CN1111198C - 人促巨核细胞生成素及其纯化、cDNA克隆和重组蛋白质的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用生化方法从再生障碍性贫血病人的尿和血清中分离出一种新的造血细胞生长因子——人促巨核细胞生长素，经氨基酸序列分析，从人胚肝cDNA文库克隆出该因子的cDNA，继后在昆虫和中国仓鼠卵巢细胞体系中表达出有活性的重组蛋白质因子。经小鼠体内外试验和人体骨髓体外培养分析，该因子促进巨核细胞集落形成，增大巨核细胞体积，刺激血小板的生成；还促进多能干细胞的增殖。该因子可用于治疗各种血小板減少症和全血细胞減少症。

Description

人促巨核细胞生成素及其纯化、cDNA克隆和 重组蛋白质的制备方法和应用

[技术领域]

本发明涉及一种新的造血细胞生长刺激因子，即人促巨核细胞生成素(Human megakaryopoietin，简称MPO)，更具体地说，涉及MPO的分离纯化、氨基酸顺序测定和其生物活性，以及编码这些蛋白质的DNA分子的克隆及其在宿主细胞中的表达。

[背景技术]

已知造血细胞是能增殖、分化，进一步产生成熟血细胞的前体细胞，有髓系造血细胞和淋巴系造血细胞之分，髓系造血细胞包括红细胞、白细胞和巨核细胞三个系列。红细胞主要负责机体组织中氧气、二氧化碳和一些营养物质或废物的交换。白细胞主要负责抵御感染的功能，巨核细胞则产生血小板，后者在机体止血和凝血中起关键作用。

已知造血细胞均来自一共同的多能干细胞，后者具有自我复制更新的能力，并在一定的条件下能进一步分化增殖为各系定向祖细胞。这些造血干细胞和祖细胞在体外培养体系中具有不同的增殖能力和细胞表型，据此可加以鉴别和分类。

已知造血是一个复杂的过程，受许多因子调节，包括各种白细胞介素(Interleukin)，集落形成刺激因子(Colony-forming StimulatingFactor，简称CSF，例如有GM-CSF，G-CSF，M-CSF)和其它细胞生长刺激因子，如干细胞因子(Stem Cell Factor)，促红细胞生成素(Ery-thropoietin，简称EPO)和成纤维细胞生长因子(Fibroblast GrowthFactor，简称FGF)。对巨核细胞血小板生成有刺激作用的因子有IL1，IL3，IL6，IL11，GM-CSF，SCF和FGF(韩忠朝等，中华血液杂志，14：159-161，1993；Caen & Han，C R Acad Sci Paris，316：925-930，1993)。这些因子均已采用基因重组技术生产，少数已用于临床试验或治疗，但它们对提高巨核细胞和血小板数量的作用不明显。此外，这些因子的活性十分广泛，临床应用指征不明确，且具有一定的副作用。

已知再生障碍性贫血或化疗诱发骨髓衰竭的病人的血清和尿中含有很强的能促进巨核细胞生长和分化，增加血小板生成的活性物质，许多研究者试图去鉴别、分离这种物质，并已经分离纯化出一种血小板生成素(Thrombopoietin，又称c-Mpl Ligand)，由353个氨基酸残基组成。人c-MPL Ligand的cDNA克隆由1,774个核苷酸组成，末端连接-poly(A)⁺，与促红细胞生成素有23％的序列相同，纯化的c-Mpl Lig-and的分子量为28K-32K或18K-20K(SDS-PAGE分析)，因两者的序列相同，所以来自一共同的前体蛋白。该因子对巨核细胞的生长成熟有促进作用，但主要作用于生长的晚期阶段(de Sauvage等，Nature，369：533-538；Bartley等，Cell，77：1196-1244；LoK等，Nature369：565-568)。

〔发明的描述〕

本发明的目的在于提供一种新的细胞生长刺激因子，该因子来源于再生障碍性患者的血清和尿，具有促进造血干细胞向巨核细胞分化生长、调节巨核细胞生长、分化和成熟的活性。经小鼠体内外试验和人体骨髓体外培养分析，该因子促进造血干细胞向巨核细胞分化、巨核细胞集落形成，增大巨核细胞体积，刺激血小板的生成；该因子还促进多能干细胞的增殖，可用于治疗各种血小板减少症和全血细胞减少症。按其生物学特征，取名为人促巨核细胞生成素(Megakaryopoietin，以下简称MPO)。

本发明的另一个目的在于，建立一套MPO的纯化方法。

本发明的还有一个目的在于，建立一套MPO的cDNA克隆方法和采用重组DNA技术，通过现在通用的表达体系，生产有活性的重组人MPO的方法。

本发明包括MPO的纯化方法。在本发明的下述几个实施例中，将亲和层析(麦胚凝集素亲和层析和肝素亲和层析)与其他常规分离法相结合，从再障病人的尿和血清中分离纯化出人促巨核细胞生成素。使用本发明的分离纯化方法，从表达MPO的昆虫和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养液中同样地可以分离纯化出有刺激巨核细胞生长作用的蛋白质。因此，本发明的分离纯化方法是有效的MPO分离纯化方法。本发明的分离方法技术新颖、重复性好，产率也高。

在本发明的实施例中，使用的其他常规分离方法，包括提取、浓缩、沉淀、凝胶层析和高效液相层析，也可以包括电泳或其他类似的方法以及洗涤、搅拌、振荡、过滤等。

在本发明的实施例中，使用麦胚凝集素偶联的琼脂糖和肝素偶联的琼脂糖，将非亲和性的部分分离开来，极有效地提高了含MPO的蛋白质部分的单位特异性活性，有利于其后的用高效液相层析进行的分离。使用的载体除琼脂糖外，也可以是任何能与麦胚凝集素或肝素偶联的其他支承物或载体，如共知的聚苯乙烯、葡聚糖、天然或改性的纤维素、聚丙烯酰胺等。

