TW202114729A - 用於治療神經系統疾病的低唾液酸化之重組人紅血球生成素 - Google Patents

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Abstract

本發明關於生物技術和醫藥領域並描述重組人紅血球生成素之醫藥組成物，該重組人紅血球生成素之特徵在於具有岩藻糖基化之N-聚醣的微觀不均一性(microheterogeneity)，該岩藻糖基化之N-聚醣的微觀不均一性係由二、三和四觸角結構形成，該等觸角結構具有佔總聚醣之40至60%的單和二唾液酸化之唾液酸殘基、佔總聚醣之40至43%的三唾液酸化之唾液酸殘基和佔總聚醣之10至13%的四唾液酸化之唾液酸殘基。該糖基化形式賦予該組成物被容許用於神經系統疾病之性質。本發明亦描述獲得本文所描述之醫藥組成物的方法。

Description

用於治療神經系統疾病的低唾液酸化之重組人紅血球生成素
本發明關於生物技術和醫藥領域，特別是關於具有糖基化形式之重組人紅血球生成素之醫藥組成物的取得，該糖基化形式賦予該醫藥組成物被容許用於神經系統疾病之性質。
紅血球生成素(EPO)為由166個胺基酸形成之糖蛋白激素，其分子量為30.4 kDa(Lanfranco, F and Strasburger, C. J. (2016) Sports Endocrinology 47: 115-27)。EPO在胎兒和圍產期在肝臟之竇周細胞中天然產生，而成年時主要是在腎臟之間質纖維母細胞中產生。該激素刺激骨髓中紅血球產生，且在大腦對神經元損傷之反應中具有重要作用(Sirén L. et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (7): 4044-9)。
EPO為高度糖基化之分子且其碳水化合物部分佔其分子量之40%。該蛋白質含有四條與多肽鏈連接之寡醣的複合鏈，其中三條係藉由N型連接點，一條係藉由O型連接點連接，其位置已由不同的作者充分地描述：Elliott, S. et al. (2004) The Journal of Biological Chemistry, 279(16): 16854-16862；Watson et al. (1994) Glycobiology 4(2): 227-237。具有N型連接點之寡糖可含有可變數量之唾液酸端殘基且對於分泌、分子穩定性、受體結合及活體內活性至關重要(Egrie, J. and Browne, J. (2001) Br. J. Cancer, 84(l): 3-10；Goldwasser et al. (1974) J. Biol. Chem 249: 4202-4206)。
從上一世紀的整個九十年代迄今已累積大量關於重組人EPO(rhEPO)之神經保護性質的證據。在1998年，Sakanara和同事在沙鼠廣泛性缺血模型中證明在頸總動脈阻塞後，透過側腦室供給rhEPO可導致CA1區中對海馬神經元之缺血損傷減少(Sakanara, M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 4635-4640)。
EPO對中樞神經系統之細胞保護作用已在2004年由Maiese和同事們，及稍後在2005年由Viviani和同事們證明(Maiese, K. et al. (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25 (11): 577-83；Viviani, D. et al. (2005) Journal of Neurochemistry 93 (2): 257-268)。由於患者中出現與長期使用造血EPO相關之不良事件，不管在造血EPO之非臨床研究中累積的所有信息，所取得之結果尚未曾重現在臨床上。
在成人中，神經系統中之EPO受體的表現主要在神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中找到，而星形膠質細胞產生之EPO為低唾液酸化之EPO(Nagai, A. et al. (2001) Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 60 (4): 317-319)。
