DE68924222T2

DE68924222T2 - Megakaryocytopoietin, seine Herstellung und Benutzung.

Info

Publication number: DE68924222T2
Application number: DE68924222T
Authority: DE
Inventors: Zakut Haim Zakut Haim; Soreq Hermona
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1988-06-28
Filing date: 1989-06-27
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2009-06-28
Also published as: IL90719A0; EP0354989A1; DE68924222D1; ATE127842T1; EP0354989B1

Description

Diese Anmeldung betrifft Wachstumsfaktoren. Insbesondere betrifft sie Polypeptide, die die Replikation oder Differentiation von Blutzellen, insbesondere von Plättchenvorläuferzellen beeinflussen.
Im Knochenmark differenziert eine pluripotente Zelle in megakaryozytäre, erythrozytäre und myelozytäre Zellinien. Es kann eine Linie festgelegter Zellen zwischen Stammzellen und Megakaryozyten geben. Das früheste erkennbare Mitglied der Megakaryozyten- (meg) Reihe, der Megakaryoblast, hat anfangs einen Durchmesser von 20 bis 30 um mit einem basophilen Cytoplasma und einem leicht unregelmäßigen Nukleus mit lockerem netzartigem Chromatin und mehreren Nukleoli. Später können Megakaryoblasten bis zu 32 Nuklei enthalten, aber das Cytoplasma bleibt zerstreut und unreif. Wenn die Reifung fortschreitet, wird der Nukleus stärker gelappt und pyknotisch, das Cytoplasma nimmt an Menge zu und wird stärker acidophil und granulär. Die am meisten reifen Zellen können das Erscheinungsbild ergeben, daß sie an ihrer Peripherie Plättchen freisetzen. Normalerweise sind weniger als 10 % der Megakaryozyten im Blastenstadium und mehr als 50 % sind reif. Willkürliche morphologische Klassifizierungen, welche üblicherweise auf die Megakaryozytenreihe angewandt werden, sind Megakaryoblast für die früheste Form; Promegakaryozyt oder basophiler Megakaryozyt für die intermediäre Form und reifer (acidophiler, granulärer oder Plättchen produzierender) Megakaryozyt für die späten Formen. Der reife Megakaryozyt streckt Cytoplasmafilamente in gewundene Räume, wo sie sich ablösen und in einzelne Plättchen fragmentieren (Williams et al., Hematology, 1972).
Es häufen sich Hinweise, daß es eine zweistufige Regulation der Megakaryozytopoese gibt, welche mehr als einen Regulationsfaktor umfaßt (Williams et al., Br. J. Haematol. 52:173 [1982] und Williams et al., J. Cell Physiol. 110:101 [1982]).Es wird postuliert, daß die frühe Stufe der Megakaryozytopoese mitotisch ist, mit Zellproliferation und Kolonieinitiation von CFU-meg befaßt ist, aber von der Plättchenzahl nicht beeinflußt wird (Burstein et al., J. Cell Physiol. 109:333 [1981] und Kimura et al., Exp. Hematol. 13:1048 [1985]). Die spätere Reifungsstufe ist nichtmitotisch, an nukleärer Polyploidisierung und cytoplasmatischer Reifung beteiligt und wird vermutlich mittels eines Feedback-Mechanismus durch die Zahl der periphären Plättchen reguliert (Odell et al., Blood 48:765 [1976] und Ebbe et al., Blood 32:787 [1968]). Die Existenz eines besonderen und spezifischen Megakaryozyten Koloniestimulierenden Faktors (meg-CSF) ist noch umstritten (Mazur, E., Exp. Hematol. 15:340-350 [1987]). Obwohl meg-CSF's teilweise gereinigt wurden aus experimentell erzeugter Thrombopenie (Mill et al., Exp. Hematol. 14:752 [1986]) und aus mit Humanembryo-Nieren konditioniertem Medium [CM] (McDonald et al., J. Lab. Clin. Med. 85:59 [1975]) und von Mensch aus Urinextrakten von aplastischer Anämie und Purpura thrombopenica (Kawakita et al., Blood 6:556 [1983]) und Plasma (Hoffman et al., J. Clin. Invest. 75:1174 [1985]), ist ihre physiologische Funktion in den meisten Fällen bisher unbekannt. Das konditionierte Medium von Kermesbeerenmitogen aktivierten Milzzellen (PWM-SPCM) und WEHI-3 (WEHI-3CM) wurden als Megakaryozytenpotentiatoren verwendet. PWM-SpCM enthält Faktoren, die das Wachstum von CFU-meg verstärken (Metcalf et al. PNAS; USA 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et al., Blood 65:214 [1985] und Iscove, N.N., in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al., Herausgeber [New York, Academy Press] Seiten 37-52 [1978]), von denen einer Interleukin-3 (IL-3) ist, ein Kolonie-stimulierender Faktor von vielen Zellinien (Multi-CSF [Burstein, S.A., Blood Cells 11:469, 1986]). Die anderen Faktoren in diesem Medium wurden noch nicht identifiziert und isoliert. WEHI-3 ist eine myelomonozytäre Zellinie aus Maus, die relativ große Mengen von IL-3 und geringere Mengen von GM-CSF sezerniert. IL-3 wurde vor kurzem gereinigt und kloniert (Ihle et al., J. Immunol. 129:2431 [1982]) und es wurde festgestellt, daß es das Wachstum eines weiten Bereichs hämatopoetischer Zellen potentiert (Ihle et al., J. Immunol. 13:282 [1983]). Daneben kann es auch einen synergistischen Effekt mit vielen der bekannten hämatopoetischen Hormone oder Wachstumsfaktoren ausüben (Bartelmez et al., J. Cell Physiol. 122:362-369 [1985] und Warren et al., Cell 46:667-674 [1988]). Es wurde festgestellt, daß IL-3 bei der Induktion der sehr frühen multipotentiellen Vorläufer und der Ausbildung sehr großer gemischter hämatopoetischer Kolonien mit sowohl Erythropoietin (EPO) und H-1 (später bekannt als Interleukin-1 oder IL-1) synergistisch wirkt.
Andere Quellen von Megakaryozytenpotentiatoren wurden in den konditionierten Medien von Lunge, Knochen, Makrophagenzellinien, Bauchhöhlenexudatzellen aus Maus und Humanembryo-Nierenzellen gefunden. Trotz bestimmter widersprüchlicher Daten (Mazur, E., Exp. Hematol. 15:340-350 [1987]) gibt es manchen Hinweis (Geissler et al., Br. J. Haematol. 60:233-238 [1985]), daß aktivierte T-Lymphozyten eher als Monozyten eine verstärkende Rolle in der Megakaryozytopoese spielen. Dies könnte die Idee nahelegen, daß Absonderungen von aktivierten T-Lymphozyten wie etwa Interleukine Regulationsfaktoren in der meg-Entwicklung sein könnten (Geissler et al., Exp. Hematol. 15:845-853 [1987]). Eine Reihe von Untersuchungen über die Megakaryozytopoese mit gereinigtem EPO (Vainchenker et al., Blood 54:940 [1979]; McLeod et al., Nature 261:492-4 [1976] und Williams et al., Exp. Hematol. 12:734 [1984]) deuten darauf hin, daß dieses Hormon einen verstärkenden Effekt auf die meg-Koloniebildung ausübt. Vor kurzem wurde dies sowohl in serumfreien als auch Serum enthaltenden Kulturen und in der Abwesenheit akzessorischer Zellen gezeigt (Williams et al., Exp. Hematol. 12:734 [1984]). Es wurde postuliert, daß EPO stärker an den Aspekten des Ein- und Zweizellstadiums der Megakaryozytopoese beteiligt ist, im Gegensatz zur Wirkung von PWM-SpCM, das am Vierzellstadium der Megakaryozytenentwicklung beteiligt ist.
EP-A-0 260 918 offenbart einen Megakaryozyten stimulierenden Faktor, der aus menschlichen Nierenzellen isoliert wurde und ein Molekulargewicht von 15.000 auf SDS-PAGE und einen isoelektrischen Punkt von 5,1 hat. In Hoffmann et al. (J. Clin. Invest. 75 (1985), 1174-1182) wird ein aus Humanplasma erhaltener Megakaryozyten Koloniestimulierender Faktor mit einem Molekulargewicht von 46.000 auf SDS-PAGE beschrieben.
Die Wechselwirkung all dieser Faktoren auf sowohl frühe wie späte Phasen der Megakaryozytenentwicklung bleibt aufzuklären.
Plättchen sind kritisch gebildete Elemente des Blutgerinnungsmechanismus. Eine Verarmung des zirkulierenden Plättchengehalts, Thrombopenie genannt, tritt bei verschiedenen klinischen Bedingungen und Krankheiten auf. Erhöhte Plättchenabbauraten kennzeichen immunologische oder nicht immunologische erworbene Thrombozytopenie wie etwa die, die im Zusammenhang steht mit Infektionen, Moschcowitz' Syndrom, Gasser's Syndrom, direkter oder Arzneimittelinduzierter Plättchentoxizität, Post-transfusions Purpura und allergischer Thrombopenie, Purpura thrombopenica und angeborener immunologischer oder nicht immunologischer Thrombopenie wie etwa fötale Erythroblastose, prämature Thromopenie, infektiöse Thrombopenie, Thrombopenie mit großem kavernösen Hämangiom, Arzneimittelempfindlichkeit, isoimmune neonatale Thrombopenie und Thrombopenie, die im Zusammenhang steht mit maternaler Purpura thrombopenica. Verminderte oder fehlerhafte Plättchenbildung kennzeichnet Fanconi Syndrom, amegakaryozytäre Thrombopenie, erbliche Thrombopenie, neonatale Rötein, maternale Aufnahme von Thiaziddiuretika, aplastische Anämie, maligne Infiltration von Knochenmark und die Verabreichung ionisierender Strahlung und myelosuppressiver Arzneimittel.
Thrombopenie ist klinisch gefährlich indem sie Patienten mit diesem Zustand unkontrollierten Blutungsschüben aussetzt. Im gewöhnlichen Verlauf der Ereignisse beträgt die erforderliche Zeit zur Reifung von Plättchen aus Megakaryozyten nach einem Vorfall in Menschen etwa 4 bis 5 Tage. Es wäre wünschenswert ein Mittel zu identifizieren, welches fähig ist die Plättchenentwicklung zu beschleunigen und diesen Zeitraum zu verkürzen.
Es wurden beträchtliche Anstrengungen unternommen ein derartiges Mittel, allgemein als Thrombopoietin, bezeichnet zu identifizieren. Die Wirkung eines derartigen Mittels wurde bereits 1959 beobachtet (Rak et al., "Med. Exp." 1:125) und Versuche dieses Mittel zu charakterisieren und zu reinigen wurden bis heute fortgesetzt. Von manchen wurde eine partielle Reinigung Thrombopoietin-aktiver Polypeptide berichtet (siehe z.B. Tayrien et al., "J. Biol. Chem". 262:3262, 1987 und Hoffman et al., "J. Clin. Invest". 75:1174, 1985), während andere postuliert haben, daß Thrombopoietin keine besondere Einheit für sich selbst ist, sondern eher einfach die polyfunktionelle Manifestierung eines bekannten Hormons ist (IL-3, Sparrow et al., "Prog. Clin. Biol. Res." 215 (Megakaryocyte Dev. Funct.):123, 1986).
Es ist demgemäß ein Gegenstand dieser Erfindung ein Thrombopoietin-aktives Polypeptid zu erhalten, das in einer pharmazeutisch reinen Form vorliegt.
Es ist ein anderer Gegenstand, eine für das Polypeptid codierende Nukleinsäure bereitzustellen und diese Nukleinsäure zu verwenden um das Polypeptid in rekombinanter Zellkultur zu erzeugen, für eine diagnostische Verwendung oder für eine therapeutische Verwendung bei der Behandlung von Thrombopenie.
Es ist nochmals ein weiterer Gegenstand Varianten des Polypeptids zu synthetisieren, umfassend Aminosequenz- und kovalente Derivate davon.
Ein anderer Gegenstand ist es Antikörper zu erzeugen, welche fähig sind an das Polypeptid zu binden.
Ein nochmals weiterer Gegenstand ist es diagnostische Verfahren zur Bestimmung des Polypeptids oder einer Nukleinsäure oder dessen Antikörper in Testproben bereitzustellen, welche Verfahren beim Nachweis und der Klassifizierung von Leukämien nützlich sind.
Diese und andere Gegenstände der Erfindung werden dem gewöhnlichen Fachmann bei Berücksichtigung der Beschreibung als ganzes offensichtlich werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist wie in den Ansprüchen 1 bis 13 beansprucht.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung eines für ein Thrombopoietin-aktives Polypeptid (nachstehend Megakaryozytopoietin oder "MKP") codierenden Gens. Während einer Untersuchung mehrerer cDNA-Banken aus menschlichen Fötalgeweben mit Butyrylcholinesterase cDNA-Sonden wurde zufällig eine für ein Butyrylcholinesterasederivat codierende DNA-Sequenz gefunden. Dieses Derivat enthielt das erste Exon des Butyrylcholinesterasegens aus Mensch (250 Nukleotide der 5'-Region der codierenden Sequenz von Butyrylcholinesterase) Der 3'-Bereich dieses Klons (nachfolgend "Klon 14") enthielt jedoch einen offenen Leserahmen, der für ein anderes Polypeptid als den Rest von Butyrylcholinesterase codierte. Es wurde weiterhin festgestellt, daß die DNA im 3'-Bereich des Butyrylcholinesterasederivats mit genomischen DNA-Fragmenten hybridisierte, die aus einer akuten myelozytären Leukämie erhalten wurden.
Es wird eine Nukleinsäure umfassend die Klon 14 Sequenz bereitgestellt um MKP durch rekombinante Kultur herzustellen. Eine Nukleinsäure, welche unter stringenten Bedingungen mit der Klon 14 Sequenz hybridisieren kann (aber die nicht für das Klon 14 Polypeptid oder einen Teil davon codieren muß) wird verwendet um DNA-Quellen zu testen, welche für verwandte Polypeptide codieren oder auf Gewebe oder Zellinien, welche dieses Gen transkribieren oder zur Primer Extension.
Im Umfang dieser Erfindung liegen auch therapeutische Präparationen von MKP, welche durch herkömmliche Verfahren aus natürlichen oder rekombinanten MKP-Quellen erhalten wurden, Antikörper gegen MKP und diagnostische Verfahren zur Bestimmung von MKP, seiner Nukleinsäure oder seiner Antikörper.

