CN1107891A

CN1107891A - 人促巨核细胞生成素及其分离纯化和基因克隆方法及应用

Info

Publication number: CN1107891A
Application number: CN 94112066
Authority: CN
Inventors: 顾学范; 韩忠朝
Original assignee: BEITE BIOLOGY TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: BEITE BIOLOGY TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Priority date: 1994-03-04
Filing date: 1994-03-04
Publication date: 1995-09-06
Also published as: AU1888095A; WO1995023861A1

Abstract

本发明涉及采用生化方法从再生障碍性贫血病人的尿和血清中分离出一种新的造血细胞生长因子 ——人促巨核细胞生成素，经氨基酸序列分析，从人胚肝cDNA文库克隆出该因子的cDNA，经小鼠体内外试验和人体骨髓体外培养分析，该因子能明显促进骨髓巨核细胞集落的形成，增大巨核细胞的体积，刺激小鼠血小板的生成，能治疗各种血小板减少症，与其它造血细胞生长因子合用能促使粒细胞与红细胞的生长，可治疗全血细胞减少症或粒细胞减少症或贫血。

Description

本发明涉及人促巨核细胞生成素（Human megakaryopoietin简称MPO）的分离纯化，基因（cDNA）克隆，氨基酸和核苷酸顺序测定以及采用基因工程方法生产重组人MPO，以及MPO本身或含有MPO的制剂作为治疗血小板和其它血细胞减少症的药物或保健品，或作为研究和临床诊断试剂的应用。

已知造血细胞是能增殖和分化进一步产生成熟血细胞的前体细胞，有髓系造血细胞和淋巴系造血细胞之分，髓系造血细胞包括红细胞，白细胞和巨核细胞三个系列。红细胞主要负责机体组织中氧气，二氧化碳和一些营养物质或废物的交换。白细胞主要负责抵御感染的功能，巨核细胞则产生血小板，后者在机体止血和凝血中起关键作用。

已知造血细胞均来自一共同的多能干细胞，后者具有自我复制更新的能力并在一定的条件能进一步分化增殖为各系定向祖细胞。这些造血干细胞和祖细胞在体外培养体系中具有不同的增殖能力和细胞表型，据此可加以鉴别和分类。

已知造血是一个复杂的过程，受许多因子调节，包括各种细胞介素（Interleukin），集落形成刺激因子（GM-CSF，G-CSF，M-CSF）和其它细胞生长刺激因子，如干细胞因子（Stem cell factor），促红细胞生成素（Erythropoietin，简称EPO）和成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，简称FGF）。对巨核细胞血小板生成有刺激作用的因子有IL1，IL3，IL6，IL11，GM-CSF，SCF和FGF（韩忠朝等，中华血液杂志，14：159-161，1993Caen&Han，C R Acad Sci Paris，316：925-30，1993）。这些因子均已采用基因重组技术生产，少数已用于临床试验或治疗，但提高巨核细胞和血小板数量的作用不明显。此外，这些因子的活性十分广泛，临床应用指征不明确且具有一定的副作用。

已知再生障碍性贫血或化疗诱发骨髓衰竭的病人其血清和尿中含有很高的能促进巨核细胞生长和分化，增加血小板生成的活性物质，许多研究者试图去鉴别，分离这种物质，并取得一些资料（Hoffman，Blood，74：1196-212 1989;Mazur等，Blood，76：290-7 1990;EricKson-Miller等，Br J Haematol，84：197-203，1993），但至今未能获取结构明确并具活性的天然或基因重组因子。

本发明的目的是：

（1）采用本发明的一套生化方法，从再生障碍性病人的尿和血清中分离纯化出一种新的蛋白质因子，即一种新的造血细胞生长因子-人促巨核细胞生长素。

（2）建立一套制备MPO的生化方法和MPO的cDNA克隆方法，并提出了采用重组DNA技术用基因工程方法大量生产MPO的技术方案。

（3）MPO应用的技术方案。

本发明建立了一套分离方法从再生障碍性贫血病人的尿和血清中分离纯化出一种新的具有调节巨核细胞生长，分化和成熟活性的蛋白因子，取名为促巨核细胞生长素（Megakaryopoietin，简称MPO）。根据蛋白质顺序，设计出相应的核苷酸引物在人胚肝cDNA文库中筛选出MPO的cDNA克隆，并测出其核苷酸顺序。