許多研究人員已進行修飾rhEPO之工作以取得具有相同之神經保護性質，但無由該造血作用引起之不良事件的藥物。藉由rhEPO之全酶催化性脫唾液酸化作用所取得之稱為AsialoEPO(US 2004/0122216)的EPO具有所需之上述特性，此種EPO對rhEPO受體具有高親和性，但由於血漿半衰期極短，因而保護作用有限。紅血球生成素之修飾的另一實例為藉由蛋白質之胺基甲醯化來將離胺酸轉化成高瓜胺酸，以產生稱為CEPO之胺基甲酸化的EPO (Leist, M., Ghezzi, P., Grasso, G., et al. (2004) 305 (5681): 239-242)。儘管二種EPO 均顯示無造血作用，但在使用CEPO進行之臨床試驗中，即使未觀察到不良反應，亦未證明神經保護效力。
專利申請案WO 2007/009404申請具有低唾液酸含量之EPO的不同鼻用配製劑(後來在其作者之出版品中稱為NeuroEPO)之專利(García, JC and Sosa, I. (2009), The Scientific World Journal , 9: 970-981)。該rhEPO係藉由中空纖維膜醱酵過程和離子交換層析術純化來分離出最酸性同種型(將唾液酸含量較高者唾液酸含量較低者分開)來獲得。該NeuroEPO具有13個同種型之輪廓，其中有9種與造血rhEPO共享，稱為EPOCIM® 。
本發明之作者最先描述在攪拌槽(ST)中之生產過程，該過程與藉由層析術進行之純化步驟組合，該層析術使用整體管柱作為陰離子交換劑，該陰離子交換劑具有季銨配體Q，其不需額外之化學和遺傳修飾即能增加rhEPO低唾液酸化之同種型的表現。該等同種型在一個範圍內之pH下具有介於4.25至5.85之等電點輪廓，及與糖基化相關之不同於NeuroEPO的三級結構，這使其在活體外和活體內之神經保護和神經修復機制均具有較大的效力。
發明之簡短說明
於一實施態樣中，本發明之目的為一種醫藥組成物，其包含rhEPO作為活性成分，該rhEPO之同種型輪廓的等電點係介於4.25至5.85。該rhEPO具有岩藻糖基化之N-聚醣的微觀不均一性，該岩藻糖基化之N-聚醣的微觀不均一性係由二、三和四觸角結構形成，該等觸角結構具有佔總聚醣之40至60%的單和二唾液酸化之唾液酸殘基、佔該總聚醣之40至43%的三唾液酸化之唾液酸殘基和佔該總聚醣之10至13%的四唾液酸化之唾液酸殘基，及醫藥上可接受之賦形劑。
特別是，在絲胺酸126之O-糖基化位點具有3種唾液酸型(sialoform)，該3種唾液酸型具有0至2個唾液酸殘基，該單唾液酸化之結構佔最大量且佔總聚醣之78至82%，而該無唾液酸化之結構佔該總聚醣的6至10%。
該天門冬醯胺83之N-糖基化位點包含： -具有1和2個唾液酸殘基之岩藻糖基化的二觸角結構，其中該結構佔總聚醣之8至12%， -具有1、2和3個唾液酸殘基之岩藻糖基化的三觸角結構，其中該結構佔總聚醣之17至21%， -具有1至4個唾液酸殘基之岩藻糖基化的四觸角結構，其中該結構佔總聚醣之27至31%，和 -具有第1和2型N-乙醯基乳糖胺之岩藻糖基化的四觸角結構，其具有1至4個唾液酸殘基，該結構佔總聚醣之38至42%。
用於本發明之申請專利的醫藥組成物之醫藥上可接受的賦形劑包括，但不限於生物黏附聚合物，諸如羥丙基甲基纖維素和蛋白穩定劑，諸如L-色胺酸、L-白胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽和L-組胺酸鹽酸鹽。
上述之為本發明醫藥組成物標的之一部分的rhEPO同種型結構賦予該醫藥組成物在活體外和活體內之神經保護和神經修復機制更大的效力。
於另一實施態樣中，本發明之目的為用於獲得未經修飾之rhEPO的方法，其中該醱酵過程係在ST中，在34±2℃之溫度下，使用不含蛋白質且pH值介於7.2至7.3之培養基以灌注模式進行，該培養基係經補充麩胺醯胺直至取得介於8至12 mmol/L之最終濃度。該方法亦包含純化過程，該純化過程具有層析步驟，該層析步驟中使用整體管柱作為陰離子交換劑，該陰離子交換劑具有Q季銨配體，該平衡緩衝液為pH 7.9至8.1且電導率為1.35至1.65 mS/cm之20 mmol/L Tris 10mmol/L HCl溶液，且該層析步驟係使用pH 4.3至4.5且電導率為2至3.5mS/cm之50 mmol/L醋酸鈉洗提緩衝液。
藉由本申請案中所描述之方法，醫藥組成物具有增加數量之低唾液酸含量同種型，該低唾液酸含量同種型具有不同於NeuroEPO之與糖基化相關的三級結構 ，該結構賦予該組成物在活體外和活體內之神經保護和神經修復機制更大的效力。
本發明之目的亦包括使用本文所描述之醫藥組成物來治療癡呆、中風、帕金森氏症、共濟失調(ataxia)、顱腦外傷、青光眼、自閉症、新生兒缺氧、多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化和由創傷、中毒或放射照射引起之神經損傷。特別是，本文描述使用此醫藥組成物來治療需要該治療之個體的方法，其中該組成物之投予係在1mL之體積中投予0.1mg至4mg，每週投予1至3次，持續進行6至12個月。發明之詳細說明 醫藥組成物
