WO2006067094A1 - Verfahren zur isolierung neuraler zellen mit tenascin-r-verbindungen - Google Patents

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WO2006067094A1
WO2006067094A1 PCT/EP2005/056860 EP2005056860W WO2006067094A1 WO 2006067094 A1 WO2006067094 A1 WO 2006067094A1 EP 2005056860 W EP2005056860 W EP 2005056860W WO 2006067094 A1 WO2006067094 A1 WO 2006067094A1
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tenascin
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probe
cell
oligodendrocytes
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PCT/EP2005/056860
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Penka Pesheva
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Rheinische-Friedrich- Wilhelms- Universität Bonn
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    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the invention relates to a method for the isolation of neural cells using tenascin-R compounds, especially suitable for this method Tenascin-R fragments and Tenascin-R fusion proteins, the recombinant production of these Tenascin-R compounds, and a Kit for carrying out this method and the use of the method for producing highly pure neural cell populations.
  • the invention further relates to antibodies which are suitable for the detection and isolation of tenascin-R compounds.
  • the cell When cells come into contact with the surrounding extracellular milieu, the cell can respond to many different responses, ranging from rejection and avoidance of the environment on the one hand to stable cell adhesion on the other.
  • Such cellular behavior leads to patterning at the organism level or to neoplasm at the tissue or organ level as a consequence of injury (Boudreau, NJ, Jones, PL, Biochem J. 339: 481-488 (1999); Sobeih, MM, Corfas, G.
  • chondroitin sulfate proteoglycans or tenascin family proteins correlates with biological processes involving neuronal adhesion and migration, axon navigation, synapse formation and plasticity, and the effects of Growth factors and cytokines as well as the survival of neurons and the structural organization of the extracellular matrix include (Dow, KE, Wang, W., Cell Mol.
  • Tenascin-R (formerly known as Jl-160/180, Janusin or Restrictin) is a member of the tenascin family of extracellular matrix proteins that occurs exclusively in the vertebrate CNS and is found there by oligodendrocytes and some groups of neurons, ie Motoneurons and interneurons are expressed during later stages of development and in the adult state (Pesheva, P., Probstmeier, R., Prog Neurobiol 61: 465-93 (2000); Scherberich, A. et al., J. Cell Sei. 117-571-81 (2004)).
  • TN-R 160 molecular weights of 160 kD
  • T-R 180 molecular weights of 180 kD
  • TN-R is found in tissue primarily in association with oligodendrocytes, myelinated axons, perineuronal networks of moto- and interneurons, as well as dendritic and synapse-rich regions.
  • TN-R is made up of four different domain structures (FIG. 1).
  • the N-terminus whose sequence occurs only in tenascin proteins, contains a cysteine-rich segment (Cys-rich), and is followed by four and a half EGF-like segments (EGF-like) and 9 fibronectin type III (FN III). similar domains (of which the 6th domain can alternatively be spliced).
  • the C-terminus of the TN-R protein forms a globular, fibrinogen-like domain (FNG).
  • TN-R 180 Individual TN-R polypeptide chains are linked together at their N-termini via disulfide bridges to form homotrimers (TN-R 180) or dimers (TN-R 160), the latter being prepared by proteolytic cleavage of TN-R 180 near the N-terminus (Woodworth, A. et al., J. Biol. Chem. 279: 10413-21 (2004)).
  • TN-R The functional range of TN-R encompasses the molecular control of neural cell adhesion, migration and differentiation (from axon navigation of appendicant neurons to the maturation of myelin-forming oligodendrocytes) during normal developmental processes as well as regenerative processes after injury in the adult brain (Pesheva, P., Probstmeier, R , Prog., Neurobiol., 61: 465-93 (2000); Chiquet-Ehrismann, R., Int., J. Biochem., Cell, Biol., 36: 986-90 (2004)).
  • TN-R acts as an adhesive or antiadhesive molecule, as a differentiation factor for oligodendrocytes, or as a "stop molecule" for growing axons. These properties depend on the respective framework conditions: the particular cell type, the presence of cellular receptors and signal cascades, the spatial distribution and the post-translational modification of the TN-R glycoprotein. Some of the cellular receptors of TN-R that have been identified (F3 / F11, disialogangliosides, sulfatides) induce different cellular mechanisms of action, on the one hand, in patterning during ontogenesis, on the other hand, are important in regenerative processes (Angelov, D., et al., J.
  • the latter is mediated by sulfatides and ultimately causes oligodendrocyte migration and myelination / remyelination.
  • the former can be either substrate-independent (mediated by F3 / F11 and other unknown factors), or substrate / integrin-dependent (mediated by fibronectin and GD2 / GD3).
  • the inhibitory effect of TN-R ultimately has an impact on neural cell migration, spatially coordinated axon growth, and synaptogenesis, or it contributes to prevention of axon regeneration and adhesion of activated microglia in a TN-R rich environment under injury conditions.
  • TN-R neural receptors and intracellular signaling pathways mediating the action of TN-R in neuronal and glial cells are known, as well as molecular components involved in the expression of TN-R by oligodendrocytes and motor neurons (Table 1; Pesheva, P. et al., Prog. Brain Res. 132: 103-14 (2001)).
  • Tab.l Cellular receptors and ligands identified for TN-R of the extracellular matrix.
  • the right-hand half of the table shows the domains of TN-R relevant to the respective interaction;
  • CS GAG chondroitin sulfate glycosaminoglycans;
  • EGF-L EGF-like segments and cysteine-rich segment.
  • TN-R proteins purified from adult rodent brain promote the adhesion and extension of O4 / sulfatide-positive oligodendrocytes isolated from early postnatal brain ( Figure 3; Pesheva, P. et al., J. Neurosci 17: 4642-51 (1997) )). These events are mediated by sulfatides, a group of glycolipids found in the cell membrane of oligodendrocytes.
  • EP 0759987, US 5,635,360, US 5,681,931 and US 5,591,583 describe human TN-R and its immunological detection using antibodies to a protein fragment comprising nucleotides 2686-3165 of the cDNA sequence and thus FN III domains 6 and 7 of the human TN-R corresponds.
  • the earliest stages of developing glial cells are found in mammals in the spinal cord in ventral areas of the neural tube, in the brain in the ventricular zones of the forebrain.
  • first progenitor cells of oligodendrocytes which are characterized by a simple morphology and the expression of the disialoganglioside GD3 and / or 04 antigens, proliferate and subsequently migrate into regions of the later emerging white matter (Miller, RH Prog. Neurobiol. 67: 451-67 (2002); Noble, M. et al., Dev. Biol. 265: 33-52 (2004); Liu, Y. Rao, MS, Biol. Cell. 96: 279-90 (2004); ). There the cells become postmitotic and differentiate into mature oligodendrocytes with a complex morphology.
  • This maturation process correlates with the expression of myelin-specific lipids (sulfatides and galactocerebrosides) and proteins (MBP, MAG, and PLP).
  • the formation, survival and differentiation of oligodendrocytes into myelin-forming cells are regulated by various growth factors (bFGF, PDGF, CNTF, IGF-I, NT-3), hormones and extracellular matrix molecules (thyroid hormones, retinoic acid, TN-R) (Dubois-Dalcq M., Murray, K., Pathol. Biol. (Paris) 48: 80-6 (2000); Kagawa, T. et al., Microsc. Res. Tech. 52: 740-5 (2001); M. et al., Dev. Neurosci. 25: 217-33 (2003)).
  • glial cells such as oligodendrocytes and neural stem cells
  • their extraction in the field of basic research as well as in potential diagnostic / therapeutic applications has so far had to be relatively high time-consuming and low-efficient enrichment processes of primary cells are used.
  • these methods often only allow the production of enriched mixed cell populations.
  • the previous methods for isolating defined cell populations use different techniques, such as density gradient centrifugation or immunological methods (fluorescence-activated cell sorting, biomagnetic cell sorting, antibody- and complement-mediated cell killing, antibody panning) (Luxemteil, AT et al., Nat. Biotechnol. Nos.
  • TN-R proteins support the stable adhesion of oligodendrocytes of different maturity stages and have an antiadhesive effect on neuronal and microglial cells. This allows the isolation and purification of defined cell populations from neural primary tissue, particularly for the direct selective purification of oligodendrocytes from mixed neural cell populations.
  • a method is provided which makes it possible to isolate a highly pure defined cell population, in particular an oligodendrocyte population, from primary tissue of neural origin in a single purification step.
  • the invention relates to (1) a method for isolating and purifying neural cells from vertebrate neural primary tissue, comprising selecting the cells from a single cell suspension using a tenascin-R containing probe (hereinafter also “tenascin-R probe”).
  • tenascin-R probe which comprises tenascin-R compounds selected from native tenascin-R (hereinafter "TN-R” for short) as well as homologues and fragments thereof and fusion proteins of such compounds;
  • the native tenascin-R is human tenascin-R and / or has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 or is a substitution, deletion and / or addition mutant thereof; and or
  • the tenascin-R fragment comprises the C-terminus of native tenascin-R or a substitution, deletion and / or addition mutant thereof, especially that region which encodes nucleotides 3940-4155 of SEQ ID NO: 1 in particular one of those regions encoded by nucleotides 2926-4155, 3439-4155, 3487-4155 or 3940-4155 of human TN-R of SEQ ID NO: 1; and or
  • the tenascin R fragment comprises amino acid residues 1287 to 1358 of SEQ ID NO: 2, preferably one or more of the partial sequences of the human TN-R selected from the amino acids 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 or 949- 1358 in SEQ ID NO: 2 or a substitution, deletion and / or addition mutant thereof; and / or (iv) the tenascin-R fusion protein comprises a tenascin R component comprising native tenascin R, a tenascin R fragment or a tenascin R mutant, in particular as described above under (i) to (iii) and comprising a functional component comprising further functional peptides or proteins, or composed of two or more, preferably two or three functional tenascin-R components as defined above;
  • (6) a vector comprising a DNA according to (5); (7) a host organism transformed / transfected with a vector according to (6) and / or having a DNA according to (5);
  • TN-R is obtainable from at least two different vertebrates, and / or which binds to TN-R of at least two different species, in particular of at least two different vertebrates, ie cross-reactivity with different vertebrate TN-R; (10) a preferred embodiment of the antibody of (9), wherein the antibody is a monoclonal antibody;
  • a tenascin-R probe as defined in (1) or (2) and / or (ii) a vector encoding such a tenascin-R probe, and / or (iii) a stock culture of a cell line which is suitable for expressing, preferably recombinantly expressing, the tenascin-R probe as defined in (1) or (2);
  • tenascin-R probe for the production of neural cells, in particular oligodendrocytes, for the growth of differentiated cells, especially neural cells, in neurobiological and cell physiological studies, in the biological and clinical Research and diagnostic and therapeutic methods in vitro and in vivo, in particular for the manufacture of a medicament for cell therapy and for the therapy of neurodegenerative diseases associated with a loss of oligodendrocytes or myelin, in particular multiple sclerosis and periventricular leukomalacia (PVL); and
  • a method of cell therapy or therapy of neurodegenerative diseases associated with loss of oligodendrocytes or myelin, in particular multiple sclerosis and periventricular leukomalacia (PVL), comprising administering a tenascin-R probe as defined in (1) or (2), preferably a tenascin-R fragment or tenascin-R fusion protein as defined in (4), to a human or animal patient; and (17) a method of producing oligodendrocytes from isolated stem cells in vitro by incubating the stem cells in the presence of a tenascin R probe as defined in (1) or (2), preferably a tenascin R fragment or tenascin R Fusion protein as defined in (4).
  • Fig. 1 Construction of TN-R.
  • the position of the alternatively spliced FN HI-like domain is indicated as R1.
  • the inserted partial image shows electron micrographs of rotationally evaporated TN-R molecules purified from mouse brain. Individual polypeptide chains are linked together at their N-terminal ends via disulfide bridges, leading to the formation of dimers (TN-R 160) or trimers (TN-R 180).
  • Fig. 2 CLUSTAL W (1.82) alignment of the known amino acid sequences of tenascin-R from various vertebrates. "*” denotes identical amino acids, “:” denotes conservative amino acid substitution, “.” denotes semi-conservative amino acid exchange. The high phylogenetic conservation of the C-terminus containing the FNG domain can be clearly recognized.
  • TN-R substrates were preincubated in the absence (- GL) or presence of sulfatides (+ SuIf), galactocerebroside (+ GaIC), monosial gangliosides (+ GMl) and sphingosine (+ Sph).
  • Oligodendrocytes left half of the picture
  • erythrocytes RBC, right half of the picture
  • the number of adherent cells after one hour of incubation on untreated TN-R substrates was set as 100%.
  • FIG. 4 Influencing of the differentiation of oligodendrocytes by TN-R. Oligodendrocytes purified from early-postnatal mouse brain were seeded onto PLL (poly-L-lysine) substrates in the absence (-NT-R) or presence (+ TN-R) of substrate-bound TN-R proteins (purified from human or rat brain). The expression of myelin-specific proteins (MBP) was detected after 2 days in culture by means of indirect immunofluorescence staining.
  • FIG. 5 Characterization of the specificity and functional activity of the monoclonal antibodies R1, R2, R4, R5 and R6.
  • Brain extracts 50 ⁇ g total protein / bag from shark (Squalus),
  • Goldfish (Carassius), salamander (Salamandra), grass snake (Natrix), Greek tortoise (Testudo), pigeon (Columba), hedgehog (Erinaceus), mouse (Mus) and human (Homo) were separated by gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose filters and labeled with R6 Antibodies incubated. Immunoreactive protein bands were detected by incubation with peroxidase-linked anti-mouse IgG antibodies. Immunoaffinity purified TN-R from mouse brain (w / TN-R) with the characteristic protein bands of 160 and 180 kD served as reference.
  • E Western blot of R4 with various tissues and tenascins. Brain, heart, liver, kidney and lung of adult mice, skin and skin fibroblast-conditioned medium (CM) of neonatal mice, TN-R 160 from adult mouse brain and TN-C (br TN-C) from early postnatal mouse brain were tested.
  • CM skin and skin fibroblast-conditioned medium
  • TN-R 160 from adult mouse brain
  • TN-C br TN-C
  • pTN-C Ab polyclonal antibody to TN-C
  • R4 MAb monoclonal antibody to TN-R.
  • FIG. 6 Immunoaffinity-purified TN-R proteins from adult brain of various vertebrate species.
  • Lane 1 (shark), lane 2 (carp), lane 3 (chicken), lane 4 (mouse), lane 5 (rat), lane 6 (human).
  • TN-R is detectable as a polypeptide with the major forms of 220 kD (in the shark brain), 170 kD (in the carp brain) or 160 kD and 180 kD (in the higher vertebrate brain).
  • Figure 7 Selection of oligodendrocytes from single cell suspensions (from brain tissue of 2 (P2), 5 (P5) and 8 (P8) day old mice) on substrate-bound TN-R proteins isolated from the brain of various vertebrates (carp, chicken (ch) , Rat, human) of different vertebrate classes (fish, bird, mammal). Cells adhering to these substrates were stained with toluidine blue after one day in culture (upper lines). Adherent cells could be identified as oligodendrocytes by indirect immunofluorescence staining with antibodies against myelin-specific glycolipids (GaIC) after 2 (P8) to 5 days (P2) in culture (bottom line, image section does not correspond to the image of the top lines). 99 ⁇ 1% of the isolated cells were GalC positive.
  • GaIC myelin-specific glycolipids
  • Figure 8 Ability of TN-R of various species to elicit oligodendrocyte differentiation.
  • TN-R secretion by cultured mouse oligodendrocytes was compared to that of oligodendrocytes on PLL-BSA and expressed as a multiple of protein secretion.
  • the invention relates to a method for isolating high-purity cell populations from neural primary tissue in a single-step method using native tenascin-R Vertebrate proteins or TN-R fragments, preferably from fish, amphibians, reptiles, birds and mammals, more preferably from shark, carp, chicken, rodents including mouse and rat, bovine, porcine and human, most preferably from rodent and human , by selective substrate adhesion.
  • native tenascin-R Vertebrate proteins or TN-R fragments preferably from fish, amphibians, reptiles, birds and mammals, more preferably from shark, carp, chicken, rodents including mouse and rat, bovine, porcine and human, most preferably from rodent and human , by selective substrate adhesion.
  • “Tenascin-R probe” in the context of the present invention means a protein comprising native tenascin-R recognized and bound by oligodendrocytes in vivo and in vitro, and / or other tenascin-R compounds including tenascin R homologs and Tenascin-R fragments, which may also be bound with high sensitivity and specificity in vivo and in vitro by oligodendrocytes and / or by other neural cells from primary tissue, with "tenascin-R compounds” being defined elsewhere Has. This also includes fusion proteins from several tenascin-R compounds, preferably from two or three tenascin-R compounds.
  • fusion proteins can be linked together directly or by means of a (flexible) linker peptide.
  • a (flexible) linker peptide Preference is given to fusion proteins from TN-R fragments.
  • the tenascin-R probe contains human tenascin-R and its homologues and fragments, most preferably the partial sequence of human TN-R comprising amino acid residues 1287-1358 of SEQ ID NO: 2.
  • the tenascin-R probe may, in addition to its TN-R moieties, also have non-TN-R moieties which ensure the stability of the TN-R moiety and / or maintain or increase the immobilizability and coupling ability to other molecules.
  • a tenascin-R probe according to the invention is produced recombinantly.
  • "Tenascin-R compounds” according to the invention are proteins or peptides which are either native TN-R, substantially identical to native TN-R, fragments of native TN-R or their substantially identical homologues.
  • Primary tissue is a biological tissue taken directly from an organism and used without further alteration of its genetic material becomes.
  • Primary cells are cells derived from primary tissue. Primary cells are advantageous over cell lines because they are structurally and functionally closest to the cells in the intact organism because of their origin.
  • Isolated in the case of a protein means that it has been separated or purified from other proteins with which it is normally associated in the organism in which it naturally occurs. This includes biochemically purified proteins, recombinantly produced proteins, and chemically synthesized proteins. The definition also applies to nucleic acids, in particular DNA, and peptides. “Native” is used synonymously with “natural” or “naturally occurring”.
  • customary methods for the recombinant production of eukaryotic proteins are used, in particular the expression as a fusion protein in eukaryotic cells, very particularly preferably the expression as a fusion protein with polyhistidine tail and / or Xpress tag. Further preferred is the use of DNA encoding the corresponding protein.
  • Nucleic acid sequences in particular DNA sequences, which code for proteins or peptides according to the invention are in the context of the present invention either identical or substantially identical to the native or to its underlying artificial sequence according to the invention. If a specific nucleic acid sequence is mentioned in the context of this invention, then this sequence itself and the sequences substantially identical to it are recorded.
  • substantially identical here means that only one exchange of bases in the sequence has taken place in the context of the degenerate nucleic acid code, that is to say that the codons within coding sequences of the substantially identical nucleic acid are changed only in relation to the original molecule in a manner which does not result in a change in the amino acid sequence of the translation product (usually replacing the codon with another codon of its codon family).
  • sequences named in the sequence listing and their fragments according to the invention are preferred.
  • Protein sequences and peptide sequences can be modified in the context of the present invention by substitution of amino acids. Preferred are those substitutions in which the function and / or conformation of the protein or peptide is retained, particularly those substitutions in which one or more amino acids are replaced by amino acids having similar chemical properties, eg VaNn by alanine ("conservative amino acid exchange") ,
  • the proportion of substituted amino acids compared to the native protein or, if it is not a native protein to the starting sequence is preferably 0-30% (based on the number of amino acids in the sequence), particularly preferably 0-15%, completely more preferably 0-5%.
  • Nucleic acid sequences and amino acid sequences can be used as full-length sequences or as addition or deletion products of these full-length sequences for carrying out the invention.
  • the addition products also comprise fusion proteins, moreover amino acid sequences which are formed by addition of 1-100, preferably 1-30, most preferably 1-10 amino acids.
  • the added amino acids can be added or added individually or in contiguous sections of 2 or more linked amino acids. The addition may take place at the N- or C-terminus or within the original sequence. Several additions are allowed in a sequence, with a single addition being preferred, more preferably an addition at the C or N terminus.
  • deletion products of the full length amino acid sequences are formed - if not stated otherwise for specific sequences - by deleting 1-100, preferably 1-20, most preferably 1-10 amino acids.
  • the deleted amino acids can be removed individually or in contiguous sections of 2 or more linked amino acids.
  • the deletion may occur at the N- or C-terminus or within the original sequence. Several deletions are allowed in a sequence, with a single deletion being preferred, more preferably a deletion at the C or N-terminus.
  • the permissible deletions and additions in the nucleic acid sequences according to the invention have the scope and the extent which correspond to the permissible amino acid deletions or additions. In addition to the deletion and addition of whole codons addition or deletion of single or paired bases is possible.
  • a fragment of a nucleic acid or protein is part of its sequence that is shorter than full length but still minimal for hybridization or specific binding required sequence section contains.
  • this sequence segment is still able to hybridize with the native nucleic acid under stringent conditions and preferably comprises at least 15 nucleotides, more preferably at least 25 nucleotides.
  • this sequence portion is sufficient to allow binding of an antibody specific for a portion of the native protein or a cell that binds to TN-R or a TN-R fragment.
  • the peptide length is preferably at least 5 amino acids, more preferably at least 10 amino acids, most preferably at least 20 amino acids.
  • a "fusion protein" in the context of the present invention comprises at least one tenascin-R compound of the invention linked to at least one second protein or peptide.
  • This second protein or peptide is preferably a selection or marker protein, a protein which serves to bind the fusion protein to a surface, or a tenascin-R compound.
  • Preferred are fusion proteins of native tenascin-R and other functional proteins and peptides, and fusion proteins of two or more, more preferably two or three tenascin-R fragments.
  • the nucleic acid sequences encoding the individual parts of the fusion protein in a vector or a transformed host organism are linked together in a manner that permits expression under the control of a single promoter.
  • the amino acid sequences of the individual functional parts of the fusion protein are linked either directly or with a linker.
  • the linker is 1-30 amino acids long, preferably 10-20 amino acids.
  • Neurodegenerative disorders are disorders of the nervous system associated with the death of neuronal and / or macroglial cells due to impairment of their functional integrity. Such cell damage and loss leads to failure or disruption of the functions of the affected regions of the nervous system and / or of the body parts controlled by these regions.
  • the cells isolated by the method of embodiments (1) and (2) are preferably glial cells, more preferably oligodendrocytes.
  • the tenascin-R probe for use in embodiment (1) comprises either a native TN-R protein or a TN-R protein fragment.
  • the native TN-R is derived preferably from brain tissue of fish (shark, carp, goldfish, trout, etc.), amphibians (salamander, frog, etc.), reptiles (Greek tortoise, grass snake, etc.), birds (chicken, pigeon, etc.) and mammals ( Hedgehog, rabbit, rodent, pig, cattle, human), especially of mammals, in particular of rodents, pigs, cattle or humans.
  • the native TN-R protein is preferably produced recombinantly.
  • the TN-R protein fragments are preferably prepared recombinantly and / or human TN-R fragments.
  • a preferred source of the corresponding DNA sequence in the latter case is the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y.
