CN87105478A - 新颖的神经元营养因子 - Google Patents

Abstract

一种新颖的神经元营养因子，分子量大约为14,400道尔顿，等电点大约为10，通过以下方法制备：将哺乳动物脑组织，特别是牛脑组织匀浆化，对匀浆进行酸沉淀，用阻留范围为5至10千道尔顿的透析膜对上清液进行透析，然后对经透析的上清液进行层析。神经元营养活性组分可用乙酸铵梯度缓冲液对阳离子交换层析柱洗脱以进一步纯化。本发明的神经元营养因子可用于各种神经疾病的治疗。

Description

本发明涉及一种从哺乳动物脑中，特别是从牛的尾状核中分离出来的新的大分子神经元营养因子（SDNF），并涉及一种制备该物质的方法。从化学观点来看，纯化的神经元营养因子是等电点大约为10的碱性蛋白质，用十二烷基硫酸钠SDS凝胶电泳测得其分子量大约与溶菌酶相同，也就是大约为14，400道尔顿。从生物学观点来看，该分子能够在体外培养液中促进神经系统神经细胞的存活。特别是那些中枢神经系统的神经细胞的存活。本发明的神经元营养因子的来源、化学及生物学特性与其它曾报导的被确认的大分子神经元营养因子是有区别的。另外，还确定了SDNF的药物应用方法，该应用方法也构成了本发明的一部分。

神经元营养因子的定义及作用

现在已经确定，在体内及体外哺乳动物细胞的生长及存活系受到一系列大多为蛋白质类或肽类的胞外类似激素的信号的调节，如所知的生长因子等的调节。从生物学上看，每一种生长因子作用在一组特殊的相应靶细胞。

对大分子蛋白生长因子的研究表明，在发育阶段及成熟期促进哺乳动物细胞存活及神经元细胞生长的蛋白生长因子，目前对于神经生物学的研究相当有用。有人提出，在神经系统发育过程中，直接从体液及细胞微环境中分离出的存于体外的神经元营养因子，对于神经元细胞的生存及死亡起到调节作用（Cowan    W.M.et    al.，Science    225：1258，1984）。事实上有些报导说，对于靶衍生的（target-derived）神经元营养因子的神经支配轴突之间生长的竟争，在胚胎发生过程中决定了哪些神经元生存或哪些死亡。在成熟期，情况即使不完全相同，但也是类似的，有人提出神经元营养因子对于维持神经元细胞的生存及大脑正常功能联系是必不可少的。（Varon    S.，Discussions    in    Neuroscience，vol.II，No.3，1985.）因而，神经细胞弱化或死亡（发生于外伤性损伤之后、或病理学过程，如发作或神经变性疾病，以及衰老）会引起体内神经元营养学因子的缺乏或受到抑制。（Varon    S.，ibid;Appel    S.H.，Ann.Neurol.10：499，1981;Varon    S.et    al.，Dev.Neurosci.6：73，1984.）.有些研究者提出，成年的哺乳动物神经元营养因子不单是在外围神经系统也是在中枢神经系统损伤后的修复及再生过程的根源。的确，现代神经生物学技术在动物的中枢神经系统所作的移植及损伤实验中的应用使人们增强了对成年哺乳动物中枢神经系统的修复是可能的这一信念，并且提供了获得正确营养信号是有效的信息（Gage    F.H.et    al.，Nature    308：637，1984）.直至近日，唯一能很好地确定其特性的大分子蛋白神经元营养因子是神经生长因子（NGF）（Levi-Montalcini    R.et    al.，physiol.Rev.48：534，1968;Levi-Montalcini    R.，Ann.Rev.Neurosci.5：341，1982）人们发现NGF在体内及体外，只能促进有限类型的哺乳动物神经元的存活，从而使人们相信NGF仅是一族大分子神经元营养因子（其中每种仅对确定类型的神经元存活起调节作用）中的一种。目前，另外仅有两种大分子神经元营养因子被纯化并且确定其特性，即为睫状神经营养因子（CNTF）（Varon    S.，Discussions    in    Neuroscience，vol.II，No.3，1985;Varon    S.et    al.，Dev.Neurosci.6：73，1984）及由脑中分离的神经元营养因子（BDNF）（Varon    S.，Discussions    in    Ncuroscience，vol.II，No.3，1985;Barde    Y.et    al.，Embo    J.1：549，1982）

以下对这些因子的来源、化学特性及生物学活性作概要的说明。

神经元营养因子的生物测试

体外神经细胞培养系统已被证实为对于组织提取物的神经元营养活性的研究及对于适用于分离或纯化神经元营养因子的复杂手续进行的监测是基本的而又不可缺少的工具。有人作过演示表明，以单层有丝分裂后分离的（postmitotic）神经细胞培养物，置于体外合适的“限制性”培养条件之下时需要外部加入的营养补充物，并对之发生响应。因而，半提纯或提纯的原料制品的神经细胞营养活力的评价可以通过对体外神经元细胞存活的促进能力大小来加以测定。更进一步，对特定的神经元标记（例如神经元丝含量的分析或特定识别标记的分析）常常可用于对形态学判断标准进行支持或确认。

确认神经元营养因子的特性

如前所述，目前所确认的大分子神经元营养因子为神经生长因子（NGF）、睫状神经元营养因子（CNTF）及从脑中分离的神经元营养因子（BDNF）。下面对这些因子的生物学来源、化学特性及生物学活性作分别的说明。

1，神经生长因子（NGF）

来源：NGF最初系于鼠肉瘤性肿瘤中发现（Levi-Montalcini    R.et    al.，J.Exp.Zool.116：321，1951）它从雄性鼠的下颌下唾液腺中分离得到匀质（Varon    S.et    al.，Biochemistry    6：2202，1967），然后又从蛇毒中获得（Angeletti    R.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    65：668，1970）。许多其它的相对富含NGF的来源也有报导，包括在豚鼠前列腺（Harper    G.P.et    al.，Nature    279：160，1979）及人类胎盘（Goldstein    L.D.et    al.，Neurochem.Res.3：175，1978）。据报导在其它组织中还存在有少量的NGF，这些组织包括哺乳动物中枢神经系统（Varon    S.，Discussions    in    Ncuroscience，vol.II，No.3，1985;Hefti    F.et    al.，Neuroscience    14：55，1985）。这些潜在的NGF来源及明显的作用位点之间的生理学上的关系尚不很明了，但是人们普遍认为NGF是那些需要被对NGF发生响应的细胞进行神经支配的各种外围组织分泌的。同样还对由雄性鼠的下颌下腺体得到的NGF的顺序进行测定并进行克隆。（Scott    J.et    al.，Nature    302：538，1983;Ulrich    A.et    al.，Nature    303：821，1983）人类β-NGF基团也被成功地进行了分离，并且进行了克隆。（Ulrich    A.et    al.，Nature    303：821，1983;European    Patent    No.0121388）.