MPO纯化方法中各分离步骤的最佳组合和最佳分离纯化条件，本领域的技术人员可以通过常规实验方法加以确定。

本发明还包括编码MPO的DNA分子的克隆及其在宿主细胞中的表达。在本发明的下述一个实施例中，确定了纯化的人促巨核细胞生成素的分子量范围和氨基酸序列。并在另二个实施例中，根据蛋白质顺序，设计出相应的核苷酸引物，在人胚肝cDNA文库中克隆出MPO的cDNA，并测出其核苷酸顺序，继后在昆虫和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞体系中表达出有活性的重组蛋白质因子。

在对人尿MPO用反相高效液相层析(HPLC)进行最后的分离后得到的产物中，我们发现二个活性高的组分，经¹²⁵I标记后作聚丙酰胺电泳分析，其分子量在还原状态下(加二巯基乙醇)为24-32Kd，在非还原状态下为35-45Kd。将35-45Kd MPO蛋白用2％胰蛋白酶消化处理，经氨基酸序列分析，确定了MPO蛋白的氨基酸序列。

根据获得的氨基酸序列，用已知的遗传密码推测与氨基酸相应的核苷酸，我们设计了多对变性引物进行PCR扩增。其中一对变性引物在以胚肝cDNA文库为模板的扩增中获得一条特异性扩增带，变性引物序列如下：1)TGYAAYTGYG AYTAYAAYTG YCARCAYTAYATGGA；2)TTYGGNGGNT TRTTYTTYTT YTGNTTYTTYCANTADCT。所获特异扩增带的cDNA经序列测定，证实与MPO的氨基酸序列吻合。

此特异性cDNA扩增产物用DIG-dUTP标记，将其作为探针筛选人胚肝cDNA文库。在直径为14cm的琼脂平板中播下4-5万个克隆，用尼龙膜转移，尼龙膜经变性及缓冲液处理后与标记的cDNA探针杂交，经洗脱及荧光显影，在X光底片上获得图象。

由于使用的cDNA文库的质粒为λ-ZAP。筛选到的阳性克隆可以用R408辅助噬菌体进行菌体内pBluescript的切除，在含有氨苄青霉素的LB平板上克隆，再经多次亚克隆和DNA测序，获得MPO cDNA序列，经比较截止1995年2月的基因和氨基酸资料库(cDNA序列与EMBL，Genbank比较，氨基酸序列与Swissprot资料库比较)，未见有相同的cDNA序列。

然后，根据获得的MPO cDNA，构建含MPO cDNA的转移载体，在宿主细胞中表达MPO。用EcoRI和pstI酶解质粒pGEM-MPO(本实验室构建)，回收MPO cDNA片段，克隆入pVL 1392的EcoRI和PstI位点之间，产生的质粒pVL 1392 MPO与BaculoGoldTM线性化的病毒基因组DNA共转染Sf9昆虫细胞，根据被转染的细胞形态的变化，筛选出重组病毒AcNPV-MPO。重组病毒转染昆虫细胞4至8天后，其上清液经初步分离纯化，其蛋白组份比未转染的昆虫细胞培养上清液多出一分子量为45Kd的蛋白质，且对巨核细胞集落形成有明显的刺激作用。

用EcoRI和BamHI酶解pGEM-MPO，用LMP Agarose回收MPO cDNA片段，真核表达载体pSV2-dhfr用Hind III酶解。将MPO基因片段和Hind III酶切过的pSV2-dhfr填平后连接，产生质粒pSV2-MPO。随后用pSV2-MPO转染CHO-dhfr-细胞，从中挑取dhfr⁺克隆69个，用PCR方法产生237bp片段，经[³²p]标记后作为探针，杂交阳性，证实MPO基因的存在。部分克隆作氨甲喋呤(MTX)加压，以扩增基因，增加表达量。加压后的细胞裂解液作SDS-PAGE分析。条件培养液经生物活性测定，证实对巨核细胞集落形成有明显的刺激作用。

上述的克隆，克隆分离，鉴别，定性和测序的程序在后面的实施例中将更详细地描述。

MPO也可以通过其它类型的重组细胞产生，如原核细胞的大肠杆菌，或其它真核细胞，比如酵母细胞。构建适当的携带编码MPOcDNA的表达载体，用来转化宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)或感染昆虫细胞，以产生重组的MPO的方法，在本领域是共知的。例如，可参见Ausubel等人编著的“Current Protocols in MolecularBiology” Current Protocols，1993；和Sambrook等人编著的“Molecu-lar Cloning：A Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring HarborPress，1989。

本发明还涉及MPO的活性突变蛋白和活性片段，还涉及由融合于另一多肽或蛋白质的天然MPO，或它们的活性突变蛋白或它们的活性片段组成的融合蛋白，融合蛋白发挥相似的促进巨核细胞生长分化的生物学活性。

将构建的含编码MPO、它们的活性片段、突变蛋白或融合蛋白的DNA，和操纵转录与翻译调控信号的DNA序列的载体导入真核生物宿主细胞中。为了能选出已导入的DNA稳定地整合入染色体中的细胞，可以使用一种或多种标记以选择含表达载体的宿主细胞。标记可以将营养缺陷型宿主，提供耐致命物质(如抗菌素)的能力，提供抗重金属如铜的耐性，或类似的性能。可选择的标记基因可以直接连于待表达的基因顺序，也可以通过共转染一起引入同一细胞。也需要一些额外的因子以最理想地合成出单链结合蛋白mRNA。这些因子可以包括拼接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。

为了表达MPO蛋白、它们的活性片段或衍生物，最好将待引入已选择好的细胞的DNA分子插入到一个能在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。

在选择特定质粒或病毒载体中的重要因素包括：能方便地识别并将含有载体的受体细胞从不含载体的受体细胞中选择出来；在特定宿主中所期望的载体的拷贝数目；是否有利于使载体在不同种的宿主细胞之间“穿梭”。

