JPH05509096A - 骨髄間質細胞及び始原細胞の刺激 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 び’ＪＪＡ細　の東１ 及五二立野 細胞生物学及び医学の分野における本発明は、Ｗ及び！盗内での骨髄細胞の刺激 のための線維芽成長因子特に塩基性線維芽成長因子の使用に関する。

及呵Ω宣旦 ：その−と１゛ ！生気での造血細胞の長期維持を可能にする組織培養技術が開発されてきた（Ｄ ｅｘｔｅｒ、　Ｔ、Ｍ、、　Ａｃｔａ　Ｈａｅｍａｔ、　６２：　２９９−３０ ５　（１９７９年））。この培養システムの極めて重要な構成要素は、培養容器 内の骨髄誘導された粘着間質細胞層の予備形成である。間質層は内皮細胞、線維 芽細胞、脂肪細胞、マクロファージから成る（Ｗｅｉｓｓ。

Ｌ、、　Ｌ−ワ」止鄭工１１７：　４６７−５３８　（１９６５年）：　Ｌｉｃ ｈｔｍａｎ、　Ｍ、Ａ、。

込且工胎旦ｌ匣工９：　３９１−４１０　（１９８１年））。さまざまな培養条 件により、Ｂリンパ球（Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、　Ｃ，Ａ、、他、Ｊ、　Ｉｍｍｎｎ ｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ６７：　３５３−３６９　（１９８４年）又は骨髄性細胞 （Ｄｅｘｔｅｒ他、Ｊ、　（１：ｅｌｌ。

肋芸１」工９１：　３３５−３４４　（１９７７年））細胞系統の間質細胞依存 性長期培養における細胞の選択的増殖が可能となる。ＩＬＬ及びＩＦＮ−ガンマ といったい（つかのサイトカインは、細胞増殖又は細胞分化を促進しつる粘着細 胞によるさまざまな因子の生産を増大させることがわかっている（Ｚｕｃａｌｉ 、　Ｊ、Ｒ，他、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７７：１８５７−１８６ ３　（１９８６年）　；　Ｐｈ１ｌｉｐ、　Ｒ，他、匣剋匹工到：　８６−８９ （１９８６年））。Ｌｉｔ３７ｅは、一部にはこれらの細胞を大量に得ることが 困難であったことを理由にして、ヒト骨髄間質細胞に対するその他のリンホカイ ンの効果に関して知られている。

造血細胞は、拡張した自己再生特性及び果粒法、単球／マクロファージ、リンパ 球、赤血球及び巨核球（血小板を発生させるもの）といったような血液細胞の単 数又は複数の分化した形態へと成熟する能力によって機能的に定義づけられてき た、骨髄に太き（限定された細胞の１群である。！生立二基、幹細胞は、制限さ れた増殖能力を有するように思われ、無制限に分裂することはできない。

造血細胞は本質的に、未刺激細胞分裂ができないと思われる。果粒法−マクロフ ァージコロニーー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ５Ｆ）は、血中 の２つの関連する白血球個体群すなわち果粒法と単球／マクロファージの生産、 分化及び機能を調節する特異的糖タンパク質である。

骨髄移植は、造血細胞の機能不全が関与する疾病（例えば再生不良性貧血）又は 造血細胞を不可逆的に損傷する治療（例えばガンの化学療法及び放射線療法）を 含む疾病といった数多くの疾病のための、益々一般的になりつつある治療形態で ある。ドナーと被移植者の不完全な適合に関連した臨床学的問題のため、患者自 身が自らのドナー・どじで役立つ自己骨髄移植が可能なかぎり好ましいものであ る。

自己骨髄移植には、被移植者の骨髄の全含有量の５％未満を取り出してそれを凍 結状態で保存し適切な時期に再度注入することが関与する。動物の移植体モデル を研究しているＭａｕｃｈ他（Ｂｌｏｏｄ　７４・８７２−８２５　（１９８９ 年））は、移植された骨髄細胞の用量に比例する被移植動物体内の骨髄の幹細胞 含有量及び自己再生能力の減少を発見した。この減少（周辺血液の白血球数又は 骨髄細胞充実度に反映されてはいない）は、初期骨髄回収の後に観察され、移植 後経時的に変化しておらず、骨髄自己再生能力の永久的損失を実証している。

骨髄抑制（白血球特に果粒法又は好中球の生成における抑制）は、大部分の化学 療法に悪性細胞に対する特異性が欠如していることそして骨髄幹細胞及びその他 の増殖しなければならない未成熟の血液細胞が特に化学療法薬剤及び放射線によ る損傷を受けやすいことを理由として、ガン治療にとって一般的な重大な複雑化 をもたらす。ガン患者における治療に関連する死亡の主な原因は、好中球減少症 の期間及び重症度の両方の関数である感染である。自己骨髄移植の使用は、さま ざまな新生物に対するより集中的で従って効果的な化学及び放射線療法を可能に した。しかしながら罹病率及び死亡率は、自家骨髄がうま（植え付けられて造血 再形成を始めるのに必要なほぼ３週間の期間中に高いものとなっている。

骨髄抑制は同様に、抗生物質、抗うつ薬、抗炎症薬、抗ウィルス剤の投与後、或 はまた甲状腺疾病治療の後にも発生しつる。骨髄抑制はまた、エイズといったよ うなさまざまな免疫抑制障害にも併発する。

Ｂｒａｎｄｔ他（Ｎｅｗ　Ｅｎ　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３１８：　８６９−８７ ６　（１９ｇ８年））は、高用量化学療法及び自己骨髄移植の後の造血再形成の ための、組換え型ヒト果粒法−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ ）の使用を記述しており、許容可能なＧＭＣ３Ｆ用量の範囲全体にわたる加速化 された骨髄回復を発見した。

塊１亙瓜五二了 上皮細胞又は間葉細胞のいずれかの増殖に対して効めの高い刺激効果を有する多 くのペプチドが識別された。組織成長に対するその調節作用のため、これらのペ プチドは集合的に「成長因子」と呼ばわている。残念なことに、はとんどの成長 因子は、その当初の識別及び分離の間に検定さおだ生物学的活性に従って名付け られた。しかしながら今では、当初その故に名付けられた生物学的活性よりもは るかに広い範囲の作用を数多くの成長因子が有していることが明らかとなってき ており、大部分は今や多機能性であると考えられている。その士、本質から離れ た名の例けられた数多くの因子は、純化時点で単一の分子単位となった。

塩基性及び酸性の線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ及びａＦＧＦ）は、胚性中胚葉 及び神経外胚葉から派生したさまざまな細胞のための効めある分裂促進因子及び 分化因子として作用する約１６〜２５キロダルトンのみかけの分子量（Ｍｒ）を もつペプチドである。

塩基性ＦＧＦ　（ｐＩ９．６）は、まず最初にマウスの線維芽細胞（Ｂ　Ａ　Ｌ 　Ｂ　／　ｃ　３　Ｔ　３細胞）の増殖及び形質転換を誘発するその能力によっ て識別された（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、　Ｎａｔｕｒｅ　２４９： 　１２３−１２７　（１９７４年））。ｂＦＧＦは多機能性である。すなわち、 これは増殖を刺激することもできるし、また、分化を誘発又は遅延させることも できる。塩基性ＦＧＦは、細胞機能におけるその他の重要なプロセスも刺激する が、ＦＧＦのさまざまな作用のメカニズムは今後なおも解明していかなくてはな らない（Ｒｉｆｋｉｎ、　Ｄ、Ｂ　ｆｌ！！、ム四且１］　Ｂｉ劇」ｌユ凹：　 １−６　（１９８９年））。

塩基性ＦＧＦは、１つの共通の特性すなわち強い血管形成潜在力つまり新しい血 管を形成する能力を共有する中胚葉又は神経外胚葉から派生した正常な又は悪性 の大部分の組織から純化された。構造上の研究から、ｂＦＧＦは、最初の１５個 のＮ末端アミノ酸の欠如した切形［切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）　］形状でも存 在しうる１５５のアミノ酸から成る単鎖ペプチドであることがわかった。切形ｂ ＦＧＦは、細胞表面レセプタへの結合及び生物学的検定において天然のｂＦＧＦ と同様に効力があり、このことはすなわちｂＦＧＦのＮ末端領域が結合又は生物 活性にとって不必要であることを表わしている。細胞供給源に応じて、ｂＦＧＦ の無傷又は切形のいずれかの形が見い出される。切形の形態が組織内の分子全体 と共存するが或はまた抽出及び分離プロセスの間のタンパク質分解開裂の人為産 物であるかについてはわかっていない。

