WO2007013586A1 - 新規ペプチド - Google Patents

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WO2007013586A1
WO2007013586A1 PCT/JP2006/314969 JP2006314969W WO2007013586A1 WO 2007013586 A1 WO2007013586 A1 WO 2007013586A1 JP 2006314969 W JP2006314969 W JP 2006314969W WO 2007013586 A1 WO2007013586 A1 WO 2007013586A1
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WO
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peptide
amino acid
seq
acid sequence
substituted
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PCT/JP2006/314969
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English (en)
French (fr)
Inventor
Motoo Yamasaki
Noriyuki Takahashi
Naoto Minamino
Kazuki Sasaki
Toshifumi Takao
Yoshinori Satomi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Japan As Represented By The President Of National Cardiovascular Center
Osaka University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Priority to EP06781879A priority patent/EP1939286A4/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide, a DNA encoding the peptide, an antibody that specifically binds to the peptide, a method for producing the peptide, a medicament containing the peptide, and a screening method using the peptide.
  • the VGF gene was identified as a gene that increases upon nerve growth factor stimulation of rat PC12 cells (see Non-Patent Document 1), and then the human VGF gene was isolated (see Non-Patent Document 2).
  • the VGF gene-disrupted mice food intake was unchanged, weight loss, body fat loss, increased oxygen consumption, increased exercise capacity, and abnormal reproductive function. In particular, increased energy metabolism is observed (see Non-Patent Document 3).
  • VGF gene is expressed in the central, peripheral nervous system, endocrine, and neuroendocrine cells, and its expression and distribution regulate feeding behavior and gastrointestinal motility-Europeptide ⁇ , Peptide ⁇ , Ghrelin (ghrelin) ), Similar to the expression pattern of cholecystocun, etc., and present in parts related to energy metabolism (see Non-Patent Document 4).
  • VGF The protein encoded by the VGF gene (hereinafter referred to as VGF) is 615 amino acids in humans and 617 amino acids in rats / mouses.
  • the amino acids 1 to 22 of VGF are signal peptides, and there are sequences that undergo processing such as cleavage and amidation by prohormone complexase.
  • VGF processing has been investigated mainly in rats, and rat VGF (598-617) (numbers in parentheses indicate the position of the peptide sequence in the amino acid sequence of VGF.) The same applies to the following peptides), rat VGF (599-617), rat VGF (601-617), rat VGF (602-617), rat VGF (587-617), rat VGF (588- 617), rat VGF (567—617), rat VGF (556—617), rat ⁇ 0 (489—617), rat ⁇ 0 18 (181 ⁇ : sequence not confirmed) The existence is confirmed (see Non-Patent Document 5).
  • Rat VGF (577—617), rat VGF (588—617), rat VGF, which are partial peptides of rat VGF (556 617) (599-617) showed the activity that caused erection when administered directly to the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) of male rats. This activity was confirmed in rat VGF (556-576). It was not possible (see Non-Patent Document 6). In addition, when VGF (588-596) was intraperitoneally administered to VGF gene-disrupted mice, it was reported that the body weight increased by about 10% to 15% (see Patent Document 1).
  • Non-patent Document 9 As an antibody specifically recognizing VGF or a peptide derived from VGF, a polyclonal antibody having a peptide having an amino acid sequence of 573 to 617 corresponding to the C-terminus of rat VGF as an antigen (Non-patent Document 9) A polyclonal antibody using a peptide having the amino acid sequence of 556 to 565 of human VGF as an antigen (see Non-Patent Document 4), a polyclonal antibody using a peptide consisting of the amino acid sequence of 443 to 588 of rat VGF as an antigen (see FIG. Non-Patent Document 10) has been reported.
  • Patent Document 1 WO01 / 07477
  • Patent Document 2 WO02Z82075
  • Non-Patent Document 1 Science, (USA), 1985, No. 229, No. 4711, p. 39 3-395
  • Non-Patent Document 2 Genomics, (USA), 1997, No. 45, No. 2, p. 443 -446
  • Non-Patent Document 3 Neuron, (USA), 1999, 23rd, No. 3, p. 537-5
  • Non-Patent Document 4 Cellular and Molecular Neurobiology, (USA), 2004, No. 24, No. 4, p. 517-533
  • Non-Patent Document 5 Journal ⁇ Journal of Neurochemistry, (UK;), 2002, 81st, No. 3, p. 565-574
  • Non-Patent Document 6 European Journal of Neuroscience, (France), 2004, No. 20, No. 11, p. 3035-3040
  • Non-Patent Document 7 Journal ⁇ ⁇ Chromatography B: Biomedical ⁇ Sciences
  • Non-Patent Document 8 Endocrinology, (USA), 1994, No. 135, No. 6, p. 2742-2748
  • Non-Patent Document 9 Endocrinology, (USA), 1999, No. 140, No. 8, p. 3727-3735
  • Non-Patent Document 10 The EMBO Journal, (UK), 1989, 8th, 8th, p. 2217-2223
  • An object of the present invention is to provide a novel peptide having circulatory regulation activity, and further, DNA encoding the peptide, an antibody that specifically binds to the peptide, a method for producing the peptide, and the peptide And a screening method using the peptide.
  • the present invention relates to the following (1) to (12).
  • Z 1 represents a hydrogen atom or a peptide residue of an arbitrary sequence of 1 to L 1 amino acid force
  • A represents a peptide residue consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, 2 represents an amino group or a peptide residue of any sequence comprising 1 to 38 amino acid forces
  • R 1 is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkanol, a substituted or unsubstituted aroyl, a substituted or unsubstituted heteroaryl carbo yl, a substituted or unsubstituted alkoxy carbo yl, Represents a substituted or unsubstituted aryloxycarbon, or a substituted or unsubstituted heteroaryloxycarbon, R 2 is hydroxy, substituted or unsubstituted alkoxy, or substituted or unsubstituted A represents amino, and B represents the above (a) to (d)!, A peptide residue of any peptide).
  • a method for producing the peptide comprising culturing the transformant according to (5) in a medium, producing and accumulating the peptide in the culture, and collecting the peptide from the culture.
  • any of the powers of SEQ ID NOs: 1 to 5, in the amino acid sequence represented by 28 or 29, amino acid sequence power in which 1 or more and 5 or less amino acids are substituted, deleted, or added also becomes a heart or blood vessel cell
  • R 3 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkanol, a substituted or unsubstituted aroyl, a substituted or unsubstituted heteroaryl carbo yl, a substituted or unsubstituted alkoxy carbo yl
  • R 4 represents hydroxy, substituted or unsubstituted alkoxy, or substituted or unsubstituted, substituted or unsubstituted aryloxycarboro, or substituted or unsubstituted heteroaryloxycarb
  • A represents amino
  • C represents the above (a) to (e)!, A peptide residue of one of the peptides).
  • (11) Measure the cellular response when any of the peptides or pharmacologically acceptable salts and test substances of (a) to (f) described in (9) are contacted with cells of the heart or blood vessels
  • the test substance when the cellular response is promoted is compared with the cellular response when the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof is contacted with the cell in the absence of the test substance.
  • a substance that promotes an increase in intracellular calcium ion concentration in heart or blood vessel cells by the peptide characterized in that it is specified as a substance that promotes an increase in intracellular calcium ion concentration in heart or blood vessel cells by Screening method.
  • the peptide of any one of (a) to (f) described in (9) or a pharmacologically acceptable salt thereof and a test substance are contacted with a heart or blood vessel cell or a membrane fraction of the cell.
  • the amount of the peptide or pharmacologically acceptable salt thereof bound to the cell or membrane fraction of the cell is measured, and the peptide or pharmacologically acceptable salt thereof is determined as a non-test substance.
  • the binding amount is reduced compared to the binding amount of the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof when contacted with the cell or a membrane fraction of the cell in the presence of A method for screening an agonist or antagonist for a receptor of the peptide, wherein the test substance is identified as an agonist or antagonist for the receptor of the peptide.
  • a novel peptide having circulation regulation activity DNA encoding the peptide, an antibody that specifically binds to the peptide, a method for producing the peptide, a medicine containing the peptide, and the peptide are used.
  • a method for screening an agonist or an antagonist against a substance that promotes or suppresses the activity of the peptide or a receptor of the peptide is provided.
  • the peptide of the present invention is useful for the treatment of cardiovascular diseases such as myocardial infarction, ischemic heart disease and cerebral infarction.
  • FIG. 1 shows an increase in intracellular calcium concentration in cardiac cells of apoaequorin-expressing mice by 1 ⁇ mol ZL of peptide 1 (SEQ ID NO: 27).
  • the horizontal axis is the time (seconds) after the addition of the medium, and the vertical axis is the relative luminescence (RLU) per second.
  • Peptide 1 was added at 25 seconds.
  • FIG. 2 shows an increase in intracellular calcium concentration in vascular cells of apoaequorin-expressing mice by 5 ⁇ mol ZL of peptide 2 (SEQ ID NO: 26).
  • the horizontal axis is the time (seconds) after the addition of the medium, and the vertical axis is the relative luminescence (RLU) per second.
  • Peptide 2 was added at 25 seconds.
  • FIG. 3 shows the increase in intracellular calcium concentration in heart cells of apoaequorin-expressing mice by molZL peptide 2.
  • the horizontal axis represents the time (seconds) after addition of the medium, and the vertical axis represents the relative light output (RLU) per second.
  • Peptide 2 was added in 25 seconds.
  • FIG. 4 shows an increase in intracellular calcium concentration in cardiac cells of apoaequorin-expressing mice by 1 ⁇ mol ZL of peptide 3 (SEQ ID NO: 2).
  • the horizontal axis represents the time (seconds) after addition of the medium, and the vertical axis represents the relative luminescence (RLU) per second.
  • Peptide 3 was added at 25 seconds.
  • FIG. 5 shows the increase in intracellular calcium concentration of blood vessel cells of apoaequorin-expressing mice by 5 ⁇ mol ZL of peptide 4 (SEQ ID NO: 5).
  • the horizontal axis represents the time (seconds) after addition of the medium, and the vertical axis represents the relative luminescence (RLU) per second.
  • Peptide 4 was added at 25 seconds.
  • FIG. 6 shows the increase of intracellular calcium concentration in cardiac cells of apoaequorin-expressing mice by 5 ⁇ mol ZL of peptide 5 (SEQ ID NO: 1).
  • the horizontal axis shows the time after addition of the medium ( Second), the vertical axis represents the relative light output (RLU) per second.
  • Peptide 5 was added at 25 seconds.
  • FIG. 7 shows an increase in intracellular calcium concentration in vascular cells of apoaequorin-expressing mice by 5 ⁇ mol ZL of peptide 9 (SEQ ID NO: 28).
  • the horizontal axis is the time (seconds) after the addition of the medium, and the vertical axis is the relative luminescence (RLU) per second.
  • Peptide 9 was added at 25 seconds.
  • FIG. 8 shows the increase of intracellular calcium concentration in cardiac cells of apoaequorin-expressing mice by 1 ⁇ mol ZL of peptide 10 (SEQ ID NO: 29).
  • the horizontal axis is the time (seconds) after the addition of the medium, and the vertical axis is the relative luminescence (RLU) per second.
  • Peptide 10 was added at 25 seconds.
  • FIG. 7 shows an increase in intracellular calcium concentration in vascular cells of apoaequorin-expressing mice by peptide 10 of 5 / z molZL.
  • the horizontal axis represents the time (seconds) after addition of the medium, and the vertical axis represents the relative light output (RLU) per second.
  • Peptide 10 was added in 25 seconds.
  • FIG. 10 shows an increase in blood pressure in rats caused by peptide 2.
  • the horizontal axis is the time (minutes) after administration of Peptide 2, and the vertical axis is the change in mean arterial pressure.
  • FIG. 11 shows the specificity of binding of antisera to various peptides derived from VGF.
  • ⁇ indicates peptide 1
  • ⁇ indicates peptide 2
  • mouth indicates peptide 3
  • ⁇ indicates the ratio of the specific binding of antiserum to the maximum binding amount when peptide 8 (SEQ ID NO: 8) is added.
  • the horizontal axis is the amount of each peptide added (fmol)
  • the vertical axis is the ratio of specific binding to the maximum binding amount BZB
  • the peptide of the present invention is any one of the following peptides (a) to (e) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of human VGF.
  • the amino acid sequence of the peptide of (a) may be any number of amino acids as long as it includes any of SEQ ID NOS: 1-4, 28 or 29, but 80 or less is preferred 60 The following is more preferred: 40 or less is particularly preferred.
  • (c) It consists of an amino acid sequence having 90% or more homology with any one of the amino acid sequences represented by any of 28 or 29 in SEQ ID NOs: 1 to 4, and determines the intracellular calcium ion concentration in heart or blood vessel cells. Peptides with increasing activity.
  • Z 1 represents a hydrogen atom or a peptide residue having an arbitrary sequence of 1 to 8 amino acids
  • A represents a peptide residue consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17
  • Z 2 represents Represents an amino group or a peptide residue of any sequence comprising 1 to 32 amino acids.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14 to 16 are the acid sequences of rat VGF (567-585), rat VGF (567-617), and rat VGF (556-617), respectively.
  • R 1 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkanol, a substituted or unsubstituted aryl, a substituted or unsubstituted heteroaryl carbo yl, a substituted or unsubstituted alkoxy carbo yl, Represents a substituted or unsubstituted aryloxycarbon, or a substituted or unsubstituted heteroaryloxycarbon, R 2 is hydroxy, substituted or unsubstituted alkoxy, or substituted or unsubstituted A represents amino, and B represents (a) to (d)!, A peptide residue of one of the peptides)
  • amino acid to be substituted or added for example, it is known as an essential amino acid.
  • L-amino acids L-alanin, L-asparagine, L-aspartic acid, L-arginine, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-iso-oral isine, L-nour-isin, L-lysine, L —Methionine, L-Felanalanin, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-parin, and L-cystine.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, norine, norpaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine, tert-leucine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Amino acid sequences having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by 28 or 29 in any one of SEQ ID NOS: 1-4 are homology analysis programs BLAST 2 Sequences [FEMS M icrobiol Lett. 174, 247 (1999)] using the default conditions (program: blastp, matrix: BLOSUM62 ⁇ open gap: ⁇ ⁇ penalties, extension gap: 1 penalty ⁇ gap x— dropoff: 50, ex pect: 10.0, word size: 3)
  • the homology (with the target sequence) Any number of amino acids that are the same as the sequence of 28 or 29 that was subjected to homology analysis of SEQ ID NOs: 1 to 4 Z: homology analysis was performed of either force 28 or 29 of SEQ ID NOs: 1 to 4
  • the total number of amino acids in the sequence plus the number of gaps inserted during alignment) is 90% or more, preferably 95% or more.
  • A is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, that is, a peptide residue having an amino acid sequence ability represented by the following formula (IV).
  • X 1 , X 2 and X 3 are independently the same or different amino acids in the represented) formula (IV), but X 1, X 2 and X 3 represent the same or different independently any amino acid, preferably X 1 is tyrosine or Hue - a Ruaranin, X 2 is serine, Threon, homoserine, leucine, isoleucine, norleucine, norin, norpaline, alanine, 2 aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanin or tert-leucine, X 3 tyrosine, Hue is - Ruara Nin or histidine, more preferably X 2 is serine or Aranin, X 3 is a Chi port
  • Z 1 is a hydrogen atom or a peptide residue having an arbitrary sequence of 1 to L 1 amino acids, preferably a hydrogen atom or the following formula (V): A peptide residue consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 18).
  • X 4 , X 5 and X 6 independently represent any amino acid which is the same or different
  • X 4 , X 5 and X 6 are preferably serine, threonine, Homoserine, oral isine, isoleucine, norleucine, norin, norpaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine or tert-leucine, more preferred X 4 and X 5 are serine or alanine X 6 is serine or leucine, and more preferably X 4 , X 5 and X 6 are serine, alanine and leucine, respectively, or alanine, serine and serine, respectively.
  • Z 2 is a pair flops tide residues Amino groups or 1-38 amino acids force becomes arbitrary sequence, represented by preferably Amino groups, the following formula (VI) It is a peptide residue consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 19) or a peptide residue consisting of an amino acid sequence represented by the following formula (VII) (SEQ ID NO: 20).
  • X 7 and X 9 are glycine, aspartic acid, glutamic acid, isospartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoaminodipic acid or 2-aminosuberic acid
  • X 8 and X 1G is arginine, lysine, orthine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid, leucine, isoleucine, norleucine, norline, norparin, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O— Methylserine, t-butyl glycine, t-butinolelanine, cyclohexylalanine or tert-leucine
  • X 11 is aspartic acid, glutamic acid, isopasinate, isoglutamate, 2-aminoadipic acid or 2-aminosuberic acid There, X
  • alkanoyl includes, for example, linear or branched 1 to 20 carbon atoms such as formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isoptylinole, norellinore, isonono Examples include relinole, pinot oleore, hexanoinole, heptanoinole, laureuinole, ecosanol.
  • aryl moiety of aroyl and aryloxy balls examples include, for example, phenyl and naphthyl having 6 to 15 carbon atoms.
  • heteroaryl moiety of heteroaryl and heteroaryloxycarbonyl examples include, for example, furyl, chael, pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, pyridyl, pyridazyl, and pyrimidinyl. , Pyrazyl, indolyl, indazolyl, benzimidazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolyl, quinazolyl, quinoxalinyl, naphthylidyl and the like.
  • alkoxycarbonyl and the alkyl moiety of alkoxy include, for example, linear or branched carbon atoms having 1 to 20 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, Examples include decyl, dodecyl, and eicosyl.
  • Substituents in the substituted alkanoyl, substituted alkoxycarbol and substituted alkoxy are the same or different and have 1 to 3 substitutions such as hydroxy, canolepoxy, 3 to 8 carbons, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclo And cycloaliphatic alkyl such as xyl, cycloheptyl, cyclooctyl, substituted or unsubstituted phenyl, fluorenyl and the like.
  • Examples of the substituent of the substituted phenol include alkyl groups, alkoxy groups, hydroxy groups, nitro groups, sulfo groups, cyan groups, and halogen groups having the same or different number of substitutions.
  • Examples of halogen include fluorine, chlorine, bromine, Each atom of iodine is raised.
  • the alkyl and alkoxy alkyl moieties as substituents of the substituted phenyl have the same meanings as the above alkoxy carbo and alkoxy alkyl moieties.
  • Substituents in the substituted aryl, substituted aryloxy, substituted heteroaryl and substituted heteroarylcarboxyl are the same or different and have 1 to 3 substituents. And has the same meaning as the substituent of the above substituted phenyl.
  • Examples of the substituent in the substituted amino include the same or different substituents having 1 to 2 substituents such as substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted aryl, and the like.
  • Alkyl has the same meaning as the alkyl moiety such as alkoxy
  • the substituent of the substituted alkyl has the same meaning as the substituent such as substituted alkoxy.
  • the aryl is synonymous with the aryl moiety of the above-described aryl or aryloxyball, and the substituent of the substituted aryl is synonymous with the substituent of the above-described aryl or aryloxyball.
  • amino acid residues constituting B are chemically modified or protected.
  • amino acid residues whose side chain functional groups are chemically modified or protected include aspartic acid residues or glutamic acid residues in which the side chain carboxy group is protected with a benzyl ester, and the side chain thiol group has a carboxy group.
  • examples include methylated cysteine residues.
  • Examples of the pharmacologically acceptable salt include acid addition salts, metal salts, organic base addition salts and the like.
  • the acid addition salt include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate and phosphate, and organic acid salts such as acetate, maleate, fumarate, tartrate and kenate.
  • the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt, zinc salt and the like.
  • Organic base addition salts include, for example, primary amines such as methylamine, ethylamine, and aline, secondary amines such as dimethylamine, jetylamine, pyrrolidine, piperidine, morpholine, and piperazine, trimethylamine, and triethylamine. And salts formed with tertiary amines such as amine, N, N-dimethyl dilin and pyridine, and ammonium salts.
  • peptide of the present invention include (i) a peptide having an amino acid sequence ability of SEQ ID NO: 1, (ii) a peptide having an amino acid sequence ability of SEQ ID NO: 2, and (iii) a formula (II) , R 1 is water atom, B is an amino acid sequence force becomes peptide residue of SEQ ID NO: 3, and peptide R 2 is amino unsubstituted, i.e.
  • R 1 is a hydrogen atom
  • B is an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a peptide in which R 2 is an unsubstituted amino, ie, a sequence in which the C-terminal proline residue is amidated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 27 (V) a peptide consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 28, (vi) a peptide consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 29, (vii) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, (viii) sequence And a peptide consisting of the amino acid sequence of No. 21 and (ix) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID No. 22.
  • the peptides (vii) to (ix) are peptides based on the rat VGF sequence corresponding to the peptides (ii) to (iv), respectively.
  • the peptide of the present invention is, for example, Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato et al.
  • the synthesis method include an azide method, an acid chloride method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, a dichloromethane method, an active ester method, a carboimidazole method, and a redox method.
  • the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method can be applied to the synthesis. That is, the target peptide can be synthesized by condensing the amino acid constituting the peptide of the present invention and the remaining part and removing the protecting group when the product has a protecting group.
  • the peptide of the present invention is one in which the side chain of the amino acid residue constituting the peptide and Z or the amino terminal of the peptide and Z or the carboxy terminal of the peptide are chemically modified or protected.
  • a method of chemical modification after peptide synthesis a method of peptide synthesis using chemically modified amino acids, or a method of appropriately selecting the reaction conditions for final deprotection of peptide synthesis.
  • the peptide of the present invention can also be synthesized using an automatic peptide synthesizer.
  • Peptide synthesis using a peptide synthesizer was performed by appropriately protecting the side chain on a commercially available peptide synthesizer such as a peptide synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation or a peptide synthesizer manufactured by Advanced ChemTech, Inc. N o; —Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl) -amino acid or Na-Boc (t-butyloxycarbonyl) -amino acid, etc. it can.
  • the peptide of the present invention can be purified by a combination of usual purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention can be expressed in a host cell and produced.
  • DNA encoding the peptide of the present invention can be synthesized by a DNA synthesizer by designing a base sequence to be coded from the amino acid sequence of the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention is a partial peptide of human VGF containing any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, it should be isolated by PCR using human brain or spleen cell cDNA as a saddle type. You can also.
  • the end of the region encoding the peptide of the present invention is made to be a stop codon.
  • SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, Examples include DNA consisting of the base sequences of 34 and 35.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA encoding the peptide of the present invention obtained above into the downstream of the promoter of an appropriate expression vector, and the recombinant vector is
  • bacteria for example, bacteria, yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like can be used as long as they can express the target gene.
  • the expression vector one that can replicate autonomously in the above host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA encoding the peptide of the present invention can be transcribed is used. It is done.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the peptide of the present invention can be autonomously replicated in the prokaryote, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, the present invention Preferred is a vector composed of DNA, transcription termination sequence, and more. Includes genes that control promoters! /, Even! / ⁇
  • Examples of expression vectors include pSE420 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad.
  • the promoter may be any as long as it functions in the host cell.
  • trp promoter P
  • lac promoter P promoter
  • P promoter P promoter
  • tip LR examples include promoters derived from E. coli and phages such as the T7 promoter. Also, two promoters in series ( ⁇ X 2), tac promoter, lacT7 promoter
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Escherichia, Serratia Bacillus, Brevibacterium, Corvnebacterium, Microbacterium, For example, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichiacoli XL2-Blue, Escherricnia coli DH1, Escherichia coli MClOOO. Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HBli. , Escherichia coli W3110, Escherichia coli TBL Serratia ficaria.Serratia fonticola, S erratialiauefaciens, Serratia marcescens.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-2483942
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATC C37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter Gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MFa 1 promoter, cup 1 promoter and the like.
  • Host cells include the genus Saccharomvces, Schizosa ccharomvces rot, Trichosporon genus, Schwanniomvces genus, Pichia C and ida
  • microorganisms belonging to the above include Saccharomvces cerevisiae. Achizosaccharomvcespom be, Kluweromvces lactis. Fnchosporon pullulans. Achwanniomvcesalluvius, Candida and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electopore position method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1990)], Spheroplast (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)), lithium acetate method (J. Bacteriology, 153, 163 (1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, The method described in 1929 (11978) can be mentioned.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • a promoter of the cytomegalovirus (CMV) IE (immediate early) gene an early promoter of SV40, a retrovirus-less promoter. Examples thereof include promoters, meta-mouthone promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • CMV IE cytomegalovirus
  • Examples of host cells include human cells, such as Namalwa cells, monkey cells, COS cells, Chinese ', Muster cells, CHO cells, and HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-299). Can give.
  • any method for introducing a recombinant vector into animal cells any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] calcium phosphate
  • the method Japanese Patent Laid-Open No. 227075
  • the ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] Virology, 52, 456 (1973) and the like can be mentioned.
  • a recombinant gene transfer vector and a defective baculovirus genome are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further infected into insect cells, and the peptide is introduced. Can be expressed.
  • Examples of gene transfer vectors used in the method include pVL1392 pVLl 393 (Betaton Dickinson), P BlueBac4.5 (Invitrogen), and the like.
  • baculoviruses include the ability to use Autodala californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects crayfish insects.
  • insect cells include Spodoptera fi ⁇ gie ⁇ ovarian cells S19 S1 1 [Baculovirus expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)] Trichodusiani egg Certain High 5 (Invitrogen) etc. can be used.
  • Examples of a method for co-introducing the recombinant gene introduction vector and the baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (JP-A-2-227075), the lipofuxion method [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84, 7413 (1987)] etc. I can make it.
  • expression vectors include Ti plasmids and tobacco mosaic virus vectors.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include a cauliflower mosaic quinores 35S promoter and an ininectin 1-promotor.
  • host cells include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat and barley.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into plant cells.
  • Agrobacterium JP 59-140 885, JP 60-70080, WO94 / 00977
  • an elect mouth position method Japanese Patent Laid-Open No. 60-251887
  • a method using a particle gun Gene gun
  • Patent No. 2606856, Patent No. 2517813 Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the peptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the peptide of the present invention is collected from the culture. Can be manufactured.
  • the method of culturing the transformant of the present invention in a medium can be carried out according to a usual method used for culturing a host.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host
  • the transformant is used as a medium for culturing the transformant.
  • the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be used by the body, and the culture of the transformant can be efficiently performed, it is possible to use natural media and synthetic media!
  • the carbon source may be any material that can be assimilated by the transformant, for example, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic substances such as acetic acid and propionic acid, etc. Alcohols such as acid, ethanol and propanol can be used.
  • Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonia, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other inorganic or organic acid ammonia. Salt, other Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof, and the like can be used.
  • inorganic salt for example, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. are used. be able to.
  • the culture is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture time is preferably 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually preferably 16 hours to 7 days.
  • the pH during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH can be adjusted using inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline to the medium.
  • an inducer to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the k £ promoter cultivate a microorganism transformed with a recombinant vector using isopropyl 1 ⁇ -D-thiogalatatopyranoside, etc., and a 1m promoter.
  • indoleacrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host for example, RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's minimal'essential medium ( MEM) (Science, 122, 501 (1952)), Dulbecco's modified Eagle medium (Virology, 8, 396 (1959)), 199 medium (Proceeding of the Society for Biological Medicine, 73, 1 (1950)) or these Examples include a medium in which fetal calf serum is added to the medium.
  • Culture is usually preferably performed in the presence of 5% CO.
  • the pH is 6 to 8, and the temperature is 30.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin to the medium during culture. You can do it.
  • the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • a medium for culturing a transformant obtained using insect cells as a host commonly used TNM-FH medium (Betaton's Dickinson), Sf-900 II SFM medium (Invitrogen) ), ExCell400, ExCell405 (all from JRH Biosciences), Grace's insect medium [Nature, 195, 788 (1962)], etc. 7.
  • the temperature is preferably 25-30 ° C. It is preferable to carry out for 1-5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as necessary during culture.
  • a transformant obtained using plant cells as a host is differentiated as cells or plant cells or organs. Can be cultured.
  • a medium for culturing the transformant a commonly used Murashige 'and' Stag medium, White medium, or a medium supplemented with plant hormones such as auxin, cytokinin, etc. is used. be able to.
  • the culture is preferably performed for 3 to 60 days, preferably at a pH of 5 to 9 and a temperature of 20 to 40 ° C.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a microorganism, animal cell, or plant cell-derived transformant having a recombinant vector incorporating the DNA encoding the peptide of the present invention is cultured according to a normal culture method to produce the peptide.
  • the peptide can be produced by accumulating and collecting the peptide from the culture.
  • the peptide of the present invention is produced by producing a fusion protein of an arbitrary polypeptide (hereinafter referred to as polypeptide X) and the peptide of the present invention, and then the peptide of the present invention. May be isolated from the fusion protein.
  • An expression vector that expresses the fusion protein When preparing a DNA encoding the above-mentioned peptide of the present invention, Kutaichi was prepared by adding a DNA encoding a specific protease recognition sequence or methionine to the 5 ′ end to express polypeptide X. The vector can be prepared by ligating together DNA encoding polypeptide X and a frame.
  • Polypeptide X is capable of using any polypeptide, such as dartathione S-transferase, maltose binding protein, DsbA, DsbC, protein A, and the like.
  • specific protease recognition sequences include factor Xa recognition sequence (Ile-Glu-Gly-A rg ), enterokinase recognition sequence (Asp-Asp-Asp-Lys), and the like.
  • a polypeptide X expression vector can be prepared by inserting a DNA encoding polypeptide X in place of the DNA encoding the peptide of the present invention, in accordance with the above-described expression vector of the peptide of the present invention.
  • commercially available fusion protein expression vectors for example, fusion protein expression vector pGEX-3 (manufactured by GE Healthcare) with dartathione S-transferase, fusion protein expression vector with maltose binding protein pMAL-c2X PMAL-p2E (manufactured by Biolabs), fusion protein expression vector pET-39b (+) (EMD Biosciences) with DsbA, etc. may be used.
  • the fusion protein can be cleaved by treatment with a protease corresponding to the recognition sequence.
  • the peptide of the present invention is fused to the C terminus of polypeptide X via methionine, the peptide of the present invention is treated with cyanogen bromide according to the method described in JP-A-1-102096.
  • the fusion protein can be cleaved.
  • the peptide of the present invention can be isolated and purified by combining gel filtration, reverse phase HPLC, affinity chromatography and the like.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention is prepared by attaching the DNA encoding the signal peptide of the secreted protein to the 5 ′ end. Then, using this DNA, a recombinant vector is prepared in the same manner as described above and introduced into a host cell. It can be produced by secreting light peptides into the medium.
  • the peptide of the present invention is not the N-terminal cationin, it can be produced by a method of producing the above fusion protein and then isolating it or secreting it into a medium.
  • the peptide of the present invention having the amino acid sequence ability of SEQ ID NO: 2 can be produced as follows. First, a DNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and a DNA comprising a base sequence complementary to SEQ ID NO: 11 are chemically synthesized with a DNA synthesizer, and then both are annealed to prepare a double-stranded DNA.
  • the double-stranded DNA and pMAL-c2X cleaved with Xmnl are ligated to prepare a plasmid in which the double-stranded DNA is inserted into the Xmnl site of pMAL-c2X.
  • the obtained plasmid encodes a fusion protein in which the factor Xa recognition sequence (Ile-Glu-Gly-Arg) and the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are fused to the C-terminus of the maltose binding protein.
  • Escherichiacoli is transformed with the resulting plasmid.
  • the obtained transformant is cultured in a medium, and the fusion protein is expressed in the cells of the transformant.
  • the cultured cells are isolated by centrifugation and then disrupted to obtain a solution containing the fusion protein. After isolating the fusion protein from the resulting solution by affinity chromatography using a column with maltose immobilized, the fusion protein is treated with Factor Xa to fuse the peptide having the amino acid sequence ability of SEQ ID NO: 2. Separate protein power.
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 can be isolated and purified by gel filtration or reverse phase HPLC.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Manton Gaurin homogenizer. Then, disrupt the cells with dynomill or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract, a usual protein isolation and purification method, that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, and a precipitation using an organic solvent.
  • a usual protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, and a precipitation using an organic solvent.
  • anion-exchange chromatography using a resin such as Jetylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Corporation), Resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Cation exchange chromatography using butyl cephalo Hydrophobic chromatography methods using resins such as glucose and ferrule sepharose, gel filtration methods using molecular sieves, affinity chromatography methods, chromatofocusing methods, electrophoresis methods such as isoelectric focusing etc. Purified samples can be obtained using methods alone or in combination.
  • a resin such as Jetylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Corporation)
  • Resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Cation exchange chromatography using butyl cephalo Hydrophobic chromatography methods using resins such as glucose and ferrule sepharose, gel filtration methods using mole
  • the cell is recovered in the same manner, and then crushed and centrifuged to recover the peptide insoluble substance as a precipitate fraction.
  • the recovered peptide insolubles are solubilized with a protein denaturant.
  • the solubilized solution is diluted or dialyzed, and the peptide is returned to a normal three-dimensional structure by reducing the concentration of the protein denaturant in the soluble solution.
  • a purified preparation of the peptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the peptide of the present invention When the peptide of the present invention is secreted extracellularly, the peptide can be recovered in the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a technique such as centrifugation as described above, and a purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Can be obtained.
  • the antibody of the present invention is an antibody that binds to an epitope present in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a sequence in which the C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is amidated (SEQ ID NO: 27), which is described in 1. It can specifically bind to the peptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies or monoclonal antibodies prepared by Fab, Fab ⁇ F (ab '), etc.
  • Monoclonal antibodies include human chimeric antibodies that also have the monoclonal antibody variable regions and human antibody constant regions produced by non-human animals, and the complementarity determining regions (CDRs) of monoclonal antibodies produced by non-human animals. Also included are variable CDR regions inserted into the framework region of the antibody and human CDR-grafted antibodies that also serve as constant regions of human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Polyclonal antibodies that bind to the epitopes present in number 27) can be produced. This polyclonal antibody can specifically bind to the peptide of the present invention.
  • a carrier protein such as moccine, cythyroglobulin, ovalbumin, etc.
  • Covalent binding of the antigen peptide to the carrier protein can be performed by a reaction using a cross-linking agent such as maleimide, carpositimide, or dartalaldehyde.
  • a cross-linking agent such as maleimide, carpositimide, or dartalaldehyde.
  • adjuvants examples include Freund's complete adjuvant, hydroxyaluminum gel, pertussis vaccine, and the like.
  • As a non-human animal to administer an antigen Usagi, catcher formate can Rukoto using rats, mice, hamsters, etc., dosage per once per animal, the amount having 50-200 8 containing the peptide of the antigen Is preferred.
  • the administration of the antigen is preferably performed 3 to 10 times every 1 to 3 weeks after the first administration until the antibody titer of the serum is sufficiently increased.
  • the antibody titer of serum can be measured by enzyme immunity assay, radioimmunoassay method, etc. by collecting blood samples 3 to 7 days after each administration.
  • Enzyme immunoassay is based on the literature [Enzyme immunoassay, Medical School (1976); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. Is fixed to a suitable plate with another carrier protein, (ii) blocked and washed, and (iii) immunized animal power is reacted with the prepared serum and washed.
  • Serum is prepared by collecting blood from a non-human animal that showed a sufficient antibody titer against the peptide whose serum was the antigen.
  • This serum ie antiserum
  • This serum is used as a polyclonal antibody It can be used, and the antiserum can also purify polyclonal antibodies.
  • Methods for purifying polyclonal antibodies with antiserum activity include, for example, centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, force prillate precipitation (Ant3 ⁇ 4odies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988 )], Or DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A or G-force ram or gel filtration column, etc.
  • a monoclonal antibody that binds to an epitope present in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a sequence in which the C-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is amidated (SEQ ID NO: 27) can be produced.
  • This monoclonal antibody can specifically bind to the peptide of the present invention.
  • mice or rats that have been administered the same antigens as in the polyclonal antibody production in (1) and whose sera showed sufficient antibody titers against the antigenic peptides.
  • Spleen cells can be used as antibody-producing cells.
  • Antibody-producing cells can be prepared from mice or rats that have shown a sufficient antibody titer, for example, as follows.
  • the spleen is removed. Shred the spleen in MEM, loosen it with tweezers, centrifuge, discard the supernatant, and collect the precipitated spleen cells. Treat the resulting spleen cells with Tris-salt-ammonium buffer (PH 7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes, and then use the cells washed 3 times with MEM as antibody-producing cells. Can do.
  • Tris-salt-ammonium buffer PH 7.65
  • myeloma cells cell lines established from mouse or rat myeloma cells can be used. Examples of established myeloma cells include 8-azaguanine-resistant mice (B and 8 / 0-derived) myeloma cell lines 1 3 3-63 838-1; 1 ⁇ 1 ⁇ Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Europ. J. Immunol, 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 [Nature, 276, 269 (1978)], P3— X63— Ag8653 [J. Immunol, 123, 1548 (1979) )], P3-X63-A g8 [Nature, 256, 495 (1975)].
  • 8-azaguanine-resistant mice B and 8 / 0-derived myeloma cell lines 1 3 3-63 838-1; 1 ⁇ 1 ⁇ Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Europ. J. Immun
  • These cell lines consisted of 8 azaguanine medium [RPMI-1640 medium with glutamine (1.5 mmolZL), 2-mercaptoethanol (5 X 10 " 5 mol / L), ditamycin (10 ⁇ g / mL) and ushi fetal serum. It is preferable to subculture with medium supplemented with 10% (hereinafter referred to as normal medium) and medium with 8 azaguanine (15 gZmL) in addition, and normal three to four days before cell fusion.
  • the cells are cultured in a medium, and 2 ⁇ 10 7 or more of these cells are preferably used for fusion.
  • the antibody-producing cells obtained in (a) and the myeloma cells obtained in (b) can be cell-fused using, for example, polyethylene glycol as described below, to produce nobridoma.
  • MEM or PBS diisodium phosphate 1.83 g, monopotassium phosphate 0.21 g, salt 7.65 g, distilled water 1 Wash well with rittle, pH 7.2
  • the cells after cell fusion can be cultured, for example, as described below, and a hybridoma with high antibody production can be selected.
  • a hybridoma with high antibody production can be selected.
  • Hipokisanchi emissions (10 _4 molZL) to gently HAT medium [normal medium in blowing, thymidine (1. 5 X 10 _5 molZL) and Medium supplemented with aminopterin (4 ⁇ 10 _7 mol ZL) Suspend in lOOmL.
  • HAT medium normal medium in blowing, thymidine (1. 5 X 10 _5 molZL) and Medium supplemented with aminopterin (4 ⁇ 10 _7 mol ZL)
  • the dormer can be selected as a high antibody yield, hybridoma or hybridoma.
  • the hybridoma is cloned, and from each of the obtained hybridoma clones. By selecting one that produces a high amount of antibody, a hybridoma cell that stably produces a high amount of antibody can be obtained. Cloning can be performed, for example, by limiting dilution, etc., and is repeated twice. [First time is HT medium (medium excluding HAT medium and aminopterin), and second time is normal medium. Is preferred.
  • the above-mentioned antibody titer is measured, and the clones of nobrid and ibridoma corresponding to the culture supernatant in which a strong antibody titer is recognized can be stably expressed as an antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be prepared, for example, from ascites after the noblebrid monomer selected in (c) is grown as ascites cancer in nude mice as follows. 2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane (pristane) 0.5 mL was intraperitoneally administered, and the mice of the present invention obtained in (c) were obtained from 8-10 week-old mice or nude mice raised for 2 weeks. It is preferable to inject intraperitoneally 5 to 20 ⁇ 10 6 cells of hyperidoma cells producing a local antibody. After 10 to 21 days, collect the mouse force ascites from which the hyperidoma became ascites tumor and centrifuge at 3, OOOrpm for 5 minutes to remove the solids. From the obtained ascites supernatant, a monoclonal antibody can be purified and obtained by the same method as that used for the polyclonal antibody.
  • the subclass of an antibody can be determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the amount of peptide can be calculated by the Lauri method or absorbance at 280 nm.
  • the antibody of the present invention can be used to detect or quantify the peptide of the present invention immunologically.
  • Immunological detection or quantification methods include competitive methods, sandwich methods, immunohistochemistry, Western plots, agglutination methods (monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific, 1987; Chemical Research Method, Tokyo Chemical Doujin, 1986).
  • the antibody of the present invention is mixed with a sample solution and a certain amount of a competitive substance (the peptide of the present invention to be measured labeled with an enzyme, piotin, radioisotope, fluorescent substance, etc.) After reacting, the peptide of the present invention and the competitive substance in the sample solution are competitively bound to the antibody, and then the amount of the competitive substance bound to the antibody is measured using a label. It is a method for quantifying the peptide of the invention.
  • the antibody is immobilized on a solid phase such as a plate or a bead
  • the peptide of the present invention and the competitor are bound competitively with the antibody
  • the solid phase is washed
  • the competitor is bound to the antibody on the solid phase.
  • a method for measuring the amount of binding, the peptide of the present invention and the competitor are bound to the antibody competitively, and then the immune complex is precipitated with ⁇ -globulin and polyethylene glycol to bind to the antibody.
  • a method for measuring the amount of a competitor substance separated from a substance and bound to an antibody can be used.
  • a peptide solution of the present invention having a concentration of 5 to 10 points is prepared, and when this solution is used as a sample solution, the binding amount of the competitor to the antibody is measured to determine the peptide concentration and the competitor.
  • a calibration curve in which the binding amount of the peptide of the present invention is plotted is prepared, and the binding amount of the competitor substance is applied to the calibration curve with the sample solution for quantifying the peptide of the present invention to quantify the peptide of the present invention in the sample solution. be able to.
  • the sandwich method is a method using two types of antibodies that specifically bind to the peptide of the present invention.
  • a sample solution is prepared by immobilizing one antibody on a solid phase such as a plate or a bead. After the peptide of the present invention in the sample is bound to the antibody on the solid phase, the other antibody labeled with an enzyme, piotin, radioisotope, fluorescent substance, etc. is reacted, There is a method in which the labeled antibody is further bound to the peptide of the present invention bound to the antibody, the binding amount of the labeled antibody is measured using a labeling substance, and the peptide of the present invention is quantified from the binding amount.
  • the peptide of the present invention in the sample solution can be quantified.
  • the enzyme immunoassay is a method in which the competitor or antibody is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase or peroxidase in the above-described competitive method or sandwich method, and a reagent that develops or emits light with the labeled enzyme is allowed to react.
  • This is a quantitative method for measuring the amount of binding of a competitor or labeled antibody from the amount of luminescence.
  • Radio Imno Assy In the competitive method and sandwich method described above, the competitive substance or antibody is labeled with a radioisotope, and its radioactivity is a quantitative method for measuring the binding amount of the competitive substance or labeled antibody.
  • an antibody of the present invention labeled with an enzyme, piotin, a radioisotope, a fluorescent substance, a gold colloid, or the like is applied to a section prepared by freezing tissue or cells or embedding in paraffin. After the reaction, the antibody of the present invention is detected using a labeling substance to detect the peptide of the present invention in a tissue or a cell.
  • the agglutination method is a particle produced by reacting particles such as latex to which the antibody of the present invention is immobilized with a sample solution, and binding the antibody on the particles to the peptide of the present invention in the sample. Is a method for detecting or quantifying the agglutination by measuring absorbance.
  • VGFC powder derived peptides the following (a) to (f)! Or any of the peptides are referred to as “VGFC powder derived peptides”.
  • the peptide of the present invention described in 1. is included in a peptide derived from VGFC powder.
  • any of the powers of SEQ ID NOs: 1 to 5, in the amino acid sequence represented by 28 or 29, amino acid sequence power in which 1 or more and 5 or less amino acids are substituted, deleted, or added also becomes a heart or blood vessel cell
  • R 3 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkanol, a substituted or unsubstituted aroyl, a substituted or unsubstituted heteroaryl carbo yl, a substituted or unsubstituted alkoxy carbo yl
  • R 4 represents hydroxy, substituted or unsubstituted alkoxy, or substituted or unsubstituted, substituted or unsubstituted aryloxycarboro, or substituted or unsubstituted heteroaryloxycarb
  • A represents amino
  • C represents the above (a) to (e)!, Which is a peptide residue).
  • VGFC end-derived peptide amino acid substitution, deletion and addition in the peptide of the present invention in 1.
  • amino acid sequence homology As well as the definition of amino acid sequence homology.
  • the definition of each group in formula (III) is the same as the definition of each group in formula (II) of 1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 is an amino acid sequence represented by the following formula (VIII).