Kurze Zusammenfassung der Zeichnungen

Die Figuren 1a bis 1e stellen die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Klon 14 dar. Der obere durch die Nukleotide 1 bis 564 codierte Leserahmen wird einem Polypeptid zugeschrieben das innerhalb des Vollängen-MKP vorkommt, welches wahrscheinlich den C-Terminus von MKP darstellt und wird hierin als die Sequenz oder das Polypeptid von Figur 1 bezeichnet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

MKP ist ein Hormon-aktives Polypeptid, von dem angenommen wird, daß es Nützlichkeit in der Modulierung der Hämatopoese und von Immunantworten und in diagnostischen Untersuchungen hat. MKP, seine Immunogene, seine Antikörper und eine Nukleinsäure, welche mit einer für MKP codierenden Nukleinsäure hybridisiert, sind bei der Subklassifizierung seltener Leukämien diagnostisch nützlich. MKP-Polypeptid wird in Standards zur Bestimmung von MKP Express ion durch Leukämien verwendet. Eine Nukleinsäure, die fähig ist mit für MKP codierender RNA zu hybridisieren, findet Anwendung in der Bestimmung von MKP Genamplifikation in diesen gleichen Leukämien. MKP Immunogene sind nützlich zur Herstellung von Antikörpern gegen MKP, die ihrerseits nützlich sind in MKP Immuntests, wie nachstehend ausführlicher beschrieben werden wird.
Die hämatopoetischen und immunmodulatorischen Eigenschaften von MKP werden aufgeklärt durch herkömmliche Durchmusterungstests, die den Einfluß von MKP auf das Wachstum und/oder die Differenzierung von Blutzellen und deren Vorläufern einschließlich Erythrozyten, Megakaryozyten, Stammzellen, Monozyten, Lymphozyten u.dgl. messen. Auf Basis vorläufiger Daten wird angenommen, daß MKP die Entwicklung oder Differenzierung von Megakaryozyten potenziert und eine Nützlichkeit aufweist bei therapeutischen Bedingungen, wenn eine derartige Aktivität benötigt wird. Es wird jedoch verstanden werden, daß MKP vermutlich polyfunktionell ist, und die Bestimmung anderer Wirkungen und somit Verwendungen für MKP entspricht der normalen Fachkenntnis des Fachmanns.
MKP ist definiert als ein Polypeptid mit der im bezeichneten oberen Leserahmen von Figur 1 angegebenen Sequenz, zusammen mit Aminosäuresequenzvarianten davon, worin einer oder mehrere Aminosäurereste eingefügt, entfernt oder ersetzt wurden und worin die Varianten im wesentlichen die gleiche qualitative biologische Wirkung wie das Polypeptid von Figur 1 oder sein Vollängen-, reifes Gegenstück aufweisen.
Die biologische Aktivität von MKP wird definiert als die Fähigkeit das Wachstum oder die Differentierung von Blutzellen oder deren Vorläuferzellen zu modulieren oder die Fähigkeit mit einem gegen das Polypeptid von Figur 1 erzeugten Antikörper kreuzzureagieren. Bevorzugt wird die biologische Wirkung von MKP bestimmt durch das im nachstehenden Beispiel beschriebene modifizierte Iscove's Verfahren oder durch andere herkömmliche Tests, die denjenigen aus dem Fachgebiet bekannt sind.
MKP-Varianten werden Sequenzen aufweisen die gewöhnlich zu mehr als etwa 80 Prozent mit der bezeichneten Sequenz von Figur 1 homolog sind, wobei die Sequenzen ausgerichtet wurden um eine maximale Homologie zu erreichen und alle konservativen Substitionen nicht als homolog erachtet werden. N- oder Cterminale Substitutionen sollten nicht als die Homologie der Variante zur Sequenz von Figur 1 vermindernd ausgelegt werden. MKP-Varianten schließen jedes bisher identifizierte Polypeptid aus. Typische in der Natur aufgefundene Varianten der Sequenz von Figur 1 können das Vollängenanalog von MKP, Gegenstücke aus Tieren wie etwa Schwein, nicht humane Primaten, Pferd, Maus und Schaf und Allele der vorgenannten umfassen. Andere Aminosäuresequenzvarianten sind vorbestimmt und werden durch site-directed Mutagenese hergestellt.
Aminosäuresequenzvarianten von MKP umfassen vorbestimmte Deletionen oder Einfügungen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in Figur 1 gezeigten MKP-Sequenz oder seinem reifen Homolog. Aminosäuresequenzdeletionen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten und sind üblicherweise fortlaufend. Fortlaufende Deletionen werden gewöhnlich mit einer geraden Anzahl von Resten durchgeführt, aber einzelne oder ungerade Zahlen von Deletionen sind innerhalb des Umfangs davon.
Einfügungen werden ebenfalls bevorzugt in geraden Zahlen der Reste durchgeführt obwohl Einfügungen im allgemeinen im Bereich von 1 bis 5 Resten liegen können. Einfügungen umfassen jedoch auch Fusionen an einen oder beide der Amino- oder Carboxytermini von MKP, welche in einem Längenbereich von 1 Rest bis zu Polypeptiden die 100 oder mehr Reste enthalten liegen. Ein Beispiel einer terminalen Einzeleinfügung ist reifes MKP mit einem N-terminalen Methioninrest. Diese Variante ist ein Artefakt der direkten Expression von MKP in rekombinanter Zellkultur, d.h. Expression ohne eine Signalsequenz um die Sekretion von reifen MKP zu steuern. Andere Beispiele terminaler Einfügungen umfassen 1) Fusionen von heterologen Signalsequenzen an den N-Terminus von reifem MKP um die Sekretion von reifem MKP aus rekombinanten Wirten zu erleichtern 2) Fusionen von immunogenen Polypeptiden z.B. bakteriellen Polypeptiden, wie etwa Beta-Lactamase oder einem durch den E.coli trp locus codierten Enzym, und 3) N-terminale Fusionen mit Cholinesterasen oder N-terminalen Fragmenten von Cholinesterasen, insbesondere von Butyrylcholinesterase. Der Antikörper und MKP sind kovalent gebunden, beispielsweise durch das Verfahren der EP 170,697A, obwohl andere Verfahren zum Verbinden von Proteinen herkömmlich sind und dem Fachmann bekannt sind. Immunogene Fusionen sind nützlich zum Herstellen immunogener MKP, welche als Impfstoffe zum Herstellen von MKP- Antikörpern geeignet sind.
Die dritte Gruppe von Varianten sind diejenigen, in denen mindestens ein Rest im MKP-Molekül entfernt wurde, und ein unterschiedlicher Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Derartige Substitionen werden im allgemeinen gemäß der folgenden Tabelle durchgeführt. Tabelle 1 Ursprünglicher Rest beispielhafter Ersatz
Wesentliche Veränderungen in der Funktion oder der immunologischen Identität werden durchgeführt durch Auswählen von Substitutionen, die geringfügiger konservativ sind als diejenigen in Tabelle 1, d.h. Auswählen von Resten die sich stärker unterscheiden in ihrer Wirkung auf das Aufrechterhalten (a) der Struktur des Polypeptidgrundgerüsts im Bereich der Substition z.B. als eine Blatt- oder Helixstruktur, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) dem Volumen der Seitenkette. Die Substitionen von denen im allgemeinen erwartet wird, daß sie die stärksten Veränderungen der Eigenschaften von MKP verursachen, werden diejenigen sein in denen (a) ein hydrophiler Rest z.B. Serin oder Threonin für (oder durch) einen hydrophoben Rest substituiert wird z.B. Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Valin oder Alanin, (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen anderen Rest substituiert wird, (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette z.B. Lysin, Arginin oder Histidin für (oder durch) einen elektronegativen Rest substituiert wird z.B. Glutamat oder Aspartat oder (d) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette z.B. Phenylalanin für (oder durch) einen mit keiner derartigen Seitenkette z.B. Glycin substituiert wird.
MKP-Nukleinsäure wird definiert als RNA oder DNA welche für MKP codiert oder mit einer derartigen DNA hybridisiert und unter stringenten Bedingungen damit stabil gebunden bleibt und eine Länge von mehr als etwa 10 Basen aufweist. Stringente Bedingungen werden definiert als niedrige Ionenstärke und hohe Waschtemperatur, z.B. 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat/0,1 % NaDodSo&sub4; bei 50ºC oder alternativ die Gegenwart von Denaturierungsmitteln wie etwa Formamid z.B. 50 % (Vol/Vol) Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat und 42ºC für die Hybridisierung. Für MKP codierende DNA wird aus cDNA Banken aus Fötalgewebe, gewöhnlicherweise Leber oder sezierten Gehirnregionen erhalten, aus cDNAS oder genomischer DNA von AML Leukämiezellen oder durch in vitro Synthese. Hybridisierende Nukleinsäure wird im allgemeinen durch in vitro Synthese erhalten. Die ursprüngliche Entdeckung einer DNA-Sequenz für MKP war zufällig, aber es wird verstanden werden, daß ein Fachmann leicht in der Lage wäre eine für MKP codierende Nukleinsäure zu erhalten, nachdem er mit der für MKP codierenden Nukleotidsequenz versorgt wurde. Dies wird günstig erreicht durch Absuchen von cDNA- oder genomischen Banken aus Mensch durch aus Figur 1 ausgewählte markierte Oligonukleotidsequenzen gemäß bekannter Kriterien, unter anderem daß die Sequenz eine ausreichende Länge aufweisen sollte und ausreichend unzweideutig bestimmt sein sollte, damit falsch Positive minimiert werden. Typischerweise ist ein mit P32 markiertes Oligonukleotid mit etwa 30 bis 50 Basen ausreichend, insbesondere falls das Oligonukleotid ein oder mehrere Codons für Methionin oder Tryptophan enthält.