理想的真核生物质粒包括pVL1392、pSV2等或它们的衍生物。这些质粒是本领域中共知的。

一旦制备好含目的基因的表达载体，可以通过一系列合适的方法中的任何一种将表达载体引入适当的宿主细胞，如通过转化、转染、脂质体载体转染、接合作用、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀法、直接显微注射法等。

用于本发明的宿主细胞可以是原核或真核生物的。理想的原核生物宿主包括细菌如大肠杆菌( E.Coli)、芽孢杆菌属( Bacillus)、链霉素属( Streptomyces)、假单孢菌属( Pseudomonas)、沙门菌属( Salmonella)、沙雷菌属( Serratia)等。在这些条件下，蛋白质将不被糖基化。原核生物宿主必须可与表达质粒中的复制子和控制顺序相容。

然而，因为MPO是糖基化的蛋白，所以真核生物宿主优于原核生物宿主。理想的真核生物宿主是哺乳动物细胞，如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为这些细胞可提供蛋白质分子翻译后的修饰，包括正确的折叠，形成正确的二硫键以及在正确的位点糖基化。同样，酵母细胞和昆虫细胞也可进行翻译后肽的修饰，包括高度的甘露糖基化。有许多使用强启动子顺序和高拷贝数目质粒的重组DNA策略，可用来在酵母和昆虫细胞中产生所期望的蛋白质。酵母细胞识别克隆的哺乳动物基因产物上的引导顺序并分泌带引导顺序的肽。引入载体后，宿主细胞在选择培养基上生长，选择含载体的细胞。克隆的基因顺序的表达导致产生MPO或它的融合蛋白或突变蛋白、或其活性片段。

此处所用的术语“突变蛋白”指MPO的类似物，其中一个或多个天然MPO或其活性片段的氨基酸残基被不同的氨基酸残基所替换或缺失，或者一个或多个氨基酸残基被加入到天然MPO的顺序中。而且，与天然的MPO的活性片段相比，没有显著改变所得到的产物的活性。这些突变蛋白可以用已知的人工合成和/或定点诱变技术或任何其它已知的适合用于该目的的技术来制备。

任何一种这样的突变蛋白最好具有与MPO的氨基酸顺序足够一样的氨基酸顺序，从而使其具有与MPO或其活性片段实质上相似的活性。

在较佳的具体例子中，任何这样的突变蛋白与MPO至少具有40％的一致性或同源性。更佳的具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或最佳的具有至少90％一致性或同源性。

根据本发明所能使用的MPO、多肽或它们的活性片段的突变蛋白，或者为其编码的核酸，包括一系列有限的实质上对应的置换肽或多聚核苷酸顺序，它们可以由本领域的一般熟练技术人员，依据此处给出的说明和指导，通过适当的实验方法常规地获得。

根据本发明，较佳的突变蛋白的改变是那些已知的“保守的”置换。MPO或多肽或它们的活性片段的保守的氨基酸置换可以包括一组同义氨基酸，这些氨基酸具有足够相似的物化性能使得组中氨基酸之间的置换会保留该分子的生物学功能〔Grantham， Science，Vol，185，pp.862-864(1974)〕。已经清楚，在上述限定的顺序中也可以插入或缺失一些氨基酸而不改变其功能，尤其是如果插入或缺失只包括少数氨基酸例如小于30个，较佳的小于10个，并且不去除或替换对功能构象至关重要的氨基酸如Cys残基时〔Anfinsen，“PrinciplesThat Govern The Folding of Protein Chains”， Science，Vol.，181，PP.223-230(1973)〕。这样的缺失和/或插入而形成的蛋白质和突变蛋白归于本发明的范围。

本发明的突变蛋白包括由核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，这些核酸在严谨条件下会与编码本发明的MPO的DNA或RNA杂交。本发明还包括一类核酸，它能作为探针用于鉴别和纯化所期望的核酸。此外，该核酸是主要的候选对象，以确定它是否编码一种具有本发明的MPO功能活性的蛋白质。

本发明的重要用途在于：

(1)可以采用已经建立的分离方法从人或动物的尿和血清中大量纯化天然MPO。由于天然人MPO主要于存在于再生障碍性贫血病人的血清和尿中(Hoffman，Blood，74：1196-1212，1989，Han et al，Int J Hematol，54：3-14，1991)来源有限，不易大量制备，但假如将某些动物如牛、狗，猪或老鼠进行照射，造成继发性再生障碍性贫血，然后制备血清，再采用本发明的方法纯化分离MPO，则来源充足；

(2)按照本发明所述的MPO的cDNA克隆方法，可以设计出与MPO不完全相同的变性引物进行PCR扩增，从而进一步获得MPO的类似物的cDNA；

(3)根据本发明提供的MPO cDNA序列，采用重组DNA技术，可通过现在通用的各种表达体系，如大肠杆菌，酵母菌，昆虫或哺乳类动物细胞的表达，大量生产重组的MPO及其变异物。我们在昆虫和CHO细胞成功表达出重组人MPO便充分证明了这一用途；

(4)MPO和其突变因子作为造血细胞生长因子，可广泛用于研究血细胞的生长调节并可用作体外造血干细胞和祖细胞、巨核细胞和血小板生长和大量扩增的重要试剂；

(5)整个MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的突变蛋白单独可制作成药物治疗各种原因引起的血小板减少和全血细胞减少；

(6)MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的突变蛋白与一些能增加其活性的物质(如粘多糖或脂)组成的复合制剂可用作药物，治疗各种原因引起的血小板减少和全血细胞减少；

(7)MPO蛋白质分子或其活性多肽片段或该因子的突变蛋白与一些造血细胞生长因子(SCF，EPO，TPO，GM-CSF和IL3)体外合用，对红系和粒系祖细胞的生长也有作用，因此与治疗有效量的这些生长因子配伍合用，可治疗其它全血细胞减少症；

