DE60024997T2

DE60024997T2 - Vgf polypeptide und verfahren zur behandlung von vgf-erkrankungen

Info

Publication number: DE60024997T2
Application number: DE60024997T
Authority: DE
Inventors: Hai Yan; C. Thomas BOONE
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1999-07-21
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: EP1196442A1; DK1196442T3; AU783199B2; ATE313561T1; EP1196442B1; ES2255502T3; JP2006176528A; JP2003505471A; WO2001007477A1; DE60024997D1; MXPA02000680A; AU6112700A; CA2380037A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue VGF-Polypeptide und selektiv bindende Mittel. Die Erfindung betrifft ebenfalls Wirtszellen und Verfahren für die Herstellung von VGF-Polypeptiden. Des weiteren betrifft die Erfindung VGF-pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren für die Diagnose, Behandlung, Linderung und/oder Vorbeugung von Erkrankungen, Zuständen und Erkrankungen, die mit VGF-Polypeptiden assoziiert sind.
Hintergrund der Erfindung
VGF ist ein sekretiertes Polypeptid, das in Neuronen und endokrinen Zellen gefunden wird. Canu et al., 1997, Genomics, 45:443-46. VGF befindet sich im Hypothalamus und ist im Gehirn durch elektrische Aktivität, Verletzung und der tagesrhythmischen Uhr reguliert. Es wurde gezeigt, daß der Hypothalamus eine wichtige Rolle in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Energieleistung spielt, und es wurde gezeigt, daß eine Beschädigung des Hypothalamus sowohl den Appetit als auch das Körpergewicht beeinträchtigt. Schwarz et al., 1995, Am. J. Physiol., 169:949-47. Es wurde ebenfalls erkannt, daß VGF eine Rolle im Metabolismus spielt.
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von menschlichem und Ratten-VGF ist bekannt und zeigt eine Homologie zueinander. Canu et al., supra. Das VGF-Gen, das ursprünglich als ein 2,7 kb cDNA-Fragment identifiziert wurde, wird in Subpopulationen von Neuronen und endokrinen Zellen in vitro durch Neurotrophine transkribiert.
Fettsucht und Anorexie sind Störungen der Energiehomeostase, die sich aus einem Ungleichgewicht zwischen Energieaufnahme und -abgabe ergeben. Es gibt einen Bedarf von effektiver Behandlung für diese Zustände. Es gibt ebenfalls einen Bedarf für eine effektive Behandlung von Kachexie, Sterilität, hypermetabolischen Zustände, Hyperaktivität, Hypoaktivität, Hyperinsulinproduktion und verwandten Zuständen und Erkrankungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Der vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, umfassend die Aminosäuresequenz dargestellt in SEQ ID NO: 2.
Der Erfindung stellt ebenfalls ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, umfassend ein Fragment der Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, worin das Fragment eine Aktivität des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 aufweist.
Des weiteren stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, umfassend die Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution und worin das Polypeptid eine Aktivität von dem Polypeptid wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat,
(b) die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 mit mindestens einer Aminosäureinsertion und worin das Polypeptid eine Aktivität des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat,
(c) die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 mit mindestens einer Aminosäuredeletion und worin das Polypeptid eine Aktivität von dem Polypeptid wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat,
(d) die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, die eine C- und/oder N-terminale Verkürzung aufweist und worin das Polypeptid eine Aktivität des Polypeptids wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat; und
(e) die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 mit mindestens einer Modifikation ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresubstitutionen, Aminosäureinsertionen, Aminosäuredeletionen, Carboxylterminale Verkürzungen und Aminoterminale Verkürzungen und worin das Polypeptid eine Aktivität von einem Polypeptid wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 hat.

Ebenso bereitgestellt werden Fusionspolypeptide umfassend mindestens ein Polypeptid wie beschrieben, fusioniert an eine heterologe Aminosäuresequenz.
Der vorliegende Erfindung stellt weiterhin selektiv bindende Mittel zur Verfügung, wie zum Beispiel Antikörper, die zu einer spezifischen Bindung an mindestens ein Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, in der Lage sind.
Der vorliegenden Erfindung stellt des weiteren selektiv bindende Mittel zur Verfügung, die befähigt sind, ein Fragment von mindestens einem Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2 spezifisch zu binden, oder eine natürlich auftretende Variante davon.
Die selektiv bindenden Mittel der vorliegenden Erfindung können Antikörper oder Fragmente davon sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf: Mausantikörper, humanisierte Antiköper, menschliche Antikörper, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, CDR-enthaltende Antiköper, antiidiotypische Antikörper und variable Regionenfragmente (solche wie Fab oder ein Fab-Fragment). Das selektiv bindende Mittel der vorliegenden Erfindung schließt selektiv bindende Mittel oder Fragmente davon ein, die mindestens eine komplementär erkennende Region mit Spezifität für ein Polypeptid haben, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2.
Das selektiv bindende Mittel der Erfindung kann optional an einen nachweisbaren Marker gebunden sein.
Ebenfalls bereitgestellt werden selektiv bindende Mittel, die zum Entgegenwirken der VGF-biologischen Aktivität befähigt sind.
Ein bevorzugtes selektiv bindendes Mittel, oder Fragment davon, ist zur spezifischen Bindung eines Polypeptids befähigt, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 2, oder einem Fragment davon.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, umfassend die Polypeptide oder selektiv bindende Mittel der Erfindung, und eine oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Mittel sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen. Das Formulierungsmittel kann ein geeigneter Träger, Adjuvant, Lösungsmittel, Stabilisierer oder Antioxidans sein. VGF-Polypeptide oder selektiv bindende Mittel können kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer, wie Polyethylenglykol und Dextran, modifiziert sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden verwendet, um eine therapeutisch effektive Menge des VGF-Polypeptids oder des selektiv bindenden Mittels der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Der vorliegenden Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zur Herstellung des Medikaments zur Behandlung von VGF-vermittelten Erkrankungen, Zustände oder Veränderung zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Behandlung, Verhütung oder Verbesserung von VGF-vermittelten Erkrankungen, Zustände oder Veränderungen zur Verfügung, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge eines VGF-Polypeptids oder selektiv bindenden Mittels der Erfindung an einen Patienten. VGF-vermittelte Erkrankungen, Zustände und Veränderungen schließen Fettsucht, Sterilität, Kachexie, Eßstörungen, AIDS-bezogener Komplex, hypermetabolische Zustände, Hyperaktivität, Hypoaktivität und Hyperinsulinherstellung ein. VGF-vermittelte Eßstörungen schließen Bulimie und Anorexia nervosa ein. Es wird erkannt werden, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls Verabreichen von Kombinationen von VGF-Polypeptiden oder selektiv bindenden Mitteln der vorliegenden Erfindung bereitstellen.
Ebenfalls bereitgestellt sind Verfahren zur Diagnose von VGF-vermittelten Erkrankungen, Zuständen oder Störungen oder einer Empfänglichkeit für eine VGF-vermittelte Erkrankung, Zustand oder Störung in einem Tier, umfassend die Ermittlung des Vorhandenseins oder der Menge der Expression von einem VGF-Polypeptid, und Diagnose der VGF-vermittelten Erkrankung, Zustands oder Störung oder Empfänglichkeit für eine VGF-vermittelte Erkrankung, Zustand oder Störung basierend auf dem Vorhandensein oder der Menge der Expression des VGF-Polypeptids. Im bevorzugten Verfahren zur Diagnose von VGF-vermittelten Erkrankungen, Zuständen oder Störungen oder einer Empfänglichkeit für eine VGF-vermittelte Erkrankung, Zustand oder Störung, ist das Tier ein Säugetier. In weiter bevorzugten Verfahren ist das Tier ein Mensch.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Testen von Testmolekülen zur Verfügung, um ein Testmolekül, das zu einem VGF-Polypeptid bindet, zu identifizieren. Das Verfahren umfaßt das Zusammenbringen von VGF-Polypeptiden mit einem Testmolekül, und Erfassung des Ausmaßes der Bindung des Testmoleküls an das Polypeptid. Das Verfahren umfaßt des weiteren die Ermittlung, ob solche Testmoleküle Agonisten oder Antagonisten des VGF-Polypeptids sind. Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren ein Verfahren zum Testen der Auswirkung von Molekülen auf die Expression des VGF-Polypeptids oder auf die Aktivität des VGF-Polypeptids zur Verfügung.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden nach Betrachtung der gesamten Beschreibung offensichtlich sein.
Die Ansprüche beziehe sich auf SEQ ID NO: 2; der Bezug auf andere SEQ ID NOs dient dazu, beim Verständnis und der Ausführung der beanspruchten Erfindung zu helfen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt das Körpergewicht von VGF-Knockout-Mäusen dar, im Anschluß an die Verabreichung von VGF-1a (SEQ ID NO: 2). Die Verabreichung von VGF-1a wurde an Tag 5 beendet (wie durch den Pfeil angedeutet),
2 stellt den Antikörpertiter von einem Kaninchen dar, dem VGF-1 injiziert wurde (SEQ ID NO: 1); berechnet aus 1:100 zu 2× serieller Verdünnung; und
3 stellt den Antiköpertiter von einem Kaninchen dar, dem VGF-2 injiziert wurde (SEQ ID NO: 4); berechnet aus 1:100 zu 2× serieller Verdünnung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Abschnittsüberschriften, wie hierin verwendet, sind nur für organisatorische Verwendungszwecke und sind nicht dazu gedacht, den beschriebenen Subjektgegenstand zu begrenzen. Alle Referenzen, die in dieser Anmeldung aufgeführt sind, sind ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlossen.
Definitionen
Der Begriff „VGF-Polypeptid" betrifft Polypeptide, umfassend eine der Aminosäuresequenzen wie in Tabelle 1 dargestellt und verwandte Polypeptide wie hierin beschrieben. Verwandte Polypeptide schließen VGF-Polypeptid-Fragmente, -Orthologe, -Varianten und -Derivative ein, die mindestens ein Charakteristikum von einem der VGF-Polypeptide dargestellt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 besitzen. VGF-Polypeptide können reife Polypeptide sein, wie hierin definiert, und können einen Aminoterminus-Methioninrest haben oder nicht haben, je nach dem Verfahren, durch das sie hergestellt wurden.
TABELLE 1 VGF-Polypeptide
Der Begriff „VGF-Polypeptidfragment" betrifft auf ein Polypeptid, das eine Verkürzung an einem Aminoterminus und/oder eine Verkürzung an einem Carboxylterminus von einem der VGF-Polypeptide dargestellt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 umfaßt. Der Begriff „VGF-Polypeptidfragment" betrifft ebenso eine Aminoterminus- und/oder Carboxylterminus-Verkürzung von VGF-Polypeptidorthologen, -varianten oder -derivativen. VGF-Polypeptidfragmente können asu alternativem RNA-Splicing oder aus in vivo Proteaseaktivität resultieren. Solche VGF-Polypeptidfragmente können optional einen Aminoterminus-Methioninrest umfassen. Es wird erkannt werden, daß solche Fragmente benutzt werden können, um z.B. Antikörper gegen VGF-Polypeptide zu generieren.
Der Begriff „VGF-Polypeptidortholog" betrifft ein Polypeptid von einer anderen Spezies, das einem der VGF-Polypeptide wie dargestellt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 entspricht. Zum Beispiel werden Mäuse- und Menschen-VGF-Polypeptide als Orthologe voneinander betrachtet.
Der Begriff „VGF-Polypeptidvarianten" betrifft VGF-Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenzen, die eine oder mehrere Aminosäuresequenzsubstitutionen (konservative, nicht-konservative oder Kombinationen davon), Deletionen (solche wie intern Deletionen und/oder VGF-Polypeptidfragmente), und/oder Additionen (solche wie intern Additionen und/oder VGF-Fusionspolypeptide) verglichen mit einem der VGF-Polypeptide wie dargestellt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 aufweisen. Varianten können natürlich vorkommen (z.B. VGF-Polypeptid-allelische Varianten oder VGF-Polypeptidorthologe) oder können künstlich hergestellt sein.
Der Begriff „VGF-Polypeptidderivative" betrifft eines des VGF-Polypeptide wie dargestellt in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10, oder VGF-Polypeptidfragmente, -orthologe oder -varianten wie hierin definiert, das chemisch modifiziert wurde. Chemische Modifikationen können z.B. durch kovalente Bindungen von einem oder mehreren Polymeren, einschließlich aber nicht begrenzt auf wasserlösliche Polymere, N-verbundene oder O-verbundene Kohlenwasserstoffe, Zucker und Phosphate sein. VGF-Polypeptidderivative werden auf eine Weise modifiziert, die sich von den natürlich vorkommendem VGF-Polypeptid unterscheidet, entweder in der Art und Weise oder an der Stelle der Moleküle, die an das Polypeptid gebunden sind. VGF-Polypeptidderivative schließen des weiteren VGF-Polypeptide ein, die eine Deletion von einer oder mehreren chemischen Gruppen haben, die natürlicherwesie an ein VGF-Polypeptid gebunden sind.
Der Begriff „reifes VGF-Polypeptid" betrifft ein VGF-Polypeptid, dem eine Leadersequenz fehlt. Ein reifes VGF-Polypeptid kann ebenfalls andere Modifikationen einschließen, wie etwa proteolytische Prozessierung des Aminoterminus (mit oder ohne einer Leadersequenz) und/oder des Carboxylterminus, Spaltung eines kleineren Polypeptids von einem größeren Vorläufer, N-verbundene und/oder O-verbundene Glykosylierung und dergleichen.
Der Begriff „VGF-Fusionspolypeptid" betrifft eine Fusion von einer oder mehreren Aminosäuren (solche wie hetereologe Peptide oder Polypeptide) an den Amino- oder Carboxylterminus eines VGF-Polypeptids, Fragments, Orthologs, Variante oder Derivativs.
Der Begriff „biologisch aktives VGF-Polypeptid" betrifft ein VGF-Polypeptid, das mindestens eine Aktivitätscharakteristik von dem Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in einer der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 aufweist. Zusätzlich kann ein VGF-Polypeptid als ein Immunogen aktiv sein; d.h., das VGF-Polypeptid enthält mindestens ein Epitop, gegen das Antikörper erzeugt werden können.
Der Begriff „isoliertes Polypeptid" betrifft ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das (1) von mindestens ca. 50 Prozent der Polynukleotide, Lipide, Kohlenwasserstoffen oder anderen Materialien, mit denen es natürlicherweise gefunden wird, wenn es aus der Ursprungszelle isoliert wird, getrennt wurde, (2) es nicht verbunden ist (durch kovalente oder nicht-kovalente Interaktion) an alles oder einem Teil eines Polypeptids an welches das „isolierte Polypeptid" in der Natur gebunden ist, (3) funktionell verbunden ist (durch kovalente oder nicht-kovalente Interaktion) an ein Polypeptid, mit dem es nicht in der Natur verbunden ist, oder (4) nicht in der Natur vorkommt. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid im wesentlichen frei von jedem anderen kontaminierenden Polypeptid oder anderen Kontaminanten, die in seiner natürlichen Umgebung gefunden werden, die mit seiner therapeutischen, diagnostischen, prophylaktischen oder der Forschungsverwendung interferieren.
Der Begriff „Vektor" wird benutzt, um auf jedes Molekül (z.B. Nukleinsäure, Plasmid oder Virus) zu bezeichnen, das verwendet wird, um Kodierungsinformationen in eine Wirtszelle zu transferieren.
Der Begriff „Expressionsvektor" betrifft einen Vektor, der für die Transformation in eine Wirtszelle geeignet ist, und der Nukleinsäuresequenzen enthält, die die Expression von inserierten heterologen Nukleinsäuresequenzen steuern und/oder kontrollieren. Expression schließt ein, ist aber nicht begrenzt auf, Prozesse wie Transkription, Translation und RNA-Splicing, wenn Introns vorhanden sind.
Der Begriff „Wirtszelle" wird verwendet, um eine Zelle zu betreffen, die transformiert wurde, oder die geeignet ist, mit einer Nukleinsäuresequenz transformiert zu werden, und dann ein ausgewähltes Gen des Interesses exprimiert. Der Begriff schließt die Nachkommen der Vorgängerzelle ein, egal ob der Nachkomme identisch ist in der Morphologie oder in der Genetik mit der ursprünglichen Vorgängerzelle oder nicht, solange wie das selektierte Gen vorhanden ist.
Der Begriff „Identität", wie im Stand der Technik bekannt, betrifft die Beziehung zwischen den Sequenzen von zwei oder mehreren Polypeptidmolekülen oder zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen, wie durch den Vergleich von Sequenzen ermittelt. In der Technik bedeutet „Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandschaft zwischen Polypeptidenn oder Nukleinsäuremolekülen, in jedem Fall ermittelt durch das Übereinstimmen zwischen Strängen von zwei oder mehreren Nukleotiden oder zwei oder mehreren Aminiosäuresequenzen. Die „Identität" mißt die Prozent der Ubereinstimmung zwischen der kleineren von zwei oder mehreren Sequenzen mit Lückenanordnungen (wenn welche vorhanden) adressiert durch ein bestimmtes mathematisches Modell oder Computerprogramm (d.h. „Algorithmus").
Der Begriff „Ähnlichkeit" ist ein verwandtes Konzept, aber im Gegensatz zu „Identität" bezieht sich „Ähnlichkeit" auf ein Maß der Verwandtschaft, was sowohl Übereinstimmung als auch konservative Substitutionsübereinstimmung einschließt. Wenn zwei Polypeptidsequenzen, z.B. 10/20 identische Aminosäuren haben und die verbleibenden alle nicht-konservative Substitutionen sind, würden die Prozent Identität und Ähnlichkeit beide 50% sein. Wenn im selben Beispiel in fünf weiteren Positionen konservative Substitutionen sind, bleibt die Prozent-Identität 50%, die Prozent-Ähnlichkeit würde 75% (15/20) betragen. Deshalb wird in Fällen, in denen konservative Substitutionen sind, die Prozent-Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden höher sein als die Prozent-Identität zwischen diesen zwei Polypeptiden.
Der Begriff „Nukleinsäuresequenz" oder „Nukleinsäuremoleküle" betrifft eine DNA- oder RNA-Sequenz. Der Begriff schließt Moleküle ein, die von einer der bekannten Basenanaloga von DNA oder RNA gebildet wurden, solche wie, aber nicht beschränkt auf 4-Acetylcytosin, 8-Hydroxy-N6-methyladenosin, Aziridinylcytosin, Pseudoisocytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxy-methylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methyladenin, 1-Methylpseudouracil, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosequeuosin, 5'-Methoxycarbonyl-methyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Oxybutoxosin, Pseudouracil, Queuosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, N-Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure, Pseudouracil, Queuosin, 2-Thiocytosin und 2,6-Diaminopurin.
Der Begriff „natürlich vorkommend" oder „nativ" betrifft, wenn er in der Verbindung mit biologischen Materialien wie Nukleinsäuremolekülen, Polypeptiden, Wirtszellen und dergleichen verwendet wird, Materialien, die in der Natur gefunden werden und nicht durch den Mensch verändert sind. Dementsprechend betrifft „nicht natürlich vorkommend" oder „nicht ursprünglich", wie hier gebraucht, Materialien, die in der Natur nicht gefunden werden oder die durch den Menschen strukturell modifiziert wurden oder synthetisiert wurden.
Der Begriff „operativ verbunden" wird hier gebraucht, um eine Anordnung von flankierenden Sequenzen zu betreffen, worin die so beschriebenen flankierenden Sequenzen konfiguriert oder versammelt sind, um ihre normale Funktion auszuführen. Dementsprechend kann eine flankierende Sequenz operativ verbunden mit einer Kodierungssequenz, befähigt sein, die Replikation, Transkription und/oder Translation der Kodierungssequenz zu bewirken. Zum Beispiel ist eine Kodierungssequenz operativ verbunden mit einem Promotor, wenn der Promotor befähigt ist, die Transkription von dieser Kodierungssequenz auszuführen. Eine flankierende Sequenz muß nicht benachbart zu der Kodierungssequenz sein, solange ihre Funktion korrekt ist. Dementsprechend kann z.B. eine zwischengeschaltete nicht-translatierte aber transkribierte Sequenz zwischen einer Promotersequenz und der Kodierungssequenz vorhanden sein, und die Promotorsequenz kann immer noch als „operativ verbunden" mit der Kodierungssequenz betrachtet werden.
Die Begriffe „effektive Menge" und „therapeutisch effektive Menge" beziehen sich jeweils auf die Menge von einem VGF-Polypeptid, das verwendet wurde, um einen sichtbaren Spiegel von einer oder mehreren biologischen Aktivitäten von dem VGF-Polypeptid wie hierin dargestellt, zu unterstützen.
Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" oder „physiologisch akzeptabler Träger" wie hierin gebraucht, bezieht sich auf einen oder mehrere Formulierungsmaterialien, die für die Ausführung oder Förderung der Abgabe von dem VGF-Polypeptid oder VGF selektiven Bindungsmittel als eine pharmazeutische Zusammenseztung geeignet sind.
Der Begriff „selektiv bindendes Mittel" betrifft ein Molekül oder Moleküle, die Spezifität für ein VGF-Polypeptid haben. Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „spezifisch" und „Spezifität" auf die Fähigkeit des selektiv bindenden Mittels an die VGF-Polypeptide zu binden und nicht an nicht-VGF-Polypeptide zu binden. Trotzdem wird erkannt werden, daß die selektiv bindenden Mittel ebenso an VGF-Orthologe binden können.
Der Begriff „Transduktion" wird verwendet, um sich auf den Transfer von Genen von einem Bakterium auf ein anderes zu beziehen, üblicherweise durch einen Phagen. „Transduktion" betrifft ebenfalls die Aufnahme und den Transfer von eukaryotischen zellulären Sequenzen durch Retroviren.
Der Begriff „Transfektion" wird verwendet, um sich auf die Aufnahme von fremder oder exogener DNA durch eine Zelle zu beziehen, und eine Zelle wurde „transfiziert", wenn die exogene DNA innerhalb der Zellmembran eingeführt wurde. Eine Anzahl von Transfektionstechniken sind in der Technik gut bekannt und sind hier beschrieben. Siehe z.B. Graham et al., 1973, Virology 52:546; Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, 1986) und Chu et al., 1981, Gene 13:197. Solche Techniken können verwendet werden, um eine oder mehrere exogene DNA-Gruppen in geeignete Wirtszellen einzuführen.
Der Begriff „Transformation" wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Veränderung in genetischen Charakteristiken einer Zelle, und eine Zelle wurde transformiert, wenn sie modifiziert wurde, um neue DNA zu enthalten. Zum Beispiel ist eine Zelle transformiert, wenn sie genetisch modifiziert ist, verglichen mit ihrem ursprünglichen Zustand. Im Anschluß an eine Transfektion oder Transduktion kann die transformierte DNA mit der der Zelle durch physikalische Integration in ein Chromosom der Zelle rekombiniert werden, kann vorübergehend als ein episomales Element erhalten werden, ohne repliziert zu werden, oder kann unabhängig als ein Plasmid repliziert werden. Ein Zelle wird als stabil transformiert betrachtet, wenn die DNA mit der Teilung der Zelle repliziert wurde.
Verwandtschaft von VGF-Polypeptiden
Konservative Modifikationen der Aminosäuresequenz von einem VGF-Polypeptid werden ein Polypeptid ergeben, das funktionelle und chemische Charakteristika hat, die ähnlich sind zu denen eines VGF-Polypeptids. Im Gegensatz dazu können beträchtliche Modifikationen in den funktionellen und/oder chemischen Charakteristika von VGF-Polypeptiden durch Auswählen von Substitutionen in der Aminosäuresequenz des VGF-Polypeptid erreicht werden, die in ihren Effekten signifikant verschieden sind auf (a) die Beibehaltung der Struktur des molekularen Rückgrats im Bereich der Substitution, z.B. als eine Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) die Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) die Masse der Seitenkette.
Zum Beispiel kann eine „konservative Aminosäuresubstitution" die Substitution eines nativen Aminosäurerests durch einem nicht nicht-nativen Rest einschließen, so dass es einen kleinen oder keinen Effekt in der Polarität oder Ladung des Aminosäurerestes an dieser Stelle gibt. Des weiteren kann jeder native Rest in dem Polypeptid ebenso durch Alanin substituiert sein, wie früher für die „Alanin Scanning Mutagenese" beschrieben wurde.
Konservative Aminosäuresubstitutionen schließen ebenso nicht natürlich auftretende Aminosäurereste ein, die typischerweise durch chemische Peptidsynthese eingefügt werden, anders als durch Synthese in biologischen Systemen. Dies schließt Peptidomimetika und andere revertierte oder invertierte Formen von Aminosäuregruppen ein.
Natürlich vorkommende Reste können basierend auf den allgemeinen Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt werden:

1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
3) sauer: Asp, Glu;
4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro; und
6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Zum Beispiel können nicht konservativen Substitutionen den Austausch eines Mitglieds von einer dieser Gruppen gegen ein Mitglied von einer anderen Gruppe einschließen. Die substituierten Reste können in Regionen eines VGF-Polypeptids eingeführt werden, die homolog mit anderen VGF-Polypeptidorthologen sind oder in die nicht homologen Regionen des Moleküls.
Bei der Einführung von solchen Veränderungen kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Jeder Aminosäure ist ein hydropathischer Index auf der Basis seiner Hydrophobizität und Ladungs-Charakteristik zugeordnet. Hydropathische Indizes sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5) Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9); und Arginin (–4,5).
Die Bedeutung des hydropathischen Aminsäureindex bei der Verleihung einer interaktiven biologischen Funktion an ein Protein ist dem Fachmann allgemeinen bekannt (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31). Es ist bekannt, daß bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert werden können, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder Wert haben und immer noch eine ähnliche biologische Aktivität beibehalten. Bei Veränderung basierend auf dem hydropathischen Index ist die Substitution von Aminosäuren der hydropathischen Indizes zwischen ±2 liegend bevorzugt, derjenigen, die zwischen ±1 liegen besonders bevorzugt und denen, die zwischen ±0,5 liegen, noch weiter bevorzugt.
Es ist in diesem Gebiet ebenso bekannt, daß die Substitution von ähnlichen Aminosäuren auf der Basis von Hydrophilie effektiv durchgeführt werden kann, insbesondere in dem Fall, wo das dadurch hergestellte biologisch funktionell äquivalente Protein oder Peptid für die Verwendung in immunologischen Ausführungsformen vorgesehen ist, wie in dem vorliegenden Fall. Die größte lokale Durchschnittshydrophilie von einem Protein, wie durch die Hydrophilie von seinen angrenzenden Aminosäuren erhalten wird, korreliert mit seiner Immunogenizität und Antigenizität, d.h., mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins.