  • the expression of the fragments is preferably carried out after transformation of human FIp-In 293 cells (Invitrogen) with the corresponding DNA sequences (Ex. 2).
  • the TN-R probe in embodiment (1) may also contain further functional protein or peptide sequences and / or be coupled to a carrier.
  • a preferred aspect of embodiments (1) and (2) is the use of the C-terminus of TN-R in the tenascin-R probe, particularly those regions which represent FN III domains 7 and 8 and the FNG domain , These regions can be used either individually or linked together, with the presence of the FNG domain in the probe being preferred.
  • DNA fragments of embodiment (5) preferably include bp 3940-4155, 2926-4155, bp 3487-4155 and / or bp 3439-4155 of SEQ ID NO: 1.
  • Preferred tenascin-R fragments for use in a tenascin-R probe are thus fragments containing the C-terminus of the TN-R.
  • the C-terminus of the TN-R protein forms a fibrinogen-like domain in which four cysteine residues, including the surrounding four to five amino acids, are highly conserved in position and composition in higher vertebrates.
  • This region preferably the region comprising amino acids 1287-1358 in human TN-R, most preferably the region corresponding to amino acids 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 (Carnemolla, B. et al., J. Biol. Biol. Chem.
  • TN-R fragment in the TN-R probe for adsorbing oligodendrocytes.
  • This region also represents the preferred sequence of the tenascin-R fragments according to embodiment (4).
  • Particularly preferred as the TN-R fragment are peptides having the sequence of amino acid residues 949-1358 or 1120-1358 of SEQ ID NO: 1.
  • TN-R proteins as an adhesive substrate for oligodendrocytes is reflected at the molecular level by high conservation of the amino acid sequence between different vertebrate species: the human TN-R sequence has homologies of 93% (to rat), 75% (to chicken) and 60% (to zebrafish) (Figure 2). This feature takes advantage of the present application.
  • One aspect of embodiment (1) is the preparation of the tenascin-R probe by isolating the tenascin R from natural sources (see Example 1) or as a recombinant native protein. Production by recombinant methods is preferred here.
  • the isolation of the TN-R from natural sources preferably takes place by known chromatographic and / or immunological methods for protein purification, in particular by affinity chromatography on TN-R antibodies (Example 1). Tissue and single-cell suspensions of higher and lower vertebrates may be the sources of TN-R.
  • Recombinant methods for the production of the TN-R probe include the known common methods for the transformation of prokaryotes and eukaryotes (described, for example, in G. Schrimpf (ed.), Genetic Engineering Methods, 3rd Edition, Spektrum Akademischer Verlag (2002); C, The Engineer 12 (3): 18 (1998); Unger, T., The Engineer ll (17): 20 (1997)).
  • Suitable methods of producing recombinant proteins or protein fragments include transfection or transformation methods based on different expression systems / vectors for prokaryotic (especially E. coli) and eukaryotic cells (yeast, fungi, insect and mammalian cells).
  • mammalian cells are preferred as producers.
  • the different expression vectors for mammalian cells differ mainly in promoter type (SV40, CMV, human EFlalpha, MMTV-LTR, MSV- LTR, RSV-LTR, etc.), mode of expression (transient, constitutive, inducible), induction mechanism, selection marker (antibiotic or drug resistance and / or co-expression of readily detectable proteins), and elements for subcellular targeting of the gene product (mitochondria, nucleus, secretion ).
  • promoter type SV40, CMV, human EFlalpha, MMTV-LTR, MSV- LTR, RSV-LTR, etc.
  • mode of expression transient, constitutive, inducible
  • selection marker antibiotic or drug resistance and / or co-expression of readily detectable proteins
  • elements for subcellular targeting of the gene product mitochondria, nucleus, secretion .
  • eukaryotic expression systems that constitutively express the foreign gene are
  • defined PCR fragments of the human TN-R are cloned with the aid of the TOPO TA cloning system (Invitrogen) into the pcsecTag / FRT / V5-His-TOPO vector (Invitrogen) which allows the constitutive expression and secretion of the desired 6xHis-peptide C-terminal protein fragment in human FIp-In 293 cells (Invitrogen).
  • the plasmid pFRT / lacZeo Invitrogen
  • the FRT region is specifically recognized by the FIp recombinase.
  • Another aspect of embodiment (1) is the production of the TN-R fragments by chemical synthesis, by fragmentation of isolated TN-R or recombinant, preferably recombinant according to embodiment (8).
  • Suitable recombinant methods include the known common methods for the transformation of prokaryotes and eukaryotes (described, for example, in G. Schrimpf (Ed.), Genetic Engineering Methods, 3rd Edition, Spektrum Akademischer Verlag (2002), Smith, C, The Philosoph 12 (3 ): 18 (1998); Unger, T., The Engineer ll (17): 20 (1997)).
  • a host organism can be used, which is transformed or transfected with a vector comprising the above-defined DNA sequences encoding TN-R or TN-R fusion protein.
  • a vector may contain functional sequences such as promoters, leader sequences, etc. adapted to the host organism in addition to said DNA sequences.
  • TN-R Fragments as well as fragmentation of isolated TN-R can be used in methods known in the art, such as solid-phase peptide synthesis or enzymatic or mechanical fragmentation methods.
  • a fusion protein comprising a tenascin-R moiety selected from native tenascin-R or tenascin-R fragments and fusion proteins from two of the more tenascin-R fragments, and a functional component comprising functional peptide or protein sequences.
  • the components can be linked together directly or by means of a (flexible) linker peptide.
  • Another aspect relates to the combination of two or more of the above-defined tenascin-R components, in particular tenascin-R fragments, in a manner not corresponding to the native amino acid sequence, to a tenascin-R probe of the invention.
  • the linkage can also be carried out directly or by means of a linker peptide.
  • a linker peptide For the synthesis, the above-mentioned vector systems can be used, wherein those cDNA sequences of parts of the TN-R sequence, which are not spatially adjacent, are linked together via terminal restriction enzyme cleavage sites by customary technical methods.
  • the tenascin-R probe according to embodiments (1) to (4) preferably comprises the partial sequence of human TN-R comprising amino acid residues 1287-1358, more particularly the region corresponding to amino acid residues 1287-1358, 1120-1358, 1136 No. 1358 or 949-1358 in SEQ ID NO: 2.
  • a preferred aspect of (1) to (4) is that the probe has one of the amino acid sequences of this group or is composed of 2 or more of the amino acid sequences of that group in a fusion protein, also allowing the repetition of one or more of the sequences within the fusion protein is.
  • the invention also relates to the nucleic acids which comprise nucleic acid fragments which code for such proteins, preferably DNA sequences and cDNA.
  • the tenascin-R probe is human tenascin-R or a homologue / fragment thereof and obtainable either by human cell preparation or by recombinant production.
  • it is available as native TN-R from cells of neural origin, most preferably from SH-SY5Y neuroblastoma cells.
  • recombinant Production of specifically the TN-R fragments preferably takes place in appropriately transformed human FIp-In 293 cells.
  • a preferred aspect of embodiments (1) and (2) is the performance of the method as a one-step process and / or by selective substrate adhesion to the tenascin-R probe.
  • single cell suspensions obtained by enzymatic treatment of the desired central nervous tissue are seeded on plastic surfaces coated with TN-R proteins or protein fragments. After incubation, preferably for 8-20 h and preferably in serum-free medium (which prevents proliferation of astrocytic and microglial cells), pure oligodendrocyte populations are found on the immobilized TN-R substrates ( Figure 7). Other cell types are present in the cell culture supernatant and can be completely removed by changing the medium.
  • oligodendrocytes can be selected from a primary tissue on TN-R substrates.
  • isolation of oligodendrocytes from mixed glial cultures is associated with high loss of cells (eg shaking off the oligodendrocytes and microglia adhering to an astrocyte monolayer and further selection of microglial cells).
  • a comparative example may make this clear: in order to obtain a yield of 2-4 x 10 6 oligodendrocytes from P0-P2 rodent brains, selection on TN-R substrates from the tissue of only one brain is sufficient in only one step, whereas for culturing mixed glial cultures ten brains and at least 2 weeks of cultivation time are required.
  • the isolation method according to (1) and (2) according to the invention allows the isolation of complete oligodendrocyte populations and is thus also advantageous over immunological selection methods such as e.g. FACS, biomagnetic cell sorting or antibody panning. These allow only the accumulation of distinct oligodendrocyte populations; Oligodendroglial cells that are not recognized by the antibodies are lost.
  • immunological selection methods such as e.g. FACS, biomagnetic cell sorting or antibody panning.
  • the process according to the invention of (1) and (2) thus makes it possible to isolate oligodendrocyte populations, which are often sufficient for further experiments, from a single vertebrate, in particular a single rodent. This is particularly advantageous when certain effects are examined in mice, for example, in transgenic mice, knockout mice or test substances treated mice occur.
  • the primary tissues used as the starting material of the embodiment (1) and (2) may be composed of different CNS regions as well as different ones
  • CNS regions are the brain and individual brain regions (especially forebrain, cerebellum, hippocampus,
  • Developmental stages include embryonic, fetal, early / late postnatal and adult tissues, preferably early postnatal and adult tissues.
  • this cell contains one or more differentiation stages, preferably a single differentiation stage.
  • the primary neural tissues used to perform the method of (1) and (2) are from lower and higher vertebrates, including fish, amphibians, reptiles, birds and mammals, most preferably shark, carp, chicken, rodents, including mice and rat, bovine, porcine and human, most preferably rodent and human.
  • the TN-R probe for use in (1) and (2) is preferably derived from TN-R higher and lower vertebrates. Preferably, it is the native TN-R or a fragment of the native TN-R.
  • the recovery of single cell suspensions of primary tissue for use in the method according to embodiment (1) or (2) is carried out according to methods customary in the art.
  • the tissue can be transferred in one or more steps mechanically and / or enzymatically into tissue fragments and / or individual cells. Suitable methods are described in "Cell and Tissue Culture” (T. Lindl, Spektrum Akademischer Verlag, 2002) and “Current Protocols in Neuroscience” (John Wiley & Sons, Inc., 2004, J Crawley et al.).
  • the cells thus obtained are resuspended in serum-free medium and then contacted with the TN-R probe.
  • the non-adherent cells are removed.
  • the adhered cells may either remain adherent for further use or enzymatically, preferably by treatment with trypsin or trypsin-EDTA, Collagenase, dispase, pronase, Accutase ® or other suitable proteinases, in particular with Accutase ® , are replaced by the adsorbent.
  • Their further use includes the cultivation - also on other substrates or plastic surfaces or in other defined media - for the recovery of, for example, immature precursor oligodendrocytes or myelin-incompetent oligodendrocytes.
  • the method of (1) and (2) can be used regardless of whether the TN-R probe and the primary neural tissue are from organisms of the same species. Thus, isolation of oligodendrocytes across species boundaries is possible.
  • TN-R from various vertebrates can be used to select oligodendrocytes from single cell cultures of other species (Example 3, Figure 7). Among other things, this includes the selection of human, porcine, bovine, chicken, mouse, rat, frog and other higher vertebrate oligodendrocytes on TN-R from another species (including fish, chicken, mouse, rat, bovine, porcine, human, etc .).
  • the method according to (1) and (2) can furthermore be used independently of which differentiation stage (for example precursor-immature-mature oligodendrocytes) the selected cells are present. All cells of a cell type are selected, regardless of their stage of development.
  • the selection of defined cell populations from single cell suspensions according to (1) and (2) takes place in one aspect in that the cells bound to the TN-R probe are isolated and provided for further use.
  • the TN-R probe is a modified TN-R or a TN-R probe.
  • the TN-R probe in the latter aspect preferably comprises the FN
  • the tenascin-R probe is coupled to a support material by suitable methods for immobilization.
  • the immobilization can be covalent or noncovalent.
  • suitable immobilization methods include adequate coupling techniques, which include Do not alter the specificity of the tenascin-R probe, such as the covalent crosslinking of the protein with the support material or the immobilization by interaction with a suitable antibody.
  • the coupling preferably takes place noncovalently (Example 3), via an antibody or by covalent crosslinking.
  • carrier materials such as cell culture plates are coated with TN-R or with recombinantly produced TN-R fragments by the carrier material, preferably a plastic surface, with a Solution of the TN-R probe is incubated and then washed. Selective substrate adhesion is then used to isolate the purest cell populations from cell suspensions.
  • oligodendrocyte preparations were obtained from early postnatal rodent brains (Example 3): 2x10 6 oligodendrocytes from a P0-P2 rodent forebrain, 4-6x10 6 oligodendrocytes from a P5 rodent brain, 2x10 6 oligodendrocytes from a P7 -P8 Nagerkleinhirn. Similar results are possible with recombinantly produced tenascin R fragments.
  • the TN-R probe is immobilized on a plastic surface. This also allows the selective adhesion and isolation of defined cell populations, especially oligodendrocytes, but not other neural cells (such as astrocytes, microglia, or neurons) from the mixed cell populations used as starting material.
  • the immobilization is preferably carried out by direct contact of the TN-R probe with the carrier surface. After a sufficient incubation period (1-4 h), the unbound protein is washed off. The unoccupied binding sites on the surface are then blocked, e.g. by incubation with a BSA-containing blocking buffer.
  • the surfaces so coated may be kept moist until used or used after drying, with the use of non-dried surfaces being preferred.
  • TN-R probe in embodiment (3), native TN-R or a fragment of native TN-R is used. It is also possible to use a mixture of more than one TN-R probe for coating the carrier material.
  • the method according to embodiments (1) to (3) is for obtaining neural cells, in particular oligodendrocytes, for the growth of differentiated cells, in particular neural cells, in neurobiological and cell physiological Studies, in biological and clinical research and for diagnostic and therapeutic methods in vitro and in vivo, in particular for the manufacture of a medicament for cell therapy and for the therapy of neurodegenerative diseases suitable. Furthermore, it can be used to detect neurodegenerative diseases.
  • Embodiment (9) relates to antibodies, preferably monoclonal antibodies according to embodiment (10), which bind to TN-R in at least two species, preferably two vertebrates, preferably the monoclonal antibodies R4 and R6 (Ex. 5). These show in contrast to those described in Pesheva, P. et al. (J. Cell. Biol. 109: 1765-1778 (1989)) antibodies Rl and R2 cross-reactivity with various species / vertebrates.
  • R6 can be used to detect TN-R in all vertebrate classes (fish, amphibians, reptiles, birds and mammals, Figures 5A and 5B); R4 recognizes the protein only in higher vertebrate classes ( Figure 5A and Tab. 2).
  • R4 and R6 recognize protein epitopes on the TN-R molecule, i. they are still active after glycosidase digestion, which leads to the cleavage of the sugar residues of the protein.
  • the cross-activity with different species is conditioned by the method of preparation, namely that a suitable host organism is immunized with tenascin-R from at least two different species, preferably two different vertebrates, by conventional methods and isolated following screening and purification steps.
  • Suitable host organisms for the immunization are, in particular, non-human mammals such as rodents (mice, rats, etc.), rabbits, guinea pigs, goats, etc.
  • the antibodies according to embodiment (9) can be used in various immunochemical methods based on the detection and / or binding of TN-R (Table 2, Scope of application), in particular in ELISAs, Western blots, histological and cytological examinations and immunoprecipitations. They are also important in in vitro assays because their presence can neutralize the inhibitory effect of the TN-R protein on neuronal cell adhesion and axon growth (Figure 5C).
  • the antibodies react specifically with TN-R in brain extracts or purified TN-R and show no cross-reactivity with other TN proteins. The latter can be deduced from the fact that no reaction with heart or kidney (contained in mouse TN-W, Scherbich, A. et al., J.
  • Conditioned medium containing TN-X, Zweers, MC et al., Cell Tissue Res. 319: 279-287 (2005)
  • TN-C preparations from mouse brain takes place.
  • the reactivity of R4 and R6 is shown in FIG.
  • cross-reactivity of the antibodies of embodiment (9) is that R1, R2, R4, R5 and R6 react with TN-R of all higher vertebrates tested, and R1, R5 and R6 are reactive with all species tested (Table 2, Fig. 5B). The latter are therefore preferred in one aspect of embodiment (9).
  • R1, R2, R4, R5, and R6 recognize distinct protein epitopes on TN-R as evidenced by enzymatic removal of the N- and O-linked glycoconjugates and determination of topographical proximity of molecular epitopes by competitive ELISA. This also explains why the antibodies have different effects on the adhesion and neurite outgrowth of mouse neurons on TN-R containing substrate ( Figures 5C and D, Ex. 6). These in vitro assays indicate that epitopes recognized by R4, R5, and R6 (and partially R2) are involved in such processes. Therefore, preferred antibodies of embodiment (9) are antibodies directed against such epitopes.
  • the antibodies according to embodiment (10) can be produced by culturing the cell line according to embodiment (11).
  • the cell line embodiment (11) are in particular so-called hybridoma cell lines. These are e.g. by immunization of a suitable host organism with TN-R of at least two different species as described above, isolation of spleen cells of the host organism and subsequent fusion with suitable primary cells, e.g. Myeloma cells. Depending on the host organism and the origin of the primary cells are homo- or heterohybridoma cells, the former being preferred.
  • embodiment (10) of the invention under which R4, R5 and R6, in particular R4 and R6, as produced by the hybridoma cell lines DSM ACC2754 (tn-R4) and DSM ACC2753 (tn-R6), are particularly preferred.
  • the antibodies of embodiments (9) and (10) of the invention are useful not only for immunochemical detection of TN-R, but also for inhibiting the action of TN-R in vivo and in vitro.
  • the antibodies of embodiments (9) and (10) are further according to embodiment (14) for selectively targeting neural development in vivo and in vitro, for therapy and prophylaxis of traumatic nerve lesions and for the production of medicaments for the purposeful influencing of neural development and for the therapy and prophylaxis of traumatic nerve lesions.
  • Traumatic nerve lesions arise, for example, after mechanical nerve damage. Regeneration of the nerve fibers following such lesions is negatively affected by TN-R (Probstmeier, R. et al., J. Neurosci Res. 60: 21-36 (2000); Zhang, Y. et al., Mol. Cell.
  • the invention also relates to a method for the therapy and prophylaxis of traumatic nerve lesions and to the targeted influencing of neural development, comprising administering a suitable amount of antibody according to embodiment (9) or (10) to a patient receiving such a treatment requirement.
  • a suitable amount of antibody according to embodiment (9) or (10) to a patient receiving such a treatment requirement.
  • the amount of antibody administered and the dosage required will be determined by the treating physician on a case-by-case basis. It depends, inter alia, on the one hand on the age, body weight and the constitution of the patient, on the other hand on the nature and severity of the disease to be treated.
  • the kit according to embodiment (12) preferably contains the protein defined in embodiment (4) or a stock culture of the cell line for production of this protein.
  • This kit particularly preferably contains human tenascin-R or its fragments according to the invention and / or a stock culture of cells which are suitable for the recombinant production of these proteins.
  • a preferred aspect of embodiment (12) is a kit in which the tenascin-R probe is bound to a support material by an adequate coupling technique as described in the aspects of embodiment (3) and / or in which TN-R is further attached.
  • Antibody eg for checking the immobilization efficiency of the TN-R probe
  • one or more enzymatic solution (s) for cell dissociation optionally means for detecting the binding of cells to the tenascin R probe, buffer and / or culture media are included ,
  • the buffers and media include in particular blocking buffer and defined serum-free culture media.
  • the Kit-containing antibodies are preferably antibodies of embodiment (9) or (10).
  • TN-R fragment or TN-R fusion protein as defined in embodiment (4) is preferred.
  • a preferred use of the TN-R probe according to the invention is the use of the tenascin-R probe for obtaining oligodendrocytes according to embodiment (13).
  • a related aspect of embodiment (13) is the growth of differentiated cells from the cell populations so obtained. The differentiation-promoting effect of the native TN-R has already been described (Pesheva, P. et al., J. Neurosci 17: 4642-51 (1997)).
  • the fragments of the TN-R according to the invention can also have differentiation-promoting effects on oligodendrocytes of different maturity stages, in particular H-TNR-S3 and H-TNR-S6 (compare Example 2).
  • the diagnostic methods according to embodiment (13) can be performed in vivo and in vitro, but preferably in vitro.
  • a tenascin-R probe according to embodiment (4) in particular human tenascin-R or its fragments according to the invention, is preferably used.
  • the tenascin-R probe may have been purified from sources in which it naturally occurs, or may have been produced recombinantly.
  • a recombinant tenascin-R probe is used.
  • Neurodegenerative diseases associated with a loss of oligodendrocytes (by cell death) or myelin e.g. Multiple sclerosis (MS), characterized by the fact that in the affected regions remyelination can not take place or only to a small extent. This is largely due to the fact that the existing "traumatic" (ie altered as a result of the action of pathological stimuli) precursor and immature oligodendrocytes are unable to differentiate / remyelinate.
  • the invention offers approaches for new diagnostic and / or therapeutic methods:
  • TN-R probes For the diagnosis of MS, especially the fast (within 1-2 days) selection of "traumatic" cells on TN-R probes is suitable, preferably from an animal model or from biopsy samples of patients. This makes it possible to carry out direct investigations of their molecular profile and / or the development of diagnostic markers. For the development of a drug for cell therapy "traumatic" oligodendrocytes with different Drug candidates are treated to determine the influence of the latter on the "recovery of traumatic cells", or the remyelination potency of such cells.
  • the method according to the invention is also suitable for the selection of "normal" adult oligodendrocytes, which are cultivated under traumatic conditions in vitro (by addition of relevant cytokines or CSF samples of
  • oligodendrocytes can serve to develop diagnostic markers, and various stages of traumatic changes can also be detected.
  • the oligodendrocytes thus obtained are also suitable for screening for drug candidates that abolish cell death and / or a lack of myelinization competence of oligodendrocytes under traumatic conditions, or can be used as a drug for cell therapy in vivo.
  • a recombinant TN-R fragment in particular the C-terminus or a C-terminal fragment, v. A. the fragments H-TNR-S3 and / or H-TNR-S6 (see Example T), as a medicament or for the manufacture of a medicament for direct cell therapy in neurodegenerative diseases, especially multiple sclerosis possible.
  • a preferred aspect of embodiment (13) is thus the use of the tenascin-R probe for the diagnosis of multiple sclerosis (MS) and for the manufacture of a medicament against MS.
  • Another preferred aspect of embodiment (13) is thus the use of the tenascin-R probe for the manufacture of a medicament for cell therapy and therapy of neurodegenerative diseases associated with loss of oligodendrocytes or myelin, in particular multiple sclerosis and periventricular leukomalacia (PVL ).
  • Embodiment (16) relates to a method for cell therapy and therapy of neurodegenerative diseases associated with loss of oligodendrocytes or myelin, in particular multiple sclerosis and periventricular leukomalacia (PVL), comprising administering a pharmacologically acceptable Amount of TN-R probe to a patient in need of such treatment.
  • the amount administered and the dosage required will be determined by the treating physician on a case by case basis. It depends, inter alia, on the one hand on the age, body weight and the constitution of the patient, on the other hand on the nature and severity of the disease to be treated.