化学特性

对由鼠下颌下腺体获得的NGF的特性了解得最为清楚。鼠腺体NGF为7S蛋白质复合体（分子量约为140，000道尔顿），具有三个亚单位（α、β、γ）并包含Zn⁺⁺。NGF的活力仅与亚单位β（即2.5 SNGF），即系分子量大约为25，300道尔顿（在SDS凝胶电泳中显示分子量大约为12，650道尔顿），等电点大约为9.3的碱性二聚蛋白质。来自于雄鼠下颌下腺体及人类来源（Provenience）或其它来源的β-NGF的顺序已经有人作了报导。（Scott J.et al.，Nature 302：538，1983;Ulrich A.et al.，Nature 303：821，1983）.

生物学活性

来自鼠下颌下腺体的NGF已被用于体外及体内的关于NGF活性的绝大多数研究。

NGF体外生物学活性范围的评定，对初级神经元细胞及在培养物的克隆细胞都作了测定。在体外对NGF发生响应的初级神经元细胞据报导包括位于背侧根部神经节的胎感觉中枢神经元（胚胎期为8-12），位于交感神经神经节的自主性释放出去甲肾上腺素的（noradrenergic）胎儿神经细胞，位于间隔（septum）的胆碱能的神经细胞及发育中的肾上腺嗜铬性细胞。其中感觉中枢及交感神经的神经元依赖NGF而生存并发展，然而胆碱能的神经细胞却似乎不需依赖NGF而生存，然而仅仅为了它们的分化，也可说表型特征在表达是与神经元传递体（neurotransmittor）紧密相联系的。在发育的初始阶段在肾上腺嗜铬性细胞（分离自神经嵴）中加入NGF可导致神经细胞表型的表达。在体外对NGF发生响应的克隆细胞据报导包括分离自神经嵴肿瘤的嗜铬性肾上腺细胞，即为嗜铬细胞瘤细胞（PC12）及人类成神经细胞瘤细胞。当用NGF处理之后，这些细胞从一个高度增生的形式突转成分裂后的神经细胞阶段。

在体内对NGF发生响应的神经细胞据报导包括：背测根部神经节的感觉中枢神经元，交感神经神经元及发生在发育阶段和成年期发生损伤之后的中枢神经系统的胆碱能神经元。对于后种情形，在大脑中施用NGF可促进神经元细胞的存活及表型特征的表达。这些作用与损伤后引起的行为变化的改善有联系。

睫状神经元营养因子（CNTF）

来源：CNTF最初从胚胎组织（E8）从小鸡的（chicks′）眼睛包括脉络膜及有色素的上皮的虹膜睫状体中检测到并提纯。随后，CNTF活性系通过一系列不同的组织提取物，包括成年大鼠坐骨神经及大鼠中枢神经系统伤液，来进行确定。

化学特性

将由小鸡（chick）胚胎眼内的组织提纯的CNTF（按蛋白质表示为大约2×10^-4，按营养活性表示为9%）用SDS凝胶电泳测定分子量为20，400道尔顿，等电点大约为5。分子量与净负电荷都显示CNTF明显地与来自于鼠下颌下的蛋白β-NGF不同。对于来自小鸡（chicks′）眼睛的CNTF的顺序还无人报导，也还没有将制备规模的CNTF从哺乳动物中分离纯化的方法。

生物学活性

生物学研究主要地用小鸡（chicks′）眼睛的提取物，半提纯或提纯的CNTF制品，仅仅于体外进行。在体外，产生响应的神经元包括来源于胎鸡（chicks）的睫状神经节（E8），来源于鼠背侧根部神经节的新生期神经元，及来源于小鸡（chick）E11神经节及大鼠新生期神经节的交感神经（sympathetic）神经元。据报导，这些活性都不能被抗鼠下颌下β-NGF的抗体所阻碍或抑制。CNTF在体内的作用尚未有人报导。

由脑中分离的神经元营养因子（BDNF）

来源：BDNF的活性在来自于C6大鼠克隆细胞系的控制条件的培养基上及在各种动物物种的脑提取物中进行研究。该因子已可从成年猪脑中被提纯。

化学特性

提纯自成年猪脑的BDNF（产量以蛋白质表示为3.8×10^-8，以营养活性表示低于5%），是高度碱性的多肽（p I等电点大于10.1），用SDS-凝胶电泳测定分子量大约为12，300道尔顿。没有文献对该因子的顺序进行了报导。BDNF分子及其提取手续由西德专利申请第DE3213963 AL号描述。

生物活性

生物学活性的研究用猪脑提取原料，半提纯及提纯的BDNF制品仅仅在体外进行。实验显示，对来源于普拉西多氏盘（placode）的感觉中枢神经细胞及来源于神经嵴的感觉中枢袖经细胞的存活有促进作用，并且能够促进轴突的长出及体外视网膜移出物的细胞存活（Turner    J.E.，Develop.Brain    Res.18：251，1985;Turner    J.E.，Develop.Brain    Res.18：265，1985）尽管其化学特性与β-NGF非常类似，但检测不出有交叉免疫反应发生。另外，BDNF对于交感神经神经细胞无作用。对于BDNF体内作用还没有人进行报导。

由哺乳动物脑中分离的新颖的神经元营养因子

本发明涉及一种新颖的神经元营养因子（SDNF），该因子分子量为14，400道尔顿，对于神经系统，特别是中枢神经系统的神经元有活性作用，本发明还涉及制备该因子的方法。

来源及纯化方法

本发明的新颖神经元营养因子可以根据以下的方法而获得，以下的分离方法为构成本发明的一部分。所采用的方法具有的特征为，将哺乳动物，特别是牛的脑子，最好将尾状核在中性条件下打成匀浆，然后在pH4～5进行酸沉淀，然后用分子筛层析法，采用浓度在10    mM至30    mM之间的稀释的缓冲液洗脱剂进行洗脱;活性组分用阳离子交换层析法，采用浓度在0.1M至1M之间的乙酸铵缓冲剂进行梯度洗脱以进一步纯化，然后收集活性组份并且冷冻干燥。