本發明之rhEPO標的之特徵在於其具有介於4.25至5.85之等電點輪廓及與糖基化無關的二級和三級蛋白質結構，其類似於保持與糖基化相關之相同三級結構的rhEPO，在絲胺酸126中具有一個O-糖基化位點且在天門冬醯胺24、38和83具有3個N-糖基化位點。本文描述之rhEPO 的碳水化合物組成將其與其他rhEPO區分開。該岩藻糖基化之N-聚醣的微觀不均一性係由二、三和四觸角結構所組成，該觸角結構具有佔總碳水化合物之40至60%(較佳為佔43至50%)的單和二唾液酸化之唾液酸殘基、佔總碳水化合物之40至43%的三唾液酸化之唾液酸殘基和佔總碳水化合物之10至13%的四唾液酸化之唾液酸殘基。
特別是，絲胺酸126之O-糖基化位點具有3種唾液酸型，該3種唾液酸型具有0至2個唾液酸殘基，該單唾液酸化之結構佔最大量且佔總聚醣之78至82%，而該無唾液酸化之結構佔總聚醣之6至10%。
天門冬醯胺83之N-糖基化位點包含： -具有1和2個唾液酸殘基之岩藻糖基化的二觸角結構，其中該結構佔總聚醣之8至12%， -具有1、2和3個唾液酸殘基之岩藻糖基化的三觸角結構，其中該結構佔總聚醣之17至21%， -具有1至4個唾液酸殘基之岩藻糖基化的四觸角結構，其中該結構佔總聚醣之27至31%，和 -具有第1和2型N-乙醯基乳糖胺之岩藻糖基化的四觸角結構，其具有1至4個唾液酸殘基，其中該結構佔總聚醣之38至42%。
本發明中，術語低唾液酸化之rhEPO、EPO、HS或鹼性同種型可互換使用以指具有上述特徵之醫藥組成物(亦通稱為NeuroEPO plus)。
本發明之醫藥組成物標的具有rhEPO之低唾液酸化同種型作為活性成分。該低唾液酸化同種型係透過本發明中描述之方法獲得，這並不意味對該rhEPO進行化學和/或遺傳修飾以獲得該同種型。作為該醫藥組成物之一部分活性成分的rhEPO同種型具有不同於NeuroEPO之與糖基化相關的三級結構，該糖基化形式賦予該醫藥組成物在活體外和活體內之神經保護和神經恢復機制更大的效力。
本發明之醫藥組成物標的係藉由鼻或眼途徑投予且為水溶液形式，其成品劑型為滴鼻劑、鼻噴霧或眼藥水。該醫藥配製劑包含低唾液酸化之rhEPO作為活性成分及可選擇地，醫藥上合適之賦形劑和/或穩定劑。
醫藥上可接受之賦形劑和/或穩定劑在所使用之劑量和濃度下對接受它們的個體不具有毒性且可包括生物黏附性聚合物，諸如羥甲基纖維素、羥丙基纖維素和甲基纖維素；蛋白質穩定劑，諸如L-色胺酸、L-白胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽和/或L-組胺酸鹽酸鹽，及其鹽類。治療應用和治療方法
本發明提供可用於治療神經系統疾病(諸如腦血管、精神病和神經退化性疾病)之醫藥組成物。特別是，該疾病可為：癡呆、中風、帕金森氏症、共濟失調(ataxia)、顱腦外傷、青光眼、自閉症、新生兒缺氧、多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化和由創傷、中毒或放射照射引起之神經損傷。
本發明進一步提供包含對有需要該治療之個體投予低唾液酸化之rhEPO的方法，該方法係每週投予1至3次，持續6至12個月。該投予係藉由將藥物慢慢地滴注在鼻內(IN)進行。該投予劑量係介於0.1mg至4mg之間，較佳為介於0.5mg至1mg之間。每一劑量之最大投予體積為1 mL；每一鼻孔0.5 mL，每日總劑量為3 mL。該積可分佈在較小之體積，每次施用間隔5至15分鐘，較佳為每15分鐘施用一次。用於獲得 rhEPO 之 低唾液酸化同種型的方法
本發明所申請專利之方法係由不同階段組成並採用下述細胞株：細胞株
可用於執行本發明之方法標的之細胞株與報導用於產生rhEPO者相同。最常用之細胞株為：CHO、COS、BHK、Namalwa、HeLa、Hep3B、HepG2，對本發明而言，較佳為使用CHO細胞株。醱酵過程
本發明之醱酵過程係使用ST技術執行。該過程係由幾個階段組成，第一階段包含將來自工作細胞庫之安瓿解凍直至達到室溫(18至24℃)。隨後，執行擴增階段，其中該細胞被縮放至可確保適當接種在該種子醱酵器中之細胞濃度和細胞存活率以達到增加生物質之目的。
一旦細胞密度達到≥1×106 細胞/mL時，以不同的操作模式開始醱酵。這些模式可為：分批培養、有或無生物質保留之連續培養。
為了獲得低唾液酸化之同種型，該醱酵階段之溫度應確保在34±2℃之範圍內且pH在6.8±0.4之範圍內。
細胞應在不含蛋白質之培養基中生長，直至麩胺醯胺之最終濃度達到8至12 mmol/L。純化過程
該低唾液酸化之rhEPO 的純化過程包含下列層析步驟：
