, 또는 트레오닐 (HRG-α의 경우) 또는 글루타미닐 (HRG-β의 경우) 대신 서열 RCT 또는 RCQ에 도입된다.

p185^HER2에 대한 결합 친화성을 지니고 있는 바람직한 HRG-α리간드는 도 1a 내지 D의 아미노산 226 내지 265를 포함한다. 이러한 HRG-α리간드는 아미노산 226에 앞서 부가의 1 내지 20개 아미노산을 추가로 포함하고 아미노산 265 다음에 부가의 1 내지 20개 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. p185^HER2에 대한 결합 친화성을 지니고 있는 바람직한 HRG-β리간드는 도 2a 내지 2e의 아미노산 226 내지 265를 포함한다. 이러한 HRG-β리간드는 아미노산 226에 앞서 부가의 1 내지 20개 아미노산을 추가로 포함하고 아미노산 265 다음에 부가의 1 내지 20개 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따라서 제조될 기타 헤레굴린 서열은 GFD의 것이다. 이들은 시험관내에서 합성하거나 재조합 세포 배양물에서 제조한다. 이들은 다음에 기재되는 바와 같이 헤레굴린-이종 시그날의 조절 하에 분비시킴으로써 효모 또는 이. 콜라이 (E. coli)에서 가장 저렴하게 생성되긴 하지만, 포유류 단백질 시그날, 예를 들면, tPA, UK 또는 분비된 바이러스성 단백질의 시그날을 사용하여 포유류 세포에서 제조하는 것도 또한 고려된다. GFD는 천연 헤레굴린의 서열이거나 또는 다음에 기재되는 바와 같은 변이체일 수 있다. GFD 서열에는 EGF족의 구성원으로부터의 하나 이상의 잔기가 GFD 서열 내로 또는 서열 상으로 치환된 것이 포함된다.

부가의 헤레굴린은 GFD, 및 GFD의 C-말단과 막횡단 도메인의 N-말단 간의 서열을 함유하는 것이다 (후자는 C-말단 절단 영역 또는 CTC로 명명됨). 이러한 변이체 (HRG-GFD-CTC)에서는, DNA 개시 코돈이 헤레굴린-이종 시그날 서열의 5' 말단에 존재하거나 GFD-코딩 영역의 5' 말단에 인접하여 있고, 정지 코돈이 첫 번째 약 1 내지 3개의 세포외 영역 (ECD) 잔기 중의 하나 또는 첫 번째 약 1 내지 2개 막횡단 도메인 잔기 중의 하나 대신에 발견된다. 또한, 몇몇 HRG-GFD-CTC 변이체에서는, 상기 코돈들이 치환, 삽입 또는 결실에 의해 GFD-CTC 단백질 분해 부위에서 변형된다. 이러한 GFD-CTC 단백질 분해 부위는 GFD C-말단 잔기, 및 이러한 잔기로부터의 약 5개 잔기 N-말단 및 5개 잔기 C-말단을 함유하는 영역이다. Met-227 말단과 Val-229 말단 HRG-α-GFD가 생물학적 활성이라는 것은 공지되어 있다. HRG- α-GFD에 대한 C-말단은 Met-227, Lys-228, Val-229, Gln-230, Asn-231 또는 Gln-232일 수 있고, HRG-β-GFD에 대한 C-말단은 Met-226, Ala-227, Ser-228, Phe-229, Trp-230 또는 Lys231/Ser231일 수 있다. 본래의 C-말단은 C-말단 서열 분석함으로써 용이하게 결정하지만, GFD 서열이 목적하는 활성을 보유하고 있는 한은 HRG-GFD가 본래의 말단을 갖고 있는 것이 중요하지는 않다. HRG-GFD-CTC의 몇몇 양태에서는, CTC에서의 아미노산 변화(들)를 대상으로 하여, 시험관내에서 단백질 분해에 대해 저항하고 HRG-GFD의 생성에 관여하고 있는 프로테아제를 억제시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝한다.

HRG-ECD 변이체는 HRG-GFD-CTC 변이체에 대한 것과 동일한 위치에 정지 코돈을 제공함으로써 제조한다. HRG-ECD는 이의 아단편과 연계하여 상기 언급된 하나 이상의 변이체 (예를 들면, CTC-단백질 분해 부위 변형물을 함유하는 GFD-CTC 변이체) 중의 어떠한 것도 포함할 수 있다.

보다 긴 헤레굴린 폴리펩티드를 제조하고자 하고 소정의 헤레굴린의 5' 또는 3' 말단이 본원에 기재되지 않은 경우에는, 결손 영역이 보다 완전한 헤레굴린 핵산으로부터의 상동 영역에 의해 공급되는 핵산을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 또 다른 한편, 이러한 결손 영역은, 당해 도면에 기재된 DNA 또는 이의 단편을 사용하여 라이브러리를 프로빙함으로써 수득할 수 있다.

A. 헤레굴린을 코딩하는 DNA의 단리

헤레굴린을 코딩하는 DNA는 헤레굴린 mRNA를 보유하고 있고 이를 탐지 가능한 수준으로 발현시키는 것으로 여겨지는 조직으로부터 제조된 모든 cDNA 라이브러 리로부터 수득할 수 있다. 따라서, HRG-α유전자는 게놈 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 유사한 과정이 기타 헤레굴린, 예를 들면, HRG-β1, HRG-β2 또는 HRG-β3 코딩 유전자의 단리에 사용될 수 있다.

라이브러리는 관심있는 유전자 또는 이에 의해 코딩된 단백질을 동정하도록 고안된 프로브를 사용하여 스크리닝한다. cDNA 발현 라이브러리의 경우, 적합한 프로브에는 HRG-α를 인식하고 이와 특이적으로 결합되는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체; 동일하거나 상이한 종으로부터의 HRG-αcDNA의 공지되거나 추정되는 부분을 코딩하는, 길이가 약 20 내지 80개 염기인 올리고뉴클레오티드; 및(또는) 동일하거나 유사한 유전자를 코딩하는 상보적 또는 상동 cDNA 또는 이의 단편이 포함된다. 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하기에 적절한 프로브에는 올리고뉴클레오티드; 동일하거나 유사한 유전자를 코딩하는 cDNAs 또는 이의 단편; 및(또는) 상동 게놈 DNA 또는 이의 단편이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 선택된 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 것은 문헌 [chapters 10-12 of Sambrook et al 상기 참조]에 기재된 바와 같은 표준 과정을 사용하여 수행할 수 있다.

HRG-α를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 또 다른 방법은 문헌 [section 14 of Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법론을 이용하는 것이다. 이러한 방법은 HRG-α와 혼성화될 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용을 요구한다. 올리고뉴클레오티드를 선별하기 위한 전략이 다음에 기재되어 있다.

관심있는 유전자를 수득하기 위한 또 다른 대체 방법은 참조 문헌으로 삽입된 문헌 [Engels et al., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989)]에 기재된 방법들 중의 하나를 사용하여 이를 화학적으로 합성하는 것이다. 이들 방법에는 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트, 및 H-포스포네이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 및 고체 지지체 상에서의 올리고뉴클레오티드 합성법이 포함된다. 이들 방법은, 해당 유전자의 전체 아미노산 서열이 공지되어 있거나 코딩 가닥에 상보적인 핵산 서열이 이용 가능한 경우에 사용될 수 있거나, 또 다른 한편으로, 표적 아미노산 서열이 공지되어 있는 경우에는, 각 아미노산 잔기에 대해 공지되어 있고 바람직한 코딩 잔기를 사용하여 가망있는 핵산 서열을 추정할 수 있다.

본 발명을 실시하는데 바람직한 방법은 조심스럽게 선별된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 각종 조직, 바람직하게는 사람 유방, 결장, 침샘, 태반, 태아, 뇌 및 암 세포주로부터 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 헤레굴린-유사 리간드를 코딩하는 DNA의 기타 생물학적 공급원으로는 기타 포유동물 및 조류를 포함한다. 이들 중에서, 바람직한 포유동물은 다음 순서의 구성원들이다: 소, 양, 말, 쥐 및 설치류.

프로브로서 선별된 올리고뉴클레오티드 서열은 가 (false) 양성물을 최소화시키기에 충분한 길이여야 하고 충분하게 명백해야 한다. 실제적인 뉴클레오티드 서열은, 예를 들면, HRG-α의 보존되거나 고도로 상동성인 뉴클레오티드 서열 또는 영역에 기초한 것일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 위치에서 변성될 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것은, 특정 라이브러리를 특정 종으로부터 스크리닝하는 경우에 특히 중요한데, 여기서는 이러한 종에서의 우선적인 코돈 활용이 공지되어 있지 않다. 이러한 올리고뉴클레오티드는, 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA와의 혼성화시 탐지될 수 있는 정도로 표지시켜야만 한다. 바람직한 표지 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 키나제와 함께 ³²P-표지된 ATP를 사용하여 상기 올리고뉴클레오티드를 방사성 표지시키는 것이다. 그러나, 바이오틴화 또는 효소 표지화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 기타 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 표지시킬 수 있다.

특히 관심있는 것은 전장의 폴리펩티드를 코딩하는 HRG-α핵산이다. 몇몇 바람직한 양태에 있어서, 이러한 핵산 서열에는 본래의 HRG-α시그날 서열이 포함된다. 단백질 코딩 서열 모두를 갖고 있는 핵산은 선별된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, 경우에 따라, 문헌 [section 7.79 of Sambrook et al., 상기 참조]에 기재된 바와 같은 전구체 및 cDNA 내로 역전사되지 않을 수도 있는 mRNA의 프로세싱 중간체를 탐지하기 위한 통상적인 프라이머 연장 과정을 사용하여 수득한다.

도 1a 내지 1d의 HRG-α코딩 DNA를 사용하여, 상기 논의된 방법을 이용하는 혼성화를 통하여 기타 동물 종으로부터 유사한 리간드를 코딩하는 DNA를 분리시킬 수 있다. 바람직한 동물은 포유동물, 특히 소, 양, 말, 고양이, 개 및 설치류이 고, 보다 특정하게는 쥐, 마우스 및 토끼이다.

EGF-유사 도메인 단편 HRG-β1 177-244는, Nsil/Xbal-함유 오버행 (overhang)을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 벡터 pHL89 [참조: Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992)]로부터 증폭시켰다. 상기 단편을 동일한 부위에서 제한 분해-연결에 의해 파아지미드 디스플레이 벡터 pam-g3 내로 삽입하여 작제물 pHRG2-g3 (177-244)를 생성시켰다. pam-g3은 사람 성장 호르몬 (hGH)의 파아지 디스플레이를 위해 고안되었고 문헌 [참조: Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)]에 기재된, phGFam-g3의 유도체였다. pam-g3은, phGHam-g3에 존재하는 hGH 유전자를 제거한 다음, 이러한 유전자를, 클로닝에 사용된 제한 부위에서의 절단을 위한 공간을 제공해주는 스터퍼 (stuffer) 단편으로 대체함으로써 제조하였다. HRG-β1 단편을 pIII의 잔기 247에 부착시켰다.

상기 언급된 작제물로부터 발현된 HRG-β1 EGF-유사 도메인은 상기 작제물의 명칭에 나타난 "p" 및 "-g3"을 제거하여 명시한다. 따라서, pHRG2-g3 작제물로부터 발현된 HRG-β1 EGF-유사 도메인은 "HRG2"로 명명된다. 이 영역은 문헌 [참조: Bass et al., Protein 8:309-314 (1990)]에 기재된 바와 같이, pIII 융합 단백질로서 파아지 상에 1가적으로 디스플레이되었다. 유사하게, 변이체 HRG-β1_147-227, HRG-β1_147-244, 및 HRG-β1_177-227을 상기 언급된 바와 같이 제조 및 발현되었다.

B. 헤레굴린의 아미노산 서열 변이체

헤레굴린의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 헤레굴린 DNA에 도입하거나, 또는 목적하는 헤레굴린 폴리펩티드를 시험관내 합성함으로써 제조한다. 이러한 변이체에는, 예를 들면, 사람 헤레굴린 서열에 대해 제시된 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실물, 삽입물 또는 치환물이 포함된다. 결실물, 삽입물 및 치환물의 모든 조합물을 만들어 최종 작제물에 도달하게 만들 수 있는데, 단 최종 작제물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 신규하지도 않고 선행 기술에 비해 자명하지 않은 헤레굴린 변이체 또는 폴리펩티드 서열은 본 발명의 범위에서 제외된다. 아미노산 변화물은 또한, HRG-α의 번역 후 프로세스를 변형시킬 수도 있는데, 예를 들면, 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키거나, 막 앵커링 특징을 변형시키거나, 삽입, 결실, 또는 본래 헤레굴린의 리더 서열에 영향을 미침으로써 헤레굴린의 세포내 위치를 변형시키거나, 또는 단백질 분해에 의한 절단에 대한 이의 감수성을 변형시킬 수 있다.

헤레굴린 서열은 단백질 분해적으로 프로세싱하여 수 많은 헤레굴린 단편을 생성시킬 수 있다. HRG-α의 HRG-GFD 서열은 모두, HRG-α시스테인 226과 시스테인 265 사이의 아미노산 서열을 함유한다. HRG-α단편의 아미노 말단은 알라닌 1과 시스테인 226 간의 펩티드 결합, 바람직하게는 아르기닌, 라이신, 발린 또는 메티오닌에 인접한, 가장 바람직하게는 메티오닌 45와 세린 46 간의 모든 펩티드 결합을 절단시킴으로써 비롯될 수 있다. HRG-α단편의 카르복시 말단은 시스테인 265 간의 펩티드 결합, 바람직하게는 아르기닌, 라이신, 발린 또는 메티오닌에 인접한, 가장 바람직하게는 라이신 272와 발린 273 간의 펩티드 결합, 라이신 278과 알라닌 279 간의 펩티드 결합 또는 라이신 285와 아르기닌 286 간의 펩티드 결합을 절단시킴으로써 비롯될 수 있다. 이러한 단백질 분해적 프로세싱으로부터 비롯된 HRG-α리간드가 바람직한 리간드이다.

HRG-β-GFD's는 HRG-α-GFD's에 대해 상기 논의된 것과 유사하다. 각각의 HRG-β-GFD는 도 2a 내지 2e의 시스테인 212에서부터 시스테인 251까지의 폴리펩티드 세그먼트를 함유한다. HRG-β1단편의 아미노 말단은 알라닌 1과 시스테인 212 간의 펩티드 결합, 바람직하게는 아르기닌, 라이신, 발린 또는 메티오닌에 인접한, 가장 바람직하게는 메티오닌 31과 세린 32 간의 모든 펩티드 결합을 절단시킴으로써 비롯될 수 있다. HRG-β1 단편의 카르복시 말단은 도 2a 내지 2e의 시스테인 251 간의 펩티드 결합, 바람직하게는 아르기닌, 라이신, 발린 또는 메티오닌에 인접한, 가장 바람직하게는 발린 255와 메티오닌 256 간의 펩티드 결합, 라이신 261과 히스티딘 262 간의 펩티드 결합, 라이신 276과 알라닌 277 간의 펩티드 결합, 또는 라이신 301과 트레오닌 302 간의 펩티드 결합을 절단시킴으로써 비롯될 수 있다. 이러한 단백질 분해적 프로세싱으로부터 비롯된 HRG-β1 리간드가 바람직한 리간드이다. 유사하게, 도 3a 내지 3e에 근거한 HRG-β2 및 도 4a 내지 4c에 근거한 HRG-β3의 바람직한 단편 리간드를 생성하기 위한 프로세싱은, 바람직하게는 아르기닌, 라이신, 발린 또는 메티오닌에 인접한, 도 3a 내지 3e 및 4a 내지 4c의 헤레굴린 서열을 절단함으로써 수행할 수 있다.

헤레굴린의 아미노산 서열 변이체를 고안하는데 있어서, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 성질은 변형시키고자 하는 헤레굴린 특징에 좌우될 것이다. 돌연변이용 부위는, 예를 들어, (1) 먼저 보존적 아미노산 선택물로 치환한 다음 성취된 결과에 따라서 보다 라디칼 선택물로 치환하거나, (2) 표적 잔기를 결실시키거나, 또는 (3) 인접한 기타 수용체 리간드의 잔기를 위치 설정된 부위에 삽입함으로써, 개별적으로 또는 일련으로 변형시킬 수 있다.

돌연변이 유발시키기에 바람직한 위치에 설정되어 있는 헤레굴린 폴리펩티드의 특정 잔기 또는 영역을 동정하기에 유용한 방법은 문헌 [참조: Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이, "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발법"으로 불리운다. 따라서, 표적 잔기의 특정 잔기 또는 그룹을 동정하고 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같이 하전된 잔기), 중성 또는 음성적으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닐 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 이러한 아미노산과 세포 내외부의 주변 수성 환경과의 상호작용에 영향을 끼치게 한다. 이어서, 추가의 또는 기타 변이체를 치환 부위에 도입함으로써, 상기 치환에 대한 기능상 민감성을 나타내는 영역을 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 부위가 예정되긴 하였지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 소정 부위에서의 돌연변이 성능을 최적화하기 위해서, 알라닌 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이 유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행할 수 있으며, 발현된 헤레굴린 변이체를 대상으로 하여, 목적하는 활성의 최적의 조합에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 변이체를 작제하는데 있어서 2가지 주요 변수, 즉 돌연변이 부위의 위치 설정과 돌연변이의 성질이 있다. 이들은 헤레굴린 서열로부터의 변이체이고, 천연에서는 발견되지 않는 변이체나 대립 유전자에 도달하기 위해서, DNA를 돌연변이시킴으로써 만들어진 예정된 돌연변이체 형태 또는 천연의 대립 유전자 (이는 헤레굴린 DNA의 조작을 요구하지 않을 것이다)를 나타낼 수 있다. 일반적으로, 선택된 돌연변이의 위치 설정 및 성질은 변형될 헤레굴린 특징에 좌우될 것이다. 명백하게, 예를 들면, 헤레굴린을 공지된 수용체 리간드로 전환시키는 변이는 본 발명의 범위 내에 포함되지 않을 뿐만 아니라, 신규하지 않거나 선행 기술에 비해 자명하지 않은 어떠한 기타 헤레굴린 변이체 또는 폴리펩티드 서열도 본 발명의 범위 내에 포함되지 않는다.

아미노산 서열 결실물은 일반적으로 약 1 내지 30개 잔기, 보다 바람직하게는 약 1 내지 10개 잔기의 범위이고, 전형적으로 약 1 내지 5개가 연속된다. 결실물을 기타 EGF족 전구체와 낮은 상동성의 영역 내로 도입하여 헤레굴린 활성을 변형시킬 수 있다. 기타 EGF족 서열과 상당히 상동성인 영역 내의 헤레굴린으로부터의 결실은 헤레굴린의 생물학적 활성을 보다 더 많이 변형시킬 것이다. 연속되는 결실물의 수는 이와 같이 영향을 받은 영역 내의 헤레굴린의 4차원 구조, 예를 들면, 시스테인 가교결합, 베타-주름진 판 또는 알파 나선을 보존하도록 선택될 것이다.

아미노산 서열 삽입물에는 길이가 1개 잔기에서부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 범위의 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물이 포함된다. 서열내 삽입물 (즉, 헤레굴린 서열 내의 삽입물)은 일반적으로 약 1 내지 10개 잔기, 보다 바람직하게는 1 내지 5개 잔기, 가장 바람직하게는 1 내지 3개 잔기의 범위일 수 있다. 말단 삽입물에 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 헤레굴린 (헤레굴린을 세균성 재조합 세포 배양물에서 직접적으로 발현시킨 인공산물), 및 성숙한 헤레굴린이 재조합 숙주 세포로부터 분비되는 것을 촉진시키기 위해 헤레굴린의 N-말단에 이종 N-말단 시그날 서열을 융합시킨 것이 포함된다. 이러한 시그날 서열은 일반적으로 의도하는 숙주 세포 종으로부터 수득된 형태이므로, 의도하는 숙주 세포 종과 상동성일 것이다. 적합한 서열에는 이. 콜라이용의 STII, tPA 또는 lpp, 효모용의 알파 인자, 및 포유류 세포용의 바이러스성 시그날 (예: herpes gD)이 포함된다.

헤레굴린의 기타 삽입 변이체에는, 면역원성 폴리펩티드, 예를 들면, 세균성 폴리펩티드, 예를 들면, 베타-락타마제 또는 이. 콜라이 trp 유전자좌에 의해 코딩된 효소, 또는 효모 단백질, 소의 혈청 알부민 및 화학주성 폴리펩티드와 헤레굴린의 N- 또는 C-말단과의 융합물이 포함된다. WO 89/02922 (1989. 4. 6자 공개)에 기재된 바와 같이, 반감기가 긴 단백질, 예를 들면, 면역글로불린 불변 영역 (또는 기타 면역글루불린 영역), 알부민 또는 페리틴과 헤레굴린-ECD의 C-말단 융합물이 고려된다.

또 다른 그룹의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 헤레굴린 분자 내의 하나 이상의 잔기가 제거되고 그 대신에 상이한 잔기가 삽입되어 있는 것이다. 치환 돌연변이 유발에 가장 관심있는 부위로는 헤레굴린의 활성 부위(들)로서 동정된 부위, 및 각종 종으로부터의 헤레굴린 리간드에서 발견된 아미노산이 측쇄 벌크, 전하 및(또는) 소수성 측면에서 상당히 상이한 부위가 있다. 성장 인자로서의 생물학적 활성을 지니고 있는 HRG-GFD의 가능한 아영역은, 특히 EGF 활 성을 지니는 것으로 밝혀진 EGF 아서열과의 유사성을 기준으로 하여 대략 글리신 218에서부터 발린 226까지의 서열 (HRG-α) 및 글리신 218에서부터 라이신 228/세린 228까지의 서열 (HRG-β) 내에서의 C-말단 세그먼트이다.

관심있는 기타 부위는 각종 종으로부터 수득된 헤레굴린-유사 리간드의 특정한 잔기가 동일한 부위이다. 이들 위치는 헤레굴린의 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 이들 부위, 특히 3개 이상의 기타 동일하게 보존된 부위의 서열 내에 속하는 부위가 비교적 보존적인 방식으로 치환된다. 이러한 보존적 치환물은 "바람직한 치환물"이란 표제로 다음 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 치환물 예로 명시되거나 아미노산 부류를 참조로 하여 다음에 추가로 기재되는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되어, 생성물을 스크리닝하였다.