ヒトのｂＦＧＦｃＤＮＡ及びゲノミッククローンは、１５５個のアミノ酸の１７ ．８ｋＤａ遺伝子産物を予測しているが、ヒトの胎盤から分離されたｂＦＧＦタ ンパク質は、予測された開始メチオニンに対して２つの付加的なアミノ酸Ｎ末端 を含んでいる。ヒト細胞系統５Ｋ−ＨＥＰ−１は、４つの分子形態のｂＦＧＦ　 （１７，８，２２，５，２３，１及び２４．２ｋＤａ）を同時発現することがわ かっている。１７．８ｋＤａ　ｂＦＧＦタンパク質は、以前に予測されたメチオ ニン（ＡＵＧ）コドンで翻訳的に開始されるが、一方２２．５−２３．１−及び ２４．２−ｋＤａのタンパク質は異常な非ＡＵＧコドンで開始する。より高い分 子量の形態は、約１８ｋＤａのｂＦＧＦの共直線性Ｎ末端延長である（例えばＦ ｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’Ｌユ鵠虹」■工μｓＬ胚：　３ ９７８−３９８１　（１９８９年）を参照のこと）。

ｂＦＧＦを含む数多くの器官に血管が密に分布している。血管内皮細胞はｂＦＧ Ｆ遺伝子を発現し、生物活性ｂＦＧＦを合成する。ｂＦＧＦは同様に、さまざま な正常な２倍体細胞（その全てが一生九でｂＦＧＦに感応する）の中及びこれら の細胞から誘導されたさまざまな腫瘍の中でも発現される。

ｂＦＧＦに対する応答性をもつ細胞型は、きわめて特異なＦＧＦ細胞表面レセプ タを支持している。ｂＦＧＦ又はａＦＧＦのいずれもその他の成長因子のための レセプタに結合せずその他の成長因子はＦＧＦレセプタに結合しない。ｂＦＧＦ 又はａＦＧＦの自らのレセプタ（ＢＨＫ−２１細胞上の）に対する架橋結合の研 究によると、両方の因子が共に、見かけ上はそのグリコジル化の度合だけが異な る１４５と１２５ｋＤのＭｒをもつ同じ２つの膜成分と相互作用するということ が示されている。

ｂＦＧＦと１つの細胞の相互作用は膜の流動性及び波打ちの増大を導き、これは 、アクチン細胞骨格の動的構造の急速な変化と相関する。塩基性ＦＧＦは同様に さまざまな特異タンパク質特に１扛穴タンパク質の合成をも刺激する。これらの 分泌タンパク質の１つである「主要分泌タンパク質」は最近チオール依存性カテ プシンであることが示された。ＦＧＦは同様に、プロラクチン／成長ホルモン族 の一員でありプロリフニリンと同じである当初「分裂促進因子調節タンパク質」 と名付けられた糖タンパク質の合成及び遊離をも刺激する。

塩基性ＦＧＦば、短い露出が細胞分裂に対する「コミットメント」を誘発する正 常な二倍体細胞のための「受容能」因子として作用することができる。細胞サイ クルを通しての進行はさらに１−ランスフェリン及び高密度リポタンパク質を含 む血漿成分によって媒介される。

塩基性ＦＧＦは、応答性細胞の形態学及び成長パターンに対して急性かつ長時間 の効果を有する。ｂＦＧＦは移動活性を増大し、細胞−下層接着性の減少、十字 パターンでの成長及び膜の波釘ぢの増大のために３Ｔ３細胞の融合性培養が［形 質転換された状態」に見えるようにする。塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆは同様に、形質転換 されていない細胞の軟寒天内での成長をも誘発し、形質転換成長因子−β（ＴＧ ＦＢ）の効果を増すことができる。塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆは、中胚葉誘導細胞のため の有効な分裂促進因子であり、それぞれ１．５ｐＭと１０ｐＭでの半最大及び最 大効果で細胞増殖をトリガーする。塩基性ＦＧＦは、きわめて低い密度（例えば クローニング条件下）で接種された細胞及び低密度培養の両方について分裂促進 性をもち、平均細胞倍増時間を大幅に短縮する。これは主として、細胞サイクル の６１段階の短縮によるものである。

塩基性ＦＧＦは、培養された細胞の形質発現を安定化させる。この特性は、さも なければ低密度で反復的に継代されたとき培養内のその正常な表現型を失うこと になる細胞型の長時間の培養を可能にしたことから、特に有利なものである。ｂ ＦＧＦのこの生物学的効果は、ｂＦＧＦの存在する中でクローニングされ維持さ れ次にさまざまな間隔でそれを奪い取られた大きな血管又は角膜から誘導された 内皮細胞内で詳細に研究されてきた。塩基性ＦＧＦは、３次元コラーゲン基質に 侵入し自ら組織して毛細血管に似た特徴的細管を形成するべ（毛管内皮細胞を誘 発することができる。これに付随して、ｂＦＧＦは、新生血管性応答内に関与し たタンパク質分解酵素であるウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子 を生産すべく内皮細胞を刺激する。従って、ｂＦＧＦは、内皮細胞の移動、侵入 及びプラスミノーゲン活性化因子の生産を含む、二生応血管形成の特徴であるプ ロセスを刺激することができる。

塩基性ＦＧＦは同様に、軟骨細胞、ヒツジ前脂肪細胞線維芽細胞、神経膠星状細 胞及び乏突起膠細胞を含むさまざまな細胞のための分化因子としても作用する： 神経細胞のｂＦＧＦ治療は、神経突起の外植食及びオルニチン脱炭素酵素活性の 両方を誘発する。細胞分化に対するｂＦＧＦの効果の全てが刺激性のものとはか ぎらない。例えば、ｂＦＧＦは、正常の２倍体筋芽細胞の分化及び融合をｙでき る立証されたい（つかの胚芽細胞系統においては、ｂＦＧＦ及びａＦＧＦはクレ アチンホスホキナーゼの発現を減少できる。

ＦＧＦは同様に、果粒膜細胞、副腎皮質細胞、水晶体上皮細胞及び血管内皮細胞 といったような培養された細胞の究極的老化を著しく遅らせる。ｂＦＧＦが存在 しない状態で維持された場合、これらの細胞は制限された寿命を有し、一方ｂＦ ＧＦが存在する状態ではこれらは２００世代以上にわたり増殖できる。発達的に は、ｂＦＧＦは、下等を髄動物における肢の再生を促進し、神経系の早期発達に おいて役目を果たすことができる。塩基性ＦＧＦは、海馬又は皮質のいずれかか ら誘導された神経細胞の存続及び分化の両方を促進する。ＦＧＦは同様に、正常 な発達中又は特異的病原性事象にひき続いてそのダリア特性に影響を与λること により神経膠星状細胞及び乏突起膠細胞の増殖及び分化に強い効果を有すること もできる。

塩基性ＦＧＦは、五生恐ならびにＷでの創傷の冶ゆに関与する全ての細胞型の増 殖を刺激するというその能力により、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来 成長因子（ＰＤＧＦ）又はＴＧＦＢといったその他の成長因子とは異なっている 。これらの細胞型には、毛管内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、軟骨細胞 及び胚芽細胞が含まれる。

塩基性ＦＧＦは同様に、二体円の肉芽組織の形成、線維芽細胞及び胚芽細胞の合 成機能、離脱した表皮の再上皮形成及び軟骨形成の速度をも増大させる。塩基性 ＦＧＦは、！体円工効力ある血管形成誘導因子として作用し、黄体、副腎、腎及 び網膜などの健康な血管分布組織内での主要な血管形成剤である。

ｂＦＧＦの大きく広がった分布及びその広い標的細胞範囲のため、少な（とも２ ３の異なる名前がｂＦＧＦとして知られている分子に対して与えられてきた（白 面性成長因子（胸腺）、マクロファージ成長因子、胚性腎由来血管形成誘導因子 ２、前立腺成長因子、大グリア細胞成長因子２、内皮成長因子、腫瘍血管形成誘 導因子、肝ガン成長因子、軟骨肉腫成長因子、軟骨由来成長因子１、眼由来成長 因子１、ヘパリン結合成長因子クラス■、筋原性成長因子、ヒト胎盤純化因子、 子宮由来成長因子、胚性ガン腫由来成長因子、ヒト下垂体成長因子、下垂体由来 軟骨細胞成長因子、脂肪細胞成長因子、前立腺骨芽細胞因子、乳ガン由来成長因 子、ダリア成長因子及び脳由来神経親和性因子）。

塩基性ＦＧＦは、その細胞間局在化及び、ｂＦＧＦがいかにしていつ放出される かということに関する問いを生じさせる一般に分泌に必要なシグナル配列の欠如 といった点で、成長因子の中でも独特のものである。

ＦＧＦは、虚血性心疾患の治療のために用いられ（Ｆｒａｎｅｏに対する米国特 許第４，２９６．１００号及び４．３７８．３４７号）、心筋梗塞後に継続した 時間、心臓内の血流を増大させることがわかっている。