  • the method (17) for producing oligodendrocytes from isolated stem cells is preferably performed with neural or non-neural stem cells having a potential for sulfatide expression.
  • Particularly preferred isolated stem cells are progenitor cells of neural or hematopoietic origin.
  • human neural stem cells in the presence of TN-R can be selectively differentiated into mature oligodendrocytes (Example 7).
  • method (17) serves to differentiate immature oligodendrocytes in vitro.
  • immature oligodendrocytes morphologically differentiate under the influence of exogenous, substrate-bound TN-R of all vertebrates tested.
  • myeligenic expression is up-regulated, as evidenced by the rapid induction of MBP expression.
  • These effects are particularly pronounced when using TN-R from higher vertebrates.
  • the cellular response of the oligodendrocytes is believed to be mediated by TN-R interaction with sulfatidides and likely involves autocrine TN-R regulation (Pesheva, P. et al., J. Neurosci 17: 4642-4651 (1997)).
  • TN-R secretion by oligodendrocytes cultured on TN-R-containing substrate was increased by TN-R from higher vertebrates and slightly less by fish TN-R (Fig. 8B).
  • a TN-R concentration of at least 10 ⁇ g / ml is used for the differentiation of immature oligodendrocytes in vitro on TN-R coated surfaces.
  • a TN-R concentration of at least 20 ⁇ g / ml is particularly preferred.
  • the method (17) is preferably carried out with TN-R of higher vertebrates, particularly preferably with a TN-R probe according to the invention, very particularly preferably with native TN-R or a TN-R fragment or fusion protein of embodiment (4).
  • hybridoma cell lines tn-R4 producer of the antibody R4
  • tn-R6 producer of the antibody R6
  • 1% (w / v) trypsin solution 1% (w / v) trypsin (cell culture tested), 0.1% (w / v) DNase I, 1mM EDTA, 0.8mM MgSO 4 , 10mM HEPES in HBSS (Ca / Mg-free).
  • DNase solution 0.05% (w / v) DNase I, 10mM HEPES in BME (Basal Medium Eagle).
  • DMEM serum-free medium
  • insulin 10 ⁇ g / ml
  • progesterone (0.06 ⁇ g / ml)
  • triiodothyronine (0.34 ⁇ g / ml
  • L-thyroxine 0.52 ⁇ M
  • Putrescine (16 ⁇ g / ml)
  • sodium selenite (0.22 ⁇ M)
  • transferrin 0.1 mg / ml
  • HEPES 25 mM
  • gentamycin 25 ⁇ g / ml
  • penicillin 100 units / ml
  • streptomycin 0.1 mg / ml
  • Blocking buffer 2% (w / v) BSA (bovine serum albumin, fatty acid-free) in PBS (150 mM NaCl, 8 mM Na 2 HPO 4 , 17.4 mM NaH 2 PO 4 ), pH 7.2, heat-inactivated (for 20 Minutes at 7O 0 C).
  • BSA bovine serum albumin, fatty acid-free
  • Tissue extracts and Western blot Tissue samples in PBS or TES (.. See example 1) were homogenized X-100 with or without 1% Triton® for 2 h at 4 0 C. All buffers contained spermidine and protease inhibitors (see Example 1). Insoluble material was separated by sedimentation. Tissue extracts from fish (50 ⁇ g protein / lane) and other vertebrates (20 ⁇ g protein / lane) were separated by SDS-PAGE under reducing conditions over 7% polyacrylamide gels and either Siber-stained or analyzed by Western blot with TN-R specific antibodies.
  • Enzymatic treatment of TN-R For the enzymatic removal of N-linked oligosaccharides, purified TN-R proteins with N-glycosidase F or H (Roche Diagnostics) treated as described (Pesheva, P. et al., J. Cell Biol. 109: 1765-1778 (1989)). For the enzymatic removal of O-linked GAGs, the NT-R proteins were treated with chondroitinase ABC or heparinase (Sigma) as described (Probstmeier, R. et al., Brain Res. 863: 42-51 (2000)).
  • Cell Cultures Primary cultures of cerebellar neurons (in serum-free Fischer medium, Pesheva, P.
  • oligodendrocytes in serum-free Sato medium, Pesheva, P. et al. Neurosci 17: 4642-4651 (1997)
  • skin fibroblasts in DMEM 10% FCS
  • cerebellar neurons IxIO 6 cells / ml were cultured on the test substrates in a serum-free Fischer medium.
  • Example 1 Immunoaffinity Chromatography of TN-R Proteins The purification of TN-R proteins from adult brain (shark, carp, chicken, mouse, rat, bovine, porcine, human) was carried out by immunoaffinity chromatographic methods ( Figure 6).
  • the starting tissue with a urea-containing buffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, IM urea, pH 7.9, including 1 mM spermidine and the following protease inhibitors: l ⁇ M aprotinin, 5 uM SBTI (trypsin inhibitor Soybean), 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), iodoacetamide (19 ⁇ g / ml), Type III trypsin inhibitor from egg white (10 ⁇ g / ml)) for 2 h at 4 0 C digested and then pelleted insolubles for 30 minutes at 30,000 g.
  • a urea-containing buffer 20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, IM urea, pH 7.9, including 1 mM spermidine and the following protease inhibitors: l ⁇ M
  • the supernatant was precipitated with 40% (w / v) ammonium sulfate and precipitated portions collected by a centrifugation step at 30,000 g.
  • the precipitate was subsequently dissolved in 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, pH 7.2, and dialyzed against the same buffer. Undissolved portions were removed by centrifugation at 100,000 g and 40 ° C. for one hour.
  • TES buffer 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 7.4; 1 mM spermidine, and including the protease inhibitors mentioned above
  • Not dissolved fractions were then g by a one-hour centrifugation at 100,000 and 4 0 C removed.
  • the supernatant from the last centrifugation step was then used for the further immunoaffinity chromatographic purification of TN-R proteins. For this, the supernatants were passed over column matrices to which monoclonal TN-R antibodies were bound.
  • R1, R2 Pesheva, P. et al., J. Cell Biol. 109: 1765-1778 (1989)
  • R4 or R6 see Example 5
  • These antibodies were coupled to CNBr-activated Sepharose ® 4B. After passage of the centrifugation supernatants antibody columns were first washed with 20 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5 M NaCl, 0.5% (v / v) Triton ® X-100, pH 7.2, then washed with PBS (phosphate buffered saline, pH 7.2).
  • PBS phosphate buffered saline, pH 7.2
  • the TN-R proteins bound to the antibodies were dissolved from the column with a basic elution buffer (0.1 M diethylamine, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 11.2). The eluate was immediately neutralized and dialysed against PBS.
  • a basic elution buffer 0.1 M diethylamine, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 11.2
  • the human TN-R protein is composed of several distinct domains (Carnemolla, B. et al., J. Biol. Chem. 271: 8157-60 (1996)). Starting with a cysteine-rich region at the N-terminus, followed by 4.5 EGF-like domains and 8 FN HI-like domains (where between the 5th and 6th domains another may be present with corresponding alternative splicing, what then 9 FN III-like domains), the molecule terminates at the C-terminus with a fibrinogen-like domain.
  • the published human TN-R sequence comprises 4716 bases (SEQ ID NO: 1; NCBI nucleotide NM_003285) with 9 FN HI-like domains. Of this, the coding region of the section between bases 82 to 4158, the signal peptide (for the secretion of the TN-R protein), the base region 82 to 150.
  • the signal peptide for the secretion of the TN-R protein
  • the base region 82 to 150 For the production of recombinant eukaryotic TN-R protein fragments expressed subsequent DNA sequences corresponding to individual Domain ranges selected:
  • SEQ ID NO: 3 upstream: TCC ATG ATC AAG CCT TCA GAG TG (bp 151-173)
  • SEQ ID NO: 4 downstream: AGG GGC AAC TGC TGA GCA GT (bp 1046-1065)
  • SEQ ID NO: 5 upstream: TCA GCA GTT GCC CCT CCA GAG G (bp 1051-1072)
  • SEQ ID NO: 6 downstream: ATG AGG GAA CAC CCG GCC TCC (bp 3463-3483) (product length: 2433 bp)
  • SEQ ID NO: 7 upstream: ATC ACC TCC ACC GCT TTC ACC (bp 3439-3459)
  • SEQ ID NO: 8 downstream: GAA CTG TAA GGA CTG CCG TTT TCT (bp 4132-4155)
  • SEQ ID NO: 9 upstream: TCC ATG ATC AAG CCT TCA GAG TG (bp 151-173)
  • SEQ ID NO: 10 downstream: GCC GTC AAT GAC TGT GGA GAC (bp 1579-1599)
  • H-TNR-S5 SEQ ID NO: 11 upstream: GCC AGC GTC TCC ACA GTC ATT G (bp 1573-1594)
  • SEQ ID NO: 12 downstream: GTT GTC CAT GGC TGT GTG CAC A (bp 2925-2946)
  • SEQ ID NO: 13 upstream: GTG CAC ACA GCC ATG GAC AA (bp 2926-2945)
  • SEQ ID NO: 14 downstream: GAA CTG TAA GGA CTG CCG TTT TC (bp 4133-4155)
  • the PCR fragments obtained were, with the aid of the TOPO TA cloning system (Invitrogen), which makes use of the protruding A residues of the PCR products when using Taq polymerase, according to the manufacturer's instructions in the pcsecTag / FRT / V5-His-TOPO Vector (Invitrogen) cloned.
  • This vector after stable integration into eukaryotic Flp-In cell lines (see below), allowed the secretion of the desired protein fragment at the C-terminus with a 6xHis peptide into the cell culture supernatant.
  • PolyHis Wearing Protein fragments were purified by nickel chelate chromatography from collected cell culture supernatants.
  • FIp-In 293 cells As producers of protein fragments, FIp-In 293 cells (Invitrogen) derived from the human kidney cell line HEK 293 were used. In FIp-In cells, the plasmid pFRT / lacZeo (Invitrogen) is stably integrated. This vector contains an FRT region specifically recognized by the Flp recombinase.
  • Example 3 Selective purification of oligo-dendrocytes from mammalian CNS tissue using native tenascin-R
  • postnatal mouse brains (either whole brain or isolated forebrain and cerebellar regions or preparations of the optical nerve) of the age groups postnatal day 0 (PO) to adult were used.
  • Isolated brain areas were treated with 0.5 to 1% (w / v) trypsin solution after mechanical comminution according to their origin or age (PO to P2 brains with 0.5% (w / v) trypsin solution for 12 min at room temperature ( RT), P5 brains with 1% (w / v) trypsin solution for 15 min at RT, P8 brains with 1% (w / v) trypsin solution for 20 min at RT and adult brains with 1% (w / v) trypsin solution for 30 min at RT).
  • the portions of tissue were, after addition of a larger volume of HBSS at 600 g pelleted for 10 minutes at 4 0 C.
  • the pelleted pieces of tissue were taken up in DNase solution and repeatedly pipetted up and down in a Pasteur pipette with a constricted tip diameter.
  • the resulting crude cell suspension was diluted in a 5-10 fold volume of serum-free medium (supplemented with 0.2% (w / v) heat-inactivated bovine serum albumin) and incubated on ice for 5 minutes.
  • the single-cell suspension containing supernatant was added at 600 g for 10 min at 4 0 C centrifuged and resuspended the pelletized single cells in serum-free medium.
  • the individual cell suspensions thus obtained contained all the cell types present in the corresponding brains / brain areas (neurons, astrocytes, oligodendrocytes, microglia, meningial and endothelial cells).
  • the single cell suspensions (2x10 6 cells / ml in serum-free medium) presented in the last section were plated on tenascin-R protein coated cell culture dishes (see below) and incubated for 8-20 hours in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) cultivated. Non-adherent cells were rinsed away with HBSS and cultured adherent cells in serum-free medium.
  • the cells adhering to TN-R substrates were incubated with a GalC-specific monoclonal mouse antibody (Ol, Bansai, R. et al., J. Neurosci. Res. 24: 548-557 (1989)) (30 min at RT). After fixing the cells with 4% (v / v) paraformaldehyde in PBS for 10 min at RT, binding of the ol antibody to the cells was achieved by incubation with cyanine-3 or FITC-coupled anti-mouse Ig antibodies (20 min RT) detected by fluorescence microscopy. On the substrate remained 99 +/- 1% GalC-stained cells, so only oligodendrocytes (Figure 7, bottom line).
  • GalC-specific monoclonal mouse antibody Ol, Bansai, R. et al., J. Neurosci. Res. 24: 548-557 (1989)
  • the cells obtained by this single step process was detached from the substrate for other uses by treatment with Accutase ® (Sigma) and are further cultivated on other substrates / plastic surfaces or at other defined media for the production of, for example, immature progenitor oligodendrocytes or myelin competent oligodendrocytes.
  • substrates from Tenascin-R proteins / protein fragments plastic surfaces (cell culture dishes, flasks, etc.) were incubated with the corresponding proteins / protein fragments (20-40 ⁇ g / ml in PBS) for 1-2 h at 37 ° C.
  • TN-R proteins from shark, carp, chicken, mouse, rat, bovine, porcine or human could be used for the production of TN-R substrates to obtain pure oligodendrocyte populations. At least the substrates made from rodent TN-R can also be dried after coating, without losing the specific adhesive properties of TN-R proteins for oligodendrocytes.
  • Example 3 For the selection of pure oligodendrocyte populations from CNS tissue with the help of recombinantly produced TN-R fragments are essentially described in Example 3 steps for the recovery of single cell suspensions postnatal brain tissue and for selection of oligodendrocytes on TN-R fragment-coated cell culture dishes from the cell suspension under serum-free culture conditions.
  • the oligodendroglial cells obtained by this one-step method can be detached from the substrate for further uses and further propagated or examined on other substrates or under other culture conditions.
  • plastic surfaces are coated with the corresponding protein fragments derived from the C-terminus of the human TN-R, which contain amino acid sequences of the FNG domains and / or parts thereof (10-20 ⁇ g / ml in PBS for 2 h at 37 ° C).
  • the corresponding TN-R fragments are covalently coupled to the carrier, for example by an N-alkyl carbamate bond of amino groups of the protein fragment a 1,1 '- carbonyldiimidazole-activated matrices (ie plastic surfaces or biopolymers).
  • the substrate carriers are then washed with PBS, incubated with blocking buffer (1 h at 37 ° C.) and finally washed again with PBS.
  • the monoclonal TN-R antibodies R4, R5 and R6 were prepared by immunization with an equimolar mixture of chicken TN-R and human TN-R as antigen in BALB / c mice (3 subcutaneous injections at 2-week intervals with 5 ⁇ g protein / mouse).
  • the TN-R proteins mentioned were previously obtained from adult brain tissue by immunoaffinity chromatographic purification over column matrices to which R2 antibodies were coupled.
  • Hybridoma clones obtained by the fusion of mouse spleen cells derived from mice immunized with these TN-R proteins with mouse myeloma cells (myeloma cell line P3X63 / Ag8) were screened in chicken, mouse and human TN-R ELISA assays.
  • microtiter plates were coated with mouse or an equimolar mixture of chicken and human TN-R (0.5 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 overnight at 4 ° C.) and incubated with hybridoma cell supernatants (2 h at 37 ° C.) ). The bonds of the cross-reactive present in these supernatants Antibody was detected by incubation with peroxidase-linked anti-mouse Ig antibodies.
  • the specificity of positive hybridoma clones for TN-R was independent of the origin of the TN-R protein, as demonstrated by further ELISA and Western blot analyzes of immunoaffinity-purified TN-R proteins and brain extracts.
  • the purification of the antibodies was carried out by separating the supernatants of the hybridoma cultures on protein G Sepharose columns (Amersham).
  • the results for R1, R2, R4, R5 and R6 are summarized in Tab.
  • Rl recognized only the 180 kD form of the TN-R protein. None of the antibodies reacted with other ECM proteins besides TN-R (such as TN-C, fibronectin, laminin, vitronectin, or collagens, see Figure 5E). R4 and R6 were still active after cleavage of the sugar residues from the TN-R proteins by glycosidase digestion, so they recognized protein nepitopes on the TN-R molecule. Table 2 summarizes the results of several ELISA and Western blot analyzes: while R2 and R4 respond primarily to TN-R of higher vertebrates, R1, R5 and R6 recognize all vertebrate species tested.
  • Rl recognizes mainly the 180 kD form.
  • the antibodies can be used in various immunochemical procedures (Table 2).
  • R2, R4, R5 and R6 interfere in vitro with the inhibitory effect of TN-R on neuronal cell adhesion and axon growth by neutralizing this effect ( Figures 5C and 5D).
  • TN-R for short and long-term adhesion tests, either TN-R alone, TN-R in a mixture with other ECM proteins or protein fragments, or a TN-R layer on PLL substrate were prepared as described (Pesheva, P. et al., Neuron 10: 69-82 (1993); Pesheva, P. et al., J. Cell, p.107: 2323-2333 (1994)).
  • laminin was mixed with BSA (control protein) or TN-R (ratio 20: 20 .mu.g / ml for each protein) is applied as a coating in cell culture dishes and incubated for 60 min at 37 0 C.
  • TN-R alone (20 ⁇ g / ml in PBS) or BSA or TN-R mixed with laminin, fibronectin or fibronectin fragments (20:20 ⁇ g / ml ratio for each protein) were layered on plastic cell culture dishes and incubated at 37 ° C for 60 min.
  • cultured cells (see above, cell cultures) were detached from the cell culture dish by mild treatment with Accutase® (PAA Laboratories, 10 min at RT) or 0.01% trypsin (Sigma, 5 min at RT). Then single cell cultures (IxIO 6 cells / ml) were plated in the appropriate medium on the test substrates.
  • Human neural stem cells (Cambrex, human neural progenitors: PT-2599; 3xlO 6 cells / ml) were as Neurospheroide in NPMM (Neural Progenitor Maintenance medium, Cambrex, CC-3209) for 7 days (at 37 0 C and 5% CO 2 ) in cell culture flasks (T-75). The medium was changed every 2-3 days.
  • the neurospheroids containing stem cells were plated out on laminin (20 ⁇ g / ml) coated cell culture dishes (1-2 neurospheroids / dish) and cultivated in a defined serum-free medium (DMEM / Ham 's F12, N2 supplement (Invitrogen), 50 ng / ml bFGF, 10 ng / ml PDGF) for a minimum of 7 days. The medium was renewed every 2 days in half. These culture conditions led to pre-programming of the neural stem cells into a dominant glial phenotype (detectable by the expression of sulfatidides).
  • DMEM / Ham 's F12, N2 supplement (Invitrogen) 50 ng / ml bFGF, 10 ng / ml PDGF
  • the cells were then detached from the cell culture dishes by treatment with Accutase® (PAA, 10 min at RT), in a defined medium (IxIO 6 cells / ml in DMEM, N2 supplement, 10 ng / ml T3 (triiodothyronine, Sigma)) and plated on poly-D-lysine (PDL, Sigma) or on PDL and TN-R (20 ⁇ g / ml) coated cell culture plates. The subsequent incubation at 37 ° C.
  • PDA poly-D-lysine

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von neuralen Zellen unter Verwendung von Tenascin-R-Verbindungen, besonders für dieses Verfahren geeignete Tenascin-R-Fragmente und Tenascin-R-Fusionsproteine, die rekombinante Herstellung dieser Tenascin-R-Verbindungen, sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens und die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung hochreiner neuraler Zellpopulationen. Die Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die für die Detektion und Isolation von Tenascin-R-Verbindungen geeignet sind.

Description

05273 lwo/JH/PCH
Verfahren zur Isolierung neuraler Zellen mit Tenascin-R-Verbindungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von neuralen Zellen unter Verwendung von Tenascin-R-Verbindungen, besonders für dieses Verfahren geeignete Tenascin-R-Fragmente und Tenascin-R-Fusionsproteine, die rekombi- nante Herstellung dieser Tenascin-R-Verbindungen, sowie einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens und die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung hochreiner neuraler Zellpopulationen. Die Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die für die Detektion und Isolation von Tenascin-R-Verbindungen geeignet sind.
Hintergrund der Erfindung
Bei der Kontaktaufnahme von Zellen mit dem sie umgebenden extrazellulären Milieu kann es zu vielfältigen Antworten der Zelle kommen, die von Abstoßung und Vermeidung des Milieus auf der einen bis zur stabilen Zelladhäsion auf der anderen Seite reichen können. Das Wechselspiel zwischen Komponenten der extrazellulären Umgebung, der Extrazellulärmatrix, einerseits, und auf der Zelloberfläche vorhandenen Rezeptoren für solche Komponenten andererseits, bildet die Grundlage für viele entwicklungsbiologische Prozesse, die für eine Zelle unter anderem durch Proliferations-, Migrations- oder Differenzierungsverhalten gekennzeichnet sind. Solch zelluläres Verhalten führt auf Organismenebene zur Musterbildung oder auf Gewebe- oder Organebene zur Neubildung als Folge einer Verletzung (Boudreau, N. J., Jones, P. L., Biochem. J. 339:481-488 (1999); Sobeih, M. M., Corfas, G., Int. J. Dev. Neurosci. 148:971-84 (2002); Schmid, R. S., Anton, E. S., Cereb. Cortex. 13:219-24 (2003)). Im Zentralnervensystem (ZNS) korreliert die regulierte Expression von Extrazellulärmatrixkomponenten wie Chondroitin- sulfat-Proteoglykanen oder Proteinen der Tenascin-Familie mit biologischen Prozessen, welche sowohl die Adhäsion und Migration von Neuronen, die Navigation von Axonen, die Synapsenbildung und -plastizität, die Wirkung von Wachstumsfaktoren und Cytokinen als auch das Überleben von Neuronen und die strukturelle Organisation der Extrazellulärmatrix umfassen (Dow, K. E., Wang, W., Cell Mol. Life Sei. 54:567-81 (1998); Wright, J. W. et al., Peptides 23:221-46 (2002); Grimpe, B., Silver, J., Prog. Brain Res. 137:333-49 (2002); Bosman, F. T., Stamenkovic, L, J. Pathol. 200:423-8 (2003)). Tenascin-R (TN-R) (ehemals als Jl-160/180, Janusin oder Restrictin bezeichnet) ist ein Mitglied der Tenascin-Familie von Extrazellulärmatrixproteinen, das exklusiv im ZNS von Vertebraten auftritt und dort von Oligodendrozyten und manchen Gruppen von Neuronen, i.e. Motoneurone und Interneurone, während späterer Entwicklungsstadien und im erwachsenen Zustand exprimiert wird (Pesheva, P., Probstmeier, R., Prog. Neurobiol. 61:465-93 (2000); Scherberich, A. et al., J. Cell Sei. 117-571-81 (2004)). Das Protein tritt in zwei molekularen Formen auf, mit Molekulargewichten von 160 kD (TN-R 160) oder 180 kD (TN-R 180). TN-R findet sich im Gewebe primär in Assoziation mit Oligodendrozyten, myelinisierten Axonen, perineuronalen Netzen von Moto- und Interneuronen, sowie dendriten- und synapsenreichen Regionen.