Von besonderem Interesse ist eine MKP-Nukleinsäure, welche das Vollängenmolekül codiert, einschließlich aber nicht notwendigerweise seiner natürlichen Signalsequenz. Dieses wird erhalten durch Durchmustern von cDNA- oder genomischen Banken unter Verwendung des in Figur 1 dargestellten Vollängenklons und falls erforderlich unter Verwendung herkömmlicher Primer Extension Verfahren um DNA zu gewinnen, welche an ihrem 5'- codierenden Ende vollständig ist. Ein derartiger Klon wird auf einfache Weise mittels der Anwesenheit eines Startcodons im Leserahmen der Sequenz von Figur 1 identifiziert. Der Vollängenklon wird höchstwahrscheinlich auch für eine Signalsequenz von etwa 15 bis 25 im wesentlichen hydrophoben Resten codieren, welche unmittelbar auf den Startcodon folgen. Der Vollängenklon wird dann in eine Säugerwirtszelle transfiziert, unter Kontrolle geeigneter Expressionskontrollsequenzen, worauf der Vorläufer prozessiert und als reifer Vollängen-MKP sezerniert werden wird. Der N- Terminus dieses Moleküls wird durch herkömmlichen Edman-Abbau o.dgl. bestimmt, um den reifen Aminoterminus aufzuklären. Dies zusammen mit einer Analyse des C-terminalen Endes der natürlichen Signalsequenz leitet die Auswahl der geeigneten N-terminalen Stelle zum Konstruieren heterologer Signalsequenzfusionen, welche z.B. in mikrobiellen Wirt-Vektor-Systemen verwendbar sind.
Die für MKP codierende Nukleinsäure wird dann zur weiteren Klonierung oder zur Expression in einen replizierfähigen Vektor ligiert. Vektoren sind nützlich um in Zusammenarbeit mit kompatibien Wirtszellen (ein Wirt-Vektor-System) zwei Funktionen auszuführen. Eine Funktion ist es die Klonierung der Nukleinsäure die für MKP codiert zu erleichtern, d.h. verwendbare Mengen der Nukleinsäure zu erzeugen. Die andere Funktion ist es die Expression von MKP zu steuern. Eine oder beide dieser Funktionen werden durch das Vektor-Wirt-System ausgeführt. Die Vektoren werden in Abhängigkeit von der Funktion die sie ausführen sollen, sowie von der Wirtszelle, die für Klonierung oder Expression ausgewählt wird, verschiedene Komponenten enthalten.
Jeder Vektor wird eine Nukleinsäure enthalten die wie oben beschrieben für MKP codiert. Typischerweise wird dies die DNA sein, die für MKP in seiner reifen Form codiert, das an seinem Aminoterminus mit einem Sekretionssignal verbunden ist. Dieses Sekretionssignal ist bevorzugt die MKP-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von MKP in Humanzellen in vivo steuert. Geeignete Sekretionssignale umfassen jedoch auch Signale von anderen Tier-MKP, virale Signale oder Signale von sezernierten Polypeptiden der gleichen oder verwandter Arten.
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten eine Nukleinsäuresequenz die es dem Vektor ermöglicht in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemeinen ist in Klonierungsvektoren diese Sequenz eine, die es dem Vektor ermöglicht unabhängig von den Wirtschromosen zu replizieren und welche Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen umfaßt. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren gut bekannt. Der Replikationsursprung des gut bekannten Plasmids pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2u Plasmidursprung für Hefe und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyomavirus, Adenovirus, VSV oder BPV) sind als Klonierungsvektoren in Säugerzellen geeignet. Ursprünge sind für Säugerexpressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40- Ursprung wird in den Beispielen lediglich verwendet, da er den frühen Promotor enthält). Die meisten Expressionsvektoren sind "shuttle" Vektoren, d.h. sie sind in mindestens einer Klasse von Organismen zur Replikation fähig, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E.coli kloniert und dann wird der gleiche Vektor zur Expression in Hefe oder Säugerzellen transfiziert, obwohl er nicht fähig ist unabhängig vom Chromosom der Wirtszelle zu replizieren.
DNA wird auch durch Einfügen in das Wirtsgenom kloniert. Dies wird mit Bazillenarten einfach bewerksteiligt, beispielsweise durch Aufnahme einer DNA-Sequenz in den Vektor, die zu einer in der genomischen DNA des Bazillus vorkommenden Sequenz komplementär ist. Eine Transfektion des Bazillus mit diesem Vektor hat eine homologe Rekombination mit dem Genom und ein Einfügen von MKP-DNA zur Folge. Die Rückgewinnung von für MKP codierender genomischer DNA ist jedoch komplizierter als diejenige eines exogen replizierten Vektors, da ein Restriktionsenzymverdau erforderlich ist um die MKP-DNA herauszuschneiden.
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, auch eine selektierbare Markierung genannt. Dies ist ein Gen, das für ein Protein codiert, welches für das Überleben oder das Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderlich ist. Die Gegenwart dieses Gens gewährleistet, daß jede Wirtszelle welche den Vektor deletiert, keinen Vorteil bezüglich Wachstum oder Reproduktion über transformierte Wirte erhält. Typische Selektionsgene codieren für Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin vermitteln, (b) auxotrophe Mängel komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe liefern, welche aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. für Bazillen das für die D-Alanin Racemase codierende Gen.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1 Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorkommt (Stinchomb et al., 1979, "Nature" 282:39; Kingsman et al., 1979, "Gene" 7:141 oder Tschemper et al., 1980, "Gene" 10:157). Das trpl Gen stellt eine Selektionsmarkierung für einen mutanten Hefestamm bereit, welcher die Fähigkeit in Tryptophan zu wachsen nicht aufweist, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, "Genetics" 85:12). Die Anwesenheit der trp1 Schädigung im Hefewirtszellgenom liefert dann eine wirksame Umgebung zum Nachweisen von Transformation durch Wachstum in der Abwesenheit von Tryptophan. In ählicher Weise werden Leu2 defiziente Hefestämme (ATCC 20,622 oder 38,626) durch bekannte, das Leu2 Gen tragende Piasmide komplementiert.
Beispiele geeigneter selektierbarer Markierungen für Säugerzellen sind Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Deratige Markierungen ermöglichen die Identifizierung von Zellen welche kompetent waren um die MKP- Nukleinsäure aufzunehmen. Die Säugerzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, den zu überleben lediglich die Transformanten einzigartig angepaßt sind, indem sie die Markierung aufgenommen haben. Ein Selektionsdruck wird ausgeübt durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen, in denen die Konzentration des Selektionsmittels in Medium nach und nach verändert wird, was zu einer Amplifizierung sowohl des Selektionsgens als auch der für MKP codierenden DNA führt. Amplifizierung ist der Vorgang durch den Gene, für die ein hoher Bedarf besteht, zur Erzeugung eines für Wachstum kritischen Proteins, innerhalb der Chromosomen aufeinanderfolgender Generationen rekombinanter Zellen hintereinander wiederholt werden. Von der amplifizierten DNA werden erhöhte Mengen MKP synthetisiert.
Beispielsweise werden Zellen, welche mit dem DHFR- Selektionsgen transformiert sind zuerst identifiziert durch Kultivieren aller der Transformanten in einem Kulturmedium welches kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin enthält. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die Eierstockzellinie von chinesischem Hamster (CHO), welche in DHFR-Wirkung defizient ist, hergestellt und propagiert wie beschrieben von Urlaub und Chasin, 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77:4216. Eine besonders nützliche DHFR ist eine mutierte DHFR, die gegenüber MTX in hohem Maße resistent ist (EP 117 060A). Dieses Selektionsmittel kann mit jedem anderweitig geeigneten Wirt z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1 verwendet werden, ungeachtet der Gegenwart von endogener DHFR. Die DHFR- und MKP-codierende DNA wird dann durch Aussetzen an ein Mittel (Methotrexat oder MTX) das die DHFR inaktiviert, amplifiziert. Man stellt sicher, daß die Zelle mehr DHFR benötigt (und demzufolge alle exogene DNA amplifiziert) durch Selektieren auflediglich die Zellen, die in aufeinanderfolgenden Durchgängen mit immer größerer MTX-Konzentration wachsen können.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die geeignet sind für die Anpassung an die Synthese des Hybridrezeptors in rekombinanter Wirbeltierzellkultur sind beschrieben in M.J. Gething et al., "Nature" 293:620-625 (1981); N. Mantei et al., "Nature" 281:40-46 (1979) und A. Levinson et al., EP 117,060A und 117,058A. Ein insbesondere geeignetes Ausgangsplasmid zur Expression von MKP in Säugerzellkultur ist pE342.HBV E400.D22 (auch genannt pE348H8VE400D22, EP 117,058A).
Expressionsvektoren sollten, anders als Klonierungsvektoren, einen Promotor enthalten, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und mit der MKP Nukleinsäure operativ verknüpft ist. Promotoren sind nicht translatierte Sequenzen, die stromaufwärts des Startkodons eines Strukturgens angeordnet sind (im allgemeinen innerhalb etwa 100 bis 1000 bp), welche die Transkription und Translation der Nukleinsäure unter ihrer Kontrolle reguiieren. Sie fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die in Antwort auf eine bestimmte Veränderung der Kultivierungsbedingungen, z.B. die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder eine Temperaturveränderung, eine erhöhte Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle initieren. Heutzutage ist eine große Anzahl von Promotoren, welche von einer Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden, gut bekannt. Diese Promotoren werden mit für MKP codierender DNA operativ verknüpft, indem sie von ihrem Ursprungsgen durch Restriktionsenzymverdau entfernt werden, gefolgt von Einfügen 5' zum Startcodon von MKP. Dies soll nicht bedeuten, daß der genomische MKP-Promotor nicht geeignet sei. Heterologe Promotoren werden jedoch im allgemeinen eine stärkere Transkription und höhere Ausbeuten von exprimiertem MKP zur Folge haben.