新鲜的及冷冻状态（例如：-70℃）的哺乳动物脑子都能作用。以下所描述的所有纯化步骤最好都在0℃至6℃温度范围内进行。

每一批制品，无论是采用全部或部分动物脑子都要在2或4倍体积的缓冲溶液中打成匀浆，在pH变化为6至7.4的范围内稀释，然后优先采用盐酸酸化至pH为4至5的变化范围内，优先采用pH为4.5，随后搅拌数小时。用离心（例如，40，000rpm，40分钟）分离沉淀物质，将上清液中和并对稀释的缓冲溶液进行透析，最后冷冻干燥。可以将透析范围为分子量在5至10千道尔顿内的透析膜透析。采用分离范围为5，000至150，000道尔顿的固定相进行分子过滤分离。采用浓度变化范围在10    mM至30    mM，pH变化范围为6至7.4的缓冲液对样品进行洗脱。收集生物学活性组份，冷冻干燥，在阳离子交换层析柱上上柱并用浓度在0.1M至1M，pH为6至7的乙酸铵缓冲液进行梯度洗脱。神经元营养活性组份在洗脱剂浓度大约为1M时洗脱，然后再次收集并冷冻干燥。

如果生物学活性物质的浓度已经达到足够的程度，或如果采用其中较少的纯化步骤时，上述方法可在任何纯化步骤下中断。

以下的例子对本发明进行描述，尽管并不对本发明进行限制。

例子

由屠宰场得到新鲜牛脑子，然后在冰上分割尾状核。每批制品大约将150克有尾组织（25～30脑子）与3倍体积的磷酸缓冲液（PBS）打成匀浆（Polytron，setting 6，60 seconds）然后用含苯甲基磺酰氟（PMSF）（0.3mg/ml）及EGTA（乙二醇双β胺基乙醚N，N′-四乙酸）（1mM）的缓冲溶液稀释10倍（pH7.4），用HCl酸化至pH4.5，在冰中维持2小时，随后离心（40，000rpm，40分钟）。收集上清液并中和至（pH7.4），在稀释的PBS1：10（pH7.4）中透析过夜，冷冻干燥后分成若干份并置于-20℃温度下。使用前要立即（Imme-diately），用蒸馏水重新将组份分散至原有的体积的1/10蛋白含量用Peterson G.L.的方法（Anal.Biochem.83：346 1977）进行测定。然后样品在培养基中稀释，用牛血清白蛋白（1mg/ml）浸透的0.45微米Millex滤器过滤，将合适数量的过滤上清液组份加入至无血清中脑细胞培养物中以测定神经元营养活性。根据分子量采用葡聚糖G-150（细颗粒）层析柱（尺寸为8cm×120cm）分离上清液中的组成成份。将冷冻干燥的上清液重新分散在蒸馏水中，并进行上柱（6ml缓冲洗脱液中含大约750mg蛋白质）。洗脱剂缓冲液的毫摩尔组成为（pH7.30）：NaCl，13.68;KCl，0.27;Na₂HPO₄·7H₂O，0.8;KH₂PO₄，1.5。

使用蠕动泵以每小时90毫升的流速对柱进行洗脱。用紫外监测仪在280nm波长下对洗脱液的光学密度进行连续监测。自动收集15ml的组份并在冷冻干燥之后对神经元营养活性进行测试。凝胶过滤层析及组份收集都是在4℃温度的冷房中进行。

从葡聚糖G-150柱上洗脱下的具有生物学活性组份收集后进行冷冻干燥。将冷冻干燥的各组份重新扩散于100μl0.1M的CH₃COO（NH₄），pH6.45。取10μl测定蛋白质。剩下的100μl（1.9mg蛋白质）对TSK-CM-3 SW柱（一种用于高效液相层析HPLC的离子交换柱）进行上柱。用（NH₄）COOCH₃（0.1M-1M），pH6.45对组份进行梯度洗脱，流速为每分钟0.5毫升。缓冲液A：0.1M（NH₄）COOCH₃，pH6.45。缓冲液B：1M（NH₄）COOCH₃，pH6.45。洗脱曲线：0-20分钟，100%A/0%B（isoctatic 同溶剂洗脱）20-40分钟，0%A/100%B（线性）;40-70分钟，0%A/100%B（isocratic同溶剂洗脱）;70-75分钟，100%A/0%B（线性）。组份冷冻干燥后重新分散于0.6ml磷酸缓冲液（10mM，pH5.7）中。

取100μl测定蛋白质含量，剩下材料用于生物测定及SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析。

表1列出分离（纯化）程序的各主要阶段，并对该例的纯化程度（用蛋白质表示），及在纯化过程中可能获得的神经元营养活性的百分产率进行了报导。蛋白质及营养活性产率使该方法区别于用于纯化CNTF及BDNF的其它方法。

表1    牛脑神经元营养因子之主要纯化阶段的数据概要

阶段    总蛋白质（mg）    纯化    专一活性    总量    营养单位

倍数    μg/TU＊    营养单位    回收%

匀浆    11.625    1    -    -    -

酸化沉    750    15.5    6    125，000    100%

淀后的

上清液

葡聚糖    14.7    791    0.3    49，000    39%

G-150

CM-    0.361    32202    0.01    36，100    29%

HPLC

^＊营养单位定义为：可响应最大数目的神经细胞的一半存活的蛋白质浓度（μg/ml）。

化学特性

由匀浆经过酸化沉淀、中和作用及透折获得的上清液组份粗产品的生物学活性对胰蛋白酶（trpsin）是敏感的，表明了该活性分子的本质为蛋白质或肽类。上述上清液提出物粗产品中存在的生物学活性分子的各组份系从葡聚糖G-150柱上洗脱下来，相应的分子量变化范围为10，000至30，000道尔顿（图1）。图1显示总匀浆在酸化沉淀、中和及透析之后所得的牛尾状核上清液在葡聚糖G-150上柱而得到的典型的洗脱曲线，同时还显示了对组份的生物学活性鉴定。制备的条件如上所述。所有各组份均以0.01至10μg/ml范围内的蛋白浓度对其生物学活性进行测定。观察到的活性在图1中用水平线标明。存在于通过葡聚糖G-150柱层析而得到的活性组分的生物学活性分子再从TSK-CM-3    SW柱上用大约1M乙酸铵的缓冲液洗脱下来（图2）。