MPO的分离方法：

作为本发明的首要方面，我们建立了一套新的生化分离方法从再生障碍性贫血的尿以及血清中分离出一个新的蛋白质，这套方法如下：

1.取再生障碍性贫血病人的尿液，加0.1%酚（Phenol）后超滤浓缩（Amicon YM10过滤器），再经过Sephadex G50柱，收集含蛋白质部分或直接取再生障碍性贫血病人的血清。

2.加入氯化胍（3M）处理，再加乙醇沉淀（60-90%饱和）。

3.收集沉淀，用PBS缓冲液透析。

4.经透析的清液上麦胚凝集素（WGA）-Sepharose（Pharmacia LKB）柱层析，用PBS作为缓冲液，2M乙酰葡糖胺洗脱。

5.洗脱液上反向HPLC-VYDAC C18柱，用A液：0.1%三氟醋酸，B液：70%化甲烷乙腈-0.1%三氟醋酸，40分钟梯度洗脱。

6.Superose6-HPLC（Pharmacia LKB）柱层析，PBS作为缓冲液。

7.肝素-Sepharose柱（Bio-Rad）层析，用A液：0.1%三氟醋酸，B液：70%化甲烷乙腈-0.1%三氟醋酸，30分钟梯度洗脱。

8.反向HPLC-Nucleosil C4柱，收集产物。

（方法流程见说明书附图1）。

在最后的洗脱物中，我们发明一活性高的组分，经¹²⁵Ⅰ标记后作聚丙酰胺电泳分析为分子量约24-32KD的单一蛋白。

值得提出的是Superose 6柱能分离出二个活性组份，一个落在24-55KD范围内，另一个落在7-13KD范围内（见表Ⅲ）。

本发明应用的所有化学制剂和材料都已商品化可以买到，本发明分离方法技术新颖重复性好，产率也高。

MPO氨基酸序列分析：

本发明的另一项重要实验是对纯化分离出来的MPO蛋白质作氨基酸序列分析，我们把按图1方法从55升再障病人的尿中分离开来的30微克MPO蛋白用2%胰蛋白酶消化处理，然后进行氨基酸序列分析，得出下列二条肽序列。

（1）DATCNCDYNC QHYMECCPD

（2）SPKPPNKKKT KKVIESEE

MPO的cDNA分子克隆：

根据获得的氨基酸序列，用已知的遗传密码推测与氨基酸相应的核苷酸，我们设计了多对变性引物进行PCR扩增。其中一对变性引物在以胚肝cDNA文库为模板的扩增中获得一条特异性扩增带，变性引物序列如下1）TGYAAYTGYG AYTAYAAYTG YCARCAYTAY ATGGA2）TTYGGNGGNT TRTTYTTYTT YTGNTTYTTY CANTADCT。所获特异扩增带的cDNA序列测定（表Ⅱ）证实与氨基酸序列吻合（见表1）。

此特异性cDNA扩增产物用DIG-dUTP（BOEHRING产品）标记，作为探针在人胚肝cDNA文库中筛查，每盘直径为14cm的碟子中播下4-5万个克隆，用尼龙膜转移，尼龙膜经变性及缓冲处理后与标记的cDNA探针杂交，经洗脱及荧光显景，在X光底片上获得图象。

由于使用的cDNA文库的质粒为人-ZAP，筛查到的阳性克隆可以用R408 HELPER PHAGE进行体内pBluescript的切除，在含有氨苄青霉素的LB碟子上克隆，再经多次亚克隆和DNA测序，获得了表Ⅱ所示的MPO cDNA序列，经比较1993年的资料基因库，未见有相同的cDNA序列。