Eine Nukleinsäure ist operativ verknüpft, wenn sie mit einer anderen Nukleinsäuresequenz in eine funktionelle Beziehung gebracht wird. Beispielsweise ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operativ mit einer DNA für ein Polypeptid verknüpft, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, welches an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer codierenden Sequenz operativ verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist mit einer codierenden Sequenz operativ verknüpft, wenn sie derart angeordnet ist, um eine Translation zu erleichtern. Im allgemeinen bedeutet operativ verknüpft, daß die verknüpften DNA-Sequenzen durchgehend sind und im Fall eines Sekretionsleaders durchgehend und im Leseraster. Ein Verknüpfen wird bewerkstelligt durch Ligieren bei passenden Restriktionsstellen. Falls derartige Stellen nicht vorhanden sind, dann werden gemäß herkömmlicher Praxis synthetische Oligonukleotidadaptoren oder -linker verwendet.
Geeignete Promotoren zur Verwendung mit prokaryontischen Wirten umfassen die ß-Lactamase- und Lactosepromotorsysteme (Chang et al., 1978, "Nature" 275:615 und Goeddel et al., 1979 "Nature" 281:544), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel 1980 "Nucleic Acids Res." 8:4057 und europäische Anmeldung Veröffentlichungsnr. 36,776) und Hybridpromotoren wie etwa den tac-Promotor (H. de Boer et al., 1983, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80:21-25). Andere bakterielle Promotoren sind jedoch geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch es einem Fachmann ermöglicht wird, sie operativ in für MKP codierende DNA zu ligieren (Siebenlist et al., 1980, "Cell" 20:269) unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren um alle erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden auch eine Shine-Dalgarno (S.D.) Sequenz enthalten, welche operativ mit der für MKP codierenden DNA verknüpft ist.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, "J. Biol. Chem." 255:2073) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, ''J. Adv. Enzyme Reg." 7:149 und Holland, 1978, "Biochemistry" 17:4900) wie etwa Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6- phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, welche induzierbare Promotoren sind mit dem zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme im Zusammenhang mit Stickstoffmetabolismus, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehyrogenase und Enzyme die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Expression in Hefe sind weiterhin beschrieben in R. Hitzeman et al., EP 73,657A. Hefe-Enhancer werden auch mit Hefepromotoren vorteilhaft verwendet.
MKP-Transkription von Vektoren in Säugerwirtszellen wird durch Promotoren kontrolliert, welche erhalten werden aus den Genomen von Viren wie etwa Polyomavirus, Cytomegalovirus, Adenovirus, Retroviren, Hepatitis B Virus und am meisten bevorzugt Affenvirus 40 (SV40) oder durch heterologe Säugerpromotoren z.B. den Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40 Virus werden günstig erhalten als ein SV40 Restriktionsfragment, das auch den viralen SV40 Replikationsursprung enthält (Fiers et al., 1978, "Nature" 273:113). Promotoren der Wirtszelle oder verwandter Spezies sind natürlich hierbei auch geeignet.
Transkription von für MKP codierender DNA durch höhere Eukaryonten wird erhöht durch Einfügen einer Enhancer-Sequenz in den Vektor. Ein Enhancer ist eine Nukleotidsequenz, üblicherweise etwa von 10 bis 300 bp, die als ein Promotor wirkt um deren Transkription zu erhöhen und tut dies in einer Weise, die relativ unabhängig von Orientierung und Lage ist. Es sind nun viele Enhancersequenzen von Säugergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Üblicherweise wird man jedoch einen Enhancer eines eukaryontischen Zellvirus verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), den frühen Promotorenhancer von Cytomegalovirus, den Polyomaenhancer von der späten Seite des Replikationsursprungs und adenovirale Enhancer. Der Enhancer kann in einer Position 5' oder 3' zur für MKP codierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, aber er wird bevorzugt an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
In eukaryontischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhaltige Zellen aus einem anderen multizellulären Organismus) verwendete Expressionsvektoren werden ebenfalls Sequenzen enthalten, welche für die Termination der Transkription und zum Stabilisieren der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise verfügbar aus den 5' und manchmal den 3' nicht-translatierten Bereichen eukaryontischer oder viraler DNAS oder cDNAS. Diese Bereiche enthalten Bereiche, die als polyadenylierte Abschnitte im nicht-translatierten Bereich der für MKP codierenden mRNA transkripiert werden. Die 3' nichttranslatierten Bereiche umfassen auch Transkriptionsterminationsstellen.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der Vektoren hierin sind die Prokaryonten, Hefe oder oben beschriebene höhere eukaryontische Zellen. Geeignete Prokaryonten umfassen gramnegative oder grampositive Organismen, z.B. E.coli oder Bazillen. Ein bevorzugter Klonierungswirt ist E.coli 294 (ATCC 31,446) obwohl andere gramnegative oder grampositive Prokaryonten wie etwa E.coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) E.coli W3110 (ATCC 27,325) Pseudomonas species oder Serratia Marcescens geeignet sind.
Zusätzlich zu Prokaryonten sind eukaryontische Mikroben wie etwa filamentäre Pilze oder Hefe für Vektoren, welche für MPK codieren, geeignete Wirte. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der unter den niederen eukaryontischen Wirtsmikroorganismen der am häufigsten verwendete. Eine Anzahl anderer Genera, Spezies und Stämme ist jedoch allgemein verfügbar und hierin geeignet.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von MKP stammen von multizellulären Organismen ab. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungswirkungen fähig. Im Prinzip kann mit jeder eukaryontischen Zellkultur gearbeitet werden, ob aus Wirbeltier- oder nicht- Wirbeltierkultur, obwohl Zellen von Säugetieren wie etwa Menschen bevorzugt sind. Eine Propagierung derartiger Zellen in Kultur ist der se gut bekannt. Siehe Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Herausgeber (1973). Beispiele geeigneter Säugerwirtszellinien sind VERO- und HeLa- Zellen, Eierstockzellinien von chinesischem Hamster, die WI38- , BHK-, COS-7-, MDCK-Zellinien und die Embyro-Nierenzellinie 293 aus Mensch.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressionsoder Klonierungsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, welche modifiziert sind wie es angemessen ist um Promotoren zu induzieren oder Transformanten, welche amplifizierte Gene enthalten, zu selektieren. Die Kulturbedingungen wie etwa Temperatur, pH u.dgl. sind geeignet diejenigen, die früher mit der je nachdem zum Klonieren oder zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden, und sind für den gewöhnlichen Fachmann offensichtlich.
MKP wird bevorzugt aus dem Kulturmedium als ein sezerniertes Protein gewonnen, obwohl es wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal exprimiert wird, auch aus Lysaten der Wirtszelle gewonnen werden kann. Als ein erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert um teilchenförmige Zelltrüminer zu entfernen. MKP wird auch von kontaminierenden löslichen Proteinen gereinigt, beispielsweise durch Fraktionierung oder Immunaff initäts- oder Ionenaustauschsäulen. Derartige Verfahren wie Chromatographie über Alkylsepharose, Siliciumoxid oder ein Anionen- oder Kationenaustauschharz oder Gelelektrophorese werden verwendet, um das MKP von Kontaminationen abzutrennen. MKP-Varianten, in denen Reste deletiert, eingefügt oder substituiert wurden, werden in der gleichen Weise wie natürliches MKP gewonnen, wobei alle wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften, welche durch die Veränderung verursacht wurden, berücksichtigt werden. Beispielsweise erleichtert eine Präparation einer MKP- Fusion mit einem anderen Protein, z.B. bakteriellen Antigenen, eine Reinigung, weil eine einen Antikörper gegen das Antigen enthaltende Immunaffinitätssäule verwendet werden kann um die Fusion zu adsorbieren. Ein Proteaseinhibitor wie etwa PMSF kann ebenfalls nützlich sein um einen proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen und Antibiotika können aufgenommen werden um das Wachstum zufälliger Kontaminationen zu verhindern. Ein Fachmann wird erkennen, daß Reinigungsverfahren welche für natürliches MKP geeignet sind eine Modifizierung erfordern können, um Veränderungen in der Eigenschaft von MKP oder seiner Varianten bei Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.