首先，執行在有色配體中之擬親和層析術(pseudo affinity chromatography)。該步驟之目的為捕獲rhEPO並部分去除存在於該上清液(SN)中之主要污染物。隨後進行到凝膠過濾層析以將該蛋白質之緩衝液改變成下一個層析步驟之施用溶液的緩衝液。
然後，藉由金屬螯合物來執行擬親和層析術。該步驟之目的在於捕獲rhEPO並完全排除該過程之先前步驟中未去除之污染物部分。再次進行凝膠過濾層析術以將該緩衝液改變成下一個層析步驟之施用溶液的緩衝液。
作為生產過程之關鍵階段，以Q季銨配體執行陰離子交換層析術。於該層析步驟中，使用整體管柱。此層析術之目的為將低唾液酸化(生物活性)之同種型從酸性同種型中分離出、保持DNA和產物的濃度。所有這些均確保取得未被酸性同種型污染或與酸性同種型混合之低唾液酸化同種型。
最後，再次 執行凝膠過濾層析術以改變該緩衝液並容許該蛋白質以活性原料之形式洗提出。
實施例 1. 在實驗室規模下， pH 和溫度影響 rhEPO 同種形輪廓。
從經人EPO基因轉染之CHO細胞株取得種子細胞庫，令該種子細胞庫適應懸浮生長於不含蛋白質之培養基中。經過37代(代表培養25天)後取得對該培養基之完全適應。
為了評估該細胞株在不同pH和溫度條件下之性能，進行實驗設計，其中將二個變量組合在一起。該實驗條件顯示於表1中。藉由添加0.5 mol/L氫氧化鈉來控制培養物之pH。
Figure 02_image001
藉由等電聚焦來測定對應於在所評估之不同條件下的培養物中產生之SN樣本的rhEPO 之同種型輪廓。使用pH 2至5及pH 3至10之安弗林(ampholin)的混合物，使用內部EPOCIM®參考物質作為對照組。使用Gene Tools 程式，藉由光密度測定法分析樣品中每種同種型之強度百分比。其pH值介於2.80至4.25之同種型被定義為酸性同種型，而其pH值介於4.25至6.55之同種型被定義為鹼性同種型(第1A圖)。
第1B圖顯示出同種型輪廓受溫度強烈影響。不管pH值，當將對應於各條件之SN樣本在37℃之溫度下與對照組相比較時，可觀察到7種酸性同種型。另一方面，在35℃下觀察到酸性同種型損失，這在pH 7.2和7.3之條件下更加明顯。
第2圖顯示在pH 7.2和7.3及溫度35℃之條件下，所取得之全部同種型(100%)均為鹼性同種型。實施例 2. 在 先導性規模下， pH 和溫度影響 rhEPO 同種形輪廓。
在更受控制和有利於細胞培養之環境中評估在實驗室規模(溫度35℃，pH 7.2和7.3 )下獲得之最佳培養條件的影響。從實施例1中描述之種子細胞庫，使用具有3.5升有效體積之ST型生物反應器(Infors-AGCH 4103，Bottmingen)設計四個醱酵回合。操作條件顯示於表2中。在所有評估之條件下，初始細胞存活率均超過90%以上。
Figure 02_image003
在每次醱酵結束時採樣並藉由等電聚焦技術測定在生物反應器中之評估條件下的培養物中所產生之SN樣品的同種型輪廓。一旦獲得這些輪廓，使用Gene Tools程式並從對應於該等電聚焦凝膠之圖像開始，測定存在於該凝膠中之每一條帶的強度並評估每種條件下之低唾液酸化的同種型之比例。
從第3圖中可知，在培養條件2和3(35℃，pH 7.2-7.3)下，低唾液酸化之同種型的比例高於在條件1和4下之比例。這些結果證實在實驗室規模下獲得之調查結果，亦即，藉由修飾該操作條件以具有pH 7.2至7.3和溫度35℃時可修飾rhEPO之同種型輪廓，pH值介於4.25至5.85之條件下可取得較大之強度。實施例 3. 藉由增加培養基中之麩胺醯胺的濃度有利於 rhEPO 鹼性同種型之表現。
為了評估培養基中之麩胺醯胺的濃度增加是否對低唾液酸化之同種型的增加有影響，評估產生rhEPO之CHO細胞株的性能。使用暴露於培養基之不同麩胺醯胺濃度的種子細胞庫，並使其適應該培養基15天。從初始細胞濃度0.5×106 細胞/mL(培養基之最終體積為300mL)開始，使用保持在37℃培養箱中且攪拌速度為600rpm之旋轉瓶進行評估。培養基中之最終麩胺醯胺濃度為8、12和16 mmol/L，並使用具有6 mmol/L之麩胺醯胺的培養基作為對照組。
以不同濃度之麩胺醯胺處理7天後，藉由光密度測定法評估培養物之SN中的低唾液酸化之同種型的相對強度。
第4圖顯示藉由該三個評估之變量的每一個變量均可取得相對於該對照組而言較高比例之低唾液酸化的同種型，從而證實增加培養基中之麩胺醯胺的濃度有利於獲得SN中之低唾液酸化同種型。使用8 mmol/L之麩胺醯胺(87%)時可觀察到這些同種型之最高數值。實施例 4. 在實驗室規模下， pH 和電導率影響 Q 強季銨陰離子交換劑中之酸性和鹼性同種型的吸附。