本发明的重要用途在于：

（1）可以采用已经建立的分离方法从人或动物的尿和血清中大量纯化天然MPO，由于天然人MPO主要于存在于再生障碍性贫血病人的血和尿中（Hoffman，Blood，74：1196-212 1989;Han et al，Int J Hematol，54：3-14，1991）来源有限，不易大量提取，但假如将某些动物如牛，狗，猪或老鼠进行照射，造成继发性再生障碍性贫血，然后制备血清，再采用本发明的方法纯化分离MPO，则来源充足;

（2）根据本发明提供的MPO cDNA序列，采用重组DNA技术，可通过现在通用的各种表达体系，如大肠杆菌，酵母菌，昆虫或哺乳类动物细胞的表达，大量生产基因重组的MPO及其Mutants（变异物）;

（3）MPO和其Mutant因了作为造血细胞生长因子，可广泛用于研究血细胞的生长调节并可用作体外造血干细胞和祖细胞，巨核细胞和血小板生长和大量扩增的重要试剂;

（4）整个MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的Mutant蛋白单独可制作成药物治疗各种原因引起的血小板减少;

（5）MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的Mutant蛋白与一些能增加其活性的物质（如粘多糖或脂）组成的复合制剂可用作药物，治疗各种原因引起的血小板减少;

（6）MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的Mutant蛋白与一些造血细胞生长因子（SCF，EPO，GM-CSF和IL3）体外合用，对红系和粒系祖细胞的生长也有作用，因此与治疗有效量的这些生长因子配伍合用，可治疗全血细胞减少症;

（7）MPO和其Mutant因子可用作抗原在鼠，兔子和羊等动物身上制备单克隆和多克隆抗体，MPO及其抗体可配备成试剂盒，用于MPO水平测定和定位，可作为与巨核细胞和血小板有关疾病的诊断和科研试剂，抗MPO抗体还可用于因MPO水平增高引起的有关疾病的治疗药物;

（8）MPO及其抗体，可用作鉴别分离MPO受体的重要工具，这可通过目前通用的受体鉴别分离方法来进行。

本发明用下述实例进行说明，但不局限于此。

例一，从7例再障病人陆续收集到55升尿。每批收集的尿随即用Amicon的YM10过滤器超滤浓缩，然后用Sephadex G50层析脱盐。蛋白部分随即冷冻干燥保存至55升尿均处理完毕。尿蛋白经3M的氯化胍处理后，按图1方法进行分离纯化。每步分离后，采用小鼠骨髓体外血浆凝块法（Han etal，Br J Haematol，81：1-5，1992）对所有的组份都作活性分析。具有明显剌激巨核细胞生长的组份随即进行下一步的分离纯化。人尿促巨核细胞生成素的纯化与活性分析结果摘要录于表Ⅲ。

表Ⅲ：人尿促巨核细胞生成素分离纯化及活性分析摘要

分离步骤(活性部位) 特异性活性总纯化指数

集落数/mg

1.尿蛋白(SephadexG50后) 3 1

2.酒精沉淀物(60-90%饱和度) 300 30

3.麦胚凝集素柱(亲和部分) 4100 ≈1400

4.反向HPLC-C18(20-26管) 7600 ≈2530

5.Superose-6层析柱

(1)(20-22管) 12000 4000

(2)(35-37管) 11000 ≈3300

6.肝素柱(亲和部分)