Ｎｅｖｏ他（米国特許第４，６４２，１２０号）は、軟骨及び硬骨の欠陥を修復 するためにＦＧＦを用いることを開示した。

５ｅｎｏｏ他（欧州特許公報ＥＰ２８１８２２号）は、！１恐での細胞成長を促 進するのに用いることができしかも熱傷のゆ合促進物質及び血栓症の治療薬とし て作用しうるｂＦＧＦの突然変異タンパク質を開示している。

アラカワ他の欧州特許公報（ＥＰ３２０１４８）は、哨乳動物のｂＦＧＦ因子の 生物学的特性のうち少なくとも１つを有する組換え型ｂＦＧＦ類似体を開示して いる。このｂＦＧＦは、血管新生化、再上皮形成及び創傷修復を誘発するように 思われる。

尺肛Ω叉豹 本発明の目的は、先行技術における前述の欠点を克服することにある。

本発明のもう１つの目的は、線維芽細胞成長因子好ましくは塩基性線維芽細胞成 長因子（ｂＦＧＦ）又はその機能的誘導体を用いて間質細胞を刺激することによ り骨髄移植で用いるための多数の骨髄間質細胞を培養することにある。

本発明のさらにもう１つの目的は、二体３でｂＦＧＦ又はその機能的誘導体を用 いて造血始原細胞を処理し、より効果的な骨髄移植のためにその数を増大させる ことにある。

本発明のさらなる目的は、骨髄移植体の被移植者に対してｂＦＧＦ又はその機能 的誘導体を単独で又は単数又は複数のコロニー刺激因子と組合わせた形で投与す ることによって、骨髄移植片の設置及び造血プロセスの再構成を促進することに ある。

この組合せ治療は、血球生産を調節し造血不全によりひき起こされた疾患状態（ 例えば再生不良性貧血又は好中球減少症）又は過形成によりひき起こされる疾患 状態（例えばさまざまな形の白血病）を治療するために特に有効である。

本発明のさらにもう１つの目的は、ｂＦＧＦ又はその機能的誘導体を用いて内因 性サイトカインを刺激することにより、成る種の骨髄形成不全又は形成異常状態 を治療することにある。

本発明のもう１つの目的は、ｂＦＧＦ又はその機能的誘導体を投与することによ って、移植された骨髄の有効性を増大させるため、移植に先立って骨髄ドナーの 体内の始原細胞の濃度を増加させることにある。

ヒトの骨髄間質細胞の培養に対しｂＦＧＦを極く少量（１−あたりナノグラム単 位で）添加することにより、これらの細胞の増殖速度ならびに達成される最終細 胞密度は大幅に増大する。したがって、この技術は、治療及び研究を目的とした 造血細胞の培養を維持するために用いることのできるヒトの骨髄間質細胞を大量 に提供するのに有効である。

２皿り固皇ス五朋 りは、骨髄（ＢＭ）間質細胞の形態学に対するｂＦＧＦの効果を示す一組の顕微 鏡写真である。ｂＦＧＦが無い状態（ａ）及び（ｃ）及び２０ｎｇ／ａ＋７のｂ ＦＧＦが存在する状態（ｂ）及び（ｄ）での異なる密度における間質培養の定位 相の顕微鏡写真である。スケールパー＝５０戸。

２旦は、骨髄間質細胞成長に対するｂＦＧＦのさまざまな濃度の効果を示すグラ フである。３回継代させた骨髄間質細胞を、ｂＦＧＦが無い状態（ム）又はｂＦ ＧＦが２０　（０）、　２　（・）、又は０．２　（△）　ｎｇ／−存在する状 態で３５ｍｍの培養皿１枚にっき３Ｘ１０’個の細胞の割合で間質培地内に接種 した。複製皿を取り出し、指示された時間で細胞数を決定した。

区旦は、異なる培地内での骨髄間質細胞の成長に対するｂＦＧＦの効果を示すグ ラフである。２回継代させた骨髄間質細胞を、間質培地（ムーム）内、２０ｎｇ ／ＮＩのｂＦＧＦ　（△−△）、ＲＰＭＩ−１６４０（１０％のＦｅ２を含む） （・−−・）又はＲＰＭＩ−］、６４０（１０％のＦｅ２を含む）＋２０ｎｇ／ −のｂＦＧＦ（〇−〇）を含む間質培地の中で３５ｍｍの皿１枚あたり６Ｘ１０ ’個の細胞の割合で接種した。複製皿を取り出し、指示された時間で細胞数を決 定した。

１は、ヘパリンによる間質細胞成長に対するｂＦＧＦの効果の増強作用を示すグ ラフである。２回継代させた骨髄間質細胞を、単独の間質培地（ムーム）；２ｎ ｇ／−のｂＦＧＦ　（○−○）；２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ　（△−△）；２ｎ ｇ／−のｂＦＧＦ及び２０ｕｇ／ｍｌのヘパリン（・−一・）；そして２０μｇ ／ｄ！のヘパリンのみ（■−−１）を含む間質培地の中で、３５ｍｍの皿１枚あ たり６Ｘ１０’個の細胞の割合で接種した。複製皿を取り出し、指示された時間 で細胞数を決定した。

ＩＩは、細胞成長に対するｂＦＧＦの効果の可逆性を示すグラフである。４回継 代させた骨髄間質細胞を用いた。５週間の期間にわたりｂＦＧＦの存在する中で ２度継代させたい（つかの培養に対して２０ｎｇ／−の割合でｂＦＧＦを付加し た。これらの培養を次に、２０ｎｇ／−のｂＦＧＦが連続的に存在する中で（△ −△）或はまたトリプシン処理に先立つその除去に続いて（・−一・）、３５ｍ ｍの皿１枚あたり３Ｘ１０’個の細胞の割合で、トリプシン処理及び接種した。

ｂＦＧＦ無しで４回継代させた随伴培養を同じ密度で接種した（ムーム）。複製 皿を取り出し、指示された時間で細胞数を決定した。

［は、骨髄間質細胞成長に対するｂＦＧＦへの短時間の露呈の効果を示すグラフ である。２回継代させた骨髄間質細胞を３５ｍｍの皿１枚あたり６Ｘ１０’個の 細胞の割合で接種した。培地のみ（ムーム）又は２０　ｎｇ／−のｂＦＧＦを含 む培地を４時間（〇−−０）、２４時間（ローーロ）、又は連続して（△−△） 、培地の各セットに付加した。ｂＦＧＦ含有培地を取り出した後、培養を２−の 間質培地で清浄し、間質培地を単独で次にこれらの皿に付加した。複製皿を取り 出し、指示された時間で細胞数を決定した。

区ユは、ｂＦＧＦの存在する中で培養された細胞と対照細胞の密度を比較した棒 グラフである。骨髄間質細胞を２０ｎｇ／ｄのｂＦＧＦの存在しない状態とする 状態で７５ｃｍ”のフラスコ１本あたり２Ｘ１０”個の被膜形成細胞の割合で接 種した。１０日〜１２日の間隔で、フラスコの各セットについての細胞数が決定 され、７５ｃｍ”のフラスコ１本あたり１．３Ｘ１０’個の割合で細胞を継代さ せた。

［は、ｂＦＧＦによる造血始原細胞の生成の強化を示す棒グラフである。ヒト骨 髄細胞を、ｂＦＧＦが存在しない状態及び２０ｎｇ／−１２ｎｇ／ｄ、１　ｎｇ ／−及び０．２ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中で、７５ｃｍ”のフラスコ１本 あたり２ＸＩＯ’の被膜形成細胞の割合で接種した。造血始原細胞のフォーカス （細胞増殖巣）を含む粘着間質細胞を樹立させた。培地内に放出された細胞数を 決定した。

［は、ｂＦＧＦの影響下での培地内への果粒細胞の放出を示すグラフである。ｂ ＦＧＦが無い状態及び２０ｎｇ／ｍ／、２ｎｇ／＋＋ｆ、１ｎｇ／−及び０．２ ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中で７５ｃｍ２のフラスコ１本あたり２Ｘ１０’ の被膜形成細胞の割合で、ヒト骨髄を接種した。さまざまな間隔で、上澄内の細 胞を収穫し、スライドを調製した。差動的細胞計数により標本中に存在する異な る細胞型の百分率が識別された。

［ＬＬＱ−は、ｂＦＧＦによるＣＳＦに対する始原細胞の濃度依存型刺激を示す 一組の棒グラフである。ヒトの骨髄をｂＦＧＦが存在しない状態及び２０ｎｇ／ ｄ、２ｎｇ／＋ｄ、］、ｎｇ／Ｍｌ及び０．２ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中 で７５ｃｍ”のフラスコ１本あたり２Ｘ１０’個の被膜形成細胞の割合で接種し た。さまざまな間隔で、上澄中の細胞を収穫し、骨髄からの細胞の成長を刺激す る複数のＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ３Ｆ及び５６３７−ＣＭ）のうちの１つ が存在する中で又は存在しない状態で軟寒天内で接種した。