  • X 13 is Asuparagin acid, glutamic acid, Isoasuparagin acid, isoglutamine acid, 2-aminoadipic acid or 2 Aminosu base phosphoric acid
  • X 14 is ⁇ arginine, lysine, Ol - Chin, 2,4 diaminobutanoic acid, 2,3 diaminopropionic acid or histidine
  • X 13 is aspartic acid or glutamic acid
  • X 14 is arginine or histidine
  • X 13 and X 14 are The forces are glutamic acid and arginine, respectively, or aspartic acid and histidine, respectively.
  • amino acid sequence of 1 to 32 amino acids that is added to the N-terminus of SEQ ID NO: 23 is preferably an amino acid sequence represented by the following formula (IX) (SEQ ID NO: 24).
  • x 15 , X 16 and X 17 are serine, threonine, homoserine, leucine, isoleucine, norleucine, norrin, norparin, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butyl Glycine, tert-butylalanine, cyclohexylalanine or tert-leucine, X 18 is tyrosine or phenylalanine, X 19 is serine, thread nin, homoserine, leucine, isoleucine, norleucine, parin, norparin, alanine, 2-aminobutanoate, Mechionin, O- methylserine, t Buchiruda lysine, a Kishiruaranin or tert- leucine t- butyl Honoré alanine, cyclohexane,
  • ⁇ 15 , ⁇ 16 , ⁇ 17 , ⁇ 18 , ⁇ 19 , ⁇ 2 , X 21 and X 22 are serine, alanine, leucine, tyrosine, serine, tyrosine, glycine and arginine, respectively. Or alanine, serine, serine, phenylalanine, alanine, histidine, waspartic acid and leucine respectively.
  • Specific examples of peptides derived from VGFC powder include peptides (i) to (ix), which are specific examples of the peptide of the present invention described in 1. (X), a peptide consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 5.
  • (Xi) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and (xii) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the peptide of (X) is a peptide corresponding to the C-terminal 586 to 615th sequence of human VGF
  • the peptide of (xi) is a peptide derived from rat VGF corresponding to the peptide of (X)
  • the peptide of (xii) Is a peptide derived from rat VGF corresponding to the peptide of (i) of the present invention.
  • VGFC powder-derived peptide and pharmacologically acceptable salts thereof have an activity of increasing intracellular calcium concentration in blood vessels or heart cells, and therefore have a blood circulation and blood flow regulating activity. Therefore, peptides derived from VGFC powder and pharmacologically acceptable salts thereof should be used as active ingredients in circulatory regulators, pressors, or therapeutic agents for circulatory diseases such as myocardial infarction, ischemic heart disease or cerebral infarction. Can do.
  • Examples of the pharmacologically acceptable salt of the peptide derived from VGFC powder include the salts listed as the pharmacologically acceptable salt of the peptide of the present invention in 1.
  • a pharmaceutical preparation containing a peptide derived from VGFC powder or a pharmacologically acceptable salt thereof is an active ingredient of the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof alone or for any other treatment. Can be contained as a mixture with the active ingredients.
  • these pharmaceutical preparations are prepared by mixing the active ingredient together with one or more pharmacologically acceptable carriers and by any method well known in the technical field of pharmaceutical sciences. Manufactured.
  • the route of administration may be oral or parenteral, for example intravenously, as desired to use the most effective treatment.
  • Administration forms include tablets, powders, granules, syrups, injections and the like.
  • Liquid preparations suitable for oral administration, such as syrups, are water, sucrose, sorbit
  • Sugars such as fructose, Daricols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, preservatives such as p-hydroxybenzoate esters, flavors such as strawberry flavor and peppermint Etc.
  • tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, Disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin, surfactants such as fatty acid esters, plasticizers such as glycerin, etc. Can be used.
  • Formulations suitable for parenteral administration preferably comprise a sterile aqueous solution containing an active compound that is isotonic with the blood of the recipient.
  • a solution for injection is prepared using a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution.
  • a carrier such as a salt solution, a glucose solution, or a mixture of salt water and a glucose solution.
  • these parenteral agents one kind selected from diluents, preservatives, flavors, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc., exemplified for oral agents. Or more auxiliary components can be added.
  • the dose and frequency of administration of the peptide of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof vary depending on the dosage form, patient age, body weight, nature or severity of symptoms to be treated, orally In this case, 0.01 mg to 1 lg, preferably 0.05 to 50 mg per adult is administered once to several times a day. In the case of parenteral administration such as intravenous administration, per adult, 0.001 to 100 mg, preferably ⁇ or 0.01 to: LOmg is given once or several times. However, the dose and the number of doses vary depending on the various conditions described above.
  • a peptide derived from VGFC powder or a pharmacologically acceptable salt thereof has a circulation regulating activity has an activity to increase intracellular calcium ion concentration or blood pressure by the following measurement method. You can confirm it by speaking.
  • a heart or blood vessel is collected from a transgenic mouse (WO02Z010371) that expresses apoaequorin produced by introducing an apoaequorin gene expression vector into a fertilized egg.
  • the obtained heart or blood vessel is shredded, suspended and cultured in a medium containing coelenterazine, and coelenterazine is taken up into cells to form etaolin (a complex of apoetaolin and coelenterazine).
  • Aequorin binds to intracellular calcium ions Since it emits light, the relative luminescence per second of the cells before and after the addition of the medium containing the peptide or its pharmacologically acceptable salt is measured over time with a luminometer, and an indicator of intracellular calcium ion concentration And When the relative luminescence increases due to the addition of a peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof, the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof has an activity to increase intracellular calcium ion concentration.
  • Fura-2 Indo-, which is obtained by pulverizing a heart or blood vessel collected from an animal individual, or a cell line derived from the heart or blood vessel, whose excitation wavelength, fluorescence wavelength, or fluorescence intensity changes with or without calcium ions. Suspend the cells in a buffer containing a calcium ion-binding fluorescent reagent such as 1 and incubate them into the cells. Fura-2 binds to calcium ion and shifts the peak of the fluorescence excitation wavelength from 380 nm to 340 nm. Therefore, before and after adding a buffer containing a peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the ratio of the fluorescence intensity when excited at a wavelength of 340 nm to the fluorescence intensity when excited at a wavelength of 380 nm is measured with a fluorescence measuring device and used as an indicator of intracellular calcium ion concentration.
  • the ratio of fluorescence intensity is increased by adding a peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof, the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof has an activity to increase intracellular calcium ion concentration.
  • Indo-1 binds to calcium ion, the fluorescence wavelength shifts from 480 nm to 400 nm.
  • a wavelength of 480 ⁇ m The ratio of the fluorescence intensity at a wavelength of 400 nm to the fluorescence intensity is measured with a fluorescence measuring device and used as an index of intracellular calcium ion concentration.
  • the ratio of fluorescence intensity is increased by the addition of a peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof, the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof has an activity of increasing intracellular calcium ion concentration. I can confirm that.
  • a catheter is inserted into the external jugular vein and internal carotid artery of anesthetized animals such as rats, and the arterial pressure is continuously measured by connecting the internal carotid artery catheter to a pressure monitor.
  • the peptide or its pharmacologically acceptable salt dissolved in physiological saline is administered, and the peptide pressure is compared before and after administration of the peptide or its pharmacologically acceptable salt.
  • the arterial pressure is increased by administration of a pharmacologically acceptable salt thereof, it can be confirmed that the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof has an activity of increasing blood pressure.
  • Substances that inhibit the increase in intracellular calcium ion concentration in cardiac or vascular cells by VGFC-derived peptides are: (i) the VGFC-derived peptides or their pharmacologically acceptable (Ii) contact the same cell with the VGFC powder-derived peptide or its pharmacologically acceptable salt in the absence of the test substance. (M) When the cellular response is suppressed in the presence of the test substance, the test substance is treated with the VGFC powder-derived peptide to cause intracellular calcium ions in cardiac or vascular cells. By screening as a substance that inhibits the increase in concentration, screening can be performed.
  • test substance is identified as a substance that promotes an increase in intracellular calcium ion concentration in the heart or blood vessel cells by the VGFC end-derived peptide.
  • a substance that promotes an increase in intracellular calcium ion concentration in blood vessel cells can be screened.
  • any cellular response can be used as long as it is a measurable cellular response that occurs when the VGFC terminal-derived peptide is brought into contact with cardiac or vascular cells. Increase in ion concentration.
  • the heart or blood vessel cell used in the above screening method is derived from the heart or blood vessel as long as it shows a cellular response when contacted with a VGFC-derived peptide.
  • a cell line or a heart or blood vessel collected from an animal may be used.
  • the substance that promotes the increase in intracellular calcium ion concentration in cardiac or vascular cells by the VGFC powder-derived peptide obtained by the above screening method, as well as the VGFC powder-derived peptide, has a circulation-regulating activity. It can be used as a circulatory regulator, a pressor, or a therapeutic agent for circulatory diseases such as myocardial infarction, ischemic heart disease or cerebral infarction.
  • substances that inhibit the increase of intracellular calcium ions in cardiac or vascular cells by peptides derived from VGFC powder inhibit the activity of VGFC powder derived peptides, for example, to increase blood pressure. Can do.
  • An agonist or antagonist for the receptor of a peptide derived from VGFC powder is: (i) the VGFC powder derived peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof and a test substance in heart or blood vessel cells or membrane fraction of the cells. The amount of binding of the peptide or a pharmacologically acceptable salt thereof to the membrane fraction of the cell or cell when the cell is contacted, and (ii) the test substance in the same cell or membrane fraction.
  • the test substance is added to the receptor for the peptide derived from the VGFC powder.
  • the cells described in 5. above can be used as heart or blood vessel cells.
  • the cells or the cell membrane fraction of the cells are suspended in a suitable buffer.
  • the buffer solution is a buffer solution that does not inhibit the binding of the peptide derived from VGFC powder to the cell or the cell membrane fraction of the cell, it may be V.
  • a phosphate buffer of pH 4 to 10 preferably pH 6 to 8 Liquid or Tris—HC 1 Buffer solution or the like is used.
  • various proteins such as surfactants such as CHAPS, Tween-80, digitonin and deoxycholic acid can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-64, and pepstatin can be added to suppress degradation of the polypeptide or ligand of the present invention by protease.
  • a suspension of 10 ⁇ L to 10 mL of the cell or a cell membrane fraction of the cell is coated with a VGFC end-derived peptide having a certain amount of radioactivity labeled with a radioisotope such as 125 I or 3 H.
  • Coupling experiments are performed in the coexistence.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably 4 to 37 ° C., for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • filter with a glass fiber filter, etc. wash with an appropriate amount of the same buffer, and measure the radioactivity remaining on the glass fiber filter with a ⁇ counter or liquid scintillation counter.
  • the bond amount at this time is defined as the total bond amount ( ⁇ ).
  • the binding inhibition rate of the test substance can be determined by the following formula.
  • Inhibition rate (%) [1 ⁇ (C-B) / (A-B) ⁇ ] X 100
  • the agonist for the receptor of the VGFC end-derived peptide obtained by the above screening method has a circulatory regulating activity, so that it is a circulatory regulator, pressor or myocardial infarction, ischemic. It can be used as a therapeutic agent for cardiovascular diseases such as heart disease or cerebral infarction.
  • an antagonist to a receptor for a peptide derived from VGFC powder inhibits the activity of VGFC powder derived peptide, for example, to increase blood pressure, and therefore can be used as a hypotensive agent.
  • a human spleen-derived cell line (10 8 cells) grown to confluence was cultured for 6 hours in phenol / serum-free RPMI medium, and the medium was collected. After collecting the culture medium and centrifuging, 1Z50 volume of ImolZL hydrochloric acid was added to the supernatant, and then a sample was extracted using a Sep-Pak C 18 cartridge (manufactured by Waters). The cartridge was washed with 0.1% trifluoroacetic acid (hereinafter abbreviated as TFA), and the sample was eluted with 60% acetononitrile—0.1% TFA.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • NP L-2100 manufactured by Hitachi
  • NP L-2100 manufactured by Hitachi
  • the lyophilized sample was dissolved in ImolZL acetic acid, neutralized with ImolZL Tris (pHl 1), and reduced in a reduction reaction solution (ImmolZL EDTA, 25 mmolZL dithiothreitol, 0.5 molZl Tris, PH8.5). Heated at ° C for 1 hour. Subsequently, podoacetamide was added to a final concentration of 50 mmol ZL, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 15 minutes in the dark.
  • the reaction was stopped with glacial acetic acid and desalted using a Sepp-Pack C18 cartridge. After desalting, the lyophilized sample was dissolved in 0.1% TFA, and a reverse-phase HPLC column (Vydac Protein & Peptide C18, 1 mm X 15 mm (Grace Vydac)) was used. The sample was separated from the H PLC [HPLC pump L-6000 (Hitachi)] at a flow rate of 50 ⁇ LZ and collected every 30 seconds.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • ESI electrospray ionization
  • Mass spectrometry by the ESI method was performed using a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Q-Tof 2, manufactured by Micromass). Acquired tandem mass spectra were identified based on NCBI and Swiss-Prot amino acid sequence databases using analysis software Mascot MS / MS Ion Search (Mascot MS / MS Ion Search, Matrix Science) did. As a result, six types of peptides having a partial amino acid sequence of human VGF, namely peptide 1 (SEQ ID NO: 27), peptide 2 (SEQ ID NO: 26), peptide 3 (SEQ ID NO: 2), peptide 4 (sequence) No.
  • peptide 9 SEQ ID NO: 28
  • peptide 10 SEQ ID NO: 29
  • Peptide 1 and peptide 2 have a force that is not modified at the N-terminus. It was plausible.
  • Peptide 3, Peptide 4, Peptide 9 and Peptide 10 were modified with both N-terminal and C-terminal modified.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) is the amino acid sequence of human VGF (SEQ ID NO: 9) at positions 565 to 577, and at the C-terminal of the sequence of SEQ ID NO: 26
  • Amino acid sequence excluding amide (SEQ ID NO: 3) is 554-57
  • SEQ ID NO: 2 is 554-583
  • SEQ ID NO: 5 is 586-615
  • the amino acid sequence of peptide 4 (SEQ ID NO: 5) was the same amino acid sequence as peptide V [Endocrinology, 135, 2742-2748 (1994)] derived from ushi VGF.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to the 554th to 615th sequences of the amino acid sequence of human VGF, and includes all amino acid sequences of SEQ ID NOS: 2 to 5.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 corresponds to the 556th to 585th sequences of the amino acid sequence of rat VGF, and is a rat sequence corresponding to peptide 3.
  • Chemical synthesis was performed by a solid phase synthesis method using a peptide synthesizer with No; -Fmoc-protected amino acid, and the synthesized peptide was purified by reverse phase HPLC.
  • Aspartic acid Fmoc— Asp (OtBu) — OH ( ⁇ ⁇ —9-fluore-l-methyloxy carbo-luo L-aspartic acid—13 t-butyl ester)
  • Threonine Fmoc—Thr (tBu) —OH ( ⁇ ⁇ —9—Fluorenylmethyloxycarbo Ninore O—t—Butinore L—Threonine)
  • Glutamic acid Fmoc-Glu (OtBu) — OH ( ⁇ ⁇ —9-fluorene-methylmethyl ball—L glutamic acid— ⁇ —t butyl ester)
  • Tyrosine Fmoc— Tyr (tBu) — OH ( ⁇ ⁇ — 9—Fluorenylmethyloxycarbonyl ro — t-butyl L—tyrosine)
  • Lysine Fmoc— Lys (Boc) — OH ( ⁇ ⁇ —9—fluorene-methylmethyl ⁇ t butyloxycarbonyl L-lysine)
  • Arginine Fmoc— Arg (Pbf) OH ( ⁇ ⁇ —9 Fluorenylmethyloxycarbo nitrone NG— 2, 2, 4, 6, 7 Pentamethyldihydrobenzofuran 5—Sulphonyl-Lanoreginine)
  • Cystine Fmoc-Cys (Trt) — OH: ⁇ ⁇ — 9—Fluore-rumethyloxycarbo-Lu S Trityl-L-cysteine
  • a Discovery HS C18 column (10 m, 25 cm x 21.2 cm, manufactured by Sigma-Ano Redrich Co.) was used.
  • ALDI-TOF mass spectrometer Autoflex (Autoflex, manufactured by Brucker) is used It was confirmed by mass spectrometry by MALDI method.
  • a saturated cyano 4-hydroxycinnamic acid (manufactured by Sigma-Aldrich) prepared with 50% ACN—0.1% TFA was used.
  • Peptide 1 (American 'Peptide' Company) was confirmed by MALDI mass spectrometry using MA LDI-TOF mass spectrometer Voyager DE Pro (Applied Biosystems).
  • the matrix used was a 2-fold diluted solution of ⁇ -cyan-4-hydroxycinnamic acid (Sigma-Aldrich) prepared with 50% AC N—0.1% TFA.
  • VGF-derived peptide activity to increase intracellular calcium ion concentration
  • the patent document (WO02Z010371) describes a method for producing an apoaequorin-expressing mouse, a method for evaluating a physiologically active substance using a biological sample derived from the mouse, and a physiologically active peptide as shown below using the organ of the mouse.
  • the experimental results evaluated are disclosed. That is, when angiotensin II was added to each organ obtained from an apoaequorin-expressing mouse at a final concentration of 1 ⁇ mol / L, strong luminescence was observed in blood vessels, eclampsia, and adrenal gland, and bragicun at a final concentration of 10 molZL. After supplementation, it was described that strong luminescence was observed in blood vessels, eclampsia, and adrenal glands, and apoaequorin-expressing mice can be used to evaluate the physiological activity of novel peptides.
  • Apoaequorin-expressing mice were prepared according to the method disclosed in Reference Example 4 of the patent document (WO02Z010371). After killing the apoaequorin-expressing mice, the thymus, spleen, bone, blood vessel, heart, kidney, adrenal gland, spleen, pituitary gland, and uterus were removed, and each organ was reduced to approximately Chopped into 1-2 mm 3 cubes. Next, in a 5 mL tube (Rohren-Tubes; manufactured by Sarstedt, No. 55. 476), 10 ⁇ mol ZL coelenterazine (Molecular Probes) dissolved in RPMI 1640 medium.
  • peptide 1 was found in the thymus, heart ( Figure 1), pituitary gland, and uterus
  • peptide 2 was found in the thymus, spleen, bone, blood vessel ( Figure 2), heart ( Figure 3), and uterus.
  • Peptide 3 is thymus, spleen, bone, blood vessel, heart ( Figure 4), kidney, adrenal gland, pituitary, uterus
  • peptide 4 is thymus, spleen, blood vessel ( Figure 5), pituitary, peptide 5 is In the heart (FIG. 6), peptide 9 was observed in the blood vessels (FIG. 7), and peptide 10 was observed in the heart (FIG.
  • peptides 1 to 5 and peptides 9 and 10 have an activity to increase the concentration of calcium ions in the cells, in the cells of the heart or blood vessels that are organs involved in the circulatory system. Gawakuta.
  • Wistar rats male, 10 weeks old, 250-300 g were anesthetized by intraperitoneal injection of 50 mg Z body weight pen pen valpital.
  • a catheter was inserted into the external jugular vein and internal carotid artery of an anesthetized rat, the internal carotid artery catheter was connected to a pressure monitor, and 300 nmol of peptide 2 (100 ⁇ L dissolved in saline from the external jugular vein) ) was administered as a bolus, and blood pressure was measured continuously.
  • the change in mean arterial pressure after peptide administration is shown in FIG. As can be seen in FIG. 10, a clear increase in blood pressure was observed with the administration of peptide 2.
  • a cysteine residue at the base of peptide 1 Peptide 7 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with the addition of was chemically synthesized in the same manner as in Example 1 by request from American Peptide Company.
  • Peptide 7 4.9 mg was covalently linked via a cysteine residue to maleimide activated keyhole limpet hemocyanin (Injec t Activated mcKLH; Pierce) lOmg.
  • the covalent bond reaction was performed according to the Pierce manual.
  • the obtained peptide 7 and KLH conjugate dialyzed with physiological saline was used as the antigen. Antigen was aliquoted and stored at -35 ° C until use.
  • the resulting physiological saline solution of lmL (equivalent to about 7Og of peptide 7) was mixed with Freund's complete adjuvant to make a stable emulsion, and male magpies (New Zealand) 9 times every 3 weeks.
  • White rabbit was immunized by intradermal administration. After the administration, the antibody titer was measured, and a serum was prepared from Usagika et al.
  • the antibody titer was measured by radioimmunoassay (RIA) as shown below. That is, in a polystyrene tube, RIA buffer [25 mmol ZL EDTA, 80 mmol / L sodium chloride, 0.05% di sodium, 0.5% N-ethino-remalimi-treated BSA, 0.5% Triton X— 50 mmol / L sodium phosphate buffer containing 100 (pH 7.
  • RIA buffer [25 mmol ZL EDTA, 80 mmol / L sodium chloride, 0.05% di sodium, 0.5% N-ethino-remalimi-treated BSA, 0.5% Triton X— 50 mmol / L sodium phosphate buffer containing 100 (pH 7.
  • ⁇ (%) (( ⁇ - ⁇ ) / ⁇ ) X 100
  • [0145] [ 12 3 ⁇ 4 labeling of the antigen peptide was performed by labeling the tyrosine residue on the terminal side of the antigen peptide by the lactoperoxidase method. That is, 1 g of peptide is dissolved in 25 L of 0.4 mol ZL sodium acetate (pH 5.6), and 10 ml of 0. lmol / L sodium acetate (pH 5.6) solution containing 200 ng of lactoperoxidase 10 / zz L Na 125 I 5 / ⁇ ⁇ ⁇ (18. 5 MBq), the 0.002% Kasani ⁇ containing 5 / z L and stirred with ⁇ Ka ⁇ , allowed to react for 10 minutes at 30 ° C.
  • antiserum above antibody titer showed 9 X 10 5, i.e. in the above RIA, be diluted into 9 X 10 5 times, 30% of ⁇ Ka ⁇ antigen peptide Using antisera that showed binding, the binding specificity to six types of peptides derived from VGF was examined by RIA.
  • RIA buffer containing antiserum 100 L diluted 9 X 10 5 fold with RIA buffer, a fixed amount of [125 1] labeled peptide 1 (about 20000cpm, 500 ⁇ 550Bq, about 1 Ofmol as a peptide amount)
  • 100 ⁇ L of the solution 100 L of RIA buffer containing each VGF-derived peptide diluted in stages, and incubate at 4 ° C for 40 hours. Were bound competitively.
  • antiserum was not added to measure non-specific binding, instead of using RIA buffer, and to measure the maximum binding amount, VGF-derived peptide solution was not added, and RIA buffer was used instead. The reaction using was also performed.