(1)5-(1)组份 86000 ≈28700

(2)5-(2)组份 49000 ≈16300

7.反向HPLC-C4

(1)6-(1)(8-9管) 143000 ≈47700

(2)6-(2)(8-9管) 138000 46000

骨髓细胞来自Balb/c小鼠。巨核细胞培养和鉴别方法按文献（Han et al，Br J Haemtol 81：1-5，1992）进行

例二，从7例再障病人陆续采集到的血清550毫升，经3M氯化胍处理后，按图1方法进行分离纯化人血清促巨核细胞生成素。其活性分析方法同例1，结果摘要如下：

表Ⅳ：人血清促巨核细胞生成素纯化及活性分析摘要

分离步骤(活性部位) 特异性活性总纯化指数

巨核细胞集落数/mg

1.血清 10 1

2.乙醇沉淀物(60-90%饱和度) 400 40

3.麦胚凝集素亲和层析(亲和部分) 5000 500

4.反向HPLC-C18(第23-25管) 9500 950

5.Superose-6层析(第20-22管) 17000 1700

6.肝素亲和层析(亲和部分) 30000 3000

7.反向HPLC-C4(第8-9管) 68000* 6800*

与表Ⅲ比较，人血清MPO与尿MPO可用同样方法纯化，它们的性质也基本相同。＊因蛋白量很小，其浓度为估计值。

例三：将本发明纯化的人尿MPO对Balb/c小鼠骨髓巨核细胞祖细胞（CFU-MK），粒单细胞祖细胞（CFU-GM）和红细胞祖细胞BFU-E生长的作用进行体外实验分析，其结果见表Ⅴ：

表Ⅴ：人尿MPO对CFU-MK和CFU-GM生长的作用

因子浓度(ng/me) CFU-MK CFU-GM BFU-E

(/2×10⁵细胞)

1)MPO 0 2±0.5 4±0.9 0

2) 10 21±3.0* 5±1 0

3) 50 46±4.1* 6±1 2±0.5

4)IL3 50 43±3.2 32±5 3±0.5

5)IL3+MPO 72±5.4*# 42±3 3±0.8

6)IL6 20 18±1.6 15±3 1±0.3

7)IL6+MPO 57±1.2*# 8±1 1.5±0.4

8)EPO 12±3 7±2 33±2

9)EPO+MPO 66±5# 13±2 55±2#

10)SCF 11±2 10±1 3±1

11)SCF+MPO 56±3 22±2# 8±2

＊与正常组（MPO ong/ml）对照，P＜0.05;＃与未加MPO组对照，P＜0.05。

例四：将本发明得到的人尿MPO加入正常人骨髓细胞培养，发现对人CFU-MK也有明显的刺激作用，其结果为：

表Ⅵ：人尿MPO对正常人CFU-MK和CFU-GM的作用

MPO 肝素 CFU-MK CFU-GM

浓度(ng/ml) (μg/ml) 集落数/2×10⁵细胞集落数/2×10⁵细胞

0 0 1±0.2 13±0.7

10 0 7±2 14±1

50 0 28±3* 14±2

100 0 48±2* 19±3

0 10 2±0.3 12±2

10 10 31±3* 16±3

50 10 42±5* 15±2

100 10 65±5* 16±3

人骨髓CFU-MK和CFU-GM培养采用已报道的方法（Han et al，Blood 75：1234-1239，1990）。意指与对照组比较P＜0.05，＊意指＜0.01。

从表Ⅶ看出，人MPO对人骨髓巨核细胞生长有明显的刺激作用。

例五：本发明所述人尿MPO对巨核细胞的成熟也有促进作用，表Ⅶ的结果指出人MPO能增加巨核细胞的直径。已知巨核细胞直径为判断其成熟程度的指标之一（Han et al，Br J Haematol，81：1-5，1992）

表Ⅶ：人尿MPO对小鼠巨核细胞直径的影响

未加MPO组加50ngMPO组加MPO(100ng/ml)组

巨核细胞直径(μM) 28±4 39±3* 42±4*

每组共测量了200个巨核细胞，数据以平均数±标准差表示。

＊意指与未加MPO组比较P＜0.01。采用Student′s t tesr检测。

实施例六：人尿MPO分离5步后获得的第一组份（Superose 6组份）用于小鼠体内分析。每只Balb/c小鼠于腹腔内注射MPO组份100μg/次，每日二次，共注射4天。对照组小鼠则以同样方式注射PBS。最后一次注射后第4天，取小鼠血用Coulter细胞计数器计算末梢血细胞数量，同时取骨髓作祖细胞（CFU-MK和CFU-GM）和巨核细胞数量分析。整个分析采用文献报道方法（Han等 C R Acad Sci Paris 313：553-8，1991），其结果见表Ⅷ：

