DE69632949T2

DE69632949T2 - Die aktivierung von rezeptoren durch gas6

Info

Publication number: DE69632949T2
Application number: DE69632949T
Authority: DE
Inventors: Jian Chen; R.Glenn Hammonds; Paul J. Godowski; Melanie R. Mark; Jennie P. Mather; Ronghao Li
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1996-03-05
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2016-03-06
Also published as: EP0815224B1; AU712585B2; IL117425A0; AU5183696A; ATE271606T1; US6169070B1; CA2214629A1; ES2225874T3; DE69632949D1; MX9706827A; JP3342873B2; WO1996028548A1; EP0815224A1; JPH10505507A; CA2214629C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zur Aktivierung der Rse- oder Mer-Tyrosinkinaserezeptoren. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Verfahren zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung von Zellen, die den Rse-Rezeptor (z. B. Gliazellen) oder Mer-Rezeptor (z. B. Monozyten) umfassen, unter Verwendung von gas6. Die Erfindung betrifft außerdem gas6-Varianten, insbesondere solche, die weniger γ-carboxyliert sind als aus der Natur isoliertes gas6.
Beschreibung verwandter Gebiete
Spezifische Signale, die das Wachstum und die Differenzierung von Zellen in sich entwickelndem und adultem Geweben regeln, üben ihre Wirkung aus, indem sie an Zelloberflächenrezeptoren, die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität aufweisen, binden und diese aktivieren. Mark et al. haben vor kurzem die komplementären DNA-Sequenzen der Rezeptortyrosinkinase Rse von Menschen und Mäusen beschrieben, die vorzugsweise im adulten Gehirn exprimiert wird (Mark et al., J. Biol. Chem. 269, 10720 (1994)). Die extrazelluläre Domäne eines Rse-Rezeptors besteht aus zwei immunglobulinähnlichen (Ig-L) Wiederholungen, gefolgt von zwei Wiederholungen von Fibronectin Typ III. Komplementäre DNA-Sequenzen, die für Proteine kodieren, die identisch mit menschlichem (Ohashi et al., Oncogene 9, 699 (1994)) und murinem Rse (Lai et al., Oncogene 9, 2567 (1994)) sind, wurden unabhängig voneinander beschrieben und Sky bzw. Tyro3 genannt. Siehe auch Fujimoto und Yamamoto, Oncogene 9, 693 (1994), über das murine Äquivalent zu Rse, das sie brt nennen, und Dai et al., Oncogene 9, 975 (1994), zu dem menschlichen Molekül, das sie tif nennen.
Die Expression von Rse in verschiedenen Geweben wurde schon untersucht. Lai et al., w. o., haben herausgefunden, dass sich im adulfen Gehirn Rse-mRNA in Neuronen des Neocortex, Cerebellums und Hippocampus befindet. Schulz et al. haben in diesem Zusammenhang herausgefunden, dass Rse im Cortex cerebralis, lateralen Septum, Hippocampus, Bulbus olfactorius und im Cerebellum stark exprimiert wird. Die höchsten Werte der Rse-Expression im Gehirn wurden in Zusammenhang mit Neuronen gemessen (Schulz et al., Molec. Brain Res. 28, 273–280 (1995)). Im Zentralnervensystem (ZNS) von Mäusen tritt die stärkste Rse-Expression in späten embryonalen Phasen und nach der Geburt auf, was mit der Bildung und Aufrechterhaltung von synaptischen Verbindungen in Cortex- und Hippocampusneuronen zusammenfällt (Lai et al., w. o., und Schneider et al., Cell 54, 787–793 (1988)). Dieser Prozess wird vermutlich lokal gesteuert, und zwar von Zellen, die in direktem Kontakt miteinander sind oder nahe beieinander positioniert sind. Durch eine Northern-Blot-Analyse haben Mark et al., w. o., herausgefunden, dass in RNA-Proben vom Gehirn und von der Niere viel Rse-mRNA vorhanden ist. Dai et al., w. o., haben herausgefunden, dass Rse in menschlichen Ovarien und Testes stark exprimiert wird. Die Expression von Rse in verschiedenen menschlichen Zelllinien wurde ebenfalls von Mark et al., w. o., untersucht. Wenig oder keine Rse-mRNA wurde durch Northern-Blotting von mRNA-Proben von der Monoxyten-Zelllinie THP-1 oder von lymphoblastenähnlichen RAJI-Zellen detektiert. Das Rse-Transkript wurde jedoch in mehreren hämatopoetischen Zelllinien detektiert, einschließlich Knochenmarkszellen (d. h. der myelogenen Leukämielinie K562 und myelomonozytischen U937-Zellen) und der megakaryozytischen Leukämielinien DAMI und CMK11-5 sowie in der menschlichen Brustkarzinomzelllinie MCF-7. Von den untersuchten Zelllinien wiesen Hep-3B-Zellen, eine menschliche Hepatokarzinomzelllinie, die höchsten Expressionswerte auf.
Rse ist strukturell mit Axl (auch als Ufo oder Ark bekannt) verwandt und weist 43% Gesamtaminosäuresequenzidentität mit diesem Tyrosinkinaserezeptor auf. Siehe O'Bryan et al., Mol. Cell. Biol. 11, 5016 (1991), Janssen et al., Oncogene 6, 2113 (1991), Rescigno et al., Oncogene 5, 1908 (1991), und Bellosta et al., 15, 614 (1995), über Axl. Rse und Axl definieren zusammen mit Mer (Graham et al., Cell Growth Differ. 5, 647 (1994)) eine Klasse von Rezeptortyrosinkinasen, deren extrazelluläre Domänen neuraler Zellerkennung und Adhäsionsmolekülen ähneln (Ruitishauser, U., Current Opin. Neurobiology 3, 709 (1993), und Brummendorf und Rathjen, J. Neurochemistry 61, 1207 (1993)). Wie Rse wird auch Axl im Nervensystem exprimiert, wird aber in peripherem Gewebe stärker exprimiert als Rse.
Mer-mRNA wird in mononuklearen peripheren Blutzellen, mononuklearen Knochenmarkzellen und Monozyten detektiert, nicht jedoch in Granulozyten. Trotz der Tatsache, dass Mer-mRNA in neoplastischen B- und T-Zelllinien exprimiert wird, wird es in normalen B- oder T-Lymphozyten nicht detektiert (Graham et al., Cell Growth Differ. 5, 647 (1994)). Mer wird in menschlichem Gewebe weithin exprimiert, aber die höchsten Werte für Mer-mRNA treten in den Testes, den Ovarien, der Prostata, der Lunge und der Niere auf (Graham et al., Cell Growth Differ. 5, 647 (1994)).
Falsch gesteuerte Expression von Mer, Rse und Axl wird mit zellulärer Transformation in Zusammenhang gebracht. Axl wurde beispielsweise unter Verwendung eines Transfektions-/Turmorgenitätstests aus DNA von Patienten mit chronischer myelogener Leukämie (O'Brian et al., w. o.) und chronischer myeloproliferativer Erkrankung (Janssen et al., w. o.) isoliert. Mer wurde aus einer neoplastischen B-Zelllinie kloniert und in zahlreichen transformierten T-Zelllinien akuter lymphozytischer Leukämie exprimiert (Graham et al., w. o.). Rse und Axl führen bei Überexpression in Fibroblasten zu zellulärer Transformation (O'Brian et al., w. o.; Ohashi et al., Oncogene 9, 669 (1994); Taylor et al., J. Biol. Chem. 270, 6872–6880 (1995); und McCloskey et al., Cell Growth and Diff. 5, 1105–1117 (1994)). Rse-mRNA und Proteine werden auch in Säugetiertumoren überexprimiert, die von transgenen Tieren stammen, welche entweder wnt-1- oder fgf-3-Onkogene überexprimieren (Taylor et al., J. Biol. Chem. 270, 6872–6880 (1994)).
Über mutmaßliche Liganden für die Rse- und Axl-Rezeptoren wurde berichtet. Varnum et al., Nature 373, 623 (1995), und Stitt et al., Cell 80, 661–670 (1995), haben vor kurzem berichtet, dass gas6 (growth arrest-specific gene 6 – wachstumsarrest spezifisches Gen 6) ein Ligand für Axl ist. gas6 gehört zu einer Reihe von murinen Genen, die bei Serumentzug in NIH-3T3-Zellen stark exprimiert werden (Schneider et al., Cell 54, 787–793 (1988)). Diese Gene wurden als Wachstumsarrest-spezifische Gene bezeichnet, da ihre Expression während der Wachstumsinduktion negativ gesteuert wird. Das menschliche Homolog von murinem gas6 wurde ebenfalls von Manfioletti et al., Molec. Cell. Biol 13(8), 4976–4985 (1993), kloniert und sequenziert. Sie kamen zu dem Schluss, dass gas6 ein von Vitamin K abhängiges Protein ist, und vermuteten, dass es bei der Steuerung einer Proteasenkaskade eine Rolle spielen könnte, die bei der Steuerung des Wachstums von Bedeutung ist. gas6 wird in verschiedenen Geweben, einschließlich des Gehirns, exprimiert. Siehe auch Colombo et al., Genome 2, 130–134 (1992), und Ferrero et al., J. Cellular Physil. 158, 263–269 (1994), zu gas6.
Stitt et al., w. o., berichteten außerdem, dass das Protein S der Ligand für Tyro3 ist. Protein S ist ein von Vitamin K abhängiges Plasmaprotein, das als Antikoagulans fungiert, indem es als Cofaktor zur Stimulierung der proteolytischen Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa durch aktiviertes Protein C wirkt. Siehe Easmon et al., Aterioscler. Thromb. 12, 135 (1992). Demgemäß ist Protein S ein wichtiger negativer Regulator der Blutgerinnungskaskade. Siehe Walker et al., J. Biol. Chem. 255, 5521–5524 (1980), Walker et al., J. Biol. Chem. 256, 11128–11131 (1981), Walker et al., Arch. Biochem. Biophys. 252, 322–328 (1991), Griffin et al., Blood 79, 3203 (1992), und Easmon, D., Arterioscler. Thromb. 12, 135 (1992). Die Entdeckung, dass etwa die Hälfte des Proteins S im menschlichen Plasma an C4BP gebunden ist, stützt weiter die Annahme, dass das Protein S an der Komplementkaskade mitwirkt. Dahlback et al., PNAS (USA) 78, 2512–2516 (1981). Die Rolle von Protein S als Mitogen für glatte Muskelzellen wurde ebenfalls beschrieben. Gasic et al., PNAS (USA) 89, 2317–2320 (1992).
Protein S kann in vier Domänen unterteilt werden (siehe die 1A, 1C und 1D hierin). Die Reste 1–52 (Region A) sind reich an γ-Carboxyglutaminsäure-(Gla-)Resten, welche die Ca²⁺-abhängige Bindung von Protein S an negativ geladene Phos pholipide vermittelt (Walker, J. Biol. Chem. 259, 10335 (1984)). Die Region B umfasst eine thrombinempfindliche Schleife. Die Region C enthält vier Epidermiswachstumsfaktor-(EGF-)ähnliche Wiederholungen. Die Region D ist homolog zum steroidhormonbindenden Globulin-(SHBG-)Protein (Hammond et al., FEBS Lett. 215, 100 (1987)). Wie Joseph und Baker (FASER J. 6, 2477 (1994)) erläuterten, ist diese Region homolog zu Domänen in der A-Kette von Laminin (23% Identität) und Merosin (22% Identität) und zu einer Domäne in den Drosophila-Krumen (19%).
Murine und menschliche gas6-cDNAs kodieren für Proteine mit 43 bzw. 44% Aminosäuresequenzidentität zu menschlichem Protein S.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorangehende Erfindung betrifft gas6-Varianten, die im Wesentlichen nicht γ-carboxyliert sind oder im Wesentlichen weniger γ-carboxyliert sind als gas6 von einer endogenen Quelle des Moleküls. Beispiele für solche Varianten umfassen gas6-Varianten, denen ein oder mehrere Glutaminsäurereste von der A-Domäne von gas6 fehlen, die normalerweise γ-carboxyliert sind, Fragmente von gas6, denen die A-Domäne fehlt, sowie Fragmente, die im Wesentlichen aus der D-Domäne von gas6 bestehen (oder ein G-Domänenfragment von gas6).
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Aktivierung eines Rse- oder Mer-Rezeptors bereit, indem eine Zelle (vorzugsweise eine menschlichen Zelle), die den Rse- oder Mer-Rezeptor umfasst, gas6-Varianten gemäß vorliegender Erfindung in einer Menge ausgesetzt wird, die ausreicht, um den Rse- oder Mer-Rezeptor zu aktivieren. Der Rse- oder Mer-Rezeptor ist normalerweise zellgebunden, und das gas6 ist vorzugsweise menschliches gas6. Die Erfindung stellt weiters ein Verfahren zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung einer Zelle bereit, in deren Zellmembran der Rse- oder Mer-Rezeptor inkorporiert ist, indem die Zelle gas6-Varianten gemäß der Erfindung in einer Menge ausgesetzt wird, die ausreicht, um das Überleben, die Proliferation und/oder die Differenzierung der Zelle zu fördern. Die Zelle kann ein Neuron oder eine Gliazelle, wie beispielsweise eine Schwann-Zelle, oder ein Monozyt (z. B. ein Makrophage) sein. Die Zelle kann in einer Zellkultur oder in einem Säugetier (z. B. einem Menschen) vorhanden sein, das an einer neurologischen Erkrankung oder Störung leidet. Häufig wird das gas6 in einem physiologisch annehmbaren Träger bereitgestellt.
Die Erfindung stellt auch Sets und Gegenstände zur Herstellung bereit, die gas6-Varianten gemäß vorliegender Erfindung umfassen. Der Herstellungsgegenstand umfasst normalerweise Anleitungen zur Verwendung der gas6-Variante in einer In-vitro-Zellkultur oder zur Verabreichung der gas6-Variante an ein Säugetier.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die 1A–1D zeigen eine schematische Darstellung der Struktur von Protein S und gas6 (1A) und einen Vergleich der Aminosäurehomologie zwischen den bovinen (b) und menschlichen (h) Formen von Protein S (1C bzw. 1D) mit menschlichem gas6 (1B). Bei h-gas6 stellen die Kästchen die Gla-Region (d. h. die A-Domäne) der Schleifenregion (d. h. der B-Domäne), die 4 EGF-ähnlichen Wiederholungen (C₁–C₄), welche die C-Domäne bilden, und die zum sexhormonbindenden Globulin homologe Region (d. h. die D-Domäne) dar, die ebenfalls mit den G-Domänen einer Laminin-A-Kette und Merosin und mit Drosophila-Krumen-Protein zusammenhängt. Der Prozentsatz der Aminosäureidentität zwischen h-gas6 und entweder b-Protein S oder h-Protein S ist innerhalb der entsprechenden Kästchen angegeben. Die Aminosäuren an den Rändern der einzelnen Regionen sind über den Kästchen angegeben.
2 zeigt einen Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen von murinem gas6 (m-gas6) (Seq.-ID Nr. 1), h-gas6 (Seq.-ID Nr. 2) und h-Protein S (Seq.-ID Nr. 3). Reste der "Prä-" und "Pro-"Sequenzen sind angegeben (wobei der Pfeil den letzten Rest jeder Vorläufersequenz markiert). Die A- bis D-Domänen sind angeführt, eben so wie die beiden G-Domänen, die in den D-Domänen liegen (d. h. G-Domäne 1 und G-Domäne 2).
Die 3A–3D sind Diagramme, welche die Charakterisierung des Rse-L in fötalem Rinderserum (FBS) zeigen. 3A zeigt die Bindung von ¹²⁵I-Rse-IgG als Funktion der FBS-Konzentration. Die Bindung, der Prozentsatz der gesamten addierten Counts, die membranassoziiert sind (100 × B/T, d. h. gebunden/gesamt („bound/total")), ist als Funktion der FBS-Konzentration dargestellt. Die Daten wurden an ein 4-Parameter-Modell angepasst, das eine EC₅₀ von 0,58 Vol.-% ergab. 3B zeigt die Bindung von ¹²⁵I-Rse-IgG als Funktion der Ca²⁺-Konzentration bei konstanter FBS-Konzentration. Die Bindung wurde wie in 3A entweder in Gegenwart eines 10% diafiltrierten FBS oder in seiner Abwesenheit und bei variierender Konzentration von zugesetztem Ca²⁺ durchgeführt. Die EC₅₀ von Ca²⁺ liegt in einem 4-Parameter-Modell der Daten bei 0,18 mM. 3C ist eine Scatchard-Analyse von ¹²⁵I-Rse-IgG-Bindung an CMK11-5-Membranen, die durch FBS vermittelt ist. Eine einzelne Konzentration von ¹²⁵I-Rse-IgG, FBS und Ca²⁺ wurde mit steigenden Konzentrationen von unmarkiertem Rse-IgG verwendet, und die Bindung wurde gegen das Verhältnis zwischen gebunden und frei (B/F) nach der Korrektur für nichtspezifische Bindung aufgetragen. Versuche mit sowohl 1% (K_d = 0,82 nM) und 10% (K_d = 2,2 nM) FBS sind dargestellt. 3D ist eine KIRA-Analyse der dosisabhängigen Aktivierung von Rse-Phosphorylierung durch die Q-Sepharose-angereicherte (QSE-)Fraktion von FBS. Das eingefügte Diagramm zeigt, dass Rse-L-Aktivität spezifisch durch Inkubation mit Rse-IgG neutralisiert wurde. Rse-Phosphorylierung ist in Zellen mit Serumentzug (–) dargestellt; oder in Zellen, die mit einer QSE-Fraktion in Abwesenheit von zugesetzten IgG-Proteinen (QSE) behandelt wurden; oder mit QSE, das wie angeführt mit Rse-IgG oder CD4-IgG inkubiert wurde.
4 ist ein Ablaufdiagramm des KIRA-ELISA für den Rse-Rezeptor, der in Beispiel 4 beschrieben ist.
5 zeigt die Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-Rse-IgG an gas6 durch unmarkiertes Rse-IgG. Steigende Mengen von unmarkiertem Rse-IgG wurden zu Röhrchen mit konstantem ¹²⁵I-Rse-IgG und gas6 zugesetzt. Ein nichtlinearer Fit nach dem Verfahren des kleinsten Quadrats ergab unter Verwendung einer einzigen Klasse von Stellen eine geschätzte Dissoziationsgleichgewichtskonstante von 0,46 ± 0,04 nM. Das eingefügte Diagramm zeigt einen Scatchard-Plot von gebunden (B) über gebunden/frei (B/F) nach Korrektur für nichtspezifische Bindung.
Die 6A–6C zeigen Rse-L-Aktivität in Astrozytenkulturen. Um zu bestimmen, ob Astrozyten einen Rse-Liganden sekretieren, wurde ein serumfreies Medium, das 3 Tage lang konditioniert worden war, in einer Zentrifugenultrafiltrationsvorrichtung Cetricon-10 10fach konzentriert und direkt zu Teströhrchen zugesetzt, um die angegebenen Endkonzentrationen zu erhalten. In 6A wurde die Bindung von ¹²⁵I-Rse-IgG an CMK11-5-Membranen durch den Zusatz eines durch Astrozyten konditionierten Mediums (ACM) ermöglicht, wobei bei 13 Vol.-% ACM die halbe maximale Wirkung erzielt wurde. 6B ist eine KIRA-Analyse einer Phosphorylierung von Rse durch ACM. 6C zeigt, dass die Phosphorylierung von Rse durch ACM durch Inkubation mit Rse-IgG gehemmt wurde, durch CD4-IgG jedoch nicht. Eine Neutralisierung wurde wie bei 3 beschrieben durchgeführt.
Wie in 7 zu sehen ist, zeigte eine Deletionsanalyse von gas6, dass die G-Domänen für die Bindung an Rse in vitro ausreichen. Epitopmarkiertes (gD) gas6 oder Protein S oder N-terminale Trunkierungsvarianten von gas6 (welche die angeführten Reste enthaften) wurden konstruiert und vorübergehend in 293-Zellen exprimiert, im Wesentlichen nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren. Proteine mit dem korrekten Molekulargewicht konnten in unfraktionierten (Input-)Zellüberständen unter Verwendung eines gegen die Epitopmarkierung gerichteten Antikörpers detektiert werden. Im Gegensatz zu Protein S wurden die gas6-Derivate durch Rse-IgG aus den Zellüberständen ausgefällt. Die Bindung war spezifisch für die extrazelluläre Domäne von Rse, weil Proteine durch das menschliche Kontroll-Fc nicht ausgefällt wur den. Zu Quantifizierungszwecken stellen die unfraktionierten (Input-)Bahnen 20% des zur Ausfällung verwendeten Materials dar.
8 zeigt, dass gas6 die Proliferation von P45-Rattenzellen gemäß Schwann in dosisabhängiger Form auslöst. Zellen wurden in den angegebenen Konzentrationen von rekombinantem menschlichem gas6 in 24-Well-Platten in einem F12/DME-Medium mit 10 μg/ml Insulin und Transferrin und 5 μg/ml Vitamin E ausplattiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit einer Coulter-Zähler gezählt. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung für sechs Wells für jede Behandlung.
9 zeigt, dass durch gas6 ausgelöste Proliferation von p45-Rattenzellen gemäß Schwann durch Rse-IgG neutralisiert wird. Zellen wurden wie in 8 beschrieben ausplattiert. Kontrollzellen wurde nichts weiter zugesetzt. Alle anderen Zellen wurden mit zwei unterschiedlichen gas6-Raffinationen (d. h. Charge Nr. 15 und Nr. 9) und 10 μg/ml entweder Rse-IgG (markiertes Rse) oder CD4-IgG (markiertes CD4Fc) behandelt.
10 zeigt eine Dosis-WirkungsKurve der Aktivierung von Rse-Phosphorylierung im KIRA-Test, wie er in Beispiel 10 beschrieben ist.
11 zeigt eine Ionenaustauschchromatographie eines Mediums, das durch menschliches rekombinantes gas6 exprimierende Zellen konditioniert ist. Das Medium (700 ml) wurde gegen einen Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM Benzamidin) dialysiert, auf 0,1% CHAPS eingestellt und bei 10 ml/min auf eine 6-ml-Resource-Q-Säule (Pharmacia) gegeben. Die Säule wurde mit dem Puffer A gewaschen und mit 70 ml linearem Gradient von 0 bis 0,4 M NaCl in Puffer A mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert, wodurch Fraktionen von 2,0 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen wurde mithilfe des Bariumchloridbindeverfahrens, das in Beispiel 6 beschrieben ist, und des in Beispiel 4 beschriebenen KIRA-Tests auf ihre Fähigkeit analysiert, Rse zu binden und zu aktivieren. Die Bindeaktivität ist als Prozentsatz der gesamten zugeführten Radioaktivität ausgedrückt, die durch Bariumchlorid ausgefällt wird. Die KIRA-Aktivität ist in Einheiten/ml (U/ml) bezogen auf einen Standard ausgedrückt.
Die 12A–12C zeigen die Wirkung von gas6 und anderen Wachstumsfaktoren auf das Wachstum von menschlichen Schwann-Zellen und die DNA-Synthese. Alle Daten sind als Mittel ± Standardfehler (n = 4) angeführt. 12A zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven von menschlichen Schwann-Zellen auf gas6 unter verschiedenen Bedingungen. Die Zellenanzahl wurde mit einem Coulter-Zähler 84 Stunden nach einer Kultivierung mit den angegebenen Konzentrationen von gas6 bestimmt. 12B zeigt, dass gas6 die Thymidininkorporation in Schwann-Zellen, die wie in 12A kultiviert waren, in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von gas6 erhöhte. 3H-Methyl]-thymidin (0,5 μCi/ml) wurde nach 48 Stunden Kultivierung zugesetzt. Nach 96 Stunden Kultivierung wurden Zellen geerntet und zur Messung der in DNA inkorporierten Radioaktivität verarbeitet. 12C zeigt die Wirkung von Wachstumsfaktoren auf das Wachstum von Schwann-Zellen in Gegenwart von 8F. Schwann-Zellen wurden mit oder ohne PDGF (10 ng/ml), basischem FGF (20 ng/ml), IL-1α (1 ng/ml), TGF-β1 (1 ng/ml) und gas6 (30 ng/ml) in 8F ausplattiert. Nach 108 Stunden wurden Zellenanzahl gezählt.