為了測定有利於Q強季銨陰離子交換劑中之酸性同種型的最大吸附之pH和電導率條件，評估下列緩衝溶液：20 mmol/L磷酸鈉(無水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉二水合物)和20 mmol/L Tris 10 mmol/L HCl。研究pH介於6至8且電導率介於1.5至5 mS/cm之不同pH和電導率值的緩衝溶液。
在pH 6和電導率1.50 mS/cm之條件下可觀察到酸性同種型對交換劑之最大吸附。另一方面，低唾液酸化(鹼性)同種型在pH 8和電導率1.50 mS/cm時具有最大吸附。結果顯示於第5圖中。實施例 5. 在實驗室規模下，就分離 rhEPO 同種型之容量而言，相較於使用常規層析凝膠技術者，使用整體管柱技術之 Q 強陰離子基質具有較佳性能。
使用2個貫穿曲線來計算所研究之每種技術的動態吸附容量(Q)，該計算係採用由每種技術之製造商建議的二種線性流速進行，層析凝膠之技術(Q SFF)係採用100 cm/h和600 cm/h，而整體管柱之技術(CIM QA)係採用156 cm/h和624 cm/h。根據實施例4中獲得之結果，以常規技術和整體管柱技術進行之實驗所使用之平衡溶液為pH 8且電導率為1.5 mS/cm之Tris-HCl緩衝液。
將rhEPO樣品施加於管柱並在不同時間在管柱出口採取樣品。藉由分光光度法測定各樣品中之蛋白質濃度(C)。藉由各樣品中之已知的C值可計算未吸附之蛋白質分數C/C0 。計算每次之荷載量，此荷載量為施加在管柱之每單位體積之凝膠的蛋白質質量，以mg rhEPO/mL Q基質表示。
第6圖中，將C/C0數值相對於動態吸附容量以圖形表示於貫穿曲線中，該貫穿曲線能允許知道在指定之流速下，每一未吸附之蛋白質分數C/C0 =0.1之凝膠的Q。第6A圖顯示以常規層析凝膠技術獲得之貫穿曲線，其中該最低流速為具有最高動態容量者。第6B圖顯示該整體管柱在測試之二種線性流速下具有非常類似的動態吸附容量，因此其可在較高之流速下操作，而不會經歷該基質之動態吸附容量變化。
表3顯示以所執行之不同測量獲得之Q值。
Figure 02_image005
當比較在填充床中之強陰離子交換劑和整體管柱技術進行之Q研究的結果，可觀察到該二種技術 在所研究之最低線性速率下具有類似之Q。然而，在最高之線性速率下，該整體管柱之動態吸附容量較 所評估之傳統層析基質的動態吸附容量高1.40倍。因此，可歸結出該整體管柱允許該過程之工作流程增加，而不會影響處理該欲純化之rhEPO質量的容量。實施例 6. 在實驗室規模下，降低 pH 值有利於整體管柱中之 低唾液酸化之 rhEPO 同種型的洗提。
使用Q SFF和CIM QA管柱進行實驗測試。根據實施例4，該二種技術所使用之平衡溶液為pH 8且電導率為1.5 mS/cm之Tris-HCl緩衝液。Q SFF管柱之工作線性速率為600 cm/h，而整體管柱之工作線性速率為624 cm/h。用於該實驗之產品為將緩衝液改變成上述平衡溶液後從“Sephadex ”G-25分子排阻層析柱獲得者。使用pH值為4.41；4.81；5.06；5.20之0.01%的50 mmol/L Tween 20醋酸鈉緩衝液，以整體管柱陰離子交換柱進行數輪以洗提出鹼性同種型。
在每一輪之低唾液酸化(鹼性)同種型和酸性同種型的洗提中獲得之回收率顯示於第7圖中。分析這些結果可確定當鹼性同種型之洗提緩衝液的pH增加時其性能下降，因此，選擇pH 4.41之50 mmol/L醋酸鈉緩衝液來用於洗提。實施例 7. 就同種型分離和純度而言，在 製造規模下 獲得低唾液酸化之 rhEPO 的過程是一致的。
從實施例1中描述之種子細胞庫進行醱酵運行，該起始細胞存活力大於90%。在35℃之溫度下，在不含蛋白質培養基中進行醱酵階段，該培養基係經補充以達到麩胺醯胺最終濃度為8mmol/L，該培養基之pH保持介於7.2至7.3。
一旦獲得四次收穫，進行純化階段，其中在關鍵步驟方面，使用整體管柱作為陰離子交換劑，該陰離子交換劑具有Q季銨配體。使用pH 8且電導率1.5 mS/cm之Tris-HCl溶液作為平衡緩衝液，並使用pH 4.41之50 mmol/ L醋酸鈉緩衝液作為洗提溶液。
藉由等電聚焦技術測定純化過程後獲得之四批活性原料的同種型輪廓。使用pH介於2至5和介於3至10之安弗林混合物並使用內部EPOCIM® 參考物質作為對照組。第8圖顯示分離同種型之一致性，其中觀察到由六種主要同種型構成之同種型輪廓，其中僅二種與對照組共有。
此外，根據用於測定歐洲8.0藥典(2014)中描述之分子的程序和藉由逆相HPLC測定之純度來測定該純化之同種型的唾液酸含量。表4顯示獲得之唾液酸含量和純度結果。
Figure 02_image007