본래 잔기	치환물 예	바람직한 치환물
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro	pro
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르루이신	leu
Leu (L)	노르루이신; ile;val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala	leu
Pro (P)	gly	gly
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르루이신	leu

헤레굴린의 기능 또는 면역학적 정체에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드의 주쇄의 구조, 예를 들면, 박판 또는 나선형 입체 배좌로서의 구조를 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 해당 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과을 실질적으로 상이하게 만드는 치환을 선별함으로써 수행된다. 천연 잔기는 공통의 측쇄 성질을 기준으로 하여 다음 그룹으로 나눈다:

1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

3) 산성: asp, glu;

4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 한 구성원을 또 다른 구성원으로 교환시킬 것이다. 이와 같이 치환된 잔기는 다른 수용체 리간드와 상동성인 헤레굴린의 영역, 또는 보다 바람직하게는 해당 분자의 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서는, 분자 내에 존재하는 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 불활성화시키는 것이 바람직하다. 이들 부위는 코딩된 아미노산 서열을 검사함으로써 동정된다. 프로테아제 절단 부위가 동정되는 경우에는, 표적화 잔기를 또 다른 잔기, 바람직하게는 글루타민과 같은 염기성 잔기 또는 세린과 같은 친수 성 잔기로 치환시키거나; 이 잔기를 결실시키거나; 또는 상기 잔기 바로 다음에 프롤릴 잔기를 삽입함으로써, 상기 프로테아제 절단 부위가 단백질 분해적 절단에 대해 불활성이 되도록 한다.

또 다른 양태에서는, 시그날 서열의 출발 메티오닐 잔기 이외의 모든 메티오닐 잔기, 또는 이러한 각각의 메티오닐 잔기에 대해 N- 또는 C-말단인 약 3개의 잔기 내에 위치한 모든 잔기를 또 다른 잔기 (바람직하게는, 표 1에 따름)로 치환시키거나 결실시킨다. 또 다른 한편, 약 1 내지 3개의 잔기를 상기 부위에 인접하게 삽입한다.

헤레굴린의 적당한 입체 배좌를 유지시키는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 또한, 일반적으로 세린으로 치환시켜 해당 분자의 산화적 안정성을 증진시키고 이상한 가교결합을 막을 수 있다.

치환, 결실 또는 삽입에 특히 적합하거나, 또는 단편으로서 사용하기에 특히 적합한 부위에는, 도 1a 내지 1d의 HRG-α의 N-말단으로부터 번호가 매겨진, 다음 부위가 포함된다:

1) 42-43, 64-65, 151-152의 세린-글리신 디펩티드에서 가능한 글리코스아미노글리칸 첨가 부위;

2) 164, 170, 208 및 437번 위치, 및 부위 (NDS) 164-166, (NIT) 170-172, (NTS) 208-210, 및 NTS (609-611)에서 가능한 아스파라긴-연결된 글리코실화 부위;

3) 209-218의 세린과 트레오닌 집단에서의 가능한 O-글리코실화 부위;

4) 226, 234, 240, 254, 256 및 265에서의 시스테인 부위;

5) 287-309에서의 막횡단 도메인;

6) 시스테인 226 및 240의 루프 1;

7) 시스테인 234 및 254의 루프 2;

8) 시스테인 256 및 265의 루프 3; 및

9) 2-3, 8-9, 23-24, 33-34, 36-37, 45-46, 48-49, 62-63, 66-67, 86-87, 110-111, 123-124, 134-135, 142-143, 272-273, 278-279 및 285-286에서의 가능한 프로테아제 프로세싱 부위.

HRG-β1 내의 유사한 영역은 이의 서열을 참조함으로써 결정할 수 있다. 이러한 유사한 HRG-β1 아미노산은 HRG-α에 대해 상기 논의된 바와 같이 돌연변이시키거나 변형시킬 수 있다. HRG-β2 내의 유사한 영역은 또한, 이의 서열을 참조함으로써 결정할 수 있다. 이러한 유사한 HRG-β2 아미노산은 HRG-α또는 HRG-β1에 대해 상기 논의된 바와 같이 돌연변이시키거나 변형시킬 수 있다. HRG-β3 내의 유사한 영역은 또한, 이의 서열을 참조함으로써 결정할 수 있다. 추가로, 이러한 유사한 HRG-β3 아미노산은 HRG-α, HRG-β1 또는 HRG-β2에 대해 상기 논의된 바와 같이 돌연변이시키거나 변형시킬 수 있다.

또 다른 헤레굴린 변이체는 감마-헤레굴린이다. γ-HRG는 서열 11을 갖는 본래의 서열 γ-HRG의 한 가지 이상의 생물학적 특성을 보유하고 있는 모든 폴리펩티드 서열이다. 이 변이체의 생물학적 특성은 상기 언급된 헤레굴린에 대한 것과 동일하다. 이 변이체는 본래의 γ-HRG 공급원, 예를 들면, 사람 MDA-MB-175 세포 또는 또 다른 공급원, 예를 들면, 또 다른 동물 종으로부터 분리된 폴리펩티드 뿐만 아니라 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 폴리펩티드를 포괄한다. 작용성 유도체, 대립 유전자성 변이체, 천연 이소형 및 이의 동족체를 포함한 변이체 형태가 또한 이에 포함된다. 종종, γ-HRG은 "본래의 γ-HRG"인데, 이는 포유동물로부터 분리시킨 내인성 γ-HRG 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 γ-HRG는 또한, 본래의 γ-HRG (예를 들면, 도 7a 내지 7c에 도시된 사람 γ-HRG)와 동일한 아미노산 서열을 지니고 있는 한은, "본래의 서열 γ-HRG"일 수 있다. 이러한 본래 서열의 아미노산 서열 변이체는, 적당한 뉴클레오티드 변화를 본래의 서열 DNA 내로 도입하거나, 또는 목적하는 폴리펩티드를 시험관내에서 합성함으로써 제조한다. 이러한 변이체에는, 예를 들면, 기타 헤레굴린에 대해 일반적으로 앞서 언급된 바와 같이, 도 7a 내지 7c에서 사람 단백질에 대해 제시된 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실물, 이의 삽입물 또는 치환물이 포함된다. 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 최종 작제물의 제조에 이용되는데, 단 이러한 최종 작제물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 이러한 아미노산 변화는 또한, O-연결된 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 본래 서열의 번역 후 프로세스를 변화시킬 수 있다.

부가의 변이체에는, 다음 중에서 선택된, 645-아미노산 본래 사람 헤레굴린-β1의 잔기에 상응하는 선택된 잔기에서 아미노산 치환물을 지니고 있는 폴리펩티드가 포함된다:

S177, H178, L179, V180, K181, E184, E186,

K187, T188, V191, N192, G193, G194, E195,

M198, V199, K200, D201, N204, P205, S206,

R207, Y208, L209, K211, P213, N214, E215,

T217, G218, D219, Q222, N223, Y224, S228 및 F229.

이러한 양태의 변이체에서는, 아미노산 치환이, 선택된 잔기를 선택된 잔기에 상응하는 표피 성장 인자 (EGF) 잔기로 대체시키는 것이 아니다.

기타 헤레굴린-β1 변이체에는 다음 중에서 선택된 아미노산 치환이 포함된다:

S177W; H178S, E, R 또는 A; V180Q, I 또는 E;

K181P 또는 A; A183G; E184V, W, K, R, G 또는 N;

K185E, S, Q 또는 G; E186R; K187E 또는 A; T188Q;

E195Q; F197Y; M198R 또는 K; K200R; D201T 또는 I;

P205T 또는 Y; S206K, H, G, P 또는 R; R207Y;

Y208R 또는 L; L209M 또는 G; K211R; P213S, T, N 또는 K;

N214L, K, S 또는 E; F216M; N223H 또는 W; 및 M226I.

이러한 양태의 변이체에서는, 헤레굴린 변이체에, 상기 그룹 중에서 선택된 아미노산 치환체 세트가 포함된다.

본원에 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것 이외에도, 당해 헤레굴린 변이체는 하나 이상의 기타 변형, 예를 들면, 아미노산 치환, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 화학적 변형을 지닐 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 특정 단편인 헤레굴린 변이체를 제공한다. 이러한 양태의 변이에서는, 상기 단편이 대략 잔기 175에서부터 대략 잔기 230까지 연장되는 사람 헤레굴린-β1의 일정 부분 (즉, EGF-유사 도메인)에 상응하는 잔기를 포함한다. 예를 들면, 이 단편은 잔기 177에서부터 잔기 244로 연장될 수 있고 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다 (rHRGβ1-177-244).

헤레굴린의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 DNA는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법으로는, 천연 공급원으로부터 단리시키는 방법 (천연의 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 이전에 제조된 헤레굴린의 변이체 또는 헤레굴린의 비-변이체형을 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 위치 지정된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카셋트 돌연변이 유발시킴으로써 제조하는 방법이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 기술은 헤레굴린 핵산 (DNA 또는 RNA), 또는 헤레굴린 핵산에 상보적인 핵산을 활용할 수 있다.

올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이 유발이 헤레굴린 DNA의 치환, 결실 및 삽입 변이체를 제조하는데 바람직한 방법이다. 이 기술은 문헌 [참조: Adelman et al., DNA, 2: 183 (1983)]에 기재된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 간략하게 언급하면, 헤레굴린 DNA는, 목적하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 DNA 주형 (여기서, 이러한 주형은 변형되지 않거나 천연 헤레굴린의 DNA 서열을 함유하는, 단일 가닥 형태의 플라스미드 또는 박테리오파아지임)과 혼성화시킴으로써 변형시킨다. 혼성화 후, DNA 폴리머라제를 사용하여 상기 주형의 완전한 제2의 상보 가닥을 합성하는데, 이에 올리고뉴클레오티드 프라이머가 혼입되고 이는 헤레굴린 DNA 중에서 선택된 변화를 코딩할 것이다.

일반적으로, 길이가 25개 이상의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 최적의 올리고뉴클레오티드는 해당 돌연변이를 코딩하는 뉴클레오티드(들)의 어느 한쪽에서 상기 주형에 완전하게 상보적인 12 내지 15개 뉴클레오티드를 가질 것이다. 이로써, 상기 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 DNA 주형 분자와 적절하게 혼성화될 것임이 보장된다. 이 올리고뉴클레오티드는 문헌 [참조: Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 5765, 1978]에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 용이하게 합성한다.

단일 가닥 DNA 주형은 또한, 표준 기술을 사용하여 이중 가닥 플라스미드 (또는 기타) DNA를 변성시킴으로써 생성시킬 수도 있다.

(예를 들어, 아미노산 서열 변이체를 생성시키기 위하여) 본래의 DNA 서열을 변형시키는 경우에는, 상기 올리고뉴클레오티드를 적합한 혼성화 조건 하에서 단일 가닥 주형과 혼성화시킨다. 이어서, DNA 중합 효소, 통상적으로 DNA폴리머라제 I의 클레노우 단편을 가하여, 합성용 프라이머로서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 주형의 상보 가닥을 합성한다. 따라서, DNA의 한 가닥이 돌연변이된 형태의 헤레굴린을 코딩하고 다른 가닥 (본래 주형)이 본래의 변형되지 않은 서열의 헤레굴린을 코딩하는 이형-이중체 분자가 형성된다. 이어서, 이러한 이형-이중체 분자를 적합한 숙주 세포, 통상적으로는 이. 콜라이 JM101과 같은 원핵생물 내로 형질전환시킨다. 이 세포를 성장시킨 후, 아가로즈 평판 위에 플레이팅하고, ³²P-포스 페이트로 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 스크리닝하여, 돌연변이된 DNA를 함유하는 세균성 콜로니를 동정한다. 이어서, 돌연변이된 영역을 잘라내어 단백질 생성에 적당한 벡터, 일반적으로 적당한 숙주의 형질전환을 위해 통상적으로 이용되는 유형의 발현 벡터에 놓아둔다.

이러한 방법은, 플라스미드의 양 가닥이 돌연변이(들)를 함유하는 동형-이중체 분자가 생성되도록 변형시킬 수 있다. 이 변형은 다음과 같다: 단일쇄 올리고뉴클레오티드를 상기 언급된 바와 같은 단일 가닥의 주형에 어닐링시킨다. 3개의 데옥시리보뉴클레오티드, 즉 데옥시리보아데노신 (dATP), 데옥시리보구아노신 (dGTP) 및 데옥시리보티미딘 (dTTP)의 혼합물을 dCTP- (aS) (공급처: Amersham Corporation)로 지칭되는 변형된 티오-데옥시리보시토신과 합한다. 이 혼합물을 주형-올리고뉴클레오티드 복합체에 가한다. DNA 폴리머라제를 상기 혼합물에 가하면, 돌연변이된 염기를 제외하고는 상기 주형과 동일한 DNA의 가닥이 생성된다. 또한, 이러한 새로운 DNA 가닥은 dCTP 대신 dCTP-(aS)를 함유할 것이며, 이는 제한 엔도뉴클레아제 분해로부터 보호한다. 이중 가닥의 이형-이중체의 주형 가닥을 적당한 제한 효소로 니킹한 후, 이 주형 가닥을, 돌연변이될 부위(들)를 함유하는 영역을 통과하여 ExoIII 뉴클레아제 또는 또 다른 적당한 뉴클레아제로 분해시킬 수 있다. 이어서, 상기 반응을 중지시켜, 단지 부분적으로 단일 가닥인 분자를 남겨 둔다. 이어서, 4개의 모든 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP 및 DNA 리가제의 존재하에서 DNA 폴리머라제를 사용하여, 완전한 이중 가닥의 DNA 동형-이중체를 형성시킨다. 이어서, 이러한 동형-이중체 분자를 상기 언급된 바와 같이, 이. 콜라이 JM101 등의 적합한 숙주 세포 내로 형질전환시킬 수 있다.

하나 이상의 아미노산이 치환될 헤레굴린 변이체를 코딩하는 DNA는 여러 가지 방법 중의 한 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 이 아미노산이 폴리펩티드 쇄 내에서 함께 근접하게 위치한 경우, 이들은 목적하는 아미노산 치환을 모두 코딩하는 하나의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 동시에 돌연변이시킬 수 있다. 그러나, 이러한 아미노산이 서로 일정한 거리를 두고 위치한 경우에는 (대략 10개 이상의 아미노산 간격으로 떨어져 있음), 목적하는 변화를 모두 코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드를 생성시키는 것이 보다 어렵다. 대신, 두 가지 대체 방법 중의 한 방법을 이용할 수 있다.

첫 번째 방법에서는, 치환될 각 아미노산에 대해 별개의 올리고뉴클레오티드를 생성시킨다. 이어서, 상기 올리고뉴클레오티드를 단일 가닥 주형 DNA에 동시에 어닐링시키면, 상기 주형으로부터 합성되는 DNA의 두 번째 가닥은 목적하는 아미노산 치환 모두를 코딩할 것이다.

또 다른 방법은 목적하는 돌연변이체를 생성하기 위해 돌연변이 유발을 2라운드 이상 수행하는 것을 포함한다. 제1 라운드는 단일 돌연변이체에 대해 기재된 바와 같은데; 야생형 DNA를 주형에 사용하고, 첫 번째 목적하는 아미노산 치환(들)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 상기 주형에 어닐링시킨 다음, 이형-이중체 DNA 분자를 생성시킨다. 돌연변이 유발의 제2 라운드는 제1 라운드에서 생성된 돌연변이된 DNA를 주형으로서 이용한다. 따라서, 이 주형은 이미 하나 이상의 돌연변이를 함유하고 있다. 이어서, 부가의 목적하는 아미노산 치환(들)을 코딩하는 올리 고뉴클레오티드를 상기 주형에 어닐링시키면, 이로써 생성된 DNA 가닥은 돌연변이 유발의 제1 라운드와 제2 라운드 모두로부터의 돌연변이를 코딩한다. 이와 같이 생성된 DNA는 돌연변이 유발의 제3 라운드에서 주형으로서 사용할 수 있으며, 같은 방식으로 계속될 수 있다.

헤레굴린의 아미노산 변이체를 제조하는데 PCR 돌연변이 유발이 또한 적합하다. 다음 논의가 DNA를 지칭하긴 하지만, RNA에도 적용되는 기술이라는 것을 인지해야 한다. PCR 기술은 일반적으로, 다음 과정을 지칭한다 [Erlich, 상기 참조, the chapter by R. Higuchi, p.61-70]. 소량의 주형 DNA가 PCR에서 출발 물질로서 사용된 경우, 주형 DNA 중의 상응하는 영역과 서열상 약간 상이한 프라이머를 사용하여, 이러한 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 특정 DNA 단편을 비교적 다량으로 생성시킬 수 있다. 플라스미드 DNA 내로 돌연변이를 도입하기 위해서는, 이들 프라이머 중의 하나를, 상기 돌연변이의 위치를 중첩시켜 이 돌연변이를 함유하도록 고안시키는데; 이때 다른 프라이머의 서열은 플라스미드의 반대편 가닥의 서열 연장물과 동일해야만 하지만, 이 서열은 플라스미드 DNA를 따라 어느 곳에 위치할 수도 있다. 그러나, 제2 프라이머의 서열은 제1 프라이머의 서열로부터 200개 뉴클레오티드 내에 위치하여, 상기 프라이머들에 의해 결합된 DNA의 전체 증폭 영역이 상기 말단 내에서 용이하게 서열 분석될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭시키면, 상기 프라이머에 의해 특정화된 돌연변이 위치 및 가능하게는 다른 위치 (이는 주형 복사가 다소 오차를 나타내기 쉽기 때문이다)에서 상이한 DNA 단편 집단이 생성된다.

주형 대 생성물 물질의 비율이 극도로 낮은 경우, 대부분의 생성물 DNA 단편에는 목적하는 돌연변이가 혼입된다. 이 생성물 물질을 사용하여, 표준 DNA 기술을 이용하여 PCR 주형으로서 작용된 플라스미드 내의 상응하는 영역을 대체시킨다. 돌연변이체 제2의 프라이머를 사용하거나 또는 상이한 돌연변이체 프라이머들로 제2의 PCR을 수행하고 이로써 생성된 두 PCR 단편을 3가지 (또는 그 이상)-쌍 연결로 벡터 단편에 동시에 연결시킴으로써, 별도 위치에서의 돌연변이를 동시에 도입할 수 있다.

PCR 돌연변이 유발의 구체적인 예에서는, 주형 플라스미드 DNA (1㎎)를, 증폭될 영역외의 플라스미드 DNA에 독특한 인식 부위를 갖고 있는 제한 엔도뉴클레아제로 분해함으로써 선형화시킨다. 이 물질 중의 100 ng을, 4개의 데옥시뉴클레오티드 트리-포스페이트를 함유하고 GENEAMP 키트 (공급처: Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA)에 포함되는, PCR 완충제 함유 PCR 혼합물, 및 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 25 pmole에 최종 용적이 50 ㎖가 되도록 가한다. 이 반응 혼합물에 35 ㎖ 광유를 바른다. 이 반응물을 100 ℃에서 5분 동안 변성시키고, 얼음 위에 잠시 놓아둔 다음, 1 ㎖ 더머스 아쿠아티커스 (Thermus aquaticus; Taq) DNA 폴리머라제 (5 단위/㎖; 공급처: Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA)를 광유 층 아래에 가한다. 이어서, 상기 반응 혼합물을 다음과 같이 프로그램된 DNA 열 순환기 (공급처: Perkin-Elmer Cetus)에 삽입한다:

2분, 55 ℃,

30초, 72 ℃, 이어서 다음 주기를 19회 반복한다:

30초, 94 ℃,

30초, 55 ℃ 및

30초, 72 ℃.

이 프로그램이 끝날 무렵, 반응용 바이알을 상기 열 순환기로부터 꺼내고, 수성 상을 새로운 바이알로 옮기며, 이를 페놀/클로로포름 (50:50:vol)로 추출한 다음, 에탄올 침전시켰으며, 표준 과정으로 DNA를 회수하였다. 후속적으로, 상기 물질을 벡터 내로 삽입시키기에 적당하게 처리한다.

변이체를 제조하는 또 다른 방법인 카셋트 돌연변이 유발은 문헌 [참조: Wells et al., Gene, 34:315, 1985]에 기재된 기술에 근거한 것이다. 출발 물질은 돌연변이시키고자 하는 헤레굴린 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 기타 벡터)이다. 돌연변이될 헤레굴린 DNA 내의 코돈(들)을 동정한다. 이와 같이 동정된 돌연변이 부위(들)의 각 측면 상에는 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 존재해야만 한다. 이러한 제한 부위가 존재하지 않을 경우, 상기 언급된 올리고뉴클레오티드-매개된 돌연변이 유발법을 사용하여 이들 부위를 생성시켜, 이들을 헤레굴린 DNA 내의 적당한 위치에 도입시킬 수 있다. 제한 부위를 플라스미드 내로 도입시킨 후, 이 플라스미드를 이들 부위에서 절단하여 이를 선형화시킨다. 제한 부위들 간의 DNA 서열을 코딩하지만 목적하는 돌연변이(들)를 함유하는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 표준 과정으로 합성한다. 두 가닥을 별도로 합성한 다음, 표준 기술을 사용하여 함께 혼성화시킨다. 이러한 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 카셋트로 지칭한다. 이 카셋트는 상기와 같이 선형화된 플라스미드의 말단과 부합되 는 3' 말단 및 5' 말단을 지니도록 고안되므로, 이를 플라스미드에 직접적으로 연결시킬 수 있다. 이 플라스미드는 본원에서, 돌연변이된 헤레굴린 DNA 서열을 함유하고 있다.

C. 클로닝 비히클 내로의 DNA의 삽입

본래의 또는 변이체 헤레굴린을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 DNA를, 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 추가의 발현을 위해 복제 가능한 벡터 내로 삽입한다. 많은 벡터가 이용 가능하며, 적당한 벡터의 선택은 1) 이것이 DNA 증폭 또는 DNA 발현에 사용될 수 있는지 여부, 2) 벡터 내로 삽입될 DNA의 크기, 및 3) 이 벡터로 형질전환될 숙주 세포에 좌우될 것이다. 각 벡터는 이의 기능 (DNA의 증폭 또는 DNA의 발현) 및 이와 상용 가능한 숙주 세포에 따라서 각종 성분을 함유한다. 이러한 벡터 성분에는, 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다: 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마아커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열.

(i) 시그날 서열 성분

일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 한 성분이거나, 벡터 내로 삽입되는 헤레굴린 DNA의 일부일 수 있다. 천연 헤레굴린 DNA는, HER2/HER3 수용체와 결합되는 성숙한 헤레굴린 폴리펩티드 리간드를 형성하기 위해 폴리펩티드의 번역 후 프로세싱 동안에 절단되는 폴리펩티드의 아미노 말단 (헤레굴린을 코딩하는 DNA의 5' 말단)에 시그날 서열을 코딩하는 것으로 생각되나, 통상적인 시그날 구조는 명백하지 않다. 본래의 헤레굴린은 세포로부터 분비되지만, 폴리펩티드의 카르복실 말단 영 역 내에 세포질성 영역과 막횡단 도메인을 함유하기 때문에 막 내에 수용된 채로 있다. 따라서, 헤레굴린의 분비된 가용형에서는, 막횡단 도메인을 포함한, 분자의 카르복실 말단 영역이 통상적으로 결실된다. 이와 같이 절단된 변이체 헤레굴린 폴리펩티드가 세포로부터 분비될 수 있는데, 단 이러한 절단형 변이체를 코딩하는 DNA는 숙주에 의해 인식되는 시그날 서열을 코딩한다.