13 zeigt den zeitlichen Verlauf des Wachstums von menschlichen Schwann-Zellen in einer Kultur. Menschliche Schwann-Zellen wurden bei 2 × 10⁴ Zellen/Well in 24-Well-Multiplatten in F12/DME (1 : 1) ergänzt mit 8F mit oder ohne gas6 oder 10% diafiltriertem fötalem Rinderserum (FBS) ausplattiert. Alle 24 Stunden wurden vier Wells mit Kulturen von jeder Gruppe zur Zellzählung genommen. Die angeführten Daten sind Mittel ± Standardfehler (n = 4).
14 zeigt die Neutralisierung von durch gas6 ausgelöste Phosphorylierung von Rse durch Rezeptor-Fc-Fusionsproteine, gemessen in einem KIRA-Test. Der Prozentsatz der in CHO-Rse.gD-Zellen, die in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von Rezeptorfusionsproteinen mit gereinigtem gas6 behandelt wurden, beob achteten Phosphorylierung bezogen auf jene in Zellen, die nur mit gas6 behandelt wurden, ist dargestellt.
Die 15A–15D zeigen eine kinetische Analyse von Ligandenbindung an Mer-Fc. Mer-Fc wurde an die carboxymethylierte Dextranschicht auf der Oberfläche eines BIAcore^TM-Biosensors gekoppelt. Gereinigtes gas6 (15A, B und C) oder Protein S (15D) bei einer Konzentration von entweder 100 nM (gestrichelte Linie) oder 140 nM (durchgehende Linie) wurde bei 160 s über die Oberfläche des Biosensors injiziert. Bei 340 s wurde die Injektorschleife auf Puffer umgestellt, um die Dissoziation. zu verfolgen. Die Bindung von gas6 an Mer-Fc auf dem Chip wurde durch Vorinkubation mit löslichem Mer-Fc blockiert (15B), mit CD4-Fc jedoch nicht (15C). Keine Bindung von Protein S an Mer-Fc wurde beobachtet (15D).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
1. Definitionen
Die Begriffe "gas6" und "gas6-Polypeptid" beziehen sich hierin (sofern nicht anders angegeben) auf ein Polypeptid, das zur Aktivierung des Rse-Rezeptors oder Mer-Rezeptors fähig ist und die reife, Prä-, Präpro- und Pro-Formen des gas6-Polypeptids umfasst, die entweder aus einer natürlichen Quelle gereinigt, chemisch synthetisiert oder rekombinant hergestellt ist. Konkret umfasst die vorliegende Definition ein "menschliches" gas6-Polypeptid, das die in Manfioletti et al., Mol. Cell. Biol. 13 (8), 4976–4985 (1993), veröffentlichte Aminosäuresequenz umfasst (erhältlich von EMBL/GenBank/DDBJ unter der Zugangsnummer X59846) und gas6-Polypeptide von anderen Säugetieren (wie z. B. murines gas6, siehe Manfioletti et al., w. o.). Wenn das gas6-Polypeptid die Aminosäuresequenz des in der Natur vorkommenden gas6-Polypeptids aufweist, wird es hierin als "natives Polypeptid" oder "Nativsequenzpolypeptid" bezeichnet, ungeachtet des Verfahrens, nach dem es hergestellt wird (beispielsweise kann es aus einer endogenen Quelle des Moleküls isoliert oder durch Syntheseverfahren hergestellt werden).
Gas6 weist verschiedene Aminosäure"regionen" oder "-domänen" auf, die in den 1A–B und 2 dargestellt sind. Die "A-Domäne", oder "Gla-Region" am Aminoterminus des Polypeptids weist Reste auf, die reich an γ-Carboxyglutaminsäure (Gla-Resten) sind, die anscheinend calciumabhängige Bindung von gas6 an negativ geladene Phospholipide in Zellmembranen vermitteln. Die A-Domäne erstreckt sich etwa von Rest 46–86 von murinem gas6 und etwa von Rest 49–89 von menschlichem gas6. Die darauf folgende "B-Domäne" umfasst eine thrombinempfindliche "Schleife" und erstreckt sich etwa von Rest 87–114 von murinem gas6 und etwa von Rest 90–117 von menschlichem gas6. Die dritte Domäne, "C-Domäne" genannt, weist hierin vier Epidermiswachstumsfaktor-(EGF-)ähnliche Wiederholungen auf (C₁–C₄ in 1B). Diese C-Domäne erstreckt sich etwa von Rest 115–275 von murinem gas6 und etwa von Rest 118–278 von menschlichem gas6. Die verbleibende "D-Domäne" ist homolog zu einem steroidhormonbindenden Globulin-(SHBG-)Protein und umfasst etwa die Reste 276–673 von murinem gas6 und die Reste 279–678 von menschlichem gas6. Die D-Domäne umfasst ein Paar von "G-Domänen", die als "G-Domäne 1" (d. h. etwa die Reste 311–468 von murinem gas6 und etwa die Reste 314–471 von menschlichem gas6) und "G-Domäne 2" (d. h. etwa die Reste 500–666 von murinem gas6 und die Reste 503–671 von menschlichem gas6) bezeichnet werden.
Die Begriffe "gas6" und "gas6-Polypeptid" umfassen auch "Varianten" oder "Mutanten" von nativem gas6. Solche Varianten umfassen Fragmente der menschlichen gas6-Sequenz; Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus oder innerhalb der menschlichen gas6-Sequenz hinzugefügt werden; ein oder mehrere Aminosäurereste deletiert sind, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Aminosäureresten substituiert; und Derivate der obigen Proteine, Polypeptide oder Fragmente davon, worin ein Aminosäurerest kovalent modifiziert wurde, so dass das resultierende Produkt eine nicht natürlich vorkommende Aminosäure ist. gas6-Varianten können synthetisch hergestellt werden, beispielsweise durch ortsgerichtete oder PCR-Mutagenese, oder natürlich vorkommen, wie beispielsweise im Falle von allelen Formen und anderen natürlich vorkommenden Varianten der translatierten Aminosäuresequenz, die in Manfioletti et al. angeführt sind und in Menschen und anderen Tierarten vorkommen können.
Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung umfasst eine gas6-Variante, vorausgesetzt, dass sie funktionell aktiv ist. "Funktionell aktiv" und "funktionelle Aktivität" in Bezug auf gas6 bedeutet hierin, dass das gas6 zur Aktivierung des Rse-Rezeptors und/oder Mer-Rezeptors und/oder zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung von den Rse-Rezeptor oder Mer-Rezeptor umfassenden Zellen, wie beispielsweise Neuronen, Gliazellen oder monozytischen Zellen, fähig ist. Eine "Gliazelle" stammt vom zentralen oder peripheren Nervensystem und kann aus Oligodendroglia-, Astrozyten, Ependym- oder Mikrogliazellen sowie Satellitenzellen von Ganglia und den Neurolemm- oder Schwann-Zellen um die peripheren Nervenfasern ausgewählt sein. Eine "monozytische Zelle" ist ein mononuklearer Leukozyt, wie z. B. ein Makrophage.
gas6-Varianten gemäß vorliegender Erfindung weisen zumindest 75% (vorzugsweise mehr als 80% und noch bevorzugter mehr als 90%) Sequenzidentität mit der translatierten Aminosäuresequenz auf, die für reifes gas6 oder Fragmente davon kodiert, nachdem die Sequenzen zur Bereitstellung von maximaler Homologie vergleichend angeordnet wurden, bestimmt beispielsweise durch die von Fitch et al., PNAS (USA) 80, 1382–1386 (1983), beschriebene Version des Algorithmus gemäß Needleman et al., J. Mol. Biol 48, 443–453 (1970). Um für funktionelle aktive gas6-Varianten zu screenen, kann eine Variante einem oder mehreren der folgenden funktionellen Aktivitätstests unterzogen werden:

(a) Rezeptoraktivierungstests zur Messung der Down-Regulierung oder Aktivierung von Rezeptortyrosinkinaseaktivität (z. B. Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers zur Bestimmung, ob die Variante zur Aktivierung eines Rse-Rezeptors oder Mer-Rezeptors fähig ist, siehe Beispiel 3 hierin).
(b) KIRA-ELISA zur Bestimmung der Rse- oder Mer-Rezeptoraktivierungsfähigkeit der Variante gemäß Beispiel 4 hierin.
(c) Schwann-Zellenproliferationstest zur Bestimmung, ob die Variante zur Förderung von Schwann-Zellenproliferation in einer Zellkultur fähig ist oder nicht. Siehe Beispiel 9 hierin.

Aminosäuresequenzvarianten von gas6 können hergestellt werden, indem geeignete Nucleotidveränderungen in gas6-DNA eingeführt werden und danach die resultierende modifizierte DNA in einer Wirtszelle exprimierd wird, oder durch In-vitro-Synthese. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der gas6-Aminosäuresequenz gemäß Manfioletti et al. Jede Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann durch0geführt werden, um eine Aminosäuresequenzvariante von gas6 zu erhalten, unter der Bedingung, dass solch eine Variante die gewünschten hierin beschriebenen Merkmale aufweist. Veränderungen in der Aminosäuresequenz, um eine Aminosäuresequenzvariante von gas6 zu erhalten, können auch zu weiteren Modifikationen von gas6 bei seiner Expression in Wirtszellen führen, beispielsweise aufgrund solcher Veränderungen, die zur Einbringung oder Verschiebung von Glykosylierung führen.
Es gibt zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten von gas6: die Position der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Hierbei handelt es sich um Varianten der menschlichen gas6-Aminosäuresequenz, die natürlich vorkommende allele Formen von gas6 darstellen können, oder um vorgegebene Mutantenformen von gas6, die durch Mutation von gas6-DNA erhalten werden, entweder um ein nicht in der Natur vorkommendes Allel oder eine nicht in der Natur vorkommende Variante herzustellen. Im Allgemeinen hängt die Position und die Art der gewählten Mutation von den Merkmalen des zu modifizierenden gas6 ab.
Aufgrund der Degeneration von für ein Nucleotid kodierenden Sequenzen können Mutationen in der menschlichen gas6-Nucleotidsequenz vorgenommen werden, oh ne dass die dadurch kodierte Aminosäuresequenz des gas6 beeinflusst wird. Auch anderen Mutationen sind möglich, die zu gas6 führen, das eine andere Aminosäuresequenz aufweist als die gemäß Manfioletti et al., aber funktionell aktiv ist. Solche funktionell aktiven Aminosäuresequenzvarianten von gas6 werden ausgewählt, indem beispielsweise ein oder mehrere Aminosäurereste in der menschlichen gas6-Aminosäuresequenz mit anderen Aminosäureresten mit ähnlicher oder anderer Polarität oder Ladung substituiert werden.
Ein nützlicher Ansatz ist die "Alanin-Scanning-Mutagenese". Hier wird ein Aminosäurerest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (beispielsweise geladene Reste, wie z. B. arg, asp, his, lys und glu) und mithilfe eines DNA-Rekombinationsverfahrens durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung zwischen den Aminosäuren und der umliegenden wässrigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Cunningham et al., Science 244, 1081–1085 (1989). Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Substitutionen aufweisen, werden dann raffiniert, indem weitere oder andere Varianten an oder für die Substitutionsstellen eingeführt werden.
So muss die Art der Mutation selbst nicht vorher bestimmt werden, während die Einführungsstelle einer Aminosäuresequenzvariation vorgegeben ist. Um beispielsweise die Wirksamkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, wird ala-Scanning oder zufallsbestimmte Mutagenese am Zielcodon oder an der Zielregion durchgeführt, und die exprimierten gas6-Varianten werden wie oben beschrieben auf funktionelle Aktivität gescreent.
Aminosäuresequenzdeletionen reichen im Allgemeinen von etwa 1 bis 30 Resten, noch bevorzugter etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend. Deletionen aus Regionen mit wesentlicher Homologie mit anderen Tyrosinkinaserezeptorliganden wirken sich beispielsweise häufiger auf die funktionelle Aktivität von gas6 aus. Im Allgemeinen wird die Anzahl von aufeinander folgenden Deletionen so gewählt, dass die tertiäre Struktur von gas6 in der betroffenen Domäne er halten bleibt, beispielsweise β-Faltblatt oder α-Helix. Den Varianten gemäß vorliegender Erfindung fehlen ein oder mehrere Glutaminsäurereste in der A-Domäne von gas6 (d. h. jene E-Reste in der A-Domäne von gas6, die in 2 zu sehen sind) oder die gesamte A-Domäne. Eine bevorzugte Deletionsmutante von gas6 ist die D-Domäne von gas6 oder besteht aus ihren G-Domänen.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, deren Länge von einem Aminosäurerest bis zu Polypeptiden mit hundert oder mehr Resten reicht, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenzinsertionen (d. h. Insertionen innerhalb der menschlichen gas6-Aminosäuresequenz) können im Allgemeinen von etwa 1 bis 10 Resten, noch bevorzugter 1 bis 5 Resten, insbesondere 1 bis 3 Resten, reichen. Beispiele für terminale Insertionen umfassen gas6 mit einem N-terminalen Methionylrest (wie sie beispielsweise aus der direkten Expression von gas6 in einer rekombinanten Zellkultur resultieren können) und gas6 mit einer heterologen N-terminalen Signalsequenz zur Verbesserung der Sekretion von gas6 aus rekombinanten Wirtszellen. Andere Insertionen umfassen die Fusion an den N- oder C-Terminus von gas6 von immunogenen Polypeptiden (beispielsweise bakterielle Polypeptide, wie z. B. β-Lactamase oder ein durch den E.-coli-trp-Locus kodiertes Enzym, oder ein Hefeprotein) und C-terminale Fusionen mit Proteinen mit langer Halbwertszeit, wie beispielsweise konstante Immunglobulinregionen, Albumin oder Ferritin, wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/02922 (veröffentlicht am 6. April 1989) beschrieben ist.
Die dritte Variantengruppe sind solche, bei denen zumindest ein Aminosäurerest in der gas6-Aminosäuresequenz, und vorzugsweise nur einer, entfernt und an seiner Stelle ein anderer Rest eingebracht wurde. Die Stellen von größtem Interesse zur Herstellung solcher Substitutionen befinden sich in den Regionen der gas6-Aminosäuresequenz, welche die größte Homologie mit anderen Tyrosinkinaserezeptorliganden aufweisen. Diese Stellen sind wahrscheinlich für die funktionelle Aktivität von gas6 wichtig. Um die funktionelle Aktivität aufrechtzuerhalten, werden demgemäß diese Stellen, vor allem solche, die innerhalb einer Sequenz mit zumindest drei anderen identischen konservierten Stellen liegen, auf relativ konservative Weise substituiert. Solche konservativen Substitutionen sind in Tabelle 1 unter "Bevorzugte Substitution" zusammengefasst. Wenn solche Substitutionen zu keiner Veränderung der funktionellen Aktivität führen, dann können weitere Veränderungen, die in Tabelle 1 als "Substitutionsbeispiele" bezeichnet sind oder weiter unten in Bezug auf Aminosäureklassen beschrieben sind, vorgenommen werden, und die resultierende gas6-Variante kann auf funktionelle Aktivität analysiert werden.
TABELLE 1
Insertions-, Deletions- und Substitionsveränderungen in der gas6-Aminosäuresequenz können vorgenommen werden, um die Stabilität von gas6 zu verbessern. Trypsin oder andere Protease-Spaltstellen werden beispielsweise durch Untersuchung der kodierten Aminosäuresequenz auf Arginyl- oder Lysinylreste identifiziert. Diese werden gegenüber Proteasen inaktiv gemacht, indem der Rest durch einen anderen Rest ausgetauscht wird, vorzugsweise durch einen basischen Rest, wie z. B. Glutamin, oder einen hydrophoben Rest, wie z. B. Serin; indem der Rest deletiert wird; oder indem direkt nach dem Rest ein Prolylrest insertiert wird. Außerdem können Cysteinreste, die nicht an der Aufrechterhaltung der geeigneten Konformation von gas6 für funktionelle Aktivität mitwirken, substituiert werden, im Allgemeinen mit Serin, um die Oxidationsbeständigkeit des Moleküls zu verbessern und eine abweichende Vernetzung zu verhindern.
DNA, die für Aminosäuresequenzvarianten von gas6 kodiert, kann durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen Isolation aus einer natürlichen Quellen (im Falle von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten von gas6) oder Herstellung durch ortsgerichtete (oder oligonucleotidvermittelte) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer vorher hergestellten DNA, die für eine Variante oder eine Nichtvariante von gas6 kodiert, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Ortsgerichtete Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von gas6-DNA. Dieses Verfahren ist auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt (siehe beispielsweise Zoller et al., Meth. Enz. 100, 4668–500 (1983); Zoller et al., Meth. Enz. 154, 329–350 (1987); Carter, Meth. Enz. 154, 382–403 (1987); und Horwitz et al., Meth. Enz. 185, 599–611 (1990)) und wurde beispielsweise verwendet, um Aminosäuresequenzvarianten von Trypsin und T4-Lysozym herzustellen, wobei die Varianten bestimmte gewünschte funktionelle Eigenschaften aufweisen. Perry et al., Science 226, 555–557 (1984); und Craik et al., Science 228, 291–297 (1985).
Kurz gesagt wird bei der Durchführung einer ortsgerichteten Mutagenese von gas6-DNA die gas6-DNA verändert, indem zuerst ein für die gewünschte Mutation kodierendes Oligonucleotid an einen Einzelstrang solch einer gas6-DNA hybridisiert wird. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen gesamten Zweitstrang zu synthetisieren, wobei das hybridisierte Oligonucleotid als Primer und der gas6-DNA-Einzelstrang als Matrize verwendet wird. So wird das für die gewünschte Mutation kodierende Oligonucleotid in die resultierende doppelsträngige DNA inkorporiert.
PCR-Mutagenese ist ebenfalls geeignet, um Aminosäuresequenzvarianten von gas6 herzustellen. Siehe Higuchi, PCR Protocols, 177–183, Academic Press (1990); und Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17, 723–733 (1989). Kurz gesagt können, wenn in einer PCR geringe Mengen Matrizen-DNA als Ausgangsmaterial verwendet werden, Primer, deren Sequenz sich leicht von der entsprechenden Region in einer Matrizen-DNA unterscheidet, verwendet werden, um relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments herzustellen, das sich von der Matrizensequenz nur an den Positionen unterscheidet, an denen sich die Primer von der Matrize unterscheiden.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, Kassettenmutagenese, basiert auf dem von Wells et a., Gene 34, 315–323 (1985), beschriebenen Verfahren. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende gas6-DNA enthält. Das/die Codon(s) in der zu mutierenden gas6-DNA werden identifiziert. Auf jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) muss eine einzelne vorhandene Restriktionsendonucleasestelle vorhanden sein. Wenn keine solchen Restriktionsstellen vorhanden sind, müssen sie unter Verwendung des oben beschriebenen oligonucleotidvermittelten Mutageneseverfahrens geschaffen werden, um sie an geeigneten Stellen in die gas6-DNA einzuführen. Die Plasmid-DNA wird an diesen Stellen geschnitten, um sie zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, aber die gewünschte(n) Mutationen) aufweist, wird unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert, wobei die beiden Stränge des Oligonucleotids separat synthetisiert und dann unter Verwendung von Standardverfahren aneinander hybridisiert werden. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette weist 5'- und 3'-Enden auf, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt an das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte gas6-DNA-Sequenz.
Kovalente Modifikationen von gas6-Molekülen liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Beispielsweise werden kovalente Modifikationen in gas6 eingeführt, indem gewünschte Aminosäurereste von gas6 mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das zu einer Reaktion mit ausgewählten Aminosäureseitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten fähig ist.
Cysteinylreste werden häufig mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie z. B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu erhalten. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlorquecksilber(II)-benzoat, 2-Chlorquecksilber(II)-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat mit pH 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Agens relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls zweckmäßig; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumkakodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Eine Derivatisierung mit diesen Stoffen kehrt die Ladung der Lysinylreste um. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α- aminohältigen Resten umfassen Imidoester, wie z. B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Umsetzung mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, wozu Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin gehören. Eine Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Umsetzung aufgrund des hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Außerdem können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie den Arginin-ε-Aminogruppen reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann unter besonderer Berücksichtigung der Einführung von Spektralmarkierungen in Tyrosylreste durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan durchgeführt werden. Meistens werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I jodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
Carboxy-Nebengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') selektiv modifiziert, worin R und R' unterschiedliche Alkylgruppen sind, wie beispielsweise 1-Cyclohexyl-3-(2-mopholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen in Asparaginyl- und Glutaminylreste übergeführt.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Agenzien ist nützlich zur Vernetzung von gas6 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche für diagnostische und/oder therapeutische Zwecke. Herkömmliche Vernetzer umfassen beispielsweise 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccin imidylester, wie z. B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleinimide, wie z. B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie beispielsweise Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Bildung von Vernetzungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrizes, wie z. B. dicyanbromidaktivierte Kohlenhydrate, und die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substrate für Proteinimmobilisierung eingesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylreste desamidiert. Alternativ dazu können diese Reste unter leicht sauren Bedingungen desamidiert werden. Jede beliebige Form dieser Reste fällt in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Andere Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten, Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung aller C-terminalen Carboxygruppen. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, 79–86 (W. H. Freeman & Co., 1983). Gas6 ist auch kovalent an nicht proteinartige Polymeren gebunden, wie beispielsweise Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, und zwar auf die in den US-Patenten Nr. 4.179.337; 4.301.144; 4.496.689; 4.640.835; 4.670.417; oder 4.791.192 beschriebene Weise.
Das bevorzugte gas6 ist ein solches, das "in einem Menschen nicht immunogen" ist, was bedeutet, dass bei Kontaktierung des Polypeptids mit dem geeigneten Gewebe eines Menschen in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und in therapeutisch wirksamer Menge beim Polypeptid nach der zweiten Verabreichung des Polypeptids nach einer geeigneten Latenzzeit (z. B. 8 bis 14 Tage) kein Zustand der Empfindlichkeit oder Resistenz nachweisbar ist.
Eine gas6-Variante gemäß vorliegender Erfindung ist eine solche, die im Wesentlichen nicht "γ-carboxyliert" oder weniger carboxyliert ist als "natives" gas6, das von einer endogenen Quelle des Moleküls (z. B. Serum) stammt, oder natives gas6, das durch eine rekombinante Zelle hergestellt wurde, worin die Bedingungen zur Kultivierung solch einer Zelle die γ-Carboxylierung des gas6 erleichtern (z. B. ist Vitamin K im Kulturmedium vorhanden). Vitamin K ist ein Cofaktor für das Carboxylaseenzym. Die A-Domäne von nativem gas6 weist verschiedene Glutaminsäurereste auf, die normalerweise γ-carboxyliert sind (siehe Manfioletti et al., w. o.). So fehlt den gas6-Varianten gemäß vorliegender Erfindung ein oder mehrere E-Reste der A-Domäne von nativem gas6 (siehe 2) oder die gesamte Domäne. Das Ausmaß der γ-Carboxylierung kann durch eine Aminosäuresequenzanalyse oder den Bariumchloridtest aus Beispiel 11 gemessen werden.