唾液酸含量少於10莫耳唾液酸/蛋白質分子且該四批中之純度大於95%，從其中可得出結論：該獲得低唾液酸化之rhEPO之過程保證獲得pH值介於4.25至5.85之同種型，此與在NeuroEPO中觀察到的不同。實施例 8. 與 低唾液酸化之 rhEPO 糖基化相關之三級結構顯示出獨特性 微觀不均一性。 聚醣分析
為了研究其N-聚醣輪廓，低唾液酸化之rhEPO經歷變性過程，並以肽N-糖苷酶F(PNGase F)進行酶催化性分解。一旦釋出N-聚醣時，使用HyperSep Hypercab SPE匣，藉由固相萃取將其純化(Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta 940: 92-103)。隨後，根據Giménez，等人2015.(Gimenez, E et al. (2015) Anal. Chim. Acta, 866: 59-68)描述之程序將其衍生化。
依照Mancera-Arteu, M. et al. (2016) Anal. Chim. Acta, 940: 92-103描述之方法進行與質譜偶聯之兩性離子親水性交互作用毛細管液相層析術。
第9圖顯示在低唾液酸化之rhEPO中檢測到之三種聚醣的質譜。從其中可以看出，聚醣3Ant2SiA1Fuc佔最大量，而聚醣4Ant4SiA1Fuc之發現量減少。
表5顯示根據結構之聚醣的相對面積之百分比。
Figure 02_image009
表6顯示檢測到之聚醣的對應之相對面積、單同位素實驗分子量(Mexp)和質量誤差。由圖中可知有大量聚醣具有較少之唾液酸化結構。
Figure 02_image011
從表6中可知，具有較多唾液酸化結構(4 個唾液酸分子)之聚醣的發現比率低。取而代之的是，檢測到未曾在其他rhEPO中發現之具有唾液酸分子的結構，諸如3Ant1SiA1Fuc、4Ant1SiA1Fuc、4Ant1LacNAc1SiA1Fuc和4Ant3LacNAc1SiA1Fuc。聚醣4Ant3Sia1Fuc在低唾液酸化之rhEPO中含量豐富。再者，相關於檢測之總聚醣之藉由觸角分組的相對面積之百分比與其他rhEPO不同且具有一或二個唾液酸殘基之結構佔藉由觸角分組的相對面積之50%以上。糖肽分析
為了檢測存在於O126 和N83 糖肽中之所有糖型，以胰蛋白酶和神經胺酸酶(rhEPO HS-TN)分解rhEPO和rhEPO-CRS(藥典參考產品)。研究從胰蛋白酶分解分析(rhEPO HS-T)所檢測到之每種糖型中的所有唾液酸型。根據Giménez, E. et al. (2011) Rapid Commun Mass Spectrom. 25: 2307-2316描述之方法，藉由質譜法分析該樣品。
第10A和10B圖分別顯示在rhEPO HS-TN和HS-T分解物中檢測到之O126 糖肽糖型的EIE。在第一圖中，觀察到對應於O126 /0SiA糖型之單峰，由於神經胺酸酶產生完全去唾液酸化之糖肽，因而所有唾液酸型成為單一糖型。相反地，當僅使用胰蛋白酶分解時，觀察到具有0、1和2個唾液酸分子之三種唾液酸型。
表7顯示檢測之O126 唾液酸型及對應之相對面積、單同位素實驗分子質量(Mexp)和質量誤差。
Figure 02_image013
獲得之結果表明佔最大量之唾液酸型為含有一個唾液酸分子者。無唾液酸化同種型之相對面積的百分比及僅具有一個唾液酸者之相對面積的百分比均高於所描述之其他rhEPO的相對面積百分比，發現二種唾液酸型之比例均不同於CRS rhEPO所具者。
在N83糖肽之情況中，當分析rhEPO HS-TN分解物時，檢測到六個峰，該六個峰對應於無唾液酸之六種不同糖型。所獲得之EIE顯示於第11圖中，而所檢測之糖型顯示於表8中。所獲得之結果顯示出在N83 位點處具有較高比例之複合的去唾液酸化四觸角結構。
Figure 02_image015
第12A圖顯示出rhEPO HS-TN分解物中之不同四觸角結構之間未分開。相反地，當分析rhEPO HS-TN分解物之唾液酸化的糖型時，可觀察到它們之間明顯分開，那些具有3個唾液酸殘基者具有較大的強度(第12B圖)。這些結果與從聚醣研究得到的結果相符。
表9顯示出檢測之所有唾液酸型及對應之相對面積、單同位素實驗分子質量(Mexp)和質量誤差。
Figure 02_image017
結果證實當僅以胰蛋白酶分解該蛋白質時，該低唾液酸化之rhEPO的特徵在於具有較少之唾液酸化結構(例如2Ant1SiA1Fuc或3Ant1SiA1Fuc)。當驗明該單唾液酸化結構和二唾液酸化結構之相對面積的百分比時，結果表明它們佔約60%。
與其他糖型相比較時，N83 糖肽中之四觸角結構被發現百分比最高，具有二個唾液酸殘基者為佔最大比例者。實施例 9. 低唾液酸化 之 r hEPO 對星形 膠質細胞對抗 DMSO 之毒性具有恢復效果。