表Ⅷ：人尿MPO对小鼠巨核细胞和血小板生成的体内作用

骨髓(/10⁵细胞)

组别

CFU-MK 巨核细胞 CFU-GM 血小板白细胞血红蛋白

万/10³mm /10³mm g/100ml

PBS 34±3 159±12 44±3 908±24 2500±400 15±2

MPO 67±5* 288±13* 51±4 1240±35* 3500±350 15±3

＊意指与PBS组对比P＜0.05，Student′s t测验。

由上述试验结果可见。MPO不但在体外能刺激巨核细胞生长，注射人体内也能刺激巨核细胞和血小板的生长，因此可用于治疗血小板减少症。

实施例七：如将按本发明所述的MPO用作抗原免疫小鼠或兔子或其它动物，可得到相应的单克隆或多克隆抗体。抗MPO抗体可用来检测人的血清MPO浓度，作为诊断试剂，也可以用来研究MPO的作用机制和造血发生的机制，作为科研试剂。还可以用作药物，治疗因MPO产生过多的疾病。

实施例八：按照本发明所述的MPO cDNA克隆方法，可以设计与MPO不完全相同的变性引物进行PCR扩增，从而进一步获得MPO的类似物的cDNA。

实施例九：通过将已知的人MPO或其类似物的DNA编码序列（全部或一部分）插入到有关表达体系的细胞里，然后大量培养这些细胞（可以是哺乳类细胞，昆虫细胞，原生类细胞或细菌），采集该细胞培养悬液并按本发明方法分离纯化有刺激巨核细胞生长分化作用的蛋白质，其氨基酸序列将与表Ⅰ所述序列相同或大部分相同，也可以是其中一个片段。

实施例十：采取上述基因重组技术生产的MPO或类似物可以制成药物。这种药物可以是单一成份或复合成份。可以用来治疗各种血小板减少症。其剂量可按小鼠体内剂量推算。制剂可以是注射剂，口服片制，胶囊口服液等。