Die folgenden Hydrophiliewerte wurden diesen Aminosäureresten zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0±1); Glutamat (+3,0±1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5±1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); und Tryptophan (–3,4). Durch vorgenommene Veränderungen, die auf ähnlichen Hydrophiliewerten beruhen, ist die Substitution von Aminosäuren und deren Hydrophiliewerte zwischen ±2 liegen bevorzugt, die zwischen ±1 liegenden im Besonderen bevorzugt, und denen, die zwischen ±0,5 liegen, sogar noch weiter bevorzugt. Man kann auch Epitope von primären Aminosäuresequenzen auf der Basis von Hydrophilie identifizieren. Diese Regionen werden auch als „epitopische Kernregionen" bezeichnet.
Gewünschte Aminosäuresubstitutionen (entweder konservativ oder nicht konservativ) können vom Fachmann zum dem Zeitpunkt untersucht werden, an dem diese gewünscht sind. Zum Beispiel können Aminosäuresubstitutionen verwendet werden, um wichtige Reste des VGF-Polypeptids zu identifizieren oder die Affinität ansteigen oder abnehmen zu lassen von dem hierin beschriebenen VGF-Polypeptiden. Exemplarische Aminosäuresubstitutionen sind in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2 Aminosäuresubstitution
Ein Fachmann wird im Stande sein, passende VGF-Polypeptidvarianten durch die Verwendung von gut bekannten Techniken zu bestimmen. Zur Identifizierung geeigneter Gebiete des Moleküls, die geändert werden könnten ohne die biologische Aktivität zu zerstören, kann ein Fachmann auf Bereiche abzielen, von denen nicht geglaubt wird, daß sie für die Aktivität wichtig sind. Zum Beispiel, wenn ähnliche Polypeptide mit ähnlichen Aktivitäten von der gleichen Art oder von anderen Arten bekannt sind, kann der Fachmann die Aminosäuresequenz von einem VGF-Polypeptid mit solchen ähnlichen Polypeptiden vergleichen. Mit solch einem Vergleich kann man Reste und Teile der Moleküle, die konserviert sind, in ähnlichen Polypeptiden identifizieren. Es wird erkannt werden, daß Veränderungen in Gebieten des VGF-Moleküls, die relativ zu solchen ähnlichen Peptiden nicht konserviert sind, weniger wahrscheinlich die biologische Aktivität und/oder Struktur eines VGF-Polypeptids beeinträchtigen. Ein Fachmann würde ebenfalls wissen, daß man auch in relativ konservierten Regionen chemisch ähnliche Aminosäuren für die natürlich vorkommenden Reste substituieren kann, wobei man die Aktivität beibehält (konservative Aminosäurerest-Substitutionen). Dafür können sogar Gebiete, die für die biologische Aktivität oder für die Struktur wichtig sein können, konservativen Aminosäuresubstitutionen unterzogen werden, ohne die biologische Aktivität zu zerstören oder ohne die Polypeptidstruktur nachteilig zu beeinträchtigen.
Zusätzlich kann ein Fachmann Struktur-Funktionsstudien bewerten, wobei Reste in ähnlichen Polypeptiden identifiziert werden, die für die Aktivität oder Struktur wichtig sind. In Hinsicht auf solch einen Vergleich kann man den Bedarf an Aminosäureresten in einem VGF-Polypeptid vorhersagen, die zu Aminosäureresten korrespondieren, die für die Aktivität oder Struktur in ähnlichen Polypeptiden wichtig sind. Ein Fachmann kann sich für chemisch ähnliche Aminosäuresubstitutionen für solche vorhergesagten wichtigen Aminosäurereste von VGF-Polypeptiden entscheiden.
Ein Fachmann kann ebenso die dreidimensionale Struktur analysieren und die Aminosäuresequenz in Relation zu der Struktur in ähnlichen Polypeptiden. In Hinsicht auf solch eine Information kann ein Fachmann die Anordnung der Aminosäurereste von einem VGF-Polypeptid vorhersagen in Hinsicht auf seine dreidimensionale Struktur. Ein Fachmann kann sich dafür entscheiden, keine radikalen Veränderungen in den Aminosäureresten vorzunehmen, wonach man sie auf der Oberfläche des Proteins erwarten würde, da solche Reste in wichtigen Interaktionen mit anderen Molekülen involviert sein können. Weiterhin kann ein Fachmann Testvarianten, die eine einzige Aminosäuresubstitution an jedem Aminosäurerest enthalten, generieren. Die Varianten können klassifiziert werden durch Verwendung von Aktivitätstest, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Varianten können benutzt werden, um Informationen über geeignete Varianten zu erfassen. Zum Beispiel werden, wenn einer entdeckt hat, daß eine Veränderung an einem bestimmten Aminosäurerest in einer zerstörten ungewünscht reduzierten oder unpassenden Aktivität resultiert, Varianten mit solch einer Veränderung vermeiden. Mit anderen Worten, basierend auf der Information erfaßt durch solche Routineexperimente, kann ein Fachmann einfach die Aminosäuren erkennen, bei denen weitere Substitutionen vermieden werden sollten, entweder allein oder in Kombination mit anderen Mutationen.
Eine Anzahl von wissenschaftlichen Publikationen wurde der Vorhersage von Sekundärstrukturen gewidmet: Siehe Moult, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7:422-27; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-45; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-22; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-48; Chou et al., 1978, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; und Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-84. Des weiteren sind momentan Computerprogramme erhältlich, die bei der Vorhersage von Sekundärstrukturen helfen. Ein Verfahren, um Sekundärstrukturen vorherzusagen, basiert auf Homologiemodellierung. Zum Beispiel haben zwei Polypeptide oder Proteine, die eine Sequenzidentität von mehr als 30% oder eine Ähnlichkeit von mehr als 40% haben, oft eine ähnliche Strukturtopologie. Die kürzliche Zunahme der Proteinstrukturdatenbanken (PDB) bietet eine erhöhte Vorhersagbarkeit von Sekundärstrukturen, die potentielle Anzahl von Faltungen in der Struktur eines Polypeptides oder Proteins einschließen. Siehe Holm et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27:244-47. Es wurde vorgeschlagen, daß es eine begrenzte Anzahl von Faltungen in einem gegebenen Polypeptid oder Protein gibt und dass, sobald eine kritische Anzahl von Strukturen gelöst wurden, strukturelle Vorhersagen in dramatischer Weise genauer werden (Brenner et al., 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:369-76).
Zusätzliche Verfahren um Sekundärstrukturen vorherzusagen, schließen „Einfädeln" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sipple et al., 1996, Structure 4:15-19), „Profilanalyse" (Bowie et al., 1991, Science, 253:164-70; Gribskov et al., 1990, Methods Enzymol. 183: 146-59; Gribskov et a., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84:4355-58) und "evolutionäre Verbindung" (siehe Holm et al., supra, und Brenner et al., supra) ein.
Bevorzugte VGF-Polypeptidvarianten schließen Glycosylierungsvarianten ein, worin, verglichen mit der Aminosäuresequenz der VGF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, worin die Anzahl und/oder der Typ der Glycosylierungsstellen geändert wurden. Eine Ausführungsform von VGF-Polypeptidvarianten schließt eine größere oder kleinere Anzahl von N-verbundenen Glycosylierungsstellen ein, als die Aminosäuresequenz von den VGF-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung. Eine N-verbundene Glycosylierungsstelle ist durch die Sequenz: Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr charakterisiert, worin der Aminsäurerest, der mit X gekennzeichnet ist, jeder Aminosäurerest außer Prolin sein kann. Die Substitution von Aminosäureresten, um diese Sequenz herzustellen, stellt eine potentielle neue Stelle für die Addition einer N-verbundenen Kohlenstoffhydratkette dar. Alternativ werden Substitutionen, die diese Sequenz beseitigen eine existierende N-verbundene Kohlenstoffhydratkette entfernen. Ebenfalls bereitgestellt ist ein Rearrangement von N-verbundenen Kohlenwasserstoffketten, worin eine oder mehrere N-verbundene Glycosylierungsstellen (typischerweise diejenigen, die natürlich vorkommen) beseitigt sind und eine oder mehrere neue N-verbundene Stelle hergestellt sind. Zusätzlich sind bevorzugte VGF-Varianten eingeschlossen Cysteinvarianten, worin ein oder mehrere Cysteinreste entfernt oder durch eine anderen Aminosäure (z.B. Serin) substituiert sind, verglichen mit der Aminosäuresequenz der VGF-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung. Cysteinvarianten sind nützlich, wenn VGF-Polypeptide nach der Isolation eines unlöslichen Einschlußkörpers wieder in eine biologisch aktive Konformation gefaltet werden müssen. Cysteinvarianten haben im allgemeinen weniger Cysteinreste als die natürlichen Proteine und typischerweise eine gerade Anzahl, um die Interaktionen zu minimieren, die aus ungepaarten Cysteinen resultiert.
Zusätzlich können VGF-Polypeptide an ein homologes Polypeptid fusioniert sein, um ein Homodimer zu bilden oder an ein heterologes Polypeptid, um ein Heterodimer zu bilden. Heterologe Peptide und Polypeptide schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf: Ein Epitop, das den Nachweis und/oder Isolation eines VGF-Fusionspolypeptids ermöglicht; ein Transmembranrezeptorprotein oder ein Teil davon, wie zum Beispiel eine extrazelluläre Domäne oder eine Transmembran- oder intrazelluläre Domäne; einen Liganden oder Teil davon, der an ein Transmembran-Rezeptorprotein bindet; ein Enzym oder ein Teil davon, das katalytisch aktiv ist; ein Polypeptid oder Peptid, das Oligomerisierung fördert, wie zum Beispiel eine Leuzin-Zipper-Domäne; ein Polypeptid oder Peptid, das die Stabilität erhöht wie zum Beispiel eine Immunoglobulin konstante Region; und ein Polypeptid, das eine therapeutische Aktivität hat, die sich von den VGF-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung unterscheidet.
Fusionen können entweder am Aminoterminus oder an dem Carboxyterminus des VGF-Polypeptids vorgenommen werden. Fusionen können entweder ohne Verbindungs- oder Adaptermolekül vorgenommen werden oder durch ein Verbindungs- oder Adaptermolekül. Ein Verbindungs- oder Adaptermolekül kann einen oder mehrere Aminosäurereste enthalten, typischerweise von ungefähr 20 bis ungefähr 50 Aminosäurereste. Ein Verbindungs- oder Adaptermolekül kann auch mit einer Spaltungsstelle für eine DNA Restriktionsendonuklease oder für eine Protease hergestellt werden um die Abtrennung der verbundenen Gruppen zu erlauben. Es wird erkannt werden, daß, sobald sie hergestellt sind, die Fusionspolypeptide entsprechend den Verfahren, die hier beschrieben wurden, derivatisiert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein VGF-Polypeptid an eine oder mehrere Domänen einer Fc-Region des menschlichen IgG gebunden. Antikörper umfassen zwei funktionelle unabhängige Teile, eine variable Domäne, die bekannt ist als „Fab", die Antigene bindet und eine konstante Domäne, bekannt als „Fc", beteiligt an Effektorfunktionen, wie zu Beispiel Komplement-Aktivierung und Angriffe durch phagozytotische Zellen. Ein Fc hat eine lange Serum-Halbwertszeit, wohingegen ein Fab kurzlebig ist. Capon et al., 1989, Nature 337:525-31. Wenn es zusammen mit einem therapeutischen Protein konstruiert ist, kann eine Fc Domäne eine längere Halbwertszeit zur Verfügung stellen oder solche Funktionen wie Fc Rezeptorbindung, Protein A Bindung, komplementäre Fixierung und vielleicht sogar Plazenta-Transfer enthalten. Id. Tabelle III faßt die Verwendung von bestimmten Fc Fusionen, die in der Technik bekannt sind, zusammen.
TABELLE III Fc Fusion mit therapeutischen Proteinen
In einem Beispiel können die menschliche IgG-Gelenk-, CH2- und CH3-Region an entweder den Aminoterminus oder den Carboxylterminus von VGF-Polypeptiden, durch Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gebunden sein. Das resultierende VGF-Fusionspolypeptid kann durch die Verwendung einer Protein A Affinitätssäule gereinigt werden. Von Peptiden und Proteinen, die an die Fc-Region gebunden sind, wurde gefunden, dass sie eine wesentlich größere Halbzeit in vivo aufweisen als ungebundene Gegenstücke. Des weiteren erlaubt eine Fusion an eine Fc-Region eine Dimerisierung/Multimerisierung eines Fusionpolypeptids. Die Fc-Region kann eine natürlich vorkommende Fc-Region sein oder kann verändert worden sein, um bestimmte Qualitäten zu verbessern, wie zum Beispiel die therapeutische Qualität, Zirkulationszeit oder reduzierte Aggregation.
Identität und Ähnlichkeit der verwandten Polypeptide können durch bekannte Verfahren leicht berechnet werden. Solche Verfahren schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die, die in Computational Molecular Biology (A.M. Lesk, ed., Oxford University Press 1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (D.W. Smith, ed., Academic Press 1993); Computer Analysis of Sequence Data (Part I, A.M. Griffin und H.G. Griffin, eds. Humana Press 1994); G. von Heinle, Sequence Analysis in Molecular Biology (Academic Press 1987); Sequence Analysis Primer (M. Gribskov und J. Devereux, eds., M. Stockton Press 1991); und Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073, beschrieben sind.
Bevorzugte Verfahren, um die Identität und/oder Ählichkeit zu erkennen, sind so aufgebaut, um die größtmögliche Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Verfahren um die Identität und Ähnlichkeit zu berechnen, sind in öffentlich erhältlichen Computerprogrammen beschrieben. Bevorzugte Computerprogrammverfahren, um die Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu berechnen, schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf das GCG Programmpacket, einschließlich GAP (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, und FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215;403-10): Das BLASTX Programm ist vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) und anderen Quellen (Altschul et al., BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD); Altschul et al., 1990 supra) öffentlich erhältlich. Der gut bekannte Smith Waterman Algorithmus kann ebenfalls verwendet werden, um die Identität zu ermitteln.
Bestimmte Anordnungsschemata, um zwei Aminosäuresequenzen anzuordnen, können in der Übereinstimmung von nur einer kleinen Region der zwei Sequenzen resultieren, und diese kleine aneinandergereihte Region kann sehr hohe Sequenzidentität aufweisen, auch wenn es keine signifikante Verwandtschaft zwischen den zwei vollständigen Sequenzen gibt. Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform das selektierende Anordnungsverfahren (GAP Programm) zu einer Aneinanderreihung führen, die sich im angeführten Polypeptid über mindestens 50 kontinuierliche Aminosäuren erstreckt.
Zum Beispiel werden durch die Verwendung des Computeralgorithmus GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), zwei Polypeptide, für die die Prozent Sequenzidentität berechnet werden soll, im Hinblick auf die optimale Übereinstimmung ihrer entsprechenden Aminosäuren angeordnet (die „übereinstimmende Strecke", wie durch den Algorithmus ermittelt). Ein Bestrafungswert für die Größe einer Lücke (der als 3X der Durchschnittsdiagonale berechnet ist; die „Durchschnittsdiagonale" ist der Durchschnitt der Diagonale der verwendeten Vergleichsmatrix; die „Diagonale" ist die Anzahl oder Nummer, zugewiesen jeder perfekten Aminosäureübereinstimmung durch die spezifische Vergleichsmatrix) und ein Bestrafungswert für die Vergrößerung dieser Lücke (der normalerweise 0,1 X des Bestrafungswerts für die Größe einer Lücke ist), als auch eine Vergleichsmatrix wie etwa PAM 250 oder BLOSUM 62, werden in Verbindung mit dem Algorithmus verwendet. Eine Standardvergleichsmatrix wird durch den Algorithmus ebenfalls verwendet (siehe Dayhoff et al., 5 Altas of Protein Sequence and Structure (Supp. 3 1987) (PAM250 Vergleichsmatrix); Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915-19 (BLOSUM 62 Vergleichsmatrix).
Bevorzugte Parameter für den Polypeptidsequenzvergleich schließen folgende ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-53;
Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 (Henikoff et al., supra);
Lückenbestrafungswert: 12
Lückenlängenbestrafungswert: 4
Schwellenwert der Ähnlichkeit: 0
Das GAP Programm ist mit den obigen Parametern brauchbar. Die zuvor genannten Parameter sind die Ausgangsparameter für Polypeptidvergleiche (zusammen mit keiner Bestrafung für Endlücken) bei Verwendung von GAP-Algorithmen.
Andere beispielhafte Algorithmen, Bestrafungswerte für die Größe einer Lücke, Bestrafungswerte für die Länge einer Lücke, Vergleichsmatrices und Schwellenwerte von Ähnlichkeiten können verwendet werden, einschließend denen, die in dem Programm-Handbuch, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997, angegeben sind. Die spezifische Auswahl, die getroffen wird, ist für den Fachmann ersichtlich und wird auf dem spezifischen Vergleich, der gemacht werden muß beruhen, so wie zum Besipiel Protein zu Protein, Protein zu DNA; und zusätzlich davon, ob der Vergleich zwischen gegebenen Paaren von Sequenzen (in diesem Fall sind GAP oder BestFit normalerweise bevorzugt) oder zwischen einer Sequenz und einer großen Datenbank von Sequenzen (in diesem Fall sind FASTA oder BLASTA bevorzugt) durchgeführt wird.
Nukleinsäuremoleküle
Die Nukleinsäuremoleküle, die für ein Polypeptid kodieren, das die Aminosäuresequenz von einem VGF-Polypeptid einschließt, können leicht auf eine Vielzahl von Wegen erhalten werden, eingeschließlich, ohne Begrenzung, durch chemische Synthese, cDNA- odser Genombibliothekscreening, Expressionsbibliotheksscreening, und/oder PCR-Amplifikation von cDNA.
Rekombinante DNA Verfahren, die hier verwendet werden, sind im allgemeinen diejenigen, die in Sambrook et. al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. und Wiley and Sons 1994) angegeben sind.
Nukleinsäuremoleküle, die für Aminosäuresequenzen von VGF-Polypeptiden kodieren, können durch Expressionsklonierung identifiziert werden, das den Nachweis von positiven Klonen, basierend auf einer Eigenschaft des exprimierten Proteins, einschließt. Typischerweise werden Nukleinsäurebibliotheken durch die Bindung eines Antikörpers oder anderen Bindungspartners (z.B. Rezeptor oder Ligand) an klonierte Proteine, die exprimiert sind und auf einer Wirtszellenoberfläche präsentiert werden, klassifiziert. Der Antikörper oder Bindungspartner ist mit einem meßbaren Marker modifiziert, um die Zellen zu identifizieren, die den gewünschten Klon exprimieren.
Rekombinante Expressionstechniken, ausgeführt in Übereinstimmung mit den Beschreibungen, die unten angeführt sind, können befolgt werden, um diese Polypeptidnukleotide herzustellen und um die kodierten Polypeptide zu exprimieren. Zum Beispiel kann ein Fachmann durch Insertieren einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Aminosäuresequenz eines VGF-Polypeptids kodiert, in einen passenden Vektor einfach große Mengen einer gewünschten Nukleotidsequenz herstellen. Die Sequenzen können dann benutzt werden, um Detektionsproben oder Amplifikationsprimer zu erzeugen. Alternativ kann ein Polynukleotid, das für die Aminosäuresequenz eines VGF-Polypeptids kodiert, in einen Expressionsvektor eingeführt werden. Durch das Einführen eines Expressionsvektors in einen passenden Wirt kann das kodierte VGF-Polypeptid in großen Mengen hergestellt werden.
Ein anderes Verfahren, um eine geeignete Nukleinsäuresequenz zu erhalten, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR). Bei diesem Verfahren wird aus Poly(A)+RNA oder Gesamt-RNA durch die Verwendung des Enzyms reverse Transkriptase cDNA hergestellt. Zwei Primer, typischerweise komplementär zu zwei separaten Regionen der cDNA, die für die Amniosäuresequenz des VGF-Polypeptids kodieret, werden dann zusammen mit einer Polymerase wie zum Beispiel der Taq Polymerase zu der cDNA hinzugefügt, und die Polymerase amplifiziert die cDNA Region zwischen den zwei Primern.
Ein anderes Mittel, um ein für die Aminosäuresequenz eines VGF-Polypeptids kodierendes Nukleinsäuremolekül herzustellen, ist chemische Synthese unter der Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel denjenigen, die beschrieben sind in Engels et al., 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716-34. Diese Verfahren schließen ein, inter alia, Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren für Nukleinsäuresynthesen. Eine bevorzugtes Verfahren für solche chemischen Synthesen sind Polymer-gestützte Synthesen unter Verwendung von Standard-Phosphoramidchemie. Typischerweise ist die DNA, die für die Aminosäuresequenz eines VGF-Polypeptids kodiert, mehrere hundert Nukleotide lang. Nukleinsäuren, die länger als ungefähr hundert Nukleotide sind, können durch die Verwendung dieser Verfahren als mehrere Fragmente synthetisiert werden. Die Fragmente können dann zusammenligiert werden, um die volle Länge der Nukleotidsequenz eines VGF-Gens zu erhalten. Normalerweise weist das DNA-Fragment, das für den Aminoterminus des Polypeptids kodiert, ein ATG auf, das für einen Methioninrest steht. Dieses Methionin kann oder kann nicht in der reifen Form des VGF-Polypeptids vorhanden sein, abhängig davon, ob das Polypeptid, das in der Wirtszelle hergestellt wurde, dazu in der Lage ist, durch die Zelle sekretiert zu werden. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.
In bestimmten Ausführungsformen enthalten Nukleinsäurevarianten Kodons, die verändert wurden, um eine optimale Expression des VGF-Polypeptids in der gegebenen Wirtszelle zu erhalten. Bestimmte Kodonveränderungen hängen von dem VGF-Polypeptid und der Wirtszelle, die für die Expression ausgewählt wurde, ab. Solche „Kodonoptimierungen" können durch eine Vielzahl von Verfahren ausgeführt werden, z.B. durch Auswahl von Kodons, die für die Verwendung in hoch exprimierten Genen in einer gegebenen Wirtszelle bevorzugt werden. Computeralgorithmen, die Kodonhäufigkeitstabellen wie z.B. „Eco_high.Cod" für Kodonpräferenzen für hoch exprimierte bakterielle Gene berücksichtigen, können verwendet werden und werden durch die University of Wisconsin, Package Version 9.0 (Genetics Computer Group, Madison, WI) bereitgestellt. Andere nützliche Kodonhäufigkeitstabellen schließen „Celegans_high.cod", „Celegans_low.cod", „Drosophila_high.cod", „Human_high.cod", „Maize_high.cod" und „Yeast_high.cod" ein.
In einigen Fällen kann es erwünscht sein, Nukleinsäuremoleküle herzustellen, die für VGF-Polypeptidvarianten kodieren. Nukleinsäuremoleküle, die für Varianten kodieren, können durch die Verwendung von Stellen-spezifischer Mutagenese, PCR-Amplifikation oder anderer geeigneter Verfahren, in denen die Primer(s) die erwünschte Punktmutation haben, hergestellt werden (siehe Sambrook et al., supra, und Ausubel et al., supra, für die Beschreibung der Mutagenesetechniken). Chemische Synthesen, die die durch Engels et al., supra, beschriebenen Verfahren anwenden, können ebenso verwendet werden, um solche Varianten herzustellen. Andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.
Vektoren und Wirtszellen
Ein Nukleinsäuremolekül, das für die Aminosäuresequenz von einem VGF-Polypeptid kodiert, wird durch die Verwendung von Standard-Ligationstechniken in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert.
Der Vektor ist typischerweise basierend auf seiner Funktionalität in der verwendeten spezifischen Wirtszelle ausgewählt (d. h., der Vektor ist kompatibel mit der Wirtszellenmaschinerie in dem Sinne, daß die Amplifikation des Gens und/oder der Expression der Gene ausgeführt werden kann). Ein Nukleinsäuremolekül, das für die Aminosäuresequenz des VGF-Polypeptids kodiert, kann in Prokaryonten, Hefe, Insekten (Baculovirussystem) und/oder eukaryotischen Wirtszellen amplifiziert/exprimiert werden. Die Auswahl der Wirtszelle wird zum Teil davon abhängen, ob das VGF-Polypeptid post-translational modifiziert wird (zum Beispiel, glycosiliert und/oder phosphoriliert). Wenn dies der Fall ist, sind Hefe-, Insekten- oder Säugetierwirtszellen bevorzugt. Für eine Zusammenfassung von Expressionsvektoren siehe Meth. Enz., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed., Academic Press 1990).
Typischerweise werden Expressionsvektoren, die in jeder der Wirtszellen verwendet werden, Sequenzen für Plasmiderhaltung und für die Klonierung und Expression von exogenen Nukleotidsequenzen enthalten. Solche Sequenzen, allgemein als „flankierende Sequenzen" bezeichnet, schließen in bestimmten Ausführungsformen typischerweise eine oder mehrere von den folgenden Nukleotidssequenzen ein: einen Promotor, einen oder mehrere Enhancersequenzen, einen Replikationsursprung, eine transkriptionale Terminierungssequenz, eine komplette Intronsequenz, die eine Donor und eine Akzeptor-Splicestelle enthält, eine Sequenz, die für eine Leadersequenz für eine Polypeptidsekretion kodiert, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Polyadenylierungssequenz, eine Polylinkerregion, um die Nukleinsäure zu insertieren die für das Polypeptid das exprimiert werden soll kodiert und ein selektierendes Markerelement. Jede dieser Sequenzen ist im folgenden erklärt.
Gegebenenfalls kann der Vektor eine „Tag"-kodierende Sequenz enthalten, das heißt, ein Oligonukleotidmolekül, das am 5'- oder 3'-Ende der für das VGF-Polypeptid kodierenden Sequenz angeordnet ist; eine Oligonukleotidsequenz, die für Poly-His kodiert (wie zum Beispiel Hexa-His) oder anderen „Tag", wie zum Beispiel FLAG, HA (Hämagglutinin-Influenzavirus), oder myc, für die kommerziell erhältliche Antikörper verfügbar sind. Dieser Tag ist typischerweise mit dem Polypeptid, das das genannte Polypeptid exprimiert fusioniert und kann als ein Mittel für die Affinitätsaufreinigung des VGF-Polypeptids aus der Wirtszelle dienen. Affinitätsaufreinigung kann zum Beispiel durch eine Säulenchromatographie ausgeführt werden, bei der Antikörper gegen den Tag als eine Affinitätsmatrix verwendet werden. Gegebenenfalls kann der Tag danach von dem gereinigten VGF-Polypeptid durch verschiedene Mittel, wie zum Beispiel unter der Verwendung von bestimmten Peptidasen zur Spaltung, entfernt werden.