將PG4星形膠質細胞株培養在葡萄糖含量高且補充有3.7g/L NaHCO3 和10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改質之Eagle氏培養基(DMEM)中。將細胞在溫度37℃及5%CO2 /95%空氣之大氣下培育24小時。在具體指定之時間後，萃取SN並使用8%DMSO來引起細胞損害，再次培育24小時。隨後，除去SN並添加具有不同濃度之低唾液酸化之rhEPO(1.25；2.5；5和10 ng/mL)的2%DMEM培養基。在24h和48h，添加Alamar Blue試劑，然後將細胞培育6小時並在540/630nm讀取。所有培育均在溫度37℃及5%CO2 / 95%空氣之大氣下進行。
從第13圖可知在不同濃度(1.25；2.5；5和10 ng/mL)之低唾液酸化的rhEPO下，細胞恢復其存活力的能力如何，最佳條件為1.25 ng/mL之低唾液酸化rhEPO，此證明星形膠質細胞之恢復能力。實施例 10. 低唾液酸化之 r hEPO 具有較 NeuroEPO 為佳之神經保護活性。
依照Kahn K. in 1972, (Kahn K. (1972) Minneap 22: 510-515)描述之方法，使用來自蒙古之沙鼠發展永久性單側缺血之模型。隨後，將動物隨機分成五個實驗組： 第1組：載劑，10 µL之載劑 第2組：使用0.142 mg/kg之低唾液酸化的rhEPO治療 第3組：使用0.0142 mg/kg之低唾液酸化的rhEPO治療 第4組：使用0.142 mg/kg之NeuroEPO治療 第5組：使用0.0142 mg/kg之NeuroEPO治療
每種治療均經由IN途徑投予，每天3次，共4天。在治療前4天的期間內進行動物之評估，並在接下來3天的恢復期間進行評估。
結果表明與使用載劑者比較，使用0.142和0.0142 mg/kg二種劑量之低唾液酸化的rhEPO治療之動物具有顯著較高之存活率，而使用NeuroEPO治療時，僅0.142mg/kg劑量組之死亡率顯著下降，但0.0142 mg/kg劑量組則否(第14圖)。
神經學評估證明低唾液酸化之rhEPO (NeuroEPO plus)的神經保護作用，與安慰劑組及使用NeuroEPO治療之組別相比較，該低唾液酸化之rhEPO (NeuroEPO plus)顯著降低以所使用之劑量治療的動物之神經學得分，其中該相同結果僅能以0.142mg/kg劑量之低唾液酸化的rhEPO獲得(第15圖)(Duncan統計檢定，相同字母p＞0.05；不同字母p＞0.05)。實施例 11. 在正常細胞之小鼠模型中， 低唾液酸化之 rhEPO 不會增加網狀紅血球計數。
將B6D2F1雌性小鼠隨機分為6個實驗組，每組6隻動物，並接受如下述之單劑量治療： 第1組：藉由皮下途徑(SC)投予在200 µL體積中之0.003 mg/mL的rhEPO工作參考物質。 第2組：藉由SC途徑投予在200 µL體積中之0.006 mg/mL之低唾液酸化的rhEPO。 第3組：藉由IN途徑投予在200 µL體積中之0.5 mg/mL之低唾液酸化的rhEPO。 第4組：藉由IN途徑投予在200 µL體積中之1 mg/mL之低唾液酸化的rhEPO。 第5組：藉由IN途徑投予在200 µL體積中之2 mg/mL之低唾液酸化的rhEPO。 第6組：對照組，藉由SC途徑投予200 µL之賦形劑。
網狀紅血球計數之結果顯示於第16圖中。從圖中可知，對照組中之動物與藉由SC和IN途徑投予低唾液酸化之rhEPO進行治療的動物之間並無顯著差異。使用rhEPO工作參考物質治療之動物的網狀紅血球計數明顯高於對照組和使用SC和IN二種途徑投予低唾液酸化之rhEPO進行治療之組別中的動物(Duncan氏檢定，相同字母p＞0.05；不同字母p＜0.05)。
結果證明低唾液酸化之EPO即使在為此試驗建立之最高劑量下亦不會增加網狀紅血球計數，這表明其不具有造血作用。
[第 1 圖 ]同種型輪廓：A)同種型之切割定義；B)在評估之溫度和pH條件下之培養物中產生的SN。
[第 2 圖 ]在評估之溫度和pH條件下培養物中之低唾液酸化同種型的比例。
[第 3 圖 ]在先導性規模之評估條件下的每個培養物中之低唾液酸化同種型的比例。
[第 4 圖 ]SN中較低酸性之同種型的相對強度。
[第 5 圖 ]流動相之pH值和電導率對Q季銨配體中rhEPO同種型之靜態吸附能力的影響：(A)低唾液酸化同種型(鹼性的)，(B)酸性同種型。
[第 6 圖 ]貫穿曲線(breakthrough curve)A)：層析基質“Q SFF”，B)：整體管柱“CIM QA”。
[第 7 圖 ]洗提緩衝液pH對鹼性和酸性同種型性能之影響。