"gas6-Antagonist" oder "Antagonist" bezieht sich auf eine Substanz, die einer funktionellen Aktivität von gas6 entgegengerichtet ist oder diese stört. Beispiele für gas6-Antagonisten umfassen neutralisierende Antikörper, Rse-IgG, extrazelluläre Rse-Domäne (Rse-ECD), Axl-IgG, Axl-ECD, Mer-IgG und Mer-ECD.
Der Begriff "Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst genauer gesagt einzelne monoklonale Anti-gas6-Antikörper (einschließlich Agonisten- und Antagonisten-Antikörper) und Anti-gas6-Antikörperzusammensetzungen mit Polyepitopspezifität.
Der Begriff "monoklonaler Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d. h. die einzelnen Antikörper, die die Population umfassen, sind identisch, mit der Ausnahme von möglichen natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringem Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind äußerst spezifisch, da sie gegen einen einzelnen antigenen Ort gerichtet sind. Darüber hinaus ist, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epi tope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen Hybrid- und rekombinante Antikörper, die durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines Anti-gas6-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z. B. "humanisierte" Antikörper) oder einer leichten Kette mit einer schweren Kette oder einer Kette von einer Spezies mit einer Kette von einer anderen Spezies oder Fusionen mit heterologen Proteinen hergestellt werden, ungeachtet der Ursprungsspezies oder Immunglobulinklassen- oder -subklassebezeichnung, sowie Antikörperfragmente (z. B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen. (Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.816.566 und Mage & Lamoyi, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 79–97, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)).
Somit bezeichnet der Modifikator "monoklonal" den Charakter des Antikörpers, wie er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und ist nicht so auszulegen, dass er die Herstellung des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erfordert. Die gemäß vorliegender Erfindung einzusetzenden monoklonalen Antikörper können beispielsweise durch das Hybridomverfahren hergestellt werden, das zum ersten Mal von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (US-Patent Nr. 4.816.567). Die "monoklonalen Antikörper" können beispielsweise auch aus Phagenbibliotheken isoliert werden, die unter Verwendung der von McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
"Humanisiere" Formen von nichtmenschlichen (z. B. murinen) Antikörpern sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz von nichtmenschlichem Immunglobulin enthaften. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste von einer CDR einer nichtmenschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie beispielsweise einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregion-(FR-)Reste vom menschlichen Immunglobulin durch entsprechende nichtmenschliche Reste ersetzt. Außerdem kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDRs oder Rahmensequenzen vorhanden sind. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Antikörperwirkung weiter zu verfeinern und optimieren. Im Allgemeinen umfasst ein humanisierter Antikörper im Wesentlichen alle zumindest einer, typischerweise zweier, variabler Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nichtmenschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen von einer menschlichen Immunglobulin-Consensus-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise den eines menschlichen Immunglobulins.
Der Begriff "neutralisierender Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der zur spezifischen Bindung an gas6 fähig ist und der die funktionelle Aktivität von gas6 in vivo und/oder in vitro im Wesentlichen hemmen oder aufheben kann. Typischerweise hemmt ein neutralisierender Antikörper die funktionelle Aktivität von gas6 zu zumindest 50%, vorzugsweise zu mehr als 80%, wie beispielsweise durch KIRA-ELISA bestimmt werden kann (siehe Beispiel 4).
Polyklonale Antikörper, die gegen gas6 gerichtet sind, werden üblicherweise durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen von gas6 und einem Adjuvans in Tieren herangezogen. Es kann von Vorteil sein, gas6 oder ein Peptidfragment davon an ein Trägerprotein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, wie beispielsweise Schlüsselloch-Napfschnecke-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, wobei ein bifunktioneller Stoff oder ein Derivatisierungsmittel verwendet wird, wie beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (Konjugation über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R'N=C=NR, worin R und R' unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden mit solchen gas6-Trägerproteinkonjugaten immunisiert, indem 1 mg oder 1 μg eines Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Komplettem Freundschen Adjuvans kombiniert wird und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Mengen an Konjugat in Komplettem Freundschem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Anti-gas6-Antikörperfiter untersucht. Die Tiere werden solange geboostet, bis der Antikörperfiter nicht mehr weiter steigt. Vorzugsweise werden die Tiere durch Injektion eines Konjugats desselben gas6 mit einem anderen Trägerprotein und/oder durch einen anderen Vernetzer geboostet. Konjugate von gas6 und ein geeignetes Trägerprotein können auch als Fusionsproteine in einer rekombinanten Zellkultur hergestellt werden. Außerdem werden Aggregationsmittel, wie beispielsweise Alum, verwendet, um die Immunreaktion zu verstärken.
Monoklonale Antikörper, die gegen gas6 gerichtet sind, werden unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens hergestellt, das die Herstellung eines Antikörpermoleküls durch kontinuierliche Zelllinien in einer Kultur ermöglicht. Beispiele für geeignete Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern umfassen das ursprüngliche Hybridomverfahren von Kohler et al., Nature 256, 495–497 (1975), und das menschliche B-Zellhybridomverfahren, Kozbor, J. Immumol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987).
Verfahren zur Humanisierung nichtmenschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer nichtmenschlichen Quelle eingeführt wurden. Diese nichtmenschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import reste" bezeichnet, weil sie typischerweise von einer variablen "Importdomäne" stammen. Eine Humanisierung kann gemäß auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren durchgeführt werden (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); und Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), indem die entsprechenden Regionen eines menschlichen Antikörpers durch komplementariätsbestimmende Regionen von Nagern (CDRs) ersetzt werden.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z. B. Mäuse) zu schaffen, die bei Immunisierung in Abwesenheit von endogener Immunglobulinproduktion zur Produktion eines gesamten Repertoires von menschlichen Antikörpern fähig sind. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozytoge Deletion des Antikörperschwerkettenverbindungsregions-(J_H-)Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen in kompletter Inhibition von endogener Antikörperproduktion resultiert. Der Transfer der menschlichen Keimbahnimmunglobulingenanordnung in solche keimbahnmutierte Mäuse führt bei Antigenanregung zur Produktion von menschlichen Antikörpern. Siehe beispielsweise Jakobovits et al., PNAS 90, 2551–2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); und Bruggermann et al., Year in Immuo. 7, 33 (1993). Menschliche Antikörper können auch in Phagendisplay-Bibliotheken hergestellt werden. Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991).
Der Begriff "Immunoadhäsin" wird austauschbar mit den Ausdrücken "gas6-Immunglobulinchimäre" ("gast6-Ig"), "Rse-Immunglobulinchimäre" ("Rse-Ig") und "Mer-Immunglobulinchimäre" ("Mer-Ig") verwendet und bezieht sich auf ein chimäres Molekül, das eine funktionell aktive gas6-Variante (z. B. seine D-Domäne), Rse oder Mer (z. B. ihre ECDs) mit einer Immunglobulinsequenz kombiniert. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, eine konstante Immunglobulindomäne. Die Immunglobulingruppierung in den Chimären gemäß vorliegender Erfindung können aus IgG₁-, IgG₂-, IgG₃- oder IgG₄-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM erhalten werden, vorzugsweise jedoch aus IgG₁ oder IgG₃.
Chimären, die aus einer Proteinsequenz (z. B. Rse- oder Mer-Rezeptor-ECD) bestehen, die an eine geeignete konstante Immunglobulindomänensequenz (Immunoadhäsine) gebunden sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Immunoadhäsine, die in der Literatur beschrieben werden, umfassen Fusionen von T-Zellrezeptor (Gascoigne et al., PNAS (USA) 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); und TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., PNAS (USA) 88, 10535–10539 (1991)).
Die einfachste und direkteste Immunoadhäsinform kombiniert die funktionell aktive(n) Regionen) des "Adhäsinproteins" mit den Gelenk- und Fc-Regionen einer Immunglobulinschwerkette. Üblicherweise wird bei der Herstellung der gas6-, Mer- oder Rse-Immunglobulinchimären gemäß vorliegender Erfindung Nucleinsäure, die für die extrazelluläre Domäne eines Rse- oder Mer-Rezeptors oder für gas6 (oder ein Fragment davon) kodiert, C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer konstanten Immunglobulindomänensequenz kodiert, aber auch N-terminale Fusionen sind möglich.
Typischerweise behält das kodierte chimäre Polypeptid in solchen Fusionen zumindest funktionel aktive Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette bei. Fusionen werden auch am C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder direkt N-terminal zum C_H1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen.
Die genaue Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht entscheidend; spezielle Stellen sind allgemein bekannt und können so gewählt werden, dass die biolo gische Aktivität, Sekretion oder Bindungscharakteristika der Rse-, Mer- oder gas6-Immunglobulinchimären optimiert werden.
Rse-, Mer- oder gas6-Immunglobulinchimären können als Monomere oder als Hetero- oder Homomultimere, insbesondere als Dimere oder Tetramere, angeordnet sein, wie im Wesentlichen in der WO 91/08298 beschrieben ist.
Die gas6-Sequenz oder extrazelluläre Rse- oder Mer-Rezeptordomänensequenz kann an den N-Terminus der Fc-Domäne eines Immunglobulins G₁ (IgG₁) fusioniert sein. Es ist möglich, die gesamte konstante Schwerkettenregion an die gas6-, Mer- oder Rse-Rezeptorsequenz zu fusionieren. Noch bevorzugter wird jedoch eine Sequenz, die in der Gelenk-Region stromauf von der Papain-Spaltstelle beginnt, die IgG-Fc chemisch definiert (d. h. Rest 216, wobei als erster Rest der konstanten Schwerkettenregion 114 genommen wird), oder eine analoge Stelle anderer Immunglobuline wird bei der Fusion verwendet. Die Rse- oder Mer-Rezeptor- oder die gas6-Aminosäuresegeunz kann an (a) die Gelenk-Region und C_H2 und C_H3 oder (b) die C_H1-, Gelenk-, C_H2- und C_H3-Domänen einer schweren IgG₁-, IgG₂- oder IgG₃-Kette fusioniert werden. Die genaue Stelle, an der die Fusion durchgeführt wird, ist nicht entscheidend, und die optimale Stelle kann durch Routineversuche bestimmt werden.
Die Rse-, Mer- oder gas6-Immunglobulinchimären können als Multimere angeordnet sein, insbesondere als Homodimere oder -tetramere. Im Allgemeinen weisen diese zusammengesetzten Immunglobuline bekannte Struktureinheiten auf. Eine grundlegende vierkettige Struktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE vorkommen. Eine vierkettige Einheit ist in den Immunglobulinen mit höheren Molekulargewicht wiederholt; IgM kommt im Allgemeinen als Pentamer von vier Grundbausteinen vor, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin, und gelegentlich IgG-Globulin, können auch in Multimerform in einem Serum vorkommen. Im Falle eines Multimers können die vier Einheiten gleich oder unterschiedlich sein.
Alternativ dazu können die Rse-, Mer- oder gas6-Sequenzen zwischen Immunglobulinleichtketten- und -schwerkettensequenzen insertiert werden, so dass ein Immunglobulin erhalten wird, das eine chimäre Schwerkette umfasst. Bei dieser Ausführungsform werden die Rse-, Mer- oder gas6-Sequenzen in jedem Arm eines Immunglobulins an das 3'-Ende einer Immunglobulinschwerkette fusioniert, entweder zwischen der Gelenk- und der C_H2-Domäne oder zwischen der C_H2- und der C_H3-Domäne. Ähnliche Konstrukte wurden von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), beschrieben.
Obwohl die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette im Immunoadhäsin gemäß vorliegender Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulinleichtkette entweder kovalent an ein Rse-, Mer- oder gas6-Immunglobulinschwerkettenfusionspalypeptid gebunden oder direkt an den Rse- oder Mer-Rezeptor oder gas6 fusioniert vorhanden sein. Im ersten Fall wird die DNA, die für eine Immunglobulinleichtkette kodiert, typischerweise gemeinsam mit der DNA exprimiert, die für das Rse-, Mer- oder gas6-Immunglobulinschwerkettenfusionsprotein kodiert. Bei einer Sekretion werden die schwere und leichte Hybridkette kovalent verbunden, um eine immunglobulinähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei disulfidverbundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Verfahren, die zur Herstellung solcher Strukturen geeignet sind, sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4.816.567 offenbart.
Die Immunglobulinsequenzen, die bei der Konstruktion des Immunoadhäsins gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, können von einer konstanten IgG-Immunglobulinschwerkettendomäne stammen. Bei menschlichen Immunoadhäsinen ist die Verwendung von menschlichen IgG₁- und IgG₃-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG₁ ist, dass IgG₁-Immunoadhäsine effizient auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert die Reinigung von IgG₃ Protein G, was ein bedeutend weniger vielseitiges Medium ist. Aber auch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen sollten in Betracht gezogen werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunoadhäsionkonstruktion gewählt wird. Das IgG₃-Gelenk ist beispiels weise länger und flexibler, so dass es größere "Adhäsindomänen" aufnehmen kann, die bei einer Fusion an IgG eventuell nicht richtig gefaltet werden oder funktionieren. Außerdem sollte die Valenz beachtet werden; IgG-Immunoadhäsine sind zweiwertige Homodimere, während Ig-Subtypen, wie beispielsweise IgA und IgM, dimere bzw. pentamere Strukturen der Ig-Homodimergrundeinheit ergeben können. Bei Rse-, Mer- oder gas6-Immunoadhäsinen, die für eine In-vivo-Anwendung ausgerichtet sind, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die durch die Fc-Region spezifiziert werden, von Bedeutung. Obwohl IgG, IgG₂ und IgG₄ alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, sind ihre relativen Wirkungsstärken bei der Aktivierung des Komplementsystems unterschiedlich. IgG₄ aktiviert kein Komplement, und IgG₂ weist bedeutend schwächere Komplementaktivierung auf als IgG. Darüber hinaus bindet IgG₂, anders als IgG, nicht an Fc-Rezeptoren auf mononuklearen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG₃ optimal für Komplementaktivierung ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit nur etwa ein Drittel der anderen IgG-Isotypen. Eine weitere wichtige Überlegung in Bezug auf Immunoadhäsine, die als menschliche Therapeutika verwendet werden sollen, ist die Anzahl von allotypischen Varianten des speziellen Isotyps. Im Allgemeinen sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. IgG weist beispielsweise nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, wovon sich zwei (G1m und 2) in der Fc-Region befinden; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht immunogen. Im Gegensatz dazu gibt es in IgG₃ 12 serologisch definierte Allotypen, von denen sich alle in der Fc-Region befinden; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht immunogen ist. So ist die potentielle Immunogenität eines γ-3-Immunoadhäsins größer als die eines γ-1-Immunoadhäsins.
Gas6-, Mer- und Rse-Immunoadhäsine werden am besten durch Fusion der cDNA-Sequenz, die für den gas6-, Mer- oder Rse-Abschnitt kodiert, in-frame an eine Ig-cDNA-Sequenz fusioniert. Eine Fusion an genomische Ig-Fragmente kann jedoch auch durchgeführt werden (siehe beispielsweise Gascoigne et al., w. o.; Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letztere Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen zur Ex pression. cDNAs, die für konstante IgG-Schwerkettenregionen kodieren, können basierend auf veröffentlichten Sequenzen von cDNA-Bibliotheken, die von Milz- oder peripheren Blutlymphozyten stammen, isoliert werden, und zwar durch Hybridisierungs- oder Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Verfahren. Die für das "Adhäsin" kodierenden cDNAs und die Ig-Teile des Immunoadhäsins werden hintereinander in einen Plasmidvektor insertiert, der eine effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen auslöst. Für eine Expression in Säugetierzellen sind auf pRK5 basierende Vektoren (Schall et al., Cell 61, 361–370 (1990)) und auf CDM8 basierende Vektoren (Seed, Nature 329, 840 (1989)) nützlich. Die genaue Verbindung kann durch Entfernen der zusätzlichen Sequenzen zwischen den bestimmten Verbindungscodons geschaffen werden, wobei oligonucleotidgerichtete Deletionsmutagenese verwendet wird (Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); und Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989)). Synthetische Oligonucleotide können verwendet werden, in denen jede Hälfte zu der Sequenz auf der jeweiligen Seite der gewünschten Verbindung komplementär ist; idealerweise handelt es sich um 36- bis 48-mere. Alternativ dazu können PCR-Verfahren verwendet werden, um die beiden Teile des Moleküls in-frame mit einem geeigneten Vektor zu verbinden.
Die Wahl der Wirtszelllinie zur Expression des Immunoadhäsins hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine weitere Erwägung betrifft die erforderliche Proteinmenge. Milligrammmengen können oft durch vorübergehende Transfektionen produziert werden. Die Adenovirus-EIA-transformierte menschliche embryonale 293-Nierenzellfinie kann beispielsweise durch eine Modifikation des Calciumphosphatverfahrens vorübergehend mit auf pRK5 basierenden Vektoren transfiziert werden, um eine effiziente Immunoadhäsinexpression zu ermöglichen. Auf CDM8 basierende Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextranverfahren zu transfizieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); und Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347–353 (1990)). Wenn größere Proteinmengen gewünscht sind, kann das Immunoadhäsin nach stabiler Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Beispielsweise kann ein auf pRK5 basierender Vektor in Gegenwart eines zusätzlichen Plasmids, das für Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert und Resistenz gegenüber G418 verleiht, in Chinahamster-Eierstockzellen (COS-Zellen) eingebracht werden. Klone, die gegen G418 resistent sind, können in einer Kultur selektiert werden. Diese Klone werden in Gegenwart von zunehmenden Gehalten an DHFR-Inhibitor Methotrexat gezüchtet, und Klone werden ausgewählt, in denen die Anzahl an Genkopien, die für DHFR und Immunoadhäsinsequenzen kodieren, coamplifiziert ist. Wenn das Immunoadhäsin eine hydrophobe Leader-Sequenz am N-Terminus enthält, wird es wahrscheinlich von den transfizierten Zellen verarbeitet und sekretiert. Die Expression von Immunoadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann einzigartig geeignete Wirtszellen erfordern. Komponenten, wie beispielsweise eine Leichtkette oder J-Kette, können beispielsweise durch bestimmte Myelom- oder Hybridomwirtszellen bereitgestellt werden (Gascoigne et al., w. o.; und Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)).
Immunoadhäsine können durch Affinitätschromatographie gut gereinigt werden. Die Eignung eines Proteins A als Affinitätsligand hängt von der Spezies und vom Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die in der Chimäre verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunoadhäsine zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Mäuseisotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden wird, ist meistens Agarose, aber auch andere Matrizen sind verfügbar. Mechanisch stabile Matrizen, wie beispielsweise Glas mit definierter Porengröße öder Poly(styroldivinyl)benzol ermöglichen höhere Strömungsgeschwindigkeiten und kürzere Processing-Zeiten als mit Agarose erzielt werden können. Die Bedingungen zur Bindung eines Immunoadhäsins an die Protein-A- oder Protein-G-Affinitätssäule werden vollkommen von den Eigenschaften der Fc-Domäne bestimmt; d. h. von ihrer Spezies und ihrem Isotyp. Im Allgemeinen findet, wenn der geeignete Ligand gewählt wird, direkt vom unkonditionierten Kulturfluid aus eine effiziente Bindung statt. Ein charakteristisches Merkmal von Immunoadhäsinen ist, dass die Bindekapazität für Protein A bei menschlichen γ1-Molekülen im Vergleich zu einem Antikörper desselben Fc-Typs etwas verringert wird. Gebundenes Immunoadhäsin kann entweder in einem Puffer mit saurem pH (von oder über 3,0) oder mit neutralem pH, der ein mild chaotropes Salz enthält, effizient eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann in einem Immunoadhäsinpräparat resultieren, das > 95% rein ist.
Der Ausdruck "extrazelluläre Rse-Domäne" oder "Rse-ECD" bezieht sich hierin auf eine Polypeptidsequenz, die mit der extrazellulären Domäne eines Rse-Rezeptors eine ligandenbindende Funktion teilt. "Ligandenbindende Funktion" bezieht sich auf die Fähigkeit des Polypeptids, einen Rse-Liganden, wie beispielsweise gas6, zu binden. Demgemäß ist es häufig nicht notwendig, die gesamte extrazelluläre Domäne aufzunehmen, da oft kleinere Segmente zur Ligandenbindung geeignet sind. Der Begriff ECD umfasst Polypeptidsequenzen, in denen die zytoplasmatische Domäne und die hydrophobe Transmembransequenz (und gegebenenfalls 1–20 Aminosäuren, die aminoterminal zur Transmembrandomäne liegen) des Rse-Rezeptors deletiert wurden. Im Allgemeinen umfasst die ECD des Rse-Rezeptors Aminosäurereste von etwa 1–428 der in Mark et al., w. o., offenbarten reifen Rse-Rezeptorsequenz.
Der Begriff "extrazelluläre Mer-Domäne" oder "Mer-ECD" bezieht sich hierin auf eine Polypeptidsequenz, die mit der extrazellulären Domäne des Mer-Rezeptors eine ligandenbindende Funktion teilt. "Ligandenbindende Funktion" bezieht sich auf die Fähigkeit des Polypeptids, einen Mer-Liganden, wie beispielsweise gas6, zu binden. Demgemäß ist es manchmal nicht notwendig, die gesamte extrazelluläre Domäne aufzunehmen, da oft kleinere Segmente zur Ligandenbindung geeignet sind. Der Begriff ECD umfasst Polypeptidsequenzen, in denen die zytoplasmatische Domäne und die hydrophobe Transmembransequenz (und gegebenenfalls 1–20 Aminosäuren, die aminoterminal zur Transmembrandomäne liegen) des Mer-Rezeptors deletiert wurden. Im Allgemeinen umfasst die ECD des Mer-Rezeptors Aminosäurereste von etwa 1–499 der in der GenBank-Dantenbank (Zugangsnummer U08023) offenbarten reifen menschlichen Mer-Rezeptorsequenz.
Der Ausdruck "epitopmarkiert" bezieht sich hierin auf ein chimäres Polypeptid, das funktionell aktives gas6 umfasst, das an ein "Markierungspolypeptid" fusioniert ist. Das Markierungspolypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch kurz genug, um die funktionelle Aktivität des gas6 nicht zu beeinträchtigen. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise auch ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper dagegen mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und üblicherweise etwa 8–50 Aminosäurereste (vorzugsweise etwa 9–30 Reste) auf. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyterminus des gas6 nachgewiesen. Solche epitopmarkierte Formen von gas6 sind wünschenswert, da ihre Gegenwart unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen das Markierungspolypeptid detektiert werden kann. Außerdem ermöglicht die Bereitstellung der Epitopmarkierung eine einfache Reinigung des gas6 durch Affinitätsreinigung unter Verwendung des Anti-Markierungsantikörpers.
Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Beispiele umfassen das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); die cmyc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5 (12), 3610–3616 (1985)); und die Herpes-Simplex-Virusglykoprotein-D-(gD-)Markierung und ihren Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)). Andere Markierungspolypeptide wurden ebenfalls offenbart. Beispiele umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); und das KT3-Epitoppeptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulinepitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)). Sobald ein Markierungspolypeptid gewählt wurde, kann ein Antikörper dagegen unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren hergestellt werden.
gas6-Markierungspolypeptidfusionen werden am besten durch Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den gas6-Abschnitt kodiert, in-frame an die Markierungspoly peptid-DNA-Sequenz und Exprimieren des resultierenden DNA-Fusionskonstrukts in geeigneten Wirtszellen hergestellt. Herkömmlicherweise wird bei der Herstellung der gas6-Markierungspolypeptidchimären gemäß vorliegender Erfindung Nucleinsäure, die für das gas6 (oder ein Fragment davon) kodiert, am 3'-Ende an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Markierungspolypeptids kodiert, aber auch 5'-Fusionen sind möglich.