实施例十一：本发明所述的MPO可与其它有效剂量的造血细胞生长因子合用，治疗各种全血细胞减少症，粒细胞减少症和贫血。

实施例十二：本发明所述的MPO还可用作Ex vivo造血干细胞扩增试剂，包括单用扩增巨核细胞，与其它因子合用扩增各系的祖细胞。

表Ⅰ.人MPO的氨基酸序列

5 10 15 20 25

1 M A W K T L P I Y L L L L L S V F V I Q Q V S S Q

26 D L S S C A G R C G E G Y S R D A T C N C D Y N C

51 Q H Y M E C C P D F K R V C T A E L S C K G R C F

75 E S F E R G R E C D C D A Q C K K Y D K C C P D Y

101 E S F C A E V H N P T S P P S S K K A P P P S G A

126 S Q T I K S T T K R S P K P P N K K K T K K V I E

151 S E E I T E V K D N K K N R T K K K P T P K P P V

176 V D E A G S G L D N G D F K V T T P D T S T T Q H

201 N K V S T S P K I T T A K P I N P R P S L P P N S

226 D T S K E T S L T V N K E T T V E T K E T T T T N

251 K Q T S T D G K E K T T S A K E T Q S I E K T S A

276 K D L A P T S K V L A K P T P K A E T T T K G P A

301 L T T P K E P T P T T P K E P A S T T P K E P T P

326 T T I K S A P T T P K E P A P T T T K S A P T T P

351 K E P A P T T T K E P A P T T P K E P A P T T T K

376 E P A P T T T K S H P P L P R S C X X X X C T Q P

401 T P K E P H P P L P R S L H P P T K E P A P T T P

426 K E P A P T A P K K P A P L P P L E X X X K K K K

451 K K

表Ⅱ.人MPO的cDNA序列

1 TTTCAGGTAC CGTAGGTACC CTTGCCGTAA AGGATGGCAT

41 GGAAAACACT TCCCATTTAC CTGTTGTTGC TGCTGTCTGT

81 TTTCGTGATT CAGCAAGTTT CATCTCAAGA TTTATCAAGC

121 TGTGCAGGGA GATGTGGGGA AGGGTATTCT AGAGATGCCA

161 CCTGCAACTG TGATTATAAC TGTCAACACT ACATGGAGTG

201 CTGCCCTGAT TTCAAGAGAG TCTGCACTGC GGAGCTTTCC

241 TGTAAAGGCC GCTGCTTTGA GTCCTTCGAG AGAGGGAGGG

281 AGTGTGACTG CGACGCCCAA TGTAAGAAGT ATGACAAGTG

321 CTGTCCCGAT TATGAGAGTT TCTGTGCAGA AGTGCATAAT

361 CCCACATCAC CACCATCTTC AAAGAAAGCA CCTCCACCTT

401 CAGGAGCATC TCAAACCATC AAATCAACAA CCAAACGTTC

441 ACCCAAACCA CCAAACAAGA AGAAGACTAA GAAAGTTATA

481 GAATCAGAGG AAATAACAGA AGTAAAAGAT AACAAGAAGA

521 ACAGAACTAA AAAGAAACCT ACCCCCAAAC CACCAGTTGT

561 AGATGAAGCT GGAAGTGGAT TGGACAATGG TGACTTCAAG

601 GTCACAACTC CTGACACGTC TACCACCCAA CACAATAAAG

641 TCAGCACATC TCCCAAGATC ACAACAGCAA AACCAATAAA

681 TCCCAGACCC AGTCTTCCAC CTAATTCTGA TACATCTAAA

721 GAGACGTCTT TGACAGTGAA TAAAGAGACA ACAGTTGAAA

761 CTAAAGAAAC TACTACAACA AATAAACAGA CTTCAACTGA

801 TGGAAAAGAG AAGACTACTT CCGCTAAAGA GACACAAAGT

841 ATAGAGAAAA CATCTGCTAA AGATTTAGCA CCCACATCTA

881 AAGTGCTGGC TAAACCTACA CCCAAAGCTG AAACTACAAC

921 CAAAGGCCCT GCTCTCACCA CTCCCAAGGA GCCCACGCCC

961 ACCACTCCCA AGGAGCCTGC ATCTACCACA CCCAAAGAGC

1001 CCACACCTAC CACCATCAAG TCTGCACCCA CCACCCCCAA

1041 GGAGCCTGCA CCCACCACCA CCAAGTCTGC ACCCACCACT

1081 CCCAAGGAGC CTGCACCCAC CACCACCAAG GAGCCTGCAC

1121 CCACCACTCC CAAGGAGCCT GCACCCACCA CCACCAAGGA

1161 GCCTGCACCC ACCACCACCA AGTCTCACCC ACCACTCCCA

1201 AGGAGCTGCA C????????? ?TGCACCCAA CCAACTCCCA

1241 AGGAGCCTCA CCCACCACTC CCAAGGAGCC TGCACCCACC

1281 AACCAAGGAG CCTGCACCCA CCACTCCCAA AGAGCCTGCA

1321 CCCACTGCCC CCAAGAAGCC TGCCCCTCTA CCCCCTCTAG

1361 AGCC?????? ?AAAAAAAAA AAAAAAAAAA

MPO的分离方法图示如下：

氯化胍(3M)处理

↓

乙醇沉淀(60-90%饱和)

↓PBS透析

麦胚凝集素(WGA)-sepharose(Pharmacia LKB)

PBS作为缓冲液

↓2M乙酰葡糖胺洗脱

反向HPLC-VYDAC C18柱

A:0.1%三氟醋酸

B:70%化甲烷乙腈-0.1%三氟醋酸

↓40分钟梯度洗脱

Superose 6-HPLC(Pharmacia LKB)

↓PBS作为缓冲液

肝素-sepharose柱(Bio-Rad)