  • Nonspecific binding reactions are performed in quadruplicate and other reactions in duplicate.
  • the immune complex was precipitated from the reaction product in the same manner as the antibody titer measurement, and the radioactivity (cpm) was measured.
  • the maximum binding amount when the average radioactivity of the nonspecific binding reaction is N
  • the radioactivity value of the addition reaction of each VGF-derived peptide is Y
  • the radioactivity value of the maximum binding reaction is ⁇ .
  • the ratio ⁇ (%) of the amount ⁇ was determined by the following formula.
  • ⁇ / ⁇ (%) ⁇ ( ⁇ - ⁇ ) / ( ⁇ - ⁇ ) ⁇ X 100
  • ⁇ / ⁇ 50%, that is, maximum
  • the amount of the peptide that inhibits the binding amount by 50% was used as an index of the strength of binding of the antiserum to the peptide. The lower the amount of peptide that inhibits 50%, the stronger the binding.
  • SEQ ID NO: 8 is the 606th to 615th sequence of the amino acid sequence of human VGF, and does not include the amino acid sequence of peptide 1.
  • Peptide 1 is 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 fmol
  • Peptide 2 is 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024fmol
  • peptide 3 is 1, 3.3, 10, 3 3, 100, 333, 1000, 3300, 10000, 33000, 100000, 333000, lOOOOOOfm ol
  • peptide 8 is 1000, 10000, 100000, lOOOOOOfmol Measurements were made with each amount of peptide tube.
  • peptides 1 and 2 inhibited the binding of antisera to a similar extent in a dose-dependent manner, and the amount of 50% inhibition of peptide 1 was 7.5 fmol.
  • Peptide 3 also inhibited antisera binding in an amount-dependent manner, but the inhibition was about 10,000 times greater to show the same degree of inhibition as peptides 1 and 2.
  • Peptide 8 did not show any inhibition. Therefore, this antiserum has a very strong binding to peptide 1, which is an antigen, and also binds to peptide 2 having a structure containing peptide 1 to the same extent!
  • Peptide 3 has a structure that does not contain the peptide 1 amino acid sequence.
  • Peptide 1 has a structure without the C-terminal amide.
  • Peptide 8 does not contain the peptide 1 amino acid sequence. Is an antibody that binds to an epitope present in the sequence in which the C-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is amidated (SEQ ID NO: 27), particularly an epitope present in the region containing the amide at the C-terminus of the sequence; It was considered to be a binding antibody.
  • a novel peptide having circulatory regulation activity is provided. Since the peptide has a circulatory regulation activity, it is useful as a circulatory regulator and a pressor, and can be used for the treatment of circulatory diseases such as myocardial infarction, ischemic heart disease or cerebral infarction.
  • circulatory diseases such as myocardial infarction, ischemic heart disease or cerebral infarction.
  • SEQ ID NO: 1 Inventor: Motoo Yamazaki; Noriyuki Takahashi; Naoto Minamino;
  • SEQ ID NO: 10 DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 11 DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 12 DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 13 DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 17 Consensus sequence for VGF-derived peptide
  • SEQ ID NO: 18 Consensus sequence for VGF-derived peptide
  • SEQ ID NO: 20 Consensus sequence for VGF-derived peptide
  • SEQ ID NO: 21 peptide based on rat VGF sequence corresponding to peptide 2
  • SEQ ID NO: 22 peptide based on rat VGF sequence corresponding to peptide 1
  • SEQ ID NO: 23 consensus sequence of VGF-derived peptide
  • SEQ ID NO: 24 Consensus sequence for VGF-derived peptide
  • SEQ ID NO: 34 DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28
  • SEQ ID NO: 35 DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29

Abstract

　本発明により、循環調節活性を有する新規なペプチドが提供される。該ペプチドは、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤として有用であり、また心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療に用いることができる。

Description

明 細 書
新規ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、新規ペプチド、該ペプチドをコードする DNA、該ペプチドと特異的に結 合する抗体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、該ペプチドを利用す るスクリーニング方法に関する。 背景技術
[0002] VGF遺伝子は、ラット PC12細胞の神経成長因子刺激により増加する遺伝子として 同定され (非特許文献 1参照）、その後、ヒト VGF遺伝子が単離された (非特許文献 2 参照)。 VGF遺伝子破壊マウスでは、摂食量は不変、体重減少、体脂肪減少、酸素 消費増加、運動量増加が認められ、また生殖機能にも異常が見られた。特に、エネ ルギ一代謝亢進が認められて ヽる (非特許文献 3参照)。
[0003] VGF遺伝子は中枢、末梢神経系、内分泌、神経内分泌細胞に発現し、発現や分 布は、摂食行動や消化管の運動を制御する-ユーロペプチド Ύ、ペプチド ΎΥ、グレリ ン (ghrelin)、 コレシストキュン等の発現パターンと類似し、エネルギー代謝に関連す る部分に存在する (非特許文献 4参照)。
VGF遺伝子がコードする蛋白質 (以下、 VGFとよぶ）は、ヒトで 615アミノ酸、ラット / マウスで 617アミノ酸である。 VGFの 1〜22番目のアミノ酸はシグナルペプチドであり 、またプロホルモンコンペルターゼによる切断やアミド化等のプロセッシングを受ける 配列が存在する。 VGFのプロセッシングについて、ラットを中心に調べられており、ラ ットの脳より、ラット VGF (598— 617) (かっこ内の数字は、 VGFのアミノ酸配列にお けるペプチドの配列の位置を表す。以下のペプチドについても同様）、ラット VGF (5 99— 617)、ラッ卜 VGF (601— 617)、ラッ卜 VGF (602— 617)、ラッ卜 VGF (587— 617)、ラッ卜 VGF (588— 617)、ラッ卜 VGF (567— 617)、ラッ卜 VGF (556— 617) 、ラット¥0 （489— 617)、ラット¥0 18 (181^^ :配列未確認）の¥0 に由来する ペプチドの存在が確認されて 、る（非特許文献 5参照)。ラット VGF (556 617)の 部分ペプチドである、ラット VGF (577— 617)、ラット VGF (588— 617)、ラット VGF (599-617)は、ォスのラットの視床下部室傍核 (PVN)に直接投与することにより、 勃起を引き起こす活性を示した力 ラット VGF (556— 576)にはこの活'性は確認され なカゝつた (非特許文献 6参照)。また、 VGF (588— 596)を VGF遺伝子破壊マウスに 腹腔内投与したところ、 10%〜 15%程度の体重上昇があったことが報告されている (特許文献 1参照)。
[0004] ヒト VGFに由来するペプチドについては、ヒト脳脊髄液においてヒト VGF (23— 62 )、ヒト VGF (23— 59)、ヒト VGF (26— 62) (非特許文献 7参照）、さらに、ヒト VGF (2 3— 58)、ヒト VGF (24— 59)、ヒト VGF (24— 62)、ヒト VGF (26— 57)、ヒト VGF (2 6— 58)、ヒト VGF (26— 59)、ヒト VGF (26— 61)、ヒト VGF (26— 64)、ヒト VGF (4 9 62)、ヒト VGF (90— 114)、ヒト VGF (350— 367)、ヒト VGF (350— 370)、ヒト VGF (373— 404)、ヒト VGF (373— 417)、ヒト VGF (420— 471)、ヒト VGF (420 —478)の存在が報告されている（特許文献 2参照)。また、ゥシの脳下垂体後葉から 、ラット VGF (588— 617)に相当し、ヒト VGFの 586— 615番目の配列と同一の配列 のペプチドが単離されている（非特許文献 8参照)。しかし、これらのヒトまたはゥシの VGFに由来するペプチドの生理活性にっ 、ては、報告されて!、な!/、。
[0005] VGFまたは VGFに由来するペプチドを特異的に認識する抗体としては、ラット VG Fの C末端に相当する 573〜617番目のアミノ酸配列力もなるペプチドを抗原とした ポリクローナル抗体（非特許文献 9参照）、ヒト VGFの 556〜565番目のアミノ酸配列 力 なるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体 (非特許文献 4参照）、ラット VGFの 443〜588番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非 特許文献 10参照)等が報告されて ヽる。
特許文献 1： WO01/07477
特許文献 2： WO02Z82075
非特許文献 1 :サイエンス (Science), (米国）， 1985年，第 229卷，第 4711号， p. 39 3- 395
非特許文献 2 :ジヱノミクス (Genomics), (米国）， 1997年，第 45卷、第 2号， p. 443 -446
非特許文献 3 :二ユーロン (Neuron), (米国）， 1999年，第 23卷，第 3号， p. 537— 5 非特許文献 4 :セリユラ一'アンド'モレキユラ一'ニューロバイオロジー（Cellular and M olecular Neurobiology) , (米国）， 2004年，第 24卷，第 4号， p. 517— 533 非特許文献 5：ジャーナル ·ォブ ·ニューロケミストリー（Journal of Neurochemistry) , ( イギリス；)， 2002年，第 81卷，第 3号， p. 565 - 574
非特許文献 6：ョ一口ピアン'ジャーナノレ ·ォブ ·ニューロサイエンス (European Journal of Neuroscience) , (フランス）， 2004年，第 20卷，第 11号， p. 3035— 3040 非特許文献 7：ジャーナル ·ォブ ·クロマトグラフィー B：バイオメディカル ·サイェンシズ
• ント · . プリケ ~~ンヨンス（Journal ofし hromatograpny B: Biomedical Sciences and
Applications) , (オランダ）， 2001年，第 754卷，第 2号， p. 357— 367
非特許文献 8 :エンドクリノロジー（Endocrinology) , (米国）， 1994年，第 135卷，第 6 号， p. 2742- 2748
非特許文献 9 :エンドクリノロジー（Endocrinology) , (米国）， 1999年，第 140卷，第 8 号， p. 3727- 3735
非特許文献 10 :ザ'ェンボ 'ジャーナル（The EMBO Journal) , (イギリス）， 1989年， 第 8卷，第 8号， p. 2217- 2223
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、循環調節活性を有する新規なペプチドを提供すること、さらに該 ペプチドをコードする DNA、該ペプチドと特異的に結合する抗体、該ペプチドの製 造方法、該ペプチドを含む医薬、および該ペプチドを利用するスクリーニング方法を 提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は以下の（1)〜（12)に関する。
(1)以下の（a)〜（e)のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩： (a)配列番号 1〜4のいずれか、 28または 29で表されるアミノ酸配列を含むペプチド (ただし、配列番号 9、 30、 31、 32または 33で表されるアミノ酸配列力もなるペプチド は除く）； (b)配列番号 1〜4のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以 上 5以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、心臓また は血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(c)配列番号 1〜4のいずれ力 28または 29で表されるアミノ酸配列と 90%以上の 相同性を有するアミノ酸配列力 なり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムィ オン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(d)下記式 (I)で表されるペプチド (ただし、配列番号 14〜16の配列力もなるぺプチ ドを除く）
[0008] [化 1]
Z1 - A - Z2 (I)
[0009] (式中、 Z1は水素原子または 1〜： L 1個のアミノ酸力 なる任意の配列のペプチド残基 を表し、 Aは配列番号 17のアミノ酸配列からなるペプチド残基を表し、 Z2は、アミノ基 または 1〜38個のアミノ酸力 なる任意の配列のペプチド残基を表す）；および
(e)下記式 (II)で表されるペプチド
[0010] [化 2]
R1 - B - R2 (II)
[0011] (式中、 R1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノィル、置換もしくは非置換のァ ロイル、置換もしくは非置換のへテロアリールカルボ-ル、置換もしくは非置換のアル コキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールォキシカルボ-ル、または置換もし くは非置換のへテロアリールォキシカルボ-ルを表し、 R2はヒドロキシ、置換もしくは 非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、 Bは上記 (a)〜（d) の!、ずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
[0012] (2)ペプチド力 以下の（a)〜（d)のいずれかのペプチドである、（1)記載のペプチド またはその薬理学的に許容される塩：
(a)配列番号 1のアミノ酸配列からなるペプチド；
(b)配列番号 2のアミノ酸配列力 なるペプチド；
(c)配列番号 28のアミノ酸配列力もなるペプチド；
(d)配列番号 29のアミノ酸配列力もなるペプチド； (e) (1)の式（II)において、 R1が水素原子であり、 Bが配列番号 3のアミノ酸配列から なるペプチド残基であり、かつ R2が非置換のァミノであるペプチド；および
(f) (1)の式（II)において、 R1が水素原子であり、 Bが配列番号 4のアミノ酸配列から なるペプチド残基であり、かつ R2が非置換のァミノであるペプチド。
[0013] (3) (1)の（a)〜（c)に記載のペプチドをコードする DNA。
(4) (3)記載の DNAをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
(5) (4)記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(6) (5)記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から該ペプチドを採取することを特徴とする該ペプチドの製造方法。
[0014] (7)配列番号 4のアミノ酸配列または配列番号 4のアミノ酸配列の C末端がアミド化し た配列中に存在するェピトープと結合する抗体。
(8) (7)記載の抗体を用いて、（1)または（2)に記載のペプチドを検出または定量す る方法。
[0015] (9)以下の（a)〜 (f)力 選ばれる少なくとも 1つのペプチドまたはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含む循環調節剤：
(a)配列番号 1〜5のいずれか、 28または 29で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
(b)配列番号 1〜5のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以 上 5以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、心臓また は血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(c)配列番号 1〜5のいずれ力 28または 29で表されるアミノ酸配列と 90%以上の 相同性を有するアミノ酸配列力 なり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムィ オン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；および
(d) (1)の式 (I)で表されるペプチド；
(e)配列番号 23のアミノ酸配列力 なるペプチド、または配列番号 23のアミノ酸配列 の N末端に 1〜32個のアミノ酸力もなる任意のアミノ酸配列が付カ卩したアミノ酸配列 からなるペプチド。
(f)下記式 (III)で表されるペプチド [0016] [化 3]
R3 - C R4 (III)
[0017] (式中、 R3は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノィル、置換もしくは非置換のァ ロイル、置換もしくは非置換のへテロアリールカルボ-ル、置換もしくは非置換のアル コキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールォキシカルボ-ル、または置換もし くは非置換のへテロアリールォキシカルボ-ルを表し、 R4はヒドロキシ、置換もしくは 非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、 Cは上記 (a)〜（e) の!、ずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
[0018] (10) (9)記載の（a)〜(f)のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される 塩および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し 、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞 に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が抑制される場合の試験物質を 該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻 害する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細 胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質のスクリーニング方法。
(11) (9)記載の（a)〜 (f )の 、ずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される 塩および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し 、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞 に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が促進される場合の試験物質を 該ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促 進する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細 胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質のスクリーニング方法。
(12) (9)記載の（a)〜 (f)のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される 塩および試験物質を心臓もしくは血管の細胞または該細胞の膜画分に接触させた 場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許 容される塩の結合量を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試 験物質の非存在下で該細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該ペプチド またはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較して、結合量が低下する場合の 試験物質を該ペプチドの受容体に対するァゴ-ストまたはアンタゴ-ストとして特定 することを特徴とする、該ペプチドの受容体に対するァゴニストまたはアンタゴニスト のスクリーニング方法。 発明の効果
[0019] 本発明により、循環調節活性を有する新規ペプチド、該ペプチドをコードする DNA 、該ペプチドと特異的に結合する抗体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む 医薬、該ペプチドを利用する、該ペプチドの活性を促進または抑制する物質あるい は該ペプチドの受容体に対するァゴ-ストまたはアンタゴ-ストのスクリーニング方法 が提供される。本発明のペプチドは、心筋梗塞、虚血性心疾患、脳梗塞等の循環器 系疾患の治療に有用である。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]図 1は、 1 μ molZLのペプチド 1 (配列番号 27)による、アポェクオリン発現マウ スの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時 間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 1を添加した。
[図 2]図 2は、 5 μ molZLのペプチド 2 (配列番号 26)による、アポェクオリン発現マウ スの血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時 間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 2を添加した。
[図 3]図 3は、： molZLのペプチド 2による、アポェクオリン発現マウスの心臓の細 胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸 は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 2を添カ卩した。
[図 4]図 4は、 1 μ molZLのペプチド 3 (配列番号 2)による、アポェクオリン発現マウス の心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（ 秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 3を添加した。
[図 5]図 5は、 5 μ molZLのペプチド 4 (配列番号 5)による、アポェクオリン発現マウス の血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（ 秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 4を添加した。
[図 6]図 6は、 5 μ molZLのペプチド 5 (配列番号 1)による、アポェクオリン発現マウス の心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（ 秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 5を添加した。
[図 7]図 7は、 5 μ molZLのペプチド 9 (配列番号 28)による、アポェクオリン発現マウ スの血管の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時 間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 9を添加した。
[図 8]図 8は、 1 μ molZLのペプチド 10 (配列番号 29)による、アポェクオリン発現マ ウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時 間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 10を添加した。
[図 9]図 7は、 5 /z molZLのペプチド 10による、アポェクオリン発現マウスの血管の細 胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸 は毎秒の相対発光量 (RLU)である。 25秒でペプチド 10を添カ卩した。
[図 10]図 10は、ペプチド 2によるラットの血圧上昇を示す。横軸はペプチド 2投与後 の時間 (分)、縦軸は平均動脈圧の変動である。
[図 11]図 11は、抗血清の VGFに由来する各種ペプチドに対する結合の特異性を示 す。參はペプチド 1、◊はペプチド 2、口はペプチド 3、♦はペプチド 8 (配列番号 8) 添加時における、抗血清の特異的結合の最大結合量に対する割合を示す。横軸は 各ペプチドの添加量 (fmol)、縦軸は最大結合量に対する特異的結合の割合 BZB
0
(%)である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 1.本発明のペプチド
本発明のペプチドは、以下の（a)〜（e)のいずれかのペプチドまたはその薬理学的 に許容される塩である。
[0022] (a)配列番号 1〜4のいずれ力 28または 29で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
(ただし、配列番号 9、 30、 31、 32、 33のアミノ酸配列からなるペプチドは除く）。 配列番号 9のアミノ酸配列は、ヒト VGFのアミノ酸配列である。（a)のペプチドのアミ ノ酸配列は、配列番号 1〜4のいずれか、 28または 29で表される配列を含んでいれ ば、アミノ酸数はいくつでもよいが、 80以下が好ましぐ 60以下がさらに好ましぐ 40 以下が特に好ましい。
(b)配列番号 1〜4のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以 上 5以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、心臓また は血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド。
(c)配列番号 1〜4のいずれ力 28または 29で表されるのいずれかのアミノ酸配列と 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、心臓または血管の細胞の細胞内 カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド。
(d)下記式 (I)で表されるペプチド (ただし、配列番号 14〜16の配列力もなるぺプチ ドを除く）
[0023] [化 4]
Z1 - A - Z2 (I)
[0024] (式中、 Z1は水素原子または 1〜8個のアミノ酸力 なる任意の配列のペプチド残基 を表し、 Aは配列番号 17のアミノ酸配列からなるペプチド残基を表し、 Z2は、アミノ基 または 1〜32個のアミノ酸力 なる任意の配列のペプチド残基を表す)。
配列番号 14〜16のアミノ酸配列は、それぞれラット VGF (567— 585)、ラット VGF (567— 617)、ラッ卜 VGF (556— 617)のア 酸配列である。
(e)下記式 (II)で表されるペプチド。
[0025] [化 5]
R1 - B - R2 (II)