Epitopmarkiertes gas6 kann leicht durch Affinitätschromatographie unter Verwendung des Anti-Markierungsantikörpers gereinigt werden. Die Matrix, an die der Affinitätsantikörper gebunden ist, ist meistens Agarose, aber auch andere Matrizen sind verfügbar (z. B. Glas mit definierter Porengröße oder Poly(styroldivinyl)benzol). Das epitopmarkierte gas6 kann beispielsweise aus der Affinitätssäule eluiert werden, indem der Puffer-pH oder die Ionenstärke variiert oder Chaotrope zugesetzt werden.
Eine "exogene" Verbindung ist hierin eine Verbindung, die in einer Zelle und/oder einem Säugetier, die/das mit der Verbindung behandelt werden soll, fremd ist oder zu einer Verbindung homolog ist, die in der Zelle oder dem Säugetier vorkommen, aber außerhalb der Zelle oder des Säugetiers produziert wird.
"Isoliert" in Bezug auf die verschiedenen, hierin offenbarten Proteine bedeutet, dass ein Protein identifiziert und von einer Komponente in seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigenden Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche die diagnostische oder therapeutische Verwendungen des Proteins beeinträchtigen würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nichtproteinartige gelöste Stoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein (1) bis zu einem Grad, der ausreicht, um zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz mithilfe eines Spinning-Cup-Sequenators zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt.
Ein "im Wesentlichen reines" Protein ist eine Zusammensetzung, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, zumindest etwa 90 Gew.-%, vorzugsweise zumindest etwa 95 Gew.-%, des Proteins enthält. Ein "im Wesentlichen homogenes" Protein ist eine Zusammensetzung, die, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, zumindest etwa 99 Gew.-% des Proteins enthält.
"Rse-Rezeptoren" oder "Rse-Rezeptorproteintyrosinkinasen" (d. h. "rPTKs") von Säugetieren wurden von Mark et al., J. Biol. Chem. 269, 10720 (1994), beschrieben. In dieser Anmeldung steht der Begriff "Rse-Rezeptor" für einen endogenen Rse-Rezeptor, der in einer Zelle von Interesse vorhanden ist, sowie für einen Rse-Rezeptor, der in einer Zelle vorhanden ist, weil die Zelle beispielsweise mit Nucleinsäure transformiert wurde, die für den Rse-Rezeptor kodiert. Demgemäß kann der Rse-Rezeptor eine Aminosäure oder eine kovalente Variante eines der von Mark et al. beschriebenen nativen Rse-Rezeptoren sein, solange diese immer noch "funktionell aktiv" ist (d. h. durch einen Rse-Liganden, wie beispielsweise gas6, aktivierbar ist). Der bevorzugte Rse-Rezeptor ist ein endogener menschlicher Rse-Rezeptor, der in der Zellmembran einer menschlichen Zelle vorhanden ist.
Die Bezeichnung "Aktivierung eines Rse-Rezeptors" bezieht sich auf den Schritt, bei dem die intrazelluläre Kinasedomäne des Rse-Rezeptors die Phosphorylierung der Tyrosinreste in einem Substratpolypeptid verursacht. Oft gehören die Tyrosinreste zum Rse-Rezeptor (d. h. das "Substrat" umfasst die intrazelluläre Domäne des Rse-Rezeptors). Daher hängt der Aktivierungsgrad mit der "Autophosphorylierung" des Rse-Rezeptors zusammen. Die Rse-Rezeptor-Autophosphorylierung kann durch Western-Blotting unter Verwendung eines Antiphosphotyrosinantikörpers (siehe Beispiel 3) oder durch KIRA-ELISA (siehe Beispiel 4) detektiert werden. Die Aktivierung des Rse-Rezeptors kann jedoch mit der Phosphorylierung eines anderen Substrats als der Rse-Rezeptor (beispielsweise Tyrosinkinase, die neben dem Rse-Rezeptor vorhanden ist) korrelieren. Dies kann durch Messen der Tyrosinphosphorylierung des Substrats (beispielsweise durch Western-Blotting) detektiert werden.
"Mer-Rezeptoren" von Säugetieren wurden von Graham et al., Cell Growth Differ. 5, 647 (1994) (siehe GenBank-Datenbank-Zugangsnummer U08023 für die korrekte menschliche Mer-Sequenz), und Graham et al., Oncogene 10 (12), 2349–2359 (1995), beschrieben. In dieser Anmeldung steht der Begriff "Mer-Rezeptor" für einen endogenen Mer-Rezeptor, der in der in einer Zelle von Interesse vorhanden ist, sowie für einen Mer-Rezeptor, der in einer Zelle vorhanden ist, weil die Zelle beispielsweise mit Nucleinsäure transformiert wurde, die für den Mer-Rezeptor kodiert. Der bevorzugte Mer-Rezeptor ist ein endogener menschlicher Mer-Rezeptor, der in einer menschlichen Zelle vorhanden ist.
Die Bezeichnung "Aktivierung eines Mer-Rezeptors" bezieht sich auf den Schritt, bei dem die intrazelluläre Kinasedomäne des Mer-Rezeptors die Phosphorylierung der Tyrosinreste in einem Substratpolypeptid verursacht. Oft gehören die Tyrosinreste zum Mer-Rezeptor (d. h. das "Substrat" umfasst die intrazelluläre Domäne des Mer-Rezeptors). Daher hängt der Aktivierungsgrad mit der "Autophosphorylierung" des Mer-Rezeptors zusammen. Die Mer-Rezeptor-Autophosphorylierung kann durch Western-Blotting unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosinantikörpers oder durch KIRA-ELISA detektiert werden (siehe weiter unten). Die Aktivierung des Mer-Rezeptors kann jedoch mit der Phosphorylierung eines anderen Substrats als der Mer-Rezeptor (beispielsweise Tyrosinkinase, die neben dem Mer-Rezeptor vorhanden ist) korrelieren. Dies kann durch Messen der Tyrosinphosphorylierung des Substrats (beispielsweise durch Western-Blotting) detektiert werden.
Der Ausdruck "Förderung des Überlebens einer Zelle" bezieht sich auf die Verlängerung der Dauer der Existenz einer Zelle im Vergleich mit einer unbehandelten Zelle, die nicht gas6 ausgesetzt wurde, und zwar entweder in vitro oder in vivo.
Der Ausdruck "Förderung der Proliferation einer Zelle" umfasst den Schritt der Steigerung des Ausmaßes des Wachstums und/oder der Reproduktion einer Zelle im Vergleich zu einer unbehandelten Zelle, entweder in vivo oder in vitro. Eine Zunahme der Zellproliferation in einer Zellkultur kann durch Zählen der Anzahl an Zellen vor und nach dem Aussetzen gegenüber gas6 detektiert werden (siehe Beispiel 9). Das Ausmaß der Proliferation kann durch mikroskopische Untersuchung des Konfluenzgrades quantifiziert werden. Zellproliferation kann auch durch Messung von ³H-Aufnahme von Zellen quantifiziert werden.
Unter "Förderung der Differenzierung einer Zelle" versteht sich die Steigerung des Ausmaßes des Erwerbs oder des Besitzes eines oder mehrerer Merkmale oder einer oder mehrerer Funktionen, die sich von denen der ursprünglichen Zelle unterschieden (d. h. Zellspezialisierung). Dies kann durch Screenen auf eine Veränderung im Phänotypen der Zelle detektiert werden (beispielsweise durch Identifikation von morphologischen Veränderungen in der Zelle, siehe Beispiel 9).
"Physiologisch annehmbare" Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind solche, die für die Zelle oder das Säugetier, die diesen ausgesetzt werden, in den eingesetzten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Oft ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer, wie beispielsweise Phosphat, Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie beispielsweise EDTA; Zuckeralkohole, wie beispielsweise Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie beispielsweise Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie beispielsweise Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Die Begriffe "behandeln", "Behandlung" und "Therapie" beziehen sich auf Heiltherapien, prophylaktische Therapie und vorbeugende Therapien.
Der Begriff "Säugetier" bezieht sich auf jedes beliebige Säugetier, das als Säugetier klassifiziert wird, einschließlich Menschen, Kühe, Pferde, Hunde und Katzen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Säugetier ein Mensch.
Der Ausdruck "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmen Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise andere, jetzt noch nicht eingehend untersuchte Sequenzen. Eukaryotische Zellen verwenden bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Eine Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader ist beispielsweise operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids mitwirkt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie eine Translation vereinfacht. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind, und im Falle eines sekretorischen Leaders, dass sie zusammenhängend sind und in Lesephase vorliegen. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Das Binden kann auch durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen erreicht werden. Wenn keine solchen Stellen vorhanden sind, werden die synthetischen Oligonucleotidadapter oder -linker gemäß herkömmlicher Verfahren verwendet.
2. gas6-Produktion
Verfahren, die zur Herstellung von nativem gas6 oder gas6-Varianten geeignet sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen die Isolation von gas6 aus einer endogenen Quelle dieses Polypeptids (z. B. Serum), Peptidsynthese (unter Verwendung eines Peptidsynthesegeräts) und Rekombinationsverfahren (oder eine beliebige Kombination dieser Verfahren). Das bevorzugte Verfahren für die Herstellung von nativem gas6 oder gas6-Varianten ist ein Rekombinationsverfahren. Die gas6-Varianten gemäß vorliegender Erfindung sind solche, die im Wesentlichen nicht γ-carboxyliert sind. Das umfasst die Schaffung eines Moleküls, dem ein oder mehrere Glutaminsäurereste in der A-Domäne des nativen gas6 fehlen, die normalerweise γ-carboxyliert sind. Gegebenenfalls kann die gesamte A-Domäne durch enzymatische Spaltung aus dem nativen Molekül entfernt werden, aber normalerweise wird ein Nucleinsäuremolekül isoliert, das für das gewünschte Fragment kodiert (z. B. die D-Domäne oder eine G-Domäne davon). Dieses Nucleinsäuremolekül kann von der nativen gas6-Nucleinsäure stammen.
Nucleinsäure, die für natives gas6 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek isoliert werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, das wahrscheinlich die Polypeptid-mRNA besitzt und es in detektierbarem Ausmaß exprimiert (z. B. Gehirngewebe, siehe Beispiel 6). Bibliotheken werden mit Sonden (wie beispielsweise Antikörpern oder Oligonucleotiden mit etwa 20–80 Basen) gescreent, die darauf ausgerichtet sind, das gas6-Gen oder das dadurch kodierte Protein zu identifizieren. Das Screenen der cDNA oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, wie sie in den Kapiteln 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben sind, durchgeführt werden.
Verfahren zur Schaffung von gas6-Varianten durch Modifikation der Nucleinsäure vom Wildtyp wurden oben beschrieben. Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), die für die gas6-Variante kodiert, wird zum weiteren Klonieren (Amplifizieren der DNA) oder zum Exprimieren in einen replizierbaren Vektor insertiert. Viele Vektoren sind verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen eines oder mehrere der Folgenden, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt: eine Signal sequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Verstärkerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Die gas6-Variante kann als Fusionspolypeptid mit einer Signalsequenz oder als anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids hergestellt werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die bevorzugt ausgewählte heterologe Signalsequenz ist eine solche, die durch die Wirtszelle erkannt und bearbeitet (d. h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Bei prokaryotischen Wirtszellen kann die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus Alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, substituiert sein. Bei Hefesekretion kann die native Signalsequenz durch beispielsweise einen Hefeinvertaseleader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182, erteilt am 23. April 1991, beschrieben ist) oder Säurephosphataseleader, den C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal substituiert sein. Bei Säugetierzellexpression ist die native gas6-Signalsequenz zufrieden stellend, obwohl auch andere Säugetiersignalsequenzen als virale sekretorische Leader geeignet sein können, wie beispielsweise das Herpes-simplex-gD-Signal. Die DNA für solch eine Vorläuferregion ist im Leseraster an DNA ligiert, die für das native gas6 oder eine gas6-Variante kodiert.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine solche, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkt oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Reihe von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt des Plasmids pBR322 ist für die meisten gramne gativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zur Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen geeignet. Im Allgemeinen ist die Replikationsstartpunktkomponente für Säugetierexpressionsvektoren nicht erforderlich (typischerweise wird nur der SV40-Startpunkt verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die in komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das Gen, das für D-Alaninracemase für Bacilli kodiert. Ein Beispiel für ein Selektionsschema basiert auf der Verwendung eines Arzneimittels, um das Wachstum einer Wirtszelle zu arretieren. Diese Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht und so das Selektionssystem überlebt. Beispiele für solch eine dominante Selektion nutzt die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 (1985)). Die drei oben angeführten Beispiele nutzen Bakteriengene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegenüber dem geeigneten Arzneimittel G428 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein weiteres Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind solche, welche die Identifikation von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der gas6-Variantennucleinsäure fähig sind, wie beispielsweise DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, den nur die Transformanten, die auf einzigartige Weise darauf eingestellt sind, überleben können, indem sie den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird geschaffen, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, in denen die Konzentration eines Selektionsmittels im Medium immer wieder verändert wird, wodurch es zur Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der DNA kommt, die für die gas6-Variante kodiert. Steigende Mengen gas6 werden von der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele für amplifizierbare Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Metallothioneingene von Primaten, Adenosindeaminase, Ornithindecarboxylase usw.
Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert sind, werden beispielsweise zuerst identifiziert, indem alle Transformanten in einem Methotrexat (Mtx) – ein kompetitiver Antagonist von DHFR – enthaltenden Kulturmedium kultiviert werden. Eine geeignete Wirtszelle bei Verwendung von DHFR vom Wildtyp ist die Chinahamster-Eierstockzellenlinie (CHO-Zelllinie), die geringe DHFR-Aktivität aufweist und gemäß Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), hergestellt und vermehrt sind. Die transformierten Zellen werden dann steigenden Methotrexatwerten ausgesetzt. Das führt zur Synthese von mehreren Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig von mehreren Kopien anderer DNA, welche die Expressionsvektoren umfasst, wie beispielsweise der DNA, die für die gas6-Variante kodiert. Dieses Amplifizierungsverfahren kann mit jedem beliebigen anderen geeigneten Wirt verwendet werden, wie beispielsweise ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, trotz des Vorhandenseins von endogenem DHFR, wenn beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen, das äußerst resistent gegen Mtx ist, eingesetzt wird ( EP 117.060 ).
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte vom Wildtyp, die endogenes DHFR enthalten) mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert werden, die für Wildtyp-gas6-Varianten-DHFR-Protein kodieren, und ein weiterer selektierbarer Marker, wie beispielsweise Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (APH), kann durch Zellwachstum in einem Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker enthält, wie beispielsweise ein Aminoglycosidantibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe bereit, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, wie beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart einer trp1-Läsion im Hefezellengenom stellt dann ein wirksames Umfeld bereit, um eine Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan zu detektieren. Auf ähnliche Weise werden Leu2-arme Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide ergänzt, die das Leu2-Gen enthalten.
Außerdem können Vektoren vom 1,6 μm großen ringförmigen Plasmid pKD1 zur Transformation von Kluyveromyces-Hefe verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). Vor kurzem wurde über ein Expressionssystem für K. lactis zur großtechnischen Produktion von rekombinantem Kälberchymosin berichtet. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Expressionsvektoren mit hoher Kopienzahl zur Sekretion von reifem rekombinantem Humanserumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces wurden ebenfalls offenbart. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die gas6-Nucleinsäure gebunden ist. Eine große Anzahl an Promotoren, die durch verschiedene mögliche Wirtszellen erkannt werden, sind allgemein bekannt. Diese Promotoren werden operabel an eine DNA gebunden, die für eine gas6-Variante kodiert, indem der Promotor durch Restriktionsenzymverdauung aus der Quellen-DNA entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird.
Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactosepromotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), und EP 36.766 ) und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Andere bekannte Bakterienpromtoren sind aber auch geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung sie unter Verwendung von Linkern oder Adaptern operabel an DNA binden kann, die für das gas6 kodiert (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1990)), um beliebige gewünschte Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in Bakteriensystemen enthalten außerdem eine Shine-Dalgarno-(S. D.-)Sequenz, die operabel an die DNA gebunden ist, die für das gas6 kodiert.
Promotorsequenzen sind für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotische Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle befindet, an der die Transkription gestartet wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstartpunkt vieler Gene befindet, ist eine CXCAAT-Region, worin X jedes beliebige Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly(A)-Schwanzes am 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle diese Sequenzen können auf geeignete Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert werden.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere Glycolyseenzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie beispielsweise Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil sind, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen geregelt werden kann, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit Stickstoffmetabolismus assoziierte degradative Enzyme, Metallothionein, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression sind in Hitzeman et al., EP 73.657A , genauer beschrieben. Hefe-Enhancer können auch mit Hefepromotoren vorteilhaft verwendet werden.
Gas6-Variantentranskription von Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren geregelt, die von den Genomen von Viren, wie z. B. Polyomaviren, Geflügelpockenviren (UK 2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenoviren (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomviren, Zytomegalie-Viren, Retroviren, Hepatitis-B-Viren und insbesondere Affenvirus 40 (SV40), von heterologen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, oder von Hitzeschockpromotoren erhalten wurden.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus können leicht als SV40-Restriktionsfragment erhalten werden, das auch den viralen SV40-Replikationsstartpunkt enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus kann leicht als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten werden. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), zur Expression von cDNA, die für ein Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), zur Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Kontrolle eines Thmyidinkinasepromotors vom Herpes-simplex-Virus; Canani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), zur Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Mäuse- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), zur Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryofibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Mäuse-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Rous-Sarkomvirus-Wiederholung als Promotor.
Die Transkription von DNA, die für die gas6-Variante kodiert, durch höhere Eukaryoten wird oft durch Insertion einer Verstärkersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind relativ unabhängig von Ausrichtung und Position und wurden 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)) nachgewiesen. Heute sind viele Enhancersequenzen von Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer von einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite der Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Zytomegalie-Viruspromotorenhancer, den Polyomaenhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirusenhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), zur verstärkende Elementen zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' zur für gas6 kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Expressionsvektoren, die in eurkaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Menschen- oder kernhaltige Zellen von anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten außerdem Sequenzen, die für die Termination der Transkription und Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen sind im Allgemeinen von der 5'- und gelegentlich von der 3'-untranslatierten Region von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAS erhältlich. Diese Regionen ent halten Nucleotidsegmente, die im untranslatierten Abschnitt der mRNA, die für die gas6-Variante kodiert, als polyadenylierte Fragmente transkribiert sind.
Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der oben genannten Komponenten enthalten, erfolgt unter Verwendung von herkömmlichen Ligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschneidert und in der gewünschten Form erneut ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden.
Zur Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um den E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) und erfolgreiche Transformanten zu transformieren, die durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert wurden, wenn geeignet. Plasmide von den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonukleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren gemäß Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder das Verfahren gemäß Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Besonders nützlich bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung sind Expressionsvektoren, die eine vorübergehende Expression von DNA, die für gas6-Varianten kodiert, in Säugetierzellen ermöglichen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der zur effizienten Replikation in einer Wirtszelle fähig ist, sodass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors anhäuft und wiederum große Mengen eines gewünschten Polypeptids synthetisiert, für das der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., w. o., 16.17–16.22. Systeme für vorübergehende Expression, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen eine bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren, sowie das rasche Screenen von gas6-Varianten mit den gewünschten Bindungsspezifitäten/-affinitäten.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese der gas6-Varianten in rekombinanten Wirbeltierzellkulturen geeignet sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid für die Säugetierzellkulturexpression von gas6 ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B (PCT-Veröff. Nr. WO 91/08291, veröffentlicht am 13. Juni 1991).
Die Wahl der Wirtszelllinie zur Expression einer gas6-Variante hängt vor allem vom Expressionsvektor ab. Es kann wünschenswert sein, eine Wirtszelle auszuwählen, die kein γ-Carboxylaseenzym aufweist. Ein häufig nützlicher Wirt für diesen Zweck ist eine nicht von einem Säugetier stammende Zelle (z. B. eine prokaryotische Zelle, der bekannterweise dieses Enzym fehlt). Alternativ dazu kann eine Säugetierzelllinie verwendet werden, aus der dieses Enzym entfernt wurde.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der Vektoren hierin sind Prokaryoten-, Hefe- oder andere höhere Eukaryotenzellen, die weiter oben beschrieben wurden. Zu diesem Zweck geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie beispielsweise gramnegative oder grampositive Organismen, wie beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z. B. Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugte E.-coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl andere Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) ebenfalls geeignet sind. Diese Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung. Der Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt, weil er ein herkömmlicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren. Der Stamm W3110 kann beispielsweise so modifiziert werden, dass eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen erzielt wird, wobei Beispiele für solche Wirte den E.-coli-W3110-Stamm 27C7 umfassen. Der komplette Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kan^r. Der Stamm 27C7 wurden am 30. Oktober 1991 in der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der Stamm von E. coli mit mutierter periplasmatischer Protease, der im US-Patent Nr. 4.946.783 vom 7. August 1990 offenbart ist, verwendet werden. Alternativ dazu sind auch Klonierungsverfahren, wie beispielsweise PCR oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Neben Prokaryoten sind auch eukaryotische Mikroben, wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren, die für eine gas6-Variante kodieren. Saccharomyces cerevisiae, oder herkömmliche Bäckerhefe, ist der am häufigsten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Eine Reihe von anderen Arten, Spezies und Stämmen ist jedoch ebenfalls verfügbar und hierin verwendbar, wie beispielsweise Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., w. o.), wie beispielsweise K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424); K. bulgaricus (ATCC 16.045); K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., w. o.), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris (EP183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie beispielsweise Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem, Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glycosylierten gas6-Varianten stammen von mehrzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Processing- und Glycosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur geeignet, egal ob sie von einer Wirbeltier- oder Wirbellosenkultur stammt. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten sowie entsprechende geeignete Insektenwirtszellen von Wirten, wie beispielsweise Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Mücke), Aedes albopictus (Mücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, wurden identifiziert. Siehe beispielsweise Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., Genetic Engineering Bd. 8, 277–279, Setlow et al., Hrsg., Plenum Publishing (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Reihe von Virusstämmen zur Transfektion sind allgemein erhältlich, wie beispielsweise die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als Viren gemäß vorliegender Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdäpfel (Kartoffeln), Sojabohnen, Petunien, Paradeiser (Tomaten) und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das vorher so manipuliert wurde, dass sie die gas6-Varianten-DNA enthält. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die DNA, die für die gas6-Variante kodiert, in den Pflanzenzellwirt transferiert, sodass dieser transfiziert ist und unter geeigneten Bedingungen die gas6-Varianten-DNA exprimiert. Außerdem sind Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie beispielsweise der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Darüber hinaus sind DNA-Segmente, die aus der stromauf gelegenen Region des T-DNA-780-Gens isoliert sind, zur Aktivierung oder Steigerung der Transkription von pflanzenexprimierbaren Genen in re kombinantem DNA-hältigen Pflanzengewebe fähig. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in einer Kultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Hrsg. (1973)). Beispiele für geeignete Säugetierzelllinien sind eine Affennieren-CV1-Linie, die durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) transformiert wurde; eine menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, die für Wachstum in eines Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen von der Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzehen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (HepG2, HB 8065); Mäuse-Brusttumoren (MMT 060562, ATCC CCL 51); TR1-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-4-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren gemäß vorliegender Erfindung transfiziert und in herkömmlichen Nährmedien auf eine Art kultiviert, wie sie zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, geeignet ist. Je nach verwendeter Wirtszelle wird die Transfektion unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Im Allgemeinen wird für Prokaryoten oder andere Zellen, die beträchtliche Zellwandbarrieren aufweisen, Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie sie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., w. o., beschrieben ist, oder Elektroporation eingesetzt. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation be stimmter Pflanzenzellen verwendet, wie in Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben ist. Außerdem können Pflanzen unter Verwendung von Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie sie in der WO 91/00358, veröffentlicht am 10. Jänner 1991, beschrieben ist.
Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Calciumphosphatausfällungsverfahren gemäß Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte der Säugetierwirtszellsystemtransformationen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216, erteilt am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren gemäß Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 33829 (1979), durchgeführt. Aber auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie beispielsweise nukleare Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z. B. Polybren, Polyornithin, usw. können verwendet werden. Zu verschiedenen Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Prokaryotische Zellen, die zur Herstellung der gas6-Variante gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, werden in geeigneten Medien kultiviert, wie in Sambrook et al., w. o., allgemein beschrieben ist.
Die Säugetierwirtszellen, die zur Herstellung der gas6-Variante gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden, können in unterschiedlichen Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie beispielsweise Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann jedes der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), in den US-Patenten Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; in der WO 90/03430; in der WO 87/00195; im US-Patent Re. 30.985; oder im US-Patent 5.122.469, die alle durch Verweis hierin aufgenommen sind, beschriebene Medium als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann je nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (z. B. Insulin, Transferrin oder Epidermis-Wachstumsfaktor), Salzen (z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (z. B. HEPES), Nucleosiden (z. B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (z. B. das Arzneimittel Gentamycin^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im Mikromolbereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Auch jede beliebige andere Ergänzung kann in geeigneten Konzentrationen zugeführt werden, was Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist es wünschenswert, die transformierte Wirtszelle in Abwesenheit von Vitamin K zu kultivieren, da so die γ-Carboxylierung der A-Domäne des gas6-Polypeptids verringert werden kann. Alternativ dazu können die transformierten Wirtszellen in Gegenwart eines Carboxylaseinhibitors, wie z. B. Warfarin, kultiviert werden.
Die Kultivierungsbedingungen, wie beispielsweise Temperatur, pH und dergleichen, sind dieselben, wie sie vorher für die zur Expression gewählten Wirtszellen verwendet wurden und sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung hinreichend bekannt. Im Allgemeinen finden sich Grundlagen, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Säugetierzellkulturen in M. Butler, Hrsg., Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, IL Press (1991). Die in dieser Veröffentlichung genannten Wirtszellen umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
Eine gas6-Variante wird vorzugsweise als sekretiertes Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl sie auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann.
Wenn eine gas6-Variante in einer rekombinante Zelle produziert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist sie vollkommen frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch notwendig, gas6 von Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen in Bezug auf gas6 sind. Ein erster Schritt umfasst das Entfernen von Teilchentrümmern, entweder Wirtszellen oder lysierte Fragmente, beispielsweise durch Zentrifugation oder Ultrafiltration; gegebenenfalls kann das Protein mit einem im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilter konzentriert werden, wonach das gas6 durch einen oder mehrere Schritte von anderen Verunreinigungen abgetrennt wird, die aus Heparin-Sepharose-Chromatographie, Immunaffinitätschromatographie, Ionenaustauschsäulenfraktionierung (z. B. auf DEAE oder Carboxymethyl- oder Sulfopropylgruppen enthaltenden Matrizen), Chromatographie auf Blue-Sepharose, CM-Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, Linsen-Lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con-A-Sepharose, Ether-Toyopearl, Butyl-Toyopearl, Phenyl-Toyopearl oder Protein-A-Sepharose, SDS-PAGE-Chromatographie, Silicachromatographie, Chromatofokussierung, Umkehrphasen-HPLC (z. B. Silicagel mit angehängten aliphatischen Gruppen), Gelfiltration unter Verwendung beispielsweise eines Sephadex-Molekularsiebs oder Größenausschlusschromatographie, Chromatographie auf Säulen, die selektiv gs6 binden, und Ethanol- oder Ammoniumsulfatausfällung ausgewählt sind. Ein Proteaseinhibitor kann in einem der vorangegangenen Schritte inkkludiert sein, um die Proteolyse zu hemmen, und Antibiotika können inkludiert sein, um das Wachstum von hinzukommenden Verunreinigungen zu verhindern. Beispiele für geeignete Proteaseinhibitor umfassen Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin, 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochloridbestatin, Chymostatin und Benzamidin.
Gas6-Varianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert wurden, werden auf dieselbe Weise gewonnen wie natives gas6, wobei wesentliche Veränderungen der Eigenschaften durch die Variation bedacht werden. Die Herstellung von "epitopmarkiertem" gas6 erleichtert beispielsweise die Reinigung unter Verwendung einer Immunaffinitätssäule, die Antikörper gegen das Antigen enthält, um das Fusionspoly peptid zu adsorbieren. Immunaffinitätssäulen, wie beispielsweise eine polyklonale Kaninchen-Anti-gas6-Säule, können verwendet werden, um die gas6-Variante durch Bindung an zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass Reinigungsverfahren für natives gas6 eventuelle eine Modifikation erfordern können, um den Veränderungen im Charakter von gas6 oder seinen Varianten bei Produktion in einer rekombinanten Zellkultur Rechnung zu tragen.
3. In-vitro- und In-vivo-Verwendungen von gas6-Varianten
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Aktivierung eines Rse-Rezeptors oder Mer-Rezeptors und/oder zur Förderung des Überlebens, der Proliferation oder der Differenzierung von Zellen, die den Rse-Rezeptor oder Mer-Rezeptor umfassen, unter Verwendung von gas6-Varianten bereit. Die gas6-Varianten, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können, können auf verschiedene Arten hergestellt werden, wie im vorigen Abschnitt beschrieben wurde (siehe auch Beispiel 6).
Die gas6-Variante kann von einer menschlichen oder nichtmenschlichen Spezies stammen. Beispielsweise kann ein Säugetier mit Varianten von gas6 von einer anderen Säugetierspezies behandelt werden (z. B. können Mäuse mit menschlichem gas6 behandelt werden). Zwischen murinem gas6 und menschlichem gas6 besteht beträchtliche Homologie (etwa 81% Aminosäureidentität), und so wird erwartet, dass gas6 von verschiedenen Säugetierspezies verwendet werden kann. Vorzugsweise wird das Säugetier jedoch mit homologem gas6 behandelt (z. B. werden Menschen mit menschlichem gas6 behandelt), um mögliche Immunogenität des gas6 im Säugetier zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Aktivierung eine Rse- oder Mer-Rezeptors und/oder zur Förderung des Überlebens, der Proliferation oder der Differenzierung von Zellen, die den Rse- oder Mer-Rezeptor umfassen, in vivo und in vitro. Die Zellen werden normalerweise mit dem gas6-Varianten-Polypeptid behandelt. Auf dem Gebiet der Erfindung wurden jedoch schon gentherapeutische Ansätze beschrieben, die in die vorliegende Erfindung aufgenommen sind. Diese Verfahren umfassen Genverabreichung an eine Zelle unter Verwendung eines Adenovirus, Herpes-simplex-1-Virus oder adenoassoziierten Virus sowie von auf Lipid basierenden Verabreichungssystemen (z. B. Liposome). Retroviren sind für Ex-vivo-Gentherapieansätze nützlich. Demgemäß ist es möglich, die Nucleinsäure zu verabreichen, die für eine gas6-Variante kodiert, was zur Expression des gas6-Varianten-Polypeptids im Patienten oder in einer Gewebekultur führt. Zu Beispielen für gentherapeutische Verfahren siehe WO 93/25673 und die darin genannten Literaturverweise.
Gemäß den In-vitro-Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Zellen bereitgestellt, die den Rse- oder Mer-Rezeptor umfassen, und in ein Zellkulturmedium gegeben. Beispiele für Rse-Rezeptor-hältige Zellen umfassen Nervenzellen, z. B. Gehirnzellen (wie z. B. Neuronen des Neocortex, Cerebellum und Hippocampus); Gliazellen (z. B. Schwann-Zellen oder Astrozyten); von Niere oder Brust stammende Zellen; Zellen von Ovarien oder Testes; Fibroblastenzellen, wie z. B. Mäuse-3T3-Zellen; Zellen vom hämatopoetischen System, wie z. B. CMK11-5. Beispiele für Mer-Rezeptor-hältige Zellen umfassen mononukleare periphere Blutzellen, mononukleare Zellen des Knochenmarks, Monozyten, primäre hämatopoetische Zeilen und Zellen von Testes, Ovarien, Prostata, Lunge, Niere, Milz, Leukozyten des peripheren Bluts, Plazenta, Thymus, Dünndarm, Dickdarm oder Leber. Beispiele für Zelllinien, die unter Verwendung von gas6 kultiviert werden sollen, umfassen T-Lymphozytenleukämiezelllinien (z. B. CCRF-HSB-2, JURKAT, HPB-ALL und Peer); die K-562-Zelllinie; monozytische Leukämie-/Lymphomzelllinien (z. B. U-937); megakaryoblastische Leukämiezelllinien (z. B. UT-7) und andere Zelllinien, die einen Mer-Rezeptor exprimieren, wie sie in Graham et al., Cell Growth Differ. 5, 647 (1994), beschrieben sind.
Geeignete Gewebekulturmedien sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ausreichend bekannt und umfassen Minimal Essential Medium (MEM), RPMI-1640 und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Diese Gewebekulturmedien sind im Handel von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA) und GIBCO (Grand Island, NY, USA) erhältlich. Die Zellen werden dann im Zellkulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die ausreichen, damit die Zellen lebensfähig bleiben und in Gegenwart einer effektiven Menge gas6 wachsen. Die Zellen könne auf verschiedene Arten kultiviert werden, einschließlich Kultivierung in einer Koagulum-, Agar- oder Flüssigkeitskultur.
Die Zellen werden bei physiologisch annehmbaren Temperaturen, wie beispielsweise 37°C, beispielsweise in Gegenwart einer effektiven Menge gas6-Variante kultiviert. Die Menge der gas6-Variante kann variieren, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 10 ng/ml bis etwa 1 mg/ml. Die gas6-Variante kann natürlich in einer Dosis zur Kultur zugesetzt werden, die von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung empirisch ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt wurde. Die Konzentration der gas6-Variante in der Kultur hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie beispielsweise den Bedingungen, unter denen die Zellen und gas6 kultiviert werden. Die spezifische Temperatur und Dauer der Inkubation sowie andere Kultivierungsbedingungen können in Abhängigkeit von Faktoren variieren, wie beispielsweise der Konzentration der gas6-Variante und der Art der Zellen und des Mediums. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können operative und optimale Kultivierungsbedingungen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmen. Die Proliferation, die Differenzierung und/oder das Überleben der Zellen (z. B. Nervenzellen oder mononukleare Zellen) in den Kulturen kann durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Tests bestimmt werden, z. B. durch die, die auch weiter oben beschrieben sind.
Es wird angenommen, dass die Verwendung einer gas6-Variante zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung in vitro auf verschiedene Arten nützlich sein kann. Beispielsweise können Nervenzellen, die in vitro in Gegenwart einer gas6-Variante kultiviert wurden, in ein Säugetier infundiert werden, das an verringerten Mengen der Zellen leidet. In anderen Ausführungsformen kann eine gas6-Variante verwendet werden, um hämatopoetische Zellen (wie z. B. Monozyten/Makrophagen) ex vivo zu kultivieren, die dann einem Patienten mit erhöhten Werten dieser Blutzellen verabreicht werden kann (beispielsweise wenn der Patient eine Chemo- oder Strahlentherapie durchlaufen hat). Stabile In-vitro-Kulturen können auch zur Isolation von zellspezifischen Faktoren und zur Expression von endogenen oder rekombinant eingebrachten Proteinen in der Zelle verwendet werden. gas6-Varianten können auch zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung von Zellen verwendet werden, die das Wachstum und/oder die Differenzierung anderer Zellen in einer Zellkultur unterstützen (z. B. Stromazellen zur Unterstützung von nichtadhärenten Knochenmarkszellen). Auf diese Weise können Schwann-Zellen das neuronale Überleben in einer Zellkultur fördern.
Eine gas6-Variante ist zur Züchtung von Schwann-Zellen ex vivo insbesondere geeignet. Wünschenswerterweise sollten solche Populationen von Zellen in einer Zellkultur zur Isolation von zellspezifischen Faktoren, z. B. P75^NGFR, das ein Schwann-Zellen-spezifischer Marker ist, vorhanden sein. Solche Faktoren sind nützliche Dianosewerkzeuge oder können wie etwa im Falle von P75^NGFR, als Antigene verwendet werden, um Antikörper für diagnostische Zwecke herzustellen. Außerdem sind stabile Populationen von Schwann-Zellen in einer Zellkultur wünschenswert, um eine Charakterisierung anderer Mitogene und wachstumshemmender Faktoren für diese Zellen zu erleichtern.
Die Erfindung stellt außerdem In-vivo-Verwendungen für gas6-Varianten bereit. Basierend auf der Fähigkeit von gas6, die Proliferation von Gliazellen zu fördern (siehe Beispiel 9), wird angenommen, dass dieses Molekül für die Behandlung von Krankheiten besonders geeignet ist, die Demyelinisierung, Schädigung oder Verlust von Gliazellen involvieren (z. B. Multiple Sklerose).
Außerdem wird angenommen, dass gas6 nützlich zur Förderung, Aufrechterhaltung und/oder Regeneration von Neuronen in vivo ist, einschließlich zentraler (Gehirn und Rückenmark), peripherer (Sympathikus-, Parasympathikus-, Sinnes- und Darmneuronen) und Motorneuronen. Demgemäß können gas6-Varianten in Verfahren zur Diagnose und/oder Behandlung verschiedener "neurologischer Erkrankungen oder Störungen" verwendet werden, welche sich auf das Nervensystem eines Säugetiers, wie beispielsweise eines Menschen, auswirken.
Solche Erkrankungen oder Störungen können in Patienten auftreten, deren Nervensystem durch beispielsweise ein Trauma, eine Operation, einen Schlaganfall, eine Ischämie, eine Infektion, eine Stoffwechselerkrankung, einen Nährstoffmangel, Malignität oder toxische Stoffe geschädigt ist. Der Wirkstoff ist so ausgerichtet, dass der das Überleben oder Wachstum von Neuronen fördert. Eine gas6-Variante kann beispielsweise verwendet werden, um das Überleben oder Wachstum von Motorneuronen zu fördern, die durch ein Trauma oder eine Operation geschädigt wurden. Außerdem kann eine gas6-Variante verwendet werden, um Motorneuronenstörungen, wie beispielsweise amyotrophe Lateralsklerose (Lou-Gehrig-Syndrom), Bell-Lähmung und verschiedene Zustände, die spinale Muskelatrophie oder Lähmung beinhalten, zu behandeln. gas6 kann auch verwendet werden, um menschliche "neurodegenerative Störungen", wie beispielsweise die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson-Krankheit, Epilepsie, Multiple Sklerose, Huntington-Chorea, das Down-Syndrom, Nerventaubheit und die Menière-Krankheit, zu behandeln.
Weiters kann eine gas6-Variante verwendet werden, um Neuropathie, insbesondere periphere Neuropathie, zu behandeln. "Periphere Neuropathie" bezieht sich auf eine Störung, die sich auf das periphere Nervensystem auswirkt und sich meist als eine oder eine Kombination von motorischen, sensorischen, sensomotorischen oder autonomen neuralen Funktionsstörungen zeigt. Die große Vielfalt an durch periphere Neuropathien gezeigten Morphologien kann einzig und allein auf eine gleichfalls große Vielfalt an Ursachen zurückgeführt werden. Beispielsweise können periphere Neuropathien genetisch bedingt sind, das Ergebnisse einer systemischen Erkrankung sein oder durch einen toxischen Stoff verursacht worden sein. Beispiele umfassen distale sensomotorische Neuropathie oder autonome Neuropathien, wie z. B. verringerte Motilität des Magen-Darm-Trakts oder Atonie der Harnblase, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele für Neuropathien in Zusammenhang mit systemi schen Erkrankungen umfassen das Post-Polio-Syndrom; Beispiele für vererbte Neuropathien umfassen die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, die Refsum-Krankheit, Abetalipoproteinämie, die Tangier-Krankheit, das Krabbe-Syndrom, methachromatische Leukodystrophie, das Fabry-Syndrom und das Dejerine-Sottas-Syndrom; und Beispiele für durch toxische Stoffe ausgelöste Neuropathien umfassen solche, die durch Behandlung mit einem chemotherapeutischen Wirkstoff, wie z. B. Vincristin, Cisplatin, Methotrexat oder 3'-Azido-3'-desoxythymidin, ausgelöst werden.
Aufgrund der Expression eines Rse-Rezeptors und Mer-Rezeptors auf hämatopoetischen Zellen kann eine gas6-Variante verwendet werden, um die Repopulation von reifen Blutzelllinien in Patienten zu fördern, die eine Chemo- oder Strahlungstherapie oder Knochenmarkstransplantationstherapie durchlaufen haben. Es wird angenommen, dass gas6 durch die Förderung der Proliferation und/oder Differenzierung von hämatopoetischen Zellen (z. B. Monozyten und Megakaryozyten) wirkt. Auf ähnliche Weise kann eine gas6-Variante verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die durch einen Rückgang an Blutzellen charakterisiert sind. Beispiele für diese Krankheiten umfassen Anämie (einschließlich makrozytischer und aplastischer Anämie); Thrombozytopenie; Monozytopenie; Hypoplasie; immun-(automimmun-)thrombozytopenische Purpura (ITP); und HIV-induzierte ITP. gas6 kann auch zur Förderung des Wachstums und/oder der Reparatur von Gewebe (z. B. Testis, Ovarium, Prostata, Lunge oder Niere), das einen oder beide der Rezeptoren exprimiert, verwendet werden. Auch zur Verbesserung der Fortpflanzungsfunktion kann eine gas6-Variante eingesetzt werden, wenn in den Testes und Ovarien starke Expression von Mer-Rezeptoren vorhanden ist.
Da Mer auf mononuklearen Zellen exprimiert wird, wird angenommen, dass eine gas6-Variante zur Behandlung von Zuständen verwendet werden kann, in denen die Proliferation und/oder Differenzierung dieser Zellen gewünscht ist. Beispielsweise kann eine gas6-Variante verwendet werden, um die Monozyten-(z. B. Makrophagen-)Werte in einem Patienten zu erhöhen, wenn dies erforderlich oder gewünscht ist.
In anderen Ausführungsformen kann eine gas6-Variante verwendet werden, um die Funktion von Zellen zu modulieren, die den Mer- oder Rse-Rezeptor aufweisen. Beispielsweise kann eine gas6-Variante eingesetzt werden, um Monozyten/Makrophagen in Situationen zu aktivieren, in denen solch eine Aktivierung gewünscht ist (z. B. zur Behandlung von Infektionen).
Therapeutische Formulierungen einer gas6-Variante werden durch Vermischen der gas6-Variante mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren, die allgemein bekannt sind, hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für den Patienten in den eingesetzten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie beispielsweise Phosphat, Citrat oder andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie beispielsweise Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie beispielsweise EDTA; Zuckeralkohole, wie beispielsweise Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie beispielsweise Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie beispielsweise Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Es kann wünschenswert sein, eine gas6-Variante an eine Membran, wie beispielsweise eine Silicongummimembran, zu adsorbieren, die in der Nähe von geschädigtem Nervengewebe implantiert werden kann, oder eine gas6-Variante in Liposome zu inkorporieren. PCT Veröff. Nr. WO 91/04014 (veröffentlicht am 4. April 1991). In einer weiteren Ausführungsform ist die für therapeutische Zwecke verwendete gas6-Variante eine gas6-Variante, die kovalent an eine anderes Protein, wie z. B. eine Immunglobulindomäne, gebunden ist (z. B. um gas6-IgG herzustellen).
Eine gas6-Variante wird gegebenenfalls mit anderen neurotrophen Faktoren kombiniert oder zusammen mit diesen verabreicht, um eine gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen. Beispielsweise kann eine gas6-Variante zusammen mit einem Nervenwachstumsfaktor (NGF), mit Neurotrophinen (NT-3), mit einem von einem Knochen stammenden Nervenfaktor (BDNF), mit Neurotrophinen-4 und -5 (NT-4/5), einem insulinähnlichen Wachstumsfaktor (z. B. IGF-1 oder IGF-2) oder einem anderen neurotrophen Faktor verwendet werden, um eine synergistische Stimulationswirkung auf das Wachstum von Sinnesneuronen zu erreichen, worin der Begriff "synergistisch" bedeutet, dass die Wirkung der Kombination von gas6 mit einer zweiten Substanz stärker ist als die Wirkung einer der beiden Substanzen alleine.
Zur Verwendung bei der Hämatopoese kann eine gas6-Variante zusammen mit einem oder mehreren Zytokinen verabreicht werden. Zu den Zytokinen gehören Wachstumshormone, insulinähnliche Wachstumsfaktoren, menschliche Wachstumshormone, menschliche N-Methionyl-Wachstumshormone, Rinderwachstumshormone, Parathormone, Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glykoproteinhormone, wie z. B. follikelstimulierende Hormone (FSH), schilddrüsenstimulierende Hormone (TSH) und luteinisierende Hormone (LH), hämatopoetische Wachstumsfaktoren, hepatische Wachstumsfaktoren, Fibroblastenwachstumsfaktoren, Prolactin, Plazentalaktogen, Tumornekrosefaktor-α und -β, Mullerian-Inhibiting-Substanz, mäusegonadotropinassoziierte Peptide, Inhibin, Activin, vaskuläre Endothelwachstumsfaktoren, Integrin, Thrombopoietin, Nervenwachstumsfaktoren, wie z. B. NGF-β, Blutplättchenwachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z. B. TGF-α und TGF-β, insulinähnliche Wachstumsfaktoren I und II, Erythropoietin (EPO), osteoinduktive Faktoren, Interferonen, wie z. B. Interferon-α, -β und -γ, das Koloniewachstum stimulierenden Faktoren (CSFs), wie z. B. Makrophage-CSF (M-CSF), Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF) und Granulozyten-CSF (G-CSF), Interleukine (ILs), wie z. B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF, SCF und Kit-Liganden. Die obigen Begriffe umfassen hierin Proteine von natürlichen Quellen oder von rekombinanten Zellkulturen. Auf ähnliche Weise umfassen die Begriffe biologisch akti ve Äquivalente, deren Aminosäuresequenz sich beispielsweise durch eine oder mehrere Aminosäuren oder die sich in der Art oder im Ausmaß der Glykosylierung unterscheiden.
Eine gas6-Variante, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet wird, muss steril sein. Dies kann leicht erreicht werden, indem eine Lösung einer gas6-Variante durch sterile Filtrationsmembranen filtriert wird. Danach kann die filtrierte Lösung in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gegeben werden, beispielsweise in einen Beutel für intravenöse Lösungen oder ein Phiole mit einem Stöpsel, der mithilfe einer Nadel für subkutane Injektionen durchstochen werden kann. Die filtrierte Lösung kann auch gefriergetrocknet werden, um eine sterile gas6-Variante in Pulverform herzustellen.
Verfahren zur Verabreichung von gas6-Varianten in vivo umfassen Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intrathekalem, intramuskulärem, intraokulärem, intraarteriellem oder intraläsionalem Wege und mithilfe von Retardformulierungen.