A:0.1%TFA,

B:70%化甲烷乙腈-0.1%三氟醋酸

↓30分钟梯度洗脱

反向HPLC-Nucleosil C4柱

Claims

1、一种新的人造血细胞生长刺激蛋白质因子，对巨核细胞的生长有明显的促进作用，按其特征取名为人促巨核细胞生长素(Megakaryopoietin简称MPO)，具有与表Ⅰ所列氨基酸序列相同或大部相同的蛋白质或具有生物活性的该蛋白多肽片段。

2、根据权利要求1所述的MPO，其特征是cDNA序列编码

a.与表Ⅱ所示cDNA序列相同或基本相同的cDNA序列

b.表Ⅱ所列cDNA序列的一个片段

c.能与之任一部分杂交的DNA序列

3、根据权利要求1所述的MPO，其特征是：

a.存在于再生障碍性贫血病人血清和尿中

b.能在60-90%乙醇饱和沉淀

c.能结合到麦胚凝集素Sepharose上

d.能结合到反向HPLC（C₄和C₁₈）上，并能在20-50%的化甲烷乙腈（Acetonitrite）液洗脱

e.在Superose 6凝胶层析柱中以PBS作为缓冲液从分子量25-55KD和7-13KD的组分中分离

f.能结合到肝素Sepharose柱上

g，在10%聚丙酰胺电泳，并经二巯基乙醇处理和小鼠骨髓细胞血浆凝块培养生物活性分析，其分子量为26-38KD或7-13KD

以上组成了基本的分离纯化方法。

4、根据权利要求1所述的MPO，其特征是具有刺激巨核细胞祖细胞的增殖，形成集落，并促进巨核细胞的分化成熟，与白细胞介素3（IL3），干细胞因子（Stem cell faclor），粒单细胞集落形成刺激因子（GM-CSF）或与促红细胞生成素（EPO）合用，能分别促进粒系或红系祖细胞的生长。

5、根据权利要求1和2所述的MPO，其特征是用基因工程方法从人胚肝cDNA文库中克隆筛查获得编码MPO的cDNA序列，并将其转化人哺乳类细胞，昆虫细胞，原生类细胞或细菌，通过表达从细胞培养悬液中分离纯化出MPO或其具有生物活性的蛋白多肽片段。

6、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段制成的药物，包括单一成份或多种成份，糖化或非糖化的药物制剂。

7、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段制成的药物，可以与治疗有效量的其他造血细胞生长因子和白细胞介素（Interleukin）1，3和11，粒细胞、粒单细胞和单核细胞集落形成刺激因子（G-CSF，GM-CSF和M-CSF），促红细胞生成素（Erythropoietin），干细胞因子（SCF）以及成纤维细胞生长因子（FGF）配伍制成。