[0026] (式中、 R1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノィル、置換もしくは非置換のァ ロイル、置換もしくは非置換のへテロアリールカルボ-ル、置換もしくは非置換のアル コキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールォキシカルボ-ル、または置換もし くは非置換のへテロアリールォキシカルボ-ルを表し、 R2はヒドロキシ、置換もしくは 非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、 Bは上記 (a)〜（d) の!、ずれかのペプチドのペプチド残基を表す）
[0027] 配列番号 1〜4のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以上 5以下のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ 一もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、 1以上 5以下のアミノ酸残基の置 換、欠失もしくは付加があることを意味し、置換、欠失もしくは付加が同時に生じても よい。置換または付加されるアミノ酸としては、例えば、必須アミノ酸として知られる 20 種類の L-アミノ酸、すなわち Lーァラニン、 Lーァスパラギン、 Lーァスパラギン酸、 L —アルギニン、 L—グルタミン、 L—グルタミン酸、グリシン、 L—ヒスチジン、 L—イソ口 イシン、 L一口イシン、 L—リジン、 L—メチォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L—プロリン 、 L—セリン、 L—スレオニン、 L—トリプトファン、 L—チロシン、 L—パリンおよび L— システィンがあげられる力 これに限定されるものではなぐ例えば、 tert-ロイシン、ノ ルロイシン、ノルパリン、 2—アミノブタン酸、 O—メチルセリン、 t—ブチルグリシン、 t —ブチルァラニン、シクロへキシルァラニン、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2 —ァミノアジピン酸、 2—アミノスべリン酸、オル-チン、 2, 4—ジァミノブタン酸、 2, 3 —ジァミノプロピオン酸、 3—ヒドロキシプロリン、 4—ヒドロキシプロリン、ホモセリン等 の他のアミノ酸でもよぐまた D—アミノ酸あるいは |8—アミノ酸でもよい。
[0028] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残 基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2—アミノブ タン酸、メチォニン、 O—メチルセリン、 t—ブチルグリシン、 t—ブチルァラニン、シクロ へキシルァラニン、 tert-ロイシン
B群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2—ァミノ アジピン酸、 2—アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グルタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2, 4—ジアミノブタン酸、 2, 3—ジァミノプロピ オン酸
E群：プロリン、 3—ヒドロキシプロリン、 4ーヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ-ルァラニン、チロシン
[0029] 配列番号 1〜4のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列と 90%以上の相 同性を有するアミノ酸配列とは、相同性解析プログラム BLAST 2 Sequences [FEMS M icrobiol Lett. 174, 247 (1999)〕を用いてデフォルトの条件（program: blastp、 matrix: BLOSUM62^ open gap: 丄丄 penalties、 extension gap: 1 penalty ^ gap x— dropoff: 50、 ex pect: 10.0、 word size: 3)で計算し、アラインメントをしたときに、相同性 (対象の配列と 配列番号 1〜4のいずれ力、 28または 29のうちの相同性解析を行った配列との間で 同一のアミノ酸数 Z配列番号 1〜4のいずれ力 28または 29のうちの相同性解析を 行った配列の全体のアミノ酸数 +アラインメント時に挿入されたギャップの数）が 90% 以上、好ましくは 95%以上であるアミノ酸配列をいう。
[0030] 式 (I)において、 Aは配列番号 17のアミノ酸配列、すなわち下記の式 (IV)で表され るアミノ酸配列力もなるペプチド残基である。
[0031] [化 6]
His— X1— His His Ala Leu Pro Pro X2— Arg— His X3— Pro (IV) [0032] (式中、 X1、 X2および X3は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す） 式 (IV)において、 X1、 X2および X3は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を 表すが、好ましくは X1はチロシンまたはフエ-ルァラニンであり、 X2はセリン、スレオ- ン、ホモセリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2 アミノブタン酸、メチォニン、 O—メチルセリン、 t—ブチルグリシン、 tーブチルァラ ニン、シクロへキシルァラニンまたは tert-ロイシンであり、 X3はチロシン、フエ-ルァラ ニンまたはヒスチジンであり、より好ましくは X2はセリンまたはァラニンであり、 X3はチ 口シンまたはヒスチジンであり、さらに好ましくは、 X1、 X2、 X3はそれぞれチロシン、セ リン、チロシンである力、またはそれぞれフエ二ルァラニン、ァラニン、ヒスチジンであ る。
[0033] 式（I)において、 Z1は水素原子または 1〜： L 1個のアミノ酸からなる任意の配列のぺ プチド残基であるが、好ましくは水素原子または、下記式 (V)で表されるアミノ酸配列 (配列番号 18)からなるペプチド残基である。
[0034] [化 7]
Thr— Leu— Gin— Pro— Pro— X4— X5— X6— Arg— Arg— Arg (V)
[0035] (式中、 X4、 X5および X6は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す） 式 (V)において、 X4、 X5および X6は好ましくはセリン、スレオニン、ホモセリン、口イシ ン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2—アミノブタン酸、メチ ォニン、 O—メチルセリン、 t—ブチルグリシン、 tーブチルァラニン、シクロへキシルァ ラニンまたは tert-ロイシンであり、より好ましくは X4および X5はセリンまたはァラニン であり、 x6はセリンまたはロイシンであり、さらに好ましくは X4、 X5および X6がそれぞれ セリン、ァラニン、ロイシンである力 またはそれぞれァラニン、セリン、セリンである。
[0036] 式 (I)において、 Z2はァミノ基または 1〜38個のアミノ酸力 なる任意の配列のぺプ チド残基であるが、好ましくはァミノ基、下記式 (VI)で表されるアミノ酸配列（配列番 号 19)からなるペプチド残基、または、下記式 (VII)で表されるアミノ酸配列（配列番 号 20)からなるペプチド残基である。
[0037] [化 8]
X7 - X8 - Glu - Ala - Gin - Ala (VI)
[0038] (式中、 X7および X8は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
[0039] [化 9]
X9 - X10 - Glu - Ala - Gin - Ala - Arg - Arg - Ala - Gin - Glu - Glu - Ala - X11 - A1 a— ulu— ulu— Arg— Arg— Leu— uln— ulu— uln— Glu— Glu— Leu— ulu— Asn— Ty r— lie— Glu - His - Val - Leu— Leu— X12— Arg— Pro (VII)
[0040] (式中、 X9、 X1G、 X11および X12は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す )
式 (VI)および (VII)において、好ましくは、 X7および X9はグリシン、ァスパラギン酸、 グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2—ァミノアジピン酸または 2— アミノスべリン酸であり、 X8および X1Gはアルギニン、リジン、オル-チン、 2, 4—ジアミ ノブタン酸、 2, 3—ジァミノプロピオン酸、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン 、ノルパリン、ァラニン、 2—アミノブタン酸、メチォニン、 O—メチルセリン、 t—ブチル グリシン、 tーブチノレアラニン、シクロへキシルァラニンまたは tert-ロイシンであり、 X11 はァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2—アミノア ジピン酸または 2—アミノスべリン酸であり、 X12はアルギニン、リジン、オル-チン、 2, 4ージアミノブタン酸、 2, 3—ジァミノプロピオン酸またはヒスチジンであり、より好まし くは X7および X9はグリシンまたはァスパラギン酸であり、 X8および X1Gはアルギニンま たはロイシンであり、 X11はァスパラギン酸またはグルタミン酸であり、 X12はアルギニン またはヒスチジンであり、さらに好ましくは、 X7および X8はそれぞれグリシンおよびァ ルギニンである力、またはそれぞれァスパラギン酸およびロイシンであり、 X9、 X1G、 X1 1および x12はそれぞれグリシン、アルギニン、グルタミン酸およびアルギニンであるか
、またはそれぞれァスパラギン酸、ロイシン、ァスパラギン酸およびヒスチジンである。
[0041] 上記式 (II)の各基の定義において、アルカノィルとしては、例えば直鎖または分枝 状の炭素数 1〜20の、例えばホルミル、ァセチル、プロピオニル、ブチリル、イソプチ リノレ、ノ レリノレ、イソノ レリノレ、ピノくロイノレ、へキサノィノレ、ヘプタノィノレ、ラウロイノレ、ェ ィコサノィル等があげられる。
ァロイルおよびァリールォキシカルボ-ルのァリール部分としては、例えば炭素数 6 〜15の、例えばフエニル、ナフチル等があげられる。
[0042] ヘテロァリールカルボ-ルおよびへテロアリールォキシカルボ-ルのヘテロァリー ル部分としては、例えばフリル、チェ-ル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ォキサ ゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリダジ -ル、ピリミジニル、ピラジ -ル、インドリル、イン ダゾリル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリ-ル、キナゾリ-ル、キノ キサリニル、ナフチリジ-ル等があげられる。
[0043] アルコキシカルボ-ルおよびアルコキシのアルキル部分としては、例えば直鎖また は分枝状の炭素数 1〜20の、例えばメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチ ル、ペンチル、へキシル、ヘプチル、デシル、ドデシル、エイコシル等があげられる。 置換アルカノィル、置換アルコキシカルボ-ルおよび置換アルコキシにおける置換 基としては、同一または異なって置換数 1〜3の、例えばヒドロキシ、カノレポキシ、炭素 数 3〜8の、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル、 シクロへプチル、シクロォクチル等の脂環式アルキル、置換もしくは非置換のフエ- ル、フルォレニル等があげられる。置換フエ-ルの置換基としては、同一または異な つて置換数 1〜3の、例えばアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、スルホ、シァノ 、ハロゲン等があげられ、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があ げられる。置換フエ-ルの置換基としてのアルキル、アルコキシのアルキル部分は、 前記アルコキシカルボ-ルおよびアルコキシのアルキル部分と同義である。
[0044] 置換ァロイル、置換ァリールォキシカルボ-ル、置換へテロアリールカルボ-ルおよ び置換へテロアリールォキシカルボ-ルにおける置換基は、同一または異なって置 換数 1〜3であり、上記の置換フ ニルの置換基と同義である。 置換ァミノにおける置換基としては、同一または異なって置換数 1〜2の、例えば置 換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のァリール等があげられる。アルキ ルは、前記アルコキシ等のアルキル部分と同義であり、置換アルキルの置換基は、前 記置換アルコキシ等の置換基と同義である。ァリールは、前記ァロイルまたはァリー ルォキシカルボ-ルのァリール部分と同義であり、置換ァリールの置換基は、前記ァ ロイルまたはァリールォキシカルボ-ルの置換基と同義である。
[0045] また、 Bを構成するアミノ酸残基の側鎖の官能基が化学的に修飾または保護された ものであっても力まわな 、。そのように側鎖官能基が化学的に修飾または保護された アミノ酸残基としては、例えば、側鎖カルボキシ基がベンジルエステルで保護された ァスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基、側鎖チオール基がカルボキシメチル 化されたシスティン残基等があげられる。
[0046] 薬理学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩 等があげられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸 塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩等の有機酸塩 があげられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩 、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等 があげられる。有機塩基付加塩としては、例えば、メチルァミン、ェチルァミン、ァ-リ ン等の一級ァミン、ジメチルァミン、ジェチルァミン、ピロリジン、ピぺリジン、モルホリ ン、ピぺラジン等の二級ァミン、トリメチルァミン、トリエチルァミン、 N, N—ジメチルァ 二リン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩、アンモ-ゥム塩等があげられる。
[0047] 本発明のペプチドの具体的な例として、（i)配列番号 1のアミノ酸配列力 なるぺプ チド、（ii)配列番号 2のアミノ酸配列力 なるペプチド、（iii)式 (II)において、 R1が水 素原子であり、 Bが配列番号 3のアミノ酸配列力 なるペプチド残基であり、かつ R2が 非置換のァミノであるペプチド、すなわち配列番号 3のアミノ酸配列において、 C末端 のプロリン残基がアミドィ匕して 、る配列（配列番号 26のアミノ酸配列）からなるぺプチ ド、（iv)式（II)において、 R1が水素原子であり、 Bが配列番号 4のアミノ酸配列からな るペプチド残基であり、かつ R2が非置換のァミノであるペプチド、すなわち配列番号 4 のアミノ酸配列にぉ 、て、 C末端のプロリン残基がアミド化して 、る配列（配列番号 27 のアミノ酸配列）からなるペプチド、（V)配列番号 28のアミノ酸力もなるペプチド、 (vi) 配列番号 29のアミノ酸からなるペプチド、 (vii)配列番号 6のアミノ酸配列力 なるぺ プチド、（viii)配列番号 21のアミノ酸配列からなるペプチド、（ix)配列番号 22のァミノ 酸配列からなるペプチドがあげられる。 （vii)〜（ix)のペプチドは、（ii)〜（iv)のぺプ チドにそれぞれ対応する、ラット VGFの配列に基づくペプチドである。
[0048] 2.本発明のペプチドの製造方法
(1)化学的合成による製造方法
本発明のペプチドは、例えば泉屋信夫、加藤哲夫ら， 「ペプチド合成の基礎と実験
」，丸善， （1985年)、相本三郎ら， 「実験化学講座」，第 4版，第 22卷， 「有機合成 IV 酸 'アミノ酸'ペプチド」，丸善， （1999年）、 Int. J. Pept. Protein Res. 35, 161-214 (1 990)、 Fields, G. B., Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology, vol. 28 9, Academic Press, (1997)、 Pennington, M. W. and Dunn, B. M., Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 35, Humana Press, (1994)等【こ g己載 の通常のペプチド合成法により合成後、精製すること〖こよって得ることができる。具体 的な合成法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物 法、ジクロロメタン法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等があげ られる。また、その合成は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用すること ができる。すなわち、本発明のペプチドを構成するアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドを 合成することができる。
[0049] さらに、本発明のペプチドが、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖および Zまた はペプチドのァミノ末端および Zまたはペプチドのカルボキシ末端が化学修飾や保 護がなされているものである場合には、ペプチド合成後に化学修飾する方法、化学 修飾されたアミノ酸を用いてペプチド合成する方法、またはペプチド合成の最終脱保 護の反応条件を適当に選ぶ方法等、ペプチド合成化学の分野において従来公知の 方法〔泉屋信夫ら， 「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善， （1985年)、矢島治明監修 , 「続医薬品の開発」，第 14卷， 「ペプチド合成」，広川書店， （1991年)、 日本生化 学会編「生化学実験講座」，第 1卷， 「タンパク質の化学 IV—ィ匕学修飾とペプチド合 成」，東京化学同人、大野素徳ら， 「生物化学実験法」，第 12, 13卷， 「蛋白質の化 学修飾 (上）（下)」，学会出版センター， （1981年)〕によって製造することができる。
[0050] また、本発明のペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。ぺ プチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト 'ケムテック社 (Advanced ChemTech, Inc.)製ペプチド合成機等の市販のペプチド合 成機上で、適当に側鎖を保護した N o;—Fmoc ( 9—フルォレニルメチルォキシカル ボニル）—アミノ酸あるいは N a— Boc (t—ブチルォキシカルボ-ル）—アミノ酸等を 用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミ ノ酸および担体榭脂は、アプライド 'バイオシステムズ社 (Applied Biosystems) ,島津 製作所、国産化学株式会社、 EMDバイオサイェンシズ社（EMD Biosienses, Inc.)、 渡辺化学株式会社、アドバンスト'ケムテック社、アナスペック社 (AnaSpec, In ）また はペプチド研究所株式会社等力 入手することができる。
[0051] 本発明のペプチドの精製は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマ トグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶等を組み合わせて行なうことができる。
[0052] (2)遺伝子工学的手法による製造方法
本発明のペプチドが前述の 20種類の必須アミノ酸力もなり、側鎖、 N末端または C 末端の修飾を受けていない場合は、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd e dition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載された方法等を用い、 例えば以下の方法により、本発明のペプチドをコードする DNAを宿主細胞中で発現 させて、製造することができる。
[0053] 本発明のペプチドをコードする DNAは、本発明のペプチドのアミノ酸配列から、コ ードする塩基配列を設計し、 DNA合成機により合成することができる。また、本発明 のペプチドが配列番号 1〜4のいずれかの配列を含むヒト VGFの部分ペプチドの場 合は、ヒトの脳または脾臓の細胞の cDNAを铸型とした PCRにより、単離することもで きる。本発明のペプチドをコードする DNAを、本発明のペプチドの製造に用いる場 合は、本発明のペプチドをコードする領域の末端は終止コドンになるようにする。例 えば、本発明のペプチドである配列番号 1、 2、 3、 4、 28および 29のそれぞれのアミ ノ酸配列からなるペプチドをコードする DNAの例として、配列番号 10、 11、 12、 13、 34および 35のそれぞれの塩基配列からなる DNAをあげることができる。
[0054] 以下に、本発明のペプチドが N末端力メチォニンである場合の製造方法を記載す る。
上記で得られた本発明のペプチドをコードする DNAを適当な発現ベクターのプロ モーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製し、該組換えベクターを
、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、例えば細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、 目的と する遺伝子を発現できるものであれば 、ずれも用いることができる。
[0055] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中へ の組込が可能で、本発明のペプチドをコードする DNAを転写できる位置にプロモー ターを含有して ヽるものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のペプチドをコードする DNAを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の DNA、転写終結配列、より構成された ベクターであることが好まし 、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/、てもよ!/ヽ
[0056] 発現ベクターとしては、例えば、 pSE420 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-1 (プロメ ガ社製）、 pQE-30 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、 pGELl〔 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript II SK (―) (ストラタジーン 社)、 PTrs30〔形質転換大腸菌株 (FERM BP-5407)より調製〕、 PTrs32〔形質転換大 腸菌株（FERM BP-5408)より調製〕、 pGHA2〔形質転換大腸菌株（FERM BP-400)よ り調製〕、 PGKA2〔形質転換大腸菌株 (FERM P-6798)より調製〕、 PTerm2 (特開平 3_ 22979)、 pGEX— 2T (GEヘルスケア社製）、 pET (ノバジェン社製）、 pKK223-2 (GEへ ルスケア社製）、 pMAL-c2X (ニュー'イングランド 'バイオラブズ社製)等をあげること ができる。
[0057] プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。
例えば、 trpプロモーター（P )、 lacプロモーター、 Pプロモーター、 Pプロモーター、
tip L R T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることがで きる。また を 2つ直列させたプロモーター（Ρ X 2)、 tacプロモーター、 lacT7プロモ
Ptrp trp
一ター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いる ことができる。
[0058] リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンと の間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま 、。 本発明の組換えベクターにおいては、本発明の DNAの発現には転写終結配列は 必ずしも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ま しい。
宿主細胞としては、ェシエリヒア（Escherichia)属、セラチア（Serratia)属、バチルス（ Bacillus)属、ブレビパクテリゥム（Brevibacterium)属、コリネパクテリゥム（Corvnebacte rium)属、ミクロノくクテリウム（Microbacterium)属、シユードモナス (Pseudomonas)鼠等 に属する微生物、例えば、 Escherichia coli XL1- Blue、 Escherichiacoli XL2- Blue、 Es chericnia coli DH1、 Escherichia coliMClOOO. Escherichia coli KY3276、 Escherichia coliW1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Eschericniacoli No.49 、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coliTBL Serratia ficaria. Serratia fonticola、 S erratialiauefaciens、 Serratia marcescens. Bacillus subtilis、 Bacillusamvloliauefacines 、 Brevibacterium ammoniagenes. BrevibacteriumimmariophilumATCC 14068、 Breviba cterium saccharolvticum ATCC14066、 Brevibacteriumflavum ATCC14067、 Brevibac terium lactofermentum ATCC13869、 Corvnebacteriumglutamicum ATCC13032、 Cor vnebacterium glutamicum ATCC13869、 Corvnebacteriumacetoacidophilum ATCC 13 870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、 Pseudomonasputida、 Pseudomo nas sp. D-0110等をあげることができる。
[0059] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭 63- 2483942)、または Ge ne, 17, 107 (1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法 等をあげることができる。 [0060] 酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等をあげる ことができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば、へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プ 口モーター、 gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、 MF a 1プ 口モーター、 cup 1プロモーター等をあげることができる。
[0061] 宿主細胞としては、サッカロミセス (Saccharomvces)属、シゾサッカロミセス (Schizosa ccharomvces クルィベロ セス (Kluweromvces)腐、トリコスホロン (Trichosporon) 属、シュヮニォミセス（Schwanniomvces)属、ピキア（Pichia)属、カンデイダ（Candida) 為等に属する微生物、例？ _は、 Saccharomvces cerevisiae. achizosaccharomvcespom be、 Kluweromvces lactis. fnchosporon pullulans. achwanniomvcesalluvius、 Candida 等をあげることができる。
[0062] 組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1990)〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチ ゥム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (19 78)記載の方法等をあげることができる。
[0063] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNA3.1(+)
(インビチロジェン社製）、 PAGE107〔特開平 3- 22979、 Cytotechnology, 3, 133 (1990) 〕、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8〔Nature, 329, 840 (1987)〕、 pREP4 (Invitroge n社製）、 pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕等をあげることができる。
[0064] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが でき、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモータ 一、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモ 一ター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることができる。また 、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよ!、。 [0065] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ' 、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637 (特開昭 63- 29 9)等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する 方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法〔Cytotech nology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リボフヱクシヨン法〔P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] Virology, 52, 456 (1973)等をあげるこ とがでさる。
[0066] 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント 'プロトコールズ'イン'モレ =Τュフ ヽィォロン ~~、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記 載された方法によって、ペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよび欠損型バキュロウィルスゲノムを昆虫細胞 に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、さらに組換えウィル スを昆虫細胞に感染させ、ペプチドを発現させることができる。