图2显示了由葡聚糖G-150柱得到的活性洗脱液再从TSK-CM-3    SW柱上洗脱而得到的典型的HPLC洗脱曲线。纯化条件已由上述。所有组份都用0.001至0.3μg/ml变化范围内的蛋白浓度对其生物学活性进行测定。用图表上的水平线来代表由大约1M乙酸铵洗脱的组份中观察到的活性。

后者洗脱时间近似于细胞色素C，表明活性分子的等电点近于细胞色素C，即大约为10-10.5。该特性区别于等电点大约为5的CNTF。用12.5%W/V聚丙烯酰胺凝胶板及（PAGF）根据Laemmli    U.K.的方法（Nature    227：680，1970）配成的含SDS的不连续（discontinuous）缓冲液按照Lee    V.等人介绍的SDS-PAGE的电泳方法（Neuroscience    6：2773，1981）对由主要纯化步骤（上清液提取物在对总匀浆进行的酸沉淀、中和及透析之后通过对葡聚糖G-150及TSK-CM-3    SW上柱而得到）得到的生物学活性物质进行的SDS-PAGE电泳示于图3A。图3A显示了用BioRad标准蛋白质（第1及5行）及由主要的纯化步骤，即，对总匀桨（第2行）进行酸沉淀、中和及冷冻干燥，得到上清液提取物，用葡聚糖G-150柱纯化物（第3行）及用TSK-CM-3    SW柱（第4行），而得到的活性物质（5μg蛋白质/行）纯化物进行的银着色之后进行的SDS-PAGE凝胶电泳的例子。

所用的标准分子量指示物为肌球蛋白（分子量200，000），β-半乳糖苷酶（分子量为116，250），磷酸化酶b（分子量92，500），牛血清白蛋白（分子量66，200），卵白蛋白（分子量45，000），碳酸酐酶（Carbon    anhydrase）（分子量31，000），大豆胰蛋白酶抑制剂（分子量21，500）及溶菌酶（分子量14，400）。用于电泳的缓冲液样品的组成为62.5m    M    Tris[三（羟甲基）-氨基甲烷]（pH6.8），10%W/V

甘油2%W/VSDS（十二烷基硫酸钠）2.5mM    EDTA，2.5mM    EGTA，0.01%溴酸蓝及5%的β-巯基乙醇。

由TSK-CM-3    SW柱得到的生物学活性物质的信号带的移动情况与用标准的溶菌酶（Bio    Rad）（Lysozyme）（Bio    Rad）相近，因而具有的分子量大约为14，400道尔顿。该分子量与其它被确定的神经元营养因子（NGF，CNTF，BDNF）不同。的确事实上，由TSK-CM-3    SW柱洗脱下来的活性物质在SDS-PAGE凝胶电泳上移动的位置与鼠唾液腺β-NGF不相近（图3B）。

图3B显示了用标准Bio    Rad指示物（第1及4行）及2.5μg来源于鼠下颌下腺的β-NGF（第2行）及2.5μg由TSK-CM-3    SW柱（第3行）洗脱下来的活性物质进行银着色后进行的SDS-PAGE凝胶电泳的例子。所用的标准蛋白质如图3A。

NGF移动系在由TSK-CM-3    SW柱洗脱得到的活性分子移动位置的下方。据报导BDNF在SDS电泳中移动的位置与NGF相近。从而进一步表明了由TSK-CM-3    SW柱洗脱得到的活性分子可能不同于BDNF。

生物活性

由纯化的主要步骤（对总匀浆进行酸沉淀，中和及透析得到上清液提出物粗产品，在G-150柱及TSK-CM-3 SW柱上上柱得到洗脱液）的物质的生物学活性常常通过监测其对离体的胎鼠中脑细胞无血清培养的作用而测定。此外，还可以通过对培养系统中的专一的多巴胺能的（dopaminergic）神经元对³H-多巴胺标记的吸收及（GABAergic）神经元的¹⁴C-GABA专一标记的特定摄入进行测定以确认其形态学上的判断。

下面系细胞培养液的制备方法，细胞存活数的计算及细胞培养液的特性及特定的摄入参数以及从纯化工序中在几个主要阶段内所得材料的作用效果。

1.细胞培养物的制备方法及用于评价

在体外的细胞类型的免疫化学标准

在无菌条件下从13天胚胎鼠的脑中分割嘴侧的中脑盖。在用下列毫摩尔组成的PBS溶液：Na Cl，136.8;KCl，2.7;Na₂HPO₄·7H₂O，8;KH₂PO₄，1.5及葡萄糖含量（6mg/ml）和牛的血清白蛋白（0.1mg/ml）（PH7.4）机械分裂混合的脑区。然后将此细胞离心（45转/分钟，离心4分钟），再将它悬浮在培养介质中，通过一个20微米的耐泰克斯过滤器（Nytex filter），用一个分离细胞的计数器计数并铺板在35毫米的佛尔康（Falcon）组织培养塑料碟中。

在每个碟上涂以牛皮肤胶原蛋白（Vitrogen，100微克蛋白质），用伊格尔巴塞尔（Eagle′s    Basal）培养基（BME），（加入）Na    HCO和NaOH以提高离子强度和pH值（埃尔斯泰勒T.等的组织生物学杂志（Elsdale    T.et    al，J.Cell.Biol.54：626，1972）。

此培养基由BEM和用汉姆（Ham）F12（1∶1）的一种混合物构成，用葡萄糖（33mM）、谷氨酰胺（2mM）、NaHCO₃（15mM）海派斯（HEPES）（N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸（10mM）补充，用如戴安泡泽厄U.（Di Porzio U）等（Nature 288：370，1980）所述的用胰岛素（25μg/ml）、铁传递蛋白（100μg/ml）、腐胺（60μM）、黄体酮（20nM）、亚硒酸钠（30nM）、青霉素G（0.5U/ml）和链霉素（0.5μg/ml）补充;且含有T₃（3，3′，5′-三碘代-DL-甲腺原氨酸）（30n M）[皮尔玛罗特J.（Puymirat J.等，Neusoscience 10：801，1983]。典型的，将2毫升含有所需的经分离的细胞数的介质加至每个碟中。