Flankierende Sequenzen können homolog sein (d. h., von derselben Spezies und/oder Stamm der Wirtszelle), heterolog (d. h., von einer anderen Spezies oder Stamm als die der Wirtszelle), Hybrid (d. h., eine Kombination von flankierenden Sequenzen von mehr als einem Ursprung), oder synthetisch, oder die flankierenden Sequenzen können native Sequenzen sein, die die normale Funktion enthalten, um die VGF-Polypeptidexpression zu regulieren. Als solche kann die Quelle für die flankierenden Sequenzen jeder prokaryotische oder eukaryotische Organismus sein, jeder Vertebraten- oder Invertebratenorganismus, oder jede Pflanze, solange die flankierende Sequenz darin funktional ist und durch die Wirtszellenmaschinerie aktiviert werden kann.
Nützliche Flankierungssequenzen können durch jedes der verschiedenen Verfahren, die in der Technik bekannt sind, erhalten werden. Typischerweise sind hierin nützliche flankierende Sequenzen – außer die VGF-Gen flankierenden Sequenzen – kürzlich durch Kartierung und/oder durch Restriktionsendonuklease-Verdau identifiziert worden und können daher aus der passenden Gewebequelle isoliert werden, indem geeignete Restriktionsendonukleasen verwendet werden. In einigen Fällen kann die gesamte Nukleotidsequenz der flankierenden Sequenz bekannt sein. Hier kann die flankierende Sequenz synthetisiert werden, indem hierin für die Nukleinsäuresynthese oder Klonierung beschriebene Verfahren verwendet werden.
Wenn alles oder nur ein Teil der flankierenden Sequenz bekannt ist, kann es durch die Verwendung von PCR und/oder durch das Screening von Genom-Bibliotheken mit einem passenden Oligonukleotid und/oder flankierenden Sequenzfragment von derselben oder anderen Spezies erhalten werden. Wenn die flankierende Sequenz nicht bekannt ist, kann ein Fragment der DNA, die die flankierende Sequenz enthält, aus einem größeren Stück einer DNA, die zum Beispiel eine Kodierungssequenz oder sogar ein anderes Gen oder Gene enthält, isoliert werden. Die Isolierung kann durch Restriktionsendonuklease-Verdau erreicht werden, um das exakte DNA-Fragment zu erhalten, gefolgt durch die Isolierung durch die Verwendung der Agarosegel-Aufreinigung, Quiagen^®-Säulenchromatographie (Chatsworth, CA), oder anderer Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Die Auswahl der passenden Enzyme, um diesen Zweck zu erreichen, werden einem Fachmann leicht ersichtlich sein.
Ein Replikationsursprung ist typischerweise ein Teil derjenigen prokaryontischen Expressionsvektoren, die kommerziell erhalten wurden, und der Ursprung hilft bei der Amplifikation des Vektors bis zu einer bestimmten Kopienanzahl, was in einigen Fällen für die optimale Expression des VGF-Polypeptids wichtig sein kann. Wenn der Vektor der Wahl keinen Replikationsstellenursprung enthält, kann dieser chemisch synthetisiert werden, basierend auf einer bekannten Sequenz, und in den Vektor inseriert werden. Zum Beispiel ist der Replikationsursprung des Plasmids pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) für die meisten Gramnegativen Bakterien geeignet und viele Ursprünge (zum Beispiel SV40, Polyoma, Adenovirus, vesikularer Stomatitusvirus (VSV), oder Papillomaviren, wie zum Beispiel HPV oder BPV) sind nützlich, um die Vektoren in Säugetierzellen zu klonieren. Im allgemeinen ist die Replikationsursprungskomponente für Säugetierexpressionsvektoren nicht erforderlich (z. B. wird der SV40-Ursprung oft nur deshalb benutzt, weil er den früheren Promotor enthält).
Eine Transkriptionsendsequenz ist typischerweise am 3'-Ende der Polypeptid-Kodierungsregion angeordnet und dient zum Abbruch der Transkription. Normalerweise ist eine Transkriptionsendsequenz in prokaryontischen Zellen ein G-C-reiches Fragment, gefolgt von einer Poly-T-Sequenz. Während die Sequenz aus einer Bibliothek leicht kloniert werden kann oder sogar kommerziell als ein Teil des Vektors erhältlich ist, kann sie auch leicht durch Verfahren zur Nukleinsäuresynthese wie diejenigen, die hier beschrieben sind, synthetisiert werden.
Ein selektierendes Markergen-Element kodiert für ein Protein, das für das Überleben und das Wachstum der Wirtszelle, die in einem selektiven Kulturmedium wächst, erforderlich ist. Typische Selektionsmarkergene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine übertragen, z.B. Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin für prokaryontische Wirtszellen; (b) auxotrophe Defizite der Zelle komplementieren; oder (c) kritische Nährsstoffe bereitstellen, die nicht aus dem komplexen Medium erhältlich sind. Bevorzugte selektive Marker sind das Kanamycin-Resistenzgen, das Ampicillin-Resistenzgen und das Tetracyclin-Resistenzgen. Ein Neomycin-Resistenzgen kann ebenfalls für die Selektion von prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen verwendet werden.
Andere Selektionsgene können ebenfalls verwendet werden, um die Gene, die exprimiert werden, zu amplifizieren. Amplifikation ist der Prozeß, wobe die Gene, die in höherem Maße für die Herstellung des Proteins, welches kritisch ist für das Wachstum, erforderlich sind, in Tandem wiederholt werden, in den Chromosomen bei aufeinanderfolgenden Generationen von rekombinanten Zellen. Beispiele für geeignete selektive Marker von Säugetierzellen schließen Dihydrofolatreduktase (DHFR) und Thymidinkinase ein. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, wobei nur die Transformanten durch den Vorteil der Anwesenheit des Selektionsgens in dem Vektor eindeutig zum Überleben angepasst sind. Selektionsdruck wird durch die Kultivierung der transformierten Zelle unter Bedingungen, in denen die Konzentration des selektiven Mittels in dem Medium in effektiver Weise geändert ist, ausgeübt, wobei dies zur Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der DNA, die für das VGF-Polypeptid kodiert, führt. Daraus resultieren erhöhte Mengen des VGF-Polypeptids, das aus der amplifizierten DNA synthetisiert wird.
Eine Ribosomenbindungsstelle ist normalerweise für die Translations-Initiation der mRNA erforderlich und ist durch eine Shine-Dalgarno-Sequenz (Prokaryonten) oder eine Kozak-Sequenz (Eukaryonten) charakterisiert. Das Element ist typischerweise 3' zum Promotor und am 5' zur Kodierungssequenz des VGF-Polypeptids angeordnet, das exprimiert werden soll. Die Shine-Dalgarno-Sequenz ist unterschiedlich, aber typischerweise ein Polypurin (d. h. weist einen hohen A-G-Gehalt auf). Viele Shine-Dalgarno-Sequenzen wurden identifiziert, jede dieser kann durch die Verwendung von Verfahren, die hierin dargestellt sind, leicht synthetisiert werden und kann in einem prokaryontischen Vektor verwendet werden.
Eine Leader- oder Signalsequenz kann verwendet werden, um ein VGF-Polypeptid aus einer Wirtszelle heraus zu leiten. Typischerweise ist die Nukleotidsequenz, die für eine Signalsequenz kodiert, in der Kodierungssequenz des VGF-Nukleinsäuremoleküls angeordnet oder direkt am 5'-Ende der VGF-Polypeptid-kodierenden Region. Viele Signalsequenzen wurden identifiziert, und jede von diesen, die in der selektierten Wirtszelle funktional sind, können in Verbindung mit einem VGF-Nukleinsäuremolekül verwendet werden. Dafür kann eine Signalsequenz zu dem VGF-Nukleinsäuremolekül homolog (natürlich vorkommend) oder heterolog sein. Zusätzlich kann eine Signalsequenz durch die Verwendung von hierin beschriebenen Verfahren chemisch synthetisiert werden. In den meisten Fällen führt die Ausschüttung eines VGF-Polypeptids aus einer Wirtszelle durch das Vorhandensein eines Signalpeptids zu der Entfernung des Signalpeptids des ausgeschütteten VGF-Polypeptid. Die Signalsequenz kann eine Komponente des Vektors sein, oder ein Teil des VGF-Nukleinsäuremoleküls, das in den Vektor inseriert wurde.
Eine Nukleotidsequenz, die für eine native VGF-Polypeptidsignalsequenz kodiert, kann an eine VGF-Polypeptid-Kodierungsregion angrenzen oder eine Nukleotidsequenz, die für eine heterologe Signalsequenz kodiert, kann an eine VGF-Polypeptidkodierungsregion angrenzen. Die heterologe Signalsequenz, die ausgewählt wird, sollte eine sein, die durch die Wirtszelle erkannt und prozessiert wird, das heißt, durch eine Signalpeptidase gespalten. Für prokaryontische Wirtszellen, die nicht die native VGF-Polypeptidsignalsequenz erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryontische Signalsequenz ersetzt, ausgewählt zum Beispiel aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase oder hitze-stabilen Enterotoxin II-Leader. Für Hefesekretion kann die native VGF-Polypeptidsignalsequenz durch die Hefe-Invertase-, Alphafaktor- oder Säurephosphatase-Leader substituiert sein. Bei der Säugetierzell-Expression ist die native Signalsequenz ausreichend, obwohl andere Säugetier-Signalsequenzen ebenfalls geeignet sein können.
In einigen Fällen, wenn die Glycosylierung in einem eukaryotischen Wirtszellenexpressionssystem erwünscht ist, kann man die verschiedenen Vorläufersequenzen manipulieren, um die Glycosylierung oder die Ausbeute zu verbessern. Zum Beispiel kann man die Peptidase-Spaltungsstelle von einem bestimmten Signalpeptid verändern, oder Pro-Sequenzen hinzufügen, die ebenso Glycosilierung hervorrufen können. Das finale Proteinprodukt kann in der –1 Position (entsprechend der ersten Aminosäure des reifen Proteins) eine oder mehrere zusätzliche Aminosäuren aufweisen, die zur Expression führen und nicht komplett entfernt wurden. Zum Beispiel kann das Endproteinprodukt eine oder zwei Aminosäurereste aufweisen, die in der Peptidase-Spaltungsstelle gefunden werden, die an den Aminoterminus gebunden ist. Alternativ kann die Verwendung von einigen Enzym-Spaltungsstellen in einer wenig verkürzten Form des gewünschten VGF-Polypeptids resultieren, wenn das Enzym in solch einem Gebiet in dem reifen Polypeptid schneidet.
In vielen Fällen wird die Transkription des Nukleinsäuremoleküls durch die Anwesenheit von einem oder mehreren Introns im Vektor erhöht; dies ist vor allem der Fall, wenn ein Polypeptid in einer eukaryontischen Wirtszelle hergestellt ist, insbesondere in Säugetier-Wirtszellen. Die Introns, die benutzt werden, können natürlich vorkommen in dem VGF-Gen, insbesondere, wenn das benutzte Gen eine Gesamtlängen-genomische Sequenz oder ein Fragment davon ist. Wenn das Intron in dem Gen nicht natürlich vorkommt (wie für die meisten cDNAs), kann das Intron aus anderen Quellen erhalten werden. Die Position des Introns in bezug auf die flankierenden Sequenzen und das VGF-Gen ist im allgemeinen wichtig, da das Intron transkribiert werden muß, um effektiv zu sein. Demnach ist, wenn ein VGF-cDNA-Molekül transkribiert wird, die bevorzugte Position für das Intron 3' zu der Transkriptionsstartstelle und 5' zu der Poly-A-Transkriptions-Terminationssequenz. Bevorzugterweise wird das Intron oder die Introns an der einen oder der anderen Stelle angeordnet (d. h., 5' oder 3') zu der cDNA, so daß es die Kodierungssequenz nicht unterbricht. Jedes Intron von jeder Quelle, einschließlich viral, prokaryontische und eukaryontische (Pflanzen oder Tiere) Organismen, kann verwendet werden, vorausgesetzt, daß es mit der Wirtszelle, in die es inseriert wird, kompatibel ist. Ebenfalls hierin eingeschlossen sind synthetische Introns. Optional können mehr als ein Intron in einem Vektor verwendet werden.
Expression und Klonierungsvektoren enthalten typischerweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und geeignet mit dem Molekül verbunden wird, das für das VGF-Polypeptid kodiert. Promotoren sind nicht-transkribierte Sequenzen, die „upstream" angeordnet sind (d. h., 5') zu dem Start-Codon von einem Strukturgen (im allgemeinen in ungefähr 100 bis 1000 bp), die die Transkription des Strukturgens kontrollieren. Promotoren werden im allgemeinen in eine von zwei Klassen eingeteilt: Induzierbare Promotoren und konstitutive Promotoren. Induzierbare Promotoren initiieren erhöhte Spiegel der Transkription von DNA unter deren Kontrolle in Antwort auf Veränderungen in der Kulturbedingung, wie zum Beispiel das Vorhandensein oder das Fehlen von einem Nährstoff oder der Veränderung von Temperatur. Konstitutive Promotoren, auf der anderen Seite, initiieren kontinuierlich Genproduktherstellung; was bedeutet, daß es nur wenig oder keine Kontrolle über die Gen-Expression gibt. Eine große Anzahl von Promotoren, die durch eine Vielzahl von potentiellen Wirtszellen erkannt werden, sind gut bekannt. Ein geeigneter Promotor wird mit der DNA, die für das VGF-Polypeptid kodiert, geeignet verbunden durch Entfernen des Promotors aus der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau und Insertion der gewünschten Promotorsequenz in den Vektor. Die native VGF-Promotorsequenz kann verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression des VGF-Nukleidsäuremoleküls zu steuern. Ein heterologer Promotor ist jedoch bevorzugt, wenn er höhere Transkription und einen höheren Ertrag des exprimierten Proteins erlaubt, verglichen mit dem nativen Promotor und solange er mit dem Wirtszellensystem, das für die Verwendung ausgewählt wurde, kompatibel ist.
Promotoren, die für die Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignet sind, schließen Beta-Lactamase und Lactose-Promotorsysteme ein; alkalische Phosphatase; ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem; und Hybrid-Promotoren, wie den Tac-Promotor. Andere bekannte bakterielle Promotoren sind ebenfalls geeignet. Deren Sequenzen wurden veröffentlicht, wodurch es dem Fachmann ermöglicht wird, sie an die gewünschte DNA-Sequenz zu binden, wobei Verbindungsmoleküle oder Adapter verwendet werden, um benötigte Restriktionsstellen zu erhalten.
Für die Verwendung in Hefewirten geeignete Promotoren sind in diesem Gebiet ebenso gut bekannt. Hefe-Enhancer werden vorteilhafterweise mit Hefe-Promotoren verwendet. Geeignete Promotoren für die Verwendung in Säugetier-Wirtszellen sind gut bekannt und schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf diejenigen, die aus dem Genom eines Virus erhalten wurden, wie zum Beispiel Polyoma-Virus, Fowlpox-Virus, Adenovirus (wie zum Beispiel Adenovirus 2), Rinderpapilloma-Virus, Vogelsarcoma-Virus, Cytomegalovirus, Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und am meisten bevorzugt den Simian-Virus 40 (SV40). Andere geeignete Säugetierpromotoren schließen heterologe Säugetierpromotoren ein, wie zum Beispiel Hitzeschock-Promotoren und den Aktin-Promotor.
Zusätzliche Promotoren, die interessant sein können, um die VGF-Gen-Expression zu kontrollieren, schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf: die SV40 frühe Promotor-Region (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290:304-10); den CMV-Promotor; den Promotor, der die 3'-langen terminalen Repeats des Rous Sarcoma-Virus enthält (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-97); den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); die Regulationssequenz des Metallothioningens (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); den prokaryontischen Expressionsvektor, wie zum Beispiel den Beta-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31) oder den Tac-Promotor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). Ebenfalls von Interesse sind die folgenden Tier-transkriptionellen Kontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren verwendet wurden: Die Elastase 1 Genkontrollregion, die in azinösen Zellen des Pankreas aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409(1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); die Insulin-Genkontrollregion, die in Beta-Zellen des Pankreas aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); die Immunglobulin-Genkontrollregion, die in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); die Maus-Brusttumorvirus-Kontrollregion, die in Hoden, Brust, Lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); die Albumin-Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); die Alpha-Fetoprotein-Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); die Alpha 1-Antitrypsin Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); die Beta-Globin-Genkontrollregion, die in myelotischen Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); Die Myelin-Basisches-Protein-Genkontrollregion, die in oligodendrozytischen Zellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); die Myosin leichte Kette-2 Genkontrollregion, die in der quergestreiften Muskulatur aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314:283-86) und die Gonadotropinausschüttende Hormon Genkontrollregion, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).
Eine Enhancersequenz kann in den Vektor eingeführt werden, um die Transkription in höheren Eukaryonten zu erhöhen, die eine DNA enthält, die für das VGF-Polypeptid kodiert. Enhancer sind cis-aktivierende Elemente der DNA, normalerweise zwischen 10–300 Basenpaare lang, die am Promoter angreifen, um die Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ unabhängig in ihrer Orientierung und Position. Sie wurden am 5' und 3'-Ende der Transkriptionseinheit gefunden. Verschiedene Enhancersequenzen sind bekannt, erhältlich von Säugetiergenen (d.h. z.B. Globin, Elastase, Albumin, Alpha-Feto-Protein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer von einem Virus verwendet. Der SV40 Enhancer, der Zytomegalovirus frühe Promoterenhancer, der Polyoma-Enhancer und Adenovirusenhancer sind beispielsweise fördernde Elemente für die Aktivierung von eukaryontischen Promotoren. Während ein Enhancer in den Vektor an der Position 5' oder 3' zu einem VGF-Nukleinsäuremolekül gesplict werden kann, ist er typischerweise an der 5'-Stelle von dem Promotor angeordnet.
Expressionsvektoren können aus einem Startvektor, wie zum Beispiel einem kommerziell erhältlichen Vektor hergestellt werden. Solche Vektoren können oder können nicht alle der erwünschten flankierenden Sequenzen enthalten. Wenn eine oder mehrere der flankierenden Sequenzen, die hierin beschrieben sind, in dem Vektor nicht schon vorhanden sind, können sie einzeln erhalten werden und in den Vektor ligiert werden. Verfahren, die verwendet werden, um jede der flankierenden Sequenzen zu erhalten, sind dem Fachmann gut bekannt.
Bevorzugte Vektoren sind diejenigen, die mit bakteriellen, Insekten- und Säugetierwirtszellen kompatibel sind. Solche Vektoren schließen ein, inter alia, pCRII, pCR3 und pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla, CA), pETI5 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-Alpha (PCT Pub. No. WO 90/14363) und pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY).
Zusätzlich geeignete Vektoren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, aber es wird erkannt werden, daß das Vektorsystem mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sein muß. Solche Vektoren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Plasmide wie zum Beispiel den Bluescript^®-Plasmidderivaten (eine hoch-Kopienanzahl ColEI-basierendes Phagemid, Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA), PCR-Klonierungsplasmide, aufgebaut für die Klonierung von Taq-amplifizierten PCR-Produkten (z.B., TOPT^TM TA Cloning^® Kit, PCR2.1^® Plasmidderivate, Invitrogen, Carlsbad, CA), und Säugetier-, Hefe- oder Virusvektoren, wie zum Beispiel Baculovirus-Expressionssystem (pBacPAK Plasmidderivate, Clontech, Palo Alto, CA).
Nachdem der Vektor hergestellt wurde und ein Nukleinsäuremolekül, das für das VGF-Polypeptid kodiert, in der richtigen Stelle in dem Vektor inseriert wurde, kann der vollständige Vektor für die Amplifikation und/oder Polypeptidexpression in eine passende Wirtszelle eingebracht werden. Die Transformation eines Expressionsvektors für ein VGF-Polypeptid in einer ausgewählten Wirtszelle kann durch gut bekannte Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Verfahren wie zum Beispiel der Transfektion, Infektions-, Calziumchlorid-, Elektroporations-, Mikroinjektions-, Lipofektions-, DEAE-Dextranverfahren, oder anderen bekannten Techniken. Das gewählte Verfahren wird zum Teil eine Funktion des Typs der verwendeten Wirtszelle sein. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und sind z.B. in Sambrook et al., supra, dargestellt.
Wirtszellen können prokaryontische Wirtszellen (wie E. coli) oder eukaryontische Wirtszellen (wie Hefe, Insekten oder Vertebratenzellen) sein. Die Wirtszelle, wenn sie unter passenden Bedingungen kultiviert wird, synthetisiert ein VGF-Polypeptid, das anschließend aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium sekretiert) oder direkt von der Wirtszelle, die es herstellt (wenn es nicht sekretiert wird) geerntet werden kann. Die Auswahl von geeigneten Wirtszellen hängt von einigen Faktoren ab, wie dem gewünschten Expressionsspiegel, Polypeptidmodifikation, die für die Aktivität wünschenswert oder nötig sind (wie etwa Glykosylierung oder Phosphorylierung) und die Einfachheit, es in ein biologisch aktives Molekül zu falten.
Eine Vielzahl von passenden Wirtszellen sind auf diesem Gebiet bekannt, und viele davon sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA erhältlich. Beispiele schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Säugetierzellen, wie zum Beispiel die chinesischen Hamster-Ovarienzellen (CHO), CHO DHFR(–)-Zellen (Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:4216-20), menschliche embryonale Nieren-(HEK) 293 oder 293T-Zellen, oder 3T3-Zellen. Die Auswahl von passenden Säugetierwirtszellen und Verfahren für die Transformation, Kultivierung, Amplifikation, Screening, Produktherstellung und Aufreinigung sind in der Technik gut bekannt. Andere geeignete Säugetierzelllinien sind die Affen-COS-1 und COS-7 Zelllinien und die CV-1 Zelllinie. Weiter Beispiele für Säugetierwirtszellen schließen Primatenzelllinien und Nagetierzelllinien ein, einschließlich transformierte Zelllinien. Normale diploide Zellen, Zellen einer Stammkultur erhalten von Invitrokulturen eines Primärgewebes, wie zum Beispiel primäre Explantate sind ebenfalls geeignet. Kandidatenzellen können genotypisch in dem Selektionsgen defizient sein, oder können dominant wirkendes Selektionsgen enthalten. Andere geeignete Säugetierzelllinien schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Maus-Neuroblatom N2A-Zellen, HeLa, Maus L-929-Zellen, 3T3-Linien erhalten von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen, BHK oder HaK Hamsterzelllinien. Jede dieser Zelllinien ist bekannt und für den Fachmann in der Proteinexpression erhältlich.
Ähnlich gebräuchlich als geeignete Wirtszellen sind bakterielle Zellen. Zum Beispiel sind die verschiedenen Stämme von E.coli (z.B., HB101, DH5α, DH10 und MC1061) als Wirtszellen in dem Gebiet der Biotechnologie gut bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilits, Pseudomonas spp., andere Bacillus spp., Streptomyes spp. und dergleichen können ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden.
Viele Stämme von Hefezellen, die dem Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls als Wirtszellen für die Expression von VGF-Polypeptiden erhältlich. Bevorzugte Hefezellen schließen z.B. Saccaromyces cerivisae und Pichia pastoris ein.
Zusätzlich, wenn gewünscht, können Insektenzellsysteme für die Expression von VGF-Polypeptiden verwendet werden. Solche Systeme sind z.B. in Kitts et al., 1993, Biotechniques, 14:810-17; Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4:564-72; und Lucklow et al., 1993, J. Virol., 67:4566-79 beschrieben. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf-9 und Hi5 (Invitrogen).
Ebenfalls können transgene Tiere für die Expression von glykosylierten VGF-Polypeptiden verwendet werden. Zum Beispiel kann man ein transgenes Milch-produzierendes Tier verwenden (eine Kuh oder Ziege zum Beispiel) und erhält das vorliegende glykosylierte Polypeptid in der Tiermilch. Man kann ebenfalls Pflanzen für die Herstellung von VGF-Polypeptiden verwenden, obwohl im allgemeinen die Glykosylierung, die in Pflanzen auftritt, unterschiedlich ist von der, die in Säugetierzellen stattfindet, was zu einem glykosylierten Produkt führen kann, das für die Verwendung als menschliches Therapeutikum nicht geeignet ist.
Polypeptid-Herstellung
Wirtszellen, die einen VGF-Polypeptidexpressionsvektor enthalten, können kultiviert werden indem Standardmedien verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Medien werden normalerweise alle Nährstoffe enthalten, die für das Wachstum und das Überleben der Zellen nötig sind. Geeignete Medien für die Kultivierung von E. coli Zellen schließen z.B. Luria Broth (LB) und/oder Terrific Broth (TB) ein. Geeignete Medien für die Kultivierung von eukaryontischen Zellen schließen Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI 1640), Minimal Essential Medium (MEM) und/oder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ein, wobei alle mit Serum und/oder Wachstumsfaktoren versetzt werden konnten, wenn es für die bestimmte Zelllinie, die kultiviert wird, notwendig ist. Ein geeignetes Medium für Insektenkulturen ist das Grace's Medium, ergänzt mit Yeastolat, Labtalbumin Hydrolysat und/oder fötalem Kälberserum, wie benötigt.
Typischerweise wird ein Antibiotikum oder eine andere Verbindung, die für das selektive Wachstum von transfizierten oder transformierten Zellen brauchbar ist, als Zusatz zum Medium hinzugefügt. Die verwendete Verbindung wird durch das selektierende Markerelement, das auf dem Plasmid vorhanden ist mit dem die Wirtszelle transformiert wurde, vorgegeben. Zum Beispiel ist die zu dem Kulturmedium hinzugegebene Verbindung Kanamycin, wenn das selektierende Markerelement eine Kanamycin-Resistenz ist. Andere Verbindungen für das selektive Wachstum schließen Ampicillin, Tetracyclin und Neomycin ein.