Therapeutische Formulierungen von MKP werden hergestellt zur Lagerung durch Mischen von MKP mit dem gewünschten Reinheitsgrad, gegebenenfalls mit physiologisch verträglichen Trägern, Vehikeln oder Stabilisatoren in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wäßriger Lösungen. Verträgliche Träger, Vehikel oder Stabilisatoren sind bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für Empfänger nicht toxisch und umfassen Puffer, wie etwa Phosphat, Citrat und andere organische Säuren, Antioxidantien umfassend Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste) Proteine wie etwa Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline, hydrophile Polymere wie etwa Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie etwa Glycin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate umfassend Glucose, Mannose oder Dextrine, Chelatbildner wie etwa EDTA, Zuckeralkohole wie etwa Mannitol oder Sorbitol, Salz-bildende Gegenionen wie etwa Natrium und/oder nicht ionische oberflächenaktive Mittel wie etwa Tween, Pluronics oder PEG. Für eine therapeutische Verabreichung zu verwendendes MKP muß steril sein. Dies wird auf einfache Weise bewerkstelligt durch Filtration durch sterile Filtermembranen vor oder im Anschluß an eine Lyophilisierung. MKP wird üblicherweise in lyophilisierter Form gelagert werden. Der pH-Wert der MKP- Präparationen wird typischerweise um etwa 6 bis 8 liegen.
Therapeutische MKP-Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einer Öffnung für sterilen Zugang gegeben, beispielsweise einen Beutel für intravenöse Lösung oder eine Ampulle mit einem Verschluß der mit einer subkutanen Injektionsnadel durchbohrbar ist.
MKP wird gegebenenfalls kombiniert mit oder verabreicht zusammen mit anderen thrombo- oder erythropotenzierenden Mitteln, umfassend Interleukin-3, Erythropoietin oder Activin und wird mit anderen herkömmlichen Therapien für Thrombopenie verwendet.
Antikörper gegen MKP werden mit anderen herkömmlichen Therapien für Thrombozytämie verwendet, wobei sie die abnormal hohen Megakaryozytopoeseraten, die diese Art von Krankheit kennzeichnen, blockieren.
MKP-Präparationen werden typischerweise Tieren, welche Trombopenie aufweisen, verabreicht. Die Verabreichungsart erfolgt nach bekannten Verfahren, z.B. intravenös, intraperetoneal, intramuskulär, intralesionale Infusion oder Injektion oder durch Systeme mit lang anhaltender Freisetzung wie nachstehend angemerkt. MKP wird kontinuierlich durch Infusion verabreicht, obwohl eine Bolusinjektion annehmbar ist.
Geeignete Beispiele von Präparationen mit langanhaltender Freisetzung umfassen semipermeable Polymermatrizen in der Art vorgeformter Gegenstände z.B. Filme oder Mikrokapseln. Matrizen für langanhaltende Freisetzung umfassen Polylactide (US-Patent 3,773,919, EP 58,481), Copolymere von L- Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22 (1):547-556), Poly(2- hydroxyethylmethacrylat) (R. Langer et al., 1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15:167-277 und R. Langer, 1982, chem. Tech. 12:98-105), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., Id.) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133,988A). MKP- Zusammensetzungen mit lang anhaltender Freisetzung umfassen auch in Liposomen eingeschlossenes MKP. MKP enthaltende Liposomen werden durch per se bekannte Verfahren hergestellt: DE 32 18 121A; Epstein et al., 1985, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:3688-3692; Hwang et al, 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77:4030-4034; EP 52322A, EP 36676A; EP 88046A, EP143949A, EP 142641A, die japanische Patentanmeldung 83-118008, die US- Patente 4,485,045 und 4,544,545 und EP 102,324A. Gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200 bis 800 Angström) unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der ausgewählte Anteil für die optimale MKP-Therapie eingestellt wird.
Die therapeutisch zu verwendende Menge von MKP wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen der Verabreichungsart und dem Zustand des Patienten abhängen.
Demgemäß wird es für den Therapeuten erforderlich sein, die Dosierung zu titrieren und die Verabreichungsart nach Bedarf zu modifizieren um die optimale therapeutische Wirkung zu erhalten. Typischerweise wird der Kliniker MKP verabreichen bis eine Dosis erreicht ist, die einen normalen Plättchengehalt von etwa 250 ± 50 x 10³/ul Blut wieder herstellt. Der Fortschritt dieser Therapie wird auf einfache Weise überwacht durch herkömmliche Hämatologietests oder Zellzählungen im Labor. Geeignete therapeutische Ausgangsdosierungen können aus den nachstehend beschriebenen in vitro Wirksamkeitsuntersuchungen extrapoliert werden.
Geeignete diagnostische Tests für MKP und seine Antikörper sind der se gut bekannt. Zusätzlich zu dem nachstehend beschriebenen Biotest kann man Kompetitions-, Sandwich- und sterische Inhibierungs-Immuntesttechniken verwenden. Die Kompetitions- und Sandwichverfahren verwenden einen Phasentrennungsschritt als einen festen Bestandteil des Verfahrens, während die sterischen Inhibierungstests in einem einzigen Reaktionsgemisch durchgeführt werden. Im wesentlichen werden die gleichen Verfahren für den Test von MKP und für Substanzen die MKP binden verwendet, obwohl bestimmte Verfahren bevorzugt werden in Abhängigkeit vom Molekulargewicht der zu untersuchenden Substanz. Die zu untersuchende Substanz wird daher hierin als ein Analyt bezeichnet, ungeachtet ihres anderweitigen Status als ein Antigen oder Antikörper und Proteine die den Analyten binden werden als Bindungspartner bezeichnet, ob sie Antikörper, Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene sind.
Analytische Verfahren für MKP oder seine Antikörper verwenden alle eines oder mehrere der folgenden Reagenzien: markiertes Analytanalogum, immobilisiertes Analytanalogum, markierter Bindungspartner, immobilisierter Bindungspartner und sterische Konjugate. Die markierten Reagenzien sind auch als "Nachweisstoffe" bekannt.
Die verwendete Markierung ist jede nachweisbare Funktionalität die die Bindung von Analyt und seinem Bindungspartner nicht beeinträchtigt. Zahlreiche Markierungen sind zur Verwendung in Immuntests bekannt, wobei Beispiele Enzyme wie etwa Meerrettichperoxidase, Radioisotope wie etwa ¹&sup4;C und ¹³¹I, Fluorophore wie etwa Seltenerdchelate oder Fluoreszein, stabile Radikale u.dgl. umfassen. Es sind herkömmliche Verfahren verfügbar um diese Markierungen kovalent an Proteine oder Polypeptide zu binden. Derartige Bindungsverfahren sind zur Verwendung mit MKP oder seinen Antikörpern, die alle proteinhaltig sind, geeignet.
Für bestimmte Testverfahren ist eine Immobilisierung von Reagentien erforderlich. Eine Immobilisierung bringt ein Abtrennen des Bindungspartners von jedem Analyten, der in Lösung frei verbleibt mit sich. Dies wird herkömmlich bewerkstelligt durch Unlöslichmachen entweder des Bindungspartners oder des Analytanalogums vor dem Testverfahren, wie durch Adsorption an eine wasserunlösliche Matrix oder Oberfläche (Bennich et al., US-3,720,760), durch kovalentes Koppeln (z.B. unter Verwendung einer Quervernetzung mit Glutaraldehyd) oder durch Unlöslichmachen des Partners oder Analogums nachträglich, z.B. durch Immunpräzipitation.
Andere Testverfahren wie etwa kompetitive oder Sandwichverfahren sind gut eingeführt und werden in der gewerblichen diagnostischen Industrie weithin verwendet.
Kompetitive Tests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Analogums (des "Nachweisstoffes") mit dem Analyten in der Untersuchungsprobe um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen auf einem gemeinsamen Bindungspartner zu kompetieren. Der Bindungspartner wird im allgemeinen vor oder nach der Kompetition unlöslich gemacht und dann werden der an den Bindungspartner gebundene Nachweisstoff und Analyt vom ungebundenen Nachweisstoff und Analyt abgetrennt. Diese Abtrennung wird bewerkstelligt durch Dekantieren (wenn der Bindungspartner zuvor unlöslich gemacht wurde) oder durch Zentrifugieren (wenn der Bindungspartner nach der Kompetitionsreaktion präzipitiert wurde). Die Menge des Analyten in der Untersuchungsprobe ist umgekehrt proportional zur Menge von gebundenem Nachweisstoff, wie durch die Menge der Markierungssubtanz gemessen. Dosiswirkungskurven mit bekannten Mengen von Analyt werden hergestellt und mit den Untersuchungsergebnissen verglichen, um die in der Untersuchungsprobe vorhandene Menge von Analyt quantitativ zu bestimmen. Diese Tests werden, wenn Enzyme als die nachweisbaren Markierungen verwendet werden, ELISA-Systeme genannt.
Eine andere Art eines kompetitiven Tests, "homogener" Test genannt, erfordert keine Phasentrennung. Hier wird ein Konjugat eines Enzyms mit dem Analyten hergestellt und derart verwendet, daß wenn ein Antianalyt an den Analyten bindet die Gegenwart des Antianalyten die Enzymaktivität modifiziert. In diesem Fall werden MKP oder seine immunologisch wirksamen Fragmente mit einer bifunktionellen organischen Verbrückung an ein Enzym wie etwa Peroxidase konjugiert. Konjugate werden zur Verwendung mit Anti-MKP ausgewählt, so daß eine Bindung des Anti-MKP die Enzymaktivität der Markierung hemmt oder potenziert. Dieses Verfahren wird per se unter dem Namen EMIT weithin praktiziert.
Sterische Konjugate werden in sterischen Inhibierungsverfahren für einen homogenen Test verwendet. Diese Konjugate werden synthetisiert durch kovalentes Verknüpfen eines Haptens mit niedrigem Molekulargewicht an einen kleinen Analyten, so daß ein Antikörper gegen das Hapten im wesentlichen nicht in der Lage ist das Konjugat zur gleichen Zeit wie ein Anti-Analyt zu binden. Bei diesem Testverfahren bindet der in der Untersuchungsprobe vorhandene Analyt Anti-Analyt, wobei zugelassen wird, daß Antihapten das Konjugat bindet, was eine Veränderung der Eigenschaft des Konjugathaptens, z.B. eine Veränderung in der Fluoreszenz wenn das Hapten ein Fluorophor ist, zur Folge hat. Aufgrund des hohen Molekulargewichts von MKP sind homogene oder sterische Hinderungsverfahren zur Bestimmung von MKP nicht bevorzugt.