通过利用单克隆抗体RT97对神经丝蛋白质（安德汤B.H（Anderton    B.H.）等，Nature298：84，1982），一种体外特珠的神经元细胞指示剂，如道赫蒂P.（Doherty    P.）等所述的（J.Neurochem.）42：1116，1984）间接免疫荧光法进行体外细胞类型的鉴别。简单地说，在-20℃下将此培养物在甲醇中固定7分钟。通过用在PBS中的0.1%（vol/vol）的三通X-100（一种聚氧化甲烯醚）处理，使此经固定的培养物渗透，然后用含有PBS的10%的小牛胎儿血清（FCS）培养60分钟以阻断非特异性的蛋白质粘合位置。用在PBS中的抗神经元丝状抗体（稀释1∶500）培养，室温下进行60分钟，且然后用含有10%的FCS的PBS冲洗3次。然后在室温下60分钟内将若丹明结合的山羊抗鼠高度亲和性的经纯化的免疫球蛋白G（稀释1∶100）加至培养物中，且在PBS中用10%的FCS冲洗3次以后，用甘油/PBS（1∶1）覆盖，并在一个装有若丹明差向萤光和相对比光学系统的策斯（Zeiss）照相显微镜Ⅲ中检验。根据拉夫M.C.（Raff    M.C.）等所述的方法（Brain    Res，174：283，1979），用鼠GFAP（神经胶质的原纤维酸性蛋白质）抗血清（加至体外的特异的标记星形细胞）及山羊抗鼠高度亲和的经纯化的若丹明-结合的免疫球蛋白G实行免疫萤光法测定。

2.在培养物中用时间来评定细胞存活的方法

在体外试验;根据时间，通过形态学标准（即是，在体外，根据时间，通过相对比显微镜观察存活细胞的数量）和用生物化学法测定DNA含量及用每个碟中存活的多巴胺能的细胞的数量来评定细胞存活。

DNA测定系根据欧文B.G.（Erwin    B.G.）（Anal.Biochem.110-291，1981）所建立的方法，每一碟中多巴胺能的细胞数系根据特定的多巴胺摄入（量）及萤光神经细胞的目测系波尔斯特德G.（BolstadG.）等（Comp.Biochem.Physiol.62：61，1979）所叙述的乙醛酸-诱导的萤光法测定。为了后面的目的，此细胞用一个装有儿茶酚胺差向萤光和相对比光学系统的策斯照相显微镜Ⅲ观察。利用预固定的同等物计算相应于至少3%的总表面积的对GIF显示阳性的经细胞的数量。

3.特异的多巴胺和GABA摄入的评定的方法

如伯杰B.（Berger B.）等（Neuroscience7：193，1982）所述进行特异的³H-多巴胺摄入的评定。此细胞用用葡萄糖（5mM）、CaCl₂（1mM）、MgSO₄（1mM）、抗坏血酸（0.1mM）、帕吉林（Pargyline）（0.1mM）补充的经预热的PBS（液）洗涤一次，并用0.8毫升上述溶液预培养5分钟。必要时，将苯托品（5μM）、去甲基丙咪嗪（5μM）或氟塞丁（fluoxetine）（1μM）加至此培养基中。常规地，然后加入0.2毫升³H-多巴胺（50μM）最终浓度，SA（特异活性）22-33-Ci/mmol），并在37℃下继续培养15分钟。通过移去此培养混合物而停止摄入，然后用冰冷的PBS迅速冲洗4次。然后，用0.5ml0.4M的HCl O₄加无水乙醇（3∶1v/v）从每个碟中萃取H-多巴胺二次。回收超过95%。在添加10ml的InstagelⅡ（一种液体闪光计数液体）之后，用一种派卡德特立卡伯（Packard Tri Carb）闪光计数器（型号460 C）评定放射活性。对培养末期的个别试样和洗液中用0.5ml的高氯酸（0.4N）萃取细胞内的放射活性，并用高压液相色谱法（HPLC）分析（科特克C.（Kotate C.）等，J.Neurosci，2：1307，1982;舒姆A.（Shum A.）等，J.Chromatog，228：123，1982）。在多巴胺滞留时间内聚集的放射活性超过注入的放射活性的95%。

如普罗切恩兹A.（Prochiantz    A.）等所述（Nature    293：570，1981），在37℃下，用添加的0.1μM的¹⁴C-GABA（225mMCi.nmol）测试C-GABA的特异的摄入量15分钟。氨基氧乙酸（10μM）被用于阻止GABA分解代谢。必要时，加入此GABA摄入抑制剂，二氨基丁酸（10^-3M）。洗涤和萃取过程为那些研究H-多巴胺摄入所述的。通过薄层层析（TLC）进行GABA的鉴别（拉谢R.S.（Lasher R.S.）Brain Res.69：235，1974）。超过90%的放射活性与一个具有真实的GABA的点一起移动。

4.在细胞培养系统中的形态学评定，存活性和生物化学性质

在4天和8天体外培养后，存在于碟中的超过98%的粘附生存的细胞对于具有单细胞系的抗体RT97的免疫细胞化学的染色法为阳性免疫反应。同样，在培养物中，少于1%的此细胞，在总的培养时间内，对具有GFAP抗血清的染色法具有免疫反应性的。这表明在培养物中超过98%的此细胞可被分类为神经元的成分。在培养物系统中的多巴胺能激活神经元的数量的显影表明这些细胞近似于存在于体外的总的细胞（繁殖）数量的0.1-0.2%。

在所用的培养物系统中的细胞的存活性在体外多至4天未变。然而，在体外，在4天和8天之间，存活性降至约60-80%。这不仅在形态学评定之后，而且在下列每个碟中的DNA含量和多巴胺能的细胞的数量的评定之后都很清楚。这表面所用的在培养物条件下的中脑神经元细胞的存活性是有限的，且在存在于此培养物系统中的不同类型的细胞的存活性方面无显著的变化发生（参见附图4）。

附图4为一个表示总的神经元的变量、阳性的GIF的神经元的变量和BZT-灵敏的多巴胺摄入的变量和时间关系图。将此中脑细胞放在一种浓度为1×10⁶细胞/35mm碟的培养物介质中。

附图4上显示如下（内容）：

DNA/碟（●-●）;BZT-灵敏的多巴胺摄入（量）（○-○）;GIF⁺细胞的数量/碟（块直方图）;BZT-灵敏的多巴胺摄入（量）/10³GIF⁺细胞（虚线直方图）。