Die Menge von hergestelltem VGF-Polypeptid durch die Wirtszelle kann durch die Verwendung von Standardverfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, evaluiert werden. Solche Verfahren schließen ohne Begrenzung Western Blot-Analysen, SDS-Polyacrylamidgel-Electrophorese, nicht-denaturierende Gelelectrophorese, High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) Separation, Immunopräzipitation und/oder Aktivitätstests, wie den DNA Bindungsgel-Shifttest, ein.
Wenn ein VGF-Polypeptid hergestellt wurde, um von den Wirtszellen sekretiert zu werden, wird die Mehrzahl des Polypeptids im Zellkulturmedium gefunden werden. Wenn aber das VGF-Polypeptid nicht von den Wirtszellen sekretiert wird, wird es im Cytoplasma und/oder dem Nukleus (für eukaryontische Wirtszellen) oder im Cytosol (für Gram-negative bakterielle Wirtszellen) vorhanden sein.
Für ein VGF-Polypeptid, das in einem Wirtszellencytoplasma und/oder -nukleus (für eukaryontische Wirtszellen) oder im Cytosol (für bakterielle Wirtszellen) vorhanden ist, kann das intrazelluläre Material (einschliesslich Einschluß Körper für Gram-negative Bakterien) durch die Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind aus der Wirtszelle extrahiert werden. Zum Beispiel können die Wirtszellen lysiert werden, um die Inhaltsstoffe aus dem Periplasma/Cytoplasma freizusetzen durch French press, Homogenisierung und/oder Ultraschallbehandlung, gefolgt von Zentrifugation.
Wenn ein VGF-Polypeptid im Cytosol Einschlusskörperchen gebildet hat, können diese oft an die innere und/oder äußere Zellmembran binden, und dieses Material wird primär im Pelletmaterial nach der Zentrifugation gefunden.
Das Pellet kann dann mit extremem pH oder mit einem chaotropischen Mittel wie zum Beispiel einem Detergenz, Guanidin, Guanidinderivaten, Harnstoff oder Harnstoffderivaten behandelt werden, in der Anwesenheit von einem reduzierenden Mittel, wie zum beispiel Dithiothreitol bei einem basischen pH oder Tris Carboxyethylphosphin bei einem sauren pH, um die Einschlusskörperchen freizusetzen, aufzubrechen und zu lösen. Das gelöste VGF-Polypeptid kann dann durch die Verwendung von Gelelektrophorese, Immunopräzipitation oder dergleichen analysiert werden. Wenn es erwünscht ist, das VGF-Polypeptid zu isolieren, kann die Isolierung durch die Verwendung von Standardverfahren wie denen, die hierin und in Marston et al., 1990, Meth. Enz., 182:264-75 beschrieben sind durchgeführt werden.
In einigen Fällen kann ein VGF-Polypeptid nach der Isolierung nicht biologisch aktiv sein. Verschiedene Verfahren zur „Faltung" oder Konvertierung des Polypeptids in seine Tertiärstruktur und zur Generierung von Disulfidbindungen können verwendet werden, um die biologische Aktivität wieder herzustellen. Solche Verfahren schließen das Aussetzen des gelösten Polypeptids von einem pH von normalerweise über 7 und in der Anwesenheit einer bestimmten Konzentration eines Chaotrops. Die Auswahl des Chaotrops ist sehr ähnlich zu der Auswahl die für die Lösung der Einschlusskörperchen verwendet wird, aber normalerweise wird der Chaotrop in einer niedrigeren Konzentration verwendet und ist nicht notwendigerweise der gleiche wie der Chaotrop, der für die Lösung verwendet wurde. In den meisten Fällen wird die Faltungs/Oxidationslösung ebenfalls ein reduzierendes Mittel oder ein reduzierendes Mittel plus seiner oxidierten Form in einer spezifischen Menge enthalten, um ein bestimmtes Redoxpotential herzustellen, um eine Disulfidverschiebung zu erlauben, die in einer Formation von Protein-Cysteinbrücken resultiert. Einige der im allgemeinen gebrauchten Redoxpaare schließen ein Cystein/Cystamin, Glutathion (GSH/dithiobis GSH, Kupferchlorid, Dithiothreitol(DTT)/Dithian DTT und 2-2-Mercaptoethanol(bME)/Dithiob(ME). In vielen Fällen kann ein zusätzliches Lösungsmittel verwendet werden, um die Effizienz der Faltung zu erhöhen, und die mehr herkömmlichen für diesen Zweck verwendeten Reagenzien schließen Glycin, Polyethylenglycol verschiedener Molekulargewichte, Arginin und dergleichen ein.
Wenn Einschlusskörperchen nicht in einem signifikanten Maße nach Expression von einem VGF-Polypeptid gebildet werden, wird das Polypeptid nach der Zentrifugation von dem Zellhomogenat primär im Überstand gefunden werden. Das Polypeptid kann dann weiter durch die Verwendung von Verfahren, wie denen, die hier beschrieben sind vom Überstand isoliert werden.
Die Aufreinigung von einem VGF-Polypeptid aus der Lösung kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Techniken durchgeführt werden. Wenn das Polypeptid synthetisiert wurde, so daß es einen Tag wie Hexahistidin enthält (VGF-Polypeptid/Hexa-His) oder andere kleine Peptide wie FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) oder myc (Invitrogen, Carlsbad, CA), entweder am Carboxyl oder am Aminoterminus, kann es in einem Ein-Schritt Verfahren gereinigt werden durch den Durchlauf durch eine Affinitätssäule, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für den Tag aufweist.
Zum Beispiel bindet Polyhistidin mit einer hohen Affinität und Spezifizität an Nickel. Dementsprechend kann eine Affinititätssäule von Nickel (wie den Qiagen^® Nickelsäulen) für die Aufreinigungen von VGF-Polypeptid/polyHis verwendet werden. Siehe, z.B. Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8 (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. und Wiley and Sons 1993).
Zusätzlich können VGF-Polypeptide durch die Verwendung von einem monoklonalen Antikörper gereinigt werden, der befähigt ist, ein VGF-Polypeptid spezifisch zu erkennen und zu binden.
In Situationen, in denen es bevorzugt wird, ein VGF-Polypeptid teilweise oder komplett zu reinigen, so daß es teilweise oder komplett frei ist von Kontaminationen, können Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Solche Verfahren schließen ohne Begrenzung ein, die Trennung durch Elektrophorese, gefolgt von Elektroelution, verschiedene Typen von Chromatographie (Affinität, Immunaffinität, molekulares Sieb und Ionenaustausch), HPLC und präparative, isoelektrische Fokussierung („Isoprime" Maschine/Technik, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). In einigen Fällen können zwei oder mehrere Reinigungstechniken kombiniert werden, um eine erhöhte Reinheit zu erhalten.
VGF-Polypeptide können ebenfalls durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden (solche wie Festphasepeptidsynthese) durch die Verwendung von Techniken, die in dem Gebiet bekannt sind, wie denen, die bei Merrifield et al., 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Houghten et al., 1985, Proc Natl Acad. Sci. USA 82:5132; und Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co. 1984) angegeben sind. Solche Peptide können mit oder ohne ein Methionin am Aminoterminus synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte VGF-Polypeptide können durch die Verwendung von Verfahren, die dargestellt sind in den Referenzen für die Bildung von Disulfidbrücken oxidiert werden. Von chemisch synthetisierten VGF-Polypeptiden wird erwartet, daß sie die vergleichbare biologische Aktivität enthalten wie die korrespondierenden VGF-Polypeptide, die rekombinant hergestellt werden oder aus natürlichen Quellen aufgereinigt wurden, und diese können austauschbar mit einem rekombinanten oder natürlichen VGF-Polypeptid verwendet werden.
Andere Mittel, um VGF-Polypeptide zu erhalten, ist durch Aufreinigung aus biologischen Proben, wie zum Beispiel Ursprungsgewebe und/oder Flüssigkeiten, in denen das VGF-Polypeptid natürlicherweise gefunden wird. Solche Aufreinigung kann durch die Verwendung von Verfahren für die Proteinaufreinigung, wie hier beschrieben, durchgeführt werden. Die Anwesenheit des VGF-Polypeptids während der Aufreinigung kann überwacht werden z. B. durch die Verwendung eines Antikörpers, der hergestellt ist gegen rekombinant hergestellte VGF-Polypeptide oder Peptidfragmente davon. Eine Vielzahl von zusätzlichen Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden ist in diesem Gebiet bekannt, und die Verfahren können verwendet werden, um Polypeptide herzustellen, die eine Spezifität für VGF-Polypeptide haben. Siehe z. B. Roberts et al., 1997, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-73, der die Herstellung von Fusionsproteinen beschreibt zwischen einer mRNA und seinem kodierten Peptid. Siehe ebenfalls Roberts, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:268-73.
U.S. Patente Nr. 5,763,192; 5,814,476; 5,723,323 und 5,817,483 beschreiben Verfahren zur Herstellung von Peptiden oder Polypeptiden. Dies wird durch die Herstellung von stochastischen Genen oder Fragmenten davon und der Einschleusung von diesen Genen in Wirtszellen durchgeführt, die eines oder mehrere der durch diese stochastischen Gene kodierten Proteine herstellen. Die Wirtszellen werden dann gescreened, um diese Klone zu identifizieren, die die Peptide oder Polypeptide, die die gewünschte Aktivität haben, herstellen.
Ein weiteres Verfahren für die Herstellung von Peptiden oder Polypeptiden ist in PCT/US98/20094 (WO99/15650) beschrieben, angemeldet durch Athersys, Inc. Bekannt als „Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery" (RAGE-GD), beinhaltet das verfahren die Aktivierung von endogener Gen-Expression oder Über-Expression von einem Gen durch in situ-Rekombinationsverfahren. Zum Beispiel wird die Expression von einem endogenen Gen aktiviert oder erhöht durch die Integration einer regulatorischen Sequenz in eine Zielzelle, die in der Lage ist, die Expression des Gens durch nicht homologe oder illegitime Rekombination zu aktivieren. Die Ziel-DNA wird zuerst Bestrahlung ausgesetzt und ein genetischer Promotor wird inseriert. Der Promotor findet eventuell einen Bruch am Anfang des Gens, wobei die Transkription des Gens gestartet wird. Dies resultiert in der Expression des gewünschten Peptids oder Polypeptids.
Es wird erkannt werden, daß diese Verfahren ebenfalls verwendet werden können, um umfangreiche IL-17-ähnliche Proteinexpressionsbibliotheken zu erzeugen, die anschließend für das „High troughput"-phänotypische Screening in einer Vielzahl von Tests verwendet werden können, wie zum Beispiel biochemische Tests, zelluläre Tests und Ganzorganismen-Tests (z. B. Pflanzen, Mäuse, usw.).
Synthese
Der Fachmann wird erkennen, daß die hierin beschrieben VGF-Polypeptidmoleküle durch rekombinante und andere Mittel hergestellt werden können.
Selektive Bindungsmittel
Der Ausdruck „selektives Bindungsmittel" betrifft ein Molekül, das Spezifität für eines oder mehrere VGF-Polypeptide besitzt. Geeignete selektive Bindungsmittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Antikörper und Derivative davon, Polypeptide und kleine Moleküle. Geeignete selektive Bindungsmittel werden durch die Verwendung von Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind hergestellt. Ein beispielhaftes VGF-Polypeptid-selektives Bindungsmittel der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine bestimmte Menge eines VGF-Polypeptids zu binden, wodurch es die Bindung des Polypeptids an einen VGF-Polypeptid-Rezeptor inhibiert.
Der Ausdruck „Antigen" betrifft ein Molekül oder einen Teil eines Molekül, das befähigt ist, an ein selektiv bindendes Mittel zu binden und zusätzlich befähigt ist, in einem Tier verwendet zu werden, das Antikörper herstellt, die in der Lage sind, an ein Epitop von diesem Antigen zu binden. Ein Antigen kann eine oder mehrere Epitope besitzen.
Der Ausdruck „Epitop" betrifft den Teil eines Moleküls, das befähigt ist, von einem selektiven Bindungsmittel an einer oder mehrere Antibindungsstellen des bindenden Mittels erkannt zu werden und gebunden zu werden. Epitope bestehen normalerweise aus einer chemisch aktiven Oberflächegruppen von Molekülen, wie zum Beispiel Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, die eine spezifische dreidimensionale strukturelle Charakteristik ebenso wie eine spezifische Ladungscharakteristik aufweisen. Der Ausdruck „neutralisierendes Epitop" betrifft ein Epitop, das, wenn es an ein selektiv bindendes Mittel gebunden ist zu einem Verlust der biologischen Aktivität des Moleküls, das das Epitop enthält, führt, in vivo, in vitro oder in situ, bevorzugterweise in vivo, einschließlich der Bindung der VGF-Polypeptide an einem VGF-Polypeptidrezeptor. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antigen-Bindungsregion" auf den Teil des selektiven Bindungsmittels, das die Aminosäurereste enthält, die mit dem Antigen interagieren und dem Bindungsmittel seine Spezifität und Affinität für das Antigen verleihen. Vorzugsweise wird die Antigen-Bindungsregion einen Mausursprung haben. In anderen Ausführungsformen kann die Antigen-Bindungsregion von anderen Tierarten erhalten werden, insbesodere Nagetiere wie zum Beispiel ein Kaninchen, Ratte oder Hamster. Zum Beispiel wird die Antigen-Bindungsregion für das selektive Bindungsmittel der vorliegenden Erfindung bevorzugterweise von einem nicht menschlichen Antikörper abgeleitet, der spezifisch für menschliches VGF-Polypeptid ist. Bevorzugte Quellen für eine DNA, die für solch einen nicht menschlichen Antikörper kodiert, schließen Zelllinien ein, die Antikörper herstellen, wie zum Beispiel Hybridzelllinien, die im allgemeinen als Hybridome bekannt sind.
Selektive Bindungsmittel wie zum Beispiel Antikörper und Antikörperfragmente, die VGF-Polypeptide binden, liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die Antikörper können polyklonal, einschließlich monospezifisch polyklonal; monoklonal; rekombinant; chimär; humanisiert wie zum Beispiel CDR-grafted; menschlich; Einzelketten; und/oder bispezifisch; so wie Fragmente; Varianten; oder Derivate davon sein. Antikörperfragmente schließen die Teile des Antikörpers ein, die an ein Epitop von einem VGF-Polypeptid binden. Beispiele für solche Fragmente schließen Fab und F(ab')-Fragmente ein, erhalten durch die enzymatische Spaltung von Volllängen Antikörpern. Andere Bindungsfragmente schließen diejenigen ein, die durch rekombinante DNA-Techniken erhalten werden, wie zum Beispiel die Expression von rekombinanten Plasmiden die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für Antikörper variable Regionen kodieren.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, erhalten aus dem Serum von Tieren, die mit einem Antigen immunisiert wurden. Ein Antigen ist ein Molekül oder ein Teil von einem Molekül, das in der Lage ist, an einen Antikörper gebunden zu sein, das zusätzlich befähigt ist, in einem Tier die Herstellung eines Antikörpers zu induzieren, der befähigt ist, an ein Epitop von diesem Antigen zu binden. Ein Antigen kann ein oder mehrere Epitope aufweisen. Die spezifische Reaktion, auf die oben Bezug genommen wird, ist dazu gedacht, anzugeben, daß das Antigen mit seinem korrespondierenden Antikörper in einer hoch selektiven Weise reagieren wird und nicht mit der Vielzahl von anderen Antikörpern, die auf andere Antigene reagieren.
Polyklonale Antikörper, die gegen ein VGF-Polypeptid gerichtet sind, werden im allgemeinen in Tieren (zum Beispiel Hasen oder Mäusen) durch die Ausführung von multiplen subcutanen oder intraperitonealen Injektionen eines VGF-Polypeptids und eines Adiuvans hergestellt. Es kann nützlich sein, ein VGF-Polypeptid an ein Trägerprotein zu konjugieren, das in der Spezies immunogen ist, die immunisiert werden soll, wie zum Beispiel Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serum, Albumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Ebenso werden aggregierende Mittel wie zum Beispiel Alaun verwendet, um die Immunantwort zu verstärken. Nach der Immunisierung wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf einen Anti-VGF-Antikörpertiter getestet.
Monoklonale Antikörper enthalten eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch für ein Antigen sind, und dessen Population im wesentlichen ähnliche Epitop-Bindungsstellen enthält. Solche Antikörper können von jeder Immunoglobulinklasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und jede Unterklasse davon. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung herstellt, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung in hohen Titern in vivo oder in situ ist ein bevorzugtes Verfahren der Herstellung.
Monoklonale Antikörper, die gegen ein VGF-Polypeptid gerichtet sind, werden durch die Verwendung eines Verfahren hergestellt, das die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur zur Verfügung stellt. Beispiele für geeignete Verfahren für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern schließen die Hybridoma-Verfahren von Kohler et al., 1975, Nature 256:495-97 und das menschliche B-Zell Hybridomaverfahren (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Application 51-63 (Marcel Dekker, Inc., 1987) ein. Ebenso durch die Erfindung bereitgestellt werden Hybridomazelllinien, die monoklonale Antikörper herstellen, die mit VGF-Polypeptiden reaktiv sind.
Bevorzugte Anti-VGF-selektive bindende Mittel schließen monoklonale Antikörper ein, die kompetitiv in vivo die Bindung an ein menschliches VGF-Polypeptid oder einen Antikörper, der im wesentlichen dieselbe spezifische Bindungscharakteristika aufweist, sowie Fragmente und Regionen davon oder einen Teil davon, inhibieren. Bevorzugte Verfahren für die Bestimmung von monoklonaler Antikörper-Spezifität und -Affinität durch kompetitive Inhibierung können in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Current Protocols in Immunology (Colligan et al., eds., Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, 1993); and Muller, 1988, Meth. Enzymol. 92:589-601 gefunden werden.
Monoklonale Antikörper der Erfindung können zur Verwendung als Therapeutika modifiziert werden. Eine Ausführungsform ist ein „chimärer" Antikörper, in dem ein Teil der schweren (H) und/oder leichten (L) Kette identisch ist mit oder homolog ist zu einer entsprechenden Sequenz in Antikörpern, die von einer bestimmten Art erhalten werden oder die zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse gehören, während der Rest der Kette(n) mit einer entsprechenden Sequenz in Antikörpern identisch oder homolog dazu ist, die von anderen Arten erhalten wurden oder zu einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse gehören. Ebenfalls eingeschlossen sind Fragmente von solchen Antikörpern, solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen. Siehe U.S. Patent Nr. 4,816,567; Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-55.
Chimäre Antikörper und Verfahren für deren Herstellung sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe Cabilly et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3273-77; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-55; Boulianne et al., 1984, Nature 312:643-46; Neuberger et al., 1985, Nature 314:268-70; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3439-43; und Harlow and Lane, supra.
Wie hier verwendet, schließt der Begriff "chimärer Antikörper" monovalente, divalente oder polyvalente Immunoglobuline ein. Ein monovalenter chimärer Antikörper ist ein Dimer (HL), gebildet durch eine chimäre H-Kette, die durch Disulfid-Brücken mit einer chimären L-Kette assoziiert ist. Ein divalenter chimärer Antikörper ist ein Tetramer (H₂L₂), gebildet durch zwei HL-Dimere, die durch mindestens eine Disulfid-Brücke zusammengefügt sind. Ein polyvalenter chimärer Antikörper kann ebenfalls hergestellt werden, zum Beispiel durch die Verwendung einer C_H-Region, die aggregiert (z. B., aus einer IgM H-Kette oder μ-Kette).
Chimäre Antikörper der vorliegenden Erfindung können einzelne H- und/oder L-Immunoglobulinketten umfassen. Eine bevorzugte chimäre H-Kette umfasst eine Antigen-Bindungsregion, abgeleitet von einer H-Kette eines nicht menschlichen Antikörpers, der spezifisch für ein VGF-Polypeptid ist, die an zumindest einen Teil einer menschlichen H-Kette C-Region (C_H), wie zum Beispiel CH₁ oder CH₂ gebunden ist. Eine bevorzugte chimäre L-Kette umfasst eine Antigen-Bindungsregion, erhalten von einer L-Kette von einem nicht menschlichen Antikörper, der spezifisch für ein VGF-Polypeptid ist, die an zumindest einen Teil von einer menschlichen L-Ketten-C-Region (C_L) gebunden ist.
Selektiv bindende Mittel, die chimäre H-Ketten und L-Ketten von derselben oder unterschiedlicher variable Region-Bindungsspezifität haben, können ebenfalls durch geeignete Verbindung aus einzelnen Polypeptidketten hergestellt werden, gemäß Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind. Siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994) und Harlow et al., supra. Unter der Verwendung dieses Ansatzes werden Wirtszellen die chimäre H-Ketten (oder deren Derivate) exprimieren getrennt kultiviert von Wirtszellen, die chimäre L-Ketten (oder deren Derivate), exprimieren, und die Immunoglobulinketten werden getrennt aufgereinigt und dann assoziiert. Alternativ können die Wirtszellen co-kultiviert werden und es den Ketten ermöglicht werden, spontan im Kulturmedium zu assoziieren, gefolgt durch Aufreinigung des zusammengefügten Immunoglobulins.
Die Erfindung stellt ebenfalls „Derivate" von selektiven Bindungsmitteln bereit, wie zum Beispiel Antikörper, Fragmente, Regionen oder Derivaten davon, wobei der Begriff die Proteine einschließt, die durch verkürzte oder modifizierte Gene kodiert werden, um molekulare Arten zu ergeben, die funktionale Immunoglobulinfragmente darstellen. Die Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Addition von genetischen Sequenzen, die für cytotoxische Proteine kodieren, wie zum Beispiel Pflanzen- und bakterielle Toxine. Die Fragmente und Derivate können aus jeder der Wirtszellen dieser Erfindung hergestellt werden. Alternativ können die Anti-VGF-selektiven Bindungsmittel, wie zum Beispiel Antikörper, Fragmente oder Regionen davon an ein cytotoxisches Protein oder Verbindungen in vitro gebunden werden, um cytotoxische Anti-VGF-Antikörper zur Verfügung zu stellen, die selektiv Zellen töten würden, die VGF-Polypeptidrezeptoren aufweisen.
Geeignete Fragmente schließen zum Beispiel Fab, Fab', F(ab')₂ und Fv ein. Diesen Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers, werden schneller aus dem Kreislauf beseitigt und können weniger nicht-spezifische Gewebebindung haben, als ein intakter Antikörper. Siehe Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316-25. Diese Fragmente werden aus intakten Antikörpern durch die Verwendung von Verfahren hergestellt, die im Stand der Technik gut bekannt sind, zum Bespiel durch proteolytische Spaltung mit Enzymen wie Papain (um Fab-Fragmente herzustellen) oder Pepsin (um F(ab')₂-Fragmente herzustellen). Die Identifizierung von diesen Antigen-Bindungsregionen und/oder Epitopen durch monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung stellt die nötige Information zur Verfügung, um zusätzliche monoklonale Antikörper mit ähnlichen Bindungscharakteristika zu generieren, und eine therapeutische oder diagnostische Brauchbarkeit, die parallel zu den Ausführungsformen dieser Anmeldung vorliegen.
In einer anderen Ausführungsform ist ein monoklonaler Antikörper der Erfindung ein „humanisierter" Antikörper. Verfahren für die Humanisierung von nicht menschlichen Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe U.S. Patent Nrn. 5,585,089 und 5,693,762. Im allgemeinen hat ein humanisierter Antikörper eine oder mehrere Aminosäurereste, die aus einer Quelle eingeführt sind, die nicht menschlich ist. Humanisierung kann z. B. durch die Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik beschrieben sind (Jones et al., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-36), durch Substituierung von mindestens einem Teil einer Nagetier-komplementären Erkennungsregion (CDR) durch die korrespondierenden Regionen eines menschlichen Antikörpers.
Techniken für die Herstellung von rekombinanten DNA-Versionen der Antigen-bindenden Regionen eines Antikörpermoleküls (d. h. Fab oder variable Regionenfragmente) die die Generierung von monoklonalen Antikörpern umgehen, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen. In dieser Technik, werden antikörperspezifische Messeger-RNA-Moleküle aus Immunsystemzellen extrahiert, die aus einem immunisierten Tier genommen werden und werden in cDNA transkribiert. Die cDNA wird dann in ein bakterielles Expressionssystem kloniert. Ein Beispiel für solch eine Technik, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet ist, verwendet ein Bakteriophagen Lamda Vektorsystem, das eine Leadersequenz aufweist, die dazu führt, dass das exprimierte Fab-Protein in den periplasmatischen Raum wandert (zwischen der bakteriellen Zellmembran und der Zellwand) oder ausgeschüttet zu werden. Man kann schnell eine große Anzahl von funktionellen Fab-Fragmenten auf diejenigen hin erzeugen und screenen, die das Antigen binden. Solche VGF-bindende Moleküle (Fab-Fragmente mit Spezifität für VGF-Polypeptide) sind spezifisch in den Begriff „Antikörper", wie hier verwendet, mit eingeschlossen.
Ebenfalls in dem Umfang der Erfindung liegen Techniken, die für die Herstellung von chimären Antikörpern durch das Splicing der Gene aus einem Mausantikörpermolekül von geeigneter Antigenspezifität mit Genen von einem menschlichen Antikörpermolekül von geeigneter biologischer Aktivität (wie zum Beispiel die Fähigkeit menschliches Komplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln) entwickelt wurden. Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-55; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-08. Selektiv bindende Mittel wie zum Beispiel Antikörper, die durch diese Technik hergestellt sind, liegen innerhalb des Bereichs der Erfindung.
Es wird erkannt werden, dass die Erfindung nicht begrenzt ist auf Maus- oder Rattenmonoklonale Antikörper; vielmehr können menschliche Antikörper verwendet werden. Solche Antikörper können durch die Verwendung von Human-Hybridomen erhalten werden. Siehe Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77 (1985). Vollständig menschliche Antikörper, die VGF-Polypeptide binden, sind dementsprechend durch die Erfindung umfasst. Solche Antikörper werden durch Immunisierung mit einem VGF-Antigen (gegebenenfalls konjugiert mit einem Träger) von transgenen Tieren (zum Beispiel Mäuse), die befähigt sind ein Repertoire von menschlichen Antikörpern in der Abwesenheit einer endogenen Immunoglobulinproduktion zu produzieren, hergestellt. Siehe zum Beispiel, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2551-55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58; Bruggemann et al., 1993, Year in Immuno. 7: 33-40.