皿エユば、低濃度のｂＦＧＦが培地内の始原細胞個体群を増大させることを示す グラフである。ｂＦＧＦが無い状態及び２０ｎｇ／ｍ、２ｎｇ／ｄ、ｌｎｇ／ｌ ｄ及び０．２ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中で、７５ｃｍ２のフラスコ１本あ たり２Ｘ１０’の被膜形成細胞の割合でヒト骨髄を接種した。−週間の間隔で上 澄内の細胞を収穫し、ＧＭ−ＣＳＦが存在する中で軟寒天内で接種し１４日後コ ロニーを計数した。７日の培養後、Ｇ−ＣＳＦ又は５６３７−ＣＭを用いて同様 の結果が得られた。

区エユは、ｂＦＧＦが存在する中での造血始原細胞のフォーカスを含む粘着間質 細胞層の樹立を示す棒グラフである。ｂＦＧＦが存在しない状態及び２０ｎｇ／ ｄ、２ｎｇ／ｄ！、ｌｎｇ／Ｍｆ！及び０．２ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する状 態で７５ｃｍ”のフラスコ１本あたり２Ｘ１０’の被膜形成細胞の割合でヒトの 骨髄細胞を接種した。

Ｘ朋ｍ１り緻朋 本発明者らは、上述の多重の活性をもつ成長因子であるｂＦＧＦが、造血細胞の 成長及び分化を支持することのできる骨髄間質培養の成長を刺激できるものであ ることを発見した。さらに、本発明者らは、Ｊ！＃髄培髄内地内髄発生がｂＦＧ Ｆによって刺激されることも発見した。その上、ｂＦＧＦは、コロニー刺激因子 の効果をも増強する。

「造血」という語は、血液の細胞要素の生産の意味で用いられ、骨髄発生、リン パ球新生及び赤血球形成を含む。

「造血始原細胞」というのは、成熟した血球の前駆体である血球系列（骨髄、赤 血球、リンパ球、巨核球）のいずれかのうちの１つの細胞のことを言う。この語 はここでは自己再生すると同時にあらゆる系列を発生させるような多能性幹細胞 ならびにこれらの多能性幹細胞に比べてより制限された自己再生能力を有する可 能性がありしかも特定の細胞系列に「コミットメント」された前駆細胞といった 非常に初期の前駆体を含むものとして意図されている。特に、骨髄系統の前駆細 胞から誘導されると思われている骨髄始原細胞が、本発明の方法の標的である。

一般に、哺乳類においては、造血始原細胞の存在及び増殖活性は、骨髄に制限さ れている。しかしながら、骨髄性造血が発生するかぎり、それは本発明の範囲内 に入るものと考えられる。

塩基性ＦＧＦは、骨髄間質細胞の成長を刺激し、収穫されたばかりの骨髄細胞の 培養に続く一次間質細胞層の形成を大幅に促進する。ｂＦＧＦが存在する中では 、間質細胞は高い密度を達成し、その接触阻止を喪失し、多層シートの形で成長 する。「間質細胞」というのは、粘着層の形で培養内で成長する骨髄中に存在す る細胞の異種起源の個体群のことである。間質細胞には、脂肪細胞、前脂肪細胞 、線維芽細胞コロニー形成単位（ＤＦＵ−Ｆ）、網膜細胞及びマクロファージと 呼ばれる骨髄から由来する細胞が含まれる、クローニングされた間質細胞系統も 同様に本発明の範囲内に入るものとして考慮される。骨髄間質細胞の技術分野の 現状については、本書に参考として内含されるＤｏｒｓｈｋｉｎｄ　（Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８＋１１１〜１３７　（１９９０年））によっ て総括されている。

ヘパラン硫酸は、造血に影響を及ぼす細胞外基質の１成分であるとして知られて いる。コロニー刺激因子のような成長因子はヘパリンに結合して、間質細胞が造 血に影響を及ぼす考えられる１つのメカニズムとして役立つことが示されてきた （Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｒ，Ｑ、匝胆匹３３２：　３７６−３７８　（１９８８年 ））。

ヘパリンは、低濃度のｂＦＧＦの刺激効果を増強する（Ｓａｋａｓｅｌａ。

０、他、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０７＋　７４３−７５１　（１９ｇ８ 年）　；　Ｕｌｒｉｅｈ、　Ｓ他。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ　１３７：　１２ ０５−１２１３　（１９８６年）；以下の例参照）。ヘパリンに加えて、ヘパリ ン断片又は合成ヘパリン代用物の使用は、本発明の範囲内で意図されている。ヘ パリン製剤は組成、分子サイズ、構造、置換基（Ｎ−硫酸、〇−硫酸及びグルク ロン酸）の位置及び配列に関して非均質で異質である（Ｇｏｌｄｇａｂｅｒ他、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：　８７７　（１９８７年）　；　７ａｎｚｉ他、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２３５：　８８１（１９８７年）　；　Ｒｏｂａｋｉｓ、　Ｎ、に 、他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

■、　４１９０　（１９８７年））、この異質性が、観察されるさまざまな効果 の原因であると思われている。

ヘパリンは修飾でき、又ヘパリン断片を当該技術分野では既知のものである方法 によって合成することも可能である（Ｃｈｏａｙ、　Ｊｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋しｍ ユｅｓ、　Ｃｏｗｓ、　１１６；　４９２　（１９８３年）　：　ｖａｎＢｏｅ ｃｋｅｌ、　Ｃ，Ａ、Ａ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２９：　 ８（１３（１９８８年）、これらは両書共本書中に参考として内含されている） 。

好ましいヘパリン断片は、六糖類又は五糖類の断片を含んでいる。好ましい合成 ヘパリン代用物は、例えばβ−サイクロデキストリンテトラデカ硫酸といったよ うな６つ又は８つのグルコビラノース単位のサイクロデキストリンを含む。

サイクロデキストリンは、６個乃至８個のグルコビラノース単位から構渠された 天然に発生する環状非還元水溶性オリゴ糖である（Ｂｅｎｄｅｒ、　Ｍ、Ｌ、他 、Ｃｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　池ＩΣｕ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｊ、ｎ、　１９７８年）　；　Ｓａｅｎｇｅｒ、　Ｌ、　Ａｎ　ｅｗ　 Ｃｅｍ、　Ｉｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎ　１゜９１：　３４４　（１９８０年）　； 　Ｓａｅｎｇｅｒ、　Ｗ、、　Ｉｎ：　Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　７（Ａｔｗｏｏｄ 、　Ｊ、Ｌ、他ｅｄｓ、）、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ、　１９８４年、ｖｏｌ、　２．　ｐｐ２３２−２５９）。

本発明に従うと、ｂＦＧＦは、造血を刺激するため（例えば骨髄被移植者の場合 ）又は始原細胞の数を増大させるため（例えば骨髄ドナーの場合）に被検者に対 して投与される。

ｂＦＧＦは、その意図された目的を達成するいかなる手段によって投与されても よい。例えば、投与は、皮下、静脈内、筋肉、腹腔内、鼻腔内、経皮又は経頬と いったさまざまな非経口投与であってよい。

代替的には又は同時に、投与は経口的なものであってもよい。非経口投与は、巨 丸剤注射又は経時的に段階的にがん流によるものであってよい。

１体臼又は二体五で投与されるｂＦＧＦ又はＣ３Ｆといった付加的因子（以下参 照）の用量は、被移植者の年令、性別、健康状態及び体重、同時進行治療がある 場合にはその種類、治療の頻度及び望まれる効果の性質によって異なる。以下に 提供されている有効量の範囲は、発明を制限するものではな（好ましい用量範囲 を表わしている。しかしながら最も好ましい用量は、当業者であれば理解し決定 できるように、個々の被検者に合わせて調整されることになる。

非経口投与のための製剤には、当該分野において知られている補助剤又は賦形剤 を含みつる無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。錠 剤及びカプセルといった薬剤も同様に、日常的方法に従って調製可能である。

骨髄ドナー又は被移植者のいずれかにおいて骨髄の成長を促進するのに投与され る場合、ｂＦＧＦは、有効量好ましくは体重１ｋｇあたり約ｏ、ｉｍから約２０ ＋ａｇの範囲内の有効量で投与される。

二体恐で骨髄間質細胞又は始原細胞の成長を促進するために用いられる場合、ｂ ＦＧＦは好ましくは０．０１〜１０［／Ｌの最終濃度を達成するよう培地に付加 される。

塩基性ＦＧＦは同様に、悪性疾患のための化学療法の後の果粒法の生産を高める ためにも用いられる。好ましくはｂＦＧＦは、化学療法の骨髄抑制作用又は上述 の既知のその他の骨髄抑制原因の結果でありうる感染から患者を保護するため、 体重１ｋｇにつき約０．１μｇから約２０μｇの用量で投与される。