(8)MPO和其突变因子可用作抗原在鼠、兔子和羊等动物身上制备单克隆和多克隆抗体，MPO及其抗体可配备成试剂盒，用于MPO水平测定和定位，可作为与巨核细胞和血小板有关疾病的诊断和科研试剂，抗MPO抗体还可用于因MPO水平增高引起的有关疾病的治疗药物；

(9)MPO及其抗体，可用作鉴别分离MPO受体的重要工具，这可通过目前通用的受体鉴别分离方法来进行。

[附图说明]

图1一个阳性克隆的亚克隆原位杂交图。黑点表示阳性克隆。

图2克隆质粒pGEM-MPO结构示意图。

图3多角体病毒表达载体pVL 1392-MPO构建示意图。

图4肝素柱分离峰II的SDS-PAGE银染分析结果。

   Lane 1：实验样品；Lane 2：对照样品。箭头指表达产物

   MPO条带。

图5表达质粒pSV2-MPO构建示意图。

图6含MPO基因的CHO细胞裂解液的SDS-PAGE银染分析结果。

Lane 1：实验样品；Lane 2：对照样品。箭头指产物MPO条带。

[最佳实施方式]

下面，结合实施例，对本发明作进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。实施例1人尿MPO的分离纯化

收集再障病人的尿55升，随即用Amicon的YM10过滤器将尿超滤浓缩。然后用Sephadex G50层析脱盐。将所得的蛋白部分用3M氯化胍处理，再按下列流程所示方法分离纯化。

MPO分离流程(流程1)1.                 氯化胍(3M)处理

                      ↓2.              乙醇沉淀(60-90％饱和)

                      ↓PBS透析3.    麦胚凝集素(WGA)-Sepharose 6MB(Pharmacia LKB)

                      ↓含0.2M乙酰葡糖胺的PBS洗脱4.    反相HPLC-C₁₈柱(美国VYDDC公司，Cat^#218TP510)

                      ｜溶剂：A：0.1％三氟醋酸

                      ｜B：70％乙腈-0.1％三氟醋酸

                      ｜流速：0.5ml/分，1.5ml/管

                      ↓从A液→B液线性梯度洗脱40分钟5.           Superose 6-HPLC(Pharmacia LKB)

                      ↓PBS作为缓冲液6.         肝素-Sepharose CL-6B柱(Bio-Rad).

                      ｜2M NaCl洗脱

                      ↓收集蛋白峰7.        反相HPLC-Nucleosil C₄柱(4.6×30mm，

       日本TOUZART & Matignon公司产品)

         或反相HPLC-C₈柱(4.6×30mm，

         美国Applied Biosystems产品)

每步分离后，采用小鼠骨髓体外血浆凝块法(Han et al，Br JHaematol，81：1-5，1992)对所有的组份都作活性分析，具有明显刺激巨核细胞生长的组份随即进行下一步的分离纯化，人尿促巨核细胞生成素的纯化与活性分析结果见表I。

    表1：人尿促巨核细胞生成素分离纯化及活性分析

    分离步骤(活性部位)              特异性活性        总纯化指数

                                    集落数/mg

    1.尿蛋白(Sephadex G50后)         3                  1

    2.酒精沉淀物(60-90％饱和度)      300                30

    3.麦胚凝集素柱(亲和部分)         4100               ≈1400

    4.反相HPLC-C18(20-26管)          7600               ≈2530

    5.Superose-6层析柱

      (1)(20-22管)                   12000              4000

      (2)(35-37管)                   11000              ≈3300

    6.肝素柱(亲和部分)

      (1)5-(1)组份                   86000              ≈28700

      (2)5-(2)组份                   49000              ≈16300

    7.反相HPLC-C4

      (1)6-(1)组份(8-9管)            143000             ≈47700

      (2)6-(2)组份(8-9管)            138000             46000骨髓细胞来自Balb/c小鼠。巨核细胞培养和鉴别方法按文献(Han et al，Br J Haemtol 81，1-5，1992)进行。

从表1的结果可知，通过流程1的MPO分离纯化方法，人尿中促巨核细胞生成素明显地得到了分离、纯化。实施例2 人血清MPO的分离纯化

收集再障病人的血清550毫升，经3M氯化胍处理后，按流程1所示的方法进行人血清促巨核细胞生成素的分离纯化。其活性分析方法同实施例1，结果如下：

          表2.人血清促巨核细胞生成素纯化及活性分析

分离步骤(活性部位)              特异性活性           总纯化指数

                                巨核细胞集落数/mg

1.血清                             10                    1

2.乙醇沉淀物(60-90％饱和度)        400                   40

3.麦胚凝集素亲和层析(亲和部分)     5000                  500

4.反相HPLC-C18(第23-25管)          9500                  950

5.Superose-6层析(第20-22管)        17000                 1700

6.肝素亲和层析(亲和部分)           3000                  3000

6.反相HPLC-C4(第8-9管)             68000*                6800*

*因蛋白量很小，其浓度为估计值。

从表2的结果可知，与人尿MPO一样，人血清MPO也可以通过流程1所示的方法进行分离纯化。实施例3MPO氨基酸序列的分析

在实施例1中经反相HPLC-Nucleosi C₄柱或C₈柱分离得到的产物中，我们发现二个活性高的组分，经¹²⁵I标记后作聚丙烯酰胺电泳分析，其分子量在还原状态下(加二巯基乙醇)为24-32Kd和7-13Kd(表1的35-37管)，在非还原状态下为35-45Kd和7-13Kd。

将上述35-45Kd的MPO蛋白质30微克用2％胰蛋白酶消化处理后，用美国Applied Biosystems公司的473型氨基酸序列分析仪进行氨基酸序列分析。其结果如序列1所示(序列中第405-407位和第456-457位的xxx表示任何氨基酸)。实施例4MPO的cDNA分子克隆