Sandwichtests sind zur Bestimmung von MKP oder MKP-Antikörpern insbesondere geeignet. In sequentiellen Sandwichtests wird ein immobilisierter Bindungspartner verwendet um Analyt in der Untersuchungsprobe zu adsorbieren, die Untersuchungsprobe wird entfernt wie etwa durch Waschen, der gebundene Analyt wird verwendet um markierten Bindungspartner zu adsorbieren und gebundenes Material wird dann von restlichem Nachweisstoff abgetrennt. Die Menge von gebundenem Nachweisstoff ist zum Analyt in der Untersuchungsprobe direkt proportional. In "simultanen" Sandwichtests wird die Untersuchungsprobe nicht abgetrennt bevor der markierte Bindungspartner zugegeben wird. Ein sequentieller Sandwichtest, welcher einen monoklonalen Anti-MKP-Antikörper als einen Antikörper und einen polyklonalen Anti-MKP-Antikörper als den anderen verwendet, ist zum Untersuchen von Proben auf MKP-Aktivität geeignet.
Die vorstehend genannten sind lediglich beispielhafte Diagnostiktests für MKP und Antikörper. Andere Verfahren, die nun oder später zur Bestimmung dieser Analyten entwickelt werden, werden vom Umfang hierin umfaßt einschließlich des unten beschriebenen Biotests.
Kovalente Modifizierungen des MKP-Moleküls werden vom Umfang hierin umfaßt. Derartige Modifizierungen werden in das Molekül eingeführt durch Umsetzen vorbestimmter Aminosäurereste des gereinigten oder rohen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das fähig ist mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren. Die entstehenden kovalenten Derivate sind nützlich als Immunogene oder in Programmen, die darauf gerichtet sind Reste, die für biologische Aktivität wichtig sind, zu identifizieren.
Cysteinreste werden sehr häufig mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen) wie etwa Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt um Carboxymethyl- oder Carboxamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinreste werden auch derivatisiert durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Bromo- ß-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetolphosphat, N- Alkylmaleimide, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2- pyridyldisulfid, p-Chloromercuribenzoat, 2-Chloromercuri-4- nitrophenol oder Chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Histidinreste werden derivatisiert durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5 bis 7,0; dieses Mittel ist relativ spezifisch für die Histidinseitenkette. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls geeignet; die Reaktion sollte in 0,1 M Natriumkakodylat bei pH 6,0 durchgeführt werden.
Lysin- und Amino-terminale Reste werden mit Succinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Eine Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung einer Umkehrung der Ladung der Lysinreste. Andere geeignete Reagentien zur Derivatisierung αν Amino enthaltender Reste umfassen Imidoester wie etwa Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Claroborohydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O- Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und eine Transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Argininreste werden modifiziert durch Reaktion mit einem mehrerer herkömmlicher Mittel unter ihnen Phenylglyoxal, 2,3- Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Eine Derivatisierung von Argininresten erfordert, daß die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, aufgrund des hohen pKa der funktionellen Gruppe Guanidin. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der Arginin-&epsi;-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosinresten per se ist in großem Umfang untersucht worden, mit besonderem Interesse Spektralmarkierungen in Thyrosinreste einzuführen, durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Sehr häufig werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet um O-Acetylthyrosylspezies bzw. 3- Nitroderivate zu bilden. Tyrosinreste werden unter Verwendung von ¹²&sup5;I oder ¹³¹I jodiniert um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests herzustellen, wobei das nachstehend beschriebene Chloramin T Verfahren geeignet ist.
Carbonsäureseitengruppen (Asparaginsäure oder Glutaminsäure) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') wie etwa 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4)-ethyl)carbodiimid oder 1- Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid selektiv modifiziert. Weiterhin werden Aspartat und Glutamatreste durch Reaktion mit Ammoniumionen in Asparagin und Glutaminreste überführt.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich zur Herstellung intermolekularer Aggregate des Proteins mit immunogenen Polypeptiden sowie zum Quervernetzen des Proteins an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Test oder bei der Affinitätsreinigung von MKP- Antikörper. Gewöhnlich verwendete quervernetzende Mittel umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4- Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester umfassend Disuccinimidylester wie etwa 3,3'- Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide wie etwa Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie etwa Methyl-3-[(p-Azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben lichtaktivierbare Intermediate, die fähig sind in der Gegenwart von Licht Quervernetzungen auszubilden. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizes wie etwa Cyanogenbromid, aktivierte Kohlehydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten 3,969,287, 3,691,016, 4,195,128, 4,247,642, 4,229,537 und 4,330,440 beschrieben werden, zur Proteinimmobilisierung verwendet.
Glutamin- und Asparaginreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamat- und Aspartatresten deamidiert. Alternativ können diese Reste unter leicht sauren Bedingungen deamidiert werden. Jede Form dieser Reste fällt in den Umfang von MKP.
Andere Modifizierungen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Serin- oder Threoninresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, Seiten 79-86 [1983]), Acetylierung des N-terminalen Amins und in manchen Fällen Amidierung der C-terminalen Carbonsäuregruppe.
Antikörper gegen MKP werden im allgemeinen in Tieren gezücht durch mehrere sc oder ip Injektionen von MKP und eines Adjuvans wie etwa Freund'sches Adjuvans und/oder Tumornekrosefaktor. Es kann nützlich sein das MKP an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke (keyhole limpet), Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, z.B. Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Succinsäureanhydrid, SOCl&sub2; oder R¹N = C = NR. Aggregierende Mittel wie etwa Alaun können ebenfalls verwendet werden um die Immunantwort zu verstärken.
Tiere, gewöhnlicherweise Kaninchen oder Mäuse, werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate, bevorzugt ein Glutaraldehyd- oder Succinsäureanhydridkonjugat an Sojabohnentrypsininhibitor, immunisiert durch Kombinieren von 1 mg oder 1 ug Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Freund'schem komplettem Adjuvans und Injizieren der Lösung intradermal an mehreren Stellen mit humanen TNF-α zu ug/kg. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge von Konjugat in kompletten Freund'schem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen aufgefrischt. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgelassen und das Serum auf den Anti-MKP-Titer untersucht. Die Tiere werden aufgefrischt bis der Titer einen Plateauwert erreicht. Bevorzugt wird das Tier mit dem Konjugat des gleichen MKP-Polypeptids, aber das an ein unterschiedliches Protein und/oder mittels eines unterschiedlichen quervernetzenden Mittels konjugiert ist, aufgefrischt.
Monoklonale Antikörper werden hergestellt durch Gewinnen von Milzzellen aus geeignet immunisierten Tieren und Immortalisieren der Zellen in herkömmlicher Weise z.B. durch Fusion mit Myelomzellen oder durch Transformation mit EB-Virus und Durchmustern auf Klone welche den gewünschten Antikörper exprimieren.
Quantifizierung von amplifizierten MKP Genen in periphären Blutzellen von Leukämiepatienten wird diagnostiziert durch DNA dot blot Hybridisierung. Für diesen Zweck werden Reihenverdünnungen denaturierter genomischer DNA, welche durch Standardverfahren aus Blutproben untersuchter Patienten gereinigt wurde, unter Verwendung geeigneter Auftragsmittel auf Nylonfilter aufgebracht. Gereinigte MKP-DNA wird parallel zur Kalibrierung aufgebracht. Alle Proben enthalten auch denaturierte Träger-DNA wie etwa Lachssperma-DNA um eine konstante DNA-Gesamtmenge pro Auftragspunkt (üblicherweise 2 ug) zu ergeben. Filter werden zur Hybridisierung mit P32 MKP DNA oder mit biotinylierter MKP DNA inkubiert und unter stringenten Bedingungen gewaschen. Die Mengen genomischer MKP DNA, die mit der markierten Sonde in jedem Patienten hybridisieren, werden dann bestimmt in Werten die pgMKP DNA entsprechen, durch optische Densitometrie auf exponiertem Röntgenfilm (im Falle einer P32 markierten Sonde) oder einer konjugierten zweiten Fluorosonde (im Falle biotinylierter MKP DNA) . In einer typischen Diagnoseuntersuchung werden Proben von bis 2 ug genomischer DNA 16 Stunden hybridisiert und wie oben ausgeführt gewaschen.
Das Prinzip dieses Tests ist die Bestimmung mutmaßlicher Störungen auf der Stufe des MKP-Gens und nicht des Proteinprodukts. Da molekulare Veränderungen auf der Stufe von Genen und Chromosomen scheinbar mit dem Auftreten angeborener Krankheiten verknüpft sind sowie das Ausmaß bestimmter Krankheiten widerspiegeln, kann diese Art der Bestimmung neue klinische Information liefern.