[0067] 該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、例えば、 pVL1392 pVLl 393 (ベタトン'ディッキンソン社製）、 PBlueBac4.5 (インビトロジェン社製）等をあげるこ とがでさる。
バキュロウィルスとしては、例えば、ャガ科昆虫に感染するウィルスであるアウトダラ ファ 'カリフオノレニ力'ヌクレア一'ポリへドロシス'ウイノレス (Autographa californica nucle ar polyhedrosis virus)等を用 ヽること力でさる。
[0068] 昆虫細胞としては、例えば、 Spodoptera fi^gie^の卵巣細胞である S19 S1 1 [Bac ulovirus expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)] Trichodusianiの卵巢細朐である High 5 (インビトロジェン社製）等 を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクター と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法 (特開平 2 -227075)、リポフエクシヨン法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあ げることができる。
[0069] 植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 Tiプラス ミド、タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば、カリフラワーモザイクゥイノレスの 35Sプロモーター、ィネアクチン 1プ 口モーター等をあげることができる。
[0070] 宿主細胞としては、例えばタバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、 アルファルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入する方法であれば ヽ ずれも用いることができ、例えば、ァグロパクテリゥム (Agrobacterium) (特開昭 59-140 885、特開昭 60-70080、 WO94/00977)、エレクト口ポレーシヨン法（特開昭 60-251887 )、パーティクルガン (遺伝子銃）を用いる方法 (特許第 2606856、特許第 2517813)等 をあげることができる。
[0071] 以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発 明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のペプチド を製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
[0072] 本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主と して得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質 転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を 効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地の!/、ずれを用いてもょ 、。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよぐ例えばグルコース、 フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等の アルコ一ル類等を用いることができる。
[0073] 窒素源としては、例えばアンモニア、塩ィ匕アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸ァ ンモ-ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他 の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー 、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその 消化物等を用いることができる。
[0074] 無機塩としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム 、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カル シゥム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好まし い。培養温度は 15〜40°Cが好ましぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間が好ましい 。培養中の pHは 3. 0〜9. 0に保持することが好ましい。 pHの調整は、無機または有 機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができ る。
[0075] また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に 添カロしてちょい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた糸且換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加するのが好 ましい。例えば、 k£プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を 培養するときにはイソプロピル一 β—D—チォガラタトピラノシド等を、 1mプロモータ 一を用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールァク リル酸等を培地に添加してもよ 、。
[0076] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、 Ea gleのミニマル'エッセンシャル培地（MEM) [Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ 改変イーグル培地 [Virology, 8, 396 (1959)〕、 199培地 [Proceeding of the Society fo r the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添カロし た培地等があげられる。
[0077] 培養は、通常、 5%CO存在下で行うのが好ましぐ pHは 6〜8、温度は 30
2 〜40°C が好ましぐ 1〜7日間行うのが好ましい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カロ してちよい。
また、特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝 子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
[0078] 昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている TNM— FH培地（ベタトン'ディッキンソン社製）、 Sf— 900 II SFM培地（ インビチトロジェン社製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRHバイオサイェンシズ社 製）、グレース（Grace)の昆虫培地 [Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる 培養は、通常、 pHは 6〜7、温度は 25〜30°Cが好ましぐ 1〜5日間行うのが好まし い。
[0079] また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているムラシゲ'アンド'スターグ培地、ホワイト (White)培地、またはこれら 培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いることが できる。
[0080] 培養は、通常、 pHは 5〜9、温度は 20〜40°Cが好ましぐ 3〜60日間行うのが好ま しい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地 に添カ卩してもよい。
上記のとおり、本発明のペプチドをコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクター を保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培 養方法に従って培養し、該ペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ペプチドを採取 することにより、該ペプチドを製造することができる。
[0081] 本発明のペプチドは、宿主細胞内での分解を避けるため、任意のポリペプチド (以 下、ポリペプチド Xよぶ）と本発明のペプチドとの融合蛋白質を製造した後、本発明の ペプチドを融合蛋白質から単離して製造してもよい。融合蛋白質を発現する発現べ クタ一は、上記の本発明のペプチドをコードする DNAを作製する際に、その 5 '末端 に特定のプロテアーゼの認識配列またはメチォニンをコードする DNAを付加して作 製し、ポリペプチド Xの発現ベクターの、ポリペプチド Xをコードする DNAとフレーム を合わせて連結して作製することができる。ただし、メチォニンをコードする DNAを付 加するのは、本発明のペプチドカ^チォニンを含んでいない場合に限る。ポリべプチ ド Xとしては任意のポリペプチドを用いることができる力 例えば、ダルタチオン S—ト ランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白質、 DsbA、 DsbC、プロテイン A等があげられ る。特定のプロテアーゼの認識配列としては、ファクター Xa認識配列（Ile-Glu-Gly-A rg)、ェンテロキナーゼ認識配列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)等があげられる。ポリぺプ チド Xの発現ベクターは、上記の本発明のペプチドの発現ベクターに準じて、本発明 のペプチドをコードする DNAの代わりにポリペプチド Xをコードする DNAを挿入して 作製できる。また、市販の融合蛋白質発現用ベクター、例えば、ダルタチオン S—トラ ンスフェラーゼとの融合蛋白質発現用ベクター pGEX-3 (GEヘルスケア社製）、マルト ース結合蛋白質との融合蛋白質発現ベクター pMAL- c2X、 pMAL- p2E (-ュ一'イン グランド 'バイオラブズ社製）、 DsbAとの融合蛋白質発現ベクター pET-39b(+) (EMD バイオサイェンシズ社製)等を利用してもよ ヽ。ポリペプチド Xに特定のプロテアーゼ の認識配列を介して本発明のペプチドが融合している場合は、認識配列に対応する プロテアーゼ処理により、本発明のペプチドを融合蛋白質力 切断することができる 。ポリペプチド Xの C末端にメチォニンを介して本発明のペプチドが融合して 、る場 合は、特開平 1— 102096に記載の方法に準じて、臭化シアン処理することにより、 本発明のペプチドを融合蛋白質力 切断することができる。プロテアーゼまたは臭化 シアンで処理した後、ゲルろ過、逆相 HPLC、ァフィユティークロマトグラフィー等を 組み合わせることにより、本発明のペプチドを単離精製することができる。
文献〔J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (19 89); Genes Develop., 4, 1288 (1990);特開平 5- 336963; WO94/23021〕の記載に準 じて、上記の本発明のペプチドをコードする DNAを作製する際に、その 5'末端に分 泌蛋白質のシグナルペプチドをコードする DNAを付カ卩して作製し、該 DNAを用い て、上記と同様にして組換えベクターを作製し、宿主細胞に導入することにより、本発 明のペプチドを培地中に分泌させて製造することができる。
[0083] 本発明のペプチドの N末端カ チォニンでない場合は、上記の融合蛋白質を製造 した後に単離する方法または培地中に分泌させる方法で製造することができる。例え ば、配列番号 2のアミノ酸配列力 なる本発明のペプチドは、以下のようにして製造で きる。まず、配列番号 11の塩基配列力 なる DNAおよび配列番号 11と相補的な塩 基配列からなる DNAを DNA合成機でィ匕学合成した後、両者をアニーリングして 2本 鎖 DNAを調製する。該 2本鎖 DNAと Xmnlで切断した pMAL-c2Xを連結させて、 pM AL-c2Xの Xmnlサイトに該 2本鎖 DNAを挿入したプラスミドを作製する。得られたプラ スミドは、マルトース結合蛋白質の C末端に、ファクター Xa認識配列（Ile-Glu-Gly-Ar g)および配列番号 2のアミノ酸配列力 なるペプチドが融合した融合蛋白質をコード する。得られたプラスミドで Escherichiacoliを形皙転椽する。得られた形質転換体を培 地中に培養して、形質転換体の細胞内に融合蛋白質を発現させる。培養後の菌体 を遠心分離により単離した後、菌体を破砕して、融合蛋白質を含む溶液を得る。得ら れた溶液から、マルトースを固定ィ匕したカラムによるァフィ二ティークロマトグラフィー により、融合蛋白質を単離した後、ファクター Xaで融合蛋白質を処理し、配列番号 2 のアミノ酸配列力 なるペプチドを融合蛋白質力 切り離す。ゲルろ過あるいは逆相 HPLC等で配列番号 2のアミノ酸配列力 なるペプチドを単離、精製することができる
[0084] 本発明の形質転換体により製造されたペプチドを単離精製するためには、通常の 蛋白質の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後 、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプ レス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出 液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白 質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒によ る沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA- 75 (三菱ィ匕 成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pha rmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロ ース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩 を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製 標品を得ることができる。
[0085] また、該ペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回 収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてペプチドの不溶体を回収す る。回収したペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する。該可溶化液を希釈ま たは透析し、該可溶ィ匕液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ペプチドを 正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ペプチドの 精製標品を得ることができる。
[0086] 本発明のペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドを回収 することができる。すなわち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理 することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用い ることにより、精製標品を得ることができる。
[0087] 3.本発明のペプチドと特異的に結合する抗体
本発明の抗体は、配列番号 4のアミノ酸配列または配列番号 4のアミノ酸配列の C 末端がアミド化した配列 (配列番号 27)中に存在するェピトープと結合する抗体であ り、 1.に記載した本発明のペプチドに特異的に結合することができる。本発明の抗 体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、本発明の抗体には、 ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体力 調製される Fab、 Fab\ F(ab')等の
2 抗体断片も含まれる。また、モノクローナル抗体には、非ヒト動物で作製したモノクロ ーナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域力もなるヒト型キメラ抗体、非ヒト動物で 作製したモノクローナル抗体の相補性決定領域 (CDR)をヒト抗体のフレームワーク 領域に挿入した可変領域と、ヒト抗体の定常領域力もなるヒト型 CDR移植抗体も含ま れる。
[0088] (1)ポリクローナル抗体の作製
配列番号 4のアミノ酸配列力 なるペプチド、または配列番号 4のアミノ酸配列にお V、て、 C末端のプロリン残基がアミドィ匕して 、る配列（配列番号 27)からなるペプチド を抗原として、非ヒト動物の皮内、静脈内、腹腔内または筋肉内等に投与することに より、配列番号 4のアミノ酸配列または配列番号 4のアミノ酸配列の C末端がアミドィ匕 した配列（配列番号 27)中に存在するェピトープと結合するポリクローナル抗体を作 製することができる。このポリクローナル抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合 することができる。この場合、抗原とするペプチドをキーホール 'リンペット'へモシァ- ン、ゥシチログロブリン、オボアルブミン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを、ァ ジュバントと共に投与するのが望ましい。抗原とするペプチドのキャリア蛋白への共有 結合は、マレイミド、カルポジイミド、ダルタルアルデヒド等の架橋剤を用いた反応によ り行うことができる。マレイミドの反応を行う場合は、抗原とするペプチドのアミノ酸配 列の N末端または C末端にシスティン残基を付加したペプチドを上記 2に記載の方 法で作製し、システィンを介して共有結合させる。アジュバントとしては、例えばフロイ ントの完全アジュバント、水酸ィ匕アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等があげられる 。抗原を投与する非ヒト動物として、ゥサギ、ャギ、ラット、マウス、ハムスター等を用い ることができ、投与量は動物 1匹に 1回当たり、抗原とするペプチドを 50〜200 8含 有する量が好ましい。
[0089] 該抗原の投与は、例えば 1回目の投与の後 1〜3週間おきに、血清の抗体価が十 分に上昇するまで 3〜10回行うのが好ましい。血清の抗体価は、各投与後 3〜7日目 に採血して血清を調製し、酵素免疫測定法、ラジオィムノアツセィ法等により測定で きる。酵素免疫測定法は、文献〔酵素免疫測定法、医学書院（1976); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕に つき、 (i)抗原とした ペプチドを抗原に用いたものとは別のキャリア蛋白質と共有結合させたものを適当な プレートに固定ィ匕し、（ii)ブロッキングを行って洗浄し、（iii)免疫した動物力も調製し た血清を反応させた後、洗浄し、（iv)免疫に用いた動物の IgGに対する酵素標識した 抗体と反応させて洗浄し、（V)標識酵素により発色または発光する基質を用いた反応 を行い、発色量または発光量を測定して抗体価の指標とする、という手順で行うこと ができる。
[0090] その血清が抗原としたペプチドに対して十分な抗体価を示した非ヒト動物より、血液 を採取して血清を調製する。この血清、すなわち抗血清をポリクローナル抗体として 使用することもできるし、該抗血清力もポリクローナル抗体を精製することもできる。 抗血清力もポリクローナル抗体を精製する方法としては、例えば遠心分離、 40〜5 0%飽和硫酸アンモ-ゥムによる塩析、力プリル酸沈殿〔Ant¾odies, A Laboratory m anual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、または DEAE—セファロースカラム 、陰イオン交換カラム、プロテイン Aまたは G—力ラムあるいはゲル濾過カラム等を用 V、るクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
[0091] (2)モノクローナル抗体の作製
以下に示す方法より、配列番号 4のアミノ酸配列または配列番号 4のアミノ酸配列の C末端がアミドィ匕した配列 (配列番号 27)中に存在するェピトープと結合するモノクロ ーナル抗体を作製することができる。このモノクローナル抗体は、本発明のペプチド に特異的に結合することができる。
[0092] (a)抗体産生細胞の調製
マウスまたはラットを抗原を投与する動物として用い、 (1)のポリクローナル抗体の 作製と同様の抗原の投与を行い、その血清が抗原としたペプチドに対して十分な抗 体価を示したマウスまたはラットを、抗体産生細胞の供給源とすることができる。抗体 産生細胞としては、脾細胞を用いることができる。抗体産生細胞は、十分な抗体価を 示したマウスまたはラットから、例えば以下のようにして調製することができる。
[0093] 該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原を最終投与した後 3〜7日目に、脾臓を 摘出する。脾臓を MEM中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離した後、上清を捨 て、沈殿の脾細胞を回収する。得られた脾細胞をトリス—塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (P H7. 65)で 1〜2分間処理し赤血球を除去した後、 MEMで 3回洗浄したものを抗体 産生細胞として用いることができる。
[0094] (b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットの骨髄腫細胞カも榭立した株化細胞を用 いることができる。株化骨髄腫細胞としては、例えば、 8—ァザグァニン耐性マウス (B し8/0由来）骨髄腫細胞株133— 63八38— 1；1 ^1\ Topics. Microbiol. Immunol. , 81, 1 (1978); Europ. J. Immunol, 6, 511 (1976)] , SP2/0-Agl4 [Nature, 276, 269 (1978)〕、 P3— X63— Ag8653〔J. Immunol, 123, 1548 (1979)〕、 P3—X63—A g8 [Nature, 256, 495 (1975)〕等があげられる。これらの細胞株は、 8 ァザグァニン 培地〔RPMI— 1640培地にグルタミン（1. 5mmolZL)、 2—メルカプトエタノール（5 X 10"5mol/L)、ジヱンタマイシン（10 μ g/mL)およびゥシ胎児血清（10%)をカロ えた培地（以下、正常培地という）に、さらに 8 ァザグァニン（15 gZmL)をカ卩えた 培地〕で継代するのが好ましぐまた細胞融合の 3〜4日前には正常培地で培養する のが好ましい。融合には該細胞を 2 X 107個以上用いるのが好ましい。
[0095] (c)ハイプリドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と (b)で取得した骨髄腫細胞を、例えば、以下のよう にしてポリエチレングリコールを用いて細胞融合させるにより、ノ、イブリドーマを作製 できる。（a)で取得した抗体産生細胞と (b)で取得した骨髄腫細胞を、 MEMまたは P BS (リン酸ニナトリウム 1. 83g、リン酸一カリウム 0. 21g、食塩 7. 65g、蒸留水 1リット ル、 pH7. 2)でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞 = 5〜： LO : lにな るよう混合し、 1, 200rpmで 5分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画 分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、 37°Cで、 108抗体産生細胞あ たり、ポリエチレングリコール 1000 2g、 MEM 2mLおよびジメチルスルホキシド 0. 7mLを混合した溶液を 0. 2〜： LmL添カ卩し、さらに 1〜2分間ごとに MEM 1〜2 mLを数回添加する。添加後、 MEMをカ卩えて全量が 50mLになるように調製する。 該調製液を 900rpmで 5分間遠心分離後、上清を捨てる。
[0096] 細胞融合後の細胞は、例えば、以下のように培養し、抗体の生産量の高いハイプリ ドーマを選択することができる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、 メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに HAT培地〔正常培地にヒポキサンチ ン（10_4molZL)、チミジン（1. 5 X 10_5molZL)およびアミノプテリン（4 X 10_7m olZL)を加えた培地〕 lOOmL中に懸濁する。該懸濁液を 96穴培養用プレートに 10 0 μ LZ穴ずつ分注し、 5%COインキュベータ一中、 37°Cで 7〜14日間培養するの
2
が好ましい。培養後、培養上清の一部を採取し、血清の代わりに該培養上清を用い て（1)で上述した抗体価の測定を行 ヽ、抗体価の高 、培養上清に対応するハイプリ ドーマを、抗体の生産量の高 、ノ、イブリドーマとして選択することができる。
[0097] 該ハイブリドーマは、クロー-ングを行い、得られた各ハイブリドーマのクローンから 、抗体を高生産するものを選択することにより、安定して抗体を高生産するハイブリド 一マ細胞を得ることができる。クロー-ングは、例えば、限界希釈法等により行うことが でき、 2回繰り返す〔1回目は、 HT培地 (HAT培地カゝらアミノプテリンを除いた培地） 、 2回目は、正常培地を使用する〕のが好ましい。クローユングにより得られた各クロー ンの培養上清を用いて、上述の抗体価の測定を行い、強い抗体価の認められた培 養上清に対応するノ、イブリドーマのクローンを、安定して抗体を高生産するハイブリド 一マ細胞として選択することができる。
[0098] (d)モノクローナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、以下のように (c)で選択されたノヽイブリド 一マをヌードマウス内で腹水癌として増殖させた後、腹水から調製することができる。 2, 6, 10, 14—テトラメチルペンタデカン (プリスタン) 0. 5mLを腹腔内投与し、 2週 間飼育した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、（c)で取得した本発明のモノク ローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞 5〜20 X 106細胞 Z匹を腹腔内に注射 するのが好ましい。 10〜21日後に、ハイプリドーマが腹水癌化したマウス力 腹水を 採取し、 3, OOOrpmで 5分間遠心分離して固形分を除去する。得られた腹水の上清 より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、 取得することができる。
[0099] 抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラット モノクローナル抗体タイピングキットを用いて行うことができる。ペプチド量は、ローリ 一法あるいは 280nmでの吸光度より算出することができる。
[0100] (3)本発明の抗体を用いた本発明のペプチドの測定方法
本発明の抗体を用いて、本発明のペプチドを免疫学的に検出または定量すること ができる。免疫学的な検出または定量方法としては、競合法、サンドイッチ法、免疫 組織化学、ウェスタンプロット、凝集法 (単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイ ェンティフィック、 1987 ;続生化学実験講座 5、免疫生化学研究法、東京化学同人、 1 986)等があげられる。
[0101] 競合法は、本発明の抗体に、試料溶液および一定量の競合物質 (測定対象の本 発明のペプチドを酵素、ピオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもの）を 反応させて、試料溶液中の本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結 合させた後、抗体と結合した競合物質の量を標識を利用して測定し、その結合量か ら本発明のペプチドを定量する方法である。例えば抗体をプレートやビーズ等の固 相に固定ィ匕し、本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、 固相を洗浄し、固相上の抗体への競合物質の結合量を測定する方法、本発明のぺ プチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、 γ —グロブリンおよびポリェ チレングリコールにより免疫複合体を沈殿させて抗体と結合して 、な 、競合物質と分 離し、抗体と結合した競合物質の量を測定する方法等があげられる。例えば、 5〜10 点の濃度を決めた本発明のペプチドの溶液を調製し、この溶液を試料溶液とした場 合の競合物質の抗体への結合量を測定して、ペプチドの濃度と競合物質の結合量 をプロットした検量線を作成し、本発明のペプチドを定量する試料溶液にっ 、ての、 競合物質の結合量を検量線にあてはめることにより、試料溶液の本発明のペプチド を定量することができる。
[0102] サンドイッチ法は本発明のペプチドと特異的に結合する 2種類の抗体を使用する方 法であり、例えば、片方の抗体をプレートやビーズ等の固相に固定ィ匕したものに試料 溶液を反応させ、試料中の本発明のペプチドを固相上の抗体と結合させた後、酵素 、ピオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもう一方の抗体を反応させて、 固相上の抗体と結合した本発明のペプチドにさらに該標識抗体を結合させ、該標識 抗体の結合量を標識物質を利用して測定し、その結合量から本発明のペプチドを定 量する方法があげられる。例えば、 5〜： LO点の濃度を決めた本発明のペプチドの溶 液を調製し、この溶液を試料溶液とした場合の、標識抗体への結合量を測定して、 ペプチドの濃度と標識の結合量をプロットした検量線を作成し、本発明のペプチドを 定量する試料溶液についての、標識抗体の結合量を検量線にあてはめることにより、 試料溶液の本発明のペプチドを定量することができる。
[0103] 酵素免疫測定法は、上記の競合法、サンドイッチ法において、競合物質あるいは 抗体をアルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ等の酵素で標識し、該標識酵素 により発色または発光する試薬を反応させ、その発色または発光量から競合物質ま たは標識抗体の結合量を測定する定量方法である。また、ラジオィムノアッセィは、 上記の競合法、サンドイッチ法において、競合物質あるいは抗体を放射性同位元素 で標識し、その放射活性力 競合物質または標識抗体の結合量を測定する定量方 法である。
[0104] 免疫組織ィ匕学は、組織や細胞を凍結またはパラフィンに包埋して作製した切片に 対し、酵素、ピオチン、放射性同位元素、蛍光物質、金コロイド等で標識した本発明 の抗体を反応させた後、本発明の抗体を標識物質を利用して検出し、組織または細 胞における本発明のペプチドを検出する方法である。