본 발명의 헤레굴린은 직접적으로 발현될 수 있을 뿐만 아니라 이종 폴리펩티드, 바람직하게는 시그날 서열, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N- 및(또는) C-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합물로서 발현될 수 있다. 일반적으로, 시그날 서열은 벡터의 한 성분이거나, 벡터 내로 삽입되는 헤레굴린 DNA의 일부일 수 있다. 본래의 시그날 서열이 결실되어 있고 이것이 이종 시그날 서열로 대체된 헤레굴린이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이와 같이 선택된 이종 시그날 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는, 즉 시그날 펩티다제에 의해 절단되는 것이여야 한다. 본래의 헤레굴린 시그날 서열을 인식하지 않고 이를 프로세싱하지 않는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 시그날 서열을, 예를 들면, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정한 장독소 II 리더의 그룹 중에서 선택된 원핵성 시그날 서열로 치환시킨다. 효모 분비를 위해서는, 본래의 헤레굴린 시그날 서열을 효모 인버타제, 알파 인자, 또는 산 포스파타제 리더로 치환시킬 수 있다. 포유류 세포 발현에서는, 본래의 시그날 서열이 만족스럽긴 하지만, 기타 포유류 시그날 서열도 적합할 수 있다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 벡터와 클로닝 벡터 모두는 일반적으로 하나 이상의 선택된 숙주 세포 내에서 벡터가 복제할 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유하고 있다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는, 상기 서열은 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 벡터가 복제할 수 있게 하는 것이고, 이에는 복제 기점 또는 자율 복제 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 세균용으로 적합하고, 2m 플라스미드 기점은 효모용으로 적합하며, 각종 바이러스 기원물 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)이 포유류 세포에서 클로닝 벡터용으로 적합하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터에는 필요하지 않다 (SV40은 단지 이것이 초기 프로모터를 함유하기 때문에 전형적으로 사용될 수 있다).

대부분의 발현 벡터는 "셔틀 (shuttle)" 벡터인데, 즉 이들은 한 가지 이상 종류의 생물체에서 복제할 수 있지만 발현을 위해 또 다른 생물체 내로 형질감염시 킬 수 있다. 예를 들면, 한 벡터를 이. 콜라이에서 클론닝한 후, 동일한 벡터가 숙주 세포 염색체와 무관하게 복제할 수 없는 경우라 할지라도 이 벡터를 발현을 위해 효모 또는 포유류 세포 내로 형질전환시킨다.

DNA는 또한, 숙주 게놈 내로 삽입시킴으로써 증폭시킬 수 있다. 이는, 예를 들면, 바실러스 (Bacillus) 게놈 DNA에서 발견되는 서열에 상보적인 DNA 서열을 벡터 내에 혼입시킴으로써, 숙주로서 바실러스 종을 사용하여 용이하게 수행한다. 이러한 벡터로 바실러스를 형질감염시키면, 상기 게놈과 상동성 재조합이 이루어지고 헤레굴린 DNA가 삽입된다. 그러나, 헤레굴린을 코딩하는 게놈 DNA를 회수하는 것이, 외생적으로 복제된 벡터의 회수보다 더 복잡한데, 이는 헤레굴린 DNA를 절개하기 위해서는 제한 효소 분해가 필요하기 때문이다. DNA를 PCR에 의해 직접적으로 증폭시키거나 어떠한 복제 성분을 사용하지 않고 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있다.

(iii) 선별 유전자 성분

발현 및 클로닝 벡터는 또한 선별 가능한 마아커로 명명되는 선별 유전자를 함유해야 한다. 이 유전자는 선택적인 배양 배지에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 이러한 선별 유전자를 코딩하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들면, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여해주거나, (b) 생장요구성 결핍을 보충해주거나, 또는 (c) 복합 배지로부터는 입수 가능하지 않은 중요한 영양소를 제공해주는 단백질를 코딩한다 (예를 들면, 바실러스에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자).

선별 방법의 한 예는 숙주 세포의 성장을 억제하는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환되는 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 발현하므로, 선별 방법에서 생존한다. 이러한 우성적 선별의 예들은 약물 네오마이신 [참조: Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:327, 1982], 마이코페놀산 [참조: Mulligan et al., Science 209:1422, 1980] 또는 하이그로마이신 [참조: Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413, 1985]을 이용하고 있다. 앞서 제공 된 3가지 예는 진핵 조절하에 세균성 유전자를 이용하여 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt (마이코페놀산) 또는 하이그로마이신 각각에 대해 내성을 지닌다.

포유류 세포용으로 적합한 선별성 마아커의 또 다른 예는 헤레굴린 핵산을 채택하는데 적격한 세포의 동정을 가능케 해주는 것인데, 예를 들면, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHRF) 또는 티미딘 키나제이다. 이러한 포유류 세포 형질전환체는, 이러한 형질전환체 만이 상기 마아커를 채택함으로써 생존하도록 독특하게 적응시킨 선별 압력 하에 놓아둔다. 배지 중의 선별제의 농도가 연속적으로 변화함으로써 선별 유전자와 헤레굴린을 코딩하는 DNA 모두의 증폭을 유도해주는 조건하에서 상기 형질전환체를 배양함으로써 상기 선별 압력을 부하한다. 증폭은, 성장에 결정적인 단백질 생산에 훨씬 더 많이 요구되는 유전자가, 재조합 세포의 다음 세대들의 염색체 내에 종렬식으로 반복되는 과정이다. 이와 같이 증폭된 DNA로부터, 증가된 양의 헤레굴린을 합성한다.

예를 들면, DHRF 선별 유전자로 형질전환시킨 세포는 먼저, DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 상기 형질전환체 모두를 배양함으로써 동정한다. 야생형 DHFR이 이용되는 경우에 적당한 숙주 세포는 문헌 [참조: Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된, DHFR 활성이 결핍된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다. 이어서, 상기와 같이 형질전환된 세포를 증가된 수준의 메토트렉세이트에 노출시킨다. 이로써, DHRF 유전자의 다중 복사물이 합성되고, 이와 동시에, 발현 벡 터를 포함하는 기타 DNA, 예를 들면, 헤레굴린을 코딩하는 DNA의 다중 복사물이 합성된다. 이러한 증폭 기술은, 예를 들어, Mtx에 고도로 내성인 돌연변이체 DHFR 유전자가 이용되는 경우에 내인성 DHFR의 존재에도 불구하고, 기타 적합한 모든 숙주, 예를 들면, ATCC No. CCL61 CHO-K1과 함께 사용될 수 있다 (EP 117,060). 또 다른 한편, 헤레굴린, 야생형 DHFR 단백질 및 또 다른 선별성 마아커 (예를 들면, 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 (APH))를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환시키거나 공동-형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는, 아미노글리코시드성 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신 또는 G418와 같은 선별성 마아커용 선별제를 함유하는 배지에서 세포 성장시킴으로써 선별할 수 있다 (미국 특허 제4,965,199호 참조).

효모에서 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp 1 유전자이다 [참조: Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, 1979; Kingsman et al., Gene, 7: 141, 1979; or Tschemper et al., Gene, 10: 157, 1980]. 이러한 trp 1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 돌연변이체 효모 균주, 예를 들면, ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 [참조: Jones, Genetics, 85:12, 1977]에 대한 선별성 마아커를 제공해준다. 이때, 효모 숙주 세포 게놈 내에 trp 1 병변이 존재하는 것은, 트립토판 부재하에서의 성장에 의한 형질전환을 탐지하는데 효과적인 환경을 제공해준다. 유사하게, Leu 2-결핍성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu 2 유전자를 보유하고 있는 공지된 플라스미드로써 보충된다.

(iv) 프로모터 성분

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 헤레굴린 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 함유한다. 프로모터는, 특정한 핵산 서열, 예를 들면, 이들이 작동가능하게 연결되어 있는 헤레굴린의 전사 및 번역을 조절시키는 구조 유전자 (일반적으로 약 100 내지 1000bp 내임)의 개시 코돈에 대해 상단 (5')에 위치한 번역되지 않은 서열이다. 이러한 프로모터는 전형적으로, 두 부류, 즉 유도성 프로모터와 구성성 프로모터에 속한다. 유도성 프로모터는 배양 조건 하에서의 몇몇 변화, 예를 들면, 특정 영양소의 존재 또는 부재 여부 또는 온도 변화에 반응하여 이들을 조절하면서, DNA로부터의 증가 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다. 지금, 각종의 가능성 있는 숙주 세포에 의해 인식된 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 이들 프로모터는 해당 프로모터를 제한 효소 분해하여 공급원 DNA로부터 제거한 다음 이와 같이 분리된 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입시킴으로써, 헤레굴린을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결시킨다. 본래의 헤레굴린 프로모터 서열과 많은 이종 프로모터 모두를 사용하여 헤레굴린 DNA의 증폭 및(또는) 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터가 바람직한데, 이는 이들이 일반적으로, 본래의 헤레굴린 프로모터와 비교해서 헤레굴린을 보다 더 많이 전사하고 발현시킬 수 있게 해주기 때문이다.

원핵성 숙주와 사용하기에 적합한 프로모터에는 b-락타마제 및 락토즈 프로모터 시스템 [참조: Chang et al., Nature, 275: 615, 1978; and Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979], 트립토판 (trp) 프로모터 시스템인 알칼리 포스파타제 [참조: Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057, 1980 and EP 36,776], tPA (U.S. 5,641,655) 및 하이브리드 프로모터, 예를 들면, tac 프로모터 [참조: deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983]가 포함된다. 그러나, 공지된 기타 세균성 프로모터도 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열이 정립됨에 따라, 숙련인들은, 목적하는 어떠한 제한 부위도 제공해주는 링커 또는 어댑터를 사용하여 이들을 헤레굴린 코딩 DNA에 작동가능하게 연결시켜 줄 수 있다 [참조: Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980]. 세균성 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 일반적으로, 헤레굴린 코딩 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 함유할 것이다.

효모 숙주와 사용하기에 적합한 프로모팅 서열에는 3-포스포글리세레이트 키나제 [참조: Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980] 또는 기타 당분해 효소 [참조: Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg 7: 149, 1968; and Holland, Biochemistry 17:4900, 1978], 예를 들면, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.

성장 조건에 의해 조절되는, 부가의 전사 이점을 지니고 있는 유도성 프로모터인 기타 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연계된 분해성 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토즈 및 갈락토즈 활용에 관여하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 문헌 [참조: Hitzeman et al., EP 73,657A]에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서가 또한, 효모 프로모터와 유리하게 사용된다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실제적으로 모든 진핵성 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상단에 위치한 AT-풍부 영역을 지니고 있다. 많은 유전자의 전사 출발 부위로부터 70 내지 80개 염기 상단에 발견된 또 다른 서열은 CXCAAT 영역 (여기서, X는 모든 뉴클레오티드일 수 있다)이다. 대부분의 진핵성 유전자의 3' 말단에는 AATAAA 서열이 있는데, 이는 폴리 A 테일을 코딩 서열의 3' 말단에 첨가하기 위한 시그날일 수 있다. 이들 서열 모두는 포유류 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

포유류 숙주 세포 중의 벡터로부터의 헤레굴린 유전자 전사는, 폴리오마 바이러스, 전염성 상피종 바이러스 [UK 2,211,504 (1989. 7. 5.자 공개)], 아데노바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스 2), 소의 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터; 이종 포유류 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터; 열-쇽 프로모터; 및 헤레굴린 서열과 정상적으로 연합된 프로모터에 의해 조절될 수 있지만, 단 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 상용가능해야 한다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스성 복제 기점을 함유하기도 하는 SV40 제한 단편으로서 용이하게 수득된다 [참조: Fiers et la., Nature, 273:113 (1978); Mulligan and Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Palakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)]. 사람 사이토메갈로바이러스의 즉시형 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다 [참조: Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)]. 벡터로서 소의 유두종 바이러스를 사용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 기재되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 면역 인터페론을 코딩하는 cDNA를 몽키 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982)]을 참조하고; 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 사람 b-인터페론 cDNA를 마우스 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)]을 참조하며; 사람 인터페론 b1 유전자를 배양된 마우스 및 토끼 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982)을 참조하고; 프로모터로서 라우스 육종 바이러스 장 말단 반복체를 사용하여 세균성 CAT 서열을 CV-1 몽키 신장 세포, 치킨 배아 섬유아세포, 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포 및 마우스 NIH-3T3 세포에서 발현시키는 것에 관해서는 문헌 [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)]을 참조한다.

(v) 인핸서 요소 성분

보다 고등 진핵생물에 의해 본 발명의 헤레굴린을 코딩하는 DNA를 전사하는 것은 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 이의 전사 를 증가시키기 위해 프로모터 상에서 작용되는, 통상 약 10 내지 300bp의 DNA의 시스-작용성 요소이다. 인핸서는 전사 단위에 대해 5' [참조: Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993-1981] 및 3' [참조: Lusky et al., Mol. Cell Bio., 3: 1108, 1983], 인트론 내 [참조: Banerji et al., Cell, 33: 729, 1983] 뿐만 아니라 코딩 서열 자체 내 [참조: Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4: 1293, 1984]인 것으로 밝혀진, 비교적 배향 및 위치 독립적이다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자로부터 공지되어 있다 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, a-페토프로테인 및 인슐린). 그러나, 전형적으로, 당업자는 진핵성 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 이의 예에는 진핵성 프로모터의 활성화를 위한 요소를 증진시키기 위한, 복제 기점 (bp 100-270)의 후기 측면 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측면 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서 [참조: Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982)]가 포함된다. 이러한 인핸서는 헤레굴린 DNA에 대해 5' 또는 3' 위치에 존재하지만, 바람직하게는 상기 프로모터로부터의 5' 부위에 위치하는 벡터 내로 스플라이싱할 수 있다.

(vi) 전사 종결 성분

진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람, 또는 기타 다세포 유기체로부터의 핵화 세포)에 사용된 발현 벡터는 또한, 전사를 종결하고 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵성 또는 바이러스성 DNA 또는 cDNA의 5' 말단, 종종 3' 비번역 영역으로부터 통상 입수할 수 있다. 이들 영역은 헤레굴린 코딩 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다. 이러한 3' 비번역 영역은 또한 전사 종결 부위를 포함한다.

상기 열거된 성분들 중의 하나 이상, 목적하는 코딩 및 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터의 작제는 표준 라이게이션 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, (맞게) 조정한 다음 목적하는 형태로 재연결시켜 요구되는 플라스미드를 생성시킨다.

작제된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하는 분석을 수행하기 위하여, 상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 31,446)를 형질전환시키고, 경우에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 성공적인 형질전환체를 선별한다. 이러한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해하여 분석하고/하거나 문헌 [참조: Messing et al., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981)]에 기재된 방법 또는 문헌 [참조: Maxam et al., Methods in Enzymes 65:499 (1980)]에 기재된 방법에 의해 서열 분석한다.

본 발명을 실시하는데 특히 유용한 것은 헤레굴린을 코딩하는 DNA의 포유류 세포에서의 일시적인 발현을 제공해주는 발현 벡터이다. 일반적으로, 일시적인 발현은, 숙주 세포에서 효율적으로 복제시킬 수 있는 발현 벡터를 사용함으로써, 숙주 세포에 이러한 발현 벡터의 많은 복사물이 축적되어 결국에는 상기 발현 벡터에 의해 코딩된 목적하는 폴리펩티드를 고수준으로 합성하는 것을 포함한다. 적합한 발현 벡터와 숙주 세포를 포함하는 일시적인 발현 시스템은, 클론된 DNA에 의해 코 딩된 폴리펩티드를 편리하게 포지티브 동정해줄 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 또는 생리학적 성질에 대해 상기 폴리펩티드를 신속하게 스크리닝해준다. 따라서, 헤레굴린-유사 활성을 지니고 있는 헤레굴린 동족체 및 변이체 동정을 목적으로 하는 일시적인 발현 시스템이 본 발명에 특히 유용하다. 이러한 일시적인 발현 시스템은 미국 특허 제5,024,939호에 기재되어 있다.

재조합 척추동물 세포 배양물에서 헤레굴린을 합성하도록 적응시키는데 적합한 기타 방법, 벡터 및 숙주 세포가 문헌 [참조: Gething et al., Nature 293: 620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al., EP 117,060 and EP 117,058]에 기재되어 있다. 헤레굴린의 포유류 세포 배양물 발현에 특히 유용한 발현 플라스미드는 pRK5 (EP 공개특허공보 제307,247호) 또는 pSV16B [본원에 참조 문헌으로 삽입된 미국 특허원 제07/441,574호 (1989. 11. 22자 출원)]이다.

D. 숙주 세포의 선택 및 형질전환

본원에서 벡터를 클로닝하거나 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모 또는 상기 언급된 바와 같은 고등 진핵 세포이다. 적합한 원핵생물에는 그람-음성 또는 그람-양성 생물체, 예를 들면, 이. 콜라이, 바실리 (예: B. subtilis), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예: P. aeruginosa), 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans)와 같은 유박테리아가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 x1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)와 같은 기타 균주도 적합하다. 이들 예는 제한적이 아니라 예시일 뿐이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해성 효소를 분비해야 한다. 또 다른 한편, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들면, PCR 또는 기타 핵산 폴리머라제 반응도 적합하다.

원핵생물 이외에도, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵성 미생물이 헤레굴린-코딩 벡터에 적합한 숙주이다. 하등 진핵성 숙주 유기체 중에서 가장 통상적으로 사용되고 있는 것은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵효모이다. 그러나, 시키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)[Beach and Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139,383 (1985. 5. 2)], 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (U.S.S.N. 4,943,529), 예를 들면, 케이. 락티스 (K. lactis)[Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)], 케이. 프라길리스 (K. fragilis), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus), 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)[EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 (1988)]; 칸디다 (Candida), 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)[Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)], 및 필라멘트상 진균, 예를 들면, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium) (WO 91/00357 (1991. 1. 10자 공개)) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들면, 에이. 니둘란스 (A. nidulans)[Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tibum et al., Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)] 및 에이. 니거 (A. niger)[Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985)]와 같은 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에서 사용된다.

글리코실화 헤레굴린 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도한다. 이러한 숙주 세포는 복잡한 프로세싱과 글리코실화 활성을 수행할 수 있다. 원칙적으로, 어떠한 고등 진핵 세포 배양물도, 이들이 척추동무 배양물이든 아니면 비-척추동물 배양물이든 간에, 작업 가능하다. 비-척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 애집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 숙주 세포와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 가능한 곤충 숙주 세포가 동정되었다 [참조: 예를 들면, Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; and Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985)]. 이러한 각종 바이러스성 균주, 예를 들면, 아우토그라파 칼리포미카 (Autographa califomica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 입수 가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해, 본 발명에 따르는 바이러스로서 본원에 사용될 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수 있다. 전형적으로, 식물 세포는, 헤레굴린 DNA를 함유하도록 미리 유전자 조작시킨, 세균 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 특정 균주와 함께 인큐베이션함으로써 형질감염시킨다. 이 식물 세포 배양물을 에이. 투메파시엔스 (A. tumefaciens)와 함께 인큐베이션하는 동안, 헤레굴린을 코딩하는 DNA를 상기 식물 세포 숙주에 전이시켜 이것이 형질감염되도록 하면, 이는 적당한 조건하에서 헤레굴린 DNA를 발현할 것이다. 또한, 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날 서열과 같이, 식물 세포와 화합성인 조절 및 시그날 서열도 이용 가능하다 [참조: Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)]. 또한, T-DNA 780 유전자의 상단 영역으로부터 분리된 DNA 세그먼트는 재조합 DNA-함유 식물 조직에서 식물-발현성 유전자의 전사 수준을 증가시키거나 활성화시킬 수 있다 [EP 321,196 (1989. 6. 21 공개)].

그러나, 가장 큰 관심은 척추동물 세포에 대한 것이며, 척추동물 세포를 배양물 (조직 배양물)에서 증식시키는 것이 최근 몇년 동안에 통상적인 과정이 되었다 [참조: Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 몽키 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 사람 배아 신장주 (293 세포 또는 현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977 참조); 갓난 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980) 참조); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980) 참조); 몽키 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 몽키 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 사람 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 사람 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 사람 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방암 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 사람 간암 세포주 (Hep G2)이다. 바람직한 숙주 세포는 사람 배아 신장 293 및 중국 햄스터 난소 세포이다.

숙주 세포를 형질감염시키고, 바람직하게는 상기 언급된 본 발명의 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 경우에 따라 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다.

형질감염은 어떠한 코딩 서열이 실제로 발현되던지 간에, 특정 숙주 세포가 특정 발현 벡터를 채택하는 것을 지칭한다. 수 많은 형질감염법, 예를 들면, CaPO₄ 및 전기천공법이 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있다. 성공적인 형질감염은 일반적으로, 상기 벡터의 작동에 관한 어떤 특정한 지시가 숙주 세포 내에 일어나는 경우에 인식된다.

형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체 통합에 의해 복제 가능하도록 DNA를 특정 유기체 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라 서, 형질전환은 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 수행한다. 문헌 [setion 1.82 of Sambrook et al. 상기 참조]에 기재된 바와 같이, 염화 칼슘을 이용하는 칼슘 처리법이, 원핵생물, 및 실질적인 세포벽 장벽을 함유하고 있는 기타 세포에 사용된다. 아그로박테륨 투메파시엔스로의 감염이, 문헌 [참조: Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and WO 89/05859 (1989. 6. 29)]에 기재된 바와 같이, 특정한 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이러한 세포벽을 지니고 있지 않는 포유류 세포의 경우에는, 문헌 [setion 16.30-16.37 of Sambrook et al. 상기 참조]에 기재된 인산칼슘 침전법이 바람직하다. 포유류 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 국면이 미국 특허 제4,399,216호 (1983. 8. 16)에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 전형적으로, 문헌 [참조: Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)]의 방법에 따라서 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하는 다른 방법, 예를 들면, 핵 주입, 전기천공 또는 원형질체 융합법이 사용될 수도 있다.

E. 숙주 세포의 배양

본 발명의 헤레굴린 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용된 원핵성 세포를, 문헌 [Sambrook et al. 상기 참조]에 일반적으로 기재된 바와 같이 적합한 배지에서 배양한다.

본 발명의 헤레굴린을 제조하기 위해 사용된 포유류 숙주 세포를 각종 배지에서 배양할 수 있다. 햄즈 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘벡코 변형 이글즈 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 입수 가능한 배지가 상기 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [참조: Ham and Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980), U.S. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; or 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S.Pat.Re. 30,985; U.S. 5,122,468 or USSN 07/592,141 (1990. 10. 3 출원), 이의 전문이 본원에 참조 문헌으로 삽입되어 있다]에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중의 어떠한 것에도 필요에 따라, 호르몬 및(또는) 기타 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면, 젠타마이신 약물), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코즈 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 기타 어떠한 필수 보충물도, 당업자에게 공지되어 있는 적당한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 미리 사용된 것이며, 이는 당해 분야의 숙련인에게는 명백할 것이다.