Ein anti-idiotypischer(Anti-Id-)Antikörper ist ein Antikörper, der einmalige Determinanten erkennt, die im allgemeinen mit einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein Anti-Id-Antikörper kann durch Immunisierung von einem Tier derselben Art und genetischen Typs (zum Beispiel, Mäusestamm) als der Quelle des monoklonalen Antikörpers hergestellt werden, mit dem monoklonalen Antikörper gegen den ein Anti-Id hergestellt wird. Das immunisierte Tier wird die idiotypische Determinate des immunisierenden Antikörpers erkennen und mit der Herstellung eines Antikörpers gegen diese idiotypische Determinante (Anti-Id-Antikörper) antworten. Siehe zum Beispiel, U.S. Patent No. 4,699,880. Der Anti-Id-Antikörper kann ebenfalls als ein „Immunogen" verwendet werden, um eine Immunantwort in noch einem anderen Tier zu induzieren, was einen sogenannten anti-anti-Id-Antikörper herstellt. Der anti-anti-Id kann epitopisch identisch zu dem ursprünglichen monoklonalen Antikörper sein, der den anti-Id induziert. Demnach ist es durch die Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypischen Determinaten eines monoklonalen Antikörpers möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper der identischen Spezifität exprimieren.
Ebenfalls in der Erfindung mit eingeschlossen sind menschliche Antikörper, die VGF-Polypeptide binden. Durch die Verwendung von transgenen Tieren (z. B. Mäusen), die in der Lage sind, ein Repertoire von menschlichen Antikörpern in der Abwesenheit von endogener Immunoglobulinproduktion herzustellen, werden solche Antikörper durch Immunisierung mit VGF-Polypeptid-Antigen hergestellt (d. h. sie weisen mindestens 6 aufeinanderfolgende Aminosäuren auf), gegebenenfalls konjugiert an einen Träger. Siehe z. B., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 2251-55; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-58; Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33. In einem Verfahren werden solche transgenen Tiere hergestellt durch die Inhibierung der endogenen Loci, die darin für die schwere und leichte Immunoglobulinketten kodieren und Insertion von Loci in das Genom, die für die menschlichen schwere und leichte Kettenproteine kodieren. Teilweise modifizierte Tiere, das sind die, die weniger als das komplette Komplement von Modifikationen aufweisen, werden dann eingekreuzt, um ein Tier zu erhalten, das alle der gewünschten Immunsystemmodifikationen aufweist. Wenn ein Immunogen verabreicht wird, stellen diese transgenen Tiere Antikörper mit menschlichen (anders als z. B. Mause-) Aminosäuresequenzen her, einschließlich variabler Regionen, die immunospezifisch für diese Antigene sind. Siehe PCT Anm. Nrn. PCT/US96/05928 und PCT/US93/06926. Zusätzliche Verfahren sind in U.S. Patent Nr. 5,545,807, PCT Anm. Nrn. PCT/US91/245 und PCT/GB89/01207 und in EP Pub. Nrn. 546073B1 und 546073A1 beschrieben. Menschliche Antikörper können ebenfalls durch die Expression von rekombinanter DNA in Wirtszellen oder durch Expression in Hybridomazellen, wie hierin beschrieben, hergestellt werden.
In einer alternativen Ausführungsform können menschliche Antikörper ebenfalls aus Phagen-Display-Bibliotheken (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581) hergestellt werden. Diese Verfahren ahmen die Immunselektion nach, durch das Zeigen von Antikörperrepertoiren auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen und anschließender Selektion von Phagen durch deren Bindung an ein Antigen der Wahl. Eine solche Technik ist in PCT Anm. Nr. PCT/US98/17364 beschrieben, die die Isolierung von hoher Affinität und funktionell agonistischen Antikörpern für MPL- und msk-Rezeptoren durch die Verwendung eines solchen Ansatzes, beschreiben.
Chimäre, CDR-grafted und humanisierte Antikörper werden typischerweise durch rekombinante Verfahren hergestellt. Nukleinsäuren, die für Antikörper kodieren, werden in die Wirtszellen eingeführt und exprimiert, unter der Verwendung von Materialien und den Verfahren, die hierin beschrieben wurden und im Stand der Technik bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper in Säugetierwirtszellen, wie zum Beispiel den CHO-Zellen hergestellt. Monoklonale (z. B. menschliche) Antikörper können durch die Expression von rekombinanter DNA in Wirtszellen oder durch die Expression in Hybridomazellen wie hierin beschrieben hergestellt werden.
Die anti-VGF-Antikörper der Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren verwendet werden, wie zum Beispiel kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunopräzipitationstests (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)) für den Nachweis und die Quantifizierung von VGF-Polypeptiden. Die Antikörper werden an VGF-Polypeptide mit einer Affinität binden, die geeignet für das Testverfahren ist, das verwendet wird.
Für diagnostische Anwendungen, können anti-VGF-Antikörper in bestimmten Ausführungsformen mit nachweisbaren Gruppen markiert werden. Die nachweisbaren Gruppen können alle sein, die befähigt sind, ein entweder direktes oder indirektes nachweisbares Signal herzustellen. Zum Beispiel können die nachweisbaren Gruppen Radioisotope wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ¹²⁵J, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In oder ⁶⁷Ga sein; eine fluoreszente oder chemilumineszente Verbindung, wie zum Beispiel Fluoreszein, Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; oder ein Enzym, wie zum Beispiel alkalische Phosphatase, Galaktosidase oder Meerrettich-Peroxidase (Bayer et al., 1990, Meth. Enz. 184:138-63).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (z. B. eines VGF-Polypeptid, oder eines immunologisch reaktiver Teil davon) mit einem Testprobenanalyten (ein VGF-Polypeptid) um die Bindung an eine begrenzte Menge von anti-VGF-Antikörper zu konkurrieren. Die Menge von einem VGF-Polypeptid in der Testprobe ist entgegengesetzt proportional zu der Menge des Standards der an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards der gebunden wird zu erleichtern, werden die Antikörper typischerweise vor oder nach der Kompetition unlöslich gemacht, so dass der Standard und der Analyt die an die Antikörper gebunden sind, bequem von dem Standard und der Analyten der ungebunden bleibt getrennt werden können.
Sandwichtests schließen typischerweise die Verwendung von zwei Antikörpern ein, von denen jeder in der Lage ist, an einem unterschiedlichen immunogenen Teil oder Epitop des Proteins zu binden, das erkannt und/oder quantifiziert werden soll. Im einem Sandwichtest, ist der Testprobenanalyt typischerweise an den ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Hilfsmittel immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch er einen unlöslichen Drei-Teile-Komplex bildet. Siehe z. B. U. S. Patent Nr. 4,376,110. Der zweite Antikörper kann mit einer nachweisbaren Gruppe (Direkt-Sandwichtest) selbst markiert sein oder kann durch die Verwendung eines anti-Immunoglobulin-Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist (indirekte Sandwichtests) gemessen werden. Z. B. ist ein Typ von Sandwichtest ein Enzymgebundener Immun-Sorbenttest (ELISA) in dessen Fall die nachweisbare Gruppe ein Enzym darstellt.
Die selektiven Bindungsmittel einschließlich anti-VGF-Antikörper sind auch für das in vivo-Imaging nützlich. Ein Antikörper der mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist, kann einem Tier verabreicht werden, bevorzugterweise in die Blutbahn, und die Anwesenheit und die die Lokalisierung des markierten Antikörpers in dem Wirt kann getestet werden. Der Antikörper kann mit jeder Gruppe die in einem Tier nachweisbar ist markiert werden, entweder durch kernmagnetische Resonanz, Radiologie oder einem anderen Erkennungsmittel, das im Stand der Technik bekannt ist.
Selektive Bindungsmittel der Erfindung, eingeschließlich Antikörper, können als Therapeutika verwendet werden. Diese therapeutischen Mittel sind im allgemeinen Agonisten oder Antagonisten, so dass sie entweder entsprechend mindestens eine der biologischen Aktivitäten des VGF-Polypeptids fördern oder reduzieren. In einer Ausführungsform sind die antagonistischen Antikörper der Erfindung Antikörper oder bindende Fragmente davon, die spezifisch an ein VGF-Polypeptid binden können und die die funktionelle Aktivität eines VGF-Polypeptids in vivo oder in vitro inhibieren oder eliminieren können. Im bevorzugten Ausführungsformen wird das selektive Bindungsmittel, z. B. ein antagonistischer Antikörper, die funktionelle Aktivität eines VGF-Polypeptids um mindestes ungefähr 50% inhibieren und bevorzugterweise um mindestens ungefähr 80%. In einer weiteren Ausführungsform kann das selektive Bindungsmittel ein anti-VGF-Polypeptid-Antikörper sein, der mit einem VGF-Polypeptid-Bindungspartner interagieren kann (einem Ligand oder Rezeptor), wodurch er die VGF-Polypeptid-Aktivität in vitro oder in vivo inhibiert oder eliminiert. Selektive Bindungsmittel einschließlich agonistischen und antagonistischen anti-VGF-Polypeptid-Antikörpern werden durch Screeningtests identifiziert, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit, das VGF-selektive Bindungsmittel (wie zum Beispiel Antikörper) und andere Reagenzien, die für die Erkennung der VGF-Polypeptidspiegel in biologischen Proben nützlich sind, umfassen. Solche Reagenzien können einen nachweisbaren Marker, ein Blockierungsserum, positive und negative Kontrollproben und Nachweisreagenzien einschließen.
Chemische Derivate
Chemisch modifizierte Derivate von VGF-Polypeptiden können durch den Fachmann hergestellt werden, gegeben die hierin beschriebene Offenbarungen. VGF-Polypeptidderivate sind in einer Weise modifiziert, die unterschiedlich ist – entweder in dem Typ oder der Lokalisierung der Moleküle, die natürlicherweise mit dem Polypeptid verbunden sind. Derivate können Moleküle einschließen, die durch die Deletion von einer oder mehrerer natürlich angbundenen chemischen Gruppen gebildet wurden. VGF-Polypeptide können durch die kovalente Bindung von einem oder mehreren Polymeren modifiziert sein. Z. B. ist das ausgewählte Polymer typischerweise wasserlöslich, so dass das Protein an das es gebunden ist in einer wässrigen Umgebung, wie zum Beispiel einer physiologischen Umgebung, nicht präzipitiert. Eingeschlossen im Umfang der geeigneten Polymere ist ein Gemisch von Polymeren. Vorzugsweise wird das Polymer für die therapeutische Verwendung der Endprodukt-Präparation, pharmazeutisch akzeptabel sein.
Die Polymere können jeweils von jedem Molekulargewicht sein und können verzweigt oder nicht verzweigt sein. Die Polymere haben jeweils typischerweise ein Durchschnittsmolekulargewicht von zwischen ungefähr 2 kDa bis ungefähr 100 kDa (wobei der Begriff „ungefähr" anzeigt, dass in Präparationen von wasserlöslichen Polymeren einige Moleküle mehr wiegen werden, andere weniger als das angegebene Molekulargewicht). Das Durchschnittsmolekulargewicht von jedem Polymer ist vorzugsweise zwischen ungefähr 5 kDa und ungefähr 50 kDa, weiter bevorzugt zwischen ungefähr 12 kDa und ungefähr 40 kDa und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 20 kDa und ungefähr 35 kDa.
Geeignete wasserlösliche Polymere oder Gemische davon schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, N-verbundene oder O-verbundene Kohlenwasserstoffe, Zucker, Phosphate, Polyethylenglykol (PEG) (einschließlich der Formen von PEG, die verwendet wurden, um Proteine in Derivate umzuwandeln, einschließlich Mono-(C₁-C₁₀), Alkoxy-, oder Aryloxy-Polyethylenglykol), Monomethoxy-Polyethylenglykol, Dextran (wie zum Beispiel Dextran niedrigen Molekulargewichts von z. B. ungefähr 6 kDa), Zellulose oder andere Kohlenwasserstoffe basierend auf Polymeren, Poly-(N-Vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykol, Homopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Kopolymere, polyoxyethylierte Polyole (z. B., Glycerin) und Polyvinylalkohole. Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind bifunktionale kreuzvernetzte Moleküle, die verwendet werden können, um kovalent angebrachte VGF-Polypeptidmultimere herzustellen.
Im allgemeinen kann chemische Derivatisierung unter jeder geeigneten Bedingung durchgeführt werden, die verwendet wird, um ein Protein mit einem aktivierten Polymermolekül zu reagieren. Verfahren für die Herstellung von chemischen Derivaten von Polypeptiden werden im allgemeinen folgende Schritte umfassen: (a) Reagieren des Polypeptids mit dem aktivierten Polymermolekül (wie zum Beispiel einem reaktiven Ester oder Aldehydderivat des Polymermoleküls unter Bedingungen bei denen ein VGF-Polypeptid mit einem oder mehreren Polymermolekülen verbunden wird, und (b) Erhaltung der Reaktionsprodukte. Die optimalen Reaktionsbedingungen werden basierend auf den bekannten Parametern und dem gewünschten Ergebnis ermittelt. Zum Beispiel je größer der Anteil der Polymermoleküle zum Protein ist, desto größer ist der Prozentsatz von gebundenem Polymermolekül. In einer Ausführungsform kann das VGF-Polypeptid eine einzelne Polymermolekülgruppe am Aminoterminus aufweisen. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5, 234, 784.
Die Pegylierung von dem Polypeptid kann spezifisch durch die Verwendung einer der Pegylierungs-Reaktionen, die im Stand der Technik bekannt sind, ausgeführt werden. Solche Reaktionen sind z. B. in den folgenden Referenzen beschrieben: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3:4-10; EP Pub. Nrn. 154316 und 401384; und U.S. Patent Nr. 4,179,337. Zum Beispiel kann die Pegylierung durch eine Acylierungsreaktion oder einer Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglykolmolekül (oder einem analogen reaktiven wasserlöslichen Polymer) wie hierin beschrieben ausgeführt werden. Für die Acylierungsreaktion sollte ein ausgewähltes Polymer eine einzelne reaktive Estergruppe haben. Für eine reduktive Alkylisierung sollte ein ausgewähltes Polymer eine einzelne reaktive Aldehydgruppe besitzen. Ein reaktives Aldehyd ist z. B. Polyethylenglykol-Propionaldehyd, das wasserstabil ist oder Mono C₁-C₁₀-Alkoxy oder Aryloxyderivate davon (siehe U.S. Patent Nr. 5,252,714).
In einer weiteren Ausführungsform können VGF-Polypeptide chemisch an Biotin gekoppelt sein. Die Biotin-VGF-Polypeptidmoleküle werden dann an Avidin gebunden, was zu tetravalenten Avidin/Biotin/VGF-Polypeptidmolekülen führt. VGF-Polypeptide können ebenfalls an Dinitrophenol (DNP) oder Trinitrophenol (TNP) kovalent gebunden werden, und die sich ergebenden resultierenden Konjugate mit anti-DNP oder anti-TNP-IgM präzipitiert werden, um dekamerische Konjugate mit einer Valenz von 10 zu bilden.
Im allgemeinen schließen die Zustände, die durch die Verabreichung der vorliegenden VGF-Polypeptidderivate gelindert oder moduliert werden sollen diejenigen ein, die für VGF-Polypeptide hier beschrieben sind. Nichtsdestotrotz können die VGF-Polypeptidderivate, die hierin offenbart sind, zusätzliche Aktivitäten aufweisen, gesteigerte oder reduzierte biologische Aktivität, oder andere Charakteristika, wie zum Beispiel erhöhte oder reduzierte Halbwertszeiten, verglichen mit den nicht-derivatisierten Molekülen.
Testen auf andere Modulatoren der VGF-Polypeptidaktivität
In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, Moleküle zu identifizieren, die Modulatoren sind, d. h. Agonisten oder Antagonisten, der Aktivität von VGF-Polypeptiden. Natürliche oder synthetische Moleküle, die die VGF-Polypeptide modulieren, können unter der Verwendung von einem oder mehreren Screening-Tests, wie zum Beispiel denjenigen, die hierin beschrieben sind, identifiziert werden. Solche Moleküle können entweder auf eine ex vivo-Weise oder eine in vivo-Weise durch Injektion, oder durch orale Gabe, Implantationsvorrichtungen oder dergleichen verabreicht werden.
„Testmolekül" betrifft ein Molekül, das unter Evaluierung auf seine Fähigkeit hin, die Aktivität eines VGF-Polypeptids zu modulieren (d. h. Erhöhen oder Erniedrigen), steht. Meistens wird ein Testmolekül direkt mit einem VGF-Polypeptid interagieren. Nichtsdestotrotz ist es ebenfalls vorgesehen, dass ein Testmolekül auch die VGF-Polypeptidaktivität indirekt modulieren kann, wie zum Beispiel durch die Beeinflussung der VGF-Genexpression, oder durch die Bindung an einen VGF-Polypeptidbindungspartner (z. B. einen Rezeptor oder Liganden). In einer Ausführungsform wird das Testmolekül an ein VGF-Polypeptid mit einer Affinitätskonstante von mindestens ungefähr 10^–6 M, vorzugsweise ungefähr 10^–8 M, weiter bevorzugt ungefähr 10^–9 M und noch weiter bevorzugt ungefähr 10^–10 M binden.
Ein VGF-Polypeptidagonist oder -antagonist kann ein Protein, Peptid, Kohlenwasserstoff, Fett oder Molekül niederen Molekulargewichts sein, das mit einem VFG-Polypeptid interagiert um dessen Aktivität zu regulieren. Moleküle, die die VGF-Polypeptidexpression regulieren schließen Nukleinsäuren ein, die komplementär zu Nukleinsäuren sind, die für ein VGF-Polypeptid kodieren oder die zu Nukleinsäuresequenzen komplementär sind, die die Expression eines VGF-Polypeptids steuern oder kontrollieren und die als Antisense-Regulaturen der Expression wirken.
Wenn ein Testmolekül einmal als interagierend mit einem VGF-Polypeptid identifiziert wurde, kann das Molekül auf seine Fähigkeit hin weiter ausgewertet werden, die VGF-Polypeptidaktivität zu erhöhen oder zu vermindern. Das Messen der Interaktion des Testmoleküls mit dem VGF-Polypeptid kann in verschiedenen Formaten ausgeführt werden, einschließlich zellbasierenden Bindungstests, Membranbindungstests, Lösungs-Phasetests und Immuntests. Im allgemeinen wird ein Testmolekül mit einem VGF-Polypeptid für eine bestimmte Zeit inkubiert, und die VGF-Polypeptidaktivität wird durch einen oder mehrere Tests zur Messung der biologischen Aktivität ermittelt.
Die Interaktion der Testmoleküle mit VGF-Polypeptiden kann auch durch die Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern in einem Immuntest direkt getestet werden. Alternativ dazu können modifizierte Formen der VGF-Polypeptide, die Epitop-Tags, wie hierin beschrieben, enthalten, in Lösungen und Immuntests verwendet werden.
In dem Fall, dass VGF-Polypeptide eine biologische Aktivität durch eine Interaktion mit einem Bindungspartner zeigen (z. B. einem Rezeptor oder einem Liganden), kann eine Vielzahl von in vitro-Tests verwendet werden, um die Bindung von einem VGF-Polypeptid an einen korrespondierenden Bindungspartner (wie zum Beispiel ein selektives Bindungsmittel, Rezeptor oder Ligand) zu messen. Diese Tests können verwendet werden, um die Testmoleküle auf ihre Fähigkeit zu screenen, die Rate und/oder das Bindungsmaß von einem VGF-Polypeptid an seinen Bindungspartner zu erhöhen oder zu vermindern. In einem Test wird ein VGF-Polypeptid in den Wells einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Radiomarkierte VGF-Polypeptid-Bindungspartner (z. B. jodierte VGF-Polypeptid-Bindungspartner) und ein Testmolekül können dann hinzugefügt werden, entweder eines nach dem anderen (in jeder Reihenfolge) oder gleichzeitig. Nach der Inkubation können die Wells gewaschen werden und auf ihre Radioaktivität hin durch die Verwendung eines Scintillationszählers getestet werden, um das Ausmaß, mit dem der Bindungspartner an das VGF-Polypeptid gebunden hat, zu messen. Typischerweise wird ein Molekül in einer Reihe von Konzentrationen getestet werden und eine Serie von Kontrollwells, denen eine oder mehrere Elemente des Tests fehlen, können verwendet werden, um die Exaktheit in der Messung der Ergebnisse zu gewährleisten. Eine Alternative zu diesem Verfahren schließt das Vertauschen der „Positionen" der Proteine ein, d. h. der immobilisierte VGF-Polypeptid-Bindungspartner wird in die Mikrotiterplattewells gegeben, mit dem Testmolekül und radiomarkiertem VGF-Polypeptid inkubiert und das Maß der VGF-Polypeptid-Bindung wird gemessen. Siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Kap. 18 (Ausubel et al., Hrsg., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1995).
Als eine Alternative zu Radiomarkierung können ein VGF-Polypeptid oder sein Bindungspartner mit Biotin konjugiert werden, und die Anwesenheit des biotinylierten Proteins kann dann durch die Verwendung von Streptavidin, verbunden mit einem Enzym, wie zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) gemessen werden, das dann colorometrisch oder durch Fluoreszentes-Tagging durch Streptavidin gemessen werden kann. Ein Antikörper der gegen ein VGF-Polypeptid oder gegen einen VGF-Polypeptid-Bindungspartner gerichtet ist und der mit Biotin konjugiert ist kann ebenfalls zum Zweck des Nachweises nach der Inkubation des Komplexes mit dem Enzym-gebundenen Streptavidin, das mit AP oder HRP verbunden ist, verwendet werden.
Ein VGF-Polypeptid oder ein VGF-Polypeptid-Bindungspartner kann ebenfalls durch die Bindung an Agarose-Kügelchen, Acryl-Kügelchen oder andere Typen von solchen inerten Festphasesubstraten immobilisiert sein. Der Substratproteinkomplex kann in eine Lösung plaziert werden, die das komplementäre Protein und die Testverbindung enthält. Nach der Inkubation können die Kügelchen durch Zentrifugation präzipitiert werden, und die Menge der Bindung zwischen dem VGF-Polypeptid und seinem Bindungspartner kann durch hierin beschriebene Verfahren ermittelt werden. Alternativ dazu kann der Substratproteinkomplex in einer Säule immobilisiert werden, wobei das Testmolekül und das komplementäre Protein durch die Säule passieren. Die Bildung des Komplexes zwischen einem VGF-Polypeptids und seinem Bindungspartner kann dann durch die Verwendung von einer der hierin beschriebenen Techniken (z. B. Radiomarkierung oder Antikörperbindung) ermittelt werden.
Ein weiterer in vitro-Test, der für die Identifizierung eines Testmoleküls nützlich ist, das die Bildung des Komplexes zwischen einem VGF-Polypeptid-Bindeprotein und einem VGF-Polypeptid-Bindungspartner erhöht oder vermindert, ist ein Oberflächen-Plasmon-Resonanzerkennungssystem, wie das BIAcore Assay System (Pharmacia, Piscataway, NJ). Das BIAcore System wird verwendet, wie durch den Hersteller angegeben. Dieser Test schließt im wesentlichen die kovalente Bindung von entweder dem VGF-Polypeptid oder dem VGF-Polypeptid-Bindungspartner an einen Dextran-beschichteten Sensorchip ein, der sich in einem Detektor befindet. Die Testverbindung und das andere komplementäre Protein können dann in die Kammer, die den Sensorchip enthält, injiziert werden, entweder simultan oder der Reihe nach. Die Menge des komplementären Proteins das bindet kann dann basierend auf der Veränderung der molekularen Masse gemessen werden, die physisch mit der Dextran beschichteten Seite des Sensorchips assoziiert ist, wobei die Veränderung in der molekularen Masse durch das Detektorsystem gemessen wird.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei oder mehrere Testverbindungen zusammen auf ihre Fähigkeit hin zu messen, die Bildung des Komplexes zwischen dem VGF-Polypeptid und dem VGF-Polypeptid-Bindungspartner zu erhöhen oder zu verringern. In diesen Fällen können die Tests, die hier dargestellt sind, durch das Hinzufügen von solchen zusätzlichen Testverbindungen entweder simultan oder im Anschluß an die erste Testverbindung einfach modifiziert werden. Die verbleibenden Schritte des Tests sind wie hier dargestellt.
In vitro-Tests, wie diese, die hier beschrieben werden, können vorteilhafterweise verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen auf die Auswirkungen der Bildung des Komplexes zwischen einem VGF-Polypeptid und VGF-Polypeptid-Bindungspartner zu screenen. Die Tests können automatisiert werden, um die Verbindung zu screenen, die in Phagen-Display, synthetischen Peptiden und chemischen Synthesebibliotheken generiert wurden.
Verbindungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen einem VGF-Polypeptid und einem VGF-Polypeptid-Bindungspartner erhöhen oder verringern, können auch in Zellkulturen durch die Verwendung von Zellen und Zelllinien gescreened werden, die entweder VGF-Polypeptide oder VGF-Polypeptid-Bindungspartner exprimieren. Zellen und Zelllinien können von jedem Säugetier erhalten werden, aber vorzugsweise sind sie von Menschen oder anderen Primaten, Hunde- oder Nagetierquellen. Die Bindung von einem VGF-Polypeptid an Zellen, die VGF-Polypeptid-Bindungspartner auf ihrer Oberfläche exprimieren, wird in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Testmoleküle gemessen, und das Ausmaß der Bindung kann z. B. durch Durchflusszytometrie ermittelt werden, durch die Verwendung von biotinylierten Antikörpern gegen einen VGF-Polypeptid-Bindungspartner. Zellkulturtests können vorteilhafterweise verwendet werden, um die Verbindungen weiter zu analysieren die in Proteinbindungstests, die hierin beschrieben wurden, positiv bewertet wurden.
Zellkulturen können auch verwendet werden, um die Auswirkungen von Pharmazeutika-Kandidaten zu screenen. Zum Beispiel können Pharmazeutika-Kandidaten die Expression des VGF-Gens vermindern oder erhöhen. In bestimmten Ausführungsformen kann die Menge des VGF-Polypeptids oder des VGF-Polypeptidfragments, das nach der Einwirkung der Zellkultur gegenüber dem Pharmazeutika-Kandidat hergestellt wurde, gemessen werden. In bestimmten Ausführungsformen kann man den aktuellen Einfluß des Pharmazeutika-Kandidaten auf die Zellkultur messen. Zum Beispiel kann die Überexpression von einem bestimmten Gen einen bestimmten Einfluß auf die Zellkultur haben. In solchen Fällen kann man die Fähigkeit eines Pharmazeutika-Kandidaten für eine Erhöhung oder Verminderung der Expression von einem Gen testen oder seine Fähigkeit, einem bestimmten Einfluß auf die Zellkultur vorzubeugen oder diesen zu inhibieren. In anderen Beispielen kann die Herstellung von einem bestimmten metabolischen Produkt, wie zum Beispiel einem Fragment eines Polypeptids in einer Erkrankung oder einem pathologischen Zustand resultieren oder mit einer solchen assoziiert sein. In solchen Fällen kann man die Fähigkeit eines Pharmazeutika-Kandidaten zur Verminderung der Herstellung von solch einem metabolischen Produkt in der Zellkultur testen.