根据实施例3中MPO的氨基酸序列中的二条肽序列：1)DATC-NCDYNC QHYMECCPD；2)SPKPPNKKKT KKVIESEE，用已知的遗传密码推测与氨基酸相应的核苷酸，我们设计了多对变性引物进行PCR扩增。其中一对变性引物为：1)TGYAAYTGYG AY-TAYAAYTG YCARCAYTAY ATGGA；2)TTYGGNGGNT TRT-TYTTYTT YTGNTTYTTY CANTADCT(其中Y＝C.T，R＝A.G，N＝A.C.G.T，D＝G.A.T)。在以胚肝cDNA文库为模板的扩增中获得一条特异性扩增带。所获特异扩增带经DNA序列测定(见序列2(序列2中和第1212-1221位和第1365-1371位的x表示任何核苷酸))证实与氨基酸序列吻合(见序列1)。

此特异性cDNA扩增产物用DIG-dUTP(BOEHRING产品)标记，作为探针筛选人胚肝cDNA文库。在直径为14cm的琼脂平板中播下4-5万个克隆，用尼龙膜转移，尼龙膜经变性及缓冲处理后与标记的cDNA探针杂交，经洗脱及荧光显影，在X光底片上获得图象(图1)。在100万个克隆中共筛选出2个阳性克隆。

由于使用的cDNA文库的质粒为λ-ZAP，筛选到的阳性克隆可以用R408辅助噬菌体进行体内pBluescript的切除，在含有氨苄青霉素的LB平板上克隆，再经多次亚克隆和DNA测序，获得了序列2所示的MPO cDNA序列，MPO cDNA全长1389bp，编码441个氨基酸残基(序列1)，经比较1995年的基因资料库(见前述)，未见有相同的cD-NA序列。

我们采用重组DNA技术，在昆虫细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达出有刺激巨核细胞生长活性的MPO。实施例5 MPO在昆虫细胞中的表达含MPO cDNA转移载体的构建和重组病毒的筛选

分子克隆主要参考Sambrook等的方法(Sambrook，T.et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Har-bor Laboratory，New York.)。pGEM质粒购自Promrga公司。将MPO cDNA克隆入pGEM，构成质粒pGEM-MPO。此为MPO cDNA来源(见图2)。用EcoRI和PstI酶解质粒pGEM-MPO，回收MPOcDNA片段，克隆入昆虫细胞表达质粒pVL1392的EcoRI和PstI位点处(图3)。经琼脂糖电泳鉴定cDNA插入方向，有1.4Kb片段出现，说明cDNA插入方向是正确的，构建成的质粒称作pVL1392-MPO.在这种情况下，MPO cDNA的表达受控于AcNPV多角体病毒启动子，以非融合蛋白形式表达。用产生的重组质粒pVL1392-MPO和BaculoGold^TM线性化的病毒基因组DNA(Parmigen公司)共转染Sf9昆虫细胞(Christopher & Christopher，DNA cloning：A practical ap-proach 1985，3：163，IRL Press，Oxford.)。借助于倒置显微镜观察被转染的细胞形态的变化，筛选出重组病毒AcNPV-MPO。抽提重组病毒基因组DNA，用一对引物[(1)GATGGCATGGAAAACACTTCCCC(MK2，22mer)；(2)TCGAAGGACTCAAAGCAGCGGC(MKR2，22mer)。用Applied Biosys-tems DNA合成仪合成。]，作PCR扩增，产生237bp片段；用Boehringer Mannheim Biochemicals的随机引物试剂盒和Amersham公司的[α-³²P]-dATP制备³²P标记的MPO cDNA，将其作探针，进行杂交分析，结果均为阳性，这进一步证实重组病毒含有MPO cDNA插入物，产生的重组病毒称作AcNPV-MPO。MPO cDNA在昆虫细胞中的表达及其产物的初步分离

在无血清培养基(Sf-900，Gibco公司产品)中培养昆虫细胞。用重组病毒AcNPV-MPO感染昆虫细胞144小时后，收集培养液，超离心(100,000×g)45分钟，取上清液，作肝素-Sepharose CL-6B(简称肝素)柱和麦胚凝集素-Sepharose 6MB(简称WGA)柱分离纯化。肝素柱(Pharmacia公司产品)1.0×20cm，200ml样品过柱二次后，柱先用PBS淋洗，后分别以含0.5MNaCl和1.0MNaCl的磷酸缓冲液(pH7.2)洗脱，分别合并洗脱峰，对0.01％NH₄HCO₃溶液透析，冰冻干燥后备用。WGA柱(Pharmacia公司产品)2×15cm，200ml样品过柱二次后，柱先用PBS淋洗，后以含0.5M乙酰葡糖胺的PBS溶液洗脱，合并洗脱峰，对0.01％NH₄HCO₃溶液透析，冰冻干燥备用。经肝素柱和WGA柱分离的样品作SDS-PAGE分析(Chen，W.et al.J.Bi-ol.Chem.，266：4082，1991)和生物活力测定。

肝素柱分离峰II产物的电泳结果(图4)，与对照相比，至少多一分子量为45Kd的额外条带。生物活性测定表明，昆虫细胞表达的MPO有促进巨核细胞集落形成的作用，加入不同的粗纯化物，与对照相比，均有40％的促进作用(见表3)。

    表3.表达MPO的昆虫细胞培养液对小鼠巨核细胞的作用

                                    加入量(μl)      巨核细胞集落/10⁵

                                                     种植细胞

    PBS                               100              29±5

    不表达MPO的昆虫细胞培养液         10               9±3

                                      100              3±1

    表达MPO的昆虫细胞培养液           10               78±6^*

                                      100              87±5^*

有*者表示与PBS组或与不表达MPO的细胞培养组比较，P＜0.05。

本实验结果为二次实验的平均值。实施例6 MPO在CHO细胞中的表达表达载体的构建

质粒的提取和酶解，DNA片段的分离纯化、体外重组及转化均按文献(Sambrook，T.et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manu-al，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York.)报道的方法进行。