ウェスタンブロットは、試料に含まれる蛋白質およびペプチドを SDS—ポリアクリル アミドゲルで分離した後、ゲル力 ポリフッ化ビ-リデン (PVDF)膜、ニトロセルロース 膜等に蛋白質およびペプチドをブロットし、酵素、ピオチン、放射性同位元素等で標 識した本発明の抗体を反応させた後、標識物質を利用して本発明の抗体を検出し、 膜上の本発明のペプチドを検出する方法である。
[0105] 凝集法は、本発明の抗体を固定ィ匕したラテックス等の粒子と、試料溶液とを反応さ せて、試料中の本発明のペプチドに粒子上の抗体が結合することにより生ずる粒子 の凝集を、吸光度の測定により検出または定量する方法である。
[0106] 4. VGFC末由来ペプチドを含有する医薬製剤
本発明にお 、て、以下の（a)〜（f)の!、ずれかのペプチドを「VGFC末由来べプチ ド」とよぶ。 1. に記載した本発明のペプチドは、 VGFC末由来ペプチドに含まれる。
(a)配列番号 1〜5のいずれか、 28または 29で表されるアミノ酸配列を含むペプチド (ただし、配列番号 9、 30、 31、 32または 33のアミノ酸配列を含むペプチドは除く）；
(b)配列番号 1〜5のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以 上 5以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、心臓また は血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(c)配列番号 1〜5のいずれ力 28または 29で表されるアミノ酸配列と 90%以上の 相同性を有するアミノ酸配列力 なり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムィ オン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(d) l .の式 (I)で表されるペプチド；
(e)配列番号 23のアミノ酸配列力 なるペプチド、または配列番号 23のアミノ酸配列 の N末端に 1〜32個のアミノ酸力もなる任意のアミノ酸配列が付カ卩したアミノ酸配列 からなるペプチド；および
(f)下記式 (III)で表されるペプチド
[0107] [化 10]
R3 - C R4 (III)
[0108] (式中、 R3は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノィル、置換もしくは非置換のァ ロイル、置換もしくは非置換のへテロアリールカルボ-ル、置換もしくは非置換のアル コキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールォキシカルボ-ル、または置換もし くは非置換のへテロアリールォキシカルボ-ルを表し、 R4はヒドロキシ、置換もしくは 非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、 Cは上記 (a)〜（e) の!、ずれかのペプチド残基を表す）。
[0109] 上記の「VGFC末由来ペプチド」における、アミノ酸の置換、欠失および付加、なら びにアミノ酸配列の相同性の定義は、 1.の本発明のペプチドにおけるアミノ酸の置 換、欠失および付加ならびにアミノ酸配列の相同性の定義と同じものである。また、 式 (III)における各基の定義は、 1.の式 (II)における各基の定義と同じものである。 配列番号 23のアミノ酸配列は、下記の式 (VIII)で表されるアミノ酸配列である。
[0110] [化 11]
Ala Gin Glu Glu Ala— X13— Ala Glu Glu Arg— Arg— Leu Gin Glu Gin― Glu― Glu— Leu— Glu— Asn— Tyr— He— Glu― His― Val― Leu― Leu― X —A rg— Pro (VIII)
[0111] (式中、 x13および X14は独立して同一または異なった任意のアミノ酸を表す）
式 (VIII)において、好ましくは、 X13はァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン 酸、イソグルタミン酸、 2—アミノアジピン酸または 2—アミノスべリン酸であり、 X14はァ ルギニン、リジン、オル-チン、 2, 4 ジアミノブタン酸、 2, 3 ジァミノプロピオン酸 またはヒスチジンであり、より好ましくは、 X13はァスパラギン酸またはグルタミン酸であ り、 X14はアルギニンまたはヒスチジンであり、 X13および X14はそれぞれグルタミン酸お よびアルギニンである力、またはそれぞれァスパラギン酸およびヒスチジンである。
[0112] 配列番号 23の N末端に付加する 1〜32個のアミノ酸力もなるアミノ酸配列は、いか なる配列でもよ 、が、好ましくは下記式 (IX)で表されるアミノ酸配列（配列番号 24)で ある。
[0113] [化 12]
Thr— Leu— Gin— Pro— Pro— X15— X16— X17— Arg— Arg— Arg— His— X18— His— His - Ala - Leu - Pro - Pro - X19 - Arg - His - X20 - Pro - X21 - X22 - Glu - Ala - G In— Ala— Arg— Arg (IX)
[0114] (式中、 x15、 x16、 x17、 x18、 x19、 x2°、 X21および X22は独立して同一または異なった 任意のアミノ酸を表す）
式（IX)において、好ましくは、 x15、 X16および X17はセリン、スレオニン、ホモセリン、 ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノ リン、ノルパリン、ァラニン、 2—アミノブタン酸 、メチォニン、 O—メチルセリン、 t ブチルグリシン、 tーブチルァラニン、シクロへキ シルァラニンまたは tert-ロイシンであり、 X18はチロシンまたはフエ二ルァラニンであり 、 X19はセリン、スレ才ニン、ホモセリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、パリン、 ノルパリン、ァラニン、 2—アミノブタン酸、メチォニン、 O—メチルセリン、 tーブチルダ リシン、 t—ブチノレアラニン、シクロへキシルァラニンまたは tert-ロイシンであり、 X2Gは チロシン、フエ-ルァラニンまたはヒスチジンであり、 X21はグリシン、ァスパラギン酸、 グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2—ァミノアジピン酸または 2— アミノスべリン酸であり、 X22はアルギニン、リジン、オル-チン、 2, 4 ジアミノブタン 酸、 2, 3 ジァミノプロピオン酸、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、パリン、ノルバ リン、ァラニン、 2—アミノブタン酸、メチォニン、 O—メチルセリン、 t—ブチルグリシン 、 tーブチルァラニン、シクロへキシルァラニンまたは tert-ロイシンであり、より好ましく は X15および X16はセリンまたはァラニンであり、 X17はセリンまたはロイシンであり、 X18 はチロシンまたはフエ二ルァラニンであり、 X19はセリンまたはァラニンであり、 X2Gはチ 口シンまたはヒスチジンであり、 X21はグリシンまたはァスパラギン酸であり、 X22はアル ギニンまたはロイシンであり、さらに好ましくは、 χ15、 χ16、 χ17、 χ18、 χ19、 Χ2、 X21お よび X22がそれぞれセリン、ァラニン、ロイシン、チロシン、セリン、チロシン、グリシンお よびアルギニンである力 またはそれぞれァラニン、セリン、セリン、フエ二ルァラニン、 ァラニン、ヒスチジン、ァスパラギン酸およびロイシンである。 [0115] VGFC末由来ペプチドの具体例としては、 1.に記載した本発明のペプチドの具体 例である（i)〜（ix)のペプチドの他、（X)配列番号 5のアミノ酸からなるペプチド、 (xi) 配列番号 25のアミノ酸配列からなるペプチド、 (xii)配列番号 16のアミノ酸配列から なるペプチドをあげることができる。（X)のペプチドは、ヒト VGFの C末端 586〜615 番目の配列に相当するペプチド、（xi)のペプチドは、（X)のペプチドに対応するラット VGFに由来するペプチド、（xii)のペプチドは、本発明の（i)のペプチドに対応するラ ット VGFに由来するペプチドである。
[0116] VGFC末由来ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は、血管または心臓の 細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するので、血圧や血流量を調節 する循環調節活性を有する。したがって、 VGFC末由来ペプチドおよびその薬理学 的に許容される塩は循環調節剤、昇圧剤、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または 脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬の有効成分として用いることができる。 VGFC末 由来ペプチドの薬理学的に許容される塩としては、 1.の本発明のペプチドの薬理学 的に許容される塩としてあげた塩があげられる。
[0117] VGFC末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬製剤は 、活性成分として該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩単独で、あるいは任 意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それ ら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一 緒に混合し、製剤学の技術分野にぉ 、てよく知られて 、る任意の方法により製造さ れる。
[0118] 投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口または、 例えば静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等がある。 経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット
、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のダリコール類、ご ま油、ォリーブ油、大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤 、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。 また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、 澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、 ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪 酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。
[0119] 非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性ィ匕合物を 含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または 塩水とブドウ糖溶液の混合物カゝらなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。 また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー 類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される 1種も しくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
[0120] 本発明のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与量および投与回数 は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異な る力 通常経口の場合、成人一人当り 0. 01mg〜lg、好ましくは 0. 05〜50mgを一 日一回ないし数回投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り 0. 001 〜100mg 、好ましく ίま 0. 01〜： LOmgを一曰一回な!/ヽし数回投与する。し力 しながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動す る。
[0121] 5. VGFC末由来ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩の循環調節活性の測 定
VGFC末由来ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が循環調節活性を有し ていることは、以下の測定法により細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性 、あるいは血圧を上昇させる活性を有して ヽることで確認できる。
[0122] (a)細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性の測定
(i)アポェクオリン発現トランスジェニックマウスの利用
アポェクオリン遺伝子の発現ベクターを受精卵に導入して作製した、全身にアポェ クオリンを発現するトランスジエニックマウス (WO02Z010371)から、心臓または血 管を採取する。得られた心臓または血管を細断し、セレンテラジンを含む培地に懸濁 して培養し、細胞内にセレンテラジンを取り込ませてエタオリン (アポエタオリンとセレ ンテラジンの複合体)を形成させる。ェクオリンは、細胞内カルシウムイオンと結合して 発光するので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む培地を添加する 前と添加後の細胞の毎秒の相対発光量をルミノメーターで経時的に測定し、細胞内 カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の 添カ卩により、相対発光量が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容 される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる
[0123] (ii)カルシウム結合性蛍光試薬の利用
動物個体から採取した心臓または血管を細断したもの、あるいは心臓または血管に 由来する細胞株を、カルシウムイオンの有無で、励起波長、蛍光波長あるいは蛍光 強度が変化するような Fura—2、 Indo— 1等のカルシウムイオン結合性の蛍光試薬 を含む緩衝液に懸濁して培養し、細胞内に取り込ませる。 Fura— 2はカルシウムィォ ンと結合することにより、蛍光励起波長のピークが 380nmから 340nmにシフトするの で、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添カロ 後に、 380nmの波長で励起した時の蛍光強度に対する 340nmの波長で励起した 時の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標と する。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添カ卩により、蛍光強度の比が 増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシゥ ムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。 Indo— 1はカルシウムィォ ンと結合することにより、蛍光波長が 480nmから 400nmにシフトするので、ペプチド またはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添加後に、 480η mの波長の蛍光強度に対する 400nmの波長の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測 定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許 容される塩の添加により、蛍光強度の比が増加する場合に、該ペプチドまたはその 薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する ことが確認できる。
[0124] (b)血圧を上昇させる活性
麻酔下にあるラット等の動物の外頸静脈と内頸動脈にカテーテルを挿入し、内頸動 脈のカテーテルを圧モニターに接続して動脈圧を連続的に測定する。外頸静脈から 生理食塩水に溶解したペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を投与し、ぺプ チドまたはその薬理学的に許容される塩の投与前と投与後の動脈圧を比較して、ぺ プチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与により、動脈圧が上昇する場合に 、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が血圧を上昇させる活性を有する ことが確認できる。
[0125] 6. VGFC末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン 濃度の上昇を阻害または促進する物質のスクリーニング方法
VGFC末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃 度の上昇を阻害する物質は、（i)心臓または血管の細胞に、該 VGFC末由来べプチ ドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の細胞応 答を測定し、（ii)同じ細胞に試験物質の非存在下で、該 VGFC末由来ペプチドまた はその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の細胞応答と比較し、（m)試験物 質の存在下で細胞応答が抑制される場合にその試験物質を該 VGFC末由来ぺプ チドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する 物質として特定すること、によりスクリーニングできる。
[0126] また同様に、（i)心臓または血管の細胞に、該 VGFC末由来ペプチドまたはその薬 理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の細胞応答を測定し、 (ii) 同じ細胞に試験物質の非存在下で、該 VGFC末由来ペプチドまたはその薬理学的 に許容される塩を接触させた場合の細胞応答と比較し、 (iii)試験物質の存在下で細 胞応答が促進される場合にその試験物質を該 VGFC末由来ペプチドによる心臓ま たは血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定す ること、により該 VGFC末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシ ゥムイオン濃度の上昇を促進する物質をスクリーニングできる。
[0127] 細胞応答としては、心臓または血管の細胞に該 VGFC末由来ペプチドを接触させ たときに起こる、測定可能な細胞応答であれば、いかなる細胞応答でも力まわないが 、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇があげられる。
上記のスクリーニング方法で用いる心臓または血管の細胞は、 VGFC末由来ぺプ チドと接触させたときに細胞応答を示す細胞であれば、心臓または血管に由来する 細胞株でもよいし、動物から採取した心臓または血管を細断したものでもよい。アポ ェクオリン遺伝子を導入して作製した全身にアポェクオリンを発現するトランスジェ- ックマウス (WO02/010371)の心臓または血管を採取し、細断して得られる細胞は 、セレンテラジンの存在下で発光量をルミノメーターで測定することにより、細胞内力 ルシゥムイオン濃度を簡便に測定できるので、好まし 、。
[0128] 上記のスクリーニング方法で得られる VGFC末由来ペプチドによる心臓または血管 の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質は、 VGFC末由来べ プチドと同様に、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤、あるいは心筋 梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬に用いることができる 。また、 VGFC末由来ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムィォ ン濃度の上昇を阻害する物質は、 VGFC末由来ペプチドが有する、例えば血圧を上 昇させる活性を阻害するので、降圧剤として用いることができる。
[0129] 7. VGFC末由来ペプチドの受容体に対するァゴ-ストまたはアンタゴ-ストのスクリ 一二ング方法
VGFC末由来ペプチドの受容体に対するァゴニストまたはアンタゴニストは、（i)心 臓もしくは血管の細胞または該細胞の膜画分に、該 VGFC末由来ペプチドまたはそ の薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の該細胞または該細 胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測 定し、 (ii)同じ細胞または膜画分に試験物質の非存在下で、該 VGFC末由来べプチ ドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の該細胞または該細胞の膜 画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較し、 (iii )試験物質の存在下で該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量が低 下する場合にその試験物質を該 VGFC末由来ペプチドの受容体に対するァゴニスト またはアンタゴニストとして特定すること、によりスクリーニングできる。
[0130] 心臓または血管の細胞は、上記 5.に記載の細胞を用いることができる。該細胞ま たは該細胞の細胞膜画分は、適当な緩衝液に懸濁する。緩衝液は、 VGFC末由来 ペプチドと該細胞または該細胞の細胞膜画分との結合を阻害しない緩衝液であれば Vヽずれでもよぐ例えば pH4〜 10 (望ましくは pH6〜 8)のリン酸緩衝液や Tris— HC 1緩衝液等が用いられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twee n— 80、ジギトニン、デォキシコール酸等の界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンゃゼラ チン等の各種蛋白質を緩衝液に加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発 明のポリペプチドやリガンドの分解を抑える目的で PMSF、ロイぺプチン、 E— 64、 ぺプスタチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
[0131] 10 μ L〜10mLの該細胞または該細胞の細胞膜画分の懸濁液に、 125I、 3H等の放 射性同位元素で標識した一定の放射能量を有する VGFC末由来ペプチドを共存さ せて結合実験を行う。反応は 0〜50°C、好ましくは 4〜37°Cで、 20分〜 24時間、好 ましくは 30分〜 3時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同緩衝液 で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を γ カウンターまたは液体シ ンチレーシヨンカウンターで計測する。この時の結合量を全結合量 (Α)とする。大過 剰の非標識の同化合物を加えた条件で同様の反応を行い、その時の結合量を非特 異的結合量 (Β)とする。試験物質を加えた条件で同様の反応を行い、その時の結合 量を Cとする。試験物質の結合阻害率は下記の式で求めることができる。
阻害率 (％) = [1 { (C-B) / (A-B) }] X 100
[0132] 上記のスクリーニング方法で得られる VGFC末由来ペプチドの受容体に対するァ ゴニストは、 VGFC末由来ペプチドと同様に、循環調節活性を有するので、循環調 節剤、昇圧剤あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の 治療薬に用いることができる。また、 VGFC末由来ペプチドの受容体に対するアンタ ゴニストは、 VGFC末由来ペプチドが有する、例えば血圧を上昇させる活性を阻害 するので、降圧剤として用いることができる。
[0133] 以下に、本発明の実施例を示す。
実施例 1
[0134] VGFに由来するペプチドの単離と構造決定
コンフルェントになるまで増殖させたヒト脾臓由来細胞株（108個）を、フエノールレツ ドおよび血清を含まな!/ヽ RPMI培地中で 6時間培養後に培地を回収した。培地を回 収し遠心した後の上清に ImolZLの塩酸を 1Z50容量カ卩えた後に、セップ パック (Sep- Pak) C 18カートリッジ〔ウォーターズ (Waters)社製〕を用いて試料を抽出した。 カートリッジは 0. 1%トリフルォロ酢酸（以下、 TFAと略する）で洗浄し、 60%ァセトニ トリル— 0. 1%TFAで試料を溶出させた。溶出液を凍結乾燥の後に 60%ァセトニトリ ルー 0. 1%TFAに溶解させ、同液で平衡化したゲル濾過 HPLCカラム〔TSKgel G2000SW 、21. 5mm X 30cm (東ソ一株式会社製）〕を用いた HPLC〔HPLCポ
XL
ンプ L— 2100 (日立製)〕により、流速 1. 5mlZ分で分離し、ペプチド画分を回収し た。凍結乾燥した同試料を ImolZL酢酸に溶解の後、 ImolZLトリス (pHl l)で中 和させ、還元反応液（ImmolZL EDTA、 25mmolZLジチオスレィトール、 0. 5 molZlトリス、 PH8. 5)中で 37°C1時間加温した。引き続きョードアセトアミドを終濃 度 50mmolZLになるようにカ卩え、遮光して室温で 15分間反応させた。氷酢酸で反 応を停止させ、セップ—パック C18カートリッジを用いて脱塩した。脱塩後、凍結乾燥 した試料を 0. 1%TFAに溶解し、逆相 HPLCカラム〔バイダック（Vydac) Protein & P eptide C18、 1mm X 15mm (グレース 'バイダック（Grace Vydac)社製）〕を用いた H PLC〔HPLCポンプ L—6000 (日立製）〕〖こより、流速 50 μ LZ分で分離し、 30秒ご とに分取した。各画分は減圧乾燥の後、 50%メタノール— 2%酢酸に溶解させ、マト リックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI)法とエレクトロスプレーイオン化（ESI) 法の 2種類の質量分析法で分析した。 MALDI法では、ターゲットプレートに上記試 料を塗布後に、 50%ACN— 0. 1%TFAに溶解させた 2. 5mg/mL α—シァノー 4ーヒドロキシ桂皮酸溶液を 0. 5 L添加した。プレートは、タンデム飛行時間型 (TO F)質量分析計〔4700プロテオミクス ·アナライザー、アプライド ·バイオシステムズ社 製〕で質量分析し、検出されるペプチドを逐次同定した。 ESI法による質量分析は、 四重極飛行時間型質量分析計〔Q— Tof 2、マイクロマス (Micromass)社製〕を用いて 実施した。獲得したタンデムマススペクトルは、解析ソフトウェア マスコット MS/MS イオン ·サーチ [Mascot MS/MS Ion Search,マトリックス ·サイエンス（Matrix Science) 社製〕を用い、 NCBIおよび Swiss— Protのアミノ酸配列データベースを基に同定し た。その結果、ヒト VGFの一部のアミノ酸配列を有する 6種類のペプチド、すなわちぺ プチド 1 (配列番号 27)、ペプチド 2 (配列番号 26)、ペプチド 3 (配列番号 2)、ぺプチ ド 4 (配列番号 5)、ペプチド 9 (配列番号 28)およびペプチド 10 (配列番号 29)を見出 した。ペプチド 1およびペプチド 2は、 N末端は修飾されていな力 た力 C末端がァ ミドィ匕されていた。ペプチド 3、ペプチド 4、ペプチド 9およびペプチド 10は、 N末端、 C末端とも修飾されて 、な力つた。配列番号 27の配列の C末端のアミドを除 、たアミ ノ酸配列（配列番号 4)は、ヒト VGFのアミノ酸配列（配列番号 9)の 565〜577番目、 配列番号 26の配列の C末端のアミドを除いたアミノ酸配列（配列番号 3)は 554〜57 7番目、配列番号 2は 554〜583番目、配列番号 5は 586〜615番目、配列番号 28 ίま 485〜503番目、酉己歹 IJ番号 29ίま 533〜552番目にそれぞれネ目当した。ペプチド 4 のアミノ酸配列（配列番号 5)はゥシの VGFに由来するペプチド V [Endocrinology, 13 5, 2742-2748 (1994)〕と同じアミノ酸配列であった。
実施例 2
[0135] VGFに由来するペプチドの調製
実施例 1で見出されたペプチド 1、ペプチド 2、ペプチド 3、ペプチド 4、ペプチド 9お よびペプチド 10ならびにこれらのペプチドと関連するペプチドとして、配列番号 1のァ ミノ酸配列力 なるペプチド 5、配列番号 6のアミノ酸配列力 なるペプチド 6をそれぞ れ、シグマ ジエノシス (Sigma-Genosys)社（ペプチド 2〜6)およびアメリカン'ぺプチ ド'カンパ-一社（American Peptide Company Inc.) (ペプチド 1)に依頼して化学合 成した。配列番号 1のアミノ酸配列はヒト VGFのアミノ酸配列の 554〜615番目の配 列に相当し、配列番号 2〜5の全てのアミノ酸配列を含む。配列番号 6のアミノ酸配列 は、ラット VGFのアミノ酸配列の 556〜585番目の配列に相当し、ペプチド 3に対応 するラットの配列である。化学合成は、ペプチド合成機を用い、 N o;—Fmoc保護アミ ノ酸を用いた固相合成法により行い、合成後のペプチドは逆相 HPLCにより精製し た。
[0136] ペプチド 2〜6 (シグマージエノシス社）については、アバカス'ペプチド 'シンセサイ サ ~~ (Abacus peptide synthesizer)を用 ヽ、フップ 'ホ°リマ ~~社 (Rapp Polymere umBH )製の C末端アミドペプチド用榭脂テンタゲル S RAM (TentaGel S RAM,ペプチド 2 )または C末端フリーペプチド用榭脂テンタゲル S PHB (TentaGel S PHB)に N a - Fmoc保護アミノ酸を結合させたもの（ペプチド 3および 6：テンタゲル S PHB— Fmo c ァラニン、ペプチド 4および 5 :テンタゲノレ S PHB— Fmoc プロリン）、 Ν α— F moc保護アミノ酸 (EMDバイオサイェンシズ社製)を用いて化学合成を行った。以下 に、使用したァスパラギン酸、セリン、スレオニン、グルタミン酸、チロシン、リジン、ヒス チジン、アルギニンおよびシスティンの各側鎖保護アミノ酸を示した。
ァスパラギン酸： Fmoc— Asp (OtBu)— OH (Ν α—9—フルォレ -ルメチルォキシ カルボ-ルー Lーァスパラギン酸— 13 t—ブチルエステル）
セリン： Fmoc - Ser (tBu)— OH (Ν α— 9—フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル — O— t ブチノレ— L セリン）
スレオニン： Fmoc— Thr (tBu)— OH (Ν α— 9—フルォレニルメチルォキシカルボ 二ノレ一 O—t—ブチノレ一 L—スレオニン）
グルタミン酸： Fmoc - Glu (OtBu)— OH (Ν α— 9—フルォレ -ルメチルォキシカル ボ-ル—L グルタミン酸— γ—t ブチルエステル）
チロシン： Fmoc— Tyr (tBu)— OH (Ν α— 9—フルォレニルメチルォキシカルボ二 ルー Ο— t ブチル L—チロシン）
リジン： Fmoc— Lys (Boc)— OH (Ν α—9—フルォレ -ルメチルォキシカルボ-ル ε t ブチルォキシカルボ二ルー L リジン）