Internalisierende Proteine
Die tat-Proteinsequenz (von HIV) kann verwendet werden, um Proteine in eine Zelle einzuführen. Siehe z. B., Falwell et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:664-68. Zum Beispiel wurde eine 11-Aminosäuren-lange Sequenz (Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R-; SEQ ID NO:11) des HIV-tat-Proteins (genannt „Proteintransduktionsdomaine" oder TAT PDT) als eine Sequenz beschrieben, die den Austausch zwischen der zytoplasmatischen Membran und der Kernmembran einer Zelle vermittelt. Siehe Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72; und Nagahara et al., 1998, Nat. Med. 4:1449-52. In diesen Verfahren werden FITC-Konstrukte (FITC-markiertes G-G-G-G-Y-G-R-K-K-R-R-Q-R-R-R; SEQ ID NO:12), die Gewebe im Anschluß an intraperitonale Verabreichung durchdringen hergestellt und die Bindung von solchen Konstrukten durch fluoreszenzaktivierte Zellsorteranalyse (FACS) gemessen. Zellen, die mit einem tat-β-gal-Fusionsprotein behandelt werden, werden β-gal-Aktivität aufweisen. Im Anschluß an die Injektion kann die Expression von solchen Konstrukten in einer Anzahl von Geweben gemessen werden, einschließlich Leber, Niere, Lunge, Herz und Gehirngewebe. Es wird vermutet, daß solche Konstrukte einiges Ausmaß von Entfaltung unterlaufen, um in die Zelle einzutreten und als solche eine Rückfaltung nach dem Eintritt in die Zelle benötigen.
Es wird dementsprechend erkannt, dass die tat-Proteinsequenz verwendet werden kann, um ein gewisses Polypeptid in eine Zelle einzubringen. Zum Beispiel kann durch die Verwendung einer tat-Proteinsequenz ein VGF-Antagonist (wie zum Beispiel ein anti-VGF-selektiv-bindendes Mittel, kleines Molekül, löslicher Rezeptor oder antisense-Oligonukleotid) intrazellulär verabreicht werden, um die Aktivität des VGF-Moleküls zu inhibieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „VGF-Molekül" auf sowohl VGF-Nukleinsäuremoleküle als auch VGF-Polypeptide, wie sie hier definiert sind. Wenn es erwünscht ist, kann das VGF-Protein auch intern an eine Zelle verabreicht werden, unter der Verwendung dieser Verfahren. Siehe ebenfalls Straus, 1999, Science 285: 1466-67.
Therapeutische Verwendungen
Die VGF-Polypeptide und selektiv bindendenden Mittel der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine Anzahl von akuten und chronischen Erkrankungen und Zustände, die hierin aufgeführt sind, zu behandeln, zu diagnostizieren, zu lindern oder zu verhindern.
VGF-vermittelte Erkrankungen, Zustände und Störungen schließen Fettsucht, Sterilität, Kachexie, Eßstörungen, AIDS-vermittelter Komplex, hypermetabolische Zustände, Hyperaktivität, Hypoaktivität und Hyperinsulinproduktion ein.
Andere Erkrankungen, die durch unerwünschte Spiegel von VGF-Polypeptiden verursacht oder durch diese vermittelt werden, sind in dem Umfang der Erfindung mit eingeschlossen. Unerwünschte Spiegel schließen erhöhte Spiegel von VGF-Polypeptiden und verringerte Spiegel von VGF-Polypeptiden ein.
VGF-Polypeptid-Zusammensetzungen und Verabreichung
Therapeutische Zusammensetzung sind im Umfang der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen. Solche VGF-Polypeptid-pharmazeutischen Zusammensetzungen können eine therapeutisch effektive Menge eines VGF-Polypeptids in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Formulierungsmittel, ausgewählt nach der Eignung für der Art der Verabreichung, umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen können eine therapeutisch effektive Menge von einem oder mehreren VGF-Polypeptid-selektiv-bindenden Mitteln in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Formulierungsmittel umfassen, das ausgewählt wurde nach seiner Eignung zur Art der Verabreichung.
Akzeptable Formulierungen sind bevorzugterweise für Empfänger bei den verwendeten Dosen und Konzentrationen nicht toxisch.
Die pharmazeutische Zusammensetzungen kann Formulierungsmaterialien zur Modifizierung, Beibehaltung oder Konservierung, von z. B. der pH, Osmolarität, Viskosität, Klarheit, Farbe, Isotonizität, Geruch, Sterilität, Stabilität, Rate der Löslichkeit oder der Abgabe, Adsorption, oder Penetration der Zusammenseztung enthalten. Geeignete Formulierungsmaterialien schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Aminosäuren (wie zum Beispiel Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin), antimikrobielle Mittel, antioxidative Mittel (solche wie Askorbinsäure, Natriumsulfit oder Natriumhydrogensulfit), Puffer (solche wie Borat, Bikarbonat, Tris-HCl, Zitrate, Phosphate oder andere organische Säuren), Quellmittel (wie zum Beispiel Manitol oder Glyzin), chelatbildende Verbindungen (wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)), Komplexbildner (wie zum Beispiel Koffein, Polyvinylpyrrolidon, beta-Cyclodextrin oder Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin), Füllmittel, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenwasserstoffe (wie zum Beispiel Glukose, Mannose oder Dextrine), Proteine (wie zum Beispiel Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline), Färbe-, Duft- und Lösungsmittel, emulgierende Mittel, hydrophile Polymere (wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon), Polypeptide niedrigen Molekulargewichts, salzbildende Gegenionen (wie zum Beispiel Natrium), Konservierungsmittel (wie zum Beispiel Benzalkoniumchlorid, Benzolsäure, Salicylsäure, Thimerosal, Phenethylalkohol, Methylparaben, Propylparaben, Chlorhexidin, Sorbinsäure oder Wasserstoffperoxid), Lösungsmittel (wie zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol oder Polyethylenglykol), Zuckeralkohole (wie zum Beispiel Mannitol oder Sorbitol), Suspendierungsmittel, Tenside oder Benetzungsmittel (wie zum Beispiel Pluronics; PEG; Sorbitanester; Polysorbate wie zum Beispiel Polysorbat 20 oder Polysorbat 80; Triton; Tromethamin; Lecithin; Cholesterin oder Tyloxapal), Stabilitätsfördernde Mittel (wie zum Beispiel Saccharose oder Sorbitol), die Tonizität erhöhende Mittel (wie zum Beispiel Alkalimetallhalogenide – bevorzugterweise Natrium- oder Kaliumchlorid – oder Mannitolsorbitol), Zuführungsvehikel, Verdünnungsmittel, Arzneistoffträger und/oder pharmazeutische Adjuvantien. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences (18 th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990).
Die optimale pharmazeutische Zusammensetzung wird durch einen Fachmann bestimmt werden, in Abhängigkeit von z. B. dem beabsichtigten Weg der Verabreichung, Verabreichungsart und der gewünschten Dosis. Siehe z. B., Remington's Pharmaceutical Sciences supra. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Status, die Stabilität, Rate der in vivo-Abgabe und die Rate von in vivo-Clearance des VGF-Moleküls beeinflussen.
Das primäre Vehikel oder Träger in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann entweder von wässriger oder wasserfreier Art sein. Z. B. kann ein geeignetes Vehikel oder Träger für die Injektion, Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder künstliche Cerebrospinalflüssigkeit sein, möglicherweise versetzt mit anderen Materialien, die für Zusammensetzungen für parenterale Verabreichungen herkömmlich sind. Neutral-gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt mit Serumalbumin sind des weiteren beispielhafte Vehikel. Andere beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen Trispuffer von ungefähr pH 7,0 bis 8,5 oder Acetatpuffer von ungefähr pH 4,0 bis 5,5, der des weiteren Sorbitol oder andere geeignete Zusätze enthalten kann. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können VGF-Polypeptid-Zusammensetzungen für die Aufbewahrung hergestellt werden, durch Mischen der ausgewählten Zusammensetzung, die den gewünschten Grad an Reinheit hat, mit optionalen Formulierungsmaterialien (Remington's Pharmaceutical Sciences supra) in der Form von einem gefriergetrockneten Kuchen oder einer wässrigen Lösung. Des weiteren kann das VGF-Polypeptidprodukt als ein gefriergetrocknetes Produkt durch die Verwendung eines geeigneten Arzneistoffträgers wie Saccharose hergestellt werden.
Die VGF-Polypeptid-pharmazeutischen Zusammensetzungen können für parenterale Verabreichungen ausgewählt werden. Alternativ können die Zusammensetzungen für Inhalation oder für die Darreichung durch den Verdauungstrakt, wie zum Beispiel oral, ausgewählt werden. Die Herstellung von solchen pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzungen liegt innerhalb des Fachwissens.
Die Formulierungskomponenten sind in Konzentrationen vorhanden, die für die Stelle der Verabreichung akzeptabel sind. Z. B. werden Puffer verwendet, um die Zusammensetzung bei physiologischen pH oder einem gering niedrigerem pH zu halten, typischerweise innerhalb eines pH-Bereichs von ungefähr 5 bis ungefähr 8.
Wenn parenterale Verabreichung vorgesehen ist, kann die therapeutische Zusammensetzung für die Verwendung in dieser Erfindung in der Form von Pyrogen-freien, parenteral akzeptablen wasserhaltigen Lösungen vorliegen, umfassend die gewünschten VGF-Moleküle in einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel. Ein besonders geeignetes Vehikel für die parenterale Injektion ist steriles destilliertes Wasser, in dem ein VGF-Molekül als eine sterile, isotonische Lösung, geeignet konserviert, formuliert ist. Eine weitere Präparation kann die Formulierung des gewünschten Moleküls mit einem Mittel einschließen, das injizierbare Mikrosphären, bioerodierbare Partikel, Polymerverbindungen (wie zum Beispiel Polymilchsäure oder Polyglykolsäure), Kügelchen oder Liposomen enthält, die eine kontrollierte und verzögerte Freisetzung des Produkts bereitstellen, das dann durch eine Depot-Injektion verabreicht werden kann. Hyaluronsäure kann ebenfalls verwendet werden, und dies kann den Effekt haben, einen verlängerten Verbleib im Kreislauf zu begünstigen. Andere geeignete Mittel für die Einführung des gewünschten Moleküls schließen implantierbare Medikament-Zuführvorrichtungen ein.
In einer Ausführungsform kann die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Inhalation formuliert werden. Z. B. können VGF-Polypeptide als ein trockenes Pulver für die Inhalation formuliert werden. VGF-Polypeptide oder Nukleinsäuremolekül-Inhalationslösungen können ebenfalls mit einem Treibmittel für Aerosolausschüttung formuliert werden. In einer weiteren Ausführungsform können die Lösungen zerstäubt werden. Pulmonare Verabreichung ist des weiteren beschrieben in PCT Pub. Nr. WO 94/20069, die die pulmonare Verabreichung von chemisch modifizierten Proteinen beschreibt.
Es wird ebenfalls vorgesehen, dass bestimmte Formulierungen oral verabreicht werden können. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können VGF-Polypeptide, die in dieser Weise verabreicht werden, mit oder ohne den Trägern die üblicherweise in der Verbindung mit festen Dosierungsformen wie Tabletten und Kapseln verwendet werden, formuliert werden. Zum Beispiel kann eine Kapsel aufgebaut werden, um den aktiven Teil der Formulierung an dem Punkt des gastrointestinalen Trakts auszuschütten, wenn die Bioverfügbarkeit maximal ist und der präsystemische Abbau minimiert ist. Zusätzliche Mittel können mit eingeschlossen werden, um die Absorption des VGF-Polypeptids zu ermöglichen. Lösungsmittel, Aromastoffe, niedrig schmelzende Wachse, pflanzliche Öle, Gleitmittel, Stellmittel, Tabletten-Sprengmittel und Bindemittel können ebenfalls verwendet werden.
Eine andere pharmazeutische Zusammensetzung kann eine effektive Menge der VGF-Polypeptide in einem Gemisch mit nicht-toxischen Arzneistoffträgern einschließen, die geeignet sind für die Herstellung von Tabletten. Durch die Lösung der Tabletten in sterilem Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel, können Lösungen in Einzeldosierungsform hergestellt werden. Geeignete Arzneistoffträger schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, inerte Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Calciumcarbonat, Natriumcarbonat oder Bicarbonat, Laktose oder Calciumphosphat; oder Bindemittel, wie zum Beispiel Stärke, Gelatine, oder Akazia oder Gleitmittel wie zum Beispiel Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talkum.
Zusätzliche VGF-Polypeptid-pharmazeutische Zusammensetzungen werden für einen Fachmann offensichtlich sein, einschließlich Formulierungen, die die VGF-Polypeptide in verzögerten oder kontrollierter-Zuführungsmitteln einschließen. Techniken für die Formulierung einer Vielzahl von anderen verzögerten oder kontrollierter-Zuführungsmitteln, wie zum Beispiel Liposomenträger, bioerodierbare Mikropartikel oder poröse Kügelchen und Depotinjektionen sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Siehe z. B. PCT/US93/00829, die die kontrollierte Abgabe von porösen Polymer-Mikropartikeln für die Zuführungvon pharmazeutischen Zusammensetzungen beschreibt.
Zusätzliche Beispiele von Präparationen mit verzögerter Freisetzung schließen semipermeable Polymermatrices in Form von geformten Artikeln ein, z. B. Filme oder Mikrokapseln. Abgabematrices mit verzögerter Freisetzung können Polyester, Hydrogele, Polylaktide (U.S. Patent Nr. 3,773,919 und EP Pub. Nr. 0584819), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 und Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105) Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D(–)-3-Hydroxybuttersäure (EP Pub. Nr. 133988) sein. Zusammensetzngen mit verzögerter Freisetzung können ebenfalls Liposomen einschließen, die durch jede der verschiedenen Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden können. Siehe z. B. Eppstein et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 3688-92, und EP Pub. Nrn. 036676, 088046 und 143949.
Die VGF-pharmazeutische Zusammensetzung, die für die in vivo-Verabreichung verwendet wird, muß typischerweise steril sein. Dies kann durch Filtration durch eine sterile Filtermembran erreicht werden. Wenn die Zusammensetzung gefriergetrocknet ist, kann die Sterilisation bei der Verwendung dieses Verfahrens entweder vorher oder nach der Gefriertrocknung und der Rekonstitution durchgeführt werden. Die Zusammensetzung für die parenterale Verabreichung kann in gefriergetrockneter Form oder in einer Lösung aufbewahrt werden. Zusätzlich wird die parenterale Zusammensetzung in allgemeinen in einen Behälter plaziert, der einen sterilen Zugang aufweist, z. B. ein intravenöser Lösungsbeutel oder ein Fläschchen, das einen Stopfen aufweist, der durch eine hypodermische Injektionsnadel durchbohrbar ist.
Sobald die pharmazeutische Zusammensetzung formuliert ist, kann sie in sterile Fläschchen als eine Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder als ein dehydriertes oder gefriergetrocknetes Puder aufbewahrt werden. Solche Formulierungen können entweder in einer ready-to-use-Form oder in einer Form (z. B. gefriergetrocknet) aufbewahrt werden, was eine Rekonstitution vor der Verabreichung erfordert.
In einer bestimmten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Kits für die Herstellung einer Einzeldosis-Verabreichungseinheit. Die Kits können jeweils sowohl einen ersten Behälter enthalten, der ein getrocknetes Protein enthält und einen zweiten Behälter, der eine wässrige Formulierung enthält. Ebenfalls im Umfang der Erfindung mit eingeschlossen sind Kits, die Einzel- und Multikammer-vorgefüllte Spritzen enthalten (z. B. Flüssigspritzen und Lyospritzen).
Die effektive Menge einer VGF-pharmazeutischen Zusammensetzung, die therapeutisch verwendet wird, hängt z. B. von dem therapeutischen Kontext und Zielen ab. Ein Fachmann wird erkennen, dass der geeignete Dosisspiegel für die Behandlung variieren wird, in Abhängigkeit von zum Teil dem zugeführten Molekül, der Indikation für die das VGF-Molekül verwendet wird, der Art der Verabreichung und der Größe (Körpergewicht, Körperoberfläche und Organgröße) und dem Zustand (Alter und allgemeine Gesundheit) des Patienten. Dementsprechend kann der Kliniker die Dosis titrieren und die Route der Verabreichung modifizieren, um so den optimalen therapeutischen Effekt zu erhalten. Eine typische Dosis kann von ungefähr 0,1 μg/kg bis zu ungefähr 100mg/kg oder mehr reichen, in Abhängigkeit von den Faktoren, die oben angeführt sind. In anderen Ausführungsformen kann die Dosis von 0,1 μg/kg bis zu 100 mg/kg reichen; oder 1 μg/kg bis ungefähr 100mg/kg; oder 5 μg/kg bis zu ungefähr 100 mg/kg.
Die Häufigkeit der Dosisgabe wird von den pharmakokinetischen Parametern des VGF-Moleküls in der verwendeten Formulierung abhängen. Typischerweise wird ein Kliniker die Zusammensetzung verabreichen, bis die Dosis erreicht ist, die den gewünschten Effekt bewirkt. Die Zusammensetzung kann dafür als Einzeldosis verabreicht werden, als Zwei- oder Mehrfachdosis (die dieselbe Menge oder nicht dieselbe Menge des gewünschten Moleküls enthalten kann) über die Zeit hinweg, oder als eine kontinuierliche Infusion durch eine implantierte Vorrichtung oder Katheter. Eine weitere Verfeinerung der geeigneten Dosis wird von einem Fachmann routinemäßig durchgeführt und liegt im Bereich der Aufgaben, die routinemäßig durch diesen durchgeführt werden. Geeignete Dosen können durch die Verwendung von Dosis-Responsedaten ermittelt werden.
Die Art der Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung ist im Einklang mit bekannten Verfahren, z. B. oral; durch intravenöse Injektion, intraperitoneale, intracerebrale (intraparenchymale), intracerebroventrikulare, intramuskuläre, intraoculare, intraarterielle, intraportale oder intralesionale Routen; durch Systeme mit verzögerter Abgabe; oder durch Implantationsvorrichtungen. Wenn erwünscht, können die Zusammensetzungen durch eine Bolusinjektion verabreicht werden oder kontinuierlich durch Infusion oder durch eine Implantationsvorrichtun.
Alternativ oder zusätzlich kann die Zusammensetzung lokal durch Implantation einer Membran, Schwamm oder anderen geeigneten Material verabreicht werden auf dem das gewünschte Molekül absorbiert oder eingekapselt ist. Wenn eine v Implantationsvorrichtung verwendet wird, kann die Vorrichtung in jedes geeignete Gewebe oder Organ implantiert werden, und die Ausschüttung des gewünschten Moleküls kann durch Diffusion, zeitlich festgelegte Abgabebolus oder kontinuierliche Verabreichung vorliegen.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die VGF-Polypeptid-pharmazeutischen Zusammensetzungen in einer ex vivo-Weise zu verwenden. In solchen Fällen werden Zellen, Gewebe oder Organe, die von einem Patienten entfernt wurden, einer VGF-Polypeptid-pharmazeutischen Zusammensetzungen ausgesetzt, wonach die Zellen, Gewebe oder Organe direkt wieder zurück in den Patienten implantiert werden.
In anderen Fällen kann ein VGF-Polypeptid durch die Implantierung von bestimmten Zellen, die gentechnisch verändert wurden zugeführt werden, unter der Verwendung von Verfahren, wie denen, die hier beschrieben sind, um das VGF-Polypeptid zu exprimieren und zu sekretieren. Solche Zellen können tierische oder menschliche Zellen sein und können autolog, heterolog oder xenogen sein. Optional können die Zellen immortalisiert sein. Um die Chance einer immunologischen Antwort zu vermindern, können die Zellen eingekapselt sein, um die Infiltration in umgebende Gewebe zu vermeiden. Die Materialien für die Einkapselung sind typischerweise biokompatible semipermeable Polymereinschlüsse oder -membranen, die die Abgabe der/des Proteinprodukte/s erlauben, aber die Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder andere schädliche Faktoren aus den umgebenden Geweben vermeiden.
Wie hierin diskutiert, kann es wünschenswert sein, isolierte Zellpopulationen (wie zum Beispiel Stammzellen, Lymphozyten, rote Blutzellen, Chondrozyten, Neuronen und dergleichen) mit einem oder mehreren VGF-Polypeptiden zu behandeln. Dies kann durch die Aussetzung der isolierten Zellen gegenüber dem Polypeptid direkt erreicht werden, wobei es in einer Form vorkommt, die für die Zellmembran permeabel ist.
Zusätzliche Ausführungsformen der vorliegende Erfindung betreffen Zellen und Verfahren (z. B. homologe Rekombination und/oder andere kombinante Produktionsverfahren) für sowohl die in vitro-Herstellung von therapeutischen Polypeptiden als auch für die Herstellung und Ausschüttung von therapeutischen Polypeptiden durch Gentherapie oder Zelltherapie. Homologe und andere Rekombinationsverfahren können verwendet werden, um eine Zelle zu modifizieren, die ein normales transkriptionelles stillgelegtes VGF-Gen enthält, oder ein unterexprimiertes Gen und dadurch eine Zelle herstellt, die therapeutisch effiziente Mengen von VGF-Polypeptiden exprimiert.
Homologe Rekombination ist eine Technik, die ursprünglich entwickelt wurde für das Abziele auf Gene, um Mutationen in transkriptionell aktiven Genen zu induzieren oder korrigieren. Kucherlapati, 1989, Prog. in Nucl. Acid Res. & Mol. Biol. 36:301. Die grundlegende Technik wurde als ein Verfahren für die Einführung von spezifischen Mutationen in eine spezifische Region des Säugetiergenoms entwickelt (Thomas et al., 1986, Cell 44: 419-28; Thomas und Capecchi, 1987 Cell 51:503-12; Doetschman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8583-87) oder um die spezifischen Mutationen in defekten Genen zu korrigieren (Doetschman et al., 1987, Nature 330: 576-78). Exemplarische homologe Rekombinationstechniken sind in U.S. Patent Nr. 5,272,071; EP Pub. Nrn. 9193051 und 505500; PCT/US90/07642 und PCT Pub. Nr. WO 91/09955 beschrieben.
Durch homologe Rekombination kann die DNA-Sequenz, die in das Genom inseriert werden soll, zu einer spezifischen Region des Gens von Interesse geführt werden, durch Anbringung an eine abzielende DNA. Die abzielende DNA ist eine Nukleotidsequenz, die zu einer Region einer genomischen DNA komplementär (homolog) ist. Kleine Teile der abzielende DNA, die komplementär zu einer spezifischen Region des Genoms sind werden während der DNA-Replikationsphase mit dem parenteralen Strang in Kontakt gebracht. Es ist eine allgemeine Eigenschaft der DNA, die in die Zelle inseriert wurde, zu hybridisieren und daher mit anderen Teilen der endogenen DNA zu rekombinieren durch gemeinsame homologe Regionen. Wenn dieser komplementäre Strang an ein Oligonukleotid gebunden ist, das eine Mutation oder eine unterschiedliche Sequenz oder ein zusätzliches Nukleotid enthält, wird es als ein Ergebnis der Rekombination ebenfalls in den neusynthetisierten Strang inkorporiert. Als ein Ergebnis der Korrekturlesefunktion ist es für die neue DNA Sequenz möglich, als ein Template zu dienen. Dementsprechend wird die transferrierte DNA in das Genom eingefügt.
Angebunden an diese Teile der Ziel-DNA sind Regionen der DNA, die mit einem VGF-Polypeptid interagieren können oder die Expression kontrollieren können, z. B. flankierende Sequenzen. Zum Beispiel wird ein Promoter-Enhancer-Element, ein Suppressor oder ein exogenes Transkription modulierendes Element in das Genom der vorgesehenen Wirtszelle inseriert, in der Nähe und Orientierung, die für die Beeinflussung der Transkription der DNA geeignet ist, die für das gewünschte VGF-Polypeptid kodiert. Das Kontrollelement kontrolliert einen Teil der DNA, die in dem Wirtszellgenom vorhanden ist. Dementsprechend kann die Exression des gewünschten VGF-Polypeptids erreicht werden, nicht durch Transfektion von DNA, die für das VGF-Gen selbst kodiert, sondern vielmehr durch die Verwendung der abzielenden DNA (enthaltend Regionen von Homologie mit dem endogenen Gen von Interesse), die mit DNA-regulatorischen Segmenten gekoppelt ist, das die endogene Gesequenzen mit erkennbaren Signalen für die Transkription von einem VGF-Gen versieht.
In einem beispielhaften Verfahren wird die Expression eines gewünschten Ziel-Gens in einer Zelle (d. h. ein gewünschtes endogenes zelluläres Gen) durch homologe Rekombination in das zelluläre Genom an einer vorausgewählten Stelle durch die Einführung von DNA, die mindestens eine regulatorische Sequenz, ein Exon, und die Splice-Donor-Stelle beinhaltet, verändert. Diese Komponenten werden auf solche Weise in die chromosomale (genomische) DNA eingeschleust, dass dies in der Herstellung einer neuen Transkriptionseinheit resultiert (in der die regulatorische Sequenz, das Exon und die Splice-Donor-Stelle, die in dem DNA-Konstrukt vorhanden sind, operativ mit dem endogenen Gen verbunden werden). Als ein Ergebnis der Einführung von diesen Komponenten in die chromosomale DNA ist die Expression des gewünschten endogenen Gens verändert.
Veränderte Genexpression, wie hier beschrieben, schließt die Aktivierung (oder das Verursachen der Expression) von einem Gen, das normalerweise stumm (nicht exprimiert) in der Zelle wie erhalten ist, sowie Erhöhen der Expression eines Gens, das in der Zelle wie erhalten nicht in physiologisch signifikanten Spiegeln exprimiert wird. Die Ausführungsformen umfassen des weiteren Veränderungen des Musters der Regulierung oder Induktion ein, so dass es verschieden ist von den Mustern der Regulierung oder Induktion die in der Zelle wie erhalten auftritt, und eine Reduzierung (einschließlich Eliminierung) der Expression eines Gens, das in der Zelle wie erhalten exprimiert wird.