8、根据权利要求6和7所述的药物制剂，可以治疗各种血小板减少症，血细胞减少症。

9、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段可用作研究造血细胞生长调节和它们的受体的试剂。

10、根据权利要求1所述的MPO或其活性片段或类似物可用作体外或EX VIVO造血干细胞和巨核细胞祖细胞扩增的重要试剂。

表Ⅰ.人MPO的氨基酸序列

5 10 15 20 25

1 M A W K T L P I Y L L L L L S V F V I Q Q V S S Q

26 D L S S C A G R C G E G Y S R D A T C N C D Y N C

51 Q H Y M E C C P D F K R V C T A E L S C K G R C F

75 E S F E R G R E C D C D A Q C K K Y D K C C P D Y

101 E S F C A E V H N P T S P P S S K K A P P P S G A

126 S Q T I K S T T K R S P K P P N K K K T K K V I E

151 S E E I T E V K D N K K N R T K K K P T P K P P V

176 V D E A G S G L D N G D F K V T T P D T S T T Q H

201 N K V S T S P K I T T A K P I N P R P S L P P N S

226 D T S K E T S L T V N K E T T V E T K E T T T T N

251 K Q T S T D G K E K T T S A K E T Q S I E K T S A

276 K D L A P T S K V L A K P T P K A E T T T K G P A

301 L T T P K E P T P T T P K E P A S T T P K E P T P

326 T T I K S A P T T P K E P A P T T T K S A P T T P

351 K E P A P T T T K E P A P T T P K E P A P T T T K

376 E P A P T T T K S H P P L P R S C X X X X C T Q P

401 T P K E P H P P L P R S L H P P T K E P A P T T P

426 K E P A P T A P K K P A P L P P L E X X X K K K K

451 K K

表Ⅱ.人MPO的cDNA序列

1 TTTCAGGTAC CGTAGGTACC CTTGCCGTAA AGGATGGCAT

41 GGAAAACACT TCCCATTTAC CTGTTGTTGC TGCTGTCTGT

81 TTTCGTGATT CAGCAAGTTT CATCTCAAGA TTTATCAAGC

121 TGTGCAGGGA GATGTGGGGA AGGGTATTCT AGAGATGCCA

161 CCTGCAACTG TGATTATAAC TGTCAACACT ACATGGAGTG

201 CTGCCCTGAT TTCAAGAGAG TCTGCACTGC GGAGCTTTCC

241 TGTAAAGGCC GCTGCTTTGA GTCCTTCGAG AGAGGGAGGG

281 AGTGTGACTG CGACGCCCAA TGTAAGAAGT ATGACAAGTG

321 CTGTCCCGAT TATGAGAGTT TCTGTGCAGA AGTGCATAAT

361 CCCACATCAC CACCATCTTC AAAGAAAGCA CCTCCACCTT

401 CAGGAGCATC TCAAACCATC AAATCAACAA CCAAACGTTC

441 ACCCAAACCA CCAAACAAGA AGAAGACTAA GAAAGTTATA

481 GAATCAGAGG AAATAACAGA AGTAAAAGAT AACAAGAAGA

521 ACAGAACTAA AAAGAAACCT ACCCCCAAAC CACCAGTTGT

561 AGATGAAGCT GGAAGTGGAT TGGACAATGG TGACTTCAAG

601 GTCACAACTC CTGACACGTC TACCACCCAA CACAATAAAG

641 TCAGCACATC TCCCAAGATC ACAACAGCAA AACCAATAAA

681 TCCCAGACCC AGTCTTCCAC CTAATTCTGA TACATCTAAA

721 GAGACGTCTT TGACAGTGAA TAAAGAGACA ACAGTTGAAA

761 CTAAAGAAAC TACTACAACA AATAAACAGA CTTCAACTGA

801 TGGAAAAGAG AAGACTACTT CCGCTAAAGA GACACAAAGT

841 ATAGAGAAAA CATCTGCTAA AGATTTAGCA CCCACATCTA

881 AAGTGCTGGC TAAACCTACA CCCAAAGCTG AAACTACAAC

921 CAAAGGCCCT GCTCTCACCA CTCCCAAGGA GCCCACGCCC

961 ACCACTCCCA AGGAGCCTGC ATCTACCACA CCCAAAGAGC

1001 CCACACCTAC CACCATCAAG TCTGCACCCA CCACCCCCAA

1041 GGAGCCTGCA CCCACCACCA CCAAGTCTGC ACCCACCACT

1081 CCCAAGGAGC CTGCACCCAC CACCACCAAG GAGCCTGCAC

1121 CCACCACTCC CAAGGAGCCT GCACCCACCA CCACCAAGGA

1161 GCCTGCACCC ACCACCACCA AGTCTCACCC ACCACTCCCA

1201 AGGAGCTGCA C????????? ?TGCACCCAA CCAACTCCCA

1241 AGGAGCCTCA CCCACCACTC CCAAGGAGCC TGCACCCACC

1281 AACCAAGGAG CCTGCACCCA CCACTCCCAA AGAGCCTGCA

1321 CCCACTGCCC CCAAGAAGCC TGCCCCTCTA CCCCCTCTAG

1361 AGCC?????? ?AAAAAAAAA AAAAAAAAAA