同样确定在培养物中的细胞存活性、⁷H-多巴胺的特异摄入量和在体外、在第4天与第8天之间¹⁴C-GABA降至约60-80%。这又指示着在存在于体外的各种细胞类型之间在特性方面无明显的区别，且意味着这些摄入参数是在体外的细胞存活性的合适的标记。

5.从纯化过程的主要步骤中衍生的物质的生物活性

为此目的，在运用前立即将从纯化的主要步骤中衍生的冷冻干燥分成几部分再悬浮起始体积1/10蒸馏水。根据彼得森G.L（Peterson    G.L.）（Anal.Biochem.83：346，1977）评定蛋白质含量。用培养基稀释试样，通过米莱克斯（Millex）0.45微米的过滤器过滤，并在牛的血清白蛋白（1mg/ml）预饱和。然后，在铺平板那天将适合量的经过滤的物质加至中脑细胞培养物中。同样，将等量的牛的血清加至对照的细胞培养物中在各培养物中，每二天换一次介质或交替地用从纯化步骤中衍生的物质补充或在对照培养物情况下用白蛋白补充。从各主要纯化步骤衍生的物质-在总的匀浆的酸沉淀之后所得到的粗上清液，从分子量范围在10至30千道尔顿内洗脱的萄聚糖凝胶G-150柱中所得到的流份和从用约1M乙酸铵洗脱的TSK-CM-3SW柱所得到的流分-均能提高存活性，即在培养物中的经分离的胎儿的中脑神经元的细胞存活并得到发育。在铺板的（天0）那天起加至培养物介质之后，粗培养物上层流份或白蛋白（对照培养物）在体外细胞培养物的第8天的形态学现象，如附图5A和5B中所示。这些附图描述在添加10μg/ml的在对照培养物（附图5A）中的白蛋白和10μg/ml在酸沉积及渗析总的匀浆液（附图5B）所得到的上层萃取物之后，在体外（试验中），在第8天时（出现）胎儿鼠中脑细胞的典型现象。

同样从总的DNA含量，每个碟子中多巴胺能的细胞的数量（附图6），及根据在体外（试验中）的时间³H-多巴胺和¹⁴C-GABA的特异摄入（量）的测定而得到证实。

附图6表示在将10μg/ml白蛋白加至对照培养物（块直方图）以及添加10μg/ml在酸沉积及渗析总的匀浆液（虚线直方图）后的上清液之后，体外（试验）表明，在第8天时每个碟子中GIF⁺细胞的（例如，DA多巴胺能的）和DNA含量的数量的测定。三个为一组进行分析，所得值±S.E.（意味着标准误差）。附图7表示根据多巴胺摄入的有关量与上层清液浓度的效果。这事实从每个碟子中的GABA和DNA摄入的确定中观察到。

特别是，附图7表示对BZT-灵敏的多巴胺摄入的各种浓度的牛脑的萃取物（在酸沉积及渗析总的匀浆后所得到的）的添加效果。将一种浓度为0.5×10⁵细胞的中脑细胞/1毫升培养物介质/池（24mm）中。在沉积时加入50μl/体积所示量的牛脑的萃取物。必要时，试样用牛的血清白蛋白补充以达到40μg/ml蛋白质的最终浓度。在体外（试验中），在第4天测定摄入参数。三个试样为一组进行分析，所得值为±S.D.（标准偏差）的平均值。同时，这此结果表明活性物质能提高存活和发育在体外（试验中）的各种神经细胞类型，特别是那些存在于所用的培养物中的。尽管当在（提取物的）上清液中，在用10和30千道尔顿（范围）之间洗脱的葡聚糖凝胶G-150流份的池中及在用约1M的乙酸铵洗脱的TSK-CM-3 SW柱的流份组中测试营养活性时，可测得相似的效果，但这些效果必需的物质的量不同。特别是，当在体外（试验时）加入浓度为约6μg/ml的显示一种1/2最大（semimaximal）生物学活性的粗上层萃取物时，可测得在从葡聚糖凝胶G-150和TSK-CM-3SW柱中所得到在流份中的此1/2最大活性分别为约0.3μg/ml和10ng/ml（参见表1）。在体外（试验中）的其它类型的神经元细胞培养物的生物活性的测试，特别是从胎儿鼠纹状体中分化的神经元细胞，表明活性分子在存在于不同区域的神经系统特别是中枢神经系统（CNS）中的各种神经元类型的提高存活和发育方面（的作用）是有效的。进一步讲，在体外（试验中）活性物质在增进来自12天的胚胎小鸡而不是来自8天的胚胎小鸡的背侧神经末梢神经节神经元的神经的生长方面是有效的。这效果再一次表明神经营养因子可以和自鼠唾液腺衍生的β-NGF有区别。实际上，添加各种浓度（从1ng至300ng/ml）的来自鼠唾液腺的β-NGF对在培养物中的常规所用的鼠的经分化的中脑细胞的存活是无效的。

Ⅳ.由哺乳类动物脑中所得到的神经元营养因子在体内的应用

本篇专利的另一个目标是：由哺乳类动物脑中所得到的神经元营养因子在体内的应用，如上面已经讨论过的，神经元营养因子可调整神经细胞的存活和神经对环境的适应性（定义为神经细胞对于它所处的微生物环境的调整适应的能力），它不仅是神经系统的发展方向，而且愈趋成熟。事实上，根据累积起来的证据，可以表明：神经因子可能这样控制细胞的成熟过程：（万隆S.（Varon    S.）discussions    in    Neuroscince第Ⅱ卷，第3篇，1985）。

Ⅰ.维持细胞运转和正常的细胞老熟即：必定是充分地运用神经元营养因子，维持正常的营养需求，因此，体内神经变态的运转就反映了营养剂的不适当。

Ⅱ.对于体内化学和机械的细胞损坏进行修复和重整，因为尤其轴突（神经小胞）的损坏会导致神经元营养因子对神经细胞的供给缺乏，神经细胞会受到创伤或病理性的损伤甚至死亡，这其中可能也包括正常的老熟过程。