Beispiel 1

Eine Modifizierung von Iscove's Verfahren (in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et al, Herausgeber [New York, Academy Press] Seiten 37-52) zum Anziehen hämatopoeitischer Stammzellen in Methylcellulosekultur wurde verwendet in Kombination mit IMDM-Medium (Iscove's Modifizierung von Dulbecco's Medium). Knochenmarks-(BM)-zellen von 8 bis 12 Wochen alten C3H/HeJ (endotoxinresistenten) Mäusen wurden mittels Spritze abgenommen und im obigen Medium bei einer Konzentration von 10&sup5; Zellen/ml bei 5 % CO&sub2; und 37ºC angezogen.
5 % PWM-Sp-CM + 10 % WEHI-CM stellten die positive Kontrolle dar während 10 % WEHI-CM alleine die Negativkontrolle für alle anschließenden Experimente bildete. In einem typischen Experiment wurde die Anzahl von megakaryozytären Kolonien am Tag 7 in der Positivkontrolle zu 60/ml/Platte ermittelt während 30/ml/Platte in der Negativkontrolle bestimmt wurden.

I

Eine neue cDNA-Sequenz wurde in reversen Transkripten fötaler Gangliosid mRNA durch die Verwendung von BuChE-Sonden identifiziert. Diese bestand aus den exakten ersten 249 Nukleotiden von BuChE-cDNA (Prody et al. 1987) gefolgt von der in Figur 1 umfaßten Sequenz. Die Verknüpfungsstelle war daher
... TTT CTT GGA ATT CGC GGC ...
Phe Leu Gly Ile Arg Gly
Buche cDNA Klon 14 cDNA
Es ist jedoch anzumerken, daß es möglich ist, daß das ATT- Triplett ebenfalls von BuChE cDNA beigesteuert wird und kein Teil von Klon 14 ist.
Xenopus Oocyten wurde entweder Klon 14 non-sense mRNA Klon 14 sense mRNA Butyrlcholinesterase (BuChE) mRNA oder Barth Medium (das zum Anziehen der Oocyten verwendete Medium) injiziert. Die Überstände wurde nach 20 bis 22 Stunden geerntet, mit IMDM auf 1:20 verdünnt, filtersterilisiert und erneut mit IMDM auf 1 zu 100 verdünnt. Jeder der Überstände wurde in zwei Konzentrationen, 1 zu 20 und 1 zu 100 in lediglich WEHI-CM enthaltendes Kulturmedium eingebracht. In jedem Fall machte er 5 % des Gesamtvolumens aus. Megakaryozytenkolonien wurden nach sieben Tagen Inkubation ausgezählt. Zugegebener Faktor Anzahl megakaryozytärer Kolonien/mla positiv negativ Hemmung Ergebnisse Nb nonsense sense a. Ergebnisse ausgedrückt als Durchschnitt ± SEM b. N = Anzahl ausgezählter Platten
Aus diesem Experiment war es offensichtlich, daß sowohl der sense Klon 14 und das Barth Medium Ergebnisse erzeugten, die ähnlich oder überlegen war zu dem synergistischen Effekt von PWM-SpCM und WEHI-CM, während BuChE auf das Megakaryozytenkoloniewachstum entschiedend hemmend wirkte. Diese letztere Erkenntnis ist in einer Linie mit den früheren Ergebnissen von Burstein et al. (J. Cell Physiol. 103:201-208 [1980]) die zeigten, daß ein Acetylcholinesterase- (AChE) -Inhibitor ein Megakaryozytenkoloniewachstum stimulierte. Der nonsense Klon 14 ergab dazwischenliegende Werte, die schwierig zu interpretieren waren. Zu diesem Zeitpunkt konnten wir nicht zwischen den Hintergrundeffekten der endogenen Oocytensekretionen in das Barth Medium und denen, die durch den sense Klon 14 induziert wurden, wenn in die Oocyten injziert, unterscheiden. Es sollte diesbezüglich bemerkt werden, daß eine mRNA Mikroinjektion das endogene Ausmaß der Proteinsekretion aus Oocyten vermindert (H. Soreq, nicht veröffentlicht). Es ist somit möglich daß die Klon 14 nonsense Gruppe die korrekte Negativkontrolle für den sense Klon 14 darstellt.

II.

Um zu bestimmen ob die umgebenden Zellen der Oocyten Faktoren erzeugten, welche wirksam waren die Megakaryozytenentwicklung zu potenzieren, wurde das obige Experiment wiederholt unter Verwendung ganzer Oocyten wie zuvor und zusätzlich von Oocyten, die an umgebenden Zellen durch Kollagenasebehandlung (Kollagenasetyp I, Sigma) verarmt waren. Beiden Oocytenarten wurde sense Klon 14 injiziert. Die Ergebnisse bestätigten diejenigen von Experiment I ,die hier wiederholt wurden, umfassend Klon 14 sense und antisense, BuChE und das Barth injizierte Oocyten CM. Zugegebene Faktoren Positive Ergebnisse N 14 sense Kollagenase-behandelt
Die Anzahl der Megakaryozytenkolonien, die erzeugt wurden aus dem CM der Kollagenase-behandelten Oocyten, die mit 14 Sens Klon injiziert worden waren, entsprachen denen die aus dem Barth Medium erzeugt worden waren und waren geringfügig höher als diejenigen, die aus den unbehandelten 14 sense Klon Oocyten und den PWM + WEHI Kontrollen gebildet wurden. Es wurde daher versuchsweise geschlossen, daß die umgebenden Zellen des Oocyten keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren zu denen, die durch die Barth injizierten Oocyten und/oder die 14 sense Klon mRNA erzeugt wurden, bereitstellen.

III.

In einem weiteren Versuch um zwischen den möglichen Wirkungen nativer Sekretionen des Oocyten und den denjenigen des 14 sense Klones zu unterscheiden, wurden die verdünnten Überstände unbehandelter Oocyten und Barth injizierter Oocyten 3' und 15' bei 45ºC behandelt. Der Grundgedanke hierbei war, daß amphibische Proteine viel stärker gegenüber Temperaturen wie etwa 45ºC empfindlich sind als Säugerproteine und möglicherweise inaktiviert würden. Die Überstände wurden vor dem Erwärmen mit Sorgfalt verdünnt, so daß Konzentrationseffekte diejenigen aufgrund des Erwärmens nicht maskieren würden. Die Ergebnisse sind wie in der Tabelle: Zugegebene Faktoren Anzahl megakaryocytärer Kolonien/ml N 3. unbehandelte Oocytensekretion Inkubation 4. Barth behandelte Oocytensekretion
Es wurde aus dem obigen Experiment geschlossen, daß ein Erwärmen der Oocytenüberstände für sogar lediglich 3 Minuten eine merkliche Verminderung der Megakaryozyten-potenzierenden Aktivität verursacht. Sowohl Barth injizierte als auch unbehandelte Oocytensekretionen enthalten diese Aktivität in ähnlichen Mengen, was zeigt, daß der native Oocytenfaktor kein Ergebnis der Injektion selbst ist.

IV.

Die Wirkung von CM's von Oocyten, die mit 14 sense Klon oder Barthmedium injiziert worden waren, vor und nach Kollagenasebehandlung, auf die Stimulation früher multipotentieller hämatopoietischer Vorläufer, wurde untersucht. Erythropoietin (EPO) und WEHI-3-CM enthaltende Kulturen wurden als die Vergleichsbasis für alle experimentellen Kombinationen verwendet. Diese Kombination von Faktoren ist synergistisch und ist dafür bekannt, daß sie eine hohe Zahl großer gemischter Kolonien, d.h. klonaler Kolonien, welche verschiedene Typen hämatopoetischer Zellen enthalten, erzeugt. In diesem Fall ist der vorwiegende Zelltyp erythroid mit kleineren Zahlen von Makrophagen, Granulozyten und Megakaryozyten.
Zwei Einheiten EPO/ml wurden in diesen Experimenten verwendet und der Inkubationszeitraum betrug 8 bis 10 Tage bei 5 % CO2 und 37ºC. Zugegebene Faktoren Mischkolonien/ml G-M Kolonien/ml sense Kollagenase-behandelt Barth
Aus diesem Experiment wurde geschlossen, daß CM's von Barth und 14 sense Klon einen hämatopoietischen Wachstumsfaktor enthalten, der in Gegenwart von sowohl EPO und WEHI -CM synergistisch die Erzeugung von Mischkolonien, welche vorwiegend Zellen der erythroiden Linie enthalten, verstärkt. Der Effekt war bei der 1:20 Verdünnung am stärksten ausgeprägt. Hier gab es wie in den Megakaryozytenexperimenten keinen Unterschied zwischen Oocyten mit oder ohne umgebende Zellen. Es war wiederum nicht möglich zwischen dem Effekt der nativen Oocytensekretion und demjenigen, der durch die Injektion des 14 sense Klons induziert wird, zu unterscheiden. Aus den wenigen getroffenen Beobachtungen scheint es, daß der 14 sense Klon auch einen ausgesprochenen Effekt auf die Anzahl der erzeugten Granulozyten-Makrophagen-Kolonien hatte.