본 명세서에서 지칭된 숙주 세포는 시험관내 배양물 중의 세포 뿐만 아니라 숙주 동물 내에 있는 세포를 포괄한다.

본 발명의 헤레굴린은, 동종 재조합에 의해 제조할 수 있거나, 또는 당해 분야에서 현재 사용되고 있는 헤레굴린 코딩 DNA를 이미 함유하고 있는 세포 내로 도입된 조절 요소를 활용하는 재조합 제조 방법으로 제조할 수 있는 것으로 추가로 기대된다. 예를 들면, 강력한 프로모터/인핸서 요소, 억제인자 또는 외인성 전사 조절 요소가, 목적하는 헤레굴린을 코딩하는 DNA의 전사에 영향을 미치기에 충분한 배향으로 근접하게, 의도된 숙주 세포의 게놈 내에 삽입된다. 이러한 조절 요소는 본 발명의 헤레굴린을 코딩하지 못하지만, 상기 DNA가 숙주 세포 게놈에 존재한다. 그 다음, 경우에 따라, 발현의 증가 또는 감소 수준에 대해 스크리닝하거나 본 발명의 헤레굴린을 만드는 세포에 대해 스크리닝한다.

F. 유전자 증폭/발현의 검출

유전자 증폭 및(또는) 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적당히 표지된 프로브를 사용하여, 예를 들면, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량화하가 위한 노던 블롯팅 [참조: Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (DNA 분석) 또는 원위치에서의 혼성화에 의해 직접적으로 샘플 내에서 측정할 수 있다. 각종 표지가 이용될 수 있는데, 가장 통상적으로는 방사성 동위원소, 특히 ³²P가 이용된다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 내로 도입하기 위한 바이오틴-변형된 뉴클레오티드를 사용하는 바와 같은 다른 기술을 이용할 수도 있다. 이때, 바이오틴은 광범위한 표지, 예를 들면, 방사성 핵종, 형광인자, 효소 등으로 표지시킬 수 있는 항체 또는 아비딘과 결합하기 위한 부위로서 작용한다. 또 다른 한편, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함한 특이적 이중체를 인식할 수 있는 항체가 이용될 수 있다. 이어서, 이러한 항체는 표지시킬 수 있으며, 검정을 수행할 수 있는데, 여기서는 상기 이중체를 표면에 결합시켜, 이중체가 표면 상에 형성되면, 이러한 이중체에 결합된 항체의 존재 여부를 탐지할 수 있다.

또 다른 한편, 유전자 발현은 면역학적 방법, 예를 들면, 조직 절편을 면역조직화학적으로 염색시키고 세포 배양물 또는 체액을 분석하여 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량화함으로써 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 기술을 사용하여, 특정 세포 샘플을, 전형적으로 탈수 및 고정시킨 다음, 커플링된 유전자 생성물에 특이적인 표지된 항체와 반응시켜 (여기서, 상기 표지는 통상적으로, 효소적 표지, 형광성 표지, 발광성 표지 등과 같이 가시적으로 검출 가능함) 준비한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 특히 민감한 염색 기술이 문헌 [참조: Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 (1980)]에 기재되어 있다.

샘플 유체의 면역조직화학적 염색 및(또는) 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 모든 포유동물에게서 제조될 수 있다. 편리하게는, 상기 항체를 본래의 헤레굴린 폴리펩티드에 대해 제조하거나, 또는 다음에 추가로 기재되는 바와 같이 본원에 제공된 DNA 서열을 기준으로 한 합성 펩티드에 대해 제조할 수 있다.

G. 헤레굴린 폴리펩티드의 정제

헤레굴린을 세포성 막 분획으로부터 회수한다. 또 다른 방법으로는, 단백질 분해적으로 절단되거나 절단형의 발현된 가용성 헤레굴린 단편 또는 아영역을 가용성 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수한다. 분비 시그날을 사용하지 않고 직접적으로 발현된 경우에는 헤레굴린을 숙주 세포 용해물로부터 회수한다.

헤레굴린이 사람 기원이 아닌 재조합 세포에서 발현된 경우, 헤레굴린은 사람 기원의 단백질 또는 폴리펩티드를 전혀 갖고 있지 않다. 그러나, 헤레굴린을 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 정제하여 헤레굴린과 실질적으로 상동성인 제제를 수득하는 것이 바람직하다. 첫 번째 단계로서, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리시켜 미립형 세포 부스러기를 제거한다. 이어서, 상기 막 및 가용성 단백질 분획을 분리시킨다. 이어서, 헤레굴린이 막 결합되어 있는지에 따라서, 헤레굴린을 배양 용해물의 막 분획과 가용성 단백질 분획 (프로테아제의 존재를 요구함) 모두로부터 정제한다. 다음 과정은 적합한 정제 과정의 예시이다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카, 헤파린 SEPHAROSE 또는 양이온 교환 수지 (예: DEAE) 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 및 예를 들어, SEPHADEX G-75를 이용한 겔 여과.

잔기를 결실, 삽입 또는 치환시킨 헤레굴린 변이체는, 이러한 변화에 의해 야기된 실질적인 특성 변화 모두를 고려하여, 본래의 헤레굴린과 동일한 방식으로 회수한다. 예를 들면, 또 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들면, 세균성 또는 바이러스성 항원과의 헤레굴린 융합물 제조가 정제를 촉진시켜 주는데; 이 항원에 대한 항체를 함유하는 면역친화성 칼럼을 사용하여 상기 융합물을 흡착시킬 수 있다. 토끼 폴리클로날 항-헤레굴린 칼럼과 같은 면역친화성 칼럼을 이용하여, 헤레굴린 변이체를 한 가지 이상의 나머지 면역 에피토프에 결합시킴으로써 이를 흡착시킬 수 있다. 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)와 같은 프로테아제 억제제가 또한, 정제 동안의 단백질 분해적 분해를 억제시키는데 유용할 수 있으며, 외래 오염물의 성장을 방지하기 위한 항체가 포함될 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 본래의 헤레굴린의 정제 방법은 재조합 세포 배양물에서의 발현시 또는 헤레굴린 변이체의 특징 변화를 고려하여 변형시킬 필요가 있다는 것을 인지할 것이다.

H. 헤레굴린의 공유결합 변형물

헤레굴린 폴리펩티드의 공유결합 변형물은 본 발명의 범주 내에 속한다. 본래의 헤레굴린과 헤레굴린의 아미노산 서열 변이체 모두를 임의로 공유결합 변형시킨다. 본 발명의 범주 내에 포함되는 한 가지 유형의 공유결합 변형물은 헤레굴린 폴리펩티드 단편이다. 약 40개 아미노산 잔기를 갖는, HRG-GDF와 같은 헤레굴린 단편은 화학적 합성하거나, 또는 전장의 헤레굴린 폴리펩티드 또는 헤레굴린 변이체 폴리펩티드를 효소적 또는 화학적으로 절단함으로써 편리하게 제조한다. 기타 유형의 헤레굴린 또는 이의 단편의 공유결합 변형물은, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제를 헤레굴린 또는 이의 단편의 표적화 아미노산 잔기와 반응시킴으로써, 상기 분자 내로 도입한다.

가장 통상적으로는 시스테이닐 잔기를 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예를 들면, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응시켜 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 시스테이닐 잔기는 또한, 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β- (5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤 조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시킴으로써 유도체화한다.

히스티딜 잔기는 pH 5.5 내지 7.0에서 디에틸피로카르보네이트와 반응시킴으로써 유도체화하는데, 이는 이러한 제제가 상기 히스티딜 측쇄에 대해 비교적 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드가 또한 유용한데; 이러한 반응은 pH 6.0 하에 0.1M 나트륨 카코딜레이트에서 수행하는 것이 바람직하다.

라이시닐 및 아미노 말단 잔기는 석신산 또는 기타 카르복실산 무수물과 반응시킨다. 이들 제제로 유도체화시키는 것은 라이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 지니고 있다. a-아미노-함유 잔기를 유도체화시키는데 적합한 기타 시약에는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로히드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미나제-촉매된 반응이 포함된다.

아르기닐 잔기는 1개 또는 수 개의 통상적인 시약, 예를 들면, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온 및 닌히드린과 반응시킴으로써 변형시킨다. 아르기닌 잔기를 유도체화시키기 위해서는, 구아니딘 작용성 그룹의 높은 pK_a로 인해 상기 반응을 알칼리성 조건 하에 수행해야 한다. 추가로, 이들 시약은 라이신 그룹 뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노 그룹과 반응시킬 수 있다.

방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과 반응시킴으로써 스펙트럼 표지를 티로실 잔기 내로 도입하는데 특히 관심을 가지고, 티로실 잔기의 특이적 변형물을 만들 수 있다. 가장 통상적으로는, N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메 탄을 사용하여 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 형성시킨다. 티로실 잔기를 ¹²⁵I 또는 ¹³¹I로 요오드화하여, 방사선면역검정에 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하는데, 상기 언급된 클로르아민 T 방법이 적합하다.

카르복실 측쇄기 (아스파르틸 또는 글루타밀)은 카르보디이미드 (R'-N=C=N-R') (여기서, R 및 R'는 상이한 알킬 그룹이다), 예를 들면, 1-사이클로헥실-3- (2-모르폴리닐-4-에틸)카르보디이미드 또는 1-에틸-3- (4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카르보디이미드와 반응시킴으로써 선택적으로 변형시킨다. 더욱이, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기를 암모늄 이온과 반응시킴으로써 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환시킨다.

이관능성 제제로 유도체화시키는 것이, 항-헤레굴린 항체의 정제 방법에 사용하기 위해 수-불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 헤레굴린을 가교결합시키는데 유용하며, 그 반대의 과정도 가능하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제로는, 예를 들면, 1,1-비스 (디아조아세틸)-2-페닐에탄; 글루타르알데히드; N-히드록시석신이미드에스테르, 예를 들면, 4-아지도살리실산과의 에스테르; 3,3'-디티오비스 (석신이미딜프로피오네이트)과 같은 디석신이미딜 에스테르를 포함한 동종-이관능성 이미도에스테르; 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드가 있다. 메틸-3- ((p-아지도페닐)디티오)프로피오이미데이트와 같은 유도체화제는 빛의 존재하에서 가교결합물을 형성할 수 있는 광활성화될 수 있는 중간체를 생성시킨다. 또 다른 한편, 반응성 수-불용성 매트릭스, 예를 들면, 시아노겐 브로마이 드-활성화 탄수화물 및 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 반응성 기질이 단백질 고정화에 이용된다.

글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 종종 탈아미드화하여, 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기를 각각 형성시킨다. 또 다른 한편, 이들 잔기를 순한 산성 조건 하에서 탈아미드화시킨다. 이들 잔기 중의 어느 한 형태는 본 발명의 범주 내에 속한다.

기타 변형으로는 프롤린 및 라이신의 히드록시화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실 그룹의 인산화; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 a-아미노 그룹의 메틸화 [참조: T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]; N-말단 아민의 아세틸화; 및 모든 C-말단 카르복실기의 아미드화가 있다.

헤레굴린을 헤레굴린과 이종의 폴리펩티드와 임의로 융합시킨다. 이러한 이종의 폴리펩티드는 임의로, M13 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 등의 파아지 외피 단백질에서 발견되는 것과 같은 앵커 서열이다. 이들 이종 폴리펩티드는 측쇄를 통하거나 말단 잔기를 통하여 헤레굴린 폴리펩티드에 공유적으로 커플링시킬 수 있다.

헤레굴린은 이의 본래의 글리코실화 패턴을 변화시킴으로써 공유결합적으로 변형시킬 수도 있다. 이들 양태에서의 하나 이상의 탄수화물 치환체는, 소정의 부위에서의 모노사카라이드를 첨가, 제거 또는 변화시키거나, 또는 상기 글리코실화 부위를 가하거나 결실시킴에 따라 헤레굴린 내의 잔기를 변형시킴으로서 변형시킨다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결되는 것은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리-펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리-펩티드 서열 중의 어느 하나가 폴리펩티드에 존재하면, 가능성 있는 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈 또는 크실로즈 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신을 사용할 수도 있다.

글리코실화 부위는, 상기 언급된 트리-펩티드 서열 중의 하나 이상을 함유하도록 이의 아미노산 서열을 변화시킴으로써 헤레굴린에 가할 수 있다 (N-연결된 글리코실화 부위에 대함). 이러한 변화는 또한, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 헤레굴린에 첨가하거나 이들로 치환함으로써 만들 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대함). 각 경우, 특히 미리 선택된 염기에서 헤레굴린을 코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 목적하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 함으로써 DNA 수준을 변화시켜, 헤레굴린을 변화시키는 것이 바람직하다.

글리코시드를 헤레굴린에 화학적 또는 효소적으로 커플링시키면, 탄수화물 치환체의 수가 증가한다. 이들 과정은 N- 및 O-연결된 글리코실화할 수 있는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 생성을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 방식에 따라서, 당(들)을 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실 그룹, (c) 유리 설프히드릴 그룹, 예를 들면, 시스테인의 설프히드릴 그룹, (d) 유리 히드록실 그룹, 예를 들면, 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 히드록실 그룹, (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착시킬 수 있다. 이들 방법은 문헌 [참조: WO 87/05330 (1987. 9. 11 공개) 및 Aplin and Wriston, CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

헤레굴린 상에 존재하는 탄수화물 잔기는 화학적 또는 효소적으로 제거한다. 화학적 탈글리코실화시키기 위해서는, 상기 폴리펩티드를 화합물 트리플루오로메탄설폰산 또는 등가 화합물에 노출시켜야 한다. 이러한 처리 결과, 연결성 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당이 절단되어, 폴리펩티드가 본래 상태로 남게된다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [참조: Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) and Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 탄수화물 잔기는 문헌 [참조: Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같은 각종 엔도- 및 엑소-글리코시다제에 의해 헤레굴린으로부터 제거한다.

글리코실화는 또한, 문헌 [참조: Duskin et al., J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)]에 기재된 바와 같은 투니카마이신에 의해 억제된다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코시드 연결을 차단시킨다.

헤레굴린은 또한, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로, 헤레굴린을 각종 비-단백질성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 연결시킴으로써 변형시킬 수 있다.

비-막 결합된 헤레굴린의 생체내 순환 반감기를 증가시키기 위한 한 가지 바람직한 방법은 반감기를 연장시켜주는 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 상기 헤레굴린을 접합시키는 것이다 [참조: Maxfield et al., Polymer 16, 505-509 (1975); Bailey, F.E., et al., in Nonionic Surfactants (Schick, M.J., ed.) pp.794-821, 1967; Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186, 1984; Katre, N.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 1487-1491, 1987; Goodson, R. et al., Bio Technology, 8, 343-346, 1990]. PEG에 대한 접합물은 면역원성과 독성이 저하된 것으로 또한 보고되었다 [참조: Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3578-3581, 1977].

헤레굴린은 또한, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의하거나 계면 중합반응에 의해 제조된 미소캡슐 (예를 들면, 각각 히드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리- (메틸메타크릴레이트) 미소캡슐) 내에 포획시킬 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)]에 기재되어 있다.

당해 분야의 숙련인은 의도한 목적에 최적인 변이체를 선별하기 위하여 변이체를 스크리닝할 수 있을 것이다. 예를 들면, 소정의 항원 또는 HER2 수용체에 대한 친화성 변화와 같은, 헤레굴린의 면역학적 특징 변화는 본래의 헤레굴린 (특히 본래의 헤레굴린-GFD)와 같은 표준물 또는 대조군을 사용하여 경쟁적-유형의 면역분석법으로 측정한다. 레독스 또는 열 안정성, 소수성, 단백질 분해적 분해에 대한 감수성, 재조합 세포 배양물 또는 혈장에서의 안정성, 또는 담체와 응집되거나 이러한 담체 내로 응집되는 경향과 같은 단백질 또는 폴리펩티드 특성의 기타 가능성 있는 변형이 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 분석된다.

I. 헤레굴린 항체 제조

본 발명의 항체는 통상적인 스크리닝하여 수득하고, 이에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 이들의 단편이 포함된다.

폴리클로날 항체는 바람직하게는, 관련 항원 및 보조액을 여러번 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 동물 내에서 생성시킨다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시석신이미드 (라이신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 석신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R'는 상이한 알킬 그룹이다)을 사용하여, 면역시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어, 상기 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대함)을 프로인트 완전 보조액 3용적과 합한 다음 이 용액을 다중 부위에 표피 내로 주사함으로써, 동물을 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 보조액 중의 펩티드 또는 접합체 본래 양의 1/5 내지 1/10을 다중 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 촉진시킨다. 7 내지 14일 후에, 상기 동물로부터 채혈하고 혈청을 대상으로 항체 역가를 검정한다. 역가가 안정 수준에 도달할 때까지 동물을 촉진시킨다. 바람직하게는, 상기 동물을, 상기와 항원은 동일하지만 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교결합제를 통하여 접합되는 접합체로 촉진시킨다. 접합체는 또한, 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합물로서 만들 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집제가 면역 반응을 증진시키는데 적합하게 사용된다.

모노클로날 항체는 문헌 [참조: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 만들 수 있다.

이러한 하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적당한 숙주 동물, 예를 들면, 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이를 상기 언급된 바와 같이 면역시켜, 면역에 사용된 단백질과 특이적으로 결합될 항체를 생성시키거나 이를 생성할 수 있는 임파구를 유도한다. 또 다른 한편, 임파구를 시험관내에서 면역시킬 수 있다. 이어서, 임파구를 적합한 융합제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세 포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)].

이로써 제조된 하이브리도마 세포를, 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하고 성장시킨다. 예를 들면, 이러한 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)이 결여된 경우, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍성 세포의 성장을 억제시키는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 골수종 세포는, 효과적으로 융합되고 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 지지해주며 HAT 배지와 같은 배지에 민감성인 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐의 골수종 세포, 예를 들면, 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)로부터 입수 가능한 MOP-21 및 M.C.-11 마우스 종양으로부터 유도된 것, 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (Rockville, Maryland USA)로부터 입수 가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 사람 골수종 및 마우스-사람 이종골수종 세포주가 또한, 사람 모노클로날 항체를 생성시키는 것으로 기재되었다 [참조: Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987].

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 대상으로 하여, 항원에 대 해 지시된 모노클로날 항체를 생성하는지에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들면, 방사선 면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)으로 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화성은, 예를 들면, 문헌 [참조: Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석으로 결정할 수 있다.

목적하는 특이성, 친화성, 및(또는) 활성의 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 이 클론을 제한 희석시킴으로써 서브클로닝하고 표준 방법으로 배양시킨다 [참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 이에 적합한 배양 배지로는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 또한, 하이브리도마 세포를 특정 동물에서 복수증 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.

이러한 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 면역학적 정제 과정, 예를 들면, 단백질 A-SEPHAROSE, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 상기 배양 배지, 복수증 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리시킨다.

이러한 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 분리시키고 통상적인 과정 (예를 들면, 이러한 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 사용하여 서열 분 석한다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용된다. 일단 분리되면, 이 DNA를 발현 벡터 내에 놓아둔 다음, 숙주 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 면역글로불린 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포 내에 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 항체의 재조합 생성은 다음에 보다 상세히 기재될 것이다.

항체를 생성하는 하이브리도마 세포주는, 배양 상등액을 대상으로 하여 HER2 및(또는) HER3 수용체와 결합되는 항체에 대해 스크리닝함으로써 동정한다. 이는 가용성 수용체 제제를 사용하는 통상적인 면역분석법 또는 세포-결합된 수용체 및 표지된 후보 항체를 사용하는 FACS에 의해 통상 수행된다. 아고니스트 항체는 바람직하게는, 상기 언급된 헤레굴린 티로신 자가 인산화 검정에서 자가 인산화를 자극하는 항체이다.

하이브리드 세포주는 세포 배양 배지 중에서 시험관내 배양을 유지시킬 수 있다. 본 발명의 세포주는 하이포크산틴-아미노프테린 티미딘 (HAT) 배지 중에 연속 세포주를 포함하는 조성물에서 선택되고/되거나 이에 유지시킬 수 있다. 사실상, 하이브리도마 세포주가 일단 정착되면, 이를 각종 영양상 적절한 배지 상에서 유지시킬 수 있다. 더욱이, 이러한 하이브리드 세포주를, 액체 질소 하에서의 동결 및 저장을 포함한, 통상적인 수 많은 방법으로 저장 및 보존할 수 있다. 동결된 세포주는 소생시킨 다음, 모노클로날 항체의 합성과 분비를 계속해서 수행하여 무한적으로 이를 배양할 수 있다. 이와 같이 분비된 항체는 침전, 이온 교환 크로 마토그래피, 친화 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 방법에 의해 조직 배양 상등액으로부터 회수한다. 본원에 기재된 항체는 또한, 수거된 혈장으로부터 이들 면역글로불린을 정제하기 위해 지금까지 사용되어 온 방법 (예를 들면, 에탄올 또는 폴리에틸렌 글리콜 침전 과정)과 같이, IgG 또는 IgM을 정제시키기 위한 통상적인 방법에 의해 하이브리도마 세포 배양물로부터 회수한다.

사람 항체가 사용될 수 있으며, 이것이 바람직하다. 이러한 항체는 사람 하이브리도마를 사용함으로써 수득할 수 있다 [참조: Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)]. 쥐의 항-HER2/HER3 가변 영역 및 적절한 생물학적 활성 (예: 사람 보체를 활성화시키고 ADCC를 매개하는 능력)의 사람 불변 영역을 함유하는 키메릭 항체 [참조: Cabilly et al., U.S. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984); Takeda et al., Nature 314:452 (1985)]가, 통상적인 CDR-그래프팅 방법 [참조: Nature 332:333-327 (1988); EP 02394000 A2]에 의해 생성된 사람 적응화 항체와 같이, 본 발명의 범주 내에 속한다.

모노클로날 항체의 발생을 우회시키는 항체 분자의 항원-결합 영역의 재조합 DNA 버젼을 생성시키는 기술 또한 본 발명의 실시 내에 포괄된다. 당업자는 면역시킨 대상체로부터 취한 면역계 세포로부터 항체-특이적 메신저 RNA 분자를 추출하고, 이들을 상보적 DNA (cDNA) 내로 전사한 다음, 이 cDNA를 세균성 발현 시스템 내로 클로닝하고 목적하는 결합 특징에 대해 선별한다. 스크립스/스트라타젠 (Scripps/Stratagene) 방법은 발현된 Fab 단백질이 주변세포질 공간 (세균성 세포 막과 세포벽 사이)으로 이동하도록 해주거나 분비되도록 해주는 리더 서열을 함유하는 박테리오파아지 람다 벡터 시스템을 이용한다. 당업자는 상당수의 작용성 Fab 단편을 신속하게 생성시키고 스크리닝하여, 목적하는 특징을 지닌 수용체와 결합하는 것을 동정할 수 있다. 또 다른 한편, 항체는 문헌 [참조: Hoogenboom, Tibtech February 1997 (vol 15); Neri et al., Cell Biophysics 27:47-61 (1995); Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-55 (1994); and Soderlind et al., Immunol. Rev. 130:109-124 (1992) 및 본원에 기재된 참조 문헌]에 기재된 파아지 디스플레이 기술 뿐만 아니라 문헌 [참조: Lowman et al., Biochem. 30:10832-10838 (1991)]에 기재된 1가 파아지 디스플레이 기술에 의해 제조할 수 있다.