[第 8 圖 ]生產規模之低唾液酸化rhEPO同種型的分佈。
[第 9 圖 ]藉由與質譜術偶聯之兩性離子型親水性交互作用液相層析術進行之低唾液酸化rhEPO之N-聚醣研究。
[第 10 圖 ]觀察到之使用a )胰蛋白酶和神經胺酸酶及b)胰蛋白酶分解所產生的低唾液酸化之rhEPO O126糖肽糖型的萃取離子電泳圖(EIE)。
[第 11 圖 ]觀察到之由胰蛋白酶和神經胺酸酶分解所產生之糖型的N83糖肽之EIE。
[第 12 圖 ]觀察到之由a)胰蛋白酶和神經胺酸酶及b)胰蛋白酶分解所產生之糖型的低唾液酸化之rhEPO N83糖肽的EIE。
[第 13 圖 ]以8%二甲亞碸(DMSO)造成星形膠質細胞培養物細胞損傷及隨後以低唾液酸化之rhEPO處理後24小時和48小時，星形膠質細胞培養物之細胞存活力輪廓。
[第 14 圖 ]Kaplan-Meier圖表，觀察7天之期間內的生存力。
[第 15 圖 ]動物梗死後24小時之神經學狀態。
[第 16 圖 ]在正常細胞小鼠模型中施用不同rhEPO同種型對網狀紅血球數量之影響。
本發明藉由下列實施例和附圖進一步闡述。然而，這些實施例並不應被解釋為限制本發明之範圍。

Claims (13)

  1. 一種醫藥組成物，其包含重組人紅血球生成素(rhEPO)作為活性成分，該重組人紅血球生成素(rhEPO)之等電點輪廓係介於4.25至5.85。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中岩藻糖基化之N-聚醣的微觀不均一性係由二、三和四觸角結構形成，該等觸角結構具有佔總聚醣之40至60%的單和二唾液酸化之唾液酸殘基、佔該總聚醣之40至43%的三唾液酸化之唾液酸殘基和佔該總聚醣之10至13%的四唾液酸化之唾液酸殘基，及醫藥上可接受之賦形劑。
  3. 如請求項1之醫藥組成物，其中絲胺酸126之O-糖基化位點具有3種唾液酸型(sialoform)，該3種唾液酸型具有0至2個唾液酸殘基，其中單唾液酸化之結構佔最大量且佔總聚醣之78至82%，且無唾液酸化之結構佔該總聚醣的6至10%。
  4. 如請求項1之醫藥組成物，其中天門冬醯胺83之N-糖基化位點包含： -具有1和2個唾液酸殘基之岩藻糖基化的二觸角結構，其中該結構佔總聚醣之8至12%， -具有1、2和3個唾液酸殘基之岩藻糖基化的三觸角結構，其中該結構佔總聚醣之17至21%， -具有1至4個唾液酸殘基之岩藻糖基化的四觸角結構，其中該結構佔總聚醣之27至31%，和 -具有第1和2型N-乙醯基乳糖胺之岩藻糖基化的四觸角結構，其呈現1至4個唾液酸殘基，其中該結構佔總聚醣之38至42%。
  5. 如請求項1之醫藥組成物，其中該醫藥上可接受之賦形劑包含生物黏附性聚合物和蛋白質穩定劑。
  6. 如請求項5之醫藥組成物，其中該生物黏附性聚合物係選自包含下列之群組： -羥甲基纖維素， -羥丙基纖維素，和 -甲基纖維素。
  7. 如請求項5之醫藥組成物，其中該蛋白質穩定劑係選自包含下列之群組： -L-色胺酸， -L-白胺酸， -L-精胺酸鹽酸鹽，和 -L-組胺酸鹽酸鹽。
  8. 一種用於獲得rhEPO之方法，該rhEPO未經額外之化學和遺傳工程修飾且具有介於4.25至5.85之等電點輪廓，其中醱酵過程係在攪拌槽中進行，且其中純化過程中使用整體管柱作為陰離子交換劑之層析步驟，該陰離子交換劑具有Q季銨配體。
  9. 如請求項8之方法，其中該rhEPO之醱酵過程係在攪拌槽中，在35℃之溫度下和介於7.2至7.3的pH，在經補充麩胺醯胺之不含蛋白質的培養基中進行以使最終濃度介於8至12 mmol/L。
  10. 如請求項8之方法，其中該純化過程中使用pH 8且電導率1.5 mS/cm之20 mmol/L Tris 10mmol/L HCl溶液作為平衡緩衝液，並使用pH 4.41之50 mmol/L醋酸鈉溶液作為洗提緩衝液。
  11. 一種醫藥組成物，其活性成分為藉由如請求項8至10之方法獲得之低唾液酸化rhEPO。
  12. 一種如請求項1至7和11之醫藥組成物於治療下列疾病之用途：癡呆、中風、帕金森氏症、共濟失調(ataxia)、顱腦外傷、青光眼、自閉症、新生兒缺氧、多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化和由創傷、中毒或放射照射引起之神經損傷。
  13. 一種用於治療需要該治療之個體的方法，其包含投予如請求項1至7和11之醫藥組成物，該醫藥組成物之投予係在1mL之體積中投予0.1mg至4mg，每週投予1至3次，持續6至12個月。
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