ヒスチジン： Fmoc - His (Trt)— OH (Ν α— 9—フルォレ -ルメチルォキシカルボ- ル Nim -トリチル -L-ヒスチジン）
アルギニン： Fmoc— Arg (Pbf) OH (Ν α— 9 フルォレニルメチルォキシカルボ 二ルー NG— 2, 2, 4, 6, 7 ペンタメチルジヒドロべンゾフラン 5—スルフォニルー Lーァノレギニン）
システィン： Fmoc - Cys (Trt)— OH： Ν α— 9—フルォレ -ルメチルォキシカルボ- ルー S トリチル -L-システィン
[0137] 脱保護用のタリべージカクテルは、トリフルォロ酢酸 (TFA)：脱イオン水：ジチォス レイトール (粉末）：トリイソプロビルシラン = 88 : 5 : 5 : 2の混合物を用いた。また、逆相
HPLCは、ディスカバリー（Discovery) HS C18カラム（10 m、 25cm X 21. 2cm、 シグマ―ァノレドリツチ社製）を用い、 0. 1 % TFA水溶液 ( A液）および 0. 1 % TFA ァセトニトリル溶液 (B液)の溶媒系で行った。
[0138] 合成後のペプチドの構造を、ペプチド 2〜6 (シグマージエノシス社）については、 M
ALDI— TOF質量分析計オートフレックス〔Autoflex、ブルカー（Brucker)社製〕を用 いた MALDI法による質量分析で確認した。マトリックスは、 50%ACN— 0. 1 %TF Aで調製した aーシァノー 4ーヒドロキシ桂皮酸 (シグマ一アルドリッチ社製)飽和溶 液を用いた。また、ペプチド 1 (アメリカン 'ペプチド 'カンパ-一社）については、 MA LDI—TOF質量分析計ボイジャー DEプロ（Voyager DE Pro,アプライド 'バイオシス テムズ社)を用いた MALDI法による質量分析で確認した。マトリックスは、 50%AC N— 0. 1 %TF Aで調製した α—シァノ— 4—ヒドロキシ桂皮酸（シグマ一アルドリッチ 社製)飽和溶液を 2倍希釈した溶液を用いた。さらに、アミノ酸分析〔Anal. Biochem., 222, 19 (1994)]によっても、ペプチドの構造の確認を行った。加水分解はピコタグ用 ワークステーション (ウォーターズ社製)を使用し、塩酸蒸気中 110°Cで 22時間行 、、 加水分解物のアミノ酸組成はアミノ酸分析機 L— 8500 (日立製)を用いて行った。 実施例 3
[0139] VGFに由来するペプチドの細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性
全身にアポェクオリンを発現しているアポェクオリン遺伝子のトランスジエニックマウ ス（以下、アポェクオリン発現マウスとよぶ）の各臓器を利用して、実施例 2で合成した ペプチド 1〜5、 9および 10力 細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有 するかどうかを調べた。アポェクオリン発現マウスの細胞は、アポェクオリンが発光基 質セレンテラジンの存在下でカルシウムイオンと結合し発光するため、細胞内カルシ ゥムイオン濃度をモニターできる。なお、特許文献 (WO02Z010371)には、アポェ クオリン発現マウスの作製法、該マウス由来の生体試料を使用した生理活性物質の 評価方法および、以下に示すような生理活性ペプチドを該マウスの臓器を使用して 評価した実験結果が開示されている。すなわち、アポェクオリン発現マウスより得られ た各臓器に、アンジォテンシン IIを終濃度 1 μ mol/Lで添加したところ、血管、子宫 、副腎において強い発光が観察され、またブラジキュンを終濃度 10 molZLで添 カロしたところ、血管、子宫、副腎において強い発光が観察されたとの記載があり、アポ ェクオリン発現マウスは新規なペプチドの生理活性評価に使用可能である。
[0140] アポェクオリン発現マウスは特許文献 (WO02Z010371)の参考例 4で開示され ている方法に従い作製した。アポェクオリン発現マウスを屠殺後、胸腺、脾臓、骨、血 管、心臓、腎臓、副腎、脾臓、下垂体、子宮の各臓器を摘出し、それぞれの臓器を約 1〜 2mm3の立方体に細断した。次に、 5mLチューブ（Rohren- Tubes ;ザルスタツト（S arstedt)社製、 No. 55. 476)中で、 RPMI 1640培地に溶解した 10 μ molZLセレ ンテラジン〔モレキュラ^ ~ ·プローブズ（Molecular Probes社）製〕溶液 50 μ Lに、調製 した各種臓器試料を 3個づっ加え 37°Cで 3時間培養した。 3時間後、 RPMI1640培 地を添カ卩し、 25秒後に RPMI 1640培地に溶解したペプチド 1〜 5それぞれを終濃度 1 μ mol/Lおよび 5 μ mol/Lになるように添加し、 /レミノメーター〔オートルーマット（ AutoLumat) LB953、ベルトルード（Berthold)社製〕を用いて、 RPMI1640培地の添 加直後から 1秒ごとに相対発光量を測定した。
[0141] その結果、その結果、ペプチド 1は胸腺、心臓（図 1)、下垂体、子宮で、ペプチド 2 は、胸腺、脾臓、骨、血管（図 2)、心臓 (図 3)、子宮で、ペプチド 3は胸腺、脾臓、骨 、血管、心臓 (図 4)、腎臓、副腎、下垂体、子宮で、ペプチド 4は、胸腺、脾臓、血管（ 図 5)、下垂体で、ペプチド 5は、心臓（図 6)で、ペプチド 9は血管（図 7)で、ペプチド 10は心臓（図 8)、血管（図 9)でそれぞれ発光が観察された。以上から、ペプチド 1〜 5及びペプチド 9、 10は、循環器系に関与する臓器である心臓または血管の細胞に ぉ 、て細胞内のカルシウムイオンの濃度を上昇させる活性を有して 、ることがわかつ た。
実施例 4
[0142] ペプチド 2のラットの血圧に対する作用
ウィスター（Wistar)ラッ卜（雄、 10週齢、 250〜300g)に、 50mgZ体重 kgのペン卜 バルピタールを腹腔内投与し、麻酔した。麻酔下にあるラットの外頸静脈と内頸動脈 にカテーテルを挿入し、内頸動脈のカテーテルを圧モニターに接続し、外頸静脈か ら生理食塩水に溶解した 300nmolのペプチド 2 (100 μ L)をボーラス投与し、連続 的に血圧を測定した。ペプチド投与後の平均動脈圧の変動を図 10に示した。図 10 に見られるように、ペプチド 2の投与により、明らかな血圧上昇が認められた。
実施例 5
[0143] ペプチド 1を抗原とする抗体の作製
(1)動物の免疫と抗血清の調製
ペプチド 1をキャリア蛋白質と結合させるため、ペプチド 1の Ν末端にシスティン残基 を付加した配列番号 7のアミノ酸配列力もなるペプチド 7を実施例 1と同様にアメリカ ン.ペプチド ·カンパ-一社に依頼して化学合成した。ペプチド 7 4. 9mgを、システ イン残基を介して、マレイミドで活性化したキーホール ·リンペット ·へモシァニン〔Injec t Activated mcKLH;ピアース（Pierce)社製〕 lOmgと共有結合させた。共有結合の 反応はピアース社のマニュアルに従って行った。得られたペプチド 7と KLHとのコン ジュゲートを生理食塩水で透析したものを抗原とした。抗原は分注し、使用時まで— 35°Cで保存した。得られた抗原の生理食塩溶液 lmL (ペプチド 7約 200 gに相当） を当容のフロイントの完全アジュバントと混合して安定なェマルジヨンを作成し、 3週 間毎に 9回雄のゥサギ（New Zealand white rabbit)に皮内投与して、免疫した。投与 後に抗体価を測定し、抗体価の上昇が見られたゥサギカゝら血清を調製し、抗血清とし た。
(2)抗体価の測定
抗体価の測定は、以下に示すようなラジオィムノアッセィ (RIA)により行った。すな わち、ポリスチレンチューブ内で、 RIA緩衝液〔25mmolZL EDTA、 80mmol/L 塩ィ匕ナトリウム、 0. 05% ジィ匕ナトリウム、 0. 5%N—ェチノレマレイミ 処理 BSA、 0. 5%トリトン X— 100を含む 50mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 4)〕で段階的 に希釈した抗血清 100 Lに、一定量の [12¾標識したペプチド 1 (約 20000cpm、 500〜550Bq、ペプチド量として約 lOfmol)を含む RIA緩衝液 100 μ Lを添カ卩し、 4 °Cで 40時間インキュベートし、抗血清中の抗体と標識したペプチド 1を結合させた。 対照として、非特異結合を測定するため、抗血清の代わりに、抗血清を含まない RIA 緩衝液を用いた反応も行った。インキュベート後、 1%ゥシ γ—グロブリン（シグマ— アルドリッチ社製)溶液〔80mmolZL塩ィ匕ナトリウム、 0. 05%アジ化ナトリウムを含む 50mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 4)〕 100 Lを添カ卩して混合し、さらに 23 o/oポリエチレングリコール # 6000 (ナカライテスタ社製)溶液〔80mmolZL塩ィ匕ナトリ ゥム、 0. 05%アジ化ナトリウムを含む 50mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液（pH7. 4) 〕 500 μ Lを添カ卩して混合し、氷上で 10分以上静置した後、 3000rpmで 15分間遠 心分離して、免疫複合体を沈殿させた。抗体と結合していない [12¾標識したぺプチ ド 1が含まれる上清を吸引して除き、 y—カウンターで沈殿の放射活性 A (cpm)を測 定した。非特異結合の反応チューブについても同様にして放射活性 N (非特異結合 量； cpm)を測定し、沈殿の放射活性の値 Aから非特異結合量 Nの値を差し引 、た 値を抗血清の特異的結合量とした。反応に用いた [12¾標識したペプチド 1を含む R IA緩衝液 100 Lの放射活性 T (cpm)を γ—カウンターで測定し、添加した抗原べ プチドの放射活性に対する特異的結合量の割合 Χ (%)を以下の式で求めた。抗血 清の希釈率と Xとをプロットし、 Xが 30%になる希釈率の逆数を抗体価の指標とした。 Χ (%) = { (Α-Ν) /Ύ) X 100
[0145] 抗原ペプチドの [12¾標識は、ラクトペルォキシダーゼ法により、抗原ペプチドの Ν 末側のチロシン残基を標識した。すなわち、ペプチド 1 gを 0. 4molZL酢酸ナ トリウム（pH5. 6) 25 Lに溶解させ、 200ngのラクトペルォキシダーゼを含む 0. lm ol/L酢酸ナトリウム（pH5. 6)溶液 10 レ 3. YMBq/ zz L Na125I 5 /ζ Ι^ ( 18. 5 MBq)、 0. 002%過酸ィ匕水素 5 /z Lを添カ卩して撹拌し、 30°Cで 10分間反応させた。 さらに 0. 002%過酸ィ匕水素 5 Lを添カ卩して撹拌し、 30°Cで 10分間反応させた。水 500 μ Lを添カ卩し、 ACN勾配 10— 60%Z0. 1 %TFAの溶媒系を用いた C18系の 逆相 HPLCにより、標識ペプチドを分取した。ペプチド溶液は 60%ACN— 0. 1 %T FAで希釈し、分注して— 85°Cで保存した。
[0146] (3)抗血清の結合特異性
得られた抗血清のうち、上記の抗体価が 9 X 105を示した抗血清、すなわち上記の RIAにおいて、 9 X 105倍に希釈しても、添カ卩した抗原ペプチドの 30%が結合を示し た抗血清を用 、て、 RIAにより VGFに由来する 6種類のペプチドに対する結合特異 性を調べた。すなわち、 RIA緩衝液で 9 X 105倍に希釈した抗血清 100 Lに、一定 量の [1251]標識したペプチド 1 (約 20000cpm、 500〜550Bq、ペプチド量として約 1 Ofmol)を含む RIA緩衝液 100 μ L、段階的に希釈した各 VGF由来ペプチドを含む RIA緩衝液 100 Lを添カ卩し、 4°Cで 40時間インキュベートし、抗血清中の抗体に標 識ペプチド 1と VGF由来ペプチドを競合的に結合させた。対照として、非特異結合を 測定するため、抗血清を添加せず、代わりに RIA緩衝液を用いた反応、最大結合量 を測定するため、 VGF由来ペプチド溶液を添加せず、代わりに RIA緩衝液を用いた 反応も行った。非特異結合の反応は 4連、その他の反応は 2連で行い、それぞれの 反応物に対し、上記の抗体価の測定と同様にして免疫複合体を沈殿させ、その放射 活性 (cpm)を測定した。非特異結合の反応の放射活性の平均を非特異結合量 N、 各 VGF由来ペプチドの添加反応の放射活性の値を Y、最大結合の反応の放射活性 の値を Ζとしたとき、最大結合量 Βに対するペプチド添加時の抗血清の特異的結合
0
量 Βの割合 ΒΖΒ (%)を以下の式により求めた。
0
Β/Β (%) = { (Υ-Ν) / (Ζ-Ν) } X 100
0
抗血清が添加したペプチドにも結合する場合は、添加したペプチドが、量の増加と 共に、抗血清の抗原ペプチドへの結合を競合的に阻害するので、ペプチド添加時の 抗血清の特異的結合量が減少する。したがって、 Β/Βが 50%になる、つまり最大
0
結合量を 50%阻害するペプチドの量を、そのペプチドに対する抗血清の結合の強さ の指標とした。 50%阻害するペプチドの量が低いほど、結合の強さが強いことになる
[0147] VGFに由来するペプチドとしては、実施例 2で調製したペプチド 1〜3、および配列 番号 8のアミノ酸配列力 なるペプチド 8を用いた。配列番号 8はヒト VGFのアミノ酸 配列の 606〜615番目の配列であり、ペプチド 1のアミノ酸配列は含まない。ぺプチ ド 1は 0. 5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128、 256、 512、 1024fmol、ペプチド 2は 1 、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128、 256、 512、 1024fmol、ペプチド 3は 1、 3. 3、 10、 3 3、 100、 333、 1000、 3300、 10000、 33000、 100000、 333000、 lOOOOOOfm ol、ペプチド 8は 1000、 10000、 100000、 lOOOOOOfmolの各量のペプチドブチュ ーブで測定を行った。
[0148] 図 11に示すように、ペプチド 1および 2は量依存的に同程度に抗血清の結合を阻 害し、ペプチド 1の 50%阻害の量は 7. 5fmolであった。ペプチド 3も量依存的に抗 血清の結合を阻害したが、その阻害は弱ぐペプチド 1および 2と同程度の阻害を示 すには、約 10000倍の量が必要であった。ペプチド 8は全く阻害を示さなかった。し たがって、この抗血清は、抗原であるペプチド 1に非常に強い結合をするとともに、ぺ プチド 1を含む構造を有するペプチド 2にも同程度に強!、結合をするが、ペプチド 3 に対してはペプチド 1の 1Z10000の弱い結合しかせず、ペプチド 8に対しては、全く 結合をしな 、結合特異性を示す、ペプチド 1および 2に特異的に結合する抗体であ つた。なお、 VGF以外のペプチドとして、アンジォテンシン II、カルシトニン遺伝子関 連ペプチド、 Leu エンケフアリン、ニューロメジン U— 8、サブスタンス 、バソプレツ シン、 Met エンケフアリン一 Arg Gly— Leu、アドレノメジュリン、カルシトニン、 PHI 27、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、 PAMP— 20、カルシトニン受容体刺激べ プチドに対する結合を、上記と同様にして 1、 10、 lOOpmolの各量のペプチドで調 ベたが、どのペプチドも 1、 10および lOOpmolいずれも阻害を示さず、ペプチド 1お よび 2に特異的に結合する抗体であることが確認された。
[0149] ペプチド 3はペプチド 1のアミノ酸配列を含む力 ペプチド 1の C末端のアミドを有さ な 、構造であり、ペプチド 8はペプチド 1のアミノ酸配列は含まな 、構造であるので、 この抗血清は、ペプチド 1の配列番号 4のアミノ酸配列の C末端がアミドィ匕した配列（ 配列番号 27)中に存在するェピトープと結合する抗体、特に該配列の C末端のアミド を含む領域に存在するェピトープと結合する抗体であると考えられた。
産業上の利用可能性
[0150] 本発明により、循環調節活性を有する新規なペプチドが提供される。該ペプチドは 、循環調節活性を有するので、循環調節剤、昇圧剤として有用であり、また心筋梗塞 、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療に用いることができる。 「配列表フリーテキスト」
配列番号 1 発明者：山崎基生；高橋憲行；南野直人；
発明者:佐々木ー榭；高尾敏文；里見佳典
配列番号 7—合成ペプチド 7
配列番号 10—配列番号 1のアミノ酸配列をコードする DNA
配列番号 11 配列番号 2のアミノ酸配列をコードする DNA
配列番号 12 配列番号 3のアミノ酸配列をコードする DNA
配列番号 13 配列番号 4のアミノ酸配列をコードする DNA
配列番号 17— VGF由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号 18— VGF由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号 19 VGF由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号 20— VGF由来ペプチドのコンセンサス配列 配列番号 21一ペプチド 2に対応するラット VGF配列に基づくペプチド 配列番号 22—ペプチド 1に対応するラット VGF配列に基づくペプチド 配列番号 23— VGF由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号 24— VGF由来ペプチドのコンセンサス配列
配列番号 34—配列番号 28のアミノ酸配列をコードする DNA 配列番号 35—配列番号 29のアミノ酸配列をコードする DNA

Claims

請求の範囲
[1] 以下の（a)〜（e)のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
(a)配列番号 1〜4のいずれか、 28または 29で表されるアミノ酸配列を含むペプチド (ただし、配列番号 9、 30、 31、 32または 33のアミノ酸配列力もなるペプチドは除く）；
(b)配列番号 1〜4のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以 上 5以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、心臓また は血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(c)配列番号 1〜4のいずれ力 28または 29で表されるアミノ酸配列と 90%以上の 相同性を有するアミノ酸配列力 なり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムィ オン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(d)下記式 (I)で表されるペプチド (ただし、配列番号 14〜16の配列力もなるぺプチ ドを除く）
[化 13]
Z1 - A - Z2 (I)
(式中、 Z1は水素原子または 1〜： L 1個のアミノ酸力 なる任意の配列のペプチド残基 を表し、 Aは配列番号 17のアミノ酸配列からなるペプチド残基を表し、 Z2は、アミノ基 または 1〜38個のアミノ酸力 なる任意の配列のペプチド残基を表す）；および
(e)下記式 (II)で表されるペプチド
[化 14]
R1 - B - R2 (II)
(式中、 R1は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノィル、置換もしくは非置換のァ ロイル、置換もしくは非置換のへテロアリールカルボ-ル、置換もしくは非置換のアル コキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールォキシカルボ-ル、または置換もし くは非置換のへテロアリールォキシカルボ-ルを表し、 R2はヒドロキシ、置換もしくは 非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、 Bは上記 (a)〜（d) の!、ずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
[2] ペプチドが、以下の（a)〜（f)の!、ずれかのペプチドである、請求項 1記載のペプチド またはその薬理学的に許容される塩： (a)配列番号 1のアミノ酸配列からなるペプチド；
(b)配列番号 2のアミノ酸配列力 なるペプチド；
(c)配列番号 28のアミノ酸配列力もなるペプチド；
(d)配列番号 29のアミノ酸配列力もなるペプチド；
(e)請求項 1の式 (II)において、 R1が水素原子であり、 Bが配列番号 3のアミノ酸配列 からなるペプチド残基であり、かつ R2が非置換のァミノであるペプチド；および
(f)請求項 1の式 (II)において、 R1が水素原子であり、 Bが配列番号 4のアミノ酸配列 からなるペプチド残基であり、かつ R2が非置換のァミノであるペプチド。
[3] 請求項 1の（a)〜（c)に記載のペプチドをコードする DNA。
[4] 請求項 3記載の DNAをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
[5] 請求項 4記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[6] 請求項 5記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から該ペプチドを採取することを特徴とする該ペプチドの製造方法。
[7] 配列番号 4のアミノ酸配列または配列番号 4のアミノ酸配列の C末端がアミド化した配 列に存在するェピトープと結合する抗体。
[8] 請求項 7記載の抗体を用いて、請求項 1または 2に記載のペプチドを検出または定量 する方法。
[9] 以下の（a)〜 (f)力も選ばれる少なくとも 1つのペプチドまたはその薬理学的に許容さ れる塩を有効成分として含む循環調節剤：
(a)配列番号 1〜5のいずれか、 28または 29で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
(b)配列番号 1〜5のいずれ力、 28または 29で表されるアミノ酸配列において、 1以 上 5以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列力もなり、心臓また は血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
(c)配列番号 1〜5のいずれ力 28または 29で表されるアミノ酸配列と 90%以上の 相同性を有するアミノ酸配列力 なり、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムィ オン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；および
(d)請求項 1の式 (I)で表されるペプチド； (e)配列番号 23のアミノ酸配列力 なるペプチド、または配列番号 23のアミノ酸配列 の N末端に 1〜32個のアミノ酸力もなる任意のアミノ酸配列が付カ卩したアミノ酸配列 からなるペプチド。
(f)下記式 (III)で表されるペプチド
[化 15]
R3 - C R4 (III)
(式中、 R3は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノィル、置換もしくは非置換のァ ロイル、置換もしくは非置換のへテロアリールカルボ-ル、置換もしくは非置換のアル コキシカルボ-ル、置換もしくは非置換のァリールォキシカルボ-ル、または置換もし くは非置換のへテロアリールォキシカルボ-ルを表し、 R4はヒドロキシ、置換もしくは 非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、 Cは上記 (a)〜（e) の!、ずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
[10] 請求項 9記載の（a)〜 (f)の 、ずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩 および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、 該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に 接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が抑制される場合の試験物質を該 ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害 する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細胞 の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質のスクリーニング方法。
[11] 請求項 9記載の（a)〜 (f )の 、ずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩 および試験物質を心臓または血管の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、 該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に 接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が促進される場合の試験物質を該 ペプチドによる心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進 する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる心臓または血管の細胞 の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質のスクリーニング方法。
[12] 請求項 9記載の（a)〜 (f)の 、ずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩 および試験物質を心臓もしくは血管の細胞または該細胞の膜画分に接触させた場 合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容 される塩の結合量を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験 物質の非存在下で該細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該ペプチドま たはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較して、結合量が低下する場合の試 験物質を該ペプチドの受容体に対するァゴ-ストまたはアンタゴ-ストとして特定する ことを特徴とする、該ペプチドの受容体に対するァゴ-ストまたはアンタゴ-ストのスク リーニング方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007105442A1 (ja) * 2006-02-22 2007-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 摂食障害または摂水障害の治療薬
JP5914906B2 (ja) * 2010-12-28 2016-05-11 国立大学法人 宮崎大学 インスリン分泌促進剤
WO2023102377A3 (en) * 2021-11-30 2023-07-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antisense inhibitors of mir17hg pre-rna as therapeutic agents in cancer

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001064835A2 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
JP2003505428A (ja) * 1999-07-21 2003-02-12 アムジエン・インコーポレーテツド Ｖｇｆ選択的結合剤およびｖｇｆ関連障害の治療方法
JP2004531250A (ja) * 2001-04-06 2004-10-14 ビオ・ビジョン・アーゲー 慢性痴呆疾患の検出方法、関連ペプチドおよび検出試薬

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2380037A1 (en) * 1999-07-21 2001-02-01 Amgen Inc. Vgf polypeptides and methods of treating vgf-related disorders
US20040081972A1 (en) * 2000-08-01 2004-04-29 Mitsuo Satoh Novel physiologically active peptide and use thereof
WO2004048938A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
JPWO2007105442A1 (ja) * 2006-02-22 2009-07-30 協和発酵キリン株式会社 摂食障害または摂水障害の治療薬

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003505428A (ja) * 1999-07-21 2003-02-12 アムジエン・インコーポレーテツド Ｖｇｆ選択的結合剤およびｖｇｆ関連障害の治療方法
WO2001064835A2 (en) * 2000-02-28 2001-09-07 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
JP2004531250A (ja) * 2001-04-06 2004-10-14 ビオ・ビジョン・アーゲー 慢性痴呆疾患の検出方法、関連ペプチドおよび検出試薬

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CANU N. ET AL.: "Cloning, structural organization analysis, and chromosomal assignment of the human gene for the neurosecretory protein VGF", GENOMICS, vol. 45, no. 2, 1997, pages 443 - 446, XP004434167 *
SALTON S.R.J. ET AL.: "Structure of the gene encoding VGF, a nervous system-specific mRNA that is rapidly and selectively induced by nerve growth factor in PC12 cells", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 11, no. 5, 1991, pages 2335 - 2349, XP003003947 *
TRANI ET AL.: "Isolation and characterization of VGF peptides in rat brain. Role of PC1/3 and PC2 in the maturation of VGF precursor", JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY, vol. 81, no. 3, 2002, pages 565 - 574, XP003006590 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007105442A1 (ja) * 2006-02-22 2007-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 摂食障害または摂水障害の治療薬
JP5914906B2 (ja) * 2010-12-28 2016-05-11 国立大学法人 宮崎大学 インスリン分泌促進剤
WO2023102377A3 (en) * 2021-11-30 2023-07-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antisense inhibitors of mir17hg pre-rna as therapeutic agents in cancer

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