2. 헤레굴린 및 아고니스트 항체의 치료학적 조성물, 투여 및 용도

헤레굴린은 본 발명에서 내이-지지 세포 증식을 유도하여 새로운 모 세포 발생을 향상시키기 위해 사용된다. 이들 효과는 조직 손상, 예를 들면, 내이 신경독성 상해 또는 소음 폭력, 변성 청각 상실 또는 평형감각 결함, 또는 수술이나 물리적 상해와 연관된 손상과 연관된 질병 상태를 치료하게 해준다.

와우 이식 분야는 또한, 내이 기능에 대한 와우 천공술의 단기간 효과와 장기간 효과 모두를 통찰할 수 있게 해주었다. 지금, 이식된 카테터와 모형 주입용 펌프를 사용하여, 성장 인자를 동물의 내이에 투여하는 것이 가능하다. 헤레굴린을 사람 내이에 국소 투여하여, 모 세포 기능장애와 관련된 내이 장애를 치료할 수 있다.

헤레굴린 또는 아고니스트 항체의 치료제는, 목적하는 순도의 헤레굴린 단백 질을 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 참조]와 혼합함으로써, 동결건조된 케이크 또는 수용제 형태로 저장하기 위해 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산을 포함한 산화방지제; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트란을 포함한, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 만니톨 또는 솔비톨 등의 당 알콜; 나트륨 등의 염-형성 반대이온; 및(또는) TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제가 포함된다.

생체내 투여용으로 사용될 헤레굴린 또는 아고니스트 항체는 멸균성이어야만 한다. 이는 동결건조 및 재구성을 수행하기 이전 또는 이후에, 멸균성 여과막 내로 여과시킴으로써 용이하게 수행된다. 이러한 헤레굴린 또는 항체는 통상적으로 동결건조된 형태 또는 용액 형태로 저장될 것이다.

헤레굴린 또는 항체 치료 조성물은 일반적으로, 멸균성 휴대용 가방이 있는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘로 관통할 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 주머니 또는 바이알에 넣는다.

헤레굴린 또는 항체 투여 경로는 공지된 방법에 따르는데, 예를 들면, 내이 로의 주사 또는 주입 투여 또는 병변내 경로, 또는 다음에 언급된 바와 같은 서방출 시스템에 따른다. 헤레굴린 리간드를 주입 또는 볼러스 주사에 의해 연속적으로 투여할 수 있다. 아고니스트 항체를 동일한 방식으로 투여하는 것이 바람직하다.

헤레굴린, 헤레굴린 변이체 또는 단편, 및 아고니스트 항체는 공지된 방법을 사용하여 분무 건조시키거나 분무 동결 건조시킬 수 있다 [참조: Yeo et al., Biotech, and Bioeng., 41:341-346 (1993); Gombotz et al. PCT/US90/02421].

서방출 제제의 적합한 예에는 상기 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 서방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들면, 문헌 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982))에 기재된 바와 같은 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리 (비닐알콜)], 폴리액티드 (U.S. 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 [참조: Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)], 비-분해 가능한 에틸렌-비닐 아세테이트 [Langer et al., 상기 참조], 분해 가능한 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면, LUPRON DEPOT (락트산-글리콜산 공중합체와 루이프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (EP 133,988)이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 분자를 100일에 걸쳐 방출되게 할 수 있지만, 특정한 히드로겔은 단백질을 보다 짧은 기간 동안 방출시킨다. 캡슐화 단백질이 체내에 장기간 잔류하는 경우, 이들은 37℃하 수분에 노출된 결과로서 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성을 상실하고 면역원성 변화가 일어날 수 있다. 관련 기전에 따라서 단백질을 안정화시키기 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들면, 응집 기전이 티오-디설파이드 상호변화를 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견된 경우에는, 설프히드릴 잔기를 변화시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 조절하고, 적당한 부가제를 사용한 다음 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 이룰 수 있다.

서방출 헤레굴린 또는 항체 조성물에는 또한, 리포솜을 이용하여 포획된 헤레굴린 또는 항체가 포함된다. 헤레굴린 또는 항체를 함유하는 리포솜은 그 자체가 공지된 방법으로 제조한다 [참조: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; 일본 특허원 제83-118008호; U.S. 4,485,045 and 4,544,545; and EP 102,334]. 통상적으로, 리포솜은 지질 함량이 약 30몰% 콜레스테롤을 초과하는데, 이와 같이 선택된 비율은 최적의 헤레굴린 치료법을 위해 조정되는 작은 (약 200 내지 800Å) 단층 유형이다. 순환 시간이 향상된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.

따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 선천성 또는 후천성 면역결핍증의 결과로서 또는 화학요법 치료의 부작용으로서 면역억제된 동물 및 사람에게서 기회성 감염을 예방 및 치료하는데 사용된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명 의 조성물은, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia), 헤모필러스 인플루엔자 (Hemophilus influenza)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그람-양성 세균; 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 그람-음성 세균; 박테륨 엔테리티스 (Bacterium enteritis), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis); 미코박테륨 튜베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 미코박테륨 레프래 (Mycobacterium leprae)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 내산성 세균에 의해 유발된 질환을 예방 및(또는) 치료하기 위한 개선된 방법 및 조성물을 제공하기 위해, 공지된 항균제와 함께 사용하는 것이 유리하다. 항균제를 본 발명의 조성물과 함께 조합하여 사용하는 것은, 심각한 내이 신경독성을 지니는 것으로 공지되어 있고 상기 항균제의 유용성을 저하시키는 항균성 아미노글리코시드, 예를 들면, 젠타마이신, 스트렙토마이신 등을 사용하는 경우에 유리하다. 본 발명의 조성물을 상기 제제와 함께 사용하게 되면, 치료학적 (항균성) 효능은 여전히 달성하면서도 독성 항균제의 투여량을 보다 적게할 수 있다.

몇몇 양태에서는, 본 발명의 조성물을 내이 신경독소와 함께 투여한다. 예를 들면, 아미노글리코시드 항생제를 투여함으로써 포유동물의 감염증을 치료하는 방법에 있어서, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 헤레굴린 또는 아고니스트를 투여하여 상기 항생제와 연관된 내이 신경독소-유도된 청각 장애를 저하 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 개선된 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서는, 화학요법용 화합물을 투여함으로써 포유동물의 암을 치료하는 방법에 있어서, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 조성물을 투여하여 상기 화학요법용 화합물과 연관된 내이 신경독소-유도된 청각 장애를 저하 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 개선된 방법이 제공된다.

또한, 본원에는, 청각 또는 평형감각 결함 또는 장애를 유도할 수 있는 제제 또는 효과에 대한 노출시, 노출 이전 또는 후에 내이 지지 세포 증식, 재생 또는 성장을 유도함으로써 신규한 내이 모 세포를 증진시키는 방법이 제공된다. 이러한 제제 및 효과는 본원에 기재된 것이다. 이러한 방법은 헤레굴린 또는 아고니스트, 또는 본원에서 유용한 것으로 기재된 인자의 유효량을 내이 모 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 청각-장애성 내이 신경독소에 대한 노출시, 노출 이전 또는 후에 사용한다.

한 양태에서는, 당해 치료 방법을, 화학요법제 투여로부터 발생된 청각 장애자에게 적용하여 이의 내이 신경독성 효과를 치료한다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 내이 신경독성 화학요법제에는 항종양제, 예를 들면, 시스플라틴 또는 시스플라틴-유사 화합물, 택솔 또는 택솔-유사 화합물, 및 내이 신경독성-유도된 청각 장애를 야기시키는 것으로 여겨지는 기타 화학요법제, 예를 들면, 혈액 악성종양 및 육종을 치료하는데 사용되는 항종양제인 빈크리스틴이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

한 양태에서는, 본 발명의 방법을, 말라리아의 치료에 전형적으로 사용되어 온 퀴닌 및 이의 합성 치환물 투여로부터 발생된 청각 장애자에게 적용하여 이의 내이 신경독성 부작용을 치료한다.

또 다른 양태에서는, 본 발명의 방법을, 이뇨제 투여로부터 발생된 청각 장애자에게 적용하여 이의 내이 신경독성 부작용을 치료한다. 이뇨제, 특히 "루프" 이뇨제, 즉 헨레 루프에 주로 작용하는 이뇨제가 후보 내이 신경독소이다. 이의 예로는 푸로세미드, 에타크린산 및 머쿠리알스가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이뇨제는 전형적으로 부종을 예방하거나 제거하기 위해 사용된다. 이뇨제는 또한, 고혈압, 과칼슘혈증, 특발성 과칼슘뇨증 및 신원발성 요붕증과 같은 비-부종 상태에 사용된다.

또 다른 양태에서는, 본 발명의 조성물을, 신경단위 세포 성장, 증식 또는 재생을 증진시키는 제제와 함께 투여한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 저농도의 젠타마이신은 모 세포를 우선적으로 사멸시키지만, 신경절 신경단위에 대한 손상을 중요하지 않다. 그러나, 고농도의 젠타마이신은 신경절 신경단위 뿐만 아니라 모 세포를 변성시킨다. 따라서, 이러한 아미노글리코시드의 이중 독성은 본 발명의 방법, 바람직하게는 본 발명의 조성물로 처리할 수 있다.

당해 헤레굴린 또는 아고니스트는 비경구, 비내, 폐동맥내, 경구 또는 피부를 통한 흡수를 포함한 적합한 기술에 의해 환자에게 직접적으로 투여한다. 이들을 함께 투여하는 경우, 이들을 동일한 경로로 투여할 필요는 없다. 이들은 국소적으로 또는 전신 투여될 수 있다. 비경구 투여의 예에는 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내 및 복강, 및 와우내 투여가 포함된다. 이들은 매일 피하 주사함으로써 투여할 수 있다. 이들은 이식체로 투여할 수 있다. 이들은 이도에 액체 점적제로 투여하거나, 내이의 고실계 방에 운반시키거나, 또는 와우 청각 이식체의 확산성 구성원으로서 제공한다.

헤레굴린 또는 항체 아고니스트는 조합하여, 주입 및 주사를 포함한 적합한 기술에 의해 포유동물에게 직접적으로 투여할 수 있다. 구체적인 투여 경로는, 예를 들면, 헤레굴린을 단독으로 사용하여 감지되거나 예상된 부작용을 포함한 환자의 병력, 및 교정될 특정한 장애에 좌우될 것이다. 비경구 투여의 예에는 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내 및 복강내 투여가 포함된다. 가장 바람직하게는, 연속적으로 주입하거나 (예를 들면, 서방출 장치 또는 미니펌프, 예를 들면, 삼투압 펌프 또는 피부 패치를 사용함) 주사하여 (예를 들면, 정맥내 또는 피하 수단을 사용함) 투여한다. 이러한 투여는 단일 볼러스 (bolus)로서 또는 서방출 데포 제형에 의해 이루어질 수 있다. 당해 아고니스트(들)는, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 피내, 안내, 동맥내, 피하 또는 병변내 경로에 의한 주입 또는 주사, 국소 투여, 경구 활성의 작은 분자가 이용되는 경우에는 다음에 언급된 바와 같은 서방출 시스템을 이용한 경구 투여, 또는 펌프와 같은 연속 투여 수단을 사용하거나 패치 또는 이식 시스템을 이용하여, 예를 들면, 성장 인자(들) 및(또는) 호중구(들)을 분비하는 면역 분리된 세포 또는 서방출용 비히클을 이식하여 카테터를 내재시키는 것을 포함한 수 많은 경로에 의해, 필요에 따라 예방적 및 치료적 적용을 위해 급성 또는 만성 방식으로 투여된다. 아고니스트(들)는 주입하거나, 청소율이 충분히 느린 경우에는 주기적 볼러스 주사하거나, 또는 혈류, 림프, CNS 또는 척수 내로 투여함으로써 연속적으로 투여한다. 바람직한 투여 방식은 전형적으로 이식체에 의해 귀 또는 전정의 환부, 및 바람직하게는 환부 모 세포, 이들의 지지 세포 및 (임의로) 이 와 관련된 신경단위에 직접적으로 적용하여, 분자가 상기 공급원에 대해 지시하고 아고니스트의 부작용을 최소화시키도록 한다.

언급된 바와 같이, 당해 조성물은 삼투압 미니펌프의 보조하에 만성적으로 주입되거나 만성적으로 이식된 캐뉼라를 통하여 주사할 수 있다. 작은 튜빙을 통하여 단백질을 적당한 영역에 운반시키는 피하용 펌프가 이용 가능하다. 고도로 복잡한 펌프가 피부를 통하여 재충전되고 이들의 운반 속도는 외과적 중개 없이도 설정될 수 있다. 총체적으로 이식된 약물 운반 시스템을 통한 피하 펌프 장치 또는 연속적인 주입을 포함하는 적합한 투여 방법과 운반 시스템의 예는 문헌 [참조: Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24: 271-277 (1987) and DeYebenes et al., Mov. Disord., 2: 143-158 (1987), 이의 전문이 본원에 참조 문헌으로 삽입되어 있다]에 기재된 파킨슨병에 대한 동물 모델 및 알츠하이머병 환자에게 도파민, 도파민 아고니스트 및 콜린작용성 아고니스트를 투여하는데 사용된 것이다. 아고니스트를 능동적으로 생산하는 세포를, 증가된 아고니스트 농도를 필요로 하는 부위 내로 도입할 수 있는 것으로 예상된다.

치료적으로 이용될 헤레굴린 또는 항체의 유효량은, 예를 들면, 치료 대상체, 투여 경로 및 환자의 상태에 좌우될 것이다. 또한, 헤레굴린 폴리펩티드의 양은 일반적으로, 아고니스트 항체의 양 미만일 것이다. 따라서, 임상의가 투여량의 역가를 측정하고 필요에 따라 투여 경로를 변형시켜 최적의 치료 효과를 획득하는 것이 필요할 것이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서, 약 1 ㎍/㎏ 내지 약 1 ㎎/㎏, 및 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 전형적으로, 임상 의는 투여량이 목적하는 효과에 도달할 때까지 헤레굴린 또는 항체를 투여할 것이다. 이러한 치료요법의 진행은 청각 또는 평형감각을 개선시키기 위한 통상적인 진단 또는 임상 시험에 의해 용이하게 모니터된다.

추가의 양태에서는, 내이-지지 세포를 포유류 조직으로부터 수득하거나 분리하여, 당해 분야에 널리 공지된 기술 (생검 등)을 사용하여 정상적인 내이-지지 세포 샘플을 수득할 수 있다. 이어서, 이러한 샘플을 헤레굴린 단백질로 처리하여, 상기 샘플 중에서 모 세포 또는 내이-지지 세포 성장 및(또는) 증식을 유도함으로써 내이-지지 세포 집단을 증식시킬 수 있다. 전형적으로, 헤레굴린을 약 0.1 내지 약 100 nM, 바람직하게는 1 내지 50 nM의 농도로 시험관내 내이-지지 세포 배양물에 가할 것이다. 경우에 따라, 1차 내이-지지 세포를 여러 세대 동안 시험관내에서 배양하여 모 세포 또는 내이-지지 세포 집단을 충분히 증식시킬 수 있다. 이러한 모 세포 또는 내이-지지 세포는 상기 논의된 바와 같은 포유류 세포 배양에 적합한 조건 하에서 배양한다. 증식 후, 이와 같이 증식된 샘플을, 포유류 조직을 재상피화시킬 목적으로 상기 포유동물에게 재도입한다.

HRG-α 또는 헤레굴린에 관해 본원에서 기재된 방법 및 과정은 일반적으로, HRG-β1, HRG-β2 및 HRG-β3과 같은 기타 헤레굴린 및 이의 변이체 뿐만 아니라 항체에 유사하게 적용될 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조 문헌은 본원에 참조 문헌으로 삽입되어 있다. 다음 실시예는 예시하기 위해 제공된 것이지, 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.

실시예 I

내이-지지 세포 배양물의 특징 확인

배양된 해리되지 않은 소낭 상피 세포를 대상으로 하여, 섬유아세포, 신경교 또는 신경단위 세포의 특징이 아닌 상피 세포의 특징을 발현하는지를 결정하였다. 소낭 박판은 문헌 [참조: Zheng et al., Journal of Neuroscience, 17 (21):8270-82 (1997) and Zheng et al., Journal of Neuroscience, 17 (1):216-226 (1997)]의 방법에 의해 준비하였다. 소낭 박판 배양물은 주로 지지 세포와 모 세포를 함유하였다.

앞서 보고된 방법 [참조: Corwin et al., 1995]에 기초하여, 소낭 상피 박판은 37 ℃에서 30분 동안 0.5 ㎎/㎖ 더모라이신 (Sigma; 한크스 칼슘 및 마그네슘-무함유 평형된 염 용액 중)을 사용하여 생후 3일생 (P3) 또는 4 내지 5일생 위스타 쥐로부터 분리시켰다. 이어서, 상기 상피 박판을 0.125% 트립신과 0.125% 콜라게나제의 혼합물에서 37 ℃ 하에 8분 동안 인큐베이션하였다. 0.005% 대두 트립신 억제제 (Sigma)와 0.005% DNase (Worthington)의 혼합물을 이용하여 효소 활성을 불활성화시키고 BME 중의 0.05% DNase에서 1 ㎖ 피펫으로 10회 동안 피펫팅하였다. 5% 소 태아 혈청-보충된 배지를 사용하였다. 이 세포 현탁액을, 200 ㎕의 혈청-함유 배지 (DMEM + 5% 소 태아 혈청, 4.5 ㎎/㎖ 글루코즈, 2 mM 글루타민, 25 ng/㎖ 펀기존 및 10 units/㎖ 페니실린) 중의 폴리라이신 (500 ㎍/㎖) 코팅된 96-웰 플레이트 (3중 수소 첨가된 티미딘 분석용) 또는 16-웰 랩텍 (LabTek) 슬라이드 (BrdU 표지화 및 기타 면역세포화학용)에 대략 70 세포/㎟의 밀도로 최종적으로 플레이팅 하였다. 통상적으로, 4 리터(litter)의 새끼 (40 P3 또는 P4-5 쥐)로부터 준비된 세포를 80웰 내로 동일하게 분취하였다.

대부분의 분리된 단일 세포는 배양물에서 2일 후에 사망하였지만, 대략 10 내지 80개 세포를 함유하는 상기 세포 덩어리는 잘 생존하였으며 혈청-보충된 배지에서 패치로 성장하였다. 상이한 유형의 세포 마아커로 면역세포화학적 염색한 결과, 이들 배양된 세포가, 융합막 (tight junction) 단백질 ZO1, F-액틴 및 사이토케라틴을 포함한 상피 세포 항원을 발현한 것으로 나타났다. 이들은 다른 유형의 세포, 예를 들면, 신경교 사상체 단백질 (GFAP), 희소돌기 아교세포 항원 (마이엘린), 신경 세사 단백질 또는 섬유아세포 항원, 비멘틴 및 Thy1.1에 대한 항원은 발현하지 않았다. 소낭 상피 박판은 대부분 지지 세포와 모 세포를 함유하고 있기 때문에, 배양물에서 생존하고 있는 대다수의 유사분열 세포는 소낭 지지 세포군을 나타내었다.

실시예 II

지지 세포 증식 및 모 세포 발생의 자극

현재 공지된 성장 인자 중의 어떠한 것이 소낭 지지 세포의 증식을 자극하고 분열 세포의 수 증가를 자극하는지를 조사하기 위하여, 브로모-데옥시우리딘 (BrdU) 면역세포화학을 문헌 [참조: Zheng et al., Journal of Neuroscience, 17 (1):216-226 (1997)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게 언급하면, 배양한지 1일 후에, BrdU (1:400; 아머샴 세포 증식 키트)을 24시간 동안 배양 배지에 가하였다. 이 배양물을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 (30분), 2N HCl로 처리한 다음 (40분), 4℃에서 밤새 항-BrdU 모노클로날 항체 (Becton-Dickinson, 0.1% 트리톤-X100을 함유하는 인산염 완충 식염수 중의 1:40)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 배양물을 벡터 ABC 키트로 처리하였다. 디아미노벤지딘-퍼옥시다제 반응 후, 상기 세포를 에탄올로 탈수시키고, 히스토클리어 (Histoclear; American Histology)로 클리어시킨 다음, 퍼마운트 (Permount; Fisher)에 표본으로 만들었다. 실험군 각각에 대해 10개 이상의 배양 웰의 전체 부위에서 BrdU-양성 세포를 계수하였다. 데이타는 평균치 ± s.e.m으로 나타내었다. 투-테일드, 언페어드 (two-tailed, unpaired) t-시험을 통계학적 분석에 사용하였다.

Her 수용체를 활성화시키는 것으로 공지된 기타 인자들보다 헤레굴린 (HRG-β1-177-244) 함유 배양물에서 훨씬 많은수의 BrdU-양성 세포가 관찰되었다. 대조군 배양물 및 헤레굴린 함유 배양물로부터 수행된 세포 계수 결과, 헤레굴린이 소낭 지지 세포의 증식을 크게 향상시킨다는 것이 확인되었다 (p<0.0001, 도 9). 100 nM의 IGF-1, 100nM의 TGF-α (R & D 시스템즈), EGF 100 nM (Collaborative Research), 100 nM의 SMDF, 100 nM의 β셀룰린, 20 nM의 뉴레굴린 3, 100 nM의 HB-EGF (Elenius et al., EMBO Journal 16 (6):1268-78 (1997)), 및 100 nM의 IGF1-결합 단백질은 헤레굴린과 비해, 전부는 아니지만 보다 약한 유사분열물질이다. SMDF 폴리펩티드는 WO 96/15244에 기재된 바와 같이 제조한다. erbB4와 결합되어 이를 활성화시키는 신경 조직-풍부 단백질인 뉴레굴린-3은 문헌 [참조: Zhang et al., Proceedings of the National Academy of Science, 94 (18):9562-7 (1997)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. β-셀룰린은 문헌 [참조: Daly et al., Cancer Research, 57 (17):3804-11 (1997)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. HRGβ1 _(177-244)의 EGF-유사 도메인을 앞서 기재된 바와 같이 이. 콜라이에서 발현시키고, 정제하고 방사성 요오드화하였다 [참조: Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:14661-14665 (1994)]. 세포를 플레이팅할 때 모든 인자를 상기 배양물에 가하였다.