Ⅲ.在一些病理条件下，（万隆S.ibid）的再生和死亡，即不同的病理条件伴随不同的营养缺乏症，营养供给系统的衰退或超过营养需要都可能导致营养缺陷。

从上面的观点来看，这篇专利也引导了下列有关亲神经元因子SDNF的应用，特别指出了不经肠胃的用法（包括：虽然并非全部是：包括硬膜外的、脑池内的、心室内的、鞘内的、静脉内的、肌内的、皮下的、舌下的、牙龈间的、直肠的和鼻骨的），SDNF分子单独进入体内或者与神经节苷酯（尤其，牛脑神经节苷酯混合剂，即从牛脑中所得到的单一神经节苷酯片断GM，以及半合成神经节苷酯衍生物，更好的是神经节内酯衍生物），结合使用或和与磷酯（牛脑磷酸酯混合剂，或是单一的牛脑磷酯片断及磷酯酰丝氨酸，或是半合成磷酯衍生物）相结合使用，这取决于神经病理条件：

Ⅰ急性的、亚急性的、或慢性的神经系统损伤;包括外部损伤、化学损伤、脉管损伤及缺损（如中风），以及传染性的、炎性的和因肿瘤引发的损伤。

Ⅱ神经系统的老化：包括阿尔茨海默病。

Ⅲ神经系统的慢性疾病。

Ⅳ神经系统或影响神经系统的免疫学疾病。

SDNF分子与神经节苷酯及磷酯的联合使用结果表明：牛脑神经节苷酯和牛脑磷酯可增加细胞对神经元营养因子的应答活性，这在体外和很有可能在体内的试验当中反应出来。

下面的表格描述了GM，和牛纹状体浸出物对于中脑炎细胞培养的影响。

表2

BIT-灵敏的³H- BABA-灵敏的

DA摄入¹⁴C-GABA摄入

物质    fmol/平板15分钟    pmol/平板15分钟

白蛋白    29.51±5.78    0.56±0.14

白蛋白+GM    69.14±3.38    1.04±0.05

纹状体浸出物    104.68±7.60    2.41±0.27

纹状体浸出物+GM    140.58±17.82    4.56±0.10

＊中脑炎细胞（1×10⁶/平板）在含中白蛋白（15μg/ml）或纹状体浸出物（15μg/ml）的无血清培养基上单独培养，或在培养基中再加入10^-7mGM₁。椐在Ⅲc中报道的摄入量试验的方法，将上述实验进行四天，三个为一组进行分析，所得平均值为±S.E.

牛纹状体浸出物以前面所报导的方法（Ⅲa）进行制备。

a.药剂组成

由哺乳动物脑内所得SDNF分子，再制备药剂，这里不描述了，对于神经节苷酯和磷酯可能是同样的情况，包括我们所知道的合成有效的药剂的方法及对病人的最佳用法都是一样的，这就意味着，大量的SDNF有效活性与合适的药物载体分不开。合适的载体和它们的配方包含一些蛋白质，例如，在“雷明顿（Remington′s    Phaema    ceutical    Sciences”一书（雷明顿的Pharmaceulical    Sciencese.玛克（Mack）印刷公司，伊斯顿（Easton），Pa.美国，1985）.中就有例子。这些载体介质含有可注射的“已存储的配方”。

由上可见，药物配方包括（也不是全部的）：SDNF溶液或是冷冻干燥的SDNF粉末与一个或更多的药物载体或稀释剂一起，该稀释剂保存在一适当pH缓冲剂和等渗性的生理液体中，表3表明的只是说明目的，而不应受这些限制，这些体系制备成溶液的状态，以对付神经系统紊乱者。在冷冻干燥粉剂的制备时，要提供赋形剂，但这不是绝对的，也可采用甘露醇或甘氨酸，并要具备相应的缓冲剂，缓冲剂的体积要求是能够达到等渗性，缓冲剂的pH要求适当，相似的溶液也可以用于SDNF分子的药剂组成物，得在所需的一定体积的等渗溶液中形成，但这也不是绝对的，用磷酸盐或柠檬酸盐缓冲的生理含盐水可得到多种药物配方时所需的等渗溶液，并具一定所希望的pH，如中性pH等。

又为了所述的目的，表4A和4B列出一些治疗神经系统紊乱的可能的药剂组成。在表4A和4B中列出的药剂组成每一剂量用两个小瓶制备。第一个小瓶含有具有约0.01%至50活性物质重量%的一种组成，与一种药物学上可接受的赋形剂，如甘氨酸或甘露醇。第二个小瓶含有一种用配成所需体积的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲的盐水溶液。在使用前混合此两个小瓶中的物质立即使用，且此冷冻干燥的活性物质马上溶解而得到一种可注射的溶液。表4B也列出了用于皮下注射的一种药剂学组成的可能的实施例（系统5）。

此药剂配方也包括，但不限于此，具有亲脂性的例如，水溶性的、自行乳化的糖原白明胶的或其它类型的赋形剂直肠施用的栓剂。在此制备中，SDNF可以重量在总的赋形剂的0.001%和1%重量范围内存在。此栓剂的形式也可含有，但不限于此适合量的乙酰基-水杨酸盐。表5列出，仅为所述的目的，治疗神经系统紊乱的可能的栓剂的制备。

进一步讲，以冷冻干燥的形式和作为溶液的SDNF的药物制备均可包括有效剂量的上述磷脂或神经节苷酯，例如，此剂量可分别与（虽然不是唯一的）通常用于人类治疗神经恢复或由于年老的神经病所用的剂量一样，且可根据施用途径。SDNF的药物学制备剂量和施用次数由所需的效果（由临床试验决定）和施用途径决定，例如，（施用的）剂量和次数可与通常用于用其它神经元营养剂如NGF研究的一样（虽然，不是唯一的）。

表3

用于可注射的溶液的药剂组成的实施例：

制备1-一个2ml的安瓿瓶包含：

活性物质    μg    5    （500TU）

氯化钠    mg    16

柠檬酸盐缓冲剂PH＝7    ml    2

在无热源的蒸馏水    q.b.中

制备2-一个2ml的安瓿瓶包含：

活性物质    μg    100    （10，000TU）

氯化钠    mg    16

柠檬酸盐缓冲剂PH＝7    ml    2

在无热源的蒸馏水    q.b.中

此营养单元（TU）如表1中定义。

表4A

药剂组成系统的实施例

系统1

a）一个2ml的小瓶包含：

冷冻干燥的活性物质    μg    5    （500TU）

甘氨酸    mg    30

b）一个2ml的小瓶的溶剂包含：

氯化钠    mg    16

在水中的柠檬酸盐缓冲剂    ml    2

无热原的蒸馏水    q.b.