进行DNA重组与扩增的宿主细菌E.coli JM103和真核表达载体pSV2-dfhr为Gibco-BRL公司产品，表达宿主细胞CHO-dhfr^-，购自美国ATCC公司。pGEM-MPO为MPO cDNA的来源，DNA限制性内切酶购自Promega公司，随机引物标记试剂盒系BoehringerMannheim Biochemicals产品。〔α-³²P〕-dATP为Amersham公司产品。细胞培养基和胎牛血清为Gibco产品，聚合酶链反应(PCR)引物为：(I)GATGGCATGGAAAACACTTCCCC(MK2，22mer)和(II)TCGAAGGACTCAAAGCAGCGGC(MKR2，22mer)，用AppliedBiosystems DNA合成仪合成。

pGEM-MPO经EcoRI和BamHI酶切，用LMP琼脂糖回收基因片段，pSV2 dhfr用Hind III酶解。MPO基因片段和Hind III酶切过的pSV2-dhfr经填平后连接，产生质粒pSV2-MPO.用ApaI酶解产生1872bp和4531bp片段，说明MPOcDNA片段插入方向正确，基因表达受控于SV40早启动子(图5)。细胞培养、转染及氨甲喋呤加压扩增和MPO的表达

CHO-dhfr^-细胞先培养子非选择性培养液(Ham’s F12+150μg/ml脯氨酸+10％胎牛血清+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素)中，37℃，5％CO₂孵箱培养。转染前一天，取对数生长期细胞，0.1％胰蛋白酶(Sigma)消化，60mm培养皿中接种1×10⁹细胞，培养20-24小时，转染前3小时换液一次，用磷酸钙沉淀法(Christopher，R.B.and Christopher C.G.H.A pratical approach 3：163，1985.IRLPress，Oxford.)将质粒DNA导入细胞，继续培养24小时后，换成选择性培养液(DMEM+150μg/ml脯氨酸+10％透析胎牛血清+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素)、每3-4天换液一次，12-20天后计dhfr⁺细胞集落，计转染效率，并用细胞集落分离器挑出集落，建立克隆培养，逐渐增加氨甲喋呤(Methotrexate MTX，Sigma)浓度进行加压扩增。

挑取69个dhfr⁺克隆，用与实施例5相同方法进行PCR扩增，产生237bp片段；用[³²p]标记探针，杂交阳性，证实MPO基因的存在，挑选出其中9个克隆作MTX加压，以扩增基因，增加表达量，细胞株用0.025μM和0.05μM MTX加压，细胞裂解液作SDS-PAGE分析(Chen，W.et al.J.Biol.Chem，266：4082，1991)，与仅用pSV2-dhfr质粒转染所得的细胞相比，CHO-MPO至少多一分子量为49Kd的额外条带(图6)。条件培养液作活性测定，证实对巨核细胞集落形成有明显的刺激作用，具体结果见表4。

      表4.表达MPO的CHO细胞培养液对小鼠巨核细胞生长的作用

                              加入量(μl)    巨核细胞集落

                                             /10⁵种植细胞

    PBS                          50            27±3

    不表达MPO的CHO细胞培养液     50            31±3

    表达MPO的CHO细胞培养液       50            67±4^*

有*者表示与PBS组或与不表达MPO的细胞培养液比较，P＜0.05。

本实验结果为二次实验的平均值。实施例7 人尿MPO对CFU-MK和CFU-GM生长的作用

将本发明纯化的人尿MPO对Balb/c小鼠骨髓巨核细胞祖细胞(CFU-MK)，粒单细胞祖细胞(CFU-GM)和红细胞祖细胞(BFU-E)生长的作用，按Han等报道的方法(Br J Haematol，1990；74：395-401)进行体外实验分析，发现人尿MPO对小鼠骨髓巨核细胞生长有明显的刺激作用，具体结果见表5。

                        表5

因子         浓度       CFU-MK          CFU-GM    BFU-E

             (ng/ml)    (/2×10⁵细胞)

1)MPO        0          2±0.5          4±0.9     0

2)MPO        10         21±3.0*        5±1       0

3)MPO        50         46±4.1*        6±1       2±0.5

4)IL3        50         43±3.2         32±5      3±0.5

5)IL3+MPO    50+50      72±5.4*#       42±3      3±0.8

6)IL6        20         18±1.6         15±3      1±0.3

7)IL6+MPO    20+50      57±1.2*#       8±1       1.5±0.4

8)EPO        1U         12±3           7±2       33±2

9)EPO+MPO    1U+50      66±5#          13±2      55±2#

10)SCF       20         11±2           10±1      3±1

11)SCF+MPO   20+50      56±3           22±2#     8±2

*与MPO空白组对照，P＜0.05。

#与加同一因子，但未加MPO组对照，P＜0.05。实施例8 人尿MPO对正常人CFU-MK和CFU-GM作用

采用已报道的方法(Han et al，Blood 75：1234-1239，1990)进行人骨髓CFU-MK和CFU-GM的培养。在培养时，加入本发明的人尿MPO，发现人尿MPO对人骨髓巨核细胞生长有明显的刺激作用。具体结果见表6。值得指出的是肝素的加入，使MPO的活性明显增强，提示肝素与MPO合用可产生协同作用。

                           表6

    MPO            肝素          CFU-MK             CFU-GM

    浓度(ng/ml)    (μg/ml)      集落数/2×10^s胞    集落数/2×10⁵细胞

    0              0             1±0.2             13±0.7

    10             0             7±2               14±1

    50             0             28±3*             14±2

    100            0             48±2*             19±3

    0              10            2±0.3             12±2

    10             10            31±3*             16±3

    50             10            42±5*             15±2

    100            10            65±5*             16±3

显著性测验，均为P＜0.05，其中，有*者，P＜0.01。实施例9 人尿MPO对小鼠巨核细胞直径的影响

已知巨核细胞直径是判断巨核细胞成熟程度的指标之一。我们采用已报道的方法(Han et al，Br.J.Haematol.，81：1-5，1992)，在进行小鼠巨核细胞培养时，加入人尿MPO，发现人尿MPO能增加巨核细胞的直径，对巨核细胞的成熟有促进作用。具体结果见表7。