헤레굴린의 효과가 용량-의존적인지를 결정하기 위하여, 0.03 nM 내지 10 nM 헤레굴린 범위 하의 소낭 상피 박판 배양물에서 용량-의존적 연구를 수행하였다 (도 10). BrdU 양성 세포수에서 헤레굴린-용량-의존적 증가가 관찰되었다. 헤레굴린의 최대 효과는 3 nM에서 나타났다.

실시예 III

소낭 체외이식조직 배양물에서의 지지 세포 증식과 모 세포 발생의 자극

3-D 콜라겐 매트릭스 배양물을 활용하고 이의 정상적인 생체내 구조를 유지하는 기관형 소낭 체외이식조직 배양물을 문헌 [참조: Zheng et al., Journal of Neuroscience, 17 (21):8270-82 (1997)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이 시스템은 생체내 상태와 유사한 생리학적으로 중요한 시스템에서 지지 세포 증식에 대한 헤레굴린의 효과를 시험하기 위한 우수한 수단을 제공해준다. 특히, 내이 신경독성-유도된 손상 (예를 들면, 항생제 젠타마이신) 후의 헤레굴린의 효과를 조사하였다.

부착된 전정 신경절을 사용하여 P3 위스타르 쥐로부터 소낭을 절개하고 이를 혈청 무함유 배지 중의 3차원 ("3-D") 콜라겐 겔에서 배양하였다. 한 양태에서는, 새로 제조한 콜라겐 겔 액적 (20 ㎕)을 35 ㎜ 눈크 (Nunc) 조직 배양 디쉬의 바닥 위에 놓고, 다음과 같이 앞서 기재된 [참조: Gao et al., Neuron 6:705-715 (1991)] 것으로부터 변형시켰다. 쥐 꼬리 콜라겐 (타입 I, Collaborative Research)을 10x BME 배지 및 2% 탄산나트륨과 10:1:1의 비율로 혼합한 다음, 사용하기 직전에 얼음 위에 놓아두었다. 소낭 체외이식조직을 함유하는 콜라겐 매트릭스를 겔화될 때까지 5 내지 10분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 매트릭스를, 상기 체외이식 조직을 덮기에 충분한 배지를 사용하여 규정된 혈청-무함유 배지에서 배양하였다 [2 ㎖의 혈청-무함유 배지 (BME + 혈청 무함유 보충물 (Sigma I-1884), 1% BSA, 2 mM 글루타민, 및 5 ㎎/㎖ 글루코즈; 항생제를 함유하지 않음)]. 그 후, 상기 배양 배지를 매일 교환해주었다.

소낭 체외이식 조직을 3-D 콜라겐에 봉매시키는 것은 이러한 체외이식 조직을 부유시키거나 단층 기질 위에 놓는 것보다 이들의 정상적인 구조를 유지하는데 더 우수한데, 이는 체외이식 조직이 접히지 않은 채로 있고 이 조직으로부터의 세포 이동이 제한될 수 있기 때문이다. 소낭 체외이식 전조직 표본 배양물은, P3 쥐로부터 절개하여 시험관내에서 2일 동안 성장시킨 소낭 조직의 노마르스키 (Nomarski) 현미경 사진으로 저배율 및 고배율로 관찰된 바와 같이 3-D 콜라겐 겔 배양물에서 정상적인 구조를 유지하였다. 이러한 체외이식 조직 중의 모 세포는 잘 성장하였고 이들의 정상적인 결합도를 유지하였다. 이 모 세포는 이들의 정상적인 위치에 유지되었다. 이러한 배양 조건하에서는 모 세포의 전체적인 세포 사 멸이 전혀 발생되지 않았다.

소낭 전조직 표본의 유기 배양물을 체외이식한지 1 내지 2일 후에 배양한 다음, 2일 동안 젠타마이신 (1 mM)으로 처리한 후, 3중 수소 처리된 티미딘의 존재하에 11일 동안 헤레굴린 (3 nM)으로 처리하였다. 표지된 세포의 수를 측정하기 위하여, 상기 조직을 고정시키고, 여러 분획으로 나눈 다음, 자가방사선사진술 처리하였다. 대조군 배양물과 비교해 보면, 헤레굴린에 반응하여, 지지 세포층 (SC)과 모 세포층 (HC) 모두에서의 ³H-티미딘 표지된 세포수의 증가가 관찰되었는데, 이는 유사하게 처리된 샘플을 나타내는 도 11a 내지 11d에 도시된 바와 같다. 지지 세포층과 모 세포층 모두에서의 ³H-티미딘 표지된 세포의 세포 계수치는 도 12에 도시된 바와 같이 헤레굴린이 결여된 대조군 배양물에 비해서 상당히 증가하였다. 이 데이타는 소낭 박판 배양물에서 획득된 데이타와 부합된다. 그리고, 이러한 데이타는 모 세포 손상과 상해를 수반한 경우에, 헤레굴린이 내이-지지 세포 증식을 증가시켜 모 세포 발생을 유도하는데 작용할 수 있다는 것을 지시해준다.

실시예 IV

헤레굴린은 Her2 수용체를 통하여 작용한다

헤레굴린이 생리학적으로 관련된 인자이고 이것이 생리학적으로 관련된 수용체를 통하여 작용한다는 것을 추가로 입증하기 위하여, 쥐 소낭 감각 상피의 모 세포 및 지지 세포층에서의 헤레굴린 및 이의 수용체 Her2, Her3 및 Her4의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. P3 소낭 박판 배양물 및 UEC4 세포 (내이-지지 세포주)로 부터 RNA를 추출하였다. 적당한 유전자-특이적 프라이머를 이용한 TaqMan PCR 분석을 사용하여 [참조: Heid et al., Genome Research, 6 (10):986-94 (1996)], 4개 모두가 내이에서 발현되었지만 헤레굴린 및 Her2는 Her3 또는 Her4보다 높은 수준으로 발현되었다는 것이 관찰되었다 (도 13 참조). Her4는 상기 내이-지지 세포주에서 발현되지 않았다.

Her2가 실제로 단백질 수준으로 발현되었는지를 결정하고 이의 국재화를 확인하기 위하여, 형광 표지된 항-Her2 모노클로날 항체를 사용하여 쥐 P0 (0일) 와우 및 성인 소낭을 면역염색시켰다. Her2는 내이 중의 모 세포 및 지지 세포 감각 상피층에 국재화되었다 (도 14a (와우) 및 도 14b (소낭)). 항-HER2 모노클로날 항체 2C4 및 4D5가 다른 문헌에 기재되어 있다 [참조: Fendly et al., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)]. 이러한 관찰은 헤레굴린 항체를 이용한 면역염색 결과, 헤레굴린이 내이의 모 세포에 의해 발현되는 것을 시사한다는 것과 부합된다.

면역어드헤신 Her4-IgG를 첨가하지 않고 Her2에 대한 중화 모노클로날 항체를 포화량으로 소낭 배양물에 첨가는 헤레굴린의 효과를 차단하였다. 따라서, 헤레굴린은 지지 세포 증식을 자극하고, 이에 따라 Her4-매개된 경로가 아닌 Her2-매개된 시그날링 경로를 활성화시킴으로써 새로운 모 세포의 발생을 자극한다.

또한, 배아 쥐 내이 체외이식 조직 배양물을 이용한 예비 실험은 헤레굴린이 모 세포 기원세포의 증식을 향상시킴으로써 모 세포 분화에 영향을 미친다는 사실을 나타낸다. 헤레굴린으로 처리된 쥐 E14 이낭 (otocyst)는 처리되지 않은 배양물에 비해서 모 세포 기원세포 세포의 수 증가의 반응을 나타낸다. 이는 성인 조직의 연구와 부합되는데, 이는 헤레굴린이 모 세포로 분화시키는 세포의 증식을 자극한다는 것을 나타내준다.

실시예 V

헤레굴린은 내이 신경독성 상해 및 소음 폭력 후 생체내에서 내이 지지 세포 증식과 모 세포 발생을 향상시키는 작용을 한다

친칠라 (chinchillas)는 모 세포 손상 또는 상해에 대해 또는 이러한 상해 후 또는 이에 대한 인자 또는 제제의 효과를 시험하도록 인정된 모델이다. 친칠라를 젠타마이신 또는 카보플라틴으로 처리하거나, 또는 청음으로 인한 청력 장해 처리할 수 있다. 바람직하게는, 5마리 이상의 친칠라가 시험군 각각과 대조군으로 사용된다. 대조군을 내이 신경독성제 또는 소음 폭력으로 처리한 다음 회복시킨다. 전형적으로, 4 내지 6주면 회복하기에 충분하다. 시험군을 상해에 덧붙여 헤레굴린으로 처리한다. 모든 동물에게 미니펌프를 사용하여, 바람직하게는 피하 주입을 통하여 BrdU를 투여하여, 처리 기간 동안에 분열되는 세포를 표지시킨다. 헤레굴린, 또는 본원에 교시된 바와 같은 헤레굴린 인자들 중의 하나를 내이에 투여할 것이다. 미니펌프를 사용할 수 있다. 헤레굴린을 와우 내로 주입할 수 있다. 처리 기간 후, 와우 및 소낭 반점을 상기 동물로부터 절개한다. 이 조직을 고정시키고 BrdU 면역조직화학적 표지화를 수행하였다. 내이 감각 상피에서 BrdU 표지된 세포를 계수한다. 두군으로부터의 세포 계수치를 비교하고 통계적으로 분석하여 헤레굴린 처리에 의해 유도된 지지 세포 증식 및 새로운 모 세포 발생 증진량을 결 정한다.