TN-R ist aus vier unterschiedlichen Domänenstrukturen aufgebaut (Fig. 1). Der N- Terminus, dessen Sequenz nur in Tenascin-Proteinen vorkommt, enthält ein Cystein-reiches Segment (Cys-rich), und wird gefolgt von viereinhalb EGF- ähnlichen Segmenten (EGF-like) sowie 9 Fibronektin Typ III (FN III)-ähnlichen Domänen (von denen die 6. Domäne alternativ gespleisst werden kann). Den C- Terminus des TN-R Proteins bildet eine globuläre, Fibrinogen-ähnliche Domäne (FNG). Einzelne TN-R Polypeptidketten sind an ihren N-Termini über Disulfidbrücken miteinander verbunden und bilden so Homotrimere (TN-R 180) oder -dimere (TN-R 160), wobei letztere durch proteolytische Spaltung von TN-R 180 nahe des N- Terminus entstehen (Woodworth, A. et al., J. Biol. Chem. 279: 10413-21 (2004)).
Die Funktionsweite von TN-R umfasst die molekulare Kontrolle neuraler Zelladhäsion, Migration und Differenzierung (von der Axonnavigation Fortsätze bildender Neuronen bis zur Reifung myelinbildender Oligodendrozyten) während normaler entwicklungsbiologischer Vorgänge sowie regenerativer Prozesse nach Verletzung im erwachsenen Gehirn (Pesheva, P., Probstmeier, R., Prog. Neurobiol. 61:465-93 (2000); Chiquet-Ehrismann, R., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 36:986-90 (2004)). TN-R wirkt u.a. als adhäsives oder antiadhäsives Molekül, als Differenzierungsfaktor für Oligodendrozyten, oder als "Stopmolekül" für wachsende Axone. Diese Eigenschaften sind von den entsprechenden Rahmenbedingungen abhängig: dem jeweiligen Zelltyp, dem Vorhandensein zellulärer Rezeptoren und Signalkaskaden, der räumlichen Verteilung und der posttranslationalen Modifikation des TN-R Glykoproteins. Einige der zellulären Rezeptoren von TN-R, die identifiziert wurden (F3/F11, Disialoganglioside, Sulfatide), induzieren unterschiedliche zelluläre Wirkmechanismen, die einerseits bei der Musterbildung während der Ontogenese, andererseits bei regenerativen Prozessen von Bedeutung sind (Angelov, D. et al., J. Neurosci. 18:6218-29 (1998); Probstmeier, R. et al., J. Neurosci. Res. 60:21-36 (2000); Montag-Sallaz, M., Montag, D., Genes Brain Behav. 2:20-31 (2003); Saghatelyan, A. et al., Nat. Neurosci. 7:347-56 (2004); Brenneke, F. et al., Epilepsy Res. 58: 133-43 (2004)). Die beiden wesentlichen Effekte von TN-R auf das Verhalten neuraler Zellen sind die Inhibition der Zelladhäsion und des Neuritenwachstums einerseits und die Förderung der Oligodendrozytenadhäsion und -differenzierung andererseits. Letztere erfolgt vermittelt durch Sulfatide und bewirkt letztendlich Oligodendrozytenmigration und Myelinisierung/Remyelini- sierung. Erstere kann entweder substratunabhängig erfolgen (vermittelt durch F3/F11 und andere, noch unbekannte Faktoren), oder Substrat/Integrin-abhängig (vermittelt durch Fibronektin und GD2/GD3). Die inhibitorische Wirkung von TN-R hat letztlich einen Einfluss auf die neurale Zellmigration, das räumlich koordinierte Axonwachstum und die Synaptogenese, oder sie trägt unter Verletzungsbedingungen zur Verhinderung der Axon-Regeneration und der Adhäsion aktivierter Mikroglia in einer TN-R-reichen Umgebung bei.
Einige neurale Rezeptoren und intrazelluläre Signalwege, die die Wirkung von TN-R in neuronalen und glialen Zellen vermitteln, sind bekannt, ebenso konnten molekulare Komponenten identifiziert werden, die an der Expression von TN-R durch Oligodendrozyten und Motoneurone beteiligt sind (Tab. 1; Pesheva, P. et al., Prog. Brain Res. 132: 103-14 (2001)).
Tab.l: Für TN-R identifizierte zelluläre Rezeptoren und Liganden der Extrazellulärmatrix. In der rechten Tabellenhälfte sind die für die jeweilige Interaktion relevanten Domänen von TN-R angegeben; CS GAG: Chondroitinsulfat- Glykosaminoglykane; EGF-L: EGF-ähnliche Segmente und Cystein-reiches Segment.
Figure imgf000005_0001
Als aus mehreren Domänen aufgebautes Extrazellulärmatrixprotein erscheint eine Aufteilung der distinkten biologischen Funktionen auf distinkte Domänenbereiche und/oder distinkte Glykostrukturen von TN-R nahe liegend (Fig. 1). Es ist bekannt, dass aus adultem Nagergehirn aufgereinigte TN-R Proteine die Adhäsion und Fortsatzbildung von aus früh postnatalem Gehirn isolierten O4/Sulfatid-positiven Oligodendrozyten fördern (Fig. 3; Pesheva, P. et al., J. Neurosci. 17:4642-51 (1997)). Diese Vorgänge werden durch Sulfatide vermittelt, einer Gruppe von in der Zellmembran von Oligodendrozyten vorkommenden Glykolipiden. Eine wichtige Konsequenz der Interaktion von TN-R mit Sulfatid-exprimierenden Oligodendrozyten ist eine Stimulierung der Reifung dieser Zellen; i.e. die vermehrte Expression myelinspezifischer Proteine und Glykolipide, was eine Sulfatid-vermittelte Wirkungsweise des Differenzierungspotentials von TN-R auf Oligodendrozyten nahe legt (Fig. 4; Pesheva, P. et al., J. Neurosci. 17:4642-51 (1997)).
EP 0759987, US 5,635,360, US 5,681,931 und US 5,591,583 beschreiben humanes TN-R und dessen immunologischen Nachweis unter Verwendung von Antikörpern gegen ein Proteinfragment, welches den Nukleotiden 2686-3165 der cDNA-Sequenz und somit den FN III-Domänen 6 und 7 des humanen TN-R entspricht. Die frühesten Stadien sich entwickelnder Gliazellen finden sich in Säugern im Rückenmark in ventralen Bereichen des Neuralrohrs, im Gehirn in den ventrikulären Zonen des Vorderhirns. In diesen Regionen proliferieren erste Vorläuferzellen von Oligodendrozyten, die durch eine einfache Morphologie und die Expression des Disialogangliosids GD3 und/oder von 04 Antigenen gekennzeichnet sind, und wandern in der Folgezeit in Bereiche der später entstehenden weißen Substanz ein (Miller, R. H. Prog. Neurobiol. 67:451-67 (2002); Noble, M. et al., Dev. Biol. 265:33-52 (2004); Liu, Y. Rao, M. S., Biol. Cell. 96:279-90 (2004)). Dort werden die Zellen postmitotisch und differenzieren in reife Oligodendrozyten mit einer komplexen Morphologie. Dieser Reifungsprozess korreliert mit der Expression myelinspezifischer Lipide (Sulfatide und Galactocerebroside) und Proteine (MBP, MAG, und PLP). Die Entstehung, das Überleben und die Differenzierung von Oligodendrozyten in myelinbildende Zellen werden über verschiedene Wachstumsfaktoren (bFGF, PDGF, CNTF, IGF-I, NT-3), Hormone und Extrazellulärmatrixmoleküle (Thyroidhormone, Retinolsäure, TN-R) reguliert (Dubois-Dalcq, M., Murray, K., Pathol. Biol. (Paris) 48:80-6 (2000); Kagawa, T. et al., Microsc. Res. Tech. 52:740-5 (2001); Noble, M. et al., Dev. Neurosci. 25:217-33 (2003)).
Da insbesondere für gliale Zellen (wie Oligodendrozyten und neurale Stammzellen) keine adäquaten Modellsysteme in Gestalt von Zelllinien vorhanden sind, muss zu ihrer Gewinnung sowohl in der Grundlagenforschung als auch im Rahmen potentieller diagnostischer/therapeutischer Anwendungsbereiche bisher auf relativ zeitaufwendige und niedrig effiziente Anreicherungsverfahren von Primärzellen zurückgegriffen werden. Diese Verfahren ermöglichen außerdem oftmals nur die Herstellung angereicherter Mischzellpopulationen. Die bisherigen Verfahren zur Isolierung definierter Zellpopulationen nutzen unterschiedliche Techniken wie Dichtegradientenzentrifugationen oder immunologische Verfahren (Fluorescence- activated cell sorting, biomagnetic cell sorting, Antikörper- und Komplementvermittelte Zelltötung, Antikörper-Panning) (Luxembourg, A. T. et al., Nat. Biotechnol. 16:281-5 (1998); Uchida, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 14720-5 (2000); Nistri, S. et al., Biol. Proced. Online 4:32-37 (2002); Nunes, M. C. et al., Nat. Med. 9:439-47 (2003); Vroemen, M., Weidner, N., J. Neurosci. Methods 124: 135-43 (2003)). Solche Verfahren sind nicht sehr effizient und ergeben nur eine unvollständige Anreicherung (durch Dichtegradientenzentrifugationen sind z.B. nur Anreicherungen distinkter Zellpopulationen möglich), oder sie sind zeitintensiv und/oder hohen Zellverlusten begleitet (wie bei immunologischen Verfahren). Dies gilt insbesondere für Oligodendrozyten, die bisher durch eine mehrwöchige Kultivierung gemischter glialer Kulturen (McCarthy, K. D., DeVeINs, J., J. Cell Biol. 85:890-902 (1980); Kramer, E. M. et al., J. Biol. Chem. 274:29042-9 (1999); Testai, F. D. et al., J. Neurosci. Res. 75:66-74 (2004)) oder über mehrere Selektionsschritte mit Hilfe von Fluorescence-activated/biomagnetic cell sorting oder Antikörper-Panning gewonnen werden (Scarlato, M. et al., J. Neurosci. Res. 59:430-5 (2000); Tang, D. G. et al., J. Cell Biol. 148:971-84 (2000); Diers-Fenger, M. et al., GNa 34:213-28 (2001); Crang, A. J. et al., Eur. J. Neurosci. 20: 1445-60 (2004)).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Isolierung definierter Zellpopulationen aus Primärgeweben, insbesondere solchen neuralen Ursprungs, ist nach den bislang bekannten Methoden aufwändig und zeitintensiv, und als Ergebnis werden häufig nur wenig angereicherte Zeilmischpopulationen erhalten. Es wurde nun gefunden, dass gereinigte TN-R Proteine die stabile Adhäsion von Oligodendrozyten unterschiedlicher Reifestadien unterstützen und auf neuronale und mikrogliale Zellen antiadhäsiv wirken. Dieses ermöglicht die Isolierung und Reinigung definierter Zellpopulationen aus neuralem Primärgewebe, insbesondere zur direkten selektiven Aufreinigung von Oligodendrozyten aus gemischten neuralen Zellpopulationen. Es wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, das es ermöglicht, in einem einzigen Reinigungsschritt eine hochreine definierte Zellpopulation, insbesondere eine Oligodendrozytenpopulation, aus Primärgewebe neuralen Ursprungs zu isolieren.
Die Erfindung betrifft im Einzelnen (1) ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von neuralen Zellen aus neuralem Primärgewebe von Vertebraten, umfassend die Selektion der Zellen aus einer Einzelzellsuspension mittels einer Tenascin-R-haltigen Sonde (nachfolgend auch "Tenascin-R-Sonde"), welche Tenascin-R-Verbindungen ausgewählt aus nativem Tenascin-R (nachfolgen kurz "TN-R") sowie Homologen und Fragmenten desselben und Fusionsproteine derartiger Verbindungen umfasst;
(2) eine bevorzugte Ausführungsform des vorstehend definierten Verfahrens (1), wobei
(i) das native Tenascin-R humanes Tenascin-R ist und/oder die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besitzt oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante derselben ist; und/oder
(ii) das Tenascin-R-Fragment den C-Terminus von nativem Tenascin-R oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante desselben umfasst, besonders denjenigen Bereich, der durch die Nukleotide 3940-4155 der SEQ ID NO: 1 kodiert wird, insbesondere einen derjenigen Bereiche, die durch die Nukleotide 2926-4155, 3439-4155, 3487-4155 oder 3940-4155 von humanem TN- R der SEQ ID NO: 1 kodiert werden; und/oder
(iii) das Tenascin-R-Fragment die Aminosäurereste 1287 bis 1358 der SEQ ID NO:2, bevorzugt eine oder mehrere der Teilsequenzen des humanen TN-R ausgewählt aus den Aminosäuren 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 oder 949- 1358 in SEQ ID NO:2 oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante derselben umfasst; und/oder (iv) das Tenascin-R-Fusionsprotein eine Tenascin-R-Komponente, umfassend natives Tenascin-R, ein Tenascin-R- Fragment oder eine Tenascin-R-Mutante, insbesondere wie vorstehend unter (i) bis (iii) beschrieben, und eine funktionelle Komponente, umfassend weitere funktionelle Peptide oder Proteine, aufweist oder aus zwei oder mehr, bevorzugt zwei oder drei funktionellen Tenascin-R- Komponenten wie vorstehend definiert zusammengesetzt ist;
(3) eine bevorzugte Ausführungsform des vorstehend definierten Verfahrens (1) oder (2), wobei (i) die Tenascin-R-Sonde durch nichtkovalente Wechselwirkungen (wie Wechselwirkung mit TN-R-spezifischen Antikörpern etc.) oder durch eine andere adäquate Kupplungstechnik, welche die Spezifität der Tenascin-R-Sonde nicht verändert (wie kovalente Vernetzung etc.), an ein Trägermaterial gebunden ist, und/oder
(ii) die Einzelzellsuspension mit der Tenascin-R-Sonde in Kontakt gebracht wird, so dass in der Einzelzellsuspension vorhandene Tenascin-R-bindende Zellen an die Sonde gebunden werden; und/oder (iii) durch spezifische Bindung neuraler Stammzellen aus der Einzelzellsuspension an die Tenascin-R-Sonde eine Isolierung dieser Zellen aus der Zellkultur erfolgt, die nicht gebundenen Zellen entfernt werden und optional anschließend die über die Tenascin-R-Sonde an das Trägermaterial gebundenen Zellen durch Trypsinierung, Inkubation mit Accutase® oder ein anderes adäquates Verfahren vom Trägermaterial abgelöst werden; und/oder (iv) die gebundenen Zellen durch immunologische Methoden nachgewiesen werden; und/oder (v) das Verfahren in vitro erfolgt;
(4) ein Tenascin-R-Fragment oder Tenascin-R-Fusionsprotein, welches wie vorstehend unter (1) oder (2) definiert ist und bevorzugt eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Aminosäuren 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 oder 949- 1358 in SEQ ID NO:2 besitzt;
(5) eine DNA, die für ein Tenascin-R-Fragment oder TN-R-Fusionsprotein nach (4) kodiert;
(6) einen Vektor, der eine DNA nach (5) umfasst; (7) einen Wirtsorganismus, der mit einem Vektor nach (6) transformiert/transfiziert ist und/oder eine DNA nach (5) aufweist;
(8) ein Verfahren zur Herstellung eines Tenascin-R-Fragments oder TN-R- Fusionsproteins nach (4), umfassend das Kultivieren des Wirtsorganismus nach (7);
(9) einen Antikörper, der durch Immunisierung eines geeigneten Wirtsorganismus mit Tenascin-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Spezies, insbesondere mit
TN-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Vertebraten erhältlich ist, und/oder welcher an TN-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Spezies, insbesondere von wenigstens zwei unterschiedlichen Vertebraten bindet, d.h. Kreuzreaktivität mit unterschiedlichen Vertebraten-TN-R zeigt; (10) eine bevorzugte Ausführungsform des Antikörpers nach (9), wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist;
(11) eine Zelllinie, die den Antikörper nach (10) produziert;
(12) einen Kit zur Isolierung und Reinigung von neuralen Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, nach einem oder mehreren der Verfahren (1) und (2), insbesondere enthaltend
(i) eine wie in (1) oder (2) definierte Tenascin-R-Sonde, und/oder (ii) einen Vektor, der für eine solche Tenascin-R-Sonde kodiert, und/oder (iii) eine Stammkultur einer Zelllinie, die dazu geeignet ist, die wie in (1) oder (2) definierte Tenascin-R-Sonde zu exprimieren, vorzugsweise rekombinant zu exprimieren;
(13) die Verwendung der Tenascin-R-Sonde nach (1) oder (2) zur Gewinnung von neuralen Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, für die Anzucht differenzierter Zellen, insbesondere neuraler Zellen, in neurobiologischen und zellphysiologischen Untersuchungen, in der biologischen und klinischen Forschung und für diagnostische und therapeutische Verfahren in vitro und in vivo, insbesondere für die Herstellung eines Medikaments zur Zelltherapie und zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten oder Myelin einhergehen, insbesondere Multipler Sklerose und periventrikulärer Leukomalazie (PVL); und
(14) die Verwendung des Antikörpers nach (9) oder (10) (i) zum immunochemischen Nachweis von TN-R;
(ii) zur Hemmung der Wirkung von TN-R; (iii) zur Beeinflussung der Neuralentwicklung und (iv) zur Herstellung von Medikamenten zur Therapie und Prophylaxe traumatischer Nervenläsionen und von Medikamenten zur gezielten Beeinflussung der Neuralentwicklung;
(15) ein Verfahren zur Therapie und Prophylaxe von traumatischen Nervenläsionen oder zur gezielten Beeinflussung der Neuralentwicklung, umfassend die Verabreichung einer pharmakologisch ausreichenden Menge des Antikörpers nach (9) oder (10) an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf;
(16) ein Verfahren zur Zelltherapie oder zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten oder Myelin einhergehen, insbesondere von Multipler Sklerose und periventrikulärer Leukomalazie (PVL), umfassend die Gabe einer Tenascin-R-Sonde wie in (1) oder (2) definiert, bevorzugt eines Tenascin-R-Fragments oder Tenascin-R-Fusionsproteins wie in (4) definiert, an einen menschlichen oder tierischen Patienten; und (17) ein Verfahren zur Herstellung von Oligodendrozyten aus isolierten Stammzellen in vitro durch Inkubation der Stammzellen in Anwesenheit einer Tenascin-R-Sonde wie in (1) oder (2) definiert, bevorzugt eines Tenascin-R- Fragments oder Tenascin-R-Fusionsproteins wie in (4) definiert.
Kurzbeschreibung der Figuren Fig. 1: Aufbau von TN-R. Die Position der alternativ gespleißten FN HI-ähnlichen Domäne ist als Rl angegeben. Die eingefügte Teilabbildung zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen rotationsbedampfter TN-R Moleküle, die aus Mausgehirn gereinigt wurden. Einzelne Polypeptidketten sind an ihren N-terminalen Enden über Disulfidbrücken miteinander verbunden, was zur Ausbildung von Dimeren (TN-R 160) oder Trimeren (TN-R 180) führt.
Fig. 2: CLUSTAL W (1.82)-Alignment der bekannten Aminosäuresequenzen von Tenascin-R aus verschiedenen Vertebraten. "*" kennzeichnet identische Aminosäuren, ":" kennzeichnet konservativen Aminosäureaustausch, "." kennzeichnet semi-konservativen Aminosäureaustausch. Gut zu erkennen ist die hohe phylogene- tische Konservierung des die FNG-Domäne enthaltenden C-Terminus.
Fig. 3: Einfluss verschiedener polarer Glykolipide und O4-Antikörper auf die Zelladhäsion durch TN-R. TN-R Substrate wurden in der Abwesenheit (- GL) oder Anwesenheit von Sulfatiden (+ SuIf), Galactocerebrosiden (+ GaIC), Monosialo- gangliosiden (+ GMl) und Sphingosin (+ Sph) vorinkubiert. Oligodendrozyten (OL, linke Bildhälfte) oder Erythrozyten (RBC, rechte Bildhälfte) wurden in Ab- oder Anwesenheit von 04 Antikörpern (+ 04 Ab) auf die entsprechend behandelten Substrate ausgesät. Die Zahl adhärenter Zellen nach einstündiger Inkubationszeit auf unbehandelten TN-R-Substraten wurde als 100% gesetzt.
Fig. 4: Beeinflussung der Differenzierung von Oligodendrozyten durch TN-R. Aus frühpostnatalem Mausgehirn aufgereinigte Oligodendrozyten wurden auf PLL (PoIy- L-Lysin)-Substraten in der Abwesenheit (- TN-R) oder Anwesenheit (+ TN-R) von substratgebundenen TN-R Proteinen (gereinigt aus humanem oder Rattengehirn) ausgesät. Die Expression myelinspezifischer Proteine (MBP) wurde nach 2 Tagen in Kultur mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Fig. 5: Charakterisierung der Spezifität und funktionellen Aktivität der monoklonalen Antikörper Rl, R2, R4, R5 und R6.
A) ELISA-Assay zur Analyse der Kreuzreaktivitäten von R4 und R6 mit TN-R Proteinen verschiedener Vertebratenklassen. Mikrotiterplatten wurden mit Gehirn- extrakten verschiedener Vertebraten (40 μg/ml) beschichtet und die Bindung der Antikörper R4 und R6 (nach 2 Stunden Inkubation bei 370C) mit Peroxidase- gekoppelten anti-Maus IgG Antikörpern nachgewiesen. Maximale Bindung für den jeweiligen Antikörper wurde als 100% gesetzt.
B) Westernblot-Analyse von Gehirnextrakten verschiedener Vertebraten mit R6 Antikörper. Gehirnextrakte (50 μg Gesamtprotein/Tasche) aus Hai (Squalus),
Goldfisch (Carassius), Salamander (Salamandra), Ringelnatter (Natrix), griechischer Landschildkröte (Testudo), Taube (Columba), Igel (Erinaceus), Maus (Mus) und Mensch (Homo) wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf Nitrozellulosefilter transferiert und mit R6 Antikörper inkubiert. Immunreaktive Proteinbanden wurden durch Inkubation mit Peroxidase-gekoppelten anti-Maus IgG Antikörpern nachgewiesen. Immunaffinitätsgereinigtes TN-R aus Mausgehirn (m. TN-R) mit den charakteristischen Proteinbanden von 160 und 180 kD diente als Referenz.
C) Einfluss von R4 und R6 Antikörpern auf die TN-R-vermittelte Inhibition der neuronalen Zelladhäsion und Neuritenbildung (Bsp. 6). Kleinhirnneurone aus 8 Tage alten Mäusen wurden auf gemischte Substrate (im Verhältnis 1: 1) bestehend aus Laminin und Rinderserumalbumin (BSA, Kontrollsubstrat) oder Laminin und humanem TN-R (h. TN-R) ausgesät. Die Substrate wurden vor dem Ausplattieren der Zellen in Ab- (- Ab) oder Anwesenheit von R4 oder R6 Antikörpern (+ R4/R6) inkubiert. Zelladhäsion und Neuritenbildung wurden 2 Tage nach Kulturnahme lichtmikroskopisch ausgewertet.