Ein Verfahren, durch das homologe Rekombination verwendet werden kann, um die VGF-Polypeptidherstellung von einem zellulären endogenen VGF-Gen zu erhöhen oder zu verursachen, schließt zunächst die Verwendung der homologen Rekombination ein, um eine Rekombinantionssequenz aus einem stellenspezifischen Rekombinationssystem (z. B. Cre/loxP, FLP/FRT) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5: 521-27: Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225: 890-900) stromaufwärts von (d. h. 5' zu) der zellulären endogenen genomischen VGF-Polypeptid-Kodierungsregion zu plazieren. Ein Plasmid, das eine Rekombinationsstelle homolog zu der Stelle enthält, die gerade stromaufwärts von der genomischen VGF-Polypeptidkodierenden Region plaziert wurde, wird in die modifizierte Zelllinie zusammen mit dem geeigneten Rekombinaseenzym eingeführt. Diese Rekombinase verursacht die Integration des Plasmids durch die Plasmid-Rekombinationsstelle in die Rekombinationsstelle, die stromaufwärts der genomischen VGF-Polypeptidkodierungsregion der Zelllinie angeordnet ist (Baubonis and Sauer, 1993, Nucleic Acids Res. 21: 2025-29; O'Gorman et al., 1991, Science 251:1351-55). Jede flankierende Sequenz, von der bekannt ist, dass sie die Transkription erhöht (z. b. Enhancer/Promotor, Intron, translationaler Enhancer), wenn geeignet in dem Plasmid angeordnet, würde in solcher Weise integrieren, um eine neue oder modifizierte transkriptionelle Einheit zu bilden, was zu de novo oder erhöhter Polypeptidherstellung des zellulären endogenen VGF-Gens führt.
Ein weiteres Verfahren, um die Zelllinie zu verwenden, in der die stellenspezifische Rekombinations-Sequenz gerade stromaufwärts von der zellulären endogenen, genomischen VGF-Polypeptid-Kodierungsregion plaziert wird, ist es, die homologe Rekombination zu verwenden, um eine zweite Rekombinationsstelle anderswo in Zellliniengenomen einzuführen. Das geeignete Rekombinaseenzym wird dann in die zwei-Rekombinationsstellen-Zellline eingeführt, wodurch sie ein Rekombinationsereignis (Deletion, Inversion und Translokation) (Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-27; Sauer, 1993, Methods Enzymol., 225:890-900) verursacht, das eine neue oder modifizierte transkriptionelle Einheit erzeugt, die in de novo oder erhöhter VGF-Polypeptid-Herstellung des zellulären endogenen VGF-Gens resultiert.
Ein zusätzlicher Ansatz für die Erhöhung oder Verursachung der Expression von VGF-Polypeptid aus dem zellulären VGF-Gen schließt die Erhöhung oder die Verursachung der Expression von einem Gen oder Genen (zum Beispiel Transkriptionsfaktoren) und/oder Verringerung der Expression von einem Gen oder Genen (zum Beispiel transkriptionellen Repressoren) in einer Weise ein, die zu de novo oder erhöhter VGF-Polypeptid-Herstellung des zellulären endogenen VGF-Gens führt. Dieses Verfahren schließt die Induktion von nicht natürlich vorkommenden Polypeptiden (zum Beispiel einem Polypeptid, das die stellenspezifische DNA-Verbindungsdomäne, fusioniert an eine Transkriptionsfaktordomäne, aufweist) in die Zelle ein, so sich eine daß de novo oder erhöhte VGF-Polypeptid-Herstellung des zellulären endogenen VGF-Gens ergibt.
VGF-Polypeptid-Zelltherapie, zum Beispiel die Implantation von Zellen, die VGF-Polypeptide herstellen, ist ebenfalls vorgesehen. Diese Ausführungsform schließt die Implantation von Zellen ein, die in der Lage sind, eine biologisch aktive Form von VGF-Polypeptiden zu synthetisieren und zu sekretieren. Solche VGF-Polypeptid-herstellenden Zellen können Zellen sein, die natürliche Produzenten von VGF-Polypeptiden sind, oder können rekombinante Zellen sein, deren Fähigkeit, VGF-Polypeptide herzustellen, durch die Transformation mit einem Gen, das für das gewünschte VGF-Polypeptid kodiert, erhöht ist, oder mit einem Gen, das die Expression des VGF-Polypeptids erhöht. Solch eine Modifikation kann mittels eines Vektors, der für die Zuführung des Gens sowie der Unterstützung seiner Expression und Sekretion, erreicht werden. Um eine potentielle immunologische Reaktion in Patienten, denen VGF-Polypeptid verabreicht wurde, zu minimieren, wie sie bei der Verabreichung eines minimieren, wie sie bei der Verabreichung eines Polypeptids einer fremden Spezies hervorgerufen werden kann, ist es bevorzugt, daß die natürlichen Zellen, die VGF-Polypeptid herstellen menschlichem Ursprungs sind und menschliches VGF-Polypeptid herstellen. Dementsprechend ist es bevorzugt, daß die rekombinanten Zellen, die das VGF-Polypeptid herstellen, mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der ein Gen enthält, das für das menschliche VGF-Polypeptid kodiert.
Implantierte Zellen können eingeschlossen sein, um die Infiltration in umgebendes Gewebe zu verhindern. Menschliche und nicht menschliche Tierzellen können in Patienten in biokompatiblen, semipermeablen Polymer-Einkapselungen oder -membranen implantiert werden, die die Abgabe des VGF-Polypeptids erlauben, jedoch die Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder durch andere schädliche Faktoren des umgebenden Gewebes verhindern. Alternativ können die eigenen Zellen des Patienten, transformiert um das VGF-Polypeptids ex vivo herzustellen, direkt in den Patienten ohne solche Einkapselungen implantiert werden.
Techniken für die Einkapselung von lebenden Zellen sind im Stand der Technik bekannt, und die Herstellung von eingekapselten Zellen und deren Implantation in Patienten können routinemäßig ausgeführt werden. Zum Beispiel beschreibt Baetge et al. (PCT Pub. Nr. WO 95/05452 und PCT/US94/09299) Membrankapseln, die genetisch veränderte Zellen für die effektive Ausschüttung von biologisch aktiven Molekülen enthalten. Die Kapseln sind biokompatibel und einfach erhältlich. Die Kapseln schließen Zellen ein, die mit rekombinanten DNA-Molekülen transfiziert sind, die DNA-Sequenzen umfassen, die für biologisch aktive Moleküle kodieren, die operativ mit Promotoren verbunden sind, die keiner Herunterregulierung in vivo nach der Implantation in ein Säugetier unterliegen. Die Vorrichtungen stellen die Ausschüttung von Molekülen von lebenden Zellen zu spezifischen Zellen in dem Empfänger bereit. Zusätzlich siehe U.S. Patent Nrn. 4,892,538; 5,011,472 und 5,106,627. Ein System für die Einkapselung von lebenden Zellen ist in PCT Pub. Nr. WO 91/10425 (Aebischer et al.) beschrieben; siehe ebenfalls PCT Pub. Nr. WO 91/10470 (Aebischer et al.); Winn et al., 1991, Exper. Neurol 113:322-29; Aebischer et al., 1991, Exper. Neurol. 111:269-75; und Tresco et al., 1992, ASAIO 38:17-23.
In vivo und in vitro Gentherapie-Zuführung von VGF-Polypeptiden ist ebenfalls vorhergesehen. Ein Beispiel für eine Gentherapietechnik ist die Verwendung von Nukleinsäure (entweder genomische DNA, cDNA und/oder synthetische DNA), die für ein VGF-Polypeptid kodiert, die operativ verbunden ist mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor, um ein „Gentherapie-DNA-Konstrukt" zu bilden. Der Promotor kann homolog oder heterolog zu dem endogenen VGF-Gen sein, vorausgesetzt, daß er in der Zelle oder dem Gewebetyp aktiv ist, in den das Konstrukt inseriert ist. Andere Komponenten von Gentherapie-DNA-Konstrukten können gegebenenfalls in DNA-Moleküle eingeschlossen werden, die für stellenspezifische Integration hergestellt wurden (zum Beispiel endogene Sequenzen, die nützlich sind für die homologe Rekombination), gewebespezifische Promotoren, Enhancer oder Silencer, DNA-Moleküle die in der Lage sind einen selektiven Vorteil über die Ausgangszelle zur Verfügung zu stellen, DNA-Moleküle, die als Marker zur Identifizierung von transformierten Zellen nützlich sind, negative Selektionssysteme, zellspezifische Bindungsmittel (wie zum Bespiel für Zell-Abzielen), zellspezifische Internalisierungsfaktoren, Transkriptionsfaktoren, die die Expression von einem Vektor fördern und Faktoren, die die Vektorherstellung ermöglichen.
Ein Gentherapie-DNA-Konstrukt kann dann in Zellen (entweder ex vivo oder in vivo) unter der Verwendung von viralen oder nicht viralen Vektoren eingeführt werden. Ein Mittel für die Einführung von Gentherapie-DNA-Konstrukten ist mittels viraler Vektoren, wie hierin beschrieben. Bestimmte Vektoren, wie retrovirale Vektoren, werden das DNA-Konstrukt zu der chromosomalen DNA der Zellen liefern, und das Gen kann in die chromosomale DNA integrieren. Andere Vektoren werden als Episome fungieren, und das Gentherapie-DNA-Konstrukt wird im Zytoplasma bleiben.
In weiteren Ausführungsformen können regulatorische Elemente für die kontrollierte Expression von VGF-Genen in Zielzellen eingeschlossen werden. Solche Elemente werden in Antwort auf einem geeigneten Effektor angeschaltet. Auf diese Weise kann ein therapeutisches Polypeptid, wenn erwünscht, exprimiert werden. Ein konventionelles Kontrollmittel schließt die Verwendung von kleinen Molekül-Dimerisierungsmitteln oder Rapalogen ein, um die chimären Proteine zu dimerisieren, die eine kleine Molekülbindungsdomäne enthalten und eine Domäne, die einen biologischen Prozeß initiieren kann, wie zum Beispiel ein DNA-Bindungsprotein oder Transkriptionsaktivierungsprotein (siehe PCT Pub. Nrn. WO 96/41865, WO 97/31898 und WO 97/31899). Die Dimerisierung von Proteinen kann verwendet werden, um die Transkription des Transgens zu initiieren.
Eine alternative Regulierungstechnologie verwendet ein Verfahren der Lagerung von Proteinen, die von dem Gen des Interesses exprimiert sind, innerhalb der Zelle als ein Aggregat oder Cluster. Das Gen des Interesses wird als ein Fusionsprotein exprimiert, das eine konditionale Aggregationsdomäne einschließt, was zum Zurückhalten des aggregierten Proteins im endoplasmatischen Retikulum führt. Die gelagerten Proteine sind stabil und inaktiv in der Zelle. Die Proteine können jedoch durch die Verabreichung eines Medikaments (z. B. kleiner Molekülligand) freigesetzt werden, das die konditionale Aggregationsdomäne entfernen und dadurch spezifisch die Aggregate oder Cluster voneinander trennen, so daß die Proteine von der Zelle ausgeschüttet werden können. Siehe Aridor et al., 2000, Science 287:816-17 und Rivera et al., 2000, Science 287:826-30.
Noch andere geignete Kontrollmittel oder Genschalter schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, die hierin beschriebene Systeme. Mifepristone (RU486) wird als Progesteronantagonist verwendet. Die Bindung einer modifizierten Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne an einem Progesteronantagonisten aktiviert die Transkription durch die Bildung eines Dimers aus zwei Transkriptionsfaktoren, die dann in den Nukleus passieren, um an die DNA zu binden. Die Liganden-Bindungsdomäne ist modifiziert, um die Fähigkeit des Rezeptors zu eliminieren, an einen natürlichen Liganden zu binden. Das modifizierte Steroidhormon-Rezeptorsystem ist genauer in U.S. Patent Nr. 5,364,791 und PCT Pub. Nrn. WO 96/40911 und WO 97/10337 beschrieben.
Ein anderes Kontrollsystem verwendet Ecdyson (ein Fruchtfliegen-Steroidhormon), welches an einen Ecdyson-Rezeptor (cytoplasmatischer Rezeptor) bindet und ihn aktiviert. Der Rezeptor translokalisiert dann zum Nukleus, um ein spezifisches DNA-Antwortelement zu binden (Promotor des Ecdyson-Antwortgens). Der Ecdyson-Rezeptor schließt eine Transaktivierungs-Domäne, DNA-Bindungsdomäne und Ligandenbindungsdomäne ein, um die Transkription zu initiieren. Das Ecdyson-System ist genauer in U.S. Patent Nr. 5,514,578 und PCT Pub. Nrn. WO 97/38117, WO 96/37609 und WO 93/03162 beschrieben.
Ein weiteres Kontrollmittel verwendet einen positiven Tetracyclin-kontrollierbaren Transaktivator. Dieses System schließt eine mutierte Tet-Repressorprotein-DNA-Bindungsdomäne (eine TET-R-4-Aminosäure ist mutiert, was zu einem reversen Tetracyclin-regulierten Transaktivierungsprotein führt, d. h. es bindet an einem Tet-Operator in Anwesenheit von Tetracyclin) ein, verbunden mit einem Polypeptid, das die Transkription aktiviert. Solche Systeme sind in U.S. Patent Nrn. 5,464,758; 5,650,298 und 5,654,168 beschrieben.
Zusätzliche Expressions-Kontrollsysteme und Nukleinsäurekonstrukte sind in U.S. Patent Nrn. 5,741,679 und 5,834,186 von Innovir Laboratories Inc. beschrieben.
Die In vivo-Gentherapie kann durch die Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das für ein VGF-Polypeptid kodiert, in Zellen erreicht werden, durch lokale Injektion oder durch andere geeignete virale oder nicht virale Zuführungsvektoren. Hefti, 1994, Neurobiology 25:1418-35. Zum Beispiel kann ein Nukleinsäuremolekül, das für ein VGF-Polypeptid kodiert, in einem Adeno-assoziierten Virus (AAV) Vektor für die zuführung an Zielzellen (siehe z. B. Johnson, PCT Pub. Nr. WO 95/34670; PCT App. Nr. PCT/US95/07178) enthalten sein. Das rekombinante AAV-Genom enthält typischerweise AAV-invertierte terminale Repeats, die eine DNA-Sequenz flankieren, die für ein VGF-Polypeptid kodiert, welches operativ mit einem funktionalen Promotor und einer Polyadenylierungssequenz verbunden ist.
Alternative geeignete virale Vektoren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Retrovirus, Adenovirus, Herpes simplex-Virus, Lentivirus, Hepatitisvirus, Parvovirus, Papovavirus, Pockenvirus, Alphavirus, Coronavirus, Rhabdovirus, Paramyxovirus und Papillomavirus. U.S. Patent Nr. 5,672,344 beschreibt ein in vivo viral vermitteltes Gentransfer-System, welches einen rekombinanten neurotrophischen HSV-1-Vektor einschließt. U.S. Patent Nr. 5,399,346 stellt Beispiele für ein Verfahren bereit, um einen Patienten mit einem therapeutischen Protein zu versehen, durch Zufuhr an humane Zellen, die in vitro behandelt wurden, um ein DNA-Segment zu inserieren, das für ein therapeutisches Protein kodiert. Zusätzliche Verfahren und Materialien für die Praxis von Gentherapietechniken sind in U.S. Patent Nrn. 5,631,236 (unter der Beteiligung adenoviraler Vektoren), 5,672,510 (unter der Beteiligung retroviraler Vektoren), 5,635,399 (unter der Beteiligung retroviraler Vektoren, die Cytokine exprimieren) beschrieben.
Nicht virale Zuführungsverfahren schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, Liposomvermittelten Transfer, nackte DNA-Zufuhr (direkte Injektion), Rezeptor-vermittelter Transfer (Ligand-DNA-Komplex), Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation und Mikropartikelbeschuss (z. B. Gene-Gun). Gentherapiematerialien und -verfahren können auch induzierbare Promotoren, gewebespezifische Enhancer-Promotoren, DNA-Sequenzen, die für stellenspezifische Integration aufgebaut sind, DNA-Sequenzen, die einen selektiven Vorteil gegenüber den Vorläuferzellen bereitstellen können, Marker, um transformierte Zellen nachzuweisen, negative Selektionssysteme und Expressions-Kontrollsysteme (Sicherheitsmessung), Zell-spezifische Bindungsmittel (für Zell-Abzielung), Zell-spezifische Internalisierungsfaktoren und Transkriptionsfaktoren, um die Expression durch einen Vektor zu fördern, sowie Verfahren zur Vektor-Herstellung, einschließen. Solche zusätzlichen Verfahren und Materialien für die Praxis von Gentherapietechniken sind in U.S. Patent Nr. 4,970,154 (unter der Beteiligung von Elektroporationstechniken), 5,679,559 (beschreibt ein Lipoprotein-enthaltendes System für Genzufuhr), 5,676,954 (unter der Beteiligung von Liposomträgern), 5,593,875 (beschreibt ein Verfahren für Calciumphosphattransfektion) und 4,945,050 (beschreibt ein Verfahren, wobei biologisch aktive Partikel auf Zellen mit einer Geschwindigkeit geschossen werden, bei der die Partikel die Oberfläche von der Zellen durchdringen und in das Innere der Zellen eingeschleust werden), und PCT Pub. Nr. WO96/40958 (unter der Beteiligung von nuklearen Liganden) beschrieben.
Es wird ebenfalls vorgesehen, daß die VGF-Gentherapie oder Zelltherapie des weiteren die Zuführung von einem oder mehreren zusätzlichen Polypeptiden in dieselbe oder andere Zellen mit einschließen kann. Solche Zellen können getrennt in den Patienten eingeführt werden, oder die Zellen können in einer einzigen implantierbaren Einheit, wie zum beispiel die einkapselnde Membran wie oben beschrieben enthalten sein, oder die Zellen können getrennt modifiziert werden mittels viraler Vektoren.
Ein Mittel, um die endogene VGF-Polypeptidexpression in einer Zelle durch Gentherapie zu erhöhen, ist es, ein oder mehrere Enhancer-Elemente in den VGF-Polypeptidpromotor zu inserieren, wo die Enhancer-Elemente zu erhöhter transkriptioneller Aktivität eines VGF-Gens führen können. Die Enhancer-Elemente, die verwendet werden, werden in Hinsicht auf das Gewebe ausgewählt, in dem man wünscht, die Gene zu aktivieren – Enhancer-Elemente, die für die Promotoraktivierung in diesem Gewebe bekannt sind, werden ausgewählt werden. Zum Beispiel, wenn ein Gen, das für ein VGF-Polypeptid kodiert, in T-Zellen „angeschaltet" werden soll, wird das lck-Promotor Enhancer-Element verwendet. Dadurch wird der funktionelle Teil des transkriptionellen Elements, der hinzugefügt werden soll, in ein Fragment an DNA inseriert, das den VGF-Polypeptidpromotor enthält (und gegebenenfalls in einen Vektor und/oder 5' und/oder 3'-flankierende Sequenzen inseriert), unter Verwendung von Standardklonierungstechniken. Dieses Konstrukt, das als ein „homologes Rekombinationskonstrukt" bekannt ist, kann dann in die gewünschten Zellen entweder ex vivo oder in vivo eingeführt werden.
Gentherapie kann ebenfalls verwendet werden, um die VGF-Polypeptidexpression durch Modifizierung der Nukleotidsequenz des endogenen Promotors zu vermindern. Solch eine Modifikation wird typischerweise durch homologe Rekombinationsverfahren erreicht. Zum Beispiel kann ein DNA-Molekül, das alles oder einen Teil des Promotors des VGF-Gens enthält, das für die Inaktivierung ausgewählt ist, verwendet werden, um Stücke des Promotors, der die Transkription reguliert, zu entfernen und/oder zu ersetzen. Zum Beispiel kann die TATA-Box und/oder die Bindungsstelle eines transkriptionellen Aktivators des Promotors deletiert werden, durch die Verwendung von Standard-molekularbiologischen Techniken; solch eine Deletion kann durch die Unterdrückung der Transkription des korrespondierenden VGF-Gens Promotoraktivität verhindern. Die Deletion der TATA-Box oder der Transkriptionsaktivator-Bindungsstelle in dem Promotor kann durch die Erzeugung eines DNA-Konstrukts durchgeführt werden, das alles oder den relevanten Teil eines VGF-Polypeptidpromotors enthält (von derselben oder einer verwandten Spezies des VGF-Gens, das reguliert werden soll), indem eine oder mehrere der TATA-Boxen und/oder transkriptionellen Aktivator-Bindungsstellen-Nukleotide durch Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden mutiert werden. Als ein Ergebnis weist die TATA-Box und/oder Aktivator-Bindungsstelle eine verminderte Aktivität auf, oder wurde komplett inaktiviert. Dieses Konstrukt, das auch typischerweise mindestens ca. 500 Basen DNA enthält, die der ursprünglichen (endogenen) 5' und 3' DNA-Sequenz entsprechen, die an das Promotorsegment angrenzen, das modifiziert wurde, kann in die passenden Zellen eingeführt werden (entweder ex vivo oder in vivo), entweder direkt oder durch einen viralen Vektor, wie hierin beschrieben. Typischerweise wird die Integration des Konstrukts in die genomische DNA der Zellen durch eine homologe Rekombination erfolgen, wobei die 5' und 3' DNA-Sequenzen in dem Promotorkonstrukt dazu dienen können, zu helfen, die modifizierte Promotorregion über Hybridisierung an die endogene chromosomale DNA zu integrieren.
Verwendungen von VGF-Polypeptiden
VGF-Polypeptide können (gleichzeitig oder der Reihe nach) in Kombination mit einem oder mehreren Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Entzündungshemmern, und/oder chemotherapeutischen Mitteln verwendet werden, wie es für den zu behandelnden Zustand geeignet ist.
Andere Verfahren können ebenfalls verwendet werden, wenn es erwünscht ist, die Aktivität von einem oder mehreren VGF-Polypeptiden zu inhibieren. Solche Inhibierung kann durch Nukleinsäuremoleküle hervorgerufen werden, die zu Expressionkontrollsequenzen komplementär sind und daran (Triple Helix Formation) oder an VGF-mRNA hybridisieren. Zum Beispiel können Antisense-DNA oder RNA-Moleküle, die eine Sequenz haben, die komplementär zu zumindest einem Teil des VGF-Gens ist, in die Zelle eingeführt werden. Antisense-Sonden können durch verfügbare Techniken hergestellt werden, bei denen die Sequenz des VGF-Gens wie hier beschrieben, verwendet wird. Typischerweise wird jedes dieser Antisense-Moleküle komplementär zu der Startstelle (5' Ende) von jedem selektierten VGF-Gen sein. Wenn das Antisense-Molekül dann an die korrespondierende VGF-mRNA hybridisiert, wird die Translation von dieser mRNA verhindert oder reduziert. Antisense-Inhibitoren stellen Informationen bereit, die sich auf die Verminderung oder das Fehlen von VGF-Polypeptiden in einer Zelle oder einem Organismus bezieht.
Alternativ kann Gentherapie verwendet werden, um einen dominant-negativen Inhibitor von einem oder mehreren VGF-Polypeptiden zu erzeugen. In dieser Situation kann die DNA, die für ein Mutanten-Polypeptid von jedem ausgewählten VGF-Polypeptid kodiert, hergestellt werden und in die Zellen von einem Patienten eingeführt werden, unter Verwendung entweder viraler oder nicht viraler Verfahren, wie hier beschrieben. Jede dieser Mutanten wird typischerweise so aufgebaut, um mit endogenen Polypeptiden in seiner biologischen Rolle zu konkurrieren.
Zusätzlich kann ein VGF-Polypeptid, ob es biologisch aktiv ist oder nicht, als ein Immunogen verwendet werden, was bedeutet, daß das Polypeptid mindestens ein Epitop enthält, an das Antikörper gebunden werden. Selektive Bindungsmittel, die an ein VGF-Polypeptid (wie hierin beschrieben) binden, können in vivo oder in vitro für diagnostische Verfahren verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die Verwendung in markierter Form, um die Anwesenheit von VGF-Polypeptiden in einer Körperflüssigkeit oder einem Zellbeispiel nachzuweisen. Die Antikörper können ebenfalls verwendet werden, um eine Anzahl von Erkrankungen und Störungen, eingeschlossen diejenigen, die hierin benannt wurden, zu verhindern, zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die Antikörper können an ein VGF-Polypeptid binden, so daß sie mindestens eine Aktivitätscharakteristik eines VGF-Polypeptids vermindern oder blockieren, oder sie können an ein Polypeptid binden, um mindestens eine Aktivitätscharakteristik von einem VGF-Polypeptid zu erhöhen (einschließlivh durch Erhöhen der Pharmakokinetik des VGF-Polypeptids).
Die VGF-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können unter der Verwendung einer Expressionsklonierungsstrategie verwendet werden, um VGF-Polypeptidrezeptoren zu klonieren. Radiomarkierte (125-Jod)-VGF-Polypeptide oder Affinitäts/Aktivitäts-markierte VGF-Polypeptide (wie zum Beispiel ein Fc-Fusions- oder eine alkalische Phosphatasefusion) können in Bindungstests verwendet werden, um einen Zelltyp oder eine Zelllinie oder Gewebe, das VGF-Polypeptidrezeptoren exprimiert, zu identifizieren. RNA, die aus solchen Zellen oder Geweben isoliert wird, kann in cDNA konvertiert werden, in einen Säugetierexpressionsvektor kloniert werden und in Säugetierzellen transfiziert werden (wie zum Beispiel COS oder 293-Zellen), um eine Expressionsbibliothek zu erzeugen. Ein radiomarkiertes oder markiertes VGF-Polypeptid kann dann als ein Affinitätsligand verwendet werden, um aus dieser Bibliothek die Zahl der Zellen zu identifizieren und zu isolieren, die den VGF-Polypeptid-Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren. DNA kann dann aus diesen Zellen isoliert werden und in Säugetierzellen transfiziert werden, um eine Sekundärexpressionsbibliothek herzustellen, in der die Fraktion von Zellen, die den VGF-Polypeptidrezeptor exprimiert, um ein Vielfaches höher ist, als in der ursprünglichen Bibliothek. Dieser Anreicherungsprozess kann immer wieder wiederholt werden, bis ein einzelner rekombinanter Klon, der einen VGF-Polypeptidrezeptor enthält, isoliert ist. Die Isolierung eines VGF-Polypeptidrezeptors ist nützlich zur Identifizierung und Entwicklung von neuen Agonisten und Antagonisten von VGF-Polypeptid-Signalwegen. Solche Agonisten und Antagonisten schließen lösliche VGF-Polypeptidrezeptoren, Anti-VGF-Polypeptidrezeptor-Antikörper, kleine Moleküle oder Antisense-Oligonukleotide ein, und diese können zur Behandlung, zur Vorbeugung oder Diagnose von einer oder mehreren Erkrankungen oder Störungen, die hierin beschrieben wurden, verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sind nur zur verdeutlichung gedacht und sollten nicht so ausgelegt werden, daß sie in irgendeiner Weise den Umfang der Erfindung begrenzen.