V.

Morphologische Studien

Von Kolonien die in Kulturen, die unter verschiedenen Bedingungen erzeugt wurden, auftraten, wurden unter Verwendung einer Shandon Model 2 Cytozentrifuge und einer May-Grunwald- Giemsa Färbung Cytospinpräparationen hergestellt. Es wurde festgestellt, daß Kolonien einen hohen Anteil (bis zu 80 %) sowohl frühe als auch reife Megakaryozyten enthielten und einen kleineren Anteil von Granulozyten, Makrophagen und Plasmazyten. Frühe Megakaryozyten, gekennzeichnet durch einzelne, große, gelappte oder nierenförmige Nuklei, waren viel zahlreicher als die reifen Formen.
Unter Verwendung von differentiellem Interferenzkontrast wurde eine interessante Gruppe von Phänomenen beobachtet. Zu gegebenen Entwicklungsstadien der Kulturen (bei 6 bis 10 Tagen) wurde beobachtet, daß enorme Amöben-ähnliche Formen sich fließend durch das Medium bewegten, die häufig das gesamte Gesichtsfeld überdeckten. Diese Megakaryozyten mit freier Form, vermutlich das Ergebnis einer Fusion, würden innerhalb Minuten damit beginnen sich in zwei kleinere Megakaryozyten abzuschnüren. Manchmal konnte man sogar ein gleichzeitiges Abschnüren an zwei verschiedenen Stellen beobachten, was zur Bildung dreier kleinerer Megakaryozyten führte. In den Kulturen in denen zahlreiche ähnliche Formen in derselben Größenordnung wie Plättchen (0,5 bis 1 Mikrometer) am Boden der Petrischalen gefunden wurden, wurden Miniaturdichtegradienten gebildet. In intermediären Lagen waren Megakaryozyten kleiner und mittlerer Größen konzentriert und die enormen Megakaryozyten mit einer freien Form schwammen oben. An der Oberfläche der Megakaryozyten mit mittlerer Größen waren häufig Cluster von Granulozyten angeheftet. Es ist möglich, daß das Abschnüren kleiner Megakaryozyten aus den großen freien Formen ein Teil der nicht mitotischen cytoplasmatischen Reifung der Megakaryopoese darstellt.

Folgerungen

1. Die synergistische Kombination von PWM-SpCM + WEHI-3-CM und WEHI-3-CM alleine können in einem Methylcellulose-IMDM klonalen Test als Megakaryozytenpotentiatoren verwendet werden und als eine Vergleichsgrundlage für eine megakaryozytopoetische Aktivität unbekannter Wachstumsfaktoren dienen. Die Quellen dieser Wachstumsfaktoren sind die Überstände von Xenopos Oocyten, die induziert wurden durch mRNAS verschiedener Klone, die aus einer cDNA Bank eines Hirnstammes von einem neugeborenen Mensch entwickelt wurden.
2. Ersatz des PWM-SpCM durch die verschiedenen Überstände des sense Klons 14 und des für das Oocytenwachstum verwendeten Barthmediums führten zu einer ähnlichen synergistischen Potenzierung des CFU-Megakaryozytenwachstums. Dies ließ jedoch Zweifel an der Quelle der synergistischen Faktoren bestehen.
3. BuChE mRNA, wenn durch Xenopus Oocyten in Protein translatiert, hemmte das Wachstum von CFU-Megakaryozyten, verhielt sich diesbezüglich umgekehrt zu AChE Inhibitoren, ein Ergebnis das angesichts von Inhibitoruntersuchungen und der beträchtlichen Sequenzhomologie zwischen humaner AChE und BuChE zu erwarten war.
4. Oocyten umgebende Zellen waren für die festgestellte synergistische Aktivität nicht verantwortlich, da ihre Entfernung durch Kollagenase falls überhaupt eine erhöhte Wirkung auf eine megakaryozytäre Koloniebildung hatte.
5. Ein Erwärmen der Überstände unbehandelter oder Barth injizierter Oocyten während 3 bis 15'' bei 45ºC verursachte eine merkliche Verminderung in der megakaryozytären synergistischen Aktivität was darauf hinweist, daß mindestens ein Teil der synergistischen Aktivität auf temperaturempfindliche amphibische Proteine zurückzuführen sein könnte.
6. Es zeigte sich, daß die gleichen Überstände der Klon 14 und Barth injizierten Oocyten eine beträchtliche synergistische Wirkung mit EPO und WEHI-CM auf die Mischkoloniebildung und CFU-GM Bildung hatten. Diese Wirkung, falls festgestellt wird daß sie mit dem gleichen Molekül in Zusammenhang steht, das die synergistische Wirkung auf CFU- Megakaryozytenkolonien erzeugt, könnte eine Multi-CSF Natur der Wirkung nahelegen. In diesem Zusammenhang könnte EPO eine Wirkung auf die Entwicklung von CFU-megakaryozytären Kolonien haben.
7. Auf Basis früherer Untersuchungen mit WEHI-3-CM kann angenommen werden, daß die Wirkung von WEHI in den obigen Experimenten durch die Anwesenheit von IL-3 in diesem CM verursacht wird.

Beispiel 2

Die Untersuchung in diesem Beispiel wurde durchgeführt um die Annahme zu erforschen, daß die Klon 14- und die Humancholinesterasegene physikalisch verwandt sind und nicht lediglich ein Rekombinationsartefaktereignis darstellen, und daß geänderte Klon 14 Gene (umgelagert, amplifiziert oder in beliebiger anderer Weise mutagenisiert) an den hohen Plättchenzahlen in Patienten mit akuter myeloider Leukämie beteiligt sind.
Es wurden daher 17 Leukämiefälle untersucht unter Verwendung von Butyrylcholinesterase (BuChE) cDNA und Klone 14 cDNA als Sonden. Diese umfaßten 9 Fälle von AML, 5 Fälle von AMLM&sub2; (gekennzeichnet durch eine ungünstige Prognose und einen raschen Verlauf), einen Fall von AMOL (akute monozytäre Leukämie), einen Fall von AMGL (akute megakaryozytäre Leukämie) und einen mit der potentiellen Diagnose von Polycythaemia vera, einer semi-malignen Krankheit die mit abnormaler Erythyropoese in Verbindung gebracht wird. Geringfügige Modifizierungen in den DNA Restriktionsmustern konnten in verschiedenen von diesen beobachtet werden, aber waren schwierig zu interpretieren. Zwei der AMLM2 Blut DNA Proben zeigten jedoch eine beträchtliche Amplifikation wie folgt: Amplifizierte DNA-Fragmente (+Enzyme) Probe Nr. gesunde Kontrolle markierte cDNA-Probe Clone 14
Zusammenfassend: Amplifizierte Signale in sowohl existierenden als auch nicht nachgewiesenen Restriktionsfragmenten wurden mit 3 verschiedenen Enzymen (PVU&sub2;, HindIII und EcoRI) in zwei verschiedenen AMLM&sub2; Fällen von 5 beobachtet. Höchst interessant war die Amplifizierung der mit Klon 14 hybridisierfähigen DNA von einer Amplifizierung von BuChE positiven Sequenzen begleitet. Die Tatsache, daß verschiedene Größen der Restriktionsfragmente mit der 3' Sonde hybridisierten' schloß die Möglichkeit von Kreuzhybridisierung aus. Verschiedene der amplifizierten Banden konnten mit geringeren Intensitäten in dem mutmaßlichen Fall einer Polycythaemia vera (Vagues Krankheit) oder in einem oder zwei der anderen AML Fälle beobachtet werden.
Die adr. Probe stellt einen Patienten dar, der derzeit nach einer chemotherapeutischen Behandlung im Remissionstadium ist, dessen Serum- und Erythrozyten ChE in den Mengen und biochemischen Eigenschaften anscheinend normal waren. ChE Gene und Klon 14 werden beide unter spezifischen Stimulantien koreguliert und koamplifiziert.

Claims

1. Isolat einer Nukleinsäure, umfassend die Nukleotide 1 bis 564 von Figur 1.

2. Nukleinsäure von mehr als 10 bp, welche fähig ist unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure von Anspruch 1 zu hybridisieren und für ein Protein zu codieren mit der Fähigkeit das Wachstum oder die Differenzierung von Blutzellen oder deren Vorläuferzellen zu modulieren oder der Fähigkeit mit einem gegen das modulierende Protein erzeugten Antikörper kreuzzureagieren, wobei stringente Bedingungen definiert sind als Waschen in der Gegenwart von 0,15 M NaCl / 0,015 M Natriumcitrat / 0,1 % NaDoSO&sub4; bei 50ºC oder alternativ die Gegenwart von 50 % (vol/vol) Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin / 0,1 % Ficoll / 0,1 % Polyvinylpyrrolidon / 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat und 42ºC für die Hybridisierung.

3. Replizierbarer Vektor' umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2.

4. Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 transformiert ist.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine Säugerzelle ist.

6. Verfahren zur Diagnose von Leukämie, umfassend das Testen einer Leukämiezelle auf Transkription oder Translation der Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2 oder auf Bestimmung struktureller Veränderungen wie etwa Deletionen, Umlagerungen oder Amplifizierung einer derartigen Nukleinsäure.

7. Protein, umfassend eine durch die Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 codierte Aminosäuresequenz.

8. Zusammensetzung umfassend ein zellfreies Protein nach Anspruch 7.

9. Antikörper, der fähig ist das Protein nach Anspruch 7 zu binden.

10. Protein nach Anspruch 7, das mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist.

11. Protein nach Anspruch 10, wobei die Gruppe ein Radioisotop oder ein Enzym ist.

12. Zusammensetzung, geeignet zur Verabreichung an einen Patienten, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins nach Anspruch 7 und einen physiologisch verträglichen Träger.

13. Zusammensetzung, geeignet zur Verabreichung an einen Patienten, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von Antikörpern gegen ein Protein nach Anspruch 7, die fähig sind dessen physiologische Aktivität zu blockieren, und einen verträglichen Träger.