D) Langzeit-Adhäsion von Maus-Kleinhirnneuronen auf Poly-L-Lysin(PLL)-TN-R- Substrat unter Einfluss der monoklonalen Antikörper. Substrat mit BSA (Kontrolle) oder TN-R aus Mensch wurden in Ab- (-Ab) oder Anwesenheit von TN-R-Antikörpern präinkubiert und anschließend die Neurone ausplattiert. Die Zahl der Neurone, die nach 24 h am Kontroll-Substrat hafteten, wurde als 100 % gesetzt.
E) Westernblot von R4 mit verschiedenen Geweben und Tenascinen. Getestet wurden Hirn, Herz, Leber, Niere und Lunge adulter Mäuse, Haut und Hautfibroblasten-konditioniertes Medium (CM) neonataler Mäuse, TN-R 160 aus adultem Maushirn und TN-C (br. TN-C) aus frühem postnatalen Maushirn. pTN-C Ab: polyklonaler Antikörper gegen TN-C; R4 MAb: monoklonaler Antikörper gegen TN-R.
Fig. 6: Aus adultem Gehirn verschiedener Vertebratenspezies immunaffinitäts- gereinigte TN-R Proteine. Spur 1 (Hai), Spur 2 (Karpfen), Spur 3 (Huhn), Spur 4 (Maus), Spur 5 (Ratte), Spur 6 (Mensch). TN-R ist nachweisbar als Polypeptid mit den Hauptformen von 220 kD (im Haigehirn), 170 kD (im Karpfengehirn) oder 160 kD und 180 kD (im Gehirn höherer Vertebraten).
Fig. 7: Selektion von Oligodendrozyten aus Einzelzellsuspensionen (aus Gehirngewebe von 2 (P2), 5 (P5) und 8 (P8) Tage alten Mäusen) auf substratgebundene TN-R Proteine isoliert aus dem Gehirn verschiedener Vertebraten (Karpfen, Huhn (ch), Ratte, Mensch) unterschiedlicher Vertebratenklassen (Fisch, Vogel, Säuger). An diese Substrate adhärierende Zellen wurden nach einem Tag in Kultur mit Toluidinblau gefärbt (obere Zeilen). Adhärente Zellen konnten mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern gegen myelinspezifische Glykolipide (GaIC) nach 2 (P8) bis 5 Tagen (P2) in Kultur als Oligodendrozyten identifiziert werden (untere Zeile; Bildausschnitt korrespondiert nicht mit dem Bildausschnitt der oberen Zeilen). 99±1% der isolierten Zellen waren GalC-positiv.
Fig. 8: Fähigkeit von TN-R verschiedener Arten, die Oligodendrozyten-Diffenzierung hervorzurufen. A) MBP-Expression durch Maus-Oligodendrozyten nach 48 h Kultur auf PLL-TN-R- Substrat.
B) Autokrine Regulation der TN-R-Sekretion durch kultivierte Maus- Oligodendrozyten. Die TN-R-Sekretion durch Oligodendrozyten auf PLL-TN-R wurde mit derjenigen von Oligodendrozyten auf PLL-BSA verglichen und als Vielfaches der Proteinsekretion (Protein increase) ausgedrückt.
Sequenzprotokoll - freier Text
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die Erfindung betrifft eine Methode zur Isolierung hochreiner Zellpopulationen aus neuralem Primärgewebe in einem Einstufen verfahren mit Hilfe nativer Tenascin-R- Proteine oder TN-R-Fragmente von Vertebraten, bevorzugt von Fischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugetieren, besonders bevorzugt von Hai, Karpfen, Huhn, Nagern einschließlich Maus und Ratte, Rind, Schwein und Mensch, ganz besonders bevorzugt aus Nagern und Mensch, durch selektive Substratadhäsion. Phylogenetische Studien zur Funktion von Tenascin-R im Nervensystem von Vertebraten zeigen als stammesgeschichtlich hoch konservierte Funktion von Tenascin-R-Proteinen die Unterstützung der Adhäsion und Fortsatzbildung von Oligodendrozyten (Fig. 3 und 7). Die vorliegende Erfindung zeigt, dass diese Eigenschaft des gesamten Tenascin-R-Proteins auch auf distinkten rekombinanten Fragmenten des humanen Tenascin-R Proteins lokalisierbar ist.
"Tenascin-R-Sonde" bedeutet im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Protein, das natives Tenascin-R, welches in vivo und in vitro durch Oligodendrozyten erkannt und gebunden wird, und/oder weitere Tenascin-R-Verbindungen einschließlich Tenascin-R-Homologe und Tenascin-R-Fragmente, die ebenfalls mit hoher Sensitivität und Spezifität in vivo und in vitro durch Oligodendrozyten und/oder durch andere neurale Zellen aus Primärgewebe gebunden werden, enthalten kann, wobei "Tenascin-R-Verbindungen" die an anderer Stelle definierte Bedeutung hat. Dies schließt auch Fusionsproteine aus mehreren Tenascin-R- Verbindungen ein, bevorzugt aus zwei oder drei Tenascin-R-Verbindungen. Die Bestandteile dieser Fusionsproteine können direkt oder mittels eines (flexiblen) Linkerpeptids miteinander verknüpft sein. Bevorzugt sind Fusionsproteine aus TN- R-Fragmenten. Besonders bevorzugt enthält die Tenascin-R-Sonde humanes Tenascin-R und dessen Homologe und Fragmente, ganz besonders bevorzugt die Teilsequenz der humanen TN-R, welche die Aminosäurereste 1287-1358 der SEQ ID NO:2 umfasst. Die Tenascin-R-Sonde kann neben ihren TN-R-Anteilen auch Nicht- TN-R-Anteile besitzen, welche die Stabilität des TN-R-Anteils gewährleisten und/oder die Immobilisierbarkeit und Kopplungsfähigkeit an andere Moleküle erhalten oder erhöhen. Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Tenascin-R-Sonde rekombinant hergestellt. "Tenascin-R-Verbindungen" sind erfindungsgemäß Proteine oder Peptide, welche entweder native TN-R, substantiell identisch zu nativen TN-R, Fragmente von nativen TN-R oder deren substantiell identische Homologe sind.
"Primärgewebe" ist ein biologisches Gewebe, das direkt aus einem Organismus entnommen und ohne weitere Veränderung seines genetischen Materials verwendet wird. "Primärzellen" sind aus Primärgewebe stammende Zellen. Primärzellen sind gegenüber Zelllinien vorteilhaft, weil sie aufgrund ihrer Herkunft den Zellen im intakten Organismus strukturell und funktionell am nächsten stehen.
"Isoliert" bedeutet im Falle eines Proteins, dass es von anderen Proteinen, mit denen es normalerweise in demjenigen Organismus assoziiert ist, in welchem es natürlicherweise vorkommt, getrennt oder gereinigt wurde. Dies umfasst biochemisch gereinigte Proteine, rekombinant hergestellte Proteine und auf chemischem Wege synthetisierte Proteine. Die Definition gilt übertragen auch für Nukleinsäuren, insbesondere DNA, und Peptide. "Nativ" wird gleichbedeutend mit "natürlich" bzw. "natürlich vorkommend" verwendet.
Für die erfindungsgemäße "rekombinante Herstellung" werden in der Fachwelt übliche Methoden zur rekombinanten Herstellung eukaryotischer Proteine verwendet, insbesondere die Expression als Fusionsprotein in eukaryotischen Zellen, ganz besonders bevorzugt die Expression als Fusionsprotein mit Polyhistidinschwanz und/oder Xpress-Tag. Des weiteren bevorzugt ist die Verwendung von DNA, die für das entsprechende Protein kodiert.
Nukleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die für erfindungsgemäße Proteine oder Peptide kodieren, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung entweder identisch oder substantiell identisch zur nativen oder zu der ihr zugrundeliegenden künstlichen erfindungsgemäßen Sequenz. Wenn im Rahmen dieser Erfindung eine spezielle Nukleinsäuresequenz genannt wird, so sind damit diese Sequenz selbst und die zu ihr substantiell identischen Sequenzen erfasst. "Substantiell identisch" bedeutet hierbei, dass nur ein Austausch von Basen in der Sequenz im Rahmen des degenerierten Nukleinsäure-Codes erfolgt ist, dass also dadurch die Codons innerhalb kodierender Sequenzen der substantiell identischen Nukleinsäure lediglich gegenüber dem ursprünglichen Molekül in einer Weise verändert sind, welche nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des Translationsprodukts führt (in der Regel Austausch des Codons durch ein anderes Codon seiner Codon-Familie). Bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Sequenzen, welche im Sequenzprotokoll benannt werden, und deren erfindungsgemäße Fragmente.
Proteinsequenzen und Peptidsequenzen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Substitution von Aminosäuren modifiziert werden. Bevorzugt sind solche Substitutionen, bei denen die Funktion und/oder Konformation des Proteins oder Peptids erhalten bleibt, besonders bevorzugt jene Substitutionen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren durch Aminosäuren ersetzt werden, die ähnliche chemische Eigenschaften besitzen, z.B. VaNn durch Alanin ("konservativer Aminosäureaustausch"). Der Anteil der substituierten Aminosäuren im Vergleich zum nativen Protein oder - falls es sich nicht um ein natives Protein handelt - zur Ausgangssequenz beträgt bevorzugt 0-30% (bezogen auf die Zahl der Aminosäuren in der Sequenz), besonders bevorzugt 0-15%, ganz besonders bevorzugt 0-5%.
Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen können als Volllänge-Sequenzen oder als Additions- oder Deletionsprodukte dieser Volllängesequenzen zur Durchführung der Erfindung eingesetzt werden. Bei den Aminosäuresequenzen umfassen die Additionsprodukte auch Fusionsproteine, außerdem Aminosäuresequenzen, die durch Addition von 1-100, bevorzugt 1-30, ganz besonders bevorzugt 1-10 Aminosäuren entstehen. Die addierten Aminosäuren können dabei einzeln oder in zusammenhängenden Abschnitten von 2 oder mehr miteinander verknüpften Aminosäuren ein- oder angefügt werden. Die Addition kann am N- oder C-Terminus oder innerhalb der ursprünglichen Sequenz stattfinden. Es sind mehrere Additionen in einer Sequenz zulässig, wobei eine einzelne Addition bevorzugt ist, besonders bevorzugt eine Addition am C- oder N-Terminus. Die Deletionsprodukte der Volllängen-Aminosäuresequenzen entstehen - falls nicht für spezielle Sequenzen anders angegeben - durch Deletion von 1-100, bevorzugt 1-20, ganz besonders bevorzugt 1-10 Aminosäuren. Die deletierten Aminosäuren können dabei einzeln oder in zusammenhängenden Abschnitten von 2 oder mehr miteinander verknüpften Aminosäuren entfernt werden. Die Deletion kann am N- oder C-Terminus oder innerhalb der ursprünglichen Sequenz stattfinden. Es sind mehrere Deletionen in einer Sequenz zulässig, wobei eine einzelne Deletion bevorzugt ist, besonders bevorzugt eine Deletion am C- oder N-Terminus.
Die zulässigen Deletionen und Additionen in den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen haben den Umfang und die Ausprägung, welche der zulässigen Aminosäuredeletionen bzw.- additionen entsprechen. Über die Deletion und Addition ganzer Codons hinaus ist auch die Addition oder Deletion von einzelnen oder paarweisen Basen möglich.
Ein Fragment einer Nukleinsäure oder eines Proteins ist ein Teil von dessen Sequenz, das kürzer als Volllänge ist, jedoch noch einen minimal zur Hybridisierung bzw. spezifischen Bindung erforderlichen Sequenzabschnitt enthält. Im Falle einer Nukleinsäure ist dieser Sequenzabschnitt noch in der Lage, mit der nativen Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren und umfasst vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide, besonders bevorzugt mindestens 25 Nukleotide. Im Falle eines Peptids ist dieser Sequenzabschnitt ausreichend, um eine Bindung eines für einen Abschnitt des nativen Proteins spezifischen Antikörpers oder einer Zelle, welche an TN-R oder ein TN-R-Fragment bindet, zu ermöglichen. Die Peptidlänge beträgt vorzugsweise wenigstens 5 Aminosäuren, besonders bevorzugt wenigstens 10 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt wenigstens 20 Aminosäuren.
Ein "Fusionsprotein" im Kontext der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens eine erfindungsgemäße Tenascin-R-Verbindung, die mit mindestens einem zweiten Protein oder Peptid verknüpft ist. Dieses zweite Protein oder Peptid ist bevorzugt ein Selektions- oder Markerprotein, ein Protein, welches der Bindung des Fusions- proteins an eine Oberfläche dient, oder eine Tenascin-R-Verbindung. Bevorzugt sind Fusionsproteine aus nativem Tenascin-R und weiteren funktionellen Proteinen und Peptiden, und Fusionsproteine aus zwei oder mehr, besonders bevorzugt zwei oder drei Tenascin-R-Fragmenten. Die Nukleinsäuresequenzen, die in einem Vektor oder einem transformierten Wirtsorganismus für die einzelnen Teile des Fusionsproteins kodieren, sind in einer Weise miteinander verknüpft, welche die Expression unter der Kontrolle eines einzigen Promoters erlaubt. Die Aminosäuresequenzen der einzelnen funktionalen Teile des Fusionsproteins sind dabei entweder direkt oder mit einem Linker verknüpft. Der Linker ist 1-30 Aminosäuren lang, bevorzugt 10-20 Aminosäuren. "Neurodegenerative Erkrankungen" sind Erkrankungen des Nervensystems, die mit dem Absterben von neuronalen und/oder makroglialen Zellen aufgrund von Beeinträchtigungen ihrer funktionellen Integrität assoziiert sind. Solche Zellschädigungen und -Verluste führen zu Ausfall oder Störung der Funktionen der betroffenen Regionen des Nervensystems und/oder der von diesen Regionen gesteuerten Körperteilen.
Die durch das Verfahren nach Ausführungsform (1) und (2) isolierten Zellen sind bevorzugt gliale Zellen, besonders bevorzugt Oligodendrozyten.
Die Tenascin-R-Sonde zur Verwendung in Ausführungsform (1) umfasst entweder ein natives TN-R Protein oder ein TN-R Proteinfragment. Das native TN-R stammt dabei bevorzugt aus Hirngewebe von Fisch (Hai, Karpfen, Goldfisch, Forelle etc.), Amphibien (Salamander, Frosch, etc.), Reptilien (griechische Landschildkröte, Ringelnatter, etc.), Vögeln (Huhn, Taube etc.) und Säugern (Igel, Kaninchen, Nager, Schwein, Rind, Mensch), besonders von Säugetieren, insbesondere aus Nager, Schwein, Rind oder Mensch. Das native TN-R Protein wird bevorzugt rekombinant hergestellt. Die TN-R-Proteinfragmente sind bevorzugt rekombinant hergestellt und/oder humane TN-R-Fragmente. Eine bevorzugte Quelle für die entsprechende DNA-Sequenz ist im letztgenannten Fall die humane Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y. Die Expression der Fragmente erfolgt bevorzugt nach Transformation von humanen FIp-In 293-Zellen (Invitrogen) mit den entsprechenden DNA-Sequenzen (Bsp. 2).
Die TN-R-Sonde kann in Ausführungsform (1) zudem weitere funktionelle Proteinoder Peptidsequenzen enthalten und/oder an einen Träger gekoppelt sein.
Ein bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (1) und (2) ist die Verwendung des C- Terminus von TN-R in der Tenascin-R-Sonde, insbesondere derjenigen Bereiche, welche die FN III-Domänen 7 und 8 sowie die FNG-Domäne repräsentieren. Diese Bereiche können entweder einzeln oder miteinander verknüpft verwendet werden, wobei die Gegenwart der FNG-Domäne in der Sonde bevorzugt ist. Besonders bevorzugt ist die Verwendung desjenigen Bereichs des humanen TN-R, der die FNG-Domäne umfasst, also durch die Nukleotide 3940-4155 der SEQ ID NO: 1 kodiert wird; ganz besonders die Verwendung derjenigen Bereiche des humanen TN-R, welche durch bp 2926-4155 (FN III 7,8 + FNG-Domäne; Bsp. 2: H-TNR-6), und/oder durch bp 3439-4155 (FNG-Domäne; Bsp. 2: H-TNR-3) bp 3940-4155 und/oder bp 3487-4155 in SEQ ID NO: 1 kodiert werden. Demzufolge umfassen DNA-Fragmente der Ausführungsform (5) bevorzugt bp 3940-4155, 2926-4155, bp 3487-4155 und/oder bp 3439-4155 der SEQ ID NO: 1.
Bevorzugte Tenascin-R-Fragmente für den Einsatz in einer Tenascin-R-Sonde sind somit Fragmente, die den C-Terminus des TN-R enthalten. Der C-Terminus des TN- R Proteins bildet eine Fibrinogen-ähnlichen Domäne, in dem vier Cysteinreste inklusive der umgebenden vier bis fünf Aminosäuren bei höheren Vertebraten in Position und Zusammensetzung hochgradig konserviert sind. Dieser Bereich, bevorzugt der Bereich, welcher in humanem TN-R die Aminosäuren 1287-1358 umfasst, ganz besonders der Bereich, der den Aminosäuren 1287-1358, 1120- 1358, 1136-1358 (Carnemolla, B. et al., J. Biol. Chem. 271:8157-8160 (1996)) oder 949-1358 in SEQ ID NO:2 entspricht, ist für den Einsatz als Tenascin-R- Fragment in der TN-R-Sonde zur Adsorption von Oligodendrozyten bevorzugt. Dieser Bereich stellt darüberhinaus die bevorzugte Sequenz der Tenascin-R- Fragmente nach Ausführungsform (4) dar. Besonders bevorzugt sind als TN-R- Fragment Peptide mit der Sequenz der Aminosäurereste 949-1358 oder 1120-1358 von SEQ ID NO: 1.
Die phylogenetisch konservierte Eigenschaft von TN-R Proteinen, als adhäsives Substrat für Oligodendrozyten wirken zu können, wird auf molekularer Ebene durch eine hohe Konservierung der Aminosäuresequenz zwischen verschiedenen Vertebratenspezies reflektiert: die humane TN-R Sequenz weist Homologien von 93% (zu Ratte), 75% (zu Huhn) und 60% (zu Zebrafisch) auf (Fig. 2). Diese Eigenschaft macht sich die vorliegende Anmeldung zunutze.
Ein Aspekt der Ausführungsform (1) ist die Herstellung der Tenascin-R-Sonde durch Isolierung des Tenascin R aus natürlichen Quellen (vgl. Bsp. 1) oder als rekombinantes natives Protein. Die Herstellung durch rekombinante Methoden ist hierbei bevorzugt.
Die Isolierung des TN-R aus natürlichen Quellen erfolgt bevorzugt durch bekannte chromatographische und/oder immunologische Methoden zur Proteinreinigung, insbesondere durch Affinitätschromatographie an TN-R-Antikörper (Bsp. 1). Als Quelle für das TN-R kommen Gewebe und Einzelzellsuspensionen höherer und niederer Vertebraten infrage.
Rekombinante Methoden zur Herstellung der TN-R-Sonde umfassen die bekannten gängigen Methoden zur Transformation von Pro- und Eukaryoten (beschrieben z.B. in G. Schrimpf (Hrsg.), Gentechnische Methoden, 3. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag (2002); Smith, C, The Scientist 12(3): 18 (1998); Unger, T., The Scientist ll(17):20 (1997)). Geeignete Methoden zur Herstellung rekombinanter Proteine oder Proteinfragmente umfassen Transfektions- oder Transformationsmethoden, die auf verschiedenen Expressionssystemen/-vektoren für prokaryotische (insbesondere E. coli) und eukaryotische Zellen (Hefe, Pilze, Insekten- und Säugerzellen) basieren. Um funktionell aktive rekombinante Proteine zu erzeugen (also solche, die nach ihrer Faltung/Konformation und Glykosylierung dem nativen Protein am ähnlichsten sind), werden Säugerzellen als Produzenten bevorzugt. Die verschiedenen Expressionsvektoren für Säugerzellen unterscheiden sich hauptsächlich in Promotertyp (SV40, CMV, human EFlalpha, MMTV-LTR, MSV- LTR, RSV-LTR, etc.), Art der Expression (transient, konstitutiv, induzierbar), Induktionsmechanismus, Selektionsmarker (Antibiotikum- oder Drogenresistenz und/oder Koexpression leicht nachweisbarer Proteine) und Elemente für subzelluläres Targeting des Genprodukts (Mitochondrien, Kern, Sekretion). Als Produzenten rekombinanter Proteine/Proteinfragmente werden eukaryotische Expressionssysteme, die das Fremdgen konstitutiv exprimieren, bevorzugt.
In einer bevorzugten Durchführungsform von (2) zur erfindungsgemäßen Expression humaner rekombinanter Proteinfragmente werden definierte PCR- Fragmente des humanen TN-R mit Hilfe des TOPO TA Klonierungssystems (Invitrogen) in den pcsecTag/FRT/V5-His-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert, welcher die konstitutive Expression und Sekretion des gewünschten, mit einem am C-Terminus mit 6xHis-Peptid versehenen Proteinfragments in humanen FIp-In 293 Zellen (Invitrogen) erlaubt. In Flp-In-Zellen ist das Plasmid pFRT/lacZeo (Invitrogen) stabil integriert, die FRT-Region wird spezifisch von der FIp- Rekombinase erkannt. Bei gleichzeitiger Transfektion der Flp-293-Zellen mit dem pOG44-Plasmid, das die Expression der Flp-Rekombinase ermöglicht, und dem die Basensequenz des gewünschten Proteinfragments tragenden pcsecTag/FRT/V5-His- TOPO-Vektor kommt es an der FRT-Region zu einem Einbau der für die Herstellung eines sekretierten Proteinfragments notwendigen Anteile des pcsecTag/FRT/V5-His- TOPO-Vektors. Dies ermöglicht die Sekretion polyHis-tragender Proteinfragmente in den Zellkulturüberstand und ihre Aufreinigung über Nickel-Chelatchromatographie aus gesammelten Zellkulturüberständen.