<110> Genentech, Inc. Gao, Wei-Qiang <120> HAIR CELL DISORDERS <130> GENENT.035VPC <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Arg Ala Pro Gln Arg Gly Arg Ser Leu Ser Pro Ser Arg Asp Lys 1 5 10 15 Leu Phe Pro Asn Pro Ile Arg Ala Leu Gly Pro Asn Ser Pro Ala Pro 20 25 30 Arg Ala Val Arg Val Glu Arg Ser Val Ser Gly Glu Met Ser Glu Arg 35 40 45 Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Glu Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser Pro Ala Leu Pro 65 70 75 80 Pro Arg Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala Ala Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Arg Phe 100 105 110 Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn Lys Pro Gln 115 120 125 Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu Arg Ile Asn 130 135 140 Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser 145 150 155 160 Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr Ile Val Glu Ser 165 170 175 Asn Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Gly Ala Tyr Val 180 185 190 Ser Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr Glu Gly Ala Asn 195 200 205 Thr Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu Val 210 215 220 Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys 225 230 235 240 Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys 245 250 255 Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn Val Pro Met Lys 260 265 270 Val Gln Asn Gln Glu Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Lys Arg Val Leu 275 280 285 Thr Ile Thr Gly Ile Cys Ile Ala Leu Leu Val Val Gly Ile Met Cys 290 295 300 Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys Lys Leu His Asp 305 310 315 320 Arg Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ser Glu Arg Asn Asn Met Met Asn Ile 325 330 335 Ala Asn Gly Pro His His Pro Asn Pro Pro Pro Glu Asn Val Gln Leu 340 345 350 Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys Asn Val Ile Ser Ser Glu His Ile Val 355 360 365 Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser Phe Ser Thr Ser His Tyr Thr Ser Thr 370 375 380 Ala His His Ser Thr Thr Val Thr Gln Thr Pro Ser His Ser Trp Ser 385 390 395 400 Asn Gly His Thr Glu Ser Ile Leu Ser Glu Ser His Ser Val Ile Val 405 410 415 Met Ser Ser Val Glu Asn Ser Arg His Ser Ser Pro Thr Gly Gly Pro 420 425 430 Arg Gly Arg Leu Asn Gly Thr Gly Gly Pro Arg Glu Cys Asn Ser Phe 435 440 445 Leu Arg His Ala Arg Glu Thr Pro Asp Ser Tyr Arg Asp Ser Pro His 450 455 460 Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala Met Thr Thr Pro Ala Arg Met Ser Pro 465 470 475 480 Val Asp Phe His Thr Pro Ser Ser Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Met 485 490 495 Ser Pro Pro Val Ser Ser Met Thr Val Ser Met Pro Ser Met Ala Val 500 505 510 Ser Pro Phe Met Glu Glu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Val Thr Pro Pro 515 520 525 Arg Leu Arg Glu Lys Lys Phe Asp His His Pro Gln Gln Phe Ser Ser 530 535 540 Phe His His Asn Pro Ala His Asp Ser Asn Ser Leu Pro Ala Ser Pro 545 550 555 560 Leu Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Thr Thr Gln Glu Tyr Glu 565 570 575 Pro Ala Gln Glu Pro Val Lys Lys Leu Ala Asn Ser Arg Arg Ala Lys 580 585 590 Arg Thr Lys Pro Asn Gly His Ile Ala Asn Arg Leu Glu Val Asp Ser 595 600 605 Asn Thr Ser Ser Gln Ser Ser Asn Ser Glu Ser Glu Thr Glu Asp Glu 610 615 620 Arg Val Gly Glu Asp Thr Pro Phe Leu Gly Ile Gln Asn Pro Leu Ala 625 630 635 640 Ala Ser Leu Glu Ala Thr Pro Ala Phe Arg Leu Ala Asp Ser Arg Thr 645 650 655 Asn Pro Ala Gly Arg Phe Ser Thr Gln Glu Glu Ile Gln 660 665 <210> 2 <211> 2226 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (2)...(2008) <400> 2 g ggc gcg agc gcc tca gcg cgg ccg ctc gct ctc ccc ctc gag gga caa 49 Gly Ala Ser Ala Ser Ala Arg Pro Leu Ala Leu Pro Leu Glu Gly Gln 1 5 10 15 act ttt ccc aaa ccc gat ccg agc cct tgg acc aaa ctc gcc tgc gcc 97 Thr Phe Pro Lys Pro Asp Pro Ser Pro Trp Thr Lys Leu Ala Cys Ala 20 25 30 gag agc cgt ccg cgt aga gcg ctc cgt ctc cgg cga gat gtc cga gcg 145 Glu Ser Arg Pro Arg Arg Ala Leu Arg Leu Arg Arg Asp Val Arg Ala 35 40 45 caa aga agg cag agg caa agg gaa ggg caa gaa gaa gga gcg agg ctc 193 Gln Arg Arg Gln Arg Gln Arg Glu Gly Gln Glu Glu Gly Ala Arg Leu 50 55 60 cgg caa gaa gcc gga gtc cgc ggc ggg cag cca gag ccc agc ctt gcc 241 Arg Gln Glu Ala Gly Val Arg Gly Gly Gln Pro Glu Pro Ser Leu Ala 65 70 75 80 tcc ccg att gaa aga gat gaa aag cca gga atc ggc tgc agg ttc caa 289 Ser Pro Ile Glu Arg Asp Glu Lys Pro Gly Ile Gly Cys Arg Phe Gln 85 90 95 act agt cct tcg gtg tga aac cag ttc tga ata ctc ctc tct cag att 337 Thr Ser Pro Ser Val * Asn Gln Phe * Ile Leu Leu Ser Gln Ile 100 105 110 caa gtg gtt caa gaa tgg gaa tga att gaa tcg aaa aaa caa acc aca 385 Gln Val Val Gln Glu Trp Glu * Ile Glu Ser Lys Lys Gln Thr Thr 115 120 125 aaa tat caa gat aca aaa aaa gcc agg gaa gtc aga act tcg cat taa 433 Lys Tyr Gln Asp Thr Lys Lys Ala Arg Glu Val Arg Thr Ser His * 130 135 140 caa agc atc act ggc tga ttc tgg aga gta tat gtg caa agt gat cag 481 Gln Ser Ile Thr Gly * Phe Trp Arg Val Tyr Val Gln Ser Asp Gln 145 150 155 caa att agg aaa tga cag tgc ctc tgc caa tat cac cat cgt gga atc 529 Gln Ile Arg Lys * Gln Cys Leu Cys Gln Tyr His His Arg Gly Ile 160 165 170 aaa cga gat cat cac tgg tat gcc agc ctc aac tga agg agc ata tgt 577 Lys Arg Asp His His Trp Tyr Ala Ser Leu Asn * Arg Ser Ile Cys 175 180 185 gtc ttc aga gtc tcc cat tag aat atc agt atc cac aga agg agc aaa 625 Val Phe Arg Val Ser His * Asn Ile Ser Ile His Arg Arg Ser Lys 190 195 200 tac ttc ttc atc tac atc tac atc cac cac tgg gac aag cca tct tgt 673 Tyr Phe Phe Ile Tyr Ile Tyr Ile His His Trp Asp Lys Pro Ser Cys 205 210 215 aaa atg tgc gga gaa gga gaa aac ttt ctg tgt gaa tgg agg gga gtg 721 Lys Met Cys Gly Glu Gly Glu Asn Phe Leu Cys Glu Trp Arg Gly Val 220 225 230 ctt cat ggt gaa aga cct ttc aaa ccc ctc gag ata ctt gtg caa gtg 769 Leu His Gly Glu Arg Pro Phe Lys Pro Leu Glu Ile Leu Val Gln Val 235 240 245 cca acc tgg att cac tgg agc aag atg tac tga gaa tgt gcc cat gaa 817 Pro Thr Trp Ile His Trp Ser Lys Met Tyr * Glu Cys Ala His Glu 250 255 260 agt cca aaa cca aga aaa ggc gga gga gct gta cca gaa gag agt gct 865 Ser Pro Lys Pro Arg Lys Gly Gly Gly Ala Val Pro Glu Glu Ser Ala 265 270 275 gac cat aac cgg cat ctg cat cgc cct cct tgt ggt cgg cat cat gtg 913 Asp His Asn Arg His Leu His Arg Pro Pro Cys Gly Arg His His Val 280 285 290 295 tgt ggt ggc cta ctg caa aac caa gaa aca gcg gaa aaa gct gca tga 961 Cys Gly Gly Leu Leu Gln Asn Gln Glu Thr Ala Glu Lys Ala Ala * 300 305 310 ccg tct tcg gca gag cct tcg gtc tga acg aaa caa tat gat gaa cat 1009 Pro Ser Ser Ala Glu Pro Ser Val * Thr Lys Gln Tyr Asp Glu His 315 320 325 tgc caa tgg gcc tca cca tcc taa ccc acc ccc cga gaa tgt cca gct 1057 Cys Gln Trp Ala Ser Pro Ser * Pro Thr Pro Arg Glu Cys Pro Ala 330 335 340 ggt gaa tca ata cgt atc taa aaa cgt cat ctc cag tga gca tat tgt 1105 Gly Glu Ser Ile Arg Ile * Lys Arg His Leu Gln * Ala Tyr Cys 345 350 tga gag aga agc aga gac atc ctt ttc cac cag tca cta tac ttc cac 1153 * Glu Arg Ser Arg Asp Ile Leu Phe His Gln Ser Leu Tyr Phe His 355 360 365 agc cca tca ctc cac tac tgt cac cca gac tcc tag cca cag ctg gag 1201 Ser Pro Ser Leu His Tyr Cys His Pro Asp Ser * Pro Gln Leu Glu 370 375 380 caa cgg aca cac tga aag cat cct ttc cga aag cca ctc tgt aat cgt 1249 Gln Arg Thr His * Lys His Pro Phe Arg Lys Pro Leu Cys Asn Arg 385 390 395 gat gtc atc cgt aga aaa cag tag gca cag cag ccc aac tgg ggg ccc 1297 Asp Val Ile Arg Arg Lys Gln * Ala Gln Gln Pro Asn Trp Gly Pro 400 405 410 aag agg acg tct taa tgg cac agg agg ccc tcg tga atg taa cag ctt 1345 Lys Arg Thr Ser * Trp His Arg Arg Pro Ser * Met * Gln Leu 415 420 425 cct cag gca tgc cag aga aac ccc tga ttc cta ccg aga ctc tcc tca 1393 Pro Gln Ala Cys Gln Arg Asn Pro * Phe Leu Pro Arg Leu Ser Ser 430 435 440 tag tga aag gta tgt gtc agc cat gac cac ccc ggc tcg tat gtc acc 1441 * * Lys Val Cys Val Ser His Asp His Pro Gly Ser Tyr Val Thr 445 450 455 tgt aga ttt cca cac gcc aag ctc ccc caa atc gcc ccc ttc gga aat 1489 Cys Arg Phe Pro His Ala Lys Leu Pro Gln Ile Ala Pro Phe Gly Asn 460 465 470 gtc tcc acc cgt gtc cag cat gac ggt gtc cat gcc ttc cat ggc ggt 1537 Val Ser Thr Arg Val Gln His Asp Gly Val His Ala Phe His Gly Gly 475 480 485 cag ccc ctt cat gga aga aga gag acc tct act tct cgt gac acc acc 1585 Gln Pro Leu His Gly Arg Arg Glu Thr Ser Thr Ser Arg Asp Thr Thr 490 495 500 aag gct gcg gga gaa gaa gtt tga cca tca ccc tca gca gtt cag ctc 1633 Lys Ala Ala Gly Glu Glu Val * Pro Ser Pro Ser Ala Val Gln Leu 505 510 515 ctt cca cca caa ccc cgc gca tga cag taa cag cct ccc tgc tag ccc 1681 Leu Pro Pro Gln Pro Arg Ala * Gln * Gln Pro Pro Cys * Pro 520 525 530 ctt gag gat agt gga gga tga gga gta tga aac gac cca aga gta cga 1729 Leu Glu Asp Ser Gly Gly * Gly Val * Asn Asp Pro Arg Val Arg 535 540 545 gcc agc cca aga gcc tgt taa gaa act cgc caa tag ccg gcg ggc caa 1777 Ala Ser Pro Arg Ala Cys * Glu Thr Arg Gln * Pro Ala Gly Gln 550 555 560 aag aac caa gcc caa tgg cca cat tgc taa cag att gga agt gga cag 1825 Lys Asn Gln Ala Gln Trp Pro His Cys * Gln Ile Gly Ser Gly Gln 565 570 575 caa cac aag ctc cca gag cag taa ctc aga gag tga aac aga aga tga 1873 Gln His Lys Leu Pro Glu Gln * Leu Arg Glu * Asn Arg Arg * 580 585 aag agt agg tga aga tac gcc ttt cct ggg cat aca gaa ccc cct ggc 1921 Lys Ser Arg * Arg Tyr Ala Phe Pro Gly His Thr Glu Pro Pro Gly 590 595 600 agc cag tct tga ggc aac acc tgc ctt ccg cct ggc tga cag cag gac 1969 Ser Gln Ser * Gly Asn Thr Cys Leu Pro Pro Gly * Gln Gln Asp 605 610 615 taa ccc agc agg ccg ctt ctc gac aca gga aga aat cca ggccaggctg 2018 * Pro Ser Arg Pro Leu Leu Asp Thr Gly Arg Asn Pro 620 625 tctagtgtaa ttgctaacca agaccctatt gctgtataaa acctaaataa acacatagat 2078 tcacctgtaa aactttattt tatataataa agtattccac cttaaattaa acaatttatt 2138 ttattttagc agttctgcaa atagaaaaca ggaaaaaaac ttttataaat taaatatatg 2198 tatgtaaaaa tgaaaaaaaa aaaaaaaa 2226 <210> 3 <211> 675 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Lys Leu Phe Pro Asn Pro Ile Arg Ala Leu Gly Pro Asn Ser Pro 1 5 10 15 Ala Pro Arg Ala Val Arg Val Glu Arg Ser Val Ser Gly Glu Met Ser 20 25 30 Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Glu Arg 35 40 45 Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser Pro Ala 50 55 60 Leu Pro Pro Gln Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala Ala Gly 65 70 75 80 Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu 85 90 95 Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn Lys 100 105 110 Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu Arg 115 120 125 Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys Val 130 135 140 Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr Ile Val 145 150 155 160 Glu Ser Asn Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Gly Ala 165 170 175 Tyr Val Ser Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Asn Thr Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His 195 200 205 Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly 210 215 220 Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys 225 230 235 240 Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met 245 250 255 Ala Ser Phe Tyr Lys His Leu Gly Ile Glu Phe Met Glu Ala Glu Glu 260 265 270 Leu Tyr Gln Lys Arg Val Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Ile Ala Leu 275 280 285 Leu Val Val Gly Ile Met Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys Lys 290 295 300 Gln Arg Lys Lys Leu His Asp Arg Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ser Glu 305 310 315 320 Arg Asn Asn Met Met Asn Ile Ala Asn Gly Pro His His Pro Asn Pro 325 330 335 Pro Pro Glu Asn Val Gln Leu Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys Asn Val 340 345 350 Ile Ser Ser Glu His Ile Val Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser Phe Ser 355 360 365 Thr Ser His Tyr Thr Ser Thr Ala His His Ser Thr Thr Val Thr Gln 370 375 380 Thr Pro Ser His Ser Trp Ser Asn Gly His Thr Glu Ser Ile Leu Ser 385 390 395 400 Glu Ser His Ser Val Ile Val Met Ser Ser Val Glu Asn Ser Arg His 405 410 415 Ser Ser Pro Thr Gly Gly Pro Arg Gly Arg Leu Asn Gly Thr Gly Gly 420 425 430 Pro Arg Glu Cys Asn Ser Phe Leu Arg His Ala Arg Glu Thr Pro Asp 435 440 445 Ser Tyr Arg Asp Ser Pro His Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala Met Thr 450 455 460 Thr Pro Ala Arg Met Ser Pro Val Asp Phe His Thr Pro Ser Ser Pro 465 470 475 480 Lys Ser Pro Pro Ser Glu Met Ser Pro Pro Val Ser Ser Met Thr Val 485 490 495 Ser Met Pro Ser Met Ala Val Ser Pro Phe Met Glu Glu Glu Arg Pro 500 505 510 Leu Leu Leu Val Thr Pro Pro Arg Leu Arg Glu Lys Lys Phe Asp His 515 520 525 His Pro Gln Gln Phe Ser Ser Phe His His Asn Pro Ala His Asp Ser 530 535 540 Asn Ser Leu Pro Ala Ser Pro Leu Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu Tyr 545 550 555 560 Glu Thr Thr Gln Glu Tyr Glu Pro Ala Gln Glu Pro Val Lys Lys Leu 565 570 575 Ala Asn Ser Arg Arg Ala Lys Arg Thr Lys Pro Asn Gly His Ile Ala 580 585 590 Asn Arg Leu Glu Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gln Ser Ser Asn Ser 595 600 605 Glu Ser Glu Thr Glu Asp Glu Arg Val Gly Glu Asp Thr Pro Phe Leu 610 615 620 Gly Ile Gln Asn Pro Leu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Thr Pro Ala Phe 625 630 635 640 Arg Leu Ala Asp Ser Arg Thr Asn Pro Ala Gly Arg Phe Ser Thr Gln 645 650 655 Glu Glu Ile Gln Ala Arg Leu Ser Ser Val Ile Ala Asn Gln Asp Pro 660 665 670 Ile Ala Val 675 <210> 4 <211> 2199 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (3)...(2027) <400> 4 gg gac aaa ctt ttc cca aac ccg atc cga gcc ctt gga cca aac tcg 47 Asp Lys Leu Phe Pro Asn Pro Ile Arg Ala Leu Gly Pro Asn Ser 1 5 10 15 cct gcg ccg aga gcc gtc cgc gta gag cgc tcc gtc tcc ggc gag atg 95 Pro Ala Pro Arg Ala Val Arg Val Glu Arg Ser Val Ser Gly Glu Met 20 25 30 tcc gag cgc aaa gaa ggc aga ggc aaa ggg aag ggc aag aag aag gag 143 Ser Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Glu 35 40 45 cga ggc tcc ggc aag aag ccg gag tcc gcg gcg ggc agc cag agc cca 191 Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser Pro 50 55 60 gcc ttg cct ccc caa ttg aaa gag atg aaa agc cag gaa tcg gct gca 239 Ala Leu Pro Pro Gln Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala Ala 65 70 75 ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct 287 Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser 80 85 90 95 ctc aga ttc aag tgg ttc aag aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac 335 Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn 100 105 110 aaa cca caa aat atc aag ata caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt 383 Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu 115 120 125 cgc att aac aaa gca tca ctg gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa 431 Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys 130 135 140 gtg atc agc aaa tta gga aat gac agt gcc tct gcc aat atc acc atc 479 Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr Ile 145 150 155 gtg gaa tca aac gag atc atc act ggt atg cca gcc tca act gaa gga 527 Val Glu Ser Asn Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Gly 160 165 170 175 gca tat gtg tct tca gag tct ccc att aga ata tca gta tcc aca gaa 575 Ala Tyr Val Ser Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr Glu 180 185 190 gga gca aat act tct tca tct aca tct aca tcc acc act ggg aca agc 623 Gly Ala Asn Thr Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser 195 200 205 cat ctt gta aaa tgt gcg gag aag gag aaa act ttc tgt gtg aat gga 671 His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly 210 215 220 ggg gag tgc ttc atg gtg aaa gac ctt tca aac ccc tcg aga tac ttg 719 Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu 225 230 235 tgc aag tgc cca aat gag ttt act ggt gat cgc tgc caa aac tac gta 767 Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val 240 245 250 255 atg gcc agc ttc tac aag cat ctt ggg att gaa ttt atg gag gcg gag 815 Met Ala Ser Phe Tyr Lys His Leu Gly Ile Glu Phe Met Glu Ala Glu 260 265 270 gag ctg tac cag aag aga gtg ctg acc ata acc ggc atc tgc atc gcc 863 Glu Leu Tyr Gln Lys Arg Val Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Ile Ala 275 280 285 ctc ctt gtg gtc ggc atc atg tgt gtg gtg gcc tac tgc aaa acc aag 911 Leu Leu Val Val Gly Ile Met Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys 290 295 300 aaa cag cgg aaa aag ctg cat gac cgt ctt cgg cag agc ctt cgg tct 959 Lys Gln Arg Lys Lys Leu His Asp Arg Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ser 305 310 315 gaa cga aac aat atg atg aac att gcc aat ggg cct cac cat cct aac 1007 Glu Arg Asn Asn Met Met Asn Ile Ala Asn Gly Pro His His Pro Asn 320 325 330 335 cca ccc ccc gag aat gtc cag ctg gtg aat caa tac gta tct aaa aac 1055 Pro Pro Pro Glu Asn Val Gln Leu Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys Asn 340 345 350 gtc atc tcc agt gag cat att gtt gag aga gaa gca gag aca tcc ttt 1103 Val Ile Ser Ser Glu His Ile Val Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser Phe 355 360 365 tcc acc agt cac tat act tcc aca gcc cat cac tcc act act gtc acc 1151 Ser Thr Ser His Tyr Thr Ser Thr Ala His His Ser Thr Thr Val Thr 370 375 380 cag act cct agc cac agc tgg agc aac gga cac act gaa agc atc ctt 1199 Gln Thr Pro Ser His Ser Trp Ser Asn Gly His Thr Glu Ser Ile Leu 385 390 395 tcc gaa agc cac tct gta atc gtg atg tca tcc gta gaa aac agt agg 1247 Ser Glu Ser His Ser Val Ile Val Met Ser Ser Val Glu Asn Ser Arg 400 405 410 415 cac agc agc cca act ggg ggc cca aga gga cgt ctt aat ggc aca gga 1295 His Ser Ser Pro Thr Gly Gly Pro Arg Gly Arg Leu Asn Gly Thr Gly 420 425 430 ggc cct cgt gaa tgt aac agc ttc ctc agg cat gcc aga gaa acc cct 1343 Gly Pro Arg Glu Cys Asn Ser Phe Leu Arg His Ala Arg Glu Thr Pro 435 440 445 gat tcc tac cga gac tct cct cat agt gaa agg tat gtg tca gcc atg 1391 Asp Ser Tyr Arg Asp Ser Pro His Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala Met 450 455 460 acc acc ccg gct cgt atg tca cct gta gat ttc cac acg cca agc tcc 1439 Thr Thr Pro Ala Arg Met Ser Pro Val Asp Phe His Thr Pro Ser Ser 465 470 475 ccc aaa tcg ccc cct tcg gaa atg tct cca ccc gtg tcc agc atg acg 1487 Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Met Ser Pro Pro Val Ser Ser Met Thr 480 485 490 495 gtg tcc atg cct tcc atg gcg gtc agc ccc ttc atg gaa gaa gag aga 1535 Val Ser Met Pro Ser Met Ala Val Ser Pro Phe Met Glu Glu Glu Arg 500 505 510 cct cta ctt ctc gtg aca cca cca agg ctg cgg gag aag aag ttt gac 1583 Pro Leu Leu Leu Val Thr Pro Pro Arg Leu Arg Glu Lys Lys Phe Asp 515 520 525 cat cac cct cag cag ttc agc tcc ttc cac cac aac ccc gcg cat gac 1631 His His Pro Gln Gln Phe Ser Ser Phe His His Asn Pro Ala His Asp 530 535 540 agt aac agc ctc cct gct agc ccc ttg agg ata gtg gag gat gag gag 1679 Ser Asn Ser Leu Pro Ala Ser Pro Leu Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu 545 550 555 tat gaa acg acc caa gag tac gag cca gcc caa gag cct gtt aag aaa 1727 Tyr Glu Thr Thr Gln Glu Tyr Glu Pro Ala Gln Glu Pro Val Lys Lys 560 565 570 575 ctc gcc aat agc cgg cgg gcc aaa aga acc aag ccc aat ggc cac att 1775 Leu Ala Asn Ser Arg Arg Ala Lys Arg Thr Lys Pro Asn Gly His Ile 580 585 590 gct aac aga ttg gaa gtg gac agc aac aca agc tcc cag agc agt aac 1823 Ala Asn Arg Leu Glu Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gln Ser Ser Asn 595 600 605 tca gag agt gaa aca gaa gat gaa aga gta ggt gaa gat acg cct ttc 1871 Ser Glu Ser Glu Thr Glu Asp Glu Arg Val Gly Glu Asp Thr Pro Phe 610 615 620 ctg ggc ata cag aac ccc ctg gca gcc agt ctt gag gca aca cct gcc 1919 Leu Gly Ile Gln Asn Pro Leu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Thr Pro Ala 625 630 635 ttc cgc ctg gct gac agc agg act aac cca gca ggc cgc ttc tcg aca 1967 Phe Arg Leu Ala Asp Ser Arg Thr Asn Pro Ala Gly Arg Phe Ser Thr 640 645 650 655 cag gaa gaa atc cag gcc agg ctg tct agt gta att gct aac caa gac 2015 Gln Glu Glu Ile Gln Ala Arg Leu Ser Ser Val Ile Ala Asn Gln Asp 660 665 670 cct att gct gta taaaacctaa ataaacacat agattcacct gtaaaacttt 2067 Pro Ile Ala Val 675 attttatata ataaagtatt ccaccttaaa ttaaacaatt tattttattt tagcagttct 2127 gcaaatagaa aacaggaaaa aaacttttat aaattaaata tatgtatgta aaaatgaaaa 2187 aaaaaaaaaa aa 2199 <210> 5 <211> 637 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ser Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Pro Ala Leu Pro Pro Gln Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala 35 40 45 Ala Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser 50 55 60 Ser Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys 65 70 75 80 Asn Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu 85 90 95 Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys 100 105 110 Lys Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr 115 120 125 Ile Val Glu Ser Asn Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu 130 135 140 Gly Ala Tyr Val Ser Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr 145 150 155 160 Glu Gly Ala Asn Thr Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr 165 170 175 Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn 180 185 190 Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr 210 215 220 Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Lys Arg Val 225 230 235 240 Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Ile Ala Leu Leu Val Val Gly Ile Met 245 250 255 Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys Lys Leu His 260 265 270 Asp Arg Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ser Glu Arg Asn Asn Met Met Asn 275 280 285 Ile Ala Asn Gly Pro His His Pro Asn Pro Pro Pro Glu Asn Val Gln 290 295 300 Leu Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys Asn Val Ile Ser Ser Glu His Ile 305 310 315 320 Val Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser Phe Ser Thr Ser His Tyr Thr Ser 325 330 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Lys Arg Thr Lys Pro Asn Gly His Ile Ala Asn Arg Leu Glu Val Asp 545 550 555 560 Ser Asn Thr Ser Ser Gln Ser Ser Asn Ser Glu Ser Glu Thr Glu Asp 565 570 575 Glu Arg Val Gly Glu Asp Thr Pro Phe Leu Gly Ile Gln Asn Pro Leu 580 585 590 Ala Ala Ser Leu Glu Ala Thr Pro Ala Phe Arg Leu Ala Asp Ser Arg 595 600 605 Thr Asn Pro Ala Gly Arg Phe Ser Thr Gln Glu Glu Ile Gln Ala Arg 610 615 620 Leu Ser Ser Val Ile Ala Asn Gln Asp Pro Ile Ala Val 625 630 635 <210> 6 <211> 2460 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (461)...(2371) <400> 6 gtggctgcgg ggcaattgaa aaagagccgg cgaggagttc cccgaaactt gttggaactc 60 cgggctcgcg cggaggccag gagctgagcg gcggcggctg ccggacgatg ggagcgtgag 120 caggacggtg ataacctctc cccgatcggg ttgcgagggc gccgggcaga ggccaggacg 180 cgagccgcca gcggcgggac ccatcgacga cttcccgggg cgacaggagc agccccgaga 240 gccagggcga gcgcccgttc caggtggccg gaccgcccgc cgcgtccgcg ccgcgctccc 300 tgcaggcaac gggagacgcc cccgcgcagc gcgagcgcct cagcgcggcc gctcgctctc 360 cccatcgagg gacaaacttt tcccaaaccc gatccgagcc cttggaccaa actcgcctgc 420 gccgagagcc gtccgcgtag agcgctccgt ctccggcgag atg tcc gag cgc aaa 475 Met Ser Glu Arg Lys 1 5 gaa ggc aga ggc aaa ggg aag ggc aag aag aag gag cga ggc tcc ggc 523 Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Glu Arg Gly Ser Gly 10 15 20 aag aag ccg gag tcc gcg gcg ggc agc cag agc cca gcc ttg cct ccc 571 Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser Pro Ala Leu Pro Pro 25 30 35 caa ttg aaa gag atg aaa agc cag gaa tcg gct gca ggt tcc aaa cta 619 Gln Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala Ala Gly Ser Lys Leu 40 45 50 gtc ctt cgg tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag 667 Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Arg Phe Lys 55 60 65 tgg ttc aag aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac aaa cca caa aat 715 Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn Lys Pro Gln Asn 70 75 80 85 atc aag ata caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt cgc att aac aaa 763 Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu Arg Ile Asn Lys 90 95 100 gca tca ctg gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa gtg atc agc aaa 811 Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser Lys 105 110 115 tta gga aat gac agt gcc tct gcc aat atc acc atc gtg gaa tca aac 859 Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr Ile Val Glu Ser Asn 120 125 130 gag atc atc act ggt atg cca gcc tca act gaa gga gca tat gtg tct 907 Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Gly Ala Tyr Val Ser 135 140 145 tca gag tct ccc att aga ata tca gta tcc aca gaa gga gca aat act 955 Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr Glu Gly Ala Asn Thr 150 155 160 165 tct tca tct aca tct aca tcc acc act ggg aca agc cat ctt gta aaa 1003 Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu Val Lys 170 175 180 tgt gcg gag aag gag aaa act ttc tgt gtg aat gga ggg gag tgc ttc 1051 Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe 185 190 195 atg gtg aaa gac ctt tca aac ccc tcg aga tac ttg tgc aag tgc cca 1099 Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro 200 205 210 aat 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Met Ser Pro Val Asp Phe His 425 430 435 acg cca agc tcc ccc aaa tcg ccc cct tcg gaa atg tct cca ccc gtg 1819 Thr Pro Ser Ser Pro Lys Ser Pro Pro Ser Glu Met Ser Pro Pro Val 440 445 450 tcc agc atg acg gtg tcc aag cct tcc atg gcg gtc agc ccc ttc atg 1867 Ser Ser Met Thr Val Ser Lys Pro Ser Met Ala Val Ser Pro Phe Met 455 460 465 gaa gaa gag aga cct cta ctt ctc gtg aca cca cca agg ctg cgg gag 1915 Glu Glu Glu Arg Pro Leu Leu Leu Val Thr Pro Pro Arg Leu Arg Glu 470 475 480 485 aag aag ttt gac cat cac cct cag cag ttc agc tcc ttc cac cac aac 1963 Lys Lys Phe Asp His His Pro Gln Gln Phe Ser Ser Phe His His Asn 490 495 500 ccc gcg cat gac agt aac agc ctc cct gct agc ccc ttg agg ata gtg 2011 Pro Ala His Asp Ser Asn Ser Leu Pro Ala Ser Pro Leu Arg Ile Val 505 510 515 gag gat gag gag tat gaa acg acc caa gag tac gag cca gcc caa gag 2059 Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Thr Thr Gln Glu Tyr Glu Pro Ala Gln Glu 520 525 530 cct gtt aag aaa ctc gcc aat agc cgg cgg gcc aaa aga acc aag ccc 2107 Pro Val Lys Lys Leu Ala Asn Ser Arg Arg Ala Lys Arg Thr Lys Pro 535 540 545 aat ggc cac att gct aac aga ttg gaa gtg gac agc aac aca agc tcc 2155 Asn Gly His Ile Ala Asn Arg Leu Glu Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser 550 555 560 565 cag agc agt aac tca gag agt gaa aca gaa gat gaa aga gta ggt gaa 2203 Gln Ser Ser Asn Ser Glu Ser Glu Thr Glu Asp Glu Arg Val Gly Glu 570 575 580 gat acg cct ttc ctg ggc ata cag aac ccc ctg gca gcc agt ctt gag 2251 Asp Thr Pro Phe Leu Gly Ile Gln Asn Pro Leu Ala Ala Ser Leu Glu 585 590 595 gca aca cct gcc ttc cgc ctg gct gac agc agg act aac cca gca ggc 2299 Ala Thr Pro Ala Phe Arg Leu Ala Asp Ser Arg Thr Asn Pro Ala Gly 600 605 610 cgc ttc tcg aca cag gaa gaa atc cag gcc agg ctg tct agt gta att 2347 Arg Phe Ser Thr Gln Glu Glu Ile Gln Ala Arg Leu Ser Ser Val Ile 615 620 625 gct aac caa gac cct att gct gta taaaacctaa ataaacacat agattcacct 2401 Ala Asn Gln Asp Pro Ile Ala Val 630 635 gtaaaacttt attttatata ataaagtatt ccaccttaaa ttaaacaatt tattttatt 2460 <210> 7 <211> 241 <212> PRT 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cgccagcggc gggacccatc 240 gacgacttcc cggggcgaca ggagcagccc cgagagccag ggcgagcgcc cgttccaggt 300 ggccggaccg cccgccgcgt ccgcgccgcg ctccctgcag gcaacgggag acgcccccgc 360 gcagcgcgag cgcctcagcg cggccgctcg ctctccccat cgagggacaa acttttccca 420 aacccgatcc gagcccttgg accaaactcg cctgcgccga gagccgtccg cgtagagcgc 480 tccgtctccg gcgag atg tcc gag cgc aaa gaa ggc aga ggc aaa ggg aag 531 Met Ser Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys 1 5 10 ggc aag aag aag gag cga ggc tcc ggc aag aag ccg gag tcc gcg gcg 579 Gly Lys Lys Lys Glu Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala 15 20 25 ggc agc cag agc cca gcc ttg cct ccc caa ttg aaa gag atg aaa agc 627 Gly Ser Gln Ser Pro Ala Leu Pro Pro Gln Leu Lys Glu Met Lys Ser 30 35 40 cag gaa tcg gct gca ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg tgt gaa acc agt 675 Gln Glu Ser Ala Ala Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser 45 50 55 60 tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag tgg ttc aag aat ggg aat gaa 723 Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu 65 70 75 ttg 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Asn Pro Pro Pro 285 290 295 300 gag aat gtc cag ctg gtg aat caa tac gta tct aaa aac gtc atc tcc 1443 Glu Asn Val Gln Leu Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys Asn Val Ile Ser 305 310 315 agt gag cat att gtt gag aga gaa gca gag aca tcc ttt tcc acc agt 1491 Ser Glu His Ile Val Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser Phe Ser Thr Ser 320 325 330 cac tat act tcc aca gcc cat cac tcc act act gtc acc cag act cct 1539 His Tyr Thr Ser Thr Ala His His Ser Thr Thr Val Thr Gln Thr Pro 335 340 345 agc cac agc tgg agc aac gga cac act gaa agc atc ctt tcc gaa agc 1587 Ser His Ser Trp Ser Asn Gly His Thr Glu Ser Ile Leu Ser Glu Ser 350 355 360 cac tct gta atc gtg atg tca tcc gta gaa aac agt agg cac agc agc 1635 His Ser Val Ile Val Met Ser Ser Val Glu Asn Ser Arg His Ser Ser 365 370 375 380 cca act ggg ggc cca aga gga cgt ctt aat ggc aca gga ggc cct cgt 1683 Pro Thr Gly Gly Pro Arg Gly Arg Leu Asn Gly Thr Gly Gly Pro Arg 385 390 395 gaa tgt aac agc ttc ctc agg cat gcc aga gaa acc cct gat tcc tac 1731 Glu Cys Asn Ser Phe Leu Arg His Ala Arg Glu Thr Pro Asp Ser Tyr 400 405 410 cga gac tct cct cat agt gaa agg taaaaccgaa ggcaaagcta ctgcagagga 1785 Arg Asp Ser Pro His Ser Glu Arg 415 420 gaaactcagt cagagaatcc ctgtgagcac ctgcggtctc acctcaggaa atctactcta 1845 atcagaataa ggggcggcag ttacctgttc taggagtgct cctagttgat gaagtcatct 1905 ctttgtttga cggaacttat ttcttctgag cttctctcgt cgtcccagtg actgacaggc 1965 aacagactct taaagagctg ggatgctttg atgcggaagg tgcagcacat ggagtttcca 2025 gctctggcca tgggctcaga cccactcggg gtctcagtgt cctcagttgt aacattagag 2085 agatggcatc aatgcttgat aaggaccctt ctataattcc aattgccagt tatccaaact 2145 ctgattcggt ggtcgagctg gcctcgtgtt cttatctgct aaccctgtct taccttccag 2205 cctcagttaa gtcaaatcaa gggctatgtc attgctgaat gtcatggggg gcaactgctt 2265 gccctccacc ctatagtatc tattttatga aattccaaga agggatgaat aaataaatct 2325 cttggatgct gcgtctggca gtcttcacgg gtggttttca aagcagaaaa aaaaaaaaaa 2385 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2431 <210> 11 <211> 768 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Asp Val Lys Glu Arg Lys Pro Tyr Arg Ser Leu Thr Arg Arg Arg 1 5 10 15 Asp Ala Glu Arg Arg Tyr Thr Ser Ser Ser Ala Asp Ser Glu Glu Gly 20 25 30 Lys Ala Pro Gln Lys Ser Tyr Ser Ser Ser Glu Thr Leu Lys Ala Tyr 35 40 45 Asp Gln Asp Ala Arg Leu Ala Tyr Gly Ser Arg Val Lys Asp Ile Val 50 55 60 Pro Gln Glu Ala Glu Glu Phe Cys Arg Thr Gly Ala Asn Phe Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Leu Gly Leu Glu Glu Val Thr Pro Pro His Gly Thr Leu Tyr 85 90 95 Arg Thr Asp Ile Gly Leu Pro His Cys Gly Tyr Ser Met Gly Ala Gly 100 105 110 Ser Asp Ala Asp Met Glu Ala Asp Thr Val Leu Ser Pro Glu His Pro 115 120 125 Val Arg Leu Trp Gly Arg Ser Thr Arg Ser Gly Arg Ser Ser Cys Leu 130 135 140 Ser Ser Arg Ala Asn Ser Asn Leu Thr Leu Thr Asp Thr Glu His Glu 145 150 155 160 Asn Thr Glu Thr Asp His Pro Gly Gly Leu Gln Asn His Ala Arg Leu 165 170 175 Arg Thr Pro Pro Pro Pro Leu Ser His Ala His Thr Pro Asn Gln His 180 185 190 His Ala Ala Ser Ile Asn Ser Leu Asn Arg Gly Asn Phe Thr Pro Arg 195 200 205 Ser Asn Pro Ser Pro Ala Pro Thr Asp His Ser Leu Ser Gly Glu Pro 210 215 220 Pro Ala Gly Gly Ala Gln Glu Pro Ala His Ala Gln Glu Asn Trp Leu 225 230 235 240 Leu Asn Ser Asn Ile Pro Leu Glu Thr Arg Asn Leu Gly Lys Gln Pro 245 250 255 Phe Leu Gly Thr Leu Gln Asp Asn Leu Ile Glu Met Asp Ile Leu Gly 260 265 270 Ala Ser Arg His Asp Gly Ala Tyr Ser Asp Gly His Phe Leu Phe Lys 275 280 285 Pro Gly Gly Thr Ser Pro Leu Phe Cys Thr Thr Ser Pro Gly Tyr Pro 290 295 300 Leu Thr Ser Ser Thr Val Tyr Ser Pro Pro Pro Arg Pro Leu Pro Arg 305 310 315 320 Ser Thr Phe Ala Arg Pro Ala Phe Asn Leu Lys Lys Pro Ser Lys Tyr 325 330 335 Cys Asn Trp Lys Cys Ala Ala Leu Ser Ala Ile Val Ile Ser Ala Thr 340 345 350 Leu Val Ile Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ala Met His Leu Phe Gly Leu 355 360 365 Asn Trp His Leu Gln Pro Met Glu Gly Gln Met Tyr Glu Ile Thr Glu 370 375 380 Asp Thr Ala Ser Ser Trp Pro Val Pro Thr Asp Val Ser Leu Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Gly Gly Thr Gly Leu Glu Thr Pro Asp Arg Lys Gly Lys Gly Thr 405 410 415 Thr Glu Gly Lys Pro Ser Ser Phe Phe Pro Glu Asp Ser Phe Ile Asp 420 425 430 Ser Gly Glu Ile Asp Val Gly Arg Arg Ala Ser Gln Lys Ile Pro Pro 435 440 445 Gly Thr Phe Trp Arg Ser Gln Val Phe Ile Asp His Pro Val His Leu 450 455 460 Lys Phe Asn Val Ser Leu Gly Lys Ala Ala Leu Val Gly Ile Tyr Gly 465 470 475 480 Arg Lys Gly Leu Pro Pro Ser His Thr Gln Phe Asp Phe Val Glu Leu 485 490 495 Leu Asp Gly Arg Arg Leu Leu Thr Gln Glu Ala Arg Ser Leu Glu Gly 500 505 510 Thr Pro Arg Gln Ser Arg Gly Thr Val Pro Pro Ser Ser His Glu Thr 515 520 525 Gly Phe Ile Gln Tyr Leu Asp Ser Gly Ile Trp His Leu Ala Phe Tyr 530 535 540 Asn Asp Gly Lys Glu Ser Glu Val Val Ser Phe Leu Thr Thr Ala Ile 545 550 555 560 Ala Leu Pro Pro Arg Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala Ala 565 570 575 Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser 580 585 590 Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn 595 600 605 Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu 610 615 620 Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser 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ttatttgaag gactattctt 240 agaccctttt aagaagattt aaagaaaaac cactcggccc tgagtgcggc gaggaccctg 300 tttgtggatg tggaggagcg cgggccggag gcc atg gac gtg aag gag agg aag 354 Met Asp Val Lys Glu Arg Lys 1 5 cct tac cgc tcg ctg acc cgg cgc cgc gac gcc gag cgc cgc tac acc 402 Pro Tyr Arg Ser Leu Thr Arg Arg Arg Asp Ala Glu Arg Arg Tyr Thr 10 15 20 agc tcg tcc gcg gac agc gag gag ggc aaa gcc ccg cag aaa tcg tac 450 Ser Ser Ser Ala Asp Ser Glu Glu Gly Lys Ala Pro Gln Lys Ser Tyr 25 30 35 agc tcc agc gag acc ctg aag gcc tac gac cag gac gcc cgc cta gcc 498 Ser Ser Ser Glu Thr Leu Lys Ala Tyr Asp Gln Asp Ala Arg Leu Ala 40 45 50 55 tat ggc agc cgc gtc aag gac att gtg ccg cag gag gcc gag gaa ttc 546 Tyr Gly Ser Arg Val Lys Asp Ile Val Pro Gln Glu Ala Glu Glu Phe 60 65 70 tgc cgc aca ggt gcc aac ttc acc ctg cgg gag ctg ggg ctg gaa gaa 594 Cys Arg Thr Gly Ala Asn Phe Thr Leu Arg Glu Leu Gly Leu Glu Glu 75 80 85 gta acg ccc cct cac ggg acc ctg tac cgg aca gac att ggc ctc ccc 642 Val Thr Pro Pro His Gly Thr Leu Tyr Arg Thr Asp Ile Gly Leu Pro 90 95 100 cac tgc ggc tac tcc atg ggg gct ggc tct gat gcc gac atg gag gct 690 His Cys Gly Tyr Ser Met Gly Ala Gly Ser Asp Ala Asp Met Glu Ala 105 110 115 gac acg gtg ctg tcc cct gag cac ccc gtg cgt ctg tgg ggc cgg agc 738 Asp Thr Val Leu Ser Pro Glu His Pro Val Arg Leu Trp Gly Arg Ser 120 125 130 135 aca cgg tca ggg cgc agc tcc tgc ctg tcc agc cgg gcc aat tcc aat 786 Thr Arg Ser Gly Arg Ser Ser Cys Leu Ser Ser Arg Ala Asn Ser Asn 140 145 150 ctc aca ctc acc gac acc gag cat gaa aac act gag act gat cat ccg 834 Leu Thr Leu Thr Asp Thr Glu His Glu Asn Thr Glu Thr Asp His Pro 155 160 165 ggc ggc ctg cag aac cac gcg cgg ctc cgg acg ccg ccg ccg ccg ctc 882 Gly Gly Leu Gln Asn His Ala Arg Leu Arg Thr Pro Pro Pro Pro Leu 170 175 180 tcg cac gcc cac acc ccc aac cag cac cac gcg gcc tcc att aac tcc 930 Ser His Ala His Thr Pro Asn Gln His His Ala Ala Ser Ile Asn Ser 185 190 195 ctg aac cgg ggc aac ttc acg ccg agg agc aac ccc agc ccg gcc ccc 978 Leu Asn Arg Gly 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gga gaa att gat gtg gga 1650 Phe Phe Pro Glu Asp Ser Phe Ile Asp Ser Gly Glu Ile Asp Val Gly 425 430 435 agg cga gct tcc cag aag att cct cct ggc act ttc tgg aga tct caa 1698 Arg Arg Ala Ser Gln Lys Ile Pro Pro Gly Thr Phe Trp Arg Ser Gln 440 445 450 455 gtg ttc ata gac cat cct gtg cat ctg aaa ttc aat gtg tct ctg gga 1746 Val Phe Ile Asp His Pro Val His Leu Lys Phe Asn Val Ser Leu Gly 460 465 470 aag gca gcc ctg gtt ggc att tat ggc aga aaa ggc ctc cct cct tca 1794 Lys Ala Ala Leu Val Gly Ile Tyr Gly Arg Lys Gly Leu Pro Pro Ser 475 480 485 cat aca cag ttt gac ttt gtg gag ctg ctg gat ggc agg agg ctc cta 1842 His Thr Gln Phe Asp Phe Val Glu Leu Leu Asp Gly Arg Arg Leu Leu 490 495 500 acc cag gag gcg cgg agc cta gag ggg acc ccg cgc cag tct cgg gga 1890 Thr Gln Glu Ala Arg Ser Leu Glu Gly Thr Pro Arg Gln Ser Arg Gly 505 510 515 act gtg ccc ccc tcc agc cat gag aca ggc ttc atc cag tat ttg gat 1938 Thr Val Pro Pro Ser Ser His Glu Thr Gly Phe Ile Gln Tyr Leu Asp 520 525 530 535 tca gga atc tgg cac ttg gct ttt tac aat gac gga aag gag tca gaa 1986 Ser Gly Ile Trp His Leu Ala Phe Tyr Asn Asp Gly Lys Glu Ser Glu 540 545 550 gtg gtt tcc ttt ctc acc act gcc att gcc ttg cct ccc cga ttg aaa 2034 Val Val Ser Phe Leu Thr Thr Ala Ile Ala Leu Pro Pro Arg Leu Lys 555 560 565 gag atg aaa agc cag gaa tcg gct gca ggt tcc aaa cta gtc ctt cgg 2082 Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala Ala Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg 570 575 580 tgt gaa acc agt tct gaa tac tcc tct ctc aga ttc aag tgg ttc aag 2130 Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys 585 590 595 aat ggg aat gaa ttg aat cga aaa aac aaa cca caa aat atc aag ata 2178 Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile 600 605 610 615 caa aaa aag cca ggg aag tca gaa ctt cgc att aac aaa gca tca ctg 2226 Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu 620 625 630 gct gat tct gga gag tat atg tgc aaa gtg atc agc aaa tta gga aat 2274 Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn 635 640 645 gac agt gcc tct gcc aat atc acc atc gtg gaa tca aac gag atc atc 2322 Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr Ile Val Glu Ser Asn Glu Ile Ile 650 655 660 act ggt atg cca gcc tca act gaa gga gca tat gtg tct tca gag tct 2370 Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Gly Ala Tyr Val Ser Ser Glu Ser 665 670 675 ccc att aga ata tca gta tcc aca gaa gga gca aat act tct tca tct 2418 Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr Glu Gly Ala Asn Thr Ser Ser Ser 680 685 690 695 aca tct aca tcc acc act ggg aca agc cat ctt gta aaa tgt gcg gag 2466 Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu 700 705 710 aag gag aaa act ttc tgt gtg aat gga ggg gag tgc ttc atg gtg aaa 2514 Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys 715 720 725 gac ctt tca aac ccc tcg aga tac ttg tgc aag tgc cca aat gag ttt 2562 Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe 730 735 740 act ggt gat cgc tgc caa aac tac gta atg gcc agc ttc tac agt acg 2610 Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe 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cgatctattt tcgtccctgt cctcttgacg agcccgggat 240 ggtttggagt agcatttaaa agaactagaa aagtggccca gaaacagcag cttaaagaat 300 tattacgata tactttgatt ttgtagttgc taggagcttt tcttcccccc ttgcatcttt 360 ctgaactctt cttgatttta ataatggcct tggacttgga cgatttatcg atttccccct 420 gtaagatgct gtatcatttg gttggggggg cctctgcgtg gtaatggacc gtgagagcgg 480 ccaggccttc ttctggaggt gagccg atg gag att tat tcc cca gac atg tct 533 Met Glu Ile Tyr Ser Pro Asp Met Ser 1 5 gag gtc gcc gcc gag agg tcc tcc agc ccc tcc act cag ctg agt gca 581 Glu Val Ala Ala Glu Arg Ser Ser Ser Pro Ser Thr Gln Leu Ser Ala 10 15 20 25 gac cca tct ctt gat ggg ctt ccg gca gca gaa gac atg cca gag ccc 629 Asp Pro Ser Leu Asp Gly Leu Pro Ala Ala Glu Asp Met Pro Glu Pro 30 35 40 cag act gaa gat ggg aga acc cct gga ctc gtg ggc ctg gcc gtg ccc 677 Gln Thr Glu Asp Gly Arg Thr Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala Val Pro 45 50 55 tgc tgt gcg tgc cta gaa gct gag cgc ctg aga ggt tgc ctc aac tca 725 Cys Cys Ala Cys Leu Glu Ala Glu Arg Leu Arg Gly Cys Leu Asn Ser 60 65 70 gag aaa atc tgc att gtc ccc atc ctg gct tgc ctg gtc agc ctc tgc 773 Glu Lys Ile Cys Ile Val Pro Ile Leu Ala Cys Leu Val Ser Leu Cys 75 80 85 ctc tgc atc gcc ggc ctc aag tgg gta ttt gtg gac aag atc ttt gaa 821 Leu Cys Ile Ala Gly Leu Lys Trp Val Phe Val Asp Lys Ile Phe Glu 90 95 100 105 tat gac tct cct act cac ctt gac cct ggg ggg tta ggc cag gac cct 869 Tyr Asp Ser Pro Thr His Leu Asp Pro Gly Gly Leu Gly Gln Asp Pro 110 115 120 att att tct ctg gac gca act gct gcc tca gct gtg tgg gtg tcg tct 917 Ile Ile Ser Leu Asp Ala Thr Ala Ala Ser Ala Val Trp Val Ser Ser 125 130 135 gag gca tac act tca cct gtc tct agg gct caa tct gaa agt gag gtt 965 Glu Ala Tyr Thr Ser Pro Val Ser Arg Ala Gln Ser Glu Ser Glu Val 140 145 150 caa gtt aca gtg caa ggt gac aag gct gtt gtc tcc ttt gaa cca tca 1013 Gln Val Thr Val Gln Gly Asp Lys Ala Val Val Ser Phe Glu Pro Ser 155 160 165 gcg gca ccg aca ccg aag aat cgt att ttt gcc ttt tct ttc ttg ccg 1061 Ala Ala Pro Thr Pro Lys Asn Arg Ile Phe Ala Phe Ser Phe Leu Pro 170 175 180 185 tcc act gcg cca tcc ttc cct tca ccc acc cgg aac cct gag gtg aga 1109 Ser Thr Ala Pro Ser Phe Pro Ser Pro Thr Arg Asn Pro Glu Val Arg 190 195 200 acg ccc aag tca gca act cag cca caa aca aca gaa act aat ctc caa 1157 Thr Pro Lys Ser Ala Thr Gln Pro Gln Thr Thr Glu Thr Asn Leu Gln 205 210 215 act gct cct aaa ctt tct aca tct aca tcc acc act ggg aca agc cat 1205 Thr Ala Pro Lys Leu Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His 220 225 230 ctt gta aaa tgt gcg gag aag gag aaa act ttc tgt gtg aat gga ggg 1253 Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly 235 240 245 gag tgc ttc atg gtg aaa gac ctt tca aac ccc tcg aga tac ttg tgc 1301 Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys 250 255 260 265 aag tgc cca aat gag ttt act ggt gat cgc tgc caa aac tac gta atg 1349 Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met 270 275 280 gcc agc ttc tac agt acg tcc act ccc ttt ctg tct ctg cct gaa 1394 Ala Ser Phe Tyr Ser Thr Ser Thr Pro Phe Leu Ser Leu Pro Glu 285 290 295 taggagcatg ctcagttggt gctgctttct tgttgctgca tctcccctca gattccacct 1454 agagctagat gtgtcttacc agatctaata ttgactgcct ctgcctgtcg catgagaaca 1514 ttaacaaaag caattgtatt acttcctctg ttcgcgacta gttggctctg agatactaat 1574 aggtgtgtga ggctccggat gtttctggaa ttgatattga atgatgtgat acaaattgat 1634 agtcaatatc aagcagtgaa atatgataat aaaggcattt caaagtctca cttttattga 1694 taaaataaaa atcattctac tgaacagtcc atcttcttta tacaatgacc acatcctgaa 1754 aagggtgttg ctaagctgta accgatatgc acttgaaatg atggtaagtt aattttgatt 1814 cagaatgtgt tatttgtcac aaataaacat aataaaagga aaaaaaaaac ccgaattc 1872 <210> 14 <211> 296 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Glu Ile Tyr Ser Pro Asp Met Ser Glu Val Ala Ala Glu Arg Ser 1 5 10 15 Ser Ser Pro Ser Thr Gln Leu Ser Ala Asp Pro Ser Leu Asp Gly Leu 20 25 30 Pro Ala Ala Glu Asp Met Pro Glu Pro Gln Thr Glu Asp Gly Arg Thr 35 40 45 Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala Val Pro Cys Cys Ala Cys Leu Glu Ala 50 55 60 Glu Arg Leu Arg Gly Cys Leu Asn Ser Glu Lys Ile Cys Ile Val Pro 65 70 75 80 Ile Leu Ala Cys Leu Val Ser Leu Cys Leu Cys Ile Ala Gly Leu Lys 85 90 95 Trp Val Phe Val Asp Lys Ile Phe Glu Tyr Asp Ser Pro Thr His Leu 100 105 110 Asp Pro Gly Gly Leu Gly Gln Asp Pro Ile Ile Ser Leu Asp Ala Thr 115 120 125 Ala Ala Ser Ala Val Trp Val Ser Ser Glu Ala Tyr Thr Ser Pro Val 130 135 140 Ser Arg Ala Gln Ser Glu Ser Glu Val Gln Val Thr Val Gln Gly Asp 145 150 155 160 Lys Ala Val Val Ser Phe Glu Pro Ser Ala Ala Pro Thr Pro Lys Asn 165 170 175 Arg Ile Phe Ala Phe Ser Phe Leu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Phe Pro 180 185 190 Ser Pro Thr Arg Asn Pro Glu Val Arg Thr Pro Lys Ser Ala Thr Gln 195 200 205 Pro Gln Thr Thr Glu Thr Asn Leu Gln Thr Ala Pro Lys Leu Ser Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys 225 230 235 240 Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp 245 250 255 Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr 260 265 270 Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Ser Thr Ser 275 280 285 Thr Pro Phe Leu Ser Leu Pro Glu 290 295