骨髄細胞の生産を高めかくして骨髄移植を受ける患者の造血再構成を促進するた めには、ｂＦＧＦ又はその機能的誘導体く以下に規定されているような）は、好 ましくは、各製剤につき体重１ｋｇあたり約０．１μｇから約２０ｍｇの範囲の 用量で投与される。ｂＦＧＦは好ましくは、患者が骨髄が受け入れるよりも最高 １週間前に投与され、この投与は、移植片（ｇｒａｆｔ）の樹立に先立つ「ウィ ンドウ」を著しく短（する。

骨髄移植を受ける患者における骨髄細胞の生産を高めるためのもう１つの方法は 、好ましくは各製剤について体重１ｋｇあたり約０．１μｇから約２０ｍｇの範 囲の容量で、単数又は複数のコロニー刺激因子と組合わセてｂＦＧＦ又はその機 能的誘導体を投与することである。ｂＦＧＦ及びＣ３Ｆの混合物は好ましくは、 患者が骨髄移植を受けるより最高１週間前に投与され、この投与は、被移植者が ｉｉｔ髄抑側抑制は特に感染を受けやすい状態にある期間である移植片の樹立に 先立つ「ウィンドウ」を著しく短縮する。

ここで用いられる「コロニー刺激因子Ｊ　（Ｃ５Ｆ）というのは、造血面を刺激 する当該分野では既知のいずれかのＣ５Ｆ及び関連するサイトカイン及びリンホ カインのことである。このような因子には、ＧＭ　Ｃ５Ｆ、Ｇ−Ｃ５Ｆ、Ｍ　Ｃ ＳＦ、ＩＬ−３、Ｉ　Ｌ−４及びＩＬ−６が含まれるが、これらに制限されてい るわけではない。ＣＳＦ及び造血におけるその役目の論述については、Ｎ１ｅｎ ｈｕｉｓ、　Ａ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎ　、　Ｊ、　Ｍｅｄ、３１８：　９１６−９ １１１　（１９８８年）：Ｂｒａｎｄｔ他（１）　、Ｃｏｓｍａｎ、　Ｄ、、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９：　９ｇ−９８（１９８８年）：及びＤｏｒｓｈｋｉｎ ｄ　（ｌ　）を参照されたい。

本発明の方法は、ｂＦＧＦと組合せた形での単数又は複数のＣ３Ｆの使用を意図 するものである。当業者であれば容易に、望まれる単数又は複数の特定の効果に 応じてＣ３Ｆ又はＣ５Ｆのどの組合せを使用すべきかを決定することができる。

本発明に従うと、骨髄ドナーには、好ましくは体重１ｋｇあたり約Ｑ、１ｊＪｇ から約２０１１１ｇの有効量のｂＦＧＦ又はその機能的誘導体が与えられる。こ の処置は骨髄中の始原細胞の数が増大するのに充分な骨髄を得る時点に先立つ一 定の時点で開始される。好ましい処置時間は骨髄を獲得する前最高２週間の期間 である。ドナーの骨髄中の始原細胞の生産を高めることにより、この処置は骨髄 移植の効率を高めるべく設計されている。

適当な骨髄ドナーが得られない場合、患者自身の骨髄細胞がｂＦＧＦ又はその機 能的誘導体が存在する中で培養され、患者への体内移植のために使用されるべき 原始始原（幹）細胞の次に続く世代のための間質細胞「支持細胞」層を提供する 。間質細胞の培養方法については、本書に参考として内含されているＤｅｘｔｅ ｒ、　Ｔ、Ｍ、ｌ、Ｌｏｎ　Ｔｅｒｍ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ、　ｅｄ、　Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｄ、Ｂ、他、Ｌｉ５ｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ　４４１　（１９８４年）及びＤｏｒｓｈｋｉｎｄ、　 Ｋ、　他、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、　８９：　３７−４７　（１９８６年）に記述されている。以下の例 で記述されているように、ｂＦＧＦを間質細胞培地に添加することが可能である 。代替的には、移植のために用いるべき個体群内の始原細胞数を増大させるよう に、骨髄培養全体に対して直接ｂＦＧＦ又はその機能的誘導体を添加することが 可能である。

骨髄線維症の病因には、骨髄中の過度のｂＦＧＦ生産が関与している可能性があ る。骨髄線維症又はその関連疾患の患者を治療する上で、ｂＦＧＦに対する抗体 又はＦ　Ｇ　Ｆレセプタに対する拮抗物質つる。この化合物はｂＦＧＦを含む数 多（の成長因子と結合し、最近はガン患者の治療にも用いられてきている（Ｒｏ ｃｈａ、　Ｒ，Ｖ、　他、左ン貴ｌ■：　１０５−１１５　（１９９０年）ａ本 発明の好ましい被験動物は哺乳類である。「哺乳類」というのは、哨乳綱に属す る個体を意味する。本発明は、獣医学的使用をも意図しているものの、人間の被 検者の治療に特に役立つものである。

ｂＦＧＦに加えて、本発明は、本書に記述されている全ての用途のために類似の 生物活性をもつその他の線維芽成長因子及びその機能的誘導体を包含するもので ある。同様に、活性のあらゆる形態のＦＧＦ　Ｉ−ランスクリプトから誘導され たＦＧＦ、ＦＧＦ活性をもつ全ての突然変異タンパク質及びＦＧＦレセプタと相 互作用しつる全ての分子も意図されている。当該技術分野において知られている その他のＦＧＦとしては、酸性ＦＧＦ、ｈｓｔ／に−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ −５，１ｎｔ−２が含まれる（Ｒｉｆｋｉｎ、　Ｄ、Ｂ他、凱巳参照）。

同様に本発明の範囲内で意図されているのは、１７．８．２２．５．２３．１及 び２４．２ｋＤａといった分子量を有するもののようなりＦＧＦの代用分子形態 である。１７．８ｋＤａのｂＦＧＦタンパク質は、以前に予測されたメチオニン （ＡＵＧ）コドンで翻訳的に開始され、一方２２．５ｋＤａ　、２３．１ｋＤａ 及び２４．２−ｋＤａのタンパク質は異常な非−ＡＵＧコドンで開始する。さら に高い分子量形態は、１８ｋＤａのｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの共直線性Ｎ末端延長である （本書に参考として指示されているＦｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚ　＠、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ’ＩＡｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８６：　３９７８−３９８１　（１ ９ｇ９年））、。

組換え型又は純化された無傷のｂＦＧＦの代用としては、ｂＦＧＦ分子の機能的 誘導体を用いることが可能である。例えば、ヒトｂＦＧＦの一次的構造的立体配 座及び生物学的特性の一部又は全てを有する組換え型ｂＦＧＦ類似体を記述して いるアラカワ化の欧州特許公報ＥＰ３２０１４８号を参照されたい。これらの類 似体においては、天然に発生する塩基性線維芽細胞成長因子のシスティン残基の 少な（とも１つが異なるアミノ酸残基で置換されている。

本発明に従って使用できるもう１つの形態のｂＦＧＦば、５ｅｎｏ。

他の欧州特許公報ＥＰ２８１８２２号に開示されている。開示されている突然変 異タンパク質には、天然に発生する化合物と同じ活性を有するものの（例えばタ ンパク質活性を低下させる立体配座などの）望ましくない三次構造の形成を結果 としてもたらすシスティン残基その他の残基を介して分子間架橋及び分子間連鎖 を形成することのできない、修飾された微生物学に産生された生物活性タンパク 質が含まれる。

「機能的誘導体」というのは、以下に定義づＬＪされるようなＦＧＦの好ましく はｂＦＧＦによる「断片」、「変異型」、「類似体」又は「化学的誘導体」のこ とである。ｊつの機能的誘導体は、本発明に従ってその効用を可能にするｂＦＧ Ｆの機能の少なくども一部分を保持する。

ｌ）トＧＦの「断片」は、分子のあらゆるサブセットつまり比較的短いペプチド のことを言う。

ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの「変異型」というのは、ペプチド全体又はその断片のいずれか に本質的に類似する分子のことである。変異型ペプチドは、当該技術分野におい て周知の方法を用いて、変異型ペプチドの直接化学合成によって便利に調製する ことができる。

代替的には、ペプチドのアミノ酸配列変異型は、合成ペプチドをコード化するＤ ＮＡ内の突然変異によって調製できる。、１：のような変異型には、例えばアミ ノ酸配列内の残基からの欠失（損）又はこれらの残基の挿入又は置換が含まれる 。最終的な構成が望ましい活性を有することを条件として、最終的構成に到達す べく欠失、挿入及び置換のいかなる組合せを行なうことも可能である。明らかに 、変異型ペプチドをコード化するＤＮＡ内で行なわれることになる突然変異は読 取り枠を変えてはならず、好ましくは二次ｍＲＮＡ構造を生成する可能性のある 相補的領域を生み出さない。