Ein weiterer Aspekt der Ausführungsform (1) ist die Herstellung der TN-R- Fragmente durch chemische Synthese, durch Fragmentierung von isoliertem TN-R oder rekombinant, bevorzugt rekombinant gemäß Ausführungsform (8). Geeignete rekombinante Methoden umfassen die bekannten gängigen Methoden zur Transformation von Pro- und Eukaryoten (beschrieben z.B. in G. Schrimpf (Hrsg.), Gentechnische Methoden, 3. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag (2002); Smith, C, The Scientist 12(3): 18 (1998); Unger, T., The Scientist ll(17):20 (1997)). Hierfür kann ein Wirtsorganismus gemäß Ausführungsform (7) verwendet werden, der mit einem Vektor transformiert oder transfiziert ist, der die vorstehend definierten TN-R oder TN-R-Fusionsprotein kodierenden DNA Sequenzen umfasst. Solch ein Vektor kann, neben den genannten DNA Sequenzen noch an den Wirtsorganismus angepasste funktionelle Sequenzen wie Promotoren, Leadersequenzen usw. enthalten. Zur chemischen Herstellung von TN-R- Fragmenten sowie zur Fragmentierung von isoliertem TN-R können einschlägig bekannte Methoden verwendet werden, wie z.B. Festphasen-Peptidsynthese bzw. enzymatische oder mechanische Fragmentierungsmethoden.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (1) betrifft ein Fusionsprotein umfassend eine Tenascin-R-Komponente, ausgewählt aus nativem Tenascin-R oder Tenascin-R-Fragmenten und Fusionsproteinen aus zwei der mehr Tenascin-R- Fragmente, und eine funktionelle Komponente, die funktionelle Peptid- oder Proteinsequenzen umfasst. Die Komponenten können direkt oder mittels eines (flexiblen) Linkerpeptides miteinander verknüpft sein. Ein weiterer Aspekt betrifft die Kombination von zwei oder mehreren der vorstehend definierten Tenascin-R- Komponenten, insbesondere Tenascin-R-Fragmenten, in einer Art und Weise, die nicht der nativen Aminosäuresequenz entspricht, zu einer erfindungsgemäßen Tenascin-R-Sonde. Die Verknüpfung kann ebenfalls direkt oder mittels eines Linkerpeptids erfolgen. Zur Synthese können die oben genannten Vektorsysteme verwendet werden, wobei diejenigen cDNA-Sequenzen von Teilen der TN-R- Sequenz, welche räumlich nicht benachbart sind, über endständige Restriktionsenzym-Schnittstellen nach gängigen technischen verfahren miteinander verknüpft werden.
Die Tenascin-R-Sonde gemäß Ausführungsform (1) bis (4) umfasst vorzugsweise die Teilsequenz der humanen TN-R, welche die Aminosäurereste 1287-1358 umfasst, ganz besonders den Bereich, der den Aminosäureresten 1287-1358, 1120- 1358, 1136-1358 oder 949-1358 in SEQ ID NO:2 entspricht. Ein bevorzugter Aspekt von (1) bis (4) ist, dass die Sonde eine der Aminosäuresequenzen dieser Gruppe besitzt oder sich aus 2 oder mehreren der Aminosäuresequenzen dieser Gruppe in einem Fusionsprotein zusammensetzt, wobei auch die Wiederholung einer oder mehrerer der Sequenzen innerhalb des Fusionsproteins möglich ist. Gegenstand der Erfindung sind auch die Nukleinsäuren, die Nukleinsäurefragmente umfassen, welche für derartige Proteine kodieren, bevorzugt DNA-Sequenzen und cDNA. In einem bevorzugten Aspekt der Ausführungsform (2) ist die Tenascin-R-Sonde humanes Tenascin-R oder ein Homologes/Fragment desselben und entweder durch Präparation aus Zellen von Menschen oder durch rekombinante Herstellung erhältlich. Insbesondere ist es als natives TN-R aus Zellen neuralen Ursprungs, besonders bevorzugt aus SH-SY5Y Neuroblastomzellen erhältlich. Rekombinante Herstellung speziell der TN-R-Fragmente findet bevorzugt in entsprechend transformierten humanen FIp-In 293-Zellen statt.
Ein bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (1) und (2) ist die Durchführung des Verfahrens als Einstufenverfahren und/oder durch selektive Substratadhäsion an die Tenascin-R-Sonde. Hierbei werden durch enzymatische Behandlung des gewünschten zentralnervösen Gewebes gewonnene Einzelzellsuspensionen auf mit TN-R Proteinen oder Proteinfragmenten beschichteten Plastikoberflächen ausgesät. Nach Inkubation, bevorzugt für 8-20 h und bevorzugt in serumfreiem Medium (was eine Vermehrung astrozytärer und mikroglialer Zellen verhindert), finden sich auf den immobilisierten TN-R Substraten reine Oligodendrozytenpopulationen (Fig. 7). Andere Zelltypen liegen im Zellkulturüberstand vor und können durch Mediumwechsel vollständig entfernt werden. Da nur ein einziger Selektionsschritt erfolgt und die Selektionsphase kurz ist im Vergleich zur Dauer der bislang üblichen mehrwöchigen Kultivierung gemischter glialer Kulturen und weiterer Selektionsverfahren, ist die resultierende Zellausbeute hoch. Grund dafür ist u.a., dass sämtliche Oligodendrozyten (verschiedener Differenzierungsstadien) aus einem Primärgewebe auf TN-R-Substraten selektioniert werden können. Im Gegensatz hierzu ist die Isolierung von Oligodendrozyten aus gemischten glialen Kulturen mit einem hohen Verlust an Zellen verbunden (z.B. beim Abschütteln der auf einer Astrozyten-Monoschicht haftenden Oligodendrozyten und Mikroglia und bei weiterer Selektion mikroglialer Zellen). Ein Vergleichsbeispiel mag dies verdeutlichen: um eine Ausbeute von 2-4 x 106 Oligodendrozyten aus P0-P2 Nagergehirnen zu erhalten, genügt eine Selektion auf TN-R-Substraten aus dem Gewebe nur eines Gehirns in nur einem Schritt, während dafür bei Kultivierung gemischter glialer Kulturen zehn Gehirne und mindestens 2 Wochen Kultivierungszeit erforderlich sind.
Das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren nach (1) und (2) erlaubt die Isolierung vollständiger Oligodendrozytenpopulationen und ist damit auch vorteilhaft gegenüber immunologischen Selektionsverfahren wie z.B. FACS, biomagnetic cell sorting oder Antikörper-Panning. Diese erlauben nur die Anreicherung distinkter Oligodendrozytenpopulationen; oligodendrogliale Zellen, die von den Antikörpern nicht erkannt werden, gehen verloren.
Das erfindungsgemäße Verfahren von (1) und (2) ermöglich somit die Isolierung von oftmals für weitere Experimente ausreichenden Oligodendrozytenpopulationen aus einem einzigen Vertebraten, insbesondere einem einzigen Nager. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn bestimmte Effekte an Mäusen untersucht werden, die z.B. in transgenen Mäusen, Knockout-Mäusen oder mit Testsubstanzen behandelten Mäusen auftreten.
Die als Startmaterial der Ausführungsform (1) und (2) verwendeten Primärgewebe können aus unterschiedlichen ZNS-Bereichen sowie aus unterschiedlichen
Entwicklungsstadien stammen. Bevorzugte ZNS-Bereiche sind das Gehirn und einzelne Gehirnregionen (insbesondere Vorderhirn, Kleinhirn, Hippocampus,
Hirnstamm), der optische Nerv und das Rückenmark. Die geeigneten
Entwicklungsstadien umfassen embryonale, fötale, früh-/spätpostnatale und adulte Gewebe, bevorzugt frühpostnatale und adulte Gewebe.
Wird im Verfahren nach (1) bis (3) eine Einzelzellsuspension verwendet, so enthält diese Zellen einer oder mehrerer Differenzierungsstufen, bevorzugt einer einzigen Differenzierungsstufe.
Die neuralen Primärgewebe, die zur Durchführung des Verfahrens nach (1) und (2) verwendet werden, stammen aus niederen und höheren Vertebraten, einschließlich Fischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugetieren, besonders bevorzugt aus Hai, Karpfen, Huhn, Nagern einschließlich Maus und Ratte, Rind, Schwein und Mensch, ganz besonders bevorzugt aus Nagern und Mensch.
Die TN-R-Sonde zur Verwendung in (1) und (2) stammt vorzugsweise aus TN-R höherer und niederer Vertebraten. Bevorzugt ist sie das native TN-R oder ein Fragment des nativen TN-R.
Die Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus Primärgewebe zum Einsatz im Verfahren gemäß Ausführungsform (1) oder (2) erfolgt nach in der Fachwelt üblichen Methoden. So kann das Gewebe in einem oder mehreren Schritten mechanisch und/oder enzymatisch in Gewebefragmente und/oder einzelne Zellen überführt werden. Geeignete Methoden werden in "Zell- und Gewebekultur" (T. Lindl, Spektrum Akademischer Verlag, 2002) und "Current Protocols in Neuroscience" (John Wiley & Sons, Inc., 2004, Hrsg. J Crawley et al.) beschrieben. Die so gewonnenen Zellen werden in serumfreiem Medium resuspendiert und dann mit der TN-R-Sonde in Kontakt gebracht. Nach einer zur vollständigen Adsorption der selektierten Zellen ausreichenden Inkubationszeit (1-48 h, bevorzugt 8-20 h) unter geeigneten Bedingungen werden die nicht adhärierten Zellen entfernt. Die adhärierten Zellen können für eine weitere Verwendung entweder adhärent bleiben oder enzymatisch, bevorzugt durch Behandlung mit Trypsin bzw. Trypsin-EDTA, Collagenase, Dispase, Pronase, Accutase® oder anderen geeigneten Proteinasen, insbesondere mit Accutase®, vom Adsorbens abgelöst werden. Ihre Weiterverwendung umfasst die Kultivierung - auch auf anderen Substraten oder Plastikoberflächen bzw. in anderen definierten Medien - zur Gewinnung von beispielsweise unreifen Vorläufer-Oligodendrozyten oder myelinkompetenten Oligodendrozyten.
Das Verfahren nach (1) und (2) kann unabhängig davon eingesetzt werden, ob die TN-R-Sonde und das neurale Primärgewebe aus Organismen derselben Spezies stammen. So ist eine Isolierung von Oligodendrozyten über Speziesgrenzen hinweg möglich. TN-R aus verschiedenen Vertebraten können zur Selektion von Oligodendrozyten aus Einzelzellkulturen anderer Spezies verwendet werden (Bsp. 3; Fig. 7). Unter anderem umfasst dies die Selektion von Oligodendrozyten aus Mensch, Schwein, Rind, Huhn, Maus, Ratte, Frosch und anderen höheren Vertebraten auf TN-R aus einer anderen Spezies (umfassend Fisch, Huhn, Maus, Ratte, Rind, Schwein, Mensch etc.). Das Verfahren nach (1) und (2) kann des weiteren unabhängig davon eingesetzt werden, in welcher Differenzierungsstufe (z.B. Vorläufer - unreife - reife Oligodendrozyten) die selektierten Zellen vorliegen. Es werden allen Zellen einer Zellart selektiert, unabhängig von ihrem Entwicklungsstadium.
Die Selektion von definierten Zellpopulationen aus Einzelzellsuspensionen gemäß (1) und (2) erfolgt in einem Aspekt dadurch, dass die an die TN-R-Sonde gebundenen Zellen isoliert werden und zur weiteren Verwendung vorgesehen sind.
In einem anderen Aspekt dagegen ist es der Überstand, der durch die spezifische
Adsorption von Zellen an die TN-R-Sonde von diesen Zellen befreit wird und zur weiteren Verwendung als definierte Zellpopulation vorgesehen ist. In wieder einem anderen Aspekt wird als TN-R-Sonde ein modifiziertes TN-R oder ein TN-R-
Fragment eingesetzt, dass für andere Zellen als das Ausgangsprotein (natives TN-
R) selektiv ist. Die TN-R-Sonde im letztgenannten Aspekt umfaßt bevorzugt die FN
III-Domänen 1 bis 8 oder 4 bis 6, besonders bevorzugt die durch bp 1051-3483 in
SEQ ID NO: 1 (H-TNR-S2; humane FN III-Domäne 1-8) und bp 1573-2945 in SEQ ID NO: 1 (H-TNR-S5; humane FN III-Domäne 4-6) kodierten Proteine.
In einem Aspekt der Ausführungsform (3) ist die Tenascin-R-Sonde durch geeignete Methoden zur Immobilisierung an ein Trägermaterial gekoppelt. Die Immobilisierung kann kovalent oder nichtkovalent erfolgen. Derartige geeignete Immobilisierungsmethoden umfassen adäquate Kupplungstechniken, welche die Spezifität der Tenascin-R-Sonde nicht verändern, wie z.B. die kovalente Vernetzung des Proteins mit dem Trägermaterial oder die Immobilisierung durch Wechselwirkung mit einem geeigneten Antikörper. Bevorzugt erfolgt die Kupplung nichtkovalent (Bsp. 3), über einen Antikörper oder durch kovalente Vernetzung. In einer bevorzugten Ausprägung dieses Aspekts der Ausführungsform (3) werden zur Isolierung von Zellen aus Primärgewebe neuralen Ursprungs Trägermaterialien wie z.B. Zellkulturplatten mit TN-R bzw. mit rekombinant hergestellten TN-R- Fragmenten beschichtet, indem das Trägermaterial, bevorzugt eine Plastikoberfläche, mit einer Lösung der TN-R-Sonde inkubiert und anschließend gewaschen wird. Durch selektive Substratadhäsion erfolgt dann die Isolierung reinster Zellpopulationen aus Zellsuspensionen. Unter Verwendung von TN-R konnten aus frühpostnatalen Nagerhirnen 100% reine Oligodendrozyten- präparationen gewonnen werden (Bsp.3): 2xlO6 Oligodendrozyten aus einem P0-P2 Nagervorderhirn, 4-6xlO6 Oligodendrozyten aus einem P5 Nagervorderhirn, 2xlO6 Oligodendrozyten aus einem P7-P8 Nagerkleinhirn. Ähnliche Ergebnisse sind mit rekombinant hergestellten Tenascin-R-Fragmenten möglich.
In einer weiteren Ausprägung dieses Aspekts wird die TN-R-Sonde auf einer Plastikoberfläche immobilisiert. Dies ermöglicht ebenfalls die selektive Adhäsion und Isolation von definierten Zellpopulationen, insbesondere von Oligodendrozyten, jedoch nicht von anderen neuralen Zellen (wie Astrozyten, Mikroglia oder Neuronen), aus den als Startmaterial verwendeten gemischten Zellpopulationen.
Die Immobilisierung erfolgt bevorzugt durch direkten Kontakt der TN-R-Sonde mit der Trägeroberfläche. Nach ausreichender Inkubationszeit (1-4 h) wird das nicht gebundene Protein abgewaschen. Die nicht besetzten Bindungsstellen auf der Oberfläche werden anschließend blockiert, z.B. durch Inkubation mit einem BSA- haltigen Blockierungspuffer. Die so beschichteten Oberflächen können bis zu ihrer Verwendung feucht gehalten oder nach Eintrocknen verwendet werden, wobei der Einsatz nicht eingetrockneter Oberflächen bevorzugt ist.
Als bevorzugte TN-R-Sonde werden in Ausführungsform (3) natives TN-R oder ein Fragment des nativen TN-R verwendet. Auch die Verwendung einer Mischung aus mehr als einer TN-R-Sonde zur Beschichtung des Trägermaterials ist möglich.
Das Verfahren nach Ausführungsform (1) bis (3) ist zur Gewinnung von neuralen Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, für die Anzucht differenzierter Zellen, insbesondere neuraler Zellen, in neurobiologischen und zellphysiologischen Untersuchungen, in der biologischen und klinischen Forschung und für diagnostische und therapeutische Verfahren in vitro und in vivo, insbesondere für die Herstellung eines Medikaments zur Zelltherapie und zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten geeignet. Des Weiteren ist es zum Nachweis von neurodegenerativen Krankheiten nutzbar.
Ausführungsform (9) betrifft Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper gemäß Ausführungsform (10), welche an TN-R in wenigstens zwei Spezies, vorzugsweise zwei Vertebraten binden, bevorzugt die monoklonalen Antikörper R4 und R6 (Bsp. 5). Diese zeigen im Gegensatz zu den in Pesheva, P. et al. (J. Cell. Biol. 109: 1765-1778 (1989)) beschriebenen Antikörpern Rl und R2 Kreuzreaktivität mit verschiedenen Spezies/Vertebraten. Besonders R6 kann zum Nachweis von TN-R in allen Vertebratenklassen (Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säuger; Fig. 5A und 5B) verwendet werden; R4 erkennt das Protein nur in höheren Vertebratenklassen (Fig. 5A und Tab. 2). R4 und R6 erkennen Proteinepitope auf dem TN-R Molekül, d.h. sie sind auch nach Glykosidase-Verdau, der zur Abspaltung der Zuckerreste des Proteins führt, noch aktiv.
Die Kreuzaktivität mit verschiedenen Spezies ist bedingt durch das Herstellverfahren, nämlich dass ein geeigneter Wirtsorganismus mit Tenascin-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Spezies, vorzugsweise von zwei unterschiedlichen Vertebraten durch übliche Verfahren immunisiert wird und nachfolgenden Screening- und Reinigungsschritten isoliert wird. Geeignete Wirtsorganismen für die Immunisierung sind insbesondere nicht-humane Säuger wie Nager (Mäuse, Ratten u.s.w.), Kaninchen, Meerschweinchen, Ziege u.s.w.
Die Antikörper nach Ausführungsform (9) sind in verschiedenen auf Nachweis und/oder Bindung von TN-R basierenden immunochemischen Verfahren anwendbar (Tab. 2, Anwendungsbereiche), insbesondere in ELISAs, Westernblots, histologischen und zytologischen Untersuchungen und Immunpräzipitationen. Auch in in vitro-Assays sind sie von Bedeutung, da ihre Anwesenheit die inhibitorische Wirkung des TN-R Proteins auf die neuronale Zelladhäsion und das Axonwachstum neutralisieren kann (Fig. 5C). Die Antikörper reagieren spezifisch mit TN-R in Hirn- Extrakten oder gereinigtem TN-R und zeigen keine Kreuzreaktivität mit anderen TN-Proteinen. Letzteres läßt sich daraus schließen, dass keine Reaktion mit Herz oder Niere (in Maus enthaltend TN-W, Scherbich, A. et al., J. Cell. Sei. 117:571-581 (2004)), neonataler Haut oder Hautfibroblasten-konditionertem Medium (enthaltend TN-X, Zweers, M. C. et al., Cell Tissue Res. 319:279-287 (2005)) und TN-C-Präparationen aus Maushirn stattfindet. Exemplarisch ist in Fig. 5 die Reaktivität von R4 und R6 dargestellt.
Kreuzreaktivität der Antikörper nach Ausführungsform (9) besteht jedoch insofern, dass Rl, R2, R4, R5 und R6 mit TN-R aller getesteten höheren Vertebraten reagieren, und Rl, R5 und R6 sogar mit allen getesteten Arten (Tab.2, Fig. 5B). Letztere sind in einem Aspekt der Ausführungsform (9) daher bevorzugt.
Rl, R2, R4, R5 und R6 erkennen unterschiedliche Protein-Epitope auf TN-R, was sich durch enzymatische Entfernung der N- und O-verknüpften Glycokonjugate und Feststellung der topographischen Nähe molekularer Epitope durch kompetitiven ELISA zeigte. Dies erklärt auch, warum die Antikörper unterschiedlichen Einfluss auf die Adhäsion und das Neuritenwachstum von Maus-Neuronen auf TN-R-haltigem Substrat haben (Fig. 5C und D, Bsp. 6). Diese in wfcro-Tests weisen darauf hin, dass Epitope, welche durch R4, R5, und R6 (und teilweise R2) erkannt werden, in derartige Prozesse involviert sind. Daher sind bevorzugte Antikörper der Ausführungsform (9) Antikörper, welche gegen derartige Epitope gerichtet sind.
Die Antikörper gemäß Ausführungsform (10) können dabei durch Kultivieren der Zelllinie gemäß Ausführungsform (11) hergestellt werden. Die Zelllinien Ausführungsform (11) sind insbesondere sogenannte Hybridomzelllinien. Diese sind z.B. durch Immunisierung eines geeigneten Wirtsorganismus mit TN-R von wenigstens zwei verschiedenen Spezies, wie vorstehend beschrieben, Isolation von Milzzellen des Wirtsorganismus und nachfolgendes Verschmelzen mit geeigneten primären Zellen, z. B. Myelomzellen, erhältlich. In Abhängigkeit vom Wirtsorganismus und vom Ursprung der primären Zellen handelt es sich um Homo- oder Heterohybridomzellen, wobei das Erstere bevorzugt ist.
Weiterhin bevorzugt sind die monoklonalen Antikörper gemäß Ausführungsform (10) der Erfindung, unter denen R4, R5 und R6, insbesondere R4 und R6, wie sie durch die Hybridomzelllinien DSM ACC2754 (tn-R4) und DSM ACC2753 (tn-R6) produziert werden, besonders bevorzugt sind. Die Antikörper der Ausführungsformen (9) und (10) der Erfindung sind nicht nur zum immunochemischen Nachweis von TN-R geeignet, sondern auch zur Hemmung der Wirkung von TN-R in vivo und in vitro. Aufgrund ihrer Wechselwirkung mit TN-R in Bezug auf die neuronale Zelladhäsion und das Axonwachstum sind die Antikörper nach Ausführungsformen (9) und (10) des weiteren gemäß Ausführungsform (14) zur gezielten Beeinflussung der Neuralentwicklung in vivo und in vitro, zur Therapie und Prophylaxe von traumatischen Nervenläsionen und zur Herstellung von Medikamenten zur gezielten Beeinflussung der Neuralentwicklung und zur Therapie und Prophylaxe von traumatischen Nervenläsionen einsetzbar. Traumatische Nervenläsionen entstehen z.B. nach mechanischer Nervenschädigung. Die Regeneration der Nervenfasern nach solchen Läsionen wird durch TN-R negativ beeinflusst (Probstmeier, R. et al., J. Neurosci. Res. 60:21-36 (2000); Zhang, Y. et al., Mol. Cell. Neurosci. 17:444- 459 (2001); Becker, CC. et al., Mol. Cell. Neurosci. 26:376-389 (2004); Xu, G. et al., J. Neurochem. 91 : 1018-1023 (2004)).
Die Erfindung betrifft daher in Ausführungsform (15) ebenfalls ein Verfahren zur Therapie und Prophylaxe von traumatischen Nervenläsionen und zur gezielten Beeinflussung der Neuralentwicklung umfassend das Verabreichen einer geeigneten Menge an Antikörper nach Ausführungsform (9) oder (10) an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. Die verabreichte Antikörpermenge und die notwendige Dosierung wird vom behandelnden Arzt von Fall zu Fall festzulegen sein. Sie hängt dabei unter anderem einerseits vom Alter, Körpergewicht und der Konstitution des Patienten, andererseits von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit ab.
Der Kit gemäß Ausführungsform (12) enthält bevorzugt das in Ausführungsform (4) definierten Protein oder eine Stammkultur der Zelllinie zur Produktion dieses Proteins. Besonders bevorzugt enthält dieser Kit humanes Tenascin-R oder dessen erfindungsgemäße Fragmente und/oder eine Stammkultur von Zellen, die zur rekombinanten Produktion dieser Proteine geeignet sind.
Ein bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (12) ist ein Kit, in dem die Tenascin- R-Sonde durch eine adäquate Kupplungstechnik wie in den Aspekten der Ausführungsform (3) beschrieben an ein Trägermaterial gebunden ist, und/oder in dem weiterhin TN-R-Antikörper (z.B. zur Überprüfung der Immobilisierungseffizienz der TN-R-Sonde), eine oder mehrere enzymatische Lösung(en) zur Zelldissoziierung, ggf. Mittel zur Detektion der Bindung von Zellen an die Tenascin- R-Sonde, Puffer und/oder Kulturmedien enthalten sind. Zu den Puffern und Medien zählen insbesondere Blockierungspuffer und definierte serumfreie Kulturmedien. Im Kit enthaltene Antikörper sind bevorzugt Antikörper der Ausführungsform (9) oder (10).