Retardformulierungen bestehen im Allgemeinen aus einer gas6-Variante und einer Matrix, aus der das gas6 oder der gas6-Antagonist über einen Zeitraum abgegeben wird. Geeignete Matrizen umfassen halbdurchlässige Polymermatrizes in Gestalt von Formstücken, beispielsweise Membranen, Fasern oder Mikrokapseln. Retardmatrizen können Polyester, Hydrogele, Polylactide, US-Pat. Nr. 3.773.919, Copolymere aus L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Ethylenvinylacetat, Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die therapeutische Formulierung einer gas6-Variante, die in Liposomen eingeschlossen oder damit komplexiert ist. Beispielsweise kann eine kovalent an eine Glykophosphatidylinositolgruppierung gebun dene gas6-Variante verwendet werden, um ein Liposom zu bilden, das eine gas6-Variante umfasst. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die therapeutische Formulierung Zellen, die aktiv eine gas6-Variante produzieren. Solche Zellen können direkt in das Gewebe eines Patienten eingebracht oder in porösen Membranen eingeschlossen werden, die dann einem Patienten implantiert werden, wobei in beiden Fällen die Abgabe einer gas6-Variante in Bereichen im Körper des Patienten bereitgestellt wird, die erhöhte oder verringerte Konzentrationen von gas6 erfordern. Alternativ dazu kann ein Expressionsvektor, der gas6-Varianten-DNA umfasst, zur In-vivo-Transformation von Zellen eines Patienten verwendet werden, um dasselbe Ergebnis zu erzielen.
Eine wirksame Menge einer gas6-Variante, die therapeutisch eingesetzt werden kann, hängt beispielsweise von den Zielen der Therapie, vom Verabreichungsweg und vom Zustand des Patienten ab. Demgemäß muss der Therapeut die Dosierung titrieren und den Verabreichungsweg so anpassen, dass die optimale therapeutische Wirkung erzielt wird. Eine typische Tagesdosis kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis zu 100 mg/kg oder mehr liegen, je nach den oben genannten Faktoren. Wenn möglich sollten die geeigneten Dosisbereiche zuerst in vitro, beispielsweise durch Tests für das Überleben oder Wachstum von Zellen, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, und dann in geeigneten Tiermodellen bestimmt werden, woraus dann Dosisbereiche für menschliche Patienten extrapoliert werden können. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Förderung des Überlebens oder Wachstums von Neuronen wirksam ist, eine lokale gas6-Konzentration in vivo von zwischen etwa 0,1 und 10 ng/ml bereit.
Die Erfindung stellt außerdem einen Herstellungsartikel und ein Set bereit, das Materialien enthält, die zur Aktivierung eines Rse- oder Mer-Rezeptors oder zur Förderung des Überlebens, der Proliferation oder der Differenzierung von Zellen, die den Rse- oder Mer-Rezeptor umfassen, nützlich sind. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter mit einem Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Fla schen, Phiolen und Reagenzgläser. Die Behälter können aus verschiedenen Materialien bestehen, wie beispielsweise Glas oder Kunststoff. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Aktivierung des Rse- oder Mer-Rezeptors und/oder zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung von Zellen, die den Rezeptor von Interesse aufweisen, wirksam ist. Der aktive Wirkstoff in der Zusammensetzung ist eine gas6-Variante. Das Etikett auf dem Behälter gibt an, dass die Zusammensetzung zur Aktivierung des Rse- oder Mer-Rezeptors und/oder zur Förderung des Überlebens, der Proliferation und/oder der Differenzierung von Zellen, die diesen Rezeptor aufweisen, verwendet wird, und kann außerdem Anleitungen zur Verwendung in vivo oder in vitro umfassen, wie oben beschrieben ist.
Das Set gemäß vorliegender Erfindung umfasst den oben beschriebenen Behälter und einen zweiten Behälter, der einen Puffer enthält. Außerdem kann er andere Materialien enthalten, die vom kommerziellen Standpunkt und aus der Sicht des Verwenders wünschenswert sind, einschließlich anderer Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanleitungen.
Einige der folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung; andere stellen nützliche Hintergrundinformationen bereit. Sie dienen jedoch keinesfalls zur Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung eines Rse-IgG-Fusionsproteins
Um eine Quelle eines Rse-Liganden (Rse-L) zu identifizieren, wurde ein Fusionsprotein, das die extrazelluläre Domäne des menschlichen Rse gefolgt von einem Fc-Abschnitt von menschlichem IgG (Rse-IgG) enthielt, als Sonde verwendet, um Zellen unter Verwendung von Durchflusszytometrie auf oberflächengebundene Rse-L zu screenen (siehe Beispiel 2). Rse-IgG wurden durch Fusion der Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 1–428) von menschlichem Rse kodiert (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269 (14), 10720–10728 (1994), an die Amino säuren 216–443 von menschlichem IgGγ₁ durch einen BstEII-Linker konstruiert (Hinzufügen von Aminosäuren Val und Thr). Der Linker wurde durch PCR unter Verwendung der Primer (5'-TCAAGACAATGGAACCCAGG (Seq.-ID Nr. 4) und 5'-CATGGAATTCGGTGACCGATGTGCGGCTGTGAGGAG (Seq.-ID Nr. 5)) zu Rse-Sequenzen hinzugefügt. Die cDNA, die für Rse-IgG kodiert, wurde in einen auf SV40 basierenden Expressionsvektor transferiert und durch Elektroporation (250 Volt, 960 μF) in DHFR^–-CHO-Zellen eingebracht. DHFR⁺-Zellen wurden selektiert, und die Rse-IgG-Expression in einzelnen Klonen wurde unter Verwendung eines für menschliches Fc spezifischen ELISA bestimmt. Rse-IgG wurde ein einer Protein-A-Sepharose-Säule (Pharmacia) gereinigt.
Beispiel 2
Bindungsanalyse
Eine fluoreszenzaktivierte Zellsortier-(FACS-)Analyse wurde unter Verwendung von Rse-IgG durchgeführt, wie in Goodwin et al., Cell 73, 447 (1993), beschrieben ist. Die Zellen der megakaryozytischen Leukämielinie CMK11-5 (Adachi et al., Exp. Nematol. 19, 923 (1991)) banden spezifisch Rse-IgG, jedoch keine Kontroll-Fusionsproteine, welche die identische Fc-Domäne enthielten, wie z. B. HGFr-IgG (Mark et al., J. Biol. Chem. 267, 26166 (1992)) oder CD4-IgG (Capon et al., Nature 337, 525 (1989)). Die Bindung von Rse-IgG wurde durch den Zusatz von Ca²⁺ erhöht und durch Behandlung mit 2 mM EDTA aufgehoben.
Danach wurde ein In-vitro-Bindungstest durchgeführt, um die Interaktion von ¹²⁵I-Rse-IgG mit dem mutmaßlich oberflächengebundenen Rse-L zu charakterisieren. CMK11-5-Zellen wurden in 10 mM TrisCl, pH 7,5, 10 Minuten lang auf Eis suspendiert, durch ein Kombination von Beschallung und Scheren lysiert, und ganze Membranen wurden durch Zentrifugation entnommen und in 50 mM TrisCl, pH 7,5, 20% Glycerin bei –80°C gelagert. Membranen, die 200.000 Zellen entsprachen, wurden mit fötalem Rinderserum (FBS) oder Säulenfraktionen, Konkurrenten und ¹²⁵I-Rse-IgG in einem Gesamtvolumen von 0,1–0,12 ml kombiniert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1 ml eiskalter Testpuffer zu jedem Röhrchen zugesetzt. Dann wurde die membranassoziierte Radioaktivität durch 4-minütige Zentrifugation bei 15.000 g gesammelt, durch Absaugung der überstehenden Flüssigkeit von ungebundener Radioaktivität abgetrennt und in einem γ-Zähler gezählt. Der Testpuffer war 50 mM Tris-HCl, 0,05% Tween-20, 0,1% BSA, 5 mM CaCl₂.
Da Durchflusszytometrieanalysen in Gegenwart eines Serums durchgeführt wurden, wurde die Wirkung von FBS im Membranbindungstest bestimmt. Es zeigte sich, dass die Bindung absolut von der FBS-Konzentration abhing; in Abwesenheit von FBS trat keine verschiebbare Bindung auf, und die Hälfte der maximalen Bindung wurde mit 0,58% FBS beobachtet (3A).
Die Bindung hing auch vom Ca²⁺ ab; die Hälfte der maximalen Bindung wurde mit 0,18 mM Ca²⁺ erreicht (3B). Obwohl die scheinbare Anzahl an Bindungsstellen für Rse-IgG von der FBS-Konzentration abhing, wurde die Affinität nicht stark verändert (K_d von 0,82 nM in 1% FBS vs. 2,2 nM in 10% FBS) (3C). Die Bindung war spezifisch; andere rekombinante IgG-Fusionsproteine, wie z. B. CD4-IgG, konkurrierten nicht um die Bindung mit ¹²⁵I-Rse-IgG.
Beispiel 3
Epitopmarkierter Rse-Rezeptor und seine Aktivierung
Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen), die eine Version eines Rse-Rezeptors mit einer C-terminalen Glykoprotein-D-(gD-)Markierung eines Herpes-simplex-Virus Typ I (HSV-1) exprimieren (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)) wurden hergestellt, um ein Rse-L weiter zu charakterisieren.
Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide wurden verwendet, um die für die C-terminalen 10 Aminosäuren (880–890) kodierende Sequenz von menschlichem Rse wiederherzustellen und zusätzliche 21 Aminosäuren hinzuzufügen, die das gD-Epi top für den Antikörper 5B6 (Paborsky et al., w. o.) und ein Stoppcodon enthielten. Die endgültige Sequenz des synthetischen Abschnitts des Fusionsgens war:
kodierender Strang
nichtkodierender Strang
Die synthetische DNA wurde mit der cDNA, die für die Aminosäuren 1–880 des menschlichen Rse kodiert, an der PstI-Stelle, beginnend am Nucleotid 2644 der veröffentlichten menschlichen Rse-cDNA-Sequenz (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269 (14), 10720–10728 (1994)), und an HindIII-Stellen im Polylinker des Expressionsvektors pSV17.ID.LL (siehe PCT/US84/13329) vom Vektor pRK (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987)) ligiert, um das Expressionsplasmid pSV.ID.Rse.gD zu schaffen. Kurz gesagt umfasst das Expressionsplasmid ein dicistronisches primäres Transkript, das die für DHFR kodierende Sequenz, begrenzt durch 5'-Spleißdonor- und 3'-Spleißakzeptor-Intronspleißstellen, enthält, gefolgt von einer Sequenz, die für Rse.gD kodiert. Die Nachricht voller Länge (nicht gespleißt) enthält DHFR als erstes offenes Leseraster und schafft so ein DHFR-Protein, um eine Selektion von stabilen Transformanten zu ermöglichen.
dp12.CH0-Zellen ( EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wurden mit pSV.ID.Rse.gD elektroporiert, das an einer einzigartigen NotI-Stelle im Plasmidrückgrat linearisiert wurde. Die DNA wurde nach einer Extraktion mit Phenol/Chloroform mit Ethanol gefällt und in 10 μl 10/1 Tris/EDTA resuspendiert. Dann wurden 20 μg DNA 10 Minuten lang mit 10⁷ CHO.dp12-Zellen in 1 ml PBS auf Eis inkubiert, bevor eine Elektroporation bei 350 Volt und 330 μl durchgeführt wurde. Die Zellen wurde weitere 10 Minuten auf Eis gegeben, bevor sie in ein nichtselektives Medium ausplat tiert wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in ein nucleosidfreies Medium gegeben, um nach stabilen DHFR⁺-Klonen zu selektieren.
Um eine Zelllinie zu identifizieren, die Rse.gD-Nucleinsäure exprimiert, wurden Kandidatenklone durch eine FACS-Analyse unter Verwendung des polyklonalen Antiserums 19B gescreent, das Epitope in der extrazellulären Domäne von Rse erkennt. Um zu bestätigen, dass Klone, die im FACS-Test positive Ergebnisse brachten, eine Rse.gD-Nucleinsäure voller Länge exprimieren, wurden Zelllysate hergestellt (Lokker et al., EMBO J. 11, 2503–2510 (1992)), und solubilisiertes Rse.gD wurde mit dem 19B-Antiserum immungefällt. Die immungefällten Proteine wurden unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von 7% PAGE fraktioniert, auf Nitrozellulose geblottet und dann mit dem Anti-gD-5B6-Antikörper (Paborsky et al., w. o.) untersucht, das mit einem Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antimaus-IgG-Antikörper detektiert wurde.
Die Fähigkeit von Rse.gD, in Zellklonen als Reaktion auf 20% FBS, teilweise gereinigte Fraktionen von FBS mit der Rse-Rezeptorbindungsaktivität (d. h. eine 1 : 10-Verdünnung der QSE-Fraktion, erhalten in Beispiel 5) oder eine Kontrolle (d. h. keine Zusätze) eine Autophosphorylierung zu durchlaufen, wurde durch Western-Blotting bestimmt. Kurz gesagt wurden 5 × 10⁵ dp12.CHO-Zellen, die mit Rse.gD-Nucleinsäure wie oben beschrieben transformiert worden waren, in Gegenwart eines Serums 6 Stunden lang auf eine 60-mm-Schale ausgesät. Die Zellen wurden dann in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen und 16 Stunden lang Serumentzug ausgesetzt. Die Serumentzug ausgesetzten Zellen wurden dann 10 Minuten lang der Probe ausgesetzt. Das Rse.gD-Protein wurde unter Verwendung des monoklonalen Anti-gD-5B6-Antikörpers aus CHO-Zelllysaten immungefällt. Proteine wurden unter reduzierenden Bedingungen auf 7% SDS-PAGE fraktioniert und auf Nitrocellulose transferiert. Eine Phosphorylierung von Rse wurde mit einem markierten Antiphosphotyrosinantikörper 4G10 (im Handel erhältlich von UBI, New York, USA) detektiert.
Der Zusatz von entweder 20% FBS oder teilweise gereinigten Fraktionen von FBS mit der Rse-IgG-Bindungsaktivität zu Serumentzug ausgesetzten Zellen, die Rse-gD exprimieren, führte zur Phosphorylierung des 140-kDa-Rse-Rezeptors an Tyrosinresten. Der Rse-Rezeptor wurde durch die Kontrolle nicht aktiviert.
Beispiel 4
KIRA-ELISA
Die Aktivität in FBS, die Rse.gD aktivierte, wurde unter Verwendung eines auf ELISA basierenden "KIRA-"(Kinase-Rezeptor-Aktivierungs-)Tests weiter charakterisiert, der eine Nochdurchsatzanalyse möglicher Rse-L-Quellen ermöglicht. Siehe 4 für eine schematische Darstellung dieses Tests.
Rse.gD-transformierte dp12.CHO-Zellen, die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden waren, wurden in 100 μl Medium in die Wells einer 96-Well-Kulturplatte mit flachem Boden geimpft (5 × 10⁴ pro Well) und über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ kultiviert. Am folgenden Morgen wurden die Well-Überstände dekantiert, und die Platten wurden auf einem Papiertuch leicht gestopft. 50 μl eines Mediums, das eine wie in Beispiel 5 beschrieben erhaltene QSE-Fraktion oder eine Kontrolle (d. h. das Medium alleine) enthielt, wurden dann zu jedem Well zugesetzt. Für Neutralisierungsversuche wurden mögliche Ligandenquellen vor ihrem Hinzufügen zu. den Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Rse-IgG oder CD4-IgG (100 μg/ml) behandelt. Die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 37°C stimuliert, die Well-Überstände wurden dekantiert, und die Platten wurden erneut auf einem Papiertuch leicht gestopft. Um die Zellen zu lysieren und die Rezeptoren zu solubilisieren, wurden 100 μl des Lysepuffers zu jedem Well zugesetzt. Der Lysepuffer bestand aus 150 mM NaCl mit 50 mM HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01% Thimerosal, 30 KIU/ml Aprotinin (ICN Biochemicals, Aurora, OH, USA), 1 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 μM Leupeptin (ICN Biochemicals) und 2 mM Natriumorthovanadat (Na₃VO₄; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), pH 7,5. Die Platte wurde dann 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Plattenrüttler (Bellco Instruments, Vineland, NJ, USA) leicht gerüttelt.
Während die Zellen solubilisiert wurden, wurde eine ELISA-Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dänemark), die über Nacht bei 4°C mit dem monoklonalen 5B6-Anti-gD-Antikörper (0,5 μg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, 100 μl/Well) beschichtet worden waren, dekantiert, auf einem Papiertuch gestopft und mit 150 μl/Well Blockpuffer (PBS mit 0,5% BSA (Intergen Company, Purchase, NY, USA) und 0,01% Thimerosal) 60 Minuten lang bei Raumtemperatur blockiert, wobei das Ganze leicht gerührt wurde. Nach 60 Minuten wurde die mit Anti-gD-5B6 beschichtete Platte 6-mal mit einem Waschpuffer (PBS mit 0,05% Tween-20 und 0,01% Thimerosal) unter Verwendung eines automatischen Plattenwaschgeräts (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA, USA) gewaschen.
Das Lysat, das solubilisiertes Rse.gD vom Zellkultur-Mikrotiterwell enthält, wurde in einen Anti-gD-5B6-beschichteten und blockierten ELISA-Well transferiert (85 μl/Well) und 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Das ungebundene Rse.gD wurde durch Waschen mit einem Waschpuffer entfernt, und 100 μl biotinyliertes 4G10 (Antiphosphotyrosin) wurde zu 0,15 μg/ml in einem Puffer (PBS mit 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 mM EDTA und 0,01% Thimerosal) zu jedem Well zugesetzt. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte gewaschen, und 100 μl HRPO-konjugiertes Streptavidin (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA, USA), das 1 : 6 × 10⁴ in einem Verdünnungspuffer verdünnt war, wurde zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wurde unter leichtem Rühren 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das freie Avidinkonjugat wurde weggewaschen, und 100 μl einer frisch hergestellten Substratlösung (Tetramethylbenzidin (TMB); 2-Komponentensubstratset; Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD, USA) wurden zu jedem Well zugesetzt. Die Reaktion wurde 10 Minuten lang fortschreiten gelassen, wonach die Farbentwicklung durch den Zusatz von 100 μl/Well 1,0 M H₃PO₄ gestoppt wurde. Das Absorptionsvermögen bei 450 nm wurde bei einer Referenzwellenlänge von 650 nm (ABS_450/650) mithilfe eines νmax-Plattenlesegeräts (Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) abgelesen und mit einem Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA, USA) und DeltaSoft-Software (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ, USA) kontrolliert.
Die Phosphorylierung von Rse.gD wurde in dosisabhängiger Form stimuliert, und diese Aktivität wurde durch Rse-IgG, nicht jedoch durch das Kontroll-CD4-IgG neutralisiert (3D). Diese Daten zeigen, dass ein Ligand in FBS vorhanden ist, der zur Aktivierung von Rse fähig ist.
Beispiel 5
Rse-Ligandencharakterisierung
Der Rse-L wurde durch Ionenaustausch- und Rse-Affinitätschromatographie aus FBS gereinigt (siehe folgende Tabelle 2).
Tabelle 2 Reinigung eines Rse-Liganden von FBS
Fötales Rinderserum (FBS) wurde gegen 50 mM Tris HCl pH 7,5 dialysiert (Molekulargewichts-Cutoff bei 6.000 Da) und sterilfiltriert (0,22 μ Cellulosenitrat, Corning), bevor es auf eine Q-Sepharose-Säule geladen wurde, die in Puffer A, 10 mM Tris HCl, pH 7,5, äquilibriert war. Puffer B war Puffer A mit 1 M NaCl. Die Säule wurde mit einem Säulenvolumen Gradient von 0 bis 18% B, dann mit 10 Säulenvolumina Gradient von 18 bis 60% B eluiert. Aktive Fraktionen, die um 0,4 M NaCl eluier ten, wurden gepoolt und gegen 50 mM Tris HCl pH 7,5, 5 mM Benzamidin dialysiert. Diese Q-Sepharose-angereicherte Fraktion (QSE) wurde auf eine Rse-IgG-Affinitätssäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM Benzamidin gewaschen und mit 4 M Harnstoff, 0,1 M Tris HCl, pH 7,5, 5 mM Benzamidin eluiert. Das Eluat wurde konzentriert und durch Zentrifugenultrafiltration (Centricon 10) dialysiert. Rse-IgG-Säulen wurden unter Verwendung von 2 mg Rse-IgG pro ml Emphaseharz gemäß den Anleitungen des Herstellers (Pierce) hergestellt. Die in der Tabelle angeführten Mengen beziehen sich auf 100 ml FBS als Ausgangsmaterial. Eine Einheit Bindungsaktivität ist als Menge definiert, die gemäß dem In-vitro-Bindungsaktivierungstest aus Beispiel 2 in 1 ml einer Probe mit einem EC₅₀ von 1 Vol.-% vorhanden ist.
Eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) des affinitätsgereinigten Rse-L-Präparats ergab eine breite Bande, die bei 60 kDa zentriert war, mit unreduzierten Proben, die sich bei einer Reduktion in mehrere, eng beieinander liegende Banden von 65 bis 68 kDa auflösten. Fraktionen wurden 10 Minuten lang in einem Probenpuffer auf 90°C erhitzt, auf einem 4–20% SDS-Polyacrylamidgel (Novex) aufgelöst und durch Silberfärbung visualisiert. Das Eluat von Rse-IgG-affinitätsgereinigtem Rse-L wurde vor der Elektrophorese mit 25 mM DTT reduziert.
Das Rse-L-Präparat wurde durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt, elektrogeblottet und sequenziert. Elektroblotten auf Millipore-Immobilon-PSQ-Membranen wurde 1 Stunde lang wie beschrieben bei einer konstanten Stromstärke von 250 mA in einer Transblot-Transferzelle von Biorad durchgeführt (P. Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, 10035 (1987)). Die Membran wurde 30 s lang mit 0,1% Coomassie-Blau R-250 in 50% Methanol gefärbt, 2 bis 3 Minuten lang mit 10% Essigsäure in 50% Methanol entfärbt, gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und bei 4°C gelagert. Eine automatische Proteinsequenzierung wurde auf Sequenatoren 473A und 490A von Applied Biosystems, die mit Online-PTH-Analysatoren ausgestattet waren, durchgeführt. Peaks wurden mit Justice-Innovation-Software unter Verwendung von Nelson-Analytical-760-Schnittstellen inte griert. Die Sequenzinterpretation wurde wie in Henzel et al., J. Chromatogr. 404, 41 (1987), beschrieben durchgeführt.
Die Herstellung ergab eine aminoterminale Sequenz von XQVLIRRXRANTL (Seq.-ID Nr. 8), die der vom bovinen Protein S entsprach. Protein-S-Sequenzen wurden von verschiedenen unabhängigen Herstellungen von Rse-L erhalten. Nach der SDS-PAGE wurden manche Präparate durch die Gegenwart einer 14-kDa-Spezies mit einer N-terminalen Sequenz von ANTL (Seq.-ID Nr. 9) charakterisiert, wie vorher für das bovine Protein S berichtet worden war, zusammen mit 60- bis 70-kDa-Spezies mit Sequenzen, die der Spaltung innerhalb der thrombinempfindlichen Schleifenregion des bovinen Protein S entsprachen. Nach der CnBr-Spaltung des Sequenzierungsfilters wurden > 99% aller identifizierbaren Reste durch ein Gemisch aus Protein-S-CnBr-Fragmenten ausgewiesen. Außerdem konnte die Rse-L-Aktivität nicht durch Anionenaustauschchromatographie in Gegenwart von Ca²⁺, Kationenaustauschchromatographie, Hydrophob-Chromatographie, Blue-Sepharose-Chromatographie oder nichtdenaturierende Gelelektrophorese vom Protein S abgetrennt werden. Die Rse-L-Aktivität im FBS und in den gereinigten Fraktionen konnte durch polyklonale Protein-S-Antiseren neutralisiert werden.