遺伝子レベルでは、これらの変異型は通常、ペプチド分子をコード化するＤＮＡ 内のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎ　’４、ＤＮＡ　 ２：　１８３　Ｆ１９８３年）で例示されているような）によって調製され、か くして変異型をコード化するＤＮＡを生成しその後組換久型細飽培養内でこのＤ ＮＡを発現する。変異型は代表的には非変異型ペプチドと同じ定性的生物活性を 示す。

ｂＦＧＦの「類似体」というのは、分子全体又はその断片のいずれかにかなり類 似した非天然分子のことである。

ｂＦＧＦの「化学的誘導体」には、通常ペプチドの一部ではない付加的な化学的 部分を含む、ペプチドの共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれている。このよ うな修飾は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反 応できる有接誘導体合成剤と反応させることによって分子の中に導入されうる、 システイニル残基は、クロロ酢酸又はクロロアセ！・アミドとい−〕だアルファ ハロ酢酸塩（及び相応するアミン）と反応させられるのが最も一般的である。シ ステイニル残基は同様に、プロ丁−１リフルオロアセトン、アルファーブロモ− ベーター（５−イミドジイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アル キルマ１ノイニミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリ ジル・ジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩、２−＝クロロメルクリ＝ ４−二トロフェノール、又はクロロ−７−二トロベンゾー２−オフサ−１，３− ジアゾールとの反応によっても誘導体合成される。

ヒスチジル残基は、ｐＨ５，５−７，０でジエチルピロカルボネートとの反応に よって誘導体合成されるが、これはこの製剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特 異的であるからである。

臭化パラブロモフェナシルも同じく有効である。この反応は好ましくはｐＨ６， ０でＯ，ＬＭＯカコジル酸ナトリウム中で行なわれる。

リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又はその他のカルボギシル酸無水物と 反応させる。これらの製剤との誘導体合成は、リジニル残基の電荷を逆転させる 効果をもつ。アルファーアミノ含有残基の誘導体△成のために適したその他の適 切な試薬としては、ピコリンイミド駿メチルなどのイミドエステル；リン酸ビリ ドキサル；ビリドキザル；クロロ水素化ホウ素ニトリニトロベンゼンスルホン駿 、０−メチルイソ尿素；２．４ペンタンジオン；及びグリコキシＬ−１〜とのト ランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。

アルギニル残基は、フェニル−グリオキサル、２，３−ブタンジオン、］、］２ −シクロヘキサンジオンびニンヒドリンなどの単数又は複数の従来の試薬との反 応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体合成は、グアニジミノ官能基の 高いｐＫａのため反応をアルカリ性条件内で行なうことを必要とする。さらにこ れらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応し つる。

チロシル残基自体の特異修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメ タンとの反応によってチロシル残基内にスペクトル櫻識を導入する上での特別な 関心を寄せて、広範に研究された。最も一般的には、０−アセチルチロシル種及 び３−ニトロ誘導体をそれぞハ形成博”るため、Ｎアセチルイミジゾル及びテト ラニトロメタンが用いられる。

１−シロ口へキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド 又はＪ−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルポジイミ １ζなどのカルボジイミド（Ｒ”　−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’　）との反応により、カ ルボキシ側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）が選択的に修飾される。さらに 、アスパルチル及びヴルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、ア スパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。

グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば、相応するグルタミル及びア スパルチル残基に脱アミド化される。代替的には。

これらの残基は、弱酸性条件内で脱アミド化される。これらのいずれの形態の残 基も本発明の範囲内に入る。

二官能性剤での誘導体合成は、非水溶性支持基質又はその他の巨大分子担体に対 してペプチドを架橋結合するのに有効である。一般に用いられる架橋結合剤には 、例えば、１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルア ルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチ ル酸とのエステル、３．３′−ジチオビス−（スクシンイミジルプロピオン酸） などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス −Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドなどが含まれる 。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］ブロビオイデートなどの誘導 体合成剤は、光が存在する中で架橋結合を形成することのできる光活性化可能な 中間体を生成する。代替的には、臭化シアンにより活性化された炭水化物などの 反応性非水溶性基質及び米国特許第３．９６９，２８７号、３，６９１，０１６ 号、４，１９５．１２８号；４，２４７，６４２号：４．２２９，５３７号；及 び４，３３０，４４０号に記述されているような反応性基質がタンパク質の固定 化に用いられる。

その他の修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はチオニル 残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジンの側鎖の アルファアミノ基のメチル化（Ｔ、ＥＣｒｅｉＨｈｔ、ｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ、 ５：、Ｓ−１−ｒｕｃ−ｊ；旦Ｈｅ　ａ　ｄ、Ｍｏ１ｅ　ｃｕｌｅ−アｒ　ＱＪ ）　ｅ　ｒ杏±生■B Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｐｍａｎ　＆　ＣＯ，、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ｌ）［ ）、　７９−８６　（１９８３）ｌ、Ｎ末端ア：ミンの７セチル化及び成る種の 場合におけるＣ−末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

このような誘導体合成さｔ）た部分は、可溶性、吸収性、生物学四半；成期など を改善することができる。これらの部分は代替的には、タンパ、り質などの望ま しくないあらゆる副作用を除去するかヌは減衰させることができる。このような 効果を媒介することのできる部分は、例λば肚鮭ゴ↓９正Ｌ−リｙ１凹些ぢ二色 り一鈍籾匹旦Ｈ，１６ｔｈ　ｅｄ、。

ＭａｃＲＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ１ｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８ ０年）の中で開示されている。

以下の例は本発明を例証するためのものであり、本発明を眼定するものではない 。

門 回よ」」−■ド旦、堅九ｊ！ＪｌｔＪ引乱０五朋１１ヒト骨髄間質細賂に対する ｂＦＧＦの効果を、このような細胞を充分な数だけ得るという開閉の克服手段と して検討した。

Ａ、材■考方４ 組換λ−型ヒトｂＦＧＦはＳｙｎｅｒｇｅｎ　Ｈｎｃ、　（Ｂｏｕｌｄｅｒ、　 Ｃｏ）から得た。

トリプシン、ヘパリン及びヒドロコルチゾンはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から得た。アルファ最小必須培地（ａ　 Ｍ　Ｅ　Ｍ　）はＦｌｏＷ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＭｃＬｅａｎ、　Ｖ Ａ）から得た。ウシ胎児血清はＡｒｍｏｕｒＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｇ ｏ　（Ｋａｎｋａｋｅｅ、　Ｉｆ、）から又ウマ血清はＧ　Ｉ　Ｂ　Ｃ０（Ｇｒ ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）から入手した。

ヒト骨髄間質細胞は、インフォームドコンセントを得て健康な成人ボランティア から入手した。被膜細胞は、１２．５％のウシ胎児血清、１２５％のウマ血清、 １０−’Ｍのヒドロコルチゾン、１０”’Ｍの２−メルカプｆｊ−タノール、１ ６ｎｂ４のグルタミン及び抗生物質を含むαＭＥＭから成るｒ間質培地」中に３ 　Ｘ　１．　Ｏ’　ｌｄの濃度で接種した。２〜３週間以内に粘着細胞層が一層 得られた。大量洗浄によって非粘着細胞麿を除去し、細胞を追い出すための０４ ０２％のＥＤＴＡを含む０．２５トリプシンでまず処理することによって粘着細 胞層を継代さぜた。ｔ）ＦＧＦを指示ａ度で添加した。を髄間質細胞の成長に対 するｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの効果を試験する時点で４８時間の間隔で新鮮な「間質培地 」を添加した。

Ｂ、■ １　胆３ヱ 培地内の骨髄間質細胞の形態学に対するｂＦＧＦの効果は図１に示すように、印 象的なものであった。細胞がさらにコンバクＬ・な形態を有するようにｂ　Ｆ　 Ｇ　Ｆで間質細胞の細長い線維芽細胞形態を変化させた（図１８及び１ｂ）。ｂ ＦＧＦは同様に、細胞の集密的培養の外観も変化さセた。ｂＦＧＦが存在する場 合、細胞は多層の形で高密度まで成長し、一方ｂＦＧＦの無い状態に維持された 子の対照物は低い細胞密度で接触阻止されたく図ＩＣ及びｌｄ）。