In Ausführungsform (13) ist die Verwendung eines TN-R-Fragments oder eines TN- R-Fusionsproteins wie in Ausführungsform (4) definiert, bevorzugt. Eine bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen TN-R-Sonde ist der Einsatz der Tenascin-R-Sonde zur Gewinnung von Oligodendrozyten gemäß Ausführungsform (13). Ein damit verknüpfter Aspekt der Ausführungsform (13) ist die Anzucht differenzierter Zellen aus den so gewonnenen Zellpopulationen. Die differenzierungsfördernde Wirkung des nativen TN-R wurde bereits beschrieben (Pesheva, P. et al., J. Neurosci. 17:4642-51 (1997)). Auch die erfindungsgemäßen Fragmente des TN-R können differenzierungsfördernd auf Oligodendrozyten unterschiedlicher Reifestadien wirken, insbesondere H-TNR-S3 und H-TNR-S6 (vgl. Bsp. 2).
Die Diagnoseverfahren gemäß der Ausführungsform (13) können in vivo und in vitro durchgeführt werden, bevorzugt jedoch in vitro. Bevorzugt verwendet wird für die Verwendung gemäß Ausführungsform (13) eine Tenascin-R-Sonde gemäß Ausführungsform (4), insbesondere humanes Tenascin-R oder dessen erfindungsgemäße Fragmente. Die Tenascin-R-Sonde kann dabei aus Quellen gereinigt worden sein, in denen sie natürlich vorkommt, oder rekombinant hergestellt worden sein. Bevorzugt wird eine rekombinante Tenascin-R-Sonde verwendet.
Neurodegenerative Erkrankungen, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten (durch Zelltod) oder Myelin assoziiert sind, wie z.B. Multiple Sklerose (MS), zeichnen sich dadurch aus, dass in den betroffenen Regionen Remyelinisierung nicht oder nur im geringen Umfang stattfinden kann. Das liegt zum Großteil daran, dass die vorhandenen "traumatischen" (also als Folge der Wirkung pathologischer Stimuli veränderten) Vorläufer- und unreifen Oligodendrozyten nicht in der Lage sind zu differenzieren/remyelinisieren. Die Erfindung bietet hier Ansätze für neue diagnostische und/oder therapeutische Verfahren:
Zur Diagnose von MS ist besonders die schnelle (innerhalb von 1-2 Tagen) Selektion "traumatischer" Zellen auf TN-R-Sonden geeignet, bevorzugt aus einem Tiermodell oder aus Biopsie-Proben von Patienten. Dies ermöglicht die Durchführung von direkten Untersuchungen ihres molekularen Profils und/oder die Entwicklung diagnostischer Marker. Für die Entwicklung eines Medikaments zur Zelltherapie können "traumatische" Oligodendrozyten mit verschiedenen Wirkstoffkandidaten behandelt werden, um den Einfluss der letzteren auf die "Genesung traumatischer Zellen", bzw. die Remyelinisierungspotenz solcher Zellen zu bestimmen.
Die erfindungsgemäße Methode ist auch geeignet zur Selektion "normaler" adulter Oligodendrozyten, welche vor der Kultivierung unter traumatischen Bedingungen in vitro (durch Zugabe relevanter Cytokine oder Liquorproben von
Patienten/erkrankten Tieren) selektioniert und anschließend mit
Wirkstoffkandidaten behandelt werden. Solch ein in wtro-System erlaubt
Untersuchungen zu den stattfindenden traumatischen Veränderungen in Oligodendrozyten, die Rückschlüsse auf solche Veränderungen in vivo ermöglichen.
Des weiteren können derartig kultivierte Oligodendrozyten zur Entwicklung diagnostischer Marker dienen, wobei auch verschiedene Stadien der traumatischen Veränderungen festgestellt werden können. Die so gewonnenen Oligodendrozyten sind auch geeignet zum Screening auf Wirkstoffkandidaten, die den Zelltod und/oder eine fehlende Myelinisierungskompetenz von Oligodendrozyten unter traumatischen Bedingungen aufheben, bzw. als Medikament zur Zelltherapie in vivo eingesetzt werden können.
Schließlich ist auch der Einsatz eines rekombinanten TN-R-Fragments, insbesondere des C-Terminus oder eines C-terminalen Fragments, v.a. der Fragmente H-TNR-S3 und/oder H-TNR-S6 (vgl. Bsp. T), als Medikament oder zur Herstellung eines Medikaments zur direkten Zelltherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Multipler Sklerose, möglich.
Ein bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (13) ist somit die Verwendung der Tenascin-R-Sonde zur Diagnose von Multipler Sklerose (MS) und zur Herstellung eines Medikaments gegen MS.
Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Ausführungsform (13) ist somit die Verwendung der Tenascin-R-Sonde zur Herstellung eines Medikaments zur Zelltherapie und zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten oder Myelin einhergehen, insbesondere Multipler Sklerose und periventrikulärer Leukomalazie (PVL).
Ausführungsform (16) betrifft ein Verfahren zur Zelltherapie und zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten oder Myelin einhergehen, insbesondere Multipler Sklerose und periventrikulärer Leukomalazie (PVL), unfassend das Verabreichen einer pharmakologisch geeigneten Menge der TN-R-Sonde an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. Die verabreichte Menge und die notwendige Dosierung wird vom behandelnden Arzt von Fall zu Fall festzulegen sein. Sie hängt dabei unter anderem einerseits vom Alter, Körpergewicht und der Konstitution des Patienten, andererseits von der Art und Schwere der zu behandelnden Krankheit ab.
Das Verfahren (17) zur Herstellung von Oligodendrozyten aus isolierten Stammzellen wird bevorzugt mit neuralen oder nicht-neuralen Stammzellen durchgeführt, welche ein Potential zur Sulfatid-Expression besitzen. Besonders bevorzugte isolierte Stammzellen sind Vorläuferzellen neuralen oder hämatopoetischen Ursprungs. So können humane neurale Stammzellen in Gegenwart von TN-R selektiv zu reifen Oligodendrozyten differenziert werden (Bsp. 7).
Ganz besonders bevorzugt dient das Verfahren (17) der Differenzierung unreifer Oligodendrozyten in vitro. Wie Fig. 8 zeigt, differenzieren sich unreife Oligodendrozyten unter dem Einfluss von exogenem, substratgebundenen TN-R aller getesteten Vertebraten morphologisch. Gleichzeitig wird die Myelingen- Expression hochreguliert, wie sich durch die rasche Induktion von MBP-Expression belegen lässt. Diese Effekte sind besonders stark bei Einsatz von TN-R aus höheren Vertebraten. Die Zellantwort der Oligodendrozyten wird vermutlich durch TN-R- Wechselwirkung mit Sulfatiden vermittelt und beinhaltet wahrscheinlich eine autokrine TN-R-Regulation (Pesheva, P. et al., J. Neurosci. 17:4642-4651 (1997)). Letzteres wird dadurch unterstützt, dass die TN-R-Sekretion durch Oligodendrozyten, welche auf TN-R-haltigem Substrat kultiviert wurden, durch TN-R aus höheren Vertebraten stark und durch Fisch-TN-R etwas weniger erhöht wurde (Fig. 8B).
Bevorzugt wird für die Differenzierung unreifer Oligodendrozyten in vitro auf TN-R- beschichteten Oberflächen eine TN-R-Konzentration von mindestens 10 μg/ml eingesetzt. Besonders bevorzugt ist eine TN-R-Konzentration von mindestens 20 μg/ml, ganz besonders eine TN-R-Konzentration von 20 μg/ml. Bevorzugt wird das Verfahren (17) mit TN-R höherer Vertebraten, besonders bevorzugt mit einer erfindungsgemäßen TN-R-Sonde, ganz besonders bevorzugt mit nativem TN-R oder einem TN-R-Fragment oder -Fusionsprotein der Ausführungsform (4) durchgeführt. Die Hybridomzelllinien tn-R4 (Produzent des Antikörpers R4) und tn-R6 (Produzent des Antikörpers R6) wurden am 02. Dezember 2005 unter den Hinterlegungsnummern DSM ACC2754 bzw. DSM ACC2753 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese schränken den Schutzbereich der Erfindung jedoch nicht ein.
Beispiele Verwendete Lösungen/Medien:
1. HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (Sigma)
2. Enzymatische Lösungen für Zelldissoziierung:
1% (w/v) Trypsinlösung: 1% (w/v) Trypsin (Zellkultur getestet), 0,1% (w/v) DNase I, 1 mM EDTA, 0,8 mM MgSO4, 10 mM HEPES in HBSS (Ca/Mg-frei). DNaselösung: 0,05% (w/v) DNase I, 10 mM HEPES in BME (Basal Medium Eagle).
3. Definiertes serumfreies Medium: DMEM (Sigma) supplementiert mit Insulin (10 μg/ml), Progesteron (0,06 μg/ml), Trijodothyronin (0,34 μg/ml), L-Thyroxin (0,52 μM), Putrescin (16 μg/ml), Natriumselenit (0,22 μM), Transferrin (0,1 mg/ml), HEPES (25 mM), Gentamycin (25 μg/ml), Penicillin (100 units/ml) sowie Streptomycin (0,1 mg/ml).
4. Blockierungspuffer: 2% (w/v) BSA (Rinderserumalbumin, fettsäurefrei) in PBS (150 mM NaCI, 8 mM Na2HPO4, 17,4 mM NaH2PO4), pH 7,2, hitzeinaktiviert (für 20 Minuten bei 7O0C).
Gewebeextrakte und Westernblots: Gewebeproben wurden in PBS oder TES (s. Bsp. 1) mit oder ohne 1 % Triton® X-100 für 2 h bei 4 0C homogenisiert. Alle Puffer enthielten Spermidin und Proteaseinhibitoren (vgl. Bsp. 1). Unlösliches Material wurde durch Sedimentation abgetrennt. Gewebeextrakte aus Fischen (50 μg Protein/Spur) und anderen Vertebraten (20 μg Protein/Spur) wurden durch SDS- PAGE unter reduzierenden Bedingungen über 7 %-Polyacrylamid-Gele aufgetrennt und entweder Sibergefärbt oder durch Westernblot mit TN-R spezifischen Antikörpern analysiert. Bei den Westernblots dienten alkalische-Phosphatase- oder horseradish-Peroxidase (HRP)-konjugierte sekundäare Antikörper (Promega; Roche Daignostics) zur Detektion (Pesheva, P. et al., J. Neurosci. Res. 51 :49-57 (1998)).
Enzymatische Behandlung von TN-R: Zur enzymatischen Entfernung von N- verknüpften Oligosacchariden wurden gereinigte TN-R Proteine mit N-Glycosidase F oder H (Roche Diagnostics) behandelt wie beschrieben (Pesheva, P. et al., J. Cell. Biol. 109: 1765-1778 (1989)). Zur enzymatischen Entfernung von O-verknüpften GAGs wurden die NT-R Proteine mit Chondroitinase ABC oder Heparinase (Sigma) behandelt wie beschrieben (Probstmeier, R. et al., Brain Res. 863:42-51 (2000)). Zellkulturen: Primäre Kulturen von Kleinhirnneuronen (in serumfreiem Fischer- Medium; Pesheva, P. et al., Neuron 10:69-82 (1993)), Oligodendrozyten (in serumfreiem Sato-Medium; Pesheva, P. et al., J. Neurosci. 17:4642-4651 (1997)) und Hautfibroblasten (in DMEM 10 % FCS) wurden wie beschrieben hergestellt. Zur Untersuchung des Neuritenwachstums wurden Kleinhirnneurone (IxIO6 Zellen/ml) auf den Testsubstraten in einem serumfreien Fischer-Medium kultiviert.
Beispiel 1: Immunaffinitätschromatoqraphische Aufreiniqunq von TN-R Proteinen Die Aufreinigung von TN-R Proteinen aus adultem Gehirn (Hai, Karpfen, Huhn, Maus, Ratte, Rind, Schwein, Mensch) erfolgte über immunaffinitäts- chromatographische Verfahren (Fig. 6). Hierzu wurde das Ausgangsgewebe mit einem Harnstoff-haltigen Puffer (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, IM Harnstoff, pH 7,9; inklusive 1 mM Spermidin und folgenden Proteaseinhibitoren: lμM Aprotinin, 5 μM SBTI (Trypsininhibitor aus Sojabohne), 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), Iodoacetamid (19 μg/ml), Typ III Trypsininhibitor aus Eiweiß (10 μg/ml)) für 2 h bei 40C aufgeschlossen und anschließend unlösliche Anteile für 30 Minuten bei 30.000 g pelletiert. Der Überstand wurde mit 40% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt und präzipitierte Anteile durch einen Zentrifugationsschritt bei 30.000 g gesammelt. Das Präzipitat wurde nachfolgend in 20 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCI, pH 7,2, gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert. Nicht gelöste Anteile wurden durch eine einstündige Zentrifugation bei 100.000 g und 40C entfernt.
Alternativ wurde folgendes Aufschlussverfahren verwendet: Homogenisation des Gewebes in TES Puffer (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 10 mM EDTA, pH 7,4; inklusive 1 mM Spermidin und den oben angegebenen Proteaseinhibitoren) und Übernachtinkubation bei 40C. Nicht gelöste Anteile wurden danach durch eine einstündige Zentrifugation bei 100.000 g und 40C entfernt. Der Überstand des jeweils letzten Zentrifugationsschritts wurde anschließend für die weitere immunaffinitätschromatographische Reinigung von TN-R Proteinen verwendet. Hierzu wurden die Überstände über Säulenmatrizes geleitet, an die monoklonale TN-R Antikörper gebunden waren. Es handelte sich dabei um monoklonale Antikörper, die als Rl, R2 (Pesheva, P. et al., J. Cell. Biol. 109: 1765-1778 (1989)), R4 oder R6 (siehe Bsp. 5) bezeichnet wurden. Diese Antikörper wurden an CNBr- aktivierte Sepharose®4B gekoppelt. Nach Passage der Zentrifugationsüberstände wurden die Antikörpersäulen zuerst mit 20 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,5 M NaCI, 0,5% (v/v) Triton®X-100, pH 7,2, anschließend mit PBS (Phosphatgepufferte Saline, pH 7,2) gewaschen. Die an die Antikörper gebundenen TN-R Proteine wurden mit einem basischen Elutionspuffer (0,1 M Diethylamin, 0,1 M NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 11,2) von der Säule gelöst. Das Eluat wurde sofort neutralisiert und gegen PBS dialysiert.
Beispiel 2: Herstellung humaner TN-R Fragmente
Ähnlich wie die anderen bekannten TN-R Proteine, setzt sich das humane TN-R Protein aus verschiedenen distinkten Domänen zusammen (Carnemolla, B. et al., J. Biol. Chem. 271:8157-60 (1996)). Beginnend mit einer Cystein-reichen Region am N-Terminus, gefolgt von 4,5 EGF-ähnlichen Domänen und 8 FN HI-ähnlichen Domänen (wobei zwischen der 5. und 6. Domäne eine weitere bei entsprechendem alternativem Spleißen vorhanden sein kann, was dann 9 FN III-ähnlich Domänen ergibt), endet das Molekül am C-Terminus mit einer Fibrinogen-ähnlichen Domäne. Die publizierte humane TN-R-Sequenz umfasst mit 9 FN HI-ähnlichen Domänen 4716 Basen (SEQ ID NO: 1; NCBI nucleotide NM_003285). Hiervon entfällt auf den kodierenden Bereich der Abschnitt zwischen den Basen 82 bis 4158, auf das Signalpeptid (zur Sekretion des TN-R Proteins) der Basenbereich 82 bis 150. Für die Herstellung rekombinanter eukaryotisch exprimierter TN-R Proteinfragmente wurden nachfolgende DNA-Sequenzen entsprechend einzelner Domänenbereiche ausgewählt:
"H-TNR-Sl": bp 151-1065
(Bereich: „Cys-Region" bis „EGF-ähnliche Domänen" (inkl.))
"H-TNR-S2": bp 1051-3483
(Bereich: „FN-III-ähnliche Domäne 1" bis ,, FN-III-ähnliche Domäne 8" (inkl.)) H-TNR-S3": bp 3439-4155
(Bereich: „Fibrinogen-ähnliche Domäne " (inkl.)) "H-TNR-S4": bp 151-1599
(Bereich: „Cys"-Region bis ,, FN-III-ähnliche Domäne 3 (inkl.)) "H-TNR-S5": bp 1573-2945 (Bereich: „ FN-III-ähnliche Domäne 4 " bis „ FN-III-ähnliche Domäne 6 " (inkl.)) "H-TNR-S6": bp 2926-4155
(Bereich: „ FN-III-ähnliche Domäne 7" bis „Fibrinogen- ähnliche Domäne " (inkl.)) In ihrer Gesamtheit decken die Fragmente H-TNR-Sl bis H-TNR-S6 das ganze TN-R Protein ab. Zur Gewinnung humaner TN-R-spezifischer mRNA wurde die menschliche Neuroblastomzelllinie SH-SY5Y verwendet (Woodworth, A. et al., J. Biol. Chem. 279: 10413-21 (2004)). Gesamt-RNA wurde aus diesen Zellen unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) nach Herstellervorschrift gereinigt. Die cDNA- Synthese aus diesen RNA-Präparationen erfolgte unter Verwendung von "Random hexamer"-Primern oder oligo(dT)-Primern mit Hilfe des SuperScript II Systems (Invitrogen) nach Herstellervorschrift. Zur Herstellung von H-TNR-Sl- bis H-TNR- S6-spezifischer cDNA-Fragmente wurden folgende Primer verwendet:
H-TNR-Sl
SEQ ID NO:3: upstream: TCC ATG ATC AAG CCT TCA GAG TG (bp 151-173) SEQ ID NO:4: downstream: AGG GGC AAC TGC TGA GCA GT (bp 1046-1065)
(Produktlänge: 915 bp)
H-TNR-S2
SEQ ID NO:5: upstream: TCA GCA GTT GCC CCT CCA GAG G (bp 1051-1072)
SEQ ID NO:6: downstream: ATG AGG GAA CAC CCG GCC TCC (bp 3463-3483) (Produktlänge: 2433 bp)
H-TNR-S3
SEQ ID NO:7: upstream: ATC ACC TCC ACC GCT TTC ACC (bp 3439-3459)
SEQ ID NO:8: downstream: GAA CTG TAA GGA CTG CCG TTT TCT (bp 4132-4155)
(Produktlänge: 717 bp) H-TNR-S4
SEQ ID NO:9: upstream: TCC ATG ATC AAG CCT TCA GAG TG (bp 151-173)
SEQ ID NO: 10: downstream: GCC GTC AAT GAC TGT GGA GAC (bp 1579-1599)
(Produktlänge: 1449 bp)
H-TNR-S5 SEQ ID NO: 11: upstream: GCC AGC GTC TCC ACA GTC ATT G (bp 1573-1594)
SEQ ID NO: 12: downstream: GTT GTC CAT GGC TGT GTG CAC A (bp 2925-2946)
(Produktlänge: 1374 bp)
H-TNR-S6
SEQ ID NO: 13: upstream: GTG CAC ACA GCC ATG GAC AA (bp 2926-2945) SEQ ID NO: 14: downstream: GAA CTG TAA GGA CTG CCG TTT TC (bp 4133-4155)
(Produktlänge: 1230 bp)
Die gewonnenen PCR-Fragmente wurden mit Hilfe des TOPO TA Klonierungssystems (Invitrogen), das sich die überstehenden A-Reste der PCR- Produkte bei Verwendung von Taq-Polymerase zunutze macht, nach Herstellervorschrift in den pcsecTag/FRT/V5-His-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert. Dieser Vektor erlaubte nach stabiler Integration in eukaryotische Flp-In-Zellinien (siehe unten) die Sekretion des gewünschten, am C-Terminus mit einem 6xHis- Peptid versehenen Proteinfragments in den Zellkulturüberstand. PolyHis-tragende Protei nf rag mente wurden über Nickel-Chelatchromatographie aus gesammelten Zellkulturüberständen aufgereinigt.
Als Produzenten der Proteinfragmente wurden FIp-In 293 Zellen (Invitrogen) verwendet, die sich von der menschlichen Nierenzelllinie HEK 293 ableiten. In FIp- In-Zellen ist das Plasmid pFRT/lacZeo (Invitrogen) stabil integriert. Dieser Vektor enthält eine von der Flp-Rekombinase spezifisch erkannte FRT-Region. Bei gleichzeitiger Transfektion der Flp-293-Zellen mit dem pOG44-Plasmid, das die Expression der Flp-Rekombinase ermöglicht, und dem die Basensequenz des gewünschten Proteinfragments tragenden pcsecTag/FRT/V5-His-TOPO-Vektor kommt es an der FRT-Region zu einem Einbau der für die Herstellung des sekretierten Proteinfragments notwendigen Anteile des pcsecTag/FRT/V5-His-TOPO- Vektors.
Beispiel 3: Selektive Aufreiniqunq von Oliqodendrozyten aus ZNS-Gewebe von Säugern mit Hilfe von nativem Tenascin-R
Als Ausgangsmaterial wurden postnatale Mausgehirne (entweder das Gesamtgehirn oder isolierte Vorderhirn- und Kleinhirnbereiche bzw. Präparationen des optischen Nervs) der Altersstufen Postnataltag 0 (PO) bis adult verwendet. Isolierte Gehirnbereiche wurden nach mechanischer Zerkleinerung entsprechend der Herkunft bzw. des Alters mit 0,5 bis l%iger (w/v) Trypsinlösung behandelt (PO bis P2 Gehirne mit 0,5% (w/v) Trypsinlösung für 12 min bei Raumtemperatur (RT), P5 Gehirne mit 1% (w/v) Trypsinlösung für 15 min bei RT, P8 Gehirne mit 1% (w/v) Trypsinlösung für 20 min bei RT und adulte Gehirne mit 1% (w/v) Trypsinlösung für 30 min bei RT). Die Gewebsteile wurden nach Zugabe eines größeren Volumens HBSS bei 600 g für 10 Minuten bei 40C pelletiert.