                     表7

              未加MPO组  加MPO(50ng/ml)组  加MPO(100ng/ml)组巨核细胞直径(μm)  28±4       39±3*             42±4*

每组共测量了200个巨核细胞，数据以平均数±标准差表示。

有*者表示与未加MPO组比较，P＜0.01。采用Student’s t test检测。实施例10 人尿MPO对小鼠巨核细胞和血小板生成的体内作用

使用实施例1中用Superose-6分离后的第一组份(第20-22管)作为试验用人尿MPO组份。在每只Balb/c小鼠的腹腔内注射MPO组份100μg/次，每日二次，共注射4天。对照组小鼠则以同样方式注射PBS。最后一次注射后第4天，取小鼠血用细胞计数器计算末梢血细胞数量，同时取骨髓作祖细胞(CFU-MK和CFU-GM)和巨核细胞数量分析。整个分析采用文献报道方法(Han等，C R Acad Sci Paris313：553-558，1991)，其结果见表8。

                                  表8

          骨髓(/10⁵细胞)

         CFU-MK  巨核细胞  CFU-GM 血小板     白细胞     血红蛋白

                                  万/10³mm   /10³mm      g/100ml

    PBS  34±3   159±12   44±3  908±24    2500±400  15±2

    MPO  67±5*  288±13*  51±4  1240±35*  3500±350  15±3

有*者表示与PBS组对比，P＜0.05，采用Student’s t test检测。

由上述试验结果可见，MPO不但在体外能刺激巨核细胞生长，注射入体内也能刺激巨核细胞和血小板的生长，因此有希望成为治疗血小板减少症的药剂。实施例11 MPO扩增正常小鼠造血干细胞和对人脐带血单个细胞分化的作用

本发明所述的MPO还可用作体外和离体体内造血干细胞扩增试剂，包括单用扩增巨核细胞，与其它因子合用扩增各系的祖细胞。应用MPO体外扩增小鼠造血干细胞的结果见表9，而应用MPO体外扩增人CD34⁺细胞和糖蛋白IIb/IIIa阳性细胞的结果见表10。

                                       表9

预孵育因子	HPP-CFC	CFU-MK	CFU-GM	BFU-E
					无(PBS)	0	5±1/105细胞	10±2/105细胞	0
人MPO(100ng/ml)	7±1/105细胞	35±4/105细胞	12±3/105细胞	1±0.2/105细胞
					鼠SCF(100ng/ml)	8±1/105细胞	21±4/105细胞	17±3/105细胞	2±1/105细胞
鼠IL3(100ng/ml)	2±1/105细胞	28±1/105细胞	23±5/105细胞	0
					鼠GM-SCF(100ng/ml)	3±1/105细胞	12±2/105细胞	37±4/105细胞	0
人EPO(2U/ml)	0	8±1/105细胞	7±1/105细胞	25±4/105细胞
					人PF4(1μg/ml)	6±1/105细胞	27±2/105细胞	17±2/105细胞	2±1/105细胞
MPO+SCF	37±5/105细胞	67±6/105细胞	24±5/105细胞	3±1/105细胞
					MPO+IL3	17±4/105细胞	73±6/105细胞	42±2/105细胞	7±1/105细胞
MPO+GM-CSF	15±3/105细胞	39±3/105细胞	77±4/105细胞	0
					MPO+EPO	11±2/105细胞	7±1/105细胞	17±3/105细胞	47±4/105细胞
MPO+PF4	34±4/105细胞	77±8/105细胞	7±1/105细胞	4±3/105细胞

注：小鼠骨髓细胞(10⁶细胞/ml)预先与上述因子孵育48小时，然后按Han方法(J.Lab ＆Clin Med，1994；123：610-616)在含2％再障猪血清的血浆凝块体系中培养10天，检测各种集落的数量。

               表10

	对照	MPO(100ng/ml)
			SCF结合细胞	6％	13％
CD34阳性细胞	0.3％	4.2％
			CD41a阳性细胞	3％	8.2％

注：人脐带血单个细胞分离后在含或不含MPO的液体培养基中培养7天，经洗涤后，细胞分别与荧光标记的抗CD34抗体，抗CD34α抗体和SCF孵育40分钟，洗涤后用FACS(荧光激活细胞分离仪)分析结果。

上述具体实施例的描述揭示了本发明的一般性质，从而使其他技术人员通过应用目前的知识，为了各种应用能容易地修饰和/或改动这些具体实施例而没有背离本发明的一般构思，因而这些改动和修饰应是属于这些公开例子的等价事例的范围和内涵之中。应理解，此处所采用的措辞或术语是为了便于描述，而不起限制作用。

                 序列1：人MPO的氨基酸序列1phe gln val pro AMB    val pro leu pro OCH   arg met ala trp lys16thr leu pro ile tyr    leu leu leu leu leu   ser val phe val ile31gln gln val ser ser    gln asp leu ser ser   cys ala gly arg cys46gly glu gly tyr ser    arg asp ala thr cys   asn cys asp tyr asn61cys gln his tyr met    glu cys cys pro asp   phe lys arg val cys76thr ala glu leu ser    cys lys gly arg cys   phe glu ser phe glu91arg gly arg glu cys    asp cys asp ala gln   cys lys lys tyr asp106lys cys cys pro asp    tyr glu ser phe cys   ala glu val his asn121pro thr ser pro pro    ser ser lys lys ala   pro pro pro ser gly136ala ser gln thr ile    lys ser thr thr lys   arg ser pro lys pro151pro asn lys lys lys    thr lys lys val ile   glu ser glu glu ile166thr glu val lys asp    asn lys lys asn arg   thr lys lys lys pro181thr pro lys pro pro    val val asp glu ala   gly ser gly leu asp196asn gly asp phe lys    val thr thr pro asp   thr ser thr thr gln211his asn lys val ser    thr ser pro lys ile   thr thr ala lys pro226ile asn pro arg pro    ser leu pro pro asn   ser asp thr ser lys241glu thr ser leu thr    val asn lys glu thr   thr val glu thr lys256glu thr thr thr thr    asn lys gln thr ser   thr asp gly lys glu271lys thr thr ser ala    lys glu thr gln ser   ile glu lys thr ser286ala lys asp leu ala    pro thr ser lys val   leu ala lys pro thr301pro lys ala glu thr    thr thr lys gly pro   ala leu thr thr pro316lys glu pro thr pro    thr thr pro lys glu   pro ala ser thr thr331pro lys glu pro thr    pro thr thr ile lys   ser ala pro thr thr346pro lys glu pro ala    pro thr thr thr lys   ser ala pro thr thr361pro lys glu pro ala    pro thr thr thr lys   glu pro ala pro thr376thr pro lys glu pro    ala pro thr thr thr   lys glu pro ala pro391thr thr thr lys ser    his pro pro leu pro   arg ser cys thr xxx406xxx xxx cys thr gln    pro thr pro lys glu   pro his pro pro leu421pro arg ser leu his    pro pro thr lys glu   pro ala pro thr thr436pro lys glu pro ala    pro thr ala pro lys   lys pro ala pro leu451pro pro leu glu pro    xxx xxx lys lys lys   lys lys lys