２　録 ｂＦＧＦを添加すると、−次間質細胞層の密度が増加した、−次骨髄被膜細胞を 、Ｏｎｇ、０．２％ｇ、２Ｂ又は２０ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中で３５ｍ ｍの皿１枚につき１−あたり３Ｘ１０’個の細胞の割合で「間質培地」内に接種 し、１５日後に複製皿上の細胞数を決定した。表１に示されているように、細胞 を２０ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中で培養した場合、細胞密度の５倍の増加 が見られた；０．２ｎｇ／−のｂＦＧＦは細胞密度をほぼ２倍にした。

艮１ 一次骨髄間質細胞の成長に対するｂＦＧＦの効果ｂＦＧＦが存在しない状態又は 指示された濃度のｂＦＧＦが存在する状態で３５ｍｍのベトリ皿１枚あたり３Ｘ １０’個の細胞の割合で間質培地内に一次骨髄被膜細胞を接種した。複製皿上で １５日後に細胞数を決定した。

ｂＦＧＦが存在する中で連続的に間質細胞を培養すると、その老化は著しく遅ら された。

間質細胞は、制限された増殖能を有し、約２世代後に老化したが、一方ｂＦＧＦ の存在する中で連続的に培養された細胞は、表２に示されているように約２６世 代存続した。

表呈 骨髄間質細胞の老化に対するｂＦＧＦの効果実験番号　対　照　ｂＦＧＦ処理さ れたものＩ　ＮＤ’　２９ ２　３．１　２１．８ ３　０．８　１６．８ ６　２、２　ＮＤ （ａ）測定されず 骨髄は、６名の健康なボランティアから取り出し、ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆの無い状態及 び２０ｎｇ／ＮＩのｂＦＧＦが連続的に存在する状態で培養した。１０〜１３日 の間隔で、単層をトリプシンで取り出し、７５ｃｍ”のフラスコに１．３Ｘ１０ ’の細胞を添加した。このプロセスを、細胞成長が止まるまで連続させた。

成長に対する刺激効果は、培養内で継代された間質細胞層を次にｂＦＧＦに露呈 させた時点でも見られた。図２は、付加に先立って３回継代させられた間質細胞 に対するｂＦＧＦの濃度変化の効果を表している。９日間、２０ｎｇ／−のｂＦ ＧＦで処理した皿には、未処理の培養内に見られるような細胞数の１０倍の細胞 が含まれていた。低濃度のｂＦＧＦ　（０，２ｎｇ／−）も同様に細胞の成長を 著しく強めた。

間質細胞は、図３に示されているように、１０％のウシ胎児血清が補足されたＲ ＰＭＩ−１６４０培地内で培養された場合、きわめて制限された増殖能を有して いた。この培地に対して２０ｎｇ／ｍ／の割合でｂＦＧＦを付加すると、間質細 胞の増殖能は大幅に増大した；例λばｂＦＧＦを伴って９日間培養した後、細胞 数の１２倍の増大が見られた。２０ｎｇ／ｄのｂＦＧＦが存在する中で培養され た細胞は、ｂＦＧＦ無しの「間質培地ｊ内のものに比べて速い速度で成長する。

しかしながら、ＲＰＭＩ−１６４０＋ｂＦＧＦ内で培養された細胞はど高い最終 密度に達しなかった。

ヘパリンはｂＦＧＦによる成長刺激の効果を増強した。図４に示すとおり、２　 ｎｇ／−のｂＦＧＦと２０μｇ／−のヘパリンが存在する中で培養された細胞の 成長速度はｂＦＧＦが単独で存在する中で培養された細胞の成長速度よりもかな り高いものであり、２０ｎｇ／ｄのｂＦＧＦが存在する中で培養された細胞の成 長速度よりも幾分か高いものであった。２０［／−の割合でのヘパリン単独では 、細胞の成長に対する効果はほとんどなかった。

間質細胞の成長に対するｂＦＧＦの効果は完全に可逆的であった。５週間にわた る２回の継代について２０ｎｇ／−のｂＦＧＦが存在する中で培養された細胞は 、図５に示されているように、単層のトリプシン処理及び継代に先立ち除去され た。これとは対照的に、ｂＦＧＦを短時間間質細胞に添加した場合、著しい成長 刺激効果が見られた。

ｂＦＧＦに対する短時間の露出でさえ、細胞の成長を刺激した（図６）。ｂＦＧ Ｆを２４時間細胞に添加した後これを取り出し正規の間質培地と置換した場合、 ３倍の細胞数増加が見られた。

ｂＦＧＦが存在する中で培養された細胞は、対照培地内の細胞よりもはるかに高 い密度に達した（図７）。同様に、ｂＦＧＦが存在する中で培養された細胞は、 老化が発生しないうちにはるかに多（の回数継代させることができた。老化は、 ｂＦＧＦ無しで培養された細胞については約２世代であったのに比べ、約２６世 代の後で起こった。従って、これまで不可能であった大量のヒト骨髄間質細胞の 生成のために、塩基性ＦＧＦを使用することが可能である。

ｂＦＧＦは、培地内に放出される造血細胞の数を増大させたことも留意すべきで ある（図８）。これらの条件の下で塩基性ＦＧＦは、間質細胞層と結びつけた造 血始原細胞の生成をも著しく刺激する。

細胞培養に低濃度のｂＦＧＦを添加した結果として、培地内に注ぎ込まれる果粒 法の百分率は増大した（図９）、この実験は、ｂＦＧＦが骨髄系統の細胞の生産 を高めることを実証している。骨髄移植後又は悪性疾患のための化学療法の後の 果粒法の生産増大は、患者を感染から保護する。試験された全ての濃度でｂＦＧ Ｆは、二止恐のＣＳＦに応答することのできる始原細胞の生成を刺激した（図１ ０及び図１１）、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、及び５６３７−ならし培地（ＣＭ ）は全て骨髄始原細胞の成長を刺激した。ＧＭ−ＣＳＦはＧ−ＣＳＦに比べより 多（の始原細胞に対し作用し、５６３７−ＣＭは異なるサイトカインの混合物を 含んでいる。従って、ｂＦＧＦを伴って培養された細胞の培地内に存在する始原 細胞は、骨髄由来のものであった。

培養中のｂＦＧＦの存在は、間質細胞層内の始原細胞含有フォーカス（ｆｏｃｉ ）の数を増加させた（図１２）。ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆは、粘着間質τ内の始原細胞の フォー・−カスの発達を促進し、間質細胞層と結びついた造血を高めた。

Ｃ１直江 塩基性ＦＧＦはこれまでに、数多（の中胚葉由来細胞についての有効な分裂促進 因子であり、成る種の培養された細胞内で老化を遅延させることが示されてきた （Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　ｆｆｌ、動画口：８５−１１８　（１９７８年 ）　；　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ　ｆｊｇ、　Ｉｎ　Ｆｏｒｄ　Ｒ，Ｊ、及 びＭａｉｚｅｌＡ、Ｌ、　（ｅｄｓ）、　Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ 　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ。

Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５年、ｐｐ　１０９− １３；　ＧｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃＺｆＩ！！、Ｅｎｄｏｃｒ、　Ｒｅｖ、　８ ：　９５−１１４　（１９１１７年）。

本発明者らは、０．２ｎｇ／−という低い濃度で、ｂＦＧＦは骨髄間質細胞のた めの有効な分裂促進因子であることを立証した。ｂＦＧＦは又、骨髄間質細胞の 培養により達成される最終的密度をも高め、その結果細胞は密度の高い多層シー トを形成し形質転換された形態を有することになる。長い時間ｂＦＧＦに露出し た後、ｂＦＧＦをひとたび培地から除去し細胞をトリプシン処理させ継代させる と、細胞の成長速度は、未処理の細胞のものと比較できる速度まで戻る。

ｂＦＧＦが細胞基質内に存在するヘパラン硫酸に結合すること、又ヘパリン及び ヘパラン硫酸との相互作用がｂＦＧＦをタンパク質分解劣化から保護することが 実証されてきた（Ｓｏｍｍｅｒ、　Ａ　他、ムＣｅ１１．　Ｐｈ　５ｉｏ１．１ ３８：　２１５−２２０　（１９８９年）　；　５ａｋｓｅｌａｌ、Ｊ、　Ｃｅ １ｌ氾且り朋７：　７４３−７５１　（１９８８年））。ｂＦＧＦの基質（マト リックス）結合は成長因子のタンク（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を提供することがで き、また、細胞の表面上の親和力の高い特異的レセプタのための連続的リガンド 供給源を提供することができる（Ｍｏｓｅａｔｅｌｌｉ、　Ｄ、、　Ｊ。

Ｃ：ｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、　１０７：　７５３−７５９　（１９８８）；　Ｆｌａ ｕｍｅｎｈａｆｔ、　Ｒｉ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ肋Ｌ■医工±ニア５〜８１　（１９ ８９年）、ここでは、間質細胞の過渡的（４時間の）露呈の後に著しい成長刺激 が続（ことが示された。