Zur Gewinnung von Einzelzellen wurden die pelletierten Gewebestücke in DNase- Lösung aufgenommen und in einer Pasteurpipette mit verengtem Spitzendurchmesser mehrmals auf- und abpipettiert. Die erhaltene grobe Zellsuspension wurde in einem 5-10fachem Volumen an serumfreiem Medium (supplementiert mit 0,2% (w/v) hitzeinaktiviertem Rinderserumalbumin) verdünnt und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Der die Einzelzellsuspension enthaltende Überstand wurde bei 600 g für 10 min bei 40C zentrifugiert und die pelletierten Einzelzellen in serumfreiem Medium resuspendiert. Die so gewonnenen Einzelzellsuspensionen enthielten alle in den entsprechenden Gehirnen/Gehirnbereichen vorhandenen Zelltypen (Neurone, Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia, meningiale und endotheliale Zellen). Zur Gewinnung reiner Oligodendrozytenpopulationen wurden die im letzten Abschnitt vorgestellten Einzelzellsuspensionen (2xlO6 Zellen/ml in serumfreiem Medium) auf mit Tenascin-R Protein beschichteten Zellkulturschalen (siehe unten) ausplattiert und für 8-20 Stunden in einem CO2-Inkubator (5% CO2) kultiviert. Nicht adhärente Zellen wurden mit HBSS weggespült und adhärente Zellen in serumfreiem Medium weiter kultiviert. Anschließend wurden die auf TN-R- Substraten adhärenten Zellen mit einem GalC-spezifischen monoklonalen Maus- Antikörper (Ol; Bansai, R. et al., J. Neurosci. Res. 24:548-557 (1989)) inkubiert (30 min bei RT). Nach Fixierung der Zellen mit 4 % (v/v) Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei RT wurde die Bindung des Ol-Antikörpers auf die Zellen durch Inkubation mit Cyanin3- oder FITC-gekoppelten anti-Maus-Ig-Antikörpern (20 min bei RT) fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen. Auf dem Substrat verblieben 99+/-l% GalC-färbbare Zellen, also nur Oligodendrozyten (Fig. 7, untere Zeile). Die durch dieses Einstufenverfahren gewonnenen Zellen konnten für weitere Verwendungszwecke durch Behandlung mit Accutase® (Sigma) vom Substrat abgelöst und auf anderen Substraten/Plastikoberflachen bzw. in anderen definierten Medien zur Gewinnung von beispielsweise unreifen Vorläufer-Oligodendrozyten oder myelinkompetenten Oligodendrozyten weiter kultiviert werden. Für die Herstellung von Substraten aus Tenascin-R Proteinen/Proteinfragmenten wurden Plastikoberflächen (Zellkulturschalen, -flaschen, etc.) mit den entsprechenden Proteinen/Proteinfragmenten (20-40 μg/ml in PBS) für 1-2 h bei 370C inkubiert, mit PBS gewaschen, anschließend mit Blockierungspuffer inkubiert (1 h bei 370C) und abschließend erneut mit PBS (2-3 mal) gewaschen. Für die Herstellung von TN-R-Substraten zur Gewinnung reiner Oligodendrozyten- populationen konnten TN-R Proteine aus Hai, Karpfen, Huhn, Maus, Ratte, Rind, Schwein, oder Mensch verwendet werden. Zumindest die aus Nager-TN-R hergestellten Substrate können nach Beschichtung auch eingetrocknet werden, ohne dass die spezifisch adhäsiven Eigenschaften der TN-R Proteine für Oligodendrozyten hierdurch verloren gingen.
Beispiel 4: Selektive Aufreiniqunq von Oliqodendrozyten aus ZNS-Gewebe von Säugern mit Hilfe von Tenascin-R-Fraqmenten
Für die Selektion reiner Oligodendrozytenpopulationen aus ZNS-Gewebe mit Hilfe von rekombinant hergestellten TN-R-Fragmenten werden im Wesentlichen die in Bsp. 3 beschriebenen Schritte zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus postnatalem Gehirngewebe und zur Selektion von Oligodendrozyten auf mit TN-R- Fragmenten beschichteten Zellkulturschalen aus der Zellsuspension unter serumfreien Kulturbedingungen angewandt. Die durch dieses Einstufenverfahren gewonnenen oligodendroglialen Zellen können für weitere Verwendungszwecke vom Substrat abgelöst und auf anderen Substraten bzw. unter anderen Kulturbedingungen weiter vermehrt oder untersucht werden. Für die Herstellung von Substraten aus rekombinant hergestellten TN-R- Fragmenten werden Plastikoberflächen mit den entsprechenden, aus dem C- Terminus des humanen TN-R stammenden Proteinfragmenten, die Aminosäuresequenzen der FNG-Domöne und/oder Teile davon enthalten, beschichtet (10-20 μg/ml in PBS für 2 h bei 37°C). Alternativ werden die entsprechenden TN-R-Fragmente kovalent an Träger gekoppelt, z.B. durch eine N- Alkylcarbamat-Bindung von Aminogruppen des Proteinfragments a 1,1 '- Carbonyldiimidazol-aktivierte Matrizes (i.e. Plastikoberflächen oder Biopolymere). Die Substratträger werden anschließend mit PBS gewaschen, mir Blockierungspuffer inkubiert (1 h bei 37°C) und abschließend erneut mit PBS gewaschen.
Beispiel 5: Herstellung monoklonaler TN-R Antikörper
Die monoklonalen TN-R Antikörper Rl und R2 wurden bereits charakterisiert (Rl = Antikörper aus Klon 597, R2 = Antikörper aus Klon 596 in Pesheva, P. et al., J. Cell. Biol. 109: 1765-1778 (1989)). Sie wurden gegen Hühnerhirn-Glycoproteine erzeugt und erkennen diverse Vertebraten-TN-R, u.a. von Huhn und Mensch (Tab. 2). Die monoklonalen TN-R-Antikörper R4, R5 und R6 wurden durch Immunisierung mit einer äquimolaren Mischung aus Huhn-TN-R und humanem TN-R als Antigen in BALB/c-Mäusen hergestellt (3 subkutane Injektionen in 2-Wochen-Abständen mit 5 μg Protein/Maus). Die genannten TN-R Proteine waren zuvor durch immunaffinitätschromatographische Reinigung über Säulenmatrices, an die R2 Antikörper gekoppelt waren, aus erwachsenem Hirngewebe gewonnen worden. Hybridomklone, gewonnen durch die Fusion von aus mit diesen TN-R Proteinen immunisierten Mäusen stammenden Milzzellen mit Maus-Myelomzellen (Myelomzelllinie P3X63/Ag8), wurden in ELISA-Assays gegen Huhn-, Maus- und humanes TN-R gescreent. Hierfür wurden Mikrotiterplatten mit Maus- oder einen äquimolaren Mischung aus Huhn- und humanen TN-R beschichtet (0,5 μg/ml in 0,1 M NaHCO3 über Nacht bei 4°C) und mit Hybridomzellüberständen inkubiert (2h bei 37°C). Die Bindungen der in diesen Überständen vorhandenen kreuzreaktiven Antikörper wurde durch Inkubation mit Peroxidase-gekoppelten anti-Maus-Ig- Antikörpern nachgewiesen. Die Spezifität positiver Hybridomklone für TN-R war unabhängig von der Herkunft des TN-R Proteins, wie durch weitere ELISA- und Westernblotanalysen von immunaffinitätsgereinigten TN-R Proteinen und Gehirnextrakten gezeigt werden konnte.
Die Reinigung der Antikörper erfolgte durch Auftrennung der Überstände der Hybridomkulturen über Protein G-Sepharose-Säulen (Amersham). Die Antikörper R4, R5 und R6 gehörten wie Rl und R2 der IgGl-Subklasse von Immunglobulinen an und erkannten TN-R Proteine in verschiedenen Vertebratenklassen (Fig. 5 und Tab.2): Fische (R5, R6), Amphibien (R5, R6), Reptilien (R4, R5, R6), Vögel (R4, R5, R6) und Säuger (R4, R5, R6). R4 erkannte also nur das TN-R in höheren Vertebratenklassen. Die Ergebnisse für Rl , R2, R4, R5 und R6 sind in Tab. 2 zusammengefasst. In höheren Vertebraten erkannte Rl nur die 180 kD-Form des TN-R Proteins. Keiner der Antikörper reagierte mit anderen ECM-Proteinen neben TN-R (wie z.B. TN-C, Fibronectin, Laminin, Vitronectin oder Kollagenen; vgl. Fig. 5E). R4 und R6 waren auch nach Abspaltung der Zuckerreste von den TN-R Proteinen durch Glykosidase-Verdau noch aktiv, sie erkannten also Protei nepitope auf dem TN-R-Molekül. Tab. 2 fasst die Ergebnisse mehrerer ELISA- und Western Blot-Analysen zusammen: während R2 und R4 hauptsächlich mit TN-R höherer Vertebraten reagieren, erkennen Rl, R5 und R6 alle getesteten Vertebratenarten. In höheren Vertebraten, die sowohl die 160 kD- als auch die 180 kD-Form von TN-R aufweisen, erkennt Rl hauptsächlich die 180 kD-Form. Die Antikörper sind in verschiedenen immunochemischen Verfahren einsetzbar (Tab.2). Des weiteren interferieren R2, R4, R5 und R6 in vitro mit der inhibitorischen Wirkung des TN-R auf die neuronale Zelladhäsion und das Axonwachstum, indem sie diese Wirkung neutralisieren (Fig. 5C und 5D).
Tab. 2: Kreuzreaktivitäten der monoklonalen TN-R Antikörper (Rl, R2, R4, R5, R6)mit verschiedenen Vertebraten; Anwendungsbereiche.
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Beispiel 6: Zelladhäsions- und Neuritenwachstumstests
Für Kurz- und Langzeitadhäsionstests wurden entweder TN-R alleine, TN-R in einer Mischung mit anderen ECM-Proteinen oder Proteinfragmenten, oder eine TN-R- Schicht auf PLL-Substrat hergestellt wie beschrieben (Pesheva, P. et al., Neuron 10:69-82 (1993); Pesheva, P. et al., J. Cell. Sei. 107:2323-2333 (1994)). Für Neuritenwachstumstests wurde Laminin in Mischung mit BSA (Kontroll protein) oder TN-R (Verhältnis 20:20μg/ml für jedes Protein) in Zellkulturschalen als Beschichtung aufgebracht und 60 min bei 37 0C inkubiert. Für Zeiladhäsionstests wurden entweder TN-R alleine (20 μg/ml in PBS) oder BSA bzw. TN-R vermischt mit Laminin, Fibronectin oder Fibronectin-Fragmenten (Verhältnis 20:20 μg/ml für jedes Protein) als Schicht auf Plastik-Zellkulturschalen ausgebracht und 60 min bei 37°C inkubiert. Für die Zeiladhäsionstests wurden kultivierte Zellen (s. oben, Zellkulturen) durch milde Behandlung mit Accutase® (PAA Laboratories; 10 min bei RT) oder 0,01 % Trypsin (Sigma; 5 min bei RT) aus der Zellkulturschale gelöst. Dann wurden Einzelzellkulturen (IxIO6 Zellen/ml) im jeweils geeigneten Medium auf die Testsubstrate ausplattiert. Für quantitative Analysen wurden Zellen, welche an die verschiedenen getesteten Substrate anhafteten in mikroskopischen Feldern von 800 μm2 mit der Bildanalysesoftware AxioVision (Zeiss) ausgezählt. Mittelwerte ± Standardabweichung wurden aus den Ergebnissen von fünf verschiedenen mikroskopischen Feldern gebildet.
Beispiel 7: Differenzierung von Oliqodendrozyten aus humanen neuralen Stammzellen
Humane neurale Stammzellen (Cambrex, human neural progenitors: PT-2599; 3xlO6 Zellen/ml) wurden als Neurospheroide in NPMM (Neural Progenitor Maintenance Medium, Cambrex, CC-3209) für 7 Tage (bei 37 0C und 5% CO2) in Zellkulturflaschen (T-75) vermehrt. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Anschließend wurden die Stammzellen enthaltenden Neurospheroide auf mit Laminin (20 μg/ml) beschichteten Zellkulturschalen ausplattiert (1-2 Neurosphero- ide/Schale) und durch Kultivierung in einem definierten serumfreien Medium (DMEM/Ham 's F12, N2 Supplement (Invitrogen), 50 ng/ml bFGF, 10 ng/ml PDGF) für minimal 7 Tage vermehrt. Das Medium wurde alle 2 Tage zur Hälfte erneuert. Diese Kulturbedingungen führten zur Vorprogrammierung der neuralen Stammzellen zu einem dominant glialen Phänotyp (nachweisbar durch die Expression von Sulfatiden). Die Zellen wurden anschließend durch Behandlung mit Accutase® (PAA, 10 min bei RT) von den Zellkulturschalen abgelöst, in einem definierten Medium (IxIO6 Zellen/ml in DMEM, N2 Supplement, 10 ng/ml T3 (Trijodothyronin, Sigma)) aufgenommen und auf nur mit Poly-D-Lysin (PDL, Sigma) oder auf mit PDL und TN-R (20 μg/ml) beschichteten Zellkulturplatten ausplattiert. Die anschließende Inkubation bei 37 0C und 5% CO2 führte dazu, dass sich nach 5 Tagen in Gegenwart von TN-R, nicht aber in Gegenwart von nur PDL dominant reife Oligodendrozyten gebildet hatten, wie durch die Expression von MBP (myelin basic protein) nachgewiesen wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von neuralen Zellen aus neuralem Primärgewebe von Vertebraten, umfassend die Selektion der Zellen aus einer Einzelzellsuspension mittels einer Tenascin-R-haltigen Sonde ("Tenascin-R-Sonde"), welche Tenascin-R-Verbindungen ausgewählt aus nativem Tenascin-R (TN-R) sowie Homologen und Fragmenten desselben und Fusionsproteine derartiger Verbindungen umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei
(i) die Tenascin-R-Verbindung der Tenascin-R-Sonde eine rekombinante Tenascin- R-Verbindung ist; und/oder
(ii) das TN-R aus Vertebraten, bevorzugt aus Fischen, Reptilien, Amphibien, Vögeln und Säugetieren, besonders bevorzugt aus Hai, Karpfen, Huhn, Nagern einschließlich Maus und Ratte, Rind, Schwein und Mensch, ganz besonders bevorzugt aus Nagern und Mensch stammt; und/oder (iii) die Tenascin-R-Sonde weitere funktionelle Peptid- oder Proteinsequenzen enthält und/oder an einen Träger gekoppelt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei
(i) das native Tenascin-R humanes Tenascin-R ist und/oder die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 besitzt oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante derselben ist; und/oder
(ii) das Tenascin-R-Fragment den C-Terminus von nativem Tenascin-R oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante desselben umfasst, bevorzugt denjenigen Bereich umfasst, der durch die Nukleotide 3940-4155 der SEQ ID NO: 1 kodiert wird, besonders bevorzugt einen derjenigen Bereiche umfasst, die durch die Nukleotide 2926-4155, 3439-4155, 3487-4155 oder 3940-4155 von humanem TN- R der SEQ ID NO: 1 kodiert werden; und/oder
(iii) das Tenascin-R-Fragment die Aminosäurereste 1287 bis 1358 der SEQ ID NO:2, bevorzugt eine oder mehrere der Teilsequenzen des humanen TN-R ausgewählt aus den Aminosäuren 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 oder 949- 1358 in SEQ ID NO:2 oder eine Substitutions-, Deletions- und/oder Additionsmutante derselben umfasst; und/oder (iv) das Tenascin-R-Fusionsprotein eine Tenascin-R-Komponente, umfassend natives Tenascin-R, ein Tenascin-R- Fragment oder eine Tenascin-R-Mutante, insbesondere wie vorstehend unter (i) bis (iii) beschrieben, und eine funktionelle Komponente, umfassend weitere funktionelle Peptide oder Proteine, aufweist oder aus zwei oder mehr, bevorzugt zwei oder drei funktionellen Tenascin-R-Komponenten wie vorstehend definiert zusammengesetzt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Tenascin-R-Fragment ein Peptid mit der Sequenz der Aminosäurereste 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 oder 949-1358, vorzugsweise der Aminosäurereste 949-1358 oder 1120-1358 von SEQ ID NO: 1 ist.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei
(i) das Verfahren zur Isolierung und Reinigung von glialen Zellen, bevorzugt von Oligodendrozyten, geeignet ist; und/oder (ii) das Vertebraten-Primärgewebe aus niederen oder höheren Vertebraten einschließlich Fischen, Amphibien, Vögeln und Säugetieren, besonders bevorzugt aus Hai, Karpfen, Huhn, Nagern einschließlich Maus und Ratte, Rind, Schwein und Mensch, ganz besonders bevorzugt aus Nagern und Mensch stammt; und/oder (iii) die Isolierung der Zellen durch selektive Substratadhäsion an die Tenascin-R- Sonde und/oder in einem einzigen Reinigungsschritt erfolgt.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Einzelzellsuspension
(i) aus embryonalem, fötalem, früh- oder spätpostnatalem und/oder adultem Gewebe hergestellt wird; und/oder (ii) aus Gewebe aus verschiedenen Bereichen des Nervensystems, bevorzugt aus Nervengewebe oder Gehirn, besonders bevorzugt aus Gehirn, Rückenmark oder optischem Nerv hergestellt wird; und/oder
(iii) Zellen einer oder mehrerer Differenzierungsstufen, bevorzugt einer einzigen Differenzierungsstufe, enthält.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei
(i) die Tenascin-R-Sonde durch nichtkovalente Wechselwirkungen, einschließlich Wechselwirkung mit TN-R-spezifischen Antikörpern usw., oder durch eine andere adäquate Kupplungstechnik, welche die Spezifität der Tenascin-R-Sonde nicht verändert, einschließlich kovalente Vernetzung usw., an ein Trägermaterial gebunden ist; und/oder
(ii) die Einzelzellsuspension mit der Tenascin-R-Sonde in Kontakt gebracht wird, so dass in der Einzelzellsuspension vorhandene Tenascin-R-bindende Zellen an die Sonde gebunden werden; und/oder (iii) durch spezifische Bindung neuraler Stammzellen aus der Einzelzellsuspension an die Tenascin-R-Sonde eine Isolierung dieser Zellen aus der Zellkultur erfolgt, die nicht gebundenen Zellen entfernt werden und optional anschließend die über die Tenascin-R-Sonde an das Trägermaterial gebundenen Zellen durch Trypsinierung, Inkubation mit Accutase® oder ein anderes adäquates Verfahren vom Trägermaterial abgelöst werden; und/oder
(iv) die gebundenen Zellen durch immunologische Methoden nachgewiesen werden; und/oder (v) das Verfahren in vitro erfolgt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, das
(i) zur Gewinnung von neuralen Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, für die Anzucht differenzierter Zellen, insbesondere neuraler Zellen, in neurobiologischen und zellphysiologischen Untersuchungen, in der biologischen und klinischen Forschung und für diagnostische und therapeutische Verfahren in vitro und in vivo, insbesondere für die Herstellung eines Medikaments zur Zelltherapie und zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten; und/oder (ii) zum Nachweis von neurodegenerativen Krankheiten geeignet ist.
9. Tenascin-R-Fragment oder Tenascin-R-Fusionsprotein wie in Anspruch 3 oder 4 definiert.
10. Tenascin-R-Fragment oder Tenascin-R-Fusionsprotein nach Anspruch 9, welches eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Aminosäuren 1287-1358, 1120-1358, 1136-1358 oder 949-1358 in SEQ ID NO:2 aufweist.
11. DNA, die für ein Tenascin-R-Fragment oder Tenascin-R-Fusionsprotein nach Anspruch 9 oder 10 kodiert.
12. Vektor, der eine DNA nach Anspruch 11 umfasst.
13. Wirtsorganismus, der mit einem Vektor nach Anspruch 12 transformiert/trans- fiziert ist und/oder eine DNA nach Anspruch 11 aufweist.
14. Verfahren zur Herstellung eines Tenascin-R-Fragments oder Tenascin-R- Fusionsproteins nach Anspruch 10, umfassend das Kultivieren des Wirtsorganismus nach Anspruch 13.
15. Antikörper, der durch Immunisierung eines geeigneten Wirtsorganismus mit Tenascin-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Spezies, insbesondere mit Tenascin-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Vertebraten erhältlich ist, und/oder welcher an Tenascin-R von wenigstens zwei unterschiedlichen Spezies, insbesondere von wenigstens zwei unterschiedlichen Vertebraten bindet.
16. Antikörper nach Anspruch 15, der monoklonal ist und bevorzugt durch die Hybridomzelllinie DSM ACC2754 oder DSM ACC2753 produziert wird.
17. Zelllinie oder Hybridomzelllinie, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 16 produziert.
18. Verwendung des Antikörpers nach Anspruch 15 oder 16 (i) zum immunochemischen Nachweis von TN-R; (ii) zur Hemmung der Wirkung von TN-R;
(iii) zur Beeinflussung der Neuralentwicklung und
(iv) zur Herstellung von Medikamenten zur Therapie und Prophylaxe traumatischer
Nervenläsionen und von Medikamenten zur gezielten Beeinflussung der
Neuralentwicklung.
19. Verfahren zur Therapie und Prophylaxe traumatischer Nervenläsionen oder zur gezielten Beeinflussung der Neuralentwicklung, umfassend die Verabreichung einer pharmakologisch ausreichenden Menge des Antikörpers gemäß Anspruch 15 oder 16 an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
20. Kit zur Isolierung und Reinigung von neuralen Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, nach einem oder mehreren der Verfahren der Ansprüche 1 bis 8, insbesondere enthaltend
(i) eine wie in Ansprüchen 1 bis 4 definierte Tenascin-R-Sonde, und/oder (ii) einen Vektor, der für die in (i) definierte Tenascin-R-Sonde kodiert, und/oder (iii) eine Stammkultur einer Zelllinie, die dazu geeignet ist, die wie in Ansprüchen 1 bis 4 definierte Tenascin-R-Sonde zu exprimieren.
21. Kit nach Anspruch 20, wobei
(i) die Sonde an ein Trägermaterial gebunden ist; und/oder
(ii) der Kit weiterhin Tenascin-R-Antikörper, insbesondere die in Anspruch 15 definierten Antikörper umfasst; und/oder
(iii) der Kit weiterhin enzymatische Lösungen zur Zelldissoziierung, Puffer und/oder Kulturmedien umfasst.
22. Verwendung einer Tenascin-R-Sonde wie in Ansprüchen 1 bis 4 definiert, bevorzugt eines Tenascin-R-Fragments oder Tenascin-R-Fusionsproteins wie in Anspruch 9 oder 10 definiert, zur Gewinnung von neuralen Zellen, insbesondere von Oligodendrozyten, für die Anzucht differenzierter Zellen, insbesondere neuraler Zellen, in neurobiologischen und zellphysiologischen Untersuchungen, in der biologischen und klinischen Forschung und für diagnostische und therapeutische Verfahren in vitro und in vivo, insbesondere für die Herstellung eines Medikaments zur Zelltherapie und zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten oder Myelin einhergehen, insbesondere Multipler Sklerose und periventrikulärer Leukomalazie (PVL).
23. Verfahren zur Zelltherapie oder zur Therapie von neurodegenerativen Krankheiten, die mit einem Verlust von Oligodendrozyten oder Myelin einhergehen, insbesondere von Multipler Sklerose und periventrikulärer Leukomalazie (PVL), umfassend die Gabe einer Tenascin-R-Sonde wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bevorzugt eines Tenascin-R-Fragments oder Tenascin- R-Fusionsproteins wie in Anspruch 9 oder 10 definiert, an einen menschlichen oder tierischen Patienten.
24. Verfahren zur Herstellung von Oligodendrozyten aus isolierten Stammzellen in vitro durch Inkubation der Stammzellen in Anwesenheit einer Tenascin-R-Sonde wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bevorzugt eines Tenascin- R-Fragments oder Tenascin-R-Fusionsproteins wie in Anspruch 9 oder 10 definiert.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die isolierten Stammzellen neurale oder nicht-neurale Stammzellen sind, welche das Potential zur Sulfatid-Expression besitzen.
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