               序列2：人MPO cDNA的核苷酸序列1TTT CAG GTA CCG TAG    GTA CCC TTG CCG TAA    AGG ATG GCA TGG AAA46ACA CTT CCC ATT TAC    CTG TTG TTG CTG CTG    TCT GTT TTC GTG ATT91CAG CAA GTT TCA TCT    CAA GAT TTA TCA AGC    TGT GCA GGG AGA TGT136GGG GAA GGG TAT TCT    AGA GAT GCC ACC TGC    AAC TGT GAT TAT AAC181TGT CAA CAC TAC ATG    GAG TGC TGC CCT GAT    TTC AAG AGA GTC TGC226ACT GCG GAG CTT TCC    TGT AAA GGC CGC TGC    TTT GAG TCC TTC GAG271AGA GGG AGG GAG TGT    GAC TGC GAC GCC CAA    TGT AAG AAG TAT GAC316AAG TGC TGT CCC GAT    TAT GAG AGT TTC TGT    GCA GAA GTG CAT AAT361CCC ACA TCA CCA CCA    TCT TCA AAG AAA GCA    CCT CCA CCT TCA GGA406GCA TCT CAA ACC ATC    AAA TCA ACA ACC AAA    CGT TCA CCC AAA CCA451CCA AAC AAG AAG AAG    ACT AAG AAA GTT ATA    GAA TCA GAG GAA ATA496ACA GAA GTA AAA GAT    AAC AAG AAG AAC AGA    ACT AAA AAG AAA CCT541ACC CCC AAA CCA CCA    GTT GTA GAT GAA GCT    GGA AGT GGA TTG GAC586AAT GGT GAC TTC AAG    GTC ACA ACT CCT GAC    ACG TCT ACC ACC CAA631CAC AAT AAA GTC AGC    ACA TCT CCC AAG ATC    ACA ACA GCA AAA CCA676ATA AAT CCC AGA CCC    AGT CTT CCA CCT AAT    TCT GAT ACA TCT AAA721GAG ACG TCT TTG ACA    GTG AAT AAA GAG ACA    ACA GTT GAA ACT AAA766GAA ACT ACT ACA ACA    ATT AAA CAG ACT TCA    ACT GAT GGA AAA GAG811AAG ACT ACT TCC GCT    AAA GAG ACA CAA AGT    ATA GAG AAA ACA TCT856GCT AAA GAT TTA GCA    CCC ACA TCT AAA GTG    CTG GCT AAA CCT ACA901CCC AAA GCT GAA ACT    ACA ACC AAA GGC CCT    GCT CTC ACC ACT CCC946AAG GAG CCC ACG CCC    ACC ACT CCC AAG GAG    CCT GCA TCT ACC ACA991CCC AAA GAG CCC ACA    CCT ACC ACC ATC AAG    TCT GCA CCC ACC ACC1036CCC AAG GAG CCT GCA    CCC ACC ACC ACC AAG    TCT GCA CCC ACC ACT1081CCC AAG GAG CCT GCA    CCC ACC ACC ACC AAG    GAG CCT GCA CCC ACC1126ACT CCC AAG GAG CCT    GCA CCC ACC ACC ACC    AAG GAG CCT GCA CCC1171ACC ACC ACC AAG TCT    CAC CCA CCA CTC CCA    AGG AGC TGC ACX XXX1216XXX XXX TGC ACC CAA    CCA ACT CCC AAG GAG    CCT CAC CCA CCA CTC1261CCA AGG AGC CTG CAC    CCA CCA ACC AAG GAG    CCT GCA CCC ACC ACT1306CCC AAA GAG CCT GCA    CCC ACT GCC CCC AAG    AAG CCT GCC CCT CTA1351CCC CCT CTA GAG CCX    XXX XXX AAA AAA AAA    AAA AAA AAA

Claims (7)

1.一种人促巨核细胞生成素(MPO)，含有序列1所示氨基酸序列中的1-452位氨基酸组成的多肽序列。

2.一种编码人促巨核细胞生成素(MPO)的DNA分子，其特征在于，含

(A)序列2所示核苷酸序列中的1-1209位核苷酸；或

(B)与(A)互补的核苷酸序列。

3.一种用于扩增造血干细胞、巨核细胞和血小板的组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的MPO和生理学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，还包含选自干细胞因子、白介素3、白介素6、促红细胞生成素、粒单核细胞集落形成刺激因子和血小板第4因子的一种或多种细胞因子。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，还包含肝素类多糖物质。

6.权利要求1所述的MPO在体外扩增造血干细胞和巨核细胞/血小板中的应用。

7.权利要求1所述的MPO在制备用于扩增造血干细胞、巨核细胞和血小板的药物中的应用。

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