ヘパリンは、それがｂＦＧＦをタンパク質分解による劣化から保護することが考 えられる理由となって、ｂＦＧＦの成長刺激効果を増強させる。

骨髄間質細胞は、造血システムめ必須の構成要素であり、造血幹細胞の成長及び 分化に必要なコロニー刺激因子の供給源として知られている。

塩基性ＦＧＦは、ウシ骨基質製剤から分離されてきており（Ｈａｕｓｃｈｋａ、 　５ｖｆｌ！！、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６１：　１２６６５−１２ ６７４　（１９８６年）、造血システムの間質細胞成分の機能及び増殖のために 必要な重要な因子でありうる。

間質培地に添加された場合ｂＦＧＦが二体恐での多数のヒト線維芽細胞の成長を 可能にするという事実は、骨髄生理学に関連するさまざまなサイトカインに対す るその応答性を調査するためのより容易に利用可能なこれらの線維芽細胞の供給 源を提供する。

本発明について充分に記述した今、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から 逸脱することな（、また、不当な実験を行なうことなく、広範囲の等価のパラメ ータ、濃度及び条件内で同じことを実施できることが評価できるだろう。

本発明は、その具体的な実施態様に関連して記述されてきたが、さらなる変更も 可能であることがわかるだろう。本出願は、一般に本発明の原則に従った、そし て本発明の関連する技術分野における既知の又は慣習的実践の範囲内に入り添付 の請求の範囲内で以下に規定される上述の基本的特徴にあてはまりつるような本 開示のあらゆる変形態様、用途又は適合化を網羅することを意図したものである 。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ 時間（日数） 細胞数ＸＩＯ’ ｂＦＧＦ（ｎｇ／ｍｌ　） ０　２　４　６　８　Ｔ。

時間（退散） −ｂＦＧＦ　ｎｇ／ｍｌ−一− −ｂＦＧＦ　ｎｇ／ｍｌ−一− −ｂＦＧＦ　ｎｇ／ｍｌ−一− ＦＩＧ、７１ 退散 ＦＩＧ、１２ ｂＦＧＦ（ｎｇ／ｍｌ） 要　約 培養骨髄中に造血始原細胞を生成させる際にフィーダー細胞（支持細胞）として 有用な多数の骨髄間質細胞の産生を刺激する、塩基性線維芽細晧成長因子（ｂＦ ＧＦ）を生体外で用いる。ｂＦＧＦの影響下で培養された骨髄細胞を自己由来の 又は異種の骨髄移植に用いる。骨髄の移植定着率を促すために、骨髄移植の被移 植者にｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆを１種以上のコロニー刺激因子と共に投与する。それに替 わるか、またはそれに付加的に５提供される骨髄中に存在する造血始原細胞の濃 度を増加させるために、骨髄提供者にｂＦＧＦを投与する。塩基性ＦＧＦはまた 、コロニー刺激因子及びインタヘロイキンのような内因性サイトカインを刺激す る目的で形成不全状態の患者に投与される。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１２月８日

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．有効量の線維芽細胞成長因子、その機能的誘導体又は線維芽細胞成長因子活 性をもつあらゆる分子と骨髄成長因子を接触させることを含む、骨髄細胞の成長 及び／又は分化を刺激する方法。
2. ２．前記接触が生体内で行なわれる、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記接触が生体外で行なわれる、請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．前記線維芽細胞因子が、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因 子、ｈｓｔ／Ｋ−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５及びｉｎｔ−２、又はその機能 的誘導体より成る群から選択される、請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．前記線維芽細胞成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体 である、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記線維芽細胞成長因子又はその機能的 誘導体の１７．５キロダルトン、２２．５キロダルトン、２３．１キロダルトン 及び２４．２キロダルトン形態より成る群から選択される、請求の範囲第５項に 記載の方法。
7. ７．有効量の線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体と間質細胞を接触させる ことを含む骨髄間質細胞の成長を刺激する方法。
8. ８．前記接触が生体内で行なわれる、請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．前記接触が生体外で行なわれる、請求の範囲第７項に記載の方法。
10. １０．前記線維芽細胞成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成 長因子、ｈｓｔ／Ｋ−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５及びｉｎｔ−２又はその機 能的誘導体より成る群から選択される、請求の範囲第７項に記載の方法。
11. １１．前記線維芽細胞成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導 体である、請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記線維芽細胞成長因子又はその機能 的誘導体の１７．５キロダルトン、２２．５キロダルトン、２３．１キロダルト ン及び２４．２キロダルトン形態より成る群から選ばれる、請求の範囲第１１項 に記載の方法。
13. １３．有効量の線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体を含む培地内で骨髄細 胞を培養することを含む、生体外で骨髄細胞個体群内の造血始原細胞数を増大さ せる方法。
14. １４．前記線維芽細胞成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞 成長因子、ｈｓｔ／Ｋ−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５及びｉｎｔ−２又はその 機能的誘導体より成る群から選ばれる、請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．前記線維芽細胞成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導 体である請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記線維芽細胞成長因子又はその機能 的誘導体の１７．５キロダルトン、２２．５キロダルトン、２３．１キロダルト ン及び２４．２キロダルトン形態より成る群から選ばれる、請求の範囲第１５項 に記載の方法。
17. １７．線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体と少なくとも１つのコロニー刺 激因子の組合せの有効量を被検体に投与することを含む、被検体内の移植された 骨髄細胞の移植を促進する方法。
18. １８．前記線維芽細胞成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞 成長因子、ｈｓｔ／Ｋ−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５及びｉｎｔ−２又はその 機能的誘導体より成る群から選ばれる、請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．前記線維芽細胞成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子又はその機能的誘 導体である、請求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記線維芽細胞成長因子又はその機能 的誘導体の１７．５キロダルトン、２２．５キロダルトン、２３．１キロダルト ン、及び２４．２キロダルトン形態より成る群から選ばれる、請求の範囲第１９ 項に記載の方法。
21. ２１．前記コロニー刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、イン ターロイキン−３、インターロイキン−４及びインターロイキン−６より成る群 から選ばれる、請求の範囲第１７項に記載の方法。
22. ２２．骨髄内造血始原細胞の生産を増大させるのに充分な時間だけ骨髄の収穫に 先行して、有効量の線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体をドナーに投与す ることを含む、生体内で見込みある骨髄ドナーの骨髄内の造血始原細胞の生産を 増大させる方法。
23. ２３．前記線維芽細胞成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞 成長因子、ｈｓｔ／Ｋ−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５及びｉｎｔ−２又はその 機能的誘導体より成る群から選ばれる、請求の範囲第２２項に記載の方法。
24. ２４．前記線維芽細胞成長因子が塩基性線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導 体である、請求の範囲第２３項に記載の方法。
25. ２５．前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記線維芽細胞成長因子又はその機能 的誘導体の１７．５キロダルトン、２２．５キロダルトン、２３．１キロダルト ン及び２４．２キロダルトン形態より成る群から選ばれる、請求の範囲第２４項 に記載の方法。
26. ２６．前記線維芽細胞成長因子と組合せた形で有効量のヘパリン又はヘパリン類 似体を投与することを付加的に含む、請求の範囲第２２項に記載の方法。
27. ２７．患者に有効量の線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体を投与すること を含む、骨髄細胞系統の異形成又は形成不全と結びついた疾病をもつ被検者を治 療する方法。
28. ２８．前記線維芽細胞成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞 成長因子、ｈｓｔ／Ｋ−ｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５及びｉｎｔ−２又はその 機能的誘導体より成る群から選ばれる、請求の範囲第２７項に記載の方法。
29. ２９．前記線維芽細胞成長因子が、塩基性線維芽細胞成長因子又はその機能的誘 導体である、請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. ３０．前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記線維芽細胞成長因子又はその機能 的誘導体の１７．５キロダルトン、２２．５キロダルトン、２３．１キロダルト ン及び２４．２キロダルトン形態より成る群から選ばれる、請求の範囲第２９項 に記載の方法。
31. ３１．前記線維芽細胞成長因子又はその機能的誘導体と組合せた形で前記被検者 に対し少なくとも１つのコロニー刺激因子を投与することを含む、請求の範囲第 ２７項に記載の方法。
32. ３２．前記コロニー刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、イン ターロイキン−３、インターロイキン−４及びインターロイキン−６より成る群 から選ばれる、請求の範囲第３１項に記載の方法。
33. ３３．前記被検体がヒトである、請求の範囲第１項に記載の方法。
34. ３４．前記被検体がヒトである、請求の範囲第７項に記載の方法。
35. ３５．前記被検体がヒトである、請求の範囲第１３項に記載の方法。
36. ３６．前記被検体がヒトである、請求の範囲第１７項に記載の方法。
37. ３７．前記被検体がヒトである、請求の範囲第２２項に記載の方法。
38. ３８．前記被検体がヒトである、請求の範囲第２７項に記載の方法。