Beispiel 1: Herstellung von Anti-VGF-Polypeptid-Antikörpern
Antikörper gegen VGF-Polypeptide wurden durch die Injektion von VGF-Polypeptiden in Kaninchen hergestellt, die durch die Amgen Boulder Peptide Technology Group unter Verwendung von Standardpeptidsynthese-Protokollen synthetisiert wurden. Nach der Peptidsynthese wurden VGF-Polypeptide von verschiedenen Chargen zusammengefasst und gefriergetrocknet. Der Peptidgehalt für jedes VGF-Polypeptid wurde dann durch Hydrolyse mit HCl gemessen.
Um polyklonale Anti-VGF-Polypeptid-Antikörper aus VGF-Polypeptiden herzustellen (VGF-1; SEQ ID Nr.: 1 oder VGF-2, SEQ ID Nr.: 4; Tabelle I), denen die Cysteinreste fehlten, wurden 5 mg an VGF-Polypeptid und 0,5 ml Imject^® EDC Conjugation Buffer (Pierce, Rockford, IL) in ein 2 ml-Gefäß transferiert, und die Mischung wurde gevortext. Ein 20 mg-Fläschchen von Imject^® Keyhole Limpet Hämocyanin (Pierce) wurde in 2 ml sterilisiertem Wasser gelöst, und 0,5 ml von dieser Lösung wurden zu einer VGF-Polypeptid-Lösung hinzugefügt. Danach wurden Keyhole Limpet Hämocyanin, 0,1 ml EDC (10 mg von EDC (Pierce) in 1 ml sterilisiertem Wassers) zu dem VGF-Polypeptid hinzugegeben, und diese Lösung wurde bei Raumtemperatur für mindestens zwei Stunden inkubiert.
Nach dieser Inkubation wurde konjugiertes VGF-Polypeptid in ein Spectra/Por 6-Dialysis Röhrchen (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) transferiert, das ein Molekulargewichtsausschluß von 1000 hat und in 2 l PBS über Nacht bei 4°C dialysiert, um EDTA aus der Probe zu entfernen, das ein bekanntes Antikoagulans ist. Die dialysierte konjugierte VGF-Polypeptid-Lösung wurde dann in ein 15 ml kegelförmigen Gefäß transferiert und PBS wurde hinzugefügt, um das Volumen der Lösung auf 4 ml zu bringen. Aliquots von jeweils 1 ml wurden dann in 2 ml Schraubverschlussgefäße transferiert, jeder Aliquot wurde dann in eine 2 ml Glasspritze aufgezogen und dann wurden 1 ml Titermax^® Research Adjuvant (CytRx, Norcorss, Georgia) aufgezogen.
Die Spritze wurde dann mit einer 18-Gauge-Mischnadel bestückt, und diese Lösung wurde zu einer Emulsion gemischt. Die Mischung wurde dann in zwei 1 ml-Spritzen für die intramuskuläre Injektion in Kaninchen transferiert. Die Kaninchen wurden dann mit 0,1 ml VGF-Polypeptid-Adjuvanslösung an zwei Injektionsstellen injiziert und wurden dann vier Wochen und sechs Wochen später geboostet. Den Kaninchen wurde im Anschluß an den zweiten Boost Blut abgenommen (wobei ungefähr 5 ml entfernt wurden), und dann erfolgte wiederum Test-Blutabnahme nach zwei Wochen. Wenn die Herstellungs-Blutabnahmen als akzeptabel erachtet wurden, wurden die Kaninchen wieder geboostet und dann einmal die Woche für 6 Wochen Blut abgenommen (wobei ungefähr ungefähr 40 ml entfernt wurden), zwei Wochen nach diesem Boost. 1 und 2 verdeutlichen die Antikörpertiterspiegel von Kaninchen, die mit entweder VGF-1 oder VGF-2 injiziert wurden.
Um polyklonale Anti-VGF-Polypeptid-Antikörper aus VGF-Polypeptiden herzustellen, die Cysteinreste enthalten, wurden 5 mg VGF-Polypeptid und 0,5 ml Imject^® Maleimide Conjugation Puffer (Pierce) in ein 2 ml-Fläschchen transferiert und die Mischung wurde gevortext. Ein 20 mg-Fläschchen Imject^® Keyhole Limpet Hämocyanin (Pierce) wurde in 2 ml sterilisiertem Wasser gelöst, und 0,5 ml dieser Lösung wurden zu einer VGF-Polypeptidlösung hinzugefügt. Im Anschluß and die Zugabe des Keyhole Limpet Hämocyanins wurde die VGF-Polypeptidlösung bei Raumtemperatur für mindestens 2 Stunden inkubiert.
Nach dieser Inkubation wurde das konjugierte VGF-Polypeptid in ein Specta/Por 6 Dialysis Röhrchen transferiert und in 2 l PBS über Nacht bei 4°C dialysiert, um EDTA aus der Probe zu entfernen. Die dialysierte, konjugierte VGF-Polypeptidlösung wurde dann in einem 15 ml kegelförmige Gefäße transferiert und PBS wurde hinzugefügt, um das Volumen der Lösung auf 4 ml zu bringen. Aliquots von je 1 ml wurden in 2 ml Schraubverschlussgefäße transferiert, jedes Aliquot wurde in eine 2 ml Glasspritze aufgezogen und dann wurden 1 ml von Titermax^® Research Adjuvant (CytRx) aufgezogen.
Die Spritze wurde dann mit einer 18-Gauge-Mischnadel bestückt, und die Lösung wurde zu einer Emulsion gemischt. Das Gemisch wurde dann in zwei 1 ml Spritzen zur intramuskularen Injektion in Kaninchen transferiert. Die Kaninchen wurden mit 0,1 ml von VGF-Polypeptid-Adjuvanslösung an zwei Injektionsstellen injiziert und wurden dann nach vier Wochen und sechs Wochen geboostet. Den Kaninchen wurde im Anschluß an den zweiten Boost Blut abgenommen (wobei ungefähr 5 ml entfernt wurden) und dann nach zwei Wochen wieder Test-Blut abgenommen. Wenn die Herstellungs-Blutabnahmen als akzeptabel erachtet wurden, wurden die Kaninchen wieder geboostet und dann einmal die Woche für 6 Wochen Blut abgenommen (wobei ungefähr ungefähr 40 ml entfernt wurden), zwei Wochen nach diesem Boost.
Beispiel 2: Biologische Aktivität von VGF-Polypeptid in Knockout-Mäusen
Die biologische Aktivität von VGF-Polypeptiden in Knockout-Mäusen wurde durch die Verwendung von VGF-Polypeptiden analysiert, die durch die Amgen Boulder Peptide Technology Group unter die Verwendung von Standardpeptidsynthese-Protokollen synthetisiert wurden. Nach der Peptidsynthese wurden die VGF-Polypeptide aus verschiedenen Chargen zusammengefasst und gefriergetrocknet. Der Peptidgehalt von jedem VGF-Polypeptid wurde durch Hydrolyse mit HCl ermittelt.
VGF-Gen Knockout-Mäuse wurden von Steve Salton von Mt. Sinai School of Medicine, New York, NY erhalten. Vor der Verabreichung von VGF-Polypeptid wurden die Knockout-Mäuse unter LD 12:12-Bedingungen (d.h. 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit) gehalten. 24 Stunden vor der VGF-Polypeptidinjektion wurden die Knockout-Mäuse in Einzelkäfige transferiert und in einen temporären Stall umgesiedelt, wo die Mäuse für die verbleibende Zeit des Experiments unter LD 12:12-Bedingungen gehalten wurden.
VGF-Polypeptid wurde den Knockout-Mäusen zweimal täglich verabreicht (um 9:00 Uhr und um 18:00 Uhr) durch intraperitoneale Injektion von 2 mg von VGF-1a (SEQ ID Nr.: 2; Tabelle I). Vor der Injektion wurde VGF-1a-Polypeptid in einem CSF-Lösungspuffer (126,6 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 2,0 mM MgCl₂ und 1,4 mM CaCl₂, 10 mM NaPO₄, pH 7,4) auf 16 % verdünnt. Knockout-Mäusen wurde VGF-1a-Polypeptid für 5 Tage verabreicht, und das Körpergewicht von jeder Maus wurde täglich gemessen. Das Körpergewicht von den behandelnden Mäusen wurde täglich für drei Tage nach dem Entzug von VGF-1a-Polypeptid gemessen.
1 verdeutlicht das Körpergewicht von VGF-Knockout-Mäusen nach der Verabreichung von VGF-1a. Drei von vier behandelten Mäusen nahmen um 10–15 % Körpergewicht zu. Aus diesem Experiment war es nicht möglich zu erkennen, ob der Anstieg des Gewichts ein Ergebnis von erhöhter Aufnahme von Nahrung oder Wasser war.
Beispiel 3: VGF-Polypeptid-FC-Fusionsproteine
VGF-Polypeptide werden als Fusionsproteine mit einer humanen Immunglobulin-IgG schwere Ketten Fc-Region an ihrem Carboxyl- oder Aminoterminus exprimiert. Durch die Verwendung von geeigneten PCR-Primern und Standard-PCR-Amplifikationsverfahren werden VGF-Polypeptid-Fc-Fusionenkonstrukte durch die Verbindung einer DNA-Sequenz hergestellt, die für die Fc-Region von menschlichem IgG1 kodiert, mit der, die für VGF-1 (SEQ ID Nr. 1), VGF-1b (SEQ ID Nr. 3) oder VGF-2 (SEQ ID Nr. 4) Polypeptid kodiert.
VGF-Polypeptid-Fc-Fusionsprodukte, erzeugt durch PCR, werden mit Restriktionsendonuklease Nde I und Bam H1 verdaut, in den Vektor pAMG21 ligiert und dann in kompetente E. coli-Stamm 2596 Zellen durch die Verwendung von Standardtechniken transformiert. Klone werden auf ihre Fähigkeit hin gescreent, das rekombinante Proteinprodukt herzustellen, und die Genfusion zu besitzen, die die korrekte Nukleotidsequenz aufweist.
Bakterielle Kulturen, die die Fc-Fusionskonstrukte in dem E. coli-Stamm GM221 enthalten, werden bei 37°C in Luria Broth-Medium kultiviert, das 50 mg/ml Kanamycin enthält. Induktion von Genproduktexpressionen von dem luxPR-Promotor wird nach der Zugabe von synthetischem Autoinducer N-(3-Oxohexanoyl)-DL-homoserinelakton zu dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 20 ng/ml erhalten. Die Kulturen werden bei 37°C für zusätzliche drei Stunden inkubiert. Nach dieser Inkubation werden die bakteriellen Kulturen unter dem Mikroskop auf die Anwesenheit von Einschlusskörperchen geprüft und dann durch Zentrifugation geerntet. Die Zellpellets werden dann direkt durch Resuspension in Laemmli Ptobenpuffer lysiert, der 10% β-Mercaptoethanol enthält, und werden dann durch SDS-PAGE analysiert.
VGF-Polypeptid-Fc-Fusionsproteine werden durch zuerst Aufbrechen der Zellen in Wasser durch die Verwendung von Hochdruckhomogenisierung (d. h. 2 Passagen bei 14000 PSI) aufgereinigt. Einschlusskörperchen werden durch Zentrifugation bei 4200 U/min in J-6B für eine Stunde geerntet, und die Einschlusskörperchen werden dann in 6M Guanidin, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 für eine Stunde bei 1/10-Verhältnis gelöst. Die gelöste Mischung wird dann 20 mal in 2 M Harnstoff, 50 mM Tris, 160 mM Arginin, 3 mM Cystein, pH 8,5 verdünnt. Die Mischung wird über Nacht in der Kälte gerührt, auf die 10-fache Menge durch Ultrafiltration konzentriert und dann 3-fach mit 10 mM Tris, 1,5 mM Harnstoff, pH 9 verdünnt. Der pH des Gemisches wird dann mit Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Das Präzipitat wird dann durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wird dann auf eine SP-Sepharose-Fast-Flow-Säule, äquilibriert in 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinladung; Raumtemperatur); geladen. Das Protein wird dann von der Säule durch die Verwendung von einem 20-Säulen-Volumen-Gradienten in demselben Puffer eluiert, der von 100 mM NaCl bis 500 mM NaCl reicht. Die Lösung aus der Säule wird dann dreimal verdünnt und auf eine SP-Sepharose HP-Säule in 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinladung; Raumtemperatur) geladen. Das Protein wird dann durch die Verwendung eines 20-Säulen-Volumen-Gradienten in demselben Puffer eluiert, der von 150 mM NaCl bis 400 mM NaCl reicht. Der Peak wird zusammengefaßt und filtriert.
VGF-Polypeptid-Fc-Fusionsproteinaktivität wird unter Verwendung von hier beschriebenen Verfahren gemessen oder durch solche, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispiel 4: Expression von Maus-VGF-Polypeptid in transgenen Mäusen
Um die biologische Aktivität eines VGF-Polypeptid zu messen, wurde ein Konstrukt, das für ein Maus-VGF-Polypeptid unter der Kontrolle von einem Synapsin-Promotor kodiert, durch die Verwendung von Standardprotokollen hergestellt. Von der Zuführung dieses Konstrukts wird erwartet, daß sie pathologische Veränderungen verursacht, die für die Funktion des VGF-Polypeptids informativ sind. Ähnlich dazu wurde ein Konstrukt, das die volle Länge des VGF-Polypeptids unter der Kontrolle des Beta-Aktin-Promotors enthält, durch die Verwendung von Standardprotokollen hergestellt. Von der Zuführung dieses Konstrukts wurde erwartet, daß es eine ubiquitäre Expression ergibt.
Um diese Konstrukte zu generieren, wurde PCR verwendet, um die Template-DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die für das Maus-VGF-Polypeptid kodieren, durch die Verwendung von Primern, die den 5'- und 3'-Enden der gewünschten Sequenz entsprechen und die die Restriktionsenzymstellen enthalten, um die Insertion von amplifiziertem Produkt in einen Expressionsvektor zu erlauben. Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte auf dem Gel getrennt, mit dem passenden Restriktionsenzym verdaut und durch die Verwendung von Standard Rekombinations-DNA-Techniken in den Expressionsvektor eingefügt. Siehe Graham et al., 1997, Nature Genetics, 17:272-74 und Ray et al., 1991, Genes Dev. 5: 2265-73.
Nach der Ligation wurden die Reaktionsgemische verwendet, um einen E. coli-Wirtsstamm durch Elektroporation zu transformieren und die Transformanten wurden dann auf Wirkstoffresistenz selektiert. Piasmid-DNA von ausgewählten Kolonien wurde isoliert und für die DNA-Sequenzierung verwendet, um die Anwesenheit von den passenden Inserts und die Abwesenheit von Mutation zu bestätigen. VGF-Polypeptid-Expressionsvektoren wurden durch zwei Runden von CsCl-Dichtegadienten-Zenrifugation aufgereinigt, mit einem passenden Restriktionsenzym gespalten und die linearen Fragmente, die das Maus-VGF-Polypeptid-Transgen enthalten, wurden dann durch Gelelektrophorese aufgereinigt. Das aufgereinigte Fragment wurde dann in 5 mM Tris, pH 7,4 und 0,2 mM EDTA bei einer Konzentration von 2 μg/ml resuspendiert.
Einzelzellembryonen von BDF1 × BDF1 Zuchtmäusen wurden wie beschrieben injiziert (PCT Pub. Nr. WO 97/23614). Die Embryonen wurden dann über Nacht in einem CO₂-Inkubator gehalten und 15 bis 20 Zwei-Zell-Embryos wurden dann in die Eileiter einer pseudoschwangeren CD1 weiblichen Maus transferiert. Nachkommen, die von der Implantation von mikro-injizierten Embryonen erhalten wurden, wurden durch PCR-Amplifikation des integrierten Transgens in genomische DNA-Beispiele wie folgt gescreent. Ohrstücke wurden in 20 μl Ohrpuffer (20 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,5% SDS und 500 mg/ml Proteinase K) bei 55°C über Nacht verdaut. Die Proben wurden dann in 200 μl TE verdünnt, und 2 μl von der Ohrprobe wurde in einer PCR-Reaktion verwendet, bei der passende Primer verwendet wurden.
Transgene Stammtiere wurde identifiziert und verwendet, um F1-Mäuse zu generieren. Um dies zu tun, wurden Teile der Milz, der Leber und Gesamthirn von F1-Mäusen entfernt und die gesamte zelluläre RNA aus der Milz durch die Verwendung von Total RNA Extraction Kits (Qiagen) isoliert, und die transgene Expression wurde durch RT-PCR gemessen. RNA, die aus der Milz gewonnen wurde, wurde durch die Verwendung von SuperScript^TM Preamplification System (Gibco-BRL) wie folgt in cDNA konvertiert. Ein geeigneter Primer, der sich in der Expressionsvektorsequenz und 3' zu dem VGF-Polypeptid-Transgen befindet, wird für die cDNA-Synthese von dem transgenen Transkript verwendet. 10 mg der Gesamt-RNA, die aus der Leber, Gehirn und dem Milzgewebe von transgenen Stammtieren gewonnen wurde und Kontrollen wurden mit 1mM des Primers für 10 Minuten bei 70°C inkubiert und auf Eis plaziert. Die Reaktion wurde dann mit 10 mM Tris-HCl, ph 8,3, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 10 mM auf jedes dNTP, 0,1 mM DTT und 200 U SuperScript II reverser Transkriptase versetzt. Danach wurde für 50 Minuten bei 42°C inkubiert; die Reaktion wird durch Erhitzung für 15 Minuten auf 72°C gestoppt und mit 2 U von RNase H 20 Minuten bei 37°C verdaut. Proben werden dann durch PCR amplifiziert unter der Verwendung von Primern verwendet werden, die spezifisch für Maus-VGF-Polypeptid sind.
Die Littermates von transgenen positiven F1-Mäusen wurden gekreuzt, um F2 homozygote Mäuse zu erzeugen. Der Expressionsspiegel von VGF mRNA in F2-Mäusen wurde wie hier beschrieben gemessen.
Beispiel 5: Biologische Aktivität von Maus-VGF-Polypeptid in F2 transgenen Mäusen.
Vor der Euthanasie werden die F2 transgenen Tiere, die in Beispiel 4 erhalten wurden, gewogen, mit Isofluoran betäubt und Blut entnommen durch Herzpunktur. Die Proben wurden der Hämatologie- und Serumchemieanalyse unterzogen. Radiographie wurde nach terminaler Blutleere durchgeführt. Nach grober Präparation, werden die Haupt-viszeralen Organe einer Gewichtanalyse unterzogen.
Nach der groben Präparation wurden Gewebe (d. h. Leber, Milz, Pankreas, Magen, der gesamte gastrointestinale Trakt, Niere, reproduktive Organe, Haut und Brustdrüsen, Knochen, Gehirn, Herz, Lunge, Thymus, Luftröhre, Ösophagus, Schilddrüse, Nebennieren, Harnblase, Lymphknoten und Skelettmuskel) entfernt und in 10% gepuffertes Zn-Formalin für histologische Untersuchungen fixiert. Nach der Fixierung wurde das Gewebe in Paraffinblöcken konserviert, und 3 mm Schnitte angefertigt. Alle Schnitte werden mit Hämatoxylin und Exosin gefärbt und wurden dann histologisch untersucht.
Die Milz, Lymphknoten und Peyer-Plaques von sowohl den transgenen und den Kontrollmäusen wurden dann mit B-Zell und T-Zell-spezifischen Antikörpern wie folgt immunohistologisch analysiert. Die Formalinfixierten Paraffineingebetteten Schnitte wurden deparaffiniert und in deionisiertem Wasser hydriert. Die Schnitte wurden mit 3%igem Wasserstoffperoxid gelöscht, mit Proteinblock geblockt (Lipshaw, Pittsburgh, PA), und in Ratten-monoklonalen Antimaus B220 und CD3 inkubiert (Harlan, Indianapolis, IN). Antikörperbindung wird durch biotinyliertes Kaninchen-anti-Ratten-Immunglobulin und Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (BioGenex, San Ramon, CA) mit DAB als ein Chromagen (BioTek, Santa Barbara, CA) nachgewiesen. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt.
Nach der Leichenschau wurden MLN und die Schnitte der Milz und des Thymus von den transgenen Tieren und Kontroll-Littermates entfernt. Einzelzellsuspensionen wurden durch leichtes Reiben des Gewebes mit dem flachen Ende einer Spritze gegen dem Boden eines 100 mm Nylonzellabscheider (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) hergestellt. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, gezählt und ungefähr 1 × 10⁶ Zellen von jedem Gewebe wurden dann für 10 Minuten mit 0,5 μg CD16/32 (FcγIII/II) Fc-Block in einen 20 μl Volumen inkubiert. Die Proben wurden dann für 30 Minuten bei 2 bis 8°C in einem 100 μl Volumen von PBS (wobei Ca⁺ und Mg⁺ fehlen), 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,01 Natriumazid mit 0,5 μg Antikörper von FITC- oder PE-konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen CD90.2 (Thy-1.2), CD45R (B220), CD11b (MAC-1), Gr-1, DC4 oder CD8 (PharMingen, San Diego, CA) gefärbt. Nach der Antikörperbindung wurden die Zellen gewaschen und dann durch Durchflußzytometrie auf einem FACScan (Becton Dickinson) analysiert.
Während die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, soll es verstanden werden, dass dem Fachmann Variationen und Modifikationen ersichtlich sind. Demnach ist es vorgesehen, dass die beigefügten Ansprüche alle solchen äquivalenten Variationen mit eindecken, die in dem Umfang der Erfindung wie beansprucht mit eingeschlossen sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz wie angegeben in SEQ ID Nr. 2 aufweist.
Isoliertes Polypeptid, umfassend ein Fragment der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben, wobei das Fragment eine Aktivität des Polypeptid wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben aufweist.
Isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben, mit mindestens einer konservativen Aminosäuresubstitution und wobei das Polypeptid eine Aktivität des wie in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Polypeptids aufweist, (b) Die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben, mit mindestens einer Aminosäureinsertion und wobei das Polypeptid eine Aktivität des wie in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Polypeptids aufweist, (c) Die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben, mit mindestens einer Aminosäuredeletion und wobei das Polypeptid eine Aktivität des wie in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Polypeptids aufweist, (d) Die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben, die eine C- und/oder N-terminale Verkürzung aufweist und wobei das Polypeptid eine Aktivität des wie in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Polypeptids aufweist, und (e) Die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID Nr. 2 angegeben, mit mindestens einer Modifikation ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuresubstitutionen, Aminosäureinsertionen, Aminosäuredeletionen, Carboxyl-terminaler Verkürzung und Amono-terminaler Verkürzung, und wobei das Polypeptid eine Aktivität des wie in SEQ ID Nr. 2 angegebenen Polypeptids aufweist.
Fusionspolypeptid, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, fusioniert an eine heterologe Aminosäuresequenz.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 4, wobei die heterologe Aminosäuresequenz eine IgG-konstante Domäne oder ein Fragment davon ist.
Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 und ein pharmazeutisch akzeptables Formulierungsmittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das pharmazeutisch akzeptable Formulierungsmittel ein Träger, Adjuvans, Löslichmacher, Stabilisator oder anti-oxidierendes Mittel ist.
Polypeptid, umfassend ein Derivat des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3.
Polypeptid nach Anspruch 8, das kovalent mit einem Wasser-löslichen Polymer modifiziert ist.
Polypeptid nach Anspruch 9, wobei das Wasser-lösliche Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol, Monomethoxy-Polyethylenglykol, Dextran, Zellulose, Poly-(N-Vinylpyrrolidon) Polyethylenglykol, Propylenglykol-Homopolymeren, Polypropylenoxid/Ethylenoxid Co-Polymeren, Polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol.
Polypeptid nach Anspruch 9, wobei das Wasser-lösliche Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol und Dextran.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Vorbeugung oder Linderung einer VGF-Polypeptid-zusammenhängenden Erkrankung, Abweichung oder eines Zustands.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die VGF-Polypeptid-zusammenhängende Erkrankung, Abweichung oder der Zustand Fettsucht ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die VGF-Polypeptid-zusammenhängende Erkrankung, Abweichung der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sterilität, Kachexie, Eßstörungen, AIDS-zusammenhängendem Komplex, hypermetabolischen Zuständen, Hyperaktivität, Hypoaktivität und Hyperinsulinproduktion.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Eßstörung Bulimie und Anorexia nervosa ist.
In-vitro Verfahren zur Diagnose eines VGF-Polypeptid-zusammenhängenden Zustands oder eine Empfindlichkeit gegenüber einem VGF-Polypeptid-zusammenhängenden Zustand in einem Subjekt, umfassend: (a) Bestimmen der Anwesenheit oder der Menge der Expression des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, 4 und (b) Diagnostizieren eines VGF-Polypeptid-zusammenhängenden Zustands oder einer Empfindlichkeit gegenüber einem VGF-Polypeptid-zusammenhängenden Zustand, basierend auf der Anwesenheit oder der Menge an Expression des Polypeptids.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die an ein Polypeptid bindet, umfassend: (a) In Kontakt-bringen des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 mit einer Verbindung; und (b) Bestimmen des Ausmaßes der Bindung des Polypeptids an die Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 17, weiterhin umfassend Bestimmen der Aktivität des Polypeptids, wenn an die Verbindung gebunden.
Vorrichtung, umfassend: (a) Eine zur Implantation geeignete Membran; und (b) Zellen, die innerhalb der Membran eingeschlossen sind, wobei die Zellen ein Protein nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, 4 sekretieren, und wobei die Membran gegenüber diesem Protein durchlässig ist und undurchlässig ist gegenüber Materialien, die für die Zellen schädlich sind.