Menschliches Serum oder rekombinantes menschliches Protein S, das in 293-Zellen exprimiert wird, wies sowohl im KIRA- als auch im Rse-IgG-Bindungstest geringe Aktivität auf. Menschliches Serum wurde von Pierce und lokalen Blutbanken bezogen. Menschliches Protein S (Calbiochem, Enzyme Research Labs oder Celsus Labs) wies im Membranbindungstest einen EC₅₀ von > 250 nM auf. Im Vergleich dazu wies das gereinigte bovine Protein S in diesem Test einen EC₅₀ von 1,2 nM auf. Beim KIRA-Test führten Konzentrationen von bis zu 150 nM menschliches Protein S zu geringer Phosphorylierung von Rse. cDNAs von menschlichem Protein S wurden durch PCR unter Verwendung von 1 μg menschlicher fötaler Leber-cDNA (Clontech) als Matrize mit Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) gemäß Mark et al., w. o. (1992), erhalten. Menschliches Protein S wurde genau wie für menschliches gas6 oben beschrieben in 293-Zellen exprimiert, die in Gegenwart von 2 μg/ml Vitamin K gezüch tet wurden, und die Expression wurde durch metabolische Markierung von Kulturen und/oder durch Western-Blotting mit einem polyklonalen Anti-Protein-S-Antiserum verifiziert. Gereinigtes menschliches Protein S band an ¹²⁵1-Rse-IgG, aber mit 200fach geringerer Affinität als gereinigtes bovines Protein S.
Die Hypothese wurde aufgestellt, dass ein Homolog von Protein S eventuell effektiver ist. Eine Suche der GenBank-Datenbank ergab wesentliche Ähnlichkeit (44% Aminosäureidentität und eine ähnliche Domänenstruktur) zwischen der Aminosäuresequenz von menschlichem Protein S und dem vorhergesagten Produkt eines menschlichen wachstumsarrestspezifischen Gens 6 (gas6) (Manfioletti et al., w. o.).
Beispiel 6
Rekombinante Produktion von gas6
Es wurde bestimmt, ob menschliches gas6 ein Ligand für Rse ist. gas6-cDNA-Klone wurden durch Polymerasekettenreaktionsklonierung von revers transkribierter menschlicher Gehirn-cDNA erhalten. Das menschliche gas6-Klon voller Länge wurde durch Binden von cDNAs konstruiert, die für die Aminosäuren 1–318 und 319–678 kodierten. gas6-cDNAs wurden wie beschrieben durch PCR unter Verwendung von 1 μg menschlicher fötaler Gehirn-cDNA (Clontech) als Matrize mit Pfu-DNA-Polymerase erhalten (Mark et al., J. Biol. Chem. 267, 26166 (1992)). Vorwärts- und Rückwärts-Primer, die zum Erhalt der 5'- und 3'-Abschnitte von hgas6 ausgerichtet waren, waren:
Menschliche fötale Nieren-293-Zellen wurden vorübergehend wie in Mark et al., J. Biol. Chem. 267, 26166 (1992), beschrieben transfiziert. Nach einer 4-stündigen Inkubation wurde das Medium durch ein Wachstumsmedium plus Antibiotika und 2 μg/ml Vitamin K ersetzt. Die Bedingungen zur metabolischen Markierung mit ³⁵S-Cys und ³⁵S-Met waren wie in Mark et al. beschrieben. Zur Fällung mit IgG-Fusionsproteinen wurden zuerst radioaktiv markierte Überstände mit Pansorbin (Calbiochem) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vorgeklärt, dann 4 Stunden lang bei 4°C mit 10 μg des IgG-Fusionsproteins inkubiert. Fusionsproteine wurden mit 20 μl Pansorbin gefällt, die Komplexe wurden durch 1-minütige Zentrifugation bei 14.000 × g gesammelt und dann 3-mal mit PBS gewaschen, das 0,1% Triton-X 100 enthielt. Die Niederschläge wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert (Capon et al., Nature 337, 525 (1989)). Die Radioaktivität im getrockneten Gel wurde mithilfe eines Fuji-Phosphoimagers analysiert.
Konditionierte Medien von Zellen, die nach einer Transfektion mit einem gas6-Expressionsvektor metabolisch markiert worden waren, enthielten ein 70-kDa-Protein, das durch das Rse-IgG-Fusionsprotein selektiv gefällt werden könnte, nicht jedoch durch das Kontrollfusionsprotein CD4-IgG. Ein konditioniertes Medium von unmarkierten Transfektionen förderte die Bindung von ¹²⁵I-Rse-IgG an Membranen und löste eine Phosphorylierung eines Rse-Rezeptors aus, der in CHO-Zellen exprimiert wurde. Diese Daten zeigten, dass rekombinantes menschliches gas6 an einen menschlichen Rse-Rezeptor bindet und diesen aktiviert.
Rekombinantes gas6 wurde durch Affinitätschromatographie vom konditionierten Medium gereinigt. Menschliche fötale Nieren-293-Zellen wurden vorübergehend wie in Mark et al., w. o. (1992), beschrieben transfiziert. Nach einer 4-stündigen Inkubation wurde das Medium durch ein serumfreies Wachstumsmedium plus Antibiotika und 2 μg/ml Vitamin K ersetzt. Die konditionierten Medien wurden 2 und 4 Tage nach der Transfektion gesammelt. Die konditionierten Medien der transfizierten Zellen, nicht jedoch das von entweder nichttransfizierten oder scheintransfizierten 293-Zellen, aktivierten die Bindung von ¹²⁵I-Rse-IgG. Ein Liter gepooltes konditioniertes Medium wurde durch Zentrifugation geklärt, mit 1 Volumen Puffer A (50 mM Tris HCl, pH 7,5, 0,1% CHAPS, 5 mM Benzamidin) verdünnt und auf eine 6-ml-Resource-Q-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit Puffer A äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 12 Säulenvolumina Gradient von 0 bis 0,4 M NaCl in Puffer A eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und mit 1 Volumen Puffer A verdünnt, wonach sie auf eine Rse-IgG-Affintitätssäule aufgetragen wurden, die gewaschen und wie beschrieben entwickelt wurde (siehe Beispiel 5).
Die Identität von rekombinantem gas6 wurde durch eine aminoterminale Sequenz verifiziert. Die Sequenz des rekombinanten Materials beginnt mit der Sequenz ⁴⁹AFQVFEEA⁵⁶Seq.-ID Nr. 14). Das Signal von den Glutaminsäureresten in dieser Sequenz war schwach, was mit γ-Carboxylierung übereinstimmte.
Ein allgemein bekanntes Merkmal von Gla-hältigen Proteinen ist ihre Copräzipitation mit unlöslichen Bariumsalzen (Bahlbeck, Biochem. J. 209, 837 (1983); Discipio und Davie, Biochemistry 18, 899 (1979)). Ein Test, der auf diesem Merkmal basiert, ermöglicht die Analyse der Bindung von gereinigtem gas6 an ¹²⁵I-Rse-IgG in Abwesenheit von Zellmembranen. Proben, die verschiedenen Verdünnungen von Rse-L in 25 mM HEPES, pH 7,2, 0,1% BSA und 0,05% Tween-20 enthielten, wurden kombiniert und mit ¹²⁵I-Rse-IgG, das im selben Puffer verdünnt war, in einem Gesamtvolumen von 100–120 ml vermischt. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1 ml einer frisch hergestellten eiskalten Suspension von BaCl₂ (10 mM) in einer phosphatgepufferten Salzlösung zu jedem Röhrchen zugesetzt, und fällbare Radioaktivität wurde durch Zentrifugation und Absaugung des Überstandsfluids gesammelt. Die Dissoziationskonstante für Rse-IgG und gas6, die in diesem Test gemessen wurde, betrug 0,46 nM (5).
Gereinigtes gas6 stimulierte die Phosphorylierung von Rse auf dosisabhängige Weise. Ein Zeitablaufsversuch zeigte, dass die Phosphorylierung von Rse innerhalb von zwei Minuten nach dem Zusatz von gereinigtem gas6 ausgelöst wurde. Die Aktivierung der Rse-Phosphorylierung durch gas6 wurde durch Rse-IgG, nicht aber durch CD4-IgG neutralisiert.
Beispiel 7
gas6-Expression und -Charakterisierung
gas6- und Rse-Rezeptor-Expression in adultem menschlichem Gehirngewebe wurde untersucht. Ein Blot mit 2 μg polyadenylierter RNA von menschlichem Gehirngewebe (Clontech) wurde mit willkürlich geprimten markierten Sonden, die den Aminosäuren 1–420 von Rse oder den Aminosäuren 358–605 von gas6 entsprachen, hybridisiert. Die Gewebe waren Amygdala, Nucleus caudatus, Corpus callosum, Hippocampus, Hypathalaums, Substantia nigra, Nucleus subthalamicus und Thalamus.
In Übereinstimmung mit der Hypothese, dass gas6 ein Ligand für Rse sein könnte, zeigte sich, dass gas6- und Rse-mRNA in jedem dieser adulten menschlichen Gewebe coexprimiert werden.
Es wurde berichtet, dass Astrozyten neurotrophe Faktoren synthetisieren, die das Wachstum und Überleben von Neuronen unterstützen. Moretto et al., J. Neuropath. & Exp. Neuro 53, 78 (1994), und Lin et al., Science 260, 1130 (1993). Es wurde bestimmt, ob kultivierte Rattenastrozyten auch einen Liganden für Rse synthetisieren. Ein Northern-Blot wurde hergestellt, der 1 μg polyadenylierter RNA von 1 Tag alten postnatalen Astrozyten oder Hippocampus-Neuronen, die aus E18-Rattenembryos hergestellt wurden, enthielten. Astrozyten wurden wie beschrieben hergestellt (Banker und Goslin, Culturing Nerve Cells, 260–261, MIT Press, Cambridge (1991)) und dann 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage lang in einem serumfreien Medium kultiviert. Hippocampus-Neuronen wurden 0 Tage, 3 Tage oder 4 Tage lang in einem serumfreien Medium kultiviert. Der Blot wurde mit einer ³²P-markierten Sonde hybridisiert, die den Aminosäuren 1–460 von murinem gas6 entsprach. Der Blot wurde gestrippt und dann mit einer ³²P-markierten Actinsonde hybridisiert, um die Unversehrtheit der RNA-Proben zu bestätigen.
gas6-mRNA wurde in kultivierten Astrozyten vom Typ I, die aus 1 Tag alten postnatalen Ratten hergestellt worden waren, detektiert, konnten in E18-Hippocampus-Neuronen jedoch nicht detektiert werden.
Hierin und anderswo erhaltene Expressionsdaten für gas6 und Rse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 3 Expression von gas6 und Rse in einer primären Zellkultur und in primären Zelllinien
Die Fähigkeit von kultivierten Rattenastrozyten, auch einen Liganden für den Rse-Rezeptor zu synthetisieren, wurde untersucht. Siehe Legende für die 6A–6C. Ein astrozytenkonditioniertes Medium enthielt einen Faktor, der ¹²⁵I-Rse-IgG band (6A) und Tyrosinphosphorylierung von Rse stimulierte (6B). Diese Aktivität wurde durch Rse-IgG, nicht aber durch CD4-IgG neutralisiert (6C).
Beispiel 8
gas6-Varianten
Um die Wechselwirkungen zwischen gas6 und Zellmembranen und Rse weiter zu charakterisieren, wurde eine Reihe von N-terminalen Deletionsvarianten hergestellt, die eine Epitopmarkierung aufwiesen.
Die für die gD-Signalsequenz und die Epitopmarkierung kodierenden Sequenzen (Mark et al., w. o. (1992)) wurden über eine XhoI-Stelle fusioniert, die durch PCR zu kodierenden Sequenzen hinzugefügt wurde, direkt vor der ersten Aminosäure von reifem gas6 (gD.gas6; Vorwärts-Primer 5'-AGCTGCTCGAGGCGCTGTTGCCGGCGC (Seq.-ID Nr. 15)) oder Protein S (gD.Protein S; Vorwärts-Primer 5'-AGCTGCTCGAGGCAAATTCTTTACTTGAA (Seq.-ID Nr. 16)) oder Aminosäuren 118 (gD.gas6.118-C; Vorwärts-Primer 5'-AGCTGCTCGAGGACCAGTGCACGCCCAACC (Seq.-ID Nr. 17)) und 279 (gD.gas6.279-C; Vorwärts-Primer 5'-GCTGCTCGAGGACATCTTGCCGTGCGTG (Seq.-ID Nr. 18)) von gas6. Der Rückwärts-Primer für gD.gas6 und gD.gas6.118-C war 5'-CATGGATCCTACCGGAAGTCAAACTCAGCTA (Seq.-ID Nr. 11). Die Rückwärts-Primer für gD.gas6.279-C und gD.Protein S waren 5'-GTCGGATCCGACAGAGACTGAGAAGCC (Seq.-ID Nr. 13) bzw. 5'-CATTCATTTATGTCAAATTCA (Seq.-ID Nr. 19). gas6.gD wurde durch Fusionieren der für gas6 kodierenden Sequenzen an die C-terminale gD-Markierung, die für Rse-gD verwendet wurde, über eine NheI-Stelle konstruiert, die durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-ATGGAGATCAAGGTCTG (Seq.-ID Nr. 20) bzw. 5'-CATCTTGAGGCTAGCGGCTGCGGCGGGCTCCAC (Seq.-ID Nr. 21) hinzugefügt wurde. Die Polypeptide wurden in 293-Zellen im Wesentlichen unter Verwendung desselben Verfahrens exprimiert, das in Beispiel 6 für gas6 voller Länge beschrieben ist.
gD.gas6.118-C und gD.gas6.279-C, welche die EGF-Wiederholungen und nebeneinander liegende G-Domänen in der D-Domäne bzw. nur die G-Domänen enthielten, wurden durch Rse-IgG (7) aus Zellkulturüberständen gefällt. Menschliches Protein S wurde in diesem Test nicht gefällt, das mit der oben genannte Beobachtung übereinstimmt, dass menschliches Protein S Rse mit geringerer Affinität bindet als menschliches gas6. Diese Derivate von gas6, die für die Gla-Domäne (d. h. die A-Domäne) trunkiert wurden, erreichen ebenfalls keine Assoziation mit Membranen auf Ca²⁺-Weise.
Diese Daten zeigen, dass gas6 über die G-Domäne an Rse bindet und dass die membranbindende und Rse-bindende Aktivität trennbar sind und lassen vermuten, dass die Gla-Domäne für Ca²⁺-abhängige Assoziation mit Zellmembranen erforderlich ist.
Die in diesem Beispiel beschriebenen gas6-Varianten waren funktionell aktiv. Vor allem aktivierten gD.gas6.118-C und gD.gas6.279-C die Rse-Phosphorylierung im KIRA-Test gemäß Beispiel 4 genauso wirksam wie gD-markiertes gas6 voller Länge (7).
Beispiel 9
Schwann-Zellen-Proliferationstest
Rse-mRNA, aber keine gas6-mRNA, wurde ebenfalls in der Ratten-Schwann-Zelllinie rhESC detektiert, die von Ratten-E14-Dorszalwurzelganglien stammt. Der Zusatz von gereinigtem gas6 zu diesen Zellen führte zur einer dosisabhängigen Steigerung der Zellzahl (50%ige Zunahme nach 48 Stunden) mit einem EC₅₀ von ~0,3 nM (8). Eine gas6-Behandlung veränderte außerdem die Morphologie dieser Zellen; un behandelte Zellen waren multipolar mit zahlreichen verzweigten Prozessen, während gas6-behandelte Zellen spindelförmig mit zwei glatten Hauptprozessen wurden und sich selbst parallel anordneten. Außerdem zeigte sich, dass gas6-induzierte Proliferation durch Rse-IgG, aber nicht durch CD4-IgG neutralisiert wurde. Siehe 9.
Unter Verwendung von Rse- und Axl-spezifischen Antikörpern wurden auch Rse- und Axl-Rezeptortyrosinkinasen in menschlichen Schwann-Zellen detektiert. Die Fähigkeit von gas6, die Proliferation von menschlichen Schwann-Zellen zu fördern, wurde bestimmt.
Peripheres Nervengewebe wurde nach Zustimmung der betroffenen Patienten wie beschrieben von der University of Miami School of Medicine erhalten (Levi et al., J. Neuroscience 15 (2), 1329–1340 (1995)). Teile von peripheren Nervenfasern wurden in eine Belzer-UW-Lösung gegeben und nach Kalifornien geschickt. Nach Erhalt wurden die Nervenfasern mit frischem F12/DME (1 : 1) gewaschen und mit 1% Collagenase/Dispase-Lösung (Boehringer) 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurde das Gewebe vorsichtig 3 × gewaschen, indem das Gewebe in ein frisches Gewebekulturmedium gegeben wurde. Die Fasern wurden in einem serumfreien Medium in 100-mm-Petrischalen ausplattiert, das mit der folgenden Formel für Ratten-Schwann-Zellen ergänzt war: F12/DME (1 : 1), ergänzt mit Insulin (10 μg/ml), Transferrin (10 μg/ml), α-Tocopherol (5 μg/ml), rekombinantem menschlichem Heregulin-β1_177–244, hergestellt gemäß Holmes et al., Science 256, 1205–1210 (1992), (10 nmol/l), Forskolin (5 μmolar), Progesteron (3 × 10^–8 molar) und Rinder-Hypophysenextrakt (BPE) (3 μl/ml). Die Schwann-Zellen wurden 48 Stunden lang in einer Suspension kultiviert, um eine teilweise Demyelinisierung zu ermöglichen. Die Nervenfasern wurden dann durch 5-minütige Zentrifugation bei 1.000 U/min gepoolt und durch vorsichtiges Pipettieren resuspendiert und dispergiert.
Die dispergierten Schwann-Zellen wurden auf lamininbeschichteten (Gibco BRL) Gewebekultur-Multiplatten mit 48 Wells bei 8 × 10³ Zellen/Well in einem definierten Medium unter Zusatz von Aprotinin (25 μg/ml) und 50 μl/ml chemisch definierten Lipiden (Sigma Kat.-Nr. 11905-015; Gibco BRL) erneut ausplattiert. Diese Kulturen wurden als "Primärkulturen" bezeichnet. Das Medium wurde alle 5 Tage gewechselt. Konfluente Kulturen von reinen Schwann-Zellen konnten innerhalb von 2 Wochen erhalten werden. Bei der ersten und zweiten Passage wurden Zellen unter Verwendung von Collagenase/Dispase (Boehringer Mannheim) von der Platte entfernt, mit einem 3 BSA enthaltenden Medium gewaschen und wie beschrieben ausplattiert. Die verwendeten Medien waren "6F"-Medium: F12/DME (1 : 1), ergänzt mit Insulin (10 μg/ml), Transferrin (10 μg/ml), α-Tocopherol (5 μg/ml), Progesteron (3 × 10^–8 molar), Aprotinin (25 μg/ml) und chemisch definierten Lipiden (Sigma Kat.-Nr. 11905-015). Ein "8F-"Medium enthält die Ergänzungen eines 6F-MEdiums sowie rekombinantes menschliches Heregulin-β1_177–244 (10 nmol/l) und Forskolin (5 μM). Die Wirkung von gas6 auf das Überleben und die Proliferation von Schwann-Zellen wurde untersucht, indem gas6 zu einem dieser Kulturmedien zugesetzt wurde.
gas6 stimuliert das Wachstum von Schwann-Zellen auf dosisabhängig Weise (12A), wobei bei 1 ng/ml (14 pM) eine beträchtliche Wirkung und mit Dosen über 10 ng/ml die maximale Wirkung erzielt wird. gas6 alleine führt im Vergleich zu einem Kontrollmedium zu einer beträchtlichen Steigerung der Schwann-Zellzahl. In Gegenwart des cAMP-Aktivators Forskolin ist die Steigerung der gesamten Zellzahl mit gas6 stärker ausgeprägt. Eine synergistische Wirkung tritt auch zwischen gas6 und Heregulin auf gas6 erhöhte sowohl die Zellzahl als auch die Thymidininkorporation, auch in Gegenwart von bevorzugten Konzentrationen von Forskolin und Heregulin (12B).
In Gegenwart der bevorzugten Konzentrationen von Heregulin und Forskolin zeigten andere Wachstumsfaktoren, die vorher das Wachstum von Schwann-Zellen stimuliert hatten, keinerlei Wirkung (PDGF, FGF-β) oder verringerten die Zellzahl (IL-1α und TGF-β1) (12C). Der Zusatz von 10 ng–5 μg menschliches oder bovines Protein S führte bei 5-tägiger Kultivierung zu keiner Erhöhung der Schwann-Zellzahl. Im Gegensatz dazu führten 30 μg/ml gas6 zu einer maximalen Erhöhung der Zellzahl. Die Kombination von gas6 mit Forskolin und Heregulin führt in einem Zeitraum von 5 Tagen zu maximalem Zellwachstum, das mit jenem der Kombination von 6F + Forskolin + Heregulin + 5% FBS vergleichbar ist.
gas6 weist beträchtliche Wirkung auf die Zellmorphologie auf, die durch eine Untersuchung der Phasenkontrastmikroaufnahmen von menschlichen Schwann-Zellen bestimmt werden kann, die in 6F + Heregulin; 6F + Heregulin + gas6; 8F + gas6; und 8F + 10% fötales Rinderserum gezüchtet worden waren. Mikroaufnahmen wurden nach 96 Stunden Kultivierung gemacht. Die Schwann-Zellen, die in Gegenwart von gas6 gezüchtet werden, weisen Prozesse auf, die viel länger sind als die in Zellen, die in Gegenwart von Heregulin oder Heregulin mit Forskolin gezüchtet werden. Mitotische Figuren können auch in den 8F + gas6-Kulturen und sogar in Zellen mit voll entwickelter spindelförmiger Schwann-Zellen-Morphologie erkannt werden. Der Zusatz von Serum zu den 8F-Kulturer verändert die Zellmorphologie, was zu einem Abflachen, Ausbreiten und schließlich Vakuolisieren der Zellen führt.
Zellen wurden durch Immunfluoreszenz für die Schwann-Zellenmarker GFAP und S100-Protein gefärbt. Kurz gesagt wurden menschliche Passage-4-Schwann-Zellen, die in 8F + gas6 gezüchtet worden waren, 24 Stunden lang auf lamininbeschichteten Chamber-Trägern kultiviert und in 10% Formalin in PBS fixiert. Fixierte Zellen wurden mit 10% Ziegenserum blockiert und mit Kaninchen-Anti-GFAB (ICN) und -Anti-S-100-Protein (ICN) inkubiert, und zwar in vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen. Spezifische Bindung der primären Antikörper wurde mit Ziegen-Antikaninchen-IgG-(Fab')₂-FITC-Konjugaten gefärbt. Zellen wurde mit dem DNA-Farbstoff Propidiumiodid gegengefärbt. Negative Kontrollen wurden auf WI-38-Zellen ausgeführt, die eine negative Färbung aufwiesen. Gezüchtete Zellen wiesen nach 4 Subkulturen 100% immunfluoreszente Färbung für die Schwann-Zellmarker GFAB und S100-Protein auf.