系统2

a）一个2ml的小瓶包含：

冻干的活性物质    μg    5    （500TU）

甘露醇    mg    40

b）一个2ml小瓶的溶剂包含：

氯化钠    mg    16

在水中的柠檬酸盐缓冲剂    ml    2

在无热原的蒸馏水    q.b.

系统3

a）一个3ml的小瓶包含：

冷干的活性物质    μg    100    （10，000TU）

甘氨酸    mg    45

b）一个3ml小瓶的溶剂包含：

氯化钠    mg    24

在水中的柠檬酸盐缓冲剂    ml    3

在无热原的蒸馏水    q.b.

此营养单元的单位（TU）如表1中定义。

表4B

药物学组成系统的实施例

系统4

a）一个3ml的小瓶包含：

冻干的活性物质    μg    100    （10，000TU）

甘露醇    mg    60

b）一个3ml的小瓶的溶剂包含：

氯化钠    mg    24

在水中的柠檬酸盐缓冲剂    ml    3

在无热原的蒸馏水    q.b.

系统5（用于皮下注射的实施例）

a）一个2ml的小瓶包含：

冻结的干燥的活性物质    μg    10    （1，000TU）

甘氨酸    mg    30

b）一个2ml小瓶的溶剂包含：

氯化钠    mg    16

在水中的柠檬酸盐缓冲剂    ml    2

无热原的蒸馏水    q.b.

此营养单元单位（TU）如表1中定义。

表5

以用于直肠途径的栓剂形式（存在）的药物学组成的实施例

制备1

活性物质    μg    100    （10，000TU）

可可脂    g    2.5

制备2

活性物质    μg    100    （10，000TU）

卡波蜡1540（carbo    wax）    g    1.75

卡波蜡6000    g    0.75

制备3

活性物质    μg    100    （10，000TU）

吐温61    g    2.125

羊毛脂    g    0.25

制备4

活性物质    μg    100    （10，000TU）

甘油    g    1.5

水    g    0.75

白明胶    g    0.25

此营养单位（TU）如表1中定义。

Claims (30)

1、一种制备分子量大约为14，400道尔顿的碱性蛋白质神经元营养因子的方法，其特征为，所述方法包括如下步骤：(a)哺乳动物脑组织的匀桨化(b)对制得的匀桨进行酸沉淀(c)用阻留分子量范围为5至10千道尔顿的透析膜对得到的上清液进行透析(c)根据分子量的大小对透析得到的上清液进行层析分离。

2、如权利要求1所述之方法，其特征为，还包括以下步骤（e）用乙酸铵缓冲液梯度洗脱的阳离子交换层析法对得到的神经元营养活性组份进行纯化。

3、如权利要求1或2所述之方法，其特征为，其中所述之哺乳动物脑组织为牛脑组织。

4、如权利要求1或2所述之方法，其特征为，将由牛脑分出的尾状核用于上述方法的步骤中。

5、如权利要求1所述之方法，其特征为，步骤（b）在pH4至5的酸度下进行。

6、如权利要求1所述之方法，其特征为，其中的层析分离步骤（d）是用浓度为10n  M至30n  M之间的稀释缓冲洗脱剂在分子筛上进行的。

7、如权利要求6所述之方法，其特征为，采用分离范围为5，000至150，000道尔顿的固定相进行分离。

8、如权利要求2所述之方法，其特征为，用浓度自0.1M至1MpH自6至7的梯度乙酸铵缓冲液洗脱剂对阳离子交换层析柱进行洗脱，而获得神经元营养活性组份。

9、如权利要求1或2所述之方法，其中各步骤在0℃至6℃的温度下进行。

10、如权利要求1或2所述之方法，其特征为，将神经元活性组份收集在一起并进行冷冻干燥。

11、一种分子量大约14，400道尔顿的碱性蛋白质神经元营养因子。

12、如权利要求11所述的神经元营养因子，其特征为，该神经元营养因子的等电点大约为10。

13、如权利要求11所述的神经元营养因子，其特征为，至少具有0.01mg/营养单位的专一活性，所述的神经单位的定义为，使响应于饱和浓度的活性物质的神经细胞存活的量大数目的一半存活时所需蛋白质浓度（μg/ml）。

14、一种神经元营养因子，其特征为，该神经元营养因子为哺乳动物脑尾状核中分离的碱性蛋白质，具有神经元营养活性，其分子量大约为14，4000道尔顿。

15、如权利要求14所述的神经元营养因子，其特征为，其等电点大约为10。

16、如权利要求1所述方法制备的神经元营养因子。

17、如权利要求16所述之神经元营养因子，其特征为，当用葡聚糖G-150进行所述层析分离时，组份用图1中的完全水平线段表示。

18、如权利要求2所述方法制备的亲神经因子。

19、如权利要求18所述的神经元营养因子，其特征为，组份用图2中的完全水平线段表示。

20、如权利要求1或2所述的方法所制备的神经元营养因子，其特征为，该神经元营养因子能够促进神经元细胞的生存及分化。

21、一种含有神经元营养活性数量的如权利要求11所述的神经元营养因子的复合药物，及药物上可接受的赋形剂或稀释用载体。

22、一种含有神经元营养活性数量的如权利要求14或15所述的神经元营养因子的复合药物，及药物上可接受的赋形剂或稀释用载体。

23、一种含有神经元营养活性数量的如权利要求1或2所述方法制得的神经元营养因子的复合药物，及药物上可接受的赋形剂或稀释用载体。

24、如权利要求21至23中任一项所述的药物复合物，其特征为，还进一步包括至少为一种神经节脂或磷脂的组成成份。

25、一种对神经元疾病的治疗方法，其特征为，该方法包括对病人施以有效数量的如权利要求11或14所述的神经元营养因子。

26、如权利要求25所述之方法，其特征为，所述的神经元疾病为在神经系统中发生的外伤性损伤、化学损伤、脉管损伤、脉管短缺、由感染或炎症或肿瘤引起神经系统的损伤。

27、如权利要求25所述的方法，其特征为，所述的神经元疾病是神经系统的老化。

28、如权利要求25所述之方法，其特征为，所述的神经元疾病为慢性神经变性或对神经系统产生影响的慢性免疫学疾病。

29、如权利要求25所述之方法，其特征为，所述的神经元营养因子是根据权利要求1或2的方法制备的。

30、如权利要求25所述的方法，其特征为，所述的神经元营养因子至少是和一种神经节甙脂或一种磷脂一起施用的。

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