Claims (18)

1. HER2 및(또는) HER3 수용체 또는 그의 조합을 활성화시키는, 헤레굴린(HRG)-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β2-유사, HRG-β3, γ-HRG, 이들의 단편, 및 HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β2-유사, HRG-β3, γ-HRG에 대한 아고니스트 항체, 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단리된 리간드의 유효량을 포함하며, HER2 및(또는) HER3 수용체를 발현하는 내이-지지 세포 (inner-ear-supporting cell)와 접촉될 때, 모 (hair) 세포 발생, 또는 내이-지지 세포 성장, 재생 및(또는) 증식을 유도하는 제약 조성물.
2. HER2 및(또는) HER3 수용체 또는 그의 조합을 활성화시키는, HER2 또는 HER3 수용체와 결합할 수 있는 헤레굴린 폴리펩티드, 헤레굴린 변이체, 헤레굴린 아고니스트 항체, 또는 이들의 단편인 단리된 활성화 리간드의 유효량을 포함하며, HER2 및(또는) HER3 수용체를 발현하는 내이-지지 세포와 접촉될 때, 모 세포 발생, 또는 내이-지지 세포 성장, 재생 및(또는) 증식을 유도하는 제약 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 사람 헤레굴린 또는 이의 단편인 제약 조성물.
4. 제2항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 HRG-α, -β1, -β2, -β2-유사 및 -β3, 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제약 조성물.
5. 제2항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 γ-HRG 또는 이의 단편인 제약 조성물.
6. 제2항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 재조합 사람 헤레굴린 또는 이의 단편인 제약 조성물.
7. 제2항에 있어서, 상기 지지 세포가 와우 이식체 내에 있는 것인 제약 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏의 1일 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
9. 제2항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 아고니스트 항체인 제약 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것인 제약 조성물.
11. 제6항에 있어서, 상기 헤레굴린이 rHRG-β1-177-244인 제약 조성물.
12. 제1항에 있어서, 상기 내이-지지 세포가 소낭 또는 와우 내에 있는 것인 제약 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 내이-지지 세포가 HER2, HER3 또는 이들 모두를 발현하는 것인 제약 조성물.
14. 유효량의 단리된 HER2 및(또는) HER3 활성화 리간드를 포함하는, 내이 지지 세포의 수를 증가시키기 위한 제약 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 HER2 및(또는) HER3 수용체와 결합할 수 있는 헤레굴린 폴리펩티드, 헤레굴린 변이체, 헤레굴린 아고니스트 항체, 또는 이들의 단편인 제약 조성물.
16. 유효량의 단리된 HER2 및(또는) HER3 활성화 리간드를 포함하는, 모 세포 관련된 청각 장애 치료용 제약 조성물.
17. 제16항에 있어서, 상기 활성화 리간드가 HER2 및(또는) HER3 수용체와 결합할 수 있는 헤레굴린 폴리펩티드, 헤레굴린 변이체, 헤레굴린 아고니스트 항체, 또는 이들의 단편인 제약 조성물.
18. 삭제

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