Die Fähigkeit von gas6, die Proliferation von menschlichen Schwann-Zellen durch die Axl-Rse-Familie von Tyrosinkinaserezeptoren zu stimulieren, wurde untersucht. Menschliche Schwann-Zellen wurden 15 Minuten lang in einem Inkubator mit 37°C mit 0, 0,01, 0,1 oder 1 μg/ml menschlichem gas6 (hgas6) stimuliert. Zelllysate wurden mit einem Kaninchen-Anti-hRseFc-Fusionsproteinantikörper und einem Kaninchen-Anti-hAxl-Antikörper hergestellt und immungefällt. Tyrosinphosphorylierung eines hRSE- und hAxl-Rezeptors wurde mithilfe eines 4G10-Antiphosphorylierungsantikörpers detektiert. 10⁶ menschliche Schwann-Zellen wurden fast bis zur Konfluenz in einem definierten Medium (8F + gas6) gezüchtet und 24 Stunden vor dem Experiment in 6F gegeben. Die Zellen wurden 15 Minuten lang in einem Inkubator mit 37°C mit gereinigtem rekombinantem hgas6 behandelt und dann mit 1 ml Lysepuffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 135 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Natriumvanadat und 1 mM Natriummolybdat, 2 mM EDTA und 2 mM EGTA, 10% Glycerin, 1% NP40, 1 μM Okadainsäure, 1 mM PMSF und 1 mM AEBSF) auf Eis lysiert. Die Zelllysate wurden durch Zentrifugation bei 14.000 × g 10 Minuten lang bei 4°C geklärt. Immunfällungen wurden unter Verwendung von 1 μg eines Kaninchen-Anti-hRseFc-Fusionsproteinantikörpers oder 2 μg eines Kaninchen-Anti-hAxl-Antiserums, das gegen die 10 Aminosäuren am COOH-Terminus von hAxl gezüchtet wurde, bei 4°C 2 Stunden lang durchgeführt. Ein Immunkomplex wurde mit 10 μl von Protein-A-Sepharose-CL-4B-Kügelchen gewonnen. Proteine wurden auf einem 4- bis 12%igen Gradientengel von Novex aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Anti-Phosphotyrosin-Immunblotting wurde unter Verwendung eines 4G10-Mäuse-Antiphosphotyrosinantikörpers (UBI), eines Ziegen-Anti-Mäuse-Meerrettich-Peroxidasekonjugats und eines ECL-Entwicklungssets (Amersham) durchgeführt. Der Zusatz von menschlichem gsa6 zu menschlichen Schwann-Zellen führt zu einer Autophosphorylierung von sowohl Axl- als auch Rse-Rezeptoren auf (einem) Tyrosinrest(en). Die Aktivierung von Axl und Rse konnte bei 1,4–14 μM gas6 detektiert werden. Solche eine Phosphorylierung von Axl und Rse tritt in Kulturen, die mit Heregulin stimuliert werden, nicht auf. gas6-Expression in kultivierten Ratten-Schwann-Zellen wurde durch einen Northern-Blot nicht nachgewiesen. Außerdem trat keine gas6-Aktivität im mit Ratten-Schwann-Zellen konditionierten Medium auf. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, scheint es doch möglich, dass gas6 durch die Züchtung von Axonen oder durch nahe gelegene Fibroblastenzellen (aus denen gas6 anfangs kloniert wurde) produziert wird. Diese Aktivierung von Axl-Rse-Rezeptoren auf Schwann-Zellen durch gas6 ist äußerst spezifisch, da Wachstumsfaktoren, die bekannterweise über andere Tyrosinkinaserezeptoren, wie z. B. PDGF und FGF, wirken, die Proliferation von menschlichen Schwann-Zellen unter diesen definierten Bedingungen nicht fördern. Die Schwann-Zellen-Wachstumsfaktoren GGF/Heregulin, die unabhängig voneinander durch die erbB-Rezeptorfamilie wirken, wirken in dieser Studie mit gas6 zusammen.
Vorteilhafterweise werden Populationen von Säugetier-Schwann-Zellen (vorzugsweise menschliche Schwann-Zellen) als zelluläre Prosthese zur Transplantation in Bereiche von geschädigtem Rückenmark verwendet, um die Regeneration von unterbrochenen zentralen Axonen zu beeinflussen, die Reparatur von peripheren Nervenverletzungen zu unterstützen und Alternativen zu autogenetischen Transplantaten bereitzustellen. Siehe Levi et al., J. Neuroscience 14 (3), 1309–1319 (1994). Die Verwendung von Zellkulturverfahren, um eine reiche Quelle von autologem Transplantationsmaterial durch geringe Biopsie zu erhalten, wurde bei der Bereitstellung von menschlichen Epidermiszellen, um ausgedehnte Verbrennungen abzudecken, schon klinisch erfolgreich umgesetzt (Gallico et al., N. Eng. J. Med. 311, 337–451 (1984)). Außerdem zeigte sich, dass Schwann-Zellen von menschlichen Xenotransplantaten zur Myelinisation von regenerierenden peripheren Axonen von Mäusen fähig sind, die immununterdrückt wurden (Aguayo et al., Nature 268, 753–755. (1977), und Aguayo et al., Soc. Neurosci. Symp. 4, 361–383 (1979)). Demgemäß ist zu erwarten, dass der obige Ansatz in Säugetieren, einschließlich Menschen, erfolgreich ist.
Beispiel 10
gas6-Immunoadhäsin
gD.gas6.279-C.IgG wurde durch Fusionieren der für gD.gas6.279-C kodierenden Sequenzen (siehe Beispiel 8) an die Aminosäuren 216–443 von menschlichem IgGγ1 über einen BstEII-Linker konstruiert (Hinzufügen der Aminosäuren Val und Thr). Der Linker wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-ATGGAGATCAAGGTCTG (Seq.-ID Nr. 20) und 5'-GTCGGTGACCGCTGCTGCGGGCTCCAC (Seq.-ID Nr. 22) zu gD.gas6.279-C-Sequenzen hinzugefügt.
Das so gebildete gas6-Immunoadhäsin wurde dem in Beispiel 4 beschriebenen KIRA-Test unterzogen. Kurz gesagt wurden verschiedene Verdünnungen von konditionieren Medien von Zellen, die gD.gas6.279-C.IgG vorübergehend exprimierten, einem KIRA-Test unterzogen. Das Ausgangsmaterial wies eine: gD.gas6.279-C.IgG-Konzentration von 230 ng/ml auf. Die EC₅₀ für die Aktivierung betrug etwa 0,4 nM. Siehe 10. In konditionierten Medien von vorübergehend transfizierten Kontrollzelllinien wurde keine Aktivität beobachtet.
Beispiel 11
Aktivierung von Rse durch nicht γ-carboxyliertes gas6
Ein Medium (700 ml), das 3 Tage lang durch 293-Zellen konditioniert wurde, die mit menschlichem gas6 (hgas6.17) transfiziert waren, wurde gegen 2 × 8 l 50 mM Tris-NCl, pH 7,5, 5 mM Benzamidin (Puffer A) dialysiert. Das Dialysat wurde auf 0,1% CHAPS eingestellt und bei 10 ml/min auf eine 6-ml-Resource-Q-Säule (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und mit 70 ml eines linearen Gradienten von 0 bis 0,4 M NaCl in Puffer A bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert, wodurch 2,0-ml-Fraktionen gewonnen wurden.
Die Fraktionen wurden durch das in Beispiel 6 beschriebene Bariumchloridbindungsverfahren und den in Beispiel 4 beschriebenen KIRA-Test auf ihre Fähigkeit analysiert, Rse zu binden und zu aktivieren. Der Bariumchloridtest kann durch die Bindung von Gla-hältigen Rse-Liganden detektieren, während der KIRA-Test gegenüber allen Rse-Aktivatoren empfindlich ist. Die Bindungsaktivität war bei Fraktion 31 zentriert, während der KIRA einen zusätzlichen früheren Elutionspeak aufwies, der bei Fraktion 24 zentriert war.
Aliquoten (10 μl) der Fraktionen 20 bis 44 wurden auf 8% Acrylamid-(Novex)SDS-Gelen analysiert, und Proteine wurde durch Silberfärbung visualisiert. In diesen Fraktionen comigrierte eine 75-kD-Bande mit herkömmlichem hgas6. Integrierte Intensitäten der 75-kD-Bande wurden durch Laser-Scanning (Molecular Dynamics) und Bildanalyse (NIH Image) gemessen. Peakintensitäten wurden in den Fraktionen 24 und 31 gefunden, die den 2 Regionen der KIRA-Aktivität entsprachen. Die Menge an hgas6 in den einzelnen Fraktionen wurde aus der Farbintensität einer bekannten Menge (0,34 μg) eines Standardpräparats von hgas6 geschätzt, das auf demselben Gel laufen gelassen wurde, wobei von einer linearen Beziehung zwischen der Farbintensität und der Proteinladung ausgegangen wurde.
Eine Sequenzanalyse für die 75-kD-Banden der Fraktionen 24 und 31 wurde nach einer SDS-PAGE und einem elektrophoretischen Transfer zu PVDF-Membranen durchgeführt. Die aminoterminale Sequenz beider Banden wurde eindeutig als die von hgas6 identifiziert (AFQVF), aber die beiden könnten durch die Gegenwart oder Abwesenheit von modifizierten Glutaminsäureresten in späteren Zyklen unterschieden werden. Der Sequenz der Fraktion 31 fehlte ein Signal von Glutaminsäure in den Zyklen 6, 7, 14 und 16, was mit einer γ-Carboxymodifikation dieser Reste übereinstimmte. Die Sequenz der Fraktion 24 stimmte an all diesen Positionen mit unmodifizierter Glutaminsäure überein.
Sowohl die Sequenzanalyse als auch das Bindungsverhalten der frühen Elutionsform von hgas6 stimmen mit seiner Identifikation als unmodifizierte Form von hgas6 überein, der die charakteristische γ-Carboxymodifikation von Glutaminsäure fehlt. Die zweite entdeckte Form von rekombinantem hgas6 scheint aktiver zu sein als die zuerst beschriebene Gla-hältige Form. Die spezifische Aktivität der beiden Formen wurde aus den KIRA-Daten in 11 und der densitometrischen Quantifizierung von hgas6 berechnet. Die spezifische Aktivität der Fraktion 31 (Form 1) beträgt 1170 KIRA-Einheiten/mg P, während die der Fraktion 24 (Form 2) 3158 beträgt. Das zeigt, dass die Form 2, der die Gla-Modifikation fehlt, bei der Aktivierung von Rse wirksamer ist als die Gla-hältige Form 1.
Beispiel 12
Aktivierung eines Mer-Rezeptors durch gas6
Eine für menschliches Mer kodierende cDNA wurde durch Screenen einer menschlichen Testis-cDNA-Bibliothek erhalten, die in λ-DR2 (Clontech, Palo Alto, CA, USA) mit den folgenden Oligonucleotidsonden hergestellt worden war:
Ein positiver Phage wurde gereinigt, und die Insertgrößen wurden bestimmt. Drei überlappende Klone, hMer.cl4, hMer.cl25 und hMer.cl6 (die nt 1–561, nt 223–2025 und nt 1902–3608 der jeweiligen veröffentlichten Sequenz entsprachen), wurden kombiniert, um eine cDNA herzustellen, die für das gesamte offene Leseraster von menschlichem Mer kodiert.
Mer-Fc wurde konstruiert, indem die für die Aminosäuren 1–499 von menschlichem Mer kodierende Sequenz über einen NarI-BstEII-Linker (5'-GCGCCTGGCAACGCG-3' (Seq.-ID Nr. 26), 5'-GTGACCGCGTTGCCAG-3' (Seq.-ID Nr. 27)) (Hinzufügen der Aminosäuren Glycin und Histidin) an die Aminosäuren 216–443 von menschlichem IgGγ1 fusioniert wurde. Menschliche embrionale Nieren-(HEK-)293-Zellen, die Mer-Fc exprimierten, wurden unter Verwendung eines für menschliches Fc spezifischen ELISA gescreent. Mer-Fc wurde auf einer Protein-A-Sepharose-Säule (Pharmacia) gereinigt.
Epitopmarkiertes gD.Mer wurde konstruiert, indem die für die Aminosäuren 1–53 des Herpes-simplex-Virus-Typ-1-(HSV-1-)Glykoproteins D (gD) kodierenden Sequenzen an die für die Aminosäuren 36–961 von menschlichem Mer kodierenden Sequenzen fusioniert wurden. Siehe Beispiel 3. Oligos (5'-CGAATTCCTCGAGCCGGGACCTTTTCCAGGGAGC-3' (Seq.-ID Nr. 28) und 5'- CCAACTGTGTGTTTGAAGGCAAGAGGCGG-3' (Seq.-ID Nr. 29)) wurden verwendet, um eine XhoI-Stelle durch PCR zur menschlichen Mer-cDNA hinzuzufügen. Die gD.Mer-cDNA wurde in einen auf CMV basierenden Expressionsvektor insertiert, und HEK-293-Zellen wurden durch Western-Blotting und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, wie in Beispiel 3 beschrieben, transfiziert, selektiert und gescreent.
Rekombinantes menschliches gas6 und Protein S wurden gemäß Godowski et al., Cell 82, 355–358 (1995), exprimiert. Die Expression wurde durch metabolische Markierung von Kulturen mit ³⁵S-Cys und ³⁵S-Met (Merk et al., J. Biol. Chem. 267, 26166 (1992)) und/oder durch Western-Blotting mit polyklonalem Kaninchen-Anti-gas6- oder -Anti-Protein-S-Antiserum (Sigma) verifiziert. N-terminal markierte Versionen van Protein S oder gas6 wurden gemäß Godowski et al., w. o. (1995), hergestellt.
Verfahren zur Detektion von Rse-Phosphorylierung unter Verwendung von KIRA-ELISA und Western-Analyse unter Verwendung von Antiphosphotyrosinantikörpern wurden in den Beispielen 3 und 4 erläutert. Für Neutralisierungsversuche wurden mögliche Ligandenquellen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit dem angegebenen Fc-Fusionsprotein behandelt, bevor sie zu Zellen zugesetzt wurden. Um die Fähigkeit möglicher Liganden zu untersuchen, eine Phosphorylierung von gD.Mer auszulösen, wurden 500.000 Zellen in Gegenwart von Serum 6 Stunden lang auf eine 60-mm-Schale geimpft. Die Zellen wurden dann zweimal in PBS gewaschen und 16 Stunden lang Serumentzug ausgesetzt. Mögliche Liganden wurden zu den Zellen zugesetzt, und gD.Mer wurde unter Verwendung von 5B6 aus Lysaten immungefällt, durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht und mit einem Antiphosphotyrosinantikörper (4G10) geblottet.
Zur Bindung an Rse-Fc, Axl-Fc und Mer-Fc wurde ein konditioniertes Medium, das 5–10 nM gas6 oder Protein S enthielt, mit Protein-A-Sepharose (Calbiochem) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur vorgeklärt und dann 4 Stunden lang bei 4°C mit 5 μg des Rezeptor-Fc-Fusionsproteins inkubiert. Fusionsproteine wurden mit 20 μl Protein-A-Sepharose immungefällt, und die Komplexe wurden durch 1-minütige Zen trifugation bei 14.000 × g gesammelt und 3-mal mit PBS, das 0,1% Triton X-100 enthielt, gewaschen. Präzipitate wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Western-Blots der SDS-PAGE-Gele wurden mit einem Antikörper 5B6 untersucht.
Eine Proteinwechselwirkungsanalyse unter Verwendung von BIAcor^TM-Instrumenten wurde mit an BIAcore-CM5-Sensorchips gekoppeltem Mer-Fc durchgeführt, wobei gereinigtes gas6 oder Protein S verwendet wurden. Für Neutralisierungsversuche wurden 5 μg von entweder Mer-Fc oder CD4-Fc 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit gas6 vermischt, bevor es über den Chip injiziert wurde. Sensogramme wurden mithilfe von BIA-Evaluierungssoftware 2.1 von Pharmacia Biosensor AB untersucht. Scheinbare Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten (kd) und Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten (ka) wurden durch Bewertung des Sensogramms mit A + B = AB-Typ-1-Anpassungen erhalten. Eine Gleichgewichtsdissoziationskontante K_d wurde als kd/ka berechnet.
Ergebnisse
Die Fähigkeit von Mer-Fc, gas6-induzierte Phosphorylierung von Rse im auf ELISA basierenden KIRA-Test zu neutralisieren, wurde untersucht. Die Aktivierung von RSE durch gas6 wurde durch Rse-Fc und Mer-Fc auf dosisabhängige Weise blockiert (14). Die Neutralisierung war spezifisch für Rse-Fc und Mer-Fc, da das Kontrollprotein CD4-Fc in diesem Test zu keiner Hemmung führte. Rse-Fc war bei der Neutralisierung von gas6 etwas stärker als Mer-Fc. Diese Daten lassen vermuten, dass Mer-Fc wie Rse-Fc die Aktivierung von Rse durch Bindung an gas6 blockiert.
Die Fähigkeit von Axl-Fc, Rse-Fc und Mer-Fc, direkt an gas6 zu binden, wurde unter Verwendung eines Copräzipitationstests bestimmt. Die Fähigkeit dieser Rezeptoren, Protein S zu binden, wurde ebenfalls bestimmt. Um einen quantitativ besseren Vergleich der Bindungseigenschaften zu ermöglichen, wurden Versionen von gas6 und Protein S verwendet, die Epitopmarkierungen aufwiesen. Ein konditioniertes Medium von Zellen, die für markiertes gas6 oder Protein S exprimierten, wurden mit jedem der Rezeptorfusionsproteine inkubiert. Die Fc-Fusionsproteine und die daran gebundenen Proteine wurden mit Protein A gewonnen und gut gewaschen. Markierte Proteine, die an die Fc-Fusionsproteine banden, wurden durch Western-Blotting und Detektion mit einem Antikörper bestimmt, der gegen die Epitopmarkierung gerichtet war. Sowohl Axl-Fc als auch Rse-Fc banden markiertes gas6, nicht jedoch Protein S. Das gleiche Ergebnis wurde mit Mer-Fc erhalten. Die Bindung war insofern spezifisch, als weder gas6 noch Protein S das Kontroll-CD4-Fc banden.
Die Kinetik der Wechselwirkung von gas6 mit extrazellulären Domänen von Mer und Rse wurde unter Verwendung eines BIAcore-Instruments verglichen. Mer-Fc wurde auf einem Biosensorchip immobilisiert, und verschiedene Konzentrationen von gas6 wurden über den Chip fließen gelassen. Ein repräsentatives Sensogramm von solch einem Experiment ist in 15A zu sehen. Keine Bindung an Protein S wurde beobachtet, und die Bindung von gas6 an auf dem Chip immobilisiertes Mer-Fc wurde durch lösliches Mer-Fc, nicht jedoch CD4-Fc blockiert (15). Die Dissoziationskonstante (K_d) für die Wechselwirkung von gas6 mit Mer-Fc betrug 6 nM. Die K_d für die Bindung von gas6 an Rse-Fc betrug 4,2 nM.
HEK-293-Zellen wurden mit einem Expressionsvektor transfiziert, der für eine Version von Mer kodierte, die eine aminoterminale Epitopmarkierung aufwies. Eine Kandidatenzelllinie (293.gD.Mer), die gD.Mer exprimierte, wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter Verwendung von 5B6, einem monoklonalen Antikörper, der die Epitopmarkierung erkennt, identifiziert. Eine Inkubation dieser Zellen mit dem Antikörper 5B6 führte zu rascher Phosphorylierung von neuen Proteinen mit etwa 180 und 200 kDa, die in untransfizierten HEK-293-Kontrollzellen nicht vorhanden waren. Wenn die Zellen mit einem Kontrollantikörper inkubiert wurden, trat keine Rezeptorphosphorylierung auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass Mer für eine funktionelle Tyrosinkinase kodiert.
Die Fähigkeit von menschlichem gas6 und Protein S, die Kinaseaktivität von Mer zu aktivieren, wurde untersucht. Mer wurde nicht phosphoryliert, wenn diese Zellen mit Protein S behandelt wurden. In Zellen, die mit gas6 behandelt waren, wurde jedoch Rezeptorphosphorylierung detektiert. Ein Zeitablaufsversuch zeigte, dass Mer innerhalb von Minuten nach dem Zusatz von gas6 phosphoryliert wurde und dass die Phosphorylierung nach Stimulierung der Zellen mit gas6 in Konzentrationen von 1–3 nM detektiert werden konnte.
Die Fähigkeit von gas6, die Phosphorylierung von endogen exprimiertem Mer zu induzieren, wurde untersucht. Mer-mRNA wurde durch reverse-Transkriptions-PCR in der monozytischen Leukämiezellline THP-1 detektiert. Unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der gegen die extrazelluläre Domäne von. Mer gerichtet war, wurde die Expression von Mer auf der Oberfläche von THP-1-Zellen bestätigt. Eine Behandlung dieser Zellen mit gas6 löste die rasche Phosphorylierung eines 180-kDa-Proteins aus, das mit Antikörper gegen Mer immungefällt worden war. Diese Beobachtungen zeigen, dass gas6 ein funktioneller Ligand für Mer ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

gas6-Polypeptid-Variante, der ein oder mehrere Glutaminsäurereste der A-Domäne von nativem gas6 fehlen, oder ein Fragment davon, worin die Variante oder das Fragment zumindest 75% Sequenzidentität mit reifem, nativem gas6 mit der in 2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist und den Rse-Rezeptor und/oder den Mer-Rezeptor aktivieren kann und/oder die Proliferation, das Überleben und/oder die Differenzierung von den Rse- oder Mer-Rezeptor enthaltenden Zellen fördern kann.
gas6-Variante nach Anspruch 1, der die A-Domäne von nativem gas6 fehlt.
gas6-Variante nach Anspruch 2, die die D-Domäne von gas6 ist.
gas6-Variante nach Anspruch 2, die die in 2 dargelegten G-Domänen von gas6 umfasst.
gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die von menschlichem gas6 abgeleitet ist.
Zusammensetzung, umfassend eine gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Nucleinsäure, die für eine gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
Vektor, umfassend Nucleinsäure nach Anspruch 7.
Wirtszelle, umfassend Nucleinsäure nach Anspruch 7.
Verfahren zur Herstellung einer gas6-Polypeptid-Variante, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 9, so dass die Nucleinsäure exprimiert wird, sowie das Gewinnen der gas6-Variante aus der Zellkultur.
In-vitro-Verfahren zum Aktivieren von Rse-Rezeptor, umfassend einen Schritt, beidem eine Zelle, die den Rse-Rezeptor umfasst, einem exogenen gas6-Polypeptid in einer Menge ausgesetzt wird, die ausreicht, um den Rse-Rezeptor zu aktivieren, worin das gas6-Polypeptid eine gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die gas6-Variante im Wesentlichen nicht γ-carboxyliert ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, worin die gas6-Variante ein Immunadhäsin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin die Zelle eine Gliazelle ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Gliazelle eine Schwann-Zelle ist.
In-vitro-Verfahren zur Förderung des Überlebens, der Proliferation oder der Differenzierung einer Zelle, die den Rse-Rezeptor umfasst, umfassend einen Schritt, bei dem die Zelle einem exogenen gas6-Polypeptid in einer Menge ausgesetzt wird, die ausreicht, um das Überleben, die Proliferation oder die Differenzierung der Zelle zu fördern, worin das gas6-Polypeptid eine gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die Zelle eine menschliche Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, das die Förderung der Zellproliferation umfasst.
In-vitro-Verfahren zum Aktivieren von Mer-Rezeptor, umfassend einen Schritt, bei dem eine Zelle, die den Mer-Rezeptor umfasst, einem exogenen gas6-Polypeptid in einer Menge ausgesetzt wird, die ausreicht, um den Mer-Rezeptor zu aktivieren, worin das gas6-Polypeptid eine gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zelle eine einkernige Zelle ist.
In-vitro-Verfahren zur Förderung des Überlebens, der Proliferation oder der Differenzierung einer Zelle, die den Mer-Rezeptor umfasst, umfassend einen Schritt, bei dem die Zelle einem exogenen gas6-Polypeptid in einer Menge ausgesetzt wird, die ausreicht, um das Überleben, die Proliferation oder die Differenzierung der Zelle zu fördern, worin das gas6-Polypeptid eine gas6-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
gas6-Polypeptid-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung einer gas6-Polypeptid-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Aktivierung des Rse- oder Mer-Rezeptors einer Zelle.
Verwendung einer gas6-Polypeptid-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung des Überlebens, der Proliferation oder der Differenzierung einer Zelle, die den Rse- oder Mer-Rezeptor umfasst.
Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, worin die Zelle aus Gliazellen, Nervenzellen, hämatopoetischen Zellen, einkernigen Zellen oder Zellen der Testes, des Ovariums, der Prostata, der Lunge oder der Niere ausgewählt ist.